(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列において、下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）に含まれるアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型タンパク質であって、当該アミノ酸置換が、下記（ａ）〜（ｄ）の１又はそれ以上の置換であるタンパク質。
（ｉ）Asn Glu Ser
（ｉｉ）Asn Val Thr
（ｉｉｉ）His Val Gly Asn Lys Thr（配列番号４３）
（ａ）アミノ酸配列（ｉ）におけるAsnのLysへの置換
（ｂ）アミノ酸配列（ｉｉ）におけるThrのGlnへの置換
（ｃ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるAsnのSerへの置換
（ｄ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるHisのAspへの置換
【請求項２】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記アミノ酸置換が、前記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換である請求項１に記載の
タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスパラギン結合型糖タンパク質において、Ｎ結合型糖鎖が結合していない、当該変異が導入される前の糖タンパク質の生理活性が保持された変異型タンパク質、及びこれを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書中で用いた略号について説明する。
ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー（bromophenol blue）
ＣＭＰ：シチジン ５'−一リン酸（cytidine 5'-monophosphate）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid）
ＥＧＴＡ：エチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）−N,N,N',N'−四酢酸（ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid）
Ｅｎｄｏ  Ｈ：エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ Ｈ（endo-β-N-acetylglucosaminidase H）
ＥＲ：小胞体（endoplasmic reticulum）
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清（fetal bovine serum）
ＨＲＰ：ホースラディッシュのペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＨＰＴＬＣ：高速薄層クロマトグラフィー（high performance thin-layer chromatography）
ＬａｃＣｅｒ：ラクトシルセラミド（lactosylceramide）
Ｎ結合型糖鎖：アスパラギン結合型糖鎖（N-linked sugar chain, asparagine type sugar chain）
Ｎ結合型糖タンパク質：アスパラギン結合型糖タンパク質（N-linked glycoprotein, asparagine type glycoprotein）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオリド（phenylmethanesulfonyl fluoride）
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ：ペプチド-N（4）-（N-アセチル-β-D-グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（peptide-N(4)-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl) asparagine amidase）
ＰＶＤＦ：ポリビニリデンジフルオリド（polyvinylidene difluoride）
ＳＡＴ−Ｉ：シアリルトランスフェラーゼ−Ｉ（sialyltransferase-I）
ｈＳＡＴ−Ｉ：ヒト由来のＳＡＴ−Ｉ
ｍＳＡＴ−Ｉ：マウス由来のＳＡＴ−Ｉ
ｚＳＡＴ−Ｉ：ゼブラフィッシュ由来のＳＡＴ−Ｉ
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis）
また本明細書においては、タンパク質のＮ末端からＪ番目の位置に存在するアミノ酸Ｘ（一文字表記）を「ＸＪ」と表記する。例えば、Ｎ末端から１８０番目の位置に存在するAsnは「N180」と、Ｎ末端から３３６番目の位置に存在するThrは「T336」と表記する。【０００３】
また本明細書においては、タンパク質のＮ末端からＪ番目の位置に存在するアミノ酸Ｘ（一文字表記）がアミノ酸Ｚ（一文字表記）に置換されたタンパク質を「ＸＪＺ」と表記する。例えば、Ｎ末端から１７７番目の位置に存在するHisがAspに置換されているタンパク質は「H177D」と、Ｎ末端から２２４番目の位置に存在するAsnがLysに置換されているタンパク質は「N224K」と表記する。また、複数の箇所が他のアミノ酸に置換されている場合には、これを併記することによって表示する。例えば、Ｎ末端から１７７番目の位置に存在するHisがAspに置換され、かつ、Ｎ末端から２２４番目の位置に存在するAsnがLysに置換されているタンパク質は「H177D、N224K」と表記する。【０００４】
生体内の分泌タンパク質のうち大部分は糖タンパク質として存在していると考えられている。糖鎖はタンパク質の物理的安定化、酵素活性の発現、細胞間接着、癌転移、シグナル伝達、細胞内局在、微生物感染、免疫応答などの幅広い機能を有している。したがって、本来糖タンパク質に結合しているべき糖鎖が欠如すれば、多くの場合、当該糖タンパク質の本来の生理活性が発現されない又はそのレベルが低下する等の何らかの影響が出ることになる。【０００５】
糖タンパク質に結合する糖鎖であるＮ結合型糖鎖は、タンパク質におけるAsn-Xaa-Ser/Thr（ただしXaaはPro以外のアミノ酸）からなるコンセンサス配列におけるAsnに結合することが知られている。【０００６】
糖転移酵素も糖タンパク質の１つであり、多くの糖転移酵素には複数のＮ結合型糖鎖が結合することが知られている。糖転移酵素における前記のコンセンサス配列中のＮを、これと最も構造的に近似するＱに置換したものや、糖転移酵素をツニカマイシン（ドリコールピロリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン形成を阻害してタンパク質への糖転移を抑制する）で処理したものは、その酵素活性が著しく低下することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。【０００７】
例えば、α1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α1,3-fucosyltransferase（Fuc））III、IV、V及びVI、α2,3-シアリルトランスフェラーゼ（α2,3-sialyltransferase（ST3Gal I））、α2,6-シアリルトランスフェラーゼ（α2,6-sialyltransferase（ST6Gal I））、α2,8-シアリルトランスフェラーゼ（α2,8-sialyltransferase（ST8Sia I）；GD3合成酵素）、UDP-N-アセチルグルコサミン：β-D-マンノシド β1,4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ III（UDP-N-acetylglucosamine：β-D-mannoside β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III（GnT III））、コア 2 β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（core 2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase（C2 GnT））、ガラクトシルセラミドスルホトランスフェラーゼ（galactosylceramide sulphotransferase（CST））、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ I（N-acetylgalactosaminyltransferase I（GalNac-T））、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（β1,3-galactosyltransferase（Gal-T2））、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ 2B（UDP-glucuronosyltransferase 2B（UGT2B））などは、酵素活性の発現に糖鎖が必須であることが報告されている。【０００８】
SAT-Iは、ラクトシルセラミドにシアル酸を転移し、GM3を合成するシアリルトランスフェラーゼ（シアル酸転移酵素）の一つであり、既にhSAT-I、mSAT-I、zSAT-Iのクローニングがなされている（非特許文献３、非特許文献４）。他にも、イヌ、ウシ、ラット、トリ、メダカ、テトラドン由来SAT-Iについてもクローニングがなされている。【０００９】
しかし、Ｎ結合型糖タンパク質において、本来これに結合しているＮ結合型糖鎖が結合しておらず、変異が導入される前の糖タンパク質の生理活性を保持している変異型タンパク質は知られていないし、このような変異型タンパク質を生産する方法等についても知られていない。【００１０】
【非特許文献１】マルチナ，Ｊ．Ａ．（Martina J. A.）ら，１９９８年，The Journal of Biological Chemistry，第２７３巻，ｐ３７２５−３７３１
【非特許文献２】エクハード，Ｍ．（Eckhardt M.）ら，２００２年，The Biochemical Journal，第３６８巻，ｐ３１７−３２４
【非特許文献３】イシイ，Ａ．（Ishii A.）ら，１９９８年，The Journal of Biological Chemistry，第２７３巻，ｐ３１６５２−３１６５５
【非特許文献４】コウノ，Ｍ．（Kono M.）ら，１９９８年，Biochemical and Biophysical Research Communications，第２５３巻，ｐ１７０−１７５
【発明の開示】
【００１１】
糖タンパク質の生理活性を、当該糖タンパク質に本来結合しているべき糖鎖を欠いた状態で発現させることができれば、その糖タンパク質と同等の生理活性を有するタンパク質を簡便、迅速、大量かつ安価に製造することができ、またその品質を一定に保つことができる。したがって本発明は、Ｎ結合型糖タンパク質において、本来結合しているべきＮ結合型糖鎖を欠いた変異型タンパク質であって、当該糖タンパク質の生理活性を保持したタンパク質、及びこれを生産する方法を提供することを課題とする。
【００１２】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ結合型糖タンパク質のポリペプチド中に存在する特定のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸を、他のアミノ酸に置換することにより、Ｎ結合型糖鎖を欠いた状態でも変異が導入される前の糖タンパク質の機能が保持されることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列モチーフを有するＮ結合型糖タンパク質のアミノ酸配列において、（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に含まれるアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型タンパク質であって、当該置換アミノ酸を含むアミノ酸配列がＮ結合型糖鎖による修飾を受けず、活性を保持したタンパク質（以下、「本発明タンパク質」という。）を提供する。
（Ｉ）Asn Xa1 Xa2（配列番号１）
（ＩＩ）Xa3 Val Gly Asn Xa1 Xa2（配列番号２）
（ただし（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Xa1はPro以外のアミノ酸を、Xa2はThr又はSerを、Xa3はHis又はAspをそれぞれ示す。）
【００１４】
また、前記アミノ酸配列（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）におけるアミノ酸置換は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（Ａ）AsnのLys又はSerへの置換
（Ｂ）Xa2のGlnへの置換
（Ｃ）Xa3のAspへの置換
【００１５】
また、この糖タンパク質は、酵素であることが好ましく、糖転移酵素であることがさらに好ましく、なかでもシアル酸転移酵素であることが好ましい。
【００１６】
また、シアル酸転移酵素はSAT-Iが好ましく、これに含まれる前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列であり、前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列であることが好ましい。
（ｉ）Asn Glu Ser
（ｉｉ）Asn Val Thr
（ｉｉｉ）His Val Gly Asn Lys Thr（配列番号４３）
【００１７】
また、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、下記（ａ）〜（ｄ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（ａ）アミノ酸配列（ｉ）におけるAsnのLysへの置換
（ｂ）アミノ酸配列（ｉｉ）におけるThrのGlnへの置換
（ｃ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるAsnのSerへの置換
（ｄ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるHisのAspへの置換
【００１８】
また、変異が導入される前のSAT-Iは、配列番号４のアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００１９】
また、変異型SAT-Iとしては、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質が特に好ましい。
・配列番号６に記載のアミノ酸配列
・配列番号８に記載のアミノ酸配列
・配列番号１０に記載のアミノ酸配列
・配列番号１２に記載のアミノ酸配列
・配列番号１４に記載のアミノ酸配列
・配列番号１６に記載のアミノ酸配列
・配列番号１８に記載のアミノ酸配列
【００２０】
また、本発明は、本発明タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明ポリヌクレオチド」という。）を提供する。
【００２１】
また、本発明は、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列モチーフを有するアスパラギン結合型糖タンパク質のアミノ酸配列において、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列又はこれを含むアミノ酸配列を、他の生物由来の対応するタンパク質、又は前記糖タンパク質と同一の生物に由来し、同一のタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質の対応するアミノ酸配列と比較することにより、これらのアミノ酸配列の相違を明らかにし、当該相違するアミノ酸を比較対象の対応するアミノ酸に置換することを特徴とする、当該置換アミノ酸を含むアミノ酸配列がアスパラギン結合型糖鎖による修飾を受けない、活性を保持した変異型タンパク質の生産方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
（Ｉ）Asn Xa1 Xa2（配列番号１）
（ＩＩ）Xa3 Val Gly Asn Xa1 Xa2（配列番号２）
（ただし（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Xa1はPro以外のアミノ酸を、Xa2はThr又はSerを、Xa3はHis又はAspをそれぞれ示す。）
【００２２】
また、本発明方法において、前記アミノ酸配列（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）におけるアミノ酸置換は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（Ａ）AsnのLys又はSerへの置換
（Ｂ）Xa2のGlnへの置換
（Ｃ）Xa3のAspへの置換
【００２３】
また、本発明方法は、好ましくは酵素、さらに好ましくは糖転移酵素、なかでもシアル酸転移酵素に好ましく適用することができる。
【００２４】
また、シアル酸転移酵素の中ではSAT-Iに好ましく適用でき、これに含まれる前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列であり、前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列であることが好ましい。
（ｉ）Asn Glu Ser
（ｉｉ）Asn Val Thr
（ｉｉｉ）His Val Gly Asn Lys Thr（配列番号４３）
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】hSAT-I、mSAT-I及びzSAT-Iのアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、点線横棒部分は膜貫通領域を、最初の実線横棒部分はシアリルモチーフＬ、２番目の実線横棒部分はシアリルモチーフＳ、３番目の実線横棒部分はシアリルモチーフＶＳを示す。また、四角で囲った部分はＮ結合型糖鎖が結合しうる部分（Ｎ−グリコシレーションサイト）を示す。
【図２】mSAT-Iを発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図３】mSAT-Iを、ツニカマイシン（Tuni.）、キフネシン（Kif.）又はカスタノスペルミン（Cas.）の存在下で発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図４】図３で用いたライセートのSAT-I活性を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【図５】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図６】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートをEndo Hで処理した場合のイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図７】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートをPNGase Fで処理した場合のイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図８】図７の結果（SAT-Iのトータルの存在量）を数値化した結果を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【図９】mSAT-I変異体のトリプシンに対する感受性を示す図（写真）である。
【図１０】mSAT-I変異体の酵素活性を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【図１１】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図１２】mSAT-I変異体の酵素活性を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【図１３】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図１４】mSAT-I変異体の酵素活性を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で、＊＊はｐ＜０．０５でそれぞれ有意差があることを示す。
【図１５】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図１６】mSAT-I変異体の酵素活性を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で、＊＊はｐ＜０．０５でそれぞれ有意差があることを示す。
【図１７】mSAT-I変異体を発現させた細胞のライセートのイムノブロッティングを示す図（写真）である。
【図１８】mSAT-I変異体の酵素活性を示す図である。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【図１９】mSAT-IをHEK293細胞にて発現させた細胞のライセート及び培養培地のイムノブロッティングを示す図（写真）である。1〜4は対照として用いたベクター、5〜8はmSAT-Iの結果を示し、Ｃ及びＭは各々細胞のライセートと培養培地による結果を示し、PNGaseF(-)はPNGaseF未処理、PNGaseF(+)はPNGaseF処理後の結果を示す。
【図２０】mSAT-I変異体の分泌量を示す図である。なお、分泌量は、細胞内に存在したSAT-Iタンパク量に対する基質に分泌されたSAT-Iタンパク量の割合で示す。＊は野生型に対してｐ＜０．００１で、＊＊はｐ＜０．０２で有意差があることを示す。
【図２１】大腸菌で発現させたmSAT-I「H177D，N180S，N224K，T336Q」変異体とmSAT-I野生型の酵素活性を示す図（写真）である。左列「−」は、バッファーのみを、右側２列はそれぞれGM3標準品の０，０５μｇ、０．２５μｇを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞  本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列モチーフを有するＮ結合型糖タンパク質のアミノ酸配列において、（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に含まれるアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異型タンパク質であって、当該置換アミノ酸を含むアミノ酸配列がＮ結合型糖鎖による修飾を受けず、活性を保持したタンパク質である。
（Ｉ）Asn Xa1 Xa2（配列番号１）
（ＩＩ）Xa3 Val Gly Asn Xa1 Xa2（配列番号２）
（ただし（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Xa1はPro以外のアミノ酸を、Xa2はThr又はSerを、Xa3はHis又はAspをそれぞれ示す。）【００２７】
ここで、変異を導入するＮ結合型糖タンパク質は、Ｎ結合型糖鎖を含む糖タンパク質である限りにおいて特に限定されない。前記Ｎ結合型糖鎖は、ハイマンノース型、複合型及び混合型の何れでもよく、その数も限定されない。また、前記Ｎ結合型糖タンパク質は、Ｏ結合型糖鎖を含んでいてもよい。【００２８】
一般に、野生型のＮ結合型糖タンパク質のポリペプチド中には、前記（Ｉ）、（ＩＩ）又はこれらの両方のアミノ酸配列が１又はそれ以上存在している。
変異を導入する糖タンパク質中に、前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが１箇所だけ存在する場合には、本発明タンパク質は、当該アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものであればよい。糖タンパク質中に前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが２箇所以上存在する場合には、本発明タンパク質は、これらの少なくとも１つのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものであればよい。もちろん、糖タンパク質中に存在するアミノ酸配列モチーフの全てにおいて、アミノ酸が置換されているものであってもよい。前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフについても同様である。【００２９】
また、変異を導入する糖タンパク質中に前記（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方のアミノ酸配列モチーフが存在する場合には、本発明タンパク質は、これらの少なくとも１つのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものであればよい。もちろん、その両方においてアミノ酸が置換されているものであってもよい。
したがって、糖タンパク質中に前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが２箇所、（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフが３箇所存在する場合には、本発明タンパク質は、その５箇所のうちの少なくとも１つの箇所において少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものであればよい。この場合、本発明タンパク質として例えば、この５箇所のうち、２箇所の前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフと、２箇所の前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフにおいて、アミノ酸が置換されているものやこれらの全てにおいてアミノ酸が置換されているものが挙げられる。【００３０】
アミノ酸置換により得られた本発明タンパク質において、当該置換アミノ酸を含む前記アミノ酸配列（Ｉ）及び（ＩＩ）のAsnは、糖鎖修飾を受けない。Ｎ結合型糖鎖は、タンパク質におけるAsn-Xaa-Ser/Thr（ただしXaaはPro以外のアミノ酸）からなるコンセンサス配列におけるAsnに結合することから、このコンセンサス配列が前記の置換によって破壊されれば、Ｎ結合型糖鎖は置換アミノ酸を含む前記アミノ酸配列において保持されない。本発明の変異型タンパク質は、置換部位以外にＮ結合型糖鎖を有しているものであってもよいが、全体としてＮ結合型糖鎖を有していないものが好ましい。【００３１】
このような、Ｎ結合型糖タンパク質の前記アミノ酸配列（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸が置換された、活性を保持した変異型タンパク質は、例えば、グリコシレーションサイト又はこれを含むアミノ酸配列を、他の生物由来の対応する糖タンパク質、又は同一の生物に由来し、同一のタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、当該グリコシレーションサイトに糖鎖が結合するタンパク質と結合しないタンパク質におけるグリコシレーションサイトのアミノ酸配列の相違を明らかにし、当該グリコシレーションサイトに糖鎖が結合するタンパク質の相違するアミノ酸を、糖鎖が結合しないタンパク質の対応するアミノ酸に置換することにより得ることができる。【００３２】
具体的には、前記アミノ酸配列（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）におけるアミノ酸置換は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（Ａ）AsnのLys又はSerへの置換
（Ｂ）Xa2のGlnへの置換
（Ｃ）Xa3のAspへの置換【００３３】
例えば、変異を導入する糖タンパク質中に前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが１箇所だけ存在する場合には、本発明タンパク質は、当該アミノ酸配列中のAsnがLys又はSerに置換されているか、Xa2がGlnに置換されているか、若しくはこれらの両方の置換がされているものであればよい。糖タンパク質中に前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが２箇所以上存在する場合には、本発明タンパク質は、これらの少なくとも１つのアミノ酸配列中のAsnがSer又はLysに置換されているか、Xa2がGlnに置換されていればよい。したがって、例えば変異を導入する糖タンパク質中に前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが６箇所存在する場合には、本発明タンパク質は、これら６箇所のうちの少なくとも１つの箇所において、AsnのLys又はSerへの置換及びXa2のGlnへの置換のうち少なくとも何れかが起こっていることになる。【００３４】
変異を導入する糖タンパク質中に複数の前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが存在する場合、本発明タンパク質のアミノ酸置換の種類及び個数は、特に制限されない。
すなわち、例えば、糖タンパク質中に前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが６箇所存在する場合には、本発明タンパク質は、これらの１つのアミノ酸配列ではAsnがSerに置換され、他の１つのアミノ酸配列ではAsnがLysに置換され、他の２つのアミノ酸配列ではXa2がGlnに置換され、残りの２つのアミノ酸配列は置換されていないものであってもよい。前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフについても以上の説明と同様である。【００３５】
本発明において、変異を導入する糖タンパク質は、何らかの生理活性を有するものであることが好ましい。前記アミノ酸置換により得られる本発明タンパク質は、本来結合している一部又は全てのＮ結合型糖鎖を保持しない状態であっても、もとの糖タンパク質の生理活性を保持していることを特徴とする。糖タンパク質の生理活性が保持されているか否かは、糖タンパク質の種類に応じ当業者によって適宜選定される生理活性測定方法を用いて、変異が導入される前の糖タンパク質の生理活性と比較することによって調べることができる。
生理活性を保持しているとは、変異が導入される前のＮ結合型糖タンパク質が有する生理活性と同一の種類の活性を有していれば、必ずしも同等又はそれ以上の大きさの活性を有している必要はないが、変異型タンパク質の活性が、変異が導入される前のＮ結合型糖タンパク質の活性に対して、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上であるのがよい。【００３６】
また、生理活性を有する糖タンパク質としては、例えば、酵素、抗体、サイトカイン、ホルモン、シグナル伝達物質、受容体等が例示される。これらはあくまで一例であり、これらに限定されるものではないが、なかでも酵素であることが好ましい。酵素としては、例えば、糖転移酵素、硫酸基転移酵素、糖分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、リガーゼ等が例示される。これらはあくまで一例であり、これらに限定されるものではないが、なかでも糖転移酵素が好ましい。糖転移酵素としては、シアリルトランスフェラーゼ（シアル酸転移酵素）、フコシルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ等が例示される。これらはあくまで一例であり、これらに限定されるものではないが、なかでもシアル酸転移酵素であることが好ましい。【００３７】
シアル酸転移酵素としては、特に制限されず、SAT-I、α2,3-シアリルトランスフェラーゼ、α2,6-シアリルトランスフェラーゼ、α2,8-シアリルトランスフェラーゼ等が例示されるが、SAT-Iが好ましい。【００３８】
また、SAT-Iのアミノ酸配列においては、前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列であり、前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列であることが好ましい。
（ｉ）Asn Glu Ser（配列番号４のアミノ酸番号２２４〜２２６のアミノ酸配列）
（ｉｉ）Asn Val Thr（配列番号４のアミノ酸番号３３４〜３３６のアミノ酸配列）
（ｉｉｉ）His Val Gly Asn Lys Thr（配列番号４３、配列番号４のアミノ酸番号１７７〜１８２のアミノ酸配列）【００３９】
また、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、下記（ａ）〜（ｄ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（ａ）アミノ酸配列（ｉ）におけるAsnのLysへの置換
（ｂ）アミノ酸配列（ｉｉ）におけるThrのGlnへの置換
（ｃ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるAsnのSerへの置換
（ｄ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるHisのAspへの置換【００４０】
前記アミノ酸置換の種類は、変異型SAT-Iが酵素活性を保持している限りにおいて特に制限されないが、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のうちの何れか、（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、（ｃ）と（ｄ）の組み合わせ、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）の組み合わせ又は（ａ）〜（ｄ）全ての組み合わせによる置換であることが好ましい。【００４１】
変異が導入される前のSAT-Iのアミノ酸配列は、ラクトシルセラミドにシアル酸を転移し、GM3を合成する酵素で非還元末端ガラクトースにα-2,3結合で転移する反応を触媒するシアリルトランスフェラーゼである限り特に制限されないが、mSAT-Iのアミノ酸配列（配列番号４）が好ましい。また、mSAT-Iのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するSAT-Iを用いてもよい。【００４２】
変異が導入される前のSAT-Iのアミノ酸配列としては、hSAT-Iのアミノ酸配列（配列番号４２）を用いることも好ましい。また、hSAT-Iのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するSAT-Iを用いてもよい。【００４３】
また、変異型SAT-Iとしては、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質が特に好ましい。
・配列番号６に記載のアミノ酸配列
・配列番号８に記載のアミノ酸配列
・配列番号１０に記載のアミノ酸配列
・配列番号１２に記載のアミノ酸配列
・配列番号１４に記載のアミノ酸配列
・配列番号１６に記載のアミノ酸配列
・配列番号１８に記載のアミノ酸配列【００４４】
また、本発明タンパク質の生理活性に対して実質的に影響を及ぼさない限りにおいて、本発明タンパク質に他のタンパク質（ペプチドを含む）が連結していても良い。すなわち、「本発明タンパク質」には、本発明タンパク質と他のタンパク質（ペプチドを含む）とを結合させた融合タンパク質も包含される。ここにいう「他のタンパク質」はペプチドをも含む概念であり、その種類も特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。融合タンパク質を製造する目的としては、タンパク質を細胞外に分泌させたり、分離や精製を容易にしたり、検出を容易にしたり、複数のタンパク質の活性を併有させたりすること等が例示されるが、これらに限定されるものではない。「他のタンパク質」の例示については、後述の「本発明ポリヌクレオチド」に関する説明を参照されたい。【００４５】
本発明タンパク質は、本発明によって如何なる部分を如何に置換すればよいのかが明らかにされたことから、これによって化学的に合成することも、遺伝子工学的に製造することも可能である。遺伝子工学的に製造する方法については、後述の「本発明ポリヌクレオチド」及び実施例を参照されたい。
本発明タンパク質が取得、合成又は製造等されたか否かは、得られたタンパク質のアミノ酸配列（又はこれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列）等を分析し、本発明タンパク質（又は本発明ポリヌクレオチド）の配列と比較することによって容易に判別することができる。
また、本発明タンパク質において、置換アミノ酸を含む前記アミノ酸配列にＮ結合型糖鎖が結合しているか否かは、適当なグリコシダーゼ（例えばPNGase Fなど）を作用させることによって糖鎖が遊離するか否か、タンパク質の分子量が変化するか否か等によって簡便に調べることができる。【００４６】
＜２＞本発明ポリヌクレオチド
本発明ポリヌクレオチドは、本発明タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。【００４７】
本発明タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するポリヌクレオチドが存在しうるが、このような何れのポリヌクレオチドも本発明ポリヌクレオチドに包含されることは、当業者であれば容易に理解できるところである。【００４８】
例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するmSAT-Iに変異を導入して、以下のアミノ酸配列を有する変異型mSAT-Iを得るためには、以下の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることができるが、これらのポリヌクレオチドはあくまで一例であり、これらに限定されないことは容易に理解できるところである。
（タンパク質）
・配列番号６に記載のアミノ酸配列
・配列番号８に記載のアミノ酸配列
・配列番号１０に記載のアミノ酸配列
・配列番号１２に記載のアミノ酸配列
・配列番号１４に記載のアミノ酸配列
・配列番号１６に記載のアミノ酸配列
・配列番号１８に記載のアミノ酸配列
（ポリヌクレオチド）
・配列番号５に記載の塩基配列
・配列番号７に記載の塩基配列
・配列番号９に記載の塩基配列
・配列番号１１に記載の塩基配列
・配列番号１３に記載の塩基配列
・配列番号１５に記載の塩基配列
・配列番号１７に記載の塩基配列
本発明ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、DNAであってもRNAであっても良いが、その安定性の観点からはDNAであることが好ましい。【００４９】
また本発明ポリヌクレオチドは、本発明タンパク質を直接コードしているポリヌクレオチドのみならず、これに相補的な配列を有するポリヌクレオチドをも包含するものである。【００５０】
本発明ポリヌクレオチドは、例えば以下の方法で製造することができる。
まず、目的とするＮ結合型糖タンパク質のアミノ酸配列を解析する。また必要に応じてこれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する。そして、そのアミノ酸配列中に１又はそれ以上存在する下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるように、当該糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドの対応する部分の塩基を他の塩基に置換する。
（Ｉ）Asn Xa1 Xa2（配列番号１）
（ＩＩ）Xa3 Val Gly Asn Xa1 Xa2（配列番号２）
（ただし（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Xa1はPro以外のアミノ酸を、Xa2はThr又はSerを、Xa3はHis又はAspをそれぞれ示す。）【００５１】
置換される塩基の個数及び種類は、置換しようとするアミノ酸が、目的とする他のアミノ酸に置換されるようなものである限りにおいて特に限定されない。例えば、１つの塩基を置換すれば十分な場合もあれば、３つの塩基を置換しなければ目的とする他のアミノ酸に置換できない場合もありうる。どのように塩基の置換を導入するかは、当業者が適宜決定することができる。【００５２】
塩基の置換（本発明ポリヌクレオチドの製造）は、本発明によって如何なる部分を如何に置換すればよいのかが明らかにされたことから、化学合成の手法を用いて行っても、遺伝子工学的手法を用いて行ってもよい。【００５３】
化学合成の手法を用いる場合には、当該置換が導入されるように塩基配列をデザインし、その通りの塩基配列となるように化学合成すればよい。【００５４】
遺伝子工学的手法を用いる場合、種々の方法を採用しうるが、例えば、目的のＮ結合型糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける塩基置換を導入したい部分に対応するプライマー（目的の塩基に置換されたもの）を合成し、目的とする糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、市販の変異導入キット（例えば、QuickChange site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン（Stratagene）社製））を用いて塩基を置換する方法等を用いることもできる。その具体例は、実施例を参照されたい。【００５５】
得られた本発明ポリヌクレオチドは、さらに増幅しても、精製してもよく、また適当なプラスミド、ベクター等に組み込んでもよい。
このようにして得られた本発明ポリヌクレオチドは、本発明タンパク質の製造に用いることもできる。【００５６】
例えば、本発明ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を鋳型としてPCRを行い、本発明ポリヌクレオチドを増幅する。増幅された本発明ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター等に組み込む。
ここで用いるベクターは特に限定されず、遺伝子を導入する細胞等（宿主）の種類等に応じて当業者が適宜選定することができる。例えば宿主細胞として真核細胞を使用する場合には真核細胞用の発現ベクターを選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には原核細胞用の発現ベクターを選択すればよい。【００５７】
なかでも真核細胞用の発現ベクターを採用することが好ましく、哺乳類細胞用の発現ベクターが好ましい。【００５８】
また、この発現ベクターは、本発明ポリヌクレオチドがコードする本発明タンパク質の単離・精製が容易となるように構築されていてもよい。特に、本発明タンパク質が他のタンパク質（例えば、標識ペプチド等）と結合した「融合タンパク質」の形態で発現するように発現ベクターを構築すると、本発明タンパク質の単離・精製が容易となる。【００５９】
このような「他のタンパク質」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内で機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ（ヒスチジン残基を6〜10個並べて配した配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の13アミノ酸配列）、FLAGペプチド（8アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（β-ガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられる。【００６０】
本発明タンパク質が組み込まれた発現ベクターを抽出・精製し、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞も、用いる発現ベクターの種類に応じて適宜選択することができ、特に限定されない。宿主細胞としては、真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であってもよい。【００６１】
例えば、哺乳類細胞用の発現ベクターを用いた場合には、宿主として哺乳類細胞を用いればよい。ここにいう哺乳類細胞の種類も特に限定されず、目的、発現効率その他の観点から適宜選択することができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ細胞株）等を用いることができる。【００６２】
本発明ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が組み込まれた発現ベクターをこのような細胞に通常の方法で導入して培養する。培養の条件は、ベクター・宿主細胞の種類、目的等によって適宜選択することができる。【００６３】
このように本発明ポリヌクレオチドが導入された細胞を培養し、その培養物を採取することにより、本発明タンパク質を製造することができる。必要に応じて、タンパク質の公知の抽出・精製方法を用いて、本発明タンパク質をさらに精製してもよい。【００６４】
＜３＞本発明方法
本発明方法は、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列モチーフを有するＮ結合型糖タンパク質のアミノ酸配列において、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列又はこれを含むアミノ酸配列を、他の生物由来の対応するタンパク質、又は前記糖タンパク質と同一の生物に由来し、同一のタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質の対応するアミノ酸配列と比較することにより、これらのアミノ酸配列の相違を明らかにし、当該相違するアミノ酸を比較対象の対応するアミノ酸に置換することを特徴とする。
（Ｉ）Asn Xa1 Xa2（配列番号１）
（ＩＩ）Xa3 Val Gly Asn Xa1 Xa2（配列番号２）
（ただし（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Xa1はPro以外のアミノ酸を、Xa2はThr又はSerを、Xa3はHis又はAspをそれぞれ示す。）
また、本発明方法においてアミノ酸配列を比較する場合に、前記（Ｉ）及び（ＩＩ）のアミノ酸配列で表されるグリコシレーションサイトのみを比較してもよいが、通常は、この配列を含めたより広い範囲のアミノ酸配列を比較することが好ましい。これにより当該グリコシレーションサイトに対応するアミノ酸配列を明らかにすることができる。【００６５】
他の生物由来の対応するタンパク質とは、異なる種に属する生物において、同様の生理活性を有するタンパク質であれば特に制限されないが、その生物由来のタンパク質がグリコシレーションサイトの一部又は全部において、Ｎ結合型糖鎖を有しておらず、かつ変異が導入される前のＮ結合型糖タンパク質が有する生理活性を保持しているタンパク質であることが好ましい。哺乳動物に由来する野生型糖タンパク質から本発明の変異型タンパク質を生産する方法においては、例えば、哺乳動物に由来する野生型糖タンパク質のアミノ酸配列を、メダカやテトラドンなどの魚類に由来する対応する野生型糖タンパク質のアミノ酸配列と比較することが好ましい。【００６６】
また、アミノ酸置換対象の糖タンパク質と同一の生物に由来し、同一のタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質とは、当該タンパク質が、アミノ酸置換対象の糖タンパク質と同一の生物に由来し、かつ前記糖タンパク質と生理活性や構造が似ているものであれば特に制限されないが、他のタンパク質がグリコシレーションサイトの一部又は全部において、Ｎ結合型糖鎖を有しておらず、かつ変異が導入される前のＮ結合型糖タンパク質と同様の生理活性を有することが好ましい。【００６７】
この本発明方法に記載されているその他の用語の意義は、全て本発明タンパク質において上述した意義と同様である。【００６８】
したがって、前記アミノ酸配列（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）におけるアミノ酸置換は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（Ａ）AsnのLys又はSerへの置換
（Ｂ）Xa2のGlnへの置換
（Ｃ）Xa3のAspへの置換【００６９】
また、本発明方法は、好ましくは酵素、さらに好ましくは糖転移酵素に適用することができる。なかでも、好ましくはシアル酸転移酵素、さらに好ましくはSAT-Iに適用することができる。【００７０】
また、変異が導入される前のSAT-Iのアミノ酸配列においては、前記（Ｉ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列であり、前記（ＩＩ）のアミノ酸配列モチーフが下記（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列であることが好ましい。
（ｉ）Asn Glu Ser（配列番号４のアミノ酸番号２２４〜２２６のアミノ酸配列）
（ｉｉ）Asn Val Thr（配列番号４のアミノ酸番号３３４〜３３６のアミノ酸配列）
（ｉｉｉ）His Val Gly Asn Lys Thr（配列番号４３、配列番号４のアミノ酸番号１７７〜１８２のアミノ酸配列）【００７１】
また、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸置換は、下記（ａ）〜（ｄ）の１又はそれ以上の置換であることが好ましい。
（ａ）アミノ酸配列（ｉ）におけるAsnのLysへの置換
（ｂ）アミノ酸配列（ｉｉ）におけるThrのGlnへの置換
（ｃ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるAsnのSerへの置換
（ｄ）アミノ酸配列（ｉｉｉ）におけるHisのAspへの置換【００７２】
本発明方法におけるアミノ酸の置換は、前記の本発明タンパク質や本発明ポリヌクレオチドの説明に記載されている方法にしたがって行うことができる。【００７３】
本発明方法において、Ｎ結合型糖鎖を保持しているか否かや、糖タンパク質の生理活性が保持されているか否かも、前記の本発明タンパク質の説明に記載した方法で確認することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、SAT-I（Ｎ結合型糖タンパク質の一種）を用いた実施例により、本発明をより具体的に説明する。
＜１＞材料・方法等
本実施例において使用した材料・方法等は、以下の通りである。
・リポフェクトアミン2000試薬（LIPOFECTAMINETM 2000 Reagent）：ライフテクノロジー社（Life Technology, Inc.）製
・NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM (HAM)：シグマ（SIGMA）製
・PVDF膜（Immobilon）：ミリポア（MILLIPORE）製
・Ｘ線フィルム (Medical X-ray Film)：コダック（Kodak）製
・Endo H：ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）製
・PNGase F：ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）製
・ツニカマイシン（Tunicamycin）：シグマ（SIGMA）製
・キフネシン（Kifnecin）：カルビオケム（CALBIOCHEM）製
・カスタノスペルミン（Castanospermine）：カルビオケム（CALBIOCHEM）製
・CMP-シアル酸：シグマ（SIGMA）製
・LacCer：マトレヤ社（Matreya, Inc.）製
・SepPak Plus18：ウォーターズ・アソシエイツ（Waters Associates (Milford, MA)）製
・シリカゲルHPTLCプレート：メルク（Merck）製
・抗SAT-I抗体：抗SAT-IウサギIgG抗体（mSAT-IのC末端側（51残基）を抗原として作製したポリクローナル抗体）
・5 x SDSサンプルバッファー（SDS sample buffer）: 62.5mM トリス（pH 6.8）、2％ SDS、10％ glyserol、0.001％ BPB、5％ 2-メルカプトエタノール
・泳動バッファー（running buffer）：25mM トリス (pH 8.9)、192mM グリシン、0.1％ SDS
・転写バッファーtransfer buffer：25mM トリス、192mM グリシン、20％ メタノール
・TBS-Tバッファー：137mM NaCl、20mM トリス（pH 7.5）、0.05％ Tween 20
・ブロッキングバッファー（blocking buffer）：TBS-Tバッファーで調製した5％スキムミルク溶液
・細胞懸濁用液（Cell suspension solution）：5％ グリセロール、15mM カコジル酸ナトリウム、0.1％ ルブロール（Lubrol；ICN Biomedicals Inc.）、プロテアーゼ阻害剤混合物（protease inhibitor mixture（CompleteTM EDTA free）；Roche Applied Science）
・4 x 反応混合液（Reaction mixture）: 400 mM カコジル酸ナトリウム、40mM MgCl2、1.6％ Triton X-100
・PBS：137mM NaCl、2.68mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4
・ＩＰバッファー（IP buffer）：50mM トリス（pH7.4）、150mM NaCl、2mM NaF、1mM EDTA、1mM EGTA, 1％ TritonX-100、1mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤混合物（protease inhibitor mixture（CompleteTM EDTA free）；Roche Applied Science）
・細胞培養
CHO細胞は、10％ (v/v) FBS、100単位/ml ペニシリン、100ng/mlストレプトマイシン、 9.4％ (v/v) 炭酸水素ナトリウム及び100mM L-グルタミンを含有するNUTRIENT MIXTURE F-12 HAM培地を使用して、37℃、5％ CO2の条件下で培養した。細胞の回収は、0.25％トリプシン（Trypsin）／1mM EDTA溶液を用いて、３日に一度継代を行った。
・CHO細胞へのSAT-I遺伝子の導入
CHO細胞を６穴のプレートにまき、90％〜95％になるまで培養した後、抗生物質、血清を含まない培地 (HAM(-/-))で静かに洗い、同培地を2.25 ml添加し、250μlのFBSを加えた。【００７５】
次に、プラスミド（2μg；pcDNA3.1 Zeo(+)（インビトロジェン社）にmSAT-I遺伝子を組み込んだもの）及びLIPOFECTAMINETM 2000 Reagent 10μlを、それぞれ250μlのHAM(-/-)と混合し、5分間室温で放置した。その後、これら両者を混合し、20分間室温で放置した後、これを細胞に添加して24時間培養した。ツニカマイシン等の阻害剤を添加する場合には、トランスフェクション後６時間目に培地を入れ替え、これに阻害剤を添加して（終濃度：ツニカマイシン：2.5μg/ml、キフネシン：5μg/ml、カスタノスペルミン：1 mM）、18時間培養した。
・SDS-PAGE
濃縮ゲルとして5％、分離ゲルとして7.5％又は10％のポリアクリルアミドゲルを用いた。5 x SDSサンプルバッファーを試料溶液の1/3容量添加し、37 ℃で約３分間煮沸して変性させることによって泳動用試料を調製した。ミニリアルスラブゲル電気泳動装置（バイオクラフト社製）を用い、20 mAの一定電流で約80分泳動を行った。分子量の指標となる分子量マーカーとして Prestained Protein Markerを用いた。分子量マーカーに含有されるタンパク質のそれぞれの分子量は175、83、62、47.5、32.5、25、16.5及び6.5 kDaであった。
・イムノブロッティング（immunoblotting）
SDS-PAGE終了後、ゲルと活性化させたPVDF膜を、何れも転写バッファーで約５分間振とうして平衡化した。セミドライ型転写用装置（商品名：Trans-Blot SD、バイオラッド（Bio Rad）社製）を用い、10Vで30分間、ゲル中のタンパク質をPVDF膜上に転写した。PVDF膜を、ブロッキングバッファーを用いて室温で１時間ブロッキングした。その後、１次抗体（抗SAT-I抗体）をブロッキングバッファーで1,000倍に希釈し、これにPVDF膜を浸して4℃で一晩振とうした。その後、TBS-Tバッファーで約5,000倍に希釈した２次抗体（HRP標識した抗ウサギIgG）溶液にPVDF膜を浸し、室温で１時間反応させた。【００７６】
反応後のPVDF膜を、ウエスタンブロッティング検出試薬（ECL又はECL Plus（アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences）社製）若しくはLumi-Light Plus（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製））を用いて発色させた。検出には、Ｘ線フィルムを用いた。
・糖鎖切断反応
アルカリ−アセトン法によって調製したサンプルに、Endo H又はPNGase Fを添加し、37℃で１時間反応させた。その後これらのサンプルをイムノブロッティングによって解析した。
・SAT-Iの活性測定
mSAT-I遺伝子を導入したCHO細胞（6穴プレート）を氷冷したPBSで洗浄した後、80μlの細胞懸濁用液を添加し、細胞を回収した。超音波処理（10秒間を１回）して細胞を破砕した後、4℃下、15,000 x gで10分間遠心し、上清を回収して酵素源とした。また、10.68μlの1mg/ml LacCerを室温で乾固させ、これに10μlの4 x 反応混合液を添加し、ソニケーション処理してLacCerを懸濁させた。これに酵素源20μlと、放射ラベルされたCMP-シアル酸（Cytidine 5'-monophosphate, [4, 5, 6, 7, 8, 9-14C] sialic acid（NEN Life Science Products））と放射ラベルされていないCMP-シアル酸を1:4の割合にしたものを添加して、37℃で２時間反応させた。【００７７】
反応後の溶液から脂質を含有する画分をSep-Pak Plus 18で精製し、HPTLCプレートにアプライした。展開溶媒（chloroform/methanol/0.2％ CaCl2（55/45/10））を用いて脂質を分離した。
・SAT-I変異体の作製
mSAT-Iを鋳型として、QuickChange site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン（Stratagene）社製）を用い、キットの説明書に従ってmSAT-Iの種々の変異体を作製した。各変異体の作製に使用したプライマーを以下に示す。【００７８】
N180Q：
5'-CTCTGAACACGTTGGGCAGAAAACTACTATAAGG-3'  （配列番号１９）
5'-CCTTATAGTAGTTTTCTGCCCAACGTGTTCAGAG-3'  （配列番号２０）
N180K：
5'-CTCTGAACACGTTGGGAAGAAAACTACTATAAGG-3'  （配列番号２１）
5'-CCTTATAGTAGTTTTCTTCCCAACGTGTTCAGAG-3'  （配列番号２２）
N180S：
5'-CTCTGAACACGTTGGGAGCAAAACTACTATAAGG-3'  （配列番号２３）
5'-CCTTATAGTAGTTTTGCTCCCAACGTGTTCAGAG-3'  （配列番号２４）
H177D, N180S：
5'-GAGGGTTACTCTGAAGAGGTTGGGCAGAAAACTACTATAAGG-3'  （配列番号２５）
5'-CCTTATAGTAGTTTTGCTCCCAACGTCTTCAGAGTAACCCTC-3'  （配列番号２６）
H177D：
5'-GAGGGTTACTCTGAAGAGGTTGGGCAGAAAACTAC-3'  （配列番号２７）
5'-GTAGTTTTATTCCCAACGTCTTCAGAGTAACCCTC-3'  （配列番号２８）
N224Q：
5'-GCAATGGTAAAACAGGAAAGCCTGCCC-3'  （配列番号２９）
5'-GGGCAGGCTTTCCTGTTTTACCATTGC-3'  （配列番号３０）
N224K：
5'-GCAATGGTAAAAAAGGAAAGCCTGCCC-3'  （配列番号３１）
5'-GGGCAGGCTTTCCTTTTTTACCATTGC-3'  （配列番号３２）
N224D：
5'-GCTTCAAGCAATGGTAAAACAGGAAAGCCTGCCCTTTTG-3'  （配列番号３３）
5'-CAAAAGGGCAGGCTTTCATCTTTTACCATTGCTTGAAGC-3'  （配列番号３４）
N334Q：
5'-CTGGCAGGTCATGCACCAGGTGACCACAGAGACCAAG-3'  （配列番号３５）
5'-CTTGGTCTCTGTGGTCACCTGGTGCATGACCTGCCAG-3'  （配列番号３６）
N334K：
5'-CTGGCAGGTCATGCACAAGGTGACCACAGAGACCAAG-3'  （配列番号３７）
5'-CTTGGTCTCTGTGGTCACCTTGTGCATGACCTGCCAG-3'  （配列番号３８）
T336Q：
5'-CAGGTCATGCACAAGGTGACCACAGAGACCAAGTTCCTC-3'  （配列番号３９）
5'-GAGGAACTTGGTCTCTGTCTGCACATTGTGCATGACCTG-3'  （配列番号４０）【００７９】
・トリプシン感受性試験
mSAT-I遺伝子を導入したCHO細胞（6穴プレート）を氷冷したPBSで洗浄した後、100μlのＩＰバッファーを添加し、細胞を回収した。超音波処理（10秒間を１回）して細胞を破砕した後、4℃下、15,000 x gで10分間遠心した。その上清を回収し、これにトリプシンを、終濃度が0、10、20、50又は100ng/μlになるように添加して37℃で30分間反応させた。その後、10％ SDSを終濃度1％になるように添加することによって反応を停止させた。【００８０】
＜２＞結果
（１）Ｎ−グリコシレーションサイトの種間比較
クローニングされているヒト、マウス、ラット及びゼブラフィッシュのSAT-IのＮ末端側には膜貫通領域が一箇所存在し、「シアリルモチーフＬ」、「シアリルモチーフＳ」及び「シアリルモチーフＶＳ」と呼ばれるシアル酸転移酵素に保存された配列を有している。シアリルモチーフＬは、CMP-シアル酸との結合に関与することが知られているが、他のモチーフの機能については明らかにされていない。hSAT-I（配列番号４２）、mSAT-I（配列番号４）及びzSAT-I（配列番号４１）のアミノ酸配列を比較した結果を図１に示す。【００８１】
また、Ｎ結合型糖鎖は、糖タンパク質に存在する「Asn-Xaa-Thr/Ser」というアミノ酸配列のAsn残基に結合することが知られている。【００８２】
図１中、点線横棒部分は膜貫通領域を、最初の実線横棒部分はシアリルモチーフＬ、２番目の実線横棒部分はシアリルモチーフＳ、３番目の実線横棒部分はシアリルモチーフＶＳを示す。また、太い四角で囲った部分はＮ結合型糖鎖が結合しうる部分（Ｎ−グリコシレーションサイト）を示す。mSAT-Iには、N180、N224及びN334にＮ結合型糖鎖が結合しうることが示された。【００８３】
Ｎ−グリコシレーションサイトのアミノ酸配列を比較すると、シアリルモチーフＬに含まれる部位を除いて種間で保存されていなかった。このことから、シアリルモチーフＬ以外に存在する糖鎖がSAT-Iにとって重要でない、又は変化したアミノ酸配列が糖鎖の機能を代替している、という２つの可能性が考えられた。
なお、mSAT-Iのアミノ酸配列とクローニングされているウシ、イヌ、ラット、トリ、メダカ（Killifish）及びテトラドン（tetradon）のSAT-Iのアミノ酸配列を、Clustal W（Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,and Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680）とBOXSHADE(Institute for Animal Health, Surrey, UK)手順に従い比較したところ、mSAT-IのＮ-グリコシレーションサイト（N180,N224,N334近辺）のアミノ酸配列に相当するウシ、イヌ、ラット及びトリのアミノ酸配列部分に関してはアミノ酸の保存の割合が高かった。しかし、一方、メダカ及びテトラドンではアミノ酸の保存の割合は低く、N180、N224、N334に相当するアミノ酸は各々Ｓ、Ｋ、Ｄと異なっていた。
同様に、ヒト由来シアリルトランスフェラーゼについて、各種酵素ファミリーにおけるアミノ酸配列と比較したところ、例えば、SAT-IにおけるシアリルモチーフＬに存在するグリコシレーションサイトの１８０番目のＮはＳやＴであったり、１７７番目のＨはＤであるなど、酵素ファミリー間で相違が見られた。
また、各種シアリルトランスフェラーゼにおけるグリコシレーションサイトやその数は、種間や酵素ファミリー間で違いがあることが知られており、高等生物への進化過程における糖転移酵素の機能的調節の変化を反映していると考えられる。つまり、特定のアミノ酸の置換により、糖鎖が無くても活性が維持される酵素を作製出来る可能性を示唆している。【００８４】
（２）SAT-Iに結合している糖鎖の有無及びその種類の検討
mSAT-IのＣ末端側51残基を抗原として抗SAT-I抗体（ポリクローナル）を作製した。CHO細胞を用いてmSAT-Iを一過性に発現させ、その細胞のライセートをSDS-PAGEに付し、次いで抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングに付した。また、その細胞のライセートをEndo H又はPNGase Fで処理したものについても同様に抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングに付した。結果を図２に示す。【００８５】
アミノ酸配列から推定されるmSAT-Iの分子量は約40kDaであるが、これよりも大きな42kDa付近にメジャーなバンドが、さらに45kDaから48kDaにかけてブロードなバンドが検出された（図２中のレーン２）。このことからmSAT-Iには何らかの修飾がされていることが示唆された。
また、PNGase Fで処理するとmSAT-Iのバンドが全て分子量40kDaに収束し（図２中のレーン４）、Endo Hで処理した場合には完全に糖鎖が切断されずにEndo H耐性のバンドが検出された（図２中のレーン３）。これらの結果から、mSAT-Iには、ゴルジ体で修飾される複合型糖鎖が結合していることが示された。【００８６】
（３）SAT-I活性に与える糖鎖の影響
CHO細胞を用いてmSAT-Iを一過性に発現させる際にＥＲにおける糖鎖プロセッシングの阻害剤（ツニカマイシン、キフネシン又はカスタノスペルミン）で処理した。ツニカマイシンで処理すると、ドリコールピロリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン形成を阻害することによってタンパク質への糖転移が抑制される。キフネシンで処理すると、マンノシダーゼを阻害することによってゴルジ体に輸送される直前のハイマンノース型糖鎖を持つmSAT-Iが生成し、複合型糖鎖を有するmSAT-Iができなくなる。カスタノスペルミンで処理すると、グルコシダーゼI及びIIを阻害することによってモノグルコシル化糖鎖を認識して相互作用するカルネキシンやカルレテュキュリンとの相互作用が抑制される。【００８７】
これらの阻害剤で処理した細胞のライセートをEndo Hの存在下又は非存在下で調製し、そのライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った結果を図３に示す。また、このライセートを用いてSAT-I活性を測定した結果を図４に示す。【００８８】
図３より、ツニカマイシンで処理するとSAT-Iへの糖転移が完全に抑制されること、及び、キフネシン又はカスタノスペルミンで処理するとハイマンノース型糖鎖（Endo Hで切断される）のみが結合することが示された。【００８９】
図４より、ツニカマイシン処理によって糖鎖が付加されなかったSAT-Iの活性は著しく減少することが示された。一方、キフネシンやカスタノスペルミン処理によって得られたハイマンノース型糖鎖を保持するSAT-Iは、阻害剤未処理のmSAT-Iと同等の活性を有していた。これらの結果から、SAT-Iの活性にはハイマンノース型の糖鎖が必須であること、及び、通常のSAT-Iのフォールディング過程においてカルネキシンやカルレテュキュリンとの相互作用は不要であることが示された。【００９０】
（４）「N180Q」、「N224Q」、「N334Q」及び「N180Q, N224Q, N334Q」変異体の作製
mSAT-Iに存在する３つのＮ−グリコシレーションサイト（N180、N224及びN334）におけるAsnの何れか１つ又は全てをGlnに置換した変異体（「N180Q」、「N224Q」、「N334Q」及び「N180Q, N224Q, N334Q」）を作製した。【００９１】
これらの変異体を、CHO細胞を用いて一過性に発現させ、その細胞のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った。その結果を図５に示す。【００９２】
その結果、何れの変異体においても分子量の低下がみられ、「N180Q, N224Q, N334Q」変異体では、野生型のmSAT-IをPNGaseで処理した分子量と同じになった。【００９３】
また、N334Q変異体と「N180Q, N224Q, N334Q」変異体において、SAT-Iの存在量が著しく減少していた。以上の結果より、mSAT-Iにおいて３つのＮ−グリコシレーションサイトの全てに糖鎖が付加されており、それ以外の部位では糖鎖修飾がされてないことが示された。【００９４】
次に、各変異体を発現させた細胞のライセートをEndo Hで処理し（３７℃、１時間）、処理後のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った結果を図６に示す。【００９５】
その結果、N180Q変異体においてEndo H耐性のバンドが特異的に減少していた。N334Q変異体におけるEndo H耐性のバンドの減少は、Endo H感受性のバンドも同様に減少していることからみて、特異的なものではないと判断される。【００９６】
次に、各変異体を発現させた細胞のライセートをPNGase Fで処理し（３７℃、１時間）、処理後のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行うことで、SAT-Iのトータルの存在量を比較した。イムノブロッティングの結果を図７に、これをもとに存在量を数値化した結果（３回の平均値）を図８に示す。【００９７】
その結果、N334Q変異体及び「N180Q, N224Q, N334Q」変異体において、野生型と比較して約50％のタンパク質存在量の低下が見られた。しかしツニカマイシンで処理するとこのような減少は見られなかったことから、糖鎖がこのSAT-I存在量の減少に関与しているとは考えにくい。また、[35S]-メチオニンを用いたパルスラベル実験を行った結果、この減少はタンパク質の翻訳レベルで起こっていることが示された。したがって、変異によってmRNAの二次構造が著しく変化し、タンパク質への翻訳効率が低下したことにより、N334Q変異体と「N180Q, N224Q, N334Q」変異体のタンパク質存在量が減少したと考えられる。【００９８】
（５）各変異体におけるトリプシン感受性の比較
タンパク質のフォールティング異常によって、トリプシンなどのプロテアーゼに対する感受性が高まることが知られている。そこで、N180Q変異体、N224Q変異体、N334Q変異体及び「N180Q, N224Q, N334Q」変異体の構造が著しく変化しているか否かを、トリプシンに対する感受性を比較することによって調べた。CHO細胞を用いてmSAT-Iを一過性に発現させ、そのライセートを調製し、0、10、20、50又は100 ng/mlのトリプシンを用いて37℃で１時間処理した。結果を図９に示す。【００９９】
図９に示すように、野生型と各変異体との間で、トリプシン感受性に大きな差は見られなかった。したがって、糖鎖が欠如することでSAT-Iの高次構造が大きく変化する可能性は低いことが示唆された。【０１００】
（６）糖鎖がmSAT-I活性に与える影響
CHO細胞を用いて各変異体を一過性に発現させ、そのライセートを酵素源として酵素活性を測定した。結果を図１０に示す。【０１０１】
その結果、N180Q変異体、N224Q変異体、N334Q変異体及び「N180Q, N224Q, N334Q」変異体の全てにおいて、野生型と比較して著しく活性が減少した。特にN180Q変異体は、N224Q変異体やN334Q変異体よりも活性が低く、糖鎖が全く結合していない「N180Q, N224Q, N334Q」変異体ではほとんど酵素活性が消失していた。以上の結果から、各々の糖鎖の存在が、mSAT-Iの酵素活性の発現に必須であることが示された。【０１０２】
（７）アミノ酸置換によるＮ結合型糖鎖の機能の保持（タンパク質の生理活性の保持）
特定の部分のアミノ酸を置換することによって、Ｎ結合型糖鎖の機能を保持することが可能か否か（Ｎ結合型糖鎖を保持しない状態で当該タンパク質の生理活性を保持させることができるか否か）を、mSAT-Iを用いて調べた。【０１０３】
まず、N224に結合する糖鎖について検討した。N224K変異体（配列番号６）及びN224D変異体を作製し、それらの活性を野生型及びN224Q変異体の活性と比較した。【０１０４】
これらの変異体を、CHO細胞を用いて一過性に発現させ、その細胞のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った。結果を図１１に示す。その結果、N224K変異体及びN224D変異体は、何れもN224Q変異体と同様のバンドパターンを示した。【０１０５】
また、それぞれの変異体のSAT-I活性を測定した結果を図１２に示す。その結果、N224K変異体は野生型と同程度の活性を示した。一方、K（Lys）とは逆のチャージを有するD（Asp）に置換したN224D変異体では、N224Q変異体よりも活性が低下していた。これらの結果から、N224に結合する糖鎖の機能は、N224をプラスチャージを有するK（Lys）に置換することによって保持することができることが示された。そしてこのようなアミノ酸の置換を施すことによって、Ｎ結合型糖鎖を保持しない状態でタンパク質の生理活性（SAT-Iの酵素活性）を保持できることが示された。【０１０６】
次に、N334に結合する糖鎖について検討した。N334K変異体及びT336Q変異体（配列番号８）を作製し、それらの活性を野生型及びN334Q変異体の活性と比較した。【０１０７】
これらの変異体を、CHO細胞を用いて一過性に発現させ、その細胞のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った。結果を図１３に示す。その結果、N334K変異体及びT336Q変異体は、何れもN334Q変異体と同様のバンドパターンを示した。【０１０８】
また、それぞれの変異体のSAT-I活性を測定した結果を図１４に示す。その結果、N334K変異体はN334Q変異体と同程度の活性しか示さなかったのに対し、T336Q変異体は野生型の約1.5倍の活性を示した。これらの結果から、N334に結合する糖鎖の機能は、T336をQ(Gln)に置換することによって保持することができることが示された。そしてこのようなアミノ酸の置換を施すことによって、Ｎ結合型糖鎖を保持しない状態でタンパク質の生理活性（SAT-Iの酵素活性）を保持できることが示された。【０１０９】
次に、N180に結合する糖鎖について検討した。N180K変異体、N180S変異体（配列番号１０）、「H177D, N180S」変異体（配列番号１２）及びH177D変異体（配列番号１４）を作製し、それらの活性を野生型及びN180Q変異体の活性と比較した。【０１１０】
これらの変異体を、CHO細胞を用いて一過性に発現させ、その細胞のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った。結果を図１５に示す。その結果、N180S変異体及び「H177D, N180S」変異体は、N180Q変異体と同様に42kDa付近に、N180K変異体は42kDa付近と40kDa付近にメジャーなバンドが現れた。H177D変異体は野生型と同様のバンドパターンを示した。【０１１１】
また、それぞれの変異体のSAT-I活性を測定した結果を図１６に示す。その結果、N180K変異体はN180Q変異体と同程度の活性しか示さなかったが、N180S変異体は野生型の約50％の活性を、「H177D, N180S」変異体は野生型と同等又はそれ以上の活性を示した。さらにH177D変異体では野生型の約1.5倍の活性を示した。これらの結果から、N180に結合する糖鎖の機能は、H177をD(Asp)に置換すること及び／又はN180をS(Ser)に置換することによって保持することができることが示された。そしてこのようなアミノ酸の置換を施すことによって、Ｎ結合型糖鎖を保持しない状態でタンパク質の生理活性（SAT-Iの酵素活性）を保持できることが示された。【０１１２】
次に、糖鎖付加部位が無い「N180S, N224K, T336Q」変異体及び「H177D, N180S, N224K, T336Q」変異体（配列番号１６）を作製し、それらの活性を野生型及び「N180Q, N224Q, N334Q」変異体の活性と比較した。【０１１３】
これらの変異体を、CHO細胞を用いて一過性に発現させ、その細胞のライセートをSDS-PAGEに付し、抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った。結果を図１７に示す。その結果、何れの変異体も、PNGase Fで処理した場合と同様に35kDa付近にバンドが出現した。【０１１４】
また、それぞれの変異体のSAT-I活性を測定した結果を図１８に示す。その結果、「N180S, N224K, T336Q」変異体は野生型の約40％もの活性を、「H177D, N180S, N224K, T336Q」変異体は野生型の約50％もの活性を示した。また、別途「N224K, T336Q」変異体（配列番号１８）を作製し、同様にSAT-I活性を測定した結果、野生型と同等の活性を示した。【０１１５】
これらの結果から、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載のアミノ酸配列モチーフを有するＮ結合型糖タンパク質のアミノ酸配列において、（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に含まれるアミノ酸を、下記（Ａ）〜（Ｃ）の１又はそれ以上の規則に従って他のアミノ酸に置換することにより、当該置換アミノ酸を含む下記アミノ酸配列においてＮ結合型糖鎖による修飾を受けなくても、変異が導入される前の糖タンパク質の生理活性が保持されることが示された。
（Ｉ）Asn Xa1 Xa2（配列番号１）
（ＩＩ）Xa3 Val Gly Asn Xa1 Xa2（配列番号２）
（ただし（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Xa1はPro以外のアミノ酸を、Xa2はThr又はSerを、Xa3はHis又はAspをそれぞれ示す。）
（Ａ）AsnのLys又はSerへの置換
（Ｂ）Xa2のGlnへの置換
（Ｃ）Xa3のAspへの置換【０１１６】
（８）アミノ酸置換が細胞外分泌に与える影響
SAT-Iの細胞外分泌について実験を行った。
前記CHO細胞を用いた形質転換と同様に、Dulbecco修飾Eagle培地にてHEK293細胞を培養し、野生型mSAT-Iを組み込んだpcDNA3ベクター（野生型pcDNA3.1 Zeo(+)-mST3Gal-V）を用い、HEK293細胞にてSAT-Iを一過性に発現させた。培養後、細胞と培地を別々に回収し、当該細胞のライセートと培地について、SDS-PAGEに付し抗SAT-I抗体を用いたイムノブロッティングを行った。更に、細胞のライセートと培地を各々PNGaseF処理した後、同様にイムノブロッティングを行い比較した（図１９）。対照としては、pcDNA3ベクターを用いた。
培地中に分泌されたSAT-Iは、45kDaと38kDaに幅広のバンドが確認された。この45kDaのバンドは、PNGaseF処理後のイムノブロッティングでは確認されないことより、45kDaはＮ結合型糖鎖を保持していると推測される。なお、当該45kDaのバンドはEndoH耐性であった。【０１１７】
更に、前記で作製したmSAT-Iの各変異体（N180Q変異体、「H177D, N180S」変異体、「N224Q」変異体、N224K変異体、N334Q変異体、T336Q変異体）と野生型mSAT-IをHEK293細胞を用いて一過性に発現させ、細胞から抽出されたmSAT-Iと培地に分泌されたmSAT-IについてPNGaseF処理を行った後、各々SDS-PAGEに付し抗SAT-I抗体を用いてイムノブロッティングを行った。SDS-PAGEのバンドを濃度測定により解析し、細胞内に存在したタンパク量に対する基質に分泌されたタンパク量の割合を算出し、さらに、野生型mSAT-Iの当該割合を100％として、各変異体の分泌量を算出した（図２０）。
N224Q変異体とN224K変異体の分泌量は野生型とほぼ同様であった。一方、N180Q変異体は野生型と比べ２０％の分泌量であり、「H177D, N180S」変異体は野生型と比べ５０％の分泌量であった。驚くべき事に、N334Q変異体とT336Q変異体は野生型と比べ３００％を超える分泌量であった。これらの結果から、SAT-Iの１８０番目のＮに結合しているＮ結合型糖鎖は培地への分泌に重要な役割を果たしており、一方、３３４番目のＮに結合しているＮ結合型糖鎖は細胞内へ保持する機能に関与していることが判明した。
野生型とほぼ同等の活性を保持していた「H177D, N180S」変異体の分泌量は、野生型の２０％程の活性しか示さなかった変異型N180Qの分泌量のほぼ２倍であった。
N180Q変異体は、Ｎ結合型糖鎖の喪失により酵素不活性である異常な構造となり、野生型の２０％程度の活性と２０％程度の分泌量となった。一方、「H177D, N180S」変異体は、野生型とほぼ同等の酵素活性を有しており、酵素活性構造は保持されていると考えられる。分泌量の減少は１８０番目のＮに結合しているＮ結合型糖鎖の喪失に起因していると推測される。
これらの結果より、１８０番目のＮに結合しているＮ結合型糖鎖だけでなく、当該部位の近傍のタンパク構造もSAT-Iの活性や分泌に関与していることが示唆された。【０１１８】
なお、本発明タンパク質を遺伝子工学的に製造する場合、前記細胞外への分泌に関する機能の調節は重要となる。培養培地から目的とする本発明タンパク質を得る方法は、培養細胞から目的とする本発明タンパク質を得る方法に比べて、より簡便で効率が良い。【０１１９】
（９）大腸菌におけるmSAT-Iの「H177D, N180S, N224K, T336Q」変異体の発現
(i)大腸菌におけるmSAT-I変異体の発現
大腸菌におけるmSAT-I変異体の発現を、コールドショック発現システム（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。
具体的には、大腸菌BL21株をシャペロンプラスミドpG-Tf2（タカラバイオ株式会社製）で形質転換し、BL21-pG-Tf2を作製し、大腸菌BL21株のコンピテントセルを調製した。次に、膜貫通領域（TM）を欠失させた（ΔTM）変異型mSAT-I遺伝子をSAT-Iの発現用プラスミド（Psu141、Psu142）に導入し、該プラスミドを用いて前記コンピテントセルを再度形質転換し、BL21-pG-Tf2-pSU141及びBL21-pG-Tf2-pSU142を作製した。これをLB培地（Trypton, yeast extract, NaCl, pH7.2）１ｍＬにおいて３７℃で前培養した後、当該前培養したものを、LB培地に、600ｎｍにおける吸光度ＯＤ＝０．１に希釈される様に添加し、同時にテトラサイクリンを５ng/mLになるように加え、３７℃で、600ｎｍにおける吸光度ＯＤ＝０．５３になるまで培養した。培養温度を１５℃にし、更に３０分培養を行った後、IPTG（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside/SIGMA製）を0.01mmol/Lになるように添加し、４８時間、１５℃で培養した。培養完了後、菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体に１mLの１mmol/Lフッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＢＥＳＦ；プロテアーゼインヒビター）を含むＰＢＳで懸濁し、３０秒ｘ２回超音波破砕を行った後、20,000xgで１５分遠心し、上清を回収した。
対照として、野生型ΔTM-mSAT-Iの発現も同様に行った。【０１２０】
(ii)大腸菌で発現させたmSAT-I変異体の精製
次いで、mSAT-I変異体の精製を行った。先ず、１．５ｍＬのチューブに、Ｎｉ−ＮＴＡ superflow（QIAGEN社製）をゲル量１０μＬになるように分注し、0.01%TritonX-100を含むＰＢＳを１００μＬ加え、ゲルをよくなじませた後、平衡化処理を行い、遠心して上清を除去した。更に、前記(i)において得られた上清を分注し、タッピングしてゲルと軽く混ぜた後、４℃にて２時間、ロータリーミキサーで反応させた。反応後、遠心し、上清を除き、洗浄バッファー（wash buffer、組成：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４(pH8.0)、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、０．０１％TritonX-100）を添加した。再度遠心し、上清を除き、溶出バッファー（elute buffer、組成：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４(pH8.0)、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２５ｍＭイミダゾール）を加え、タッピングして軽く混ぜ、再度遠心を行い、上清を回収した。回収した上清を、Ni-affinity精製サンプルとした。
同様に、野生型mSAT-Iの精製も行った。
また、前記溶出バッファー中のイミダゾールを透析し、２０ｍＭ トリス塩酸（pH7.2）、１５０ｍＭＮａＣｌに置換し、酵素源として、後述(iii)にて用いた。【０１２１】
(iii)mSAT-I変異体の活性測定
LacCer溶液の溶媒（クロロホルム:メタノール=1:1）を飛ばした後、4 x 反応混合液を４回加え、超音波処理によりLacCerを懸濁させた。更に、3 mM CMP-シアル酸５０μｌと酵素源１００μｌ及びバッファー（組成：２０ｍＭ トリス塩酸、150 mM NaCl、pH7.2）のみを加え、37℃で２時間反応させた。反応溶液からガングリオシドGM3をSep-Pak Plus18で精製し、HPTLCプレートにアプライし、同時にGM3の標準物質（0.25、0.05μｇ）も添加した。展開溶媒にはクロロホルム／メタノール／0.2% CaCl2（55/45/10）を用いて脂質を分離した。HPTLCプレートからPVDF膜へすべての脂質を熱転写した。得られたPVDF膜を乾燥後、ブロッキングバッファーでブロッキングし、1次抗体（GM3の特異的IgMモノクローナル抗体であるM2590を使用）をブロッキングバッファー中で反応させた。TBS-TバッファーでPVDF膜をよく洗った後、2次抗体（抗マウスIgM抗体  HRP標識）とブロッキングバッファー中で反応させた。TBS-TバッファーでPVDF膜をよく洗った後、ECL kit（Amersham Biosciences製）を用いて発色させ、X線フィルムでGM3を検出した。
同様に、大腸菌で発現させた野生型mSAT-Iについても活性を測定した。
結果（図２１）より、野生型mSAT-Iでは０．０５μｇ以下のGM3が検出され、変異体SAT-Iでは約０．５μｇのGM3が検出された。これより、変異体mSAT-Iは、野生型に比べ１０倍以上の活性があると考えられる。【０１２２】
この結果より、糖鎖修飾されていない変異型SAT-Iの遺伝子は、大腸菌中で発現させることができ、野生型SAT-Iの活性を有することが分かった。本発明の変異型タンパク質は、糖鎖が結合していない状態で活性を有するタンパク質であるため、大腸菌などの微生物細胞を用いて多量生産することが可能であり、有用である。【０１２３】
なお、本発明は、Ｎ結合型糖タンパク質における特定のグリコシレーションサイト又はこれを含めた近傍部位のアミノ酸配列を複数の動物種間で比較して、当該グリコシレーションサイトに糖鎖が結合する動物種と結合しない動物種におけるアミノ酸配列の相違を明らかにし、当該グリコシレーションサイトに糖鎖が結合する動物種における当該相違するアミノ酸を、糖鎖が結合しない動物種における当該相違するアミノ酸に置換することを特徴とする、糖鎖を保持しない状態で当該タンパク質の生理活性を保持させる方法についての思想をも包含するものである。【０１２４】
本発明タンパク質は、糖鎖が各種機能の発現に関与しているＮ結合型糖タンパク質において、その一部又は全てのＮ結合型糖鎖を保持しない状態で、当該糖タンパク質の生理活性を保持していることから、変異が導入される前のＮ結合型糖タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を簡便、迅速、大量かつ安価に製造することができ、さらにその品質を一定に保つことができることから、極めて有用である。本発明ポリヌクレオチドを利用すれば、本発明タンパク質の製造をより容易かつ迅速に行うことができ、極めて有用である。さらに本発明方法は、糖タンパク質の生理機能を糖鎖を保持しない状態で発現させることができ、極めて有用である。このような本発明は、医薬、試薬、種々の物質の合成ツール等としても極めて有用なものである。
【産業上の利用の可能性】
【０１２５】
本発明タンパク質は、変異が導入される前のＮ結合型糖タンパク質と同等の機能を有するため、医薬、試薬、種々の物質の合成ツール等として利用することができる。本発明ポリヌクレオチドは、本発明タンパク質の製造ツール等として利用することができる。また本発明方法は、これを本発明タンパク質の製造等に応用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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