(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース−１−リン酸を有効成分とするインテグリン産生促進剤
【請求項２】
請求項１のインテグリンがインテグリンβ１である請求項１記載のインテグリン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１のインテグリンがインテグリンα２β１である請求項１記載のインテグリン産生促進剤。
【請求項４】
グルコース−１−リン酸を有効成分とするビンキュリン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース−１−リン酸を有効成分とするインテグリンおよびビンキュリン産生促進剤に関するものであり、その利用分野としては、例えば、化粧品、飲食品、医薬部外品、医薬品等に用いることにより皮膚のたるみを改善し、弾力感を付与する組成物および、癌細胞の増殖抑制、転移抑制効果を有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、常に、乾燥、紫外線等の外界の刺激にさらされており、加齢とともにハリ、弾力が喪失し、たるみが生じる。従来、このような皮膚のたるみを改善し、皮膚に弾力を与える組成物として表皮と基底膜の接着を改善、強化したり、表皮細胞のインテグリンの産生を促進させることにより肌のシワ、たるみ、肌理構造を改善するものの提案がなされてきた。また、収れん剤により皮膚を引き締める効果を期待するものが知られていた。特許文献１にはセイヨウキズタ、エキナセア、カボチャ、セイヨウタンポポ、およびアンジェリカの植物またはその抽出物を含有させたケラチノサイトに対するインテグリンα６β４産生促進用組成物が例示されている。
また、特許文献２にも、ケラチノサイトに対する皮膚基底膜賦活成分であるラミニン５産生促進剤および皮膚基底細胞賦活成分であるインテグリンα６β４産生促進剤を含み、それぞれ単独よりもより効果的に皮膚の老化を予防、防止、改善する組成物が例示されている。
さらに、特許文献３にも、ケラチノサイトに対するインテグリン産生促進物質において、ヤナギハッカ属に属するヒソップ、ステビア属に属するステビア、アブラナ属に属するブロッコリー、ゼニアオイ属に属するゼニアオイ，ハイアオイであることを特徴とする皮膚外用剤が例示されている。
【特許文献１】特開２００３−１７１２２５
【特許文献２】特開２００３−２２６６５５
【特許文献３】特開２００４−２６２８６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、表皮と基底膜の接着を改善、強化したり、表皮細胞のインテグリンの産生を促進させることでは、肌のシワ、たるみを改善するのには十分でなく、また、収れん剤により皮膚を引き締める効果も一時的な作用にすぎず、継続的に皮膚のたるみ・弾力を改善できるものではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者らは、特に皮膚線維芽細胞とコラーゲンなどの細胞外マトリックスとの相互作用に着目した。すなわち皮膚の線維芽細胞に作用して、線維芽細胞のインテグリンおよびビンキュリンの産生を促進させることにより、真皮細胞外マトリックスとの接着を強化し、皮膚のたるみや弾力を改善する効果のある組成物を提供するものである。
【０００５】
皮膚は表皮、真皮、皮下組織の３層に主に分けられ、それらのうち真皮は皮膚の構造の維持に極めて重要であり、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンといった線維により強固かつ柔軟に造られ、真皮結合組織を形成している。ヒト皮膚細胞、特にヒト皮膚線維芽細胞はこれらコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンなどの線維と相互作用することにより結合組織の状態をコントロールしている。従って、皮膚線維芽細胞とコラーゲンなど細胞外マトリックスとの相互作用は皮膚のたるみ・弾力の維持に深く関わっている。
【発明の効果】
【０００６】
そこで、本発明者らは皮膚細胞においてはこれまでほとんど注目されていなかった接着タンパクであるインテグリンとビンキュリンに着目し、インテグリンおよびビンキュリンタンパク量を増大させることにより、皮膚細胞、特に皮膚線維芽細胞と細胞外マトリックスとの相互作用を活性化することにより、皮膚のたるみ・弾力を改善できることを見出した。
【０００７】
一方、多くの癌細胞においてインテグリン、特にインテグリンβ-1サブユニットが強く発現されていることが知られている。インテグリンはαおよびβヘテロダイマーを形成する一群の分子ファミリーを構成する生体分子であり、細胞表面のリガンドや細胞外マトリックスに結合することが知られている分子である。インテグリンは、そのβサブユニットにより更にβ-1、β-2、β-3サブグループに分類されている。また、インテグリンの発現量が癌細胞の生体内における増殖速度や転移などの悪性度と密接に関連していることが報告されている。例えば、β-1サブグループに属するα5β1はその発現量が増加すると腫瘍形成が認められなくなることが報告されている(Cell. 60, 849-859 (1990))。このようにインテグリンの重要性は近年増大しており、白血球接着抑制、血小板凝集阻害、癌転移抑制、あるいは心筋梗塞、動脈硬化症、骨溶解性疾患等の治療、予防への応用が期待できる。また、ビンキュリンはインテグリン裏打ちタンパクの1つとして最も良く知られているタンパクであり、発現増強により接着の強化を起こし、細胞の運動を抑制することが知られている。
【０００８】
すなわち本発明は、グルコース−１−リン酸を有効成分とする、ヒト皮膚細胞のインテグリンおよびビンキュリンの産生促進剤を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明においてインテグリン、ビンキュリンは、ヒト皮膚細胞に発現するものであればよいが、特にヒト皮膚線維芽細胞に発現するものであることが好ましい。ヒト皮膚線維芽細胞に発現するものであれば特に優れた皮膚引き締め効果を発揮することができる。
【００１０】
インテグリンは、αサブユニット、βサブユニットからなり、αサブユニットは更にα１からα５、αＬ等が存在し、βサブユニットはβ１、β２、β３等が存在するが、各種結合組織に存在するコラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン等マトリックスと線維芽細胞など結合組織に存在する細胞との相互作用を考えると、これらのうちα1サブユニット、α2サブユニット、β１サブユニットの発現が促進されるのが好ましく、更にはα２サブユニットの発現が促進され、同時にβ１サブユニットの発現が促進されることがより望ましい。また、特に、皮膚線維芽細胞 に関してはコラーゲンとの相互作用の観点からα２β１インテグリンの発現が促進されることが好ましい。
【００１１】
本発明のインテグリンおよびビンキュリン産生促進剤はグルコース-1-リン酸を有効成分とする。グルコース−１−リン酸は生体内でのグルコース代謝産物であり、有機物の解毒と排泄に重要なUDP-D-グルクロン酸が産生される。UDP-D-グルクロン酸はフェノールなどの異物とか薬物の腎排泄を高めることによって解毒作用に利用される。また、ヒアルロン酸やヘパリンのような酸性多糖のD-グルクロン酸の前駆体としても重要な物質である。
【００１２】
本発明で使用するグルコース−１−リン酸は、市販されている試薬を用いてもよく、酵母などの微生物などより溶媒を用いて抽出することで得られるものでも良い。
【００１３】
本発明で使用する抽出物を得るための抽出溶媒としては、供する製品の使用目的、種類、あるいは後に行う加工処理等を考慮した上で選択すれば良いが、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いて抽出し、精製して使用することが出来る。
【００１４】
グルコース−１−リン酸を微生物などより抽出する場合は微生物を乾燥後、重量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。
【００１５】
以上のような条件で得られる上記抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により精製、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
【００１６】
本発明で使用するグルコース−１−リン酸の形態としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状、ゲル状等いずれの形状でも良く、最終的な製品を構成する上で最適な形状を任意に選択することができる。
【００１７】
本発明の組成物の剤型は任意であり、皮膚外用剤としては、例えば液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤又はパップ剤等の医薬又は医薬部外品が好ましく挙げられる。さらに、医薬品類、医薬部外品類、化粧品類又は飲食品に配合して用いることができる。特に、外皮に適用される医薬品，医薬部外品，化粧品組成物といった外用剤組成物に適用される。
【００１８】
本発明の具体的な使用形態としては、水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、粉末、賦形剤、界面活性剤、油剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、甘味剤、色素、香料等を必要に応じて混合して適宜配合することにより外用剤組成物の化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー、軟膏、分散液、洗浄料、および液体状、ペースト状、カプセル状、粉末状、錠剤等種々の剤型とすることができる。
【００１９】
本発明によるグルコース−１−リン酸の皮膚組成物への配合量は、期待される作用の程度によって若干異なり特に限定しないが、通常、製剤全量中、固形分換算して、0.0001質量％以上、好ましくは0.01〜20.0質量％の濃度範囲とすることが有効である。
【００２０】
以下、本発明によるインテグリンおよびビンキュリン産生促進剤の効果にかかわる試験実施例を示すと共にその素材を用いた外用剤への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
細胞の培養
細胞：HFSKF-II（理化学研究所）
培地：D-MEM＋FBS15%
正常ヒト線維芽細胞であるHFSKF-II細胞を、15%FBSを添加したD-MEM培地で培養した。細胞を50cm2 plateに50%コンフルーエント程度に植え付け培養した。翌日、グルコース−１−リン酸（和光純薬工業より入手した試薬）を各濃度添加した。添加後、48時間後に細胞を回収し、ウエスタン・ブロッティングの試料とした。
【００２２】
ウエスタン・ブロッティング7.6%アクリルアミドのゲルで電気泳動を行い、PVDF膜に転写後、インテグリン抗体としてIntegrinβ-1（M-106）sc-8978  （SANTA  CRUZ  BIOTECHNOLOGY、INC）Human（Rabbit  polyclonal）、ビンキュリン抗体としてVinculin（H-10）sc-25336  （SANTA  CRUZ  BIOTECHNOLOGY、INC）Human（mouse  monoclonal）、二次抗体としてECLTM  Anti-rabbit  IgG、Horseradish Peroxidase linked whole
antibody（from donkey）NA934V（Amersham
Bioscience UK Limited）、ECLTM  Anti-mouse  IgG、Horseradish  Peroxidase  linked  whole  antibody（from  sheep）NA931V（Amersham  Bioscience  UK  Limited）を用いてウエスタン・ブロッティングを行い、130KDaのインテグリンタンパク、117KDaのビンキュリンタンパクを確認した。
【００２３】
インテグリン、ビンキュリンタンパク量の測定
ウエスタン・ブロッティングで得られたバンド強度はDolphin-DOC(WEALTEC)により解析を行った。試料未添加区のインテグリンタンパクのバンド強度の面積を１００として、それぞれのエキス添加区のインテグリンのバンド強度面積を比例計算し、インテグリンタンパク量とした。ビンキュリンタンパクについてもインテグリンと同様に処理して行った。
【００２４】
【表−１】
0005081607.tif 000002
【００２５】
実験結果を表-1に示す。バンド強度面積を解析の結果、対照区を100とした場合、グルコース−１−リン酸2mM添加区では122、4mM添加区では130のインテグリンβ1産生量を示し、グルコース−１−リン酸によるインテグリンβ1の産生促進効果が確認できた。また、ビンキュリンタンパクについては、グルコース−１−リン酸2mM添加区では118、4mM添加区では124の産生量を示し、グルコース−１−リン酸によるビンキュリン産生促進効果が確認できた。
【００２６】
（実施例２）各種組成物の製造
本発明による各種組成物を製造した。以下にその処方例を示すが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
化粧料の処方例
【００２７】
（１）クリーム組成物                                
（重量％）
a)ミツロウ                                           
2.0
b)ステアリルアルコール    
5.0
c)ステアリン酸                                       
8.0
d)スクワラン                                        
10.0
e)自己乳化型グリセリルモノステアレート               
3.0
f)ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.)             
1.0
g)グルコース−１−リン酸                      
2.0
h)1,3-ブチレングリコール                          
5.0
i)防腐剤・酸化防止剤                               
適量
j)精製水            
残部
k)水酸化カリウム                                     
0.3
製法  a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。g)〜j)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜ｆ)に加えて乳化する。その後、予めj)の一部で溶解させておいたk)を加え、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００２８】
（２）乳液状組成物                                 
（重量％）
a)ミツロウ                                           
0.5
b)ワセリン                                           
2.0
c)スクワラン                    
8.0
d)ソルビタンセスキオレエート                 
0.8
e)ポリオキシエチレンオレイルエーテル(20E.O.)           1.2
f)グルコース−１−リン酸                                
5.0
g)1,3-ブチレングリコール                         
7.0
h)カルボキシビニルポリマー                           
0.2
i)水酸化カリウム                                      
0.1
j)精製水           
残部
k)防腐剤・酸化防止剤                              
適量
l)エタノール                                         
7.0
製法  a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。f)〜k)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。 50℃で
l)を添加し、40℃まで冷却する。
【００２９】
（３）化粧水様組成物                                   
(重量%)
a)グルコース−１−リン酸        
1.0
b)α-リノレン酸                                         0.1
c)グリセリン                    
5.0
d)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)     1.0
e)エタノール                                           
6.0
f)香料                                            
適量
g)防腐剤・酸化防止剤                             
適量
h)精製水              
残部
製法  a)〜h)までを混合し、均一に溶解する。
【００３０】
（４）パック剤                                      
(重量%)
a)グルコース−１−リン酸                               
3.0
b)酢酸ビニル樹脂エマルジョン                        
15.0
c)ポリビニルアルコール                          
10.0
d)キュウイシード油                                  
3.0
e)グリセリン                                        
5.0
f)酸化チタン                                        
8.0
g)カオリン                                        
7.0
h)エタノール              
8.0
i)香料            
適量
j)防腐剤・酸化防止剤                      
適量
k)精製水                       
残部
製法 a)〜k)までを混合し、よく撹拌、分散させ均一にする。
【００３１】
（５）軟膏剤                                          (重量%)
a)流動パラフィン                                        20.0
b)白色ワセリン                                          50.0
c)セタノール                                            10.0
d)ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油                18.0
e) グルコース−１−リン酸                                   2.0
製法：加熱しながらa)〜e)を加え混合し、軟膏剤を調製する。
【００３２】
（６）ゲル剤                                          (重量%)
a)ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油                9.0
b)カーボポール９４１                                    0.5
c)エタノール                                           22.0
d)トリエタノールアミン                                  1.5
e) グルコース−１−リン酸                                  4.0
f)精製水                                                63.0
製法：加熱しながら、f)にa)、b)、e)を加えて溶解させた後、d)、c)を加えて攪拌しながら冷却し、ゲル剤を調製する。
【００３３】
（７）液剤                                            (重量%)
a)ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油               10.0
b)エタノール                                           20.0
c) グルコース−１−リン酸                                  5.0
d)精製水                                               65.0
製法：a)〜d)を加えて溶解し、液剤を調製する。
【００３４】
（８）錠剤                                          （重量%）
ａ）でんぷん                                          72.0
ｂ）ショ糖脂肪酸エステル                               8.0
ｃ）グルコース−１−リン酸                            20.0
製法：a）〜ｃ）の原料を混合し、打錠機器で成型して、８ ｍ ｍ 径の素錠を製造した。この素錠を常法によりフィルムコートして、錠剤を完成した。
【００３５】
（９）カプセル剤
ａ）乳糖                                190mg
ｂ）ステアリン酸マグネシウム             10mg
ｃ）グルコース−１−リン酸               10mg
合計                                    210mg
製法：a）〜ｃ）を均一に混合し、６０メッシュのふるいを通した後、この粉末全量を２号ゼラチンカプセルに充填した。
【００３６】
（１０）ドリンク剤
ａ）レモン果汁                           20mL
ｂ）プロポリス                           0.3g
ｃ）ビタミンC                           0.2g
ｄ）はちみつ                            13.0g
ｅ）グルコース−１−リン酸               1.0g
ｆ）水                                  適量
合計                                    100ｍL
製法：a）〜ｅ）を十分攪拌後、ｆ）を加え、全量を１００ｍL とした。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上のように、本発明に係るインテグリン・ビンキュリン産生促進剤は、化粧品、飲食品、医薬部外品、医薬品等に用いることにより、皮膚線維芽細胞と真皮細胞外マトリックスとの接着を強化し、皮膚のたるみや弾力を改善する効果のある組成物を提供し、また、癌細胞の増殖抑制、転移抑制効果を有する組成物へ利用できる。