(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドであって、かつエンドヌクアレーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
（ｅ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも下記（ａ）、（ｂ）の理化学的性質を有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド：
（ａ）基質特異性：線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに作用する；
（ｂ）低温での反応性：０〜１０℃での活性が２０℃での活性の３０％以上を保持する。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択される核酸であって、かつエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｄ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する核酸；
（ｅ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する核酸において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された核酸；
（ｆ）前記（ｄ）に記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸；
（ｇ）前記（ａ）〜（ｅ）いずれか記載の核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核酸；および
（ｈ）前記（ｄ）に記載の核酸の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を有する核酸。
【請求項４】
請求項３記載の核酸を含んでなる、組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３記載の核酸を保持してなる、形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養する工程、およびエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを培養物中から回収する工程を包含することを特徴とする、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドを用いて核酸を分解する工程を包含する核酸の分解方法。
【請求項８】
請求項１記載のポリペプチドを用いてタンパク質抽出液を処理する工程を包含するタンパク質抽出液の粘性の低減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学用試薬あるいは工業用酵素として有用な、低温〜常温において高い活性を有するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドの製造方法、さらに該ポリペプチドを用いた核酸の分解方法およびタンパク質抽出液の粘性の低減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドヌクレアーゼは遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、ＲＴ−ＰＣＲを行う前のゲノムＤＮＡの除去、Ｔ７あるいはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ合成反応後に鋳型ＤＮＡを分解する反応、ＤＮＡライブラリ合成、フットプリント法、タンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減あるいは２次元電気泳動サンプルの前処理などに幅広く利用されている。
高分子核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）は、その作用様式に基づき、（ａ）高分子核酸の糖リン酸鎖（主鎖）の内部のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドヌクレアーゼ、（ｂ）主鎖の５’および／または３’末端から順次切断を行うエキソヌクレアーゼ、に分類される。
さらに、エンドヌクレアーゼはその基質に基づき、（ａ）ＤＮＡを分解するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、（ｂ）ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、（ｃ）ＤＮＡおよびＲＮＡを分解する酵素（これを単にヌクレアーゼということもある）、に分類することができる。【０００３】
上記エンドヌクレアーゼのうち（ａ）デオキシリボヌクレアーゼとしては、（i）二本鎖および一本鎖ＤＮＡに作用して３’−ＯＨ末端、５’−Ｐ末端を有するオリゴヌクレオチドに分解するデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）、（ii）二本鎖および一本鎖ＤＮＡに作用して３’−Ｐ末端、５’−ＯＨ末端を有するオリゴヌクレオチドに分解するデオキシリボヌクレアーゼＩＩ（ＤＮａｓｅＩＩ）、（iii）一本鎖ＤＮＡ分子内のシトシンの５’側のホスホジエステル結合を選択的に切断し、３’−ＯＨ末端、５’−Ｐ末端を有するオリゴヌクレオチドに分解するエンドデオキシリボヌクレアーゼＩＶ、（iv）特定の塩基配列を認識し切断する制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）、などが例示される。【０００４】
例えばデオキシリボヌクレアーゼＩは、ＥＣ  ３．１．２１．１に分類され（例えば、非特許文献１参照）、上記活性の他、二本鎖ＤＮＡ両鎖において、それぞれ別の部位でホスホジエステル結合を加水分解し、一本鎖切断（ｎｉｃｋｉｎｇ）をおこし、次第に高分子核酸を低分子化する活性を有すること、基質によって反応速度が異なり、二本鎖ＤＮＡ＞一本鎖ＤＮＡ＞オリゴヌクレオチドの順に遅くなること、また塩基配列に対する特異性がないか極めて低いことが知られている。【０００５】
デオキシリボヌクレアーゼＩは、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、魚類などの膵・腎・肝・心臓・血清など、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、大腸菌、Ｔ４ファージ、λファージ、などにその存在が確認されている。【０００６】
デオキシリボヌクレアーゼＩは、核酸増幅反応における偽陽性（ｐｓｅｕｄｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）を防止するために利用されている。
ＰＣＲ反応系に鋳型ＤＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼを添加する前にデオキシリボヌクレアーゼＩを添加し、コンタミしている核酸やプライマーと非特異的結合をしている核酸などを分解するためにＤＮａｓｅＩが使用されている（例えば、非特許文献２参照）。
ＰＣＲを行う前にデオキシリボヌクレアーゼＩを失活させる必要があるが、当該デオキシリボヌクレアーゼは高温でも安定して活性を有し、失活させるためには３０分間煮沸しなければならない。【０００７】
この問題を解決するため、低温〜常温において活性を示すが、中高温において容易に失活する酵素を用いる方法が開発されている。
例えば、特許文献１記載の小エビＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ由来ＤＮａｓｅは、１２℃では活性を示さないが、２２〜３７℃において活性を示すことが記載されている。しかしながら、該酵素は一本鎖ＤＮＡを分解することはできない。また、該酵素を完全に失活させるためには９４℃にて５分間保持する必要がある。
また、特許文献２には、海水中および海洋生物から単離された微生物由来ＤＮａｓｅおよびプロテアーゼが記載されている。該ＤＮａｓｅは由来となる微生物によって温度感受性が多少異なるが、２０℃以上で活性を示し、５０〜６０℃以上で失活する。しかしながら、該ＤＮａｓｅに関して、二本鎖ＤＮＡを分解することは記載されているが、一本鎖ＤＮＡを分解するかどうかに関する記載はない。また、温度感受性以外の理化学的性質やアミノ酸配列、該ＤＮａｓｅをコードする核酸の塩基配列については何ら記載されていない。【０００８】
また、エンドヌクレアーゼのうち（ｃ）のＤＮＡおよびＲＮＡを分解する活性を有するエンドヌクレアーゼは、遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、さらにタンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減あるいは２次元電気泳動サンプルの前処理などに使われている。
例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのヌクレアーゼ（例えば特許文献３、非特許文献３参照）、カイコのヌクレアーゼＳＷ、マングマメのヌクレアーゼ、ポテトおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｏｒ  ａｇｉｌｉｓのヌクレアーゼ（例えば、非特許文献４参照）などが知られている。反応機構は、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、合成ポリヌクレオチドの分子内のリン酸ジエステル結合を特異的に切断して５´−ジ−およびトリヌクレオチドを生成するものである。【０００９】
上記活性を有するエンドヌクレアーゼのうち、一本鎖、二本鎖、その他の形状に関係なく、すべての種類のＤＮＡおよびＲＮＡ基質に作用するものは、タンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減あるいは２次元電気泳動サンプルの前処理に使われている（例えば、特許文献３参照）。例えば、ノバジェン社製のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅａｓｅがそのような目的で使用されている。【００１０】
上記活性を有するエンドヌクレアーゼは、タンパク質抽出液の粘性を低減させる目的で、細胞破砕上清に添加して使用できる。細胞破砕によって目的タンパク質を抽出する際、破砕処理中に生ずる熱や機械力によってタンパク質が変性し、活性の低下を招くおそれがある。それを防ぐため、細胞破砕の間、氷で冷却した緩衝液を用いたり、氷中で冷やしながら行うのが一般的である。また、破砕処理後も目的タンパク質が熱に弱いときはもちろん、抽出液中のタンパク質分解酵素の働きを抑えるためにも抽出液を冷却することが必要である。
さらに、微生物などの急速に増殖する細胞から得た抽出液には大量の核酸物質が含まれているが、その後のサンプル処理を容易にするためにも、抽出液の段階で粘性を低減することが重要になってくる。
そのため、冷却された細胞抽出液の段階で粘性を低減することが必要となる。また、目的タンパク質が熱に弱いときは目的タンパク質に影響を与えないためにも、低温〜常温において上記活性を示すエンドヌクレアーゼを開発することが必要である。
低温でもＤＮＡおよびＲＮＡを分解する活性を保持するエンドヌクレアーゼについての知見はない。【００１１】
【特許文献１】国際公開第９９／０７８８７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／１８２３０号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５１７３４１８号明細書
【非特許文献１】Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／）
【非特許文献２】Ｆｕｒｒｅｒ  Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３４６巻、第６２８２号、第３２４頁（１９９０年）
【非特許文献３】Ｇｅｏｒｇｅ  Ｎ．Ｅａｖｅｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第８５巻、第２７３〜２７８頁（１９６３年）
【非特許文献４】Ａｕｄｒｅｙ  Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２３５巻、第３０１６〜３０２２頁、第３０２３〜３０２７頁（１９６０年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、遺伝子工学用試薬として、さらに工業用酵素として有用な、ゲノムＤＮＡの除去、ＲＮＡ合成反応後に鋳型ＤＮＡを分解する反応、ＤＮＡライブラリ合成、フットプリント法、タンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減、２次元電気泳動サンプルの前処理およびウイルス精製時の前処理などのいずれにおいても有用なエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリペプチドをコードする核酸を提供することにある。
また、本発明の目的は、当該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法ならびに該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いた核酸の分解方法およびタンパク質抽出液の粘性の低減方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは鋭意研究の結果、低温性微生物であるＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ａｃ１０株から低温域において活性を有するエンドヌクレアーゼをコードする核酸を見出し、該遺伝子をクローニングしてエンドヌクレアーゼポリペプチドを製造し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の発明は、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドであって、かつエンドヌクアレーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列またはその一部を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列相同性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
（ｅ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、に関する。【００１４】
本発明の第２の発明は、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）の理化学的性質を有することを特徴とする本発明の第１の発明のポリペプチド：
（ａ）基質特異性：線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに作用する；
（ｂ）低温での反応性：０〜１０℃での活性が２０℃での活性の３０％以上を保持する、に関する。【００１５】
本発明の第３の発明は、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択される核酸であって、かつエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号１０記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｄ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する核酸またはその一部を有する核酸；
（ｅ）配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する核酸またはその一部を有する核酸において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された核酸；
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）いずれか記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸；
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）いずれか記載の核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核酸；および
（ｈ）前記（ａ）〜（ｇ）いずれか記載の核酸の塩基配列と少なくとも６０％の配列相同性を有する塩基配列を有する核酸、に関する。【００１６】
本発明の第４の発明は、本発明の第３の発明の核酸を含んでなる、組換えＤＮＡ、に関する。【００１７】
本発明の第５の発明は、本発明の第３の発明の核酸を保持してなる、形質転換体、に関する。【００１８】
本発明の第６の発明は、本発明の第５の発明の形質転換体を培養する工程、およびエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを培養物中から回収する工程を包含することを特徴とする、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法、に関する。【００１９】
本発明の第７の発明は、本発明の第１の発明のポリペプチドを用いて核酸を分解する工程を包含する核酸の分解方法、に関する。【００２０】
本発明の第８の発明は、本発明の第１の発明のポリペプチドを用いてタンパク質抽出液を処理する工程を包含するタンパク質抽出液の粘性の低減方法、に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、遺伝子工学用試薬として、さらに工業用酵素として、ゲノムＤＮＡの除去、ＲＮＡ合成反応後に鋳型ＤＮＡを分解する反応、ＤＮＡライブラリ合成、フットプリント法、タンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減、２次元電気泳動サンプルの前処理およびウイルス精製時の前処理などのいずれにおいても有用なエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリペプチドをコードする核酸ならびに当該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法が提供される。本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、核酸増幅反応の前処理、ＲＮＡ合成後の鋳型核酸処理、タンパク質抽出液の前処理、タンパク質溶液中の核酸除去による精製において好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの活性測定試験結果を示す図である。
【図２】図２は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの熱安定性試験結果を示す図である。
【図３】図３は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの至適温度試験結果を示す図である。
【図４】図４は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの基質特異性試験結果を示す図である。
【図５】図５は、ＥＤＴＡの低温性微生物由来ＤＮａｓｅの反応に対する影響試験結果を示す図である。
【図６】図６は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの至適ｐＨ試験結果を示す図である。
【図７】図７は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅのｐＨ安定性試験結果を示す図である。
【図８】図８は、本発明のエンドヌクレアーゼの活性測定試験結果を示す図である。
【図９】図９は、本発明のエンドヌクレアーゼの分子量を調べたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動試験結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明のエンドヌクレアーゼとＢｅｎｚｏｎａｓｅとの低温での反応性比較試験結果を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明のエンドヌクレアーゼの基質特異性試験結果を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明のエンドヌクレアーゼの至適ｐＨ試験結果を示す図である。
【図１３−１】図１３−１は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結果を示す図である。
【図１３−２】図１３−２は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結果を示す図である。
【図１３−３】図１３−３は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結果を示す図である。
【図１３−４】図１３−４は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結果を示す図である。
【図１４】図１４は、本発明のエンドヌクレアーゼとＤＮａｓｅＩの低温で大腸菌からタンパク質抽出する際の粘性の低減効果を示す電気泳動結果である。
【図１５】図１５は、本発明のエンドヌクレアーゼとＤＮａｓｅＩの低温で大腸菌からタンパク質抽出する際の粘性の低減効果を示す電気泳動結果である。
【図１６】図１６は、本発明のエンドヌクレアーゼとＤＮａｓｅＩの大腸菌ゲノムＤＮＡ分解反応比較試験結果を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明のエンドヌクレアーゼとＤＮａｓｅＩの大腸菌ゲノムＤＮＡ分解反応比較試験結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書においてエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとは、高分子核酸の糖リン酸鎖（主鎖）の内部のリン酸ジエステル結合を加水分解する反応を触媒するポリペプチドのことをいう。【００２４】
本明細書においてＤＮａｓｅとは、二本鎖および一本鎖ＤＮＡに作用して３’−ＯＨ末端、５’−Ｐ末端を有するオリゴヌクレオチドに分解する反応を触媒するポリペプチドのことをいう。【００２５】
本明細書において低温とは、２０℃未満の温度を指し、常温（中温）とは、２０〜５０℃の範囲の温度を指し、高温とは、５０℃より高い温度を指す。【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列表の配列番号１０もしくは配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。
ここで、本明細書に記載の「機能的同等物」として、配列表の配列番号１０もしくは配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１以上の、例えば、１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。【００２７】
本発明によって開示されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列表の配列番号１０もしくは配列番号３）に少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の相同性を有し、かつ、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明の範囲内に属するものである。【００２８】
さらに、遺伝子工学的にポリペプチドの生産を行う際には融合ポリペプチドとして発現させることがしばしば行われる。たとえば目的ポリペプチドの発現量を増加させるためにＮ末端に他のポリペプチド由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的ポリペプチドのＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、このペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより目的ポリペプチドの精製を容易にすることなどが行われている。従って本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとは一部異なったアミノ酸配列を有するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであっても、それが本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと本質的に同等の活性を示す限りにおいて、該酵素は「機能的同等物」として本発明の範囲内に属するものである。【００２９】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号１０もしくは配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含む核酸、例えば、配列表の配列番号１１もしくは配列番号４に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸が挙げられる。また、配列表の配列番号１０もしくは配列番号３のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドをコードする核酸も挙げられる。【００３０】
また、さらにこれらの配列あるいはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で、かつ下記エンドヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列も本発明の範囲内である。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能」とは、特に本発明を限定するものではないが、０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である）中、６５℃にて１２〜２０時間インキュベートした後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃にて３０分間洗浄を行っても、本発明の核酸またはその相補鎖とハイブリダイズしていることを言う。【００３１】
さらに、本発明によって開示された塩基配列（配列表の配列番号１１もしくは配列番号４）に少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の相同性を有する核酸は、本発明の範囲内に属するものである。【００３２】
上記相同性は、例えばコンピュータープログラム  ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（タカラバイオ社製）、コンピュータアルゴリズム  ＦＡＳＴＡ〔バージョン３．０；Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ  Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８５巻、第８号、第２４４４〜２４４８頁（１９８８年）〕、コンピュータアルゴリズム  ＢＬＡＳＴ〔バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２５巻、第１７号、第３３８９〜３４０２頁（１９９７年）〕などによって測定することができる。【００３３】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核酸は、本発明の範囲内に属するものである。
ここで本明細書に記載の「アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸」なる用語について説明する。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。従って、あるアミノ酸配列をコードする核酸は、そのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。
本明細書中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する核酸ではなくても、それが本発明中に開示されたアミノ酸配列をコードする限り該核酸は本発明に包含されるものである。
また、本発明の核酸は、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものであればＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラヌクレオチドのいずれであってもよく、さらに修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。その形態は、二本鎖、一本鎖のいずれであってもよい。【００３４】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのヌクレアーゼであるＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ノバジェン社製）と比較して、低温において高いエンドヌクレアーゼ活性を保持する特徴を有したポリペプチドである。【００３５】
本発明の配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号１１に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドの理化学的性質は、以下（ａ）〜（ｌ）の通りである。
（ａ）基質特異性：線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ，一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに対して活性を示す。
（ｂ）低温での反応性：０〜１０℃での活性が２０℃での活性の３０％以上を保持している。
（ｃ）活性を有する温度範囲：０〜５０℃
（ｄ）ｐＨ安定性：３７℃、３０分間の処理に対し、ｐＨ６〜１０の範囲で活性を保持している。
（ｅ）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により２５〜３１ｋＤａである。
（ｆ）至適マグネシウムイオン濃度：６０〜１２０ｍＭ
（ｇ）至適ナトリウムイオン濃度：０〜１６７ｍＭ
（ｈ）至適カリウムイオン濃度：０〜１６７ｍＭ
（ｉ）至適カルシウムイオン濃度：０〜４２ｍＭ
（ｊ）至適ジチオスレイトール濃度：０〜１６７ｍＭ
（ｋ）至適２−メルカプトエタノール濃度：０〜３３３ｍＭ
（ｌ）至適硫酸アンモニウム濃度：０〜８３ｍＭ【００３６】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、上記理化学的性質を有しているものであれば特に限定はされないが例えば、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ａｃ１０株から得ることができる。【００３７】
生化学的特性を解析したところ、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、タンパク質溶液中の核酸の除去やタンパク質抽出液の粘性の低減に適している。特に、低温での上記用途での使用に適している。【００３８】
本明細書において、低温での反応性は、以下のようにして算出することができる。
まず、調べたいエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドについて、酵素ユニット量を決定する。例えば、基質としてサケ精巣由来ＤＮＡ（和光純薬社製）を用い、基質溶液（４０μｇ／ｍｌ、１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  塩化マグネシウム）５００μｌにエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドのサンプル１００μｌを加えた反応系で、３７℃において２６０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素量を１Ｕとする。
次に、上記基質溶液  ５００μｌに、これに上記方法により決定された２．３Ｕのエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド含有溶液（１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  塩化マグネシウム）１００μｌを加えたものを反応液とする。
当該活性測定は、上記反応液を０、５、１０、１５、２０℃の各種温度において、１０分間反応させた後、２６０ｎｍの吸光度の増加量を測定することにより算出する。
次に２０℃でのエンドヌクレアーゼ活性を１００として各温度における相対活性（％）を計算し比較することにより低温での反応性を評価することができる。
例えば、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは０〜１０℃での相対活性が３０〜７０％程度であるのに対して、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ノバジェン社製）は、０〜１０℃での相対活性が０〜２０％程度まで著しく低下する。従って、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、市販のＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅと比較して、低温において、特に０〜１０℃において、高いエンドヌクレアーゼ活性を保持している。【００３９】
また、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号４に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩと比較してより低温で失活する特徴を有している。例えば、ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩは９０℃でも活性を保持しているが、実施例１記載のように本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは７０℃、３０分処理で完全に失活する。【００４０】
前記エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの理化学的性質は、以下（ａ）〜（ｈ）の通りである。
（ａ）基質特異性：線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ，一本鎖ＤＮＡに対して活性を示す。
（ｂ）７０℃、３０分処理で完全に失活する。
（ｃ）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により２７〜３１ｋＤａである。
（ｄ）至適温度：３０〜４０℃
（ｅ）温度安定性：４０℃で３０分間、活性を保持している。
（ｆ）至適ｐＨ：６〜１０
（ｇ）ｐＨ安定性：３７℃、３０分間の処理に対し、ｐＨ４〜１０の範囲で活性を保持している。
（ｈ）阻害剤の影響：５ｍＭ  ＥＤＴＡによって活性が阻害される。【００４１】
上記熱安定性については、実施例１−（５）記載の方法に基づいて算出することができる。また、上記エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、４０℃までは高い活性を示すが、それを超えると活性が低下し始め、５０℃を超えると急速に活性が低下し、６０℃でほぼ活性がなくなり、７０℃で完全に失活する。このことは、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドがＰＣＲのコンタミネーション除去やＲＴ−ＰＣＲのゲノム除去などの遺伝子工学用試薬として非常に優れたものであることを示すものである。【００４２】
（２）本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドを生産する微生物の培養物から、あるいは当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体から大量生産することが可能である。【００４３】
特に限定はされないが、例えば、低温性微生物Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ａｃ１０株を１５℃で好気培養する。増殖した菌体を破砕してＤＮＡを抽出、精製する方法、また得られたＤＮＡを制限酵素で切断する方法等は公知の方法を用いる事ができる。当該方法の詳細は、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第３版〔ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行〕に記載されている。【００４４】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、特に限定はされないが例えば配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する核酸又はその一部が組み込まれた組換えプラスミドで形質転換された形質転換体を適切な培養条件、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ＬＢ培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で培養することにより、その菌体内に発現させることができる。該ポリペプチドは上記の培養菌体を破砕し、該ポリペプチドを精製することにより、得ることができる。【００４５】
遺伝子工学的な操作による上記酵素、ポリペプチドの製造方法としては、例えば、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが宿主生物で機能する適当なプロモーターに機能的に接続された組換えＤＮＡを挿入したベクターを用いて形質転換された宿主細胞、または該組換えＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡにインテグレーションされた宿主細胞を、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが発現できる条件のもとに培養し、さらに当該ポリペプチドを培養液から回収する方法が挙げられる。前記の組換えＤＮＡは、オペレータやターミネータ等の調節因子をさらに含んでいてもよい。【００４６】
また、上記本発明のポリペプチドに、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓタグ配列等）、大腸菌シャペロンの一種であるトリガーファクター（ＴＦ）タグ配列あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ配列、ＨＲＶ  ３Ｃ配列、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ配列等）などのアミノ酸配列を付加したものも本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドに含まれる。前記ポリペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号８記載のアミノ酸配列を有するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。【００４７】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造するためのベクターには、特に限定はなく、市販のベクター、発現系のいずれもが使用できる。特に、限定はされないが例えばｐＥＴシステム（ノバジェン社製）を用いることができる。さらに、低温で機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ（コールドショック発現）系ベクターが挙げられる。
本発明の製造方法の一態様としては、国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターで製造する方法が例示される。
コールドショック発現系は、低温で発現誘導するため、宿主大腸菌由来のタンパク質の合成が抑制され、目的タンパク質のみを高効率で得ることができ、従来の大腸菌発現系と比較して発現量や可溶性度の向上が期待できる。さらに、トリガーファクター（ＴＦ）の可溶化タグ機能およびシャペロン機能により、これまで発現が困難であった遺伝子を、より高い確率で可溶化タンパク質として発現させることが可能となる。
すなわち、本発明の製造方法においては、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現できるベクターであればいずれもが好適に使用できる。
また、当該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを得られるならば、ポリペプチド発現時は封入体の形態であるが、その後のリホールディング操作により当該機能を回復できるものを発現できるベクターも含まれる。
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造するためのベクターとしては、例えば、実施例１記載のｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３１３）および実施例２記載のｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１が好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号９記載の塩基配列を含むベクターが好適に使用できる。【００４８】
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造するには、一般の組み換え酵素製造の手段に準じて行えば良い。即ち、本発明のポリペプチドを生産し得る組み換え微生物を培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から分離することができる。この菌体を破砕して無細胞抽出液を調製し、粗酵素液として以下の精製操作に用いる。また、酵素が菌体外に分泌されている場合には、菌体が除去された培養液上清を粗酵素液とすることができる。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により濃縮し、および／または適当な方法を用いて粉末化して精製に用いることもできる。また、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。
例えば、実施例２において、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを生産し得る組み換え微生物を培養後、遠心分離により菌体を培養液から分離することができる。この菌体を超音波破砕し、遠心分離により菌体が除去された培養液上清を、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）およびＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製し、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造することができる。【００４９】
このようにして得られた本発明の配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号１１に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼとしての機能を有するポリペプチドは、長鎖および短鎖線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを基質とする。さらにその分解効率は、長鎖線状二本鎖ＤＮＡ≒短鎖線状二本鎖ＤＮＡ＞環状二本鎖ＤＮＡ＞一本鎖ＤＮＡ≒ＲＮＡの順に低くなる。また、本発明のエンドヌクレアーゼは、λ−ＤＮＡ、ｐＵＣ１１９、Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡのいずれも分解することができる。【００５０】
また、本発明の配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号４に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、長鎖および短鎖線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡを基質とする。その分解効率は、長鎖線状二本鎖ＤＮＡ≒短鎖線状二本鎖ＤＮＡ＞環状二本鎖ＤＮＡ＞一本鎖ＤＮＡの順に低くなる。また、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、λ−ＤＮＡ、ｐＵＣ１１９、Ｍ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡのいずれも分解しており、基質の形状（一本鎖、二本鎖）や塩基配列に対する特異性はないと考えられる。【００５１】
（３）本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いた核酸の分解方法、タンパク質抽出液の粘性の低減方法および該方法のための組成物ならびにキット
上記（１）の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、核酸の分解方法において好適に使用することができる。特に限定はされないが例えば、大腸菌超音波破砕上清に添加し、低温で反応させ、残存する大腸菌由来ゲノムの量を従来のＤＮａｓｅＩの場合と比較すると、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、目的タンパク質に影響を与えずにゲノムＤＮＡを分解することができる。
上記方法において、特に配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号１１に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、タンパク質精製において障害となる核酸の分解方法に好適に使用できる。【００５２】
また、上記（１）の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、タンパク質の抽出方法において好適に使用することができる。特に限定はされないが、タンパク質抽出用試薬キット、例えばＴＡＬＯＮ  ｘＴｒａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて氷上でタンパク質抽出を行う際に、当該ポリペプチドを抽出液に添加し、粘性低減効果を比較してみると、従来のＤＮａｓｅＩの場合と比較して１オーダー低い添加量でも目的タンパク質に影響を与えずに粘性を下げることができる。
上記方法において、特に配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号１１に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列において、１以上の、例えば１もしくは複数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、タンパク質抽出において障害となる抽出液の粘性の低減方法に好適に使用できる。【００５３】
本発明のタンパク質溶液中の核酸の除去やタンパク質抽出液の粘性の低減などを行うための組成物ならびにキットは、上記（１）記載の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含有することを特徴とする。さらに、反応用バッファーを含んでいてもよい。
前記キットとしては、例えばタンパク質抽出用試薬キットに本発明のポリペプチドを含有させたキットが挙げられる。タンパク質抽出用試薬キットには、上記（１）記載の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、反応用バッファー以外に、プロテアーゼ阻害剤、溶菌酵素、界面活性剤を含んでいてもよい。前記プロテアーゼ阻害剤、溶菌酵素、界面活性剤としては、ＰＭＳＦ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）などが例示される。【００５４】
さらに上記（１）の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰＣＲのコンタミ除去やＲＴ−ＰＣＲのゲノム除去に用いることができる。
当該方法のための組成物ならびにキットは、上記（１）の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含むものが好適に使用できる。さらに、反応用バッファーを含んでいてもよい。
前記キットとしては、特に限定はされないが例えばＰＣＲ用キットに本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含有させたキットが挙げられる。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作についてはモレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第３版〔ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行〕に記載の方法によった。【００５６】
実施例１  コールドショック発現系を用いた低温性微生物由来ＤＮａｓｅの発現検討
（１）発現ベクターの構築
低温性微生物Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ａｃ１０株ゲノムＤＮＡ配列からｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．：Ｐ２５７３６）と相同的なポリペプチドをコードするＯＲＦを推定した。
該ＯＲＦの配列をもとに配列表の配列番号１及び２記載の合成プライマー１及び２をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅのアミノ酸配列（配列表の配列番号３）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列をもち、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を塩基番号４〜９にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー２は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅのアミノ酸配列（配列表の配列番号３）のアミノ酸番号２４７〜２５４に相当する塩基配列をもち、さらに制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号４〜９にもつ合成ＤＮＡである。【００５７】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（低温性微生物  Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ａｃ１０株ゲノムＤＮＡ）１μｌ、１０μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１００ｐｍｏｌの合成プライマー１、１００ｐｍｏｌの合成プライマー２、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  ３０秒、５８℃  ３０秒、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００５８】
反応終了後、該反応液１００μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００５９】
次に、国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの記載に基づき、プラスミドｐＭＭ０４７を出発材料としてｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を構築した。
このｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを上記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００６０】
この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１とした。当該プラスミドは、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１と命名、表示され、平成１７年（２００５年）２月１６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター〔日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）〕にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３１３として国際寄託されている。このｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅ  アミノ酸配列（配列表の配列番号３）のアミノ酸番号１〜２５４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表の配列番号４）を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、該アミノ酸配列のＮ末にＰｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ配列ならびにリンカーを有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、当該ポリペプチドをコードする核酸の塩基配列を配列表の配列番号６に示す。【００６１】
（２）形質転換体の調製
ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。形質転換体は、１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）を用いてスクリーニングすることにより得た。【００６２】
（３）低温性微生物由来ＤＮａｓｅの発現
上記（２）で得られた形質転換体を用いて、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの発現を調べた。対照としてインサートを導入していないｐＣｏｌｄ０８ベクターのみを用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１も同時に行った。培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を用いて３７℃で培養し、濁度がＯＤ６００＝０．８程度に達した時点で１５℃、１５分間培養後、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を２４時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体をＰＢＳに懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液を調製、ついで１５，０００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分の０．０５ＯＤ分（ＯＤ６００）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％ゲル）に供し、ＣＢＢ染色および抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。
その結果、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した菌体のみに、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質である低温性微生物由来ＤＮａｓｅの発現が確認された。該融合タンパク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて３１ｋＤａ付近であった。また、ｔａｇ配列を除去した本発明のＤＮａｓｅの分子量は、２９ｋＤａ付近であった。【００６３】
（４）低温性微生物由来ＤＮａｓｅ活性の測定
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、ＤＮａｓｅ活性を測定した。前記の対照大腸菌の超音波破砕可溶性画分のものも同時に行った。活性測定は以下のようにして行った。
活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社製）を基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記（３）で調製したタンパク質サンプル０．０２５ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。２０℃で２時間反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図１に示す。
図１において、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１はｐＣｏｌｄ０８ベクターのみを導入した大腸菌の可溶性画分、レーン２はｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分、レーン３は基質を反応系に添加していないｐＣｏｌｄ０８ベクターのみを導入した大腸菌の可溶性画分、レーン４は基質を反応系に添加していないｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分である。
図１より、λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔをｐＣｏｌｄ０８ベクターのみを導入した大腸菌の可溶性画分（レーン１）は基質が分解しないのに対し、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分（レーン２）は基質が分解し、低温性微生物由来のＤＮａｓｅの活性が確認された。また、レーン２とレーン４の比較より、低分子のスメアなバンドは大腸菌由来の混入物であった。【００６４】
（５）低温性微生物由来ＤＮａｓｅの熱安定性
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、熱安定性を調べた。ＰＢＳ中、各種温度（４℃〜９０℃）で３０分放置後、ＤＮａｓｅ活性を測定した。対照としてウシ膵臓由来のＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いた。活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分０．０２ＯＤ分（ＯＤ６００）またはウシ膵由来ＤＮａｓｅＩ  ８Ｕ、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。２０℃（ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩは３７℃）で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図２に示す。
図２において、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１〜８は本発明の低温性微生物由来ＤＮａｓｅを用いた場合、レーン９〜１６はウシ膵由来ＤＮａｓｅＩを用いた場合である。
また、図２において、レーン１および９は４℃、レーン２は１０℃、レーン３は２０℃、レーン４および１０は３０℃、レーン５および１１は４０℃、レーン６および１２は５０℃、レーン７および１３は６０℃、レーン８および１４は７０℃、レーン１５は８０℃、レーン１６は９０℃で、それぞれ３０分間放置したものである。
図２より、低温性微生物由来ＤＮａｓｅは４℃（レーン１）〜４０℃（レーン５）までは高い活性を示しているが、５０℃（レーン６）から失活がみられ、６０℃（レーン７）でほぼ失活し、７０℃（レーン８）で完全に失活したが、ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩは９０℃（レーン１６）でも活性を保持していた。【００６５】
（６）低温性微生物由来ＤＮａｓｅの至適温度
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、至適温度を調べた。対照としてウシ膵由来ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いた。活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分５×１０−４または５×１０−５ＯＤ分（ＯＤ６００）（ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩ  ０．１ｍＵまたは１ｍＵ）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。１０〜７０℃の各種温度で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図３に示す。
図３において、パネル（Ａ）は本発明の低温性微生物由来ＤＮａｓｅを５×１０−４ＯＤ分、パネル（Ｂ）は本発明の低温性微生物由来ＤＮａｓｅを５×１０−５ＯＤ分、パネル（Ｃ）はウシ膵由来ＤＮａｓｅＩを１ｍＵ、パネル（Ｄ）はウシ膵由来ＤＮａｓｅＩを０．１ｍＵ用いた場合である。全てのパネルにおいて、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１は１０℃、レーン２は２０℃、レーン３は３０℃、レーン４は４０℃、レーン５は５０℃、レーン６は６０℃、レーン７は７０℃で、それぞれ３０分間放置したものである。
図３より、低温性微生物由来ＤＮａｓｅは低温から常温（１０〜４０℃）において高い活性を示し、その至適温度は３０〜４０℃付近であった。一方、ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩは低い温度では活性は低く、高温ほど高活性であった。【００６６】
（７）低温性微生物由来ＤＮａｓｅの基質特異性
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、種々の基質を用いた場合の活性を測定した。基質としてλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ以外に、λＤＮＡ（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、Ｍ１３  ｍｐ１８  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を検討に用いた。基質  １μｇ、上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分５×１０−３、５×１０−４、５×１０−５または５×１０−６ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図４に示す。
図４において、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１は酵素無添加、レーン２は５×１０−６ＯＤ分、レーン３は５×１０−５ＯＤ分、レーン４は５×１０−４ＯＤ分、レーン５は５×１０−３ＯＤ分の本発明の低温性微生物由来ＤＮａｓｅを用いた場合である。
図４より、線状二本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ、４８．５ｋｂｐ）、環状二本鎖ＤＮＡ（ｐＵＣ１１９、３．２ｋｂｐ）、一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３  ｍｐ１８  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ、７．２ｋｂｐ）のいずれの基質も分解された。本発明のエンドヌクレアーゼの基質分解効率は、長鎖線状二本鎖ＤＮＡ≒短鎖線状二本鎖ＤＮＡ＞環状二本鎖ＤＮＡ＞一本鎖ＤＮＡの順に低くなる。また、本発明のエンドヌクレアーゼは、λ−ＤＮＡ、ｐＵＣ１１９、Ｍ１３ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡのいずれも分解しており、基質の形状（一本鎖、二本鎖）や塩基配列に対する特異性はないと考えられる。【００６７】
（８）ＥＤＴＡの低温性微生物由来ＤＮａｓｅの反応に対する影響
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、ＥＤＴＡの反応に対する影響を調べた。反応液中に各種濃度（０、０．２、１、５ｍＭ）のＥＤＴＡ存在下でＤＮａｓｅ活性を測定した。対照としてウシ膵由来ＤＮａｓｅＩを用いた。活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分５×１０−４ＯＤ分（ＯＤ６００）またはウシ膵由来ＤＮａｓｅＩ  １ｍＵ、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図５に示す。
図５において、パネル（Ａ）は本発明の低温性微生物由来ＤＮａｓｅを、パネル（Ｂ）はウシ膵由来ＤＮａｓｅＩを用いた場合である。いずれのパネルにおいても、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１はＥＤＴＡ  ０ｍＭ、レーン２はＥＤＴＡ  ０．２ｍＭ、レーン３はＥＤＴＡ  １ｍＭ、レーン４はＥＤＴＡ  ５ｍＭを反応系に添加した場合である。
図５より、５ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下では、低温性微生物由来ＤＮａｓｅは活性が認められなかった（パネル（Ａ）レーン４）が、ウシ膵由来ＤＮａｓｅＩは活性を保持していた（パネル（Ｂ）レーン４）。【００６８】
（９）低温性微生物由来ＤＮａｓｅの至適ｐＨ
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、至適ｐＨを調べた。
活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを基質として用いた。緩衝液は、ｐＨ４、５：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、７、８：リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９、１０：ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて検討した。
λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分５×１０−４または５×１０−５ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  上記緩衝液、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。ｐＨ４〜１０の各種ｐＨにおいて、３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図６に示す。
図６において、パネル（Ａ）は５×１０−５ＯＤ分、パネル（Ｂ）は５×１０−４ＯＤ分を用いた場合である。いずれのパネルにおいても、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１はｐＨ４、レーン２はｐＨ５、レーン３はｐＨ６、レーン４はｐＨ７、レーン５はｐＨ７．５、レーン６はｐＨ８、レーン７はｐＨ９、レーン８はｐＨ１０である。
その結果、パネル（Ｂ）のレーン３〜８において基質が切断されたことから、低温性微生物由来ＤＮａｓｅの至適ｐＨは６〜１０であった。【００６９】
（１０）低温性微生物由来ＤＮａｓｅのｐＨ安定性
上記（３）で調製した、ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、ｐＨ安定性を調べた。
各種４０ｍＭ緩衝液中（ｐＨ４、５：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、７、８：リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９、１０：ホウ酸ナトリウム緩衝液）、３７℃で３０分放置後、ＤＮａｓｅ活性を測定した。活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、各種緩衝液３７℃で３０分放置後のサンプル５×１０−４ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図７に示す。
図７において、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１はｐＨ４、レーン２はｐＨ５、レーン３はｐＨ６、レーン４はｐＨ７、レーン５はｐＨ７．５、レーン６はｐＨ８、レーン７はｐＨ９、レーン８はｐＨ１０である。
その結果、レーン１〜８において基質が切断されたことから、低温性微生物由来ＤＮａｓｅはｐＨ４〜１０において活性を保持していた。【００７０】
実施例２  コールドショック発現系を用いた低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現検討
（１）発現ベクターの構築
上記実施例１で構築した組み換えプラスミドｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１の発現系よりも更に工業的スケールでの製造に適した発現系の構築を試みた。
上記実施例１（１）で合成した合成プライマー２に加え、新たに配列表の配列番号７記載の合成プライマー３をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー３は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅのアミノ酸配列（配列表の配列番号３）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列をもち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号４〜９にもつ合成ＤＮＡである。【００７１】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（ｐＣｏｌｄ０８−Ｅｎｄ１）１μｌ、１０μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１００ｐｍｏｌの合成プライマー２、１００ｐｍｏｌの合成プライマー３、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  ３０秒、５８℃  ３０秒、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００７２】
反応終了後、該反応液１００μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００７３】
次に、ｐＣｏｌｄＴＦベクター（タカラバイオ社製）を上記ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００７４】
この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１とした。このｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１は、低温性微生物由来ＤＮａｓｅのアミノ酸配列（配列表の配列番号３）のアミノ酸番号１〜２５４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表の配列番号４）を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、該アミノ酸配列のＮ末にＰｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  タグ配列、ＴＦタグ配列、ＨＲＶ  ３Ｃ配列、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  配列、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ配列ならびにリンカーを有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に、当該ポリペプチドをコードする核酸の塩基配列を配列表の配列番号９に示す。【００７５】
（２）形質転換体の調製
ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行った。形質転換体は、１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）を用いてスクリーニングすることにより得た。【００７６】
（３）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現
上記（２）で得られた形質転換体を用いて、低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現を調べた。対照としてインサートを導入していないｐＣｏｌｄＴＦベクターのみを用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１も同時に行った。培養には、５ｍｌのＬＢ液体培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を用いて３７℃で培養し、濁度がＯＤ６００＝０．８程度に達した時点で１５℃、１５分間培養後、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を２４時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体をＰＢＳに懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液を調製、ついで１５，０００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。【００７７】
（４）ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分でのエンドヌクレアーゼ活性の測定
上記（３）で調製したｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分可溶性画分について、エンドヌクレアーゼ活性を測定した。対照としてｐＣｏｌｄＴＦベクターのみを導入した大腸菌より同様に調製した。活性測定は以下のようにして行った。
活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社製）を基質として用いた。λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分０．００６２５ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図８に示す。
図８において、レーン１は可溶性画分無添加、レーン２はｐＣｏｌｄＴＦベクターのみを導入した大腸菌の可溶性画分、レーン３はｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分である。
図８に示したように、無添加およびｐＣｏｌｄＴＦベクターのみを導入した大腸菌の可溶性画分（レーン１、２）は、基質であるλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを分解しないのに対し、ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分（レーン３）は、基質を分解し、本発明の低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの活性が確認された。【００７８】
（５）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現、精製および活性測定
上記（２）で得られた形質転換体を用いて、低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現、精製および活性測定を行なった。１００ｍｌのＬＢ液体培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）２本を用いて３７℃で濁度がＯＤ６００＝０．６程度に達する時点まで培養した。得られた培養液を２０ＬのＬＢ液体培地に植菌し、濁度がＯＤ６００＝０．６程度に達した時点で１５℃、１５分間培養後、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、更に１５℃で２４時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を２４時間行ったのち、３６．４ｇの湿菌体を回収した。得られた菌体を３６０ｍｌの１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＰＭＳＦに懸濁後、超音波破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ，２０分）により３７０ｍｌの可溶性画分を得た。【００７９】
上記可溶性画分３７０ｍｌを用いて精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１００ｍｌ分のＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）をφ３５ｍｍのカラムに充填し、５００ｍｌの１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＰＭＳＦで平衡化した。その後、上記可溶性画分３７０ｍｌを供し、３００ｍｌの同緩衝液、３００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液で順次樹脂を洗浄した後、３００ｍｌの１Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。得られたエンドヌクレアーゼ活性を含む溶出画分に２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離（１８，０００ｇ，２０分）により３３０ｍｌの上清を得た。得られた上清を、３００ｍｌの１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２Ｍ  硫酸アンモニウムで平衡化された３０ｍｌ分（φ１６ｍｍのカラム）のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）に供した。続いて２２５ｍｌの同緩衝液で洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。洗浄後、１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２Ｍ  硫酸アンモニウムから１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０Ｍ  硫酸アンモニウムへの濃度勾配溶出を行った（１０ｍｌ/ｆｒ, 合計  ６００ｍｌ）。各画分についてエンドヌクレアーゼ活性測定を行い、活性が認められた９０ｍｌのｆｒ．２８〜３６を回収した。次に、５Ｌの１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して２回透析を行ない、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用いて濃縮を行ない、５．５ｍｌのタンパク質サンプルを得た。【００８０】
その一部について５−２０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供し、活性が認められたｆｒ．２８〜３６画分を透析、濃縮したタンパク質サンプルの分子量を調べた。結果を図９に示す。
図９において、レーンＭは分子量マーカー  ９７，６６、４５、３１、２１、１４ＫＤａ、レーン１は活性が認められたｆｒ．２８〜３６画分を透析、濃縮したタンパク質サンプルである。
その結果、分子量２５ＫＤａ付近に主なタンパク質のバンドが確認された。２５ＫＤａ付近のタンパク質のバンドについてＮ末端アミノ酸配列解析を１０残基行った。その結果、配列表の配列番号３のアミノ酸番号３６〜４５のアミノ酸配列に一致したことから活性タンパク質はタグ配列および目的タンパク質のＮ末領域の一部が欠落していることが分かった。当該活性タンパク質のアミノ酸配列は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定法によって平均質量を測定し、その結果から決定した。当該活性タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１０に、当該ポリペプチドをコードする核酸の塩基配列を配列表の配列番号１１に示す。【００８１】
この活性タンパク質を以下の活性確認に使用した。
定量的な活性測定にはサケ精巣由来ＤＮＡ（和光純薬社製）を基質として用いた。基質溶液（４０μｇ／ｍｌ、１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  塩化マグネシウム）５００μｌ、これに上記調製したタンパク質サンプル１００μｌを加えたものを反応液とした。３７℃において２６０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素量を１Ｕとした。その結果、得られたエンドヌクレアーゼの総活性は７９万Ｕであった。【００８２】
実施例３  低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの性質検討
（１）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの低温での反応性
上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドについて、低温でのエンドヌクレアーゼ活性を調べた。対照としてノバジェン社製のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅａｓｅを用い、活性測定にはサケ精巣由来ＤＮＡ（和光純薬社製）を基質として用いた。基質溶液（４０μｇ／ｍｌ、１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  塩化マグネシウム）５００μｌ、これに上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド含有溶液（２．３Ｕ、１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  塩化マグネシウム）１００μｌを加えたものを反応液とした。活性測定は、０、５、１０、１５、２０℃の各種温度において、１０分間反応後の２６０ｎｍの吸光度の増加量を測定して行った。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅについても上記組成の反応液を用いて同様に活性測定した。結果を図１０に示す。
図１０において、四角（■）は上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、三角（▲）はＢｅｎｚｏｎａｓｅである。
図１０に示したように、２０℃での活性を１００として相対活性（％）を計算し比較すると、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは０〜１０℃での相対活性が３０〜７０％程度であるのに対して、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅは、０〜１０℃での相対活性が０〜２０％程度まで著しく低下した。従って、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、市販のＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅと比較して、低温において、特に０〜１０℃において、高いエンドヌクレアーゼ活性を保持していた。【００８３】
（２）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの基質特異性
上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドについて、種々の基質を用いた場合の活性を測定した。基質としてλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ以外に、λＤＮＡ（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、Ｍ１３  ｍｐ１８  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ（ロシュ社製）を検討に用いた。基質  １μｇ、上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド１Ｕ，０．１Ｕ，０．０１Ｕまたは０．００１Ｕ、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、６０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図１１に示す。
図１１において、基質として、レーン１から５はλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ、レーン６から１０はλＤＮＡ、レーン１１から１５はｐＵＣ１１９、レーン１６から２０はＭ１３  ｍｐ１８  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ、そしてレーン２１から２５は１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡをそれぞれ用いた。また、レーン１、６、１１、１６、２１は酵素無添加、レーン２、７、１２、１７、２２は０．００１Ｕ分、レーン３、８、１３、１８、２３は０．０１Ｕ分、レーン４、９、１４、１９、２４は０．１Ｕ分、レーン５、１０、１５、２０、２５は１Ｕ分の本発明の低温性微生物由来エンドヌクレアーゼを用いた場合である。
図１１に示したように、本発明のエンドヌクレアーゼは、線状二本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ、４８．５ｋｂｐ）、環状二本鎖ＤＮＡ（ｐＵＣ１１９、３．２ｋｂｐ）、一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３  ｍｐ１８  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ、７．２ｋｂｐ）、ＲＮＡ（１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ）のいずれの基質も分解することが確認できた。また、本発明のエンドヌクレアーゼの基質分解効率は、長鎖線状二本鎖ＤＮＡ≒短鎖線状二本鎖ＤＮＡ＞環状二本鎖ＤＮＡ＞一本鎖ＤＮＡ≒ＲＮＡの順に低くなっていた。【００８４】
（３）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの至適ｐＨ
上記実施例２（３）で調製したｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分について、至適ｐＨを調べた。
活性測定にはλ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを基質として用いた。緩衝液は、ｐＨ４、５：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、７：リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、８：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９、１０：ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて検討した。
λ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  １μｇ、上記実施例２（３）で調製したｐＣｏｌｄＴＦ−Ｅｎｄ１を導入した大腸菌の可溶性画分７×１０−４ＯＤ分（ＯＤ６００）、１０×反応緩衝液（４００ｍＭ  上記緩衝液、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１Ｍ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム）  ５μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を５０μｌとしたものを反応液とした。ｐＨ４〜１０の各種ｐＨにおいて、３７℃で３０分反応後、反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図１２に示す。
図１２において、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１はｐＨ４、レーン２はｐＨ５、レーン３はｐＨ６、レーン４はｐＨ７、レーン５はｐＨ７．５、レーン６はｐＨ８、レーン７はｐＨ９、レーン８はｐＨ１０である。
その結果、レーン３〜８において基質が切断されたことから本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの至適ｐＨは６〜１０であった。【００８５】
（４）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響
上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドについて、種々添加剤の影響を調べた。活性測定にはサケ精巣由来ＤＮＡ（和光純薬社製）を基質として用いた。基質溶液（４０μｇ／ｍｌ、１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化マグネシウム（マグネシウムイオンの影響検討時は除く））５００μｌ、これに上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド０．２５Ｕを含む１００μｌを加えたものを反応液とした。３７℃において２６０ｎｍの吸光度の増加量を測定し、種々添加剤の影響を調べた。【００８６】
１．マグネシウムイオンの影響
上記反応液組成に最終濃度が０、０．８、１．７、４．２、５、１０、２０、４０、８０、１００，１２０，１４０，１６０ｍＭとなるように塩化マグネシウムを添加し、マグネシウムイオン濃度の影響を調べた。結果を図１３−１に示す。
図１３−１において、塩化マグネシウムの最終濃度が１００ｍＭのときの活性を１００として表示した。
図１３−１より、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの至適マグネシウムイオン濃度は６０〜１２０ｍＭであった。【００８７】
２．ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンの影響
上記反応液組成に最終濃度が０、８、１７、４２、８３、１６７、３３３ｍＭとなるようにそれぞれ塩化ナトリウム、塩化カリウムあるいは塩化カルシウムを添加し、各イオン濃度の影響を調べた。結果を図１３−２に示す。
図１３−２において、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムの最終濃度が０ｍＭのときの活性を１００として表示した。また、四角（■）は塩化ナトリウム、丸（●）は塩化カリウム、三角（▲）は塩化カルシウムである。
図１３−２より、ナトリウムイオンおよびカリウムイオン濃度は１６７ｍＭまで、カルシウムイオン濃度は４２ｍＭまで高い活性であった。【００８８】
３．還元剤の影響
上記反応液組成に最終濃度が０、８、１７、４２、８３、１６７、３３３ｍＭとなるようにジチオスレイトールあるいは２−メルカプトエタノールを添加し、各還元剤の影響を調べた。結果を図１３−３に示す。
図１３−３において、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールの最終濃度が０ｍＭのときの活性を１００として表示した。また、四角（■）はジチオスレイトール、三角（▲）は２−メルカプトエタノールである。
図１３−３より、ジチオスレイトール濃度は１６７ｍＭまで、２−メルカプトエタノール濃度は３３３ｍＭまで高い活性であった。【００８９】
４．リン酸カリウム、硫酸アンモニウムの影響
上記反応液組成に最終濃度が０、４、８、１７、４２、８３、１６７、３３３ｍＭとなるようにリン酸カリウムあるいは硫酸アンモニウムを添加し、各添加剤の影響を調べた。結果を図１３−４に示す。
図１３−４において、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムの最終濃度が０ｍＭのときの活性を１００として表示した。また、四角（■）はリン酸カリウム、三角（▲）は硫酸アンモニウムである。
図１３−４より、リン酸カリウム濃度は４ｍＭでも低い活性となり、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの反応緩衝液としてはリン酸緩衝液は不向きであることがわかった。硫酸アンモニウム濃度は８３ｍＭまで高い活性であった。【００９０】
（５）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの低温で大腸菌からタンパク質抽出する際の粘性の低減効果
上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを、タンパク質抽出用試薬キット、ＴＡＬＯＮ  ｘＴｒａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて抽出を行う際に、ＤＮａｓｅＩの代わりに添加し、粘性の低減を検討した。ＴＡＬＯＮ  ｘＴｒａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔのプロトコールに準じて行った。酵母のＡＩＰ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．：Ｕ３５６６７）をｐＣｏｌｄＴＦベクターに挿入し発現させた大腸菌ＢＬ２１湿菌体６．４ｍｇに、ＴＡＬＯＮ  ｘＴｒａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  １２８μｌ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（５０×）１．２８μｌ、さらにそれぞれ３通りの量（０．２５６Ｕ、２．５６Ｕ、２５．６Ｕ）のＤＮａｓｅＩまたは本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを添加し、３０℃または氷上で３０分間反応させた。【００９１】
反応液の１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図１４に示す。
また、１％アガロースゲル電気泳動に使用した残りの抽出処理液にサンプル緩衝液を加えて煮沸後、抽出処理液４μｌ相当分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図１５に示す。
図１４において、レーン１から７は３０℃で反応させたもの、レーン８から１４は氷上で反応させたもので、電気泳動画像でバンドが確認されないレーンは、粘性のためピペッティングできず適切にアプライできなかったものを示し、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１、８は酵素無添加、レーン２、９はＤＮａｓｅＩ  ０．２５６Ｕ、レーン３、１０はＤＮａｓｅＩ  ２.５６Ｕ、レーン４、１１はＤＮａｓｅＩ  ２５．６Ｕ、レーン５、１２は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ０．２５６Ｕ、レーン６、１３は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ２.５６Ｕ、レーン７、１４は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ２５．６Ｕを用いた場合である。
図１４より、氷上で処理した場合、ＤＮａｓｅＩは２．５６Ｕの使用でもピペッティングが困難なほどの粘性が残り、適切にアプライできなかった（レーン１０）のに対し、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドでは２．５６ＵでゲノムＤＮＡの分解による粘性の低減が確認された（レーン１３）。
図１５において、レーン１から７は３０℃で反応させたもの、レーン８から１４は氷上で反応させたもので、電気泳動画像でバンドが確認されないレーンは、粘性のためピペッティングできず適切にアプライできなかったものを示し、レーンＭは分子量マーカー  ９７，６６、４５、３１、２１、１４ＫＤａ、レーン１、８は酵素無添加、レーン２、９はＤＮａｓｅＩ  ０．２５６Ｕ、レーン３、１０はＤＮａｓｅＩ  ２.５６Ｕ、レーン４、１１はＤＮａｓｅＩ  ２５．６Ｕ、レーン５、１２は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ０．２５６Ｕ、レーン６、１３は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ２.５６Ｕ、レーン７、１４は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ２５．６Ｕを用いた場合である。
図１５より、氷上で処理した場合、ＤＮａｓｅＩは０．２５６Ｕ使用したとき、ピペッティングが困難なほどの粘性が残り、適切にアプライできなかった（レーン９）。それに対し、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは０．２５６Ｕ使用で適切にアプライでき（レーン１２）、ゲノムＤＮＡの分解による粘性の低減がＤＮａｓｅＩより１オーダー低い添加量で確認できた。
以上のことから、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、氷上処理によりメインバンドとして観察できる目的タンパク質に影響を与えずに粘性を下げることができることを確認した。【００９２】
（６）低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの大腸菌超音波破砕上清中のゲノムＤＮＡの分解
上記実施例２（５）で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドまたはＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を大腸菌超音波破砕上清に添加し、残存する大腸菌由来ゲノムの量を比較した。
酵母のＡＩＰ２遺伝子をｐＣｏｌｄＴＦベクターに挿入し発現させた大腸菌ＢＬ２１菌体に１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  塩化マグネシウムを添加し（１ｇ湿菌体当たり５ｍｌの緩衝液）、破砕上清を同緩衝液で５０倍希釈した。希釈上清５０μｌにＤＮａｓｅＩまたは本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをそれぞれ３通りの量（０．１Ｕ、１Ｕ、１０Ｕ）を添加し、３０℃または氷上で反応させた。３０分および２時間後の反応液１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。３０分反応後の結果を図１６に、２時間反応後の結果を図１７に示す。
図１６および図１７において、レーン１から７は３０℃で反応させたもの、レーン８から１４は氷上で反応させたもので、レーンＭはλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン１、８は酵素無添加、レーン２、９はＤＮａｓｅＩ  ０．１Ｕ、レーン３、１０はＤＮａｓｅＩ  １Ｕ、レーン４、１１はＤＮａｓｅＩ  １０Ｕ、レーン５、１２は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  ０．１Ｕ、レーン６、１３は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  １Ｕ、レーン７、１４は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド  １０Ｕを用いた場合である。
図１６および図１７において、氷上で反応させた場合、ＤＮａｓｅＩ（レーン１０、１１）と本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（レーン１３、１４）を比較すると、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの方がゲノムＤＮＡの分解が良好に進行することが確認された。
以上のことから、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、低温反応で、目的タンパク質に影響を与えずにＤＮＡを分解できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、ＰＣＲのコンタミ除去、ＲＴ−ＰＣＲのゲノム除去、タンパク質溶液中の核酸の除去やタンパク質抽出液の粘性の低減などに有用な、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリペプチドをコードする遺伝子が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
SEQ ID NO:1; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase. “nucleotide 4 to 9 is EcoRI restriction site.”
SEQ ID NO:2; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase. “nucleotide 4 to 9 is BamHI restriction site.”
SEQ ID NO:5; A sequence of artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Factor Xa sequence and linker, and DNase.
SEQ ID NO:6; A sequence of a gene encoding an artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Factor Xa sequence and linker, and DNase.
SEQ ID NO:7; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase. “nucleotide 4 to 9 is NdeI restriction site.”
SEQ ID NO:8; A sequence of artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Trigger Factor sequence, HRV 3C sequence, Thrombin sequence, Factor Xa sequence and linker, and endonuclease.
SEQ ID NO:9; A sequence of a gene encoding an artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Trigger Factor sequence, HRV 3C sequence, Thrombin sequence, Factor Xa sequence and linker, and endonuclease.
【図１】
0004857260.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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