(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬の製造における、哺乳類細胞のＡＡＶ形質導入を増加させる量のプロテアソーム阻害剤の使用であって、該プロテアソーム阻害剤が、哺乳類細胞の膜へのウイルスの結合の後であってウイルスゲノムの発現可能な形態をもたらす第二の鎖の合成の前に、ＡＡＶ形質導入を増加させ、
ここで、該プロテアソーム阻害剤が、場合によりＮ−及び／又はＣ−末端保護基を有するジ−またはトリ−ペプチドである、上記使用。
【請求項２】
組換えＡＡＶのエンドソームプロセシングが改変される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
該プロテアソーム阻害剤が式（Ｉ）：Ｒ1 −Ａ−（Ｂ）n −Ｃ〔式中、Ｒ1 はＮ−末端アミノ酸ブロック基であり、それぞれＡおよびＢは独立してアミノ酸であり、Ｃはアミノ酸であり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており、そしてｎは０、１、２または３である〕の化合物またはその薬剤的に許容できる塩である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
Ｒ1 が（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイルである、請求項３記載の使用。
【請求項５】
Ｒ1 がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルである、請求項３記載の使用。
【請求項６】
それぞれＡおよびＢが、独立してアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンである、請求項３記載の使用。
【請求項７】
それぞれＡおよびＢが、イソロイシンである、請求項３記載の使用。
【請求項８】
末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されている、Ｃがアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンである請求項３記載の使用。
【請求項９】
Ｒ1 が（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイルまたはベンジルオキシカルボニルであり、ＡおよびＢがそれぞれイソロイシンであり、Ｃがノル−ロイシンまたはノル−バリンである請求項３記載の使用であって、末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており、そしてＮが１である上記使用。
【請求項１０】
該プロテアソーム阻害剤が式（ＩＩ）
【化１】
0004969002.tif 000023
〔式中、
Ｒ2 は、Ｎ−末端アミノ酸ブロック基であり、
Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 は、それぞれ独立して水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、そして
Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、それぞれ独立して水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである〕の化合物またはこの薬剤的に許容できる塩である、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ2 が（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
Ｒ2 がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
Ｒ3 が水素または（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１４】
Ｒ3 が２−メチルプロピルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１５】
Ｒ4 が水素または（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１６】
Ｒ4 が２−メチルプロピルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１７】
Ｒ5 が水素または（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１８】
Ｒ5 がブチルまたはプロピルである、請求項１０記載の使用。
【請求項１９】
Ｒ2 がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルであり、Ｒ3 およびＲ4 がそれぞれ２−メチルプロピルであり、Ｒ5 がブチルまたはプロピルであり、そしてＲ6 、Ｒ7 およびＲ8 が、それぞれ独立して水素である、請求項１０記載の使用。
【請求項２０】
該プロテアソーム阻害剤がユビキチンの活性化、ユビキチンキャリヤータンパク質、ユビキチンリガーゼ、およびこれらの組み合わせへのユビキチンの転移を阻害する、請求項１記載の使用。
【請求項２１】
該プロテアソーム阻害剤が式（Ｖ）
Ｒ−Ａ−Ａ1 −Ｒ1
〔式中、Ｒは、水素、アミノ酸、またはペプチドであり、ここでＮ末端アミノ酸は場合によりアセチル、アシル、トルフルオロアセチル、またはベンジルオキシカルボニルを用いてアミノ基において保護されることができ、Ａはアミノ酸または直接結合であり、Ａ1 はアミノ酸であり、そして
Ｒ1 は、ヒドロキシまたはアミノ酸であり、ここでＣ−末端アミノ酸は、場合により（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルエステルまたはアミド（例えばＣ（＝Ｏ）ＮＲ2 、ここで、それぞれのＲは独立して水素または（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキルである）を用いてカルボキシ基において保護されていてもよい〕
の化合物またはこの薬剤的に許容できる塩である、請求項１記載の使用。
【請求項２２】
該プロテアソーム阻害剤がＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ、またはこれらの組み合わせである、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
該プロテアソーム阻害剤の活性を増加させる第二の薬剤をさらに含んでなる、請求項１記載の使用。
【請求項２４】
第二の薬剤がＥＧＴＡである、請求項２３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
米国政府権利の言明
本発明は、少なくともその一部分が、アメリカ合衆国政府からの補助金（米国国立衛生研究所からの契約第ＨＬ５１８８７号）により行われた。米国政府が本発明において一定の権利を有する可能性がある。
発明の背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、多数の標的臓器および遺伝疾患に対する遺伝子治療ベクターとしてその可能性が強調されている種々の特性を有する。ｒＡＡＶベクター系は、アデノウイルスおよびレトロウイルスに対して大きい利益を提供する可能性がある。これらには、非−分裂細胞のゲノム内への組込みに対するｒＡＡＶの能力、すべてのウイルス遺伝子を欠損できることによる可能な免疫反応の欠失、およびｒＡＡＶが高力価まで濃縮できるという事実を含む。
【０００２】
アデノ随伴ウイルスタイプ−２（ＡＡＶ−２）は、嚢胞性繊維症の遺伝子治療のために非常に有望なベクターであると示唆されている(Conrad et al., 1996;Flotte et al., 1993; Halbert et al., 1997)。ラビットおよびアカゲザル(rhesus macaques) の気道へのＡＡＶベクターの生体内投与は、ウイルスＤＮＡの６カ月間までの持続という長期残存を証明した(Conrad et al., 1996; Halbert et al., 1997) 。このベクター系は種々のヒト、サル、およびネズミ細胞株内の非常に広い宿主親和性を有することが主張されている事実にもかかわらず(Lebkowski et al., 1998; Muzyczka, 1992)、ヒト気道上皮内の総合形質導入効率はかなり低いように思われる。外的刺激、例えばＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはアデノウイルス初期遺伝子産物が存在しないと(Alexander et al., 1997; Alexander et al., 1996; Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996;Halbert et al., 1997; Russel et al., 1996)、ｒＡＡＶを用いる一次細胞およびその他の非−分裂細胞の生体内形質導入は著しく非効率である。反対に、Ｓ−期において活発に分裂する細胞のｒＡＡＶ形質導入は、著しく効率的である(Russel et al., 1994) 。しかし、ｒＡＡＶは、骨格筋およびＣＮＳニューロンのin situ 形質導入において著しい効率を示し、ｒＡＡＶベクターが非−分裂細胞の一定の集団を効果的に形質導入でき、そして細胞特異性特性がウイルスプロセシングに対して大きい影響を有することを示す(Duan et al., 1998; Kaplitt et al., 1994: Xiao et al., 1996)。
【０００３】
２件の研究は、ウイルスゲノムの一本鎖から二本鎖への転換が、ＡＡＶ媒介遺伝子導入に対する律速段階であろうと示唆している(Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996) 。これらの研究は、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６が、一本鎖ＤＮＡゲノムの線型、二本鎖複製形ダイマー（Ｒｆｄ）およびモノマー（Ｒｆｍ）へのｒＡＡＶ複製の溶解期の特性的な経路を通じる転換を増加させることを示した。これらの複製形の構造は、１個の共有結合末端を有する頭−頭および尾−尾方向線型コンカテマー(concatamer)から成る(Ferrari et al., 1996; Ficheret al., 1996) 。反対に最近の研究は、頭−尾モノマーおよびコンカテマー構造を有する二本鎖環状中間体へのｒＡＡＶゲノムの転換のための別の経路を解明した(Duan et al., 1999; Duan et al., 1998; Sanlioglu et a l., 1999) 。環状ＡＡＶゲノムまたはＲｆ中間体のいずれかの形成に導く明確な経路は、種々の細胞因子により調節されるように見える。例えば、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６発現は、環状ゲノム形成を低下させ、一方アデノウイルスＥ２ａはその形成を増加させる(Duan et al., 1999) 。同様に、ＵＶ照射もＡＡＶ環状中間体形成を増加させるが、しかしＲｆ中間体は増加しない(Sanlioglu et a l., 1999) 。環状ＡＡＶ中間体が、筋肉中での長期エピソーム持続および導入遺伝子発現にに関連するという知見(Duan et al., 1998) およびＵＶ照射が環状中間体および組込みの範囲の両方を増加するという知見に基づいて、ＡＡＶ環状中間体は潜在的な相の前組込み構造であろう。
【０００４】
ヒト気道は、特別な繊毛性(ciliated)または非繊毛性上皮細胞により覆われており、これは外的環境から保護するだけでなく、気道内腔と下の粘膜下組織との間の分子の交換の制御に関係する機能も行っている。これらの細胞機能は、膜タンパク質および細胞レベルより下の細胞小器官の分布に関して高度に極性の構成により支持されている(Rodriguez-Boulan et al., 1993; Willis et al., 1996)。従来の研究は、この非対称な空間構成が、遺伝子導入の効率に対して著しい影響を有することを示唆している。例えば、頂端面上のインテグリンおよびアデノウイルス繊維受容体の欠失が、分化した繊毛性気道上皮のこのウイルス系による非効率的な感染を説明するであろう(Goldman et al., 1995; Zabner et al., 1997) 。極性化気道上皮細胞に関する最近の研究は、レトロウイルス感染性に対する同様の面依存性も明らかにし、これは部分的には側底膜に対するレトロウイルス受容体の分配により説明されるであろう(Wang et al., 1998) 。さらに、極性化気道上皮のｒＡＡＶ感染における極性の同様な知見が報告されている(Duan et al., 1998) 。これらの研究は、気道上皮の側底側からのｒＡＡＶの２００倍大きい感染性を証明する。
【０００５】
上皮細胞内への極性侵入も、種々の他のウイルスに対して周知の現象である。例えば、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、およびセムリキ森林ウイルスは、極性上皮を主として側底膜を通して形質導入する(Basak et al., 1989; Fuller et al., 1984; Rodriguez et al., 1991; Tugizov et al., 1996) 。反対に、サルウイルス４０および麻疹ウイルスは、優先的に頂端膜を介して感染する(Blau et al., 1995; Clayspri et al., 1988)。一般に、細胞膜受容体の非対称分布は、これらのウイルスにより示される感染の極性が関係すると信じられる。
【０００６】
しかし、他の律速段階がウイルス形質導入の総合効率に関係することも妥当と思われる。これらの段階は、ウイルス結合、エンドサイトーシス、エンドソームプロセシング、核輸送、脱外被、遺伝子変換、転写および翻訳を含む。これに関して、極性化ＭＤＣＫ細胞における従来の研究は、頂端面からの被覆ピットの遅い成熟を証明し、これは  頂端膜と側底膜の間のエンドサイトーシスの速度の差を示す(Naim et al., 1995) 。
【０００７】
ＡＡＶに対して、ウイルスベクター形質導入における律速段階を増強させるために、２種の方法が使用されている。これらは、細胞表面受容体(Qing et al.,1997) および／またはウイルス外被タンパク質内の受容体リガンド(Wickham etal., 1996a; Wickham et al., 1996b; Bartlett et al., 1999) の操作を含む。別の方法は、ｒＡＡＶの場合の発現可能な形への非機能性ウイルスゲノムの分子変換を増加するか(Fisher et al., 1996; Sanlioglu et al., 1999) 、または導入遺伝子発現カセットを改変して転写および翻訳効率を増加させる(Zabner et al., 1996; Xiao et al., 1998)ことにより導入遺伝子発現を増加しようと試みている。
【０００８】
嚢胞性繊維症は、白色人種で最も一般的な遺伝病であり、この疾患に対する遺伝子治療は肺気道上皮を標的とする。嚢胞性繊維症処置のための遺伝子治療ビヒクルとしてのＡＡＶの開発は、そのウイルス生物学に基づいて種々の独自の利点を有する。例えば、野生型ＡＡＶ感染は、呼吸器上皮に起きることは知られているが、しかし関連する病理は知られていない。しかし、上記のように、完全に分化した気道上皮は、ｒＡＡＶ−２だけでなく他の現在使用されているアデノウイルス、レンチウイルス、テトロウイルスおよびＡＡＶを含むウイルスベクターのすべての他のタイプの頂端面からの感染に極めて耐性である。
【０００９】
従って、要求されているのは、ｒＡＡＶ形質導入を生体内で改変、例えば増加または増強できる薬剤の同定である。同様に要求されているのは、非−分裂細胞、例えば肝臓および気道内のものにおけるｒＡＡＶ内の導入遺伝子の発現を増加または増強する薬剤の同定である。
発明の概要
本発明は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、例えば哺乳類の肺または肝細胞、または真核細胞の集団のアデノ随伴ウイルス形質導入を改変する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、細胞または細胞集団を薬剤およびウイルスと接触させることを含んでなる。次いで、ウイルス形質導入が改変されたかどうかを決定する。好ましい細胞は、哺乳類、鳥類、爬虫類、特には家畜化された哺乳類および鳥類、例えばヒト、非ヒト霊長類、畜牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ラビット、ニワトリ、およびシチメンチョウのものを含む。例えば、空気−液体界面またはヒト気管支異種移植片で増殖した極性化ヒト気道上皮細胞は、ウイルス形質導入を改変する薬剤を同定するために有用である。好ましい薬剤は、例えばウイルスエンドサイトーシスの増強、エンドソーム内のウイルス核酸またはタンパク質分解の低下、および／または核へのウイルス輸送を増加することによりウイルス形質導入を増加させるものである。従って、ウイルス形質導入を増加させる薬剤は、治療ペプチドまたはポリペプチドを導入および／または発現するためにｒＡＡＶを用いる遺伝子治療に特に有用である。
【００１０】
以下に記載するように、ウイルス結合、例えばウイルス受容体の制限された分布、および気道上皮の頂端膜におけるＡＡＶ−２のエンドサイトーシスは、この組織タイプの形質導入における主要な律速段階ではない。実際に、分化したヒト気道上皮は、ｒＡＡＶ−２を著しく効率的に頂端面から内部化(internalize) する。どちらかというば、核への内部化したウイルスのエンドソームプロセシングおよび転送(trafficking) が、気道の頂端膜からの感染に続いてＡＡＶ−２が遭遇する主要な障害である。一本鎖ＡＡＶ  ＤＮＡの環状ゲノムへの効率的な変換に導く側底側感染とは異なり、頂端側感染は、転写的に不活性な状態の細胞内一本鎖ウイルスＤＮＡの５０日にも達する持続を起こさせた。ＡＡＶ−２のエンドソームプロセシングおよび核への細胞内経路の効率を増加させるプロテアソーム阻害剤を用いて、頂端面から２００倍以上の著しく増加した形質導入が観察され、ほとんど側底面からの形質導入のものに近い。ＡＡＶキャプシドタンパク質がエンドサイトーシスの後にユビキチン化され、そして侵入するウイルスのユビキチン媒介プロテアソーム分解が、プロテアソームまたはユビキチンリガーゼ阻害剤のいずれかを用いる処理によりブロックできることも見いだされた。
【００１１】
従って、ウイルスキャプシドのユビキチン化は、一本鎖ＤＮＡゲノムを転写的に活性な状態に変換するための核および／または核プロセシングイベントへのウイルスの転送の効率を改変するために主要な障害であると考えられる。さらに重要なことは、マウス肺内のプロテアソーム阻害剤の生体内適用は、ｒＡＡＶ遺伝子導入を大きい細気管支内の上皮細胞の検出不能レベルから平均１０．４±１．６％まで上昇させた。従って、気道内の形質導入に対する主要なエンドソームプロセシング障害を回避するためのプロテアソーム阻害剤の使用は、呼吸器疾患、例えば嚢胞性繊維症の生体内ＡＡＶ媒介遺伝子治療に対して、ならびにウイルスプロセシングが律速イベントと思われる他の組織に対する臨床的に有用な戦略を提供するであろう。
【００１２】
細胞、例えばヒト細胞のｒＡＡＶによる形質導入を増加させる好ましい薬剤は、ペプチドシステインプロテアーゼ阻害剤、例えばＬＬｎＬを含む。従って、本発明は、さらに真核細胞をウイルスおよび、式（Ｉ）：Ｒ1 −Ａ−（Ｂ）n −Ｃ〔式中、Ｒ1 はＮ−末端アミノ酸ブロック基であり、それぞれＡおよびＢは独立してアミノ酸であり、Ｃはアミノ酸であり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており、そしてｎは０、１、２または３である〕の化合物またはその薬剤的に許容できる塩を含んでなる薬剤と接触させる方法を提供する。
【００１３】
【化４】
0004969002.tif 000002
【００１４】
本発明の別の好ましい薬剤は、式（ＩＩ）
〔式中、
Ｒ2 は、Ｎ−末端アミノ酸ブロック基であり、
Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 が、それぞれ独立して水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、そして
Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 が、それぞれ独立して水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである〕の化合物またはこの薬剤的に許容できるこの塩である。
【００１５】
本発明の方法に有用な他の好ましい薬剤は、式（ＩＩＩ）
【００１６】
【化５】
0004969002.tif 000003
【００１７】
〔式中、
Ｒ1 は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチルまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲで置換されてもよく、ここで、それぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、
Ｒ2 は、（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり、
Ｒ3 は、Ｈ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシまたは（Ｃ3 〜Ｃ8 ）シクロアルキルであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＳＲ、またはＮＲＲで置換されてもよく、ここで、それぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、
Ｒ4 は、Ｈ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシまたは（Ｃ3 〜Ｃ8 ）シクロアルキルであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＳＲ、またはＮＲＲで置換されてもよく、ここで、それぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、
Ｒ5 は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ2 、またはトリフルオロメチルであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲで置換されてもよく、ここでそれぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、そして
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ（式中、ＲはＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである）である〕
の化合物またはこの薬剤的に許容できる塩である。
【００１８】
好ましくは、Ｒ1 がＯＨである。Ｒ2 が（＝Ｏ）であり、Ｒ3 がＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであっても好ましく、そして最も好ましくはＲ3 がメチルである。その他の好ましい態様は、Ｒ4 がＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであるものを含み、そしてさらに好ましくはＲ4 がＨであり、Ｒ5 がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、またはＯＨであり、そしてさらに好ましくはＲ5 がＯＨである。式（ＩＩＩ）の化合物は、ＸがＯまたはＳ、好ましくはＯであるものを含み、ここで両方の-----が単結合であるか、一方の-----が二重結合であるか、または両方の-----が二重結合である。さらに好ましい態様では、Ｒ1 がＯＨであり、Ｒ2 が（＝Ｏ）であり、Ｒ3 がメチルであり、Ｒ4がＨであり、Ｒ5 がＯＨであり、ＸがＯであり、そして両方の-----が二重結合である。
【００１９】
さらに本発明の方法に有用な好ましい薬剤は、式（ＩＩＩ）
【００２０】
【化６】
0004969002.tif 000004
【００２１】
〔式中、Ｒ1 はハロゲン、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチルまたはＯＨである〕の化合物である。好ましくはＲ1 がＯＨである。Ｒ2 が（＝Ｏ）であり、Ｒ3 がＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであっても好ましく、そして最も好ましくはＲ3 がメチルである。その他の好ましい態様は、Ｒ4 がＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであるものを含み、そしてさらに好ましくはＲ4 がＨであり、Ｒ5 がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、またはＯＨであり、さらに好ましくはＲ5 がＯＨである。式（ＩＶ）の化合物は、ＸがＯまたはＳ、好ましくはＯであるものを含み、ここで両方の-----が単結合であるか、一方の-----）が二重結合であるか、または両方の-----が二重結合である。さらに好ましい態様では、Ｒ1 がＯＨであり、Ｒ2 が（＝Ｏ）であり、Ｒ3 がメチルであり、Ｒ4 がＨであり、Ｒ5 がＯＨであり、ＸがＯであり、そして両方の-----が二重結合である。
【００２２】
本発明の方法に有用な他の好ましい薬剤は、ユビキチンの活性化、ユビキチンキャリヤータンパク質へのユビキチンの転移、ユビキチンリガーゼ、またはこれらの組み合わせを阻害する薬剤を含む好ましいユビキチンリガーゼ阻害剤は、式（ＩＶ）
Ｒ−Ａ−Ａ1 −Ｒ1
〔式中、Ｒは、水素、アミノ酸、またはペプチドであり、ここでＮ末端アミノ酸は場合によりアセチル、アシル、トルフルオロアセチル、またはベンジルオキシカルボニルを用いてアミノ基において保護されることができ、
Ａはアミノ酸または直接結合であり、
Ａ1 はアミノ酸であり、そして
Ｒ1 は、ヒドロキシまたはアミノ酸であり、ここでＣ−末端アミノ酸は、場合により（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルエステルまたはアミド（例えばＣ（＝Ｏ）ＮＲ2 （ここで、それぞれのＲは独立して水素または（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキルである）を用いてカルボキシ基において保護されている〕
の化合物またはこの薬剤的に許容できる塩を含む．
Ｒの特定の値は水素である。
【００２３】
Ａの特定の値はアミノ酸である。Ａの他の特定の値はＩｌｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓである。Ａの他の特定の値はＬｅｕまたはＨｉｓである。
【００２４】
Ａ1 の特定の値はＡｌａまたはＧｌｙである。Ａ1 の他の特定の値はＡｌａである。
【００２５】
Ｒ1 の特定の値はヒドロキシである。
【００２６】
特定すると、ペプチドはジペプチド（すなわちアミノ酸２個を含んでなることができる）であることができる。
【００２７】
特定すると、ペプチドはＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＨであることができる。さらに特定すると、ペプチドはＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨまたはＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨであることができる。
【００２８】
さらに、本明細書中に記載のように、ウイルスのエンドソームプロセシングを阻害する薬剤の活性は、薬剤、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの添加により増加してもよく、これらはエンドソームプロセシングに関連する経路において分子を改変するものであって、例えばカルシウムキレート化剤または細胞内カルシウムレベルの調節剤のような薬剤である。従って、本発明は、１）エンドソームプロセシングの阻害剤、および２）阻害剤の活性を増加する薬剤を含んでなる組成物またはキットも提供する。阻害剤、またはこれらの組み合わせは、本発明の方法で使用してもよく、または阻害剤の活性を増加させる薬剤と一緒に使用してもよい。
【００２９】
従って、本発明は、真核細胞または細胞集団のアデノ随伴ウイルス形質導入を改変するための方法も提供する、この方法は、細胞を、ウイルス形質導入を改変するために有効な一定量の本発明の薬剤および一定量のウイルスと接触することを含んでなる。薬剤は、細胞とウイルスの接触の前または細胞とウイルスの接触の後に、ウイルスとを同時に細胞に接触させてもよい。１種または複数の薬剤および／またはウイルスは、所望の効果、すなわちｒＡＡＶ形質導入を増加させるために、それぞれ一回投与、または反復投与してもよい。アデノ随伴ウイルスは、広い宿主範囲（肺発現に対する）を有し、そして筋肉内で持続することが証明されているので、ｒＡＡＶは、あらゆる動物、および特には哺乳類および鳥類、魚類、および爬虫類、ことには家畜化された哺乳類、鳥類、例えば畜牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ、およびシチメンチョウ内での遺伝子発現のためにに使用してもよい。ヒトおよび家畜の両者への使用が特に好ましい。
【００３０】
発現される遺伝子は、あらゆる所望の制御要素（例えばプロモーター、オペレーター）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、または転写がある種のＲＮＡ含有分子（例えば転写制御要素、＋ＲＮＡ、またはアンチセンス分子）のすべてまたは一部分を産生する非−コーディングＤＮＡ断片のいずれであることもできる。
【００３１】
ベクターが有用な治療または予防治療は、血液疾患（例えば鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、およびファンコーニ貧血）、神経疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病、および骨格筋、心筋および平滑菌に関係する筋肉疾患、ならびに肺の疾患、例えば嚢胞性繊維症および喘息を含む。特には、本発明のベクターが有用な治療遺伝子は、β−グロブリン遺伝子、γ−グロブリン遺伝子、第８因子遺伝子、第９因子遺伝子、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス受容体遺伝子（ＣＦＴＲ）、ファンコーニ貧血補体グループ、リボザイムをコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（パーキンソン病）、グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ゴーシェ病）、アリールスルファターゼａ遺伝子（異染性白質ジストロフィー）または他のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含む。本発明の範囲内には、組換えアデノ随伴ウイルスベクター内の１個またはそれ以上のオープンリーディングフレームも包含し、すなわち複数の遺伝子が一個のベクターに存在してもよい。さらに、環状中間体として、コンカテマーであってもよく、そのコンカテマーのそれぞれのモノマーは異なる遺伝子を含んでなってもよい。
【００３２】
組換えアデノ随伴ウイルスの環状化中間体は、Ｈｅｌａ細胞、繊維芽細胞および筋肉細胞に連結した配列にエピソーム持続性を与える。従って、組換えアデノ随伴ウイルスの生体内での持続性は、上昇したエピソーム安定性を有する組込み前中間体を表すエピソーム環状化ゲノムを通じて起きることができる。従って、組換えアデノ随伴ウイルスは、アデノ随伴ウイルスの環状中間体の１種またはそれ以上の最初のＤＮＡセグメント、すなわちその生物的活性セグメントまたはその変種を含んでなるベクターから好ましくは調製され、そのＤＮＡセグメントは宿主細胞内のベクターのエピソーム的安定性または持続性の増加を与え、そして第二ＤＮＡセグメントは遺伝子を含んでなる。好ましくは第二ＤＮＡセグメントは、治療的に有効なポリペプチドをコードする。
【００３３】
［発明の詳細な説明］
定義
本明細書中に使用する「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるかまたはこれと会合する巨大分子または巨大分子の会合物を呼び、そしてこれは生体内および生体外での細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用できる。例示としてのベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよびその他の遺伝子送達媒体を含む。送達されるポリヌクレオチド、場合により「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と呼ばれるものは、遺伝子治療に重要なコーディング配列（例えば治療的に重要なタンパク質をコードする遺伝子）および／または選択可能または検出可能な標識を含んでなってもよい。
【００３４】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスであり、そしてウイルス自体またはその誘導体を呼ぶために使用してもよい。この用語は、すべてのサブタイプおよび天然に存在の形および組換え形の両方を含み、除外を要求される場合を除く。略字「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを呼び、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶ」ベクター）とも呼ばれる。
【００３５】
本明細書中に使用する「形質導入(transduction)」または「形質導入(transducing) 」は、外在ポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子を宿主細胞内へ導入してポリヌクレオチド、例えば細胞内の導入遺伝子発現に導く過程を呼ぶ用語である。この過程は、１）細胞膜へのウイルスの結合、２）エンドサイトーシス、３）エンドソームからの脱出および核への転送、４）ウイルス粒子の外被を外し、環状中間体を含む発現可能な二本鎖形を形成するための第二のＤＮＡ鎖の合成、および５）宿主ゲノム内への組込みを含み、例えば本発明の薬剤によるこれらのいずれか、またはこれらまたはこれらの組み合わせの改変は、宿主細胞または細胞集団内に導入されたポリヌクレオチドの改変された発現または持続をもたらす。ｒＡＡＶを介して導入されたポリヌクレオチドの改変された発現または持続は、タンパク質、発現、およびＤＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼーションを含み、これらに限定されない当該技術分野では周知の方法により測定できる。本発明の薬剤は、好ましくは、ウイルスエンドサイトーシス、エンドソームからの脱出および核への転送、および／または核内でのウイルス粒子の脱外被を増加し、導入されたポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子の発現を生体外でも生体内でも改変する。外因性ポリヌクレオチドの導入のために使用される方法は、周知の技術、例えばトランスフェクション、リポフェクション、ウイルス感染、形質転換、および電気さく孔法、ならびに非−ウイルス遺伝子送達形質技術を含む。導入されたポリヌクレオチドは、安定または一時的に宿主細胞内に維持されてもよい。安定な維持は、代表的には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞と許容性の複製始点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えばプラスミド）または核またはミトコンドリア染色体内に組み込むことを必要とする。
【００３６】
「遺伝子送達」は、遺伝子導入のために外在ポリヌクレオチドを細胞内に導入することを呼び、そしてターゲティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含してもよい。
【００３７】
「遺伝子導入」は、外在ポリヌクレオチドの細胞内への導入を呼び、これはターゲティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含してもよいが、しかしその後の遺伝子の発現とは異なり、これを含まない。
【００３８】
「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子転写、翻訳、および翻訳後の装飾の過程を呼ぶ。
【００３９】
「検出可能な標識(marker)遺伝子」は、遺伝子を有する細胞を特異的に検出させる遺伝子である（例えば標識遺伝子を持っていない細胞から区別する）。多様なこのような遺伝子が当該技術分野では公知である。
【００４０】
「選択可能な標識遺伝子」は、相当する選択剤の存在において、遺伝子を有する細胞に特異的に存在または不在を選択させる遺伝子である。例としては、抗生物質耐性遺伝子は、相当する抗生物質の存在において、宿主細胞を陽性に選択させるための陽性選択可能標識遺伝子として使用できる。種々の陽性および陰性の選択可能標識が当該技術分野では公知であり、その一部は以下に記載する。
【００４１】
本明細書中に使用する「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわちＡＡＶに非相同のポリヌクレオチド）を含んでなるＡＡＶベクターを呼び、代表的には、細胞の遺伝的形質転換のために重要な配列である。本発明の好ましいベクター構築物中では、非相同ポリヌクレオチドは、少なくとも１個、好ましくは２個のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が近接している。用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を含む。
【００４２】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１個のＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは野生型ＡＡＶのすべてのキャプシドタンパク質）およびキャプシドに入ったポリヌクレオチドから成るウイルス粒子を呼ぶ。粒子が非相同ポリヌクレオチド（すなわち野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば哺乳類細胞に送達されるべき導入遺伝子）を含んでなる場合には、これは代表的には「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。
【００４３】
ＡＡＶに対する「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）を哺乳類細胞により複製およびパッケージングさせるウイルスを呼ぶ。ＡＡＶに対して種々のこのようなヘルパーウイルスが当該技術分野では公知であり、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス、例えばワクシニアが含まれる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルスタイプ５が最も一般的に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類起源の多数のアデノウイルスが既知であり、そして寄託機関、例えばＡＴＣＣから入手できる。ヘルペスファミリーのウイルスは、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バー−ウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含み、これらもＡＴＣＣなどの寄託機関から入手できる。
【００４４】
「感染性」ウイルスまたウイルス粒子は、ウイルス粒子が栄養性である細胞内に送達できるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。この用語は、ウイルスのいかなる複製能力を必ずしも意味しない。
【００４５】
「複製可能」ウイルス（例えば複製可能ＡＡＶ、ときには「ＲＣＡ」と省略される）は、感染性で、そして感染した細胞内で複製可能な（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）表現型的に野生型のウイルスを呼ぶ。ＡＡＶの場合に、複製可能性は、一般に機能性ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。本明細書中に記載する好ましいｒＡＡＶベクターは、１個またはそれ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠失により哺乳類細胞（特にはヒト細胞）中で複製不可能である。好ましくは、このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と侵入したｒＡＡＶベクターとの間の組換えによりＲＣＡが産生される可能性を最小化するために、あらゆるＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠失している。本明細書中に記載する好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、あったとしても少数のＲＣＡを含むものである（好ましくは１０2 ｒＡＡＶ粒子あたりに約１ＲＣＡ以下、より好ましくは１０4 ｒＡＡＶ粒子あたりに約１ＲＣＡ以下、さらに好ましくは１０8 ｒＡＡＶ粒子あたりに約１ＲＣＡ以下、それ以上に好ましくは１０12ｒＡＡＶ粒子あたりに約１ＲＣＡ以下、最も好ましくはＲＣＡが含まれない）。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形を呼び、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化またはキャップしたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでなってもよく、そして非−ヌクレオチド成分で中断されていてもよい。存在する場合に、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマー構築の前または後に与えられてもよい。本明細書中有に使用する用語ポリヌクレオチドは、二本鎖および一本鎖分子に互換可能に使用される。特に規定または要求しない限り、ポリヌクレオチドであると記載された本明細書中に本発明のあらゆる態様は、二本鎖形および二本鎖形を形成していることが既知または予想される２本の相補一本鎖形それぞれの両方を包含する。
【００４７】
本明細書中に使用する「転写調節配列」または「ＴＲＳ」は、遺伝子またはこれが操作的に連結するコーディング配列の転写を制御するゲノム領域を呼ぶ。本発明内で使用する転写調節配列は、一般に少なくとも１個の転写プロモーターを含み、そして１個またはそれ以上の転写のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含んでもよい。
【００４８】
「操作的に連結」は、このように記載された成分が協同した様式で機能できるような関係にある２個またはそれ以上の成分の配置を呼ぶ。例としては、転写調節配列またはプロモーターは、ＴＲＳまたプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合に、コーディング配列に操作的に連結している。操作的に連結したＴＲＳは、一般にコーディング配列とシスで結合するが、しかしかならずしも直接これに隣接する必要はない。
【００４９】
「非相同」は、比較される全体の他の部分と遺伝子型的に異なる部分から誘導されることを意味する。例えば、異なる細胞タイプ内に遺伝子操作技術により導入されたポリヌクレオチドは、非相同ポリヌクレオチドである（そして、発現された場合には、非相同ポリペプチドをコードできる）。同様に、本来のコーディング配列から取り去られそして異なるコーディング配列に操作的に連結されたＴＲＳまたはプロモーターは、非相同ＴＲＳまたはプロモーターである。
【００５０】
「レプリコン」は、ポリヌクレオチドの複製を適当な宿主細胞内で可能とする機転または複製を含んでなるポリヌクレオチドを呼ぶ。レプリコンの例は、エピソーム（プラスミドを含む）、ならびに染色体（例えば核またはミトコンドリア染色体）を含む。細胞内へのポリヌクレオチドの「安定な組込み」は、細胞内で安定に維持されるようになるレプリコン内へポリヌクレオチドが組み込まれることを意味する。プラスミドのようなエピソームは、時には数世代も維持できるが、エピソーム的に保持される遺伝物質は、一般に染色体に組み込まれた物質よりも欠失する可能性が高い。しかし、ポリヌクレオチドの維持は、しばしばポリヌクレオチド内またはこれに隣接する選択可能な標識の取り込みにより行うことができ、次いでポリヌクレオチドを有する細胞を選択的圧力下で維持する。ある場合には、配列が染色体内に組み込まれない限り、これらは有効に安定的に維持できない。従って、選択可能な標識を含んでなる配列の保持のための選択は、その中で標識が染色体内に安定に組み込まれた細胞の選択をもたらすことができる。抗生物質耐性遺伝子は、この場合に便利に利用でき、これは当該技術分野では周知である。代表的には、安定に組み込まれたポリヌクレオチドは、平均して少なくとも約２０世代、好ましくは少なくとも約１００世代、さらに好ましくは永久に維持されるように予想される。真核生物染色体のクロマチン構造は、組み込まれたポリヌクレオチドの発現レベルに影響できる。エピソーム上に保持された遺伝子を有すると、特定の遺伝子の複数の安定維持コピーを有するよう希望する場合に特に有用であることができる。本発明の範囲内で特に望ましい性質を有する安定細胞株の選択は、以下に記載して説明する。
【００５１】
本明細書中に使用する「パッケージング」は、ウイルスベクター、特にはＡＡＶベクターの構築およびキャプシド化をもたらす一連の細胞スケール以下のイベントを呼ぶ。従って、適当なベクターが適当な条件下でパッケージング細胞株内に導入される場合に、これはウイルス粒子内に集積できる。ウイルスベクター、特にはＡＡＶベクターのパッケージングを伴う機能は、本明細書中および当該技術分野に記載されている。
【００５２】
「ターミネーター」は、リード・スルー転写が低減または防止するようになるポリヌクレオチド配列を呼ぶ（すなわち、これはターミネーターの一方側からの転写のターミネーターの他方側への継続を現象または防止する）。転写が中断される程度は、代表的には、ターミネーター配列の塩基配列および／または長さの関数である。特に、多数の分子生物学的系で周知のように、特定のＤＮＡ配列、一般に「転写終止配列」と呼ばれるものは、ＲＮＡポリメラーゼによるリード・スルー・転写を中断する特定の配列であり、ＲＮＡポリメラーゼ分子を転写されているＤＮＡから停止および／または外すことによると推測される。このような配列特異性ターミネーターの代表的な例は、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えばＳＶ４０ポリＡを含む。このような配列特異性ターミネーターに加えてまたはこれに代えて、プロモーターとコーディング領域との間への比較的長いＤＮＡ配列の挿入もコーディング領域の転写を中断する傾向があり、これは一般に中間挿入配列の長さに比例する。この効果は、ＲＮＡポリメラーゼ分子が常に転写中のＤＮＡ分子から離れる傾向があるために起きると推測され、そしてコーディング領域に到着する前に通過しなければならない配列の長さが長くなると、一般に、コーディング領域の転写が完了または場合によれば開始する前でも離脱が起きる可能性が高くなる。従って、ターミネーターは、転写を一方向のみから（「一方向ターミネーター」）または両方向から（「二方向ターミネーター」）防止してもよく、そして配列特異性終止配列または配列非特異性終止配列または両方を含んでなってもよい。種々のこのようなターミネーター配列が当該技術分野では公知であり、そして本発明の範囲内でのこのような配列の例示的な使用は、以下に記載される。
【００５３】
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞カルチャー」および「パッケージング細胞株」およびその他のこのような用語は、本発明に有用な高級真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞を表す。これらの細胞は、組換えベクター、ウイルスまたはその他の転移ポリヌクレオチドのレシピエントとして使用でき、そして形質導入された最初の細胞の後代を含む。単一細胞の後代は、最初の親細胞と完全に一致（形態的またはゲノム集合内で）する必要はない。
【００５４】
「治療遺伝子」「標的ポリヌクレオチド」「導入遺伝子」、「関係する遺伝子」などは、一般にベクターを用いて導入される遺伝子または複数の遺伝子を呼ぶ。代表的には、本発明の範囲内で、このような遺伝子はｒＡＡＶベクター内に位置する（このベクターは逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域に近接し、従って複製およびｒＡＡＶ粒子内にキャプシド化できる）。標的ポリヌクレオチドは、本発明内で、多数の異なる用途のためのｒＡＡＶベクターの作製のために使用できる。このようなポリヌクレオチドは、下記を含み、これらの限定はされない。（ｉ）構造タンパク質または酵素の欠失、欠損または最適状態に及ばないレベルにより起きる欠陥を救済するための遺伝子治療の他の形で有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）アンチセンス分子内に転写されるポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）転写または翻訳因子を結合するデコイ内に転写されるポリヌクレオチド、（ｉｖ）細胞調節体、例えばサイトカインをコードするポリヌクレオチド、（ｖ）特定の薬剤に対して可能なレシピエント細胞を産生できるポリヌクレオチド、例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、および（ｖｉ）ガン治療のためのポリヌクレオチド、例えば種々のガン治療のためのＥ１Ａガンサプレッサー遺伝子またはｐ５３ガンサプレッサー遺伝子。レシピエント宿主細胞内の導入遺伝子の発現を起こすために、これは好ましくはプロモーターそれ自体または非相同的プロモーターに操作的に連結される。多数の適合するプロモーターが当該技術分野では公知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベルに依存し、構成的発現、誘導的発現、細胞特異性または組織特異性発現などを希望するかどうかによる。ｒＡＡＶベクターは、選択可能な標識を含んでもよい。
【００５５】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコード可能な少なくとも１個のオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを呼ぶ。
【００５６】
ポリヌクレオチドに適用された場合の「組換え」は、ポリヌクレオチドがクローニング、制限および／または結合ステップ、および天然に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の操作の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。この用語は、それぞれ最初のポリヌクレオチド構築物の複製物および最初のウイルス構築物の後代を含む。
【００５７】
「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含むポリヌクレオチドの機能性調節に寄与する分子の相互作用に含まれるヌクレオチド配列である。調節は、過程の頻度、速度、または特異性に影響してもよく、そして本質的に増強または阻害性であってもよい。当該技術分野で公知の制御要素は、例えば転写調節配列、例えばプロモーターまたはエンハンサーである。プロモーターは、一定の条件下でＲＮＡポリメラーゼを結合しそして通常はプロモーターから下流（３’方向）に位置するコーディング領域の転写を開始する能力があるＤＮＡ領域である。プロモーターはＡＡＶプロモーター、例えばＰ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶ  ＩＴＲプロモーター、ならびに非相同プロモーターを含む。
【００５８】
「発現ベクター」は、関係するポリペプチドをコードし、そして意図する標的細胞内にタンパク質の発現を起こすために使用される領域を含んでなるベクターである。発現ベクターは、標的内のタンパク質の促進を容易にするためにコード化領域に操作的に連結する制御要素も含んでなる。発現のために操作的に連結する制御要素と遺伝子または複数の遺伝子との組み合わせは、時に「発現カセット」と呼ばれ、その多数が既知であり、そして当該技術分野で利用できるかまたは当該技術分野で利用できる成分から容易に構築できる。
【００５９】
「遺伝的改変」は、遺伝要素が有糸分裂または減数分裂以外により細胞内に導入される過程を呼ぶ。要素は細胞に非相同性であってもよく、または細胞内にすでに存在する要素の追加のコピーまたは改善されたものであってもよい。遺伝的改変は、例えば、組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドを用いて当該技術分野では公知のあらゆる過程、例えば電気さく孔、リン酸カルシウム沈降、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触を通じて細胞をトランスフェクションして行ってもよい。遺伝的改変は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入または感染により行ってもよい。好ましくは、遺伝要素は、細胞内の染色体またはミニクロモソーム内に導入される。しかし、細胞およびその後代の表現型および／または遺伝型を変化させるあらゆる改変は、この用語内に含まれる。
【００６０】
細胞は、生体外で細胞の長期間の培養の間にその機能を行うために配列が利用できる場合には、遺伝子配列を「安定して」改変、形質導入または形質転換されるといわれる。好ましい例では、このような細胞は、遺伝子改変が改変された細胞の後代によっても遺伝可能なように導入されると「遺伝的」に改変される。
【００６１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書内であらゆる長さのアミノ酸のポリマーを互換可能に呼ぶように用いられる。この用語は、変性、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、脂質化または標識化合物と複合されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば「ＣＦＴＲ」および類似のポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物の範囲内で考察する場合には、それぞれ不変のポリペプチド、またはそのあらゆる断片または遺伝子的に操作された誘導体であって、当初のタンパク質の所望の生化学的機能を保持しているものを呼ぶ。同様に、ＣＦＴＲ、およびその他の遺伝子治療に使用するためのこのような遺伝子（代表的には、レシピエント細胞への送達される「導入遺伝子」と呼ばれる）への言及は、所望の生化学的機能を有する不変のポリペプチドまたはあらゆる断片または遺伝子的に操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６２】
「単離された」プラスミド、ウイルスまたはその他の物質は、物質または類似の物質が天然に存在または最初に調製された形で存在するであろう他の成分の少なくとも一部が存在しない物質の調製を呼ぶ。従って、例えば、単離された物質は、起源の混合物からそれを濃縮技術を用いて調製されてもよい。濃縮は、絶対的基準、例えば溶液の体積あたりの重量で測定でき、またはこれは期限混合物中に存在する第二のあらゆる介在物質に関連して測定できる。本発明の態様の濃縮が上昇すると好ましさも上昇する。従って、例えば、２倍の濃縮は好ましく、１０倍の濃縮は一層好ましく、１００倍の濃縮はさらに好ましく、１０００倍の濃縮はそれ以上さらに好ましい。
【００６３】
ＡＡＶの調製は、感染性ＡＡＶ粒子と感染性ヘルパーウイルスとの比が少なくとも１０2 ：１、好ましくは少なくとも１０4 ：１、さらに好ましくは少なくとも１０6 ：１、さらに好ましくは少なくとも１０8 ：１であるとヘルパーウイルスを「本質的に含まない」を言われる。調製物は、好ましくは相当する量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形で存在する場合に、このようなヘルパーウイルスレベルの結果として存在するタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質汚染物は、一般にＳＤＳゲル上のクーマシー染色バンドの存在として観察できる（例えばＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に相当するものとは異なるバンドの出現）。
【００６４】
ウイルス産生、複製またはパッケージングの記載に使用される場合の「効率」は、方法の有用な性質を呼ぶ。特には、細胞あたりに産生されたウイルス粒子の増殖速度および数である。「高効率」産生は、細胞あたりに少なくとも１００ウイルス粒子の産生、好ましくは少なくとも約１０，０００個およびさらに好ましくは少なくとも約１００，０００個の粒子が、規定の生育期間中で産生されることを示す。
【００６５】
本発明に従って処理される「個体」または「患者」は、脊椎動物、特には哺乳類の構成員を呼び、そして家畜動物、スポーツ用動物、およびヒトを含む霊長類を呼び、これらには限定されない。
【００６６】
個体または細胞の「処理」は、処理を開始した時点での個体または細胞の本来の経過を改変、例えば個体内の予防、治療またはその他の有益な効果を引き出すための試みにおける介入のあらゆる形式である。例えば個体の処理は、あらゆる病理学的状態、遺伝的または誘発的遺伝子欠失、ウイルス、細菌または寄生生物の感染、新生物または形成不全性状態、または免疫系機能不全例えば自己免疫または免疫抑制を含む（これらに限定はされない）状態により起きた病理を低下または制限するために採用しもよい。処理は、組成物、例えば薬剤組成物の投与、および組成物で処理された適合する細胞の投与を含む（これらに限定はされない）。処理は、予防的にも治療的にも行ってもよい。すなわち、病理学的イベントの開始または病因的薬剤への接触の前またはその後である。
【００６７】
本発明の実施は、別途断らない限り、分子生物学、ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用の技術を用い、これらは当該技術分野の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば下記を参照のこと。
【００６８】
【表１】
0004969002.tif 000005
【００６９】
１．ｒＡＡＶベクター
組換えＡＡＶベクターは、ヒト遺伝子治療、特に疾患、例えば嚢胞性繊維症および鎌状細胞貧血に対して可能な強力な方法である。遺伝子治療の方法において他の方法に対するｒＡＡＶベクターの主要な利点は、これが一般に宿主細胞内に安定に組み込まれるようになるために標的細胞の継続した複製を要求しないことにある。
【００７０】
ｒＡＡＶベクターおよび／またはウイルスは１種またはそれ以上の検出可能標識を含んでもよい。種々のこのような標識は公知であり、例示として、細菌性β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスホターゼ（ＡＰ）遺伝子および生体外および生体内の両方でのレポーター分子として使用されている種々の細胞表面標識をコードする遺伝子を含む。ｒＡＡＶベクターおよび／またはウイルスは、１個またはそれ以上の選択可能な標識を含んでもよい。
【００７１】
組換えＡＡＶベクターおよび／またはウイルスは、タンパク質をコードしないポリヌクレオチド、例えば二倍体を形成して正常ｍＲＮＡの翻訳を遮断するために使用できるアンチセンスｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの補体）をコードするポリヌクレオチドおよびリボザイムをコードするポリヌクレオチド（ＲＮＡ触媒）を含むポリヌクレオチドを含んでなることもできる。
ＩＩ．ＡＡＶベクターの選択および調製
種々の血清型は遺伝子レベルでも機能的および構造的に関連しているので、あらゆる血清型のアデノ随伴ウイルスが遺伝レベルでもｒＡＡＶの調製に使用できる（例えばBlacklow, Parvoviruses and Human Disease, J.R. Pattison ed. (1988), pp165-174;およびRose, Comprehensive Virology, 3,1, 1974 参照）。すべてのＡＡＶ血清型は、相同性ｒｅｐ遺伝子により媒介される同様の複製性を明らかに示し、そしてすべてが一般的にＡＡＶ２で発現されるものと同様の３種の関連キャプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、さらに、ゲノムの長さに沿った血清型の間の広範な交差ハイブリダイゼーション、およびＩＴＲに相当する末端における類似した自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析により示唆される。同様の感染パターンも、それぞれの血清型内の複製機能は、同様の調節制御下にあることを示唆する。種々のＡＡＶ血清型の中で、ＡＡＶ２が最も一般的に使用される。
【００７２】
本発明のＡＡＶベクターは、代表的にはＡＡＶに非相同性のポリヌクレオチドを含んでなる。ポリヌクレオチドは、遺伝子治療の範囲内で標的細胞に機能、例えばある種の表現型の発現の上昇および下降調節を提供する能力のために代表的には関連がある。このような非相同性ポリヌクレオチドまたは「導入遺伝子」は、一般に所望の機能またはコード化遺伝子を提供するために十分な長さである。
【００７３】
非相同性ポリヌクレオチドの転写が意図する標的細胞内に所望される場合には、例えば標的細胞内の転写の所望のレベルおよび／または特異性に関連して、それ自体または非相同性プロモーターに操作的に連結していてもよく、これは当該技術分野では公知である。種々のプロモーターおよびエンハンサーがこの目的に適合する。構成的プロモーターは、遺伝子転写の継続するレベルを提供し、そして治療的ポリヌクレオチドが継続ベースで発現されることが望まれる場合には好ましい。誘導可能なプロモーターは、一般に、誘発要因が存在しないと低い活性を示し、そして誘導要因が存在すると上昇制御される。一定の時点または一定の場所でのみの発現が望まれる場合、または誘発剤を用いる発現レベルの滴定が望まれる場合には、これらが好ましいであろう。プロモーターおよびエンハンサーは、組織特異性であってもよい。すなわち、これらの活性は一定の細胞タイプ内でのみ発現し、これは遺伝子調節要素がこれらの細胞内のみで見いだされると推測される。
【００７４】
プロモーターの例示的な例は、サルウイルス４０からのＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルスポリヘドロンエンハンサー／プロモーター要素、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの極初期プロモーターおよびＬＴＲ要素を含む種々のレトロウイルスプロモーターである。誘導可能プロモーターは、重金属イオン誘導可能プロモーター（例えばマウス乳ガンウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーター）、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのプロモーターを含む。例示として、組織特異性プロモーターの例は、種々のサーファクチン(surfactin) プロモーター（肺内での発現のため）、ミオシンプロモーター（例えば筋肉内）、およびアルブミンプロモーター（肝臓内発現のため）を含む。各種の他のプロモーターが既知であり、そして一般に当該技術分野で既知で入手可能であり、そしてこのようなプロモーターの多数の配列が配列データベース、例えばジーンバンク・データベース(GeneBank database) から利用できる。
【００７５】
意図する標的細胞内で翻訳を希望する場合には、非相同ポリヌクレオチドは、好ましくは翻訳を促進する制御要素（例えばリボソーム結合部位すなわち「ＲＢＳ」およびポリアデニル化シグナル）も含んでなる。従って、非相同ポリヌクレオチドは、一般に、適切なプロモーターに操作的に連結する少なくとも１個のコーディング領域を含んでなり、そして例えば、操作的に連結するエンハンサー、リボソーム結合部位およびポリ−Ａシグナルも含んでなってもよい。非相同性ポリヌクレオチドは、一個のコード化領域、または１個を越えるコード化領域を同じかまたは異なるプロモーターの制御下で含んでなってもよい。制御要素およびコード化領域の組み合わせを含む単位全体は、しばしば発現カセットと呼ばれる。
【００７６】
非相同性ポリヌクレオチドは、組換え技術によりＡＡＶゲノムコーディング領域内または好ましくはその代わり（すなわちＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）に組み込まれるが、しかし、一般に両側でＡＡＶ逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）がどちらかの側で近接している。これは、ＩＴＲがコーディング配列から上流側および下流側の両方に現れ、いずれも直接近位にあり、好ましくは（必ずしも必要ではないが）複製−可能なＡＡＶゲノムを再生するかもしれない組換えの可能性を低下させるためにＡＡＶ起源のいかなる介在配列もないことを意味する。しかし、単独のＩＴＲでも、２個のＩＴＲを含んでなる配置と通常は関連する機能を実行するために十分であろうし（例えばＷＯ９４／１３７８８参照）、従ってＩＴＲ１個のみを有するベクター構築物は、本発明のパッケージングおよび調製方法と関連して使用できる。
【００７７】
ｒｅｐに対する本来のプロモーターは自己制御性であり、そして産生されるＡＶの量を制限できる。ｒｅｐ遺伝子も、ｒｅｐがベクター構築物の一部分として提供されてもまたは別々のいずれかであっても、非相同プロモーターに操作的に連結できる。ｒｅｐ遺伝子発現により強くは下降制御されないあらゆる非相同プロモーターが適合する。しかし、ｒｅｐ遺伝子の構成的発現が宿主細胞に負の影響を有するために、誘導可能なプロモーターが好ましい。各種の誘導可能なプロモーターが当該技術分野では既知であり、例示として、重金属イオン誘導可能プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、ステロイドホルモン誘導可能プロモーター（例えばＭＭＴＶプロモーターまたは成長ホルモンプロモーター）、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのプロモーターが含まれる。誘導可能プロモーターの特に好ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを補足するために使用されるヘルパーウイルスにより誘導されるものである。多数のヘルパーウイルス誘導可能プロモーターが記述されており、これには、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヘルペスウイルスタンパク質、例えばＶＰ１６または１ＣＰ４により誘導可能なヘルペスウイルスプロモーター、ならびにワクシニアまたはポックスウイルス誘導可能プロモーターを含む。
【００７８】
ヘルパーウイルス誘導可能プロモーターの同定および試験のための方法は、記載されている（例えばＷＯ９６／１７９４７号参照）。従って、候補プロモーターがヘルパーウイルス誘導可能であるかどうかおよびこれらが高効率パッケージング細胞の産生に有用であるかどうかを決定する方法は当該技術分野で公知である。要約すると、一つのこのような方法は、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターを推定ヘルパーウイルス誘導可能プロモーターと置換することを含む（当該技術分野で既知であるかまたは周知の技術、例えばプロモーターを含まない「レポーター」遺伝子への連結を用いて同定）。ＡＡＶｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子（ｐ５置換を有する）、好ましくは陽性選択可能標識に連結したもの、例えば抗生物質耐性遺伝子を、次いで適当な宿主細胞（例えばＨｅＬａまたはＡ５４９細胞、以下に例示）中に安定に組み込む。選択条件（例えば抗生物質の存在下）で比較的良く生育する細胞を、次いでヘルパーウイルスを加えてｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するためのこれらの能力に関して試験する。ｒｅｐおよび／またはｃａｐ発現のための最初の試験として、細胞はＲｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質を検出する免疫蛍光を用いて容易にスクリーニングできる。次いで、パッケージング能力および効率の確認は、侵入するｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングに対する機能試験により決定できる。この方法を用いて、マウスのメタロチオネイン遺伝子から誘導したヘルパー−ウイルス−誘導可能プロモーターが、ｐ５プロモーターに対する適当な置換として同定され、そしてｒＡＡＶ粒子の高い力価を生成するために使用される（ＷＯ９６／１７９４７に記載のように）。
【００７９】
種々のＡＡＶゲノムの相対キャプシド化サイズ限界を考慮すると、ゲノム内への大きい非相同ポリヌクレオチドの挿入が、ＡＡＶ配列の一部分の除去を必要とする。１個またはそれ以上の遺伝子の除去は、複製可能なＡＡＶ（”ＲＣＡ”）産生の見込みを低下するためにいかなる場合にも望ましい。従って、ｒｅｐ、ｃａｐまたは双方のコード化またはプロモーター配列は、好ましくは除去されるが、それはこれらの遺伝子により与えられる機能は、トランス状態で与えられることができるからである。
【００８０】
得られたベクターは、これらの機能に関して「欠失」していると呼ばれる。ベクターを複製およびパッケージするために、欠失した機能をパッケージング遺伝子または複数のこれら遺伝子で補足し、これらは一緒になって種々の欠失したｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子産物に必要な機能をコードする。パッケージング遺伝子または遺伝子カセットは、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲで近接されず、そして好ましくはｒＡＡＶゲノムといかなる本質的な相同性も共有しない。従って、ベクター配列と別途に供給されたパッケージング遺伝子との間の複製の間の相同組換えを最小にするために、２個のポリヌクレオチド配列の重複を回避することが望ましい。組み替えの相同性のレベルおよび相当する頻度は、相同配列の長さおよびこれらの共有する部分のレベルが増加するとと増加する。与えられた系で関心を呼び起こす相同のレベルは、理論的に決定しそして実験的に確認でき、これは当該技術分野では公知である。しかし、代表的には、全長の少なくとも８０％一致の際に重複配列が約２５ヌクレオチド配列以下の場合、または全長の少なくとも７０％一致の際に重複配列が約５０ヌクレオチド配列以下の場合に、組換えは本質的に低下または排除される。当然ながら、一層低いレベルの相同性が望ましく、それはこれが組み替えの見込みをさらに低下させるからである。いかなる重複がなくても、ＲＣＡ産生のいくらかの残留頻度はあるように見える。ＲＣＡ産生の頻度のこれ以上の低下（例えば非相同性組換えにより）が、ＡＡＶの複製およびキャプシド化機能の「切除」により得ることがきで、これはアレンら(Allen et al., WO98/27204)に記載されている。
【００８１】
ＡＡＶベクター構築物、および相補パッケージング遺伝子構築物は、本発明中で多数の異なる形で実行できる。ウイルス粒子、プラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞は、すべてこのような構築物をパッケージング細胞内に、一時的または永久に導入するために使用できる。
【００８２】
本発明のある態様では、ＡＡＶベクターおよび存在する場合に相補パッケージング遺伝子は、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子、またはこれらのあらゆる組み合わせの形で提供される。他の態様では、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子、または双方のいずれかが、遺伝子的に改変（好ましくは遺伝的に改変）された真核細胞の形で提供される。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子、または双方を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞の開発は、信頼できるレベルで発現される物質の確立された供給源を提供する。
【００８３】
従って、種々の異なる遺伝子的に改変された細胞は、本発明の範囲内で使用できる。例示として、哺乳類宿主細胞は、安定に組み込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１個の不変のコピーと一緒に使用してもよい。プロモーターに操作的に連結した少なくとも１個のＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子を含んでなるＡＡＶパッケージングプラスミドは、複製機能を提供するために使用できる（米国特許（ＵＳ）第５，６５８，７７６号に記載の通り）。あるいは、プロモーターに操作的に連結したＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳類細胞株は、複製機能を提供するために使用できる（例えばTrempe et al., WO95/13392 号; Burstein et al(WO98/23018 号);およびJohnson et al(米国特許(US)第5,656,785 号) 参照) 。上記のようにキャプシド化タンパク質を提供するＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子と一緒または別々に提供できる（例えば以上に引用した出願および特許ならびにAllen et al. (WO98/27204号) 参照）。その他の組み合わせも可能であり、本発明の範囲内に含まれる。
ＩＩＩ．ｒＡＡＶ作製
遺伝子治療などの目的に有用な組換えＡＡＶ粒子を作製するために、パッケージング細胞株に、好ましくは、１個またはそれ以上の関係するポリヌクレオチド（すなわち標的ポリヌクレオチド）の周囲のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含んでなる組換えＡＡＶベクターが供給される。
【００８４】
標的ポリヌクレオチドは、一般にそれ自体または非相同プロモーターのいずれかのプロモーターに操作的に連結している。多数の適合するプロモーターが当該技術分野では公知であり、その選択は標的ポリヌクレオチドの発現の希望するレベル（すなわち、構成性発現、誘導性発現、細胞特異性または組織特異性発現などのいずれを希望するか）に依存する。
【００８５】
好ましくは、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクターによりすでに感染している細胞の選択を可能とするために陽性選択可能標識も含む。必要または希望されるようになった場合にこれらの同じ細胞に対する選択の手段として、陰性選択可能標識が含まれてもよい。好ましい態様では、S.D. Lupton が記載した「二官能性選択可能融合遺伝子」が使用できる。例えばPCT/US91/08442号およびPCT/US94/05601号参照。要約すると、これらの構築物は、優勢な陽性選択可能標識と陰性選択可能標識の間の直接翻訳融合を含む、好ましい陽性選択可能標識は、ｈｐｈ、ｎｅｏ、およびｇｐｔから成る群より選ばれる遺伝子から誘導され、そして好ましい陰性選択可能遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−１  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔから成る群より選ばれる遺伝子から誘導される。特に好ましい標識は、二官能性選択可能融合遺伝子であり、ここで陽性選択可能標識はｈｐｈまたはｎｅｏから誘導され、そして陰性選択可能標識はシトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子から誘導される。
【００８６】
有用な標的ポチヌクレオチドは、多数の異なる応用のためにｒＡＡＶベクター中に使用できる。このようなポリヌクレオチドは、下記を含むが、これに限定はされない。（ｉ）構造タンパク質または酵素の欠失、欠陥または最適でないレベルにより起きる欠失を救済するための遺伝子治療の他の形に有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）アンチセンス分子内に転写されるポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）転写または翻訳因子を結合するデコイ内に転写されるポリヌクレオチド、（ｉｖ）細胞調節因子、例えばサイトカインをコードするポリヌクレオチド、（ｖ）特異性薬剤、例えばレシピエント細胞をヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を可能とするレシピエント産生ができるポリヌクレオチド、および（ＶＩ）ガン治療のためのポリヌクレオチド、例えば、ある種の肺ガンおよび乳ガンに関連する欠損または破壊されたｐ５３遺伝子の置換のための野生型ｐ５３ガンサプレッサーｃＤＮＡ、または乳ガンおよび卵巣ガンを含む各種の異なるガンの腫瘍発生および／または転移を阻害する能力があるＥ１Ａガンサプレッサー遺伝子。
【００８７】
得られた組換えＡＡＶ粒子の治療特異性は、導入された特定のベクターまたはプロ−ベクターにより決定されるので、同じ基本パッケージング細胞株がこれらのいずれの応用に対しても変性できる。例えば、特異性標的ポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、数種の可能な方法のいずれかによりＡＡＶベクターの産生のためのパッケージング細胞内に導入でき、これには、例えばｒＡＡＶプロ−ベクターを含んでなるプラスミドの電気さく孔またはトランスフェクション、またはｒＡＡＶベクターまたはプロベクターを含んでなるｒＡＡＶまたはヘルパーウイルスを用いる感染が含まれる。
【００８８】
ヘルペスウイルスは、ｒＡＡＶベクターの導入の前、その間またはその後に導入できる。例えば、プラスミドは、ヘルパーウイルスと一緒に培地内に同時感染でき、次いで、細胞を十分な期間、代表的には２〜５日間、当該技術分野では公知の複製およびパッケージングのために適する条件下で培養できる（引用文献は上記、そして実施例は下記参照）。溶解物を調製し、そして組換えＡＡＶベクター粒子を当該技術分野では公知の方法を用いて精製する。
【００８９】
下記の実施例でも説明する好ましい態様では、組換えＡＡＶベクターは、自体が、パッケージングのために使用される哺乳類細胞内に安定に組み込まれる。次いで、このようなｒＡＡＶ「産生細胞」を培養し、使用するまで保管する。このような産生細胞からｒＡＡＶ粒子の産生を誘導するために、使用者は細胞をヘルパーウイルスに感染させそしてＡＡＶの複製およびパッケージングに適する条件下で細胞を培養するだけでよい（下記の通り）。
【００９０】
あるいは、１種またはそれ以上のＡＡＶスプリット−パッケージング遺伝子またはｒＡＡＶベクターは組換えヘルパーウイルスの一部分として導入できる。例えば、アデノウイルスのＥ１、Ｅ３および／またはＥ４遺伝子は、１種またはそれ以上のスプリット−パッケージング遺伝子またはｒＡＡＶベクターと置換できる。アデノウイルスベクター、例えばＥ１および／またはＥ３領域内へのクローニングを容易にするための技術は、当該技術分野では公知である（例えばBett,A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806 (1994) 参照）。従って、組換えアデノウイルスのようなヘルパーウイルスは、ヘルパーウイルス機能を与えるために使用でき、ならびにＡＡＶパッケージング遺伝子および／またはｒＡＡＶプロ−ベクターも同様であり、これは（当該技術分野では公知のように）このようなヘルパーウイルス内の多数の遺伝子（例えばアデノウイルスのＥ３遺伝子）が、ヘルパーウイルス活性を失うことなく置換できるからである。トランス状態であらゆる必要なヘルパーウイルス機能を提供することにより、追加の遺伝子がのようなヘルパーウイルス内に挿入できる。例えば、ヒト２９３細胞は、アデノウイルスＥ１変異体を補足できるアデノウイルス遺伝子を含む。従って、細胞がこのようなアデノウイルス機能をトランス状態で有効に提供できる細胞内で使用するために、非相同遺伝子もＥ１遺伝子が欠失しているアデノウイルス内にクローニングできる。あるいは、ヘルパーウイルスの使用は、パッケージング細胞内にすべての必要なヘルパーウイルス機能を提供することで不要となる。
ＩＶ．細胞内への遺伝物質の導入
当該技術分野に記載されそして本明細書中および上記の引用文献中に例示されているように、遺伝物質はこのような細胞を形質転換または形質導入する各種の手段のいずれかを用いて細胞（例えばＡＡＶ産生のための哺乳類「産生細胞）内に導入できる。例示として、このような技術は、例えば細菌プラスミドを用いるトランスフェクション、ウイルスベクターを用いる感染、電気さく孔、リン酸カルシウム沈降、および種々の脂質に基づく組成物のいずれかを用いる導入（例えばしばしば「リポフェクション」と呼ばれる方法）を含む。これらの技術を実行するための方法および組成物は、当該技術分野で記載され、広く入手可能である。
【００９１】
適当に改変された細胞の選択は、当該技術分野のいかなる技術によっても実行できる、例えば、細胞を改変するために使用されるポリヌクレオチド配列は、当該技術分野では公知の１種またはそれ以上の検出可能または選択的に検出可能な標識に同時に導入または操作的に連結できる。例示として、選択可能な標識として薬剤耐性遺伝子を使用できる。次いで、薬剤耐性細胞を取り出して培養し、次いで所望の配列、すなわちパッケージング遺伝子産物、または非相同ポリヌクレオチドの産物の発現を適宜試験する。導入したポリヌクレオチドの取得、定位および／または維持に対する試験は、ＤＮＡハイブリダゼーションに基づく技術（例えばサザンブロッティングおよびその他の当該技術分野で公知の方法）を用いて行うことができる。発現のための試験は、遺伝子的に改変された細胞から抽出したＲＮＡのノーザン分析により、または相当する遺伝子産物に対する間接免疫蛍光により容易に行うことができる。パッケージング能力および効率の試験および確認は、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスの残った機能成分を細胞に導入してＡＡＶ粒子の産生を試験できる。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物を用いて遺伝的に改変されている場合には、これらを細胞に分離して導入し、そして各段階を順次実証すると一般的にさらに便利である（本質的ではないが）。このような技術を記載した引用文献は、本明細書中の引用文献に含まれる。
Ｖ．ヘルパーウイルスの選択および調製
以上に考察したように、ＡＡＶは自己複製を欠失したパルボウイルスであり、そして一般にある種の複製機能を提供するためにヘルパーウイルスに依存しなければならない。多数のこのようなヘルパーウイルスが同定され、これにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガリウイルスおよびＨＨＶ−６を含み、これらには限定されない）、およびポックスウイルス（とくにはワクシニア）を含む。このようなあらゆるウイルスを本発明に使用してもよい。
【００９２】
しばしば、ヘルパーウイルスは目的とする宿主細胞を感染できるタイプおよびサブグループのアデノウイルスである。サブグループＣ、特には血清型１、２、４、６および７のヒトアデノウイルスが一般に使用される。血清型５が一般に好ましい。
【００９３】
アデノウイルスの特徴および生育パターンは、当該技術分野では公知である。読者は、例えばHorowitz "Adenoviridae and their replication", pp771-816、Fundamental Virology, Fields et al., eds、が参照できる。パッケージされたアデノウイルスゲノムは、線状ＤＮＡ分子であり、左手および右手末端において末端タンパク質複合体を通じてアデノウイルスＩＴＲを通じて連結し、環を形成する。初期、中間および後期成分に対する制御およびコード化領域はゲノム内で重複している。初期領域遺伝子は、アデノウイルスゲノムの複製に関係し、そしてＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４領域内へのこれらの位置に依存して分類される。
【００９４】
本質的ではないけれども、原理的に、ヘルパーウイルス株が、最終的に遺伝子治療を受けるために最終的に患者内での複製に対して欠失していることが望ましい。従って、ｒＡＡＶ調製物内に存在するあらゆる残留ヘルパーウイルスは、複製不能である。Ｅ１ＡまたはＥ１ＡとＥ３領域の両方が欠失しているアデノウイルスは殆どのヒト細胞に感染性ではない。これらは欠失した活性を補足できる許容細胞株（例えばヒト２９３細胞株）内で複製できる。ヘルパー機能と関連するように見えるアデノウイルスの領域、ならびに関連しない領域が同定され、当該技術分野で記載されている（例えばP. Colosi et al., WO97/17458号、およびこの中に引用されている文献参照）。
ＶＩ．遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用
ＡＡＶベクターは、遺伝子治療の目的で個体に投与するために使用できる。遺伝子治療に適する疾患は、ウイルス、細菌、または寄生虫感染、種々の悪性疾患および高度増殖性状態(hyperproliferation)、自己免疫状態、および先天性欠陥により誘導されるものを含み、これらの限定はされない。
【００９５】
遺伝子治療は、細胞内または細胞により分泌される特定のタンパク質の発現のレベルを増加して行うことができる。本発明のベクターは、遺伝子標識、欠失または欠陥遺伝子の置換、または治療遺伝子の挿入のいずれかのために細胞と遺伝的に改変するために使用してもよい。あるいは、発現のレベルを低下させる細胞にポリヌクレオチドを供給してもよい。これは、望ましくない表現型、例えば悪性疾患の経過の間での増幅または過剰発現される遺伝子、または微生物感染の経過の間で導入または過剰発現された遺伝子の産物の抑制のために使用してもよい。発現レベルは、例えば標的遺伝子またはＲＮＡ転写物（アンチセンス治療）のいずれかとの安定なハイブリッドを形成する能力、関連するｍＲＮＡを切断するためのリボザイムとして作用する能力、または標的遺伝子の産物に対するデコイとして作用する能力がある配列を含んでなる治療ポリヌクレオチドの供給により低下させてもよい。
【００９６】
本発明の方法によるｒＡＡＶベクターの導入は、当該技術分野で利用できて周知であるあらゆる数の送達技術（外科的または非外科的）の使用を含む。このような送達技術は、例えば血管カテーテル挿入、カニューレ挿入、注射、吸入、塗擦、局所、経口、経皮、動脈内、静脈内、および／または腹腔投与を含む。ベクターは、例えば例示として、人工血管（ＰＴＦＥまたはダクロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内ペーヴィング(intravascular paving)ならびにその他の非血管補てつ物を含むバイオプロステーゼにより導入されることができる。ベクター溶液の送達、頻度、組成および投与範囲に関する一般的技術は、当該技術分野の技術の範囲内である。
【００９７】
特に、本発明のベクターの組織への送達のために、ベクターを宿主動物に導入するあらゆる物理的および生物学的方法が使用できる。ベクターは、裸の組換えベクターおよびウイルス外被タンパク質内にパッケージされたベクターＤＮＡの両方を意味し、これはＡＡＶ投与のために周知である。ＡＡＶベクターをリン酸塩緩衝生理食塩水内に単に溶解することは、筋肉組織発現のために有用な媒体を供給するために十分であることが確証されており、そしてベクターと同時投与できるキャリヤーまたは他の成分に既知の制限はない（しかしＤＮＡを分解する成分はベクターの正常の方法では回避される）。薬剤組成物は、注射用製剤としてまたは経皮輸送による筋肉への送達するために局所用製剤として調製できる。筋肉内注射および経皮輸送の両者のための多数の製剤がこれまで開発されそして本発明の実施のために使用できる、ベクターは、投与および取り扱いを容易にするためにあらゆる薬剤的に許容できるキャリヤーと一緒に使用できる。
【００９８】
筋肉内注射の目的で、アジュバント、例えばゴマ油またはラッカセイ油またはプロピレングリコール内の溶液が使用でき、ならびに滅菌した水溶液も使用できる。このような水溶液は、所望の場合には緩衝してもよく、そして液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグルコースを用いて等張性を与えられる。遊離酸（酸性リン酸基を含むＤＮＡ）または薬剤的に許容できる塩としてのＡＡＶベクターの溶液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水中で調製できる。ＡＡＶウイルス粒子の分散は、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中および油中でも調製できる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製剤は、微生物の生育を防止するために保存剤を含む。これに関して、使用される滅菌水性媒体は、当該技術分野の熟練者には周知の標準技術により容易に得られる。
【００９９】
注射用に適する剤形は、滅菌液剤または分散剤および滅菌注射液剤または分散剤の即時調合のための滅菌散剤を含む。すべての場合に、剤形は滅菌されていなければならず、そして容易に注射器で使用できるように液状でなければならない。これは製造よび貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対抗して保存されなければならない。キャリヤーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）を含む溶剤または分散剤、これらの適当な混合物、および植物油であることができる。例えば被覆、例えばレシチンの使用により、分散液の場合に所要の粒径の維持により、または界面活性剤の使用により適当な流動性を維持できる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより得ることができる。多くの場合に、等張剤、例えば砂糖または塩化ナトリウムを含むことも好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収遅延のための薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用して得ることができる。
【０１００】
滅菌注射用液剤は、必要量のＡＡＶベクターを種々の上記の他の成分を必要に応じて含む適当な溶剤中に入れ、次いで濾過滅菌を行って調製される。一般に、分散液は、滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体よび所要の上記の他の成分を含む滅菌したビヒクル中に入れて調製される。滅菌した注射用液剤の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、有効成分の粉末に加えて上記のこれらの滅菌濾過溶液からのあらゆる追加の所望の成分を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１０１】
局所投与の目的には、それ以外は上記の非蛍光溶液に同じ希薄滅菌、水溶液（通常濃度約０．１〜５％）が、経皮貼付剤内への混和に適する容器内で調製され、そして公知のキャリヤー、例えば薬品グレードのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むこともできる。
【０１０２】
特に重要なことは、適切に作用する嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節剤（ＣＦＴＲ）の気道上皮への供給による嚢胞性繊維症の遺伝子欠陥の修正である。従って、本来のＣＦＴＲタンパク質をコードするｒＡＡＶベクター、およびこれらの変異体および断片は、すべて本発明の好ましい態様である。
【０１０３】
本発明の組成物は、生体内でも生体外でも使用してよい。生体内遺伝子治療は、本発明のベクターを直接患者に投与することを含んでなる。薬剤組成物は液状の溶液または懸濁液として、エマルションとして、または使用前に液体内に溶解または懸濁するために適する固体形で供給することができる。気道内に投与するために、投与の好ましい方法は、適当な噴霧装置を用いて固体または液体のいずれかのエーロゾルを供給する組成物を用いるエーロゾルによる。気道へ好ましい他の投与方法では、ベクターを点滴注入するための可とう性光ファイバー気管支鏡を用いる。代表的には、ウイルスベクターは、薬剤的に許容でき、発熱物質を含まない緩衝液、例えばリンゲル平衡塩溶液（ｐＨ７．４）内に入れる。要求はされないけれども、薬剤組成物は、場合により正確な量の投与に適する単位用量形として供給してもよい。
【０１０４】
処置する患者に応じて、有効量のウイルスを投与する。有効量は、一回または分割した投与で与えてもよい。低いパーセントの形質導入で遺伝的欠陥を治療できる場合には、処置の目的は、一般に形質導入のこのレベルに達するかまたは越えることである。  ある場合には、この形質導入レベルは、標的細胞の約１〜５％の形質導入だけで達成されるが、しかしさらに代表的には希望する組織タイプの細胞の２０％、通常は少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、その上さらに好ましくは希望する組成タイプの細胞の少なくとも約９９％である。指針として、気管支鏡により投与される一回投与中に存在するベクター粒子の数は、一般に少なくとも約１ｘ１０8 、さらに代表的には５ｘ１０8 、１ｘ１０10、およびある場合には１ｘ１０11粒子であり、これらはＤＮアーゼ耐性およびＤＮアーゼ感受性粒子の両方を含む。ＤＮアーゼ耐性粒子として、用量は一般に１ｘ１０6 〜１ｘ１０14粒子の間、さらに一般的には１ｘ１０8 〜１ｘ１０12粒子の間である。処置は、２または３週間毎に必要に応じて反復ができるが、しかし１８０日の間に１回の処置で十分であろう。
【０１０５】
宿主細胞中の所望のＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイを行ってもよい。このようなアッセイには、例えば当該技術分野の熟練者には周知の「分子生物学的」アッセイ、例えばサザンおよびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ、「生物化学的」アッセイ、例えば免疫学的手段（免疫沈降、免疫アフィニティーカラム、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法）によるベクター内に存在する遺伝子から発現されたポリペプチドの存在を検出する方法、または本発明の範囲内に入る特定の核酸分子の存在および／または発現を同定するために有用な他のアッセイを含む。
【０１０６】
導入されたＤＮＡセグメントから産生されたＲＮＡを検出および定量するために、ＲＴ−ＰＣＲが使用される。ＰＣＲのこの応用において、最初に逆転写酵素などの酵素を用いてＲＮＡをＤＮＡに逆転写することが必要であり、次いで慣用のＰＣＲ技術を用いてＤＮＡを増幅する。多くの場合に、有用なＰＣＲ技術は、ＲＮＡ産物の完全性を証明しない。ＲＮＡ産物の性質に関するこれ以上の情報は、ノーザンブロッティングにより得てもよい。この技術は、ＲＮＡ種の存在を証明しそしてそのＲＮＡの完全性に関する情報を与える。ＲＮＡ種の存在または不在は、ドット(dot) またはスロットブロット(slot blot) ノーザンハイブリダイゼーションを用いて決定もできる。これらの技術は、ノーザンブロット法の変形であり、ＲＮＡ種の存在または不在を証明するだけである。
【０１０７】
サザンブロット法およびＰＣＲは問題のＤＮＡセグメントを検出するために使用できるが、これらはＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報は提供しない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のポリペプチド産物を特異的に同定するかまたは宿主細胞内に導入されたＤＮＡセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価して評価してもよい。
【０１０８】
従って、遺伝子改変の有効性は、種々の基準により測定できる。生検または外科摘出により取り出された試料は、in situ ハイブリダゼーション、ベクター特異性プローブを用いるＰＣＲ増幅、ＲＮアーゼプロテクション、免疫組織学、または免疫蛍光細胞計数により分析してもよい。ベクターが気管支鏡により投与される場合には、肺機能試験を行ってもよく、そして炎症性サイトカインの存在に関して気管支洗浄を行ってもよい。処置された患者は臨床徴候に関して検査してもよく、そして治療用ポリヌクレオチドにより運搬された筈の機能を細胞が発現するかどうかを決定する。
【０１０９】
生体内および生体外治療を使用するかどうか、および特定の組成物、用量、および投与経路の選択の決定は、処置する状態および患者の特徴を含みこれに限定はされない多数の異なる因子に依存する。このような特徴および適当な治療方式の設計の評価は、最終的には処方する医師の責任である。
【０１１０】
上記は、なかでもヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）および細胞タンパク質を本質的に含まない組換えＡＡＶベクターの高力価調剤を作製するための方法を提供する。本発明の精神から離れることなく、当該技術分野の熟練者によりこれらの方法に対して変更を与えることが可能と理解される。
ＶＩＩ．本発明の実施に有用な薬剤
本発明の実施に有用な薬剤は、ｒＡＡＶ形質導入効率を改変する薬剤を含む。好ましい薬剤は、ｒＡＡＶ形質導入を増強または増加する薬剤を含む。このような薬剤は、ウイルスエンドサイトーシスを増加する薬剤、例えばブレフェルジンＡ、エンドソームプロセシングおよび／または核への転送では例えばシステインプロテアーゼ阻害剤を含む。好ましくは、阻害剤は、エンドソーム、例えばリソソーム性システインプロテアーゼ阻害剤である。さらに好ましくは、本発明の薬剤は可逆性システインプロテアーゼ阻害剤である。本発明の範囲内のシステインプロテアーゼ阻害剤は、シスタチン、例えばシスタチンＢまたはシスタチンＣ、アンチパイン、ロイペプチン、Ｅ−６４、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、ＫＯ２（Wacher et al., J. Pharma. Sci. 87. 1322(1988) ）、ＬＬｎＬ、Ｚ−ＬＬＬ、ＣＢＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈ、システインプロテアーゼ阻害剤、例えば米国特許（ＵＳ）第5,607,831 号、第5,374,623 号、第5,639,732 号、第5,658,906 号、第5,714,484 号、第5,560,937 号、第5,374,623 号、第5,607,831 号、第5,723,580 号、第5,744,339 号、第5,827,877 号、第5,852,007 号、および第5,776,718号、特開平10-77276号、特開平8-198870号、特開平8-81431 号、特開平7-126294号、特開平4-202170号、WO96/21006号およびWO96/40737号に開示されたものを含む。
【０１１１】
好ましいシステインプロテアーゼ阻害剤は、ペプチドおよびこれらの類似体である。本発明の範囲内の好ましいペプチドシステインプロテアーゼ阻害剤は、アミノ酸残基２〜２０個、好ましくは３〜１０個、さらに好ましくは３〜８個を含んでなる。「アミノ酸」は、ＤまたはＬ形の天然アミノ酸（例えばＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ）、ならびに非天然アミノ酸（例えばホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、ノル−ロイシン、ノル−バリン、およびｔ−ブチルグリシン）の残基を含んでなる。ペプチド類似体は、少なくとも１種のＤ形のアミノ酸および／または非天然アミノ酸、またはその他の非天然アミノ酸部分を含んでなる分子である。
【０１１２】
好ましいペプチドシステインプロテアーゼ阻害剤は、式（Ｉ）：Ｒ1 −Ａ−（Ｂ）n −Ｃ
〔式中、Ｒ1 はＮ−末端アミノ酸ブロック基であり、ＡおよびＢそれぞれは独立してアミノ酸であり、Ｃはアミノ酸であり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており、そしてｎは０、１、２または３である〕の化合物またはその薬剤的に許容できる塩を含む。一つの好ましい態様では、Ｒ1 が（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、アセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。別の好ましい態様では、ＡおよびＢそれぞれが、独立してアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、さらに好ましいくは、ＡおよびＢそれぞれがイソロイシンである。さらに別の好ましい態様では、Ｃがアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリン〔式中、末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されている〕であり、そしてさらに好ましくは、Ｃがノル−ロイシンまたはノル−バリン〔式中、末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されている〕である。
【０１１３】
さらに好ましい態様では、Ｒ1 が（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイルまたはベンジルオキシカルボニルであり、ＡおよびＢがそれぞれイソロイシンであり、Ｃがノル−ロイシンまたはノル−バリンであり〔式中、末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されている〕、そしてＮが１である。
【０１１４】
本発明の範囲内に含まれるのは、式（ＩＩ）
【０１１５】
【化７】
0004969002.tif 000006
【０１１６】
〔式中、
Ｒ2 は、Ｎ−末端アミノ酸ブロック基であり、
Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 は、それぞれ独立して水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、そして
Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、それぞれ独立して水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである〕の化合物またはこの薬剤的に許容できる塩である。好ましくは、Ｒ2 が（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、アセリルまたはベンジルオキシカルボニルである。また好ましくはＲ3 が水素または（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、例えば２−メチルプロピルである。Ｒ4 が水素または（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、例えば２−メチルプロピルが好ましい。
【０１１７】
別の好ましい態様では、Ｒ5 が水素または（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、例えばブチルまたはプロピルである。
【０１１８】
さらに別の好ましい態様では、Ｒ2 がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルであり、Ｒ3 およびＲ4 がそれぞれ２−メチルプロピルであり、Ｒ5 がブチルまたはプロピルであり、そしてＲ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、それぞれ独立して水素である。
【０１１９】
本発明の方法に有用な別の好ましい薬剤は、式（ＩＩＩ）
【０１２０】
【化８】
0004969002.tif 000007
【０１２１】
〔式中、
Ｒ1 は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチルまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲで置換されてもよく、ここで、それぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、
Ｒ2 は、（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり、
Ｒ3 は、Ｈ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシまたは（Ｃ3 〜Ｃ8 ）シクロアルキルであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＳＲ、またはＮＲＲで置換されてもよく、ここで、それぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、
Ｒ4 は、Ｈ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシまたは（Ｃ3 〜Ｃ8 ）シクロアルキルであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＳＲ、またはＮＲＲで置換されてもよく、ここで、それぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、
Ｒ5 は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルケニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキニル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ2 、またはトリフルオロメチルであり、ここであらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ2 、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲで置換されてもよく、ここでそれぞれのＲは独立してＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり、そして
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ（ＲはＨまたは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである）である〕
の化合物またはこの薬剤的に許容できる塩である。
【０１２２】
下記の定義は、特に別途断らない限り適用される。アルキルは、直鎖または分枝上鎖の基を表すが、しかし個別の基への言及、例えば「プロピル」は直鎖基のみを含み、分枝状異性体、例えば「イソプロピル」は特定して言及される。アリールはフェニル基または環原子約９〜１０個を有するオルト融合二環式炭素環基でその中の少なくとも１個の環は芳香族環であるものを表す。
【０１２３】
適するＮ−アミノ酸ブロック基は、当該技術分野の熟練者には公知である（例えば、T.W. Greene, Protecting Groups In Organic Synthesis; Wiley: New York, 1981、および該明細書に引用された参考文献を参照）。Ｒ1 の好ましい値は、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル（例えばアセチル）およびベンジルオキシカルボニルである。
ＶＩＩＩ．本発明の薬剤の投与の用量、製剤よび経路
本発明に従って同定された薬剤の投与は、連続または断続であってもよく、これは例えばレシピエントの生理学的条件、投与の目的が治療または予防であるかどうか、および熟練した医師には公知のその他の因子に依存する。本発明の薬剤の投与は、あらかじめ選定された期間にわたり本質的に連続であるか、または間隔をおいた一連の期間で行ってもよい。局所または全身投与の両者が考慮される。本発明の薬剤が予防目的で使用される場合には、本発明の薬剤は、慢性的使用に従うべきであり、好ましくは全身投与による。
【０１２４】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物のこれらの塩を含む本発明の薬剤は、好ましくは約０．０１μＭ〜約１ｍＭ、さらに好ましくは約０．１μＭ〜約４０μＭ、その上にさらに好ましくは約１μＭ〜約４０μＭの用量で投与されるが、しかし他の用量も有益な効果を生じる。例えば、好ましいＬＬｎＬの用量は、約１μＭ〜約４０μＭを含むが、ＺＬＬの好ましい用量は、約０．１μＭ〜約４μＭを含む。
【０１２５】
以下に記載のように場合により徐放のために処方してもよい本発明の薬剤を含んでなる１種またはそれ以上の適当な単位用量形は、経口、または直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸郭内、肺内および鼻経由を含む非経口を含む種々の経路で投与できる。例えば、肝臓への投与には、静脈内投与が好ましい。肺への投与は、気道投与が好ましい。製剤は、適合する場合には、区分された単位用量形で提供してもよくそして薬剤学では周知のあらゆる方法で調製してもよい。このような方法は、薬剤と液状キャリヤー、固体マトリックス、半固体キャリヤー、微細に粉砕した固体キャリヤーまたはこれらの組み合わせと一緒にし、次いで、必要な場合には製品を所望の投与形に賦形または成形する工程を含んでもよい。
【０１２６】
本発明の薬剤が経口投与のために調製される場合には、これらは好ましくは薬剤的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、薬剤製剤または単位用量形に形成する。このような製剤内の全有効成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を含んでなる。「薬剤的に許容できる」としては、キャリヤー、希釈剤、賦形剤および／または塩が、製剤の他の成分と許容性であり、そしてこれらのレシピエントに対して無害でなければならないことを意味する。経口投与のための有効成分は、粉末として、または顆粒として、溶液、懸濁液またはエマルションとして、または到達できる基材、例えばチューインガムから有効成分の摂取のための合成樹脂として存在してもよい。有効成分は、大型丸薬、舐薬またはペーストとして提供してもよい。
【０１２７】
本発明の薬剤を含む製剤は、当該技術分野では周知の方法により、周知で容易に使用できる成分を用いて調製できる。例えば、薬剤は、通常の賦形剤、希釈剤、またはキャリヤーを用いて処方でき、そして錠剤、カプセル、懸濁剤、散剤、などに成形してもよい。このような薬剤に適する賦形剤、希釈剤、またはキャリヤーの例は、下記を含む。充填剤および増量剤、例えばデンプン、糖類、ナンニトール、およびケイ素誘導体、結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよびその他のセルロース誘導体、アルギン酸化合物、ゼラチン、およびポリビニル−ピロリドン、湿潤剤、例えばグリセロール、崩壊剤、例えば炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム、溶解遅延のための薬剤、例えばパラフィン、再吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、界面活性剤、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、吸収性キャリヤー、例えばカオリンおよびベントナイト、および滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、および固体ポリエチルグリコール。
【０１２８】
例えば、本発明の薬剤を含む錠剤およびカプレットは、緩衝剤、例えば炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムを含むことができる。カプレットおよび錠剤は、不活性成分、例えばセルロース、プレゼラチン化したデンプン、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マイクロクリスタリンセルロース、デンプン、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、トウモロコシデンプン、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、およびステアリン酸亜鉛などを含むこともできる。本発明の薬剤を含む硬質および軟質ゼラチンカプセルは、不活性成分、例えばゼラチン、マイクロクリスタリンセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、タルクおよび二酸化チタン等ならびに液体ビヒクル、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油を含むことができる。さらに本発明の薬剤の腸溶被覆カプレットまたは錠剤は、胃内での消化に耐え、そして十二指腸のさらに中性からアルカリ性環境内で溶解するように設計される。
【０１２９】
本発明の薬剤は、経口投与のためのエリキシル剤または液剤として、または非経口投与、例えば筋肉内、皮下または静脈内経路のために適する液剤として製剤されてもよい。
【０１３０】
本発明の薬剤の製剤は、水性または非水性の溶液または分散液の形、あるいはエマルションまたは懸濁液の形をとることができる。
【０１３１】
従って、治療剤は、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または連続輸液）のために製剤してもよく、そしてアンプル、充填済注射器、小容量輸液容器の単独用量形または保存剤を加えた複数用量容器内で提供してもよい。有効成分は、油性または水性ビヒクル内の懸濁液、溶液またはエマルションの形を取ってもよく、そして製剤助剤、例えば懸濁剤、安定剤および／または分散剤などを含んでもよい。あるいは、有効成分は、適当なビヒクル、例えば滅菌して発熱物質を含まない水を用いる調剤のために使用前に、滅菌固体の無菌単離により、または溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形であってもよい。
【０１３２】
これらの調剤は、従来技術から周知の薬剤的に許容できるビヒクルおよびアジュバントを含むことができる。例えば、生理学的観点から、水に加えて、溶剤、例えばアセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、グリコールエーテル、例えば名称「ダウアノール(Dowanol) 」として販売されている製品、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖の酸のＣ1 〜Ｃ4 −アルキルエステル、好ましくは酪酸エチルまたは酪酸イソプロピル、脂肪酸トリグリセリド、例えば名称「ミグリオール(Miglyol) 」として販売されている製品、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、鉱油および植物油およびポリシロキサンから選択される１種またはそれ以上の有機溶剤を用いて溶液を用いる液剤を調製することが可能である。
【０１３３】
本発明による組成物は、増粘剤、例えばセルロースおよび／またはセルロース誘導体を含むこともできる。これらは、ガム類、例えばキサンタン、グアールおまたはカルボガムまたはアラビアゴム、またはポリエチレングリコール、ベントン(bentone) およびモンモリロン石等も含むことができる。
【０１３４】
必要な場合には、抗酸化剤、界面活性剤、その他の保存剤、皮膜形成剤、角質溶解剤、コメド溶解剤(comedolytic agent) 、香料および着色剤から選ばれるアジュバントを加えることも可能である。また、上記状態またはその他の状態のいずれに対するものであっても、他の活性成分を加えてもよい。
【０１３５】
例えば、抗酸化剤の中では、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールおよびその誘導体が挙げられる。主として局所投与のために条件を整える剤形は、クリーム、乳剤、ゲル、分散液またはミクロエマルションの形、高度または低度に濃縮したローション剤、含浸パッド、膏薬または貼付剤、または噴霧または発泡形のエーロゾル製剤の形または石鹸ケークの形を取る。
【０１３６】
さらに、薬剤は徐放投与形などとしての製剤にも良く適合する。製剤は、有効成分を消化管または気道にのみまたは好ましくはこれらの特定の部分にのみ、可能なら一定の期間にわたって放出するように構成できる。被覆、エンベロープ、および保護マトリックスは、例えばポリマー状物質、例えばポリラクチド−グリコレート、リポソーム、ミクロエマルション、ミクロ粒子、ナノ粒子またはワックスから作製してもよい。これらの被覆、エンベロープ、および保護マトリックスは、留置装置、例えばステント、カテーテル、腹膜透析などを被覆するために有用である。
【０１３７】
本発明の薬剤は、経皮投与のために貼付剤を介して送達できる。薬剤の経皮送達に適する貼付剤の例については、米国特許（ＵＳ）第5,560,922 号を参照のこと。経皮送達のための貼付剤は、バッキング層と、薬剤と同時に１種またはそれ以上の皮膚透過助剤を中に分散または溶解したポリマーマトリックスを含んでなることができる。バッキング層は、薬剤に非透過性のあらゆる適当な材料からなることができる。バッキング層はマトリックス層の保護カバーとして役立ち、そして支持機能も与える。バッキングは、ポリマーマトリックスと本質的に同じ大きさであるかまたはポリマーマトリックスの側部分を越えて延びてもよい大きい寸法またはポリマーマトリックスの側を覆い、次いでバッキング層の表面が接着手段のための基部となることができるような形でもよい。あるいは、ポリマーマトリックスは、接着性ポリマー、例えばポリアクリレートまたはアクリレート／酢酸ビニルコポリマーを含むかまたは配合していてもよい。長期の適用のために、皮膚の含水または浸軟を最小にできるように、微細孔および／または通気性バッキングラミネートを用いることも望ましいであろう。
【０１３８】
バッキング層作製のために適する材料の例は、高密度および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、例えばポリ（エチレンフタレート）、金属フォイル、これらの適当なポリマーフィルムの金属フォイル積層物などである。好ましくは、バッキング層に使用される材料は、このようなポリマーフィルムと金属フォイル、例えばアルミニウムフォイルとの積層物である。このような積層物中で、積層物のポリマーフィルムが、通常接着性ポリマーマトリックスと接触する。
【０１３９】
バッキング層は、所望の保護および支持機能を与えるために適するあらゆる適当な厚さであることができる。適当な厚さは、約１０〜約２００μｍである。
【０１４０】
一般に、生物学的に受容できる接着性ポリマー層を形成するために使用されるこれらのポリマーは、薬剤が制御された速度で通過できる成形された本体、薄い壁またはコーティングを形成できるものである。適当なポリマーは、生物学的および薬学的に許容性、非アレルギー性およびこれらが接触する体液または組織中に不溶性で許容性の液体である。可溶性ポリマーの使用は、皮膚水分によるマトリックスの溶解または浸食が、薬剤の放出速度ならびに取り外しに便利なようにその位置にとどまる投与単位の能力に影響するので、避けるべきである。
【０１４１】
接着性ポリマー層を作製するための材料の例は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／アクリル酸エチルコポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコーンエラストマー、特には薬品グレードポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー（ヒドロゲル）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレンビニルオキシエタノールコポリマー、シリコーンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサンポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（ポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）など、セルロースポリマー、例えばメチルまたはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびセルロースエステル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレンなどを含む。
【０１４２】
好ましくは、生物学的に受容できる接着性ポリマーマトリックスは、室温以下のガラス転移点を有するポリマーから選択しなければならない。ポリマーは室温である程度の結晶度を持ってもよいが、しかし必要ではない。架橋性モノマー単位または部位をこのようなポリマー内に組み込むことができる。例えば、架橋性モノマーは、ポリアクリレートポリマー内に組み込むことができ、これらは薬剤をポリマー内に分散した後にマトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマーのための既知の架橋性モノマーは、ポリオールのポリメタクリルエステル、例えばブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどを含む。このような部位を提供するその他のモノマーには、アクリル酸アリル、メタクリル酸アリル、マレイン酸ジアリルなどが含まれる。
【０１４３】
好ましくは、可塑剤および／または湿潤剤が接着性ポリマーマトリックス中に分散される。水溶性ポリオールが一般にこの目的に適する。調剤中に湿潤剤の組込みは、皮膚表面で投与単位に水分を吸収させ、これはさらに皮膚刺激を低下し、そして送達系の接着性ポリマー層の剥離を防止することに役立つ。
【０１４４】
経皮送達系から放出された薬剤は、それぞれの皮膚の層を透過できなければならない。薬剤の透過速度を上昇するために、経皮薬剤投与系は、分子透過に最大の抵抗をする皮膚の最外層、角質層の透過性を特に上昇できなければならない。薬剤の経皮投与のための貼付剤の調製は、当該技術分野に周知である。
【０１４５】
吸入による上部（鼻）または下部気道への投与のために、本発明の薬剤は、吹送器、ネブライザーまたは加圧容器またはその他のエーロゾル噴霧投与に便利な手段から便利に投与される。加圧容器は、適当な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適合する気体を含んでなってもよい。加圧エーロゾルの場合に、投与単位は、一定量を供給する弁を備えて決定されてもよい。
【０１４６】
あるいは、吸入または吹送による投与のために、組成物は乾燥散剤、例えば薬剤および適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンとの粉末混合物の形を取ってもよい。粉末組成物は、粉末が吸入器、吹送器又は定量吸入器を用いて投与できる例えばカプセルまたはカートリッジ、または例えばゼラチンまたはブリスター包装内の単位投与形内で提供してもよい。
【０１４７】
鼻内投与のために、薬剤は、点鼻剤、液体噴霧剤、例えばプラスチックビンの噴霧器または定量投与吸入器を介して投与してもよい。代表的な噴霧器は、Mistometer(Wintrop) およびMedihaler(Riker)である。
【０１４８】
本発明の薬剤の局所投与は、薬剤を疾患の部位またはその近くに送達する各種の技術により行うことができる。部位特異性または標的局部送達技術の例は、利用できる技術を限定する意図ではなく、その例示である。例には、局所送達カテーテル、例えば輸液または留置カテーテル、例えば針輸液カテーテル、シャントおよびステントまたはその他の移植可能な器具、部位指定キャリヤー、直接注射、または直接適用を含む。
【０１４９】
局所投与のために、薬剤は当該技術分野では公知のようにして標的領域に直接適用してもよい。この目的のための便利な形には、創傷包帯、被覆包帯またはその他のポリマー被覆、膏薬、クリーム、ローション、ペースト、ジェリー、噴霧、およびエーロゾルが含まれる。膏薬およびクリームは、例えば水性または油性基剤に適当な増粘および／またはゲル化剤を加えて製剤してもよい。ローションは、水性または油性基剤を用いて製剤されてもよくそして一般に１種またはそれ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤または着色剤を含む。有効成分はイオン導入によっても送達でき、例えば米国特許（ＵＳ）第4,140,122 号、第4,383,529 号または第4,051,842 号に開示されている。局所製剤における本発明の薬剤の重量百分率は、種々の因子に関係するが、しかし調剤の全重量の０．０１％〜９５％、そして代表的には０．１〜２５重量％である。
【０１５０】
滴下剤、例えば点眼剤または点鼻剤は、水性または非水性基剤を用いて処方され、同時に１種またはそれ以上の分散剤、可溶化剤または懸濁剤を含んでなってもよい。液状噴霧剤は、便利には加圧容器から送達される。滴下剤は、簡単な点眼用フタ付きビン、または液状内容物を特殊な形状の容器を介して滴下するために適したプラスチックビンを介して送達することができる。
【０１５１】
薬剤は、さらに口または喉の局所投与のために製剤してもよい。例えば、有効成分を、さらに調味基剤、通常はスクロースまたはアラビアゴムまたはトラガントを含んでなるトローチ剤として、不活性基剤例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム中の組成物を含んでなる芳香錠剤、および適当な液状キャリヤー内に本発明の組成物を含んでなる口洗浄剤として製剤してもよい。
【０１５２】
本明細書中に記載した製剤および組成物は、その他の成分、例えば抗微生物剤、または保存剤を含んでもよい。さらに、有効成分は、他の薬剤、例えば気管支拡張剤と組み合わせて使用してもよい。
【０１５３】
本発明の薬剤は、哺乳類に、単独または薬剤的に許容できるキャリヤーと組み合わせて投与してもよい。上記のように、有効成分とキャリヤーとの相対比率は、化合物の溶解度および化合物性質、投与の選択した経路および標準的な調剤方法により決定される。
【０１５４】
本薬剤の用量は、投与の形、選定した特定の化合物および治療する特定の患者の生理学的性質により変化する。一般に、最初は少量を使用し、必要に応じて、場合により最適量に達するまで少しずつ増量する。
【０１５５】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明するが、限定するものではない。
実施例１
気管支上皮細胞法におけるｒＡＡＶ形質導入の極性および時間経過
極性ヒト気管支上皮の一次カルチャー。一次ヒト気道上皮細胞を従来の記載のようにして肺移植体からの気管支試料の酵素消化により捕集した(Kondo et al., 1991; Zhang et al., 1995)。単離した気道一次細胞を、コラーゲン被覆ミリセル−ＨＡカルチャーインサート(Millicell-HA culture insert, Millipore Corp., Bedford, MA) 上に密度５ｘ１０5 細胞／ｃｍ2 で接種した。一次カルチャーを空気−液体界面で２週間以上培養し、その時点で粘膜微繊毛上皮への分化が起きた。細胞の側底面側へのみの供給に使用したカルチャー培地は、４９％ＤＭＥＭ、４９％ハム(Ham) のＦ１２および２％ウルトラサー(Ultraser)Ｇ（BioSpectra, Cedex,France) を含んでいた。
【０１５６】
ｒＡＡＶの産生。組換えＡＡＶウイルスをＣａＰＯ4 同時−トランスフェクションプロトコールにより産生し、そして以前に記載されたように(Duan et al.,1997) 定密度塩化セシウム超遠心分離３回で精製した。プロウイルスプラスミドｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの転写制御下で、ＧＦＰレポーター遺伝子をコードするｒＡＡＶ（ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ）産生に使用した(Duan et al., 1998)。組み合えウイルスストックを５８℃で６０分間加熱して汚染ヘルパーアデノウイルスを不活性化した。代表的な収量は、プラスミド標準に対するＤＮＡスロットブロットハイブリダゼーションアッセイに基づいて２〜５ｘ１０12粒子／ｍｌであった。繁殖に使用した組換えアデノウイルス（Ad. CMVAlkphos;Duan et al., 1997) に対する第二レポターアッセイに基づいて、アデノウイルス汚染のレベルは、ｒＡＡＶの１ｘ１０10ＤＮＡ粒子当たりに１機能性粒子以下であった（感度限界）。ウイルス調製物は、以前の記載のように(Duan et al., 1998) 、抗Ｒｅｐ抗体(American Research Products, Inc., Belmont, MA) を用いて２９３細胞に同時感染させたＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ／Ａｄ．ＣＭＶＬａｃＺの免疫細胞化学染色によりｗｔＡＡＶの汚染を評価した。感染に１ｘ１０10ｒＡＡＶ粒子（感度限界）を使用した場合に、すべてのｒＡＡＶストックが、Ｒｅｐ免疫反応性の存在しないことを示した。Ｒｅｐ／Ｃａｐコーディングプラスミドを用いるトランスフェクションは、Ｒｅｐタンパク質の抗体染色に対する対照として役立った。
【０１５７】
極性化気道上皮の感染。一次気道カルチャー上に適用する前に、ｒＡＡＶの精製したストックをＰＢＳ中で透析した。気道細胞の感染のために、５μｌ  ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（５ｘ１０9 粒子、近似ＭＯＩ＝５０００）を培地１００ｕｌと混合し、そしてミリセルインサートの頂端側または側底側コンパートメント内に直接適用した。頂端側および側底側の両方の感染に対して、ｒＡＡＶを含む培地を２４時間後に除去し、そして新しい培地で置換（基底側に対し）または空気に暴露（頂端側に対し）した。
【０１５８】
ヘパリン硫酸プロテオグリカンの免疫蛍光定位。極性化気道上皮内のＡＡＶタイプ−２受容体（膜−会合ヘパリン硫酸プロテオグリカン）の定位を、１５分間の４％パラホルムアルデヒド固定、スクロース中の凍結保護、およびＯＣＴ中の固定に続いて凍結切片について行った。８μｍ切片を２０％ヤギ血清／ＰＢＳ中で２０分間ブロックし、次いでラット抗ヘパリン硫酸プロテオグリカンモノクローナル抗体(Chemico International Inc., Temecula, CA)の１：２００希釈中でインキュベーションした。抗原は、ＦＩＴＣ−接合ヤギ抗−ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove,PA)の１：２５０希釈を用いる間接免疫蛍光法により検出した。核はヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）を用いて対比染色した。免疫細胞化学染色の特異性は、特異競争性ヘパリン硫酸(Sigma, St. Louis, MO)、または非特異競争性コンドロイチン硫酸Ｃ(Sigma, St. Louis, MO)のいずれかを用い、最終濃度５μｇ／ｍｌで８時間、４℃、次いで切片に抗体を適用して、一次抗体の前染色により行った競争実験で確認した。
結果
気道上皮細胞の極性化カルチャーの感染に著しい極性が証明され、側底膜は頂端膜より２００倍形質導入可能であった（図１）。さらに、これらの試験は、レポーターＧＦＰ導入遺伝子の発現は、最高レベルに達するために著しい時間（４０日間）を要したことを示した。同様の知見は、他のｒＡＡＶレポター、例えばＡＶ．ＲＳＶ  Ａｌｋｐｈｏｓを用いても得られ、形質導入に要する時間遅れは、導入遺伝子カセットのためではないことを示唆している。免疫蛍光定位法を用いて、既知ＡＡＶ−２受容体の一つ（膜会合ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ＨＳＰＧ）が、分化した気道細胞の基底面に極限された限定された発現のパターンを有することが見いだされた（図２）。
【０１５９】
従って、ｒＡＡＶによる極性化気道上皮の形質導入は、頂端面と比較して側底面からの方がかなり大きい。この差は、基底面上のＨＳＰＧの制限された定位に少なくとも一部分は起因すると考えられる。ＨＳＰＧの同じ定位パターンが、独立した抗−ＨＳＰＧ抗体２個を用いる本来のヒト気管支組織で観察された（データは記載しない）。等張ＥＧＴＡ溶液を用いる頂端面の前処理による上皮密着結合の一時的な破壊は、頂端面に適用されたｒＡＡＶの形質導入を８倍増加させた(Duan et al., 1998) 。従って、側底膜への限定された接近は、ｒＡＡＶ形質導入に対する障害であろう。気道内でのｒＡＡＶ形質導入生物学の他の興味ある特徴は、有効な導入遺伝子発現に要する長い時間である。この知見には２種の可能な説明がある。第一は、核へのｒＡＡＶの輸送が遅い律速段階である。あるいは、発現可能な二本鎖形への一本鎖ｒＡＡＶゲノムの転換が律速段階である。
実施例２
側底膜におけるＡＡＶ結合
受容体の存在量が、ｒＡＡＶ結合が頂端面で律速であるという意見を支持し、最終的にこの事実はウイルス結合の直接評価を必要とすることを示す。この目的で、エンドサイトーシスが存在しない４℃における結合を研究するために放射能標識ウイルスを使用した。さらに、上記の遺伝子発現試験で記載したと同じ条件で全結合および侵入を研究した。他の系でｒＡＡＶを増加することが知られている環境刺激（すなわちＵＶ照射）も評価した。
方法
ウイルス結合および取り込みアッセイ。トリチウム標識ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを以前記載されたプロトコール(Summerford et al., 1998) に従い、いくつかの変更を加えて調製した。要約すると、ｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉおよびｐＲｅｐＣａｐプラスミドを用いるトランスフェクションおよびＡｄ．ＣＭＶＬａｃＺを用いる感染の７時間後に、メチル− 3Ｈチミジン（比放射能３１５９ＧＢｑ／ミリモル、NET-027Z, NEN Life Science Products, Inc. MA) を加えて最終濃度１μＣｉ／ｍｌの細胞培地とした。 3Ｈ−ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを精製した。代表的な収量は、３．６ｘ１０8 粒子／μｌ、比放射能４ｘ１０-7ｃｐｍ／ビリオンであった。極性化気管支上皮細胞へのｒＡＡＶの結合を評価するために、１００μｌ 3Ｈ−ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（ＭＯＩ＝６０，０００粒子／細胞、全体で１．２ｘ１０4 ｃｐｍ、３ｘ１０10粒子）を頂端面または側底面のいずれかに上記のように加え、そして４℃で９０分間インキュベーションした。分化した気道上皮内へのｒＡＡＶの複合結合／取り込みを同じ設定で測定したが、ただし、採取する前にカルチャーを３７℃で２４時間インキュベーションした。これらの複合ウイルス結合／取り込みアッセイを、終点として導入遺伝子発現を用いるｒＡＡＶ形質導入の機能性試験に使用しと同じ感染条件で行った。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、in situ でレディーセイフ(Ready Safe)液体シンチレーションカクテル(Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA)５ｍｌを用い、室温で５分間細胞を溶解し、そしてシンチレーションカウンターで放射能を定量した。結合および内部化されたｒＡＡＶ粒子の量の計算は、 3Ｈ−標識ビリオンの既知の比放射能に基づいて行った。
【０１６０】
ＵＶ照射。ＵＶ照射実験のためにミリセルインサートを一時的に空の１００ｍｍ組織カルチャープレート（頂端面が上）内に置き、そして２５ｊ／ｍ2 のＵＶ光（２５４ｎｍ）に暴露した。照射の後、ミリセルインサートを、側底面上にウルトラサー(Ultraser)−Ｇ培地を含むプレートに迅速に返還した。上記のように支持膜の頂端面または側底面のいずれかに１００μｌ中の５ｘ１０9 ｒＡＡＶ粒子の適用によるＵＶ照射の直後に、ｒＡＡＶの感染を行った。
結果
ｒＡＡＶ形質導入効率は、不死化した細胞株および非分裂一次細胞の両者において、細胞の生存率または増殖能力を著しくは改変しない用量においてＵＶ照射により改善できることが従来知られていた(Alexander et al., 1994; Ferrari et al., 1996)。一次カルチャーの頂端側または側底側のいずれかへのｒＡＡＶの適用の前のＵＶ照射（２５ｊ／ｍ2 ）の効果を評価した。図３Ａに示すように、ウイルスをＵＶ刺激の後に頂端面に加えた場合に、導入遺伝子発現における３０倍の増加が、処理の４０日後に観察された。この結果は、ＵＶを用いてＡＡＶ形質導入を増加した以前の成功を確認した(Alexander et al., 1994; Ferrari etal., 1996)。興味あることに、ＡＡＶ感染をＵＶ照射カルチャー室の側底側で行った場合に、効率は、やはり側底側から感染された非照射対照と比較して、感染４０日後に２倍低下した（図３Ｂ）。これらの結果は、ＵＶ照射が、極性化気道一次カルチャー内でｒＡＡＶ形質導入を調節する能力があることを示唆する。しかし、この調節の大きさおよび方向は感染の細胞面に依存して異なる。ＵＶ照射後の頂端面側からの増加した形質導入は、基底および頂端コンパートメント内のＡＡＶの非対称侵入および／またはプロセシング経路によるようである。ＵＶ照射後のＨＳＰＧの定位研究は、頂端面での検出できる増加は証明しなかったが、しかし基底膜での免疫反応性のほほ完全な低下を証明した(Duan et al., 1988)。これらの知見は、ＵＶ照射後のｒＡＡＶ形質導入における２種類の可能な変動の説明を示唆する。第一は、ＵＶ後の基底感染性の低下は、部分的にはＨＳＰＧ受容体の減少によるものであろう。第二は、検出可能なＨＳＰＧ受容体が存在しない場合の頂端膜でのｒＡＡＶ形質導入をＵＶが増加できることは、ＡＡＶ結合および取り込みのための別の経路が頂端膜で起きているに違いないことを示唆する。
【０１６１】
ＵＶ増強の機構およびＨＳＰＧ受容体存在量とｒＡＡＶ形質導入との相関をさらに研究するために、放射能標識ｒＡＡＶを結合およびウイルス取り込みを試験するために使用した。これらの研究からの知見は、４℃における側底膜へのより高い結合を確認し、従ってＨＳＰＧ定位研究を支持する（図４）。しかし、結合の差が６〜７倍に過ぎないことは、結合の他にｒＡＡＶ形質導入より他の現象が、頂端膜および側底膜からの形質導入における２００倍の変動を起こしているに違いないことを示唆する。第二のユニークな知見は、３７℃で２４時間でのウイルス結合および取り込みが、４℃における頂端膜および側底膜の両方からのものと同等であったことである（図４）。この観察は、ウイルス結合が比較的効率的であり、そしてウイルスの取り込み（またはエンドサイトーシス）がｒＡＡＶ形質導入に関係する限定因子であることを示唆する。さらに、頂端面形質導入を３０倍増加するＵＶ照射に続いて、４℃または３７℃のいずれでも頂端面からのウイルス結合／取り込みに検出可能な変化をもたらさない。この知見は、ｒＡＡＶ結合単独ではｒＡＡＶ形質導入の効率と相関しないことを強調する。
【０１６２】
頂端膜および側底膜からのｒＡＡＶ形質導入における差を起こすその他の因子をさらに評価するために、ナイル・レッドビーズ(Nile Red beads)（ＡＡＶ粒子と類似した大きさ、２０μｍ、を有する）を頂端膜および側底膜からのエンドサイトーシス速度の評価に利用した。これらの研究は、側底膜が頂端膜よりも著しく高い受容体非依存性エンドサイトーシスの速度を有することを証明した（図５）。さらに、ＵＶ照射の後に、ナイル・レッドビーズの取り込みが著しく増加した（図５）。これらの知見は、増加したベクター結合が存在しない場合に、ＵＶ照射により誘導される律速段階としてのウイルスのエンドサイトーシスを意味する。
【０１６３】
これらの知見は、極性化気道上皮における頂端膜と側底膜との間の機能的な相違を強調し、そして基底膜における一層高い結合レベルおよび一層高いエンドサイトーシス速度が、増加した形質導入を起こしているらしいことを示唆する。さらに、微繊毛を含む細胞骨格構造の著しい再構成を起こす(Duan et al., 1988)頂端膜へのＵＶ照射が、ウイルス結合における変化がない場合に頂端膜エンドサイトーシスで著しい増加をもたらし、側底膜エンドサイトーシスではもたらさない。これらの研究は、頂端膜からのｒＡＡＶ形質導入における律速段階としてのエンドサイトーシスの速度および／または核へのウイルスの転送を示唆する。
実施例３
Ｃｙ３標識ｒＡＡＶを用いるウイルスエンドサイトーシスおよび核への転送の評価
ＡＡＶのエンドサイトーシスおよび核転送をこれらの過程を調節する種々の薬剤を用いる処理の後で試験するために、蛍光標識ウイルスを調製した。ウイルスを下記のプロトコールを用いて標識した。３回ＣｓＣｌバンド精製した(banded)ｒＡＡＶ（ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ）をAmersham(Piscataway, NJ)からの変更した方法を利用して２官能性ＮＨＳ−エステル  カルボシアニン−Ｃｙ３と接合した。この方法は、Ｃｙ３をウイルスキャプシド内のアミン基をエステル結合として接合する。要約すると、ウイルス５ｘ１０11粒子を３０分間、４℃で、ＮＨＳ−エステル  カルボシアニン−Ｃｙ３の上昇する濃度を用いて丁度１ｍｌの反応容積中でインキュベーションした。架橋反応の数種の反応条件で、染料：ｒＡＡＶ粒子比０．２、１、５、２５、１００、および２００を用いて評価した。溶液を透析室（１０，０００ＭＷカットオフ、Gibco BRL, Gaithersburg, MD ）に移送し、そして２４時間、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む透析緩衝液を２回交換して透析した。最後に、試料を血清を含まないＤＭＥＭ中で一晩透析し、そしてセントリコン(Centricon, Amicon) 中で濃縮した。この溶液を、ガラススライド上のＨｅＬａ細胞のウイルス感染のために４℃で９０分間、血清を用いないで直接使用した。ウイルスの４℃結合の後、スライドを血清を含まない媒体中で２回洗浄し、そして分析のために固定するかまたは１０％血清含有媒体の存在下での連続感染のために３７℃シフトした。１００の染料−対−粒子比を用いた条件が最善の結果を与えた。
【０１６４】
これらの標識実験からの結果を図１８に示し、そして標識ウイルスがエンドサイトーシスがない場合の４℃において細胞表面へ有効に結合することを、予想どおりに証明した。６０分間、３７℃において、細胞質内のウイルスの存在量の目に見える上昇が認められ、これは１２０分間、３７℃で核に有効に輸送されたものである（図１８ＡおよびＢ）。さらに、標識ウイルスは、同様の擬標識したウイルスストックと比較して、ＨｅＬａ細胞上の感染２４時間後のＧＦＰ発現の９５％以上の機能性形質導入を保持した。ウイルス結合は、感染の時点でヘパリンにより濃度依存性で阻害された（図１８Ｃ）。ヘパリンは、ヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体との結合をブロックすることにより、ＨｅＬａ細胞内の大部分のｒＡＡＶ形質導入を阻害することがすでに知られている。Ｃｙ３−標識ｒＡＡＶは、ＧＦＰ導入遺伝子発現により測定して、その官能性形質導入活性の９５％以上を保持した。従って、大部分の標識ビリオンは、エンドサイトーシスに対して機能的に活性である。極性化気道上皮細胞モデルにおけるｒＡＡＶのエンドサイトーシスに関して、Ｃｙ−３標識ｒＡＡＶとＦＩＴＣ標識トランスフェリンとの同時定位は、大部分のＡＡＶ粒子がトランスフェリン含有ベシクル内にエンドサイトーシスされていることを証明する（図１８Ｄ）。従って、ｒＡＡＶはクラスリン被覆ピットを通じてエンドサイトーシスされるようである。
実施例４
エンドソーム処理がＡＡＶ形質導入を制限する
側底膜がより高いエンドサイトーシス速度を有しそしてＵＶ照射が頂端膜からのエンドソーム取り込みおよびｒＡＡＶ形質導入を増加するという知見に基づいて、ウイルス取り込みおよび核への輸送に影響するエンドソーム経路が頂端膜からでは制約であることが可能である。反対に、これらの経路は、気道上皮細胞の側底膜からでは最大レベルで活性であろう。エンドソームプロセシングの重要性をさらに研究するために、エンドソームプロセシングを改変することが知られている数種の化合物の効果を評価した。
方法
最初の研究は、用量滴定および毒性が迅速にアッセイできるので、集密一次ヒト繊維芽細胞内で行った。選択した化合物をｒＡＡＶ感染の前に繊維芽細胞単層を処理するために使用した。ｒＡＡＶ形質導入は、感染９６時間後にＦＡＣＳ分析により評価し、そして死滅細胞の割合をヨウ化プロピジウムの組込みにより同時に評価した。
【０１６５】
これらの化合物は、ノコダゾール(nocodazole, Sigma, St. Louis, Mo;解重合した微小管で、リソソーム散乱を起こす）、硫酸ビンブラスチン(vinblastin sulfate, Sigma, St. Louis, Mo;解重合した微小管で、細胞内エンソドームおよびリソソームの運動をブロックしてエンドサイトーシスを阻害する）、サイトカラシンＢ（cytochalasin B, Sigma, St. Louis, Mo; 解重合した微小繊維、すなわちアクチンで、エンドソームとリソソームとの融合をブロックする。細胞内のエンドソームとリソソームの運動をブロックしてエンドサイトーシスを阻害する）、ブレフェルジンＡ（brefeldin A, BFA, Sigma, St. Louis, Mo; ＥＲからゴルジへのタンパク質輸送を可逆的にブロックする。ＢＦＡは頂端側からのエンドサイトーシスを増加するが側底側からは増加しないことが知られている、Prydz et al., (1992)参照）、ＮＨ4 Ｃｌ（Sigma, St. Louis, Mo; エンドソームｐＨを上昇させる向リソソーム試薬であって、そしてイヌパルボウイルス脱外被を阻害することが示されている。Basak et al.(1992)参照）、クロロキン（Sigma, St. Louis, Mo; エンドソームｐＨを上昇させそしてリソソームシステインプロテアーゼのカテプシンＢを阻害する向リソソーム試薬であって、そしてイヌパルボウイルス脱外被を阻害することが示されている。Basak et al.(1992)参照）、およびＬＬｎＬ（Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル、Calbiochem-Novabiochem Corp. LaJolla, CA) およびＺ−ＬＬＬ（Ｎ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルバリナル、Calbiochem-Novabiochem Corp. LaJolla, CA) 、これらはトリペプチト性のアルデヒドシステインプロテアーゼ阻害剤である。これらのトリペプチドは、構造的にクロロキンに類似しているが、異なる脂質溶解性およびシステインプロテアーゼに対する特異性を有する(Seglen, 1983)。これらの分子は、ｐＨ変化とは異なる機構で分子のエンドソーム分解を低下する。これらは２６Ｓユビキチンおよびプロテアソーム依存性タンパク質分解経路を阻害することも知られている(Rock et al., 1994) 。
結果
イヌカルボウイルスに関して以前に報告されたように(Basake et al., 1992)、エンドソームｐＨを上昇させるＮＨ4 Ｃｌおよびクロロキンの両者は、ｒＡＡＶ形質導入を著しく阻害した（図６）。これらの結果は、ウイルス放出の促進および／または感染後の脱外被におけるエンドソームｐＨの重要性を支持する。さらに、微小フィラメントの形成を中断するサイトカラシンＢのような試薬は、ｒＡＡＶ形質導入に著しい低下をもたらし、アクチン微小フィラメントがｒＡＡＶ形質導入にある役割を有することを示唆する。さらに、微小管解重合を促進しそしてＭＤＣＫ内でのエンドサイトーシスを低下の両方するビンブラスチンは、ｒＡＡＶ形質導入にほとんど作用しない。
【０１６６】
しかし、最も興味があるのは、ＥＲからゴルジへの小胞輸送を中断しそしてＭＤＣＫ細胞内の頂端膜エンドサイトーシスを増加することが知られているＢＦＡを用いる処理(Prydz et al., 1992)が、著しいｒＡＡＶ形質導入増加に導くことである。ＥＲからゴルジへの小胞輸送の重要性は明らかではないが、しかし、ＵＶ照射が膜エンドサイトーシスも増加しそしてＢＦＡも同じことを行うことが示唆されている知見を考慮すると、これらの知見は、受容体結合ｒＡＡＶの膜エンドサイトーシスの速度が形質導入における律速段階ではないかと示唆する。ＢＦＡに対すると同様に、２種のエンドソームプロテアーゼ阻害剤（トリペプチドのＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬ）は、両者ともｒＡＡＶ形質導入を著しく増加する。これらのトリペプチドは、これまでプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率の上昇のために使用され、そしてＤＮＡのリソソーム分解を阻害すると考えられていた(Coonrod etal., 1997) 。
【０１６７】
データは、エンドサイトーシスおよびエンドソームプロセシングがｒＡＡＶ形質導入において鍵となる律速段階であるという仮説を支持する。微小管ではなくて、アクチン微小フィラメントがｒＡＡＶ形質導入に重要であり、核へのｒＡＡＶ輸送を促進することにより作用するであろうと考えられる。さらに、サイトカラシンＢは、極性化ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルスによる頂端側感染を有効にブロックし、側底側はしない(Gottlieb et al., 1993) 。これらの知見は、エンドサイト小胞は極性化上皮細胞の２面で形成される過程に基本的な差があり、そしてアクチン繊維の完全性および／または重合が頂端面で要求されることを示す。しかし、微小管解重合剤、例えばビンブラスチンがｒＡＡＶ−２形質導入を阻害しないという知見は、イヌパルボウイルスのノコダゾール阻害に関する以前の報告(Vihinen-Tanta et al., 1998)とは異なる。最後に、トリペプチドプロテアーゼ阻害剤を用いた研究は、ｒＡＡＶ形質導入における著しい増加を証明した。この知見は、ウイルスのエンドソーム分解および／またはエンドソーム放出が、ｒＡＡＶ形質導入における重要な律速段階であることを示唆する。
実施例５
放射能標識ｒＡＡＶを用いるエンドサイトーシスおよび核への転送の評価
放射能標識ウイルスは、エンドサイトーシスおよび核転送に関する試験でＣｙ３−標識ウイルスに対していくつかの独特の利点を提供する。第一に、Ｃｙ３−標識ウイルスとは異なり、35Ｓ−および 3Ｈ標識ウイルスを用いると、ビリオンに対する共有結合修飾を必要としない。従って、共有結合修飾した分子による転送に対する凝集またはその他の未知の作用に遭遇しない。第二に、35Ｓ−および 3Ｈ標識ウイルスと比較して、ウイルスキャプシドタンパク質およびＤＮＡの運命がそれぞれ評価できる。ｒＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉは、下記のプロトコールで標識された。準集密(subconfluent)２９３細胞の２０枚の１５０ｍｍプレートに、Ａｄ．ＬａｃＺ（５ｐｆｕ／細胞）を用いて１時間感染させ、次いでｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＧ１ｏｒｉ（２５０μｇ）およびｐＲｅｐＣａｐ（７５０μｇ）のリン酸カルシウムトランスフェクション。細胞をさらに１０時間インキュベーションし、その時点で培地を２％ＦＢＳメチオニン不含ＤＭＥＭに４５〜６０分間交換した。次いで培地を、２％ＦＢＳメチオニン不含ＤＭＥＭ中４００ｍｌあたりの35Ｓ−メチオニンの１５ｍＣｉを含む標識培地に再交換し（最終＝１．４９ＭＢｑ／ｍｌ）そして細胞を１．５時間、３７で標識適用(pulse) した。標識適用の後、Ｌ−メチオニンを最終濃度３０ｍｇ／Ｌまで再度加え、細胞をさらに３０時間、３７℃でインキュベーションした。細胞溶解物を調製しそしてウイルスを精製した。標識したウイルスの代表的な比放射能は、５ｘ１０-6ｃｐｍ／粒子であり、これは５．５ｘ１０-7ｃｐｍ／粒子の比放射能のこの分野での他の報告よりもいくらか高かった(Baetlett et al., 1999) 。
【０１６８】
ＬＬｎＬの存在または不在でのｒＡＡＶが核へ転送する効果を比較した結果を図１９に示す。ＬＬｎＬの存在または不在での頂端側と側底側からの35Ｓ標識ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）で感染した極性気道上皮細胞の凍結切片を写真エマルションの上に置きそして５週間暴露し、次いで現像した。図１９ＡおよびＢの顕微鏡写真は、ＬＬｎＬの存在下での側底面感染の後の銀粒子により示されるウイルスの核および細胞質蓄積を証明する。銀粒子に関連する細胞質および核の形態測定分析を図１９Ｃに示し、そしてこれは感染２時間後のＬＬｎＬの存在下での核転送の著しい増加を証明する。ウイルスの核蓄積の増加は、頂端側と側底側感染の後のＬＬｎＬの存在下で認められる。従って、ウイルスのエンドサイトーシス速度および核転送は、気道内での律速であるようであり、そしてこれらの過程はトリペプチドプロテアーゼ阻害剤により増加した。
実施例６
エンドソームプロセシング阻害剤は、極性化気道細胞内のｒＡＡＶ形質導入を増加する
材料および方法
ヒト気管支上皮の一次カルチャーおよび使用した試薬
一次ヒト気道上皮細胞は、以前の記載のように、肺移植体からの気管支試料の酵素消化により捕集した(Kondo et al., 1991; Zabner et al., 1996) 。単離した一次気道細胞を密度５ｘ１０5 細胞／ｃｍ2 でコラーゲン被覆ミリセル−ＨＡカルチャーインサート(Millicell-HA culture inserts, Millicell Corp., Bedford, MA)上に接種した。一次カルチャーを空気−液体界面で２週間以上培養し、その時点で粘膜微繊毛上皮細胞への分化が起きた。細胞の側底側への供給のみに使用した培地は、４９％ＤＭＥＭ、４９％Ｈａｍ’ｓＦ１２および２％ウルトラサーＧ(BioSepra, Cedex, France) を含んでいた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐ）、エトポシド（Ｅｔｏｐ）、アフィジコリン（Ａｐｈｉ）、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）およびゲニステイン（Ｇｅｎｉ）は、Sigma(St. Louis, MO)から購入した。トリペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害剤Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−ノルロイシン（ＬＬｎＬ）およびベンゾキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシナル（Ｚ−ＬＬＬ）は、Calbiochem-Novabiochem Corp.(LaJolla, CA) から購入した。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）阻害剤は、Bachem Bioscience (King of Prussia, PA) から入手した。抗−ＡＶＶキャプシドモノクローナル抗体（抗−ＶＰ−１、２および３）は、American Research Products (Belmont, MA)から購入し、そして抗ユビキチン抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA) から購入した。
【０１６９】
組換えＡＡＶウイルスストックの調製。組換えＡＡＶは、ＣａＰＯ4 同時トランスフェクションプロトコールにより作製し、そして上記の実施例１記載のようにして、等密度の塩化セシウム超遠心分離３回により精製した。プロウイルスプラスミドｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉは、Duan et al.(1998) により記載されている。ＲＳＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリ−アデニル化シグナルの転写制御下でアルカリホスホターゼレポーター遺伝子をコードするプロウイルスプラスミドｐＣｉｓＲＳＶ．ＡｌｋｐｈｏｓをＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ作製に使用した(Yang et al., 1999) 。ＡＶ．ＬａｃＺ作製に使用したプロウイルスプラスミドｐＣｉｓＲＳＶ．ＬａｃＺは、最初に３４７４ｂｐ  ＮｏｔＩ消化β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＣＭＶβ、Clontechから）をｐＲｅｐ４(Invitrogen)のＮｏｔＩ側に挿入して作製した。ＲＳＶプロモーター、β−ガラクトシダーゼレポター遺伝子およびＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナルを含む全β−ガラクトシダーゼ発現カセットをＳａｌＩにより切除し、次いでｐＳｕｂ２０１骨格中に平滑末端連結によりクローンした(Samulski et al., 1987) 。組換えウイルスストックを５８℃に６０分間加熱して汚染しているヘルパーアデノウイルスを不活性化した。代表的な収量は、プラスミド標準に対するＤＮＡスロットブロットハイブリダゼーションアッセイに基づいて５ｘ１０5 〜５ｘ１０9 細胞／μｌであった。繁殖に対して使用した組換えアデノウイルス（ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉに対してはＡｄ．ＣＭＶＡｌｋｐｈｏｓ、ＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓに対してはＡｄ．ＣＭＶＬａｃＺ、ＡＶ．ＬａｃＺに対してはＡｄ．ＣＭＶＧＦＰ）に対する第二レポーターアッセイ(Duan et al., 1997) に基づいて、アデノウイルス汚染のレベルは、アデノウイルスの存在下での２９３細胞の感染に使用したｒＡＡＶ粒子１ｘ１０10あたりに機能性粒子１個以下であった。Ｒｅｐ／Ｃａｐコード化プラスミドを用いるトランスフェクションは、Ｒｅｐタンパク質の抗体染色に対する対照として役立った。生体外または生体内感染の前に、ウイルスをＰＢＳ中で透析した。
【０１７０】
極性化気道上皮細胞および一次ヒト繊維芽細胞の形質導入。完全に分化した気管支細胞のｒＡＡＶ感染は、Duan et al.(1998) の記載のようにして行った。気道細胞の頂端面からの感染のために、５μｌｒＡＡＶを培地５０μｌと混合しそしてミリセルインサートの頂端コンパートメントに直接適用した（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）。頂端面感染の間に、ミリセルの側底側は連続的に培地に浸した。基底側への遺伝子転移は、ミリセルインサートを反転しそして支持しているフィルター膜の底にウイルスベクター体積５０μｌで２時間適用して行った。次いで、当初のウイルス接種物の連続した存在と追加の培地４５０μｌ中でミリセルインサートを正しい位置に戻した。頂端側および側底側の両方の感染のために、ｒＡＡＶ含有培地を２４間後に取り去り、そして新しいカルチャー培地に交換（基底側）または空気に暴露（頂端側）した。極性化気道細胞内のＡＡＶ形質導入の効力に対する種々の薬剤の効果を試験するために、気道上皮感染の前にそれぞれの溶液１μｌをＡＡＶと混合した。薬剤は、別途断らない限り、通常２４時間のＡＡＶ感染期間中存在した。大部分の薬剤はＤＭＳＯ中に溶かしたが、ただし、ヒドロキシ尿素（リン酸塩緩衝生理食塩水中に溶解）、Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（０．９％氷酢酸中に溶解）およびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ（５０％メタノール中に溶解）を除く。薬剤の作用濃度は下記である。０．１μＭカンプトテチン、１０μＭエトポシド、５μｇ／ｍｌアフィジコリン、４０ｍＭヒドロキシ尿素、５０μＭゲニステイン、４０μＭ  ＬＬｎＬおよび４μＭ  Ｚ−ＬＬＬ。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）阻害剤（Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ）を使用する場合には、気道細胞を、感染の前に最終濃度２ｍＭの両方の阻害剤の混合物を６０分間前処理し、次いで側底面からの２４時間感染の全期間に阻害剤（０．２ｍＭ）を連続した存在させた。ＥＧＴＡ処理を含む研究は、水中の３ｍＭ  ＥＧＴＡを用いる１０分間の極性化気道上皮の頂端膜の一時的処理により行った(Duan et al., 1998) 。等張ＥＧＴＡ処理の後、カルチャーを培地を用いて２回洗浄し、そして４０μＭ  ＬＬｎＬの存在または不在においてｒＡＡＶを用いて感染させた。ヒト一次繊維芽細胞（Ｐ４）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン、および８９％ＤＭＥＭ中に維持した。ＡＶ．ＧＥＰ３ｏｒｉを用いる感染は、２％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中の１０００ＤＮＡ粒子／細胞のＭＯＩにおける８０％集密繊維芽細胞を用いて２４時間行った。
【０１７１】
ｒＡＡＶのＳ35標識。ｒＡＶ．ＧＥＰ３ｏｒｉのキャプシドタンパク質中のメチオニン残留物を、変更を加えた以前に公開したプロトコール(Mizukami et al., 1996) に従って放射性ウイルスストックの作製の間に標識した。要約すると、準集密２９３細胞の２０枚の１５０ｍｍプレートを、Ａｄ．ＬａｃＺ（５ｐｆｕ／細胞）を用いて１時間感染させ、次いでｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（２５０μｇ）およびｐＲｅｐＣａｐ（７５０μｇ）のリン酸カルシウムトランスフェクションを行った。細胞をさらに１０時間インキュベーションし、その時点で培地を２％ＦＢＳメチオニン不含ＤＭＥＭに４５〜６０分間交換した。培地を２％ＰＢＳメチオニン不含ＤＥＤＭの４００ｍｌあたりにＳ35メチオニン１５ｍｌを含む標識培地（最終＝１．４９ＭＢｑ／ｍｌ）に再交換し、そして細胞を１．５時間、３７℃で標識適用した。標識の後、Ｌ−メチオニンを最終濃度３０ｍｇ／Ｌまで加えて戻し、そして細胞をさらに３０時間、３７℃でインキュベーションした。細胞溶解物を調製し、そしてウイルスを上記のようにして等密度塩化セシウム超遠心分離により精製した。標識ウイルス調製物の代表的な比放射能は、５ｘ１０-6ｃｐｍ／粒子であり、これは他の研究者により報告された５．５ｘ１０-7ｃｐｍ／粒子より少し高い(Bartlet et al., 1999)。
【０１７２】
ウイルス結合／侵入アッセイおよびウイルス粒子のin situ 定位。極性化気管支上皮細胞へのｒＡＡＶの結合を評価するために、Ｓ35標識ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを頂端面または側底面のいずれかに適用し（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）、次いで４℃で６０分間培養した。分化した気道上皮内へのｒＡＡＶの複合結合／侵入を同じ条件下で測定したが、ただし、採取の前に培地を３７℃でさらに２〜２４時間インキュベーションした。これらの複合ウイルス結合／侵入アッセイは、同じ条件下で、導入遺伝子発現を終点とするｒＡＡＶ形質導入の機能性研究のためのものに使用して行った。ＰＢＳを用いた洗浄３回の後に、細胞をin situ で液体シンチレーションカクテル５ｍｌを加えて室温で５分間溶解させ、そして放射能をシンチレーションカウンターで定量した。
【０１７３】
極性化ヒト気管支上皮細胞内のｒＡＡＶ粒子の細胞下レベル定位を分析するために、Ｓ35標識ウイルス（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）を粘膜または漿膜面に適用して感染を行った。感染の２時間後に、トランスウエル(transwell) を培地を用いて３回洗浄しそして４％パラホルムアルデヒド内で一晩固定し、次いで凍結保護および凍結割断のために埋め込んだ。１０μｍ凍結切片を写真エマルション上に置き、前に公開したプロトコールに従って５週間現像した(Duan et al., 1998) 。
【０１７４】
極性化気道上皮カルチャーの感染の後のｒＡＡＶウイルスゲノムの分子分析。結合してエンドサイトーシスしたウイルスの分子状態を、ｒＡＡＶ感染の後に種々の時点でアッセイした。細胞表面に付着したウイルスの量を試験するために、ｒＡＡＶ感染を４℃で１時間行った。結合の後、ウイルスの内部化の程度を、ウイルスの存在下、３７℃で４〜２４時間の連続インキュベーションにより評価した。ウイルスＤＮＡを変更したヒルト(Hirt)プロトコールに従って抽出し、そしてハイボンド(Hybond)Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)を用いてサザンブロットを行った(Duan et al., 1997) 。ウイルスゲノムからの１．６ｋｂ一本鎖ウイルスＤＮＡ、２．７ｋｂ二本鎖環状中間体、および４．７ｋｂ二本鎖複製物を、５ｘ１０6 ｃｐｍ／ｍｌでの導入遺伝子ＥＧＦＰ特異性プローブを用いて検出した。ブロットを０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５５℃で２０分間のストリンジェンシーで２回洗浄した。ウイルス内部化を評価する目的の研究において、細胞表面に付着したウイルスを、０．５％トリプシン、および５．３ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液１ｍｌを用い３７℃で１０分間でトリプシン処理して除去し（ミリセルインサートの頂端側および側底側コンパートメントに５００μｌ緩衝液を加えた）、次いで氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した。外部に結合したＡＡＶウイルスを、４℃で６０分間感染した細胞から抽出したＨｉｒｔ  ＤＮＡ中の１．６ｋｂウイルスゲノムバンドの強度により決定した。内部化したウイルスは、感染後に３７℃で４および２４時間トリプシン処理した細胞から抽出したＨｉｒｔ  ＤＮＡ中の１．６ｋｂウイルスゲノムバンドの強度により決定した。内部化ウイルスの分子構造内の動的変化は、ウイルスを培地から取り出した後、２、１０、２０、３０および５０日でアッセイした。
【０１７５】
免疫沈降によるユビキチン化ＡＡＶキャプシドタンパク質の検出。ＡＡＶユビキチン化に対するプロテアソーム阻害剤の効果を分析するために、ヒト一次繊維芽細胞をウイルス感染の６時間後に、１Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。次いで、細胞溶解物を３０μｌタンパク質Ａ−アガロースを用いて透明化(cleared)した。上清をモノクローナル抗−ＶＰ１、２、および３抗体（クローンＢ１、ＡＲＰ）の１０μｌと一緒にインキュベーションし、次いで３０μｌタンパク質Ａ−アガロースを加えた。ペレットをＩＸ  ＲＩＰＡ緩衝液を用いて４回洗浄し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ニトロセルロースフィルター上に転移した後、ブロットを、抗−ユビキチンモノクローナル抗体（クローンＰ４Ｄ１、Santa Cruzカタログ#SC8017）の１：１０００希釈物、次いで１：５００ＨＲＰ−接合二次抗体（ＢＭＢ）を用いてプローブした。最終洗浄の後、免疫反応性をＥＣＬシステム(Amersham)を用いて可視化した。
【０１７６】
マウス内の生体内試験。動物実験は、アイオワ大学の制度化した指針に従って行った。マウス肺内のＡＡＶ媒介遺伝子転移に対するプロテアソーム阻害剤の影響を決定するために、６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスをメトキシフルラン室を用いて軽く麻酔した。ＡＶ．ＬａｃＺ（５ｘ１０10粒子）を単独または１０μｌ点滴注入液中の４００μＭ  Ｚ−ＬＬを用いて、Walters et al.(2000)が記載したようにして鼻噴霧により投与した。ＤＭＳＯ溶剤の予期しない毒性を防止するために、プロテアソーム阻害剤Ｚ−ＬＬＬをエタノール中に４０ｍＭストック溶液として溶かし、そして１％最終濃度でウイルス接種物中に含ませた。Ｚ−ＬＬＬを含まないウイルス感染対照も１％最終濃度のエタノールを含んでいた。一次培養したヒト気道細胞および繊維芽細胞の両方の研究が４０μＭ  ＬＬｎＬおよび４μＭ  Ｚ−ＬＬＬの間で近い増加効率であることを証明し、そしてエタノール中のＬＬｎＬの低い溶解度のために（実施例７では、気管に投与されたＤＭＳＯ中のＬＬｎＬの低い用量を使用した）、この特定のマウス肺研究にはＺ−ＬＬＬのみを試験した。感染の２、１０および１５０日後に動物を安楽死させそしてＰＢＳ（１０ｍｌ）を右心室中に点滴注入し、次いで肺および心臓を不変のカセットとして取り出した。気道に管を挿入し、水圧力１０ｃｍで下記の溶液を順番に点滴注入した。ＰＢＳ、０．５％グルタルアルデヒド、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ／ＰＢＳ、および最後に室温で一晩のインキュベーションのためのＸ−ｇａｌ染色試薬。次いで、Ｘ−ｇａｌ染色したマウス肺を１０％中性緩衝ホルマリン中、４８時間、室温で後固定し、そして順番に、１０％、２０％および３０％スクロース／ＰＢＳ溶液中で凍結保存した。肺（それぞれの条件でＮ＝３）をＯＣＴ（最適切断温度、Baxter, Warrendale, PA) 内に埋め込みそして１５μｍの順次切片を、気道上皮内の陽性細胞の割合を計算して遺伝子導入に関して分析した。気道の直径を形態測定分析の結果の分類のために記録した（＞３６０μｍ、２６０〜３５０μｍ、１６０〜２５０μｍ、＜１５０μｍ）。１５０より大きい気道断面をそれぞれの実験条件に対して定量した。
結果
極性化気道上皮内のｒＡＡＶゲノムの分子分析
最近の研究は、分化した気道上皮の頂端面において、ＡＡＶ−２受容体、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび共受容体、ＦＧＦＲ−１およびαＶβ５インテグリンの欠失を明らかにした(Duan et al., 1998; Duan et al., 1999; Hugheset al., 1993; Goldman et al., 1999) 。しかし、頂端膜および側底膜における放射性ウイルスの結合の差は、４〜７倍に過ぎない（側底＞頂端）(Duan et al., 1998) 。結合におけるこれらの差は、ｒＡＡＶ−２を用いる感染の極性で観察された２００倍の変動（側底＞＞頂端）を説明するには不十分である(Duan et al., 1998) 。これらの知見は、ウイルス結合および／または取り込みが、気道上皮内の不十分な粘膜導入に寄与する単独の限定因子ではないことを示唆する。この目的で、空気−液体界面でカルチャーされたヒト気管支上皮の頂端側および側底側感染の５０日後におけるｒＡＡＶ  ＤＮＡの分子状態を評価した。この時点で、ＥＧＰＦレポーターから測定された遺伝子発現は、側底側に感染されたカルチャー内が２００倍以上高かった（データは記載しない）(Duan et al., 1998)。カルチャーからのＨｉｒｔ  ＤＮＡを、32Ｐ標識ＥＧＰＦプローブを用いるサザンブロットハイブリダゼーションにより評価した。図８に示すように、頂端側適用ｒＡＡＶの顕著な量が気道細胞を感染することができた。しかし、この時点（５０日後）では、一本鎖ウイルスゲノム（ｓｓＤＮＡ）のみが検出された。この結果は、ｒＡＡＶが粘膜表面からエンドサイトーシスすることができ、そしてエンドサイトーシスされたウイルスｓｓＤＮＡはある未知の細胞内コンパートメント内に安全に隔離されていることを明らかに示唆する。反対に、大部分の側底側適用ｒＡＡＶは二本鎖形に変換され、これらは１％非−変性アガロースゲル中で２．８ｋｂおよび＞１２ｋｂで移動したことを明らかに示唆する（図８）。従来の報告と一致して(Sanlioglu et al., 1999; Duan et al., 1999) 、その後のＨｉｒｔ  ＤＮＡの制限酵素マッピングおよびサザンブロットは、２．８ｋｂバンドがスーパーコイル化した環状エピソーム分子であることを確認した（データは記載しない）。側底側感染の後に著しく強くなる＞１２ｋｂバンドの実体は、現在では未知であるがしかしＡＡＶゲノムのエピソーム環状コンカテマーを表すであろう。総合すると、これらの結果は、ＡＡＶウイルスＤＮＡの環状ゲノムへの不十分な分子転換が、気道の頂端面からのｒＡＡＶ媒介遺伝子導入に対する著しい障害となっていることを示唆する。さらに、自己開始による線型複製ではなくて環状化が、極性化気道上皮内のｒＡＡＶ変換に対する主要な経路である。
【０１７７】
プロテアソーム阻害剤は、極性化気道上皮内のｒＡＡＶ感染を劇的に増加する。ｒＡＡＶが気道内で頂端感染の後に、ある細胞コンパートメント内に潜在しているように見えること、およびウイルスゲノムの分子転換を改変する薬剤が気道上皮内のｒＡＡＶ形質導入を増加させるのではないかとの事実を考慮して、数種の薬剤をこの観点から試験し、これには、ＤＮＡ損傷剤(Alexander et al., 1994)、ＤＮＡ合成およびトポイソメラーゼ阻害剤(Russel et al., 1995) 、および細胞チロシンキナーゼ阻害剤(Qing et al., 1997; Man et al., 1998) が含まれる。カンプトテチン、エトポシド、ヒドロキシ尿素、およびゲニステインの適用は、側底面からのｒＡＡＶ形質導入に１０〜６０倍の増加をもたらした（図９）。しかし、興味あることには、これらの薬剤のいずれも頂端面からのｒＡＡＶ形質導入を促進しなかった（データは記載しない）。他の細胞タイプ内でｒＡＡＶ形質導入に関与する核内イベントに影響することが知られている化学薬品(Sanlioglu et al., 1999)は、気道内でのｒＡＡＶ頂端側感染を促進しないことが知られているので、細胞内過程、例えばユビキチン−プロテアソーム経路に影響する他の薬品を試験した。プロテアソーム系は、ＨＩＶなどのウイルスを含む多数の外来および内在性分子の細胞内プロセシングを調節することが知られている(Schwartz et al., 1998) 。プロテアソーム経路の数種の特異性、細胞透過性のペプチドアルデヒド阻害剤が最近発見されている(Rock et al., (1994); Fenteany et al., 1995)。これらの阻害剤は、プロテアソームコア内のタンパク質分解性酵素の活性部位に結合し、そしてこれらの機能を可逆的にブロックする(Rubin etal., 1995)。プロテアソームが感染後にｒＡＡＶを封鎖する細胞内コンパートメントであるかどうかを試験するために、トリペプチド性アルデヒドプロテアソーム阻害剤（システインプロテアーゼ阻害剤）Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル（ＬＬｎＬ、カルパイン阻害剤Ｉとも呼ばれる）を、ｒＡＡＶ感染の時点でヒト気管支上皮細胞の極性化カルチャーに適用した。意外にも、４０μＭ  ＬＬｎＬをｒＡＡＶと同時に漿膜面に適用すると、導入遺伝子発現に２００倍以上の増加が感染後２日で得られた（図９）。同様の結果は、他のユビキチン−プロテアソーム経路阻害剤のＮ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル（Ｚ−ＬＬＬ、ＭＧ１３２とも呼ばれる）(Jansen et al., 1995) を試験しても得られた（データは記載しない）。しかし、最も重要な知見は、これらのプロテアソーム阻害剤も本質的に粘膜面からのｒＡＡＶ形質導入を増加することである（下記参照）。他の薬剤と比較して、プロテアソーム阻害剤は気道上皮におけるｒＡＡＶ形質導入の最も強力なエンハンサーであることが見いだされた。
【０１７８】
プロテアソーム阻害剤は極性化された様式で気道上皮内のｒＡＡＶ形質導入を増加させる。プロテアソーム阻害剤は漿膜面からのｒＡＡＶ形質導入の効果を著しく増加するように見えるけれども、気道内の遺伝子送達の臨床適用に最も適切な経路は粘膜面である。頂端膜からのｒＡＡＶ形質導入に対するプロテアソーム阻害剤の効果を試験するために、ＬＬｎＬ処理後の気道上皮の粘膜面および漿膜面の両方からのｒＡＡＶ形質導入の対比速度比較を行った。図７Ａに示すように、粘膜面へのＬＬｎＬとｒＡＡＶの同時投与は、ＡＡＶ形質導入の持続的な増加をもたらし、これは感染の２２日後にピークに達した。粘膜感染とは対照的に、ＬＬｎＬの存在下での漿膜面からのｒＡＡＶ感染は、感染の７２時間後の遺伝子発現に一過性のピークをもたらしただけであり、これは２２日までに非処理試料のものと同等のレベルに戻った（図７Ｂ）。これらの結果は、ＡＡＶウイルスが頂端膜または側底膜のいずれかに適用された場合に、プロテアソーム阻害剤ＬＬｎＬが、異なる増加プロファイルを生成することを示唆する。気道上皮によるＬＬｎＬの極性化取り込みにより起きる可能な作用を除外するために、粘膜面および漿膜面の両方からのｒＡＡＶおよびＬＬｎＬ投与の種々の組み合わせを試験した。感染の間にＬＬｎＬがｒＡＡＶと同じかまたは異なる面に適用されることに関係なく、ＡＡＶ形質導入に対する同様の増加パターンが得られた（データは記載しない）。
【０１７９】
ＬＬｎＬ投与が特定の気道細胞タイプのｒＡＡＶ形質導入を増加させるかどうかを試験するために、アルカリホスホターゼ遺伝子（Ａｌｋｐｈｏｓ）をコードするｒＡＡＶベクターを使用した。形質導入された細胞タイプは、この問題に対応するために、Ａｌｋｐｈｏｓに対する標準組織化学的染色により評価した。ＬＬｎＬが存在しないと、ｒＡＡＶは、ウイルスの漿膜適用の３日後に優先的に基底細胞を形質導入した（図１０ＡおよびＣ）。ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルスを用いた従来の知見と一致して、ＬＬｎＬの同時投与は、ＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ形質導入の劇的な増加をもたらした（図１０ＢおよびＤ）。興味あることに、繊毛細胞形質導入は、ｒＡＡＶ感染の時点におけるＬＬｎＬを用いる処理により最も著しく増加した（図１０Ｅ）。反対に、基底細胞は、ＬＬｎＬ処置にほとんど反応しなかった。これらの知見は、ＬＬｎＬ作用の機構が、ある種の細胞特異性成分を有し、これは極性化（すなわち繊毛性）とも非極性化（すなわち基底性）細胞タイプとも異なる。
【０１８０】
ＬＬｎＬ強化ｒＡＡＶ形質導入の最適化。
【０１８１】
ＬＬｎＬの存在下で到達されるｒＡＡＶ形質導入の増加をさらに改善する目的で、ｒＡＡＶ感染後のＬＬｎＬ投与の時期および回数を変化させる数種の詳細な速度論的研究を行った（図１１）。これらの研究が数件の重要な結論が得られた。第一は、側基底投与後３日に１回のＬＬｎＬ投与が、３０日後のレベルが感染の時点での１回の投与のものと同じであったにもかかわらず、ピーク導入遺伝子発現の長さを延長した。第二は、ＬＬｎＬの連続投与が細胞に毒性でありそして１０日目には導入遺伝子発現がなくなった。第三は、ＬＬｎＬの存在下での７、１０、１５日後のｒＡＡＶを用いるカルチャーの再感染が、同様の増加パターンをもたらし、そして、予想どおりに、３０日目において観察された導入遺伝子発現の最終レベルを上昇させた（１５日目の第二回感染からのデータのみを記載する）。しかし最も注目すべきは、側底側から感染されたすべてのカルチャーは、ＬＬｎＬが投与されたかどうかには関係なく、たがいに２〜３倍の範囲内の同様な長期導入遺伝子発現レベルを生成したことである。
【０１８２】
ウイルス感染の時点でのＬＬｎＬ投与が頂端面および側底面の両方からのｒＡＡＶ形質導入を増加した事実にもかかわらず、この形質導入の速度は、著しく異なっていた。側底側感染の後の増加は一時的であり、一方頂端側感染の後の増加は長期であった（図７）。さらに、頂端膜からのＬＬｎＬを用いる誘導は長期に継続したけれども、３０日で導入遺伝子発現の最高レベルは基底感染からもたらされたものの８分の１に過ぎなかった（図７Ａ）。等張ＥＧＴＡ溶液の適用は、頂端面からのＡＡＶ形質導入を７〜１０倍増加した(Duan et al., 1998; Walters et al., 2000) 。従って、ＥＧＴＡとＬＬｎＬとの複合投与は、頂端面からのｒＡＡＶ形質導入におけるこれ以上の増加をもたらすであろう。興味あることに、ＬＬｎＬの存在下においてｒＡＡＶを用いる感染前のＥＧＴＡを用いる気道カルチャーの処理は、最初の３日間の一時的な形質導入のピークを与え、そして著しく増加した（２００倍）継続的な導入遺伝子発現のレベルを３０日まで与えた（図１１Ｂ）。この導入遺伝子発現の長期継続的レベルは、基底面からのｒＡＡＶ感染と同程度であるが、ＥＧＴＡ単独で頂端側感染した上皮に観察されたレベルよりはるかに高い（図１１Ｂ）。要約すると、これらの結果は、ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬがｒＡＡＶ形質導入に相乗効果を有し、頂端面からの形質導入に対して側底側感染後にのみ通常観察されるようなレベルで形質導入されることを証明している。
【０１８３】
ウイルス結合および内部化は、ＬＬｎＬ処理により影響されない。ＬＬｎＬの作用は、代表的にはプロテアソーム系の選択的および可逆的阻害に帰せられる。しかし、ウイルス結合および／またはエンドサイトーシスに対するあらゆる可能な効果を除外することが重要である。タイプ１単純ヘルペスウイルスに見られるように(Everett et al., 1998)、ＬＬｎＬ処理は４℃でのｒＡＡＶ結合に著しい効果を有していない（図１２）。同様に、３７℃における２時間感染期間におけるＳ35標識ｒＡＡＶの取り込みは、ＬＬｎＬ処理により変化されない（図１２）。この結果を考慮すると、ＬＬｎＬは、ウイルス結合および侵入の点から遠位の点で作用する。興味あることには、感染の２４時間後に、細胞内放射能の量の著しい低下が、ＬＬｎＬを用いて処理された上皮内で観察され、これはどの表面が感染されたかには関係なかった（図１２）。この時点における導入遺伝子発現の一致した増加（図１２）を考慮すると、ＬＬｎＬは核へのウイルスのプロセシングおよび移動を加速し、その際、Ｓ35標識キャプシドタンパク質の脱外被および除去が起きる。この機構で、Ｓ35異性体は、培地内に薄められそして細胞関連カウントの低下を説明できるであろう。
【０１８４】
ＬＬｎＬは、ｒＡＡＶのエンドソームプロセシングおよび核転送を増加する。ＬＬｎＬがｒＡＡＶの核への転送を増加するという仮説を試験すすために、頂端面および側底面からの感染に続くＳ35標識ｒＡＡＶ粒子のin situ 定位を、ＬＬｎＬの存在および不在で行った。不変の放射能標識キャプシドタンパク質の損失が感染の２４時間後に起こったので、２時間の時点をこの分析のために選定した。写真エマルションオーバーレイを用いて、Ｓ35標識ｒＡＡＶ粒子の細胞レベルより下の分布をブラインド(blinded) 形態測定分析により評価した。図１３に示すように、ウイルス粒子の大部分は、ＬＬｎＬが存在しない場合には細胞質に位置していた。これは、感染が頂端面または側底面からのいずれから行われても成り立った。反対に、ＬＬｎＬ処理は、放射能標識ｒＡＡＶ粒子の細胞内分布を本質的に変化し、核関連粒子の著しい移動をもたらした。これらの結果は、ＬＬｎＬがウイルス脱外被およびその後のＳ35異性体の媒体内への損失を増加すると示唆する、感染の２４時間後での全細胞カウントからの知見を確証した。
【０１８５】
ＬＬｎＬは、感染後の特定時間枠内でｒＡＡＶ形質導入を増加する。これまでの証拠は、ＬＬｎＬが核へのｒＡＡＶの細胞内移動を増加するように作用するであろうと示唆していた。さらに、ＬＬｎＬ作用は投与される上皮面とは無関係である（すなわち、ＬＬｎＬの漿膜投与は、粘膜感染を増加しそして逆も起きる）。これは、形質導入を増加するためにＬＬｎＬが必ずしもＡＡＶ粒子と一緒にエンドサイトーシスされる必要がないことを示す。従って、ＬＬｎＬは、ｒＡＡＶエンドサイトーシスの後の特定時点で作用するがしかしエンドソームプロセシングの間ではないのであろう。この仮説に機能的な支持を与えるために、側底面からの感染後の種々の時点でのＬＬｎＬ作用の速度論的分析を行った。これらの実験で、ＬＬｎＬを、ＡＡＶ感染の時点または感染後の種々の時点のいずれかで培地に加えた。ウイルス媒介導入遺伝子発現は、感染の後、２４時間間隔で定量した。増加は、ウイルス感染の１、２４、４８、および７２時間後のＬＬｎＬの投与に関係なく起きた。しかし、２４または４８時間でのＬＬｎＬの添加は、増加の最強のレベルを与えた。ＡＡＶ発現を低下させるＬＬｎＬの能力は、感染の２７時間後には低下しているように見え（図１４）、そして最初のＡＡＶ感染から１５日後には完全に失われた（データは記載しない）。総合すると、ｒＡＡＶが細胞に侵入した後、これは、プロテアソーム阻害剤−促進遊離に感受性である細胞内コンパートメントを標的とするであろうと考えられる。さらに、感染の１５日後のＬＬｎＬ増加効果の消滅は、導入遺伝子産物の増加した転写、翻訳、および／または安定性が、この観察に関係する機構に寄与しないようことを示唆する。
【０１８６】
ＬＬｎＬとＥＧＴＡとの組み合わせ処理は、内部化ｒＡＡＶの分解を防止する。ＬＬｎＬによるｒＡＡＶ形質導入の増加に関係する分子機構をさらに解明するために、感染した細胞内のｒＡＡＶゲノムをＨｉｒｔ  ＤＮＡをサザンブロッティングして分析した。Ｓ35標識ウイルスを用いた研究と一致して（図１２）、極性化気道上皮の両方の面に対するｒＡＡＶ結合はＬＬｎＬ投与により影響されなかった（図１５Ａ、頂端側感染に対してはレーン８および９、基底側感染に対してはレーン１１および１２）。サザンブロッティングは、さらに、基底面からの２〜７倍高いウイルス結合を証明し、これは種々の組織試料間では変動した（データは記載しない）。ウイルス内部化の程度を、表面に結合したウイルスをストリッピングした後にトリプシンで比較した。以前の結果を確認して（図８、１２および１３）、ｒＡＡＶの著しい量が、感染期間に頂端面からエンドサイトーシスされ（図１５Ｂ、レーン２および３、レーン８および９）、一方、ウイルス取り込みは側底面からの方が活性である（図１８Ｂ、レーン５および６、レーン１１および１２）。ＬＬｎＬ単独は内部化したＡＡＶウイルスＤＮＡの酵素分解を本質的に防止せず（図１５Ｂ、図１１も参照）、これは核内への増加に関してウイルス転送がＬＬｎＬによる観察された増加より重要であることを示す。しかし、等張ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬの両方を用いる処理は、頂端面から内部化したウイルスの量を本質的に増加した（図１５、レーン２、４とレーン８、１０との比較、図１８Ｃレーン１、２および５、６および１０、１２の比較）。等張ＥＧＴＡ処理のみは、頂端側感染の後、ＡＡＶ  ＤＮＡの持続性（４倍以下、図１８Ｃ、レーン１１）、またはＡＡＶ媒介遺伝子発現（１０倍以下、図５Ｂ）をわずかに増加するだけであるので(Duan et al., 1998; Walters et al., 2000) 、ＥＧＴＡとＬＬｎＬとの複合効果が関係する主要な機構は、内部化したウイルスの低下した分解およびエンドサイトーシスの増加した速度によるものであろう。これらのＥＧＴＡとＬＬｎＬとの相乗効果は、頂端膜からのｒＡＡＶ形質導入を２００倍以上増加する。さらに、一本鎖ウイルスゲノムの線状複製物または環状形への転換は、アデノウイルス初期遺伝子産物またはＵＶ照射によりそれぞれ増加されるＡＡＶ形質導入と関連する(Fisher et al., 1996; Sanlioglu et al., 1999; Duan et al., 1999)。Ａｄ．ｄ１８０２およびｒＡＡＶを用いて同時感染されたカルチャーからのＨｉｒｔ  ＤＮＡのサザンブロットに示されるように（図１５Ｃ、レーン９）、ＬＬｎＬが増加したＡＡＶ形質導入は、明らかに線状複製中間体（４．７ｋｂバンド）の形成を通じては媒介されず、これはＡｄ．ｄ１８０２同時感染により産生されたアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質の存在から分かる。
【０１８７】
気道内のｒＡＡＶ感染の後のウイルスキャプシドタンパク質のユビキチン化は、導入の効率を改変する。ユビキチン化分子のプロテアソーム依存性分解は、内在性および外来タンパク質の両方の処理のための主要な経路である(Schwartz et al., 1999) 。この経路の制御における数種の異なる段階が同定され、これには、活性化酵素（Ｅ１）によるユビキチンの活性化、ユビキチンキャリヤータンパク質（Ｅ２）への活性化ユビキチンの転移、および引き続いてのユビキチンリガーゼ（Ｅ３）によるタンパク質物質への活性化ユビキチンの送達を含む。最終的に、ユビキチン化したタンパク質はＡＴＰ−依存性過程を通って２６Ｓプロテアソームにより分解される。プロテアソーム阻害剤によるｒＡＡＶ形質導入の増加がエンドソームコンパートメントからのユビキチン化したウイルスの遊離を含むかどうかを試験するために、感染後のＡＡＶキャプシドタンパク質上のユビキチン側鎖の程度を試験し、プロテアソーム阻害剤を用いる処理がユビキチン化の程度を改変するかどうかも同時に試験した。ＡＡＶキャプシドタンパク質を、ウイルス感染６時間後のｒＡＡＶ感染ヒト極性化気道細胞および集密ヒト繊維芽細胞から抗−ＶＰ１、２、３抗体を用いて免疫沈降した。抗−ユビキチン特異性抗体を用いるその後のウエスタン分析は、プロテアソーム処理後に繊維芽細胞内のユビキチン化ＡＡＶキャプシドの細胞レベルでの著しい増加を証明した（図１６Ｂ）。ユビキチン化は、キャプシドタンパク質の分子量（６３ｋｄ、７３ｋｄおよび８７ｋｄ）を２２０〜２５０ｋｄまで著しく増加しそしてこれは他の分子に対するユビキチン化後の大きさ変化と一致する(Bregman et al., 1996)。不幸なことには、空気−液体界面培養ヒト気道細胞から回収できるウイルスの限定された量は、この系内でのユビキチン化キャプシドを検出する能力をなくした（データは記載しない）。それにもかかわらず、集密繊維芽細胞も、プロテアソーム阻害剤処理後の導入遺伝子発現の増加（１０倍）を証明した。従って、プロテアソーム阻害剤は、プロテアソーム内のユビキチン化ＡＡＶのターゲティングおよび／または分解を低下させてｒＡＡＶ形質導入を増加する。このようなプロテアソーム阻害剤の真の結果は、ユビキチン化ウイルスキャプシドの存在量を増加すると期待される。
【０１８８】
極性化気道モデルにおける技術的な限界がユビキチン化ウイルスキャプシドの直接検出を妨げるために、ユビキチン−プロテアソーム経路内の他の段階の調節が、プロテアソーム阻害剤ＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬで観察されたと同様にｒＡＡＶ形質導入を増加するかどうかを決定した。数種のジペプチド、例えばＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）を阻害することが知られている(Obin et al., 1999) 。これらのユビキチンリガーゼ阻害剤の適用は、実際に、ヒト気道細胞の側底面からのｒＡＡＶ形質導入を増加した（図１６、パネルＣ）。総合すると、繊維芽細胞および極性化気道上皮における両方のデータは、ＡＡＶキャプシドがエンドサイトーシスの後にユビキチン化され、そしてこの過程がｒＡＡＶ形質導入への障害となることを示唆する。トリペプチドプロテアソーム阻害剤によるｒＡＡＶ形質導入の増加に関係する最も説得力がある機構は、ユビキチン化されたウイルス分解および／またはプロテアソームに対するターゲティングの防止を含む。
【０１８９】
生体内のプロテアソーム阻害剤によるｒＡＡＶ形質導入の長期的増加。生体内遺伝子治療に対するプロテアソーム阻害剤の潜在的な有用性を評価するために、マウス肺内の生体内ｒＡＡＶ媒介遺伝子導入に対するこれらの薬剤の毒性および効力を試験した。マウス内でのこれらのプロテアソーム阻害剤の毒性を評価するために、極性化気道細胞内の遺伝子導入を誘導するために使用されるよりも１０、１００、および１０００倍高いＬＬｎＬまたはＺ−ＬＬＬの有効用量を、気管内および全身（ＩＶ）投与の両方で投与した。肺および肝臓の組織学的評価により、毒性は示されず（データは記載しない）、動物の死亡によっても証明されなかった。これらのプロテアソーム阻害剤が生体内のｒＡＡＶ形質導入を改善できるかどうかを研究するために、ＡＶ．ＬａｃＺ（５ｘ１０10粒子）を単独または４００μＭ  Ｚ−ＬＬＬの存在下で、鼻内投与により送達した。マウス肺を感染の３、１０および１５０日後に採取し、短期および長期作用を評価した。基底面（図７Ｂ）からまたは頂端面からのＥＧＴＡとの組み合わせた（図１１Ｂ）プロテアソーム阻害剤処理は、明白で迅速なｒＡＡＶ形質導入の増加をもたらしたが、しかし感染の３および１０日後の肺組織のＸ−ｇａｌ染色は、プロテアソーム阻害剤処理または非処理群内で検出可能な導入遺伝子発現は示さなかった（データは記載しない）。反対に、Ｚ−ＬＬＬ処理試料において１５０日目に著しい形質導入が達成された（図１７Ｅ参照）。ターゲティングした導入遺伝子発現は、実質組織内ではなくて、主として導通する気道に局限される。肺胞壁細胞はほとんど形質導入されない。平均して気道細胞の約５．８８％がＡＶ．ＬａｃＺにより形質導入され、そしてＬａｃＺ陽性細胞は全導通気道で観察され、特性的な導入プロフィールが明らかであった。大きい細気管支（＞３５０ｍｍ）内の形質導入効率は、気道上皮の平均して１０．３６±１．６３％に達し、一方、小さい細気管支（＜１５０ｍｍ）では気道細胞の１．３７±０．４１％で、β−ガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現した（図１７Ｆ）。遠位および近位の気道内の導入遺伝子発現の範囲は、それぞれ０〜４％および５〜１８％であった。大きい気道内の高くそして一致する形質導入を示す形質導入プロフィールは、小さい気道を包含する肺の領域へのウイルスの一層不均衡な送達を反映する。ＡＶ．ＬａｃＺ単独により感染された肺からの凍結切片の検査は、全部で３１５の気道切片中で（ｎ＝３動物）ただ２個のｌａｃＺ陽性細胞を明らかにした。
考察
気道の頂端面からの不十分な遺伝子導入は、組換えアデノウイルス(Walters et al., 1999; Pickles et al., 1998)、アデノ随伴ウイルス(Duan et al., 1998) 、レトロウイルス(Wang et al., 1998) 、および非ウイルスのリポソームベクター(Chu et al., 1999)を用いる嚢胞性繊維症のための多数の遺伝子治療法における主要な障害であった。一般に、気道上皮の頂端膜を通る不十分なウイルス媒介遺伝子送達は、主としてこの面上の受容体または共受容体の不足によると考えられていた。
【０１９０】
極性化気道上皮内のｒＡＡＶ感染の分子分析は、数点の独自の知見を明らかにした。第一に、気道上皮の頂端膜における既知のＡＡＶ−２受容体および共受容体の従来報告されていた不足(Duan et al., 1999) は、ＡＡＶ感染を排除しない決定的な証拠がある。側底面からの形質導入（導入遺伝子発現により決定されるもの）は、頂端膜からのものより２００倍効率的であり、Ｓ35標識ウイウルスを用いるウイルスエンドサイトーシスの定量的および半定量的分析またはサザンブロッティングは、頂端面からのウイルス取り込みが、側底膜からのものより２〜７倍効率が低いのみであることを証明した。従って、以前に同定されなかった別の受容体／共受容体および／または受容体に非依存性の機構が、気道の粘膜面からのＡＡＶ取り込みに含まれているであろうと推定することが号知的である。
【０１９１】
極性が多くのタンパク質のエンドソームプロセシングに著しく影響すると広く認められており、そして明確な選別機構が頂端側および側底側コンパートメントについて記載されている(Odorizzi et al., 1996; Rodriguez-Boulan et al., 1993)。側底側および頂端側感染の後のウイルス取り込み効率と導入遺伝子発現との間に直接相関がないことは、追加的なエンドサイトーシス後の障害がｒＡＡＶ媒介遺伝子導入に存在することを示唆する。側底面に対する頂端面経路感染に続くＡＡＶ核転送の程度の差は、基底および頂端細胞コンパートメントがＡＡＶ形質導入の極性に影響する明確な生物学的性質を有することを示唆する。ｒＡＡＶ形質導入に対するエンドソームプロセシング障害は、極性化上皮細胞には限られないであろう。この意見の支持として、核へのウイルス粒子の阻害された細胞内転送がＮＩＨ  ３Ｔ３細胞内で観察された。さらに、ｒＡＡＶはＵＶ照射により機能的活性状態に回復されるまで、集密化一次繊維芽細胞内に７日間も不活性状態で止まることができる。従って、感染に対するエンドサイトーシス後の障害は、複数の細胞タイプ内に存在する。
【０１９２】
気道内で、粘膜面からのｒＡＡＶ形質導入における主要な律速段階は、内部化したウイルスの不十分なエンドソームプロセシングを含むと考えられる。プロテアソムを通じる調節された細胞内タンパク質分解は、多くの生理学および病理学的状態において重要な役割を演じる(Schwartz et al., 1999; Kato, 1999) 。多くの特異性プロテアソーム阻害剤の最近の同定は、新規の治療方法としてのこの細胞酵素系内の薬理学的介入のための基礎を設定した。例えば、数種の細胞透過性合成トリペプチドアルデヒド（例えば本発明に使用したＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬ）は、有望なガン治療剤または抗炎症薬剤であると証明されている(Goldberg et al., 1995; Klotzel, 1998; Wojcik, 1999)。さらに、プロテアソームはＨＩＶ感染において抗ウイルス機能を有すると示唆されており(Schwartz et al.,1998) 、プロテアソーム機能の阻害は、組換えウイルスを用いる形質導入の促進に有利なことを意味する。気道内のｒＡＡＶの頂端側感染が侵入後のイベントにより著しく限定されるという分子的証拠に基づいて、ユビキチン／プロテアソーム経路は、この遮断に関して有力と考えられる。プロテアソームは、一般に内因性および外来タンパク質の排除のためのコンパートメントとして知られている。しかし、最近の研究は、プロテアソーム系がエンドサイトーシスを調節することに関与することも示唆している(Bonifacino et al., 1998; Strous et al., 1999)。遺伝子送達の観点から、プロテアソーム阻害剤は、トランスフェクションされたプラスミドＤＮＡを分解から保護することが示された(Coonrod et al., 1997)。本明細書中に記載した結果は、気道上皮へのｒＡＡＶ媒介遺伝子導入も、プロテアソーム阻害剤により著しく増加されることを証明している。さらに、この増加は、プロテアソーム阻害剤で刺激された核へのウイルス転送と相関する。プロテアソーム阻害剤は頂端面からのＡＡＶ形質導入の長期レベルを増加するが、側底側感染へのこれらの影響は形質導入の長期レベルではなくて、主としてその速度を改変すと考えられる。これらの差は、頂端面および側底面からのｒＡＡＶ形質導入に関係する基本的に異なる経路を強調する。
【０１９３】
数種の知見は、エンドサイトーシス後のウイルスのユビキチン化が、侵入ＡＡＶを選別するための重要な機構であるという意見を支持する。第一に、タンパク質のユビキチン依存性分解を遮断するとして知られているプロテアソーム阻害剤を用いる気道上皮の処理は、ｒＡＡＶ遺伝子導入を増加する。第二に、気道上皮内のユビキチンＥ３リガーゼ活性の阻害も形質導入を増加する。最後に、ｒＡＡＶキャプシドタンパク質は、集密化ヒト繊維芽細胞内に感染後にユビキチン化され、そしてこのユビキチン化の程度は、ユビキチン−プロテアソーム分解経路の阻害により増加する（図１６）。
【０１９４】
適用した観点から、本研究の最も重要な知見の一つは、マウス肺内でプロテアソーム阻害剤により誘導されるｒＡＡＶ形質導入の永続的な高いレベルである。Ｚ−ＬＬＬとｒＡＡＶとの同時投与は、感染の１５０日後で、近位気管支上皮細胞で検出不可能レベルから１０．３６±１．６３％まで導入遺伝子発現を増加する。この遺伝子発現のレベルは、ＣＦＴＲ欠失の治療修正のために十分と考えられる(Crystal, 1999) 。臨床適用のためのこの戦略の実行可能性は、さらにマウスへのプロテアソーム阻害剤投与の後で、検出できるほどの局所または全身毒性がないことでも支持される。さらに、数種の別の臓器、例えば心臓骨格筋および肝臓における予備研究は、ｒＡＡＶ２のユビキチン化が臓器特異性様式で起きるであろうことを示唆した。骨格筋および心筋内へのプロテアソーム阻害剤の適用は、短期または長期ｒＡＡＶ媒介遺伝子導入のいずれにも影響しなかった。しかし肝臓内へのＺ−ＬＬＬの適用（実施例７参照）は、感染１カ月後でｒＡＡＶ形質導入に７倍の増加をもたらした。これらの知見は、トリペプチドプロテアソーム阻害剤がウイルスプロセシングの細胞生物学に応じて、肺以外の臓器内の遺伝子導入を増加させるために使用できることを示唆する。
【０１９５】
結論として、ｒＡＡＶ−２を用いる気道内の頂端側感染に対する主要な障害は、エンドソームプロセシングおよびユビキチン化のレベルにある。ユビキチン−プロテアソーム系の調節は、嚢胞性繊維症の遺伝子治療に対する気道の粘膜面からのｒＡＡＶ形質導入を増加する革新的な戦略を明らかにした。
実施例７
生体内での肺気道上皮および肝臓内のアルカリホスファターゼ遺伝子の発現
肺または肝臓内の本発明の薬剤の存在または不在におけるｒＡＡＶの生体内活性は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子を用いて試験することができる。ＡＰ遺伝子、組換えＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓを含むｒＡＡＶベクター（５ｘ１０10粒子）を、ＰＢＳ中のウイルス単独またはＰＢＳ中で４０μＭ  ＬＬｎＬと一緒にしたウイルスのいずれかとして、マウス肺に投与した。ウイルスは、全体で体積３０μｌを、３０Ｇ針を用いてＣ５７Ｂａｌｂ／ｃマウス気管内に直接点滴注入した。マウス肺内でのウイルスの拡散を確かめるために、ウイルス投与の直後に同じ注射薬を通じて空気５０μｌを肺内にポンプ送入した。感染の９０日後に、肺をそのまま採取し、４パパラホルムアルデヒド中に固定し、次いで凍結割断した。ＡＡＶ媒介導入遺伝子発現を、耐熱性アルカリホスファターゼに対して染色した１０μｍ組織切片により評価した（図１７Ａ〜Ｃ）。
【０１９６】
組換えＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ（５ｘ１０10粒子）もＰＢＳ中のウイルス単独またはＰＢＳ中で４０μｍ  ＬＬｎＬ、またはＰＢＳ中の４０μｍ  Ｚ−ＬＬＬと一緒にしたウイルスのいずれかとしてマウス肝臓に投与した。ウイルスをＣ５７Ｂ６マウスの門脈内に直接点滴注入した。ＡＡＶ媒介アルカリホスファターゼ導入遺伝子発現を組織学染色により、感染の２および４週間後に冷凍組織切片内で評価した（図１２）。
【０１９７】
【表２】
0004969002.tif 000008
【０１９８】
【表３】
0004969002.tif 000009
【０１９９】
【表４】
0004969002.tif 000010
【０２００】
【表５】
0004969002.tif 000011
【０２０１】
【表６】
0004969002.tif 000012
【０２０２】
【表７】
0004969002.tif 000013
【０２０３】
【表８】
0004969002.tif 000014
【０２０４】
【表９】
0004969002.tif 000015
【０２０５】
【表１０】
0004969002.tif 000016
【０２０６】
【表１１】
0004969002.tif 000017
【０２０７】
【表１２】
0004969002.tif 000018
【０２０８】
【表１３】
0004969002.tif 000019
【０２０９】
【表１４】
0004969002.tif 000020
【０２１０】
【表１５】
0004969002.tif 000021
【０２１１】
【表１６】
0004969002.tif 000022
【０２１２】
すべての出版物、特許および特許出願は、引用することにより本明細書中に含まれる。以上の明細書中で、本発明は一部の好ましい態様と関係して記載され、そして多くの詳細は説明の目的で記載されているが、本発明は別の態様が可能であり、そして本明細書中の一部は、本発明の基本原理から離れることなくかなりの変化が可能であることは、当該技術分野の熟練者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  分化した気管支上皮細胞内のｒＡＡＶ形質導入の極性および時間経過。極性化気道上皮を、頂端側および側底側を経由して、ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルス（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）の５ｘ１０9 粒子を用いて２４時間感染した。ＧＦＰ導入遺伝子発現細胞の存在量は、４、８、２２、３０、および４０日目に間接蛍光顕微鏡により定量した。パネルＡの棒グラフは、それぞれの条件における４回の独立した実験の平均（±ＳＥＭ）を表す。
【図２】  極性化気管支上皮カルチャー中のＡＡＶ−２受容体、ヘパリン硫酸プロテオグリカンの免疫細胞化学定位。完全に分化したヒト気管支カルチャーの切片をヘパリン硫酸プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体を用いてインキュベーションした。免疫反応性は、ＦＩＴＣ標識二次抗体を用いて間接免疫蛍光法により検出した。パネルＡは、極性化気管支上皮の基底面に主として位置するヘパリン硫酸プロテオグリカンに対する基底免疫染色を描いたものである。免疫反応性の特異性は、免疫染色前の遊離ヘパリン硫酸を用いる一次抗体の予備インキュベーションにより確認した（パネルＢ）。
【図３】  極性化気道上皮を、ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルス（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）による感染の前に一次カルチャーの頂端側（パネルＡ）または側底側（パネルＢ）からＵＶ（２５ｊ／ｍ2 ）を用いて処理した。ＧＦＰ導入遺伝子発現細胞の存在量は、４、８、２２、３０、および４０日目に間接蛍光顕微鏡により定量した。結果は、それぞれの条件における４回の独立した実験の平均（±ＳＥＭ）を表す。
【図４】  頂端面または側底面のいずれかに適用したウイルスを結合および内部化するための極性化気管支上皮カルチャーの能力を、放射能標識したｒＡＡＶ（ 3Ｈ−ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ）を用いて定量した。二つの実験条件で、ウイルス結合（ウイルスを用いる４℃で９０分間のインキュベーション）または長期インキュベーション期間での結合および内部化ウイルスの全量（ウイルスを用いる３７℃で２４時間のインキュベーション）のいずれかで評価した。結果は、それぞれの条件における５回の独立した実験の平均（±ＳＥＭ）を表す。
【図５】  極性化気道上皮内で２００ｎｍナイルレッド蛍光ビーズ（ＡＡＶビリオンの大きさ）を用いてエンドサイトーシスを評価した。ウイルス感染実験と同じ条件下でビースを頂端面または側底面に適用した。パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＨ中の２−Ｄ共焦点再構成像は、ビーズの頂端側（Ａ〜Ｃ）および側底側（Ｄ〜Ｆ）適用の後の細胞質の頂端面下コンパートメント内に内部化された蛍光ビーズの断面定位を描いている。パネルＧ〜Ｉは、ビーズの頂端側適用の前にＵＶ（２５ｊ／ｍ2 ）を用いて処理したカルチャーを表す。数点の独立したインキュベーション時点も評価し、その中で５分（Ａ、ＤおよびＧ）および６時間（Ｂ、ＥおよびＨ）を示す。低倍率（２．５ｘ）間接蛍光顕微鏡により撮影した正面(en face) 顕微鏡写真も、インキュベーション６時間の時点のものを示す（Ｃ、ＦおよびＩ）。明らかでない理由で、適用の上皮側とは関係なくビーズは頂端面下コンパートメントに蓄積した。
【図６】  一次集密繊維芽細胞を、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）、ビンブラスチン（２２μＭ）、サイトカラシンＢ（１μＭ）、ＮＨ4 Ｃｌ（２ｍＭ）、クロロキン（２０μＭ）、ＬＬｎＬ（４００μＭ）、およびＺ−ＬＬＬ（４μＭ）（最終濃度を括弧内に示す）を用いて処理した後に、ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルスをＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞で感染した。感染の９６時間後に細胞を採取し、そして形質導入効率をＦＡＣＳ分析によりＧＦＰ発現に関して未処理ｒＡＡＶ感染細胞と比較した。化合物の毒性により起きる非−特異性効果を制御するために、生存細胞の割合もヨウ化プロピジウム組込みのないことにより評価した。非毒性の投与のみを示した。
【図７】  プロテアソーム阻害剤は、気道上皮の頂端面または側底面からのｒＡＡＶ形質導入を違って増加する。ｒＡＡＶ形質導入の効率および時間経過は、４０μＭ  ＬＬｎＬの存在または不在におけるｒＡＶ．ＧＦＰｏｒｉ３（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）を用いる感染の後に、極性化気道上皮カルチャー内で評価した。導入遺伝子発現は、間接蛍光顕微鏡により、記載の時点において、１０ｘ視野でのＧＦＰ陽性細胞の平均数を定量して測定した（各時点に対して３個の独立した試料の平均±ＳＥＭ）。ＬＬｎＬ処理の効果は、頂端面（パネルＡ）または側底面（パネルＢ）からの感染の後のそれぞれの時点における組織試料の相当する組の間で比較した。それぞれのパネルの右側の顕微鏡写真は、感染時点から３および２２日後の代表的な２０ｘ視野を示す。
【図８】  極性化気道上皮内のＡＡＶゲノムのサザンブロット分析。分化したヒト気管支上皮カルチャーをＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いて１０，０００粒子／細胞のＭＯＩで頂端面（レーン１および３）または側底面（レーン２および４）から感染した。感染の５０日後に、Ｈｉｒｔ  ＤＮＡを採取し、そして１％アガロースゲル中で電気泳動した。それぞれのレーンは、２個のトランスウエルカルチャーからの一緒にしたＨｉｒｔ  ＤＮＡを表しそして２個のゲルは２個の独立した組織試料に由来した。サザンブロットをＰ32標識ＥＧＦＰにハイブリダゼーションし、そしてフィルムに４８時間暴露した。分子量標準をオートラジオグラムの左に記載した。ＡＡＶウイルスＤＮＡの一本鎖および環状モノマー形は、それぞれ１．６ｋｂおよび２．８ｋｂで移動した。ｓｓＤＮＡは一本鎖ウイルスＤＮＡ、ＣＭは環状モノマー、ＣＣは環状コンカテマー、極性化気道上皮の環状中間体である。
【図９】  極性化気道上皮の基底面からのＡＡＶ形質導入に対する種々の薬剤の効果。完全に分化したヒト気管支気道上皮を、指定の薬剤を用いて、ＡＡＶ感染（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）の時点で側底面から処理した。Ｃａｍｐ：０．１μＭのカンプトテシン、Ｅｔｏｐ：１０μＭのエトポシド、Ａｈｐｉ：５μｇ／ｍｌのアフィドコリン、ＨＵ：５０ｍＭのヒドロキシ尿素、Ｇｅｎｉ：５０μＭのゲニステイン、ＬＬｎＬは４０μＭで使用した。大部分の試験薬剤（ヒドロキシ尿素を除く）はＤＭＳＯ中に溶かし、１％（体積／体積）ＤＭＳＯのビヒクル対照も非−特異性効果を除外するために行った。ＧＦＰ発現は、感染の４８時間後に、カルチャー皿内でランダムに１０ｘ視野１０個あたりのＧＦＰ陽性細胞の数を計数して測定した。データは、それぞれの試験薬品に対する３個の独立した感染の平均±ＳＥＭを表す。
【図１０】  プロテアソーム阻害剤ＬＬｎＬは、繊毛性細胞内にＡＡＶ形質導入を優先的に誘導する。ＡＡＶにより形質導入された細胞タイプを、４０μＭ  ＬＬｎＬの存在または不在におけるＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ感染（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）を用いる極性化上皮カルチャーの側底側感染の３日後に、アルカリホスファターゼ染色により試験した。パネルＡ（ＬＬｎＬなし）およびパネルＢ（ＬＬｎＬあり）の正面顕微鏡写真は、ＬＬｎＬの存在下における増加したｒＡＡＶ形質導入を描いている。８μｍパラフィン切片を、導入された細胞のタイプを組織学的定量のために使用した。下記３種を使用した。繊毛性細胞（頂端面および微繊毛に定位したａｌｋｐｈｏｓ発現）、内腔と接触しない上皮の下半分に存在する基底細胞、および非繊毛性、円柱状細胞。パネルＣ（ＬＬｎＬなし）およびパネルＤ（ＬＬｎＬあり）は、それぞれの条件における代表的な中性レッドで対比染色した断面を示す。ＡＡＶにより形質導入された種々の細胞タイプに対するａｌｋｐｈｏｓ染色細胞／２０００上皮細胞の数をパネルＥに示す（３個の独立したミリセルインサート試料からの平均±ＳＥＭ）。
【図１１】  極性化気管支上皮内のＬＬｎＬ増加形質導入の最適化。分化したトランスウエルカルチャーを、ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（１０，０００粒子／細胞）を用いて側底面（パネルＡ）または頂端面（パネルＢ）のどちらかから、ＬＬｎＬおよび／またはＥＧＴＡを含む指定の処理を行って感染させた。すべの感染は２４時間行いそしてＧＦＰ導入遺伝子発現を指定の時点において間接蛍光顕微鏡により測定した。データは、それぞれの実験条件に対する平均（±ＳＥＭ、Ｎ＝６）を示す。実験は、２人の異なる患者から得た試料から誘導したトランスウエル上で３回行った。下記の条件をパネルＡの側底側感染に対して評価した。１）ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉのみを用いる単回感染（黒線）、２）４０μＭ  ＬＬｎＬ存在下でのＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる単回感染（紫実線）、３）４０μＭ  ＬＬｎＬ存在下でのＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる単回感染、その後基底コンパートメントカルチャー媒体内に４０μＭ  ＬＬｎＬの５時間暴露を３日毎に反復（赤実線）、４）４０μＭ  ＬＬｎＬ存在下でのＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる単回感染、その後ｒＡＡＶを除去した後に基底媒体内に４０μＭ  ＬＬｎＬの連続暴露（緑実線）、および５）感染の時点で２４時間にわたり４０μＭ  ＬＬｎＬの存在下で、１日目および１５日目にＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる反復感染（青破線）。下記の条件をパネルＢの頂端側感染に対して評価した。１）ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉのみを用いる単回感染（黒実線）、２）ウイルス感染の前に３ｍＭ等張ＥＧＴＡを用いる前処理の後にＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる単回感染（紫実線）、３）４０μＭ  ＬＬｎＬ存在下でのＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる単回感染（緑実線）、４）ウイルス感染前の３ｍＭ等張ＥＧＴＡを用いる前処理の後に４０μＭ  ＬＬｎＬ存在下でのＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いる単回感染（赤実線）。
【図１２】  完全に分化したヒト気管支上皮内のＳ35標識ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉの結合および取り込み。頂端面または側底面からウイルスを結合または内部化する極性化気管支上皮の能力をＳ35標識ｒＡＡＶを用いて定量した。結合アッセイは、ウイルスを用いて４℃で１時間インキュベーションし、ＰＢＳ内で反復洗浄した後に行った。一緒にした結合および内部化したウイルスを、４℃で１時間以下のインキュベーション、そして引き続いて３７℃での２時間および２４時間インキュベーションの後に定量した。放射能標識ウイルスの非特異性背景結合は、平行した実験で、気管支細胞を接種しなかったコラーゲン被覆の空のチェンバーで決定した。背景カウント（平均１５．６７±５．１７ｃｐｍ／ウエル）を分析前の実験試料カウントから差し引いた。それぞれのパネルの右側のデータは、結合／内部化ウイルスのネットｃｐｍとして示す（原カウントから空のトランスウエルの背景カウントを差し引く）。結果は、それぞれの条件に対する６個の独立したトランスウエルの平均（±ＳＥＭ）を示す。実験は、２種の独立した組織試料に対して３回行った。それぞれの試料の対（ＬＬｎＬ使用または不使用）の間の差の有意性は、スチューデント(Student) のｔ−検定を用いて評価し、そしてｐ−値はそれぞれの条件のデータの上に括弧で示した。放射性ウイルスの取り込みとｒＡＡＶコード化導入遺伝子の機能的発現とを相関させるために、試料の同じ組からのＧＦＰ発現を感染の２４時間後に間接蛍光顕微鏡により定量した。結果（平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６）は、それぞれのパネルの右側に棒グラフで示した。
【図１３】  Ｓ35標識ウイルスを用いる極性化気道上皮内のｒＡＡＶのin situ 定位。極性化ヒト気道上皮をＳ35標識ウイルス（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）を用いて頂端側または側底側のいずれかから感染させた（±ＬＬｎＬ）。感染の２時間後に、トランスウエルを培地を用いて３回洗浄しそして４％パラホルムアルデヒド内に一晩固定し、次いでスクロースおよびＯＣＴ埋め込みをして凍結保護した。凍結切片１０μｍに写真エマルションを重ね、５週間暴露した後現像した。パネルＡは、ＬＬｎＬの存在下での側底側感染の後の代表的な定位パターンである。矢印は核会合ウイルスを示す。パネルＢは、パネルＡ中の四角で囲った部分の拡大である。ブラインド形態測定定量を、パネルＡの１０個のランダムに選定した視野の核関連および細胞質放射性粒子の数を数えて行った。全体で細胞６０個を視野毎に定量して、全体で試料当たりに細胞６００個および条件あたりに細胞２４００個を得た。パネルＣの結果は、それぞれの条件あたりに独立した試料４個の平均±ＳＥＭである。
【図１４】  ＬＬｎＬは、感染後の一定期間にｒＡＡＶ形質導入を誘導する。ＡＡＶ形質導入に対するＬＬｎＬ投与の速度論的効果を研究するために、プロテアソーム阻害剤ＬＬｎＬを、気道上皮の側底面からのｒＡＡＶ感染の後、種々の時点で培地に加えた。すべてのカルチャーをＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（１０，０００粒子／細胞）で０時間目に感染させた。４０μＭ  ＬＬｎＬを、感染時点（０時間目）または感染後２４時間間隔で加えた（２４、４８、および７２時間）。ＬＬｎＬ処理を行わなかった場合のＡＡＶ形質導入の基線も示した。ＧＦＰ発現は、間接蛍光顕微鏡法を用いて感染の１、２、３、および４日後に定量しそして１０ｘ視野あたりのＧＦＰ陽性細胞として表す。それぞれのパネルのデータは、３個の独立して試料からの平均（±ＳＥＭ）を表す。ＬＬｎＬ添加後の導入遺伝子媒介のｒＡＡＶ中の即時増加は、細胞質からウイルス粒子が発現できる核へのウイルス粒子のエンドソームプロセシングを増加することによりＬＬｎＬが作用するという仮説に一致する。さらに、感染の２〜３日後のＬＬｎＬの添加は、感染時点でのＬＬｎＬの添加よりも高い導入遺伝子発現レベルを与える。これらの結果は、ウイルス結合および内部化は、ＬＬｎＬにより増強される段階ではないであろうという意見を支持する。
【図１５】  ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析によるｒＡＡＶエンドサイトーシスの検討。ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ感染または模擬感染したヒト気管支上皮からのＨｉｒｔ  ＤＮＡ（パネルＡおよびＢの両方でレーン１および７）を、Ｐ32標識ＥＧＦＰプローブに対するサザンブロッティングによるウイルスゲノムの直接試験のために抽出した。パネルＡは、頂端側または側底側感染前１時間、４℃でのＬＬｎＬの存在下または不在、ＥＧＴＡを用いるか用いないウイルス結合試験を描く。細胞表面結合ウイルスは、トリプシンにより完全に除去された（パネルＡ、レーン２〜６）。表面結合ｒＡＡＶの量を決定するために、細胞をＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを用いて１時間、４℃でで感染させそしてＨｉｒｔ  ＤＮＡ抽出の前にはトリプシン処理しなかった。パネルＡ  レーン８：頂端側ＡＡＶ感染、レーン９：ＬＬｎＬが存在する場合の頂端側ＡＡＶ感染、レーン１０：ＬＬｎＬが存在する場合の頂端側感染の前に、細胞を等張ＥＧＴＡで前処理した、レーン１１：側底側感染、レーン１２：ＬＬｎＬが存在する場合の側底側感染。パネルＢは、ＬＬｎＬの存在下または不在における頂端面または側底面のいずれかからのｒＡＡＶ内部化、および等張ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬで複合処理した後の頂端面からの内部化を評価する研究の結果を示す。内部化したウイルスゲノムのネットの量を検出するために、パネルＢ内のすべての試料を、Ｈｉｒｔ  ＤＮＡ採取の直前にトリプシンを用いて処理した。感染後４時間（パネルＢ、レーン２〜６）および２４時間（パネルＢ、レーン８〜１２）、３７℃でのインキュベーションにおける内部化ウイルスの程度は、１．６ｋｂ一本鎖ウイルスゲノムバンドの強度により表される。パネルＢ  レーン２：４時間の頂端側ＡＡＶ感染、レーン３：ＬＬｎＬの存在下での４時間の頂端側ＡＡＶ感染、レーン４：ＬＬｎＬの存在下での４時間の頂端側感染の前に等張ＥＧＴＡを用いて細胞を前処理した。レーン５：４時間の基底感染、レーン６：ＬＬｎＬの存在下での４時間の側底側感染、レーン８：２４時間の頂端側ＡＡＶ感染、レーン９：ＬＬｎＬの存在下での２４時間の頂端側感染、レーン１０：ＬＬｎＬの存在下での２４時間の頂端側感染の前に等張ＥＧＴＡを用いて細胞を前処理した、レーン１１：２４時間の側底側感染、レーン１２：ＬＬｎＬの存在下での２４時間の側底側感染。パネルＣは、頂端膜（レーン１、２、５、６、１０、１１および１２）および側底膜（レーン３、４、７、８、９、１３および１４）からの２４時間感染の２、１０、３０日後におけるｒＡＡＶゲノムに対するＬＬｎＬ／ＥＧＴＡの効果を比較する。処理条件は、それぞれのレーン上に記載した。トランスウエルは、Ｈｉｒｔ ＤＮＡを採取する前にトリプシンを用いて処理しなかった。別の対照は、Ａｄ．ｄ１８０２（ＭＯＩ＝５００部／細胞）を用いた同時感染を含み、モノマーからの複製を証明した（レーン９、４．７ｋｂ）。異なる暴露時間をＣ内の異なるパネルで使用したことに注意すること（レーン１〜４は３時間、レーン５〜８は１５時間、レーン１０〜１４は１２時間）。未感染カルチャーからの相当するＤＮＡ試料は、検出可能はハイブリダゼーションを証明しなかった（データは示さない）。
【図１６】  ウイルスユビキチン化状態の変性がｒＡＡＶ形質導入を促進する。極性化ヒト気道細胞と同様に、ヒト一次集密繊維芽細胞中のｒＡＡＶ形質導入もトリペプチドプロテアソーム阻害剤により増加する。８０％集密ヒト一次繊維芽細胞を１０００ＤＮＡのＭＯＩのＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉで感染させた。パネルＡは、感染の９６時間後における４０μＭ  ＬＬｎＬの不在（左の写真）および存在（右の写真）でのＧＦＰ導入遺伝子発現を描いている。同様の効果が４μＭ  Ｚ−ＬＬＬを用いても得られる（データは記載しない）。上および下パネルは、明視野およびＦＩＴＣ−チャンネル蛍光顕微鏡写真をそれぞれ示す。ＧＦＰ発現細胞のＦＡＣＳ選別により測定したｒＡＡＶを形質導入された細胞の平均（±ＳＥＭ，Ｎ＝３）百分率をパネルＢの棒グラフに表す。パネルＣは、一次集密繊維芽細胞の感染の６時間後のユビキチン化ＡＡＶキャプシドタンパク質（矢じり印で標識）の同定を示す。本研究において、感染された細胞からのｒＡＡＶを最初に抗−ＶＰ１，２，３（ＡＡＶ−キャプシド）モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次いで抗ユビキチンモノクローナル抗体を用いてユビキチン側鎖のウエスタンブロット検出を行った。約６５および２５ｋｄで移動する二つの大きい背景バンドは、二次抗体と交差反応する重鎖および軽鎖抗体サブユニットを表す。さらに、低分子量交差反応バンド（３０〜４０ｋｄ）の等しい強度は、タンパク質の等しい負荷の内部対照として役立つ。パネルＤは、ユビキチンＥ３リガーゼの阻害による極性化気道上皮内のｒＡＡＶ形質導入の増加を表す。ユビキチンリガーゼ阻害剤ジペプチド（０．２ｍＭ  Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよび０．２ｍＭ  Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ）を用いる処理の後に、上皮をＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルス（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）を用いて側底面から感染させた。結果は、感染の１および１５日後における１０ｘ視野あたりのＧＦＰ発現細胞の平均（±ＳＥＭ，Ｎ＝３）数を示す。
【図１７】  プロテアソーム阻害剤によるマウス導通気道内のｒＡＡＶ媒介遺伝子導入の持続性誘導。パネルＡ〜Ｃ）組み合えＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ（５ｘ１０10粒子）をＰＢＳ中のウイルス単独またはＰＢＳ中の４０μＭ  ＬＬｎＬと一緒のウイルスとしてのいずれかでマウス肺に投与した。全体で３０μｌの体積で３０Ｇ針を用いてＣ５７Ｂａｌｂ／ｃマウス気管内に直接点滴注入した。マウス肺内でのウイルスの拡散を確かめるために、ウイルスを投与した後に直ちに同じ注射器を通して空気５０μｌを肺内に送った。感染の９０日後に、肺をそのまま採取しそして４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次いで冷凍割断した。ＡＡＶ媒介導入遺伝子発現は、耐熱性アルカリホスファターゼに対する１０μｍ組織切片染色により評価した。パネルＡ：ＡＡＶ単独を用いる感染、パネルＢおよびＣ：４０ｍ  ＬＬｎＬを補足したＡＡＶを用いる感染，パネルＤ〜Ｆ）６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（各グループ中の動物Ｎ＝３）を、４００μＭ  Ｚ−ＬＬＬの存在または不在でＡＶ．ＬａｃＺの５ｘ１０10ＤＮＡ粒子を用いて鼻点滴注入により感染させた。感染の１５０日後の大きい細気管支内のＬａｃＺ発現に対する組織化学的染色の代表的な例をパネルＤおよびＥに示す。それぞれのパネルの右および左側は、ノマルスキーおよび明視野顕微鏡写真である。１００μｍのスケールバーは、すべての顕微鏡写真に適用される。気道の種々のレベルにおけるＬａｃＺ発現上皮細胞の平均（±ＳＥＭ）百分率は、方法の項に概略を記載した形態測定法を用いて定量し、そして分析は、それぞれのグループに対する３匹の独立した動物からの結果を示す（パネルＣ）。
【図１８】  ＨｅＬａ細胞内のＣｙ３標識ｒＡＡＶ。ＨｅＬａ細胞をＣｙ３標識ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉの５００粒子／細胞のＭＯＩで９０分間、４℃において血清の不在で感染させた。次いで、細胞を洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒド中で固定するかまたは固定の前に３７℃でさらに６０または１２０分間インキュベーションのいずれかを行った。ウイルス感染の前に、細胞を３０分間、１μＭ  ５−クロロメチルフルオレセイン二酢酸（Cell TrackerTM Green CMFDA, Molecular Probe)内でインキュベーションして二重蛍光チャンネル像内の細胞および標識ウイルスを可視化した。９０分間、４℃で感染し、次いで６０および１２０分間、３７℃でインキュベーションした細胞の代表的な共焦点像を、Ｃｙ３および二重Ｃｙ３／ＦＩＴＣチャンネルの両方で示す（パネルＡ）。二重チャンネル像内の核をＮｕで標示する。図示した共焦点像は、細胞の中心領域内で取った０．５μｍ３層から併合したものである。パネルＢは、９０分間、４℃で感染し（パネルＢの左側）次いで１２０分間、３７℃でインキュベーションした細胞に対するノマルスキーおよびＣｙ３チャンネルを用いた非−共焦点像を示す（パネルＢの右側）。４℃で結合したウイルスは、細胞の表面膜に位置する。３７℃のインキュベーション時間が長くなると、ウイルスは核膜に転位する。４℃でのウイルス結合は、パネルＣに記入した指定濃度における遊離ヘパリンの添加により完了する（共焦点像は３件からの併合）。ＦＩＴＣ標識トランスフェリンおよびＣｙ３標識ｒＡＡＶのエンドサイトーシスは、ＨｅＬａ細胞内で観察された（パネルＤ）。９０分間４℃においてＦＩＴＣ標識トランスフェリンの存在下でＣｙ３ｒＡＡＶを用いてＨｅＬａ細胞を感染し、次いで洗浄した。次いで、細胞を固定の前に３７℃で３０分間静置し、そして共焦点顕微鏡法により分析した。パネルＤ内の像は、Ｃｙ３、ＦＩＴＣおよび組み合わせたチャンネル（合併）の単独の０．５μｍ断面であった。結果は、ｒＡＡＶおよびトランスフェリンの大部分のエンドサイト小胞内でのコロニー化を証明する。
【図１９】  プロテアソーム阻害剤Ｚ−ＬＬＬの同時投与は、生体内でマウス肝臓のＡＡＶ媒介遺伝子導入を増加する。組換えＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ（５ｘ１０10粒子）をＰＢＳ中のウイルス単独またはＰＢＳ中の４０μＭ  ＬＬｎＬと一緒のウイルスとして、またはＰＢＳ中の２００μＭ  ＬＬｎＬと一緒のウイルスとしてのいずれかでマウスの肝臓内に投与した。ウイルスは、Ｃ５７Ｂ６マウスの門脈内に直接点滴注入した。ＡＡＶ媒介アルカリホスファターゼ導入遺伝子発現は、組織学的染色により感染２〜４週間後に冷凍組織切片で評価した。それぞれの動物個体のすべての６個の肝臓葉内のａｌｋｐｈｏｓ陽性細胞の平均百分率を、ＮＩＨイメージ分析ソフトウエアにより定量した。データは、それぞれのグループ内のそれぞれの時点に対する３匹の独立したマウスの平均（±ＳＥＭ）を表す。
【図１】
0004969002.tif 000024
【図２】
0004969002.tif 000025
【図３】
0004969002.tif 000026
【図４】
0004969002.tif 000027
【図５】
0004969002.tif 000028
【図６】
0004969002.tif 000029
【図７】
0004969002.tif 000030
【図８】
0004969002.tif 000031
【図９】
0004969002.tif 000032
【図１０】
0004969002.tif 000033
【図１１】
0004969002.tif 000034
【図１２】
0004969002.tif 000035
【図１３】
0004969002.tif 000036
【図１４】
0004969002.tif 000037
【図１５Ａ−Ｂ】
0004969002.tif 000038
【図１５Ｃ】
0004969002.tif 000039
【図１６】
0004969002.tif 000040
【図１７Ａ−Ｃ】
0004969002.tif 000041
【図１７Ｄ−Ｆ】
0004969002.tif 000042
【図１８】
0004969002.tif 000043
【図１９】
0004969002.tif 000044