(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一般式（１）で表されるモノマーと一般式（２）で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマー。
【化１】
0004969760.tif 000020
（式中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を示す。）
【化２】
0004969760.tif 000021
（式中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状の、アルキル基、アルコキシル基もしくはアルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。）
【請求項２】
請求項１記載の一般式（１）で表されるモノマーと、ビオチン部位或いはイミノビオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたポリマー。
【請求項３】
さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いた請求項１または２記載のポリマー。
【請求項４】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された請求項１〜３の何れか１項記載のポリマー。
【請求項５】
相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、ｃＤＮＡとｍＲＮＡ、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Ｆｃ部位とプロテインＡ、Ｆｃ部位とプロテインＧ、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、およびヘパリンとラミニンとの組合せから選ばれた１種以上である請求項４記載のポリマー。
【請求項６】
相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジンである請求項４記載のポリマー。
【請求項７】
高分子に固定化された該一対の物質の一方が、ビオチンである請求項４記載のポリマー。
【請求項８】
ビオチンがアビジンと結合したビオチン（以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。）である請求項７記載のポリマー。
【請求項９】
アビジン化酵素をビオチンに結合させた請求項７記載のポリマー。
【請求項１０】
ビオチン化酵素をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項８記載のポリマー。
【請求項１１】
請求項９または１０記載のポリマーを用いることを特徴とする物質の変換方法。
【請求項１２】
アビジン化抗体をビオチンに結合させた請求項７記載のポリマー。
【請求項１３】
ビオチン化抗体をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項８記載のポリマー。
【請求項１４】
請求項１２または１３記載のポリマーを用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
【請求項１５】
アビジン化分子シャペロンをビオチンに結合させた請求項７記載のポリマー。
【請求項１６】
ビオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビオチンに結合させた請求項８記載のポリマー。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
【請求項１８】
アビジン化ヒートショックプロテインをビオチンに結合させた請求項７記載のポリマー。
【請求項１９】
ビオチン化ヒートショックプロテインをアビジン結合ビオチンに結合させた請求項８記載のポリマー。
【請求項２０】
請求項１８または１９記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。
【請求項２１】
アビジン化核酸をビオチンに結合させた請求項７記載のポリマー。
【請求項２２】
ビオチン化核酸をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項８記載のポリマー。
【請求項２３】
請求項２１または２２記載のポリマーを用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２５】
増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法である請求項２４記載の核酸の検出方法。
【請求項２６】
請求項１〜８の何れか１項記載のポリマーを含有する分離剤。
【請求項２７】
請求項２６記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は刺激応答性のポリマー、微生物の分離方法または濃縮方法、核酸の精製方法、検出方法、または濃縮方法、分離剤、生体物質の分離方法、および物質の変換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、刺激応答性ポリマーはドッラグデリバリーシステム（ＤＤＳ）、各種分離剤、カテーテル、人工筋肉、ケモバルブなどに広く応用され、その重要性は急激に増大している。例えば特開平８−１０３６５３号公報には、熱、ｐＨ、電位、または光などの刺激により高次構造が変化して水溶液中で膨潤したり収縮する刺激応答性高分子として、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、およびＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導体類、ポリメチルビニルエーテルなどのビニルエーテル類が記載されている。
【０００３】
しかしながら、温度変化に応答して膨潤−収縮するとして公知のポリマーは、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と記述する。）又は下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と記述する。）を有すると記載されるものの、実際は全てＬＣＳＴを有する高分子である。すなわち、或る温度以上において可逆的に高分子間同士での凝集を起こすことにより水に不溶化し、それ未満では水に溶解するという性質を有する物であった。
【０００４】
ＬＣＳＴを有するポリマーは、ある一定温度以上においてポリマーが収縮し水に対して不溶化する物であるから、分離剤等の用途に使用する際、収縮を低温下、降温操作で行いたいという要請に対して、その調整が難しいという課題があった。例えば、熱に不安定なタンパク質等の分離剤として用いる場合、ＬＣＳＴを有するポリマーは昇温操作により凝集するため、その操作によりタンパク質の変性を伴う危険性を考慮しなければならなかった。
【０００５】
一方、水溶液中でＵＣＳＴを示す高分子であるポリアクリル酸を用いたポリマー間イオンコンプレックスやポリソープなどは、緩衝液中において例えば分離剤などの用途に使用すると、ポリマーのイオン解離が起こりＵＣＳＴを示さない場合があった。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは前述の従来技術の課題に鑑み鋭意努力した、その結果、少なくとも下記一般式（１）で表されるモノマーと一般式（２）で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマーは、緩衝液中においてもＵＣＳＴを有すること、さらに、本発明のポリマーを用いれば、微生物の分離、濃縮、核酸の精製、検出、または濃縮、生体物質の分離、および物質の変換が効率よく行えることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は以下の構成を有する。
（１）少なくとも一般式（１）で表されるモノマーと一般式（２）で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマー。
【０００８】
【化１】
0004969760.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を示す。）
【００１０】
【化２】
0004969760.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状の、アルキル基、アルコキシル基もしくはアルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。）
【００１２】
（２）上記一般式（１）で表されるモノマーと、ビオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたポリマー。
（３）さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いた前記第１項または第２項記載のポリマー。
【００１３】
（４）相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された前記第１項〜第３項の何れか１項記載のポリマー。
（５）相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、ｃＤＮＡとｍＲＮＡ、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Ｆｃ部位とプロテインＡ、Ｆｃ部位とプロテインＧ、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、およびヘパリンとラミニンとの組合せから選ばれた１種以上である前記第４項記載のポリマー。
（６）相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジンである前記第４項記載のポリマー。
【００１４】
（７）高分子に固定化された該一対の物質の一方が、ビオチンである前記第４項記載のポリマー。
（８）ビオチンがアビジンと結合したビオチン（以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。）である前記第７項記載のポリマー。
（９）アビジン化酵素をビオチンに結合させた前記第７項記載のポリマー。
（１０）ビオチン化酵素をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第８項記載のポリマー。
（１１）前記第９項または第１０項記載のポリマーを用いることを特徴とする物質の変換方法。
（１２）アビジン化抗体をビオチンに結合させた前記第７項記載のポリマー。
（１３）ビオチン化抗体をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第８項記載のポリマー。
（１４）前記第１２項または第１３項記載のポリマーを用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
【００１５】
（１５）アビジン化分子シャペロンをビオチンに結合させた前記第７項記載のポリマー。
（１６）ビオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビオチンに結合させた前記第８項記載のポリマー。
（１７）前記第１５項または第１６項記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
【００１６】
（１８）アビジン化ヒートショックプロテインをビオチンに結合させた前記第７項記載のポリマー。
（１９）ビオチン化ヒートショックプロテインをアビジン結合ビオチンに結合させた前記第８項記載のポリマー。
（２０）前記第１８項または第１９項記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。
【００１７】
（２１）アビジン化核酸をビオチンに結合させた前記第７項記載のポリマー。
（２２）ビオチン化核酸をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第８項記載のポリマー。
（２３）前記第２１項または第２２項記載のポリマーを用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
（２４）前記第２３項記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
（２５）増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法である前記第２４項記載の核酸の検出方法。
【００１８】
（２６）前記第１項〜第８項の何れか１項記載のポリマーを含有する分離剤。
（２７）前記第２６項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
上限臨界温度（以下「ＵＣＳＴ」と記述する。）を有するポリマー（以下「ＵＣＳＴポリマー」と記述する。）とは、ポリマー含有溶媒において、該ポリマー含有溶媒の温度が特定温度を越えた場合には、該ポリマーが溶媒に溶解した状態となり、該特定温度以下となった場合には、該ポリマーが溶媒中に析出、凝集する性質を有するポリマーのことである。ＵＣＳＴとは該特定温度のことである。また、ＵＣＳＴを境にポリマーの溶解、析出が起こる現象をＵＣＳＴ特性と言う。
【００２０】
前述の溶媒は特に限定されるものではないが、具体的には水、および水を５０重量％以上含有する液体を挙げることができる。さらに水を５０重量％以上含有する液として具体的には、生理食塩水、緩衝液などを挙げることができる。また、ポリマーを含有した状態でＵＣＳＴ特性を示すのであれば、該溶媒は、アセトンなどの有機溶媒と水との混合液であっても良い。
本発明の第一のポリマーは、少なくとも一般式（１）で表されるモノマー（以下「モノマー（１）」と記述する。）と一般式（２）で表されるモノマー（以下「モノマー（２）」と記述する。）とを重合させて得られたＵＣＳＴポリマーである。
【００２１】
【化３】
0004969760.tif 000004
【００２２】
一般式（１）中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、本発明においてＲ１１は水素原子であることが好ましい。Ｒ１２は単結合または炭素数１〜５の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を示し、本発明においてＲ１２はメチレン基であることが好ましい。
【００２３】
【化４】
0004969760.tif 000005
【００２４】
一般式（２）中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、本発明においてＲ１３は水素原子であることが好ましい。Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。アルキル基としては炭素数１〜５の直鎖のアルキル基が好ましく、アルコキシル基およびアルキルアミノ基のアルキル基部分としては、炭素数１〜５の直鎖のアルキル基が好ましい。アリール基としては、フェニル基、およびナフチル基等が挙げられ、複素環基となるものとしてはピリミジン等が挙げられる。
【００２５】
本発明ＵＣＳＴポリマーの重合において、モノマー（１）とモノマー（２）の他に、その他の成分として、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いた場合には、その種類および使用割合を変えることによってＵＣＳＴを制御することが可能である。
その他の成分として使用するモノマーが親水性であるのか、もしくは疎水性であるのかの分類は、モノマー（１）の親水性を基準として行う。つまり、重合に用いるモノマー（１）よりも親水性であるものは親水性モノマーであり、疎水性であるものは疎水性モノマーである。また、重合に用いるモノマー（１）が複数である場合には、その中で最も親水性であるモノマーを基準に分類を行えばよい。
【００２６】
重合に用いるモノマー（１）の種類により異なり、一概に特定することはできないが、具体的にその例を挙げれば、本発明において使用する親水性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、およびアリルアミンなどを挙げることができ、疎水性モノマーとしては、アルキル（メタ）アクリレート、スチレン、エチレン、プロピレン、アセチレン等の不飽和炭化水素、アルキルビニルエーテル、およびアルキル（メタ）アクリルアミドなどを挙げることができる。
【００２７】
本発明のＵＣＳＴポリマーの重合に親水性モノマーを用いた場合、ＵＣＳＴは低下する傾向にあり、反対に疎水性モノマーを用いた場合、ＵＣＳＴは上昇する傾向にある。
本発明のＵＣＳＴポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー（１）：モノマー（２）：その他のモノマー＝９５〜２０：１〜６０：０〜４０の割合であり、好ましくは９５〜５０：１〜５０：０〜２０の割合である。
【００２８】
本発明のＵＣＳＴポリマーを含有する重合直後の反応液には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度をＵＣＳＴ以下とし、凝集させ凝集物を回収後上清を取り除くことによって行っても良い。
【００２９】
本発明の第二のポリマーは、前述のモノマー（１）とビオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたＵＣＳＴポリマーである。本発明第二のＵＣＳＴポリマーは、該ＵＣＳＴポリマー内に導入されたビオチン部位により、アビジンを特異的に吸着することが可能となることから、該ＵＣＳＴポリマーを用いれば、各種目的物質をアビジン化することによって、該目的物質の分離、精製、濃縮を効率よく行うことが可能となる。
【００３０】
モノマー（１）のうち、下記一般式（３）で表されるアクリロイルグリシンアミドは、本発明の第二のＵＣＳＴポリマーに好ましく使用することができる。
【００３１】
【化５】
0004969760.tif 000006
【００３２】
本発明において、本発明に使用するビオチン部位を有するモノマーは特に限定されるものではないが、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、ビオチンの末端カルボキシル基を用いた（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリレート誘導体などを挙げることが出来るが、本発明においてこれらに限定されるものではない。その中でも好ましい該モノマーとして、下記一般式（４）で表される重合性ビオチン誘導体を挙げることができる。
【００３３】
【化６】
0004969760.tif 000007
【００３４】
一般式（４）中、Ｒ２は水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。Ｔは酸素原子又は＝ＮＨ基を示す。Ｗは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基もしくは炭素数１〜５のアルキレン基を示す。Ｕは単結合又は−ＮＨ−基を示す。Ｘは単結合又は炭素数１〜８の炭化水素結合、酸素原子もしくは−ＮＨ−基を示す。Ｙは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、−ＮＨ基−、１，２−ジオキシエチレン基もしくは１，２−ジアミノエチレン基を示す。Ｚは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、炭素数１〜５のアルキレン基、酸素原子もしくは−ＮＨ−基を示す。Ｖは単結合又は炭素数１〜５のアルキレン基を示す。
【００３５】
一般式（４）で表される重合性ビオチン誘導体の中でも、下記一般式（５）〜（７）で表される重合性ビオチン誘導体は、本発明のＵＣＳＴポリマーに好ましく使用することができる。
【００３６】
【化７】
0004969760.tif 000008
【００３７】
一般式（５）〜（７）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜４のアルキレン基を示し、Ｒ５は炭素数２又は３のアルキレン基を示す。Ｘ１は酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｘ２〜Ｘ５はそれぞれ独立に、酸素原子又は−ＮＨ−基を示す。Ｔ、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ上記一般式（４）における定義と同じである。
【００３８】
上記一般式（５）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（８）で示されるビオチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離基に変換後、下記一般式（９）で示されるアクリル誘導体と縮合反応させることにより得ることができる。
【００３９】
【化８】
0004969760.tif 000009
【００４０】
上記一般式（６）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（１０）で示されるビオチン誘導体を、適当なアクリル化剤（メタクリル化剤等も含む。例えばアクリル酸、アクリル酸クロリド、無水アクリル酸、アクリロキシスクシンイミド等のアクリル化剤、メタクリル酸、メタクリル酸クロリド、無水メタクリル酸、メタクリロキシスクシンイミド等のメタクリル化剤などが挙げられる。）と反応させることにより得ることができる。
【００４１】
【化９】
0004969760.tif 000010
【００４２】
ここで、一般式（１０）で表されるビオチン誘導体は、一般式（８）で表されるビオチン誘導体を適当な還元剤で還元して得られるアルコール体（Ｘ４＝酸素原子）の水酸基を、脱離基機能を有する官能基に変換し、変換後の該アルコール体とアミン誘導体（Ｘ４＝−ＮＨ−）とを置換反応させることにより得ることができる。
【００４３】
上記一般式（７）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（１１）で示されるビオチン誘導体を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の非プロトン性溶媒中で、一般式（１２）で示されるイソシアネート物質と反応させることにより得ることができる。
【００４４】
【化１０】
0004969760.tif 000011
【００４５】
さらに、下記一般式（１３）で表される重合性ビオチン誘導体は、本発明のＵＣＳＴポリマーに特に好ましく使用することができる。
【００４６】
【化１１】
0004969760.tif 000012
【００４７】
さらに、本発明のＵＣＳＴポリマーに好ましく使用することができるモノマーとして、一般式（１４）で表されるビオチンメタクリアミド誘導体、および一般式（１５）で表されるビオチン誘導体が挙げられる。
【００４８】
【化１２】
0004969760.tif 000013
【００４９】
さらに、本発明の第二のＵＣＳＴポリマーには、本発明第一のＵＣＳＴポリマーと同様に、ＵＣＳＴを制御する目的で、その他のモノマーとして前述の親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いることができる。
【００５０】
本発明第二のＵＣＳＴポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー（１）：ビオチン部位あるいはイミノビオチン部位を有するモノマー：その他のモノマー＝５００〜１：５００〜０．１：０〜５０の割合であり、好ましくは１００〜５：１０〜０．５：０〜５の割合である。
【００５１】
本発明ＵＣＳＴポリマーを含有する重合直後の反応液には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度をＵＣＳＴ以下とし、凝集させ凝集物を回収後上清を取り除くことによって行っても良い。
【００５２】
本発明の第一、第二の何れのＵＣＳＴポリマーにおいても、その分子量は特定されるものではないが、質量平均分子量が５００〜１００００００の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは１０００〜１０００００の範囲である。また、そのＵＣＳＴは該分子量に依存しないことが好ましい。
【００５３】
本発明におけるＵＣＳＴとは、具体的には、本発明のＵＣＳＴポリマーを水に対して１重量％の割合で水に添加したＵＣＳＴポリマー含有水を加熱して清澄状態とし、次いでＵＣＳＴポリマー含有水の温度を１分あたり１℃の割合で降下させて行き、該ＵＣＳＴポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になった時点の温度である。
【００５４】
該ＵＣＳＴポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になって、さらに昇温乃至降温してもある温度範囲で１／２の値が保持される場合がある。この温度範囲の上限を昇温時のＵＣＳＴと言い、同下限を降温時のＵＣＳＴと言う。この両者の差（温度範囲）をスイッチング範囲と言う。このスイッチング範囲は狭ければ狭いほど良く、本発明においては１０℃以下であることが好ましく、より好ましくは０℃である。
【００５５】
本発明ＵＣＳＴポリマーのＵＣＳＴは特に限定されるものではないが、本発明のＵＣＳＴポリマーを分離剤とする場合には、０〜５０℃の範囲であることが好ましく、特に好ましくは０〜４０℃の範囲である。
【００５６】
相互に特異的作用を有する一対の物質とは、イオン間の相互作用、水素結合、疎水的相互作用、および金属原子に対する配位などの相互作用によって特異的に相互に吸着する物質であり、具体的には、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、ｃＤＮＡとｍＲＮＡ、酵素（活性部位）と基質、酵素（活性部位）と生産物、酵素（活性部位）と競争阻害剤、酵素（補酵素結合部位）と補酵素、酵素（補酵素結合部位）とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Ｆｃ部位とプロテインＡ、Ｆｃ部位とプロテインＧ、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、ヘパリンとラミニン、ポリチミンとｍＲＮＡ、大腸菌抗体と大腸菌、および抗体（ＩｇＧ）と抗ＩｇＧとの組合せを挙げることができる。
【００５７】
その中でも、ビオチンとアビジンとの組合せは本発明に最も好ましく使用することができる。本発明第一のＵＣＳＴポリマーにビオチンを固定化した場合には、アビジンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となり、本発明第一または第二のＵＣＳＴポリマーにアビジンを固定化した場合には、ビオチンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となる。
なお、本発明においてビオチンは、イミノビオチンであってもよく、アビジンはストレプトアビジンであっても良い。何れの場合も本発明の効果を得ることができる。
その際の目的物質は特に限定されるものではないが、例えば酵素、抗体、核酸、分子シャペロン、およびヒートショックプロテインなどを挙げることができる。
【００５８】
本発明のＵＣＳＴポリマーにアビジンが固定化された場合には、アビジンのビオチン結合４サイトのうち最大３サイトを開いた状態に保つことが可能であることから、ビオチン化された目的物質をさらに効率よく分離、回収することが可能となる。
しかしながら、現実的にはアビジンを直接ＵＣＳＴポリマーに固定化することは困難であることから、本発明第二のＵＣＳＴポリマーに固定されているビオチンにアビジンを結合させることによって、アビジンを本発明のＵＣＳＴポリマーに固定化することが好ましい。
【００５９】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された、本発明のＵＣＳＴポリマーを用いれば、そのもう一方の物質、該物質が固定化された物質を容易に分離、回収することが可能となる。
例えば、酵素が固定化された本発明のＵＣＳＴポリマーを酵素反応に用いれば、従来の固定化酵素を用いた酵素反応に比べ、より速い速度で基質を変換することが可能である。その際使用される酵素は特に限定されるものではないが、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、分解酵素、異性化酵素、および合成酵素などを挙げることができる。
基質の変換により生成した物質は、本発明のＵＣＳＴポリマーと該生成物質とを含有する溶液の温度を下げることにより、該ＵＣＳＴポリマーのみを析出させ、析出した該ＵＣＳＴポリマーのみを取り除くことにより、酵素と該生成物質とを容易に分離することができる。
【００６０】
抗体を固定化した本発明のＵＣＳＴポリマーを用いれば、溶液中の微生物の分離、濃縮を効率よく行うことができる。その際に使用する抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であっても良い。
溶液中の微生物の分離方法、濃縮方法は特に限定されるものではないが、具体的には、微生物を含有する溶液に該ＵＣＳＴポリマーを添加し、微生物と該ＵＣＳＴポリマーとを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、微生物を吸着したＵＣＳＴポリマーのみを析出させ、析出したＵＣＳＴポリマーのみを取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の微生物を容易に分離、濃縮することが可能である。
例えば、使用する抗体がサルモネラ抗体であれば、食品懸濁液中のサルモネラ菌だけを容易に分離、濃縮することが可能であることから、任意の抗体が固定化された本発明のＵＣＳＴポリマーと適当な検出試薬とを組み合わせることによって、感度の高い微生物検査キットもしくは診断薬を作ることも可能である。
【００６１】
分子シャペロンやヒートショックプロテインをＵＣＳＴポリマーに固定化した磁性微粒子は、溶液中における、酵素や抗体の安定性を高めることから、その繰り返し離床が可能となり、工業レベルでの蛋白質生産、物質生産を補助することが出来る。通常、分子シャペロンのような蛋白質は高価なため、工業レベルでの使用は困難である。
【００６２】
核酸を固定化した本発明のＵＣＳＴポリマーを、核酸を含有する溶液に添加し、該ＵＣＳＴポリマーと核酸とを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、核酸を吸着したＵＣＳＴポリマーのみを析出させ、析出したＵＣＳＴポリマーのみを取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の核酸を容易に分離、濃縮することが可能である。また、該核酸の分離、濃縮方法は、特定遺伝子の精製、濃縮、検出等に応用することも可能である。
【００６３】
また、複数種類の核酸と該ＵＣＳＴポリマーとを含有する混合液中で、ハイブリダイゼーションを充分に行った後、該混合液の温度を下げることにより核酸ごと凝集、回収を行った後、再度温度を上げることで容易に任意の核酸の精製、検出、濃縮を行うことが出来る。
例えば目的とするＤＮＡと相補的な配列を有するビオチン化ＤＮＡやビオチン化ポリチミンを用いることで、目的ＤＮＡやｍＲＮＡを濃縮、精製することが出来る。得られた核酸を各種遺伝子増幅法により増幅させることで、感度良く核酸を検出することが出来る。核酸の増幅方法は特に限定されないが、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法が本発明に好ましく用いることができる。
【００６４】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、本発明第一のＵＣＳＴポリマーに固定化する方法は特に限定されるものではなく、既に合成された該ＵＣＳＴポリマーに該一対の物質の一方を固定化する方法（以下「固定化法」と記載する。）や、アビジンが固定化された該一対の物質の一方を、アビジンとビオチンとの特異的作用を利用して、本発明第二のＵＣＳＴポリマーに結合させる方法（以下「結合法」と記載する。）などを挙げることができる。
【００６５】
前述の固定化法としては共有結合であることが好ましいが、イオンコンプレックスや電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合であってもよい。
抗体や酵素などの蛋白質を、本発明のＵＣＳＴポリマーに結合させる場合であれば、該蛋白質が有するアミノ基やカルボキシル基等の官能基の反応性を利用して、該ＵＣＳＴポリマーと該蛋白質とを結合させればよい。
例えば、蛋白質のアミノ基を利用する場合は、該ＵＣＳＴポリマーにカルボキシル基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。
【００６６】
【化１３】
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【００６７】
また、下記に示すようなアルデヒド基を利用する方法、エポキシ基を利用して、本発明のＵＣＳＴポリマーと蛋白質とを結合させても良い。
【００６８】
【化１４】
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【００６９】
また、該蛋白質のカルボキシル基を利用する場合であれば、本発明のＵＣＳＴポリマーにアミノ基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。
【００７０】
【化１５】
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【００７１】
また、例えば、メタクリル酸のカルボキシル基などを、上記モノマーや他のモノマーに共重合させて、カルボキシル基など適当な官能基を持つように本発明のＵＣＳＴポリマーを設計することにより、カルボジイミド等を用いる既知の蛋白質固定化方法により酵素や抗体などの蛋白質を、該ＵＣＳＴポリマーに固定化することも出来る。
【００７２】
本発明のＵＣＳＴポリマーに抗体を導入して蛋白質と結合させる場合、該結合は、ｐＨが中性付近の燐酸、トリスバッファーの中で行われることが好ましい。また、塩濃度は目的に応じて適宜設定できる。
【００７３】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方の、本発明ＵＣＳＴポリマーへの固定化は、前述のように相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、該ＵＣＳＴポリマーに直接固定化しても良いが、固定化の作業が簡便であることから、ビオチンとアビジンとの結合を介して該ＵＣＳＴポリマーに固定化されていることが好ましい。例えば、アビジンが固定化された酵素を、アビジンとビオチンとの間の特異的作用を利用して、ビオチンが固定化された本発明第二のＵＣＳＴポリマーに固定化すればよい。
【００７４】
さらに好ましくは、例えば、ビオチンが固定化された酵素を、アビジン結合ビオチンが固定化されたＵＣＳＴポリマーに固定化することである。前述のように該アビジン結合ビオチンは、最大３つのビオチン化酵素を固定化することが可能であることから、より高い効率で基質の変換、分離、回収が可能となる。
当然のことながら、これは酵素に限定されるものではなく、前述の相互に特異的作用を有する一対の物質であれば、同様の効果が得られる。
【００７５】
本発明の分離剤は、本発明のＵＣＳＴポリマーを含有するものであれば特に限定されるものではないが、該ＵＣＳＴポリマーの分離剤に対する含有割合が１〜１００重量％の範囲であることが好ましく、特に好ましくは２〜３０重量％の範囲である。
その他の成分としてはフェライト粒子、マグネタイト粒子、およびヘマタイト粒子などを挙げることができる。
本発明の分離剤を用いれば、微生物、核酸、タンパク、ペプチド、抗原、環境ホルモンなどの分離を容易に行うことが出来る。
【００７６】
本発明のＵＣＳＴポリマーは、相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された場合であっても、そのＵＣＳＴは不変であることが好ましく、さらに、溶解、不溶化の操作を繰り返し行った場合であっても、そのＵＣＳＴは不変であることが好ましい。
また、本発明のＵＣＳＴポリマーは、細菌、残留農薬の検出等の如き検査薬、診断薬への応用、微生物や細胞培養の生体物等のバイオプロダクトの分離、酵素や分子シャペロン等の固定化による生体反応機能の活性化・維持などに特に有効に利用できる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例において、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７８】
実施例１［Ｎ−アクリロイルグリシンアミドの合成］
アクリル酸クロリド９質量部とグリシンアミド塩酸塩１１質量部とをエーテル２００ｍｌ中に懸濁させ、１０℃で３時間撹拌した。その後飽和重曹水を１００ｍｌ加え、更に１時間室温で撹拌を行った。次いで、酢酸エチル２００ｍｌを加え有機相の抽出を行った。減圧下、該有機相を濃縮して得られた在留物を、酢酸エチルを移動相に用いて、シリカゲルでカラムクロマトを行い白色結晶の化合物１０質量部を得た。得られた化合物についてＮＭＲ及び質量分析を行い、該化合物がＮ−アクリロイルグリシンアミドであることを確認した。
【００７９】
実施例２［ＵＣＳＴポリマーの合成：（Ｎ−アクリロイルグリシンアミドとＮ−アセチルアクリルアミドとの共重合体（モル比１０：１））
Ｎ−アクリロイルグリシンアミド１３質量部と、Ｎ−アセチルアクリルアミド１．１質量部とを、１００ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、０．１質量部のアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を開始剤に用いて、窒素雰囲気下、３時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物についてＮＭＲ分析を行い、該重合物がＮ−アクリロイルグリシンアミドとＮ−アセチルアクリルアミドとの共重合体であることを確認した。またＧＰＣを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約６０００であった。
得られたポリマーをｐＨ＝７．６、ＰＢＳサリンバッファー中に溶解し（２質量％）、石英セル中で５００ｎｍの可視光を用いてＵＣＳＴを測定したところ、昇温時約１３℃、降温時約５℃であった。
【００８０】
実施例３［ＵＣＳＴポリマーの合成：Ｎ−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式（１４）との共重合体（モル比１０：１）］
Ｎ−アクリロイルグリシンアミド１３質量部と、モノマー式（１４）３．７質量部とを１００ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、０．１質量部のＡＩＢＮを開始剤に用いて、窒素雰囲気下、３時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物についてＮＭＲ分析を行い、該重合物がＮ−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式（１４）との共重合体であることを確認した。またＧＰＣを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約８０００であった。
得られたポリマーをｐＨ＝７．６、ＰＢＳサリンバッファー中に溶解し（２質量％）、石英セル中で５００ｎｍの可視光を用いてＵＣＳＴを測定したところ、昇温時約３３℃、降温時約２１℃であった。
【００８１】
実施例４［卵白中からのアビジンの特異的分離］
実施例３で得られたＵＣＳＴポリマー５ｍｇ、１．０％アビジン溶液５０μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水４５０μｌ、および２．５％の卵白溶液４００μｌを試験管中で良く混合した後、該試験管を氷水中に置き、溶液の温度をＵＣＳＴ以下にし高分子を凝集させた。上清部分１００μｌを取り出し、ＳＤＳによる変性処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により上清からアビジンに対応するバンドのみが無くなっていることを確認した。
【００８２】
実施例５［ＵＣＳＴポリマーの合成：Ｎ−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式（１４）との共重合体（モル比２００：１）］
Ｎ−アクリロイルグリシンアミド１３質量部とモノマー式（１４）０．１９質量部とを、１００ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、０．１質量部のＡＩＢＮを開始剤に用いて、窒素雰囲気下、３時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物についてＮＭＲ分析を行い、該重合物がＮ−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式（１４）との共重合体であることを確認した。またＧＰＣを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約８０００であった。
得られた共重合体をｐＨ＝７．６、ＰＢＳサリンバッファー中に溶解し（２質量％）、石英セル中で５００ｎｍの可視光を用いてＵＣＳＴを測定したところ、昇温時約１８℃、降温時約７℃であった。
【００８３】
実施例６［ＵＣＳＴポリマーへのアビジン固定化酵素の固定化］
実施例５で得られたＵＣＳＴポリマー３ｍｇ、市販のアビジン固定化ペルオキシダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、および１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）１００μｌを、蒸留水７００μｌに添加し良く混合した。得られた溶液を、その温度がＵＣＳＴ以下になるまで冷却し、生成した凝集物を回収し、上清１９００μｌを取り除いた後、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）１９００μｌを添加することによって、アビジン固定化ペルオキシダーゼを固定化したＵＣＳＴポリマーを含有する溶液を調製した。
該ＵＣＳＴポリマーは該溶液中において、該溶液の温度がＵＣＳＴを越えた場合には溶解し、ＵＣＳＴ以下である場合には凝集した。該溶液の温度を恒温槽により変化させ、溶解、凝集および遠心分離後の操作を行い、それぞれ段階における上清のペルオキシダーゼ活性を、下記に示すペルオキシダーゼの活性測定法により測定した。なお、遠心分離後、凝集物を回収した後は、毎回上清１９００μｌを取り除き、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）１９００μｌを添加した。
上記方法により繰り返し凝集、溶解を行った場合の上清のペルオキシダーゼ活性を測定した結果を表１に示す。なお、ペルオキシダーゼ活性は最初の溶解時の活性を１００とした場合の比活性で示した。
【００８４】
（ペルオキシダーゼ活性測定法）
１００ｍＭ過酸化水素１００μｌ、５０ｍＭフェノール１００μｌ、５０ｍＭ４−アミノアンチピリン１００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）１００μｌ、および蒸留水５８０μｌを、吸光度計のセル内で予め混合し、次いで、該セルにサンプルを２０μｌ添加し、再び良く混合した後、生成物を５００ｎｍの可視光吸収を測定することにより、該サンプルのペルオキシダーゼ活性を求めた。なお、以上の操作は３０℃で行った。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
この結果よりアビジン固定化ペルオキシダーゼの活性は、該ＵＣＳＴポリマーの溶解と凝集とを繰り返し行った場合であっても、低下しにくいことが明らかである。
【００８７】
実施例７［アビジン固定化ＵＣＳＴポリマーへのビオチン固定化酵素の固定］
まず、アビジンのビオチン結合サイト３カ所が空いている状態のアビジン固定化ＵＣＳＴポリマーを得るため、実施例５で得られたＵＣＳＴポリマー５ｍｇに１．０％アビジン溶液５００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）１００μｌ、および蒸留水３５０μｌを試験管中で良く混合した後、氷水中に置き該混合液の温度をＵＣＳＴ以下にし、該ＵＣＳＴポリマーを凝集させた。該凝集物を遠心分離後、吸引濾過し、ＵＣＳＴポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン固定化ＵＣＳＴポリマー含有液を得た。
このアビジン固定化ＵＣＳＴポリマー含有液に、市販のビオチン固定化ペルオキシダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）１００μｌ、および蒸留水７００μｌを添加し、良く混合した。得られた混合液を冷却し、生成した凝集物を回収し、回収後の該混合液から上清１９００μｌを取り除いた後、該混合液に新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）１９００μｌを添加し、ビオチン固定化ペルオキシダーゼを固定化したアビジン固定化ＵＣＳＴポリマーを調製した。このＵＣＳＴポリマーを使って、実施例６と同様に溶解、凝集回収を繰り返し、上清のペルオキシダーゼ活性を測定した結果を表２に示す。なお、ペルオキシダーゼ活性についても同様に最初の溶解時の活性を１００とした場合の比活性で示した。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
アビジン固定化ＵＣＳＴポリマーに固定化されたビオチン固定化ペルオキシダーゼの活性は、該ＵＣＳＴポリマーの溶解と凝集とを繰り返し行った場合であっても、低下しにくいことが明らかである。
【００９０】
実施例８［ＵＣＳＴポリマーへのヒートショックプロテインの固定化］
市販のビオチンが固定化されたヒートショックプロテインＨＳＰ７０、０．５ｍｇを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）１ｍｌによく混合した後、この混合液から５μｌ取り出して変性処理した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＨＳＰ７０のバンドを確認した。
続いて上記ビオチン化ＨＳＰ７０のリン酸ナトリウム緩衝溶液５００μｌを、実施例７で調製したアビジン固定化ＵＣＳＴポリマー５ｍｇに加え、良く混合したのち、その混合液を冷却し、冷却によって生成した凝集物を回収し、上清のＨＳＰ７０をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ上清にはＨＳＰ７０は無く、ＨＳＰ７０はＵＣＳＴポリマーに固定化されたアビジンと結合していることが確認された。
【００９１】
実施例９［微生物の分離濃縮方法］
市販のビオチン固定化サルモネラ抗体を、実施例７に記載の方法に準じてＵＣＳＴポリマーに固定化した。固定化したことはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い確認を行った。続いて該ビオチン固定化サルモネラ菌の濃度が１個／ｍｌになるように調整した菌けん濁液２０ｍｌに該ＵＣＳＴポリマー５ｍｇを添加してよく撹拌後、得られた混合液を冷却して該ＵＣＳＴポリマーを凝集させ、該凝集物を遠心分離により沈殿させ、上清を取り除き、次いで、残さである凝集物に水を加えて容積を１ｍｌとした。この凝集体含有液を予め滅菌し、５０℃にインキュベートしていたブレインハートインフュージョン寒天培地２０ｍｌに添加し、すばやく混合後シャーレに広げ、寒天が固まるまで放冷し、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後のコロニー数を計測した結果を表３に示した。また、これら総ての操作はクリーンベンチ内にて行った。
また、対照として、該ＵＣＳＴポリマーを添加せず、最初に調整した菌けん濁液１ｍｌ中の菌数を同様に測定した。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
この結果より、サルモネラ菌は該ＵＣＳＴポリマーにより濃縮されていることが明らかである。
【００９４】
実施例１０［ＵＣＳＴポリマーへの核酸の固定化］
市販のビオチン固定化ＤＮＡ断片５００μｌ（５０〜１０００ｂｐ）に、蒸留水４５０μｌ、および実施例７で調製したアビジン固定化ＵＣＳＴポリマー５ｍｇを加え良く混合したのち、該混合液を冷却して該ＵＣＳＴポリマーを凝集させ、該凝集を遠心分離により回収し、上清のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、いずれのＤＮＡ断片も該ＵＣＳＴポリマーに結合していることが示唆された。ＲＮＡについても同様の実験を行い、該ＵＣＳＴポリマーへの結合を確認した。
【００９５】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０００年８月２１日出願の日本特許出願Ｎｏ．２０００−２４９８１８に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明のＵＣＳＴポリマーは、緩衝液中においてもＵＣＳＴを有し、さらに、本発明のポリマーを用いれば、微生物の分離、濃縮、核酸の精製、検出、または濃縮、生体物質の分離、および物質の変換が効率よく行える。特に温度設定が難しい物質、高温環境が好ましくない物質（例えばバイオプロダクト、酵素、抗体などの蛋白質）の分離、精製、固定化酵素、検量、制御、或いはケモバルブ、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）等に有効に利用出来る。