(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共役脂肪酸混合物（Ａ）から異性体（ａ）を濃縮した濃縮物を製造する方法であって、
共役脂肪酸混合物（Ａ）と不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上とを混合して異性体（ａ）が溶解した混合溶液を得る工程、
該混合溶液から、異性体（ａ）に富んだ結晶を析出させるか、又は異性体（ａ）が希薄な結晶を析出させる晶析処理工程、及び
異性体（ａ）に富んだ結晶を得るため、又は異性体（ａ）が希薄な結晶を取り除いて異性体（ａ）に富んだ溶液を得るための固液分離処理工程
を含むことを特徴とする前記濃縮物の製造方法。
【請求項２】
共役脂肪酸混合物（Ａ）及び不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上を混合する際に有機溶媒を用いる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
共役脂肪酸混合物（Ａ）と不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上との混合割合が、共役脂肪酸混合物（Ａ）１００質量部に対して不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上が１５質量部以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
異性体（ａ）が４〜１６位にシス配置を有する不飽和脂肪酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
共役脂肪酸混合物（Ａ）が、シス配置の位置が異性体（ａ）と２位以上異なる共役脂肪酸異性体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
共役脂肪酸混合物（Ａ）が共役リノール酸の少なくとも２種の異性体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
共役脂肪酸混合物（Ａ）が９−シス，１１−トランス共役リノール酸及び１０−トランス，１２−シス共役リノール酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
不飽和脂肪酸（Ｂ）がＣ14-Ｃ20の不飽和脂肪酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
不飽和脂肪酸（Ｂ）がシス二重結合を１つ含む不飽和脂肪酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
不飽和脂肪酸（Ｂ）がオレイン酸である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
異性体（ａ）が共役リノール酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
異性体（ａ）が９−シス，１１−トランス共役リノール酸である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記有機溶媒がアセトンである、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
アルコール性水酸基を分子内に少なくとも１つ有する化合物を、請求項１〜１３のいずれか１項記載の製造方法によって得た共役脂肪酸濃縮物でエステル化することを特徴とするエステル化物の製造方法。
【請求項１５】
アルコール性水酸基を分子内に少なくとも１つ有する化合物がグリセリンである請求項１４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、通常の分別結晶法では精製できない共役脂肪酸を濃縮した濃縮物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、共役リノール酸（CLA）は脂質代謝改善、体脂肪低下作用、抗がん作用、高アレルギー作用、抗動脈硬化作用などの多彩な生理作用を有することから注目されている。共役リノール酸は、共役二重結合を１つ有する炭素数18脂肪酸の総称であり、肉や乳製品に含有する脂肪酸の一種である。共役リノール酸は、一般的にはプロピレングリコールに代表される有機溶媒をもちいたアルカリ共役化法（特許第3017108号公報）によって製造できることが知られている。この製造方法によって得られる共役リノール酸は、9c,11t-共役リノール酸（9cis,11trans-共役リノール酸）及び10t,12c-共役リノール酸（10trans,12cis-共役リノール酸）が等量生成した混合物である。これらの２つの異性体は、生理活性や副作用に差があることが知られており、所望の異性体を濃縮する濃縮物も求められている。【０００３】
一方、脂肪酸の精製方法としては分別結晶法、蒸留法、尿素付加法、銀錯体法、酵素（リパーゼ）法などが知られているが、共役脂肪酸は一般的に沸点が高く熱に不安定であるため、蒸留法は適さない。また、尿素付加法は非常に有用な方法であるが、精製した脂肪酸を食品用途で使用する場合には適さず、非常にコストもかかる。また、銀錯体法も不飽和脂肪酸には非常に有用な方法であるが、精製した脂肪酸を食品用途で使用する場合には適さなず、非常にコストもかかる。また、酵素法は非常にコストが高く、操作も煩雑である。さらに、分別結晶法は優れた方法で、一般的に広く用いられているが、凝固点の近い脂肪酸例えば共役脂肪酸の異性体などを精製することは難しい。【０００４】
従来から、特定の共役リノール酸についても、それを濃縮した濃縮物を得る方法が種々検討されてきた。例えば、共役リノール酸を酸性条件下メタノールなどと反応させてメチルエステル体を誘導し、晶析することで異性体を分離する方法が報告されている（例えば、非特許文献１参照）が、誘導体化する必要があり、コストがかかる上に分離後に加水分解の必要がある。また、そのまま晶析によって濃縮する場合には、十分に濃縮した濃縮物が得られない。さらに、クロマトグラフィーによる濃縮方法が知られているが、溶剤とカラムの使用などで非常にコストがかかる。
その他に、リパーゼの存在下で共役リノール酸の異性体混合物を構成成分とする脂肪酸混合物またはそのグリセリドエステル混合物を、有機溶媒を含まない反応系で共役リノール酸異性体に対する選択反応に付すことを特徴とする共役リノール酸異性体の精製方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。また、リパーゼ存在下で共役リノール酸異性体混合物とオクタノールとを反応させ、オクタノールエステル画分における共役リノール酸異性体組成比を変えることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。また、リパーゼ存在下で直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させることによって、9c,11t-共役リノール酸含有脂肪酸を得る方法が報告されている（例えば、特許文献３参照）。
しかしながら、これらのリパーゼを用いた方法は、リパーゼが非常に高価である上、リパーゼ存在下での各不飽和脂肪酸異性体とアルコール類、または各不飽和脂肪酸異性体誘導体の加水分解の反応性の違いにより分離する方法であるため、反応生成物と未反応物を分離する操作（例えば、蒸留）が必要であり、さらに分離後も異性体の誘導体については再度加水分解するなどの操作が必要であり、コストがかかる。また、使用するアルコール（例えば、オクタノール）によっては食用に不向きである。【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２３８１０号公報
【特許文献２】特表平１１−５１４８８７号公報
【特許文献３】特開２００１−１６９７９４号公報
【非特許文献１】O. Berdeaus, J. Voinot, E. Angioni, P. Jurneda, and J.L. Sebedio, J. Am. Oil. Chem. Soc., Vol. 75, 1749-1755 (1998).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来濃縮することが困難であった共役脂肪酸混合物から所定の異性体を濃縮した濃縮物を製造することができる、簡便で安価な方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記濃縮物を用いるエステル化物の製造方法を提供することを目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために本発明者等が鋭意検討を重ねた結果、共役リノール酸異性体混合物に特定の不飽和脂肪酸（オレイン酸）を添加して晶析処理を行うことにより、所望の異性体を濃縮した濃縮物を得ることに成功した。本発明者らはこの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、共役脂肪酸混合物（Ａ）から所望の異性体（ａ）を濃縮した濃縮物を製造する方法であって、
共役脂肪酸混合物（Ａ）と不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上とを混合して異性体（ａ）が溶解した混合溶液を得る工程、
該混合溶液から、異性体（ａ）に富んだ結晶を析出させるか、又は異性体（ａ）が希薄な結晶を析出させる晶析処理工程、及び
異性体（ａ）に富んだ結晶を得るため、又は異性体（ａ）が希薄な結晶を取り除いて異性体（ａ）に富んだ溶液を得るための固液分離処理工程
を含むことを特徴とする前記濃縮物の製造方法を提供する。【０００８】
また、本発明は、アルコール性水酸基を分子内に少なくとも１つ有する化合物を、前記製造方法によって得た不飽和脂肪酸濃縮物でエステル化することを特徴とするエステル化物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来濃縮することが困難であった混合物から所定の共役脂肪酸を濃縮した濃縮物を、非常に安価な方法で製造することができ、また、本発明の方法は、晶析と溶媒・不飽和脂肪酸除去のみを行うため、簡便である。
さらに、得られる濃縮物は食品用途に利用可能であり、濃縮物を用いて製造されたモノグリセライド（ＭＧ）、ジグリセライド（ＤＧ）、トリグリセライド（ＴＧ）などについても、食品用途に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、特定の共役脂肪酸混合物から所望の異性体を濃縮した濃縮物を製造する方法に関するものである。本発明の方法は、共役脂肪酸混合物（Ａ）と不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上とを混合した混合溶液を得る工程を含む。
混合物（Ａ）に含まれる共役脂肪酸としては、共役リノール酸、共役リノレン酸、共役イコサペンタエン酸、共役ドコサヘキサエン酸、スティリンジン酸、ディモルフェコリン酸などが挙げられる。好ましくは、Ｃ16-Ｃ20の共役不飽和脂肪酸であり、より好ましくは共役リノール酸である。
不飽和脂肪酸（Ｂ）としては、イソクロトン酸、カプロレイン酸、ミリストオレイン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、アスクレピン酸、リノール酸、リノレン酸などがあげられる。ミリストオレイン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、アスクレピン酸、リノール酸、リノレン酸などのＣ14-Ｃ20の不飽和脂肪酸が好ましい。また、ミリストオレイン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、アスクレピン酸、リノール酸、リノレン酸などのシス二重結合を１つ含む不飽和脂肪酸がより好ましい。また、オレイン酸がさらに好ましい。これらの不飽和脂肪酸（Ｂ）は単独で用いてもよく、また２種以上組み合わせて用いてもよい。
混合物（Ａ）と不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上とを混合する場合には、濃縮物において濃縮すべき所望の異性体（ａ）が溶解した混合溶液を調製することが好ましい。混合の際には有機溶媒を用いることもできる。ここで、好ましい有機溶媒としては、ケトン類（例えばアセトン、メチルエチルケトンなど）、炭化水素類（例えばヘキサン、石油エーテルなど）、芳香族炭化水素類（例えばベンゼン、トルエンなど）、アルコール類（例えばメタノール、エタノール、プロパノールなど）、含水アルコール、エーテル類（例えばジエチルエーテルなど）、エステル類（例えば酢酸エチルなど）などが挙げられる。常温で脂肪酸を溶解する溶剤で融点が冷却温度よりも低ければ何でもかまわない。より好ましくは、アセトン、ヘキサン、アルコール、含水アルコールなどであり、最も好ましくはアセトンである。
混合物（Ａ）と不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上との混合割合は、好ましくは混合物（Ａ）１００質量部に対して不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上が１５質量部以上である。より好ましくは、混合物（Ａ）１００質量部に対して不飽和脂肪酸（Ｂ）１種以上が２０〜１００質量部である。【００１１】
本発明の方法は、所望の異性体（ａ）が４〜１６位にシス配置を有する共役脂肪酸である場合に有効である。本発明の方法において、好適な４〜１６位にシス配置を有する不飽和脂肪酸としては、共役リノール酸、共役リノレン酸、共役イコサペンタエン酸、共役ドコサヘキサエン酸、スティリンジン酸、ディモルフェコリン酸、などが挙げられる。より好適には共役リノール酸であり、さらに好適には９−シス，１１−トランス共役リノール酸である。また、本発明の方法は、混合物（Ａ）がシス配置の位置が異性体（ａ）と２位以上異なる共役脂肪酸を含む場合に有効である。また、本発明の方法は、混合物（Ａ）が２種以上の共役脂肪酸を含む場合に有効である。２種以上の共役脂肪酸として２種以上の共役リノール酸を含む場合により有効であり、２種以上の共役リノール酸が９−シス，１１−トランス共役リノール酸及び１０−トランス，１２−シス共役リノール酸を含む場合に最も有効である。【００１２】
また、本発明の方法は、上記で得られた混合溶液から、
異性体（ａ）に富んだ結晶を析出させるか、又は異性体（ａ）が希薄な結晶を析出させる晶析処理工程を含む。
ここで、「異性体（ａ）に富んだ結晶」とは、混合物（Ａ）に含まれる他の異性体に対する異性体（ａ、ａ１又はａ２）の含有率が、混合物（Ａ）よりも高い含有率を有する結晶を意味し、好ましくは混合物（Ａ）における前記含有率の１．２倍以上の含有率であり、より好ましくは１．３倍以上の含有率であり、最も好ましくは１．５倍以上の含有率である。また、「異性体（ａ）が希薄な結晶」とは、混合物（Ａ）に含まれる他の異性体に対する異性体（ａ）の含有率が、混合物（Ａ）よりも低い含有率を有する結晶を意味し、好ましくは混合物（Ａ）における前記含有率の０．８倍以下の含有率であり、より好ましくは０．７倍以下の含有率であり、最も好ましくは０．６５倍以下の含有率である。【００１３】
晶析方法は、一般的な油脂、脂肪酸について行う方法と同様に行うことができ、冷却晶析法などが利用できる。晶析温度は濃縮する不飽和脂肪酸や添加する飽和脂肪酸の種類や溶剤の有無、種類、濃度などによって異なるが、一般的な脂肪酸の冷却分別条件であるアセトン溶剤を３倍量用いる条件の晶析温度は４〜−６０℃であり、好ましくは−１０〜−５０℃、より好ましくは−２０〜−４５℃である。晶析に際しては、溶媒を加えなくてもよいが、適切な溶媒を加えて行うのが望ましい。加える溶媒としては、例えばケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、炭化水素類（ヘキサン、石油エーテルなど）、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエンなど）、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノールなど）、含水アルコール、エーテル類（ジエチルエーテルなど）、エステル類（酢酸エチルなど）などが挙げられる。より好ましくは、アセトン、ヘキサン、アルコール、含水アルコールなどであり、最も好ましくはアセトンである。加える溶媒の量は、混合溶液（混合物（Ａ）＋  飽和脂肪酸（Ｂ））１００質量部に対して１０質量部以上であり、好ましくは５０〜１０００質量部、より好ましくは１００〜５００質量部である。【００１４】
また、本発明の方法は、
異性体（ａ）に富んだ結晶を得るため、又は異性体（ａ）が希薄な結晶を取り除いて異性体（ａ）に富んだ溶液を得るための固液分離処理工程
を含む。これにより、所望の異性体を濃縮した濃縮物を得ることができる。【００１５】
ここで、「異性体（ａ）に富んだ溶液」とは、混合物（Ａ）に含まれる他の異性体に対する異性体（ａ）の含有率が、混合物（Ａ）よりも高い含有率を有する溶液を意味し、好ましくは混合物（Ａ）における前記含有率の１．１倍以上の含有率であり、より好ましくは１．２倍以上の含有率であり、最も好ましくは１．５倍以上の含有率である。また、「異性体（ａ）が希薄な溶液」とは、混合物（Ａ）に含まれる他の異性体に対する異性体（ａ）の含有率が、混合物（Ａ）よりも低い含有率を有する溶液を意味し、好ましくは混合物（Ａ）における前記含有率の０．８５倍以下の含有率であり、より好ましくは０．７倍以下の含有率であり、最も好ましくは０．６倍以下の含有率である。【００１６】
固液分離方法は、一般的な油脂、脂肪酸について行う方法と同様に行うことができ、ろ過方式、遠心分離方式、沈降分離方式等が利用でき、回分式処理でも連続式処理でもよい。【００１７】
さらに、本発明の方法においては、得られた濃縮物から不飽和脂肪酸（Ｂ）及び／又は有機溶媒を除去するために、固液分離処理工程後に不飽和脂肪酸（Ｂ）及び／又は有機溶媒を除去処理する工程を含んでいてもよい。
除去方法は、一般的な油脂、脂肪酸について行う方法と同様に行うことができ、蒸留法、界面活性剤分別法、クロマトグラム法などが利用できる。蒸留法が望ましい。【００１８】
さらに、本発明の方法においては、上記処理工程を繰り返して所望の異性体を高度に濃縮した濃縮物を得ることができる。【００１９】
次に、本発明の共役脂肪酸異性体濃縮物を用いて、アルコール性水酸基を分子内に少なくとも１つ有する化合物をエステル化するエステル化物の製造方法について説明する。
アルコール性水酸基を分子内に少なくとも１つ有する化合物としては、各種モノアルコール、多価アルコール、アミノアルコールなど種々の化合物があげられる。具体的には、短鎖、中鎖、長鎖の飽和、不飽和、直鎖、分岐アルコール、グリコール類、グリセリン、エリスリトール類といった多価アルコールがあげられる。これらのうち、グリセリンが好ましい。
エステル化の条件は、例えば、特開平13−169795号公報や特開平15−113396号公報などに記載の条件に準じて行うことができる。一例をあげると、基質の合計質量、すなわちアルコール性水酸基を有する化合物と不飽和脂肪酸濃縮物の合計質量に対して、リパーゼを０．１〜２質量％添加し、３０〜６０℃で２４〜７２時間反応させる。この際、反応系を減圧にしてエステル化により生じる水を除去しながら反応を行うのがよい。
【実施例】
【００２０】
１．材料・分析装置
この実施例で用いる材料及び分析装置は以下の通りである。
（１）材料
共役リノール酸 CLA-80HGR       日清オイリオグループ株式会社
オレイン酸（18:1）                     東京化成工業株式会社
アセトン（特級）                        ナカライテスク株式会社
グリセリン                               和光純薬工業株式会社
リパーゼＱＬＭ                         名糖産業株式会社
リパーゼＲＭ                           当社出願特許  特願平2004-114443により製造
（２）分析装置
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ-2010）    株式会社 島津製作所  製
カラム  ；  DB-23  30 m×0.25 μm×0.25 mm  Agilent Technologies社製【００２１】
２．分析方法
（１）異性体分析方法
14％３フッ化ホウ素メタノール錯体メタノール溶液にてメチルエステル化した後、DB-23(Agilent Technologies)30 m×0.25 μm×0.25 mmをもちいたＧＬＣにて分析を行った。
（２）ＧＬＣ分析条件
カラム               DB-23(Agilent Technologies)  30 m×0.25 μm×0.25 mm
検出器             FID
キャリアガス       He(1mL/min)
スプリット比       100:1
カラム温度℃     220 ℃（2 ℃/min）
注入口温度      250 ℃
検出器温度      250 ℃【００２２】
３．異性体濃縮方法
以下において用いられる異性体純度とは、下記式によって与えられる量である。
異性体純度 ＝（所望の異性体量または濃度）/（全異性体量または濃度）
また、共役リノール酸の異性体について、下記の記号を用いる。
9c11t：９−シス，１１−トランス共役リノール酸
10t12c：１０−トランス，１２−シス共役リノール酸
9c11c：９−シス，１１シス共役リノール酸
10c12c：１０−シス，12−シス共役リノール酸
tt：９−トランス，１１−トランス共役リノール酸と１０−トランス，１２−トランス共役リノール酸の合計【００２３】
比較例１
共役リノール酸 CLA-80HGRを500ｇ測りとり、これにアセトン1500ｇを加えて溶解した後、-20℃で一晩撹拌しながら冷却した。次いで減圧濾過にて固形部と液状部に分別し、固形部および液状部のアセトンを留去し、固形部１を19ｇと液状部１を480ｇ得た。結果を表１に示す。固形部、液状部ともに異性体純度に変化は見られず異性体濃縮物は得られなかった。【００２４】
【表１】
0005016483.tif 000002
【００２５】
比較例２
CLA-80HGRを20ｇ測りとり、これにアセトン60ｇを加えて溶解した後、-30℃で一晩静置した。次いで減圧濾過にて固形部と液状部に分別し、固形部および液状部のアセトンを留去し、固形部２を6.7ｇと液状部２を12.5ｇ得た。結果を表２に示す。固形部、液状部ともに異性体純度に変化は見られず異性体濃縮物は得られなかった。【００２６】
【表２】
0005016483.tif 000003
【００２７】
比較例３
比較例１で得られた液状部１を10ｇ測りとり、これにアセトン30ｇ加え溶解した後、-30℃で一晩静置した。次いで減圧濾過にて固形部と液状部に分別した後、固形部と液状部のアセトンを留去し、固形部３を4.0ｇと液状部３を5.5ｇ得た。結果を表３に示す。固形部、液状部ともに異性体純度におおきな変化は見られず、異性体濃縮物は得られなかった。【００２８】
【表３】
0005016483.tif 000004
【００２９】
（ii）異性体濃縮方法
実施例１
比較例１で得られた液状部１を５ｇはかりとり、オレイン酸５ｇとアセトン３０ｇを加えて混合溶液を調製し、これを−20℃で冷却しながら一晩静置した。次いでデカンテーションにて固形部と液状部を分離した後アセトンを留去し、固形部４を６．６ｇ、液状部４を３．０ｇ得た。収量、異性体純度および脂肪酸組成の結果および比較例３の結果を表４に示した。固形部の異性体純度は比較例３と比較しておおきな変化が見られ、9c11t体の異性体純度が向上した。【００３０】
【表４】
0005016483.tif 000005
【００３１】
実施例２
比較例１と同条件で調整した液状部１を４９０ｇはかりとり、オレイン酸２１０ｇとアセトン２１００ｇを加えて混合溶液を調製し、これを−２５℃で攪拌しながら４時間冷却した。次いで減圧濾過にて固形部と液状部を分離した後にアセトンを留去し、固形部５を１９１ｇ、液状部５を５０８ｇ得た。異性体純度および脂肪酸組成の結果および比較例３の結果を表５に示した。固形部の異性体純度は比較例３と比較しておおきな変化が見られ、9c11t体の異性体純度が向上した。【００３２】
【表５】
0005016483.tif 000006
【００３３】
実施例３
実施例２で得られた固形部５を１９１ｇはかりとり、アセトン５７５ｇを加えて混合溶液を調製し、これを−２４℃で攪拌しながら４時間冷却した。次いで減圧濾過にて固形部と液状部を分離した後にアセトンを留去し、固形部６を４０ｇ、液状部５を１４４ｇ得た。異性体純度および脂肪酸組成の結果および固形部５の結果を表６に示した。固形部の異性体純度は固形部５と比較しておおきな変化が見られ、9c11t体の異性体純度がさらに向上した。【００３４】
【表６】
0005016483.tif 000007
【００３５】
実施例４
攪拌機付き反応容器に、グリセリン2g及び実施例１と同様の方法で得られた固形部18ｇを加え、これに、撹拌下、リパーゼＱＬＭ 40mg、リパーゼＲＭ 160mgを添加した。60℃で10トールにて24時間反応させ、トリグリセライド18gを得た。得られたトリグリセライドはトリグリセライド濃度94％、酸価2.9であった。