(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドもしくはタンパク質の抗原配列成分とＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメイン由来の配列成分とを含む、免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質であって、
該融合タンパク質は、ＨＥＲ５００（配列番号１）、ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ（配列番号２）、ＨＥＲ５００＊（配列番号３）およびＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号４）からなる群から選択され、
ここで、該免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質は、該融合タンパク質の該ポリペプチドもしくはタンパク質の抗原配列成分に対する細胞性免疫応答を誘発するのに有効である、
免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＨＥＲ−２細胞内ドメインの配列成分が、配列番号２５として示される配列を有する、請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質。
【請求項３】
前記ポリペプチドまたはタンパク質の成分が、腫瘍細胞と関連する、請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、連続的な核酸コード配列の翻訳によって産生される、請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、化学カップリングによって産生される、請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質であって、
ここで、前記ポリペプチドまたはタンパク質の成分が、配列番号２３として示される成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメイン配列である、
免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質がＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ（配列番号２）である、請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ２融合タンパク質。
【請求項８】
前記細胞性免疫応答が、樹状細胞誘導性Ｔ細胞媒介免疫応答である、請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ２融合タンパク質。
【請求項９】
ｉ）請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質へのインビトロでの曝露により超活性化された、樹状細胞と、
ｉｉ）請求項１に記載の免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質と
を含む、免疫刺激融合タンパク質組成物。
【請求項１０】
樹状細胞（ＤＣ）または樹状細胞前駆体（ＤＣＰ）から超活性化ＤＣを産生するための組成物であって、
ポリペプチドもしくはタンパク質の抗原配列成分とＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメイン由来の配列成分とを含む、免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質
を含み、
該融合タンパク質は、ＨＥＲ５００（配列番号１）、ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ（配列番号２）、ＨＥＲ５００＊（配列番号３）およびＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号４）からなる群から選択される、組成物。
【請求項１１】
前記樹状細胞（ＤＣ）または樹状細胞前駆体（ＤＣＰ）にインビトロで曝露するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記樹状細胞（ＤＣ）または樹状細胞前駆体（ＤＣＰ）にインビボで曝露するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
特定の抗原と関連する癌を処置するための組成物であって、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激ＨＥＲ２融合タンパク質
を含む、組成物。
【請求項１４】
特定の抗原と関連する癌を処置するための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激ＨＥＲ２融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリペプチド抗原に対する防御的なＤＣ誘導性のＴ細胞媒介性免疫応答の生成に有効な、ポリペプチド抗原配列成分およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む免疫刺激融合タンパク質；このような組成物を用いて処理された樹状細胞、ならびにこの融合タンパク質を用いた免疫治療についての方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ−２（また、ｎｅｕともいわれる）遺伝子は、内因性チロシンキナーゼ活性を保有し（Ａｋｉｙａｍａら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１６４４）、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターに広範な相同性を示す（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２）Ｍｒ  １８５，０００（ｐ１８５）の膜貫通糖タンパク質をコードする。
【０００３】
いくつかの方面の証拠は、ＨＥＲ−２の増幅と悪性形質転換との間の関連を示唆する。ＨＥＲ−２癌原遺伝子の増幅および過剰発現は、ヒトの乳癌および卵巣癌において生じ、そして患者における悪い予後および減少した生存の両方に相関した（Ｓｌａｍｏｎら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７；Ｓｌａｍｏｎら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７）。
【０００４】
実験系において、腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍の排除についての最も強力な免疫学的メカニズムである（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９９１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１）。従って、ＣＴＬによって認識される腫瘍特異的抗原（Ａｇ）は、インビボで防御免疫を誘導し得る腫瘍拒絶Ａｇとして機能するようである。
【０００５】
ＣＴＬは、細胞内タンパク質のペプチドフラグメントを含むクラスＩ分子を認識し、このフラグメントは、ＭＨＣ分子への転移の前に、小胞体へ輸送されている（Ｇｅｒｍａｉｎ、１９９５、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５４：１１４；ＨｅｅｒｍｅｌｓおよびＰｌｏｅｇｈ、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４６３）が、Ｔｈ細胞に提示されるクラスＩＩ複合体ペプチドの大半は、外因性タンパク質または細胞表面タンパク質の分解産物であり、このタンパク質は、エンドサイトーシスおよび引き続くリソソームとの融合を介して、クラスＩＩ分子の生合成経路に入る（Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ、１９９４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：２５９）。ＣＴＬは、タンパク質が、抗原プロセシングの主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（「ＭＨＣ  Ｉ」または「クラスＩ」）経路に入る場合に、誘導される。この経路に入るために、このタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾルに存在しなければならない。ここで、ペプチドに分解され、次いでこのペプチドは、小胞体に輸送され、ここで、ＨＬＡクラスＩ分子と結合する。次いで、これらのペプチドは、クラスＩ分子とともに、細胞表面上に提示され、そしてクラスＩに制限された抗原特異的ＣＴＬの誘導物質および標的として役立ち得る（Ｒｏｔｈｂａｒｄら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：８８１）。
【０００６】
免疫応答のプライミングは、「未経験の（ｎａｉｖｅ）」リンパ球（すなわち、以前に所定の免疫原が見られず、その結果、活性に応答する「エフェクター」細胞となるリンパ球）を発達および活性化する。各々の未経験の細胞は、１つ、しかもただ１つの抗原性エピトープを見極める可能性を有し、これは、鍵穴に適合する鍵に類似した状況である。このような同族のエピトープを認識するような細胞のみが、エフェクター細胞となる。
【０００７】
Ｔ細胞は、「ヘルパー」型または「細胞傷害性」型であり得る。ヘルパーＴ細胞は、リンパ球について増殖因子を分泌し、これは、Ｂ細胞およびＴ細胞の活性化および機能を刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞は、特定の抗原を発現する細胞を認識し、そして直接的または間接的のいずれかで、その細胞を殺傷する。Ｂ細胞のように、各々のＴ細胞は、１つ、しかもただ１つの抗原性エピトープに特異的なレセプターを有する。Ｔ細胞レセプターは、タンパク質のフラグメントを認識し、これは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって、細胞表面上に提示される。このＣＴＬのインビボ誘導は、代表的には、生きたウイルスまたは細胞を用いた免疫化によって達成されている（Ｔａｎａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１）、１４７、３６４６〜５２、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９５）、４６８５〜４６９２）。ＡＰＣの強力な部分集合であるＤＣの特質は、抗原を用いてパルスされた後に、未経験のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のインビボ応答を引き起こす能力である（Ｒｉｄｇｅら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４）。
【０００８】
その未成熟（休止または前駆体）形態に加えて、ＤＣは、以下の２つの成熟状態で存在する：活性化および超活性化（ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖａｔｅ）。活性化ＤＣは、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を刺激し得るが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激し得ない。一方、超活性化ＤＣは、ＣＤ８＋ＣＴＬを刺激する能力を有する。
【０００９】
腫瘍細胞は、被験体によって外来として認識されるタンパク質抗原を発現し、そして免疫サーベイランスは、いくつかの型の腫瘍の増殖および蔓延を制限し得るが、免疫系は、致命的なヒト癌から被験体を必ずしも保護するとは限らない。このような腫瘍は、急速な増殖および蔓延に起因して、免疫系を圧倒し得、そして／または腫瘍細胞は、免疫破壊を免れ得る。このような回避についての提唱されたメカニズムとしては、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による認識について必要とされるように、プロセスされた腫瘍ペプチド抗原がクラスＩ  ＭＨＣとほとんど複合体形成しないか、または複合体形成しないことをもたらす、クラスＩ  ＭＨＣ抗原の腫瘍細胞の表面上での下方制御、（２）腫瘍細胞によってクラスＩＩ  ＭＨＣ分子をほとんど発現しないか、または発現しないことに起因したＣＴＬの活性化の欠如であり、その結果、腫瘍特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（これは、ＣＴＬ活性について必要とされるらしいシグナルを産生する）を直接活性化することができない、（３）ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化についての第二のシグナルを提供する同時刺激細胞表面マーカーの欠如、および（４）抗腫瘍応答を抑制する腫瘍細胞によって産生された因子（例えば、ｆａｓ−リガンド）が挙げられるがこれらに限定されない（Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．ら、編、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第３版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、３９４〜４０５、１９９７）。
【００１０】
従って、腫瘍特異的タンパク質に対してＣＴＬ応答を引き出すための手段を提供することが望ましい。ＣＴＬは、ワクチンを用いてインビボで誘導され得るか、またはインビトロで作製され得、次いで腫瘍保有生物に再注入され得るかのいずれかである。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原配列成分、およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む免疫刺激融合タンパク質に関し、そして本発明は、この融合タンパク質のポリペプチドまたはタンパク質の抗原配列成分に対する免疫応答を引き出すに有効である。
【００１２】
１つの局面において、この免疫刺激融合タンパク質のＨＥＲ−２細胞内ドメイン配列成分は、配列番号２５として示される配列を有する。
【００１３】
別の局面において、このポリペプチドまたはタンパク質成分は、腫瘍細胞または感染性疾患の原因因子に関連する。
【００１４】
一般に、この免疫刺激融合タンパク質は、連続した核酸コード配列の翻訳によって産生される。しかし、この融合タンパク質はまた、化学結合によって産生され得る。
【００１５】
１つの好ましい実施形態において、この融合タンパク質のポリペプチドまたはタンパク質成分は、配列番号２３として示される成熟したＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメイン配列である。このような融合タンパク質および関連したアミノ酸配列の例は、以下である：ＨＥＲ５００（配列番号１）、ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ（配列番号２）、ＨＥＲ５００＊（配列番号３）、およびＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号４）。
【００１６】
本発明は、樹状細胞誘導性のＴ細胞媒介性免疫応答を媒介し得る免疫刺激融合タンパク質組成物を提供する。
【００１７】
１つの局面において、この免疫刺激融合タンパク質組成物は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原配列成分、およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む。
【００１８】
関連局面において、この免疫刺激融合タンパク質組成物は、単独かまたはこの免疫刺激融合タンパク質と組み合わせた本発明の免疫刺激融合タンパク質へのインビトロ曝露によって活性化される樹状細胞を含む。
【００１９】
本発明はまた、本発明の免疫刺激融合タンパク質へのＤＣの曝露によって、この融合タンパク質のポリペプチドまたはタンパク質の抗原配列成分に対する細胞性免疫応答をもたらすに有効な様式で、超活性化されたＤＣを産生する方法を提供する。この方法の実行において、ＤＣは、インビトロまたはインビボで、免疫刺激融合タンパク質に曝露され得る。
【００２０】
本発明は、特定の抗原に関連する原発性癌または転移癌の免疫治療の使用についての方法および組成物を提供する。ＤＣは、ヒトドナーから得られ、抗原をロードされた超活性化ＤＣをもたらすに有効な様式および時間で、本発明の免疫刺激融合タンパク質に曝露される。次いで、後者は、この免疫刺激融合タンパク質のポリペプチドまたはタンパク質成分の発現に関連した癌を有する被験体に投与され、原発性の癌または腫瘍あるいは転移の癌または腫瘍に対する免疫治療の増殖阻害応答をもたらす。このような場合において、このような超活性化ＤＣの投与は、患者への免疫刺激融合タンパク質の同時投与と組み合わせて行われ得る。
【００２１】
別の関連したアプローチにおいて、本発明は、癌を処置する方法を提供し、ここで、この癌は、この融合タンパク質のポリペプチドまたはタンパク質の抗原配列成分に対する免疫応答をもたらすに有効な様式で、癌と診断された患者に本発明の免疫刺激融合タンパク質を投与することによって、特定の抗原の発現に関連する。
【００２２】
本発明のこれらの局面の１つの例示的な実施形態において、癌は、乳癌腫、卵巣癌または結腸癌であり、そして免疫刺激融合タンパク質のポリペプチドまたはタンパク質の抗原配列成分は、配列番号２３として示される、成熟したＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメイン配列である。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に指示しない限り、以下の用語は、以下の意味を有する：
本明細書中で使用される場合、「主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子（ＭＨＣ  Ｉ）に関連する可溶性タンパク質抗原の提示」は、可溶性タンパク質抗原またはそのフラグメントを意味し、細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子とともに提示され、そしてクラスＩに制限された抗原特異的ＣＴＬの誘導物質および標的として役立ち得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「パルス」は、ＡＰＣの表面上で、ある抗原の提示を促進するに十分な時間、抗原にＡＰＣを曝露することを意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「改変された抗原提示細胞」（改変ＡＰＣ）または「改変された樹状細胞」（改変ＤＣ）は、それぞれ、ＡＰＣまたはＤＣの集団をいい、これらは、そのように改変されていないＡＰＣまたはＤＣに関するＭＨＣクラスＩに関連して、抗原を提示する能力の増強をもたらすに十分な様式で、エキソビボで処理（パルス）されている。
【００２６】
可溶性タンパク質抗原の提示に関して本明細書中で使用される場合の用語「より有効な」は、ＡＰＣによる可溶性タンパク質抗原の提示後の検出可能なＴ細胞応答の大きさにおける少なくとも２倍の増大を意味する。例えば、これは、異なる抗原または改変された抗原が、同じ培養条件および等モルのＡｇ濃度の下で、同じ数のＡＰＣによって提示される場合に得られるＴ細胞応答の大きさに関して、示された数のＡＰＣによる所定の抗原の提示後に、Ｔ細胞応答の大きさにおける少なくとも２倍の増大が検出されること意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、任意の細胞であり、これは、Ａｇを用いてパルスされた後に、Ｔリンパ球を活性化し得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「樹状細胞」または「ＤＣ」は、ＡＰＣの最も強力な部分集合であり、このＡＰＣは、代表的には、インビトロで培養された場合に樹状突起を伸長する、大きなベールで覆われた細胞である。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「活性化ＤＣ」は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を刺激し得るが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激することができない成熟ＤＣである。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「超活性化ＤＣ」は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激し得る成熟ＤＣである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「アロ刺激（ａｌｌｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）」は、細胞表面上で発現されたＭＨＣ分子における差異に起因して、同種異系Ｔ細胞を刺激し得ることを意味する。
【００３２】
「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答の産物（例えば、抗体、Ｔ細胞レセプター）と、単独またはＭＨＣ分子に関連して反応する物質をいい、この産物は、特定の免疫原によって刺激されている。従って、抗原は、応答を生じさせる特定の免疫原（例えば、抗原性ペプチド、タンパク質または多糖類）、ならびに特定の免疫原を含むかまたは発現する存在（例えば、ウイルス、細菌など）を含む。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「免疫原」は、体液性抗体および／または細胞媒介性免疫応答を刺激または誘導し得る物質をいう。
【００３４】
「ＡｇをロードされたＤＣ」は、ＤＣ、ならびに専門のＡＰＣおよび単球／マクロファージを含む種々の型のＰＢＭＣを含み、これらは、抗原に曝露され、そしてＡｇ−ＤＣによって活性化され、例えば、腫瘍Ａｇの存在下におけるエキソビボ、または腫瘍抗原への曝露によるインビボでの培養によって、インビトロでＡｇをロードされるようになり得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「超活性化樹状細胞」は、ＤＣまたはＤＣ前駆体をいい、これは、未処理のＤＣに関するＭＨＣクラスＩに関連した抗原を提示する増強した能力を有するするような様式で、エキソビボで処理されている。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫刺激融合タンパク質組成物」および「抗原性融合タンパク質組成物」は、交換可能に使用され得、そして以下にさらに記載されるように、単独で抗原性配列成分およびＨＥＲ−２細胞内ドメイン配列成分を含む本発明の融合タンパク質、ならびに／またはこのような融合タンパク質に曝露されているＤＣをいう。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「ＯＶＡ」は、ネイティブのオボアルブミンをいう；「＊」は、免疫優性なＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬをいう；「ＨＥＲ５００」は、その細胞内部分の４分の１に融合した、その細胞外部分の２分の１からなる組換え融合ヒトＨＥＲ−２タンパク質をいう；「ＨＥＲ５００＊」は、その細胞外成分と細胞内部分との間に挿入された、ＨＥＲ５００および免疫優性なＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬから作成される組換え融合タンパク質をいう；「ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ」は、ＨＥＲ５００＊およびラット顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）から構成される組換え融合タンパク質をいう；「ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ」は、ＨＥＲ５００およびヒトＧＭ−ＣＳＦから構成される組換え融合タンパク質をいう；そして、「ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ」は、以下に概説されるように、免疫優性なＯＶＡ由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬおよびラットＧＭ−ＣＳＦに融合したその細胞外部分の２分の１からなる組換え融合ヒトＨＥＲ−２タンパク質をいう。
【００３８】
「防御性Ｔ細胞媒介性応答」によって、癌細胞または固形腫瘍の増殖の遅延または減少、あるいは癌細胞の総数または合計の腫瘍負担の減弱を導くＴ細胞活性が意味される。
【００３９】
「癌または腫瘍」細胞によって、増殖制御の喪失を呈し、そして細胞の大きなクローンを異常に形成する細胞が意味される。腫瘍または癌細胞は、一般的に、接触阻害を喪失し、そして浸潤的であり得、そして／または転移する能力を有する。
【００４０】
「腫瘍抗原」は、特定の型の癌または腫瘍に関連したＡｇをいい、これは、腫瘍関連Ａｇおよび腫瘍特異的Ａｇを含む。腫瘍抗原の例は、以下のＩＩＡ節に提供される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、癌患者に関する用語「改善された治療結果」は、癌細胞または固形腫瘍の増殖の遅延または減少、あるいは癌細胞の総数または合計の腫瘍負担の減弱をいう。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、感染性疾患を有すると診断された被験体に関する用語「改善された治療結果」は、被験体内部の原因となる感染性因子の増殖の遅延または減少、および／あるいは特定の感染性疾患に代表的に関連した検出可能な症状の減少または排除をいう。
【００４３】
（ＩＩ．可溶性ポリペプチド抗原に対する免疫応答）
実験系において、腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍の排除についての最も強力な免疫学的メカニズムである。ＣＴＬは、ワクチンを用いてインビボで誘導され得るか、またはインビトロで作製され得、次いで腫瘍保有生物に再注入され得るかのいずれかである。このＣＴＬのインビボ誘導は、代表的には、生きたウイルスまたは細胞を用いた免疫化によって達成されている（Ｔａｎａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１）、１４７、３６４６〜５２、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９５）、４６８５〜４６９２）。
【００４４】
いくつかの特別なウイルスタンパク質（例えば、ＳＶ−４０ラージＴ抗原およびＢ型肝炎表面抗原）を除いて、単離されたかまたは可溶性のタンパク質の注入は、ＣＴＬの誘導をもたらさない（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９３）、２３、１５２８〜３４）。タンパク質が、抗原プロセシングの主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（「ＭＨＣ  Ｉ」または「クラスＩ」）経路に入る場合、ＣＴＬが誘導される。この経路に入るために、このタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾルに存在しなければならない。ここで、ペプチドに分解され、次いでこのペプチドは、小胞体に輸送され、ここで、ＨＬＡクラスＩ分子と結合する。次いで、これらのペプチドは、クラスＩ分子とともに、細胞表面上に提示され、そしてクラスＩに制限された抗原特異的ＣＴＬの誘導物質および標的として役立ち得る。生理学的に、ＡＰＣによって内因的に合成されるタンパク質のみが、この経路に入る。
【００４５】
免疫応答のプライミングは、「未経験の」リンパ球（すなわち、以前に免疫原が見られずに、活性に応答する「エフェクター」細胞となるリンパ球）を発達および活性化する。各々の未経験の細胞は、１つ、しかもただ１つの抗原性エピトープを見極める可能性を有し、これは、鍵穴に適合する鍵に類似した状況である。このような同族のエピトープを認識するような細胞のみが、エフェクター細胞となる。
Ｔ細胞は、「ヘルパー」型または「細胞傷害性」（細胞傷害性）型であり得る。ヘルパーＴ細胞は、リンパ球について増殖因子を分泌し、これは、Ｂ細胞およびＴ細胞の活性化および機能を刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞は、特定の抗原を発現する細胞を認識し、そして直接的または間接的のいずれかで、その細胞を殺傷する。Ｂ細胞のように、各々のＴ細胞は、１つ、しかもただ１つの抗原性エピトープに特異的なレセプターを有する。Ｔ細胞レセプターは、タンパク質のフラグメントを認識し、これは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって、細胞表面上に提示される。
【００４６】
２つの異なる型のＭＨＣタンパク質、クラスＩおよびクラスＩＩが存在し、これらの両方は、Ｔ細胞に対して、タンパク質分解的に分解されたタンパク質フラグメントを提示する。体の大半の細胞上で発現されるクラスＩ分子は、細胞傷害性Ｔ細胞に対して、内因性に合成されたタンパク質のフラグメントを提示する。専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞およびＢ細胞）上で発現されるクラスＩＩ分子は、Ｔヘルパー細胞に対して、タンパク質フラグメントを提示する。（Ｃｈｅｎ，ＣＨおよびＷｕ，ＴＣ、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．、５（４）：２３１〜５２、１９９８）
大半の場合、クラスＩ分子は、細胞において合成された外来タンパク質を提示する。クラスＩＩによる提示について、外来タンパク質は、細胞において合成され得るか、または外部（すなわち、遊離のタンパク質またはペプチドの形態で存在する）から細胞によって取り込まれ得るかのいずれかである。抗原が、細胞において合成され、そしてクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方によって提示される場合、抗体産生Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方が産生される。しかし、抗原が、細胞の外部に由来し、そしてクラスＩＩによってのみ発現される場合、特定の免疫応答が、Ｔヘルパー細胞および抗体産生に主として制限される［ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＦＵＴＵＲＥ  ＯＦ  ＤＮＡ  ＦＯＲ  ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、編、１〜２９、１９９７］。
【００４７】
従って、可溶性タンパク質抗原に対する代表的な応答は、クラスＩＩ媒介性応答である。本発明は、可溶性タンパク質抗原が、クラスＩ提示経路に入ることを可能にする組成物および方法を示す。
【００４８】
さらに、抗原刺激性Ｔ細胞のいくつかの後代は、エフェクター細胞に発達しないが、さらなる抗原チャレンジがない限り、長期間生存し得る記憶細胞になる。このような記憶細胞は、静止性であり、そして抗原によって刺激されない限り、エフェクター分子を産生しない（例えば、Ａｂｂａｓ，ＡＫら、編、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、１１６〜１２３頁；１３０〜１３４頁、１９９７を参照のこと）。
【００４９】
未経験のＴ細胞（または、所定の抗原に対して以前に曝露されていないＴ細胞）は、生存のために、正確なＭＨＣ  Ｉ制限分子のみを必要とするが、伸長のために、このＴ細胞はまた、抗原に曝露されなければならない。対照的に、記憶Ｔ細胞は、二次応答を促進するより低い機能的活性化閾値を有し、この応答は、未経験のＴ細胞よりも急速かつ強力である。
【００５０】
（Ａ．ポリペプチド抗原）
本発明は、ポリペプチド抗原成分およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む免疫刺激組成物が、ポリペプチド抗原に対する防御的なＤＣ誘導性のＴ細胞媒介性免疫応答の生成に有効であるという発見に基づく。
【００５１】
特定の目的のポリペプチド抗原は、癌細胞、腫瘍および／または感染性因子に関連した抗原である。
【００５２】
例えば、特定の組織型（特定の腫瘍組織を含む）の特徴である「腫瘍特異的抗原」および「腫瘍関連抗原」は、本発明の免疫刺激融合タンパク質における有用性を見出す。例示的な腫瘍抗原としては、腫瘍細胞上で発現される多くのタンパク質のうちのいずれかに加えて、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；前立腺酸ホスフェート（ＰＡＰ）；ＭＡＲＴ−１（黒色腫に関連；Ｃｏｕｌｉｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５、１９９４；Ｈａｗａｋａｍｉら、ＰＮＡＳ  ９１：３５１５、１９９４；Ｂａｋｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１００５、１９９４）；腫瘍拒絶抗原前駆体であるＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＧＡＧＥ；ＮＹ−ＥＳＯ（食道癌からクローニングされた）；ＳＡＲＴ−３（扁平上皮細胞癌腫抗原）、特定のＢ細胞リンパ腫に特異的な免疫グロブリン抗原、腫瘍関連抗原（例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ））、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）および多形の上皮ムチン（ＰＢＭ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
また、目的のものは、特定の感染性因子（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、口蹄疫（コクサッキーウイルス）、狂犬病ウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）および胃腸炎の原因因子（ロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルスおよびノーウォークウイルスを含む）を含むがこれらに限定されないウイルス性因子；Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むがこれらに限定されない細菌性因子、真菌性因子および寄生虫（例えば、Ｇｉａｒｄｉａ）に特異的な抗原である。
【００５４】
（免疫刺激融合タンパク質における使用についての例示的な抗原であるＨＥＲ−２）
悪性腫瘍は、形質転換関連分子群に属する分子（例えば、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２）を含む多くのタンパク質を発現する。
【００５５】
同様に、癌遺伝子産物のペプチド抗原は、特定の腫瘍型に共通であると同定されている。これらのポリペプチドは、試薬としての用途を見出し、これは、このような抗原を保有する腫瘍と反応するに有効なＴ細胞応答を一般に刺激し得る。この癌遺伝子産物のペプチド抗原であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｂｅｃｋｍａｎｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２８：３２２、１９９２）は、ヒト乳癌および婦人科学癌に関連する。
【００５６】
癌細胞におけるＨＥＲ−２過剰発現の悪性表現型および化学療法抵抗性との関連は、ＨＥＲ−２過剰発現腫瘍を有する患者についての悪い臨床結果と一致する。以下は、種々の癌に関連したＨＥＲ−２過剰発現の手短な要約である：
ＨＥＲ−２遺伝子の増幅および過剰発現は、２５〜３０％の原発性乳癌において見出され、そして悪い臨床結果に関連する。エストロゲン依存乳房腫瘍細胞においてエストロゲンレセプター（ＥＲ）の下方制御を促進されたＨＥＲ−２過剰発現のインビトロ研究（Ｐｉｅｔｒａｓら、１９９５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：２４３５）は、ＨＥＲ−２過剰発現が、ＥＲ陰性表現型に関連し（Ｚｅｉｌｌｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１０９；Ａｄｎａｎｅら、１９８９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１３８９）、そしてＨＥＲ−２過剰発現を有する患者におけるタモキシフェン治療の不首尾に関連する（Ｗｒｉｇｈｔら、１９９２、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５：１１８）ことを示す臨床データと一致する。
【００５７】
結腸直腸癌患者に対する研究は、ＨＥＲ−２発現のレベルが、結腸直腸癌の進行、再発のない期間および術後の生存時間と相関し、そしてＨＥＲ−２陽性結腸直腸癌における独立した予後因子として役立ち得ることを実証した（Ｋａｐｉｔａｎｏｖｉｃら、１９９７、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１２：１１０３）。
【００５８】
ＨＥＲ−２タンパク質の発現はまた、卵巣癌における独立した予後指標（Ｓｌａｍｏｎら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７）および子宮内膜癌における独立した予後指標（Ｓａｆｆａｒｉら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５６９３）として記載されている。
【００５９】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＨＥＲ−２の過剰発現は、無胸腺マウスにおける細胞形質転換および腫瘍増殖をもたらした（Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１７８；Ｈｕｄｚｉａｋら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７１５９）。細胞実験および動物実験は、増強されたＨＥＲ−２チロシンキナーゼ活性が、悪性表現型の発現を増大したことを示した（Ｈｕｄｚｉａｋら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７１５９；Ｍｕｌｌｅｒら、１９８８、Ｃｅｌｌ  ５４：１０５；ＹｕおよびＨｕｎｇ、１９９１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１９９１；Ｙｕら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８９１；Ｚｈａｕら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：７３）。マウス乳房腫瘍プロモーターによって駆動される活性化α−ｎｅｕ癌遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、腺全体を含む複数の乳房腫瘍を同時に発達させた（Ｍｕｌｌｅｒら、１９８８、Ｃｅｌｌ  ５４：１０５）。
【００６０】
ＨＥＲ−２の過剰発現はまた、ＮＳＣＬＣ、胃腺癌および乳癌において、化学療法薬物に対する耐性を誘導することが報告された（Ｔｓａｉら、１９９３、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８５：８９７；Ｔｓａｉら、１９９５、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：６８２；Ｐａｉｋら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３２：２９１；Ｗｒｉｇｈｔら、１９９２、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５：１１８）。
【００６１】
ＨＥＲ−２ペプチド抗原およびＨＥＲ−２ポリペプチド抗原は、当該分野で公知の方法に従って、単離、合成または組換え発現され得る。ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２についてのＤＮＡコード配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０（ヒトｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２  ｍＲＮＡ）で見出され得る。
【００６２】
このような単離されたＨＥＲ−２抗原は、多くの分子のいずれかと複合体化し得、この分子は、当該分野で周知の方法に従って、化学的または組換え的に産生された融合タンパク質のいずれかとして、以下に議論されるように、抗原に対する免疫応答を増強する。
【００６３】
（ＩＩＩ．免疫刺激融合タンパク質）
本発明は、ポリペプチド抗原配列成分およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む免疫刺激融合タンパク質が、この融合タンパク質の抗原性成分に対する防御的なＤＣ誘導性のＴ細胞媒介性の防御免疫応答の生成に有効であるという発見に基づく。
【００６４】
ＨＥＲ−２タンパク質の例示的な細胞内ドメインは、本明細書中で示されるが、その例示的な配列のより短いフラグメントがまた、活性を示し得ることが理解される。最も重要なことには、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメイン由来の配列成分が、このような配列成分を含む融合タンパク質の免疫刺激活性に貢献することが実証されている。
【００６５】
本発明の免疫刺激融合タンパク質構築物はまた、ＧＭ−ＣＳＦ、レポーター配列（例えば、免疫優性なＯＶＡ由来オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４））、１つ以上のペプチドシグナル配列、および合成の精製タグ（例えば、付加されたＣ末端アミノ酸配列）からなる群より選択される１つ以上の配列成分を含み得る。
【００６６】
本明細書中に記載される例示的な免疫刺激融合タンパク質構築物は、３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列１、３アミノ酸の成熟ＰＡＰ配列２，３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列３、ならびに９アミノ酸残基のＣ末端アミノ酸精製タグ配列（３つの連続したアラニンおよび６つの連続したヒスチジンを含む）、または１５アミノ酸残基のＣ末端アミノ酸タグ配列（グリシン、アラニン、４つの連続したプロリン、３つの連続したアラニンおよび６つの連続したヒスチジンを含む）のいずれかを有し、そしてその特徴を、以下の表１に要約した。
【００６７】
【表１】
0005110674.tif 000002
１ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１０９９のアミノ酸１〜３２に対応する３２アミノ酸
２ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１０９９のアミノ酸３３〜３５に対応する３アミノ酸
３ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０のアミノ酸１９〜２１に対応する３アミノ酸
４ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０のアミノ酸２２〜３１０に対応する２８９アミノ酸
５ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０のアミノ酸１０３８〜１２５４に対応する２１７アミノ酸
ポリペプチド抗原配列成分およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む融合タンパク質が、単独で、この融合タンパク質の抗原性成分に対する防御的なＤＣ誘導性のＴ細胞媒介性防御免疫応答の生成に有効であることが理解される。
【００６８】
従って、上記に示されるＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）配列、ＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰアミノ酸配列、ＨＥＲ−２シグナル配列およびＣ末端ペプチドタグ配列は、このような応答の生成に必要ではない。
【００６９】
本発明の免疫刺激融合タンパク質は、共有結合的または非共有結合的のいずれかで、レポーター分子と結合することによって改変され得る。広範な種々のレポーター分子は、当該分野で公知であり、そしてレポーターの選択は、アッセイフォーマットを決定する。例えば、実施例１に詳述されるように、ＯＶＡ由来免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）を、例示的な免疫刺激ＨＥＲ−２融合構築物に取り込み、そしてこの構築物の抗原提示を評価した。手短に言えば、マウスＭＨＣクラスＩに結合した場合に、ＩＬ−２分泌マウスのＴ細胞ハイブリドーマＢ３Ｚ（これは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）に応答する）を、ＨＥＲ−２融合構築物であらかじめパルスされたＤＣで刺激し、そして応答の大きさを、抗原提示の指標として、増殖ＩＬ−２依存細胞において［３Ｈ］チミジン取り込みを測定することによって評価した。
【００７０】
本発明の実施における使用についての融合タンパク質のさらなる例としては、さらなるリンカーまたはシグナルペプチド成分を伴わずに、膜遠位細胞内ＨＥＲ−２ドメインの２１７アミノ酸に直接融合した癌抗原の配列を含むタンパク質が挙げられるがこれに限定されない。このような融合タンパク質の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：本明細書中に配列番号２７（配列番号２８として示される配列についてのコード配列）として示される、膜遠位細胞内ＨＥＲ−２ドメインの２１７アミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０のアミノ酸１０３８〜１２５４）に融合した、ヒト自己免疫癌／睾丸抗原の１８０アミノ酸であるＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８７４５９のアミノ酸１〜１８０）を含む融合タンパク質；本明細書中に配列番号２９（配列番号３０として示される配列についてのコード配列）として示される、膜遠位細胞内ＨＥＲ−２ドメインの２１７アミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０のアミノ酸１０３８〜１２５４）に融合した、扁平上皮細胞癌腫抗原の９６２アミノ酸であるＳＡＲＴ３−ＩＣ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０８８０のアミノ酸１〜９６２）を含む融合タンパク質。
【００７１】
当該分野で公知のように、組換えポリペプチドはまた、異種ポリペプチド（例えば、シグナル配列あるいは成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の開裂部位を有する他のポリペプチド）との融合として産生され得る。一般に、このシグナル配列は、組換えタンパク質の発現に用いられるベクター／宿主細胞系に特異的である。
【００７２】
例えば、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に配置されるタグ配列を含む組換えポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、当該分野で公知である。このタグ配列は、このタグに対する抗体を用いて、ポリペプチドを容易に検出することを可能にし、そしてこのポリペプチドのアフィニティー精製を容易にする。
【００７３】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、本発明の例示的な融合構築物に含められている。ＧＭ−ＣＳＦ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、およそ２３〜３３，０００の見かけの分子量を有する糖タンパク質）は、造血ならびに免疫学の両方における多面発現性機能を有するサイトカインである。ヒトおよびラットのＧＭ−ＣＳＦは、単球−マクロファージの細胞、好中球および好酸球の細胞系統に結合することが示されている。高親和性レセプターへのＧＭ−ＣＳＦの結合は、ＧＭ−ＣＳＦの急速なインターナリゼーションおよび分解をもたらす（ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｌａ  ＴＨＥ  ＨＥＭＯＰＯＩＥＴＩＣ  ＣＯＬＯＮＹ−ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＮＧ  ＦＡＣＴＯＲＳ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９５））。本質的にＧＭ−ＣＳＦおよびポリペプチド抗原からなるポリペプチド複合体の免疫刺激効果は、さらに、ＵＳＳＮ  ０８／５７９，８２３（許容）に記載され、これは、本明細書中において参考として特に援用される。ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびラットＧＭ−ＣＳＦの両方は、分泌の間にタンパク質分解的に開裂された１７アミノ酸の疎水性リーダー配列とともに合成される。この成熟ポリペプチドは、１２７アミノ酸長であり、そしてこの配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００７５８およびＵ００６２０で見出され得る。
【００７４】
本明細書中に記載されるＨＥＲ−２細胞外配列６が、本発明の免疫刺激融合タンパク質に組み込まれ得る抗原性配列の例であることが認識される（６Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０のアミノ酸２２〜３１０に対応する２８９アミノ酸）。当然、腫瘍細胞または感染性因子に関連した多くの抗原のうちのいずれかが、本発明の免疫刺激融合タンパク質に同様に組み込まれ得、そしてこの融合タンパク質の抗原性成分に対して、防御的なＤＣ誘導性のＴ細胞媒介性の防御免疫応答を生成するに有効であり得るということになる。例示的な抗原は、上記のＩＩＡ節にさらに記載される。
【００７５】
（例示的なＨＥＲ−２抗原組成物）
本発明の免疫刺激融合タンパク質は、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分との抗原性配列成分の化学的結合によって作製されるか、または融合タンパク質として発現される組換えおよび連続した核酸コード配列の発現によって作製される。化学的結合および／または組換えタンパク質発現がまた使用されて、この融合タンパク質にさらなるペプチド配列（例えば、レポーター配列、シグナルペプチド配列および／または精製タグ）を組み込み得る。
【００７６】
融合タンパク質として発現されている、例示的なヒトＨＥＲ−２由来の組換えおよび連続した核酸コード配列を、以下に記載する。
【００７７】
例示的なＨＥＲ５００構築物（配列番号６）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列についてのコード配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列についてのコード配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸についてのコード配列、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸についてのコード配列、ならびに３つの連続したアラニンおよび６つの連続したヒスチジンについてのコード配列。
【００７８】
例示的なＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号７）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列についてのコード配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列についてのコード配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸についてのコード配列、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｌａリンカー、成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦについてのコード配列（１２７残基）、ならびにグリシン、アラニン、４つの連続したプロリン、３つの連続したアラニンおよび６つの連続したヒスチジンについてのコード配列。
【００７９】
例示的なＨＥＲ５００＊構築物（配列番号８）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列についてのコード配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列についてのコード配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸についてのコード配列、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）についてのコード配列、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸についてのコード配列、３つの連続したアラニンおよび６つの連続したヒスチジン。
【００８０】
例示的なＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号９）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列についてのコード配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列についてのコード配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸についてのコード配列、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）についてのコード配列、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｌａリンカー、成熟ラットＧＭ−ＣＳＦについてのコード配列（１２７残基）、ならびにグリシン、アラニン、４つの連続したプロリン、アラニンおよび６つの連続したヒスチジンについてのコード配列。
例示的なＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号１０）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列についてのコード配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列についてのコード配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列についてのコード配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸についてのコード配列、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）についてのコード配列、Ａｌａリンカー、成熟ラットＧＭ−ＣＳＦについてのコード配列（１２７残基）、ならびにグリシン、アラニン、４つの連続したプロリン、アラニンおよび６つの連続したヒスチジンについてのコード配列。
【００８１】
ＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列との抗原性配列の化学的結合による、免疫刺激融合タンパク質の産生についての方法は、当該分野で公知の従来の結合技術を含む。１つ以上の付加されたペプチド配列をまた含む構築物において、化学的結合はまた、当該分野で公知の従来の結合技術を用いて達成される。例えば、ペプチドは、脱水剤（例えば、ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣＩ））を用いて結合されて、２つのペプチド間にペプチド結合を形成し得る。あるいは、結合は、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、スルフヒドリル基、イプシロンアミノ基、カルボキシル基、またはポリペプチドに存在する他の反応性基を介して形成され得る。
【００８２】
（ＩＶ．組換え融合タンパク質の産生）
本発明は、組換え技術を用いて産生された免疫刺激融合タンパク質を含む。このような免疫刺激融合タンパク質は、当業者によって慣用的に利用される多くの方法のうちのいずれかによって産生され得る。
【００８３】
別段の通知がない限り、本明細書中で使用されるすべての用語は、当業者に使用される用語と同じ意味を有する。専門家は、当業者によって慣用的に使用される定義および技術について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（１９８９）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．に特に示される。
【００８４】
融合タンパク質は、この融合タンパク質の発現を促進する条件下での、この融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞の培養、その後の宿主細胞または細胞培養培地からの融合タンパク質の回収によって産生され得る。
【００８５】
本発明の免疫刺激融合タンパク質の核酸コード配列は、宿主において複製可能および生存可能である限りは、ポリペプチドの発現について、種々の発現ベクターのうちのいずれか１つに挿入される。一般に、この核酸コード配列は、慣用的な技術を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および関連するサブクローニング手順は、当業者の範囲にあるとみなされる。ベクターは、適切な宿主、および／または免疫刺激融合タンパク質コード配列が正常には発現されないベクターもしくは宿主環境におけるコード配列の発現に有効な調節配列（例えば、非コード配列（例えば、イントロンおよび制御エレメント、すなわちプロモーターおよびターミネーターエレメント、または５’および／または３’非翻訳領域）を含む）を含み得、コード配列に作動可能に連結される。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、市販されており、これらの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【００８６】
本発明はまた、組換え技術によって、本発明の免疫刺激融合タンパク質の発現に有効なベクターを含むように遺伝子操作されている宿主細胞に関する。宿主細胞は、適切なベクターを用いて遺伝子操作（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクト）され、このようなベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。このベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態をとり得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現について選択された宿主細胞について慣用的に使用される条件であり、そして当業者に明らかである。
【００８７】
異種タンパク質の発現についての細胞への核酸の導入方法はまた、当業者に公知である。例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、およびポリカチオン（例えば、ポリブレンまたはポリオルニチン）の使用が挙げられる。哺乳動物細胞を含む形質転換の一般的局面は、米国特許第４，３９９，２１６号およびＫｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７〜５３７（１９９０）に記載されており、これらの両方は、本明細書中において参考として特に援用される。
【００８８】
本発明の免疫刺激融合タンパク質のクローニングまたは発現についての適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および高等真核生物細胞が挙げられる。適切な原核生物としては、真正細菌（例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８９】
本発明のグリコシル化免疫刺激融合タンパク質の発現についての適切な宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）ならびに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。この適切な宿主細胞の選択は、当該分野内にあるとみなされる。
【００９０】
このような免疫刺激融合タンパク質の産生についてのプロセスは、この融合タンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養する工程、および細胞培養物からこの融合タンパク質を回収する工程を包含する。一般に、細胞培養の生産性の最大化についての原理、プロトコルおよび実際的技術は、ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ、編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に見出され得る。より具体的には、バキュロウイルス系における発現についての技術は、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ＥＫら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７、１９９４に記載され、これは、本明細書中において参考として特に援用される。
【００９１】
本発明の免疫刺激融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、発現、および細胞培養物からのコードタンパク質の回収に適切な条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される特定の配列および／またはベクターに依存して、分泌、膜結合または細胞内に含まれ得る。
【００９２】
当業者によって理解されるように、本発明の免疫刺激融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、シグナル配列とともに設計され得、この配列は、原核生物または真核生物の細胞膜を介して、改変された免疫刺激融合タンパク質の分泌を指向する。
【００９３】
実施例１は、例示的な免疫刺激ＨＥＲ−２融合タンパク質の構築を詳述し、そしてこの核酸および推定アミノ酸配列を、表２に示す。
【００９４】
種々のＨＥＲ−２融合タンパク質についてのコード配列を含む発現ベクターを使用して、哺乳動物２９３−ＥＢＮＡ細胞および昆虫ＳＦ２１細胞をトランスフェクトした。一旦、構築、発現および精製されると、ラットＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＧＭ−ＣＳＦのいずれかを含むＨＥＲ２融合タンパク質を、当業者に慣用的に利用される適切なアッセイにおいて、ＧＭ−ＣＳＦ生物活性について試験した。昆虫細胞および哺乳動物細胞由来の融合タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞系の増殖を支持する能力によって証明されるように、ＧＭ−ＣＳＦ活性を示した。同様に、ＨＥＲ−２の存在を、当該分野で周知の方法に従って、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ試験の両方において、ＨＥＲ−２特異的モノクローナル抗体を用いて確認した。
【００９５】
上述の記述は、本発明の特定の実施形態を記載するが、当業者が、公知の方法に従って、種々の抗原についてのコード配列を置換し得、そして発現について異なるベクターおよび細胞系を使用し得、それによって、本明細書中に記載される原理に従って、免疫刺激融合タンパク質組成物を調製することが認識される。
【００９６】
組換え融合タンパク質として、化学的結合によって産生されても、連続したコード配列の発現によって産生されても、ＤＣは、本発明の免疫刺激融合タンパク質に曝露され得、そしてＭＨＣ  Ｉに関連して、このようなＤＣによって提示され得、この融合タンパク質に対する細胞性免疫応答をもたらす。
【００９７】
（Ｖ．活性化樹状細胞（ＤＣ）の作製）
（Ａ．ＤＣ前駆体およびＤＣの単離および特徴付け）
ヒト樹状細胞前駆体（ＤＣ前駆体）を、多くの供給源（末梢血、臍帯血、骨髄およびリンパ球器官を含むがこれらに限定されない）のうちのいずれかから獲得し得る。
【００９８】
当該分野で公知の多くの方法のうちのいずれかによって単離および濃縮されたＤＣ前駆体は、本発明の方法の実施に有効なＤＣ前駆体集団をもたらす。
【００９９】
好ましいアプローチにおいて、ＤＣ前駆体は、末梢血から得られる。このアプローチにおいて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、標準的な白血球搬出法によって健康なドナーから収集され、そしてＤＣ前駆体は、共有に係わるＵＳＳＮ  ６０／１６８，９９１（００２１）において記載されるように、例えば、一段階浮遊密度遠心分離または連続二段階浮遊密度遠心分離のいずれかによって、それぞれ浮遊密度溶液ＢＤＳ  ７７またはＢＤＳ  ７７および６５（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて単離される。
【０１００】
ＤＣ前駆体は、健康な被験体、または特定の抗原の発現に関連した疾患を患うことが公知の被験体から獲得され得る。このようなＤＣ前駆体は、同種異系または自己由来であり得る。
【０１０１】
一旦、ＤＣ前駆体が得られると、この前駆体は、最適な抗原取り込み、プロセシングおよび提示の状態で、細胞集団を拡張し、そしてＤＣを維持するに適切な条件および十分な時間の下で培養される。
【０１０２】
ＤＣ前駆体の培養に対する１つの好ましいアプローチにおいて、ＤＣは、共有に係わるＵＳＳＮ  ６０／１５８，６１８に詳述されるように、無血清培地またはタンパク質を含まない培地において４０時間、外因性に添加されたサイトカインの非存在下で、エキソビボでの培養によって、このようなＤＣ前駆体から作製される。手短に言えば、ＤＣ前駆体は、５％  ＣＯ２の下、３７℃の給湿インキュベーターにおいて４０時間、２ｍＭグルタミンを補充したＡｉｍ  Ｖ培地において、１×１０７／ｍｌの密度で、テフロン（登録商標）バッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ）中で培養する。培養期間の間、ＤＣ前駆体は、Ａｇでパルスされる。
【０１０３】
ＤＣの単離および培養の好ましい局面は、外因性に補充されたサイトカインを欠如する培養培地の使用、およびＡｇをロードされた超活性化ＤＣの作製をもたらすに有効な様式における無血清条件下の培養を含む。
【０１０４】
この画分におけるＤＣの純度は、機能的な特徴付けとともに、共有に係わるＵＳＳＮ  ６０／１５８，６１８にさらに記載されるような表現型の特徴付けについて、例えば、フローサイトメトリー（すなわち、ＦＡＣＳ）分析を用いて定量され得る。細胞表面の表現型分析は、およそ１〜３×１０７細胞からなるサンプルを用いて行われ、これは、ＰＢＳにおける１０％正常マウス血清において１０分間インキュベートされ、ＰＢＳにおいて洗浄され、そして２５０〜７５０μｌのＰＢＳに再懸濁される。次いで、この細胞懸濁液は、丸底の９６ウェルプレートに、１ウェル当たり３０μｌで分配される。ＦＩＴＣ結合体化、ＰＥ結合体化およびＰｅｒＣＰ結合体化ｍＡｂが、１ウェル当たり１０μｌで添加され、そして細胞が暗闇において氷上で２０分間インキュベートされる。次いで、細胞が、１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳで洗浄され、そしてＰＢＳにおいて１ウェル当たり４００μｌに再懸濁され、次いで、ネガティブコントロールとして、アイソタイプに適合したコントロールＡｂで標識された細胞を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析される。成熟ＤＣの好ましい機能的特徴付けは、アロ刺激の獲得およびＡｇ提示能力を含む。
【０１０５】
Ａｇをロードされた超活性化ＤＣは、すでにＡｇをプロセスしており、そしてＡｇを免疫細胞に提示する能力を有し、そしてＡｇ特異的免疫応答（例えば、腫瘍抗原に対するＣＴＬ媒介性のＴ細胞応答）を迅速に生成する。
【０１０６】
本発明の別の局面に従って、ＤＣは、本発明のＨＥＲ−２融合タンパク質の曝露の前または後のいずれかの凍結保存によって保存され得る。凍結保存についての例示的な方法は、共有に係わるＵＳＳＮ  ６０，１６８，９９１にさらに記載される。小規模な凍結保存について、細胞は、あらかじめ冷却された５％ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）（Ｓｗｉｓｓ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ）において、１ｍｌ当たり２０〜２００×１０６で再懸濁され得る。次いで、上記ＨＡＳ溶液における等量の２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、滴状に添加された。この混合物は、凍結ガラス瓶において、１ガラス瓶当たり１ｍｌで分取され、そして凍結チャンバ（Ｎａｌｇｅｎｅ）において−８０℃で一晩凍結される。このガラス瓶は、朝に液体窒素タンクに移される。大規模な凍結保存について、細胞は、ＡＩＭ  Ｖにおいて、１ｍｌ当たり３０〜６００×１０６で再懸濁され得る。次いで、等量の２０％  ＡＩＭ  Ｖが、徐々に添加される。この混合物は、速度制御凍結システム（Ｆｏｒｍａ）を用いて、１バッグ当たり２０ｍｌで、凍結容器（Ｃｒｙｏｃｙｔｅ、Ｂａｘｔｅｒ）において凍結される。
【０１０７】
（Ｂ．融合タンパク質の抗原性の評価）
（インビトロ抗原提示）
抗原提示アッセイを使用して、種々の免疫刺激融合タンパク質の抗原提示能力を評価し得る。例示的なアッセイは、実施例１に記載され、ここで、ＩＬ−２分泌マウスのＴ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚ（これは、ＯＶＡ由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１５４１）を結合したマウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２−Ｋｂ）に応答する）は、種々のＤＣを用いて刺激され、このＤＣは、操作されたＨＥＲ−２融合タンパク質を用いてあらかじめパルスされ、そして応答の大きさは、増殖するＩＬ−２依存性細胞への［３Ｈ］チミジン取り込みの測定によって評価される。
【０１０８】
本明細書中に記載されるアッセイフォーマットを使用して、固定数のＡＰＣとともに抗原の滴定を用いて、抗原提示を評価し得る。
【０１０９】
（Ｂ．動物モデルにおけるインビボアッセイ）
本発明の免疫刺激融合タンパク質は、動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。このような場合、免疫刺激融合タンパク質組成物またはこの組成物を用いてエキソビボで処理された超活性化ＤＣによる動物のあらかじめの免疫化は、腫瘍または感染性因子のインビボ増殖を抑制するに有効である。
【０１１０】
このアプローチの１つの例において、ＨＥＲ−２融合タンパク質組成物であるＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号４）（これは、ＨＥＲ２の細胞内ドメインに由来する２１７アミノ酸に融合した、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに由来する２８９アミノ酸からなる抗原性成分を有する）を用いてエキソビボでパルスされた活性化ＤＣによるマウスのあらかじめの免疫化は、マウスにおけるＨＥＲ−２発現自己腫瘍のインビボ増殖を抑制した（実施例２）。別のアプローチにおいて、動物（例えば、マウス）は、特定の感染性因子または腫瘍形成細胞を用いて接種され、次いで、本発明の免疫刺激融合タンパク質で処理され、そして抗原性組成物が感染性因子または確立された腫瘍のインビボ増殖を抑制する能力について評価される。
【０１１１】
実施例３は、ＨＥＲ−２融合タンパク質組成物であるＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号４）、ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ（配列番号２）、ＨＥＲ５００＊（配列番号３）およびＨＥＲ５００（配列番号１）を用いてエキソビボでパルスされた活性化ＤＣを用いたマウスの感染後注射が、ＨＥＲ−２発現自己腫瘍細胞を用いて以前に接種されたマウスについての生存時間を増大した点において、このアプローチを例示する。
【０１１２】
この動物研究の結果は、有効な抗腫瘍応答を生成するために、本発明の免疫刺激融合タンパク質が、抗原性配列成分およびＨＥＲ−２の細胞内ドメインに由来する配列成分を含まなければならないことを確認する。
【０１１３】
（ＶＩ．免疫治療および癌治療についての組成物および方法）
本発明は、免疫刺激融合タンパク質組成物を提供し、これは、ＣＤ８＋ＣＴＬ媒介性応答ならびにＣＤ４＋Ｔｈ細胞増殖性応答の両方の誘導のための抗原を効果的に提示し得る。
【０１１４】
従って、本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物は、一般に有用であり、そして一次および二次免疫応答の生成に関与する広範囲の免疫治療適用、免疫予防適用および癌治療適用において利用され得る。
【０１１５】
本発明はまた、ＭＨＣクラスＩに関連して提示された、改変された可溶性ポリペプチド抗原またはタンパク質抗原を提供する。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明の改変された可溶性タンパク質抗原を用いた免疫化は、抗原に対するＭＨＣクラスＩ媒介性の細胞性免疫応答をもたらし、この抗原は、未改変形態で提供される場合、同じ大きさの細胞性免疫応答を誘発しない。
【０１１７】
このような改変された可溶性タンパク質抗原を用いた免疫化は、ＭＨＣクラスＩ媒介性の細胞性免疫応答をもたらし、この応答は、未改変形態で提供される場合、同じ抗原に対する細胞性免疫応答よりもより大きい大きさであり、従って、大きな防御を提供する。
【０１１８】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、免疫刺激組成物を提供し、この組成物は、免疫刺激融合タンパク質にエキソビボで曝露されたＤＣを含み、この融合タンパク質は、上記のように、ポリペプチド抗原配列成分およびＨＥＲ−２タンパク質の細胞内ドメインに由来する配列成分を含み、これは、ポリペプチド抗原のみを含む組成物よりも効果的にＴ細胞応答を誘導し得る。
【０１１９】
免疫刺激融合タンパク質単独、または免疫刺激融合タンパク質と組み合わせて、本発明の免疫刺激融合タンパク質にエキソビボで曝露されたＤＣを含む免疫刺激組成物は、被験体の免疫治療における有用性を見出し、そしてワクチンとして機能し得る。
【０１２０】
関連局面において、本発明は、特定の型の癌または感染性疾患に関連したポリペプチド抗原に対して、被験体を免疫する方法を含む。この方法は、以下にさらに記載されるように、免疫刺激融合タンパク質組成物を用いて、ＤＣを曝露またはパルスする工程を包含する。
【０１２１】
本発明の方法の実施において、曝露工程は、インビトロ（エキソビボ）、インビボ、またはインビトロおよびインビボの両方で行われ得る。例えば、本発明の免疫刺激融合タンパク質は、被験体に直接注射され得るか、またはＤＣは、この融合タンパク質の抗原性成分の細胞表面提示を誘導するに有効な様式で、インビトロでこの免疫刺激融合タンパク質に曝露され得、そしてパルスされたＤＣが、被験体に戻される。
【０１２２】
免疫刺激融合タンパク質単独、またはこの免疫刺激融合タンパク質へのインビトロ曝露によって刺激されるＤＣと組み合わせて、免疫刺激融合タンパク質を含む抗原性組成物が、例えば、直接のインビボ投与、エキソビボ体細胞治療、インビボ移植可能デバイス、またはエキソビボ体外デバイスにおいて使用され得る。
【０１２３】
多くの方法のうちのいずれかを使用して、本発明の免疫刺激融合タンパク質を用いてＤＣをパルスし得、ＭＨＣ  Ｉに関連した抗原の提示を有効にすることが理解される。本明細書中に詳述される実験は、免疫刺激融合タンパク質への曝露によるＤＣの活性化が、「内因性の」クラスＩ経路を介して、融合タンパク質の抗原性成分のプロセシングを容易にし、その結果、抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子と共に提示され、従って、ＣＤ８＋ＣＴＬを活性化し得ることを実証する。
【０１２４】
上述より、本発明が、可溶性タンパク質抗原のプロセシングが、クラスＩＩ経路とは反対に、ＭＨＣクラスＩ経路を介して生じるという独特の特徴を有する組成物および方法を提供することが理解される。
【０１２５】
（ＶＩＩ．治療適用）
（Ａ．免疫刺激融合タンパク質組成物へのエキソビボでのＤＣの曝露）
本発明は、ＤＣが、被験体において、インビトロ（エキソビボ）またはインビボのいずれかで、免疫刺激融合タンパク質組成物に曝露され得、この融合タンパク質の抗原性成分に対する防御的なＴ細胞媒介性応答を生じるという発見に基づく。
【０１２６】
ＤＣは、免疫刺激融合タンパク質組成物を用いて、インビトロ（エキソビボ）で処理され、その後、被験体に投与される。この被験体は、ＤＣを獲得した同じ個体（自家移植）、または異なる個体（同種異系移植）であり得る。同種異系移植において、ドナーおよびレシピエントは、ドナー細胞およびレシピエント細胞両方の、もう一方に対する免疫応答を最小化するために、ＨＬＡ抗原の類似性に基づいて適合される。
【０１２７】
被験体は、単独、または処置下の条件について代表的に使用される治療レジメン（例えば、癌の処置のための放射線療法および／または化学療法）と組み合わせて、本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物を用いて処置され得る。
【０１２８】
一般に、ＤＣ前駆体は、上記のように、外因的に補充されたサイトカインを欠如する培地において無血清条件下で得られ、培養され、その後、本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物に、ＤＣがインビトロ（エキソビボ）で曝露され、その後、被験体に活性化ＤＣが再注入される。
【０１２９】
エキソビボで再注入された免疫刺激融合タンパク質組成物で処理されたＤＣは、この融合タンパク質の抗原性成分に対する免疫応答の迅速な生成のための手段を提供する。
【０１３０】
（Ｂ．免疫刺激融合タンパク質組成物のインビボ投与）
別の局面において、本発明は、本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物のインビボ投与によって、被験体を処置する方法に関する。
【０１３１】
１つの実施形態において、この被験体は、腫瘍特異的抗原を発現する型の癌を有する。本発明に従って、腫瘍特異的抗原配列成分、およびＨＥＲ−２の細胞内ドメインに由来する配列成分を含む免疫刺激融合タンパク質が作製され得る。このような場合、この免疫刺激融合タンパク質を用いてエキソビボでパルスされたＤＣが、単独またはこの融合タンパク質と組み合わせて被験体に投与され、被験体について改善された治療結果をもたらし、例えば、腫瘍特異的抗原を発現する癌細胞または固形腫瘍の増殖の遅延または減少、あるいは癌細胞の総数または総腫瘍負担における減少によって証明される。
【０１３２】
関連する実施形態において、この被験体は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または他の型の感染を有すると診断されており、これは、特定の抗原（例えば、ウイルス抗原）の発現に関連する。本発明に従って、ＨＥＲ−２の細胞内ドメインに由来する配列成分とともに、抗原（例えば、ＨＢＶ特異的抗原）からなる配列成分を含む免疫刺激融合タンパク質が作製され得る。このような場合、この免疫刺激融合タンパク質を用いてエキソビボでパルスされたＤＣが、単独またはこの融合タンパク質と組み合わせて被験体に投与され、被験体について改善された治療結果をもたらし、被験体内部の原因となる感染性因子の増殖の遅延、および／または特定の感染性疾患に代表的に関連した検出可能な症状の減少もしくは排除によって証明される。
【０１３３】
どちらの状況においても、被験体への本発明の免疫刺激融合タンパク質のインビボ投与は、以下に依存して、被験体における抗原に対する防御的なＤＣ誘導性のＴ細胞媒介性免疫応答を生成するための手段を提供する：（１）投与される抗原性組成物、（２）投与の継続時間、用量および頻度、ならびに（３）被験体の総体的状態。
【０１３４】
１つの例において、この被験体は、ＨＥＲ−２を発現する癌を有し、そして本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物（これは、融合タンパク質の抗原性成分として、ＨＥＲ２を含む）の投与は、被験体の治療結果を改善する手段を提供する。この実施形態において、この免疫刺激ＨＥＲ−２組成物は、被験体においてＨＥＲ−２を発現する癌細胞に対する細胞性免疫応答をもたらすに有効な様式で、被験体に投与される。
【０１３５】
（Ｃ．患者の処置）
免疫刺激融合タンパク質組成物の有効な送達は、本発明の重要な局面である。本発明に従って、このような送達経路としては、非経口経路（例えば、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＣ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射および筋内（ＩＭ）注射）を含む種々の全身性経路が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３６】
樹状細胞に免疫刺激融合タンパク質を送達するに有効な方法、あるいは抗原発現細胞にごく接近して、免疫刺激融合タンパク質またはＤＣ組成物を導入するに有効な方法がまた意図されることが理解される。
【０１３７】
１つの好ましい実施形態において、この免疫刺激組成物は、融合タンパク質であり、薬学的に受容可能なキャリアに含まれ、そして静脈内経路によって送達される。この実施形態のさらなる局面において、この免疫刺激融合タンパク質組成物は、短期間の一定間隔（例えば、２ヶ月以下の隔週間隔）で投与される。しかし、いくつかの場合において、この融合タンパク質組成物は、長期間にわたって断続的に投与される。
【０１３８】
代表的には、１以上の用量の免疫刺激融合タンパク質が、一般的には約２ヶ月間にわたって隔週間隔で投与される。ＩＶ、ＳＣまたはＩＭ経路による投与のための好ましい用量は、１患者当たり約５μｇ／ｋｇ〜１患者当たり約５ｍｇ／ｋｇである。
【０１３９】
別の好ましい実施形態において、この免疫刺激組成物は、免疫刺激融合タンパク質にエキソビボで曝露されたＤＣを含み、これは、薬学的に受容可能なキャリアに含まれ、そしてＩＶ、ＳＣまたはＩＭ経路によって送達される。
【０１４０】
この実施形態の１つの局面において、この免疫刺激融合タンパク質組成物は、１０７〜１０１１ＤＣを含み、これは、実施例２および３に記載されるように、ＡｇをロードされたＤＣを作製するに有効な様式で、１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの所定の免疫刺激融合タンパク質に曝露されている。次いで、約１０７〜１０１１ＤＣの用量が、短期間の確立された手順（例えば、２ヶ月以下の隔週間隔）に従って、静脈注射あるいはＳＣ注射またはＩＭ注射によって、被験体に投与される。しかし、いくつかの場合、この免疫刺激融合タンパク質組成物は、長期間断続的に投与される。
【０１４１】
代表的には、１以上の用量の免疫刺激融合タンパク質組成物が、一般的には約２ヶ月間にわたって隔週間隔で投与される。一般に、この方法は、被験体に、適切な薬学的キャリア中において、処置の下で被験体に改善された治療結果をもたらすに有効な量の免疫刺激融合タンパク質またはＤＣ組成物を投与する工程を包含する。
【０１４２】
当然、この免疫刺激融合タンパク質またはＤＣ組成物は、任意の簡便なビヒクル（これは、生理学的に受容可能である）において投与され得るということになる。このような免疫刺激融合タンパク質またはＤＣ組成物は、当業者によって使用される、種々の標準的な生理学的に受容可能なキャリアのうちのいずれかを含み得る。このような薬学的キャリアの例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水およびリンガー液が挙げられるがこれらに限定されない。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択された投与の様式に依存して変化することが理解される。
【０１４３】
徐放性組成物はまた、本出願の範囲内にあることが意図される。これらは、成形品形態の半透性のポリマーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）を含み得る。
【０１４４】
この方法の好ましい適用において、被験体は、ヒト被験体である。被験体はまた、癌患者、特に、特定の癌特異的抗原または癌関連抗原を発現する癌を有すると診断される患者であり得、そしてこの患者は、化学療法および／または放射線療法を受けていても、受けていなくてもよい。
【０１４５】
本発明の免疫刺激融合タンパク質またはＤＣ組成物の有効なインビボ用量が、投与の頻度および経路、ならびに処置下にある被験体の状態に従って変化することが理解される。従って、このようなインビボ治療は、一般的に、最適な治療結果を達成するために、処置されている状態に適切な試験によるモニタリング、および用量または処置レジメンにおける対応する調整を必要とする。
【０１４６】
（Ｄ．処置のモニタリング）
本明細書中に記載される方法に関与する所定の治療レジメンの効力が、例えば、このような投与後の種々の時点での、被験体の癌の状態および生物学的状態のモニタリングに加えて、当該分野で周知の方法を用いた、末梢血における融合タンパク質の抗原性成分に対するＣＴＬ応答、ヘルパーＴ細胞応答および／または抗体応答の誘導のモニタリングによってモニターされ得る。
【０１４７】
被験体が、特定の型の癌を有すると診断されている場合において、癌の状態はまた、処置下の癌の型に適切な診断技術を用いてモニターされる。同様に、被験体が、特定の型の感染を有すると診断されている場合において、感染の状態はまた、処置下の感染の型に適切な診断技術を用いてモニターされる。
【０１４８】
この免疫刺激融合タンパク質またはＤＣ組成物の処置レジメンは、示されるように、処置下の被験体の状態および上記のアッセイの結果に基づいて、調整され得る（用量、頻度、経路など）。
【０１４９】
（ＶＩＩＩ．有用性）
本発明は、ＣＤ８＋ＣＴＬ媒介性、ならびにＣＤ４＋Ｔｈ細胞増殖応答の両方の誘導について、抗原を有効に提示し得る免疫刺激融合タンパク質組成物を提供する。
【０１５０】
従って、本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物は、一般的に有用であり、そして一次および二次免疫応答の生成に関与する広範囲の免疫治療適用、免疫予防適用および癌治療適用において使用され得る。
【０１５１】
本発明の免疫刺激融合タンパク質組成物は、癌の免疫治療における有用性を見出し、この癌は、特定の抗原の発現に関与する。例えば、本明細書中に記載されるＨＥＲ−２融合タンパク質組成物は、ＨＥＲ−２を発現する腫瘍（例えば、乳癌、卵巣癌および結腸癌）の免疫治療における有用性を見出す。
【０１５２】
本発明の利点としては、樹状細胞（ＤＣ）に、本発明の免疫刺激融合タンパク質を提示し、ＤＣ活性化をもたらすことによって、単離されたかまたは可溶性のポリペプチドまたはタンパク質抗原に対する細胞性免疫の増強を誘導することが挙げられる。上記で議論されるように、このような誘導は、誘導物質として、可溶性のポリペプチドまたはタンパク質抗原を用いて、一般には観察されない。このような活性化ＤＣの作製は、自己ＤＣまたは同種異系ＤＣを用いてインビトロ（エキソビボ）で達成され得るか、あるいは被験体への本発明の免疫刺激融合タンパク質の投与後に、インビボで生じ得る。
【０１５３】
本明細書において引用されるすべての特許および参考文献は、本明細書によって、その全体において参考として特に援用される。
【０１５４】
以下の実施例は、例示的であるが、決して本発明を制限することは意図されない。
【０１５５】
（実施例１）
（例示的なＨＥＲ−２融合タンパク質の産生）
１つの例において、ヒトＨＥＲ−２を、当該分野で公知の方法に従って、ＳＫ−ＢＲ３細胞系からクローニングした。この配列の３’末端の停止コドンを、変異させて除き、そしてＮｏｔ  Ｉ部位をその場所に挿入して、ＨＥＲ−２  ｃＤＮＡを、Ｃ末端タグペプチド、ラットＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡに融合させた。ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡを、標準的な方法に従って、ＰＢＭＣライブラリーからクローニングした。ＮｏｔＩ部位を、このＤＮＡの５’末端に挿入し、そしてＸｂａＩクローニング部位を、インフレームの停止コドンと共に３’末端に挿入した。ＰＣＲで作製されたｃＤＮＡを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして特定の哺乳動物細胞株または昆虫細胞株へのトランスフェクションのために制限ベクターにクローニングした。
【０１５６】
種々のＨＥＲ２融合タンパク質についてのコード配列を含む発現ベクターを用いて、哺乳動物２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（一過性発現）および昆虫ＳＦ２１細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）をトランスフェクトした。融合タンパク質産物を、組織培養物の上清から回収し、そして金属アフィニティーカラム（ＮＴＡ樹脂、Ｑｉａｇｅｎ）を通過させることにより、アフィニティー精製した。ＨＥＲ５００−ｈＧＭ−ＣＳＦについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、哺乳動物細胞および昆虫細胞由来の産物として、それぞれ１２０ｋＤａおよび１１０ｋＤａに移動するタンパク質のバンドを示した。６９０ポリペプチドの骨格の推定の大きさは、７４８７７Ｄａである。
【０１５７】
ヒトＨＥＲ−２由来タンパク質を、以下のコード配列を用いて、組換えタンパク質として産生した。
【０１５８】
ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号４）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナルペプチド、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸、Ａｌａ  Ａｌａリンカー、１２７アミノ酸の成熟ラットＧＭ−ＣＳＦ配列、およびＧｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ。
【０１５９】
ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号５）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、３アミノ酸のＨＥＲ−２シグナル配列、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）、Ａｌａリンカー、１２７アミノ酸の成熟ラットＧＭ−ＣＳＦ配列、およびＧｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ。
【０１６０】
ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号９）またはＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（配列番号１０）融合タンパク質についてのコード配列を含むＢＰ８バキュロウイルス発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＳＦ２１細胞をトランスフェクトした。融合タンパク質産物を、組織培養物の上清から回収し、そして金属アフィニティークロマトグラフィーによってアフィニティー精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦについては１０５ｋＤａに、そしてＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦについては６０ｋＤａに移動するタンパク質バンドを示した。
【０１６１】
一旦、構築、発現および精製されると、ラットＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＧＭ−ＣＳＦを含むＨＥＲ−２融合分子を、ＧＭ−ＣＳＦ生物活性の適切なアッセイについて試験し、そしてＨＥＲ−２の存在を、当該分野で周知の方法に従って、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ試験の両方において、ＨＥＲ−２特異的なモノクローナル抗体を用いて確認した。
【０１６２】
（ＨＥＲ−２融合タンパク質のインビトロでの提示の評価）
ＩＬ−２分泌マウスのＴ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚ（これは、ＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１５４１）を結合したマウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２−Ｋｂ）に応答する）を用いて、ＯＶＡ由来の免疫優性ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを含むＨＥＲ−２融合タンパク質の抗原提示能力を評価した。
【０１６３】
組織培養物を、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンおよび３×１０−５Ｍの２−ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充したＩＭＤＭ培地において、３７℃で、５％のＣＯ２を含む給湿雰囲気（組織培養インキュベーター）において維持した。
【０１６４】
活性化ＤＣの富化調整物を、３７℃で２時間、組織培養フラスコにおいて、自己Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞をインキュベートし、非接着細胞を除去し、そして１μＭのイオノマイシンと共に２日間、残りの接着細胞を培養することによって獲得した。
【０１６５】
ＩＬ−２分泌アッセイを、以前に記載されるように実施した［Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、１９９８、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１：３．１４］。より具体的には、１０５のハイブリドーマ細胞を、０．２ｍｌのマイクロウェルにおいて、３×１０４の活性化ＤＣおよび種々の濃度のＨＥＲ−２抗原の存在下で培養した。１日後、培養物上清を収集し、そして最後の６時間の培養期間の間の［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定されるように、１０４のＨＴ−２細胞（ＩＬ−２依存性細胞株）の増殖を支持する能力について、２４時間、５０％濃度で試験した。
【０１６６】
ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯより購入したグレードＶＩＩ、９９％純度のニワトリオボアルブミン）に関して、ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦおよびＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質に対するＢ３Ｚ細胞の応答を、インビトロで評価した。３Ｈチミジン取り込みに基づくＣＰＭとして示される細胞増殖応答（図１）は、ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦおよびＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質が、Ｂ３Ｚの刺激において、ネイティブのＯＶＡ自身よりも有効である（それぞれ、約１０倍および１００倍を超える）ことを示す。ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦを超えるＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦの１０倍の優勢は、Ａｇの増強された提示が、この融合タンパク質における２１７アミノ酸に由来するさらなる細胞内ＨＥＲ−２ドメイン（これは、ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦに存在するが、ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦには存在しない）の内包に相関することを示す。
【０１６７】
（実施例２）
（ＡｇをパルスされたＤＣを用いたあらかじめの免疫化による、インビボの腫瘍増殖の妨害）
ＨＥＲ−２発現自己腫瘍のインビボ増殖の抑制に対する、ＨＥＲ−２をパルスされた活性化ＤＣを用いたあらかじめの免疫化の効果を、マウスモデルにおいて評価した。
【０１６８】
マウス腫瘍細胞株Ｅ．ＨＥＲ−２を、標準的な方法に従って、全長のヒトＨＥＲ−２  ｃＤＮＡを用いたＥＬ−４細胞（胸腺腫に由来するＣ５７ＢＬ／６マウス系統；ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のトランスフェクトによって作製した。
【０１６９】
ヒトＨＥＲ−２由来タンパク質を、以下のコード配列を用いて、実施例１において以前に記載されるように、組換えタンパク質として産生した。
【０１７０】
ＨＥＲ５００構築物（配列番号１）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、ＨＥＲ−２シグナル配列の３アミノ酸、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸、およびＡｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  ＨｉｓからなるＣ末端タグ。
【０１７１】
ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号２）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、ＨＥＲ−２シグナル配列の３アミノ酸、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、ＨＥＲ−２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸、Ａｌａ  Ａｌａリンカー、１２７アミノ酸の成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦ配列、およびＧｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  ＨｉｓからなるＣ末端タグ。
【０１７２】
ＨＥＲ５００＊構築物（配列番号３）を、５’から３’方向に、以下についてのコード配列を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、ＨＥＲ−２シグナル配列の３アミノ酸、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）、ＨＥＲ２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸、およびＡｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  ＨｉｓからなるＣ末端タグ。
【０１７３】
ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号４）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、ＨＥＲ−２シグナル配列の３アミノ酸、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）、ＨＥＲ２膜遠位細胞内ドメインの２１７アミノ酸、Ａｌａ  Ａｌａリンカー、１２７アミノ酸の成熟ラットＧＭ−ＣＳＦ配列、およびＧｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  ＨｉｓからなるＣ末端タグ。
ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ構築物（配列番号５）を、５’から３’方向に、以下を含むコード配列の発現によって産生した：３２アミノ酸のＰＡＰシグナル配列、成熟ＰＡＰタンパク質の３アミノ酸配列、Ａｌａ  Ａｒｇリンカー、ＨＥＲ−２シグナル配列の３アミノ酸、成熟ＨＥＲ−２膜遠位細胞外ドメインの２８９アミノ酸、Ａｌａリンカー、ＯＶＡ由来の免疫優性オクタペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）、Ａｌａリンカー、１２７アミノ酸の成熟ラットＧＭ−ＣＳＦ配列、およびＧｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  ＨｉｓからなるＣ末端タグ。
【０１７４】
８週齢の任意抽出された雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２週間間隔で、０．１ｍｌのＰＢＳ中の２．５×１０５のＡｇをパルスされた活性化ＤＣの３回のＩＰ注射を与えた。活性化ＤＣの富化調整物を、３７℃で２時間、組織培養フラスコにおいて、雌性Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞をインキュベートし、非接着細胞を除去し、そして引き続いて、１μＭのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３８２３；Ｒｉｄｇｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４）の存在下で２日間、残りの接着細胞を培養することによって獲得した。この様式で得られたＤＣを、示されたＨＥＲ−２融合タンパク質の各々とともに１μＭで１６時間共培養することによってパルスし、２回洗浄し、そしてマウスに注射した。最後のインビボ免疫化から２週間後、マウスを、０．１ｍｌのＰＢＳ中の５×１０５Ｅ．ＨＥＲ−２細胞のＩＰ注射でチャレンジした。マウスを毎日モニターし、そしてその生存を記録した。２つの独立した実験の結果を、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示す。
【０１７５】
ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦをパルスされたＤＣを用いた免疫化は、腫瘍増殖を妨害したが、ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦでの処理は、効果を有さなかった（図２Ａ）。これらの結果は、有効な抗腫瘍応答を生成するための強いレベルのＡｇ提示の達成における細胞内ＨＥＲ−２ドメイン由来のセグメントの重要性を確認する点で、インビトロで得られた結果に一致する。図２Ｂに示される実験結果は、ＨＥＲ−２発現腫瘍に対する有意なレベルのインビボ防御がまた、以下のいずれかの場合に生成され得ることを実証する：（ａ）ＨＥＲ５００を含む免疫原が、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ）に融合される場合、（ｂ）任意のＧＭ−ＣＳＦの非存在下において、ＨＥＲ−２抗原の細胞内部分および細胞外部分の両方が、構築物（ＨＥＲ５００およびＨＥＲ５００＊）をもたらす場合、ならびに（ｃ）ＯＶＡ由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬの非存在下（ＨＥＲ５００およびＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ）。
【０１７６】
（実施例３）
（Ａｇをパルスされた活性化ＤＣを用いた免疫化による、確立された腫瘍のインビボ抑制）
異なるＨＥＲ−２融合タンパク質を用いた免疫治療の効力を、腫瘍保有実験マウス（すなわち、ＨＥＲ−２発現腫瘍細胞をあらかじめ注入された動物）へのＨＥＲ−２融合タンパク質の投与によってさらに評価した。１２週齢の０日目の０．１ｍｌのＰＢＳ中の５×１０５のＥ．ＨＥＲ−２細胞のＩＰ注射、その後の０．１ｍｌのＰＢＳ中の２．５×１０５のＡｇをパルスされた活性化ＤＣの２回のＩＰ注射（実施例２において記載されるように調製した）（それぞれ、１日後および１２日後）。マウスを毎日モニターし、そしてその生存を記録した。図３に示されるように、ＨＥＲ５００を含む抗原性構築物（ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ、ＨＥＲ５００およびＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ）を用いてパルスされたＤＣでの処理は、腫瘍保有マウスの生存が著しく延長するという顕著な治療効果を示した。
【０１７７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、同質遺伝子的に超活性化された樹状細胞（ＤＣ）によって提示される種々の抗原（Ａｇ）に対する、インターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌マウスのＭＨＣクラスＩ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚ［ニワトリオボアルブミン「ＯＶＡ」由来の免疫優性ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的である（Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１５４１）］の応答を示す。ＣＰＭは、１分間当たりのカウントをいう；ｃｐｍは、所定の試験群−可溶性Ａｇの非存在下において得られるバックグラウンドのｃｐｍ値についての絶対的ｃｐｍ間の差をいう（示される実験において、後者は、９，５８１であった）。種々の抗原の組成物は、以下に記載される図において示される。
【図２Ａ】図２Ａは、免疫化抗原として、「なし」（白四角）、「ＨＥＲ３００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ」（黒三角）およびＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（白三角）を用いて、腫瘍細胞でのチャレンジ後４２日まで、マウスの生存に対するＡｇをパルスされた超活性化ＤＣを用いたあらかじめの免疫の効果に関する実験の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、免疫化抗原として、「なし」（白丸、７匹のマウス）、「ＨＥＲ５００＊」（白四角、７匹のマウス）、ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ（黒三角、８匹のマウス）、「ＨＥＲ５００」（黒丸、７匹のマウス）およびＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ（黒菱形、７匹のマウス）を用いて、腫瘍細胞でのチャレンジ後７７日まで、マウスの生存に対するＡｇをパルスされた超活性化ＤＣを用いたあらかじめの免疫の効果に関する別の実験結果を示す。
【図３】図３は、免疫化抗原として、「なし」（黒四角）、「ＨＥＲ５００＊・ｒＧＭ−ＣＳＦ」（黒三角）、ＨＥＲ５００（黒菱形）および「ＨＥＲ５００・ｈＧＭ−ＣＳＦ」（白丸）を用いて、腫瘍細胞注入後６３日まで、マウス（１群当たり１０匹）の生存に対するＡｇをパルスされた超活性化ＤＣを用いた感染後免疫の効果に関する実験の結果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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