(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の全ての工程を含む、所望の細胞または微生物を予め決めた数含有する試料の自動調製方法。
（ａ）試料から、粒子分離装置により所望の細胞または微生物を予め決めた数分離する工程
（ｂ）当該予め決めた数の所望の細胞または微生物を受け取るために、細胞または微生物を保持することができる受け器または表面を、収集装置により配置させる工程
（ｃ）当該収集装置からの信号に従って、該粒子分離装置により分離された該予め決めた数の細胞または微生物を、該受け器中または表面上へ分配する工程
ここで信号は、マウスボタンスイッチがバイパスされオプトアイソレーターで置き換えられた改良コンピューターマウス回路により、該収集装置から該粒子分離装置に送られ、
該改良コンピューターマウス回路は、ａｃｑｕｉｒｅ機能ボタンを通じて、粒子分離装置を制御するソフトウェアを作動させ、
これによって、信号が受信されたときに該予め決めた数の細胞または微生物が該受け器中または表面上へ送達され、
該受け器または表面は、該収集装置によって細胞または微生物を収集するために充分な時間、配置され、
収集に引き続いて、該収集装置は、次の細胞または微生物を受け取る次の受け器または表面を先に進めて配置し、
該収集装置は、その後、改良コンピューターマウス回路により、さらなる予め決めた数の所望の細胞または微生物の分配を開始するように、粒子分離装置に信号を送る。
【請求項２】
前記細胞または微生物は、細胞、細菌、原生動物、酵母、真菌類、胞子、花粉およびウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、動物細胞または植物細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子分離装置は、フローサイトメーター、コールター粒子分離装置及び光学粒子分離装置からなる群から選択される自動液体分離装置である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子分離装置がフローサイトメーターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記収集装置がフラクションコレクターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子分離装置および前記収集装置が、改良コンピューターマウス回路を介して電子通信を行い、これによって、前記受け器または表面が前記分配された分離された細胞または微生物を受け取る位置に移動した場合に、改良コンピューターマウス回路により、該収集装置から該粒子分離装置へ電気信号が送られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞または微生物は、γ線照射またはＵＶ照射による照射を受けている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の全ての工程を含む、所望の数の微生物または細胞を含有する試料の自動調製方法。
（ａ）フローサイトメーターを用いて微生物または細胞を分離する工程
（ｂ）該フローサイトメーターにより分離された所望の数の微生物または細胞を受け器中または表面上へ分配する工程  ここで、当該受け器または表面は、微生物または細胞を保持することができ、かつ、該微生物または細胞を収集するために充分な時間フラクションコレクターによって収集領域に配置される
（ｃ）該受け器または表面を収集領域から自動的に移動させ、該収集領域に別の受け器または表面を配置させる工程
（ｄ）微生物または細胞を分配するためにフローサイトメーターへ自動的に信号を送信する工程、および
（ｅ）所要数の試料が調製されるまで、該微生物または細胞の分配を自動的に反復する工程
ここで、微生物または細胞を分配するためにフローサイトメーターへ自動的に信号を送信する工程は、マウスボタンスイッチがバイパスされオプトアイソレーターで置き換えられた改良コンピューターマウス回路を通じて信号を送ることによってフラクションコレクターにより実行され、
該改良コンピューターマウス回路は、ａｃｑｕｉｒｅ機能ボタンを通じて、フローサイトメーターを制御するソフトウェアを作動させる。
【請求項１０】
前記微生物または細胞をγ線またはＵＶ照射する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料内の微生物または細胞数を確認するために、試料の一部分について分析を実施する工程をさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらなる品質管理手順として各試料を秤量する工程をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料を用いて試験方法の有効性を決定する工程をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的微生物または細胞を前記試料中に含まれている混入粒子と識別するために、該試料がマーカーで染色される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が蛍光抗体マーカーで染色される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下の構成を含む、所望の数の微生物または細胞を含有する試料を自動調製するためのシステム。
（ａ）フローサイトメーター
（ｂ）収集領域を有し、かつ、微生物または細胞を保持できる受け器または表面を複数格納することができるフラクションコレクター
（ｃ）該フラクションコレクターを該フローサイトメーターに電子的に接続させる、マウスボタンスイッチがバイパスされオプトアイソレーターで置き換えられた改良コンピューターマウス回路
当該改良コンピューターマウス回路は該フラクションコレクターから該フローサイトメーターに信号を送るために適合しており、ａｃｑｕｉｒｅ機能ボタンを通じて、フローサイトメーターのための選別命令を制御するソフトウェアを作動させる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、小粒子、例えば細胞、細菌、原生動物、酵母、真菌類、胞子、花粉およびウイルスなどを予め決められた数含有する試料を調製する方法に関する。注：参考文献は本明細書の最後尾に一括する。
【０００２】
［発明の背景］
細胞または微生物を、液体または固体中において測定する多くの例が挙げられる。空気、水、食物、飲料および臨床試料などの試料は、種々の微生物学的方法にて日常的に試験されている。これらの試験が正確かつ信頼性高く行われ、それらの結果は試料間および研究室間で比較可能であることが必要不可欠である。
【０００３】
使用される試験方法は、多種多様であるが、それらは全て、試料についてのある種の操作を含み、例えば、フローテーション、ピペッティング、遠心分離、フィルタリング、あるいはホモジナイズ処理が挙げられる。これらの操作中に、試料の損失および細胞または微生物の損失が生じる。これらの損失は試料のタイプが異なると変わるものである。また、方法によっては、加熱、凍結、振とう、混合あるいはｐＨ調整などの種々な前処理を含むことがあり、これらの処理もまた、細胞または微生物の損失を引き起こす。全ての試験方法は検出プロセスを含み、また回収された粒子の計数を含むであろう。これは、寒天平板上のコロニーの計数のような単純なプロセスであってもよいし、あるいはフローサイトメトリーまたは免疫磁気分離などの複雑な分析プロセスであってもよい。これらの検出および計数プロセスは全て、試験結果に影響する不正確さを伴なうものである。
【０００４】
品質管理（ＱＣ）は、試験方法の正確さを点検し、試験プロセス中に細胞または微生物のどのような損失が生じるかを決定するために日常的に行われる。ＱＣプロセスは、しばしば、特定の細胞または微生物を接種した試料の分析を含み、その後、試料に接種した細胞または微生物の数を検出された数と比較する。
【０００５】
ＱＣプロセスは、既知数の細胞または微生物を含有する対照試料の利用可能性に依存している。これらの対照試料は信頼できるものでなくてはならず、各試料内の数は正確でなければならない。このような対照試料は調製が難しく、安定でないことが多く、また広く利用可能ではない。
【０００６】
水は、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）およびジアルジア（Giardia）が存在するかどうかについて日常的に試験される。その試験方法は、生物の損失が起こりうる幾多のプロセスを含む（Vesey et al., 1994a）。したがって、厳格な品質管理が行われ、そのやり方の実績を監視することが重要である。品質管理には既知数のシストおよびオーシストを含有する標準品を分析することが含まれ、ピペッティングのような従来の手法を用いた基準となる試料の調製法では、不正確な調製品を生じる（Reynolds et al., 1999）。さらに、調製品は安定でない。変質および微生物の凝集が、時間の経過に伴い生じる。
【０００７】
フローサイトメトリーは正確な対照試料の調製に有用であることが示されてきた（Reynolds et al., 1999）。しかしながら、この方法は長たらしく時間がかかるため、大量生産には適さない。
【０００８】
冷却水および配水システムは、レジオネラ（Legionella）が存在するかどうかについて日常的に試験される。試験方法には、遠心分離または濾過による水試料中の細菌の濃縮、それに次ぐ培養プロセス、免疫学的手法または分子学的方法のいずれかによるレジオネラ菌を検出することが含まれる。培養プロセスの使用は、結果を得るのに５〜１０日を要するため制限される。
【０００９】
免疫学的および分子学的方法は、両者とも偽陰性の結果を生じやすいため、厳密に質を管理することは必要不可欠である。品質管理には、既知数のレジオネラ細胞を含有する標準品の分析を含めることがある。しかしながら、正確な標準品を調製することは難しく、またそれらは安定でない。試料は、フローサイトメトリーを用いて調製し、細胞の光散乱を分析して、それらの細胞を選別することができる。生きているレジオネラ細胞を選別する場合は、圧電キャピラリー分配(dispensing)などのエーロゾルを生成しないアリクォーチング法(aliquoting method)がバイオハザードの危険性を克服するために必要とされるであろう。
【００１０】
したがって、既知数の細胞または微生物を含有する対照試料を作るための、自動化された、正確で便利な、かつ費用効率のよいプロセスが必要とされる。
【００１１】
本発明は、微生物または細胞などの小粒子を予め決められた数含有する対照試料の自動調製を可能とするものである。既知数の微生物または細胞を含有するこれらの試料は、γ線照射、あるいは他の方法で試料の安定性および保存期間を延長するための処理がなされてもよい。各試料中の微生物または細胞の数を確認するために複数の試料の一部に対して試験することがある。
【００１２】
［発明の概要］
第１の態様において、本発明は所望の粒子、特に、微生物または細胞を予め決められた数含有する対照試料の自動調製方法に関し、この方法は、粒子試料を供給すること、および粒子分離手段により予め決められた数の所望の粒子を分離すること、選別命令(sorting instruction)に従って、分配された粒子を受け取るよう収集手段により配置された受け器中へまたは表面上へ上記予め決められた数の粒子を分配することを含み、選別命令により選別（sort）された全ての粒子を収集するのに十分な時間、正確に配置された受け器中または表面上へ予め決められた数の粒子を送達するように選別命令が作動しているとき、上記収集手段は、粒子分配手段からの選別命令によって作動し、粒子を受け取る次の表面または受け器を先に進めて配置し、その後、上記収集手段は次の選別命令を開始するように該粒子分離手段に信号を送ることを特徴とする方法に関する。
【００１３】
粒子は、小粒子、特に品質管理に使用される粒子であり、細胞（動物細胞または植物細胞など）、細菌、原生動物、酵母、真菌類、胞子、花粉およびウイルスを含む。
【００１４】
粒子分離手段は、好ましくは、フローサイトメーター、クールター粒子分離装置、あるいは化学的、物理的、生物学的、蛍光または他の特性に基づいて粒子を分離するあらゆる他の手段など、自動液体ハンドリング分離手段である。
【００１５】
粒子の分配および分析に用いられる粒子分離手段の特定の例は、フローサイトメトリーである。フローサイトメトリーは、微生物または細胞（Shapiro, 1996; Vesey et al., 1994b）あるいは他の粒子の光散乱特性を規定するために用いることができる。フローサイトメトリーは、微生物または細胞あるいは他の粒子を予め決めた集団に調製することを可能にする。微生物を混入粒子と識別する光散乱特性を用いて、フローサイトメーターを微生物または細胞などの粒子を規定数を選別するために設定することができる。その後、選別された微生物は、フラクション収集などの収集手段により、試験管またはトレーなどの受け器中へあるいはスライドなどの表面上へ収集することができる。いったん収集が完了すると、新たな受け器が自動的に所定位置につき、フローサイトメーターは電子的に信号を送り、再び選別を始める。
【００１６】
粒子を分配または選別する他の粒子分離手段として、クールター感知、またはインピーダンス、磁性、質量または比重の測定により粒子を分離する手段が挙げられる。また、ラマン顕微鏡法、光散乱、画像、蛍光、吸収および発光を用いた光学検出粒子分離手段を使用することもできる。
【００１７】
粒子分離手段のさらなる例として、圧電キャピラリー分配、圧電作動キャッチャーチューブ、帯電液滴の偏光、音響操作（定在波、 衝撃波）、静電操作、および光学ピンセットが挙げられる。
【００１８】
収集手段は、フラクションコレクター、または所望物質の試料を多数個収集できる他のいかなる装置であってもよい。
【００１９】
粒子分離手段および収集手段は、分離手段からの選別信号が、粒子を受け取るための受け器、表面または他の手段を、分離された粒子を受け取るために一部分移動させるように電子通信する。例えば、フローサイトメーターの電気出力がフラクションコレクターの入力に接続され得る。
【００２０】
受け器は、試験管、バイアル、シャーレ、膜、スライドまたはマルチウェルプレートもしくはディシュのウェルなど任意の受け器であってよく、好ましくは、粒子試料を受け取った後に閉じることができる受け器である。表面の参考としては、スライドまたはあらゆる他の表面が挙げられる。
【００２１】
調製後、対照試料はγ線照射またはＵＶ照射などの照射を受けてもよく、あるいは粒子の構造完全性、または分析もしくは検出に影響しない方法で不活性化／保存または滅菌することができる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、既知数の微生物または細胞を含有する管理試料の自動調製方法であって、
（ａ）微生物または細胞試料を分析すること（該試料は、蛍光抗体（または標的微生物を試料中に含まれている混入粒子と識別するのに役立つ他のもの）で染色してもよい）、
（ｂ）選別された全ての粒子を収集するために十分な時間、正確に配置される受け器中へまたは表面上へ、既知数の微生物または細胞を分配すること、
（ｃ）該受け器または表面を収集領域から自動的に移動させ、該収集領域に別の受け器または表面を配置させること、
（ｄ）該粒子を分配するために、ディスペンサーへ自動的に信号を送信すること、
（ｅ）所要数の対照試料が調製されるまで、サイクルを自動的に反復すること、
（ｆ）該対照試料へγ線照射すること、
（ｇ）該対照試料内の微生物数を確認するために、対照試料の一部分について分析を実施すること、
（ｈ）さらなる品質管理手順として、各試料をすべて秤量すること、
（ｉ）該対照試料を用いて、試験方法の有効性を決定すること、
を含む方法に関する。
【００２３】
実施例１
クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）およびジアルジア(Giardia)
クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のオーシストは、シドニーにて、自然感染した新生子ウシのプール糞便から精製した。糞便試料を遠心分離し（２０００ｇ、１０分）、水に２度再懸濁した後、５倍容量の１％（ｗ／ｗ）NaHCO３に再懸濁した。その後、脂肪物質を１倍容量のエーテルで２度抽出し、続いて遠心分離した（２０００ｇ、１０分間）。ペレットを水に再懸濁し、予め湿らせた非吸着性脱脂綿の層に通して濾過した。溶出液を、１０倍容量の５５％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液上に注ぎ、遠心分離した（２０００ｇ、１０分間）。オーシストをショ糖界面から収集し、目に見える混入物質が検出することができなくなるまでショ糖フローテーション工程を繰り返した。精製したオーシストを氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで３０分間表面滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水（１５０ｍｍｏｌ／ｌ  NaCl、１５ｍｍｏｌ／ｌ  KH２PO4、２０ｍｍｏｌ／ｌ  NaHPO４、２７ｍｍｏｌ／ｌ  KCl、ｐＨ７．４）（PBS）中で１度洗浄し、PBSで約１×１０７オーシスト／ｍｌの濃度に希釈して、４℃にて保存した。
【００２４】
ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)のシストはWaterborne Inc(New Orleans, USA)から購入した。
【００２５】
クリプトスポリジウムおよびジアルジアストックの不活性化
シストおよびオーシストの懸濁液を０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液で約２×１０５生物／ｍｌの濃度に個々に希釈した（フローサイトメトリーによる計数により測定した）。各懸濁液の一定分量（２ｍｌ）を個々の１２×７５ｍｍファルコンチューブに入れた。チュ−ブにキャップをした後、微生物の不活性化を確実にするために、チューブを＝＞２００，０００ラドのγ線照射に曝した。チューブに「不活性化ストック」とラベルし、使用まで４℃（＋／−４℃）で保存した。
【００２６】
計装
Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメーターを分析および細胞の選別に用いた。Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメーターにより選別された微生物を収集するために特別に設計された装置を、機器の始動前にフローサイトメーターに取り付けた。
【００２７】
この装置は、ＦＲＡＣ１００フラクションコレクター（Pharmacia Ltd）、長さ約２５ｃｍのシリコンチューブ、改良マッキントッシュコンピュータマウスおよび電気ケーブルから構成される。
【００２８】
フラクションコレクターが新しいチューブを収集領域に配置するたびに、電気パルスがコレクターの背部の出力ソケットに送られる。この電気パルスは、フローサイトメーターに信号を送り、細胞の選別を開始させるために用いた。
【００２９】
通常、フローサイトメーターは、サイトメーター制御ソフトウェアにおける「獲得(acquire)」機能ボタン上にマウスアイコンを移動し、マウスボタンを押すことにより、特定数の微生物の選別をトリガする。改良マウス回路において、マウスボタンスイッチはバイパスされ、オプトアイソレーター(opto-coupler)で置換される。フラクションコレクターからの信号（５電圧論理）が入力に達すると、オプトアイソレーターのトランジスタ側は切り換えを行う。９ボルトの電池は、切り換え電圧をちょうど下回るレベルにオプトアイソレーターのトランジスタ側は通る電圧を維持するために用いられた。電池とトランジスタの間にダイオードを挿入し、９ボルトの電池からトランジスタに印加された電圧を低減させた。マウスリードを通常のマウスポートに差し込むことにより、改良マウスをサイトメーターに接続した。電気リードをフラクションコレクター上の信号出力ソケットと改良マウス回路の入力の間に接続した。
【００３０】
装置にサイトメーターの流体工学システムを取り付けるために、以下の手順を行った。
１）サイトメーターフードを開いた。
２）フローセル光遮蔽を取り外した。
３）先在するソートチューブを取り外した。
４）分配装置をサイトメーターの底面に取り付けた。
５）分配装置のソートチューブをサイトメーターのソートヘッドに取り付けた。６）フローセル光遮蔽を元へ戻した。
【００３１】
カルーセルを初期設定するために、以下の手順を行った。
１）カルーセルの電源を入れた。
２）フラクションサイズとして、０．１０の値を入力した。
３）カルーセルを６ｍｌプラスチック試験管で満たした。
４）ディスペンサーアームを最初の試験管の上に配置する。
【００３２】
サイトメーターを設定するために、以下の手順を行った。
１）サイトメーターをユーザーマニュアルに従い始動した（Becton Dickinson, San Jose, USA）
２）シースタンク(SHEATH tank)をＩＳＯＴＯＮ（Coulter Pty Ltd, Brookvale）で満たし、次いでベルジャーに設置し、３０分間ベルジャーを真空にすることにより脱気する。
３）シースタンクをサイトメーターに接続し、サイトメーターを２つのプライムサイクルを通過させる。
４）SSCに対するFSCのドットプロットを表示させた。
５）全ての検出器のための対数増幅器を選択した。
【００３３】
クリプトスポリジウムの分配
１）不活性化クリプトスポリジウムストックの試料を負荷し、低流速設定にて実行した。
２）ドットプロットの中央にオーシスト集団が現れるまで、FSCおよびSSC検出器の電圧を調節した。
３）しきい値がオーシスト集団を僅かに下回るまで、しきい電流比を調節した。４）オーシスト集団周辺に円形領域（Ｒ１）を描いた。
５）SINGLE CELLモードにおいて領域Ｒ１に現れる１００個の粒子を選別するようサイトメーターを設定した。
６）コンピュータ画面上のカーソルをAQUIREボタン上に配置した。
７）フラクションコレクター上のRUNを押した。
【００３４】
いったん全９６個の試験管への選別が完了したら、不活性化クリプトスポリジウムストックの試料をサイトメーターから取り外し、１０％次亜塩素酸ナトリウムの試料を５分間流して、サイトメーターを洗浄した。
【００３５】
ジアルジアの分配
１）不活性化ジアルジアストックの試料を負荷し、低流速設定にて実行した。
２）しきい値がシスト集団を僅かに下回るまで、しきい電流比を調節した。
３）オーシスト集団上に領域（Ｒ１）を配置させた。
４）SINGLE CELLモードにおける領域Ｒ１に現れる１００個の粒子を選別するためにサイトメーターを設定した。
５）コンピュータ画面上のカーソルをAQUIREボタン上に配置した。
６）フラクションコレクターのディスペンサーアームを最初の試験管の上に配置した。
７）フラクションコレクター上のRUNを押した。
【００３６】
いったん全９６個の試験管への選別が完了したら、試験管にキャップをし、４℃のラックに置き、８時間以内γ線照射した。
【００３７】
試験管の滅菌
選別されたクリプトスポリジウムのオーシストおよびジアルジアのシストを含有する試験管を＝＞２００，０００ラドのγ線照射に曝した後、４℃で保存した。
【００３８】
品質管理
生産された試験管のうち５％（生産工程を通して均等な間隔で）について、正確な数のジアルジアおよびクリプトスポリジウムが各試験管に含まれていることを保証するための分析を行った。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識クリプトスポリジウム特異的およびジアルジア特異的モノクローナル抗体を濾過（０．２２μｍ）した後、１００μｌずつ各試験管に入れた。室温で１５分間のインキュベーション後、フローサイトメトリーにより試料を分析し、各試験管内のシストおよびオーシストの数を記録した。
【００３９】
試験した試験管中のシストおよびオーシストの平均値および標準偏差を割り出し、記録した。
【００４０】
生産された全ての試験管を秤量し、全試験管の重量の中央値より０．１ｇ大きいまたは小さい試験管を破棄した。
【００４１】
対照試料の使用
クリプトスポリジウムのオーシストおよびジアルジアのシストの対照試料を、クリプトスポリジウムおよびジアルジアの存在に関して水試料を試験するための商業ラボによって用いられる免疫磁気分離法およびフローサイトメトリー法の品質管理を行うために用いた。
【００４２】
対照試料の５０本の試験管を試薬等級の水に加え、免疫磁気分離法およびフローサイトメトリー法により分析した。下記式：
（検出数／対照物質の平均値）×１００
を用いて、結果を回収パーセトで表わした。
【００４３】
分析した５０種類の試薬等級の水試料からのクリプトスポリジウムのオーシストおよびジアルジアのシストの平均回収率は、それぞれ８２％±１８および７２％±１６であった。
【００４４】
参考文献
Reynolds,D.T., Slade, R.B., Sykes, N.J., Jonas,A. and Frivker,C.R., 1999. Isolation of Cryptosporidium Oocysts from Water:How Can Precise Recovery Data be Generated?
Shapiro, H,M., 1995. A practical guide to flow cytometry, third edition. A.R.Lisss, New York.
Vesey, G., Hutton, P.E., Champion, A.C., Ashbolt, N.J., Williams,K.L., Warton, A., and Veal, D.A.,1994a. Application of flow cytometric methods for the routine detection of Cryptosporidium and Giardia in water. Cytometry, 16, 1-6
Vesey, G.; Narai, J; Ashbolt,N., Williams,K.L. and Veal, D.A. 1994b. Detection of specific microorganisma in environmental samples using flow cytometry. In: Methods in Cell Biology, Volume 42 Flow Cytometry Second Edition. ed. Darzynkiewicz, Z., Robinson; J.P. and Crissman, H.A. pp.489-522, Academic Press Inc., New York.