(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｇ）から選択されるいずれかの改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（Ａ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、配列番号１または配列番号１０２に示されるアミノ酸配列の第２番目に該当するアミノ酸残基がリジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、およびグルタミンから選択されるいずれかのアミノ酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｂ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、配列番号１または配列番号１０２に示されるアミノ酸配列の第１０３番目に該当するヒスチジン残基がメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニン、およびトリプトファンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｃ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列では第１７６番目、第１９９番目、および第２２４番目に該当し、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列では第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目に該当する少なくとも１つのリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｄ）上記（Ａ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいて、さらに、第１０３番目に該当するヒスチジン残基がメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニン、およびトリプトファンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｅ）上記（Ａ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列では第１７６番目、第１９９番目、および第２２４番目に該当し、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列では第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目に該当する少なくとも１つのリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｆ）上記（Ｂ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列では第１７６番目、第１９９番目、および第２２４番目に該当し、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列では第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目に該当する少なくとも１つのリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｇ）上記（Ｄ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列では第１７６番目、第１９９番目、および第２２４番目に該当し、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列では第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目に該当する少なくとも１つのリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
【請求項２】
野生型ヒドロキシニトリルリアーゼがキャッサバまたはパラゴムノキ由来である請求項１記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養して得られる培養物。
【請求項７】
請求項６記載の培養物から採取される改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項８】
請求項６記載の培養物から改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを採取することを特徴とする改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。
【請求項９】
ケトン化合物またはアルデヒド化合物と、シアン化合物とを、請求項１、２、または７に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼで処理し、得られる処理物からシアンヒドリンを採取することを特徴とするシアンヒドリンの製造方法。
【請求項１０】
ケトン化合物またはアルデヒド化合物と、シアン化合物とを、請求項１、２、または７に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼで処理し、得られる処理物からシアンヒドリンを採取し、前記シアンヒドリンを加水分解することを特徴とするヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼおよび当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法に関する。
【背景技術】  ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアンヒドリンの製造反応を触媒する酵素である。すなわち、ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物からシアノヒドリン（α−ヒドロキシニトリル）の合成反応に用いられる酵素触媒である。シアンヒドリンは、さまざまな化合物に変換することが可能であり、有機合成中間体として有用である。また、光学活性シアンヒドリンは、α−ヒドロキシ酸、α−ヒドロキシケトン、β−アミノアルコールなどの合成に使用でき、医薬品、化学品等分野で使用される重要な種々の光学活性中間体を合成する上で極めて有用である。したがって、ヒドロキシニトリルリアーゼを大量に生産する方法の開発が望まれている。
シアンヒドリン合成を触媒するヒドロキシニトリルリアーゼは、（Ｓ）選択性および（Ｒ）選択性の２つのグループに分けられる。その中で（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、酸性条件下においてケトンまたはアルデヒドとシアン化合物から（Ｓ）−シアンヒドリンを生成する反応を触媒する。この反応の代表例として、ベンズアルデヒドとシアン化合物である青酸から、（Ｓ）−マンデロニトリル（ｍａｎｄｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）を生成する反応がある。また、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、安価な基質から医薬および化成品中間体として利用価値の高い光学活性体を生産することのできる生体触媒としても使用されており、多くの分野において極めて有用である。光学活性シアンヒドリンの工業的生産にヒドロキシニトリルリアーゼを利用するために、菌体あたりまたはタンパク質あたりの活性が高く立体選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを大量に生産する方法の開発が望まれている。
ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアン配糖体（ｃｙａｎｏｇｅｎｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を有する植物においてのみ存在することが知られている。例えば、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとしてアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）などのバラ科植物由来のものなどが知られている。また、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとして、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）などのイネ科植物由来、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）やパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などのトウダイグサ科植物由来、キシメニア（Ｘｉｍｅｎｉａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）などのボロボロノキ科植物由来のものなどが知られている。しかし、これらの植物体からは微量のヒドロキシニトリルリアーゼしか抽出することができなかった。
そこで、医薬、化学的に有用なヒドロキシニトリルリアーゼを大量に得るために、遺伝子工学的な方法でヒドロキシニトリルリアーゼを得る試みがされてきた（１〜９）。しかしながら、形質転換体を用いて異種タンパク質を発現させる場合には、同種タンパク質についての研究によって得た結果（発現量や生化学的活性など）をそのままあてはめることができない場合がある。すなわち、形質転換体を用いて異種タンパク質を発現させる場合には、形質転換体の挙動や発現量、目的タンパク質の生化学的活性などを予め予測することは容易ではない。
また、発現させようとするタンパク質の種類によっては、形質転換体宿主内で正常なタンパク質の折りたたみが行われず、いわゆる封入体が形成されてしまうことがある。そして、この封入体中のタンパク質は本来の活性が失われた不活性型タンパク質となることが多く知られている。ヒドロキシニトリルリアーゼにおいても、例えば、大腸菌形質転換体を３７℃で培養して発現させたヒドロキシニトリルリアーゼの９９％は不活性な封入体の形で不溶性画分中に見出されることが報告されている（１）。また、大腸菌で製造した粗酵素液の酵素活性が０．５４５ｕｎｉｔ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎであること（２−４）、大腸菌（宿主Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］）で製造した粗酵素液の液活性が０．５Ｕ／ｍｌであること（１４）、粗酵素液の比活性が０．２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（宿主Ｔｏｐ１０’，２８℃）および０．６１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（宿主ＸＬ１−ｂｌｕｅ，２２℃）であること（１５，１６）が報告されている。しかし、上記の酵素活性は、いずれも十分であるとはいえない。
これらの問題点を解決する手段として、例えば、ヒドロキシニトリルリアーゼを発現する大腸菌形質転換体を低温で培養することにより、封入体の形成を抑制して、活性を有するヒドロキシニトリルリアーゼ収率を向上させようとしている（８）。しかしながら、この技術では、培養時間が長時間に及ぶうえ、低温を維持するため、電力、冷却水など大量のユーティリティーを使用しなければならないという問題点がある。ヒドロキシニトリルリアーゼの工業的製造を考えた場合、これらの問題点は、大幅な製造コストアップの要因となる。
ところで、近年の組換えＤＮＡ技術の進歩により、タンパク質の構成アミノ酸の１個以上を欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸で置換した変異体を作製することが比較的容易に可能となっている。特に、タンパク質が酵素である場合、これら変異体は、欠失、付加、挿入または置換されるアミノ酸残基の個所および置換されるアミノ酸の種類によっては、変異の導入されていない酵素と比較して、安定性、有機溶媒耐性、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、基質特異性、基質親和性などの性能が向上することが知られている。これら性能の向上は、触媒としての酵素の安定化、反応工程の簡略化、反応収率の向上等を通じて、酵素反応を利用した工業的生産における大幅な生産コスト低減をもたらすことがある。従って、多くの酵素において様々な性能が向上した有用な改良酵素の創製が行われている。
ヒドロキシニトリルリアーゼにおいても、構成するアミノ酸の１つまたは複数個を欠失、付加、挿入または置換した変異体の報告がなされている。例えば、変異ヒドロキシニトリルリアーゼが芳香族アルデヒド、とくに３−フェノキシベンズアルデヒドに対する親和性を向上したことが報告されているが（９，１０）、大幅なヒドロキシニトリルリアーゼ製造収率の向上には至っていない。また、１２８番目のトリプトファンを他のアミノ酸に置換した変異体および８１番目のシステインをアラニンに置換した変異体を作製し、大腸菌Ｍ１５株を宿主とする形質転換体を得て、１００μＭのＩＰＴＧを含有するＴＢ媒体中、培養温度３７℃を２０℃に冷却した培養条件において、該変異体を発現するＭ１５株形質転換体のいくつかは、細胞あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを発現するＭ１５株形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性よりも高いことが報告されている（６）。しかしながら、同文献中、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを発現するＭ１５株形質転換体のヒドロキシニトリルリアーゼ活性は、同培養条件によって得られた野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを発現するＪＭ１０９株形質転換体のものの１／２程度であり、発現能力の高い宿主において変異体の効果を必ずしも実証しているとは言えない。また、中国産キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）亜種由来ヒドロキシニトリルリアーゼにおける１１３番目のアミノ酸であるグリシンをセリンに置換した変異ヒドロキシニトリルリアーゼの比活性が向上したことが報告されている（１１）。しかし、一般的なキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリアーゼの１１３番目のアミノ酸はセリンであり、該アミノ酸がヒドロキシニトリルリアーゼ活性に重要であることを示しているに過ぎない。
ところで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞抽出液中のタンパク質の４０％は、翻訳時には存在するＮ末端のメチオニンが、プロセッシングを受けていることが報告されている（１７）。このプロセッシングは、メチオニンアミノペプチダーゼと呼ばれる酵素によって触媒される（１８）。大腸菌細胞内に存在する内在性タンパク質が、メチオニンアミノペプチダーゼによるプロセッシングを受け易いか否かは、内在性タンパク質の２番目のアミノ酸の種類によって決定され、２番目のアミノ酸の側鎖が大きいほどプロセッシングを受け難いことが報告されいる（１２）。また、「タンパク質のＮ末端アミノ酸の種類によって、大腸菌細胞内におけるそのタンパク質の安定性が決定される」というＮ末端則が報告されている（１３）。Ｎ末端側によれば、タンパク質のＮ末端がアルギニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどの場合、細胞内におけるタンパク質の安定性は低く、速やかに分解される。これらの知見に基づき、目的タンパク質の２番目のアミノ酸を、側鎖が大きく（すなわち、メチオニンアミノペプチダーゼによるプロセッシングを受け難い）、かつ、アルギニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン以外のものにすれば、形質転換体宿主内での目的タンパク質の安定性向上を期待できる可能性も考えられる。しかし、上記の結果（１２，１３）は、宿主内在性のタンパク質、またはいくつかのモデルタンパク質の解析によって得られたものであり、異種タンパク質であるヒドロキシニトリルリアーゼが必ずしも上述の法則に従うとは限らない。その理由は、前述したように、形質転換体を用いて異種タンパク質を発現させる場合には、形質転換体の挙動や発現量、目的タンパク質の生化学的活性などを予め予測することは容易ではないからである。
以上のように、顕著に性能が向上したヒドロキシニトリラーゼを取得しようとするこれまでの試みは必ずしも成功しているとは言い難く、さらなる有用ヒドロキシニトリラーゼ変異体の創出が切望されていた。
参考文献
（１）特表平１１−５０８７７５号公報
（２）特開２０００−１８９１５９号公報
（３）特開２０００−１８９１６０号公報
（４）特開２０００−２４５４８６号公報
（５）特開２００２−３３０７９１号公報
（６）国際公開第０１４８１７８号パンフレット
（７）特開２００４−１９４５５０号公報
（８）特開２００４−１９４５５１号公報
（９）特開２０００−１２５８８６号公報
（１０）Ｈｏｌｇｅｒ  Ｂｕｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．４（２００３）２１１−２１６
（１１）Ｇｏｎｇｈｏｎｇ  Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５（２００３）１０４１−１０４７
（１２）Ｐｈ．−Ｈｅｒｖｅ  Ｈｉｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８６（１９８９），８２４７−８２５１
（１３）Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ９３（１９９６），１２１４２−１２１４９
（１４）Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５（１９９６）４３７−４３９
（１５）Ｍｅｉｎｈａｒｄ  Ｈａｓｓｌａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６），５８８４−５８９１
（１６）Ｍｅｉｎｈａｒｄ  Ｈａｓｓｌａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １１（１９９７），６１−７１
（１７）Ｗａｌｌｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７（１９６３），４８３−４９６
（１８）Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１９８７），７５１−７５７
【発明の開示】
本発明は、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼおよび当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために誠意研究を行った結果、野生型ヒドキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することにより、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を大幅に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｇ）から選択されるいずれかの改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（Ａ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｂ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｃ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｄ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基および第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｅ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｆ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｇ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（２）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼがキャッサバまたはパラゴムノキ由来である（１）記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（３）第２番目のアミノ酸残基が、リジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、メチオニン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換された（１）または（２）記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（４）第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が、以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するアミノ酸に置換された（１）〜（３）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（ａ）分子中に含まれる窒素原子数が１または２のアミノ酸である
（ｂ）中性アミノ酸である
（５）第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニンおよびトリプトファンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換された（１）〜（４）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（６）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中の第１７５番目から第２２４番目の領域に存在する少なくとも１つのリジン残基が、他のアミノ酸に置換された（１）〜（５）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（７）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中の第１７５番目から第２２４番目の領域に存在する少なくとも１つのリジン残基が、以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するアミノ酸に置換された（１）〜（６）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（ａ）分子中に含まれる窒素原子数が１または２のアミノ酸である
（ｂ）中性アミノ酸である
（８）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中の第１７５番目から第２２４番目の領域に存在する少なくとも１つのリジン残基が、プロリンに置換された（１）〜（７）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（９）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の、第１７６番目、第１９９番目および第２２４番目のリジン残基からなる群から選択される少なくとも一つのリジン残基が他のアミノ酸に置換された（１）〜（８）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（１０）配列番号１０２で示されるアミノ酸配列中の、第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目のリジン残基からなる群から選択される少なくとも一つのリジン残基が他のアミノ酸に置換された（１）〜（８）のいずれか一項に記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、（Ａ）〜（Ｇ）記載の置換部位のアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
（１３）（１２）記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（１４）（１３）記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
（１５）（１４）記載の形質転換体を培養して得られる培養物。
（１６）（１５）記載の培養物から採取される改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（１７）（１５）記載の培養物から改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを採取することを特徴とする改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。
（１８）ケトン化合物またはアルデヒド化合物と、シアン化合物とを、（１）〜（１１）および（１６）のいずれかに記載の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼで処理し、得られる処理物からシアンヒドリンを採取することを特徴とするシアンヒドリンの製造方法。
（１９）（１８）記載の方法により得られたシアンヒドリンを加水分解することを特徴とするヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１における植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の作製法を示す模式図である。
図２は、実施例３における大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の作製法を示す模式図である。
図３は、実施例６において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、空ベクター導入形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ））、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３）、および２番目のアミノ酸を置換したヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体（ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｋ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｎ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｑ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｐ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｔ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｙ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｌ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｍ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｓ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｅ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ａ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｇ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｄ）の発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較解析した図である。矢印はヒドロキシニトリルリアーゼタンパク質のバンドを示す。
図４は、実施例８において、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ、ｐＵＭＥＳＤｓｙを鋳型とした１回目のＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲで得られたランダム変異体発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌ、およびｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌを鋳型に用いた２回目のＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲで得られたランダム変異体発現形質転換体（１９−Ｅ８、３６−Ｅ１０）からそれぞれ調製した細胞抽出液可溶性画分（Ｓ）および不溶性画分（Ｉ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果の図である。
図５は、実施例９において、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤ、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにＨ１０３Ｌ変異を導入した改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌ、および植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにＨ１０３Ｌ変異を導入した改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌからそれぞれ調製した細胞抽出液可溶性画分（Ｓ）および不溶性画分（Ｉ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果の図である。
図６（Ａ）は、実施例１０において、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ（Ｈｉｓ）およびそのアミノ酸配列の第１０３番目のヒスチジン残基を他のアミノ酸に変異させた９種類のアミノ酸置換体のヒドロキシニトリルリアーゼ活性を示す図である。（Ｂ）は、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ（Ｈｉｓ）およびそのアミノ酸配列の第１０３番目のヒスチジン残基を他のアミノ酸に変異させた１０種類のアミノ酸置換体のヒドロキシニトリルリアーゼ活性を示す図である。
図７は、実施例１２において、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３、Ｖ２Ｉ変異が導入された植物コドン改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、Ｈ１０３Ｌ変異が導入された植物コドン改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｈ１０３Ｌ、Ｖ２Ｉ変異およびＨ１０３Ｌ変異が導入された植物コドン複合改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌについて、３０℃および３７℃でフラスコ培養を行って得られた細胞抽出液各画分（Ｔ：全画分、Ｐ：不溶性画分、Ｓ：可溶性画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果の図である。
図８は、実施例１２において、Ｖ２Ｉ変異が導入された植物コドン改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、および、Ｖ２Ｉ変異とＨ１０３Ｌ変異が導入された植物コドン複合改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌのジャー培養評価における菌濃度、活性（比活性、液活性）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔ：全画分、Ｐ：不溶性画分、Ｓ：可溶性画分）の結果を示す図である。
図９は、実施例１３において、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのＨ１０３残基をコードするコドンの違いによる発現量への影響を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
図１０は、実施例１４において、精製した野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＭｅＨＮＬ）およびＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＭｅＨＮＬ−Ｈ１０３Ｍ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
図１１は、実施例１５および実施例１６において、リジン残基置換変異体の可溶性画分由来タンパク質１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施の形態について説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することにより、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を大幅に向上させることができることに基づくものである。
（Ｉ）ヒドロキシニトリルリアーゼ活性
本発明において、「ヒドロキシニトリルリアーゼ活性」とは、ケトンまたはアルデヒドとシアン化化合物とからシアンヒドリンを生成する反応を触媒する活性（以下、「合成活性」と呼ぶ）、およびその逆反応を触媒する活性（以下、「分解活性」と呼ぶ）のいずれをも意味する。本発明においては、合成活性は、ベンズアルデヒドからの（Ｓ）−マンデロニトリルの生成量を測定することにより算出することができる。マンデロニトリルの生成は、例えばＨＰＬＣで定量することができる。また、分解活性は、基質であるマンデロニトリルからのベンズアルデヒドの生成量を測定することにより算出することができる。ベンズアルデヒドの生成量は、例えば、クエン酸ナトリウム緩衝液に、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼとラセミ体マンデロニトリル（ｒａｃｅｍｉｃ  ｍａｎｄｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）を添加したときの波長２８０ｎｍにおける吸光値の増加を追跡することで定量することができる。
本発明は、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した改良型ヒドロキシニトリルリアーゼに関するものである。本発明における改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、後に説明するように、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が野生型ヒドロキシニトリルリアーゼよりも高くなることを特徴とする。ここで言う形質転換体あたりの活性向上の本質的な原因としては、変異導入に起因するものであれば如何なるものでもよく、例えば、酵素タンパク質あたり比活性自体の向上、活性型コンフォメーション形成能の向上、形質転換体中（特に可溶性画分）における発現量増加などが挙げられる。さらには、金属イオン耐性、有機溶媒耐性、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性等の耐性向上も挙げられる。したがって、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、変異導入によって形質転換体あたりの活性が向上したヒドロキシニトリルリアーゼであればよく、酵素タンパク質あたりの非活性自体の向上したヒドロキシニトリルリアーゼ、活性型コンフォメーション形成能が向上したヒドロキシニトリルリアーゼ、または形質転換体あたりの発現量が向上したヒドロキシニトリルリアーゼなどを含むものである。
ここで、「形質転換体あたりの活性」は、形質転換体の培養装置あたり、培養液あたり、形質転換体量（湿潤または乾燥）あたり、（粗）酵素溶液あたり、可溶性画分あたり、または酵素溶液中のタンパク質量あたりのヒドロキシニトリルリアーゼの活性などを意味する。活性が高い（低い）は、酵素液中のタンパク質量などの単位重量あたりまたは酵素溶液などの単位溶液量あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性（比活性、液活性）が、対照よりも高い（低い）ことを意味する。
本明細書において「比活性」は、単位タンパク質量あたりまたは単位菌体質量あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を意味する。
本明細書において「液活性」は、単位溶液量あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を意味する。
（ＩＩ）ヒドロキシニトリルリアーゼ
（ＩＩ−１）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ
本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼに変異を導入することによって改良したものあり、その由来は特に限定されるものではないが、例えば植物由来のものが好ましい。ここで、「野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ」とは、自然界の生物（例えば植物）より分離されうるヒドロキシニトリルリアーゼを指し、該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失、挿入、もしくは他のアミノ酸による置換がなく、天然由来の特性を保持したままのヒドロキシニトリルリアーゼを意味する。本発明において、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼは、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼまたは（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼであるが、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが好ましい。由来植物としては、例えばキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、キシメニア（Ｘｉｍｅｎｉａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）などが挙げられ、好ましくはキャッサバまたはパラゴムノキである。例えば、キャッサバ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０９１に公開されており、配列番号１で表される。また、パラゴムノキ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ４０４０２に公開されており、配列番号１０２で表される。
本明細書では、主にキャッサバ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを例に挙げて説明するが、前述のように、ヒドロキシニトリルリアーゼの由来は限定されず、キャッサバ由来以外のヒドロキシニトリルリアーゼにおいても、本発明で示した変異の位置または変異するアミノ酸種若しくは塩基配列を適応することによって、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が向上する。野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの中には、異なる生物種由来であってもアミノ酸配列上の相同性が高いものがあり、その例としては、例えば、キャッサバ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼとパラゴムノキ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼが挙げられ、両者間のアミノ酸配列相同性は７４％である（特表平１１−５０８７７５号公報）。本発明において、高い相同性は、例えば６０％以上の相同性をいい、好ましくは７５％以上の相同性であり、特に好ましくは９０％以上の相同性である。また、アミノ酸配列全長にわたる相同性が低い場合でも、タンパク質の二次構造（例えばαヘリックスやβシートの構造や位置等）、三次構造あるいは四次構造の類似性が高いものも存在する。本発明で使用するキャッサバまたはパラゴムノキ以外に由来する野生型ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記の相同性、類似性についての特徴を有するヒドロキシニトリルリアーゼであることが好ましい。
（ＩＩ−２）改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
本発明における「改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ」とは、主として遺伝子組み換え技術を利用して野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異を有し、かつ、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が野生型ヒドロキシニトリルリアーゼよりも高くなることを特徴とするヒドロキシニトリルリアーゼと定義される。「改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ」は、本発明の範囲に含まれる。
本発明において「改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ」は、好ましくは、以下の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの特徴を有し、かつ、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを導入した形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性よりも高くなったものがあげられる。
（Ａ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｂ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｃ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｄ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基および第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｅ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｆ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｇ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目のアミノ酸残基、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
上記（Ａ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｇ）において、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの第２番目のアミノ酸残基（例えばバリン）を置換するアミノ酸は、置換後のアミノ酸を含むポリペプチドの形質転換体あたりの活性が、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの形質転換体あたりの活性よりも向上する限り、野生型以外のアミノ酸であれば特に限定されるものではない。第２番目のアミノ酸残基を置換するアミノ酸は、例えばキャッサバ由来のヒドロキシニトリルリアーゼではバリン以外の１９種のアミノ酸から選択され、パラゴムノキ由来のヒドロキシニトリルリアーゼではアラニン以外の１９種のアミノ酸から選択される。第２番目のアミノ酸残基を置換するアミノ酸は、好ましくはリジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、メチオニン、セリン、グルタミン酸、アラニン、グリシンまたはアスパラギン酸であり、より好ましくはリジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、メチオニン、セリンまたはグルタミン酸であり、さらに好ましくはリジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、メチオニンまたはセリンであり、特に好ましくは、リジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニンまたはグルタミンである。
これまでに、細胞内におけるタンパク質の安定性に関連する知見として、第２番目のアミノ酸とホルミルメチオニンプロセッシングの関係またはＮ末端則が報告されている。「第２番目のアミノ酸とホルミルメチオニンプロセッシングの関係」とは、タンパク質の２番目のアミノ酸の種類によって、メチオニンアミノペプチダーゼによるプロセッシングの受け易さが決定され、２番目のアミノ酸の側鎖が大きいほどプロセッシングを受け難いというものである。「Ｎ末端側」とは、タンパク質のＮ末端がアルギニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどの場合、細胞内におけるタンパク質の安定性は低く、速やかに分解されるというものである。これらの関係または法則によれば、例えば配列番号１における２番目のアミノ酸残基がバリンである場合とイソロイシンである場合を比較して、タンパク質の安定性に有意な差はないとされていた。しかし、本発明の１つの特徴は、上記のように２番目のアミノ酸を他のアミノ酸に変異することによって、発現量が向上し、結果として形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が向上する点にある。従って、本発明は、既存の前記関係または法則により説明できるものではなく、まったく新しい原理に起因するものと考えられる。
上記（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）または（Ｇ）において、野性型ヒドロキシニトリルリアーゼの第１０３番目のヒスチジン残基を置換するアミノ酸は、置換後のアミノ酸を含むポリペプチドの形質転換体あたりの活性が、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの形質転換体あたりの活性よりも向上する限り、ヒスチジン以外のアミノ酸であれば特に限定されるものではない。第１０３番目のヒスチジン残基を置換するアミノ酸は、以下（ａ）および（ｂ）のいずれか一方または両方の性質を有するアミノ酸が好ましい。
（ａ）分子中に含まれる窒素原子数が１または２のアミノ酸である
（ｂ）中性アミノ酸である
ここで、（ａ）分子中に含まれる窒素原子数が１または２のアミノ酸とは、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンを指す。また、（ｂ）の中性アミノ酸とは、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸以外のアミノ酸を指すものとし、具体的には、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、チロシン、グリシン、プロリンが挙げられる（生化学辞典（東京化学同人））。第１０３番目のヒスチジン残基を置換するアミノ酸は、上記（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するアミノ酸であれば限定されないが、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニンまたはトリプトファンなどが好ましく、さらに好ましくは、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システインまたはトリプトファンである。
また、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１０３番目の近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼも、本発明に含まれる。キャッサバまたはパラゴムノキ以外の由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼでは、キャッサバまたはパラゴムノキの第１０３番目のヒスチジン残基に相当するヒスチジン残基が、第１０３番目の近傍に存在する場合がある。この場合は、第１０３番目の近傍に存在するヒスチジン残基を上記のように他のアミノ酸に変異すればよい。
本発明において「第１０３番目の近傍」のヒスチジン残基とは、第９３番目〜第１１３番目、好ましくは第９８番目〜第１０８番目、より好ましくは第１００番目〜第１０６番目のヒスチジン残基である。
キャッサバまたはパラゴムノキ由来のヒドロキシニトリルリアーゼの第１０３番目のヒスチジン残基に相当するヒスチジン残基の位置は、例えば、キャッサバまたはパラゴムノキ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列と、対象となるヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列とをアライメントすることによって知ることができる。アミノ酸配列のアライメントは、例えば、日本ＤＮＡデータバンクホームページのＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｃｌｕｓｔａｌｗ−ｊ．ｈｔｍｌ）によって行うことができる。
上記（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｇ）において、他のアミノ酸残基に置換されるリジン残基は、置換後のアミノ酸を含むポリペプチドの形質転換体あたりの活性が、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの形質転換体あたりの活性よりも向上する限り、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中に存在するリジン残基であれば特に限定されるものではない。他のアミノ酸残基に置換される好ましいリジン残基の箇所としては、野性型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中の第１７５番目から第２２４番目の領域に存在する少なくとも１つのリジン残基が挙げられ、より好ましくは、例えばキャッサバ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいては第１７６番目、第１９９番目および第２２４番目のリジシ残基から選ばれる１つ以上が、パラゴムノキ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいては第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目のリジン残基から選ばれる１つ以上がそれぞれ挙げられる。
また、これらリジン残基を置換するアミノ酸は、以下（ａ）および（ｂ）のいずれか一方または両方の性質を有するアミノ酸が好ましい。
（ａ）分子中に含まれる窒素原子数が１または２のアミノ酸である
（ｂ）中性アミノ酸である
ここで、（ａ）の分子中に含まれる窒素原子数が１または２のアミノ酸とは、上述したとおりである。また（ｂ）の中性アミノ酸とは、上述したとおりである。これらリジン残基を置換する最も好ましいアミノ酸は、プロリンである。
すなわち、上記（Ａ）〜（Ｃ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの好ましい態様として、例えば具体的にはそれぞれ以下のようなものが挙げられる。
（Ａ）配列番号１または配列番号１０２に示す野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目に位置するバリン残基またはアラニン残基が、リジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、メチオニン、セリン、グルタミン酸のいずれかのアミノ酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｂ）配列番号１または配列番号１０２に示す野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１０３番目に位置するヒスチジン残基が、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニン、トリプトファンのいずれかのアミノ酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
（Ｃ）配列番号１に示す野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１７６番目、第１９９番目または第２２４番目のリジン残基のいずれか一つ、第１７６番目および第１９９番目のリジン残基、第１７６番目および第２２４番目のリジン残基、第１９９番目および第２２４番目のリジン残基、または第１７６番目、１９９番目および第２２４番目のリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ、配列番号１０２に示す野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第１７５番目、第１９８番目または第２２３番目のリジン残基のいずれか一つ、第１７５番目および第１９８番目のリジン残基、第１７５番目および第２２３番目のリジン残基、第１９８番目および第２２３番目のリジン残基、または第１７５番目、第１９８番目および第２２３番目のリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
また、（Ｄ）〜（Ｇ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記（Ａ）〜（Ｃ）いずれか２つまたは３つすべての態様を有する改良型ヒドロキシニトリルリアーゼとして表される。例えば、（Ｄ）は（Ａ）と（Ｂ）との組み合わせであるから、配列番号１または配列番号１０２に示す野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、第２番目に位置するバリン残基またはアラニン残基が、リジン、アスパラギン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、メチオニン、セリン、グルタミン酸のいずれかのアミノ酸に置換され、かつ、第１０３番目に位置するヒスチジン残基が、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニン、トリプトファンのいずれかのアミノ酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを意味する。
ここで、配列番号１はキャッサバ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号１０２はパラゴムノキ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列を示す。
また、配列番号１または配列番号１０２において、第１２５番目のフェニルアラニン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ、第２０５番目のスレオニン残基がセリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ、または第２３５番目のアスパラギン残基がグリシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼも本発明に含まれる。
さらに、（Ａ）〜（Ｇ）のような特徴を有し、すなわち、上記置換の態様は維持しつつ、さらに、（Ａ）〜（Ｇ）記載の置換部位のアミノ酸を除く、１個または数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が野生型ヒドロキシニトリルリアーゼよりも高くなるポリペプチドも、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの範囲である。当該ポリペプチドは、例えば、以下の態様が含まれる。
（Ａ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、置換された第２番目のアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｂ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、置換された第１０３番目またはその近傍のアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、リジンが置換されたアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｄ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸残基および第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、置換された第２番目および第１０３番目またはその近傍のアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｅ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、置換された第２番目のアミノ酸およびリジンが置換されたアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｆ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、置換された第１０３番目またはその近傍のアミノ酸およびリジンが置換されたアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｇ）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸残基、第１０３番目またはその近傍のヒスチジン残基および当該配列中に存在する少なくとも１つのリジン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、置換された第２番目のアミノ酸、置換された第１０３番目またはその近傍のアミノ酸およびリジンが置換されたアミノ酸を除く、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するポリペプチド
なお、本明細書中、アミノ酸のアルファベット表記は通常の３文字または１文字で表すことがあり、数字の前に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を、数字の後に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を指すことがある。例えば、１７６番目のリジンがプロリンに置換された場合は、「Ｋ１７６Ｐ」と表示することがある。他の場合も同様である。
（ＩＩＩ）ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
（ＩＩＩ−１）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの中には、その遺伝子配列が明らかにされているものがあり、例えば上述のキャッサバ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの遺伝子配列は配列番号２で表される（ＧｅｎＢａｎｋ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０９１）。本発明において、これを「植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子」と記述することがある。また、上述のパラゴムノキ由来の野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの遺伝子配列は配列番号１０３で表される（ＧｅｎＢａｎｋ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ４０４０２）。
植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を取得する方法の一つとしては、植物から該遺伝子のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等を抽出し、常法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）））に従ってｃＤＮＡを合成する方法が挙げられる。すなわち、公知の植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子配列情報をもとにプライマーを設計し、該プライマーを用いてＰＣＲ法でヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を増幅することにより植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を得ることができる。また、公知の遺伝子配列情報を基に、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）などを利用して、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子全長を化学的に合成することも可能である。例えば、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をいくつかの領域（例えば、５０塩基程度）に分割し、隣り合う領域とのオーバーラップ（例えば、２０塩基程度）を両端に有する複数のオリゴヌクレオチドを設計および合成する。該オリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で互いにアニールさせて植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を増幅することができる。
ところで、近年では、遺伝子組換え技術を用い、他の生物を宿主として用いて目的のタンパク質を生産させることが可能であるが、その際、宿主において使用頻度の高いコドンを採用することにより、目的タンパク質の発現量が向上する例が多く知られている。ここで、コドン使用頻度とは、塩基配列からアミノ酸配列への情報変換過程において使用されるコドンの頻度を意味し、コドンとは、ｍＲＮＡ中の３個のヌクレオチドの並び方を意味する。上記情報変換過程では、上記３塩基が１単位となって１つのアミノ酸に翻訳される。６４種類のコドンは２０種類のアミノ酸に対応するため、遺伝暗号の縮重が存在し、１つのアミノ酸は１〜６種類の同義コドンを持つ。例えばバリンのコドンは、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧの４種類が存在する。一つのアミノ酸に対して複数のコドンがある場合、生物はその複数のコドンを均等な割合で用いるのでなく、生物毎に特徴のある割合で特定のコドンを偏って用いている。このような生物毎のコドン使用頻度（コドンユーセージ）は一部データベース化されており、コドンユーセージデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）で調べることができる。
使用頻度が「高い」とは、複数のコドンが存在するときは最低のコドン使用頻度よりも高いことを意味し、最も高い使用頻度である必要はない。また、コドンが１つしか存在しない場合（例えばメチオニンおよびトリプトファン）は、使用頻度とは無関係に使用される。但し、宿主における発現効率を考慮すると、宿主における高発現遺伝子で使用頻度の高いコドンまたは宿主において最も使用頻度の高いコドンを使用することが好ましい。より具体的には、例えば宿主として大腸菌Ｋ１２株を用いる場合、表１で示されるコドンユーセージ表から使用頻度の最も高いコドンを知ることができる（表２）。従って、宿主として大腸菌Ｋ１２株を用いる場合に、遺伝子工学技術を用いて発現させようとする目的遺伝子のコドンを表２に示すコドンに変換することができる。例えば、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、すなわち、上述したようにキャッサバから該遺伝子のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等を抽出し、ｃＤＮＡを合成する方法によって得られるキャッサバ由来のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子で使用されているバリンのコドンが「ＧＴＡ」であるとすると、「ＧＴＡ」を大腸菌Ｋ１２株におけるバリンの最頻用コドンである「ＧＴＧ」に変換することができる。
【表１】
0004956193.tif 000002
【表２】
0004956193.tif 000003
コドンを変換する領域は、コード配列（ＣＤＳ）内であれば限定されるものではなく、ＣＤＳの全てのコドンに対して変換することも、部分的に１または複数箇所を変換することもできる。本発明におけるキャッサバ由来野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの場合、コドンを変換するアミノ酸の数は、アミノ酸２５８残基の内、１以上であれば良く、好ましくは１〜１００、さらに好ましくは１０〜７０残基である。
このように、宿主に適したコドンで構成され、かつ野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を、本発明においては「宿主コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子」と呼び、特に宿主が大腸菌である場合には、「大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子」と呼ぶことがあり、上述の「植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子」と区別することができる。「ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子」の接頭に「○○コドン」が付随しない場合は、植物コドン、大腸菌コドンの別を限定しないか、あるいはいずれをも意味するものとする。
宿主コドンヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、例えば変換しようとするコドンの数が比較的少ない場合は、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をベースに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法を利用して調製することができる。特に近年では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて比較的容易に行うことができる。この他、上述したように、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）により、多くのコドンを宿主最頻用に変換した宿主コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を全合成することも可能である。大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、例えば、後の実施例で述べる配列番号３で表される塩基配列からなる大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が挙げられる。
（ＩＩＩ−２）改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
本発明における改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とは、（ＩＩ−２）で述べた改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素タンパク質をコードする遺伝子を意味する。本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子には、例えば、配列番号１（キャッサバ由来）または配列番号１０２（パラゴムノキ由来）のアミノ酸配列で表される野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいて、（ＩＩ−２）の（Ａ）〜（Ｇ）において上述したようなアミノ酸置換変異を有する改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が含まれ、そのベースとなる野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのコドンは、植物コドン、宿主コドンいずれでもよい。本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子として、例えば以下のような態様が挙げられる。
（Ａ）
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＡＡまたはＡＡＧに置換したもの、好ましくは４、５番目の塩基Ｇ、ＴをそれぞれＡ、Ａに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がリジンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＡＣまたはＡＡＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＡＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアスパラギンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＴＡ、ＡＴＣまたはＡＴＴに置換したもの、好ましくは４、６番目の塩基Ｇ、ＡをそれぞれＡ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がイソロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧまたはＣＧＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＣＧＴに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアルギニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＣＡＡまたはＣＡＧに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＣＡＧに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がグルタミンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＣＣＧに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＣＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がスレオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＴＡＣまたはＴＡＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＴＡＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がチロシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧまたはＣＴＴに置換したもの、好ましくは４、６番目の塩基Ｇ、ＡをそれぞれＣ、Ｇに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＴＧに置換したもの、すなわち、４、６番目の塩基Ｇ、ＡをそれぞれＡ、Ｇに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がメチオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧまたはＴＣＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＡをＡＧＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がセリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＧＡＡまたはＧＡＧに置換したもの、好ましくは５番目の塩基ＴをＡに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がグルタミン酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＡをそれぞれＣ、Ｔに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアラニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧまたはＧＧＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＡをそれぞれＧ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がグリシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４〜６番目の塩基ＧＴＡをＧＡＣまたはＧＡＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＡをそれぞれＡ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアスパラギン酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＡＡまたはＡＡＧに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＡＡに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がリジンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＡＣまたはＡＡＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＡＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアスパラギンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＴＡ、ＡＴＣまたはＡＴＴに置換したもの、好ましくは４、６番目の塩基Ｇ、ＧをそれぞれＡ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がイソロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧまたはＣＧＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＧをＣＧＴに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアルギニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＣＡＡまたはＣＡＧに置換したもの、好ましくは４、５番目の塩基Ｇ、ＴをそれぞれＣ、Ａに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がグルタミンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは４、５番目の塩基Ｇ、ＴをそれぞれＣ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＣＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がスレオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＴＡＣまたはＴＡＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＧをＴＡＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がチロシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧまたはＣＴＴに置換したもの、好ましくは４番目の塩基ＧをＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＴＧに置換したもの、すなわち、４番目の塩基ＧをＡに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がメチオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧまたはＴＣＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＴＧをＡＧＣに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がセリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＧＡＡまたはＧＡＧに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＧをそれぞれＡ、Ａに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がグルタミン酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＧをそれぞれＣ、Ｔに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアラニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧまたはＧＧＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＧをぞれぞれＧ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がグリシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において４〜６番目の塩基ＧＴＧをＧＡＣまたはＧＡＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｔ、ＧをぞれぞれＡ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するバリン残基がアスパラギン酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＡＡまたはＡＡＧに置換したもの、好ましくは４、５番目の塩基Ｇ、ＣをそれぞれＡ、Ａに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がリジンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＡＣまたはＡＡＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＡＣに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がアスパラギンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＴＡ、ＡＴＣまたはＡＴＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＴＣに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がイソロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧまたはＣＧＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＣＧＴに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がアルギニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＣＡＡまたはＣＡＧに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＣＡＧに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がグルタミンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは４、６番目の塩基Ｇ、ＡをそれぞれＣ、Ｇに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴに置換したもの、好ましくは４、６番目の塩基Ｇ、ＡをそれぞれＡ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がスレオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＴＡＣまたはＴＡＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＴＡＣに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がチロシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧまたはＣＴＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＣＴＧに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＴＧに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がメチオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧまたはＴＣＴに置換したもの、好ましくは４〜６番目の塩基ＧＣＡをＡＧＣに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がセリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＧＡＡまたはＧＡＧに置換したもの、好ましくは５番目の塩基ＣをＡに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がグルタミン酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧまたはＧＧＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｃ、ＡをそれぞれＧ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がグリシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において４〜６番目の塩基ＧＣＡをＧＡＣまたはＧＡＴに置換したもの、好ましくは５、６番目の塩基Ｃ、ＡをぞれぞれＡ、Ｃに置換したもの（第２番目に位置するアラニン残基がアスパラギン酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）
（Ｂ）
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＡＴＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がメチオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧまたはＣＴＴに置換したもの、好ましくは３０８、３０９番目の塩基Ａ、ＣをそれぞれＴ、Ｇに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＡＴＡ、ＡＴＣまたはＡＴＴに置換したもの、好ましくは３０７、３０８番目の塩基Ｃ、ＡをそれぞれＡ、Ｔに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がイソロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧまたはＧＴＴに置換したもの、好ましくは３０７、３０８番目の塩基Ｃ、ＡをそれぞれＧ、Ｔに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がバリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＴＧＣまたはＴＧＴに置換したもの、好ましくは３０７、３０８番目の塩基Ｃ、ＡをそれぞれＴ、Ｇに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がシステインに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＣＡＡまたはＣＡＧに置換したもの、好ましくは３０９番目の塩基ＣをＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がグルタミンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧまたはＴＣＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＴＣＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がセリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＡＣＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がスレオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＴに置換したもの、好ましくは３０７、３０８番目の塩基Ｃ、ＡをそれぞれＧ、Ｃに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がアラニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２または配列番号１０３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＴＧＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がトリプトファンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＴＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がメチオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧまたはＣＴＴに置換したもの、好ましくは３０８、３０９番目の塩基Ａ、ＴをそれぞれＴ、Ｃに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＴＡ、ＡＴＣまたはＡＴＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＴＣに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がイソロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧまたはＧＴＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＧＴＣに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がバリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＴＧＣまたはＴＧＴに置換したもの、好ましくは３０７、３０８番目の塩基Ｃ、ＡをそれぞれＴ、Ｇに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がシステインに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＣＡＡまたはＣＡＧに置換したもの、好ましくは３０９番目の塩基ＴをＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がグルタミンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧまたはＴＣＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＧＣに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がセリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＡＣＣに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がスレオニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＴに置換したもの、好ましくは３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＧＣＣに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がアラニンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＴをＴＧＧに置換したもの（第１０３番目に位置するヒスチジン残基がトリプトファンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）
なお、（ＩＩ−２）で述べた、第１０３番目の近傍のヒスチジン残基が他のアミノ酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ、すなわち、キャッサバまたはパラゴムノキ由来のヒドロキシニトリルリアーゼの第１０３番目のヒスチジン残基に相当するヒスチジン残基が変異した改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子も、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子に含まれる。
（Ｃ）
配列番号２において５２６〜５２８番目の塩基ＡＡＧをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは５２６〜５２８番目の塩基ＡＡＧをＣＣＣに置換したもの（第１７６番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において５９５〜５９７番目の塩基ＡＡＧをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは５９５〜５９７番目の塩基ＡＡＧをＣＣＣに置換したもの（第１９９番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において６７０〜６７２番目の塩基ＡＡＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは６７０〜６７２番目の塩基ＡＡＡをＣＣＴに置換したもの（第２２４番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において５２６〜５２８番目の塩基ＡＡＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは５２６〜５２８番目の塩基ＡＡＡをＣＣＣに置換したもの（第１７６番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において５９５〜５９７番目の塩基ＡＡＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは５９５〜５９７番目の塩基ＡＡＡをＣＣＣに置換したもの（第１９９番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号３において６７０〜６７２番目の塩基ＡＡＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは６７０〜６７２番目の塩基ＡＡＡをＣＣＴに置換したもの（第２２４番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において５２３〜５２５番目の塩基ＡＡＧをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは５２３〜５２５番目の塩基ＡＡＧをＣＣＣに置換したもの（第１７５番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において５９２〜５９４番目の塩基ＡＡＧをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは５９２〜５９４番目の塩基ＡＡＧをＣＣＣに置換したもの（第１９８番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号１０３において６６７〜６６９番目の塩基ＡＡＡをＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴに置換したもの、好ましくは６６７〜６６９番目の塩基ＡＡＡをＣＣＴに置換したもの（第２２３番目に位置するリジン残基がプロリンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）
また、（Ｄ）〜（Ｇ）の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、上記（Ａ）〜（Ｃ）いずれか２つまたは３つすべての態様を有する改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子で表される。
例えば、（Ｄ）は（Ａ）と（Ｂ）との組み合わせであるから、（Ｄ）の遺伝子として、配列番号２において４、５番目の塩基Ｇ、ＴをそれぞれＡ、Ａに置換され、かつ、３０７〜３０９番目の塩基ＣＡＣをＡＴＧに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を例示することができる。
また、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、上記（Ａ）〜（Ｇ）の態様にさらに以下の置換を伴っていてもよい。
配列番号２において３７３〜３７５番目の塩基ＴＴＴをＣＴＴに置換したもの（第１２５番目に位置するフェニルアラニン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、
配列番号２において４３６〜４３８番目の塩基ＡＣＣをＡＣＡに置換したもの、
配列番号２において６１３〜６１５番目の塩基ＡＣＣをＴＣＣに置換したもの（第２０５番目に位置するフェニルアラニン残基がロイシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）、または
配列番号２において７０３〜７０５番目の塩基ＧＡＴをＧＧＴに置換したもの（第２３５番目に位置するアスパラギン酸がグリシンに置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする）
さらに、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子としては、上記（Ａ）〜（Ｇ）で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が野生型ヒドロキシニトリルリアーゼよりも高くなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡは、例えば、上記（Ａ）〜（Ｇ）で表される塩基配列からなる改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子ＤＮＡ若しくはその相補配列、またはこれらの断片をプロープとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用することも、市販のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーを利用することも可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００〜２０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡを得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、上記（Ａ）〜（Ｇ）で表される塩基配列に対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡまたはその部分断片が挙げられる。
本発明において、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の調製を行う方法は変異を導入する既知の如何なる方法でもよく、通常は、公知の方法で行なうことができる。例えば、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を基に、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法や、遺伝子ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。
これらの部位特異的変異誘発法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２（１９８５）、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６（１９８８）等に記載されている。近年では、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法を基にした部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ（株）社製）等を用いて行うことができる。また、目的とする変異導入箇所が、対象遺伝子配列において消化・連結が容易な制限酵素部位の近隣に存在する場合、目的変異を導入したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてＰＣＲを行うことで、目的変異が導入された遺伝子ＤＮＡ断片を容易に得ることができる。さらには、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）で伸長させて合成遺伝子として得ることもできる。
また、ハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてランダムに変異を導入する方法などのランダムな変異導入法によっても、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子から改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を得ることができる。
（ＩＶ）組換えベクター、形質転換体
（ＩＶ−１）組換えベクター
上記の方法によって得た本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を宿主で発現させるために、遺伝子の上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することができる。あるいは、当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該変異遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用する。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。すなわち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。
プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。
ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特段限定されるものではなく、例えばρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター等が挙げられる。
また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法などにより付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列などが挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作製して利用してもよい。
一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明において使用されるベクターは、上記の変異遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＴｒｃ９９Ａ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ、日本）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＥＴ−１２（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）、ｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）などを用いることができる。また、必要に応じてこれらベクターを改変したものも用いることができる。また、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーターを有する発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡまたはｐＫＫ２３３−２などを用いることもできる。
上記の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。
（ＩＶ−１）形質転換体
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換または形質導入することで、形質転換体または形質導入体（以下、これらをまとめて「形質転換体」ともいう）を作製する。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母（Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。
細菌を宿主とする場合、本発明においては、特に大腸菌を好ましい宿主として用いることができる。大腸菌としては、例えば、大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、Ｃ６００株などを挙げることができる。特に、上述したようなラクトースオペロンのｌａｃプロモーターおよびその派生プロモーターを発現プロモーターとして用いる場合、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子を有する宿主を用いれば発現が誘導型となり（ＩＰＴＧ等で誘導）、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子を有しない宿主を用いれば発現は構成型となるので、必要に応じた宿主を利用することができる。これら菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）などから容易に入手可能である。枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
植物細胞を宿主とする場合は、タバコＢＹ−２細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
（Ｖ）培養物および改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法
本発明においで、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
本発明は、当該培養物から改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを採取することを特徴とする、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法をも含む。
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の改良型ヒドロキシニトリルリナーゼは、上記培養物中に蓄積される。
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。また、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養中、ベクターおよび目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加してもよく、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中に、必要に応じてアンピシリンを培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＬＡＡ等を培地に添加することができる。
形質転換体の培養条件は、目的の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの生産性および宿主の生育が妨げられない条件であれば特段限定されるものではないが、通常、培養温度は１０℃〜４５℃、好ましくは１０℃〜４０℃、さらに好ましくは１５℃〜４０℃、さらにより好ましくは２０℃〜８７℃で行い、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。培養時間は５〜１２０時間、好ましくは５〜１００時間、さらに好ましくは１０〜１００時間、さらにより好ましくは１５〜８０時間程度行う。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、大腸菌であれば６〜９に調整する。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
特に大腸菌形質転換体を培養する場合には、振盪培養または通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。特に大腸菌形質転換体を培養するには、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整するのが適当である。また、培養は、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施するのが好ましい。特に、工業的規模での改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ生産を行う場合は、通気攪拌培養を利用することができる。さらに、通気攪拌培養の操作方式としては限定されることなく、回分式（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、半回分式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ，  ｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）および連続式（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のいずれで行ってもよい。特に、高濃度培養により、装置あたり、時間あたり、費用あたり、または操作あたりの生産を高めたい場合には、半回分式培養を行うことができる。半回分式で用いられる流加（ｆｅｄ）培地成分は、初発（ｂａｔｃｈ）培地成分と同一の組成のものを用いても、組成を変更してもよいが、初発培地と比較して培地成分濃度はより高濃度であることが好ましい。流加培地の体積は特段限定されることはないが、通常、初発培地の１／２以下の体積を添加させることができる。流加培地を添加していく方法（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｍｏｄｅ）としては、例えば、定流的流加法（ｃｏｎｓｔａｎｔ）、指数的流化法（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）、段階的増加流化法（ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）、比増殖速度制御流化法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ−ｒａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｐＨスタット流化法（ｐＨ−ｓｔａｔ）、ＤＯスタット流化法（ＤＯ−ｓｔａｔ）、グルコース濃度制御流化法（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、酢酸濃度モニタリング流化法（ａｃｅｔａｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、ファジー神経回路流化法（ｆｕｚｚｙ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）などが挙げられるが（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６），１４，９８−１０５）、所望のヒドロキシニトリルリアーゼ生産性が得られれば特段限定されるものではない。なお、半回分式培養実施時の培養終了時期は、流化培地の投入終了後に限定される必要はなく、必要に応じて培養を継続し、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が最も高い時点で培養終了とすることができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地またはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。形質転換（導入）体が植物細胞または植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地、ＬＳ基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
形質転換体が植物細胞または植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地、ＬＳ基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
上記培養条件で培養すると、本発明の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを上記培養物中、すなわち、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積させることができる。
培養後、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することにより、目的の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを採取することができる。
破砕前に、必要であれば、遠心分離や膜ろ過などの固液分離操作により、培地除去および洗浄を行うことができる。
遠心分離は、菌体または細胞を沈降させる遠心力が供給できるものであれば特段限定されることはなく、円筒型や分離板型などを利用することができる。遠心力としては、例えば、５００Ｇ〜２０，０００Ｇ程度で行うことができる。
また、本工程に利用しうる膜ろ過は、目的とする固液分離を達成できれば、精密ろ過（ＭＦ）膜、限外ろ過（ＵＦ）膜いずれでもよいが、通常、精密ろ過（ＭＦ）膜を用いることが好ましい。精密ろ過は、例えば流動方向に基づけば、デッドエンド方式やクロスフロー（タンジェンシャルフロー）方式に分類でき、圧力の加え方に基づけば、重力式、加圧式、真空式、遠心力式などに分類でき、操作様式に基づけば、回分式と連続式などに分類することができるが、固液分離操作を行うことができるものであれば、そのいずれをも利用することができる。ＭＦ膜の材質としては、高分子膜、セラミック膜、金属膜、およびそれらの複合型に大別でき、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性および固液分離操作時の該活性回収率を低下させるものでなければ特段限定されるものではないが、特に高分子膜、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、混合セルロースエステル、銅アンモニア法再生セルロースエステル、ポリイミド、ナイロン、テフロンなどの使用が好ましい。膜の孔径としては、菌体または細胞を捕捉し、濃縮操作が可能であればよく、通常、０．１〜０．５μｍ程度のものを用いることができる。
本発明において「活性回収率」とは、固液分離などの操作を行う際、操作前の活性を１００％として、操作後に回収された活性の相対比（％）を意味する。
上記の遠心分離および膜ろ過による固液分離操作時には、必要に応じて、水または緩衝液、等張液を添加して希釈洗浄を行うこともできる。用いられる緩衝液は、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性および固液分離操作時の該活性回収率を低下させるものでなければ特段限定されるものではなく、例えば、塩濃度は５〜５００ｍＭ、好ましくは５〜１５０ｍＭ程度であり、ｐＨは４〜８程度のものであればよい。緩衝液成分としては、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩などのリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などの塩類を挙げることができる。具体的には、例えば、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６〜７）、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜６）などが挙げられる。また、等張液としては例えば、０．７〜０．９％塩化ナトリウム溶液などが挙げられる。その他、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを安定しうる物質、例えば、フラボノイド類等を添加してもよい（Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１），３９（３），１６１−１６７）。
菌体または細胞の破砕方法としては、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独または必要に応じ組み合わせて利用することができる。工業的規模で菌体または細胞の破砕を行う場合は、操作性、回収率、コスト等を勘案し、主に高圧処理や磨砕処理、衝突処理を利用することが好ましく、場合によってはこれら物理的破砕操作に酵素処理などを組み合わせてもよい。各破砕処理方法において、菌体または細胞からの改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ回収率が十分高いものであれば、操作条件は特段限定されることはない。十分高い改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ回収率とは、例えば、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、もっとも好ましくは９９％以上である。
ビーズミルによる磨砕処理を行う場合、用いられるビーズは、例えば、密度２．５〜６．０ｇ／ｃｍ３、サイズ０．１〜１．０ｍｍのものを通常８０〜８５％程度充填することにより破砕を行うことができ、運転方式としては回分式、連続式いずれをも採用することができる。菌体または細胞濃度も特段限定されないが、例えば、細菌であれば６〜１２％程度、酵母であれば１４〜１８％程度とすればよい。
高圧処理を行う場合、処理圧力は、菌体または細胞からの改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ回収率が十分高いものであれば特段限定されないが、例えば、４０〜１５０ＭＰａ程度の圧力で破砕を行うことができる。菌体または細胞濃度も特段限定されないが、例えば、２０％以下程度であればよい。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いることにより、多段階処理を行い、破砕および操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力１０ＭＰａあたり２〜３℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。
衝突処理の場合、例えば、被破砕菌体または細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理（凍結速度：例えば１分間当たり数千℃）などによって凍結微細粒子（例えば５０μｍ以下）にしておき、これを高速（例えば約３００ｍ／ｓ）の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで菌体または細胞を破砕することができる。
上記のような菌体または細胞破砕処理の結果、細胞内の核酸が流出することにより、処理液の粘度が上昇してハンドリングが困難になる場合、あるいは、後段の残渣分離工程での活性回収率向上に効果がある場合は、必要に応じて、核酸除去または核酸分解により、処理液の粘度低減や残渣分離工程での活性回収率の向上を期待することができる。細胞破砕液中の核酸を除去または分解する方法としては、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性または該活性回収率を低下させず、かつ、核酸を除去または分解することができる方法であればいかなる方法でも良いが、例えば、生化学実験講座５巻２００〜２０１頁に記載されているように、細胞破砕液にプロタミン硫酸あるいはストレプトマイシンを添加することにより核酸を沈澱させる方法、核酸分解酵素で核酸を分解する方法、デキストラン−ポリエチレングリコールを用い液々分離を行う方法などが挙げられる。また、物理的破砕処理をさらに追加することも有効である場合がある。これら方法のうち、特に、工程の煩雑化を避けつつ迅速に核酸を分解したい場合には、核酸分解酵素で核酸を分解する方法を採ることができる。核酸分解酵素処理に用いる核酸分解酵素は、少なくともデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に作用し、核酸分解反応触媒能力を有し、ＤＮＡ重合度を下げるものであればいかなるものでもよく、該形質転換体細胞内に本来存在する核酸分解酵素を利用してもよいが、別途、外因性の核酸分解酵素を添加してもよい。別途添加する核酸分解酵素としては、例えば、ウシ脾臓由来ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ、日本）、ブタ脾臓由来ＤＮａｓｅＩＩ（和光純薬、日本）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来核酸分解酵素Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（タカラバイオ、日本）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（和光純薬、日本）などが挙げられる。添加する酵素量は酵素の種類やユニット数（Ｕ）の定義により異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。必要に応じて、核酸分解酵素に要求されるマグネシウムなどの補因子を添加しても良い。処理温度は用いる核酸分解酵素によって異なるが、常温生物種由来の核酸分解酵素であれば、例えば、２０〜４０℃の温度が用いられる。
得られた破砕液から菌体または細胞破砕残渣を除去する必要がある場合は、例えば、遠心分離やろ過（デッドエンド方式あるいはクロスフロー方式）などにより除去することができる。
遠心分離操作は、前述の通り行うことができる。菌体または細胞破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて、凝集剤を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。有機高分子凝集剤は、イオン性に基づけば、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤を挙げることができ、原料面に基づけば、アクリル系、ポリエチレンイミン、縮合系ポリカチオン（ポリアミン）、ジメチルジアリルアンモニウムクロライド、キトサンなどを挙げることができるが、本発明において使用する凝集剤は、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性または該活性回収率を低下させず、かつ、残渣分離効率を向上させることができるものであればいずれの凝集剤でも良い。アクリル系凝集剤の成分となるアクリル系水溶性モノマーとしては、例えば、アクリルアミド、アクリル酸ナトリウム、アクリルアミド２メチル−プロパンスルホン酸ナトリウム、ジメチルアミノエチル−メタクリレート、メタクリロイロキシエチル−トリメチルアンモニウム−クロライド、メタクリロイロキシエチル−ベンジルジメチル−アンモニウムクロライド、ジメチルアミノエチル−アクリレート、アクリロイロキシエチル−トリメチルアンモニウム−クロライド、ジメチルアミノプロピル−アクリルアミド、アクリルアミドプロピル−トリメチルアンモニウム−クロライド、ポリアミジン−クロライドなどが挙げられ、これらモノマーの単一重合物、多様な組成による共重合物または高分子変性物がアクリル系凝集剤として挙げられる。特に代表的なカチオン系高分子凝集剤としては、ポリアミノアルキルメタアクリレート類，ポリアムノアルキルメタアクリレートとアクリルアミドの共重合物類，ポリアクリルアミドのマンニツヒ変性物類，ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類，ポリビニルイミダゾリン類，ポリアクリルアミド類，アミン系重縮合物類などがあげられ、すでに多くの商品が市販されている。その主なものとしては，例えば，サンポリ−Ｋ−６０１，Ｋ−６０２（主成分ポリアミン，三共化成），クリフロツクＬＣ−５９９（主成分ポリアミンおよびポリアミド，栗田工業），ハイモロツクＭ−１６６，Ｍ−５６６，Ｍ−９６６，（主成分アクリルアミド変性物，協立有機工業），ユニフロツカ−ＵＦ−３０１，ＵＦ−３０４，ＵＦ−３０５，（主成分ポリアクリルアミド，ユニチカ），ＵＦ−３３０，ＵＦ−３４０，（主成分アミノメタアクリル酸エステル，ユニチカ），ＵＦ−５０５（主成分ジシアンアミン，ユニチカ），リユーフロツクＣ−１１０（主成分ポリアミン，大日本インキ化学），ピユリフロツクＣ−３１（主成分ポリアミン，ダウケミカル）が挙げられる。また、ダイヤニトリックス社（日本）製Ｋ−４００シリーズ、ＫＭ−２００シリーズ、ＫＭ−１２００シリーズ、ＫＡＭ−２００シリーズ、ＫＤ−２００シリーズ、ＫＰ−０００シリーズ、ＫＰ−１００シリーズ、ＫＰ−２００シリーズ、ＫＰ−３００シリーズ、ＫＰ−５００シリーズ、ＫＰ−１２００シリーズ、ＫＡ−０００シリーズ、ＫＡ−２００シリーズ、ＫＡ−３００シリーズ、ＫＡ−４００シリーズ、ＫＡ−６００シリーズ、ＫＡ−７００シリーズ、ＫＡ−８００シリーズなども挙げられる。これら凝集剤は単独もしくは二種以上を併用して使用できる。本発明において使用する凝集剤は、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性または該活性回収率を低下させず、かつ、残渣分離効率を向上させることができるものであれば上述のいずれの凝集剤でも良いが、具体的には、例えば、ダイヤニトリックス社（日本）製Ｋ−４０１、Ｋ−４０３Ｂ、Ｋ−４０５、Ｋ−４０８、Ｋ−４０９、Ｋ−４１５、ＫＰ２０１Ｈ、ＫＰ３０９、ＫＰ７０００などが挙げられる。凝集剤の添加量としては、凝集剤の種類や菌体または破砕液の液状によっても異なるが、例えば、破砕した微生物乾燥重量％濃度の１／５０〜１／２の濃度、好ましくは１／２０〜１／５濃度である。添加方法としては、例えば、凝集剤を予め水に溶解した後、菌体または細胞破砕液に添加して少なくとも５分から２４時間、好ましくは３０分から１０時間程度、静置または撹拌すればよい。そのときの温度としては、例えば、０℃〜６０℃、特に０℃〜５０℃、さらに０℃〜４０℃が好ましい。また、ｐＨの調整が必要な場合には、適宜、無機塩終濃度が５〜２００ｍＭとなるよう添加して緩衝液化することもできるし、必要に応じて、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを安定化する物質を添加してもよい。
ろ過により残渣分離を行う場合、目的とする残渣分離を達成できれば、精密ろ過（ＭＦ）膜、限外ろ過（ＵＦ）膜いずれの膜を使用してもよいが、通常、精密ろ過（ＭＦ）膜を用いることが好ましい。精密ろ過膜は、前述の通り、残渣分離操作を行うことができるものであれば、いずれをも利用することができる。膜の孔径としては、菌体または細胞残渣を捕捉し、かつ、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性がろ液側に回収できるものであればよく、例えば、０．１〜０．５μｍ程度のものを用いることができる。さらに、ろ過助剤、必要に応じて凝集剤を用いれば、孔径０．５μｍ以上の膜あるいはろ紙を利用することもできる。ろ過助剤としては、珪藻土やセルロースパウダー、活性炭などが挙げられる。凝集剤は上述のとおりである。
残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを含む粗酵素溶液とすることができる。その後、必要に応じて、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー（例えばＳｅｐｈａｄｅｘカラム）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー（例えばｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、陰イオンクロマトグラフィー（例えばＭｏｎｏＱカラム）等）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からヒドロキシニトリルリアーゼを単離精製することができる。
なお、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼが菌体内または細胞内に生産される場合、菌体や細胞そのものを上述のように遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま目的の酵素反応などに使用することも可能である。その場合、必要に応じて、培養後の細胞をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等の無機担体に担持したもの等、処理物として利用することもできる。
一方、本発明の形質転換体が遺伝子組換え体であり、かつ、製造工程での形質転換体の環境への漏出、製品への混入、または使用後の取り扱い等で、二次的に微生物汚染を引き起こす可能性が危惧する場合には、必要に応じて不活化処理を行うことができる。不活化方法としては、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性または該活性回収率を低下させず、かつ、形質転換体を不活化できる方法であればいかなる方法でも良く、例えば、熱処理、菌体破砕処理、薬剤処理などの方法を単独または組み合わせて利用できる。例えば、菌体破砕処理の前または後に、薬剤処理を行うことで、不活化を行うことができる。使用する薬剤としては、形質転換体の宿主種類により異なるが、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類が挙げられる。また、エタノール等のアルコール類、２−メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン、シトルリン等のアミノ酸類なども挙げられる。薬剤の濃度は、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性または該活性回収率を低下させず、かつ、不活化できる濃度であればよいが、例えば、該形質転換体宿主が大腸菌で塩化ベンゼトニウムおよびグルタルアルデヒドを用いる場合、それぞれ終濃度０．０５〜０．５％程度が好ましい。また、不活化処理の際、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの安定性等を向上させる目的で、例えば、フラボノイド類等を添加してもよい。処理温度は、０〜５０℃、好ましくは０〜４０℃で行われる。また、ｐＨは、４〜８程度が好ましい。
一方、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼが菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、上述したような遠心分離やろ過等により菌体または細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を単独または適宜組み合わせて用いることにより、精製することもできる。
形質転換体が植物細胞または植物組織である場合は、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。その後、必要であれば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー（例えばＳｅｐｈａｄｅｘカラム）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー（例えばｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、陰イオンクロマトグラフィー（例えばＭｏｎｏＱカラム）等）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からヒドロキシニトリルリアーゼを単離精製することができる。
以上のようにして得られた改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、本発明の範囲に含まれる。得られた改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの生産収率は、例えば、培養装置あたり、培養液あたり、菌体湿重量または乾燥重量あたり、酵素液中タンパク質重量あたりなどの単位で、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を測定することにより算出することができるが、特段限定されるものではない。改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ活性は、上述した分解活性または合成活性いずれの値をも適用することができる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの分析手段によっても間接的に算出することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。さらには、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼに対する抗体を作製し、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ法などの免疫学的手法によっても算出することが可能である。
また、本発明においては、上記改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子または改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む組換えベクターから改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを採取することも可能である。すなわち、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを産生することが可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、例えば前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
（ＶＩ）シアンヒドリンの製造方法およびヒドロキシカルボン酸の製造方法
上述のように製造された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ケトン化合物またはアルデヒド化合物、およびシアン化合物に、上述の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを接触させることにより、光学活性なシアンヒドリンを製造することができる。酵素触媒としては、上述のように適当な宿主内で改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、またはその処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の細胞をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
基質として使用されるケトン化合物またはアルデヒド化合物およびシアン化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。例えば、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来のヒドロキシニトリルリアーゼであれば、好適な基質は、アルデヒド化合物とシアン化合物である。アルデヒド化合物としては、ベンズアルデヒドが好ましい。また、シアン化合物としては、青酸が好ましい。
シアンヒドリンの合成反応における金属イオンによる影響は、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼよりもＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの方が少ない。また、ニッケルイオンの存在によっては、シアンヒドリンの合成は影響を受けにくい。
生体触媒の使用形態、反応様式は、生体触媒の種類等により適宜選択される。生体触媒の使用形態としては、上述の培養物、精製酵素をそのまま使用しても良いし、それらを適当な担体に保持し固定化酵素として使用することもできる。
反応方法および反応終了後のシアンヒドリンの採取方法は、基質、酵素触媒の特性により適宜選択される。酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止、リサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
本発明において「光学活性」は、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている物質の状態、またはいずれか一方の鏡像異性体から成っている物質の状態を意味する。
採取された光学活性シアンヒドリンは、さらに硫酸、塩酸等の鉱酸により加水分解反応を実施することによって、光学活性なヒドロキシカルボン酸に変換することも可能である。該加水分解反応は、従来の一般的な方法と同様に鉱酸を用いて実施することが好ましい。ここで用いる鉱酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸、過塩素酸等が挙げられ、中でも塩酸が好ましい。加水分解工程で用いる溶媒は、通常は水を用いるが、必要に応じて、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの極性溶媒、トルエン、ヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素系溶媒、または、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒を共存させても差し支えない。これらの溶媒は単一で用いても混合して用いても構わない。鉱酸の使用量は、加水分解工程に供する反応混合物中に含有される光学活性シアンヒドリンに対して０．５〜２０当量であることが好ましく、０．９〜１０当量であることがより好ましく、１〜５当量が特に好ましい。この範囲内で鉱酸を使用すると、経済的に有利で、かつヒドロキシカルボン酸の回収率が向上する点で好ましい。加水分解工程の反応温度は−５℃〜溶媒の沸点以下が好ましく、１０〜９０℃の範囲が特に好ましい。この温度範囲内であると、加水分解反応の反応速度の点および不純物を低減できるという点から好ましい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】  植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の取得
（１）ＰＣＲによる植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の作製
ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０９１記載の塩基配列を元に、配列番号２によって表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。
具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０（配列番号４〜２３）を設計および合成した。ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０９１記載のキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とその５’および３’非翻訳領域を含む塩基配列（センス鎖）およびその相補配列（アンチセンス鎖）（１，０４１塩基長）に相補的となるように２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０を設計した。ここで、Ｆ０１の５’末端にはＢａｍＨＩを含む１１塩基（斜体で表す）を、Ｒ０１の５’末端にはＫｐｎＩを含む９塩基（斜体で表す）を付加し、最終的にはキャッサバ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む１，０４１塩基対が増幅されるように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、隣のオリゴヌクレオチドと、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した。例えば、Ｆ０１とＦ０２とは、Ｆ０１の下線部とＦ２の下線部とが重なるように設計した。図１に２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０（配列番号４〜２３）の位置関係を模式的に表した。
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凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、１００ｐｍｏｌ／μｌとした。２０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をＰＣＲ−ｍｉｘ（Ｐｗｏ  １０×緩衝液、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に加えた。表３にＰＣＲ反応液の組成を示した。
【表３】
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ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５５サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子を合成した（１ｓｔ  ＰＣＲ）。
次に、上記のように作製した合成遺伝子の増幅を行った（２ｎｄ  ＰＣＲ）。１ｓｔ  ＰＣＲのＰＣＲ溶液Ｂの反応産物１．３μｌに、５μｌのＰｗｏ  １０×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水および１μｌの外側プライマーを添加した。外側プライマーとして、Ｆ０１（配列番号４）およびＲ０１（配列番号１４）のプライマーを用いた。２ｎｄ  ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。
２ｎｄ  ＰＣＲの増幅産物を１．５％アガロースゲルで確認した。
（２）植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子組換えベクターの作製
上記（１）で得られた２ｎｄ  ＰＣＲによる増幅産物である０．９ｋｂのバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。ゲルから精製したＤＮＡ（５μｌ）を制限酵素ＢａｍＨＩ（１μｌ）（オリゴヌクレオチドＦ０１中に消化認識部位が含まれる）およびＫｐｎＩ（１μｌ）（オリゴヌクレオチドＲ０１中に消化認識部位が含まれる）で３７℃、１時間消化した。その後、ＤＮＡを反応液からフェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））］により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、予めＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化しておいたベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ（株））（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作製し、この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることで増幅産物とベクターを結合した。
（３）大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルの作製
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％  ＮａＣｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養した。得られた前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。当該培養物を遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清を除いた。沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え０℃で１０分間放置した。
（４）植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のクローニング
上記（３）で作製したコンピテントセル２００μｌを上記（２）で作製したライゲーション産物１０μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、当該コンピテントセルに４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１ｍｌを添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を各２００μｌずつ、ＬＢ  Ａｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）にまき、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を１．５ｍｌのＬＢ  Ａｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて組換えベクターを回収した。得られた組換えベクターの塩基配列をＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔおよび蛍光シーケンサＣＥＱ  ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて解析した。プライマーは、オリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０を用いた。配列番号２で表されるＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９０９１記載のキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列と同一の配列を有する組換えベクターのひとつをｐＵＭＥと命名した。
【実施例２】  植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現用ベクターの作製
（１）植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現用ベクター（ｐＵＣ１９ベース）の作製。
実施例１で得られた植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列にＳＤ配列を付加したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＵＣ１９をベースとした植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターｐＵＭＥＳＤを以下のようにして作製した。まず、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする修飾ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法により得た。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ  １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った後、７２℃で１０分行った。センスプライマーＭＥＳ−１（配列番号２４）は、その配列中にＰｓｔＩ認識部位、リボソーム結合部位、ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子フレームのＴＡＧ終止コドン、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンを有する６２ヌクレオチドのものである。また、アンチセンスプライマーＭＥＳ−２（配列番号２５）は、その配列中にＢａｍＨＩ部位を有する３８ヌクレオチドのものである。
センスプライマー：
ｃｃｃｃａａａｃｔｇｃａｇｔａａｇｇａｇｇａａｔａｇａａａａｔｇｇｔａａｃｔｇｃａｃａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｇａｔｔｃａｔａｃｃ（配列番号２４）
アンチセンスプライマー：ｔａｇｔｇｃａａｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａｃａｔｇａａａａｔｇｔｇａｇ（配列番号２５）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、その後ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。この精製ＤＮＡ断片（５μｌ）、予めＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩによって消化しておいたｐＵＣ１９（タカラバイオ（株）、日本）（５μｌ）、およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニーより組換えベクターを回収した。植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む修飾ＤＮＡフラグメント（ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片）がｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの下流に正しく挿入されたプラスミドを発現ベクターｐＵＭＥＳＤと命名した。
（２）植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現用ベクター（ｐＫＫ２３３−２ベース）の作製
実施例１で得られたキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片をｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）の誘導体であるｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）のＮｃｏＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、ｐＫＫ２３３−２をベースとした植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターｐＯＸＮ１０３を以下のようにして作製した。まず、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるよう、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ  １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。センスプライマーＯＸＹＮ−６（配列番号２６）は、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を含む。また、アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−９（配列番号２７）は、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む。
ＯＸＹＮ−６：ｃｃａｃｃａｔｇｇｔａａｃｔｇｃａｃａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｇ（配列番号２６）
ＯＸＹＮ−９：ｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｔａａｃｔｔａａｔａｇｇａｇｃｔａａａａｇｃ（配列番号２７）
得られた増幅ＰＣＲ産物は、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化後、ＮｃｏＩによって部分消化した。アガロースゲル電気泳動で分離し、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）のゲルを切り出した。該ゲル中の増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。
次いで、発現用ベクターｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）を以下のように調製した。ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）５μｌをＨｉｎｄＩＩＩ（１μｌ）で消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。次いで、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株））を用いて末端を平滑処理した。該処理液を再度フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。精製した発現ベクター（５μｌ）をＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ（株））を用いて脱リン酸化処理を行った。該処理液を再度エタノール沈殿により精製した。精製したベクターＤＮＡ（５μｌ）、アニーリング済みＳｓｅ８３８７Ｉリン酸化リンカーｐＳｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ（株））（５μｌ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニーより組換えベクターを回収した。回収した組換えベクターに対してＳｓｅ８３８７Ｉ消化反応を行い、直鎖状に消化されることが確認されたものをｐＫＫ２８３−２（＋Ｓｓｅ）とした。ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）を制限酵素ＮｃｏＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。
上述の植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片（５μｌ）と発現ベクターｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）（５μｌ）を混合した。該混合液にｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーより組換えベクターを回収した。植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片が正しく発現ベクターに連結された組換えベクターを確認し、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現組換えベクターｐＯＸＮ１０３と命名した。同時に、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３を得た。
【実施例３】  大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の取得
（１）ＰＣＲによる大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の設計と作製
ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を新規に設計し、いくつかのコドンを大腸菌で良く用いられているコドンに変更した。具体的には、最終的に３０種のオリゴヌクレオチドＮｏ．１〜３０（４９ｎｔが６種、５０ｎｔが２１種、２７ｎｔが２種および４８ｎｔが１種）（配列番号２８〜５７）を設計および合成し、５０ｎｍｏｌスケールで調製した。３０種のオリゴヌクレオチドは、２０ｎｔ重なるように設計した（図２）。
0004956193.tif 000007
0004956193.tif 000008
凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、１００ｐｍｏｌ／μｌとした。３０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をＰＣＲ−ｍｉｘ（Ｐｗｏ  １０×緩衝液、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に下記表４の用量で加えた。
【表４】
0004956193.tif 000009
ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５６サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子を合成した（１ｓｔ  ＰＣＲ）。
次に、上記のように作製した合成遺伝子の増幅を行った（２ｎｄ  ＰＣＲ）。上記のＡまたはＢの反応産物１．３μｌに、５μｌのＰｗｏ  １０×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水および１μｌの外側プライマーを添加した。外側プライマーとして、Ｎｏ．１（配列番号２８）およびＮｏ．３０（配列番号５７）のプライマーを用いた。２ｎｄ  ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。
２ｎｄ  ＰＣＲの増幅産物を１．５％アガロースゲルで解析した。続いて、この０．９ｋｂのバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。ゲルから精製したＤＮＡ（５μｌ）、ベクターｐＴ７  Ｂｌｕｅ（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）、日本））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作り、この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることで増幅産物とベクターを結合した。実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーより組換えベクターを回収した。大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片が正しく発現ベクターに連結された組換えベクターを確認した。
（２）ＤＮＡ塩基配列解析
プラスミド自動分離装置（クラボウ、大阪、日本）をシークエンシング用の二本鎖ＤＮＡの調製に用いた。（１）で得られた形質転換体から精製したプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで処理し、アガロースゲルで制限酵素消化されたＤＮＡの大きさを解析した。０．９ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントを示したプラスミドＮｏ．７８を塩基配列決定のための鋳型ＤＮＡとして用いた。核酸配列解析をＭ１３ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅ  ＩＲＤ８００  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｄｙｅ  Ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ（アロカ（株））でジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法により行った。シークエンシング反応をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））で行い、反応混合物をＤＮＡシークエンサー４０００Ｌ（Ｌｉ−ｃｏｒ、Ｌｉｃｏｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）に流した。プラスミドＮｏ．７８の大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子配列は、目的の遺伝子配列と同一であることを確認した。
【実施例４】  大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現用ベクターの作製
実施例３で得られた大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列にＳＤ配列を付加したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＵＣ１９をベースとした大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターｐＵＭＥＳＤｓｙを以下のようにして作製した。まず、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする修飾ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法により得た。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ  １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてプラスミドＮｏ．７８を１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。センスプライマー（配列番号５８）は、その配列中にＳｐｈＩ認識部位、リボソーム結合部位、ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子フレームのＴＡＧ終止コドン、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンを有する６１ヌクレオチドのものである。また、アンチセンスプライマー（配列番号５９）は、その配列中にＢａｍＨＩ部位を有する３７ヌクレオチドのものである。
センスプライマー：
ｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃｔａａｇｇａｇｇａａｔａｇａａａａｔｇｇｔｇａｃｃｇｃｇｃａｔｔｔｔｇｔｇｃｔｇａｔｔｃａｔａｃｃ（配列番号５８）
アンチセンスプライマー：ａｔｔｔｔａｇｔｇｃａａｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａｃａｔｇａａａａｔｇｔｇａｇ（配列番号５９）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、その後ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。この精製ＤＮＡ断片（５μｌ）、予めＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩによって消化しておいたｐＵＣ１９（タカラバイオ（株）、日本）（５μｌ）、およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニーより組換えベクターを回収した。大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む修飾ＤＮＡフラグメント（ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片）がｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの下流に正しく挿入されたプラスミドを発現ベクターｐＵＭＥＳＤｓｙと命名した。
【実施例５】  第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター、および該ベクターを含むヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体の作製
（１）第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター、および該ベクターを含むヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体の作製（その１）
キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの第２番目のアミノ酸であるバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）に置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を、ＰＣＲによる増幅を行う際に、上述の発現ベクターｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）上のＮｃｏＩ認識部位と連結可能な制限酵素認識部位（兼目的のアミノ酸をコードするコドン）をセンスプライマー中に導入することにより作製した。
ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ  １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。センスプライマーは、以下のものを用いた。
ＯＸＹＮ−３２：ａｇａｃｃａｔｇｇｃ  ｔａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔ（配列番号６０：２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＣＴでアラニンをコードする）
ＯＸＹＮ−３３：ａｇａｃｃａｔｇｇａ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔ（配列番号６１：２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＡＣでアスパラギン酸をコードする）
ＯＸＹＮ−３４：ａｇａｃｃａｔｇｇａ  ａａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔ（配列番号６２：２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＡＡでグルタミン酸をコードする）
ＯＸＹＮ−３５：ａｇａｃｃａｔｇｇｇ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔ（配列番号６３：２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＧＣでグリシンをコードする）
ＯＸＹＮ−１０：ａｔｔｔｃｃａｔｃａ  ｔｇａｔｃａｃｔｇｃ  ａｃａｔｔｔｔｇｔｔ  ｃｔｇ（配列番号６４：３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコードする）
ＯＸＹＮ−３６：ａｇａｔｃａｔｇａｔ  ｇａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号６５：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＧでメチオニンをコードする）
ＯＸＹＮ−３７：ａｇａｔｃａｔｇａｃ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔ（配列番号６６：２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＣＣでスレオニンをコードする）
ＯＸＹＮ−３８：ａｇａｔｃａｔｇａａ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号６７：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＣでアスパラギンをコードする）
ＯＸＹＮ−３９：ａｇａｔｃａｔｇａａ  ａａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号６８：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＡでリジンをコードする）
ＯＸＹＮ−４０：ａｇａｔｃａｔｇａｇ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔ（配列番号６９：２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＧＣでセリンをコードする）
ＯＸＹＮ−４１：ａｇａａｃａｔｇｔｔ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号７０：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｃｉＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＴＴＣでフェニルアラニンをコードする）
ＯＸＹＮ−４２：ａｇａａｃａｔｇｔａ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号７１：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｃｉＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＴＡＣでチロシンをコードする）
ＯＸＹＮ−４３：ａｇａａｃａｔｇｔｇ  ｃａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号７２：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｃｉＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＴＧＣでシステインをコードする）
ＯＸＹＮ−４４：ａｇａａｃａｔｇｔｇ  ｇａｃｔｇｃａｃａｔ  ｔｔｔｇｔｔｃ（配列番号７３：２７ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｃｉＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＴＧＧでトリプトファンをコードする）
また、アンチセンスプライマーは、実施例２の（２）で用いたＯＸＹＮ−０９を用いた。
得られた増幅ＰＣＲ産物は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびグリシン置換体については制限酵素ＮｃｏＩとＳｓｅ８３８７Ｉによって、イソロイシン、メチオニン、スレオニン、アスパラギン、リジンおよびセリン置換体については制限酵素ＢｓｐＨＩとＳｓｅ８３８７Ｉによって、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびトリプトファン置換体については制限酵素ＰｃｉＩとＳｓｅ８３８７Ｉによって、それそれ二重消化を行った。ただし、ＮｃｏＩ消化は部分消化を行った。アガロースゲル電気泳動で分離後、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。精製したヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子ＤＮＡ断片（それぞれ５μｌ）と実施例２の（２）で作製した発現ベクターｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）（５μｌ）をそれぞれ混合し、さらにｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１の（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーより組換えベクターを回収した。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子ＤＮＡ断片が正しく発現ベクターに連結された発現型組換えベクターを確認し、第２番目のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、メチオニン、スレオニン、アスパラギン、リジン、セリン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびトリプトファンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターをそれぞれ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ａ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｄ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｅ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｇ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｍ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｔ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｎ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｋ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｓ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｆ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｙ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＣおよびｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｗと命名した。同時に、各ヒドロキシニトリルリアーゼ形質転換体、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ａ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｄ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｅ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｇ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｍ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｔ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｎ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｓ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｙ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＣおよびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｗを得た。
（２）第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター、および該ベクターを含むヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体の作製（その２）
キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの第２番目のアミノ酸であるバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）およびプロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）に置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子については、実施例２の（２）の方法で作製した野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターｐＯＸＮ１０３を鋳型とし、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）による部位特異的変異導入法により作製した。変異導入用プライマーには以下を用いた。
アルギニン置換体
ＯＸＹＮ−４５：ａａａｃａｇａｃｃａ  ｔｇｃｇｔａｃｔｇｃ  ａｃａｔｔｔｔｇ（配列番号７４：２８ヌクレオチドからなるセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−４６と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコードする）
ＯＸＹＮ−４６：ｃａａａａｔｇｔｇｃ  ａｇｔａｃｇｃａｔｇ  ｇｔｃｔｇｔｔｔ（配列番号７５：２８ヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−４５と相補的な配列を有する）
グルタミン置換体
ＯＸＹＮ−４７：ａａａｃａｇａｃｃａ  ｔｇｃａｇａｃｔｇｃ  ａｃａｔｔｔｔｇ（配列番号７６：２８ヌクレオチドからなるセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−４８と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＡＧでグルタミンをコードする）
ＯＸＹＮ−４８：ｃａａａａｔｇｔｇｃ  ａｇｔｃｔｇｃａｔｇ  ｇｔｃｔｇｔｔｔ（配列番号７７：２８ヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−４７と相補的な配列を有する）
ヒスチジン置換体
ＯＸＹＮ−４９：ａａａｃａｇａｃｃａ  ｔｇｃａｃａｃｔｇｃ  ａｃａｔｔｔｔｇ（配列番号７８：２８ヌクレオチドからなるセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−５０と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＡＣでヒスチジンをコードする）
ＯＸＹＮ−５０：ｃａａａａｔｇｔｇｃ  ａｇｔｇｔｇｃａｔｇ  ｇｔｃｔｇｔｔｔ（配列番号７９：２８ヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−４９と相補的な配列を有する）
ロイシン置換体
ＯＸＹＮ−５１：ａａａｃａｇａｃｃａ  ｔｇｃｔｇａｃｔｇｃ  ａｃａｔｔｔｔｇ（配列番号８０：２８ヌクレオチドからなるセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−５２と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＴＧでロイシンをコードする）
ＯＸＹＮ−５２：ｃａａａａｔｇｔｇｃ  ａｇｔｃａｇｃａｔｇ  ｇｔｃｔｇｔｔｔ（配列番号８１：２８ヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−５１と相補的な配列を有する）
プロリン置換体
ＯＸＹＮ−５３：ａａａｃａｇａｃｃａ  ｔｇｃｃｇａｃｔｇｃ  ａｃａｔｔｔｔｇ（配列番号８２：２８ヌクレオチドからなるセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−５４と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＣＧでプロリンをコードする）
ＯＸＹＮ−５４：ｃａａａａｔｇｔｇｃ  ａｇｔｃｇｇｃａｔｇ  ｇｔｃｔｇｔｔｔ（配列番号８３：２８ヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−５３と相補的な配列を有する）
該キットプロトコールに従い、伸長反応およびＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーよりプラスミドＤＮＡを回収した。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子ＤＮＡ断片が正しく発現ベクターに連結されたプラスミドを確認し、第２番目のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、ロイシンおよびプロリンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターをそれぞれ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｑ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｈ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＬおよびｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｐと命名した。同時に、各ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｈ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＬおよびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０８Ｖ２Ｐを得た。
【実施例６】  第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ形質転換体の発現量評価
（１）細胞抽出液の調製
実施例５の（１）および（２）で作製した第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ形質転換体のうち、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｋ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｎ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｑ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｐ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｔ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｙ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｌ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｍ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｓ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｅ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ａ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｇ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｄを、以下に示す培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）で３７℃で２４時間培養した。
培地組成
ペプトン          １０ｇ／Ｌ
酵母エキス        ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ          １０ｇ／Ｌ
アンピシリン      ５０ｍｇ／Ｌ
ＩＰＴＧ          １ｍＭ（終濃度）
なお、コントロールとして実施例２の（２）で得られた野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター導入した形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３も同様に培養した。
得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の１ｍｌを、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール４、ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ  ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモード１０ｓの条件で氷冷しながら３分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を細胞抽出液全画分として採取した。
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現量の解析
（１）で得られた細胞抽出液全画分を、それぞれ培養液時点での菌濃度換算でＯＤ６３０＝１２．５となるよう、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した各株由来の細胞抽出液全画分を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レーンあたり５μｌずつアプライし、電気泳動分析を行った（図３）。ヒドロキシニトリルリアーゼは約３０ｋＤａのバンドとして観察された（図３中の矢印）。空ベクターのみのＪＭ１０９／ｐＫＫ２３３−２（＋Ｓｓｅ）をバックグラウンドとし、ヒドロキシニトリルリアーゼに相当するバンドの濃度について、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３のバンドと解析比較（解析ソフトＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｖｅｒ４．５（株式会社プラネトロン製）を使用）したところ、表５のような相対値が得られた。第２番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することで発現量が大きく向上する改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを得られることが示された。
第２番目のアミノ酸とホルミルメチオニンプロセッシングの関係やＮ末端則によれば、タンパク質の２番目のアミノ酸残基がバリンである場合とイソロイシンである場合を比較して、タンパク質の安定性に有意な差はないとされている。従って、上述の発現量向上効果は、該関係・法則により説明できるものではなく、まったく新しい原理に起因するものと考えられた。
【表５】
0004956193.tif 000010
【実施例７】  第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ形質転換体の活性評価
実施例５の（１）および（２）で作製した第２番目のアミノ酸が置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ形質転換体のうち、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｋ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｎ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｑを、培養温度３０℃、培養時間２４時間とした以外は実施例６の（１）と同様の方法で培養した。なお、コントロールとして実施例２の（２）で得られた野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ組換えベクターを導入した形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３も同様に培養した。得られた培養液から、実施例６の（１）と同様の方法により細胞抽出液全画分として採取した後、遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液可溶性画分として採取した。得られた細胞抽出液可溶性画分を用い、特表平１１−５０８７７５号公報記載の方法によりヒドロキシニトリルリアーゼ活性を測定した。すなわち、ラセミマンデロニトリルからベンズアルデヒドの生成を追跡することで活性を測定した。酵素溶液５０μｌを、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９００μｌと混合し、基質溶液１００μｌ（３７．５ｍＭラセミマンデロニトリル／１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）を添加して活性測定を開始した。２８０ｎｍでの吸光の増加（対照として酵素非含有基質溶液で測定）を５分間追跡した。１Ｕは上記条件下でラセミマンデロニトリルから１分間あたりベンズアルデヒド１μｍｏｌの変換を触媒する酵素量に相当する。また、バイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド）により、添付プロトコールに従ってタンパク質の定量を行った。その結果、細胞抽出液可溶性画分タンパク質ｍｇあたりの比活性はそれぞれ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｋ由来は２２．７Ｕ／ｍｇタンパク質、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｎ由来は８．１Ｕ／ｍｇタンパク質、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ由来は５．５Ｕ／ｍｇタンパク質、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ由来は７．８Ｕ／ｍｇタンパク質、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｑ由来は４．５Ｕ／ｍｇタンパク質であった。一方、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターを導入した形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３の細胞抽出液可溶性画分タンパク質ｍｇあたりの比活性は、２．７Ｕ／ｍｇタンパク質であった。第２番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することで得られる改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの細胞抽出液タンパク質あたりの比活性は、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターを導入した形質転換体よりも大きく向上していることが確認された。
【実施例８】  Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによるランダム変異の導入とスクリーニング
（１）Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（１回目）
実施例４で作製した大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターｐＵＭＥＳＤｓｙを鋳型としてＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った。
Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの条件として、ＰＣＲ反応液中のＭｇＣｌ２とＭｎＣｌ２量を増やした組成で行った。ＰＣＲ反応溶液の組成を表６に示す。
【表６】
0004956193.tif 000011
上記プライマーの配列は以下のとおりである。
Ｍ１３−ｒｅｖｅｒｓｅ：ａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ    （配列番号８４）
Ｍ１３−ｆｏｒｗａｒｄ：ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ    （配列番号８５）
ＰＣＲの反応条件は以下のとおりである（表７）。
【表７】
0004956193.tif 000012
得られたＰＣＲ産物はＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）でアガロースゲルから抽出した。
増幅したＤＮＡおよびベクターｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ処理をし、電気泳動した。電気泳動後のゲルからそれぞれを抽出により回収し、増幅ＤＮＡとｐＵＣ１９とをライゲーションした。続いて、ライゲーション液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９をトランスフォーメーションして形質転換体を得た。変異体コロニーのマスタープレートを作製し、以下の実験に用いた。
（２）Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲにより得られた変異体のスクリーニング
（１）で得られた変異体の中から、活性上昇したものをスクリーニングした。活性測定は、変異体の培養菌体から調製した細胞抽出液可溶性画分における基質マンデロニトリルの分解活性を、ベンズアルデヒドの生成量を指標にして実施した。
（２−１）サンプル調製
９６−ｗｅｌｌプレートを用いてサンプルを調製した。０．８ｍｌ  ９６−ｗｅｌｌ滅菌プレート（ＡＢｇｅｎｅ社）にＬＢ（８０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ含有）を１５０μｌずつ分注し、変異体コロニーをマスタープレートから植菌した。このプレートをＢｉｏＳｈａｋｅｒ（Ｍ−ＢＲ−０２４、ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて３７℃、１，２００ｒｐｍで１２時間振とう培養した。培養後、培養液を遠心分離し（５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０、ローターＲ６Ｓ、日立社）、集菌した。上清を除き、新聞紙上で逆さにして培地をできる限り除去した後、得られた菌体を１００μｌの０．８５％ＮａＣｌにＢｉｏＳｈａｋｅｒを用いて懸濁した後、懸濁液を９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移した。続いて、遠心分離（４，５００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０、ローターＲ６Ｓ、日立社）により集菌し、上清を除き、新聞紙上で逆さにして水分を除去した。得られた菌体にＬｙｓｏｚｙｍｅ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（卵白由来、生化学工業）、１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を５μｌ添加し、ＴＵＰＬＥ  ＭＩＸＥＲ（スピード７、ＩＷＡＫＩ社）で懸濁した。３７℃で１時間のインキュベートによりＬｙｓｏｚｙｍｅ処理を行い、大腸菌をプロトプラスト化させた。得られた大腸菌に−４０℃および３７℃で凍結融解処理を施し、１００μｌの低張液（１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加して溶菌させた。この溶液を遠心分離（４，５００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０、ローターＲ６Ｓ、日立社）により、大腸菌のゲノムと細胞壁等を沈殿させ、上清を得て粗酵素液として以下の実験に用いた。
あるいは、変異体の形質転換体を培養し、培養菌体をリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、超音波で破砕し、細胞抽出液全画分とした。破砕液を遠心分離後、上清を採取し、細胞抽出液可溶性画分とした。沈殿物を、上清と当量のリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、細胞抽出液不溶性画分とした。
（２−２）活性測定
ヒドロキシニトリルリアーゼの基質であるマンデロニトリルの分解活性をベンズアルデヒドの生成量によって測定した。反応組成を表８に示す。
【表８】
0004956193.tif 000013
活性測定の方法は、９６−ｗｅｌｌ  ＵＶプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社）にＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、２５℃にした。次に粗酵素液を添加し、ピペッティングにより懸濁した。次にｒａｃｅｍｉｃ  ｍａｎｄｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅを添加し、ピペッティングおよび振とうした後、マイクロプレートリーダー（ＧＥＮｉｏｓ、テカン・ジャパン社）を用いて、波長２８０ｎｍにおける吸光値の増加を２５℃で１０分間測定した。解析にはＬＳ−ＰＬＡＴＥｍａｎａｇｅｒ  ２００１（Ｗｉｎ）（和光純薬工業社）を用いた。
（２−３）スクリーニング結果
ポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙまたはＰＣＲの鋳型とした検体、ネガティブコントロールとしてｐＵＣ１９を用いてスクリーニングを行った。具体的には、得られた変異体約５，０００コロニーからポジティブコントロールよりも高活性を示した１１検体を選出した。この１１検体をそれぞれ３ｍＬスケールで培養し、ヒドロキシニトリルリアーゼを発現させた。そして、ベンズアルデヒドからの（Ｓ）−マンデロニトリルの生成を測定することによって合成活性を測定した。標準アッセイ溶液は、最終容量０．９ｍｌ中に３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭベンズアルデヒドおよび１００ｍＭシアン化物溶液を含有する。１００μｌの酵素溶液を添加することによって反応を直ちに開始し、２５℃で１２０分間インキュベートした。９００μｌの有機溶媒（ヘキサン：イソプロパノール＝９：１）にサンプリングした反応液１００μｌを添加して反応を停止させ、遠心（１５，０００×ｇ、１０分、４℃）により得た上清をＨＰＬＣによりアッセイした。各成分の量は、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学社製）を用いてヘキサン：イソプロパノール＝９０：１０を移動相として流量１．０ｍｌ／分で流し、カラム温度は３０℃に設定、２５４ｎｍで測定し、それらの標準曲線を用いて算出した。標準的アッセイ条件下でベンズアルデヒドから、１分あたり１μｍｏｌのＳ−マンデロニトリルを生成する酵素の量を酵素活性の１単位を定義した。
測定の結果、ポジティブコントロールよりも著しく高活性であった検体を選出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可溶性画分の収率確認を行い、さらにＤＮＡシーケンス解析により変異の導入を確認した。
１１検体中で最も高活性を示した検体はｐＵＭＥＳＤｓｙの約１０倍の合成活性（６３．３Ｕ／ｍｌ）であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、発現したヒドロキシニトリルリアーゼのほとんどが可溶性画分に存在していた（表９および図４）。シーケンス解析により、Ｈｉｓ１０３→Ｌｅｕ１０３への１アミノ酸置換によることが確認された。得られた変異体プラスミドをｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌとした。
（３）Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによるランダム変異（２回目）
上記（２）で得られたｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌを鋳型として、再度ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った。１回目のＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの鋳型に用いたｐＵＭＥＳＤｓｙ、得られた変異体クローンｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌ、およびｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌを鋳型に用いた２回目のＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲで得られたランダム変異体クローン１９−Ｅ８、３６−Ｅ１０のヒドロキシニトリルリアーゼ合成活性（Ｕ／ｍｌ）を表９に示す。
【表９】
0004956193.tif 000014
ｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌを鋳型にしたＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの結果、クローン１９−Ｅ８では更なる活性上昇（表９）と可溶性画分の収率増加（図４）が認められた。シーケンス解析の結果、クローン１９−Ｅ８にはＨｉｓ１０３（ｃａｔ）→Ｌｅｕ（ｃｔｔ）、Ｐｈｅ１２５（ｔｔｔ）→Ｌｅｕ（ｃｔｔ）、Ｔｈｒ１４６（ａｃｃ）→Ｔｈｒ（ａｃａ）の変異（２アミノ酸置換、３塩基変異）が導入されていた。また、鋳型よりも活性上昇が認められなかったクローン３６−Ｅ１０には、Ｈｉｓ１０３（ｃａｔ）→Ｌｅｕ（ｃｔｔ）、Ｔｈｒ２０５（ａｃｃ）→Ｓｅｒ（ｔｃｃ）、Ａｓｐ２３５（ｇａｔ）→Ｇｌｙ（ｇｇｔ）の変異（３アミノ酸置換、３塩基変異）が導入されていた。
【実施例９】  野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子へのＨ１０３Ｌ置換
実施例２（１）で作製した植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＵＭＥＳＤに対して、第１０３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）がロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）となるように置換し、ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌを構築した。この部位特異的変異導入はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて行った。
ＰＣＲの反応条件を表１０に示す。
【表１０】
0004956193.tif 000015
上記プライマー（５’−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は以下のとおりである。
ＯＸＹＮ−３０：ｇｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇａａｔｔｃｃｔｔａｔｔｇｃｃ（配列番号８６）
上記プライマー（３’−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は以下のとおりである。
ＯＸＹＮ−３１：ｇｇｃａａｔａａｇｇａａｔｔｃａｇｇａａａａｃａｃｃａｇｃ（配列番号８７）
ＯＸＹＮ−３０（配列番号８６）は、２９ヌクレオチドからなるセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−３１と相補的な配列を有し、第１０３番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＴＧでロイシンをコードする。また、ＯＸＹＮ−３１（配列番号８７）は、２９ヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーであり、ＯＸＹＮ−３０と相補的な配列を有する。
ＰＣＲの反応条件は以下のとおりである（表１１）。
【表１１】
0004956193.tif 000016
ｐＵＭＥＳＤにＨ１０３Ｌ変異を導入するために、上記のプライマー（ＯＸＹＮ−３０とＯＸＹＮ−３１）を使用してＰＣＲによる部位特異的変異（１アミノ酸置換）を行った。ＰＣＲの反応液５０μｌにＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７度で１時間インキュベートした。この処理によって、鋳型ＤＮＡを消化し、変異の入ったプラスミドのみを得た。ＤｐｎＩ処理後のＰＣＲ反応液で、実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニーより組換えベクターを回収した。植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子にＨ１０３Ｌ変異が導入されているものをｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌと命名した。
実施例８で得られたｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３Ｌのヒドロキシニトリルリアーゼ活性と上記ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌのヒドロキシニトリルリアーゼ活性（合成活性）を比較した。ヒドロキシニトリルリアーゼ合成活性の測定は実施例８の方法に準じて行った。培養は、培養開始と同時に最終濃度で０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、３７℃で１２時間行い、菌体を回収した。
大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを有するプラスミドｐＵＭＥＳＤｓｙ、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼを有するプラスミドｐＵＭＥＳＤ、並びにこれらの２つのプラスミドを鋳型としてＨ１０３Ｌ置換をして得られたプラスミドｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３ＬとｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌの４検体におけるヒドロキシニトリルリアーゼ合成活性（Ｕ／ｍｌ）を表１２に示す。その結果、大腸菌コドンの場合と同様に、植物コドンのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＨ１０３Ｌ置換体（ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌ）では、酵素活性の上昇（表１２）と可溶性画分の収率増加（図５）が認められた。
【表１２】
0004956193.tif 000017
【実施例１０】  大腸菌コドンおよび植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＨ１０３残基への全アミノ酸置換
（１）Ｈ１０３残基置換体の作製
第１０３番目のアミノ酸残基を２０必須アミノ酸に変異させるランダムプライマーを大腸菌コドンおよび植物コドンの両野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子において設計し、変異体を作製した。ＰＣＲの反応条件を表１３に示す。
【表１３】
0004956193.tif 000018
上記プライマー（５’−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は以下のとおりである。
Ｈ１０３−２０ａａ−Ｆ：ｇｇｃｇｇｇｃｇｔｔｔｔｔｎｎｓａａｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｃｃ  （配列番号８８、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子増幅用）
ＭＥ−Ｈ１０３−２０ａａ−Ｆ：ｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔｃｎｎｓａａｔｔｃｃｔｔａｔｔｇｃｃａｇａｃａｃｃｇ  （配列番号８９、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子増幅用）
上記プライマー（３’−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は以下のとおりである。
Ｈ１０３−２０ａａ−Ｒ：ｇｇｃａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｓｎｎａａａａａｃｇｃｃｃｇｃｃ  （配列番号９０、大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子増幅用）
ＭＥ−Ｈ１０３−２０ａａ−Ｒ：ｃｇｇｔｇｔｃｔｇｇｃａａｔａａｇｇａａｔｔｓｎｎｇａａａａｃａｃｃａｇｃｔｇｃ  （配列番号９１、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子増幅用）
上記プライマー配列中、ｎはａ，ｔ，ｇまたはｃである。
ＰＣＲの反応条件は以下のとおりである（表１４）。
【表１４】
0004956193.tif 000019
実施例９と同様の方法により、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた部位特異的変異導入により、Ｈ１０３残基における２０アミノ酸置換体の構築を次のように行った。ｐＵＭＥＳＤｓｙとｐＵＭＥＳＤのＨ１０３残基に２０アミノ酸置換を導入するために、プライマー（上記のＨ１０３−２０ａａ−ＦとＨ１０３−２０ａａ−Ｒの組合せ、およびＭＥ−Ｈ１０３−２０ａａ−ＦとＭＥ−Ｈ１０３−２０ａａ−Ｒの組合せ）を使用してＰＣＲによる部位特異的変異（１アミノ酸置換）を行った。ＰＣＲの反応液５０μｌにＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７度で１時間インキュベートした。この処理によって、鋳型ＤＮＡを消化し、変異の入ったプラスミドのみを得た。ＤｐｎＩ処理後のＰＣＲ反応液で、大腸菌ＪＭ１０９をトランスフォーメーションした。コロニーを０．８ｍＬ  ９６−ｗｅｌｌ滅菌プレート（Ａｂｇｅｎｅ社）にランダムに植菌し、ＩＰＴＧ誘導を行い、実施例８（２−１）に記載の方法に従って酵素液を調製した。続いて、実施例８（２−２）と同様、マイクロプレートリーダーにより、分解活性を測定した。９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用いた活性測定を行う際には、コントロールとして、鋳型であるｐＵＭＥＳＤｓｙおよびｐＵＭＥＳＤと、高活性変異体であるｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３ＬおよびｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌを用いた。解析にはＬＳ−ＰＬＡＴＥｍａｎａｇｅｒ２００１（Ｗｉｎ）（和光純薬工業社）を用いた。得られたコロニーからプラスミドを抽出精製後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いたＤＮＡシーケンス解析により配列を確認した。
（２）結果
上述したランダムプライマーを用いた部位特異的変異によって、ｐＵＭＥＳＤｓｙとｐＵＭＥＳＤのＨ１０３残基にランダムにアミノ酸置換を導入した。ＤＮＡシーケンス解析によってＨ１０３残基が２０アミノ酸に置換した計４０種類の変異体を取得することができた。各アミノ酸置換体における１０３残基のコドンを表１５に示す。
【表１５】
0004956193.tif 000020
得られた変異体の形質転換体である、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３−２０ａａおよび大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３−２０ａａ（「−２０ａａ」にはアミノ酸の一文字表記が入り、Ｈ１０３置換後のアミノ酸を表す。例えば、ロイシン置換体であれば、ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｌである。）をＬＢ＋Ａｍｐ（８０μｇ／ｍｌ）培地で３７℃で培養し、培養開始と同時に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。３７℃で１２時間培養し、ヒドロキシニトリルリアーゼを大量発現させた。１２時間後、培養液を２．４ｍｌずつ集菌し、生理食塩水で洗浄した後、８００μｌの１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体反応により合成活性測定を行った。大腸菌コドンの結果を図６（Ａ）に、植物コドンの結果を図６（Ｂ）にそれぞれ示す。Ｈ１０３Ｌのほか、Ｈ１０３Ａ、Ｈ１０３Ｖ、Ｈ１０３Ｉ、Ｈ１０３Ｍ、Ｈ１０３Ｓ、Ｈ１０３Ｔ、Ｈ１０３Ｃ、Ｈ１０３Ｗ、Ｈ１０３Ｑにおいて野生型よりも高い活性が確認された。両コドンでの結果がほぼ一致していることから、Ｈ１０３変異の効果はコドンの種類によらないものであることが確認された。
【実施例１１】  第２番目と第１０３番目のアミノ酸が置換された複合改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体の作製
実施例２（２）で作製したｐＯＸＮ１０３、および実施例５（１）で作製したｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉをもとに、さらに１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）がロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）に置換された変異体を実施例９と同様の方法により、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて作製した。変異導入用プライマーには実施例９で用いたＯＸＹＮ−３０（配列番号８６）およびＯＸＹＮ−３１（配列番号８７）を用いた。
当該キットのプロトコールに従い、ＰＣＲ反応およびＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーよりプラスミドＤＮＡを回収した。第１０３番目のアミノ酸がロイシンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターを、ｐＯＸＮ１０３Ｈ１０３Ｌ（ｐＯＸＮ１０３にＨ１０３Ｌ変異導入）およびｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌ（ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＩにＨ１０３Ｌ変異導入）と命名した。
【実施例１２】  第２番目および第１０３番目のアミノ酸が置換された複合改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現組換え体の評価
（１）実験方法
（１−１）使用プラスミドおよび使用菌株
実施例２（２）で得られたｐＯＸＮ１０３（植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター）、実施例５（１）で得られたｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ（植物コドンＶ２Ｉヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター）、実施例１１で得られたｐＯＸＮ１０３Ｈ１０３Ｌ（植物コドンＨ１０３Ｌヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター）およびｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌ（植物コドンＶ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクター）により、実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９およびＣ６００株の形質転換を行い、それぞれＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｈ１０３Ｌ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌ、Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＩおよびＣ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌを得た。
（１−２）培養条件
（１−２−１）フラスコ培養評価
形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｈ１０３Ｌ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３ＬのコロニーをＬＢＡｍｐ培地（ＩＰＴＧ０または１ｍＭ含有）１００ｍｌ（５００ｍｌフラスコ）で、３０℃または３７℃で振盪（２１０ｒｐｍ）することにより、フラスコ培養を行った。
（１−２−２）ジャー培養評価
形質転換体Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌのコロニーを、以下に示す培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）で３０℃で１２時間前培養を行った。
前培養培地組成（ｐＨ７．２）：
ポリペプトンＮ（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．５ｇ／Ｌ）、アンピシリン（０．１ｇ／Ｌ）
回転数は２１０ｒｐｍで行った。
得られた前培養液２０ｍｌを以下に示す本培養培地（３Ｌジャーファーメンター中の２Ｌ）に植菌し、３７℃または２５℃で２０〜５２時間本培養を行った。
本培養培地組成
ポリペプトンＮ                ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス                      ５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                １．５ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．５ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ        ０．２ｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．０２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ      ０．０２ｇ／Ｌ
プルロニック  Ｌ−６１      ０．５ｇ／Ｌ
フルクトース                  ４０ｇ／Ｌ
アンピシリン                ０．１ｇ／Ｌ
回転数は７５０ｒｐｍ、空気流量は２Ｌ／ｍｉｎ、内圧は常圧、ｐＨは６．８−７．２制御（３Ｎ  ＮａＯＨと５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４使用）で行った。培養の途中、適時サンプリングを行い、菌濃度（ＯＤ６３０）の測定、およびヒドロキシニトリルリアーゼ分解活性測定を行った。
（１−３）サンプル調製
分解活性測定は以下のように行った。サンプリングした培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、得られた菌体を１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）またはリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄した後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の１ｍｌを、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール４、ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ  ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモード１０ｓの条件で氷冷しながら３分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を細胞抽出液全画分として採取した。破砕液を遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）し、得られた上清を細胞抽出液可溶性画分として採取した。沈殿物を、上清と等量のリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、細胞抽出液不溶性画分とした。
（１−４）活性測定
得られた細胞抽出液可溶性画分を用い、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を測定した。すなわち、基質であるラセミマンデロニトリルの分解活性（＝ベンズアルデヒドの生成）を光学的に検出（波長２８０ｎｍ）して追跡することで活性を算出した。
酵素溶液５０μｌを、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９００μｌと混合し、基質溶液１００μｌ（毎回新たに調製される３７．５ｍＭラセミマンデロニトリル／１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５））を添加して活性測定を開始した。２８０ｎｍでの吸光の増加（対照として酵素非含有基質溶液で測定）を５分間追跡した。１Ｕは上記条件下でラセミマンデロニトリルから１分間あたりベンズアルデヒド１μｍｏｌの変換を触媒する酵素量に相当する。
（１−５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１０％ポリアクリルアミドゲル（ＡＡ：Ｂｉｓ＝３８：２）、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎ泳動用緩衝液を用いて行った。
（２）２番目および１０３番目のアミノ酸変異体導入組換え体のフラスコ培養評価
上記（１−１）で得られたＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｈ１０３Ｌ、ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌについて、３０℃および３７℃でフラスコ培養を行った。培養は、１ｍＭ（終濃度）のＩＰＴＧを添加した１００ｍｌのＬＢ  Ａｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）を用い、回転数２１０ｒｐｍで行った。細胞抽出液各画分をＯＤ１２．５にあわせてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、可溶性画分の分解活性測定を行った。結果を図７に示す。野生型（ｐＯＸＮ１０３）にＨ１０３Ｌ変異のみを導入した場合（ｐＯＸＮ１０３  Ｈ１０３Ｌ）、３０℃での総タンパク質あたりの比活性は大きく変わらなかったが、３７℃では約４倍に向上した（図７；１．１５→４．１２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。可溶性酵素割合の増加と同時に、発現量自体の向上も寄与していることが確認された。
さらに、１０３番目のアミノ酸変異Ｈ１０３Ｌと２番目のアミノ酸変異Ｖ２Ｉ（ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ）とを組み合わせると（ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌ）、３０℃での比活性は約２倍に（図７；４．１８→８．１７Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、３７℃では約１０倍に比活性が向上した（図７；１．５５→１４．４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
（３）２番目および１０３番目のアミノ酸変異体導入組換え体のジャー培養評価
ｐＯＸＮ１０３Ｖ２ＩおよびｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌによる大腸菌Ｃ６００株形質転換体を用いて、３Ｌジャーファーメンターによる培養を行った。
培養結果を図８に示す。Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉを３７℃で培養すると、活性（比活性、液活性）をほとんど発現しないが、Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌはその約１０倍の活性（比活性、液活性）を示した。ここで、比活性（Ｕ／ｍｇＤＣ）は、菌体懸濁液１ｍｌあたりの分解活性を測定し、菌体懸濁液の菌濃度ＯＤ６３０から算出（係数を０．４とした）した乾燥菌体ｍｇ重量濃度（ｍｇＤＣ／ｍｌ）で除することで算出した。さらに、培養液あたりの液活性（Ｕ／ｍｌ）は、比活性（Ｕ／ｍｇＤＣ）と培養液の菌濃度（ｍｇＤＣ／ｍｌ；菌濃度ＯＤ６３０から係数を０．４として算出）とを乗することにより求めた。Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉを２５℃で５０時間以上培養した後に到達する活性（比活性、液活性）に、Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌでは半分以下の培養２０時間（３７℃）で達成した。
また、フラスコレベルでの結果以上に、Ｃ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌでは可溶性画分の割合が増加していることが認められた（図８；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
本実施例から、第１０３番目のアミノ酸変異（Ｈ１０３Ｌ）を植物コドンヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子に導入した結果、大腸菌コドンの場合と同様、３７℃培養における活性向上が確認された。そして、植物コドンＶ２Ｉ＋Ｈ１０３Ｌ形質転換体について、３Ｌジャーファーメンターを用いて３７℃にて培養を行ったところ、コントロール（植物コドンＶ２Ｉ）３７℃培養の１０倍以上の活性が得られ、第２番目のアミノ酸変異と第１０３番目のアミノ酸変異とを組み合わせることにより相乗的な活性向上効果をもたらすことが確認された。
【実施例１３】  Ｈ１０３残基におけるコドンの影響
同じアミノ酸をコードしているコドンの中には、高発現遺伝子で最も使用頻度の高いコドンと全ての遺伝子で最も使用頻度の高いコドンとがある。高発現遺伝子は、例えば、多くの大腸菌において発現量の高い遺伝子をいう。実施例４において作製したｐＵＭＥＳＤｓｙは後者のコドンを用いて合成したものである。そこで、Ｈ１０３残基のコドンが、Ｈｉｓに対応する２種類のコドン（ｃａｔとｃａｃ）のそれぞれの株を取得し、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性と発現量を調べた。
（１）置換体の作製
第１０３番目ＨｉｓをコードするコドンにおけるランダムプライマーをｐＵＭＥＳＤｓｙ上に設計し、変異体を作製した。ＰＣＲの反応条件を表１６に示す。
【表１６】
0004956193.tif 000021
上記プライマー（５’−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は以下のとおりである。
Ｈ１０３−２０ａａ−Ｆ：ｇｇｃｇｇｇｃｇｔｔｔｔｔｎｎｓａａｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｃｃ  （配列番号８８）
上記プライマー（３’−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は以下のとおりである。
Ｈ１０３−２０ａａ−Ｒ：ｇｇｃａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｓｎｎａａａａａｃｇｃｃｃｇｃｃ  （配列番号９０）
両プライマー配列中、ｎは（ａ，ｔ，ｇまたはｃ）、ｓは（ｇまたはｃ）である。
ＰＣＲの反応条件は以下のとおりである（表１７）。
【表１７】
0004956193.tif 000022
上記反応条件により、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて部位特異的変異を導入した。ＰＣＲ反応液にＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７℃で１時間処理した。ＤｐｎＩ処理後のＰＣＲ反応液で、大腸菌ＪＭ１０９をトランスフォーメーションした。コロニーからプラスミドを抽出し、精製した後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いたＤＮＡシーケンス解析を行い、ｐＵＭＥＳＤｓｙのＨ１０３のコドンがｃａｔのものとｃａｃのものを取得した。滅菌試験管に３ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（８０μｇ／ｍｌ）を入れ、ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ（Ｈ１０３ｃａｃ）とＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ（Ｈ１０３ｃａｔ）のコロニーをそれぞれ懸濁し、３７度で終夜振とう培養した（前培養）。続いて、滅菌試験管にＬＢ＋Ａｍｐ（８０μｇ／ｍｌ）＋ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を入れ、各前培養液を１％シードし、３７℃で終夜振とう培養した（本培養）。１２時間後、１．５ｍｌの培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ、日立社）により集菌し、得られた菌体を０．８５％ＮａＣｌで洗浄した。得られた菌体を５００μｌの１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体反応を行い、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学社製）を用いたＨＰＬＣ分析により活性を測定した。また、得られた菌体の一部を超音波破砕後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ、日立社）した上清を可溶性画分として得た。さらに、この沈殿に８Ｍ  Ｕｒｅａ（ｉｎ  １０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０））を菌体破砕した酵素液の１０分の１量添加し、懸濁した後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ、日立社）により得られた上清を不溶性画分として得た。可溶性画分を用いて活性測定を行い、可溶性および不溶性両画分を用いてタンパク質定量とＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
（２）異なるコドンによる影響
ｐＵＭＥＳＤｓｙのＨ１０３残基の塩基において、Ｈｉｓに対応した二つのコドン（ｃａｔとｃａｃ）に変換した。ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３（ｃａｔ）とＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｈ１０３（ｃａｃ）とをＬＢ＋Ａｍｐ（８０μｇ／ｍｌ）で３７℃で培養して、培養開始と同時に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。３７℃で１２時間培養し、ヒドロキシニトリルリアーゼを大量発現させた。１２時間後、培養液を１．５ｍｌずつ集菌し、生理食塩水で洗浄後、５００μｌの１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波による菌体破砕を行った。破砕液を低速遠心分離し、得られた上清を可溶性画分（ｓｏｌｕｂｌｅ）として、活性測定とタンパク質定量に使用した。沈殿を８Ｍ  Ｕｒｅａに溶解後、低速遠心分離で得られた上清を不溶性画分（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）としてタンパク質定量に使用した。定量した値から、それぞれ１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。
結果を表１８と図９に示す。
【表１８】
0004956193.tif 000023
大腸菌高発現遺伝子で使用頻度の高いコドン（ｃａｃ）と、大腸菌全ての遺伝子で使用頻度の高いコドン（ｃａｔ）とをＨ１０３に用いた株において、その活性（表１８）および発現量（図９）に顕著な差は認められなかった。従って、当該二つのコドン間においては活性と発現量に対して影響はほとんど無いと考えられた。
【実施例１４】Ｈ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの精製と諸性質の確認
（１）野生型ヒドロキシニトリルリアーゼおよびＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの精製
実施例２の（１）で得られたＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤおよび実施例１０の（２）で得られたＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｍを培養し、それぞれの菌体より野生型ヒドロキシニトリルリアーゼおよびＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの精製を行った。
（１−１）培養と集菌
滅菌試験管に３ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（８０μｇ／ｍｌ）を入れ、ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤおよびＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｍのコロニーを懸濁し、３７度で終夜振とう培養した（前培養）。
得られた各前培養液を以下に示す培地に１％シードした。
培地組成
ペプトン          １０ｇ／Ｌ
酵母エキス        ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ          １０ｇ／Ｌ
アンピシリン      ８０ｍｇ／Ｌ
ＩＰＴＧ          ０．１ｍＭ（終濃度）
ここで、培地液量は、ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤは計１０Ｌ、ＪＭ１０９／ｐＵＭＥＳＤ−Ｈ１０３Ｍは計２Ｌとした。３７℃で１２時間培養後（本培養）、培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により集菌した。得られた菌体は、０．７％ＮａＣｌで懸濁洗浄後、再度遠心分離により集菌した。この洗浄操作を計２回行った後、菌体を、菌体湿重量の５倍量のｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、これを菌体懸濁液とした。
（１−２）菌体破砕
超音波破砕機（Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ２０１Ｍ（９ｋＨｚ、久保田商事））を用いて、菌体懸濁液の超音波破砕をおこなった。破砕時間は２０ｍｉｎ行い、破砕後は、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により上清と沈殿に分離した。得られた沈殿をｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、再度超音波破砕を行った。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）を行い、その上清（細胞抽出液）を得た。
（１−３）熱処理
（１−２）で得られた細胞抽出液を三角フラスコに移し、ウォーターバスを用いて、６０℃、１０ｍｉｎの熱処理に供した。熱処理後、氷水にて急冷し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により変性タンパクを除去し、粗酵素液を得た。
（１−４）硫安分画
（１−３）で得られた粗酵素液を４５％硫安飽和させ、３０ｍｉｎ攪拌した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）により得られた沈殿を０−４５％画分とし、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に溶解した。続いて、上清を６５％硫安飽和させ、３０ｍｉｎ攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）により得られた沈殿を４５−６５％画分とし、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に溶解した。さらに、上清を９０％硫安飽和させ、３０ｍｉｎ攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）により得られた沈殿を６５−９０％画分とし、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に溶解した。溶解した各画分のタンパク液を１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）により透析した後、それぞれの画分の活性測定とタンパク定量を行った。活性測定は実施例８の（２−３）と同様に行い、タンパク定量はバイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド）を用い、添付プロトコールに従って行った。
（１−５）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｒｅｓｉｎをカラムに充填し、洗浄後、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化し、（１−４）で得られた透析後の酵素溶液をアプライした。１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で洗浄後、直線的な濃度勾配の０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）により溶出した。溶出後の活性画分を集め、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で透析後、次ステップに用いた。
（１−６）Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
（１−５）で得られた活性画分を３０％硫安飽和にした後、予め３０％硫安飽和１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにアプライした。３０％硫安飽和１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．ｐ）で洗浄後、直線的な濃度勾配の３０〜０％硫安飽和１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で溶出した。溶出後の活性画分を集め、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で透析後、次ステップに用いた。
（１−７）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラムクロマトグラフィー
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラムを、脱気したｍｉｌｌｉＱ水で洗浄した後、０．２Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化し、（１−６）で得られた透析後の酵素溶液をアプライした。０．２Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で溶出を行い、溶出した活性画分を集め、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で透析後、次ステップに用いた。
（１−８）ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／３０
ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／３０を、脱気したｍｉｌｌｉＱ水で洗浄した後、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化し、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で洗浄した後、（１−７）で得られた透析後の酵素溶液をアプライした。直線的な濃度勾配の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で溶出を行い、溶出した活性画分を集め、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で透析した。
（１−９）精製結果
Ｈ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの精製結果を表１９に示す。上記ステップにより最終的に９倍以上の純度にＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを精製することができた。
【表１９】
0004956193.tif 000024
精製した野生型ヒドロキシニトリルリアーゼおよびＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。後述するように、両酵素についてタンパク質あたりの比活性を求め、１レーンあたり０．３Ｕをアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図１０に示す。両酵素とも単一バンドにまで精製されていることが確認された。また、Ｈ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼのバンドが野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのそれよりも薄く観察されたことから、Ｈ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼに比して、酵素タンパク質あたりの比活性が向上していることが示唆された。実際に、両酵素の酵素タンパク質あたりの比活性を求めた結果、表２０に示すように、Ｈ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、酵素タンパク質あたりの比活性が、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼの約１．５倍にまで向上していることが確認された。
【表２０】
0004956193.tif 000025
（２）反応系におけるキレート剤および金属添加の活性への影響
実施例１４の（１）で得られた野生型ヒドロキシニトリルリアーゼおよびＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ精製酵素を用い、マンデロニトリル合成反応系中に、終濃度１ｍＭまたは１０ｍＭのキレート剤（ＥＤＴＡ）および各種金属（ＣｏＣｌ２、ＮｉＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ）を添加し、合成活性への影響を調べた。表２１に示す反応液組成によりマンデロニトリル合成反応を行い、実施例８の（２−３）と同様に活性測定を行った。
【表２１】
0004956193.tif 000026
結果を表２２に示す。表２２は、いずれの添加物も添加していない反応系での活性を１００％とした際の相対活性を示し、各添加物の欄において、上段は１ｍＭ添加時、下段は１０ｍＭ添加時の相対活性を示す。ＥＤＴＡおよびＮｉＳＯ４を１ｍＭ添加した場合、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼおよびＨ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼとも大きな活性低下は見られず、両酵素間での差も少なかった。一方、それ以外の金属（ＣｏＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ））を添加した場合、特に反応液中に１０ｍＭ添加した場合に、比較的大きな活性低下が見られた。その活性低下率は金属によって異なったが、ここで、Ｈ１０３Ｍ改良型ヒドロキシニトリルリアーゼは、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼよりも活性低下率が低いことが確認された。すなわち、Ｈ１０３Ｍ変異により金属に対する影響を受け難くなっていることが確認された。
【表２２】
0004956193.tif 000027
【実施例１５】  リジン残基単置換変異を有する改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの作製と評価
（１）リジン残基への部位特異単置換変異導入
実施例４で作製した大腸菌コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＵＭＥＳＤｓｙを鋳型として用い、第１７６番目、第１９９番目または第２２４番目のリジン残基がそれぞれ他のアミノ酸に置換された改良型ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする大腸菌コドン改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を部位特異的変異導入により作製した。この部位特異的変異導入はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用い、第１７６番目、第１９９番目または第２２４番目のアミノ酸がランダムに変異するような変異導入プライマーを用いて行った。
ＰＣＲの反応条件を表２３に示す。
【表２３】
0004956193.tif 000028
上記プライマーのうち５’−ｐｒｉｍｅｒの配列は以下のとおりである。
第１７６番目変異体の場合
Ｋ１７６−Ｆ：ｃｔｇｇｃｇａａａａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｃｎｎｓｇｇｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｇａａｃｇｔｇｃ  （配列番号９２）
第１９９番目変異体の場合
Ｋ１９９−Ｆ：ｃｇａａａａａｇｇｃｔａｔｇｇｃａｇｃａｔｔｎｎｓａａａｇｔｇｔａｔａｔｔｔｇｇａｃｃｇａｔｃａｇｇ  （配列番号９８）
第２２４番目変異体の場合
Ｋ２２４−Ｆ：ｇｃｇｃｔｇｇｃａｇａｔｔｇｃｇａａｃｔａｔｎｎｎｃｃｇｇａｔａａａｇｔｇｔａｔｃａｇｇ  （配列番号９４）
上記プライマーのうち３’−ｐｒｉｍｅｒの配列は以下のとおりである。
第１７６番目変異体の場合
Ｋ１７６−Ｒ：ｇｃａｃｇｔｔｃｔｇａａａｃａｇｇｃｔｇｃｃｓｎｎｇｃｇｃａｔｃａｃｃａｔｔｔｔｃｇｃｃａｇ  （配列番号９５）
第１９９番目変異体の場合
Ｋ１９９−Ｒ：ｃｃｔｇａｔｃｇｇｔｃｃａａａｔａｔａｃａｃｔｔｔｓｎｎａａｔｇｃｔｇｃｃａｔａｇｃｃｔｔｔｔｔ  （配列番号９６）
第２２４番目変異体の場合
Ｋ２２４−Ｒ：ｃｃｔｇａｔａｃａｃｔｔｔａｔｃｃｇｇｎｎｎａｔａｇｔｔｃｇｃａａｔｃｔｇｃｃａｇｃｇｃ  （配列番号９７）
上記プライマー配列中、ｎは（ａ，ｔ，ｇまたはｃ）、ｓは（ｇまたはｃ）である。
ＰＣＲの反応条件は以下のとおりである（表２４）。
【表２４】
0004956193.tif 000029
ＰＣＲの反応液５０μｌにＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７度で１時間インキュベートした。この処理によって、鋳型ＤＮＡを消化し、変異の入ったプラスミドのみを得た。ＤｐｎＩ処理後のＰＣＲ反応液で、実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。変異体コロニーのマスタープレートを作製し、以下の活性上昇スクリーニング実験に用いた。
（２）変異体のスクリーニング
（１）で得られた変異体の中から、活性上昇しなものをスクリーニングした。
（２−１）一次スクリーニング
９６−ｗｅｌｌプレートを用いてサンプルを調製した。０．８ｍｌ  ９６−ｗｅｌｌ滅菌プレート（Ａｂｇｅｎｅ社）にＬＢ（８０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ含有）を１５０μｌずつ分注し、変異体コロニーをマスタープレートから植菌した。このプレートをＢｉｏＳｈａｋｅｒ（Ｍ−ＢＲ−０２４、ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて３７℃、１，２００ｒｐｍで１２時間振とう培養した。培養後、培養液を遠心分離し（５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０、ローターＲ６Ｓ、日立社）、集菌した。上清を除き、新聞紙上で逆さにして培地をできる限り除去した後、得られた菌体を１００μｌの０．８５％ＮａＣｌにＢｉｏＳｈａｋｅｒを用いて懸濁した後、懸濁液を９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移した。続いて、遠心分離（４，５００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０、ローターＲ６Ｓ、日立社）により集菌し、上清を除き、新聞紙上で逆さにして水分を除去した。得られた菌体にＬｙｓｏｚｙｍｅ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（卵白由来、生化学工業）、１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ＴＵＰＬＥ  ＭＩＸＥＲ（スピード７、ＩＷＡＫＩ社）で懸濁した。３７℃で１時間のインキュベートによりＬｙｓｏｚｙｍｅ処理を行い、大腸菌をプロトプラスト化させた。得られた大腸菌に−４０℃および３７℃で凍結融解処理を施し、１００μｌの低張液（１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加して溶菌させた。この溶液を遠心分離（４，５００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０、ローターＲ６Ｓ、日立社）により、大腸菌のゲノムと細胞壁等を沈殿させ、上清を得て粗酵素液として以下の活性測定に用いた。
ヒドロキシニトリルリアーゼの基質であるマンデロニトリルの分解活性をベンズアルデヒドの生成量によって測定した。反応組成を表２５に示す。
【表２５】
0004956193.tif 000030
活性測定の方法は、９６−ｗｅｌｌ  ＵＶプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社）にＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、２５℃にした。次に粗酵素液を添加し、ピペッティングにより懸濁した。次にｒａｃｅｍｉｃ  ｍａｎｄｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅを添加し、ピペッティングおよび振とうした後、マイクロプレートリーダー（ＧＥＮｉｏｓ、テカン・ジャパン社）を用いて、波長２８０ｎｍにおける吸光値の増加を２５℃で１０分間測定した。解析にはＬＳ−ＰＬＡＴＥｍａｎａｇｅｒ  ２００１（Ｗｉｎ）（和光純薬工業社）を用いた。ポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙ、ネガティブコントロールとしてｐＵＣ１９を用いてスクリーニングを行った。第１７６番目変異体、第１９９番目変異体および第２２４番目変異体それぞれについて、それぞれ１８８検体よりポジティブコントロールよりも高活性を示す検体をＫ１７６番目変異体は１２検体、Ｋ１９９番目変異体は２検体、Ｋ２２４番目変異体は１１検体選出した。
（２−２）二次スクリーニング、
滅菌試験管に３ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（８０μｇ／ｍｌ）を入れ、一次スクリーニングにおいてポジティブコントロールよりも高活性を示した、１２検体のＫ１７６番目変異体、２検体のＫ１９９番目変異体、１１検体のＫ２２４番目変異体、ポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙおよびネガティブコントロールｐＵＣ１９を植菌し、３７度で終夜振とう培養した（前培養）。１２時間後、１．５ｍｌの培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ、日立社）により集菌し、得られた菌体を０．８５％ＮａＣｌで洗浄した。５００μｌの１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体を破砕後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃、ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ、日立社）した上清を可溶性画分として得た。得られた可溶性画分を用いて活性測定を行った。活性測定は、ベンズアルデヒドからの（Ｓ）−マンデロニトリルの生成をｃｈｉｒａｌ−ｃｏｌｕｍｎを用いたＨＰＬＣにより分析し、合成活性を測定した。反応の標準アッセイ溶液は、最終容量０．９ｍｌ中に３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭベンズアルデヒドおよび１００ｍＭシアン化物溶液を含有する。１００μｌの酵素溶液を添加することによって反応を直ちに開始し、２５℃で１２０分間インキュベートした。９００μｌの有機溶媒（ヘキサン：イソプロパノール＝９：１）を添加して反応を停止させ、遠心（１５，０００×ｇ、１０分）により得た上清をＨＰＬＣによりアッセイした。各成分の量はＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学社製）を用いてヘキサン：イソプロパノール＝９０：１０を移動相として流量１．０ｍｌ／分で流し２５４ｎｍで測定し、それらの標準曲線を用いて算出した。標準的アッセイ条件下でベンズアルデヒドから、１分あたり１μｍｏｌのＳ−マンデロニトリルを生成する酵素の量を酵素活性の１単位を定義した。第１７６番目変異体、第１９９番目変異体および第２２４番目変異体それぞれについて、ポジティブコントロールよりも高活性を示す検体が確認された。これら高活性検体の可溶性画分を用いてタンパク質定量とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（各サンプルタンパク質１０μｇ）を行った。
（２−３）スクリーニング結果
活性測定の結果、第１７６番目変異体、第１９９番目変異体および第２２４番目変異体いずれにおいても、ポジティブコントロールよりも著しく高活性な検体が確認された。それら検体から組換えベクターを調製し、実施例１（４）と同様の方法により塩基配列を調べた結果、第１７６番目変異体では野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいてリジンをコードするコドンａａａがｃｃｃとなってプロリンをコードしていた（Ｋ１７６Ｐ）。同様に、第１９９番目変異体では野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいてリジンをコードするコドンａａａがｃｃｃとなってプロリンをコードしており（Ｋ１９９Ｐ）、第２２４番目変異体では野生型ヒドロキシニトリルリアーゼにおいてリジンをコードするコドンａａａがｃｃｔとなってプロリンをコードしていた（Ｋ２２４Ｐ）。
Ｋ１７６Ｐ、Ｋ１９９ＰおよびＫ２２４Ｐの単置換変異体の可溶性画分タンパク質あたりの活性を表２６に示す。Ｋ１７６ＰはポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙの２．９倍、Ｋ１９９ＰはポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙの２．３倍、Ｋ２２４ＰはポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙの３．３倍の活性を示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（図１１）、Ｋ１７６Ｐ、Ｋ１９９ＰおよびＫ２２４Ｐいずれの単置換変異体も、可溶性画分中のヒドロキシニトリルリアーゼの量が増大していることが確認された。以上の結果から、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、リジン残基を他のアミノ酸、特にプロリンに置換することで、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現量および活性を向上させることができることが確認された。
【表２６】
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【実施例１６】  リジン残基多重置換変異を有する改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの作製と評価
（１）リジン残基多重置換変異体の作製
実施例１５で得られたリジン残基単置換変異体を元に、２箇所または３箇所のリジン残基が置換された多重置換変異体をコードする大腸菌コドン改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を作製した。まず、Ｋ２２４Ｐ変異体を含む発現ベクターｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｋ２２４Ｐを鋳型として用い、部位特異的変異導入により、第１７６番目と第２２４番目の２箇所のリジン残基がプロリンに置換された二重変異体（Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ）、および第１９９番目と第２２４番目の２箇所のリジン残基がプロリンに置換された二重変異体（Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ）を作製した。さらに、得られた二重変異体Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体を含む発現ベクターｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐを鋳型として用い、第１７６番目、第１９９番目および第２２４番目の３箇所のリジン残基すべてがプロリンに置換された三重変異体（Ｋ１７６Ｐ×Ｋ１９９×Ｋ２２４Ｐ）を作製した。実施例１５の（１）と同様、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用いて行った。
ＰＣＲの反応条件を表２７に示す。
【表２７】
0004956193.tif 000032
上記鋳型ＤＮＡは、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製およびＫ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製の場合はｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｋ２２４Ｐであり、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製の場合はｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐである。
上記プライマーのうち５’−ｐｒｉｍｅｒの配列は以下のとおりである。
Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製の場合
Ｋ１７６Ｐ−Ｆ：ｃｔｇｇｃｇａａａａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｃｃｃｎｇｇｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｇａａｃｇｔｇｃ  （配列番号９８）
Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体およびＫ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製の場合
Ｋ１９９Ｐ−Ｆ：ｃｇａａａａａｇｇｃｔａｔｇｇｃａｇｃａｔｔｃｃｎａａａｇｔｇｔａｔａｔｔｔｇｇａｃｃｇａｔｃａｇｇ  （配列番号９９）
上記プライマーのうち３’−ｐｒｉｍｅｒの配列は以下のとおりである。
Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製の場合
Ｋ１７６Ｐ−Ｒ：ｇｃａｃｇｔｔｃｔｇａａａｃａｇｇｃｔｇｃｃｎｇｇｇｃｇｃａｔｃａｃｃａｔｔｔｔｃｇｃｃａｇ  （配列番号１００）
Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体およびＫ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ変異体作製の場合
Ｋ１９９Ｐ−Ｒ：ｃｃｔｇａｔｃｇｇｔｃｃａａａｔａｔａｃａｃｔｔｔｎｇｇａａｔｇｃｔｇｃｃａｔａｇｃｃｔｔｔｔｔ  （配列番号１０１）
上記プライマー配列中、ｎは（ａ，ｔ，ｇまたはｃ）である。プロリンのコドンはｃｃｔ，ｃｃｃ，ｃｃａまたはｃｃｇであり、上記変異導入プライマーでは、目的の変異箇所が必ずプロリンコドンのいずれかとなるよう設計した（５’−ｐｒｉｍｅｒの場合はｃｃｎ、３’−ｐｒｉｍｅｒの場合はｎｇｇ）。
ＰＣＲの反応条件は実施例１５の（１）と同様である。
ＰＣＲの反応液５０μｌにＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７度で１時間インキュベートした。この処理によって、鋳型ＤＮＡを消化し、変異の入ったプラスミドのみを得た。ＤｐｎＩ処理後のＰＣＲ反応液で、実施例１（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。得られた形質転換体から組換えベクターを調製し、実施例１（３）と同様の方法により塩基配列の解析を行った結果、目的とする、第１７６番目と第２２４番目の２箇所のリジン残基がプロリンに置換された二重変異体（Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ）、第１９９番目と第２２４番目の２箇所のリジン残基がプロリンに置換された二重変異体（Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ）、第１７６番目、第１９９番目および第２２４番目の３箇所のリジン残基すべてがプロリンに置換された三重変異体（Ｋ１７６Ｐ×Ｋ１９９×Ｋ２２４Ｐ）が正しく作製されていることが確認された。
（２）リジン残基多重置換変異体の活性と発現量
実施例１５（２−３）と同様の方法により、得られたリジン残基多重置換変異体（Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ、Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４ＰおよびＫ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ）を培養し、可溶性画分を調製した後、活性測定、タンパク質定量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（各サンプルタンパク質１０μｇ）を行った。活性測定の結果を表２６に示す。Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４ＰはポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙの７．１倍、Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４ＰはポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙの５．３倍、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４ＰはポジティブコントロールｐＵＭＥＳＤｓｙの７．４倍の活性を示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（図１１）、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ、Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４ＰおよびＫ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐいずれの多重置換変異体も、上述の単置換変異体以上に可溶性画分中のヒドロキシニトリルリアーゼの量が増大していることが確認された。以上の結果から、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列において、複数のリジン残基を他のアミノ酸、特にプロリンに置換することで、細胞あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ発現量および活性を著しく向上させることができることが確認された。
【実施例１７】  第１０３番目のヒスチジン残基およびリジン残基が置換された複合改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの作製と評価
（１）第１０３番目のヒスチジン残基およびリジン残基が置換された複合変異体の作製
実施例１５および１６で得られたリジン残基単置換およびリジン残基多重置換変異体に、第１０３番目のヒスチジン残基がロイシンに置換されたＨ１０３Ｌ変異を導入した複合変異体の作製を行った。実施例１５で得られたｐＵＭＥＳＤｓｙ−Ｋ１７６Ｐ、−Ｋ１９９Ｐ、−Ｋ２２４Ｐ（以上リジン１箇所置換）、および実施例１６で得られた−Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ、−Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ（以上リジン２箇所置換）、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ（リジン３箇所置換）を鋳型とし、実施例９と同様の方法により、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて作製した。変異導入用プライマーには実施例９で用いたＯＸＹＮ−３０（配列番号８６）およびＯＸＹＮ−３１（配列番号８７）を用いた。
当該キットのプロトコールに従い、ＰＣＲ反応およびＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーよりプラスミドＤＮＡを回収した。１〜３箇所のリジン残基が置換されており、かつ、第１０３番目のアミノ酸がロイシンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ、Ｋ１７６Ｐ＋Ｈ１０３Ｌ、Ｋ１９９Ｐ＋Ｈ１０３Ｌ、Ｋ２２４Ｐ＋Ｈ１０３Ｌ（以上リジン１箇所置換＋Ｈ１０３Ｌ変異）、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ２２４Ｐ＋Ｈ１０３Ｌ、Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ＋Ｈ１０３Ｌ、（以上リジン２箇所置換＋Ｈ１０３Ｌ変異）、Ｋ１７６Ｐ×Ｋ１９９Ｐ×Ｋ２２４Ｐ＋Ｈ１０３Ｌを得た。
（２）第１０３番目のヒスチジン残基およびリジン残基が置換された複合変異体の評価
（１）で得られた形質転換体を３ｍｌのＬＢ培地で３７℃で１２ｈｒ培養し、培養開始と同時に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。１２ｈｒ後、培養液を集菌し、生理食塩水で洗浄後、３分の１量の１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体反応により活性測定を行った。その値から培養液あたりの活性を算出した。結果を表２８に示す。いずれの複合変異体も、野生型と比較して顕著な活性向上が確認された。
【表２８】
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【実施例１８】改良型ヒドロキシニトリルリアーゼによるシアンヒドリンおよびヒドロキシカルボン酸の合成
（１）シアンヒドリンの合成
実施例１２（３）で得られたＣ６００／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉジャー培養液４０ｍｌを遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）に供した後、上清３５ｍｌを除き、残った菌体と培養液を再懸濁した。得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール４、ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ  ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモード１０ｓの条件で氷冷しながら３分間破砕を５回繰り返した。破砕液を再度遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）し、得られた上清を改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素溶液とした。実施例１２（１−４）の方法により分解活性を算出したところ、該酵素溶液の活性は１１７１Ｕ／ｍｌであった。酵素溶液３．７ｇ（６４５０Ｕに相当）とｔ−ブチルメチルエーテル１７５．１ｇを混合し、反応系内を１５−１８℃に維持して充分攪拌しながら、ＨＣＮ４７．６ｇとベンズアルデヒド１２４．６ｇを約４時間かけて連続的に滴下した。滴下終了後、１時間、反応系内を１５−１８℃に維持して充分攪拌した。反応終了後、実施例８（２−３）と同様、ＨＰＬＣにより反応溶液を分析した結果、マンデロニトリルの濃度は４５重量％、その光学純度は９８％ｅｅのＳ体過剰であった。
（２）ヒドロキシカルボン酸の合成
３０〜３５℃で１６時間攪拌しながら（１）で得られたマンデロニトリル溶液１３１ｇを３５％塩酸１４７ｇに滴下した。この反応溶液はスラリーであった。１６時間攪拌後の反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、マンデロニトリルは検出されず、マンデルアミドとマンデル酸が混在していた。１６時間攪拌後の反応溶液の全量に、水３２０ｇを添加し、７５℃で２時間攪拌し加水分解した。この反応溶液は均一であった。この反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、マンデロニトリル、およびマンデルアミドは検出されず、マンデル酸の濃度は２１％、光学純度は９８％ｅｅのＳ体過剰であった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、野生型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸を置換した改良型ヒドロキシニトリルリアーゼおよびその遺伝子が得られる。当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼの遺伝子は、野生型の遺伝子に変異を導入したものだけでなく、宿主のコドン使用頻度に従い、使用頻度の高いコドンに変異させた宿主コドン型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子に変異を導入したものも含まれる。
さらに、本発明の遺伝子を宿主に形質導入して得られた形質転換体では、形質転換体あたりのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を大幅に向上させることができるため、改良型ヒドロキシニトリルリアーゼを大量かつ効率良く製造することができる。さらには、効率よく光学活性シアンヒドリンおよび光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造できる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号３〜１０１  合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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