(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞によって形成された管腔が線状模様を呈している血管新生過程の試料を撮像して得られた画像に基づいて、該試料の血管新生の状態に対応した評価値を求めるための試料状態評価方法において、
前記試料の画像から前記線状模様で囲まれた閉領域を検出する段階（Ｓ３）と、
前記閉領域の総数を評価要素値として求める段階（Ｓ４）とを含み、該評価要素値またはそれに比例した値を前記試料の前記血管新生の状態に対応した評価値とすることを特徴とする試料状態評価方法。
【請求項２】
前記閉領域を検出する段階は、
前記試料の画像のデータのうち、非線状部のデータを一つずつアドレス順に注目し、該注目データと、該注目データに対して縦方向及び横方向に連続する非線状部のデータに同一領域番号を付与するという処理を行うことで、線状部を境界とする領域を求め、
該求めた領域のうち、前記線状部で囲まれている領域を閉領域として検出することを特徴とする請求項１記載の試料状態評価方法。
【請求項３】
管腔形成を阻害させるための物質が異なる濃度で与えられた血管新生過程の試料について、該濃度毎に該試料の血管新生の状態に対応した評価値を求め、前記濃度に対する前記評価値の変化に基づいて、前記物質によって管腔形成が阻害された試料の血管新生の状態を評価することを特徴とする請求項１または請求項２記載の試料状態評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば癌の増殖により生物の組織に現れる新生血管のように、その管腔形成による線状模様が変化する試料の画像に基づいて、その試料の状態に対応した評価値を求める技術に関し、試料の状態により正しく対応する評価値を求めるための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の増殖による血管新生を阻害する薬を開発する際、血管内皮細胞を用いた血管新生モデルが知られている。そのアッセイ系において血管内皮細胞が形成する管腔形成様の線状模様を顕微鏡下で記録した画像を観測することで、癌細胞によって誘導される血管新生の度合いを把握することが行われている。
【０００３】
一方、顕微鏡でとらえた試料の画像をソフトウェア処理して、その試料の状態を表す評価値を求める装置も開発されている。
【０００４】
例えば、次の特許文献１には、ニューロンの神経突起の数や、神経突起の分岐の数などを測定する装置が開示されている。
【０００５】
また、血管新生モデルとしての血管内皮細胞管腔形成の画像解析技術として、血管内皮細胞由来の形成管腔管の総数等を測定パラメータとする技術が、例えば日本ベクトン・ディッキンソン株式会社のアプリケーションノート等に紹介されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−９５１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記したように画像に現れる形成管腔管の総数や長さを評価値として測定する技術で前記した管腔形成画像の評価を行った場合、その試料に線状模様で現れる画像を見た研究者が下す評価値に対応した値が得られない場合が多く、装置で得られた値から試料の状態を自動的に判定することが困難で、結局は研究者が画像を見て試料の状態を判断せざるを得なかった。
【０００８】
本発明は、この問題を解決し、研究者等が日常的に観察している試料の状態の判断に正確に対応した評価値が試料の画像から得られる試料状態評価方法を提供することを目的としている。
【０００９】
なお、本発明は、例えば、癌の増殖によって生物の組織に新生血管が現れ，癌の増殖が進むにつれて増加し，複雑に交差、分岐あるいは結合する管腔形成様の線状模様を記録した画像から、研究者はその線状模様の複雑さを無意識に感じて組織の状態を判定しているという知見に基づくものであり、本発明では、この線状模様の複雑さが、線で囲まれた閉領域の総数に対応付けできることを見出したことによるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の請求項１の試料状態評価方法は、
血管内皮細胞によって形成された管腔が線状模様を呈している血管新生過程の試料を撮像して得られた画像に基づいて、該試料の血管新生の状態に対応した評価値を求めるための試料状態評価方法において、
前記試料の画像から前記線状模様で囲まれた閉領域を検出する段階（Ｓ３）と、
前記閉領域の総数を評価要素値として求める段階（Ｓ４）とを含み、該評価要素値またはそれに比例した値を前記試料の前記血管新生の状態に対応した評価値とすることを特徴とする。
【００１１】
また、請求項２の試料状態評価方法は、請求項１記載の試料状態評価方法において、
前記閉領域を検出する段階は、
前記試料の画像のデータのうち、非線状部のデータを一つずつアドレス順に注目し、該注目データと、該注目データに対して縦方向及び横方向に連続する非線状部のデータに同一領域番号を付与するという処理を行うことで、線状部を境界とする領域を求め、
該求めた領域のうち、前記線状部で囲まれている領域を閉領域として検出することを特徴とする。
【００１２】
また、請求項３の試料状態評価方法は、請求項１または請求項２記載の試料状態評価方法において、
管腔形成を阻害させるための物質が異なる濃度で与えられた血管新生過程の試料について、該濃度毎に該試料の血管新生の状態に対応した評価値を求め、前記濃度に対する前記評価値の変化に基づいて、前記物質によって管腔形成が阻害された試料の血管新生の状態を評価することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
このように、本発明は、血管内皮細胞によって形成された管腔が線状模様を呈している血管新生過程の試料を撮像して得られた画像から、試料の線状模様の複雑さに応じて現れる閉領域を検出し、その閉領域の総数を評価要素値として求め、その評価要素値あるいはそれに比例した値を血管新生の状態に対応した評価値としているので、研究者が日常的に観察している画像から判断される試料の状態により正確に対応した評価値を得ることができ、その評価値による自動的な試料状態の判断が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
図１は、本発明の試料状態評価方法の手順を示すフローチャートである。以下、このフローチャートにしたがって試料状態評価方法を説明する。
【００２８】
初めに、状態に応じて線状模様が変化する評価対象の試料を顕微鏡で観察して得られたモノクロで横Ｍ画素、縦Ｎ画素の広さの画像のデータ、例えば模式的な図２の（ａ）のような６４０×４８０画素の画像データを用意する（Ｓ１）。この画像は記憶媒体に記憶されたものの他に、撮像機からリアルタイムに出力される画像データであってもよい。
【００２９】
ここでは、線状模様のある部分をデータ１、無い部分をデータ０とし、表示器の画面ではデータ１の画素が明表示、データ０の画素が暗表示となるが、図面の都合上、線状模様のあるデータ１の部分をハッチング表示、線状模様のないデータ０の部分を白表示としている。ただし、このデータの割り当ては白黒の反転処理により逆にしてもよい。
【００３０】
そして、この画像に対して線画変換処理を行い（Ｓ２）、図２の（ｂ）のように、元の画像データの線状部が例えば１ビット幅（表示画面上で１画素幅）の細線となるように変換する。実際にはこの線を形成する１画素にデータ１を割り当てる。
【００３１】
また、線の幅を０とする、即ち、隣り合う２つの画素の境界の線とすることもできる。この場合、境界の線を挟む２つの画素のアドレスに、非線部の領域のエッジであることを示す情報を付与することになる。
【００３２】
なお、ここでは、線状部の全体の幅を１画素幅に圧縮する処理とするが、線の幅は任意であり２画素以上でもよい。また、線状部の幅を圧縮するという処理は、言い換えれば、線状部を挟む領域（背景領域）の広さを、領域同士が重ならない程度まで広げていくことと同等であり、どちらの処理を実行してもよい、その処理の際に幅１画素以上で一定幅の線を残すか、隣り合う２つの画素間を通る幅ゼロの線を設定すればよい。
【００３３】
次に、この線画像の線で連続的に囲まれた閉領域を検出する（Ｓ３）。
この閉領域の検出は、表示画像に対応したＭ×Ｎ画素の画像メモリに記憶された０のデータ（非線部のデータ）をアドレス順に一つずつ調べ、注目する０のデータのアドレスに一つの領域番号ｉを付与し、そのアドレスに対して縦方向及び横方向に隣り合う０のデータのアドレスにも同一の領域番号を付与するという処理を全て行うことで、図２の（ｃ）のような各領域Ｅ（１）、Ｅ（２）、…、Ｅ（ｉ）、…を特定している。
【００３４】
なお、この領域番号の付与は、線画像の画像メモリの各画素に対応付けられたＭ×Ｎ個のアドレス空間を有する領域情報メモリへ領域番号の情報を書き込むことで行われる。
【００３５】
そして、これらの領域のうち、線で完全に囲まれている領域を閉領域として検出し、その数Ｕ、総外周長Ｒを評価要素値として求める（Ｓ４）。
【００３６】
説明の都合上、閉領域に対して領域番号を若い順に割り当てるものとする。つまり、閉領域がＵ個あれば、Ｅ（１）、Ｅ（２）、…、Ｅ（Ｕ）が有効な閉領域である。図２はＵ＝６の例であり、Ｅ（１）〜Ｅ（６）が閉領域であり、Ｅ（７）〜Ｅ（１６）は非閉領域とする。
【００３７】
各閉領域の外周長は、閉領域の最も外側の０のデータの数によって求める方法と、閉領域を囲んでいる線を形成している１のデータの数によって求める方法とが考えられる。
【００３８】
閉領域の最も外側の０のデータの数を求める方法は、閉領域が確定すればその時点で容易に算出することができ、前記したように、線画変換の処理で線の幅をゼロとしている場合には、この方法で外周長を求め、各閉領域の外周長を加算することで総外周長Ｒが得られる。ただし、線の幅が１画素以上あり、且つ閉領域の広さが狭い場合、外周長を正確に表さなくなる。例えば線の幅が１画素で閉領域の広さが１画素の極端な場合を考えると、その最も外側の０のデータ数も１画素となってしまうが、その１画素の広さの閉領域を囲んでいる１のデータの数は最小でも４画素となり、両者の差が大きくなり、このような狭い閉領域の数が多くなるとその誤差が拡大されてしまう。
【００３９】
したがって、ここでは閉領域を囲んでいる幅１画素分の線を形成している１のデータの数により求める方法を採用している。
【００４０】
閉領域を囲んでいる線は別の領域（閉領域だけでなく非閉領域も含む）との境界線であり、その境界線を形成する１のデータについてその２つの領域の情報も含めて検出する。
【００４１】
即ち、線画像のメモリの１のデータ（線を形成する可能性のあるデータ）を一つずつ調べ、例えば３×３画素の部分で示した図３の（ａ）のように、注目している１のデータＤｘの縦方向、横方向および斜め方向の隣に別の１のデータが存在しない場合には、この注目データＤｘは、線を形成しない独立した無効な点と判定し、図３の（ａ）の画像部分に対応する図３の（ｂ）の領域情報メモリの注目データＤｘの位置に独立点を示す例えば（ＤＯＴ）の情報を書き込む。なお、図３の（ｂ）の領域情報メモリのうち、図３の（ａ）の０のデータにそれぞれ対応する位置には、前記領域検出処理で得られた領域番号（この例ではｉ）が書き込まれている。
【００４２】
また、注目データＤｘの縦方向、横方向及び斜め方向のいずれかの隣に別の１のデータが存在する場合、その注目データＤｘと、その隣にある１のデータを結ぶ線を挟んだ両側の０のデータについての領域番号を領域情報メモリで調べて比較する。
【００４３】
例えば図４の（ａ）のように、注目データＤｘの斜め方向の隣に別の１のデータが存在する場合、その注目データＤｘと、その斜め方向の隣にある１のデータを結ぶ線を挟んだ両側の０のデータについての領域番号を図４の（ｂ）の領域情報メモリで調べて比較する。この場合、領域番号がともにｉで一致するので、この注目データＤｘは境界線の一部でないと判定し、領域情報メモリの対応する位置に非境界線であることを示す情報、例えば（ＮＯＮ）を書き込む。
【００４４】
また、図５の（ａ）のように注目データＤｘの縦方向と斜め方向の隣に別の１のデータが存在する場合で、その注目データＤｘと、その隣にある１のデータを結ぶ線を挟んだ両側の０のデータの領域番号が図５の（ｂ）のように異なる（ｉ≠ｊ）場合には、この注目データＤｘが２つの異なる領域の境界線の一部であると判定し、その２つの異なる領域Ｅ（ｉ）、Ｅ（ｊ）の領域番号の組からなる境界情報（ｉ，ｊ）を付与する。
【００４５】
また、図６の（ａ）のように注目データＤｘの横方向の隣に別の１のデータが存在する場合で、その注目データＤｘと、その隣にある１のデータを結ぶ線を挟んだ両側の０のデータの領域番号が図６の（ｂ）のように異なる（ｉ≠ｊ）場合には、この注目データＤｘが２つの異なる領域の境界線の一部であると判定し、その２つの異なる領域Ｅ（ｉ）、Ｅ（ｊ）の領域番号の組からなる境界情報（ｉ，ｊ）を付与する。
【００４６】
上記処理を線画像のメモリの全ての１のデータについて行うことで、無効な点、非境界線および境界線の情報を区別して与えることができる。
【００４７】
そして、例えば閉領域Ｅ（ｋ）の外周長を求める場合、領域情報メモリの中の（ｋ，＊）または（＊，ｋ）の境界情報の数を累計すればよく（記号＊は任意の値）、その累計によって得られた各閉領域の外周長を加算することで総外周長Ｒが得られる。
【００４８】
このようにして得られた閉領域の数Ｕおよび総外周長Ｒは、試料の状態変化に伴い線状模様が複雑化し、分岐し、連結し、重なりあうにしたがって大きくなる。つまり、画像の表示エリアおよびその表示面積が同一であれは、試料の状態に正確に対応して変化する評価要素値と見なすことができる。
【００４９】
したがって、この評価要素値をそれに比例したより扱い易い値、例えば、基準値に対する評価要素値の割合等に変換して試料状態を表す評価値として求めて出力する（Ｓ５）ことで、実際の試料の状態によく対応した評価値を得ることができ、それに基づいて研究者の判断に頼ることなく試料の自動評価が可能となる。
【００５０】
次に、図７のように縦横に線が交差する簡単なモデルについて、従来の総線長を求める方法と前記した閉領域の数Ｕを求める方法との違いを対比する。なお、以下の説明では上記閉領域を環形ネットワークと呼ぶ。
【００５１】
図７の（ａ）は、縦横の線の中間に切断部が無い場合で、そのときの環形ネットワーク数Ｕは１０であり、以下、図７の（ｂ）〜（ｆ）まで環形ネットワーク数Ｕが２つずつ減少する場合を考えている。
【００５２】
この環形ネットワーク数Ｕの変化と総線長の変化とを対比した結果を図８に示す。
この図８は、図７の（ａ）の状態を基準としてパーセント表示したものであるが、環形ネットワーク数Ｕの減少に対して、総線長は非常に緩慢に減少していることが判る。
【００５３】
次に、実際に癌の増殖による血管新生に対する阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の濃度の変化に対する実験動物マウスの血管内皮細胞であるＫＯＰ細胞の管腔形成阻害の状態が変化する様子を示す図９の各画像（組織の同一エリア、同一表示面積）に対して、前記処理を行って得られた環形ネットワーク数Ｕと、従来の総線長を求める方法と、図９の各画像を見た研究者が下した評価値とを対比した結果、図１０のグラフが得られた。
【００５４】
この図１０のグラフは、図９の阻害剤を用いない（濃度０ｎＭ）ときに得られた画像について得られた環形ネットワーク数Ｕ、総線長を基準とするものであり、それぞれの濃度に対して環形ネットワーク数の割合と研究者の判断値とはほぼ対応しているが、総線長の割合は、やはり研究者の判断値と大きくかけ離れていることが判る。
【００５５】
このように、環形ネットワーク（閉領域）を評価要素値とし、その値に比例した値を評価値とすることで、試料の状態、即ち、研究者の判断値によく対応した結果を得ることができる。
【００５６】
なお、計算していないが、前記したように、環形ネットワークの総外周長Ｒは、環形ネットワークの数Ｕに対応して変化するので、これを評価要素値としてもよい結果が得られることが予想できる。また、評価要素値としては、上記の閉領域の数Ｕ、総外周長Ｒだけでなく、閉領域の外周長や面積の統計量、即ち外周長や面積の度数分布や平均値、バラツキ等を用いてもよく、これらの少なくとも一つであればよい。ここで閉領域の面積は、閉領域内の画素数を求めることで得られる。
【００５７】
また、ここでは、環形ネットワークの数Ｕが多い時の状態を基準にし、環形ネットワークの数Ｕが少ない場合の評価値を百分率（パーセント）で示していたが、これは本発明を限定するものでなく、評価要素値そのものを評価値としてもよく、また、試料の単位面積あたりの環形ネットワーク数Ｕ′や総外周長Ｒ′を、評価値として次の演算で求めてもよい。
【００５８】
Ｕ′＝Ｕ／（画像に表示されている試料の面積）
Ｒ′＝Ｒ／（画像に表示されている試料の面積）
【００５９】
図１１は、上記方法を用いた試料状態評価装置２０の主要構成を示したものである。
この試料状態評価装置２０は、例えば前記図２の（ａ）で示したように状態に応じて線状模様が変化する試料の評価対象の画像を、線画変換手段２１によって図２の（ｂ）のように線状模様が、幅ゼロあるいは１画素以上の線となる線画像に変換する。前記したようにこの処理は、線状模様の線状部の幅を圧縮する方法と、背景領域を互いに重ならない程度に拡大する方法のいずれでもよい。
【００６０】
そして、前記したように、閉領域検出手段２２により図２の（ｃ）のような線画像内の線で囲まれた閉領域Ｅ（１）〜Ｅ（Ｕ）を検出する。
【００６１】
即ち、図２の（ｂ）のように得られた線画像に対応したＭ×Ｎ画素の画像メモリに記憶された０のデータ（非線部のデータ）をアドレス順に一つずつ調べ、注目する０のデータのアドレスに一つの領域番号ｉを付与し、そのアドレスに対して縦方向及び横方向に隣り合う０のデータのアドレスにも同一の領域番号を付与するという処理を全て行うことで、図２の（ｃ）のような各領域Ｅ（１）、Ｅ（２）、…を特定して、これらの領域のうち、線で完全に囲まれている領域を閉領域として検出する。なお、領域番号の付与は、前記したように、線画像の画像メモリの各画素に対応付けられたＭ×Ｎ個のアドレス空間を有する領域情報メモリ（図示せず）へ領域番号のデータを書き込むことで行われる。
【００６２】
評価要素値算出手段２３は、閉領域の総数Ｕ、総外周長Ｒあるいは前記したように閉領域の外周長や面積の統計量を評価要素値として求める。ここで総外周長Ｒを評価要素値として求める場合、前記したように、各領域の境界線となる境界情報（ｉ、ｊ）を求めて、前記領域情報メモリに書き込み、閉領域についての外周長を求め、その総和をとることで得ることができる。
【００６３】
このようにして得られた評価要素値は評価値算出手段２４に入力され、例えば前記したようにある状態における評価要素値の基準値に対する割合（百分率）が評価値として算出され、出力される。ここで、評価要素値そのものを評価値として出力してもよく、前記したように、評価要素値を試料面積で除算した値、即ち、単位面積当たり閉領域の数、外周長の少なくとも一方を評価値として算出して出力してもよい。また、評価要素値に比例した値であれば、上記以外の値、例えば評価要素値を所定数（例えば１０、１００、１０００等）で除算した値を評価値として用いることができる。
【００６４】
試料画像、線画像、閉領域検出手段２２の閉領域検出結果、評価要素値および評価値の各情報は、表示制御部３０に入力されている。表示制御部３０は、入力された画像の情報に対応した画像を、各手段の処理タイミングに応じて（例えば図２に示した順に）表示器３１の画面上に表示し、最終的な評価値を表示器の画面に出力する。また、前記した領域情報メモリに書き込まれた内容を表示器３１に表示してもよい。
【００６５】
前記実施形態では、主に癌の増殖により生物の組織に現れる新生血管のように，その管腔形成による線状模様が変化する試料の画像の変化を対象としていたが、生物の他の組織に現れる線状模様の画像を対象にしてもよい。
【００６６】
例えば、皮膚の表面の皮溝を、皮膚状態に応じて変化する線状模様として、その画像に対して、上記同等の処理を行うことで、皮膚状態に対応した評価値を得ることができる。
【００６７】
さらに、本発明は生物の試料だけでなく、金属、合成樹脂、石材等の無機物の試料にも適用可能である。例えば、化学変化、経年変化、疲労等により試料の表面や内部に現れるシワ、ヒビ、クラック等を、その試料状態に応じて変化する線状模様とし、その表面画像や内部の透視画像に対して、上記同等の処理を行うことで、試料の表面や内部の劣化に対応した評価値を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の試料評価方法の手順を示すフローチャート
【図２】本発明の処理を説明するための模式図
【図３】境界線の特定処理を説明するための図
【図４】境界線の特定処理を説明するための図
【図５】境界線の特定処理を説明するための図
【図６】境界線の特定処理を説明するための図
【図７】線状模様を単純化したモデル図
【図８】図７のモデルに対する処理結果を示す図
【図９】阻害剤の濃度変化に対するＫＯＰ細胞の線状模様が変化する様子を示す図
【図１０】図９の画像に対する処理結果を示す図
【図１１】本発明の実施形態の構成図
【符号の説明】
【００６９】
２０……試料状態評価装置、２１……線画変換手段、２２……領域検出手段、２３……評価要素値算出手段、２４……評価値算出手段、３０……表示制御部、３１……表示器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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