(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0005081346.tif 000006
（ここで、Ｒ＝ＣＨ３である）で表される化合物。
【請求項２】
有効成分として請求項１記載の化合物を含有する、酸化防止剤。
【請求項３】
有効成分として請求項１記載の化合物を含有する、酸化防止活性を有する医薬組成物。
【請求項４】
一般式（Ｉ）
【化１】
0005081346.tif 000007
（ここで、Ｒ＝Ｈ又はＣＨ３である）で表される化合物を製造する方法において、植物アジュガ・レプタンスから細胞培養物を得た後、続いて、該培養物を、好気的条件下、同化可能な炭素及び窒素源、及び無機塩を含有する液体培地中での培養に供することを特徴とする、化合物の製法。
【請求項５】
好気的条件下での培養を、ｐＨ５−７、温度１８−３２℃及び期間８−２０日で行なう、請求項４記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般式（Ｉ）
【０００２】
【化１】
0005081346.tif 000002
【０００３】
（ここで、ＲはＨ又はＣＨ３である）で表される化合物に係る。
【０００４】
以下の記載では、一般式（Ｉ）においてＲ＝Ｈである化合物をＦＰＡと称する。
【０００５】
一方、Ｒ＝ＣＨ３である化合物をＦＰＢと称する。
【０００６】
ＦＰＡ（フェニルプロパノイドグルコシド）は既に記載され、チューポリオサイド（teupolioside）と称されており（Chem. Nat. Compd. 1991, 27:5 556-559）、植物チュークリウム・ポリウム（Teucrium polium）中に存在し、二次代謝物として抗菌活性を有する。しかしながら、他の異なる植物中又は各種の植物の「インビトロ」細胞培養物中におけるＦＰＡの存在はこれまで全く記載されていない。
【０００７】
一方、ＦＰＢは、これまで全く文献に記載されていない化合物であり、したがって、これ自体が本発明の目的物である。本発明の第１の態様によれば、化合物ＦＰＡ及びＦＰＢ（これらを合わせて、ＦＰｓ又は粗製ＦＰｓと称する）の製法が提案される。
【０００８】
これは、植物アジュガ・レプタンス（Ajuga reptans）から採取された細胞系の培養細胞でなる。この植物種については、Cantino-Sanders, Syst. Bot. Vol.11 (1986), p.163-185を参照できる。
【０００９】
本発明によれば、この植物の各部分（葉、枝及び根）を、７０％エタノールで５分間、２％次亜塩素酸ナトリウムで２分間、及び０.２％塩化第二水銀で４５秒間連続洗浄することによって殺菌する。各殺菌剤での洗浄後に、処理した各部分を滅菌蒸留水で洗浄する。
【００１０】
葉、枝及び根を片に切断し、１mg/ｌナフタレン−酢酸、１mg/ｌカイネチン、０.２ｇ/ｌ ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（Ｇ５培地）及び７ｇ/ｌ寒天を含有するGamborg Ｂ５培地（O.L. Gamborgら, Exp. Cell. Res. 50, (1968), p.151）に滅菌植付けし、暗所で２８℃に維持する。
【００１１】
１０−１５日後、未分化組織（カルス）が成長し、さらに２０−３０日後、これらを同じ培養基の寒天斜面培地に移植する。良好な成長培養物を得るためには、通常、暗所で２８℃において２０日間培養することが必要である。２又は３の継代後に安定化された培養物が得られ、懸濁状培地への接種材料として使用される。
【００１２】
固体培地上で成長した培養物（未分化カルス培養物）は、無色の容易に離散可能な細胞の小さいマスでなる。楕円−球形状の細胞は直径５０−100μmを有する。上記条件下では、培養されつつあるカルスは器官形成のサイン又は分化プロセスを何ら示さない。強さ少なくとも2000ルクスの光にさらされる際には、カルスはクロロフィルの生合成のため緑色になる。しかしながら、露光はフェニルプロパノイドの生合成には影響を及ぼさない。
【００１３】
液体培地中で培養される際には、アジュガ・レプタンスの未分化カルス培養物は、５−５０個の細胞でなる小さい凝集体として成長する。細胞は固体培地上で成長したものと同じ形状及びサイズを有する。
【００１４】
したがって、カルス約１−２ｇ（そのままの重量）を、液体Ｇ５培地５０mlを収容する300 ml三角フラスコに移すことができる。120回転／分で回転する軌道撹拌機を有するトロリー上において、暗所にて２８℃で２８日間インキュベートした後、培養物の乾燥重量は約１５mg/mlであり、植物培養物５mlを、それぞれ液体Ｇ５培地５０mlを収容する三角フラスコに接種する。これらの培地を、トロリー上において、120回転／分で軌道撹拌しながら、暗所にて２３℃で１０−１４日間インキュベートする。
【００１５】
本発明の方法によれば、細胞を液体培地中で培養する。一般に、ガラス又は他の材料（例えば、ステンレス鋼）でなるフラスコ又はファーメンターが採用される。液体培地は、同化可能な炭素源、有機又は無機窒素の同化可能な源、無機塩及び、任意に、植物ホルモン及び／又はビタミンを含有する栄養溶液である。同化可能な炭素源は、スクロース、フルクトース、グルコース、デンプン、デキストリン、グリセリン、マンニトール及びマンノースの如き炭水化物でなる。
【００１６】
有機又は無機窒素の同化可能な源は、アミノ酸又はその混合物、ペプチド又はタンパク質又はそれらの水解物、カゼイン水解物、アルコールの製造におけるトウモロコシ又は小麦の蒸留残渣の如き穀類の水溶性フラクション、又は酵母及び無機硝酸塩及び無機アンモニウム塩でなる。
【００１７】
本発明の方法は、代表的には、例えば、撹拌したフラスコ内、又は通気ファーメンター内において、懸濁状培地中、ｐＨ５−７、好ましくは６.５、温度１８−３６℃、好ましくは２３℃において行われる。
【００１８】
最良の培養条件は、一般に、暗所、ｐＨ５.５−６.５及び温度１８−３２℃、期間８−１６日である。粗製ＦＰｓの生成は生育２−３日後に始まり、１０−１４日後に最大に達する。
【００１９】
粗製ＦＰｓの抽出は、細胞又は培養培地又は「in toto」培養物を原料として行われる。
【００２０】
粗製ＦＰｓは、濾過した細胞から又は「in toto」培養物から水と混和性の溶媒、例えば、メタノール、エタノール又はアセトンによって抽出される。また、粗製ＦＰｓは、細胞から分離した培養培地から固相における抽出手段によって抽出される。
【００２１】
下記の実施例の目的は、その精神を限定することなく本発明を説明することにある。
【００２２】
【実施例１】
Ｇ５培地（そのｐＨを希ＫＯＨ溶液によって６.５とした）５０mlを収容する300 ml三角フラスコ内において処理を行なう。フラスコを、偏心４cmをもって120回転／分で回転する撹拌機において撹拌した。最適インキュベーション温度は２８℃である。フラスコに、固体Ｇ５培地上での生育１４日のアジュガ・レプタンスの細胞系の細胞（ＣＭ７５と略称する）を接種した。７日後、培養物５mlを、同じ培地５０mlを収容するフラスコに滅菌状態で移植した。さらに１４日後、HPLCにおいて測定した粗製ＦＰｓの生成量は２.２ｇ/ｌであった。
【００２３】
同容量のメタノールを、100個のフラスコから得られた懸濁状の細胞培養物５ｌに添加し、ついで、均質化し、遠心処理した。
【００２４】
沈降物を水１ｌ及びメタノール２ｌに添加し、２回再抽出した。上澄液を合わせ、減圧下で５ｌに濃縮し、水性懸濁液をＸＡＤ樹脂カラムを通過させた。水３ｌ及び２０％メタノール２ｌで洗浄した後、吸着された物質をメタノール３ｌで溶出した。
【００２５】
粗製ＦＰｓ10.8ｇを含有する有機溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を水で希釈し、Ｃ１８樹脂の逆転相カラムに負荷した。
【００２６】
１０％アセトニトリル水溶液での溶出によりＦＰＡ７.１ｇが得られ、さらに２０％アセトニトリルでの溶出によりＦＰＢ２.２ｇが得られた（いずれもHPLCによって測定した）。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、両生成物の残渣を凍結乾燥したところ、ＦＰＡ７.９ｇ及びＦＰＢ２.５ｇが得られた。
【００２７】
フェニルプロパノイドＦＰＡを、RP18 Lobarプレパックカラムでのクロマトグラフィー（水及び徐々に増加する量のエタノールで溶出）によって最終的に精製した。純粋なＦＰＡを含有するフラクションを合わせ、凍結乾燥したところ、純粋なＦＰＡ（９８％以上のタイターをもつ）６.６ｇが得られた。フェニルプロパノイドＦＰＢを同様にして精製したところ、純粋な生成物（９８％以上のタイターをもつ）の収量は１.９ｇであった。
【００２８】
【実施例２】
固体Ｇ５培地上で生育したアジュガ・レプタンスの未分化カルス１０ｇを、液体Ｇ５培地５０mlを収容する２ｌフラスコに接種した。フラスコを、軌道撹拌機において120回転／分、温度２８℃でインキュベートした。７日後、全培養物を、120℃で３０分間殺菌した同じ培地６ｌを収容する１０ｌファーメンターに接種した。
【００２９】
懸濁状の培養物を、100回転／分で撹拌し、０.７ｌ/ｌ（培地）/分の空気流を通気しながら、２０℃に１０日間放置して生育させた。成長が乾燥重量で約１５ｇ/ｌに達した時点で、培養物を集め、実施例１に記載のように抽出した。
【００３０】
ＦＰＡに関する収量は培養物1.15ｇ/ｌに相当し、ＦＰＢ0.36ｇ/ｌに相当する。
【００３１】
本発明の方法に関して、一般に、生産収率が高く、方法が簡単であり（通常の工業的ファーメンター内で実施される）、フェニルプロパノイドＡ及びＢの構造体がほぼ絶対的に生産されるとの事実が観察され、本発明の主な利点を構成する。
【００３２】
本発明の更なる態様は、ＦＰＡ及びＦＰＢ化合物に関する酸化防止活性の同定にある。
【００３３】
特に、上述の方法に従ってアジュガ・レプタンスから抽出されたＦＰＡ及びＦＰＢ化合物の酸化防止活性をテストした。
【００３４】
アジュガ・レプタンスから抽出したＦＰＡ及びＦＰＢ化合物の「インビトロ」、及びこれらの物質で処置したラットの血清の「インビボ」酸化防止活性を化学ルミネセンス法によって評価し、ビタミンＥの同族水溶性生成物のものと比較した。
【００３５】
ルミノールの化学ルミネセンス反応（過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）によって酸化されて、不安定なラジカル（その基本的な状態に退化して、光を発する）を発生する）を使用した。この反応は、酵素ペルオキシダーゼによって触媒作用を受ける。
シグナル促進剤も系に存在できる：ｐ−ヨードフェノールは発光を増大させ、自身もラジカル（退化して光子を放出する）を生成する。
【００３６】
酸化防止活性をもつ物質の存在は、一連のラジカル反応を中断させ、発光を一時的に妨げる。光子の放出の時間及び消失度は、テストに供される物質の酸化防止能力及び濃度に関連する。
【００３７】
試薬
Amersham International（英国アマースハム）のＥＣＬ試薬（ルミノール／Ｈ２Ｏ２／ｐ−ヨードフェノール）
Sigma（米国ミズーリ州セントルイス）のラディッシュペルオキシダーゼ（タイプ VI-A，1100Ｕ/mg）
Sigma（米国ミズーリ州セントルイス）のTrolox：（＋／−）−６−ヒドロキシ−２,５,７,８−テトラメチルクロマン−２−カーボンシュワー（carbonsaeure）
サンプル
アジュガ・レプタンスから抽出したＦＰＡ及びＦＰＢ分子に関するサンプルを、異なる濃度（５.０、２.０、１.０及び０.５μM）の水溶液として調製し、Trolox（トコフェロールの同族水溶性生成物）の同じ濃度の溶液と比較した。アジュガ・レプタンスの粗製抽出物を用量200 mg/kgで静脈投与することによって処置したラットの血清を水にて１：２０で希釈し、未処置のラットの血清と比較した。
【００３８】
コントロールとして蒸留水を使用した。
【００３９】
酸化防止能力の評価
投与を黒色のポリスチレン注射器（Dynatech Laboratories；米国バージニア州チャンティリー）で行った。ペルオキシダーゼのストック溶液（Tris-HCl０.１Ｍ緩衝剤中１mg/ml，ｐＨ８.６）の１：10,000ｖ/ｖ希釈物（0.11Ｕ/ml）100μlをＥＣＬ試薬５mlに添加することによって化学ルミネセンス混合物を調製した。サンプルの各種の希釈物を４つずつ注射器に分配し（５０μl／注射器）、それぞれに化学ルミネセンス混合物100μlを添加した。Luminograph LB980（EG&G Berthold；ドイツ国バッドウイルドバッド）を使用して発光を直ちに測定し、化学ルミネセンス反応の速度を約６０分間監視した。発光を光子／秒／ピクセルで測定し、得られたデータを表１及び添付の図１に、コントロール（水）及び対照（Trolox又は未処置のラットの血清）と比較して示す。
【００４０】
【表１】
0005081346.tif 000003
ＦＰＡ及びＦＰＢサンプルは非常に高い「インビトロ」酸化防止活性を有し、Troloxのものよりも明らかに高いことを実証した。同じ濃度の場合の発光の消失時間は、事実、添付のグラフ（化学ルミネセンステストの速度を表す）から見られるように、かなり高い。また、ＦＰＡ化合物はＦＰＢ化合物に対してわずかに高い活性を有することが観察された。下記の表Ａは、実験対象の化合物及びTroloxの酸化防止活性（コントロールの水の５０％に等しい光子の放出を得るために必要な時間（分）として表示）を表す。
【００４１】
【表Ａ】
0005081346.tif 000004
実施例について、用量１μMでは、ＦＰＡの活性はTroloxのほぼ１２倍高いことが観察される。
【００４２】
アジュガ・レプタンスの粗製抽出物を用量200 mg/kgで静脈投与するによって「インビボ」酸化防止活性を評価した。下記の表２から及び添付の図２の対応するグラフから観察されるように、処置したラットの血清はコントロールのラットの血清に関して高い酸化防止活性を示した。
【００４３】
【表２】
0005081346.tif 000005
結論として、これらの誘導体、特にＦＰＡは、「インビトロ」及び「インビボ」の両方で驚くべき酸化防止活性を有し、最も強力な公知の酸化防止剤（ビタミンＥ）よりもかなり高く、特に、主に酸素のラジカル種に対するものであることが実証された。
【００４４】
上記実験結果に基づき、本発明の目的は、ヒトへの投与のための医薬又は栄養組成物、又は食品インテグレーターとして使用される組成物（酸化防止活性が要求される）の調製におけるＦＰＡ及びＦＰＢの使用に係る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＰＡ及びＦＰＢ化合物の酸化防止活性をTroloxと比較して示すグラフである。
【図２】アジュガ・レプタンスの粗製抽出物で処置したラットの血清の酸化防止活性を未処置のコントロールと比較して示すグラフである。
【図１】
0005081346.tif 000008
【図２】
0005081346.tif 000009