(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から採取した試料中に含まれるアグリンのタンパク質量を測定することを特徴とする哺乳動物組織における虚血状態の検出方法。
【請求項２】
試料がヒト血清である、請求項１に記載の虚血状態検出方法。
【請求項３】
タンパク質量の測定が、抗原抗体反応を用いた測定である、請求項１又は２に記載の虚血状態検出方法。
【請求項４】
タンパク質量の測定が、予め測定された非虚血状態の試料中に含まれる前記マーカータンパク質の発現レベルとの比較工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の虚血状態検出方法。
【請求項５】
虚血が心臓虚血である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の虚血状態検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物組織における虚血状態を効果的に検出可能なマーカーに関し、より詳しくは、虚血−再灌流時に特異的に放出され、特異的なマーカーとして利用可能なタンパク質及びこれを用いた虚血状態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血−再灌流（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ＩＨ／Ｒ）は、例えば心筋梗塞や心臓バイパス手術、心臓移植などで発生する心臓の主要な疾患状態である。心臓冠動脈の虚血−再灌流が発生した場合、心臓は肥大したり、虚血周囲で細胞死が観察されたり、また、心筋の繊維化が見られる。これらの現象はリモデリングと呼ばれており、これは虚血にさらされた心筋細胞ばかりでなく虚血周囲の組織においてもよく観察されている。幾つかのケースでは、虚血にさらされた心筋細胞に対する隣接する血管からの血管新生が観察されている。これらのことは、虚血−再灌流時に何らかのシグナルを伝達するための様々な因子が放出されていることを示唆している（非特許文献１，２）。
【０００３】
実際、心臓は全身に血液を送るポンプの役割ばかりでなく、ホルモン性因子を放出する内分泌系の組織として働いていることもよく知られている。一酸化窒素やプロスタグランジン、アデノシンといった低分子物質が心臓から放出され、心臓血管系の制御に関与している。これらの低分子に加え、骨形成因子（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ＝ＢＭＰ）の刺激により心筋細胞から放出されるトランスフォーミング成長因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）が線維芽細胞から心筋繊維細胞への転換を促している。一方、心臓虚血時には、炎症性サイトカインもまた心臓から放出されている（非特許文献６−８）。腫瘍壊死因子は虚血心筋において産生され、リアナジン受容体阻害を介して心臓の収縮抑制に関与している。炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）やインターロイキン６（ＩＬ−６）も虚血後の心臓から放出されている。ＩＬ−１βは心筋の直接的な阻害に加え、カルシウムを制御する遺伝子のダウンレギュレーションを介して心臓の収縮を抑制している。ＩＬ−６は、L型タイプのカルシウムチャネルを阻害することによってカルシウムの細胞内流入や心臓収縮の抑制に働いている。線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ＝ＦＧＦ）やヘパリン結合性成長因子（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ＝ＨＢＧＦ）は心筋虚血時に放出され防護因子として働くことも報告されている（非特許文献９−１５）。この様に虚血−再灌流時には様々なシグナル伝達機構が機能を果たしていることが明らかになってきており、これらのペプチド性因子を心臓虚血を捕捉するためのマーカーとして利用する動きも広がってきている。
【０００４】
ペプチド性の虚血マーカー、特に心臓虚血のマーカーとしては、これまでにＰＥＰ−１９，ＩｇＡ結合性アルカリ性ホスファターゼ、心房性／脳性ナトリウム利尿ペプチド、虚血変成アルブミン、酸素調節タンパク質、トロポニン、カルシトニン、ウロテンシン、ミオグロビン、ミオシン、アネキシン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、リポタンパク質やクレアチンキナーゼ、エノラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼなどの酵素などが開示されている（特許文献１−１８）。しかしながら、従来の虚血マーカーは、虚血状態にありながらも簡便な検出可能な程度には十分に放出されないものや、逆に虚血状態とは無関係な要因により放出されるケースなどがあり、更に従来のマーカーでは検出が困難な虚血の症例も見出されている。一方で、虚血が複数の複雑な反応の集積であることが明らかにされ、単独のマーカーだけではなく複数のマーカーを組み合わせることによって虚血状態の判定がなされてきたというこれまでの経緯からも、虚血−再灌流イベントと生理的・機能的に結びついた、特異性や再現性の高い新規な虚血マーカーの開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００７−０５６００８  ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解を阻害することを特徴とする虚血性脳疾患の治療方法
【特許文献２】特開２００６−１３２９４６  ＩｇＡ結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法およびそれに用いるキット
【特許文献３】特開２００４−０３７４５５  マーカーの組み合わせを用いた心臓疾患症例の予後判定
【特許文献４】特開２００３−２７０２５０  血液中の心不全マーカー定量方法
【特許文献５】特表２００７−５０５７２６  心臓由来が疑われる胸部痛を有する患者のリスク階層化のための装置および方法
【特許文献６】特表２００７−５１０１４６  マーカーの組合せによる急性心筋虚血性疾患の診断
【特許文献７】特表２００６−５０７５１０  組織低酸素症の体液マーカー
【特許文献８】特表２００６−５２６１４０  鑑別診断のためのマーカーおよびその使用方法
【特許文献９】特表２００５−５２２６６９  卒中および脳損傷の診断マーカーおよびその使用方法
【特許文献１０】特表２００４−５２０５９８  急性冠状動脈症候群の診断マーカーおよびその使用方法
【特許文献１１】特表２００４−５２９３５１  急性心筋梗塞および他の臨床的状態の診断への改良
【特許文献１２】特表２００３−５３２６８５  アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の用途
【特許文献１３】特表２００２−５３８４６３  脳卒中を診断しそして区別するための方法
【特許文献１４】特表平１０−５０４０９７  臓器拒絶反応のマーカー
【特許文献１５】特表平１０−５１１１８５  胸痛の発症初期に診断し鑑別するための方法ならびに装置
【特許文献１６】再公表０４−０６５９６１  酸化度の定量法
【特許文献１７】特許第３８６０６０５号  補体活性化をブロックするキメラタンパク質
【特許文献１８】特許第３６６６８６６号  神経保護治療をモニターする方法
【非特許文献１】Ｓｕｔｔｏｎ  Ｍ．Ｇ．＆Ｓｈａｒｐｅ  Ｎ．２０００．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：２９８１−２９８８．
【非特許文献２】Ｅｅｆｔｉｎｇ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．６１：４１４−４２６．
【非特許文献３】Ｓａｂｂａｈ  Ｈ．Ｎ．２０００．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４５：７０４−７１２．
【非特許文献４】Ｋａｎｇ  Ｐ．Ｍ．＆Ｉｚｕｍｏ  Ｓ．２０００．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：１１０７−１１１３．
【非特許文献５】Ｌｉｊｎｅｎ  Ｐ．Ｐｅｔｒｏｖ  Ｖ．２０００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３２：８６５−８７９．
【非特許文献６】Ｆｒａｇｏｇｉａｎｎｉｓ  Ｎ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５３：３１−４７．
【非特許文献７】Ｔｈａｉｋ  Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１０９３−１０９９．
【非特許文献８】Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｆ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：７４８−７５５．
【非特許文献９】Ｌｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：２４９９−２５０６．
【非特許文献１０】Ｊａｙａｓａｎｋａｒ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８  Ｓｕｐｐｌ．１：ＩＩ２３０−２３６．
【非特許文献１１】Ｊｉａｎｇ  Ｚ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｈ１０７１−１０８０．
【非特許文献１２】Ｈｏｕｓｅ  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：３１４０−３１４８．
【非特許文献１３】Ｔａｎａｋａ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：３７５−３８１．
【非特許文献１４】Ｄｅｔｉｌｌｉｅｕｘ  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５７：８−１９．
【非特許文献１５】Ｚｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐａｔｈｏｌ．１２：２９５−３１０．
【非特許文献１６】Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１９９２１−１９９２７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の現状に鑑み、本発明は、虚血−再灌流時に虚血組織から特異的に放出され、虚血状態を感度良く識別可能なマーカータンパク質及びこれを用いた虚血状態の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題の解決のため、特に、これまでに知られていない新規な虚血マーカーを見出すために、本発明者は、細胞・組織がある状態に置かれたときに特異的に発現するタンパク質を網羅的に解析するというプロテオーム解析の手法に着目した。すなわち培養心筋細胞の系を用いてここに虚血−再灌流刺激を与え、培養液中に放出されるタンパク質を網羅的に解析した。具体的には、虚血刺激なしで培養液中に放出されるタンパク質と虚血刺激により放出されるタンパク質のプロファイルを比較し（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、虚血−再灌流刺激によって特異的に放出されるタンパク質を同定して、刺激時に発現が亢進（Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）及び減少（Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）するマーカー候補となるタンパク質群を明らかにし、このうち発現が大幅に亢進するタンパク質数種については人工心肺による心臓手術を受ける患者さん（一時的に心臓本体は虚血状態になる）の血液中における発現の検証を行って、これらのマーカー候補が確かに虚血−再灌流時に特異的に発現亢進していることを確証し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の態様は、哺乳動物組織における虚血状態を検出する方法であって、前記哺乳動物から採取した試料中に含まれるアグリンタンパク質の発現レベルを測定することを特徴とする虚血状態の検出方法を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、試料がヒト血清である、第１の態様に記載の虚血状態検出方法を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、マーカータンパク質の発現レベルの測定が、抗原抗体反応を用いた測定である、第１または第２の態様に記載の虚血状態検出方法を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、マーカータンパク質の発現レベルの測定が、予め測定された非虚血状態の試料中に含まれる前記マーカータンパク質の発現レベルとの比較工程を含む、第１から第３の態様のうちいずれか１つに記載の虚血状態検出方法を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、虚血が心臓虚血である、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の虚血状態検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の提供する虚血マーカー並びに同虚血マーカーを利用した虚血状態の検出方法を利用することにより、組織の虚血状態、特に心臓組織の虚血−再灌流状態を迅速かつ効果的に検出することが可能となる。また本発明に係るマーカーはその発現亢進または減少を指標とした虚血治療のための創薬のターゲットとしても利用可能であり、更にこれらマーカー自体も機能的に虚血からの回復に関連したものは虚血治療薬となりうるなど、今後新たなマーカーや治療薬を開発するための優れた基礎を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、虚血後の再潅流時に、特異的かつ再現性よく放出される酵素等のタンパク質をマーカーとして、これを検出することを提案するものである。これらのマーカー物質は、例えば、ヒトを含む哺乳動物の心筋梗塞、脳梗塞、心臓手術、外傷時の止血等の後の再潅流時に、これらの虚血状態におかれた細胞またはその周辺細胞から放出されるものであると考えられる。そこで、本発明の第１の態様は、哺乳動物細胞における虚血状態を検出する方法であって、前記哺乳動物細胞から採取した試料中に含まれる下記の虚血マーカー（略称で示す；括弧内が正式名）、
Ａｒｐｃ３（ａｃｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２／３  ｃｏｍｐｌｅｘ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ３），Ｐｆｎ２（ｐｒｏｆｉｌｉｎ  ２），Ｓｇｃｅ（ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ，  ｅｐｓｉｌｏｎ），Ａｃｔｒ３（ＡＲＰ３  ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ），Ｈ３ｆ３ｂ（Ｈ３  ｈｉｓｔｏｎｅ，ａｍｉｌｙ  ３Ｂ），Ｈｉｓｔ１ｈ２ｂｍ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  １，Ｈ２ｂｍ），Ｈｉｓｔ１ｈ２ｂｐ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  １，Ｈ２ｂｐ），Ｈｉｓｔ１ｈ３ａ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  １，Ｈ３ａ），Ｈｉｓｔ２ｈ２ａａ１（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ２，Ｈ２ａａ１），Ｐｏｓｔｎ（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ，ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ），Ｆｂｌｎ５（ｆｉｂｕｌｉｎ  ５），Ｃｏｌ１８ａ１（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶＩＩＩ，ａｌｐｈａ  １），Ｌａｍｂ１−１（ｌａｍｉｎｉｎ  Ｂ１  ｓｕｂｕｎｉｔ  １），Ｌａｍｃ１（ｌａｍｉｎｉｎ，ｇａｍｍａ  １），Ｐｒｏｓ１（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ  ａｌｐｈａ），Ｃｏｌ６ａ２（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＶＩ，ａｌｐｈａ  ２），Ｃｔｎｎｂ１（ｃａｔｅｎｉｎ［ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ］，ｂｅｔａ  １），Ｄｃｂｌｄ２（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ，ＣＵＢ  ａｎｄ  ＬＣＣＬ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２），Ｉｔｇａ３（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  ３），Ｃｏｐｂ２（ｃｏａｔｏｍｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ  ２［ｂｅｔａ  ｐｒｉｍｅ］），Ｃｏｐａ（ｃｏａｔｏｍｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ），Ｃｏｐｓ３（ＣＯＰ９［ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ］ｈｏｍｏｌｏｇ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ３），Ｉｔｍ２ｂ（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ｂ），Ａｉｆｍ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  １），Ｔｒａｐ１（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １），Ａｎｘａ４（ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ４），Ａｎｘａ６（ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ６），Ｐｌａ２ｇ７（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２，ｇｒｏｕｐ  ＶＩＩ［ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ｐｌａｓｍａ］），Ａｓｐｎ（ａｓｐｏｒｉｎ），Ｌｏｘ（ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ），Ｃｒｋ（ｖ−ｃｒｋ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ＣＴ１０  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ［ａｖｉａｎ］），Ｆｂｌｎ１（ｆｉｂｕｌｉｎ  １），Ｇｐｒ５２（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５２），Ｐｐｐ２ｃａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２［ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ２Ａ］，ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ，ａｌｐｈａ  ｉｓｏｆｏｒｍ），Ｐｐｐ２ｒ２ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２［ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ２Ａ］，ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ［ＰＲ５２］，ｂｅｔａ  ｉｓｏｆｏｒｍ），Ｌｐｈｎ３（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ  ３），Ｐｔｐｒｆ（ｐｒｏ���ｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ，Ｆ），Ｒｂｂｐ９（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９），Ｐｒｒｃ１（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  １），Ｃｒｅｇ１（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｅ１Ａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  １），Ｎｐｍ１（ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ  １），Ｒｐｓ４ｘ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ４，Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ），Ｐｌｒｇ１（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  １，ＰＲＬ１  ｈｏｍｏｌｏｇ［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ］），Ｒｎａｓｅ４（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，ＲＮａｓｅ  Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ４），Ｕｇｐ２（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ２），Ｙａｒｓ（ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ），Ｇａｌｎｔ１０（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ａｌｐｈａ−Ｄｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １０），Ｎｕｄｔ２１（ｎｕｄｉｘ［ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｍｏｉｅｔｙ  Ｘ］−ｔｙｐｅ  ｍｏｔｉｆ  ２１），Ｕｂｅ２ｌ３（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｅ２Ｌ  ３），Ｕｆｄ１ｌ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  １  ｌｉｋｅ），Ｓｅｒｐｉｎｅ１（ｓｅｒｉｎｅ［ｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ］ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｃｌａｄｅ  Ｅ，ｍｅｍｂｅｒ  １［ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１］），Ｕｂａ５２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ａ−５２  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  １），Ｕｂｅ２ｖ２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｅ２  ｖａｒｉａｎｔ  ２），Ｐｓｍａ２（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ［ｐｒｏｓｏｍｅ，ｍａｃｒｏｐａｉｎ］ｓｕｂｕｎｉｔ，ａｌｐｈａ  ｔｙｐｅ  ２），Ｐｓｍｂ１（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ［ｐｒｏｓｏｍｅ，ｍａｃｒｏｐａｉｎ］ｓｕｂｕｎｉｔ，ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  １），Ｐｓｍｂ４（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ［ｐｒｏｓｏｍｅ，ｍａｃｒｏｐａｉｎ］ｓｕｂｕｎｉｔ，ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  ４），Ｐｓｍｂ６（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ［ｐｒｏｓｏｍｅ，ｍａｃｒｏｐａｉｎ］ｓｕｂｕｎｉｔ，ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  ６），Ｐｓｍｂ７（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ［ｐｒｏｓｏｍｅ，ｍａｃｒｏｐａｉｎ］ｓｕｂｕｎｉｔ，ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  ７），Ｔｒｙ１０（ｔｒｙｐｓｉｎ  １０），Ｃｃｔ４（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ４［ｄｅｌｔａ］），Ｆｋｂｐ４（ＦＫ５０６  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４），Ｂｍｐ１（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １），Ｈｅｘｂ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｂ），Ｇｌｂ１（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ｂｅｔａ  １），Ａｌｄｈ３ａ１（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ１），Ｍａｎ２ｂ２（ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ  ２，ａｌｐｈａ  Ｂ２），Ｎｇｌｙ１（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ  １），Ｆｕｃａ１（ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ａｌｐｈａ−Ｌ−１，ｔｉｓｓｕｅ），Ｏｘｃｔ１（３−ｏｘｏａｃｉｄ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １），Ｎｉｔ２（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  ２），Ｌｏｘｌ１（ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  １），Ｍａｎ１ｃ１（ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ，ａｌｐｈａ，ｃｌａｓｓ  １Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １），Ｃｒａｂｐ２（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ），Ｃｔｂｓ（ｃｈｉｔｏｂｉａｓｅ，ｄｉ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−），Ｇｓｔａ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｌｐｈａ  ４），Ｇｓｔｍ２（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｍｕ  ２），Ｈｄｈｄ２（ｈａｌｏａｃｉｄ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２），Ｓｇｓｈ（Ｎ−ｓｕｌｆｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ［ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ］），Ｈｙｉ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ［Ｅ．ｃｏｌｉ］），Ｖａｓｎ（ｖａｓｏｒｉｎ），Ｔｆｒｃ（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ），Ｌｃｎ２（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ２），Ａｐ１ｍ１（ａｄａｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＡＰ−１，ｍｕ  ｓｕｂｕｎｉｔ  １），Ｃ１ｑｔｎｆ６（Ｃ１ｑ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６），Ｖｐｓ２６ｂ（ｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ２６  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ［ｙｅａｓｔ］），Ｓｅｃ２４ｄ（ＳＥＣ２４  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  Ｄ［Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ］），Ｓｌｃ４４ａ２（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ４４，ｍｅｍｂｅｒ  ２），Ｃｄ１４（ＣＤ１４  ａｎｔｉｇｅｎ），Ａｎｐｅｐ（ａｌａｎｙｌ［ｍｅｍｂｒａｎｅ］ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ；ＣＤ１３），Ｆｋｂｐ９（ＦＫ５０６  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９），Ａｌｃａｍ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ），Ｃ３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ３），Ｔｎｃ（ｔｅｎａｓｃｉｎ  Ｃ），Ｎｕｄｃ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  Ｃ  ｈｏｍｏｌｏｇ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ］），Ｓｅｍａ４ｂ（ｓｅｍａ  ｄｏｍａｉｎ，ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ［Ｉｇ］，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ［ＴＭ］ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ，［ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ］４Ｂ），Ａｇｒｉｎ，Ｐｌｘｎｂ２（ｐｌｅｘｉｎ  Ｂ２），１１１０００７Ｌ  １５Ｒｉｋ（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １１１０００７Ｌ１５  ｇｅｎｅ），２７０００８５Ｅ  ０５Ｒｉｋ（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００８５Ｅ０５  ｇｅｎｅ），３１１０００３Ａ  １７Ｒｉｋ（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ３１１０００３Ａ１７  ｇｅｎｅ），４９３１４０６Ｃ  ０７Ｒｉｋ（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ４９３１４０６Ｃ０７  ｇｅｎｅ），６５３０４０��Ｎ  ０４Ｒｉｋ（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ６５３０４０１Ｎ０４  ｇｅｎｅ），ＥＧ５４５０９（ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ，ＥＧ５４５０９１）
のうち少なくとも１つより選択されるタンパク質の発現レベル、好ましくはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、骨形成タンパク質−１（ＢＭＰ−１）、ＣＤ１３、ＣＤ１４、テネイシンＣ（ＴｎＣ）、アグリンのうち少なくとも１つからなる虚血マーカータンパク質のタンパク質量を測定することを特徴とする、虚血状態の検出方法を提供する。組織が虚血−再灌流刺激を受けた際、それに対する応答としてこれまでに知られていなかった種々のタンパク質が細胞外・組織外に放出されることが、本発明者による培養心筋細胞での虚血／非虚血時発現タンパク質の網羅的解析から明らかとなった（図１）。これらのタンパク質を既存のデータベースと比較したところ、これまでに虚血マーカーとして報告のあるタンパク質とは異なり、アポトーシス、炎症反応、血管新生、細胞増殖、細胞接着や神経細胞再生などに関連する様々な機能を持ったタンパク質が特異的に発現していることが明らかとなった。虚血と結びついたそれぞれの反応において特異的に組織外に放出されるこれらのタンパク質の発現レベル、好ましくはこれらのタンパク質の試料中に含まれる量を測定することにより、虚血マーカーとして利用可能である。上記のマーカーは、これまでに機能が明らかにされてきたものの虚血との関連については明らかではないが、虚血後の再潅流時に放出されるものである。哺乳動物組織から採集される試料の種類、その採集方法、マーカータンパク質の検出方法などは当該分野で利用されるもののうちから適宜選択すればよいが、一般に再灌流後の血液を試料として採取するのが好ましい。また検出方法は何ら本発明を限定するものではないが、例えばヒト血液試料を採取し、血清中に含まれるタンパク質に対して上記マーカーに対する特異的抗体を用いたイムノアッセイ（簡便には蛍光イムノアッセイなど）やウェスタンブロッティングを行い、マーカータンパク質の存在を検出するといった方法があげられる。
【００１５】
上記マーカーのうち、従来アポトーシス誘導に係るタンパク質として知られていたＡＩＦは、新規な虚血マーカーとして特に適している。ここでいうＡＩＦ（またはＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ８）には、ＡＩＦそのものの他、そのプリカーサーまたはアイソフォームといった、ＡＩＦとアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を持つタンパク質や、また８０％以下の相同性であってもアポトーシス誘導という機能的な相同性を持ちかつ５０％程度の相同性を持つ哺乳動物のタンパク質群、更に好ましくはヒトでその存在が確認されているタンパク質群を含んでも良い。
【００１６】
上記マーカーのうち、従来骨細胞増殖に係るタンパク質として知られていたＢＭＰ−１は、新規な虚血マーカーとして特に適している。ここでいうＢＭＰ−１（またはＰｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）には、そのプリカーサーまたはアイソフォーム、ＢＭＰ、ＢＭＰ１−５、ＢＭＰ１−６、Ｔｏｌｌｏｉｄ−ｌｉｋｅタンパク質、そのプリカーサーまたはアイソフォーム、Ｔｏｌｌｏｉｄ−ｌｉｋｅ１、Ｔｏｌｌｏｉｄ−ｌｉｋｅ２などといった、ＢＭＰ−１とアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を持つタンパク質や、また８０％以下の相同性であっても骨細胞増殖という機能的な相同性を持ちかつ５０％程度の相同性を持つ哺乳動物のタンパク質群、更に好ましくはヒトでその存在が確認されているタンパク質群を含んでも良い。従来技術欄でも述べた通り、ＢＭＰ−１は心筋細胞に対するホルモン様作用が知られていたが、虚血時に虚血組織から放出されるという現象はまったく知られておらず、虚血マーカーとしてのＢＭＰ−１は新規なマーカーである。
【００１７】
上記マーカーのうち、血管新生に係るタンパク質として知られていたＣＤ１３は、新規な虚血マーカーとして特に適している。ここでいうＣＤ１３（またはＡｍｉｎｏ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｎ）には、そのプリカーサーまたはアイソフォーム、Ａｍｉｎｏ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ、Ｌａｅｖｅｒｉｎ、ＴＲＨ−ＤＥ（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）などといった、ＣＤ１３とアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を持つタンパク質や、また８０％以下の相同性であっても血管新生という機能的な相同性を持ちかつ５０％程度の相同性を持つ哺乳動物のタンパク質群、更に好ましくはヒトでその存在が確認されているタンパク質群を含んでも良い。
【００１８】
上記マーカーのうち、炎症反応に係るタンパク質として知られていたＣＤ１４は、新規な虚血マーカーとして特に適している。ここでいうＣＤ１４には、そのプリカーサーまたはアイソフォームなどといった、ＣＤ１４とアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を持つタンパク質や、また８０％以下の相同性であっても炎症反応という機能的な相同性を持ちかつ５０％程度の相同性を持つ哺乳動物のタンパク質群、更に好ましくはヒトでその存在が確認されているタンパク質群を含んでも良い。
【００１９】
上記マーカーのうち、細胞増殖に係るタンパク質として知られていたテネイシンＣは、新規な虚血マーカーとして特に適している。ここでいうテネイシンＣには、テネイシン、そのプリカーサー、サイトタクチン（Ｃｙｔｏｔａｃｔｉｎ）及びそのプリカーサー、テネイシンＸＢ、テネイシンＸ及びそのプリカーサー、テネイシンＲ、テネイシンＮなど、テネイシンＣとアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を持つタンパク質や、また８０％以下の相同性であっても細胞増殖という機能的な相同性を持ちかつ５０％程度の相同性を持つ哺乳動物のタンパク質群、更に好ましくはヒトでその存在が確認されているタンパク質群を含んでも良い。
【００２０】
上記マーカーのうち、神経細胞再生に係るタンパク質として知られていたアグリンは、新規な虚血マーカーとして特に適している。ここでいうアグリンとは、アグリンのプリカーサーまたはアイソフォーム、Ｐｅｒｌｅｃａｎ（Ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）１、２、またはそのアイソフォームなど、アグリンとアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を持つタンパク質や、また８０％以下の相同性であっても細胞増殖という機能的な相同性を持ちかつ５０％程度の相同性を持つ哺乳動物のタンパク質群、更に好ましくはヒトでその存在が確認されているタンパク質群を含んでも良い。
【００２１】
本発明の虚血状態検出方法を適用する試料としては、虚血が疑われる組織から放出されるマーカーを含む体液であればどの様なものでも良く、その種類が本発明を限定するものではないが、採集の容易さや既存のマーカーとの比較に供することの容易性の観点、及び疾患の早期発見のため臨床現場で用いられることが想定されることから、ヒト血液、特に血球成分を予め除いたヒト血清が好ましい。試料の採集方法や保存方法などについては、タンパク質である上記マーカーが分解されない条件を満たせば、臨床の現場等で用いられている手法を適宜応用すれば良く、これらが本発明を限定するものではない。
【００２２】
本発明におけるマーカータンパク質の発現レベルの測定手法に関しては、タンパク質の定性／定量的測定方法として用いられている手法を適宜応用すれば良く、本発明を限定するものではないが、プロトコルが確立され、また検出感度にすぐれた抗原抗体反応、すなわち前記マーカータンパク質に対する特異的抗体を用いた検出方法が好適である。前記の特異的抗体を１次抗体として例えばメンブレン転写やフローインジェクション法を用いて試料中のタンパク質に反応させ、これの検出系としては１次抗体を直接標識する方法の他、２次抗体や抗体と反応する試薬を用いた発光、発色による検出などを適宜利用すればよい。
【００２３】
本発明におけるマーカータンパク質の発現レベルを解析するに際し、より正確な虚血状態の検出のためには非虚血状態の試料、好適には非虚血状態のヒト血清中に含まれる前記マーカータンパク質の発現レベルを予め測定しておき、これと虚血が疑われる状態の試料中での同マーカータンパク質の発現レベルとを比較することが有効である。この際には、例えば多人数より採取した試料中における非虚血状態のヒトマーカー発現量を測定しこの平均値を標準としておき、これに対して虚血が疑われる試料中のマーカータンパク量を比較等すれば良い。比較工程においては、例えばマーカーの発現量を示す発色・発光を目視にて定性的に比較する他、画像処理技術などを用いて定量的・半定量的に両者の発現量を比較する方法など、分子生物学分野で採用されている比較手法を適宜用いれば良く、比較方法そのものが本発明を限定するものではない。
【００２４】
本発明の虚血マーカー及びこれを用いた虚血状態の検出方法は、哺乳動物組織における虚血状態を検出する方法として広く利用可能であると考えられるが、臨床的な必要性の高い心臓虚血が主たる対象疾患である。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
（心筋細胞の培養）本実施例に係る心筋細胞の培養、及び虚血−再灌流刺激の与え方については、非特許文献１６に記載の方法に従った。具体的には、ラット胎児心臓由来の培養細胞株であるＨ９ｃ２細胞を１００−ｍｍ培養プレートに５×１０４細胞の密度で蒔き、１０％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で７２時間培養した。その後細胞を無血清ＤＭＥＭ培地に移し、６０−７２時間培養した。虚血刺激を与えるために、細胞をＳｌｉｇｈｔｌｙ  ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＫＣｌ，０．３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４，６９ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，０．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｒ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）中で２時間、３７℃にてインキュベートした。インキュベーター中の酸素を窒素で置き換えることで虚血状態とし、このときの酸素濃度は１％であった。虚血刺激後、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地に移し、酸素濃度２０％、二酸化炭素濃度５％の通常の培養条件に戻して、３７℃にてインキュベートし再灌流状態とした。
【００２６】
（ＩＨ／Ｒ刺激により分泌されるタンパク質の精製）２時間の虚血刺激を与えたＨ９ｃ２細胞を２４時間再灌流し、細胞培養液の上清１Ｌ（リットル）を試料としてプロテオーム解析用に供した。試料を５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ陰イオン交換カラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，ＵＳＡ）にかけ、カラムにトラップされたタンパク質を５００ｍＭ  ＮａＣｌで１ｍｌ／分の流速にて溶出させた。溶出した分画を、遠心フィルターカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，ＵＳＡ）を通して脱塩及び濃縮した。
【００２７】
（トリプシンによるタンパク質のゲル中分解）濃縮した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、泳動後のゲルをＣＢＢで染色した。ＩＨ／Ｒ試料と対照試料を泳動したレーンをそれぞれゲルから切り出し、各レーンを均等にスライスして２４個の断片とした。更にこの断片を細かく刻み、２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＣＯ３を含む３０％アセトニトリルで脱染色した。脱染色したゲル細断片を１００％アセトニトリルで脱水し、その後室温にて３０分間乾燥させた。ゲル中に含まれるタンパク質を、１０ｍＭジチオトレイトール／２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＣＯ３を用い５６℃で１時間還元処理し、その後５５ｍＭ  ヨードアセトアミド／２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＣＯ３を用い室温・暗黒条件下でアルキル化した。処理後のゲルを５０％アセトニトリル／２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＣＯ３２５ｍＭで３０分間×２回、１００％アセトニトリルで５分間×１回の計３回、脱水した。脱水したゲルを室温にて３０分間乾燥させ、トリプシン溶液（ＰＲＯＭＥＧＡ，１０ｎｇ／ｍｌ  ｉｎ２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＣＯ３）で３０分間、氷上にて再膨潤させた。ゲル外の溶液を取り除き、ゲル中に含まれるタンパク質を３７℃に一晩おいて分解した。分解産物であるペプチドを５０％アセトニトリル／０．１％  トリフルオロ酢酸で３０分×２回、抽出し、抽出物を吸引乾燥して質量分析用に０．１％ギ酸に溶解させた。図２に、培養心筋細胞を用い虚血（ＩＨ／Ｒ）／非虚血（Ｃｏｎｔｒｏｌ）時に放出されるタンパク質を質量分析にかけるまでの上記手順を模式化して示した。
【００２８】
（ペプチド断片の質量分析）トリプシン処理によって得られたペプチド断片を、Ｑ−Ｔｏｆ２（ＭＩＣＲＯＭＡＳＳ，ＵＫ）を用いその用法に従ってＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析に供した。ＬＣカラムはＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８カラム（ＬＣ  ＰＡＣＫＩＮＧＳ，ＨＯＬ）を用い、ＭＳ／ＭＳ分析にはＭａｓｓＬｙｎｘ，ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ（ＭＩＣＲＯＭＡＳＳ）の各ソフトウェアを用いて解析を行った。ペプチド断片の配列データをＮＣＢＩデータベースのデータと比較し、タンパク質を同定するため、Ｍａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈ（ＭＡＴＲＩＸ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いた。こうして得られたペプチド断片から推定される発現タンパク質のプロファイルを、虚血−再灌流刺激あり、刺激無しのそれぞれについて比較した。表１はその結果から一部分を抜粋したものであり、表中ＮＣＢＩ  ＩＤはペプチド断片の配列から推測されるタンパク質のＮＣＢＩデータベースでの対応物を、Ｇｅｎｅは遺伝子名を、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｃｏｒｅは対照サンプル中の同遺伝子産物のＭａｓｃｏｔ  ＭＳ／ＭＳ  Ｉｏｎｓ  Ｓｅａｒｃｈによる”確からしさ”の指標（値が大きいほど確からしく、同時に発現量の大小も反映している）を、ＩＨ／Ｒ  ｓｃｏｒｅは虚血−再灌流刺激を与えたサンプル中での同遺伝子産物のスコアをそれぞれ表している。更に、個々のタンパク質はその発現量がそれぞれ異なっていることを考慮して、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｃｏｒｅとＩＨ／Ｒ  ｓｃｏｒｅの比をＲａｔｉｏ欄で示した。表１のうち、Ｎｏ．１−５の様に対照では発現が見られず虚血−再灌流刺激時にのみ特異的に現れるもの、Ｎｏ．６−１０の様に虚血−再灌流刺激時に発現量が増大するもの、Ｎｏ．１１−１５の様に刺激前後で発現量に変化が見られないもの、Ｎｏ．１６−２０の様に虚血−再灌流刺激時に発現量が減少するものがそれぞれ確認された。虚血−再灌流刺激時に特異的に発現するタンパク質のうちには、過去に虚血マーカーとして報告のあるミオシン等が含まれており、今回の発現解析が有効であることが示された。
【表１】
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【００２９】
上記結果のうち、虚血マーカーとしては虚血−再灌流刺激時に特異的に発現するものが最も望ましいと考えられた。網羅的な比較分析の結果、１０９種類のＩＨ／Ｒ特異的発現タンパク質が同定された（表２）。表中ＮＣＢＩ  ＩＤはペプチド断片の配列から推測されるタンパク質のＮＣＢＩデータベースでの対応物を、ＭＷは分子量を、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｓｙｍｂｏｌは正式略称を、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｎａｍｅは遺伝子産物の正式名を、Ｓｃｏｒｅは虚血−再潅流時のＭａｓｃｏｔスコアを、Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎはこれまでに報告のあるそれぞれのタンパク質の細胞内での局在を、Ｆｕｎｃｔｉｏｎはこれまでに報告のあるそれぞれのタンパク質の機能を表している。すなわち表２に記載されたタンパク質のうち、これまでに虚血マーカーとして報告のあるものを除いたタンパク質群は、虚血マーカー、好ましくは心臓虚血のマーカーとして利用可能なタンパク質である。この中には、アポトーシス関連タンパク質群、シグナル伝達系タンパク質群、成長因子及びその関連タンパク質群、プロテアーゼ、細胞接着因子、シャペロン、代謝酵素、リンパ細胞シグナルタンパク質群、神経細胞成長関連タンパク質群、トランスポーター、細胞骨格タンパク質、転写制御因子、コートマータンパク質などが含まれていた。下記表３に、それらのうち代表的なものを示す。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００３０】
（イムノブロッティング）データベースとの比較から同定された１０９種類のタンパク質のうち、アポトーシス、炎症反応、細胞接着、細胞増殖、神経細胞成長、血管新生、とそれぞれ異なった機能を有するタンパク質であると推測された６種類のタンパク質、すなわちＡＩＦ、ＢＭＰ−１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、テネイシンＣ、アグリンについて、培養細胞系における虚血−再灌流刺激前後のタンパク質発現量の比較、及び人工心肺による心臓手術を受ける患者さん（一時的に心臓本体は虚血状態になる）の血液中における発現の検証として、培養細胞上清及び血液からの試料調整とその試料を用いた電気泳動、並びにイムノブロッティングを行った。培養細胞系における虚血−再灌流刺激前後のタンパク質発現量の比較には、発現亢進がみられたＡＩＦとＢＭＰ−１の他、表１にあげたタンパク質のうち刺激前後で発現量が同等と推測されたストレス応答タンパク質の一種ＨＳＰ９０、及び刺激後に発現量が減少すると推測されたα−エノラーゼについても、検出の有効性を確認するために検証した。血液試料の採取は山口大学病院にて人工心肺を用いた開胸手術を受ける５４−７５歳の患者さん６名につき、インフォームドコンセント及び関連法令・規則に則って、血清中のＡＩＦ、ＢＭＰ−１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、テネイシンＣ、アグリンの発現量を手術前後で比較した。採取した試料（血清）はＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ［１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２．５ｍＭ  ピロリン酸Ｎａ，１ｍＭ  β−グリセロールリン酸，１ｍＭ  オルソバナジウム酸Ｎａ，１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン，１ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオライド］で溶解し、溶液を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動物をニトロセルロース膜に転写した。転写後に膜を５％脱脂粉乳または１０％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒでブロッキングし、上記の各タンパク質に対する特異的抗体を反応させ、結合しなかった抗体を洗い流した後に蛍光試薬で標的タンパク質の存在を定量的に可視化した。抗アグリン抗体、抗テネイシンＣ抗体、抗ＢＭＰ−１抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＡＩＦ抗体及び抗ＨＳＰ９０抗体、抗α−エノラーゼ抗体はそれぞれＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（ＵＳＡ）から購入したものを用い、抗原抗体反応は用法に従って行った。
【００３１】
培養細胞系における虚血−再灌流刺激前後のタンパク質発現量の比較を目的としたイムノブロッティングの結果を、図３に示す。図３ＡはＡＩＦ、ＢはＢＭＰ−１、ＣはＨＳＰ９０、Ｄはα−エノラーゼの結果を示し、ＩＨ／Ｒ  ０，２，・・・の数字はそれぞれ虚血−再灌流刺激後の経過時間（０は刺激無し）を表している。ＡＩＦ（Ａ）の発現量は、虚血刺激を与える前にはほとんどみられないのに対して、刺激を与えた２時間後には急激に増加し、２４時間後にもこの増加は継続、４８時間後にはやや減少するという傾向が見られた。ＢＭＰ−１（Ｂ）についても、刺激前には発現がみられず、刺激後２時間後にもそれほど増加はみられないが、２４時間後には明瞭な発現の亢進が観察された。ＨＳＰ９０（Ｃ）については、虚血刺激前に一定量の発現があり、刺激後２時間では一時的に発現量が減少するものの２４時間後には刺激前と同程度にまで発現量が回復しており、０時間と２４時間後の比較では発現量が同等という先の推測が裏付けられた。反対にα−エノラーゼ（Ｄ）では、刺激前に発現が観察されたが刺激後２時間でその発現が消失し、２４−４８時間後にわずかな回復がみられるもののその発現量は刺激前に比べてはるかに減少しており、こちらも上記の推測を裏付ける結果となった。虚血−再灌流刺激後に発現の亢進するタンパク質、同等なタンパク質、減少するタンパク質それぞれについて、網羅的なリストアップと個々のタンパク質に対するイムノブロットの結果が一致したことから、本発明の網羅的解析で得られたマーカー候補となるタンパク質の情報が有効であることが確認された。
【００３２】
人工心肺による心臓手術時（一時的虚血状態）の血液中における各マーカータンパク質の発現の比較結果を、図４に示す。図４ＡはＡＩＦ、ＢはＢＭＰ−１、ＣはＣＤ１３、ＤはＣＤ１４、ＥはテネイシンＣ、Ｆはアグリンの発現量を、蛍光の強度（結合した抗体量＝標的のタンパク質量を反映）でそれぞれ表したものであり、またＢＳ（Ｂｅｆｏｒｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）は手術前に採集した試料、ＤＳ（Ｄｕｒｉｎｇ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）は手術中に採集した試料、０，３，・・・は手術後の各時間における試料をそれぞれ表している。Ａ−Ｆは代表的なもの１例を挙げたが、６例いずれも同様の傾向を示した。ＡＩＦ、ＢＭＰ−１、ＣＤ１３、テネイシンＣ及びアグリンでは、手術前にはほとんど発現がみられないのと比較して、手術後２４−４８時間で血清中に含まれる各タンパク質量が増加することがイムノブロッティングの結果より示された（図中▼で示す）。ＣＤ１４については、手術前・手術中の血清に既に放出されていたが、手術後にその発現量が増大することが示された。培養細胞系での結果と臨床検体での結果に良い一致が見られたことから、本発明におけるマーカータンパク質は、虚血マーカー、好ましくは心臓虚血マーカーとしてきわめて有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】培養心筋細胞において、虚血−再灌流刺激によって特的に発現するタンパク質群を、その機能により分類・模式化して示す。
【図２】本発明における、虚血−再灌流刺激特異的に発現するタンパク質群の網羅的な解析手法を模式化して示す。
【図３】虚血−再灌流刺激を与えた培養心筋細胞における、ＡＩＦ，ＢＭＰ−１（発現亢進）、ＨＳＰ９０（発現変化無し）、及びα−エノラーゼ（発現減少）の刺激前後における発現量の経時変化を比較して示す。
【図４】人工心肺を用いた開胸手術時における血液中の各マーカータンパク質の発現量の経時変化を、手術前（ＢＳ）、手術中（ＤＳ）及び手術後（０，３，２４，４８，７２時間後）のそれぞれの時点で比較して示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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