(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌とシソ科の植物とを含む組成物であって、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対してシソ科の植物を５０〜１５０重量部の割合で含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
乳酸菌を１日当たり２〜５０ｍｇ摂取する形態となっている、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
シソ科の植物が青ジソの乾燥粉砕物である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
乳酸菌が加熱死菌体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
乳酸菌とシソ科の植物とを含む錠剤であって、１錠剤当たり乾燥物換算で乳酸菌を０．３〜１７ｍｇ及びシソ科の植物を乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対して５０〜１５０重量部の割合で含むことを特徴とする錠剤。
【請求項６】
シソ科の植物が青ジソの乾燥粉砕物である、請求項５記載の錠剤。
【請求項７】
乳酸菌が加熱死菌体である、請求項５又は６記載の錠剤。
【請求項８】
乳酸菌とシソ科の植物とを有効成分として含んでなる免疫賦活剤であって、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対してシソ科の植物を５０〜１５０重量部の割合で含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項９】
シソ科の植物が青ジソの乾燥粉砕物である、請求項８記載の免疫賦活剤。
【請求項１０】
乳酸菌が加熱死菌体である、請求項８又は９記載の免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌とシソ科の植物とを含む組成物、錠剤及び免疫賦活剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我々の体を病気から守っている生体防御機構は、生まれながらに備わっている自然免疫系と、生後、環境中の微生物などと接触することにより、学習・教育されていくより強く効率的な獲得免疫系とで構成されている。さらにこの獲得免疫系は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）型免疫とＴヘルパー２（Ｔｈ２）型免疫とに大別され、それぞれ役割を分担している。Ｔｈ１型免疫は、ウイルスや結核などの細胞内寄生細菌、腫瘍細胞などの排除を担い、Ｔｈ２型免疫は抗体を産生し、細菌や毒素の効率の良い処理を担っており、健やかな日常生活を送る上でＴｈ１型免疫とＴｈ２型免疫は、お互いに制御しながらバランス良く働いていることが重要である。しかし、現在は環境の清浄化や老化、ストレス、病気、栄養不足等によりＴｈ１型免疫とＴｈ２型免疫のバランス異常が引き起こされやすい状況にあると言えるため、現代人はＴｈ２型免疫が優位な傾向にあると言われている。そのことは、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染及び腫瘍に対する抵抗力の低下やアレルギー性疾患へのリスク増大に関連している。
【０００３】
細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や腫瘍に対する防御機構において中心的な役割を果たしているのは、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞などである。これら免疫担当細胞の活性化にはサイトカインという分子が大きく関与しており、中でもインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は初期感染系においても重要な役割を担っている。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１型免疫応答を司る中心的なサイトカインであり、感染初期ではマクロファージ、樹状細胞などにより産生される。産生されたＩＬ−１２はヘルパーＴ細胞をＴｈ１型への分化を誘導し、食細胞やキラー細胞等を活性化させるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生を促すことで感染細胞や種々の感染源を排除する。つまり、低下した免疫力を高め、初期感染系における免疫応答を賦活させるためには、ＩＬ−１２産生を促進することが重要である。
【０００４】
本来、生体防御を目的とするはずの免疫応答が結果として生体に危害を及ぼすものである場合、その免疫反応をアレルギー反応と呼んでいる。このアレルギー反応の関与する疾患を総称してアレルギー疾患と呼ぶことがある。即時型過敏反応を特徴とするアレルギー疾患の成因には、ＩｇＥ抗体が大きく関与していることが知られている。Ｂ細胞が産生する抗体にはＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤといった５つのクラスが存在するが、なかでもＩｇＧ抗体は血中濃度が最も高く、一般的なＴ細胞依存的な抗原抗体反応の中心を担っている。抗原と結合した血中のＩｇＧ抗体は好中球、マクロファージといったエフェクター細胞上のＦｃレセプターと結合し、活性化して抗原の排除を促す。本来、Ｔｈ１優位な環境下ではＩｇＧ２ａサブクラスが、Ｔｈ２優位な環境ではＩｇＧ１サブクラスが選択的に分泌され効率よく細菌や毒素といった抗原分子を排除するのだが、Ｔｈ１、Ｔｈ２のバランスに異常が生じるとＢ細胞の産生する抗体のクラスにも変化が生じる。Ｔｈ２型のサイトカインであるＩＬ−４は抗体産生を担うＢ細胞を活性化し、ＩｇＧ抗体産生を促進させるが過剰に存在すると、Ｂ細胞をＩｇＧ抗体産生細胞からＩｇＥ抗体産生細胞へと変化させる。
【０００５】
産生されたＩｇＥ抗体は抗原と結合すると、好中球、マクロファージではなくマスト細胞や好塩基球のＦｃレセプターと結合し、細胞を活性化する。これが引き金となり、活性化されたマスト細胞は元々所持していたヒスタミン等のケミカルメディエーターを放出するとともに、プロスタグランジンやロイコトリエンといった炎症性のメディエーターを一気に合成、放出するようになる。これらの炎症性のメディエーターが、平滑筋の収縮・血管透過性亢進・小血管拡張・粘膜上への粘液分泌亢進・白血球遊走・神経刺激といった典型的なアレルギー性組織反応を導くのである。つまり、ＩｇＥ抗体の過剰産生はアレルギー反応を誘発する大きな要因であり、過剰産生へとクラススイッチを誘発するＩＬ−４、さらにはＩＬ−４産生過多となるＴｈ２型へとシフトしすぎた生体環境自体がアレルギー反応の要因といえる。Ｔｈ１型サイトカインであるＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは、アレルギー疾患の要因であるＩＬ−４ならびにＩｇＥ抗体産生を抑制し、Ｔｈ２型へとシフトした生体環境をＴｈ１型へと改善する効果を有するため、こうしたアレルギー反応の抑制に有効である。
【０００６】
乳酸菌を用いた健康食品は、生菌体を直接経口的に摂取し、生存したまま腸内へ移行させ、腸内環境を整えることを目的とするものが主であった。腸内環境を構築する腸内フローラは、消化・吸収等の代謝系を維持、促進するのに必須であり、免疫系を含めた生体環境のバランスの改善に大きく寄与している。恒常的に生菌体を摂取することで、常に新しい腸内フローラを構築し代謝を活性化していくことは、健康増進につながるといえる。また、本発明者らが既に特許出願した通り（特許文献１〜６）、乳酸菌はＴリンパ球共刺激作用とＢリンパ球活性化抑制作用、ＩＬ−１２やＩＦＮ−γ等のサイトカインの産生促進作用を有するため、生体防御を主眼とした今後の機能性食品の開発において、乳酸菌は重要な役割を果たす存在であると言える。
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１１４６６７号公報
【特許文献２】特開平１０−１６７９７２号公報
【特許文献３】特開平１１−２２８４２５号公報
【特許文献４】特開２００１−６４１７４号公報
【特許文献５】特開２００２−８０３６４号公報
【特許文献６】特開２００４−１２１０７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
シソには解毒作用や抗菌作用などの薬理作用があることは古くから良く知られており、例えば赤ジソは漢方薬としても利用されている。最近の研究により、シソ科の植物に広範に含まれるポリフェノールの一種「ロスマリン酸」には、強力な抗酸化、抗炎症作用があることが見出され、Ｉ型アレルギーなどの過剰な免疫応答を改善する素材として注目されつつある（シソ抽出物は口腔内病原菌の増殖を抑制する作用を有することが報告されている（Biosci Biotechnol Biochem 66, 921-4, 2002））。しかしながら、免疫増強作用を有する乳酸菌と組み合わせた場合、強力な抗炎症作用によって乳酸菌の作用を減弱させる可能性があるため、免疫系に与える影響については検討を行う必要がある。
本発明は、乳酸菌の免疫賦活作用を抑制することなく、シソ科の植物を豊富に含む新規な組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、乳酸菌の免疫賦活作用が作用し難い条件下でも、シソ科の植物が補完的に作用することにより高い感染防御能を発揮する組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、乳酸菌とシソ科の植物の夫々の生体防御能増強作用を補完的に向上させることができる免疫賦活剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、乳酸菌とシソ科の植物とを含む組成物であって、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対してシソ科の植物を５０〜１５０重量部の割合で含むことを特徴とする組成物を提供する。
また、本発明は、乳酸菌とシソ科の植物とを含む錠剤であって、１錠剤当たり乾燥物換算で乳酸菌を０．３〜１７ｍｇ及びシソ科の植物を１５〜８５０ｍｇ含むことを特徴とする錠剤を提供する。
さらに、本発明は、乳酸菌とシソ科の植物とを有効成分として含んでなる免疫賦活剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、乳酸菌の免疫賦活作用を抑制することなく、青ジソを豊富に含む新規な組成物を提供することができる。また、乳酸菌の免疫賦活作用が作用し難い条件下でも、青ジソが補完的に作用することにより高い感染防御能を発揮する組成物を提供することができる。さらに、乳酸菌と青ジソの夫々の生体防御能増強作用を補完的に向上させることができる免疫賦活剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の組成物、錠剤及び免疫賦活剤で使用する乳酸菌としては、乳酸を産生しうる菌であれば特に限定されないが、具体的にはラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属またはエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌などが挙げられる。より具体的には、例えばラクトバチルス・アシドフィリス（Lactobaccilus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobaccilus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobaccilus buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブリュキイ（Lactobaccilus delbrueckii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobaccilus fermentum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobaccilus helveticus）、ラクトバチルス・ケフィア（Lactobaccilus kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobaccilus paracasei）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobaccilus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・スポロゲネス（Lactobacillus sporogenes）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（Lactococcusraffinolactis）、ロイコノストック・シトロボラム（Leuconostoc citrovorum）、ロイコノストック・デキストラニウム（Leuconostoc dextranicum）、ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mescenteroides）、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）などが挙げられる。
【００１２】
本発明の組成物、錠剤及び免疫賦活剤で使用する乳酸菌としては、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する菌が好ましく、具体的にはラクトバチルス・アシドフィリス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュキイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・スポロゲネスなどである。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタラムである。特に、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（平成７年１１月３０日より、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６０７で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている）が好適に使用できる。また、上記乳酸菌は、単独で用いてもよいし、複数の乳酸菌を組み合わせて用いてもよい。
本発明の組成物、錠剤及び免疫賦活剤においては、乳酸菌として、乳酸菌により食品を発酵させてなる、菌体を含んだ発酵物をそのまま用いてもよいし、発酵物から菌体を採取し、生菌のまま、又は例えば加熱、紫外線照射などにより不活性化し、ペースト状態あるいは乾燥して用いてもよい。乳酸菌の培養物から分離した生菌体又は死菌体をさらに摩砕、破砕、酵素分解、抽出処理をし、得られた処理物を必要により加熱滅菌、乾燥して用いることもできる。好ましくは、前記乳酸菌は加熱死菌体である。
【００１３】
本発明の組成物、錠剤及び免疫賦活剤で使用するシソ科の植物としては、青ジソ 、赤ジソ、カタメンジソ、チリメンジソ、エゴマ、レモンエゴマなどが挙げられる。好ましくは、青ジソであり、より好ましくは青ジソの乾燥粉砕物である。また、本発明の組成物、錠剤及び免疫賦活剤で使用するシソ科の植物の部位としては、葉や茎の部分を使用するのがよいが、花穂や実の部分が含まれていてもよい。シソ科の植物を乾燥して使用する場合には、乾燥物の水分が１５重量％、好ましくは２〜８重量％程度に乾燥するのが好ましい。乾燥方法には特に制限はなく、天日乾燥、送風乾燥、マイクロウェーブ乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥などの何れの方法でもよい。シソ科の植物は粉砕して使用しても粗砕して使用してもよいが、粉砕して使用するのが好ましい。また、シソ科の植物は例えば１３０〜１５０℃で３〜１０秒間程度加熱殺菌したものを使用してもよい。
【００１４】
本発明の組成物は、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対してシソ科の植物を５０〜１５０重量部の割合で含む。好ましくは、本発明の組成物は、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対してシソ科の植物を５０〜１００重量部の割合で含む。より好ましくは、本発明の組成物は、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対してシソ科の植物を６０〜８０重量部の割合で含む。
本発明の組成物は、常法に従って粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、飲料などの形態であってもよい。本発明の組成物は、さらに上記形態で通常使用される担体、賦形剤及び希釈剤、例えばラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アラビアガム、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、デキストリン、マルトデキストリン、還元パラチノース、植物油、動物油、アルコール、ヒドロキシルプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ショ糖エステル、二酸化ケイ素などを含んでいてもよい。
本発明の組成物は、乳酸菌を１日当たり２〜５０ｍｇ摂取する形態となっていることが好ましい。本発明の組成物は、乳酸菌を１日当たり５〜５０ｍｇ摂取する形態となっていることがより好ましい。本発明の組成物は、乳酸菌を１日当たり５〜３０ｍｇ摂取する形態となっていることが更に好ましい。
【００１５】
本発明の組成物は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ産生誘導作用を有するため、これらの日常的な摂取によりＴｈ１型免疫を亢進させることが可能であり、Ｔｈ２型免疫が優位である現代人の免疫バランスを調節する効果が期待される。すなわち、本発明の組成物は、（１）各種疾患に対する抵抗性の向上、（２）免疫抑制状態や免疫機能低下からの回復、（３）アレルギー反応の抑制に有効である。
各種疾患に対する抵抗性の向上という作用を利用することにより、具体的には、本発明の組成物は、ウイルスもしくはバクテリア等の微生物による感染症；例えば、経口感染によるコレラ菌、毒素原性大腸菌、赤痢菌、サルモネラもしくはウイルス等の感染性腸炎；気道感染によるインフルエンザもしくは風邪症候群；口腔内感染による口内炎、歯周疾患；各種悪性腫瘍、例えば、消化管や呼吸器粘膜、肝・腎等の実質臓器に発生する非上皮性悪性腫瘍の予防や治療に有効である。
免疫抑制状態や免疫機能低下からの回復という作用を利用することにより、具体的には、本発明の組成物は、腫瘍により誘導される免疫抑制状態や抗がん剤治療により誘導される免疫機能低下からの回復に適しており、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の発症予防；リステリア菌、サルモネラ菌、結核菌もしくは癩菌等の細胞内寄生性細菌の防除；ストレスに起因するＴｈ１型免疫機能低下の改善等に有効であり、加齢に伴う免疫機能低下の抑制等にも適している。また、細胞内寄生性細菌のクラミジア菌に対する感染防御作用により、クラミジア菌感染との関わりが強く示唆されている動脈硬化発症に対しても予防的に働く。
【００１６】
また、アレルギー反応の抑制という作用を利用することにより、本発明の組成物は、ＩＬ−１２産生誘導に伴うナイーブＴ細胞からのＴｈ１細胞への分化促進、及びＴｈ１細胞の活性化の促進に有効であり、Ｔｈ２型へとシフトした生体環境をＴｈ１型へと改善する効果を有する。さらに、活性化されたＴｈ１細胞により産生されたＩＦＮ−γに起因するＩＬ−４の産生抑制、及びＩｇＥ抗体産生の低下にも有効である。具体的には、本発明の組成物は、典型的なアレルギー疾患である気管支喘息、小児喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、枯草熱、食物アレルギー、蕁麻疹の一部、昆虫アレルギー、アレルギー性肝炎、アレルギー性胃腸疾患等の予防や治療に適している。
さらに、本発明の組成物は、強力な抗酸化作用や抗炎症作用、解毒作用や抗菌作用などの薬理作用を有するシソ科の植物を特定の割合で含んでいるために、このシソ科の植物が、消化管内の常在性悪玉菌が体内へ移行する、いわゆる日和見感染に対して補完的に働き、乳酸菌の感染防御能をさらに上昇させる。
【００１７】
また、本発明の錠剤は、１錠剤当たり乾燥物換算で乳酸菌を０．３〜１７ｍｇ及びシソ科の植物を１５〜８５０ｍｇ含む。好ましくは、本発明の錠剤は、１錠剤当たり乾燥物換算で乳酸菌を０．８〜８ｍｇ及びシソ科の植物を４０〜４００ｍｇ含む。
本発明の錠剤は、常法に従って製造することができる。例えば、乳酸菌と青ジソの乾燥粉末を賦型剤や結合剤などとともに一旦造粒し、得られた造粒物に打錠用滑沢剤などを加えて圧縮成形することにより錠剤を得ることができる。また、本発明の錠剤は、乳酸菌と青ジソの乾燥粉末を造粒することなく、直接賦型剤や結合剤などとともに圧縮成形して錠剤を得ることもできる。好ましくは、本発明の錠剤は、成形性がよいことら、乳酸菌と青ジソの乾燥粉末を賦型剤や結合剤などとともに一旦造粒してから圧縮成形して錠剤を得るのがよい。
【００１８】
また、本発明の免疫賦活剤は、乳酸菌とシソ科の植物とを有効成分として含む。
本発明の免疫賦活剤は、任意の投与経路で、また採用投与経路によって決まる剤型、例えば錠剤、カプセル、坐剤、溶液、シロップ、乳液等で投与することができる。製薬上許容される担体あるいは希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ラクトース、コンスターチ、アルギン酸、スターチ、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテート等で希釈された形態であってもよい。本発明の免疫賦活剤の具体的な投与量は、投与方法、患者又は被処理動物の状況、たとえば年齢、体重、性別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患者又はその病気の程度に応じて変化することは言うまでもなく、また一定の条件のもとにおける適量と投与回数は、上記指針のもととして専門医の適量決定試験によって決定されなければならない。具体的には、成人１日あたり乾燥物換算で乳酸菌を２〜５０ｍｇ及びシソ科の植物を１００〜２５００ｍｇであり、好ましくは成人１日あたり乾燥物換算で乳酸菌を５〜３０ｍｇ及びシソ科の植物を２５０〜１５００ｍｇである。
【実施例１】
【００１９】
（脾臓細胞を用いたＩＬ−１２産生誘導試験）
本実施例では、Ｔｈ１型免疫に重要であるＩＬ−１２産生誘導作用を免疫賦活作用の指標として、本組成物中の乳酸菌が持つＩＬ−１２産生誘導作用を促進する、または、抑制しない、青ジソの添加量を決定する試験をマウス脾臓細胞を用いて実施した。
［試験方法］
１．  細胞
試験には、２０週齢、雌性のＢＡＬＢ／ｃマウスから定法により脾臓細胞を調製した。
２．  被験物質
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体（以下ＨＫ−ＬＰと略す）を２０％含有する製剤（製品名：ＬＰ２０、ハウスウェルネスフーズ株式会社）と粉末青ジソ（葉と茎の部分を含む青ジソを乾燥し、一旦粗砕して１４０℃で５秒間加熱殺菌してから粉砕した乾燥粉砕物（水分４重量％））を被験物質として使用した。
３．  培養方法
９６穴の培養プレートに脾臓細胞を播種し（２．５×１０6／ｍｌ、２００μｌ）、４８時間培養した。培養液に添加した被験物質濃度を下記表に示す。ＨＫ‐ＬＰは１０ｎｇ／ｍｌあるいは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、それぞれの６７倍、１３３倍および２００倍の粉末青ジソを添加した。
【００２０】
【表１】
0005088817.tif 000002
４．  評価項目
培養上清中のＩＬ‐１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２１】
［結果および考察］
培養上清中のＩＬ‐１２濃度を図１に示す。
ＨＫ‐ＬＰを低濃度で添加して培養した場合（１０ｎｇ／ｍｌ）、青ジソ６７倍および１３３倍の添加によりＩＬ−１２産生量は僅かに上昇したが、青ジソ２００倍の添加によりＩＬ−１２産生量は低下した。
ＨＫ‐ＬＰを高濃度で添加して培養した場合（１００ｎｇ／ｍｌ）、青ジソの添加量に依存した明らかなＩＬ‐１２産生量の低下が認められた。
以上の結果から、乳酸菌と青ジソを高濃度で併用すると、青ジソのＩＬ−１２産生抑制作用が強く現れて、所望する免疫賦活組成物は得られないことが示され、また、乳酸菌と青ジソを低濃度で併用する場合でも、青ジソの添加量が多くなるとＩＬ−１２産生抑制作用が現れて、所望する免疫賦活組成物は得られないことが示された。
すなわち、乳酸菌加熱死菌体と青ジソ乾燥物を含む組成物に免疫賦活作用を発現させるためには、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対して青ジソ７０倍程度の割合で含むことが好ましいことが明らかとなった。
【実施例２】
【００２２】
（マウスを用いた抗がん試験）
本実施例では、乳酸菌はＩＬ−１２産生誘導作用を介して抗がん作用を発現するという文献情報に基づき（Murosaki S et al. Antitumor effect of heat-killed Lactobacillus plantarum L-137 through restoration of impaired Interleukin-12 production in tumor-bearing mice. Cancer Immunology Immunotherapy 2000; 49: 157-164.）、抗がん作用を指標に本組成物の免疫賦活作用を検証した。すなわち乳酸菌加熱死菌体単独を添加した飼料あるいは乳酸菌加熱死菌体に６７倍量の粉末青ジソを添加した飼料を担がんマウスに与え、本組成物の抗がん作用を評価した。
［試験方法］
１．  実験動物
試験には、ＤＢＡ／２Ｎ  ＣｒｌＣｒｌＪマウスを使用した。６週齢、雌性のマウスを日本チャールスリバー株式会社（日野飼育センター）から購入し、温度２３〜２５℃、湿度４０〜７０％、明暗各１２時間（明期：午前７時〜午後７時）に維持されたＳＰＦ環境下動物飼育室で飼育した。搬入後７日間は馴化期間とし、粉末飼料ＣＥ−２（日本クレア株式会社）を給餌器により、飲料水は水道水を自動給水装置により、いずれも自由に摂取させた。試験食投与初日に馴化期間中の体重推移および一般状態に異常がみられない個体を選び、コンピューターを用いて無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるよう群分けし、１群１５匹からなる２群に振り分けた。
２．  被験物質
ＬＰ２０と粉末青ジソを被験物質として使用した。
【００２３】
３．  被験飼料
粉末飼料ＣＥ−２を基本飼料とし、基本飼料に０．０５％ＨＫ−ＬＰを添加した飼料を対照飼料、０．０５％ＨＫ−ＬＰと３．３３％粉末青ジソを添加した飼料を試験飼料とした。
４．  腫瘍細胞株
ＤＢＡ／２マウスと同系のＰ３８８Ｄ１リンパ球様細胞株を使用した。凍結保管（−８５℃）した細胞株を融解し、１０％の牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に播種した。継代は９０mmの細胞培養用ディッシュで３日ごとに行い、３７℃でＣＯ2濃度が５％に設定された炭酸ガスインキュベーター内で維持した。
５．  群および期間
被験群は下記表２に示す２群とし、試験期間は、Ｐ３８８Ｄ１細胞投与日から３５日間とした。被験飼料はＰ３８８Ｄ１細胞接種日から給餌し、試験終了まで自由摂取させた。
【表２】
0005088817.tif 000003
【００２４】
６．  腫瘍細胞接種方法
良好な増殖状態にあるＰ３８８Ｄ１細胞を１，５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離で回収し、適量のＰＢＳを加えて同様の操作を３回繰り返すことで洗浄した後、生理食塩水で１．０×１０4／ｍｌに調整した。調整済みの細胞は、２７Ｇの注射針を取り付けた１ｍｌのポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を用いて、マウス１匹あたり２００μｌを腹腔内投与した（２．０×１０3／マウス）。
７．  評価項目
Ｐ３８８Ｄ１細胞投与日から３５日間、毎日午前９時３０分から午前１０時までの間に一般状態と生存状況を観察した。
８．  統計解析
Ｐ３８８Ｄ１細胞投与日から３５日目までの平均生存日数の群間比較は、スチューデントのｔ検定により行った。また、生存率の群間比較はログランク検定（生存分析法）により行った。解析は、統計ソフトパッケージＳｔａｔｃｅｌを用いて、各検定において危険率が５％未満の場合を「有意差あり」とし、１０％未満の場合は「傾向あり」とした。
【００２５】
［結果および考察］
腫瘍細胞接種後の生存率の経時変化および腫瘍細胞接種後３５日間の平均生存日数を図２に示す。比較例に比べて実施例では、生存率の改善傾向（Ｐ＝０．０７６）が認められ、生存期間も延長傾向（Ｐ＝０．０８３）を示した。
すなわち、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対して青ジソ６７倍の割合で含む本組成物を与えることにより、乳酸菌単独の効果として証明されている抗がん作用が損なわれることなく、むしろ増強されるという驚くべき知見が得られ、本組成物の優れた免疫賦活作用が明らかとなった。
【実施例３】
【００２６】
（マウスを用いた日和見感染試験）
本実施例では、抗がん剤で誘導される日和見感染に対する免疫賦活剤の防御作用は、免疫賦活剤を前投与すると発現しにくいという文献情報に基づき（Foster RS Jr. Altered toxicity of 5-fluorouracil following treatment with Corynebacterium parvum. Cancer Research 1978; 38: 850-858）、このような条件下で本組成物を投与し、本組成物の有用性を検証した。すなわち乳酸菌加熱死菌体単独を添加した飼料あるいは乳酸菌加熱死菌体に６７倍量の粉末青ジソを添加した飼料をマウスに与え、抗がん剤投与により日和見感染を誘導し、本組成物の日和見感染防御作用を評価した。
［試験方法］
１．  実験動物
試験には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ  ＣｒｌＣｒｌＪマウスを使用した。６週齢、雌性のマウスを日本チャールスリバー株式会社（日野飼育センター）から購入し、温度２３〜２５℃、湿度４０〜７０％、明暗各１２時間（明期：午前７時〜午後７時）に維持されたＳＰＦ環境下動物飼育室で飼育した。搬入後７日間は馴化期間とし、粉末飼料ＣＥ−２を給餌器により、飲料水は水道水を自動給水装置により、いずれも自由に摂取させた。馴化期間中の体重推移および一般状態に異常がみられない個体を選び、コンピューターを用いて無作為抽出法により各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるように群分けし、１群１８匹からなる２群に振り分けた。
２．  被験物質
ＬＰ２０と粉末青ジソを被験物質として使用した。
３．  被験飼料
粉末飼料ＣＥ−２を基本飼料とし、基本飼料に０．０５％ＨＫ−ＬＰを添加した飼料を対照飼料、０．０５％ＨＫ−ＬＰと３．３３％粉末青ジソを添加した飼料を試験飼料とした。
【００２７】
４．  試薬の調製
試験には、抗がん剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を使用した。５−ＦＵは２５ｍｇ／ｍｌの濃度で０．３５Ｍトリス溶液に溶解させた後、０．２２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌した。
５．  群および期間
被験群は下記表３に示す２群とした。試験期間は３５日間とし、５−ＦＵ投与日から２１日間を観察期間とした。被験飼料は、５−ＦＵ投与日の１４日前から給餌し、試験終了まで自由摂取させた。
【表３】
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【００２８】
６．  日和見感染誘導方法
２５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した５−ＦＵ溶液を、２７Ｇの注射針を取り付けた１ｍｌのポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を用いて、マウスの体重あたり５００ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内投与した。５−ＦＵ溶液の投与量は投与日の体重から計算した。例えば、体重２０ｇのマウスに対しては、５−ＦＵ溶液を４００μｌ投与した。
７．  評価項目
５−ＦＵ投与日から２１日間、毎日午前９時３０分から午前１０時までの間に一般状態と生存状況を観察した。
８．  統計解析
平均生存日数は、スチューデントのｔ検定により群間比較した。また、生存率の差はログランク検定（生存分析法）により群間比較した。解析は、統計ソフトパッケージＳｔａｔｃｅｌを用いて、各検定において危険率が５％未満の場合を「有意差あり」とした。
【００２９】
［結果および考察］
５−ＦＵ投与後の生存率の経時変化および５−ＦＵ投与後２１日間の平均生存日数を図３に示す。比較例に比べて実施例では、生存率が有意に改善し（Ｐ＝０．０２４）、生存期間も有意に延長した（Ｐ＝０．０１５）。
すなわち、乾燥物換算で乳酸菌１重量部に対して青ジソ６７倍の割合で含む本組成物を与えることにより、免疫賦活剤の前投与では効きにくいとされる抗がん剤誘導日和見感染症に対する有意な防御効果が認められ、乳酸菌と青ジソの夫々の生体防御能増強作用が補完的に機能した免疫賦活剤としての本組成物の有用性が証明された。
【実施例４】
【００３０】
下記表８の造粒用粉末原料を混合し、造粒用噴霧液を噴霧しながら７０〜１００℃で流動層造粒した。次いで、粒度が１ｍｍ以下となるように、得られた粒状物を篩い分けした。次いで、整粒した粒状物に打錠用添加剤を加えて混合し、ロータリー式打錠機（ＦＥＴＴＥ社）を用いて圧縮成型（１０〜５０ｋＮ）して一錠当たり約０．２５ｇの錠剤を得た。
【表４】
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【実施例５】
【００３１】
下記表９の粉末原料を混合し、ロータリー式打錠機（ＦＥＴＴＥ社）を用いて圧縮成型（１０〜５０ｋＮ）して一錠当たり約０．２５ｇの錠剤を得た。
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１の培養上清中のＩＬ−１２濃度を示すグラフである。
【図２】実施例２の試験飼料摂取による担がんマウスの生存率改善および生存期間延長効果を示すグラフである。
【図３】実施例３の試験飼料摂取による日和見感染マウスの生存率改善および生存期間延長効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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