(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞を欠失型肝細胞増殖因子／ｂＦＧＦ／ＤＭＳＯ／デキサメタゾンの存在下で培養することを特徴とする、胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、および
（ｂ）得られた胚様体を、欠失型肝細胞増殖因子／ｂＦＧＦ／ＤＭＳＯ／デキサメタゾンの存在下で培養する工程
を含む方法。
【請求項３】
胚性幹細胞が哺乳類由来のものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
哺乳類がヒトである請求項３記載の方法。
【請求項５】
哺乳類がマウスである請求項３記載の方法。
【請求項６】
胚様体が浮遊培養により形成される請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
培養が三次元培養で行なわれる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
三次元培養が、細胞接着性不織布の存在下に行われる請求項７記載の方法。
【請求項９】
得られる肝細胞が、
（１）アンモニア、ジアゼパムおよびリドカインよりなる群から選択される少なくとも１種を代謝する；
（２）アルブミンおよび／または尿素を分泌する；
（３）ＧＡＤＰＨ遺伝子、サイトケラチン１８遺伝子、グルコース６リン酸化酵素遺伝子、チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子および肝細胞核因子３ベータ遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１種を発現する；および
（４）複数の核を有する、および／または、グリコーゲン顆粒が存在する；
よりなる群から選択される少なくとも１種の機能を有する肝細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
バイオ人工肝臓の製造方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、
（ｂ）得られた胚様体をバイオ人工肝臓リアクター内に充填する工程、および
（ｃ）バイオ人工肝臓リアクター内で、前記胚様体を欠失型肝細胞増殖因子／ｂＦＧＦ／ＤＭＳＯ／デキサメタゾンの存在下で培養する工程
を含む方法。
【請求項１１】
工程（ａ）で得られた胚葉体を、細胞接着性不織布の存在下で三次元培養する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）のバイオ人工肝臓リアクターが、血液を流すための中空糸膜を備え、中空糸膜の外側に胚葉体と細胞接着性不織布が存在するものである請求項１０または１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）の肝細胞への分化誘導方法および該方法により誘導される肝細胞、ならびにバイオ人工肝臓に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、人体の中で最大の実質臓器であり、その機能は糖質、蛋白質、脂肪の代謝を始めビリルビン代謝、薬物代謝、血液凝固因子の生成など多岐にわたり、未知な機能を含めると肝臓の機能は数百にものぼり生体において非常に重要な役割を果たしている。よって、たとえそれが一時的なものであれ、重篤な肝臓疾患は患者の生命にとって極めて危険である。【０００３】
一方で、肝臓は旺盛な再生能を有し、劇症肝不全で肝傷害を受けたとしても、一週間ほど肝機能を代替することができれば患者は回復する。こうした重篤な肝疾患に対して、肝臓移植が最も効果的であることは事実であるが、深刻なドナー不足を鑑みると万人がその恩恵を受けることはできない。目下、我が国では、一時的に肝機能を代替する手段として、持続濾過透析と血漿交換を組み合わせることで、ある程度の救命率は得られているものの、充分とはいい難く、更なる有効な治療法の確立が必要であり、治療用人工肝臓の開発に対するニーズが高まっている。そこで、期待されているのが、生きた細胞の代謝能力やタンパク質合成能を活用するために細胞を充填したバイオ人工肝臓である。【０００４】
バイオ人工肝臓は、肝細胞を担体に組み込んで固定しリアクター化した生体内の肝臓を模倣した人工肝臓装置と言える。患者の血液を当該装置内に導き、肝細胞の代謝能を利用して血液中のトキシンの除去と肝臓細胞に由来する凝固因子などの生理活性物質の供給とを行なうことができる。細胞源としては、健常ヒト肝細胞が理想であるがドナー肝の不足からその入手はきわめて困難である。欧米では、移植不適合肝臓は肝細胞分離へと活用され、肝細胞移植やバイオ人工肝臓へと臨床応用されているが、本邦では移植不適合肝臓は焼却と規定されており、そのバイオ人工肝臓への活用は不可能である。【０００５】
こうした問題の対策として、ヒト末梢血幹細胞、骨髄幹細胞そして肝前駆細胞などからヒト肝細胞への誘導が研究されているが、これらの細胞は増殖能に乏しく、バイオ人工肝臓への応用に値する細胞数（十億個以上）を確保するのは現実的ではない。一方で、欧米、中国では、ブタ肝細胞を使用したバイオ人工肝臓治験がヒトで行なわれているが、ブタ内因性レトロウイルス感染、Ｅ型肝炎などの人畜共通感染症が問題視されており今後の進展が厳しい現状にある。【０００６】
また、最終分化したヒト細胞を標的に遺伝子組み換えによる不死化細胞株の樹立が検討されているが、これらの遺伝子組み換えを用いた方法では、外来遺伝子を導入するため、ヒトへの応用に際しては、遺伝子導入細胞の染色体の変化およびそれに伴う細胞の腫瘍化などといった安全面でのハードルが高い（Craig D. Woodworth et al., Molecular and Cellular Biology Oct. 4492-4501, 1988）。さらに、レトロウイルスベクターの使用に関しては、フランスのＸ染色体連鎖先天性重複性重症免疫不全症（X-Linked SCID）患児に対する、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子治療でのγδ−Ｔ細胞性白血病が発症するという事故が２００２年９月に報告されて以来、慎重な姿勢が取られている（S. Hacein-Bey-Abina et al., Science, Vol. 302(17), 415-419, 2003）。【０００７】
以上より、臨床応用の実現可能なバイオ人工肝臓を開発するに当たっては、より自然な形に近い細胞源の検討が必要とされている。【０００８】
一方、ＥＳ細胞には、１）生体を構成するあらゆる種類の細胞に分化でき、２）半永久的に増殖する能力があることから低コストで大量培養が可能であり、３）遺伝子の組換えを行なわず細胞増殖因子を用いた誘導法が適用可能であるため、遺伝子改変細胞に比べより自然体に近い細胞を入手できるなどといった利点がある。【０００９】
幹細胞から肝細胞を分化誘導する方法としては、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor：ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、デキサメタゾン、オンコスタチンＭ（インターロイキン６のファミリーに属する）、ｎ−酪酸などが使用されているが、充分に機能的な肝細胞への誘導は可能ではない（Rambhatla L et al., Cell Transplant. Vol.12, 1-11, 2003、Schwartz RE et al. J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002 および特表２００３−５３０８７９号公報）。また、肝障害を惹起したマウスの肝臓にＥＳ細胞を移植することでＥＳ細胞の肝細胞への分化誘導を促した例も報告されているが（Yamamoto H et al. Hepatology 2003 37:983, 2003）、操作が繁雑であり、分化した肝細胞を障害マウスの肝臓から回収しなければならないなどの問題点がある。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、充分に機能的であり、大量供給が可能で安全な肝細胞およびその用途、特に肝細胞を用いたバイオ人工肝臓を提供することである。
【００１１】
前記問題点に鑑み鋭意検討した結果、ＨＧＦの天然の変異体（natural variant）である欠失型肝細胞増殖因子（以下、ｄＨＧＦともいう）を用いることにより、ＥＳ細胞を効率的に機能的な肝細胞へと分化誘導できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記に示す胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法、該方法により得られる肝細胞、該肝細胞を使用するバイオ人工肝臓、該肝細胞を使用する薬物検査方法、該肝細胞を使用する生理活性物質の産生方法を提供する。
（１）  胚性幹細胞を欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養することを特徴とする、胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法。
（２）  胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、および
（ｂ）得られた胚様体を、欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養する工程
を含む方法。
（３）  胚性肝細胞が哺乳類由来のものである前記第（１）項または第（２）項記載の方法。
（４）  哺乳類がヒトである前記第（３）項記載の方法。
（５）  哺乳類がマウスである前記第（３）項記載の方法。
（６）  胚様体が浮遊培養により形成される前記第（２）項〜第（５）項のいずれかに記載の方法。
（７）  培養が三次元培養で行なわれる前記第（１）項〜第（５）項のいずれかに記載の方法。
（８）  前記第（１）項〜第（７）項のいずれかに記載の方法により誘導される肝細胞。
（９）  前記第（８）項記載の肝細胞を含有するバイオ人工肝臓。
（１０）  バイオ人工肝臓の製造方法であって、
（ａ）胚性幹細胞の胚様体を形成する工程、
（ｂ）得られた胚様体をバイオ人工肝臓リアクター内に充填する工程、および
（ｃ）バイオ人工肝臓リアクター内で、前記胚様体を欠失型肝細胞増殖因子の存在下で培養する工程
を含む方法。
（１１）  前記第（８）項記載の肝細胞を使用して薬物を検査する方法。
（１２）  前記第（８）項記載の肝細胞を使用して生理活性物質を産生する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の方法にしたがって、不織布上でマウスＥＳ細胞から分化誘導されたマウス肝細胞（実施例３）の位相差顕微鏡写真である。分化誘導された肝細胞１には肝細胞の特徴である複数の核２が観察される。
【図２】（ａ）は不織布の繊維４に付着した播種直後の胚様体３の走査顕微鏡写真であり、（ｂ）は不織布の繊維４に付着した分化誘導された肝細胞１の走査顕微鏡写真である。
【図３】本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、作製過程の一実施態様を示す図である。（ａ）は裏打ち５が施された不織布６の上に中空糸膜７を並べた図である。ここで、裏打ち５が施された不織布６にはスリット８が設けられている。（ｂ）は、（ａ）をロール状に巻く過程を示す図である。（ｃ）は、（ｂ）のＸ−Ｘ線断面拡大図である。（ｄ）は、両端に液漏れ防止部材９を設けた筒状容器１０に中空糸膜７と不織布６からなるロールを組み込んだバイオ人工肝臓リアクター１１を表わす概略図である。
【図４】本発明の方法によりマウスＥＳ細胞から分化誘導されたマウス肝細胞における肝特異的遺伝子および内因性標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。レーン１〜６は、それぞれサイズマーカー、未分化ＥＳ細胞、フィーダー細胞、分化誘導されたＥＳ細胞（実施例２）、不織布上で分化誘導されたＥＳ細胞（実施例３）およびマウス肝細胞を示す。
【図５】本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞の薬物代謝能を示すグラフである。
【図６】本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞の尿素産生能を示すグラフである。
【図７】本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞のアルブミン産生能を示すグラフである。
【図８】本発明の方法によりヒトＥＳ細胞から形成された胚様体（実施例５）を示す位相差顕微鏡写真である。
【図９】本発明の方法によりヒトＥＳ細胞から分化誘導されたヒト肝細胞（実施例５）の位相差顕微鏡写真である。
【図１０】（ａ）不織布の繊維４に付着した播種直後の胚様体２３の走査顕微鏡写真である（実施例６）。（ｂ）は不織布の繊維４に付着した分化誘導された肝細胞２１（実施例６）の走査顕微鏡写真である。
【図１１】本発明の方法により、ヒトＥＳ細胞から分化誘導されたヒト肝細胞における肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン遺伝子および内因性コントロールであるベータアクチン遺伝子の発現を示す写真である。レーン１〜７は、それぞれサイズマーカー、未分化ヒトＥＳ細胞、胚様体を形成したヒトＥＳ細胞、胚様体を形成させた後に不織布上を使用せずに分化誘導されたヒトＥＳ細胞（実施例５）、胚様体を形成させた後に不織布上で分化誘導されたヒトＥＳ細胞（実施例６）、ヒト肝細胞、そしてサイズマーカーを示す。
【図１２】本発明の方法により、不織布上でヒトＥＳ細胞から分化誘導された肝細胞の透過電子顕微鏡写真である（実施例６）。
【図１３】本発明の方法により分化誘導されたマウス肝細胞の薬物代謝能を示すグラフである。
【図１４】本発明の方法により分化誘導されたヒト肝細胞の尿素産生能を示すグラフである。
【図１５】本発明の方法により分化誘導されたヒト肝細胞のアルブミン産生能を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ＨＧＦと比較してより細胞障害性の少ないＨＧＦの天然の変異体であるｄＨＧＦを用いることにより、ＥＳ細胞を肝細胞へ分化誘導する方法に関する。【００１５】
本発明のＥＳ細胞から肝細胞を分化誘導する方法には、（ａ）ＥＳ細胞の胚様体を形成する工程、および（ｂ）得られた胚様体を、ｄＨＧＦの存在下で培養する工程を含む方法が含まれる。【００１６】
ＥＳ細胞としては、哺乳類由来のものが好ましく、哺乳類としては、ヒト、カニクイザルなどの霊長類、マウスなどが挙げられる。【００１７】
ｄＨＧＦは、天然のＨＧＦのスプライシングにより５個のアミノ酸が欠失して生じたスプライス変異体である（FEBS Letters 434 (1998)，165-170参照）。ｄＨＧＦは、特公平７−６８２７２号公報およびその分割出願である特開平７−１８８２９２号公報の記載にしたがって製造することができる。なお、これら公報においては、ｄＨＧＦは、ＴＣＦ−ＩＩとして記載されている。【００１８】
ＥＳ細胞は、受精卵が成長を続ける初期の段階である胚から製造することができる。卵子と精子が１つになった受精卵は、胎児へと成長していく途中で２つ、４つ、８つ・・・と分裂を繰り返し、５、６日目には胚盤胞と呼ばれる状態になる。胚盤胞は直径０．１ｍｍほどの球状のかたまりである内部細胞塊を抱く胞胚腔から構成される。内側の細胞塊は、いずれ内胚葉、中胚葉、外胚葉へと成長し、体のあらゆる細胞を形作っていく部分で、栄養外胚葉はそれらの胎盤を形成し、また胚を外界から隔離する袋を形成する。この内部細胞塊をほぐしたのち、細胞を取り出し、これらの細胞を増殖可能でかつ分化しない環境で培養することによりＥＳ細胞を製造することができる。したがって、ＥＳ細胞は、前記のとおり胚から製造することができる。【００１９】
このようなＥＳ細胞は、マウスでは１９８１年にエバンスら（Evans et al., 1981, Nature 292: 154-6.）や、マーチンら（Martin GR. et al., 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8.）によって樹立され、商品としては大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）などから購入可能である。【００２０】
また、ヒトＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Thomson et al., Science, 1998, 282:1145-7.）によって樹立され、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（WiCell Research Institute、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）から入手可能である。【００２１】
我国においては、ヒトＥＳ細胞の研究はナショナルバイオリソースプロジェクトに指定されており、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターで樹立されたヒトＥＳ細胞が、「再生医科学研究所ヒトＥＳ細胞分配規定」（平成１５年１１月２６日施行）にしたがって、文部科学大臣の確認（承認）を得るなどの一定の条件下に入手が可能である。現時点では、ヒトＥＳ細胞株「ＫｈＥＳ‐１」（平成１５年８月樹立）、「ＫｈＥＳ‐２」（平成１５年１０月樹立）、「ＫｈＥＳ‐３」（平成１５年１０月樹立）が入手可能である。【００２２】
前記ヒトＥＳ細胞株ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２、ＫｈＥＳ−３は、体外受精や顕微授精などの生殖補助医療のために作製された受精卵の余剰胚（移植されずに廃棄されることになっている受精卵）を用いて樹立されたものである。すなわち、この受精卵を胚盤胞の段階まで培養し、該胚盤胞から内部細胞塊を分離しフィーダー細胞上で培養し、増殖してくる未分化細胞を選別・継代を繰り返し、継代可能にすることで樹立したものであり、樹立方法自体はマウスやサルの場合と本質的にかわらない。ヒトＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞と異なりフィーダー細胞上で扁平なほぼ単層のコロニーを作り、形態的にはサルＥＳ細胞に非常によく似ている。ヒトＥＳ細胞は未分化ＥＳ細胞に特異的なマーカーを発現しており、また正常な染色体構成を保持している（末森博文、臨床病理、５２：３（２００４）、２５４〜２５８頁参照）。前記ＥＳ細胞が発現している未分化ＥＳ細胞に特異的なマーカーとしては、アルカリ性フォスファターゼ（ＡＬＰ）、ＳＳＥＡ−３および４、ＴＲＡ−１−６０および８１が認められ、ＮａｎｏｇＯｃｔ−３／４、Ｒｅｘ−１の発現がＲＴ−ＰＣＲによって確認されている。核型（Ｇバンド法による）については、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２は正常２倍体で雌の、ＫｈＥＳ−３は正常２倍体で雄の核型を持つ（京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターのホームページの「ヒトＥＳ細胞の分配について−ヒトＥＳ細胞株ＫｈＥＳ−１、−２、−３−」参照）。【００２３】
本発明においては、必要に応じて、ＥＳ細胞を分化しない条件下に継代、維持、増殖させ（以下、この工程を調製工程という場合がある）、必要に応じてその一部を使用して肝細胞に分化誘導する。【００２４】
調製工程において、ＥＳ細胞の培養を行う容器としては、増殖能の点からフィーダー細胞またはスキャフォールドでコートされたものを使用するのが好ましい。フィーダー細胞としては、γ線で照射処理したマウス胚性繊維芽細胞が挙げられる。また、該スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン（コラーゲンIVやコラーゲンIなど）、エンタクチン、自己組織化能を有するペプチドハイドロゲル、Poly(p-N-vinylbenzyl-D-lactonamide)（PVLA）（ラクトースを側鎖にもつポリスチレン誘導体）などが挙げられる。市販品としてはマトリゲル（Matrigel、ラミニン５６％、コラーゲンＩＶ３１％、エンタクチン８％からなる、ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー製）、グロースファクターリデューストマトリゲル（GFR  Matrigel、ラミニン６１％、コラーゲンＩＶ３０％、エンタクチン７％からなる、ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー製）、ピユラマトリックス（PuraＭatrix、アミノ酸１６残基（Ａｃ‐（ＲＡＤＡ）4‐ＣＯＮＨ2）で長さが約５ｎｍのオリゴペプチドであるペプチドハイドロゲル、（株）スリー  ディー  マトリックス  ジャパン製）、Ｐｏｌｙ（ｐ−Ｎ−ｖｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ−Ｄ−ｌａｃｔｏｎａｍｉｄｅ）（ＰＶＬＡ）（(有)セラジックス製）などが挙げられる。マウス由来のＥＳ細胞の場合、フィーダー細胞でコートした培養容器を使用することが好ましい。また、ヒト由来のＥＳ細胞の場合、本発明の一実施例であるバイオ人工肝臓に使用する際には、異種生物由来の細胞の混入のおそれがあるという理由から、マウス由来のフィーダー細胞でコートした培養容器を使用せず、スキャフォールドでコートされた培養容器を使用することが好ましい。さらに、ヒトＥＳ細胞の培養状態が良好であることから、前記マトリゲル（Matrigel）、グロースファクターリデューストマトリゲル（GFR  Matrigel）、ピュラマトリックス（PuraＭatrix）などを用いることがより好ましい。【００２５】
調製工程における培養液、培養条件としては、通常の方法が採用でき、たとえば、培養液としては、（１）ＥＳ培養液（Ｒ−ＥＳ−１０１、大日本住友製薬株式会社より購入）：ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培養液の混合液（1：1容量比）に１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１％ヌクレオシド、１１０μＭ ２−メルカプトエタノール（大日本住友製薬株式会社より購入）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン、１％グルタミン酸、ならびに５００Ｕ／ｍｌマウス由来白血病抑制因子（ＬＩＦ）（大日本住友製薬株式会社より購入）を補足したもの、（２）霊長類ＥＳ細胞用培地（(株)リプロセル製など）、（３）マウス胚性繊維芽細胞用馴化培地（Ｒ＆Ｄシステム製など）などが挙げられる。培養温度は、３６〜３７℃の範囲が好ましく、ｐＨは７．３〜７．４の範囲が好ましい。マウスＥＳ細胞の調製工程では、一般に分化を抑制するために白血病抑制因子（ＬＩＦ）を使用するが、ヒトＥＳ細胞の調製工程では白血病抑制因子（ＬＩＦ）は分化抑制に効果がなく、マトリゲルなどのスキャフォールドを使用するのが好ましい。また、フィーダー細胞を使用せず、スキャフォールドを使用する培養方法としては、ジェロン社（メロノパーク、カリフォルニア州、米国）が公開している方法（Protocols for the Maintenance of Human Embryonic Stem Cells in Feeder Free Conditions）が好ましい。【００２６】
本発明の方法において、ＥＳ細胞を肝細胞へ分化誘導する培養工程に使用するｄＨＧＦの濃度は、１ｎｇ／ｍｌより高くかつ１０００ｎｇ／ｍｌより低いことが好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌがより好ましく、１００ｎｇ／ｍｌが最も好ましい。ｄＨＧＦの濃度が前記範囲未満の場合、肝細胞への分化が達成されない傾向があり、一方前記範囲を超える場合、軽度の細胞障害性が確認される傾向がある。【００２７】
本発明においては、ＥＳ細胞に直接ｄＨＧＦを加えて分化誘導を行ってもよいが、まずＥＳ細胞から胚様体(Embryoid Body: EB)を形成したのち、ｄＨＧＦを加えて分化誘導を行なうことが好ましい。胚様体の形成方法としては、培養液にて約１０万個／ｍｌに希釈したＥＳ細胞をペトリ皿のフタの内側に液滴状（１滴約３０μｌ）に播種し、液滴がフタの内側にぶら下がったまま下に落ちない状態で２日間程度培養し胚様体を形成させ、その後培養液にて胚様体を洗い落としペトリ皿内で浮遊培養し成熟させるハンギングドロップ法；約５００万個のＥＳ細胞を１０ｃｍペトリ皿内で約１０ｍｌの培養液中で５日間程度浮遊培養させ胚様体を形成する浮遊培養による形成法などがあげられる。簡便性の点からは、浮遊培養による胚様体形成法がより好ましい。【００２８】
本発明においては、一般に胚様体の形成工程で３〜７日程度培養したのち、次の分化誘導工程に移るのが好ましい。【００２９】
胚様体形成工程における培養液、培養条件としては、通常の方法が採用でき、たとえば、培養液としては、（１）ＥＳ分化誘導培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２）〔ＤＭＥＭ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）と栄養素混合物Ｆ−１２（ハム）（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）が１：１容量比の割合で混合され、４．５ｍｇ／ｍｌ濃度のグルコース、２０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）を加え、ＬＩＦを加えないもの］、（２）霊長類ＥＳ細胞用培地（（株）リプロセル製など）、（３）マウス胚性繊維芽細胞用馴化培地（Ｒ＆Ｄシステム製など）などが挙げられる。培養温度は、３６〜３７℃の範囲が好ましく、ｐＨは、７．３〜７．４の範囲が好ましい。【００３０】
本発明において、分化誘導を行なう培養工程には、平面培養と三次元培養のいずれも使用できるが、近年、スキャフォールド（足場）上で細胞を三次元培養することでより生体内環境に近い条件を作ることができ、細胞機能が向上することが知られてきており、肝機能の向上という点から三次元培養が好ましい。【００３１】
三次元培養に使用するスキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、コラーゲンＩなどのコラーゲン、エンタクチン、ペプチドハイドロゲル、Ｐｏｌｙ（ｐ−Ｎ−ｖｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ−Ｄ−ｌａｃｔｏｎａｍｉｄｅ）（ＰＶＬＡ）などが挙げられる。市販品としては、前記マトリゲル（Matrigel）、グロースファクターリデューストマトリゲル（GFR  Matrigel）、ピュラマトリックス（PuraＭatrix）などが挙げられる。さらに、後述する不織布などが使用できる。【００３２】
分化誘導工程における培養液、培養条件としては、通常の方法が採用でき、たとえば、培養液としては、（１）ＥＳ分化誘導培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２）〔ＤＭＥＭ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）と栄養素混合物Ｆ−１２（ハム）（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）が１：１容量比の割合で混合され、４．５ｍｇ／ｍｌ濃度のグルコース、２０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）を加え、ＬＩＦを加えないもの〕、（２）霊長類ＥＳ細胞用培地（(株)リプロセル製など）、（３）マウス胚性繊維芽細胞用馴化培地（Ｒ＆Ｄシステム製など）などが挙げられる。培養温度は３６〜３７℃の範囲が好ましく、ｐＨは７．３〜７．４の範囲が好ましい。培養期間は１４〜２１日程度である。【００３３】
本発明の分化誘導工程では、ｄＨＧＦに加えて様々な有機溶媒、サイトカイン、ホルモンなどの１種または２種以上を併用することができる。そのような有機溶媒、サイトカイン、ホルモンなどは、細胞に悪影響を与えないものであればどのようなものでも使用することができるが、従来から細胞の分化に使用されているものが好ましい。具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ヘキサメチレンビスアセトアミドおよびほかのポリエチレンビスアセトアミドなどの有機溶媒や、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルココルチコイド、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ヘパリン、デキサメタゾン、およびＨＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびＨＢＧＦ−１などのサイトカインやホルモンなどがあげられる。【００３４】
本発明の方法によりＥＳ細胞より分化誘導された肝細胞は、形態学的特徴の観察および逆転写ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認できる。【００３５】
形態学的な確認方法としては、位相差型顕微鏡で観察される複数の核を有する細胞および電子顕微鏡で観察される細胞質内に豊富な顆粒、特にグリコーゲン顆粒の存在といった、肝細胞に特異的な形態学的特徴を確認することが挙げられる。【００３６】
また、ＲＴ−ＰＣＲにより、誘導された肝細胞の形質発現を遺伝子の発現から評価することもできる。アルブミン遺伝子が発現していることと、未分化な遺伝子であるα−フェトプロテインが発現していないことがＲＴ−ＰＣＲなどで確認できれば、分化が誘導されているということができる。また、肝細胞としての成熟度を表わす指標として、上皮細胞のマーカーであるＣＫ１８（サイトケラチン１８）、Ｇ６Ｐ（グルコース６リン酸化酵素）、ＴＡＴ（チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、ＨＮＦ３ｂ（肝細胞核因子３ベータ）の遺伝子発現が認められるのが好ましい。【００３７】
さらには、実際に肝細胞として機能できるか否かは、培地中にアンモニア、リドカイン、ジアゼパムなどを添加して代謝できるか否かが大きな点となる。また、培地中にアルブミン、尿素が産生されていれば、充分に機能的な肝細胞へと分化しているということができる。【００３８】
本発明においては、必要細胞数までＥＳ細胞を増殖させたあと、ｄＨＧＦを用いて肝細胞への分化誘導を行なうことで、遺伝子導入を必要とせず、安全な肝細胞が大量に供給できる。これをバイオ人工肝臓の細胞源とすることで万人が恩恵を受けることができるバイオ人工肝臓の開発が大いに期待できる。【００３９】
よって、本発明のもう１つの態様は、ＥＳ細胞から分化誘導させた肝細胞を含有するバイオ人工肝臓およびその製造方法である。【００４０】
本発明のバイオ人工肝臓を製造する場合、リアクター内に充填する際の細胞の分化の程度が重要であると考えられる。ＥＳ細胞は、胚様体を形成させることにより、不織布などのスキャフォールドへの接着性が増強する。また、不織布などのなどのスキャフォールドに付着した細胞は三次元のスフェロイド形成を呈する。近年、スキャフォールド上で細胞を三次元培養することでより生体内環境に近い条件を作ることができ細胞機能が向上することが知られてきており、不織布などのスキャフォールド上で細胞を培養することが機能の向上に有効である。したがって、胚様体形成後にＥＳ細胞をリアクターに充填し、ｄＨＧＦにて三次元での分化誘導を行なうことにより、平面培養するより、肝細胞に特異的な高度な機能であるアンモニア代謝能などが大幅に増強される。【００４１】
よって、ＥＳ細胞から胚様体形成を促した後にリアクターに細胞を充填し、本発明の誘導法による肝細胞への分化を行なうのが好ましい。【００４２】
バイオ人工肝臓としては、中空糸型のリアクター（デバイス）と分離・培養細胞を組み合わせたバイブリッド型の人工肝臓などが挙げられる。バイオ人工肝臓は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の肝細胞は、いずれの形態のバイオ人工肝臓にも使用可能であるが、ＥＳ細胞は、分化誘導すると増殖能力を失うが、分化が不充分であったＥＳ細胞が遺残した場合、細胞を生体内に移植すると奇形種を発症する可能性があるため、細胞移入などに伴う危険性を回避するという点から体外型であることが好ましい。【００４３】
バイオ人工肝臓の開発においては、リアクターの設計・開発も重要な要素である。バイオリアクターとしては、サーシ  バイオメディカル社（Circe Biomedical Inc.）（レキシントン、マサチューセッツ州、米国）の支援下でシダーズサイナイ医療センター（Cedars-Sinai Medical Center）（ロサンジェルス、カリフォルニア州、米国）のディメトリュー（Demetriou）らを中心としたブタ肝細胞を用いたバイオ人工肝臓治療用のヘパトアシスト（HepatAssist）（Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001; 8: 1-15.）や、ブタ肝細胞を使用したドイツのGerlachらのＭＥＬＳ（モジュラー体外肝臓システム（Modular Extracorporeal Liver System））など、様々なタイプが知られている。これらのリアクターは、もちろん本発明において使用することができるが、肝細胞が付着するための足場が無いため、細胞はただ単に、中空糸内スペースか、中空糸外スペースに充填されるのみで浮遊した状態となる傾向がある。肝細胞は、浮遊状態では、分化機能が充分に発現されない傾向があり、さらに周りの細胞と衝突し、ストレス刺激を受けやすい。【００４４】
したがって、本発明においては、肝細胞に足場が提供できるよう、中空糸と不織布などのスキャフォールドからなるリアクターが好ましい。【００４５】
中空糸膜としては、膜表面に細胞が付着して物質交換が妨げられることがなければどのようなものでも使用することができ、具体的には、従来医療用に用いられている市販の物、たとえば、ポリスルフォン膜、エチレン−酢酸ビニルランダム共重合体けん化物膜（たとえば、商品名：エバール、クラレメディカル株式会社製など）などが好ましい。市販の中空糸膜のポアサイズは、その用途から透析膜（〜５ｎｍ）、血漿成分分離膜（２０〜３０ｎｍ）、血漿分離膜（３０〜２００ｎｍ）などがある。物質の透過性の点からは、血漿分離膜（３０〜２００ｎｍ）が好ましい。拒絶反応の危険性を回避するため、中空糸内を流れる血液中の免疫担当細胞や免疫グロブリンが中空糸外の不織布などのスキャフォールド上に充填した細胞と直接接触することがないよう、３０ｎｍ〜１００ｎｍが最も好ましい。【００４６】
不織布としては、細胞が接着することが出来るように加工・修飾されているものが好ましい。不織布の繊維としては、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）などが挙げられる。なかでも、その加工のしやすさの点から、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）にポリアミノ酸ウレタン（ＰＡＵ）加工を施したものが好ましい。【００４７】
本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、ハウジングまでの過程を図３に示す。裏打５を施した不織布６上に中空糸膜７を置く（図３（ａ））。ここで、裏打ち５を施した不織布６にはスリット８が設けられている。これをロール状に巻く（図３（ｂ））。そのＸ−Ｘ線断面が図３（ｃ）である。これを両端に液漏れ防止部材９を設けた筒状容器１０に組み込む。リアクター１１には細胞注入口１２および細胞のサンプル採取を行なうことができる取り出し口１３が設けられており、スリット８は、細胞注入口１２と連絡するように配置される。【００４８】
また、バイオ人工肝臓治療は、安全かつ科学的に施行するために、１）人工肝臓リアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、２）気泡が発生した際のアラームの作動、３）リアクターの温暖化（３７度）などができる機能を一体化した装置で実施されることが好ましい。【００４９】
このようなバイオ人工肝臓として、中空糸・不織布型リアクターに新鮮分離ブタ肝臓細胞、可逆性不死化ヒト肝細胞を充填し、サル肝不全モデルでの動物実験にて良好な成績を得ている（小林直哉他、「ハイブリッド人工肝臓」、肝胆膵、２００３年、４６巻、ｐ３８１−３９３）。【００５０】
さらに、本発明の方法によりＥＳ細胞から分化誘導された肝細胞、特にヒト肝細胞は、薬剤の代謝試験用細胞として有用である。すなわち、新薬開発や安全性試験、毒性試験などにおける試験用細胞として有用である。【００５１】
肝細胞は様々な薬物代謝の中心となっており、薬物の毒性や安全性を検定するためには、肝細胞に薬物を投与して代謝のされ方を調べることが必要である。そして、物質代謝においては、ヒトと実験動物とでは大きな違いがあるので、最終的なテストはヒト肝細胞を使用した試験が不可欠である。この点において、均一な品質のヒト肝細胞を大量に提供できる本発明は有用である。このような代謝試験に用いる装置としては、前記のバイオ人工肝臓と同様な構造のものなどが使用できる。【００５２】
さらに、本発明の方法によりＥＳ細胞から分化誘導された肝細胞、特にヒト肝細胞は、生理活性物質の産生に使用できる。このような生理活性物質としては、アルブミン、各種血液凝固因子などが挙げられる。このような生理活性物質の製造装置としては、前記のバイオ人工肝臓と同様な構造のものなどが使用できる。【００５３】
以下、本発明をマウスおよびヒト由来のＥＳ細胞を用いた実施例をあげて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
製造例１
ＥＳ細胞の調製
１２９ｖマウス由来のＥＳ細胞（大日本住友製薬株式会社より購入）を、ネオマイシン耐性遺伝子が導入されているフィーダー細胞（マウス由来の胚性繊維芽細胞、大日本住友製薬株式会社より購入）を用いて、０．１％の濃度のゼラチン水（カタログ番号：Ｒ−ＥＳ−００６Ｂ、大日本住友製薬株式会社より購入）でコートしてある培養フラスコＴ−７５（ファルコン社製、ベクトン  デッキンソン  アンド  カンパニー（Becton, Dickinson and Company）販売）を使用して培養した。培養液には、ＥＳ培養液（Ｒ−ＥＳ−１０１：大日本住友製薬株式会社より購入）：ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培養液の混合液（１：１容量比）に１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１％ヌクレオシド、１１０μＭ ２−メルカプトエタノール（大日本住友製薬株式会社より購入）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン、１％グルタミン酸、ならびに５００Ｕ／ｍｌマウス由来白血病抑制因子（ＬＩＦ）（大日本住友製薬株式会社より購入）を補足したものを使用した。培養液は毎日交換し、ＥＳ細胞は、３日毎に継代した。培養プレート中にＥＳ細胞が占める割合が８０〜９０％の状態になったところで、２段階式処置にて、すなわち、まず、０．２５％濃度のトリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション（Invitrogen Corporation）製）を添加し、４５秒間経過後、トリプシン−ＥＤＴＡ液を取り除くことでフィーダー細胞を一緒に除去し（ＥＳ細胞はまだこの段階では培養プレートに残っている）、ついでその２分後にＥＳ培養液を加え剥離することによって、培養プレートに残っているＥＳ細胞を回収した。【００５５】
実施例１
製造例１で得られたＥＳ細胞５００万個を０．１％の濃度のゼラチン水（カタログ番号：Ｒ−ＥＳ−００６Ｂ、大日本住友製薬株式会社より購入）でコートしてある培養フラスコＴ−７５（ファルコン社製、ベクトン  デッキンソン  アンド  カンパニー販売）で、１０ｍｌのＥＳ分化誘導培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２）中に１００ｎｇ／ｍｌ濃度のマウス由来ｄＨＧＦ（第一製薬株式会社（東京）より提供）と、１００ｎｇ／ｍｌ濃度のｂＦＧＦ、１％濃度のＤＭＳＯ（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション（Sigma-Aldrich Coｒｐ.）製）、１０-7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）を添加して肝細胞への分化誘導培養を行なった。【００５６】
ＤＭＥＭ Ｆ１２の組成は、ＤＭＥＭ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）と栄養素混合物Ｆ−１２（ハム）（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）が１：１の割合で、４．５ｍｇ／ｍｌ濃度のグルコース、２０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）でＬＩＦを加えないものである。培養液は、３日毎に交換した。培養開始から１４日後に肝細胞への分化誘導効果の検討を行なったところ、数個の核小体を有する核といった、いわゆる肝細胞の形態学的特徴を有し、アルブミンの発現が見られ、肝細胞への分化が確認された。【００５７】
実施例２
製造例１で得られたマウスＥＳ細胞５００万個を１０ｃｍ滅菌シャーレ（浅型９０×１５ｍｍ、商品番号：ＳＨ９０−１５、旭テクノグラス株式会社製）で１０ｍｌのＥＳ培養液（Ｒ−ＥＳ−１０１）を使用し、５日間浮遊培養させて胚様体を形成した。【００５８】
ついで、ＥＳ細胞の代わりに得られた胚様体を使用した以外は、実施例１と同様にしてマウス肝細胞を誘導した。【００５９】
実施例３
実施例２と同様にして形成した胚様体を、１ｃｍ×１ｃｍ大の細胞接着性を有するポリアミノ酸ウレタン（PAU）加工のＰＴＦＥ（polytetrafluoroethylene）不織布（クラレメディカル株式会社製）を敷いた１２穴培養プレート（正式名：Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  １２−ｗｅｌｌ  Ｆａｌｃｏｎ、ファルコン社製、ベクトン  デッキンソン  アンド  カンパニー販売）に、３×１０6細胞個／ｃｍ2となるように播種し、実施例１と同じＥＳ分化誘導培地ＤＭＥＭ Ｆ１２を用い、１００ｎｇ／ｍｌ濃度のマウス由来ｄＨＧＦ（第一製薬株式会社（東京）より提供）と、１００ｎｇ／ｍｌ濃度のｂＦＧＦ、１％濃度のＤＭＳＯ（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）、１０-7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）を添加して１４日間培養し、マウス肝細胞を誘導した。培養液は３日毎に交換した。【００６０】
得られた細胞の形態は、位相差顕微鏡（オリンパスＣＫ４０、オリンパス株式会社製）を使用して観察した（図１）。また、走査電子顕微鏡により、播種した直後の胚様体の不織布繊維４への付着状況（図２（ａ））および１４日後の分化誘導された肝細胞（図２（ｂ））も観察した。符号１は分化誘導された肝細胞を、符号２は核を、符号３は胚様体を、符号４は不織布の繊維を示す。【００６１】
製造例２
バイオ人工肝臓リアクターの製造
中空糸と不織布とからなる全血還流型システムのバイオ人工肝臓（ＢＡＬ）（図３参照）を以下の手順に従い製造した。中空糸膜の種類により、表１に示すように、それぞれＢＡＬ−１〜ＢＡＬ−３とした。【００６２】
【表１】
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【００６３】
１０ｃｍの中空糸膜５５０本をレーヨンで裏打ちした不織布（１０×１０ｃｍ）の上に規則正しく置き（図３（ａ）参照）、これをロール状に巻き込んだ（図３（ｂ）参照）。断面の模式図を図３（ｃ）に示す。この不織布と中空糸膜からなるロールを、両端に液漏れ防止部材を設けた筒状容器に組み込んだ（図３（ｄ）参照）。【００６４】
なお、不織布としては、細胞接着性を有するポリアミノ酸ウレタン（ＰＡＵ）加工のＰＴＦＥ不織布（クラレメディカル株式会社製）を使用した。【００６５】
得られたリアクターの生体適合性を判定するために、各リアクターをそれぞれ健常ブタの頚部動静脈間に装着して作動させたところ、２４時間循環動態に悪影響なく無事に稼働させることができた。また、赤血球・血小板などの血球成分の減少も認めなかった。【００６６】
また、ＢＡＬ治療を安全かつ科学的に施行するために、１）ＢＡＬリアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、２）気泡が発生した際のアラームの作動、３）リアクターの温暖化（３７度）できる機能を一体化した装置を開発し、システムが良好に作動することをブタ実験にて検証した。【００６７】
実施例４
前記製造例２で得られたバイオ人工肝臓リアクターＢＡＬ−２に、実施例２で得られた胚様体を中空糸外スペースに充填し、１０ｍｌＥＳ細胞分化誘導培地：ＤＭＥＭ Ｆ１２中に１００ｎｇ／ｍｌ濃度のマウス由来ｄＨＧＦ（第一製薬株式会社（東京）より提供）と、１００ｎｇ／ｍｌ濃度の、マウス由来ｂＦＧＦ、１％濃度のＤＭＳＯ（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）、１０-7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ−アルドリッチ  コーポレーション製）を添加して肝細胞への分化誘導培養を行なった。培養液は３日毎に交換し、培養１４日後に分化誘導効果の検討を行なった。【００６８】
試験例１
誘導された肝細胞における遺伝子発現
ＲＴ−ＰＣＲ法により、誘導された肝細胞（実施例２および３）において、肝臓代謝に関わる重要な遺伝子、すなわち、ＣＫ１８（サイトケラチン１８）、Ｇ６Ｐ（グルコース６リン酸化酵素）、ＴＡＴ（チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、アルブミン、ＡＦＰ（アルファフェトタンパク質）およびＨＮＦ３ｂ（肝細胞核因子３ベータ）遺伝子の発現を調べた。内因子性コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現も調べた。ＲＴ−ＰＣＲ法では、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ  ＢＲＬ、インビトロジェン  コーポレーション製）で処理したのちに回収し、ＲＮＡトリゾール（インビトロジェン  コーポレーション製）を用いて製品の取扱説明書にしたがってＲＮＡを抽出した。１μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。【００６９】
得られた２μｇの逆転写産物を、各プライマー２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄキット（パーキン−エルマー／シータス社、ノーウォーク、コネチカット州、米国）を用い、そのプロトコールにしたがってＰＣＲ増幅に用いた。各遺伝子に対するプライマーおよびＰＣＲ条件を以下に記載する。【００７０】
マウスＣＫ１８遺伝子（１８２ｂｐ、５９℃、３５サイクル）
５′プライマー：５′−ＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡ（配列番号１）
３′プライマー：５′−ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧ（配列番号２）
マウスＧ６Ｐ遺伝子（２０６ｂｐ、５７℃、３５サイクル）
５′プライマー：５′−ＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴ（配列番号３）
３′プライマー：５′−ＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧＧＴ（配列番号４）
マウスＴＡＴ遺伝子（２１０ｂｐ、５５℃、３５サイクル）
５′プライマー：５′−ＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＧＡ（配列番号５）
３′プライマー：５′−ＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＧＴＡＧ（配列番号６）
マウスアルブミン遺伝子（１７４ｂｐ、５９℃、３５サイクル）
５′プライマー：５′−ＧＣＴＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＴＧ（配列番号７）
３′プライマー：５′−ＣＡＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴＡＧＴＣ（配列番号８）
マウスＡＦＰ遺伝子（３００ｂｐ、５９℃、３２サイクル）
５′プライマー：５′−ＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＴＡ（配列番号９）
３′プライマー：５′−ＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＡ（配列番号１０）
マウスＨＮＦ３ｂ遺伝子（５００ｂｐ、６０℃、３５サイクル）
５′プライマー：５′−ＴＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＣＧＧ（配列番号１１）
３′プライマー：５′−ＧＣＡＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴ（配列番号１２）
マウスＧＡＰＤＨ遺伝子（４５９ｂｐ、６０℃、３２サイクル）
５′プライマー：５′−ＣＡＧＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣ（配列番号１３）
３′プライマー：５′−ＴＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴ（配列番号１４）【００７１】
結果を図４に示す。レーン１から６は、それぞれサイズマーカー、未分化ＥＳ細胞、フィーダー細胞、分化誘導されたＥＳ細胞（実施例２）、不織布上で分化誘導されたＥＳ細胞（実施例３）およびマウス肝細胞を示す。実施例２および３で誘導された肝細胞では、肝臓細胞に関わる重要な遺伝子、ＣＫ１８（サイトケラチン１８）、Ｇ６Ｐ（グルコース６リン酸化酵素）、ＴＡＴ（チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、アルブミン、およびＨＮＦ３ｂ（肝細胞核因子３ベータ）遺伝子の発現が確認されるが、特に不織布を用いて誘導された肝細胞（実施例３）では、ＣＫ１８（サイトケラチン１８）、Ｇ６Ｐ（グルコース６リン酸化酵素）、ＴＡＴ（チロシンアミノ酸トランスフェラーゼ）、アルブミン遺伝子の発現が増強し、未分化細胞のマーカーであるＡＦＰ（アルファフェトタンパク質）発現の消失が観察された。当該結果は、不織布を使用することで、肝細胞への分化誘導がより効率よく誘導されることを示す。【００７２】
試験例２
肝機能の測定
（Ａ）アンモニアの代謝
実施例２〜４で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その培溶液中に、１．４ミリモルの四塩化アンモニウムを負荷し、４時間後に培養液を１０μｌ採取し、アンモニア濃度を測定した。【００７３】
（Ｂ）ジアゼパムの代謝
実施例２〜４で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その培養液中に、ジアゼパムを最終濃度１μｇ／ｍｌとなるよう負荷し、４時間後に培地を１０００μｌ採取し、ジアゼパム濃度を測定した。【００７４】
（Ｃ）リドカインの代謝
実施例２〜４で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その培養液中に、リドカインを最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるよう負荷し、４時間後に培地を１０００μｌ採取し、リドカイン濃度を測定した。【００７５】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のそれぞれの代謝率を図５に示す。代謝率は、薬物負荷時の該薬物の濃度から４時間後の各薬物濃度を引いたものを薬物負荷時の該薬物の濃度で割った値で表わす。各実施例ともに薬物代謝能が見られるが、不織布における培養、さらにはリアクター内で三次元培養することにより、薬物代謝能が増強されていることがわかる。【００７６】
（Ｄ）尿素の産生
前記（Ａ）と同様に１．４ミリモルの四塩化アンモニウムを負荷し、４時間後に培養液を採取し、尿素の産生量を測定した。実施例２〜４で、それぞれ細胞１００万個当たり２１．４μｇ、２２．２μｇおよび２４．７μｇであった（図６）。【００７７】
（Ｅ）アルブミンの産生
実施例２〜４で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その後２４時間培養したのちの培養液を採取し、マウスアルブミンＥＬＩＳＡキット（商品コード：Ｅ９０−１３４、フナコシ株式会社）を使用してアルブミンの産生量を測定した。アルブミンの産生量は、実施例２〜４で、それぞれ１ｍｌ当たり５００ｎｇ、８５０ｎｇおよび９２０ｎｇであった（図７）。不織布上での培養、さらにはリアクター内での三次元培養によりアルブミン産生能が増強されていることがわかる。【００７８】
参考例
新鮮ブタ肝臓細胞を充填したバイオ人工肝臓の機能評価
施設動物実験取り扱い指針に従い、検疫済みのカニクイザル（日本クレアから購入）を用いて製造例１において作製したバイオ人工肝臓リアクターの安全性と有効性を検討した。【００７９】
製造例１で作製したバイオ人工肝臓リアクターＢＡＬ−１に約１０億個のブタ肝臓細胞（生存率  ＞９０％）を充填した。新鮮分離ブタ肝細胞は、外科的に切除した肝臓外側区域をディスパーゼとコラゲナーゼを用いた４段階還流法にて分離した（丸山昌伸，小林直哉，都津川敏範ら、Organ Biology、Vol.9, No.3. 295-301, 2002）。【００８０】
雄性カニクイザル（４ｋｇ、ｎ＝６）に、０．５ｇ／ｋｇのＤ−ガラクトサミン（シグマ社から購入）を静注して薬剤性肝障害を誘導した。【００８１】
Ｄ−ガラクトサミン投与１８時間後に、全身麻酔下に治療群のサル（ｎ＝２）の左内頚動脈にアトム６Ｆｒのカテーテル（アトムメディカル株式会社、東京、日本）を挿入し、そして左外頚静脈にアトム６Ｆｒのカテーテルを挿入してその間に、ブタ肝臓細胞を充填したバイオ人工肝臓リアクターを接続した。ポンプにPERISTA BIO-MINIPUNP（ATTO、東京、日本）を用い、流量１０ｍｌ/分で６時間、体外循環させた。麻酔は、静脈麻酔として、デュプリバンを使用した（５ｍｌ/時間）。抗血栓療法として、血液がリアクターを通過する直前に、リアクターの中枢側よりヘパリン１０００単位を注入し、以後体外循環中はヘパリンの持続注入（ヘパリン５００単位/時間）により、全身ヘパリン化を行なった。【００８２】
ネガティブ・コントロール群（ｎ＝２）として、細胞を充填していない空リアクターを用いて、同様の試験を行なった。【００８３】
結果は、ネガティブ・コントロール群では、２例のサルはいずれもＤ−ガラクトサミン投与後１週間以内に肝不全で死亡した。剖検では、肝臓の出血壊死、顕著な萎縮、黄疸性の胸・腹水の貯留を認め、組織学的にも肝細胞の広範な壊死を認めた。一方、約１０億個のブタ肝臓細胞を装填した群はいずれも３週間以上生存し、剖検所見でも一切の異常を認めなかった。【００８４】
製造例３
ヒトＥＳ細胞の調製
ヒト由来のＥＳ細胞として、ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医科学研究所から「再生医科学研究所ヒトＥＳ細胞分配規定」に則って分配されたもの）を使用した。本細胞の培養は、ジェロン社が公開している培養方法（Protocols for the Maintenance of Human Embryonic Stem Cell in Feeder Free Conditions、ジェロン社のウェブサイト（http://www.geron.com）に公開されている。）に準じて行った。具体的には、以下のように培養した。【００８５】
培養プレートは、マトリゲル（ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー製）でコートしてある６ウェルプレート（ファルコン社製、ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー販売）を使用し、培養液はＥＳ培養液としてマウス胚性繊維芽細胞用馴化培地（カタログ番号：ＡＲ００５、Ｒ＆Ｄ  システムズ社製）を使用した。培養液は毎日交換し、交換時にはマウス塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１００ｎｇ／ｍｌとなるように、培養液中に添加した。ＥＳ細胞は７日毎に継代した。具体的には、培養プレート中にＥＳ細胞が占める割合が８０〜９０％の状態になったところで、２段階式処置にて、すなわち、まず、コラゲナーゼIV液（２００Ｕ／ｍｌ）（ギブコＲＢＬ／インビトロジェン社製、カタログ番号：１７１０４−０１９）を添加し、３７℃、１０分間経過後に、コラゲナーゼIV液を除去することによってフィーダー細胞を除去した。この段階では、未分化状態のＥＳ細胞はプレートに残っている。ついで、前記６ウェルプレートにＥＳ培養液２ｍｌを添加し、２ｍｌピペットを用いて、培養プレートに残っている未分化状態のＥＳ細胞をスクラッチして剥離した後に、５回ピペッティングし、６ウェルプレートに播種して継代した。【００８６】
実施例５
製造例３で得られた５×１０6個のＫｈＥＳ−１細胞を２ｍｌのＥＳ培養液（製造例３で使用したものと同じ）で希釈したものを、予めＥＳ培養液（製造例３で使用したものと同じ）１ｍｌを加えておいた胚様体形成用培養皿（ＣＯＳＴＡＲ、コーニング  インコーポレイティッド製）の中央に播種した。この胚様体形成用培養皿で５日間培養し、胚様体を形成した後に、１００ｎｇ／ｍｌのヒト由来ｄＨＧＦ（第一製薬株式会社より提供）、１００ｎｇ／ｍｌのヒト由来ｂＦＧＦ、１％のＤＭＳＯおよび１０-7モル濃度のデキサメタゾン（シグマ  アルドリッチ  コーポレーション製）を含むＥＳ培養液（製造例３で使用したものと同じ）で培養して、肝細胞への分化誘導を１４日間行った。培養液は２日毎に交換した。胚様体を形成したヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真を図８に、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された肝細胞の位相差顕微鏡写真を図９に示す。分化誘導された肝細胞２１には肝細胞の特徴である複数の核２２が観察される。【００８７】
実施例６
製造例３で得られたＫｈＥＳ−１細胞を、１ｃｍ×１ｃｍ大の細胞接着性を有するポリアミノ酸ウレタン（ＰＡＵ）加工のＰＴＦＥ不織布（クラレメディカル（株）製）を敷き、ＥＳ培養液（製造例３で使用したものと同じ）を加えた１２穴培養プレート（マルチウェル１２ウェルファルコン、ファルコン社製）に、３×１０6細胞数／ｃｍ2となるように播種した。前記ＥＳ細胞を培養プレートに播種したのち、５日間培養して胚様体を形成した。不織布上に形成された胚様体の走査電子顕微鏡写真を図１０（ａ）に示す。図１０（ａ）においては、不織布の繊維４に付着した胚様体２３が示されている。【００８８】
ついで、１００ｎｇ／ｍｌのヒト由来ｄＨＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのヒト由来ｂＦＧＦ、１％のＤＭＳＯおよび１０-7Ｍのデキサメタゾンを含んだＥＳ培養液（製造例３で使用したものと同じ）を用いて、１４日間培養し、肝細胞への分化誘導を行った。培養液は２日毎に交換した。不織布上で分化誘導された肝細胞の走査電子顕微鏡写真を図１０（ｂ）に示す。図１０（ｂ）においては不織布の繊維４に付着した分化誘導された肝細胞２１が示示されている。【００８９】
試験例３
誘導された肝細胞における遺伝子発現および形態学的変化
実施例５および６に記載の誘導された肝細胞において、ＲＴ−ＰＣＲ法により、肝臓代謝に関わり、肝細胞特異的な遺伝子であるアルブミン遺伝子の発現を調べた。内因性コントロールとしてベータアクチン遺伝子の発現も調べた。ＲＴ−ＰＣＲ法では、マウスの場合の試験例１と同様に行った。すなわち、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡでの処理後、回収し、製品の取り扱い説明書にしたがって、ＲＮＡトリゾールによりＲＮＡを抽出した。１μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応をさせた。【００９０】
得られた２μｇの逆転写物を、２０ｐmol/mlの各プライマーで、アンプリタッグ  ゴールド  キット（ＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ  Ｋｉｄ）（パーキン・エルマー／シータス社製）を用い、そのプロトコールにしたがって、ＰＣＲ増幅に用いた。各遺伝子に対するプライマーおよびＰＣＲ条件を以下に記載する。【００９１】
ヒトアルブミン遺伝子（５７６ｂｐ、５９℃、３５サイクル）
５′プライマー：５′−ＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号１５）
３′プライマー：５′−ＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号１６）
ヒトベータアクチン遺伝子（６１０ｂｐ、６０℃、３２サイクル）
５′プライマー：５′−ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ（配列番号１７）
３′プライマー：５′−ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＧ（配列番号１８）【００９２】
結果を図１１に示す。レーン１〜７は、それぞれサイズマーカー、未分化ヒトＥＳ細胞、胚様体を形成したヒトＥＳ細胞、胚様体を形成させた後に不織布上を使用せずに分化誘導されたヒトＥＳ細胞（実施例５）、胚様体を形成させた後に不織布上で分化誘導されたヒトＥＳ細胞（実施例６）、ヒト肝細胞、そしてサイズマーカーを示す。実施例５および６で誘導された肝細胞においては、肝細胞特異的なマーカー遺伝子であるアルブミンの発現が確認されるが、特に不織布を使用する三次元培養により誘導された肝細胞（実施例６）では、発現が増強していることが確認できる。この結果は、不織布を使用することで肝細胞の分化誘導がより効率よく誘導できることを強く支持している。【００９３】
また、不織布を使用して、誘導されたヒトＥＳ細胞の細胞内では、透過電子顕微鏡により、成熟した肝細胞に特徴的であるグリコーゲン顆粒（図１２）が観察された。図１２において、符号２４、２５、２６は、それぞれ小胞体、ミトコンドリアおよびグリコーゲン顆粒を示す。【００９４】
試験例４
肝機能の測定
（Ａ）アンモニアの代謝
実施例５〜６で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その培溶液中に、１．４ミリモルの四塩化アンモニウムを負荷し、４時間後に培養液を１０μｌ採取し、アンモニア濃度を測定した。実施例５〜６におけるアンモニアの代謝率は、それぞれ７．１％、７．８％であった。【００９５】
（Ｂ）リドカインの代謝
実施例５〜６で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その培養液中に、リドカインを最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるよう負荷し、４時間後に培地を１０００μｌ採取し、リドカイン濃度を測定した。実施例５〜６におけるリドカインの代謝率は、それぞれ１３．４％、２３．２％であった。【００９６】
前記（Ａ）、（Ｂ）のそれぞれの代謝率を図１３に示す。代謝率は、薬物負荷時の該薬物の濃度から４時間後の各薬物濃度を引いたものを薬物負荷時の該薬物の濃度で割った値で表わす。各実施例ともに薬物代謝能が見られるが、不織布上での三次元培養により、薬物代謝能が増強されていることがわかる。【００９７】
（Ｃ）尿素の産生
前記（Ａ）と同様に１．４ミリモルの四塩化アンモニウムを負荷し、４時間後に培養液を採取し、尿素の産生量を測定した。実施例５〜６で、それぞれ細胞１００万個当たり５．４μｇ、６．８μｇであった（図１４）。【００９８】
（Ｄ）アルブミンの産生
実施例５〜６で得られた肝細胞の培養液を分化誘導開始から１４日後に新しいものに交換した。その後２４時間培養したのちの培養液を採取し、albumin ELISA kit ALBUWELL II (Exocell Inc、フィラデルフィア、ペンシルべニア州、米国)を使用してアルブミンの産生量を測定した。アルブミンの産生量は、実施例５〜６で、それぞれ１ｍｌ当たり２８９ｎｇ、３４９ｎｇであった（図１５）。不織布を使用する三次元培養により誘導された肝細胞はアルブミン産生能が増強されていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の分化誘導方法により、健常ヒト肝臓細胞を代替するのに充分機能的であり、大量供給が可能で安全な肝細胞を誘導することができる。また、本発明のバイオ人工肝臓は、体外型とした場合、細胞移入などに伴う危険性を回避し、より安全性の高い治療が実現できる。さらに、本発明においては、大量供給が可能なヒト肝細胞を使用する薬物の検査方法および生理活性物質の産生方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１：マウスＣＫ１８遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号２：マウスＣＫ１８遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号３：マウスＧ６Ｐ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号４：マウスＧ６Ｐ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号５：マウスＴＡＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号６：マウスＴＡＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号７：マウスアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号８：マウスアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号９：マウスＡＦＰ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１０：マウスＡＦＰ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１１：マウスＨＮＦ３ｂ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１２：マウスＨＮＦ３ｂ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１３：マウスＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１４：マウスＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１５：ヒトアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１６：ヒトアルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１７：ヒトベータアクチンを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１８：ヒトベータアクチンを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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