(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域の塩基配列との相同性が９０％以上である一本鎖ＤＮＡと、
前記一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖ＤＮＡにアニーリングした一本鎖核酸とを有する核酸構築物であり、前記一本鎖核酸が、次式（Ｉ）又は式（ＩＩ）：
５’−Ｄ１−Ｃ１−Ｂ１−Ａ１−３’  （Ｉ）
５’−Ａ２−Ｂ２−Ｃ２−Ｄ２−３’  （ＩＩ）
［式中、Ａ１及びＡ２は２個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、Ｂ１はＡ１で及びＢ２はＡ２でそれぞれ表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない、３個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、Ｃ１はＡ１で及びＣ２はＡ２でそれぞれ表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、Ｄ１は前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を表し、Ｄ２は前記一本鎖ＤＮＡの３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を表す。］
で表される塩基配列からなり、Ａ１、Ａ２で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ１、Ｃ２で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している、前記核酸構築物。
【請求項２】
前記一本鎖ＤＮＡの塩基数が３００〜３０００であり、前記一本鎖核酸の塩基数が１５〜１００である請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記一本鎖核酸が、前記一本鎖ＤＮＡのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれをも含まない部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖ＤＮＡのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングした請求項１又は２記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記一本鎖核酸が、前記一本鎖ＤＮＡのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれよりも５’側又は３’側に位置する部分にアニーリングした請求項３記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記一本鎖核酸が、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分にアニーリングした請求項１〜４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して、欠失、置換、挿入又は付加された前記配列のいずれもが、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分に存在しない、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記一本鎖ＤＮＡにアニーリングした複数の一本鎖核酸を有し、前記複数の一本鎖核酸がそれぞれ前記一本鎖ＤＮＡの異なる部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記標的領域に疾患の原因となる異常塩基配列が含まれており、
前記一本鎖ＤＮＡが、前記標的配列領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、前記異常塩基配列が正常塩基配列となるように、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる請求項１〜７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項９】
細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域に含まれる異常塩基配列が原因となる疾患の治療剤であって、
請求項８記載の核酸構築物を含む治療剤。
【請求項１０】
生物個体を構成していない細胞内又はヒト以外の生物個体を構成している細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域の塩基配列に変異を導入する方法であって、
前記細胞内に請求項１〜８のいずれかに記載の核酸構築物を導入する工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸構築物が導入された細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞を保有するヒト以外の生物個体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡにアニーリングした一本鎖核酸とを有する核酸構築物、該核酸構築物を利用した標的領域への変異導入方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年のヒトゲノム計画の進展や大量遺伝子サンプルのスクリーニング方法の開発によって、個人の遺伝子情報をより詳細かつ簡便に調べることが可能になった。このような技術の進歩とともに、個々の患者の遺伝子情報に合わせて、変異の入った異常配列を直接正常配列に戻す遺伝子修復法は、テーラーメード医療として、非常に期待できる技術である。【０００３】  遺伝子修復法の一つであるＳｍａｌｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＦＨＲ）法は、正常配列を含む、熱変性させたＰＣＲ産物を細胞へ導入することによって、変異遺伝子を正常型へ変換することを目的としている（非特許文献１〜３）。【０００４】  哺乳動物細胞において相同組換えに関与するＲａｄ５１は、そのノックアウト動物が胎生致死であることから、細胞分裂時に生じるＤＮＡ複製の誤りを修復するために必要不可欠な蛋白質として知られている（非特許文献４及び５）。【０００５】  これまでのＲａｄ５１の生化学的な解析から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え反応においてＲａｄ５１が二本鎖よりも一本鎖ＤＮＡを基質として好むことが知られている（非特許文献６及び７）。また、Ｒａｄ５１が、一本鎖ＤＮＡの一部に二本鎖構造を持つＴａｉｌｅｄ  Ｄｕｐｌｅｘを、通常の一本鎖ＤＮＡと比べ、良い相同組換え反応の基質とすることが知られている（非特許文献７）。
【非特許文献１】Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ  Ｋ．等，「Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ＤＮＡ  ｉｎ  ＣＦ  ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．」，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１９９６年，第３巻，８５９−８６７頁
【非特許文献２】Ｇｏｎｃｚ  ＫＫ等，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＣＦＴＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．，１９９８年，第７巻，１９１３−１９１９頁
【非特許文献３】Ｃｏｌｏｓｉｍｏ  Ａ等，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２００１年，第３巻，１７８−１８５頁
【非特許文献４】Ｗｅｓｔ  ＳＣ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｖｉｅｗｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ．」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００３年，第４巻，４３５−４４５頁
【非特許文献５】Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｐ等，「ｐ５３’ｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｌｉｆｅ：ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｉｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．」，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，２００４年，第２０巻，２３５−２４３頁
【非特許文献６】Ｂａｕｍａｎｎ  Ｐ等，「Ｈｕｍａｎ  ｒａｄ５１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．」，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８７巻，７５７−７６６頁
【非特許文献７】Ｍａｚｉｎ  ＡＶ等，「Ｔａｉｌｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅ  ｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐａｉｒｉｎｇ．」，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０００年，第１９巻，１１４８−１１５６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は、細胞内の二本鎖ＤＮＡのうち、標的領域に変異を導入することができる核酸構築物、該核酸構築物を利用した標的領域への変異導入方法、該核酸構築物が導入された細胞、該細胞を保有する生物個体等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  上記課題を解決するために、本発明は、細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域の塩基配列との相同性が９０％以上である一本鎖ＤＮＡと、前記一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖ＤＮＡにアニーリングした一本鎖核酸とを有する核酸構築物を提供する。【０００８】  また、本発明は、細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域に含まれる異常塩基配列が原因となる疾患の治療剤であって、本発明の核酸構築物を含む治療剤を提供する。【０００９】  さらに、本発明は、生物個体を構成していない細胞内又はヒト以外の生物個体を構成している細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域の塩基配列に変異を導入する方法であって、前記細胞内に本発明の核酸構築物を導入する工程を含む方法を提供する。【００１０】  さらに、本発明は、本発明の核酸構築物が導入された細胞を提供する。【００１１】  さらに、本発明は、本発明の細胞を保有するヒト以外の生物個体を提供する。【００１２】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖ＤＮＡの塩基数が３００〜３０００であり、前記一本鎖核酸の塩基数が１５〜１００であることが好ましい。【００１３】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、前記一本鎖ＤＮＡのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれをも含まない部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖ＤＮＡのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングしていることが好ましい。【００１４】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、前記一本鎖ＤＮＡのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれよりも５’側又は３’側に位置する部分にアニーリングしていることが好ましい。【００１５】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分にアニーリングしていることが好ましい。【００１６】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、次式（Ｉ）：
５’−Ｄ１−Ｃ１−Ｂ１−Ａ１−３’
［式中、Ａ１は、２個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、Ｂ１は、Ａ１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない、３個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、Ｃ１は、Ａ１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、Ｄ１は、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を表す。］
で表される塩基配列からなり、Ａ１で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ１で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成していることが好ましい。【００１７】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、次式（ＩＩ）：
５’−Ａ２−Ｂ２−Ｃ２−Ｄ２−３’
［式中、Ａ２は、２個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、Ｂ２は、Ａ２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない、３個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、Ｃ２は、Ａ２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、Ｄ２は、前記一本鎖ＤＮＡの３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を表す。］
で表される塩基配列からなり、Ａ２で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ２で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成していることが好ましい。【００１８】  本発明の核酸構築物において、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれもが、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分に存在しないことが好ましい。【００１９】  本発明の核酸構築物において、前記一本鎖ＤＮＡにアニーリングした複数の一本鎖核酸を有し、前記複数の一本鎖核酸がそれぞれ前記一本鎖ＤＮＡの異なる部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含むことが好ましい。【００２０】  本発明の核酸構築物において、前記標的領域に疾患の原因となる異常塩基配列が含まれており、前記一本鎖ＤＮＡが、前記標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、前記異常塩基配列が正常塩基配列となるように、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の核酸構築物の実施形態を示す模式図である。
【図２】ｐＴＥＮＨＥＸの構成を示す模式図である。
【図３】フラグメント１単独、フラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント２からなる核酸構築物Ｓ１、フラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント３からなる核酸構築物Ｓ２、及びフラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント６からなる核酸構築物Ｓ５を用いた場合の、ｐＴＥＮＨＥＸに含まれる変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の修復効率を示す図である。
【図４】フラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント４からなる核酸構築物Ｓ３、及びフラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント５からなる核酸構築物Ｓ４を用いた場合の、ｐＴＥＮＨＥＸに含まれる変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の修復効率を示す図である。
【符号の説明】
【００２２】１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ，１０ｅ，１０ｆ・・・核酸構築物
２０・・・一本鎖ＤＮＡ
３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ，３０ｅ，３１ｅ，３０ｆ，３１ｆ・・・一本鎖核酸
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  本発明の核酸構築物は、細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列との相同性が９０％以上である一本鎖ＤＮＡと、一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖ＤＮＡにアニーリングした一本鎖核酸とを有する。【００２４】  細胞内の二本鎖ＤＮＡのうち、変異を導入したい塩基配列を含む領域が標的領域である。二本鎖ＤＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成されているので、標的領域はセンス鎖側領域とアンチセンス鎖側領域とから構成されている。センス鎖側領域の塩基配列及びアンチセンス鎖側領域の塩基配列は相補的であり、センス鎖側領域及びアンチセンス鎖側領域の塩基数は同一であり、通常３００〜３０００、好ましくは３００〜１５００、さらに好ましくは３００〜９００である。【００２５】  標的領域が存在する二本鎖ＤＮＡは、内因性の二本鎖ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）であってもよいし、外因性の二本鎖ＤＮＡ（細胞内に導入された外来ＤＮＡ）であってもよいが、内因性の二本鎖ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）であることが好ましい。【００２６】  標的領域は、細胞内の二本鎖ＤＮＡのうち、いずれの領域であってもよいが、疾患の原因となる異常塩基配列が含まれる領域であることが好ましい。異常塩基配列は、正常塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列である。疾患の原因となる変異としては、例えば、ハンチントン舞踏病で見られるＣＡＧリピートによる長鎖挿入変異、筋ジストロフィーのジストロフィン遺伝子における長鎖欠失変異、血友病の第９因子遺伝子における一塩基置換等が挙げられる。【００２７】  標的領域としては、例えば、構造遺伝子領域、調節遺伝子領域等の一部又は全部を含む領域を選択することができる。なお、構造遺伝子領域は、タンパク質のアミノ酸配列を規定している領域であり、真核細胞の構造遺伝子領域には、エクソン及びイントロンの両者が含まれる。調節遺伝子領域としては、例えば、オペレーター領域、プロモーター領域、アテニュエーター領域等が挙げられる。【００２８】  センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において欠失、置換、挿入又は付加される塩基の個数は、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列との相同性が９０％以上である限り特に限定されるものではないが、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。【００２９】  一本鎖ＤＮＡは直鎖状であり、その端部は非修飾である。すなわち、一本鎖ＤＮＡは天然型ＤＮＡであり、ホスホロチオエートＤＮＡ等のように端部が修飾された非天然型ＤＮＡは含まれない。【００３０】  センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において欠失、置換、挿入又は付加される塩基の位置は特に限定されるものではないが、標的領域に疾患の原因となる異常塩基配列が含まれている場合、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、異常塩基配列が正常塩基配列となるように、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は��加されていることが好ましい。【００３１】  一本鎖ＤＮＡの塩基配列とセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列と相同性は９０％以上であるが、好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。なお、一本鎖ＤＮＡの塩基配列がセンス鎖側領域の塩基配列と９０％以上の相同性を有する場合、一本鎖ＤＮＡはセンス鎖側領域と相同置換可能であると考えられ、一本鎖ＤＮＡの塩基配列がアンチセンス鎖側領域の塩基配列と９０％以上の相同性を有する場合、一本鎖ＤＮＡはアンチセンス鎖側領域と相同置換可能であると考えられる。一本鎖ＤＮＡのセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域との相同置換は、本発明の核酸構築物による標的領域の塩基配列への変異導入メカニズムの一つとして考えられる。【００３２】  一本鎖ＤＮＡの塩基数は、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列に対して加えられた変異に応じて異なるが、通常３００〜３０００、好ましくは３００〜１５００、さらに好ましくは３００〜９００である。【００３３】  一本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸誘導体、核酸類似体等のいずれであってもよい。核酸誘導体又は類似体としては、例えば、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等が挙げられる。【００３４】  一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡにアニーリングできる限り、一本鎖ＤＮＡのいずれの部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含んでいてもよいが、一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分にアニーリングしていることが好ましく、一本鎖ＤＮＡの３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖ＤＮＡの３’末端側部分にアニーリングしていることがさらに好ましい。一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分、特に３’末端側部分にアニーリングした核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。【００３５】  一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分は、一本鎖ＤＮＡの５’末端に位置する塩基を含む塩基配列からなる部分であり、一本鎖ＤＮＡの３’末端側部分は、一本鎖ＤＮＡの３’末端に位置する塩基を含む塩基配列からなる部分である。【００３６】  一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基の位置と、一本鎖核酸がアニーリングする位置との関係は特に限定されるものではないが、一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれをも含まない部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングしていることが好ましい。一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基の位置と、一本鎖核酸がアニーリングする位置とが異なる核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。【００３７】  例えば、一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれよりも５’側又は３’側に位置する部分にアニーリングした核酸構築物においては、一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングしているので、このような核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。特に、一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれよりも３’側に位置する部分にアニーリングした核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。【００３８】  また、一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分にアニーリングしている核酸構築物においては、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加されたいずれの塩基も、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分又は３’末端側部分に存在しなければ、一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングすることとなるので、このような核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。【００３９】  一本鎖核酸に含まれる一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の塩基数は、通常１５〜１００、好ましくは２０〜７０、さらに好ましくは２０〜５０である。【００４０】  一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列のみからなっていてもよいし、当該塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列からなっていてもよい。一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列からなる場合、一本鎖核酸のうち、一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列からなる部分が一本鎖ＤＮＡの対応部分にアニーリングする。一本鎖核酸が、一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列からなる場合、一本鎖核酸の塩基配列の塩基数は通常２５〜１３０、好ましくは２５〜１００、さらに好ましくは２５〜８０である。【００４１】  一本鎖核酸が一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列からなる場合の、本発明の核酸構築物の一実施形態を図１（ａ）及び（ｂ）に示す。【００４２】  図１（ａ）に示すように、核酸構築物１０ａは、一本鎖ＤＮＡ２０と、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２１と相補的な塩基配列からなり、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２１にアニーリングした一本鎖核酸３０ａとを有する。【００４３】  図１（ｂ）に示すように、核酸構築物１０ｂは、一本鎖ＤＮＡ２０と、一本鎖ＤＮＡ２０の３’末端側部分２２と相補的な塩基配列か���なり、一本鎖ＤＮＡ２０の３’末端側部分２２にアニーリングした一本鎖核酸３０ｂとを有する。【００４４】  一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の３’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列からなる一本鎖核酸としては、例えば、次式（Ｉ）：
５’−Ｄ１−Ｃ１−Ｂ１−Ａ１−３’
で表される塩基配列からなり、Ａ１で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ１で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している一本鎖核酸が挙げられる。【００４５】  式（Ｉ）において、Ａ１は、２個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。Ａ１で表される塩基配列の塩基数の上限値は特に限定されるものではないが、通常３０、好ましくは２０、さらに好ましくは１０である。Ａ１で表される塩基配列は特に限定されるものではないが、ＣＧ含有率が高い塩基配列であることが好ましい。Ａ１で表される塩基配列におけるＣＧ含有率は通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。【００４６】  式（Ｉ）において、Ｂ１は、Ａ１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない、３個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。Ｂ１で表される塩基配列の塩基数の上限値は特に限定されるものではないが、通常１０、好ましくは７、さらに好ましくは５である。Ｂ１で表される塩基配列は、Ａ１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない限り特に限定されるものではないが、熱的に安定なループを形成可能な塩基配列、例えば、一本鎖核酸がＤＮＡである場合にはｇａａ、ｇｘｙａ、ｇｘａｙ（ｘ及びｙは任意の塩基を表す。）等であることが好ましい。【００４７】  式（Ｉ）において、Ｃ１は、Ａ１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を表す。
式（Ｉ）において、Ｄ１は、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を表す。Ｄ１で表される塩基配列の塩基数は、通常１５〜１００、好ましくは２０〜７０、さらに好ましくは２０〜５０である。【００４８】  一本鎖核酸が式（Ｉ）で表される塩基配列からなる場合の、本発明の核酸構築物の一実施形態を図１（ｃ）に示す。【００４９】  図１（ｃ）に示すように、核酸構築物１０ｃは、一本鎖ＤＮＡ２０と、一本鎖ＤＮＡ２０にアニーリングした、式（Ｉ）で表される塩基配列からなる一本鎖核酸３０ｃと有し、一本鎖核酸３０ｃのうち、Ｄ２で表される塩基配列からなる部分が、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２３にアニーリングしており、Ａ１で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ１で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している。【００５０】  一本鎖ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列からなる一本鎖核酸としては、例えば、次式（ＩＩ）：
５’−Ａ２−Ｂ２−Ｃ２−Ｄ２−３’
で表される塩基配列からなり、Ａ２で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ２で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している一本鎖核酸が挙げられる。【００５１】  式（ＩＩ）において、Ａ２は、２個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。Ａ２で表される塩基配列の塩基数の上限値は特に限定されるものではないが、通常３０、好ましくは２０、さらに好ましくは１０である。Ａ２で表される塩基配列は特に限定されるものではないが、ＣＧ含有率が高い塩基配列であることが好ましい。Ａ２で表される塩基配列におけるＣＧ含有率は通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。【００５２】  式（ＩＩ）において、Ｂ２は、Ａ２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない、３個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。Ｂ２で表される塩基配列の塩基数の上限値は特に限定されるものではないが、通常１０、好ましくは７、さらに好ましくは５である。Ｂ２で表される塩基配列は、Ａ２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない限り特に限定されるものではないが、熱的に安定なループを形成可能な塩基配列、例えば、一本鎖核酸がＤＮＡである場合にはｇａａ、ｇｘｙａ、ｇｘａｙ（ｘ及びｙは任意の塩基を表す。）等であることが好ましい。【００５３】  式（ＩＩ）において、Ｃ２は、Ａ２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を表す。
式（ＩＩ）において、Ｄ２は、一本鎖ＤＮＡの３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を表す。Ｄ２で表される塩基配列の塩基数は、通常１５〜１００、好ましくは２０〜７０、さらに好ましくは２０〜５０である。【００５４】  一本鎖核酸が式（ＩＩ）で表される塩基配列からなる場合の、本発明の核酸構築物の一実施形態を図１（ｄ）に示す。【００５５】  図１（ｄ）に示すように、核酸構築物１０ｄは、一本鎖ＤＮＡ２０と、式（ＩＩ）で表される塩基配列からなる一本鎖核酸３０ｄと有し、一本鎖核酸３０ｄのうち、Ｄ２で表される塩基配列からなる部分は、一本鎖ＤＮＡ２０の３’末端側部分２４にアニーリングしており、Ａ２で表される塩基配列からなる部分が、Ｃ２で表される塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している。【００５６】  本発明の核酸構築物において、一本鎖ＤＮＡにアニーリングしている一本鎖核酸の数は特に限定されるものではなく、単数であってもよいし、複数であってもよい。一本鎖ＤＮＡに複数の一本鎖核酸がアニーリングしている場合、複数の一本鎖核酸はそれぞれ、一本鎖ＤＮＡの異なる部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖ＤＮＡの異なる部分にアニーリングしている。一本鎖ＤＮＡに複数の一本鎖核酸がアニーリングしている場合、一本鎖ＤＮＡのうち、ある一本鎖核酸がアニーリングする領域と、他の一本鎖核酸がアニーリングする領域とが連続していてもよいし、不連続であってもよい。【００５７】  一本鎖ＤＮＡに２つの一本鎖核酸がアニーリングしている場合の、本発明の核酸構築物の一実施形態を示す模式図を図１（ｅ）及び（ｆ）に示す。【００５８】  図１（ｅ）に示すように、核酸構築物１０ｅは、一本鎖ＤＮＡ２０と、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２５と相補的な塩基配列からなり、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分２５にアニーリングした一本鎖核酸３０ｅと、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２５に隣接する部分２６と相補的な塩基配列からなり、一本鎖ＤＮＡの部分２６にアニーリングした一本鎖核酸３１ｅとを有する。なお、一本鎖ＤＮＡのうち、５’末端側部分２５と、５’末端側部分２５に隣接する部分２６とは連続している。【００５９】  図１（ｆ）に示すように、核酸構築物１０ｆは、一本鎖ＤＮＡ２０と、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２７と相補的な塩基配列からなり、一本鎖ＤＮＡの５’末端側部分２７にアニーリングした一本鎖核酸３０ｆと、一本鎖ＤＮＡ２０の５’末端側部分２７の近傍に位置する部分２８と相補的な塩基配列からなり、一本鎖ＤＮＡの部分２８にアニーリングした一本鎖核酸３１ｆとを有する。なお、一本鎖ＤＮＡのうち、５’末端側部分２７と、５’末端側部分２７の近傍に位置する部分２８とは不連続である。【００６０】  一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖核酸は、公知の化学合成法を用いて作製することができる。この際、短鎖（例えば１００塩基長程度）のものを複数合成し、それらを公知のライゲーション法により連結し、目的の塩基長の一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖核酸を作製することができる。また、一本鎖ＤＮＡは、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡを鋳型とした変異導入型ＰＣＲ、市販の変異導入キット等により調製したファージ又はファージ���ドＤＮＡを制限酵素処理することにより作製することができる。【００６１】  本発明の治療剤は、細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域のうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に含まれる異常塩基配列が原因となる疾患の治療剤であって、本発明の核酸構築物を含む治療剤である。【００６２】  本発明の治療剤は、核酸構築物を細胞内に導入可能な形態で含むことが好ましい。細胞内に導入可能な形態としては、適当な溶媒（例えば水）に分散させた形態、中空ナノ粒子、リポソーム等の内部に封入した形態、カチオン性ポリマーとの複合体等が挙げられる。【００６３】  本発明の方法は、細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域の塩基配列に変異を導入する方法であって、細胞内に本発明の核酸構築物を導入する工程を含む方法である。【００６４】  細胞は、生物個体を構成していない細胞又は生物個体を構成している細胞のいずれであってもよい。細胞は真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよく、細胞が由来する生物種は特に限定されるものではない。細胞が由来する生物種としては、例えば、哺乳類、鳥類、昆虫類等の動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳類であることがさらに好ましい。哺乳類としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。微生物は、原核微生物及び真核微生物のいずれであってもよく、原核微生物としては、例えば、グラム陽性菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等）、グラム陰性菌（例えば、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属等）等の細菌類が挙げられ、真核微生物としては、例えば、糸状菌（カビ類）、酵母等の真菌類が挙げられる。【００６５】  細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞、又はこれらの培養細胞等が挙げられる。体細胞の具体例としては、脳、脊髄等の神経系組織；網膜細胞、嗅細胞等の感覚器；食道、胃、小腸、大腸等の消化器；肺、気管支等の呼吸器；精巣、卵巣、子宮、胎盤等の生殖器；腎臓、膀胱等の泌尿器；骨髄細胞、血球細胞等の造血器；骨格筋、平滑筋、心筋等の筋組織；骨芽細胞、破骨細胞等の骨組織；皮膚、毛根細胞等の皮膚組織等の各種組織・器官から分離された生細胞又はその培養細胞等が挙げられ、生殖細胞の具体例としては、卵、精子又はその培養細胞等が挙げられ、幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、栄養膜幹細胞（ＴＳ細胞）、骨髄幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。【００６６】  本発明の核酸構築物の細胞内への導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を使用することができる。【００６７】  細胞内に本発明の核酸構築物が導��されると、細胞内の二本鎖ＤＮＡに存在する標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域が本発明の核酸構築物に含まれる一本鎖ＤＮＡで相同置換されたのと同様の変異（１又は複数個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域のうち一方の領域に導入され、他方の領域も一方の領域と相補的となるように修正され、その結果、センス鎖側領域及びアンチセンス鎖側領域の両方に変異が導入される。【００６８】  標的領域に疾患に原因となる異常塩基配列が含まれる場合、異常塩基配列に変異を導入し、正常塩基配列に変換することにより、異常塩基配列が原因となる疾患を治療することができる。【００６９】  標的領域に変異が導入された細胞及び該細胞を保有する生物個体は、特定の化合物等に対する感受性が正常型とは異なるスクリーニング系、疾患モデル等として有用である。【００７０】  本発明の核酸構築物を保有する生物個体は、生物個体を構成する細胞内に本発明の核酸構築物が導入された生物個体であってもよいし、本発明の核酸構築物が導入された細胞を移植された生物個体であってもよい。
【実施例】
【００７１】１．方法
（１）プラスミドの作製
ｐＨｙｇＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）のＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の同じ制限酵素部位へ導入したｐＡＬＨＥに対し、Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ＩＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて部位特異的変異導入反応を行った。なお、ＨｙｇＥＧＦＰはハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）と緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子との融合遺伝子である。【００７２】  一回目の反応では、オリゴヌクレオチドＸｈｏ（５’−ｃｇｇｃａｃｃｔｃｇａｇｃａｃｇｃｇｇａｔ：配列番号１）を用いてＸｈｏＩ部位を導入し、ｐＡＬＨＥＸを作製した。このとき、正常ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン１９５はＶａｌからＧｌｕへ変化するが、遺伝子修復反応の定量には影響しなかった。【００７３】  二回目の反応では、オリゴヌクレオチドＳｉｌｅｎｔ（５’−ｇｃｇａａｇａａｔｃａｃｇｔｇｃｔｔｔｃａ−３’：配列番号２）を用いて正常ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４に遺伝子マーカーとなるＰｍａＣＩ部位を導入し、ｐＡＬＨＥＸＰを作製した。さらに、ｐＡＬＨＥＸＰに対し、オリゴヌクレオチドＯｐａｌ（５’−ｇｇｃｇａａｇａａｔｇａｃｇｔｇｃｔｔｔｃ−３’：配列番号３）を用いて、正常ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４にｏｐａｌ変異を導入し、ｐＡＬＨＥＸＢを作製した。最後の反応では、ｏｐａｌ変異と同時に、先ほど導入されたＰｍａＣＩ部位が除去され、代わりに変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のマーカーとしてＢｍｇＢＩ部位が導入される。
それぞれのプラスミドに含まれるＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の配列はシークエンス反応によって確認した。【００７４】  ｐＡＬＨＥＸＰ及びｐＡＬＨＥＸＢから精製したＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を、ＮＸＢリンカー（Ｕｐｐｅｒ：５’−ｃａｔｇｇｃｇａｔｃｃｔｃｇａ−３’：配列番号４，Ｌｏｗｅｒ：５’−ｇａｔｃｔｃｇａｇｇａｔｃｇｃ−３’：配列番号５）を用いて、ｐＴｒｉＥｘ−３Ｎｅｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＣＭＶプロモーター及びＴ７プロモーターの下流に存在するＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位へ導入し、ｐＴＥＮＨＥＳ及びｐＴＥＮＨＥＸを作製した。ｐＴＥＮＨＥＳ及びｐＴＥＮＨＥＸは、大腸菌及び哺乳動物の細胞内でそれぞれ正常型及び変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を発現することができることが確認された。これらのプラスミドを大腸菌ＤＨ−５α株に導入し、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。【００７５】（２）ファージミドの作製
ｐＴＥＮＨＥＳのＸｈｏＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＸｈｏＩ部位に導入することにより、ファージミドｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅ及びｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅを作製した。ｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅ及びｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅにおいて、ＸｈｏＩ断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のｆ１  ｏｒｉに対して逆の向きに挿入され、ｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅ及びｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅから得られる一本鎖環状ＤＮＡは、それぞれ正常型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のアンチセンス鎖及びセンス鎖を含んでいる。それぞれの挿入方向は制限酵素ＮａｅＩ及びＰｍａＣＩによって確認した。ファージミドを大腸菌ＪＭ１０５株に導入し、２×ＹＴ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐ）含有）で一晩培養した後、５ｍＬを５００ｍＬの２×ＹＴ培地（５０μｇ／ｍＬＡｍｐ含有）に移し、激しく攪拌しながら３７℃で培養した。１時間後に２５μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシンを加え、再び培養を続け、２３時間後、遠心分離（２．１５×１０３ｇ，１５分）によってファージミドを大腸菌と分離した。上清に含まれるファージミドに、７５ｍＬの２０％ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。遠心分離（１８．８×１０３ｇ，２０分）により、ファージミドを沈殿させた後、２０ｍＬの０．３Ｍ  ＡｃＯＮａ／１ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、フェノール、フェノール／クロロフォルム（１／１）、クロロフォルムを用いて、環状一本鎖ＤＮＡを回収した。ＤＮＡ溶液に２５ｍＬ  ＥｔＯＨを加え、室温で１５分間静置した後、遠心分離によって沈殿させ、５００μＬの水に溶解した。【００７６】（３）フラグメント１の調製
ｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅから得られた環状一本鎖ＤＮＡ  １ｐｍｏｌ（１．１μｇ）を、５ＵのＸｈｏＩで消化し、６０６ｎｔの断片を３．５％低融点アガロースゲルで分離した後、フェノール・クロロフォルム抽出によって回収した。環状一本鎖ＤＮＡの制限酵素処理において、ＸｈｏＩ部位周辺を二本鎖とするため、ｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅの５’及び３’側のＸｈｏＩ部位に相補的なオリゴヌクレオチドＳ５’（５’−ｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔｇｃｃｇ−３’：配列番号６）及びＳ３’（５’−ｇｇｇｇｃｔｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃ−３’：配列番号７）を、環状一本鎖ＤＮＡに対して５モル当量加えた。【００７７】  回収した断片は、ゲルろ過（ＮＡＰ５カラム，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製し、Ａ２６０／Ａ２８０が１．８以上であることを確認した。ＤＮＡ量は、ＯＤ２６０１．０あたり一本鎖ＤＮＡ  ４０μｇとして算出した。
こうして調製されたセンス配列からなる一本鎖ＤＮＡ（フラグメント１）の塩基配列を配列番号８に示す。なお、フラグメント１のうち、標的領域へ変異を導入するための塩基（以下「変異導入塩基」という。）は、配列番号８のうち１２６〜１２８番目の塩基（ｔｃａ）である。【００７８】（４）フラグメント２〜６の調製
フラグメント１の５’末端部分と相補的な塩基配列からなるフラグメント２（配列番号９）、フラグメント１の３’末端部分と相補的な塩基配列からなるフラグメント３（配列番号１０）、及びフラグメント１のうち変異導入塩基よりも３’側に位置する部分（配列番号８のうち２８６〜３２０番目の塩基からなる塩基配列部分）と相補的な塩基配列からなるフラグメント６（配列番号１６）を化学合成により作製した。化学合成はＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｊａｐａｎに委託した。【００７９】  フラグメント１の５’末端部分と相補的な塩基配列を含むフラグメント４（配列番号１１）、及びフラグメント１の３’末端部分と相補的な塩基配列を含むフラグメント５（配列番号１２）を化学合成により作製した。化学合成は北海道システムサイエンスに委託した。【００８０】  なお、フラグメント４は、次式：
５’−ＦＤ２−ＦＣ２−ＦＢ２−ＦＡ２−３’
［式中、ＦＤ２はｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｇｇａｔｃｔｃｇａ（フラグメント１の５’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列）であり、ＦＣ２はｇｃであり、ＦＢ２はｇａａａであり、ＦＡ２はｇｃである。］
で表される塩基配列からなり、ＦＡ２部分がＦＣ２部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成することができる。【００８１】  フラグメント５は、次式：
５’−ＦＡ１−ＦＢ１−ＦＣ１−ＦＤ１−３’
［式中、ＦＡ１はｇｃであり、ＦＢ１はｇａａａであり、ＦＣ１はｇｃであり、ＦＤ１はｇｇｔｇｃｃｇｇａｃｔｔｃｇｇｇｇｃａｇ（フラグメント１の３’末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列）である。］
で表される塩基配列からなり、ＦＡ１部分がＦＣ１部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成することができる。【００８２】（５）核酸構築物の作製
１０ｐｍｏｌのフラグメント１に対し、アニーリング効率を考慮して１０倍量（１００ｐｍｏｌ）の各フラグメントを、２０μＬのＴＥ緩衝液中で混合した。９５℃で５分間加熱してＤＮＡを変性させた後、氷中で５分間急冷した。さらに８０℃で５分間加熱した後、徐冷することによってフラグメント１と各フラグメントとをアニーリングさせた。【００８３】（６）核酸構築物の導入
核酸構築物の導入反応の前日に、４ｍＬの１０％  ＦＢＳを含むＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に懸濁した３×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を６ｃｍディッシュに播き、３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気下において培養した。フラグメント１又は各核酸構築物（それぞれ１０ｐｍｏｌのフラグメント１を含む）をｐＴＥＮＨＥＸ（２５ｆｍｏｌ，１２５ｎｇ）とともに、リポフェクトアミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞へ導入した。各核酸構築物を細胞へ導入するにあたり、フラグメント１には１μｇのｐＡＬＨＥＸ−Ｅｘ２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、すべてのサンプルのＤＮＡ量が４μｇとなるように調整した。【００８４】  導入反応後、４８時間培養した細胞をトリプシン処理し、１ｍＬ  ＰＢＳで洗浄した後、遠心分離により細胞を集めた。これを１００μＬのＴＥＧ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  Ｇｌｃ，ｐＨ８．０）に懸濁し、２００μＬの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％  ＳＤＳを加え、穏やかに攪拌した後、室温で５分間放置した。さらに１５０μＬの８Ｍ  ＡｃＯＮＨ４を加え、４℃で１５分間冷却した。遠心分離後、ｉｓｏＰｒＯＨ沈殿によって、上清からプラスミドＤＮＡを回収した。プラスミドＤＮＡは２０μＬの水に溶解し、使用するまで−２０℃で保存した。【００８５】（７）遺伝子修復効率の定量
回収したプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌ＤＨ−５α株に導入した。エレクトロポレーション法は、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、４℃、１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で行った。プラスミドＤＮＡを導入した大腸菌ＤＨ−５α株は、１ｍＬのＳＯＣ培地で１時間培養した後、５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ添加ＬＢ培地で希釈し、一晩培養した。このとき大腸菌ＤＨ−５α株の一部をとり、ＬＢ寒天培地に播き、コロニー数によってエレクトロポレーション効率を測定したが、大きな違いは観察されなかった。翌日、大腸菌ＤＨ−５α株を遠心分離によって回収し、１００μＬのＴＥＧに際懸濁した。これに２００μＬの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％  ＳＤＳを加え、穏やかに攪拌した後、さらに１５０μＬ  Ｓｏｌ  ＩＩＩ（３Ｍ酢酸カリウム、１１．５％酢酸）を加え、氷上に５分間放置した。遠心分離した上清をフェノール／クロロフォルム（１／１）で処理し、エタノール沈殿によりプラスミドＤＮＡを回収した。これを２０μＬの水に溶解し、このうち１〜２μＬを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株へエレクトロポレーション法を用いて導入した。このとき、大腸菌ＤＨ−５α株と同様の操作によって、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）株への形質転換を行った。形質転換後、１ｍＬのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間培養した後、５０μＬをとり５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ及び１０μＭ  ＩＰＴＧを含む１ｍＬのＬＢ培地を用いて、３７℃で３時間培養した。培養後、培地の一部を１０−１００倍希釈したものを７５μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシンＢ添加ＬＢ寒天培地（Ｈｙｇ７５：５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ、１０μＭ  ＩＰＴＧ）へ、１００−１０００希釈したものをハイグロマイシンＢを含まないＬＢ寒天培地（Ｈｙｇ０：５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ、１０μＭ  ＩＰＴＧ）へ、それぞれ等量ずつ播き、３７℃でインキュベートした。１２−２４時間後、Ｈｙｇ０に生えたコロニー数をカウントした。また、３６−４８時間後にＨｙｇ７５に生えたコロニーを、ＦＬＡ２０００Ｇ（ＦＵＪＩ  ＰＨＯＴＯ  ＦＩＬＭ社製）を用いて解析し、ＥＧＦＰの蛍光（Ｅｘ．４７３ｎｍ，Ｅｍ．５２０ｎｍ）を発するコロニー数をカウントした。Ｈｙｇ０のコロニー数を分母に、Ｈｙｇ７５のＥＧＦＰ蛍光陽性コロニー数を分子として、遺伝子修復効率を算出した。【００８６】  なお、ｐＴＥＮＨＥＸの構成を図２に示し、ｐＴＥＮＨＥＸに含まれる変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を配列番号１３に示す。配列番号１３に示す塩基配列のうち１〜３６番目の塩基からなる塩基配列は、ｐＴＥＮＨＥＸに変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を導入する際に付加された塩基配列であり、変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列は実際には３７番目の塩基から始まる。正常型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４はｔｃａでありＳｅｒをコードしているが、変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４には終止変異（ＴＧＡ）が導入されているため、ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を正常に発現することができない。本実験においては、ｐＴＥＮＨＥＸに含まれる変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４が正常型（ｔｃａ）に修復されたことを、ハイグロマイシン耐性及びＥＧＦＰの蛍光発色という２種類の表現型によって確認した。【００８７】２．結果
図３は、フラグメント１単独（図中「Ｔａｉｌｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  １」）、フラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント２からなる核酸構築物Ｓ１（図中「Ｔａｉｌｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  ２」）、フラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント３からなる核酸構築物Ｓ２（図中「Ｔａｉｌｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  ３」）、及びフラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント６からなる核酸構築物Ｓ５（図中「Ｔａｉｌｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  ６」）を用いた場合の、ｐＴＥＮＨＥＸに含まれる変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の修復効率を示す。【００８８】  図３に示すように、核酸構築物Ｓ１、Ｓ２及びＳ５は、フラグメント１単独に対し、それぞれ１．３倍、１．８倍及び１．８倍高い修復効率を示した（核酸構築物Ｓ１の修復効率２．６％，核酸構築物Ｓ２の修復効率３．７％，核酸構築物Ｓ５の修復効率３．７％）。また、核酸構築物Ｓ１の修復効率に対し、核酸構築物Ｓ２及びＳ５の修復効率は有意に高かった。【００８９】  図４は、フラグメント１単独（図中「Ｌｏｏｐｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  １」）、フラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント４からなる核酸構築物Ｓ３（図中「Ｌｏｏｐｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  ４」）、及びフラグメント１とフラグメント１にアニーリングしたフラグメント５からなる核酸構築物Ｓ４（図中「Ｌｏｏｐｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ  ５」）を用いた場合の、ｐＴＥＮＨＥＸに含まれる変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の修復効率を示す。【００９０】  図４に示すように、核酸構築物Ｓ３及びＳ４は、フラグメント１単独に対し、それぞれ１．４倍及び１．９倍高い修復効率を示した（核酸構築物Ｓ３の修復効率２．７％，核酸構築物Ｓ４の修復効率３．７％）。また、核酸構築物Ｓ３の修復効率に対し、核酸構築物Ｓ４は有意ではないものの高い修復効率を示した。フラグメント４及び５がヘアピン構造を形成する核酸構築物Ｓ３及びＳ４が、より安定な３５塩基対の二本鎖を形成する核酸構築物Ｓ１及びＳ２と同等の遺伝子修復効率を示したことから、末端のループ化によるＤＮＡ断片のエキソヌクレアーゼからの保護は非常に重要な意味を持つことが推測される。したがって、フラグメント２〜５の代わりに、細胞内のヌクレアーゼに抵抗性を持ち、なおかつＤＮＡと効率よくアニーリングできる２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ、ＰＮＡ等の核酸アナログを用いることによって、遺伝子修復効率がさらに向上することが期待できる。【００９１】  なお、ｐＴＥＮＨＥＸに対して、ＰＣＲ産物を用いた従来のＳＦＨＲ法により、変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を修復した結果、変換効率は０．１６％であった。ＰＣＲ産物は、プライマー１（５’−ｇａｇａｔｃｃｃｃｇｇａｇｃｃｇ−３’：配列番号１４）及びプライマー２（５’−ｇａｇｇｔｇｃｃｇｇａｃｔｔｃｇｇ−３’：配列番号１５）とＴａｑポリメラーゼ（Ｔｏｋｙｏｂｏ社製）を用いて増幅し、３’末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｋｉｔ（Ｔｏｋｙｏｂｏ社製）により平滑末端化し、３．５％低融点アガロース電気泳動により精製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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