(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーの分離カラムに試料導入時、試料導入バルブとモノリシスカラムにより試料導入濃縮する際に、試料導入バルブが備えている２つのポートの奥部分に、多連続孔を持つ、又は多孔質で一体型に形成し且つ、内径を分離カラム内径と同等か或いはより細くした前記モノリシスカラムの両端部を差し込み、該モノリシスカラムと試料導入バルブとの一体構造により試料バンドを狭くして分離カラムに導入することを特徴とする液体クロマトグラフィーの試料導入方法。
【請求項２】
液体クロマトグラフィーの分離カラムに試料を導入する通路に、試料導入バルブを連通させると共に、該試料導入バルブが備えている２つのポートの奥部分に、多連続孔を持つ又は多孔質である一体型で、内径を上記分離カラム内径と同等か或いはより細くしたモノリシスカラムの両端部を差し込み、該モノリシスカラムと試料導入バルブとを一体構造とさせたことを特徴とする液体クロマトグラフィーの試料導入装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーの試料導入方法及び装置に関するもので、特に試料中の溶質の量の少ないサンプルを多量に注入する試料導入方法及び装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来は、図３のようなプレカラム３を用いた濃縮流路を構築していた。ここで用いる濃縮用プレカラム３は、使う充填剤は分離カラムと保持挙動は異なったとしても、溶出時に狭いバンドで溶出し分離カラム４に導入する必要がある。プレカラム３も分離カラム４と同等以上の性能を有する必要がある。然るに、充填カラムの性能は、使用する充填剤の粒子径に反比例する。従って、圧力が高くなってしまい、図３に示すようなバルブと送液ポンプを必要とする。
その他１はインジェクションバルブ、２は切換バルブ、３はプレカラム、４は分析カラム、５はポンプ、６０はループ、７は検出器、８は溶離液、９は溶離液。
【０００３】
一方、ｉｎ−ＴｕｂｅＳＰＭＥ(チューブ内での固相マイクロ抽出)と云う手法も、試料濃縮の方法として開発されている。この方法は、細管の内側に固定相を固定化した(ガスクロマトグラフィーのキャピラリーカラムと同様)開管カラムを用いる方法である。試料量を大きくするため、抵抗の掛からない内径の太いカラムを用いる必要がある。しかし、中空管であるため、内径が大きくなると、拡散効率が下がり(溶質が液相に接触する効率が下がる。)、濃縮性能が下がる。そのため、細いキャピラリーが用いられる。しかし、接触面は増えるが、キャピラリー管表面に固定化する液相量は減り、濃縮できる試料量が限定される。当然、目的成分以外のマトリクスの影響を大きく受けることになる。分析対象範囲が絞られる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
試料導入時の試料バンドは、分離分析の最終結果に大きく影響を与える。従って、注入量が多いほど、試料バンドが大きくなり、分離能が悪くなる。
液体クロマトグラフから溶出するピークの巾（４σ）は、カラムでの広がり、注入口での広がり、検出器での広がり、配管での広がりなどの広がりのトータルであり、σ２（トータル）＝σ２（注入）＋σ２（カラム）＋σ２（検出器）＋σ２（配管）で表される。（文献（Ｊ．Ｐ．Ｃ．Ｖｉｓｓｅｒｓ，Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｇｒ．Ａ８５６，１１７−１４３（１９９９））カラムの性能を生かし、効率のよい分離を得るためにはカラム外の広がりの効果は、それぞれカラムの１／１０〜１／２０以下にする必要がある。従って、注入量は少なければ少ないほど、カラムを生かすことになるが、反面、微量分析で大量に注入し、感度を稼ぎたい。
【０００５】
サンプル注入量は、以下の式（式１）で表される。
【式１】
0004892128.tif 000002
上記式によれば、内径１ｍｍ、長さ１５ｃｍ、粒子径ｄｐ＝３μmカラムでの試料溶液の最大注入量は、カラム効率ロスを５％として計算すると、４００ｎｌになる。生体中の薬物や、環境中の有害物質分析では、試料中の溶質の量は極めて少なく、なるべく多くの試料を注入したい。
【０００６】
0004892128.tif 000003
【０００７】
次に、１０倍の感度を得るため、同様に１μＬ注入した。ロード状態でループに入れられた体積は１μＬとなる。インジェクション時には、流速４μＬ／ｍｉｎでカラムに導入することになるため、１５秒掛かることになり、広いバンド巾となる。クロマトグラム上では、１．Ｔｈｉｕｒａｍ、２．ＭＣＰＰのピークがテーリングし、完全分離しない結果となる。溶出の遅いピークでは、本カラムによる濃縮が見られ、改善されているが、完全ではない。このように本カラム入口での濃縮効果が期待できるグラジェント溶出による分析でさえ限界があり、多量注入は不可能である。
【０００８】
本発明は、多量の試料を導入し、溶出時に狭いバンドで溶出し分離カラムに導入できると共に、高速度で試料濃縮が可能になり、濃縮時でも試料変化がない試料導入方法及び装置を提案せんとするもので、第１に液体クロマトグラフィーの分離カラムに試料を導入する前に、試料導入バルブに接続した多連続孔を持つ、又は多孔質である一体型で、内径を上記分離カラム内径と同等か或いはより細くした固相抽出カラム（モノリシックカラム−Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  Ｃｏｌｕｍｎ）に試料を導入し、該固相抽出カラムと前記試料導入バルブとにより、多量試料の高速濃縮及び保持を可能にして、試料バンドを狭くしてから分離カラムに導入することを特徴とし、第２に液体クロマトグラフィーの分離カラムに試料を導入する通路に、試料導入バルブを連通させると共に、該試料導入バルブに多連続孔を持つ又は多孔質である一体型で、内径を上記分離カラム内径と同等か或いはより細くした固相抽出カラムを接続させたことを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
図１に示す実施例により本発明を詳細に説明する。
１はインジェクションバルブで、ポート１１とポート１４間にはモノリシスカラム６を設置して、ポート１６はサンプル注入口とし、シリンジ３等により試料注入可能としてある。ポート１５はドレイン２に、ポート１３はポンプ５を介し溶離液８に連通させてある。ポート１２はカラム４を介して検出器７に連通させてある。５１はポンプで、溶離液８１に連通し、ミキサー８２を介してポンプ５及びポート１３に連結してある。
【００１０】
モノリシスカラムの具体的性質については、連続孔があり、その大きさが制御されている一体型であれば特に制限されないが、例として、連続孔のポアーサイズは１〜２０ミクロンとするモノリシス構造をとる。分離カラムの内径に対し、連続孔を持つプレカラムの内径が分離カラムと同等か細いことを特徴とする。
微細粒子を充填した分離カラムに比べ、モノリシスカラムは使用時の最適線速度が同一内径の場合、速い。従来より濃縮時での試料変化がない。
【００１１】
この具体例について説明すると、多孔質ガラス、例えばＮａＯ−Ｂ２Ｏ３−ＳｉＯ２系のものがあげられ、Ａ１２Ｏ３、ＺｒＯ２、ＺｎＯ２、ＴｉＯ２、ＳｎＯ２、ＣａＯ、ＭｇＯ２等種々の酸化物を添加したガラス(製造方法は特開平７−１２０４５０号に)
多孔質セラミック、例えばアルミナシリケート、ケイ砂質、アルミナ質、多孔質ムラトイ質、ケイソウ土質、(製造方法は同上)
合成無機一有機多孔質、アルコキシドけい素、アルコキシドチタン、アルコキシドジルコニウムなどと炭化水素、芳香族、アルコール、炭素などの有機物から合成される無機一有機の両方の性質を持つ多孔質体。
【００１２】
有機多孔質(マクロポーラスポリマー)、例えば、アクリレート類、メタクリート類、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル及びスチレンからなる群から選択されたモノビニルモノマート、アルキレンジアクリレート、アルキレンジメタクリレート、ヒドロシキアルキレンジアクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート、ジビニルベンゼン及びジビニルピリジンから成る群から選ばれたジビニルモノマートのコポリマーから成るポリマー等が挙げられる。
そして、上記基材に、各種液相を化学修飾又はコーティングしたもの(例えばオクタデシル基、フェニル基など)逆に基材そのものでも各種液相を化学修飾又はコーティングしたものかは問わない。分析目的成分と夾雑物との関連で決定するのがよい。
【００１３】
又、本発明の実際の形態は種々に実施できる。一例として、図２のように組むことができる。通常のＨＰＣＬシステムを用いて図３のループ部分にモノリシスカラムを用いるだけで、種々の効果が得られる。
例えば、内径０．３ｍｍ×１０ｍｍ、３μのＯＤＳシリカゲルを濃縮カラムとして用いた場合、１０μｌの試料を３秒で濃縮カラムに入れようとした場合には、約１０Ｍｐａ以上かかる。同サイズのモノリシスカラム使用時には、０．２Ｍｐａ程度であった。
【００１４】
マニュアル及びオートサンプラーなどで試料を直接導入できる圧力は、最大で１Ｍｐａ程度で、高性能な充填タイプカラムは用いられないことになる。充填カラムで同一圧力にするためには、粒径は３０μｍ程度になり、分離能として１０分の１以下になり、十分な濃縮、分離ができない。モノリシスは低圧で使用できるので、ループ位置に取り付けることで、濃縮導入が簡単に行える。
【００１５】
充填タイプでは、濃縮がうまくいっても、メインカラム導入時に接続部と配管及びフィルター部分に拡散が生じ、ミクロカラムなど低流速ではピーク形状が悪くなる。モノリシスカラム、一体構造で、配管及びフィルターが不要となり、空間容量によるピーク形状の異常は生じない。
【００１６】
インジェクション部に従来の充填タイプを取付けようとすると、どうしても配管が必要となる。配管内部は充填物はなく、濃縮効果はないため。ピークバンドは広がる。又。パイプ内部まで充填部を入れたとしても、どうしても充填物を止めるため、フィルターが必要となる。やはり、濃縮効果は出ないのでピークバンドは広がる。これらの影響は低流速ほど出る。（図４）
【００１７】
モノリシスカラム６では、形態を所望形状に形成でき、且つインジェクターの奥部分まで差し込め、全ての場所で濃縮効果が生じ、バンドが広がらない。ポンプでの高圧濃縮を用いて、濃縮した場合においても、充填タイプでは１ｍＬ濃縮する場合、３５０Ｍｐａ送液でも約１０分以上かかる。チウラムなどの分解しやすい農薬においては、溶離液中で３分程度から分解が生じた。モノリシスカラム６利用では、１００Ｍｐａ送液で、２分以内に濃縮でき、分解する成分の分析に利用できた。このように従来から行われているカラムスイッチングにも有効となる。（図５）
【００１８】
上記の基本例に加えて、多成分系の農薬分析に応用できる。これらの農薬は、環境分析においてＨＰＬＣ測定することが義務付けられている。通常は、これらの分析を行う場合には、水溶液試料を煩雑な固相抽出を用いて、クリーンアップし、その一部をＨＰＬＣに導入するという方法が用いられる。この方法では試料の取扱いにおいて、各工程における物質収支がわからないという問題が生じる。そのため、標品添加による比較実験から実試料を推定するしかない。
【００１９】
一方、カラムスイッチングによる導入では、各工程が連続に行えるので、物質収支が明確になり、精度の高い方法となる。しかし、従来のスイッチング方法では、濃縮ポンプ及び洗浄に切り替えるバルブなどが必要で、高価なシステムＨＰＬＣとなる。インジェクション部分のループにモノリシスカラムを用いることで、簡単なＨＰＬＣシステムを用いて、カラムスイッチングと同じ効果が得られた。又、メインの分析カラムにキャピラリーカラムを用いることにより、溶媒使用量を減らすこともできた。
【００２０】
[実施例１]
インジェクションバルブ１をロード側(黒ライン)にしてシリンジ３で１０μＬ試料をポート１６から注入すると、モノリシスカラム６に入る。殆ど抵抗はなく、手で注入できる。試料成分はモノリシスカラム６入口にて濃縮される。溢れた液はポート１５を経てドレイン２から廃棄される。試料成分はモノリシスカラム６入口に狭いバンドで濃縮される。
【００２１】
次に、インジェクション側(点線)に切り替えることによって、試料はポート１３を経てポンプ５からの溶離液8により、ポート１３−ポート１４−モノリシスカラム６−ポート１１−ポート１２と云う経路で逆方向からカラム４に送り込まれる。この時、フィルターや配管パイプによる試料拡散もなくカラム４に導入される。１０μＬ注入においても従来の方法のようなテーリング現象は見られなかった。（図８）
本発明の方法では、従来のシステムに比べて、数十倍の試料が導入できることになる。
【００２２】
[実施例２]
実施例１と同じ構成で、水で希釈した試料液を用いた。試料量としては、５倍の５０μＬを導入した。
ロード側(黒ライン)にしてシリンジ３で希釈した５０μＬ試料を量り取り、ポート１６から注入した。殆ど抵抗なく手で注入できた。試料成分は−モノリシスカラム６にて、濃縮される。溢れた液はポート１５を経てドレインから廃棄される。試料成分はモノリシスカラム６入口に狭いバンドで濃縮される。濃縮効果は水で希釈されているため、大きくなり多量の試料が導入されても狭いバンドに濃縮される。
【００２３】
次に、インジェクション側(点線)に切り替えることによって、試料はポート１３を経てポンプ５からの溶離液8により、ポート１３−ポート１４−モノリシスカラム６−ポート１１−ポート１２と云う経路で逆方向からカラム４に送り込まれる。この時、フィルターや配管パイプによる試料拡散もなくカラム４に導入される。５０μＬ注入においても従来の方法のようなテーリング現象は見られなかった。（図９）
本発明の方法では、希釈すれば従来のシステムに比べて、数百倍の試料が導入できることになる。
【００２４】
[実施例３]
実施例２と同じ構成で、初期溶離液に溶解した試料液を用いた。試料量としては、５０μＬを導入した。ロード側(黒ライン)にして、初期プレコンディショニングとして、水を５０μＬ注入した。次に、５０μＬ試料を量り取り注入した。殆ど抵抗はなく、手で注入できた。モノリシスカラム６は、充分に水に置換されているので、濃縮効果が期待できない溶離液希釈試料でも目的成分は濃縮される。溢れた液はポート１５を経てドレインから廃棄される。試料成分はモノリシスカラム６入口に狭いバンドで濃縮される。モノリシスカラム６のプレコンディショニング効果も、水希釈と同じ効果が得られた。
【００２５】
次に、インジェクション側(点線)に切り替えることによって、試料はポート１３を経てポンプ５からの溶離液8により、ポート１３−ポート１４−モノリシスカラム６−ポート１１−ポート１２と云う経路で逆方向からカラム４に送り込まれる。この時、フィルターや配管パイプによる試料拡散もなくカラム４に導入される。テーリング現象は見られず、実施例２と同じクロマトが得られた。
【００２６】
[実施例４]
実施例３と同じ構成で、初期溶離液に溶解した試料液を用いた。試料量としては、５０μＬを導入した。ロード側(黒ライン)にして、初期プレコンディショニングとして、水を５０μＬ注入した。次に、５０μＬ試料を量り取り注入した次に、８０％ＡＣＮ溶液５０μＬ導入した。殆ど抵抗はなく、手で注入できた。溶出力の異なるモノリシスカラム６に流すことによって、成分の一部を洗浄脱着することができる。溶出されない成分のみが濃縮され、分析目的以外の成分は、溢れた液と同時にポート１５を経てドレインから廃棄される。目的成分はモノリシスカラム６入口に狭いバンドで濃縮される。
【００２７】
次に、インジェクション側(点線)に切り替えることによって、試料はポート１３を経てポンプ５からの溶離液8により、ポート１３−ポート１４−モノリシスカラム６−ポート１１−ポート１２と云う経路で逆方向からカラム４に送り込まれる。この時、フィルターや配管パイプによる試料拡散もなくカラム４に導入される。ロード時に８０％アセトニトリルで−モノリシスカラム６を洗浄することによって、溶出の早い１．Ｔｈｉｕｒａｍ，２．ＭＣＰＰ，３．Ｉｐｒｄｉｏｎｅ，成分のみが洗浄され、目的である４．Ｐｅｎｃｙｃｕｒｏｎ，５．Ｂｅｎｓｕｌｉｄｅのシャープなピークのみが得られた。
【００２８】
[実施例５]
マニュアルインジェクターの代りにオートサンプラーを用い、ループの代りにモノリシスカラムを装着した。ループ接続可能なオートサンブラーならば、この発明方法が適用可能であった。
実施例１〜４と同じクロマト効果が得られた。
【００２９】
【発明の効果】
上記の如く請求項１，２に記載の発明によれば、液体クロマトグラフィーの分離カラムに試料を導入する前に、試料導入バルブに連通した多連続孔を持つ、又は多孔質である一体型の固相抽出カラム（モノリシックカラム−Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  Ｃｏｌｕｍｎ）に試料を保持・濃縮し、試料バンドを狭くしてから分離カラムに導入することを特徴とするので、多量の試料を導入し、溶出時に狭いバンドで溶出し、分離カラムに導入できると共に、高速度で試料濃縮が可能になり、濃縮時でも試料変化がない資料導入方法が得られる。又、この最適線速度範囲が広く、正確な流量コントロールの必要が無く、工夫が要らないため、装置が簡略化でき、且、試料導入バルブに連結しても充分な性能が得られる。更に、高流速でも性能に影響が少ないので、試料変化の要因となる停滞時間も短くでき、さらに、分析時間の短縮にも有効となる。
【００３０】
又、請求項１，２に記載の発明によれば液体クロマトグラフィーの分離カラムに試料を導入する通路に、試料導入バルブに連通した多連続孔を持つ、又は多孔質である一体型の固相抽出カラムを連通させることとしたので、充填カラムタイプに比べて、圧力が数十分の１以下になり、高圧ポンプによる導入が要らず、簡単に試料注入部に組込めることになる。これは、マニュアルインジェクターや従来のオートサンプラーのループ部分を変更するだけで、濃縮導入できることになる。さらに、試料導入後、溶媒強度の異なる液を流すことによって、簡単にクリーンアップも可能となる。又、ＨＰＬＣ分析において、温度コントロールは、分離性能の向上及び分離特性変化を生じさせることで、有効な手段である。それを、濃縮に利用することは、従来方法では行なえなかった。濃縮充填タイプカラムは、カラム間及び充填剤から成り立ち、内部まで温度変化させることは、熱伝導から考えて不可能でその性能を引出すことはできない。請求項２に記載の発明では一体構造となるカラムの使用により、熱伝導もよく温度コントロールすることが可能となる。
【００３１】
更に、請求項１，２に記載の発明によれば固相抽出カラムをインジェクション部に直接接続することとしたので、注入バルブに直接接続でき、更に、一体構造のため、フィルターが必要でなく試料拡散の影響がないので、従来では難しい内径の細いキャピラリー、ミクロカラムにも適用できる。又、管内部全体をシールする必要がないので、拡散容量に影響しないピンポイントな拡散板も利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明一実施例概略フロー図
【図２】  同上要大説明図
【図３】  従来例概略フロー図
【図４】  従来例一要部拡大説明図
【図５】  本発明一実施例一要部拡大説明図
【図６】  従来例による一実施クロマトグラム
【図７】  従来例による他実施クロマトグラム
【図８】  本発明一実施例による一実施クロマトグラム
【図９】  本発明他実施例による一実施クロマトグラム
【符号の説明】
１  インジェクター
２  ドレイン
３  シリンジ
４  分析カラム
５  ポンプ
６  モノリシスカラム
７  検出器
８  溶離液
９  溶離液
【図１】
0004892128.tif 000004
【図２】
0004892128.tif 000005
【図３】
0004892128.tif 000006
【図４】
0004892128.tif 000007
【図５】
0004892128.tif 000008
【図６】
0004892128.tif 000009
【図７】
0004892128.tif 000010
【図８】
0004892128.tif 000011
【図９】
0004892128.tif 000012