(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子を含む電解質溶液に、目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖の核酸プローブを表面に固定化した金電極を挿入し、銅イオンを添加した後に前記金電極を作用極とした銅イオンの電析を行い、前記核酸プローブと目的遺伝子のハイブリダイゼーションによる前記電析現象の変化を確認することによって、目的遺伝子を検出することを特徴とする、遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記電析現象として、前記金電極における銅イオンのアンダーポテンシャル析出電位のカソード側へのシフトを確認することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
前記電析現象として、前記金電極における銅イオンの定電位電析をアンダーポテンシャル析出電位近傍で行い、銅の析出量の減少を確認することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
金電極として、（１１１）面を有する金電極を使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記１本鎖の核酸プローブとしてＳＨ基を有する核酸プローブを使用し、ＳＨ基と金電極の共有結合により核酸プローブを表面に固定した金電極を使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
前記電解質溶液に添加する銅イオンとして、水溶性の銅塩を使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に検出するための遺伝子検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを基板上に固定し、このものと目的遺伝子のハイブリダイゼーションを何らかの方法によって確認する技術は、今日、検体中の遺伝子検出のための重要基礎技術となっている。
例えば、ＤＮＡチップにおいては、シリコンやガラスなどの基板上に多種類の核酸プローブをスポットとして固定整列させており、試料中の遺伝子と核酸プローブの塩基配列が相補的な場合にハイブリダイゼーションが起こることを利用して多種類の遺伝子の存在確認を同時に行うことができる。ＤＮＡチップを用いた遺伝子の発現、機能の体系的・網羅的解析により、疾患を起こす仕組みが分子レベルで詳細に解明されること、疾患を起こす原因を標的分子とした画期的な新規診断法や治療法、治療薬が開発されること、疾患を起こす仕組み、かかりやすさの個人的な差異を配慮した予防・治療のオーダーメード化とそのための診断技術が確立されること、などが期待されている。
【０００３】
基板上に固定された核酸プローブと目的遺伝子のハイブリダイゼーションを検出するための既存技術としては、蛍光標識法、酵素標識法、インターカレータを用いた電気化学検出法が主要なものである。
蛍光標識法では、まず、試料中の遺伝子に蛍光色素を導入する操作を行い、蛍光標識した遺伝子が核酸プローブとハイブリダイズしたことを蛍光測定により検知する。蛍光標識法は最も汎用されている方法であるが、試料遺伝子中に蛍光色素を導入する操作が煩雑かつ複雑なため、遺伝子検出までに２〜３日程度の長時間を要するという欠点を有している。また、蛍光検出を測定原理としているために装置が大型で高価になることを免れない。
【０００４】
酵素標識法は、試料中の遺伝子に酵素を導入する手法で、酵素標識をした遺伝子が核酸プローブとハイブリダイズすることで、核酸プローブスポット上で酵素反応が行われることを利用する。酵素反応生成物を電気化学法などで検出することにより、装置の簡易化、小型化は可能になるが、標識のための操作が煩雑かつ複雑で、遺伝子検出までに長時間を要することは蛍光標識法と同様である。
【０００５】
近年、インターカレータを用いる電気化学検出法が考案された（例えば特許文献１、非特許文献１参照）。インターカレータとは、二本鎖核酸に特異的に結合する有機物、金属錯体などからなる物質の総称であり、ハイブリダイゼーション検出の目的には、電気化学活性を持ったインターカレータが用いられる。核酸プローブと遺伝子がハイブリダイズした場合には、試料溶液中に添加したインターカレータが核酸プローブと遺伝子から形成された二本鎖に取り込まれるので、取り込まれたインターカレータの酸化還元電流を核酸プローブスポットにおいて測定することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【特許文献１】特許第2573433号公報
【非特許文献１】N. Komatsu, T. Nojima, S. Takenaka, “Analysis of Electrochemical Reaction of Ferrocenylnaphthalene Diimide Captured by Double-Stranded DNA during the Electrochemical Detection of DNA Hybridization”, Electrochemistry, 74巻、2006年、65-67．
【０００６】
この検出法は、試料中の遺伝子を前もって蛍光色素や酵素で標識するような化学修飾の操作が不要なため簡便であり、遺伝子検出に要する時間を１時間程度にまで短縮することができる。また、電気化学法を検出原理とするために、装置の簡易化、小型化も可能である。ただし、試料溶液中に二本鎖核酸に取り込まれていないインターカレータが共存していると測定誤差の原因となるので、これを洗浄等により取り除く操作が不可欠であるという問題点を有する。
また、インターカレータは、二本鎖核酸に結合するだけでなく、基板上へ非特異的物理吸着を起こして感度の低下を招くことが知られており、従って、非特異的物理吸着を防ぐための基板の化学処理も必要となる。さらに、インターカレータには、二本鎖核酸に結合するというその性質ゆえに、変異原性を持つなど人体に有害なものが多く、インターカレータの安易な使用には問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その課題は、インターカレータを用いた電気化学法よりもさらに簡便で安全性に優れると共に、目的とする遺伝子と核酸ブローブのハイブリダイゼーションを短時間で検出することの出来る電気化学的な遺伝子の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、インターカレータを使わずに、電気化学的な測定によりハイブリダーゼーションを検出することが可能な方法について種々研究を重ねた結果、核酸プローブをその表面上に固定化した金電極を用いて銅イオンの電析を行った場合、ハイブリダイゼーションの前後で電析の様相が変化することを見出し、この現象を利用して本発明の遺伝子の検出方法を完成するに至った。
より具体的には、本発明は、金電極表面における銅イオンのアンダーポテンシャル析出現象を利用している。金電極上へ銅を電析する際、特定の条件下では、バルクの銅の電析に先立って、銅の平衡電極電位よりもアノード側の電位で銅原子の析出が始まることが知られている。これがアンダーポテンシャル析出であり、金結晶の（１１１）面へ銅原子が１層程度析出することに起因している（例えば非特許文献２参照）。
【非特許文献２】日本化学会編、「第５版  実験化学講座２４  表面・界面」、丸善株式会社、2007年1月30日発行、第393-402頁
【０００９】
本発明者らは、核酸プローブを固定化した金電極においてアンダーポテンシャル析出が起こることを見出した。一例として、後述する実施例１においては、アンダーポテンシャル析出電位は、およそ０．１８Ｖ（銀−塩化銀電極を基準とする値、以下同じ）であった。一方、同じく実施例１で後述するように、核酸プローブを固定化した後、目的DNAとのハイブリダイゼーションを行った金電極に関しては、アンダーポテンシャル析出電位はほぼ０．０Ｖであり、銅の平衡電極電位近くまで大きくカソード側にシフトしていた。ハイブリダイゼーションによるこのアンダーポテンシャル析出電位のカソードシフトを利用することにより、試料中における特定遺伝子の存在を検出することが可能となる。
【００１０】
すなわち、本発明では下記の構成１〜６を採用する。
１．目的遺伝子を含む電解質溶液に、目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖の核酸プローブを表面に固定化した金電極を挿入し、銅イオンを添加した後に前記金電極を作用極とした銅イオンの電析を行い、前記核酸プローブと目的遺伝子のハイブリダイゼーションによる前記電析現象の変化を確認することによって、目的遺伝子を検出することを特徴とする、遺伝子の検出方法。
２．前記電析現象として、前記金電極における銅イオンのアンダーポテンシャル析出電位のカソード側へのシフトを確認することを特徴とする、１に記載の遺伝子の検出方法。
３．前記電析現象として、前記金電極における銅イオンの定電位電析をアンダーポテンシャル析出電位近傍で行い、銅の析出量の減少を確認することを特徴とする、１に記載の遺伝子の検出方法。
４．金電極として、（１１１）面を有する金電極を使用することを特徴とする、１〜３のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
５．前記１本鎖の核酸プローブとしてＳＨ基を有する核酸プローブを使用し、ＳＨ基と金電極の共有結合により核酸プローブを表面に固定した金電極を使用することを特徴とする、１〜４のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
６．前記電解質溶液に添加する銅イオンとして、水溶性の銅塩を使用することを特徴とする、１〜５のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、試料中の遺伝子に蛍光色素や酵素などによる化学修飾を行う必要がないことなどから検出操作が簡便であり、ハイブリダイゼーションの検出を短時間で行うことができる。また、インターカレータを用いる必要がないため、検出操作の簡便性および安全性が向上する。さらに、本発明は電気化学法を検出原理としているために、簡易、小型な装置によってハイブリダイゼーションの検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明によるハイブリダイゼーションの検出方法では、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを金電極表面上に固定化する。本発明において利用される金電極はとくに形状、製法などが限定されるものではなく、金単結晶、金多結晶や蒸着法、スパッタリング法、無電解メッキ、等で基板上に作製した金薄膜などが用いられる。金単結晶の（１１１）面においてのみ銅イオンのアンダーポテンシャル析出が起こるため、金単結晶の場合は、（１１１）面だけを電解質溶液に接触させて作用極として使用する。電極として好適な形状、平滑さを有する金（１１１）面は、例えば、金線の先端を水素−酸素炎で融解後固化して球形の単結晶とし、そのものから（１１１）面を切り出す方法によって作製することができる（例えば非特許文献３参照）。
【非特許文献３】電気化学会測定法小委員会、「電気化学−そこを知りたい、議論したい」、Electrochemistry、70巻、2002年、51-58.
【００１３】
金多結晶やスパッタリング法、無電解メッキ、等で基板上に作製した金薄膜については、表面をアニール・クエンチ処理した後に、電極として使用する。アニール・クエンチ処理によって金多結晶ないしは金薄膜の表面の大部分を（１１１）面の構造とすることができる（例えば非特許文献４参照）。
核酸プローブとしては、生体試料から抽出した遺伝子および化学合成したＤＮＡのいずれもが用いられる。核酸プローブは、共有結合、イオン結合、物理吸着、等によって金電極表面に固定化できるが、好ましくは、あらかじめ核酸プローブにチオール基（SH基）を導入しておき、金と強固な共有結合を形成させる。
【非特許文献４】日本化学会編、「第５版  実験化学講座２４  表面・界面」、丸善株式会社、2007年1月30日発行、第283-301頁
【００１４】
上記で得られた核酸プローブを固定化した金電極を、検出すべき目的遺伝子を含む適当な電解質溶液に挿入することにより、核酸プローブと相補的な塩基配列を有する遺伝子の間でハイブリダイゼーションが起こり、二本鎖核酸が形成される。次に、この検体溶液に銅イオンを添加する。銅イオンの添加は、検体溶液に、水溶性の銅塩を溶解することにより行われる。この際使用される銅塩の化学形はとくに制約されるものではないが、銅イオン以外に容易に酸化または還元されるイオンを含まないものが好ましく、例えば、硫酸銅(II)、硝酸銅(II)、過塩素酸銅(II)、酢酸銅(II)などが使用される。
さらに、この電解質溶液に対極、参照極を挿入した上で、上記金電極を作用極として銅イオンのアンダーポテンシャル析出電位を測定する（ＵＰＤ電位Ａ）。アンダーポテンシャル析出電位の測定には、サイクリックボルタンメトリー、ディファレンシャルパルスボルタンメトリーなどの汎用される電気化学測定法を用いることができる。
【００１５】
一方、比較のためにハイブリダイゼーションが起きていない場合の電析電位を測定する。すなわち、上記で得られた核酸プローブを固定化した金電極を、検出すべき目的遺伝子が含まれていない電解質溶液に挿入した後、銅イオンを添加する。さらに、この電解質溶液に対極、参照極を挿入した上で、上記金電極を作用極として銅イオンのアンダーポテンシャル析出電位を測定する（ＵＰＤ電位Ｂ）。
この際に用いる電解質溶液の組成、添加する銅イオンの濃度、および使用する対極、参照極の種類は、ＵＰＤ電位Ａの測定時と同一とする。以上のようにして測定されたＵＰＤ電位Ａが、ＵＰＤ電位Ｂに比べて大きくカソード側にシフトすることから、核酸プローブと目的遺伝子のハイブリダイゼーションが起きていることを確認することができる。
【００１６】
また、定電位電析による銅の電析量によってハイブリダイゼーションを確認する方法においては、上記のＵＰＤ電位Ｂの近傍に電極電位を固定した定電位電解で上記の核酸プローブを固定化した金電極上に金属銅を析出させる。この際、金属銅の析出量が、電解質溶液に目的遺伝子が含まれている場合には、電解質溶液に目的遺伝子が含まれていない場合と比べて著しく小さくなることから、核酸プローブと目的遺伝子のハイブリダイゼーションが起きていることを検出することができる。
【００１７】
核酸プローブを固定化した金電極上への金属銅の析出量は、電気化学ストリッピング法、表面プラズモン共鳴（SPR）法、水晶振動子マイクロバランス（QCM）法などで測定することができる。好ましい方法としては、上記の定電位電解と全く同一の装置構成で測定が行えることから、電気化学ストリッピング法が用いられる。
すなわち、電極電位を、定電位電析を行った電位からアノード側の電位にシフトすることにより、いったん電析した金属銅を再溶解させる。この際に流れる電気量の測定によって、上記の金属銅の析出量を求める（例えば非特許文献５参照）。
【非特許文献５】藤島  昭、相澤益男、井上  徹  著、「電気化学測定法」、技報堂出版、1984年、第206-208頁
【００１８】
本発明においては、使用する核酸プローブを変えることにより、種々の遺伝子の検出を行うことができる。使用することができる核酸プローブの例として、遺伝病の原因遺伝子、病原性微生物の遺伝子、またはウイルスのそれぞれの全体もしくは一部の塩基配列に相補的な配列を有するプローブを挙げることができる。
核酸プローブとして遺伝病の原因遺伝子の全体もしくは一部の塩基配列に相補的な配列を有するプローブを用いた場合には、遺伝病の判定が可能になる。このような遺伝病の原因遺伝子としては、例えば、ヘモクロマトーシス、ミトコンドリア心筋症の原因遺伝子を挙げることができる。
【００１９】
病原性微生物の遺伝子の全体もしくは一部の塩基配列に相補的な配列を有するプローブを用いた場合には、微生物による感染症の診断が可能になる。例えば、人体に感染して感染症を引き起こすこのような微生物としてサルモネラ、腸管出血性大腸菌、クラミジアを挙げることができる。
ウイルスの全体もしくは一部の塩基配列に相補的な配列を有するプローブを用いた場合には、ウイルスによる感染症の診断が可能になる。例えば、人体に感染して感染症を引き起こすこのようなウイルスとしてヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスを挙げることができる。
本発明において用いられる核酸プローブの長さは特に限定されるものではなく、数merないし数百merの一本鎖核酸を用いることができるが、精度の高い検出結果を得るためには、数merないし数十merの長さのものを用いることが好ましい。
【実施例】
【００２０】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
（実施例１：銅の電析電位の測定によるハイブリダイゼーションの検出；金電極として金単結晶を用いた場合）
(1)金電極への核酸プローブの固定
金電極は、非特許文献３に記載の方法により、以下のように作製した。すなわち、直径0.8mmの金線の先端を水素−酸素炎で溶融後固化し、金線の先端に直径2mmの球形の金単結晶を設けた。この球状部分を半球状に研磨・加工し、半球の平面状の断面部分に金（１１１）面が露出するよう調製した。このようにして調製した金（１１１）面の面積は3.1mm2であった。電気化学測定の際にはこの金電極の金線部分を利用して電解質溶液表面につり下げ、ハンギング・メニスカス法により、金（１１１）面のみを電解質溶液と接触させることにより、金（１１１）面のみが作用極として作動するようにした（ハンギング・メニスカス法については、例えば、非特許文献２および３参照）。
【００２１】
核酸プローブとしては、核酸残基17からなり、5’末端にSH基を有する構造式5' HS（CH2）6-GACTTTAAGCAAGAAAC 3'の合成核酸（配列番号1）を用いた。核酸プローブ140μgを50mM NaClO4に溶解して全量を50 mlとし、核酸プローブ濃度5μMの溶液とした。上記の金電極を上記核酸プローブ溶液に５分間浸漬して核酸プローブを金電極上に固定した。金電極を核酸プローブ溶液から取り出し、充分水洗の後、乾燥した。この場合、核酸プローブは金電極上にAu-S結合を介して結合されること、すなわちAu-5'  S（CH2）6-GACTTTAAGCAAGAAAC 3'の形（配列番号2）で固定化されることが既知である。電気化学的還元脱離法によって、金電極への核酸プローブの固定化密度を見積もったところ、2.3μg/cm2、すなわち4.2×10-10 mol/cm2であった。
【００２２】
(2)核酸プローブと目的DNAのハイブリダイゼーション
目的DNAは、上記核酸プローブと相補的な塩基配列を有する5' GTTTCTTGCTTAAAGTC 3’（配列番号3）である。まず、検体溶液として目的DNAを4×SSC(0.6M NaCl, 0.06M クエン酸ナトリウム) 緩衝溶液に溶解して濃度50μM(258μg/ml)の溶液とした。目的DNAを含んだこの溶液に(1)で作製した核酸プローブを固定化した金電極を60分浸漬することにより、ハイブリダイゼーションを行わせたのち、金電極を溶液から取り出して水洗、続いて乾燥させた。
【００２３】
(3)核酸プローブを固定した金電極に関する電流−電位曲線の測定
(1)で作製した核酸プローブを固定した金電極の（１１１）面を作用極として、サイクリックボルタンメトリー法によって電流−電位曲線を測定した。電解液として1mM Cu(ClO4)2を含有する0.1M NaClO4を用い、対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極(飽和KCl)をあらかじめ電解液に挿入しておく。ここにさらに上記金電極の（１１１）面を電解液に接触させて、１分間静置後、20 mV毎秒の電位走査速度で電流−電位曲線を測定した。この際得られた電流−電位曲線を図１中の曲線１として示した。曲線１より、電極電位0.18V（上記UPD電位B）に銅イオンのUPD析出に対応するカソードピークが現われることが分かる。
【００２４】
(4)核酸プローブを固定化した後、目的DNAとのハイブリダイゼーションを行った金電極に関する電流−電位曲線の測定
(2)で作製した、核酸プローブを固定し、かつハイブリダイゼーションを行った金電極の（１１１）面を作用極として、サイクリックボルタンメトリー法によって電流−電位曲線を測定した。電解液として1mM Cu(ClO4)2を含有する0.1M NaClO4を用い、対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極をあらかじめ電解液に挿入しておく。当該電解液にさらに上記金電極の（１１１）面を接触させて、１分間静置後、20 mV毎秒の電位走査速度で電流−電位曲線を測定した。この際得られた電流−電位曲線を図１中の曲線２として示した。曲線２より、電極電位0.0 V（上記UPD電位A）に銅イオンのUPD析出に対応するカソードピークが現われることが分かる。UPD電位Aが(3)のUPD電位Bに比べ大きくカソード側にシフトしていることから、ハイブリダイゼーションが起きていることが確認される。
【００２５】
（実施例２：電気化学ストリッピング法を用いた銅の析出量測定によるハイブリダイゼーションの検出：金電極として金単結晶を用いた場合）
(1)核酸プローブを固定した金電極における銅のストリッピング電気量の測定
実施例１(1)で作製した核酸プローブを固定した金電極の（１１１）面を、1mM Cu(ClO4)2を含有する0.1M NaClO4溶液に接触させ、さらに当該溶液に対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極を挿入して３電極配置とする。まず、金電極を作用極として、0.12 Vに１分間保持し、金電極上に銅イオンを定電位電析させた。この保持電位は、UPD電位Ｂよりややカソード側の電位を選択した。その後、20mV毎秒の速度で、電位をアノード側に掃引すると銅の再溶解によるストリッピング電流が観測された。この際得られたストリッピング電流−電位曲線を図２で示した。図２の斜線部分の面積が銅のストリッピングの電気量を与え、その値は4.0×10-4 C/cm2 であった。この電気量から2.1×10-9 mol/cm2の銅が析出していたことが分かる。
【００２６】
(2)核酸プローブを固定化した後、目的DNAとのハイブリダイゼーションを行った金電極に関する銅のストリッピング電気量の測定
実施例１(2)で作製した核酸プローブを固定し、かつハイブリダイゼーションを行った金電極の（１１１）面を、1mM Cu(ClO4)2を含有する0.1M NaClO4溶液に接触させ、さらに当該溶液に対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極を挿入して３電極配置とする。まず、金電極を作用極として、0.12 Vに１分間保持し、金電極上に銅イオンを定電位電析させた。この保持電位は、電析電位Ｂよりややカソード側の電位を選択した。その後、20mV毎秒の速度で、電位をアノード側に掃引すると銅の再溶解によるストリッピング電流が観測された。この際得られたストリッピング電流−電位曲線を図３で示した。図３の斜線部分の面積が銅のストリッピングの電気量を与え、その値は、0.50×10-4 C/cm2であった。この電気量から0.26×10-9 mol/cm2の銅が析出していたことが分かり、銅の析出量が(1)の測定に比べてはるかに小さくなっていることから、ハイブリダイゼーションが起きていることが確認される。この際、核酸プローブを固定化した金電極への銅の析出量が２分の１以下になることを、ハイブリダイゼーション確認の目安とすることができる。
【００２７】
（実施例３：銅の電析電位の測定によるハイブリダイゼーションの検出；金電極として金線を用いた場合）
(1)金電極への核酸プローブの固定
金電極は、直径0.8mmの金線を以下のように加工して作製した。すなわち、当該金線を切断し、その端面をアルミナバブにより鏡面研磨した。ついで、鏡面仕上げした金線の端面を水素−酸素炎でアニール処理し、直ちに純水中に漬けて急冷したものを金電極として用いた。金線の端面以外の部分（金線の側面）はエポキシ樹脂で被覆することにより電気的に絶縁し、端面のみが電極として作用するようにした。
核酸プローブとしては、実施例1と同じく、核酸残基17からなり5’末端にSH基を有する構造式5' HS（CH2）6-GACTTTAAGCAAGAAAC 3'の合成核酸（配列番号１）を用いた。核酸プローブ140μgをpH7.0の50mM リン酸緩衝液に溶解して全量を50 mlとし、核酸プローブ濃度5μMの溶液とした。上記の金電極を上記核酸プローブ溶液に５分間浸漬して核酸プローブを金電極上に固定した。金電極を核酸プローブ溶液から取り出し、充分水洗の後、乾燥した。この場合、核酸プローブは金電極上にAu-S結合を介して結合されること、すなわちAu-5'  S（CH2）6-GACTTTAAGCAAGAAAC 3'の形（配列番号２）で固定化されることが既知である。電気化学的還元脱離法によって、金電極表面への核酸プローブの固定化密度を見積もったところ、1.7μg/cm2、すなわち3.2×10-10 mol/cm2であった。
【００２８】
(2)核酸プローブと目的DNAのハイブリダイゼーション
目的DNAは、実施例1と同じく、上記核酸プローブと相補的な塩基配列を有する5' GTTTCTTGCTTAAAGTC 3’（配列番号３）である。まず、検体溶液として目的DNAを4×SSC(0.6M NaCl, 0.06M クエン酸ナトリウム) 緩衝溶液に溶解して濃度50μM(258μg/ml)の溶液とした。目的DNAを含んだこの溶液に(1)で作製した核酸プローブを固定化した金電極を60分浸漬することにより、ハイブリダイゼーションを行わせたのち、金電極を溶液から取り出して水洗、続いて乾燥させた。
【００２９】
(3)核酸プローブを固定した金電極に関する電流−電位曲線の測定
(1)で作製した核酸プローブを固定した金電極を作用極として、サイクリックボルタンメトリー法によって電流−電位曲線を測定した。電解液として1mM Cu(NO3)2を含有する0.1M NaClO4を用い、対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極(飽和KCl)をあらかじめ電解液に挿入しておく。ここにさらに上記金電極を挿入して、１分間静置後、20 mV毎秒の電位走査速度で電流−電位曲線を測定したところ、実施例１(3)での測定結果である、図１中の曲線１と同様の形状の電流−電位曲線が得られた。この電流−電位曲線に現れたカソードピークの位置から、本実施例においては上記UPD電位Bの値が0.14Vであることが求められた。
【００３０】
(4)核酸プローブを固定化した後、目的DNAとのハイブリダイゼーションを行った金電極に関する電流−電位曲線の測定
(2)で作製した、核酸プローブを固定し、かつハイブリダイゼーションを行った金電極を作用極として、サイクリックボルタンメトリー法によって電流−電位曲線を測定した。電解液として1mM Cu(NO3)2を含有する0.1M NaClO4を用い、対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極をあらかじめ電解液に挿入しておく。ここにさらに上記金電極を挿入して、１分間静置後、20 mV毎秒の電位走査速度で電流−電位曲線を測定したところ、実施例１(4)での測定結果である、図１中の曲線２と同様の形状の電流−電位曲線が得られた。この電流−電位曲線に現れたカソードピークの位置から、本実施例においては上記UPD電位Aの値が0.0Vであることが求められた。UPD電位Aが(3)のUPD電位Bに比べ大きくカソード側にシフトしていることから、ハイブリダイゼーションが起きていることが確認される。
【００３１】
（実施例４：電気化学ストリッピング法を用いた銅の析出量測定によるハイブリダイゼーションの検出：金電極として金線を用いた場合）
(1)核酸プローブを固定した金電極における銅のストリッピング電気量の測定
実施例３(1)で作製した核酸プローブを固定した金電極を、1mM Cu(NO3)2を含有する0.1M NaClO4に挿入し、さらに対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極を挿入して３電極配置とする。まず、金電極を作用極として、0.12 Vに１分間保持し、金電極上に銅イオンを定電位電析させた。この保持電位は、UPD電位Ｂよりややカソード側の電位を選択した。その後、20mV毎秒の速度で、電位をアノード側に掃引すると銅の再溶解によるストリッピング電流が観測された。この際得られたストリッピング電流−電位曲線は、実施例２(1)での測定結果である、図２と同様の形状を示した。実施例２(1)と同様にしてストリッピング電流−電位曲線から本実施例における銅のストリッピングの電気量の値を求めたところ5.6×10-4 C/cm2 であった。この電気量から2.9×10-9 mol/cm2の銅が析出していたことが分かる。
【００３２】
(2)核酸プローブを固定化した後、目的DNAとのハイブリダイゼーションを行った金電極に関する銅のストリッピング電気量の測定
実施例３(2)で作製した核酸プローブを固定し、かつハイブリダイゼーションを行った金電極を、1mM Cu(NO3)2を含有する0.1M NaClO4に挿入し、さらに対極として白金電極、参照極として銀/塩化銀電極を挿入して３電極配置とする。まず、金電極を作用極として、0.1 Vに１分間保持した。この保持電位は、電析電位Ｂよりややカソード側の電位を選択した。その後、20mV毎秒の速度で、電位をアノード側に掃引すると銅の再溶解によるストリッピング電流が観測された。この際得られたストリッピング電流−電位曲線は、実施例２(2)での測定結果である、図３と同様の形状を示した。実施例２(2)と同様にしてストリッピング電流−電位曲線から本実施例における銅のストリッピングの電気量の値を求めたところ2.3×10-4 C/cm2であった。この電気量から1.2×10-9 mol/cm2の銅が析出していたことが分かり、銅の析出量が(1)の測定に比べて２分の１以下に減少していることから、ハイブリダイゼーションが起きていることが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１で得られた電流−電位曲線の形状とUPD電位AおよびUPD電位Bの位置を示す図である。
【図２】実施例２(1)で得られたストリッピング電流−電位曲線の形状とストリッピング電気量の大きさを示す図である。
【図３】実施例２(2)で得られたストリッピング電流−電位曲線の形状とストリッピング電気量の大きさを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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