(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２０〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２１〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含み、アルツハイマー病に関連する神経細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
神経細胞死の抑制のために用いる、請求項１または２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を培養し、発現させたポリペプチドを該宿主細胞またはその培養上清から回収する工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドを非ヒト哺乳動物の神経細胞またはインビトロで神経細胞に接触させる工程を含む、非ヒト哺乳動物の神経細胞死またはインビトロの神経細胞死を抑制する方法。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドによる細胞死の抑制活性を検出する方法であって、
（ａ）請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、非ヒト哺乳動物またはインビトロで細胞死を誘導する工程、
（ｂ）細胞死を検出する工程、を含む方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドによる神経細胞死の抑制に対する化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物および請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、非ヒト哺乳動物またはインビトロで神経細胞死を誘導する工程、
（ｂ）神経細胞死を検出する工程、を含む方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドによる神経細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検試料および請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、非ヒト哺乳動物またはインビトロで神経細胞死を誘導する工程、
（ｂ）神経細胞死を検出する工程、
（ｃ）神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項６に記載のベクターを有効成分とする医薬組成物。
【請求項１４】
神経細胞死抑制剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
アルツハイマー病の予防または治療に用いられる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該ポリペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アルツハイマー病に関連する細胞死から神経細胞を保護するポリペプチドに関する。
背景技術
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は現在最も精力的に研究されている神経変性疾患であり、臨床的には進行性の記憶喪失および認知障害、病理学的には広範囲の神経喪失、神経細胞内集積物（ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔａｎｇｌｅｓ）、およびコンゴ−レッドに高親和性の核（ｃｏｎｇｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｅｎｃｅ  ｃｏｒｅ）を持つ細胞外老人斑により特徴付けられる。ＡＤに対する効果的な治療方法は未だ存在しない。進行性の神経細胞死により、この疾患の臨床発現の全てではないにしろ、その多くを説明できることが一般に受け入れられており、ＡＤにおける神経細胞死発症の病理機構を解明し、これを防ぐことは、これまでにない有効なＡＤ治療法を確立するために必須である。
早発性の家族性ＡＤ（ＦＡＤ）を引き起こす既知の変異遺伝子としては、４種の異なるグループ：Ｖ６４２Ｉ／Ｆ／Ｇ  ＡＰＰ（数字は６９５アミノ酸を持つＡＰＰであるＡＰＰ６９５のもの）、Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ  ＡＰＰ（ＮＬ−ＡＰＰ）、プレセニリン（ＰＳ）−１変異体、およびＰＳ−２変異体が存在する（Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ  Ｇｉｂｌｉｎ，Ｆ．Ｊ．（１９９９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．４８，１２１−１２７）。Ｙａｍａｔｓｕｊｉらは、ＡＰＰの３つのＶ６４２型変異ｃＤＮＡを神経細胞株Ｆ１１に一過的に発現させた時の観察に基づき、これらのＦＡＤ遺伝子群が、神経細胞の細胞死を引き起こし得ること示唆した（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１３４９−１３５２）。この観察は、初代培養神経や他の神経細胞株を用いた実験によっても確認された（Ｚｈａｏ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４７，２５３−２６３；Ｌｕｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５，６２９−４２）。また、Ｗｏｌｏｚｉｎらは、ＦＡＤ関連変異Ｎ１４１Ｉ  ＰＳ−２がＰＣ１２細胞において有意に細胞死の比率を高めること、そしてＦＡＤ関連変異ＰＳ−１がＴリンパ球のアポトーシスを誘導することを見出した（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１７１０−１７１３；Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９，Ｓ２３−２７）。さらに、ＰＳ−１についても、Ａβ添加や栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の欠乏により誘導される神経細胞死の感受性が、ＰＳ−１変異体の発現により上昇すること（Ｇｕｏ，，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８，３７９−８３；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５，６９８−７０２；Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６．，４１２５−３０）、また、野生型ＰＳ−１を過剰発現するトランスジェニックラットに由来する培養皮質神経は、非トランスジェニックのコントロールに比べ、栄養因子欠乏による細胞死に対する感受性が高まる（Ｃｚｅｃｈ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８７，３２５−３６）ことなどが繰り返し観察されている。変異ＰＳ−１が神経細胞死の刺激因子であるのか、または神経細胞死に対し効果を持たないのかについては議論の余地が残されているものの（Ｗｅｉｈｌ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，５３６０−９；Ｂｕｒｓｚｔａｊｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，９７９０−９）、既知の４種のＦＡＤ遺伝子（Ｖ６４２型変異ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、ＰＳ−１変異体、およびＰＳ−２変異体）の全てが、神経細胞死を誘導するか、または特定の条件下で他の細胞死刺激に対する神経細胞の傷害性を増強させている可能性が高い。ゆえに、ＡＤ治療法の開発に最も重要な鍵は、神経細胞で観察されるＡＤ遺伝子により誘導される細胞死を抑制できる分子を探し出すことであると考えられる。
発明の開示
本発明は、アルツハイマー病に関連する細胞死から神経細胞を保護するポリペプチドおよびその利用を提供することを課題とする。
本発明者はこれまでに、家族性アルツハイマー病型変異Ｖ６４２Ｉアミロイド前駆体蛋白質（Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ）を誘導的に発現する神経細胞系（Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ）を確立している（国際公開番号  ＷＯ００／１４２０４参照）。この系では、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰがＦ１１神経細胞においてエクダイソン処理に応答して発現する。Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞をエクダイソンと２〜３日インキュベートすることにより、ほぼ全ての細胞が細胞死を起こすが、対照のインキュベーションではごく少数の細胞が細胞死を起こすに過ぎない。本発明者は、このＦ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞を、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞に対するアンタゴニストとして作用する遺伝子の検索に利用した。
すなわち、アルツハイマー病（ＡＤ）患者脳より発現ｃＤＮＡライブラリーを構築し、これを上記Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞にトランスフェクションして、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる神経細胞死から生き残った細胞を選択するデストラップ法によるスクリーニング操作を繰り返し行った。その結果、本発明者は、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる神経細胞死を保護する新規な遺伝子を同定することに成功した。Ｈｕｍａｎｉｎ（ＨＮ）ｃＤＮＡと名づけられたこのクローンは、新規な２４アミノ酸のポリペプチドをコードしており、ＡＤに関連する神経細胞死、すなわち、既知の全てのタイプの早発型家族性ＡＤ遺伝子［Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、Ｋ５９５Ｎ／Ｈ５９６Ｌ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌプレセニリン（ＰＳ）−１、およびＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２］およびＡβ１−４３により誘導される神経細胞死を抑制することが判明した。これに対し、ハンチントン病（ＨＤ）／脊髄小脳性運動失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｚｉａ；ＳＣＡ）に関連したポリグルタミンリピートＱ７９や、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）に関連したＣｕ／Ｚｎ依存性スーパーオキサイドディスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ１）変異体による神経毒性に対しては効果を示さなかった。ＨＮ  ｍＲＮＡは中枢神経系以外の幾つかの器官で主に産生されていた。ＨＮ  ｃＤＮＡを神経細胞にトランスフェクションしたところ、転写され予想されるペプチドが産生された後、培養液中に分泌され約１０μＭのレベルに達した。この培養上清には、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる神経細胞死からの有意な保護を示すのに十分な活性が含まれていた。合成ＨＮポリペプチドもまた、同様の用量−応答特性で４種のＡＤ遺伝子に対する神経保護作用を示し、１〜１０μＭでその抑制は最大となった。分泌能を欠損させたＨＮ誘導体をコードするｃＤＮＡを神経細胞で発現させたところ、細胞内で発現されたポリペプチドは細胞死を保護することができなかったが、同じポリペプチドを合成して培養液に添加した場合は保護作用を示したことから、ＨＮポリペプチドは細胞の外側から作用することが判明した。ポリペプチドの構造を変えて活性を試験した結果、８番目のＣｙｓと１４番目のＳｅｒが重要であることが判明した。Ｃ８Ａの置換は細胞死からのレスキュー活性を完全に欠損させ、Ｓ１４Ｇの置換はレスキュー活性を顕著に増加させた。Ｓ１４Ｇ  ＨＮポリペプチド（ＨＮＧ）は、低ｎＭ（１〜１０ｎＭ）で、４種すべてのＦＡＤ遺伝子からの完全な保護作用を示した。ＨＮの抗ＡＤ活性は初代培養皮質神経においても観察され、ＨＮにおいてはμＭレベルで、またＳ１４Ｇ誘導体（ＨＮＧ）においてはｎＭレベルで、Ａβが引き起こす細胞死および細胞傷害を保護したが、Ｃ８Ａ（ＨＮＡ）にはその活性は見られなかった。さらに、詳細な構造／機能関係を解析した結果、３番目のＰｒｏから１９番目のＰｒｏまでが神経保護機能にとって重要であり、その中でも活性に本質的な７残基を特定するに至った。また、Ｓ１４Ｇ  ＨＮポリペプチド（ＨＮＧ）のＣ８のアミノ酸は、抗ＡＤ活性を保ったまま、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、また��Ｌｙｓといった塩基性アミノ酸に置換可能であった。さらに、Ｓ１４Ｇ  ＨＮポリペプチドに２アミノ酸の変異を導入した結果、神経保護作用をさらに高めることに成功した。これらの知見を基に、より活性が高く生体投与に適したポリペプチドを開発することが可能である。これらのポリペプチドは、ＡＤの治療薬開発に新たな道を開くと共に、神経細胞死からの保護を目的とするＡＤ治療方法の開発に大きく貢献すると考えられる。
本発明は、ＡＤに関連する神経細胞死から細胞を保護する新規なポリペプチドおよびその利用に関し、より具体的には、
（１）式（Ｉ）
Ｐｒｏ−Ｘｎ１−（Ｃｙｓ／ｂＸａａ）−（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）−Ｘｎ２−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）−Ｘｎ３−Ｐｒｏ  （Ｉ）
（式中、「Ｃｙｓ／ｂＸａａ」はＣｙｓまたは塩基性アミノ酸、「（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）」はＬｅｕまたはＡｒｇ、「（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）」はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘｎ１、Ｘｎ２、およびＸｎ３はそれぞれ独立に１０残基以下の任意のアミノ酸を表す）
からなるアミノ酸配列を含み、アルツハイマー病に関連する神経細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド、
（２）下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチド、
（ａ）配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２１〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２１〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含み、アルツハイマー病に関連する神経細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド、
（３）神経細胞死の抑制のために用いる、（１）または（２）に記載のポリペプチド、
（４）（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチド、
（５）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（６）（５）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
（７）（６）に記載のベクターを保持する宿主細胞、
（８）（７）に記載の宿主細胞を培養し、発現させたポリペプチドを該宿主細胞またはその培養上清から回収する工程を含む、（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法、
（９）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞死を抑制する方法、
（１０）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドによる細胞死の抑制活性を検出する方法であって、
（ａ）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドの存在下で細胞死を誘導する工程、
（ｂ）細胞死を検出する工程、を含む方法、
（１１）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドによる神経細胞死の抑制に対する化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物および（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドの存在下で神経細胞死を誘導する工程、
（ｂ）神経細胞死を検出する工程、を含む方法、
（１２）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドによる神経細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検試料および（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドの存在下で神経細胞死を誘導する工程、
（ｂ）神経細胞死を検出する工程、
（ｃ）神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１３）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドまたは（６）に記載のベクターを有効成分とする医薬組成物、
（１４）神経細胞死抑制剤である、（１３）に記載の医薬組成物、
（１５）神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、（１３）に記載の医薬組成物、
（１６）アルツハイマー病の予防または治療に用いられる、（１３）に記載の医薬組成物、
（１７）（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチドに結合する抗体、
（１８）配列番号：４に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含む、（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの検出または操作に用いられるＤＮＡ、
（１９）（１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該ポリペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、に関する。
本発明においてポリペプチドとは２またはそれ以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体が結合したペプチドまたは蛋白質を指す。ポリペプチドにはペプチドイソステア（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）が含まれてもよい。ポリペプチドは、通常、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーなどと呼ばれるような短い鎖も含まれる。また、蛋白質と呼ばれるような、長い鎖のものも含む。ポリペプチドは、翻訳後修飾などにより天然に修飾されていてもよい。また人工的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ末端、またはカルボキシル末端などの修飾が含まれる。また、ポリペプチドは分岐していてもよく、環状でもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、［フラビン（ｆｌａｖｉｎ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトール］等の共有結合、クロスリンク形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ピログルタミン酸化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ユビキチン化などが含まれるが、これらに制限されない。
本発明は、アルツハイマー病に関連する細胞死から神経細胞を保護するポリペプチドを提供する。本発明者が単離した、Ｈｕｍａｎｉｎ（ＨＮ）ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：５に、該ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列を配列番号：４に示す。Ｈｕｍａｎｉｎは、ＡＤに関連する神経細胞死をアンタゴナイズする活性を有しており、約１０μＭの濃度で飽和活性を示す。また、Ｈｕｍａｎｉｎのアミノ酸置換体であるＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ）（配列番号：８）は、Ｈｕｍａｎｉｎに比べ１００〜１０００倍高いアンタゴナイズ効果を示した。また、ＨＮＧの８番目のＣｙｓは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＬｙｓといった塩基性アミノ酸に置換可能であり、これによりポリペプチド中のＳＨ基の修飾による活性への影響を回避することが可能となる。さらに、ＨＮＧの誘導体であるＡＧＡ−ＨＮＧ（配列番号：６０）はＨＮＧよりも数倍高い活性を示した。本発明のポリペプチドには、Ｈｕｍａｎｉｎ、ＨＮＧ、ＡＧＡ−ＨＮＧ、およびそれらのＣｙｓ残基（Ｃ８という）を塩基性アミノ酸に置換した置換体が含まれる。
また、本発明により、ＨｕｍａｎｉｎのＣ末にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加しても、神経保護作用に影響を与えないことが示された（実施例３）。さらに、ＨｕｍａｎｉｎのＣ末４アミノ酸（ＫＲＲＡ）を他のアミノ酸に置換しても、元々のＨｕｍａｉｎと同等の神経保護作用を有していた（実施例６）。これらの事実は、Ｈｕｍａｎｉｎ、ＨＮＧ、ＡＧＡ−ＨＮＧ、またはそれらのＣ８の塩基性アミノ酸への置換体のアミノ酸配列に変異を導入することによって、これらと同等またはそれ以上の神経保護作用を有するポリペプチドを作製できることを証明している。
本発明者はＨｕｍａｎｉｎの欠失変異体を用いたさらに詳細な解析を行い、Ｈｕｍａｎｉｎの３番目〜１９番目からなる１７アミノ酸のポリペプチド（ＨＮ−１７，配列番号：２１）でも、神経に対する防御活性を示すのに十分であることを見出した（実施例１３）。さらに、ＨＮＧの３番目のＰｒｏから１９番目のＰｒｏからなるポリペプチド（ＨＮＧ−１７，配列番号：２４）の各アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換して、その神経細胞死抑制活性を検証したところ、活性を維持したまま半数以上のアミノ酸残基が置換可能であった。この実験により、ＨＮＧ−１７中で神経細胞死の抑制に本質的なアミノ酸は、１番目のＰｒｏ、６位のＣｙｓ、７番目のＬｅｕ、１０〜１２番目のＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ、１７番目のＰｒｏの７アミノ酸であることが判明した。従って、これらの残基を維持したまま、他の残基を置換、欠失、および／または挿入等により改変することによりさらにアミノ酸配列を持つ異なるポリペプチドを作製することも可能である。
重要なのは、活性に本質的な上記の７アミノ酸でさえも、他のアミノ酸に置換可能であることである。例えば、ＮＨＧ−１７の１２番目のＧｌｙはＳｅｒであっても（すなわちＨＮ−１７）、神経防御活性は失われない。また、７番目のＬｅｕに相当する部位がＡｒｇに置換されている合成ポリペプチド（ＨＮＲ；配列番号：７）は、合成ＨＮと同等の神経防御活性を示した（実施例１２）。また上記のようにＮＨＧ−１７の６番目に相当するＣｙｓは、ＨＮＧにおいてＨｉｓ、Ａｒｇ、またはＬｙｓといった塩基性アミノ酸に置換しても神経防御活性を示し、特に、このＣｙｓをＡｒｇまたはＬｙｓへ置換したＨＮＧ変異体はもともとのＨＮＧと同等の神経防御活性を示した（実施例１４）。これらの事実から、本実施例で活性の検出されたポリペプチドのアミノ酸において、活性に非本質的および／または本質的なアミノ酸の変異により、これらのポリペプチドと同等またはそれ以上の神経細胞死抑制活性を有するポリペプチドを作製することも可能であると考えられる。
本発明のポリペプチドは、式（Ｉ）
Ｐｒｏ−Ｘｎ１−（Ｃｙｓ／ｂＸａａ）−（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）−Ｘｎ２−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）−Ｘｎ３−Ｐｒｏ  （Ｉ）
からなるアミノ酸配列を含み、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連する神経細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドが含まれる。式中、「Ｃｙｓ／ｂＸａａ」はＣｙｓまたは塩基性アミノ酸、「（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）」はＬｅｕまたはＡｒｇ、「（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）」はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘｎ１、Ｘｎ２、およびＸｎ３はそれぞれ独立に１０残基以下の任意のアミノ酸を表す。このようなアミノ酸配列を有するポリペプチドは、
Ｐｒｏ−（Ｘａａ）１−１０−（Ｃｙｓ／ｂＸａａ）−（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）−（Ｘａａ）１−１０−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）−（Ｘａａ）１−１０−Ｐｒｏ  （ＩＩ）
（式中、Ｘａａは任意のアミノ酸、「（Ｘａａ）ｍ−ｎ」はｍ〜ｎ残基の任意のアミノ酸、「ｂＸａａ」は塩基性アミノ酸、「Ｃｙｓ／ｂＸａａ」はＣｙｓまたは塩基性アミノ酸、「（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）」はＬｅｕまたはＡｒｇ、「（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）」はＧｌｙまたはＳｅｒを表す）
とも表現される。
塩基性アミノ酸とは、Ｒ基（側鎖）がｐＨ７．０で陽電荷を持つアミノ酸を言う。天然の塩基性アミノ酸としては、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓが挙げられる。塩基性アミノ酸としてＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓを持つ本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば
Ｐｒｏ−Ｘｎ１−（Ｃｙｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｈｉｓ）−（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）−Ｘｎ２−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）−Ｘｎ３−Ｐｒｏ  （ＩＩＩ）
（式中、「（Ｃｙｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｈｉｓ）」はＣｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓ、「（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）」はＬｅｕまたはＡｒｇ、「（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）」はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘｎ１、Ｘｎ２、およびＸｎ３はそれぞれ独立に１０残基以下の任意のアミノ酸を表す）
と表現することもできる。本発明において、この位置の塩基性アミノ酸としては特にＡｒｇまたはＬｙｓが好ましい。
好ましくは、Ｘｎ１、Ｘｎ２、およびＸｎ３はそれぞれ独立に２〜６、０〜４、および２〜６残基の任意のアミノ酸（すなわち、Ｘｎ１＝（Ｘａａ）２−６、Ｘｎ２＝（Ｘａａ）０−４、およびＸｎ３＝（Ｘａａ）２−６）、より好ましくはそれぞれ独立に３〜５、１〜３、および３〜５残基の任意のアミノ酸（すなわち、Ｘｎ１＝（Ｘａａ）３−５、Ｘｎ２＝（Ｘａａ）１−３、およびＸｎ３＝（Ｘａａ）３−５）、最も好ましくはそれぞれ独立に４、２、および４残基の任意のアミノ酸（すなわち、Ｘｎ１＝（Ｘａａ）４、Ｘｎ２＝（Ｘａａ）２、およびＸｎ３＝（Ｘａａ）４）である。６残基程度の付加されたアミノ酸はαヘリックスを形成しアミノ酸１残基のように振舞うことがある。本発明のポリペプチドとしては、４残基、２残基、および４残基の任意のアミノ酸からなるＸｎ１、Ｘｎ２、およびＸｎ３のいずれかまたは全てに、６残基またはそれ以下の任意のアミノ酸が付加されたポリペプチドであってもよい。
このようなポリペプチドは、公知のペプチド合成技術により製造することが可能であり、また、これらポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させることによっても製造することが可能である。
Ｘｎ１の配列としては、好ましくは、例えば（Ａｒｇ／Ａｌａ）−（Ｇｌｙ／Ａｌａ）−（Ｐｈｅ／Ａｌａ）−（Ｓｅｒ／Ａｌａ）からなる配列およびこれらの配列に保存的置換が加えられた配列が含まれる。ここで、例えば「Ａｒｇ／Ａｌａ」はＡｒｇまたはＡｌａであることを示す（他も同様に「／」はいずれかの残基であることを表す）。このような配列としては、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａなどが挙げられる。他にも、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなどが含まれる。また、保存的置換としては、後述の保存的置換に相当するアミノ酸のグループ内の置換などが挙げられる。また、Ｘｎ２の配列としては、好ましくは、例えば（Ｌｅｕ／Ａｌａ）−（Ｌｅｕ／Ａｌａ）からなる配列およびこれらの配列に保存的置換が加えられた配列が含まれる。このような配列としては、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａなどが挙げられる。また、Ａｌａ−Ａｌａが含まれる。また、Ｘｎ３の配列としては、好ましくは、例えば（Ｇｌｕ／Ａｌａ）−（Ｉｌｅ／Ａｌａ）−（Ａｓｐ／Ａｌａ）−（Ｌｅｕ／Ａｌａ）からなる配列およびこれらの配列に保存的置換が加えられた配列が含まれる。このような配列としては、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａなどが挙げられる。他にも、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなどが含まれる。Ｘｎ１、Ｘｎ２、およびＸｎ３の配列は任意の組み合わせで選択し得る。
ＡＤに関連する神経細胞死は、株化神経細胞（例えばＦ１１細胞）や初代神経培養（例えばラット脳皮質初代培養）におけるＡＰＰ、ＰＳ−１、またはＰＳ−２の変異体（例えばＶ６４２Ｉ／Ｆ／Ｇ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、およびＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２）の発現により引き起こされる他、初代神経培養へのＡβ（例えばＡβ１−４３）の添加によっても引き起こされる。本発明において「アルツハイマー病に関連する神経細胞死を抑制する」とは、上記を含むＡＤに関連する神経細胞死の少なくとも１つを抑制することを指す。すなわち本発明のポリペプチドには、これらのＡＤに関連する神経細胞死の少なくともいずれかを抑制する活性を有しているものが含まれる。細胞死の抑制は、完全な抑制ではなくても、有意に抑制されればよい。神経細胞死の抑制活性は、実施例に記載された方法または他に記載の方法（例えば国際公開番号  ＷＯ００／１４２０４参照）に従って検定することができる。
具体的な方法を例示すれば、例えばＶ６４２Ｉ／Ｆ／Ｇ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２などのＦＡＤ遺伝子を発現するベクターを単独で、または検定したいポリペプチドを発現するベクターと共に神経細胞（例えばＦ１１細胞）にトランスフェクトし、一定時間（例えば７２時間）培養後、細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定する。または、検定したいポリペプチドを予め調製しておき、このポリペプチドの存在下または非存在下で細胞にＦＡＤ遺伝子をトランスフェクトして、細胞死を測定してもよい。ＦＡＤ遺伝子は、誘導性プロモーターを用いてコンディショナルに発現させることもできる。検定したいポリペプチドの非存在下で誘導される細胞死に対して、ポリペプチド存在下における細胞死が有意に低下すれば、このポリペプチドはＡＤに関連する神経細胞死を抑制する活性を有すると判定される。細胞としては、他に初代培養神経などを用いてもよいし、細胞死の誘導はＡβの添加などで行ってもよい。また、細胞死の測定はトリパンブルー排除以外にも、形態変化、ＬＤＨ放出、またはアポトーシス（核の形態変化またはＤＮＡ断片化など）の測定によって行うことも可能である。
本発明のポリペプチドは、また、配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２１〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該ポリペプチドにおいて、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含み、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連する神経細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドが含まれる。
変異させるアミノ酸残基数に特に制限はないが、置換、欠失、および／または挿入によりアミノ酸配列を改変する場合は、その数は通常、１５残基以内のアミノ酸、より好ましくは１２以内、さらに好ましくは１０以内、さらに好ましくは８以内（例えば５個以内）であると考えられる。付加されるアミノ酸は、ＡＤに関連する神経細胞死を抑制する活性が保持される限り制限はない。アミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列は、人為的に作出したものであってもよく、また自然に生じたポリペプチドの配列であってもよい。
アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのポリペプチドの活性が維持されやすいと考えられる。本発明のポリペプチドは、配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２１〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸に保存的置換が加えられたポリペプチドであって、ＡＤに関連する神経細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドが含まれる。保存的置換は、神経細胞死抑制に本質的なアミノ酸（例えばＨＮＧ−１７において本質的な上記７アミノ酸）を置換する場合などにおいても重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。また、非保存的置換によりポリペプチドの神経細胞死抑制活性、安定性、組織移行性などをより上昇または下降させることも考えられる。
本発明のポリペプチドは、公知のペプチド合成技術によって合成ポリペプチドとして製造することができる（日本生化学会編，新生化学実験講座タンパク質ＶＩ，ｐｐ．３−７４，東京化学同人，１９９２年）。ペプチドの合成法は、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。また、合成ＤＮＡの作製や部位特異的変異導入法などによりＨｕｍａｎｉｎ  ｃＤＮＡ（例えば配列番号：４）に変異を導入し、これを宿主細胞で発現させて、任意のアミノ酸変異を有するポリペプチドを調製することも可能である。改変されるアミノ酸の数や位置は、得られるポリペプチドがＡＤに関連する神経細胞死を抑制する活性を有する限り制限はない。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸残基数に特に制限はないが、例えば医薬組成物として使用する場合においては、一般に分子サイズが小さい方が好ましい。活性に必要のない部分（例えばアミノ酸残基または官能基）を持たないことは、抗原性を低下させ、他の分子との非特異的な相互作用を回避できることから、好ましくない副作用を低減させる効果も期待できる。本発明のポリペプチドは、好ましくはアミノ酸５００残基以内、より好ましくは１００残基以内、より好ましくは５０残基以内、さらに好ましくは３０残基以内である。平均分子量としては、好ましくは６０ｋＤａ以内、より好ましくは１５ｋＤａ以内、より好ましくは６ｋＤａ以内、さらに好ましくは４ｋＤａ以内である。
本発明は、また、上記本発明のポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドに関する。融合ポリペプチドとは、天然において隣接していない少なくとも２つのポリペプチドが連結したポリペプチドであり、ペプチド合成により、またはポリペプチドのコード領域をフレームが一致するように連結させた核酸を発現させることにより製造することができる。他のポリペプチドとしてはタグのような数残基の短いペプチドから蛋白質のような長いポリペプチドまで任意のポリペプチドが挙げられる。具体的には、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ、マルトース結合蛋白質、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などが挙げられる。また、抗体断片（Ｆｃ断片）などが挙げられる。さらに、リーダー配列、分泌シグナル、プレ蛋白質またはプロ蛋白質の配列などが挙げられるが、それらに制限されない。本発明のポリペプチドを有効に脳血液関門を通過せしめるために、これを容易にする一群のポリペプチドを融合することもできる。
また、本発明のポリペプチドには、その塩も含まれる。このような塩は酸または塩基から誘導される。具体的には、例えば無機酸との塩（例えば、塩酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩など）、有機酸との塩（例えば、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酪酸塩、グリコール酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩など）、あるいは塩基との塩（例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基との塩、およびアルギニンやリジンなどのアミノ酸との塩）が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドには、その誘導体が含まれる。ここで「誘導体」とは、本発明のポリペプチドの官能基を既知の方法により修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つ分子を意味する。このような官能基の改変は、例えば、ポリペプチドに存在する官能基の保護、ポリペプチドの安定性または組織移行性の制御、あるいはポリペプチドの活性の制御等を目的として行われうる。例えば、本発明のポリペプチドには、そのＮ末端、Ｃ末端、及びポリペプチドを構成するアミノ酸の側鎖の官能基のいずれかが保護基等の他の置換基によって修飾されているものが含まれる。置換基としては、例えば各種のアルキル基、アシル基、アミド体、リン酸基、アミノ基、カルボキシル基、エステル基など挙げられるがこれらに制限されない。
また、本発明のポリペプチドには、ポリペプチド同士を結合させたダイマーなどの重合体、分枝状分子、環化分子が含まれる。また、ポリペプチドは担体に結合していてもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、あるいは他のポリマーなどと結合していてもよい。
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体および／またはＤ体であることができる。Ｄ体のアミノ酸の使用は、ペプチダーゼによる分解を低下させるために有用である。また、アミノ酸は天然のアミノ酸に限定されず、非天然のアミノ酸でもよい。例えば、ホモセリン、β−ヒドロキシバリン、Ｏ−４−ヒドロキシフェニルチロシン、α−ｔ−ブチルグリシン、２−アミノ酪酸、α−シクロヘキシルグリシン、α−フェニルグリシンなどをあげることができる。また、ポリペプチドのペプチド結合は、適宜ペプチド結合以外の共有結合に置換することが考えられる。非ペプチド結合への置換により、ペプチダーゼによる感受性を下げ、薬効の持続性の向上や投与ルートの選択の幅を広げることができる。非ペプチド結合の例としては、イミノ結合、エステル結合、ヒドラジン結合、セミカルバジド結合、およびアゾ結合などが挙げられるが、これらに制限されない。
また、本発明のポリペプチドの構造を模倣する化合物を設計することも考えられる。例えば、本発明のポリペプチドの構造に関する物理的および化学的性質を、活性部位修飾手法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析を含む公知の手法によって解析し、これを基にポリペプチドの神経保護作用に重要な物理的および化学的機能のマップを作成する。この機能を模擬した分子を設計し合成する。また、本発明のポリペプチドは、その活性の高さから受容体に結合すると考えられるが、同受容体に結合する化合物を設計することも考えられる。このように誘導された分子が神経保護作用を有するか否かは、実施例に記載の方法に従ってアッセイすることができる。
本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡの由来は特に制限されず、合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどが含まれる。本発明のＤＮＡには、配列番号：４で示されるＨｕｍａｎｉｎをコードするｃＤＮＡが含まれる。また、配列番号：５〜８、１０、１２、１３、２１〜２４、２６〜２９、３２、３３、３７〜４０、４６、４８、５４、または６０に記載のアミノ酸をコードする任意の縮重に基づく塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。また、本発明のＤＮＡは、コード領域以外に、５’および３’に非コード配列（非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）を含んでもよい。
本発明のＤＮＡは、ベクターに挿入して本発明のポリペプチドの生産に利用することができる他、後述するように遺伝子治療目的に利用することができる。
本発明のポリペプチドの産生のために用いられる宿主に特に制限はなく、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などの細胞または個体を用いることができる。宿主−ベクター系としては、例えば、バキュロウイルス−Ｓｆ細胞系（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：４２０５−４２０８，１９９５）、ｐｃＤＮＡ−ＣＨＯ細胞系（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９０４１−１９０４５，１９９５）、およびＣＭＶプロモータープラスミド−ＣＯＳ細胞系（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：４９８−５０９，１９９６）などが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞から分泌させうる。実施例で示されるように、ＨｕｍａｎｉｎおよびＨＮＧ等は、発現させた細胞から細胞外に分泌され、分泌されたポリペプチドは神経細胞死をアンタゴナイズする活性を示した。細胞外に分泌させた場合には、本発明のポリペプチドは宿主細胞の培養上清から簡便に回収することが可能である。
本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、神経細胞死を抑制するための試薬とすることができる。ＤＮＡは適宜ベクターに組み込み、該ベクターを試薬することができる。本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む試薬は、ポリペプチドやＤＮＡ自体を試薬として用いる他、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬を含む）等と適宜組み合わせてもよい。これらは混ぜ合わさっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。
本発明のポリペプチドを神経細胞に接触させることによって、神経の細胞死を抑制することができる。このとき、本発明のポリペプチドを細胞の外側から接触させる。例えば、細胞培養系であれば、培養液にポリペプチドを添加すればよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合は、細胞死の抑制の標的となる細胞にポリペプチドが接触し得るようにポリペプチドを投与すればよい。ポリペプチドの濃度は神経細胞死抑制活性の強弱や使用目的にもよるが、例えばＨＮと同等の活性を有するポリペプチドであれば約１０μＭまたはそれより低い濃度で、ＨＮＧと同等の活性を有するポリペプチドであれば、約１０ｎＭまたはそれより低い濃度で最大の活性を示す。ポリペプチドが分泌性であるならば、細胞内に導入または発現しても、ポリペプチドが細胞外に分泌され、細胞死を抑制することができる。このためには、例えば本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞内で発現させればよい。本発明のポリペプチドを発現するベクターを細胞に導入することにより、細胞培養系またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて神経細胞の細胞死を抑制することができる。また、分泌性の本発明のポリペプチドを発現する細胞との共培養、またはｅｘ  ｖｉｖｏ投与などにより、周囲の細胞の細胞死を抑制することも可能である。
このように、本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡを含むベクターは、神経細胞死を抑制するために用いられ得る。これらは神経細胞死抑制剤となる。また本発明は、本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡを含むベクターの、神経細胞死を抑制するための使用を提供する。
本発明は、また、本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分とする医薬組成物を提供する。本発明のポリペプチドは、細胞に外から加えることにより、または分泌性のポリペプチドを細胞内で発現させることにより、神経変性を保護することができる。従って、本発明のポリペプチドは、特に神経変性を伴う疾患に対する医薬組成物として有用である。
実施例に示されるように、化学合成されたＨｕｍａｎｉｎ（ＨＮ）ポリペプチドは、細胞外液の濃度が約１０ｎＭ以上で神経細胞死を抑制する活性を示し、１〜１０μＭの濃度で最大の抑制活性を示した。また、ＨＮＧおよびＡＧＡ−ＨＮＧポリペプチドは、約１ｎＭで有意または十分な神経保護作用を示した。この神経保護作用は、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞へ導入して発現させることによってももたらされる。従って、本発明のポリペプチドを発現するベクターを医薬として用いて、遺伝子治療などを行うことも可能であると考えられる。遺伝子治療に用いる場合は、分泌型のポリペプチド、または分泌シグナルを付加したポリペプチドを発現させることもできる。ベクターの投与方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。遺伝子治療に用いるためのベクター系としては、アデノウイルスベクター、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクター、ヘルペスウイルスベクター（いずれもＲｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０：３５−４７，１９９８）、レトロウイルスベクター（Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｋｏｈｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：ｅ２６−３３，１９９９）、レンチウイルスベクター（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，１９９９，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３−６８６）などを用いることが考えられるが、これらに制限されない。
本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現するベクターを利用して予防や治療を行なう対象となる疾患としては、本発明のポリペプチドが疾患の治療に有効である限り、特に制限されない。好適な対象疾患としては、神経関連疾患、特にアルツハイマー病が挙げられる。これまでの研究からアルツハイマー病において神経細胞の細胞死が起こることが明らかにされている（Ｉ．Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４１：３３７−３６８）。この細胞死には、ＡＰＰ（Ｉ．Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ．，１９：Ｓ３３−Ｓ３８）やプレセニリン（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．５５：２１９−２２５）のある種の活性化が関与していることが示唆されている。このため、本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病における神経変性を保護する薬剤として用いられることが期待される。また、本発明の医薬組成物を用いて、アルツハイマー病以外にも、例えば脳虚血による神経細胞の細胞死に起因する疾患を予防することも可能である（Ｔ．Ｋｉｒｉｎｏ，１９８２，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，２３９：５７−６９）。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２０４５−２０４７）、びまん性レービー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）病（Ｍ．Ｇ．Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６４６９−６４７３）、ダウン症に伴う痴呆なども、治療や予防の対象となる。また、ＡＰＰの類縁分子であるＡＰＬＰ１が、先天性ネフローゼ症候群の原因遺伝子といわれている（Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０２：１９２−１９６）ことから、ネフローゼ症候群などの腎疾患も治療や予防の対象となる。
本発明の医薬組成物は、有効成分自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。ポリペプチドの含有率は適宜決定すればよい。
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。脳神経変性疾患の治療に用いる場合においては、本発明の医薬組成物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中枢神経系に導入するのが望ましい。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。投与量、投与方法は、本発明の医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
例えば、アルツハイマー病治療などにおいて、脳神経細胞の変性保護を目的とした投与を行う場合には、本発明のポリペプチドが標的とする細胞周囲において神経変性を有効に抑制する濃度となるように投与されることが好ましい。すなわち、Ｈｕｍａｎｉｎポリペプチドまたはこれと同等の神経細胞死保護作用を有するものであれば、少なくとも１ｎＭ以上、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、より好ましくは１μＭ以上となるように投与されるべきである。ＨＮＧまたはこれと同等の神経細胞死保護作用を有するものであれば、少なくとも１ｐＭ以上、好ましくは１０ｐＭ以上、より好ましくは１００ｐＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上となるように投与されるべきである。またＡＧＡ−ＨＮＧであれば、ＨＮＧの数分の一から十分の一の濃度で同等の効果を期待できる。これらを達成するための投与量は、投与経路によって適宜決定することが可能である。
また、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体には、ポリクーナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、例えばＨＮやＨＮＧなどの本発明のポリペプチド、またはそれらの部分ペプチドを調製し、これを抗原にウサギ、ヤギ、ヒツジなどを免疫してポリクローナル抗体を作製する。抗原ペプチドは、適宜他のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンやアルブミンなどのキャリア蛋白質に結合させて免疫することができる。モノクローナル抗体は、免疫したマウスやラットの脾細胞を用い、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることにより作製することができる。抗体の作製は、公知の方法に従って行うことができる（Ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
ポリクローナル抗体は血清から、モノクローナル抗体ではハイブリドーマ培養上清またはハイブリドーマを接種した動物の腹水から硫安分画、プロテインＧセファロースカラム、抗原を固定したアフィニティーカラムなどの一般的な生化学的手法で抗体を精製することができる。
これにより調製された抗体は、本発明のポリペプチドの吸収のために用いられる他、例えば、本発明のポリペプチドの構造変異の検査や診断、本発明のポリペプチドの発現量の検出などに利用することが可能である。
ＨｕｍａｎｉｎもしくはＨｕｍａｎｉｎ様ペプチドの血中または神経組織を含む組織内濃度の低下が、ＡＤを含む神経またはその他の臓器変性疾患の診断または予後判定に用いることができる可能性がある。例えば同じＡＤ患者でも、血中のＨＮ活性の低い人は、高い人に比べ病気の進行が急速で、予後が不良である可能性が考えられる。検査方法としては、例えば抗Ｈｕｍａｎｉｎ抗体を用いたＲＩＡ法により、血液または組織サンプル中の濃度を測定したり、生検材料を免疫組織染色法で検査することが考えられる。また、例えば本発明のポリペプチドの投与による治療の際に、ポリペプチドレベルをモニターすることも考えられる。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片であってもよい。例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはそれらの修飾物が含まれる。また、ヒト型抗体もしくはヒト抗体なども含まれる。本発明の抗体を「本発明のポリペプチドの検査試薬」として用いる他、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（ＢＳＡなど）等と適宜組み合わせてもよい。これらは混ぜ合わさっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。
本発明はまた、ＨｕｍａｎｉｎをコードするＤＮＡ（配列番号：４）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含む、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の検出または操作に用いられるＤＮＡを提供する。「遺伝子の検出」とは、遺伝子の存在の検出、変異の検出、および発現の検出などの遺伝子を基にする検出を意味する。また「遺伝子の操作」とは、遺伝子への変異導入、遺伝子の増幅、および遺伝子の発現抑制などの遺伝子操作を意味する。「遺伝子の検出または操作」には、遺伝子発現の検出、および発現制御が含まれる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、７０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば９５％以上）の塩基配列上の同一性を有すればよい。配列の同一性は、例えば文献「Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０」に記載の方法に従って決定することができる。
このようなＤＮＡには、本発明のペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、本発明のポリペプチドの発現を抑制するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムをコードするＤＮＡ等）が含まれる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域を相補的にして、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
本発明は、また、本発明のポリペプチドによる細胞死の抑制活性を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）本発明のポリペプチドの存在下で細胞死を誘導する工程、および（ｂ）細胞死を検出する工程、を含む方法である。具体的な操作は、本明細書に記載された方法に従って行うことができる。この方法は、本発明のポリペプチドが様々な細胞における細胞死に対して抑制効果を有するかどうかを決定したり、その抑制効果を定量するために用いられ得る。細胞としては特に制限はなく、細胞死を起し得るさまざまな細胞が用いられる。また、細胞死の誘導は、それぞれの細胞に応じて公知の細胞死誘導系をしようすることができる。また、神経細胞を用いて、神経細胞死を誘導するさまざまな刺激、環境変化、または遺伝子発現などの諸条件に対する本発明のポリペプチドの効果を検出するためにも用いられ得る。また、このような検出は、生物種や亜種、または個体間に存在し得る、神経細胞死における本発明のポリペプチドに対する感受性の違いを検出するために用いられ得る。これにより、例えば民族、人種、または個人間で、本発明のポリペプチドの有効性を検討することができる。このような方法により、例えば臨床適用に向けた詳細な条件検討を行うことができる。
また、本発明は、本発明のポリペプチドによる神経細胞死の抑制に対する化合物の効果を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）被検化合物および本発明のポリペプチドの存在下で神経細胞死を誘導する工程、および（ｂ）神経細胞死を検出する工程、を含む方法である。この方法は、本発明のポリペプチドによる神経細胞死を促進したり抑制したりする化合物をアッセイするために用いられ得る。本発明のポリペプチドは、神経細胞表面に作用して細胞死抑制効果を発揮すると考えられる。この方法を用いれば、本発明のポリペプチドの細胞表面への接触を阻害し得る候補化合物や、逆に促進し得る候補化合物の作用を検証することができる。また、この検出方法を用いて、本発明のポリペプチドによる神経細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングすることも可能である。この方法は、（ａ）被検試料および本発明のポリペプチドの存在下で神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、および（ｃ）神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む。工程（ｃ）においては、任意の対照における場合と比較することができる。例えば、工程（ｃ）において、被検試料非存在下において検出した場合に比べ、被検試料存在下において神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することができる。神経細胞死を促進する化合物は、本発明のポリペプチドによる神経細胞死の抑制を阻害する化合物の候補となり、神経細胞死を抑制する化合物は、本発明のポリペプチドによる神経細胞死の抑制をさらに促進する化合物の候補となる。また、上記のスクリーニングにおいて、被検試料とは別の化合物における場合を対照とすることもできる。例えば本発明のポリペプチドによる神経細胞死の抑制を調節し得る別の化合物を用いて細胞死を検出し、工程（ｃ）において、該化合物の存在下における場合に比べ、工程（ａ）で用いた被検試料存在下において神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することもできる。このようなスクリーニングにおいては、本発明のポリペプチドによる神経細胞死の抑制の調節能に関して、既存の化合物よりもさらに高い効果を有する化合物をスクリーニングすることができる。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。
神経細胞死の誘導や本発明のポリペプチドの投与は、実施例に従って行うことができる。被検試料を細胞に適用するタイミングに特に制限はなく、本発明のポリペプチドを適用する前、後、または同時に適用することができる。被検試料の適用方法に制限はなく、培養細胞系であれば、例えば培地に添加される。また核酸であれば、細胞内に導入されてもよい。その他、任意の投与方法により、被検試料を適用することができる。
上記の化合物の作用の検査により評価された化合物、あるいはスクリーニングにより得られた化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。
また、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法を提供する。このようなスクリーニングは、（ａ）本発明のポリペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）本発明のポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、および（ｃ）本発明のポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実施することが可能である。
本発明のポリペプチドは、スクリーニングの手法に応じて、可溶性ポリペプチドとして、また担体に結合させた形態としてスクリーニングに用いることができる。本発明のポリペプチドは標識されていてもよい。標識としては、放射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンやジゴキシゲニンによる標識、タグ配列の付加などが挙げられる。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。被検試料は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
例えば、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする場合は、本発明のポリペプチドを固定したアフィニティーカラムに本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織または細胞の細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニングを実施することが可能である。
さらに、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織若しくは細胞（例えば脳皮質組織、またはＦ１１などの神経細胞）よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、アガロース上にプラークを形成させ、標識した本発明のポリペプチドを用いてウエストウエスタンブロッティング法によりスクリーニングしたり、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域などのＤＮＡ結合ペプチドおよびＧＡＬ４転写活性化領域などの転写活性化ペプチドを、それぞれ本発明のポリペプチドおよび被検タンパク質との融合タンパク質として発現させ、ＤＮＡ結合ペプチドの結合配列を有するプロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子の発現を通して本発明のタンパク質と被検タンパク質との結合を検出する「ｔｗｏハイブリッドシステム」等に従い実施することも可能である。
本発明のスクリーニングにより、本発明のポリペプチドに対する受容体をクローニングすることも考えられる。この場合、被検試料は受容体を発現していることが予想れる組織または細胞、例えば脳皮質組織、神経細胞株、または神経芽細胞腫や奇形腫細胞などから調製することが好ましい。神経細胞株としては、例えばＦ１１細胞、ＰＣ１２細胞（Ｌ．Ａ．ＧｒｅｅｎｅおよびＡ．Ｓ．Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，１９７６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３：２４２４−２４２８）、ＮＴＥＲＡ２細胞（Ｊ．ＳｋｏｗｒｏｎｓｋｉおよびＭ．Ｆ．Ｓｉｎｇｅｒ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６０５０−６０５４）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ．Ｏｄｅｌｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，２２４：６９−８２）等が挙げられる。
また、固定化した本発明のポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、結合する分子をスクリーニングすることも考えられる。また、表面プラズモン共鳴現象を利用した結合の検出によるスクリーニングも可能である（例えばビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）など）。これらのスクリーニングは、コンビナトリアルケミストリー技術を用いたハイスループットスクリーニングにより行うことも可能である。
本発明のスクリーニングにより得られた本発明のポリペプチドに結合する化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。本実施例に記載された実験方法を以下に示す。
Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡは以前記載されている（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１３４９−１３５２）。ＰＳ−１  ｃＤＮＡのＭ１４６Ｌ変異体およびＰＳ−２  ｃＤＮＡのＮ１４１Ｉ変異体は、それぞれＰｅｔｅｒ  Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ博士（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，７５４−７６０）、およびＬｕｃｉａｎｏ  Ｄ’Ａｄｍｉｏ博士（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１７１０−１７１３）より寄贈された。本実施例で用いた全てのＦＡＤ遺伝子はｐｃＤＮＡベクター（Ｆｕｎｋ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５６３８−５６４２）にコードされている。ＳＯＤ１  ｃＤＮＡのＡＬＳ関連変異体（Ａ４Ｔ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８８，１８５−８）、およびｐＤＮ−Ｅ／Ｇ５Ｈ−Ｑ７９は、それぞれＳｈｏｊｉ  Ｔｓｕｊｉ博士（Ｎｉｉｇａｔａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｉｉｇａｔａ，Ｊａｐａｎ）、およびＡｋｉｒａ  Ｋａｋｉｚｕｋａ博士（Ｏｓａｋａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より寄贈された。
ＨｕｍａｎｉｎをコードするプラスミドｐＨＮは、ＨＮ  ｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ａベクター（ｐＦＬＡＧ）（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）のポリクローニングサイトに挿入して構築した。すなわち、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ａプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断し、ＨＮをコードするセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＧＧＴＡＣ−３’／配列番号：１）とアンチオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＧＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧ−３’／配列番号：２）をライゲーションした。このプラスミドは、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）がＣ末端に融合したＨｕｍａｎｉｎポリペプチドを発現する。
変異ＨＮをコードするｐＦＬＡＧプラスミド（ｐＨＮＧおよびｐＨＮＡ）は、ｐＨＮからＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて構築した。配列は、直接塩基配列決定法により確認した。ＨＮ−ＥＧＦＰプラスミドの構築には、まずＨＮをコードするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをリン酸化した後、９５℃３分でアニーリングさせ、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位にＴ４  ＤＮＡライゲースによりサブクローニングした。合成ＨＮポリペプチド（ｓＨＮ）および構造改変した合成ポリペプチドは９５％以上に精製したものを用いた。合成ＨＮ（ｓＨＮ）および他の幾つかの合成ＨＮ誘導ポリペプチドは２箇所の入手経路から独立して入手したが、どちらも本質的に同じ結果が得られた。抗ＦＬＡＧ抗体はＥａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（Ｍ２モノクローナル抗体，Ｃａｔ．＃ＩＢ１３０１０）から購入した。Ａβ１−４３はＢＡＣＨＥＨ（Ｃａｔ．＃Ｈ−１５８６）より購入した。他の試薬は全て商業的に入手可能なものを用いた。
ｐＥＦ−ＢＯＳにコードされた発現ｃＤＮＡライブラリーは、研究所のガイドラインに従って、生検により孤発性ＡＤであることが確認された患者の脳試料（後頭皮質）からポリＡ＋ＲＮＡを抽出して構築した。ポリＡ＋ＲＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含む改変オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写した。二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩアダプタープライマー（５’−ｐＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ−３’および３’−ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＴＧｐ−５’）をライゲートし、ＮｏｔＩで切断した。低分子ＤＮＡを除いた後、ｃＤＮＡはｐＥＦ−ＢＯＳのＢｓｔＸＩ−ＮｏｔＩ断片にライゲートし、エレクトロポレーションによりＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株へ形質転換した。初代ライブラリーサイズおよび挿入断片の平均サイズはそれぞれ３．２×１０６ｃｆｕ／１６ｍｌおよび０．９ｋｂであった。
Ｆ１１細胞（Ｐｌａｔｉｋａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，３４９９−３５０３；Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１３４９−１３５２）は、１８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を含むＨａｍＦ−１２培地で培養した。６ウェルプレート上に７×１０４／ウェルのＦ１１細胞を播き、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で１２〜１６時間培養した後、ＦＡＤ遺伝子をコードするプラスミドを、ＨＮをコードするプラスミド（ｐＨＮ等）と共に、リポフェクションにより血清の非存在下３時間トランスフェクトし（ＦＡＤ  ｃＤＮＡ発現プラスミド１μｇ、ＨＮ  ｃＤＮＡ発現プラスミド１μｇ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ４μｌ、Ｐｌｕｓ試薬８μｌ）、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で２時間培養した。その後培地を１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地に交換し、さらに６７時間培養した。トランスフェクションから７２時間後、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。合成ＨＮポリペプチドを用いた実験では、Ｆ１１細胞（６ウェルプレート上で７×１０４／ウェル）に血清非存在下で上記と同様にＦＡＤ遺伝子を３時間トランスフェクトし、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で２時間培養した後、様々な濃度のＨＮポリペプチドと共に１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で６７時間培養し、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。ＳＯＤ１のＡＬＳ関連変異体ｃＤＮＡも同様にトランスフェクトし、その神経毒性の試験を行った。
ｐＨＮをトランスフェクトしたＦ１１細胞の培養上清（ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ）を得るためには、Ｆ１１細胞にｐＨＮをリポフェクションにて血清非存在下で３時間トランスフェクトし（ｐＨＮ  １μｇ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２μｌ、Ｐｌｕｓ試薬４μｌ）、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で２時間培養した。その後培地を１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地に交換し、さらに６７時間培養した。この培養培地を１回凍結融解してＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮとした。ＣＭ／Ｆ１１−ｖｅｃは、ｐＦＬＡＧをトランスフェクトしたＦ１１細胞から同様にして調製した。ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮＧ、およびＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮＡのイムノブロット解析では、凍結融解しない培養培地にプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ．＃１６９７４９８；２ｍｌの蒸留水に１錠を溶かし、試料の１／２５容を添加した）を加えた。細胞のライセートを用いたイムノブロット解析では、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３０μｌのホモジェナイジングバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，および１錠／５０ｍｌのプロテアーゼインヒビターカクテル］中に懸濁した。２回凍結融解した後、細胞のホモジェネートを４℃で１５，０００ｒｐｍで１０分遠心し、上清をＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動してイムノブロット解析に供した。Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動は、以前記載されたように行った（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ，Ｇ．（１９８７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６６，１６８−１７９）。
Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞は、エクダイソン誘導型Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ発現プラスミドを用いて樹立した。まず、共発現ベクターｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＦ１１細胞に導入し、それに続くＺｅｏｃｉｎ選択により、エクダイソン受容体ＥｃＲとレチノイドＸ受容体ＲＸＲの両方を安定に過剰発現するＦ１１細胞（Ｆ１１／ＥｃＲ細胞）を樹立した。多コピーのエクダイソン応答配列を有するｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡを挿入し、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞にトランスフェクトした後、Ｇ４１８選択を行った。限界希釈により、Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞をクローニングした。Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞は、１８％ＦＢＳと抗生物質を含むＨａｍＦ−１２培地で培養した。エクダイソン処理の前に、細胞を１０％ＦＢＳ存在下で２４時間培養した。その後、１０％ＦＢＳ存在下で細胞培養液にエクダイソン（４０μＭ  Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．＃Ｈ１０１−０１）を添加した。エクダイソン処理に応答して、各Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞で細胞死が起こり、全細胞中の細胞死の比率は処理後７２時間で６０〜７０％、処理後９６時間で８０〜９０％に達した。Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞の更に詳細な解析は、別途記載されている（国際公開番号  ＷＯ００／１４２０４参照）。
エクダイソンを用いたＦ１１／ＥｃＲ細胞の実験では、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞を６ウェルプレートに７×１０４／ウェルで播き、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で１２〜１６時間培養し、エクダイソン誘導型プラスミド１μｇを単独で、またはＨＮをコードするプラスミド１μｇと共に、血清非存在下で上記と同様に３時間トランスフェクトした。１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で１２〜１６時間培養した後、細胞を１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で２時間培養し、エクダイソン（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）を培地に添加した（終濃度４０μＭ）。エクダイソンで処理後７２時間での細胞死を測定した。合成ＨＮポリペプチドを用いた実験では、細胞にＦＡＤ遺伝子を血清非存在下で３時間同様にトランスフェクトし、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で１２〜１６時間培養し、様々な濃度のＨＮポリペプチドと１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地で２時間培養し、４０μＭのＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅを培地に添加した。エクダイソンで処理後７２時間での細胞死を、トリパンブルー排除アッセイにより測定した。ＨＤ／ＳＣＡ関連Ｑ７９  ｃＤＮＡも同様にトランスフェクトし、その神経毒性の試験を行った。
マウス皮質神経の初代培養は、ポリ−Ｄ−リジンコートした２４ウェルプレート（Ｓｕｍｉｔｉｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）を用い、血清非存在下およびＮ２サプリメントの存在下で、以前記載されたように行った（Ｅｋｓｉｏｇｌｕ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６４４，２８２−９０）。この方法により調製した神経の純度は＞９８％であった。調製した神経（１．２５×１０５／ウェル，２５０μｌ培地／ウェル）は、１０ｎＭまたは１０μＭのｓＨＮポリペプチド存在下または非存在下で１６時間プレインキュベートを行い、同じ濃度のｓＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で、２５μＭのＡβ１−４３で２４〜７２時間処理を行った。初代培養神経は、培地交換に伴う一過的な乾燥でも傷害を受けるため、Ａβ１−４３による細胞の処理は次のように行った。まず、古い培地の半量（１２５μｌ）を捨てた。そして、５０μＭのＡβ１−４３と先に示した濃度のｓＨＮを含む予め温めておいた新鮮な培地１２５μｌを培養に加えた。
トリパンブルー排除アッセイは、次のようにして行った。プレウォッシュなしで細胞を血清不含の培地に穏やかにピペッティングして懸濁した。２００μｌの細胞懸濁液に５０μｌの０．４％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｔ−８１５４）を加え（終濃度０．０８％）、室温で混合した。トリパンブルー溶液を加えてから３分以内に、染色された細胞を計数した。これを基に細胞死の比率を決定した［１００−細胞生存率（％）］。ＬＤＨアッセイは、神経を培養した培地６μｌをサンプリングして、キット（ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｃａｔ．＃２９９−５０６０１）を用いて行った。カルセイン染色は、以前記載されたようにして行った（Ｂｏｚｙｃｚｋｏ−Ｃｏｙｎｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０，２０５−２１６）。簡単には、６μＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ｛３’，６’−Ｄｉ−（Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−２’，７’−ｂｉｓ［Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ］ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ｔｅｔｒａａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｃａｔ．＃３４９−０７２０１｝を神経に添加し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ処理後３０分以上経過してから蛍光（ｅｘ＝４９０ｎｍ，ｅｍ＝５１５ｎｍ）を蛍光顕微鏡により観察し、スペクトロメーターにより測定した。特異的な蛍光は、全蛍光から基底状態の蛍光を差し引いて計算した。基底状態の蛍光は、トリパンブルー陽性度−蛍光強度の直線関係から算出される、１００％トリパンブルー陽性に対応する値とした。
アッセイは少なくとも３回、独立してトランスフェクションまたは処理を繰り返して行った。統計解析ではＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。
ノーザンブロット解析のためのオリゴヌクレオチドの放射標識は、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  ３’ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＮＥＮ）を用いてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により行った。すなわち、７５ｐｍｏｌのプローブオリゴヌクレオチド、１００ｐｍｏｌの３’−［３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（１８５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）、および３６ｕｎｉｔのＴｄＴを３７℃で３０分インキュベートした後、標識されたオリゴヌクレオチドをゲル濾過により分離した。この操作により、１×１０６〜５×１０６ｃｐｍ／μｌの標識プローブが得られた。プローブに用いたアンチセンスＨＮは５’−ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  Ｇ−３’（配列番号：３）である。ｃＤＮＡ断片はＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ｒａｎｄｏｍ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により放射標識した。すなわち、５０〜５００ｎｇの変性させたＤＮＡ断片および１．８５ＭＢｑ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを３７℃で３０分インキュベートした後、標識されたＤＮＡ断片をゲル濾過により分離した。この操作により、約５×１０７ｃｐｍ／μｇ  ＤＮＡの標識プローブが得られた。ノーザンブロット解析はＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った。すなわち、プレハイブリダイゼーションの後、組織のポリＡ＋−ＲＮＡがブロットされた膜（ヒト組織の膜はＣｌｏｎｔｅｃｈより、マウス組織の膜はＯｒｉｇｅｎｅより入手）を放射標識されたプローブ（２〜５×１０７ｃｐｍ）に１８時間浸漬させた。説明書に従って２ステップの洗浄を行った後、増感スクリーンを２枚使って膜をＸ線フィルムに−７０℃で露光させた。
［実施例１］  Ｈｕｍａｎｉｎの同定
Ｆ１１細胞は、Ｅ１７．５のラット初代培養神経とマウス神経芽細胞腫ＮＴＧ１８を細胞融合させて樹立された、初代培養神経の不死化細胞モデルである（Ｐｌａｔｉｋａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，３４９９−３５０３）。分化刺激がなければ、この細胞は活動電位の生成などの初代培養神経に典型的な特徴を保持している（Ｐｌａｔｉｋａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，３４９９−３５０３）。本発明者は、３種のＦＡＤ原因遺伝子であるＶ６４２Ｉ／Ｆ／Ｇ  ＡＰＰをコードするｃＤＮＡをＦ１１細胞にトランスフェクトすることにより、ＡＰＰのＶ６４２変異体の一過的な発現が細胞死を引き起こすことを見出した（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１３４９−１３５２）。そこで本発明者は、最近開発されたエクダイソン誘導系（Ｎｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，３３４６−５１）を用いて、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰを誘導できるＦ１１クローンの構築を行った。まず、エクダイソン受容体とＲＸＲの両者を過剰発現するＦ１１クローン（Ｆ１１／ＥｃＲ）を樹立し、この細胞に、エクダイソン応答配列の制御下に置かれたＨＳＶプロモーターにより発現されるＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをコードするｐＩＮＤ−Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰを安定にトランスフェクションすることにより、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰの発現を誘導することができるＦ１１細胞を樹立した。このようにして樹立されたクローンＦ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞は、そのままではＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをほとんど発現しないが、エクダイソン処理によりコンディショナルにＶ６４２Ｉ  ＡＰＰを過剰発現することが確かめられた。そしてエクダイソン処理に応答して、各Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞で細胞死が誘導され、全Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞中の細胞死の比率は処理後７２時間で６０〜７０％、処理後９６時間で８０〜９０％に達した。
これらの細胞を用いて、Ｄ’Ａｄａｍｉｏら（Ｄ’Ａｄａｍｉｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１７−２３）により開発された方法に基本的に従いながら、それに修正を加えた「デストラップスクリーニング」を行った。最初に記載された「デストラップスクリーニング」においては、Ｖｉｔｏらは正常Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーをＪｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトし、Ｔ細胞受容体の刺激により細胞死を誘導し、細胞死をアンタゴナイズする遺伝子を回収した。本発明者は、デストラップスクリーニングを行い、ＡＤ遺伝子により誘導される細胞死をアンタゴナイズする遺伝子のスクリーニングを試みた。まず、Ｆ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞に哺乳動物発現ｃＤＮＡライブラリー［ｃＤＮＡはアルツハイマー病患者の脳試料（後頭の皮質）から調製し、ライブラリーは、エロンゲーションファクタープロモーターを持つ哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳを用いて構築した］（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２）をトランスフェクトし、この細胞をエクダイソンで７２時間処理し、生き残った細胞からプラスミドを回収した。この操作を３回繰り返し、最終的に約２５０クローンのプラスミドを得た。各プラスミドを用いたドットブロットハイブリダイゼーションにより、これらのクローンは互いにクロスハイブリダイズする３６のグループに分類された。最も大きいグループは２８のクローンからなっていた。
このグループのｃＤＮＡに着目し、各クローンのシークエンスを行った結果、このグループに属するクローンは総合すると、５’配列はＷｎｔ−１３の非コード領域と相同性があり、３’配列はミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡと相同性があり、Ｃ末端にポリＡ領域を持つ１５３５ｂｐの融合配列からなるｃＤＮＡをコードしていた。この配列全体は新規なものであった（図１）。各クローンの配列を決定したのち、各クローンの一過的なトランスフェクションが、ｐＩＮＤ−Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰをコトランスフェクトしたＦ１１／ＥｃＲ細胞のエクダイソンにより誘導される細胞死を有意に抑制するかについてアッセイを行った。細胞死抑制活性を示した各々の配列を比較した結果、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死をアンタゴナイズする活性は、新規な２４アミノ酸のポリペプチド「ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ」（配列番号：５）をコードする７５ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（５’−ＡＴＧＧＣＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡ−３’／配列番号：４）によりコードされていることが判明した。本発明者は、この分子をＨｕｍａｎｉｎ（ＨＮ）と名付けた。
［実施例２］  ＦＡＤ遺伝子により誘導される細胞死における各クローンの抑制効果
図２〜４は、このグループに属する各クローンをコトランスフェクトしたときの効果を示す。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞（ＥｃＲとＲＸＲとを安定に発現するＦ１１クローンで、エクダイソンによりｐＩＮＤプラスミドによりコードされる遺伝子の発現が誘導される）にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐＩＮＤを一過的にトランスフェクトしたところ、エクダイソンの非存在下（Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ非誘導条件）では、７２時間後に約２０％の細胞が細胞死を起こしたのに対し、エクダイソンの存在下（Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ誘導条件）では、有意に高い割合（５０〜６０％）の細胞が細胞死を起こした（図２）。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐＩＮＤに加え、ＤＴ６３をコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトすると、エクダイソン存在下でも、エクダイソンにより誘導される細胞死の有意な増加は観察されなかった。これとは対照的に、ｐＥＦ−ＢＯＳ、またはＤＴ１７１をコードするｐＥＦ−ＢＯＳを細胞にトランスフェクトした場合には、エクダイソンに応答した細胞死の有意な増加が観察された。図３は、単純な一過的トランスフェクションを用いて４つの各ＦＡＤ遺伝子（Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、およびＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２）により誘導される神経細胞死におけるＤＴ６３の効果を確認した結果である。各ＦＡＤ遺伝子（Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２  ｃＤＮＡ）をコードするｐｃＤＮＡのいずれかに加え、空のｐＥＦ−ＢＯＳをＦ１１細胞にコトランスフェクションした場合、７２時間のインキュベーションにより５０〜７０％の細胞が細胞死を起こした。この条件におけるトランスフェクションの効率は約６０〜７０％であるため、各ＦＡＤ遺伝子を発現する細胞の大部分が、トランスフェクト後７２時間で細胞死を起こしたことになる。Ｆ１１細胞に、各ＦＡＤ遺伝子に加え、ＤＴ６３をコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトした場合、細胞死の増加は劇的に抑えられた。このことは、ＤＴ６３  ｃＤＮＡが４つのＡＤ遺伝子により誘導される細胞死すべてを、高い効率でアンタゴナイズすることを示している。図４は、ＨＮの全配列を含む他のＤＴクローンや全配列を含まない他のＤＴクローン（ＤＴ２９、ＤＴ４４、およびＤＴ１７１  ｃＤＮＡ）の効果を示す。ＨＮの全配列をコードするクローンであるＤＴ２９およびＤＴ４４では、各ＦＡＤ遺伝子により誘導される細胞死の顕著な抑制が認められたが、ＨＮの第一ＡＴＧコドンを持たないＤＴ１７１では、細胞死をアンタゴナイズする作用は認められなかった。これらのデータは、ＨＮがコードするＯＲＦが、４つのすべてのＦＡＤ遺伝子による細胞死から神経細胞を保護することを示している。
そこで本発明者は、ＨＮ  ｃＤＮＡをｐＦＬＡＧベクターへサブクローニング（ｐＨＮ）し、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、およびＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２の各々のＦＡＤ遺伝子による神経細胞死に対するｐＨＮの効果を直接調べた。予想された通り、Ｆ１１細胞に対するｐＨＮのトランスフェクションは、毒性をほとんど示さないばかりか、各ＦＡＤ遺伝子による毒性を解消させた（図５）。このアンタゴナイズ活性は、ｐＨＮにより各ＦＡＤ遺伝子の発現が抑制されたことによるものではない。なぜなら、ｐＨＮのコトランスフェクションは、ＣＭＶプロモーターにより発現するＥＧＦＰの発現を変化させなかったことから（データ省略）、コトランスフェクトされたｐＨＮは、同じＣＭＶプロモーターから発現される各ＦＡＤ遺伝子の発現を変化させないことが示されたからである。さらに、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、およびＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２のイムノブロッティングによっても、各遺伝子の発現にｐＨＮのコトランスフェクションがほとんど影響を与えないことが確認された（データ省略）。
［実施例３］  ＨＮの細胞外分泌
実験の過程で、ｐＨＮをトランスフェクトしたＦ１１細胞の培養上清（ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ）には、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰを含むＦＡＤ遺伝子により誘導される細胞死を有意に抑制する活性があることが判明した。新鮮な培地または空のベクターであるｐＦＬＡＧをトランスフェクトしたＦ１１細胞の培養上清（ＣＭ／Ｆ１１−ｖｅｃ）の存在下でＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＦ１１細胞では高率で細胞死が誘導されたのに対し、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ存在下でＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＦ１１細胞では、細胞死が劇的に減少した（図６）。同じことがＤＴクローンについても観察された。ＣＭ／ＤＴ２９およびＣＭ／ＤＴ６３はＶ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導されるＦ１１細胞の細胞死を完全に抑制したが、ＣＭ／ＤＴ１７１は抑制しなかった。これは、ＨＮまたはＨＮをコードするｃＤＮＡから転写されるＨＮポリペプチドは、培養液中に分泌され、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる誘導される細胞死を抑制することを示唆している。図７は、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ中のＨＮの免疫反応性を抗ＦＬＡＧ抗体で調べた結果を示している。ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮおよびｐＨＮをトランスフェクトした細胞のライセートには、ＨＮの免疫反応性を示す３〜４ｋＤａの単一のバンドを含んでおり、ＦＬＡＧ融合ＨＮの予想される分子量（３８３７Ｄａ；図７左および中央）に一致していた。合成  ＦＬＡＧ融合ＨＮポリペプチド（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡＧＴＤＹＫＤＤＤＤＫ：下線はＦＬＡＧタグ）（配列番号：６）を用いて濃度を決定した結果、ＨＮはＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ中に８〜９μＭの濃度で含まれていることがわかった（図７右）。これらの知見は、ＨＮはｐＨＮから転写され培養上清中に分泌されることを示している。
［実施例４］  ＨＮはシグナル配列様の活性をコードしている
ＨＮ配列の全２４アミノ酸中のＮ末端の２３〜２４残基は、シグナル配列の必要条件を満たしている（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２，３−９；決定のためのプログラムは〈ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／〉から提供されている）。細胞内で発現したＨＮがμＭの濃度で培養液中に分泌される事実から、シグナル配列活性そのものではないが、シグナル配列に似た活性がＨＮに含まれていることが示唆される。ＦＬＡＧタグはＣ末端に位置しており、分泌されたＨＮポリペプチドはＦＬＡＧ融合ＨＮに予想されるサイズと一致する分子量を保持していることから、ＨＮの配列全体がシグナル配列様の分泌活性をコードしていることが示唆される。
これを確認するため、ＨＮ配列のシグナル配列としての性質を計算上失わせるＬ９Ｒ変異が、ＨＮの分泌に影響するかを調べた。予想通り、Ｌ９Ｒ  ＨＮ変異体（ＨＮＲ）（配列番号：７）はこれをコードするｃＤＮＡのトランスフェクションにより細胞の内側で発現したが、培養上清中には分泌されなかった（図８上）。この結果は、ＨＮ配列のシグナル配列様の分泌活性は、ＨＮの一次構造に書き込まれていることを証明する。これとは別に、ＨＮ配列をＥＧＦＰのＮ末端に融合（ＨＮ−ＥＧＦＰ）させ、ＨＮのシグナル配列活性を直接的に調べた。Ｎ末端にＨＮを融合させたＥＧＦＰはトランスフェクトされた細胞の培養上清に分泌されたが、もともとのＥＧＦＰは細胞外に全く分泌されなかった（図８下）。Ｎ末端にＨＮＲを融合させたＥＦＧＰは、ＥＧＦＰ同様、全く分泌されなかった。これらのデータから、ＨＮそのものがシグナル配列様活性をコードしていることが実証された。このように、ＨＮはシグナル配列様分泌活性と生物学的活性とを同時にコードしているユニークな分泌蛋白質である。
［実施例５］  Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死における合成ＨＮポリペプチドの抑制効果
本発明者は次に、合成ＨＮポリペプチドＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号：５）を合成し、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞死において、このポリペプチドを細胞外から加えた場合の作用を調べた。Ｆ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトし、１０μＭの合成ＨＮポリペプチド（ｓＨＮ）存在下で培養したところ、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死は劇的に抑制された（図９）。１０ｎＭ  ｓＨＮでは極弱い抑制を示すのみであったが、抑制作用は添加するｓＨＮの濃度に依存しており、１〜１０μＭのポリペプチドのレベルで完全な抑制に達した。ＩＣ５０値は約１００ｎＭであった。この用量依存曲線は、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ中に分泌されたＨＮが約１０μＭのレベルでＶ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死を効果的に抑制した事実と一致している。
［実施例６］  Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死におけるＨＮポリペプチドおよびその構造的誘導体の抑制効果
本発明者はさらに、ｓＨＮの細胞死抑制作用が特異的な一次構造によるものであるのかを検討した（図９）。ポリペプチドとしてＳ１４Ｇ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ：下線のＧはＳから置換されている；ＨＮＧと称す）（配列番号：８）を用いると、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死に対し、１０ｎＭ以下の濃度において完全なアンタゴナイズ効果が認められ、ＩＣ５０は約１００ｐＭであった。これに対して、Ｃ８Ａ  ＨＮポリペプチド（ＭＡＰＲＧＦＳＡＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ：下線のＡはＣから置換された；ＨＮＡと称す）（配列番号：９）は１００μＭまでの濃度において、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死を有意に抑制することはできなかった。８位のＣｙｓが重要であることは、８位のＣｙｓを介したＨＮのダイマー（Ｃ８−Ｃ８  ＨＮ）により得られた結果からも示唆された。Ｃ８−Ｃ８  ＨＮのアンタゴナイズ作用のレベルは、元々のＨＮとＨＮＡの中間であった。また、対照的に、ＨＮのＣ末端のＫＲＲＡをＡＡＡＡに置換した誘導体（配列番号：１０）は、元々のＨＮポリペプチドと同様の作用能を示した。これらの結果は、ＨＮの抑制活性に一次構造が本質的な役割をもつと共に、特定のアミノ酸残基が決まった役割を有していることを示している。
［実施例７］  ＦＡＤ遺伝子により誘導される細胞死におけるＨＮポリペプチドおよびその構造的誘導体の抑制効果
次に、他のＦＡＤ遺伝子、すなわちＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、およびＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２により誘導される細胞死に対するｓＨＮ、合成ＨＮＧ（ｓＨＮＧ）、および合成ＨＮＡ（ｓＨＮＡ）の効果を調べた。図１０に示したように、元々のｓＨＮは３つのＦＡＤ遺伝子のいずれにおいても同様の用量−応答特性を示し、１μＭの濃度で各ＦＡＤ遺伝子により誘導される神経細胞死を妨げた。ｓＨＮＡは１００μＭまでの濃度において、いずれのＦＡＤ遺伝子による細胞死もアンタゴナイズしなかった。これに対し、ｓＨＮＧは１０ｎＭ以下の濃度で、各ＦＡＤ遺伝子による細胞死を抑制する完全な活性を有していた。これは、ＨＮの作用はＳ１４Ｇの置換により１００から１０００倍に高められることを示している。Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される細胞死に対するｓＨＮＧの作用（図９）を合わせて考えると、ｓＨＮＧは１０ｎＭ以下の濃度で、４種の異なるタイプのＦＡＤ遺伝子により誘導される神経細胞死を、完全にアンタゴナイズすることができると結論される。
［実施例８］  ＨＮおよびその構造的誘導体を発現するベクターの導入による細胞死抑制効果
合成ポリペプチドで得られたデータを確認するため、次にＨＮＧまたはＨＮＡをコードするプラスミド（それぞれｐＨＮＧまたはｐＨＮＡ）の細胞死抑制効果を、ｐＨＮと比較して調べた。図１１に示したように、ｐＨＮＧのコトランスフェクションは、ｐＨＮの場合と同様に、４種すべてのＦＡＤ遺伝子により誘導される細胞死を完全に抑制した。これとは対照的に、ｐＨＮＡのコトランスフェクションでは、ＨＮＡポリペプチドは、ｐＨＮおよびｐＨＮＧの場合と同様に産生され、培地中に分泌されている（図７）にも関わらず、いずれのＦＡＤ遺伝子により誘導される細胞死も抑制しなかった。各プラスミドから得られたこれらのデータは、先に述べたポリペプチドの解析結果を支持しているのみならず、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮＧ（ｐＨＮＧをトランスフェクトしたＦ１１細胞の培養上清）中のＨＮＧ濃度は１０ｎＭを超えていることを示唆している。これに一致して、イムノブロット解析では、ｐＨＮＧをトランスフェクトしたＦ１１細胞からの培養上清（ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮＧ）にはＨＮＧポリペプチドが約１０μＭ含まれていた（図７右）。これらのデータは、ＨＮの細胞死抑制活性はその特異的なアミノ酸構造により決定されており、細胞外から添加されたＨＮポリペプチドによる細胞死抑制作用は、細胞内で発現されたＨＮ  ｃＤＮＡによっても再現され得ることを示している。
［実施例９］  ＨＮの細胞死抑制効果の特異性
ＨＮの作用の特異性を明らかにするため、次にＨＮ  ｃＤＮＡまたはＨＮポリペプチドが、他の神経変性疾患の原因遺伝子により誘導される細胞死をアンタゴナイズすることができるかを調べた。７２回の繰り返しを持つポリグルタミンＱ７９は、ハンチントン病（ＨＤ）や、ある種の脊髄小脳性運動失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｚｉａ；ＳＣＡ）の原因になっていると考えられている（Ｉｋｅｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３，１９６−２０２；Ｋａｋｉｚｕｋａ，Ａ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０，２８５−９０）。Ｑ７９の発現が神経細胞の細胞死を引き起こすことが報告されているように、Ｑ７９の発現によりＦ１１細胞は細胞死を起こした（図１２）。エクダイソンにより発現が誘導されるＱ７９プラスミド（ｐＤＮ−Ｅ／Ｇ５Ｈ−Ｑ７９）をＦ１１／ＥｃＲ細胞にトランスフェクトし、エクダイソンの存在下または非存在下で神経毒性の試験を行った。この系において、ｐＤＮ−Ｅ／Ｇ５Ｈ−Ｑ７９を空ベクター（ｐＦＬＡＧ）と共にＦ１１／ＥｃＲ細胞にトランスフェクションした場合は、エクダイソン処理に応答して細胞死の比率は顕著に増加した（図１２Ａ）。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、ｐＤＮ−Ｅ／Ｇ５Ｈ−Ｑ７９をｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡと共にトランスフェクトした場合でも、エクダイソン処理により、同じように高い比率の細胞死が誘導された。これに対し、エクダイソンにより誘導されるいずれのＦＡＤ遺伝子の発現により引き起こされるＦ１１／ＥｃＲ細胞の細胞死も、ｐＨＮのコトランスフェクションにより効果的に抑制された（図１２Ｂ）。ｓＨＮを用いた実験においても、Ｑ７９により誘導される細胞死は抑制されなかった（図１２Ｃ）。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞にｐＤＮ−Ｅ／Ｇ５Ｈ−Ｑ７９をトランスフェクトした場合、４種のＦＡＤ遺伝子によるＦ１１／ＥｃＲ細胞の細胞死をｓＨＮやｓＨＮＧが完全に抑制できる濃度のｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの存在下においても、非存在下における場合と同様、エクダイソンによって大幅な細胞死が引き起こされた（図１２Ｄ）。
本発明者はまた、家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；家族性ＡＬＳ）に関連したＣｕ／Ｚｎ依存性スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ１）のＡ４Ｔ、Ｇ８５Ｒ、またはＧ９３Ａ変異体により誘導される神経細胞死に対するＨＮの効果を調べた。家族性ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体の発現が哺乳動物神経細胞の細胞死を引き起こすという以前の報告（Ｒａｂｉｚａｄｅｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，３０２４−８；Ｇｈａｄｇｅ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，８７５６−６６）と一致して、これらすべての変異体において、それぞれの変異体を発現するｃＤＮＡをＦ１１細胞にトランスフェクトすることにより、有意に細胞死が引き起こされた。そして、各ＳＯＤ１変異遺伝子に加え、ｐＨＮをＦ１１細胞にコトランスフェクトした場合でも、同様の高い細胞死が誘導された（図１３Ａ）。図１３Ｂに示したように、１００μＭのｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡのいずれによっても、各家族性ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体による細胞死の抑制は認められなかった。これらのデータは、ＨＮはＦＡＤ遺伝子により触発される細胞死実行機構を抑制する細胞内機構を活性化するが、他の神経変性疾患遺伝子による細胞死には機能しないことを示唆しており、ＨＮ  ｃＤＮＡおよびＨＮポリペプチドのアンタゴナイズ効果は、ＡＤに関連する神経細胞死に共通かつ特異的であることを証拠付ける。
［実施例１０］  初代神経培養の細胞死におけるＨＮの抑制効果
本発明者は、ＨＮによる、初代培養神経のＡＤに関連する傷害からの保護について調べた。Ａβは老人斑の主要なペプチド成分で、ＡＤ脳を病理学的に特徴付ける細胞外沈着物であり、ＡＤの病理機構に関与していると言われている（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３，４３８−４７；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５１，Ｓ２−１７；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  Ｓ６５−６７）。Ａβ処理は初代培養神経の細胞死を引き起こすことが報告されている（Ｌｏｏ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，７９５１−７９５５；Ｇｓｃｈｗｉｎｄ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，Ｇ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５，２９２−３００）。図１４に示すように、初代培養皮質神経を２５μＭのＡβ１−４３で４８〜７２時間処理すると、Ｎ２サプリメントの存在下または非存在下にて、軸索の異栄養変化（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ）を伴う広範な細胞死が引き起こされた。初代培養神経を１０μＭのｓＨＮで前処理すると、Ａβで誘導される細胞死と共に軸索の異栄養変化が劇的に抑制された。Ａβ１−４３処理により、トリパンブルー排除で測定した細胞死（図１５左パネル）と、細胞から放出されたＬＤＨにより測定した細胞傷害（図１６）が観察されたが、１０μＭのｓＨＮ処理により、細胞の生存を示すこれらの指標はベーサルな状態で観察されたレベルに完全に回復した。同じ条件で、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦは、Ａβにより誘導される神経細胞の生存およびＬＤＨ放出の増加をアンタゴナイズする効果はなかった（データ省略）。Ａβにより誘導される神経細胞死のアンタゴナイズにｓＨＮが劇的な効果をあげたのに対して、１０μＭ  ｓＨＮで神経を同様に処理しても、初代培養神経に対する２０μＭのエトポサイド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）の毒性を防ぐことはできなかった（図１５右パネルおよび図１６）。エトポサイドは抗癌剤であり、初代培養神経の細胞死を引き起こすことが報告されている（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６４１，３５０−２）。これらの知見は、ＨＮはＡβ１−４３により誘導される神経細胞死を、選択的な機構でアンタゴナイズするという考えを支持する。Ｆ１１細胞を用いたＦＡＤ遺伝子の実験で指摘したのと同様に、１０ｎＭ  ｓＨＮＧは、Ａβ１−４３による細胞死および軸索の異栄養変化から神経を完全に保護したが、１０ｎＭ  ｓＨＮまたは１０μＭ  ｓＨＮＡは、いずれもＡβの神経毒性に対し効果を示さなかった（図１４）。これらのデータは、細胞傷害のアッセイであるＬＤＨ放出アッセイ（図１６）およびトリパンブルー排除アッセイ（図１５）により確かめられたのみならず、生細胞のアッセイであるカルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）染色アッセイ（図１７および１８）によっても確かめられた。このように、ＨＮは初代培養神経においても、クローン化された神経細胞における場合と同様に効果を有していることが示された。さらに、これらのデータから、ＨＮの構造を特異的に認識する受容体（群）が、Ｆ１１細胞と初代培養神経に共��して存在していると考えることができる。
［実施例１１］  ＨＮ  ｍＲＮＡの発現
β−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡをポジティブコントロールとして、様々な組織におけるＨＮ  ｍＲＮＡの発現を調べた。ヒト組織のノーザンブロット解析により、ＨＮ  ｍＲＮＡは心臓、骨格筋、腎臓、および肝臓において顕著に発現していることが判明した（図１９ａ）。それより少ないが、依然として有意な発現が脳および消化管（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ）に認められた。胸腺、脾臓、および末梢血白血球を含む免疫系にはほとんどｍＲＮＡは検出されなかった。発現している主要なｍＲＮＡのサイズは約１．６ｋｂであり、これは、ＨＮを含む最も長いＤＴ  ｃＤＮＡの予想されるサイズに相当する。約３ｋｂおよび約１ｋｂのサイズの異なるｍＲＮＡも存在した。ＨＮの３’領域をコードし、ＨＮをコードしていないＤＴ７７（図１参照）をプローブにした場合も、またＨＮの−４４０から−４２２の５’領域に対するアンチセンスプライマー（ＧＧＧＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＣＧＣ／配列番号：１１）をプローブとした場合も、上記と同様の結果が得られ、これら全てのバンドが検出されたことから、これらのｍＲＮＡは全長ＨＮ  ｍＲＮＡとそのスプライシングバリアントであると予想される。ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーから、本発明者はＤＴ４４の位置と事実上同一であり、１ｋｂｐを超えるｃＤＮＡを幾つか単離した。マウス組織においても、以下の点を除き類似した結果を得た（図２０）。第一点はマウスの骨格筋および肝臓はヒト組織に比べＨＮ  ｍＲＮＡ量が少なかったことである。しかしながら、他のマウスの骨格筋および肝臓のＨＮ  ｍＲＮＡは多かった（データ省略）ことから、量的な差異は個体の条件が影響することが考えられる。第二点は、マウス心臓および腎臓において、１ｋｂの小さなｍＲＮＡが、１．６ｋｂのものと同等かそれ以上発現していることである。マウス脳、心臓、および骨格筋では特異的に、約０．４ｋｂのｍＲＮＡがさらに発現していた。脳の発現領域を詳しく解析した結果、脳の各領域の中では、小脳および後頭葉で比較的多量のｍＲＮＡが発現していた。これらの結果は、ＨＮ  ｍＲＮＡは主に中枢神経系以外の器官で産生されていることを示している。このことからして、ＨＮは血流に分泌され脳神経に運ばれている可能性が考えられる。または、脳内で局所的に合成されるＨＮが保護作用を発揮する可能性も想定される。これに関しては、ＡＤ脳で神経細胞死に対し最も抵抗力を示す領域である小脳および後頭葉でＨＮ  ｍＲＮＡが最も合成されていることは興味深い。
［実施例１２］  ＨＮの分泌欠損変異体の効果
これまでのデータから、細胞外から加えたＨＮポリペプチドが細胞の外側から作用することは明白であるが、細胞表面から取りこまれたＨＮポリペプチドが細胞内部で効果を発揮している可能性は否定できない。初代培養神経のＡβ１−４０による細胞死が、小胞体（ＥＲ）に存在する主要なカスパーゼであるｃａｓｐａｓｅ−１２により媒介されるという報告（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，９８−１０３）があるように、ＨＮがＥＲ内で作用している可能性も考えられる。もしそうであるなら、ＥＲで合成されたＨＮはｉｎ  ｓｉｔｕで防御シグナルを生成できることになる。そこで、分泌欠損型変異Ｌ９Ｒ  ＨＮを用いてこれを検証した。
Ｆ１１細胞にＶ６２１Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡとＬ９Ｒ  ＨＮ（ＨＮＲ）ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、Ｖ６２１Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡを単独でトランスフェクトした細胞と同様の強い細胞死が観察された（表１右レーン）。Ｖ６２１Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡとＨＮＲ  ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の細胞死は、培養液にｓＨＮが存在すると完全に抑制されることから、細胞内で発現されたＨＮＲに防御活性がないことがさらに確認された。これとは対照的に、細胞外からｓＨＮＲを添加すると、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡを同じ条件でトランスフェクトしても細胞死が誘導されないことが判明した（表１左レーン）。ＨＮＲ  ｃＤＮＡからＥＲで翻訳されたＨＮＲは培養液中には分泌されない（図８上パネル）ので、ＨＮが持つ細胞をレスキューする機能には、ＨＮポリペプチドが細胞内ではなく細胞外に存在する必要があることになる。これらのデータは、ＨＮは細胞の外側から作用することによってのみその効果を発揮できることを示している。
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（Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトする時に、ｐＦＬＡＧまたはｐＨＮプラスミド（右）を同時にコトランスフェクトするか、または１０μＭ  ｓＨＮポリペプチド（左）で処理した。７２時間培養後、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死（％）を測定した。値は３回の独立したトランスフェクションおよび処理の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。＊：Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる細胞死に対して有意な抑制（ｐ＜０．０１）、＊＊：Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる細胞死に対して有意な抑制なし）
［実施例１３］  ＨＮの防御活性における詳細な構造／機能関係
ＨＮの一次構造と防御活性との詳細な関係性を調べた。図２１は欠失したＨＮポリペプチドがＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをアンタゴナイズするかを解析した結果を示している。Ｆ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトし、１０μＭのＨＮ誘導体の存在下で培養した。この系において、ＨＮポリペプチドのＮ末端から２残基を欠失させても、細胞保護活性にはほとんど影響がなかった。これに対し、Ｎ末端から３残基を欠失させるとＨＮの活性は消失した。このことは、Ｎ末側の最末端のＭｅｔ−Ａｌａはなくてもよいが、３番目のＰｒｏは活性に本質的であることを示唆する。同様のＣ末端側の欠失実験により、図２１に示すように、ＨＮの完全な保護活性を維持するためには、Ｃ末側最末端のＶａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａはなくてもよいが、１９番目のＰｒｏは活性に本質的であることが判明した。従って、最大の活性のために必要な最少の領域はＰｒｏ３−Ｐｒｏ１９であり、これをＨＮ−１７（配列番号：２１）と名付けた。
図２２の左上パネルは、４つのＦＡＤ遺伝子による神経細胞死に対する、Ｎ末端の３残基を欠失したＨＮ（ΔＮ３）およびＨＮ−１７の効果を示している。ＨＮ−１７は、上記のＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ以外の３つのＦＡＤ遺伝子による細胞死に対しても、十分にアンタゴナイズする活性を示すのに対し、ΔＮ３ペプチドはいずれの遺伝子に対しても活性を示さなかった。図２２の他のパネルは、４つのＦＡＤ遺伝子の各々による神経細胞死における合成ＨＮ−１７の効果の用量応答関係を示す。Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１による細胞死の抑制に対しては、もともとのＨＮに比べＨＮ−１７は僅かに活性が低下しより高い濃度を必要としたものの、低μＭのＨＮ−１７は４つのＦＡＤ遺伝子による細胞死全てに対し共通して、十分な保護作用を発揮した。この結果は、Ｎ末端の２残基およびＣ末端の５残基は、この共通した保護作用には必要ではないことを示唆している。
ＨＮ−１７の保護作用にその残基が本質的であるのかをさらに検証した。まず、Ｓ１４ＧのＨＮ−１７（ＨＮＧ−１７）（配列番号：２４）１０ｎＭが、１０ｎＭのＨＮＧを用いた場合と同様、４つのＦＡＤ遺伝子によるＦ１１細胞の細胞死、およびＡβ１−４３による初代培養神経の細胞死を完全にアンタゴナイズできることが確認された。次に、ＨＮＧ−１７のＰｒｏ３からＰｒｏ１９までの各残基を１つずつＡｌａに置換したＨＮＧ−１７誘導体（配列番号：２５〜４１）を合成し、２５μＭ  Ａβ１−４３による初代培養神経の細胞死における効果を調べた。図２３は、Ａｌａに置換した各ＨＮＧ−１７誘導体の細胞死抑制効果の試験結果である。細胞死の値を示すグラフの下に置換残基を示した。この試験の結果、Ａβにより誘導される細胞死からの神経保護に本質的な以下の７残基が明確に同定された：３番目のＰｒｏ、８番目のＣｙｓ、９番目のＬｅｕ、１２番目のＬｅｕ、１３番目のＴｈｒ、１４番目のＧｌｙ（もともとはＳｅｒ）、および１９番目のＰｒｏ。この試験は、他の残基の役割を否定するものではないが、それらの残基は防御活性に影響を与えることなくＡｌａに置換することが可能であった。３番目のＰｒｏ、８番目のＣｙｓ、１４番目のＧｌｙ、および１９番目のＰｒｏが不可欠であることは、ＨＮ欠失実験（図２１）および前述のＨＮのアミノ酸残基置換実験（図９および１０）で得られたデータとも一致している。１４番目のＳｅｒをＡｌａに置換すると防御活性が失われるにも関わらず、Ｇｌｙに置換すると防御活性が高まることは注目に値する。このことから、特定の残基および側鎖の軽度の変化が、Ａβ１−４３に対するＨＮの防御活性を上昇させたり下降させたりすることが示された。
図２３の他のパネルは４つのＦＡＤ遺伝子の各々によるＦ１１神経細胞の細胞死に対するＨＮＧ−１７のＡｌａ置換体（Ａｌａ−ｓｃａｎｎｅｄ  ＨＮＧ−１７）の効果を調べた結果を示している。このデータから、アンタゴニズムに本質的役割を果たす残基は、Ａβにより誘導される初代培養神経に対するアンタゴニズムにおいて得られた結果と全く同一であることが明らかとなった。これは、ＨＮが、ＡＤの傷害の幅広いスペクトラムにおいて、共通の機構を介して神経細胞を保護することを示唆している。これら７つの本質的な残基は、細胞表面の特定の機構（受容体等）に認識されるのに必要なある種の２次構造を維持している可能性がある。
ＨＮおよびＨＮＧの活性の高い能力と共に、その活性が一次構造に厳格に依存している事実は、特異的受容体の存在を示唆している。これを支持するように、４つのＦＡＤ遺伝子およびＡβ１−４３により引き起こされる神経細胞死に対するＨＮのアンタゴニズムは、上記のように互いに非常に類似した用量応答特性を示した。このことは、ポジティブ（Ｓ１４Ｇ）およびネガティブ（Ｃ８Ａ）な機能を持つＨＮ誘導体のいずれにも当てはまる。詳細な構造／機能関係の解析により、これら様々なＡＤ傷害に対するアンタゴニズムに必須なＨＮの領域および残基は正確に一致することが実証された。さらに、分泌能欠損型の変異体の実験により、ＨＮが細胞外に分泌されることが、防御活性の発揮に必須であることが明らかとなった。これらのデータは、ＨＮの作用が細胞の外側から特異的な細胞表面受容体介していることを示している。
［実施例１４］  ＨＮＧのＣ８置換体の作製
ＨＮペプチドは第８残基にシステイン（Ｃｙｓ）を持ち、上記の通り、このＣｙｓをアラニン（Ａｌａ）に置換すると活性を失った。また、ＨＮペプチドにおいて、８位のＣｙｓにおけるＳＨ基を失ったｓＨＮのダイマー型（Ｃ８−Ｃ８）では細胞死のアンタゴナイズ活性が低下した。このことは、ＨＮペプチドの８位に対応するＣｙｓ残基のＳＨ基の修飾は、細胞死のアンタゴナイズ活性に影響を与えることを示唆している。血中や人体組織中には、Ｃｙｓ残基のＳＨ基を修飾し得る酵素が多数存在していることから、ポリペプチドを臨床応用するためには、Ｃｙｓ残基を含まないポリペプチドか、またはＣｙｓ残基のＳＨ基の修飾がポリペプチドの活性に影響を与えないものであることが好ましい。そこで、ポリペプチドＨＮＧの８位のＣｙｓを他のアミノ酸に置換した変異ポリペプチドを作製し、これらのポリペプチドの細胞死アンタゴナイズ活性を測定した。
Ｆ１１細胞をそのまま、またはＦ１１細胞にＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ  ｃＤＮＡ（１μｇ）をトランスフェクトし、８位のＣｙｓ（Ｃ８）を他の可能な１９アミノ酸残基のうちの１つに置換したＨＮＧ変異ポリペプチド（１０ｎＭ）のいずれかで処理した。トランスフェクション開始の７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死の比率を測定した。その結果、Ｃ８をＨｉｓ（配列番号：４６）、Ｌｙｓ（配列番号：４８）、またはＡｒｇ（配列番号：５４）といった塩基性アミノ酸に置換した場合に、有意な神経細胞死抑制活性を示すことが判明した（図２４上パネル）。
次に、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ  ｃＤＮＡ以外の他のＦＡＤ遺伝子による細胞死誘導に対するアンタゴナイズ活性を調べた。Ｆ１１細胞をそのまま、または１μｇのＦＡＤ遺伝子（Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ−２  ｃＤＮＡ）をトランスフェクトし、Ｃ８を他のアミノ酸に置換したＨＮＧ変異ポリペプチド（１０ｎＭ）のいずれかで処理した。トランスフェクション開始の７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死の比率を測定した。その結果、やはりＣ８をＨｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇといった塩基性アミノ酸に置換したＨＮＧ変異ポリペプチドはＦ１１細胞の神経細胞死を阻害する活性を示し、その特性はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ  ｃＤＮＡのトランスフェクションで見られたものと同様であった（図２４中央パネル）。
さらに、初代培養皮質神経のＡβによる細胞死に対する効果も検証した。初代培養皮質神経を、Ｃ８を他のアミノ酸残基に置換したいずれかのＨＮＧ変異ポリペプチド（１０ｎＭ）の存在下、２５μＭのＡβ１−４３で処理した。Ａβ処理開始の７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死の比率を測定し、カルセイン染色による生細胞のアッセイを行った。その結果、Ｃ８のＨｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ置換体は、上記と同様に初代培養皮質神経のＡβによる細胞死を抑制する活性を示した（図２４下パネル）。いずれの細胞死に対しても、Ｃ８をＬｙｓまたはＡｒｇに置換したＨＮＧ変異ポリペプチドは、もともとのＨＮＧポリペプチドと同等の強い神経細胞死抑制活性を示し、Ｃ８のＨｉｓ置換体では、細胞死抑制活性の僅かな低下が見られた。これらの結果は、本発明のポリペプチドのＣｙｓ残基はＳＨ基を持たない他のアミノ酸に置換可能であり、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ等の塩基性アミノ酸への置換、特にＬｙｓまたはＡｒｇへの置換が有用であることが明らかとなった。
［実施例１５］  ＨＮＧ誘導体の作製
ＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ  ＨＮ）の変異により、その作用をさらに高めることができるかを検証した。ＨＮＧの複数のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換して、その神経防御作用を調べた結果、ＨＮＧに対して２箇所を変異Ｒ４Ａ／Ｆ６Ａ（配列番号：６０）させると、ＨＮＧよりもさらに高いレスキュー活性を示すことを見出した。ＡＧＡ−ＨＮＧと名付けられたこのポリペプチドは、ＦＡＤ遺伝子による株化神経細胞の細胞死を僅か０．１ｎＭの濃度で完全にレスキューするのみならず、初代培養神経のＡβによる細胞死を０．３ｎＭの濃度で完全にレスキューした（図２５）。ＨＮＧの４番目のＡｒｇおよび６番目のＰｈｅは、それぞれトリプシン様プロテアーゼおよびキモトリプシン用プロテアーゼにより切断され得る部位（図２５Ａ参照）であるため、Ｒ４Ａ／Ｆ６Ａの置換によりＨＮＧは分解に対してより抵抗性となる可能性が高い。ＡＧＡ−ＨＮＧは、その濃度よりも約１０００００倍もの高濃度のＡβの神経毒性を解消させるという事実は、ＡＧＡ−ＨＮＧがこれまでにない高い作用を持つことを意味している。このように広いスペクトラムを持ち、高い神経保護作用を示す抗ＡＤ剤はこれまで全く報告されていない。ＡＧＡ−ＨＮＧまたはその誘導体は、ＡＤの化学療法への応用が期待される。
産業上の利用の可能性
本発明によって、アルツハイマーに関連する神経変性をアンタゴナイズする能力を有するポリペプチドＨｕｍａｎｉｎが提供された。該ポリペプチドは、４種のＦＡＤ遺伝子およびＡβにより誘導される神経細胞の細胞死をアンタゴナイズする能力を有する初めての分子であり、クローン化された神経細胞において、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、ＰＳ−１変異体、およびＰＳ−２変異体による細胞死を、そして初代培養神経においてＡβ１−４３による細胞死をアンタゴナイズできる。細胞外に作用し、既知のすべてのタイプの早発型ＦＡＤ遺伝子およびＡβをアンタゴナイズするという広いスペクトラムを持つ防御因子はこれまで全く同定されていない。特に、ＨＮＧが１０ｎＭ足らずでＡＤに関連する神経毒性を完全にアンタゴナイズするということは、アルツハイマーに関連する神経細胞死の機構解明に有用であると同時に、臨床応用の観点からも極めて有用である。ＨＮＧは防御作用の極めて高い作用能、汎用性、および厳格な特異性を有しており、ＨＮＧ、ＡＧＡ−ＨＮＧ、およびそれらから生み出される誘導体は、アルツハイマー病に関連する神経細胞死を予防する医薬として、また新たなアルツハイマー病治療薬開発のためのシード化合物として極めて有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｈｕｍａｎｉｎ  ｃＤＮＡクローンにおける、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる細胞死をアンタゴナイズする活性をコードする領域を示す図である。
ＤＮＡ断片を、最も長い配列（−９３４から６００；１番目の塩基はＨｕｍａｎｉｎ  ＯＲＦの最初の塩基に対応し、その１塩基前は−１である）に対して整列させた。Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導されるＦ１１／ＥｃＲ細胞の細胞死に対するそれらの活性を横に示す。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐＩＮＤ（１μｇ）と共に、１μｇのｐＥＦ−ＢＯＳまたはそれぞれのＤＮＡ断片をコードするｐＥＦ−ＢＯＳを３時間トランスフェクトし、続いてエクダイソンで７２時間処理した。トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。ｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトした細胞とそれぞれのＤＮＡ断片をトランスフェクトした細胞との間で、細胞死に統計的に有意な差があった場合、このＤＮＡ断片にはアンタゴナイズ活性があると判定し、”Ｙ”で示した。”Ｎ”は有意なアンタゴナイズ活性がなかったことを示す。
図２は、エクダイソンにより誘導されるＶ６４２Ｉ  ＡＰＰの発現による神経細胞死におけるＤＴ６３とＤＴ１７１クローンの効果を示す図である。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰプラスミドと共に、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＤＴ６３、またはＤＴ１７１（ＤＴ６３とＤ１７１はｐＥＦ−ＢＯＳにクローン化されている）をトランスフェクトし、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ（エクダイソン）処理を行った。エクダイソン処理を行わない群も設定した。エクダイソン処理の７２時間後、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。また、エクダイソン処理を行わない群も同様に測定した。図中のエラーバーのある数値は、３回の独立したトランスフェクションの結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ＤＴ６３とＤＴ１７１は図１に示されている。
図３は、ＦＡＤ遺伝子の発現により誘導される神経細胞死におけるＤＴ６３クローンの効果を示す図である。Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ｖｅｃ）またはＤＴ６３をコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。図中のエラーバーのある数値は、３回の独立したトランスフェクションの結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
図４は、ＦＡＤ遺伝子のトランスフェクションによるＦ１１細胞の細胞死におけるＤＴ２９、ＤＴ４４、およびＤＴ１７１クローンの効果を示す図である。図３と同様に、Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ｐＢＯＳ）またはＤＴクローンをコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。ＤＴ２９とＤＴ４４は図１に示されている。３つの実験を同時に行ったところ、ベーサルな細胞死の比率（トランスフェクションなし、ｐｃＤＮＡ＋ｐＢＯＳ）は共通していた。同様の実験は少なくとも３回行った。図中のエラーバーのある数値は平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
図５は、ＦＡＤ遺伝子の発現により誘導される神経細胞死における、ＨｕｍａｎｉｎをコードするプラスミドｐＨＮの効果を示す図である。Ｆ１１細胞に空ベクター（ｐｃＤＮＡ）またはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＦＬＡＧまたはＨＮをコードするｐＦＬＡＧ（ｐＨＮ）をトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。値は３回の独立した実験結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
図６は、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞死における、ｐＨＮをトランスフェクトしたＦ１１細胞からの培養上清の抑制効果を示す図である。Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐｃＤＮＡを血清非存在下で３時間トランスフェクトし、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２で２時間培養した後、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ（ＣＨ／ｐＨＮ）、ＣＮ／Ｆ１１−ｖｅｃ（ＣＭ／ｖｅｃ）、または新鮮な培地（１８％ＦＢＳを含む新しいＨａｍＦ−１２）で６７時間培養した。トランスフェクション７２時間後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。値は３回の独立した実験結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ｐ＜０．０１はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定による。
図７は、ｐＨＮをトランスフェクトしたＦ１１細胞の培養上清に含まれるＨＮポリペプチドの免疫反応性を示す写真である。左と中央のパネルは、細胞抽出液（３０μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および培養上清（２０μｌ）をＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った結果を示す（１：トランスフェクションなしの細胞；２：ｐＦＬＡＧをトランスフェクトした細胞；３：ｐＨＮをトランスフェクトした細胞）。右のパネルは、ｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清を同様に解析した結果である。右の３レーンは、培養上清中に含まれるＨＮポリペプチドのタイターを決定するために、図示した濃度のｓＨＮ−ＦＬＡＧ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡＧＴＤＹＫＤＤＤＤＫ：下線はＦＬＡＧタグ）（配列番号：６）のイムノブロットを行った結果を示す。同様の実験は４回以上繰り返した。
図８は、ＨＮポリペプチドおよびその変異体の細胞からの分泌を解析した結果を示す写真である。上パネル：Ｌ９Ｒ変異によりＨＮが細胞外に分泌されなくなることを示す図である。Ｆ１１細胞にｐＨＮ、ｐＨＮＡ、またはｐＨＮＲ（Ｌ９Ｒ  ＨＮをコードするｐＦＬＡＧ）をトランスフェクトし、７２時間後に細胞抽出液および培養上清を回収し、図７と同様に抗ＦＬＡＧ抗体を用いて解析した。
下パネル：ＨＮのシグナル配列様分泌活性を示す図である。ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ（レーン２）、ＨＮ−ＥＧＦＰ融合ｃＤＮＡ（レーン３）、またはＨＮＲ−ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ（レーン４）をＦ１１細胞にトランスフェクトし、７２時間後に細胞抽出液（左下パネル，１０μｇ／レーン）または培養上清（右下パネル，２０μｇ／レーン）を抗ＥＧＦＰポリクローナル抗体（１／２０００）およびＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（１／５０００）を用いたイムノブロットにより解析した。両パネルのレーン１はトランスフェクションを行わなかったＦ１１細胞由来の資料をブロットした結果を示す。左のバーに分子量をダルトンで示した。
図９は、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞死における、合成ＨＮ（ｓＨＮ）およびその構造的誘導体の効果を示す図である。Ｆ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐｃＤＮＡをトランスフェクトし、様々な濃度のｓＨＮ（元々のＨＮ）（配列番号：５）、ｓＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ）（配列番号：８）、ｓＨＮＡ（Ｃ８Ａ）（配列番号：９）、Ｃ８を介したｓＨＮのダイマー型（Ｃ８−Ｃ８）、および  Ｃ末のＫＲＲＡをＡＡＡＡに置換したｓＨＮ（ＫＲＲＡ２１／２２／２３／２４ＡＡＡＡ）（配列番号：１０）で処理した。トランスフェクション７２時間後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１０は、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、Ｎ１４１Ｉ  ＰＳ−２、またはＮＬ−ＡＰＰにより誘導される神経細胞死におけるｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの効果を示す図である。図９と同様に、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、Ｎ１４１Ｉ  ＰＳ−２、またはＮＬ−ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＦ１１細胞を、様々な濃度のｓＨＮ（元々のＨＮ）、ｓＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ）、またはｓＨＮＡ（Ｃ８Ａ）で処理した。トランスフェクション７２時間後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１１は、ＦＡＤ遺伝子の発現により誘導される神経細胞におけるｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡの効果を示す図である。Ｆ１１細胞に空ベクター（ｐｃＤＮＡ）またはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＦＬＡＧまたはＨＮをコードするｐＦＬＡＧ（ｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡ）をトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１２は、ポリグルタミンリピートＱ７９により誘導される神経細胞死におけるＨＮおよびその構造的誘導体の効果の欠如を示す図である。図は全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
Ａ：エクダイソンで誘導されるＱ７９の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡの効果の欠如。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型Ｑ７９発現プラスミドと共に、空ベクター（ｐＦＬＡＧ）、またはｐＨＮ、ｐＨＮＧ、もしくはｐＨＮＡをトランスフェクトし、エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｂ：エクダイソンで誘導されるＮＬ−ＡＰＰ、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｐＨＮのコトランスフェクションによる有意な抑制効果。Ａと同じ条件で、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型ＦＡＤ遺伝子プラスミドと共に、ｐＦＬＡＧまたはｐＨＮをトランスフェクトし、エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｃ：エクダイソンで誘導されるＱ７９の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの効果の欠如。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型Ｑ７９プラスミドをトランスフェクトし、１μＭのｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡで処理し、その後エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で培養した。エクダイソン処理開始の７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｄ：エクダイソンで誘導されるＮＬ−ＡＰＰ、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｓＨＮの有意な抑制効果。Ｃと同じ条件で、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型ＦＡＤ遺伝子プラスミドをトランスフェクトし、１μＭのｓＨＮで処理した後、エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で培養した。エクダイソン処理開始の７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
図１３は、ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体により誘導される神経細胞死におけるＨＮおよびその構造的誘導体の効果の欠如を示す図である。図は全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
Ａ：ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体の発現により誘導される神経細胞死における、ｐＨＮのコトランスフェクションの効果の欠如。Ｆ１１細胞に、ＡＬＳ関連変異ＳＯＤ１（ＳＯＤ１のＡ４Ｔ、Ｇ８５Ｒ、またはＧ９３Ａ変異体）をコードするｐＥＦ−ＢＯＳを、空ベクター（ｐＦＬＡＧ）、またはｐＨＮと共にトランスフェクトした。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｂ：ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体の発現により誘導される神経細胞死における、ｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの効果の欠如。Ｆ１１細胞に、Ａ４Ｔ、Ｇ８５Ｒ、またはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１をコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトし、１００μＭのｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡで処理した。その後、細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
図１４は、Ａβにより誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す位相差顕微鏡像を示す写真である。代表的な観察像を示した。初代培養皮質神経を、ｓＨＮ（１０ｎＭ，１０μＭ）、１０ｎＭ  ｓＨＮＧ、または１０μＭ  ｓＨＮＡの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３で７２時間処理した。Ａβ１−４３処理の開始１６時間前に、図示した最終濃度のＨＮポリペプチドを１回添加した。Ａβ１−４３の添加は、まず培地の半分を除去し、上記と同じ濃度のｓＨＮまたはｓＨＮＡと５０μＭのＡβ１−４３とを含む新鮮な培地を除去した培地と等量補充することによって行った。Ａβ処理しない未処理（ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の細胞も観察した。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。
図１５は、Ａβにより誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す図である。初代培養皮質神経を、図示した濃度のｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１４と同様に行った。Ａβ処理の開始から７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。これらの実験の際、ポジティブコントロールとして、初代培養神経を１０μＭ  ｓＨＮまたはＨＮ誘導体の存在下または非存在下、２０μＭのエトポサイドで７２時間同様に処理した。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１６は、Ａβにより誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す図である。培養液中に放出されたＬＤＨ量により細胞傷害性をモニターした。初代培養皮質神経を、図示した濃度のｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１４と同様に行った。Ａβ処理開始の２４、４８、または７２時間後に培養液中のＬＤＨ量を測定した。ＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で２０μＭのエトポサイドで処理した神経からのＬＤＨ放出も測定した。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１７は、Ａβ１−４３により誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す写真である。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色の結果を蛍光顕微鏡像で示す。初代培養皮質神経を、図示した最終濃度のＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１４と同様に行った。Ａβ１−４３処理の７２時間後にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色を行った。Ａβ処理しない未処理の細胞（ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）も観察した。細胞質における蛍光は生細胞であることを表す。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は代表的な結果を示す。
図１８は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色の蛍光測定の結果を示す図である。初代培養皮質神経を、図示した最終濃度のＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１４と同様に行った。Ａβ１−４３処理の７２時間後にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色を行い、蛍光強度を測定した。基底状態の蛍光強度は３６９６０（ｕｎｉｔ／ｗｅｌｌ）と計算され、これを各値から差し引いた。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１９は、ヒトの様々な組織中でのＨＮ  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。ヒト組織のポリＡ−ＲＮＡがブロットされたシートに放射標識したアンチセンスＨＮ（ａ）、５’領域をコードする１９ｍｅｒ（ｂ）、またはＤＴ７７（ｃ）をプローブとしてハイブリダイズさせた（１：脳、２：心臓、３：骨格筋、４：大腸、５：胸腺、６：脾臓、７：腎臓、８：肝臓、９：小腸、１０：膵臓、１１：肺、１２：末梢血白血球）。（ｄ）は同じシートを、β−ａｃｔｉｎをプローブにしてノーザンブロットを行った結果を示す。左側の数字は分子量サイズを示す。同様の実験は少なくとも３回行い、これと同様の結果を得た。
図２０は、マウス組織でのＨＮ  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。マウスの様々な器官から抽出したポリＡ−ＲＮＡ（２μｇ／レーン）を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ブロット後、標識したアンチセンスＨＮ（左上）またはβ−ａｃｔｉｎ（左下）をプローブにしてハイブリダイゼーションを行った（１：脳、２：心臓、３：骨格筋、４：胸腺、５：脾臓、６：腎臓、７：肝臓、８：小腸、９：胃、１０：皮膚、１１：肺）。
右のパネルはマウス脳におけるＨＮ  ｍＲＮＡの発現領域を示す図である。マウス脳の様々な領域由来のポリＡ−ＲＮＡがブロットされたシート（１：前頭葉、２：側頭葉、３：頭頂葉、４：後頭葉、５：小脳、６：肺）に、標識したアンチセンスＨＮ（右上）またはβ−ａｃｔｉｎ（右下）プローブをハイブリダイズさせた。シート間で量的な比較ができるように、左パネルと同じ量の肺由来のポリＡ−ＲＮＡをレーン６に泳動してハイブリダイゼーションを行った。
図２１は、ＨＮの防御活性における構造／機能関係の詳細な解析結果を示す図である。図はＶ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞の細胞死におけるＨＮ欠失誘導体の効果を示す。図９に示したように、各合成ＨＮ誘導体の存在下または非存在下でＦ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトし、７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。左上のパネルは、図示したようなＮ末端欠失ＨＮの試験結果を示す。右上のパネルは、図示したような、ΔＮ２  ＨＮのＣ末端欠失ポリペプチドの試験結果を示す。３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。このパネルに示された実験により得られた結果を下のパネルにまとめた。
図２２は、４種の異なるＦＡＤ遺伝子により引き起こされる神経細胞死におけるΔＮ３  ＨＮおよびＨＮ−１７の効果を示す図である。１０μＭのΔＮ３  ＨＮまたはＨＮ−１７の存在下または非存在下、Ｆ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２  ｃＤＮＡをトランスフェクトし、７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した（左上パネル）。右上のパネルと下のパネルは、ＦＡＤ遺伝子による神経細胞死の抑制におけるＨＮ−１７の効果の用量−応答曲線を示す。図のように段階的に濃度を増加させた合成ＨＮ−１７の存在下または非存在下で、Ｆ１１細胞に各ＦＡＤ遺伝子（Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２  ｃＤＮＡ）を同様にしてトランスフェクトした。７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。「ｎｏ  Ｔｘ」はＦＡＤ遺伝子をトランスフェクションしていない細胞の結果。各図は全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図２３は、４種の異なるＦＡＤ遺伝子およびＡβ１−４３により引き起こされる神経細胞死に対するＨＮＧ−１７のＡｌａ置換体（Ａｌａ−ｓｃａｎｎｅｄ  ＨＮＧ−１７）の効果を示す図である。１０ｎＭのＡｌａ置換されたＨＮＧ−１７の存在下または非存在下、初代培養神経を２５μＭのＡβ１−４３で処理（左上パネル）するか、またはＦ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２  ｃＤＮＡをトランスフェクト（他のパネル）し、７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。それぞれのＡｌａ置換ＨＮＧ−１７で細胞死アンタゴナイズ効果の検出を行った。置換残基はグラフの下に示している。それぞれのＡｌａ置換体のアミノ酸配列は、順に配列番号：２５〜４１に示した。例えば、左上パネルにおいて、１０ｎＭのＡＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＵＤＬＰ（下線を引いたＡはＰから置換された）（配列番号：２５）の存在下で初代培養神経を２５μＭ  Ａβ１−４３で７２時間インキュベートした場合、細胞死の比率は７５．３±４．４％（３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）で、Ａβ１−４３によるインキュベーションにおける細胞死の比率（７６．１±４．７％）と同等であった。１０ｎＭのＨＮＧまたはＨＮＧ−１７の存在下で神経を２５μＭ  Ａβ１−４３とインキュベートした場合は、細胞死の比率はそれぞれ２９．３±０．９％または２８．８±１．３％であり、基底状態における細胞死の比率（３０．０±１．６％）と同等であった。「ｎｏ  Ｔ」はＦＡＤ遺伝子をトランスフェクションしていない細胞、「ｖｅｃ」は空ベクターをトランスフェクトした細胞、「ｎｏ」はポリペプチドで処理していない細胞の結果を示す。各図は全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図２４は、ＨＮＧの８位のＣｙｓを他のアミノ酸に置換したＨＮＧ変異ポリペプチドの細胞死抑制効果を示す図である。
上パネル：Ｆ１１細胞をそのまま、またはＦ１１細胞にＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ  ｃＤＮＡ（１μｇ）をトランスフェクトし、Ｃ８を他の可能な１９アミノ酸残基のうちの１つに置換（図中、一文字表記で示した）したＨＮＧ変異ポリペプチド（１０ｎＭ）のいずれかで処理した。トランスフェクション開始の７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死の比率を測定した。「ｎｏ  Ｔ」はトランスフェクションなし、「ｖｅｃ」は空のｐｃＤＮＡベクターのトランスフェクションを表し、ポリペプチド処理を行わなかった結果を示している。「Ｃ」はもともとのＨＮＧを表す（配列番号：８）。「Ａ」はＨＮＡである（配列番号：９）。「Ｄ」〜「Ｙ」までのポリペプチドのアミノ酸配列は、順に配列番号：４２〜５９に示す。細胞死の比率の値は３回の独立の実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示した。全細胞中の死細胞の割合（％死細胞）を表す。
中央パネル：Ｆ１１細胞をそのまま、または１μｇのＦＡＤ遺伝子（左はＫ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ−ＡＰＰ；中央はＭ１４６Ｌ−ＰＳ−１：右はＮ１４１Ｉ−ＰＳ−２）をトランスフェクトし、Ｃ８を図示したアミノ酸残基に置換したＨＮＧ変異ポリペプチド（１０ｎＭ）のいずれかで処理した。トランスフェクション開始の７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死の比率を測定した。「ｎｏ  Ｔ」はトランスフェクションなし、「ｖｅｃ」は空のｐｃＤＮＡベクターのトランスフェクションを表し、ポリペプチド処理を行わなかった結果を示している。値は３回の独立の実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
下パネル：初代培養皮質神経を、Ｃ８を図示したアミノ酸残基に置換したいずれかのＨＮＧ変異ポリペプチド（１０ｎＭ）の存在下、２５μＭのＡβ１−４３で処理した。Ａβ処理開始の７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死の比率を測定し（左パネル）、カルセイン染色による生細胞のアッセイを行った（右パネル）。値は３回の独立の実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
図２５は、４種の異なるＦＡＤ遺伝子およびＡβ１−４３により引き起こされる神経細胞死に対するＡＧＡ−ＨＮＧ（配列番号：６０）の効果を示す図である。様々な濃度のＡＧＡ−ＨＮＧの存在下または非存在下、初代培養神経を２５μＭのＡβ１−４３で処理（パネルＢ）するか、またはＦ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２  ｃＤＮＡをトランスフェクト（パネルＣ〜Ｆ）し、７２時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。Ａβを用いた初代培養神経の実験においては、コントロールとして様々な濃度のＨＮＧを用いて同様の実験を行った。「ｎｏ  Ｔ」はトランスフェクションしていない細胞、「ｐｃＤＮＡ」は空ベクターをトランスフェクトした細胞の結果である。各パネルは全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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