(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体に対し、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼからなるヒアルロン酸分解酵素をｐＨ５〜１０にて作用せしめて重量平均分子量が１６００〜４４３０を有するコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法。
【化１】
0004993844.tif 000015
（上式中Ｒは、水素、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基を表す。）
【請求項２】
前記オキサゾリン誘導体が、２−メチル−［1,2−ジデオキシ−３−O−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−ガラクトピラノ−［2,1−ｄ］−２−オキサゾリンである請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
ほ乳類由来のヒアルロニダーゼが、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼあるいは羊睾丸由来ヒアルロニダーゼである請求項１又は２に記載の製造法。
【請求項４】
前記オキサゾリン誘導体の濃度が０．１重量％以上にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
温度が５〜６０℃にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸分解酵素を利用したコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の酵素的製造法に関する。更に詳しくは、ヒアルロン酸分解酵素であるほ乳類由来のヒアルロニダーゼを触媒とし、コンドロシンオキサゾリン誘導体をモノマー基質として酵素的に重合させてコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体を製造する方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
コンドロイチンは、D−グルクロン酸とN−アセチルガラクトサミンの二糖が直鎖状に交互に結合した枝分かれのない高分子多糖である。コンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は、化粧品、医薬品あるいは医用材料等として幅広く利用できる。
【０００３】
コンドロイチンは、牛の眼の角膜やスルメイカの皮等に含まれる他、軟骨組織に多量に存在するコンドロイチン硫酸Ａ又はＣの脱硫酸により得られることが知られている。コンドロイチンの製造法としては、含有量が比較的高いスルメイカの皮等からの抽出法が一般的であるが、純度を高くするためには多くの工程を要するため、経済的に不利である。また、前述のようにコンドロイチン硫酸Ａ又はＣの脱硫酸によっても製造することが可能であるが、コンドロイチン硫酸も軟骨組織等から抽出・精製する必要があるため有利な方法とは言い難い。
【０００４】
しかしながら、従来のコンドロイチンの製造方法である生体材料からの抽出法に替わりうる酵素化学的合成手法の開発は幾多の試行の結果においても、これまで達成されていないという課題があった。
【０００５】
本発明者らは、実用レベルにおいても有用性の高いコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の新規な製造法の開発について鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸分解酵素を用いた酵素化学的手法によるコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の新規な製造法を初めて見出した。
【０００６】
更に詳しくは、本発明者らは酵素化学的手法によるコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造において、本来ヒアルロン酸を分解する酵素として知られているヒアルロニダーゼを酵素重合触媒とし、コンドロシンオキサゾリン誘導体をモノマー基質とした場合に、モノマー基質が酵素的に重合されて高分子量のコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体が収率よく生成することを見出し本発明を完成するに至った。
【０００７】
【発明の開示】
即ち、本発明は、以下の構成を有することを特徴とする。
（１）下記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体に対し、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼからなるヒアルロン酸分解酵素をｐＨ５〜１０にて作用せしめて重量平均分子量が１６００〜４４３０を有するコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法。
【０００８】
【化２】
0004993844.tif 000002
（上式中Ｒは、水素、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基を表す。）
（２）前記オキサゾリン誘導体が、２−メチル−［1,2−ジデオキシ−３−O−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−ガラクトピラノ−［2,1−ｄ］−２−オキサゾリンである上記（１）に記載の製造法。
（３）ほ乳類由来のヒアルロニダーゼが、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼあるいは羊睾丸由来ヒアルロニダーゼである上記（１）又は（２）に記載の製造法。
（４）前記オキサゾリン誘導体の濃度が０．１重量％以上にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造法。
（５）温度が５〜６０℃にて前記オキサゾリン誘導体にヒアルロン酸分解酵素を作用せしめる上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳しく本発明を説明する。
本発明で使用する基質モノマーの一つであるコンドロシンオキサゾリン誘導体（６）を例に挙げ、合成の手順を以下に記す。また、図１に合成スキームを示す。
【００１０】
すなわち、メチル(2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル  トリクロロアセトイミデート)ウロネートを糖供与体、ベンジル 2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシドを糖受容体として用い、ジクロロメタン中、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf）を活性化剤として、アルゴン雰囲気下-20℃で１時間反応させることにより、ベンジル  2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（１）を合成した。（１）をチオ酢酸に溶解させ、乾燥雰囲気下室温で24時間反応させることにより、ベンジル  2-アセトアミド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（２）を合成した。（２）を酢酸と水に溶解させ、80℃で1時間撹拌し、ベンジル  2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシドを得た。続いて脱水ピリジン中、無水酢酸を０℃で滴下し、室温で３時間反応させることにより、ベンジル  2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（３）を得た。（３）を脱水メタノール中、水素雰囲気下で10%水酸化パラジウム炭素を触媒とする接触水素還元によりベンジル基の脱保護を行い、続いて脱水ピリジン中、無水酢酸を作用させ、2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（４）を得た。続いて脱水ジクロロメタン中、アルゴン雰囲気下、室温にて12時間、（４）にTMSOTfを作用させ、その後０℃にてトリエチルアミンを作用させることで、2-メチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジデオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1,d]-2-オキサゾリン（５）を得た。（５）を脱水メタノール中、ナトリウムメトキシドを作用させてすべてのアセチル基を脱保護し、反応溶液を減圧濃縮後、乾固させ、これを炭酸緩衝液(50mM,  pH  10.6)中で１時間撹拌することでメチルエステルを脱保護し、目的とする基質モノマーである2-メチル-[1,2-ジデオキシ-3-O-(ソディウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1,d]-2-オキサゾリン（６）を得た。
【００１１】
かくして得られたコンドロシンオキサゾリン誘導体は重合触媒としてのヒアルロン酸分解酵素の基質モノマーとして好適に使用される。酵素反応時の基質モノマー濃度は実用面から０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上で用いられる。
【００１２】
反応ｐＨは酵素の反応性と基質モノマーの安定性を考慮し、５〜１０望ましくは６．５〜９．５が好適に採用される。反応温度は５℃〜６０℃で、好ましくは、２０℃〜４０℃が用いられる。
【００１３】
使用するヒアルロン酸分解酵素としては、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼが好ましく、具体的にはエンド-β-N-アセチルヘキソサミダーゼ（EC3.2.1.35）に分類されるウシ睾丸由来又は羊睾丸由来ヒアルロニダーゼなどが好適であり、該酵素を適当な担体に固定化した固定化酵素の形態で使用することも可能である。バッチ反応あるいは連続反応形式いずれも採用される。
【００１４】
反応は水溶媒あるいは水溶媒にメタノール、エタノール、ｎ-プロパノール等のアルコール類、グリセリン、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ジメチルスルフォキシド、ジメチルフォルムアミド、酢酸エチル、ジオキサン、反応に悪影響を及ぼさない各種無機塩類又はｐＨ緩衝剤等を適宜添加した条件下でも進行する。
【００１５】
基質モノマーとしては、２−メチル−コンドロシンオキサゾリン誘導体（６）に限定されることはなく、ヒアルロニダーゼによる重合反応が進行するコンドロシンオキサゾリン基本構造を有する、前記一般式（Ｉ）のコンドロシンオキサゾリン誘導体であれば本発明に含まれる。
【００１６】
例えば、前記一般式（Ｉ）のＲが、水素あるいはメチルのかわりにエチル、プロピル、ブチルが使用可能である。
【００１７】
また、基質モノマーは、フリーの酸、ナトリウム，カリウム等の金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩等の形であれば特に限定されない。生成したコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は基質モノマーのグルクロン酸の塩の形態に依存し、フリーな酸あるいはナトリウム，カリウム等の金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの形態が含まれる。
【００１８】
上記条件下でバッチ反応を開始した場合、条件によって一概に規定できないが、数時間〜数日で反応は完了する。反応終了後、反応液を遠心分離、限外濾過、精密濾過、各種吸着カラム、溶媒沈殿及びクロマト分離などの公知精製手段を組み合わせることで高純度のコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体を単離精製することが出来る。かくして得られたコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は化粧品、医薬品あるいは医用材料等として幅広く利用できる。
【００１９】
【実施例】
以下に本発明の詳細な内容について実施例で説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
ベンジル  2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（１）の合成
遮光二口フラスコ中で、ベンジル  2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド（190mg，0.488mmol)とメチル(2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル  トリクロロアセトイミデート)ウロネート（280mg，0.585mmol）を脱水ジクロロメタン（5.00ml）に溶解させ、モレキュラーシーブス4A（MS4A；1.00g）を加え、アルゴン雰囲気下、-20℃で30分撹拌した。これにトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf；0.106ml，0.585mmol）を脱水ジクロロメタン（1.00ml）で希釈したものを-20℃で滴下し、１時間撹拌した。反応終了後トリエチルアミン（0.100ml）を加え、セライト濾過によりMS4Aを除去し、濾液をクロロホルムで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをセライトろ過により除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝3:1-1:1）にて精製し、白色結晶状のベンジル  2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（270mg，0.386mmol，収率79%）を得た。
【００２１】
分析データは、以下の通りである。
[α]Ｄ-10°（c=1.0，CHCl３）
１H  NMR（400MHz，CDCl３，TMS）：δ（ppm）；7.54-7.52（2H，m，aromatic），7.38-7.31（8H，m，aromatic)，5.56（1H，s，PhCH），5.26-5.22（2H，m，H-3’，H-4’），5.06（1H，dd，H-2’，J１’，２’=7.52Hz，J２’，３’=8.52Hz），4.99（1H，d，PhCH２，J=11.60Hz），4.92（1H，d，H-1’，J１’，２’=7.52Hz），4.69（1H，d，PhCH２，J=11.60Hz），4.37-4.29（3H，m，H-6a，H-1，H-4），4.09-4.02（2H，m，H-6b，H-5’），3.88（1H，dd，H-2，J１，２=8.04Hz，J２，３=10.5Hz），3.72（3H，s，COOCH３），3.49（1H，dd，H-3，J２，３=10.50Hz，J３，４=3.52Hz），3.37（1H，s，H-5），2.06-2.01（9H，m，Ac）
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋=700.2354m/z（C３３H３８N３O１４）
実測値  700.2357  m/z（+0.5ppm）
【００２２】
実施例２
ベンジル  2-アセトアミド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（２）の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル  2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（250mg，0.358mmol）をチオ酢酸（2.50ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、室温で24時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：トルエン/酢酸エチル＝1:0-1:3）にて精製し、白色結晶状のベンジル 2-アセトアミド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（220mg，0.307mmol，収率86%）を得た。
【００２３】
分析データは、以下の通りである。
[α]Ｄ-9.0°（c=1.0，CHCl３）
１H  NMR（400MHz，CDCl３，TMS）：δ（ppm）；7.57-7.52（2H，m，aromatic），7.37-7.30（8H，m，aromatic），5.75（1H，d，NH，JＮＨ，２=7.03Hz），5.57（1H，s，PhCH），5.23-5.19（3H，m，H-4’，H-3’，H-1），5.01（1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.29Hz），4.96-4.91（2H，m，PhCH２，H-1’），4.79（1H，dd，H-3，J２，３=11.5Hz，J３，４=3.53Hz），4.56（1H，d，PhCH２，J=12.10Hz），4.38-4.35（2H，m，H-6a，H-4），4.10（1H，dd，H-6b，J５，６ｂ=1.51Hz，J６ａ，６ｂ=11.80Hz)，4.01（1H，d，H-5’，J４’，５’=9.54Hz），3.69（3H，s，COOCH３），3.52-3.46（2H，m，H-2，H-5），2.02-2.01（9H，m，CH３CO），1.92（3H，s，CH３CONH）
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋=716.2554  m/z（C３５H４２NO１５）
実測値  716.2554  m/z（+0.0ppm）
【００２４】
実施例３
ベンジル  2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（３）の合成
ナスフラスコ中でベンジル 2-アセトアミド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（960mg，1.34mmol）を酢酸（12.0ml）と水（3.00ml）に溶解させ、80℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム/メタノール＝10:1）にて精製し、ベンジル  2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(メチル 2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（760mg，1.21mmol，収率90%）を得た。次に、得られた化合物（760mg，1.21mmol）をピリジン（10.0ml）に溶解させ、無水酢酸（0.467ml，4.84mmol）を０℃で滴下し、乾燥雰囲気下、室温で３時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈し、4%(w/v)硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをセライト濾過により除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:2-1:4）にて精製し、白色結晶状のベンジル  2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（700mg，0.984mmol，収率81%）を得た。
【００２５】
分析データは、以下の通りである。
[α]Ｄ-20°（c=1.0，CHCl３）
融点：173-174℃
１H  NMR（400MHz，CDCl３，TMS）：δ（ppm）；7.37-7.29（5H，m，aromatic），5.64（1H，d，NH，JＮＨ，２=7.03Hz），5.39（1H，d，H-4，J３，４=3.01Hz），5.22-5.14（2H，m，H-4’，H-3’），5.02（1H，d，H-1，J１，２=8.03Hz），4.97（1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.53Hz），4.89（1H，d，PhCH２，J=11.80Hz），4.70-4.65（2H，m，H-1’，H-3），4.58（1H，d，PhCH２，J=11.80Hz），4.17（1H，dd，H-6a，J５，６ａ=6.28Hz，J６ａ，６ｂ=11.29Hz），4.08（1H，dd，H-6a，J５，６ａ=6.28Hz，J６ａ，６ｂ=11.29Hz），3.98（1H，d，H-5’，J４’，５’=9.54Hz），3.87（1H，t，H-5，J５，６ａ=J５，６ｂ=6.28Hz），3.75（3H，s，COOCH３），3.46（1H，ddd，H-2，J１，２=8.03Hz，JＮＨ，２=7.03Hz，J２，３=9.28Hz），2.09-2.00（15H，m，CH３CO），1.89（3H，s，CH３CONH）
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋=712.2453  m/z（C３２H４２NO１７）
実測値  712.2453  m/z（+0.0ppm）
【００２６】
実施例４
2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（４）の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル  2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（700mg，0.984mmol）をメタノール（20.0ml）に溶解させ、10%水酸化パラジウム炭素（200mg）を加え、室温で水素雰囲気下、３時間撹拌した。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより10%水酸化パラジウム炭素を除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣を減圧下、一晩乾燥させ、得られた白色非晶状物質をピリジン（10.0ml）に溶解させ、無水酢酸（0.315ml，3.23mmol）を０℃で滴下し、乾燥雰囲気下、室温で３時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、4%(w/v)硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライト濾過により硫酸マグネシウムを除去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル)にて精製し、無色非晶状の2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（680mg，1.03mmol，α/β=1/1）を定量的に得た。
【００２７】
分析データは、以下の通りである。
１H  NMR（400MHz，CDCl３，TMS）：δ（ppm）；6.34-6.32（2H，m，H-1α，NHα），5.89（1H，d，H-1β，J１，２=8.53Hz），5.78（1H，d，NHβ，J２，ＮＨ=8.03Hz），5.49（1H，d，H-4β，J３，４=3.01Hz），5.29-5.13（7H，m，H-4α，H-3’αβ，H-4’αβ，H-2’α），5.02（1H，dd，H-2’β，J１’，２’=8.03Hz，J２’，３’=8.53Hz），4.86（1H，d，H-1’α，J１’，２’=8.03Hz），4.77（1H，d，H-1’β，J１’，２’=8.03Hz），4.55（1H，ddd，H-2α，J１，２=3.52Hz，J２，ＮＨ=7.03Hz，J２，３=8.53Hz），4.38（1H，dd，H-3β，J２，３=10.79Hz，J３，４=3.01Hz），4.24-3.97（11H，m，H-3α，H-6αβ，H-5’αβ，H-2β，H-5αβ），3.76（6H，s，COOCH３），2.19-2.02（36H，m，CH３CO），1.93-1.90（6H，d，CH３CONH）
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋=664.2089  m/z（C２７H３８NO１８）
実測値  664.2092  m/z（+0.4ppm）
【００２８】
実施例５
2-メチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジデオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1-d]-2-オキサゾリン（５）の合成
二口フラスコ中で、アルゴン雰囲気下、2-アセトアミド-4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（200mg，0.301mmol）を脱水ジクロロメタンに溶解させ、０℃でTMSOTf（0.110ml，0.603mmol）を滴下し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、０℃でトリエチルアミン（0.200ml）を加え、室温で30分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:2-2:5）にて精製し、無色非晶状の2-メチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジデオキシ-3-O-(メチル 2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1-d]-2-オキサゾリン（161mg，0.268mmol，収率89%）を得た。
【００２９】
分析データは、以下の通りである。
[α]Ｄ+34°（c=1.0，CHCl３）
１H  NMR（400MHz，CDCl３，TMS）：δ（ppm）；5.93（1H，d，H-1，J１，２=6.53Hz），5.40（1H，d，H-4，J３，４=3.51Hz），5.30-5.20（2H，m，H-3’，H-4’），5.07（1H，d，H-1’，J１’，２’=8.03Hz），4.99（1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.03Hz），4.18-4.12（3H，m，H-6，H-5），4.08（1H，d，H-5’，J４’，５’=9.53Hz），3.93（1H，dd，H-3，J２，３=6.53Hz，J３，４=3.51Hz），3.83（1H，t，H-2，J１，２=J２，３=6.53Hz），3.76（3H，s，COOCH３），2.08-2.02（18H，m，CH３CO，CH３C  of  oxazoline）
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋=604.1877  m/z（C２５H３４NO１６）
実測値  604.1879  m/z（+0.3ppm）
【００３０】
実施例６
2-メチル-[1,2-ジデオキシ-3-O-(ソディウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1-d]-2-オキサゾリン（６）の合成
二口フラスコ中で、アルゴン雰囲気下、2-メチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジデオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1-d]-2-オキサゾリン（240mg，0.398mmol）をメタノール（1.00ml）に溶解させ、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（0.500ml，0.0795mmol）を加え、室温で30分撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、凍結乾燥させた。これを炭酸緩衝液（50mM，pH 10.6，3.98ml）に溶解させ、室温で1時間撹拌し、これをそのまま凍結乾燥させることにより、2-メチル-[1,2-ジデオキシ-3-O-(ソディウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1-d]-2-オキサゾリン（160mg，純度82%）を得た。
【００３１】
分析データは、以下の通りである。
１H  NMR（400MHz，D２O，Acetone）：δ（ppm）；5.92（1H，d，H-1，J１，２=7.03Hz），4.47（1H，d，H-1’，J１’，２’=8.03Hz），4.00（1H，d，H-4，J３，４=3.52Hz），3.80-3.73（2H，m，H-2，H-5），3.64-3.52（4H，m，H-3，H-6，H-5’），3.34-3.32（2H，m，H-4’，H-3’），3.21（1H，dd，H-2’，J１’，２’=8.03Hz，J２’，３’=9.03Hz），1.84（3H，s，CH３C  of  oxazoline）
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋=402.1012  m/z（C１４H２０NNaO１１）
実測値  402.1018  m/z（+1.4ppm）
【００３２】
実施例７
酵素触媒重合によるコンドロイチンの合成
基質モノマーである2-メチル-[1,2-ジデオキシ-3-O-(ソディウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1-d]-2-オキサゾリン（5.00mg，12.5μmol）をリン酸緩衝液（50mM，pH  7.5，125μl）に溶解させ、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（ICN  Biochemicals社製，Lot  No.6830B，2160units/mg，以降、H-OTHと記す）を0.500mg加え、30℃で24時間反応を行った。反応終了後、反応液を90℃の湯浴中にて３分間加温することにより酵素を失活させ、次いで過剰量のTHFを加え、生じた沈殿を遠心分離することにより回収した。得られた沈殿を再び純水に溶解させ、重合生成物の水溶液を得た。重合生成物の基質モノマーに対する収率と分子量は、得られた水溶液のGPC測定結果より、収率＝50%，Mｎ＝2100，Mｗ＝2500であった。なお、GPC測定において、分子量は、分子量マーカーとしてヒアルロン酸ナトリウム塩（Mｎ＝800，2000，4000）を用いて作成した検量線を用いて算出し、収率は、天然のコンドロイチン硫酸を脱硫酸することにより調製されたコンドロイチンナトリウム塩（生化学工業社製，Mn＝4000，Mw＝5000）を用いて作成した検量線を用いて算出された濃度より求めた。GPC測定条件を以下に示す。
GPC条件
検出器    ：示差検出計
カラム    ：Shodex  Ohpak  SB-803HQ
カラム温度：40℃
移動相    ：0.1M  硝酸ナトリウム
流量      ：0.5ml/min
上記の水溶液から、Sephadex  G-10  サイズ排除クロマトグラフィーを用いて生成コンドロイチンを精製した。得られたコンドロイチンの１H  NMRスペクトルを図２に、１３C  NMRスペクトルを図３及び図４（図３の糖骨格部分の拡大図）に示す。これらのスペクトルは天然由来のコンドロイチンのスペクトルと一致した。
【００３３】
NMRスペクトルのピークの帰属は、以下の通りである。
１H  NMR（400MHz，D２O，Acetone）：δ（ppm）；4.31（2H，bs，H-1，H-1’），3.92（1H，bs，H-4），3.80（1H，bt，H-2），3.63-3.50（6H，m，H-3，H-4，H-5’，H-6，H-5），3.41（1H，bt，H-3’），3.17（1H，bt，H-2’），1.82（1H，s，CH３CO）
１３C  NMR（100MHz，D２O，Acetone）：δ（ppm）；174.55（C-6’），173.91（CH３CO），103.90（C-1’），100.43（C-1），79.87（C-3），79.26（C-4’），75.82（C-5’），74.53（C-5），73.26（C-3’），71.98（C-2’），67.30（C-4），60.63（C-6），50.56（C-2），22.04（CH３CO）
【００３４】
実施例８
種々の酵素を用いたコンドロイチンの合成
重合反応における触媒酵素として、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（ICN Biochemicals社製，Lot  No.9303B，560units/mg，以降、OTHと記す），牛精巣由来ヒアルロニダーゼ（SIGMA社製，Lot  No.30K7049，330units/mg，以降、BTHと記す），H-OTH，又は牛精巣由来ヒアルロニダーゼ（SIGMA社製，Lot  No.38H7026，1010units/mg，以降、H-BTHと記す）を用い、反応時間を23時間又は40時間とした以外は実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表１に示す。いずれのヒアルロニダーゼを用いてもコンドロイチンの合成が可能であった。
【００３５】
【表１】
0004993844.tif 000003
【００３６】
実施例９
コンドロイチン合成における反応ｐＨの影響
重合反応において、触媒酵素として３種のヒアルロニダーゼ（OTH，BTH又はH-OTH）を用い、表２中に示す反応時間とし、表２中に示すｐＨのリン酸緩衝液を用いることにより反応ｐＨを変更した以外は実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表２に示す。また、ヒアルロニダーゼとしてOTH又はBTHを用いたｐＨ７．０と８．０の反応液における基質モノマーの残存率の経時変化を表３，表４及び図５に示す。この基質モノマーの残存率は、一定時間毎に反応液から30μlを採取し、以下のHPLC条件で保持時間７．３〜７．４分に現われるピークの面積比から算出した。
HPLC条件
検出      ：UV  220nm
カラム    ：Shodex  Asahipak  NH2P-50  4E
カラム温度：30℃
移動相    ：リン酸緩衝液（10mM，pH7.0）30%  ＋  アセトニトリル  70%
流量      ：0.5ml/min
表３，表４及び図５に示す結果から、OTH又はBTHを添加した系では添加していない系と比較して有意にモノマー消費が促進されていることが明らかとなり、コンドロシンオキサゾリン誘導体が両酵素により認識され、オキサゾリン環の開環反応が起こっていることが明らかとなった。
【００３７】
【表２】
0004993844.tif 000004
【００３８】
【表３】
0004993844.tif 000005
【００３９】
【表４】
0004993844.tif 000006
【００４０】
実施例１０
コンドロイチン合成における酵素濃度の影響
重合反応において、触媒酵素であるH-OTHの添加量と反応時間を表５に記載の条件に変更した以外は、実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表５に示す。
【００４１】
【表５】
0004993844.tif 000007
【００４２】
実施例１１
コンドロイチン合成における反応温度の影響
重合反応において、反応温度及び反応時間を表６に記載の条件に変更した以外は、実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
0004993844.tif 000008
【００４４】
実施例１２
コンドロイチン合成における基質モノマー濃度の影響
重合反応において、基質モノマーである2-メチル-[1,2-ジデオキシ-3-O-(ソディウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ]-[2,1,d]-2-オキサゾリンの添加量及び反応時間を表７に記載の条件に変更した以外は、実施例７と同様の反応及び分析を行った結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
0004993844.tif 000009
【００４６】
実施例１３
ベンジル  4,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（７）の合成
実施例１で得た、ベンジル  2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（１）（555mg，0.793mmol）を80%酢酸水溶液（15ml）に溶解させ、80℃で1時間反応させる事により、4,6-O-ベンジリデン基を脱保護した。続いて、反応溶液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:3）にて精製し、ベンジル  2-アジド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（453mg，0.741mmol，収率93%）を得た。次に、得られた化合物（453mg，0.741mmol）をピリジン（10ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃にて無水酢酸（0.431ml，4.44mmol）を滴下し、室温で4時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈し、4%(w/v)硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをセライトろ過により除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:1）にて精製し、白色結晶状のベンジル  4,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（７）（478mg，0.687mmol，収率93%）を得た。分析データは以下の通りである。
[α]Ｄ+0.12°(c=1.0，CHCl３)
mp  144-145℃
１H  NMR(400MHz,CDCl３,TMS)δ(ppm);7.39-7.31(5H，m，aromatic)，5.33(1H，d，H-4，J３，４=3.01Hz)，5.23-5.21(2H，m，H-4’,H-3’)，4.99-4.93(2H，m，H-2’,PhCH２),4.80(1H,d,H-1’,J１’，２’=8.03Hz)，4.70(1H，d，PhCH２,J=12.05Hz)，4.29(1H，d，H-1，J１，２=8.03Hz)，4.17(1H，dd，H-6a，J５，６ａ=5.52Hz，J６ａ，６ｂ=11.54Hz)，4.08(1H，dd，H-6a，J５，６ａ=7.02Hz，J６ａ，６ｂ=11.54Hz)，3.98(1H，d，H-5’,J４’，５’=10.04Hz)，3.75(3H，s，COOCH３)，3.73-3.64(2H，m，H-5，H-2)，3.53(1H,dd,H-3，J２，３=10.54Hz，J３，４=3.01Hz)，2.11-2.01(15H，m，CH３CO)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝696.2252  m/z（C３０H３８N３O１６）
実測値  696.2249  m/z(-0.4ppm)
【００４７】
実施例１４
4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-2-プロパンアミド-D-ガラクトピラノシル アセテート（８）の合成
ベンジル  4,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（７）（100mg，0.144mmol）をメタノール（10ml）に溶解させ、10%水酸化パラジウム炭素（50mg）を加え、室温で水素雰囲気下、4時間反応させる事によりアジド基をアミノ基へ変換し、同時にベンジル基の脱保護を行った。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより10%水酸化パラジウム炭素を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（10ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃にてトリエチルアミン（1ml）、続いて無水プロピオン酸（0.180ml，1.44mmol）を加え、その後室温で2時間反応させた。反応終了後、ピリジン（1ml）を加え、反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を減圧下、一晩乾燥させた。乾燥後、得られた白色非晶状物質をピリジン（10ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃で無水酢酸（0.084ml，0.863mmol）を滴下し、その後室温で3時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、4%(w/v)硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:4）にて精製し、無色非晶状の4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-2-プロパンアミド-D-ガラクトピラノシル  アセテート（８）（37.0mg，0.0546mmol，収率38%，α/β＝5/1）を得た。分析データは以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，CDCl３,TMS)δ(ppm);6.34(1H，d，H-1α，J１，２=3.51Hz)，6.16(1H，d，NHα，J１，２=8.03Hz)，5.90(1H，d，H-1β，J１，２=8.52Hz)，5.62(1H，d，NHβ，J２，ＮＨ=8.52Hz)，.27(1H，s，H-4α)，5.25-5.13(3H，m，H-3’α，H-4’α，H-2’α)，4.85(1H，d，H-1’α,J１’，２’=8.04Hz)，4.57(1H，ddd，H-2α，J１，２=3.51Hz,J２，ＮＨ=8.03Hz,J２，３=8.53Hz)，4.23-4.19(2H，m，H-3α，H-6aα)，4.11-4.07(2H，m，H-5’α，H-6bα)，4.00(1H，dd，H-5α，J５，６ａ=6.53Hz，J５，６ｂ=11.54Hz)，3.76(3H，s，COOCH３)，2.19-2.01(20H，m，CH３CO，CH３CH２CONH)，1.09(3H，t，CH３CH２CONH，J=8.03Hz)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝678.2245  m/z（C２８H４０NO１８）
実測値  678.2248  m/z(+0.4ppm)
【００４８】
実施例１５
2-エチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１１）の合成
4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-2-プロパンアミド-D-ガラクトピラノシル  アセテート（８）（100mg，0.148mmol）を脱水ジクロロメタンに溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf；0.0404ml，0.221mmol）を滴下し、室温で18時間撹拌した。反応終了後、0℃でトリエチルアミン（0.1ml）を加え、室温で30分撹拌した後、反応溶液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:2-2:5，トリエチルアミン 0.5%）にて精製し、無色非晶状の2-エチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１１）（75.0mg，0.121mmol，収率82%）を得た。分析データは以下の通りである。
[α]Ｄ+20°(c=0.75，CHCl３)
１H  NMR(400MHz，CDCl３，TMS)δ(ppm);5.93(1H，d，H-1，J１，２=7.02Hz)，5.38(1H，d，H-4，J３，４=3.51Hz，J４，５=2.00Hz)，5.31-5.20(2H，m，H-3’，H-4’)，5.09(1H，d，H-1’，J１’，２’=7.52Hz)，5.00(1H，dd，H-2’，J１’，２’=7.52Hz，J２’，３’=8.53Hz)，4.16-4.11(3H，m，H-6，H-5)，4.05(1H，d，H-5’，J４’，５’=9.53Hz)，3.94(1H，dd，H-3，J２，３=7.02Hz，J３，４=3.51Hz)，3.83(1H，t，H-2，J１，２=J２，３=7.02Hz)，3.76(3H，s，COOCH３)，2.32(2H，q，CH３CH２  of  oxazoline，J=7.53Hz)，2.08-2.02(15H，m，CH３CO)，1.18(3H，t，CH３CH２  of  oxazoline，J=7.53Hz)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝618.2034  m/z（C２６H３６NO１６）
実測値  618.2035  m/z(+0.1ppm)
【００４９】
実施例１６
2-エチル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１４）
2-エチル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１１）（75mg，0.121mmol）をメタノール（1.21ml）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（2.34mg，0.0121mmol）を加え、0℃で30分、その後室温で30分撹拌することにより全てのO-アセチル基を脱保護した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた。続いて化合物を炭酸緩衝液（50mM，pH  10.6，1.21ml）に溶解させ、室温で1時間撹拌することによりメチルエステルを脱保護した。反応終了後、反応液をそのまま凍結乾燥させ、2-エチル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１４）（56mg，純度93%）を得た。分析データは以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，D２O，acetone)δ(ppm);5.91(1H，d，H-1，J１，２=7.53Hz)，4.47(1H，d，H-1’，J１’，２’=8.03Hz)，4.00(1H，s，H-4)，3.78-3.73(2H，m，H-2，H-5)，3.63-3.52(4H，m，H-3，H-6，H-5’)，3.34-3.32(2H，m，H-4’，H-3’)，3.22(1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.03Hz)，2.16(2H，q，CH３CH２  of  oxazoline，J=7.53Hz)，0.96(3H，t，CH３CH２  of  oxazoline，J=7.53Hz)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝416.1169  m/z（C１５H２３NO１１Na）
実測値  416.1161  m/z(-1.8ppm)
【００５０】
実施例１７
4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-2-(2-メチルプロパンアミド)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（９）の合成
実施例１３で得たベンジル  4,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（７）（315mg，0.453mmol）をメタノール（30ml）に溶解させ、10%水酸化パラジウム炭素（150mg）を加え、水素雰囲気下、室温で3.5時間反応させる事によりアジド基をアミノ基へ変換し、同時にベンジル基の脱保護を行った。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより10%水酸化パラジウム炭素を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（30ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃でトリエチルアミン（1ml）、続いて無水イソ酪酸（0.240ml，1.44mmol）を加え、室温で2時間反応させた。反応終了後、ピリジン（3ml）を加え、反応溶液を減圧乾固させた。乾燥後、得られた白色非晶状物質をピリジン（30ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃で無水酢酸（0.265ml，2.72mmol）を滴下し、室温で6時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、4%(w/v)硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:2-1:3）にて精製し、無色非晶状の4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-2-(2-メチルプロパンアミド)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（９）（129mg，0.187mmol，収率41%，α/β＝20/3）を得た。分析データは以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，CDCl３，TMS)δ(ppm);6.35(1H，d，H-1α，J１，２=3.51Hz)，6.10(1H，d，NHα，J１，２=7.53Hz)，5.90(1H，d，H-1β，J１，２=8.54Hz)，5.27(1H，d，H-4α，J３，４=2.00Hz)，5.26-5.13(3H，m，H-3’α，H-4’α，H-2’α)，4.84(1H，d，H-1’α，J１’，２’=8.53Hz)，4.55(1H，ddd，H-2α，J１，２=3.51Hz，J２，ＮＨ=7.53Hz，J２，３=8.53Hz)，4.25-4.20(2H，m，H-3α，H-6aα)，4.11-4.07(2H，m，H-5’α，H-6bα)，4.00(1H，dd，H-5a，J５，６ａ=6.52Hz，J５，６ｂ=11.04Hz)，3.76(3H，s，COOCH３)，2.27(1H，m，(CH３)２CHCONH)，2.19-1.95(18H，m，CH３CO)，1.10-1.04(6H，m，(CH３)２CHCONH)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝692.2402  m/z（C２９H４２NO１８）
実測値  692.2402  m/z(+0.1ppm)
【００５１】
実施例１８
2-イソプロピル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１２）の合成
4,6-ジ-O-アセチル-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-2-(2-メチルプロパンアミド)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（９）（118mg，0.171mmol）を脱水ジクロロメタンに溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃でTMSOTf（0.047ml，0.256mmol）を滴下し、室温で15時間撹拌した。反応終了後、0℃でトリエチルアミン（0.1ml）を加え、室温で30分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:1，トリエチルアミン 0.5%）にて精製し、無色非晶状の2-イソプロピル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１２）（82.0mg，0.130mmol，収率76%）を得た。分析データは以下の通りである。
[α]Ｄ+17°(c=0.82，CHCl３)
１H  NMR(400MHz，CDCl３，TMS)δ(ppm);5.91(1H，d，H-1，J１，２=7.03Hz)，5.36(1H，t，H-4，J３，４=J４，５=2.51Hz)，5.31-5.19(2H，m，H-3’，H-4’)，5.09(1H，d，H-1’，J１’，２’=8.53Hz)，5.00(1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.53Hz)，4.15-4.09(3H，m，H-6，H-5)，4.03(1H，d，H-5’，J４’，５’=9.54Hz)，3.94(1H，dd，H-3，J２，３=7.03Hz，J３，４=2.51Hz)，3.83(1H，t，H-2，J１，２=J２，３=7.03Hz)，3.75(3H，s，COOCH３)，2.58(1H，m，(CH３)２CHCONH)，2.08-2.02(15H，m，CH３CO)，1.20-1.18(6H，m，(CH３)２CHCONH)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝632.2190  m/z（C２７H３８NO１６）
実測値  632.2186  m/z(-0.7ppm)
【００５２】
実施例１９
2-イソプロピル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１５）の合成
2-イソプロピル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１２）（82.0mg，0.130mmol）をメタノール（1.29ml）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（2.5mg，0.013mmol）を加え、0℃で1時間、室温で1時間撹拌後、さらにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（2.5mg，0.013mmol）を加え、室温で1時間反応させる事により全てのO-アセチル基を脱保護した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた。乾燥後、化合物を炭酸緩衝液（50mM，pH 10.6，1.3ml）に溶解させ、室温で1時間攪拌する事によりメチルエステルを脱保護した。反応終了後、反応液をそのまま凍結乾燥させ、2-イソプロピル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１５）（65mg，純度83%）を得た。分析データは以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，D２O，acetone)δ(ppm);5.91(1H，d，H-1，J１，２=7.03Hz)，4.46(1H，d，H-1’，J１’，２’=8.03Hz)，4.01(1H，d，H-4，J３，４=2.01Hz)，3.77-3.73(2H，m，H-2，H-5)，3.65-3.52(4H，m，H-3，H-6，H-5’)，3.36-3.30(2H，m，H-4’，H-3’)，3.23(1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.03Hz)，2.45(1H，m，(CH３)２CHCONH)，1.01-0.97(6H，m，(CH３)２CHCONH)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝430.1325  m/z（C１６H２５NO１１Na）
実測値  430.1323  m/z(-0.5ppm)
【００５３】
実施例２０
4,6-ジ-O-アセチル-2-ベンズアミド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（１０）の合成
実施例１３で得たベンジル  4,6-ジ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-β-D-ガラクトピラノシド（７）（300mg，0.431mmol）をメタノール（30ml）に溶解させ、10%水酸化パラジウム炭素（150mg）を加え、水素雰囲気下、室温で3.5時間反応させる事によりアジド基をアミノ基へ変換し、同時にベンジル基の脱保護を行った。反応終了後、反応溶液をセライト濾過することにより10%水酸化パラジウム炭素を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（30ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃でトリエチルアミン（1ml）と塩化ベンゾイル（0.1ml，0.863mmol）を加え、1時間反応させた。反応終了後、ピリジン（3ml）を加え、反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を減圧下、一晩乾燥させた。乾燥後、得られた白色非晶状物質をピリジン（30ml）に溶解させ、乾燥雰囲気下、0℃で無水酢酸（0.252ml，2.59mmol）を滴下し、室温で3時間反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、残渣をクロロホルムで希釈した後、4%(w/v)硫酸水素カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン/酢酸エチル＝1:1-1:2）にて精製し、無色非晶状の4,6-ジ-O-アセチル-2-ベンズアミド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（１０）（180mg，0.248mmol，収率58%，α/β＝5/2）を得た。分析データは以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，CDCl３，TMS)δ(ppm);7.72-7.37(5H，m，aromatic)，6.55(1H，d，NHα，J２，ＮＨ=7.53Hz)，6.44(1H，d，H-1α，J１，２=3.01Hz)，6.16(1H，d，H-1β，J１，２=9.04Hz)，5.37(1H，d，H-4α，J３，４=2.00Hz)，5.23-5.10(3H，m，H-3’α，H-4’α，H-2’α)，4.87(1H，d，H-1’α，J１’，２’=8.03Hz)，4.83(1H，ddd，H-2α，J１，２=3.01Hz，J２，ＮＨ=7.53Hz，J２，３=8.54Hz)，4.37(1H，dd，H-3α，J２，３=8.54Hz，J３，４=2.00Hz)，4.28(1H，dd，H-6aα，J５，６ａ=5.52Hz，J６ａ，６ｂ=11.04Hz)，4.14(1H，dd，，H-6bα，J５，６ｂ=7.03Hz，J６ａ，６ｂ11.04Hz)，4.06-4.00(2H，dd，H-5’α，H-5α)，3.62(3H，s，COOCH３)，2.20-1.91(18H，m，CH３CO)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝726.2245  m/z（C３２H４０NO１８）
実測値  726.2248  m/z(+0.3ppm)
【００５４】
実施例２１
2-フェニル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル 2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１３）の合成
4,6-ジ-O-アセチル-2-ベンズアミド-2-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-D-ガラクトピラノシル  アセテート（１０）（180mg，0.248mmol）を脱水ジクロロメタン（9ml）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃でTMSOTf（0.0680ml，0.372mmol）を滴下し、その後室温で12時間撹拌した。反応終了後、0℃でトリエチルアミン（0.2ml）を加え、室温で30分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：トルエン/酢酸エチル＝3:1-2:1，トリエチルアミン 0.5%）にて精製し、無色非晶状の2-フェニル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１３）（105mg，0.158mmol，収率64%）を得た。分析データは以下の通りである。
[α]Ｄ+30°(c=1.0，CHCl３)
１H  NMR(400MHz，CDCl３，TMS)δ(ppm);7.96-7.43(5H，m，aromatic)，6.15(1H，d，H-1，J１，２=6.02Hz)，5.42(1H，s，H-4)，5.33(1H，t，H-3’，J２’，３’=J３’，４’=8.29Hz)，5.27-5.19(2H，m，H-4’，H-1’)，5.04(1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=8.29Hz)，4.17(3H，m，H-6，H-5)，4.11-4.02(3H，m，H-5’，H-2，H-3)，3.72(3H，s，COOCH３)，2.10-2.04(15H，m，CH３CO)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝666.2034  m/z（C３０H３６NO１６）
実測値  666.2043  m/z(+1.3ppm)
【００５５】
実施例２２
2-フェニル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１６）の合成
2-フェニル-[4,6-ジ-O-アセチル-1,2-ジ-デオキシ-3-O-(メチル  2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１３）（105mg，0.158mmol）をメタノール（1.58ml）に溶解させ、アルゴン雰囲気下、0℃でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（3.04mg，0.0158mmol）を加え、0℃で0.5時間、室温で1時間撹拌後、さらにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（3.04mg，0.0158mmol）を加え、室温で0.5時間撹拌することにより全てのO-アセチル基を脱保護した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた。乾燥後、化合物を炭酸緩衝液（50mM，pH  10.6，1.58ml）に溶解させ、室温で1時間撹拌することによりメチルエステルを脱保護した。反応終了後、反応液を凍結乾燥させ、2-フェニル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１６）（60mg，純度87%）を得た。分析データは以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，D２O，acetone)δ(ppm);7.77-7.34(5H，m，aromatic)，6.13(1H，d，H-1，J１，２=7.03Hz)，4.53(1H，d，H-1’，J１’，２’=7.53Hz)，4.06(1H，d，H-4，J３，４=2.51Hz)，4.00(1H，dd，H-2，J１，２=7.03Hz，J２，３=7.53Hz)，3.83(1H，dd，H-5，J５，６ａ=7.53Hz，J５，６ｂ=11.54Hz)，3.74(1H，dd，H-3，J２，３=7.53，J３，４=7.53Hz)，3.68-3.52(3H，m，H-6a，H-6b，H-5’)，3.45-3.32(2H，m，H-4’，H-3’)，3.27(1H，t，H-2’，J１’，２’=J２’，３’=7.53Hz)
High  resolution  FAB  MS：計算値  [M+H]＋＝464.1169  m/z（C１９H２３NO１１Na）
実測値  464.1173  m/z(+0.9ppm)
【００５６】
実施例２３
酵素触媒重合によるコンドロイチン誘導体の合成
基質モノマーである2-エチル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１４）（5.00mg，12.0μmol）、2-イソプロピル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１５）（5.00mg，11.6μmol）、2-フェニル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１６）（5.00mg，10.8μmol）、をそれぞれ120μl、116μl、108μlのリン酸緩衝液（50mM，pH7.5）に溶解させ、それぞれに羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（H-OTH；2502units/mg，Lot  No.8838E）を0.5mg加え、30℃で反応を行った。表８、表９、表１０中に示す各時間において反応液から3.0μlを採取し、実施例９と同じ条件でHPLC分析を行い、保持時間6分に現れるピークの面積比からモノマー残存率を求めた。その経時変化を酵素非添加の場合と比較して表８、表９、表１０及び図７、図８、図９に示す。反応終了後、反応液を90℃の湯浴中にて3分間加温することにより酵素を失活させ、次いで過剰量のTHFを加え、生じた沈殿を遠心分離することにより回収した。得られた沈殿を再び純水に溶解させ、重合生成物の水溶液を得た。得られた水溶液のGPC測定により求めた重合生成物の基質モノマーに対する収率と分子量を表１１に示す。なお、GPC測定及び検量線の作成は実施例７と同じ条件にて行った。基質モノマー（１４）及び（１５）を用いた反応液から得られた重合生成物の水溶液から、Sephadex  G-10サイズ排除クロマトグラフィーを用いて重合生成物を精製した。基質モノマー（１４）から得られた生成物の１H及び１３C  NMRスペクトルをそれぞれ図１０及び１１に示す。これらのスペクトルより、この生成物は、図６における（１７）の構造（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ３）有するコンドロイチン誘導体であることが明らかとなった。
【００５７】
NMRスペクトルの帰属は、以下の通りである。
１H  NMR(400MHz，D２O，acetone)δ(ppm);4.38(1H，d，H-1，J１，２=8.53Hz)，4.34(1H，d，H-1’，J１’，２’=8.03Hz)，3.98(1H，s，H-4)，3.88(1H，t，H-2，J１，２=8.53Hz)，3.69-3.52(6H，m，H-3，H-4’，H-5’，H-6a，H-6b，H-5)，3.43(1H，t，H-3’，J２’，３’=8.03Hz)，3.22(1H，t，H-2’，J１’，２’=8.03Hz)，2.16(2H，q，CH３CH２CO，J=7.53Hz)，0.97(3H，t，CH３CH２CO，J=7.53Hz)
１３CNMR(100MHz，D２O，acetone)δ(ppm);179.54(C-6’)，175.35(CH３CH２CO)，105.02(C-1’)，101.41(C-1)，80.86(C-3)，80.06(C-4’)，77.17(C-5’)，75.69(C-5)，74.38(C-3’)，73.26(C-2’)，68.60(C-4)，61.85(C-6)，51.60(C-2)，30.17(CH３CH２CO)，9.96(CH３CH２CO)
【００５８】
【表８】
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【００５９】
【表９】
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【００６０】
【表１０】
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【００６１】
【表１１】
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【００６２】
実施例２４
コンドロイチン誘導体合成反応の経時変化
基質モノマーである2-エチル-[1,2-ジ-デオキシ-3-O-(ソジウム  β-D-グルコピラノシルウロネート)-α-D-ガラクトピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリン（１４）（15.0mg，36.0μmol）を360μlのリン酸緩衝液（50mM，pH  7.5）に溶解させ、羊精巣由来ヒアルロニダーゼ（H-OTH；2502units/mg，Lot  No.8838E）を1.5mg加え、30℃で反応を行った。表１２中に示す各時間に反応液20μlを採取し、90℃の湯浴中にて3分間加温することにより酵素を失活させたのち、実施例２３と同じ条件にてHPLC，GPC測定を行い、基質モノマーの残存率，重合生成物の基質モノマーに対する収率及び重合生成物の分子量を求めた。結果を表１２及び図１２に示す。
【００６３】
【表１２】
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【００６４】
【産業上の利用可能性】
本発明の酵素化学的コンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法は、従来より工業的に用いられてきた生体材料からの抽出法に比較して簡便な合成法であり、且つ、反応液からの生成物の単離精製が容易なコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体の製造法を提供するものである。採取されたコンドロイチン又はコンドロイチン誘導体は化粧品、医薬品および医用材料等の材料として工業的に有用である。
【００６５】
【図面の簡単な説明】
図１：  基質モノマーの合成スキームを示す。
図２：  生成コンドロイチンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図３：  生成コンドロイチンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図４：  生成コンドロイチンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図３の糖骨格部分の拡大図）を示す。
図５：  反応液中の基質モノマー残存率の経時変化を示す。
図６：  基質モノマーの合成及び酵素重合反応スキームを示す。
図７：  基質モノマー（１４）残存率の経時変化を示す。
図８：  基質モノマー（１５）残存率の経時変化を示す。
図９：  基質モノマー（１６）残存率の経時変化を示す。
図１０：コンドロイチン誘導体（１７）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図１１：コンドロイチン誘導体（１７）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図１２：コンドロイチン誘導体合成反応の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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