(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するか、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を有効成分として含んで成る、ヒトまたは動物のリーシュマニア症を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項２】
さらに腹腔内、皮下または筋肉内投与に適する生理学的アジュバントを含んで成る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
さらに完全なまたは断片化したタンパク質LiHsp70、またはそれらの変異体を含んで成る、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
配列番号１に示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの変異体であって、保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾若しくは置換を含む変異体を含んで成る、ヒトまたは動物のリーシュマニア症を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項５】
組成物がワクチンである請求項１ないし３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヒトまたは動物被験体のリーシュマニア症を予防または処置に使用するための請求項１ないし３および５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するか、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を有効成分として含んでなるヒトまたは動物のリーシュマニア症に対して免疫応答を生じさせるための医薬組成物。
【請求項８】
請求項１ないし３、６および７のいずれかに記載の医薬組成物の、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防または処置用の医薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
説明
発明の目的
本明細書は、リーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症の予防または処置に有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA配列から形成されるキメラ遺伝子に関する本発明の応用、ならびに該キメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。この明らかな目的は、患者の体内に存在しうるリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症を予防または処置するための医薬組成物を、例えばワクチンまたはモノクローナル抗体調製物として提供するために、遺伝子配列またはキメラ遺伝子から得られるタンパク質を使用することにある。患者はイヌである必要はなく、免疫抑制が関与する疾患に罹患しているヒトであることもできる。このために、「特別（ad hoc)」に構築されたキメラ遺伝子の「インビトロ」合成から生成されるキメラ生成物から成る４つの異なるタンパク質の抗原決定基の５つを含むPQと呼ばれるタンパク質をコードするキメラ遺伝子を生成する。この生成物は、例えばイヌのリーシュマニア症に対する防護免疫反応を生じるように、あるいはイヌのリーシュマニア症に対する抗体を調製するために高度に感受性が高く、しかも特異的に形成されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、医薬品製造を目的とする工業的用途を有する。
発明の背景
リーシュマニア属の寄生性原生動物は、世界中に広く分布し、そして様々な臨床的症状を現すことが特徴である広い範囲の疾患であるリーシュマニア症を引き起こす病原体である。
【０００３】
リーシュマニア症の主形態は自然な人獣共通伝染病であり、そしてヒトが２次宿主であると考えられる。
【０００４】
多くの地中海沿岸地域に広く分布しているエル.インファンタム(L.infantum)と名付けられた種が、ヒトおよびイヌの内蔵リーシュマニア症(LV)の原因である。
【０００５】
実際に、エル.インファンタム(L.infantum)に感染したイヌは、特に臨床的症状が観察できるまでの長い潜伏期間、この寄生生物の主な保因者である。
【０００６】
疫学的データは、イヌのリーシュマニア症の有病率とヒトへの寄生生物の伝播との間に直接的な相関があることを示している。この理由から、疾患の広がりを抑えるために行われるキャンペーンの初期に、この疾患または感染を検出するにとが極めて重要である。
【０００７】
寄生生物は「サシチョウバエ科（Phlebotominae)」のハエに噛まれることより、宿主の脊椎動物に有べん毛のプロマスティゴートとして伝播し、そして寄生生物は単核ファージの細胞に入り、ここでで分化し、そして食胞融解小体構造内で無鞭毛型として複製する。
【０００８】
感染した細胞は特定の組織（主に脾臓、肝臓およびリンパ節）中に集まる。１千500万人の人がリーシュマニア症に感染し、そして世界中で毎年500,000人の新しい症例が世界中、主に未開発および発展途上の国々に現れていると予測される。
【０００９】
すでに述べたようにヨーロッパの南西部の国々では、内蔵リーシュマニア症(VL)はエル.インファンタム(L.infantum)種により引き起こされる人獣共通伝染病である。疫学的研究から最近導かれたデータでは、この感染が警報を発する発生数であることを示している。
【００１０】
イタリアでは、この地域のVLの発生率について報告されたデータは14.4％〜37％の範囲である。
【００１１】
ポルトガルでは、より特にリスボンの周辺の地域で、8.4％の血清陽性率が見いだされ、そして有病率の別の中心であるフランスのマリティーム アルプス地方では、3.2％から17.1％の間で変動することが分かった。
【００１２】
スペインでは、リーシュマニア症の有病率は研究したゾーンに依存する。カタロニアでは、9.3％の平均発生率が観察されたが、幾つかのホット−スポットでは最高18％の感染したイヌの有病率が見いだされた。
【００１３】
マヨルカ島で発生率は14％、そして他の見いだされた有病率は：ムルシアで2.4％。グラナダで8.8％、サマランカで10〜15％、マドリッド州で5.25％そしてカセルスで14％。
【００１４】
エル.インファンタム(L.infantum)により引き起こされるヒトのVLの症例数は比較的少ないと考えられるが、リーシュマニア属により感染した免疫抑制患者の高い割合は、イヌにおけるこの病気の高いレベルと関連させることができた。
【００１５】
実際にヨーロッパの南部では、リーシュマニア症に感染した50％の成人が、HIVウイルスに感染した患者でもある。一方で、このようなリーシュマニア属-HIV 同時-感染のデータに従い、（寄生生物による）感染レベルは多数の検出されない感染の存在により、この数よりも１または２オーダーの規模で高くなり得ると予想された。
【００１６】
異なる型のリーシュマニア属感染に共通する特徴は、感染が宿主に強力な体液性応答を誘導することである。したがって現在、血清学的技術に基づく診断法が最も広く使用されている。
【００１７】
このような抗体は自然な、および実験的感染における疾患の無症状期間中でも検出されると記載された。
【００１８】
この方法の感度および特異性は、使用する抗原の型、起源および純度に依存する。現在、商品化されている免疫学的方法では、完全なプロマスティゴートおよびこれらから多少なりとも調製された調製物が抗原の起源として使用されている。この方法は通常、らい病、結核症、アフリカ トリパノソーマ病、シャガス病、マラリアおよび他の寄生生物症に罹患している患者からの血清と交差反応を導く。
【００１９】
血清学的方法の感度および特異性は、使用する抗原の型、起源および純度に依存する。過去に多数のリーシュマニア属の抗原が特性決定され、その中にはこの寄生生物に対して特異的なタンパク質であると考えることができるものもある。
【００２０】
この寄生生物に対して特異的なタンパク質の中で、表面プロテアーゼGP63、表面グリコプロテインgp46およびリポホスホグリカンが付随したKMP-11タンパク質を挙げる価値がある。
【００２１】
リーシュマニア属の抗原のさらなる群は、キネシン、熱で誘導されるタンパク質、アクチンおよびチューブンリンのような進化的に保存されたタンパク質の形態である。
【００２２】
リーシュマニア症のイヌのための特異的な血清学的診断システムを開発するための方法の一部として、活性な内蔵リーシュマニア症のイヌの血清を使用した、エル.インファンタム(L.infantum)の遺伝子の発現ライブラリーの免疫−検出調査により、エル.インファンタム(L.infantum)の抗原を同定するための研究室でのプロジェクトが組まれた。
【００２３】
この方法により単離された抗原のほとんどが進化の過程で保存されたタンパク質のファミリーに属することが観察された。しかしこのような抗原のＢエピトープの同定では、すべての場合で抗原決定基がよく保存されない領域に位置したことを示す。
【００２４】
特に、酸性リボソームタンパク質LiP2aおよびLiP2bがVL血清の80％以上で認識される。
【００２５】
このようなタンパク質は疾患に特異的な抗原決定基を含み、そしてフラグメントが除去された組換え体タンパク質LiP2aおよびLiP2bはVLとシャガス病との間を区別することができる特異的な道具として使用することができると確認された。
【００２６】
また進化的尺度で大変高度に保存されているエル.インファンタム(L.infantum)のPOリボソームタンパク質は、高い割合のVLのイヌの血清により認識されることが示された。さらに抗原決定基はタンパク質のＣ−末端に、すなわち進化的過程でよく保存されなかった領域中に排他的に見いだされる。
【００２７】
VLのイヌの血清の78％で、H2Aタンパク質に対する抗体も存在することが観察され、そして真核生物間のすべてのH2Aタンパク質における配列同一性にもかかわらず、VL血清中のこのタンパク質に対する体液性応答は、リーシュマニア属のタンパク質H2Aに対して特異的な決定基により特に誘起される。
【００２８】
VLのイヌの血清により認識される抗原決定基は、H2Aタンパク質の両端でも見いだされる。
【００２９】
当該技術分野で現在遭遇する問題の明らかな解決法は、抗原決定基が豊富なタンパク質を構築するという観点でタンパク質LiP2a、LiP2b、LiPOおよびH2Aに対して特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含む合成キメラ遺伝子の集成を可能とする発明である。
【００３０】
しかし出願人が知るかぎりでは、所望の目標に到達する観点に於いて理想として記載される特徴を含む発明は現在のところ無い。この目標は、前述のタンパク質に特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含むキメラ合成遺伝子の集成体から生成される抗原決定基が豊富なタンパク質の構築である。
発明の記載
第１の観点では、本発明はイヌのリーシュマニア症を予防または処置するために有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子に関する。
【００３１】
さらなる観点では、本発明はキメラ遺伝子によりコードされるエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基の１以上を含む該キメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。
【００３２】
本発明はさらに、ヒトまたは動物におけるイヌのリーシュマニア症を予防および／または処置するための方法に関する。この治療的方法では、本発明のキメラ遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を使用することができる。また本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体、またはエピトープのようなそれらの抗原性部分を使用することができる。
【００３３】
さらなる観点において、本発明はヒトおよび／または動物のリーシュマニア症を予防および／または処置するための医薬組成物に関し、これは本発明のキメラ遺伝子および／またはそれによりコードされるタンパク質、またはそれらの部分から誘導される、またはそれらに対する活性物質を含んで成る。活性物質は好ましくは、リーシュマニア症の処置および／または予防のための医薬組成物中で使用できるものである。
【００３４】
特に医薬組成物は、本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質、または本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質の１以上の抗原決定基を含有するそれらの部分を含有するワクチンの状態である。
【００３５】
このようにさらなる観点では、本発明は
ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱ、または保存されたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるいは
ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による任意の生理学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００３６】
また本発明は、
ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱ、またはタンパク質Ｑとは保存されたアミノ酸が異なるこのタンパク質の変異体により、あるいは
ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、リーシュマニア属の寄生生物を認識する抗体の生産を刺激することができるワクチンに関する。
【００３７】
さらに本発明は、
ａ）完全なまたは断片化したタンパク質LiHsp70と組み合わさった、被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質Ｑ、または保存されたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるいは
ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００３８】
さらに別の観点では、本発明は
ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱをコードする配列、またはその配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含む変異体を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは
ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路により投与される、生理学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑを含むDNAベクターにより形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明の別の観点は、
ａ）
１）タンパク質キメラＱをコードする配列、またはこの配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含む変異体、および
２）被験体（ヒトまたは動物）に投与される、タンパク質 LiHsp 70をコードするヌクレオチドの配列または保存されたアミノ酸に関して異なるそれらの変異体、を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは
ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路による、生理学的アジュバントと投与されたａ）で定めたようなタンパク質ＱをコードするDNA配列を含む任意のベクターにより形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００４０】
さらなる態様では、本発明の医薬組成物は本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質またはそれらの一部に対する抗体を含んで成る。
【００４１】
本発明の医薬調製物は、医薬組成物および／またはワクチン用の、それ自体は既知のすべての既知のアジュバント、溶媒、バッファー等をさらに含んでよい。
【００４２】
さらなる観点では、本発明は本発明による医薬組成物またはワクチン、あるいは本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を含んで成る調製物を使用したリーシュマニア症の処置または予防法に関する。
【００４３】
この方法は一般に、キメラ遺伝子またはタンパク質に対する活性物質をヒトまたはイヌのような動物に、特に医薬的に活性な量で投与することを含んで成る。
【００４４】
リーシュマニア症の予防にはキメラ遺伝子、すなわち１以上の抗原決定基を含んで成る該タンパク質の１以上の部分をコードするキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質を含んで成るワクチンを、防御免疫反応を誘導するヒトに投与する。
【００４５】
本発明の調製物、抗体および／またはワクチン投与は、経口的に、筋肉内に、静脈内に、皮下に、（点滴）注入法等によるようなそれ自体は既知の様式で行うことができる。好ましくは調製物またはワクチンは注射され、一方抗体調製物では、注入が使用され得る。
【００４６】
本明細書で本発明のキメラ遺伝子について言及する時、この用語は中程度または緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、以下に述べる配列とハイブリダイズすることができる核酸配列も包含することに注意されたい。
【００４７】
これに関連して、ヘテロロガスなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであり得る：６×SSC（1000mlあたり20×SSC:175.3gのNaCl、107.1gのクエン酸ナトリウム・5H2O、pH 7.0）、0.1％ SDS、0.05％ピロリン酸ナトリウム、５★デンハーツ溶液（500mlあたり100×デンハーツ溶液:10gのFicoll-400、10gのポリビニルピロリドン、10gのウシ血清アルブミン(ペンタッタス 画分V))および20μg/mlの変性したニシン精子DNA中で、56℃で18〜24時間インキューベーション、続いて30分間ずつ２回、５×SSC、0.1％ SDS中にて56℃で洗浄、そして30分間ずつ２回、２×SSC、0.1％ SDS中にて56℃で洗浄。
【００４８】
例えば以下に述べる配列とハイブリダイズすることができる配列には、以下に述べる配列によりコードされるタンパク質と同じ生物活性を持つタンパク質をコードする突然変異体DNA配列を含む。そのような突然変異体配列は以下に述べる配列に１以上のヌクレオチド欠失、置換および／または付加を含んで成ることができる。好ましくは突然変異体配列は以下に与える配列と少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは90％以上のヌクレオチド相同性を有する。
【００４９】
本明細書で使用する用語であるキメラ遺伝子は、以下に述べる配列の１以上の部分を含んで成る核酸配列も包含する。好ましくはそのような配列は、以下に与えるヌクレオチド配列の少なくとも10％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％を含んで成る。そのような配列は以下に述べる配列の連続的フラグメント、あるいは１つのDNA配列中に組み合わされた、かつ／または取り込まれた以下に与える配列の２以上のフラグメントを含んで成ることができる。
【００５０】
本明細書で本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質について言及する時、この用語は同じ生物学的機能を未だ本質的に有する突然変異体タンパク質も含むことに注意されたい。そのような突然変異体タンパク質は、以下に述べる配列によりコードされるタンパク質に比べて、１以上のアミノ酸欠失、置換および／または付加を含んで成ることができる。好ましくは突然変異体タンパク質は以下に与える配列と少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは90％以上のアミノ酸相同性を有する。
【００５１】
また用語タンパク質は、本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質のフラグメントも含む。そのようなフラグメントは、好ましくは完全なタンパク質の生物活性を未だ表す。好ましくはそのようなタンパク質は完全なタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％を含んで成る。または本発明のキメラ遺伝子によりコードされる完全なタンパク質の２以上のフラグメントを組み合わせて１つのタンパク質を形成してもよい。
【００５２】
さらに具体的には本発明は、薬理学的目的、特にリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症の予防および／または処置のために有用なタンパク質をコードする、エル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子、および最終生成物または選択した抗原決定基のすべてを含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の構築物を得ることに関し、これはタンパク質rLiPO-Ct-Qを発現するクローンを最初のベクターとして使用し、そしてこのベクターに適当な制限部位の使用によりタンパク質LiP2a-Q、LiP2b-Q、LiH2A-Ct-Q、LiH2A-Nt-QをコードするDNAのフラグメントを連続して加え、そしてクローニングの各段階の後、各々の挿入物の正しい方向が推定され、そして発現生成物のサイズ、pMalベクター中で発現した最終融合タンパク質であるpPQVのアミノ酸の完全な推定配列は:
【００５３】
【表２】
0004883839.tif 000002
【００５４】
であることが特徴である。
【００５５】
また本発明は、
ａ−タンパク質キメラＱ、または被験体（ヒトまたは動物）に投与される保存されたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるいは
ｂ−単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路を介する任意の生理学的アジュバントと一緒に形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００５６】
または本発明は、
ａ−タンパク質キメラＱ、または被験体（ヒトまたは動物）に投与される保存されたアミノ酸がタンパク質Ｑとは異なるこのタンパク質の変異体により、あるいは
ｂ−腹腔内、皮下または筋肉内経路を介して単離された状態で、または生理学的アジュバントと一緒に形成される、リーシュマニア属の寄生生物を認識する抗体の生産を刺激することができるワクチン。
【００５７】
本発明の別の観点は、
ａ−被験体（ヒトまたは動物）に投与される、完全なまたは断片化したタンパク質LiHsp70と結合したタンパク質キメラＱ、またはこのタンパク質の保存されたアミノ酸の修飾もしくは置換を含む変異体により、あるいは
ｂ−単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路を介する生理学的アジュバントと一緒に形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物を含んで成る。
【００５８】
さらに
ａ−被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱをコードする配列、またはこの配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含む変異体を持つ任意のDNAベクターにより、あるいは
ｂ）筋肉または皮下経路による、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための本発明の医薬組成物が形成され得る。
【００５９】
別の観点では、本発明は
ａ−  １−タンパク質キメラＱをコードする配列、または保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含むこの配列の変異体、および
２−被験体（ヒトまたは動物）に投与された、タンパク質 LiHsp 70をコードする配列または保存されたアミノ酸に関して異なるその変異体、
を持つ任意のDNAベクターにより、あるいは
ｂ−筋肉内、皮下または腹腔内経路により形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００６０】
また本発明は、薬理学的目的、特にリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症の予防および／または処置に有用なヌクレオチド配列およびタンパク質に関し、この配列はベクターpQ31で発現される以下に示すようなDNAおよびアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列は、ベクターからのフラグメントを含む（AA1-37)。アミノ酸配列の残りは、MBP部分および最初の７つのアミノ酸(AA 1-7)を除き配列番号３のアミノ酸配列と同一であり：
【００６１】
【表３】
0004883839.tif 000003
【００６２】
【表４】
0004883839.tif 000004
【００６３】
【表５】
0004883839.tif 000005
【００６４】
あるいはリーシュマニア症に対してヒトまたは動物に防御免疫応答を生ぜしめるために使用することができるそれらの突然変異体またはフラグメント、ならびリーシュマニア症のヒトおよび動物に防御免疫応答を生じるために使用することができるこのタンパク質またはそれらの突然変異体またはフラグメントを含んで成るヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。このタンパク質は発現ベクターpQE31中の遺伝子PQVの挿入に由来する。ここで該キメラ遺伝子は好ましくは分子量38kDおよび等電点7.37で生成するポリペプチドをコードする。
【００６５】
また本発明は、上記のタンパク質またはヒトおよび動物においてリーシュマニア症に対する防御免疫反応を生ぜしめるために使用することができるそれらの突然変異体またはフラグメントを含んで成る、リーシュマニア属の寄生生物を認識する抗体の生産を刺激することができるワクチンに関する。
【００６６】
本発明のさらなる観点は、上記タンパク質またはそれらの突然変異体またはフラグメントに対する抗体を含んで成り、好ましくはエピトープのような１以上の抗原決定基を含む、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物を包含する。
【００６７】
本発明はさらに、ヒトまたは動物に上記の医薬組成物を投与することを含んで成る、ヒトまたは動物におけるリーシュマニア症の予防または処置法、あるいはヒトまたは動物に上記のワクチンを投与することを含んで成る、ヒトまたは動物におけるリーシュマニア症の予防法に関する。
【００６８】
本発明が提案するリーシュマニア症の予防および／または処置に有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子および得られるタンパク質は、本発明により本来的にその応用分野において明らかな新規性を構成し、タンパク質LiP2a、LiP2b、LiPOおよびH2Aに特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含む合成のキメラ遺伝子が集成により得られる時、これは抗原決定基が豊富なタンパク質を構成する。得られたキメラ遺伝子は、大腸菌（Escherichia.coli）中で発現させ、そして産物がその抗原性について分析された。その結果からこのキメラタンパク質が元のタンパク質のすべての抗原決定基を維持し、そして80％〜93％の間で振れる感度および96％〜100％の間の特異性を持つイヌのVLのための関連する医薬的に有用な要素を構成することが確認される。
【００６９】
より詳細には、エル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子およびそれにコードされるタンパク質は、イヌのリーシュマニア症の予防および／または処置に有用であり、そして本発明の目的で得られるタンパク質は、以下の工程により生成される、すなわち：
−キメラ遺伝子の構築。方法論。
【００７０】
クローニング法
ヒストンのタンパク質H2Aの抗原決定基をコードするDNA配列のクローニング。
【００７１】
rLiP2a-QおよびrLiP2b-Qをコードする配列のクローニング。
【００７２】
配列rLiPO-Qのクローニング。
【００７３】
キメラ遺伝子のクローニング。
−中間産物の構成物からのキメラ遺伝子の構築。
【００７４】
エル．インファンタム（小児リーシュマニア）抗原に特異的なエピトープのクローニング
−最終産物の構築
すべての選択した抗原決定基を含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の構築
−このようにして得られた配列の随意の発現
−最終産物の評価
血清
タンパク質の精製
タンパク質の電気泳動および免疫学的分析
ＦＡＳＴ  ＥＬＩＳＡによる測定
−最終産物の評価
抗原的性質
イヌＶＬの血清診断におけるキメラタンパク質ＣＰの感度および特異性
選択された抗原決定基のそれぞれ１個をコードするＤＮＡ配列のクローニングが後に続く戦略は、すべての場合に同様であり、そして第一段階では、関係する配列をＰＣＲによりそして最末端で制限酵素の標的を含む特異性オリゴヌクレオチドを用いて増幅する。
【００７５】
クローニング段階では、増幅された産物は、適当な制限酵素により指令され、そしてプラスミドｐＵＣ１８の相当する制限部位内に挿入される。
【００７６】
ＤＮＡを配列決定した後、挿入物を回収しそしてｐＭＡＬ−ｃ２と名付けた変性プラスミドの相当する制限部位にサブクローニングする。変性は、ｐＭａ１−ｃ２のポリリンカー内の標的ＨｉｎｄＩＩＩの下流側に終止コドンを挿入して作製され、得られたプラスミドをｐＭＡＬ−ｃ２’と呼ぶ。
【００７７】
ヒストンタンパク質Ｈ２Ａの抗原決定基をコードするＤＮＡ配列のクローニングに関して、エル．インファンタムのヒストンＨ２ＡをコードするクローンｃＬ７１のｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そしてヒストンＨ２Ａ、さらに正確にはｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−ＱのＮ−末端領域をコードするＤＮＡの増幅のために、下記のオリゴヌクレオチドが使用されることを指摘しなければならない：センス  ５’−ＣＣＴＴＴＡＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−３’（配列ｃＬ７１の位置８４−１０４）、アンチセンス  ５’−ＣＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＡＴＧＣＧ−３（配列ｃＬ７１の位置２０４−２２４の逆で相補的）。
【００７８】
クローニングのためのオリゴヌクレオチド内に含まれそして親配列ｃＬ−７１内には含まれない配列を太字で表す。
【００７９】
増幅されたＤＮＡ断片は、ｐＭＡＩ−ｃ２’の制限部位ＸｍｎＩから直接クローニングされる。
【００８０】
断片は、イニシエーター＃１２３４  ｍａｌＥを用いて配列決定され。そしてヒストンＨ２Ａの抗原Ｃ−末端領域、具体的にはｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑは、下記のオリゴヌクレオチドを用いて増幅される。これらは下記である。
センス  ５’−ＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧ−３’（配列ｃＬ７１の位置２７６−２９６）、
アンチセンス  ５’ＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣ−３’（プラスミドｃＬ７１の位置４５６−４７６の逆で相補的）。
【００８１】
プロリンをコードするトリプレット（下線を付した文字の後にＧＧＧとして示される）が、アンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれ、クローニングのための両方のオリゴヌクレオチド内に含まれる制限部位ＥｃｃＲＩを下線で示す。
【００８２】
ｒＬｉＰ２ａ−Ｑをコードする配列のクローニングに関して、関係する領域は、ＬｉＰ２ａおよびＬｉＰ２ｂをコードするｃＤＮＡからのＰＣＲにより増幅されることを指摘しなればならない。
【００８３】
発現クローンＬｉＰ２ａ−Ｑを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドは、下記である。
【００８４】
センス  ５’−ＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＧＴＡＣ−３’、
アンチセンス  ５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣ−３’。
【００８５】
オリゴヌクレオチドの５’最末端に付加されたＳａｌＩ制限部位を下線付けしたことを指摘しなければならない。
【００８６】
発現クローンＬｉＰ２ｂ−Ｑを構築する場合に、使用されたオチゴヌクレオチドは下記である。
【００８７】
センス５’−ＴＧＴＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣ−３’、
アンチセンス  ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＣＴＣ−３’。
【００８８】
オリゴヌクレオチドの５’最末端に酵素ＸｂａＩ（下線部）に対する制限部位が含まれ、そしてクローニングの必要性から、プロリン残基をコードする追加のトリプレットが制限部位の下流側に含まれる。
【００８９】
配列ＬｉＰＯ−Ｑのクローニングに関して、エル．インファンタムのタンパク質ＰＯのＣ−末端領域のＤＮＡ配列のクローニングが、Ｌ２７と呼ばれ、下記の配列を有するｃＤＮＡのクローンを増幅することにより行われることを指摘しなければならない。
【００９０】
センス５’−ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣ−３’（Ｌ２７ｃＤＮＡの位置１−２４）、およびｐＵＣ１８配列のイニシエーター（＃１２１１）、増幅されたＤＮＡは、酵素ＰｓｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩにより指令され、その後プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２内に挿入される。
【００９１】
得られたクローンをｐＰＱＩと呼び、そして制限部位ＰｓｔＩがセンス方向でヌクレオチド内に含まれ（下線付き配列）そして制限標的ＨｉｎｄＩＩＩがｃＤＮＡＬ２７内に存在することに注意しなければならない。
【００９２】
キメラ遺伝子のクローニングに関して、５個の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列が一個のキメラ遺伝子に構築され、そしてこの構築はクローンｐＰＱＩ上で行われ、これに抗原領域ＬｉＰ２ａ−Ｑに対するコード化領域が、３’方向に順番に（クローニングｐＰＱＩＩの結果の名称）、ＬｉＰ２ｂ−Ｑ（クローンｐＰＱＩＩＩ）、ＬｉＨ２ａ−Ｃｔ−Ｑ（クローンｐＰＱＩＶ）およびＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−Ｑ（クローンｐＰＱＶ）に付加されることを指摘しなければならない。
【００９３】
最後に、最終クローンｐＰＱＶのＳａｃＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に得られる挿入物は、ｐＱＥ３１発現プラスミド内に挿入され、得られたクローンをｐＰＱと名付ける。
【００９４】
【発明の好ましい態様】
イヌリーシュマニア症の血清学的診断のために使用できるエル．インファンタムの４種のタンパク質の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列から形成されたキメラ遺伝子および提出する得られたタンパク質は、中間産物の構築物から構成される。第一の例では、エル．インファンタムの抗原に特異性のエピトープのクローニングを行い、これはエル．インファンタムの４種のタンパク質抗原（ＬｉＰ２ａ、ＰｉＰＯ、ＬｉＰ２ｂ、ＬｉＨ２ａ）の抗原性に関する以前の研究に基づいて構成され、これはこれらのタンパク質に対して特定されるＢエピトープの存在を許容し、そしてこれはＶＬのイヌ血清により特異的に認識される。
【００９５】
エル．インファンタムのタンパク質に関するこれらの抗原の抗原的特異性を改善する観点をもって、特異性抗原決定基をこれらのタンパク質からクローニングする。これらのタンパク質の一定の領域を除いた後、これらは、ＶＬおよびその他の種々の疾患のキャリヤーである動物からの血清により認識できる。
【００９６】
特異性オリゴヌクレオチドを用いそして遺伝子ＬｉＰ２ａ、ＬｉＰ２ｂ、ＰＯおよびＨ２Ａに特異性の領域のＰＣＲ増幅により、組換えタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、ｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−ＱおよびｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−Ｑを発現する数種のクローンが構築され、これらはクローニングの詳細が記載されている方法に関する本発明の説明の部分に詳細に記載されている。
【００９７】
使用された組換えタンパク質は、下記である。
−ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、これはリボソームタンパク質ＬｉＰＯの３０個のＣ−末端残基に相当する。
−ｒＬｉＰ２ａ−ＱおよびｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、これらはそれぞれリボソームタンパク質ＬｉＰ２ａおよびｒＬｉＰ２ｂから誘導される。
−ヒストンＨ２Ａの２個のサブ領域、これらは４６個のＮ−末端残基（ｘＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−Ｑ）および６７個のＣ−末端残基（残基（ｘＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑ））に相当する。
【００９８】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合した組換えタンパク質のそれぞれは、大腸菌(E. coli) 内で発現され（図１Ａに図示）、そしてこれらはアミロースカラムＢ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。精製工程の後、組換えタンパク質に関して電気泳動を行った（レーン１〜５）。
【００９９】
組換えタンパク質がＶＬイヌ血清により認識されたかどうかを分析する目的で、３種のＶＬイヌ血清の混合物内の組換えタンパク質を含むウエスタンブロットをインキュベーションした。これらのタンパク質すべてが血清により認識された場合には、親タンパク質中に存在する抗原決定基は、組換えタンパク質（Ｃ）中に維持されていると結論される。
【０１００】
組換えタンパク質の抗原性を、ＦＡＳＴ  ＥＬＩＳＡを用いて２６個のＶＬイヌ血清のコレクションに対して試験して、親抗原の抗原決定基と比較し（図１Ｄに示す）、そして血清が選択された領域および相当する完全タンパク質の両方に対して類似した反応性値を示すという事実は、クローニング操作の間に抗原エピトープへの改変が起きていないことを確認する。
【０１０１】
最終産物、さらに正確には選択された抗原決定基すべてを含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の構築に関して、クローニング戦略が図２のＡに示されていることを指摘しなければならない。プロセスの間に産生した中間産物を示す。
【０１０２】
タンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ（ｐＰＱＩ）を発現するクローンは、初期ベクターとして使用され、そしてタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、ｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−ＱおよびｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−ＱをコードするＤＮＡ断片を適当な制限部位を用いて順番に付加する。
【０１０３】
それぞれのクローニング段階の後に、それぞれ挿入物の正確な方向を発現産物の大きさから導出し、そして最終的に最終クローンｐＰＱＶの完全ヌクレオチド配列を決定しそしてアミノ酸配列は図３中に記載した配列から導出する。
【０１０４】
産生したポリペプチドは、分子量３８ｋＤａ、等電点７．３７を有し、図３で下線を付したプロリンをコードするスペーサー配列を有する。これを行う目的は、抗原ドメインを効率的に分離しそして最終産物の安定性および抗原性に妨害となる可能性があると考えられる三次構造を避けるためである。
【０１０５】
中間産物それぞれの発現および回収を、図４のボックスＡおよびＢに示す。予想されるように、それぞれの付加の後に、ベクターｐＭＡＬ内の発現産物の大きさは、８０ｋＤａに達するまで段々と増加し、精製の間にある程度の破壊が観察される。
【０１０６】
キメラ遺伝子も、最末端のＮ−末端における６ヒスチジンの断片を用いるタンパク質の発現を許容するベクターであるプラスミドｐＱＥ内にクローニングした。得られたクローンおよび組換えタンパク質は、それぞれｐＰＱおよびＰＱと呼ぶ。
【０１０７】
ｐＰＱプラスミドを用いて形質転換した細菌内のタンパク質の発現のレベルおよび精製したタンパク質を図４で特にＤと呼ぶ部分に示し、変性した条件でアフィニティクロマトグラフィーにより精製したタンパク質ＰＱは、図４のボックスＤ、レーン２内に示す組換えタンパク質ｐＰＱＶより安定である。
【０１０８】
最終産物を評価するために、一連の材料および以下に記載する明らかに幾つかの技術を使用した。
【０１０９】
種々の起源のイヌから得たＶＬの血清を使用した。動物は適切な研究所、一般的には寄生虫学部において臨床的および解析的に評価し、そしてすべての陽性血清を間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）により試験した。
【０１１０】
これらの動物の寄生虫のアマスチゴートの存在は、膝窩およびプリースカピュラー(pleescapular)リンパ節の直接観察により確認し、そして他の領域に起源するＶＬの３３個の血清の第二の群は、寄生虫の全タンパク質抽出物に対するＥＬＩＳＡおよび／またはＩＩＦにより陽性診断が与えられた。
【０１１１】
ＶＬではない種々の疾患により冒されたイヌの血清を種々の起源から入手した。この群の中で、下記の感染からの血清が見いだされた。
【０１１２】
中擬条虫属(Mesocestoides spp.)
ディフィリディウム・カニヌム(Dyphylidium caninum)
狭頭鉤虫(Uncinaria stenocephala)
イヌ回虫(Toxocara canis)
ディペタロネーマ・ドラヌンクロイデス(Dipetalonema dranunculoides)
イヌ・ニキビダニ(Demodex canis)
イヌ・バベシア(Babesia canis)
イヌ・エールリヒア(Ehrlichia canis)
リケッチア(Ricketsia ricketsiae)
残りの血清は、いかなる感染過程にも関連がない種々の臨床症状を示すイヌから得て、そして血清対照は、１５頭の注意深く養育した健康な動物から得た。
【０１１３】
クローニングしたｐＭＡ１−ｃ２により発現された組換えタンパク質の精製は、アミロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーにより行い、そしてクローンｐＰＱにより発現された組換えタンパク質の精製は、変性条件におけるＮｉ−ＮＴＡ樹脂カラム上で行った（キアジェン(Qiagen)）。
【０１１４】
タンパク質分析のために、ＳＤＳの存在下での１０％ポリアクリミドゲル上の電気泳動を標準条件下で行った。電気泳動で分離されたタンパク質の免疫学的分析は、タンパク質を移行させたニトロセルロース膜上で行った。移行したタンパク質を、０．５％ツイーン(Tween) ２０を含むＰＢＳ緩衝液中の乾燥５％脱脂乳を用いてブロックした。
【０１１５】
ブロッキング溶液内で一次および二次抗血清にフィルターを順番に接触させ、そしてペルオキシダーゼで標識した免疫複合体を第二抗体として用い、ＥＣＬシステムを用いて特異性結合を可視化した。図４Ｅはタンパク質ＰＱのウエスタンブロットを示す。
【０１１６】
従来のＥＬＩＳＡの代わりにＦａｓｔ−ＥＬＩＳＡを用い、そして抗原の増感は、１２時間、室温で行った。
【０１１７】
すべての場合に濃度が２μｇ／ｍｌである抗原１００μｌを用いて平板を増感した。
【０１１８】
ウエル増感の後、平板を１時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ−０．５％ツイーン２０中に溶かした０．５％脱脂粉乳、そして血清をブロッキング溶液中で３００倍に希釈した）と一緒にインキュベーションした。
【０１１９】
ウエルを血清と一緒に２時間、室温でインキュベーションし、そして抗体に暴露した後、ウエルをＰＢＳ−ツイーン２０を用いて洗浄した。
【０１２０】
ペルオキシダーゼで標識した抗体を希釈度１：２０００で第二抗体として使用し、そして反応物の色を基質オルトフェニレンジアミンを用いて発色させ、４５０ｎｍにおける吸光を測定した。
【０１２１】
最終産物の評価に関して、キメラタンパク質に対しておよび「ウエスタンブロット」アッセイにおける中間産物のそれぞれに対してＶＬイヌ血清の反応性の適切な試験により、抗原性を決定したことを指摘しなければならない。すべての中間産物が、全クローニングプロセスの間、その抗原性を維持し同様に最終ｐＰＱＶ産物も維持した（図４Ｃ）。
【０１２２】
ｐＰＱプラスミドにより発現された組換えタンパク質は、ＶＬ血清により認識されたことも指摘しなければならない。さらに高い精度を有する分析を考慮して、キメラタンパク質および中間産物の抗原性、ＶＬイヌの各種の反応性の分析は、組換えタンパク質に対するＦａｓｔ−ＥＬＩＳＡにより行われ、これを図４のＦに示す。クローニングの種々の中間産物の感度は、各付加段階ごとに上昇することが強調できる。タンパク質ｐＱＩが大部分のＶＬ血清により認識され、そしてタンパク質ＰＱＩＩが同様に大部分の血清により認識されたことも指摘しなければならない。この比率はタンパク質ＰＱＩＩＩの方が大きく、そしてタンパク質ＰＱＩＶ、ＰＱＶおよびＰＱは、実際的にすべての血清により認識される。
【０１２３】
上記の考察に従って、血清により示された認識の割合は、キメラタンパク質ＰＱＶおよびＰＱのアッセイの場合と、組換えタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ、ｒＬｉＰ２ｂおよびｒＬｉＨ２Ａの混合物をアッセイした両者で同様であった。５種の選択した抗原領域のそれぞれの抗原性は、ＰＱ発現産物中に存在し、従ってこの産物は個別に発現した抗原の混合物の代わりに診断に使用できることが分かった。
【０１２４】
キメラタンパク質がイヌＶＬ血清診断に使用できるかどうかを決定する見解に関し、そしてこのタンパク質に対するイヌ血清の種々の適切な分析に従って、動物の臨床特性に従ってイヌ血清は３群に分類できることに注意すること。第一の群は、真のエル．インファンタム感染を有するイヌからの血清から成っていた。第二の群は、リーシュマニアとは異なる寄生虫に感染したイヌを含み、リーシュマニアに感染していないが種々の臨床症状を有するイヌ、およびリーシュマニア症の間に観察される症状と混同するような臨床症状を示すイヌの血清から成っていた。
【０１２５】
第三の群は、健康な犬を起源とする対照血清から成っていた。
【０１２６】
図５には、反応性の平均値を血清のそれぞれの群に対して示し、ＶＬ血清の反応性は、０．８の平均反応性値に達している（標準偏差＝０．４）。
【０１２７】
この群内で、１２個の血清の反応性は、陽性ではあるが０．３５未満であり、一方１０個の血清の反応性は０．３５〜０．５の間の値に達する。２３個の血清の反応性は、０．５〜１０の間にあり、そして１４個の血清は１．０を越える反応性を示すことが観察された。
【０１２８】
第二の群、すなわち、リーシュマニア寄生虫とは異なる寄生虫に感染している群の血清の平均吸光値は、０．２（標準偏差＝０．０５）であり、そして対照血清、すなわち第三群の反応性は、０．１（標準偏差＝０．００３）であった。群２からの血清２個だけが０．３５〜０．４の反応性を示した。
【０１２９】
上記のデータは、カットオフ値を群２に標準偏差の３倍を加えて平均反応性値と定義すると（すなわち０．３５）、ＦＡＳＴ  ＥＬＩＳＡにおけるキメラタンパク質ＰＱは、ＶＬ診断に対して８０％の感度を有することを示す。
【０１３０】
カットオフ値を対照群の反応性値により定義すると、アッセイした群の感度は９３％に達する。カットオフ値を上記の群２の血清により定義すると、タンパク質Ｑは、ＶＬ診断に対して特異性９６％を有する。健康なイヌの反応性値を考慮すると、アッセイの特異性は１００％に達する。
【０１３１】
使用すべきプロセスは下記である。
【０１３２】
１．−  緩衝液ＰＢＳ−０．５％ツイーン２０−５％脱脂乳（緩衝液Ａ）内に溶かした抗原の１μｇ／ｍｌを含む溶液のインキュベーションした１００μｌによる抗体を用いてマイクロタイター平板を被覆する。
【０１３３】
インキュベーションは、１２時間、室温で行い、次いで平板を３回、抗原を含まない同じ緩衝液を用いて洗浄する。乾燥した抗原平板は室温で保存できる。
【０１３４】
２．−  ウエルの第一インキュベーションは、緩衝液Ａ内で１／２００に希釈した動物の血清を用いて行った。インキュベーションは１時間継続する。
【０１３５】
３．−  １．項記載のようにして、洗浄フラスコを用いて３回、緩衝液Ａを用いてウエルを洗浄する。
【０１３６】
４．−  緩衝液Ａ内で１：２０００に希釈した第二抗体（過酸化物で標識したＩｇＧ）を用いてこれらをインキュベーションし、インキュベーションは１時間行う。
【０１３７】
５．−  ウエルを、３．項記載のように、すなわち洗浄フラスコを用いて、緩衝液Ａを用いて再び３回洗浄する。
【０１３８】
６．−  基質オルト−フェニレンジアミンを用いて反応性を顕在化させ、そして４５０ｎｍで吸光を測定する。
【０１３９】
キメラ遺伝子から抽出された診断のために使用するタンパク質を同定し、そして該タンパク質をコードするヌクレオチドは、下記である。
【０１４０】
【表６】
0004883839.tif 000006
【０１４１】
【表７】
0004883839.tif 000007
【０１４２】
【表８】
0004883839.tif 000008
【０１４３】
【表９】
0004883839.tif 000009
【０１４４】
当該技術分野の熟練者が本発明の範囲およびこれが提供する利益を理解できるようにするためにこの説明をさらに延長する必要はないと考えられる。
【０１４５】
要素の材料、形状、大きさおよび処理は、本発明の本質を変化させないと考えられる限り、変化が可能である。
【０１４６】
この開示が記述された内容は、常にその本質に関して広く解釈されるべきであり、そして限定されるものではない。
（リーシュマニアに対するワクチン）
【０１４７】
【発明の背景】
リーシュマニア属の原生動物の寄生体はリーシュマニア症、本質的に熱帯及び亜熱帯地域のヒト及び動物に感染する症候複合疾患を引き起こす原因である。ヒトの内蔵のリーシュマニア症の新規症例数は５００，０００の数に達する可能性があり、感染患者は最低数千万人であると算定されている。更に、皮膚及び粘膜皮膚のリーシュマニア症の患者数は毎年２，０００，０００人の次元である可能性がある（Ｍｏｄａｂｂｅｒ．，１９９０）。異なる型のリーシュマニア症に罹る危険性のあるヒトは約３億５千万人と算定できるが無症候性感染の実際の症例の明白な算定がない事実により、そして潜在性感染の存在のために実際に感染した患者数はずっと高い可能性がある。事実、リーシュマニア症は世界的影響をもつ寄生体疾患の位置付けにおいて第４位と第５位の間に位置する、風土性をもつ感染症／疾患として地球的範囲内で考えることができる。
【０１４８】
リーシュマニア症には３種類の主要な形態が区別される、皮膚、粘膜皮膚及び内臓のもので、それらの特徴は大部分は、寄生体の局在部位、それが属する種及びそれがもたらす臨床症状による。アジア地域及び地中海地域のある地方に分散された種は多くの場合自然治癒する局部的潰瘍を伴う皮膚の形態の存在をもたらす。これらの出現は森林型熱帯リーシュマニア（L．major）及び熱帯リーシュマニア（L．tropica）により誘起される。エチオピアリーシュマニア（L．aethipica）（地中海、アジア、アフリカ）もまた、その発現はより広域であるが、リーシュマニアの皮膚形態を誘発する。米国ではメキシコリーシュマニア（L．mexicana）種が通常自然治癒はしない広域の局在性をもつ皮膚形態をもたらす。ヒトの疾患の粘膜皮膚形態はブラジルリーシュマニア（L．brasiliensis）により誘起され、粘膜の破壊をもたらす口鼻及び咽頭領域における皮膚病巣の存在を特徴とする。米国、欧州、アフリカ及びアジアにおいて、最も頻発する形態のリーシュマニアはシャガシ・リーシュマニア（L．chagasi）、ドノバン・リーシュマニア（L．donovani）及び小児リーシュマニア（l.infantum）により誘起される内臓形態である。この形態のリーシュマニア症は正当な時期に適切に処置されないと致死性の熱、貧血及び強度な肝臓／脾臓腫大を伴う臨床症状を特徴とする。疾患の進行形態においては、宿主は有効な免疫反応を発達させることができない。これらすべてのリーシュマニアの形態はまた事実寄生体の主要な保有物を形成するイヌ類及び幾つかの囓歯類に認められる。地中海沿岸で小児リーシュマニアによりもたらされた健康の問題はイヌに感染／疾患の高い発生率があり、ベクター昆虫が非常に広範であるので深刻である。イヌ類全体の７〜２０％がリーシュマニアに感染しており、地方であるスペインの幾つかの地域では３０％に達すると計算されている。この事実は、基本的には免疫低下したヒトによる伝染の危険を更に増加させる深刻な家畜の問題を形成する。欧州においてはリーシュマニアによる感染の危険のある約１１百万頭のイヌがいる。
【０１４９】
小児リーシュマニアはその属の残りの種と同様に二相性の生物学的サイクルを有する。中間宿主はチョウバエ科（Psychodidae）、フレボトムス（Phlebotomus）属の昆虫である。欧州の地中海区域においては、ベクターのパパトシサシチョウバエ（P.papatosi）、フレボトムス・ロンギクスピス（P.longicuspis）及びフレボトムス・セルゲンチ（P.serugenti）も存在するが、フレボトムス・アリアス（P.arias）種及びユウガイサシチョウバエ（P.perniciosus）が主要ベクターであることが示された。寄生体が脊椎動物の宿主の血液とともにベクターにより摂取される時に、それは自身を細胞外形態で腸内に入れて、プロマスティゴートに形質転換し、分裂する。感染性形態は咽頭及び鼻の方向に移動し、そこからそれらは新規の脊椎動物の宿主中に植え付けられるであろう。プロマスティゴートはそれらが鞭毛及び長さが約１５〜２０μｍの細長い形態をもち、円い前端及び尖った後方端をもつことを特徴とする。核は中央部に位置しキネトプラストは後方端に位置する。培養液中では寄生体はある程度の形態の変異性を示す。脊椎動物の宿主の皮膚におけるプロマスティゴートの植え付け後の感染の樹立又は非樹立は本質的に２つのファクター、適当な細胞集団−マクロファージ−及び食細胞の単核系の他の細胞の存在並びにこれらの細胞内部における寄生体の生き残り及びそれ自体の複製能力、に左右される。
【０１５０】
リーシュマニアのマクロファージ中への侵入における第１段階は標的細胞の血漿膜への接近及び付着である。インビトロの研究は、マクロファージ上へのプロマスティゴートの直接の走化性引き付けはないことを示すように見える。組織の環境内では、遊離プロマスティゴーが代替通路により補体を活性化して、画分Ｃ５ａの濃度勾配の形成をもたらし、それが植え付け部位の方向へマクロファージ及びその他の炎症性細胞を引き付ける。プロマスティゴートが一旦寄生体運搬（parasitophorous）小胞内に入ると、リソソームがそれに融合してファゴリソソームを形成する。他の微生物により誘起される感染においてはファゴリソソームは毒性の酸素ラジカルの生成のような幾つかの機序による、酸化的代謝過程、加水分解性リソソーム酵素の作用、カチオン蛋白質及び低いｐＨによる分解及び排除の原因となる小器官である。ファゴリソソーム中の寄生体の生き残りは前記の機序に対する抵抗及びそれを回避するその能力の働きである。
【０１５１】
体液性及び細胞性の両方でリーシュマニアによる寄生に対する免疫反応の存在はその疾患が研究された最初の瞬間から発見され、多数の機会に改定されてきた。体液反応の種類はリーシュマニア症の形態により異なる。皮膚の形態においては体液反応は非常に弱く、一方内臓の形態においては高い抗体反応が認められる。皮膚感染症においては、遅延型過敏症試験（ＤＴＨ）によりインビボで、並びにリンパ芽球転換試験及びマクロファージ遊走抑制試験によりインビトロでの両方で検出可能な著明な細胞媒介反応がある。これらの場合には血清抗体の滴定は通常低く、過程の重症度と直接関連している。一旦無鞭毛体がマクロファージ内に入ると、感染の消散（resolution）は本質的に細胞媒介免疫機構による。細胞反応はマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ−細胞の幾つかの亜集団及びそれらすべてにより分泌される異なるリンフォカインの総合作用により決定される。寄生されたマクロファージはリーシュマニア抗原を処理し、クラスIIの主要組織適合試験複合体（ＭＨＣ−II）により仲介される方法によりその表面上にそれらを発現する。更に、マクロファージはＩＬ−１を分泌し、それがＴ−リンパ球の第２の活性化信号として働く。ヒトにおいては内臓のリーシュマニア症もしくはカラ−アザール（kala-azar）は遅延過敏症（ＤＴＨ）の不在及び細胞増殖法の両方により検出可能な弱体化または不在の細胞反応を特徴とする。Ｔ−細胞の増殖の不在はコンカナベリンＡまたはフィトヘマグルチニンのような分裂促進剤の存在下及び刺激されたＴ−細胞によるＩＬ−２の生産の阻止下ですら検出される。
【０１５２】
マウスにおいては、Ｔ−リンパ球（ＣＤ４表現型）の集団は異質性で、それらが生産するリンフォカインに従って少なくとも２種類の亜集団に分類することができる。これらの細胞は皮膚のリーシュマニア（亜集団Ｔｈ−１）に対する防御免疫の発達に必須であり、そして同時に防御免疫反応（亜集団Ｔｈ−２）の抑制に関与する。抵抗性マウスＣ５７ＢＬ／６または治癒ＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導されたＴ細胞は主としてＴｈ−１型のものであり、一方治癒しなかったＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞はＴｈ−２型のものである。概してこれらの細胞により分泌されたリンフォカインはそれらを生産する細胞系の発育を好み、他の亜集団の発育に対して拮抗効果をもつ。このようにＴｈ−２細胞により生産されたＩＬ−４及びＩＬ−１０は感染の進行に寄与し、この系の発育を好む。更に、それらはその活性化を許さないことによりマクロファージ上に直接作用することができる。しかし、ＩＬ−４をコード化する遺伝子の欠乏したリーシュマニア感染に感受性のマウスにおいては、反対の結果が得られた。幾つかの症例においてはこのサイトカインの不在が反応を再誘導して、感染に対する抵抗性を増加させ、一方他の場合には、マウスの感染性の度合に差異は認められないことが発見された。遺伝子的に抵抗性のマウスにおいてはＩＦＮ−Ｙまたはその受容体、ＣＤ４０またはＣＤ４０のリガンドの発現の不在が感染に対する感受性を増加することが認められた。ＣＤ４０とそのリガンドの相互反応はＴｈ−１に対する反応を方向付けるために必要なサイトカインＩＦＮ−Ｙの生産に必要である。Ｔｈ−１型の反応を発達させる抵抗性の遺伝子塩基をもつマウスはＴｈ−２型の反応を発達させてＩＬ−１２の発現に欠陥性である場合は感受性になる。最近のデータによりＩＬ−１２の生産は反応をＴｈ−１に向けるために重要であり、そしてＩＬ−４の不在はＴｈ−２反応を回避することができることが示唆されている。
【０１５３】
本質的に「ウエスタンブロット（Western Blot）分析法」を特徴とする抗原性特徴を有する多数のリーシュマニアの蛋白質が存在する。リーシュマニアに感染した患者及びイヌの血清中には、ｇｐ６３、ｇｐ４６、ＰＳＡ及びＫＰＭ−１１のような膜蛋白に対する抗体の存在を検知することが可能であった。更に、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ８３、ＬＩＰ２ａ、ＬＩＰ２ｂ、ＬＩＬＩＰ０、Ｈ２Ａ、Ｈ３及び、キネシンに関連した蛋白質、リーシュマニア・シャガシ（L．chagasi）のＫ３９のような細胞質の細胞内に局在の幾つかの抗原が特徴を示された。小児リーシュマニアにより感染されたイヌの血清中に存在する保存蛋白を認識する抗体の反応性はこれらの蛋白の保存の最も少ない領域の方向に向けられる。幾つかの膜蛋白は自然感染に非常に抗原性である。自然感染すべてにおいては、感染過程の期間中に発育した抗体はその中で非常に制約された区域を認識するので、蛋白に対する体液反応において著しい制約がある。ＩｇＧのレベルは通常、感染の強度に対応し、寄生による荷重により決定される抗原性刺激の程度及び期間を反映する。Ｔｈ−２型の早期反応をもたらすＣ型キナーゼ受容体（ＬＡＣＫ）に類似のリーシュマニア抗原が最近説明された。ＬＡＣＫ抗原に形質転換し、感染に感受性の遺伝的背景をもつのマウスにおいて、この抗原に対する寛容性の誘導が森林型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対して防御する。抗リーシュマニア抗体は補体の存在下でインビトロでプロマスチゴートを破壊し、食菌作用を促進し、そしてプロマスチゴート及び無鞭毛体の表面に対する幾つかの粒子の付着を誘導することができる。
【０１５４】
病理学的反応は寄生されたマクロファージの密度と平行して進行するように見える。内蔵のリーシュマニア症において、マクロファージは概して異なる有機体組織全体に拡散する方法で分散する。炎症の種類は食細胞の増殖とともにリンパ球及び血漿細胞の優勢を伴って重要な細胞浸潤物により構成される。炎症は重篤な全身の変化をもたらす罹患器官の生理学に変化をもたらす。ある場合には、異なる器官に肉芽腫及び微細肉芽腫の外観を伴う局部的肉芽腫性炎症が起こる。これらの肉芽腫はマクロファージ並びに血漿細胞及びリンパ球に囲まれた繊維球増殖体（寄生体により感染されようとされまいと）並びにある場合には繊維芽細胞により形成される。この炎症過程は罹患器官に特徴的な病巣の外観を伴う有機反応を伴う。何人かの著者は実質的に器官全体にアミロイド物質の沈着を発見した。何人かの著者は当該疾患によりもたらされた損傷は病因学的物質に直接起因させることはできず有機反応に引金を引かれるという仮説を作成した。
（リーシュマニア症に対するワクチン）
皮膚のリーシュマニア症からの回復に続く強力な免疫が本疾患に対する予防的ワクチンの開発に大きな影響を与えた。この免疫はマクロファージを活性化し寄生体を破壊する炎症性サイトカインの生産をそれと関連付けたＴ反応の誘導に由来する。感染の場合の免疫学的記憶は恐らく、付随する免疫として知られた方法で宿主中における寄生体の恒常的存在により維持される。
【０１５５】
１９４０年代の１０年間のリーシュマニア症に対するワクチン注射に関する第１の研究は免疫原として生存寄生体を使用した。これらの研究はその後の再感染に対する重要な防御をもたらしたワクチンの生産に導いた。しかし、生きた有機体が本当の感染症をもたらし得るという可能性を知ってこのようなワクチン注射計画を長い間実施させないで、その反対に、死亡した寄生体を基礎にしたワクチンに関心が集まった。これらの研究は寄生体の接種による有効なワクチンを生産する可能性に対する第１の証拠を提供した。
【０１５６】
死亡リーシュマニアのプロマスティゴートによる免疫処理を使用した臨床試験もまた４０年代の１０年間に開始された。これらのワクチンは集団に応じて０〜８２％の間の可能性がある、ある程度の防御が認められたので著明な成功をもたらした。これらのワクチンは生存寄生体のワクチンよりも小さい効果を有した。マウスを感染から防御する森林型熱帯リーシュマニア（L．major）の無毒のクローンの単離は弱毒化されたワクチンが可能であることをも示した。しかし、無毒性の喪失及び無毒性の復帰変異体の生産の危険に導く突然変異体の無視がこの種類のワクチン注射を現在許容できないものにしている。
【０１５７】
最近、ｇｐ６３、ｇｐ４６／Ｍ６、ＰＳＡ−２として知られる後者の抗原に関連した表面の抗原及び蛋白質ｄｐ７２及びｇｐ７０−２、ＬＡＣＫ蛋白質及びＫｍｐ１１のような分子として規定された候補のワクチンの同定の方向に重要な進展があった。特に蛋白質ｇｐ６３中に存在するＴエピトープが同定され、それらの幾つかのみがＴｈ−１及びＴｈ−２の両方のＴ反応を誘導することができることが見いだされた。これらの抗原はそれらをアジュバントと一緒に投与するとモデル動物に有意な防御を誘導する。リーシュマニアの蛋白質のＰＳＡ−２はＴｈ−１反応を誘導することにより森林型熱帯リーシュマニアによる感染に対して防御することができる。ヒトにおけるリーシュマニア症に対するワクチンとしてのこの蛋白質の防御機構を評価するためにＴ−細胞増殖を誘導するためのその能力をリーシュマニア症を罹患しそれから回復した患者で研究した。当該蛋白質はこれらの被験体のＴ−細胞の強力な増殖をもたらすことができるが、感染の以前の病歴のない対照においてはそれをもたらさないことが認められた。その反応はサイトカイン誘発パターンにより示されるようなＴｈ−１型のものであった。
【０１５８】
サブユニットのワクチンはそれらが同定、単離及びクローン形成が容易であるので、蛋白質抗原に強力に焦点をあてられた。しかし、必ずしもすべての可能なワクチン分子が蛋白質である必要はないことを考慮に入れる必要がある。事実、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）は感染の樹立に本質的な役目を果す。ＬＰＧのワクチン注射は森林型熱帯リーシュマニアの感染に対して防御することができる。Ｔ−細胞は非蛋白性の抗原を認識しないと述べるドグマの存在にもかかわらず、ＬＰＧ分子は皮膚のランゲルハンス細胞によりＴ−細胞に提供されるように見える。更に、微生物の糖脂質及び他の非蛋白質の分子はそれらがＣＤ−１経路を通って提供される時に、Ｔ−細胞を認識することができることを示した証拠がある。ＬＰＧと一緒の蛋白質ＫＭＰ１１が防御反応を誘導する明白な証明はないが、ＬＰＧと一緒の蛋白質様画分がＴ反応及びＬＦＮ−Ｙを誘発することができるが、蛋白質を伴わないＬＰＧ画分はそれを誘発することができないことは証明されている。
【０１５９】
サブユニットのワクチンは防御性ではあるが、短期の免疫を誘発するのみであることは一般に受け入れられている。この問題は、被験体が自然感染症の原因により定期的に増強される（boosted）ことができる地方の領域においては重要ではないかも知れない。サブユニットの使用における主要な問題は、遺伝的に広範囲の集団における単一の抗原に対して単一の反応でない可能性がある事実から起こる可能性がある。Ｂ及びＴ誘導物質を含む抗原の混合物がこの欠点を克服することができる。最近、小児リーシュマニアの膜蛋白質の抽出物を腹腔内注射するとこの寄生体の無毒のプロマスティゴート形態に対する防御を与えることができること及びその蛋白質を陽性に帯電したリポソーム中に封入するとその防御がより大きいことが発表された。アジュバンティシティ及び防御免疫性が陽性に帯電されたリポソーム中に封入されたドノバンリーシュマニア（L．donovani）抗原により与えられた。
【０１６０】
リーシュマニアの蛋白質をコード化する核酸担持遺伝子のワクチン注射は宿主に対する寄生体の遺伝的材料の投与に関する。このＤＮＡが細胞により取り込まれ、核中に誘導され、そこで転写され、その後細胞質内に翻訳される。この種類のワクチン注射の利点はＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−II経路により免疫反応を誘導することができる点である。細胞内で生産された抗原は細胞内で処理され、生成されたペプチドはＭＨＣ−Ｉ分子と一緒に細胞表面上に提供される。その結果、これらの分子は細胞毒性のＴ−細胞の誘導を引き起こすであろう。細胞外環境中に生成された抗原は特別に、特殊な抗原提供細胞により取り込まれ、処理され、ＭＨＣ−II分子に結合されたそれらの表面上に提供され、ＣＤ４＋細胞の誘導及び活性化をもたらし、それが免疫系の他の細胞のエフェクターを調節するサイトカインを分泌するであろう。
【０１６１】
ワクチンとして投与することができる最初のＤＮＡベクターはｇｐ６３遺伝子を含んでいた。更に、ＰＳＡ−２遺伝子がプラスミド中に誘導され、そしてそれがＴｈ−１反応及び防御の導入をもたらすことが認められた。Ａｇ−２を含むＤＮＡプラスミドのワクチン注射はＴｈ−１反応を誘発し、森林型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対して防御するが、刺激性免疫複合体中のＡｇ−２は組み合わせたＴｈ−１及びＴｈ−２反応を誘導しＩＦＮ−Ｙが誘導される事実にもかかわらず防御しない。同様に、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で蛋白質を表現する表現ベクター中でＬＡＣＫ蛋白質をコード化している遺伝子をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射して、森林型熱帯リーシュマニア（L．major）の感染に対する防御を認めた。粒状ＤＮＡの皮膚内注射もまたそれがより少量のＤＮＡを要するので探求しなければならないが、ＤＮＡを投与したほとんどすべての症例で、投与経路は筋肉注射であった。その他の免疫系はサルモネラ、ＢＣＧまたはワクシニアウイルスのようなベクターを使用する。ＢＣＧ中にｇｐ６３遺伝子を含むことが森林型熱帯リーシュマニア（L．major）に対する防御を誘発することができることを認めることは興味深い。
【０１６２】
蛋白質ｇｐ６３をコード化する遺伝子はまた弱毒化ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）中のｒａｃプロモーターの制御下で遺伝子のデルタａｒａＣ中に導入された。形質転換バクテリアの１×１０9コロニーの経口投与はＴｈ−１及び、ｇｐ６３を表現する肥満細胞腫細胞に対する細胞毒細胞の両方の範囲内にＴ反応を誘発する。ｇｐ６３−ＩＳＣＯＭｓ複合体の形態の蛋白質ｇｐ６３は炎症の減少及び病巣の抑制により証明されるようにマウスにおいて防御を誘発する。血清中には、ＩｇＧ２ａ型の抗体があり、更にＩＬ−２、ＩＦＮ−Ｙ及びＩＬ−１０の誘導によるＴｈ−１反応を認めることができる。ＤＴＨ反応は認められなかった。ｇｐ６３で形質転換されたチフス菌（Salmonella typhi）Ｎｒａｍｐ１はＩＬ−２及びＩＦＮ−Ｙの誘導によりＴｈ−１反応をもたらし、病巣の強力な消滅が認められる。Ｐ−４として知られるピファノ・リーシュマニア（L．pifanoi）の蛋白質はリーシュマニアの感染に対する有意な防御を誘発する。皮膚のリーシュマニアを患うヒトにおける最近の研究によりこの蛋白質またはそれから誘導されたペプチドはＴ細胞を増殖させることができることが示されている。ＩＦＮ−Ｙは誘発されるが、ＩＬ−４の誘発はない。経口投与された、ＩＬ−２、ＩＦＮ−Ｙ及びＴＮＦ−αで形質転換されたチフス菌のａｒｏ−Ａ及びａｒｏ−Ｄ突然変異体は森林型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対する治療系として働くことができる。これらの患者においてｉＮＯＳのより大きい誘発があることを認めることは興味深い。ｇｐ６３遺伝子はまたＡｒｏ−Ａ及びＡｒｏ−Ｄ突然変異体中でクローン化され、経口投与後に、コード化された蛋白質は森林型熱帯リーシュマニアの感染に対して有意な防御を誘発することができることが認められた。この同一蛋白質はサルモネラの特異的変種（ＧＩＤ１０５及びＧＩＤ１０６）中の幾つかのプロモーターに融合させて投与すると防御を誘発させることができる。
【０１６３】
小児リーシュマニア（L．infantum）の４種の蛋白質（より具体的にはＬｉｐ２ａ、Ｌｉｐ２ｂ、Ｐ０及びＨ２Ａ）からの幾つかの抗原フラグメントからなり、抗原として使用された後にイヌのリーシュマニアの診断に対して重要な価値を有することが判明し、感染されていない対照動物の血清と比較すると９３％の感受性及び１００％の特異性を伴う、Ｑと名付けられた人工的蛋白質が最近我々のグループにより説明された。同様に、我々のグループは小児リーシュマニアの蛋白質ｈｓｐ７０がこの寄生体による感染により誘起された感染症における免疫反応の重要な標的であることを示した。
【０１６４】
蛋白質Ｑがそれ自体でそしてＨｓｐ７０と組み合わせての両方で、小児リーシュマニアによる感染に対する防御系を計画するために使用することができる可能性を探求する目的をもって、モデルとしてハムスターを使用して３系列の実験を計画した。実験は蛋白質Ｑによる免疫処置が短期間の感染に対して動物を防御したか否かを検討し、もう１つは免疫処置が長期間においてかれらを防御したか否かを検討し、そして第３に２種類の蛋白質の一緒の免疫処置後にこの防御効果を検討するために計画された。その後に短期間分析並びに長期間分析の両方から、蛋白質Ｑが大部分の免疫処置動物において小児リーシュマニア感染後に肝臓及び脾臓の両方に寄生体による荷重を減少させる免疫反応を誘発させることができたこと、及び蛋白質Ｑ＋Ｈｓｐ７０による免疫処置はまた両方の蛋白質に対して有意な反応を誘発し、大部分の免疫処置動物において寄生体による荷重の有意な減少をもたらしたことが認められた。
【０１６５】
実施例１：タンパク質Ｑによる免疫処置
フロインドのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）４０μＬ（マイクロリットル）中に溶解した５μｇのタンパク質Ｑを用いて４匹の動物に免疫処置を施し、タンパク質を含まないＰＢＳ塩水溶液４０μＬで乳化した同量のアジュバントを用い他の４匹の動物に免疫処置を行なった。最初の免疫処置においては、フロインドの完全アジュバントをタンパク質と組み合わせて使用したが、２回目以降の免疫処置においては、フロインドの不完全アジュバントをタンパク質と組み合わせ、タンパク質／アジュバントの比を同じにして使用した。３回の腹腔内での免疫処置は１５日の間隔で行なった。各免疫処置を行なった後第２週目から初めて免疫処置の全期間に亙り、血液の試料を採取しエリザ（ＥＬＩＳＡ）検定法においてタンパク質Ｑに対する体液性応答を測定した。１回目の免疫処置後二週間で既にタンパク質Ｑに対する陽性のＩｇＧ応答が観測され、この応答は感染後二週間の後に高くなり、免疫処置の時間と共に増加して１／１００．０００の力価に達した。同様に、タンパク質Ｑに対する免疫応答はこの寄生虫の感染後も著しくは変更されなかった（図１）。
【０１６６】
３回目の免疫処置から１５日して、感染したハムスターに由来する感染性のアマスティゴート（ａｍａｓｔｉｇｏｔｅ）とは異なったプロマティゴート（ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）寄生虫を１０5個投与して動物に感染させた。この接種材料が感染した動物１００％に対し強い寄生虫血症を引き起こし、寄生虫投与後４ヶ月間病気を起こさせることを予めチェックしておいた。表１は、対照および予防接種を行なった動物の肝臓および脾臓の両方の組織１ｍｇ当たりの寄生虫血症のレベルを示す。予防接種を行なった動物のすべてにおいて、対照の動物に比べ肝臓における寄生虫の負荷が減少しており、このことは動物の７５％において極めて顕著に起こっていることが観測できる。脾臓における寄生虫の負荷を調べた場合でも、動物の７５％において対照に比べこの負荷は著しく低く、ＲＰＬは８３〜８６％に達することが観測できる。肝臓においてＲＰＬが２０％の動物は脾臓においては４８％であった。
【０１６７】
表１．腹腔内の経路を介してタンパク質Ｑを予防接種したハムスターの肝臓
および脾臓における寄生虫の負荷。
感染４週間後に限界希釈法（ｌｉｍｉｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（短期間）により寄生虫の負荷を測定した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の数として表す。ＲＰＬ＝寄生虫の負荷の減少率（％）。
【０１６８】
【表１０】
0004883839.tif 000010
【０１６９】
対照
４匹のハムスター    １４±５                  ２９５±３０
数は４匹の動物の平均を表す。
【０１７０】
実施例２
長期間に亙る寄生虫の負荷の減少に関し、他の接種経路を用いタンパク質Ｑで予防接種を行なう効果を証明するために、４０μＬのＰＢＳ中に溶解した５μｇのタンパク質Ｑを４０μＬのフロインドのアジュバントと混合して４匹の動物に皮下注射して投与した。第１回の免疫処置ではフロインドの完全アジュバントを使用したが、２回目以降の処置では前述のようにフロインドの不完全アジュバントを用いた。予防接種は１５日間隔で３回投与した。三回目の免疫処置後１５日して、１０5個の感染性の寄生虫を接種した。すべての免疫処置の期間および感染の全期間（５ヶ月）を通じて血液を採取し、タンパク質Ｑに対する体液性応答および寄生虫の全タンパク質に対する体液性応答の種類を測定した。図２には、感染してから第２週目において既に、前の場合と同様に３匹のマウスにおいてタンパク質Ｑに対する応答は陽性であり、１回目の免疫処理の２週間後にはこのタンパク質対する応答は非常に高かいことが示されている。この応答は、残りの免疫処置後も非常に高い値を維持し、第３回目の免疫処置後の週でも力価は１／７５．０００に達する。動物の中の１匹ではタンパク質Ｑに対する応答は時間と共に遅くなったが、実験の末期までにこの応答は他の動物のレベルに達した。従って実施例１および実施例２の両方から導かれるデータから、腹腔および皮下の両方の経路によるこのタンパク質に対する免疫応答の程度は非常に速いが、同じ時間では腹腔の経路の応答の方が高い力価に達する（１／７５．０００対１／１００．０００）と結論することができる。図３は対照の動物におけるタンパク質Ｑに対する応答を示す。このタンパク質に対する反応性は感染後１２〜１４週目に検出されることを観測することができるが、これは潜在的なリーシュマニア症に起因する最初の症状が感染した動物に検出され始める時である。表２は対照および予防接種した動物の肝臓および脾臓における寄生虫血症のレベルを示す。この表から分かるように、寄生虫血症の減少率が非常に高かった（８７〜８９％）という意味で、肝臓のレベルにおいては動物の５０％が防御された。動物の中の一匹は防御されなかったが、他の動物では寄生虫の負荷の減少率は２２％であった。これに対し、脾臓のレベルにおいては寄生虫の負荷の減少は１００％の動物の中で９８〜９９％であった。
【０１７１】
表２．皮下の経路を介してタンパク質Ｑを予防接種したハムスターの肝臓
および脾臓における寄生虫の負荷。
感染２週間後に限界希釈法（長期間）により寄生虫の負荷を測定した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の数として表す。ＲＰＬ＝寄生虫の負荷の減少率（％）。
【０１７２】
【表１１】
0004883839.tif 000011
【０１７３】
対照
４匹のハムスター
１．８×１０6±１．２×１０5    ５．２×１０8±２．６×１０7
数は４匹の動物の寄生虫負荷の平均を表す。
レーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ）のタンパク質ＬｉＨｓｐ７０を含む組成物における防御システムを設計するためにタンパク質Ｑを使用できるかどうかを試験する目的で、Ｂａｌｂ／ｃマウスで実験を行なった。免疫処置を行なった後、肝臓および脾臓の両方において寄生虫負荷は著しく減少し、若干の動物では４桁程度以下（１／１０００以下）にまで減少した。
【０１７４】
実施例３：フロインドのアジュバントの中におけるタンパク質Ｑ＋タンパク質Ｈｓｐ７０による免疫処置
４０μＬのＰＢＳ中に５μｇのタンパク質Ｑおよび５μｇのタンパク質ＬｉＨｓｐ７０を溶解し４０μＬのフロインドのアジュバント中で乳化させた液を、４匹のハムスターのそれぞれに腹腔注射した。上記のように１回目の免疫処置ではフロインドの完全アジュバントを使用したが、２回目以降ではフロインドの不完全アジュバントを用いた。予防接種は１５日間隔で３回の投与で行なった。
【０１７５】
３回目の免疫処置の後１５日して、心臓内の経路を介して１０6個の感染性寄生虫を接種し、２２週目に動物を殺した。すべての免疫処置期間および全感染期間を通じて２週間毎に動物から血液を採取し、タンパク質Ｑおよびタンパク質ＬｉＨｓｐ７０に対する体液性応答を測定した。
【０１７６】
Ｑタンパク質＋ＬｉＨｓｐ７０で免疫処置を行なったマウスの間の相対的な寄生虫負荷を表３に示す。すべての動物は高度に防御され、その幾つかでは脾臓において２桁ないし３桁以下に近い減少率が得られた。
【０１７７】
表３．感染後４ヶ月でＱ＋ＬｉＨｓｐ７０タンパク質で免疫処置を行なった
Ｂａｌｂ／ｃマウスの相対的な寄生虫の負荷
【０１７８】
【表１２】
0004883839.tif 000012
【０１７９】
対照
４匹のマウス
５．１×１０4±２×１０3        ３．２×１０6±８×１０4
数は４匹の動物の寄生虫負荷の平均を表す。
表４および５は、実施例１および２のすべての動物が免疫学的にタンパク質Ｑに対して応答し、免疫処置後２週間から始まってタンパク質Ｑに対する応答が高くなり、この応答は第２の免疫処置（４週）後も増加していることを示している。表６は、実験の全期間を通じタンパク質ＬｉＨｓｐ７０に対する応答も陽性であるが、実施例３におけるタンパク質Ｑに対する応答よりも低いことを示している。
【０１８０】
表４および５．
タンパク質Ｑを５μｇ腹腔内に注射した４匹のハムスターにおける免疫応答（表４−実施例１、短期間）、およびタンパク質Ｑを５μｇ皮下注射した４匹のハムスターに                おける免疫応答（表５−実施例２、長期間）
【０１８１】
【表１３】
0004883839.tif 000013
【０１８２】
表５：実施例２、長期間
Ｑタンパク質で免疫処置を行なったマウス（長期間）
Ｑタンパク質に対する免疫応答
【０１８３】
【表１４】
0004883839.tif 000014
【０１８４】
光学密度３を示す血清（１／２００に希釈）は１／４５．０００よりも高い力価をもっている。
対照のマウス
Ｑタンパク質に対する免疫応答（長期間）
【０１８５】
【表１５】
0004883839.tif 000015
【０１８６】
血清は１／２００に希釈した。
【０１８７】
表６
５μｇのタンパク質Ｑおよび５μｇのタンパク質ＬｉＨｓｐ７０を腹腔内に注射した
４匹のハムスターにおける免疫応答（実施例３、長期間）
Ｑタンパク質＋Ｈｓｐ７０で免疫処置を行なったマウス
Ｑタンパク質に対する免疫応答
【０１８８】
【表１６】
0004883839.tif 000016
【０１８９】
血清は１／８００に希釈した。
対照のマウス
Ｑタンパク質に対する免疫応答
【０１９０】
【表１７】
0004883839.tif 000017
【０１９１】
血清は１／２００に希釈した。
Ｑタンパク質＋Ｈｓｐ７０で免疫処置を行なったマウス
Ｈｓｐ７０タンパク質に対する免疫応答
【０１９２】
【表１８】
0004883839.tif 000018
【０１９３】
血清は１／８００に希釈した。
対照のマウス
Ｈｓｐ７０タンパク質に対する免疫応答
【０１９４】
【表１９】
0004883839.tif 000019
【０１９５】
血清は１／２００に希釈した。
【０１９６】
実施例４：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるタンパク質Ｑ＋ＢＣＧでの免疫処置
４０μＬのＰＢＳに溶解した５μｇのタンパク質Ｑおよび１０6個ののＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）のコロニー形成単位（ＣＦＵ）をを用い４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対しそれぞれ腹腔内注射を行なった。免疫処置は１５日の間隔を置いて３回行なった。３回目の免疫処置後１５日して心臓内の経路によりエル．インファンタムのＢＣＮ１５０の感染性寄生虫を１０5個接種した。免疫処置期間および感染した全期間を通じて２週間毎にマウスから血液試料を採取し、タンパク質Ｑに対する体液応答の程度を試験した。感染後８週目に動物を殺した。
【０１９７】
表７（ａおよびｂ）は、免疫処置した動物が第２週から始まってタンパク質Ｑに対して陽性に応答し、多くの場合この応答は４００，０００の値に達するまで次第に増加することを示している。表８は、予防接種された動物と対照の動物の肝臓および脾臓の間における寄生虫負荷の差を示している。
【０１９８】
表７；  ５μｇのタンパク質Ｑと１０6個のＢＣＧのＣＦＵで免疫処置を行なった
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるタンパク質Ｑに対する免疫応答
マウス  １、２、３、４    免疫処置を施したマウス
マウス  ５、６、７、８    免疫処置を施さなかった対照
【０１９９】
【表２０】
0004883839.tif 000020
【０２００】
数３は測定システムにおけるオーバーフローに相当する。
【０２０１】
指示したそれぞれの週の始めに血清を採取した。
【０２０２】
第１回目の免疫処置は０日目に行ない、２回目は１５日目に、３回目は３０日目に行なった。
【０２０３】
表８．  タンパク質Ｑ＋１０6個のＢＣＧを皮下に予防接種した
Ｂａｌｂ／ｃマウスの肝臓および脾臓における感染後８週目の寄生虫の負荷
寄生虫負荷は７０００個の核をもった細胞を含む種々の部分を測定することにより組織の印像（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）を光学顕微鏡により測定した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の量として表される。この値は１０００個の核をもった細胞当たり１個の寄生虫が組織１ｍｇ当たり２１０個の寄生虫に相当すると予め計算されている。ＲＰＢ＝寄生虫の負荷の減少率（％）
【０２０４】
【表２１】
0004883839.tif 000021
【０２０５】
対照
４匹の動物    平均    ４００±１５        ４１５５±３０
ｎ．ｄ．＝５０００個の核をもった細胞中に寄生虫が検出されなかった。
【配列表】
【表２２】
0004883839.tif 000022
【表２３】
0004883839.tif 000023
【表２４】
0004883839.tif 000024
【表２５】
0004883839.tif 000025
【表２６】
0004883839.tif 000026
【表２７】
0004883839.tif 000027
【表２８】
0004883839.tif 000028
【表２９】
0004883839.tif 000029
【表３０】
0004883839.tif 000030
【表３１】
0004883839.tif 000031
【図面の簡単な説明】
本発明の特徴の理解を助ける目的で行った記載を補完するために、本開示には、それと一体の部分として、制限的ではない説明的な性質の一組の図面を添付する。下記が記載されている。
【図１】  図１は、マルトース結合タンパク質に融合した組換えタンパク質のそれぞれに対する発現（Ａ）、アミロースカラム中の精製（Ｂ）および抗原性（Ｃ：ウエスタンブロット、Ｄ：ＥＬＩＳＡ）に相当する。Ｄの図は、完全なタンパク質に対する組換えタンパク質のそれぞれのＥＬＩＳＡ内における反応性も示す。
【図２】  本発明の目的のキメラ遺伝子を得ると考えられる種々のベクターのグラフ図示であり、これからリーシュマニア症の症状を示す動物またはヒトに対する正確な診断を行う目的に対して適切なタンパク質が抽出される。
【図３】  図３は、その調製が図２に示されるＭＢＰタンパク質に融合されたキメラ遺伝子から得られるタンパク質の同定に相当する。
【図４】  図４は、マルトース結合タンパク質（ＰＱＩ−ＰＧＶ）に融合した中間体および最終キメラ遺伝子タンパク質の発現（Ａ）、アミロールカラム中の精製（Ｂ）および抗原性（Ｃ：ウエスタンブロット、Ｆ：ＥＬＩＳＡ）に相当する。この図は、キメラ遺伝子の発現（Ｄレーン１）、Ｎｉ−Ｎｔアガロースカラム内の精製（Ｄレーン２）およびＶＬ血清に対する精製タンパク質の抗原性（Ｅ：ウエスタンブロット）および血清のコレクションに対する精製タンパク質の抗原性（Ｆ：ＥＬＩＳＡ中のＰＱ）も示す。
【図５】  図５は、最後に、３群に分類した広範な各種のイヌ血清の反応性の集約図である。第一群は、Ｌ．インファンツムによる真の感染を有する動物を含む。第二群は、種々の臨床症状は有するがリーシュマニアには感染していないイヌから得た血清を含み、そして第三群は、健康なイヌからの１５個の血清から成っている。この図は、ＶＬの血清学的診断を行うための本発明の価値を確認する。
【図１ａ】
0004883839.tif 000032
【図１ｂ】
0004883839.tif 000033
【図１ｃ】
0004883839.tif 000034
【図１ｄ】
0004883839.tif 000035
【図２】
0004883839.tif 000036
【図３】
0004883839.tif 000037
【図４ａ】
0004883839.tif 000038
【図４ｂ】
0004883839.tif 000039
【図４ｃ】
0004883839.tif 000040
【図４ｄ】
0004883839.tif 000041
【図４ｅ】
0004883839.tif 000042
【図４ｆ】
0004883839.tif 000043
【図５】
0004883839.tif 000044