(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、２１３番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、配列番号２おいて２１３番目のＡｌａがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１において第６３７番目の塩基に相応する塩基がアデニンである塩基配列からなり、かつグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、配列番号１において第６３７番目の塩基に相応する塩基がアデニンである塩基配列からなり、かつグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項９】
組換え体ＤＮＡが、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物で複製可能な組換え体ＤＮＡである、請求項８記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項１０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３５）株が保有するプラスミドｐＣＲＢｚｗｆＭ。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡまたはプラスミドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞が、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物である請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡを人為的に染色体上に取り込んだ、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する形質転換体。
【請求項１５】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１３または１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−システインからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする、該Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌由来の新規なグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ６ＰＤと略す）、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ＤＮＡを染色体上に有する形質転換体、及びこれらの形質転換体を培養することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法に関する。
背景技術
アミノ酸を効率よく生産する菌株を得るためには、その細菌における該アミノ酸の生合成に関わる遺伝子の性質およびそれらの発現・活性制御様式を知り、それに基づく合理的な育種を行うことが重要である。
アミノ酸生産に関わる遺伝子の機能を理解するための重要な方法の一つは、遺伝学的な手法、例えばアミノ酸生産性の上昇あるいは減少と遺伝子変異との関係を明らかにすることである。
アミノ酸生産菌の育種の多くは、アミノ酸アナログなどの薬剤に対する耐性変異の付与により行われているが、多くの場合、生産性向上がどの遺伝子の変異によってもたらされているかは明らかでない。
多くの微生物のアミノ酸生合成には、還元反応時の補酵素としてＮＡＤＰＨが必要である。例えば、１分子のＬ−リジン生合成には４分子のＮＡＤＰＨが必要となる。同様に、スレオニンでは１分子あたり３分子、イソロイシンでは１分子あたり５分子のＮＡＤＰＨが必要となるなど、大部分のアミノ酸の生合成には分子あたり複数のＮＡＤＰＨを必要とする。従って、微生物を用いたこれらのアミノ酸の生産にとって、ＮＡＤＰＨの供給は重要な課題である。
多くの微生物では、ＮＡＤＰＨの供給酵素は限定される。該微生物の糖代謝の主要経路上でＮＡＤＰＨを供給できるのは、主にペントースリン酸経路（ＨＭＰ）中のＧ６ＰＤ［ＥＣ１．１．１．４９］、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．４］、およびＴＣＡ回路中のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．４１］と考えられている。
なかでもＨＭＰの第一酵素であり、エムデン・マイヤーホフ経路（ＥＭＰ）との分岐点酵素でもあるＧ６ＰＤはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属やコリネバクテリウム属細菌による種々のアミノ酸の生産にとって非常に重要な酵素と考えられ、生化学的諸性質を中心に様々な解析が行われてきた。コリネバクテリウム属細菌の該酵素については、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，９８，１１５１，（１９６９）；Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１０１，（１９８７）、特開平９−２２４６６１に報告されているが、該酵素を利用したアミノ酸の生産性向上に関する検討は報告されていない。
また、大腸菌、およびコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの細菌については、該遺伝子の塩基配列が解明されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３，９６８，（１９９１）；特開平９−２２４６６１］が、該遺伝子を利用したアミノ酸の生産性向上に関する検討は報告されていない。
発明の開示
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与するＧ６ＰＤ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡまたは該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を利用して、微生物によるＬ−アミノ酸生産性をより高め、工業的に有利にＬ−アミノ酸を製造することにある。
本発明者は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することに成功し、Ｌ−アミノ酸の製造に利用できることを見出した。また、鋭意検討を行った結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列において２１３番目のＡｌａが別のアミノ酸に置換され、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸の生産性をさらに向上させることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２１）に関する。
（１）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、２１３番目のＡｌａが別のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチド。
（３）  配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（４）  上記（２）のポリペプチドのアミノ酸配列において、２１３番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチド。
（５）  配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、２１３番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチド。
（６）  上記（１）〜（５）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７）  配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（８）  配列番号１で表される塩基配列において、Ａｌａをコードする第６３７〜６３９番目の塩基配列が、Ａｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
（９）  配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（１０）  配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で表される塩基配列においてＡｌａをコードする第６３７〜６３９番目の塩基配列に相応する塩基配列がＡｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１１）  配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１において第６３７番目の塩基に相応する塩基がアデニンである塩基配列を有し、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１２）  上記（６）〜（１１）いずれか１つのＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１３）  組換え体ＤＮＡが、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物で複製可能な組換え体ＤＮＡである、上記（１２）の組換え体ＤＮＡ。
（１４）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３５）株が保有するプラスミドｐＣＲＢｚｗｆＭ。
（１５）  上記（１２）〜（１４）いずれか１つの組換え体ＤＮＡまたはプラスミドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１６）  宿主細胞が、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物である、上記（１５）の形質転換体。
（１７）  宿主細胞が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１６）の形質転換体。
（１８）  上記（６）〜（１１）いずれか１つのＤＮＡを人為的に染色体上に取り込んだ、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する形質転換体。
（１９）  コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、上記（１７）または（１８）の形質転換体。
（２０）  上記（１５）〜（１９）いずれか１つの形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（１）〜（５）いずれか１つのポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
（２１）  上記（１６）〜（１９）いずれか１つの形質転換体を培地に培養し、培養物中にＮＡＤＰＨを利用して生合成されるＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
（２２）  ＮＡＤＰＨを利用して生合成されるＬ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−システインから選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（２１）のＬ−アミノ酸の製造方法。
（２３）  Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、上記（２１）のＬ−アミノ酸の製造方法。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１３番目のＡｌａが別のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチドである。該ポリペプチドとしては、例えば配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがあげられる。
Ｇ６ＰＤ活性を有していれば、上記ポリペプチドが有するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含される。ただし、該ポリペプチドは公知のＧ６ＰＤ（例えば、配列番号２において、１２０番目のＴｈｒがＡｌａに置換されたポリペプチド）を含まない。
該１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧ６ＰＤ活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２または１２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列をもともと有し、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチド（例えばコリネバクテリウム・グルタミクムと近縁の微生物由来のＧ６ＰＤ）をコードするＤＮＡに上記方法により部位特異的変異を導入し、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２１３番目のアミノ酸に相応するアミノ酸を別のアミノ酸に置換することによっても取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがＧ６ＰＤ活性を有するためには、配列番号２または１２記載のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明のポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列においてＡｌａをコードする第６３７〜６３９番目の塩基配列がＡｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに置換された塩基配列（以下、配列番号１ｓｕｂと略す）を有するＤＮＡ、または配列番号１において、第６３７番目の塩基がアデニンである塩基配列を有するＤＮＡである配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で表される塩基配列においてＡｌａをコードする第６３７〜６３９番目の塩基配列に相応する塩基配列がＡｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧ６ＰＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。ただし、該ＤＮＡには公知のＤＮＡ（例えば、配列番号１において、３５８番目のアデニンがグアニンに置換されたＤＮＡ）は含まれない。
ここで、配列番号１のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号１または配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、前述のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号１または１１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
上記本発明のＤＮＡは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｎｏ．５８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３４）株あるいは該株に通常の変異操作を施した後、Ｌ−アミノ酸生産性が高まった変異株から取得することができる。
変異操作としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いた常法；微生物実験マニュアル，１９８６年，１３１頁，講談社サイエンティフィック社）をあげることができる。
上記本発明のＤＮＡの単離は、以下の方法により行うことができる。
すなわち、該ＤＮＡを含む株より、例えば斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により染色体ＤＮＡを調製し、該染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。得られたＤＮＡ断片を細菌内で自立複製可能なベクター（例えばプラスミド）に連結し、該連結されたＤＮＡをＧ６ＰＤ活性が欠損する微生物に導入する。得られた微生物より、Ｇ６ＰＤ活性を指標に形質転換株を単離し、該形質転換株より該酵素遺伝子を単離する。
例えば、大腸菌［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のグルコース−６−リン酸イソメラーゼのみを欠損する株はグルコースを唯一の炭素源とする培地で生育できるが、さらにＧ６ＰＤを欠損する株はグルコースを唯一の炭素源とした培地で生育できない［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，１９２（１９９６）］。従って、該２重欠損株にＤＮＡを導入し、グルコースを唯一の炭素源とした培地で生育できるようになった株を選択することにより、該株より本発明のＤＮＡを単離することができる。
本発明のＤＮＡを導入する微生物は、該ＤＮＡが発現可能なものならば、いかなる属の細菌でも使用できる。また、自立複製可能なベクターとは、該細菌内で自立複製できるものならばいかなるものでもよい。例えば、エシェリヒア属に属する微生物、なかでも大腸菌の場合、該自立複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１８（宝酒造社製）やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（東洋紡社製）が挙げられる。また、ｐＣＥ５４（特開昭５８−１０５９９９）のような大腸菌とコリネバクテリウム属細菌の両方で自立複製可能なシャトルベクターでもよい。
該ベクターと本発明のＤＮＡとの連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いる通常の方法で行なうことができる。宿主への導入は、例えば大腸菌の場合、ハナハンらの方法［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，５５７（１９８３）］等により行なうことができる。
あるいは、Ｇ６ＰＤ遺伝子の塩基配列情報［例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムの場合、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション・ナンバー  Ｅ１３６５５、あるいは配列番号１で表される塩基配列］をもとにオリゴマーＤＮＡを合成し、該オリゴマーＤＮＡをプライマー、コリネバクテリウム属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を行い、得られたＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子を有するベクターに連結してエシェリヒア属、コリネバクテリウム属細菌等の適当な宿主に導入し、該遺伝子を単離することもできる。この場合はＧ６ＰＤ欠損株を用いる必要はない。
さらには、該遺伝子の塩基配列、例えば配列番号１で表される塩基配列をもとに、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばパーキンエルマー社製ＡＢＩ３９４８を用いて合成することもできる。
上記方法により単離された本発明のＤＮＡを、宿主微生物で複製および発現が可能な発現ベクターに導入し、得られた組換え体ベクターにより宿主微生物を形質転換する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
この目的のためのベクターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の場合、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔エシェリヒア・コリ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔エシェリヒア・コリ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。また、コリネバクテリウム属に属する微生物の場合、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］、および本明細書実施例に示すｐＣＳ２９９Ｐ等が挙げられる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、下記に示したＬ−アミノ酸を生産することのできる細胞であればいずれでもよいが、好ましくは該アミノ酸を生産する能力を有する微生物が用いられる。より好ましくは、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、さらに好ましくはコリネバクテリウム属に属する微生物が、とくに好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムが用いられる。
該微生物の例として、例えば、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物をあげることができる。具体的な例としては、エシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ  ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ  ＴＢ１、エシェリヒア・コリ  ＡＴＣＣ  ９６３７、エシェリヒア・コリ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９８５、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｐｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、バチルス・ズフチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｉｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、プレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２４０、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１５８０６、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｎｍ ａｍｍｎｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ���ＡＪ１２３４０等をあげることができる。好適には、下記の菌株あるいは下記菌株から誘導されたＬ−アミノ酸生産変異株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３８６９
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３８７０
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エシェリヒア属に属する微生物の場合、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕や電気穿孔法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２３５、３７５（１９９４）］等をあげることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物の場合、プロトプラスト法（例えば、特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４９）や、電気穿孔法［例えば、［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，４０９６（１９９３）］を挙げることができる。
本発明のＤＮＡを染色体上に有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物としては、該ＤＮＡ断片が遺伝子組換えあるいは変異処理により染色体上に人為的に導入されたものであればいかなるものでもよい。例えば任意の配列のＧ６ＰＤ遺伝子を含む株から変異処理によって本発明のＤＮＡを含む株に改変された株でもよいし、あるいは、相同組換え法［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８４（１９９１）；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，１８６３（１９９８）］、ファージやトランスポゾンを用いる方法［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，２３２５−２３３９（１９９６）］などで該ＤＮＡ断片が染色体内に人為的に挿入された株でもよい。好適には、相同組み換え法により該ＤＮＡが染色体中に挿入された株があげられる。
本発明においては、遺伝子組換えに加え、変異処理により得られた株も形質転換体と呼ぶ。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
また、本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
該Ｌ−アミノ酸としては、生合成にＮＡＤＰＨを使用するアミノ酸であればいずれでもよい。例えば、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−システインなどが挙げられる。あるいは、これらアミノ酸を中間体とするアミノ酸以外の化合物でもよい。好適にはＬ−リジンが挙げられる。第１図にアミノ酸の生合成経路を示した。図中、ＮＡＤＰＨを消費する反応を下線とともに示した。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の栄養培地を用いることができる。
炭素源としては、本発明の形質転換体もしくは微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収することができる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、配列番号２または１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  新規Ｇ６ＰＤ遺伝子の取得
（１）Ｇ６ＰＤ遺伝子の塩基配列決定
コリネバクテリウム・グルタミカムＮｏ．５８株（以下、Ｎｏ．５８株と略す）は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株（以下、ＡＴＣＣ１３０３２株と略す）に変異処理を施して得られたＬ−リジン生産菌である。該菌株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１２年４月１４日付けで受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３４として寄託されている。ＡＴＣＣ１３０３２株およびＮｏ．５８株のＧ６ＰＤ遺伝子を以下のようにクローニングした。
それぞれの株より、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により染色体ＤＮＡを調製した。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ２３３株において既知となっているＧ６ＰＤ遺伝子の塩基配列［ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション・ナンバーＥ１３６５５］をもとにして、該塩基配列を標的とするＰＣＲ反応のためのプライマーを常法により作成した。配列番号３、４に該プライマーの塩基配列を示す。ＰＣＲ反応はパーキンエルマー社製サーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００）、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、各染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、及び添付のバッファーを用いて、９４℃−１分間、６０℃−１分間、７４℃−２分間のサイクルを２５回行った。増幅した約２．２ｋｂのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出精製した。
Ｇ６ＰＤ遺伝子を含む上記２．２ｋｂのＤＮＡ断片とｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（インヴィトロジェン社製）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結した後、常法に従って大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（インヴィトロジェン社製）に形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整された培地］上にて選択した形質転換株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地中で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第２版）にてプラスミドを調製した。
ＡＴＣＣ１３０３２株由来のＧ６ＰＤ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＢｚｗｆ１、Ｎｏ．５８株由来のＧ６ＰＤ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＢｚｗｆ２と命名した。
次に、これらプラスミド上のＧ６ＰＤ遺伝子の塩基配列を常法により決定した。その結果、ＡＴＣＣ１３０３２株およびＮｏ．５８株から得られたＧ６ＰＤ遺伝子の塩基配列は全く同じであることが判明した。該塩基配列を配列番号１に示す。すなわち、Ｌ−リジン生産菌Ｎｏ．５８株のＧ６ＰＤ遺伝子は野生型であることが示された。
（２）新規Ｇ６ＰＤ遺伝子の取得
Ｎｏ．５８株にＮＴＧによる変異処理（微生物実験マニュアル，１９８６年，１３１頁、講談社サイエンティフィック社）を施した後、１ｍｇ／ｍｌの６−アザウラシルを含む最少寒天培地［グルコース１０ｇ、塩化アンモニウム４ｇ、尿素２ｇ、リン酸二水素一カリウム１ｇ、リン酸一水素二カリウム３ｇ、硫酸第一鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４ｇ、硫酸マンガン７水和物４ｍｇ、塩化亜鉛７水和物４０μｇ、塩化第二鉄６水和物２００μｇ、塩化銅２水和物１０μｇ、塩化マンガン４水和物１０μｇ、四ほう酸ナトリウム１０水和物１０μｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１０μｇ、ビオチン５０μｇ、ニコチン酸５ｍｇ、アガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整された培地］に播種し、３０℃で２日間培養した。出現したコロニーを単離し、下記実施例２（４）で示した方法でＬ−リジンの生産試験を行い、Ｎｏ．５８株に比べて生産性の高いクローンを選定した。そのうちの１株をＭ１株と命名した。Ｍ１株のＧ６ＰＤ遺伝子を上記（１）の方法により単離し、該遺伝子をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターに組み込んだ。得られた組み換えプラスミドをｐＣＲＢｚｗｆＭと命名した。その塩基配列決定を行ったところ、ＡＴＣＣ１３０３２株およびＮｏ．５８株中のＧ６ＰＤ遺伝子では配列番号１の６３７番目の塩基がグアニンだが、Ｍ１株中のＧ６ＰＤ遺伝子ではアデニンに変化していた。該塩基配列を配列番号１１に示した。
該変異により、ＡＴＣＣ１３０３２株およびＮｏ．５８株中のＧ６ＰＤのアミノ端末側より２１３番目のＡｌａ（コドンＧＣＴ）が、Ｍ１株のＧ６ＰＤではＴｈｒ（コドンＡＣＴ）に変化していた。該アミノ酸配列を配列番号１２に示した。
即ち、Ｍ１株のＧ６ＰＤにはＡｌａ２１３Ｔｈｒのアミノ酸置換変異が存在することが示された。ｐＣＲＢｚｗｆＭを保有する大腸菌ＴＯＰ１０株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１２年４月１４日付けで受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３５として寄託されている。
実施例２  新規Ｇ６ＰＤ遺伝子のＬ−リジン生産に与える効果
（１）遺伝子置換用ベクターの作成
実施例１で示されたＧ６ＰＤのアミノ酸置換変異の効果を調べるため、Ｎｏ．５８株のＧ６ＰＤ遺伝子を変異型に置き換えることを試みた。
そのための遺伝子置換用ベクターを以下のように作製した。
配列番号５と６で表される塩基配列を有するそれぞれ３７ｍｅｒ、２９ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを常法に従い合成した。０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ５０μｌ中にそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌとなるように混合し、９５℃で２分間保持した後、６５℃で１５分間保持した。３時間かけて３０℃まで冷却し、両一本鎖ＤＮＡを対合させて２本鎖ＤＮＡを得た。
ｐＨＳＧ２９９（宝酒造社製）をＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ（いずれも宝酒造社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出精製した。得られたｐＨＳＧ２９９断片と上記２本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションキットｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いて連結し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。該菌株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株のうちの１株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を用いて終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＨＳＧ２９９Ｌと命名した。
（２）プラスミドｐＣＳ２９９Ｐの造成
大腸菌とコリネ型細菌双方で自立複製可能なシャトルプラスミドｐＣＳ２９９Ｐを以下の方法で作製した。
ｐＣＧ１１６［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，９２１（１９９３）］をＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で切断し、ＢｇｌＩＩ切断断片を取得した。
ｐＨＳＧ２９９（宝酒造社製）をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、得られたＢａｍＨＩ切断断片を常法にしたがってエタノール沈殿法により濃縮し、該断片をアルカリフォスファターゼで処理した。得られた上記２種類の断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。反応産物を用い、常法（モレキュラー・クローニング第２版）に従って大腸菌ＮＭ５２２株を形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、ｐＣＳ１１６−２９９Ｂｇｌ１  ＤＮＡを取得した。
該ｐＣＳ１１６−２９９Ｂｇｌ１ＤＮＡの制限酵素切断部位を常法に従って確認した。
ｐＣＳ１１６−２９９Ｂｇｌ１ＤＮＡを用いて電気穿孔法［ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，２９９，（１９８９）］によりコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２株を形質転換した。
該菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＣＭ寒天培地［ポリペプトンＳ（日本製薬社製）］１０ｇ、酵母エキスＳ（日本製薬社製）５ｇ、エルリッヒ肉エキス（極東製薬工業社製）１０ｇ、塩化ナトリウム  ３ｇ、ビオチン３０μｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株より常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素で切断することにより、該プラスミドがｐＣＳ１１６−２９９Ｂｇｌ１であることを確認した。
ｐＣＳ１１６−２９９Ｂｇｌ１  ＤＮＡを、ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩで切断した後、エタノール沈殿法により精製した。得られたＤＮＡからキロシーケンシング用デリーションキット（宝酒造社製）を用いて部分欠失プラスミドを取得した。該プラスミドを用い、常法に従って大腸菌ＮＭ５２２株を形質転換した。該菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成し、部分欠失長の異なるプラスミドを選択した。
選択したプラスミドを用いて、電気穿孔法によりコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２株を形質転換した。得られた形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＣＭ寒天培地上に塗布後、３０℃で２日間培養し、カナマイシン耐性コロニーの出現の有無を指標としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス中で自立複製能を有するプラスミドを選択した。
自立複製能を有するプラスミドの中で最も長い欠失領域を有するプラスミドを選択し、このプラスミドをｐＣＳ２９９ｄｅｌ６とした。
ｐＣＳ２９９ｄｅｌ６  ＤＮＡを常法に従って形質転換株より調製した後、制限酵素ＤｒａＩおよびＰｖｕＩＩ（いずれも宝酒造社製）を用いて切断した。該切断ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分画後、ｐＣＧ１１６由来のＤＮＡを有する約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、ＤＮＡ  ｐｒｅｐ（旭硝子社製）を用いて抽出精製した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（東洋紡績社製）ＤＮＡを、常法に従ってＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）で切断した。得られた切断ＤＮＡ断片をエタノール沈殿法により濃縮後、アルカリフォスファターゼ処理した。該処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分画後、ＤＮＡ  ｐｒｅｐを用いて抽出精製した。
上記２．７ｋｂのＤＮＡ断片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）断片をライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて連結した後、該連結ＤＮＡを用いて、常法に従って大腸菌ＮＭ５２２株を形質転換した。該菌株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）、１ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成した。ＥｃｏＲＩ切断によって３．４ｋｂと２ｋｂのＤＮＡ断片を生じるプラスミドをｐＣＳＳＫ２１とした。
配列番号７、８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成し、これらのＤＮＡをプライマーとして、ｐＨＳＧ２９９ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、添付の反応条件に従って、ＰＣＲ反応を行った。反応産物を常法に従ってエタノール沈殿した後、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ（宝酒造社製）を用いて切断した。該切断ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｐｒｅｐを用いて抽出精製した。
配列番号９、１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成し、これらのＤＮＡをプライマーとして、ｐＨＳＧ２９９ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、添付の反応条件に従って、ＰＣＲを行った。反応産物を常法に従ってエタノール沈殿した後、制限酵素ＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩを用いて切断した。該切断ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｐｒｅｐを用いて抽出精製した。
上記で取得したプラスミドｐＣＳＳＫ２１をＳａｌＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩを用いて切断した。該切断ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約２．７ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｐｒｅｐを用いて抽出精製した。抽出精製された上記の３種類のＤＮＡ断片を混合した後、ライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて連結した。
該連結ＤＮＡ断片を用いて常法に従って大腸菌ＮＭ５２２株を形質転換した。該菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ、１ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上で培養し形質転換株を選択した。
該形質転換株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成し、第１図に記載された構造を有するプラスミドをｐＣＳ２９９Ｐとした。
ｐＣＳ２９９Ｐ及びｐＨＳＧ２９９ＬをＸｂａＩ及びＰｓｔＩ（いずれも宝酒造社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。ｐＣＳ２９９Ｐに由来するコリネバクテリウム属細菌における複製開始領域（ＯｒｉＣ）を含む２．５ｋｂの断片及びｐＨＳＧ２９９Ｌ断片をそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出精製した。該２．５ｋｂのＤＮＡ断片とｐＨＳＧ２９９Ｌ断片とをライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。得られた形質転換体から上記方法と同様にプラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＨＳＧ２９９０Ｃと命名した。
ｐＭＯＢ３（ＡＴＣＣ７７２８２）及びｐＨＳＧ２９９０ＣをＰｓｔＩ（宝酒造社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、ｐＭＯＢ３に由来する枯草菌レバンシュークラーゼ（ＳａｃＢ）遺伝子を含む２．６ｋｂのＤＮＡ断片とｐＨＳＧ２９９０Ｃ断片をそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出精製した。
該２．６ｋｂのＤＮＡ断片とｐＨＳＧ２９９０Ｃ断片とをライゲーションキットｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いて連結し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。該菌株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上にて培養し、形質転換体を選択した。得られた形質転換体から上記方法と同様にプラスミドを調製した。該プラスミドをｐＨＳＧ２９９０ＣＳＢと命名した。
ｐＨＳＧ２９９０ＣＳＢをＮｏｔＩで切断して得られる５．１ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出精製した。実施例１で作成したｐＣＲＢｚｗｆＭをＮｏｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出精製した。ライゲーションキットｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いてｐＣＲＢｚｗｆＭのＮｏｔＩ部位にＯｒｉＣおよびＳａｃＢ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片を連結し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。該菌株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で培養し、形質転換株を選択した。得られた形質転換体から上記方法と同様にプラスミドを調製した。該プラスミドをｐＣＲＢＯＳｚｗｆＭと命名しこれをＧ６ＰＤ遺伝子組み込みベクターとした。
（３）Ｎｏ．５８株のＧ６ＰＤ遺伝子の置換
Ｎｏ．５８株に変異型Ｇ６ＰＤ遺伝子を含むｐＣＲＢＯＳｚｗｆＭを導入後、池田らの方法［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，１８６３（１９９８）］を用いてこれを相同組み換えで染色体ＤＮＡ中に組み込んだ。
ｐＣＲＢＯＳｚｗｆＭにコードされる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択法［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４，５４６２（１９９２）］により２度目の相同組み換えが行われた株を選択し、該選択株の中からＮｏ．５８株が従来保有していたＧ６ＰＤ遺伝子（野生型）が変異型Ｇ６ＰＤ遺伝子に置換された株を以下の方法で単離した。
Ｎｏ．５８株にｐＣＲＢＯＳｚｗｆＭを電気穿孔法［ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，２９９（１９８９）］により導入し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＫＭ１６３寒天培地〔グルコース１０ｇ、ペプトン（極東製薬工業社製）１０ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、エールリッヒ肉エキス（極東製薬工業社製）５ｇ、尿素２ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整された培地〕上にて３０℃で２日間培養し、形質転換株を得た。該形質転換株の１株であるＴｆ１株を選択し、該菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＫＭ１６３培地中で培養し、電気穿孔法によりｐＣＧ１１（特公平６−９１８２７）の導入操作を行った。導入操作後、該菌株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＫＭ１６３寒天培地上にて３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。これらの形質転換株の１株の染色体を、池田らの報告［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，１８６３（１９９８）］に従ってサザンブロットハイブリダイゼーションにより調べた。その結果、Ｃａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組み換えによりｐＣＲＢＯＳｚｗｆＭが染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型および変異型のＧ６ＰＤ遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組み換えが起こりやすくなっている。
該形質転換株（一回組換え体）をＳｕｃ培地（ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整された培地）上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。ＳａｃＢ遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するのでこの培地では生育できない。これに対し、野生型と変異型のＧ６ＰＤ遺伝子間での２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この相同組み換えの際には、野生型もしくは変異型のＧ６ＰＤ遺伝子のいずれかが、ＳａｃＢとともに欠失する。このとき野生型のＧ６ＰＤ遺伝子がＳａｃＢとともに欠失した株では、変異型のＧ６ＰＤ遺伝子への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製し、配列番号３と４で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとしてＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体のＧ６ＰＤ遺伝子が野生型か変異型かを判定した。その結果、野生型のＧ６ＰＤ遺伝子のみを有する株（例として、Ｎｏ．５８Ｗ株）、および変異型のＧ６ＰＤ遺伝子のみを有する株（例として、Ｎｏ．５８Ｍ株）とが得られたことが確認された。
（４）Ｌ−リジン生産試験
取得したＧ６ＰＤ遺伝子置換株（Ｎｏ．５８Ｗ及びＮｏ．５８Ｍ）及び親株であるＮｏ．５８株のリジン生産性を５リットルジャーファーメンターにて培養、評価した。
一次種培地〔グルコース５０ｇ、酵母エキス（日本製薬社製）１０ｇ、ペプトン（極東製薬工業社製）１０ｇ、コーンスティープトリカー５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、尿素３ｇ、ビオチン５０μｇを水１リットルに含みｐＨ７．２に調整し、炭酸カルシウムを１０ｇ加えた培地〕１００ｍｌに各菌株を植菌し、１リットルバッフル付き三角フラスコにて３０℃で２４時間培養した。次に二次種培地（グルコース５０ｇ、コーンスティープトリカー１０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、ニコチン酸５ｍｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、ビオチン１００μｇ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ、リン酸二水素一カリウム２ｇ、尿素３ｇ、硫酸第一鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１ｍｇ、硫酸アンモニウム８ｇ、ペプトン２０ｇ、炭酸水素ナトリウム２ｇを水１Ｌに含む培地）２０００ｍｌに一次種培養液を４０ｍｌ植菌し、５リットルジャーファーメンターにて３０℃で１２時間培養した。次に本培養培地［廃糖蜜９３ｇ（糖換算量）、リン酸二水素一カリウム０．５ｇ、硫酸第一鉄７水和物１０ｍｇ、チアミン塩酸塩１００μｇ、ソイペプトン２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、ニコチン酸５ｍｇ、硫酸アンモニウム１５ｇを水１リットルに含みｐＨ７．４に調整した培地］１６７５ｍｌに二次種培養液を２３０ｍｌ植菌し、５リットルジャーファーメンターにて３５℃で４２時間培養した。
本培養培地中に蓄積したＬ−リジンの定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行なった。
第１表は、Ｎｏ．５８株、Ｎｏ．５８Ｗ株、およびＮｏ．５８Ｍ株のＬ−リジン発酵生産量の測定結果である。これにより、新規の変異型Ｇ６ＰＤにより、Ｌ−リジン生産性が向上することが示された。
【表１】
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産業上の利用可能性
本発明により、改変されたＧ６ＰＤおよび該Ｇ６ＰＤＨをコードするＤＮＡが得られ、該改変されたＧ６ＰＤを用いて、微生物によるＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号  ３：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  ４：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  ５：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  ６：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  ７：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  ８：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  ９：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
配列番号  １０：人工配列の説明−合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、蛋白質を構成する２０種アミノ酸のコリネバクテリウム属細菌における生合成経路を示した図である。下線を記した箇所はＮＡＤＰＨを消費する反応を示す。枠囲みの箇所はＮＡＤＰＨを生産する反応を示す。
各反応を司る酵素に対応する遺伝子名は、基本的に大腸菌の命名法によった。図中、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはＧ６ＰＤ（ｚｗｆ）と表した。第２図は、ｐＣＳ２９９Ｐの造成過程を示した図である。
【図１】
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【図２】
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