(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）有効成分としてアムルビシンまたはその薬学上許容される塩を含む第１の組成物、および（ｂ）有効成分としてシスプラチンを含む第２の組成物からなる、小細胞肺癌併用治療のためのキット。
【請求項２】
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩が塩酸アムルビシンである請求項１のキット。
【請求項３】
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩と、シスプラチンとを組み合わせてなる小細胞肺癌の治療剤。
【請求項４】
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩が塩酸アムルビシンである請求項３の治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を有効成分とする、シスプラチンと併用するための肺癌治療剤に関する。
背景技術
アムルビシン（（＋）−（７Ｓ，９Ｓ）−９−アセチル−９−アミノ−７−［（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，１１−ジヒドロキシ−５，１２−ナフタセンジオン）は、下記化学構造式で示されるアンスラサイクリン系化合物である（特公平３−５３９７号）。
0005009483.tif 000002
アムルビシンは生体内で容易に還元されて、１３位水酸化体である代謝体（アムルビシノール）が生成されるが、このアムルビシノールはアムルビシンより腫瘍細胞増殖抑制作用がかなり強い。他のアンスラサイクリン系化合物であるドキソルビシンやダウノマイシンでも還元代謝体が生成されるが、逆に活性は減少する（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３０，５１−５７（１９９２））。アムルビシンは心毒性に関してもウサギ慢性実験モデルにおいてドキソルビシンよりもはるかに弱い（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ，１５，２１９−２２５（１９９７））。
アントラサイクリン系化合物は類似する構造を有しているものの、以下のようにその適応症や作用機序などが異なることが知られている。ダウノルビシンおよびイダルビシンは白血病に対する効能を有しているが、固形癌に対する効能を有していない。他方、ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシンおよびアクラルビシンは固形癌に対する効能を有している（日本医薬品集第２３版２０００、薬業時報社）。ダウノルビシンおよびドキソルビシンはＤＮＡ合成とＲＮＡ合成を同程度に阻害するが、アクラルビシンおよびマルセロマイシンはＤＮＡ合成よりＲＮＡ合成を強く阻害し、抗腫瘍効果の発現機序が全く異なっている（ＪＪＳＨＰ，２７，１０８７−１１１０（１９９１））。このように、癌の種類によって同じアントラサイクリン系薬剤でも有効性が異なっており、また、同じ抗癌剤でも癌の種類によって有効性が相違することが知られている。従って、ある特定の腫瘍（癌）に関して、特定の抗癌剤が有効か否かは、具体的に実験で確認することが必要である。
アムルビシンについては、他の抗癌剤と併用することにより相加的な効果を示すことがインビトロの系で報告されている（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１４，３５７−３６３（１９９６））。例えば、ヒトＴ細胞白血病ＭＯＬＴ−３細胞株とヒト骨肉種ＭＧ−６３細胞株に対して、塩酸アムルビシンとシスプラチン等の併用により相加的な効果を示すことが報告されている。さらに、マウス白血病Ｐ３８８細胞株を用いた実験により、アムルビシンとシスプラチンとのインビボの系での併用効果も報告されている（柳義和等、癌学会要旨集、講演Ｎｏ．２１６８（１９８９））。しかしながら、肺癌に対するアムルビシンとシスプラチンの併用に関しては未だ報告はなされていない。
シスプラチンは、優れた抗癌剤であるが、腎毒性等の問題となる副作用をも有していることが知られている。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討の結果、アムルビシンとシスプラチンを併用すれば、それぞれ単剤での副作用が増強されずに顕著に肺癌を治療できることを見出し、またアムルビシンとシスプラチンの併用において、治療効果を維持しつつそれぞれの投与量を減らした場合は、副作用を劇的に減らすことができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明の要旨は以下に示す通りである。
（１）アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を有効成分とする、シスプラチンと併用するための肺癌治療剤。
（２）肺癌が小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌または肺大細胞癌である（１）記載の肺癌治療剤。
（３）肺癌が小細胞肺癌である（１）記載の肺癌治療剤。
（４）塩酸アムルビシンを有効成分とする（１）〜（３）のいずれか記載の肺癌治療剤。
（５）シスプラチンの投与と同時に、分離して、または続けて投与される（１）〜（４）のいずれか記載の肺癌治療剤。
（６）シスプラチンを投与した、または投与予定である肺癌患者のための、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を有効成分とする（１）〜（５）のいずれか記載の肺癌治療剤。
（７）シスプラチンと併用するための（１）〜（６）のいずれか記載の肺癌治療剤であって、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を約６０〜約１３５ｍｇ／ｍ２単回または２〜５回に分けて投与されるように包装された肺癌治療剤。
（８）アムルビシンまたはその薬学上許容される塩が約１１０〜約１３０ｍｇ／ｍ２単回投与されるよう包装されている（７）記載の肺癌治療剤。
（９）アムルビシンまたはその薬学上許容される塩が１日１回約２５〜約５０ｍｇ／ｍ２で３日間投与されるよう包装されている（７）記載の肺癌治療剤。
（１０）アムルビシンまたはその薬学上許容される塩が１日１回約３５〜約４５ｍｇ／ｍ２を３日間投与されるよう包装された（７）記載の肺癌治療剤。
（１１）アムルビシンまたはその薬学上許容される塩が３日間連日投与される（９）または（１０）記載の肺癌治療剤。
（１２）併用されるシスプラチンが約３５〜約９０ｍｇ／ｍ２単回投与される（７）〜（１１）のいずれか記載の肺癌治療剤。
（１３）併用されるシスプラチンが約５０〜約７０ｍｇ／ｍ２単回投与される（７）〜（１１）のいずれか記載の肺癌治療剤。
（１４）副作用によってシスプラチン治療の継続ができない肺癌患者であって、副作用が軽減される量のシスプラチンの投与を受けている患者のための、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を有効成分とする（１）〜（１３）のいずれか記載の肺癌治療剤。
（１５）シスプラチンと併用される肺癌治療剤の製造のためのアムルビシンまたはその薬学上許容される塩の使用。
（１６）アムルビシンまたはその薬学上許容される塩、およびシスプラチンを投与することによる肺癌の治療方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明の肺癌治療剤は、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を有効成分とする肺癌治療剤であって、シスプラチンと併用される。
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩は、例えばＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５２，４４７７−４４８５（１９８７）に従って製造することができる。アムルビシンの薬学上許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。好ましい薬学上許容される塩として塩酸塩等を挙げることができる。
シスプラチン（シス−ジアンミンジクロロ白金）は、例えばＡｎｎ．，５１，１（１８４５）に従って製造することができる。
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の最大耐量は、塩酸アムルビシンで言えば、マウスで２５ｍｇ／ｋｇ（７５ｍｇ／ｍ２）であり、ヒトで１日１回の単回投与で１３０ｍｇ／ｍ２、３日連日投与では１日当たり５０ｍｇ／ｍ２である。シスプラチンの最大耐量は、マウスで１０ｍｇ／ｋｇ（３０ｍｇ／ｍ２）であり、ヒトで９０ｍｇ／ｍ２である。
肺癌としては、例えば小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺大細胞癌、カルチノイド、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、悪性混合腫瘍等が挙げられる。この中で、本発明の肺癌治療剤が好ましい効果を示すものの例として、小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺大細胞癌等が挙げられ、特に好ましくは小細胞肺癌を挙げることができる。
マウスを用いた実施例１の結果から、以下のことが見出された。
（１）塩酸アムルビシン最大耐量の０．５倍量（１２．５ｍｇ／ｋｇ）およびシスプラチン最大耐量の０．５倍量（５ｍｇ／ｋｇ）の併用では、それぞれの単剤の最大耐量投与群と比較して同程度の抗癌効果があり、一方、シスプラチンの副作用は激減した。
（２）塩酸アムルビシン最大耐量の０．８または１．０倍量（２０または２５ｍｇ／ｋｇ）およびシスプラチン最大耐量の０．８または１．０倍量（８または１０ｍｇ／ｋｇ）の併用では、それぞれの単剤の最大耐量投与群と比較して強力な抗癌効果があり、一方、シスプラチンの副作用は増えることなく同程度であった。
このように、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の最大耐量の約０．５〜約１倍量およびシスプラチン最大耐量の約０．５〜約１倍量を併用することで、シスプラチンおよびアムルビシンまたはその薬学上許容される塩の副作用を増やすことなく、時として副作用を減らして、安全にそして十分に抗癌効果を得ることができる。例えば、シスプラチンまたはアムルビシンの副作用が問題となる場合は、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の最大耐量の約０．５〜約１倍量およびシスプラチン最大耐量の約０．５〜約１倍量の範囲の中でより低い投与量を用いることができ、他方、シスプラチンまたはアムルビシンの副作用が問題とならない場合は、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の最大耐量の約０．５〜約１倍量およびシスプラチン最大耐量の約０．５〜約１倍量の範囲の中でより高い投与量を用いて、最大の抗癌効果を安全に得ることができる。
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩およびシスプラチンの併用において、シスプラチンの投与量として、シスプラチンの最大耐量の約０．５〜１倍量の範囲を挙げることができるが、具体的には最大耐量の約０．５倍量、約０．８倍量、約１倍量等を挙げることができる。例えば、シスプラチンを最大耐量の約０．５倍量投与する場合、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の投与量としては、その最大耐量の約０．５〜約１倍量の範囲を挙げることができ、より好ましくは、約０．８倍量または約１倍量を挙げることができる。シスプラチンを最大耐量の約０．８倍量投与する場合、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の投与量としては、その最大耐量の約０．５〜約１倍量の範囲を挙げることができ、より好ましくは、約０．８倍量または約１倍量が挙げられる。さらに、シスプラチンの最大耐量の約１倍量を投与することもできる。
ヒトの肺癌の治療においては、患者の状態、年齢、体重等により適宜変更されるが、例えばアムルビシンまたはその薬学上許容される塩を約６０〜約１３５ｍｇ／ｍ２およびシスプラチンを約３５〜約９０ｍｇ／ｍ２併用することができる。そのアムルビシンまたはその薬学上許容される塩は、例えば約６０〜約１３５ｍｇ／ｍ２を単回または２〜５回に分けて投与することができる。好ましいアムルビシンまたはその薬学上許容される塩の投与スケジュールとしては、例えば単回投与、１日１回３日間投与等を挙げることができ、特に好ましくは１日１回３日間連日投与を挙げることができる。単回投与をする際の投与量としては、例えば約１１０〜約１３０ｍｇ／ｍ２の範囲を挙げることができ、特に好ましくは約１２０ｍｇ／ｍ２等を挙げることができる。３日間連日投与をする際の１日当たりの投与量としては、例えば約２５〜約５０ｍｇ／ｍ２の範囲を挙げることができ、好ましくは約３５〜約４５ｍｇ／ｍ２の範囲が挙げられ、特に好ましくは約４０ｍｇ／ｍ２、約４５ｍｇ／ｍ２等を挙げることができる。
併用されるシスプラチンの投与量としては、例えば単回投与で約３５〜約９０ｍｇ／ｍ２の範囲が挙げられ、好ましくは単回投与で約５０〜約８０ｍｇ／ｍ２が挙げられる。具体的には約６０ｍｇ／ｍ２および約８０ｍｇ／ｍ２等が挙げられ、特に好ましい例として約６０ｍｇ／ｍ２が挙げられる。なお、シスプラチンは数回に分けて、１日あるいは数日かけて投与することもできる。
シスプラチンによる治療を行った肺癌患者で、その副作用等のために治療の継続ができないと判断された場合は、その副作用が軽減される投与量のシスプラチンを投与し、さらにアムルビシンまたはその薬学上許容される塩を投与することで、シスプラチンの副作用を低減させて治療を続行することができる。その副作用が軽減される量のシスプラチンとしては、例えば約３５〜約７０ｍｇ／ｍ２の範囲が挙げられ、好ましくは約３５〜約６０ｍｇ／ｍ２の範囲が挙げられる。
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩およびシスプラチンの投与量の組み合わせの例として、以下のものを挙げることができる。
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本発明の肺癌治療剤において、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩は、シスプラチンの投与と同時に、分離して、または続けて投与される。分離してまたは続けて投与される場合は、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩をシスプラチンより先に投与しても、後に投与してもよい。その際の両投与の間隔としては、適宜決めることができるが、例えば、１〜数時間、十〜数十時間、１〜数日、１週間等とすることができる。例えば、アムルビシンまたはその薬学上許容される塩と、シスプラチンを同じ日に投与するのが、患者の通院等の手間を考えると好ましい。
本発明の肺癌治療剤は、患者の症状、年齢、体重、投与形態、併用されるシスプラチンの投与量、投与回数等によって適宜変化するが、上記アムルビシンまたはその薬学上許容される塩およびシスプラチンの各投与後、さらに同各投与を、約７日間〜約６０日の間隔をあけて繰り返すのが好ましい。特に好ましくは、約２週間〜約４週間ごとに、さらに好ましくは約３週間ごとに繰り返すのがよい。
アムルビシンまたはその薬学上許容される塩は、通常、非経口的（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内注射、膀胱内、腹腔内、胸腔内、局所的、経直腸的、経皮的、経鼻的等）に投与することができる。好ましくは、静脈内投与を挙げることができる。また、経口投与に用いることもでき、経口投与のための形体としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤または懸濁剤などが挙げられる。
シスプラチンは、通常、非経口的（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内注射、膀胱内、腹腔内、胸腔内、局所的、経直腸的、経皮的、経鼻的等）に投与することができる。好ましくは、静脈内投与を挙げることができる。また、経口投与に用いることもでき、経口投与のための形体としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤または懸濁剤などが挙げられる。
本発明の肺癌治療剤においては、さらに他の抗癌剤、放射線療法、外科的手段等を組み合わせることもできる。また、（ａ）有効成分としてアムルビシンまたはその薬学上許容される塩を含む第１の組成物、および（ｂ）有効成分としてシスプラチンを含む第２の組成物からなる、肺癌併用治療のためのキットとすることもできる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
塩酸アムルビシンとシスプラチンとの併用による抗腫瘍効果
５週令のヌードマウス（８０匹）にヒト小細胞肺癌ＬＸ−１細胞株を皮下移植した。腫瘍移植の１５日後に腫瘍容積が約２００〜５００ｍｍ３となった３６匹を１群６匹で６群に群分けした。その日に、「ビークル群」には生理食塩水を、「塩酸アムルビシン単独投与群」には塩酸アムルビシン最大耐量（２５ｍｇ／ｋｇ）を、「シスプラチン単独投与群」にはシスプラチン最大耐量（１０ｍｇ／ｋｇ）を、「併用群（０．５×ＭＴＤ）」には塩酸アムルビシン最大耐量の０．５倍量およびシスプラチン最大耐量の０．５倍量を、「併用群（０．８×ＭＴＤ）」には塩酸アムルビシン最大耐量の０．８倍量およびシスプラチン最大耐量の０．８倍量を、「併用群（１×ＭＴＤ）」には塩酸アムルビシン最大耐量およびシスプラチン最大耐量を、それぞれ静脈内投与した。その後、２３日間、マウスの腫瘍容積と体重を測定した。
塩酸アムルビシンはシステイン緩衝液（０．４ｍｇ／ｍＬのＬ−システイン塩酸塩１水和物、６．２５ｍｇ／ｍＬの乳糖を含む）により２．５ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、また、これを生理食塩液で希釈することで２．０および１．２５ｍｇ／ｍＬの溶液を調整して、それぞれ１０ｍＬ／ｋｇの液量を投与することで、塩酸アムルビシン最大耐量、その０．８倍量、およびその０．５倍量の投与とした。
シスプラチンは（株）日本化薬より購入したランダ注（０．５ｍｇ／ｍＬ含有）を２０、１６および１０ｍＬ／ｋｇの液量で投与することで、シスプラチン最大耐量、その０．８倍量、およびその０．５倍量の投与とした。
図１および図２に、併用群（０．５×ＭＴＤ）の腫瘍容積と体重の変化を、それぞれ、塩酸アムルビシン単独投与群とシスプラチン単独投与群のデータと共に示す。
図３および図４に、併用群（０．８×ＭＴＤ）の腫瘍容積と体重の変化を、それぞれ、塩酸アムルビシン単独投与群とシスプラチン単独投与群のデータと共に示す。
図５および図６に、併用群（１×ＭＴＤ）の腫瘍容積と体重の変化を、それぞれ、塩酸アムルビシン単独投与群とシスプラチン単独投与群のデータと共に示す。
表１に、各群の腫瘍増殖率の最小Ｔ／Ｃ％値を示す。最小Ｔ／Ｃ％値は以下のように計算した。
最小Ｔ／Ｃ％値：ビークル投与群の腫瘍増殖率＊）に対するそれぞれの投与群の腫瘍増殖率＊）の比率（％）の測定期間中の最低値。
＊）腫瘍増殖率：薬剤投与時点の腫瘍容積の１群６匹の平均値に対する各測定時点の腫瘍容積の１群６匹の平均値の比率。
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１．併用群（０．５×ＭＴＤ）の結果
図１に示されるように、併用投与の抗腫瘍効果は、それぞれの単剤の最大耐量投与群と比較し同程度の効果であった。すなわち、最小Ｔ／Ｃ％値は塩酸アムルビシン単独投与群では５５％、シスプラチン単独投与群では６８％であったが、併用群（０．５×ＭＴＤ）の場合は５４％であった。
副作用は、動物の体重減少で評価すると、図２で示されるように、それぞれの単剤の単独投与群と比較し、シスプラチンの投与量半減に起因すると考えられる強い副作用の軽減効果が得られた。
２．併用群（０．８×ＭＴＤ）の結果
図３に示されるように、腫瘍の縮退が見られ、併用投与の抗腫瘍効果は、それぞれの単剤の単独投与群と比較し、強い抗腫瘍効果を示した。すなわち、最小Ｔ／Ｃ％値は塩酸アムルビシン単独投与群では５５％、シスプラチン単独投与群では６８％であったが、併用群（０．８×ＭＴＤ）の場合は４０％であった。
副作用は、動物の体重減少で評価すると、図４で示されるように、シスプラチン単独投与群と同程度であった。
３．併用群（１×ＭＴＤ）の結果
図５に示されるように、０．８倍量の場合と同様に腫瘍の縮退が見られ、併用投与の抗腫瘍効果は、それぞれの単剤の単独投与群と比較し、強い抗腫瘍効果を示した。すなわち、最小Ｔ／Ｃ％値は塩酸アムルビシン単独投与群では５５％、シスプラチン単独投与群では６８％であったが、併用群（１×ＭＴＤ）の場合は３０％であった。
副作用は、動物の体重減少で評価すると、図６で示されるように、一時的に３ｇ程度の体重減少が見られるが回復し、シスプラチン単剤の最大耐量投与群と同程度の副作用であった。
以上のように、塩酸アムルビシンとシスプラチンの併用において副作用が低減され、顕著な治療効果が認められた。また、図１〜６で分かる通り、併用の効果は投与時から２週間の間が特に顕著に表れ、３週間後にほぼ効果が消滅する。従って、約２週間〜約４週間後に再度投与を繰り返すことが好ましく、特に約３週間後に再投与し、その後も継続するのが好ましいと考えられる。
実施例２
正常および腫瘍組織でのカルボニルレダクターゼ遺伝子発現の変動解析
ヒト肺正常組織６９サンプルとヒトの肺腺癌組織４４サンプル、肺扁平上皮癌組織３２サンプル、肺大細胞癌組織５サンプルおよび白血病細胞１８サンプルからそれぞれ調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＤＮＡチップ解析を行った。ＤＮＡチップ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを用いて行った。具体的には、解析は、（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製、（２）該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５）プローブアレイの染色、（６）プローブアレイのスキャンおよび（７）遺伝子発現解析の手順で行った。
（１）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
ヒト肺正常組織６９サンプルとヒトの肺腺癌組織４４サンプル、肺扁平上皮癌組織３２サンプル、肺大細胞癌組織５サンプルおよび白血病細胞１８サンプルから調製した各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０μｇおよびＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃で１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬおよび該キットに含まれる１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ  ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）９１μＬ、該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３μＬ、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ４μＬ（４０Ｕ）および該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加して混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬおよびエタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃、１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むＤＮＡペレットを得た。その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。
以上の操作によって、ヒト肺正常組織６９サンプルとヒトの肺腺癌組織４４サンプル、肺扁平上皮癌組織３２サンプル、肺大細胞癌組織５サンプルおよび白血病細胞１８サンプル由来のｔｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡを取得した。
（２）ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
上記（１）で調製した各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ  ４μＬおよび該キットに含まれる２０×Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させた。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えた後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて添付プロトコールに従って、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
上記（３）で精製した各ラベル化ｃＲＮＡ  ２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸，ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）および１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加え、得られる反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによってラベル化ｃＲＮＡをフラグメント化した。
（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
上記（３）で得た各フラグメント化ｃＲＮＡ  ４０μＬに、５ｎＭ  Ｃｏｎｔｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ［Ｎａ＋］、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５−６．７）２００μＬおよびＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
（５）プローブアレイの染色
上記（４）で得たハイブリダイズ済みプローブアレイのそれぞれから、ハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社製））で満たした。次に、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置に、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後、染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、一次染色液（１０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＳＡＰＥ）（ＭｏｌｅｃμＬａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）、および二次染色液（１００μｇ／ｍＬ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）でそれぞれ染色した。
（６）プローブアレイのスキャン、および（７）遺伝子発現解析
上記（５）で染色した各プローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。
染色パターンをもとにＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上のカルボニルレダクターゼ１遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎおよび遺伝子発現の比較解析を行った。
その結果、ヒト白血病細胞ではカルボニルレダクターゼ１の発現頻度は１１％（１８例中２例）であり、発現量中央値は−３９となり、殆ど発現していないことが見出された。一方、ヒト肺組織のカルボニルレダクターゼ１の発現頻度は腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌および正常組織では、それぞれ５５％（４４例中２４例）、６３％（３２例中２０例）、４０％（５例中２例）および３２％（６９例中２２例）であり、また、発現量はそれぞれ５１、９６、３４および２２であり、肺正常組織に比べて肺癌組織ではカルボニルレダクターゼ１の発現が亢進していること、とくに肺腺癌と扁平上皮癌の発現量は肺正常組織の発現量の２倍および４倍以上であることが見出された。
産業上の利用の可能性
本発明により、肺癌患者を治療するために有用な、塩酸アムルビシンとシスプラチンの併用治療剤が提供される。シスプラチンとの併用により、塩酸アムルビシンの抗腫瘍治療効果を向上させることができると共に、シスプラチンの副作用を低減させた癌治療が可能になる。
【図面の簡単な説明】
図１は、塩酸アムルビシンの最大耐量（ＭＴＤ）の０．５倍量とシスプラチンの最大耐量の０．５倍量を併用した場合の、小細胞肺癌細胞の増殖抑制効果を表す。○は塩酸アムルビシン単独投与群、△はシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独投与群、◆は併用投与群を示す。
図２は、塩酸アムルビシンの最大耐量の０．５倍量とシスプラチンの最大耐量の０．５倍量を併用した場合における、副作用としての体重減少作用を表す。○は塩酸アムルビシン単独投与群、△はシスプラチン単独投与群、◆は併用投与群を示す。
図３は、塩酸アムルビシンの最大耐量の０．８倍量とシスプラチンの最大耐量の０．８倍量を併用した場合の、小細胞肺癌細胞の増殖抑制効果を表す。○は塩酸アムルビシン単独投与群、△はシスプラチン単独投与群、●は併用投与群を示す。
図４は、塩酸アムルビシンの最大耐量の０．８倍量とシスプラチンの最大耐量の０．８倍量を併用した場合における、副作用としての体重減少作用を表す。○は塩酸アムルビシン単独投与群、△はシスプラチン単独投与群、●は併用投与群を示す。
図５は、塩酸アムルビシンの最大耐量の１．０倍量とシスプラチンの最大耐量の１．０倍量を併用した場合の、小細胞肺癌細胞の増殖抑制効果を表す。○は塩酸アムルビシン単独投与群、△はシスプラチン単独投与群、■は併用投与群を示す。
図６は、塩酸アムルビシンの最大耐量の１．０倍量とシスプラチンの最大耐量の１．０倍量を併用した場合における、副作用としての体重減少作用を表す。○は塩酸アムルビシン単独投与群、△はシスプラチン単独投与群、■は併用投与群を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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