(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリア毒素変異体であるCRM197、DT52E148K、及びGST-DTからなる群から選択される少なくとも一つを有効成分とする抗癌剤であって、治療対象となる癌がEGFR遺伝子異常を有する、及び／又はHB-EGF発現が亢進している肺癌である、抗癌剤。
【請求項２】
CRM197を有効成分とする、請求項１に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Gefitinib感受性及び／又はGefitinib抵抗性肺癌に対する抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
EGFR(epidermal growth factor receptor) は上皮細胞をはじめ種々の細胞の修復、増殖に関わる分子として注目されている。さらに、癌増殖においても、EGFRは肺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌などの上皮系腺癌の中心的役割を果たしている。
【０００３】
GefitinibはEGFRの機能を抑制する低分子化合物で、肺癌を含めた多くの悪性腫瘍に臨床治験が行われており、EGFRの遺伝子異常がある（変異型EGFRを有する）肺癌症例において著明な臨床効果を示すことが報告されている。しかしながら、Gefitinib投与は、肺繊維症を含めて重篤で時に致死性の高い副作用があり、Gefitinibの継続的投与によりEGFRに新たな遺伝子異常が出現しGefitinib抵抗性となることも明らかとなっている。したがって、肺癌患者に対して現存の抗癌剤やGefitinib以外の標的治療薬の開発が切望されている。
【０００４】
一方、CRM197は、HB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害することにより、抗腫瘍作用を有することが知られているが(特許文献１，２)、肺がんに対する有効性は知られていなかった。
【特許文献１】特開2006-232761
【特許文献２】特開2004-155776
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、肺癌に有効な抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本来、遺伝子異常のあるEGFRを有する（変異型EGFRを有する）肺癌では、EGFR / EGFRリガンドが活性化し、EGFR 経路のAutocrine Loopの亢進した状態にある。すなわち、遺伝子異常の存在する（変異型EGFRを有する）肺癌では、EGFRリガンドの発現が亢進していることが推測される。
【０００７】
本発明者は、EGFR遺伝子異常をもつ（変異型EGFRを有する）Gefitinib感受性肺癌細胞株（RERF-LC-A1細胞）およびGefitinibの継続的投与によりGefitinib不応となった症例からクローニングされた抵抗性肺癌細胞株（変異型EGFRを有する）（NCI-H1975細胞）においてHB-EGFの高発現とHB-EGF特異的抑制剤であるCRM197投与による著明な抗腫瘍効果のあることを明らかにした。
【０００８】
本発明は、以下の抗癌剤に関する。
項１．  HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質を有効成分とする抗癌剤であって、治療対象となる癌がGefitinib感受性及び／又はGefitinib抵抗性肺癌である、抗癌剤。
項２．  HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質がCRM197である、項１に記載の抗癌剤。
【発明の効果】
【０００９】
肺癌は、悪性腫瘍の中で最も発生頻度が高く急増している悪性腫瘍のひとつで、5年生存率が10〜30％未満と予後不良の悪性腫瘍である。肺癌患者では、抗癌剤への反応性は30％前後と必ずしも化学療法が有効と言えず、肺癌への新たな治療開発が切望されている。
【００１０】
EGFR機能の抑制を示す低分子化合物Gefitinibは、特に、EGFR遺伝子異常を示す（変異型EGFRを有する）症例に有効であることが明らかとなっている。しかしながら、Gefitinibが有効な症例は、Gefitinibの継続的投与によりGefitinib抵抗性となることや、Gefitinibの投与により致死的な副作用である肺繊維症を誘起する
CRM197は、ヒトに投与可能なHB-EGF特異的抑制剤で、EGFR遺伝子異常を有する肺癌患者だけでなくHB-EGF発現が亢進している肺癌患者に有効な治療薬となることが期待される。CRM197の臨床活用により、既存の抗癌剤や低分子化合物などとの併用療法を含め、大きく肺癌の予後が改善する可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書において、CRM197の番号は、配列番号1のアミノ酸配列においてシグナル配列（1〜25）を除いた26位のアミノ酸（Gly)を1番として番号付けしている。
【００１２】
本発明は、HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質を有効成分として含む、Gefitinib感受性及び／又はGefitinib抵抗性肺癌を治療するための抗癌剤に関する。
【００１３】
前記物質としては、HB-EGFに対する抗体も包含されるが、ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを含むポリペプチドを好ましく例示できる。ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインは、HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害することができる。前記ポリペプチドとしては、ジフテリア毒素自体も包含されるが、ジフテリア毒素の触媒作用ドメインの１又は複数（例えば数個もしくは十数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、該触媒作用の一部もしくは全てが損なわれたポリペプチドが、低毒性のために好ましい。なお、ジフテリア毒素の25個のシグナル配列は付いていても付いていなくてもよい。
【００１４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、前記物質は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの、HB-EGFのEGFレセプターへの結合を阻害する活性を有するポリペプチドを包含する：
（ａ） ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ） （ａ）のポリペプチドのレセプター結合ドメインの１若しくは複数（例えば数個もしくは数十個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）のいずれかのタンパク質を含む複合ポリペプチド。
【００１５】
なお、レセプター結合ドメインは、一般的には378番目からC末端(535番目)までの領域を指すが、C末端側53アミノ酸程度でもレセプター結合能がかなりあるという報告がなされている（J. Biol. Chem. 265, 7331-7337, 1990）。
【００１６】
CRM197、DT52E148Kなどのジフテリア毒素の変異体は、低毒性であるため好ましく、CRM197が特に好ましい。
【００１７】
本発明の物質の毒性レベルとしては、CRM197と同じかそれ以下であることが副作用を排除し、安全性を高める観点から好ましい。
本発明の有効成分のＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性は、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において、レセプター結合ドメインに対応する378番目から535番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有している。
【００１８】
本発明の有効成分となる好ましい物質としては、(i)ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを保持しつつ触媒作用ドメインに変異（一部又は全部の置換、欠失、挿入または付加）を持たせたジフテリア毒素変異体が挙げられる。このような変異体の具体例としては、CRM197、DT52E148K及びGST-DTが挙げられる。これらはジフテリア毒素の毒性を実質的に持たず、HB-EGFのEGFレセプターへの結合を阻害する。CRM197は、25個のシグナル配列を除いてカウントした場合の52番目のGlyがGluに変異した変異体であり、DT52E148Kは、前記変異に加えてシグナル配列を除いてカウントした場合の148番目のGluがLysに変異した変異体である。また、GST-DTはGSTにジフテリア毒素のシグナル配列を除いてカウントした場合の378番目から535番目を含む蛋白質である。CRM197のアミノ酸配列（最初の25個の配列がシグナル配列を表す）を配列番号1に、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号2に表す。
【００１９】
ここで、CRM197については、ジフテリア毒素の毒性を有さない、即ちADPリボシル化活性を有さないとの報告が既になされている（T. Uchida and A.M. Pappenheimer Jr. (1972) Science 175, 901-903）。また、148Eに変異を有する148K変異体が極めて弱い活性しか持たないことは知られており(J.T.Barbieri and R.J. Collier (1987) Infect. Immun. 55, 1647-1651)、52E変異体であるCRM197にさらに148Kの変異を入れたダブルミュータントであるDT52E148Kは、さらに安全な変異体として好ましい。
【００２０】
レセプター結合ドメインを含む断片は、プラスミドに組み込まれたCRM197をコードする遺伝子(Pβ197)を鋳型にして、PCR法にてレセプター結合ドメイン部分のDNA配列を合成して、これをGST融合タンパク質やヒスチジンタグを合成させるための発現ベクター（pGEX-3X、pQE-30）のマルチクローニングサイトに挿入し、得られたプラスミドを大腸菌に組み込み、プラスミドがコードする遺伝子を大腸菌で合成させることで作成できる。
【００２１】
また、触媒作用ドメインに変異を有する変異体は、以下のようにして作成することができる。プラスミドに組み込まれたCRM197をコードする遺伝子(Pβ197)を鋳型にして、変異を持たせたい部位をプライマーとして、PCR法にてCRM197領域を合成する。プライマーは、変異を持つように点突然変異を導入したものを合成し、使用する。合成したDNAを、大腸菌用の遺伝子発現ベクター（pET-22b）に組み込み、大腸菌に形質導入を行い、変異体を大腸菌で発現させて、作成することができる。
【００２２】
本発明の治療剤は、Gefitinib感受性及び／又はGefitinib抵抗性肺癌の治療に有効である。
【００２３】
本発明の治療薬は、EGFファミリーの増殖因子の中でもとりわけHB-EGFの発現が亢進している肺癌の治療に有効である。例えば、図１に示されるようにGefitinib感受性及び／又はGefitinib抵抗性肺癌は、HB-EGFの発現レベルがTGFa、amphiregulin(AR)、epiregulin(ER)と比べて５−２００倍程度亢進しているが、このような癌において本発明の治療剤は極めて有効である。
【００２４】
本発明の抗癌剤は、上記有効成分をそのまま、または、薬学的に許容される医薬用担体と組合せて製剤化することができる。
【００２５】
前記治療薬は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することができる。
【００２６】
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、剤形はこれらに限定されることはない。
【００２７】
前記治療薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
【００２８】
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００２９】
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
【００３０】
前記本発明の治療薬に含まれる有効成分の量は、治療薬の製剤形態または投与経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約０．０００１％から７０％の範囲から適宜選択して決定することができる。
【００３１】
本発明の治療薬は、ヒトを含む哺乳動物、特にヒトに投与することができる。
【００３２】
本発明の治療薬の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、成人一日あたりの有効成分の量として、体重１ｋｇあたり１μgから５０ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、１週間に１度ずつ６−８週にわたって投与してもよいし、又は一日おきに２−３週間にわたって投与してもよいし、又は１０日から１４日間毎日投与してもよい。
本願の抗癌剤と併用可能な制癌剤としては、タキソール、タキソテール、５−ＦＵ、シスプラチン、カルボプラチン、アドリアマイシン、カンプトテンシンなどが例示される。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
(実施例1)
EGFRリガンドの発現量
ヒト肺癌細胞株であるRERF-LC-A1細胞（Gefitinib感受性）とNCI-H1975細胞（Gefitinib抵抗性）について、EGFRリガンドであるHB-EGF、amphiregulin、TGFα、EGF、epiregulin、β cellulin、epigenの発現量を測定した。結果を図1に示す。
【００３４】
図1の結果から、遺伝子異常のあるEGFRを有する（変異型EGFRを有する）肺癌細胞株では、HB-EGFが亢進していることが明らかになった。
【００３５】
(実施例2)
材料
・細胞株：ヒト肺癌細胞株RERF-LC-A1細胞（Gefitinib感受性）
ヒト肺癌細胞株NCI-H1975細胞（Gefitinib抵抗性）
・CRM197：微生物病財団作製
・抗腫瘍効果評価法：腫瘍量の測定（縦X横X横÷２）を毎週測定する
・TUNEL法：MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct（MBL code no.8445）
【００３６】
抗腫瘍効果の測定方法
1)  細胞を10％ウシ胎じ血清を含むRPMI-1640にて培養する。
2)  Subconfluentの状態で細胞をトリプシンではがし、10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640で洗い回収する。
3)  血清を含まないRPMI-1640培養液で2X107個/mlに調整して4週令のヌードマウスの皮下に250 ml(5X106個)を注射し、100 mm3(縦X横X横÷2)以上の腫瘍量を示すまで経過観察する。
4)  腫瘍量が、100 mm3(縦X横X横÷2)以上を示した時点から連日10日間（計10回）にわたりCRM197(50 mg/kg)をヌードマウスの腹腔内に投与し、腫瘍量を毎週測定する。
5)  腫瘍量の測定は、CRM197投与群(n=6)および非投与群(n=6)について10週間観察する。
【００３７】
結果を図3A（RERF-LC-A1細胞（Gefitinib感受性）に対する効果）と図3B（NCI-H1975細胞（Gefitinib抵抗性）に対する効果）に示す。
図3A、図3B の結果から、CRM197はGefitinib感受性とGefitinib抵抗性のいずれの肺癌に対しても有効であり、特にGefitinib感受性の肺癌に対しては、著効を示した。
【００３８】
アポトーシス細胞数の測定方法
１．細胞のGefitinibあるいはCRM197処理
(i)  細胞は10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640にて培養する。
(ii)  細胞をトリプシンではがし、10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640で洗った後、10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640で30分間培養する。
(iii)  1 mg/mlウシ胎児血清アルブミンを含むRPMI-1640（胎児血清を含まない）培養液で洗った後、1 mg/mlウシ胎児血清アルブミンを含むRPMI-1640（胎児血清を含まない）で30分間培養する。
(iv)  ポリリジンコートした6 cm培養皿に細胞を1×106個撒き、1 mg/mlウシ胎児血清アルブミンを含むRPMI-1640（胎児血清を含まない）培養液量を6 mlにする。
(v)  30分間培養後、細胞が培養皿に接着したことを確認し、10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640に培養液を交換し、同時にGefitinib(10 nM、100 nM、1 iM)あるいはCRM197(1〜10 μg/ml)添加し、72時間培養する。
【００３９】
なお、図2A,2Bで、Gefitinibの濃度は10 nM、100 nM、1 Mであり、図2CのCRM197の濃度は1mg/mlである。
【００４０】
２．細胞の固定
(i)  細胞をトリプシンではがし、10％ウシ胎じ血清を含むRPMI-1640で洗う。
(ii)  0.2%ウシ胎児血清アルブミンを含むPBSで2回洗う。
(iii)  4%緩衝パラホルムアルデヒドで4℃にて30分間静置する。
(iv)  0.2%ウシ胎児血清アルブミンを含むPBS で2回洗う。
【００４１】
３．細胞の浸透性の亢進
(i)  細胞沈渣に対し、精製水で70%に希釈したエタノール溶液1mlを加え、十分撹拌した後、−20℃で30分間静置する。
(ii)  0.2%ウシ胎児血清アルブミンを含むPBSで2回洗う。
【００４２】
４．DNA Nick End Labelimg
(i)  細胞沈渣に対し、TdT反応液（＊）を30μl加え、十分撹拌後、37℃で1時間反応させる。  
(ii)  0.2%ウシ胎児血清アルブミンを含むPBSで2回洗う。
(iii)  細胞沈渣を1mlの0.2%ウシ胎児血清アルブミンを含むPBSで懸濁させ、フローサイトメトリーで測定する。結果を図2A、2B、2Cに各々示す。 
（＊）TdT反応液
1．陰性コントロールとしてキット内のTdT buffer II、FITC-dUTPを19：1（28.5μl：1.5μl）の割合で混合する。
2．その他のサンプルはTdT buffer II、FITC-dUTP、TdTを18：1：1（27μl：1.5μl：1.5μl）で混合する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】肺癌細胞株におけるEGFR ligandsの発現レベル。
【図２Ａ】ヒト肺癌細胞株(RERF-LC-A1)(EGFR single mutation）に対するGefitinibの効果。Gefitinib添加（濃度別）によるApoptosis（TUNEL法）をFACSで解析（72hr. incubation）。
【図２Ｂ】ヒト肺癌細胞株(NCI-H1975)(EGFR double mutation）に対するGefitinibの効果。Gefitinib添加（濃度別）によるApoptosis（TUNEL法）をFACSで解析（72hr. incubation）。
【図２Ｃ】上段:ヒト肺癌細胞株（RERF-LC-A1；NCI-H1975）におけるCRM197添加によるApoptosis（TUNEL法）をFACSで解析（72hr. incubation）。下段：ヒト肺癌細胞株（NCI-H1975）におけるCRM197添加によるApoptosis（TUNEL法）をFACSで解析（72hr. incubation）。
【図３Ａ】ヒト肺癌細胞株におけるXenograft model でのCRM197の抗腫瘍効果
【図３Ｂ】ヒト肺癌細胞株におけるXenograft model でのCRM197の抗腫瘍効果
【図１】
0005110980.tif 000002
【図２Ａ】
0005110980.tif 000003
【図２Ｂ】
0005110980.tif 000004
【図２Ｃ】
0005110980.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005110980.tif 000007
【配列表】
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