(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単位（Ｉ）を含むポリマー：
【化１】
0004883515.tif 000025
ここで、Ｒは、水素又はメチルであり；Ｒ1は、水素、メチルおよびエチルからなる群から選択され；Ｘはアシル化剤であり、そしてここで、該ポリマーが、１．４未満の多分散性および１００，０００未満の分子量（Ｍｗ）を有する。
【請求項２】
Ｘが、Ｎ−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラ−ニトロフェニル、ジニトロフェニル、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ノルボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、５−クロロキニリノ、およびイミダゾールからなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
分子量（Ｍｗ）が５０，０００〜４０００の範囲内にある、請求項１又は２に記載のポリマー。
【請求項４】
Ｒが水素であり、Ｒ1がメチルである、請求項１〜３のいずれかに記載のポリマー。
【請求項５】
ポリマーがホモポリマーである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリマー。
【請求項６】
単位（II）を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリマー：
【化２】
0004883515.tif 000026
ここで、Ｒ2は、水素又はメチルから選択され；Ｒ3は、水素、メチルおよびエチルからなる群から選択され、Ｚは、ＮＲ4Ｒ5、ＳＲ6およびＯＲ7からなる群から選択されるペンダント基であり、ここで、Ｒ4は、アシル基であり；Ｒ5は、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリールから選択され；Ｒ6およびＲ7は、水素、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12アルコキシおよびＣ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキルからなる群から選択され、そして１以上の切断可能な結合を含み得、そして生物活性剤へ共有結合され得る。
【請求項７】
Ｚが、ｃｉｓ−アコニチルおよびアミノアシル基から選択される１以上の加水分解不安定基を含む、請求項６に記載のポリマー。
【請求項８】
（II）が生物活性剤へ結合され、そして該生物活性剤が薬物である、請求項６又は７に記載のポリマー。
【請求項９】
前記薬物が、抗癌剤である、請求項８に記載のポリマー。
【請求項１０】
該ポリマーが構造（III）を有する、請求項６〜９のいずれかに記載のポリマー：
【化３】
0004883515.tif 000027
ここで、Ｒ8およびＲ9が、それぞれＲ2およびＲ3と同一の群から選択され、Ｑは、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルキルアミド、Ｃ1〜Ｃ12アルキルイミド、Ｃ1〜Ｃ12アルカノイルからなる群から選択される可溶化基であり、そしてここで、ｍおよびｐが５００未満の整数である。
【請求項１１】
ＱがＣ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキルアミノ基である、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
ポリマーの製造方法であって、化合物（IV）
【化４】
0004883515.tif 000028
［ここで、Ｒは、水素又はメチルであり；Ｒ1は、水素、メチルおよびエチルからなる群から選択され；Ｘは、カルボキシレート活性化基である］を含むエチレン性不飽和化合物のラジカル重合を含み；ここで、該方法が、溶媒、アルキルハライドから選択される原子移動ラジカル重合開始剤、およびキレート配位子によって錯化されるＣｕ（Ｉ）Ｂｒ部分を含むメディエーター(mediator)を含む、単位（Ｉ）
【化５】
0004883515.tif 000029
［ここで、ｎは１〜５００の整数である］を含むポリマーを製造する、方法。
【請求項１３】
前記溶媒が、水、あるいはテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド、メチルホルムアミド、スルホランおよびその混合物からなる群から選択される非プロトン性溶媒である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記重合が、構造
【化６】
0004883515.tif 000030
［ここで、Ａは、Ｃ1〜Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12ヒドロキシルアルキルからなる群から選択され、ＢおよびＣは、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリールおよびＣ1〜Ｃ12ヒドロキシルアルキルからなる群から個々に選択され、Ｎと一緒になってＣ5〜Ｃ12ヘテロ環式基を形成するように結合され得、そしてこれは、窒素、硫黄、酸素およびリンから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を含み得る］
を有する開始剤の存在下で起こるニトロキシド媒介重合である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ａが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ベンジル、メチルベンゼン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンまたはその異性体からなる群から選択され、そしてＢおよびＣが、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、アダマンチル、メチルベンゼン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンまたはその異性体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記開始剤が、
【化７】
0004883515.tif 000031
からなる群から選択される構造を有し、ここで、Ｒ9〜Ｒ11が、Ｃ1〜Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキルおよびＣ1〜Ｃ12アルカリールからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
医薬の製造方法における使用のための、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリマー。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれかに記載のポリマーおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項１９】
賦形剤としての請求項１〜１１のいずれかに記載のポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、狭い分子量分布のポリマー前駆体のクラス並びに、すべて類似の分子量特性及び狭い分子量分布を有する、生理学的に可溶なポリマー治療剤、機能化ポリマー、薬学的組成物及び材料の、それからの生成に関する。
発明の背景
ポリマー療法(Duncan R., Polymer therapeutics for tumour specific delivery Chem & Ind 1997, 7, 262-264)は、生理的に可溶なポリマーを要求する生物医学的な応用のために発達したものであり、生物学的に活性なポリマー、ポリマー−薬物複合体、ポリマー−蛋白質複合体、及びポリマーと生物活性分子の他の共有結合構築物を含む。ポリマー−薬物複合体の典型的な種類は、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）のコポリマーから誘導されるものであり、ガン化学療法に用いる細胞毒性薬物との結合について、盛んに研究が行われている(Duncan R: Drug- polymer conjugates: potential for improved chemotherapy. Anti-Cancer Drugs, 1992, 3, 175-210. Putnam D, Kopecek J:  Polymer conjugates with anticancer activity. Adv.Polym.Sci., 1995,122,55-123. Duncan R, Dimitrijevic S, Evagorou E: The role of polymer conjugates in the diagnosis and treatment of cancer. STP Pharma, 1996, 6, 237-263)。
【０００２】
ＰＫ−１として知られている、ドキソルビシン（doxorubicin）に結合したＨＰＭＡ共重合体は、英国で、現在、フェーズII評価を受けている。ＰＫ−１は、フェーズＩ研究において、遊離のドキソルビシンと比べて毒性が減少していることが示された(Vasey P, Twelves C, Kaye S, Wilson P, Morrison R, Duncan R, Thomson A, Hilditch T, Murray T, Burtles S, Cassidy J: Phase I clinical and pharmacokinetic study of PKI (HPMA copolymer doxorubicin): first member of a new class of chemotherapeutic agents: drug-polymer conjugates. Clin. Cancer Res., 1999, 5, 83-94)。ＰＫ−１の最大耐量は、320mg/m2であって、遊離のドキソルビシンの通常の臨床量よりも４−５倍高い。
【０００３】
ポリマー療法を発達するために使用されるポリマーはまた、ポリマーがポリマー性のミセルやコンプレックスのような凝集体を形成し得る他の生物医学的応用のために、別個に発達するかもしれない(Kataoka K, Kwon G, Yokoyama M, Okano T, Sakurai Y- Block copolymer micelles as vehicles for drug delivery. J. Cont.Rel., 1993,24,119-132. Inoue T, Chen G, Nakamae K, Hoffman A: An AB block copolymer of oligo(methyl methacrylate) and poly(acrylic acid) for micellar delivery of hydrophobic drugs. J. Cont. Rel., 1998, 51, 221-229. Kwon G, Okano T: Polymeric micelles as new drug carriers. Adv. Drug DeL Rev., 1996, 21, 107-116.)。ポリマー療法の発達のために使用されるポリマーはまた、ポリマーが生理学的に可溶な分子としてよりもむしろ材料として使用されることを要求する他の生物医学的用途のために別個に開発されるかもしれない。従って、薬物放出マトリックス（ミクロスフェア（microspheres）及びナノ粒子（nanoparticles）を含む）、ヒドロゲル（注射可能なゲル及び粘性溶液を含む）、ハイブリッドシステム（例えば、外表面にポリ（エチレングリコール）（PEG）が結合したリポソーム）及びデバイス（ロッド、ペレット、カプセル、フィルム及びゲルを含む）が、組織又は部位特異的な薬物送達のために、組立てられ得る。ポリマーはまた、薬物処方における賦形剤として、臨床的に広く使用されている。これらの３つの広い応用分野、即ち、（１）生理学的に可溶な分子、（２）材料及び（３）賦形剤において、生物医学的ポリマーは、治療のための生物活性剤の効力を最適化するための、広い技術的土台を提供する。
【０００４】
ポリマーと共有結合できる治療のための生物活性剤は、薬物、ペプチド及び蛋白を含む。可溶で生物適合性のあるポリマーへのこのような結合により、治療剤の効力の改善をもたらすことができる。遊離の、結合していない生理活性物質と比較して、治療のためのポリマー複合体は、以下の主な理由、即ち、（１）生体分布の変化、（２）循環の延長、（３）ピノサイトーシスにより細胞が複合体を取り込んだ後の二次リソゾームの蛋白質分解性及び酸性環境下における生物活性剤の放出、及び（４）巨大分子の特徴により薬物に与えられたより好ましい物理化学的性質（例えば、生物学的液体中の増大した薬物溶解度）によって、この効力の改善を発揮する（Brocchini S and Duncan R. Polymer drug conjugates: : drug release from pendent linkersの参考文献に留意されたい。The Encyclopedia of  Controlled Drug Delivery, Wiley, New York, 1999, 786-816）。
【０００５】
さらに、生物活性剤のポリマーへの共有結合は、１以上の生物学的標的と結合した１以上の生物活性剤の複数の相互作用による改良された効力をもたらす。複数の蛋白と配位子とのこのような多価の相互作用は、生物系では一般的であり（例えば、インフルエンザウイルスの付着）、細胞表面で起こる相互作用（例えば、レセプターとレセプタークラスター）を含み得る(Mammen M, Choi S, Whitesides GM: Polyvalent interactions in biological systems: Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2754-2794. Whitesides G, Tananbaum JB. Griffin J, Mammen M: Molecules presenting a multitude of active moieties. PCT Int. Appl. WO 9846270)。ポリマー生物活性複合体の複数の同時に起こる相互作用は、一価の相互作用による複合体の，別々の、個々の結合していない生物活性成分により示される特性とは異なる、独特の共通した性質を有しているであろう。
【０００６】
さらに、適切に機能性を付与されたポリマーは、多価の相互作用により粘膜（例えば、胃腸管、気道又は膣道）と相互作用を起こし得る。このような性質は、生物活性剤の部位特異的送達又は最適には生物分布を変えるために用いられる機能化ポリマー賦形剤の長期の及び／又は優先的局在化のために有益である。
【０００７】
さらに、ポリマー生物活性剤複合体及び／又は凝集体は、刺激応答となるように、例えば、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれた後の膜分解のために設計することができる(Hoffman A, Stayton PS: Interactive molecular conjugates. US 5,998,588)。これらポリマーの構築物は、天然のマクロ分子（毒素及び輸送蛋白質）並びにウイルス類に見られる膜透過特性を組み込まなければならない。サイトゾルのアクセスは、ポリマー仲介トランスフェクリョンの間が律速であると証明されている(Kichler A, Mechtler A, Mechtler K, Behr JP, Wagner E: Influence of membrane-active peptides on lipospermine/DNA complex mediated gene transfer, Bioconjugate Chem., 1997, 8(2), 213-221.)。in vitroでのトランスフェクションの研究に用いられてきた多くのカチオン性ポリマー（例えば、（ポリ−Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）及びポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、キトサン並びにカチオン性ＰＡＭＡＭデンドリマー）は、細胞毒性（IC50値＜５０μｇ/ｍｌ）であるか、i.v. での注射後に肝親和性である。このような分子は、in vivo／臨床の発展に全体として適していない。代わりとなるエンドソーム溶解性分子が提案されているが、いずれも極めて有毒であるか（即ち、ポリ（エチレンイミン））又は免疫原性である可能性がある（例えば、融合誘導ペプチド、(Plank C, Zauner W, Wagner E: Application of membrane-active peptides for drug and gene delivery across cellular membranes, Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, 34, 21 - 35. Wagner E, Effects of membrane-active agents in gene delivery, J. Cont. Release, 1998, 53, 155-158.に概説されている。)。両性イオンの特徴を有するいくつかのポリマー(Richardson S, Kolbe H, Duncan R: Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system: Biocompatibility, body distribution and ability to complex and protect DNA Int. J. Pharm., 1999 178, 231-243. Richardson S, Ferruti P, Duncan R- Poly(amidoamine)s as potential endosomolytic polymers: Evaluation of body distribution in normal and tumour baring animals, J. Drug Targeting, 1999)は、細胞のサイトゾルの環境にアクセスするためにエンドソームを破裂させることができるpHの関数として、膜溶解活性の相当な可能性を有していることが証明されている。
【０００８】
ガンの治療において、高められた透過性及び保持（ＥＰＲ）効果により、治療有効性及び部位特異的受動取り込みに著しい改善があった (Matsumura Y, Maeda H: A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy; mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumour agent SMANCS. Cancer Res., 1986, 6, 6387-6392.)。ＥＰＲ効果は、不連続な内皮細胞の漏れのために腫瘍新生血管形成（tumour neovasculature）内でのマクロ分子又は小粒子の透過性が高められた結果である。腫瘍の新脈管形成（血管過形成(hypervasculature)）並びに脈管ネットワークの不規則性及び不完全性に加えて、リンパ液の排出の付随的な欠乏が、管外に遊出するマクロ分子の蓄積を促進する。この効果は、マクロ分子物質及び脂質に対する多くの固形腫瘍において観察されている。高められた血管透過性は、腫瘍の無秩序な成長のための栄養及び酸素の要求をサポートするであろう。レセプター仲介エンドサイトーシスにより取り込まれた腫瘍細胞を特に扱わない限り、腫瘍内の環境に入るポリマーは流動相のピノサイトーシスにより比較的緩やかに取り込まれる。一方、低分子量分子の細胞の取り込みは、通常、迅速なトランスメンブラン輸送により起こり、生理学的に可溶なポリマーの取り込みはエンドサイトーシスによりほとんど独占的におこる(Mellman 1: Endocytosis and molecular sorting. Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 1996, 12, 575-625. Duncan R, Pratten M: Pinocytosis: Mechanism and Regulation. In: Dean R, Jessup W, eds. Mononuclear Phagocytes: Physiology and Pathology. Amsterdam: Elsevier Biomedical Press, 1985- 27-51.)。
【０００９】
ポリマー生物活性複合体は、レセプター仲介エンドサイトーシスを誘発するであろう結合した生物活性剤をさらに含み得る(Putnam D, Kopecek J: Polymer conjugates with anticancer activity. Adv.Polym.Sci., 1995, 122, 55-123. Duncan R- Drug-polymer conjugates: potential for improved chemotherapy. Anti-Cancer Drugs, 1992, 3, 175-210.)。例えば、さらにガラクトサミンを含むＨＰＭＡコポリマー−ドキソルビシンは、肝細胞アシアログリコプロテインレセプターにより取り込まれるため、肝臓に選択的に集まる(Duncan R, Seymour L, Scarlett L, Lloyd J, Rejmanova P, Kopecek J: N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide copolymers with pendant galactosamine residues. Fate after intravenous administration to rats. Biochim. Biophys. Acta., 1986, 880, 62-71. Seymour L, Ulbrich K, Wedge S, Hume 1, Strohalm J, Duncan R: N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers targeted to the hepatocyte galactose-receptor: pharmacokinetics in DBA-2 mice. Br. J. Cancer, 1991, 63, 859-866.)。
【００１０】
高められた脈管透過性は、感染又は自己免疫疾患による炎症反応を被った組織内に存在することがよく知られている。ポリマー及び適当な生物活性剤の複合体は、このような条件下で健常及び炎症組織間の脈管透過性勾配を利用し、ガンの腫瘍部位で示され観察されたのと類似の，炎症部位における複合体の受動的で優先的な蓄積を導く。
【００１１】
多価の相互作用により治療的に有効であるように設計されたポリマー生物活性複合体は、ガンや感染のような疾患の治療を含む多数の臨床用途のためにアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、及びアンタゴニストとして開発されている(Griffin JH, Judice JK: Novel multi-binding therapeutic agents that modulate enzymatic processes, WO 99/64037. Yang G, Meier-Davis S, Griffin JH:Multivalent agonists, partial agonists, inverse agonists and antagonists of the 5-HT3 receptors, WO 99/64046. Christensen BG, Natarajan M, Griffin JH: Multibinding bradykinin antagonists, WO 99/64039. Fatheree P, Pace JL, Judice A Griffin JH: Preparation of multibinding Type 11 topoisomerase inhibitors as antibacterial agents, WO 99/64051. Linsell MS, Meier-Davis S, Griffin JH: Multibinding inhibitors of topoisomerase, WO 99/64054. Griffin JH, Moran EJ, Oare D: Novel therapeutic agents for macromolecular structures. PCT Int. Appl. WO 9964036. Griffin JH, Judice JK: Linked polyene macrolide antibiotic compounds and uses, WO 99/64040. Choi S, Mammen M, Whitesides GM, Griff in JH: Polyvalent presenter combinatorial libraries and their uses, WO 98/47002.)。
【００１２】
ポリマー−生物活性剤複合体の４つの主要な部分は、（１）ポリマー、（２）ペンダント鎖結合リンカー又は主鎖終末結合リンカーのいずれかであり得る生物活性剤結合リンカー、（３）ペンダント鎖可溶化溶液、及び（４）結合された生物活性剤である。いずれの成分も明確な生物学的機能を有しているが、これら４つの成分は複合体として集まると、生理学的に可溶なポリマー−生物活性剤複合体に典型的な，薬理学的、薬物動力学的及び物理化学的な特性の明確なプロフィールを生じるので、全体が部分よりも優れている。ポリマーは生物活性剤の単なる担体ではない。複合体のポリマー成分は合成した物であっても良いし、天然由来であってもよい。合成由来のポリマーは構造特性相関を独特の方法によりさらに効果的に調節し、相関させることができるという利点を有する(Brocchini S, James K, Tangpasuthadol V, Kohn J: Structure-property correlations in a combinatorial library of degradable biomaterials. J. Biomed. Mater. Res., 1998, 42(l), 66-75. Brocchini S, James K, Tangpasuthadol V, Kohn J: A Combinatorial Approach For Polymer Design. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119(19), 4553-4554.)。
【００１３】
ポリマーの溶液特性は、循環の半減期及び細胞取り込み速度の決定、強力な細胞毒性薬物の有害な副作用の最小化、好ましい物理化学的性質の付与（例えば、親油性薬物の溶解度の増加）の直接的な原因となる。ポリマー生物活性剤複合体の溶液特性は、ポリマー，結合しているリンカー及び特性修飾ペンダント鎖の構造に影響を受ける。生物活性剤の量または負荷（loading）も、ポリマー生物活性複合体の溶液特性に影響を与えるであろう。複合体の溶液特性は、複合体の最終的な生物学的特徴に影響するであろう。
【００１４】
溶液特性は、ポリマー生物活性剤複合体の生体適合性及びクリアランス速度に寄与する。生体適合性には、血液蛋白に結合する複合体の欠如及び免疫原性応答の欠如が含まれる。複合体は、腎糸球体の濾過速度及び肝臓取り込み速度に基本的に支配される血漿クリアランスを示すであろう。分子量40,000〜70,000Daのマクロ分子は、溶液構造に依るが、腎糸球体を容易に通過し、排出可能である。しかしながら、分子量とともに（又は超分子凝集体を形成することにより）分子の溶液サイズの増大に従って血液クリアランス時間が延長される。ポリマーのフレキシビリティー、電荷及び疎水性を含む構造的特徴が、このサイズの範囲におけるマクロ分子のための腎臓の排出閾値に影響を与える(Duncan R, Cable H, Rypacek F, Drobnik J, Lloyd J.- Characterization of the adsorptive pinocytic capture of a polyaspartamide modified by the incorporation of tyramine residues. Biochim. Biophys. Acta, 1985, 840, 291-293.)。HPMAコポリマー、ポリビニルピロリドン（PVP）及びポリ（エチレングリコール（PEG）を含む中性の親水性ポリマーは、フレキシブルであり、ゆるく巻いた溶液構造を有しており、一方、蛋白質は帯電しやすく、よりコンパクトな溶液構造を示す。例えば、ラットでのHPMAコポリマー−チロシナミドの糸球体濾過を制限する分子量の閾値は、約45,000Daであり(Seymour L, Duncan R, Strohalm J, Kopecelk J: Effect of molecular weight (Mw) of N-(2- hydroxypropyl)methacrylamide copolymers on body distributions and rate of excretion after subcutaneous, intraperitoneal and intravenous administration to rats. J. Biomed. Mater. Res., 1987, 21, 1341-1358.)、蛋白に対する閾値は約60kDaである。
【００１５】
コポリマーであるHPMAは、ガン化学寮法のための細胞毒性薬物の複合体のために盛んに研究されている(Duncan R, Dimitrijevic S, Evagorou E: The role of polymer conjugates in the diagnosis and treatment of cancer. STP Pharma, 1996, 6, 237-263. Putnam D, Kopecek J: Polymer conjugates with anticancer activity. Adv.Polym.Sci., 1995, 122, 55-123. Duncan R: Drug-polymer conjugates: potential for improved chemotherapy. Anti-Cancer Drugs, 1992, 3, 175-210.)。HPMAのホモポリマーは、生物学的流体（biological fluid）に可溶であり、分子量40,000Da未満で容易に排出され[4]、３０g/kgまで無毒であり、血液蛋白に結合せず[5]、免疫原性でない(Rihova B, Ulbrich K, Kopecek J, Mancal P: Immunogenicity of N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers - potential hapten or drug carriers. Folia Microbiol., 1983, 28, 217-297. Rihova B, Kopecek J, Ulbrich K, Chytry V Immunogenicity of N-(2- hydroxypropyl)methacrylamide copolymers. Makromol. Chem. Suppl., 1985, 9, 13-24. Rihova B, Riha 1: Immunological problems of polymer-bound drugs. CRC Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys., 1985, 1, 311-374. Rihova B, Ulbrich K, Strohalm J, Vetvicka V, Bilej M, Duncan R, Kopecelk J: Biocompatibility of N-(2 -hydroxypropyl)methacrylamide copolymers PCT/GBOO/03456 9 containing adriamycin. Immunogenicity, effect of haematopoietic stem cells in bone marrow in vivo and effect on mouse splenocytes and human peripheral blood lymphocytes in vitro. Biomaterials, 1989, 1-0, 335-342.)。一般に安全と認められており（GRAS）、蛋白の結合に用いられているポリ（エチレングリコール）（PEG）のように、HPMAは生体適合性であり、従って生物活性剤に結合するための良い候補ポリマーである。HPMAコポリマーは親水性であるので、疎水性薬物の可溶化が可能である。それぞれのHPMAコポリマー複合体は異なるコポリマーであるので、HPMAに類似の他の親水性ポリマーは、生物活性剤の結合のための良い候補ポリマーであり得る。
【００１６】
さらに、ポリマー−生物活性剤複合体の分子量特性は、複合体の最終的な生物学的プロフィールに影響を与えるであろう。生物分布及び薬理学的活性は、分子量依存性であることが知られている。例えば、血液循環半減期(Cartlidge S, Duncan R, Lloyd J, Kopeckova-Rejmanova P, Kopecek J: Soluble crosslinked N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers as potential drug carriers. 2. Effect of molecular weight on blood clearance and body distribution in the rat intravenous administration. Distribution of unfractionated copolymer after intraperitoneal subcutaneous and oral administration. J Con. Re/., 1986, 4, 253-264.), 腎クリアランス, 器官における蓄積(Sprincl L, Exner J, Sterba 0, Kopecek J: New types of synthetic infusion solutions Ill. Elimination and retention of poly[N-(2- hydroxypropyl)methacrylamide] in a test organism. J. Biomed. Mater Res., 1976, 10, 953-963.), エンドサイトーシス性取り込みの速度 (Duncan R, Pratten M, Cable H, Ringsdorf H, Lloyd J: Effect of molecular size of 1251-labelled poly(vinyl pyrro I i done) on its pinocytosis by rat visceral yolk sacs and peritoneal macrophages. Biochem. J., 1981, 196, 49-55. Cartlidge S, Duncan R, Lloyd J, Rejmanova P, Kopecek J: Soluble crosslinked N-(2- hydroxypropyl)methacrylamide copolymers as potential drug carriers. 1. Pinocytosis by rat visceral yolk sacs and rat intestinal cultured in vitro. Effect of molecular weight on uptake and intracellular degradation. J. Cont. Rel. , 1986, 3, 55-66.)及び生物学的活性はポリマー分子量特性に依存し得る (Kaplan A- Antitumor activity of synthetic polyanion. In: Donaruma L, Ottenbrite R, Vogl 0, eds. Anionic Polymeric Drugs. New York: Wiley, 1980; 227-254. Ottenbrite R, Regelson W, Kaplan A, Carchman R, Morahan P, Munson A: Biological activity of poly(carboxylic acid) polymers. In: Donaruma L, Vogl 0, eds. Polymeric Drugs. New York: Academic Press, 1978; 263-304. Butler G: Synthesis, characterization, and biological activity of pyran copolymers. In: Donaruma L, Ottenbrite R, Vogl 0, eds. Anionic Polymeric Drugs. New York: Wiley, 1980; 49-142. Muck K, Rolly H, Burg K: Makromol. Chem., 1977, 178, 2773. Muck K, Christ 0, Keller H: Makromol. Chem., 1977, 178, 2785. Seymour L Synthetic polymers with intrinsic anticancer activity. J. Bioact. Compat. Polymers, 1991, 6, 178-216.)。
【００１７】
細胞内の生物活性剤の次の放出を伴うポリマー生物活性剤複合体の細胞取り込みを要求する臨床用途においては、リンカーは、分解して細胞内での最適速度で生物活性剤を放出するように設計しなければならない。リンカーを結合した生物活性剤は、血漿及び血清中で分解しないことが好ましい(Vasey P, Duncan R, Twelves C, Kaye S, Strolin-Benedetti M, Cassidy J: Clinical and pharmacokinetic phase 1 study of PK1(HPMA) copolymer doxorubicin. Annals of Oncology, 1996, 7, 97.)。細胞へのエンドサイトーシスによる取り込みの際には、複合体はリソソームに局在化するであろう。これら細胞のオルガネラには、プロテアーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼ及びヌクレアーゼを含む膨大な数の加水分解酵素が含まれる。ガンの治療のためには、強力な細胞毒性薬物は、リソソーム中では分解するが、血流中ではそのまま維持される結合リンカーを用いてポリマーに結合された。多くの薬物がポリマーに結合している間は薬理学的に活性でなく、これにより循環中の遊離薬物と比べて細胞毒性が劇的に減少する。
【００１８】
結合したリンカー構造は、最適な生物学的活性のために最適化されなければならない。標的部位でのみ薬物を放出するポリマー−薬物リンカーの組み込みは、ピーク血漿濃度を低下させることができ、薬物が仲介する毒性を減少させる。
【００１９】
薬物放出速度を最適化すると、標的への暴露を用いる生物活性剤（たとえば、細胞−サイクル依存性抗ガン剤の使用）の作用メカニズムを適合させ、耐性の誘発を防止するように調節することができる。有効であるためには、ポリマー生物活性剤複合体を、標的組織中での生物活性剤の局在化を改善し、他の組織中での毒性の潜在的部位への有害な暴露を減少し、生物学的効果のためにその放出が要求されるそれら用途での生物活性剤の放出速度を最適化するように設計することが重要である。ポリマー鎖からの薬物放出の速度は、ポリマーの分子量及びポリマーに結合した薬物の量に従って変わり得る。親水性ポリマーに多量の疎水性薬物が結合すると、ポリマーミセルを形成する可能性が増す(Ulbrich K, Konak C, Tuzar Z, Kopecek J: Solution properties of drug carriers based on poly[ N-(2hydroxypropyl) methacryl am i de] containing biodegradable bonds. Makromol. Chem., 1987, 188, 1261-1272.)。ミセル複合体構造は、リンカーを分解し、結合した薬物を放出するためのリソソーム酵素のアクセスを妨げるかもしれない。さらに、疎水性薬物が結合した親水性ポリマーは、相分離が起こり複合体が不溶性になるより低い臨界溶解温度（LCST）を示し得る。単純な濁度測定アッセイ(Chytry V, Netopilik M, Bohdanecky M, Ulbrich K Phase transition parameters of potential thermosensitive drug release systems based on polymers of N- a I kyl methacrylam ides. J. Biomater. Sci. Polymer Ed., 1997, 8(11), 817- 824.)は、異なる分子量及び薬物負荷の種々のHPMAコポリマー−ドキソルビシン複合体での相分離の傾向を測定するための予備スクリーニングとして用いられた(Uchegbu F, Ringsdorf H, Duncan R: The Lower Critical Solution Temperature of Doxorubicin Polymer Conjugates. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 1996.)。生物活性剤がリンカーの分解によりポリマーから放出されると、ポリマーコンホメーションの変化が起こり、経時的な薬物放出速度、それによる薬理学的性質の相違をも導くであろうことが予想される(Pitt C, Wertheim PCT/GBOO/03456 12 J, Wang C, Shah S- Polymer-drug conjugates: Manipulation of drug delivery kinetics. Macromol. Symp., 1997,123, 225-234. Shah S, Werthim J, Wang C, Pitt C: Polymer-drug conjugates: manipulating drug delivery kinetics using model LCST systems. J. Cont. ReL, 1997, 45, 95-101.)。薬物負荷の程度及びそのポリマー溶液の性質への影響は、重要であるが充分に理解されていない現象であり、この現象は治療のためのポリマー−生物活性剤複合体のin vivoでの生物学的性質の最適化を導くために、ポリマー−生物活性剤複合体の構造と性質の関係に相関関係を持つべきである。
【００２０】
現在HPMAコポリマー−薬物複合体は、生物活性剤結合リンカー及び溶液可溶化ペンダント鎖の両方を組み込んだコポリマー前駆体と低分子量の薬物（例えばドキソルビシン）とのポリマー類似反応（polymer analogous reaction）により調製されている(Rihova B, Ulbrich K, Strohalm J, Vetvicka V, Bilej M, Duncan R, Kopecek J: Biocompatibility of N-(2 -hydroxypropyl)methacrylamide copolymers containing adriamycin. Immunogenicity, effect of haematopoietic stem cells in bone marrow in vivo and effect on mouse splenocytes and human peripheral blood lymphocytes in vitro. Biomaterials, 1989, 10, 335-342. Kopecek J, Bazilova H: Poly[N-(hydroxypropyl)methecrylamide]-i. Radical polymerisation and copolymerisation. Eur. Polymer J., 1973, 9, 7-14. Strohalm J, Kopecek J: Poly[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide] IV. Heterogeneous polymerisation. Angew. Makromol. Chem., 1978, 70, 109- 118. Rejmanova P, Labsky J, Kopecek J: Aminolyses of monomeric and polymeric 4-nitrophenyl esters of N-methacryloylamino acids. Makromol. Chem., 1977, 178, 2159-2168. Kopecek J- Reactive copolymers of N-(2- Hydroxypropyl)methacrylamide with N-methacryloylated derivatives of L- leucine and L-phenylaianine. MakromoL Chem., 1977, 178, 2169-2183. Kopecek J: The potential of water-soluble polymeric carriers in targeted and site-specific drug delivery. J. Cont. Rel., 1990, 11, 279-290.)。ポリマー類似反応により調製されるポリマー生物活性剤複合体の圧倒的多数は、生物活性剤とコポリマー性前駆体との反応により調製される（Brocchini S and Duncan R: Polymer drug conjugates: drug release from pendent linkers. の参考文献に留意されたい。The Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Wiley, New York, 1999, 786- 816.）。
【００２１】
コポリマー前駆体を用いる不利な点は、（１）生物活性剤結合リンカー又は（２）溶液可溶化ペンダント鎖の構造又は相対量をそれぞれ変えるためには、新たなコポリマー前駆体の調製が必要となる点である。ペンダント鎖構造はポリマー生物活性剤の生物学的プロフィールにとって重要であるので、コポリマー前駆体は修飾された結合リンカーを保有するそれぞれの複合体について研究するために要求される。溶液構造は、生物活性剤ポリマー複合体の全ての構造的特徴の関数である。ポリマー主鎖、結合リンカー又は溶液可溶化ペンダント鎖のいずれかの溶液−構造相関を明らかにするために、それぞれの成分のそれぞれのバリエ−ションに対して異なるコポリマー前駆体が必要となる。
【００２２】
たとえ同じコポリマー前駆体を用いたとしても、結合した生物活性剤の量又は配合量を変えるのは不可能である。生物活性剤の配合量を変化させたり、結合しているペンダント鎖の相対的な化学量論より少なかったりすると、残りの結合ペンダント鎖が薬物に結合しないであろうし、残りの結合ペンダント鎖はいくつかの他の不活性な分子により終結するであろう。ポリマー類似反応は、反応性である結合ペンダント鎖終末の官能基（たとえば、カルボン酸のｐ−ニトロフェノール活性エステル）を有しており、従って、生物活性剤を加えると、該剤は結合ペンダント鎖と共有結合を形成し、ポリマーに連結されるであろう。従って、生物活性剤の配合量が結合ペンダント鎖の相対的化学量論より少ない場合、反応性官能基は生物活性剤以外の試薬により好ましくはこの位置で消すべきであり、新たなポリマー前駆体が調製される。これらの手順は、構造の分布が広いポリマー複合体を生成する傾向にある。従って、構造−特性相関を正確に決定するのが不可能となる。明らかに、結合ペンダント鎖の相対的化学量論より多い生物活性剤の添加が望ましく、従って他のコポリマー前駆体を調製しなければならない。
【００２３】
多くのポリマー生物活性剤複合体はコ−ポリ−（メタクリルアミド）であるため、ポリマー類似反応はコ−ポリ（メタクリルアミド）前駆体上で行われる。狭い分子量分布を伴い、多分散性指数が２未満であるこのような前駆体の圧倒的多数は、コポリマー前駆体が腎臓閾値より低い分子量で重合溶液から沈殿する特別な場合を除き製造不可能である。全てが同じ分子量特性、例えば全て同じ重合度及び同じ分子量分布を有しているいくつかの異なるコポリ（メタクリルアミド類）を得ることも不可能である。コポリ（メタクリルアミド）前駆体は、一般に多分散性（PD）＞１．５〜２．０であるランダムコポリマーを通常生成する、フリーラジカル重合により調製される傾向にある。
【００２４】
さらに、結合した生物活性剤、従って結合リンカーの相対的化学量論は、溶液可溶化ペンダント鎖よりも少ないので、ポリマー類似反応は、コポリマー前駆体上で生物活性剤の結合のための反応部位の低い相対的化学量論をしばしば伴う。この有効でない結合方法は、しばしば競合的加水分解反応、及び結合リンカーが生物活性剤に共有結合しないという結果をもたらす他の消耗的な副反応で苦しめられる(Mendichi R, Rizzo V, Gigli M, Schieroni A G: Molecular characterisation of polymeric antitumour drug carriers by size exclusion chromatograpgy and universal calibration. J. Liq. Chrom. and Rel. Technol. , 1996, 19(10), 1591-1605. Configliacchi E, Razzano G, Rizzo V, Vigevani A: HPLC methods for the determination of bound and free doxorubicin and of bound and free galactosamine in methacrylamide polymer-drug conjugates. J. Pharm. Biomed. Analysis, 1996, 15, 123-129.)。これは、バッチ間の著しい構造の不均一性をもたらすばかりでなく、結合しておらず、その回収が非常に費用がかかる生物活性剤の著しい浪費を生ずる。細胞中へのエンドサイトーシスによる取り込みのために開発された複合体の場合、ペンダント鎖を有する生物活性剤結合ペンダント鎖のリソソーム分解は、生物活性ペンダント鎖とはリンクしなかった。この競合は、ポリマー生物活性剤複合体の薬理学及び薬物動力学を複雑にする。
【００２５】
現在医療用途に用いられているポリマー−生物活性剤複合体及び生物医学的なポリマーは、監督官庁（例えば、医薬品庁（Medicines Control Agency）, FDA）の観点からは、構造的に定義されていない。多くの複合体が広い分子量分布を及び結合した生物活性剤のランダムな組み込みを示す。しばしば、結合リンカーの構造が、ラセミ化又は各結合リンカーへの生物活性剤の不完全な結合のために変わる。
【００２６】
ポリマー−生物活性剤複合体（例えば、ポリマー療法）の開発に用いられる生理的に可溶なポリマーのさらなる発展には、研究のためにより明確な複合体構造物を調製することが要求される。このようにして、これらマクロ分子療法の生物学的プロフィールに影響を与える構造−特性相関をより正確に説明することが可能となるであろう。これは、多くの異なるコポリマー前駆体でのポリマー類似反応を行うことでは不可能である。現在入手可能なものよりもより狭い分子量分布を有するポリマー生物活性複合体を調製する必要がある。それぞれの生物活性結合リンカーが構造的に同一であり、ポリマー及び生物活性剤へ共有結合することを確実にする必要もある。さらに、前臨床開発においては、より効果的な戦略が求められており、そこでは類似した分子量特性の複合体が研究のために調製され、溶液特性も、ポリマー主鎖の分子量特性を変えることなく変化させることができる。HPMAコポリマー複合体はポリ（メタクリルアミド類）であり、そしてこのような複合体の調製への要求を満足するように改善された技術のいずれもが、他のヘルスケア及び民生用アプリケーションのための他のポリ（メタクリレート類）を調製するためにも利用することができ、得られたポリマーは可溶性分子として、デバイス中に組み立てられ得る，加工に適した材料、又は賦形剤のいずれかとして用いることができる。ごく限られた数の狭い分子量分布のアクリルアミドのホモ−及びコ−ポリマーのみを調製することができるので、特別な用途のために、このようなポリマーを調製するための方法を提供するプロセスが必要とされている。
【００２７】
コポリマー前駆体上でのポリマー類似反応を行うためのこれらの限定は、狭い分子量分布を有し，繰り返し単位のそれぞれが反応部位であるホモポリマー前駆体を用いたポリマー類似反応を行うことにより緩和される。生物活性剤又は誘導体の結合は、生物活性剤をポリマーに共有結合させる最初の反応で行われる。ホモポリマー前駆体のそれぞれの繰返し単位は反応に利用できる反応部位であるので、前記結合は効果的である。生物活性剤が結合する際、中間体前駆体は、終結され、反応性化学官能基を依然として有するほとんどの繰返し単位からなるコポリマーである。次いで、これらを最終的な複合体で溶液可溶化ペンダント鎖となるであろう試薬と反応させる。このような狭い分子量分布のホモポリマー前駆体を用いることにより、全て同じ狭い分子量分布を有する多くのコポリマー複合体を調製することが可能となる。それぞれの複合体は、ホモポリマー前駆体が有していたのと同じ重合度及び多分散性指数といった分子量特性も有しているであろう。
【００２８】
本発明は、制御されたラジカル重合工程による (Sawamoto M, Masami K: Living radical polymerizations based on transition metal complexes. Trends Polym. Sci. 1996, 4, 371-377. Matyjaszewski K, Mechanistic and synthetic aspects of atom transfer radical polymerization. Pure Appl. Chem. 1997, A34, 1785-1801. Chiefari J, Chong Y, Ercole F, Krstina J, Jeffery J, Le T, Mayadunne R, meijs G, Moad C, Moad G, Rizzardo E, Thang S- Living free-radical polymerization by reversible add ition-fragmentation chain transfer: the RAFT process. Macromolecules, 1998, 31, 5559-5562. Benoit D, Chaplinski V, Braslau R, Hawker C: Development of a universal alkoxyamine for "living" free radical polymerizations. J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 3904-3920.) 多分散性指数が１．２未満である狭い分子量分布のホモポリマー前駆体の合成に関する。これら制御されたラジカル重合工程が、直接狭い分子量分布のアクリルアミドホモ−及びコ−ポリマーを生じることはこれまで明らかにされていなかった。本発明は、生理学的に可溶なポリマー生物活性剤複合体、ポリマー療法、官能化ポリマー、薬学的組成物及び材料を調製するためのこれらホモポリマー前駆体の使用にも関する。
発明の要旨
本発明の１つの実施形態は、以下の単位（Ｉ）を含むポリマーを提供する：
【００２９】
【化１４】
0004883515.tif 000002
【００３０】
ここで、Ｒは、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリール、カルボン酸、カルボキシ−Ｃ1-6アルキルからなる群から選択されるか、あるいは、炭素骨格内でまたはそれへ付加されて、ヘテロ原子で置換されたＣ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリールのいずれか１つであり；Ｒ1は、水素、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基からなる群から選択され；Ｘはアシル化基であり、そしてここで、該ポリマーが、１．４未満、好ましくは１．２未満の多分散性（polydispersity）および１００，０００未満の分子量（Ｍｗ）を有する。
【００３１】
アシル化基Ｘは、好ましくは、カルボキシレート活性化基であり、そして一般的に、Ｎ−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラ−ニトロフェニル、ジニトロフェニル、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ノルボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、５−クロロキニリノ、およびイミダゾールからなる群から選択される。好ましくは、Ｘは、Ｎ−スクシンイミジルまたはイミダゾール部分である。
【００３２】
好ましくは、Ｒは、水素、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ6アルケニル、Ｃ1〜Ｃ6アラルキルおよびＣ1〜Ｃ6アルカリール、Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミドおよびＣ1〜Ｃ6アルキルイミドからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒは、水素またはメチルから選択される。
【００３３】
好ましくは、Ｒ1は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはその異性体からなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ1は、水素またはメチルから選択される。
【００３４】
本発明のポリマーは、単位（Ｉ）を組み込むホモポリマーであってもよく、あるいは他のポリマー性、オリゴマー性またはモノマー性単位を組み込むコポリマーもしくはブロックコポリマーであってもよい。例えば、ポリマーに組み込まれるさらなるポリマー性単位は、アクリルポリマー、アルキレンポリマー、ウレタンポリマー、アミドポリマー、ポリペプチド、ポリサッカリドおよびエステルポリマーを含み得る。好ましくは、ポリマーがヘテロポリマーである場合、さらなるポリマー性成分は、ポリエチレングリコール、ポリアコニット酸またはポリエステルを含む。
【００３５】
ポリマーの分子量は、理想的には、１００，０００未満、好ましくは５０，０００未満であるべきであり、ここで、ポリマーは、（腎臓閾値（renal threshold）が超えらないように）生理的に可溶性のポリマーとして使用される。
【００３６】
好ましくは、ポリマーの分子量は、５０，０００〜４０００、より好ましくは２５，０００〜４０，０００の範囲内にある。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、以下の単位（II）を含むポリマーである：
【００３８】
【化１５】
0004883515.tif 000003
【００３９】
ここで、Ｒ2は、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリール、カルボン酸およびカルボキシ−Ｃ1-6アルキルから選択され；Ｒ3は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびその異性体からなる群から選択され、Ｚは、ＮＲ4Ｒ5、ＳＲ6およびＯＲ7からなる群から選択されるペンダント基であり、ここで、Ｒ4は、アシル基、好ましくはアミノアシル基またはオリゴペプチジル基であり；Ｒ5は、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリールから選択され；Ｒ6およびＲ7は、水素、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12アルコキシおよびＣ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキルからなる群から選択され、そして１以上の切断可能な結合を含み得、そして生物活性剤へ共有結合され得る。
【００４０】
一般的に、ポリマーは、１．４未満、好ましくは１．２未満の多分散性および１００，０００、好ましくは５０，０００未満の分子量（Ｍｗ）を有する。
【００４１】
好ましくは、Ｒ2は、水素、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ6アルケニル、Ｃ1〜Ｃ6アラルキルおよびＣ1〜Ｃ6アルカリール、Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミドおよびＣ1〜Ｃ6アルキルイミドからなる群から選択される。
【００４２】
好ましくは、Ｒ3は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはその異性体からなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ2は水素であり、そしてＲ3は水素またはメチルである。
【００４３】
Ｚは、ペプチド性基を含み得る。好ましくは、Ｚは、１以上のアミノアシル基、好ましくは、２〜６のアミノアシル基、最も好ましくは４のアミノアシル基を含む。特に好ましい実施形態において、基Ｚは、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン結合を含む。アミノアシル結合は、最も好ましくは、予め選択された細胞性酵素（例えば癌細胞のリポソームにおいてみられるもの）によって切断され得るペプチド結合である。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、基Ｚは、ｃｉｓ−アコニチル基を含む。この基は、中性ｐＨ（約７．４）の血漿中で安定のままであるが、エンドソームまたはリソソームのより酸性の環境（〜ｐＨ５．５−６．５）中で加水分解によって細胞内で分解するように設計されている。
【００４５】
ペンダント鎖Ｚは、さらに、配位子または生物活性剤へ共有結合され得る。配位子は、多価相互作用し得る任意の配位子であり得る。好ましい生物活性剤は、ドキソルビシン、ダウノマイシン、またはパクラキシトール（paclaxitol）のような抗癌剤である。
【００４６】
本発明のさらに好ましいポリマーは、以下の構造（III）を有する：
【００４７】
【化１６】
0004883515.tif 000004
【００４８】
ここで、Ｒ8およびＲ9が、それぞれＲ2およびＲ3と同一の群から選択され、Ｑは、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルキルアミド、Ｃ1〜Ｃ12アルキルイミド、Ｃ1〜Ｃ12アルカノイルからなる群から選択される可溶化基（solubilising group）であり、そしてここで、ｐが５００未満の整数である。
【００４９】
好ましくは、Ｑは、アミン基、好ましくはＣ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキルアミノ基、最も好ましくは２−ヒドロキシプロピルアミノ部分を含む。この基は、水性溶液中でポリマーについての可溶化基であるように設計される。一般的に、本発明のポリマーは、水溶性ポリアクリルアミドホモ−またはコポリマー、好ましくはポリメタクリルアミドまたはポリエタクリルアミドホモ−またはコポリマーである。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明は、ポリマーの製造方法を提供し、該方法は、
化合物（IV）
【００５１】
【化１７】
0004883515.tif 000005
【００５２】
［ここで、Ｒは、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリール、カルボン酸、カルボキシ−Ｃ1-6アルキルからなる群から選択されるか、あるいは、炭素骨格内でまたはそれへ付加されて、ヘテロ原子で置換されたＣ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリールのいずれか１つであり；Ｒ1は、水素ならびにメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびその異性体からなる群から好ましくは選択されるＣ1〜Ｃ6アルキル基からなる群から選択され；Ｘは、アシル化基、好ましくはカルボキシレート活性化基である］の重合を含み；ここで、該方法が、制御ラジカル重合（controlled radical polymerization）であり、
単位（Ｉ）
【００５３】
【化１８】
0004883515.tif 000006
【００５４】
［ここで、ｎは１〜５００の整数である］を含む狭い重量分布（narrow weight distribution）ポリマーを製造する。
【００５５】
好ましくは、Ｒは、水素、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ6アルケニル、Ｃ1〜Ｃ6アラルキルおよびＣ1〜Ｃ6アルカリール、Ｃ1〜Ｃ6アルカノイル、Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミドおよびＣ1〜Ｃ6アルキルイミドからなる群から選択される。
【００５６】
好ましくは、Ｒ1は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはその異性体からなる群から選択される。
【００５７】
重合が原子移動ラジカル重合（atom transfer radical polymerization）によって行われる場合、好適なラジカル開始剤が使用される。このような開始剤は、一般的に、アルキルハライド、好ましくはアルキルブロミドを含む。特に、開始剤は、２−ブロモ−２−メチル−（２−ヒドロキシエチル）プロパノエートである。重合はまた、Ｃｕ（Ｉ）錯体を含む重合メディエーター（mediator）の存在下で行われる。このような錯体は、通常、キレート配位子によって錯化されるＣｕ（Ｉ）Ｂｒ錯体である。典型的なメディエーターは、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（Ｂｉｐｙ）2、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（Ｂｉｐｙ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（ペンタメチルジエチレン）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ［メチル6トリス（２−アミノエチル）アミン］およびＣｕ（Ｉ）Ｂｒ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン）である。
【００５８】
反応は、好適な溶媒の存在下で行われるべきである。このような溶媒は、一般的に非プロトン性溶媒、例えばテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、メチルホルムアミドおよびスルホランならびにその混合物である。あるいは、水が使用され得る。特に好ましい溶媒は、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドならびにその混合物である。
【００５９】
あるいは、重合は、ニトロキシド媒介重合（Nitroxide Mediated Polymerization）によって行われ得る。また、好適なニトロキシド媒介重合開始剤が必要とされる。このような開始剤は、一般的に、
構造
【００６０】
【化１９】
0004883515.tif 000007
【００６１】
［ここで、Ａは、Ｃ1〜Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキルからなる群から選択され、ＢおよびＣは、個々に、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12ヒドロキシルアルキルからなる群から選択され、そしてＮと一緒になってＣ1〜Ｃ12ヘテロ環式基を形成し得、そしてこれは、窒素、硫黄、酸素およびリンから選択されるヘテロ原子を含み得る］
を有する。
【００６２】
好ましくは、Ａは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ベンジル、メチルベンゼン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンまたはその異性体からなる群から選択される。ＢおよびＣは、一般的に、ニトロキシドラジカルを安定化させ得る立体的に込み合った基であるべきである。このような基は、一般的に、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、アダマンチル、メチルベンゼン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンまたはその異性体からなる群から選択される。
【００６３】
一般的な開始剤は、以下に概略される構造を有し、
【００６４】
【化２０】
0004883515.tif 000008
【００６５】
ここで、Ｒ9〜Ｒ11は、Ｃ1〜Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルキルアミド、Ｃ1〜Ｃ12アルキルイミド、Ｃ1〜Ｃ12アルカノイルからなる群から選択される。
【００６６】
また、ニトロキシド媒介重合での使用に好適な溶媒は、上記に記載の非プロトン性溶媒である。あるいは、水が使用され得る。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態は、ポリマーの製造方法を提供し、該方法は、
式（VI）
【００６８】
【化２１】
0004883515.tif 000009
【００６９】
［ここで、Ｒ12は、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキルおよびＣ1〜Ｃ18アルカリール基からなる群から選択される基であり；Ｒ13は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基からなる群から選択され；Ｅは、カルボキシレート活性化基であり、そしてｒは５〜５００の整数である］を有するポリマーと；試薬ＨＲX［ここで、ＲXは、ＮＲ14Ｒ15、ＳＲ16およびＯＲ17からなる群から選択され、ここでＲ14は、アシル基、好ましくはアミノアシル基またはオリゴペプチジル基であり；Ｒ15は、水素、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルケニル、Ｃ1〜Ｃ18アラルキル、Ｃ1〜Ｃ18アルカリール基から選択され；Ｒ16およびＲ17は、水素、Ｃ1Ｃ12アルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、Ｃ1〜Ｃ12アラルキル、Ｃ1〜Ｃ12アルカリール、Ｃ1〜Ｃ12アルコキシおよびＣ1〜Ｃ12ヒドロキシアルキルからなる群から選択され、そして１以上の切断可能な結合を含み得る］との反応を含み、
構造（VII）
【００７０】
【化２２】
0004883515.tif 000010
【００７１】
［ここで、１＜ｓ＜ｒである］
を有する誘導体化ポリマーを形成する。
【００７２】
Ｒ12は、好ましくは、水素、メチル、エチルおよびプロピルからなる群から選択され、Ｒ13は、水素、メチル、エチルおよびプロピルからなる群から選択され、そして好ましくは、Ｒ12は水素でありかつＲ13はメチルである。
【００７３】
Ｅは、Ｎ−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラ−ニトロフェニル、ジニトロフェニル、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ノルボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、５−クロロキニリノ、およびイミダゾールからなる群から選択され、好ましくはＮ−スクシンイミジルまたはイミダゾール、最も好ましくはＮ−スクシンイミジルである。
【００７４】
好ましくは、ＨＲXは、Ｈ2ＮＲ14である。
【００７５】
ＨＲXは、一般的に、Ｅ−Ｏを置換して、ＣＲ13へ結合されたアシル基と共有結合を形成し得る求核試薬である。好ましくは、ＨＲXは、一級もしくは二級アミン基を含む。最も好ましくは、ＨＲXは、上記に記載のアミノアシル結合またはｃｉｓ−アコニチル結合のような切断可能な結合を含む。一般的に、ＨＲXは、（VI）との反応の前に生物活性剤へ共有結合され、続いて構造（VII）を有するポリマーの製造を伴い、ポリマーをクエンチ（quenching）するさらなる工程が行われ得る。これは、前もって未反応化基Ｅをクエンチング基と反応させることを含む。この基は、式ＨＲX'を有し、好ましくは、アミン部分を含み、そして一般的に、ポリマーについての可溶化または溶解性改変（solubility modifying）基であるように選択される。このようなクエンチング化合物は、例えば、親水性試薬、例えばヒドロキシプロピルアミンである。
【００７６】
発明の詳細な説明
本発明は、１．２未満の多分散性を有するポリマーを提供する。ポリマーは、好ましくは、制御ラジカル重合（Controlled Radical Polymerization）によって調製される活性化ポリアクリレートエステルである。これらのポリマーは、誘導体化可能であるように設計され、そして改善した生物学的プロフィールを有するポリマー−薬物複合体（conjugate）を形成するために使用され得る。
【００７７】
本発明の特に好ましいポリマーは、構造（Ｘ）を含む。
【００７８】
【化２３】
0004883515.tif 000011
【００７９】
活性化部分は、Ｎ−スクシンイミジル基である。この特定の基は、溶液中で特に安定であることが見出されており、そして自発的な加水分解に耐える。このポリマーは、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（ペンタメチルジエチレン）メディエーターを使用する原子移動重合（Atom Transfer Polymerization）によって製造され得る。重合は、好適な非プロトン性溶媒を用いたモノマー（IX）の反応を含む。
【００８０】
【化２４】
0004883515.tif 000012
【００８１】
１つの好ましい実施形態において、溶媒はテトラヒドロフランである。別の好ましい実施形態において、溶媒は、ジメチルスルホキシドおよび必要に応じてその混合液中のジメチルホルムアミドである。反応は、好ましくは、窒素雰囲気下、および０〜１５０℃の温度で行われる。好ましい温度範囲は、３０〜８０℃、最も好ましくは５０〜７０℃である。単位（Ｘ）を含むポリマーは、引き続いて、誘導体化され得る。カルボキシル活性化基は、好適な求核試薬で置換され得る。ポリマー薬物複合体を形成するために、単位（Ｘ）をペンダント部分で誘導体化することが好ましい。このような部分は、上記に定義されるようなアミノアシル結合または加水分解的に不安定な結合を含み得る。このような結合は、疾患細胞のリソソームへ侵入すると分解し得、従って、薬物または薬物前駆体は標的部位へ直接放出される。
【００８２】
好ましくは、ペンダント部分は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ結合またはｃｉｓ−アコニチル結合を含む。このようなペンダント結合は、ポリマー誘導体化の前に薬物へ共有結合され得るか、または、ポリマー骨格へのペンダント部分の結合の次に誘導体化され得る。
【００８３】
好ましい実施形態において、単位（Ｘ）を含むポリマーは、１当量未満のペンダント基と反応され、従って、予め特定された数のＮ−スクシンイミジル部分のみを置換する。これは、残存するＮ−スクシンイミジル基を可溶化基で置換する第２のクエンチング工程（quenching step）を可能にする。このような基は、生物学的流体のような水性溶液中でのポリマーの可溶化の助けとなる。好ましいクエンチング剤（quenching agent）は、アミン、例えば２−ヒドロキシプロピルアミンを含むべきである。好ましい反応方法の大要を、以下のスキーム１に提供する。この特定の例において、薬物ドキソルビシンは、ＧＬＦＧ結合を介してポリマーへ結合される。
【００８４】
【化２５】
0004883515.tif 000013
【００８５】
ｎは、１〜５００の範囲内の整数であり、そしてｍは、活性化ポリマーと反応されたペンダント部分の当量数である。
【００８６】
ＣＲＰ法は、線形ポリマーの鎖末端でドーマント開始部分（dormant initiating moieties）を生じることが公知である。特に、ニトロキシド媒介ラジカル重合（nitroxide mediated radical polymerization）の使用は、狭い分子量分布のブロックコポリマーを調製するために使用され得る。これは、ポリマーにおける薬物結合ペンダント鎖のより定義された導入を可能にする。スキーム２に、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）として公知のＣＲＰ法を使用してブロックコポリマー前駆体を調製するこのアプローチの例を略述する。
【００８７】
【化２６】
0004883515.tif 000014
【００８８】
ここで、ｘおよびｙは、それぞれ、ペンダント部分およびクエンチング基の当量数である。
【００８９】
従って、ポリマー前駆体（XI）および（XIII）は、狭い分子量分布を有しかつ異なるｍおよびｎ繰り返し構造を有する複合体を調製の完了を駆動するポリマー類似反応のためのポリマー前駆体として使用されるように設計される。薬物結合は、ｎ繰り返し構造にのみ局在される。また、ポリマー前駆体（XI）から出発して、可溶化ペンダント鎖および薬物結合ペンダント鎖を変化させることが可能である。薬物結合ペンダント鎖の局在を定義することは、より定義されたポリマー−薬物複合体を開発するために必要である。薬物配合の程度および局在ならびにポリマー溶液特性に対するその影響は、重要であり、そして未だにほとんど理解されていない現象であり、そして治療学的ポリマー−複合体のインビボ特性に対する基本的効果を有する。従って、このアプローチは、ポリマー−薬物複合体の開発および最適化においても用途が見出される。
【００９０】
実施例
実施例１
臭化銅（Ｉ），ペンタメチルジエチレン配位子、該構造を有する開始剤，および２−ブロモ−２−メチル−（２−ヒドロキシエチル）プロパノエートおよびモノマー（IX）を、ガラスフラスコ中、ＴＨＦへ添加した。得られた溶液を、窒素でパージし、酸素を除去した。フラスコを密封し、そして７０℃でオイルバス中に２４時間置いた。サンプルを、銅成分を除去するために、中性酸化アルミニウムカラムを通過させるゲル透過クロマトグラフィーのために調製した。分析によって、２０，０００の分子量を有するポリマーの生成が明らかとなる。この活性エステルホモポリマーのサンプルを、１−アミノプロパノールでクエンチして、水溶性ポリマーを得、この1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ポリ（ＨＰＭＡ）のものと一致した。図１は、慣用のフリーラジカル重合から調製されたＨＰＭＡホモポリマーのゲル透過クロマトグラムと、原子移動ラジカル重合を使用して調製された１−アミノプロパノールクエンチ化ポリ（メタクリロイルスクシンイミド）のそれとを比較する。
【００９１】
実施例２
狭い分子量分布（ＭＷＤ）ホモポリマー前駆体３の合成。（Ａ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でのホモ重合ならびに（Ｂ）テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびアセトン中での重合。
【００９２】
【化２７】
0004883515.tif 000015
【００９３】
メタクリルオキシスクシンイミド１の合成
ジクロロメタン（１２ｍｌ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．６ｇ、５７ｍｍｏｌ）へ、５℃未満の温度に維持したメタクリロイルクロリド（６．０ｇ、５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１２ｍｌ）溶液と同時にトリエチルアミン（５．８ｇ、５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１２ｍｌ）を滴下した。完全に添加した後、反応混合物を、さらに、１時間攪拌し、次いで、炭酸水素ナトリウム水溶液（０．１Ｍ）および水（×３）で洗浄した。次いで、有機相を単離し、そして硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を除去し、白色生成物が残り、これを酢酸エチル：ヘキサンから再結晶させた。質量８ｇ、融点＝１０２℃。（1Ｈ，５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：２．００（３Ｈ，ｓ，ＣＨ3），２．８４（４Ｈ，ｓ，（ＣＨ2）2），６．０９（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ2），６．３４（1Ｈ，ｓ，＝ＣＨ2）。
【００９４】
（Ａ）ＤＭＳＯ中での均一重合：ホモポリマー性前駆体−ポリ（メタクリルオキシスクシンイミド）の合成（１→３）
モノマー１における５６％の好ましい重量濃度で溶媒としてＤＭＳＯを使用する典型的な銅媒介重合において、臭化銅（Ｉ）（３１．３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、２−２’−ビピリジン（Ｂｐｙ）（６８．３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびモノマー１（２．００ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコへ添加し、次いで、これをセプタムで密封した。次いで、フラスコ中へ、ＤＭＳＯ（１．３ｇ）を注入した。得られた褐色混合物を、溶液が形成されるまで穏やかに加熱し、次いで、アルゴンで約５分間パージした。ＤＭＳＯ（０．２ｇ）中の２−ブロモ−２−メチル−（２−ヒドロキシエチル）プロパノエート２（４６．１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のアルゴンパージした溶液を、次いで、混合物へ注入し、そしてフラスコをオイルバス中１００℃まで加熱した。反応混合物は数分後に粘性となり、そして、これを１０〜１５分後に加熱から除き、そして迅速に冷却した。ポリマー生成物を、７〜８ｍｌのＤＭＳＯを添加して粗生成物混合物を溶解することによって単離し、これをゆっくりとアセトン（１００ｍｌ）の攪拌溶液へ添加し、ホモポリマー性前駆体３が白色固体として沈殿した。アセトン溶液は、ポリマー３の沈殿の間に、銅化学種および配位子の溶解に起因して、緑色へと変化した。原子吸光分析は、ＤＭＦ中２８．０ｍｇ／ｍｌの濃度の場合に、ポリマー３中の銅含有量が０．１５３ｐｐｍであることを示した。ＤＭＳＯ反応溶液からアセトン中へのポリマー３の沈殿は、生成物ポリマーから銅を除去するために銅媒介重合において典型的に使用されているアルミナクロマトグラフィーの実行可能な代替法を提供し得る。ポリマー３の単離収量は、１．７８ｇ（８９％）であった。数平均分子量は、２２，７００ｇ／ｍｏｌであり、そして多分散性指数（polydispersity index）は１．２０であった。ポリ（メタクリルオキシスクシンイミド）３についての見かけの分子量および分子量分布を、Ｇｉｂｓｏｎ  １３３屈折率検出器へ連結されたＷａｔｅｒｓ  Ｓｔｙｒａｇｅｌ  ＨＲ４およびＨＲ３（７．３×３００ｍｍ）カラム、ポリ（メチルメタクリレート）ＰＭＭＡ校正標準（calibration standard）、ならびに０．１％ＬｉＣｌを含むＤＭＦ溶出液を使用して、決定した。
【００９５】
重合を、種々の比のモノマー１および開始剤２で行い、種々の分子量を有する狭いＭＷＤホモポリマー性前駆体３を得た。これらの実施例を表１に列挙し、そしてメタクリルオキシスクシンイミド１が２〜６ｇの範囲にわたる反応スケールにおいて行った。ＤＭＳＯにおけるこれらの均一重合条件は、数分足らずでポリマー３を与えたことにもまた注意する（例えば、表１における実験６を２分後にクエンチし、かなりの収量の狭いＭＷＤポリマー３を得た）。
【００９６】
重合を、８０〜１３０℃の範囲の温度で行い、３３〜９１％にわたる溶媒に対するメタクリルオキシスクシンイミド１の重量比で、溶液均質性（solution homogeneity）を維持した。好ましい溶媒はＤＭＳＯであるが、ＤＭＦを用いて同様の結果が得られた。モノマー１の極性溶媒（ＤＭＳＯまたはＤＭＦ）に対する重量比は、重合の結果のために重要である。ＤＭＳＯ中５６％未満（例えば、５０および４１％）のモノマー１の重量比は、より低い収率のポリマーを生じた（それぞれ、５２および４０％）。ＤＭＳＯ中のモノマー１の６０％より高い重量濃度で、重合溶液は固化した。同様にＤＭＦにおいて、モノマーの重量濃度は、重合反応の結果に重要であるが、しかし、ＤＭＦ中の最大収率はＤＭＳＯ中よりも少なかった。５０％収率のポリマー３を、６１％のモノマー１：ＤＭＦ重量比で単離した。反応を３３％のモノマー１重量比で行った場合、ポリマーは単離されなかった。より高いモノマー重量濃度（７５％を超える）で、反応混合物は固化した。
【００９７】
【表１】
0004883515.tif 000016
【００９８】
（ａ）開始モノマーおよび開始剤濃度の比。
（ｂ）反応は、２．５分後に、ＤＭＳＯでの希釈および迅速な冷却によって停止した。
【００９９】
（Ｂ）ＴＨＦおよびアセトン中での重合
溶媒（例えば、ＴＨＦ、酢酸エチルおよびアセトン）中でのモノマー１の銅媒介重合はまた、狭いＭＷＤポリマー３を与えた。収率は、ポリマーの分子量に依存して１０〜９５％の範囲であった。１０，０００ｇ／ｍｏを超える分子量で、その収率は、重合をＤＭＳＯまたはＤＭＦにおいて行った場合に観察されたものよりも低かった。このより低い収率は、ポリマー３の成熟前沈殿（premature precipitation）のために生じた。モノマー１における０．５ｇ使用する例示の銅媒介重合を、ＴＨＦ中、１６時間にわたって、７０℃で行った。これらのＴＨＦ反応において使用した銅キレート化配位子は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）であった。
【０１００】
【表２】
0004883515.tif 000017
【０１０１】
（ａ）開始モノマーおよび開始剤濃度の比。
【０１０２】
アセトンにおける銅媒介重合により、５５：１：１：２の１：２：ＣｕＢｒ：Ｂｐｙ比を使用した場合、９５％収率のポリマー３を得た。この比を１００：１：１：２へ変えた場合、３０％収率のポリマー３が得られた。
【０１０３】
実施例３．狭いＭＷＤポリ（メタクリル酸）ＰＭＡＡナトリウム塩４を与える、狭いＭＷＤホモポリマー性前駆体３の加水分解
ＧＰＣによるＰＭＡＡ４の絶対分子量の決定−これは、ホモポリマー性前駆体３および前駆体３から誘導されるポリマーの絶対分子量を与えるために使用され得る重合度（ＤＰ）を与える。
【０１０４】
【化２８】
0004883515.tif 000018
【０１０５】
ポリマー性前駆体，ポリ（メタクリルオキシスクシンイミド）３（見かけ上の数平均分子量２４，８００ｇ／ｍｏｌ；多分散性指数１．２０；ＤＭＦ溶出液およびＰＭＭＡ校正標準（calibration standard）を使用するＧＰＣによって決定した）のサンプルを、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）ナトリウム塩４へ加水分解して、狭いＭＷＤ  ＰＭＡＡナトリウム塩４を調製するために前駆体３をいかに使用するかを実証し、そして３の絶対分子量のよりよい表示を得た。前駆体３の絶対分子量を知ることは重要であり、何故ならば、次いで、前駆体３から誘導される任意のポリマーの絶対分子量を知ることが可能であるからである。
【０１０６】
ポリ（メタクリルオキシスクシンイミド）３（１ｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、そして水酸化ナトリウム水溶液（０．６６ｇ、３ｍｌ  Ｈ2Ｏ）を滴下し、ポリマーを沈殿させた。反応容器は、迅速に暖かくなり、そして均一な溶液が続いた。水（３ｍｌ）を反応溶液へ添加し、次いでこれを７０℃で２４時間加熱し、その後、さらに水（約５０ｍｌ）を添加した。溶液を、再生セルロース膜（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ，ＭＷＣＯ  ２０００）を使用して水に対して透析した。透析溶液の凍結乾燥によって、白色固体生成物４（０．３ｇ）を得、これは、狭いＭＷＤ  ＰＭＡＡナトリウム塩の市販のサンプルと一致する赤外スペクトルを有した。ＰＭＡＡナトリウム塩４の分子量を、溶出液としてｐＨ８．５のリン酸緩衝溶液およびＰＭＡＡナトリウム塩校正標準を用いてのＧＰＣによって決定した。ＧＰＣ校正標準は、前駆体３の加水分解により単離したＰＭＡＡナトリウム塩４の場合と同一であったので、得られた分子量は、ポリマー４の絶対分子量であった。この実施例についてのＰＭＡＡ４の絶対数平均分子量は、１．２０の多分散性指数を有する２２，０００であった。
【０１０７】
この値を使用して重合度（ＤＰ）を決定し、３から誘導された任意のポリマーについての繰り返し単位の数が分かった。ＰＭＡＡナトリウム塩４の繰り返し単位分子量は１０８であるので、このサンプルについてのＤＰは約２０３であった（すなわち、２２，０００ｇ／ｍｏｌ÷１０８ｇ／ｍｏｌ）。これは、前駆体３についてのＤＰが２０３であることを意味し、そして前駆体３の繰り返し単位の分子量が１８３ｇ／ｍｏｌであるので、この実施例における前駆体３の絶対数平均分子量は３７，１４９ｇ／ｍｏｌであった（すなわち、１８３ｇ／ｍｏｌ’２０３）。前駆体３のＤＰについての２０３の値は、３から誘導されるポリマーの絶対分子量を決定するために類似の様式で使用され得る。
【０１０８】
実施例４  狭いMWDのポリメタクリルアミドを製造するための、アミンと狭いMWDホモポリマー前駆体の結合。  ポリメタクリルアミド５を得るための前駆体３と１−アミノ−２−プロパノールとの反応。
【０１０９】
【化２９】
0004883515.tif 000019
【０１１０】
ポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド）３（０．２ｇ、多分散性指数１．２、ＧＰＣ、ＤＭＦ溶離液、ＰＭＭＡ校正標準）のDMF（３ｍｌ）中に、１−アミノ−２−プロパノール（０．１６ｍｌ、２．１ｍｍｏｌ）を撹拌下、０℃にて滴下した。前記溶液を室温になるまで放置して暖めた後、５０℃で１６時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、ゆっくりとアセトン（２０ｍｌ）に加え固形の生成物を沈殿させた。生成物を、メタノールから６０：４０（ｖ／ｖ）アセトン：ジエチルエーテルへの二回目の沈殿によりさらに精製し、水溶性のポリメタクリルアミド５を、白色固体として得た（多分散性指数１．３；ＧＰＣ、リン酸緩衝溶離液、ポリ（エチレングリコール）校正標準）。１−アミノ−２−プロパノールの反応を、ＩＲにより追跡した。図１に示されるように、重ね合わせたIRスペクトルは狭いMWDのホモポリマー前駆体３の１７３５ｃｍ-1における活性エステルＩＲバンドが、ポリメタクリルアミド５を得るために１−アミノ−２−プロパノールを加えると消失することが示されている。
【０１１１】
図３は、狭いMWDのホモポリマー前駆体３からこの実施例で得られた狭いMWDのポリメタクリルアミド５のGPC溶出図（elutagramme）を示し、６の慣用のフリーラジカル重合により生成されたポリメタクリルアミド５のGPC溶出図と重ね合わされている。モノマー６から慣用のフリーラジカル重合により調製されるときポリメタクリルアミド５は細胞毒性がないということが知られている。図４は、前駆体３から調製した狭いMWDのポリメタクリルアミド５も細胞毒性がないことを確かめている。
【０１１２】
【化３０】
0004883515.tif 000020
【０１１３】
両方のポリメタクリルアミド５試料は、細胞毒性のコントロールとして用いられているポリリジンと比べて、このアッセイにおいて細胞毒性を示していない。デキストランが非細胞毒性コントロールとして用いられる。
【０１１４】
ジエチルアミン、プロピルアミン及びアミノ酸のメチルエステルを含む異なるアミン類を、狭いMWDのホモポリマー前駆体３に結合させ、ホモポリマー性の狭いMWDのポリメタクリルアミドを得る。添加したアミン（下記の例では、グリシンメチルエステル）の化学量論の関数として、１７３５ｃｍ-1における前駆体３の活性エステルのＩＲバンドの対応する減少により図５に示されるように、当量未満のアミンと有効に結合して７のようなコポリマーを得ることが可能である。
【０１１５】
【化３１】
0004883515.tif 000021
【０１１６】
図５は、狭いMWDのホモポリマー前駆体３をグリシンメチルエステルで示される異なる化学量論を用いた反応から誘導された狭いMWDのコポリマー複合体７を生成するための一連の反応の吸光度モードにおける重ね合わせたＩＲスペクトルを示す。１７３５ｃｍ-1における実際の活性エステルピークの高さの減少は、２５．７、５３．７及び７４．７％であり、グリシンメチルエステルのそれぞれ０．２５、０．５０及び０．７５当量という化学量論の増加に対応していた。この実験は、狭いMWDのホモポリマー前駆体３への異なる化学量論のアミンの結合をモニターできることを示している。
【０１１７】
下記の実験は、狭いMWDのホモポリマー前駆体３を使用して狭いMWDのコポリマー性ポリ（メタクリル酸コメタクリルアミド類）９を調製できることを示している。
【０１１８】
【化３２】
0004883515.tif 000022
【０１１９】
方法
狭いMWDのホモポリマー前駆体、ポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド）３（0.3g、反応性基の１．６mmol）をDMSO（１ｍｌ）中に含むアルゴンパージしたバイアルに、１−アミノ−２−プロパノール（３つの別々の反応；０．２５eq、３２ｍｌ、４．１mmol；０．５eq、６３ｍｌ、８．２mmol及び０．７５eq、９５ｍｌ、１２．２mmol）を、撹拌下で滴下した。次いでバイアルを５０℃に３時間加熱し、それぞれの反応溶液のＦＴ−ＩＲスペクトルを取り、予測される量の１−アミノ−２−プロパノールが前駆体３に結合し、コポリマー中間体８を得ることを確認した（図６）。その後反応溶液にＮａＯＨ水溶液（１．６ｍｌ、１Ｎ）を加えた。溶液は添加によりあたたかくなり、すぐに粘性が減少した。ＩＲ分光法により１７３５ｃｍ-1における活性エステルバンドが消失したことにより加水分解を確認した。５時間撹拌した後、水（約５０ｍｌ）を加え、溶液を再生セルロース膜（SpectraPor, MWCO 2000）を用いて水に対して透析した。透析溶液を凍結乾燥して狭いMWDのコポリマー性ポリ（メタクリル酸コメタクリルアミド類）９を、白色固体生成物として得た。それぞれ質量＝０．２２ｇ、０．２３ｇ及び０．２ｇ。
【０１２０】
図６は、狭いMWDのホモポリマー前駆体３の１−アミノ−２−プロパノールの示される異なる化学量論との反応に由来する中間体である，狭いMWDのコポリマー複合体８を生成するための一連の反応について吸光度モードにおける重ね合わせたＩＲスペクトルを示す。１７３５ｃｍ-1における実際の活性エステルピークの高さの減少は、２６．０、５２．９及び７６．４％であり、１−アミノ−２−プロパンのそれぞれ０．２５、０．５０及び０．７５当量という化学量論の増加に対応していた。この図は、１当量の１−アミノ−２−プロパノールを添加することにより活性エステルバンドが減少することも示す。実際の減少は９９．９％であった。この実験は、コポリマー中間体８を化学的に官能基化し、官能基化した狭いMWDポリ（メタクリル酸コメタクリルアミド類）９を得ることができるというさらなる利点を伴った、異なる化学量論のアミン類の狭いMWDのホモポリマー前駆体３に対する結合をモニターできることを再び示す。
【０１２１】
実施例５  水溶性コポリマー複合体を調製するための狭いMDWホモポリマー前駆体３の使用。
【０１２２】
水溶性複合体１２の調製。構造１１及び１２における文字Ｇは、グリシンに対する慣用の一文字略号である。
【０１２３】
【化３３】
0004883515.tif 000023
【０１２４】
ポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド）３（１００ｍｇ、反応性基０．５５mmol）、モデル薬物誘導体、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−β−ナフチルアミド・ＨＢｒ・０．６Ｈ2Ｏ１０（１９ｍｇ、０．０６mmol、０．１eq.、１０％配合）及びマグネチックフレア（magnetic flea）を１．５ｍｌのバイアルに加えた。該バイアルを、セプタムが中心となるスクリューキャップ蓋（septum centred screw cap lid）で密封し、アルゴンで約２分パージした。次いでDMSO（０．４ｍｌ）をアルゴン下でバイアルに注入し、バイアルをマグネチックスターラーに置いた。いったん溶液が得られると、溶液の小さな試料をアルゴン下でシリンジを通して除き、直ちにFR−IR分光法に供した。次いで、トリエチルアミン（１５．２ｍｌ、０．１１mmol、２  salt eq.）をアルゴン下でバイアルに加え、バイアルを５０℃にて２時間３０分オイルバス中に置いた。冷却後、溶液の試料をアルゴン下でバイアルから除き、直ちにFR−IR分光法に供し、１７３５ｃｍ-1における活性エステルピークの対応する１０％減少が起こっていることを明確にすることにより、１０の添加を確認した。コポリマー中間体１１を含有する反応溶液に１−アミノ−２−プロパノール（８２ｍｇ、１．１mmol、２eq.）を加え、該溶液を５０℃にて１時間１５分加熱した。水溶性コポリマー複合体１２を、DMSO反応溶液のアセトン：ジエチルエーテル（５０：５０ｖ／ｖ）への沈殿により単離し、メタノールからのアセトン：ジエチルエーテル（５０：５０  ｖ／ｖ）への沈殿によりさらに精製した。
【０１２５】
図７は、複合体１２を調製するためのこの一連の反応中の活性エステルピークにおける変化を示す、重ね合わせたＩＲスペクトルを示す。これら３つのＩＲスペクトルは、１７３５ｃｍ-1における活性エステルバンドの高さの減少、並びにアミドＩ及びＩＩピークの発生を示す。スペクトル(A)は開始前駆体３であり、スペクトル(B)は１０の添加後に活性エステルバンドの高さの１０％減少を示し、スペクトル(C)は、１０の１０％添加を伴うMWDコポリマー複合体１２を得るための１−アミノ−２−プロパノール添加後の活性エステルバンドの完全な消失を示す。
【０１２６】
図８は、複合体１２を調製するための同じ反応手順についての重ね合せたIRスペクトルを示す。この実験は、同じ狭いMWDホモポリマー前駆体３を用いて、薬剤成分の異なる配合量を伴って複合体を調製できることを示す。この実験において、０．２５当量のアミン１０を０．１当量に代えて用いると、１７３５ｃｍ-1におけるピークは約２５％の高さ減少を示す。実質的に競合する加水分解反応が存在しないことを確かめるために、中間体反応溶液をさらに１２時間５０℃にて撹拌し続け、活性エステルピークのさらなる減少が起こらないことを確かめた。
【０１２７】
図８は、１０の２５％配合量での狭いMWD複合体１２の製造を示す。スペクトル(A)は開始前駆体３であり、スペクトル(B)は１０の添加後に１７３５ｃｍ-1における活性エステルバンドの高さが２５％減少したことを示し、スペクトル(C)は、１１の中間体反応溶液をさらに１２時間５０℃にて撹拌した場合に、活性エステルピークがさらに減少しないことを示し、スペクトル(D)は、１０の２５％配合量を伴う，狭いMWDコポリマー複合体１２を得るために１−アミノ−２−プロパノールを添加した後に活性エステルバンドが完全に消失したことを示す。
【０１２８】
第二段階に異なるアミンを用いて実施例５の一連の反応を行った。これは、同じ狭いMWDホモポリマー前駆体３を用いて、異なる溶液特性を有するであろう複合体を得るためにペンタント鎖分子を修飾して異なる物性を結合することが可能であるというコンセプトを実証する。下記の２つの反応手順では、手順の第二の結合反応での１−アミノ−２−プロパノールの代わりに、アミノエタノール及び１−アミノ−２，３−プロパン−ジオールをそれぞれ用いた。
【０１２９】
図９及び１０は、それぞれの反応手順をモニターするために得られた、重ね合わされたIRスペクトルを示す。
【０１３０】
図９は、１０の２５％配合量での狭いMWD複合体１３の調製を示す。スペクトル(A)は開始前駆体３であり、スペクトル(B)は１０の添加後に活性エステルバンドの高さが２５％減少したことを示し、スペクトル(C)は、１１の中間反応混合物をさらに１２時間５０℃にて撹拌した場合に、１７３５ｃｍ-1での活性エステルバンドの高さがさらに減少しないことを示し、スペクトル(D)は、１０の２５％配合量を伴う，狭いMWDコポリマー複合体１３を得るためにエタノールアミンを添加した後に活性エステルバンドが完全に消失したことを示す。
【０１３１】
図１０．  １０の２５％配合量での狭いMWD複合体１４の調製。スペクトル(A)は開始前駆体３であり、スペクトル(B)は１０の添加後に活性エステルバンドの高さが２５％減少したことを示し、スペクトル(C)は、１１の中間体反応溶液をさらに１２時間５０℃にて撹拌した場合に、１７３５ｃｍ-1での活性エステルバンドの高さがさらに減少しないことを示し、スペクトル(D)は、１０の２５％配合量を伴う，狭いMWDコポリマー複合体１４を得るためにエタノールアミンを添加した後に活性エステルバンドが完全に消失したことを示す。
【０１３２】
狭いMWDの複合体１５を得るためにアミン１０の一当量（１００％配合量）を用いた１つの実験を、狭いMWDホモポリマー前駆体３は各繰返し単位上に反応中心を有しているので、前駆体３を用いた生物活性剤の結合が効果的であることを示すためのさらなる例として実施した。この実験はまた、残存する反応部位が比較的少ないので、いったん９５％の組み込みが起こるとアミンの反応がより遅い速度を有するかもしれないことを実証する。これが、第二級アミンを過剰量加える結合反応が狭いMWD、水溶性コポリマー複合体（例えば１２，１４、及び１５）をつくることが重要である理由である。狭いMWDホモポリマー複合体１５を調製する反応をモニターして得られる，重ね合わせられたIRスペクトルを、図１１に示す。
【０１３３】
図１１は、１０の１００％配合量における狭いMWD複合体１５の調製を示す。スペクトル(A)は開始前駆体３であり、スペクトル(B)は１０の添加後１時間後のに活性エステルバンドの高さが約９５％減少したことを示し、スペクトル(C、D及びE)は、反応を各々、全部でそれぞれ２，３．５及び４．５時間５０℃にて撹拌した場合に、１７３５ｃｍ-1での活性エステルバンドの高さがさらに減少し続けることを示し、スペクトル(E)は、１０の１００％配合量を伴う，狭いMWDホモポリマー複合体１５を得るために反応混合物を全部で１６時間５０℃で撹拌した後に活性エステルバンドが完全に消失したことを示す。
【０１３４】
実施例６．  鎖伸張反応．ポリ（メタクリルオキシスクシンイミド−コ−メタクリルオキシスクシンイミド）１６の合成
銅媒介重合によるブロックコポリマーの調製のために前提条件は、開始剤（例えば２）を添加することなく狭いMWDのブロックを得るためのさらなる重合反応をドーマントの鎖末端基が開始することを示すことである。
【０１３５】
【化３４】
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【０１３６】
臭化銅（Ｉ）（４．８ｍｇ、０．０３mmol）、ビピリジン（１０．４ｍｇ、０．０６mmol）、メタクリルオキシコハク酸イミド１（１ｇ、５．５mmol）及び銅媒介重合により予め調製されたポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド）３（０．５ｇ、数平均分子量３３，８００g/mol；多分散性指数１．１５、GPC、DMF溶離液、PMMA校正標準）を含有するアルゴンでパージされた容器に、DMSO（０．２５ｇ、アルゴンパージにより予め脱気）を添加した。容器に栓をし、１３０℃にて約１０分間加熱した。冷却後、さらにDMSO（約７ｍｌ）を添加し、内容物を溶解させ、それをアセトン溶液にゆっくりと添加し、ブロックコポリマー１６を沈殿させ、収集し、真空乾燥し、白色固体（１．１ｇ、７３％）を得た。GPC分析は、開始ポリマーの伸長が起こり、新たな二番目のブロックを得て、数平均分子量９６，５００g/molで多分散性指数１．１（DMF溶離液、PMMA校正標準）であるポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド−コ−メタクリルオキシコハク酸イミド）１６が生成したことを示した。
【０１３７】
可能な競合する熱による開始を厳密に調べるための別の実験において、モノマー１をDMF中で単独で８０及び１１０℃にて８〜２４時間撹拌した。これは高い多分散性指数（＞２．５）のいくつかのポリマーを形成する結果となった。実施例２では、モノマー１の銅媒介重合は直ちに完了することを既に明らかにした。この実施例の反応（１＋３――＞１６）はまた、非常に速い（１０分）と思われ、狭いMWDのブロックコポリマーが得られ、ポリマーブロック形成に必要なドーマント(dormant)鎖末端基の存在が確認される。
【０１３８】
図１２は、実施例６に記載された鎖伸長反応の開始ポリマーとして用いられた狭いMWDのポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド）３（“A”と標識する）のGPCを示す。“B”と標識されたGPCは、ポリ（メタクリルオキシコハク酸イミド−コ−メタクリルオキシコハク酸イミド）１６を得るための鎖伸長反応を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、慣用のフリーラジカル重合に関連する幅広い分子量分布が、ＡＴＰを使用して大いに改善され得ることを示す。
【図２】  １−アミノ−２−プロパノールとの反応前後での狭いＭＷＤホモポリマー前駆体３の重ね合わせた（superimposed）ＩＲスペクトル。
【図３】  前駆体３と１−アミノ−２−プロパノール（２．０当量）の反応から誘導された狭いＭＷＤポリメタクリルアミド５（“Ａ”で標識）についてのＧＰＣ。“Ｂ”で標識したＧＰＣは、開始剤としてＡＩＢＮを使用してのアセトン中での慣用のフリーラジカル重合によって調製した５について得られた。
【図４】  狭いＭＷＤホモポリマー性前駆体３から調製された狭いＭＷＤポリアクリルアミド５ならびにモノマー６の慣用のフリーラジカル重合によって調製されたポリメタクリルアミド５の、Ｂ１６Ｆ１０細胞株を使用しての細胞傷害性アッセイ。
【図５】  狭いＭＷＤコポリマー複合体７を製造する一連の反応についての吸光度モード（absorbance mode）における重ね合わせたＩＲスペクトル。
【図６】  中間体の狭いＭＷＤコポリマー複合体８を生成する一連の反応についての吸光度モードにおける重ね合わせたＩＲスペクトル。
【図７】  複合体１２を調製するこの一連の反応の間の活性エステルピークの変化を表示する重ね合わせたＩＲスペクトル。
【図８】  １０の２５％配合での狭いＭＷＤ複合体１２の調製。
【図９】  １０の２５％配合での狭いＭＷＤ複合体１３の調製。
【図１０】  １０の２５％配合での狭いＭＷＤ複合体１４の調製。
【図１１】  １０の１００％配合での狭いＭＷＤ複合体１５の調製。
【図１２】  実施例６において記載される鎖伸長反応における出発ポリマーとして使用される狭いＭＷＤポリ（メタクリルオキシスクシンイミド）３（“Ａ”で標識）についてのＧＰＣ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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