(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法；
（ａ）３重螺旋構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、以下の（１）または（２）に記載のＤＮＡから選択される少なくとも1つのＤＮＡをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクターに導入する工程、
（１）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ、
（２）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｂ）該ベクターを用いた遺伝子導入により、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を形質転換させる工程、および
（ｃ）該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から３重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡから選択される少なくとも1つのＤＮＡが導入されたｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクター；
（ａ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
を保持するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡから選択される少なくとも1つのＤＮＡが導入されたｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクター；
（ａ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
および請求項２に記載のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、３重螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法に関する。より具体的には、ヒト・コラーゲンまたはヒト・コラーゲンの部分ペプチドの製造方法に関する。本発明の課題は生体にとって安全であり、精製取得の容易なヒト・コラーゲンおよびヒト・コラーゲンの部分ペプチドおよびその製造方法を提供することにある。さらに詳しくは、本発明は、ヒト・コラーゲンｃＤＮＡを挿入して得られる哺乳動物発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定形質導入することによるヒト・コラーゲンおよびヒト・コラーゲンの部分ペプチドの製造方法を提供することにある。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは皮膚・骨・軟骨をはじめ、ほぼ生体中の全組織に分布するタンパク質であり、細胞の足場となって組織・器官の構造を維持するなど、重要な機能を担っていることはよく知られている。一方コラーゲンは、繊維芽細胞から分泌されるコラゲナーゼおよび食細胞中に存在するコラゲナーゼにより分解される生体吸収性材料である。この様にコラーゲンは生体適合性があり、また、生体吸収性材料であるため生物素材として有用なものであると考えられている。これまでにコラーゲンは、生物素材として皮膚損傷部位の被覆材として用いられ、治癒改善が報告されている（非特許文献１および２）。【０００３】
全コラーゲンのうち４０％が皮膚に存在し、皮膚・腱では乾燥重量の７０％以上がコラーゲンである。従ってコラーゲンは人工皮膚の開発において重要である。また、細胞や器官の培養技術においても有用な素材として利用されている。このことは現在進歩の著しい再生医療分野での応用も大いに期待できるものである。また、経口摂取することにより関節リューマチが抑制されるという用途への可能性（II型コラーゲン）なども指摘されている（非特許文献３および４）。このようなコラーゲンの原材料としてはこれまでは主にブタやウシなどヒト以外の大型動物の組織由来のものが用いられてきた。【０００４】
【非特許文献１】Surg. Forum, 10, 303 (1960)
【非特許文献２】J. Surg. Res., 10, 485-491 (1970)
【非特許文献３】Lancet, 342, 799 (1993)
【非特許文献４】Science, 261, 1727-1730 (1993)
【特許文献１】特開平１０−１７９１６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようにコラーゲンは再生医療や生体移植用の生物素材あるいは医薬品として有用な物質であるが、従来から用いられてきたコラーゲンはブタやウシなどヒト以外の大型動物の組織由来のものである。コラーゲンはもともと免疫原性の低いタンパク質ではあるが、異種動物のコラーゲンを生物素材としてヒト生体内に移植、埋入あるいは投与した場合には免疫反応が低頻度ながら惹起されることが報告されている（J. Immunol., 136, 877-882 (1986)、Biomaterials, 11, 176-180 (1990)）。また、ウシにおけるプリオン汚染の問題が発生するに至って、ウシ由来のコラーゲンの使用が不可能となっている。さらにブタ等、現在コラーゲンの抽出に用いられている動物においてプリオン汚染と同様な問題が生じないという保証はない。以上の点において人体に直接適用する生物素材としては、ヒト由来コラーゲンの使用が望ましい。しかしながら、ヒト組織からコラーゲンを抽出、精製することは倫理的な問題や技術的な問題があるばかりでなく、得られたコラーゲンが不特定の架橋を形成するため、精製が困難になるという質的な問題点もある。【０００６】
抗原性がなく、病原体混入の危険性を排除し、さらに単離精製の容易なコラーゲンを得るために、遺伝子組換えの技術を応用したコラーゲンの製造が検討されてきた（Biochem. Soc., 28, 350-353 (2000)）。しかしながら、分子量１０万以上のコラーゲン分子をコードするｃＤＮＡを宿主細胞に導入するための発現ベクターの作製は非常に煩雑なものとなる。また従来の方法では生産量も低く実用化には程遠いものであった。さらにコラーゲンは３本のポリペプチド鎖が会合して３重螺旋構造をとる分子であることが知られており、このような構造は遺伝子から翻訳された一次産物がさらに複数の修飾を受けることによって形成されるが（N. Engl. J. Med., 311, 376-386 (1984)）、特定の細胞のみがこのような修飾能力を保有しているものと考えられている。【０００７】
これまでにマウス線維芽細胞、ハムスター肺細胞等を宿主とした組換えヒト・コラーゲンの生産が試みられている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 764-768 (1987)、J. Biol. Chem., 264,  20683-20687 (1989)）。しかしこれらの例において得られるコラーゲンは分子構造としては正常であるが、ヒトと宿主細胞それぞれのコラーゲン遺伝子産物からなる混成コラーゲン分子であった。また、ヒトII型コラーゲンを発現させた例（Biochem. J., 298, 31-37 (1994)）では、その生産量が培養液１Ｌあたり０．５〜１ｍｇと低いものに過ぎず、さらにｃＤＮＡ導入により発現させたII型コラーゲンに相当量の宿主由来II型コラーゲンの混入が認められた。そのため、導入遺伝子由来のII型コラーゲンと内在性のII型コラーゲンと分離する必要があった。
【０００８】
また、以上の他に酵母（特表平７−５０１９３９号公報）、昆虫細胞（特開平８−２３９７９号公報）、バシルス・ブレビス（特開平１１−１７８５７４号公報）、大腸菌（特開２００２−３２５５８４公報）を用いてヒト・コラーゲンを発現させた例も見られるが、コラーゲンペプチド発現後の修飾に動物細胞におけるそれとの差異のある危険性が考えられた。以上の如くこれまでに、示されてきたいかなる方法もヒト・コラーゲンを遺伝子組換えで製造する手段としては、量的、質的ともに満足できるものではなかった。また、これまでにコラーゲンのように３重螺旋構造を有するタンパク質を大量に製造する方法は検討されていなかった。【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法を提供することにある。より具体的には、高発現ベクターに導入したコラーゲン遺伝子を導入した宿主細胞において、導入した遺伝子に由来するヒト・コラーゲンタンパク質を大量に合成することによる、単離精製が容易で、かつ天然型コラーゲン分子と実質的に同等な構造を有するヒト・コラーゲン分子の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々の検討を行った結果、種々の哺乳動物細胞のうちでもコラーゲン分子の発現量の少ない細胞を宿主として外来遺伝子を高発現可能なベクターにコラーゲン遺伝子コンストラクトを導入することにより、宿主細胞由来のコラーゲンの混在がほとんど見られないヒト・コラーゲンを大量に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。このような、導入したコラーゲン遺伝子を大量に発現させ、宿主細胞において優先的にヒト・コラーゲンを生産させるというコラーゲンの製造方法についてはこれまでに報告がない。【００１１】
即ち、本発明者らは、３重螺旋構造を有するタンパク質の一つであるコラーゲンの発現量の少ない哺乳動物細胞を宿主として外来遺伝子を高発現することが可能なベクターに、ヒト・コラーゲン遺伝子を導入して得られたコンストラクトを導入することによって、ヒト・コラーゲンを複雑な精製工程を必要とせず大量に製造方法を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法。
（ａ）３重螺旋構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡをベクターに導入する工程
（ｂ）該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から３重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程
〔２〕３重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト・コラーゲンまたはその部分ペプチドである〔１〕に記載の方法。
〔３〕ヒト・コラーゲンが少なくとも1種類以上のα鎖からなるヒト・コラーゲンである、〔２〕に記載の方法。
〔４〕ヒト・コラーゲンが、ヒト・I型コラーゲンである〔２〕に記載の方法。
〔５〕ヒト・I型コラーゲンがα１鎖とα２鎖の複合体である〔４〕に記載の方法。
〔６〕ヒト・コラーゲンが、ヒト・II型コラーゲンである〔２〕に記載の方法。
〔７〕ヒト・コラーゲンが、ヒト・III型コラーゲンである〔２〕に記載の方法。
〔８〕３重螺旋構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡから選択される少なくとも1つのＤＮＡである、〔１〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
〔９〕哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞（ＨＥＫ２９３）である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕３重螺旋構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されるベクターが、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡである、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト・コラーゲン。
〔１３〕以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡから選択される少なくとも1つのＤＮＡが導入されたベクター。
（ａ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、４、７、または１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
〔１４〕〔１３〕に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。
〔１５〕〔１３〕に記載のベクター、または〔１４〕に記載の哺乳動物細胞を含む、３重螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトI型α１鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、hColIa1：ヒトI型α１鎖コラーゲンcDNA、PCMV：サイトメガロウイルスプロモーター、BGHPA：ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル、PSVd：エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、DHFR：マウスジヒドロ葉酸還元酵素cDNA、SVpA：シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル、ColE1ori：大腸菌中での複製起点、Neor：哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性）および大腸菌中での選択マーカー（カナマイシン耐性）を示す。
【図２】ヒトI型α２鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、hColIa2：ヒトI型α２鎖コラーゲンcDNA、PCMV：サイトメガロウイルスプロモーター、BGHPA：ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル、PSVd：エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、DHFR：マウスジヒドロ葉酸還元酵素cDNA、SVpA：シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル、ColE1ori：大腸菌中での複製起点、Neor：哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性）および大腸菌中での選択マーカー（カナマイシン耐性）を示す。
【図３】ヒトII型α１鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、hColIIa1:ヒトII型α１鎖コラーゲンcDNA、PCMV:サイトメガロウイルスプロモーター、BGHPA:ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル、PSVd:エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素cDNA、SVpA:シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル、ColE1ori:大腸菌中での複製起点、Neor:哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性）および大腸菌中での選択マーカー（カナマイシン耐性）を示す。
【図４】ヒトIII型α１鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、hColIIIa1:ヒトIII型α１鎖コラーゲンcDNA、PCMV:サイトメガロウイルスプロモーター、BGHPA:ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル、PSVd:エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素cDNA、SVpA:シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル、ColE1ori:大腸菌中での複製起点、Neor:哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性）および大腸菌中での選択マーカー（カナマイシン耐性）を示す。
【図５】培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン１：ヒトI型コラーゲン（100μg/mL）、レーン２：組換えI型コラーゲンを示す。
【図６】培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンのペプシンによる分解産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン１：組換えヒトI型コラーゲン（185μg/mL）、レーン２：組換えI型コラーゲン（20倍濃縮）を示す。
【図７】精製組換えヒトI型コラーゲンおよびそのペプシン分解物のウエスタンブロッティングによる検出を示す写真である。Ａ．抗ヒトI型コラーゲンα１鎖抗体による検出、レーン１：ヒトI型コラーゲン（50μg/mL）、レーン２：組換えI型コラーゲン、レーン３：組換えI型コラーゲンのペプシン分解物を示す。Ｂ．抗ヒトI型コラーゲンα２鎖抗体による検出、レーン１：ヒトI型コラーゲン（10μg/mL）、レーン２：組換えI型コラーゲン、レーン３：組換えI型コラーゲンのペプシン分解物を示す。
【図８】培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン１：ヒトII型コラーゲン（100μg/mL）、レーン２：組換えII型コラーゲンを示す。
【図９】培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのウエスタンブロッティングによる分析を示す写真である。レーン１：ヒトII型コラーゲン（10μg/mL）、レーン２：組換えII型コラーゲン（10倍希釈）を示す。
【図１０】培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのペプシンによる分解産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン１：ヒトII型コラーゲン（100μg/mL）、レーン２：組換えII型コラーゲン（5倍濃縮）を示す。
【図１１】培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのペプシンによる分解物のウエスタンブロッティングによる分析を示す写真である。レーン１：ヒトII型コラーゲン（10μg/mL）、レーン２：組換えII型コラーゲンを示す。
【図１２】培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン１：ヒトIII型コラーゲン（100μg/mL）、レーン２：組換えIII型コラーゲンを示す。
【図１３】培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲンおよびそのペプシン分解物のウエスタンブロッティングによる分析を示す写真である。レーン１：ヒトIII型コラーゲン（10μg/mL）、レーン２：組換えIII型コラーゲン（10倍希釈）、レーン３：組換えIII型コラーゲンペプシン分解物を示す。
【図１４】培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲン精製物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。Ａ．I型コラーゲン、レーン１：ヒトI型コラーゲン、レーン２：組換えI型コラーゲンを示す。Ｂ．III型コラーゲン、レーン１：ヒトIII型コラーゲン、レーン２：組換えIII型コラーゲンを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための最良の形態を示し、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法に関する。
（ａ）３重螺旋構造を有するタンパク質をコードするＤＮＡをベクターに導入する工程
（ｂ）該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から３重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程。【００１５】
本発明の「３重螺旋構造を有するタンパク質」とは、３重螺旋構造を有する限り特に限定されないが、好ましくはコラーゲンまたはコレクチンを、より好ましくはコラーゲンを挙げることが出来る。３重螺旋構造を有するタンパク質とは、培養製造段階で３重螺旋が構築されるタンパク質であってもよいし、培養製造後の精製等の操作により３重螺旋構造が構成されるものであってもよい。３重螺旋構造を取りうるタンパク質であるが、１本鎖構造の状態で大量に製造させてもよい。【００１６】
コラーゲンには２０数種類の異なった型、またそれらを構成する約２５種類のα鎖が存在することが知られており、それらをコードする遺伝子はそれぞれクローニングされ、塩基配列が解明されている（"Connective Tissue and Its Heritable Disorders", pp145-165, Weily-Liss Inc.発行 (1992)）。そして、これらの遺伝子はいずれも、当業者に公知の遺伝子組換え技術（例えば"Molecular Cloning"第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press発行 (1989)）によって本発明において用いられる外来遺伝子を高発現することの可能なベクターに導入することが可能である。本発明で用いるヒト・コラーゲンｃＤＮＡはこれらのクローニングされたコラーゲンｃＤＮＡのどれであってもよく、またこれらコラーゲンの部分ペプチドも含む。【００１７】
本発明のコラーゲンの由来は特に限定をされないが、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来のコラーゲンを挙げることが出来る。
さらにコラーゲンのアミノ配列の一部を置換・欠失等改変したものや、コラーゲン由来でないアミノ酸配列を付加したものも本発明のコラーゲンに含まれる。また、ベクターを宿主哺乳動物細胞に導入し、タンパク分子を発現している形質導入細胞を得る方法は公知であり、本発明においても同様の方法を適用することができる。【００１８】
上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞においてコラーゲンが組換えタンパク質として合成されていることは以下によって調べることができる。すなわち市販のヒト・コラーゲンに特異的に結合する抗体を用いてウエスタンブロッティング等の免疫化学的な方法によりコラーゲンペプチドであることを確認することができる。通常コラーゲンはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Nature, 227, 680-685 (1970)）においては、分子量通りには泳動されないため、コラーゲンをマーカーとして同時に電気泳動後、Matsudairaらの方法（J. Biol. Chem., 261, 10035-10038 (1987)）に従ってナイロン膜あるいはニトロセルロース膜に転写し、抗コラーゲン抗体との反応性を調べることができる。さらに発現ベクターによって生産された組換えコラーゲン産物の中に、３重螺旋構造を有する分子が存在することは次のようにして調べることができる。【００１９】
通常の繊維性コラーゲンは、３つのサブユニット（α鎖）から形成される３本鎖の分子で、分子内に３重螺旋構造を有している。そして、３重螺旋構造を有するコラーゲンはペプシン消化に対して耐性を有することが知られている。そこで、上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞の培養上清を酸性条件下にてペプシン消化し、ペプシン耐性な構造を有するかを調べることにより、このタンパク質試料に３本鎖分子が存在していることを示すことができる。【００２０】
即ち、本発明においては、ペプシン処理を施したタンパク質試料を、還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、得られた組換えコラーゲンは天然コラーゲンと同様のペプシン耐性を示すことが明らかになり、上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞の培養上清中にはペプシン処理に対して耐性の性質を有するコラーゲンペプチドが含まれると推察された。以上の結果から、本発明の発現ベクターは、宿主細胞において生体内に見られるのと同等な特性即ち、ペプシン耐性なコラーゲンを合成させる能力を持つことが示される。【００２１】
本発明の３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法および精製方法を以下に示すが、これらの方法に限定されるものではない。
本発明で宿主細胞として培養に用いられる哺乳動物細胞は特に限定されないが、好ましくは、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を挙げることが出来る。【００２２】
本発明で用いられるＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞は、懸濁培養することにより大量培養化が可能である。例えば、弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト・コラーゲンまたはヒト・コラーゲンの部分ペプチドをコードするｃＤＮＡを共に有するヒト・コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換えＣＨＯ細胞１×１０8〜１×１０9個を１００ｍＬ〜１Ｌの培養液でシェーカーフラスコまたはスピナーフラスコで培養することが可能である。これを適当な時間培養した後、培養上清を集めタンパク質を大量に抽出することができる。【００２３】
弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト・コラーゲンまたはヒト・コラーゲンの部分ペプチドをコードするｃＤＮＡを共に有するヒト・コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換えＣＨＯ細胞の培養上清においては、３重螺旋構造を有する３本鎖コラーゲン分子と同時に正常な３本鎖分子を形成しなかったコラーゲンも存在する。前述のように、３重螺旋構造を有しないコラーゲン分子はペプシンによって消化される。このため、３重螺旋構造を有しないコラーゲン分子はペプシンによって分解除去することができる。この処理によって同時にコラーゲン以外の培養上清中のタンパク質も分解除去することができる。以上の性質を利用して、弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト・コラーゲンまたはヒト・コラーゲンの部分ペプチドをコードするｃＤＮＡを共に有するヒト・コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換えＣＨＯ細胞の培養上清中に存在する全タンパク質を直接ペプシン処理し非コラーゲン性タンパク質を分解除去するとともに、３重螺旋構造を有しないコラーゲンも分解除去することができる。【００２４】
本発明において対象とするヒト・コラーゲンは、現在知られているI型からＸＸI型コラーゲンを含むすべてのヒト・コラーゲンであり、これらのコラーゲンの部分ペプチドも含む。本発明のコラーゲンの型は特に制限をされないが、代表例として、I型、II型、III型、IV型、V型、VII型、IX型、XI型、XII型、XVII型、またはXVIII型等を挙げることが出来、このましくは、I型、II型、III型を挙げることが出来る。I、IV、V、IX、XI型はそれぞれ2,3種類のα鎖からなり、II、III、VII、XII、XVII、XVIII型はそれぞれ１種類のα鎖からなる。これらはそれぞれ、I型：[α1 (I)]2α2(I)、II型：[α1(II)]3、III型：[α1(III)]3、IV型[α1 (IV)]2α2(IV)、V型：[α1 (V)]2α2(V)とα1 (V)α2 (V)α3 (V)、VII型：[α1(VII)]3、IX型：α1 (IX)α2 (IX)α3 (IX)、XI型：α1 (XI)α2 (XI)α3 (XI)、XII型：[α1(XII)]3、XVII型：[α1(XVII)]3、またはXVIII型：[α1(XVIII)]3という分子構成を持つが、本発明のコラーゲンの分子構成は特に限定されるものではない。また、本発明のコラーゲンの分子構成は、天然のコラーゲン由来の分子構成に限定されるものでなく、種類のことなる３種類のα鎖を人為的に複合させてもよい。【００２５】
本発明のI型コラーゲンのα１鎖をコードするDNAの塩基配列を配列番号：１に、I型コラーゲンのα２鎖をコードするDNAの塩基配列を配列番号：４に、II型コラーゲンのα１鎖をコードするDNAの塩基配列を配列番号：７に、III型コラーゲンのα１鎖をコードするDNAの塩基配列を配列番号：１０にそれぞれ示す。【００２６】
本発明のコラーゲンをコードするDNAとして、好ましくは配列番号：１、４、７、１０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号：１、４、７、１０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。選択的にハイブリダイズするとは、あらかじめ定められた配列をもつ分子（すなわち第2のオリゴヌクレオチド）がDNAまたはRNAの試料中に存在する場合、適切にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、ハイブリダイズする、二本鎖になる、または本質的に互いにのみ結合する核酸分子を指す。ストリンジェントな条件とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２７】
本発明において製造されるコラーゲンは、N末端およびC末端にプロペプチドが結合している、プロコラーゲン分子の状態であってもよいし、プロペプチドが除去された状態であってもよい。
本発明において、「コラーゲンの部分ペプチド」とは、コラーゲンをコードするｃＤＮＡの２０％以上（例えば２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをいう。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改変したものや、非コラーゲンアミノ酸配列を付加したものも含む。【００２８】
本発明において「コラーゲン発現量の少ない哺乳動物細胞」とは、１×１０6細胞／ｍＬで培養した場合に５０ｎｇ／ｍＬ以下のコラーゲン生産量である細胞のことをいい、より好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞を好適に挙げることができる。本発明において「高発現」とは、１０μｇ／ｍＬ以上のコラーゲン発現、好ましくは５０μｇ／ｍＬ以上のコラーゲン発現をいう。【００２９】
本発明において「外来遺伝子を高発現することの可能なベクター」とは、例えば該ベクターに含まれる哺乳動物細胞における薬剤選択マーカー遺伝子の働きが微弱であるため哺乳動物細胞染色体上の転写の盛んな領域に選択的に挿入されることを特徴とするベクターであることをいい、好ましくはｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクターを挙げることができる。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクターは特開平１０−１７９１６９号公報に公知である。本発明において、培養方法は浮遊、付着培養いずれでもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクターの調製
ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡベクターは公知の方法（特開平１０−１７９１６９号公報）により調製したものを使用した。【００３１】
〔実施例２〕コラーゲン発現ベクターの作製（１）：ヒトI型α１鎖ｃＤＮＡの単離
ヒトI型α１鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされ、その塩基配列が報告されている（ＥＭＢＬ遺伝子データベース登録名NM 000088）。その配列を配列番号：１に示す。ヒトI型α１ｃＤＮＡはヒト精巣由来ｃＤＮＡよりポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法（"PCR Technology", Stockton Press 発行 (1989)）により増幅された。すなわち、ヒト精巣由来ｃＤＮＡ（ベクトン・ディッキンソン社）を鋳型として配列番号：２のオリゴヌクレオチド（GCGGCCGCCACCATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG）と配列番号：３のオリゴヌクレオチド（TTCTAGATTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA）をプライマーとして配列番号：１の全長の配列をＰＣＲ法により増幅した。すなわち、市販のＰＣＲ増幅キット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer：タカラバイオ社）を用い、９４℃、５分間の加熱処理後、変性（９４℃、２０秒）、プライマーアニーリング（６０℃、３０秒）、増幅（７２℃、３分３０秒）の３ステップを３５回繰り返し、更に７２℃、７分間の処理をして反応を終了した。以後、本実施例に記載のＰＣＲ反応はすべて同様の反応サイクルにて実施した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＰＣＲ産物クローニングベクター（pT7Blue kits：Novagen社）とライゲーションキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後、ＬＢ寒天培地（ディフコ社）上に出現したアンピシリン耐性の性質を有するコロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡが得られた。このプラスミドＤＮＡより切り出したヒトI型α１鎖コラーゲンをコードするＤＮＡ断片と実施例１で調製した外来遺伝子高発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのＮｏｔ  IとＸｂａ  I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後、ＬＢ寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する１コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡ（ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ１、図１）が得られた。【００３２】
〔実施例３〕コラーゲン発現ベクターの作製（２）：ヒトI型α２鎖ｃＤＮＡの単離
ヒトI型α２鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされその塩基配列が報告されている（ＥＭＢＬ遺伝子データベース登録名NM 000089）。その配列を配列番号：４に示す。ヒトI型α２ｃＤＮＡはヒト肝臓由来ｃＤＮＡよりＰＣＲ法により増幅された。すなわち、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡ（和光純薬工業）を鋳型として配列番号：５のオリゴヌクレオチド（GCGGCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGA）と配列番号：６のオリゴヌクレオチド（ACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAAT）をプライマーとして配列番号：４の全長の配列をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＰＣＲ産物クローニングベクター（pT7Blue kits：Novagen社）とライゲーションキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後、ＬＢ寒天培地（ディフコ社）上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する４コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡが得られた。このプラスミドＤＮＡより切り出したヒトI型α２鎖コラーゲンをコードするＤＮＡ断片と外来遺伝子高発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのＮｏｔ  IとＸｂａ  I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後ＬＢ寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する１コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡ（ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ２、図２）が得られた。【００３３】
〔実施例４〕コラーゲン発現ベクターの作製（３）：ヒトII型α１鎖ｃＤＮＡの単離
ヒトII型α１鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされその塩基配列が報告されている（ＥＭＢＬ遺伝子データベース登録名NM 001844.1）。その配列を配列番号：７に示す。ヒトII型α１ｃＤＮＡはヒト精巣由来ｃＤＮＡよりＰＣＲ法により増幅された。すなわち、ヒト精巣由来ｃＤＮＡ（ベクトン・ディッキンソン社）を鋳型として配列番号：８のオリゴヌクレオチド（GGCCCCGCGGTGAGCCATGATTCGCCTCG）と配列番号：９のオリゴヌクレオチド（TCTAGATTACAAGAAGCAGACCGGCCCTAT）をプライマーとして配列番号：７の全長の配列をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＰＣＲ産物クローニングベクター（pT7Blue kits：Novagen社）とライゲーションキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後、ＬＢ寒天培地（ディフコ社）上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する４コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡが得られた。このプラスミドＤＮＡより切り出したヒトII型α１鎖コラーゲンをコードするＤＮＡ断片と外来遺伝子高発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのＮｏｔ  IとＸｂａ  I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後ＬＢ寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する１コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡ（ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIａ１、図３）が得られた。【００３４】
〔実施例５〕コラーゲン発現ベクターの作製（４）：ヒトIII型α１鎖ｃＤＮＡの単離
ヒトIII型α１鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされその塩基配列が報告されている（ＥＭＢＬ遺伝子データベース登録名X14420）。その配列を配列番号：１０に示す。ヒトIII型α１ｃＤＮＡはヒト肝臓由来ｃＤＮＡよりＰＣＲ法により増幅された。すなわち、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡ（和光純薬工業）を鋳型として配列番号：１１のオリゴヌクレオチド（GCGGCCGCCACCATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGGA）と配列番号：１２のオリゴヌクレオチド（TCTAGATTATAAAAAGCAAACAGGGCCAAC）をプライマーとして配列番号：１０の全長の配列をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＰＣＲ産物クローニングベクター（pT7Blue kits：Novagen社）とライゲーションキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後、ＬＢ寒天培地（ディフコ社）上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する４コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡが得られた。このプラスミドＤＮＡより切り出したヒトIII型α１鎖コラーゲンをコードするＤＮＡ断片と外来遺伝子高発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのＮｏｔ  IとＸｂａ  I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌ＸＬ−I  Ｂｌｕｅ株に連結されたＤＮＡを導入後ＬＢ寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する１コロニーを培養することによりプラスミドＤＮＡ（ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIIａ１、図４）が得られた。【００３５】
〔実施例６〕ヒトI型コラーゲンの生産：発現ベクターｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ１とｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ２によるヒトI型コラーゲンの遺伝子導入とG418耐性初期クローンの確立
実施例２および３で得られたｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ１とｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ２の各々１μｇをリポフェクチン法（キアゲン社製エフェクテントランスフェクション試薬）を用いて、２５ｃｍ2の培養フラスコ中の１５０万個のＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株；Dr.Gail Urlaubから譲受）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。４８時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後、５０万個の細胞を１００ｍＬの０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium培地にて希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート１０枚（９６０ウェル）中に播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、１９７ウェル中の生存細胞を１ｍＬの０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium培地とともに２４ウェルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後ＰＢＳ（インビトロジェン社）１ｍＬを各ウェルに加え再び培養上清を廃棄した。これに０．５ｍＬのＣＨＯ細胞用ＣＤ培地ＰｒｏＣＨＯ４（タカラバイオ社）を加えて５％炭酸ガス存在下で３７℃、９６時間培養した。続いて培養上清中のヒトI型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
【００３６】
〔実施例７〕ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ１とｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIａ２形質導入細胞クローンによるヒトI型コラーゲンの生産量の検定
生産量の検定はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の１２．５μＬと等量のトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学）を混合し、９５℃、５分間の熱処理を行なった。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社）に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社）で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒトI型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照としては、１２．５〜１００μｇ／ｍＬの濃度のヒトI型コラーゲン（コスモバイオ社）を同様に処理して用いた。【００３７】
〔実施例８〕ヒトI型コラーゲンの生産
Ｇ４１８耐性細胞株のうち、ヒトI型コラーゲン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた。ヒトI型コラーゲンの産生レベルは、培地当たり８５μｇ／ｍＬ（４日間）であった。【００３８】
〔実施例９〕培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
遺伝子増幅により得られたヒトI型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液IＳ  ＣＨＯ−ＣＤ（アイエスジャパン社）を用いて２５ｃｍ2培養フラスコ中で１×１０6個／ｍＬになるように調製した。これを５％炭酸ガス存在下に３７℃で９６時間培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の１２．５μＬと等量のトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学社）を混合し、９５℃、５分間の熱処理を行なった。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社）で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒトI型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、１００μｇ／ｍＬの濃度のヒトI型コラーゲンを同様に処理して用いた。図５にヒトI型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒトI型コラーゲンα１鎖と考えられる１５０ｋＤａ、１７０ｋＤａの位置のポリペプチドおよび組換えヒトI型コラーゲンα２鎖と考えられる１３０ｋＤａ、１５０ｋＤａの位置のポリペプチドが検出された。【００３９】
〔実施例１０〕培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンのペプシンによる分解とＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
ヒトI型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のペプシン分解は９９．７％酢酸を培養上清に最終濃度０．５Ｍになるように加え、これにペプシン（シグマ社）を最終濃度２４ユニット／ｍＬとなるように添加した後２０℃、２時間で実施した。以下のペプシン分解は同様にして実施した。ペプシンによる分解によって得られたサンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては１８５μｇ／ｍＬの市販の組換えヒトI型コラーゲン（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。図６にペプシンによる分解産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンは市販のヒトI型アテロコラーゲンと同様にα１鎖と考えられる１３０ｋＤａの位置のポリペプチドおよびα２鎖と考えられる１２０ｋＤａの位置のポリペプチドとして検出された。このことはヒトI型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒトI型コラーゲンが含まれていることを示していた。【００４０】
〔実施例１１〕培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンのウエスタンブロッティングによる分析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒトI型コラーゲンをＰＶＤＦメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後、２μｇ／ｍＬの濃度の抗ヒトI型コラーゲンα１鎖抗体とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヤギIｇＧ抗体を反応させた。反応した抗体はＨＲＰの活性を検出する方法でＴＭＢペルオキシダーゼ試薬（フナコシ社）を用いて行なった。比較対照としては、５０μｇ／ｍＬの組換えヒトI型コラーゲン（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。ヒトI型コラーゲンα２鎖の検出は抗ヒトI型コラーゲンα１鎖抗体のかわりに抗ヒトI型コラーゲンα２鎖抗体を用いて実施した。比較対照としては、１０μｇ／ｍＬのヒトI型コラーゲンを用いた。図７にウエスタンブロッティングによる分析結果を示す。培養上清中に抗ヒトI型コラーゲンα１鎖抗体が結合できる組換えヒトI型コラーゲンα１鎖と考えられる１７０ｋＤａの位置のポリペプチドおよび抗ヒトI型コラーゲンα２鎖抗体が結合できる組換えヒトI型コラーゲンα２鎖と考えられる１３０ｋＤａ、１５０ｋＤａの位置のポリペプチドが検出された。【００４１】
〔実施例１２〕培養上清中のヒトI型コラーゲンの精製
ヒトI型コラーゲンを含む培養上清１００ｍＬを用いて以下の様に精製を行った。
遠心濃縮フィルター（VIVASPIN20(MWCO10,000：ザルトリウス社)にて４℃で３,０００ｒｐｍの遠心分離により０．４５μｍのメンブランフィルター（ミリポア社）でろ過した１００ｍＬの培養上清を３０ｍＬに濃縮した。
４℃で３０ｍＬの９０％硫酸アンモニウム溶液を上記濃縮培養上清中に攪拌しながら徐々に加えて塩析し、全ての硫酸アンモニウムを加えてから1時間攪拌した。その後、氷中にて1時間静置した後、高速冷却遠心器にて４℃で１８,０００ｒｐｍ×３０分間遠心分離を行った。塩析によって不溶化した溶液中のコラーゲンは溶液上に浮くのでそれを回収し、５ｍＬのＤ−ＰＢＳ（シグマ社）で完全に溶解させた。これを０．４５μｍのメンブランフィルター（ミリポア社）でろ過した後にＤ−ＰＢＳで平衡化したSuperose 6（アマシャムバイオサイエンス社）を用いたゲルろ過により精製し、最初に出現するピークを分取した。集めたピークのフラクションをVIVASPIN6(MWCO100,000)で約２０倍に濃縮し、濃縮したコラーゲン溶液にＤ−ＰＢＳを適量加えてさらに濃縮し、低分子フラグメントを除去した。このＤ−ＰＢＳを加える操作を少なくとも３回以上行った。
元の培養上清１００ｍＬにつき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約３００μＬになるように濃縮したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動して精製度の確認を行った。【００４２】
〔実施例１３〕ヒトII型コラーゲンの生産試験：発現ベクターｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIａ１によるヒトII型コラーゲンの遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立
１μｇのｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIａ１を２５ｃｍ2の培養フラスコ中の１５０万個のＣＨＯ細胞ＤＧ４４株にリポフェクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。４８時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後５０万個の細胞を１００ｍＬの０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium培地にて希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート１０枚（９６０ウェル）中に播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、１２６ウェル中の生存細胞を１ｍＬの０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium培地とともに２４ウェルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後ＰＢＳ（インビトロジェン社製）１ｍＬを各ウェルに加え再び培養上清を廃棄した。これに０．５ｍＬのＣＨＯ細胞用無血清培地細胞用ＣＤ培地ＰｒｏＣＨＯ４（タカラバイオ社）を加えて５％炭酸ガス存在下で３７℃、９６時間培養した。続いて培養上清中のヒトII型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
【００４３】
〔実施例１４〕ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIａ１形質導入細胞クローンによるヒトII型コラーゲンの生産量の検定
生産量の検定はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の７．５μＬと等量のトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学社）を混合し、９５℃、５分間の熱処理を行なった。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社）に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社）で処理する事によりポリアクリルアミドゲル中のヒトII型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照としては、１２．５〜１００μｇ／ｍＬの濃度のヒトII型コラーゲン（コスモバイオ社）を同様に処理して用いた。【００４４】
〔実施例１５〕Ｇ４１８耐性細胞株の遺伝子増幅
Ｇ４１８耐性細胞株のうち、ヒトII型コラーゲン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた後に、ＭＴＸによる遺伝子増幅を行った。始めに５ｎＭのＭＴＸを含む培地で１週間、２５ｎＭのＭＴＸを含む培地で１週間、５０ｎＭのＭＴＸを含む培地で１週間、２５０ｎＭのＭＴＸを含む培地で３週間、１μＭのＭＴＸを含む培地でさらに３週間増幅させたところ、２５ｎＭのＭＴＸの時点でヒトII型コラーゲンの産生レベルは培地当たり７０μｇ／ｍＬ（４日間）に上昇した。遺伝子増幅に用いるＭＴＸ濃度は一般に１０ｎＭ〜１０μＭの間の多段階とされ、最終濃度としては１０μＭがよく用いられるが、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の樹立には問題がある。このため低濃度ＭＴＸで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本実験では１μＭまでとした。また通常セレクションを含めたＭＴＸ暴露期間は６〜１２ヶ月とされるのに対して、本実験では約９週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず有効なヒトII型コラーゲンの産生量増加がみられた。以下のＧ４１８耐性細胞株の遺伝子増幅も同様にして実施した。【００４５】
〔実施例１６〕培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
遺伝子増幅により得られたヒトII型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液IＳ  ＣＨＯ−ＣＤ（アイエスジャパン社）を用いて２５ｃｍ2培養フラスコ中で１×１０6個／ｍＬになるように調製した。これを５％炭酸ガス存在下に３７℃で９６時間培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の７．５μＬと等量のトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学）を混合し、９５℃、５分間の熱処理を行なった。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社）で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒトII型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、１００μｇ／ｍＬの濃度のヒトII型コラーゲン（コスモバイオ社）を同様に処理して用いた。図８にヒトII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒトII型コラーゲンと考えられる１７０ｋＤａ、２００ｋＤａの位置のポリペプチドが検出された。【００４６】
〔実施例１７〕培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのウエスタンブロッティングによる分析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒトII型コラーゲンをＰＶＤＦメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後１μｇ／ｍＬの濃度の抗ヒトII型コラーゲン鎖抗体（コスモバイオ社）とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギIｇＧ抗体を反応させた。反応した抗体はＨＲＰの活性を検出する方法でＴＭＢペルオキシダーゼ試薬（フナコシ社）を用いて行なった。比較対照としては、１０μｇ／ｍＬのヒトII型コラーゲン（コスモバイオ社）を用いた。培養上清中に抗ヒトII型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒトII型コラーゲンと考えられる１７０ｋＤａのポリペプチドが検出された（図９）。【００４７】
〔実施例１８〕培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンのペプシンによる分解とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびウエスタンブロッティングによる分析
ペプシンによる分解によって得られたサンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては、１００μｇ／ｍＬのヒトII型コラーゲン（コスモバイオ社）を用いた。図１０にペプシンによる分解産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンは市販のヒトII型アテロコラーゲンと同様に１３０ｋＤａのポリペプチドとして検出された。このことはヒトII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には実質的に天然型と同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒトII型コラーゲンが含まれていることを示していた。ウエスタンブロッティングによる分析においても同様の結果が得られた（図１１）。【００４８】
〔実施例１９〕ヒトIII型コラーゲンの生産試験。発現ベクターｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIIａ１によるヒトIII型コラーゲンの遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立
１μｇのｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIIａ１を用いて２５ｃｍ2の培養フラスコ中の１５０万個のＣＨＯ細胞ＤＧ４４株にリポフェクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。４８時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後３０万個の細胞を１００ｍＬの０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium培地にて希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート１０枚（９６０ウェル）中に播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養したところ、１１７ウェルにのみ細胞の生存が見られた（Ｇ４１８耐性株）。生存細胞を１ｍＬの０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium培地とともに２４ウェルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後ＰＢＳ（インビトロジェン社）１ｍＬを各ウェルに加え再び培養上清を廃棄した。これに０．５ｍＬのＣＨＯ細胞用無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  II（インビトロジェン社）を加えて５％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間培養した。続いて培養上清中のヒトIII型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
【００４９】
〔実施例２０〕ｐＮＯＷ−ｈＣｏｌIIIａ１形質導入細胞クローンによるヒトIII型コラーゲンの生産量の検定
生産量の検定はドットブロット法にて実施した。ナイロンメンブレン上に７２時間培養上清１μＬと市販のヒトIII型コラーゲン（ベクトン・ディッキンソン社）のＣＨＯ細胞用無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  IIによる２倍希釈系列（０．１２５〜８μｇ／ｍＬ）とＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  IIそれぞれ１μＬをドットし、１時間の風乾、ブロックエースによるブロッキングの後１μｇ／ｍＬの濃度の抗ヒトIII型コラーゲン抗体（コスモバイオ社）とそれに引き続いてＨＲＰ標識抗ウサギIｇＧ抗体を反応させた。反応した抗体はスーパーシグナルウエストピコ試薬にてＨＲＰの活性を検出する方法でルミノキャプチャーを用いて行なった。【００５０】
〔実施例２１〕Ｇ４１８耐性細胞株の遺伝子増幅
Ｇ４１８耐性細胞株のうち、ヒトIII型コラーゲン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた後に、ＭＴＸによる遺伝子増幅を行った。始めに１５ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間、６０ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間、２５０ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間、１μＭのＭＴＸを含む培地でさらに４週間増幅させたところ、ヒトIII型コラーゲンの産生レベルは培地当たり２２５μｇ／ｍＬ（３日間）に上昇した。【００５１】
〔実施例２２〕培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
遺伝子増幅により得られたヒトIII型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液IＳ  ＣＨＯ−ＣＤ（アイエスジャパン社）を用いて２５ｃｍ2培養フラスコ中で１×１０6個／ｍＬになるように調製した。これを５％炭酸ガス存在下に３７℃で９６時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の６μＬと等量のトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学社）を混合し、９５℃、５分間の熱処理を行なった。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社）で処理する事によりポリアクリルアミドゲル中のヒトIII型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、１００μｇ／ｍＬの濃度のヒトIII型コラーゲン（ベクトン・ディッキンソン社）を同様に処理して用いた。図１２にヒトIII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒトIII型コラーゲンと考えられる１４０ｋＤａ、１７０ｋＤａの位置のポリペプチドが検出された。【００５２】
〔実施例２３〕培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲンのウエスタンブロッティングによる分析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒトIII型コラーゲンをＰＶＤＦメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後１μｇ／ｍＬの濃度の抗ヒトIII型コラーゲン鎖抗体（コスモバイオ社）とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギIｇＧ抗体を反応させた。反応した抗体はＨＲＰの活性を検出する方法でＴＭＢペルオキシダーゼ試薬（フナコシ社）を用いて行なった。比較対照としては、１００μｇ／ｍＬのヒトIII型コラーゲン（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。培養上清中に抗ヒトIII型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒトIII型コラーゲンと考えられる１４０ｋＤａ、１７０ｋＤａの位置のポリペプチドが検出された（図１３）。
ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲンは市販のヒトIII型アテロコラーゲン（ベクトン・ディッキンソン社）と同様に１３０ｋＤａの位置のポリペプチドとして検出された。このことはヒトIII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒトIII型コラーゲンが含まれていることを示していた。【００５３】
〔実施例２４〕培養上清中のヒトI型およびIII型コラーゲンの精製
ヒトI型またはIII型コラーゲンを含む培養上清１００ｍＬを用いて実施例１２と同様に操作して精製を行った。元の培養上清１００ｍＬにつき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約３００μＬになるように濃縮したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動して精製度の確認を行った（図１４）。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高水準かつ天然型により近い組換えヒト・コラーゲンの生産を可能にする発現ベクターおよびヒト・コラーゲン生産細胞を提供することができる。また、ヘテロトリマーのヒト・コラーゲン生産細胞を提供することもできる。【００５５】
本発明の製造方法は、コラーゲンのみならず、3重螺旋構造を持つコレクチン等のタンパク質にも適用することが可能である。
さらに、本発明のコラーゲンの製造方法において、種類の異なるα鎖を同時に発現させることで、天然では本来製造されることのない（これまでに発見されていない）新規な分子構成の3重螺旋構造を持つコラーゲンを大量に製造できる可能性がある。これらの新規な分子構成の3重螺旋構造を持つコラーゲンは、既知のコラーゲンとは異なった性質を持っていることが考えられ、新規の材料としての応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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