(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）活性化剤であって、高インスリン血症、高脂血症、および高血圧症からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防又は改善のために使用する、オーラプテンからなるＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項２】
高インスリン血症、および高血圧症の少なくとも一つの疾病の予防又は改善のために使用する、請求項１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項３】
前記ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの少なくとも一方である請求項１又は２に記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項４】
前記オーラプテンが、柑橘類果実，柑橘類果汁および柑橘類果皮からなる群から選択される少なくとも１つ由来のものである請求項１から３のいずれかに記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項５】
前記柑橘類が、甘夏、八朔、夏みかんおよびグレープフルーツからなる群から選択される請求項４記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項６】
高インスリン血症、高脂血症、および高血圧症からなる群から選択される少なくとも一つの予防若しくは治療のための医薬であって、請求項１から５のいずれかに記載のＰＰＡＲ活性化剤からなる医薬。
【請求項７】
アディポネクチン分泌促進剤であって、高インスリン血症、高脂血症、および高血圧症からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防又は改善のために使用する、オーラプテンからなるアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項８】
高インスリン血症、高脂血症、および高血圧症からなる群から選択される少なくとも一つの疾病の予防又は改善のために使用する、オーラプテンからなるＰＰＡＲ活性化剤の製造のためのオーラプテンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、メタボリックシンドローム改善剤、ならびにそれを含む医薬、サプリメント、機能性食品および食品添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】  数年前より、ＷＨＯ（世界保健機構）をはじめ、米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）において、メタボリックシンドロームという概念が提唱されている。メタボリックシンドロームは、例えば、内臓脂肪型肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧症等の動脈硬化の原因となる様々な疾患が集積し、狭心症や心筋梗塞等が発症しやすい状態であり、内臓脂肪の蓄積や脂肪細胞の肥大化に起因するものと考えられている。【０００３】  内臓脂肪の蓄積が、糖尿病、高脂血症、高血圧症等の発症に関わるメカニズムとして、下記の２種類のメカニズムが明らかにされている。一つ目のメカニズムは、内臓脂肪に蓄積されたグリセリドが、空腹時に大量に分解され、その分解産物である遊離脂肪酸およびグリセロールが大量に放出され、それらが、肝臓に過剰流入する結果、高脂血症、高血糖ならびに高インスリン血症に繋がるというメカニズムである。もう一つのメカニズムは、内臓脂肪の蓄積により、アディポサイトカインの分泌が異常になり、この結果、例えば、アディポネクチンの分泌が低下し、糖尿病、動脈硬化等が発症するというメカニズムである（例えば、非特許文献１参照）。アディポネクチンは、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）αおよびＡＭＰキナーゼを活性化して、脂肪酸燃焼等を促進し、組織内中性脂肪含有量を低下させることにより、例えば、インスリン抵抗性等を改善することが明らかにされている。また、アディポネクチンには、この他に、抗糖尿病、抗動脈硬化、抗高血圧、抗炎症作用を有することが報告されている。【０００４】  一方、核内受容体であるＰＰＡＲは、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、その他、肥満、高血圧、高脂血症および動脈硬化の改善に関わっていると言われている。ＰＰＡＲには、α、δ、γの３つのタイプと、いくつかのサブタイプが知られている。ＰＰＡＲαは、主として肝臓細胞に発現し、その他、心筋細胞や消化管細胞にも発現が認められ、脂肪酸酸化、ケトン体生成、アポリポタンパク質の生成などに関与している。ＰＰＡＲδは、組織特異性が認められず、体全体に発現しているが、大腸がん細胞での発現が顕著である。ＰＰＡＲγは、γ１型とγ２型との２つのサブタイプに分類でき、γ１型は、脂肪組織、免疫系組織、副腎、小腸で発現し、γ２型は、脂肪細胞で特異的に発現しており、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っている。【０００５】  メタボリックシンドローム罹患者は、先進国を中心に増加傾向にあり、安全性に優れ、長期摂取可能なメタボリックシンドローム改善剤が、早急に求められている。
【非特許文献１】松澤祐次、「メタボリックシンドロームの概念と分子メカニズム」、治療、２００４年１１月、第８６巻、第１１号、ｐ０１１−０１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  そこで、本発明は、副作用の問題がなく、長期摂取可能であるメタボリックシンドローム改善剤の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  前記目的を達成するために、本発明のメタボリックシンドローム改善剤は、オーラプテンを含むことを特徴とする。前記メタボリックシンドロームは、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等の疾病を含む。
【発明の効果】
【０００８】  本発明者は、副作用および長期摂取の観点から、食品中に含まれる物質を中心に一連の研究を重ねた。その過程で、柑橘類に含まれるオーラプテンが、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの活性化作用、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌促進作用、ならびに肝臓細胞における超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の生成抑制作用を有することを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明のメタボリックシンドローム改善剤によれば、ＰＰＡＲの活性化により、脂肪の燃焼を促進させ、ＴＮＦαおよび遊離脂肪酸の分泌を抑制するため、脂肪細胞の状態を正常化でき、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、肥満、内臓脂肪型肥満、高血圧、高脂血症および動脈硬化等の疾病を予防若しくは治療等できる。また、本発明のメタボリックシンドローム改善剤によれば、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌促進により、脂肪酸の燃焼およびＰＰＡＲαの活性化を促進して、脂肪細胞の状態を正常化でき、また、血管内膜の炎症等を抑制して、例えば、血管内へのＬＤＬの取り込み等を阻止できるため、これによっても、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、肥満、内臓脂肪型肥満、高血圧、高脂血症および動脈硬化等の疾病を予防若しくは治療等できる。さらに、本発明のメタボリックシンドローム改善剤によれば、肝臓細胞におけるＶＬＤＬの生成を抑制することにより、中性脂肪の増加を抑制できるため、例えば、高脂血症等の疾病を予防若しくは治療等できる。このように、本発明のメタボリックシンドローム改善剤は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物に投与することにより、例えば、前述のような疾病を予防若しくは治療等できるため、メタボリックシンドロームの優れた改善効果を有するといえる。【０００９】  さらに、オーラプテンを多く含む、例えば、八朔、甘夏、夏みかん、グレープフルーツ等の柑橘類は、長年食用されてきており、その安全性は確認されている。また、オーラプテンは、カロリーが低く、この点で糖尿病患者や肥満患者等が長期摂取しても問題がない。そして、オーラプテンは、無味無臭であるため、食品等に添加しても、その食品独特の風味を損なうことがないため、例えば、食品に添加して長期に渡って日常的に摂取することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の一実施例において、オーラプテンのＰＰＡＲγリガンド活性を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例において、オーラプテンのＰＰＡＲαリガンド活性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例において、オーラプテンによるアディポネクチンｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図４】本発明の前記実施例において、オーラプテンによるアディポネクチン分泌促進効果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例において、オーラプテンによるＶＬＤＬ分泌抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  本発明のメタボリックシンドローム改善剤は、例えば、例えば、ＰＰＡＲの活性化作用、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌促進作用、肝臓細胞におけるＶＬＤＬの生成の抑制作用、脂肪細胞におけるＴＮＦαおよび遊離脂肪酸の分泌抑制作用、肝臓細胞における脂肪のβ酸化の促進作用等を有する。活性化されるＰＰＡＲは、例えば、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの少なくとも一方であり、好ましくは双方である。また、本発明のメタボリックシンドローム改善剤は、例えば、脂肪細胞のアポトーシス、分化および小型化の少なくとも一つを誘導する。なお、本発明のメタボリックシンドローム改善剤は、オーラプテン以外に、各種添加剤を含んでいても良く、さらに、例えば、その他のＰＰＡＲ活性化作用を含む成分等を含んでいても良い。【００１２】  本発明のメタボリックシンドローム改善剤において、使用するオーラプテンは、特に制限されないが、例えば、柑橘類由来のものが挙げられる。特に、果汁由来のもの、果実由来のものおよび果皮由来ものが好ましく、これらのうち１種類のみを使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記柑橘類としては、例えば、甘夏、八朔、夏みかん、グレープフルーツ等が挙げられる。前記オーラプテンは、例えば、前記柑橘類から単離精製したものを使用してもよいし、市販のものを使用してもよい。【００１３】  つぎに、本発明の医薬は、メタボリックシンドロームの予防若しくは治療のための医薬であって、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤を含む医薬である。本発明の医薬をヒト及びヒトを除く哺乳動物に投与することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等の疾病の予防若しくは治療が可能である。本発明の医薬は、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤以外に、例えば、その他のＰＰＡＲ活性化作用を含む成分、薬学的に許容可能な添加物等を含んでいても良い。本発明の医薬において、具体的な剤形は、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等があげられ、各剤形に適した添加剤や基材等を適宜使用し、日本薬局方等に記載された通常の方法に従って製造できる。また、投与経路は、特に制限されず、例えば、経口投与や非経口投与が挙げられる。前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等が挙げられる。【００１４】  つぎに、本発明のサプリメントは、メタボリックシンドロームの予防若しくは改善のためのサプリメントであって、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤を含むサプリメントである。本発明のサプリメントをヒト及びヒトを除く哺乳動物が摂取することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明のサプリメントは、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤以外に、各種添加剤、その他のサプリメント等を含んでいても良く、例えば、その他のＰＰＡＲ活性化作用を含む成分、ビタミンＣなどの各種ビタミン類、アミノ酸、オリゴ糖等を��んでいてもよい。本発明のサプリメントの形態は、特に制限されず、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等が挙げられる。【００１５】  つぎに、本発明の機能性食品は、メタボリックシンドロームの予防若しくは改善のための機能性食品であって、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤を含む機能性食品である。本発明の機能性食品をヒト及びヒトを除く哺乳動物が摂取することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明の機能性食品は、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤以外に、各種添加剤等を含んでいても良く、例えば、その他のＰＰＡＲ活性化作用を含む成分等を含んでいても良い。なお、本発明の機能性食品の形態は、特に制限されず、例えば、麺類、菓子類、機能性飲料等があげられる。【００１６】  つぎに、本発明の食品添加剤は、メタボリックシンドロームの予防若しくは改善のための食品添加剤であって、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤を含む食品添加剤である。本発明の食品添加剤をヒト及びヒトを除く哺乳動物が摂取することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明の食品添加剤は、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤以外に、各種添加剤等を含んでいても良く、例えば、その他のＰＰＡＲ活性化作用を含む成分等を含んでいても良い。本発明の食品添加剤の形態は、特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等が挙げられる。なお、本発明の食品添加剤は、例えば、飲料用も含む。【００１７】  つぎに、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、オーラプテンを含むことを特徴とする。本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、オーラプテン以外の他の成分を含んでいてもよい。前記他の成分としては、例えば、各種添加剤、その他のＰＰＡＲ活性化剤等がある。本発明のＰＰＡＲ活性化剤において使用できるオーラプテンは、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤と同様である。【００１８】  本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、例えば、前記メタボリックシンドロームの改善や皮膚疾患等の治療等に使用できる。前記皮膚疾患としては、例えば、懐胎期間が３３週以下の早産幼児の皮膚；アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎；口唇炎、荒れた唇、鼻の刺激および外陰膣炎等の粘膜の炎症；アレルギーおよび刺激物接触等で起こる湿疹皮膚炎、冬季湿疹、放射線皮膚炎、うつ血性皮膚炎；化学薬剤、火傷、水疱性障害、静脈、動脈、塞栓性又は糖尿病の潰瘍を含む血管の損傷若しくは欠血による潰瘍やびらん；バリヤの異常を伴うかまたは伴わない魚鱗癬；表皮水疱症；乾癬；肥大した瘢痕、ケロイド；内因性老化およびダーマトヘリオサス（ｄｅｒｍａｔｏｈｅｌｉｏｓｕｓ）；機械的摩擦による発疱；コルチコステロイド萎縮症；リグニン黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、紫外線角化症およびウイルス誘発異常増殖（いぼおよび尖形コンジローム）を含む黒色腫と非黒色腫の皮膚癌等があげられる。本発明のＰＰＡＲ活性化剤を皮膚疾患の治療に使用する場合、その形態は特に制限されないが、例えば、ローション剤、液剤、ゲル剤、クリーム剤、皮膚軟化クリーム剤、軟膏、スプレー剤、または局所塗布を行えるその他の形態等があげられる。【００１９】  つぎに、本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、オーラプテンを含むことを特徴とする。本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、オーラプテン以外の他の成分を含んでいてもよい。本発明のアディポネクチン分泌促進剤において使用できるオーラプテンは、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤と同様である。【００２０】  本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、例えば、前記メタボリックシンドロームの改善や慢性肝炎等の慢性肝臓疾患の治療等に利用できる。本発明のアディポネクチン分泌促進剤によれば、例えば、慢性肝炎等の慢性肝臓疾患における肝線維化を抑制できるためである。本発明のアディポネクチン分泌促進剤の形態は、特に制限されず、例えば、医薬、サプリメント、機能性食品及び食品添加物等があげられる。【００２１】  つぎに、本発明の使用は、メタボリックシンドローム改善剤の製造のためのオーラプテンの使用である。また、本発明のその他の使用は、メタボリックシンドロームを改善するためにヒト及びヒトを除く哺乳動物にオーラプテンを投与することを含む使用である。本発明のさらにその他の使用は、ＰＰＡＲ活性化剤の製造のためのオーラプテンの使用である。前記オーラプテンは、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤と同様のものを使用できる。前記哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等があげられる。【００２２】  つぎに、本発明のメタボリックシンドロームを改善する方法は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物にオーラプテンを投与することを含む方法である。本発明の改善方法において使用できるオーラプテンは、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤と同様である。本発明の改善方法において、投与するオーラプテンの形態は特に制限されず、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等があげられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、経口投与や非経口投与が挙げられ、前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等が挙げられる。【００２３】  つぎに、本発明のＰＰＡＲ活性化方法は、オーラプテンによりＰＰＡＲを活性化する方法である。本発明のＰＰＡＲ活性化方法において、前記オーラプテンを、例えば、脂肪細胞等に接触させることによりＰＰＡＲを活性化することがより好ましい。本発明の活性化方法において使用できるオーラプテンは、前記本発明のメタボリックシンドローム改善剤と同様である。【００２４】  つぎに、本発明におけるオーラプテンは、前述のように柑橘類を原料として製造することが好ましい。この製造方法の一例（特開平１１−２９５６５号公報）を、以下に示す。【００２５】  まず、柑橘類の果皮を、常温下で、水に浸漬させた後、遠心分離して果皮油を得る。前記果皮に代えて、果実、果肉、果汁を使用してもよいが、オーラプテンの含有量が多いことから、果皮を使���することが好ましい。【００２６】  続いて、前記果皮油を吸着剤に吸着させる。前記吸着剤としては、電気的に中性で、比表面積が大きい多孔性吸着剤を使用することが好ましく、例えば、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体を含む樹脂等が挙げられる。また、吸着量を多くして効率よくオーラプテンを精製するという観点から、前記吸着剤として使用する樹脂は、乾燥状態で使用することが好ましい。【００２７】  前記果皮油を吸着させた吸着剤を、アルコール水溶液を用いて洗浄することにより、吸着剤に吸着した不純物を除去する。前記アルコール水溶液のアルコール濃度は、例えば、５０％（体積比）未満であり、好ましくは１０％以上４５％以下であり、より好ましくは３５％以上４５％以下である。前記アルコールとしては、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられ、精製したオーラプテンを食品添加物に用いる場合は、エタノールが好ましく、医薬品に用いる場合は、イソプロピルアルコールが好ましい。また、前記アルコール水溶液の量は、特に制限されないが、例えば、吸着剤に吸着されているオーラプテン含有液の約１４倍（体積比）であることが好ましい。【００２８】  そして、前記吸着剤から、アルコール水溶液を用いてオーラプテンを溶出する。この溶出液は、オーラプテンを含んでいるので、そのまま使用してもよいし、濃縮若しくは乾燥させて使用してもよい。このようにして得られたオーラプテンは、ほぼ白色の無味無臭である。前記アルコール水溶液のアルコール濃度は、例えば、５０％以上９５以下であり、好ましくは６０％以上９０％以下であり、より好ましくは７５％以上８５％以下である。前記アルコール水溶液およびその添加量は、前述と同様である。【００２９】  つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例に制限されない。
【実施例１】
【００３０】  下記に示すように、本実施例は、オーラプテンによるＰＰＡＲγ活性化を確認した例である。【００３１】  ＣＶ−１細胞（雄性アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞）を、２４穴培養プレートに０．２μｇ／ｗｅｌｌとなるように植え込み、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培地には、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０ｍｇ／ｍＬペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＣＯ社）を用いた。ｐＭ−ｈＰＰＡＲγとｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃとを、リポフェクトアミンシステム（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションした。なお、ｐＭ−ｈＰＰＡＲγは、ＧＡＬ４遺伝子（アミノ酸配列１〜１４７）とヒトＰＰＡＲγリガンド結合部位遺伝子（アミノ酸配列２０４〜５０５）とを結合したキメラ蛋白発現用プラスミドであり、ｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子上流にＧＡＬ４の応答配列（ＵＡＳ）を４回組み込んだレポーター・プラスミドである。トランスフェクションの約２４時間後、種々濃度（０．１、１．０、１０、５０および１００μＭ）のオーラプテンのサンプルを前記培地に加え、２４時間培養した。前記サンプルは、オーラプテンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することにより調製した。無処置対照には、前記オーラプテンに代えて、ＤＭＳＯを加えた。培養後、デュアル・ルシフェラーゼレポータージーンアッセイシステム（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。【００３２】  測定群と同様に、コントロール群としてｐＭ−ｈＰＰＡＲγの代わりにｐＭ（ＰＰＡＲγリガンド結合部位遺伝子を除去したプラスミド）を用いて測定した。各サンプルについて、測定群及びコントロール群の発光強度の平均値（ｎ＝４）の比（測定群／コントロール群）を算出し、無処置対照に対する相対活性をサンプルのＰＰＡＲγリガンド活性とした。この結果を下記表１および図１のグラフに示す。【００３３】
【表１】
0005080813.tif 000002
【００３４】  前記表１および図１から分かるように、オーラプテンによって、ＰＰＡＲγの活性が向上し、その活性は、オーラプテンの濃度が高くなるにつれて高くなった。
【実施例２】
【００３５】  下記に示すように、本実施例は、オーラプテンによるＰＰＡＲα活性化を確認した例である。【００３６】  ｐＭ−ｈＰＰＡＲγに代えてｐＭ−ｈＰＰＡＲαを使用し、オーラプテンの濃度を、０．１、１．０、１０、５０および８０μＭとした以外は、実施例１と同様にして、オーラプテンのＰＰＡＲαリガンド活性を測定した。この結果を下記表２および図２のグラフに示す。【００３７】
【表２】
0005080813.tif 000003
【００３８】  前記表２および図２から分かるように、オーラプテンによって、ＰＰＡＲαの活性が向上し、その活性は、オーラプテンの濃度が高くなるにつれて高くなった。
【実施例３】
【００３９】  下記に示すように、本実施例は、オーラプテンによるアディポネクチンの分泌促進を確認した例である。【００４０】  （前駆脂肪細胞の分化誘導）
まず、以下の２種類の培地を準備した。
分化誘導培地（０．２５μＭ：ＤＥＸ、０．５ｍＭ：ＭＩＸ、１０μｇ／ｍＬ：インスリン／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）
ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ製）５００ｍＬに、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ製））を５５ｍＬ加え、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを調製した。これに、１ｍＭ  ＤＥＸ（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）／ＤＭＳＯ（ナカライ製）を１３８．７５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬインスリン／ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ製）を５５５μＬ加えた。なお、インスリン／ＰＢＳは、予めＰＢＳに１Ｎ  ＨＣｌを加え、インスリンが溶ける程度に酸性にした後、インスリンを溶解させた。ＭＩＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（ナカライ製）を、０．５ｍＭとなるように、使用する直前に必要な量の前記培地に加えることにより、分化誘導培地を調製した。ＭＩＸは非常に溶けにくいため、まず少量の９９．５％エタノールに溶解させた後、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに加えた。このとき９９．５％エタノールは最終濃度が、１％を越えないようにした。
分化促進培地（５μｇ／ｍＬ：インスリン／１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）
１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ  ５５５ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬインスリン／ＰＢＳを２７７．５μＬ加え、分化促進培地を調製した。【００４１】  つぎに、培養前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を解凍し、１００ｍｍディッシュにまき、３Ｔ３−Ｌ１が、約８０％コンフルエントに達するまで培養した。約８０％コンフルエントに達したディッシュ１枚分の１０Ｔ１／２を６ウェルプレート１枚に継代し、３Ｔ３−Ｌ１が６ウェルプレートにおいてコンフルエントに達するまでさらに培養した後、分化誘導培地に培地交換して分化誘導させた。４８時間後、分化促進培地に培地交換し、以降２日おきに分化促進培地で培地交換した。分化誘導開始７日後、セパゾールＲＮＡ  Ｉ  ｓｕｐｅｒ（ナカライ製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）を用いて、脂肪細胞分化初期の指標である３６Ｂ４、ａＰ２およびアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量の測定を行った。また、分化誘導７日後の培地を、各ウェルから１ｍＬずつ採取し、マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（商品名）（大塚製薬製）を用いて、培養上清中のアディポネクチン量を測定した。【００４２】  （Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）によるｍＲＮＡの定量）
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出と定量
前記６ウェルプレートから培地を除去し、各ウェルに１ｍＬずつセパゾールＲＮＡ  Ｉ  ｓｕｐｅｒ（ナカライ製）を加え、ピペッティングを数回繰り返すことにより細胞を分散させた。この液を１．５ｍＬのチューブに移し、室温で５分間放置した後、クロロホルムを２００μＬ加え、Ｖｏｒｔｅｘでよく撹絆し、室温で３分間放置した。４℃に冷却し、１２０００×ｇで１５分間遠心した。フェノール層（下層、黄色）と水層（上層、無色）との界面を乱さないように注意しながら、水層のみを別のチューブ（容量１．５ｍＬ）へ移した。この際、中間に浮いているタンパク質を取らないように注意した。前記チューブにイソプロパノールを５００μＬ加えて混和し、室温で１０分間放置した。４℃に冷却し、１２０００×ｇで１０分間遠心し、上清約１ｍＬを除去した。この沈殿に７５％エタノールを１ｍＬ加えて撹拌して、沈殿を十分に懸濁した後、４℃に冷却し、１２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を除去した。得られた沈殿（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を乾燥させた後、２０μＬのｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶かし、ＮａｎｏＤｒｏｐ（スクラム製）によりｍＲＮＡの濃度を測定した。【００４３】 逆転写
抽出し、測定したｍＲＮＡ溶液を、ｍＲＮＡ濃度が１μｇ／μＬになるように調整した。８連チューブ（容量０．２ｍＬ）に、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  プライマー１μＬと前記ＲＮＡ溶液１０μＬとを添加した。Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、前記混合液を７０℃で１０分間インキュベートし、ＲＮＡの高次構造を破壊して、氷上に移して一分以上放置した。ついで、１１μＬのＲＮＡサンプル／プライマー混合液、５μＬの５×逆転写緩衝液、１μＬのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ、５μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、及び、２μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを順に加えた（合計２４μＬ）。【００４４】  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒで、４２℃で５分間プレインキュベートした後、逆転写酵素を１μＬ添加し、チューブの内容物をピベッティングでよく混合した。Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒで、４２℃で５０分間、さらに７０℃で１５分間インキュベートした後、氷上で冷やし、軽く遠心して反応液をチューブの底に集め、−２０℃で凍結保存しておいた。なお、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）測定に使用する場合は、その都度１０倍希釈して用いた。【００４５】 Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）測定
以下の操作は全てクリーンベンチ内で行った。発現量を測定する遺伝子の断片が入ったプラスミド溶液５ｍＬを０．６５ｍＬのチューブに加え、それをＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（商品名）に付属の水４５ｍＬで１０倍に希釈した。この作業を繰り返し、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７および１０８倍の各希釈溶液を作製した。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ａｄａｐｔｅｒ（商品名）に専用キャピラリーを、ピンセットを用いてセットし、そこに前記試薬を１８μＬずつ分注した。さらに、水（ネガティブコントロール）又は７段階の希釈溶液（スタンダード）と測定用サンプルのｃＤＮＡの１０倍希釈液とを２μＬずつ添加し、ピンセットを用いて蓋をした。５０００ｒｐｍ、４℃で１０秒間遠心した後、キャピラリーをカルーセルに装填して、チャンバーにセットし、測定を行った【００４６】  （ＥＬＩＳＡによるアディポネクチン分泌量の測定）
前記マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキットの構成は、以下の通りである。
洗浄用原液
検体希釈用原液
抗体プレート（抗マウスアディポネクチンポリクローナル抗体（ウサギ）固相プレート）
標準品８．０ｎｇ／ｍＬ（リコンビナントマウスアディポネクチン）
ビオチン標識抗体液（ビオチン標識抗マウスアディポネクチン  ポリクロナール抗体（ウサギ））
酵素標識ストレプトアビジン原液（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン）
酵素標識ストレプトアビジン希釈液
基質液Ａ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）
基質液Ｂ（過酸化水素）
反応停止液【００４７】  まず、以下の試薬および検体液を調製した。
洗浄液
前記洗浄用原液４０ｍＬに対して、精製水を９６０ｍＬの割合で混合し、２．８℃で保存した。
検体希釈液
前記検体希釈用原液５０ｍＬに対して、精製水を２００ｍＬの割合で混合し、２．８℃で保存した。
標準液
前記標準品８．０ｎｇ／ｍＬを、前記検体希釈液で２段階希釈し、４．０ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、１．０ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬおよび０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度の標準液を調製した。
酵素標織ストレプトアビジン液
前記酵素標識ストレプトアビジン希釈液１２ｍＬに対して、前記酵素標識ストレプトアビジン原液を６０μＬの割合で混和した。
基質液
前記基質液Ｂ６ｍＬに対して、前記基質液Ａを６ｍＬの割合で混和した。
検体液
前記検体希釈液を用いて、コントロールおよびリガンド候補物質添加培養上清は、２５倍に希釈し、ポジティブコントロールであるビオグリタゾン添加培養上清は、５０倍に希釈した。【００４８】  検査に必要な抗体プレートのストリップだけを取り出した。前記洗浄液を、抗体プレートの各ウェルに約２００μＬずつ加えた後、プレートウォッシャーでウェルの液を完全に吸引除去した。この洗浄及び吸引を再度行った。各濃度の標準液および希釈済みの検体を各ウェルに１００μＬずつ添加し、二連で測定した。なお、標準液は、測定およびプレートごとに必ず測定した。プレートシールで抗体をカバーし、室温で６０分間静置反応させた後、抗体プレートからプレートシールを取り除き、プレートウォッシャーでウェル中の液を完全に吸引除去した。続いて、洗浄液を各ウェルに約２００μＬずつ加え、速やかに吸引除去した。この洗浄及び吸引をさらに４回繰り返した。ビオチン標準抗体液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した後、プレートシールで抗体をカバーし、室温で６０分間静置反応させた。前述と同様にして、同様にウェルの洗浄及び吸引を５回繰り返した。酵素標識ストレプトアピジン液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した後、プレートシールで抗体をカバーし、室温で６０分間静置反応させた。前述と同様にして、同様にウェルの洗浄及び吸引を５回繰り返した。基質液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で１５分間静置反応させた後、反応停止液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、プレートリーダーにより各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【００４９】  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＭ）の定量結果を用いて、各サンプルについて、３６Ｂ４のｍＲＮＡと、ａＰ２およびアディポネクチンのそれぞれとのｍＲＮＡ発現量の比を算出し、その結果を、下記表３および図３のグラフに示す。また、ＥＬＩＳＡによるアディポネクチンの分泌量の測定結果を、下記の表４および図４のグラフに示す。【００５０】
【表３】
0005080813.tif 000004
【００５１】
【表４】
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【００５２】  オーラプテンを添加した分化誘導培地で培養した脂肪細胞と、無処置対照の培地で培養した脂肪細胞とを比較した結果、オーラプテンを添加することにより、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌が促進した。
【実施例４】
【００５３】  下記に示すように、本実施例は、オーラプテンによるＶＬＤＬの分泌抑制を確認した例である。【００５４】  （細胞の培養）
ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ製）に、ＦＣＳが終濃度１０％、非必須アミノ酸が１％、ピルビン酸ナトリウムが１ｍＭ、グルタミン液が２ｍＭになるように混合した。なお、混合はクリーンベンチ内で無菌的に行った。１００ｍｍ／Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ（商品名、ＩＷＡＫＩ製）において、８０〜９０％コンフルエントに培養したＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞）の培地をピペッティングにより除去し、２ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄した。２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを加え、細胞全体に行き渡るようにゆっくりと前記ディッシュを回転させた後、これをピペッティングして除去した。前記ディッシュをＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％）の中で１５分間静置した後、増殖培地を４ｍＬ加え、ピペッティングして混合した。これを、予め３ｍＬの増殖培地を添加した２枚のディッシュに２ｍＬずつ加えた。前記ディッシュに蓋をし、十字に動かし内容物を混合した。顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ製）で細胞を確認した後、ＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％）で培養した。３、４日後、顕微鏡で８０〜９０％コンフルエントになっていることを確認した後、同様の方法で継代を行い、細胞培養を行った。【００５５】 １．タイムコース実験
ＨｅｐＧ２を８０〜９０％コンフルエントに培養し、その培地をピペッティングで除去し、２ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、増殖培地を５ｍＬ加えた。１０時間おきにチューブ（容量１．５ｍＬ）に２００μＬの培地を採取し、そのサンプルを用いて、ａｐｏＢ１００のウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡの測定を行った。【００５６】  （ウェスタンブロッティング）
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１．５ｍＬのチューブに、２０μＬの培地と、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％（ｗ／ｖ）２−メルカプトエタノールおよび０．０００５％ＢＰＢ溶液を含む緩衝液とを加え、全量を３０μＬにして、よく撹拌した。湯浴にて１００℃で５分間煮沸して、ＳＤＳ化を行った。７．５％ＳＤＳを含むアクリルアミドゲルを、Ｍｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ３  Ｃｅｌｌ（商品名、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）にセットし、ゲルがしっかり浸るように泳動バッファーを３００μＬ注いだ。なお、前記泳動バッファーは、３０ｍＬの１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、２７０ｍＬのｄ  Ｈ２Ｏで希釈して作製した。ゲルに、サンプル３０μＬとＲａｉｎｂｏｗ  Ｍａｒｋｅｒ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ製）５ｍＬとを静かに分注し、泳動を行った。泳動条件は２００Ｖ定電圧で４０〜４５分行った。パワーサプライには、Ｍｏｄｅｌ  ３０００ｘｉ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ（商品名、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を使用した。【００５７】  （２）ブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のゲルを、転写緩衝液（２．４２ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ、１１．５５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％メタノール）に、１５分間、ＰＶＤＦ膜（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｐ  ＰＶＤＦ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）とともに浸して平衡化した。セミドライ平板転写装置（日本エイドー製）を用いて、セミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した（４０ｍＡ／ｍｅｍｂｒａｎｅ、９０分）。この膜を５％スキムミルクでブロッキング（室温、１時間）した。ブロッキング後、５％スキムミルクで１０００倍希釈した５ｍＬのＭｓ×Ｈｕ  ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）を前記膜に分注し、１時間室温で反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し（１０分、２０分、３０分）、５％スキムミルクで５０００倍希釈した５ｍＬの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を前記膜に均一に注ぎ、１時間室温で反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し（１０分、５０分、１０分）、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いた化学発光法により検出を行った。【００５８】  （ＥＬＩＳＡ）
まず、ＶＬＤＬスタンダード液を調製した。ＶＬＤＬスタンダード液は、１．１６９ｍｇ／ｍＬのヒトＶＬＤＬ  ｓｔａｎｄａｒｄ（商品名、ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）を、増殖培地で希釈して用いた。希釈率は１００倍、１０００倍、１００００倍、１０００００倍および１００００００倍である。【００５９】  ＶＬＤＬ中のヒトａｐｏＢ１００を抗原として認識するサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて行った。まず、ＥＬＩＳＡ  ＰＬＡＴＥの１穴につき１００μＬのＭｏａｂ×ＬＤＬ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡｐｏＢ（ＭＯＮＯＳＡＮ製）を分注し、プレートを滅菌シールで密閉した後、４℃で一晩静置した。以後、全ての分注は１穴におけるものとする。翌日に、２００μＬのＺｅｐｔｏ  Ｂｌｏｃｋ（商品名、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を分注した後、前記プレートを密閉し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ついで、１００μＬの培地とＶＬＤＬスタンダード液とを分注した後、前記プレートを密閉し、室温で１時間静置した。２００μＬのＰＢＳＴでの洗浄と、アスピレータでの吸引とを計５回行った。ＰＢＳで１０００倍希釈した１００μＬのＡｆｆｉｎｉｔｙＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉ−ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ製）を分注し、室温で１時間静置した。前述と同様にして洗浄し、ＰＢＳで５０００倍希釈した１００μＬのＤｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を分注し、室温で１時間静置した。前述と同様にして洗浄し、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商品名、フナコシ製）のＡ液とＢ液とを混合し、５分間室温で静置した後、この混合液を１００μＬ分注し、５分間室温で静置した。前記混合液に、１００μＬの１Ｍリン酸溶液を加え、ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯｓｘ（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）で４５０ｎｍにおける光度測定を行った。測定モードはＰｈｏｔｏｍｅｔｒｙ（４５０ｎｍ、１．０Ｓ）とした。【００６０】  ヒトａｐｏＢ１００のウェスタンブロッティングの結果より、２０時間以降にバンドがはっきりと確認された。また、ＥＬＩＳＡの結果より、培養開始から５０時間くらいまで直線的なＶＬＤＬ分泌量の増加が確認された。これらの結果より、後述するＶＬＤＬ分泌抑制実験における培地の回収時間は、３０時間とした。【００６１】 ２．ＶＬＤＬ分泌抑制実験
（オーラプテンを含む培地の調製）
１５ｍＬの遠心チューブに３ｍＬの培地を加え、さらに、終濃度が１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭとなるようにオーラプテンを加え、転倒撹拌によりよく混合して、オーラプテンを含む培地を調製した。また、コントロールとして、オーラプテンの代わりにＤＭＳＯを同量加えたものを調製した。【００６２】  ＨｅｐＧ２を、１００ｍｍ／Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ（商品名、ＩＷＭＩ製）で８０〜９０％コンフルエントに培養した。前記ディッシュから、培地をピペットで除去した後、２ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄した。２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを加え、細胞全体に行き渡るようにゆっくりと前記ディッシュを回転させ、前記トリプシン−ＥＤＴＡをピペットで除去し、前記ディッシュをＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％）の中で１５分間静置した。そこに、１２ｍＬの増殖培地を加え、ピペッティングにより混合し、この混合液をＣｏｌｌａｇｅｎ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ  １２Ｗｅｌｌ／Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ（商品名、ＩＷＡＫＩ製）に、１ウェルにつき、１ｍＬずつ分注した。顕微鏡で細胞を確認した後、前記ウェルをＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％）で１〜２日間培養した。顕微鏡で８０〜９０％コンフルエントになっていることを確認した後、培地を除去し、オーラプテンを含む培地を８００μＬ加えて培地を交換した。３０時間後、各ウェルから、培地８００μＬを採取した。この採取した培地を用い、生細胞数の計測ならびに、前述と同様にしてウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡの測定を行った。ＥＬＩＳＡの結果を用いて、各サンプルについて、測定群と無処置対照とのＶＬＤＬ分泌量の比（測定群／コントロール群）を算出した。【００６３】  （生細胞数の計測）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて測定した。まず、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １．６ｍＬと増殖培地６．４ｍＬとを遠心チューブ（容量１５ｍＬ）に加え、よく撹拌した。前記培地を撹拌した直後のウェルに、前記混合液を１ウェルにつき６００μＬずつ加え、ＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％）で、４０分間インキュベートした。この混合液を、ＥＬＩＳＡ  ＰＬＡＴＥ  ９６ｗｅｌｌ（商品名、ＩＷＡＫＩ製）に、１００μＬずつ３穴に分注し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定には、ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯｓｘ（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用い、測定モードは、Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ（４９０ｎｍ、１．０Ｓ）とした。各サンプルについて、測定群と無処置対照との生細胞数の比（測定群／コントロール群）を算出した。【００６４】  以上の結果を下記表５および図５のグラフに示す。【００６５】
【表５】
0005080813.tif 000006
【００６６】  以上の結果より、オーラプテンによりＶＬＤＬの分泌抑制され、その割合は、オーラプテンの濃度が高くなるにつれより一層大きくなった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】  以上のように、本発明のメタボリックシンドローム改善剤は、優れたＰＰＡＲα活性およびＰＰＡＲγ活性、アディポネクチン分泌促進作用等を有することから、メタボリックシンドロームの改善に極めて有効であり、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化、肥満および内臓脂肪型肥満などの疾病の予防および治療等のための医薬、サプリメント、機能性食品および食品添加物として使用できる。なお、これらは、人に限られず、その他動物にも有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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