(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを含有してなる、内分泌腺内皮細胞の増殖、分化又は開窓を選択的に誘導するための組成物であって、ここでのＥＧ-ＶＥＧＦは、配列番号：２のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトの臍静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)細胞ではなく副腎皮質毛細血管内皮(ＡＣＥ)細胞の増殖又は走化性を誘導するものである組成物。
【請求項２】
ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを含有してなる、内分泌腺内皮細胞の走化性を選択的に誘導するための組成物であって、ここでのＥＧ-ＶＥＧＦは、配列番号：２のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトの臍静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)細胞ではなく副腎皮質毛細血管内皮(ＡＣＥ)細胞の増殖又は走化性を誘導するものである組成物。
【請求項３】
ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを含有してなる、内分泌組織の血管新生を選択的に誘導するための組成物であって、ここでのＥＧ-ＶＥＧＦは、配列番号：２のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトの臍静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)細胞ではなく副腎皮質毛細血管内皮(ＡＣＥ)細胞の増殖又は走化性を誘導するものである組成物。
【請求項４】
ＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニスト抗体又はＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニスト抗体断片であって、ここでのＥＧ-ＶＥＧＦは、配列番号：２のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトの臍静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)細胞ではなく副腎皮質毛細血管内皮(ＡＣＥ)細胞の増殖又は走化性を誘導するものであるアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項５】
前記抗体又は抗体断片はモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片である、請求項４に記載のアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項６】
前記抗体又は抗体断片はヒト化されたものである、請求項４に記載のアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項７】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２’、又はＦｖ断片である、請求項５又は６に記載のアンタゴニスト抗体断片。
【請求項８】
ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＧ-ＶＥＧＦと接触させ；そして
（ｂ）内皮細胞増殖又は生存に伴うＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導するＥＧ-ＶＥＧＦの能力の変化を決定する
ことを含んでなり、
該ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導するＥＧ-ＶＥＧＦの能力を増大させる又は阻害する候補化合物がＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を調節する化合物として同定され、該ＥＧ-ＶＥＧＦは、配列番号：２のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトの臍静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)細胞ではなく副腎皮質毛細血管内皮(ＡＣＥ)細胞の増殖又は走化性を誘導するものである方法。
【請求項９】
前記ＭＡＰキナーゼがＥＲＫ１又はＥＲＫ２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＧ-ＶＥＧＦと接触させ；そして
（ｂ）ＡＣＥ細胞の増殖又は生存を誘導するＥＧ-ＶＥＧＦの能力の変化を決定する
ことを含んでなり、
該ＡＣＥ細胞の増殖又は生存を誘導するＥＧ-ＶＥＧＦの能力を増大させる又は阻害する候補化合物がＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を調節する化合物として同定され、該ＥＧ-ＶＥＧＦは、配列番号：２のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒトの臍静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)細胞ではなく副腎皮質毛細血管内皮(ＡＣＥ)細胞の増殖又は走化性を誘導するものである方法。
【請求項１１】
ＡＣＥ細胞の増殖又は生存を誘導するＥＧ-ＶＥＧＦの能力を増大させる候補化合物がＥＧ-ＶＥＧＦのアゴニストとして同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＣＥ細胞の増殖又は生存を誘導するＥＧ-ＶＥＧＦの能力を阻害する候補化合物がＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストとして同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記内分泌腺内皮細胞がステロイド産生内皮細胞である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記内分泌腺内皮細胞ないしは組織が、卵巣、睾丸、子宮、子宮頸管、前立腺、副腎又は膵臓内皮細胞である、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが天然のＥＧ-ＶＥＧＦのアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物又は請求項４から７のいずれか一に記載のアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項１６】
前記ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが配列番号：２の残基２０−１０５を含む、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物又は請求項４から７のいずれか一に記載のアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項１７】
前記ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物又は請求項４から７のいずれか一に記載のアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項１８】
前記ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが配列番号：１のヌクレオチド９１−４０５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物又は請求項４から７のいずれか一に記載のアンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号：１のヌクレオチド９１−４０５の核酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
内皮細胞
局所的な微少環境は、組織又は器官特異的に血管内皮細胞の表現型及び生育特性にかなりの影響を与えるが、局所的に指令的なシグナルの性質については、殆ど知られていない。血管内皮細胞（VEGF)及び内皮細胞特異的成長因子のアンジオポエチンファミリーが、種々の生理学的及び病理学的環境における胚発育と血管形成にとって必須であるという説得力のある証拠が存在する［Ferrara及びAlitalo, Nature Medicine, 5: 1359-1364(1999); Carmeliet, Nature Medicine, 6: 389-395(2000)］。さらに、内皮細胞表現型及び生育の局所的、組織特異的、制御に関する強力な証拠が存在する［Airdら., J. Cell Biol., 138: 1117-1124(1997)；Stewart及びWiley, Dev. Biol., 84: 183-192(1981)］。内皮細胞の形態学的及び機能的特徴は、異なる器官の間で広範にわたって変化する［Simionescu及びSimionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988) pp. 355-398］。さらには、適用部位によって、試験される血管形成の型よりも、さらにかなりの程度まで新しい血管の特性が決まる［Dellianら., Am. J. Pathology, 149: 59-71(1996)；Robertsら., Am. J. Pathology, 153: 1239-1248(1998)］。脈管構造の特性に対する局所的微少環境の影響に関する分子機序は知られていないが、分化した支質は主要な役割を担うと考えられている［Dellian, 上掲］。考えられる限りでは、細胞性及び細胞外マトリックス成物の他に、組織特異的分泌タンパク質を含み得る刺激の統合的なネットワークは、常在性の内皮の生育を調節するのと同じく、構造及び機能を確定するように機能する。
従って、内皮細胞の成長及び／又は分化に影響する新規の成長及び分化因子を同定して特徴付ける最新の必要性がある。脈管構造の発達に関する我々の知識を増やすことの他に、そのような成分は、血管組織に関わる症状の診断及び治療にとって有用であろう。
【０００２】
ホルモン分泌細胞
科学及び医学療法の進展に進歩がある一方で、世の中の医学上の病気に関する新しい治療の必要性がいまだに存在する。新しい治療方法を見出すための一つの方法は、生物がどのようにして作動するかを研究することである。特に、興味の対象は、シグナル細胞がどのようにして生物の行動をコントロールするのかということである。例えば、内分泌細胞は、ホルモンと呼ばれるシグナル分子を分泌し、これらホルモンの分泌の機能不全は、種々の疾患へつながる可能性がある。
ホルモン分泌に分化した細胞には、テストステロン（睾丸のライディッヒ細胞）、エストロゲン（卵胞の卵胞膜内部細胞）及びプロゲステロン（破裂された卵胞の黄体細胞）を分泌する生殖腺の細胞が含まれる。テストステロン、エストロゲン及びプロゲステロンの外部投与を利用する医学分野に種々の治療法がある一方で、依然としてこれらホルモンを生産する細胞を制御する必要性がある。
【０００３】
ホルモン分泌に関して分化した他の細胞には、副腎の細胞及び消化系の細胞が含まれる。例えば、副腎の細胞は、エピネフリン、ノルエピネフリン及び鉱質コルチコイド及び糖質コルチコイドのようなステロイドホルモンを分泌する。特に対象となるのは、副腎皮質で生産され、多くの細胞型の代謝に影響を与えるコルチゾールである。消化系の細胞には、インシュリンを分泌する膵臓のそれらが含まれる。インシュリンは、ランゲルハンス島によって分泌され、炭水化物の代謝にとって必須である。インシュリンは、糖尿病の治療及びコントロールに用いられるが、糖尿病のような疾患の効果的な治療にとって必要である。消化管及び気道の対象となる他のホルモンには、セロトニン、エンドルフィン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、グルカゴン及びボンベシンが含まれる。
ホルモン分泌細胞、特に内分泌腺内のステロイド産生内皮細胞に関する多くの疾病及び疾患が存在する。それ故に、そのような内皮細胞へ特異的に作用する成長因子を同定することは望ましいことである。そのような内皮細胞特異的成長因子は、そのような細胞型に関わる疾患を診断して治療するために、そしてそのような疾患の診断及び治療にとって有用なさらなる候補薬を同定するために価値ある手段であろう。
【０００４】
本発明の要約
本発明は、一つの内皮細胞へ選択的に作用する新規、組織限定、成長及び分化因子の同定及び特徴付けに基づいている。内分泌腺誘導血管内皮成長因子（ＥＧ-ＶＥＧＦ）と呼ばれるこの因子は、内分泌腺から誘導された毛細血管内皮細胞の増殖、遊走及び透過窓を誘導するが、試験された種々の他の内皮及び非内皮細胞型に対して効果を示さない。ここで詳細について記載しているように、ＥＧ-ＶＥＧＦ核酸及びポリペプチドは、多くのアッセイで、診断で、そしてホルモン産生組織に関わる症状の診断及び治療で用いることができる。
一側面では、本発明は、ここで記載の、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド、又はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの薬学的に許容可能な担体との混合を含んでなる組成物に関する。一実施態様では、この組成物は、さらに、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）又はそのアゴニスト又はアントゴニストを含む。
【０００５】
さらなる側面では、本発明は、容器を含んでなる製造品、容器上の標識及び容器内に含まれる活性剤を含んでなる組成物を提供する。活性剤は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアゴニスト、及びＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニストから成る群より選択される。容器上の標識は、組成物がホルモン産生内皮細胞と関連する症状を治療するために効果的であることを示している。本発明のこの側面での一実施態様では、この症状は、内分泌腺内のステロイド産生内皮細胞に関連している。二番目の実施態様では、組織は、卵巣。睾丸、頸部、副腎又は前立腺組織である。この症状は、好ましくは、不妊性、ポリニスティック卵巣症候群又は癌である得る。
【０００６】
その他の側面では、本発明は、ＥＧ-ＶＥＧＦと結合する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、候補化合物とＥＧ-ＶＥＧＦを接触させ、候補化合物がＥＧ-ＶＥＧＦと結合するかどうか確かめることを含む。一実施態様では、アッセイは競合結合アッセイ、すなわちＥＧ-ＶＥＧＦと結合することが知られている分子と競争する候補化合物の能力を測定することである。このアッセイは、例えば、候補化合物を全細胞又はＥＧ-ＶＥＧＦのコード化配列を発現する細胞膜分画と接触させる細胞-ベースアッセイであり得る。
【０００７】
本発明は、また、ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を調節する化合物を同定する方法に関する。この方法は、候補化合物とＥＧ-ＶＥＧＦを接触させて、ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性に改変が生じたかどうかを確かめる段階を含む。一実施態様では、化合物はＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害し、その他の実施態様では、化合物はＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を増大させる。例えば、生物学的活性とは、細胞増殖又は生存に関わるキナーゼのリン酸化を誘導する能力であり得る。好ましい実施態様では、キナーゼは、ＭＡＰキナーゼ、より好ましくはＥＲＫ１又はＥＲＫ２である。他の実施態様では、生物学的活性とは、細胞増殖、走化作用の誘導、血管形成、細胞分化の誘導又は内皮細胞透過窓の誘導である。前出のように、このアッセイは、例えば、候補化合物を全細胞又はＥＧ-ＶＥＧＦのコード化配列を発現する細胞膜分画と接触させる細胞-ベースアッセイであり得る。好ましい実施態様では、この細胞は、ＥＧ-ＶＥＧＦを発現するように操作した組み換え宿主細胞である。あるいは、候補分子を単離したＥＧ-ＶＥＧＦと接触させてもよい。好ましい実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦを固体支持体上に固定化する。
【０００８】
その他の側面では、本発明は、特に、ＥＧ-ＶＥＧＦと結合又はＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を調節する能力を有する、上に記載のアッセイの一つによって同定された化合物を扱う。
さらにここで示されているのは、ＥＧ-ＶＥＧＦに対するレセプターを同定する方法である。この方法では、ＥＧ-ＶＥＧＦと細胞膜物質を含む組成物を組み合わせることを含まれ、ＥＧ-ＶＥＧＦが細胞膜物質上のレセプターと複合体を形成し、そしてそのレセプターがＥＧ-ＶＥＧＦレセプターとして同定される。本発明のこの側面の一実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦはレセプター結合し、ＥＧ-ＶＥＧＦとそのレセプターが架橋する。
【０００９】
この発明のその他の側面は、細胞又は組織の生物学的活性を刺激する方法に関する。これには、細胞増殖を刺激する方法、細胞の走化性を誘導する方法、ホルモン産生組織での血管形成を誘導する方法、細胞の細胞分化を誘導する方法、及び細胞の透過窓を誘導する方法が含まれる。これらの各方法では、生物学的活性は、細胞又は組織を、所望する生物学的活性を誘導する有効量のＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦアゴニストと接触させるこよによって、又は生物学的活性を誘導するのに有効量のＥＧ-ＶＥＧＦをコードする核酸又はＥＧ-ＶＥＧＦアゴニストを細胞又は組織へ導入することによって刺激される。この細胞は、好ましくは内皮細胞であり、特には、ホルモン産生内皮細胞又は組織である。
本発明は、また、細胞又はホルモン産生組織を生物学的活性を阻害するのに有効量のＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストと接触させることによって、又はＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストをコードする核酸を細胞へ導入することによって、上に記載の全ての生物学的活性を阻害する方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、個体を治療する方法を提供する。この方法には、ホルモン産生組織と関連する症状について個体を治療する方法、個体の繁殖能を制御する方法、個体でＥＧ-ＶＥＧＦに応答する細胞の癌を治療する方法、個体の生殖器官の癌を治療する方法、そして個体の卵巣嚢腫を治療する方法が含まれる。本発明のこの側面の方法の一実施態様では、この方法には、症状を治療し、繁殖能を制御し、癌又は卵巣嚢腫を治療するのに有効量のＥＧ-ＶＥＧＦ又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでなる組成物を個体へ投与することが含まれる。その他の実施態様では、この方法には、症状を治療するのに有効量のＥＧ-ＶＥＧＦをコードする核酸又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを個体へ投与することが含まれる。特定の実施態様では、繁殖能は、卵胞の成熟を阻害することによって制御される。さらなる実施態様では、繁殖能は、排卵を阻害することによって制御される。その他の実施態様では、個体は多嚢胞性卵巣症候群を有するか、又はそれを有する危機にあり、繁殖能は、繁殖能を維持できるように制御されている。治療されるべき癌は、例えば、卵巣癌、睾丸癌、前立腺癌、又は子宮癌であり得る。
【００１１】
下に記載した好ましい実施態様は、本発明の全ての側面に当てはまる。
一実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦである。さらなる実施態様では、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦはヒトである。その他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦは、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦの断片である。さらにその他の側面では、ＥＧ-ＶＥＧＦは、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体であり、それは好ましくは、図２（配列番号：２）の約１又は約２０から約１５０を含むアミノ酸残基の配列に対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する。さらにその他の実施態様では、アミノ酸配列変異体は、保存的置換変異体である。その他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦは天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体の断片である。その他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦは融合タンパク質として存在している。
【００１２】
上に記載の組成物及び方法は、さらにＶＥＧＦポリペプチドの用途を含み得る。一実施態様では、ＶＥＧＦポリペプチドは、天然配列ＶＥＧＦである。さらなる実施態様では、天然配列ＶＥＧＦはヒトである。その他の実施態様では、ＶＥＧＦは天然配列ＶＥＧＦの断片である。さらなるその他の実施態様では、ＶＥＧＦは、天然配列ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体である。さらなる実施態様では、アミノ酸配列変異体は、天然配列ＶＥＧＦの配列に対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する。さらなるその他の実施態様では、アミノ酸配列変異体は、保存的置換変異体である。その他の実施態様では、ＶＥＧＦは天然配列ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体の断片である。その他の実施態様では、ＶＥＧＦは融合タンパク質として存在する。
一実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦアゴニスト又はＶＥＧＦアゴニストは、それぞれ抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ又は抗-ＶＥＧＦ抗体であり、特に抗体断片を含む。その他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦアゴニストは、小分子である。
【００１３】
同じように、例えば、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦアンタゴニストは、それぞれ抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ又は抗-ＶＥＧＦ抗体であり得て、特に抗体断片を含み得る。その他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦアンタゴニストは、小分子である。
一実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦのコード化配列を発現している全細胞又は細胞膜分画は、Ｅｇ-ＶＥＧＦを発現するように操作された組み替え宿主細胞である。
本発明の他の実施態様及び変異体は、下に詳細が示された本発明の記載によって明らかになる。
【００１４】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
１．定義
特に定義されなければ、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Singletonら., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第２版., J. Wiley & Sons(New York, NY 1994)；Sambrookら., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989）。本発明の目的のために、次の用語が下に定義されている。
「ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド」、「ＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質」及び「ＥＧ-ＶＥＧＦ」（そして、「ＶＲＰＡポリペプチド」、「ＶＲＰＡタンパク質」及び「ＶＲＰＡ」も、同じポリペプチドを記載するために前出で用いた用語である）は、ここで用いる場合は、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド変異体（ここでさらに定義される）を包含する。ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、種々のソース、例えばヒト組織型、又はその他のソース、又は組み換え体及び／又は合成法によって調製される。
【００１５】
「天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦ」は、天然由来のＥＧ-ＶＥＧＦと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列はＥＧ-ＶＥＧＦは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦ」という用語には、特に、特定のＥＧ-ＶＥＧＦの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦは、図２のアミノ酸１から１０５を含んでなる成熟又は完全長天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦである（配列番号：２）。また、図２（配列番号：２）に開示のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが、ここでアミノ酸位置１として命名されているメチオニン残基で開始すると示されている一方で、図２（配列番号：２）のアミノ酸位置１より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【００１６】
「ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド」とは、下に定義されているような活性ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドで、（ａ）図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの残基１又は約２０から１０５、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）の１４から２４の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのＸから１０５、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。そのようなＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドには、例えば、図２（配列番号：２）の配列の一つ又は複数の内部ドメインと同じく、Ｎ及び／又はＣ末端で一つ又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失されたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが含まれる。通常、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、（ａ）図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの残基１又は約２０から１０５、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）の１４から２４の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのＸから１０５、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、天然ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド配列を含まない。通常、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００１７】
ここに定義されるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＥＧ-ＶＥＧＦ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表２０に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００１８】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例としては、表３Ａ-Ｂが、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００１９】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００２０】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２１】
「ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体核酸配列」とは、下に定義されるような活性ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子、並びに（ａ）図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの残基１又は約２０から１０５をコードする核酸、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）の１４から２４の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのＸから１０５をコードする核酸、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列をコードする核酸と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの残基１又は約２０から１０５をコードする核酸、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）の１４から２４の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示すＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのＸから１０５をコードする核酸、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列をコードする核酸のいずれかと、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。ＥＧ-ＶＥＧＦポリヌクレオチド変異体は、天然ＥＧ-ＶＥＧＦヌクレオチド配列を含まない。
【００２２】
通常、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、頻繁には少なくとも約６０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約９０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約３００ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約６００ヌクレオチド長、より頻繁には少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００２３】
ここで同定されるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドコード化核酸配列に関する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２４】
ここでの目的のために、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例としては、図３Ｃ-Ｄが「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００２５】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００２６】
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２７】
他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリヌクレオチドは、活性ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、図２（配列番号：２）に開示する完全長ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００２８】
上記のように実施されるアミノ酸配列同一性列比較の内容において、「ポジティブ」という用語には、比較された配列において、同一ではないが類似の特性を持つアミノ残基が含まれる。対象のアミノ酸残基に対してポジティブ値をスコアするアミノ酸残基は、対象のアミノ酸残基と一致するか、或いは対象のアミノ酸残基の好ましい置換（下の表１に定義）であるかいずれかのアミノ酸残基である。
【００２９】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。
【００３０】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドはそれに自然に付随する全ての成分を伴わない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３１】
「単離された」ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離されたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞中に存在するＥＧ-ＶＥＧＦをコードする核酸分子とは区別される。しかし、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを通常は発現する細胞に含まれるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
【００３２】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３３】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＥＧ-ＶＥＧＦモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００３４】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にすることになり、低い温度は緊縮性を低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００３５】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００３６】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００３７】
「エピトープタグ」なる修飾語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３８】
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＥＧ-ＶＥＧＦの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＥＧ-ＶＥＧＦが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力以外の、天然又は天然発生ＥＧ-ＶＥＧＦによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫」活性とは、天然又は天然発生ＥＧ-ＶＥＧＦが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力を意味する。生物活性には、特に、細胞増殖及び走化性の制御が含まれる。他の好ましい生物活性とは、内皮細胞の増殖、成長、分化及び／又は遊走がである。さらにより好ましくは、生物学的活性とは、内分泌腺の毛細内皮細胞の増殖、遊走及び／又は透過窓を誘導する能力である。その他の好ましい生物学的活性とは、内分泌腺、特に内分泌腺のステロイド産生組織の血管形成を促進及び／又は血管透過性を制御する能力である。さらにその他の好ましい生物活性とは、ＭＡＰキナーゼ、例えばＥＲＫ１又はＥＲＫ２のような細胞増殖及び／又は生存に関わっているシグナル分子のリン酸化を誘導する能力である。
【００３９】
「血管形成」という用語は最も広い意味で用いられ、特に、走化、増殖、細胞-細胞凝集、集合及び形態形成を通しての内皮前駆体細胞の血管へのデノボ集合のように、存在する血管から新しい血管が生成することが含まれる（同じく「脈管形成」とよばれる）。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、そしてここに開示した天然ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの生物学的活性を部分的にブロック、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。同じように、「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、又は天ＥＧ-ＶＥＧＦ然ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、小有機分子等が含まれる。ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに関連している一つ又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
【００４０】
「治療」とは、治癒的処置、及び予防的療法又は防止的療法の両方を指し、患者の標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。例えば、腫瘍（例えば癌）の治療では、治療薬は、腫瘍細胞の病状を直接に低下させるか、又は、他の治療薬、例えば放射線及び／又は化学療法によって、腫瘍細胞を治療に対してより感受性を高める。
【００４１】
「ステロイド合成」は、ホルモンによって誘導され、コレステロールの細胞貯蔵からミトコンドリア外膜への流動化、そしてコレステロールのプレグネノロンへの変換が起こる内膜へのその移行によって特徴付けられる「ステロイド産生細胞」でのステロイド生合成のｃＡＭＰ媒介急性制御である。
「ステロイド産生組織」とは、ステロイド合成のプロセスによって、ステロイドホルモンを生産する組織を指す。例としては、副腎、生殖器官、消化管そして気道組織が含まれる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【００４２】
治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定な例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００４３】
疾患の「病理」は、患者の良好な生存を損なう全ての現象を含む。癌では、これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
【００４４】
ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００４５】
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062[1995])；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')２断片が得られる。
【００４６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４７】
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分割される。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間に更に含んでいる。ｓＦｖのレビューには、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編(Springer-Verlag, New York, 1994)pp.269-315を参照されたい。
【００４８】
「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を同じポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号；国際公開93/11161号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
【００４９】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００５０】
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」抗体を作製するために、抗体に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
【００５１】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はそれらに対する抗体、場合によっては化学治療薬）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
ここで定義されている「小分子」とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
ここで用いられる「血管内皮成長因子」、「ＶＥＧＦ」、「ＶＥＧＦポリペプチド」及び「ＶＥＧＦタンパク質」という用語は、天然配列ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ変異体（ここでさらに定義されている）を含む。ＶＥＧＦポリペプチドは、種々のソース、例えばヒト組織型又はその他のソースから単離されるか、又は組み換え及び／又は合成方法によって調製される。
【００５２】
「天然配列ＶＥＧＦ」には、天然に由来するＶＥＧＦと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。そのような配列ＶＥＧＦは自然界から単離することができるか、又は組み換え及び／又は合成手法によって生産される。「天然配列ＶＥＧＦ」という用語は、特にＶＥＧＦの天然発生切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然発生変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然発生対立遺伝子型が含まれる。本発明の一実施態様では、天然配列ＶＥＧＦは、例えば、米国特許第５，３３２，６７１号及び５，２４０，８４８号；ＰＣＴ公報国際公開公報第９８／１００７１号；Leungら., Science 246: 1306-1309(1989)；及びKeckら., Science 246: 1309-1312(1989)に記載の、それぞれ１２１，１４５，１６５，１８９，２０６アミノ酸残基から成る５つの既知のアイソフォームの一つである。
【００５３】
「ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド」とは、天然配列ＶＥＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する下に定義したような活性ＶＥＧＦポリペプチドである。そのようなＶＥＧＦ変異体ポリペプチドには、例えば、天然配列の一つ又は複数の内部ドメイン内と同様に、Ｎ及び／又はＣ末端で一つ又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失しているＶＥＧＦポリペプチドを含む。
ＶＥＧＦに関する配列同一性（アミノ酸又は核酸のいずれか）は、特にＥＧ-ＶＥＧＦに関して記載されているのと同じ手法を用いて決定される。同様に、ＥＧ-ＶＥＧＦのアゴニスト及びアンタゴニストのための定義は、抗体に限定されるものではないが、ＶＥＧＦアゴニスト及びアンタゴニストへ適用する。
【００５４】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．完全長ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド
本発明は、本出願でＥＧ-ＶＥＧＦ（又は同じくＵＮＱ０６００）と呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別の発現ラウンドで生産されたタンパク質は、異なるＰＲＯ番号を与えられてもよいが、ＵＮＱ番号は任意の所定のＤＮＡ及びコードタンパク質にとって独特であり、変化するものではない。しかしながら、単純化のために、本明細書では、ＥＧ-ＶＥＧＦの前の定義に含まれる更なる天然相同体と同様にＤＮＡ６０６２１-１５１６によってコードされているタンパク質は、それらの起源又は製法にも関わらず、「ＥＧ-ＶＥＧＦ」と呼ばれる。
【００５５】
下記の実施例に開示するように、ここでＤＮＡ６０６２１-１５１６と命名されているｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することによって容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も同一であると証明できるリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
上にて参照したALIGN-2配列アライメントコンピュータープログラムを用いて、完全長天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦ（図２及び配列番号：２）がコブラ科マンバ属毒液のタンパク質であるＥＧ-ＶＥＧＦ_ＤＥＮＰＯとある程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出されている。しかしながら、いかなる既知の哺乳動物タンパク質との顕著な配列同一性は明らかにされていない。
【００５６】
Ｂ．ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体
ここに記載の完全長天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに加えて、ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体を調製することができると考えられる。ＥＧ-ＶＥＧＦ変異体は、適切なヌクレオチド変化をＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡへ導入することによって、及び／又は所望のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを合成することによって調製することができる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＥＧ-ＶＥＧＦの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【００５７】
天然全長配列ＥＧ-ＶＥＧＦ又はここに記載したＥＧ-ＶＥＧＦの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いて施すことができる。変異は、結果として天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦと比較してＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＥＧ-ＶＥＧＦをコードする一つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＥＧ-ＶＥＧＦの一つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＥＧ-ＶＥＧＦの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列におけるアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成すること、完全長又は成熟配列によって示された活性に対して結果として生じた変異体を試験することによって決定される。
【００５８】
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＥＧ-ＶＥＧＦ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＥＧ-ＶＥＧＦ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド断片は、図２（配列番号：２）に示した天然ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【００５９】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００６０】
0005081361.tif 000002
【００６１】
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
【００６２】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野で知られた方法を用いて作成することができる。部位特異的誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又はその他のこの分野で知られた方法をクローニングしたＤＮＡに施してＥＧ-ＶＥＧＦ変異体ＤＮＡを作成することが可能である。
【００６３】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００６４】
Ｃ．ＥＧ-ＶＥＧＦの修飾
ＥＧ-ＶＥＧＦの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＥＧ-ＶＥＧＦを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００６５】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【００６６】
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦ（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＥＧ-ＶＥＧＦアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【００６７】
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＥＧ-ＶＥＧＦの共有結合的修飾の他の型は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＥＧ-ＶＥＧＦは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＥＧ-ＶＥＧＦを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００６８】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＥＧ-ＶＥＧＦとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＥＧ-ＶＥＧＦのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＥＧ-ＶＥＧＦのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＥＧ-ＶＥＧＦを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００６９】
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＥＧ-ＶＥＧＦの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００７０】
Ｄ．ＥＧ-ＶＥＧＦの調製
以下の説明は、主として、ＥＧ-ＶＥＧＦ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＥＧ-ＶＥＧＦを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＥＧ-ＶＥＧＦを調製することができると考えられる。例えば、ＥＧ-ＶＥＧＦ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＥＧ-ＶＥＧＦの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＥＧ-ＶＥＧＦを生産してもよい。
【００７１】
１．ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡの単離
ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡは、ＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＥＧ-ＶＥＧＦ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＥＧ-ＶＥＧＦに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００７２】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００７３】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＥＧ-ＶＥＧＦ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
【００７４】
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００７５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行  米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【００７６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日発行のEP 139,383）；クルベロミセス・ホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第４，９４３，５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケー・ラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケー・フラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケー・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケー・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケー・ワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケー・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケー・テモトレランス(K. themotolerans)及びケー・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャ・パストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００７７】
グリコシル化ＥＧ-ＶＥＧＦの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００７８】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＥＧ-ＶＥＧＦをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００７９】
ＥＧ-ＶＥＧＦは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＥＧ-ＶＥＧＦ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００８０】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに関するＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００８１】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＥＧ-ＶＥＧＦ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＥＧ-ＶＥＧＦ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００８２】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ７３，６５７に更に記載されている。
【００８３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＥＧ-ＶＥＧＦ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＥＧ-ＶＥＧＦコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００８４】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＥＧ-ＶＥＧＦの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); ＥＰ１１７，０６０；  及びＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【００８５】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００８６】
５．ポリペプチドの精製
ＥＧ-ＶＥＧＦの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＥＧ-ＶＥＧＦの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＥＧ-ＶＥＧＦを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＥＧ-ＶＥＧＦの性質に依存する。
【００８７】
Ｅ．ＥＧ-ＶＥＧＦの用途
ＥＧ-ＶＥＧＦをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＥＧ-ＶＥＧＦ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの調製に有用である。
【００８８】
全長天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦ遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、全長ＥＧ-ＶＥＧＦｃＤＮＡの単離又は図１（配列番号：１）に開示のＥＧ-ＶＥＧＦ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＥＧ-ＶＥＧＦの天然発生変異体又は他の種からのＥＧ-ＶＥＧＦをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に配列番号：１のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法には、約４０塩基の選択プローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いて、ＥＧ-ＶＥＧＦ遺伝子のコード化領域を単離することが含まれる。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識され得る。本発明のＥＧ-ＶＥＧＦ遺伝子のコード化領域ポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００８９】
本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＥＧ-ＶＥＧＦ核酸の他の有用な断片は、標的ＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ（センス）又はＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48: 2659: 1988）及び van der Krolら,（BioTechniques 6: 958, 1988）に記載されている。
【００９０】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法によって標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、ＷＯ９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【００９１】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【００９２】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＥＧ-ＶＥＧＦコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするヌクレオチド配列は、そのＥＧ-ＶＥＧＦをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００９３】
また、本発明は、アッセイでＥＧ-ＶＥＧＦを用いて他のタンパク質又はＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質と結合することができる分子を同定する方法を提供する。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＥＧ-ＶＥＧＦは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイを、天然ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計することができる。このようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングによるアッセイが含まれ、それらを小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００９４】
また、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするｃＤＮＡは、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＥＧ-ＶＥＧＦ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＥＧ-ＶＥＧＦコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低いということは、病理学的状態に対して治療的介入が起こり得ることを示す。
【００９５】
あるいは、ＥＧ-ＶＥＧＦの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＥＧ-ＶＥＧＦをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＥＧ-ＶＥＧＦ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞株に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を生み出す間近になる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００９６】
また、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を伴う遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドを、例えば、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによってそれらの取り込みを促進するように修飾することができる。
【００９７】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzauら, Trends  in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【００９８】
ここに記載したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定が必要である。本発明の各ＥＧ-ＶＥＧＦ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＥＧ-ＶＥＧＦ核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【００９９】
ここに記載したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド及びモジュレーターは治療薬として用いてもよい。本発明のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド及びＥＧ-ＶＥＧＦモジュレーターは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このＥＧ-ＶＥＧＦ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１００】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜に通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は持続放出系による。
【０１０１】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１ｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
【０１０２】
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はモジュレーターの持続放出投与が望まれる場合、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（rhGH）、インターフェロン-（rhIFN-）、インターロイキン-２、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１０３】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
ここで示されている治療薬は、多くの治療に用いることが可能である。その治療には、ホルモン産生組織又は内分泌腺に関わる症状を有する個体の治療が含まれる。一側面では、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦアゴニストを、その症状を治療するのに有効な量、それを必要とする個体へ投与する。ＥＧ-ＶＥＧＦは、ポリペプチド又は核酸の形態で投与することができる。好ましくは、その症状とは、特定のホルモンを生産する細胞の数の増加を必要とする。そのような症状の例には、糖尿病が含まれる。他の症状には、例えば卵巣、睾丸、子宮、前立腺及び胎盤のような生殖細胞での細胞の数の増加が所望される症状が含まれる。
【０１０４】
好ましくは、ＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストをホルモン産生組織又は内分泌腺と関連している症状を有する個体へ投与する。ＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストが投与される場合、好ましくは、症状は、特定のホルモンを生産する細胞数の減少、又は細胞増殖の減少を必要とするものである。例えば、個体の繁殖性を制御する方法がここで示され、それには、繁殖性を制御するのに有効な量のＥＧ-ＶＥＧＦを投与することが含まれる。一実施態様では、繁殖性は、卵胞の成熟及び／又は排卵を阻害することによって制御される。あるいは、個体が多嚢胞性卵巣症候群を有するか、又はその危険を有する場合、ＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストをその個体へ投与し、一般的にその症候群を治療しないために生ずる不妊症を防ぐことによって繁殖性が維持される。症状が遺伝性で家族に頻繁にみられるか、又は症状の初期症状であるならば、個体は症状の危機にある。ＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストは、また、嚢腫、及びホルモン産生組織での過剰増殖、炎症及び過度の血管形成に関連する他の症状を治療するために投与することができる。
【０１０５】
本発明の組成物及び方法を用いて処置が施され得るステロイドホルモン依存性疾患には、さらにリポイド先天性副腎皮質過形成、不妊症、性成熟、アンドロゲン依存性腫瘍、性早熟症、マッキン・オールブライト症候群、先天性副腎形成不全、又は低ゴナドトロピン性性機能低下症が含まれる。
ここで示された薬剤及び組成物によって治療できる特定の症状は、癌、特にステロイド、例えばアンドロゲン依存性癌である。ここで示されたような癌を治療するのに好ましい方法には、癌を有するか、又はその危険がある個体へ癌を治療するのに有効な量のＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストを投与することが含まれる。一実施態様では、癌は、卵巣、睾丸、前立腺及び子宮から成る群から選択された組織のものである。
細胞増殖の方法、細胞増殖の阻害、走化性、及び走化性を阻害する方法をインビボ又はインビトロでおこなえることは理解されている。ある場合には、インビトロでＥＧ-ＶＥＧＦを細胞試料へ添加し、特定の細胞型の増殖を刺激することが所望され得る。ＥＧ-ＶＥＧＦで処理した試料は、次いでスクリーニングアッセイで用いることができるか、又は治療を必要としている個体か、又は動物モデルへ移植することができる。
【０１０６】
また、この発明は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド（アゴニスト）を模倣又は増大させる、又はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐ化合物を同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。ＥＧ-ＶＥＧＦアゴニスト及びアンタゴニストは、ここでＥＧ-ＶＥＧＦモジュレーターとも呼ばれている。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと結合又は複合化する、さもなければコードされたポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。ここで示されたスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングによるアッセイが含まれ、特にそれらを小分子薬剤候補の同定に適したものにする。一般的には、結合アッセイ及び活性アッセイが提供されている。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式でおこなうことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
【０１０７】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１０８】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１０９】
ここで同定されたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１１０】
アゴニスト及びアンタゴニストに関するアッセイでは、スクリーニングされるべき化合物とともに細胞へＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを添加してよい。ＥＧ-ＶＥＧＦによって調節されることが知られている特定の活性が観察され、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの存在下では、この活性を増大又は阻害する化合物の能力は、その化合物がそれぞれＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストであることを示している。あるいは、アゴニスト又はアンタゴニストは、競争阻害アッセイにとって適切な条件下で、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド及び候補化合物を膜結合ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドレセプター又は組み換えレセプターと混合させることによって検出され得る。ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、例えば放射能によって標識することができ、それによってレセプターと結合しているＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド分子の数を、潜在的なアゴニスト又はアンタゴニストの有効性を決定するために用いることができる。
【０１１１】
ＥＧ-ＶＥＧＦのレセプターをコードしている遺伝子は、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソーティングなど、当該分野の熟練者に周知の多くの方法によって同定される。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに対して応答性の細胞から調製され、このＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリをプールに分け、ＣＯＳ細胞又はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに対して応答性の無い他の細胞をトランスフェクトするために用いる。ガラススライド上に成長したトランスフェクト細胞を、標識ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドへ曝す。ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、部位特異的タンパク質キナーゼに対する認識部位のヨウ素化又は封入を含む種々の方法によって標識することができる。固定化及びインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。ポジティブプールを同定し、サブプールを相互作用的なサブプーリング及び再スクリーニング工程を用いて調製して再トランスフェクトし、最終的には、推定上のレセプターをコードする単一クローンを産する。
【０１１２】
レセプターの同定に関する選択的手法として、標識ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを、レセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調整物と光親和性結合させることができる。架橋結合物質を、ＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムへ曝す。レセプターを含有する標識複合体を切り取り、ペプチド断片へ分離し、タンパク質マイクロシーケンシングに供することができる。マイクロシーケンシングから得られたアミノ酸配列は、推定上のレセプターをコードする遺伝子の同定のためのｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために、縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組を設計するために用いられる。
【０１１３】
アンタゴニストに関するその他のアッセイでは、哺乳動物細胞又はレセプターを発現する膜調製物は、候補化合物の存在下で標識ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドとインキュベートされる。従って、この相互作用を増す又はブロックする化合物の能力を測定することができる。
潜在的なアンタゴニストのより特異的な例には、免疫グロブリンとＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの融合物と結合するオリゴヌクレオチド、そして特に、限定されずに、ヒト抗体及び抗体断片と同様に、ポリ及びモノクローナル抗体と抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化種を含む抗体が含まれれる。あるいは、潜在的アンタゴニストは近縁のタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を示さないＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの成熟型であり得、よってＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの作用を競争的に阻害する。
【０１１４】
他の潜在的ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの転写と生産を阻止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡとハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１１５】
潜在的アンタゴニストは、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの正常な生物学的活性を阻害する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
選択的な実施態様では、アゴニストの過剰発現は、活性がポジティブフィードバックによって制御されるアンタゴニストとして機能する。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーションにより作用し、ヌクレオチド鎖切断的切断が続く。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報番号国際公開９７／３３５５１（１９９７年９月１８日発行）を参照。
【０１１６】
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報番号国際公開９７／３３５５１, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
ここで提供されているすべてのアッセイは、種々の候補生物活性剤をスクリーニングすることに用いることができる。ここで用いられている「候補生物活性剤」、「候補薬剤」又は「候補薬」、又はここで用いられている文法的に同等の用語は、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド、プリン類似体などの、細胞活性表現型又は核酸配列及びタンパク質配列の双方を含むＥＧ-ＶＥＧＦ配列の発現の何れかを直接的又は間接的に変化させることができる生物活性剤のために試験されるすべての分子を表す。
【０１１７】
候補薬剤は、主として有機分子であるが、多くの化学物質を包含し、好ましくは１００を越え、約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小有機化合物である。小分子は、ここで更に、５０ｋＤと２０００ｋＤの間の分子量を有すると定義される。その他の実施態様では、小分子は１５００より小さい、又は１２００より小さい、又は１０００より小さい、又は７５０より小さい、又は５００ｋＤより小さい分子量を有する。一実施態様では、ここで用いられる小分子は、約１００から２００ｋＤの分子量を有する。候補薬剤は、タンパク質との構造的な相互作用に必要な官能基を含み、特には水素結合、そして主には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシ又はカルボキシ基、好ましくは、少なくとも２つの機能性化学基を含む。候補薬剤は、１つ又は複数の上記の官能基で置換された環状炭素又はヘテロ環状構造及び／又は芳香族又は多芳香族構造を頻繁に含む。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はその組み合わせの中に見出される。特に好まれるのはペプチドである。
【０１１８】
候補薬剤は、合成又は天然化合物のライブラリを含む幅広い種々のソースから得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、幅広い種々の化合物及び生物分子のランダム及び直接合成のための多くの手段を利用することができる。あるいは、細菌、糸状菌、植物及び動物抽出物形態の天然化合物のライブラリを利用することができるか、又は容易に作製することができる。更には、通常の化学的、物理的及び生化学的手段によって、天然又は合成的に作製されたライブラリ及び化合物を容易に修飾できる。構造類似体を作製するために、既知の薬理学的な薬剤にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの特異的又はランダム化学修飾を施してもよい。
【０１１９】
好ましい実施態様では、候補生物活性薬剤はタンパク質である。ここで「タンパク質」によってとは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合的に結合しているアミノ酸を意味する。このタンパク質は、天然発生アミノ酸及びペプチド結合、又は合成ペプチド模倣構造で構成されうる。従って、ここで用いられる「アミノ酸」、又は「ペプチド残基」とは、天然発生及び合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本発明の目的のアミノ酸であると考えられている。また、「アミノ酸」は、プロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基を含む。その側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置の何れかである。好ましい実施態様では、このアミノ酸は（Ｓ）又はＬ−配置である。非天然発生側鎖が用いられる場合には、非アミノ酸置換基が、例えばインビボでの分解を防いだり、遅くしたりすることに用いられてもよい。
【０１２０】
好ましい実施態様では、候補生物活性薬剤は、天然発生タンパク質又は天然発生タンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダム又は特異的消化物を用いてもよい。この方法では、原核生物及び真核生物タンパク質のライブラリは、本発明の方法でのスクリーニングのために作製される。特に、この実施態様で好まれるのは、細菌、糸状菌、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質のライブラリであり、後者は好まれており、そしてヒトタンパク質が特に好まれている。
好ましい実施様態では、候補生物活性剤は、約５から約３０アミノ酸のペプチドで、約５から約２０アミノ酸が好まれ、そして約７から約１５が特に好まれる。このペプチドは、上記で概説したように、ランダムペプチド、又は「偏向」ランダムペプチドで、天然発生タンパク質の消化物でありうる。ここで「ランダム化」又は文法的に同等な表現は、各核酸及びペプチドは、基本的に、各々ランダムヌクレオチド及びアミノ酸で構成されていることを意味する。一般的に、これらランダムペプチド（又は核酸、下記にて記載）は化学的に合成されることから、それらは、任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置へ取り入れうる。この合成工程は、配列の長さにわたってすべて又は殆どの可能性ある組み合わせの形成を許容するために、ランダム化タンパク質又は核酸を生成するように設計することができ、故にランダム化候補生物活性タンパク質性剤のライブラリを形成する。
【０１２１】
１つの実施態様では、すべての位置において配列優先又は一定さをともなわずに、ライブラリは完全にランダム化される。好ましい実施態様では、ライブラリは偏っている。すなわち、配列内のある位置は、一定に保たれているか、限られたメンバーの可能性から選択されるかの何れかである。例えば、好ましい実施態様では、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体構造的に偏った（小さい又は大きい）残基の明確な種類において、核酸結合ドメインの作成、システインの作成、架橋結合のため、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位としてのセリン、スレオニン、チロシン又はヒスチジン、等、又はプリンに対するなどのために、ヌクレオチド又はアミノ酸残基はランダム化されている。
【０１２２】
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は核酸である。ここで「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は文法的に同等の表現によって、共有結合的にともに結合している少なくとも２つのヌクレオチドが意味される。本発明の核酸は、概してリン酸ジエステル結合を含んでいるが、下記に概説するように、幾つかの場合は、代替バックボーンを有しうる核酸類似体が含まれ、この代替バックボーンは、例えば、ホスホルアミド（Beaucageら, Tetrahedron 49(10): 1925(1993)及びその参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800(1970)；Sprinzlら., Eur. J. Biochem. 81:579(1977)；Letsingerら., Nucl. Acids Res. 14:3487(1986)；Sawaiら, Chem. Lett. 805(1984), Letsingerら., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988)；及びPauwelsら., Chemica Scripta 26:141 91986)）、ホスホロチオエート（Magら., Nucleic Acids Res. 19:1437(1991)；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオアート（Briuら., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321(1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照のこと）、及びペプチド核酸バックボーン及び結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895(1992)；Meierら., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008(1992)；Nielsen, Nature, 365:566(1993)；Carlssonら., Nature 380:207(1996)、すべて参考文献によって取り入れている）を含んでなる。他の類似核酸は、ポジティブ（陽性）バックボーン（Denpcyら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6027(1995)；非イオンバックボーン(米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号；Kiedrowshiら., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423(1991)；Letsingerら., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988)；Letsingerら., Nucleoside Nucleotide 13: 1597(1994)；第２章及び３章、ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui 及びP. Dan Cook；Mesmaekerら., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395(1994)；Jeffsら., J. Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett. 37:743(1996)）並びに非リボゾームバックボーンを含み、それらは米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、及び第６及び７章、ASC Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modification in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui及びP. Dan Cookに記載のものを含む。１つ又は複数の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Jenkinsら., Chem. Soc. Rev.(1995)pp169-179参照）。幾つかの核酸類似体は、Rawls, C& E News June 2, 1997 35ページに記載されている。これら参考文献のすべては、参考によって、ここに本明細書に明らかに取り入れられる。リボース−リン酸バックボーンの修飾が、標識のような付加的物質の付加を容易にするためか、または生理的環境下におけるそのような分子の安定性と半減期を増すために施され得る／てよい。更には、天然発生核酸と類似体の混合物を作製することができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、及び天然発生核酸と類似体の混合物を作製してもよい。この核酸は、仕様としては、一本鎖又は二本鎖でもよく、或いは二本鎖又は一本鎖配列の双方の部分を含んでもよい。この核酸が、任意のデオキシリボ-及びリボ-ヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む任意の塩基の組み合わせを含む場合には、この核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの双方、ＲＮＡ又はハイブリッドでもよい。
【０１２３】
タンパク質に関する上記の一般的な記述のように、核酸候補生物活性剤は、天然発生核酸、ランダム核酸、又は「偏向」ランダム核酸でよい。例えば、タンパク質に関して上記にて概説しているように、原核生物又は真核生物ゲノムの消化物を用いてもよい。
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は、有機化学的物質であり、その幅広い多くのものを文献から得ることが可能である。
上記にて概説した好ましい実施例では、個々の遺伝子と遺伝子の産物（タンパク質）についてスクリーニングをおこなってもよい。好ましい実施態様では、遺伝子又はタンパク質は、特定の組織と関連した別々に発現した遺伝子であり、よって条件はこれら組織に関連しているとして、下記の実施例に記載されているように同定された。従って、一実施態様では、スクリーニングは、ＥＧ-ＶＥＧＦへ結合することができる候補薬剤を最初に見出すように設計され、次いで、候補薬剤のＥＧ-ＶＥＧＦ活性を調節する能力を評価するアッセイに、これら薬剤は用いられうる。従って、当該分野において認識されているように、実行しうる異なった数多くの方法がある。
【０１２４】
一実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦは、好ましくは固体支持体上に固定化され、多くの候補生物活性剤と接触し、ＥＧ-ＶＥＧＦと結合する候補が更なる研究のために選択された。候補生物活性剤が標識されたならば、候補生物活性剤の結合は直接に測定し得る。候補生物活性剤は、好ましくは放射能で標識される。あるいは、それは蛍光的に標識される。候補生物活性剤が標識されなかったならば、結合は、測定された結合に対する応答に基づいて間接的に決定され得る。あるいは、候補生物活性化合物との相互作用は、既知の標識リガンドの結合を阻害する候補生物活性剤の能力に基づいて評価される。
【０１２５】
ＥＧ-ＶＥＧＦの活性を調節する薬剤のスクリーニングも実行される。好ましい実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦの活性を調節することができる生物活性剤のスクリーニングの方法は、ＥＧ-ＶＥＧＦの試料へ候補生物活性剤を添加し、ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性の変化を測定する段階を含む。「ＥＧ-ＶＥＧＦの活性を調節すること」は、活性の増加、活性の低下、又は存在する活性の型や種類の変化を含む。従って、この実施態様では、候補薬剤は、ＥＧ-ＶＥＧＦへ結合するはずであるし（これは、必修でなくてもよいが）、そしてここで定義されるＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的又は生化学的活性を変化させるはずである。この方法は、上記にて全般的に概説したインビトロスクリーニング法、及びＥＧ-ＶＥＧＦの存在、分布、活性、量での変化に関する細胞のインビボスクリーニング法の両方を含む。
【０１２６】
従って、この実施態様では、これらの方法は、試料と候補生物活性剤を組み合わせること、並びにＥＧ-ＶＥＧＦ活性への効果を評価することを含む。ここで「ＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質活性」又は文法的に同等の用語によって、細胞増殖に限定されないが、走化性／遊走活性、血管形成、細胞分化及び細胞透過窓を含む、少なくとも一つのＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質生物学的活性が表される。これらの活性は、好ましくはホルモン産生組織及び細胞、そしてより好ましくはステロイド産生細胞に特異的である。比活性にとって好ましい細胞型には、卵巣、睾丸、前立腺、子宮そして胎盤を含む生殖系が含まれる。特に好ましい細胞型には、卵巣の支質及び卵胞膜内部、及び睾丸のライディッヒ細胞が含まれる。膵臓及び副腎皮質の細胞も好まれる。ＥＧ-ＶＥＧＦ活性の阻害剤は、任意の一つ又はそれ以上のＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質活性の阻害である。
【０１２７】
好ましい実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質の活性が上昇する；また別の好ましい実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質の活性が低下する。従って、アンタゴニストである生物活性剤は、ある実施態様で好まれ、アゴニストである生物活性剤は、他の実施態様で好まれうる。
本発明の一側面では、ＥＧ-ＶＥＧＦに対する薬剤候補物質の効果を評価することで、ＥＧ-ＶＥＧＦ配列を含む細胞は薬剤スクリーニングアッセイで用いられる。細胞型には、正常細胞、より好ましくは、腫瘍細胞を含む異常増殖速度を有する細胞、最も好ましくはヒト腫瘍細胞が含まれる。
【０１２８】
ＥＧ-ＶＥＧＦ活性を評価する方法は、当該分野で知られており、培養又は一次細胞を用いる成長及び生存度アッセイを含む。そのようなアッセイでは、細胞集団は、成長及び又は生存度に関してモニターされ、それは殆どが長時間であり、種々の濃度の生物活性剤と、又はその生物活性剤無しでインキュベートした試料と比較する。細胞数は、例えば、代謝的に活性な細胞の存在下で有色又は蛍光化合物へ変換される3-(4,5ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド（MTT)、3-(4,5ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)［米国特許第５，１８５，４５０号］及びアラマーブルーのよな薬剤を用いて定量化できる。あるいは、細胞タンパク質と結合する色素、例えばスルフォダミンＢ（ＳＲＢ）又はクリスタル・バイオレットを細胞数を定量化するために用いることができる。あるいは、細胞は、Beckman Coulterによって製造されたコールターカウンター（商品名）のような粒子カウンターを用いて直接に数えるか、又は顕微鏡を用いて血球計数板上の細胞を観察して数えることができる。好ましくは、血球計数板を用いて数えた細胞は、生存細胞から死細胞を区別するためにトリパンブルーの溶液中で観察される。細胞数を定量化する他の方法は、当該分野の熟練者に周知である。これらのアッセイは、ネクローシスの状態にある細胞を含む任意の細胞でおこなえる。
【０１２９】
タンパク質が直接又は間接的に細胞集団の特異的配向性又は運動を刺激できるならば、それは特定の細胞集団に関する走化活性を有する。好ましくは、このタンパク質は直接に細胞の定方向運動を刺激する能力を有する。下に記載するように、ＥＧ-ＶＥＧＦは、走化性活性を有する。ＥＧ-ＶＥＧＦの走化性活性の変化は、細胞走化性のための既知のアッセイを用いることによって容易に決定することができる（例えば、下の実施例に記載のような移動アッセイ）。
好ましい実施態様では、この方法には、上で定義された候補生物活性剤をＥＧ-ＶＥＧＦを含む細胞へ添加することが含まれる。好ましい細胞型には、任意の細胞がすべて含まれる。この細胞は、核酸、好ましくはＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質をコードする組み換え体を含む。好ましい実施態様では、候補薬剤のライブラリが多くの細胞で試験される。
【０１３０】
一側面では、このアッセイは、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法剤を含む薬物、放射線、発癌牲物質、又は他の細胞（すなわち細胞-細胞間接触）などの生理学的シグナルの存在下又は非存在下、又はそれへ前もって又は後で曝すことで評価される。その他の例では、判定は、細胞周期の異なる段階で判定される。
ここで示されているＥＧ-ＶＥＧＦ配列は、また、診断方法で用いることができる。ＥＧ-ＶＥＧＦの過剰発現は、生殖器官での嚢腫又は癌を示し得る。さらには、患者からの試料を、変異又は機能不全ＥＧ-ＶＥＧＦに関して分析してよい。一般的に、そのような方法には、患者からの試料を比較すること、そして試料のコントロールとＥＧ-ＶＥＧＦ発現を比較することが含まれる。
【０１３１】
Ｆ．抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体
本発明は、さらに抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体を提供する。典型的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、そしてヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【０１３２】
１．ポリクローナル抗体
抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、一つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを、複数回の皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性を示すことでが知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１３３】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１３４】
免疫剤は、典型的には、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬｓ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化細胞株は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１３５】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナサッスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＥＧ-ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１３６】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１３７】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１３８】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製には、同じくインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成が可能である。
【０１３９】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１４０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１４１】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:581(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１４２】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はＥＧ-ＶＥＧＦに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４３】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクションする。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１４４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１４５】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ)２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,  Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ’)２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオールに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ’)２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１４６】
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法が記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１４７】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアームは、特定のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子又はＦｃＲI(ＣＤ６４)、ＦｃＲII(ＣＤ３２)及びＦｃＲIII(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＥＧ-ＶＥＧＦ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１４８】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１４９】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１５０】
７．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
【０１５１】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートHCL等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１５２】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１５３】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが細胞内であり、全抗体がインヒビターとして用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)を参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、例えば細胞毒性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤等の製剤の機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１５４】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１５５】
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１５６】
Ｇ．抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体の用途
本発明の抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体は、ＥＧ-ＶＥＧＦの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
【０１５７】
また、抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＥＧ-ＶＥＧＦのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＥＧ-ＶＥＧＦに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を精製するＥＧ-ＶＥＧＦを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＥＧ-ＶＥＧＦ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＥＧ-ＶＥＧＦを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。さらには、抗-ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体は、治療及び診断薬として有用であり、ＥＧ-ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦアンタゴニストとの関連で前出にて検討した症状の治療及び／又は診断に用いることができる。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１５８】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０１５９】
実施例１：  ヒトＥＧ-ＶＥＧＦをコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ６０６２１−１５１６は、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQ（商品名）、Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのクラスター及び組み立てられたＥＳＴ断片のみならずＥＳＴでGenentech, Inc.（South San Francisco, CA）によって開発された独自のシグナル配列検索アルゴリズム（図２０Ａ-Ｑ）を適用する事により同定された。このシグナル配列アルゴリズムは、検討中の配列又は配列断片の５’末端にある一番目、あるいは二番目のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの特徴に基づく分泌シグナルスコアを計算する。一番目のＡＴＧに続くヌクレオチドには、停止コドンを持たない少なくとも３５の明白なアミノ酸がコードされていなければならない。一番目のＡＴＧが必須のアミノ酸を有する場合、二番目のものは検討しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、分泌シグナルに関連することが知られている７つのセンサー（評価パラメータ）の一組を用いて、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列にスコアをつけた。
【０１６０】
上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで「ＤＮＡ１５７０３２」と命名されたLIFESEQ（商品名）データベース、Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, データベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を公的ＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上の結果となった比較物をプログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でクラスター化し、コンセンサスＤＮＡ配列を構築した。それから得られたコンセンサス配列を図４（配列番号：３）に示し、そのコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６７４８と命名する。
【０１６１】
ＤＮＡ５６７４８配列とＩｎｃｙｔｅデータベースからのクローン番号３４７６７９２に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、クローン番号３４７６７９２を購入し、そのｃＤＮＡ挿入物を得て配列が決定した。クローン番号３４７６７９２は、卵巣組織のライブラリから単離した。組織の切片化によって、後側の漿膜が子宮内膜症の病巣を含むことが見出された。関連した腫瘍組織についての病状は、大きさに幅がある多発性平滑筋腫を示した。ここで、ｃＤＮＡ挿入物が完全長タンパク質をコードすることが見出された。このｃＤＮＡ挿入物の配列は図１に示され、ここでＤＮＡ６０６２１-１５１６と命名される。
【０１６２】
クローンＤＮＡ６０６２１-１５１６は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９１−９３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４０６−４０８に見いだされる停止コドンで終端する（図１）。予測されるポリペプチド前駆体（図２）は１０５アミノ酸長である。図２に示した完全長ＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質は、約１１７１５ダルトンの算定分子量及び約９．０５のｐＩを有する。成熟ＥＧ-ＶＥＧＦは、ヒト卵巣ライブラリからクローンされたｃＤＮＡによってコードされた８６００ダルトンのタンパク質である。１．４キロベースのｃＤＮＡは、かなり明確なシグナル配列を有する１０５個のアミノ酸から成るタンパク質をコードする。ＥＧ-ＶＥＧＦは、コリパーゼフォールドモチーフから成るシステインリッチタンパク質である。成熟タンパク質で予想される８６のアミノ酸のうち、１０がシステインである（図１５ａ及びｂ）。このタンパク質は、相互作用的表面として作用するフィンガー様突起を有するフラットフォールドとなる、ジスルフィド結合によってまとまっている大きな結合ループを有する一連の短いベータストランドを有している。図２（配列番号：２）に示した完全長ＥＧ-ＶＥＧＦ配列の分析は、図２に示しているような種々の重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、それら重要なポリペプチドドメインに関して示された位置は、上に記載のようにおおよそである。クローンＤＮＡ６０６２１-１５１６は、１９９８年８月４日にＡＴＣＣへ寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９１が付与された。
【０１６３】
図２（配列番号：２）に示した完全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いて、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析によってEG-VEGFアミノ酸配列と次のDayhoff配列の間の配列同一性が証明された：VRPA_DENPO，LFE4_CHICK，AF034208_1，AF030433_1，A55035，COL_RABIT，CELB0507_9，S67826_1，S34665及びCRU73817_1。
【０１６４】
明らかに、ＥＧ-ＶＥＧＦは、ブラックマンバ蛇デンドロスピス ポリレピス ポリレピスの毒液から精製した非毒素タンパク質と高い程度の相同性（８０％）及び同一性（６３％）を示し、毒タンパク質Ａ（ＶＰＲＡ）と命名され［Joubert及びStrydom, Hoppe-Seylers Zeitschrift fur Phys. Chemie, 361: 1787-1794(1980)］、そしてボンビア ヴァリエガタから単離したペプチドとかなり関連しているヒト分子と高い程度の相同性（７６％）及び同一性（５８％）を示し、「Ｂｖ８」と命名された［Wechselbergerら., FEBS Lett., 462: 177-181(1999)］。図１５ｂは、この相同性を例示している。図１５ｂでは、囲まれた残基が同一性及びヒトＥＧ-ＶＥＧＦ、蛇ＶＰＲＡ、を示し、そしてヒトＢＶ８相同体（Bv8 hom）アミノ酸配列が示されている。特に、ＥＧ-ＶＥＧＦに関するシステインの数と間隔は、完全に保存されている。従って、ＥＧ-ＶＥＧＦは、ヒトオーソログ又はＶＰＲＡ及びＢｖ８のかなり関連した相同体である。ＥＧ-ＶＥＧＦは、図１５ｃに見ることができるように、より限定されているが、アフリカツメガエルのヘッド・オーガナイザーdickkopfのシステイン-リッチカルボキシ配列、wntシグナル伝達の阻害剤、そしてコリパーゼと顕著な相同性を示す［Glinkaら., Nature, 391: 357-362；Aravind及びKoonin, Curr. Biology, 8: 477-478(1998）］。図１５ｃは、ヒトＥＧ-ＶＥＧＦ、ヒトdickkopf-3（hdkk3）［Krupnikら., Gene, 238:301-313(1999)］、アフリカツメガエルdkk-1（xdkk-1）［Glinkaら., Nature, 391: 357-362(1998)］及びブタコリパーゼ（col）のアライメントである。これは、コリパーゼフォールドドメインの特徴的なジスルフィド結合パターンを形成する保存システインを例示する［van Tilbeurghら., Nature, 359: 159-162(1992)］。ＥＧ-ＶＥＧＦのこのモチーフは、ヒトdkk-3のシステインリッチＣ末端ドメインと３７％同一性及び４１％相同的、及びアフリカツメガエルdkk-1ドメインと３２％同一性、４２％相同的がある。番号は、それぞれのタンパク質のアミノ酸位置を示し、囲まれた残基はＥＧ-ＶＥＧＦと同一である。
【０１６５】
実施例２：  ハイブリダイゼーションプローブとしてのＥＧ-ＶＥＧＦの用途
以下の方法は、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての利用を示している。
完全長又は成熟ＥＧ-ＶＥＧＦのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの相同的なＤＮＡ（ＥＧ-ＶＥＧＦの天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
どちらかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を、次の高緊縮性条件下において実施する。放射標識ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドをコードする遺伝子から誘導されたプローブフィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中において４２℃で２０時間実施する。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ水溶液中において４２℃で実施する。
次いで、この分野で知られている標準的技術を用いて、完全長天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡを同定することができる。
【０１６６】
実施例３：  大腸菌でのＥＧ-ＶＥＧＦの発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＥＧ-ＶＥＧＦの非グリコシル化型の調製を例証する。
選択したＰＣＲプライマーを利用して、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列を最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。種々の発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)を参照のこと)がある。このベクターを制限酵素によって消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターへライゲーションする。このベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリHisリーダー（最初の６つのSTIIコドン、ポリHis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＥＧ-ＶＥＧＦコード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
【０１６７】
次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて、このライゲーション混合物を選択した大腸菌株を形質転換するために利用した。形質転換体をＬＢプレート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。制限分析及びＤＮＡ配列決定によって、プラスミドＤＮＡを単離し、確認することができる。
選択したクローンを、抗生物質で補填されたＬＢブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。次いで、この一晩の培養を、より大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において、金属キレート化カラムを用いて精製することが可能である。
【０１６８】
以下の手法を用いて、ポリ−Hisタグ形態でＥＧ-ＶＥＧＦを大腸菌で発現させてもよい。選択したＰＣＲプライマーを用いて、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡを最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、並びに効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、そしてエンテロキナーゼによるタンパク質分解的除去を提供する他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲ増幅を施したポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−５のＯＤ６００に達するまで成長させる。次いで、培養液を５０−１００倍希釈してＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのDifco酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのSheffield hycase SF、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製）とし、そして３０℃で振盪によって約２０−３０時間成長させる。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって発現を確認するために試料を取り出し、この大量培養液を遠心分離して細胞がペレットとなるようにする。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結する。
【０１６９】
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）の大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁する。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを、各々の最終濃度が０．１Ｍ及び０．０２Ｍとなるように添加し、この溶液を４℃で終夜に渡って撹拌する。この工程によって、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。この溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮する。その上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターで濾過して透明にする。この透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化した５ｍｌのQiagen Ｎｉ-ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷する。このカラムを、５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する分画をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるその吸収によって見積もった。
【０１７０】
試料を２０ｍＭトリス、ｐＨ８．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシン及び１ｍＭＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファーで徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。このリフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくりと撹拌する。リフォールディング反応は、ＴＦＡを最終濃度が０．４％（約３のｐＨ）となるように添加することにより停止させる。タンパク質の更なる精製の前に、この溶液を０．２２ミクロンフィルターで濾過し、アセトニトリルを最終濃度が２−１０％となるように添加する。再生したタンパク質を、１０〜８０％のアセトニトリルのグラジエントによる溶離をともなう０．１％ＴＦＡの移動バッファーを使用して、Poros R1／H逆相カラムによるクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ分画のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同的な再生タンパク質を含有する分画をプールする。一般的に、殆どのタンパク質の正確に再生した種は、逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているその疎水性内面によってこれらの種が最もコンパクトであるので、最低濃度のアセトニトリルで溶離される。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質の形態を所望の形態から分離するのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
【０１７１】
所望の再生したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを含有する分画をプールし、溶液へ穏やかな窒素の弱い気流を当てることでアセトニトリルを除去した。透析、或いは調製バッファーで平衡化し、無菌濾過されたＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂によるゲル濾過によって、タンパク質を０．１４Ｍ 塩化ナトリウム及び４％マンニトールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ６．８に調製した。
【０１７２】
実施例４：  哺乳動物でのＥＧ-ＶＥＧＦの発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組み換え発現によるＥＧ-ＶＥＧＦの潜在的なグリコシル化形態の調製を例証する。
発現ベクターとしては、ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７，２４７参照）を用いる。場合によっては、上記のSambrook等に記載のようなライゲーション方法を用いて、選択した制限酵素でＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡをｐＲＫ５とライゲーションし、ＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡの挿入を可能にする。この結果生じたベクターは、ｐＲＫ５-ＥＧ-ＶＥＧＦと呼ばれる。
【０１７３】
一実施態様では、選択宿主細胞を２９３細胞にしてもよい。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）を、ウシ胎児血清、そして場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質で補ったＤＭＥＭなどの培地中の組織培養プレートで、集密化するまで成長させる。約１０μｇのｐＲＫ５-ＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡを、約１μgのＶＡ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭ トリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に、滴状の５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間に渡って、析出物を形成させる。この析出物を懸濁して２９３細胞に加え、３７℃で約４時間に渡って定着させた。培地を吸引し、２ｍｌの２０％グリセロールのＰＢＳを３０秒間で添加した。次いで、この２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加して細胞を約５日間に渡ってインキュベートした。
【０１７４】
形質移入後のの約２４時間には、培養培地を除去し、培養培地（のみ）或いは２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後には、培養上清を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに負荷する。この処理したゲルを乾燥し、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間に渡ってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施してもよく（無血清培地で）、この培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
【０１７５】
これに換わる技術としては、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて、ＥＧ-ＶＥＧＦを２９３細胞へ過度的に導入してもよい。２９３細胞を、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００ｇのｐＲＫ５-ＥＧ-ＶＥＧＦ ＤＮＡを添加する。この細胞を、まずは遠心分離によってスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間に渡ってインキュベートする。この細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５ｇ／ｍｌウシインシュリン、及び０．１ｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、培養上清を遠心分離し、濾過して細胞及び細胞片を除去した。次いで、任意の透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって、発現したＥＧ-ＶＥＧＦを含む試料を濃縮し、精製することができる。
【０１７６】
他の実施態様では、ＥＧ-ＶＥＧＦをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いて、ｐＲＫ５-ＥＧ-ＶＥＧＦをＣＨＯ細胞へ形質移入することができる。上記に記載のように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地と置換することができる。ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地と置換してもよい。好ましくは、この培養を約６日間インキュベートし、次いで培養上清を収集する。次いで、発現したＥＧ-ＶＥＧＦを含む培地を、濃縮して任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１７７】
また、エピトープタグＥＧ-ＶＥＧＦを、宿主ＣＨＯ細胞で発現させてもよい。ＥＧ-ＶＥＧＦをｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物を、ＰＣＲを施してポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグとのフレームとしてバキュロウイルス発現ベクターへ融合できる。ポリ-hisタグＥＧ-ＶＥＧＦ挿入物を、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現したポリ-hisタグＥＧ-ＶＥＧＦを含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製できる。
【０１７８】
またＥＧ-ＶＥＧＦは、一過性発現法によってＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によってＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は、以下の方法を用いて実施された。タンパク質を、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメイン及び／又はポリ-Hisタグ形態を含むＩｇＧ１定常領域配列へ融合しているＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現させる。
【０１７９】
ＰＣＲ増幅に続いて、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載のような標準的技術を用いて、それぞれのＤＮＡをＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターを、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの簡便にシャトル化ができるように作成する。ＣＨＯ細胞での発現に利用されるベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようなものであり、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持に関する選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)又はFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を使用して、約１千万のＣＨＯ細胞に導入する。この細胞を、上記のLucas等に記載されているように成長させる。下記に記載のような更なる成長及び生産のために、約３ｘ１０７の細胞をアンプルで凍結する。
【０１８０】
このプラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配することで解凍し、ボルテックスによって混合する。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管へピペットし、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２ｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２ｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）に懸濁する。次いで、この細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種する。遠心分離及び生産培地での再懸濁によって、細胞培地を新鮮な培地で交換する。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている生産培地を使用してもよい。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーから試料採取し、濾過空気での散布を実施する。２日目に、スピナーから試料採取し、温度を３３℃に変え、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）を使用する。生産を通して、７．２近傍に維持するために、必要ならばｐＨを調節する。１０日後、或いは生存率が７０％を下回るまで、細胞培養を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターで濾過する。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムへ負荷する。
【０１８１】
ポリ-Hisタグ作成物に関しては、タンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを培養上清へ５ｍＭの濃度まで添加した。この培養上清を、０．３Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのHepes，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ-ＮＴＡカラムへ４−５ｍｌ／分の流速で４℃でポンプ供給した。負荷後、このカラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーでタンパク質を溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて２５ｍｌのG25 Superfine（Pharmacia）カラムで、１０ｍＭ Hepes、０．１４Ｍ ＮａＣｌ及び４％マンニトール，ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファーへ脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
【０１８２】
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下のようにして培養上清から精製する。この培養上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）へポンプ注入する。負荷後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離する前に、このカラムを平衡バッファーで強く洗浄する。２７５Ｌの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に１ｍｌの分画を回収することによって、溶離したタンパク質を即座に中和する。高度に精製されたタンパク質は、続いて、ポリ-Hisタグタンパク質に関して上記に記載した貯蔵バッファーで脱塩する。その均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及びエドマン（Edman）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定によって評価する。
【０１８３】
実施例５：  酵母でのＥＧ-ＶＥＧＦの発現
以下の方法は、酵母でのＰＲＯポリペプチドの組換え発現を示す。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＥＧ-ＶＥＧＦの細胞内生産又は分泌のために、酵母菌発現ベクターを作成する。ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ及びプロモーターを、選択したプラスミドの適切な制限酵素部位に挿入してＥＧ-ＶＥＧＦの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするＤＮＡを、選択したプラスミドへ、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＥＧ-ＶＥＧＦシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、並びに（必要ならば）ＥＧ-ＶＥＧＦの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
【０１８４】
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択した発酵培地で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降、並びにＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分離に続くクマシーブルー染色によるゲルの染色によって分析することができる。
続いて、遠心分離と続く選択したカートリッジフィルターを用いての培地の濃縮によって、発酵培地から酵母菌細胞を取り除くことで、組換えＥＧ-ＶＥＧＦを単離そして精製できる。選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて、ＥＧ-ＶＥＧＦを含む濃縮物をさらに精製してもよい。
【０１８５】
実施例６：  バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＥＧ-ＶＥＧＦの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＥＧ-ＶＥＧＦの組換え発現を記載する。
ＥＧ-ＶＥＧＦコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグには、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）が含まれる。ｐＶＬ１３９３（PharMingen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む、種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦコード配列の所望部分、例えば、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、或いはタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
【０１８６】
例えば、ヒトＥＧ-ＶＥＧＦのコード化配列をＰＣＲで増幅し、ｐＢＰＨ．ＩｇＧのＥｃｏＲＩ及びＳｔｕＩ部位へサブクローンしてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とＣ末端融合物を生成するか、又はｐＢＰＨ．Ｈｉｓ．ｃのＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ部位へサブクローンしてＣ末端ＧＨＨＨＨＨＨＨＨタグを生成する。ベクターｐＢＰＨ．ＩｇＧ及びｐＢＰＨ．Ｈｉｓ．ｃは、バキュロウイルス発現ベクターＰＶＬ１３９３の誘導体である（PharMingen）。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時トランスフェクションすることによって作成される。２８℃で２−４日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施される。
【０１８７】
次に、発現されたポリ-hisタグＥＧ-ＶＥＧＦは、例えばＦｃ融合タンパク質のためのプロティンＡ-セファロースビーズ（Pharmacia）又はＨｉｓ-タグタンパク質のためのＮｉ２＋-ＮＴＡアガロースビーズ（Qiagen）のいずれかによって精製できる。Ｈｉｓ-タグタンパク質については、抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載のように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのHepes，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４ＭのＫＣｌ）で再懸濁し、氷上で２回ずつ２０秒間超音波処理する。この超音波処理物は、遠心分離によって透明にし、その上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈して０．４５ｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄して２５ｍＬの負荷バッファーで平衡化する。濾過した細胞抽出物を、毎分０．５ｍＬでこのカラムに負荷する。カラムを、分画回収が始まる地点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、このカラムを、非特異的に結合しているタンパク質を溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、このカラムを二次洗浄バッファーでの０から５００ｍＭイミダゾールのグラジエントで展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に共役させたＮｉ２＋-ＮＴＡによるウェスタンブロットで分析する。溶離したＨｉｓ１０-タグＥＧ-ＶＥＧＦを含む分画をプールして負荷バッファーで透析する。
【０１８８】
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＥＧ-ＶＥＧＦの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
タンパク質発現を検討するために、染色に続いて、非還元及び還元条件下で、アフィニティ精製した組み換えタンパク質に関してＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析をおこなった。１eu/mg未満のタンパク質を規定通りにＮ末端シーケンシング及びエントドキシン測定に供した。
【０１８９】
実施例７：  ＥＧ-ＶＥＧＦに結合する抗体の調製
この実施例は、ＥＧ-ＶＥＧＦと特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＥＧ-ＶＥＧＦ、ＥＧ-ＶＥＧＦを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＥＧ-ＶＥＧＦを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０１９０】
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内へ１−１００マイクログラムで注入したＥＧ-ＶＥＧＦ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, ハミルトン, モンタナ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＥＧ-ＶＥＧＦ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１９１】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＥＧ-ＶＥＧＦ静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞株に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
【０１９２】
ハイブリドーマ細胞は、ＥＧ-ＶＥＧＦに対する反応性に関するＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。ＥＧ-ＶＥＧＦに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の判定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＥＧ-ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１９３】
実施例８：  特異的抗体を用いたＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの精製
天然又は組換えＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製され得る。例えば、プロ-ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、対象とするＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロース（商品名）（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０１９４】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを含有する細胞の画分を調製することによるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加、或いはこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞、又は細胞成分画分の可溶化によって誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、細胞が成長する培地に有用な量で分泌され得る。
可溶化ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド含有調製物を、免疫親和性カラムへ貫流させ、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの好ましい吸着を可能にする条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）でカラムを洗浄する。次いで、抗体／ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）でカラムを溶離し、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを回収する。
【０１９５】
実施例９：  薬物スクリーニング
本発明は、任意の種々の薬物スクリーニング技術において、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド、或いはその結合断片を利用することによって、化合物のスクリーニングのために特に有用である。そのような試験に用いられるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸によって安定に形質転換される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質転換細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片と試験される試薬の間の複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験される試薬によって生じるＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成の減少を調べることができる。
【０１９６】
従って、本発明は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えることのできる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、そのような試薬をＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、或いは(ii)ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、当該分野で良く知られた方法によって検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、概して、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片が標識される。適切なインキュベーションの後、遊離型のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又は断片が結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに結合する、或いはＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１９７】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適した結合親和性を有する化合物に関する高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体、或いは幾つかの他の表面上で合成される。ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドは、この分野で良く知られた方法によって検出される。精製したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドを、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
【０１９８】
また、本発明は、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドとの結合が可能な中和抗体が、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド又はその断片との結合に関して、試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイを考慮する。この方法では、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドと一つ又は複数の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出することに使用することができる。
また、本発明は、ＥＧ-ＶＥＧＦの活性を調節することができる生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法では、候補生物活性剤がＥＧ-ＶＥＧＦの試料へ添加され、ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性に変化が生じた場合に割り出される。そのような変化は、ＥＧ-ＶＥＧＦの細胞増殖を刺激する、走化性を誘導する、血管形成を刺激する、細胞分化を誘導する、又はＥＲＫ１及びＥＲＫ２をリン酸化する能力であり得る。
【０１９９】
実施例１０：  合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド）或いはそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのより活性があって安定な形態の、或いはインビボでＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
【０２００】
１つの方法では、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド、又はＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶学によって、コンピュータモデル化によって、最も典型的には２つの方法の組み合わせによって決定される。分子の構造を解明し、活性部位を決定するためには、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合では、関連する構造情報は、類似ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例としては、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、或いはAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０２０１】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離し、その結晶構造を解明することもできる。この方法によって、原理的には、それに続く薬剤設計が準拠することのできるファーマコア(pharmacore)が生成される。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することによって、タンパク質結晶学を完全にバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。次いで、抗-idは、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
【０２０２】
本発明によって、Ｘ線結晶学のような分析実験を実施するために十分な量のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドが入手可能である。その上、ここで提供したＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０２０３】
実施例１１：  ノーザンブロット分析
ＥＧ-ＶＥＧＦの発現パターンを明らかにするために、幅広い種々の組織からのＲＮＡを用いてノーザンブロット分析をおこなった。ヒトＲＮＡブロットを、ＥＧ-ＶＥＧＦ ｃＤＮＡに基づいた３２Ｐ-標識ＤＮＡへハイブリダイズした。ヒト複合組織ポリＡ＋ＲＮＡアレイ及びヒトポリＡ＋ＲＮＡ複合組織ノーザンブロットをClontechから購入した。用いられた他のノーザンブロットには、ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ（Clontech）及びヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-II（Clontech）が含まれる。
【０２０４】
ノーザンブロット分析を、当該分野で良く知られた方法によっておこなった。例えば、３２Ｐ-ｄＣＴＰ ３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ（Amersham）を用いて、３０-５０ｎｇのヒト又はマウスｃＤＮＡ断片を用いたRedi-Prime IIキット（Amersham）で、ｃＤＮＡプローブを調製した。プローブをセファデックスＧ５０スピンカラム（Pharmacia）で精製し、ハイブリダイゼーションを６８℃でExpressHyb ハイブリダイゼーション溶液（Stratagene）でおこなった。その他の例では、ブロットをプローブと共に、ハイブリダイゼーションバッファー（５Ｘ ＳＳＰＥ；２Ｘ デンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ）中で４２℃、６０時間にわたってインキュベートした。このブロットを２Ｘ ＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳで１時間にわたって室温で数回洗浄し、次いで０．１Ｘ ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳで３０分間にわたって５０℃で洗浄した。このブロットを終夜暴露した後、リン光体イメージャー分析(Fuji)によって展開した。等量ＲＮＡ負荷を、コントロールのアクチンプローブとのハイブリダイゼーションによって評価した。
【０２０５】
ＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ転写物を検出した。図１８は、幾つかの独立した実験で、一本鎖ｍＲＮＡの１．４ｋｂが卵巣、睾丸、副腎皮質及び胎盤の順に減少して発現していたことを示す。長期にわたる曝露の後に前立腺で非常に弱いシグナルがあることを除いて、その他の組織では発現が検出されなかった（図１８）。同じような知見が、ヒト複合組織アレイでのインサイツハイブリダイゼーションによって得られた（データは示されず）。これらの知見は、ステロイド産生内分泌腺がＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現の主要な部位であることを示している。
【０２０６】
実施例１２：  インサイツリガンド結合
ＥＧ-ＶＥＧＦを発現する細胞型を同定するために、ヒト及び他の霊長類の一連の睾丸及び卵巣標本を用いてインサイツハイブリダイゼーション研究をおこなった。一つの組では蛍光を用い、そして一つでは標識プローブを用いる、幾つかの実験の組み合わせをおこなった。
【０２０７】
最初の組の実験では、ＯＣＴに埋め込んだ固定していない、新鮮な組織を１０ミクロンに切片化し、乾燥剤を使わずに４日間にわたって−２０℃で貯蔵した。４℃でおこなった固定化を除いて、すべての段階を室温でおこなった。切片は、４分間にわたって、３５ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）、３ｍＭ ＣａＣｌ２、３ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌでインキュベーションした。スライドをプロテアーゼインヒビター（Boehringer Manneheim）を加えた１．５％マウス血清を含むＨＢＳ-Ｃで２０分間にわたってブロッキングする前に、スライドをカチオンバッファーを加えたＨＥＰＥＳ緩衝化生理的食塩水（２５ｍＭ Hepes（pH7/2），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＣａＣｌ２，３ｍＭ ＭｇＳＯ４，５ｍＭ ＫＣｌ，及び３２ｍＭ シュークロース）で３回洗浄した。さらなるブロッキングを、ベクターラボラトリーのアビジン／ビオチンブロッキングキットを用いておこなった。初期実験では、成人ラットから調製した肝臓、副腎皮質及び卵巣を使用した。下に記載したように、他の組織を分析した。これらの切片を、０から１．５ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦ-Ｆｃの範囲のリガンドで６０分にわたってインキュベートした。置き換えは、過剰のＥＧ-ＶＥＧＦ-hisタッグタンパク質を用いて完遂した。切片は、０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳ-Ｃで３回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで１０分間にわたって固定化した。ＨＢＳ-Ｃ中の１．５％マウス血清を含むビオチン化ヤギ-ヒトＦｃ（Jackson Laboratories）である二次抗体の１：４０００希釈を３０分間にわたって切片に加えた。洗浄後、切片をパラホルムアルデヒドで１０分間、後固定した。スライドをＴＢＳ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄し、次いで１０分間、３％Ｈ２Ｏ２を含むＴＢＳで処理した。ＴＢＳでの洗浄に続いて、切片をDupont TSA kit 成分であるＨＲＰ-ストレプトアビジンの１：１０００及びビオチン化チラミドの１：５０の増幅希釈液と反応させた。最後に、ＴＢＳで１：１０００希釈したＦＩＴＣ-コンジュゲートストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）を３０分間にわたって反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ-２０を含むＴＢＳによる広範な洗浄後、Vectashild mounting mediaを用いてカバーグラスを適用した。画像は、蛍光顕微鏡のＦＩＴＣチャネルを使用して得られた。幾つかの場合には、核酸染色液であるＤＡＰＩ（例えば、モレキュラープローブ）を使用した。ＤＡＰＩは、水銀アークランプ又はアルゴン-イオンレーザーのＵＶ線で励起させることができる。さらには、発現が現れた組織の構造を示すために、前出に記載した標準的方法に従って、ヘマトキシリン・エオジン染色法を用いた。
【０２０８】
チンパンジー及びモンキーの卵巣では、最も強いシグナルは、特に一次卵胞では卵母細胞に最も近い顆粒膜細胞にあった。弱いシグナルは、原始卵胞及び卵丘の顆粒膜細胞にあった。顕著なシグナルは、卵巣皮質、特に丸くて小さな退縮した黄体（カニクイザル試料）、及び卵巣の血管極の十分に確定していないクラスターに存在した。この結果は、図５Ａ-Ｆに示されている（すべて５５ミクロン）。図５Ａはヘマトキシリン・エオジン染色法を示し、図５Ｂは、２歳のチンパンジーの卵巣にＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＶＥＧＦ発現を示す。図５Ｃはヘマトキシリン・エオジン染色法を示し、図５Ｄはカニクイザルの卵巣にＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＶＥＧＦを示す。図５Ｅはヘマトキシリン・エオジン染色法を示し、図５Ｆはチンパンジー支質卵巣にＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＶＥＧＦ発現を示す。
【０２０９】
ヒト卵巣では、皮質性支質で散在性で中程度の発現がある。シグナルは、出血黄体の周りの外卵胞膜で強かった。さらには、黄体で中程度の病巣ポジティブシグナルがあった。その結果は図６Ａ-Ｄに示してある。図６Ａはヘマトキシリン・エオジン染色法を示し、そして図６ＢはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＶＥＧＦ発現を示す（２５ミクロン）。図６Ｃはヘマトキシリン・エオジン染色法を示し、そして図６ＤはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＶＥＧＦ発現を示す（１１５ミクロン）。
また、子宮脱の４６歳の女性からの卵巣について、インサイツハイブリダイゼーション研究をおこなった。この場合、前出に記載した標準的技術を用いて、ＥＧ-ＶＥＧＦを放射能で標識した。ＥＧ-ＶＥＧＦ発現を示すオートラジオグラムが図７Ａに示されている。図７Ｂは、同じ卵巣のヘマトキシリン・エオジン染色法を示す。
さらには、ラットの副腎皮質組織切片について、インサイツハイブリダイゼーションをおこなった。図８Ａ及び８Ｂは、ＤＡＰＩを用いたＥＧ-ＶＥＧＦ核酸同定を示し、図８Ｃ及び８ＤはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質の同定を示す。
【０２１０】
さらには、ポジティブなインサイツハイブリダイゼーションの結果が、以下の組織で見出された：卵巣癌、乳頭漿液；卵巣、正常皮質；卵巣嚢胞、単一嚢胞；睾丸、慢性炎症；正常卵巣；卵巣腫瘍、乳頭漿液；副腎腺腫；及び正常睾丸。第二組の実験では、当該分野で知られている方法に従って、３３Ｐ-ＵＴＰ-標識ＲＮＡプローブを作製した。例えば、Melton, D.A., Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056(1984)に記載の方法による。センス及びアンチセンスプローブを、ヒトＥＧ-ＶＥＧＦ配列のヌクレオチド２１９-９５８に一致するｃＤＮＡ断片から合成した。インサイツハイブリダイゼーションを、当該分野で良く知られた方法に従っておこなった。この組の実験は、図９に示されている。パネルＡ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｍ及びＯは明視野画像であり、そしてＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｊ，Ｌ，Ｎ及びＰは暗視野画像に相当する。矢印は、血管の位置を示す。
【０２１１】
睾丸では、強いハイブリダイゼーションシグナルが検出された（図９、パネルＡ-Ｅ）。図９では、パネルＡ-Ｅが、シグナルはテストステロン産生のライディッヒ細胞に限定されていることを示している。睾丸の内皮細胞が、驚くことに高い代謝回転を有していることは注目すべきことである：内皮細胞の３％がBrdUで標識されていて、恐らくは、精子形成及びステロイド産生が関与している強い代謝活性と関連している［Colin及びBergh, Int. J. Androl., 19: 221-228(1996)］。この状況からは、ライディッヒ細胞は、ＶＥＧＦのような血管形成及び透過性増強因子のソースとして知られている［Collin, 上掲］。興味深いことに、これらの実験では、ＶＥＧＦハイブリダイゼーションシグナルは、ＥＧ-ＶＥＧＦシグナルよりもかなり弱い（データは示さず）。卵巣では、強いＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現は、アンドロゲン産生皮質支質、卵丘、発達している卵胞の卵胞膜及び顆粒膜に位置している（図９、パネルＦ-Ｐ）。卵胞膜内のＥＧ-ＶＥＧＦの強力な発現は、卵胞の発達及びステロイドホルモン生産に関わっている毛細血管ネットワークの発達と同時に起こり［Basset, Am. J. Anat., 73: 251-278(1943)］、そしてＥＧ-ＶＥＧＦのプロ血管形成の役割と一致する。この発現パターンは、カニクイザル及びチンパンジーなどの検討された他の霊長類種と本質的に類似している（図９，パネルＧ-Ｉそしてデータは示されず）。分化した支質で、
ＶＥＧＦが非常に低い発現を有する一方で［Ravindranathら., Endocrinology, 131: 254-260(1992)］、代わってＥＧ-ＶＥＧＦは強く発現している（図９，パネルＦ，Ｇ）。興味あることに、多嚢胞性卵巣症候群では、そのような支質は強烈に過形成性及び血管原性で、過剰量のアンドロゲンを生産する［Goldziher及びGreen, J. Clin. Endocrino. Meta., 22:325-332(1962)］。卵丘でのＥＧ-ＶＥＧＦの発現パターン（図９，パネルＮ-Ｐ）は、ＶＥＧＦのそれに非常に類似している［Ravindranathら., 上掲；Philipsら., Endocrinology, 127: 965-967(1990)］。黄体（ＣＬ）では、ＥＧ-ＶＥＧＦ発現が、細胞の異なった巣に位置している（データは示されず）。ＥＧ-ＶＥＧＦが卵巣支質及び発達している卵胞内で高く発現している一方で（図９、パネルＤ-Ｉ及びデータは示されず）、ＶＥＧＦはＣＬで最も高いレベルで発現される［Ravindranathら., 上掲］。げっ歯類［Ferraraら., Nat. Med., 4: 336-340(1998)］又は霊長類［Ryanら., Toxicol. Pathol., 27: 78-86(1999)；Fraserら., Endocrinology, 141: 995-1000(2000)］でのＶＥＧＦの不活性化は、ＣＬ発達の劇的な抑制を引き起こす。しかしながら、卵胞の発達は殆ど損なわれずに進み（観察は未公開）、他の因子が卵胞血管形成に貢献していることを示している。ＥＧ-ＶＥＧＦは、そのようなＶＥＧＦ非依存性血管形成に貢献すると思われる。従って、ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦの発現パターンは部分的に相補的発現パターンは、これらの分子が、卵巣及びこれらの因子を同時発現する他の組織において強力に血管形成を促進するために、共同作用できるか又は相補的な様式で機能し得ることを示している。
【０２１２】
実施例１３：  １２５Ｉ ＥＧ-ＶＥＧＦ細胞結合アッセイ
種々の細胞型でのレセプター分布を特徴付けるために、ＥＧ-ＶＥＧＦで１２５Ｉリガンド結合研究をおこなった。一つの場合では、５００ｇのＥＧ-ＶＥＧＦタッグタンパク質を、Pierceのヨードビーズ調製物を用いて０．５ｍＣｉ１２５Ｉで標識した。このタンパク質を、５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡで、Ｃ１８ Sep Pakによって精製した。第二組目の実験では、ＥＧ-ＶＥＧＦを、Ｎａ１２５Ｉ（Amersham）を用いるラクトパルオキシダーゼ法によってヨード化し、標識タンパク質を、続いて、前もって包装したSynChropak  RP HPLC C4カラム（Micra Scientific, Inc.）を用いる逆相クロマトグラフィーによって精製した。この分子の比活性は、４９から７０Ｃｉ／ｇの範囲であった。競合的結合アッセイを、Ｃｏｓ細胞を含む種々の細胞に関しておこなった。結合の前に、細胞を２４ウェルシャーレで２-３日培養した。
一組の実験では、０．２から０．４ｎＭの標識リガンド及び非標識ＥＧ-ＶＥＧＦ-hisを競合物として利用し、アッセイをおこなった。このアッセイで用いた非標識ＥＧ-ＶＥＧＦ-hisの最も高い濃度は２７０ｎＭであり、競合物の次の１０の濃度に関する連続的な３倍希釈であった。また、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦには、リガンドが標識ＥＧ-ＶＥＧＦ-hisに置き換わらずに、競合物（５００倍モル濃度超で）として含まれていた。
【０２１３】
その他の組の実験では、競合的アッセイは、非標識、タッグＥＧ-ＶＥＧＦを、少なくとも二重に１２の濃度へ２７０ｎＭで始まる３倍連続希釈で添加することによっておこなった。他の実験では、２００モル濃度のｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む関連しないリガンドを、特異的結合を確かめるために添加した。リガンド結合データは、New Ligandプログラムを用いて分析した。
競合的アッセイによって、高い親和性、Ｋｄが０．９−１．０ｎＭでＥＤ５０＝１０ｎＭのＥＧ-ＶＥＧＦのＡＣＥ細胞への特異的結合が明らかにされた（図１０Ａ，１０Ｂ，及び１０Ｃ）。類似の高親和性結合が、ＭＳ-１細胞で証明された（図１１Ａ及びＢ）。しかしながら、ＨＵＶＥＣを含む他の非応答性細胞は、低親和性結合成分（Ｋｄ＞８０ｎＭの）又は僅かの顕著な結合を示し、明らかに非特異的で、低親和性結合は、競合物の濃度が２７０ｎＭより高いと単に置き換えられる（図１１Ｃ及びデータは示されず）。同じように、アッセイされた５つの他の非応答性細胞型は、高い親和性結合成分を示さなかった。タンパク質架橋実験及び膜タンパク質リン酸化分析は、ＥＧ-ＶＥＧＦレセプター成分が特定のＥＧ-ＶＥＧＦ応答性細胞に限定されていることを示した（データは示されず）。
【０２１４】
実施例１４：  細胞増殖アッセイ
ＥＧ-ＶＥＧＦへ応答する細胞型のスペクトルを決定するために、内皮及び非内皮細胞型のパネルは、増殖応答に関してアッセイした。細胞を、５-８日間、Ｆｃ-タッグ及びＨｉｓ-タッグＥＧ-ＶＥＧＦリガンドの濃度の範囲で生育した。アッセイされた細胞型には、ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞（ＡＣＥ）、ウシ脳毛細血管内皮細胞（ＢＢＣ）、ヒト臍静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、成人ウシ大動脈内皮細胞（ＡＢＡＥ）、ウシ周皮細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＨＡ-ＶＳＭＣ）、乳児ハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ-１２）及びヒト新生児線維芽細胞ｈＦｂが含まれた。細胞を、６又は１２ウェルシャーレに４０００から６０００細胞／ｍｌの密度でプレートした。プレートする時に、リガンドは無く、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（GIBCO BRL）、５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、又は１ｎＭから１００ｎＭの範囲のＥＧ-ＶＥＧＦ-Ｆｃ又は-Ｈｉｓタッグタンパク質をウェルへ添加した。二重又は三重の試料を各細胞型へプレートした。集密及び形態を毎日モニターした。アッセイの５から７日目に、細胞を０．０１％トリプシン（GIBCO BRL）でトリプシン消化し、コールターカウンターを用いて細胞数を測定した。培地及び他の細胞培養試薬は、Life Technolgies, Inc. から得た。ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ及びヒトケラチノサイトは、Cloneticsから購入した。ウシ周皮細胞及びヒト新生児線維芽細胞は、M. Gerritsenからの贈り物であった。アッセイの実行に関しては、Aravind及びKoonin, Curr. Biol. 8: 477-478(1998)も参照せよ。
【０２１５】
幾つかの予備的結果が図１２Ａ-Ｅに示され、それは縦軸にウェル当たりの細胞を示している。各グラフは、１ｎＭ、１０ｎＭ又は２５ｎＭの濃度のコントロール、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、又はＥＧ-ＶＥＧＦのいずれかを用いた細胞の相対的増殖を示す。図１２Ａは、周皮細胞を用いた結果を示す。図１２Ｂは、ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＨＡ-ＶＳＭＣ）を用いた結果を示す。図１２Ｃは、乳児ハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ２１）を用いた結果を示す。図１２Ｄは、ＡＣＥを用いた結果を示す。図１２Ｅは、ウシ脳毛細血管内皮細胞（ＢＢＣ）を用いた結果を示す。
【０２１６】
同じような結果が、図１３に示す結果の実験で得られた。これらの実験では、基本培地がネガティブコントロール（Ｃｔ）、及びｂＦＧＦ（Ｆ）又はＶＥＧＦ（Ｖ）がポジティブコントロールとして機能した。ＥＧ-ＶＥＧＦは、濃度の範囲で試験された。パネルに例示されているように、ＥＧ-ＶＥＧＦは、０．２ｎＭのＥＤ５０でＡＣＥ細胞の増殖を刺激した。最大効果は、およそ２ｎＭで観察された。細胞数の倍数増加は、ＶＥＧＦによって誘導されたものと極めて類似していた。バキュロウイルス産生his-及びＦｃ-タッグＥＧ-ＶＥＧＦタンパク質は、すべての実験で極めて同じように挙動した。分裂促進因子の機能と呼応し、ＥＧ-ＶＥＧＦは、ＡＣＥ細胞内で、他の増殖及び生存シグナル分子の迅速で顕著なリン酸化だけでなく、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１及び２の迅速で顕著なリン酸化を誘導する。ＥＧ-ＶＥＧＦの分裂促進因子活性は、５０から１０００ｎｇ／ｍｌの間の濃度範囲で試験されたＶＥＧＦ可溶性レセプター（mFlt-IgG）の投与によってブロックされず、このことは、そのような効果がＶＥＧＦ遊離によって媒介されないことを示した。これらの知見は、より複雑なインビボ系で相互誘導性効果の可能性をはっきりと除外するものではない。
ＥＧ-ＶＥＧＦへの応答で増殖する細胞型のスペクトラムを決定するために、我々は種々の他の内皮及び非内皮細胞型を試験した。試験された内皮細胞型には、ヒト臍静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、ウシ脳毛細血管（ＢＢＣ）、成人ウシ大動脈内皮細胞（ＡＢＡＥ）が含まれる。
【０２１７】
図１３に見られるように、すべての試験された濃度で、ＢＢＣ細胞はＶＥＧＦで見られる増殖応答の約１０％を示し、他の内皮細胞型はＥＧ-ＶＥＧＦ投与後にいずれの効果も示さなかった。従って、ＥＧ-ＶＥＧＦは、そのような限定された標的細胞特異性を有する内皮細胞分裂促進因子の最初の例であると考えられている。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦのような他の内皮細胞分裂促進因子は、種々の内皮細胞型に対していずれの顕著な選択性も示さない［Leungら., Science, 246: 1306-1309(1989)］。
図１３，パネルｃは、ＥＧ-ＶＥＧＦが、血管平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞又はケラチノサイトの培養ではいずれの増殖応答も誘発しなかったという知見を例示している。従って、ＥＧ-ＶＥＧＦは、内皮特異的分裂促進因子だけでなく、明らかにされた内皮細胞型へ選択的に作用する。
図１３のパネルｂ及びｃでは、垂直軸上の増殖指数は、任意に１に設定されたネガティブコントロールに比例する。
【０２１８】
実施例１５：  細胞移動（走化性）アッセイ
血管形成カスケードの必須側面は走化性である［Zetter, Nature, 285: 41-43(1980)］。ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦは化学遊走物質として作用し、内皮細胞移動を刺激する。走化活性に関するアッセイ（走化性を誘導又は防ぐタンパク質の同定）は、例えば、前出に記載されているCurrent Protocols in Immunology, Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach及びStrober編, Pub. Greene Publishing Associates 及びWiley-Interscience, 6.12: 6.12.1-6.12:28；Taubら., J. Clin. Invest. 95: 1370-1376, 1995；Lindら., APMIS 103: 140-146, 1995；Muellerら., J. Immunol. 25: 1744-1748；Gruberら., J Immunol. 152: 5860-5867, 1994；Johnstonら., J Immunol., 153: 1762-1768, 1994を参照せよ。ＥＧ-ＶＥＧＦの生物学的活性を定義するために、我々は、ＡＣＥ細胞及び幾つかの他の細胞型が、修飾ボイデンチャンバーアッセイでのこの分子に対する走化性応答を示すかどうかを評価した。
【０２１９】
特に、ＡＣＥ細胞、ヒヒ副腎内皮細胞（ＢＡＥＣ）、ＭＳ-１細胞及びＨＵＶＥＣを移動アッセイに用いた。ＭＳ-１細胞株は、ＡＴＣＣからのものである。一次ヒヒ内皮細胞は、未熟又は胎児ヒヒの副腎から単離した（Clyman, UCSFの贈り物）。その組織を、基本的にMesianoら., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:968-976, 1993に記載のように分離した。要約すると、その莢膜を取り除き、残りの組織を、殺菌したカミソリの刃でおよそ２ｍｍ３の断片に精密に切った。次に、その断片をDNaseI（Life Technologies, Inc.）を添加した１０％ＦＣＳである５０：５０ Ham's F10:DMEM 培地の０．１％コラゲナーゼ（Sigma）によって３７℃で３０-４０分間インキュベーションした。単一の細胞懸濁物を洗浄し、５％ＦＣＳを含むＰＢＳに再懸濁し、１０７細胞に対して１ｇの抗-ＫＤＲモノクローナル抗体でインキュベーションし、洗浄し、次にフルオレセインイソチオシアネート（Sigma）へ共役させたヤギ抗-マウス抗体でインキュベーションした。ＫＤＲ-ポジティブ対ネガティブ集団を、EPICS ELITE細胞ソーター（Coulter Corporation）を用いて分類した。内皮細胞集団を、１０％血清及び成長因子を含有するＣＳＣ-培地（Cell Systems, Kirkland, WA)で維持した。ファルコン８．０ｍフィルター挿入物（Falcon 3097）を、１％ゼラチンでコーティングした。上に記載のようにして、アッセイの前に細胞を培養した。細胞をトリプシン処理し、アッセイのために０．１％ＢＳＡを含むＥＢＭ（内皮基本培地、Clonetics）へ移した。細胞を上のチャンバーにつき１-５ｘ１０４でプレートし、成長因子を下のチャンバーに配した。このアッセイは、日常的な３７℃で１６時間のアッセイであった。終了として、細胞をポリウレタンスワブで削り取ることによって上側の膜から取り除き、次いで下の膜にある残りの細胞をメタノールで固定化した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、Image-Proプログラムを用いて低出力の下で計測された。図１４Ａ，１４Ｂ及び図１３、パネルｄのｙ軸は、移動指数を表し、任意に１に設定したネガティブコントロールと比例する。
【０２２０】
予備的な結果が図１４Ａ及び１４Ｂに示されている。各グラフは、．２ｎＭ，．５ｎＭ，１ｎＭ又は５ｎＭの濃度での、コントロール、ＶＥＧＦの存在下、又はＥＧ-ＶＥＧＦの存在下における相対的な内皮細胞移動を示す。図１４Ｂは、ＡＣＥを用いた結果を示す。
【０２２１】
これらの結果は、図１３、パネルｄに示すさらなる実験の結果によって強調された。強力で再現可能な走化性応答は、０．５ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦのピークとする応答でＡＣＥ培養で誘発された。効果の大きさは、ＶＥＧＦによって誘導されたものと類似している。その他の一次細胞型へ我々の結果を拡張するために、我々は、ＶＥＧＦレセプター-２又はＫＤＲを認識するモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞ソーティングによって、内皮細胞をヒヒ副腎（ＢＡＥＣ）から精製した。ＢＡＥＣ培養では、０．５-５ｎＭのＥＧ-ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦによって誘導されたのと同じ大きさの走化性応答を誘導した。さらには、ＥＧ-ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦよりもさらにより大きな程度にＭＳ-１内皮細胞での移動を誘導した。マウス内分泌系膵臓の微細血管から単離したＭＳ-１細胞株は、ＶＥＧＦレセプター発現のような高い分化特性を保持する［Arbiserら., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 861-866(1997)］。しかしながら、これらの細胞がＶＥＧＦに対して強い応答を示すにも関わらず、ＨＵＶＥＣからは応答が誘発されなかった。その分裂促進因子に加えて、ＥＧ-ＶＥＧＦは、また、特定の内皮細胞型に対してであるが、化学遊走物質として作用する。
【０２２２】
これらの知見は、ヨード化ＥＧ-ＶＥＧＦが、膜タンパク質と架橋する高親和性、ＡＣＥ細胞との特異的結合を示すことを明らかにした実施例１３に示した結合研究と完全に一致する。しかしながら、ＨＵＶＥＣのような非応答性細胞では、高親和性結合が検出されていない。
【０２２３】
実施例１６：  リン酸化分析
リン酸化分析を、当該分野で周知の方法によっておこなった。要約すると、副腎由来毛細血管内皮（ＡＣＥ）細胞を、１４-１６時間にわたって０．１％ＦＣＳで血清欠乏させ、さらに０．０５％ ＢＳＡで９０分間が続いた。次いで、細胞を２．５ｍＭ ＶＥＧＦ（最大反応性を誘導するために）又は２０ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦで処理し、０．１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄した。細胞を、０．１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ パラ-ニトロフェニルリン酸、１０ｍＭ フッ化ナトリウム、０．５ｍＭ オカダ酸、そしてプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche MB 1836145）を含有する０．５ｍｌ ＲＩＰＡバッファーに溶解させた。抗-フォスフォＥＲＫ抗血清は、Promegaから購入した。
【０２２４】
分裂促進因子の機能と呼応し、ＥＧ-ＶＥＧＦは、ＡＣＥ細胞内で、他の増殖及び生存シグナル分子の迅速で顕著なリン酸化だけでなく（データは示されず）、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１及びＥＲＫ２の迅速で顕著なリン酸化を誘導する（図１５）。特に、図１５は、２０ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦがＥＲＫ１及び２の顕著で迅速なリン酸化を誘導したことを示す。５分間の因子が無い場合（ｃｔ）及びＶＥＧＦ（Ｖ）刺激がコントロールの役割を担い、ＥＧ-ＶＥＧＦ刺激に関するタイムコースが、レーンの上に示されている。全ＥＲＫ１及び２のレベルは、下位の免疫ブロットに示されている。さらには、ＥＧ-ＶＥＧＦの分裂促進因子活性は、５０と１０００ｎｇ／ｍｌの間の濃度範囲で試験されたＶＥＧＦ可溶性レセプター（mFlt-IgG）の投与によってブロックされず、このことは、そのような効果がＶＥＧＦ放出によって媒介されないことを示している。
【０２２５】
実施例１７：  透過窓術アッセイ
副腎内の内皮細胞は、むしろ、他の内分泌腺、脈絡叢、胃腸管、及び多くの腫瘍をも含む限定された部位に見出された独特な透過窓表現型を示す［Simionescu, 上掲］。透過窓とは、特異的な原形質膜微小ドメイン又は窓であり、およそ６０ｎｍの直径で、通常はクラスター形成している［Paladeら., Acta Physiol. Scand. Suppl., 463: 11-32(1979)］。この透過窓は、流体及び小さな溶質に対してかなり透過性があり、膵臓島のような他の内分泌腺だけでなくステロイド生産生じるような、支質液と原形質の間の物質の大量の交換を促進すると考えられる。我々は、ＥＧ-ＶＥＧＦがそれのみ又はＶＥＧＦとの組み合わせで内皮細胞で透過窓を誘導できるかどうかを試験した。
【０２２６】
ＥＣＭを、当該分野で周知の方法、基本的にはGospodarowiczら., J. Cell. Biol. 99: 947-961, 1984に記載によって調製された。要約すると、角膜内皮細胞を去勢牛（Pel Freez, Arkansas）から単離し、これらは、１５％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ファンギゾンで補充した５０：５０Ham's F10: DMEM培地に展開した。ＥＣＭ被膜プレートを調製するために、６-ウェルシャーレのウェルにつき４Ｘ１０４細胞をプレートし、１０％ＦＣＳ、２．５％デキストラン（Sigma 4133）及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充した低グルコースＤＭＥＭでおおよそ１０日間にわたって培養した。１０日の終わりに、細胞を速やかに０．０２Ｍ ＮＨ４ＯＨの水に溶解し、ＰＢＳで数回洗浄し、抗体を含むＰＢＳに４℃で貯蔵した。ＡＣＥ又はＭＳ-１細胞を１-２Ｘ１０５の密度でプレートし、集合するように生育させた。少なくとも二重に、無添加、２．５ｎＭ ＶＥＧＦ、１０ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦ、又は２．５ｎＭ ＶＥＧＦに加えて１０ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦを個々のウェルへ添加した。透過窓アッセイを３回反復した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍ カコジル酸塩バッファーで２時間にわたって固定化した。洗浄後、この試料を２時間にわたって含水１％オスミウムで後固定し、等級アルコール及び酸化プロピレンで脱水し、そしてＥＰＯＮＡＴＥ １２に埋め込んだ（Ted Pella, Inc., Redding CA）。極薄の切片をライヘルト ウルトラカットＥ ミクロトームで切り、酢酸ウラニル及び酢酸鉛で対比染色し、８０ｋＶでフィリップＣＭ１２透過型電子顕微鏡によって調べ、画像をＧＡＴＡＮ 引き込み式 マルチスキャン デジタル カメラでとらえた。少なくとも、各試料について１００の細胞プロファイルを調べた。
【０２２７】
図１３は、これら実験の代表的な電子顕微鏡写真を示す。パネルｅは、未処理ＡＣＥ細胞を示す。図１３のパネルｆは、ＶＥＧＦで処理したＡＣＥ細胞を示す。図１３のパネルｇは、ＥＧ-ＶＥＧＦで処理したＡＣＥ細胞を示す。矢印の頭は透過窓の位置を示し、倍率が示されている。
【０２２８】
とりわけ、今までは、インビボ及びインビトロで、ＶＥＧＦのみが透過窓を誘導する能力を示すと報告されてきた［Roberts及びPalade, Cancer Res., 57: 765-772(1997)；Esserら., J. Cell. Biol. 140: 947-959(1998)］。ＡＣＥ又はＭＳ-１細胞を、ウシ角膜内皮細胞によって生産される細胞外マトリックス上で集合するように生育させ、２４-２７時間にわたってリガンドで処理した。前出の研究と一致するのは［Esserら., 上掲］、ＶＥＧＦは、ＡＣＥ細胞プロファイルの４．３３±１．５３％で透過窓を誘導した（図１３，パネルｆ）。ＭＳ-１培養は、ＶＥＧＦへの応答で、同じような数の透過窓を得た（示されていない）。双方の細胞型では、ＥＧ-ＶＥＧＦの効果は、ＶＥＧＦのそれに非常に類似している（ＡＣＥに関する図１３，パネルｇ）。２つの因子の組み合わせによって、付加的又は協同応答を産し、それがＡＣＥ細胞プロファイルの１１±１％で透過窓を誘導する。ＶＥＧＦ又はＥＧ-ＶＥＧＦの非存在下では、透過窓は観察されない。この知見は、副腎又は卵巣の場合のように、これらの因子がインビボで協同して常在性の内皮細胞の透過窓表現型を誘導するという仮説を支持する。
【０２２９】
実施例１８：  ＥＧ-ＶＥＧＦの低酸素制御
Ａ．ＥＧ-ＶＥＧＦ発現のTaqman分析
低酸素は、生理学的及び病理学的症状の双方で、血管形成の中心誘発物質である。低酸素誘導因子（HIF）１を活性化することによって、低酸素圧がＶＥＧＦの発現、さらには、シス作用性制御エレメントを介してエリスロポエチン（Epo)及びある解糖系酵素の発現を誘導する［Semenza, J. Appl. Physiol. 88: 1474-1480(2000)］。従って、我々は、低酸素が内皮細胞でＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を制御するかどうかを確かめた。
【０２３０】
発現の分析のために、複製物、低酸素曝露ＳＷ１３及びＨ２９５Ｒ細胞（双方ともＡＴＣＣから）に対する常酸素処理の符号標本からのＲＮＡ単離物は、製造者によって記載されたRneasy kit(Qiagen)を用いて調製された。リアルタイム定量ＲＴ-ＰＣＲのために、計５０ｎｇのＲＮＡを、Perkin Elmer Taqman kit 試薬及びＡＢＩprism ７７００シーケンスディテクターで三重にアッセイした。用いたオリゴ及びプローブは次の通りである：
0005081361.tif 000003
【０２３１】
ネガティブコントロールとして、アクチンの発現分析を上に記載のように製造者によって供給されたプライマー及びプローブでおこなった（Perkin-Elmer）。
図１７Ａのパネルａは、ヒト副腎癌腫細胞株ＳＷ１３及びＨ２９５Ｒの低酸素状態への曝露は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡがそれぞれ３５２±３０％及び２６６±１４％増加した一方で、常酸素よりＥＧ-ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルがそれぞれ２７５±１５％及び２１０±１２％の増加を引き起こした。コアＨＩＦ-１結合部位に関するＥＧ-ＶＥＧＦプロモーター配列の探索は、コンセンサス配列に基づいて（5'TACGTGCGGC-3'、太字文字は不変配列を表す）転写開始部位の最初の２４５０ヌクレオチド内の推定上のエレメントを明らかにした。
【０２３２】
Ｂ．ＨＲＥルシェフェラーゼ活性分析
ＥＧ-ＶＥＧＦ遺伝子の低酸素制御がＨＩＦ-１によって媒介されるかどうかを確かめるために、推定上のＥＧ-ＶＥＧＦエレメントのコントロールの下でのルシェフェラーゼレポーター遺伝子の発現を分析した。ルシェフェラーゼレポーター構築物を、適合性があるアニールしたオリゴをｐＧＬ３-プロモーターベクターのBgIII部位へクローニングすることで作成した（Promega）：
0005081361.tif 000004
【０２３３】
ルシェフェラーゼレポーター構築物のHeLa細胞への一過性トランスフェクションを、Effecteneトランスフェクション試薬（Qiagen）を用いて６-ウェルシャーレでおこなった。各ウェルでは、０．２５ｇのｐＲＬ-ＳＶ４０コントロールベクターとともに０．７５ｇのレポーターをトランスフェクトした。三通りの、対を成すトランスフェクションを、平行低酸素インキュベーションと対比して常酸素で使用し、シャーレを１８-２４時間にわたって低酸素へ曝し、トランスフェクションの２４時間後に開始した。細胞を溶解させ、デュアル-ルシェフェラーゼレポーターアッセイ系を用いてアッセイした（Promega）。ルシェフェラーゼ活性は、コントロールのベクターの値に標準化し、代表的実験を、誤差棒が標準偏差を表す図１７Ｂに示す。
【０２３４】
低酸素条件での１８-２４時間のインキュベーションに続いて、推定上のＥＧ-ＶＥＧＦエレメントを含有するルシェフェラーゼレポーター構築物は、常酸素条件より３．３±０．８倍の増加を与えた。このレベルは、低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）Epoコンセンサスによって与えられた３．４±１．２倍に相当する（図１７，パネルｂ）。コンセンサス又は推定上のＥＧ-ＶＥＧＦ ＨＲＥのいずれかのコア配列を変異させることは、低酸素への応答を消滅させ、応答の特異性を変化させる。我々はさらなる機構を度外視することはできないが、これらの知見は、すべての有望なＨＩＦ-１がＥＧ-ＶＥＧＦ遺伝子の低酸素制御の重要な媒介物であることを示す。
従って、配列相同性を欠くにもかかわらず、ＥＧ-ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ遺伝子が、応答性内皮細胞で類似の効果、例えば低酸素誘導発現を有するだけでなく、共通の機構を介して制御され得ることは驚きである。
【０２３５】
実施例１９：  ヘパリン結合アッセイ
ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む血管形成因子は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンのような細胞外マトリックス成分と相互作用する。血管形成因子と細胞外マトリックス成分の間の相互作用は、生体利用度及びこれら分子の活性を制御することが示唆されている（Klagsburn, Semin Cancer Biol. 3:81-7(1992)）。従って、我々は、ＥＧ-ＶＥＧＦがヘパリンと結合するがどうかを試験した。
１５ｇのタッグされていないタンパク質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌのＨｉ-Ｔｒａｐ ヘパリン-セファロースカラム（Pharmacia）で展開した。このカラムを、ＮａＣｌ（０．１-２．０Ｍ）のリニアグラジェントで溶出した。ヒトＶＥＧＦ１６５を参考として用いた。
ヘパリンセファロースカラムで展開すると、ＥＧ-ＶＥＧＦが０．５Ｍ ＮａＣｌの存在下で溶出し、その一方でＶＥＧＦ１６５が同じクロマトグラフィー条件下で０．７Ｍ ＮａＣｌで溶出した。この知見は、ＥＧ-ＶＥＧＦが、インビボでは細胞外区画に隔離し得るヘパリン結合成長因子であることを示す。
【０２３６】
実施例２０：  インビボ血管形成効果の選択性
Ａ．ラット角膜嚢血管形成アッセイ
ＥＧ-ＶＥＧＦのインビボ活性を、前出に記載のように、成人ラット角膜嚢アッセイで調べた（Gilleら., J. Biol. Chem. 276: 3222-3230(2001)）。メチルセルロース及びスクラルフェートアルミニウムを加えた２００ｎｇ ＶＥＧＦ１６５又は５００ｎｇＥＧ-ＶＥＧＦを含有するハイドロンで被膜したペレットを、角膜嚢の底へ挿入した（ｎ＝６）。コントロールペレットは、５００ｎｇのＣＤ４-ＩｇＧを含有する。６日目には、動物を安楽死させ、高分子量のＦＩＴＣ-デキストランを注入して脈管構造を視覚化した。角膜全量の新生血管領域の測定を、コンピューターを補助装置とする画像分析（Image-ProPlus）を用いておこなった。
ラット角膜アッセイでは、精製ＥＧ-ＶＥＧＦは、試験されたすべての眼で顕著な応答を示さず、これとは逆に、ＶＥＧＦは期待された血管形成効果を誘導した（図１９、パネルａ-ｃ）。同じ結果がウサギ角膜で観察される。ＥＧ-ＶＥＧＦが基本的に効果を有しない一方で、ＶＥＧＦタンパク質によって誘導される強力な血管形成応答に注視すること。
【０２３７】
Ｂ．ＥＧ-ＶＥＧＦの部位特異的アデノウイルス注入の血管形成効果
ＥＧ-ＶＥＧＦのインビボ活性をさらに研究するために、局所及び持続的なＥＧ-ＶＥＧＦ送達の効果を調べた。局所及び持続的なＥＧ-ＶＥＧＦの送達を達成するために、アデノウイルス（Ａｖ）ベクターを作成し、胸腺欠損ラット又はマウスの種々の部位へ注入した。lacZ 又はＶＥＧＦを発現する組み換えＡｖベクターはコントロールとして機能した。
胸腺欠損ラットにイソフルランを用いて麻酔をかけ、そしてその左背部領域に２-２．５ｃｍの切り込みを作った。卵巣を、非外傷性ピンセットを利用して取り出して確保した。５-１０ｌの生理的食塩水中の１０８又は５ｘ１０８pfuの用量を３１Ｇ針を取り付けた気密ハミルトンシリンジを介して注入した。すべての操作は、同じ場所にＢＳＬ２プラクティスをともなうバイオセイフティーキャビネットでおこなった。骨格筋（左腓腹筋）又は皮下耳注入のために、胸腺欠損マウス又はラットをイソフルランで麻酔にかけ、その部分は汚れが無く、５０ｌ容量で各ウイルス調製物の５ｘ１０８pfuの用量を部位へ注入した。すべてのＡｖ研究での動物を、Ａｖ投与の一週間後に、動物を安楽死させた。検死では、組織学的分析のために組織を解剖し、凍結又は固定化した。
【０２３８】
ヌードラットの骨格筋に注入したとき、lacZ及びＥＧ-ＶＥＧＦ Ａｖの効果は、基本的に、最小炎症性浸潤及び血管形成の欠失と、そして多量の有糸分裂内皮細胞、水腫及び肉芽組織と識別不可能であった（図１９，パネルｄ-ｆ）。非常に類似した結果が、マウスの耳への同じＡｖベクターの注入の後に得られた（図１９，パネルｇ及びｈ）。再び、ＶＥＧＦ Ａｖは、ＥＧ-ＶＥＧＦ Ａｖを注入した動物には無い、強力な血管形成応答を引き起こした。しかしながら、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ Ａｖのいずれかの卵巣内部への送達は、一週間内で、出血性領域だけでなく肉眼で識別できる血管を有する注入された卵巣の劇的な拡張が引き起こされる（図１９，パネルｉ）。ヌードマウスによる代表的な実験での卵巣の湿重量は、LacZ群で３３±３ｍｇ、ＥＧ-ＶＥＧＦ群で４８９±３０ｍｇ、そしてＶＥＧＦ群で１９１±９１ｍｇであった（ｎ＝４）。注入されていない卵巣（３７±７ｍｇ）の重量は、LacZ群とは異なっていた。ＥＧ-ＶＥＧＦでより大きな質量への傾向があったが、ＶＥＧＦ群と比較すると、組織学的写真は非常に類似していた。双方の場合では、卵巣構造を破壊する大きな流体又は血液で満たされた嚢胞性領域が存在した（図１９、パネルｊ-ｎ）。高出力検査によって、嚢胞の末梢での激しい血管形成が明らかにされた（図１９，パネルｍ-ｎ）。LacZ卵巣の形態は正常である。従って、ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦは、血管形成に加えて、体液の血管外遊出を誘導する能力を含む、応答性組織での同じ一連の出来事を誘発することができる。
【０２３９】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,１０８０１  ユニバーシティー ブルバード, マナサッス, バージニア, ２０１１０−２２０９ アメリカ合衆国（ＡＴＣＣ）に寄託した：
0005081361.tif 000005
【０２４０】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886 OG 638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０２４１】
本出願の譲受人は、寄託した材料が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託材料の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０２４２】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦをコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド９１-４０５）を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、そのヌクレオチド配列（配列番号：１）は、ここでｃＤＮＡ６０６２１-１５１６と命名されているクローンである。また、太字で示され、下線部がなされているのは、それぞれの開始及び終止コドンの位置である。
【図２】  配列番号：１のコード化配列から誘導した天然配列ＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。同じく示されているのは、種々の他の重要なポリペプチドドメインのおおよその位置である。
【図３Ａ−Ｄ】  ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータープログラムを用いて％アミノ酸配列同一性（図３Ａ-Ｂ）及び％核酸配列同一性（図３Ｃ-Ｄ）を決定するために下に記載の方法を用いる仮定上の例示を示し、「ＰＲＯ」は対象である仮定上のＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象である「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は対象である仮定上のＥＧ-ＶＥＧＦコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は対象である「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、各「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は異なる仮定上のアミノ酸残基を表し、そして各「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は異なる仮定上のヌクレオチドを表す。
【図４】  ここでＤＮＡ５６７４８（配列番号：３）と命名されたヌクレオチド配列を示す。
【図５Ａ−Ｆ】  卵巣でのＥＧ-ＥＣＧＦのインサイツ発現を示す。図５Ａ及び５Ｂは２歳のチンパンジー卵巣を示し、図５Ａはヘマトキシリン-エオシン染色を示し、図５ＢはＦＩＴＣを用いた発現を示す。図５Ｃ及び５Ｄはカニクイザル卵巣を示し、図５Ｃはヘマトキシリン-エオシン染色を示し、図５ＤはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＥＣＧＦの発現を示す。図５Ｅ及び５Ｆはチンパンジー支質性卵巣を示し、図５Ｅはヘマトキシリン-エオシン染色を示し、図５ＦはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＥＣＧＦの発現を示す。
【図６Ａ−Ｄ】  凍結及びパラフィン包埋ヒト卵巣でのアクチン及びＥＧ-ＥＣＧＦインサイツ発現を示す。図６Ａはヘマトキシリン-エオシン染色を示し、図６ＢはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＥＣＧＦの発現を示す。図６Ｃはヘマトキシリン-エオシン染色を示し、図６ＤはＦＩＴＣを用いたＥＧ-ＥＣＧＦの発現を示す。
【図７Ａ−Ｂ】  子宮脱の４６歳婦人からの卵巣でのＥＧ-ＥＣＧＦインサイツ発現のオートラジオグラムを示し、図７Ｂは同じ卵巣のヘマトキシリン-エオシン染色を示す。
【図８Ａ−Ｄ】  副腎でのＥＧ-ＥＣＧＦインサイツ発現を示す。図８Ａ及び８ＢはＤＡＰＩを用いた核酸同定を示し、図８Ｃ及び８ＤはＦＩＴＣを用いたタンパク質の同定を示す。
【図９】  インサイツハイブリダイゼーション研究によって、ヒト睾丸では、ＥＧ-ＶＥＧＦ転写物はテストステロン産生ライディッヒ細胞に限定される（パネルＡ-Ｄ）。Ｅ、Ｆ）ＥＧ-ＶＥＧＦシグナルは、血管周囲（Ｋ，Ｌ）と記載することができる細胞であるヒト卵巣支質においてよくみられる。非常に似たパターンが、チンパンジーの卵巣で証明された（データは示されず）。Ｇ，Ｈ）強力なシグナルが、ヒト出血黄体で検出される。ヒト（Ｉ，Ｊ）及びチンパンジー（Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ）発育濾胞では、ＥＧ-ＶＥＧＦ ＲＮＡは、双方ともにステロイド産生細胞型である卵胞膜及び顆粒膜細胞、そして卵丘で発現する。Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｏは明視野画像、そしてＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｊ，Ｌ，Ｎ，Ｐは対応する暗視野画像である。矢印は、血管の進路を指す。
【図１０Ａ−Ｃ】  それぞれディスプレイスメント・プロット及びスキャッチャード・プロットであり、ウシ副腎毛細内皮細胞（ＡＣＥ）での１２５Ｉ-ＥＧ-ＶＥＧＦ-hisリガンド結合分析を示す。
【図１１Ａ−Ｃ】  図１１Ａ−Ｂは、それぞれディスプレイスメント・プロット及びスキャッチャード・プロットであり、内分泌膵臓から誘導したマウス内皮細胞株であるＭＳ-１での１２５Ｉ-ＥＧ-ＶＥＧＦ-hisリガンド結合分析を示す。図１１Ｃは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でのＥＧ-ＶＥＧＦ-hisリガンド結合分析を示す。
【図１２Ａ−Ｅ】  １ｎＭ、１０ｎＭ又は２５ｎＭの濃度でコントロール、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、又はＥＧ-ＶＥＧＦのいずれかを用いる細胞の相対増殖を示す棒グラフを示す。図１２Ａは、周皮細胞を用いた結果を示す。図１２Ｂは、ヒト大動脈血管平滑筋（ＨＡ-ＶＳＭＣ）を用いた結果を示す。図１２Ｃは、乳児ハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ２１）を用いた結果を示す。図１２Ｄは、ＡＣＥを用いた結果を示す。図１２Ｅは、ウシ脳毛細内皮細胞（ＢＢＣ）を用いた結果を示す。
【図１３】  ＥＧ-ＶＥＧＦが、特定の内皮細胞にとって分裂促進因子及び化学遊走物質であることを示す。パネルａは、ＡＣＥ培養では、ＥＧ-ＶＥＧＦが、２ｎＭで０．２ｎＭのＥＤ５０によって最大分裂促進的応答を誘導することを示す。パネルｂは、幾つかの内皮細胞型での増殖アッセイの結果を示す：ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＢＢＣ、ＡＢＡＥ。パネルｃは、非内皮細胞型での増殖アッセイの結果を示す：ヒト大動脈平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、周皮細胞及び線維芽細胞（ＢＨＫ２１）及びヒト新生児線維芽細胞（-ｈＦｂ）及びケラチン生成細胞。基本培地はネガティブコントロール（Ｃｔ）となり、それぞれ５．５及び１０ｎｇ／ｍｌで添加されたｂＦＧＦ（Ｆ）、ＥＧＦ（Ｅ）、又はＶＥＧＦ（Ｖ）は、ポジティブコントロールとなる。ＥＧ-ＶＥＧＦは、１，１０，及び１００ｎＭで試験された。パネルｄは、ＥＧ-ＶＥＧＦが、ＨＵＶＥＣではなく、ＡＣＥ細胞、一次ヒヒ副腎内皮細胞（ＢＡＥＣ）及びＭＳ-１で化学遊走的応答を誘導する。各グラフは、代表的な実験である。データは、標準偏差、及び増殖又は遊走指数が任意に値１に設定したネガティブコントロールと比例していることを示す誤差バーをともなう平均値である。パネルｅ−ｇは、ＥＧ-ＶＥＧＦが副腎皮質由来毛細内皮細胞で透過窓を誘導することを例示する。ＥＣＭ上に密集して生育するＡＣＥを、２．５ｎＭ ＶＥＧＦ、１０ｎＭ ＥＧ-ＶＥＧＦ，又は２つの因子の組み合わせで処理した。未処理（パネルｅ）、ＶＥＧＦ（パネルｆ）、又はＥＧ-ＶＥＧＦ（パネルｇ）で処理したＡＣＥ細胞の電子顕微鏡写真は、量分子が小孔を誘導することができることを明かにした。矢印の先は、小孔の位置を示す。倍率が示されている（ｅ及びｆμｍ；ｇ ｎｍ）。
【図１４Ａ−Ｂ】  ０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ又は５ｎＭの濃度のＶＥＧＦ、又はＥＧ-ＶＥＧＦを有するコントロールでの相対的な内皮細胞の遊走を示す。
【図１５】  ＥＧ-ＶＥＧＦへ曝した後のＭＡＰキナーゼＥｒｋ１及び２のリン酸化を示す。
【図１６】  ＥＧ-ＶＥＧＦ ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列、及び相同的なタンパク質とのアライメントを示す。図１６Ａは、１．４ｋｂのヒトＥＧ-ＶＥＧＦ ｃＤＮＡ配列を示す。１．４ｋｂのヒトＥＧ-ＶＥＧＦ ｃＤＮＡは、１９のアミノ酸（下線）の典型的なシグナル配列、及び８６のアミノ酸の成熟タンパク質を有する１０５のアミノ酸のタンパク質をコードする。一次タンパク質構造の際だった特徴はシステイン含量であるり、１０残基が５つのジスルフィド結合を形成する可能性がある。図１６Ｂは、ヒトＥＧ-ＶＥＧＦ、ヒトＢｖ８相同体（配列番号：４）、及びヘビＶＰＲＡ（配列番号：５）を示す。囲まれている残基は同一であることを示す。図１６Ｃは、ヒトＥＧ-ＶＥＧＦ、ヒト dickkopf-3（hdkk3、配列番号：６）、アフリカツメガエル dkk-1（xdkk1、配列番号：７）及びブタコリパーゼ（col、配列番号：８）のアライメントである。このアライメントは、このタンパク質ドメイン-コリパーゼ折り畳みの特徴的ジスルフィド結合パターンを形成する保存的システインを例示している。ＥＧ-ＶＥＧＦのこのモチーフは、ヒト dkk-3のシステイン-リッチＣ末端ドメインと３７％が同一で、４１％が相同的；そしてアフリカツメガエルdkk-1ドメインと３２％が同一で、４２％が相同的である。番号は、それぞれのタンパク質でのａａ位置を示し、囲まれた残基は、ＥＧ-ＶＥＧＦと同一である。
【図１７Ａ−Ｂ】  ＥＧ-ＶＥＧＦの低酸素制御を例示する。図１７Ａは、１８時間にわたって常酸素（２２％Ｏ２）対低酸素（２％Ｏ２）の状況に曝したＳＷ１３（黒）及びＨ２９５（空白）副腎癌細胞のＲＮＡのTaqman分析によって、常酸素コントロールよりＶＥＧＦで３５０％及び２５２％増加したのと比べて、ＥＧ-ＶＥＧＦ転写がそれぞれＳＷ１３及びＨ２９５Ｒで２７５％及び２１０％増加した。ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦデータは、アクチンに対して標準化された。図１７Ｂは、常酸素（空白）対低酸素（黒）状態におけるＨＲＥルシェフェラーゼ活性を示す。ルシェフェラーゼレポーター及びベクターの活性は、同時トランスフェクションされたRenillaルシェフェラーゼに対して標準化された。Ｅｐｏコンセンサス及びＥＧ-ＶＥＧＦ構成物の双方は、それらのそれぞれの常酸素コントロールよりおよそ３．４倍が低酸素で誘導された。Ｅｐｏ変異及びＥＧ-ＶＥＧＦ変異でのコア配列の変異は、低酸素状態への応答性を抑止し、ベクターコントロールに類似した活性となった。
【図１８】  ＥＧ-ＶＥＧＦ発現のノーザンブロット分析を示す。ヒトＲＮＡ試料のノーザンブロット分析によって、およそ１．４ｋｂの一本の転写物を明らかにされる。発現は、卵巣及び睾丸で最も高く、これに続いて副腎及び胎盤が高い。より長い曝露の後に明かである、より僅かなシグナルは、前立腺に存在する。負荷した当量ＲＮＡは、コントロールアクチンプローブによるハイブリダイゼーションによって評価した（データは示されず）。レーンの内容物は、上にブロットで示され、その大きさ（ｋｂ）は右に示されている。
【図１９】  ＥＧ-ＶＥＧＦのインビボ血管形成効果の選択性を例示する。パネルａ−ｃは、ラット角膜嚢アッセイの結果を示す。ＥＧ-ＶＥＧＦが基本的に効果がない一方で、ＶＥＧＦタンパク質によって誘導される強力な血管形成応答に注目。パネルｄ−ｆは、ヌードラットの骨格筋（ｓｍ）へのadCMV-lacZ、AdCMV-VEGF１６４  、又はAdCMV-EG-VEGF（５ｘ１０８ｐｆｕ）の注入によって得られた結果を示す。矢印の先は、注入部位を表示する細粒を指し、矢印は新しい血管を指す。lacZ及びＥＧ-ＶＥＧＦの双方がかなりの効果を有しなかった一方で、ＶＥＧＦによって誘導された、豊富な新しい血管形成をともなう血管形成応答に注意。パネルｇ−ｈは、マウスの耳へのＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦ Ａｖ注入の結果を示す。再び、ＶＥＧＦ Ａｖは、強力な血管形成応答を引き起こし、それは、ＥＧ-ＶＥＧＦ Ａｖ（d-h＝100μｍのスケール棒）で注射された動物でなかった。パネルｉは、７日後に、LacZ(ct)VEGF又はEG-VEGF Avの注入に続く卵巣の全外観を示す（スケール＝０．５ｃｍ）。より大きな広さに加えて、ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦ群の双方における存在する表在血管及び易出血性領域に注意。パネルｊ−ｎは、示されているような、Ａｖベクター（５ｘ１０８pfu）を注入した卵巣の顕微鏡写真である。ｊのlacZ卵巣の正常な構造及び形態に注意。黄体（ＣＬ）が示されている。対照的に、液の充満した又は易出血性嚢胞性領域（＊）で、ＶＥＧＦ（ｋ）及びＥＧ-ＶＥＧＦ（Ｉ）群は、僅かの類似した変化を示す（ｊ−ｌのスケール棒＝１mm）。パネルｍ−ｎは、それぞれ囲まれた領域のｋ及びｌの強力な顕微鏡写真（スケール棒＝３３μｍ）である。血管形成の激しい領域は、嚢胞性損傷の周囲で明かである。矢は、血管を指している。
【図２０Ａ−Ｑ】  ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムに関する完全なソースコードを示す。このソースコードは、UNIXオペレーティングシステムで使用するために日常的にコンパイルでき、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２０Ｊ】
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【図２０Ｋ】
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【図２０Ｌ】
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【図２０Ｍ】
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【図２０Ｎ】
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【図２０Ｏ】
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【図２０Ｐ】
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【図２０Ｑ】
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