(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨが４〜７、イオン強度が０．０００１〜０．１Ｍで、コロイド珪酸処理する工程を含む、免疫グロブリン製剤の製造方法。
【請求項２】
ｐＨが４〜７、イオン強度が０．０００１〜０．１Ｍで、コロイド珪酸処理する工程を含む、免疫グロブリン製剤の安定化方法。
【請求項３】
免疫グロブリン５０ｍｇ当たりの血清アルブミンの夾雑量を１０μｇ以下とすることによる、非イオン界面活性剤を含まず、ｐＨが４〜７、イオン強度が０．０００１〜０．１Ｍである、請求項２記載の免疫グロブリン製剤の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン製剤及びその安定化方法に関し、より詳しくは、保存安定性に優れた免疫グロブリン製剤及びその安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿蛋白成分であるγ−グロブリンのうち、特にＩｇＧを主成分とする免疫グロブリン製剤は、これまで広く各種感染症の予防並びに治療に役立てられてきた。ところで、免疫グロブリンは溶液状態において不安定であり、免疫グロブリンの凝集、即ち重合体や二量体の生成により、特に分別操作の間に生じる変性の結果として、抗補体活性とよばれる免疫グロブリンの補体結合能力が著しく増加し、人体に静脈内投与すると血清補体濃度の低下を生じ、あるいはアナフィラキシーショック等の重篤な副作用を起こすことが知られている。従って、免疫グロブリンは液状製剤ではなく、乾燥製剤、特に凍結乾燥の態様で製剤化されていた。しかし、乾燥製剤は使用時には注射用蒸留水等に溶解する必要があったため、簡単に投与することができないという問題があった。
【０００３】
一方、液状製剤は乾燥製剤に比べると注射用蒸留水等の溶解の必要性もなく、簡単に投与できる等の利点があるが、上記の如く免疫グロブリンの安定性に劣るという欠点があった。従って、溶液状態においても安定性のある静注用グロブリンの液状組成物の開発が従来より試みられている。
【０００４】
例えば、特開昭６３−１９２７２４号公報には、低電導度、ｐＨ５．５±０．２、および安定化剤としてソルビトール使用の組み合わせにより、溶液状態においても安定性のある静注用グロブリンの液状組成物が提案されている。また、特開昭５８−４３９１４号公報においては、免疫グロブリンの凝集物を実質的に含有せず、免疫血清グロブリンの単量体濃度が約９０％よりも大である免疫グロブリン組成物を得るために、免疫血清グロブリン溶液のイオン強度を約０．００１未満に、ｐＨを３．５〜５．０にすることが開示されている。
【０００５】
また、特開昭６３−８３４０号公報は、免疫血清グロブリンを約５．４に等しいか、またはそれ以下のｐＨにおいて冷エタノール分画法を用いることにより、人間の血漿源から調製し、次いでこの免疫血清グロブリンを、感染性のレトロウィルスを実質的に含まないよう、少なくとも約３日間、約４．２５に等しいかまたはそれ以下のｐＨにおいて貯蔵するか、または約６．８に等しいかまたはそれ以下のｐＨで少なくとも４５℃の温度下に貯蔵する工程を含んでなる、後天性ウィルスを実質的に含まない免疫血清グロブリンの製造方法を開示する。しかし、この発明は、レトロウィルスの不活性化を目的としており、調製された免疫グロブリン製剤において免疫グロブリンの凝集が改善されたという報告はされていない。
【０００６】
また、特開平７−２３８０３６号公報は、安定性を改善するために、酸処理あるいは室温保存により免疫グロブリンの凝集、即ち、重合体だけでなく二量体の増加をも抑制することを開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、免疫グロブリンは、本来不安定な蛋白質であるために、液状組成物を調製した際の安定性が最も懸念される課題の１つであり、本発明は、このような課題を解決するものであり、その目的は、溶液状態においても保存安定性が良好な免疫グロブリン製剤及びその安定化方法を提供するものである。
【０００８】
本発明者らは、このような事情を考慮して、さらに研究を進めた結果、免疫グロブリン画分中に微量夾雑する血清アルブミン量をさらに低減することにより、免疫グロブリンの保存安定性をさらに改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の通りである。
（１）免疫グロブリン５０ｍｇ当たりの血清アルブミンの夾雑量が１０μｇ以下であり、非イオン界面活性剤を含まず、ｐＨが４〜７、イオン強度が０．０００１〜０．１Ｍであることを特徴とする、免疫グロブリン製剤。
（２）ｐＨが４〜７、イオン強度が０．０００１〜０．１Ｍで、コロイド珪酸処理する工程を含む、免疫グロブリン製剤の安定化方法。
（３）免疫グロブリン５０ｍｇ当たりの血清アルブミンの夾雑量を１０μｇ以下とすることによる、非イオン界面活性剤を含まず、ｐＨが４〜７、イオン強度が０．０００１〜０．１Ｍである免疫グロブリン製剤の安定化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫グロブリン製剤は、血清アルブミン量の夾雑量が少ないため、溶液状態においても不溶性異物の生成が従来のものと比較して少なく保存安定性が良好なものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に本発明を詳細に説明する。本発明の免疫グロブリン製剤に使用される免疫グロブリンの態様としては、特に限定されるものではないが、公知の手法により調製され得るものを用いることができる。例えば、出発原料として免疫グロブリンを含む画分から調製されたもの、具体的には、コーンのエタノール分画により得られる画分II＋III、画分IIや、免疫グロブリンを含むこれらと同等の画分のペースト等が挙げられる。これらの画分を水性溶媒に懸濁して、免疫グロブリンが抽出される方法が例示される。この時、当該画分の少なくとも２倍容量以上、好ましくは５倍容量以上の水性媒体が使用される。ここで使用される水性媒体としては、水や、塩化ナトリウム、塩酸、酢酸、リン酸またはこれらの塩等を含有する水溶液が好ましく、また、ｐＨは４〜７、イオン強度０．００１〜０．１Ｍが好ましい。
【００１２】
また、免疫グロブリンは、ポリエチレングリコール処理型、ｐＨ４処理型、イオン交換樹脂処理型等の非化学修飾型；アルキル化型、スルホン化型等の化学修飾型；プラスミン、ペプシン、トリプシン等の酵素で処理された酵素処理型等であってもよく、中でも非化学修飾型の免疫グロブリンが好ましく用いられる。
【００１３】
本発明において非化学修飾型の免疫グロブリンとは、以下の諸性状を有するものをいう。
（１）自然のままで何らの修飾や変化も受けておらず、従って免疫グロブリンのフラグメントであるFab、F(ab’)2、Fc等を含まない。
（２）抗体価の低下がなく、同時に抗体スペクトルの低下もない。
（３）抗補体作用（補体結合性）が日本国生物学的製剤基準で安全とみなされる２０単位（ＣＨ５０値）よりも十分に低い。
【００１４】
このような非化学修飾型の免疫グロブリンは、自然状態のもので、しかも抗補体価の低いものであれば、いかなる方法にて得たものであってもよい。
【００１５】
非化学修飾型の免疫グロブリンの調製方法は公知の手法により行えばよい。例えば、エタノール分画、ポリエチレングリコール分画（特開昭５３−４７５１５号公報）、ポリエチレングリコールとヒドロキシエチルスターチの組み合わせによる分画（特開昭５１−９１３２１号公報）、酸処理（特開昭５７−３２２２８号公報）、陰イオン交換体処理（特表昭５９−５０１５４６号公報、特開昭６０−４２３３６号公報）、加熱処理とポリエチレングリコール分画の組合せ（特開昭６３−１８３５３９号公報）、液状製剤化（特開昭５８−４３９１４号公報、特開昭６３−１９７２７４号公報）等が例示される。
【００１６】
また上記方法により得られた免疫グロブリンに加熱処理を施すことが好ましい。例えば、液状加熱方法としては、安定化剤として高濃度の糖または糖アルコールを用いる方法（特開昭６１−１９１６２２号公報）、安定化剤として高濃度のソルビトールを用い、低イオン強度、酸性ｐＨで行う方法（特開昭６３−１４６８３２号公報）等が例示される。また、乾燥加熱方法としては、安定化剤としてグリシン、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、マンニトール等を用いる方法（特開昭６１−７８７３０号公報）、安定化剤として二糖類、糖アルコールを用いる方法（特開昭６２−２２８０２４号公報、特開昭６３−２８３９３３号公報）等が例示される。
【００１７】
本発明で使用される免疫グロブリンの由来は特に限定されず、具体的にはヒト、マウス、ラット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。このような免疫グロブリンの具体例として、例えばポリエチレングリコール処理ヒト免疫グロブリン等が例示される。
【００１８】
本発明の免疫グロブリン製剤は、血清アルブミンがある程度除去されたものであり、その夾雑量が少ない。血清アルブミンの除去方法としては、以下の陰イオン交換体による接触処理方法、コロイド珪酸による接触処理方法等が挙げられる。
【００１９】
Ａ）陰イオン交換体による処理方法
陰イオン交換体で接触処理して非吸着画分を回収する方法である。
（ｉ）陰イオン交換体の調製
陰イオン交換体は、陰イオン交換基を不活性担体に結合したものであるが、陰イオン交換基としてはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アミノエチル（ＱＡＥ）基等を、不活性担体としてはアガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド等を用いることができる。その結合は公知の方法で行われる。
【００２０】
（ｉｉ）処理方法
免疫グロブリン画分を適当な水性溶媒に溶解する。水性媒体は、ｐＨ４〜７（特にｐＨ５〜６）、低イオン強度（特に０．０００１〜０．１Ｍ）であることが好ましい。このような水性媒体としては、塩化ナトリウム水溶液、注射用蒸留水、酢酸緩衝液等が挙げられる。調製された免疫グロブリン溶液は、その蛋白濃度が１〜１５ｗ／ｖ％（特に３〜１０ｗ／ｖ％）、ｐＨ４〜７（特にｐＨ５〜６）となることが好ましい。
【００２１】
次いで、この免疫グロブリン溶液を、上記水性媒体で平衡化した陰イオン交換体と接触処理する。その処理に際してはバッチ法、カラム法のどちらを用いてもよい。例えば、バッチ法では、陰イオン交換体１ｍｌに対して免疫グロブリン溶液１０〜１００ｍｌ程度と混合させ、０〜４℃で３０分〜２時間程度攪拌した後、遠心分離（６０００〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。カラム法でも、陰イオン交換体１ｍｌに対して免疫グロブリン溶液１０〜１００ｍｌ程度接触させ、非吸着画分を回収する。
【００２２】
Ｂ）コロイド珪酸処理による方法
コロイド珪酸で接触処理して非吸着画分を回収する方法である。
（ｉ）吸着剤
吸着剤として用いられるコロイド珪酸としては、シリカゲル、軽質無水珪酸、ケイソウ土、酸性白土、ベントナイト、カオリン、珪酸アルミン酸マグネシウム等が挙げられる。好適には、軽質無水珪酸（商品名エアロジル（日本エアロジル社製）、商品名デリピト（ゼータ社製）等）が用いられる。
【００２３】
（ｉｉ）処理条件
精製された免疫グロブリンを適当な水性溶媒に溶解する。水性媒体は、ｐＨ４〜７（特にｐＨ５〜６）、低イオン強度（特に０．０００１〜０．１Ｍ）であることが好ましい。このような水性媒体としては、陰イオン交換体で述べたものと同様の水性媒体が挙げられる。調製された免疫グロブリン溶液は、その蛋白濃度が１〜１５ｗ／ｖ％（特に３〜１０ｗ／ｖ％）、ｐＨ４〜７（特にｐＨ５〜６）となることが好ましい。
【００２４】
この免疫グロブリン溶液は、本発明の目的に反しない範囲で、通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を含有してもよい。
【００２５】
安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤等が例示され、１〜１０ｗ／ｖ％程度添加されていることが好ましい。
【００２６】
次いで、この免疫グロブリン溶液を上記の吸着剤と接触処理する。接触条件としては、免疫グロブリン濃度１〜１００ｇ／リットル（好ましくは１０〜１００ｇ／リットル）に対して吸着剤量１〜３０ｇ／リットルが使用される。本処理はバッチ法、カラム法のどちらでも行われ得るが、好ましくはバッチ法を用いる。バッチ法の場合の条件としては、例えば、５〜２５℃、５分〜１時間程度、混和、攪拌される。その後、濾過または遠心分離により上清（非吸着画分）を回収する。
【００２７】
このように、血清アルブミンの除去された免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリン５０ｍｇ当たり血清アルブミンの夾雑量が１０μｇ以下、好ましくは５μｇ以下の性状を有するものであり、例えば、免疫グロブリンの５ｗ／ｖ％濃度の溶液状態においては、血清アルブミンの夾雑量が１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは５μｇ／ｍｌ以下の性状を有する。このような性状の免疫グロブリン製剤は、従来のものと比較して保存安定性が良好となり、例えば、３７℃、３９日の保存においても、不溶性異物の生成が極めて少ないものとなる。また、免疫グロブリン製剤中の血清アルブミンの定量法としては公知のものが利用でき、例えばＥＬＩＳＡ法、マンシーニー法、比濁法等が採用され得る。
【００２８】
本発明の免疫グロブリン製剤は、液状製剤の場合は、そのままで、あるいは適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖液等）で希釈して使用され、乾燥製剤の場合は、上記免疫グロブリン溶液を凍結乾燥をした後、使用時に適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水等）に溶解して使用される。
【００２９】
本発明の免疫グロブリン製剤の投与経路は、通常注射であり、特に静脈内投与が好ましい。本発明の免疫グロブリン製剤の投与量は、体重１ｋｇ当たり免疫グロブリンとして５０〜１０００ｍｇ／日を、１〜数日間連日静脈内投与することが標準的であるが、症状、性別、体重等に応じて投与量を増減すればよい。
【実施例】
【００３０】
本発明をさらに詳細に説明するために、実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
コーン氏の冷アルコール分画法で得られた画分II＋IIIのペースト１ｋｇを０．６％塩化ナトリウム１０リットルに溶解し、１Ｎ−塩酸でｐＨ３．８に調整し、４℃で６０分間攪拌して酸処理を行った。この溶液に平均分子量４０００のポリエチレングリコールを５００ｇ添加して溶解しつつ、これに１Ｎ−水酸化ナトリウムを添加してｐＨを徐々に上昇させて、最終的にはｐＨ５．０に調整した。その後直ちに遠心分離により沈殿を除いて澄明な上清を得た。この上清に平均分子量４０００のポリエチレングリコール７００ｇを追加し、緩やかに攪拌しながら１Ｎ−水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整し、沈殿した免疫グロブリンを遠心分離により回収した。免疫グロブリンは、例えば生理食塩水または０．０２Ｍ酢酸緩衝液に０．６％塩化ナトリウムおよび２％マンニットを添加した溶液に溶解させた。免疫グロブリン５ｗ／ｖ％溶液を無水シリカを担持したフィルター（ゼータデリピット  キュノ社製）に通して、非吸着画分を回収した。さらに、除菌濾過、凍結乾燥を行うことにより、臨床に使用できる静注用免疫グロブリン製剤を得た。このようにして得られた免疫グロブリン製剤の５ｗ／ｖ％溶液中の混入アルブミンは、マンシーニー法により定量したところ、１０μｇ／ｍｌ以下であった。
【００３１】
実施例２
ヒト血漿から冷エタノール法により得られたコーン画分II＋III１ｋｇに水１０リットルを加え、ＩｇＧを抽出し、この上清１００ｍｌ当たりソルビトール５０ｇを添加し、ｐＨ５．５に調整した後、６０℃で１０時間加熱処理した。その後ｐＨ５．５に調整した後、冷注射用水にてこの液を３倍に希釈し、ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）を終濃度が８％となるように添加し、２℃で遠心分離を行い上清を得た。この上清を１Ｎ−水酸化ナトリウムを添加してｐＨ８．８に調整した後、ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）を終濃度が１２％となるように添加し、２℃で遠心分離を行い、沈殿したＩｇＧ画分を得た。このＩｇＧ画分を注射用水に溶解し、この溶液に、注射用水で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスを添加（溶液５０ｍｌ当たり２ｍｌ）し、０〜４℃の条件下で約１時間接触処理し、処理後濾過することによりＤＥＡＥ−セファデックスを除去して濾過液（ＩｇＧ溶液）を回収した。このＩｇＧ溶液を注射用水で５ｗ／ｖ％ＩｇＧ溶液に調整し、酢酸ナトリウムでこの溶液のｐＨを約５．５に調整し、さらにソルビトールを終濃度が５％となるように添加した。この水溶液（伝導度約１ｍｍｈｏ）を、実施例１と同様に無水シリカを担持したフィルターに通して非吸着画分を回収した。さらに除菌濾過し、静注用免疫グロブリン液状製剤を得た。このようにして得られた５ｗ／ｖ％ＩｇＧ溶液中の混入アルブミンは、マンシーニー法により定量したところ、５μｇ／ｍｌであった。
【００３２】
実験例１
本発明の免疫グロブリン製剤（５ｗ／ｖ％溶液）について、コロイド珪酸による処理を行った場合と、行わなかった場合とで、免疫グロブリン溶液中の血清アルブミンの夾雑量、および３７℃、３９日間の保存後の不溶性異物の生成の度合を比較した。コロイド珪酸による処理は実施例に記載の方法に準じた。血清アルブミンの定量はマンシーニー法を用いた。不溶性異物は目視にて観察した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
0004857323.tif 000002
【００３４】
以上の結果より、コロイド珪酸により処理された免疫グロブリン製剤は、血清アルブミン量が極めて少なく、３７℃、３９日間保存しても不溶性異物が観察されないことがわかる。