(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
（ｉ）生薬試料をアセトニトリル水溶液で抽出する工程、
（ii）抽出液のｐＨを３．５〜４．５に調整する工程、及び
（iii）前記工程（ii）によりｐＨ調整された溶液をカラムクロマトグラフィーに付す工程
を含む生薬試料中の残留農薬の精製方法であって、
前記残留農薬がエステル構造を有する化合物である生薬試料中の残留農薬の精製方法。
【請求項２】
生薬試料が生薬又は漢方製剤である請求項１記載の方法。
【請求項３】
生薬試料がカンキョウ、カンゾウ、ケイヒ、サンシシ、チンピ、ビワヨウ、ニンジン、トウニン、チョレイ、ソヨウ、ダイオウ、タイソウ、センナ、シャクヤク、サンショウ、サンシュユ、コウジン、ボタンピ、オンジ及びオウギから選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項４】
エステル構造を有する化合物がピレスロイド系農薬である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生薬試料中の残留農薬を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、農産物の生産性を高めるために種々の農薬が使用されてきた。近年、農産物中の残留物質への関心が高まり、残留物質の測定が重視されてきている。これに対応する形で、厚生労働省でも、農産物中に残存する残留物質に関する基準を設定しようとしている（非特許文献１）。
【０００３】
非特許文献１には、一斉試験法として「ＧＣ／ＭＳによる農薬等の一斉試験法（農産物）」が記載されている。この方法では、試料をアセトニトリル水溶液で抽出した後、抽出液のｐＨを７．０に調整した後、カラムクロマトグラフィーに付している。
【０００４】
しかしながら、本発明者らがこの方法を生薬に適用したところ、農薬の回収率が低下し、十分な結果を得ることができなかった。
【０００５】
【非特許文献１】食安発第０１２４００１号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知、別添「食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生薬試料において高い回収率で残留農薬を精製することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次の工程：
（ｉ）生薬試料をアセトニトリル水溶液で抽出する工程、
（ii）抽出液のｐＨを３．５〜４．５に調整する工程、及び
（iii）前記工程（ii）によりｐＨ調整された溶液をカラムクロマトグラフィーに付す工程
を含む生薬試料中の残留農薬の精製方法であって、
前記残留農薬がエステル構造を有する化合物である生薬試料中の残留農薬の精製方法。
（２）生薬試料が生薬又は漢方製剤である前記（１）に記載の方法。
（３）生薬試料がカンキョウ、カンゾウ、ケイヒ、サンシシ、チンピ、ビワヨウ、ニンジン、トウニン、チョレイ、ソヨウ、ダイオウ、タイソウ、センナ、シャクヤク、サンショウ、サンシュユ、コウジン、ボタンピ、オンジ及びオウギから選ばれる前記（１）に記載の方法。
（４）エステル構造を有する化合物がピレスロイド系農薬である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生薬試料中の残留農薬を高い回収率で精製することができる。従って、本発明方法は生薬試料中の残留農薬の分析方法における前処理方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の対象となる生薬としては、例えばカンキョウ、アキョウ、イレイセン、インチンコウ、ウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウゴン、オウバク、オウレン、オンジ、ガイヨウ、カシュウ、カッコン、カッセキ、カロコン、カロニン、カンゾウ、キキョウ、キクカ、キジツ、キッソウコン、キョウカツ、キョウニン、クジン、ケイガイ、ケイヒ、コウカ、コウジン、コウブシ、コウベイ、コウボク、ゴシツ、ゴシュユ、ゴボウシ、ゴマ、ゴミシ、サイコ、サイシン、サンザシ、サンシシ、サンシュユ、サンショウ、サンソウニン、サンヤク、カンジオウ、ジコッピ、シコン、シツリシ、シャクヤク、シャゼンシ、ジュクジオウ、シュクシャ、ショウキョウ、ショウバク、ショウマ、シンイ、セッコウ、センキュウ、ゼンコ、センコツ、センタイ、センナ、ソウジュツ、ソウハクヒ、ソボク、ソヨウ、ダイオウ、タイソウ、タクシャ、チクジョ、チクセツニンジン、チモ、チャヨウ、チョウジ、チョウトウコウ、チョレイ、チンピ、テンナンショウ、テンマ、テンモンドウ、トウガシ、トウキ、トウニン、トウヒ、トコン、トチュウ、ドッカツ、ニンジン、ニンドウ、バイモ、バクガ、バクモンドウ、ハッカ、ハマボウフウ、ハンゲ、ビャクゴウ、ビャクシ、ビャクジュツ、ビワヨウ、ビンロウジ、ブクリョウ、ブシ、フンマツアメ、ボウイ、ボウフウ、ボクソク、ボタンピ、ボレイ、マオウ、マシニン、モクツウ、モッコウ、ヨクイニン、リュウガンニク、リュウコツ、リュウタン、リョウキョウ、レンギョウ、レンニク、ワキョウカツ、好ましくはカンキョウ、カンゾウ、ケイヒ、サンシシ、チンピ、ビワヨウ、ニンジン、トウニン、チョレイ、ソヨウ、ダイオウ、タイソウ、センナ、シャクヤク、サンショウ、サンシュユ、コウジン、ボタンピ、オンジ、オウギが挙げられる。
【００１０】
本発明において精製対象となる農薬としては、特に制限はなく、例えば、テフルトリン、シネリンＩ、シネリンII、シハロトリン、シペルメトリンＩ、シペルメトリンII、シペルメトリンIII、シペルメトリンIV、ジャスモリンＩ、ジャスモリンII、ピレトリンＩ、ピレトリンII、フルシトリネート、フルバリネート、デルタメトリン、アクリナトリン、ペルメトリンＩ、ペルメトリンII、シフルトリン、シラフルオフェン、フェンバレレートＩ、フェンバレレートII、エスフェンバレレート、フィプロニル、ビフェントリン、フェンプロパトリン、トラロメトリン等のピレスロイド系農薬；ジクロラン、ブロモブチド、クロメトキシニル、スウェップ、ジクロフルアニド、クロルフェンソン、ビフェノックス、シフルトリン、フルバリネート、テフルトリン、プロピザミド、ジコホール、ビナパクリル、クロルベンジレート、キントゼン、エンドスファン、プロシミドン、クロルプロピレート、ブロモプロピレート、テトラジホン、ハルフェンプロックス、フルオロイミド、クロロフェネトール、ホルペット、エンドリン等の有機塩素系農薬；メトラクロール、トリアジメノール、キノメチオネート、パクロブトラゾール、プレチラクロル、フルシラゾール、プロピコナゾール、レナシル、テニルクロール、アセタミプリド、フルトラニル、メフェナセット、フェナリモル、ビテルタノール、ピリダベン、ピリミジフェン、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、ペンジメタリン、ミクロブタニル、トリシクラゾール、シプロコナゾール、メプロニル、テブコナゾール、イプロジオン、テブフェンピラド、ピリプロキシフェン、ジフェノコナゾール、イミベンコナゾール、トリフルラリン、メトリブジン、トリクラミド、ヘキサコナゾール、エトキサゾール、シハロホップブチル、カフェンストロール等の含窒素系農薬；ピペロニル・ブトキシド等のベンゾジオキソール系農薬；アラクロール等のアセトアニリド系農薬；ブチレート、イソプロカルブ、ジエトフェンカルブ、メチオカルブ、クロロプロファム、ピリミカーブ、チオベンカルブ、ピリブチカルブ、ベンダイオカルブ、エチオフェンカルブ、フェノブカルブ、カルバリル等のカーバメート系農薬；ジメチピン、ベンフレセート等の有機硫黄系農薬等が挙げられる。
【００１１】
本発明における抽出工程においては、生薬の特性（水分含量が１０％以下である）の点から、抽出溶媒としてアセトニトリル水溶液を用いる。アセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水との割合は、容量比で、好ましくは１：１〜９５：５、更に好ましくは７：３〜９：１、最も好ましくは４：１である。アセトニトリル水溶液の使用量は、試料１ｇ当たり、通常８〜１２ｍＬ、好ましくは９〜１１ｍＬである。抽出に際して、試料及び溶媒の混合順序には制限はなく、予めアセトニトリル水溶液を調製した後、試料と混合してもよく、また試料と、アセトニトリル及び水の一方を混合した後、他方の溶媒を加えてもよい。
【００１２】
試料の使用量は、特に制限はないが、通常１〜２０ｇ、好ましくは１〜４ｇである。
【００１３】
次いで、試料と溶媒との混合物を十分に振盪する。その後、前記混合物を遠心分離し、上清をとる。好ましくは、残留物に前記アセトニトリル水溶液を添加し（残留物１ｇ当たり、通常１０〜３０ｍＬ、好ましくは１５〜２５ｍＬ）、振盪後、遠心分離して上清をとる操作を１回以上繰り返し、得られた上清を合わせる。
【００１４】
好ましくは、生薬の水不溶性の固形分を析出させ、かつ抽出上清の粘性を低下させるため、得られた上清に水を加える。ここで加える水の添加量は、試料１ｇ当たり、通常１０〜５０ｍＬ、好ましくは１５〜２５ｍＬである。
【００１５】
本発明におけるｐＨ調整工程においては、前記のようにして得られた抽出液のｐＨを３．５〜４．５に調整する。ｐＨが前記下限未満であると、ピレスロイド系農薬等のエステル構造を有する化合物は、エステル結合が切れるため、回収率が著しく低下し、前記上限を超えると、生薬のオリが生じ、オリ中に農薬が取り込まれる等により回収率が著しく低下する。前記ｐＨは、好ましくは３．８〜４．２、最も好ましくは４．０である。ｐＨ調整するために用いる溶液としては特に制限はないが、通常リン酸水溶液、酢酸水溶液、ギ酸水溶液、パラトルエンスルホン酸水溶液等の酸性水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ性水溶液等を単独で又は組み合わせて用いる。
【００１６】
本発明においては、前記のようにしてｐＨ調整された溶液をカラムクロマトグラフィーに付す。
【００１７】
本工程で用いるカラムクロマトグラフィーとしては、特に制限はなく、例えばＣ１８カラムクロマトグラフィー、ＰＳＡカラムクロマトグラフィー、グラファイトカーボンブラック（ＧＣＢ）カラムクロマトグラフィー、ＳＡＸ／ＰＳＡカラムクロマトグラフィー、フロリジルカラムクロマトグラフィー等を単独で又は組み合わせて行うことができる。
【００１８】
本発明に従えば、生薬試料においても高い回収率で残留農薬が精製されるので、これを、例えばＧＣ／ＭＳＤ（質量分析計付きガスクロマトグラフ装置）により分析することにより、生薬中の残留農薬を高精度で分析することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１及び比較例１〜３）
１．試料秤量
５０ｍＬのスリ栓付き遠沈管にカンキョウ粉末２．０ｇ（１．９５〜２．０４ｇ）を精密に量り取った。
【００２１】
２．抽出
２−１．遠沈管にアセトニトリル／水混液（容量比４：１）２０ｍＬを加えた。
２−２．遠沈管に栓をして、下記条件にて振盪した。
振盪時間：１０分、振盪速度：２００回／分
２−３．振盪後、下記条件にて遠心分離した。
回転速度：３０００ｒｐｍ、遠心時間：５分
２−４．綿栓をした漏斗を１００ｍＬ三角フラスコの上に載せ、アセトニトリル／水混液（容量比４：１）約２ｍＬで洗浄した。
２−５．綿栓をした漏斗を２００ｍＬ三角フラスコの上に載せ、遠沈管を傾け、上清を漏斗に移した。
２−６．遠沈管中の試料についてもう一度２−１〜３の操作を行った。２−５の漏斗に移し、先の抽出液と合わせた。
【００２２】
３．抽出液のｐＨ調整
３−１．２−６の漏斗を水１０ｍＬで洗い込む。漏斗をはずした後、抽出液に水２４ｍＬを加え、よく混和した。
３−２．ｐＨ試験紙を用いて、３−１の抽出液のｐＨを測定したところ、ｐＨは約５．７であった。
前記抽出液に、１０％リン酸水溶液、又は飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、ｐＨを１、４、６又は７に調整した。
ｐＨ１では、抽出液は黄色に着色し、やや濁りがみられた。ｐＨ４では、変化はみられなかった。ｐＨ６では、上層から濁りが生じ、しばらく放置したところ、オリが生じたので、実験を中止した。ｐＨ７では、やや濁った程度で大きな変化はなかった。
【００２３】
４．Ｃ１８（５ｇ）−ＰＳＡ−ＧＣＢカラム処理
（Ｃ１８カートリッジ下準備）
４−１．Ｃ１８（５ｇ）カートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にアセトニトリル約２０ｍＬを加えた。カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、水約２０ｍＬ、水／アセトニトリル混液（容量比１：１）１０ｍＬを順次加えた。
【００２４】
（農薬の吸着）
４−２．３−２の調整液をＣ１８（５ｇ）カートリッジに加えた。アダプターをつけたリザーバーカートリッジをＣ１８（５ｇ）カートリッジに取り付け、リザーバーカートリッジに３−２の調整液約６４ｍＬを加えた。Ｃ１８（５ｇ）カートリッジ上部の調整液がなくなったら、アダプターをつけたリザーバーカートリッジを外し、シリンジを用いてＣ１８（５ｇ）カートリッジ内の溶媒を押し出した。通導した液は廃棄した。水／アセトニトリル混液（容量比１：１）２０ｍＬで溶出した。
【００２５】
（ＰＳＡカートリッジ下準備）
４−３．ＰＳＡカートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にアセトニトリル約１０ｍＬを加えた。通導した液は廃棄した。
【００２６】
（ＧＣＢカートリッジ下準備）
４−４．ＧＣＢカートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にアセトニトリル１０ｍＬを加えた。通導した液は廃棄した。
【００２７】
（吸着させた農薬の溶出）
４−５．４−２のＣ１８（５ｇ）カートリッジにアダプターをつけたリザーバーカートリッジを取り付けた。Ｃ１８（５ｇ）カートリッジの下に４−３のＰＳＡカートリッジを、ＰＳＡカートリッジの下に４−４のＧＣＢカートリッジを置いた。ＧＣＢカートリッジの下に１００ｍＬ三角フラスコを置いた。
４−６．アセトニトリル５０ｍＬを量り取り、Ｃ１８（５ｇ）カートリッジ上部のリザーバーカートリッジに加えた。
４−７．Ｃ１８（５ｇ）カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、アダプターをつけたリザーバーカートリッジを外し、シリンジを用いてＣ１８（５ｇ）カートリッジ内の溶媒を押し出した。
４−８．ＰＳＡカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出し、カートリッジを取り外した。
４−９．ＧＣＢカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、ヘキサン飽和アセトニトリル２０ｍＬをＧＣＢカートリッジ上部に加えた。カートリッジ上部に溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出し、そのまま５分間放置した。
【００２８】
５．溶出液濃縮
５−１．４−９の溶出液を、ロータリーエバポレーターを用い２ｍＬまで減圧濃縮した。
５−２．５−１の濃縮液にヘキサン２ｍＬを加え、１〜２ｍＬまで減圧濃縮した。
【００２９】
６．フロリジル−ＳＡＸ／ＰＳＡカラム処理
（フロリジルカートリッジ下準備）
６−１．フロリジル（Ｆｌｏｒｉｓｉｌ）（１ｇ）カートリッジ（Ｓｕｐｅｌｃｏ社）に注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にヘキサン５ｍＬを加えた。カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、酢酸エチル５ｍＬ、ヘキサン５ｍＬを順次加えた。通導した液は廃棄した。
（ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ下準備）
６−２．ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ（０．５ｇ、０．５ｇ、６ｍＬ）に注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にヘキサン／酢酸エチル混液（容量比９：１）１０ｍＬを加えた。カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、ヘキサン／酢酸エチル混液（容量比９：１）１ｍＬを２回加えた。通導した液は廃棄した。
６−３．６−１のフロリジルカートリッジの下に６−２のＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジを、ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジの下にビーカーを置いた。
６−４．パスツールピペットを用いて５−２の濃縮液をフロリジルカートリッジ上部に加えた。
６−５．ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ下部に１００ｍＬナス型フラスコを置いた。フロリジルカートリッジ上部にヘキサン／酢酸エチル混液（容量比９：１）２０ｍＬを加えた。
６−６．フロリジルカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出し、カートリッジを取り外した。
６−７．ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出した。
【００３０】
７．溶出液濃縮
７−１．全溶出液を分取し、ロータリーエバポレーターを用い約２ｍＬまで減圧濃縮した。
７−２．７−１の濃縮液にアセトン５ｍＬを加え、約１ｍＬまで減圧濃縮した。同操作をもう一度行った。
【００３１】
８．分析試料調製
８−１．７−２の濃縮液を２ｍＬメスフラスコに移し、０．０１％ポリエチレングリコールアセトンを用いて２ｍＬに定容した。
８−２．パスツールピペットを用い、メスフラスコ内をよく撹拌した。
８−３．バイアル瓶に試料溶液を約１ｍＬ入れ、キャップをセットした。
８−４．クリンパーを用いて、キャップを閉じた。
【００３２】
９．ＧＣ／ＭＳＤ測定
以下の条件にしたがって、ＧＣ／ＭＳＤによる分析を行った。
検出器：ＭＳＤ
カラム：ＤＢ−１ＭＳ  長さ１５ｍ，内径０．２５ｍｍ，膜厚０．２５μｍ
カラム温度：100℃(2min hold) - (20℃/min) - 194℃ - (5℃/min) -220℃- (15℃/min) - 300℃(5.77min hold)
注入口温度：２５０℃
インターフェース：３００℃
注入量：２．０μＬ
注入方法：パルスドスプリットレス
パルス圧：２０．０ｐｓｉ
パルス時間：１．００ｍｉｎ
キャリアガス：ヘリウム
平均線速度：６３ｃｍ／ｓｅｃ
分析結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
0005045282.tif 000002
【００３４】
（判定基準）
（ａ）添加回収率が７０〜１２０％を示すものを適用可能と判断した。前記範囲外の回収率には取り消し線を付した。
（ｂ）クォリファイア（定性）イオン判定：
ターゲットイオン（定量分析を行うときに検量線を作成し、定量するイオン）、クォリファイアイオン（Qualifier ion；定量分析を行うときに本当にその物質であるかどうかを確認するためターゲットイオンとの比率を計算するためのイオン：定性イオン）１及びクォリファイアイオン２のいずれもが確認できる場合を「○」、ターゲットイオンと、クォリファイアイオン１又はクォリファイアイオン２が確認できる場合を「△」として表１に示した。