(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性液体（Ｉ）中に存在する負電荷を有する物質を除去する方法であって、当該方法が、
（ｉ）上記液体を、正荷電構造（アニオン交換体）及び疎水性構造を含む複数のリガンドを担持するマトリックスと、リガンドと上記物質とが結合する条件下で、接触させる段階、及び
（ｉｉ）上記マトリックスから上記物質を脱着させる段階
を含み、
（Ｉ）上記各リガンドがスペーサーを含めて次式で表され、
−−ＳＰ−−−［Ａｒ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2Ｒ3Ｒ4）］
式中、
（Ａ）［Ａｒ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2Ｒ3Ｒ4）］はリガンドを表し、
ａ）Ａｒは芳香族環であり、
ｂ）Ｒ1は［（Ｌ）nＲ’1］mであって、
・ｎ及びｍは０又は１から選択される整数であり、
・Ｌはアミノ窒素、エーテル酸素又はチオエーテル硫黄であり、
・Ｒ’1は二価リンカー基であって、１）直鎖、分枝鎖又は環式炭化水素基、及び２）−Ｃ（＝ＮＨ）−から選択され、
ｃ）Ｒ2-4は水素及び低級アルキルから選択され、
（Ｂ）ＳＰは、Ａｒ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2Ｒ3Ｒ4）と直接結合した炭素、窒素、硫黄又は酸素を与えるスペーサーであり、
（Ｃ）−−−は、スペーサーがＡｒ−Ｒ1−Ｎ+（Ｒ2Ｒ3Ｒ4）の水素を置換していることを表し、
（Ｄ）−−は、マトリックスに結合していることを表し、
（ＩＩ）段階（ｉｉ）の脱着が、上記物質がセリンプロテアーゼである場合、特にＲ’が−Ｃ（＝ＮＨ）−である場合、アニオン交換条件下で実施される、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、前記アニオン交換体（１）が、
（ａ）水性対照液体（ＩＩ）中の前記物質に、０．３Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度のアニオン交換条件下で結合することができるとともに、
（ｂ）前記物質に対するｐＨ範囲２〜１２における最大破過容量が、Ｑ−交換体（−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2Ｎ+（ＣＨ3）3）での前記物質のｐＨ範囲２〜１２における最大破過容量の２００％以上であり、
上記アニオン交換体が、同じ条件下で決定して、同じリガンド密度及び破過容量を有する、方法。
【請求項３】
ｍ＝１であり、Ｒ’が直鎖、分枝鎖又は環式炭化水素基から選択される二価リンカー基であって、上記炭化水素基は置換されていてもよいし、及び／又はエーテル酸素、チオエーテル硫黄又はアミノ窒素が介在していてもよい、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックスの複数のリガンドが１２以下のｐＫａを有し、及び／又は第１級又は第２級窒素であることを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ａｒ、ＳＰ、Ｒ’1及びＲ2-4の少なくとも１つが、−Ｎ+（Ｒ2Ｒ3Ｒ4）の正荷電窒素から１〜７原子の距離に、１又は２以上の電子供与体−受容体原子又は基を含むが、Ａｒにおけるこの原子又は基が芳香族構造のｓｐ2−炭素ではないことを特徴とする、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ｎ＝０、ｍ＝１、Ｒ’＝−Ｃ（＝ＮＨ）−、Ｒ2-4＝水素、Ａｒ＝ｐ−Ｃ6Ｈ4−、ＳＰが第２級アミノ窒素を介してＡｒに結合されていることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項７】
吸着／結合段階（ｉ）中のイオン強度が、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液のイオン強度より大きいか又は同等であることを特徴とする、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記アニオン交換体の、又は前記アニオン交換体中に存在するアニオン交換体リガンドの、水性液体（Ｉ）のｐＨが、ｐＫａ＋２以下であることを特徴とする、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記物質の負電荷を減少させるため、水性液体（ＩＩ）のｐＨが、水性液体（Ｉ）のｐＨと異なることを特徴とする、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
水性液体（ＩＩ）の極性が、水性液体（Ｉ）の極性よりも低いことを特徴とする、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、水性液体(Ｉ)から、陰性電荷を担持する化合物(＝物質)を除去する方法に関する。本方法は：
i)当該液体と、リガンドと物質の間の結合をさせる条件下に(a)陽性荷電構造および(b)疎水性構造を含む、複数の混合モードアニオン交換体を担持するベースマトリックスを含むアニオン交換体を接触させる、そして
ii)該物質を該マトリックスから、液体(II)の使用により脱着させる
段階を含む。
【０００２】
本発明はまた疎水性構造および陽性荷電構造の両方を含む新規アニオン交換リガンドが存在する、新規アニオン交換体に関する。
【０００３】
「陰性電荷を担持する」および「陰性に荷電した」なる用語は、物質が１個以上の陰性電荷を有するおよび／または陰性の正味の電荷であることを意味する。
【０００４】
本明細書の内容において、「混合モードアニオン交換体リガンド」および「バイモードアニオン交換体リガンド」なる用語は、結合する物質と相互作用する、少なくとも二つの、しかし、協同(co-operative)の部位を提供することができるリガンドを意味する。この部位の一つは、リガンドと目的の物質の間の電荷−電荷相互作用の興味深いタイプを提供する。第２の部位は、典型的に、電子アクセプター−ドナーおよび／または疎水性相互作用を提供する。電子ドナー−アクセプター相互作用は、水素結合、π−π、電荷移動、双極子−双極子、誘起双極子等のような相互作用を含む。
【０００５】
発明の背景
上記の方法は、充填または流動床の形のモノリスマトリックスまたは粒子マトリックスを利用したクロマトグラフィー手順、またバッチ式手順にも使用される。手順の目的は、陰性電荷を担持する物質の精製であり得、この場合、標的物質をマトリックスに結合させ、必要な場合、マトリックスからの脱着に続いて更に精製する。他の目的は、液体からの陰性電荷を担持する望ましくない物質の除去である。後者の場合、液体を、段階(i)でマトリックスと接触させた後に更に処理し得る。両方の場合、そして望ましいなら、マトリックスを結合物質の脱着後に再使用し得る。
【０００６】
他の使用は、陰性荷電を担持する物質または液体Ｉに残る物質のいずれかの測定が関与するアッセイ手順である。
【０００７】
先行のアニオン交換吸着において、陽性に荷電したリガンドは、典型的に、１級、２級、３級または４級アンモニウム構造のような窒素構造を含んでいる。ある場合、リガンドは、荷電構造および脱着プロトコールの必要な修飾をされている疎水性構造の両方を含むことによりデュアルまたはバイモード機能性である。・Ｓimmonds et al (Ｂiochem. Ｊ. １５７ (１９７６) １５３−１５９)；Ｂurton et al (Ｊ. Ｃhromatog. Ａ  ８１４ (１９９８) ７１−８１)；およびＹon et al (Ｂiochem. Ｊ. １５１ (１９７５) ２８１−２９０は、飽和炭化水素基を有するアニオン交換体リガンドを記載している。
・Ｃrowther et al (Ｊ. Ｃhrom. ２８２ (１９８３) ６１９−６２８)；Ｃrowther et al (Ｃhromatographia  １６ (１９８２) ３４９−３５３)；Ｗongyai (Ｃhromatographia  ３７(７／８) (１９９４) ４８５−４９０)；Ｂischoff et al (Ｊ. Ｃhrom. ２７０ (１９８３) １１７−１２６)は、芳香族成分が存在するアニオン交換体リガンドを担持する逆相でのオリゴヌクレオチドおよび小分子の高速液体クロマトグラフィーを記載している。
疎水性マトリックスに基づいたアニオン交換体からの類似の効果が記載されているＳasaki et al (Ｊ. Ｂiochem. ８６ (１９７９) １５３７−１５４８)も参照のこと。
【０００８】
セリンプロテアーゼは、p−アミノベンズアミジンがパラアミノ基を介して共有結合的に結合しているマトリックスに／から親和性吸着／脱着している。参照・脱着緩衝液よりもpＨが高く、塩濃度が低い吸着緩衝液を四お湯しているＣhang et al (Ｊ. Ｃhem. Ｔech. Ｂiotechnol. ５９ (１９９４) １３３−１３９)；
・Ｃhang et alと同様の方法でpＨを変えているが、塩濃度は変えていないＬee et al (Ｊ. Ｃhromatog. Ａ  ７０４ (１９９５) ３０７−３１４)；
・脱着のためにリガンドアナログを使用しているＫhamlichi et al., Ｊ. Ｃhromatog. ５１０ (１９９０) １２３−１３２。吸着および脱着中のpＨは同じであった。イオン強度の増加のみによる脱着は失敗した。
これらの３つの文献のいずれも、アニオン交換条件下での十分な脱着手順を記載していない。
【０００９】
ＷＯ９７２９８２５(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)は、電荷および、酸素と陽性荷電アミン窒素から２−３炭素距離のアミノ窒素が関与する水素に基づく相互作用を提供する、混合モードアニオン交換体を記載する。本刊行物は、この種のリガンドが、結合物質を溶離するのに相対的に高いイオン強度を必要とするアニオン交換体を提供できるという発見に基づく。
【００１０】
ＷＯ９９６５６０７(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)は、結合物質を溶離するのに相対的に高いイオン強度を必要とする混合モードリガンドが存在するカチオン交換体を記載する。
【００１１】
相対的に高い溶出イオン強度を必要とするアニオンおよびカチオン交換リガンドを各々提供するＷＯ９７２９８２５(ＵＳ６,０９０,２８８)およびＷＯ９９６５６０７を、引用して本明細書に包含させる。
【００１２】
ＷＯ９８０８６０３(Ｕpfront Ｃhromatography)は、一般構造Ｍ−ＳＰ１−Ｌ(ここで、Ｍは疎水性であり得る支持マトリックス、ＳＰ１はスペーサーおよびＬは、置換し得る単環または二環式同種芳香族または異種芳香族部分(同種芳香族部分は炭素環のみから成る芳香族環を含む)である)の分離媒体を記載する。置換基は、主に酸性である。分離媒体は、イオン交換よりもむしろ疎水性相互作用によるタンパク質、特に免疫グロブリンの吸着のために提案されている(塩濃度２Ｍまで)。
【００１３】
ＷＯ９６００７３５、ＷＯ９６０９１１６およびＵＳ５,６５２,３４８(Ｂurton et al)は、疎水性相互作用に基づいた分離媒体を記載する。吸着および脱着は、液体の塩濃度の各々上昇または低下により、またはpＨの変化による吸着／脱着するリガンドおよび／または物質上の電荷の変化により支持される。リガンドは典型的に、芳香族構造を含み得る疎水性部分を含む。リガンドのいくつかは、加えて、またpＨ変化による媒体の疎水性／親水性バランスの変更を可能にするための荷電可能構造を含み得る。荷電可能構造は、アミン基であり得る。
【００１４】
ＵＳ５,７８９,５７８(Ｂurton et al)は、支持マトリックスに属する炭素−炭素二重結合にチオール基を添加することにより、３−メルカプトプロピオン酸、グルタチオン等のチオール含有リガンドを固定化することを提案する。発明者らは、この場合、アニオン交換吸着のために得られる物質を用いておらず、使用を示唆していない。
【００１５】
エピクロロヒドリンを使用したスルファニル酸の結合により製造した双極子吸収剤が記載されている(リガンド＋スペーサー＝−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２Ｎ＋Ｈ２Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−)(Ｐorat et al., Ｊ. Ｃhromatog. ５１ (１９７０) ４７９−４８９；およびＯhkubo et al., Ｊ. Ｃhromatog. Ａ, ７７９ (１９９７), １１３−１２２)。これらの文献は、リガンドが陽性に、取り除く物質が陰性に荷電している分離法を記載していない。
【００１６】
ＷＰＩ Ａbstract Ａccession Ｎo. ８６−３１２１３(＝ＤＤ−Ａ−２３７８４４、Ｂehrend et al)は、物質ＲＨＮＲ'Ｘを、担体、とりわけセルロースに結合させるための２,４,６−トリハロ−１,３,５−トリアジンの使用を記載する。Ｒは水素、アリールまたはアルキルである。Ｒ'はアルキレンまたはアリレンである。Ｘはカルボキシ、スルホニル、ホスフェート、ホスホネート、ボロネート等である。
【００１７】
本発明の目的
本発明の目的は：
a)タンパク質のような陰性に荷電した物質の、相対的に高いイオン強度でのアニオン交換体への吸着／結合を達成すること；
b)減少したリガンド含量であるが、標的物質を結合する十分な能力を有することができるアニオン交換媒体を提供すること；
c)広いイオン強度の範囲内のアニオン交換体に吸着／結合する物質の溶出／脱着を可能にすること；
d)タンパク質の高い貫流容量、良好な回収率(しばしば、９５％以上)を有するアニオン交換体を設計すること；
e)クロマトグラフィー特性の有意な損失なく、アルカリおよびまたは酸性環境での再生および／または洗浄に耐えることができるアニオン交換体を設計すること；
f)低いイオン強度が必要な処理において使用する、高いイオン強度のサンプルの大量の希釈を不必要にすること；
g)単純な脱塩手順を提供すること；
h)支持マトリックスに結合したとき、陰性電荷物質の吸着において慣用の対照アニオン交換体と同等か優れた、アニオン交換体またはアニオン交換リガンドの選択法を提供すること；
i)例えば、生産性の改善および／または装置および投資の費用の軽減のための、アニオン交換体が関与する単純工程を提供すること；
j)１リットルより多いサンプル容量(＝液体(Ｉ))がアニオン交換体に適用され、処理される、例えば、大規模工程のための、分取適用に適したアニオン交換体を提供すること；
k)高塩濃度でのアニオン交換体吸着剤の分離原則ベースの溶出の新規組合せ例えば、イオン交換段階後の疎水性相互作用吸着のための機会を提供すること
である。
【００１８】
これらの目的は、高塩濃度および高イオン強度で吸着するイオン交換体が有利であるという認識に基づく。これは、脱着段階で高塩濃度および高イオン強度を利用する慣用的イオン交換体と矛盾する。
【００１９】
本発明
本発明者らは、陽性荷電原子の近くに芳香族環を含むリガンドが、少なくとも一部分この目的に合うアニオン交換体を提供し得ることを発見した。本発明者らは、アニオン交換リガンド中の陽性に荷電した原子の近くへの電子ドナー−アクセプター相互作用に関係する付加的な原子または基の包含が、物質と吸着剤の間の相互作用の強度を強め得る。
【００２０】
本明細書において、近くなる用語は、この種の原子のまたは基と陽性に荷電した原子の間の距離が１−７原子、好ましくは２、３、４および５原子であることを意味する。
【００２１】
電子ドナー−アクセプター相互作用は、電子の遊離対を伴う陰性に帯電した原子がドナーとして作用し、ドナーの電子対のアクセプターとして働く電子不足原子に結合することを意味する。Ｋarger et al., Ａn Ｉntroduction into Ｓeparation Ｓcience, Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons (１９７３) page ４２参照。
【００２２】
ドナー原子／基の説明的例は：
(a)ヒドロキシ、エーテル、カルボニルおよびエステル(−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ−)のような、電子の遊離対を伴う酸素およびアミド、
(b)チオエーテル(−Ｓ−)におけるような、遊離電子対を伴う硫黄、
(c)アミン、スルホンアミドを含むアミドにおけるような、遊離電子対を伴う窒素、シアノ、
(d)ハロ(フッ素、塩素、臭素およびヨウ素)、そして
(e)sp−およびsp２−混成軌道を有する炭素
である。
【００２３】
典型的なアクセプター原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素等のような電子不足原子または基であり、ヒドロキシおよびカルボキシ中のＨＯ−、アミドおよびアミン中の−ＮＨ−、チオール中のＨＳ−等のような負に帯電した原子への水素結合を含む。
【００２４】
本発明の第１の態様は、したがって、陰性電荷を担持し、水性液体(Ｉ)に存在する物質の除去法である。本方法は、上記のように段階(i)および段階(ii)を含む。主な特徴的性質は
・スペーサーを伴うリガンドが式：
−−ＳＰ−−−[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]
を有する
・段階(ii)における脱着が、Ｒ１が−Ｃ(＝ＮＨ)−であり、物質がセリンプロテアーゼである場合、アニオン交換条件下で行なわれる。他の物質の脱着に関しては、下記表題「脱着」参照。
【００２５】
本発明の内容で意図されるアニオン交換リガンドは、典型的に存在し得るハロゲンの寄与による分子量以外に、＜１０００、例えば、＜７０００ダルトンの分子量を有する。
【００２６】
アニオン交換体
式
−−ＳＰ−−−[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]
において：
・[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]はリガンド構造を示す
・ＳＰはリガンドをベースマトリックスに結合するスペーサーである。
・−−−はスペーサーが[Ｒ５−Ｓ−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]中の水素を置換することを示す。
・−−はベースマトリックスへの結合を示す。
【００２７】
今後、低級炭化水素基および低級アルキル(低級アルキレンを含む)は、所望により置換され、下記Ｒ２−４に関して記載するような炭素鎖を有するＣ１−１０、例えば、Ｃ１−６の飽和炭化水素基を意味する。下記参照。
【００２８】
アニオン交換体中の好ましい陽性荷電構造−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)は、１２.０未満、例えば、１０.５未満のpＫa値を有する。これは、典型的にリガンドが１級、２級または３級アンモニウム基であることを意味する。pＫaの測定に関しては、下記「吸着」の欄参照。
【００２９】
リガンド
[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]において：
a)Ａrは芳香族環構造、
b)Ｒ１は[(Ｌ)nＲ'1]m、ここで
・nおよびmは０または１から選択される整数であり、(a)m＝０または(b)m＝１である場合、n＝０である場合が好ましい；
・Ｌはアミノ窒素、エーテル酸素またはチオエーテル硫黄である；
・Ｒ'１は
１)直鎖、分枝鎖または環状炭化水素基；
２)−Ｃ(＝ＮＨ)−
から選択される２価リンカー基；
c)Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素および低級アルキルから選択される。
【００３０】
窒素上の陽性荷電は、多かれ少なかれＡr−Ｒ１および／またはＲ２−４における原子または基から脱局在化し得る。―Ｃ(＝ＮＨ)−(m＝１)のＲ'１に関して、Ｒ２−４の１個、２個または３個が好ましくは水素である。
【００３１】
基Ａr
芳香族環構造Ａrは、１個以上の芳香族環、例えば、フェニル、ビフェニルまたはナフチル構造、および縮合環または２環式構造を含む他の芳香族環系を含み得る。芳香族環は、ヘテロ環であり得、すなわち、１個以上の窒素、酸素または硫黄原子を含む。環は、Ｒ１および可能性のあるスペーサーに加えて、更なる置換基を有し得る。これらの他の置換基は、例えば、水素結合を可能にする、電子ドナーまたはアクセプター原子または基を含み得る。
【００３２】
説明的Ａr基は：ヒドロキシフェニル(２−、３−および４−)、２−ベンズイミダゾリル(benzimadazolyl)、メチルチオキシフェニル(２−、３−および４−)、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル(２−、３−および４−)、４−(２−アミノエチル)フェニル、３,４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２,４,５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル−、４−スルホンアミドフェニル等である。
【００３３】
基Ｒ'１
m＝１に関して、Ｒ'１は２価炭化水素基または−Ｃ(＝ＮＨ)−である。好ましい２価炭化水素基において、典型的に１個以上の原子または基が、水素結合または上記で定義のような他の電子アクセプター−ドナー相互作用に関与する。したがって、炭化水素基の形のＲ'１は
a)１個以上の水素が低級アルキルで置換され得る１個以上の１級アンモニウム基(−Ｎ＋Ｈ３)
b)水素が低級アルキルで置換され得る１個以上のヒドロキシ(−ＯＨ)、
で置換され得、および／または
炭化水素基の炭素鎖が１個以上の位置をチオエーテル硫黄、エーテル酸素またはアミン窒素で中断され得る。
【００３４】
典型的なＲ'１は、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−Ｃ(＝Ｏ)−、−Ｃ(＝ＮＨ)−、−ＣＨ２Ｎ＋(Ｃ２Ｈ５)２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２(ＯＣＨ２ＣＨ２−)ｎ'(ここで、ｎ'は１より大きい整数、例えば、＜１００、例えば、＜２５または＜１０)等である。ｎ＝m＝１である場合、Ｒ'１は好ましくは(a)−ＣＨ２−、(b)その炭素原子の１個または２個をヒドロキシおよび／またはヒドロキシ低級アルキルまたは低級アルキル(例えば、各々ヒドロキシメチルまたはメチル)で置換されていてもよい−ＣＨ２ＣＨ２−、(c)−(ＣＨ２)ｎ"ＳＣＨ２)ｎ'''(ここで、ｎ"およびｎ'"は各々独立して１−３の整数、例えば、１および２である)、および(d)−ＣＨ２Ｎ＋(Ｃ２Ｈ５)２ＣＨ２ＣＨ２−、(e)−ＣＨ２ＣＨ２(ＯＣＨ２ＣＨ２−)ｎ'(ここで、ｎ'は１、２または３)からのような２価炭化水素基である。
【００３５】
基Ｒ２−４
好ましい例において、スペーサーがＲ'１またはＡrに結合している場合、Ｒ２−４の２個または３個が、スペーサーが窒素に結合している場合、３個が水素である。したがって、アニオン交換体リガンドは好ましくは１級または２級アミン／アンモニウム基である。
【００３６】
Ｒ２−４アルキル基は、上記のような水素結合原子を含み得る。したがって、Ｒ２−４の水素は、１個以上の位置を−ＯＲ"１および／または−Ｎ＋(Ｒ'２Ｒ'３Ｒ'４)(ここで、Ｒ'２−４およびＲ"１は水素または低級アルキルである)で置換され得る。加えて、Ｒ２−４の炭素鎖は、１個以上の位置をチオエーテル硫黄、エーテル酸素またはアミン窒素で中断され得る。
【００３７】
Ｒ２−４の１個以上は、窒素に結合した一端を有し、他方がＲ１の水素を置換するか、残りのＲ２、Ｒ３およびＲ４の一つを置換することにより、５または６員環を形成する２価アルキレンであり得る。
【００３８】
水素でない場合、１個以上のＲ２−４、Ｒ'２−４およびＲ"１基はしばしば１−３炭素原子を有する低級アルキル基から選択される。
Ｒ２−４、Ｒ'１−４およびＲ"１基の変形において、各sp３−混成軌道を有する炭素は、アミノ窒素、チオエーテル硫黄およびエーテルおよびヒドロキシ酸素から選択される最大１個の原子を担持する。
【００３９】
スペーサー(ＳＰ)
スペーサー(ＳＰ)は、ベースマトリックスから出発し、(a)−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)の窒素まで、Ｒ２−４の一つを置換することにより、または(b)−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)をＡrに接続する原子の鎖まで、Ｒ１の水素を置換することにより、または(c)Ａrの芳香族環までＡr中の水素を置換することにより伸びる。ＳＰは常にリガンド[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]の水素を置換する。したがって、スペーサーがリガンドの窒素または硫黄原子に直接結合する場合、置換基Ｒ２−５は水素である。
【００４０】
スペーサーそれ自体は伝統的イオン交換体に慣用のものであり、したがって、直鎖、分枝鎖、環状、飽和、不飽和および芳香族炭化水素(例えば、１−２０、例えば、１−１０炭素原子まで)を含み得る。Ｒ１−４に関して上記のように、炭化水素基はヒドロキシ基、アルコキシおよびアリールオキシおよび対応するチオアナログ、および／またはアミノ基を担持し得る。炭素鎖は、１個以上の位置でアミノ窒素、エーテル酸素、チオエーテル硫黄により、Ｒ１−５に関して上記のように中断され得る。アミドおよびケトンにおけるようなカルボニル基、および加水分解に対して同等な安定性を有する他の基でもあり得る。酸素、硫黄および窒素から選択される多くても一つの基は、一つのそして同じsp３−混成軌道を有する炭素に結合する。
【００４１】
ＳＰは上記のように、例えば、水素結合に関与することにより、物質のアニオン交換体への結合を促進する１個以上の電子ドナーまたはアクセプター原子または基を提供し得る。これらの原子または基は、(a)ベースマトリックスからリガンドまで伸びるスペーサーにおける原子の鎖の一部またはそれに直接結合し得る、または(b)この鎖に結合する分枝基の一部であり得る。本明細書における分枝基は
・前段落に記載の原子の鎖に直接結合する、そして
・水素結合のような電子ドナーアクセプター相互作用に関与する原子または基を含む
基である。
【００４２】
好ましい変形において、直接Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)に結合するＳＰの部分は：
・炭素、好ましくはカルボニル炭素またはsp３−混成軌道を有する炭素；または
・窒素、好ましくはアミノまたはアミド窒素；または
・硫黄、好ましくはチオエーテル硫黄；または
・酸素、好ましくはエーテル酸素
であるが、但し、ＳＰは(b)−(d)に関して、[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]における炭素に結合する。
【００４３】
直接[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]に結合するＳＰの典型的構造は：−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)−、−Ｃ(ＣＨ３)２−、−Ｃ(ＣＨ２ＣＨ３)２−、−Ｃ(ＯＣＨ３)２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)２ＳＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−である(Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)に結合する正確な原子価)。スペーサーの残りの部分は、伝統的イオン交換体と同じ種であり得る。
【００４４】
スペーサーは、将来開発される技術も含む、慣用の共有結合的結合法により導入し得る。説明的結合化学は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなビスエポキシド、ジクロロプロパノールのようなハロゲン置換脂肪族物質、ジビニルスルホン、カルボニルジイミダゾール、グルタル酸ジアルデヒドのようなアルデヒド、キノン、シアノーゲンブロミド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムのような過ヨウ素酸塩、カルボジイミド、クロロトリアジン、トシルクロライドおよびトレシルクロライドのようなスルホニルクロライド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、オキサゾロン、マレイミド、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート、ピリジルジスルフィドおよびヒドラジドを含む。
【００４５】
ベースマトリックス
ベースマトリックスは有機および／または無機物質に基づく。
【００４６】
ベースマトリックスは、好ましくは親水性であり、ポリマーの形であり、それは水に不溶性であり、多かれ少なかれ水中で膨張性である。親水性になるように誘導体化されている疎水性ポリマーはこの定義に含まれる。適当なポリマーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、澱粉、プルラン等のようなポリサッカライドをベースにしたポリヒドロキシポリマーであり、ポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)、およびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)、ポリビニルアルコールのような完全な合成ポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンをベースにしたポリマー、２個以上のモノマーが上記ポリマーに対応するコポリマーを含む。水に可溶性のポリマーは、例えば、架橋により、および不溶性体に吸着または共有結合的結合を介して結合することにより、不溶性となるように誘導体化し得る。親水性基を、疎水性ポリマーに(例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンのコポリマー上に)、ＯＨに変換できる基を示すモノマーの重合化により、または最終ポリマーの親水性化により、例えば、親水性ポリマーのような適当な化合物の吸着により、導入できる。
【００４７】
ベースマトリックスに使用する適当な無機物質は、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタル等である。
好ましいマトリックスは、シラン、エステル、アミド基のような加水分解に対して不安定な基およびシリカ自体に存在する基を欠く。これは、使用する液体と直接接触する基に関して特に当てはまる。
【００４８】
マトリックスは多孔性または無孔性であり得る。これは、マトリックスが除去する物質が完全に一部透過性であるか(多孔性)、または非透過性である(無孔性)、すなわち、マトリックスが除去する物質に対して０.４０−０.９５の間のＫavを有すべきであることを意味する。これは、例えば、エクステンダーを有するあるマトリックスに関して、Ｋavがより低い、例えば、０.１０まで低いまたはより低いことがあり得ることを排除しない。例えば、ＷＯ９８３３５７２(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)参照。
【００４９】
本発明の特に興味深い実施態様において、マトリックスは１−１０００μm、好ましくは高性能適用に関しては５−５０μmの、分取目的では５０−３００μmの範囲のサイズの不規則なまたは球状粒子の形であり得る。
【００５０】
マトリックスの興味深い形は、液体よりも高いまたは低い密度を有する。この種のマトリックスは、流動床または膨張床クロマトグラフィーでの、ならびに異なるバッチ式手順、例えば、撹拌タンクでの大規模操作に特に適用可能である。流動および膨張床手順は、ＷＯ９２１８２３７(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)およびＷＯ９２００７９９(Ｋem−Ｅn−Ｔek)に記載されている。
【００５１】
親水性マトリックスなる用語は、マトリックスの接近可能な表面が、水性液体がマトリックスを通過できる点で親水性であることを意味する。典型的に、親水性ベースマトリックスの接近可能な表面は、例えば酸素および／または窒素原子を含む複数の極性基を曝す。このような極性基の例は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル(例えば、(−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−)nＨ(ここで、nは整数である))である。
【００５２】
本発明で使用するアニオン交換体におけるアニオン交換リガンドのレベルは、通常、０.００１−４mmol／mlマトリックス、例えば、０.００２−０.５mmol／mlマトリックスの間から通常選択され、０.００５−０.３mmol／mlマトリックスが好ましい。可能性のあるそして好ましい範囲は、とりわけ、マトリックス、リガンド、除去する物質物質の種により決定される。したがって、アニオン交換リガンドのレベルは、通常、アガロースベースのマトリックスに対して０.０１−０.３の範囲であり、０.０１−０.１mmol／mlが好ましい。デキストランベースのマトリックスに関して、範囲は典型的には０.０１−０.６mmol／mlマトリックスであり、サブレンジは０.０１−０.２mmol／mlである。ある変形において、例えば、Ｒ１が−Ｃ(＝ＮＨ)−である場合、混合モードリガンドのレベルは、しばしば、この範囲の下半分である。本発明のこれらの変形において、アニオン交換リガンドのレベルは、したがって、０.１５０mmol／mlマトリックスより小さくおよび／または１mmol／gマトリックス乾燥重量より小さい。「mmol／mlマトリックス」なる表現は、水で飽和された完全に沈降したマトリックスに関する。容量範囲は、結合塩素イオンに結合するために完全にプロトン化された形のマトリックスの容量に関する。これは、また、基−−−[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]以外の、例えば、スペーサー、または基Ｒ２−４、Ｒ'１−４およびＲ"１の可能性のある陽性荷電基に由来する寄与も含む。
【００５３】
新規アニオン交換体の適合性
本発明のアニオン交換体／アニオン交換リガンドは、アニオン交換吸着を含む工程で通常適用される条件に耐えるべきである。一般的な原則として、これは、本発明のアニオン交換体が０.１または１Ｍ  ＮaＯＨ水溶液に少なくとも１０時間、全イオン結合能に本質的な減少なく耐えることができなければならないことを意味する。「全イオン結合能に本質的な減少なく」なる用語は、全イオン結合能が最大で１０％減少することを意図する。構造的な態様から、これは、好ましい変形のアニオン交換リガンドが、純粋炭化水素基(同種芳香族および異種芳香族構造を含む)、チオエーテルおよびエーテル基、ジスルフィド基、ヒドロキシ基、スルホキシド基またはスルホン基、カルボキサミド基、スルホンアミド基、アセタールおよびケタール基、および類似の加水分解安定性の基から選択される構造のみを含むべきであることを意味する。
【００５４】
特定の物質の除去に使用するアニオン交換体の選択。
本発明の方法の好ましい変形において、アニオン交換体は、相対的に高いイオン強度で特定の物質を吸着するアニオン交換体から選択する。使用するアニオン交換体(１)は、したがって：
(a)０.２５Ｍ  ＮaＣlに対応するイオン強度の水性対照液体(II)中の目的物質を結合することができ、そして
(b)該物質について、２−１２の範囲のpＨで、慣用のアニオン交換体(２)(対照アニオン交換体)についての物質の貫流容量の＞２００％、例えば＞３００％または＞５００％または＞１０００％の最大貫流容量を可能でする
ことができる。
【００５５】
主に、測定に適用したこれらの割合の数字は、アニオン交換条件中に成した。対照液体は、典型的に緩衝化水性液体から成る。
【００５６】
この種のアニオン交換体の発見の間接的な方法は、物質(陰性電荷を担持する)に関して、慣用のアニオン交換体(対照アニオン交換体)上の同じ物質で必要な溶出イオン強度と比較して、増加した最大溶出イオン強度を有するアニオン交換体のスクリーニングである。したがって、アニオン交換体は、除去される選択物質に適用する特定条件で、慣用のアニオン交換体で必要な溶出イオン強度の１２５％以上、例えば、１４０％以上または２００％以上の溶出イオン強度であるものから選択し得る。ＷＯ９７２９８２５(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)参照。
【００５７】
上記の比較は、アニオン交換体(１)および(２)に関して本質的に同じ条件下、すなわち、本質的に同じ支持マトリックス(支持物質、ビーズサイズ、孔サイズ、孔容量、充填法等)、pＨ、温度、溶媒組成、上記の式を有する荷電リガンドの数等で行なう測定を参照とする。貫流容量は、同じ貫流における物質の同じ相対的濃度で測定する(例えば、c／c０＝１０、c／c０に関して実験部分参照)。スペーサーおよび結合化学は異なり得る。ある種の結合化学が、支持マトリックスの架橋を導き、より剛直なマトリックスをもたらし得る。この場合、比較を成す流動条件は、マトリックスが本質的に非圧縮であるレベルを選択する。
【００５８】
対照イオン交換体として、商品として入手可能なアニオン交換体Ｑ−Ｓepharose Ｆast Ｆlow (Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech, Ｕppsala, Ｓweden)を、本明細書の内容において選択した。このアニオン交換体は、リガンドおよびスペーサーアーム構造が：
−Ｏ−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２Ｎ＋(ＣＨ３)３
である、強アニオン交換体である。その塩素イオンキャパシティーは０.１８−０.２５mmol／mlゲルである。ベースマトリックスは、ビーズ形のエピクロロヒドリン架橋アガロースである。ビーズは４５−１６５μmの範囲の直径を有する。球状タンパク質の排除限界は４×１０６である。
【００５９】
最良モード
優先日に達成された実験結果に基づいて、最良のリガンドはｎ＝０、m＝１、Ｒ'１−Ｎ＋Ｈ３＝−Ｃ(＝Ｎ＋Ｈ２)ＮＨ２、およびＡr＝p−Ｃ６Ｈ４−を有するとみなされた。式−Ｃ(＝Ｎ＋Ｈ２)ＮＨ２は、実際の電荷が−Ｎ−Ｃ−Ｎ−配置上に非局在化し、水素がそれにしたがって結合している基の代表のみである。ＳＰはＡrにアミド基の窒素原子を介して結合した。スペーサーおよびベースマトリックスの最良モードの情報に関しては更に実験部分参照。
優先権主張年の間に、支持体は多くの種々のリガンドに広がっている。最良モードは目的の物質によって変化し、今日までに発見された最良のリガンドを示す実験部分から明白である。
【００６０】
吸着／脱着
吸着／脱着段階は、モノリス形のまたは充填または流動床の形における柳枝としてのアニオン交換マトリックスでのクロマトグラフィー手順として行ない得る。粒子状マトリックスに関して、これらの段階は、粒子が多かれ少なかれ液体中に完全に分散されているバッチ式モードで行ない得る(例えば、流動／膨張床で)。
段階(i)および(ii)で使用する液体は水性、すなわち、水混和性溶媒と混合されていてもよい、水である。
【００６１】
吸着
吸着の間、陰性に荷電した物質を含む液体サンプルを、上記で定義のアニオン交換体と、好ましくはアニオン交換による、吸着(結合)を可能にする条件下で接触させる。言い替えると、物質は少なくとも一部陰性であり、リガンドは少なくとも一部陽性である。
【００６２】
アニオン交換体なる用語は、除去する物質が陰性荷電を担持し、アニオン交換体が陽性に荷電している(＝アニオン交換体条件)ことを意図する。水性液体に存在する両性物質に関して、これは、pＨ＞pl−０.５、好ましくは、pＨ＞plを意味する。
【００６３】
好ましい変形において、弱アニオン交換体(好ましくは、アニオン交換体に１級または２級アミン基として存在する)を、＜pＫa＋２、好ましくは＜pＫa＋１の範囲内に緩衝化する。下限は、少なくともpＨ＝１または２まで低下でき、主に酸性環境でのアニオン交換体の安定性および等電点(pl)、および除去する物質の安定性により決定される。アニオン交換体のpＫa値は、５０％のその滴定可能基が中和されているpＨとして取る。
【００６４】
イオン強度(塩濃度または導電率として測定)は、典型的にイオン交換体、結合する物質、温度とpＨ、溶媒組成等の特定の組合せに関する溶出イオン強度より低い。本発明の利点の一つは、上記で定義の混合モードアニオン交換体の使用により、吸着／結合がまた、慣用のイオン交換体(対照イオン交換体)で通常行なわれるよりも、上昇したイオン強度でも行なうことが可能であることである。アニオン交換体を除去する物質と適合させることにより。吸着は対照イオン交換体を使用するときよりも高いイオン強度で行ない得る(同じpＨおよびそうでなければ同じ条件下で測定して)。使用するアニオン交換体に依存して、イオン強度は上記で定義の対照アニオン交換体よりも２５％以上高い、例えば、４０％以上高い可能性がある。アニオン交換体と除去する物質のある組合せは、上記の対応する対照イオン交換体を使用したときよりも、１００％より高いイオン強度での吸着を可能にし得る。
【００６５】
前段落における記載の絶対的数値は、本発明の吸着が、１５または２０mＳ／cm以上または以下のイオン強度で行ない得ることを意味する。イオン強度は３０mＳ／cmを超え、ある場合、４０mＳ／cmをさえ超える。有用なイオン強度は、しばしばＮaＣl濃度(純水)＞０.１Ｍ、例えば、＞０.３Ｍ、または＞０.５Ｍさえ対応する。使用する導電率／イオン強度は、使用するリガンド、そのマトリックス上での密度、結合する物質、その濃度等に依存する。
【００６６】
選択するアニオン交換体に依存して、対照アニオン交換体での特定物質で得られる貫流容量の２００％以上、例えば３００％以上または５００％以上または１０００％以上の最大貫流容量が達成され得る(前記と同じ条件)。
【００６７】
脱着
脱着は、確立されたプロトコールにしたがって行い得る。好ましくは、脱着工程は少なくとも以下の手順の一つを含む：
(Ａ)塩濃度(イオン強度)の増加、
(Ｂ)リガンド上の陽性荷電を減少させるためのpＨの上昇、
(Ｃ)陰性荷電の減少またはマトリックスに結合した物質上の電荷を逆転させるためのpＨの低下、
(Ｄ)水性液体(Ｉ)の極性を減少させるためのリガンドアナログまたは試薬(例えば溶媒)の添加。
本発明に従い、Ｒ'１が−Ｃ(＝ＮＨ)−である場合、セリンプロテアーゼが、アニオン交換条件下で唯一脱着する。
【００６８】
(Ａ)−(Ｄ)により提供される条件は、組合せてまたは単独で使用し得る。適当な選択は
(a)脱着する物質、
(b)アニオン交換体(リガンド、マトリックスの種類、スペーサーおよびリガンド密度)、および
(c)水性液体IIの種々の可変要素(組成、極性、温度、pＨ等)
の特定の組合せに依存する。
【００６９】
水性液体Ｉ(吸着緩衝液)を水性液体II(脱着緩衝液)で置きかえることは、したがって、温度、pＨ、極性、イオン強度、可溶性リガンドアナログの含量等のような少なくとも一つの可変要素が異なるが、脱着が起こり得るように、他の条件は未変化であることを意味するであろう。
【００７０】
最も単純な例において、これは、水性液体Ｉから水性液体IIに変える場合の：
(a)イオン強度の増加および／または
(b)脱着する物質の陰性荷電の減少のためのpＨの低下
を意味する。選択枝(a)は低下、一定または上昇したpＨを含む。選択枝(b)は減少、上昇または一定のイオン強度を含む。
【００７１】
クロマトグラフィーおよび／またはバッチ手順において、脱着する物質を伴うマトリックスはカラムまたは他の適当な容器中に、吸着液体(水性液体Ｉ)と接触して存在する。液体により提供される条件を次いで上記のように所望の物質がマトリックスから溶出されるまで変える。吸着後、典型的な脱着工程は、イオン強度以外の他の可変要素が変化しない場合、イオン強度が吸着中と比較して上昇し、多くの場合、少なくとも０.４Ｍ  ＮaＣl、例えば、０.６Ｍ  ＮaＣlに対応することを意味する。実際の値は上記の種々の因子に依存する。
【００７２】
脱着のための上昇したイオン強度の使用の必要性は、水性液体IIにより提供される条件にあまり厳密に依存しない可能性がある。下記参照。
条件における変化は、１個以上の段階で(段階的勾配)または連続的に(連続的勾配)達成できる。マトリックスと接触している液体の種々の可変要素は、一個ずつまたは組み合わせて変え得る。
イオン強度を変えるために使用する典型的な塩は、アルカリ金属またはアンモニウムイオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩等から選択される。
【００７３】
pＨを変えるために使用する典型的な緩衝液は、好ましくは、緩衝成分がリガンドに結合できない酸−塩基対、すなわち、ピペラジン、１,３−ジアミノプロパン、エタノールアミン等から選択する。段階(ii)におけるpＨの低下は脱着する物質の陰性荷電を減少し、脱着を助け、したがって、マトリックスからの放出に必要なイオン強度も減少する。使用するリガンドのpＫaおよび放出する物質のplに依存して、pＨの上昇は物質の放出またはイオン交換マトリックスへのその結合の増強をもたらし得る。
【００７４】
脱着はまた吸着液体(Ｉ)の極性よりも低い値への液体(II)の極性の調節により助けられ得る。これは、水混和性および／または低親水性有機溶媒の液体IIへの包含により達成し得る。このような溶媒の例はアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アクリロニトリル等である。水性液体IIの極性の減少(水性液体Ｉと比較して)は、脱着を助け、したがって、またマトリックスからの物質の放出に必要なイオン強度を減少するようである。
【００７５】
脱着はまた[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]の可溶性構造類似体の包含により助けられ得る。液体(II)におけるその濃度は、液体(Ｉ)におけるその濃度よりも大きくなければならない。「リガンドの構造類似体」または「リガンドアナログ」は、リガンドと構造的類似性を有し、可溶性形でマトリックスに結合したリガンドと除去する物質の間の結合を阻害する物質である。
【００７６】
回収率
下位の態様において、本発明法は吸着物質の高い回収率、例えば、６０％を超える、例えば、８０％を超える、または９０％を超える回収を可能にする。回収率は、吸着／脱着段階におけるアニオン交換体に適用した物質と比較した脱着物質の量である。多くの場合、回収率は９５％をさえ超え得、または本質的に定量的である。典型的に、アニオン交換体に適用する物質の量は、その物質に対するアニオン交換体の全結合能の１０−８０％、例えば、２０−６０％の間である。
【００７７】
液体(Ｉ)から除去する物質
本発明に従う物質の除去は、主にその物質または液体(Ｉ)に存在する他の物質の精製のために行なう。
【００７８】
本発明は、上で定義された混合モードのリガンドと相互作用可能ないくつかの構造単位を有する分子量が大きい物質を第一に意図している。適当な物質は、典型的に、約１０００ダルトン以上のおよび／または生物有機のおよび／または重合体の分子量を有する。分子あたりの正味の陰性に荷電した基の数は、典型的に１個以上である。好ましくは、物質の電荷はpＨに依存する(すなわち、該物質は両性化合物である)。生体分子の中で、ポリペプチド構造、核酸構造、脂質構造、および炭水化物構造を有するものを本発明にしたがって液体から除去することは、一般的に可能である(ただし、それらが負電荷を有するか、または有するように提供できる場合)。原則として、本発明は、また、他の生体分子および有機物質に適用可能である(ただし、それらが上で与えられた構造的な要求を満たす場合)。
【００７９】
該物質は水性媒体に溶解し得るか、または小さい生体粒子(bio−particle)の、例えばコロイドの大きさの形態であり得る。生体粒子の例証となる例はウイルス、細胞(細菌および他の単細胞生物体を含む)ならびに細胞塊および細胞オルガネラを含む細胞内器官である。
【００８０】
本発明は、特に、高濃度の塩と共に目的の物質を含む生物学的な流体由来の水性液体に適用可能であると考えられる。新規アニオン交換体は、例えば、最初にpＨを変え、吸着した物質の陽性電荷を減少させることで高いイオン強度での吸着および低いイオン強度での脱着を可能にすることにより、脱塩において極めて有用であるように見える。
【００８１】
目的の標的物質を含む高いイオン強度の典型的な液体は、例えば細胞培養からの発酵ブロス／液、およびそれに由来する液である。該細胞は脊椎動物、例えば哺乳動物、または無脊椎動物(例えばチョウおよび／またはその幼虫由来の細胞のような培養昆虫細胞)、または微生物(例えば培養真菌、細菌、酵母等)から生じ得る。また、植物細胞および他の種類の生細胞(好ましくは培養されたもの)も含まれる。
【００８２】
除去されるべき物質を含む水性液体(Ｉ)が粒子状物質を含む場合には、アップワードフローと共に新規アニオン交換リガンドを担持する流動化粒子状支持マトリックスを利用することは有益であり得る。この種の水性液体(Ｉ)は、(a)細胞の培養からの発酵ブロス／液、(b)溶解した細胞を含む液体、(c)細胞および／または組織ホモジネートを含む液体、ならびに(d)細胞から得られるペースト由来であり得る。
【００８３】
本発明の第二の態様
この態様には、親水性ベースマトリックスに結合した複数のアニオン交換リガンドを含むアニオン交換体(１)が含まれる。スペーサーが結合したリガンドは、式
−−ＳＰ−−−[Ａr−Ｒ１−Ｎ＋(Ｒ２Ｒ３Ｒ４)]
(ここで、記号は前と同じ意味を有する。)
に従う。
独特の特徴は、アニオン交換体(１)が少なくとも１つの対照タンパク質：Ｑ−交換体(−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｎ＋(ＣＨ３)３(アニオン交換体２))で得られた対応する最大貫流容量の２００％以上、例えば３００％以上または５００％以上または１０００％以上である卵白アルブミン、コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、ＩgＧ、ダイズトリプシンインヒビター(ＳＴＩ)に関して、２−１２のpＨ範囲のいずれかにおいて最大貫流容量を有することである。同一の支持マトリックス、置換度、対イオン等は、上で議論したのと同一の意味で、本質的に同一である。好ましい対照アニオン交換体は、上記のようにＱ Ｓepharose Ｆast Ｆlowである。アニオン交換体(１)およびアニオン交換体(２)の貫流容量を測定するための稼動条件(running condition)は、本明細書の他の部分で議論したのと本質的に同一である。
【００８４】
貫流容量は、「特定物質の除去のために使用されるアニオン交換体の選別」なる標題の箇所で定義したアニオン交換条件下で測定される。それぞれの対照物質の相対的な貫流容量は、典型的な場合において、貫流容量が測定されるべき緩衝液および対象物質からなる水性液体を用いて別々に測定される。
【００８５】
さまざまな実施態様およびそれらの選択物は、上と同じである。したがって、好適な変形に関して、ＳＰ、Ｒ'１およびＲ２−４の少なくとも１つは、本発明の第１の態様のために上で定義したような、例えば、水素結合に関与する、電子アクセプター−ドナー原子または基を含む。このような電子ドナー−アクセプター基または原子は、例えば、スペーサー(ＳＰ)における分枝側鎖に存在し得る。
【００８６】
本発明の第三の態様
この態様は、液体から物質を除去するための１個以上のアニオン交換体の適切性の試験(スクリーニング)の方法である。本方法は：
(a)
(i)各々がリガンドの種類(リガンド１、２、３、４、．．．．．．ｎ)の点で異なる、試験する１個以上のアニオン交換体(試験アニオン交換体、交換体１、２、３、４、．．．．．．ｎ；ｎ＝整数＞０)、そして
(ii)対照リガンドを有する対照アニオン交換体であり、支持マトリックス、対イオン等は、交換体１、２、３、４、．．．．．．ｎと対照アニオン交換体で同一であるもの；
を含むライブラリーの提供
(b)予め決定した条件での物質に対する交換体１のpＨ２−１２間のどこかでの最大貫流容量の測定；
(c)段階(b)のような、同じ条件での対照アニオン交換体のpＨ２−１２間での最大貫流容量の測定；
(d)アニオン交換体(１)が物質の除去に適している場合、段階(b)と(c)において得られた最大貫流容量の間の関係を用いた結論付け：そして
(e)必要であれば、段階(b)−(c)の、交換体２、３、４、．．．．．．ｎの少なくとも一つでの反復：
の段階を含む。
【００８７】
対照アニオン交換体と試験する個々のアニオン交換体の間の置換度が変わる場合、段階(d)を行なうときにこれを考慮しなければならない。これは、置換度の変化が、アニオン交換体１、２．．ｎに関して３、５または１０倍より大きい場合に特に適用される。
【００８８】
特に、試験アニオン交換体／リガンドで測定される最大貫流容量が対照アニオン交換体／リガンドよりも大きい場合、試験アニオン交換体／リガンドが対照アニオン／交換体を超える利点を有すると考えられる。この結論は、試験アニオン交換体／リガンドで測定した最大貫流容量が、対照アニオン交換体／リガンドの貫流容量の＞２００％、例えば＞３００％または＞５００％、または＞１０００％である場合により明白である。
【００８９】
このスクリーニング法は、アニオン交換体１−ｎの少なくとも一つが
(a)本発明の第一および第二の態様において、
(b)ＵＳ６,０９０,２８８(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)において、および
(c)本願と平行して、ＳＥ９９０４１９７−２に基づいて出願されている国際特許出願(陰イオン交換吸着方法およびチオエーテル陰イオン交換体)において、
定義されている通りである、ライブラリーのスクリーニングに特に適している。
【００９０】
本方法はまたアニオン交換体１−ｎがまた、１個以上の慣用のアニオン交換体およびピリジン、ピロール、イミダゾール等のような陽性荷電窒素原子が芳香族環の一部である、アニオン交換体を含む場合にも当てはまる。
【００９１】
２個以上のアニオン交換体１−ｎは平行してまたは連続して本方法で試験し得る。
対照アニオン交換体は本発明の第一および／または第二の態様で定義したリガンドを有し得る。
【００９２】
稼動条件および対照アニオン交換体の選択は、本発明の第一および／または第二の態様で概説のように行なうことができる。段階(b)および／または(c)は、０.１Ｍ  ＮaＣl以上、好ましくは＞０.２５Ｍ  ＮaＣlから成る水溶液のイオン強度に対応するイオン強度で行ない得る。段階(b)および(c)はアニオン交換体条件下で行ない得、または行ない得ない。
【００９３】
本発明の第三の態様において、対照アニオン交換体の表にしたまたは予め決定した貫流容量を使用し得る。したがって、本方法はまた、対照アニオン交換体または対照アニオン交換リガンドに関して外部由来の表にした値の使用を含む、異なる時期におよび／または異なる個人または機械により行なった測定値も含む。
【００９４】
このスクリーニング法により発見されたアニオン交換体は、しばしば、上記のような液体からの物質の除去に関する本発明の方法に、進歩性のある方法で使用できる。
【００９５】
タンパク質等を含む液体における塩濃度の低下のための進歩的方法。
本方法は、主に、上で定義のように陰性に荷電した、好ましくは両性の物質を含む液体(Ｉ)からの塩の除去(脱塩)の方法を意図する。今後、液体の脱塩なる用語は液体からの荷電物質の除去により減少する任意の種のイオン強度を包含する。液体(Ｉ)のイオン強度により達成される最大の利点は、０.１Ｍ  ＮaＣlまたは０.１５  ＮaＣlまたは０.２Ｍ  ＮaＣlまたは０.５Ｍ  ＮaＣlの水性液体のイオン濃度を超える。
【００９６】
本方法は：
(i)リガンドと物質の間の結合を生じる条件下で、陽性に荷電した窒素が存在する、複数の混合モードアニオン交換リガンドを担持するベースマトリックスを含む、アニオン交換体(１)と液体(Ｉ)を接触させる段階；および
ii)液体(液体(II))の使用によって、当該物質を当該アニオン交換体から脱着させる
段階を含む。
【００９７】
本方法は：
(Ａ)アニオン交換体(１)を
(a)０.２５Ｍ  ＮaＣlに対応するイオン強度の水性対照液体中の目的物質を結合することができる；および
(b)該物質について、２−１２の範囲のpＨで、Ｑ−Ｓepharose Ｆast Ｆlow(アニオン交換体２、Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech, Ｕppsala, Ｓweden)についての物質の貫流容量の＞１００％、例えば、＞１２５％、または＞２００％、、または＞３００％または＞５００％または＞１０００％の最大貫流容量が可能であり、
当該アニオン交換体(１)と(２)が本質的に同じリガンド密度を有し、貫流容量が同一条件下で決定される。
Ｂ.アニオン交換体の低い正味の陽性荷電または低い正味の陰性、０または正味の陰性電荷(可能な場合)、および／または、物質の低い正味の陰性、０または正味の陽性荷電を意味し、それにより、必要な場合、液体(Ｉ)と比較して低下したイオン強度および／または低下した極性を組み合わせることにより、および／または、中性構造類似体を包含させることにより、緩衝化酸−塩基対の使用により段階(iii)における液体(II)のpＨを調節する。
により特徴付けられる。
【００９８】
アニオン交換リガンドは、１級、２級、３級、４級アンモニウム基、またはアミジニウム基であり得る。芳香族環に窒素原子が存在するヘテロ芳香族は、３級アンモニウムなる用語に含まれる。同じ形式で、このようなヘテロ芳香族基のＮ−アルキル化形は４級アンモニウム基に含まれる。リガンドのpＫaは、４から上の間に見られる。
【００９９】
使用するアニオン交換体およびリガンドは、
(a)本明細書
(b)本願と平行して、ＳＥ９９０４１９７−２に基づいて出願されている国際特許出願(陰イオン交換吸着方法およびチオエーテル陰イオン交換体)に、および
(c)ＵＳ６,０９０,２８８(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)に
記載の混合モード種であり得る。
ＵＳ６,０９０,２８８はＷＯ−Ａ−９７２９８２５(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech)に対応し、(b)の特許出願と共に、引用して本明細書に包含させる。ＵＳ６,０９０,２８８は、酸素および陽性荷電アミン窒素から２−３炭素距離のアミノ窒素が関与する電荷相互作用および水素結合に基づいた物質の促進された結合を有する混合モードアニオン交換体を記載する。(b)のアニオン交換体は、本発明でまた定義するように、陽性荷電原子の近くにチオエーテル官能基が存在するリガンドを有する。
【０１００】
上記の段階(ii)は、溶出(段階(ii))が、段階(i)の液体(Ｉ)でのイオン強度と比較して、有意に低下したイオン強度を必要とすることを意味する。物質は、したがって、低濃度の塩、例えば、＜１００mＭ、または＜１０mＭの溶液中でさえ、濃縮形で溶出できる。典型的に、段階(ii)における適当なpＨは、脱着する所望の物質のpl＋２またはpl＋１、好ましくはpＨ＜plであろう。関与する特定のリガンドに依存して、使用するリガンド／アニオン交換体のpＨ＜pＫaを調節することが好ましいことがあり得る。
【０１０１】
pＨは、段階(i)と(ii)の間に、酸および／または塩基が揮発性および／または非電荷である緩衝化酸−塩基対の使用により調節し得る。これは、緩衝成分が単純に段階(ii)の後に除去できることを意味する。揮発性緩衝成分は、典型的に２５℃で、＞１mmＨg、例えば、＞１０mmＨgの飽和蒸気圧を有する。緩衝成分の選択に関する一般的な規則は上記の通りである。
【０１０２】
pＨの変化による溶出は、有機水混和性溶媒、好ましくは２５℃で飽和蒸気圧＞１０mmＨg、例えば、＞１０mmＨgの揮発性溶媒の液体(II)への包含により支持され得る。構造的類似体は、中性でなければならず、好ましくは溶媒に関して定義のように揮発性である。
【０１０３】
本明細書中の塩なる用語は、液体(Ｉ)または液体(II)のいずれかに溶解した場合、陽性に荷電した部分および陰性に荷電した部分を形成する化合物を意味する。各院生に荷電した部分は、分子当たり少ない数、例えば、１個、２個または３個のの陰性に荷電した部分を担持し、好ましくは非重合体である。この態様の原則をカチオン交換体での脱塩に適応する場合、塩におけるカチオンでの要求は、アニオン交換体を使用する場合のアニオンに対応する。
【０１０４】
この進歩性のある態様は、特に、膜濾過、透析、ゲル濾過等の既存の方法で脱塩できない上記の物質を含む液体、または、低い塩濃度または塩の非存在下を必要とする工程、例えば、親和性吸着、マススペクトル等で取り扱う液体に特に有用である。したがって、所望の物質を含む溶液を、ある種の分析を物質それ自体に行なう前に、本発明にしたがって脱塩することが有利である。
【０１０５】
本発明のこの態様は、また、カチオン交換体を使用する類似の態様も含む。カチオン交換体は、２０００年７月１７日に出願のＳＥ０００２６８８−０(吸着法およびリガンド)、ＷＯ９９６５０７(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ)等に定義のものであり得る。
【０１０６】
ここで、実施例により本発明を説明する。本発明は、さらに、特許請求の範囲において定義される。
【０１０７】
実験の部
第１部：アニオン交換体の合成
一般：
マトリックスの容積は、沈降吸着床容積(sedimented bed volume)を意味する。グラムで与えられるマトリックスの重量は、吸引乾燥重量(suction dried weight)を意味する。これらのマトリックスはまだ水で溶媒和された物質であると理解される。規模が大きい反応に関して、マグネット・バー・スターラーの使用はビーズを傷つけるので、撹拌は懸垂型(suspended)の、モーター駆動スターラーの使用を意味する。小規模の反応(２０mlまで)は振動テーブル上で、密閉バイアル内で行われた。機能性およびアリル化、エポキシ化の程度、またはビーズ上のイオン交換基の置換度の決定を通常の方法を用いて行った。ゲルの初歩的な分析は、また、とりわけ硫黄含有量を分析するために行われた。
【０１０８】
上で記載したアニオン交換体を製造するための典型例は、ベースマトリックスとしてＳepharose ６ Ｆast Ｆlow (Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech, Ｕppsala, Ｓweden)を用いて下記のように例示される。
【０１０９】
１. マトリックス上へのアリル基の導入
典型的な手順において、アリル化はアリルグリシジルエーテルを用いて行われたが、固体支持体上へのアリル基の導入は、臭化アリルを用いても同様に容易に達成され得ることに注意せよ。８０gのＳepharose ６ Ｆast Ｆlowを０.５gのＮaＢＨ４、１３gのＮa２ＳＯ４および４０mlの５０％ＮaＯＨ水溶液と混合した。混合液を５０℃で１時間撹拌した。１００mlのアリルグリシジルエーテルの添加後、懸濁液の温度を５０℃に維持し、１８時間撹拌した。混合液をろ過し、ゲルを５００mlの蒸留水、５００mlのエタノール、２００mlの蒸留水、２００mlの０.２Ｍ酢酸および５００mlの蒸留水で連続的に洗浄した。
【０１１０】
滴定により、完成ゲル置換度(アリル／ml)が０.３mmolと判明した。脱水したゲル(１００mlのゲルから７５mlのゲル)から出発することにより０.４５mmolのゲル置換度(アリル／ml)を得ることが可能であった。
【０１１１】
２. マトリックス上へのアミン基の導入
典型的な手順において、アミン基はアミン基の窒素原子を介するか、またはチオール含有誘導体における硫黄原子を介して直接的にマトリックス上に導入される。例えば、フェノールのような他の反応性のある求核性基を含む誘導体も同様に使用し得る。マトリックスへのカップリングをアリル基のブロモ化および塩基性条件下での求核置換を介して好ましく実施した。いくつかの場合において、そしてチオール含有誘導体に関して、該アリルへのラジカル付加も同様に行った。ゲルへの結合部位がアミン以外の求核性基を介して達成された場合、アミン基は保護された形態として導入され得、その場合には脱保護の段階が必要となる。
【０１１２】
アミン基は、また、他の通常の方法、例えば還元的アミノ化により導入され得る。
【０１１３】
２.１. ブロモ化を介するアリルＳepharoseの活性化
１００mlのアリル活性化Ｓepharose ６ Ｆast Ｆlow (０.４mmolアリル基／ml脱水済ゲル)の撹拌懸濁液に永続的な黄色が得られるまで臭素を加え、次いで、４gのＡcＯＮaおよび１００mlの蒸留水を加えた。次いで、ギ酸ナトリウム(sodium formiate)を懸濁液が完全に脱色されるまで加えた。反応混合液をろ過し、ゲルを５００mlの蒸留水で洗浄した。次いで活性化されたゲルの適当なアリコートを反応容器に移し、下記の手順に従って適当なリガンドとカップリングさせた。
【０１１４】
２.１.a. オクトパミンのＳepharose ６ Ｆast Ｆlowへのカップリング
５.５gの臭素活性化ゲル(０.４mmolアリル基／ml脱水済ゲル)を、５０％のＮaＯＨ水溶液を加えることによりpＨ１１.５に調節した、オクトパミン(２g)の水(４ml)溶液を含む反応溶液に移した。反応液を５０℃で１７時間撹拌した。懸濁液をろ過し、ゲルを３×１０mlの蒸留水、３×１０mlのＥtＯＨ、３×１０mlの０.５Ｍ塩酸および最後に３×１０mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換度は、０.１０mmolアミン基／mlであった。
【０１１５】
２.１.b. ２−アミノ―４−(トリフルオロメチル)−ベンゼンチオールのＳepharose ６ Ｆast Ｆlowへのカップリング
６gの臭素活性化ゲル(０.４mmolアリル基／ml脱水済ゲル)を、５０％のＮaＯＨ水溶液を加えることによりpＨ１１.５に調節した、２−アミノ―４−(トリフルオロメチル)−ベンゼンチオール(２.５g)の水／ＤＭＦ(２：１、４ml)溶液を含む反応溶液に移した。反応液を６０℃で１８時間撹拌した。懸濁液をろ過し、ゲルを３×１０mlの蒸留水、３×１０mlのＥtＯＨ、３×１０mlの０.５Ｍ塩酸および最後に３×１０mlで連続的に洗浄した。ゲルの置換度は、０.０７mmolアミン基／mlであった。
【０１１６】
２.１.c. ２−(Ｂoc−アミノ)エタンチオールのＳepharose ６ Ｆast Ｆlowへのカップリング
３０gの量の臭素活性化ゲル(０.４mmolアリル基／ml脱水済ゲル)を２−(Ｂoc−アミノ)―エタンチオール−Ｉ(７.３５g)の水／ＤＭＳＯ(１：３、４０ml)溶液を含む反応溶液に移した。１Ｍ  ＮaＯＨでpＨをpＨ１１に調節した。反応液を５０℃で１６時間撹拌した。反応混合液をろ過後、ゲルを３×５０mlの蒸留水、３×５０mlのＤＭＳＯ、３×５０mlの蒸留水および最後に３×５０mlのＥtＯＨで連続的に洗浄した。
【０１１７】
２.１.d. アミノエタンチオール誘導Ｓepharose ６ Ｆast Ｆlowへのシステアミンのカップリング
Ｂoc保護アミノエタンチオールゲル(６ml)(２.１.c.由来)をＣＨ２Ｃl２(６０ml)中の１０％トリフルオロ酢酸溶液で、室温で２時間処理した。懸濁液をろ過し、ゲルを３×１０mlのＣＨ２Ｃl２、３×１０mlのＥtＯＨ、および３×１０mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換度は０.２９mmolアミン基／mlであった。
【０１１８】
２.２. アリル基の直接的カップリング
２.２.a. システアミン誘導Ｓepharose ６ Ｆast Ｆlow
システアミン(４.７g)のＭeＯＨ(１５ml)溶液をＭeＯＨ(４０ml)中の１０mlアリル活性化Ｓepharose ６ Ｆast Ｆlow(０.４mmolアリル基／ml脱水済みゲル)のスラリーに加えた。反応混合液をＵＶ照射し、４０℃で１６時間撹拌した。反応混合液をろ過し、ゲルを３×１０mlのＭeＯＨ、３×１０mlの蒸留水、３×１０mlの０.５Ｍ塩酸および最後に３×１０mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換度は０.３４mmolアミン基／mlであった。
【０１１９】
３. システアミンＳepharose ６ Ｆast Ｆlowへのカップリング
３.１. Ｂoc−Ｌ−フェニルアラニン誘導システアミンＳepharose
Ｂoc−Ｌ−フェニルアラニン  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(０.４４g、１.２mmol)のＤＭＦ(２ml)溶液をＤＭＦ(５ml)中のシステアミンＳepharose(４ml、０.２mmolアミン基／mlゲル)およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１mmol)の混合液に加えた。反応を室温で１８時間継続した。反応混合物をろ過し、ゲルを３×１０mlのＤＭＦ、３×１０mlのアセトン、および最後に３×１０mlの蒸留水で連続的に洗浄した。滴定後のゲルの残余アミン基は、０.０３３mmolアミン基／mlと計算された。
【０１２０】
３.２. Ｌ−フェニルアラニン誘導システアミンＳepharose
Ｂoc保護Ｌ−フェニルアラニン誘導システアミンゲル(３ml)(３.１または２.１.d由来)をＣＨ２Ｃl２(４ml)中の１０％トリフルオロ酢酸溶液で、室温で２時間処理した。反応混合液をろ過し、ゲルを３×１０mlのＣＨ２Ｃl２、３×１０mlのアセトン、および３×１０mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの生成物の置換度は０.１９mmolアミン基／mlであった。
【０１２１】
３.３. Ｆmoc−Ｌ−チロシン誘導システアミンＳepharose
Ｆmoc−Ｌ−チロシン  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(１.１mmol)のＤＭＦ(３ml)溶液をＤＭＦ(５ml)中のシステアミンＳepharose(３.３ml、０.３mmolアミン基／mlゲル)のスラリーに加えた。混合物を室温で１８時間撹拌した。懸濁液をろ過し、ゲルを３×１０mlのＤＭＦで洗浄した。
【０１２２】
３.４. Ｌ−チロシン誘導システアミンＳepharose  Ｆmoc保護Ｌ−チロシン誘導システアミンゲル(３.３ml)(３.３由来)をＤＭＦ(１０ml)中の１０％１,８−ジアザビシクロ[５,４,０]−ウンデカ−７−エン溶液で、室温で１８時間処理した。反応混合液をろ過し、ゲルを３×１０mlのＤＭＦ、３×１０mlのアセトン、および３×１０mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換度は０.２８mmolアミン基／mlであった。
【０１２３】
第２部  クロマトグラフィー
本発明で示されたリガンドが対照アニオン交換体よりも高いイオン強度でタンパク質を吸着することを確かめるため、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の貫流容量を測定した。本研究においてＳepharose Ｆast Ｆlowに結合した新規「高塩濃度(high−salt)」アニオン交換リガンドをＱ Ｓepharose Ｆast Ｆlowと比較した。また、３つのタンパク質、すなわちコンアルブミン(Ｃon Ａ)、ラクトアルブミン(Ｌactalb)およびダイズトリプシンインヒビター(ＳＴＩ)の溶出伝導度(elution conductivity)を、すべてのアニオン交換体に関して測定した。この機能テストは、他のタンパク質と同様の高塩濃度の条件下での遅延を確かめるために使用された。高い貫流容量を有する４つの「高塩濃度」アニオン交換体リガンドを、また、アプライされたタンパク質(ＢＳＡ)の回収に関して試験した。
【０１２４】
Ａ.高塩濃度条件下での貫流容量(Ｑb１０％)
Ｑb１０％値を、同一の条件下で使用された対照アニオン交換Ｑ Ｓepharose Ｆast Ｆlowに関して相対的に高い塩濃度(０.２５Ｍ  ＮaＣl)で求めた。異なるアニオン交換体のＱb１０％値を下記の前端分析法を用いて測定した。
【０１２５】
実験
Ｉ. 緩衝液およびサンプル溶液
サンプル溶液は０.２５mＭ  ＮaＣlを加えた２０mＭピペラジン(pＨ＝６.０)に溶解させたＢＳＡであった。ＢＳＡの濃度は４mg／mlであった。緩衝液およびサンプル溶液を、使用前に０.４５μm  Ｍillipore Ｍillex ＨＡフィルターを通してろ過した。
【０１２６】
II. クロマトグラフィーのシステム
すべての実験をＵnicorn  ３.１ソフトウエアを備えたＡekta Ｅxplorer １００クロマトグラフィーシステム(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ, Ｕppsala, Ｓweden)を用いて室温で行った。サンプルを、１５０mlスーパーループ(superloop)を介してカラムにアプライした。終始、１ml／分(約３００cm／時)の流速を使用した。溶出液を、１０mmフローセルを用いて２８０nmでの吸収測定により連続的に観測した。
【０１２７】
III. 前端分析
それぞれのアニオン交換体の試作品をＨＲ  ５／５カラム(充填吸着床容積＝１)に充填し、ピペラジン緩衝液(２０mＭピペラジン、pＨ＝６.０、０.２５Ｍ  ＮaＣlを有する)で平衡化させた。貫流容量(Ｑb)を１０％の最大ＵＶ検出シグナル(２８０nm)で評価した。最大ＵＶシグナルは、試験溶液をＵＶ検出器に直接注入することにより評価された。貫流容量は、デッドボリュームの修正後、最大シグナルの１０％の高さでの保持容積から計算された。
【０１２８】
ピペラジン緩衝液で平衡化したカラムに、１ml／分(すなわち、約３００cm／時)の流速でサンプル溶液を(１５０mlスーパーループを介して)送り込んだ。サンプルの添加を、溶出液のＡ２８０がサンプル溶液のＡ２８０の１０％のレベルに達するまで継続した。そのようにして得られたデータ(すなわち、カラムに対する充填ゲル吸着床の体積(Ｖc)、その空隙容量、流速およびＢＳＡの濃度)に基づいて、ゲルの貫流容量(Ｑb１０％)を計算し得る。得られた結果は、複数の「高塩濃度のリガンド」候補物質をスクリーニングするための基礎を形成し、その結果を以下に提供する。
【０１２９】
IV. 評価
ＢＳＡサンプル溶液の吸収最大の１０％のレベルでの貫流容量(ＱbＢＳＡ)は、式：
ＱbＢＳＡ＝(ＴＲ１０％−ＴＲＤ)xＣ／Ｖc
ここで：
ＴＲ１０％＝吸収最大の１０％での保持時間(分)
ＴＲＤ＝システムの不感時間(分)
Ｃ＝ＢＳＡの濃度(４mg／mＬ)
Ｖc＝カラム容積(mＬ)
を用いて計算された。
【０１３０】
Ｂ.機能テスト
アニオン交換媒体を１.０mlのＨＲ  ５／５カラムに充填し、２０カラム容積のＡ−緩衝液(２０mＭ  リン酸緩衝液；pＨ６.８)で平衡化させた。５０μlのタンパク質混合物(６mg／mlのＣon Ａ、４mg／mlのラクトアルブミンおよび６mg／mlのＳＴＩ)をカラムにアプライし、１００％のＢ−緩衝液(Ａ−緩衝液に２.０Ｍ  ＮaＣlを加えたもの)まで直線的勾配(勾配の容積＝２０カラム容積)で溶出した。流速を０.３ml／分(１００cm／時)に調節した。すべての実験をＵnicorn  ３.１  ソフトウエアを備えたＡekta Ｅxplorer １００クロマトグラフィーシステムを用いて室温で行った。
【０１３１】
Ｃ.「高塩濃度」アニオン交換リガンドに結合したＢＳＡの回収
カラム、充填吸着床容積、緩衝液、タンパク質溶液、流速および装置の種類に関する詳細は上で概説されたものである。ピペラジン緩衝液(２０mＭピペラジン、pＨ＝６.０、０.２５Ｍ  ＮaＣlを有する)で平衡化されたカラムに、貫流容量の３０％に相当する量がアプライされるまで５０mlスーパーループからＢＳＡ溶液をアプライした。次いで、カラムを２吸着床容積の平衡化緩衝液で洗浄し、結合したＢＳＡを適当な脱着緩衝液で溶出した。リガンド(チロシン)および(２−アミノベンズイミダゾール)の場合には、吸着したＢＳＡをピペラジン緩衝液(２０mＭピペラジン、pＨ＝６.０、２.０Ｍ  ＮaＣlを有する)で溶出した。さらに、リガンド(オクトパミン)および(チロシノール)上に吸着したＢＳＡをＴＲＩＳ緩衝液(０.２Ｍ  ＴＲＩＳ、pＨ＝９.０、２Ｍ  ＮaＣlを有する)で溶出した。
【０１３２】
結果
一連の代表的な「高塩濃度」アニオン交換体リガンドの貫流容量に関して得られた結果を表１に要約し、リガンドの構造を第３部に記載する。これらの新規アニオン交換体の大部分のリガンド置換度は、約０.０５−０.３mmol／ml充填ゲルである。対照のアニオン交換体として、商品として入手可能なＱ Ｓepharose Ｆast Ｆlowを使用した。リガンドの密度は、アニオン交換体の新規シリーズと同一の範囲内にある。その結果により、次の傾向が示唆される。
１. この進歩性のあるアニオン交換リガンドは、対照のアニオン交換体Ｑ Ｓepharose Ｆast Ｆlowと比較して、３つのタンパク質すべての溶出伝導度がずっと高い(表１)。
２. この進歩性のあるアニオン交換リガンドは、また、Ｑ Ｓepharose Ｆast Ｆlowと比較してＢＳＡの貫流容量(ＱbＢＳＡ)もずっと高い。最高のＱb値を与えたリガンドは、対照アニオン交換体に比べて４３００％の増加に相当する。提供されたリガンド(表１)の中で、最低のＱb値を与えたものは、Ｑ Ｓepharose Ｆast Ｆlowと比較して５００％の増加に相当する。
３. 優れたアニオン交換リガンドのすべては、第１級または第２級アミンであるか、あるいは両方とも第１級および第１級アミンである。第４級アミンに基づくリガンドで優れたものは発見されていない。
４. 良好なアニオン交換リガンド(７、５、２７および４)からの回収データは、吸着ＢＳＡが塩段階(７および５)により、および／またはpＨと塩段階の組合せ(２および４)により、８０％より高い回収率で溶出できることを示す(第III部参照)。
【０１３３】
表１  異なるアニオン交換体における３種類のタンパク質のpＨ６での溶出伝導度およびＢＳＡの貫流容量(pＨ６および０.２５Ｍ  ＮaＣl)
【表１】
0005051957.tif 000002
ne＝溶出せず、na＝分析せず
【０１３４】
第３部：リガンドと回収率
試験した最良のリガンドは以下の化合物から誘導した：
【化１】
0005051957.tif 000003
１．チオメカミン：Ａr＝４−メチルチオキシフェニル、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、ｎ＝０、m＝１、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化２】
0005051957.tif 000004
２．チロシノール：Ａr＝４−ヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。回収率８０％
【化３】
0005051957.tif 000005
３．トリプトファノール：Ａr＝３−インドリル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化４】
0005051957.tif 000006
オクトパミン：Ａr＝４−ヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。回収率８０％
【化５】
0005051957.tif 000007
５．２−アミノベンズイミダゾール：Ａr＝２−ベンズイミダゾリル、m＝０、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。回収率８２％
【化６】
0005051957.tif 000008
６．フェニルアラニン／システアミン：Ａr＝フェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ＜、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２−で終わるＳＰ
【化７】
0005051957.tif 000009
７．チロシン：Ａr＝４−ヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ＜、−ＣＯＮＨＣＨ２−で終わるＳＰ(カルボキシ基で結合)。回収率＝９８％
【化８】
0005051957.tif 000010
８．２−アミノ−３−フェニルプロパノール：Ａr＝フェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化９】
0005051957.tif 000011
９．アルファ−(１−アミノエチル)−４−ヒドロキシベンジルアルコール：Ａr＝４−ヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ(ＣＨ３)−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化１０】
0005051957.tif 000012
１０．２−アミノ−４−ニトロフェノール：Ａr＝２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、m＝０、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化１１】
0005051957.tif 000013
２−(４−アミノフェニル)エチルアミン：
Ａr＝４−(２−アミノエチル)フェニル、m＝０、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(芳香族アミノ基で結合)。
Ａr＝４−アミノフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(脂肪族アミノ基で結合)
【化１２】
0005051957.tif 000014
１２．ノルアドレナリン：Ａr＝３,４−ジヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化１３】
0005051957.tif 000015
１３．ベンジルシステイン／システアミン：Ａr＝フェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ＜、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２−で終わるＳＰ
【化１４】
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２−アミノ−１(４−ニトロフェニル)−１,３−プロパンジオール：Ａr＝４−ニトロ(notro)フェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化１５】
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１５．２−アミノ−１−フェニル−１,３−プロパンジオール：Ａr＝フェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、アミノ基で結合し、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化１６】
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１６．２−アミノ−４−(トリフルオロメチル)−ベンゼンチオール：Ａr＝５−トリフルオロメチルフェン−１,２−ジイル、m＝０、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、Ａrで結合し、−ＳＣＨ２−で終わるＳＰ(メルカプト基で結合)
【化１７】
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１７．３,４−ジヒドロキシベンジルアミン：Ａr＝３,４−ジヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２−、アミノで結合し、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化１８】
0005051957.tif 000020
１９．Ｂoc−ＨＩＳ(Ｂoc)−Ｏsu：Ａr＝４−イミダゾリル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ＜、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ−で終わるＳＰ。
【化１９】
0005051957.tif 000021
４,６−ジアミノ−２−メルカプトピリミジン：Ａr＝４−アミノピリミド−２,６−イルまたは６−アミノ−ピリミド−２,４−ジイル、m＝０、Ａrで結合し、−ＳＣＨ２−で終わるＳＰ(メルカプト基で結合)。
【化２０】
0005051957.tif 000022
２１．トレオフェニルシステイン／システアミン：Ａr＝フェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ＜、Ｒ'１で結合し、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２−で終わるＳＰ。ＱbＢＳＡ＝１４mg／ml
【化２１】
0005051957.tif 000023
２２．チロシノール：Ａr＝４−ヒドロキシフェニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ２ＯＨ)−、アミノで結合し、−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２Ｏ−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化２２】
0005051957.tif 000024
２３．４−アミノチオフェノール：Ａr＝フェニル、m＝０、Ａrで結合し、−ＳＣＨ２−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化２３】
0005051957.tif 000025
２４．チエニルセリン／システアミン：Ａr＝２−チエニル、ｎ＝０、m＝１、Ｒ'１＝−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ＜、Ｒ'１で結合し、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２−で終わるＳＰ。
【化２４】
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２５．１,２,４,５−テトラアミノベンゼン：Ａr＝２,４,５−トリアミノフェン−１−イル、m＝０、アリールで結合し、−ＮＨＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。
【化２５】
0005051957.tif 000027
２６．４−アミノ−１,３,５−トリアジン−２−チオール：Ａr＝１,３,５−トリアジン−２,６−ジイル、m＝０、Ａrで結合し、−ＳＣＨ２−で終わるＳＰ(メルカプト基で結合)。
【化２６】
0005051957.tif 000028
２７．スルファニルアミド：Ａr＝４−スルホンアミドフェニル、m＝０、アミノで結合し、−ＮＨＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)
【化２７】
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２８．４−アミノフェノール：Ａr＝４−ヒドロキシフェニル、m＝０、アミノで結合し、−ＮＨＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−で終わるＳＰ(アミノ基で結合)。リガンド密度：低い。