(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ１が、ヒドロキシで置換されていてもよいＣ１〜４アルキルである、式Ｉの化合物：
【化１】
0004884570.tif 000023
またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
Ｒ１がメチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がエチル、またはシクロブチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミド、またはその薬学的に許容できる塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容できる塩および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
治療有効量の請求項１に記載の化合物を、必要とする哺乳動物（ヒトを除く）に投与することを含む、哺乳動物（ヒトを除く）におけるアレルギー反応、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、またはそう痒症を治療するための方法。
【請求項７】
前記治療有効量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記治療有効量が、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物にコンパニオンアニマルが含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記コンパニオンアニマルがイヌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物に家畜が含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を経口、非経口、または局所的に投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
治療有効量の請求項１に記載の化合物を、必要とする哺乳動物（ヒトを除く）に投与することを含む、哺乳動物（ヒトを除く）における神経変性疾患、角結膜炎、慢性呼吸器疾患、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、新生物および関節炎症状を治療するための方法。
【請求項１４】
治療有効量の請求項１に記載の化合物を、必要とする哺乳動物（ヒトを除く）に投与することを含む、哺乳動物（ヒトを除く）における癌、白血病、狼瘡、多発性骨髄腫を治療するための方法。
【請求項１５】
およそ６．２、１２．６および１５．７°において２θで表される少なくとも１つの特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンを含む、結晶形ＡのＮ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドマレイン酸塩。
【請求項１６】
およそ６．２、１２．６、１５．７、１８．５、２７および２８．３８°において２θで表される特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンを含む、結晶形ＡのＮ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドマレイン酸塩。
【請求項１７】
およそ６．１７８、８．５１９、１２．６０１、１３．８１９、１５．４７８、１５．７１９、１６．３２、１７．９９７、１８．５３９、２０．２９８、２０．６５９、２１．５８３、２２．６４２、２３．０８、２４．８６、２５．６０２、２６．５８２、２７．０２、２７．７２１、２８．１６１、２８．３８°において２θで表される特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンを含む、結晶形ＡのＮ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドマレイン酸塩。
【請求項１８】
およそ６．２、１２．６および１５．７°において２θで表される少なくとも１つの特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンを含む、結晶形ＡのＮ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドマレイン酸塩を調製するための方法であって、Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドとマレイン酸を反応させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載されているのは、Ｎ−メチル（４−（メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）シクロヘキシル）メタンスルホンアミド、その類似体、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤としてのそれらの使用、これらの化合物を含有する医薬組成物、およびこれらの化合物を調製するための方法である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼは、タンパク質中の特定の残基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーであり、チロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼに大きく分類される。突然変異、過剰発現、または不適当な調節、調節不全もしくは調節解除、ならびに増殖因子またはサイトカインの過剰もしくは過少産生から生じる不適当なキナーゼ活性は、それだけには限らないが、癌、心臓血管疾患、アレルギー、喘息および他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝異常、ならびにアルツハイマー病などの神経および神経変性障害を含む多くの疾患に関連付けられている。不適当なキナーゼ活性は、前述のおよび関連する疾患に関連付けられている細胞増殖、細胞分化、生存、アポトーシス、有糸分裂誘発、細胞周期制御、および細胞運動性に関連する種々の生物学的細胞応答を引き起こす。
【０００３】
したがって、タンパク質キナーゼは、治療的介入の標的としての酵素の重要なクラスとして浮上している。特に、細胞性タンパク質チロシンキナーゼ（ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、およびＴｙｋ−２）のＪＡＫファミリーは、サイトカインシグナル伝達において中心的な役割を果たす（Ｋｉｓｓｅｌｅｖａら、Ｇｅｎｅ、２００２、２８５、１；Ｙａｍａｏｋａら  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４、５、２５３））。それらの受容体と結合した後、サイトカインはＪＡＫを活性化し、それが次にサイトカイン受容体をリン酸化し、それによってシグナル伝達分子、特に、最終的に遺伝子発現をもたらすシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）ファミリーのメンバーのためのドッキング部位が形成される。多くのサイトカインは、ＪＡＫファミリーを活性化することが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、および／またはＴｙｋ−２を含むＪＡＫ酵素を有効に阻害する代替化合物の必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、式Ｉの化合物
【０００６】
【化１】
0004884570.tif 000002
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシで置換されていてもよい−Ｃ１〜４アルキルである）またはその薬学的に許容できる塩を提供する。
【０００７】
特に、Ｒ１がメチルである式Ｉの化合物を提供する。
【０００８】
特に、Ｒ１がエチルまたはシクロブチルである式Ｉの化合物を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、
薬学的に許容できる担体および式Ｉの化合物を含む医薬組成物、
治療有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を、必要とする哺乳動物に投与することによって、臓器移植拒絶反応、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、癌、変形性関節症、および糖尿病から選択される障害または症状を管理または治療するための方法、
治療有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を、必要とする哺乳動物に投与することによって、糖尿病、癌、自己免疫性甲状腺障害、潰瘍性大腸炎、クローン病、ドライアイ、アルツハイマー病、白血病、および免疫抑制または免疫調節が望ましいであろう他の適応症から選択される障害または症状を管理または治療するための方法、
治療有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を、必要とする哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における、アレルギー性皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、そう痒症およびその他のそう痒性症状を含むアレルギー反応ならびに腸疾患などの炎症性疾患から選択される障害または症状を管理または治療するための方法、
治療有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を、必要とする哺乳動物に投与することによって、慢性または難治性喘息、遅発型喘息、気道反応性亢進、気管支炎、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、再発性気道閉塞、および慢性閉塞性肺疾患を含む喘息およびその他の閉塞性気道疾患から選択される障害または症状を管理または治療するための方法、
治療有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を、必要とする哺乳動物に投与することによって、タンパク質チロシンキナーゼまたはＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３および／もしくはＴｙｋ−２を阻害するための方法、
治療有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩を、必要とする哺乳動物に投与することによって、タンパク質チロシンキナーゼまたはＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３および／もしくはＴｙｋ−２を阻害するための方法、ならびに
本発明の化合物を調製するための方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドマレイン酸塩（Ａ形）の特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す図である。
【図２】ノミ関連そう痒および皮膚炎軽減アッセイにおけるノミアレルギーのイヌにおける実施例１ｂの２７日目のＶＡＳスコアを示す図である。
【図３】ノミ関連そう痒および皮膚炎軽減アッセイにおけるノミアレルギーのイヌにおける実施例１ｂの記録４時間当たりのそう痒の秒数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上記化合物に関して、ならびに出願および請求項の全体にわたって、下記の用語は、以下に定義した意味を有する。
【００１２】
「哺乳動物」という用語は、ヒトまたは家畜およびコンパニオンアニマルを含む動物を意味する。「コンパニオンアニマル」（単数または複数）という表現は、ペットとして飼っている動物を意味する。コンパニオンアニマルの例には、ネコ、イヌ、およびウマがある。「家畜」という用語は、食物もしくは繊維などの生産物を作るため、またはその労働のために農業環境で飼育または育成した動物を意味する。実施形態によっては、家畜は、哺乳動物、例えばヒトによる摂取に適している。家畜動物の例には、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、ラムを含むヒツジ、およびウサギなどの哺乳動物、ならびにニワトリ、カモおよびシチメンチョウなどのトリがある。
【００１３】
疾患の「管理すること（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語には：（１）疾患を予防すること、すなわち疾患に曝露されているもしくは罹りやすいかもしれないが疾患の症候／徴候をまだ経験もしくは示していない哺乳動物において疾患の臨床的な症候もしくは徴候が発生しないようにすること；（２）疾患を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその臨床的な症候／徴候の発生を阻止もしくは軽減すること；または（３）疾患を緩和させること、すなわち、疾患もしくはその臨床的な症候／徴候の緩やかな軽減をもたらすことが含まれる。
【００１４】
「治療有効量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物に投与したとき、疾患に対してかかる治療を行うのに十分な化合物の量を表す。「治療有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに治療すべき哺乳動物の年齢、体重などによって異なるはずである。
【００１５】
「およそ」という用語は、Ｘ線粉末回折パターンのピークを同定するのに使用した場合、規定された２θ値±０．２°２θと定義する。結晶形がＡ形多形体であり、特許請求によって包含されているかどうかの任意の決定は、この試験中のばらつきを考慮して判断すべきである。
【００１６】
「薬学的に許容できる」は、哺乳動物、コンパニオンアニマルまたは家畜動物で使用するのに適していることを表す。
【００１７】
種々の炭化水素含有部分の炭素原子含有量は、その部分中の炭素原子の最小および最大の数を指す接頭辞によって記載されており、すなわち、接頭辞Ｃｉ〜ｊは、整数「ｉ」〜整数「ｊ」（ｉとｊを含む）個の炭素原子の部分を示す。したがって、例えば、Ｃ１〜４アルキルは、１〜４（１と４を含む）個の炭素原子のアルキルを意味する。
【００１８】
用語アルキルは、直鎖状、分枝状および環状飽和一価炭化水素基を意味するが、「プロピル」などの個々の基に言及すると、直鎖基だけが包含されており、「イソプロピル」などの分枝鎖異性体またはシクロプロピルメチルもしくはシクロペンチルなどの環状異性体は、具体的に呼ばれる。
【００１９】
同じ分子式を有するが、性質またはそれらの原子の結合順序または空間内のそれらの原子の配置が異なる化合物は、「異性体」と称される。空間内のそれらの原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と称される。式Ｉの化合物は、シス−およびトランス−アキラルジアステレオ異性体として存在できることが当業者には理解されよう。特に、本発明は、化学名Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドを有する式ＩＡの化合物、
【００２０】
【化２】
0004884570.tif 000003
またはその薬学的に許容できる塩を提供する。
【００２１】
記載された化合物の範囲内に含まれているのは、すべて本明細書に記載の化合物の異性体（例えばシス−、トランス−、またはジアステレオ異性体）単独ならびに任意の混合物である。鏡像異性体、ジアステレオ異性体、シス、トランス、シン、アンチ、溶媒和物（水和物を含む）、互変異性体、およびその混合物を含むこれらの形態すべてが記載された化合物に含まれている。
【００２２】
立体異性体混合物、例えばジアステレオ異性体の混合物は、それらの対応する異性体に、適当な分離法を用いて既知の方法で分離することができる。ジアステレオ異性体混合物は例えば、分別結晶、クロマトグラフィー、溶媒分散、および類似の手順を用いてそれらの個々のジアステレオ異性体に分離することができる。この分離は、１つの出発化合物のレベルで、または式Ｉの化合物自体の中で行うことができる。鏡像異性体は、ジアステレオ異性体塩の形成によって、例えば鏡像異性体ピュアなキラル酸との塩形成によって、またはクロマトグラフィー、例えばキラルリガンドを含むクロマトグラフ担体を用いたＨＰＬＣによって、分離することができる。
【００２３】
投与経路
哺乳動物（すなわちヒトおよび動物）における障害を治療するための治療的使用では、本発明の化合物またはその医薬組成物は、経口、非経口、局所、経直腸、経粘膜、または経腸的に投与することができる。非経口投与には、全身的な効果を引き起こすための間接注射または患部への直接注射が含まれる。局所投与には、皮膚または局部適用によって容易に接近できる臓器、例えば、眼または耳の治療が含まれる。これには、全身的な効果を引き起こすための経皮送達も含まれる。直腸投与には、坐剤の形態が含まれる。好ましい投与経路は、経口および非経口である。
【００２４】
医薬用塩
式Ｉの化合物は、その本来の形態で、または塩として使用することができる。安定な非毒性の酸性または塩基性塩を形成することが望ましい場合には、薬学的に許容できる塩としての化合物の投与が適切かもしれない。式Ｉの化合物の薬学的に許容できる塩には、酢酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エトグルタル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素／リン酸二水素、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸塩がある。
【００２５】
組成物／製剤
本発明の医薬組成物は、当技術分野でよく知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成、湿式粉砕、乳化、カプセル封入、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、凍結乾燥プロセスまたは噴霧乾燥を用いて製造することができる。
【００２６】
本発明に基づいて使用する医薬組成物は、薬剤的に使用でき、調製物への活性化合物の加工を容易にする、添加剤および佐剤を含む１種または複数の薬学的に許容できる担体を用いて従来の方法で製剤することができる。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。薬学的に許容できる添加剤および担体は、一般に当業者に既知であり、このように本発明に含まれている。かかる添加剤および担体は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている。
【００２７】
本発明の製剤は、短時間作用型、速放出型、長時間作用型、および持続放出型になるように設計することができる。したがって、製剤は、管理放出または緩放出用に製剤することもできる。
【００２８】
投与量
本発明で使用するのに適した医薬組成物には、有効成分が使用目的、すなわち、障害または疾患の管理または治療を達成するのに十分な量で含有されている組成物が含まれている。より具体的には、治療有効量は、疾患の症候／徴候の予防、緩和もしくは寛解、または治療対象の生存の延長に有効な化合物の量を表す。
【００２９】
医薬組成物およびその単位投与形態中の本発明の化合物である活性成分の量は、異なっていてもよく、または投与の方法、特定の化合物の効力および所望の濃度に応じて広く調節してもよい。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、活性成分の量は、組成物の重量によって０．０１％〜９９％の範囲になる。
【００３０】
一般に、活性成分の投与量の治療有効量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ体重／日、さらにより好ましくは約０．３〜１．５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲になる。投与量は、各対象の必要量および治療対象となる障害または疾患の重症度に応じて異なっていてもよいことを理解されたい。
【００３１】
所望の用量は、１回投与で、または適切な間隔で投与する分割投与、例えば、１日当たり２、３、４回もしくはそれ以上のサブ投与として与えることが好都合であり得る。サブ投与自体は、例えば、吹入器からの複数吸入または目への複数回の滴剤の適用によってなど、数回のばらばらの大ざっぱに間隔を空けた投与にさらに分割してもよい。
【００３２】
また、投与した初回投与量は、所望の血漿濃度を急速に達成させるために、上記の上限レベルを超えて増加させてもよいことを理解されたい。その一方で初回投与量は、最適量よりも少なくてもよく、１日投与量は、特定の状況によっては、治療のコース中に次第に増加させてもよい。所望であれば、１日量は、投与のために複数回投与、例えば、１日当たり２〜４回に分割してもよい。
【００３３】
医学および獣医学の使用
本発明の化合物は、ヤヌスキナーゼ−１（ＪＡＫ−１）、ヤヌスキナーゼ−２（ＪＡＫ−２）およびヤヌスキナーゼ−３（ＪＡＫ−３）に対して効力があるヤヌスキナーゼ阻害剤（ＪＡＫ−ｉ）である。したがって、これらは、臓器移植、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病および糖尿病からの合併症、癌、喘息、アトピー性皮膚炎、自己免疫性甲状腺障害、潰瘍性大腸炎、クローン病、アルツハイマー病、白血病、変形性関節症、そう痒症の管理、慢性呼吸器疾患および免疫抑制／免疫調節が望ましい他の適応症のための治療薬として有用である。
【００３４】
さらに、動物におけるアトピー性皮膚炎を管理するのに安全で有効な薬剤の大きな必要性がある。動物におけるアトピー性皮膚炎を治療するための市場は現在、動物、特にイヌなどのコンパニオンアニマルで苦痛および望ましくない副作用が生じるコルチコステロイドによって支配されている。抗ヒスタミン剤も使用されているが、効果が不十分である。シクロスポリンのイヌ製剤（ＡＴＯＰＩＣＡ（商標））は現在、アトピー性皮膚炎に関して販売されているが、高価であり、効力の発現が遅い。さらに、ＡＴＯＰＩＣＡ（商標）については、ＧＩ耐性問題がある。本発明の化合物は、ＪＡＫ−１およびＪＡＫ−３に対して効力があるＪＡＫ阻害剤である。これらの化合物は、ステロイド使用に代わるものになるはずであり、アトピー性皮膚炎において続く、またはノミアレルギー性皮膚炎におけるノミなどのアレルゲンもしくは原因物質の除去後にゆっくり軽減する慢性そう痒症および炎症の解消をもたらす。
【００３５】
本発明の化合物は、薬学的に許容できる形態で単独で、または哺乳動物の免疫系を調節する１種もしくは複数の別の薬剤または抗炎症剤と併せて投与することができる。これらの薬剤は、それだけには限らないが、シクロスポリンＡ（例えばＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）またはＮｅｏｒａｌ（登録商標）、ラパマイシン、ＦＫ−５０６（タクロリムス）、レフルノミド、デオキシスペルグアリン、ミコフェノレート（例えばＣｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）、アザチオプリン（例えばＩｍｕｒａｎ（登録商標））、ダクリズマブ（例えばＺｅｎａｐａｘ（登録商標））、ＯＫＴ３（例えばＯｒｔｈｏｃｏｌｏｎｅ（登録商標））、アトガム、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、および抗炎症性ステロイド（例えばプレドニゾロンまたはデキサメタゾン）を含んでいてよい。これらの薬剤は、同じまたは別個の投与形態の一部として、同じまたは異なる投与経路によって、同じまたは異なる投与スケジュールで、当業者に既知の標準的な製剤上の慣行に従って投与することができる。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、有効量の１種または複数の本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含む、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物などの対象における、ＪＡＫに関連する疾患、症状または障害を治療または予防する方法を提供する。ＪＡＫ関連疾患、症状または障害は、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、および／またはＴｙｋ−２と関連し得る。治療できる適当な対象には、家畜または野生動物、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオンアニマル；ウシおよび他の反芻動物、ブタ、家禽、ウサギなどを含む家畜；霊長類、例えばアカゲザルおよびカニクイザル（クラブイーティングまたはオナガザルとしても知られている）、マーモセット、タマリン、チンパンジー、マカクなどのサル；およびラット、マウス、アレチネズミ、モルモットなどのげっ歯類が含まれる。一実施形態では、化合物は、薬学的に許容できる形態で、場合により薬学的に許容できる担体で投与する。
【００３７】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達は、アレルギー、喘息、移植片（同種移植片）拒絶などの自己免疫疾患、関節リウマチ、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症など多くの異常免疫反応の媒介、ならびに固形悪性疾患と白血病およびリンパ腫などの血液悪性疾患に関与している。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の薬学的介入（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の概説については、Ｆｒａｎｋ、（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５：４３２：４５６およびＳｅｉｄｅｌら、（２０００）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：２６４５〜２６５６を参照のこと。
【００３８】
ＪＡＫ−３は特に、種々の生物学的プロセスに関与している。例えば、ＩＬ−４およびＩＬ−９によって誘導されたマウス肥満細胞の増殖および生存は、ＪＡＫ−３およびγ鎖シグナル伝達に依存していることが示されている。Ｓｕｚｕｋｉら、（２０００）、Ｂｌｏｏｄ  ９６：２１７２〜２１８０。ＪＡＫ−３はまた、ＩｇＥ受容体媒介肥満細胞の脱顆粒応答において重要な役割を果たし（Ｍａｌａｖｉｙａら、（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７：８０７〜８１３）、ＪＡＫ−３キナーゼの阻害は、アナフィラキシーを含むＩ型超過敏反応を予防することが示されている（Ｍａｌａｖｉｙａら、（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７０２８〜２７０３８）。ＪＡＫ−３阻害は、同種移植片拒絶反応に対して免疫抑制をもたらすことも示されている（Ｋｉｒｋｅｎ、（２００１）、Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｐｒｏｃ．３３：３２６８〜３２７０）。ＪＡＫ−３キナーゼは、関節リウマチの初期および後期（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌａｄｎｅｒら、（２０００）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎａｌ．１６４：３８９４〜３９０１）；家族性筋萎縮性側索硬化症（Ｔｒｉｅｕら、（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６７：２２〜２５）；白血病（Ｓｕｄｂｅｃｋら、（１９９９）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１５６９〜１５８２）；Ｔ細胞リンパ腫の一形態である菌状息肉腫（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９７）、Ｐｒａｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６７６４〜６７６９）；および異常細胞増殖（Ｙｕら、（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５２０６〜５２１０；Ｃａｔｌｅｔｔ−Ｆａｌｃｏｎｅら、（１９９９）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：１０５〜１１５）に関わるメカニズムにも関与している。
【００３９】
ＪＡＫ−３を含むＪＡＫキナーゼは、最もよく見られる形態の小児癌である急性リンパ芽球性白血病に罹っている子供由来の原発性白血病細胞で大量に発現されており、研究は、いくつかの細胞におけるＳＴＡＴ活性化とアポトーシスを調節するシグナルとを関連付けている（Ｄｅｍｏｕｌｉｎら、（１９９６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０〜６；Ｊｕｒｌａｎｄｅｒら、（１９９７）、Ｂｌｏｏｄ  ８９：４１４６〜５２；Ｋａｎｅｋｏら、（１９９７）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎ．１０９：１８５〜１９３；およびＮａｋａｍｕｒａら、（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９４８３〜８）。それらは、リンパ球の分化、機能および生存に重要であることも知られている。ＪＡＫ−３は特に、リンパ球、マクロファージ、および肥満細胞の機能に不可欠な役割を果たしている。このＪＡＫキナーゼの重要性を考慮に入れると、ＪＡＫ−３に選択的なものを含むＪＡＫ経路を調節する化合物は、リンパ球、マクロファージ、または肥満細胞の機能が関わっている疾患または症状を治療するのに有用であり得る（Ｋｕｄｌａｃｚら、（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ４：５１〜５７；Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：８７５〜８７８）。
【００４０】
ＪＡＫ経路の標的化またはＪＡＫキナーゼ、特にＪＡＫ−３の調節が治療的に有用であると企図される症状には、関節炎、喘息、自己免疫疾患、癌または腫瘍、糖尿病、いくつかの眼の疾患、障害または症状、炎症、腸管の炎症、アレルギーまたは症状、神経変性疾患、乾癬、移植片拒絶反応、およびウィルス感染がある。ＪＡＫ−３の阻害に利益を与え得る条件を、以下により詳細に論じる。
【００４１】
したがって、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩および医薬組成物は：
関節リウマチ、若年性関節炎、および乾癬性関節炎を含む関節炎；
慢性または難治性喘息、遅発型喘息、気道反応性亢進、気管支炎、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、再発性気道閉塞、および慢性閉塞性肺疾患を含む喘息および他の閉塞性気道疾患；
単一臓器または単一細胞型の自己免疫異常と名付けられたもの、例えば橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血の自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性精巣炎、グッドパスチャー病、自己免疫性血小板減少症、交感性眼炎、重症筋無力症、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎および膜性糸球体症、全身性の自己免疫異常に関連するとして名付けられたもの、例えば全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ライター症候群、多発性筋炎−皮膚筋炎、全身性硬化症、結節性多発性動脈炎、多発性硬化症および水疱性類天疱瘡を含む自己免疫疾患または異常、ならびにコーガン症候群、強直性脊椎炎、ヴェグナー肉芽腫症、自己免疫性脱毛症、Ｉ型または若年型糖尿病、および甲状腺炎を含むＯ細胞（体液）に基づき得るまたはＴ細胞に基づき得る別の自己免疫疾患；
消化管／胃腸管癌、大腸癌、肝臓癌、肥満細胞腫瘍および扁平上皮癌を含む皮膚癌、乳房癌および乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、腎臓癌、肺癌、筋肉腫、骨肉腫、膀胱癌、脳腫瘍、口腔黒色腫および転移性黒色腫を含む黒色腫、カポジ肉腫、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、骨髄増殖性疾患、増殖性糖尿病性網膜症、および充実性腫瘍を含む血管形成関連障害を含む癌または腫瘍；
Ｉ型糖尿病および糖尿病からの合併症を含む糖尿病；
眼の自己免疫疾患、角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病に関連するブドウ膜炎および水晶体原性ブドウ膜炎を含むブドウ膜炎、角膜炎、ヘルペス性角膜炎、円錐角膜炎、角膜上皮ジストロフィー、角膜白斑、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、フォークト−小柳−原田症候群、乾性角結膜炎（ドライアイ）、フリクテン、虹彩毛様体炎、サルコイドーシス、内分泌性眼障害、交感性眼炎、アレルギー性結膜炎、および眼内血管新生を含む眼疾患、障害または症状；
クローン病および／または潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、小児脂肪便症、直腸炎、好酸球性胃腸炎、および肥満細胞症を含む腸管の炎症、アレルギーまたは症状；
運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳虚血を含む神経変性疾患、または心的外傷、ストライク、グルタミン酸神経毒性もしくは低酸素が原因である神経変性疾患；発作における虚血性／再潅流傷害、心筋虚血、腎虚血、心臓発作、心肥大、アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症、臓器低酸素症、および血小板凝集；
アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、そう痒症および他のそう痒性症状を含む皮膚疾患、症状または障害；
ウマを含む哺乳動物におけるアレルギー性皮膚炎およびウマにおける咬傷過敏症、夏季湿疹および皮膚掻痒などのアレルギー性疾患を含むアレルギー反応；ならびに
ランゲルハンス島移植片拒絶反応、骨髄移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、骨髄、軟骨、角膜、心臓、椎間板、島、腎臓、肢、肝臓、肺、筋肉、筋芽細胞、神経、すい臓、皮膚、小腸、または気管、および異物移植などの臓器および細胞移植片拒絶反応を含む移植片拒絶反応などの種々の症状または疾患を治療するのに使用することができる。
【００４２】
別の実施形態は、ＪＡＫ酵素を非治療的量または治療有効量の１種または複数の本発明の化合物と接触させることを含む、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３および／またはＴｙｋ−２を含むＪＡＫ酵素を阻害する方法を提供する。かかる方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触は、種々の量または濃度の選択された酵素に対する１種または複数の化合物の効力を決定するために、スクリーニングアッセイを伴っていてよい。治療有効量の１種または複数の化合物とのｉｎ  ｖｉｖｏ接触は、記載された疾患、障害もしくは症状の治療または接触が行われる動物における臓器移植拒絶反応の予防法を伴っていてよい。ＪＡＫ酵素および／または宿主動物に対する１種または複数の化合物の効果も、決定または測定することができる。ＪＡＫ活性を決定するための方法には、実施例に記載されているもの、ならびにＷＯ  ９９／６５９０８、ＷＯ  ９９／６５９０９、ＷＯ  ０１／４２２４６、ＷＯ  ０２／００６６１、ＷＯ  ０２／０９６９０９、ＷＯ  ２００４／０４６１１２またはＷＯ  ２００７／０１２９５３に開示されているものがある。
【００４３】
以下の反応スキームは、本発明の化合物の一般的な合成手順を例示している。すべての出発原料は、これらのスキームに記載されている手順によって、または当業者に既知の手順によって調製する。
【００４４】
【化３】
0004884570.tif 000004
【００４５】
敏感な官能基（ＰｇまたはＰｇ１）は、本発明の化合物の合成中に保護および脱保護する必要があるかもしれないことが、当業者には明らかであろう。これは、従来の方法によって、例えばＴＷ  ＧｒｅｅｎｅおよびＰＧＭ  Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ（１９９９）、およびその中の参考文献に記載されているように、実現することができる。
【００４６】
スキームＩでは、４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（ａ）は、商業的に得ることができる。トランス−４−（メチルアミノ）−シクロヘキシル］メタノール（ｂ）は、対応するカルボン酸、トランス−４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロヘキサンカルボン酸から、０〜６０℃の温度で数時間、テトラヒドロフランなどの非プロトン性無水溶媒中での水素化アルミニウムリチウムなどの還元剤を用いた処理によって得ることができる。
【００４７】
スキームＩに示すとおり、構造（ｃ）の化合物は、最高９０℃までの高温で最長数時間、トリエチルアミンおよび炭酸カリウムなどの適当な塩基の存在下でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水性ジオキサンおよびジメチルスルホキシドなどの適当な非プロトン性極性溶媒中に、４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（ａ）とトランス−４−（メチルアミノ）−シクロヘキシル］メタノール（ｂ）の反応によって合成することができる。
【００４８】
構造（ｄ）の化合物は、構造（ｃ）の化合物から２ステップ手順で合成することができる。例えば、構造（ｄ）の化合物は、第１に、塩化メチレンなどの極性非プロトン性溶媒中で臭化チオニルまたは三臭化リンなどの臭素化試薬を用いて、保護されていないシクロヘキシルメチルブロミドをもたらし、第２に、塩化トシルなどの適当な保護試薬を添加して、保護された構造（ｄ）の化合物を得ることによって合成することになる。
【００４９】
構造（ｅ）の化合物は、構造（ｃ）の化合物から簡単な保護プロセスを用いて調製することができる。例えば、ＰｇとＰｇ１のどちらもトシルの場合、これは、塩化メチレンなどの極性非プロトン性溶媒、ＤＭＡＰなどの触媒およびトリエチルアミンなどの弱塩基の存在下で、保護されていない構造（ｃ）の化合物を塩化トシルで処理することによって、１ステップ反応で生じさせることができる。
【００５０】
構造（ｆ）の化合物は、適当な求核試薬を用いてＳアルキル化によって構造（ｅ）の化合物から合成することができる。したがって保護基（Ｐｇ１）がトシルまたはメシルなどの適当なヒドロキシル保護基である構造（ｅ）の化合物は、ジメチルスルホキシドまたはＮ−メチルピロリジンなどの極性溶媒中でチオ酢酸カリウムと最高７５℃までの高温で最長２時間まで反応させて、構造（ｆ）の化合物を得ることができる。
【００５１】
構造（ｇ）の化合物は、式（ｆ）の化合物から酸化手順によって合成することができる。多くの酸化条件、例えばＳ．Ｄ．ＢｕｒｋｅおよびＲ．Ｌ．Ｄａｎｈｅｉｓｅｒによって編集された「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  −  Ｏｘｉｄｉｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ」に記載されているものが当業者には知られている。例えば、水で濡らしてもよい構造（ｆ）の化合物は、ギ酸で処理し、続いて室温で約１５時間撹拌しながら過酸化水素をゆっくり加えて、構造（ｇ）の化合物を得ることができる。あるいは、オキソンは、酢酸などの極性溶媒中で使用でき、酢酸カリウムの存在下で反応を行うと、式（ｇ）の化合物のカリウム塩が生成する。
【００５２】
構造（ｇ）の化合物は、極性溶媒中の亜硫酸ナトリウムなどの適当な硫黄求核試薬で処理することによって、構造（ｅ）の化合物から直接合成できることが予想される。同様に、構造（ｇ）の化合物は、亜硫酸ナトリウムとの求核置換反応によって、構造（ｄ）の化合物から合成することができる。
【００５３】
還流させながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの極性共溶媒を加えた塩化メチレンなどの非プロトン性極性溶媒中の塩化チオニルなどの塩素化剤を用いて式（ｇ）のスルホン酸を処理することによって、塩素化した化合物を得る。次いで塩素化化合物は、テトラヒドロフランなどの非プロトン性無水溶媒中で純粋な気体の形にある、または室温でテトラヒドロフランなどの非プロトン性無水溶媒中に溶解している適当なアミンと反応し、構造（ｈ）の化合物を生成する。トリエチルアミンなどの無水弱塩基は、反応中に生成した塩酸を吸い取るために、使用してもよい。
【００５４】
本発明の式Ｉの化合物は、Ｐｇが適当な保護基である式（ｈ）の化合物から、当業者に既知の脱保護手順によって調製することができる。例えば、保護基（Ｐｇ）がトシルの場合、適当な脱保護条件は、メタノールまたはイソプロパノールなどのプロトン性溶媒および場合によりテトラヒドロフランおよび水などの混和性共溶媒中での水酸化リチウムまたは水酸化カリウムなどの塩基との反応を室温で数時間伴って、式Ｉの脱保護アミンをもたらす。
【００５５】
式Ｉの化合物の塩は、ブタノールなどのプロトン性溶媒および場合により水などの共溶媒の存在下における式Ｉの化合物の遊離塩基とマレイン酸などの適当な酸との反応によって形成することができる。
【００５６】
あるいは、本発明の化合物は、スキームＩＩに従って調製することができる。
【００５７】
【化４】
0004884570.tif 000005
【００５８】
スキームＩＩでは、４−メチル−７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（ｊ）は、当技術分野でよく知られている手順を用いて塩化トシルなどの保護剤を使用して、市販されている（ａ）から得ることができる。トランス−４−（メチルアミノ）−シクロヘキシル］メタノール（ｂ）は、対応するカルボン酸、トランス−４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロヘキサンカルボン酸から、０〜１１０℃の温度で数時間、トルエンなどの無水溶媒中でのビットライドなどの還元剤を用いた処理によって得ることができる。
【００５９】
スキームＩＩに示すとおり、構造（ｋ）の化合物は、最高６０℃までの高温で最長数時間、触媒量のヨウ化カリウムを含むトリエチルアミンなどの適当な塩基の存在下でアセトンなどの適当な溶媒中に、４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（ｊ）とトランス−４−（メチルアミノ）−シクロヘキシル］メタノール（ｂ）の反応によって合成することができる。
【００６０】
構造（ｋ）の化合物は、最高６０℃までの高温でトリエチルアミンまたはジエチルイソプロピルアミンなどの適当な塩基の存在下でアセトンなどの適当な溶媒中に、塩化メシルなどの適当なメシル化試薬の添加によって合成して、構造（ｋ）のメタンスルホニル化合物を得ることができる。
【００６１】
構造（ｌ）の化合物は、適当な求核試薬を用いて簡単なＳアルキル化プロセスを用いることによって構造（ｋ）の化合物から調製することができる。したがって構造（ｋ）の化合物は、イソプロピルアルコールまたは水またはトルエンなどの溶媒中で亜硫酸ナトリウムと最高９０℃までの高温で最長４時間まで反応させて、構造（ｌ）の化合物を得ることができる。
【００６２】
０〜４０℃の温度で、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの極性共溶媒を加えたＴＨＦまたは塩化メチレンなどの非プロトン性極性溶媒中の塩化チオニルなどの塩素化剤を用いて式（ｌ）のスルホン酸を処理することによって、塩素化した化合物を得る。次いで塩素化化合物は、テトラヒドロフランなどの非プロトン性無水溶媒中で純粋な気体の形にある、または室温でテトラヒドロフランなどの非プロトン性無水溶媒中に溶解している、好ましくはメチルアミン、シクロブチルアミンまたは２−ヒドロキシアゼチジンなどの適当なアミンと反応し、構造（ｈ）の化合物を生成する。トリエチルアミンなどの無水弱塩基は、反応中に生成した塩酸を吸い取るために、使用してもよい。
【実施例】
【００６３】
調製１  Ｎ−メチル−１−［トランス−４−（メチル｛７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロヘキシル］メタンスルホンアミド
【００６４】
【化５】
0004884570.tif 000006
方法（ａ）  調製２の化合物（３０８．０ｇ湿重量、２１４．５ｇ乾燥重量、０．４１ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．０ｌ）溶液にメチルアミン（２Ｍテトラヒドロフラン溶液、６８７ｍｌ）を１時間にわたって加える。室温で３０分間撹拌した後、さらにメチルアミン（２Ｍテトラヒドロフラン溶液、５３ｍｌ）を加え、反応混合物を室温で１８時間撹拌する。減圧蒸留によって混合物の体積を６００ｍｌまで減少させ、テトラヒドロフラン（３００ｍｌ）を加えてから、混合物の体積を再度およそ７５０ｍｌに減少させる。４５℃で加熱した混合物に、２−プロパノール（２４７ｍｌ）および水（６９３ｍｌ）を加える。室温まで冷却した後、固形物をろ過によって捕集し、水（２×２５０ｍｌ）で洗浄し、真空中６５℃で乾燥させて、表題化合物（１８０．４ｇ）を得る。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.17 - 1.32 (2H), 1.57 - 1.73 (4H), 1.76 - 1.92 (1H),
1.93 - 2.08 (2H), 2.30 - 2.39 (3H), 2.53 - 2.62 (3H), 2.87 - 2.98 (2H), 3.07 -
3.17 (3H), 4.53 - 4.75 (1H), 6.81 - 6.94 (1H), 7.38 - 7.47 (2H), 7.56 - 7.65
(1H), 7.92 - 8.02 (2H), 8.15 - 8.27 (1H).
【００６５】
方法（ｂ）  ０〜５℃のＴＨＦ（１．６５ｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍｌ）に溶かした調製２の化合物（１６５ｇ、０．３４ｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル（１２５ｍｌ、１７ｍｏｌ）を２５分にわたって加える。反応混合物を３０分間０〜５℃で撹拌し、次いで８時間の間４０℃までゆっくり加熱した。室温まで冷却した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、ＴＨＦと共に共沸させて、塩化チオニルを除去した。得られた塩化スルホニルに、新たなＴＨＦ（１．６５ｌ）を加え、混合物を０℃まで冷却した。乾燥Ｎ−メチルアミンガスを３０分間パージし、反応物をさらに室温で４時間撹拌した。溶媒をその体積の半分（８００ｍｌ）まで蒸発させ、ヘプタン（１．５ｌ）を加えた。生成物を沈殿させ、ろ過し、水（１ｌ）で洗浄して、表題化合物（８０ｇ）を得た。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.17 - 1.32 (2H), 1.57 - 1.73 (4H), 1.76 - 1.92 (1H),
1.93 - 2.08 (2H), 2.30 - 2.39 (3H), 2.53 - 2.62 (3H), 2.87 - 2.98 (2H), 3.07 -
3.17 (3H), 4.53 - 4.75 (1H), 6.81 - 6.94 (1H), 7.38 - 7.47 (2H), 7.56 - 7.65
(1H), 7.92 - 8.02 (2H), 8.15 - 8.27 (1H)
【００６６】
調製２  ［トランス−４−（メチル｛７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロヘキシル］メタンスルホニルクロリド
【００６７】
【化６】
0004884570.tif 000007
ジクロロメタン（１．２ｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４．１ｍｌ）に溶かした調製３の化合物（２１０．０ｇ、０．４２ｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル（１５１．０ｍｌ、２．１ｍｏｌ）を２５分にわたって加える。反応混合物を還流させながら１８時間加熱し、次いで減圧蒸留によって体積を８００ｍｌまで減少させる。およそ３０℃で加熱した混合物に、酢酸エチル（１．１ｌ）を１時間にわたって加え、続いてヘプタン（５４６ｍｌ）を室温で２０分にわたって加える。混合物を０℃まで冷却し、１時間撹拌し、得られた沈殿物を窒素下でろ過によって捕集する。固体をヘプタン（２×１２５ｍｌ）で洗浄して、表題化合物（３０８．０ｇ湿重量）を得て、これを窒素下で貯蔵し、直接使用する。
【００６８】
調製３  ［トランス−４−（メチル｛７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロヘキシル］メタンスルホン酸
【００６９】
【化７】
0004884570.tif 000008
方法（ａ）  調製４の化合物（１００．０ｇ湿重量、２３．５ｇ乾燥重量、４７．８ｍｍｏｌ）とギ酸（８２．０ｇ、６８．０ｍｌ、１．８ｍｏｌ）の混合物に、過酸化水素（３５ｗｔ．％水溶液、２１．０ｍｌ、０．２６ｍｏｌ）を１０分にわたって加える。反応混合物を室温で１５時間撹拌し、次いでメタ重硫酸ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウム水溶液（３３ｗｔ．％、３５ｍｌ）に加えることによってクエンチする。混合物に、水（５ｍｌ）、２−プロパノール（５０ｍｌ）および水酸化ナトリウム水溶液（３３ｗｔ．％、１６１ｍｌ）を加え、スラリーを室温で１時間撹拌する。固形物をろ過によって捕集し、水（１００ｍｌ）で洗浄し、真空中６０℃で乾燥させて、表題化合物（２６．０ｇ）を得る。
1H-NMR
(d6-DMSO): 0.98 - 1.18 (2H), 1.55 - 1.76 (5H), 1.99 - 2.13 (2H),
2.29 - 2.39 (5H), 3.05 - 3.15 (3H), 4.47 - 4.76 (1H), 6.77 - 6.92 (1H), 7.38 -
7.48 (2H), 7.54 - 7.62 (1H), 7.91 - 8.02 (2H), 8.17 - 8.25 (1H)
【００７０】
方法（ｂ）  ＩＰＡ−水（各５８５ｍｌ、１：１、Ｖ／Ｖ）に溶かした調製３の化合物の溶液に、硫酸ナトリウムを加え、混合物を８０〜９０℃まで２４時間加熱した。室温まで冷めた後、溶媒を最大で５０％まで蒸発させ、酢酸の添加によって反応混合物のｐＨを３〜４の範囲に調節した。トルエン（１ｌ）を加え、混合物を８０％まで蒸発させた。さらにトルエン（１ｌ）を加え、混合物を４時間還流させた。トルエンをデカントし、真空下で乾燥させることによって合成した表題化合物が得られた（１６８ｇ）。
1H-NMR
(d6-DMSO): 0.98 - 1.18 (2H), 1.55 - 1.76 (5H), 1.99 - 2.13 (2H),
2.29 - 2.39 (5H), 3.05 - 3.15 (3H), 4.47 - 4.76 (1H), 6.77 - 6.92 (1H), 7.38 -
7.48 (2H), 7.54 - 7.62 (1H), 7.91 - 8.02 (2H), 8.17 - 8.25 (1H)
【００７１】
調製４  Ｓ−｛［トランス−４−（メチル｛７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロヘキシル］メチル｝エタンチオエート
【００７２】
【化８】
0004884570.tif 000009
チオ酢酸カリウム（１１．４ｇ、９９．４ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）溶液に、ジメチルスルホキシド（１３０ｍｌ）に溶かした調製５の化合物（５０．０ｇ、８７．９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を５５℃で３時間加熱し、室温まで冷却し、炭酸水素ナトリウム水溶液（０．１Ｍ、６４０ｍｌ）に加えることによってクエンチする。混合物を１３℃まで冷却し、得られた沈殿物をろ過によって捕集し、水（２５０ｍｌ）で洗浄して、表題化合物（２０４．０ｇ湿重量）を得る。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.06 - 1.23 (2H), 1.39 - 1.51 (1H), 1.51 - 1.70 (4H),
1.74 - 1.88 (2H), 2.30 - 2.40 (6H), 2.73 - 2.84 (2H), 3.06 - 3.14 (3H), 4.44 -
4.76 (1H), 6.76 - 6.94 (1H), 7.36 - 7.49 (2H), 7.56 - 7.62 (1H), 7.90 - 8.02
(2H), 8.17 - 8.26 (1H)
【００７３】
調製５  ［トランス−４−（メチル｛７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロヘキシル］メチル４−メチルベンゼンスルホナート
【００７４】
【化９】
0004884570.tif 000010
調製６の化合物（４２．０ｇ、０．１６ｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｌ）溶液に、トリエチルアミン（６８．３ｇ、０．６８ｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（１．０ｇ、８．２ｍｍｏｌ）、続いてｐ−トルエンスルホニルクロリド（６２ｇ、０．３３ｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で２時間撹拌してから、さらにｐ−トルエンスルホニルクロリド（４５．５ｇ、０．２４ｍｏｌ）を加える。１８時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、残留物の一部分（およそ３０９ｇ）をメタノール（７５８ｍｌ）中で１５分間スラリーにする。スラリーに、水（６００ｍｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１４２ｍｌ）を加え、混合物を１時間撹拌する。固形物をろ過によって捕集し、メタノール：水［１：１、５０ｍｌ］、水（５０ｍｌ）およびヘキサン（５０ｍｌ）で洗浄する。固体を真空中６０℃で乾燥させて、表題化合物（８７．１ｇ）を得る。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.02 - 1.20 (2H), 1.53 - 1.75 (7H), 2.31 - 2.39 (3H),
2.39 - 2.47 (3H), 3.04 - 3.12 (3H), 3.80 - 3.91 (2H), 4.34 - 4.76 (1H), 6.78 -
6.93 (1H), 7.37 - 7.54 (4H), 7.54 - 7.64 (1H), 7.75 - 7.84 (2H), 7.91 - 8.01
(2H), 8.14 - 8.25 (1H)
【００７５】
調製６  ｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝−メタノール
【００７６】
【化１０】
0004884570.tif 000011
水（１ｌ）に溶かしたトランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］メタノールの化合物（ＷＯ  ２００２／１４２６７に記載されている手順に従って調製できる）（５０．０ｇ、０．３５ｍｏｌ）、４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（市販されている、４２．９ｇ、０．２７ｍｏｌ）および炭酸カリウム（５７．３ｇ、０．４２ｍｏｌ）の混合物と１，４−ジオキサン（１００ｍｌ）を９０℃で１５時間加熱する。混合物に調製７の化合物（２．０ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を９０℃でさらに１時間加熱する。室温まで冷却した後、混合物を１時間撹拌し、固形物をろ過によって捕集し、水（１５０ｍｌ）で洗浄し、真空中６５℃で乾燥させて、表題化合物（７２．７ｇ）を得る。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.00 - 1.19 (2H), 1.30 - 1.45 (1H), 1.52 - 1.77 (4H),
1.77 - 1.91 (2H), 3.09 - 3.20 (3H), 3.20 - 3.29 (2H), 4.37 - 4.51 (1H), 6.45 -
6.57 (1H), 7.06 - 7.17 (1H), 8.01 - 8.14 (1H)
【００７７】
調製７  ［トランス−４−（メチル｛７−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロヘキシル］メタンスルフィナート
【００７８】
【化１１】
0004884570.tif 000012
調製４の化合物（６０．０ｇ、０．４１８ｍｏｌ）のアセトン（６００ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン（１１７．５ｍｌ、０．８３７ｍｏｌ）および触媒ヨウ化カリウム（３．４ｇ、０．０５ｍｏｌ）、続いて４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（市販されている、１０２．８ｇ、０．３３５ｍｏｌ）を加える。得られた混合物を６０℃まで２２時間加熱した。室温まで冷ました後、アセトン（３００ｍｌ）、続いてトリエチルアミン（１４６．９ｍｌ、１．０４ｍｏｌ）、次いで塩化メシル（８１．７ｍｌ、１．０４７ｍｏｌ）を加えた。室温で４時間撹拌した後、水（１．８ｌ）を加え、その結果生成物が沈殿した。生成物をろ過し、乾燥させ、ＭＴＢＥ−ヘプタンの混合物（６：４、６００ｍｌ）と一緒に粉砕した。ＭＴＢＥ−ヘプタンからの２回目の粉砕を行い、合成した表題化合物が得られた（１２０ｇ）。
1H-NMR
(d6-DMSO):
【００７９】
調製８  ［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］メタノール
【００８０】
【化１２】
0004884570.tif 000013
ビットライド溶液（６５％、７６７ｍｌ、２．４６５ｍｏｌ）を１時間にわたってトランス−４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］シクロヘキサンカルボン酸（市販されている、１００ｇ、０．４１０９ｍｏｌ）のトルエン（１ｌ）溶液に滴下した。添加が完了した後、反応混合物を１００〜１１０℃で加熱還流した。反応混合物を、硫酸ナトリウム塩水溶液（８００ｍｌ）を用いて１０℃より低い温度でクエンチした。反応混合物をセライトに通してろ過し、ろ過ケーキをＤＣＭ（５００ｍｌ）、続いて水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し、水層をＤＣＭ（６００ｍｌ次いで４００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮して、表題化合物（６２ｇ）を得た。
1H-NMR
(CD3OD): 1.08 - 1.31 (4H), 1.51 - 1.64 (1H), 1.93 - 2.05 (2H), 2.10
- 2.22 (2H), 2.38 - 2.50 (1H), 2.50 - 2.54 (3H), 3.48 - 3.55 (2H)
【００８１】
（実施例１ａ）
Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドの調製
【００８２】
【化１３】
0004884570.tif 000014
調製１の化合物（２５０．０ｇ、０．４８ｍｏｌ）の２−プロパノール（１．２ｌ）溶液に、水（１．２ｌ）に溶かした水酸化リチウム（４８．７ｇ、２．０３ｍｏｌ）を加える。反応混合物を４０℃で８時間加熱し、次いで室温で１８時間撹拌する。混合物をろ過し、２−プロパノール：水（１：１、１００ｍｌ）を通して洗浄し、塩酸（６Ｎ）を添加することによってろ液をｐＨ７．５に調節する。１時間撹拌した後、固形物をろ過によって捕集し、２−プロパノール：水（１：２、２４０ｍｌ）で洗浄し、真空中６０℃で乾燥させて、表題化合物（１４８．７ｇ）を遊離塩基（実施例１ａ）として得る。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.20 - 1.39 (2H), 1.62 - 1.75 (4H), 1.77 - 1.91 (1H),
1.97 - 2.11 (2H), 2.54 - 2.63 (3H), 2.89 - 2.99 (2H), 3.10 - 3.21 (3H), 4.44 -
4.86 (1H), 6.43 - 6.61 (1H), 7.01 - 7.19 (1H), 7.94 - 8.16 (1H)
【００８３】
（実施例１ｂ）
Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドマレイン酸塩の調製
【００８４】
実施例１ａの化合物（２１２．０ｇ、６２８．３ｍｍｏｌ）およびマレイン酸（６７．２ｇ、５７９．０ｍｍｏｌ）の１−ブタノール（３２００ｍｌ）中混合物と水（４００ｍｌ）を室温で１８時間撹拌する。減圧蒸留（５５℃、１００ｍｂａｒ）によって混合物の体積を１６００ｍｌまで減少させ、次いで０℃まで冷却する。得られた固体をろ過によって捕集し、ヘプタン（５００ｍｌ）で洗浄し、真空中３５℃で乾燥させて、Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］−シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドのマレイン酸塩（２５３．０ｇ）をＡ形として知られる結晶形として得る。
実験ＭＨ＋  ３３８．２；予測  ３３８．２。
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.24 - 1.38 (2H), 1.68 - 1.92 (5H), 2.00 - 2.11 (2H),
2.56 - 2.61 (3H), 2.91 - 3.00 (2H), 3.15 - 3.27 (3H), 4.39 - 4.70 (1H), 6.53 -
6.73 (1H), 7.16 - 7.36 (1H), 8.07 - 8.29 (1H).
【００８５】
（実施例１ｃ）
Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝−メタンスルホンアミドマレイン酸塩（Ａ形）の粉末Ｘ線回折の採取方法
自動サンプルチェンジャー、θ−θゴニオメーター、自動ビーム発散スリット、およびＰＳＤ  Ｖａｎｔｅｃ−１検出器を取り付けたＢｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ  Ｌｔｄ．のＤ４粉末Ｘ線回折計を用いて、Ａ形、Ｎ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝−メタンスルホンアミドマレイン酸塩の粉末Ｘ線回折パターンを集めた。試料を、低バックグラウンドキャビティシリコンウェーハ試験片台上に載せることによって分析の準備をした。試験片を回転させ、その間、Ｘ線管を４０ｋＶ／３５ｍＡで作動させながら銅Ｋ−α１Ｘ線（波長＝１．５４０６オングストローム）を照射した。分析は、２°〜５５°の２θ範囲にわたって０．０１８°のステップ当たり０．２秒のカウントに設定した連続モードで実行するゴニオメーターで行った。結果を表１および表２に要約して示す。
【００８６】
【表１】
0004884570.tif 000015
【００８７】
【表２】
0004884570.tif 000016
【００８８】
当業者には容易に明らかなように、たとえ同じロットの物質で実施したときでも、Ｘ線粉末回折の結果が変動することがあり、それに続くＸＲＰＤの結果が一致しないことがある。この相違は、試験試料の調製、温度、使用したＸ線回折計の特定のモデル、オペレーターの技術などに起因し得る。用語「およそ」は、Ｘ線粉末回折パターン中のピークを規定する際に使用した場合、定められた２θ値±０．２°２θと定義する。結晶形がＡ形多形体であるかどうか、および請求項によって包含されるかどうかについての任意の決定は、この試験のばらつきに照らして解釈すべきである。
【００８９】
このばらつきは、図１に示されている。２つの異なるロットのＮ−メチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝−メタンスルホンアミドマレイン酸塩Ａ形を、同じＸＲＰＤ回折計にかけた。図１の特徴的なピークは、それがＡ形多形体であることを裏付けている。しかし、これらのピークならびに他の同定ピークの相対強度は、わずかに異なっていた。
【００９０】
（実施例２）
Ｎ−シクロブチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドの調製
【００９１】
【化１４】
0004884570.tif 000017
実施例１の基本手順に従い、重要でない変形形態を作成するが、前駆体をシクロブタンアミンに置換して、表題化合物を得る。
実験ＭＨ＋  ３７８．０；予測  ３７８．２
1H-NMR
(d6-DMSO): 1.22 - 1.32 (2H), 1.47 - 1.70 (6H), 1.78 - 2.04 (5H),
2.16 - 2.24 (2H), 2.85 - 2.86 (2H), 3.15 (3H)．3.68 - 3.78 (1H), 4.60 - 4.72 (1H), 6.51 - 6.54 (1H), 7.11 - 7.12
(1H), 7.44 - 7.49 (1H), 8.08 (1H), 11.60 (1H)
【００９２】
（実施例３）
Ｎ−エチル−１−｛トランス−４−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロヘキシル｝メタンスルホンアミドの調製
【００９３】
【化１５】
0004884570.tif 000018
実施例１の基本手順に従い、重要でない変形形態を作成するが、前駆体をエタンアミンに置換して、表題化合物を得る。
実験ＭＨ＋  ３５２．０；予測  ３５２．２
1H-NMR
(CDCl3): 1.24 - 1.44 (5H), 1.64 - 1.74 (2H), 1.87 - 2.09 (3H), 2.15
- 2.21 (2H), 2.97 - 2.99 (2H), 3.18 - 3.27 (5H), 4.46 - 4.52 (1H), 4.74 - 4.86
(1H), 6.55 (1H), 7.04 (1H), 8.28 (1H)
【００９４】
（実施例４）
ＪＡＫ酵素アッセイ
材料：組換えＪＡＫ−２（カタログ番号ＰＶ４２１０）およびＪＡＫ−３（カタログ番号ＰＶ３８５５）は（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）から購入した。この研究で使用した組換えＪＡＫ−１（ＧＳＴ−ＪＡＫ−１（８５２−１１４２））およびＴｙｋ−２（ＧＳＴ−Ｔｙｋ２（８７０−１１８７、Ｃ１１８７Ｓ））は、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで発現および精製された。アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから得た。ＪＡＫ−２およびＪＡＫ−３アッセイに使用したＪＡＫｔｉｄｅペプチド（ペプチド配列、ＦＩＴＣ−ＫＧＧＥＥＥＥＹＦＥＬＶＫＫ（配列番号：１））とＪＡＫ−１およびＴｙｋ−２アッセイに使用したＩＲＳ−１ペプチド（ペプチド配列、５−ＦＡＭ−ＫＫＳＲＧＤＹＭＴＭＱＩＧ（配列番号：２））は、（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）から購入した。コーティング試薬３は、（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ）から購入した。
【００９５】
方法：ＪＡＫｔｉｄｅ（ＪＡＫ−２およびＪＡＫ−３）またはＩＲＳ−１ペプチド（ＪＡＫ−１およびＴｙｋ−２）のリン酸化を定量化するためにペプチド移動度シフトアッセイを使用した。反応を、３８４穴プレート（Ｍａｔｒｉｃａｌ  ＭＰ−１０１）中に全体積１０マイクロリットルで実施した。反応混合物は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０００５％ツイーン−２０、ＡＴＰ（ＪＡＫ−２およびＪＡＫ−３は４マイクロモル、ＪＡＫ−１は４０マイクロモルならびにＴｙｋ−２は７マイクロモル））、２％ＤＭＳＯおよび１マイクロモル  ペプチド基質（ＪＡＫ−２およびＪＡＫ−３はＪＡＫｔｉｄｅまたはＪＡＫ−１およびＴｙｋ−２はＩＲＳ−１ペプチド）を含有していた。化合物を連続的に１００％ジメチルスルホキシドで希釈し、二組または四組に分けて１１点用量応答で試験した（反応物１０マイクロリットル当たりの化合物／ＤＭＳＯ  ２００ｎｌを加えた）。最終濃度２ｎＭ  ＪＡＫ−２、１ｎＭ  ＪＡＫ−３、７ｎＭ  Ｔｙｋ２または２０ｎＭ  ＪＡＫ−１への酵素の添加によって反応を開始した。ＪＡＫ−１では２４０分間、ＪＡＫ−２では１５０分間、ＪＡＫ−３では９０分間およびＴｙｋ−２では６０分間アッセイを実行した。アッセイを、２０マイクロリットルの１４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２２．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１５％コーティング試薬３で指定した時間に停止した。プレートをＬａｂＣｈｉｐ  ３０００（ＬＣ３０００）測定器（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に置いて、リン酸化したペプチドの形成を測定した。（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）製のＨｉｔｓ  Ｗｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータを分析して、形成した生成物の量を求めた。
【００９６】
次いでデータを内部アプリケーションに取り込み、そこで各データポイントを非阻害および無酵素対照に対する％阻害として表した。次いで４パラメータロジスティック方程式（方程式１）を用いて用量反応データを適合させて、ＩＣ５０値を決定した。
【００９７】
【数１】
0004884570.tif 000019
【００９８】
ここで、最大値は適合させた非阻害値であり、最小値は適合させた完全阻害値であり、ｓはスロープファクターである。
【００９９】
このプロトコルを用いて、実施例１および２の表題化合物について以下の結果を生み出した。
【０１００】
【表３】
0004884570.tif 000020
【０１０１】
（実施例５）
イヌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｔ細胞活性化は、種々の炎症性障害および自己免疫異常ならびに喘息、アレルギーおよびそう痒症において重要な役割を果たす。Ｔ細胞活性化は、部分的に、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介してシグナルを送るサイトカインによって誘発できるので、ＪＡＫ阻害剤は、異常なＴ細胞活性化を伴うかかる疾患に対して有効な可能性がある。
【０１０２】
方法：イヌの全血を、ビーグル犬２９匹および雑種犬２３匹からナトリウムヘパリンチューブに捕集した。全血（２０μＬ）を、ビヒクル対照または試験化合物（０．００１〜１０μＭ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃ５２７５）、およびイヌインターロイキン−２（ＩＬ−２；５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １８１５−ＣＬ／ＣＦ）を含有する培地（１％熱不活性化ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ  ＃１００８２−３９、２９２μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃２５００３０−０８１、１００ｕ／ｍｌペニシリンおよび１ｍｌ当たり１００μｇストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ  ＃１５１４０−１２２を加えたＲＰＭＩ  １６４０、Ｇｉｂｃｏ  ＃２１８７０−０７６）１８０μＬと共に９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９８）に播いた。全血と、ビヒクル対照を含んでＣｏｎＡまたはＩＬ−２を含まない培地とを含有する穴をバックグラウンド対照として使用した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。トリチウム標識チミジン、０．４μＣｉ／穴（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｅｔ０２７Ａ−００５ＭＣ）をさらに２０時間加えた。Ｂｒａｎｄｅｌ  ＭＬＲ−９６セルハーベスターおよびプリウェットフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ  １２０５−４０１、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、プレートを凍結し、次いで解凍、洗浄およびろ過した。フィルターを６０℃で１時間乾燥させ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  １６ＥＧ熱対流炉）、シンチラント（Ｗａｌｌａｃ  １２０５−４４０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）１０ｍＬと共にフィルターサンプルバッグ（Ｗａｌｌａｃ  １２０５−４１１、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中に置いた。密封したフィルターを、ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ  １２０５  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンターでカウントした。Ｇｔｅｒｍ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅプログラムｖ１．１（Ｗａｌｌａｃ  ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９８９〜１９９０）によってデータを集め、以下の式を用いて計算したパーセント阻害に変換した：
【０１０３】
【数２】
0004884570.tif 000021
データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０を用いてパーセント阻害として図示し、ＩＣ５０曲線を、２点間（ｐｏｉｎｔ  ｔｏ  ｐｏｉｎｔ）解析を用いてあてはめた。
【０１０４】
結果  ビーグルからの全血を用いた場合に得られた平均ＩＣ５０値は、実施例１ａの化合物では６６．３ｎＭ；実施例２では４１０ｎＭ；および実施例３では８３ｎＭであった。雑種犬からの全血を用いた場合に得られた平均ＩＣ５０値は、実施例１ａの化合物では１３８ｎＭであった。これらのデータは、本発明の化合物が、多くの疾患において重要な特徴であるＴ細胞増殖を阻害するのに有効であることを示唆する。
【０１０５】
（実施例６）
ノミ関連そう痒症および皮膚炎軽減アッセイ
ノミ関連そう痒症および皮膚炎は、イヌによく見られる皮膚状態である。そう痒症は、ノミ関連皮膚炎に関連する最も重篤な臨床的症状の１つであり、連続してひっかき、顔をこすり、足を噛むことは、紅斑、浮腫、脱毛症、苔癬化、および色素沈着過度などの種々の変化を皮膚にもたらし得る。ノミ関連そう痒症および皮膚炎は、実験的に誘導することができる。これらのモデルでは、炎症性細胞およびサイトカインは、アレルゲンに対する免疫反応を媒介することがわかっている。したがって、そう痒発生性および炎症誘発性サイトカイン受容体のシグナル伝達を阻害するＪＡＫ阻害剤は、ノミ関連そう痒症および皮膚炎の阻害、軽減または最小化に有効な可能性がある。
【０１０６】
研究計画
体重が５〜３５ｋｇで年齢が１歳より大きい雄および雌の雑種犬２８匹に、餌を与えていない成虫のネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）およそ１００匹を、投与を開始する１４日前に寄生させ、研究の間中、４日毎にイヌ１匹当たりノミ３０匹を再寄生させた。投与の７日前に、イヌ２４匹を、皮膚病変に関する視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）スコアに基づいて、無作為に３つの異なる治療グループ、偽薬、０．５ｍｇ／ｋｇまたは０．２５ｍｇ／ｋｇの実施例１ｂの化合物に分けた。治療は、経口的に２８日間１日２回行い、研究中、そう痒行動ならびに紅斑および皮膚病変を評価した。ビデオ記録可能な囲いの中にイヌを入れ、４時間にわたってイヌの活動を記録することによって、そう痒行動を記録した。イヌがひっかき行動に何秒費やしたかを調べることによって、そう痒活動を定量化した。腹部、鼠径部の画像キャプチャによって皮膚病変を記録し、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）に従って重症度のランクを付けた。
【０１０７】
統計的分析：
反復測定のための混合線形モデルを用いて、ビデオキャプチャしたそう痒行動の経過時間を分析した。モデルには、治療と研究日の固定効果ならびに治療と研究日の相互作用が含まれていた。変量効果には、ブロック、ブロックと治療と誤差の相互作用が含まれていた。そう痒行動（１日目）のベースラインデータを、そう痒行動の分析で共分散として使用した。最小自乗平均を、治療平均の推定値として使用した。最小自乗平均の標準誤差を推定し、９０％信頼区間を作成した。対数変換後のデータに関して最小自乗平均から幾何平均をコンピューターで計算した。ア・プリオリ対比（ａ  ｐｒｉｏｒｉ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）を使用して治療を評価した。治療差を１０％有意水準（Ｐ≦０．１０）で評価した。
【０１０８】
結果
治療結果を図２および図３に示す。病変および紅斑が、０．５ｍｇ／ｋｇグループにおいて著しく軽減した。図２は、ノミアレルギーのイヌにおける実施例１ｂの２７日目のＶＡＳスコアを示している（最小自乗平均）。１０％有意水準で偽薬と比較すると、そう痒の著しい軽減が、両グループの研究中に種々の時点で見られた（０．２５ｍｇ／ｋｇの用量が１、４および１２日目、０．５ｍｇ／ｋｇの用量が１および２０日目）。図３は、ノミアレルギーのイヌにおける実施例１ｂの記録４時間当たりのそう痒の秒数を示している（長い幾何平均）。
【０１０９】
（実施例７）
細胞増殖阻害アッセイ
ネコの細胞系  ＭＹＡ−１およびＦＥＴＪは、ＡＴＣＣ（米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得たネコのＴリンパ芽球細胞系である。これらの細胞は、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内において１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０完全培地中で培養した。
【０１１０】
Ｅｘ  ｖｉｖｏイヌのリンパ腫結節組織
ミシガン州立大学（ＭＳＵ）獣医学部で獣医学スタッフによって悪性リンパ節を切除し、輸送培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシンＢを補充したアドバンストＲＰＭＩ  １６４０完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中に置いた。結節を、小さい断片に刻んで組織ふるいを通すことによって２４時間以内の切除にて処理した。細胞懸濁液を２００ｘｇで回転させ、上清を除去し、細胞ペレットを室温で１０分間ＮＨ４Ｃｌ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を遠心分離によってペレットにした；ＮＨ４Ｃｌを除去し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で１回洗浄し、続いて増殖培地（アドバンストＲＰＭＩ完全、１％ＦＢＳ、５０ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）中に再懸濁した。次いで細胞懸濁液を１００μｍナイロン細胞ストレーナー（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ）に通し、血球計算盤を用いてカウントした。増殖培地単独、０．００５％Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ（登録商標）（熱不活性化、ホルマリン固定黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）細胞（ＳＡＣ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、および１０ｎｇ／ｍＬイヌＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した増殖培地、または１２５ｎｇ／ｍＬコンカバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）および１２５ｎｇ／ｍＬリポ多糖類（ＬＰＳ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充した増殖培地のいずれかの中で細胞を培養した。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖アッセイ法
上記培地中で培養した細胞を、１×１０３細胞／穴（ネコ細胞系）または２×１０５細胞／穴（リンパ節細胞）の密度で９６穴コスタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播き、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内において最長５日間、種々の濃度の試験化合物に曝露した。増殖に対する影響を、製造業者の使用説明書に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。一般に、可溶性テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）および電子結合試薬を用いて、増殖を間接的に測定した。組織培地に可溶なホルマザン生成物へのＭＴＳ生物還元を、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ４．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー上で４９０ｎＭにおける吸光度によってモニターした。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．００を用いてパーセントＤＭＳＯ対照として図示し、ＩＣ５０曲線を、Ｓ字状用量応答を含む非線形回帰モデルを用いてあてはめた。
【０１１２】
結果
表４は、実施例１の化合物が、増殖に関してＩＬ−２に依存しているがＩＬ−２独立系（ＦＥＴＪ）には依存していないネコのリンパ細胞系ＭＹＡ−１の増殖を阻害できることを示している。式ＩＡの化合物またはその塩も、ＴまたはＢ細胞リンパ腫と診断されたイヌから得たイヌ結節組織の増殖を阻害することができる。これらの結果は、ＪＡＫ阻害剤が、イヌおよびネコのリンパ腫を治療するのに有効かもしれないことを示唆している。
【０１１３】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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