(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚皮抽出物にキトサンを加えてデルマタン硫酸を吸着し、洗浄して不純物を除去した後、弱アルカリ性塩類溶液によりデルマタン硫酸を抽出することを特徴とする豚皮抽出物よりのデルマタン硫酸の製造方法。
【請求項２】
豚皮抽出物は豚皮を磨砕した後、蛋白分解酵素による処理を行って得られる請求項１記載の豚皮抽出物よりのデルマタン硫酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はムコ多糖類中、特にデルマタン硫酸を豚皮より製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
豚を屠殺した場合、特に関東以北においては皮は食肉と共に流通されず、肉から剥がされた不要品として処理された。その結果、豚皮は膠の原料として使用されるか、飼料として使用されるか、廃棄されるしか使用方法がなく、その有効な活用が望まれていた。
【０００３】
ところで、豚皮からデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）が抽出されることは公知であり、デルマタン硫酸が人体にとって有用な物質となり得ることは夙に知られているところである。そこで、豚皮をデルマタン硫酸の原料として活用することが想到される。
【０００４】
一般に豚皮のような動物組織よりデルマタン硫酸のようなムコ多糖を抽出する場合は、磨砕した組織に消化酵素を加えて蛋白質を分解し、これに多量のエタノールを加えてムコ多糖を沈殿させ、これをさらにクロマト法などで精製する方法が用いられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法では収得されるムコ多糖に比して極めて大量のエタノールを必要とし、しかも使用後のエタノールの回収、再利用も容易ではない。このため、高率の課税対象品であるエタノールの価格が製品に転嫁される結果として、精製されたムコ多糖の価格も必然的に高価となる。一方、人体に強毒として作用するメタノールあるいはメタノールを含有する免税エタノールでは、製品が医療用、化粧用あるいは食品添加物として使用されることから、最終製品に有毒なメタノールが残留するおそれも考えられることから危険である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は以上の従来技術の問題点に鑑みて創出されたものであり、豚皮からデルマタン硫酸を低コストで、しかも安全な方法で抽出する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
即ち、この発明は豚皮抽出物にカチオン性物質を加えてデルマタン硫酸を吸着し、洗浄して不純物を除去した後、弱アルカリ性塩類溶液によりデルマタン硫酸を抽出することを特徴とする。この発明においては、豚皮抽出物は豚皮を磨砕した後、蛋白分解酵素による処理を行って得られる。又、カチオン性物質としてはキトサンを開示する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．吸着条件の検討
この発明の原理は、強い陰電荷をもつ高分子化合物であるデルマタン硫酸などのコンドロイチン硫酸の水溶液に、強い陽電荷を持つ高分子化合物で水に不溶性のキトサンを加え、電気的にデルマタン硫酸をキトサン分子表面上に結合分離することにある。
【０００９】
デルマタン硫酸およびキトサンの荷電はｐＨにより異なり、酸性側ではデルマタン硫酸は陰荷電し、酸として溶存しているが、アルカリ性側では陽荷電を失い、ナトリウム塩などのアルカリ塩として存在する。デルマタン硫酸は硫酸基とカルボキシル基を有しているが、分子全体としては弱酸であるから、アルカリ性では電離度が低く、実際上、中性塩として振る舞う。したがって、アルカリ側ではキトサンのような陽荷電物質によって吸着されることはない。
【００１０】
これに対して酸性のｐＨでは、陰荷電した酸として存在するから、陽荷電を帯びたキトサンに電気的に吸引され、その分子表面に吸着された状態になる。
ａ）キトサンの吸着能の検討
キトサン（Ａ）およびデルマタン硫酸（Ｂ）の構造は、それぞれ下式のごとく考えられ、キトサンは同一分子の、デルマタン硫酸は互いに異なる二種の単糖誘導体分子が、それぞれ長大な重合体を形成したものである。
【００１１】
【化１】
0004915888.tif 000002
【００１２】
【化２】
0004915888.tif 000003
デルマタン硫酸の繰り返し二糖（括弧内の構造）には、硫酸基とカルボキシル基（いずれも波付下線で示す）が一個ずつ含まれ、これがキトサン分子のアミノ基（波付下線）と電気的に結合する可能性がある。
【００１３】
すなわち、キトサンの括弧内の二糖と、デルマタン硫酸の括弧内の二糖単位が相対して結合すると考えられ、前者、キトサンの括弧内二糖の式量３２２と、後者の式量４３５から、両者の理論的結合比は１：１．３５となり、１００ｇのキトサンは１３５ｇのデルマタン硫酸を吸着できることになる。
【００１４】
通常得られるキトサンは、キチンの混在によりキトサン自身の純度が６０〜８０％であることや、反応液中で必ずしも理論上の結合が起こらないことなどから、１００ｇのキトサンに対するデルマタン硫酸の最大結合量は、２５〜５０ｇ程度と考えられる。
【００１５】
実験的に純度が約８０％のキトサンを使用し、ｐＨ５で吸着実験を行ったところ、純品換算で４０ｍｇのキトサンは、少なくとも１０ｍｇのデルマタン硫酸をほぼ１００％吸着することが分かった。この量は上記推定吸着量の下限値であるが、吸着条件をさらに検討すれば、さらに良好な結果が得られるものと考える。
ｂ）吸着至適ｐＨの検討
キトサンがコンドロイチン硫酸を吸着する至適ｐＨを、コンドロイチン硫酸Ｃを用いて調べたところ、ｐＨ７以下ではほぼ１００％吸着されるが、ｐＨ８では１６％が未吸着となり、ｐＨ９では１００％非吸着であった。
【００１６】
吸着ｐＨが５以下では、吸着剤であるキトサン分子が不安定になり、ｐＨが１０以上では被吸着物質であるコンドロイチン硫酸の分解が起こるおそれがあるので、実際の吸着は主としてｐＨ５で行うことにした。
ｃ）他成分の混在による吸着能の差異
デルマタン硫酸含有試料液にキトサン微粉末を加えて吸着させるとき、コンドロイチン硫酸が純粋に近い溶液であっても、豚皮エキス水解物などのような夾雑物の多い溶液を用いても、溶液のｐＨを５に維持し、他種の陰電荷物質の存在がない状態であれば、キトサンの吸着能はあまり影響されない。
２．脱着条件の検討
キトサンに吸着されたコンドロイチン硫酸は、ｐＨ９．０のリン酸緩衝液を加えて脱着する。この場合、脱着されるコンドロイチン硫酸量は吸着量の６０〜８０％であるが、これ以上アルカリ側の緩衝液を用いても、脱着されるコンドロイチン硫酸量は増加せず、その上、ｐＨ１０以上の緩衝液では、アルカリによるムコ多糖分解作用が起こり、かえって悪い影響が現れる。
【００１７】
そこで脱着ｐＨは９．０とし、塩化ナトリウムを添加することにより、イオン強度を大きくして脱着を容易にすることとし、Ｍ／１５リン酸緩衝液（ｐＨ９．０）に塩化ナトリウムを２Ｍの濃度に加えたものを脱着液とした。
【００１８】
【実施例】
（実施例１）
濃厚シロップ状の豚皮エキス（Ｐｏｒｋ  Ｓｋｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ、以下ＰｋＳＬと略）９５．５ｇを秤取し、これを沸騰している精製水２００ｍｌ中に攪拌しながら注入し、加え終わってからさらに３０分間、引き続きよく攪拌する。
【００１９】
この液を１０℃に冷却し、１０，０００ｒｐｍ、１０℃で２５分遠心した後、上清をとり、これを５０℃に加温した後、攪拌しつつ１／１０容量のＭ／１５リン酸緩衝液および２．５Ｎ  ＮａＯＨを加えてｐＨを７．５とする。さらに３０分間、攪拌を続けた後、アルカラーゼ、プロナーゼなどの蛋白分解酵素の適量を加え、その酵素の至適作用ｐＨおよび温度で１６〜２０時間加温反応させ、エキス中に含まれる蛋白部分を分解する。
【００２０】
反応後、液を１００℃、１５分間加熱して酵素作用を停止させた後、１０℃以下に冷却し、１０，０００ｒｐｍ、１０℃、１５分間遠心して上清を集める。この液には原エキス中のコンドロイチン硫酸の大部分が含まれる。この上清の一部を取り、ウロン酸法によるデルマタン硫酸量を測定しておく。
【００２１】
上清液に精製水を加え約１０倍に希釈した後、その容量の１／１０容のＭ／１０リン酸緩衝液（ｐＨ５）を加えてｐＨを５．０とし、これに微粉状のキトサンを添加し、１０℃以下に保って約３０分攪拌を続けた後、４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分遠心して沈殿を集め、Ｍ／１００リン酸緩衝液（ｐＨ５）を加えて沈殿を洗浄した後、ｐＨ９．０の塩化ナトリウム加リン酸緩衝液を加えてデルマタン硫酸を脱着し、遠心して上清を集める。この操作を反復して得られた上清を合一し、凍結乾燥すれば粗デルマタン硫酸が得られる。収量は使用したＰｋＳＬ重量の約０．３％であった。文献（Ｃｉｆｏｎｅｌｌｉら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｒｅｐ．，１２（５）１９６８）によれば、脂肪をアセトン抽出して除去した豚皮から得られるデルマタン硫酸量は、０．２０〜０．２４％と記載されているから、上述の方法によりＰｋＳＬ中のデルマタン硫酸は、ほぼ完全に抽出できたものと考えられる。
【００２２】
（実施例２）
豚皮エキスＰｋＳＬ１ｋｇを秤取し、これを沸騰中の精製水２リットル中に小量ずつ、攪拌しながら添加する。加え終わってから、さらに１０分間沸騰させ、エキス中に含まれる蛋白質を十分変性させる。この時、突沸現象が起こりやすいから、激しく攪拌を続ける。
【００２３】
その後、液温が５０度に低下するまで水冷し、これにＭ／１５リン酸水素二ナトリウム液を、液容量の１／２０量を攪拌しながら添加した後、ｐＨを７．５になるように調整する。
【００２４】
添加後５０℃に保温しつつさらに３０分間、ゆるく攪拌を続け、反応液のｐＨをチェックし、必要あれば２Ｎ水酸化ナトリウム、あるいは２Ｎ塩酸を加えてｐＨ７．５となるようにする。
【００２５】
この液に蛋白分解酵素としてアルカラーゼ２，４Ｌ（液状）を加えてよく攪拌した後、５５℃の恒温槽に入れ、１８〜２０時間保温し、豚皮エキス中の蛋白を十分分解する。酵素液の添加量は、酵素の純度と豚皮エキス中に蛋白含量により一定ではないから、予備実験により必要量を確かめる。蛋白分解酵素は他の種類（プロナーゼ等）でもよいが、蛋白分解が不十分であるときはムコ多糖の収得量が低下し、かつ、ブタの蛋白（主としてコラーゲン）が最終製品に混入することになるから、好ましくない。
【００２６】
酵素で消化した後、反応液を加熱沸騰させるか、または反応液中に過熱水蒸気を通じて１００〜１１０℃に加熱し、約２０分間この温度に保つことにより、酵素蛋白を十分変性させる。その後冷水により１０℃以下に冷却し、シャープレス等の遠心機（５，０００Ｇ以上）により遠心分離して上清を集める。３層に分離するときは、上層は脂肪分画、下層は変性蛋白層であるから、中層のみを集める。消化酵素としてアルカラーゼを使用したときは、褐色やや混濁した液が得られる。
【００２７】
遠心上清を集め、混和して全体を均一にした後一部を採取し、ウロン酸法によりデルマタン硫酸量を測定し、吸着に必要とするキトサン量を決めておく。合一上清に１０倍量の精製水をくわえて攪拌、希釈し、リン酸緩衝液を加えてｐＨ５．０とし、計算量のキトサンを加えて１０℃で約３０分攪拌した後遠心して沈殿を集め、前の沈殿と合わせてＭ／１００リン酸緩衝液を加えて攪拌洗浄し、再度遠心して沈殿を取る。
【００２８】
沈殿にｐＨ９の塩化ナトリウム加リン酸緩衝液を添加し、３７℃に加温攪拌してデルマタン硫酸を溶出し、遠心して上清を集める。これを凍結乾燥すれば塩化ナトリウムとリン酸ナトリウムの混入した粗デルマタン硫酸が得られる。デルマタン硫酸としての収量は、出発原料のＰｋＳＬに対して０．２３％であった。
【００２９】
この粗製品から純デルマタン硫酸を製造するときは、アルコール分別沈殿法、あるいはカラムクロマト法を用いる必要があるが、前者の場合においてもエタノール使用量は一般の抽出法に比べると、著しく少量である。
【００３０】
【発明の効果】
この発明によれば、高価なエタノールは製造の最終過程においてのみ少量使用すれば済むので、製造原価を大幅に切り下げ、従来品よりも純度の高い製品を、より安価に市場に提供することができ、同時に従来その処理に困っていた豚皮の効果的なリサイクルも図ることができる。