(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺細菌感染を減少または阻害するための組成物であって、
治療上有効量の、ｐＨ４以下のプロトン化した核酸であって、該プロトン化した核酸が、
該核酸の３’及び／または５’位の、ブロッキング化学修飾、
天然に生ずるヌクレオチドポリマーの骨格構造から修飾された核酸骨格構造、
一以上の糖基における、２’または３’置換、
から選択される１以上の修飾によりヌクレアーゼ耐性を有する、核酸と、
賦形剤担体と
を含む組成物。
【請求項２】
前記核酸が、３’−５’ヌクレオシド間結合を含み、糖基の２’残基が置換されており、該置換により、該核酸が、天然に生ずるヌクレオチドＲＮＡもしくはＤＮＡと区別される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸が、２’−５’ヌクレオシド間結合を含み、糖基の３’残基が置換されており、該置換により、該核酸が、天然に生ずるヌクレオチドＲＮＡもしくはＤＮＡと区別される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記核酸が、２〜１００のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸が、部分的に置換されたホスホロチオエート、完全に置換されたホスホロチオエート、ホスホネート、ホスフェートエステル、ホスホルアミデート、２’−修飾ＲＮＡ、３’−修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸、プロピン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸が、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、スルホンヌクレオチド間結合、３’−３’結合、５’−２’結合、５’−５’結合、２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）ホスホジエステル、モルホリノ結合、ｐ−エトキシオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ結合、ｐ−イソプロピルオリゴヌクレオチドから選択される化学的成分により、完全にまたは部分的に誘導化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、プロトン化された核酸ポリマーを含み、１またはそれ以上の外来性プロトンが、核酸の塩基構造上のアミン基と前記ポリマー上のホスホジエステル結合のリン酸基とを含むプロトンアクセプター部位に付加され、前記核酸が、１から６のｐＨで、３７℃で少なくとも１時間のｐＨ安定性により特徴づけられ、前記核酸が抗菌活性を示す、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、プロトン化された核酸モノマーを含み、１またはそれ以上の外来性プロトンが、核酸の塩基構造上のアミン基と前記モノマー上のリン酸基とを含むプロトンアクセプター部位に付加され、前記核酸が、０．０１から７．０のｐＨで、少なくとも１時間のｐＨ安定性により特徴づけられ、前記核酸が抗菌活性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
組成物がリポソームと会合している、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
肺細菌感染を減少させ、または阻害するための使用のための薬学的組成物であって、治療上有効量のプロトン化された核酸ポリマーを含み、該ポリマーが、核酸の塩基構造上のアミン基と前記ポリマー上のホスホジエステル結合のリン酸基とを含むプロトンアクセプター部位に付加された、１またはそれ以上の外来性プロトンを有し、該プロトン化した核酸ポリマーが、
該核酸の３’及び／または５’位の、ブロッキング化学修飾、
天然に生ずるヌクレオチドポリマーの骨格構造から修飾された核酸骨格構造、
糖基における、２’または３’置換、
から選択される１以上の修飾によりヌクレアーゼ耐性を有し、
前記組成物のエアロゾル化粒子を肺組織に沈着させるエアロゾル化投与に適した形態である、組成物。
【請求項１１】
核酸が、前記核酸の３’末端、または５’末端にブロッキング化学的修飾を含み、および核酸が、同じ数のヌクレオチドを有する天然に生ずるポリマーの少なくとも２倍のヌクレアーゼ耐性を有する、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が液体形態であり、および組成物が１ｍｇ／ｍｌで水に溶解したときに０から４以下のｐＨを有する、請求項１０または１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
治療上有効量の第２の治療用薬剤を含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
肺細菌感染を減少させ、または阻害するための使用のための薬学的組成物であって、治療上有効量の、プロトン化された核酸ポリマーを含み、該ポリマーが、核酸の塩基構造上のアミン基と前記ポリマー上のホスホジエステル結合のリン酸基とを含むプロトンアクセプター部位に付加された、１またはそれ以上の外来性プロトンを有し、該プロトン化した核酸ポリマーが、
該核酸の３’及び／または５’位の、ブロッキング化学修飾、
天然に生ずるヌクレオチドポリマーの骨格構造から修飾された核酸骨格構造、
糖基における、２’または３’置換、
から選択される１以上の修飾によりヌクレアーゼ耐性を有し、
前記核酸が、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、真菌遺伝子、および内因性哺乳動物遺伝子からなる群より選択される、肺疾患を媒介する遺伝子の発現に影響を与え、
前記修飾された核酸が、哺乳動物被検体において遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
前記組成物のエアロゾル化された粒子を肺組織に沈着させるエアロゾル化投与に適した形態である、組成物。
【請求項１５】
肺疾患を媒介する遺伝子が内因性哺乳動物遺伝子であり、および修飾された核酸が哺乳動物被験体において遺伝子の発現を抑制する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記核酸が、天然に生ずるヌクレオチドポリマーの骨格構造から修飾された骨格構造を含み、前記核酸が、水中で、１ｍｇ／ｌの濃度において、ｐＨ０から４を示す範囲でプロトン化しており、前記核酸が、１から４のｐＨで、少なくとも１時間のｐＨ安定性により特徴づけられる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物がエアロゾル化されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が患者の肺に吸入され、エアロゾル化された組成物の粒子が、肺組織に沈着される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記エアロゾル化された組成物の粒子が、１〜５μｍの範囲の直径を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸が、糖基の残基における修飾と、該核酸の３’末端におけるブロッキング化学修飾とを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が固体の形態であり、前記組成物が１ｍｇ／ｌの濃度で水に溶解したときに０から４以下のｐＨを有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記核酸が、３’−５’ヌクレオシド間結合を含み、糖基の２’残基が置換されており、該置換により、該核酸が、天然に生ずるヌクレオチドＲＮＡもしくはＤＮＡと区別される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記核酸が、２’−５’ヌクレオシド間結合を含み、糖基の３’残基が置換されており、該置換により、該核酸が、天然に生ずるヌクレオチドＲＮＡもしくはＤＮＡと区別される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸が、２〜１００のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸が、部分的に置換されたホスホロチオエート、完全に置換されたホスホロチオエート、ホスホネート、ホスフェートエステル、ホスホルアミデート、２’−修飾ＲＮＡ、３’−修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸、プロピン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記核酸が、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、スルホンヌクレオチド間結合、３’−３’結合、５’−２’結合、５’−５’結合、２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）ホスホジエステル、モルホリノ結合、ｐ−エトキシオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ結合、ｐ−イソプロピルオリゴヌクレオチドから選択される化学的成分により、完全にまたは部分的に誘導化されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、天然に生ずるヌクレオチドモノマーの構造から修飾された構造と、核酸の塩基構造上のアミン基と、前記モノマー上のリン酸基とを含むプロトンアクセプター部位に付加された１またはそれ以上の外来性プロトンとを有するモノマーを含み、核酸が、０．０１から４のｐＨで、少なくとも１時間のｐＨ安定性により特徴づけられ、前記核酸が抗菌活性を示す、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２８】
モノマーの５’位のブロッキング化学修飾と、モノマーの３’位のブロッキング化学修飾とをさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記核酸が、１から４のｐＨを有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記核酸が、天然に生ずるＲＮＡもしくはＤＮＡに対して、糖基の２’位に修飾をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記肺疾患が、肺細菌感染である、請求項１４に記載の組成物
【請求項３２】
前記肺細菌感染が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染である、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は，抗生物質の肺輸送に関し，特に呼吸器感染の緩和のための抗生物質の輸送に関する。
【０００２】
発明の背景
細菌呼吸器感染は，米国において，特に免疫防御メカニズムに障害を有する患者の間で主要な健康上の問題である。嚢胞性線維症（ＣＦ），後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ），うっ血性心不全，慢性肺疾患，癌を有する患者，および老齢者はすべて呼吸器感染の高いリスクを有している。例えば，ＣＦ患者における肺の虚弱化は，日和見感染性生物により引き起こされる慢性気管支内感染の結果として産生される化膿性痰の蓄積を伴う。ＣＦに罹患したほとんどすべての患者が，最終的には呼吸不全で死亡する。
【０００３】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは，土，水，植物，および動物（ヒトを含む）に住む小さい好気性グラム陰性杆菌である。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは時々健康な人の皮膚，外耳，上部呼吸管または大腸に住み着き，これらの感染は通常は穏和である。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染は免疫障害患者においてはるかに深刻であり，多くの合併症，例えばＣＦ患者の下部呼吸管の慢性感染症；化学療法誘導性の重症の好中球減少症の後の血液悪性腫瘍を併発する菌血性肺炎；およびＡＩＤＳ，うっ血性心不全，および慢性肺疾患を有する患者における原発性肺炎を引き起こす。
【０００４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは，頑強性，潜在的破壊性，および抗微生物薬剤に対する増加する耐性のため主要な健康上の問題であるブドウ状球菌である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染から生ずる肺炎は，最も一般的には入院中の気管挿管後に生じ，またはウイルス呼吸器感染の後に生ずる。そのような感染は，老齢および／または収容患者の間で非常に一般的である。さらに，Ｓ．ａｕｒｅｕｓの呼吸器感染は，静脈薬剤ユーザーの間で一般的な右側心内膜炎等の状況下における敗血性肺塞栓形成，およびしばしば留置静脈カテーテルの合併症である敗血性血栓静脈炎を引き起こしうる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは，慣用の全身抗生物質では治療することがしばしば困難であるため，免疫障害患者における健康上の問題でもある。
【０００５】
これらのおよび他の肺細菌感染の現在の治療法は，しばしば高価であり，非特異的であり，有効であるためには非常に大量を使用しなければならない。一例においては，ＣＦ患者に見られる慢性気管支炎または気管支拡張に対して現在選択される治療は，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して活性のあるアミノグリコシドおよびβラクタムの腹膜内投与である。しかし，アミノグリコシドの気管支分泌への透過は少なく，ピーク血清濃度のわずか約１２％である（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，３：６７（１９８１））。Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，８：５３（１９９３）に従えば，痰はイオン強度が高く，２価カチオンが存在するため，痰それ自体がアミノグリコシドの生物活性に阻害的である。この阻害活性は，痰中のアミノグリコシドの濃度を特定のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの単離物の最小阻害濃度の１０倍に増加させることにより克服することができる（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，Ｉ４８：１０６９（１９８３））が，これは全身毒性，例えば耳毒性および腎毒性のリスクを増加させる。静脈内治療は，患者の辛苦を増加させるかもしれず，しばしば入院が必要である。これは治療コストを増加させ，患者を他の潜在的感染に暴露する。
【０００６】
ＣＦの治療にエアロゾル化抗生物質を用いる最初の研究の１つは，Ｌａｎｃｅｔ，２２：１３７７−９（１９８１）に報告された。２０人のＣＦ患者における制御された二重盲検実験は，カルベニシリンおよびゲンタマイシンのエアロゾル投与により，ＣＦ患者の健康状態を改善することができることを示した。残念ながら，多くの抗生物質，例えばアミノグリコシドの物理学的性質のため，薬剤のエアロゾル化には比較的高い用量の薬剤が必要であり，したがってそのような治療はかなり高価になる。
【０００７】
当該技術分野においては，細菌呼吸器感染，特に免疫に障害を有する患者における呼吸器感染のための，費用効率がよくかつ治療上有効な処置が必要とされている。また，抗生物質薬剤を呼吸管の感染部位に特異的に導入する有効な方法が必要とされている。
【０００８】
発明の概要
本発明は，プロトン化／酸性化核酸を肺に投与することにより細菌呼吸器感染を治療する方法を提供する。これらの修飾された核酸は，細菌の種類にかかわらず殺菌性および／または静菌性薬剤として有効であり，したがって，診断が困難である場合または多数の感染性生物が存在する場合に，特に有用である。本発明の核酸の抗生物質活性は，核酸の特定の配列または核酸分子の長さのいずれにも依存しない。本発明の核酸は，プロトン化／酸性化されており，水に溶解したときに，ｐＨ７未満から約１，より好ましくはｐＨ４．５未満から約１，さらにより好ましくはｐＨ２未満から約１のｐＨを与える。エアロゾル化プロトン化／酸性化核酸の処方は，好ましくはエアロゾル化され，手で支える自給式のディスポーザブルユニットにより投与される。
【０００９】
本発明の核酸は，ヌクレアーゼ耐性骨格，酸耐性骨格，および好ましい態様においては，酸耐性およびヌクレアーゼ耐性骨格の両方を有することができる。
【００１０】
治療の好ましい方法は，プロトン化／酸性化核酸を，細菌成長を阻害または防止して細菌成長を緩和させるのに十分な量で，または細菌感染を治療するのに有効な量で，動物，特にヒトの気管支管にエアロゾル化輸送することを含む。
【００１１】
別の態様においては，本発明は，プロトン化／酸性化核酸を肺輸送して，ウイルス感染，炎症性疾患，癌，真菌感染等が関与する原発性呼吸器疾患を治療または予防することを提供する。ここで，これらの疾患の治療を標的とする核酸は，細菌感染を同時に治療または予防するために，さらにプロトン化されている。好ましくは，この態様の核酸は，原発性呼吸器疾患に関与することが知られている遺伝子，例えば，ウイルス構造蛋白質をコードする遺伝子または癌に関与する内因性遺伝子，例えばオンコジンの発現を制御する。
【００１２】
投与する核酸の用量は，多くの因子，例えば，患者の吸息速度，感染領域の位置（すなわち，上部または下部呼吸管），感染の程度，および感染に関与する特定の細菌の種により様々である。感染領域のよりよい治療のためには，調剤を肺の特定の部位にターゲティングすることがしばしば好ましい。例えば，肺炎を治療するために下部呼吸管に粒子を沈着させるためには，エアロゾル化処方を肺中に深く進ませることが望ましい。粒子の輸送は，部分的には，粒子サイズを調節することにより制御することができる。粒子サイズを調節することに加えて，プロトン化／酸性化核酸の輸送は，患者の呼吸サイクルの所望の時点でエアロゾル化用量を放出することによって得ることができる。
【００１３】
別の目的は，プロトン化／酸性化オリゴヌクレオチド処方を患者に投与する方法を提供することであり，ここで，処方は，同じ測定吸息流速（０．１−２．０リットル／秒の範囲）で，別々に決定された吸息容量（０．１５−１．５リットルの範囲）で，反復して患者に輸送される。好ましくは，オリゴヌクレオチドは２−１００核酸の長さである。
【００１４】
別の目的は，プロトン化／酸性化核酸モノマー処方を患者に投与する方法を提供することであり，ここで，処方は，同じ測定吸息流速（０．１−２．０リットル／秒の範囲）および別々に決定した吸息容量（０．１５−１．５リットルの範囲）で，患者に繰り返し輸送される。
【００１５】
本発明の目的は，病原性細菌により引き起こされる呼吸器疾患を治療するためにプロトン化／酸性化核酸を使用することである。
【００１６】
本発明の別の目的は，非細菌性病原体，例えば，ウイルス感染および真菌感染により引き起こされる呼吸器疾患を治療し，同時に二次細菌感染を治療および／または予防するために，プロトン化／酸性化核酸を使用することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は，プロトン化／酸性化核酸を投与して免疫応答を抑制し，同時に二次細菌感染を治療および／または予防することにより，肺免疫応答活性を治療することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は，プロトン化／酸性化核酸を投与して発癌，転移，および／または脱分化を抑制し，同時に二次細菌感染を治療および／または予防することにより，肺新生物を治療することである。
【００１９】
本発明の利点は，プロトン化／酸性化核酸の作用のメカニズムが比較的非特異的であるように見え，このため，任意の細菌，例えば臨床的に関連性の深い病原性細菌に対して有効である点にある。
【００２０】
本発明の別の利点は，プロトン化／酸性化核酸が修飾核酸で治療する被検体に対して無毒性であることである。
【００２１】
本発明の別の利点は，修飾核酸で治療する被検体が，核酸からの望まない副作用を事実上示さないことである。
【００２２】
プロトン化／酸性化核酸の抗菌効力が，長さにも配列にも依存しないことが，さらなる利点である。
【００２３】
本発明のこれらのおよび他の目的，利点および特徴は，以下により完全に記載される核酸およびその用途の詳細を読めば，当業者には明らかとなるであろう。
【００２４】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の肺輸送の方法を説明する前に，本発明は，記載される特定の方法に限定されるものではなく，したがってもちろん様々でありうることが理解されるべきである。また，本明細書において用いられる用語は，特定の態様を記載する目的のためのみであり，限定を意図するものではないことが理解されるべきである。これは，本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。
【００２５】
特に記載しないかぎり，本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は，本発明の属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては，本明細書に記載されるものと類似または同等である任意の方法および材料を用いることができるが，ここでは好ましい方法および材料を記載する。本明細書において言及されるすべての刊行物は，刊行物が引用されるものに関連した方法および／または材料を開示および記載するために，本明細書の一部としてここに引用する。
【００２６】
本明細書において議論される刊行物は，もっぱら本出願の出願日前の開示のために提供される。ここに記載されるいずれのものも，本発明が先の発明によってそのような刊行物に先立つ権利がないと認めるものと解釈すべきではない。さらに，提供される刊行物の日付は実際の発行日とは異なるかもしれず，これは別途確認する必要があるかもしれない。
【００２７】
定義
"処方"との用語は，室温で流動性の液体であり，薬学的に活性な量の本発明のプロトン化／酸性化核酸を含む任意の単一の液体，混合物，溶液，懸濁液などを記述するために用いられる。処方は，処方をエアロゾル化して粒子（直径０．１−１０ミクロン）とし，患者の肺に吸入するときに，好ましくは肺の標的部分に到達するように，好ましくは，さらに担体からなり，より好ましくは，生理学的特性（例えば粘度）を有する液体である。担体は任意の薬学的に許容しうる材料であることができ，好ましくは活性薬剤と適合性の流動性液体である。処方は，好ましくは溶液，例えば水性溶液，エタノール性溶液，水性／エタノール性溶液，食塩水溶液，コロイド懸濁液および微小結晶懸濁液である。"処方"との用語はさらに，プロトン化／酸性化核酸，および好ましくはオリゴヌクレオチドまたはモノマーの乾燥粉末をさらに含みうる。
【００２８】
"担体"との用語は，処方の実質的に不活性な（生物学的に）成分，例えばプロトン化／酸性化核酸をそれと混合，またはそれに懸濁または溶解する，薬学的に許容しうる賦形剤物質を意味する。担体は，好ましくは流動性液体である。有用な担体は，核酸と有害なように相互作用せず，担体および活性成分を含む処方をエアロゾル化したときに，エアロゾル化粒子，好ましくは０．１−１０．０μｍ（より好ましくは１−５μｍ）の範囲の直径を有する粒子の形成を可能とする特性を有する。担体には，水，エタノール，食塩水溶液およびそれらの混合物が含まれ，純水が好ましい。適切なエアロゾルを形成するよう処方することができ，活性成分またはヒト肺組織または鼻腔経路に有害な影響を与えないかぎり，他の担体を用いることができる。
【００２９】
"エアロゾル"との用語は，処方の粒子を意味し，ここで，粒子は０．１−１０ミクロン，好ましくは１−５μｍの範囲の直径を有し，好ましくは処方の総容量は５μｌから１０，０００μｌである。約１−３ミクロンの直径を有する約１０μｌの粒子が，約５０ｍｌ−２リットル，好ましくは１００ｍｌ−１，０００ｍｌの容量中に存在する。
【００３０】
"空気"，"無粒子空気"，"無エアロゾル空気"等は，本明細書において互換的に用いられ，実質的に他の物質を含まず，特に，意図的に加えられる粒子，例えばエアロゾルを生成する処方の粒子を含まない，ある容量の空気を記述する。この用語は，空気が意図的に加えられた処方の粒子を含まないことを意味し，通常の周囲空気が濾過されるかまたはすべての粒子を除去するよう処置されていることを暗示することを意図するものではない。ただし，濾過を行ってもよい。空気は薬剤輸送において用いるために好ましい気体であるが，他の非毒性気体，例えば，ＣＯ2も用いることができることに注意すべきである。
【００３１】
"粒子"，"エアロゾル化粒子"および"エアロゾル化粒子処方の"との用語は，本明細書において互換的に用いられ，本発明のプロトン化／酸性化核酸からなる処方の粒子を意味する。これらのいずれも，担体（例えば薬学的に活性な呼吸器薬剤および担体）とともに処方される。粒子は，粒子を形成したときに，患者が患者の肺内に粒子を吸入することができるように，粒子が十分な時間空気中に懸濁されているように，十分に小さいサイズを有する。粒子は，０．１μｍから約５０μｍ，好ましくは０．５から１０μｍの範囲のサイズを有する。粒子の直径は，空力学的直径である。
【００３２】
"実質的に乾燥した"との用語は，容器中またはエアロゾルの粒子中で，総重量に基づいて１０％以下の遊離水，エタノールまたは他の液体担体を含み，好ましくは検出可能な遊離液体担体を含まないプロトン化／酸性化核酸を意味する。
【００３３】
"投与量ユニット"との用語は，核酸をこれを必要とする患者に肺内投与経路により投与することを意味し，１５分間またはそれ以下，好ましくは１０分間またはそれ以下，より好ましくは５分間またはそれ以下の時間の間に，投薬装置から（１またはそれ以上の容器から）処方が１回またはそれ以上放出されることを包含する。その時間の間に，１またはそれ以上の吸入が患者によりなされ，１またはそれ以上の用量の核酸が放出され吸入される。
【００３４】
"核酸"および"核酸分子"との用語は，本明細書において互換的に用いられ，ヌクレオチド，すなわち，リボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオチドまたはその両方からなる分子を表す。この用語は，リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み，ポリマーの場合には，リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは５’−３’結合により連結されている。しかし，結合は，核酸合成の技術分野において知られる結合の任意のものを含み，例えば，５’−２’結合を含む核酸が含まれる。核酸分子において用いられるヌクレオチドは，天然に生ずるものであってもよく，または天然に生ずる塩基対と塩基対形成関係を形成しうる，合成で製造される類似体であってもよい。塩基対形成関係を形成しうる天然に生じない塩基の例には，限定されないが，アザおよびデアザピリミジン類似体，アザおよびデアザプリン類似体，およびプリンおよびピリミジン環の炭素および窒素原子の１またはそれ以上が，複素原子，例えば酸素，イオウ，セレニウム，リン等により置換されている他の複素環塩基類似体が含まれる。
【００３５】
本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチド"との用語は，約２−約１００ヌクレオチド，より好ましくは２−８０ヌクレオチド，さらにより好ましくは約４−約３５ヌクレオチドを含む核酸分子を表す。
【００３６】
本明細書において用いる場合，"モノマー"との用語は，単一のヌクレオチドからなる核酸分子およびその誘導体を意味する。
【００３７】
本明細書において用いる場合，"修飾オリゴヌクレオチド"，"修飾モノマー"，"修飾核酸分子"との用語は，核酸塩基，糖部分，ヌクレオシド間ホスフェート結合の全てまたはいずれかの天然の分子構造の分子レベルで，１またはそれ以上の化学的修飾を，ならびに追加の置換基，例えばジアミン，コレステリルまたは他の親油性基を有する分子，またはこれらの部位における修飾の組み合わせを有する核酸を表す。ヌクレオシド間ホスフェート結合は，ホスホジエステル，ホスホトリエステル，ホスホルアミダイト，シロキサン，カーボネート，カルボキシメチルエステル，アセトアミデート，カルバメート，チオエーテル，架橋ホスホルアミデート，架橋メチレンホスホネート，ホスホロチオエート，メチルホスホネート，ホスホロジチオエート，架橋ホスホロチオエートおよび／またはスルホンヌクレオチド間結合，または３’−３’，２’−５’，または５’−５’結合，およびそのような類似の結合の組み合わせ（混合骨格修飾オリゴヌクレオチドが生成）でありうる。修飾は，オリゴヌクレオチド分子の内部（単一または反復）または末端にあることができ，ヌクレオシド間ホスフェート結合の分子への付加でありうる。これには，例えばコレステリル，アミノ基と末端リボースとの間に種々の数の炭素残基を有するジアミン化合物，反対側の鎖または付随する酵素または他の蛋白質を切断するかまたはこれと架橋するデオキシリボースおよびホスフェート修飾が含まれる。親電子性基，例えばリボースジアルデヒドは，そのような蛋白質のリシル残基のイプシロンアミノ基と共有結合することができる。親核性基，例えばオリゴマーにつながれたｎ−エチルマレイミドは，ｍＲＮＡの５’末端または他の親電子性部位と共有結合することができる。修飾オリゴヌクレオチドとの用語はまた，糖部分への修飾を含むオリゴヌクレオチド，例えば２’−置換リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含み，これらの任意のものは，５’−３’結合により一緒に連結されている。修飾オリゴヌクレオチドはまた，配列の標的特異性が維持されているＰＮＡまたはモルホリノ修飾骨格からなっていてもよい。
【００３８】
本明細書において用いる場合，"核酸骨格"との用語は，分子中でヌクレオチドを連結する化学成分の構造を表す。この用語は，化学的にヌクレオチドを連結させる任意のおよびすべての手段から形成される構造を含んでいてもよい。本明細書において用いられる場合，修飾骨格とは，ヌクレオチド間の化学的結合への修飾，ならびに安定性および親和性を増強させるために用いることができる他の修飾，例えば糖構造への修飾を含む。例えば，塩基が天然のβ−アノマーに対して反転しているデオキシリボースのα−アノマーを用いることができる。好ましい態様においては，糖基の２’−ＯＨは，２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）に変更することができ，これは親和性を含むことなく分解に対する耐性を与える。
【００３９】
本明細書において互換的に用いられる，"酸性化"および"プロトン化／酸性化"との用語は，プロトン（または水素陽イオン）を核酸のプロトンアクセプター部位に付加するプロセスを表す。プロトンアクセプター部位は，核酸の塩基構造上のアミン基およびホスホジエステル結合のリン酸を含む。ｐＨが低下するにつれて，これらのプロトン化されるアクセプター部位の数が増加し，より高度にプロトン化／酸性化された核酸が得られる。
【００４０】
"プロトン化／酸性化核酸"との用語は，１ｍｌあたり約１６Ａ260の濃度で水に溶解したときに，生理学的ｐＨより低いｐＨ，すなわち，約ｐＨ７より低いｐＨを有する核酸を表す。修飾核酸，ヌクレアーゼ−耐性核酸，およびアンチセンス核酸は，この定義により包含されることを意味する。一般に，核酸は，プロトンを核酸上の反応性部位に付加することによりプロトン化／酸性化するが，核酸のｐＨを低下させる他の修飾もまた用いることができ，この用語に包含されることが意図される。
【００４１】
本明細書において用いる場合，"末端ブロックされた"との用語は，例えばヌクレアーゼの作用による選択されたヌクレオチドの分解を分子レベルで防止する化学的修飾を有する核酸を表す。この化学的修飾は，これが核酸の絶対に必要な部分，例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのコーディング領域を保護するように配置される。末端ブロックは，３’末端ブロックでも５’末端ブロックでもよい。例えば，３’末端ブロックは，分子の最も３’側の位置であってもよく，核酸の絶対に必要な配列の３’側であるかぎり３’末端から内部であってもよい。
【００４２】
"実質的にヌクレアーゼ耐性"との用語は，天然に生ずるまたは未修飾核酸と比較してヌクレアーゼ分解に対して耐性である核酸を表す。本発明の修飾核酸は，その未修飾対応物よりヌクレアーゼ分解に対して少なくとも１．２５倍耐性が高く，より好ましくは少なくとも２倍耐性が高く，さらにより好ましくは少なくとも５倍耐性が高く，最も好ましくは少なくとも１０倍耐性が高い。そのような実質的にヌクレアーゼ耐性の核酸には，限定されないが，骨格修飾，例えばホスホロチオエート，メチルホスホネート，エチルホスホトリエステル，２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート，２’−Ｏ−メチル−ｐ−エトキシリボヌクレオチド，２’−Ｏ−アルキル，２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル），２’−フルオロ，２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド，メチルカルバメート，メチルカーボネート，反転塩基（例えば，反転Ｔ），またはこれらの骨格のキメラ版を有する核酸が含まれる。
【００４３】
本明細書において用いられる場合，"実質的に酸耐性"とは，未修飾核酸と比較して酸分解に対して耐性である核酸を表す。典型的には，核酸の相対的酸耐性は，耐性核酸の分解のパーセントを，その未修飾対応物質（すなわち，"正常な"骨格，塩基，およびホスホジエステル結合を有する対応する核酸）の分解のパーセントと比較することにより測定される。酸耐性である核酸は，好ましくはその非修飾対応物質より，酸分解に対する耐性が少なくとも１．５高く，または少なくとも２倍耐性が高く，さらに好ましくは少なくとも５倍耐性が高く，最も好ましくは少なくとも１０倍耐性が高い。
【００４４】
本明細書において用いる場合，"アルキル"との用語は，１−６個の炭素原子を含む分枝鎖または非分枝鎖の飽和炭化水素鎖，例えばメチル，エチル，プロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，ｎ−ヘキシルなどを表す。
【００４５】
本明細書において用いる場合，"肺疾患に関与する遺伝子"との用語は，その発現が疾患の感染，進行，または悪性化に関与する任意の遺伝子を表す。例えば，肺疾患に関与する遺伝子は，真菌生物Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉの複製に関与する任意の遺伝子でありうる。そのような遺伝子の発現を抑制すると，複製が，したがってこの生物により引き起こされる肺炎の進行が妨害されるであろう。別の例においては，肺疾患に関与する遺伝子は，患者において不完全な，ＣＦ等の遺伝子疾患の原因である遺伝子でありうる。外来的に導入されたヒト型のＣＦＲ遺伝子（ＣＦ患者において不完全な遺伝子）の発現は，機能型のＣＦＲ蛋白質を提供することにより，疾患の症状を緩和することができる。さらに別の例においては，肺疾患に関与する遺伝子は，小細胞癌腫に関与するオンコジンなどの，患者において過剰発現されている内因性ヒト遺伝子でありうる。オンコジンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるオンコジンの発現の抑制は，疾患の進行および／または転移を停止するであろう。
【００４６】
本明細書において用いられる場合，"治療"，"治療する"等の用語は，一般に，所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は，予防的，すなわち疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するか，および／または治療的，すなわち疾患および／または疾患に特徴的な有害な効果を完全にまたは部分的に治癒させることである。本明細書において用いる場合，"治療"との用語は，動物，特にヒトにおける疾患のすべての治療をカバーし，以下のことを含む；
【００４７】
（ａ）疾患の素因を有するがまだ疾患を有すると診断されていない被検体において呼吸器疾患が生ずることを防ぐ；
（ｂ）呼吸器疾患を阻害する，すなわち，その進行を休止させる；または
（ｃ）呼吸器疾患を軽減する，すなわち，疾患の退行および／または改善を引き起こす。本発明は，特に任意の感染性細菌を有する患者を治療することに向けられる。
【００４８】
本発明の一般的観点
本発明は，任意の配列および任意の長さのプロトン化／酸性化核酸が，薬剤耐性および抗生物質感受性細菌に対してインビトロおよびインビボの両方で有効な新規な種類の抗生物質であるという発見に基づく。詳細には，本発明のプロトン化／酸性化核酸は，すべての細菌種に対して有効な抗菌薬剤であり，ヒトおよび動物において細菌感染の治療または予防に用いることができる。すなわち，本発明は，プロトン化，ヌクレアーゼ耐性核酸，および細菌を殺すかまたは細菌成長を阻害するのに有効であるようにこれらを製造する方法を含む。特に，本発明は，病原性細菌に対する核酸の抗菌作用を促進するためにプロトン化する方法に関する。
【００４９】
さらに，他の疾病または疾患の治療用に現在用いられている核酸，例えば特定の遺伝子を標的とするアンチセンス核酸もまたプロトン化／酸性化することができ，このことにより，そのような核酸に抗菌活性の追加の治療的効果を与えることができる。すなわち，本発明はまた，同時に細菌感染を治療または予防するためにさらにプロトン化された核酸を使用して，ウイルス感染，癌，真菌感染等が関与する疾患を治療または予防することを含む。
【００５０】
プロトン化／酸性化を用いて，核酸に抗菌剤として機能する能力を付与することができる。核酸の酸性化は，プロトン（または正の水素イオン）を核酸の反応性部位に付加するプロセスである。プロトン化される反応性部位の数が増加するにつれて，ｐＨは低下し，核酸の細菌阻害活性は増加する。したがって，本発明の核酸は，プロトン化／酸性化されて，水に溶解したときにｐＨ７より低く約ｐＨ１までの，好ましい態様においては，ｐＨ６−約１またはｐＨ５−約１のｐＨを与える。別の好ましい態様においては，溶解した核酸はｐＨ４．５−約１，または好ましい態様においてはｐＨ４．０−約１，またはより好ましい態様においては，ｐＨ３．０−約１，または別のより好ましい態様においては，ｐＨ２．０−１である。
【００５１】
好ましい態様においては，本発明の組成物および方法のプロトン化／酸性化核酸は，実質的にヌクレアーゼ耐性，実質的に酸耐性，および好ましくは，実質的にヌクレアーゼ耐性でありかつ実質的に酸耐性である。この態様には，ホスホロチオエート結合，２’−Ｏ−メチル−ホスホジエステル，２’−Ｏ−アルキル，２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル），２’−フルオロ，２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル，ｐ−イソプロピル核酸，ホスホルアミデート，キメラ結合，および任意の他の骨格修飾により完全に誘導化された核酸も含まれる。この態様はまた，核酸を内因性ヌクレアーゼ活性に実質的に耐性にする他の修飾も含む。核酸をヌクレアーゼ耐性にする方法には，限定されないが，核酸を構成するプリンまたはピリミジン塩基を共有結合的に修飾することが含まれる。例えば，修飾塩基を含む核酸が実質的にヌクレアーゼ耐性となるように，塩基をメチル化，ヒドロキシメチル化，またはさもなくば置換（例えばグリコシル化）することができる。
【００５２】
最も好ましい態様においては，プロトン化／酸性化核酸は，酸分解，エキソヌクレアーゼ分解，およびエンドヌクレアーゼ消化に実質的に耐性な骨格を有するであろう。
【００５３】
典型的には，核酸の相対的ヌクレアーゼ耐性は，耐性核酸の分解のパーセントをその未修飾対応物（すなわち，"正常な"骨格，塩基，およびホスホジエステル結合を有する対応する核酸）の分解のパーセントと比較することにより測定することができる。分解のパーセントは，分析的ＨＰＬＣを用いて全長核酸の喪失を評価することにより，または任意の他の適当な方法により（例えば，染色，オートラジオグラフィー，蛍光などを用いて生成物をシークエンスゲル上で可視化することにより，または光学密度のシフトを測定することにより），決定することができる。分解は一般に時間の関数として測定される。
【００５４】
未修飾核酸と修飾核酸との比較は，無傷の修飾核酸のパーセンテージと無傷の未修飾核酸のパーセンテージとの比率を求めることにより行うことができる。例えば，ヌクレアーゼに１５分間暴露した後に，２５％の未修飾核酸が無傷であり（すなわち７５％分解される），５０％の修飾核酸が無傷である（すなわち５０％分解される）場合，修飾核酸は未修飾核酸よりヌクレアーゼ分解に対して２倍（５０％を２５％で割る）耐性が高いと言われる。一般に，実質的にヌクレアーゼ耐性の核酸は，ヌクレアーゼに１５分間暴露した後に，対応する配列を有する未修飾核酸より少なくとも約１．２５倍ヌクレアーゼ分解に対して耐性が高く，典型的には少なくとも約１．５倍耐性が高く，好ましくは約１．７５倍耐性が高く，より好ましくは少なくとも約１０倍耐性が高いであろう。
【００５５】
酸分解のパーセントは，分析ＨＰＬＣを用いて全長核酸の喪失を評価することにより，または任意の他の適当な方法により（例えば，染色，オートラジオグラフィー，蛍光等を用いて生成物をシークエンシングゲル上で可視化することにより，または光学密度のシフトを測定することにより）決定することができる。分解は一般に時間の関数として測定される。
【００５６】
未修飾核酸と修飾核酸との比較は，無傷の修飾核酸のパーセンテージと無傷の未修飾核酸のパーセンテージとの比率を求めることにより行うことができる。例えば，低ｐＨ環境に３０分間暴露した後，未修飾核酸の２５％が無傷であり（すなわち７５％が分解される），修飾核酸の５０％が無傷である（すなわち５０％が分解される）場合，修飾核酸は未修飾核酸より酸分解に対して２倍（５０％を２５％で割る）耐性が高いと言われる。一般に，実質的に"酸耐性"核酸は，３７℃でｐＨ約１．５−約４．５に３０分間暴露した後，酸分解に対して，対応する配列を有する未修飾核酸より少なくとも約１．２５倍耐性が高く，典型的には少なくとも約１．５倍耐性が高く，好ましくは約１．７５耐性が高く，より好ましくは少なくとも約１０倍耐性が高いであろう。
【００５７】
本明細書に記載される精製核酸は，単独の治療用薬剤として用いてもよく，または追加の抗菌剤または他の治療用薬剤と組み合わせてもよい。例えば，記載されるヌクレアーゼ耐性抗菌核酸は，慣用の抗生物質または細菌の遺伝子発現を阻害する他の化学基に結合させることができる。あるいは，精製された核酸を，他の疾患および／または症状を緩和させるよう設計された薬剤，例えば，うっ血除去薬，抗ヒスタミン薬，制吐剤，鎮静薬，鎮痛剤等とともに治療用組成物中に含ませることができる。別の例においては，核酸は，炎症に関与する遺伝子，例えばホスホジエステラーゼ−４の抑制に向けられたアンチセンス分子であってもよい。さらに，抗菌核酸を，例えば，核酸のインビボ安定性をさらに増強させるか，さもなくばその薬理学的特性を増強する（例えば，インビボ半減期を増加させる，毒性を減少させる，生体利用性を促進する等），種々のよく確立された化合物または構造と複合体化させることができる。
【００５８】
修飾核酸の抗菌効果は配列に依存しないため，本発明の核酸の配列は様々でありうる。例えば，細菌感染の治療に向けられる核酸は，細菌成長に必要な既知の細菌遺伝子に相補的であってもよい。別の例においては，本発明の核酸は，治療または予防している感染を引き起こす細菌のゲノム中の任意の配列と実質的な配列ホモロジーを有していなくてもよい。さらに別の例においては，他の治療標的，例えば，ウイルス，癌細胞，真菌感染に向けられた核酸を本発明にしたがってプロトン化／酸性化して，それらの主たる治療機能に加えて，抗菌薬剤としても同時に機能させることができる。このようにして，免疫応答を抑制するように，または腫瘍原性，転移，脱分化，または新脈管形成を抑制するように設計された治療剤は，同時に，主たる適応症に付随する可能性のある二次細菌感染を治療または予防することができる。疾患，例えば，炎症，癌，ウイルス感染，真菌感染等の治療に用いられるアンチセンス配列は，本明細書の開示を読めば，当業者が決定することができる。
【００５９】
本発明の核酸の殺菌活性および／または静菌活性は，当業者に利用可能な多くの方法の任意のものを用いて測定することができる。そのような方法の一例は，抗生物質を用いる細菌感染の治療のインビボ効力を予測しうると認識されているＭＩＣ（最小阻害濃度）試験を用いる抗菌活性の測定である。本発明の核酸は，細菌を前処理して膜を透過性にしなくても，核酸のＰＥＧ修飾なしでも，この試験において抗菌活性を示す。
【００６０】
本発明においては，ある範囲の化学的変更を伴う核酸のプロトン化／酸性化を用いることができるが，本発明の好ましい態様は，５−ブタノール−２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ−ブタノール−３’または２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルの化学的構造を有し，水に溶解したときにｐＨ３−１を有するプロトン化／酸性化核酸である。本発明の特に好ましい態様は，５’−ブタノール−２’−Ｏ−メチルＲＮＡ−ブタノール−３’の化学的骨格構造を有し，水に溶解したときにｐＨ３−１を有するプロトン化／酸性化核酸である。
【００６１】
核酸合成
核酸は，市販のＤＮＡ合成機で，１μＭから１ｍＭのスケールで，標準的なホスホルアミダイト化学および当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ，１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７−６０８９，Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０（２０）：３９０８−３９１３，Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ，１９８５，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．３２６：２６３−２８０，ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４（２２）：９０８１−９０９３，およびＦａｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（本明細書の一部としてここに引用する）に記載される方法を用いて合成することができる。
【００６２】
核酸は，当業者に知られる任意の方法により精製することができる。好ましい態様においては，核酸は，市販の逆相またはイオン交換媒体，例えばＷａｔｅｒのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｋ，ＰｈａｒｍａｃｉａのＳｏｕｒｃｅＱ等でクロマトグラフィーにより精製する。ピーク画分を合わせ，試料を脱塩し，ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）に基づく媒体，例えばＨａｍｉｌｔｏｎのＰＲＰ１またはＰＲＰ３，またはＰｏｌｙｍｅｒ  ＬａｂのＰＬＲＰ樹脂での逆相クロマトグラフィーを用いて濃縮する。あるいは，エタノール沈澱，透析濾過またはゲル濾過を用い，次にＳａｖａｎｔのＳｐｅｅｄＶａｃ等の市販の装置で真空下で凍結乾燥または溶媒蒸発することができる。任意に，少量の核酸をポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動的に精製することができる。
【００６３】
凍結乾燥または乾燥した核酸の調製物は，無発熱物質の滅菌生理食塩水（すなわち０．８５％食塩水），滅菌シグマ（Ｓｉｇｍａ）水に溶解し，０．４５ミクロンのゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）フィルター（または滅菌０．２ミクロンの無発熱物質フィルター）を通して濾過することができる。記載される核酸は，広範な化学基または結合の任意のもの，例えば，限定されないが，ホスホルアミデート；ホスホロチオエート；アルキルホスホネート；２’−Ｏ−メチル；２’−修飾ＲＮＡ；モルホリノ基；ホスフェートエステル；プロピン基；または上述の基または他の結合の任意の組み合わせのキメラ（またはそれらの類似体）で，部分的にまたは完全に置換されていてもよい。
【００６４】
種々の標準的な方法を用いて，本明細書に記載される抗菌核酸を精製することができる。簡単には，本発明の抗菌核酸は，市販の逆相媒体でのクロマトグラフィーにより（例えば，ｔｈｅ  ＲＡＩＮＩＮ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ＤＹＮＡＭＡＸ（登録商標）−３００Ａ，Ｐｕｒｅ−ＤＮＡ逆相カラム，１９８９の使用説明書，または現在のその改訂版，（本明細書の一部としてここに引用する）を参照），またはイオン交換媒体，例えばＷａｔｅｒのＰｒｏｔｅｉｎ  ＰａｋまたはＰｈａｒｍａｃｉａのＳｏｕｒｃｅＱ（一般に，Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａ，１９９４，"Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ"，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ａｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．６９８：２９３−３０１；およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓを参照）により精製することができる。ピーク画分を合わせ，試料を濃縮し，アルコール（エタノール，ブタノール，イソプロパノール，およびそれらの異性体および混合物等）沈澱，逆相クロマトグラフィー，透析濾過またはゲル濾過により脱塩する。
【００６５】
核酸は，とりわけ，所望の核酸の合成の間に生成される不完全な核酸生成物を実質的に含まないように単離されているとき，純粋であると考えられる。好ましくは，精製した核酸はまた，オリゴヌクレオチドの抗菌活性を隠すかさもなくばマスクするかもしれない夾雑物を実質的に含まないであろう。開示される方法のいずれかまたは当業者に知られる任意の他の方法により酸性化した後の精製した核酸は，とりわけ，過剰のプロトン化／酸性化剤を実質的に含まないように単離されているプロトン化／酸性化核酸である。一般に，核酸が標的細胞に結合するかまたはその中に入って目的とする生理学的活性を調節することができる場合には，核酸の有用性を減少させるであろう夾雑物を実質的に含まないとみなすべきである。
【００６６】
特定の態様においては，本発明の核酸は，以下の１またはそれ以上から構成される：部分的にまたは完全に置換されたホスホロチオエート；ホスホネート；ホスフェートエステル；ホスホルアミデート；２’−修飾ＲＮＡ；３’−修飾ＲＮＡ；ペプチド核酸；プロピンまたはこれらの類似体。核酸は，化学的成分，例えば，限定されないが，ホスホジエステル結合，ホスホトリエステル結合，ホスホルアミデート結合，シロキサン結合，カーボネート結合，カルボキシメチルエステル結合，アセトアミデート結合，カルバメート結合，チオエーテル結合，架橋ホスホルアミデート結合，架橋メチレンホスホネート結合，ホスホロチオエート結合，メチルホスホネート結合，ホスホロジチオエート結合，モルホリノ，架橋ホスホロチオエート結合，スルホンヌクレオチド間結合，３’−３’結合，５’−２’結合，５’−５’結合，２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド，２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）ホスホジエステル，モルホリノ結合，ｐ−エトキシオリゴヌクレオチド，ＰＮＡ結合，ｐ−イソプロピルオリゴヌクレオチド，またはホスホルアミデートにより，完全にまたは部分的に誘導化されていてもよい。
【００６７】
プロトン化／酸性化核酸
上述の合成および精製工程の後に，または工程中に，精製または部分精製されたまたは粗核酸を低ｐＨまたは酸性の環境に供することにより，本発明のプロトン化／酸性化形態の核酸を生成することができる。精製または粗核酸は，酸，例えば，限定されないが，リン酸，硝酸，塩酸，酢酸等を用いてプロトン化／酸性化することができる。例えば，酸は溶液中で核酸と組み合わせることができ，あるいは，核酸を酸性溶液に溶解してもよい。過剰の酸は，クロマトグラフィーにより，または場合によって核酸を乾燥することにより，除去することができる。
【００６８】
プロトン化核酸を製造するための，当業者に知られる他の方法も同じく，本発明の範囲内であることが企図される。本発明の核酸をいったんプロトン化したのち，望ましくない成分，例えば，過剰の酸から分離することができる。当業者には，オリゴヌクレオチドを望ましくない成分から分離する多くの方法が知られている。例えば，プロトン化の後に，オリゴヌクレオチド溶液をクロマトグラフィーに供することができる。好ましい態様においては，プロトン化の後に，オリゴヌクレオチド溶液を，ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）系の樹脂（例えば，ＨａｍｉｌｔｏｎのＰＲＰ−１または３およびＰｏｌｙｍｅｒＬａｂのＰＬＲＰ）を通す。
【００６９】
プロトン化／酸性化核酸は，直接用いることができ，または，好ましい態様においては，さらに加工して，沈澱，逆相クロマトグラフィー，透析濾過，またはゲル濾過により過剰の酸および塩を除去することができる。プロトン化／酸性化オリゴは，沈澱，凍結乾燥，溶媒蒸発などにより濃縮することができる。本発明の酸性化核酸調製物は，水または食塩水中に懸濁したとき，プロトン化／酸性化のレベルに依存して，典型的には１−４．５のｐＨを示す。これは，酸性化工程においてどの程度の量の酸が用いられたかにより決定することができる。あるいは，核酸は，水素イオンを満たしたカチオン交換カラムを通過させることにより，プロトン化することができる。
【００７０】
酸およびヌクレアーゼ耐性核酸
一般に，ｐＨ２−１付近の核酸調製物は，ｐＨ４．５またはその付近の核酸より優れた抗菌活性を示す。多くのオリゴの骨格はｐＨ２では安定ではなく，脱プリン化が生ずるが，多くの骨格はｐＨ４−５では比較的安定である。２’−Ｏ−アルキル，３’−Ｏ−アルキル，および２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）核酸が所望のｐＨ２−１において安定であることが発見された。
【００７１】
１つの態様においては，本発明は実質的にヌクレアーゼ耐性である核酸を用いる。これには，ホスホロチオエート結合，２’−Ｏ−メチルホスホジエステル，２’−Ｏ−アルキル，２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル），２’−フルオロ，２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル，ｐ−エトキシ，モルホリノ核酸，ｐ−イソプロピル核酸，ホスホルアミデート，キメラ結合，および任意の他の骨格修飾，ならびに核酸を内因性ヌクレアーゼ活性に対して実質的に耐性にする他の修飾により，完全に誘導化された核酸が含まれる。核酸をヌクレアーゼ耐性にする別の方法には，限定されないが，核酸を構成するプリンまたはピリミジン塩基を共有結合的に修飾することが含まれる。例えば，修飾された塩基を含む核酸が実質的にヌクレアーゼ耐性となるように，塩基をメチル化，ヒドロキシメチル化，あるいは置換（例えばグリコシル化）することができる。
【００７２】
類似の修飾を有する２’−Ｏ−アルキル置換核酸および分子は顕著な酸安定性およびエンドヌクレアーゼ耐性を示すが，これらは３’エキソヌクレアーゼに感受性である。２’−Ｏ−アルキル置換核酸のエキソヌクレアーゼ耐性を増強するため，リボ核酸配列の５’および３’末端をエキソヌクレアーゼブロッキング官能基に結合させることが好ましい。例えば，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチドをオリゴリボヌクレオチドのいずれかの末端に配置することができる。さらに，１またはそれ以上の反転塩基をオリゴリボヌクレオチドのいずれかの末端に配置することができ，または１またはそれ以上のアルキル，例えばブタノール置換ヌクレオチドまたは化学基をオリゴリボヌクレオチドの１またはそれ以上の末端に配置することができる。酵素耐性ブタノールは，好ましくは構造ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ（４−ヒドロキシブチル）を有し，これはＣ４スペーサーとも称される。したがって，本発明の好ましい態様は，以下の構造：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中，"Ｂ"は，約１−約９８塩基の長さの２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）オリゴリボヌクレオチドであり，"Ａ"および"Ｃ"は，それぞれ５’および３’末端ブロッキング基（例えば，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド（典型的には６より少ない），反転塩基結合，またはアルキル，アルケニル，もしくはアルキニル基または置換ヌクレオチド）である］を有する抗菌核酸を含むプロトン化／酸性化核酸である。ブロッキング基としては，反転塩基，ジデオキシヌクレオチド，メチルホスフェート，アルキル基，アリール基，コルジセピン，シトシンアラビノシド，２’−メトキシ−エトキシヌクレオチド，ホスホルアミデート，ペプチド結合，ジニトロフェニル基，ホスホロチオエート結合を有する２’−または３’−Ｏ−メチル塩基，３’−Ｏ−メチル塩基，フルオレセイン，コレステロール，ビオチン，アクリジン，ローダミン，プソラーレン，およびグリセリルが挙げられる。
【００７３】
抗菌核酸の治療用途
疾患の治療的処置に用いる場合，抗菌プロトン化／酸性化核酸またはそれらの混合物の適当な投与量は，いくつかのよく確立された方法論のいずれによっても決定することができる。例えば，慣用的に動物実験を用いて，キログラム体重あたりの生物活性剤の最大許容用量すなわちＭＴＤを決定する。一般に，試験する動物種の少なくとも１つは哺乳動物である。当業者は適当に，これを基礎として有効な用量を推定し，他の種，例えばヒトに対する毒性を回避することができる。さらに，治療上の投与量は，感染の重篤性および宿主のサイズまたは種等の因子によって変更することができる。さらに，非経口的に，および適切に処方された形態の抗菌核酸を吸入治療により肺に直接適用することの両方により，肺感染を治療することができる。
【００７４】
免疫に障害を有する患者，例えば，後天性免疫不全疾患症候群（ＡＩＤＳ）に罹患した患者，ＨＩＶに感染した者，化学療法または放射線療法を受けている患者等においては，細菌感染が特に問題のある二次合併症であるため，本明細書に記載される発明のさらに別の態様は，ウイルス，癌，真菌または他の標的を有する治療的核酸の使用であり，ここで，核酸は抗菌核酸としても働くことができるようにさらにプロトン化／酸性化されている。遺伝子は，外来生物の生命維持に必要な遺伝子，例えば酵母の複製遺伝子またはウイルスの構造蛋白質を標的とすることができる。このことにより，ある種類の生物による一次感染と二次的細菌感染の予防または治療とを同時に治療することが可能となる。例えば，ＡＩＤＳ患者において，Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉを標的とするプロトン化／酸性化アンチセンス遺伝子は真菌感染を標的とするであろうが，さらに，同時またはその後の日和見細菌感染を治療または予防するであろう。核酸は，目的とする遺伝子の発現または活性に影響を与えることによりその主たる標的に向けられるであろうが，それに加えて，抗菌剤としても機能するであろう。
【００７５】
あるいは，核酸は，例えば脂質担体−核酸混合物を用いて，肺細胞中における内因性遺伝子の発現に向けることができる。エアロゾル化トランスジン輸送による肺細胞のトランスフェクションを記載する米国特許５，６４１，６６２を参照（本明細書の一部としてここに引用する）。これは，遺伝的疾患，例えば機能的外来性ヒトＣＦＲ遺伝子を導入する嚢胞性線維症の遺伝子治療において非常に有用であろう。これはまた，内因性遺伝子の増強されたまたは抑制された発現，または外来性遺伝子の発現が有効であろう，癌，例えば小細胞肺癌腫に対しても有用でありうる。米国特許５，８４９，８６３（本明細書の一部としてここに引用する）を参照。当業者には明らかなように，内因性および外来性の両方のヒト遺伝子を含む他の治療用途もまた可能である。
【００７６】
別の態様においては，プロトン化／酸性化核酸を別の治療用薬剤とともに投与する。例えば，本発明の核酸は，濃くなったまたは蓄積された粘液分泌を伴う肺疾患に罹患した患者の粘液の粘度を低下させる薬剤とともに投与することができる。この目的のためのリン脂質の肺輸送を記載する米国特許５，６９８，５３７を参照。別の例においては，本発明の核酸は，抗炎症剤とともに投与することができ，これは患者における細菌感染の治療に有効であろう。
【００７７】
本発明の方法が有効である細菌生物の例には，グラム陽性細菌，グラム陰性細菌，抗酸菌，放線菌，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが含まれる。本発明の方法は，すべての細菌生物による感染に対して有効であり，そのような細菌には，以下の属のメンバーが含まれる：Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ，Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｒａｃｈｎｉａ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ，Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，Ｒｉｂｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ｋｕｒｔｈｉａ，Ｎｏｃａｒｄｉａ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ，Ｓｅｒｒａｔｉａ，Ｒｏｔｈｉａ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ，Ｖｉｂｒｉｏ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ，およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ。
【００７８】
薬学的組成物および輸送
乾燥粉末装置用の処方は，裸の核酸構造，ウイルスもしくは哺乳動物ベクター中または小胞構造中の核酸のいずれかを含むことができる。現在望ましいプロトン化／酸性化抗菌核酸は，好ましくは種々の生理学的担体分子とともに処方する。これらの分子は，核酸組成物を安定化させ，粒子の分散を促進し，および／または特定の細胞のタイプまたは位置への核酸の輸送を容易にするよう機能することができる。
【００７９】
組成物の多くの物理学的特性および投与量単位を変化させることにより，投与する核酸の用量を調節して，組成物を肺の所望の部位に所望の用量で最も適切に輸送することができる。例えば，ある種の肺輸送装置を用いることにより，患者が低い吸息速度を有する場合には投与量単位あたりより多くの組成物を用いるべきであり，一方，高い吸息速度を有する患者にはより少ない量が必要である。投与量単位は，一回投与で輸送してもよく，または投与量単位を同じ測定吸息流速（０．１−２．０リットル／秒の範囲）および別に決定した吸息体積（０．１５−１．５リットルの範囲）で，患者に繰り返し輸送してもよい。
【００８０】
粒子の輸送はまた，部分的には，粒子サイズを調節することにより制御することができる。粒子サイズは，肺に沈着しかつ呼気により放出されないように十分大きくあるべきであるが，核酸が標的細胞内に適切に吸収されるために適当な表面領域を有するように十分小さくあるべきである。
【００８１】
粒子サイズを調節することに加えて，プロトン化／酸性化核酸は，患者の呼吸サイクルの所望の点においてエアロゾル化した用量を放出することにより輸送することができる。例えば肺炎を治療するために，粒子を下部呼吸管に沈着させるためには，エアロゾル化処方を肺の奥深くに導入することが望ましい。
【００８２】
本明細書に記載される抗菌核酸はまた，標的細胞中に入る能力を増強する分子との複合体とすることができる。そのような分子の例には，限定されないが，炭水化物，ポリアミン，アミノ酸，ペプチド，脂質，および細菌成長に重要な分子が含まれる。例えば，抗菌核酸は，脂質，カチオン性脂質，またはアニオン性脂質（これがプロトン化／酸性化核酸には好ましい）と組み合わせることができる。得られる核酸／脂質乳濁液，またはリポソーム性懸濁液は，とりわけ，核酸のインビボ半減期を有効に増加させる。プロトン化／酸性化核酸とともに用いるための適当なアニオン脂質には，限定されないが，カルジオリピン，ジミリストイル，ジパルミトイル，もしくはジオレオイルホスファチジルコリン，またはホスファチジルグリセロール，パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロール，ホスファチジン酸，リソホスファチジン酸，ホスファチジルセリン，ホスファチジルイノシトール，およびアニオン性型のコレステロールが含まれる。カチオン性，アニオン性，および／または中性の脂質組成物またはリポソームの使用は，一般に，国際公開ＷＯ９０／１４０７４，ＷＯ９１／１６０２４，ＷＯ９１／１７４２４，および米国特許４，８９７，３５５（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。抗菌核酸を脂質結合構造中に組み込むことによって適当なターゲティング薬剤（すなわち，特異的抗体またはレセプター）を核酸／脂質複合体中に取り込ませることにより，プロトン化／酸性化抗菌核酸を特定のタイプの細菌細胞にターゲティングすることができる。
【００８３】
プロトン化／酸性化核酸は，哺乳動物宿主，通常は骨粗鬆症に罹患しているかそのリスクを有するヒト宿主への肺または呼吸器輸送に適当な薬学的に許容しうる組成物中に処方されるであろう。特定の処方には，乾燥粉末，噴霧に適した液体溶液または懸濁液および計量用量吸入器（ＭＤＩ）において用いるのに適した噴射剤処方が含まれる。そのような処方の製造は，特許文献，化学文献および医学文献によく記載されており，以下の記載は例示のみを意図するものである。
【００８４】
乾燥粉末処方は典型的には，乾燥した，通常は凍結乾燥した形態のプロトン化／酸性化核酸を含み，その粒子サイズは，肺の肺胞領域中での沈着に好ましい範囲内であり，典型的には０．５μｍ−５μｍである。好ましい範囲のサイズのプロトン化／酸性化核酸の呼吸可能な粉末は，ジェットミル，噴霧乾燥，溶媒沈澱等の種々の慣用的な手法により製造することができる。次に，乾燥粉末を，装置を通る患者吸息を用いて粉末を分散させる慣用的な乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）で，または外部動力源を用いて粉末をエアロゾル雲中に分散させる空気補助装置で，患者に投与することができる。
【００８５】
乾燥粉末用の処方は，親水性の賦形剤物質を含むことができる。好ましくは，そのような賦形剤は，乾燥粉末エアロゾル中への核酸の分散を促進し，核酸構築物が身体中に輸送されるにしたがってその湿潤化を促進し，核酸構築物を安定化させるように機能する。ＷＯ９６／３２１１６（１９９６年１０月１７日公開，本明細書の一部としてここに引用する）を参照のこと。
【００８６】
乾燥粉末装置は，典型的には，単一のエアロゾル化用量（"ひと吹き（ｐｕｆｆ）"）を生成するために約１ｍｇ−１０ｍｇの範囲の粉末質量を必要とする。以下に議論されるように，必要とされるプロトン化／酸性化核酸の用量は一般にこの量よりはるかに少ないため，プロトン化／酸性化核酸粉末は，典型的には薬学的に許容しうる乾燥増量粉末と組み合わせ，ここで，プロトン化／酸性化核酸は通常は約１重量％−１０重量％で存在する。好ましい乾燥増量粉末には，ショ糖，ラクトース，トレハロース，ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ），およびグリシンが含まれる。他の適当な乾燥増量粉末には，セロビオース，デキストラン，マルトトリオース，ペクチン，クエン酸ナトリウム，アスコルビン酸ナトリウム，マンニトール等が含まれる。
【００８７】
典型的には，適当な緩衝液および塩を用いて，粒子を形成する前に，溶液中のプロトン化／酸性化核酸を安定化させることができる。適当な緩衝液には，リン酸，クエン酸，酢酸，およびｔｒｉｓ−ＨＣｌが含まれ，典型的には濃度は約５ｍＭ−５０ｍＭである。適当な塩には，塩化ナトリウム，炭酸ナトリウム，塩化カルシウム等が含まれる。肺中で溶解したときにプロトン化／酸性化核酸の生物学的活性を促進するであろう他の添加物，例えばキレート剤，ペプチダーゼ阻害剤等も適切であろう。例えば，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は，ペプチダーゼの補因子である二価カチオンのキレーターとして有用であろう。
【００８８】
ネブライザシステムにおいて用いるためのプロトン化／酸性化核酸の液体処方は，やや酸性の緩衝液（ｐＨ４−６）を用いることができ，ここでプロトン化／酸性化核酸の濃度は約１ｍｇ／ｍｌ−２０ｍｇ／ｍｌである。適当な緩衝液には，５ｍＭ−５０ｍＭの濃度の酢酸塩，アスコルビン酸塩およびクエン酸塩が含まれる。これらの緩衝液は抗酸化剤として作用することができ，またはプロトン化／酸性化核酸中の遊離メチオニンを酸化から保護するために他の生理学的に許容しうる抗酸化剤を加えることができる。化学的安定性を増強または維持するために，他の成分，例えば，キレート剤，プロテアーゼ阻害剤，等張剤，不活性ガス等を加えてもよい。
【００８９】
ＭＤＩにおいて用いるためには，本発明のプロトン化／酸性化核酸を適当なエアロゾル噴射剤，例えばクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）またはヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）に溶解または懸濁する。適当なＣＦＣには，トリクロロモノフルオロメタン（噴射剤１１），ジクロロテトラフルオロメタン（噴射剤１１４），およびジクロロジフルオロメタン（噴射剤１２）が含まれる。適当なＨＦＣには，テトラフルオロエタン（ＨＦＣ−１３４ａ）およびヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ−２２７）が含まれる。
【００９０】
好ましくは，エアロゾル噴射剤中に取り込ませるためには，乾燥粉末処方について記載されるように，本発明のプロトン化／酸性化核酸を加工して呼吸に適する粒子とする。次に，粒子を噴射剤中に懸濁し，典型的には界面活性剤で被覆してその分散を促進する。適当な界面活性剤には，オレイン酸，トリオレイン酸ソルビタンおよび種々の長鎖ジグリセリドおよびリン脂質が含まれる。
【００９１】
そのようなエアロゾル噴射剤処方は，化学的安定性および生理学的許容性を維持または増強するために，さらに低級アルコール，例えばエタノール（３０重量％まで）および他の添加物を含んでいてもよい。本発明にしたがうプロトン化／酸性化核酸の肺または呼吸器投与は，嚢胞性線維症または喘息の治療に特に有用であろう。この場合，プロトン化／酸性化核酸は抗炎症治療剤と組み合わせて投与することができる。そのような治療方法は，米国特許４，６９８，３２８および４，８３３，１２５によく記載されており，その開示は先に本明細書の一部として引用されている。
【００９２】
細菌感染の治療のためのプロトン化／酸性化核酸の総エアロゾル化投与量は，典型的には１日あたり約１００μｇ−２，０００μｇ，通常は１日あたり約２５０μｇ−１０００μｇの範囲内である。そのような投与量により，１日あたり約５０μｇ−５００μｇ，通常は１日あたり１００μｇ−２５０μｇの範囲の合計全身的利用性（すなわち，血液に輸送される量）が得られるであろう。精密な投与量は，もちろん，用いる特定のプロトン化／酸性化核酸または類似体の活性および他の既知の薬物動力学的因子に依存して様々であろう。通常は，プロトン化／酸性化核酸の総投与量は，複数の，典型的には少なくとも２回，しばしば３から１０回の別々のエアロゾル化用量として輸送され，ここで各エアロゾル化ボーラスは５０μｇ−５００μｇのプロトン化／酸性化核酸を含む。
【００９３】
本発明の方法にしたがうプロトン化／酸性化核酸の肺輸送は，所望の搏動性血清濃度プロファイルを与えることが見いだされた。プロトン化／酸性化核酸の搏動性血清濃度プロファイルは，典型的には投与の３０分後にピークを有し，血清濃度は急速に低下し，典型的にはピークから３０分以内に最大の５０％未満に，ピークから６０分以内に２５％未満に低下する。
【００９４】
乾燥粉末装置用の処方は，裸の核酸構造，ウイルスもしくは哺乳動物ベクターまたは小胞構造中の核酸のいずれかを含む。乾燥粉末処方の場合，プロトン化／酸性化核酸の総投与量が患者により吸入されるべき１またはそれ以上のエアロゾル化ボーラスにより上述の範囲内になるように，十分な量の乾燥バルク粉末を加える。典型的には，活性なプロトン化／酸性化核酸は約１重量％−２５重量％の粉末で存在し，エアロゾル化ボーラスは１ｍｇ−１０ｍｇの粉末を含む。ネブライザにおいて用いるのに適当な液体処方は，典型的には約１ｍｇ／ｍｌ−２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のプロトン化／酸性化核酸を有し，ボーラスを輸送するのに必要な噴霧された液体の総容量は，約０．１ｍｌ−１ｍｌの範囲である。エアロゾル噴射剤処方は，ＭＤＩにより，１回のエアロゾル用量あたり約０．５ｍｇ−５ｍｇのプロトン化／酸性化核酸で輸送される。ＭＤＩ装置の非能率性のため，わずかの部分，典型的には５％−２０％の範囲の薬剤のみが肺に到達するであろう。すなわち，十分な量のプロトン化／酸性化核酸は，各ボーラスに約０．１−１ｍｇのプロトン化／酸性化核酸を含む，２から５のエアロゾル化ボーラスで輸送することができる。
【００９５】
エアロゾルは，核酸を噴射剤（例えばエチルアルコール）中に，または噴射剤および溶媒相中に，溶解または懸濁することにより製造することができる。局所またはエアロゾル形態用の薬学的組成物は，用いられる特定の形態により，一般に約０．０１重量％−約４０重量％，好ましくは約０．０２重量％−約１０重量％，より好ましくは約０．０５重量％−約５重量％の核酸を含むであろう。
【００９６】
一般に異なるメカニズムおよび方法論を用いて吸入用のエアロゾルを生成するいくつかの異なるタイプの装置がある。最も一般的に用いられている装置は，計量用量吸入器（ＭＤＩ）であり，これは低沸点の噴射剤を含む処方を有する薬剤処方容器を含む。処方は，容器中で加圧下に保持され，容器のバルブを開いたときに計量された用量の処方がエアロゾルとして放出される。処方が容器外で大気圧にさらされたとき，低沸点の噴射剤は速やかに蒸発，すなわち"フラッシュ"する。薬剤を含む処方の粒子は噴射剤なしで患者の肺に吸入され，その後患者の循環系に移動する。多数の異なるタイプのＭＤＩ装置が存在する。このタイプの装置は，米国特許５，４０４，８７１および５，３６４，８３８に記載されている。
【００９７】
別のタイプのエアロゾル輸送装置は，多孔質膜を通して処方を押し出す。孔を通して移動する処方は，破壊されて小さい粒子を形成し，これが患者により吸入される。このタイプの装置は米国特許５，５５４，６４６および５，５２２，３８５に示される。
【００９８】
さらに別のタイプの装置は，乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）装置である。その名前が示すとおり，そのような装置は乾燥粉末の処方を用い，ここで粉末は気体の爆発によりエアロゾル化雲中に吹き込まれる。典型的なＤＰＩ装置は，米国特許５，４５８，１３５，５，４９２，１１２，５，６２２，１６６，および５，７７５，３２０に示される。
【００９９】
実施例
以下の実施例は，当業者に本発明をいかにして作成し使用するかの完全な開示および記載を提供するために記載され，発明者らが自らの発明として認識するものの範囲を限定することを意図するものではなく，発明者らが，以下の実験が実施したすべての実験でありそれのみであることを示すことを意図するものではない。用いる数値（例えば，量，温度など）に関して正確性を確実にするよう努力してきたが，ある実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に記載しない限り，部は重量部であり，分子量は平均分子量であり，温度は摂氏であり，圧力は大気圧またはそれに近い。
【０１００】
実施例１：細菌成長研究
制限栄養成長研究
制限栄養成長研究のためには，細胞をプレートから取り出し，ＰＢＳ中に懸濁して最終濃度１０5ＣＦＵ／ｍｌおよび最終用量１ｍｌとした。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地を加えた（Ｓ．ａｕｒｅｕｓＡＣＣ＃１３３０１については４０μｌ，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＣＣ＃１０１４５については２０μｌ）。１００μｌの水または１００μｌの核酸（３２Ａ260ユニット，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド，ホスホジエステル結合，５’および３’反転Ｔ末端ブロック，配列ＣＧＣＣＡＴＴＧＧ，配列番号１）を加え，管を振盪せずに３５℃で約２４時間インキュベートした。Ａ625を測定し，パーセント阻害を対照のパーセントとして計算した。結果を以下の表に示す。
【表１】
0004883840.tif 000002
【０１０１】
定常成長研究
核酸の抗菌活性に及ぼすｐＨの影響を調べるために，定常成長アッセイも行った。細胞をプレートから取り出し，食塩水に懸濁して，１ｍｌのＰＢＳ中最終濃度１０7ＣＦＵ／ｍｌのＳ．ａｕｒｅｕｓとした。１００μｌの水または１００μｌの核酸（３２Ａ260ユニット，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド，ホスホジエステル結合，５’および３’反転Ｔ末端ブロック，配列ＣＧＣＣＡＴＴＧＧ，配列番号１）を加え，管を振盪せずに３５℃で約２４時間インキュベートした。アリコートを直接または希釈後に播種して，３７℃でインキュベートし，２４時間後にコロニーを計数した。結果を以下の表に示す。
【表２】
0004883840.tif 000003
【０１０２】
これらの結果から，ヌクレオチドのｐＨを低くすると，これに殺菌性および静菌性効果が付与されることが結論づけられる。次に，配列同一性および長さの影響を調べた。
【０１０３】
実施例２：抗菌活性に及ぼす配列の影響
定常成長研究
最初に，配列の長さの影響を調べるために，定常成長アッセイを行った。細胞をプレートから取り出し，食塩水に懸濁してＰＢＳ１ｍｌ中最終濃度１０7ＣＦＵ／ｍｌのＳｔｒｅｐ．ｍｕｔａｎｓとした。５０μｌの水または５０μｌの種々の長さの核酸（１６Ａ260単位）を加え，管を３５℃で振盪せずに約２４時間インキュベートした。用いた各核酸は，ホスホジエステル結合の２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドからなり，５’および３’反転Ｔ末端ブロッキングを有する。配列は以下のとおりであった：１１４．６−ＣＧＣＣＡＴ（配列番号２）；１１４．１２−ＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧ（配列番号３）；１１４．２１−ＧＧＡＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＴＡＴＡＴＣ（配列番号４）。各核酸について以下の表に示される長さは，５’および３’末端の反転Ｔを含む。アリコートを直接または希釈後に播種し，３７℃でインキュベートし，２４時間後にコロニーを計数した。結果を以下の表に示す。
【表３】
0004883840.tif 000004
【０１０４】
制限栄養成長研究
次に，ヌクレオチドホモポリマー（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ，配列番号５；ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ，配列番号６；ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ，配列番号７；ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ，配列番号８）の影響を調べるために，制限栄養成長アッセイを行った。用いた各ホモポリマーは，ホスホジエステル結合の２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドからなり，３’および５’の両方のブタノール末端ブロッキングを有する。細胞をプレートから取り出し，１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁して，最終濃度１０5ＣＦＵ／ｍｌとした。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地を加えた（Ｓ．ａｕｒｅｖｓＡＣＣ＃１３３０１については４０μｌ，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＣＣ＃１０１４５については２０μｌ）。１００μｌの水または１００μｌの核酸（ｐＨ１．５（３２Ａ260ユニット））を加え，管を振盪せずに３５℃で約２４時間インキュベートした。Ａ625を測定し，パーセント阻害を対照のパーセントとして計算した。結果を以下の表に示す。
【表４】
0004883840.tif 000005
【０１０５】
次に，モノマー，ダイマーおよびトリマーの影響を調べるために，制限栄養成長アッセイを行った。用いた各核酸は，ホスホジエステル結合の２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドからなり，ブタノールによる３’および５’の両方のブロッキングを有する。１１４．１２と称される核酸は，ＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴ，配列番号９の配列を有する。細胞をプレートから取り出し，１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁して，最終濃度１０5ＣＦＵ／ｍｌとした。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地を加えた（Ｓ．ａｕｒｅｕｓＡＣＣ＃１３３０１については４０μｌ，Ｅ．ｃｏｌｉＡＣＣ＃３５２１８については２０μｌ）。２５μｌの水または２５μｌの核酸（ｐＨ１．５（８Ａ260ユニット））を加え，管を振盪せずに３５℃で約２４時間インキュベートした。Ａ625を測定し，パーセント阻害を対照のパーセントとして計算した。アリコートを直接または希釈後に播種し，３７℃でインキュベートし，２４時間後にコロニーを計数してＣＦＵを決定した。結果は以下の表に示される。
【表５】
0004883840.tif 000006
【０１０６】
モノマー，ダイマーおよびトリマーの影響を調べるために定常状態アッセイを行った。用いた各核酸は，ブタノールの３’および５’ブロッキングの両方を有する，ホスホジエステル結合の２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドからなるものであった。１１４．１２と称される核酸は，ＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴ，配列番号９の配列を有する。細胞をプレートから取り出し，食塩水に懸濁して，１ｍｌのＰＢＳ中，Ｓ．ａｕｒｅｕｓについては０．０８，Ｅ．ｃｏｌｉについては０．１２，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについては０．１のＡ625とした。２５μｌの水または２５μｌの核酸（８Ａ260ユニット）を加え，管を３５℃で振盪せずに約２４時間インキュベートした。アリコートを直接または希釈後に播種し，３７℃でインキュベートし，２４時間後にコロニーを計数してＣＦＵを決定した。結果を以下の表に示す。
【表６】
0004883840.tif 000007
【０１０７】
結論として，これらの結果は，プロトン化／酸性化核酸が抗菌剤として機能する能力は配列の同一性に依存しないことを示す。さらに，モノマー程度の短いホモポリマーおよび核酸も有効である。これらの結果は，配列はオリゴヌクレオチドの活性に役割を果たすかもしれないが，アンチセンス依存性ではなくしたがって配列非依存性である抗菌効果の別のメカニズムが存在することを示す。
【０１０８】
実施例３；耳感染の局所的治療の有効性
プロトン化／酸性化核酸は，チンチラにおいてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌により引き起こされる外耳表皮感染の治療に非常に有効であった。連続的プロトン化／酸性化核酸治療を施したチンチラの感染耳は，処置開始から４日後にはすべて完全に治癒した。
【０１０９】
チンチラの耳をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌で感染させた。詳細には，耳を水に長時間暴露することにより，チンチラの耳の表皮層を浸軟させた。これは，チンチラの耳管の内表面を覆う皮膚の表皮層にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染の受容性の環境を作ることを助ける。洗浄したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの懸濁液で綿プリージを飽和させ，これをチンチラの耳管に挿入した。プリージは４８時間後に除去した。
【０１１０】
チンチラの処置は感染後第３日に開始した。このとき，耳顕微鏡検査により測定して，耳は"レベル３"の重篤度を有すると判定された。チンチラには，４００μｌのプロトン化／酸性化核酸（ｐＨ１．５），配列ＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴ，配列番号９，水中（２．８ｍＭｏｌａｒ），またはベヒクル混合物（水／エタノール／プロピレングリコール）中（２ｍＭｏｌａｒ）の４００μｌの同一の配列のプロトン化／酸性化核酸のいずれかを，１日に２回局所投与した。核酸は，ホスホジエステル結合の２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドからなり，５’および３’末端の両方でブタノールによる末端ブロックを有していた。チンチラは毎日調べて，耳感染の重篤度の程度に基づいて，処置の有効性を評価した。
【０１１１】
プロトン化／酸性化核酸処置の結果は，耳顕微鏡検査により判定して，処置したチンチラの耳はすべて耳感染の重篤度の有意な低下を示した。有意な改善は，プロトン化／酸性化核酸で３回処置した後に観察することができた。チンチラにはさらに４−５日間処置を与えた。未処置対照チンチラは，この時間枠の中では改善を示さなかった。これに対し，連続的プロトン化／酸性化核酸処置を施したすべての耳感染は，感染後第７日までに完全に治癒した（すなわち，プロトン化／酸性化核酸での処置の開始から４日後）。
【０１１２】
さらに，２つの輸送媒体，すなわち水またはベヒクル混合物（水／エタノール／プロピレングリコール）に溶解したプロトン化／酸性化核酸の間では，治癒の進行にわずかの相違があった。耳顕微鏡検査に基づけば，ベヒクル混合物中のプロトン化／酸性化核酸は耳感染の治療においてわずかに有効性が高かった。
【０１１３】
結論として，プロトン化／酸性化核酸は，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにより引き起こされたチンチラの外耳感染の治療において有効性を示した。この感染性細菌は自然には抗生物質耐性細菌であるため，このことは重要である。
【０１１４】
実施例４：プロトン化／酸性化オリゴヌクレオチドの肺輸送
齧歯類モデル系および市販のジェットネブライザを用いて，酸性化／プロトン化オリゴヌクレオチドの肺輸送における有効性について試験する。これらの実験に用いたオリゴヌクレオチドは，滅菌水に溶解したプロトン化／酸性化ＡＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴ，配列番号９（２．８ｍＭｏｌａｒ）である。核酸は，ホスホジエステル結合の２’−Ｏ−メチル置換デオキシリボヌクレオチドからなり，末端を５’および３’末端の両方でブタノールで末端ブロックされている。オリゴヌクレオチドは，肺輸送のためにマイクロカプセル化してもよく，または裸の核酸として直接投与してもよい。
【０１１５】
マイクロカプセル化
プロトン化／酸性化オリゴヌクレオチドを含むリポソームを，硫酸アンモニウム勾配を利用する，リモート充填法（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３９：２１０４−２１１１（１９９５））を用いて調製した。
【０１１６】
感染および処置
改変Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の培養物にＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ生ワクチン株＃２９６６８４（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を接種し，３７℃で４−５日間インキュベートした。８０匹の６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスを麻酔し，それぞれをＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ培養物のＬＤ５０と等しい投与量（一般にマウス１匹あたり約５０μｌ）で鼻腔内感染させた。
【０１１７】
感染後２４時間において，マウスを２４ポートのノーズオンリーエアロゾル暴露チャンバにおいた。最初の実験群の２０匹のマウスを，ＰｕｒＲＤ  Ｒａｉｎｄｒｏｐネブライザ（Ｐｕｒｉｔａｎ−Ｂｅｒｍｅｔｔ，Ｌｅｎｏｘａ，Ｋａｎｓａｓ）を用いて生成したエアロゾル化リポソーム封入修飾オリゴヌクレオチドに暴露した。第２の実験群の２０匹のマウスを，水に溶解しエアロゾル化した裸の修飾オリゴヌクレオチド（これもＰｕｒＲＤ  Ｒａｉｎｄｒｏｐネブライザを用いてエアロゾル化）に暴露した。第１の対照群にはエアロゾル化リポソーム封入水を与え，第２の対照群にはエアロゾル化水を与えた。感染動物は，感染による症状の兆候および死亡について毎日モニターした。感染後第１４日に，感染から生存したマウスの数を測定した。
【０１１８】
リポソーム封入オリゴヌクレオチドを投与したマウスおよび裸のオリゴヌクレオチドを投与したマウスの両方とも，５５−６０％の生存率を示した。これに対し，対照群はいずれも０％の生存率を有していた。
【０１１９】
実施例５：リポソーム性プロトン化／酸性化モノマーのラットモデルへの肺輸送
次に，図１に示されるリポソーム封入プロトン化チミジンモノマーの肺輸送を，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの呼吸器感染の治療において試験した。
【０１２０】
動物モデルの調製
慢性肺感染の治療の動物モデルは，寒天ビーズ中にメッシュ化（ｅｎｍｅｓｈ）したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの株で気管内感染させたラットにおいて樹立した。この研究においては，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２つのＣＦ株を用いた。先に記載されているように（Ｄｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１），Ｐ（Ｒ）Ｐ４４３８株およびＰＡＯ株は，それぞれシプロフロキサシン耐性およびシプロフロキサシン感受性である。これらの株は，Ｄｒ．ＨａｒｖｅｙＲａｂｉｎ（嚢胞性線維症クリニック，Ｆｏｏｔｈｉｌｌｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ，Ｃａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から提供された。本研究において用いた，寒天ビーズ中にメッシュ化したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは，先に記載された方法（Ｃａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）を改変して，以下のように調製した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡＯおよびＰ（Ｒ）Ｐ４４３８株）を，１００ｍｌの黒い蓋付きボトル中で，２％グルコースを補充した２５ｍｌのＬＢ培地中で１６−１８時間成長させた。濁度はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ１６０Ｕ分光光度計を用いて波長６００ｎｍで測定した。培養物を約０．４ＯＤ600／ｍｌの濃度（５ｘ１０9ＣＦＵ／ｍｌ）に希釈した。次に，１ｍｌの細菌懸濁物を１９ｍｌの２％不活性寒天（ＰＢＳ中に溶解）に加えて，２．５ｘｌ０8ＣＦＵ／ｍｌの濃度を得た。２％不活性寒天（Ｓｉｇｍａ）は，細菌懸濁液に加える前に温水浴中で５０℃に暖めた。１０ｍｌの細菌−不活性寒天混合物を，コーニングホットプレート上で３．７５ｃｍ（ｌ）ｘ７ｍｍ（直径）の磁気撹拌子を用いて速度９で撹拌している２００ｍｌのミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）に一滴ずつ加えた。１０秒間撹拌した後，速度６で約１−２分間寒天を固化させた。
【０１２１】
次に，寒天ビーズ懸濁液を２５０ｍｌの遠心分離管に入れ，Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離器（モデルＪ２−２１Ｍ）およびＪＡ−１４ローターを用いて，８１００ｒｐｍ（〜１０，０００ｇ）で４℃で１５分間遠心分離した。上清を廃棄し，ペレットをフィルター滅菌した０．５％のデオキシコール酸（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。懸濁液を８１００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した。これをさらに１回繰り返し，上清を除去し，ゆるいペレットを得た。２０ｍｌのＰＢＳをペレットに加え，懸濁液を５０ｍｌファルコンチューブに移し，４０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した。上清を除去した後，最終ペレットを等量のＰＢＳに再懸濁して，５０：５０寒天ビーズ／ＰＢＳ懸濁液を得た。偽寒天ビーズ（細菌なし）は，細菌培養物なしで，同じ調製方法を用いて調製した。
【０１２２】
寒天ビーズ懸濁液（１ｍｌ）を１ｍｌシリンジを用いて５０ｍｌのファルコンチューブから取り出し，２ｍｌの組織ホモジナイザー中ですりつぶした。次に，ホモジナイズした溶液の１００μｌのアリコートを連続的に１０-5まで希釈した。各希釈物の１００μｌのアリコートをトリプチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）上に播種し，ＣＯ2，水冷却インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３７℃で１６−１８時間インキュベートした。プレートのコロニー形成ユニット（ＣＰＵ）を計数し，寒天ビーズの濃度を決定した。ラットに慢性の非致死的肺感染を樹立するための寒天ビーズ中のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの所望の濃度は，１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍＬであると決定された。４回の洗浄工程およびＰＢＳ中の１／２希釈後の細菌の収率は８％であると決定された。偽寒天ビーズの分析では，予測されたように，Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの成長は認められなかった。
【０１２３】
すりつぶしていない寒天ビーズ懸濁液１滴をスライド上に置き，風乾させた。寒天ビーズを位相差顕微鏡で２５Ｘ，４０Ｘおよび１００Ｘで観察し，サイズは直径１０−１５０μｍの範囲内にあると決定された。
【０１２４】
感染の動物モデルを作成するために，各ラットに合計約２−１０ｘ１０6個のメッシュ化細菌を投与した。気管内投与を用いて，ラットをメッシュ化寒天ビーズで感染させた。数群のラットをケタミン／キシラジン（体重１ｋｇあたり９０ｍｇケタミン，１０ｍｇキシラジンを筋肉内に投与）で麻酔した。ラットが意識不明となったとき，仰向けにおいた。後頸の基部から胸郭にわたって皮膚に約２−２．５ｃｍの正中切開を形成した。切開により暴露された下顎骨下唾液腺間の結合組織を２組の鉗子でつかみ，次にこれを横に引っ張って互いに離し，気管に被さる胸骨甲状筋を暴露した。筋肉は半分ずつが結合組織により一緒に保持されている。かなり強く押し下げながら１組の鉗子の点を筋肉の中心で上下させることによりこれらの２つの部分を分離した。このことにより，結合組織が裂け，２つの部分の間の中央平面が現れた。鉗子を用いて気管を暴露するよう保ちながら，気管の表面に小さい切開を作成した。次に，カーブした丸い先端の２２ゲージの針を切開中に挿入し，気管を右肺方向に送った。抵抗を感じたとき，特定の容量のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ含有寒天ビーズ（チャレンジ）または薬剤（治療）のいずれかをゆっくり注入した。感染後第２８日に，対照および処置ラットを安楽死させ，右肺および左肺の両方を無菌的に回収した。
【０１２５】
プロトン化モノマーのマイクロ封入
マイクロ封入プロトン化モノマーは，リモート充填小胞（ＲＬＶ）または多層状小胞（ＭＬＶ）リポソームのいずれかを用いて作成した。リモート充填のためには，Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）の方法の改変を用いて，リモート充填により製造したリポソーム−封入モノマーを調製した。単層板小胞は，２つの０．２μｍポリカーボネートフィルターを通して押し出した後に得た。モノマーは４００ｍＭ硫酸アンモニウム勾配を用いて充填した。脂質成分は５５：４５モル比のホスファチジルコリン／コレステロールから構成された。薬剤対脂質比は６．６５ｍｇ：３０μｍｏｌであった。
【０１２６】
ＭＬＶリポソーム−封入プロトン化モノマーは，凍結乾燥封入法を用いて調製した。これは，Ｋｉｒｂｙ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１：３３−４５（１９８４））の方法に基づき，Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌにより記載された方法の改変である。この方法は，比較的高いトラップ効率が得られる簡単かつ穏和な方法であるため選択した。脂質混合物は卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ），コレステロール（ＣＨＯＬ）およびジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）をモル比７：２：１で含有した。薬剤対脂質比は１６６μｇモノマー：１μｍｏｌ脂質であった。典型的な大量製造においては，大きい１０００ｍｌのＲＢフラスコ中で２４１μｍｏｌの総脂質を２０ｍｌのクロロホルムに溶解した。回転蒸発器ですべてのクロロホルムを蒸発させ，ＲＢフラスコの下半分に脂質フィルムの均一な層を得た。脂質フィルムを真空オーブン中で８５ｋＰａで４５℃で１時間さらに乾燥した。脂質フィルムを０．９％食塩水でｐＨ＝７で再水和させて多層状小胞（ＭＬＬＶ）を得，次にガラスバイアル中に分取した。次に，各バイアル中の脂質溶液を液体窒素中に沈めることにより凍結した。試料を１８時間凍結乾燥して，脂質の白色粉末を形成させた。０．５ｍｌの凍結乾燥脂質懸濁液を含むガラスバイアルを１１８μｌのＮＵ−３（６６００Ａ／ｍｌ）で水和した。試料を加熱ブロックで４５℃で１５分間加熱し，次に２２℃で１時間放置した。０．９％Ｎａｃｅ（ｐＨ＝７，４ｍｌ）を粘稠な懸濁液に加え，５０，０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離により遊離のプロトン化モノマーを除去した。
【０１２７】
肺ホモジネートの細菌負荷の判定
動物モデルの肺における細菌負荷（および後の実験における対照および処置ラットの細菌負荷）を決定するために，肺を無菌的に回収した。次に，各肺を５ｍｌの滅菌リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で手で支える組織グラインダーを用いてホモジナイズし，次に氷中においた。次に上清を播種して，トリプチカーゼ大豆寒天（ＴＡ）プレートで成長させた。接種したプレートを３７℃で１−２日間インキュベートし，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの数を測定した。動物モデルにおけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染の進行は，以下の表１に示される。
【表７】
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【０１２８】
プロトン化モノマーの気管内投与
感染ラットをリポソーム封入プロトン化モノマーの気管内投与を用いて処置するために，最初に，先に記載したように，ラットを筋肉内注射によりケタミン／キシラジンで麻酔した。麻酔した後，ラットを単一用量のリポソーム封入プロトン化モノマー（ＭＬＶ，ＲＬＶ，または小単層小胞，ＳＵＶ）で，２６００Ａ／ｍｌ（ラット１匹あたり２５０μｌ）の濃度で，右肺への気管内点滴により処置した。未処置感染対照ラットには，等容量のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を投与した。気管内投与の後，術後の保護を維持して完全な快復を確実にした。処置の４日後，ラットを過剰量のケタミン／キシラジンにより安楽死させ，肺を回収し，ホモジナイズし，細菌負荷を測定した。
【０１２９】
リポソーム−封入プロトン化モノマーの気管内投与は，処置群においては，未処置対照と比較して，コロニー形成単位（ＣＦＵ）の適度の約１−２ｌｏｇ10の減少を示した。以下の表２を参照。
【表８】
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【０１３０】
感染ラットを単一のエアロゾル処置でリポソーム封入プロトン化モノマーで処置すると，処置ラットの３３％で肺ホモジネートからＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが根絶され，残りの６７％は，ＰＢＳ処置群と比較して有意なＣＦＵ減少を示した。これらの結果は，リポソーム−封入プロトン化モノマーのエアロゾル輸送が，嚢胞性線維症患者において肺Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染に対する有望な治療法を提供するであろうことを示唆する。
【０１３１】
リポソーム含有エアロゾルの生成および特性決定
リポソーム性プロトン化モノマーの肺輸送用のエアロゾル吸入を評価するために，リポソームを破壊せずに呼吸可能なサイズの範囲内になるようエアロゾル化粒子を製造した。
【０１３２】
リポソーム封入プロトン化モノマー（ＲＬＶ）を，ジェットネブライザＰａｒｉ  ＬＣ  ＳＴＡＲ（Ｐａｒｉ，，Ｓｔａｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてエアロゾル化した。ＲＬＶリポソーム封入プロトン化モノマー（１３００Ａ／ｍｌ）を容量４ｍｌでネブライザのリザーバーに加えた。エアロゾルは，乾燥圧縮空気を用いて，４０ｌｂｓ／ｉｎ．2で流速４Ｌ／ｍｉｎで生成した。生成したエアロゾル粒子は，エアロゾル運転の種々の段階で，レーザー空力学粒子サイザー（ＡＰＳ）（モデル３３２０；ＴＳＩ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）およびＡＰＳ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．９（ＴＳＩ）を用いてモニターし，特性決定した。リポソーム封入薬剤を含有するエアロゾル粒子を，ＭＭＡＤ，幾何学的標準偏差（ＧＳＤ）およびピーク粒子計数（ＰＰＣ）について特性決定した。
【０１３３】
リポソーム封入プロトン化モノマーエアロゾルの空力学的粒子のサイズは，質量平均空力学的直径（ＭＭＡＤ）が３．８±０．２μｍ，幾何学的標準偏差が２．２μｍであり，粒子の約９０％が２μｍ未満で生成されたことを示した。エアロゾルの典型的な粒子サイズ分布を図２に示す。
【０１３４】
メッシュ化Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させたラットを，リポソーム封入プロトン化モノマーまたはリポソーム化ＰＢＳで処置した。感染後第２週に処置を施した。メッシュ化Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させたラットを２４ポートのノーズオンリーエアロゾル暴露チャンバ（Ｉｎ−Ｔｏｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）においた。次に，動物を，エアロゾルリポソーム封入プロトン化モノマーまたはリポソーム化ＰＢＳに７０分間暴露した。Ｐａｒｉ  ＬＣ  ＳＴＡＲネブライザ（Ｐａｒｉ，Ｓｔａｍｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてこれらのエアロゾル粒子を生成させ，先に記載したようにＡＰＳシステムを用いて特性決定した。処置後第４日において，過剰量のケタミン／キシラジンによりラットを安楽死させ，肺を回収し，ホモジナイズし，細菌負荷を測定した。
【０１３５】
エアロゾル化ＰＢＳで処置したラットの肺においては，５匹すべてのラットは，未処置右肺において１．２ｘ１０6から４．０ｘ１０8の範囲のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣＦＵ数を示した。これに対し，処置ラット肺は，有意に減少したＣＦＵを示すか（２／６），または成長を示さなかった（４／６ラット）。以下の表３を参照。これらの結果は，リポソーム性モノマーのエアロゾル化輸送もまた肺における細菌感染の治療に有効であることを示す。
【表９】
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【０１３６】
特定の態様を参照して本発明を説明してきたが，当業者には，本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく，種々の変更および均等物をなしうることが理解される。さらに，特定の状況，材料，組成，方法，工程を本発明の目的，精神および範囲に適合させるために多くの改変をなすことができる。すべてのそのような改変は，特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は，肺感染研究に用いたプロトン化モノマーの化学的構造を示す。
【図２】  図２は，リポソーム性プロトン化モノマーの肺輸送に用いたエアロゾルの典型的な粒子サイズ分布を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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