(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を含有する被検液に、デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking Aminopeptidase) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine A
minopeptidase)、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ(N-Acylaminoacyl-pep
tide hydrolase) 又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)を作用させてＮ末端のフルクトシルバリンを遊離し、これを定量することを特徴とするＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は糖化蛋白質の定量方法。
【請求項２】
遊離されたＮ末端のフルクトシルバリンの定量を糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて測定する請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドが糖化へモグロビンのＮ末端のフラグメントであるか、あるいはＮ末端のバリンがフルクトシル化されている糖化蛋白質が糖化へモグロビンである請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
デブロッキングアミノペプチダーゼ (Deblocking Aminopeptidase) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ (Dipeptidyl Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine
Aminopeptidase)、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ(N-Acylaminoacyl-p
eptide hydrolase) 又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)を含有してなるＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質の定量用組成物。
【請求項５】
デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking Aminopeptidase）、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine
Aminopeptidase) 、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ(N-Acylaminoacyl-p
eptide hydrolase) 若しくはヘミセルラーゼ（Hemicelullase) 並びに糖化アミノ酸に作用する酵素を含有してなるＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質の定量用組成物。
【請求項６】
Ｎ末端のバリンが糖化されているペプチドが糖化へモグロビンのＮ末端のフラグメントであるか、あるいはＮ末端のバリンがフルクトシル化されている糖化蛋白質が糖化へモグロビンである請求項４または５に記載の定量用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液から、Ｎ末端の糖化アミノ酸又はペプチドをプロテアーゼを用いて遊離させ、遊離された糖化アミノ酸又はペプチドを定量する方法及びこの定量に用いる組成物に関する。本発明によると、特に血液試料中の糖化ヘモグロビンを正確、簡便かつ迅速に定量することができる。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病の診断及び管理行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、中でも近年の研究により血液中の糖化ヘモグロビンを７％以下の値に管理すれば合併症の発症および進展の危険率を優位に低下させ得ることが証明され、臨床の現場では無くてはならない指標として多用されている。
【０００３】
糖化ヘモグロビンの定量法としては、通常、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィ法、免疫法及び酵素法が知られている。しかしながら前記電気泳動法、クロマトグラフィー法は高価な専用装置を必要とし、また処理スピードが遅く、多数の検体を処理する臨床検査には適していない。また前記免疫法は分析方法が比較的簡単で時間も短時間で済むことから近年急速に広まってきたが、抗原抗体反応を用いる為に、再現性や共存物質の影響の点で必ずしも精度が良いといえないという問題がある。
【０００４】
このように高価な専用装置が不必要であり、処理スピードが速く、高精度、簡便、安価な糖化ヘモグロビンの定量方法としては酵素法が挙げられる。糖化ヘモグロビンの定義は、へモグロビンβ鎖Ｎ末端のアミノ酸が糖化されたヘモグロビンであるから、酵素を用いて糖化ヘモグロビンの測定を行う場合、Ｎ末端のアミノ酸が糖化されたヘモグロビンからＮ末端の糖化アミノ酸又はＮ末端の糖化アミノ酸を含むペプチドを遊離させ、これを定量しなくてはならない。一般的にヘモグロビンの糖化部位はαアミノ基が約60％、εアミノ基が約40％糖化されていると考えられており、かつ蛋白質のＮ末端が糖化を受けふさがれている蛋白質はプロテアーゼに対し耐性である。Ｎ末端のアミノ酸が糖化されたヘモグロビンからＮ末端の糖化アミノ酸又はＮ末端の糖化アミノ酸を含むペプチドを遊離した例としては以下の (a)〜(h) が知られている。
【０００５】
(a) グリコヘモグロビンに 8M 尿素を加え20分煮沸変性後、トリプシン処理、ペニシリウム(Penicillium) 属由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)にて定量する方法（特開平8-336386) 。
(b) グリコヘモグロビンをプロテアーゼ処理してアスペルギルス(Aspergillus）属由来FAODにて定量する方法（特開平10-33177、特開平10-33180) 。
(c) プロテアーゼ処理を行いFAODにて検出する方法 (特開平5-192193号公報) 。
(d) エンド型及びエキソ型プロテアーゼを用いて糖化ヘモグロビンを測定する方法(WO97/13872)。
【０００６】
(e) Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質をセリンカルボキシペプチダーゼを用いて酵素処理する方法（特開2001-57897）。
(f) ヘモグロビンA1c のβ鎖Ｎ末端から３番目のロイシンのカルボキシル基側を切断出来るプロテアーゼで処理し、ついで生成したフルクトシルバリルヒスチジルロイシンからヒスチジルロイシンを切り取ることが出来るプロテアーゼで処理するヘモグロビンA1c の測定方法（特開2000-300294)。
(g) 糖化蛋白質からαアミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させるコリネバクテリウム(Corynebacterium）属及びシュードモナス(Pseudomonas）属由来の新規酵素を用いて、糖化アミノ酸を遊離させ、これを定量する方法(WO00/50579)。
(h) 糖化蛋白質からαアミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させるスフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)属、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属、コマモナス(Comamonas) 属、ムコー(Mucor）属及びペニシリウム(Penicillium）属由来の新規酵素を用いて糖化アミノ酸を遊離させ、これを定量する方法(WO00/61732)。
【０００７】
上記 (a)〜(d) の方法はε及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸の両方に良く作用するFAODを用いて測定されていることから糖化へモグロビンの定義であるαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸のみを測定しているかどうかは明らかでない。
【０００８】
さらに本発明者らの実験によれば(a) 〜(d) に使用されているプロテアーゼはαアミノ基が糖化された蛋白質に作用していることを確認できる合成基質、例えば糖化バリルパラニトロアニリド（以下FValpNAと略す）に作用することは出来なかった。よって公知の糖化へモグロビンの測定方法は本来測定すべきであるＮ末端の糖化されたαアミノ基ではなく、糖化されたεアミノ基を測定しているものと考えられる。
【０００９】
一方、上記（e)〜（h)の方法を用いれば糖化ヘモグロビンのＮ末端の糖化部位を測定することが可能である。しかし、（e)及び（f)の方法では一度エンドプロテアーゼでＮ末端の糖化アミノ酸を含むペプチドを切り出し、続いてカルボキシペプチダ−ゼを用いて糖化アミノ酸まで分解する方法であり、少なくとも２種類のプロテアーゼが必要である。
【００１０】
また上記(g) 及び（h)はコリネバクテリウム(Corynebacterium) 属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)属、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属、コマモナス(Comamonas) 属、ムコー(Mucor) 属及びペニシリウム(Penicillium) 属由来の酵素に限定されている。
これまでデブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl  Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine  Aminopeptidase)、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase) 又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)を作用させ、Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを遊離させ、これを定量する糖化ペプチド又は糖化蛋白質の定量方法については報告がなされていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このようなＮ末端が糖化されたペプチドあるいは糖化された蛋白質の定量における問題点を解決することを目的としてなされたものである。すなわち、本発明の課題は、Ｎ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液から、Ｎ末端の糖化アミノ酸又はペプチドを遊離させ、これを定量する方法及びこの定量のための組成物を提供することにある。本発明のさらなる課題は、臨床生化学検査、特に血液中の糖化ヘモグロビンの測定に有用な定量方法及び定量用組成物を大量、安価に提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、糖化ヘモグロビンのＮ末端を効率的に分解するプロテアーゼを検索する目的で、FValpNA 等を合成した。しかしながら意外にもこれまで糖化ヘモグロビンに対する作用が確認されているプロテアーゼはこの合成基質を分解する活性を確認することができなかった。よって、これまで明らかにされている糖化ヘモグロビンからのFAODによる発色はＮ末端の糖化バリンに由来するものではなくεアミノ基に結合した糖を測定していると考えられた。
【００１３】
そこで本発明者らは、合成基質FValpNA 等を用い幅広く自然界からプロテアーゼをスクリーニングした結果、蛋白質やペプチドのＮ末端がブロックされた蛋白質のデブロッキング（Deblocking）に使用するプロテアーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl  Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase）、又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)にFValpNA を分解する活性があることを見出した。
【００１４】
しかしながらバクテリア、カビから得られたプロテアーゼは培養、精製工程が複雑で臨床の現場に試薬として安価に大量に供給することは困難であり、一方デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl  Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase）、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase) 又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)は大量に安価に供給することが可能であった。
【００１５】
さらに、またこれらのプロテアーゼ反応液にFAOD等の糖化アミノ酸に作用する酵素を作用させることにより糖化ヘモグロビンを再現性良く、精度良くかつ簡便に測定できることを見出し本発明の完成に至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、Ｎ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液に、デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ (Dipeptidyl  Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase）、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase) 又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)を作用させ、Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを遊離させ、これを定量する方法、及び定量のために使用する組成物に関する。本発明は、特に、血液試料中の糖化ヘモグロビンをこのような酵素を用いて正確、簡便、迅速、安価に定量するのに有用な測定方法及び定量用組成物である。
【００１７】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる被検液はＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液であればいかなるものを用いても良い。好ましくは糖化ヘモグロビンのＮ末端を含むペプチド又は糖化ヘモグロビンを含有する被検液であり、さらに好ましくは、全血、全血の溶血液、遠心分離された赤血球、洗浄赤血球等が挙げられる。また分離された赤血球や糖化ヘモグロビンをあらかじめプロテアーゼにより断片化したプロテアーゼ処理液も好ましい被検液として用いることができる。
【００１８】
本発明に使用しうるプロテアーゼは、デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase) 、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase;  E.C.=3.4.19.1) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl  aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase）、へミセルラーゼ（Hemicelullase)であればいかなる酵素を用いても良い。
【００１９】
好ましい酵素の例としては、デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking Aminopeptidase)には、パイロコッカス(Pyrococcus)属由来のデプロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase) 、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ(N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase)には、ブタ肝臓由来のN-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase;  E.C.=3.4.19.1) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl  Aminopeptidase) には、例えばジペプチジルアミノペプチダーゼ I (Dipeptidyl  Aminopeptidase I) に属するカテプシンＣ(Cathepsin C；E.C.=3.4.14.1 ；from Bovine Spleen；シグマ社製) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ II(Dipeptidyl  Aminopeptidase II ；E.C.=3.4.14.2 ；各種臓器リソソームに所在) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ III (Dipeptidyl Aminopeptidase III)に属するアンギオテンシナーゼ（Angiotensinase；E.C.=3.4.14.4 ；赤血球) 、ジペプチジルアミノペプチダーゼ IV (Dipeptidyl  Aminopeptidase IV；E.C.=3.4.14.5 ；ブタ肝臓；シグマ社製) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase； E.C.=3.4.11.1；ブタ腎、cytosol ；シグマ社製) 、へミセルラーゼ（Hemicelullase)には、例えばヘミセルラーゼ「アマノ」（アマノ製薬社製）、スミチームＸ（新日本化学工業社製）、ヘミセルラーゼＮ（田辺製薬社製）、セルロシンＨＣ（阪急バイオインダストリー社製）、ヘミセルラーゼ（東京化成社製）等が挙げられるが、本発明ではこれらの酵素に限定されるものではない。
【００２０】
さらに本発明においてＮ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを遊離するさいにはＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質に作用しＮ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを遊離する前記のプロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、前記のプロテアーゼの反応前又は同時に他のエンドプロテアーゼを作用させても良い。このようにすることによってＮ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを遊離する反応速度を高めることができる。
【００２１】
本発明のＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質に作用し、Ｎ末端の糖化アミノ酸又はペプチドを遊離するプロテアーゼの活性測定に使用する合成基質としては、αフルクトシルアミノ酸誘導体又はαフルクトシルペプチドである合成基質であればいかなる基質を用いても良い。αフルクトシルとはアミノ酸、ペプチドのＮ末端のαアミノ基がグルコースと結合して非酵素的に生成するアマドリ化合物をいう。
【００２２】
合成基質がフルクトシルアミノ酸誘導体の場合はフルクトシルバリン誘導体が最も好ましいが、他のアミノ酸を用いても良く、また基質と生成物を見分ける目的でアミノ酸のＣ末端をアニリド、エステル等の形で保護しておく必要がある。本発明者らはプロテアーゼのスクリーニングを容易にする目的で、プロテアーゼ切断時に黄色い色を呈するパラニトロアニリドを用いたが、その他どのような保護基を用いても良い。その他の保護基を用いる場合には、例えばプロテアーゼ反応のみで発色に導ける場合にはその発色をプロテアーゼの検出に用いれば良く、またプロテアーゼ反応のみでは発色に導けない場合、生成した糖化アミノ酸をFAODを用い過酸化水素に変換し公知の方法でプロテアーゼの検出を行えば良い。
【００２３】
合成基質が、フルクトシルペプチドの場合は、糖化ヘモグロビンＮ末端と同様の配列であれば好ましく、例えばフルクトシルバリルヒスチジン(Val-His) からフルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン(Val-His-Leu-Thr-Pro) までの２〜５残基のフルクトシルペプチド若しくはそのペプチドＣ末端を誘導体化したものが最も好ましいが、その他の配列のペプチドを用いても良い。
【００２４】
合成基質の合成方法はアミノ酸誘導体又はペプチドを公知の方法、例えばハシバらの方法（Hashiba H,J.Agric.Food Chem.24:70,1976）でフルクトシル化し、精製をすれば良い。また、これ以外の方法を用いても合成することができる。アミノ酸又はペプチドのＣ末端の誘導体化は公知の方法で誘導体化するか又は市販の物を用いれば良い。
【００２５】
本発明に於けるＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質に作用し、Ｎ末端の糖化アミノ酸又はペプチドを遊離するプロテアーゼの活性測定は、以下の方法で行った。なおこの活性測定はFAOD（旭化成社製）がFValpNAには作用しないがプロテアーゼの作用により生じたフルクトシルバリン（以下FValと略する。）に作用することを利用している。
【００２６】
＜＜プロテアーゼの活性測定方法＞＞
＜反応液の組成＞
6mM  FValpNA
15mM  Tris-HCl buffer pH7.5 （和光純薬社製）
2U/ml  FAOD （旭化成社製）
2U/ml  パーオキシダーゼ（以下POD と略する。シグマ社製）
0.01%  4-アミノアンチピリン（以下4AA と略する。; 和光純薬社製）
0.01%  N-エチル-N- （2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-m- トルイ  ジン（以下TOOSと略する。; 和光純薬社製）
【００２７】
上記反応液を 933μL をキュベットにとり37℃で５分間予備加温する。適当に希釈したプロテアーゼを含有する溶液67μLを加え、撹拌し反応を開始し、555nmの10分間あたりの吸光度変化ΔAを測定する。また基質であるFValpNA の代わりに蒸留水を処方した反応液を作成し、同様の操作を行い吸光度変化ΔAブランク（以下ΔA ｂと略す。）を測定した。なお、糖化アミノ酸誘導体から37℃、１分間に 1μM の糖化アミノ酸を生成する酵素量を1Uと定義した。
計算式は下記の式１の通りである。
【００２８】
【式１】
0004925384.tif 000002
【００２９】
39.2： 4AA-TOOS のミリモル吸光係数
2：過酸化水素２分子から4-AA、TOOSが縮合した色素１分子を生じるこことによる係数
10：反応時間（分）
1000：総反応液量（μL)
67：酵素溶液量（μL)
【００３０】
本発明における、遊離されたＮ末端の糖化アミノ酸またはペプチドを測定する方法としては除蛋白後糖化アミノ酸、糖化ペプチドの還元能を利用して色素等を発色させて定量しても良く、また好ましくは除蛋白することなくクロマトグラフィー、抗原抗体反応、酵素反応等の手段を用いて定量しても良く、最も好ましくは糖化アミノ酸、または糖化ペプチドに作用する酵素を用いて定量すれば良い。
【００３１】
糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用する酵素としては、前記プロテアーゼの作用により、被検液に含まれるＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質から生成される糖化アミノ酸または糖化ペプチドに有効に作用し、実質的にＮ末端が糖化されたペプチド及び蛋白質が測定できる酵素であれば如何なるものを用いても良いが、αアミノ基が糖化されたアミノ酸または糖化ペプチドに効率的に作用する酵素が好ましく、αアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用しεアミノ基が糖化されたアミノ酸には実質的に作用しない酵素が最も好ましい。また一般にこのようなαアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用しεアミノ基が糖化されたアミノ酸には実質的に作用しない酵素は安定性が悪いことから、安定性の高いεアミノ基及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸両方に良く作用する酵素を用いて測定しても良く、さらに安定性が高いεアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用する酵素を用いてεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを消去し、安定性の高いεアミノ基及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸の両方に良く作用する酵素を用いてαアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定しても良い。
【００３２】
特異性の点から、最も好ましい糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、εアミノ基が糖化されたアミノ酸には作用しないαアミノ基糖化アミノ酸特異的な酵素、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（FAOD)(コリネバクテリウム（Corynebacterium)属由来（FERM P-8245)) が挙げられるがこれらの酵素は45℃で10分の処理で残存活性10％以下と安定性が悪く、実使用には好ましくない。一方εアミノ基及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸の両方に良く作用する酵素であり安定性が高い酵素としてはギベレラ（Gibberella）属またはアスペルギルス（Aspergillus)属（例えばIFO-6365、-4242 、-5710 等）由来フルクトサミンオキシダーゼ、カンジダ（Candida)属由来フルクトシルアミンデグリカーゼ、ペニシリウム（Penicillium)属（例えばIFO-4651、-6581 、-7905 、-5748 、-7994 、-4897 、-5337 等）由来フルクトシルアミノ酸分解酵素、フサリウム（Fusarium）属（例えばIFO-4468、-4471 、-6384 、-7706 、-9964 、-9971 、-31180、-9972 等）由来、アクレモニウム（Acremonium）属由来又はデブリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等の少なくとも糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼが挙げられ、さらに好ましい例としてはプロテアーゼと共存した状態でも十分な活性を有する、遺伝子組み替えフルクトサミンオキシダーゼ（旭化成工業社製）が挙げられる。
【００３３】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性測定法を下記に示す。
＜＜糖化アミノ酸に作用する酵素の活性測定法＞＞
＜反応液の組成＞
50mM トリス-HCl緩衝液  pH7.5
0.03%  4-AA（和光純薬社製）
0.02% フェノール（和光純薬社製）
4.5U/ml  POD（シグマ社製）
1.0mM  FVal 若しくはαカルボベンズオキシε- D-フルクトシル-L- リジン
（ハシバらの方法に基づき合成、精製した。Hashiba H,J.Agric.Food
Chem.24:70,1976, 以下FZLys と略す。）
【００３４】
上記の反応液1ml を小試験管に入れ、37℃で5 分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液0.02mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後に0.5%のSDS を2ml 添加して反応を停止し、波長555nm の吸光度を測定する（As）。またブランクとして酵素液の代わりに蒸留水0.02mlを用いて同一の操作を行い吸光度を測定する（Ab）。酵素作用の吸光度（As）と盲検の吸光度（Ab）の吸光度差（As-Ab)より酵素活性を求める。別にあらかじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素との関係を調べておく。37℃、１分間に１μM の過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義し、下記の計算式(2) で酵素活性を求める。
【００３５】
【式２】
0004925384.tif 000003
【００３６】
3.02：総反応液量(ml)
0.02：酵素溶液量(ml)
10：反応時間（分）
2：過酸化水素2 分子から4-AA、フェノールが縮合した色素１分子を
生じることによる係数
12.0：4AA-フェノールのミリモル吸光係数
【００３７】
本発明のＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液からＮ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを遊離する反応の液組成については、使用するＮ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液からＮ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを遊離するプロテアーゼの至適pHを考慮し、反応が効率よく進行するようにpH及びプロテアーゼ濃度を決定すればよい。
【００３８】
例えば前記パイロコッカス(Pyrococcus)属由来のデブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase；タカラ社製）を用いる場合には、蛋白質分解活性がpH 6.5〜9.0 付近で強いことから、反応のpHは 6.5〜9.0 を選択することができる。またプロテアーゼ濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中の蛋白質を十分に分解し得る濃度であれば良く0.01〜1000U/mlが好ましく、 0.1〜500U/ml がさらに好ましい。
【００３９】
糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて断片化された糖化ペプチドまたは蛋白質を測定する反応の液組成については、使用する糖化アミノ酸に作用する酵素の至適pHを考慮し、反応が効率よく進行するようにpHを選択しその後糖化アミノ酸に作用する酵素量を決定すればよい。
【００４０】
例えば遺伝子組換フルクトサミンオキシダーゼ（旭化成工業社製）の場合、最大活性の50％以上の活性を示す領域がpH 6.5〜10と広く、反応のpHは 6.5〜10を選択できる。また酵素添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液から生成された糖化アミノ酸を十分に測定し得る濃度で有れば良く、 0.01U〜1000U/mlが好ましく、0.1U〜500U/ml がより好ましく、0.5U〜100U/mlが最も好ましい。
【００４１】
以上のことから、本発明に於ける糖化蛋白質定量用組成物としては、デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking  Aminopeptidase）、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipeptidyl  Aminopeptidase) 、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase）、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase）又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)を含有するもの、又はデブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking Aminopeptidase)、ジペプチジルアミノペプチダーゼ(Dipeptidyl  Aminopeptidase)、ロイシンアミノペプチダーゼ(Leucine  Aminopeptidase）、N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide  hydrolase）又はヘミセルラーゼ（Hemicelullase)及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含有するものとして調製すれば良く、例えば液状品、液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００４２】
さらに本発明に基づく糖化蛋白質を定量する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、pH調整剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００４３】
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類〔例えばポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル（トリトンX-100)、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル等〕、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類〔例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン20) 、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ツイーン40) 等〕、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレンひまし油、ポリオキシエチレンステロール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンラノリン類、ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸・リン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、Ｎアシルアミノ酸塩類、アルキルエーテルカルボン酸塩類、アルキルリン酸塩、Ｎアシルタウリン酸塩、スルホン酸塩、アルキル硫酸、酢酸ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤、レシチン誘導体（以上日光ケミカルズ社製）、アデカトール720N、アデカトールB-795 、アデカトールSO-120、アデカノールB-795(以上旭電化工業社製）、ポリエチレングリコール類、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ポリエチレングリコールイソオクチルフェニルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、トリトン X-305、トリトンX-114 、トリトン X-405、トリトンWR-1339(以上ナカライテスク社製）等が例示される。これらの界面活性剤は、0.01〜10％、好適には0.05〜５％の濃度で用いることが好ましい。
【００４４】
塩類としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等が挙げられる。これらの塩類は、１mM〜5M、好適には10mM〜1Mの濃度で用いることが好ましい。緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン-NaOH 緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられ、これらは10mM〜2M、好適には20mM〜1Mの濃度で用いることが好ましい。防腐剤には、例えばアジ化ナトリウムがあり、0.01〜10％、好適には0.05〜１％を適宜添加すればよい。
【００４５】
また本発明に基づく糖化蛋白質の定量方法における糖化アミノ酸に作用する酵素作用の検出は、例えばデヒドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を、例えば補酵素として NADを用いて生成される変化の量として還元型補酵素である還元型 NADをその極大吸収波長域である340nm 付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、あるいは生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート（以下、 PMSと略す。）、メトキシ PMS、ジメチルアミノベンゾフェノキサジニウムクロライド（メルドラブルー）等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、WST-1 、WST-8(以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に定量してもよく、またこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定してもよい。
【００４６】
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いた場合には反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定することができる。
【００４７】
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成させ、発色、発光、蛍光等により定量しても良く、また電気化学的手法によって定量しても良く、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を定量しても良い。
【００４８】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で4-AA若しくは3-メチル -2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬等を用いることができる。
【００４９】
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例としてN, Nジメチルアニリン、N, N- ジエチルアニリン、2,4-ジクロロフェノール、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-3, 5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N- スルホプロピル-3,5ジメチルアニリン(MAPS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-3, 5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-m- トルイジン(TOOS)、N-エチル-N- スルホプロピル-m- アニシジン(ADPS)、N-エチル-N- スルホプロピルアニリン(ALPS)、N-エチル-N- スルホプロピル−3, 5- ジメトキシアニリン(DAPS)、N-スルホプロピル-3, 5-ジメトキシアニリン(HDAPS) 、N-エチル-N- スルホプロピル-m- トルイジン(TOPS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-アニシジン(ADOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）アニリン(ALOS)、N-(2- ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-3, 5-ジメトキシアニリン(HDAOS) 、N-スルホプロピル−アニリン(HALPS) ( 以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。
【００５０】
またロイコ型試薬の具体例としては、o-ジアニシジン、o-トリジン、3, 3ジアミノベンジジン、3, 3, 5, 5- テトラメチルベンジジン（以上同人化学研究所社製）、N- (カルボキシメチルアミノカルボニル）-4, 4-ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン(DA64)、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7- ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン(DA67)（以上和光純薬社製）等が挙げられる。
【００５１】
さらに蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、4-ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフルオレスシン誘導体等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロール等を用いることができる。
【００５２】
カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドを定量する方法としては、ハンチ反応を用いる方法や、MBTHとの縮合反応により発色させる方法、若しくはアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる方法等が挙げられる。
グルコソンの定量はジフェニルアミン等の公知のアルドース試薬を用いて定量すればよい。
【００５３】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受することのできる材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金、銀等が挙げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができ、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。
【００５４】
かくして調製された本発明の定量用組成物によって、被検液中の糖化ペプチド又は糖化蛋白質を定量するには、定量用組成物に被検液 0.001〜0.5ml を加え、37℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後の一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分後と８分後の５分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素又はその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素又はその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度の糖化アミノ酸、ペプチド又は蛋白質を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化ペプチドおよび糖化蛋白質の量を求めることができる。
【００５５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を実施例を挙げて具体的に述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【実施例１】
＜Ｎ末端が糖化されたペプチド又は蛋白質に作用しＮ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを遊離するプロテアーゼのスクリーニング＞
スクリーニングは、プロテアーゼの絞込みを大量に行う１次スクリーニング、及び１次スクリーニングでピックアップされたものから合成基質よりフルクトシルアミンオキシダーゼを用いてフルクトシルバリンの精製を確認する２次スクリーニングの２段階に分けて行った。
【００５６】
(1) １次スクリーニング
＜反応液１＞
100mM トリス−HCl 緩衝液  pH8.5
2mM  FValpNA
上記反応液１を96穴プレートに 200μL とり、プロテアーゼを含有する溶液50μL(高濃度の方が好ましい) を添加し室温で10分〜１晩反応させ黄色く着色したプロテアーゼを選択した。さらに着色が確認されたプロテアーゼは上記反応液900 μL をキュベットにとり、プロテアーゼを含有する溶液50μL を添加し500nm の吸光度変化ΔＡを測定した。また基質であるFValpNA の代わりに蒸留水を処方した反応液を作成し、同様の操作を行い吸光度変化ΔＡブランクを測定した。糖化アミノ酸誘導体へのプロテアーゼの作用はΔＡ−ΔＡブランクにより計算した。
【００５７】
(2) ２次スクリーニング
１次スクリーニングにて活性の認められたプロテアーゼ及び従来糖化ヘモグロビンへの作用が報告されていたプロテアーゼに関し下記の活性確認を行った。
＜反応液２＞
6mM  FValpNA
15mM  Tris-HCl buffer pH7.5 （和光純薬社製）
2U/ml  FAOD(旭化成社製）
2U/ml  POD（シグマ社製）
0.01%  4-AA(和光純薬社製）
0.01%  TOOS(和光純薬社製）
【００５８】
上記反応液２を 933μL キュベットにとり37℃で５分間予備加温する。適当に希釈したプロテアーゼを含有する溶液67μL 添加し、撹拌して反応を開始し、555nm の10分間あたりの吸光度変化ΔＡを測定する。また基質であるFValpNA の代わりに蒸留水を処方した反応液を作成し、同様の操作を行い吸光度変化ΔＡブランクを測定した。糖化アミノ酸誘導体へのプロテアーゼの作用はΔＡ−ΔＡブランクにより計算した。
結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
0004925384.tif 000004
【００６０】
表１に示したとおり意外なことにこれまで糖化ヘモグロビンの測定に使用できるといわれてきたプロテアーゼにはFValpNAからFValを遊離する活性は認められなかった。
【００６１】
一方パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）属由来デブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking aminopeptidase ；タカラ社製）、ブタ肝由来N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide hydrolase ；タカラ社製）等のＮ末端がブロックされたペプチドや蛋白質に作用し、Ｎ端のブロックされたアミノ酸を遊離するプロテアーゼには強い作用が確認された。
【００６２】
同様にＮ末端から２アミノ酸を遊離するジペプチジルペプチダーゼ（Dipeptidyl  peptidase)、たとえばウシ脾臓由来カテプシンＣやジペプチジルアミノペプチダーゼIV（Dipeptidyl  aminopeptidaseIV）にも同様な作用が確認された。これは糖化アミノ酸をアミノ酸２分子としてプロテアーゼが認識し糖化アミノ酸を効率的に遊離するためと考えられた．
【００６３】
また前記の特殊なアミノペプチダーゼを除いたアミノペプチダーゼのなかではロイシンアミノペプチダーゼのみが合成基質からフルクトシルバリンを遊離する活性が認められその他のアミノペプチダーゼからは活性が確認できなかった。これはロイシンの側鎖がＮ末端に結合した糖と大きさが似ていることからロイシンアミノペプチダーゼのみに活性が確認できたものと推定された。
さらにヘミセルラーゼにも同様な活性が確認された。
【００６４】
【実施例２】
＜合成基質に対する反応曲線＞
＜反応液＞  実施例１の反応液２に同じ
【００６５】
＜操作＞
実施例１に示された反応液２を 933μL キュベットにとり37℃で 500秒間予備加温する。適当に希釈したプロテアーゼを含有する溶液67μL 添加、撹拌し反応を開始し、555nm の吸光度を測定する。また基質であるFValpNA の代わりに蒸留水を処方した反応液を作成し、同様の操作を行い吸光度変化を測定した。FValpNAから得られる吸光度から水ブランクを差し引き反応曲線を算出した。
結果を図１に示す。
【００６６】
図１からわかるようにデブロッキングアミノペプチダーゼ（Deblocking aminopeptidase ；タカラ社製）、ブタ肝由来N-アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（N-Acylaminoacyl-peptide hydrolase ；タカラ社製）及びプチジルアミノペプチダーゼIV（Dipeptidyl  aminopeptidaseIV) に関し、FValpNA からFValを生じFOD によって過酸化水素が経時的に生じる様子が観察された。
【００６７】
【実施例３】
＜糖化ヘモグロビンを基質とした場合の検量線＞
＜反応液１＞
10mM  Tris緩衝液  pH8.5
10U/ml  デブロッキングアミノペプチダーゼ（タカラ社製、日本）
【００６８】
＜反応液２＞
150 mM  Tris緩衝液  pH8.5
15U/ml  POD(シグマ社製）
12mM  TOOS
8mM  4-AA（和光純薬社製）
2U/ml  FOD(旭化成工業社製）
＜Hb基質溶液＞
ヒトヘモグロビンを４g/dlになるように蒸留水に溶解してHb基質溶液とした。
Hb基質溶液(4g/dl) の0.0 、0.5 、1.0 、1.5 、2.0 倍濃度の試料を用いた。
【００６９】
＜操作＞
上記反応液１ 240μl を試験管に取り37℃で５分間加温する。Hb基質溶液 8μl を添加し、攪拌して反応を開始し、正確に５分後にトリクロル酢酸にて除蛋白し、中和後この溶液に反応液２を80μL を添加した。反応液２添加前後の546nm の吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
【００７０】
Hb基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引き感度を計算した。またHb1.0 倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図２に示す。
図２から分かるようにHb基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られた。またHb1.0 倍濃度ではCV値＝2.5 ％と良好な再現性が確認されており、本発明の測定系を用いて糖化ヘモグロビンが選択的に、感度良く、また再現良く測定されていることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例２に基づく合成基質を用いた場合の反応曲線である。
【図２】本発明の実施例３に基づく糖化ヘモグロビンの検量線である。
【図１】
0004925384.tif 000005
【図２】
0004925384.tif 000006