(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
0004857114.tif 000008
（式中、Ｒは、メチル基、カルボキシル基、カルバモイル基、ヒドロキシイミノメチル基、又はシアノ基を示す。）
で表される４置換ピリジンに、その２位にヒドロキシル基を導入する能力を有するデルフティア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属、又はアシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属に属する微生物又はその処理物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：
【化２】
0004857114.tif 000009
（式中、Ｒは、メチル基、カルボキシル基、カルバモイル基、ヒドロキシイミノメチル基、又はシアノ基を示す。）
で表される２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの製造方法。
【請求項２】
前記微生物が、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、又はアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）である請求項１に記載の２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの製造方法。
【請求項３】
デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、及びアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）からなる群から選んだ微生物。
【請求項４】
式（３）：
【化３】
0004857114.tif 000010
で表される２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用して４置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを製造する方法に関する。２−ヒドロキシ−４置換ピリジンは、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルでの中間体として用いられ、産業上有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
化学的合成によって２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを製造する方法がいくつか知られている。例えば、２−ヒドロキシイソニコチン酸又はその前駆体である２−ハロゲノイソニコチン酸の製造方法としては、［ｉ］イソニコチン酸とフッ素ガスを氷温下で反応させた後、塩酸で加水分解して２−ヒドロキシイソニコチン酸を得る方法［米国特許４９６８８０３号公報：特許文献１］、又は［ii］イソニコチン酸Ｎ−オキサイドをオキシ塩化リン及び五塩化リンと還流下で反応させ、２−クロロイソニコチン酸を得る方法［特公平６−３７４７２号公報：特許文献２］が知られている。
２−ヒドロキシ−４−シアノピリジンの製造方法としては、［iii］４−シアノピリジン  Ｎ−オキサイドをトリフルオロ酢酸無水物と１１０℃で７日間反応させて４−シアノ−２−ピリドンを得る方法［ヌクレオサイズ  アンド  ヌクレオタイズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），３（４），３６９−３８８，（１９８４）：非特許文献１］が知られている。
２−ヒドロキシ−４−メチルピリジンの製造方法としては、［iv］４−メチルピリジンをアセチル  ハイポフルオライトと−１０℃で反応させて２−アセトキシ−４−メチルピリジンを得た後、加水分解して４−メチル−２−ピリドンを得る方法［ジャーナル  オブ  ジ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），１０９，３７８９−３７９０，（１９８７）：非特許文献２］が知られている。
２−ヒドロキシイソニコチン酸アミドの製造方法は知られていない。なお、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムは文献未記載の新規化合物である。
しかしながら、前記の製造方法［ｉ］〜［iv］の内、方法［ｉ］は、ハロゲンガスの取り扱いに注意が必要なうえ、反応には特殊な装置が必要である。また、方法［ii］〜方法［iv］は、特殊な試薬を扱い、かつ温度条件が厳しく、また工程数が多く煩雑であり、工業的手法とは言い難い。このように、化学的合成による方法では、工程数が多く、しかも取扱注意な原料を使用するため、実用的な方法ではない。【０００３】
一方、微生物学的手法による２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの製造方法は今まで報告されていない。イソニコチン酸を２−ヒドロキシイソニコチン酸へと変換する酵素活性を持つ微生物として、サルシナ・スピーシーズ（Ｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．）［インディアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  ＆  バイオフィジックス（Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ），１５，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，４９２−４９３，（１９７８）：非特許文献３］と、マイコバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）［ジャーナル  オブ  ジェネラル  マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），１３７，１０７３−１０８０，（１９９１）：非特許文献４］が知られているが、これらの非特許文献３及び非特許文献４は微生物の代謝経路を解明するための報告であり、代謝中間体である２−ヒドロキシイソニコチン酸の生産を目的としたものではない。そのため、微生物の酵素生産能力と２−ヒドロキシイソニコチン酸の蓄積量の点から、工業的な２−ヒドロキシイソニコチン酸の生産を考えると、微生物を利用する方法としては満足することのできるものではない。【０００４】
【特許文献１】米国特許４９６８８０３号公報
【特許文献２】特公平６−３７４７２号公報
【非特許文献１】ヌクレオサイズ  アンド  ヌクレオタイズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），３（４），３６９−３８８，（１９８４）
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  ジ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），１０９，３７８９−３７９０，（１９８７）
【非特許文献３】インディアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  ＆  バイオフィジックス（Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ），１５，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，４９２−４９３，（１９７８）
【非特許文献４】ジャーナル  オブ  ジェネラル  マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），１３７，１０７３−１０８０，（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、４置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンへの工業的利用が可能な製造方法を開発するべく鋭意検討を重ねた結果、４置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを著量生成し、蓄積する能力を有する微生物が存在することを見出し、この微生物を利用することにより、４置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを製造し、工業的にも利用可能な方法を提供することができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は、一般式（１）：
【化１】
0004857114.tif 000002
（式中、Ｒは、メチル基、カルボキシル基、カルバモイル基、ヒドロキシイミノメチル基、又はシアノ基を示す。）
で表される４置換ピリジンに、その２位にヒドロキシル基を導入する能力を有する微生物又はその処理物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：
【化２】
0004857114.tif 000003
（式中、Ｒは、メチル基、カルボキシル基、カルバモイル基、ヒドロキシイミノメチル基、又はシアノ基を示す。）
で表される２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの製造方法に関する。【０００７】
本発明方法の好ましい態様においては、前記微生物が、デルフティア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属、又はアシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属に属する微生物である。
本発明方法のより好ましい態様においては、特に前記微生物が、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、又はアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）である。【０００８】
また、本発明は、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、及びアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）からなる群から選んだ微生物にも関する。【０００９】
更に、本発明は、式（３）：
【化３】
0004857114.tif 000004
で表される新規２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムにも関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明方法によれば、通常の温度及び圧力の条件下に、安全かつ単一工程で４置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを製造することができ、この製造方法は工業的にも利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明方法において出発原料として用いる一般式（１）で表される４置換ピリジンとしては、４−メチルピリジン（別称：γ−ピコリン）〔Ｒ＝メチル基〕、イソニコチン酸〔Ｒ＝カルボキシル基〕、イソニコチン酸アミド〔Ｒ＝カルバモイル基〕、４−ピリジンアルドキシム〔Ｒ＝ヒドロキシイミノメチル基〕、及び４−シアノピリジン〔Ｒ＝シアノ基〕を挙げることができる。
出発原料としてイソニコチン酸を使用する際は、イソニコチン酸又はその塩を用いることができる。イソニコチン酸の塩としては、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩）、又はアンモニウム塩を挙げることができる。
本発明方法において出発原料として用いる４置換ピリジンは、当該４置換ピリジンそのものを使用することができるが、当該４置換ピリジンを合成して得られた反応液をそのまま使用することもできる。例えば、出発原料として４−ピリジンアルドキシムを使用する際は、４−ピリジンアルドキシムそのものを使用することができるが、４−ピリジンカルバルデヒドから合成された４−ピリジンアルドキシムを含む反応液をそのまま使用することもできる。【００１２】
本発明方法で使用される微生物は、一般式（１）で表される４置換ピリジンから一般式（２）で表される対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを著量生成し、蓄積する能力を有する微生物であればその起源は何ら問わない。【００１３】
一般式（１）で表される４置換ピリジンから、一般式（２）で表される対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを著量生成し、蓄積する能力を有する微生物は、例えば、デルフティア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属に属する微生物、又はアシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属に属する微生物が好ましい。
更に前記微生物の好ましい態様として具体的には、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７、又はアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４を挙げることができる。デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９は、平成１６年７月２７日付けで、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７及びアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４は平成１６年３月１８日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国内寄託されたものであり、平成１７年８月２日から国際寄託に移行されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）はそれぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９［ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１３８］、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８［ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４０］、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４１］である。【００１４】
本発明方法において使用することのできるデルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９［国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１３８］）株の菌学的性質は次のとおりである。
１．形態的・培養的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．８μｍ
（３）長さ：１．５〜２．０μｍ
（４）胞子形成：−
（５）運動性：＋
（６）コロニー形態：周縁全縁、隆起状態レンズ状、表面形状スムーズ、クリーム色【００１５】
２．生理学的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）グラム染色：−
（２）各培養温度での生育：３７℃  ＋、４５℃  −
（３）カタラーゼ：＋
（４）オキシダーゼ：＋
（５）酸／ガス産生（グルコース）：−／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：−／−
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）ブドウ糖  酸性化：−
（10）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（11）ウレアーゼ：−
（12）エスクリン加水分解：−
（13）ゼラチン加水分解：−
（14）β−ガラクトシダーゼ：−
（15）各種化合物の資化性
ブドウ糖：−
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−マンノース：−
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：＋
アジピン酸：＋
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（16）チトクロームオキシダーゼ：＋
（17）ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地での生育性：＋【００１６】
３．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち５’末端側約５００塩基の配列を解析した。決定された塩基配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はデルフティア属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はデルフティア・アシドボランス（Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）ＩＡＭ１２４０９株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０２１４１７〕であり、相同率は９９％であった。
以上の結果より、本菌株をデルフティア・スピーシーズであると判定した。従って、本発明は、この新規菌株にも関する。【００１７】
本発明方法において使用することのできるデルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８［国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４０］）株の菌学的性質は次のとおりである。
１．形態的・培養的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．８μｍ
（３）長さ：１．５〜３．０μｍ
（４）胞子形成：−
（５）運動性：＋
（６）コロニー形態：周縁やや波状、低凸状、光沢あり、クリーム色【００１８】
２．生理学的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）グラム染色：−
（２）各培養温度での生育：３７℃  ＋、４５℃  −
（３）カタラーゼ：＋
（４）オキシダーゼ：＋
（５）酸／ガス産生（グルコース）：−／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：−／−（アルカリ産生）
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）ブドウ糖  酸性化：−
（10）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（11）ウレアーゼ：−
（12）エスクリン加水分解：−
（13）ゼラチン加水分解：−
（14）β−ガラクトシダーゼ：−
（15）各種化合物の資化性
ブドウ糖：−
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−マンノース：−
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：＋
アジピン酸：＋
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：＋
（16）チトクロームオキシダーゼ：＋【００１９】
３．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち５’末端側約５００塩基の配列を解析した。決定された塩基配列を配列表の配列番号２に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号２）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はデルフティア属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はデルフティア・ツルハテンシス（Ｄｅｌｆｔｉａ  ｔｓｕｒｕｈａｔｅｎｓｉｓ）Ｔ７株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７５０１７〕であり、相同率は９９％であった。
以上の結果より、本菌株をデルフティア・スピーシーズであると判定した。従って、本発明は、この新規菌株にも関する。【００２０】
本発明方法において使用することのできるアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７［国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４１］）株の菌学的性質は次のとおりである。
１．形態的・培養的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．７〜０．８μｍ
（３）長さ：１．５〜２．０μｍ
（４）胞子形成：−
（５）運動性：＋
（６）コロニー形態：全縁滑らか、低凸状、光沢あり、クリーム色【００２１】
２．生理学的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）グラム染色：−
（２）各培養温度での生育：３７℃  ＋、４５℃  −
（３）カタラーゼ：＋
（４）オキシダーゼ：＋
（５）酸／ガス産生（グルコース）：−／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：−／−
（７）硝酸塩還元：＋
（８）インドール産生：−
（９）ブドウ糖  酸性化：−
（10）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（11）ウレアーゼ：−
（12）エスクリン加水分解：−
（13）ゼラチン加水分解：−
（14）β−ガラクトシダーゼ：−
（15）各種化合物の資化性
ブドウ糖：＋
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−マンノース：−
Ｄ−マンニトール：−
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：−
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：−
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：−
（16）チトクロームオキシダーゼ：＋
（17）Ｔｗｅｅｎ  ８０の加水分解：＋【００２２】
３．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち５’末端側約５００塩基の配列を解析した。決定された塩基配列を配列表の配列番号３に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号３）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はアシドボラックス属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はアシドボラックス・デフルビー（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ）ＢＳＢ４１１株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｙ１８６１６〕であり、相同率は９９％であった。
以上の結果より、本菌株をアシドボラックス・スピーシーズであると判定した。従って、本発明は、この新規菌株にも関する。【００２３】
次に、本発明方法において使用するデルフティア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属、又はアシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属に属する微生物の培養方法、特には、本発明による新規微生物であるデルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、又はアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）の培養方法について説明する。【００２４】
前記微生物を培養するための培地は、通常これらの微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培地の炭素源及び窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、及び／又はアミノ酸などを使用することができる。また、必要に応じて、有機酸、微量金属塩、ビタミン類、核酸関連物質、及び／又は無機塩類などを添加することもできる。
更に、培養の際に、前記微生物が有する、一般式（１）で表される４置換ピリジンから一般式（２）で表される対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを生成する能力を最大限に引き出すために、必要に応じて前記４置換ピリジンを培地に添加して培養することもできる。その場合、前記４置換ピリジンの添加量は、培地に対して０．０１〜３．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜２．０ｗ／ｖ％である。【００２５】
前記微生物の培養温度は、好ましくは１０〜３７℃、より好ましくは２３〜３２℃である。培養時の培地のｐＨは、好ましくは６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ６．５〜９．０である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましく、液体培養時には通気及び撹拌を行うことが望ましい。バッチ培養を行う場合の培養時間は、好ましくは１０時間〜１週間、より好ましくは１〜３日間行うことができる。【００２６】
以上のようにして、前記の微生物、特には、本発明による新規微生物の培養菌体を培地中に蓄積させることができる。［ｉ］得られた培養液はそのまま以下に述べる反応に使用してもよいし、［ii］微生物を培養液から回収して反応に使用したり、更に［iii］回収した微生物の処理物、例えば、破砕物、粗酵素、又は精製酵素などを反応に使用することもできる。【００２７】
続いて、前記の微生物（特には、本発明による新規微生物）又はその処理物により、一般式（１）で表される４置換ピリジンから、一般式（２）で表される対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを生成する反応を実施する。この反応は、バッチ式でも、また、バイオリアクターなどを用いた連続式でも可能である。バッチ式反応の場合には、数時間から１週間で行うことができる。【００２８】
上述の［ｉ］の場合を具体的に説明すると、上記の方法で増殖させた前記微生物を含む培養液に、直接、一般式（１）で表される４置換ピリジンを加え、一般式（２）で表される対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを系内に蓄積させる反応を開始させることができる。蓄積反応のｐＨは、好ましくはｐＨ６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ６．０〜９．０であり、反応温度は、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは１０〜３５℃である。前記４置換ピリジンの添加量は、培養液に対して好ましくは０．１〜５．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．５〜３．０ｗ／ｖ％である。４置換ピリジンの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の４置換ピリジンによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。【００２９】
対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの蓄積反応は、前記微生物が十分に増殖して、変換能力が十分となった時点から開始することができるが、前記微生物の増殖が十分でない培養初期段階でも、生育阻害が起こらない濃度範囲で培地に４置換ピリジンを添加して、微生物の増殖と対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの蓄積反応を同時に行うことができる。【００３０】
また、上述の［ii］の場合には、上記の方法で増殖させた微生物を、ろ過又は遠心分離により培養液から回収して蓄積反応に使用することができる。すなわち、得られた微生物は４置換ピリジンを含む生理食塩水、又は緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件（ｐＨ、温度、４置換ピリジンの添加量）は［ｉ］の場合と同じである。更に、上述の［iii］の場合には、回収した微生物の処理物、例えば、破砕物、粗酵素、又は精製酵素などは、４置換ピリジンを含む生理食塩水、又は緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件は、［ｉ］の場合と同様である。あるいは、微生物又はその処理物を公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を上記水性溶媒と接触させて反応に使用してもよい。【００３１】
前記微生物又はその処理物を使用した蓄積反応に用いる水性溶媒としては、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、又はホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。【００３２】
以上のようにして得られた蓄積反応後の反応液から、必要に応じて、ろ過、又は遠心分離などにより微生物を除去した後、塩酸や硫酸などの酸溶液を加えて、２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを沈殿させ、回収することができる。粗酵素、又は精製酵素などの処理物を使用した場合などでは菌体除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを回収することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下に代表的な実施例を示し、本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。実施例において使用する培地を以下記載する。
（１）培地Ａ
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１．２５ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物４．３ｇ、リン酸二水素カリウム４．２ｇ、硫酸鉄（II）七水和物０．３ｇ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物０．３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、及びイソニコチン酸５．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。【００３４】
（２）培地Ｂ
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１．２５ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物４．３ｇ、リン酸二水素カリウム４．２ｇ、硫酸鉄（II）七水和物０．３ｇ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物０．３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、イソニコチン酸５．０ｇ、及びグルタミン酸ナトリウム５．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。【００３５】
（３）培地Ｃ
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１．２５ｇ、シーライフ１．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物４．３ｇ、リン酸二水素カリウム４．２ｇ、硫酸鉄（II）七水和物３．０ｍｇ、モリブデン（VI）酸二ナトリウム二水和物３．０ｍｇ、及びイソニコチン酸５．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０又は９．０に調整した培地。オートクレーブ滅菌後の培地ｐＨはそれぞれ７．０又は８．５である。【００３６】
《実施例１：デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９を用いた培養液での２−ヒドロキシイソニコチン酸の蓄積反応》
培地Ａ１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したデルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養した。
一方、撹拌、通気、温度、及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地Ｂ１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した後、このジャーファーメンターに、前記培地Ａの２４時間培養液１０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２７℃及びｐＨ７．０で２２時間培養を行った。
その後、ｐＨを６．７として培養液中のイソニコチン酸濃度が０．５〜１．０ｗ／ｖ％の範囲に保たれるようにイソニコチン酸を適宜断続的に添加し、２−ヒドロキシイソニコチン酸の蓄積反応を行った。蓄積が進まなくなった培養７７時間目で反応を終了し、培養液の遠心上清を下記の条件でＨＰＬＣ分析したところ、２−ヒドロキシイソニコチン酸の蓄積量は９１．６ｇ（０．６６ｍｏｌ）であった。前記培地Ａ及び培地Ｂに含まれていたイソニコチン酸と前記蓄積反応中に添加したイソニコチン酸の合計量１２６．１ｇ（１．０２ｍｏｌ）に対して、２−ヒドロキシイソニコチン酸のモル変換率は６４．３％に相当した。【００３７】
上記で得られた培養液（定量値で２−ヒドロキシイソニコチン酸９１．６ｇを含む）について、菌体を遠心分離で除去した後、塩酸による酸析及び活性炭による不純物除去処理を行い、白色結晶を得た。得られた結晶は、乾燥重量で８１．５ｇ、ＨＰＬＣ分析の面比は１００％であった。得られた化合物は、ＨＰＬＣ−ＭＳ、ＮＭＲ及びＩＲ分析により、２−ヒドロキシイソニコチン酸と同定された。
［ＨＰＬＣの分析条件］
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ  ４．６×２５０ｍｍ、
移動相；０．５ｖ／ｖ％メタノール（８５％リン酸を加えてｐＨを２．５に調整）、
流速；１ｍＬ／分、
カラム温度；２５℃、
検出波長；２１０ｎｍ、
保持時間；イソニコチン酸＝４．１分、２−ヒドロキシイソニコチン酸＝１６．９分、２，６−ジヒドロキシイソニコチン酸（別称：シトラジン酸）＝１８．６分。【００３８】
《実施例２：単離菌株の２−ヒドロキシイソニコチン酸生成活性》
培地Ｃ１０ｍＬを２５ｍＬ容の試験管に入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この試験管に、栄養寒天培地に維持した、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、又はアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）の菌体をそれぞれ１白金耳接種し、２７℃で２５時間振とう培養した。なお、培地Ｃのオートクレーブ滅菌後のｐＨは、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９では７．０とし、他の菌株ではｐＨ８．５とした。
培養終了後、培養液の遠心上清に含まれる目的物の２−ヒドロキシイソニコチン酸と副生成物の２，６−ジヒドロキシイソニコチン酸を定量して、培地に含まれていたイソニコチン酸に対する２−ヒドロキシイソニコチン酸のモル変換率（％）を求めた。また、２−ヒドロキシイソニコチン酸のモル生成量を［ａ］、２，６−ジヒドロキシイソニコチン酸のモル生成量を［ｂ］として、２−ヒドロキシイソニコチン酸の純度［Ｐ］（％）を以下の計算式：
Ｐ＝［ａ／（ａ＋ｂ）］×１００
から求めた。
更に、培養液１ｍＬを遠心分離により集菌し、得られた菌体に０．５ｗ／ｖ％イソニコチン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０に調整）０．５ｍＬを加え、懸濁した。これを３０℃で３０分間振とうして反応を行った。生成した２−ヒドロキシイソニコチン酸と２，６−ジヒドロキシイソニコチン酸をＨＰＬＣにより定量し、２−ヒドロキシイソニコチン酸蓄積量１μｍｏｌ／ｍｉｎを１ｕｎｉｔ（Ｕ）として、培養液１Ｌあたりの２−ヒドロキシイソニコチン酸蓄積活性（Ｕ／Ｌ  ｂｒｏｔｈ）を求めた〔以下、静止菌体活性（Ｕ／Ｌ  ｂｒｏｔｈ）とする〕。また、上記と同様に、静止菌体反応における２−ヒドロキシイソニコチン酸の純度（％）を求めた。結果を表１に示す。表中における２ＨＩＮＡは２−ヒドロキシイソニコチン酸を表す。【００３９】
【表１】
0004857114.tif 000005
【００４０】
《実施例３：デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９の静止菌体を用いた２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの蓄積反応》
実施例１と同様の方法でデルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）を培養した後、培養液２００ｍＬを遠心分離により集菌し、静止菌体を得た。これに、表２に掲げる４置換ピリジン０．５ｗ／ｖ％を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０に調整）１００ｍＬを加え、懸濁した。この懸濁液を、撹拌、通気、温度、及びｐＨ調整を行うことができる１００ｍＬ容の反応槽に入れ、撹拌、及び通気を行いながら、２７℃及びｐＨ７．０にて反応を行った。
４４時間反応後、２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを定量した。反応生成物はＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ−ＭＳの測定により確認した。結果を表２に示す。【００４１】
【表２】
0004857114.tif 000006
４−ピリジンアルドキシムを反応基質として得られた、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシム０．２７ｇを含む溶液にイソプロパノール１００ｍＬを添加し、３０分間の撹拌の後、固形分をろ過により除いた。ろ液に水１００ｍＬを添加した後、減圧濃縮し、イソプロパノールを除去することにより結晶が析出した。析出した結晶をろ取することにより粗結晶０．２０ｇを得た。得られた結晶を水で洗浄後、ろ取し、白色結晶の２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシム０．１５ｇ（単離収率５３％）を得た。ＩＲ、プロトンＮＭＲ及びＭＳの測定により構造を確認した。
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）；３１８０，３０７０，２９２０，１６６０，１５２０，１４３０，１３３０，１３００，１２５０，１０００，９００，８７０，８００，７７０
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ｐｐｍ）；１１．７８（１Ｈ，ｓ），１１．４８（１Ｈ，ｓ），７．９５（１Ｈ，ｓ），７．２９（１Ｈ，ｄ），６．４０（１Ｈ，ｓ），６．４０（１Ｈ，ｄ）
ＭＳ（ＭＨ＋）；１３９【００４２】
《実施例４：各静止菌体を用いた２−ヒドロキシ−４置換ピリジンの蓄積反応》
実施例１と同様の方法で、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）、デルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ｃ２１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８８）、又はアシドボラックス・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ８５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８７）を培養した後、培養液１０ｍＬを遠心分離により集菌し、静止菌体を得た。この静止菌体に、表３に掲げる４置換ピリジン０．５ｗ／ｖ％を含む０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０に調整）２ｍＬを加え、懸濁した。この懸濁液を１５ｍＬ容の容器に入れ、撹拌をしながら２７℃及びｐＨ７．０にて反応を行った。４４時間反応後、２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを定量した。結果を表３に示す。【００４３】
【表３】
0004857114.tif 000007
【００４４】
《実施例５：ＹＧＫ−Ａ６４９の静止菌体を用いた２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムの蓄積反応》
塩酸ヒドロキシルアミン１．３ｇをイオン交換水５ｇに溶解させ、６５℃に加熱し、４−ピリジンカルバルデヒド２ｇを滴下した。６５℃で３０分反応させ、４−ピリジンアルドキシムを２．２ｇ含有する反応液を得た。得られた４−ピリジンアルドキシムはＨＰＬＣにより確認した。次に、反応液を３０℃まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にてｐＨ６になるように中和した。この中和液に６００ｍＬの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０に調整）を添加し、さらに、実施例１と同様の方法でデルフティア・スピーシーズ  ＹＧＫ−Ａ６４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３８９）を培養した後、培養液１０００ｍＬを遠心分離により集菌し得られた静止菌体を加え、懸濁した。この懸濁液を、撹拌、通気、温度、及びｐＨ調整を行うことができる２０００ｍＬ容の反応槽に入れ、撹拌、及び通気を行いながら、２０℃及びｐＨ７〜８にて反応を行った。１０８時間反応後、２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムを反応収率８７％で得た。得られた２−ヒドロキシ−４−ピリジンアルドキシムは、ＩＲ、プロトンＮＭＲ及びＭＳの測定により実施例３に記載する器機分析の数値を示し、構造を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明方法は、微生物を利用して４置換ピリジンから対応する２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを製造することができ、この製造方法は工業的利用が可能であるため、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルでの中間体として有用な２−ヒドロキシ−４置換ピリジンを効率的に提供することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
0004857114000001.app