(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
1x10-6M未満の解離定数（KD）でヒトKDRタンパク質の細胞外ドメインに結合し、SEQ ID NO:192のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一であるアミノ酸配列を含むフィブロネクチンタイプIIIの10番目（10Fn3）のドメイン、を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
10Fn3ドメインがN末端からC末端の順に以下を含む、請求項1記載のポリペプチド：
a) βストランドまたはβ様ストランド、A；
b) ループ、AB；
c) βストランド、B；
d) ループ、BC；
e) βストランド C；
f) ループ CD；
g) βストランド D；
h) ループ DE；
i) βストランド F；
j) ループ FG；および
k)βストランドまたはβ様ストランド、G。
【請求項３】
ループFGがKDR結合に関与する、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ループBC、DE、およびFGがKDR結合に関与する、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項５】
哺乳動物におけるポリペプチドの排除速度を未修飾ポリペプチドの1/3未満に減少させる部分に結合され、当該部分が、ポリエチレングリコール、糖、シアル酸、許容性の良好なタンパク質部分、Fc断片および血清アルブミンからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６】
排除速度を減少させる部分がポリエチレングリコール部分である、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリエチレングリコール部分がポリペプチドのチオール部分またはアミン部分に共有結合されている、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項８】
1x10-7M未満の解離定数（KD）でヒトKDRタンパク質の細胞外ドメインに結合し、KDR媒介性VEGF活性を阻害する、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
VEGF-AのVEGF165アイソフォームと競合的にKDRに結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
VEGF-AおよびVEGF-Dと競合的にKDRに結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
1x10-6M未満のKDでマウスFlk1の細胞外ドメインとも結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO:194のアミノ酸配列を含む、請求項12記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリエチレングリコール部分が93位のシステイン残基に共有結合されている、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリエチレングリコール部分が約10 kDa〜約60 kDaの分子量を有する、請求項14記載のポリペプチド。
【請求項１６】
VEGFの生物活性を阻害する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１７】
50 nM以下のKDでKDRと結合する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１８】
1x10-7M未満の解離定数（KD）でヒトKDRタンパク質の細胞外ドメインに結合し、KDR媒介性VEGF活性を阻害する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む治療製剤。
【請求項２０】
過剰増殖性病態の治療の際に使用するための、請求項8記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項２１】
請求項1記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２２】
SEQ ID NO:192-194からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項21記載の核酸。
【請求項２３】
プロモーターと機能的に連結された請求項21又は22記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項21又は22記載の核酸を含む細胞。
【請求項２５】
請求項1記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸を発現させる段階を含む、請求項１記載のポリペプチドを生成する方法。
【請求項２６】
核酸が、SEQ ID NO:192-194からなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
核酸が細胞内で発現される、請求項25又は26記載の方法。
【請求項２８】
核酸が無細胞系で発現される、請求項25又は26記載の方法。
【請求項２９】
SEQ ID NO:194のアミノ酸配列からなるポリペプチド、該ポリペプチドの93位のシステイン残基に共有結合されている分岐型40 kDa ポリエチレングリコール部分、および薬学的に許容される担体を含む、治療製剤。
【請求項３０】
10Fn3ドメインがSEQ ID NO:192のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ポリエチレングリコール部分が10 kDa〜60 kDaの分子量を有する、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ポリエチレングリコール部分が40 kDaの分子量を有し、分岐型である、請求項6記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規な血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）結合ポリペプチド、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）によって媒介される生物活性を阻害するためのこれらのポリペプチドの使用法に関する。【０００２】
関連出願
本出願は、「Inhibitors of Vascular Endothelial Growth Factor Receptors」という名称で2003年12月5日に出願した米国仮特許出願第60/527,886号の出願日の恩典を主張する。上記参照出願の教示はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】発明の背景
血管新生は、既存の毛細血管または後毛細管細静脈から新たな血管が形成される過程であり；これは、排卵、胚発生、創傷修復、および心筋での側枝血管の生成を含む多くの生理学的過程の重要な構成要素である。血管新生はまた、腫瘍の増殖および転移、糖尿病網膜症、ならびに黄斑変性症などの多くの病理学的状態の中核をなす。多くの場合、この過程は、様々なサイトカインおよび増殖因子に応答した既存の血管内皮細胞の活性化から始まる。癌においては、腫瘍から放出さるサイトカインまたは血管新生因子が、特定の細胞表面受容体と相互作用することによって血管内皮細胞を刺激する。活性化された内皮細胞は血管の基底膜を分解する酵素を分泌し、内皮細胞が腫瘍組織に浸潤できるようになる。このような状態になったならば、内皮細胞は分化して既存の血管の新たな血管側枝を形成する。新たな血管は腫瘍に栄養分を提供し、よってさらなる増殖が促進され、また新たな血管は転移経路を提供する。【０００４】  今日までに、特に強力な因子ＶＥＧＦを含む多くの血管新生因子が同定されている。ＶＥＧＦは最初、濾胞星状細胞の馴化培地および種々の細胞株から精製された。最近になって、ＶＥＧＦの多くの構造類似体および選択的スプライシング型が同定された。様々な形態のＶＥＧＦが、高親和性リガンドとして一連のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合する。ＶＥＧＦＲはチロシンキナーゼ受容体であり、その多くは血管新生の重要な調節因子である。ＶＥＧＦＲファミリーは以下の３つの主要なサブタイプを含む：ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２（ヒトでは、キナーゼインサートドメイン受容体、「ＫＤＲ」としても知られる）、およびＶＥＧＦＲ−３。ＶＥＧＦの形態の中で、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２と結合し、これを活性化することが知られている。【０００５】  同族受容体を介して作用するＶＥＧＦは、血管新生過程において血管内皮特異的マイトジェンとして機能し得る。さらに、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲは、癌などの不適切な血管新生によって特徴づけられる状況において上方制御されているという実質的な証拠が存在する。その結果、多くの研究が、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを標的にするおよび阻害する治療法の同定に重点を置いている。【０００６】  ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを標的にするまたは阻害する現在の治療アプローチには、抗体、ペプチド、および小分子キナーゼ阻害剤が含まれる。これらのうち抗体が、リガンドおよび細胞受容体のインビボ認識および阻害のために最も広く用いられている。高度に特異的な抗体は、受容体−リガンド相互作用を阻止し、それによってその成分の生物活性を中和するため、およびまた表面上に同族受容体を発現している細胞に毒物を特異的に送達するために用いられている。抗体は効果的ではあるものの、生成するのに組換え哺乳動物細胞における発現に依存する、大きく複雑な分子である。抗体はまた、補体経路の活性化および抗体介在性細胞傷害性を含む、望ましくない場合が多い様々な副作用をもたらす。その結果、不適切な血管新生によって特徴づけられる癌などの疾患の治療として、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ経路を特異的に阻害し得る有効な治療法の必要性が残っている。
【発明の開示】
【０００７】発明の概要
一つには、本開示は、ＶＥＧＦＲ−２受容体、特にヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲとしても知られる）およびマウスＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１としても知られる）に結合する新規な単一ドメインポリペプチドを提供する。本明細書に記載するＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質は、例えば、インビボまたはインビトロでＶＥＧＦＲ−２を検出するために使用できる。さらに、本明細書に記載する特定のＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−２媒介性生物活性に関連する疾患を治療するために使用できる。例えば、ＫＤＲはＶＥＧＦの血管新生促進作用を媒介するため、本開示の特定のＫＤＲ結合タンパク質はヒト患者において血管新生を抑制するために使用できる。本開示の特定のＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、および網膜症などの疾患を治療するために使用できる。組織の細胞の過剰増殖に関連した多くの疾患は血管新生成分を含むと考えられ、したがって本明細書に記載する特定のＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質を用いてそのような疾患を治療し得ることが期待される。
【０００８】  本明細書に記載する単一ドメインポリペプチドは一般にＶＥＧＦＲ−２などの標的に結合するポリペプチドであり、標的結合活性は、抗原結合活性が一般に重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方によってもたらされる抗体および一本鎖抗体とは区別されて、単一構造ドメイン内に存在する。本開示はまた、標的に結合する単一ドメインポリペプチドを含み得るより大きなタンパク質を提供する。例えば、結合活性が増加した複合分子を作製するために、複数の単一ドメインポリペプチドを結合することができる。同様に、単一ドメインポリペプチドを多くの他のポリペプチドに（例えば、融合タンパク質として）結合することができる。特定の局面において、単一ドメインポリペプチドは、免疫グロブリンドメインおよび免疫グロブリン様ドメインによって例証される、少なくとも２つのβシートに内に分布する少なくとも５〜７個のβストランドまたはβ様ストランドを含み得る。β様ストランドとは、単一ドメインポリペプチドの安定化に関与するが、必ずしもβストランドの高次構造をとるとは限らないアミノ酸の鎖である。β様ストランドがタンパク質の安定化に関与しているかどうかは、その鎖を欠失させるかまたは鎖の配列を変更し、タンパク質の安定性が減少するかどうかを解析することによって評価し得る。安定性は、例えば熱変性および再生実験によって評価することができる。好ましくは、単一ドメインポリペプチドは２つ以下のβ様ストランドを含む。β様ストランドは通常αヘリックス高次構造をとらず、ランダムコイル構造をとり得る。免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリン様ドメインでは、β様ストランドは、そうでなければ最もＮ末端側のβストランドまたは最もＣ末端側のβストランドによって占有される構造内の位置に存在する場合が最も多い。タンパク質配列の内部に位置する場合に通常βストランドを形成するアミノ酸鎖は、Ｎ末端またはＣ末端に近い位置に位置する場合、明白にはβストランドではなく、本明細書においてβ様ストランドと称する高次構造をとり得る。
【０００９】  特定の態様において、本開示は、ＶＥＧＦＲ−２に結合する単一ドメインポリペプチドを提供する。好ましくは、単一ドメインポリペプチドはヒトＫＤＲ、マウスＦｌｋ−１、またはその両方に結合する。単一ドメインポリペプチドは、少なくとも２つのβシートの間に分布する少なくとも７つのβストランドまたはβ様ストランド、および２つのβストランドまたはβ様ストランドを結合する、ＶＥＧＦＲ−２への結合に関与する少なくとも１つのループ部分を含む構造構成を有する約８０〜約１５０アミノ酸を含み得る。すなわち、ループ部分は２つのβストランド、２つのβ様ストランド、または１つのβストランドと１つのβ様ストランドを結合し得る。典型的に、１つまたは複数のループ部分はＶＥＧＦＲ−２結合に関与するが、１つのまたは複数のβストランドまたはβ様ストランド部分、特にループ部分に最も近接して位置するβストランドまたはβ様ストランド部分もまたＶＥＧＦＲ−２結合に関与する可能性がある。単一ドメインポリペプチドは、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリン様ドメインである構造単位を含み得る。単一ドメインポリペプチドはＶＥＧＦＲ−２の任意の部分に結合し得るが、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインに結合するポリペプチドが好ましい。結合は、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）に関して、および速度定数（例えば、結合速度定数、Ｋｏｎ、および解離速度定数、ｋｏｆｆ）に関して評価され得る。単一ドメインポリペプチドは典型的に、１０−６Ｍ未満、または１０−７Ｍ、５ｘ１０−８Ｍ、１０−８Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ−２に結合するように選択される。ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、ＶＥＧＦファミリーの１つ、２つ、またはそれ以上のメンバー、特にＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄとの結合に関して競合し得り、血管内皮細胞の増殖、血管の透過化、および血管内皮細胞の運動性の増加などの１つまたは複数のＶＥＧＦＲ−２媒介性生物学的事象を抑制し得る。ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、治療目的に、およびＶＥＧＦＲ−２の検出または結合が関与する任意の目的に使用することができる。治療に使用するためのポリペプチドは一般に、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫＤを有するが、ｋｏｆｆが十分に低いかまたはｋｏｎが十分に高い場合にはより高いＫＤ値も許容され得る。特定の態様において、ＶＥＧＦＲ−２に結合する単一ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群より選択される共通ＶＥＧＦＲ−２結合配列を含む。好ましくは、そのような配列はループ、特にＦＧループ内に位置している。
【００１０】  特定の態様において、単一ドメインポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）可変ドメインを含む。Ｉｇ可変ドメインは、例えば、ヒトＶＬドメイン、ヒトＶＨドメイン、およびラクダＶＨＨドメインからなる群より選択され得る。Ｉｇ可変領域の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のループはＶＥＧＦＲ−２への結合に関与し得り、典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３として知られるループのいずれかがＶＥＧＦＲ−２結合に関与する。
【００１１】  特定の態様において、単一ドメインポリペプチドは免疫グロブリン様ドメインを含む。免疫グロブリン様ドメインの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のループは、ＶＥＧＦＲ−２への結合に関与し得る。好ましい免疫グロブリン様ドメインは、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ドメインである。そのようなドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、βストランドまたはβ様ストランド、Ａ；ループ、超；βストランド、Ｂ；ループ、ＢＣ；βストランドＣ；ループＣＤ；βストランドＤ；ループＤＥ；βストランドＦ；ループＦＧ；およびβストランドまたはβ様ストランドＧを含み得る。構造構成の例として、図２２を参照されたい。任意に、ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたはすべてがＶＥＧＦＲ−２結合に関与し得るが、好ましいループはＢＣ、ＤＥ、およびＦＧである。好ましいＦｎ３ドメインはヒトフィブロネクチンに由来するＦｎ３ドメインであり、特に１０Ｆｎ３と称されるフィブロネクチンの１０番目のＦｎ３ドメインである。本明細書に開示するいずれのＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドも、天然１０Ｆｎ３と同一のアミノ酸配列を有さないこと；配列はＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質が得られるように改変されているが、タンパク質は１０Ｆｎ３の基本的な構造特性を有すること、および特に、天然１０Ｆｎ３との認識できる配列相同性を保持するものをそれでもなお本明細書では「１０Ｆｎ３ポリペプチド」と称することに留意されたい。この命名法は、例えば、特定の標的タンパク質に対して作製された組換え抗体ＶＬドメインは任意の天然ＶＬドメインと同一ではない場合もあるが、それにもかかわらずこのタンパク質がＶＬタンパク質と承認される、抗体分野において認められる命名法と類似している。１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であってよい。可変性の大部分は一般に、１つまたは複数のループ内に存在する。そのような可変性が生理的条件においてポリペプチドの安定性を破壊しないならば、１０Ｆｎ３ポリペプチドのβストランドまたはβ様ストランドはそれぞれ本質的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の対応するβストランドまたはβ様ストランドの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列からなってよい。１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の対応するループの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的になるループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの配列をそれぞれ有し得る。多くの場合、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのいずれかまたはすべては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と比較して保存性が低い。例えば、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧはすべて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の対応するループと２０％、１０％未満、または０％の同一性であってよい。
【００１２】  特定の態様において、本開示は、ＶＥＧＦＲ−２に結合する免疫グロブリン様折りたたみを有するドメインを含む非抗体ポリペプチドを提供する。非抗体ポリペプチドは２０ｋＤａ未満または１５ｋＤａ未満の分子量を有し得り、一般に（例えば、アミノ酸配列の変更により）Ｆｎ３骨格などの参照または「骨格」タンパク質に由来する。非抗体ポリペプチドは、１０−６Ｍ未満、または１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ−２と結合し得る。未改変の参照タンパク質はＶＥＧＦＲ−２に意味をもって結合しないか、または１０−６Ｍを超えるＫＤで結合する。非抗体ポリペプチドは、特に５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫＤを有する場合にＶＥＧＦシグナル伝達を阻害し得るが、ｋｏｆｆが十分に低い場合には（例えば、５ｘ１０−４  Ｓ−１）それよりも高いＫＤ値も許容され得る。免疫グロブリン様折りたたみは１０Ｆｎ３ポリペプチドであってよい。
【００１３】
特定の態様において、本開示は、VEGFR-2に結合する免疫グロブリン折りたたみを有する単一ドメインを含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドは20 kDa未満または15 kDa未の分子量を有し得り、一般に（例えば、アミノ酸配列の変更により）免疫グロブリンの可変ドメインに由来する。ポリペプチドは、10-6M未満、または10-7M未満、5x10-8 M未満、10-8M未満、もしくは10-9M未満のKDでVEGFR-2と結合し得る。ポリペプチドは、特に5x10-8M未満、10-8M未満、または10-9M未満のKDを有する場合にVEGFシグナル伝達を阻害し得るが、koffが十分に低いかまたはkonが十分に高い場合にはそれよりも高いKD値も許容され得る。特定の好ましい態様において、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに由来する免疫グロブリン折りたたみを有し、VEGFR-2に結合し得る単一ドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:241〜310からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００１４】  特定の好ましい態様において、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２〜１９４のいずれかのアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質を提供する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの場合、関心対象のＰＥＧ部分または他の部分を９３位にシステインに共有結合することができる。ＰＥＧ部分はまた、ポリペプチド内のアミン部分に共有結合することもできる。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのＮ末端に見出される１級アミンまたはリジンもしくはアルギニンなどのアミノ酸内に存在するアミン基であってよい。特定の態様において、ＰＥＧ部分は、ａ）Ｎ末端、ｂ）Ｎ末端と最もＮ末端側のβストランドまたはβ様ストランドの間；ｃ）標的結合部位と反対側のポリペプチド面上に位置するループ；ｄ）Ｃ末端と最もＣ末端側のβストランドまたはβ様ストランドの間；およびｅ）Ｃ末端からなる群より選択されるポリペプチド上の位置に結合される。
【００１５】
特定の局面において、本開示は、VEGFR-2結合を媒介する短いペプチド配列を提供する。そのような配列は、単離された形態で、または免疫グロブリもしくは免疫グロブリン様ドメインなどの特定のタンパク質構造内に挿入された場合に、VEGFR-2結合を媒介し得る。そのような配列の例には、SEQ ID NO:1〜4として開示される配列、およびSEQ ID NO:1〜4と少なくとも85%、90%、または95%同一であり、かつVEGFR-2結合活性を保持する他の配列が含まれる。したがって本開示は、SEQ ID NO:1〜4のいずれかの配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、VEGFR-2に結合し、かつVEGFR-2への結合に関してVEGF種と競合する実質的に純粋なポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドの例には、SEQ ID NO:6〜183、186〜197、および199のいずれかの配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。好ましくは、そのようなポリペプチドはVEGFの生物活性を阻害し、10-6M未満、または10-7M未満、5x10-8M未満、10-8M未満、もしくは10-9M未満のKDでVEGFR-2と結合し得る。
【００１６】  特定の態様においては、本明細書に記載するＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドのいずれかを、例えば、同様にＶＥＧＦＲ−２に結合する部分（例えば、第２の同一なまたは異なるＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチド）、異なる標的に結合する部分（例えば、二重特異性性結合剤を作製するため）、標識部分、タンパク質の精製を容易にする部分、または改善された薬物動態を提供する部分を含む、１つまたは複数のさらなる部分と結合することができる。薬物動態の改善は、認知される治療必要性に従って評価され得る。おそらくは投薬後にタンパク質が血清中に利用できる状態で残存する時間を延長することによって、生物学的利用能を増加させることおよび／または投薬間の時間を延長することが望ましい場合が多い。場合によっては、長期にわたるタンパク質の血清濃度の継続性を改善すること（例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の相違を減少させること）が望ましい。血液からのタンパク質排除を遅延させる傾向がある部分には、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）、および許容性の良好なタンパク質部分（例えば、Ｆｃ断片または血清アルブミン）が含まれる。単一ドメインポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、またはヒト）におけるポリペプチドの排除速度を未修飾ポリペプチドの１／３未満に減少させる部分に結合させることができる。薬物動態の改善の他の尺度には血中半減期が含まれ得り、血中半減期はα相とβ相に分類される場合が多い。適切な部分を付加することによって、これらの相の一方または両方を改善することができる。ポリエチレングリコールを使用する場合、１つまたは複数のＰＥＧ分子をタンパク質の異なる位置に結合することができ、そのような結合は、アミン、チオール、または他の適切な反応基との反応によって達成され得る。ＰＥＧ化は、適切な反応基をタンパク質に導入して、ＰＥＧ化が優先的に起こる部位を作製する、部位特異的ＰＥＧ化によって達成され得る。好ましい態様において、タンパク質は、所望の位置でシステイン残基を有し、システインにおける部位特異的ＰＥＧ化が可能になるように改変される。ＰＥＧの分子量は広範囲にわたり様々であってよく、ＰＥＧは分岐していても直鎖状であってもよい。特に本開示は、ＰＥＧ化が１０Ｆｎ３ポリペプチドの標的結合活性と適合し得ること、およびさらにＰＥＧ化によってそのようなポリペプチドの薬物動態が改善されることを証明する。したがって、１つの態様において本開示は、そのようなポリペプチドが結合し得る標的にかかわらず、ＰＥＧ化型の１０Ｆｎ３ポリペプチドを提供する。
【００１７】  特定の態様において、本開示は、本明細書に開示するＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドのいずれかを含む製剤を提供する。製剤は、ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む治療製剤であってよい。製剤はまた、抗癌剤または抗血管新生剤などのさらなる活性物質を含む複合製剤であってよい。
【００１８】  特定の局面において、本開示は、細胞中のＶＥＧＦ生物活性を阻害するため、またはＶＥＧＦＲ−２によって媒介される生物活性を阻害するために、ＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質を使用する方法を提供する。細胞はインビボに存在してもエクスビボに存在してもよく、例えば生体の細胞、培養細胞、または組織試料中の細胞であってよい。本方法は、細胞を、本明細書において開示するＶＥＧＦＲ−２阻害ポリペプチドのいずれかと、そのような生物活性を阻害するのに十分な量でおよび十分な時間接触させる段階を含み得る。
【００１９】  特定の局面において、本開示は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２の阻害に応答する病態を有する患者を治療する方法を提供する。そのような方法は、患者に、本明細書に記載するＶＥＧＦＲ−２阻害ポリペプチドのいずれかの有効量を投与する段階を含み得る。病態は、不適切な血管新生によって特徴づけられる病態であってよい。病態は過剰増殖性病態であってよい。治療に適した病態（または疾患）の例には、自己免疫疾患、炎症性疾患、網膜症（特に増殖性網膜症）、および癌が含まれる。疾患、特に自己免疫疾患、炎症性疾患、網膜症、および癌からなる群より選択される疾患を治療する医薬品を調製するために、本明細書に記載するＶＥＧＲ−２阻害ポリペプチドのいずれかを使用することができる。
【００２０】  特定の局面において、本開示は、試料中のＶＥＧＦＲ−２を検出する方法を提供する。方法は、ポリペプチド−ＶＥＧＦＲ−２複合体が形成され得る条件下で、試料を本明細書に記載するＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドと接触させる段階；および複合体を検出し、それによって試料中のＶＥＧＦＲ−２を検出する段階を含み得る。検出は、例えば、Ｘ線検査、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析、または表面プラズモン共鳴など、当技術分野において周知である任意の技法を用いて実施し得る。試料は、生検試料、特に腫瘍の生検試料、疑わしい腫瘍、または望ましくない血管新生を起こしていることが疑われる組織などの生物試料である場合が多い。試料は、ヒトまたは他の哺乳動物に由来し得る。ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、放射性部分、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、ハプテン部分などで標識することができる。
ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、固体支持体上に固定化してもよい。
【００２１】
本開示の別の局面は、本明細書に掲示するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸に関する。特定の態様において、核酸は、SEQ ID NO:6〜183、186〜197、199、および241〜528のいずれかからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。特定の態様において、核酸は、ストリンジェントな条件においてSEQ ID NO:184の核酸配列とハイブリダイズし、ヒトKDRと1x10-6M未満のKDで結合するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。特定の態様において、核酸は、SEQ ID NO:184およびSEQ ID NO:185からなる群より選択される核酸配列を含み得る。
【００２２】
本開示のさらなる局面は、プロモーターと機能的に連結された、本明細書に開示するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。本開示の別の局面は、本明細書に開示する核酸を含む細胞に関する。また、本開示のポリペプチドをコードする核酸を発現させる段階を含む、VEGFR-2、例えばKDRと結合するポリペプチドを生成する方法を提供する。特定の態様において、核酸は、SEQ ID NO:6〜183、186〜197、199、および241〜528のいずれかからなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含み得る。特定の局面において、核酸は、ストリンジェントな条件においてSEQ ID NO:184の核酸配列とハイブリダイズする配列を含む。特定の態様において、核酸は、SEQ ID NO:184およびSEQ ID NO:185からなる群より選択される核酸配列を含む。特定の態様において、核酸は細胞内で発現される。または、核酸は無細胞系で発現される。
【００２３】  特定の局面において、本開示は、ポリペプチドがどの標的に結合するように操作されるかにかかわらず、任意の１０Ｆｎ３ポリペプチドに適用できる発見を提供する。
上記のように、本開示は、ＰＥＧを用いて、標的結合を大きく妨げることなく１０Ｆｎ３ポリペプチドの薬物動態の改善に成功し得ることを実証する。したがって本開示は、標的に結合し、かつ非ＰＥＧ化ポリペプチドと比較して改善された薬物動態を有するＰＥＧ化１０Ｆｎ３ポリペプチドを提供する。さらなる態様において、本開示は、１０Ｆｎ３ポリペプチドの最初の８アミノ酸を欠失させることで、標的結合親和性が増加し得ることを実証する。したがって本開示は、最初の８アミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を参照にして番号付けされたアミノ酸）を欠く１０Ｆｎ３ポリペプチドを提供する。翻訳および適切なプロセシングを促進するために、１つまたは２つのアミノ酸を欠失型のポリペプチドに付加し得ることが理解される。本開示は、１０Ｆｎ３ポリペプチドの皮下投与によって、ポリペプチドの血流への放出が遅延されること、および１０Ｆｎ３ポリペプチドの最大血清濃度が減少することを実証する。したがって本開示は、皮下投与によって患者に１０Ｆｎ３ポリペプチドを投与する方法を提供する。この投与経路は、静脈内投与と比較して放出の遅延を達成するために、および／または同等の投与量を静脈内投与することによって達成される最大血清濃度と比較して、１０Ｆｎ３ポリペプチドの最大血清濃度を少なくとも２５％または少なくとも５０％減少させるために有用であり得る。投与する１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ポリエチレングリコール部分など、１０Ｆｎ３ポリペプチドの血中半減期を延長させる（または排除速度を減少させる、もしくは同様に別の薬物動態パラメータに影響を及ぼす）部分と結合することができる。好ましくは、投与する１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２４】  特定の局面において、本開示は、第１哺乳動物に由来する予め選択された標的タンパク質、および第２哺乳動物に由来するその相同体に結合する単一ドメインポリペプチドを提供する。そのような単一ドメインポリペプチドは、第１哺乳動物がヒトであり、第２哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、イヌ、または非ヒト霊長動物など、前臨床試験を行うのに望ましい哺乳動物である場合に、特に有用である。本開示は、そのような二重特異性を有するように単一ドメインポリペプチドを操作できること、ならびに二重特異性によって、ヒト細胞、ヒト対象、および動物モデルにおいて同じポリペプチドを試験できることで、薬物開発が簡便になることを実証する。好ましくは、二重特異性ポリペプチドが作製できるように、第１哺乳動物の予め選択された標的タンパク質と第２哺乳動物に由来するその相同体のアミノ酸配列は、十分に類似している。例えば、予め選択された標的タンパク質および第２哺乳動物に由来する相同体は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたり少なくとも８０％、９０％、または９５％の同一性を共有し得り、任意には全タンパク質配列にわたり、または膜タンパク質の場合には細胞外ドメインの配列にわたり、少なくとも８０％、９０％、または９５％の同一性を共有し得る。この種類の二重特異性結合特性を有する単一ドメインポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様ドメインを含み得り、好ましくは、１ｘ１０−６Ｍ、１ｘ１０−７Ｍ、５ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、または１ｘ１０−９Ｍ未満の解離定数で、予め選択されたヒト標的タンパク質およびその相同体の両方に結合する。
【００２５】発明の詳細な説明
１．概要
本明細書はとりわけ、ＶＥＧＦＲ−２受容体に結合する新規な単一ドメインポリペプチドの同定および生成について記載する。ヒトではＫＤＲおよびマウスではＦＬＫ−１とも称されるＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦシグナル伝達の血管新生促進効果の主要なメディエーターである。ＶＥＧＦＲ−２にはＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄが結合し、ＶＥＧＦＲ−２はこれらによって活性化される。血管内皮細胞では、ＶＥＧＦＲ−２の活性化によって細胞の増殖および遊走が促進され、インビボでは、ＶＥＧＦＲ−２の活性化によって血管新生が誘発され、また脈管構造の透過性が増加する。血管新生の増大は腫瘍増殖および様々な網膜症の重要な特徴として確立しており、脈管構造の透過性の増加は多くの炎症反応における重要な事象である。
【００２６】  本開示は、ＶＥＧＦＲ−２に結合する何百もの単一ドメインポリペプチドを提供するが、その多くはインビトロおよび／またはインビボＶＥＧＦアンタゴニスト活性を示す。ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する単一ドメインポリペプチドは、多くの治療用途において有用であると考えられる。抗ＫＤＲ抗体は、癌および癌に起因する合併症から増殖性網膜症、炎症性疾患、および線維症にわたる疾患および病態に対して、インビボ有用性を有するとして確立されている。本明細書に提示するインビボおよびインビトロデータによれば、単一ドメインポリペプチドは同じ疾患範囲の治療において有用であると考えられる。
【００２７】  治療用途に加えて、ＶＥＧＦＲ−２結合単一ドメインポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−２を検出することが望ましい任意の状況において使用することができる。例えば、造血系統の特に有用な細胞を含む多くの幹細胞はＶＥＧＦＲ−２を発現する。ＫＤＲ結合ポリペプチドを特に標識形式で使用して、幹細胞を検出することおよび細胞選別を容易にすることができる。インビボでは、標識ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドを用いて、ＶＥＧＦＲ−２が発現されている組織を画像化することができる。ＶＥＧＦＲ−２発現の上昇は、特に高レベルの血管新生活性または炎症活性を表している組織に特有である。組織試料の組織学的解析もまた、ＶＥＧＦＲ−２の検出から恩恵を受け得る。例えば、抗ＶＥＧＦＲ−２または抗ＶＥＧＦ治療の有効可能性を評価するために、腫瘍生検試料においてＶＥＧＦＲ−２発現を検出することが望ましい場合がある。興味深いことに、本明細書に開示するＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質の多くは、ナノモル濃度の解離定数でＶＥＧＦＲ−２に結合するにもかかわらず、ＶＥＧＦＲ−２媒介性生物学的事象に有意な効果を及ぼし得ない。したがってそのような結合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−２媒介性事象を有意に撹乱することなくＶＥＧＦＲ−２を発現する細胞を選択的に標識することが望ましい場合が多い、インビボ可視化法または細胞標識法において有用であり得る。
【００２８】  本開示は、ＶＥＧＦＲ−２への結合に重要である新規単一ドメインポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定するための、核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−タンパク質およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を利用する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）と称されるインビトロディスプレイ技術の使用について記載する。核酸−タンパク質融合技術とは、タンパク質をそのコード遺伝情報と共有結合させるディスプレイ技術である。
ＰＲＯｆｕｉｏｎ（商標）技術を用いて、ヒトフィブロネクチンタイプ３ドメイン（１０Ｆｎ３）に基づく骨格を使用して構築された、または抗体軽鎖の可変ドメインから構築された単一ドメインポリペプチドをコードする核酸の集合体をスクリーニングした。発現されるポリペプチドは骨格タンパク質の「ライブラリー」と称されるが、これを高親和性でＶＥＧＦＲ−２と結合し得るポリペプチドに関してスクリーニングした。本発明者らは、骨格タンパク質のこのライブラリーから、ＶＥＧＦＲ−２に結合し、場合によってはＶＥＧＦ生物活性を阻害する新規な単一ドメインポリペプチドを単離した。さらに、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様骨格内に位置する多くの独立してランダム化したループが、ＶＥＧＦＲ−２結合に関与する共通配列の関連セットに収束する傾向があることが見出された。したがって、これらの共通配列を有するポリペプチドは、これらが同定されたタンパク質状況から分離された場合でさえも、ＶＥＧＦＲ−２結合剤として有用であることが予想される。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１〜４を参照されたい。そのようなポリペプチドは、独立した小ペプチドＶＥＧＦＲ−２結合剤として使用し得り、または他のタンパク質、特に免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様折りたたみを共有するタンパク質内に位置し得る。
【００２９】  上記したように、本開示は、ＶＥＧＦＲ−２への高親和性結合、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、またはＶＥＧＦ−Ｄの１つまたは複数に関するアンタゴニスト作用、および薬物動態の改善などの特定の所望の特性を有する単一ドメインポリペプチドが、有効な抗癌剤として使用され得ることを実証する。抗癌剤としてのそのようなポリペプチドの有効性は、癌における血管新生の役割に関連していることが予想されるが、本発明者らは任意の特定の機構に縛られることを望まない。形式上、本単一ドメインポリペプチドが、血管新生過程とは無関係の理由で癌に対して有効であるという可能性もある。
【００３０】  本発明者らの知る限り、本開示は、インビボでの治療効果を達成するためにＦｎ３に基づくポリペプチドを使用する、初めて成功した試みである。インビボ有効性を達成するためになされた改善および発見の多くは、Ｆｎ３に基づく他のポリペプチドにも広く適用できると考えられる。すなわち、Ｆｎ３に基づくポリペプチドのリガンド結合特性は一般に、溶媒接近ループ領域内に位置する比較的少数のアミノ酸によって決定されるが、Ｆｎ３に基づくポリペプチドの薬物動態特性などの他の特性は、リガンド結合に直接関与せず、また標的タンパク質にかかわらずタンパク質間で保存されているタンパク質の大部分によって決定される傾向がある。これは、ＣＤＲ領域と称される少数のループが抗原結合を媒介し、インビボ抗体挙動の他の特性は主として保存されたフレームワーク領域および定常ドメインによって決定される抗体にも当てはまる。
【００３１】  「阻害する」とは、本明細書においては以下のいずれかに関して使用される場合が多い、現象の測定可能な減少を意味する：ポリペプチド処理していない対照試料と比較した、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの相互作用、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲ媒介性血管新生、血管新生、血管新生の症状、ＶＥＧＦＲ含有細胞の生存度、ＶＥＧＦ依存性Ｂａ／Ｆ３細胞の生存度、またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲ媒介性細胞増殖。活性または相互作用の減少が少なくとも１０％、好ましくは２０％、３０％、４０％、または５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である場合、ポリペプチドはＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２媒介性活性を阻害することになる。
【００３２】  「ＶＥＧＦ結合活性」とは、任意のＶＥＧＦ受容体を介して作用する、しかし特にＶＥＧＦＲ−２受容体を介してシグナル伝達する任意のＶＥＧＦファミリーメンバーの任意の機能を意味する。ＶＥＧＦファミリーには、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、および胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ならびにＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６を含むＶＥＧＦの種々の選択的スプライシング型が含まれる（Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６６：１１９４７−１１９５４，１９９１）。チロシンキナーゼ受容体のＶＥＧＦＲファミリーには、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１としても知られる）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ（ヒト型）またはＦｌｋ−１（マウス型）としても知られる）、およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４としても知られる）が含まれる。ＶＥＧＦリガンドはＶＥＧＦ受容体に結合し、例えば血管新生、脈管形成、内皮細胞増殖、血管拡張、および細胞遊走を誘導する。ＶＥＧＦリガンドはまた、同族受容体への結合を介してアポトーシスを抑制し得る。ＶＥＧＦＲ−２は、血管新生に最も関与しているＶＥＧＦＲであると考えられている。ＶＥＧＦＲ−２またはＫＤＲ媒介性生物活性とは、ＶＥＧＦＲ−２またはＫＤＲの拮抗作用によって生物活性の測定可能な減少が起こるような、ＶＥＧＦＲ−２またはＫＤＲが著しく関与する任意の生物学的機能である。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲの生物活性は、当技術分野において周知である標準的なアッセイ法によって測定することができる。例には、リガンド結合アッセイ法およびスキャッチャードプロット解析；受容体二量体化アッセイ法；細胞リン酸化アッセイ法；チロシンキナーゼリン酸化アッセイ法（例えば、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９５：２００−２０７，２００３）；ＢｒｄＵ標識実験および細胞計数実験などの内皮細胞増殖アッセイ法；ＶＥＧＦ依存性細胞増殖アッセイ法；ならびに血管新生アッセイ法が含まれる。血管新生を測定する方法は標準的であり、例えばＪａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：２６６−２７６，２００２）に記載されている。血管新生は、非分岐血管区域の数（単位面積当たりの区域の数）、機能的血管密度（単位面積当たりの灌流血管の全長）、血管径、脈管の形成、または血管容量密度（単位面積当たりの、各区域の長さおよび直径に基づいて計算された全血管容量）を測定することにより評価することができる。ＶＥＧＦ媒介性増殖および血管新生の例示的なアッセイ法は、米国特許第６，５５９，１２６号、Ｌｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：１１９４（２００１）、Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：１２３４（１９７８）、およびＢａｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３５８８（２０００）に見出され得る。これらのアッセイは精製受容体もしくはリガンドまたはその両方を用いて行うことができ、またインビトロでもインビボでも行うことができる。これらのアッセイはまた、遺伝子導入されたまたは天然のリガンドもしくは受容体またはその両方を用いて細胞���で行うことができる。ＶＥＧＦの生物活性を阻害するポリペプチドは、ＶＥＧＦの生物活性の少なくとも１０％の減少、好ましくは２０％、３０％、４０％、または５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の減少をもたらす。生物活性の阻害はまた、ＩＣ５０によって測定され得る。好ましくは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２の生物活性を阻害するポリペプチドは、１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【００３３】２．ポリペプチド
本明細書に記載する方法を用いて、２つの関連するタンパク質構造群：免疫グロブリン折りたたみを有するタンパク質および免疫グロブリン様折りたたみを有するタンパク質に由来する単一ドメインＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドを作製することに成功した。「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらず、２つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に用いられる。ポリペプチドは、天然アミノ酸、および参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，５５９，１２６号に記載されているような非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学的方法のいずれかで修飾され得る（例えば、アミノ酸を保護基で修飾することができる；カルボキシ末端アミノ酸を末端アミド基にすることができる；アミノ末端残基を、例えば親油性を増強させる基で修飾することができる；または安定性もしくはインビボ半減期を増大させるために、ポリペプチドを化学的にグリコシル化するかもしくは別の方法で修飾することができる）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの環式化合物などの別の構造または他の分子の結合を含み得り、また立体配置が変化した（すなわち、ＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）１つまたはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドを含み得る。「単一ドメインポリペプチド」という用語は、対象ポリペプチドの標的結合活性（例えば、ＶＥＧＦＲ−２結合活性）が、例えば、抗原結合活性が一般に重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方によってもたらされる抗体および一本鎖抗体とは区別されて、単一構造ドメイン内に存在することを示すために用いられる。結合活性が増加した複合分子を作製するために、本明細書に開示するような複数の単一ドメインポリペプチドを結合し得ることが意図される。同様に、単一ドメインポリペプチドを、蛍光ポリペプチド、標的化ポリペプチド、および異なる治療効果を有するポリペプチドなどの多くの他のポリペプチドに（例えば、融合タンパク質として）結合することができる。
【００３４】  免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様骨格の単一ドメインポリペプチドは、特定の構造特性を共有する傾向がある。例えば、ポリペプチドは約８０〜約１５０アミノ酸を含み得り、アミノ酸は一連のβストランドまたはβ様ストランドに構造的に構成されて、βストランドまたはβ様ストランドが介在ループ部分によって結合されたβシートを形成する。重鎖可変ドメインおよび１０Ｆｎ３ドメインの構造構成の例を図２２にす。βシートは単一ドメインポリペプチドの安定な核を形成し、また一方でβストランドまたはβ様ストランドを結合するループから構成される２つの「面」を形成する。本明細書に記載するように、これらのループを変更して要望に合わせたリガンド結合部位を作製することができ、適切な対照を使用することで、タンパク質の全体的な安定性を破壊することなくそのような変更物を作製することができる。抗体では、これらのループのうちの３つは周知の相補性決定領域（または「ＣＤＲ」）である。
【００３５】  単一ドメインポリペプチドを形成するための骨格は、生理的条件において高度に可溶性であり安定であるべきである。免疫グロブリン骨格の例は、単一ドメインＶＨもしくはＶＬ骨格および単一ドメインラクダＶＨＨドメイン（ラクダで見出された重鎖可変ドメインの形態）、または天然で見出されるもしくは実験室において操作された他の免疫グロブリン可変ドメインである。本明細書に開示する単一ドメイン形式では、免疫グロブリンポリペプチドは、結合活性を獲得するために第２ポリペプチドと二量体を形成する必要がない。したがって、第２タンパク質とのジスルフィド架橋結合を媒介するシステインを天然に含む任意のそのようなポリペプチドは、システインを除去するように変更され得る。または、単一ドメインポリペプチドにＰＥＧなどのさらなる部分を結合するのに使用するため、システインは保持され得る。
【００３６】  他の骨格は、非抗体骨格タンパク質であってよい。  「非抗体骨格タンパク質またはドメイン」とは、免疫グロブリン様折りたたみを有する非抗体ポリペプチドを意味する。「抗体様折りたたみ」とは、２層の逆平行βシートを含み、２つのβシートの平らな疎水面が相互に向かい合って詰め込まれた約８０〜１５０アミノ酸残基のタンパク質ドメインを意味する。そのような骨格の例は「フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質」であり、これはフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（Ｆｎ３）に基づくポリペプチドを意味する。フィブロネクチンは、細胞外基質の形成および細胞間相互作用において重要な役割を果たす大きなタンパク質であり；これは、３つのタイプ（タイプＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）の小さなドメインの多くの繰り返しからなる（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。Ｆｎ３自体は、細胞接着分子、細胞表面ホルモン受容体およびサイトカイン受容体、シャペロニン、ならびに糖質結合ドメインの一部を含む大きなサブファミリーの模範例である。総説に関しては、Ｂｏｒｋ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２  Ｏｃｔ  １；８９（１９）：８９９０−４；Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｓｅｐ  ３０；２４２（４）：３０９−２０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＆  Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９４  Ｍａｙ  １５；２（５）：３３３−７；Ｈａｒｐｅｚ  ＆  Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｍａｙ１３；２３８（４）：５２８−３９）を参照されたい。
【００３７】
好ましくは、フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質は「10Fn3」骨格であり、これは、1つまたは複数の溶媒接近ループ、特にBCループ（アミノ酸20〜30）、DEループ（アミノ酸52〜56）、およびFGループ（アミノ酸77〜87）として同定される3つのループの1つまたは複数がランダム化されるまたは変異された、ヒトフィブロネクチンタイプIIIタンパク質の10番目のモジュールに基づくポリペプチド変種を意味する（番号付けの図式はヒトフィブロネクチンの10番目のタイプIIIドメインの配列に基づき、アミノ酸Val-Ser-Asp-Val-Proがアミノ酸番号1〜5を表す）。ヒトフィブロネクチンタイプIIIドメインの野生型の10番目のモジュールのアミノ酸配列は：
0005006651.tif 000002
である。したがって、野生型BCループはDAPAVTVRの配列を含み；野生型DEループはGSKSTの配列を含み、野生型FGループはGRGDSPASSKPの配列を含む。BC、DE、およびFGループに隣接する配列はまた、例えば表1〜3においてフレームワーク1、2、3、および4と称される。
【００３８】  様々な改良変異体１０Ｆｎ３骨格が同定されている。Ａｓｐ７の改良は、負に荷電していないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）によって置換される。これらの変異体はいずれも、中性ｐＨにおける変異体１０Ｆｎ３の、野生型よりも高い安定性を促進する効果を有する。１０Ｆｎ３骨格における有益であるかまたは中立である種々のさらなる改変が開示されている。例えば、Ｂａｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２００２Ｄｅｃ；１５（１２）；１０１５−２０；Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１  Ａｕｇ２８；４０（３４）：１０３２６−３３を参照されたい。
【００３９】  さらに、１０Ｆｎ３骨格に対するいくつかの新たな改変を本明細書に開示する。特に重要なことには、野生型ヒト１０Ｆｎ３の最初の８アミノ酸を欠失させることで、ＶＥＧＦＲ−２結合がおよそ３倍に改善されることが見出された。最初の８アミノ酸は、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに近接した位置に折りたたまれる傾向があるため、この変異体はまた、異なる標的に対する結合に関して選択される他の１０Ｆｎ３骨格においても標的結合を改善することが期待される。したがって、最初の８アミノ酸を欠いた１０Ｆｎ３骨格をコードする核酸のライブラリーを構築して、この改良ライブラリーにおいてスクリーニングを行うことができる。
【００４０】  変種および野生型１０Ｆｎ３タンパク質はどちらも、同じ構造、すなわち７つのβストランドドメイン配列（Ａ〜と称される）、および７つのβストランドドメイン配列を結合する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、およびＦＧループ）によって特徴づけられる。Ｎ末端およびＣ末端に近接して位置するβストランドは、溶液中でβ様高次構造をとり得る。ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：５では、ＡＢループは残基１５〜１６に相当し、ＢＣループは残基２２〜３０に相当し、ＣＤループは残基３９〜４５に相当し、ＤＥループは残基５１〜５５に相当し、ＥＦループは残基６０〜６６に相当し、ＦＧループは残基７６〜８７に相当する。図２２に示されるように、ＢＣループ、ＤＥループ、およびＦＧループはすべて、ポリペプチドの同じ面に位置する。同様に、免疫グロブリンも骨格も、少なくとも７つのβストランドまたはβ様ストランド、しばしば９つのβストランドまたはβ様ストランドを有する傾向がある。
【００４１】  本明細書に開示する単一ドメインポリペプチドは、少なくとも２つのβシートの間に分布する少なくとも５〜７個のβストランドまたはβ様ストランド、および２つのβストランドまたはβ様ストランドを結合する少なくとも１つのループ部分を有し得り、ループ部分はＶＥＧＦＲ−２、特にＫＤＲへの結合に関与し、その結合は１ｘ１０−６Ｍ未満、好ましくは１ｘ１０−８Ｍ未満の解離定数によって特徴づけられる。本明細書に記載する、５ｘ１０−９Ｍ未満の解離定数を有するポリペプチドは、ＶＥＧＦシグナル伝達を抑制するためのインビボでの治療的使用に特に望ましい。１ｘ１０−６Ｍ〜５ｘ１０−９Ｍの解離定数を有するポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質のエクスビボまたはインビボでの検出または標識に使用するのに望ましいと考えられる。
【００４２】  任意に、ＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質は、同じ種に由来する他の関連タンパク質と比較してＶＥＧＦＲ−２に特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、標的タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２）を認識しこれと相互作用するが、試料、例えば生物試料中の他の分子を実質的に認識せずこれと相互作用しないポリペプチドを意味する。好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、少なくとも５００ｎＭ程度のＫＤでＶＥＧＦＲと特異的に結合する。好ましくは、ポリペプチドは、１ｐＭ〜５００ｎＭ、より好ましくは１ｐＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは１ｐ＜〜１０ｎＭ、最も好ましくは１ｐＭ〜１ｎＭまたはそれよりも低いＫＤでＶＥＧＦＲと特異的に結合する。
【００４３】  一般に、選択された標的に結合し得る特異的なポリペプチド変種を同定するために、骨格単一ドメインポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする。これらのライブラリーは、例えばファージディスプレイライブラリーまたはＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）ライブラリーであってよい。
【００４４】  例示的な態様において、本発明者らは、新規なインビトロＲＮＡ−タンパク質融合ディスプレイ技術を利用して、ヒト（ＫＤＲ）およびマウス（Ｆｌｋ−１）ＶＥＧＦＲ−２の両方に結合し、ＶＥＧＦに依存的な生物活性を阻害するポリペプチドを単離した。これらのポリペプチドは、フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質のライブラリー（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ，ＪＭＢ  ２８４：１１４１（１９９８））、およびＶＨ分子の集団に由来するＣＤＲ３  ドメインと交換することによってＣＤＲ３の多様性が増加したＶＬドメインのライブラリーから同定された。１０Ｆｎ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるように約９４個のアミノ酸残基を含む。
【００４５】  さらに、上記のように、１０Ｆｎ３のＮ末端のアミノ酸配列も同様に変異または欠失させることができる。例えば、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループのランダム化は、全長１０Ｆｎ３の状況で、またはＮ末端の１〜８アミノ酸の欠失または変異を有する１０Ｆｎ３の状況で起こり得る。例えば、８位のＬをＱに変異させることができる。多様なライブラリーを作製するためにランダム化した後、フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質を、タンパク質、この場合はＶＥＧＦＲに対して高親和性を有するポリペプチドを選択するスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。（ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細については、参照により本明細書に組み入れられるＳｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，２５８，５５８号；第６，２６１，８０４号；第６，２４１，５５３号；第６，２８１，３４４号；第６，２０７，４４６号、第６，５１８，０１８号；国際公開公報第００／３４７８７号；ＷＯ第０１／６４９４２号；ＷＯ第０２／０３２９２５号；およびＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−１２３０２，１９９７を参照されたい。）
【００４６】  本明細書に記載する最初の選択では、２３〜２９、５２〜５５、および７７〜８６位にある１０Ｆｎ３の３つの領域をランダム化し、ヒトＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン（ヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合したＫＤＲのアミノ酸１〜７６４）に対するインビトロ選択に使用した。ｍＲＮＡディスプレイ（ＲＮＡ−タンパク質融合）およびインビトロ選択を使用して、本発明者らは約１０兆個の変種を有する１０Ｆｎ３に基づくライブラリーをサンプリングした。最初の選択により、ＫＤＲ（ヒトＶＥＧＦＲ−２）への結合に関してＶＥＧＦと拮抗する、中程度の親和性（ＫＤ＝１０〜２００ｎＭ）を有するポリペプチドが同定された。続いて、最初の選択に由来する単一クローン（ＫＤ＝１１〜１３ｎＭ）を、突然変異誘発およびさらなる選択に供した。この親和性成熟過程により、６０ｐＭ〜２ｎＭの解離定数を有する新たなＶＥＧＦＲ結合ポリペプチドが得られた。ＫＤＲ結合剤を表３に示す。さらに、本発明者らはまた、始めはＦｌｋ−１に対する検出可能な結合親和性を有さなかったＫＤＲ結合剤の突然変異誘発した集団から、Ｆｌｋ−１、マウスＫＤＲ相同体に結合し得るポリペプチドを単離し、結果的にヒトおよびマウスＶＥＧＦＲ−２の両方に対する二重特異性を示すポリペプチドを単離した。これらのポリペプチドは、ＫＤＲまたはＦｌｋ−１細胞外ドメインを提示する細胞に結合することが示される。これらのポリペプチドはまた、ＶＥＧＦ依存性増殖アッセイにおいて細胞増殖を抑制した。ＫＤＲおよびＦｌｋ−１に結合するポリペプチドを表２に示し、好ましいＫＤＲ結合剤およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１結合剤の選択を表１に示す。
【００４７】  本発明者らは、これらの選択で同定されたＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドを用いて、ＶＥＧＦＲ−２に対するポリペプチドの結合に必要なＦＧループアミノ酸共通配列を決定した。この配列を以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４に記載する。
【００４８】  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４などのＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、単独で（単離ペプチドとして）、１０Ｆｎ３単一ドメインポリペプチドの一部として、（全長アミノ末端または欠失アミノ末端を有する）全長フィブロネクチンもしくはその断片の一部として、免疫グロブリン（特に単一ドメイン免疫グロブリン）の状況において、免疫グロブリン様折りたたみを有する別のタンパク質の状況において、または別の非関連タンパク質の状況において製剤化することができる。ポリペプチドはまた、それ自体はＶＥＧＦＲへの結合に寄与しない異種タンパク質との融合タンパク質の一部として製剤化することができる。さらに、本発明のポリペプチドはまた核酸と融合させることも可能である。ポリペプチドまた、単量体、二量体、または多量体として操作され得る。
【００４９】  好ましい共通ＶＥＧＦＲ−２結合ペプチドの配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−（Ｌ／Ｍ）ＧＸＮ（Ｇ／Ｄ）（Ｈ／Ｒ）ＥＬ（Ｌ／Ｍ）ＴＰ
［Ｘは任意のアミノ酸であってよく；（／）は同じ位置の選択的アミノ酸を表す］
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−ＸＥＲＮＧＲＸＬ（Ｌ／Ｍ／Ｎ）ＴＰ
［Ｘは任意のアミノ酸であってよく；（／）は同じ位置の選択的アミノ酸を表す。］
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−（Ｄ／Ｅ）ＧＸＮＸＲＸＸＩＰ
［Ｘは任意のアミノ酸であってよく；（／）は同じ位置の選択的アミノ酸を表す。］
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−（Ｄ／Ｅ）Ｇ（Ｒ／Ｐ）Ｎ（Ｇ／Ｅ）Ｒ（Ｓ／Ｌ）（Ｓ／Ｆ）ＩＰ
［Ｘは任意のアミノ酸であってよく；（／）は同じ位置の選択的アミノ酸を表す。］
【００５０】
好ましいVEGFR-2結合10Fn3ポリペプチドの配列：
0005006651.tif 000003
0005006651.tif 000004
0005006651.tif 000005
0005006651.tif 000006
0005006651.tif 000007
0005006651.tif 000008
0005006651.tif 000009
0005006651.tif 000010
0005006651.tif 000011
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0005006651.tif 000029
0005006651.tif 000030
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0005006651.tif 000055
0005006651.tif 000056
0005006651.tif 000057
【００５１】  上記のＣＴ−０１分子は最初の８アミノ酸の欠失を有し、Ｎ末端またはＣ末端にさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、さらなるＭＧ配列をＮ末端に置くことができる。
Ｍは通常切断されて、Ｎ末端にはＧＥＶ…配列が残る。通常の８アミノ酸をＮ末端に再付加することでも、所望の特性を有するＫＤＲ結合タンパク質が生成される。Ｎ末端のメチオニンは通常切断されて、配列：
0005006651.tif 000058
が得られる。
【００５２】  本明細書に開示するポリペプチドは、特に標的タンパク質と相互作用しないと考えられるタンパク質の部分において、１つまたは複数の保存的置換によって修飾され得る。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様ドメイン内の５％、１０％、２０％、もしくはさらに３０％程度、またはそれ以上のアミノ酸が、標的に対するタンパク質の親和性を実質的に変更することなく、保存的置換によって変更され得ると考えられる。そのような変化はインビボにおけるポリペプチドの免疫原性を変更するかもしれず、免疫原性が減少する場合、そのような変化は望ましい。本明細書で使用する「保存的置換」とは、対応する参照残基と物理的または機能的に類似した残基である。すなわち、保存的置換とその参照残基は、類似した大きさ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する。好ましい保存的置換は、許容される点突然変異に関してＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２（１９７８  ＆  Ｓｕｐｐ．）において定義された基準を満たす置換である。保存的置換の例は以下の群内の置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。
【００５３】  本明細書に開示するポリペプチドはまた、効力、生物学的利用能、化学的安定性、および／または有効性を改善するために修飾してもよい。例えば、本発明の１つの態様では、生物活性およびポリペプチド構造の化学的安定性を改良するために、Ｄ−アミノ酸ペプチドまたはレトロエナンチオ（ｒｅｔｒｏｅｎａｎｔｉｏ）ペプチド配列が作製され得る（例えば、Ｊｕｖｖａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．１１８：８９８９−８９９７，１９９６；Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０：６５６−６５８，１９８０を参照のこと）。ラクタム制約（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、前記を参照のこと）、および／またはジペプチド代用物としてのアザビシクロアルカンアミノ酸もまた、天然ペプチドの生物学的特性および薬理学的特性を改善するために利用され得る（例えば、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：１２７８９−１２８５４，１９９７を参照のこと）。
【００５４】  チオアミド、二級アミンおよび三級アミン、特に複素環などのアミド結合代用物（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」  Ｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３  Ｖｏｌ．７，ｐｐ２６７−３５７の総説を参照のこと）もまた、ポリペプチド骨格の酵素分解を妨げて、それにより活性を改善するために利用され得る。環状ポリペプチドは酵素分解に対する感受性が非常に低いことから、直鎖ポリペプチドの環状ポリペプチド類似体への変換を利用して、代謝的安定性を改善することも可能である（一般的に、Ｖｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：５５−５８，１９８１を参照のこと）。
【００５５】  ポリペプチドはまた、代謝を遅延させるまたは妨げるため、および親油性を増大させるために、エステルおよびアミドとしての末端基キャッピングを利用して修飾することもできる。種々のリンカーによって結合されたペプチドの二量体もまた、活性および特性を増強し得る（例えば、Ｙ．Ｓｈｉｏｍｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２４−２６，ｐｇｓ．４７−５０．１９８９を参照のこと）。非天然アミノ酸などのポリペプチド修飾のさらなる例に関しては、米国特許第６，５５９，１２６号を参照されたい。
【００５６】
インビボで使用する場合、PEG化に適した形態が作製され得る。例えば、N末端の8アミノ酸を欠くCT-01型について以下に示すように、システインを含むC末端尾部が付加され、発現される（C末端にEIDKPCQが付加される）
0005006651.tif 000059
以下に記載するインビボ実験では、この分子のPEG化型を使用する。システインの代わりにセリンを有する対照型もまた使用した：
0005006651.tif 000060
【００５７】  同じＣ末端尾部を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３に示すＮ末端８アミノ酸を有するＣＴ−０１型に付加することもできる。
【００５８】
所望のKDR結合特性を有するさらなる変種が単離された。以下のコア配列はいくぶん異なるFGループを有し、例えば、N末端MG配列、欠失された8アミノ酸を回復するN末端配列、および/またはPEG化用のシステインを提供するためのC末端尾部と共に発現させることができる。
0005006651.tif 000061
別のそのような変種はコア配列：
0005006651.tif 000062
を有する。
【００５９】  さらに、同様の方法により、ＶＬフレームワーク内の好ましい単一ドメイン免疫グロブリンポリペプチドも単離され、これを図２１に開示する。
【００６０】  本発明には、本明細書に記載するポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列もまた含まれる。当業者によって理解されるように、３塩基目の縮重により、ほぼすべてのアミノ酸が、コードヌクレオチド配列において２つ以上のトリプレットコドンで示され得る。さらに、わずかな塩基対変化はコードされるアミノ酸配列において保存的置換をもたらし得るが、遺伝子産物の生物活性を実質的に変更しないと考えられる。したがって、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列は、わずかに配列を修飾することができ、それでもなおそれぞれの遺伝子産物をコードし得る。
【００６１】  さらに、本発明のポリペプチドを、さらに変異させて、より高い親和性でＶＥＧＦＲと結合するポリペプチドをスクリーニングし得るリードポリペプチドとして使用することができる。一例では、本明細書に記載するポリペプチドは、さらに変異させるかまたはランダム化して、リードポリペプチドと異なるアミノ酸変異を有するポリペプチドを作製するリードポリペプチドとして使用される。次いで、さらにランダム化されたポリペプチドを用いて、本明細書に記載するＶＥＧＦ生物活性を阻害する（例えば、ＶＥＧＦＲに結合し、同じ受容体へのＶＥＧＦの結合を阻止する）ポリペプチドをスクリーニングすることができる。
【００６２】３．核酸およびポリペプチドの生成
本発明のポリペプチドは、当技術分野において周知である任意の標準的な方法を用いて生成することができる。
【００６３】
一例において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、cDNA）を組換え発現ベクターに挿入し、発現を促進する条件下においてDNA配列を発現させることによる組換えDNA法により作製される。本明細書に開示するCT-01ポリペプチドをコードする核酸配列の例には以下のものがある：
0005006651.tif 000063
0005006651.tif 000064
【００６４】  本明細書に開示する種々のポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。コドン使用頻度は、細胞内での発現を改善するように選択され得る。そのようなコドン使用頻度は、選択した細胞種に依存することになる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞について、特定のコドン使用頻度パターンが開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｊａｎ２１；１００（２）：４３８−４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００２  Ｏｃｔ；２６（１）：９６−１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＮＤ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１  Ｏｃｔ；１２（５）：４４６−９：Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９９６  Ｓｅｐ；６０（３）：５１２−３８；およびＳｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｙｅａｓｔ．１９９１Ｏｃｔ；７（７）：６５７−７８を参照されたい。
【００６５】  核酸操作の一般的な技法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２  ｅｄ．，１９８９，またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、および定期的な最新情報に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに連結する。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。宿主における複製能は通常、複製開始点によって付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み入れられる。
【００６６】  組換えＤＮＡはまた、タンパク質の精製に有用であると考えられる任意の種類のタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例には、これらに限定されるわけではないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主との使用に適したクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）に見出すことができ、その関連する開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】  当業者に周知であるように、発現構築物は、宿主細胞に適した方法を用いて宿主細胞に導入する。核酸を宿主細胞に導入する様々な方法が当技術分野において周知であり、これにはエレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化リビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染物質の場合）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６８】  適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が含まれる。適切な細菌には、例えば大腸菌またはバシラス種といったグラム陰性菌またはグラム陽性菌が含まれる。好ましくはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス種に由来する酵母もまた、ポリペプチドの産生に使用することができる。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞において異種タンパク質を産生させるためのバキュロウイルス系については、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８）に概説されている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が含まれる。精製ポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多くの用途のため、本明細書に開示するポリペプチドの多くの小さなサイズのものは、発現の好ましい方法として大腸菌で発現される。次いで、培地または細胞抽出物からタンパク質が精製される。
【００６９】  本明細書に開示するタンパク質はまた、細胞翻訳系を用いて生成することもできる。そのような目的では、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写が行われてｍＲＮＡが産生されるように、および利用する特定の無細胞系（哺乳動物もしくは酵母無細胞翻訳系などの真核生物、または細菌無細胞翻訳系などの原核生物）でｍＲＮＡの無細胞翻訳が行われるように、修飾されなければならない。
【００７０】  ＶＥＧＦＲ結合ポリペプチドはまた、化学合成によって作製することもできる（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬに記載されている方法による）。タンパク質の修飾もまた化学合成によって作製され得る。
【００７１】  本発明のポリペプチドは、タンパク質化学の分野において周知であるタンパク質の単離／精製法によって精製され得る。非限定的な例には、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。精製後、ポリペプチドは、ろ過および透析を含むがこれらに限定されない当業者に周知の様々な方法のいずれかにより、異なる緩衝液に交換するおよび／または濃縮することができる。
【００７２】  精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９８％の純度である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは薬学的産物として使用するのに十分純粋である。
【００７３】４．ポリペプチドの翻訳後修飾
特定の態様において、本発明の結合ポリペプチドはさらに翻訳後修飾を含み得る。例示的な翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ｓｕｍｏ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水基の付加が含まれる。結果として、修飾された可溶性ポリペプチドは、脂質、多糖または単糖、およびリン酸などの非アミノ酸成分を含み得る。グリコシル化の好ましい形式は、ポリペプチドに１つまたは複数のシアル酸部分を結合するシアル化である。シアル酸部分は、溶解度および血中半減期を改善すると共に、タンパク質の免疫原性の可能性を減少させる。例えば、Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１  Ｊｕｌ  ３１；４０（３０）：８８６８−７６を参照されたい。ポリペプチドの機能性に及ぼすそのような非アミノ酸成分の効果は、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦ機能におけるその拮抗作用の役割、例えば血管新生または腫瘍増殖に及ぼすその抑制効果について試験され得る。
【００７４】  本発明の１つの特定の態様において、修飾型の対象可溶性ポリペプチドは、非タンパク質ポリマーに対する対象可溶性ポリペプチドの結合を含む。１つの特定の態様において、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；または第４，１７９，３３７号に記載されているようなポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。本発明の修飾ポリペプチドの例には、ＰＥＧ化Ｍ５ＦＬおよびＰＥＧ化ＣＴ−０１が含まれる。
【００７５】  ＰＥＧは、市販されている、または当技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製され得る、周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  １３８−１６１）。「ＰＥＧ」という用語は、大きさまたはＰＥＧの末端における修飾にかかわらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く用いられ、式：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ  （１）
（式中、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ１−４アルキルである）によって表され得る。１つの態様において、本発明のＰＥＧは一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわちＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。ＰＥＧは、結合反応に必要な；分子の化学合成によって生じる；または分子の部分に最適距離を保つためのスペーサーである化学基を含み得る。さらに、このようなＰＥＧは、互いに結合した１つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなってよい。２つ以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、分岐型（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄまたはｂｒａｎｃｈｅｄ）ＰＥＧと称される。分岐型ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール、およびエチレンオキシドを含む種々のポリオールにポリエチレンオキシドを付加することによって調製される。例えば、ペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから、４分岐型ＰＥＧを調製することができる。分岐型ＰＥＧは、例えば、ＥＰ−Ａ第０  ４７３  ０８４号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの１つの形態には、リジンの１級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が含まれる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６（１９９５）６２−６９）。
【００７６】  ＰＥＧは周知であるが、本発明者らの知る限り、ＰＥＧ化１０Ｆｎ３ポリペプチドがＰＥＧ化され、リガンド結合活性を保持し得ることが初めて実証される。好ましい態様において、ＰＥＧ化１０Ｆｎ３ポリペプチドは、特にＮ末端またはＣ末端のシステイン部分にＰＥＧを結合させることによる、部位特異的ＰＥＧ化によって作製される。したがって本開示は、少なくとも１つのループが標的結合に関与する、約８０〜約１５０アミノ酸を有する１０Ｆｎ３ドメイン；および共有結合されたＰＥＧ部分を含む、改善された薬物動態特性を有する標的結合１０Ｆｎ３ポリペプチドであって、１００ｎＭ未満のＫＤで標的と結合し、哺乳動物において３０ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ未満の排除速度を有する１０Ｆｎ３ポリペプチドを提供する。ＰＥＧ部分は、Ｃｙｓ残基への結合によるなど、部位特異的ＰＥＧ化によって１０Ｆｎ３ポリペプチドに結合することができ、Ｃｙｓ残基は、１０Ｆｎ３ポリペプチドのＮ末端、またはＮ末端と最もＮ末端側のβストランドもしくはβ様ストランドの間、または１０Ｆｎ３ポリペプチドのＣ末端、またはＣ末端と最もＣ末端側のβストランドもしくはβ様ストランドの間に位置し得る。Ｃｙｓ残基は、他の位置、特に標的結合に関与しないループのいずれかに位置してもよい。ＰＥＧ部分はまた、アミンへの結合によるなど、他の化学反応によって結合することもできる。
【００７７】  ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧ結合は一般に、ＰＥＧの活性化および活性化ＰＥＧ中間体の標的タンパク質／ペプチドへ、またはその後活性化されて標的タンパク質／ペプチドに結合されるリンカーへの直接的結合を含む（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３７５１（１９９７）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５８２（１９９７）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．、ならびにＨａｒｒｉｓ  ｅｔ．ａｌ．：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｃｈａｐ．２１  ａｎｄ  ２２を参照のこと）。ＰＥＧ分子を含む結合ポリペプチドは複合化タンパク質の別名でも知られ、一方ＰＥＧ分子の結合を欠くタンパク質は非複合化と称され得ることに留意されたい。
【００７８】  ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドに結合させるために、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは２０〜２３００）の様々な分子量型のＰＥＧが選択され得る。ＰＥＧにおける反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載される分子量に関して概算される。活性化リンカー上のＰＥＧの分子量を組み合わせたものが薬学的使用に適していることが好ましい。したがって、１つの態様において、ＰＥＧ分子の分子量は１００，０００Ｄａを超えない。例えば、３つのＰＥＧ分子をリンカーに結合する場合、各ＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａ（ｎはそれぞれ約２７０）という同じ分子量を有するならば、リンカー上のＰＥＧの全分子量は約３６，０００Ｄａ（ｎ全体は約８２０）である。またリンカーに結合するＰＥＧの分子量は異なってもよく、例えばリンカー上の３つの分子うち、２つのＰＥＧ分子はそれぞれ５，０００Ｄａ（ｎはそれぞれ約１１０）であってよく、１つのＰＥＧ分子は１２，０００Ｄａ（ｎは約２７０）であってよい。
【００７９】  本発明の特定の態様において、ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、式：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲの１つのポリ（エチレングリコール）基と共有結合され、ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（すなわち、カルボニル）が結合ポリペプチドのアミノ基の１つとアミド結合を形成する：Ｒは低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは約４５０〜約９５０であり；ｎおよびｍは、複合体から結合ポリペプチドを引いた分子量が約１０〜４０ｋＤａになるように選択される。１つの態様では、結合ポリペプチドのリジンのε−アミノ基が利用可能な（遊離）アミノ基である。
【００８０】  上記の複合体は、式（ＩＩ）：Ｐ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ（ＩＩ）（式中、Ｐは本明細書に記載する結合ポリペプチドの基であり（すなわち、式（ＩＩ）に示されるカルボニルとアミド結合を形成する１つまたは複数のアミノ基を含まない）；Ｒは低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは約４５０〜約９５０であり、複合体から結合ポリペプチドを引いた分子量が約１０〜４０ｋＤａになるように選択される）によってより具体的に示すことができる。本明細書において、「ｍ」の所与の範囲は位置づけの意味を有する。「ｍ」の範囲はいずれの場合にも、ＰＥＧ基の分子量によって正確に決定される。
【００８１】  当業者は、例えば、ＰＥＧ化結合ポリペプチドを治療にどのように使用するか、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、免疫原性、および他の考慮事項に基づいて、ＰＥＧの適切な分子量を選択することができる。ＰＥＧ、およびタンパク質の特性を増強させるためのその使用に関する考察については、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：９１−１１４（１９９３）を参照されたい。
【００８２】  本発明の１つの態様においては、ＰＥＧ分子は活性化されて、結合ポリペプチド上のアミノ基、リジンなどと反応し得る（Ｂｅｎｃｈａｍ  Ｃ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，２５（１９８３）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，１４１（１９８５）．；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｄｒｓ  ９−１１０  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４６９（１９９９）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９，１１７７−１１８３（１９８３）；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，１１９−１２８（１９９０））。
【００８３】  １つの特定の態様では、ＰＥＧ−結合ポリペプチド複合体を形成するために、ＰＥＧの炭酸エステルが用いられる。ＰＥＧとの反応においてＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）が用いられて、活性化混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートが形成され得り、次にこれをリンカーの求核基または結合ポリペプチドのアミノ基と反応させることができる（米国特許第５，２８１，６９８号および米国特許第５，９３２，４６２号を参照のこと）。同様の種類の反応において、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートおよびジ−（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させて、それぞれＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネート（米国特許第５，３８２，６５７号）を形成することができる。
【００８４】１０Ｆｎ３ポリペプチドのＰＥＧ化は、最先端の方法に従って、例えば結合ポリペプチドと求電子的に活性のあるＰＥＧ（供給業者；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．、米国、ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）との反応によって行うことができる。本発明の好ましいＰＥＧ試薬は、例えば、プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、またはｍＰＥＧ２−ＮＨＳなどの分岐型Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６（１９９５）６２−６９）。このような方法は、結合ポリペプチドリジンのε−アミノ基または結合ポリペプチドのＮ末端アミノ基におけるＰＥＧ化に用いられ得る。
【００８５】  別の態様において、ＰＥＧ分子は、結合ポリペプチド上のスルフヒドリル基に結合することができる（Ｓａｒｔｏｒｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７，４５（１９９１）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，７，３６３−３６８（１９９６）；Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，３４３；米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および第５，７６６，８９７号は、スルフヒドリル基に結合できる例示的な反応性ＰＥＧ種について記載している。
【００８６】  ＰＥＧ分子を結合ポリペプチド上のシステイン残基に結合するいくつかの態様では、システイン残基は結合ポリペプチドに固有のものであり、他の態様においては、１つまたは複数のシステイン残基が結合ポリペプチド内に挿入される。システイン残基を作製するために、結合ポリペプチドコード配列内に変異を導入することができる。これは、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基をシステインに変異させることによって達成され得る。システイン残基に変異するための好ましいアミノ酸には、セリン、スレオニン、アラニン、および他の親水性残基が含まれる。好ましくは、システインに変異させる残基は表面露出残基である。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面露出度を予測するアルゴリズムは、当技術分野において周知である。または、結合ポリペプチドを設計し進化させる基礎としたフレームワークの結晶構造が解析されているならば（Ｈｉｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．（２００１）２０−２７；４１４（６８６６）：９３３−８）、結合ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより表面残基を予測することができ、ひいては表面露出残基を同定することができる。１つの態様において、システイン残基は、結合ポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端に、もしくはその近傍に、またはループ領域内に導入される。
【００８７】  いくつかの態様において、ＰＥＧ化結合ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合されたＰＥＧを含む。部位特異的Ｎ末端還元的アミノ化については、Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＪＰＥＴ，２９７，１０５９、および米国特許第５，８２４，７８４に記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を利用するタンパク質の還元的アミノ化へのＰＥＧ−アルデヒドの使用については、米国特許第４，００２，５３１号、Ｗｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，１２５７９、およびＣｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５，１３３に記載されている。
【００８８】  別の態様において、ＰＥＧ化結合ポリペプチドはリンカーに共有結合した１つまたは複数のＰＥＧ分子を含み、このリンカーは次に結合ポリペプチドのＮ末端のアミノ残基のαアミノ基に結合されている。そのようなアプローチは、米国特許公報第２００２／００４４９２１号およびＷＯ第９４／０１４５１号に記載されている。
【００８９】  １つの態様において、結合ポリペプチドはＣ末端でＰＥＧ化される。特定の態様において、タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンを導入し、続いてシュタウディンガー反応によりメチル−ＰＥＧ−トリアリルホスフィン化合物を結合することによって、Ｃ末端でＰＥＧ化される。このＣ末端結合法は、Ｃａｚａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００４；１５（５）１００５−１００９に記載されている。
【００９０】  結合ポリペプチドのモノＰＥＧ化はまた、ＷＯ第９４／０１４５１号に記載されている一般的な方法に従って生成することもできる。ＷＯ第９４／０１４５１号は、修飾された末端アミノ酸α−炭素反応基を有する組換えポリペプチドを調製する方法について記載している。本方法の工程は、組換えポリペプチドを形成する段階、およびそのＮ末端α−アミンおよびＣ末端α−カルボキシルを１つまたは複数の生物学的に付加された保護基で保護する段階を含む。次いで、ポリペプチドを化学保護剤と反応させて、反応性側鎖基を選択的に保護し得り、それによって側鎖基が修飾されるのを防ぐ。続いて、ポリペプチドを生物学的保護基に特異的な切断試薬で切断し、未保護の末端アミノ酸α−炭素反応基を形成する。未保護の末端アミノ酸α−炭素反応基を、化学修飾剤で修飾する。次に、側鎖が保護された末端修飾単一コピーポリペプチドの側鎖基を脱保護して、末端が修飾された組換え単一コピーポリペプチドを形成する。本方法における工程の数および順序は、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸の選択的修飾を達成するために変更することができる。
【００９１】  結合反応における結合ポリペプチドと活性化ＰＥＧの比率は、約１：０．５〜１：５０、約１：１〜１：３０、約１：５〜１：１５であってよい。本方法においては、結合ポリペプチドに対するＰＥＧの共有結合的付加を触媒するため、様々な水溶性緩衝液を用いることができる。１つの態様において、使用する緩衝液のｐＨは約７．０〜９．０である。別の態様では、ｐＨはわずかに塩基性範囲にあり、例えば約７．５〜８．５である。例えばリン酸緩衝液など、中性ｐＨに近いｐＫａを有する緩衝液も使用することができる。
【００９２】  サイズ排除（例えば、ゲルろ過）およびイオン交換クロマトグラフィーなど、当技術分野において周知である従来の分離および精製技法を用いて、ＰＥＧ化結合ポリペプチドを精製することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより生成物を分離することも可能である。分離され得る生成物には、モノ、ジ、トリ、ポリ、および非ＰＥＧ化結合ポリペプチド、ならびに遊離のＰＥＧが含まれる。モノＰＥＧ複合体の割合は、組成物中のモノＰＥＧの割合を増加させるために、溶出ピーク周囲の広い画分をプールすることにより調節することができる。約９０％のモノＰＥＧ複合体が、収率および活性の良好なバランスを示す。例えば少なくとも９２％、または少なくとも９６％の複合体がモノＰＥＧ種である組成物が望ましいと考えられる。本発明の１つの態様において、モノＰＥＧ複合体の割合は９０％〜９６％である。
【００９３】  １つの態様において、本発明のＰＥＧ化結合ポリペプチドは、１つ、２つ、またはそれ以上のＰＥＧ部分を含む。１つの態様において、ＰＥＧ部分は、タンパク質の表面上にある、および／または標的リガンドと接触する表面から離れたアミノ酸残基に結合される。１つの態様において、ＰＥＧ結合ポリペプチド中のＰＥＧの組み合わせた分子量または全分子量は約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａであり、任意に約１０，０００Ｄａ〜３６，０００Ｄａである。１つの態様において、ＰＥＧ化結合ポリペプチド中のＰＥＧは実質的に線状の直鎖ＰＥＧである。
【００９４】  本発明の１つの態様において、ＰＥＧ化結合ポリペプチド中のＰＥＧは、ヒドロキシルアミンアッセイ（例えば、室温における８〜１６時間の４５０ｍＭヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５））によりＰＥＧ化アミノ酸残基から加水分解されず、したがって安定である。１つの態様においては、組成物の８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を超える割合が、安定なモノＰＥＧ結合ポリペプチドである。
【００９５】  別の態様において、本発明のＰＥＧ化結合ポリペプチドは、好ましくは、非修飾タンパク質に付随する生物活性の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を保持する。１つの態様において、生物活性とは、ＫＤ、ｋｏｎ、またはｋｏｆｆによって評価される、ＶＥＧＦＲ−２に結合する能力を指す。１つの特定の態様において、ＰＥＧ化結合ポリペプチドタンパク質は、非ＰＥＧ化結合ポリペプチドと比較してＶＥＧＦＲへの結合の増加を示す。
【００９６】  ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清排除速度は、非修飾結合ポリペプチドの排除速度と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには９０％減少し得る。ＰＥＧ修飾ポリペプチドは、非修飾タンパク質の半減期（ｔ１／２）と比較して延長された半減期を有し得る。ＰＥＧ結合ポリペプチドの半減期は、非修飾結合ポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、もしくは５００％、またはさらには１０００％延長され得る。いくつかの態様において、タンパク質半減期は、緩衝生理食塩溶液中または血清中など、インビトロで決定される。他の態様においては、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中でのタンパク質の半減期のようなインビボ半減期である。
【００９７】５．治療用製剤および投与方法
本発明は、ＶＥＧＦ生物活性の阻害に応答する病態を治療する、または前病態を予防する方法を扱う。好ましい例は、不適切な血管新生によって特徴づけられる病態である。投与の方法および投与量は、特定のポリペプチドの種類および治療する特定の病態に応じて異なるが、当業者によって容易に決定され得る。一般に、規制機関は、治療として用いられるタンパク質試薬が、許容される程度に低レベルの発熱物質しか含まないように製剤化されることを義務付けている。したがって、治療用製剤は一般に、実質的に発熱物質を含まないか、または適切な規制機関（例えば、ＦＤＡ）によって決定された許容されるレベル未満の発熱物質しか含まない点で、他の製剤とは区別される。
【００９８】  本発明の治療化合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に単位剤形として投与することができる。投与は、非限定的な例として、非経口（例えば、静脈内、皮下）、経口、または局所投与であってよい。さらに、裸のＤＮＡ送達、組換え遺伝子およびベクター、患者の細胞のエクスビボ操作を含む細胞に基づく送達などのような、本発明のポリペプチドをコードする核酸を使用する任意の遺伝子治療法を用いることも可能である。
【００９９】  化合物は、経口投与に関しては、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、または徐放錠；あるいは静脈内、皮下、または非経口投与に関しては、液体；局所投与に関しては、ゲル、ローション剤、軟膏剤、クリーム、またはポリマーもしくは他の徐放賦形剤の形態であってよい。
【０１００】  当技術分野で周知の製剤化方法は、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０ｔｈ  ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ．，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）に見出される。非経口投与用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性油、または水素化ナフタレンを含み得る。化合物の放出を調節するには、生体適合性があり生物分解性のあるラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いることができる。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を用いて、化合物の体内分布を調節することも可能である。有用と考えられる非経口送達系には、他に、エチレン−ビニルアセテート共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが含まれる。製剤中の化合物の濃度は、投与する薬剤の投与量および投与経路を含む多くの要因によって異なる。
【０１０１】  ポリペプチドは任意に、製薬業界で通常用いられる、薬学的に許容される塩（非毒性酸付加塩など）または金属錯体として投与してもよい。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が含まれる。金属複合体は、亜鉛、鉄などを含む。１つの態様において、ポリペプチドは、熱安定性を高めるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。
【０１０２】  経口用製剤には、薬学的に許容される非毒性賦形剤との混合物中に有効成分を含む錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または増量剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、および付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）であってよい。
【０１０３】  経口用製剤はまた、チュアブル錠、または有効成分が不活性固体希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル、または有効成分が水もしくは油媒体と混合されている軟ゼラチンカプセルとして提供されてもよい。
【０１０４】  治療上有効な用量とは、投与されるものに対して治療効果をもたらす用量を指す。正確な用量は治療する疾患に依存することになり、周知の技法を用いて当業者によって確定され得る。一般的に、ポリペプチドは、１日当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ投与される。ポリペプチドは毎日投与することもできるし（例えば、１日に１回、２回、３回、または４回）、より低い頻度で（例えば１日おきに１回、週または月に１回または２回）投与することもできる。さらに、当技術分野で周知であるように、年齢、ならびに体重、一般的な健康状態、性別、食習慣、投与時間、薬物間相互作用、および疾患の重症度に対する調節が必要であると考えられ、これは当業者による日常的な実験により確定されることになる。
【０１０５】６．例示的な使用
本明細書に記載するＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドおよびそれらの関連変種は、多くの治療用途および診断用途に有用である。これらには、ＶＥＧＦＲ−２への結合に関して競合することによるかまたはＶＥＧＦＲ−２への結合を遮断することによるＶＥＧＦの生物活性の阻害、および細胞、好ましくはＶＥＧＦＲ−２を発現している細胞への毒性部分または画像化部分の送達が含まれる。
【０１０６】  これらの分子の大きさが小さいことおよび構造が安定であることは、薬剤の製造、迅速な排除が望ましい特定用途における体内からの迅速な排除、またはそのような特徴を有する分子を用いることで適合し得るもしくは改善される新規送達系への製剤化に関して特に有用であり得る。
【０１０７】  本発明のポリペプチドは、ＶＥＧＦ生物活性の阻害剤としての有効性に基づき、以下を含むがそれらに限定されない、不適切な血管新生に関連した多くの病態に対して有効である：自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、または乾癬）；心疾患（例えば、アテローム性動脈硬化または血管再狭窄）；網膜症（例えば、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、または血管新生緑内障）、腎疾患（例えば、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症候群；移植片拒絶；炎症性腎疾患；糸球体腎炎；メサンギウム増殖性糸球体腎炎；溶血性尿毒症症候群；および高血圧性腎硬化）；血管芽細胞腫；血管腫；甲状腺過形成；組織移植；慢性炎症；メーグス症候群；心嚢液貯留；胸水；自己免疫疾患；糖尿病；子宮内膜症、慢性喘息、望ましくない線維症（特に肝線維症）、および癌、ならびに胸水および腹水などの癌に起因する合併症。好ましくは、本発明のＶＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、過剰増殖性疾患または癌および癌の転移拡散の予防処置に用いられ得る。癌の非限定的な例には、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、軟骨癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、リンパ節癌、神経組織癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、骨格筋癌、皮膚癌、脊髄癌、脾臓癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、気管癌、泌尿生殖器癌、尿管癌、尿道癌、子宮癌、または膣癌が含まれる。治療可能なさらなる病態は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，５２４，５８３号に見出すことができる。ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドの使用に関して記載している他の参照には、ＭｃＬｅｏｄ  ＤＳ  ｅｔａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００２  Ｆｅｂ；４３（２）：４７４−８２；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；１３（１１）：６７１−８１；Ｙｏｓｈｉｊｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ．２００３  Ｓｅｐ；５２（９）：１３４７−５４；Ｖｅｒｈｅｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０００；５  Ｓｕｐｐｌ  １：４５−５０；Ｂｏｌｄｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００１；１９（１）：２４−３６が含まれる。
【０１０８】  本明細書に記載するように、血管新生関連疾患には、例えば固形腫瘍、白血病などの血液由来腫瘍、および腫瘍転移を含む血管新生依存性癌；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；免疫性炎症および非免疫性炎症などの炎症性疾患；慢性関節リウマチおよび乾癬；眼血管新生疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オスラーウェバー症候群；心筋血管新生；プラーク新血管新生；毛細血管拡張症；血友病性関節症；血管線維腫；ならびに創傷肉芽形成および創傷治癒；毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、冠動脈側枝、虚血肢血管新生、角膜疾患、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新血管新生、骨折、脈管形成、造血が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０９】  ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、単独で、または化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的介入、またはこれらの任意の組み合わせなどの１つまたは複数のさらなる治療と組み合わせて投与することができる。長期療法は、上記の他の治療戦略における補助療法と同様に可能である。
【０１１０】  そのような方法の特定の態様において、１つまたは複数のポリペプチド治療薬は、共に（同時に）または異なった時間に（順次に）投与することができる。さらに、ポリペプチド治療薬は、癌を治療するまたは血管新生を抑制する別の種類の化合物と共に投与することができる。
【０１１１】  特定の態様において、本発明の本治療薬は単独で使用することができる。または、本治療薬は、増殖性疾患（例えば、腫瘍）の治療または予防を対象とした他の従来の抗癌治療アプローチと組み合わせて使用することができる。例えば、そのような方法は、予防的癌防止、手術後の癌の再発および転移の予防において、ならびに他の従来の癌治療の補助剤として使用することができる。本発明は、従来の癌治療（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および手術）の有効性が、本ポリペプチド治療薬の使用により増強され得ることを認識する。
【０１１２】  様々な従来化合物が、抗腫瘍活性を有することが示されている。これらの化合物は、固形腫瘍を縮小させる、転移およびさらなる増殖を妨げる、または白血病もしくは骨髄悪性腫瘍における悪性腫瘍の数を減少させるために、化学療法における薬学的薬剤として使用されている。化学療法は様々な種類の悪性腫瘍の治療に有効であるが、多くの抗腫瘍化合物は望ましくない副作用を誘発する。２つまたはそれ以上の異なる治療を組み合わせた場合、治療は相乗的に作用して、それぞれの治療の投与量を減じることが可能となり、それによってそれぞれの化合物を高い投与量で使用した場合に起こる有害な副作用を低減できることが示されている。他の例においては、ある治療に抵抗性である悪性腫瘍は、２つまたはそれ以上の異なる治療の組み合わせに反応する場合がある。
【０１１３】  本発明のポリペプチド治療薬を別の従来の抗腫瘍薬と組み合わせて同時にまたは順次に投与する場合、そのような治療薬は、抗腫瘍薬の治療効果を増強する、またはそのような抗腫瘍薬に対する細胞の抵抗性を克服することが判明する場合がある。これによって抗腫瘍薬の投与量を減じることができ、ひいては望ましくない副作用が軽減されるか、または耐性細胞において抗腫瘍薬の有効性が回復する。
【０１１４】  併用抗腫瘍療法に用いられ得る薬学的化合物には、単に例証するために過ぎないが以下のものが含まれる：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン。
【０１１５】  特定の化学療法抗腫瘍化合物は、その作用機序によって例えば以下の群に分類され得る：代謝拮抗剤／抗癌剤、例えばピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、およびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗剤、ならびに関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；天然物を含む抗増殖剤／抗分裂剤、例えばビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤（例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロン、およびナベルビン）、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンポテシン、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミド、およびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力をもたない細胞を除去するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；抗増殖／抗分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロランブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン（ｔｒａｚｅｎｅｓ）−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗分裂代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体（メトトレキセト）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩、および他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解薬（例えば組織プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走薬（ａｎｔｉｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）；抗分泌薬（ブレベルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチ��）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）、および増殖因子阻害剤（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；、アンジオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）アムサクリン、カンポテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊剤。
【０１１６】  特定の態様において、併用抗血管新生療法に用いられ得る薬学的化合物には、以下のものが含まれる：（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）などの「血管新生分子」の放出阻害剤；（２）抗βｂＦＧＦ抗体などの血管新生分子の中和剤；および（３）コラゲナーゼ阻害剤、基底膜代謝回転阻害剤、血管新生抑制ステロイド、真菌由来血管新生阻害剤、血小板因子４、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミンおよび金チオマレートなどのリウマチ薬、ビタミンＤ３類似体、α−インターフェロンなどを含む、血管新生刺激に応答する内皮細胞の阻害剤。血管新生の提案されているさらなる阻害剤については、Ｂｌｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０３２：８９−１１８（１９９０）、Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）、Ｉｎｇｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：４４−５１（１９８８）、ならびに米国特許第５，０９２，８８５号、第５，１１２，９４６号、第５，１９２，７４４号、第５，２０２，３５２号、および第６５７３２５６を参照されたい。さらに、血管新生を抑制するために使用され得る多種多様な化合物が存在し、例えば、エンドスタチンタンパク質または誘導体、アンジオスタチンのリジン結合断片、メラニンまたはメラニン促進化合物、プラスミノーゲン断片（例えば、プラスミノーゲンのクリングル１〜３）、トロポニンサブユニット、ビトロネクチンαｖβ３の拮抗剤、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質または類似体（例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシン）、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドに結合されたＭｅｔＡＰ−２抑制コアを含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコンおよびその類似体、ならびにｎａａｌａｄアーゼ阻害剤がある。例えば、米国特許第６，３９５，７１８号、第６，６２，０７５号、第６，４６５，４３１号、第６，４７５，７８４号、第６，４８２，８０２号、第６，４８２，８１０号、第６，５００，４３１号、第６，５００，９２４号、第６，５１８，２９８号、第６，５２１，４３９号、第６，５２５，０１９号、第６，５３８，１０３号、第６，５４４，７５８号、第６，５４４，９４７号、第６，５４８，４７７号、第６，５５９，１２６号、および６，５６９，８４５号を参照されたい。
【０１１７】  併用療法の性質に応じて、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、他の療法が施されている間および／またはその後に続けることができる。ポリペプチド治療薬の投与は、単回投与または複数回投与で行われ得る。場合によっては、ポリペプチド治療薬の投与は従来の療法の少なくとも数日前に開始され、他の例では、投与は従来の療法の直前またはそれと同時に開始される。
【０１１８】  本明細書に記載するＶＥＧＦＲ−２結合タンパク質はまた、検出可能に標識して、画像化用途または診断用途の目的で、ＶＥＧＦＲ−２を発現している細胞と接触させるために使用することができる。診断目的では、本発明のポリペプチドは好ましくは固体支持体上に固定化される。好ましい固体支持体には、カラム（例えば、アガロースに基づくアフィニティーカラムなどのアフィニティーカラム）、マイクロチップ、またはビーズが含まれる。
【０１１９】  診断用途の１つの態様では、不適切な血管新生によって特徴づけられる病態を有する疑いのある患者に由来する、血清または組織生検試料などの生物試料を、ＶＥＧＦＲ−２のレベルを検出するために本発明の検出可能に標識されたポリペプチドと接触させる。次いで、検出されたＶＥＧＦＲ−２のレベルを、同様に標識ポリペプチドと接触させた正常試料において検出されたＶＥＧＦＲ−２のレベルと比較する。ＶＥＧＦＲ−２のレベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の増加は、不適切な血管新生によって特徴づけられる病態の診断上の指標と見なされ得る。
【０１２０】  特定の態様において、本発明のＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、検出され得る標識にさらに結合される（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であってよい）。活性部分は以下のような放射性物質であってよい：鉄キレートなどの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃｏそのような部分に結合された結合剤は画像化剤として使用することができ、ヒトなどの哺乳動物における診断上の使用のために有効な量で投与され、次いで画像化剤の局在性および蓄積が検出される。画像化剤の局在性および蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像化法、コンピュータ断層撮影法、または陽電子放出断層撮影法によって検出され得る。ＶＥＧＦＲを対象にしたＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドを使用する免疫シンチグラフィーを用いて、癌および脈管構造を検出および／または診断することができる。例えば、９９テクネジウム、１１１インジウム、または１２５ヨウ素で標識したＶＥＧＦＲ−２マーカーに対する結合ポリペプチドのいずれかは、そのような画像化に効率的に使用することができる。当業者には明白であるように、投与する放射性同位元素の量は放射性同位元素に依存する。当業者は、活性部分として使用する所与の放射性核種の比放射能およびエネルギーに基づいて、投与すべき画像化剤の量を容易に製剤化することができる。典型的に、画像化剤の用量当たり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは１〜１０ミリキュリー、最も頻繁には２〜５ミリキュリーが投与される。したがって、放射性部分に結合された標的化部分を含む、画像化剤として有用である本発明の組成物は、０．１〜１００ミリキュリー、いくつかの態様において好ましくは１〜１０ミリキュリー、いくつかの態様において好ましくは２〜５ミリキュリー、いくつかの態様においてより好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【０１２１】  本発明のＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドはまた、ＶＥＧＦＲ−２を発現している細胞または組織にさらなる治療薬（これらに限定されるわけではないが、薬剤化合物、化学療法化合物、および放射線治療化合物）を送達するために使用することができる。一例では、ＶＥＧＦＲ−２を発現している腫瘍細胞または組織に化学療法薬を標的化送達するために、ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドを化学療法薬と融合させる。
【０１２２】  本発明のＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドは、研究、診断、および治療用途を含む様々な用途に有用である。例えば、本ポリペプチドを用いて、受容体またはその一部を単離および／または精製すること、ならびに受容体の構造（例えば、高次構造）および機能を研究することができる。
【０１２３】  特定の局面では、本発明の種々の結合ポリペプチドを使用し、例えば内皮細胞（例えば、静脈内皮細胞）において、またはＶＥＧＦＲ−２遺伝子をトランスフェクションした細胞において、ＶＥＧＦＲ−２の発現を検出または測定することができる。したがって、本ポリペプチドは、診断または研究目的での、細胞選別および画像化（例えば、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別）などの用途において有用性を有する。
【０１２４】  特定の態様において、結合ポリペプチドまたはその断片は、診断目的のために標識されても標識されなくてもよい。典型的に診断アッセイは、ＶＥＧＦＲ−２に対する結合ポリペプチドの結合によって生じる複合体の形成の検出を伴う。結合ポリペプチドまたは断片は、抗体と同様に直接標識することができる。これらに限定されないが、放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含む種々の標識を使用することができる。多くの適切な免疫測定法が当業者に周知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；第３，８５０，７５２号；第３，９０１，６５４号；および第４，０９８，８７６号を参照のこと）。非標識の場合には、結合ポリペプチドは凝集アッセイなどのアッセイに使用することができる。非標識結合ポリペプチドはまた、結合ポリペプチドと反応する標識抗体または他の適切な試薬（例えば、標識プロテインＡ）などの、結合ポリペプチドを検出するために使用し得る別の（１つまたは複数の）適切な試薬と組み合わせて使用することも可能である。
【０１２５】  １つの態様において、本発明の結合ポリペプチドは酵素免疫法において使用することができ、その場合、本ポリペプチドは酵素に結合させておく。ＶＥＧＦＲ−２タンパク質を含む生物試料を本結合ポリペプチドと混合すると、結合ポリペプチドとＶＥＧＦＲ−２タンパク質との間に結合が生じる。１つの態様において、ＶＥＧＦＲタンパク質を発現している細胞（例えば、内皮細胞）を含む試料を本抗体と混合すると、結合ポリペプチドと、結合ポリペプチドによって認識されるＶＥＧＦＲ−２タンパク質を有する細胞との間に結合が生じる。これらの結合した細胞を非結合試薬から分離し得り、例えば、酵素が作用した場合に色または他の検出可能な変化を生じる酵素の基質と試料を接触させることによって、細胞に特異的に結合した結合ポリペプチド−酵素複合体の存在を検出することができる。別の態様では、本結合ポリペプチドは非標識であってよく、本結合ポリペプチドを認識する二次標識ポリペプチド（例えば、抗体）を添加することができる。
【０１２６】  特定の局面において、生物試料中のＶＥＧＦＲ−２タンパク質の存在の検出に使用するためのキットもまた調製することができる。そのようなキットは、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質またはそのような受容体の一部に結合するＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチド、および結合ポリペプチドと受容体タンパク質またはその一部との複合体の存在を検出するのに適した１つまたは複数の補助試薬を含む。本発明のポリペプチド組成物は、単独で、または他のエピトープに特異的なさらなる抗体と組み合わせて、凍結乾燥形態で提供することができる。結合ポリペプチドおよび／または抗体は標識されていてもされていなくてもよく、補助成分（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸、および炭酸などの緩衝液、安定剤、賦形剤、殺生物剤、および／または例えばウシ血清アルブミンなどの不活性タンパク質）と共にキット内に含めることができる。例えば、結合ポリペプチドおよび／または抗体は、補助成分との凍結乾燥混合物として提供されてもよいし、または補助成分は使用者が組み合わせるように個別に提供されてもよい。一般にこれらの補助物質は、活性結合ポリペプチドまたは抗体の量に基づいて約５重量％未満存在し、通常はポリペプチドまたは抗体濃度に基づいて全量で少なくとも約０．００１重量％存在する。結合ポリペプチドに結合し得る二次抗体を使用する場合には、そのような抗体を、例えば別のバイアルまたは容器に入れてキット中に提供することができる。二次抗体は存在する場合、典型的に標識されており、上記の抗体製剤と同様の方法で製剤化することができる。
【０１２７】  同様に本発明は、ＶＥＧＦＲ−２の発現を検出および／または定量化する方法であって、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物を、ＶＥＧＦＲ−２またはこの受容体の一部に結合する結合ポリペプチドとこれらへの結合に適した条件下で接触させ、結合をモニターする方法に関する。結合ポリペプチドとＶＥＧＦＲ−２またはその一部との間で複合体が形成されたことを示す結合ポリペプチドの検出は、受容体の存在を示す。ポリペプチドの細胞への結合は、実施例に記載する方法などの標準的な方法によって決定することができる。この方法を用いて、個体の細胞におけるＶＥＧＦＲ−２発現を検出することができる。任意に、内皮細胞の表面上でのＶＥＧＦＲ−２の定量的発現を、例えばフローサイトメトリーによって評価することができ、染色強度を疾患の感受性、進行、またはリスクと相関づけることができる。
【０１２８】  本発明はまた、特定の疾患に対する哺乳動物の感受性を検出する方法に関する。例えば、本方法を用いて、細胞上に存在するＶＥＧＦＲ−２の量および／または哺乳動物におけるＶＥＧＦＲ−２陽性細胞の数に基づいて進行する疾患に対する哺乳動物の感受性を検出することができる。１つの態様において、本発明は、腫瘍に対する哺乳動物の感受性を検出する方法に関する。この態様では、正常個体においてＶＥＧＦＲ−２を発現する細胞を含む被験試料をＶＥＧＦＲ−２またはその一部と結合する結合ポリペプチドと、それらへの結合に適した条件下で接触させる。腫瘍に対する個体の感受性を示す結合および／または結合の量を検出するが、受容体が高レベルであるほど腫瘍に対する個体の感受性が高い。
【０１２９】実施例：
以下の実施例は本発明を説明する目的で提供するものであり、限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３０】実施例１．ＫＤＲ結合分子の最初の同定
ヒトフィブロネクチンの１０番目のタイプ３ドメインの骨格に基づき、２３〜２９位、５２〜５５位、および７７〜８６位（アミノ酸番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を参照にする）の３つの領域をランダム化して、約１０１３個のＲＮＡ−タンパク質融合変種のライブラリーを構築した（３ループライブラリー；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：９３３−９４２，２００２）。２３〜２９位および７７〜８６位（２ループライブラリー）または７７〜８６位（１ループライブラリー）でのみランダム化した領域を含む同様のライブラリーを構築した。これらの３つのライブラリーの混合物を、ヒトＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン（ＫＤＲ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合した細胞外ドメイン、残基１〜７６４）に対するインビトロ選択に使用した。この用途のために、ループのアミノ酸の位置を残基２３〜３０（ＢＣループ）、５２〜５６（ＤＥループ）、および７７〜８７（ＦＧループ）と定義する。６ラウンドの選択の後、ＤＮＡ配列決定により標的結合集団を解析したが、これらはいくつかの複製物が存在するが多様であることが判明した。１５個の独立したクローンによってコードされるタンパク質をＫＤＲに対する結合に関してスクリーニングし（図１Ａ）、続いて最も良好な結合剤をＶＥＧＦの存在下における標的結合の阻害について解析した（図１Ｂ）。ＫＤＲ−ＶＥＧＦ結合を阻害する複数のクローンが同定され、これらのクローンが天然リガンド（ＶＥＧＦ）結合部位においてまたはその近傍でＫＤＲと結合することが示唆された。２つの結合分子（ＶＲ２８およびＶＲ１２）がＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を直接阻害する能力を、固定化ＶＥＧＦおよびＫＤＲ−Ｆｃを含む移動相を用いて、選択した結合タンパク質を含めてまたは含めずに、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイで評価した。ＶＲ２８、それよりも低い程度でＶＲ１２は用量依存的様式でＶＥＧＦへのＫＤＲ結合を阻害したが、非競合クローン（ＶＲ１７）は阻害しなかった（図１Ｃ）。最後に、精製組換えＫＤＲに対する結合に加えて、ＶＲ２８はまたＫＤＲ発現組換えＣＨＯ細胞に結合するが、対照ＣＨＯ細胞には結合しないようであった（図１Ｄ）。
【０１３１】  ＶＲ２８クローンの結合ループの配列を表４の１行目に示す。
【０１３２】  ＶＲ２８は配列を決定した結合集団の中で最も豊富なクローンではなかったが（配列を決定した２８クローンのうち１コピー）、ＫＤＲに対するその結合親和性は、放射性平衡結合アッセイ（図３および表５）およびＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（表７）で決定された解離定数１１〜１３ｎＭを有して、この結合集団の試験したクローンの中で最良であった。分子の残りの骨格部分は、野生型１０Ｆｎ３とは相違がなかった（結合に影響しない６９位における偶発的な骨格変化を修正した後）。しかし、ＶＲ２８は、ＶＥＧＦ依存性細胞増殖アッセイにおいてＶＥＧＦ−ＫＤＲシグナル伝達の阻害をほとんど示さなかった。したがって、ナイーブライブラリーからの選択により、生化学的結合研究においてＶＥＧＦとＫＤＲの相互作用を妨げる抗体模倣体が得られたが、生物学的シグナル伝達アッセイにおける中和機能には親和性の改善が有用であった。
【０１３３】実施例２．クローンＶＲ２８の親和性成熟
結合ループ内のみでの配列変更に焦点を置いた突然変異誘発戦略を利用した。始めにどのループが最も改善をもたらす可能性が高いかを試験するため、ループ特異的高頻度変異誘発ＰＣＲを行い、ＶＲ２８の各ループに独立して最大で３０％の変異を導入した。ＫＤＲに対して選択を３ラウンド行った後、ＫＤＲ−Ｆｃに対する結合が改良された複数のクローンが認められた。選択プールの配列解析から、変異の大部分はＦＧループ内に蓄積し、ＢＣループおよびＤＥループはほぼ原型のまま残っていることが明らかになった。この結果から、ＦＧループがさらなる修飾の最も適した標的であることが示された。
【０１３４】
したがって、オリゴヌクレオチド突然変異誘発によりFGループ内のVR28配列を変更することによって、約1012個の変種の新規ライブラリーを構築した。FGループの位置のそれぞれについて（残基77〜86［VAQNDHELIT（SEQ ID NO:198）および次のプロリン（残基87）］）、VR28コードDNAおよびNNSの50:50混合物を各位置に導入した。約80クローンのランダムな試料をDNA配列解析したところ、予想通りクローン当たり平均して6アミノ酸の変化が明らかになった。標的に対してより高い親和性を有するクローンを支持するために、選択過程において低いKDR-Fc濃度を使用した。4ラウンドの選択過程における標的結合のプロファイルを図2に示す。4ラウンドの選択後、結合集団をサブクローニングして解析した。表5および図3Aに、個々の結合クローンの親和性測定値を要約する。KDR-Fcに対して測定された結合定数は、VR28（11 nM）の10〜30倍改善されて<0.4〜<1.8 nMであった。
【０１３５】  そのいくつかを表４（Ｋクローン）に示すが、配列解析から、結合集団は多様であるが、クローン間にいくつかの共通モチーフが同定されることが明らかになった。最も顕著なことには、Ｐｒｏ８７およびＬｅｕ８４が（ＶＲ２８に見られるように）ほとんどすべてのクローンに認められ、これらの残基が結合部位の構造に必須であることが示唆された。配列決定したクローンにおいてＨ８２ＫまたはＨ８２Ｒの変化のみが認められたことから、８２位には正に荷電したアミノ酸が必要であると考えられ、または７８位には脂肪族アミノ酸が主を占めていた。Ｄ８１は多くの場合Ｇに変異されており、その結果この位置における負の荷電が消失し、可動性が増加した。さらに、選択された集団における全体的な変異の割合は、選択前のプールに匹敵しており、ＦＧループは変化に対して非常に開放的であることが示唆された。
【０１３６】  ヒトフィブロネクチンの１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端におけるいくつかの残基は、構造決定によって示唆されるようにＦＧループに近接して位置する（Ｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ７１：６７１−６７８，１９９２）。２つの領域が近接していることは、標的結合に負の影響を及ぼす可能性があると考えられる。Ｎ末端領域における２つの偶発的な変異、Ｌ８ＰおよびＬ８Ｑは、おそらくＦＧループに対するＮ末端の位置の変化に起因して、多くの選択されたクローンの中でＫＤＲへのより良好な結合をもたらした。Ｎ末端の影響をさらに試験するために、２３個の異なるＫＤＲ結合剤について、βシートの前のＮ末端の最初の８残基が欠失された結合分子を作製した。次いで、欠失していない対応物と標的結合を比較した。図３Ｂに示すように、ＫＤＲ−Ｆｃに対する結合は欠失させることで平均して約３倍良好であった。
【０１３７】実施例３．ヒト（ＫＤＲ）およびマウス（Ｆｌｋ−１）ＶＥＧＦＲ−２に対する二重特異性を有する結合剤の選択
ＶＲ２８および親和性成熟した変種（Ｋクローン）の大部分は、図４に示すように、ＫＤＲのマウス相同体、Ｆｌｋ  １に結合し得なかった。しかし、ＫＤＲとＦｌｋ  １は高レベルの配列同一性を共有しているため（８５％、Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３１７−１６３２２（１９９２）、Ｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３８７７−３８８３（１９９６））、ＫＤＲおよびＦｌｋ  １の両方に結合し得る抗体模倣体が単離されることが考えられる。そのような二重結合剤は、同じ分子を動物モデルにおける機能研究において、次いでヒトにおける機能研究において試験できることから、望ましい。
【０１３８】  ＦＧループの突然変異誘発およびＫＤＲに対する４ラウンドの選択後のクローン集団を、Ｆｌｋ  １に対してさらに３ラウンド選択した。図２に示すように、ラウンド５からラウンド７にかけてＦｌｋ  １に対する結合の増加が認められ、Ｆｌｋ  １結合剤の濃縮が示された。複数の個々のクローンについて結合を解析した結果、ＫＤＲのみに対して選択されたクローン（Ｋクローン）とは対照的に、Ｆｌｋ  １に対するさらなる選択に由来するほとんどのクローン（Ｅクローン）は、ＫＤＲおよびＦｌｋ  １の両方と相互作用し得ることが明らかになった。放射性平衡結合アッセイ（表６および図５）およびＢＩＡｃｏｒｅ（表７）により決定された両標的に対する結合定数から、個々のクローンは両標的に高親和性で結合し得ることが示される。
【０１３９】  例えば、Ｅ１９はＫＤＲに対して６０ｐＭおよびＦｌｋ−１に対して３４０ｐＭというＫｄを有する。これらの結果から、選択過程における単純な標的変換戦略によって、おそらくは両標的によってかけられる選択圧を介して、Ｆｌｋ−１に結合し得ない中程度のＫＤＲ結合剤であるＶＲ２８の変異誘発集団から、ＫＤＲおよびＦｌｋ−１の両方に対する二重特異性を有する分子が単離され得ることが実証される。選択されたフィブロネクチンに基づく結合タンパク質は、高い標的濃度においてもＶＥＧＦＲ１に対する実質的な結合は認められず、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）に対して高度に特異的である。
【０１４０】
配列解析から、いくつかのモチーフはKDR結合剤プールで認められたモチーフと類似しているが（残基84および87それぞれにおけるLeuおよびPro；残基82におけ正に荷電したアミノ酸、主にArg）、いくつかのモチーフは維持されていないことが（78位における脂肪族）明らかになった。さらに、モチーフERNGR（残基78〜82）がFlk-1に結合するほぼすべてのクローンに存在した（表4）；このモチーフは、KDR結合プール中にはほとんど認められなかった。R79およびR82は、この位置に異なる残基が存在する場合、Flk-1への結合は大きく減少し、KDRへの結合は減少しないことから、Flk-1への高親和性結合に特に重要であると考えられる（図6A）。KDRおよびFlk-1への結合における各ループの重要性を決定するため、表4に示すクローンE6およびE26のループを、NNSランダム化配列によって1度に1ループ置換した。図6Bに示すように、置換後、タンパク質はもはやKDRにもFlk-1にも結合できない。これらの結果から、各ループは標的に対する結合に必要であることが示され、標的との相互作用には3つのループすべてが協同的に関与することが示唆される。
【０１４１】
両標的に結合し得るクローンを得るために、別の突然変異誘発戦略を独立して使用した。KDRと高親和性で（Kd=2 nM；表7）結合しFlk-1と低親和性で（Kd>3000 nM）結合する、VR28の高頻度変異誘発PCR親和性成熟の産物であるクローン159Q(8)L（表4）を、開始点として選択した。FGループの最初の6アミノ酸を十分にランダム化し（NNS）、残りの5残基（ELFTP）は原型のまま残した。Flk-1に対して選択を6ラウンド行った後、結合プールをDEループ（52〜56位）において再度ランダム化し、Flk-1に対してさらに3ラウンドおよびKDRに対して1ラウンドの選択を行った。このようにして、KDRおよびFlk-1の両方に対する多くの高親和性結合分子が得られた（表4および図4）。例えば、クローンM5FLは、KDRに対する高い結合親和性を維持しつつ（Kd=890 pM）、元のクローンの1000倍の改善である2.1 nMのKdでFlk-1に結合し得る。興味深いことに、VR28の変異誘発集団から選択されたFlk-1結合分子において認められたERNGRモチーフは、FGループのこの領域を十分にランダム化したにもかかわらず、クローン159Q(8)Lの変異誘発および選択に由来する複数のクローン中にも同様に存在した。2つの独立したライブラリーから同様の結合分子が単離されたことから、親和性成熟過程は、FGループ内に位置する最適なFlk-1結合モチーフを単離するのに強力であることが示唆される。
【０１４２】
実施例4. インビトロにおける細胞表面結合およびVEGF活性の中和
大腸菌が産生する結合分子を用いて、細胞培養モデル系におけるKDRおよびFlk-1結合分子の機能性を評価した。抗His6タグマウス抗体（大腸菌が発現するタンパク質はHisタグと共に発現された）および抗マウス蛍光標識抗体からなる検出系を使用して、結合分子が、低いナノモル濃度のEC50でKDRまたはFlk-1を発現する哺乳動物細胞に特異的に結合することが示された（図7および表8）。
【０１４３】  より重要なことには、エリスロポエチン受容体シグナル伝達ドメインに結合された細胞外ＫＤＲまたはＦｌｋ−１ドメインを発現する組換えＢＡ／Ｆ３細胞（ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）を用いた場合、これらの分子は、ＫＤＲ発現細胞については３〜１２ｎＭおよびＦｌｋ−１発現細胞については２〜５ｎＭのＩＣ５０を有して、用量依存的様式でＶＥＧＦ刺激による細胞増殖を抑制した。図８および表９に示すように、抑制の強度は対照抗ＫＤＲモノクローナル抗体および抗Ｆｌｋ−１モノクローナル抗体と同程度であると考えられる。
【０１４４】  ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の増殖のＶＥＧＦ阻害に関して、多くのクローンをさらに試験した。ＨＵＶＥＣ細胞は、ＶＥＧＦに反応する体内の細胞と密接に関連した天然のヒト細胞である。図９および表１０に示すように、野生型フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質はこのヒト由来細胞系においＶＥＧＦ活性の阻害に関して不活性であるのに対し、フィブロネクチンに基づく結合タンパク質はこの系においてもＶＥＧＦ活性を阻害する活性を有した。
【０１４５】実施例５．Ｍ５ＦＬタンパク質の熱安定性および可逆的リフォールディング
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、ＫＤＲ結合剤Ｍ５ＦＬの熱安定性を明らかにした。標準的なＰＢＳ緩衝液条件（リン酸ナトリウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）下では、Ｍ５ＦＬは５６℃で単一の不可逆的熱融解転移を有することが判明した。その後、酢酸ナトリウムｐＨ４．５が、Ｍ５ＦＬタンパク質の溶解度に好ましい緩衝液であると同定された。この緩衝液（１００ｍＭ）中でのＤＳＣ実験から、Ｍ５ＦＬはこれらの条件下でより安定であり（Ｔｍ＝６７〜７７℃）、融解転移が可逆的であることが実証された（図１０）。可逆的融解転移を用いてタンパク質治療薬の長期保存を支持する好ましい条件が同定されており（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：５２４１（１９９９））、よってＮａ−酢酸ｐＨ４．５はＭ５ＦＬタンパク質の保存に最適な緩衝液であると同定された。
【０１４６】
実施例6. PEG化M5FLタンパク質のインビトロ結合および細胞に基づく活性
C末端伸長を有するM5FLタンパク質を大腸菌発現系で産生させて、以下のタンパク質配列を得た（Cys100に斜線を施し、C末端伸長に下線を引いてある；かなりの割合のタンパク質が最初のメチオニンを欠いて産生される）：
0005006651.tif 000065
【０１４７】  １００位のシステイン残基の単一のスルフヒドリルを用いて、標準的なマレイミド化学法によりＰＥＧ変種に結合し、２つの異なるＰＥＧ化型Ｍ５ＦＬを得た。直鎖状２０ｋＤ  ＰＥＧおよび分岐型４０  ｋＤ  ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＭ５ＦＬと結合して、それぞれＭ５ＦＬ−ＰＥＧ２０およびＭ５ＦＬ−ＰＥＧ４０を作製した。陽イオン交換クロマトグラフィーにより、未反応のタンパク質およびＰＥＧからＰＥＧ化タンパク質形態を精製した。２つのＰＥＧ型Ｍ５ＦＬの共有結合を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１）および質量分析によって確認した。
【０１４８】  ＢＩＡｃｏｒｅチップ上にアミド化学法によって固定化したヒトおよびマウスＶＥＧＦ受容体標的タンパク質を用いて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ）によりインビトロ親和性測定を行った。いずれの標的タンパク質に対しても、２０ｋＤおよび４０ｋＤ  ＰＥＧ化Ｍ５ＦＬ型は未修飾のＭ５ＦＬよりも遅い結合速度（Ｋａ）を有し、解離定数（ｋｄ）にはほぼ影響がないことが判明した（表１１）。
【０１４９】  実施例４に記載したＢａ／Ｆ３系を用いて、ＰＥＧ化Ｍ５ＦＬ調製物の機能性を試験した。図１２は、それぞれの結合剤の濃度の関数としてのＡ４９０（細胞増殖の程度を表す）のプロットを示す。曲線はほぼ同一であり、どちらのＰＥＧ化型の生物活性にもＰＥＧ化の影響がほぼないことが示された。
【０１５０】  ＫＤＲ結合ポリペプチドのサブセットについてＫｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫＤを解析し、ＢａＦ３細胞に基づくＶＥＧＦ阻害アッセイのＥＣ５０と比較した。散布図から、ｋｏｎはＥＣ５０と十分に相関するが、ｋｏｆｆは十分に相関しないことが示された。１０５ｓ−１以上のｋｏｎを有するＫＤＲ結合タンパク質の９０％超は、１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有した。ＫＤはｋｏｎとｋｏｆｆの比であり、予想通りＥＣ５０と中程度の相関を示す。
【０１５１】  ＣＴ−０１を含む多くのＫＤＲ結合タンパク質を、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３への結合に関して評価した。タンパク質はＶＥＧＦＲ−２に対する高度の特異性を示した。
【０１５２】実施例６：ＫＤＲ結合タンパク質ＣＴ−０１の調製物はヒト内皮細胞においてＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を阻害する。
上記実施例に記載した方法を受けて、１０Ｆｎ３に基づくさらなるＫＤＲ結合タンパク質を作製した。上記の実施例５でＭ５ＦＬタンパク質の開発に関して記載したように、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイを用いてヒトＫＤＲおよびマウスＦｌｋ−１に対するＫＤについて、およびＢａ／Ｆ３アッセイにおけるＩＣ５０について試験した。ＣＴ−０１と命名したタンパク質は、これらのアッセイそれぞれにおいて所望の特性を示し、よってさらなる解析に使用した。
【０１５３】
CT-01を導出した最初のクローンは、配列：
0005006651.tif 000066
を有した。FGループ配列に下線を引いてある。
【０１５４】  上記のような親和性成熟により、ＣＴ−０１のコア型が生成された。
0005006651.tif 000067
【０１５５】  上記のＣＴ−０１分子は最初の８アミノ酸の欠失を有し、Ｎ末端またはＣ末端にさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、さらなるＭＧ配列をＮ末端に置くことができる。Ｍは通常切断されて、Ｎ末端にはＧＥＶ…配列が残る。通常の８アミノ酸をＮ末端に再付加することでも、所望の特性を有するＫＤＲ結合タンパク質が生成される。Ｎ末端のメチオニンは通常切断されて、配列：
0005006651.tif 000068
が得られる。
【０１５６】
インビボで使用するには、PEG化に適した形態を作製することができる。例えば、N末端の8アミノ酸を欠く形態について以下に示すように、システインを含むC末端尾部を付加して、これを発現させた。
0005006651.tif 000069
以下に記載するインビボ実験では、この分子のPEG化型を使用する。システインの代わりにセリンを有する対照型もまた使用した。
0005006651.tif 000070
【０１５７】  同じＣ末端尾部を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３に示すＮ末端８アミノ酸を有するＣＴ−０１型に付加することもできる。
【０１５８】
所望のKDR結合特性を有するさらなる変種が単離された。以下のコア配列はいくぶん異なるFGループを有し、例えば、N末端MG配列、欠失された8アミノ酸を回復するN末端配列、および/またはPEG化用のシステインを提供するためのC末端尾部と共に発現させることができる。
0005006651.tif 000071
別のそのような変種はコア配列：
0005006651.tif 000072
を有する。
【０１５９】  これらの変種を比較することによって、ＦＧループの共通配列：（Ｄ／Ｅ）ＧＸＮＸＲＸＸＩＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）が示される。より詳細には、共通配列は（Ｄ／Ｅ）Ｇ（Ｒ／Ｐ）Ｎ（Ｇ／Ｅ）Ｒ（Ｓ／Ｌ）（Ｓ／Ｆ）ＩＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）として表すことができる。
【０１６０】実施例７：ＣＴ−０１はヒト内皮細胞においてＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を阻害する。
図１３に示すように、ＶＥＧＦＲ−２を介したＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達は、ＶＥＧＦＲ−２の細胞内ドメインのリン酸化、およびその後のホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２が関与する経路の活性化によって媒介され、内皮細胞増殖をもたらす。
【０１６１】  本明細書に開示するＫＤＲ結合剤がこのシグナル伝達経路の活性化を抑制するかどうかを評価するため、ヒト微小血管内皮細胞をＶＥＧＦＲ結合ポリペプチド（例えば、ＣＴ−０１）で３０分間処理し、ＶＥＧＦ−Ａで５分間刺激した。ホスホ−ＶＥＧＦＲ−２、非ホスホ−ＶＥＧＦＲ−２、ホスホ−ＥＲＫ１／２、および非ホスホ−ＥＲＫ１／２に特異的な抗体を用いて、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン解析により解析した。
【０１６２】  図１３に示すように、１３０ｐＭ  ＣＴ−０１はホスホ−ＶＥＧＦＲ−２の形成を抑制し、また下流のリン酸化ＥＲＫ１／２の形成を減少させる。リン酸化ＥＲＫ１／２は完全には排除されないが、これはおそらく、ＥＲＫ１／２は多くのさらなるシグナル伝達経路からシグナルを受け取るという事実による。
【０１６３】実施例８：フィブロネクチンに基づくＫＤＲ結合タンパク質のＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｄによるシグナル伝達の阻止
ＶＥＧＦＲ−２は３つのＶＥＧＦ種、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄの受容体である。ＫＤＲを介するＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｄ媒介性シグナル伝達に及ぼすフィブロネクチンに基づくＫＤＲ結合タンパク質の影響を評価する実験を行った。
【０１６４】  Ｆｌｋ−１媒介性シグナル伝達に依存するＢａ／Ｆ３細胞株を作製した。図１４の左側のパネルに示すように、細胞生存度は、著しく高レベルのＶＥＧＦ−Ｄが必要であるものの、細胞をＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄで処理することにより維持することができた。
【０１６５】  図１４の中央のパネルに示すように、細胞を１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ−Ａの存在下で維持し、本明細書に開示するＭ５ＦＬもしくはＣＴ−０１タンパク質、またはＤＣ−１０１抗Ｆｌｋ−１抗体と接触させた。試薬はそれぞれＶＥＧＦ−Ａが媒介する細胞生存度を逆行させ、これにより、Ｆｌｋ−１を介したＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達が阻止されたことが示される。
【０１６６】  図１４の右側のパネルに示すように、細胞を３００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ−Ｄの存在下で維持し、本明細書に開示するＭ５ＦＬもしくはＦ１０タンパク質、または抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体と接触させた。Ｍ５ＦＬおよびＦ１０はＶＥＧＦ−Ｄが媒介する細胞生存度を逆行させ、これにより、Ｆｌｋ−１を介したＶＥＧＦ−Ｄシグナル伝達が阻止されたことが示される。抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は影響を及ぼさす、本アッセイの特異性が実証される。
【０１６７】実施例９：薬物動態
薬物動態研究：未変性ＣＴ−０１またはＰＥＧ化型（４０ｋＤａ  ＰＥＧ、ＣＴ−０１ＰＥＧ４０）を１２５Ｉでヨウ素化した。ヨウ素化タンパク質１０〜２０ｍＣｉを成体雄ラットの静脈内または腹腔内に投与し、表示の時間にヨウ素化タンパク質レベルを測定した。組織分布研究では、１５分、２時間、および６時間後にラットを屠殺し、放射能レベルを測定した。図１５および１６を参照されたい。非修飾ＣＴ−０１は、血液から迅速に排除される１２ｋＤａタンパク質である。６９．９ｍＬ／ｈｒ／ｋｇの排除、最大血清濃度９．１ｍｇを有して、曲線下面積（ＡＵＣ）値は１４．６ｈｒ＊ｍｇ／ｍＬである。初期半減期（α）は０．３時間であり、第二相半減期（β）は１３．５時間である。これと比較して、静脈内ＰＥＧ化ＣＴ−０１は、主に初期相の排除の劇的な減少が原因で、血中における存在が著しく増加した。ＡＵＣは１０倍超増大して１９３となり、排除速度は１／１０未満に低下して５．２となり、Ｃｍａｘは１２．９ｍｇ／ｍｌである。α半減期は１時間まで延長され、β半減期は１６．２時間まで延長される。ラットにおけるこれらに薬物動態はヒトにおける週に２回の投与計画に相当し、この投与の程度は十分に許容可能な範囲内にある。
【０１６８】  ＰＥＧ化ＣＴ−０１の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与は貯蔵様薬物動態を有した。ＣＴ−０１の血中濃度の最初の急増は認められなかった。代わりに、ＣＴ−０１の量はよりゆっくりと増加し、ゆっくりと減少した。静脈内投与時のＣＴ−０１濃度の最初の急増に起因する副作用の問題がある場合、そのような薬物動態は望ましいと考えられる。１０Ｆｎ３に基づく他の薬剤も、ｉ．ｐ．投与で同様に挙動を示す可能性が高い。したがって、これは、１０Ｆｎ３に基づく薬剤による時間遅延投薬を達成するための一般化可能な様式であると考えられる。
【０１６９】  図１６に示すように、肝臓がＰＥＧ化型ＣＴ−０１を分泌する主な経路である。ＣＴ−０１の長期蓄積は検出されなかった。
【０１７０】  ２０ｋＤＡ  ＰＥＧ部分に結合したＣＴ−０１を用いた場合にも、同様の結果が得られた。
【０１７１】実施例１０：ＣＴ−０１のインビボ有効性
図１７に概説するＭｉｌｅｓアッセイを用いて、腫瘍効果研究のための用量、スケジュール、および投与パラメータを評価する。ＶＥＧＦ投与の４時間前に、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスの腹腔内に緩衝液または１、５、および２０ｍｇ／ｋｇのＣＴ−０１ＰＥＧ４０を投与した。背中の皮膚にＶＥＧＦ−Ａを皮内局所投与することにより、エバンスブルー色素の血管漏出が誘導される（図１７および１８）。
【０１７２】  ＫＤＲ結合剤で処理したマウスは、ＶＥＧＦ媒介性血管漏出のレベルの統計的に有意な減少を示した。ＣＴ−０１の５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ用量は有意な結果を示した。したがって、マウス腫瘍モデル研究には５ｍｇ／ｋｇ用量を選択した。
【０１７３】実施例１１：ＣＴ−０１の腫瘍増殖抑制
Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ腫瘍アッセイ：
１日目に、２ｘ１０６個のＢ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ腫瘍細胞をＣ５７／ＢＬ雄マウスの皮下に移植した。６日目に、触知腫瘤が検出された。腫瘍が測定可能な大きさになった８日目に、媒体対照、５、１５、または４０ｍｇ／ｋｇ  ＣＴ−０１ＰＥＧ４０の腹腔内連日投与を開始した。最低用量である５ｍｇ／ｋｇは腫瘍増殖を減少させた。１８日目に、１５および４０ｍｇ／ｋｇで処理したマウスは、腫瘍増殖の５０％および６６％の減少を示した。図１９を参照されたい。
【０１７４】Ｕ８７ヒト神経膠芽腫アッセイ：
５ｘ１０６個のＵ８７ヒト神経膠芽腫腫瘍細胞を雄ヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍体積が約５０ｍｍ３に到達した時点で、処置を開始した（０日目）。媒体対照、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ  ＣＴ−０１ＰＥＧ４０を一日おきに（ＥＯＤ）静脈内投与した。抗Ｆｌｋ−１抗体ＤＣ１０１を、最適投与計画に関して発表されている通り、４０ｍｇ／ｋｇで週に２回投与した。最低用量である３ｍｇ／ｋｇは腫瘍増殖を減少させた。１２日目に、１０および３０ｍｇ／ｋｇで処理したマウスは、腫瘍増殖の５０％の減少を示した。図２０を参照されたい。有効性は抗Ｆｌｋ−１抗体の有効性と匹敵する。
【０１７５】  以下の材料および方法を実施例１〜１１に記載した実験に使用した。
【０１７６】組換えタンパク質：
組換えヒトＶＥＧＦ１６５、マウスＶＥＧＦ１６４、ヒトニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、ヒトおよびマウス血管内皮増殖因子受容体−２Ｆｃキメラ（ＫＤＲ−ＦｃおよびＦｌｋ−１−Ｆｃ）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入した。標的タンパク質のビオチン化は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州）の存在において、１ｘＰＢＳ中で４℃にて２時間行った。１ｘＰＢＳに対して透析することにより、過剰量のＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを除去した。ビオチン化のレベルは質量分析によって決定し、標的タンパク質濃度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州）を使用して測定した。
【０１７７】
プライマー：
ライブラリーの構築および選択されたクローンの突然変異誘発において最終的に使用するため、以下のオリゴヌクレオチドを化学合成により調製した。
T7 TMV Fn：
0005006651.tif 000073
T7 TMV N末端欠失：
0005006651.tif 000074
MK165-4 A20：
0005006651.tif 000075
N末端フォワード：
0005006651.tif 000076
BCDEリバース：
0005006651.tif 000077
BCDEフォワード：
0005006651.tif 000078
DEFGリバース：
0005006651.tif 000079
DEFGフォワード：
0005006651.tif 000080
C末端ポリA：
0005006651.tif 000081
Hu3'FLAGSTOP：
0005006651.tif 000082
VR28FG-50：
0005006651.tif 000083
F1U2：
0005006651.tif 000084
F2：
0005006651.tif 000085
F3159：
0005006651.tif 000086
F4：
0005006651.tif 000087
F5159：
0005006651.tif 000088
F5-X5：
0005006651.tif 000089
F6：
0005006651.tif 000090
F7X6159：
0005006651.tif 000091
F8：
0005006651.tif 000092
C2asaiA20：
0005006651.tif 000093
C2RT：
0005006651.tif 000094
hf01 BCリバース：
0005006651.tif 000095
hf01 DEリバース：
0005006651.tif 000096
hf01 FGリバース：
0005006651.tif 000097
BCDE rev：
0005006651.tif 000098
BCDE for：
0005006651.tif 000099
hf01 DE-FGフォワード：
0005006651.tif 000100
Front FGリバース：
0005006651.tif 000101
hf01 RT FlagポリAリバース：
0005006651.tif 000102
5-RI-hKDR-1B：
0005006651.tif 000103
3-EPO/hKDR-2312B：
0005006651.tif 000104
5-RI-mKDR-1：
0005006651.tif 000105
3-EPO-mKDR-2312：
0005006651.tif 000106
5-RI-hTrkB-1：
0005006651.tif 000107
3-EpoR/hTrkB-1310：
0005006651.tif 000108
5-hKDR/EPO-2274B：
0005006651.tif 000109
5-mKDR/EPO-2274：
0005006651.tif 000110
3-XHO-EpoR-3066：
0005006651.tif 000111
5'hTrkB/EpoR-1274：
0005006651.tif 000112
【０１７８】緩衝液
本明細書に記載する実験では、以下の緩衝液を使用した。緩衝液Ａ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）；緩衝液Ｂ（１Ｘ  ＰＢＳ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）；緩衝液Ｃ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ８．０）；緩衝液Ｃａ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ８．０）；緩衝液Ｄ（２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ）；緩衝液Ｅ（１Ｘ  ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｆ（１Ｘ  ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｇ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｈ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｉ（１ｘＰＢＳ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｊ（１ｘＰＢＳ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｋ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、２５ｍＭイミダゾール、１ｘ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ８．０）；緩衝液Ｌ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）；緩衝液Ｍ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｎ（１ｘＰＢＳ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）；緩衝液Ｏ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）。
【０１７９】一次ライブラリーの構築：
骨格としてヒトフィブロネクチンの１０番目のドメインを使用するライブラリーの構築は、以前に記載されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前記）。それぞれ２３〜２９位、５２〜５５位、および７７〜８６位に相当する３つのループ領域を、コード計画としてＮＮＳ（標準的なヌクレオチド混合物、式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの等モル混合物；Ｓ＝ＧおよびＣの等モル混合物）を用いてランダム化した。２３〜２９位および７７〜８６位（２ループライブラリー）または７７〜８６位（１ループライブラリー）でのみランダム化した領域を含む同様のライブラリーも構築した。これらのライブラリーをほぼ等モル量で混合した。この混合ライブラリーは約１ｘ１０１３個のクローンを含み、ＶＲ２８が同定されたＫＤＲ選択で用いられた。
【０１８０】変異誘発ライブラリーの構築：
高頻度変異誘発ＰＣＲ。ＶＲ２８クローンにおける骨格の変異Ｔ（６９）ＩをＰＣＲによって野生型配列に修正したが（以下を参照）、ＫＤＲに対するＶＲ２８結合剤の結合特性に変化は認められなかった。以前に記載された条件を用いて、ＶＲ２８のループ領域に変異を導入した（Ｖａｒｔａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２４：２６２７−２６３１，１９９６）。各ループ隣接するプライマー対（Ｎ末端フォワード／ＢＣＤＥリバース、ＢＣＤＥフォワード／ＤＥＦＧリバース、ＤＥＦＧフォワード／Ｃ末端ポリＡ）を用いて、ＶＲ２８鋳型において３ラウンドの高頻度変異誘発ＰＣＲを行った。重複伸長ならびに隣接プライマーＴ７ＴＭＶＦｎおよびＭＫ１６５−４  Ａ２０を使用したＰＣＲにより、得られた断片を組み立てた。最終ＰＣＲ反応によるクローンのＤＮＡ配列を決定し、ライブラリーが正しく構築されていることを確認した。骨格領域では１．５％の変異誘発率であるのに対し、ループ領域では最大で３０％の変異誘発率が認められた。
【０１８１】  オリゴ突然変異誘発。ＰＣＲによるＶＲ２８のＦＧループのオリゴ突然変異誘発には、ＶＲ２８ＦＧ−５０プライマー、ＤＥＦＧリバースプライマー、および隣接プライマーを使用した。ＦＧループをコードする各ヌクレオチドの位置において、プライマーＶＲ２８ＦＧ−５０は、ＶＲ２８ヌクレオチド５０％、および４つの全ヌクレオチド（Ｎ）またはＧもしくＣ（Ｓ）の等量混合物５０％を含んだ。この計画は、ＶＲ２８  ＦＧループのアミノ酸の約６７％が別のアミノ酸でランダムに置換されるように設計されたもので、これはＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０１８２】  １５９（Ｑ８Ｌ）ランダム化サブライブラリー。クローン１５９（Ｑ８Ｌ）クローンのＦＧループのオリゴ突然変異誘発、３段階伸長、および増幅を行った。一次伸長では、プライマー対（ａ：Ｆ１Ｕ２／Ｆ２、ｂ：Ｆ３１５９／Ｆ４、ｃ：Ｆ５１５９／Ｆ６、ｄ：Ｆ７Ｘ６１５９／Ｆ８）を等濃度（各１００ｐｍｏｌ）で混合し、１０サイクル増幅した。二次伸長では、一次反応物の１／２０を組み合わせ（ａ／ｂおよびｃ／ｄ）、増幅をさらに１０サイクル継続した。完全に相補的な断片の再アニーリングよりも伸長の方に増幅を偏らせるため、断片ａｂ用のＦ１Ｕ２フォワードプライマーまたは断片ｃｄ用のＣ２ａｓａｉＡ２０リバースプライマー５０ｐｍｏｌを用いて、半構築物産物（各０．５ｐｍｏｌ）の線形増幅をさらに２０サイクル行った。最後に、伸長された半構築物断片ａｂおよびｃｄを組み合わせて、さらなる成分を含めずに２０サイクル増幅した。プライマーＦ７Ｘ６１５９は、クローン１５９（Ｑ８Ｌ）の最初の６コード位置それぞれにおいてＮＮＳを含み、それ以外はクローン１５９（Ｑ８Ｌ）と同一であった。最終ＰＣＲ反応によるクローンのＤＮＡ配列を決定して、ライブラリー１５９（Ｑ８Ｌ）−ＦＧＸ６が正しく構築されていることを確認した。サブライブラリーは約１ｘ１０９個のクローンを含んだ。
【０１８３】  １５９（Ｑ８Ｌ）−ＦＧＸ６ライブラリーを６ラウンド選択した後のプール（ＰＲ６）のＤＥループをランダム化するため、プライマーＦ１Ｕ２／Ｆ４およびＦ５Ｘ５／Ｃ２ａｓａｉＡ２０を用いてＰＣＲにより２つの半構築物断片を調製した。Ｆ５Ｘ５プライマーは、ＤＥループの４つの位置および５６位においてＮＮＳを含んだ。次いで、伸長された断片ａｂおよびｃｄを組み合わせて、さらなる成分を含めずに２０サイクル増幅した。
【０１８４】フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質への点突然変異、欠失、およびランダム（ＮＮＳ）ループ配列の導入：
ＶＲ２８クローンを鋳型として使用した２段階ＰＣＲで、ＶＲ２８結合剤の骨格変異Ｔ（６９）Ｉを野生型配列に修正した。プライマーＮ末端フォワード／ＤＥＦＧリバースおよびＤＥＦＧフォワード／Ｃ末端ポリＡを用いて得られた半構築物断片を組み合わせて、プライマーＴ７ＴＭＶ  ＦｎおよびＭＫ１６５−４  Ａ２０を用いてＶＲ２８（Ｉ６９Ｔ）クローン全体（本文中ではＶＲ２８と表す）を構築した。クローン１５９（Ｑ８Ｌ）におけるＮ末端変異の修正は、プライマーＮ末端フォワード／Ｃ末端ポリＡを用いたＰＣＲ、およびその後のプライマーＴ７ＴＭＶ  ＦｎおよびＭＫ１６５−４  Ａ２０を用いた伸長によって行った。
【０１８５】  フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質のＮ末端への欠失Δ１−８の導入は、プライマーＴ７  ＴＭＶ  Ｎ末端欠失およびＭＫ１６５−４  Ａ２０を用いた増幅によって行った。
【０１８６】  ＮＮＳループ配列を含むＥクローンのキメラの構築を、２段階ＰＣＲで行った。プライマーＴ７  ＴＭＶ  Ｎ末端欠失／ＢＣＤＥ  ｒｅｖ（ａ：ＥクローンのＢＣループ）；Ｎ末端フォワード／ｈｆ０１  ＢＣリバース（ｂ：ＢＣ  ＮＮＳ）；ＢＣＤＥ  ｆｏｒ／Ｆｒｏｎｔ  ＦＧリバース（ｃ：ＥクローンのＤＥループ）；ＢＣＤＥ  ｆｏｒ／ｈｆ０１  ＤＥリバース（ｄ：ＤＥ  ＮＮＳ）；ｈｆ０１  ＤＥ−ＦＧフォワード／ｈｆ０１  ＲＴ−ＦｌａｇポリＡリバース（ｅ：ＥクローンのＦＧ）；ｈｆ０１  ＤＥ−ＦＧフォワード／ｈｇ０１  ＦＧリバース（ｆ：ＦＧ  ＮＮＳ）を用いて、ループ領域を増幅した。断片ｂ／ｃ／ｅ、ａ／ｄ／ｅ、ａ／ｃ／ｆを組み合わせ、伸長、ならびにプライマーＴ７Ｔｍｖ  Ｎ末端欠失およびｈｆ０１  ＲＴＦｌａｇポリＡリバースを用いる増幅によって、プール全体を構築した。
【０１８７】
構築物はすべてDNA配列決定により確認および/または解析した。すべての構築物および変異誘発ライブラリーは、インビトロでのRNA-タンパク質融合生成および精製のため、5'隣接領域にT7 TMVプロモーターおよび3'隣接領域にFlagタグまたはHis6タグ配列を含んだ。
【０１８８】
RNA-タンパク質融合生成
選択の各ラウンドでは、MegaScript転写キット（Ambion）を用いてPCR DNAを37℃で4時間転写した。37℃で20分間DNase I（Ambion）消化することによって、鋳型DNAを除去した。フェノール/クロロホルム抽出、およびその後のNAP-25カラム（Amersham）でのゲルろ過により、RNAを精製した。ピューロマイシンリンカーPEG 6/10（5' Pso u agc gga ugc XXX XXX CC Pu 3'、式中、Pso=C6-ソラレン、u、a、g、c=2'OMe-RNA、C=標準的アミダイト、X：スペーサーホスホアミダイト9（9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホアミダイト）；Pu=ピューロマイシン-CPG）は、以前に記載されている通りに合成した（Kurz et al, Nuc. Acid Res. 28:83, 2000）。リンカーを、0.1 M NaCl、25 mM TrisHCl、pH 7.0中で85℃から4℃に徐々に温度を下げていくことで、ライブラリーRNAとアニーリングさせた。次いで、リンカーとRNAをUV光（365 nm）に15分間曝露して架橋した。架橋された混合物（600 pmol RNA）を、35S標識メチオニンの存在下で、ウサギ網状赤血球溶血液翻訳キット（Ambion）を用いるインビトロ翻訳反応物中に含め、30℃で60分間インキュベートした。融合形成を増強するため、0.5 M KClおよび0.05 M MgCl2を反応物に添加し、4℃で30分間インキュベートした。オリゴ-dTセルロース（Sigma）クロマトグラフィーを用いて、融合分子を以下のように精製した。翻訳および融合混合物を緩衝液A（100 mM TrisHCl、1 M NaCl、0.05% Tween-20、pH 8.0）に希釈して、オリゴdTセルロースに添加した。スラリーを4℃で1時間回転し、スピンカラムに移した。オリゴdTセルロースビーズをカラム上で10カラム体積の緩衝液Aで洗浄し、3カラム体積のH2Oで溶出した。逆転写反応は、プライマーHu3'FLAGSTOPを使用して、SuperScript II Reverse Transcriptionキット（Invitrogen）を用いて42℃で1時間行った。別法として選択の過程で、反応性システインを介した非特異的結合の可能性を減少させるため、チオール基を1 mM 2-ニトロ-5-チオシアナト安息香酸（NTCB）またはN-エチルマレイミド（NEM）と反応させた。反応は室温で1時間行った。融合分子を、M2アガロース（Sigma）を用いて抗FLAGアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。M2ビーズを反応物に添加し、緩衝液B（1X PBS、0.02% Triton X100）中で4℃で1時間回転した。次いで、ビーズをスピンカラムに供し、5カラム体積の緩衝液Bで洗浄し、3カラム体積の緩衝液Gに溶解した100μM FlagペプチドDYKDDDDK（Sigma）で融合分子を溶出した。試料中の35Sメチオニンのシンチレーション計測によって測定した比放射能に基づいて、融合物の収量を算出した。
【０１８９】  １５９（Ｑ８Ｌ）ランダム化ライブラリーに関しては、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）での合理化半自動化手順によりＲＮＡ−タンパク質融合物を調製した。工程は、以下に記載する数段階を除いて、上記の手順と同様であった。ＲＮＡ−タンパク質融合分子の精製は、磁性オリゴｄＴビーズ（ＧｅｎｏＶｉｓｉｏｎ）において、緩衝液Ｃ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ８．０）中で行った。ビーズを１０反応体積の緩衝液Ｃａ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ８．０）で洗浄し、融合タンパク質を１体積のＨ２Ｏで溶出した。逆転写（ＲＴ）は、プライマーＣＲ２Ｔを使用して行った。融合タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。ＲＴ反応物を緩衝液Ｄ（２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ）中でＮｉ−ＮＴＡビーズと共に室温で２０分間インキュベートし、次いでビーズを１０反応体積の緩衝液Ｅ（１Ｘ  ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ７．４）で洗浄し、融合分子を１体積の緩衝液Ｆ（１Ｘ  ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。
【０１９０】選択：
ＫＤＲに対する一次選択。プロテインＡビーズおよびＦｃタンパク質への非特異的結合を減少させるため、選択前に、融合ライブラリー（１ｍｌ中に約１０１３クローン）を、２００ｎＭヒトＩｇＧ１を予め固定化したプロテインＡビーズ（Ｄｙｎａｌ）１５０μｌと共に３０℃で１時間インキュベートした（前排除）。次いで、上清を緩衝液Ｇ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、０．１ｍｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７．４）中で、ＫＤＲ−Ｆｃキメラと共に反転回転させながら３０℃で１時間インキュベートした。ＫＤＲ−Ｆｃの最終濃度は、ラウンド１では２５０ｎＭ、ラウンド２〜４では１００ｎＭ、ならびにラウンド５および６では１０ｎＭであった。標的をプロテインＡビーズ３００μｌ（ラウンド１）またはプロテインＡビーズ１００μｌ（ラウンド２〜６）上に、反転回転させながら３０℃で３０分間捕獲し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．４）１ｍｌで５回洗浄した。結合した融合分子を、０．１Ｍ  ＫＯＨ  １００μｌで１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０  ５０μｌ中に溶出した。隣接プライマーＴ７ＴＭＶ  ＦｎおよびＭＫ１６５−４  Ａ２０を用いて、ＰＣＲにより溶出物からＤＮＡを増幅した。
【０１９１】  ＫＤＲ結合剤ＶＲ２８の親和性および特異性成熟。上記したように、高頻度変異誘発ＰＣＲまたはオリゴ特異的突然変異誘発によりクローンＶＲ２８に変異を誘発し、融合サブライブラリーを構築した。プロテインＡビーズによる前排除の後、上記の手順に従って緩衝液Ｉ（１ｘＰＢＳ、０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、０．１ｍｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７．４）中で選択を４ラウンド行った。プライマーＴ７ＴＭＶ  ＦｎおよびＭＫ１６５−４  Ａ２０を用いて、ＰＣＲにより溶出物からＤＮＡを増幅した。オリゴ突然変異誘発に由来するライブラリーでは、低い標的濃度（選択の最初の４ラウンドでは０．１ｎＭ  ＫＤＲ）を使用し、次いで選択のさらなる３ラウンドについては１ｎＭマウスＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｆｌｋ−１）を導入した。最後の３ラウンドでは、ＰＣＲにプライマーＴ７  ＴＭＶ  Ｎ末端欠失およびＭＫ１６５−４  Ａ２０を使用した。
【０１９２】  ＫＤＲ結合剤１５９の特異性成熟では、クローン１５９Ｑ（８）ＬのＦＧループの最初の６つの位置を、上記のようにＰＣＲによってランダム化した。ビオチン化マウスＶＥＧＦ−Ｒ２（７０ｎＭ）に対する融合サブライブラリーの結合は、緩衝液Ｉ中で室温で３０分間行った。選択手順の残りは、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）で継続した。ビオチン化標的をストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）５０μｌ上に捕獲し、ビーズを１０倍量の緩衝液Ｉおよび１倍量の緩衝液Ｊ（１ｘＰＢＳ、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．４）で洗浄した。結合した融合分子を、０．１Ｍ  ＫＯＨ  １００μｌで１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０  ５０μｌ中に溶出した。プライマーＦ１Ｕ２およびＣ２ａｓａｉＡ２０を用いて、ＰＣＲにより溶出物からＤＮＡを増幅した。４ラウンドの選択の後、さらなる２ラウンドには、以下の通りに７ｎＭ  Ｆｌｋ−１に対する解離速度／再結合選択を適用した。ビオチン化マウスＦｌｋ−１との結合反応を３０分進行させた後、１００倍過剰量の非ビオチン化Ｆｌｋ−１を添加し、弱い結合剤の解離を見越して反応をさらに６時間継続した。ビオチン化標的をストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）５０μｌ上に捕獲し、緩衝液Ｊ１ｍｌで５回洗浄した。結合した融合分子を、７５℃で５分間インキュベートすることにより溶出した。上清を７ｎＭ  Ｆｌｋ−１への再結合に供し、標準的な選択手順を継続した。最終溶出プールに由来するＤＮＡをＤＥループランダム化（上記を参照）に供し、融合サブライブラリーを７ｎＭマウスＶＥＧＦ−Ｒ２に対して３ラウンド選択した。４ラウンド目に、１ｎＭヒトＶＥＧＦ−Ｒ２への再結合による解離速度選択に供した。プライマーＦ１Ｕ２およびＣ２ａｓａｉＡ２０を用いて、ＰＣＲにより溶出物から最終ＤＮＡを増幅した。
【０１９３】放射性平衡結合アッセイ
解析用に３５Ｓ標識結合タンパク質を調製するため、リンカーの連結段階を除くこと以外はＲＮＡ−タンパク質融合精製に関して上記した通りにｍＲＮＡを調製した。３５Ｓ標識Ｍｅｔの存在下でウサギ網状赤血球溶血液翻訳キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ｍＲＮＡを３０℃で１時間発現させた。発現されたタンパク質を、上記のようにＭ２−アガロースＦｌａｇビーズ（Ｓｉｇｍａ）で精製した。この手順によって、核酸尾部を含まないコードタンパク質が生成された。直接結合アッセイでは、０〜２００ｎＭの濃度のＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃ融合物を一定濃度の精製タンパク質（０．２または０．５ｎＭ）に添加し、緩衝液Ｂ中で３０℃で１時間インキュベートした。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（商標）を使用して、室温でさらに１０分間、プロテインＡ磁気ビーズにより受容体−結合剤複合体を捕獲した。ビーズを６反応体積の緩衝液Ｂで洗浄した。０．１Ｍ  ＫＯＨ  １００μＬでビーズからタンパク質を溶出した。５０μＬの反応混合物および溶出液をＬｕｍａＰｌａｔｅ−９６（Ｐａｃｋａｒｄ）上で乾燥させ、プレート上の３５Ｓの量をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ装置（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。標的に結合したフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の量を、反応混合物中の放射能に対する、プロテインＡ磁気ビーズから溶出された放射能の割合として評価した。ＫＤＲ−Ｆｃの非存在下での結合を測定することによって、ビーズに対するフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の非特異的結合を決定したが、非特異的結合は投入量の１〜２％未満を示した。特異的結合は全結合から非特異的結合を減算することによって得た。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いてデータを解析し、一部位非線形結合方程式により適合化した。
【０１９４】
フィブロネクチンに基づく可溶性骨格タンパク質結合剤の発現および精製：
大腸菌で発現させるため、各クローンの残基1〜101およびその後に続くHis6タグをpET9d由来ベクターにクローニングし、大腸菌BL21 (DE3) PlysS細胞（Invitrogen）で発現させた。一晩培養液20 mlを用いて、50μg/mLカナマイシンおよび34μg/mLクロラムフェニコールを含むLB培地1リットルに接種した。培養液をA600が0.4〜0.6になるまで37℃で培養した。培養物を1 mMイソプロピル-β-チオガラクトシド（IPTG、Invitrogen）で誘導した後、37℃でさらに3時間培養し、4℃にて3,000 gで30分間遠心分離することにより回収した。細胞ペレットを50 mLの溶解緩衝液K（50 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、5%グリセロール、5 mM CHAPS、25 mMイミダゾール、1x Complete（商標） Protease Inhibitor Cocktail（Roche）、pH 8.0）緩衝液Lに再懸濁し、氷上で80 Wにて10秒間休止させながら15秒間のパルスで4回超音波処理した。4℃にて30,000 gで30分間遠心分離することにより、可溶性画分を分離した。洗浄緩衝液L（50 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、5%グリセロール、25 mMイミダゾール、pH 8.0）で予め平行化したTALON（商標） SuperflowTM Metal Affinity Resin（Clontech）10 mLと共に、上清を4℃で1時間回転した。次いで、10カラム体積の緩衝液Lおよび30カラム体積の緩衝液M（1xPBS、pH 7.4、25 mMイミダゾール、pH 7.4）で樹脂を洗浄した。タンパク質を5カラム体積の緩衝液N（1xPBS、250 mMイミダゾール、pH 7.4）で溶出し、1xPBSに対して4℃で透析した。沈殿物は0.22μmでろ過することで（Millipore）除去した。
【０１９５】フィブロネクチンに基づく可溶性骨格タンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ解析：
標的に対するフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質結合タンパク質の結合速度論を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００  バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて測定した。ヒトおよびマウスＶＥＧＦ−Ｒ２−ＦＣ融合物をＣＭ５センサーチップ上に固定化し、可溶性結合タンパク質を緩衝液Ｏ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）中の０〜１００ｎＭの濃度で注入した。各濃度でセンサーグラムを取得し、プログラム、ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて評価して、速度定数ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ）を決定した。速度定数ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から親和定数ＫＤを算出した。
【０１９６】  阻害実験では、ヒトＶＥＧＦ１６５をＣＭ−５チップの表面上に固定化し、０〜１００ｎＭの様々な濃度の可溶性結合タンパク質の存在下で、２０ｎＭ濃度のＫＤＲ−Ｆｃを注入した。チップへのＫＤＲ−Ｆｃ結合が５０％のみ観察された時の濃度で、ＩＣ５０を決定した。
【０１９７】ＶＥＧＦＲ結合ポリペプチドの可逆的リフォールディング：
１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中のＭ５ＦＬタンパク質において、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）解析を行った。最初のＤＳＣ実行（スキャン１）は、Ｎ−ＤＳＣ  ＩＩ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ）で１分間に１℃の速度で温度に５〜９５℃の傾斜をつけ、続いて１０℃まで逆スキャンすることによって（表示せず）行い、その後２回目を実行した（スキャン２）。これらの条件下で、データは２つの転移モデルを用いて最適に適合化された（Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ）を使用して、Ｔｍ＝７７℃および６７℃）。図１０を参照されたい。
【０１９８】Ｍ５ＦＬタンパク質のＰＥＧ化：
Ｃ１００型のＭ５ＦＬタンパク質は、１００位のＳｅｒがシステインに変異されたＭ５ＦＬの完全な配列を有し、タンパク質を精製するために用いられるさらなるＣ末端Ｈｉｓタグを含む。精製されたＭ５ＦＬタンパク質を、様々なマレイミド誘導体化ＰＥＧ形態（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）を結合することによって、単一のシステイン残基の位置で修飾した。反応して得られたタンパク質を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲルで泳動した（図１１）。
【０１９９】細胞株の作製：
プラスミドの構築。ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１、またはヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインに融合されたヒトエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインから構成されるキメラ受容体をコードするプラスミドを、２段階ＰＣＲ手順によって構築した。受容体遺伝子全体をコードするプラスミドから、細胞外ドメインをコードするＰＣＲ産物を増幅した：ＫＤＲ（アミノ酸１〜７６４）は、プライマー５−ＲＩ−ｈＫＤＲ−１Ｂ／３−ＥＰＯ／ｈＫＤＲ−２３１２Ｂを用いてクローンＰＲ１３７１＿Ｈ１１（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州、ロックビル）から導出し、Ｆｌｋ−１（アミノ酸１〜７６２）は、プライマー５−ＲＩ−ｍＫＤＲ−１／３−ＥＰＯ／ｍＫＤＲ−２３１２を用いてクローン＃４２３８９８４（ＩＭＡＧＥ）から導出し、ヒトＴｒｋＢ（アミノ酸１〜４３０）は、プライマー５−ＲＩ−ｈＴｒｋＢ−１／３−ＥｐｏＲ／ｈＴｒｋＢ−１３１０を用いてクローン＃Ｘ７５９５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｅｎｅｓｔｏｒｍ）から導出した。ＥｐｏＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（アミノ酸２５１〜５０８）をコードするＰＣＲ産物は、共通プライマー３−ＸＨＯ−ＥｐｏＲ−３０６６、ならびに受容体断片ＰＣＲ産物の末端に相補的な短い配列相補性を付加した３つの遺伝子特異的プライマー５−ｈＫＤＲ／ＥＰＯ−２２７４Ｂ（ＫＤＲ）、５−ｍＫＤＲ−ＥＰＯ−２２７４（Ｆｌｋ−１）、および５’ｈＴｒｋＢ／ＥｐｏＲ−１２７４（ヒトＴｒｋＢ）のうちの１つを用いてクローン＃Ｍ６０４５９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｅｎｅｓｔｏｒｍ）から増幅した。次いで、キメラ遺伝子の半分をコードするＰＣＲ産物を混合し、３−ＸＨＯ−ＥｐｏＲ−３０６６および増幅の前のサイクルで使用した各遺伝子に特異的な５’プライマー（５−ＲＩ−ｈＫＤＲ−１Ｂ、５−ＲＩ−ｍＫＤＲ−１、および５−ＲＩ−ｈＴｒｋＢ−１）を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、プラスミドｐｈＫＥ８（ヒトＫＤＲ／ＥｐｏＲ融合物）、ｐｍＫＥ２（ｆｌｋ−１／ＥｐｏＲ融合物）、およびｐｈＴＥ（ＴｒｋＢ／ＥｐｏＲ融合物）を作製した。
【０２００】  フローサイトメトリー用の細胞株の作製。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州、マナッサス）に、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のみ、ｐｍＫＥ２のみ、またはｐｃＤＮＡ３．１と全長ヒトＫＤＲをコードするプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、クローンＰＲ１３７１−Ｈ１１）の混合物を安定にトランスフェクションした。安定なトランスフェクタントを選択して、０．５ｍｇ／ｍｌジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で維持した。トランスフェクションされた集団を抗ＫＤＲポリクローナル抗血清（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した後に蛍光活性化細胞選別することによって、ＣＨＯ−ＫＤＲと称するヒトＫＤＲ発現クローンおよびＣＨＯ−Ｆｌｋと称するマウスＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲキメラ発現集団を取得した。ＣＨＯ−ＫＤＲおよびＣＨＯ−Ｆｌｋ細胞株は、日常的に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＣ）、０．５ｍｇ／ｍｌジェネティシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【０２０１】  Ｂａ／Ｆ３細胞株の作製。前Ｂ細胞株Ｂａ／Ｆ３（ＤＳＭＺ、ドイツ、ブラウンシュワイク）に、ヒトエリスロポエチン受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合されたヒトまたはマウスＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインからなる受容体キメラ（上記を参照）であるｐｈＫＥ８またはｐｍＫＥ２をトランスフェクションすることにより、ＶＥＧＦＲ−２によるＶＥＧＦ結合に応答して増殖する細胞株を作製した。Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の１０％馴化培地（ＤＳＭＺ；イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｇｉｂｃｏ）／１０％ＦＢＳ／２５μＭ  β−メルカプトエタノールで培養）を必須増殖因子の供給源として添加した最小Ｂａ／Ｆ３培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ））で維持した。プラスミドｐｍＫＥ２またはｐｈＫＥ８をエレクトロポレーションした後、安定なトランスフェクタントを０．７５ｍｇ／ｍｌジェネティシン中で選択した。ジェネティシン耐性集団を、１００ｎｇ／ｍｌヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む最小Ｂａ／Ｆ３培地に移し、得られたＶＥＧＦ依存性集団をＢａ／Ｆ３−ＦｌｋおよびＢａ／Ｆ３−ＫＤＲと命名した。ＮＴ−４による刺激に応答性であるキメラＴｒｋＢ受容体を発現する対照細胞株（Ｂａ／Ｆ３−ＴｒｋＢ）も同様に、プラスミドｐｈＴＥおよびヒトＮＴ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作製した。
【０２０２】
フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の細胞表面結合の解析：
細胞表面KDRおよびFlk-1に対するフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の結合を、フローサイトメトリーによりVEGF-R2発現細胞および対照細胞において同時に解析した。CHO-pcDNA細胞（対照）をトリプシン-EDTAを用いてディッシュから解離し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコPBS（D-PBS-；Invitrogen）で洗浄し、1.5μM CMTMR（5-(and-6)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)-テトラメチルローダミン）（Molecular Probes）で37℃で30分間染色した。細胞をD-PBS-で洗浄し、37℃でさらに30分間インキュベートし、次に氷上でブロッキング緩衝液（D-PBS-/10%ウシ胎児血清）に再懸濁した。CHO-KDRまたはCHO-Flk細胞を、CMTMRを省くこと以外は同様に処理した。V底96ウェルプレートの各ウェル中で、75,000個のCMTMR染色CHO-pcDNA3細胞を、同数の非染色CHO-KDRまたはCHO-Flk細胞と混合した。抗体およびフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質はすべて、25μl/ウェルのブロッキング緩衝液で希釈し、各処理は4℃で1時間行った。His6をタグ化したフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質で細胞混合物を染色し、冷D-PBS-で2回洗浄し、次いで2.5μg/ml抗His6 MAb（R&D Systems）で処理し、洗浄し、4μg/ml Alexa Fluor 488結合抗マウス抗体（Molecular Probes）で染色した。抗KDRマウスモノクローナル抗体（Accurate Chemical、ニューヨーク州、ウェストベリー）または抗flk-1ヤギポリクローナル抗体（R&D Systems）で処理する細胞については、抗His6段階を省略し、抗体結合は種に適したAlexa Fluor 488結合二次抗体（Molecular Probes）で検出した。染色後、細胞を200μl/ウェルのD-PBS-/1% FBS/1μg/ml 7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD；Molecular Probes）に再懸濁し、488 nMレーザーを備えたFACSCalibur（Becton Dickinson、カリフォルニア州、サンノゼ）でフローサイトメトリーにより解析した。死細胞（7-AAD陽性）を排除するためにゲートをかけた後、CMTMR陰性または陽性集団にそれぞれゲートをかけて、VEGFR-2発現細胞およびCHO-pcDNA3細胞をAlexa Fluor 488蛍光について独立して測定した。対照実験から、CMTMRによる染色は染色細胞の表面上におけるAlexa Fluor 488結合抗体の検出を妨げないことが示された。
【０２０３】  細胞表面結合はまた、上記の二次抗体を用いて蛍光顕微鏡により評価した。これらの研究のため、抗体をカルシウムおよびマグネシウムを含むＤ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ＋）／１０％ＦＢＳで希釈した。細胞は２４ウェルまたは９６ウェルプレートで培養し、倒立蛍光顕微鏡で観察するために染色後はＤ−ＰＢＳ＋中で保存した。
【０２０４】Ｂａ／Ｆ３細胞増殖アッセイ：
Ｂａ／Ｆ３細胞を最小Ｂａ／Ｆ３培地で３回洗浄し、１５．８ｎｇ／ｍｌの増殖因子（Ｂａ／Ｆ３−ＫＤＲ、Ｂａ／Ｆ３−ｆｌｋ、またはＢａ／Ｆ３−ＴｒｋＢ細胞それぞれについてヒトＶＥＧＦ１６５、マウスＶＥＧＦ１６４、またはｈＮＴ−４）を含む同じ培地に再懸濁し、９６ウェル組織培養プレートのウェル当たり、５ｘ１０４個のＢａ／Ｆ３−ＫＤＲ細胞、または２ｘ１０４個のＢａ／Ｆ３−ｆｌｋもしくはＢａ／Ｆ３−ＴｒｋＢ細胞を含む９５μｌを添加した。試験タンパク質のＰＢＳによる段階希釈物５μｌを各ウェルに添加し、最終量をＢａ／Ｆ３培地／５％ＰＢＳ／１５ｎｇ／ｍｌ増殖因子１００μｌとした。３７℃で７２時間インキュベートした後、各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｌを添加して３７℃で４時間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定することにより、増殖を測定した。
【０２０５】ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイ：
継代２〜６代目のＨＵＶＥＣ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州、ウォーカーズビル）をＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で培養した。５０００細胞／ウェルを２００μｌの飢餓培地（０．２％ウシ胎児血清および１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾン溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加した等量のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）およびＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ））に再懸濁し、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングして、４８時間インキュベートした。フィブロネクチンに基づく結合タンパク質をウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートし、次いでヒトＶＥＧＦ１６５を最終濃度１６ｎｇ／ｍｌになるように添加した。４８時間インキュベートした後、１．９ｍｇ／ｍｌ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と４４μｇ／ｍｌフェナジンメトサルフェート（Ｓｉｇｍａ）の混合物を３０μｌ／ウェル添加し、Ｂａ／Ｆ３細胞について上記したように４９０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞生存度を測定した。
【０２０６】
実施例12：抗体軽鎖に基づくVEGFR結合ポリペプチド
図21Aおよび21Bは、抗体軽鎖可変領域（VL）フレームワーク/骨格に基づくVEGFR結合ポリペプチド（SEQ ID NO:241〜310）のアミノ酸配列を示す。
【０２０７】  軽鎖可変ドメインタンパク質は、１０Ｆｎ３由来タンパク質との使用について記載した通りに、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）システムを用いて作製した。
【０２０８】  本明細書で引用した参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
（表１）好ましい特異的ペプチド配列
0005006651.tif 000113
0005006651.tif 000114
【０２１０】
（表２）KDR＆FLK結合剤
0005006651.tif 000115
0005006651.tif 000116
0005006651.tif 000117
0005006651.tif 000118
【０２１１】
（表３）KDR結合剤
0005006651.tif 000119
0005006651.tif 000120
0005006651.tif 000121
0005006651.tif 000122
0005006651.tif 000123
【０２１２】
（表４）特徴づけられたVEGF-R2結合クローンの配列
0005006651.tif 000124
【０２１３】放射性平衡結合アッセイで決定されたＫＤＲ−Ｆｃに対するトリネクチン（ｔｒｉｎｅｃｔｉｎ）結合剤の親和性
【表５】
0005006651.tif 000125
【０２１４】放射性平衡結合アッセイで決定されたＫＤＲおよびＦｌｋ−１に対するトリネクチン結合剤の親和性
【表６】
0005006651.tif 000126
【０２１５】ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによるｋａ、ｋｄ、およびＫｄの決定
【表７】
0005006651.tif 000127
【０２１６】ＫＤＲ（ＣＨＯ  ＫＤＲ）およびＦｌｋ−１（ＣＨＯ  Ｆｌｋ−１）発現細胞に対する結合
【表８】
0005006651.tif 000128
【０２１７】ＫＤＲ（Ｂａ／Ｆ３−ＫＤＲ）およびＦｌｋ−１（Ｂａ／Ｆ３−Ｆｌｋ）発現細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖の抑制
【表９】
0005006651.tif 000129
【０２１８】ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖の抑制
【表１０】
0005006651.tif 000130
【０２１９】
【表１１】
0005006651.tif 000131
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】6ラウンドのKDR選択から得られたKDR結合単一クローンの特徴を示すグラフおよび画像である。図1Aは、放射性平衡結合アッセイで解析した、25 nM KDR-Fcに対するフィブロネクチンに基づく結合タンパク質の特異的結合を示すグラフである。図1Bは、100倍過剰量のVEGF165の存在下における、KDR-Fcと選択されたフィブロネクチンに基づく結合タンパク質の特異的結合の阻害を示すグラフである。この図から示されるように、特定の結合タンパク質はVEGF165と競合的にKDR-Fcに結合し、クローン8によって例証される他の結合タンパク質はVEGF165と競合しなかった。図1Cは、BIAcoreで解析した、選択されたフィブロネクチンに基づく結合タンパク質の存在下における、KDR-Fcと固定化されたVEGF165との相互作用の阻害を示すグラフである。図1Dは、免疫蛍光法によって検出された、KDR発現細胞および対照細胞に対するVR28の結合を示す画像である。
【図２】VR28 KDR結合剤の親和性成熟の選択プロファイルを示すグラフである。左側に、KDR-FcおよびFlk1-Fc（非常に低く、表示されていないバー）に対するVR28クローンの結合を示す。中央に、未精製の突然変異誘発プールおよびその後のKDR-Fcに対する濃縮ラウンドの結合を示す。右側に、Flk-1-Fcに対するさらなる濃縮ラウンドの結合を示す。結合は、1 nM KDR FcまたはFlk1-Fcを用いて、放射性平衡結合アッセイにより投入量の割合として評価した。
【図３】VR28結合剤の抗KDR親和性成熟の4ラウンド目に由来するKDR結合単一クローンの特徴を示すグラフである。図3Aは、放射性平衡結合アッセイにおける、KDR-Fcに対するVR28（-■-）、および親和性成熟されたK1（-▲-）、K6（-▼-）、K9（-◆-）、K10（-●-）、K12（-□-）、K13（-△-）、K14（-▽-）、K15（-◇-）の飽和結合を示す。図3Bは、KDR-Fcに対するN末端欠失を有するおよび有さないクローンの結合を示す。フィブロネクチンに基づく結合タンパク質のN末端における欠失Δ1-8は、KDR-Fcに対する結合を改善した。データは、N末端欠失を有するおよび有さない23個の独立したクローンの平均したKDR-Fc結合を表す。
【図４】選択されたクローンのKDRおよびFlk-１に対する結合を示すグラフである。VR28、ならびにヒトKDRに対する4ラウンドの親和性成熟後（Kクローン）、およびヒト（KDR）およびマウス（flk-1）に対する7ラウンドの親和性成熟後（Eクローン）に選択されたクローンの特異的結合。VEGFR-2-Fcキメラを放射性平衡結合アッセイで比較した。データは3回の独立した実験の平均を表す。ここに示すように、マウスおよびヒトVEGFR-2タンパク質の両方に対して成熟させることにより、両タンパク質に結合する結合剤が生成される。
【図５】VR28結合剤の親和性成熟の7ラウンド目に由来するVEGFR-2結合単一クローンの特徴を示すグラフである。KDR（図5A）およびFlk1（図5B）-Fcキメラに対するVR28（-■-）、および特異性成熟されたE3（-▲-）、E5（-▼-）、E6（-◆-）、E9（-●-）、E18（-□-）、E19（-△-）、E25（-▽-）、E26（-◇-）、E28（-○-）、E29（-×-）クローンの飽和結合を、放射性平衡結合アッセイで試験した。
【図６】VR28結合剤の親和性成熟の7ラウンド目に由来する単一クローンによるVEGFR-2結合の特徴を示すグラフである。図6Aは、ヒトおよびマウスVEGFR-2に対する二重特異性を有する結合剤における、マウスVEGFR-2（Flk1）への結合にとっての79位および82位のアルギニンの重要性を示す。これらの位置をR以外のアミノ酸で置換した場合（X79=E、Q、W、P；X82=L、K）、Flk1への結合は顕著に減少したが、KDRへの結合は減少しなかった。図6Bは、フィブロネクチンに基づくKDR結合タンパク質における標的への結合にとっての、これらタンパク質の3つの可変ループ（BC、DE、およびFG）すべての重要性を示す。各ループをNNS配列によって1度に置換すると、KDRおよびFlk1に対する結合が影響された。結合データはE6およびE26クローンによる平均である。
【図７】ヒトKDR受容体（図7A）およびEpoR-Flk1キメラ（図7B）を発現するCHO細胞に対する、選択されたフィブロネクチンに基づく結合タンパク質の結合を示すグラフである。E18（-■-）、E19（-▲-）、E26（-▼-）、E29（-◆-）、および野生型（-□-）のフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質を試験した。対照CHOに対する結合は認められなかった（データは示さず）。
【図８】様々な量のフィブロネクチンに基づく結合タンパク質：E18（-■-）、E19（-▲-）、E26（-▼-）、E29（-◆-）、M5（-●-）、野生型（-□-）、および抗KDRまたは抗flk-1 Ab（-△-）の存在下における、KDRおよびFlk1を発現するBa/F3-KDR細胞（図8A）およびBa/F3-Flk-1細胞（図8B）のVEGF誘導性増殖の抑制を示すグラフである。データは2回の独立した実験の平均を表す。
【図９】様々な量のフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質：E18（-■-）、E19（-▲-）、E26（-▼-）、E29（-◆-）、M5（-●-）、野生型（-□-）の存在下におけるHUVEC増殖アッセイの結果を示すグラフである。示されるように、KDR結合タンパク質は増殖を約40%まで減少させた。
【図１０】最適緩衝液中でのM5FLの可逆的リフォールディングを示すグラフのセットである。
【図１１】PEG化型M5FLのSDS-PAGE解析を示す画像である。M、分子量マーカー［Sea Blue Plus、Invitorogen］；‐、M5FLのみ；20、20 kD PEGを含むM5FL；40、40 kD PEGを含むM5FL。
【図１２】様々な量のM5FL（-◆-）、M5FL PEG20（-■-）、およびM5FL PEG40（-▲-）それぞれによる、Ba/F3-KDR細胞のVEGF誘導性増殖の抑制を示すグラフである。PEG化は本アッセイにおいてM5FL活性にほとんど影響しない。
【図１３】内皮細胞におけるVEGFR-2シグナル伝達のウェスタン解析を示す。ホスホVEGFR-2−リン酸化VEGFR-2の可視化。VEGFR-2−試料添加対照。ホスホERK1/2−リン酸化ERK1/2（MAPK）の可視化。ERK1−試料添加対照。結果から、130 pM CT-01がVEGF-AによるVEGFR-2活性化およびシグナル伝達を遮断することが実証された。
【図１４】様々な10Fn3由来分子（例えば、M5FL、F10、CT-01）がVEGF-AおよびVEGF-Dシグナル伝達を遮断し得ることを示す。
【図１５】静脈内投与および腹腔内投与した125I未変性CT-01、125I PEG化CT-01の比較を示す。CT-01は12 kDaタンパク質であり、血液から急速に排除される。40 kDa PEGを付加することにより、排除速度は1/10に低下し、AUCは10倍増大する。ラットにおける16時間という半減期は、ヒトにおける週に2回の投薬に相当する。投与経路が腹腔内であるCT-01-PEG40は、静脈内投与のたった50%のAUCを有する。
【図１６】正常ラットにおける125I-CT01PEG40の組織分布を示す。125I-CT01PEG40の組織分布から、主に肝臓、次に腎臓を介する分泌が示される。これは、高分子量PEG型に期待されるものである。CT-01PEG40の長期蓄積は検出されない。
【図１７】血管透過性を測定するMilesアッセイ法の概略図である。
【図１８】Milesアッセイにより、CT-01がVEGFをインビボで遮断することを示す。結果から、5 mg/kg CT01-PEG40がVEGF投与を遮断することが示される。
【図１９】B16-F10マウスメラノーマ腫瘍アッセイを用いて、CT-01が腫瘍増殖を抑制することを示す。
【図２０】U87ヒト神経膠芽腫を用いて、CT-01が腫瘍増殖を抑制することを示す。
【図２１】抗体軽鎖フレームワーク/骨格に基づくVEGFR結合ポリペプチドの配列（SEQ ID NO:241〜310）を示す。
【図２２】免疫グロブリン折りたたみを有する単一ドメインポリペプチド（免疫グロブリンのVHドメイン、左側）および免疫グロブリン様折りたたみを有する単一ドメインポリペプチド（10Fn3ドメイン、右側）の構造構成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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