(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP（アデノウイルスデスプロテイン）をコードする領域が除去された組換えアデノウイルスを含む、癌細胞検出用試薬。
【請求項２】
ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP（アデノウイルスデスプロテイン）をコードする領域が除去された組換えアデノウイルスを含む、癌の診断用試薬。
【請求項３】
体内における検出、診断又はナビゲーション手術のために使用される、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがhTERTプロモーターである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項５】
標識タンパク質がGFP又はEGFPである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項６】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項７】
請求項１及び３〜６のいずれか１項に記載の試薬を、被験者から採取した血液中に存在する癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌細胞の検出方法。
【請求項８】
癌細胞検出用試薬の製造における、下記の組換えアデノウイルスの使用。
ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP（アデノウイルスデスプロテイン）をコードする領域が除去された組換えアデノウイルス
【請求項９】
癌の診断用試薬の製造における、下記の組換えアデノウイルスの使用。
ヒトテロメラーゼのプロモーター、アデノウイルスE1A遺伝子、IRES配列及びアデノウイルスE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがアデノウイルスゲノムのE3領域に組み込まれてADP（アデノウイルスデスプロテイン）をコードする領域が除去された組換えアデノウイルス
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、本発明は、癌細胞の検出用若しくは癌の診断用試薬並びに細胞死誘導剤に関する。
【背景技術】  癌化した細胞又は不死化した細胞株においては、テロメラーゼ活性が増大している頻度が高く、生殖系列の細胞、血球系細胞、上皮系細胞等以外の正常な体細胞ではテロメラーゼの活性はほとんど検出されていない。従って、テロメラーゼ活性を指標として癌を検出する試みがなされている（Ｓｈａｙ  ＪＷ，Ｚｏｕ  Ｙ，Ｈｉｙａｍａ  Ｅ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＷＥ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０（７）：６７７−８５，２００１）。
一方、生体内で癌組織や転移リンパ節を検出する試みは、画像診断の分野で研究が進んでいる。例えば、ＰＥＴによる生物学的診断やニューラルネットワークを駆使した画像解析などが報告されている。また、制限増殖型ウイルスの抗腫瘍活性や安全性を検討した研究報告も散見され（ＤｅＷｅｅｓｅ  ＴＬ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ  Ｈ，Ｌｉ  Ｓ，Ｍｉｋｈａｋ  Ｂ，Ｄｒｅｗ  Ｒ，Ｇｏｅｍａｎｎ  Ｍ，Ｈａｍｐｅｒ  Ｕ，ＤｅＪｏｎｇ  Ｒ，Ｄｅｔｏｒｉｅ  Ｎ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ，Ｈａｕｌｋ  Ｔ，ＤｅＭａｒｚｏ  ＡＭ，Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ  Ｓ，Ｙｕ  ＤＣ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＲ，Ｃａｒｄｕｃｃｉ  ＭＡ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＷＧ，Ｓｉｍｏｎｓ  ＪＷ．Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＣＶ７０６，ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ，ＰＳＡ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（２０）：７４６４−７２，２００１）、本発明者も、テロメラーゼのプロモーターを有し、かつ増殖能を有するウイルスを癌細胞に感染させることにより、ウイルスの増殖により癌細胞を死滅ことができることを見出した（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｔ，Ｋａｇａｗａ  Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｎ，Ｓｈｉｒａｋｉｙａ  Ｙ，Ｕｍｅｏｋａ  Ｔ，Ｔｅｒａｉｓｈｉ  Ｆ，Ｔａｋｉ  Ｍ，Ｋｙｏ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｎ，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｔ．Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｌｉｎｋｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０（１）：２８５−９２，２００４）。
しかし、癌細胞へのターゲッティングの困難さから、術中のｉｎ  ｓｉｔｕでの癌検出システムは未だ開発されていない。また、ウイルスを生体内に感染させた場合の癌細胞内動態を、実際に癌組織の可視化に応用した研究はまだ知られていない。
【発明の開示】
上記のように、これまで、生体内においても可視化が可能な癌細胞の検出用若しくは癌の診断用試薬、並びに細胞死誘導剤の開発が望まれていた。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、蛍光標識タンパク質をコードする遺伝子をウイルスゲノムのＥ３領域に組み込み、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットをＥ１領域に組み込み、両カセットを発現させることにより、癌細胞を極めて高感度に検出し、しかも、生体内において検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、癌細胞検出用試薬。
（２）ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、癌の診断用試薬。
上記（１）及び（２）において、これらの試薬は、体内における検出、診断又はナビゲーション手術のために使用することができる。これらのヒトテロメラーゼプロモーターとしてｈＴＥＲＴプロモーターを、標識タンパク質としてＧＦＰを例示することができる。この標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターを使用することができる。さらにウイルスとしては、例えばアデノウイルスが挙げられる。
（３）ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む細胞死誘導カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む細胞死誘導剤。
この場合、ヒトテロメラーゼのプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターであってもよい。また、細胞死誘導関連タンパク質としては、免疫関連タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質、及びテロメラーゼ関連タンパク質が挙げられる。さらに、例えば、免疫関連タンパク質としてＰＡ２８を、アポトーシス誘導タンパク質としてＴＲＡＩＬを、テロメラーゼ関連タンパク質としてＡＵ５を例示することができる。また、細胞死誘導関連タンパク質の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターであってもよく、さらにウイルスがアデノウイルスであってもよい。本発明の細胞として、癌細胞を使用することもできる。
（４）上記（１）の試薬を癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌細胞の検出方法。
（５）上記（２）の試薬を癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌の診断方法。
（６）上記（３）の誘導剤を標的細胞に感染させることを特徴とする、該標的細胞の細胞死を誘導する方法。
【図面の簡単な説明】図１は、テロメライシン−ＧＦＰの構造を示す図である。
図２は、非増殖性ウイルスの増殖を示す図である。
図３は、インビトロにおけるＡｄ−ＧＦＰ共感染による癌細胞の検出結果を示す図である。
図４は、インビボにおけるＡｄ−ＧＦＰ共感染によるヒト癌組織の検出結果を示す図である。
図５は、ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−ＧＦＰ感染による形態学的変化を示す図である。
図６は、ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−ＧＦＰ感染によるＧＦＰ蛍光発現を示す図である。
図７は、定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメライシン−ＧＦＰ増殖を示す図である。
図８は、ヒト大腸癌細胞へのテロメライシン−ＧＦＰ感染によるＧＦＰ蛍光発現を示す図である。
図９は、定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメライシン−ＧＦＰ増殖を示す図である。
図１０は、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）へのテロメライシン−ＧＦＰ感染による形態学的変化を示す図である。
図１１は、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）へのテロメライシン−ＧＦＰ感染によるＧＦＰ蛍光発現を示す図である。
図１２は、定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメライシン−ＧＦＰ増殖の比較を示す図である。
図１３は、蛍光イメージングによるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図１４は、蛍光イメージングによるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図１５は、蛍光イメージングによるテロメライシン−ＧＦＰのリンパ節転移モデルにおける腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図１６は、ヌードマウスとＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける組織学的解析を示す図である。
図１７は、ヌードマウスとＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける開腹所見を示す図である。
図１８は、蛍光イメージングによるＨＴ２９直腸腫瘍および傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図１９は、蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
図２０は、蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書に記載された参考文献は、参照として本明細書の全体に組み込まれるものとする。
１．癌細胞検出用試薬及び検出方法
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、癌細胞検出用試薬である。また、本発明は、当該試薬を癌細胞に感染させ、当該癌細胞から発する蛍光を検出することを特徴とする、癌細胞の検出方法である。本発明において、「組換えウイルス」とは、後述の複製カセットと標識カセットがゲノムに組み込まれたウイルスをいう。用いられるウイルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ５のアデノウイルスが特に好ましい。
本発明に使用される組換えウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域相当する領域に複製カセットが、及びアデノウイルスゲノムのＥ３領域に相当する領域に標識カセットが組み込まれたものである。複製カセットは、ヒトテロメラーゼプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むものであり、ヒトテロメラーゼプロモーターにより、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子が駆動され、癌細胞特異的およびテロメラーゼ特異的に増殖・複製される。また、標識カセットは、プロモーター及び標識タンパク質をコードする遺伝子を含むものであり、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターにより標識タンパク質をコードする遺伝子が駆動される（図１）。
「テロメラーゼプロモーター」は、テロメラーゼの転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する。テロメラーゼとは、真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。このようなテロメラーゼプロモーターの種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のプロモーターが好ましい。ｈＴＥＲＴは、その５’末端の上流１．４ｋｂｐの領域には、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がｈＴＥＲＴプロモーターと考えられるが、中でも、翻訳開始部位の上流１８１ｂｐの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流３７８ｂｐ程度の配列をｈＴＥＲＴプロモーターとして使用するのが好ましい。この３７８ｂｐ程度の配列は、１８１ｂｐのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。４５５ｂｐの長さのｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。
ｈＴＥＲＴプロモーターは、配列番号１に示される塩基配列のほか、配列番号１からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列よりなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつｈＴＥＲＴプロモーター活性を有するヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）等を参照することができる。
本発明において、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むこととしたのは、ＩＲＥＳ配列をＥ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子との間に挿入したものを使用すると、ウイルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるためである。なお、Ｅ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子は、Ｅ１遺伝子に含まれる遺伝子であるが、このＥ１遺伝子とは、ウイルスの有するＤＮＡ複製に関する初期遺伝子（ｅａｒｌｙ：Ｅ）と後期遺伝子（ｌａｔｅ：Ｌ）のうちの初期遺伝子の一つをいい、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。Ｅ１Ａ遺伝子によりコードされるＥ１Ａタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４等）の転写を活性化する。Ｅ１Ｂ遺伝子でコードされるＥ１Ｂタンパク質は、後期遺伝子（Ｌ遺伝子）のｍＲＮＡが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示す。
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示される塩基配列のほか、配列番号２及び配列番号３からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列よりなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ各々Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）等を参照することができる。
ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）とは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、１８ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来ｍＲＮＡはこの配列を介して翻訳されることが知られている。ＩＲＥＳ配列からの翻訳効率は高く、ｍＲＮＡの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりＥ１Ａ遺伝子とＩＲＥＳ配列の下流にあるＥ１Ｂ遺伝子の両方が独立に翻訳される。ＩＲＥＳを使用すると、テロメラーゼプロモーターの発現制御がＥ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子に独立して及ぶために、Ｅ１Ａ遺伝子あるいはＥ１Ｂ遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。ＩＲＥＳ配列を配列番号４に示す。
また、ＩＲＥＳは、配列番号４に示される塩基配列のほか、配列番号４からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列よりなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＩＲＥＳ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）等を参照することができる。
また、本発明において、ヒトテロメラーゼのプロモーターはＥ１遺伝子の上流に有する。テロメラーゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。
本発明の複製カセットに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｅｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を用いる方法、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等によるアガロースゲルを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ＆スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社））を利用して配列を解析することも可能である。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のＤＮＡ断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のＩＲＥＳ（ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合サイト）が含まれていて、１種類のｍＲＮＡから２箇所のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を翻訳することが可能なｐＩＲＥＳベクターのほか、大腸菌由来のプラスミド（ｐＣＲ４、ｐＣＲ２、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられるが、本発明の場合は、ｐＩＲＥＳベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子」をこの順に含む複製カセットを作製することができるため、好ましい。ＤＮＡの連結には、ＤＮＡリガーゼを用いることができる。本発明において、ヒトテロメラーゼとしてｈＴＥＲＴを用いる場合について以下に具体的に説明する。
２９３細胞等のＥ１遺伝子を発現している細胞からＥ１Ａ−Ｓ、Ｅ１Ａ−ＡＳ、Ｅ１Ｂ−Ｓ、Ｅ１Ｂ−ＡＳ等の適当なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＤＮＡ−ＰＣＲを行うことによりＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を増幅し、必要に応じてＴＡクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認した後、公知の制限酵素でＥ１Ａ及びＥ１ＢのＤＮＡ断片を切り出す。
次に、本発明に使用されるｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂからなる複製カセットは、ｐＩＲＥＳベクターのような公知のベクターに『ｈＴＥＲＴプロモーター配列−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ』の順になるように各遺伝子を、マルチクローニングサイト等を利用して挿入することにより作製することができる。また、必要に応じて、ｐＳｈｕｔｔｌｅなどの公知ベクターに含まれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを公知の制限酵素により取り除き、その部位にｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂから適当な制限酵素を用いて切り出した配列を挿入することができる。このように、本発明に使用されるｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂからなる複製カセットのみを組込んだアデノウイルスを「テロメライシン」又は「Ｔｅｌｏｍｅｌｙｓｉｎ」という。ｈＴＥＲＴプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なＥ１遺伝子を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
本発明の試薬として使用される組換えウイルス中には、複製カセットと共に標識カセットも含む。この「標識カセット」は、例えば、アデノウイルスではＥ３領域に組み込まれる。
ここで、本発明において使用される組換えウイルスであるウイルスベクター本来の機能は、ウイルス増殖による細胞障害である。従って、本発明の試薬を微小癌組織の診断目的で使用するためには、上記細胞障害が発生する時期はできるだけ遅い方が好ましい。その理由は、細胞が破壊されると本発明の組換えウイルスの増殖で生じた蛍光発現が消失し、その存在部位を同定するのが困難となるためである。
一方、例えば、アデノウイルスＥ３領域にはＥ３ＡおよびＥ３Ｂが存在し、Ｅ３Ａ領域の１１．６ｋＤａのＡＤＰ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞障害及びウイルスの拡散を促進する機能を有している。
従って、本発明に使用する組換えウイルスは、ＡＤＰを含むＥ３領域のような細胞障害及びウイルスの拡散を促進する機能を有するタンパク質をコードするウイルスゲノム領域を除去することで細胞死のタイミングを遅らせ、ＧＦＰ等の蛍光発現による癌組織の同定を容易にしている。
標識カセットを構成する標識タンパク質は、上記ウイルスが増殖した細胞内で発光して可視化されるタンパク質であり、好ましくは蛍光を発する物質が用いられる。このような物質としては、例えば、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、それを改変した変異体（ＧＦＰ  バリアント）である、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＧＦＰ）又はｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ  ＧＦＰ）などが挙げられる。また、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧＦＰを使用することも可能であり、これらをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。
また、上記遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとは、目的とする上記遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター、ＳＲαプロモーター等が挙げられるがこれに限定されるものではない。好ましくはＣＭＶプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターを用いることができる。
本発明の標識カセットに含まれる組換え遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を用いる方法、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等によるアガロースゲルを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ＆スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社））を利用して配列を解析することも可能である。その後、上記のようにして得られた遺伝子をを公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のＤＮＡ断片を、上記標識タンパク質をコードする遺伝子断片の上流に、当該遺伝子を駆動させうるように上記プロモーターをコードする遺伝子断片を配置するように組換え遺伝子を設計する。このとき、プラスミドとして、シャトルプラスミドｐＨＭ１１などを用いることができる。そして、ＤＮＡリガーゼを用いて両遺伝子を連結させ、ベクターに挿入し、標識カセット組換え遺伝子を作製する。
公知のベクターとしては、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＣＲ４、ｐＣＲ２、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
その後、上記複製カセット及び標識カセットを含む組換え遺伝子を、適当な制限酵素を用いて切り出し、適当なウイルス発現ベクター挿入することにより、組換えウイルスを作製することができる。ウイルス発現ベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられえるが、上記したように、アデノウイルス、特にタイプ５のアデノウイルスが好ましい。カセットのウイルスへの組み込みは、例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
本発明では、具体的には、シャトルプラスミドｐＨＭ１１にｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）由来のＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０Ｐ（Ａ）を挿入し、このプラスミドのＣｓｐ４５Ｉ断片を、ｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂを組み込んだｐＳｈｕｔｔｌｅベクターのＣｌａＩ部位に挿入することによって得ることができる。
本発明では、具体的には、上記のように作製した組換え遺伝子から、公知の制限酵素により必要な部分の配列を切り出し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）等の市販のキットを用いてＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ等のウイルスのＤＮＡに挿入することができる（得られたものを「ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢ」という。）。
そして、このＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢを公知の制限酵素により線状化した後、２９３細胞等の培養細胞にトランスフェクションすることで、感染性のある組換えウイルスを作製することができる。
本発明において検出の対象となる癌細胞の種類は、限定されるものではなく、あらゆる種類の癌の細胞を用いることができる。例えば、頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前立腺、膵、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌、あるいは白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等に有効である。ヒトの組織由来の癌細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明はそのようなテロメラーゼ活性により増殖が活発になった癌細胞を全般的に検出することが可能である。
癌細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、テロメラーゼが含まれる癌細胞においてはｈＴＥＲＴが発現し、複製カセットが機能する。これによりウイルスは増殖し、また増殖によって標識タンパク質の複製も増加することから、標識タンパク質が発現して可視化されることとなる。
したがって、本発明の試薬は、正常細胞では蛍光発色せず、本発明の試薬を含む癌細胞は発光し、癌細胞を視覚的に観察することができる。
組換えウイルスを細胞に感染させるには、例えば、以下の方法がある。まず、ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９等の細胞を適当な培養液が入った培養プレートに播き、炭酸ガス存在下で、３７℃で培養する。培養液は、動物細胞培養に一般的に使用されるＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０などが採用され、必要応じて血清、抗生物質、ビタミン等を添加することができる。培養した細胞に一定量の本ウイルス、例えば、０．１〜１０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、好ましくは、１ＭＯＩを接種することにより感染させる。ＭＯＩとは、一定量の培養細胞に一定量のウイルス粒子を感染させる場合のウイルス量（感染単位）と細胞数の比をいい、ウイルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。
なお、ウイルス増殖を確認するには、ウイルス感染細胞を回収し、ＤＮＡを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで定量的に解析することができる。
標識された細胞の検出については、ウイルス増殖がみられる細胞は、励起光をあてることにより所定の蛍光（例えばＧＦＰの場合は緑色蛍光）を発するため、それにより癌細胞を可視化することができる。例えば、ウイルス感染細胞を蛍光顕微鏡下に観察すると、細胞でＧＦＰ蛍光発現が見られる。またウイルス感染細胞を経時的に観察するには、ＣＣＤカメラを用いて、経時的にＧＦＰ蛍光発現を観察することができる。
生体内において細胞をリアルタイムで標識および検出するには、本発明の組換えウイルスを生体内に投与すればよい。
本発明の試薬はそのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等に、注射、鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明ウイルスの量を１０６〜１０１１ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０９〜１０１１ＰＦＵ程度とするのがよく、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
生体内においてリアルタイムで標識を観察することは、体内診断薬に用いるメリットがある。これは、いわゆるナビゲーション手術などに有用である。
外科手術において、病変臓器を含めて広範囲の切除を行えば、手術を乗り切った患者では長期生存が得られる。しかし、手術そのものによる合併症の発生率は高くなり、また機能を失うことで術後の日常生活への影響は避けられない。長期生存の遠隔成績を維持しながら、患者の負担を軽減した低侵襲な治療を導入することは、癌治療において重要なことである。
必要最小限の切除を行う手術の縮小化による低侵襲化を目指す場合にほしい情報の一つに転移リンパ節の有無があり、それを知る方法としてセンチネルリンパ節（ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｎｏｄｅ，ＳＮ）が注目されている。ＳＮとは腫瘍から最初にリンパ流をうけるリンパ節であり、ここに最初の微小転移が生ずるという仮説がある。この仮説をＳＮ理論という。乳癌では欧米を中心に大規模な臨床試験が開始されているが、その他の固形腫瘍にもこの考え方が通用するかについては未だ不明であり、その検証がはじまったところである。
本発明の試薬による体内癌診断システムは、ＳＮより有効な方法として、癌細胞において蛍光タンパク質を直接発現させ、高感度術中蛍光検出システムにより腫瘍組織又は転移陽性リンパ節を同定する技術、すなわち「ナビゲーション手術」の技術を確立することができる。テロメラーゼ活性を持つ多くの癌細胞では本発明の組換えウイルスが増殖し、例えばＧＦＰの強い緑色蛍光を発することができる。
胃癌の単発リンパ節転移部位の解析から、１０％前後のｓｋｉｐ転移、すなわち第１群リンパ節を飛び越した第２群以遠リンパ節への初発転移が報告されており、これを根拠としてＳＮナビゲーションの危険性を唱える意見も多い。しかしながら、本発明の試薬による体内癌診断システムは、腫瘍組織又は転移陽性リンパ節を直接術中にリアルタイムに同定し、切除範囲のナビゲーションとするものであり、独創的かつ画期的であるとともに、よりスムースに手術を進めるためには極めて実用的である。具体的には、ＳＮナビゲーションの際と同様の手技で、本発明の試薬を手術より数日前に内視鏡的に腫瘍部（例えば胃癌や大腸癌周囲の胃・大腸粘膜、胃癌・大腸癌・肺癌・膵癌などの腫瘍内部、等）に注入し、腫瘍浸潤組織、腫瘍転移組織、あるいは所属リンパ節へウイルスが分布し、腫瘍部位又は転移陽性部位でのウイルスが増殖するために十分な時間をおく。
手術時には、開腹後にＧＦＰ蛍光励起光源から術野を投射し、特殊３ＣＣＤカメラからの映像をフェース・マウント・ディスプレイに投影する。透過レンズを使用することで、実際の術野の視野も確保でき、オーバーラップしたＧＦＰ画像により転移陽性リンパ節を検出することができる。さらに、専用フィルターを装着することで、カメラを用いずに肉眼的に蛍光を視認することが可能となる。
２．体外診断用試薬
本発明の試薬は、スクリーニング目的の体外診断薬としても応用可能である。現在、腫瘍マーカーの定量は、肉眼的に検出できない、あるいは原発巣が同定できない癌の存在を知る最も一般的な方法である。しかし、腫瘍マーカーはその癌特異性で必ずしも満足できるものではなく、またすべての癌種を単一のマーカーで検索することは極めて困難である。
テロメラーゼはヒト悪性腫瘍の８５％以上で活性の上昇が確認されており、その癌特異性に関しては極めて高いと考えられる。
本発明の試薬を用いた体外的癌診断は、例えば以下の通り行うことができる。
被験者から採取した全血から赤血球を除き、その他の細胞浮遊液に一定の比率（０．１〜１０ＭＯＩ、好ましくは、１ＭＯＩ）の本発明の試薬を試験管内で混合する。一定の時間（例えば１２〜４８時間）放置し、癌細胞へのウイルスの感染および増殖を促し、その細胞分画におけるＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにて定量的に解析する。このシステムを用いて、末梢血中に存在する遊離癌細胞を高感度に検出することが可能となる。この方法は、末梢血中にごく微量にしか存在しない遊離癌細胞を検出するために用いることができる。
３．細胞死誘導剤及び細胞死を誘導する方法
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む細胞死誘導カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む細胞死誘導剤を提供する。好ましくは、癌細胞の細胞死の誘導剤として、癌の遺伝子治療、さらに手術後の再発予防、転移の防止及び／又は予防等にも使用できる。
本発明の細胞死誘導剤に含まれる組換えウイルスの細胞死誘導カセットには、プロモーターにより駆動される細胞死を誘導しうるタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれている。
この組換えウイルスに用いられる細胞死誘導カセットには、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子と該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが含まれる。したがって、例えば本発明の誘導剤を癌細胞に導入すると、癌細胞で特異的にウイルスが増殖する結果、細胞死誘導タンパク質の細胞内発現量が高まり、他の正常細胞を傷つけることなく、癌細胞でのみ細胞死を誘導することができる。
細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子とは、特定の細胞の細胞死の誘導に関連するタンパク質をコードする遺伝子をいう。
細胞死誘導関連タンパク質として、例えば以下のものが挙げられ、本発明においてはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を組み込むことができる。
たとえば、免疫関連タンパク質として、ＰＡ２８が挙げられる。ＰＡ２８は細胞内のプロテアソームを活性化するタンパク質であり、過剰発現により免疫反応を惹起するとともに細胞死も誘導するタンパク質である。また、アポトーシス誘導タンパク質として、ＴＲＡＩＬが挙げられる。ＴＲＡＩＬは、細胞表面の受容体と結合することでアポトーシス細胞死を誘導する分子をいう。テロメラーゼ関連タンパク質として、ＡＵ５が挙げられる。ＡＵ５は、テロメラーゼ活性を有する細胞で細胞死を誘導することができる配列を有する。
これらの細胞死誘導関連タンパク質の遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を用いる方法、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等によるアガロースゲルを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ＆スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社））を利用して配列を解析することも可能である。
また、癌細胞の細胞死の誘導物質として、癌抑制遺伝子も含む。癌抑制遺伝子は癌細胞の増殖を抑える機能を有しているからである。この場合、癌抑制遺伝子は、例えば従来の遺伝子治療で用いられている以下のものが挙げられる。
ｐ５３（配列番号１１；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１４６９４）：多種の癌
ｐ１５（配列番号１２；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ３６８４４）：多種の癌
ｐ１６（配列番号１３；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ２７２１１）：多種の癌
ＡＰＣ（配列番号１４；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ７４０８８）：大腸癌、胃癌、すい臓癌
ＢＲＣＡ−１（配列番号１５；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ１４６８０）：卵巣癌、乳癌
ＤＰＣ−４（配列番号１６；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４４３７８）：大腸癌、すい臓癌
ＦＨＩＴ（配列番号１７；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ１１２０１２）：胃癌、肺癌、子宮癌
ｐ７３（配列番号１８；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｙ１１４１６）：神経芽細胞種
ＰＡＴＣＨＥＤ（配列番号１９；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ５９４６４）：基底細胞癌
Ｒｂｐ１１０（配列番号２０；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１５４００）：肺癌、骨肉種
ＤＣＣ（配列番号２１；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７６１３２）：大腸癌
ＮＦ１（配列番号２２；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ０００２６７）：神経繊維腫症１型
ＮＦ２（配列番号２３；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ１１３５３）：神経繊維腫症２型
ＷＴ−１（配列番号２４；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ０００３７８）：ウィルムス腫瘍
これらの癌抑制遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。必要に応じて、ＤＮＡシークエンスにて期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。
上記遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとは、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。好ましくはＣＭＶプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターを用いうるが、これに限定されず、例えば、ＳＶ４０後期プロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いることができる。
本発明の細胞死誘導剤は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。
本発明の細胞死誘導剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明ウイルスの量を１０６〜１０１１ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０９〜１０１１ＰＦＵ程度とするのがよく、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、該ウイルスが感染し易くすることもできる。更に、本発明のウイルスは、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗癌剤を併用することもできる。抗癌剤には、以下のものがあるが、これらに限定されない。
（１）アルキル化活性剤：この製剤は、癌細胞の核酸タンパク質にアルキル基を導入して細胞障害を起こさせる作用を有するものであり、例えばカルボコン、プスルファン（マスタード薬）、ニムスチン（ニトロソウレア類）などがあげられる。
（２）代謝拮抗活性剤：この製剤は、代謝過程で酵素に拮抗して、細胞合成を阻害する作用を有するものであり、例えばメトトレキサート（葉酸系）、メルカプトプリン、（プリン系）、シタラビン（ピリミジン系）、フルオロウラシル、テガフール、カルモフールなどがあげられる。
（３）抗生物質：抗癌作用を有する、アクチノマイシンＤ、プレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンＣなどがあげられる。
（４）微小管阻害活性剤：この製剤は、微小管に作用して抗腫瘍効果を示すものであり、例えばドセタキセル、パクリタキセル（タキサン）、ビノレルビン、ピンクリスチン、ビンブラスチン（アルカロイド系）などがあげられる。
（５）白金製剤：この製剤は、ＤＮＡ鎖内又は鎖間結合あるいはＤＮＡタンパク質結合を構成して、ＤＮＡ合成を阻害する作用を有するものであり、例えば、シスプラチン、アルボプラチン、ネダプラチンなどがあげられる。
（６）トポイソメラーゼ阻害活性剤：トポイソメラーゼを阻害する、イリノテカン（トポイソメラーゼＩ阻害薬）、ポドフィロトキシン誘導体（トポイソメラーゼＩＩ阻害薬）などがあげられる。なお、トポイソメラーゼとは、ＤＮＡに一時的に切れ目を入れてＤＮＡ鎖のリンキング数を変える反応を触媒する酵素である。
本発明の細胞死誘導剤等は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。
（１）正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくい。
（２）本発明のウイルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウイルスよりも低い濃度で使用することができる。
（３）本発明のウイルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウイルス作用が働く。
本発明の組換えウイルスを標的細胞中で感染させることで標的細胞において細胞死を誘導することができる。標的細胞の種類は特に限定されるものではないが、例えば腫瘍細胞、増殖が活発な細胞、テロメラーゼ活性が上昇している細胞などを挙げることができる。
細胞死が誘導されたか否かを判断するには、形態学的観察を以下の方法により行うことができる。すなわち、培養容器の底面に付着した細胞に本発明の組換えウイルスを感染させ一定の時間を経ると、倒立顕微鏡下で細胞は円形化し、底面からはがれて光沢を持った細胞として培養液中に浮遊する。この時点で細胞はその生命を維持する機構に破綻を来たしており、細胞死が誘導されたと判断できる。また、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ、ＸＴＴなど）を用いた市販の生細胞アッセイキットでも、細胞死を確認することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  インビトロにおける共感染による癌細胞描出
本実施例は、複製カセットを含むウイルス「テロメライシン（Ｔｅｌｏｍｅｌｙｓｉｎ）」と、標識カセットを含む非増殖型ウイルス「Ａｄ−ＧＦＰ」とを共感染させたときに、インビトロで蛍光を発するかどうかを予備的に検討したものである。
ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９に０．１ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のＡｄ−ＧＦＰを感染させた（図２）。
その結果、ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９に０．１ＭＯＩのＡｄ−ＧＦＰを感染させてもほとんど緑色傾向は認められないが、１ＭＯＩのＴＲＡＤを併用すると癌細胞のみで蛍光が検出でき、ＷＩ３８やＮＨＬＦなどのヒト線維芽細胞やヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの正常細胞では蛍光はまったく見られなかった（図３）。
【実施例２】  インビボにおけるテロメライシンとＡｄ−ＧＦＰ共感染によるヒト癌組織の描出
本実施例は、複製カセットを含むウイルス「テロメライシン」と、標識カセットを含む非増殖型ウイルス「Ａｄ−ＧＦＰ」とを共感染させたときに、インビボで蛍光を発するかどうかを予備的に検討したものである。
ヌードマウスの背部皮下に移植したヒト大腸癌ＳＷ６２０およびヒト肺癌Ａ５４９腫瘍に、８×１０５ＰＦＵのＡｄ−ＧＦＰと８×１０６ＰＦＵのＴＲＡＤを腫瘍内投与し、経時的に蛍光を観察した。
その結果、いずれの腫瘍でも投与後２日目から斑状の蛍光が検出され、１４日目までに消失していたことが示された（図４）。
【実施例３】  テロメライシン−ＧＦＰによる癌細胞の検出
１．テロメラーゼプロモーターとＥ１遺伝子を含む複製カセット及びＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子を含む標識カセットを単一のウイルスに含むＧＦＰ発現増殖型ウイルス（テロメライシン−ＧＦＰ）の作製
テロメライシン−ＧＦＰの概要を図１に示す。テロメライシン−ＧＦＰは、ｈＴＥＲＴプロモーターによりＥ１Ａ／ＩＲＥＳ／Ｅ１Ｂが駆動され、癌細胞特異的およびテロメラーゼ特異的に増殖・複製が認められる一方、さらにＥ３領域に、プロモーターにより駆動されるオワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子が組み込まれている。したがって、ウイルス増殖がみられる細胞は励起光により緑色蛍光を発し、癌細胞を可視化することが可能となる。
このような非増殖型ウイルスは以下の通り作製した。
２．組換えウイルスの作製。
２９３細胞から抽出したＲＮＡから以下の特異的プライマー（Ｅ１Ａ−Ｓ、Ｅ１Ａ−ＡＳ）及びＰＣＲ条件を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、８９７ｂｐのＥ１Ａ遺伝子を増幅した。
Ｅ１Ａ−Ｓ：５’−ＡＣＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＧ−３’（配列番号５）
Ｅ１Ａ−ＡＳ：５’−ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号６）
0005006045.tif 000002
0005006045.tif 000003
２９３細胞から抽出したＤＮＡより以下のプライマー（Ｅ１Ｂ−Ｓ、Ｅ１Ｂ−ＡＳ）を用いてＤＮＡ−ＰＣＲを行い、１８２２ｂｐのＥ１Ｂ遺伝子を増幅した。
Ｅ１Ｂ−Ｓ：５’−ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＧＧ−３’（配列番号７）
Ｅ１Ｂ−ＡＳ：５’−ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＣＴＣ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ液組成、反応条件（サイクル、温度）はＥ１Ａ遺伝子の場合と同様であった。
それぞれのＰＣＲ産物のＴＡクローニング（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  ｄｕａｌ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行い、シークエンスを確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩにより、各々９１１ｂｐ（Ｅ１Ａ）、１８３６ｂｐ（Ｅ１Ｂ）のＤＮＡ断片を切り出した。
ｐＩＲＥＳベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＭｌｕＩ切断部位にＥ１Ａを、ＳａｌＩ部位にＥ１Ｂをそれぞれ順方向に挿入した（Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳＩ−Ｅ１Ｂ）。
制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩで切り出した４５５ｂｐのｈＴＥＲＴプロモーター配列を、Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ＢのＥ１Ａ上流にあるＸｈｏＩ部位に順方向に挿入した（ｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ）。
ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターに含まれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを制限酵素ＭｆｅＩおよびＮｈｅＩ処理により取り除き、その部位にｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂより制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切り出した３８２８ｂｐの配列を挿入した（ｐＳｈ−ｈＡＩＢ）。
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をＡｇｅＩ／ＮｈｅＩで切断し、クレノウ断片で平滑化し自己結合（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）した（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）。
このｐＥＧＦＰ−Ｎ２をＮｓｉＩ／ＡｆｌＩＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化しＢｇｌＩＩリンカーを使って、ＢｇｌＩＩ部位を作製した。このＢｇｌＩＩ断片をｐＨＭ１１のＢａｍＨＩ部位に挿入した（ｐＨＭ１１−ＥＧＦＰ−Ｎ２）。
さらに、ｐＨＭ１１−ＥＧＦＰ−Ｎ２のＣｓｐ４５Ｉ断片をｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂを組み込んだｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（ｐＳｈ−ｈＡＩＢ）のＣｌａＩ部位に挿入した。
作製した組換え遺伝子を制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩにより４３８１ｂｐの配列を切り出し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡに挿入した（ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢ）。ＡｄｅｎｏＸ０−ｈＡＩＢを制限酵素ＰａｃＩ処理で線状化した後、２９３細胞にトランスフェクションし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製した（以下、「テロメライシン−ＧＦＰ」という）。
【実施例４】  ヒト肺癌細胞の検出試験
１．ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−ＧＦＰ感染による形態学的変化
インビトロで培養中のヒト非小細胞肺癌由来Ｈ１２９９細胞にテロメライシン−ＧＦＰを１ＭＯＩおよび１０ＭＯＩで感染させた。具体的には、２４ウェルプレートに５ｘ１０４個のＨ１２９９細胞を蒔き、２４時間後に細胞数をカウントして１ＭＯＩあるいは１０ＭＯＩとなるような濃度のウイルスを培養液中に添加した。その後、経時的に倒立顕微鏡下に細胞形態を観察し、ウイルスの細胞障害活性を検討した。
その結果、濃度依存性にまた時間依存性にウイルス増殖による細胞死が誘導された。１０ＭＯＩ感染後１２０時間では、倒立顕微鏡下にほとんどの細胞が円形となり浮遊していた（図５）。
２．ヒト肺癌細胞へのテロメライシン−ＧＦＰ感染によるＧＦＰ蛍光発現
図６に示した倒立顕微鏡像を蛍光顕微鏡下に観察した。濃度依存性にまた時間依存性にウイルス増殖を示すＧＦＰ緑色蛍光が認められた（図６）。１０ＭＯＩ感染後７２時間で最も多くの細胞でＧＦＰ発現がみられ、その後細胞死の誘導とともにＧＦＰ陽性細胞数は減少していた（図６）。
３．定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメライシン−ＧＦＰ増殖の検証
Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞に１０ＭＯ１でテロメライシン−ＧＦＰを感染させ、２時間後から２６、５０、７４時間後に細胞を回収し、ＤＮＡを抽出した。テロメライシン−ＧＦＰが有するＥ１Ａ遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ウイルス増殖・複製を定量的に解析した。用いたプライマー及びＰＣＲ条件は以下の通りである。
Ｅ１Ａ−Ｓ：５’−ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＡＡ−３’（配列番号９）
Ｅ１Ａ−ＡＳ：５’−ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＴＴ−３’（配列番号１０）
0005006045.tif 000004
その結果、テロメライシン−ＧＦＰは２６時間後にはすでに１００万倍に増殖しており（図７）、その後プラトーに達するが、やや遅れてＧＦＰ蛍光も増強していくことが示された（図７）。
【実施例５】  ヒト大腸癌細胞の検出試験
１．ヒト大腸癌細胞へのテロメライシン−ＧＦＰ感染によるＧＦＰ蛍光発現
ヒト大腸癌由来ＳＷ６２０細胞に１０ＭＯＩでテロメライシン−ＧＦＰを感染させ、倒立顕微鏡下および蛍光顕微鏡下に経時的に変化を観察した。
その結果、Ｈ１２９９細胞の際と同様に、時間依存性にウイルス増殖を示すＧＦＰ緑色蛍光が認められた（図８）。
２．定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメライシン−ＧＦＰ増殖の検証
Ｈ１２９９細胞と同様に、ＳＷ６２０ヒト大腸癌細胞に１０ＭＯＩでテロメライシン−ＧＦＰを感染させ、２時間後から２６、５０、７４、９８時間後に細胞を回収、ＤＮＡを抽出し、ウイルス増殖をリアルタイムＰＣＲにて定量的に解析した。リアルタイムＰＣＲの条件（反応液組成、サイクル、時間等）はＨ１２９９細胞の場合と同様である。
その結果、テロメライシン−ＧＦＰは２６時間後には１００万倍に増殖しており、その後９８時間後までほぼプラトーであった（図９）。
【実施例６】１．正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）へのテロメライシン−ＧＦＰ感染による形態学的変化
インビトロで培養中の正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）にテロメライシン−ＧＦＰを１ＭＯＩおよび１０ＭＯＩで感染させ、倒立顕微鏡下に１２０時間まで観察した。
その結果、形態学的変化は見られず、細胞死は誘導されなかった（図１０）。
２．正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）へのテロメライシン−ＧＦＰ感染によるＧＦＰ蛍光発現
図１０の倒立顕微鏡像を蛍光顕微鏡下に観察すると、若干の細胞でＧＦＰ蛍光発現は見られるが、細胞密度を考慮すると癌細胞に比べてきわめて稀であった。従って、テロメライシン−ＧＦＰはほとんど正常細胞では増殖・複製していないと考えられた（図１１）。
３．定量的リアルタイムＰＣＲによるテロメライシン−ＧＦＰ増殖の検証上記のように、Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞、ＳＷ６２０ヒト大腸癌細胞、正常ヒト肺線雑芽細胞（ＮＨＬＦ）に１０ＭＯＩでテロメライシン−ＧＦＰを感染させ、経時的に細胞を回収、ＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにてウイルス増殖を定量的に解析した。
その結果、癌細胞ではテロメライシン−ＧＦＰは２４時間後には約１００万倍に増殖し、７２時間後には顕著なＧＦＰ蛍光を発していたのに対し、ＮＨＬＦでは７２時間後でも１０００倍程度の増殖にとどまり、ＧＦＰ蛍光もほとんど検出できなかった（図１２）。
【実施例７】  蛍光イメージングによるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製の検出
１．ヌードマウスに移植したＨ１２９９ヒト肺癌腫瘍内に１０７ＰＦＵのテロメライシン−ＧＦＰを投与し、ＣＣＤカメラにて経時的にＧＦＰ蛍光発現を観察した。
その結果、２４時間以内にテロメライシン−ＧＦＰ増殖によるＧＦＰ蛍光発現が認められるようになり、３日後、５日後とその範囲および輝度が増強した（図１３）。
２．上記と同様にして、ヌードマウスに移植したＨ１２９９ヒト肺癌腫瘍内に１０７ＰＦＵのテロメライシン−ＧＦＰを投与し、１週間後および３週間後に皮下腫瘍を摘出した。ＣＣＤカメラにて腫瘍全体および割面でのＧＦＰ蛍光発現を観察した。
その結果、摘出腫瘍表面で蛍光発現が微弱な場合も、割面では広い範囲でテロメライシン−ＧＦＰの増殖が確認でき、３週間後の組織ではほとんど腫瘍全体で蛍光が認められた（図１４）。
３．上記と同様にして、同所性モデルとしてヌードマウスの直腸壁内にＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を移植し、肉眼的腫瘍を形成した時点で１０７ＰＦＵのテロメライシン−ＧＦＰを投与した。ＣＣＤカメラにて１週間後にテロメライシン−ＧＦＰ増殖によるＧＦＰ蛍光発現が認められるようになり、その蛍光発現は３週間後でも維持されていた（図１５）。
【実施例８】１．ヌードマウスとＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける組織学的解析
ヌードマウスの直腸壁内にＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を移植し、肉眼的腫瘍を形成した時点で腫瘍を摘出、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて解析した。
その結果、直腸周囲には腫瘍が形成されており、さらに直腸壁内のリンパ管内にも腫瘍細胞塊が確認できた（図１６）。
２．ヌードマウスとＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を用いた同所性直腸癌モデルにおける開腹所見
ＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を直腸壁内に移植後、肉眼的腫瘍が形成された時点で開腹したところ、３個の大動脈周囲のリンパ節（ＬＮ）の腫脹が認められた（図１７）。
３．蛍光イメージングによるＨＴ２９直腸腫瘍および傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製の検出
ＣＣＤカメラによる蛍光イメージングにより、移植されたＨＴ２９直腸腫瘍および３個のうち１個の傍大動脈リンパ節においてＧＦＰ蛍光発現が認められた（図１８）。
４．蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製の検出
ＣＣＤカメラによる蛍光イメージングにより、傍大動脈リンパ節３個のうち１個のみでＧＦＰ蛍光発現が認められた（図１９）。
５．蛍光イメージングによる傍大動脈リンパ節におけるテロメライシン−ＧＦＰの腫瘍内増殖・複製の検出
傍大動脈リンパ節を組織学的に解析したところ、ＣＣＤカメラによる蛍光イメージングによりＧＦＰ蛍光発現陽性であった１個のみで転移腫瘍組織が検出され、テロメライシン−ＧＦＰの増殖が転移陽性リンパ節のみであることが確認された（図２０）。
参考文献
Ｒｅｉｄ  Ｔ，Ｇａｌａｎｉｓ  Ｅ，Ａｂｂｒｕｚｚｅｓｅ  Ｊ，Ｓｚｅ  Ｄ，Ｗｅｉｎ  ＬＭ，Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｊ，Ｒａｎｄｌｅｖ  Ｂ，Ｈｅｉｓｅ  Ｃ，Ｕｐｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ  Ｍ，Ｒｏｍｅ  Ｌ，Ｒｕｂｉｎ  Ｊ，Ｋｉｒｎ  Ｄ．Ｈｅｐａｔｉｃ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（ｄ１１５２０）：ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｖｉｒａｌ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２（２１）：６０７０−９，２００２．
【産業上の利用可能性】  本発明により、癌細胞検出用試薬又は癌の診断用試薬及び細胞死誘導剤が提供される。本発明の試薬は生体内においても極めて高感度に癌細胞を検出することができるため、いわゆるナビゲーション手術等に有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
【図１】
0005006045.tif 000005
【図２】
0005006045.tif 000006
【図３】
0005006045.tif 000007
【図４】
0005006045.tif 000008
【図５】
0005006045.tif 000009
【図６】
0005006045.tif 000010
【図７】
0005006045.tif 000011
【図８】
0005006045.tif 000012
【図９】
0005006045.tif 000013
【図１０】
0005006045.tif 000014
【図１１】
0005006045.tif 000015
【図１２】
0005006045.tif 000016
【図１３】
0005006045.tif 000017
【図１４】
0005006045.tif 000018
【図１５】
0005006045.tif 000019
【図１６】
0005006045.tif 000020
【図１７】
0005006045.tif 000021
【図１８】
0005006045.tif 000022
【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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