(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１又は配列番号：２に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤。
【請求項２】
前記HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）スフィンゴミエリンの生合成過程で合成される３−ケトジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロセラミド、セラミド及びスフィンゴミエリンから選択される化合物の量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記化合物の量を減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
【請求項４】
前記スフィンゴミエリンの生合成過程で合成される化合物が、セラミド又はスフィンゴミエリンであることを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）セリンパルミトイル転移酵素の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
【請求項６】
前記セリンパルミトイル転移酵素が、ＬＣＢ１であることを特徴とする、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項３〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。また、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの感染者は世界で１〜２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの患者の約５０％が慢性肝炎に移行しそのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変、肝癌となる。肝癌の約９０％の原因がＣ型肝炎といわれている。日本国内では、毎年２万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。【０００３】
ＨＣＶは１９８９年に輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶはエンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは１本鎖（＋）ＲＮＡからなり、フラビウイルス科のヘパチウイルス（Hepacivirus）属に分類される。【０００４】
ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多く、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多いことも知られている。【０００５】
よって、Ｃ型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対処療法とは別に、患部である肝臓においてＨＣＶを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。【０００６】
現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の１／３程度である。特にＨＣＶ  ゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフェロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗ＨＣＶ薬の開発が強く望まれている。【０００７】
近年、リバビリン（Ribavirin：１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用によるＣ型肝炎治療薬として市販されているが、有効率は依然低く、更なる新規なＣ型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。【０００８】
ＨＣＶ遺伝子がクローニングされて以来、ウイルス遺伝子の機構と機能、各ウイルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウイルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、信頼できる培養細胞を用いたＨＣＶ感染実験系は構築されていなかった。従って従来、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。【０００９】
しかし近年、ＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでのＨＣＶ複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬を容易に評価することができるようになった（非特許文献１）。この系でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製のメカニズムは、肝細胞に感染した全長ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアッセイ系ということができる。【００１０】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号パンフレット
【特許文献２】特願2003-34056
【特許文献３】特願2003-272420
【非特許文献１】ブイ・ローマンなど著、サイエンス（Science）、１９９９年、第２８５巻、第１１０−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明者らは、国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号（特許文献１）に開示されており、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する一連の化合物が、上記レプリコンアッセイ法で高いＨＣＶの複製阻害活性を有することを見出した（特許文献２）。また本願発明者らは、該化合物がインビトロの細胞毒性については軽微であり、ＨＣＶ感染症の予防剤または治療剤として極めて有用であることを見出し、さらに該化合物および誘導体の合成方法を構築した（特許文献３）。これら阻害剤はＨＣＶ感染症の治療薬となる可能性が高いと考えられる。しかし、ＨＣＶが生体内にどのような異常を引き起こしているのか、また、これらの一連の化合物はどのような生体内反応を阻害するかについてはこれまで解明されておらず、該化合物を薬剤として使用した時の挙動が懸念されていた。また、該化合物を医薬品として使用する上で、該化合物が生体内のどのようなカスケードに関与し、抗ＨＣＶ複製阻害活性を引き起こすのかについての解明が求められていた。【００１２】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する一連の化合物およびそれらの誘導体が、生体内のどのようなカスケードに関与し、抗ＨＣＶ複製阻害活性を引き起こすのかについて解明することにある。また、該化合物の阻害するカスケードを特定することで、それらのカスケードを遮断する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤を提供する。さらに、ＨＣＶ感染および抗ＨＣＶ複製阻害活性のメカニズムを解明することで、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、まず本願発明者らはオーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する化合物の一つである以下の式（II）で表される化合物と、該化合物に部分的に類似した構造を持つミリオシンについて、ＨＣＶレプリコンアッセイを行った。【００１４】
式（II）：
0004849622.tif 000002
【００１５】
ミリオシンはスフィンゴ脂質生合成（図１）の初段階で、セリンとパルミトイルCoAを縮合させて、３-ケトジヒドロスフィンゴシンを生成するセリンパルミトイル転移酵素（SPT）を特異的に阻害する化合物であり（Zweerink, M. M., Edison, A., M., Wells, G. B., Pinto, W., Lester, R. L., J. Biol. Chem., 267, 25032-25038 (1992) 、スフィンゴ脂質生合成全体を停止させる活性を持つ。【００１６】
式（II）で表される化合物またはミリオシンを1pMから100μMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、培養し全RNAを抽出した後で、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。その結果、ミリオシン及び式（II）で表される化合物に1-10nMの濃度でレプリコンRNAを50%減少させる効果が認められた（図２、３）。さらに、ミリオシン又は式（II）で表される化合物を１ｐMから100uMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、培養しタンパク質を回収した後、HCVタンパク由来の抗NS3ウサギ抗体を用いてウエスタン解析を行った。その結果、ミリオシン及び式（II）で表される化合物に1-10nMの濃度でHCVタンパク質の発現を50%減少させる効果が認められた（図４、５）。【００１７】
次に、スフィンゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフィンゴシンからジヒドロセラミドを生成するジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル転移酵素を特異的に阻害するフモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性を測定した。フモニシンB1を1.37uMから1000uMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、培養した後に、ルミネッセンス測定を行った。その結果、フモニシンB1は10-1000uMの濃度で、HCVレプリコン阻害活性を示すことが明らかになった（図６）。【００１８】
以上の結果より、セリンパルミトイル転移酵素（SPT）を特異的に阻害する化合物ミリオシンおよびジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル転移酵素を特異的に阻害するフモニシンB1は、抗HCV複製阻害活性を持ち、スフィンゴ脂質合成がHCV感染に関与していることが示唆された。そこで、本発明者らは、スフィンゴ脂質生合成の一つの過程を触媒するセリンパルミトイル転移酵素の阻害が、HCVレプリコン活性の阻害と直接関与しているかを確認するために、siRNAを用いたセリンパルミトイル転移酵素のノックダウン実験を行った。まず、セリンパルミトイル転移酵素のヘテロダイマーのうち１サブユニットLCB1を標的として、2種の特異的なsiRNA（si246、si633）を合成した。ウェスタンブロット解析を用いてsiRNAによるLCB1の発現阻害を測定したところ、コントロールsiRNAと比較して、2種類のsiRNAで共に発現阻害を示し、si246では特に強い発現阻害が認められた（図７）。【００１９】
さらに、LCB1をsiRNAによりノックダウンして、HCVレプリコン阻害活性を測定した。具体的には、LCB1発現を低下させた条件下で、Huh-3-1細胞における細胞毒性及びHCVレプリコン活性の影響を測定した。その結果、LCB1の発現を抑制したsi246、si633処理した細胞では、コントロールsiRNA処理した細胞に対し有意にHCVレプリコン活性を阻害し、特にLCB１の発現を強く抑制したsi246で阻害効果が強く認められた（図８）。また、同条件下においてsiRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとんど影響が認められなかった。これらの結果より、スフィンゴ脂質生合成がHCV感染に関与することがわかり、該生合成過程に存在する酵素活性を阻害することによって、HCV感染症の治療または予防を行うことが可能であると示唆された。【００２０】
次に、HCVレプリコン細胞を100 nMの式（II）で表される化合物で96時間処理し、HCV-NS3タンパク質の発現阻害を確認したところ、式（II）で表される化合物の添加により核周辺のHCV-NS3タンパク質が消失した（図10）。また、HCVレプリコン細胞を100 nMの式（II）で表される化合物で48時間および96時間処理し、ウエスタンブロット解析により、HCVの非構造タンパク質NS3,NS5A,およびNS5Bの発現を確認したところ、全てのタンパク質で発現の低下がみられた（図11）。これらの結果により、式（II）で表される化合物が、HCVのウイルス複製に関与している非構造タンパク質NS3,NS5A,およびNS5Bの発現を抑制させる効果を持つことが、明らかとなった。【００２１】
次に、ヒト組み換えSPT（ヘテロダイマーLCB1及びLCB2）タンパク質を調製し、式（II）で表される化合物のSPT阻害活性を測定したところ、式（II）で表される化合物はIC50 約10 nMでSPT阻害活性を有していることが明らかとなった（図12）。【００２２】
次に、HCVレプリコン細胞を式（II）で表される化合物で48時間処理し、［14C］セリンで標識したところ、式（II）で表される化合物が濃度依存的に細胞内のセラミド及びスフィンゴミエリンのde novo合成を阻害することが明らかとなった（図13）。また、細胞性浸透性セラミド（C2−セラミド）を式（II）で表される化合物と同時にHCVレプリコン細胞に添加し培養したところ、式（II）で表される化合物によるHCV複製阻害はC2セラミドの濃度に依存して抑制された（図14）。【００２３】
次に、HCVレプリコン細胞を、既知のSPT阻害剤ミリオシン、セラミド合成阻害剤フモニシンB1、及びセラミド輸送阻害剤HPA-12で処理し、レプリコン活性および生細胞数を測定したところ、いずれの化合物も細胞毒性を認めない濃度でHCVの複製を抑制することが明らかとなった（図15）。【００２４】
次に、HCVレプリコン細胞に１ mMの式（II）で表される化合物を添加し、ラフトタンパク質の発現を確認したところ、式（II）で表される化合物は可溶化剤耐性画分のNS5Bのタンパク質発現を低下させた（図16）。しかしながら、NS5Aや宿主のラフト結合タンパク質カベオリン−2においては、式（II）で表される化合物による影響は認められなかった。また、HCVレプリコン細胞に１ mMの式（II）で表される化合物を添加し、ショ糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質（可溶化剤耐性）、非ラフトタンパク質を分離したところ、NS5Bにおいて有意にラフト上からの解離が認められた（図17）。【００２５】
即ち、本発明者らは、スフィンゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
これまで、HCV遺伝子の機構と機能の解明が行われ、HCVの非構造タンパク質を標的としたHCV治療剤の開発が進められていたが、非構造タンパク質自体が複製の過程で変異を起こす可能性があるため、効果的な治療剤の開発が困難であった。
本発明により、スフィンゴミエリンの生合成がHCVの複製に関与することがわかり、ホスト細胞内でのウイルスの複製のメカニズムが明らかとなった。本発明の知見は、スフィンゴミエリン生合成系を新規なホストターゲットとした抗HCV剤の開発に大きく貢献するものである。これまでの抗HCV剤は、標的となるカスケードが不明確であり副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的がスフィンゴミエリン生合成系であり、より明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。また、本発明の抗HCV剤は、HCVのサブタイプや種々のタンパク質の変異によらず、広く抗HCVの作用を示す可能性がある。【００２６】
本発明は、より具体的には、以下の（１）〜（２３）を提供する。
（１）スフィンゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤。
（２）スフィンゴミエリンの生合成過程が、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程である（１）に記載の薬剤。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、（２）に記載の薬剤。
（ａ）パルミトイルCoAから3-ケトジヒドロスフィンゴシンの生合成に関与する、セリンパルミトイル転移酵素（SPT）の酵素活性を阻害する化合物
（ｂ）セリンパルミトイル転移酵素（SPT）の発現を抑制する化合物
（４）セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、スフィンゴファンギン、ミリオシン、以下の式（I）で表される化合物またはそれらの誘導体である、（３）に記載の薬剤。
式（I）：
0004849622.tif 000003
〔式中、Ａは、−（ＣＨ2）n−を表し、ここでｎは、０〜１０の整数を表し；
Ｂは、−ＣＨ2−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ2）−、または−Ｃ（＝ＮＯＲ）−を表し、ここでＲは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｄは、−（ＣＨ2）m−Ｒ′を表し、ここでｍは、０〜１０の整数を表し、Ｒ′は、水素原子、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、置換されていてもよい複素環式基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、−ＯＸ基（ここで、Ｘは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいアリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し；
Ｅは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Ｇは、−（ＣＨ2）p−Ｊを表し、ここでｐは、０〜４の整数を表し、Ｊは、水素、ＯＨ基、ＳＨ基、メチルチオ基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよい複素環式基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を表し；
結合Ｑは、単結合または二重結合を表し；そして
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＬ、直鎖又は分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここでＬは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示す。〕
（５）セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、以下の式（II）で表される化合物またはそれらの誘導体である、（３）に記載の薬剤。
式（II）：
0004849622.tif 000004
（６）セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）である、（３）に記載の薬剤。
（ａ）セリンパルミトイル転移酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）セリンパルミトイル転移酵素をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
（７）以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、（２）に記載の薬剤。
（ａ）スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）からジヒドロセラミドの生合成に関与する、ジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル転移酵素活性を阻害する化合物
（ｂ）（ａ）に記載のジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル化酵素の発現を抑制する化合物
（８）スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）からジヒドロセラミドの生合成に関与する、ジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル転移酵素活性を阻害する化合物が、フモニシンB1またはその誘導体である（７）に記載の薬剤。
（９）ジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル化酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）である、（７）に記載の薬剤。
（ａ）ジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル化酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）ジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル化酵素をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
（１０）以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、（２）に記載の薬剤。
（ａ）セラミドからスフィンゴミエリンの生合成に関与する、スフィンゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物
（ｂ）（ａ）に記載のスフィンゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物
（１１）スフィンゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（ａ）または（ｂ）である、（１０）に記載の薬剤。
（ａ）スフィンゴミエリン合成酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA
（ｂ）スフィンゴミエリン合成酵素をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
（１２）HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の薬剤。
（１３）以下の式（I）で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤。
式（I）：
0004849622.tif 000005
〔式中、Ａは、−（ＣＨ2）n−を表し、ここでｎは、０〜１０の整数を表し；
Ｂは、−ＣＨ2−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ2）−、または−Ｃ（＝ＮＯＲ）−を表し、ここでＲは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｄは、−（ＣＨ2）m−Ｒ′を表し、ここでｍは、０〜１０の整数を表し、Ｒ′は、水素原子、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、置換されていてもよい複素環式基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、−ＯＸ基（ここで、Ｘは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいアリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し；
Ｅは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Ｇは、−（ＣＨ2）p−Ｊを表し、ここでｐは、０〜４の整数を表し、Ｊは、水素、ＯＨ基、ＳＨ基、メチルチオ基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよい複素環式基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を表し；
結合Ｑは、単結合または二重結合を表し；そして
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＬ、直鎖又は分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここでＬは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示す。〕
（１４）以下の式（II）で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤。
式（II）：
0004849622.tif 000006
（１５）ヒト由来のセリンパルミトイル転移酵素を阻害する、（１３）または（１４）に記載の阻害剤。
（１６）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）スフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）（ａ）に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程
（ｃ）（ａ）に記載の酵素と結合する被検化合物を選択する工程
（１７）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）スフィンゴミエリンの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記化合物の量を減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
（１８）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を細胞に接触させる工程
（ｂ）スフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
（１９）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）スフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
（２０）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）スフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該スフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
（２１）スフィンゴミエリンの生合成過程が、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程である（１６）〜（２０）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２２）パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素が、セリンパルミトイル転移酵素、Ｎ−アシル転移酵素およびスフィンゴミエリン合成酵素である、（２１）に記載のスクリーニング方法。
（２３）HCV感染症が、C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、（１６）〜（２２）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２４）（１６）〜（２３）のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】スフィンゴ脂質合成経路（パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンまでの合成経路）を示す図である。
【図２】ノザンブロット解析によるミリオシンのHCV  RNA複製阻害活性を示す写真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。
【図３】ノザンブロット解析による式（II）で表される化合物のHCV  RNA複製阻害活性を示す写真である。横軸は式（II）で表される化合物の濃度を表す。
【図４】ウェスタンブロット解析によるミリオシンのHCVタンパク合成阻害活性を示す写真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。
【図５】ウェスタンブロット解析による式（II）で表される化合物のHCVタンパク合成阻害活性を示す写真である。横軸は式（II）で表される化合物の濃度を表す。
【図６】フモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性を示す図である。
【図７】siRNAによるセリンパルミトイル転移酵素（LCB1)のタンパク質発現阻害を示す写真である。
【図８】siRNAによるHCVレプリコン阻害活性および細胞毒性の影響を示す図である。
【図９】式（II）で表される化合物によるHCVレプリコンの阻害及び宿主細胞への毒性を示す図である。
【図１０】式（II）で表される化合物によるHCV-NS3タンパク質の発現阻害を示す写真である。免疫染色の後、蛍光顕微鏡にて観察した。白色はNS3タンパク質、灰色はヘキスト３３342で染色された核を示す。
【図１１】式（II）で表される化合物によるNS3、NS5A、およびNS-5Bタンパク質の発現阻害を示す図である。各タンパク質の発現は、ウェスタンブロット解析により行った。
【図１２】式（II）で表される化合物によるSPT阻害活性を示す図である。
【図１３】式（II）で表される化合物によるセラミド、スフィンゴミエリンのde novo合成阻害を示す図である。
【図１４】Ｃ２−セラミドによる式（II）で表される化合物のHCV複製阻害の抑制を示す図である。
【図１５】ラフト生合成関連低分子化合物によるHCV複製阻害を示す図である。
【図１６】式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。
【図１７】式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、スフィンゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。【００２９】
本発明において、スフィンゴミエリンの生合成過程としては、より好ましくはパルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程（図１）を挙げることが出来る。【００３０】
本発明において、スフィンゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物とは、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程に関わる生体内反応を、直接的もしくは間接的に阻害するものであれば如何なる化合物であってもよい。スフィンゴミエリンの生合成過程に関わる酵素の活性を阻害する化合物、生合成に関わる酵素の発現を阻害する化合物であってもよく、また、これらの阻害剤を生成または増加させる化合物であって、生合成に関わる酵素を間接的に阻害する化合物であってもよい。【００３１】
本発明において、スフィンゴミエリンの生合成過程に関わる酵素としては、セリンパルミトイル転移酵素、３−ケトジヒドロスフィンゴシン還元酵素、ジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素、ジヒドロセラミド不飽和化酵素、スフィンゴミエリン合成酵素等があるが（図１）、好ましくは、セリンパルミトイル転移酵素、ジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素、スフィンゴミエリン合成酵素を挙げることができる。【００３２】
本発明の化合物としては、スフィンゴ脂質生合成過程の初段階である、パルミトイルCoAから3-ケトジヒドロスフィンゴシンの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するセリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはセリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる。【００３３】
本発明の、セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよいが、好ましくはスフィンゴファギン、ミリオシン、以下の式（I）で表される化合物またはそれらの誘導体を挙げることができる。【００３４】
式（I）：
0004849622.tif 000007
【００３５】
式中、Ａは、−（ＣＨ2）n−を表し、ここでｎは、０〜１０の整数を表し；
Ｂは、−ＣＨ2−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＮＨ2）−、または−Ｃ（＝ＮＯＲ）−を表し、ここでＲは、水素原子、炭素数１〜８の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｄは、−（ＣＨ2）m−Ｒ′を表し、ここでｍは、０〜１０の整数を表し、Ｒ′は、水素原子、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、置換されていてもよい複素環式基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、−ＯＸ基（ここで、Ｘは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいアリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し；
Ｅは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Ｇは、−（ＣＨ2）p−Ｊを表し、ここでｐは、０〜４の整数を表し、Ｊは、水素、ＯＨ基、ＳＨ基、メチルチオ基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよい複素環式基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を表し；
結合Ｑは、単結合または二重結合を表し；そして
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＬ、直鎖又は分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここでＬは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示す。
【００３６】
本発明においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、特に本明細書中で定義している場合を除き、炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基を意味し、好ましくは炭素数１〜７の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基を意味する。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基などが挙げられる。またシクロアルキル基とは、炭素数３〜８の環状炭化水素基を意味する。たとえば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。また、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基は、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基であって、少なくとも１の二重結合を含むものを意味する。例えば、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、２−ブテニル基、２−エテニル−２−ブテニル基などが挙げられる。直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基とは、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基であって、少なくとも１の三重結合を含むものを意味する。例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、３−ブチニル基、２−ペンチニル基、３−ペンチニル基、４−ペンチニル基、２−ヘキシニル基、４−ヘキシニル基、２−デシニル基、６，６−ジメチル−ヘプタ−２，４−ジイン−１−イル基などが挙げられる。【００３７】
また、本明細書において記載される複素環式基とは、窒素原子、硫黄原子、および酸素原子から独立して選択されるヘテロ原子１〜４個（好ましくは１または２個）を環員として含む４〜６員の単環または７〜１０員の二環の環式基（好ましくは単環基）であって、少なくとも１の二重結合を有していてもよい基を意味し、具体的にはピラン、モルホリン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロピラン、１，３−ジオキサン、ピペラジン、ピペリジン、チオモルホリンなどから誘導される基が挙げられる。【００３８】
本明細書において記載されるアリール基は、芳香族性を有する単環または多環の炭化水素基を意味する。具体的には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレンなどから誘導される基を挙げることができる。【００３９】
本明細書において記載されるヘテロアリール基は、芳香族性を有し、窒素原子、硫黄原子、および酸素原子から独立して選択されるヘテロ原子１〜４個（好ましくは１または２個）を環員として含む４〜６員の単環または７〜１０員の二環の環状基（好ましくは単環基）を意味する。具体的には、フラン、チオフェン、ピロール、ジアゾール、ピリジン、チアゾール、イミダゾール、ピリミジン、インドール、キノリン、オキサゾール、イソキサゾール、ピラジン、トリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピラゾールなどから誘導される基を挙げることができる。【００４０】
本明細書において記載されるアラルキル基は、上記のアリール基で置換されている上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体的にはベンジル基、フェネチル基などを挙げることができる。【００４１】
本明細書において記載されるヘテロアリールアルキル基は、上記のヘテロアリール基で置換されている上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。【００４２】
本明細書において記載されるアシル基は、カルボニル基を介して結合している、上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、または複素環式基を意味する。【００４３】
本明細書において記載される「置換されていてもよい」は、特に本明細書中で定義されている場合を除き、このように付記されている基が、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニルオキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニルオキシ基、シクロアルキル基、シクロアルキルオキシ基、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、ハロゲン原子、アリール基、アリールオキシ基、ヘテロアリール基、ヘテロアリールオキシ基、アラルキル基、アラルキルオキシ基、アミノ基（直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、アシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホニル基、カルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボニル基、ホルミル基、アミノスルホニル基などの基で置換されていてもよいことを意味する。これらの置換基に含まれるアリールおよびヘテロアリール部分は、更にハロゲン原子、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニルオキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニルオキシ基、シクロアルキル基、シクロアルキルオキシ基、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、ハロゲン原子、アリール基、アリールオキシ基、ヘテロアリール基、アラルキル基、アラルキルオキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノもしくはジ置換されていてもよいアミノ基、アシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、カルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボニル基、ホルミル基、アミノスルホニル基などによってモノ、ジもしくはトリ置換されていてもよい。【００４４】
本発明の好ましい式（I）の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。【００４５】
0004849622.tif 000008
【００４６】
0004849622.tif 000009
【００４７】
0004849622.tif 000010
【００４８】
0004849622.tif 000011
【００４９】
0004849622.tif 000012
【００５０】
0004849622.tif 000013
【００５１】
0004849622.tif 000014
【００５２】
0004849622.tif 000015
【００５３】
0004849622.tif 000016
【００５４】
0004849622.tif 000017
本発明の式（I）の化合物を合成する方法の一例を、以下の反応スキームにより説明する。【００５５】
一般製法−１
0004849622.tif 000018
【００５６】
上記式中、各記号は、上記式（Ｉ）に記載したとおりであり、また、Ｐ、Ｐ′、およびＰ″は、ヒドロキシ保護基を示す。出発化合物である化合物１は、文献記載の方法（J. Org. Chem.1989, 45, 5522, B.E.Marron, et al）に従って合成することができる。【００５７】
工程１−１
化合物１を、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム、水素化アルミニウムリチウムなどの還元剤で、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下で反応させた後、続いて冷却下、好ましくは−７８℃でヨウ素で処理することにより化合物２を得ることができる。【００５８】
工程１−２
化合物２を、ジエチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチルなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、触媒量のピリジニウムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸酢酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下でジヒドロピランと反応させることにより化合物３を得ることができる。【００５９】
工程１−３
化合物３を、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、tert−ブチルリチウム、ｎ−ブチルリチウム、sec−ブチルリチウムなどの強塩基と室温あるいは冷却下、好ましくは−７８℃で反応させ、さらにホルムアルデヒドを加え冷却下、好ましくは氷温下で反応させることにより化合物４を得ることができる。【００６０】
工程１−４
化合物４を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、クロロホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、イミダゾール、トリメチルアミン、ピリジンなどの塩基存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下でtert−ブチルジフェニルクロロシランと反応させることにより化合物５を得ることができる。【００６１】
工程１−５
化合物５を、エタノール、メタノール、プロパノールなどの各種アルコール類溶媒中、触媒量のピリジニウムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸酢酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは還流加熱下で反応させることにより化合物６を得ることができる。【００６２】
工程１−６
化合物６を、塩化メチレン、クロロホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、チタンテトライソプロポキシド、チタンテトラブチロキシドなどのルイス酸及びＬ−（＋）−酒石酸ジエチル，  Ｌ−（＋）−酒石酸ジプロピルあるいはＤ−（−）−酒石酸ジエチル、Ｄ−（−）−酒石酸ジプロピルの存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下でtert−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシドなどの過酸化物と反応させることにより化合物７を得ることができる。【００６３】
工程１−７
以下に記載する一般製法−２で合成された、所望の鎖Ａ（−（ＣＨ2）n−）および基Ｄを有する、式：【００６４】
0004849622.tif 000019
で示される化合物の三重結合をハイドロメタレーション（例えばハイドロジルコネーションやハイドロボレーション）した後、トランスメタレーション（例えばグリニアール試薬やジアルキル亜鉛などを使用して）して得られるビニルメタル誘導体と化合物７を、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で室温あるいは冷却下、好ましくは−７８℃で反応させることにより化合物８を得ることができる。【００６５】
工程１−８
化合物８を、ジエチルエーテル、トルエン、へキサン、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、触媒量のピリジニウムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で、２，２−ジメトキシプロパンまたはアセトンなどと反応させることにより化合物９を得ることができる。【００６６】
工程１−９
化合物９を、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、へキサン、塩化メチレン、クロロホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、フッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化水素酸、酢酸、希塩酸などの存在下、室温あるいは冷却下で反応させることにより化合物１０を得ることができる。【００６７】
工程１−１０
化合物１０を、過酸化マンガン、硝酸、ジョーンズ酸化などの酸化反応により対応するジカルボン酸を得ることができる。或いは化合物１０を過マンガン酸カリ、スワン酸化、コリンズ酸化、ＴＥＭＰＯ酸化などの酸化反応により対応するジアルデヒドを得ることができる。好ましくは、塩化メチレン、クロロホルムなどの溶媒中、塩化オキザリルとジメチルスルホキサイドの存在下、冷却下、好ましくは−７８℃で化合物１０を反応させた後、トリエチルアミンなどの塩基で処理することによりジアルデヒドを得ることができる。得られる生成物を、続いて過マンガン酸カリ、亜塩素酸ナトリウム、クロム酸などの酸化剤によりジカルボン酸とすることができる。好ましくは２−メチル−２−プロパノール、２−メチル−２−ブテン中、室温或いは冷却下、好ましくは冷却下、亜塩素酸ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの水溶液と反応させることによりジカルボン酸を得ることができる。得られる生成物を、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、へキサン、塩化メチレン、クロロホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中又は無溶媒中で、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジtert-ブチルアセタール中、或いは２，２，２−トリクロロアセトイミダートtert-ブチルを室温或いは加熱下で反応させることにより化合物１１を得ることができる。【００６８】
工程１−１１
化合物１１を、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中、水共存下でピリジニウムパラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより化合物１２を得ることができる。【００６９】
工程１−１２
化合物１２を、過酸化マンガン、硝酸、ジョーンズ酸化などの酸化反応により対応するジカルボン酸とすることができる。好ましくは化合物１２を、アセトン中、室温或いは冷却下、好ましくは冷却下でジョーンズ試薬と反応させることにより化合物１３を得ることができる。【００７０】
工程１−１３
化合物１３とα−アミノ酸tert-ブチルエステル塩酸塩を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの塩基存在下、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＢｔ）などのカップリング試薬と作用させることにより、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより、式（Ｉ）の化合物の一態様である化合物１４−Ａを得ることができる。【００７１】
工程１−１４
化合物１４−Ａを、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、へキサン、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、水などの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、アニソールの存在下或いは無存在下、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより、式（Ｉ）の化合物の一態様である化合物１４−Ｂを得ることができる。【００７２】
本発明の式（Ｉ）の化合物のうち、上記の化合物１４−Ａおよび１４−Ｂ以外の化合物を得るには、化合物１４−Ａまたは１４−Ｂから出発して、必要に応じて加水分解、還元、アミノ化もしくはアミド化、ヒドロキシイミノ化、および／またはエステル変換に付すことにより、目的とする式（Ｉ）の化合物を得ることができる。また結合Ｑが単結合である式（Ｉ）の化合物は、化合物１４−Ａまたは１４−Ｂを、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによっても得ることができる。【００７３】
式（Ｉ）の化合物を合成するために有用な中間体化合物である、式：【００７４】
0004849622.tif 000020
〔式中、Ｄおよびｎは、上記に記載のとおりであり、Ｍ1およびＭ2は同一または異なって酸素原子または硫黄原子を表し、ＰおよびＰ′は、同一または異なってヒドロキシ保護基を表す〕で示される化合物は、式：【００７５】
0004849622.tif 000021
〔式中、ＰおよびＰ′は、上記に記載のとおりである〕で示される化合物を、式：【００７６】
0004849622.tif 000022
〔式中、Ｄ、ｎ、Ｍ1およびＭ2は、上記に記載のとおりである〕で示される化合物と、反応させ合成することが出来る。この方法は、上記一般製法−１の工程１−７の方法である。【００７７】
上記の式（Ｉ）の化合物を合成するための中間体化合物の１つである化合物：【００７８】
0004849622.tif 000023
は、以下の反応スキームにより合成することができる。【００７９】
一般製法−２
0004849622.tif 000024
【００８０】
工程２−１
末端に三重結合を有し、所望の鎖Ａ（−（ＣＨ2）n−）を有する化合物ａとＮ，Ｏ-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩を、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、へキサン、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチルなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの塩基存在下、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＢｔ）などのカップリング試薬を室温下で作用させることにより、化合物ｂを得ることができる。【００８１】
工程２−２
上記工程で得られた化合物ｂを、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、へキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で、所望の基Ｄを有するグリニャール試薬或いはアルキルリチウム試薬と反応させることにより、基Ｄが導入された化合物ｃを得ることができる。【００８２】
工程２−３
上記工程で得られた化合物ｃとエチレングリコールを、ベンゼン、トルエン、１，２−ジクロロエタンなどの溶媒中で、ピリジニウムパラトルエンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸などの酸の存在下、加熱下生成してくる水を共沸除去しながら反応させることにより、化合物ｄを得ることができる。【００８３】
ここで得られた化合物ｄは、上述した化合物（Ｉ）の製造工程を示した一般製法−１の工程１−７において使用することができる。なおＭ1および／またはＭ2が硫黄原子である、化合物ｄに相当する化合物も、当業者に公知の方法により得ることができる。【００８４】
上記式（Ｉ）の化合物を合成するための原料化合物である式：【００８５】
0004849622.tif 000025
の化合物は、当業者に公知の方法、下記の一般製法−３〜一般製法−５の反応スキームにより製造することができる。【００８６】
一般製法−３
0004849622.tif 000026
【００８７】
上記式中、Ｐ’’’はカルボキシル基の保護基を示し、P’’’’はアミノ酸の保護基を示し、Mは直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基を示す。【００８８】
工程３−１
化合物AAをアセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジロキシカルボニル、９−フルオレニルメチルカルボニル等のようなアミノ基の保護基によって保護することにより化合物BBを得ることができる。この時の反応条件は、保護基P’’’’の種類により適宜選択される。【００８９】
工程３−２
化合物BBを、ジエチルエーテル、トルエン、シクロヘキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、酢酸エチル、シメチルスルホキサイドなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウムなどの塩基の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは室温で、ハロゲン或いはメタンスルホン酸エステル、トルエンスルホン酸エステル等の離脱基によって置換されたMと反応させることにより化合物CCを得ることができる。或いは化合物BBを光延反応条件下、水酸基で置換されたMと反応させることにより化合物CCを得ることができる。【００９０】
工程３−３
化合物CCのアミノ基の保護基Ｐ’’’’を脱保護することにより化合物DDを得ることができる。この時の反応条件は、保護基P’’’’の種類により適宜選択される。【００９１】
一般製法−４
0004849622.tif 000027
【００９２】
上記式中、P’’’はカルボキシル基の保護基を示し、P’’’’はアミノ基の保護基を示し、Ｔはスルホン酸エステルなどの離脱基を示し、Ｕは置換されてもよいアリール、或いは置換されてもよいヘテロアリール基を示す。【００９３】
工程４−１
化合物BBを、ジエチルエーテル、トルエン、シクロヘキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイドなどの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、N，N−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−N，N−ジメチルアミノピリジンなどの塩基の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で、メタンスルホン酸クロライド、トルエンスルホン酸クロライド、無水トリフルオロスルホン酸等と反応させることにより化合物EEを得ることができる。【００９４】
工程４−２
化合物EEを、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、酢酸エチル、アセトニトリル、水などの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、パラジウムジアセテート、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムなどのパラジウム触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、アリール或いはヘテロアリールホウ酸誘導体、又はアリール或いはヘテロアリールホウ酸エステル誘導体等と反応させることにより化合物FFを得ることができる。【００９５】
工程４−３
化合物FFのアミノ基の保護基P’’’’を脱保護することにより化合物GGを得ることができる。この時の反応条件は、保護基P’’’’の種類により適宜選択される。
【００９６】
一般製法−５
0004849622.tif 000028
【００９７】
上記式中、P’’’はカルボキシル基の保護基を示し、Ｐ’’’’はアミノ酸の保護基を示し、Ｕは置換されてもよいアリール、或いは置換されてもよいヘテロアリール基を示す。【００９８】
工程５−１
化合物BBをジエチルエーテル、トルエン、シクロヘキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルム、ジメチルスルホキサイドなどの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶液中で、水素化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、又は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの塩基及びジアセトキシ第二銅、沃化第一銅等の触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、アリール或いはヘテロアリールホウ酸誘導体、アリール或いはヘテロアリールホウ酸エステル誘導体、又はハロゲン化アリール或いはハロゲン化ヘテロアリール誘導体等と反応させることにより化合物HHを得ることができる。【００９９】
工程５−２
化合物HHのアミノ基の保護基P’’’’を脱保護することにより化合物ＩＩを得ることができる。この時の反応条件は、保護基Ｐ’’’’の種類により適宜選択される。【０１００】
上記の式（I）の誘導体一覧に記載した化合物（４０）（式（II）に示す化合物と同じものである）は、国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号に開示されており、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属の微生物に由来し、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス等の病原性真菌に対する抗菌活性、及び、免疫反応を阻害する効果を有することが知られている。上記化合物（４８）は、国際公開公報ＷＯ９４／１８１５７号に開示されており、スクアレン合成阻害剤、抗真菌剤として有用であることが知られている。【０１０１】
この化合物（４０）は、フザリウム（Fusarium）属、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属等の糸状菌類で、上記化合物を産生する菌株を培養し、その後、上記菌株の培養物から単離することにより製造することができる。【０１０２】
化合物（４０）の製造に用いることができる菌株としては、フザリウム（Fusarium）属、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属等の糸状菌類に属し、上記化合物を産生することができるものであれば特に限定されず、例えば、フザリウム・エスピー（Fusarium sp.）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）、オーレオバシディウム・エスピー（Aureobasidium sp.）ＴＫＲ２４４９株（国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号）等を挙げることができる。【０１０３】
Ｆ１４７６株は、上記化合物（４０）を有利に産生する特性を有するものである。また、上記Ｆ１４７６株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：
生育温度範囲は、１０〜３０℃であり、好ましくは、２０〜３０℃である。
生育可能pH範囲は、３〜１１であり、好ましくは、５〜７である。【０１０４】
Ｆ１４７６株は、Fusarium sp. F 1476と表示し、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、２００３年２月４日付で、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９０として寄託されている。【０１０５】
本発明においては、上記Ｆ１４７６株の他に、Ｆ１４７６株の自然又は人工的な突然変異体、あるいはフザリウム属、オーレオバシディウム属等の糸状菌類に属するその他の菌種等であって、Ｆ１４７６株の産生能を有する微生物を使用することができる。【０１０６】
本発明においては、上記化合物（４０）の化合物は、上記Ｆ１４７６株を、栄養源含有培地に接種し、これを培養することによって培養物を得ることができる。上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸等を挙げることができる。【０１０７】
上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機窒素化合物、無機窒素化合物等を挙げることができる。【０１０８】
上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等の無機塩類等を挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。【０１０９】
上記栄養源は、単独か又は適宜組み合わせて使用することができる。【０１１０】
上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の重金属塩；ビオチン、ビタミンＢ1等のビタミン類；その他、菌の生育を助け、上記化合物（４０）の産生を促進する有機物、無機物等を適宜添加することができる。【０１１１】
上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル等の消泡剤、界面活性剤等を添加することができる。【０１１２】
上記化合物（４０）を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、生理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体培養法、液体培養法等の培養方法を採用することができる。【０１１３】
上述の培養方法によって、上記化合物（４０）は、培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄積された上記化合物（４０）を、公知の方法により、培養物中から分離した後、必要に応じて更に精製することができる。【０１１４】
上記分離は、培養物全体を、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタノール、メチルイソブチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培養物を濾過又は遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。【０１１５】
上記分離した培養液から上記化合物（４０）を分離するには、上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中の上記化合物（４０）を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することもできる。【０１１６】
上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂等を挙げることができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質等によって適宜１種又は２種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を適宜組み合わせたもの等を挙げることができる。【０１１７】
上記分離した菌体から上記化合物（４０）を分離するには、アセトン等の親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。【０１１８】
本発明においては、このようにして培養物中から分離された上記化合物（４０）の粗抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。【０１１９】
上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等を挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、水等を挙げることができ、これらは２種以上を併用することができる。【０１２０】
上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基等が結合した化学結合型シリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。【０１２１】
さらに、上記化合物（４０）を出発物質として下記に記載の製法１から１１のいずれかの方法を用いて化合物（４１）〜（５４）で表される誘導体を得ることができる。
製法１：上記化合物（４０）を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラハイドロフラン等の溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケッル等の触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体である化合物（４６）を得ることができる。
製法２：上記化合物（４０）を、メタノール、エタノール、プロパノール、テトラハイドロフラン等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジエチルアルミニウムナトリウム、リチウムアルミニウムハイドライド等の還元剤の存在下、室温または冷却条件下で還元することによりアルコール体である化合物（４７）等を得ることができる。
製法３：上記化合物（４０）を、メタノール、ジオキサン、テトラハイドロフラン、水等の溶媒中、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の存在下、室温または冷却件下で処理することにより脱アルキル化体である化合物（４８）等を得ることができる。さらに上記化合物（４８）を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラハイドロフラン等の溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケッル、酸化白金等の触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体である化合物（４９）等を得ることができる。
製法４：上記化合物（４８）等を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム等の塩基の存在化、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラハイドロフラン等の溶媒中、室温または加熱条件下で、アルキルハライド、アリルハライド、アルキニルハライド等のアルキル化剤で処理することによりテトラアルキル、テトラアルキニル及びテトラアルケニル化体を合成することができる。また本化合物を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム等の塩基の存在化、メタノール、ジオキサン、テトラハイドロフラン、水等の溶媒中、室温または加熱条件下で処理することによりアルキル、アルキニル及びアルケニル化体である化合物を合成することができる。
製法５：上記化合物（４０）と各種アミンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラハイドロフラン等の溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン等の塩基の存在下でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＢｔ）等の縮合剤で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するトリアミド体である化合物（５０）等を得ることができる。
製法６：上記化合物（４０）を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラハイドロフラン等の溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケッル、酸化白金等の触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりテトラヒドロ体である化合物（５１）等を得ることができる。
製法７：上記化合物（４０）を、テトラハイドロフラン、ＤＭＦ及びジクロロメタンなどの溶媒中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等の縮合剤により各種のアルコール（Ｒ−ＯＨ）と反応させることによって、室温または加熱条件下で、対応するトリエステル（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ）を得ることができる。あるいは、上記化合物（４０）を、メタノール及びジクロロメタンなどの混合溶媒中、アミドジヒドロ体トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ2）等で処理し、トリメチルエステル体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3=ＣＨ3）を得ることができる。
製法８：製法７で得たトリメチルエステル体をメタノール、 エタノール及びブタノール等の溶媒中で４−トルエンスルフォニルヒドラジド等のヒドラジン誘導体で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するヒドラジド体を得、本ヒドラジド体をカテコールボラン等の還元剤で処理した後、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基の存在化、エタノール、メタノール及び水等の溶媒中、室温または加熱条件下で、脱ケト体である化合物（５２）等を得ることができる。
製法９：上記化合物（４０）とヒドロキシルアミンまたは各種Ｏ−置換ヒドロキシルアミンをピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の存在下で、室温または加熱条件下で処理することにより対応するオキシムエーテル及びオキシム体である化合物（５３），（５４）等を得ることができる。
製法１０：上記化合物（４０）を、テトラハイドロフラン、ジクロロメタン、クロロフォルム等の溶媒中、ジエチルアミノサルファートリフルオライド（ＤＡＳＴ）等で処理し、ハロゲン化体を得ることができる。
製法１１：上記化合物（４０）と各種アミンをエタノール、メタノール及び、テトラハイドロフラン等の溶媒中で、中性あるいは弱酸性条件下で、室温または加熱条件下で、水素化シアノホウ素ナトリウムあるいは水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム等還元剤で処理することによりにより、還元的アミノ化を行い対応するアミン体（Ｂ＝−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5））を得ることができる。【０１２２】
本発明の、セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物としては、セリンパルミトイル転移酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムを挙げることができる。本発明において、発現を抑制されるセリンパルミトイル転移酵素の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。セリンパルミトイル転移酵素をコードするDNAとしては配列番号：４または６（LCB1またはLCB2）に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：５または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、および配列番号：５または７に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来のDNA等も含まれる。「１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」は、天然型のタンパク質と同等の機能を有し、かつ高い相同性を持つものである。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。【０１２３】
上記天然由来のDNAは、配列番号：４または６に記載の塩基配列からなるDNAにハイブリダイズするDNAである。ハイブリダイゼーションにおける条件は当業者であれば適宜選択することができるが、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、5×SSC 、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。【０１２４】
セリンパルミトイル転移酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNAとしては、より好ましくは配列番号：１および２で表すsiRNAを挙げることができる。【０１２５】
本発明の化合物としては、スフィンゴ脂質生合成過程の途中段階である、スフィンガニン（ジヒロドスフィンゴシン）からジヒドロセラミドの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる。【０１２６】
本発明の、ジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよいが、好ましくはフモニシンB１またはその誘導体を挙げることができる。【０１２７】
本発明の、ジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素の発現を抑制する化合物としては、ジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムを挙げることができる。【０１２８】
本発明の化合物としては、スフィンゴ脂質生合成過程の途中段階である、セラミドからスフィンゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するスフィンゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはスフィンゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる。【０１２９】
本発明の、スフィンゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよい。【０１３０】
本発明の、スフィンゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物としては、スフィンゴミエリン合成酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムを挙げることができる。スフィンゴミエリン合成酵素をコードするDNAとしては配列番号：８に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、および配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来のDNA等も含まれる。【０１３１】
本発明の「酵素の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。【０１３２】
本発明の「酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA」の一つの態様は、酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAである。【０１３３】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。【０１３４】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。【０１３５】
「酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA」の他の一つの態様は、酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なdsRNAである。RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA（以下dsRNA）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3’末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。【０１３６】
本発明のRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。【０１３７】
本発明のdsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。【０１３８】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。【０１３９】
本発明のRNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。【０１４０】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の相同性を有する。【０１４１】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。【０１４２】
本発明の「酵素の発現の抑制」は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。【０１４３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA 配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。【０１４４】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている。【０１４５】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.Dzianottand J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyama et al. Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。【０１４６】
本明細書における「治療」という記載は、本発明の薬物を被験者に投与することによって、ＨＣＶを消滅あるいは軽減させること、さらなるＨＣＶの広がりを抑制すること、ＨＣＶの感染による症状を軽減することを意味する。ＨＣＶの感染による症状としては、好ましくはＣ型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。【０１４７】
本発明の化合物は、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。【０１４８】
上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％である。【０１４９】
本発明の化合物を、常法に従って主薬として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。【０１５０】
さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリドなどを挙げることができる。注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすべて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有することもできる。【０１５１】
上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。【０１５２】
本発明の化合物など又はそれの製薬上許容され得る塩を医薬として投与する場合、抗ウイルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、0.1〜2000mgの範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。【０１５３】
上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型などにより行うことができる。【０１５４】
上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。【０１５５】
上記局所投与（経皮投与など）は、例えば、液剤、クリーム剤、粉末剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。【０１５６】
上記経直腸的投与は、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物などからなる低融点固体に混入した座剤などを用いて行うことができる。【０１５７】
上記投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。【０１５８】
本発明は、式（I）で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤に関する。また、式（II）で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤に関する。【０１５９】
該阻害剤はHCV感染症を予防または治療する薬剤として使用できるだけではなく、スフィンゴ脂質合成の異常によって引き起こされる疾患、例えば脂質（スフィンゴミエリン)が異常蓄積する疾患であるスフィンゴリピドーシス、スフィンゴリピドバインディングモチーフを持つベータアミロイドタンパク質が関与するアルツハイマー病、脊髄運動ニューロン内のセラミドが増加し神経細胞死を引き起こす筋萎縮性側索硬化症（Cutler, R. G., et al., Ann. Neurol., 52, 448-457, 2002）、gp120タンパク質が関与するHIV感染症、およびPrPタンパク質が関与するプリオン病、ラフトに結合して宿主細胞に感染するウイルス感染症（例えばインフルエンザ、HIV）等の有用な予防または治療する薬剤として利用できる。【０１６０】
本発明は、HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に関する。【０１６１】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、まず、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。【０１６２】
本発明のスクリーニング方法における「パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成に関与する酵素（以下「該生合成酵素」として約して使用される場合もある）」としては、セリンパルミトイル転移酵素、３−ケトジヒドロスフィンゴシン還元酵素、ジヒドロスフィンゴシン−N−アシル転移酵素、ジヒドロセラミド不飽和化酵素、スフィンゴミエリン合成酵素等を挙げることができる。これら酵素の由来は、特に制限はなく、例えばこれらの酵素は酵母またはヒトを含む哺乳動物等の由来のものであってもよい。【０１６３】
第一の態様に用いられる生合成酵素の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。該生合成酵素が発現している細胞としては、内在性の生合成酵素を発現している細胞、または外来性の 生合成酵素を発現している細胞が挙げられる。上記内在性の生合成酵素を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。また、上記外来性の生合成酵素を発現している細胞は、例えば、生合成酵素をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。このような外来性の生合成酵素が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。【０１６４】
生合成酵素が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、生合成酵素をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。【０１６５】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。【０１６６】
本発明において「接触」は、生合成酵素の状態に応じて行う。例えば、生合成酵素が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、酵母またはヒトを含む哺乳動物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、生合成酵素が発現している細胞へ導入する、または該ベクターを生合成酵素が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法を利用することも可能である。【０１６７】
第一の態様では、次いで、上記生合成酵素と被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵母ツーハイブリット法や、BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素と結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、HCV感染症を治療または予防するための薬剤が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下のスクリーニングの被検化合物として用いてもよい。
【０１６８】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。【０１６９】
第二の態様では、次いで、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程で合成される化合物の量を測定する。合成される化合物としては、３−ケトジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロセラミド、セラミド等の中間生成物等も含まれるが、より好ましくは最終生成物であるスフィンゴミエリンを挙げることができる。合成された化合物の定量は、GC-MS法、MS-MS法、LC-MS法等公知の方法によって測定することができる。また、合成された化合物がスフィンゴミエリンの様にリン脂質である場合には、リン酸脂質中のリン酸の定量を行うことによっても定量を行うことができる。本方法においては、ついで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、合成された化合物の量を減少させた場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【０１７０】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。【０１７１】
第三の態様では、次いで、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する。該生合成酵素の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該生合成酵素のmRNAを定法に 従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該生合成酵素の発現レベルを測定することも可能である。【０１７２】
また、該生合成酵素を含む画分を定法に従って回収し、該生合成酵素の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、該生合成酵素に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該生合成酵素の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。【０１７３】
該生合成酵素の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該生合成酵素、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、該生合成酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、該生合成酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【０１７４】
第三の態様においては、ついで、該生合成酵素の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【０１７５】
本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず該生合成酵素のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する【０１７６】
第四の態様において、「機能的に結合した」とは、生合成酵素のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、生合成酵素のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、生合成酵素のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の 意に含まれる。【０１７７】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。第四の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。【０１７８】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc） の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。【０１７９】
第四の態様においては、ついで、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【０１８０】
本発明のスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。【０１８１】
第五の態様では、次いで、上記生合成酵素の活性を測定する。生合成酵素の活性測定は、それぞれの酵素につき公知の方法で行うことができる。一般的には、基質と生成物との間の分光学的性質の差を利用して、その時間的変化を測定する活性測定法が使用されるが、酵素上の情報基（例えばトリプトファンやチロシンのようなアミノ酸残基、および補酵素等）からの情報をストップフロー法や種々の緩和法を用いて、酵素反応をより直接的に測定する方法が選択されてもよい。活性測定法に用いられる分光学的方法としては、吸光、蛍光、CD、NMR、ESR、IR、ラマン等を挙げることができる。第五の態様においては、ついで、上記生合成酵素の活性が、被検化合物を接触させないときに比べ低下する場合に、被検化合物を、HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。【０１８２】
本発明は、上記に記載の5つのスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。このようなキットには、上記に記載の５つのスクリーニング方法の検出工程や測定工程に使用されるものを含みうる。例えば、パルミトイルCoAからスフィンゴミエリンの生合成に関与する酵素の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗体、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１８３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【０１８４】
〔実施例１〕ノザンブロット解析によるミリオシンまたはオーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する式（II）で表される化合物のHCV  RNA複製阻害活性の測定
ミリオシン又は以下の式（II）で表される化合物を１ｐMから100uMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、５％CO2存在下、37度にて培養した。【０１８５】
式（II）：
0004849622.tif 000029
【０１８６】
72時間後に細胞を回収し、全RNAを抽出した後で、Ambion社のノザンマックスキットの方法に従いネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。【０１８７】
ノザン解析は以下のものを用いた。すなわち、NorthernMax transfer buffer (Ambion #8672), 転写膜 BrightStar-Plus (Ambion #10100), ろ紙（Sigma P-6664）, ULTRAhyb (Ambion #8670)。プローブの標識はBiotinStar Psoralen-Biotin kit (Ambion #9860G3)でビオチン化標識した。High Stringency buffer (Amibion #8674); BrightStar BioDetect kit (Wash buffer, Ambion #8650G; Blocking buffer, Ambion #8651G; Streptavidin-Alkaline Phosphatase, Ambion #2374G; Assay buffer, Ambion #8652G;CDP-Star, Ambion #8653G)【０１８８】
１％アガロースゲルで1ugのトータルRNAを泳動し、泳動後エチジウムブロミドでRNAを染色して写真をとり、脱色後NorthernMax transfer bufferを用いて転写膜に2時間転写した。湿ったままの状態でUVクロスリンカーにてRNAを転写膜に固定化した。ハイブリダイゼーションオーブンを用いて、ULTRAhybにて42度、30分間の回転前処理の後、前処理液を捨て、ビオチン化したネオマイシン耐性遺伝子と10mlのULTRAhyb液を加えて42度一夜振とう処理した。
【０１８９】
ULTRAhyb液を捨て、42度に保温したHigh Stringency bufferを15ml加え42度で30分間振とうした。同様の操作をもう一度繰り返した。浸る程度のWash bufferで転写膜を洗浄した。転写膜をBlocking bufferで30分間振とうした。液を捨て、10mlのBlocking bufferに2ulのStreptavidin-Alkaline Phosphataseを加えたもので室温30分間振とうした。転写膜を浸る程度のBlocking bufferで10分間振とうした。Wash bufferで5分間洗浄し、Wash bufferで転写膜を洗浄した後、CDP-Starで転写膜を覆い、5分後に余分な液を除き、1時間後にX線フィルムに感光させ、バンドの濃さからRNA量を比較した。その結果、ミリオシン及び式（II）で表される化合物に1-10nMの濃度でレプリコンRNAを50%減少させる効果が認められた（図２、３）。【０１９０】
〔実施例２〕ウェスタンブロット解析によるミリオシンまたは式（II）で表される化合物のHCVタンパク合成阻害の測定
ウェスタン解析は以下の方法でおこなった。ミリオシン又は式（II）で表される化合物を１ｐMから100uMの範囲でレプリコン細胞Huh-3-1に与え、５％CO2存在下、37度にて培養した。72時間後に培地を捨て、PBS(Phosphate buffered saline)を加え、ピペッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。Phosphate用溶解液（50 mM Tris-HCl(pH7.5),0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin）を加えてピペッティングにより細胞を破壊し、高速遠心により上清を回収した。Dye Reagent (Nacalai tesque #074-27)にてタンパク定量をおこなった（ウシγグロブリン標準液、BIO-RAD#500-0005）。得られたタンパク質5ugを9−11%グラジエントゲル（第一化学薬品、＃317552）でトリス‐グリシン‐SDS緩衝液（BIO-RAD＃161-0772）で電気泳動した。分子量サイズマーカーはRainbow molecular weight markers（AmershamBioscience#RPN756）を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（BIO-RAD#170-3930）にてメンブレン（PROTRAN BA85, Nitrocellulose transfer membrane(Shleicher&Schuell #10401196)に転写した。HCVタンパク由来の抗NS3ウサギ抗体を用いてウエスタン解析を行った。内部標準として抗アクチンウサギ抗体を用いた。その結果、 ミリオシン及び式（II）で表される化合物に1-10nMの濃度でHCVタンパク質の発現を50%減少させる効果が認められた（図４，５）。【０１９１】
〔実施例３〕フモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性の測定
スフィンゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフィンゴシンからジヒドロセラミドを生成するジヒドロスフィンゴシン−Ｎ−アシル転移酵素を特異的に阻害するフモニシンB1のHCVレプリコン阻害活性を測定した。【０１９２】
ホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞(Huh-3-1)を5%ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコMEM（Gibco cat. no. 10569）に懸濁し96穴プレートに5000細胞／Wellで蒔き、5%CO2、37度で一夜培養した。約20時間後、フモニシンB1を順次３倍希釈し、終濃度1.37uMから1000uMになるように加え、さらに3日間培養した。アッセイプレートは２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアプレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、Wellあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0%として薬剤のIC50（50%阻害濃度）を算出した。一方、細胞毒性試験はセル・カウントキット−８（DOJIN Laboratories, cat. No.341-07761）をWellあたり10μl入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、約30分間放置後にOD450nmが1.0程度になった時点で測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0%として薬剤のIC50（50%阻害濃度）を算出した。【０１９３】
その結果、フモニシンB1は10-1000uMの濃度で、HCVレプリコン阻害活性を示すことがわかった（図６）。【０１９４】
〔実施例４〕セリンパルミトイル転移酵素のsiRNA合成
SPTの阻害がHCVレプリコン活性を阻害しているかを確認する目的で、LCB1（SPTのヘテロダイマーのうち１サブユニット）を標的としたsiRNAを合成した。２種の特異的なsiRNA (si246、si633)は、LCB1ｃDNAの配列（GenBank Accession No. Y08685）をもとにデザインし、Qiagen社により合成された。コントロールsiRNA（配列番号：３）は、LCB１の発現に影響しない配列を使用した。合成したsiRNA配列を配列番号：１（si246）および配列番号：２(si633)に示した。
【０１９５】
〔実施例５〕ウエスタンブロット解析を用いたsiRNAによるLCB1のタンパク質発現阻害
6穴プレートに1.2×105個のHuh-3-1細胞をまき、３７℃、５％CO2で一晩培養した。2.3μLの20μM siRNAを100μL のECR buffer(RNAiFect Kit中に含まれるBuffer) に加え、激しく攪拌し、さらに4μLのRNAiFectトランスフェクション試薬 (Qiagen cat. No. 301605) を加え、緩やかに攪拌して室温にて10分間放置した。siRNAは、最終濃度が35 nMになるように加え、4日間培養した。
【０１９６】
細胞を細胞溶解用緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin）に懸濁し、氷上で10分間放置した。15,000×gで10分間遠心し、上清を回収した。タンパク質の定量後、各サンプルの蛋白量を10μgに調製し、1/4量の５×SDSサンプル緩衝液（125 mM Tris-HCl (pH 6.5), 25 % Glycerol, 5% SDS, 0.25 % BPB, 5% 2-Mercaptoethanol）に加え、98℃5分処理する。ポリアクリルアミドゲルPAGミニ9/11（第一化学、cat. No. 317552）で電気泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブレンPROTRAN BA85 (Schleicher&Schuell cat. No. 10404496) にブロッティング (70V、3時間) する。メンブレンをBlocking Buffer(10% skim milk, 0.1% Tween 20/PBS)でBlockingを行う。1000倍希釈した抗LCB1抗体（Transduction cat. No. L89820）及び250倍希釈した抗アクチン(20-33) 抗体 (Sigma cat. No. A5060) で２時間室温にて反応させる。メンブレンを0.1%Tween 20/PBSにて洗浄後、二次抗体として、1000倍希釈した抗マウスIgG-HRP（Cell Signaling cat. No. A7076）及び抗ウサギIgG-HRP (Cell Signaling cat. No. A7074)を1時間室温にてそれぞれ反応させる。メンブレンを0.1%Tween 20/PBSにて洗浄後、ECLで1分間反応させ、オートラジオグラフィーにてシグナルを検出した。【０１９７】
その結果、図７に示すように、コントロールsiRNAと比較して、si246、si633はともにLCB1のタンパク質発現量の減少が認められた。特に、si246では強く発現阻害が認められた。【０１９８】
〔実施例６〕LCB1のノックダウンによるHCVレプリコン阻害活性効果
実施例５の結果にもとづいて、Huh-3-1細胞がLCB1発現を低下する条件下での細胞毒性及びHCVレプリコン活性の影響を以下の方法にて測定した。すなわち、96穴プレートに1ウエルあたり3500個の細胞をまき、３７℃、５％CO2で一晩培養した。1.75 μLの2 μM siRNAを23.3μL のECR 緩衝液(RNAiFect Kit中に含まれる緩衝液) に加え、激しく攪拌し、さらに0.31μLのRNAiFectトランスフェクション試薬を加え、緩やかに攪拌して室温にて10分間放置した。siRNAは、最終濃度が35 nMになるように加え、4日間培養した。細胞毒性による影響は、培地に10μLのCell counting kit-8 (DOJIN Laboratories cat. No. 341-07761) を加えて３−４回ピペットで混和し、３７℃、１時間放置後、マイクロプレートリーダーEmax (Molecular devices) を用いて450 nmの吸光度で測定した。HCVレプリコン活性は、培養終了後、新しい培地に交換し、Steady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）を用い、Wellあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害0％として薬剤のIC50（50％阻害濃度）を算出した。
【０１９９】
その結果、図８に示すように、LCB1の発現を抑制したsi246、si633処理した細胞では、コントロールsiRNA処理した細胞に対し、有意にHCVレプリコン活性を阻害した。この阻害効果は、LCB１の発現を強く抑制したsi246で強く認められた。また、同条件下においてsiRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとんど影響が認められなかった。【０２００】
〔実施例７〕HCVレプリコンアッセイおよび細胞毒性試験
式（I）で表される化合物またはそれらの誘導体について、HCVレプリコンアッセイおよび細胞毒性試験を行った。【０２０１】
まず、HCV−RNAのコピー数を定量するためにHCV−RNAの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。Kriegerら（J. Virol.75:4614）の方法に従い、HCV遺伝子のIRES（Internal Ribosome Entry Site）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。インビトロで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でHuh7細胞に導入し、G418耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞（Huh-3-1）を5％ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコＭＥＭ（Gibco cat. no. 10569-010）に懸濁し、96穴プレートに5000細胞／ウェルで播種し、5％ＣＯ2  37℃で一夜培養した。約20時間後、希釈した試験化合物をウェルあたり10μl加え、さらに3日間培養した。アッセイプレートを2系統用意し、1つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、ウェルあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、試験化合物未添加の値を阻害０％として薬剤のＩＣ50（50％阻害濃度）を算出した。【０２０２】
また、細胞毒性の測定にはCell counting kit-8（同人堂カタログNo.341-07761）を用いた。すなわち、10μlのCell counting kit-8をクリアープレートに添加し、37度で30〜60分間保温した。96穴プレートリーダーにて波長450nm、対照波長630nmで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を細胞毒性0％として薬剤のＣＣ50（50%細胞毒性濃度）を算出した。
【０２０３】
上記のHCVレプリコンアッセイおよび細胞毒性試験の結果を表１および２に示す。【０２０４】
【表１】
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【０２０５】
【表２】
0004849622.tif 000031
【０２０６】
〔実施例８〕式（II）で表される化合物によるHCV レプリコンの阻害及び宿主細胞への毒性
HCVレプリコン細胞に、図９に示された濃度の式（II）で表される化合物で処理を行い、レプリコン複製阻害活性及び細胞生存阻害活性を測定した。 レプリコンによるルシフェラーゼ活性はSteady-GLO luciferase assay system (Promega, cat. no. E2510)、細胞生存阻害活性は、Cell counting counting kit-8 (Dojin Laboratories, cat. no. 341-07761)を用いて測定したその結果図9に示すように、式（II）で表される化合物による処理により濃度依存的にHCVレプリコン阻害活性を認めた（IC50＝2 nM)。また、式（II）で表される化合物の細胞毒性は、認められなかった（CC50＞50nM)。
【０２０７】
〔実施例９〕免疫染色法による式（II）で表される化合物のHCV-NS3タンパク質発現阻害の確認
HCVレプリコン細胞を100 nMの式（II）で表される化合物で96時間処理した後、細胞を3.7％ホルムアルデヒドで固定した。３％ BSAでブロッキング後、NS3抗体（Fホフマン・ラロシュより供与）でインキュベートした後、洗浄した細胞をTexas-RedラベルしたウサギIgG（Molecular probe )でインキュベートし、蛍光顕微鏡で解析した(図１０)。その結果、図１０に示すように、HCV-NS3タンパク質は核周辺に存在したが、式（II）で表される化合物の添加によりそれが消失した(白色で示された部分はNS3タンパク質、灰色で示された部分はヘキスト３３342（Sigma, cat. no. B2261) で染色された核を示す。）。【０２０８】
〔実施例１０〕ウエスタンブロット解析による式（II）で表される化合物のNS3、NS5A及びNS5Bタンパク質の発現阻害
レプリコン細胞を100 ｎMの式（II）で表される化合物で図１１に示された時間（48時間および96時間）処理した。ウエスタンブロット解析は、実施例５と同様の方法にておこなった。その結果、時間依存的にHCVの非構造タンパク質NS3、NS5A及びNS5Bを各抗体で検出した結果、ウイルスタンパク質の発現レベルの低下が認められた（図１１）。【０２０９】
〔実施例１１〕 式（II）で表される化合物によるSPT阻害活性
in vitroにおけるSPT阻害活性を測定するために、ヒト組み換え型SPT（ヘテロダイマーLCB1及びLCB2）タンパク質を調製した。ヒト肝臓のｃDNAライブラリー（Clontech, cat. no. 639307) から、LCB1及びLCB2のcDNAをRT-PCRによって取得し、Hisタグ付きのpBudCE4.1ベクター(Invitogen, cat. no. V532-20)に組み込んだ。HEK293細胞(ATCC, cat. no. CRL-1573)に遺伝子導入し、72時間後、細胞を溶解し、Ni-NTAアガロース（Qiagen, cat. no. 1018244)にてタンパク質を精製した。SPT活性は反応緩衝液[200 mM HEPES buffer (pH 8.0), 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.05 mM pyridoxal 5-phosphate, 0.2 mM palmitoyl-CoA, 0.1 mM L-serine, and 1 mCi [3H]serine (Amersham, cat. no. TRK308)]に精製したSPTを加え、15分37℃にて反応した。クロロホルム：メタノール（1：2, v/v)で抽出後有機層を水で2回再抽出した後、有機層の放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、図１２に示すように、式（II）で表される化合物はIC50約10ｎM でSPT阻害活性を有していることが明らかとなった。【０２１０】
〔実施例１２〕式（II）で表される化合物によるセラミド、スフィンゴミエリンのde novo合成阻害
HCVレプリコン細胞を、図13に示された濃度の式（II）で表される化合物で48時間処理した後、 [14C]セリンで３時間標識した。クロロホルム：メタノール（1：2, v/v)で抽出後、de novo合成されたセラミド（図１３Ａ)、スフィンゴミエリン（図１３Ｂ）を薄層クロマトグラフィーにより分離した。その結果、図１３に示すように、式（II）で表される化合物は濃度依存的に細胞内のセラミド及びスフィンゴミエリンのde novo合成を阻害した。【０２１１】
〔実施例１３〕C２−セラミドによる式（II）で表される化合物の複製阻害の回復
式（II）で表される化合物によるHCVレプリコン阻害活性が、スフィンゴ脂質生合成経路に依存するか否かを明らかにするために、細胞性浸透性セラミド：C2−セラミド(Sigma, cat. no. A7191)を式（II）で表される化合物と同時にHCVレプリコン細胞に添加し、96時間培養した。細胞抽出物を用いて、実施例５と同様の方法にてウエスタンブロット解析を行った。その結果(図１４)、式（II）で表される化合物によるHCV複製阻害はC2セラミドの濃度に依存して抑制されることが明らかとなった。【０２１２】
〔実施例１４〕ラフト生合成関連低分子化合物によるHCV複製阻害
HCVレプリコン細胞を、既知のSPT阻害剤ミリオシン (Sigma, cat. no. M1177）、セラミド合成阻害剤フモニシン B1(Sigma,  cat. no. F1147)、およびセラミド輸送阻害剤HPA-12 [KobayashiらOrg.lett.(2002)の合成方法に準じて合成）で処理した後、72時間後レプリコン活性及び生細胞数を測定した。その結果、いずれの化合物も細胞毒性を認めない濃度でHCVの複製を抑制する効果が認められた(図１５）。【０２１３】
〔実施例１５〕式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質の影響（１）
HCVレプリコン細胞に1μMの式（II）で表される化合物を72時間添加した後、細胞抽出液を可溶化剤1% Nonidet P-40 (Nacalai tesque, cat. no. 252-23)にて1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、フラクション１−９まで分離し、ウエスタンブロット解析は、実施例５と同様な方法にて行った。その結果、図１６に示すように式（II）で表される化合物は可溶化剤耐性画分のNS5Bの発現レベルを低下させた。しかしながら、NS5Aや宿主のラフト結合タンパク質カベオリン-2において式（II）で表される化合物による影響は認められなかった。カベオリン-2の発現はカベオリン-2抗体（BD Transduction, cat. no. 610684)により確認した。
【０２１４】
〔実施例１６〕式（II）で表される化合物によるラフトタンパク質の影響（２）
HCVレプリコン細胞に1μMの式（II）で表される化合物を72時間添加した後、細胞抽出液を1% NP-40で1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質（可溶化剤耐性）、非ラフトタンパク質を分離し、PBSで希釈し濃縮後ELISA解析により定量した。その結果、式（II）で表される化合物は、NS5Bにおいて有意にラフト上から解離が認められた(図１７）。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明により、スフィンゴ脂質生合成がHCV感染に関与することがわかり、スフィンゴ脂質生合成に関わる酵素の活性や発現を阻害する化合物が、HCV感染症の極めて有用な治療剤または予防剤となりうることがわかった。また、スフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリンは細胞膜上のラフトの構成成分であり、インフルエンザ、HIV等のウイルスがラフトを介して複製されることから（Takeda M. et al. (2003) PNAS, 100, 25、Lucero H. A., et al. (2004) Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208、Simons K. (1997) Nature, 387, 569、G.−Z. Leu et al. (2004)）、HCVはラフトを介して複製されていることが強く示唆された。よって、ラフトを標的とした本発明の化合物を有効成分とする薬剤は、HCV感染症を予防または治療する薬剤として利用できる可能性がある。【０２１６】
これまでのHCV感染症を予防または治療する薬剤は、生体内のどのカスケードに作用するかが知られておらず、副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的が明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。【０２１７】
また、本発明の薬剤はHCV感染症を予防または治療する薬剤として使用できるだけではなく、スフィンゴ脂質合成の異常によって引き起こされる疾患、例えば脂質（スフィンゴミエリン)が異常蓄積する疾患であるスフィンゴリピドーシス、スフィンゴリピドバインディングモチーフを持つベータアミロイドタンパク質が関与するアルツハイマー病、gp120タンパク質が関与するHIV感染症、およびPrPタンパク質が関与するプリオン病、さらには、脊髄運動ニューロン内のセラミドが増加し神経細胞死を引き起こす筋萎縮性側索硬化症（Cutler, R. G., et al., Ann. Neurol., 52, 448-457, 2002）、ラフトに結合して宿主細胞に感染するウイルス感染症（例えばインフルエンザ、HIV）等の有用な予防または治療する薬剤として利用できると考えられる。
【図１】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【配列表】
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