(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を含有する水性媒体中、（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体と、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤との組み合わせ、および、（ｂ）ホスホリパーゼＤの存在下、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールに、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または（ｄ）酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法。
【請求項２】
過酸化水素の定量がパーオキシダーゼの存在下、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる請求項１記載の方法。
【請求項４】
還元型補酵素の定量が生成した還元型補酵素を還元発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式（Ｉ）
【化６】
0005027648.tif 000020
（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは、水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される界面活性剤である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ホスホリパーゼＤ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体と、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤との組み合わせを含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
【請求項７】
さらに過酸化水素定量用試薬を含有する請求項６記載の試薬。
【請求項８】
ホスホリパーゼＤ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、および、ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体と、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤との組み合わせを含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
【請求項９】
さらに還元型補酵素定量用試薬を含有する請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式（Ｉ）
【化７】
0005027648.tif 000021
（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは、水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される界面活性剤である請求項６〜９のいずれかに記載の試薬。
【請求項１１】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体を含有する第１試薬と、ホスホリパーゼＤ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
【請求項１２】
さらに過酸化水素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体を含有する第１試薬と、ホスホリパーゼＤ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
【請求項１４】
さらに還元型補酵素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式（Ｉ）
【化８】
0005027648.tif 000022
（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは、水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される界面活性剤である請求項１１〜１４のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、臨床検査において動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白質（以下、ＲＬＰと略記する）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】  血液中には、種々のリポ蛋白が含有されている。これらのリポ蛋白は比重の違いにより、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）に分類されている。各リポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、蛋白質等の構成成分の割合が異なっており、生体内で異なる作用を有する。【０００３】  臨床検査において、ＨＤＬ中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の因子、ＬＤＬ中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。
また、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが動脈硬化症の危険因子としてＬＤＬ中のコレステロールより密接な指標となることが示されてきている。脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質としては、例えばＲＬＰがあげられている。【０００４】  最近、免疫吸着法によるＲＬＰ中のコレステロール（以下、ＲＬＰ−Ｃと略記する）の定量法が開発された。本定量法においては、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体およびアポＢ−４８を認識しない特異的抗アポＢ−１００モノクローナル抗体を含有するアフィニティーゲルを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより血清からＲＬＰを分離し、この分離したＲＬＰに含まれるコレステロールが定量される。本定量法に適用されるＲＬＰ中のコレステロール定量用試薬が、（株）日本抗体研究所から販売されている［製品名：ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ］（非特許文献１、非特許文献２参照）。この免疫吸着法によるＲＬＰ−Ｃの定量法については、厚生労働省より保険点数が付与されている。【０００５】  しかしながら本方法は抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィー方法を使用するもので、試料の分離操作を必要とする等操作が煩雑で時間がかかる。
また、試料の分離操作が不要なＲＬＰ−Ｃを簡便に感度良く測定する方法が知られている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００１−２３１５９７号公報
【非特許文献１】動脈硬化、２５（９，１０）、３７１（１９９８）
【非特許文献２】クリニカル  ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、４８（２）、２１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の目的は、試料の分離操作が不要なＲＬＰ−Ｃを簡便に感度良く定量する定量方法、試薬およびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明は、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素が、特定の界面活性剤の組み合わせおよびリン脂質を加水分解する酵素の存在下、レムナント様リポ蛋白質コレステロールに特異的に作用するという知見に基づき完成された。本発明は、下記（１）〜（２０）に関する。【０００８】  （１）  試料を含有する水性媒体中、（ａ）（ｉ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン長鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤［以下、界面活性剤（ｄ１）という］と、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤［以下、界面活性剤（ｄ２）という］との組み合わせ、または、（ｉｉ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体［以下、界面活性剤（ｄ３）という］と、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種の界面活性剤［以下、界面活性剤（ｄ４）という］との組み合わせ、並びに（ｂ）リン脂質を加水分解する酵素の存在下、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールに、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または（ｄ）酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中のレムナント様コレステロールの定量方法。【０００９】  （２）  過酸化水素の定量がパーオキシダーゼの存在下、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる前記（１）記載の方法。
（３）  還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる前記（１）記載の方法。【００１０】  （４）  還元型補酵素の定量が生成した還元型補酵素を還元発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる前記（１）記載の方法。
（５）  ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式（Ｉ）【００１１】
【化１】
0005027648.tif 000002
【００１２】（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは、水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される界面活性剤である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣまたはホスホリパーゼＡ２である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００１３】  （７）  リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤（ｄ２）との組み合わせ、または、界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）との組み合わせを含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
（８）  さらに過酸化水素定量用試薬を含有する前記（７）記載の試薬。【００１４】  （９）  リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、および界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤（ｄ２）との組み合わせまたは界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）との組み合わせを含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
（１０）  さらに還元型補酵素定量用試薬を含有する前記（９）記載の試薬。【００１５】  （１１）  ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式（Ｉ）【００１６】
【化２】
0005027648.tif 000003
【００１７】（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは、水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される界面活性剤である前記（７）〜（１０）のいずれかに記載の試薬。
（１２）  リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣまたはホスホリパーゼＡ２である前記（７）〜（１１）のいずれかに記載の試薬。【００１８】  （１３）  界面活性剤（ｄ１）を含有する第１試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、界面活性剤（ｄ２）を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
（１４）  界面活性剤（ｄ３）を含有する第１試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、界面活性剤（ｄ４）を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。【００１９】  （１５）  さらに過酸化水素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する前記（１３）または（１４）記載のキット。
（１６）  界面活性剤（ｄ１）を含有する第１試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、界面活性剤（ｄ２）を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。【００２０】  （１７）  界面活性剤（ｄ３）を含有する第１試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、界面活性剤（ｄ４）を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。【００２１】  （１８）  さらに還元型補酵素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する前記（１６）または（１７）記載のキット。
（１９）  ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式（Ｉ）【００２２】
【化３】
0005027648.tif 000004
【００２３】（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは、水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される界面活性剤である前記（１３）、（１５）、（１６）または（１８）記載のキット。
（２０）  リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、または、ホスホリパーゼＡ２である前記（１３）〜（１９）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００２４】  本発明により、試料の分離操作が不要なＲＬＰ−Ｃを簡便に感度良く定量する方法、試薬およびキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例４の定量法との相関図を表す。
【図２】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例５の定量法との相関図を表す。
【図３】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例６の定量法との相関図を表す。
【図４】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と比較例２の定量法との相関図を表す。
【図５】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例１１の定量法との相関図を表す。
【図６】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例１２の定量法との相関図を表す。
【図７】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例１３の定量法との相関図を表す。
【図８】ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた定量法と実施例１４の定量法との相関図を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】  本発明において、「レムナント様リポ蛋白（ＲＬＰ）」という用語は、ＶＬＤＬレムナントとＣＭレムナントをあわせたリポ蛋白を意味する。また、「レムナント様リポ蛋白コレステロール（ＲＬＰ−Ｃ）」という用語は、ＲＬＰ中のエステル型コレステロールおよび遊離型コレステロールを合わせた意味で使用される。従って、ＲＬＰ−Ｃとは、ＶＬＤＬレムナント中のエステル型コレステロール、ＶＬＤＬレムナント中の遊離型コレステロール、ＣＭレムナント中のエステル型コレステロールおよびＣＭレムナント中の遊離型コレステロールを合わせたものである。
本発明の定量方法によって全血、血漿、血清等の試料中のＲＬＰ−Ｃを定量できる。【００２７】  本発明の特徴は、リン脂質を加水分解する酵素の存在下に、ＲＬＰ−Ｃに特異的にコレステロール定量反応に用いられる酵素を作用させる界面活性剤として、ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体（以下、ＰＯＥ・ＰＯＢ共重合体と略記する）、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル（以下、ＰＯＥスチレン化フェニルエーテルと略記する）およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン長鎖分岐アルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ長鎖分岐アルキルエーテルと略記する）からなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤［以下、界面活性剤（ｄ１）という］と、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルアリールエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル（以下、ＰＯＥアルキルアリールエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルと略記する）およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ短鎖分岐アルキルエーテルと略記する）からなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤［以下、界面活性剤（ｄ２）という］との組み合わせ、または、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ共重合体と略記する）［以下、界面活性剤（ｄ３）という］と、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル（以下、ＰＯＥアルキルアリールエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルと略記する）およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ短鎖分岐アルキルエーテルと略記する）からなる群より選択される一種または二種の界面活性剤［以下、界面活性剤（ｄ４）という］との組み合わせが優れた効果を奏することにある。【００２８】  すなわち、これらの界面活性剤の組み合わせは、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる。
本発明方法によれば試料中のＲＬＰ−Ｃは、水性媒体中、リン脂質を加水分解する酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる界面活性剤の組み合わせ、すなわち、（ｉ）界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤（ｄ２）との組み合わせ、または、（ｉｉ）界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）との組み合わせの存在下、試料中のＲＬＰ−Ｃに、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または（ｄ）酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することにより定量することができる。【００２９】  試料中のＲＬＰ−Ｃに、酸素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を作用させることにより、試料中のＲＬＰ中のエステル型コレステロールがコレステロールエステル加水分解酵素の作用により遊離型コレステロールに変換され、該変換されて生成する遊離型コレステロールおよびＲＬＰ中の遊離型コレステロールと酸素とから、コレステロール酸化酵素の作用によって過酸化水素が生成する。【００３０】  また試料中のＲＬＰ−Ｃに、酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させることにより、試料中のＲＬＰ中のエステル型コレステロールがコレステロールエステル加水分解酵素の作用により遊離型コレステロールに変換され、該変換されて生成する遊離型コレステロールおよびＲＬＰ中の遊離型コレステロールと酸化型補酵素からコレステロール脱水素酵素の作用により還元型補酵素が生成する。【００３１】  酵素反応は、界面活性剤（ｄ１）および界面活性剤（ｄ２）の組み合わせ、または、界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）の組み合わせ、ならびに、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、コレステロールの定量に必要なコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素（コレステロール脱水素酵素を用いる場合には酸化型補酵素が必要）を含有する緩衝液等の水溶液中で行われる。
界面活性剤（ｄ１）および界面活性剤（ｄ２）の組み合わせ、および、界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）の組み合わせにおいては、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤（ｄ２）、界面活性剤（ｄ３）、界面活性剤（ｄ４）として、界面活性剤（ｄ１）〜（ｄ４）を構成する界面活性剤を一種または二種以上用いてもよい。【００３２】  界面活性剤（ｄ１）および界面活性剤（ｄ２）の組み合わせとしては、第１表〜第７表に示す組み合わせが例示される。【００３３】
【表１】
0005027648.tif 000005
【００３４】
【表２】
0005027648.tif 000006
【００３５】
【表３】
0005027648.tif 000007
【００３６】
【表４】
0005027648.tif 000008
【００３７】
【表５】
0005027648.tif 000009
【００３８】
【表６】
0005027648.tif 000010
【００３９】
【表７】
0005027648.tif 000011
【００４０】  界面活性剤（ｄ１）および界面活性剤（ｄ２）の組み合わせの中でも、リン脂質を加水分解する酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をレムナント様リポ蛋白コレステロールに特異的に作用させる作用の強い組合せが好ましい。
具体的には、第１表に記載されたＰＯＥ・ＰＯＢ共重合体と界面活性剤（ｄ２）との組み合わせが好ましい。
ＰＯＥ・ＰＯＢ共重合体と界面活性剤（ｄ２）との組み合わせの中でも、第８表に示す以下の組み合わせがより好ましい。【００４１】
【表８】
0005027648.tif 000012
【００４２】  界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）の組み合わせとしては、次の第９表に示す組み合わせが例示される。【００４３】
【表９】
0005027648.tif 000013
【００４４】  界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）の組み合わせの中でも、リン脂質を加水分解する酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる作用の強い組合せが好ましい。
具体的には、第１０表に示す以下の組み合わせが好ましい。
【表１０】
0005027648.tif 000014
【００４５】  反応によって生成する過酸化水素または還元型補酵素の定量はそれ自体公知の方法によって行われる。
酵素反応の反応液中には、必要に応じて、シクロデキストリンもしくはその誘導体、アルブミンまたはリポ蛋白凝集剤の存在下に行うこともできる。シクロデキストリンもしくはその誘導体、アルブミンまたはリポ蛋白凝集剤によってレムナント様リポ蛋白以外のリポ蛋白コレステロールに酵素が作用するのを抑制することができるので好ましい。【００４６】  また、酵素反応の反応液中には、必要に応じて、ＲＬＰ−Ｃの定量反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を活性化するためによく使用される酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類を共存させることもできる。【００４７】  コレステロールエステル加水分解反応、遊離コレステロールの酸化または脱水素反応は、リン脂質を加水分解する酵素、および界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤活性剤（ｄ２）との組み合わせ、もしくは、界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）との組み合わせの存在下に、順次行うことができる。また、試料と界面活性剤とを予め水溶液中接触させ、次いで、この溶液にリン脂質を加水分解する酵素、コレステロールの反応に関与する酵素を添加して、コレステロールの反応を行うこともできる。コレステロールの反応は、ＲＬＰ−Ｃの定量に必要な成分を全て含有する水溶液中で行わせることもできるが、ＲＬＰ−Ｃの定量に必要な成分を２〜３のグループに分けて、分けられた成分を順次、反応液に添加することによっても行うことができる。ＲＬＰ−Ｃの定量は、好ましくは、後述のＲＬＰ−Ｃ定量用キットを用いて行われる。【００４８】  水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロール脱水素酵素は、通常０．００１〜４００Ｕ／ｍＬで、好ましくは０．０１〜２００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．０５〜１００Ｕ／ｍＬの濃度で用いられる。
水性媒体中、リン脂質を加水分解する酵素の濃度は、特に制限はないが、０．００１〜４００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．０１〜２００Ｕ／ｍＬがより好ましく、０．０５〜１００Ｕ／ｍＬが特に好ましい。【００４９】  水性媒体中、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤活性剤（ｄ２）、界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）の濃度は、それぞれに、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０５〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
酵素反応は通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、通常２〜３０分で完了する。【００５０】  生成した過酸化水素は例えばパーオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体との反応によって色素を生成させ、反応液の吸光度の変化を例えば生成した色素の吸収極大波長で測定することにより定量される。また生成した過酸化水素は例えば化学発光物質、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等と過酸化水素とを反応させてフォトンを生成させ、生成したフォトンを定量することにより定量される。【００５１】  還元型補酵素は例えば酵素反応によって生成した還元型補酵素含有液の吸光度を３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、より好ましくは３４０ｎｍ付近で測定することによって定量できる。また、生成した還元型補酵素は例えばジアホラーゼまたは電子キャリアーの存在下還元型補酵素と還元によって色素に変換される色原体との反応によって色素を生成させ、反応液の吸光度の変化を例えば生成した色素の吸収極大波長で測定することによって定量される。電子キャリアーの例は１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェートである。【００５２】  試料中のＲＬＰ−Ｃの濃度は、例えば予め既知の濃度のＲＬＰ−Ｃを含有する試料を用いて、コレステロール濃度と過酸化水素または還元型補酵素の量との関係を示す検量線を作成し、この検量線から求めることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素はコレステロールエステルを加水分解できる酵素、例えばコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が用いられ、動物、植物または微生物由来または、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を使用することができる。化学的に修飾された酵素としては、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等の化学修飾基で修飾された酵素が含まれる。特にポリエチレングリコールを主成分とする基で修飾された酵素が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が含まれる。【００５３】  化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）は、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が含まれる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造は、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が含まれる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造は、例えばアミノ基を含む。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造は、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等を含む。【００５４】  化学修飾剤の例は、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥＡＣ−５０ＨＳ、サンブライトＭＥＣ−５０ＨＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水酢酸（ＤＴＰＡ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学研究所社製）、ポリウレタン修飾用の活性化ポリウレタンＰ４０００（ベーリンガーマンハイム社製）、デキストラン修飾用のデキストランＴ４０、活性化ＴＣＴ（ベーリンガーマンハイム社製）等を含む。【００５５】  酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができる。
まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。【００５６】  コレステロール酸化酵素は動物、植物または微生物由来酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を用いることができる。
化学修飾酵素は、前述の化学修飾方法により作製することができる。
コレステロール脱水素酵素は、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば、動物、植物または微生物由来の酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素を用いることができる。化学的に修飾された酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。【００５７】  リン脂質を加水分解する酵素としては、リン脂質を分解する能力を有する酵素であれば特に制限されない。例えば動物、植物および微生物由来のリン脂質を分解する酵素があげられる。具体的なリン脂質を分解する酵素としては、例えばホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、リゾホスホリパーゼ等があげられる。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いる定量法において使用される酸化型補酵素の例は、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰである。【００５８】  本発明において使用される界面活性剤（ｄ１）は、本発明において使用される界面活性剤（ｄ２）と組み合わさって、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる機能を有する。界面活性剤（ｄ１）および界面活性剤（ｄ２）は、それぞれ単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる機能が高い必要はない。【００５９】  本発明において使用される界面活性剤（ｄ３）は、本発明において使用される界面活性剤（ｄ４）と組み合わさって、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる機能を有する。界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）は、それぞれ単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＲＬＰ−Ｃに特異的に作用させる機能が高い必要はない。【００６０】  ＰＯＥ・ＰＯＢ共重合体は、ポリオキシエチレンとポリオキシブチレンとのランダム重合体、ブロック重合体を含み、例えば一般式（Ｉ）【００６１】
【化４】
0005027648.tif 000015
【００６２】（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）と称する］等が挙げられる。一般式（Ｉ）中、Ｒは水素原子が好ましい。
化合物（Ｉ）における直鎖または分岐のアルキルは、炭素数が１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシル、イコシル、イソイコシル、ヘネイコシル、イソヘネイルコシル、ドコシル（ベヘニル）、イソドコシル、トリコシル、イソトリコシル、テトラコシル、イソテトラコシル、ペンタコシル、イソペンタコシル、ヘキサコシル、イソヘキサコシル、ヘプタコシル、イソヘプタコシル、オクタコシル、イソオクタコシル、ノナコシル、イソノナコシル、トリアコンシル、イソトリアコンシル、等を含む。【００６３】  ポリオキシブチレン部分の分子量としては、７００以上が好ましく、１，０００以上がより好ましく、１，５００以上が特に好ましい。
化合物（Ｉ）の具体例は、プロノンＢ−２０４、プロノンＢ−２０８（以上、日本油脂社製）を含む。
ＰＯＥスチレン化フェニルエーテルの例は、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−９、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−１２．５、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−２０、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−１０、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ−５、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ−７．５、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ−１６、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ−２０、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ−５０（以上、青木油脂社製）等であって、市販されている。【００６４】  ＰＯＥ・ＰＯＰ長鎖分岐アルキルエーテルにおける長鎖分岐アルキルとしては、例えば炭素数２０〜３０の分岐アルキル、例えばイソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドコシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＰ長鎖分岐アルキルエーテルの具体例は、ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製）等であり、市販されている。
ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルアリールエーテルおよびＰＯＥアルキルアリールエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８以上の、たとえばオクチル、ノニル等が挙げられる、アリールとしては、例えばフェニル、ナフチル等が挙げられる。アリールとしては、フェニルが好ましい。【００６５】  ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＰ短鎖分岐アルキルエーテルにおける短鎖分岐アルキルとしては、炭素数６〜１９の分岐アルキル、例えばイソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル等が挙げられる。【００６６】  ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルアリールエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。具体例は、エマルゲンＬ−４０（花王社製）、アクロネセスＫＰ−１８９Ｒ（日本油脂社製）等であって、市販されている。
ＰＯＥアルキルアリールエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。具体例は、エマルゲン９１１、エマルゲン８１０（以上、花王社製）、ノニオンＨＳ−２１０、ノニオンＨＳ−２１５、ノニオンＮＳ−２０８．５、ノニオンＨＳ−２０８（以上、日本油脂社製）等であって、市販されている。【００６７】  ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルおよびＰＯＥ・ＰＯＰ分岐アルキルエーテルとしては、親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）が９〜２０のＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルおよびＰＯＥ・ＰＯＰ分岐アルキルエーテルが好ましい。ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルの具体例は、ワンダサーフＲＬ−１００、ワンダサーフＳ−１０００（以上、青木油脂社製）等であって、市販されている。ＰＯＥ・ＰＯＰ短鎖分岐アルキルエーテルの具体例は、ワンダサーフＩＤ−７０、ワンダサーフＩＤ−９０（以上、青木油脂社製）等であって、市販されている。【００６８】  ＰＯＥ・ＰＯＰ共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのランダム重合体、ブロック重合体を含み、例えば一般式（ＩＩ）【００６９】
【化５】
0005027648.tif 000016
【００７０】（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される化合物等が挙げられる。一般式（ＩＩ）中、Ｒは水素原子が好ましい。
化合物（ＩＩ）における直鎖または分岐のアルキルは、前述の化合物（Ｉ）における直鎖または分岐のアルキルと同様のものが挙げられる。【００７１】  本化合物におけるポリオキシプロピレン部分の分子量としては、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。
具体例は、プルロニックＦ−１０８、プルロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＬ−１０３（以上、旭電化工業社製）、プロノン１０２、プロノン１０４、プロノン２０１、プロノン２０４、プロノン２０８、プロノン２０２Ｂ（以上、日本油脂社製）等であって、市販されている。【００７２】  水性媒体は、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤の例はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。【００７３】  グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）を含む。【００７４】  緩衝液は通常４〜１０、好ましくは５〜９のｐＨで、通常０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
過酸化水素定量に用いられる色原体として、例えばパーオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体が用いられる。その例はロイコ型色原体、酸化カップリング型色原体を含む。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。【００７５】  ロイコ型色原体の例は１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）である。【００７６】  酸化カップリング型色原体は、過酸化水素およびパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化によってカップリングして色素に変換される色原体である。２つの化合物の組み合わせの例はカプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせを含む。【００７７】  カプラーの例は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジンである。アニリン類の例はＮ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）を含む。フェノール類の例はフェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）を含む。【００７８】  パーオキシダーゼは、通常１〜１００ｋＵ／Ｌの濃度で用いられ��。色原体は、通常０．０１〜１０ｇ／Ｌの濃度で用いられる。
還元型補酵素の定量に用いられる色原体として、例えばジアホラーゼまたは電子キャリアーの存在下還元型補酵素と還元によって色素に変換される色原体が用いられる。その例は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）を含む。【００７９】  ジアホラーゼおよび電子キャリアーは、通常１〜１００ｋＵ／Ｌの濃度で用いられる。色原体は、通常０．０１〜１０ｇ／Ｌの濃度で用いられる。【００８０】  シクロデキストリンまたはその誘導体の例はシクロデキストリン、ジメチルシクロデキストリン、トリメチルシクロデキストリン、ヒドロキシエチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、カルボキシメチルシクロデキストリン、グリコシルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、シクロデキスロリンスルフェート、シクロデキストリンポリマーであり、ヒドロキシエチルシクロデキストリンおよびヒドロキシプロピルシクロデキストリンが好ましい。【００８１】  シクロデキストリンの例はα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンである。
ジメチルシクロデキストリンの例はジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリンである。
トリメチルシクロデキストリンの例はトリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリンである。【００８２】  ヒドロキシエチルシクロデキストリンの例はヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリンである。
ヒドロキシプロピルシクロデキストリンの例はヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである。【００８３】  カルボキシメチルシクロデキストリンの例はカルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリンである。
グリコシルシクロデキストリンの例はグリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリンである。【００８４】  マルトシルシクロデキストリンの例はマルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリンである。
シクロデキストリンスルフェートの例はα−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェートである。
シクロデキストリンポリマーの例はβ−シクロデキストリンポリマーである。２種類以上のシクロデキストリンまたはその誘導体を組み合わせて使用することもできる。【００８５】  水性媒体中、シクロデキストリンもしくはその誘導体の濃度は、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
アルブミンの例はウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミンを含み、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。水性媒体中、アルブミンの濃度は、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。【００８６】  リポ蛋白凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価の金属塩が、あげられる。水性媒体中、リポ蛋白凝集剤の濃度は、それぞれ独立に０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。【００８７】  酵素活性化剤の例は、胆汁酸類、アルキルスルホン酸塩等のアニオン性界面活性剤を含む。胆汁酸類の例は、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸を含む。アルキルスルホン酸塩の例は１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン酸塩を含む。アルキルスルホン酸塩における塩の例はアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を含む。【００８８】  安定化剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウムを含む。
防腐剤の例は、アジ化ナトリウム、抗生物質を含む。
干渉抑制剤の例は、アスコルビン酸の影響を抑制するためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響を抑制するためのフェロシアン化カリウムを含む。【００８９】
塩類の例は、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムを含む。
本発明のＲＬＰ−Ｃの定量方法として、以下の具体的態様を例示することができる。
【００９０】 定量方法１
（１）水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤（ｄ２）、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する過酸化水素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のＲＬＰ−Ｃ濃度を決定する方法。【００９１】 定量方法２
（１）水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤（ｄ３）、界面活性剤（ｄ４）、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する過酸化水素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のＲＬＰ−Ｃ濃度を決定する方法。【００９２】 定量方法３
（１）水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤（ｄ２）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のＲＬＰ−Ｃ濃度を決定する方法。【００９３】 定量方法４
（１）水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤（ｄ３）、界面活性剤（ｄ４）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のＲＬＰ−Ｃ濃度を決定する方法。【００９４】  （ＲＬＰ−Ｃ定量用試薬）
本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬は、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤（ｄ２）の組み合わせもしくは界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）の組み合わせを含有する。該試薬は、過酸化水素定量用試薬を含有することができる。過酸化水素定量用試薬の例は、パーオキシダーゼおよび前述のパーオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体を含有する試薬が挙げられる。【００９５】  また、本発明の他のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬は、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、および、界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤（ｄ２）の組み合わせもしくは界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）の組み合わせを含有する。該試薬は、還元型補酵素定量用試薬を含有することができる。還元型補酵素定量用試薬の例は、ジアホラーゼまたは電子キャリアーおよび前述のジアホラーゼまたは電子キャリアーの存在下還元型補酵素と還元によって色素に変換される色原体を含有する試薬が挙げられる。【００９６】  本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬として、以下の具体的態様を例示することができる。
試薬１
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤（ｄ２）および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤（ｄ３）、界面活性剤（ｄ４）および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。【００９７】 試薬３
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤（ｄ１）および界面活性剤（ｄ２）を含有する試薬。
試薬４
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤（ｄ３）および界面活性剤（ｄ４）を含有する試薬。【００９８】 試薬５
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤（ｄ２）および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬６
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤（ｄ３）、界面活性剤（ｄ４）および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
（ＲＬＰ−Ｃ定量用キット）
本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されるのが好ましい。キットの形態は、２試薬および３試薬が用いられるが、２試薬系が好ましい。【００９９】  第１試薬と第２試薬の２試薬系のキットにおいて、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは別々の試薬に含有されてもよいが、同一試薬に含有されるキットが好ましく、特に、第２試薬に含有されるキットが好ましい。リン脂質を加水分解する酵素は、第１試薬、第２試薬のいずれかまたは両方に含有されるが、第２試薬に含有されることが好ましい。【０１００】  界面活性剤（ｄ１）と界面活性剤（ｄ２）は、第１試薬、第２試薬のいずれかまたは両方に含有されるが、界面活性剤（ｄ１）は第１試薬に含有されることが好ましい。界面活性剤（ｄ３）と界面活性剤（ｄ４）は、第１試薬、第２試薬のいずれかまたは両方に含有されるが、界面活性剤（ｄ３）は第１試薬に含有されることが好ましい。
酸化型補酵素は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有される。過酸化水素定量用試薬は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有されるが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は好ましくは別々の試薬に含有される。還元型補酵素定量用試薬は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有される。【０１０１】  本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用キットとして、以下の具体的態様を例示することができる。
キット１
第１試薬
界面活性剤（ｄ１）および過酸化水素定量用試薬の一部を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤（ｄ２）、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬の残りの一部を含有する試薬。【０１０２】 キット２
第１試薬
界面活性剤（ｄ３）および過酸化水素定量用試薬の一部を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤（ｄ４）、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬の残りの一部を含有する試薬。【０１０３】 キット３
第１試薬
界面活性剤（ｄ１）を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤（ｄ２）、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。【０１０４】 キット４
第１試薬
界面活性剤（ｄ３）を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤（ｄ４）、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。【０１０５】 キット５
第１試薬
界面活性剤（ｄ１）を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤（ｄ２）、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。【０１０６】 キット６
第１試薬
界面活性剤（ｄ３）を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤（ｄ４）、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。【０１０７】  本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬およびキットは、試料中のＲＬＰ−Ｃの定量に使用することができる。
本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬およびキットにおける各成分は、前述のＲＬＰ−Ｃ定量方法に記載のリン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤（ｄ１）、界面活性剤（ｄ２）、界面活性剤（ｄ３）、界面活性剤（ｄ４）、過酸化水素定量用試薬および還元型補酵素定量用試薬を用いることができる。【０１０８】  本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬およびキットには、必要に応じて、前述の水性媒体、シクロデキストリンもしくはその誘導体、アルブミン、リポ蛋白凝集剤、酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類等が含有されてもよい。
本発明のＲＬＰ−Ｃ定量用試薬およびキットにおける酵素、２種の界面活性剤は、水性媒体で溶解された状態でＲＬＰ−Ｃ定量方法の項に記載の濃度となる含量で構成される。【０１０９】  以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および機器を使用した。【０１１０】  ＭＯＰＳ（グッド緩衝剤；同仁化学研究所社製）、ＴＯＯＳ［トリンダー試薬（酸化カップリング型色原体）；同仁化学研究所社製］、４−アミノアンチピリン（半井化学社製）、硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、プロノンＢ−２０８｛ＰＯＥ・ＰＯＢ共重合体［界面活性剤（ｄ１）］；日本油脂社製｝、プロノンＢ−２０４｛ＰＯＥ・ＰＯＢ共重合体［界面活性剤（ｄ１）］；日本油脂社製｝、ワンダサーフＲＬ−１００｛ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル［界面活性剤（ｄ２）］；青木油脂社製｝、ワンダサーフＩＤ−７０｛ＰＯＥ・ＰＯＰ短鎖分岐アルキルエーテル［界面活性剤（ｄ２）］；青木油脂社製｝、ワンダサーフＩＤ−９０｛ＰＯＥ・ＰＯＰ短鎖分岐アルキルエーテル［界面活性剤（ｄ２）］；青木油脂社製｝、エマルゲンＬ−４０｛ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルアリールエーテル［界面活性剤（ｄ２）］；花王社製｝、プルロニックＦ−１０８（ＰＯＥ・ＰＯＰ共重合体；旭電化工業社製）、ホスホリパーゼＤ（旭化成社製）、コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ；協和発酵工業社製）、コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ；東洋紡績社製）、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）（東洋紡績社製）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）（旭化成社製）。
【実施例１】
【０１１１】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                  ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                                ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                            ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８                        ８ｇ／Ｌ
ワンダサーフ  ＲＬ−１００                  １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１１２】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                    ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．５ｇ／Ｌ
ワンダサーフＲＬ−１００                      １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例２】
【０１１３】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                                ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                            ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０４                        ８ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−７０                      １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                    １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）            ２Ｕ／ｍＬ【０１１４】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．５ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−７０                      １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例３】
【０１１５】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                              ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                          ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８                      ８ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１１６】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                    ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                          ３ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ【０１１７】比較例１
ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。当処方は、特開２００１−２３１５９７号公報の実施例１に記載された処方である。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                                ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                            ２ｇ／Ｌ
プルロニックＦ−１０８                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１１８】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                    ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                          ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ２Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例４】
【０１１９】  ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例１のキットを用いて、ヒト新鮮血清６４検体について、各検体中のＲＬＰ−Ｃを日立７１７０型自動分析機により、以下の方法により定量した。
（１）検量線の作成
ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた測定より、ＲＬＰ−Ｃ濃度が３２．４ｍｇ／ｄＬであることが判明している血清標準液を標準品として用いて、当該血清標準液を適宜希釈して調製した希釈血清を検量線作成用サンプルとした。【０１２０】  測定用キットとして実施例１のキットを用いて、以下の手順に従い、日立７１７０型自動分析機にて、各希釈血清中のＲＬＰ−Ｃ濃度を測定し、検量線を作成した。
反応セルへ希釈血清（３．８μＬ）と第１試薬（０．１８ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し（測光ポイント：１６）、次いで、この反応液に、３７℃に予め加温された第２試薬（０．０６ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した（測光ポイント：３２）。反応における吸光度変化（Ｅ２−Ｅ１）と希釈血清中のＲＬＰ−Ｃ濃度との関係から検量線を作成した。
（２）ヒト新鮮血清６４検体中のＲＬＰ−Ｃの定量
血清標準液の代わりにヒト新鮮血清６４検体を用いて、（１）と同様の方法により、該６４検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と（１）で作成した検量線とから、各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
【実施例５】
【０１２１】  ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例４の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例４の定量において使用したヒト新鮮血清６４検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
【実施例６】
【０１２２】  ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例４の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例４の定量において使用したヒト新鮮血清６４検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。【０１２３】比較例２
ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに比較例１のキットを用いる以外は実施例４の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例４の定量において使用したヒト新鮮血清６４検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。【０１２４】試験例１
ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた測定との相関
前述のヒト新鮮血清６４検体について、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いて、各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
各検体について、実施例４〜６および比較例２の定量法とＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いた定量法との相関性を相関係数で評価した。その結果を第１１表に示す。また、相関図を図１〜図４に示す。【０１２５】
【表１１】
0005027648.tif 000017
【０１２６】  第１１表に示すように、本発明の方法は、比較例２（特開２００１−２３１５９７号公報の実施例１に記載されたキットを用いた定量）に比較して、いずれも、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いた定量法との相関が良好な処方であることが判明した。【０１２７】試験例２
ＩＩＩ型高脂血症検体中のＲＬＰ−Ｃの定量
ＩＩＩ型高脂血症患者の血清検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）、実施例１〜３および比較例１のキットを用いて決定した。なお、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた測定より、ＲＬＰ−Ｃ濃度が３２．４ｍｇ／ｄＬであることが判明している血清標準液を標準品として用いて、当該血清標準液を適宜希釈して調製した希釈血清を検量線作成用サンプルとした。その結果を第１２表に示す。【０１２８】
【表１２】
0005027648.tif 000018
【０１２９】  ＩＩＩ型高脂血症患者の血清には、特にＶＬＤＬレムナントが多く存在することが知られている。従って、第１２表の結果から、本発明の定量法においては、比較例１のキット（特開２００１−２３１５９７号公報の実施例１に記載されたキット）に比較して、ＶＬＤＬレムナント中のコレステロールの反応性が向上していることがわかる。また、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いた定量法に比較しても、本発明の定量法においてはＲＬＰ−Ｃに対する反応性が高いことがわかる。
【実施例７】
【０１３０】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                              ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                          ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８                      ８ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        １ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−７０                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１３１】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                    ０．５ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−７０                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                            １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例８】
【０１３２】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                              ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                          ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８                      ８ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        １ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−７０                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１３３】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                    ０．５ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−７０                    １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                            １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例９】
【０１３４】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                              ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                          ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８                      ８ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        １ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−９０                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１３５】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                    ０．５ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−９０                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                            １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例１０】
【０１３６】  ＲＬＰ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＲＬＰ−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ                              ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                          ２ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８                      ８ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        １ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−９０                    １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）                  １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）          ２Ｕ／ｍＬ【０１３７】・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）                ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                    ０．５ｇ／Ｌ
ワンダサーフＩＤ−９０                    １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０                        １ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                            １０Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステル加水分解酵素（ＣＨＥＲ）    １Ｕ／ｍＬ
コレステロール酸化酵素（ＣＨＯＤ）              ３Ｕ／ｍＬ
ホスホリパーゼＤ                              ５Ｕ／ｍＬ
【実施例１１】
【０１３８】  ＲＬＰ−Ｃの定量
定量用キットとして、実施例１のキットの代わりに実施例７のキットを、検体として、実施例５〜８で使用したヒト新鮮血清６４検体の代わりにヒト新鮮血清３５検体を用いる以外は実施例４の定量法と同様の方法により、日立７１７０型自動分析装置により、当該３５検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
【実施例１２】
【０１３９】  ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例７のキットの代わりに実施例８のキットを用いる以外は実施例１１の定量法と同様の方法により、日立７１７０型自動分析装置により、ヒト新鮮血清３５検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
【実施例１３】
【０１４０】  ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例７のキットの代わりに実施例９のキットを用いる以外は実施例１１の定量法と同様の方法により、日立７１７０型自動分析装置により、ヒト新鮮血清３５検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
【実施例１４】
【０１４１】  ＲＬＰ−Ｃの定量
実施例７のキットの代わりに実施例１０のキットを用いる以外は実施例１１の定量法と同様の方法により、日立７１７０型自動分析装置により、ヒト新鮮血清３５検体の各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。【０１４２】試験例３
ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いた測定との相関
実施例１１〜１４で使用したヒト新鮮血清３５検体について、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ（日本抗体研究所社製）を用いて、各検体中のＲＬＰ−Ｃ濃度を定量した。
各検体について、実施例１１〜１４の定量法とＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いた定量法との相関性を相関係数で評価した。その結果を第１３表に示す。また、相関図を図５〜図８に示す。
【表１３】
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第１３表に示すように、界面活性剤（ｄ２）として２種類の界面活性剤を使用したキットにおいても、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いた定量法との間に良好な相関関係が認められた。また、第１１表に示した実施例４〜６との比較から、界面活性剤（ｄ２）を１種類使用したキットよりも、２種類使用したキットを用いた定量の方が、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いた定量法との間によりよい相関が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】  本発明により、動脈硬化性疾患の診断に有用なＲＬＰ−Ｃの定量方法、試薬およびキットが提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005027648.tif 000028
【図７】
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【図８】
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