(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｓｐ７０融合蛋白複合体を含む医薬組成物であって、該Ｈｓｐ７０融合蛋白複合体は第１部分と第２部分を含み、
該第１部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列からなるＨｓｐ７０蛋白のフラグメントであり；および
該第２部分は転写因子ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットである、医薬組成物。
【請求項２】
免疫抑制薬、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗生物質、および抗血管超増殖化合物（anti-vascular hyperproliferation compound）からなる群から選ばれる追加の活性化合物の少なくとも１種をさらに含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該Ｈｓｐ７０蛋白のフラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該Ｈｓｐ７０蛋白のフラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該Ｈｓｐ７０蛋白のフラグメントが該転写因子ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットに対しＣ−末端にある、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該転写因子ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される該転写因子ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットの残基３７−４０９を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、熱ショック蛋白Ｈｓｐ７０を用いる、化合物の細胞内輸送（delivery）、好ましくは核内輸送に関する。
【０００２】
（背景技術）
熱ショック蛋白（“Ｈｓｐｓ”）は、蛋白合成およびホウルディング（folding）、小胞トラフイッキング（trafficking）および抗原プロセシング（processing）およびプレゼンテーション（presentation）を含む多くの細胞内および細胞間プロセスにおいて、不可欠な役割を演じることが長く知られてきた、分子シャペロン（chaperone）蛋白のファミリーである。Ｈｓｐｓは、最も高度に保存される公知蛋白の１つであり、かつ蛋白−蛋白相互作用を介して多くの調節的活性を果たす。Ｈｓｐ７０は、熱ショック蛋白ファミリーの１メンバーである［Ｍilner  Ｃ．Ｍ．およびＣampbell  Ｒ．Ｄ．の「Ｉmmunogenetics」（３２：２４２−２５１、１９９０年）；Ｇenbank受入  Ｎｏ．Ｍ５９８２８］。Ｈｓｐ７０の最も特徴のある機能の１つは、細胞間膜を横切って細胞の異なる区画室（compartments）への蛋白の転座を助成することである。
【０００３】
細胞内移送活性が、ＨＳＶ−１構造蛋白ＶＰ２２［Ｅlliottらの「Ｃell」（８８：２２３−２３３、１９９７年）］やＨＩＶ  Ｔａｔ蛋白［Ｖivesらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２７２：１６０１０−１６０１７、１９９７年）などのウイルス性蛋白、並びにアンテナペディア・ホメオドメイン（Ａntennapedia  homeodomain）から誘導されるペプチド配列、線維芽細胞成長因子［Ｈawigerの「Ｃurr．Ｏpin．Ｉmmun．」（９：１８９−１９４、１９９７年）、および最近では神経ペプチド・ガラニン（galanin）［Ｐoogaらの「ＦＡＳＥＢ  Ｊ．」（１２：６７−７７、１９９８年）］に関して報告されている。蛋白基質の輸送は、これらの移送ペプチドの幾つかによっても証明されている［Ｐhelanらの「Ｎature  Ｂiotechnology」（１６：４４０−４４３、１９９８年）；Ｆawellらの「Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．」（９１：６６４−６６８、１９９４年）；Ｒojasらの「Ｎature  Ｂiotechnology」（１６：３７０−３７５、１９９８年）］。
【０００４】
またＨｓｐｓは、免疫応答において多くの重要な機能を果たし、過去数年にわたって、防護免疫の発生においてＨｓｐｓの性質を特性決定する興味が増大しつつある。一連の研究［Ｒomanらの「Ｉmmunology」（８８：４８７−４９２、１９９６年）；Ｓuzueらの「Ｊ．Ｉmmunol．」（１５６：８７３−８７９、１９９６年）］によれば、Ｈｓｐ７０は担体蛋白として作用し、結合ペプチドまたは蛋白基質がエンドソーム区画室に入り、次いで外因性抗原のＭＨＣＩＩ種プロセシング経路に接近するのを可能ならしめることが証明された。このようなＨｓｐ７０−ペプチド複合体あるいはＨｓｐ７０融合蛋白による処理は、カーゴ（cargo）−特異的増殖Ｔ細胞応答を誘い出すことができる。しかしながら、マウスの免疫化に用いる癌細胞−由来Ｈｓｐ７０が特異的抗腫瘍ＣＴＬ応答をもたらす他の実験によって［Ｕdonoらの「Ｊ．Ｅxp．Ｍed．」（１７８：１３９１−１３９６、１９９３年）］、Ｈｓｐｓは内因性ＭＨＣＩ種プロセシング経路を用いていることが示唆された。
【０００５】
これらのデータは、Ｈｓｐ７０が血漿膜を横切り、かつ無傷細胞の細胞質区画室に入ることができることを暗示した。非熱ショック依存メカニズムによる軸索細胞からのＨｓｐｓの放出を報告する以前の研究［Ｈightowerらの「Ｊ．Ｃell  Ｐhysiol．」（１３８：２５７−２６６、１９８９年）］は、Ｈｓｐファミリー膜の幾つかが一定細胞の血漿膜を横切ることができるという所見を支持する。
【０００６】
上記の研究は、Ｈｓｐ７０の血漿膜転座能力を暗示するものであるが、このような活性は完全には証明されていない。蛋白を血漿膜や核膜を横切って輸送するのに、Ｈｓｐ７０を利用しうるかそうでないかは示されていない。そこで、蛋白あるいはＤＮＡなどの化合物を細胞核に輸送して、細胞活性を調節する必要が存在する。
【０００７】
本発明者らは、ヒト７０ｋＤ熱ショック蛋白が細胞膜を横切って転座し、素早く細胞質および核入口（entry）に達しうることを明らかにした。さらにまた、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットのアミノ酸３７−４０９［Ｍeyer  Ｒ．らの「ＰＮＡＳ」（８８：９６６−９７０、１９９１年）；Ｇenbank受入Ｎｏ．Ｍ５８６０３］に縮合するＨｓｐ７０ペプチドからなるキメラ蛋白も、この転座特性を示す。種々の異なるペプチドに関し細胞移入（import）活性が報告されているが、細胞内移送（transport）には一般に、特異的核局在配列（“ＮＬＳ”）の存在が必要である。熱ショックは、熱ショック因子活性化に続いて内因性熱ショック蛋白の合成および核転座の増加を誘発することが知られているが、本発明者らは、外因性熱ショック蛋白の核局在が、前もって熱ショックなしに生じうることを明らかにした。
【０００８】
また本発明者らは、Ｈｓｐ７０の移送および核局在特性が９０アミノ酸Ｃ−末端フラグメントの中に保持されることを明らかにし；Ｃ−末端フラグメント並びに多くのペプチド結合ドメインを包含する大きなフラグメントを用いて、うまくいった核内移送を証明した。ここで、最初の証拠は、外因性Ｈｓｐ７０融合蛋白の細胞膜を横切り、核入口に到達し、生物学的機能を発揮する能力の立証である。
【０００９】
従って、本発明の目的は、生物学的機能をもつ分子の細胞区画室および核区画室両方への輸送（delivery）のための担体を提供することである。本発明の好ましい具体例では、蛋白またはＤＮＡなどの分子の指示された（directed）非侵襲性輸送のビヒクルとして、本明細書記載の、遺伝子発現を調節しうるＨｓｐ７０またはＨｓｐ７０のフラグメントである。
【００１０】
（発明の概要）
７０ｋＤ熱ショック蛋白（“Ｈｓｐ７０”）は、蛋白を種々の細胞小器官にシャペロンする（chaperoning）のに必要な、高度に保存され遍在する蛋白である。本発明者らは、Ｈｓｐ７０を細胞に外因添加すると、Ｈｓｐ７０が容易に細胞質区画室および核区画室両方に移入するのを明らかにする。本発明者らは、化合物を細胞にシャペロンするのに、Ｈｓｐ７０を使用できることを証明した。炎症性応答の重要な転写調節器（regulator）であるＮＦ−κＢを、核区画室に輸送するのに、Ｈｓｐ７０を用いた。本発明者らは、Ｃ−末端Ｈｓｐ７０ペプチドおよびＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットのアミノ酸３７−４０９からなる融合蛋白が、細胞の核の中に案内され、特別にＤＮＡと結合し、次いでカッパＩｇ発現およびＴＮＦα産生を活性化したことを明らかにする。本発明には、遺伝子発現を調節することにより、免疫応答をコントロールするために、蛋白またはＤＮＡの細胞質内および核輸送のビヒクルとしてＨｓｐ７０の使用が含まれる。
【００１１】
（図面の説明）
図１は、示差的Ｈｓｐ７０摂取活性（uptake  activity）を示す種々の細胞類型を示す。培養培地に１０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０−ＦＩＴＣを加えて、各種の細胞を処理した。単球細胞のマーカーとして抗ＣＤ１４−ＰＥを、Ｂ細胞の場合は抗ＣＤ１９−ＰＥを、あるいはＴ細胞の場合は抗ＣＤ３−ＰＥを用いて、ヒト末梢血球を染色した。３７℃で１時間の培養後、細胞をＰＢＳ中で洗い、２％パラホルムアルデヒドに固定し、再度洗い、次いで共焦点レーザー走査鏡検法による可視化のためにＰＢＳ中に再懸濁した。対照として平行実験に、等モル量のＢＳＡ−ＦＩＴＣを用いた。図１Ａは７０Ｚ／３細胞＋Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣを示し；図１Ｂは７０Ｚ／３細胞＋ＢＳＡ−ＦＩＴＣを示し；図１Ｃは抗ＣＤ１４−ＰＥ＋Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣで染色したＰＢＬを示し；図１Ｄは抗ＣＤ１４−ＰＥ＋ＢＳＡ−ＦＩＴＣで染色したＰＢＬを示し；図１Ｅは抗ＣＤ１９−ＰＥ＋Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣで染色したＰＢＬを示し；および図１Ｆは抗ＣＤ３−ＰＥ＋Ｈｓｐ７０で染色した末梢血液Ｔ細胞を示す。
【００１２】
図２は、Ｈｓｐ７０細胞摂取の動態を示す。図２Ａは７０Ｚ／３細胞によるＨｓｐ７０−ＦＩＴＣの摂取の動態を示す。完全ＲＰＭＩ中１μＭのＨｓｐ７０−ＦＩＴＣを用い、細胞を３７℃にて各種の時間で培養した。細胞をＰＢＳ中で１回洗い、遊離のＨｓｐ７０−ＦＩＴＣを分離し、次いでＰＢＳに再懸濁し、蛍光計で分析した。ポイントは実験的であり、修正回帰プログラム（modified  regression  program）で曲線を調整した（ＸＬ１fit）。図２Ｂは、７０Ｚ／３細胞による摂取に対するＨｓｐ７０の用量効果を示す。各種濃度のＨｓｐ７０−ＦＩＴＣを用い、細胞を３７℃で１時間培養し、次いで（Ａ）と同様に、洗って分析した。
【００１３】
図３は、Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣの細胞内摂取がアジドによって影響を受けないが、４℃で抑制されたことを示す。７０Ｚ／３細胞は、未処理であるか（図３Ａ）、あるいは３７℃でＨｓｐ７０−ＦＩＴＣとの培養前に０．０５％のナトリウムアジドで３０分間予備処理されるか（図３Ｂ）、またはＨｓｐ７０−ＦＩＴＣの添加およびさらに４℃で１時間の培養に先立ち、４℃で３０分間予備培養する（図３Ｃ）のいずれかであった。対照として３７℃で細胞にＢＳＡ−ＦＩＴＣを１時間加えた（図３Ｄ）。内在化したＨｓｐ７０−ＦＩＴＣは、トランスフェリンと共に局在しなかった。細胞を３７℃にてＨｓｐ７０−ＦＩＴＣおよびテキサス・レッド（Ｔexas  Ｒed）−共役トランスフェリンの両方で１時間処理した（図３Ｅ）。
【００１４】
図４は、融合蛋白の細胞質および核への移送を示す。ＮＦ−ｋＢのｐ５０サブユニットのアミノ酸３７−４０９に融合する、Ｈｓｐ７０のＣ末端２４４（Ｈｓｐ７０／２８−ｐ５０）または９２（Ｈｓｐ７０／１０−ｐ５０）のいずれかからなるＦＩＴＣ−標識融合蛋白を７０Ｚ／３細胞に移送した。記載の如く、７０Ｚ／３細胞を３７℃にて、全長のＨｓｐ７０−ＦＩＴＣ（図４Ａ）、Ｈｓｐ７０／２８−ｐ５０−ＦＩＴＣ（図４Ｂ）、Ｈｓｐ７０／１０−ｐ５０−ＦＩＴＣ（図４Ｃ）、または対照のＢＳＡ−ＦＩＴＣ（図４Ｄ）で１時間処理した。融合細胞の細胞内局在化を、共焦点レーザー走査鏡検法で可視化した。
【００１５】
図５は、内在化した細胞内Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ７０−ｐ５０が２４時間までの間安定のままでいたことを明らかにする。細胞を全長のＨｓｐ７０−ＦＩＴＣ（図５Ａ）またはＨｓｐ７０／２８−ｐ５０−ＦＩＴＣ（図５Ｂ）のいずれかで処理した後、洗浄し、さらに３７℃にて増加時間の間培養した。細胞を表示の時点で採取し、Ｌaemmliサンプル緩衝剤に溶解し、全細胞溶解産物蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルを蛍光強度測定分析に付した。レーン１：未処理細胞、レーン２：チェース（chase）なし、レーン３：１時間のチェース、レーン４：２時間のチェース、レーン５：６時間のチェース、レーン６：２４時間のチェース、レーン７：４日間のチェース。
【００１６】
図６は、内在化したＨｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白がＤＮＡ−結合活性を示したことを表わす。細胞溶解および核抽出物の発生前に、７０Ｚ／３細胞を表示の如く１時間処理した。ＥＭＳＡを行い、特異的なＤＮＡ結合複合体を、表示抗体によるスーパーシフト（supershift）分析で同定した。図６Ａのレーン１：非刺激細胞対照、レーン２：ＬＰＳ−処理、レーン３：Ｈｓｐ７０−ｐ５０−処理、レーン４：非標識ＮＦ−κＢオリゴと競合する、Ｈｓｐ７０−ｐ５０−処理抽出物、レーン５：レーン４と同じ、但し、非標識八量体オリゴと競合。図６Ｂのレーン１：ＬＰＳ−処理、レーン２：ＬＰＳ−処理および抗ｐ５０でスーパーシフト、レーン３：抗ｐ６５、レーン４：抗Ｃ−ｒｅｌ、レーン５：抗Ｈｓｐ７０、レーン６−１０：レーン１−５と同じ、但し、Ｈｓｐ７０−ｐ５０を用いる処理抽出物。
【００１７】
図７は、Ｈｓｐ７０−ｐ５０−処理細胞が活性化となり、表面カッパＩｇを発現し、かつＴＮＦαを生成したことを示す。（図７Ａ）７０Ｚ／３細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは３０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０／１０−ｐ５０で一夜処理した後、洗浄し、抗カッパ−ＦＩＴＣおよびＦＡＣＳ分析で染色した。（図７Ｂ）ヒト末梢血液リンパ球を５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは４０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０／１０−ｐ５０もしくはＨｓｐ７０／２８−ｐ５０で６時間処理し、上層液を採取し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦαレベルを分析した。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、熱ショック蛋白Ｈｓｐ７０が細胞によって、細胞類型に特異的な方法で、細胞質および核の両方に内在化することを明らかにする。摂取のメカニズムは知られていないが、データから、Ｈｓｐ７０の結合および内在化がエネルギー依存性でかつ高能力レセプタ（high  capacity  receptor）を要することが示唆される。
【００１９】
細胞表面−関連および分泌形態のＨｓｐ７０が存在するという観察から［Ｍulthoffらの「Ｃell  Ｓtress  ＆  Ｃhaperones」（１：１６７−１７６、１９９６年）］から、この蛋白は多分、転写の調節による環境ストレッサー（ストレス要因）の細胞保護を移動させる手段として、細胞−細胞コミュニケーション（communication）において機能しうることが示唆される。実際に、核内の幾つかの転写因子の転写促進ドメインとＨｓｐ７０の物理的相互作用について、最近幾つかの報告がなされている。たとえば、Ｈｓｐ７０は、遺伝子転写の抑制をもたらす、ＨＳＦ（熱ショック因子）［Ｓhiらの「Ｇenes  Ｄev．」（１２：６５４−６６６、１９９８年）］と、細胞増殖の抑制をもたらす、Ｗilms腫瘍抑制遺伝子［Ｍaheswaranらの「Ｇenes  Ｄev．」（１２：１１０８−１１２０、１９９８年）］の両方の転写促進ドメインに直接結合することができる。
【００２０】
これらのデータおよび他のデータは、転写因子やことによると他の核蛋白の調節におけるＨｓｐ７０の役割を暗示する。これらのデータは他のデータを補完して、Ｈｓｐ７０が細胞質シャペロンとして、転写因子、たとえばＮＦ−κＢ自体、並びに無数の補因子、たとえばＨｉｐ、Ｈｏｐ、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ９０、ＢＡＧ−１および他の補因子と相互に作用することができることを示した［Ｄemandらの「Ｍol．Ｃell．Ｂiol．」（１８：２０２３−２０２８、１９９８年）］。事実、グリアおよび軸索細胞において、移出した（exported）Ｈｓｐ７０の放出および細胞内移動が報告され［Ｈightowerらの「Ｊ．Ｃell  Ｐhysiol．」（１３８：２５７−２６６、１９８９年）］；および種々のヒト細胞系におけるＨｓｐ７０の熱ショックまたはリポソーム移動による蓄積は、細胞生存を増加せしめ、かつアポプトシス細胞死から保護することが示されている［Ｌasunskaiaらの「Ａpoptosis」（２：１５６−１６３、１９９７年）。
【００２１】
過酷なまたはダメージ条件下の細胞からの熱ショック蛋白の放出は、隣接細胞に対する防護ストレス応答の移動の恒常性メカニズムであってよく、該隣接細胞はこのような応答にマウントする（mount）ことができない。加えて、抗腫瘍または抗ウイルス免疫を誘発するペプチド結合Ｈｓｐ７０分子の能力並びに記憶ＣＴＬｓの発育（development）を記載する最近の報告は、これらの蛋白が抗原プレゼンテーション機能の付与により、防護的免疫応答を伝達する役割を果たしうるという考えを支持する［Ｂlachereらの「Ｊ．Ｅxp．Ｍed．」（１８６：１３１５−１３２２、１９９７年）；Ｃiupituらの「Ｊ．Ｅxp．Ｍed．」（１８７：６８５−６９１、１９９８年）］。本発明者らは、内因性Ｈｓｐ７０（および関連ペプチドまたは蛋白）が感染またはアポプトシス細胞によって環境に放出される旨述べている。これらのＨｓｐ７０蛋白複合体は、その免疫能力が弱まる隣接細胞に対し役に立つようになり、免疫応答を高めあるいは強化する刺激剤として作用する。
【００２２】
本発明者らは、種々の細胞類型により、外因供給Ｈｓｐ７０融合蛋白の有効な細胞および核摂取並びに長期の細胞内安定性を証明した。この速い安定な移送は、細胞質および核が長時間にわたって局在状態のままでいる場合、これらに治療剤を輸送するビヒクルとして、Ｈｓｐ７０−由来ペプチドの有用性に対し重要な暗示を有する。核移入プロセスの操作は特に、遺伝子発現の調節対照のますます興味のある標的となるので［Ｆujiharaらの「Ｂiochem．Ｐharm．」（５６：１５７−１６１、１９９８年）］、将来、細胞内標的輸送のより効力のある手段の開発に重点が置かれると思われる。輸送システムとしてＨｓｐ７０の使用は、これまで記載された他の蛋白候補（candidates）に比し多くの利点を有し、たとえば、蛋白はヒト起点のものであることから、異物（すなわち、ウイルスまたは虫）や潜在的免疫性物質を含有しないという事実が挙げられる。
【００２３】
Ｈｓｐ７０の可溶フラグメントの使用は、潜在的に免疫原性をさらに減少するだろう。Ｈｓｐ７０は高度に発現した豊富な蛋白なので、それはヒトにおいて十分に許容されると思われ、実際に、既に免疫応答の役割を演じている。さらに、我々が気付いた細胞類型−特異性は、より有効な調節的対照に対し、免疫システムの特定細胞に化合物を標的にするのを可能ならしめるだろう。最後に、蛋白基質の優先的かつ長命の核指示輸送は、細胞質蛋白分解からの保護を付与しうる。我々のデータは、遺伝子発現を調節し、次いで免疫抑制性または免疫刺激性コントロールを付与する分子を輸送する新規の手段として、Ｈｓｐ７０配列の潜在的使用を支持する。
【００２４】
本発明者らは、本発明の具体例において、ＮＦ−κＢｐ５０サブユニットのアミノ酸３７−４０９に接合したＨｓｐ７０のフラグメントからなる融合蛋白を開示する（ここで、該融合蛋白をＨｓｐ７０−ｐ５０、Ｈｓｐ７０／２８−ｐ５０、またはＨｓｐ７０／１０−ｐ５０と称す）。ＮＦ−κＢｐ５０ホモ二量体は一般に、Ｃ−末端賦活ドメインの非依存に基づき、ほとんどの細胞類型においてＮＦ−κＢ転写抑制因子として作用すると考えられているが、本発明者らが気付いた下流の生物学的事態（events）は、転写賦活に対する融合蛋白の優勢な陰性効果を反映しなかった。Ｈｓｐ７０−ｐ５０−誘発転写促進が観察されることの可能な説明は多数存在する。
【００２５】
第１に、熱ショック蛋白配列、特にＥＥＶＤドメイン自体は、転写促進活性を有しうる。Ｈｓｐ７０は、核内で熱ショック因子と結合し、ＥＥＶＤドメインによって転写促進活性を干渉することが知られている。後記実施例中のＨｓｐ７０配列は、ＮＦ−κＢｐ５０配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のアミノ酸３７−４０９に対しＣ−末端でクローン化されているので、ＥＥＶＤドメインは、転写促進を付与したり、あるいは他の細胞または核の補因子と相互作用することにも潜在的に利用できる。Ｍeyer  Ｒ．らの「ＰＮＡＳ」（Ｖol.８８、９６６−９７０、１９９１年２月）に示される、ＮＦ−κＢ  ｐ５０配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のアミノ酸３７−４０９は、
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である。核複合体のより綿密な分析により、転写促進活性を持つ他の可能なコンポーネントに関する糸口が得られる。
【００２６】
第２に、ｐ５０ホモ二量体は、個々の状況で転写促進活性を簡単に示しうる。Ｆujitaらは［「Ｇenes  Ｄev．」（６：７７５−７８７、１９９２年）］、ＮＦ−κＢサブユニットのホモおよびヘテロ二量体のインビトロでの転写賦活を試験し、幾つかの転写混合物へのｐ５０単独添加が、重大な転写刺激をもたらすことを決定した。彼等は、この賦活を、κＢモチーフ（motifs）内のヌクレオチド配列の微細構造の差異のせいと考える。おもしろいことに、このグループは、Ｉｇκ配列モチーフを用いる対照に比し、ｐ５０ホモ二量体による４倍の転写刺激を観測した。これらのデータは、表面カッパＩｇ発現を分析する実験で我々が観察した賦活に符合するものである。第３に、Ｈｓｐ７０−ｐ５０サブユニットは、我々がまだ検出していない、ＤＮＡ結合複合体に他の転写促進因子を補充しているかもしれない。
【００２７】
従って、本発明には、細胞活性の調節、好ましくは細胞内の核活性、たとえば転写因子の活性の調節のため、Ｈｓｐ７０、またはＨｓｐ７０のフラグメントの使用が含まれる。語句“核活性”には、細胞内の核酸分子の転写が含まれる。語句“調節”には、細胞活性の増強、減少、活性化または不活性化が含まれる。Ｈｓｐ７０蛋白またはそのフラグメントを単独で用い、細胞の細胞質および／または核への移動により、細胞活性を調節してＨｓｐ７０−関連障害を処置することができる。“Ｈｓｐ７０−関連障害”とは、Ｈｓｐ７０が障害または疾患の代謝経路で調節的役割を演じるその障害または疾患状態を指称する。本発明で用いる語句“処置”とは、患者の個々の障害症状の軽減、個々の障害に関連する確認できる測定の改善、または個々の免疫応答（たとえば移植拒絶）の予防を指称する。語句“患者”とは、哺乳類、好ましくはヒトを指称する。
【００２８】
加えて、本発明には、１種以上の化合物を細胞に運ぶシャペロンとして、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ７０のフラグメントの使用が含まれる。Ｈｓｐ７０またはそのフラグメントを化合物に接合させて、複合体を形成する（ここで、“Ｈｓｐ７０複合体”と称し、Ｈｓｐ７０またはそのフラグメントと、Ｈｓｐ７０蛋白またはそのフラグメントに付随または接合するいずれの化合物をも含有する）。次いで、Ｈｓｐ７０複合体を細胞、または細胞を取巻く環境に供して、Ｈｓｐ７０複合体を細胞の細胞質および／または核に移送せしめる。Ｈｓｐ７０蛋白またはそのフラグメントに接合しうる化合物としては、これらに限定されるものでないが、蛋白、ペプチド、核酸および小分子が挙げられる。“核酸”または“ポリヌクレオチド”としては、個々のヌクレオチド並びにＤＮＡおよびＲＮＡ配列またはそのフラグメントが挙げられる。
【００２９】
Ｈｓｐ７０、そのフラグメント、および／または本発明のＨｓｐ７０複合体で処置できる疾患状態としては、移植拒絶および自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチ、多発硬化症、若年性糖尿病、喘息、および炎症性腸疾患、並びに炎症性疾患、癌、ウイルス複製疾患および血管病が挙げられる。
【００３０】
たとえば、本発明のＨｓｐ７０複合体および医薬組成物は、移植拒絶（たとえば腎臓、肝臓、肺、膵臓（島細胞など）、骨髄、角膜、小腸および皮膚同種移植や、心臓弁異種移植）；および自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチ、多発硬化症、若年性糖尿病、喘息、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、狼瘡、糖尿病、重症筋無力症、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、肺炎症、眼ぶどう膜炎、肝炎、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、ベーチェットまたはシェーグレン症候群（乾燥眼／口）、悪性または免疫溶血性貧血、特発性副腎機能不全、多腺自己免疫症候群、糸球体腎炎、強皮症、扁平苔癬、白斑（皮膚の色素脱失）、自己免疫甲状腺炎、および肺胞炎；炎症性疾患、たとえば変形性関節症、急性膵炎、慢性膵炎、喘息および成人呼吸促進症候群の処置に、並びに癌および腫瘍、たとえば固形腫、リンパ腫および白血病；血管病、たとえば再狭窄、狭窄および関節硬化症；およびＤＮＡおよびＲＮＡウイルス性複製疾患、たとえばレトロウイルス病、およびヘルペスの処置に有用である。
【００３１】
また、細胞の細胞質および／または核に輸送されるべき化合物からなるＨｓｐ７０複合体の少なくとも１種を含有する医薬組成物も、本発明の技術的範囲に属する。Ｈｓｐ７０複合体はそれ単独、または追加の活性化合物の少なくとも１種や医薬的に許容しうる担体、アジュバントまたはビヒクルのいずれかといっしょに投与されてよい。“追加の活性化合物”には、これらに限定されるものでないが、免疫抑制薬、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗生物質または抗血管超増殖化合物からなる群から選ばれる作用物質が含まれる。
【００３２】
語句“医薬的に許容しうる担体、アジュバントまたはビヒクル”とは、本発明のＨｓｐ７０複合体といっしょに被検者に投与することができ、かつ該複合体の薬理活性を破壊しない担体、アジュバントまたはビヒクルを指称する。本発明の医薬組成物に使用しうる医薬的に許容しうる担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、これらに限定されるものでないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型薬物輸送システム（“ＳＥＤＤＳ”）たとえばｄα−トコフェロール・ポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬製剤に用いる界面活性剤、たとえばＴweensまたは他の類似のポリマー輸送マトリックス、血清蛋白、たとえばヒト血清アルブミン、緩衝物質、たとえばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、たとえば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース−ベース物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【００３３】
また、本発明化合物の輸送を高めるため、α−、β−およびγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、または２−および３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリンなどの化学変性誘導体、もしくは他の可溶化誘導体も使用しうる。
【００３４】
本発明組成物は、以下に記載の他の治療剤を含有してもよく、また医薬製剤の分野で周知といった技法に従い、通常の固体または液体ビヒクルまたは希釈剤、並びに所定の投与形式に適するタイプの医薬用添加成分（たとえば賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、フレーバー等）を用いて配合されてよい。
【００３５】
本発明のＨｓｐ７０複合体の少なくとも１種を含有する医薬組成物は、たとえば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤または粉剤などの形状での経口投与；舌下投与；バッカル剤投与；皮下、静脈内、筋肉内または胸骨内注射または注入技法（たとえば殺菌注射用水性または非水性溶液または懸濁液）などによる非経口投与；吸入噴射などによる鼻腔投与；クリームまたは軟膏などの形状での局所投与；または坐剤などの形状での直腸投与で、また非毒性の医薬的に許容しうるビヒクルまたは希釈剤を含有する投与単位製剤で投与することができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、たとえば即座放出または長期放出に適する形状で投与しうる。即座放出または長期放出は、本発明化合物を含有する適当な医薬組成物の使用により、あるいは特に長期放出の場合、皮下埋没物または浸透ポンプなどの器具の使用によって達成されうる。また本発明Ｈｓｐ７０複合体は、リポソームで投与されてもよい。
【００３７】
経口投与用組成物の具体例として、たとえば嵩を付与する微結晶セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および当該分野で公知の甘味剤またはフレーバーを含有しうる懸濁液；およびたとえば微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、スターチ、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または当該分野で公知の他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および潤滑剤を含有しうる即座放出錠剤が挙げられる。
【００３８】
また本発明化合物は、舌下および／またはバッカル剤投与により口腔内に投与しうる。成形錠剤、圧縮錠剤または凍結乾燥錠剤が、使用しうる具体的な剤形である。具体的な組成物としては、本発明のＨｓｐ７０複合体を速溶解希釈剤、たとえばマンニトール、ラクトース、スクロースおよび／またはシクロデキストリンと配合したものが挙げられる。
【００３９】
またかかる配合物に、高分子量賦形剤、たとえばセルロース（アビセル（avicel））またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含ませてもよい。さらにまた、かかる配合物は、粘膜密着性を助成する賦形剤、たとえばヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマー（たとえばＧantrez）、および放出をコントロールする作用物質、たとえばポリアクリル酸コポリマー（たとえばＣarbopol９３４）も含有しうる。また、加工や使用を容易にするため、潤滑剤、グライダント（glidants）、フレーバー、着色剤および安定剤を加えてもよい。
【００４０】
鼻腔エアロゾルまたは吸入投与用組成物の具体例として、たとえばベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、および／または当該分野で公知の他の可溶化または分散剤を含有しうる食塩水溶液が挙げられる。
【００４１】
非経口投与用組成物の具体例として、たとえばマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液などの適当な非毒性の非経口投与に許容しうる希釈剤または溶剤、または合成モノもしくはジグリセリドを含む他の適当な分散または湿潤および懸濁剤やオレイン酸を含む脂肪酸を含有しうる注射用溶液または懸濁液が挙げられる。本発明で用いる語句“非経口”としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、鞘内、傷内および頭側内の注射または注入技法が包含される。
【００４２】
直腸投与用組成物の具体例として、たとえば常温で固体であるが、直腸腔内で液化および／または溶解して薬物を放出する、ココアバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールなどの適当な非刺激性賦形剤を含有しうる坐剤が挙げられる。
局所投与用組成物の具体例として、局所担体、たとえばＰlastibase（ポリエチレンでゲル化した鉱油）が挙げられる。
【００４３】
本発明のＨｓｐ７０複合体の“治療上有効な”量は、当業者によって決定することができ、かつ具体的には、成人（ヒト）の場合で１日当り約０．１〜１００ｍｇ／体重（Ｋｇ）の活性化合物となる投与量が挙げられ、１日当り単一用量または２〜３回の個々の分割用量で投与しうる。個々の被検者のいずれの場合も、特定の投与用量および投与の頻度は適宜に変動でき、かつ特定使用化合物の活性、該化合物の代謝安定性および作用長さ、被検者の種、年令、体重、全般的な健康状態、性別およびダイエット、投与の形式および時間、排泄速度、薬物組合せ、および個々の症状のひどさを含む種々の要因に左右されることが理解されるだろう。処置に好ましい被検体は、動物、最も好ましくは哺乳類、たとえばヒトである。
【００４４】
“治療上有効量”とは、所望の結果、たとえば患者の個々の障害の症状の軽減、個々の障害に関連する確認できる測定の改善、または個々の免疫応答の予防を達成するのに必要な量を意味する。
【００４５】
個々の被検者のいずれの場合も、特定の投与用量および投与の頻度は適宜に変動でき、かつ特定使用化合物の活性、該化合物の代謝安定性および作用長さ、被検者の種、年令、体重、全般的な健康状態、性別およびダイエット、投与の形式および時間、排泄速度、薬物組合せ、および個々の症状のひどさを含む種々の要因に左右されることが理解されるだろう。処置に好ましい被検体は、動物、最も好ましくは哺乳類、たとえばヒトである。
【００４６】
本発明のＨｓｐ７０複合体は、その１種または２種以上の混合物単独、または他の適当な治療剤、たとえば抗炎症薬、抗増殖薬、化学療法剤および免疫抑制薬と組合せて使用しうる。
【００４７】
次に挙げる実施例は、本発明の具体例の例示であって、いかなる点でも本発明の技術的範囲を制限するものではない。前記または後記の本発明で引用する参考文献はいずれも、そっくりそのまま、ここに導入する。
【００４８】
組換えＨｓｐ７０の製造
以下に示す方法を用いて、組換えＨｓｐ７０を作成し；Ｈｓｐ７０融合蛋白は、公表配列に符号するプライマー（primers）を用い、かつ原核生物発現ベクター，ＰｒｏＥｘＨｔａ（ライフ・テクノロジイズ・インコーポレイテッド）への指示クローニング（ｄirected  cloning）を可能ならしめる制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、ヒトＨｓｐ７０ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅法によって生成した。ＮＦ−κＢ  ｐ５０配列は、公表ｐ５０配列に符号するプライマーを用い同様にして発生し、および同じ発現ベクターにおいて（５’to）Ｈｓｐ７０配列の上流にクローン化された。
【００４９】
クローニング・ベクターは、金属カラム上の発現蛋白の精製に用いる６×Ｈｉｓ  ｔａｇを有した。ＤＮＡを細菌宿主に形質転換し、ＩＰＴＧを用いて蛋白発現を誘発した。通常の親和性精製技法を用いて、可溶の発現した融合蛋白を精製した後、次の実験に用いた。
【００５０】
実施例１
Ｈｓｐ７０−仲介移送は細胞類型に特異的である
外因添加Ｈｓｐ７０の細胞内局在化を調べるため、我々は全長Ｈｓｐ７０を蛍光標識し、それが各種の細胞類型によって内在化されうるかを試験する。細胞を最終濃度１０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０−ＦＩＴＣ（または対照としてＢＳＡ−ＦＩＴＣ）で１時間処理し、次いで共焦点レーザー走査鏡検法に先立ち、洗浄および固定する。細胞内Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣのほとんどは均一に、ネズミのｐｒｅ−Ｂ７０Ｚ／３細胞の核および細胞質に局在したのに対し、ＢＳＡ−ＦＩＴＣの移入はごくわずかであった（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００５１】
我々はまた、ヒトの末梢血液単球によるＨｓｐ７０−ＦＩＴＣのかなりの摂取を観察したが、Ｔ細胞はそうでなかった（図１Ｃ−１Ｆ）。おもしろいことに、末梢血液単球の染色パターンは、細胞質および核を通じて均一であることが少なくないが、それは時々、斑点状染色で特徴づけられ、細胞質内の小胞局在をほのめかしていることに気づいた。本発明者らは、ＰＢＬｓの特定の染色パターンがドナーによって変動することを認識したが、これは細胞賦活の状態が外因性Ｈｓｐ７０の摂取効率または細胞内局在で役割を演じうることを暗示する。
【００５２】
この仮説に一致して、我々は、静止する末梢血液Ｂ細胞が摂取に対し抵抗するが、それらは抗ＣＤ４０＋抗Ｉｇ抗体と共に、インビトロの４８時間の賦活後に蛋白を移送するよう誘発されうることを認識した。このＢ細胞賦活の方法は、種々の分染および増殖関連遺伝子の発現をもたらすことが知られている。これに対し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８による抹消血液Ｔ細胞の賦活は、Ｈｓｐ７０移送に影響を及ぼさなかった。Ｊurkat  Ｔ細胞系またはＨｅＬａ線維芽細胞系による細胞内摂取は見られなかったが、２つの完熟Ｂ細胞系：ＲＡＪＩおよびＲＪＡＢにより有効な摂取を観察した。
【００５３】
さらに我々は、２つの単球細胞系：ＴＨＰ−１およびＵ９３７によるわずかな細胞質摂取を認めたが、それは高濃度（１００μｇ／ｍｌ）のＨｓｐ７０−ＦＩＴＣとの長期（６〜２４時間）培養後のみである。我々が述べるＢ細胞−および単球−特異的Ｈｓｐ７０移送活性は、抗原プレゼンテーションにおいてＨｓｐ７０熱ショック・ファミリーメンバーに対し役割を提案する報告に一致するが［Ｍanaraらの「Ｂlood」（８２：２８６５−２８７１、１９９３年）；Ｖanbuskirkらの「Ｊ．Ｅxp．Ｍed．」（１７０：１７９９−１８０９、１９８９年）］、それはこれらの細胞が一般に、抗原提示細胞として機能すると考えられるからである。
【００５４】
細胞Ｈｓｐ７０摂取の細胞類型特異性および誘発性は、Ｈｓｐ７０蛋白の必要表面または核レセプタの示差的発現を反映しうる。細胞外Ｈｓｐ７０の結合および内在化に必要と思われる表面蛋白を調べる研究が、現在進行中である。
【００５５】
実施例２
Ｈｓｐ７０細胞摂取の動態
我々は次に、７０Ｚ／３細胞によるＨｓｐ７０摂取の時間経過および用量影響を調べた。５×１０５細胞を３７℃にて、１μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０−ＦＩＴＣと共に、１０分〜４８時間の増加時間にわたって培養する。非混和（unincorporated）Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣをＰＢＳで洗った後、細胞内および細胞−関連蛍光を蛍光分析で定量する。これらの実験から、我々は、以下の事項を決定した。すなわち、内在化プロセスが遅いようであるが、それは最大内在化が６〜８時間まででは達せず（図２Ａ）、その時間の後、摂取の速度が少し低下し、かつ２日間までの培養中、一定のままでとどまるためである。
【００５６】
用量範囲を試験するため、我々はＨｓｐ７０−ＦＩＴＣの量を変化させ、１時間培養の時間と処理細胞を選んだ。我々の分析から、細胞内蛍光の強度は、細胞外Ｈｓｐ７０の濃度を１００μｇ／ｍｌ（１．４μＭ）まで増加させるにつれて増大し、かつ該強度は細胞を０．１μｇ／ｍｌの如く低いレベルで処理したときでも検出しうる（図２Ｂ、１．４ｎＭ）ことが認められた。
【００５７】
我々は、以下の事項を決定した。すなわち、細胞外濃度１μＭのＨｓｐ７０−ＦＩＴＣによる細胞の処理は、１ｐｌ／細胞の容量を仮定すれば、１時間の培養後に７００ｎＭの細胞内濃度をもたらす。この摂取効率は、他のペプチド配列の場合に報告されたものに匹敵する［Ｐhelanらの「Ｎature  Ｂiotechnology」（１６：４４０−４４３、１９９８年）］。Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣの摂取は、高能力レセプター仲介摂取メカニズムを示す、我々が用いた濃度範囲（３５ｎＭ〜１μＭ）において飽和できなかった（not saturable）。さらに、内在化は１０倍過剰の非標識Ｈｓｐ７０による予備培養によってブロックできなかった。
【００５８】
実施例３
Ｈｓｐ７０−仲介細胞内移送のメカニズム
移送のメカニズムを調べるため、Ｈｓｐ７０の移入を各種条件下で検討した。全長Ｈｓｐ７０蛋白をナトリウムアジド０．０５％の存在下、ＰＢＬｓで移送したが、細胞を４℃で培養すると、移送活性は完全に根絶し、これはＨｓｐ７０−仲介移送に対しエネルギー依存コンポーネントの存在を暗示する。
【００５９】
これらのデータは、トランスフェリンを用いる共同内在化実験に結びつき、トランスフェリンおよびＨｓｐ７０の蓄積が両７０Ｚ／３細胞（図３Ｅ）およびヒトＰＢＬｓの分離した細胞内区画室で起こることが明らかになり、これはこのメカニズムが従来のエンドサイトーシスを要しないことを暗示した。
【００６０】
実施例４
外因性ＮＦ−κＢ−Ｃ末端Ｈｓｐ７０融合蛋白は、核に指示できる
転写因子ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットに、２４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）または９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）アミノ酸Ｈｓｐ７０Ｃ末端ポリペプチドが融合してなる２種の融合蛋白を産生して、他の蛋白基質を細胞に指示するＨｓｐ７０ペプチドの能力を検討した。
【００６１】
２４４アミノ酸ポリペプチドは、下記の配列を有する。
【化１】
0004892132.tif 000002
【００６２】
９２アミノ酸ポリペプチドは、下記の配列を有する。
【化２】
0004892132.tif 000003
【００６３】
両ＦＩＴＣ−共役融合蛋白を細胞に外因添加すると、両融合蛋白は７０Ｚ／３細胞（図４）およびＰＢＬｓ（データ図示せず）の細胞質および核に入り、動態および特異性はＨｓｐ７０ペプチド単独に類似した。この移送は、安定かつ飽和不可であり、重大な蛋白分解を伴なわずに起った。ＦＩＴＣ−Ｈｓｐ７０の最大摂取は、共焦点鏡検法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で判定されるように、３０分鼓動後で、非混和蛋白の洗出（washout）および３７℃の培養後の２４時間安定状態のままであった。蛋白安定性を評価するため、洗浄および９６時間以内の３７℃のチェースに先立ち、細胞を１０μｇ／ｍｌＦＩＴＣ−共役全長Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ７０／２８−ｐ５０により１時間鼓動させる。
【００６４】
Ｌaemmiサンプル緩衝剤中細胞溶解で全細胞抽出物を産生せしめ、蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。ゲルを蛍光強度測定による分析に付した結果、２４時間以内の培養後の全細胞抽出物において、〜７５ｋＤ融合蛋白並びに全長Ｈｓｐ７０自体（その蛍光標識化合物によって内因性Ｈｓｐ７０と区別できる）の両方の存在が認められ、寸法の測定できるほどの変化はなくあるいは低分子量分解生成物の出現もなかった（図５）。これらのデータは、細胞内の標的Ｈｓｐ７０が細胞によって保持され、しかも重大な分解もなく、かつ４８時間以上の半減期を有することを暗示する。
【００６５】
実施例５
移送されたＮＦ−κＢ  ｐ５０は、ＤＮＡ−結合活性を示す
内在化した融合蛋白が機能的活性を保有するかどうかに取り組むため、我々は、Ｈｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白−処理細胞の核抽出物について、その特定カッパＤＮＡ配列に結合する能力を試験した。我々は以下の事項を認めることができた。すなわち、精製した融合蛋白はカッパＤＮＡに結合することができ（データ図示せず）、このことは、ｐ５０サブユニットがＨｓｐ７０配列の存在によって、立体配座的に損傷されないことを暗示する。７０Ｚ／３細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０／１０−ｐ５０またはＨｓｐ７０／２８−ｐ５０で１時間処理した後、核抽出物を調製し、ゲルシフト・アッセイを行なう。
【００６６】
我々は、ＤＮＡ結合活性が細胞による核摂取後に融合蛋白によって保持されることを認識したが、これは、移入プロセスが重大な分解あるいは活性の損失をもたらさないことを示す（図６Ａ）。このＤＮＡ結合活性は特異的であるが、それは、複合体が過剰の非標識ＮＦ−κＢ配列と競合するが、八量体配列とは競合しないためである（図６Ａ）。我々は、異なる融合蛋白で処理した細胞からの核抽出物により異なる複合体が形成されるのを認め；さらにそれらの複合体は、ＬＰＳ−誘発内因性ＮＦ−κＢによって形成される複合体とは異なった。スーパーシフト実験において、我々は以下の事項を観察した。すなわち、抗ｐ５０抗体は、融合蛋白−処理細胞から、予想の如く、ＤＮＡ−結合複合体の全体をほとんど移動させることができ、これによって、融合蛋白は、主にホモ二量体として、ＤＮＡに結合しているようであることが確認される（図６Ｂ）。
【００６７】
また我々は、抗ｐ６５および抗Ｈｓｐ７０（カルボキシ−末端４アミノ酸ＥＥＶＤに対して指示）抗体両方との培養時に、特定複合体における検出できる減少を観察したが、これは組換えＨｓｐ７０−ｐ５０サブユニットに加えて内因性ｐ６５サブユニットの存在を示す。これに対し、対照ＬＰＳ−処理細胞からの核抽出物は、ｐ５０およびｐ６５サブユニットの両方を含有する複合体を形成し、そしてスーパーシフトのパターンは、融合蛋白で処理した細胞と異なった。これらのデータは、異なる蛋白／ＤＮＡ複合体の形成を示し、かつ融合蛋白がＤＮＡに直接結合し、単に内因性ＮＦ−κＢを賦活していなかったことを暗示する。
【００６８】
実施例６
Ｈｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白は、表面カッパＩｇ発現およびＴＮＦα産生を賦活する
Ｈｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白による細胞の処理は、潜在的に、細胞中のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合部位と相互作用する複合体の形成をもたらしうるので、我々はＮＦ−κＢ経路の下流生物学的事態を評価することに決めた。我々は、各種細胞のＨｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白による処理が、ＮＦ−κＢによって正常に調節される幾つかの炎症性および免疫応答の賦活をもたらすことを観察した。マウス７０Ｚ／３ｐｒｅ−Ｂ細胞のＨｓｐ７０／１０−ｐ５０融合蛋白による処理は、表面上の高レベルのカッパＩｇ軽鎖を誘発するのに、ＬＰＳと同じ位有効であることが認められた（図７Ａ）。
【００６９】
加えて、ＬＰＳ−誘発賦活と異なり、融合蛋白−誘発表面カッパ発現は、細胞の処理に先立ち、蛋白の３０分の６５℃熱変性によってなくなったが、これによって、賦活には無傷（intact）蛋白が必要であることが確認される。Ｈｓｐ７０／２８−ｐ５０の場合にも、同様な結果が得られた（データ示さず）。ＴＮＦα産生は、これもＮＦ−κＢによって大いに調節される炎症性応答の他の例であった。
【００７０】
我々は、内在化した融合蛋白も、ヒト末梢血液リンパ球によりＴＮＦα産生を誘発しうることを観察した（図７Ｂ）。新たに単離したＰＢＬｓをＬＰＳまたはＨｓｐ７０−ｐ５０と共に６時間培養し、その時間後、上層液を集め、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン・レベルを試験する。再度我々は、融合蛋白がＴＮＦα産生の誘発にＬＰＳと同様有効であることを認識し、かつ融合蛋白の熱変性がその効果をなくすことを示すことにより、無傷蛋白が賦活の原因をなすことを実証した。
【００７１】
上述の実施例で、以下に示す実験手順を用いた。
Ｈｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白の発現と精製：
ＮＦ−κＢｐ１０５サブユニット蛋白のアミノ酸１−４０６に対応するヌクレオチド配列を用い、２つのｐ５０融合蛋白を作る。この配列は、ＤＮＡ結合ドメインおよびｒｅｌ相同性ドメインを含有する。Ｈｓｐ７０の長さが異なる２つの融合蛋白を用いた。２つのＨｓｐ７０配列は共に、Ｃ−末端から由来され、末端２７６または７３５ヌクレオチドを含有し、これらは１０ｋＤ（上記の９２アミノ酸ポリペプチド）および２８ｋＤ（上記の２４４アミノ酸ポリペプチド）蛋白フラグメントに相当する。１０ｋＤまたは２８ｋＤＨｓｐ７０蛋白がｐ５０蛋白にＣ−末端融合し、得られる融合蛋白はそれぞれ、Ｈｓｐ７０／１０−ｐ５０またはＨｓｐ７０／２８−ｐ５０を示す。クローニング、発現および精製のため、製造業者の推奨規格に従って、原核生物発現ベクターＰｒｏＥＸ  ＨＴ（ＭＤ、ガイサーズブルグのＬife  Ｔechnologies）を用いた。
【００７２】
共焦点レーザー走査鏡検法：
細胞を典型的に、３７℃にて１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−共役蛋白でまたはテキストの指示通りに１時間処理した後、ＰＢＳ中で洗浄、２％パラホルムアルデヒド中で固定、さらにＰＢＳ中で洗浄、次いでモレキュラー・ダイナミックス・レーザーシャープ（Ｍolecular  Ｄynamics  Ｌaser  Ｓharp）ソフトウェアおよびアドービ・フォトショップ（Ａdobe  Ｐhotoshop）を用いる共焦点鏡検法で可視分析を行なう。
【００７３】
移入したＨｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白のウエスタンブロット分析：
細胞を３７℃にてＦＩＴＣ−共役蛋白で１時間処理し、ＰＢＳ中で洗い、これを核抽出物の調製に用いる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白等量に分ける。ゲルを酢酸中に固定し、蛍光計とイメージ・クアント（Ｉmage  Ｑuant）ソフトウェアで蛍光分析に付す。
【００７４】
電気泳動移動度シフト測定法：
確立したプロトコルの改変を用いて、７０Ｚ／３細胞から核抽出物を調製する［Ｔepperらの「Ｊ．Ｉmmunol.」（１５５：２４２７−２４３６、１９９５年）］。Ｂradfordアッセイで蛋白濃度を判定し、ＮＦ−κＢ（５’ＧＡＴＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））または八量体（５’ＴＧＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５））オリゴヌクレオチド（ＷＩ、マジソンのＰromega）を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４キナーゼでエンド標識する。オリゴヌクレオチド・プローブとの結合反応の条件は、前記の記載と同じ。スーパーシフト・アッセイは、ＮＦ−κＢ  ｐ５０、ｐ６５およびＣ−Ｒｅｌポリクローナル抗体（ＣＡ、サンタ・クルツのＳanta  Ｃruz  Ｂiotechnology）およびＨｓｐ７０抗体を用い以下の手順で行なう。すなわち、核抽出物を反応緩衝剤中、３μｌの抗体と共に３０分間予備培養し、次いで標準操作に従って、ゲル遅延アッセイをし続ける。非標識ＮＦ−κＢおよび八量体オリゴヌクレオチドを用い、競合実験を行なう。サンプルを生の（native）６％ポリアクリルアミドゲルにて分析し、オートラジオグラフを作る。
【００７５】
免疫蛍光検査アッセイ（ＦＡＣＳ）：
７０Ｚ／３細胞を、３０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０／１０−ｐ５０融合蛋白または１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで処理し、３７℃で一夜培養する。次いで細胞をＰＢＳ中で洗い、そしてＦＩＴＣ−共役抗カッパ抗体で染色する前に、２％パラホルムアルデヒド中に固定する。さらにＰＢＳ洗浄後、細胞をＦＡＣＳＴＡＲにて画像化および分析に付す。
【００７６】
ＴＮＦαアッセイ：
ヒト末梢血液リンパ球を前記と同様に単離し、４０μｇ／ｍｌのＨｓｐ７０融合蛋白またはＬＰＳで６時間処理する。上層液を集め、ＥＬＩＳＡ（ＭＡ、ケンブリッジのＧenzyme）でＴＮＦαを分析する。
本発明について明瞭および理解を目的として具体的例示および実施例によりある程度詳細に説明したが、特許請求の範囲に基づく技術的範囲内で、一定の変更や改変を成しうることは明らかであろう。
【００７７】
0004892132.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】  示差的Ｈｓｐ７０摂取活性を示す種々の細胞類型を示し、図１Ａは７０Ｚ／３細胞＋Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣ；図１Ｂは７０Ｚ／３細胞＋ＢＳＡ−ＦＩＴＣ；図１Ｃは抗ＣＤ１４−ＰＥ＋Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣで染色したＰＢＬ；図１Ｄは抗ＣＤ１４−ＰＥ＋ＢＳＡ−ＦＩＴＣで染色したＰＢＬ；図１Ｅは抗ＣＤ１９−ＰＥ＋Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣで染色したＰＢＬ；図１Ｆは抗ＣＤ３−ＰＥ＋Ｈｓｐ７０で染色した末梢血液Ｔ細胞を示す。
【図２】  Ｈｓｐ７０細胞摂取の動態を示し、図２Ａは７０Ｚ／３細胞によるＨｓｐ７０−ＦＩＴＣの摂取の動態；図２Ｂは７０Ｚ／３細胞による摂取に対するＨｓｐ７０の用量効果を示す。
【図３】  Ｈｓｐ７０−ＦＩＴＣの細胞内摂取がアジドによって影響を受けないが、４℃で抑制されることを示す。
【図４】  融合蛋白の細胞質および核への移送を示す。
【図５】  内在化した細胞内Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ７０−ｐ５０が２４時間までの間安定のままでいたことを示す。
【図６】  内在化したＨｓｐ７０−ｐ５０融合蛋白がＤＮＡ−結合活性を示したことを明らかにする。
【図７】  Ｈｓｐ７０−ｐ５０−処理細胞が活性化となり、表面カッパＩｇを発現し、かつＴＮＦαを生成したことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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