(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の化合物であって、
【化１】
0004931312.tif 000022
ここで、
Ｒｈ１は、ハロ基であり；
Ｒｈ２は、水素またはハロ基であり；
Ｒｓは、下式
【化２】
0004931312.tif 000023
の基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立してＨおよびアルキルから選択される、化合物。
【請求項２】
下式を有する請求項１に記載の化合物であって、
【化３】
0004931312.tif 000024
ここで、Ｒｈ１は、ハロ基であり、Ｒｓは、下式
【化４】
0004931312.tif 000025
の基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立してＨおよびアルキルから選択される、化合物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つがＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２の各々がＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が以下の式からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【化４】
0004931312.tif 000026
【化５】
0004931312.tif 000027
【化６】
0004931312.tif 000028
【化７】
0004931312.tif 000029
。
【請求項６】
薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦活剤または補助剤と混合された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
癌の処置における使用のための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を含む、癌の処置における使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、化合物に関する。
【０００２】
特に、本発明は、化合物およびこの化合物を含む薬学的組成物に関する。本発明はまた、治療適用におけるこの化合物または組成物の使用に関する。
【０００３】
（発明の背景）
証拠は、エストロゲンが内分泌物依存性組織（例えば、乳房および子宮内膜）における腫瘍増殖の促進に関与する主要なマイトジェンであることを示唆する。血漿エストロゲン濃度は、乳癌を有する女性でも乳癌を有さない女性でも同様であるが、乳房腫瘍のエストロンレベルおよびエストラジオールレベルは、正常乳房組織または正常血液よりも有意に高い。エストロゲンのインサイチュ合成は、腫瘍における高レベルのエストロゲンに対して重大に寄与していると考えられ、従って、エストロゲン生合成のインヒビター、特に特異的インヒビターは、内分泌依存性腫瘍の処置のために潜在的な価値がある。
【０００４】
過去２０年間にわたって、アロマターゼ経路（アンドロゲン前駆体であるアンドロステンジオンを、エストロンに変換する）のインヒビターの開発に多くの興味が持たれてきた。しかし、現在では、エストロンスルファターゼ（Ｅ１−ＳＴＳ）経路（すなわち、アロマターゼ経路と反対に、エストロンサルフェートのエストロンへの加水分解（Ｅ１ＳからＥ１））は、乳房腫瘍におけるエストロゲンの主要な供給源であるという証拠が存在する。この理論は、アロマターゼインヒビター（例えば、アミノグルテチミドおよび４−ヒドロキシアンドロステンジオン）により処置された乳癌を有する閉経後の女性における血漿エストロゲン濃度の穏やかな減少、またこれらのアロマターゼインヒビターで処置された患者における血漿Ｅ１Ｓ濃度が比較的高いままであるという事実により支持される。非結合体化エストロゲンの半減期（２０分）と比較してＥ１Ｓの血中での長い半減期（１０〜１２時間）、ならびに肝臓、および正常および悪性の乳房組織における高レベルのステロイドスルファターゼ活性もまた、この理論に支持を与える。
【０００５】
ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１５８７は、エストロン依存性腫瘍（特に乳癌）の処置における使用のための、新規なステロイドスルファターゼインヒビターおよびそれらを含有する薬学的組成物を教示する。これらのステロイドスルファターゼインヒビターは、Ｎ，Ｎ−ジメチルエストロン−３−スルファメートのようなスルファメートエステルであり、そして好ましくはエストロン−３−スルファメート（そうでなければ「ＥＭＡＴＥ」として知られる）である。
【０００６】
ＥＭＡＴＥ（２−メトキシエストロン−３−Ｏ−スルファメート）（これは、エストロン−３−Ｏ−スルファメートのアナログである）は、以下の構造：
【０００７】
【化１】
0004931312.tif 000002
を有する。ＥＭＡＴＥが強力なＥ１−ＳＴＳインヒビターであることは公知である。なぜならば、これは、０．１ｍＭでインタクトなＭＣＦ−７細胞において９９％より高いＥ１−ＳＴＳ活性の阻害を示すからである。ＥＭＡＴＥはまた、Ｅ１−ＳＴＳ酵素を、時間依存性かつ濃度依存性の様式で阻害し、このことは、ＥＭＡＴＥが活性部位指向性不活性化因子（ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）として作用することを示す。ＥＭＡＴＥは、元々Ｅ１−ＳＴＳの阻害のために設計されたが、これはまた、ジヒドロエピアンドロステロンスルファターゼ（ＤＨＡ−ＳＴＳ）を阻害する。この酵素は、エストロゲン性ステロイドアンドロステンジオールの生合成を調節する際に中枢の役割を有すると考えられる。また、現在では、アンドロステンジオールが乳房腫瘍増殖のプロモーターとして非常に重要でさえあり得ることを示す証拠が存在する。ＥＭＡＴＥはまた、インビボでも活性である。なぜならば、経口かまたは皮下のいずれかで投与される場合に、ラット肝臓Ｅ１−ＳＴＳ活性（９９％）およびＤＨＡ−ＳＴＳ活性（９９％）のほとんど完全な阻害を生じたからである。さらに、ＥＭＡＴＥは、ラットにおいて記憶増強効果を有することが示された。マウスにおける研究は、ＤＨＡ−ＳＴＳ活性と免疫応答の一部の調節との間の関係を示唆した。これはまたヒトでも起こり得ると考えられる。ＥＭＡＴＥ中のスルファメート部分のＯ原子を架橋することは、阻害活性のために重要である。従って、３−Ｏ−原子が、エストロン−３−Ｎ−スルファメートおよびエストロン−３−Ｓ−スルファメートにおけるように、他のヘテロ原子で置換される場合、これらのアナログは、より弱い時間非依存性不活性化因子である。
【０００８】
Ｅ１−ＳＴＳの阻害について最適な効力はＥＭＡＴＥにおいて達成され得たが、エストロンが、スルファターゼ阻害の間に放出され得ること、およびＥＭＡＴＥおよびそのエストラジオール同族体が、エストロゲン様活性を有し得ることは、可能である。
【０００９】
Ａｈｍｅｄら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９９  Ｊａｎ  ２７；２５４（３）：８１１−５）は、ＳＴＳのステロイドインヒビターおよび非ステロイドインヒビターの構造−活性相関研究について報告する。
【００１０】
本発明は、Ｅ１−ＳＴＳの阻害および他の治療的適用に適切な新規な化合物を提供することを目的とする。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、特定のハロ化合物が有効なステロイドスルファターゼインヒビターとして使用され得るという驚くべき発見に基づく。
【００１２】
ハロ化合物は、環系化合物の置換基である少なくとも１個のハロ基を含む。この環系化合物は、少なくとも１個の環成分を含む。この環成分は、環内に少なくとも４個の原子を含む。代表的には、これらの４個の原子は、炭素原子である。従って、代表的には、この環成分は、ヒドロカルビル基である。この環系化合物はまた、この環系上のさらなる置換基として、スルファメート基、ホスホネート基、チオホスホネート基、スルホネート基またはスルホンアミド基のうちの１種以上を含む。スルファメート基、ホスホネート基、チオホスホネート基、スルホネート基またはスルホンアミド基の少なくとも１種は、環成分上の置換基である。好ましい局面において、ハロ基は、少なくとも１個のスルファメート基、ホスホネート基、チオホスホネート基、スルホネート基またはスルホンアミド基を有する原子に隣接する原子上の置換基である。
【００１３】
本発明のハロ化合物は、他の置換基を含み得る。これらの他の置換基は、例えば、本発明の化合物の活性をさらに増加し得、および／または安定性（エキソビボおよび／またはインビボ）を増加し得る。
【００１４】
（発明の詳細な局面）
本発明の１局面によれば、図１に提供される式（Ｉａ）の化合物が提供され、ここで：Ｘは、環内に少なくとも４個の原子を有するヒドロカルビル環であり；Ｋは、ヒドロカルビル基であり；Ｒｈ１は、任意のハロ基であり；Ｒｈ２は、任意のハロ基であり；Ｒｈ１およびＲｈ２のうち少なくとも１個が存在し；Ｒｓは、スルファメート基、ホスホネート基、チオホスホネート基、スルホネート基またはスルホンアミド基のうちいずれか１個であり；そしてここで、この化合物は、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）活性を阻害し得る。
【００１５】
本発明の１局面によれば、（ａ）式（Ｉａ）を有する１種以上の候補化合物を用いて、ステロイドスルファターゼアッセイを実施する、工程；（ｂ）該候補化合物の１種以上が、ＳＴＳ活性を調節し得るかどうかを決定する、工程；および（ｃ）ＳＴＳ活性を調節し得る候補化合物の１種以上を選択する、工程を含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の１局面によれば、（ａ）式（Ｉａ）を有する１種以上の候補化合物を用いて、ステロイドスルファターゼアッセイを実施する、工程；（ｂ）該候補化合物の１種以上が、ＳＴＳ活性を調節し得るかどうかを決定する、工程；および（ｃ）ＳＴＳ活性を阻害し得る候補化合物の１種以上を選択する、工程、を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法のいずれか１つにおいて、１つ以上の追加の工程が存在し得る。例えば、この方法はまた、（例えば、化学的技術および／または酵素的技術によって）同定された候補化合物を調節する工程、およびＳＴＳ阻害効果（この効果はより大きいかまたは異なる場合に、見られ得る）について改変された化合物を試験する任意のさらなる工程、を包含する。さらなる例として、この方法はまた、同定された候補化合物の構造を（例えば、結晶学的技術の使用によって）決定し、次いで、（そのＳＴＳ阻害作用をさらに増加するために）コンピューターモデリング研究を実施する工程を包含する。従って、本発明はまた、上記の同定された候補化合物についてのデータセット（例えば、結晶学的座標）を有するコンピューターを包含する。本発明はまた、タンパク質結合研究のような分析のためのコンピュータースクリーン上に提供される際に同定された候補化合物を包含する。
【００１８】
本発明の１局面によれば、本発明の方法によって同定された化合物が提供される。
【００１９】
本発明の１局面によれば、医薬における使用のための本発明に従う化合物が提供される。
【００２０】
本発明の１局面によれば、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦活剤または補助剤と混合された、本発明に従う化合物を含む薬学的組成物が提供される。
【００２１】
本発明の１局面によれば、ＳＴＳに関連した状態または疾患の治療における使用のための医薬の製造における本発明に従う化合物の使用が提供される。
【００２２】
本発明の１局面によれば、有害ＳＴＳレベルに関連した状態または疾患の治療における使用のための医薬の製造における本発明に従う化合物の使用が提供される。
【００２３】
参照を容易にするために、本発明のこれらの局面およびさらなる局面は、本明細書中において、適切な節の表題下で議論される。しかし、各節下での教示は、必ずしも、各々の特定の節に限定されるとは限らない。
【００２４】
（好ましい局面）
好ましくは、Ｙと結合したＸは、ステロイド構造を模倣する。
【００２５】
好ましくは、Ｋは、環式基である。
【００２６】
好ましくは、Ｘは、６員環である。
【００２７】
好ましくは、Ｘ環は、環内に６個の炭素原子を有する。
【００２８】
好ましくは、Ｙと結合したＸは、ステロイド環構造である。
【００２９】
好ましくは、Ｋ基およびＸ環は、ステロイド環構造またはそれらの置換された誘導体である。
【００３０】
好ましくは、Ｒｓ基は、Ｘ環の３位である。
【００３１】
好ましくは、Ｒｓは、スルファメート基である。
【００３２】
好ましくは、Ｒｈ１は、Ｘ環の２位である。
【００３３】
好ましくは、Ｒｈ２は、Ｘ環の４位である。
【００３４】
好ましくは、式（Ｉａ）の化合物は、式（Ｉｂ）として提供される式を有し、ここで、Ｒｈ１、Ｒｈ２、Ｒｓ、ＸおよびＫの各々は、上記の意味を有し、ここでＲｈ１およびＲｈ２のうちの少なくとも１個が、存在する。
【００３５】
好ましくは、Ｋ基およびＸ環は、一緒になって、全ての置換基を包括し、最大で、約５０個の炭素原子、より通常は、約３０〜４０個以下の炭素原子を含む。
【００３６】
幾つかの適用の場合、好ましくは、この化合物は、エストロゲン効果を有しないか、または最小限のエストロゲン効果を有する。
【００３７】
幾つかの適用の場合、好ましくは、この化合物は、エストロゲン効果を有する。
【００３８】
幾つかの適用の場合、好ましくは、この化合物は、可逆性の作用を有する。
【００３９】
幾つかの適用の場合、好ましくは、この化合物は、不可逆性の作用を有する。
【００４０】
１実施形態において、本発明の化合物は、胸部癌の処置に有用である。
【００４１】
２つの好ましい化合物は、２−ヨードＥＭＡＴＥおよび２−ブロモＥＭＡＴＥである。
【００４２】
（幾つかの利点）
本発明の１つの重要な利点は、本発明のスルファメート化合物がＳＴＳインヒビターとして作用し得ることである。
【００４３】
本発明の化合物の別の利点は、それらがインビボにおいて有効であり得ることである。
【００４４】
本発明の化合物の幾つかは、非エストロゲン性化合物であり得る。本明細書中において、用語「非エストロゲン性」とは、エストロゲン活性を全く示さないか、または実質的に示さないことを意味する。
【００４５】
別の利点は、この化合物の幾つかが、ホルモン活性を表示または誘発する化合物に代謝され得ないことである。
【００４６】
本発明の化合物の幾つかはまた、それらが経口活性であり得るという点で有利である。
【００４７】
本発明の化合物の幾つかは、特に、医薬が初期年齢から投与される必要があり得る際、癌（例えば、胸部癌）、および（あるいは）非悪性状態（例えば、自己免疫疾患の防止）の処置に有用であり得る。
【００４８】
従って、本発明の化合物はまた、内分泌依存癌の処置（例えば、自己免疫疾患の処置）以外の治療用途を有すると考えられる。
【００４９】
（ステロイドスルファターゼ）
ステロイドスルファターゼは、時折、ステロイドスルファターゼまたはステリルスルファターゼまたは略して「ＳＴＳ」といわれるが、エストロンスルフェート、デヒドロエピアンドロステロンおよびコレステロールスルフェートのような幾つかの硫酸化ステロイド（ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ）を加水分解する。ＳＴＳは、酵素番号ＥＣ３．１．６．２が割り当てられる。
【００５０】
ＳＴＳは、クローン化され、そして発現されてきた。例えば、Ｓｔｅｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３８６５−１３８７２（１９８９））およびＹｅｎら（Ｃｅｌｌ  ４９：４４３−４５４（１９８７））を参照のこと。
【００５１】
ＳＴＳは、多くの疾患状態に関連付けられてきた酵素である。
【００５２】
例えば、研究者は、ＳＴＳの全欠乏症が魚鱗癬を産生することを発見した。幾つかの研究者によれば、ＳＴＳ欠乏症は、日本において非常に流行している。同じ研究者（Ｓａｋｕｒａら、Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ  １９９７  Ｎｏｖ；２０（６）：８０７−１０）はまた、アレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、またはアトピー性皮膚炎）が、ステロイドスルファターゼ欠乏症と関連し得ることを報告した。
【００５３】
ＳＴＳ活性の全体的欠乏を通して生じる疾患状態に加えて、ＳＴＳ活性の増加したレベルはまた、ほとんどの疾患状態をもたらし得る。例として、上記に示されるように、胸部癌増殖および転移におけるＳＴＳの役割を支持する強力な証拠が存在する。
【００５４】
ＳＴＳはまた、他の疾患条件に関連付けられてきた。例えば、Ｌｅ  Ｒｏｙら（Ｂｅｈａｖ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９  Ｍａｒ；２９（２）：１３１−６）は、ステロイドスルファターゼ濃度とマウスの発作挙動の開始との間に遺伝的な相関性が存在し得ることを決定した。この著者らは、ステロイドの硫酸化が、突然変異誘発による攻撃に関連することが示された遺伝子を含む、複合ネットワークのプライムムーバー（ｐｒｉｍｅ  ｍｏｖｅｒ）であり得ると結論付けた。
【００５５】
（ＳＴＳ阻害）
ＳＴＳ活性に関連した幾つかの疾患状態は、不活性な硫酸化エストロンの活性な非硫酸化エストロンへの転化によると考えられる。ＳＴＳ活性に関連した疾患状態において、ＳＴＳ活性を阻害することが所望される。
【００５６】
本明細書中において、用語「阻害する」とは、ＳＴＳの有害作用を低減および／または排除および／またはマスクおよび／または防止することを含む。
【００５７】
（ＳＴＳインヒビター）
本発明に従って、本発明の化合物は、ＳＴＳインヒビターとして作用し得る。
【００５８】
本明細書中において、本発明の化合物に関して、本明細書中で使用される用語「インヒビター」とは、ＳＴＳ活性を阻害し得る、例えば、ＳＴＳの有害作用を低減および／または排除および／またはマスクおよび／または防止し得る化合物を意味する。ＳＴＳインヒビターは、アンタゴニストとして作用し得る。
【００５９】
エストロンスルファターゼ活性を阻害する化合物の能力は、インタクトなＭＣＦ−７胸部癌細胞または胎盤ミクロソームのいずれかを使用して評価され得る。さらに、動物モデルが使用され得る。適切なアッセイプロトコルについての詳細は、以下の節に提供される。他のアッセイが使用され、ＳＴＳ活性、次いでＳＴＳ阻害を決定し得ることに注意すべきである。例えば、引用はまた、ＷＯ−Ａ−９９／５０４５３の教示に対して行われ得る。
【００６０】
好ましくは、幾つかの適用の場合、本化合物は、スルファメート基が、スルフェート基によって置換され、スルフェート誘導体を形成する場合、このスルフェート誘導体は、ステロイドスルファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２）活性（すなわち、ｐＨ７．４および３７℃でステロイドスルファターゼＥＣ３．１．６．２でインキュベートした場合）を有する酵素によって加水分解可能であるという特徴によってさらに特徴付けられる。
【００６１】
１つの好ましい実施形態において、化合物のスルファメート基が、スルフェート基と置き換えられてスルフェート化合物を形成した場合、このスルフェート化合物がステロイドスルファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２）活性を有する酵素によって加水分解可能であり、ｐＨ７．４および３７℃でステロイドスルファターゼＥＣ３．１．６．２でインキュベートした場合、２００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、好ましくは１００ｍＭ未満、好ましくは７５ｍＭ未満、好ましくは５０ｍＭ未満のＫｍ値を生じる。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明の化合物は、ステロイドスルファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２）活性を有する酵素によって加水分解可能ではない。
【００６３】
幾つかの適用の場合、好ましくは、本発明の化合物は、所望の標的（例えば、ＳＴＳ）に対して少なくとも約１００倍の選択性を有し、好ましくは、所望の標的に対して少なくとも約１５０倍の選択性を有し、好ましくは、所望の標的に対して少なくとも約２００倍の選択性を有し、好ましくは、所望の標的に対して少なくとも約２５０倍の選択性を有し、好ましくは、所望の標的に対して少なくとも約３００倍の選択性を有し、好ましくは、所望の標的に対して少なくとも約３５０倍の選択性を有する。
【００６４】
本発明の化合物は、ＳＴＳ活性を阻害する能力に加えて、またはその能力の代わりに、他の有利な特性を有し得る。
【００６５】
（Ｋ基）
Ｋ基は、環式構造である必要はない。この点において、Ｋ基は、インビボにおいて環様構造に従う能力を有し得る直鎖構造であり得る。
【００６６】
好ましい局面において、Ｋ基は、環式であり、環式基Ｋを形成する。
【００６７】
環式Ｋは、必ずしもＸ環に縮合される必要はない。この点において、それらは、適切なスペーサー基（ヒドロカルビル基であり得る）によって隔てられ得る。
【００６８】
好ましい局面において、環式基Ｋは、Ｘ環に縮合される。
【００６９】
Ｋ基は、多環式基であり得、縮合された多環式である必要はない。
【００７０】
従って、好ましい局面において、Ｋ基および環Ｘは、多環式化合物を構成する。示されるように、本明細書中での用語「多環式」は、縮合環構造および非縮合環構造（それらの組み合わせを含む）を含む。
【００７１】
環式基ＫおよびＸのうちの少なくとも１個は、複素環式基（複素環）または非複素環式基であり得る。
【００７２】
環式基ＫおよびＸのうちの少なくとも１個は、飽和環構造または不飽和環構造（例えば、アリール基）であり得る。
【００７３】
好ましくは、環式基の少なくとも１個は、アリール環である。
【００７４】
この環式基が、多環式である場合、この化合物の環成分の幾つかまたは全ては、一緒に縮合されるか、または１個以上の適切なスペーサー基を介して接合され得る。
【００７５】
この多環式化合物は、多くの縮合環を含み得る。この点において、縮合環は、異なるサイズの環（例えば、３つの６員環（６，６，６）、１つの６員環、１つの７員環および１つの６員環（６，７，６）、１つの６員環および２つの８員環（６，８，８）など）の任意の組み合わせを含み得る。
【００７６】
１局面において、本発明は、多環式化合物が（６，６，７）環以外である化合物に関する。さらなる局面において、本発明は、多環式化合物が７員以外を有する特定の環のみを含む化合物に関する。
【００７７】
好ましくは、多環式化合物は、全ての置換基を包括し、約５０以下の炭素原子、より通常は、約３０〜４０個以下の炭素原子を含む。
【００７８】
この多環式化合物は、少なくとも２個の環成分、または少なくとも３個の環成分、または少なくとも４個の環成分を含み得る。
【００７９】
好ましくは、この多環式化合物は、４個の環成分を含む。
【００８０】
好ましい多環式化合物は、ステロイド性環成分、またはその生体−等配電子体（ｂｉｏ−ｉｓｏｓｔｅｒｅ）を有する。
【００８１】
（ヒドロカルビル）
本明細書中で使用される場合の用語「ヒドロカルビル基」は、少なくともＣおよびＨを含む基を意味し、そして必要に応じて１つ以上の他の適切な置換基を含み得る。このような置換基の例としては、ハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環式基などが挙げられ得る。これらの置換基が環式基である可能性に加えて、置換基の組合せが環式基を形成し得る。ヒドロカルビル基が、１つより多くのＣを含む場合、これらの炭素は、必ずしも互いに連結される必要はない。例えば、少なくとも２つの炭素は、適切な元素または基を介して連結され得る。したがって、ヒドロカルビル基は、特定のヘテロ原子を含み得る。適切なヘテロ原子は、当業者に明らかであり、これらとしては、例えば、イオウ、窒素および酸素が挙げられる。ヒドロカルビル基の非限定的な例は、アシル基である。
【００８２】
代表的なヒドロカルビル基は、炭化水素基である。本明細書中で、用語「炭化水素」は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基のいずれか１つを意味し、これらの基は、直鎖、分岐鎖、または環式であり得るか、またはアリール基であり得る。用語炭化水素もまた、必要に応じて置換されているこれらの基を含む。炭化水素が、炭化水素上に置換基（単数または複数）を有する分岐した構造である場合、この置換（単数）は、炭化水素骨格上でも分岐上でもよい；あるいは、これらの置換（複数）は、炭化水素骨格上でも分岐上でもよい
（スルファメート基）
１つの実施形態において、環Ｘは、置換基としてスルファメート基を有する。本明細書中で使用される場合の用語「スルファメート」は、スルファミン酸のエステル、もしくはスルファミン酸のＮ−置換誘導体のエステル、またはその塩を含む。
【００８３】
Ｒｓがスルファメート基である場合、本発明の化合物は、スルファメート化合物と称される。
【００８４】
代表的には、スルファメート基は、以下の式：
（Ｒ１）（Ｒ２）Ｎ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｏ−
を有し、ここで好ましくはＲ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニルおよびアリール、またはその組合せから選択されるか、または共にアルキレンを表わし、ここで各アルキルまたはシクロアルキルまたはアルケニルは、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を含む。
【００８５】
置換される場合、本発明のＮ−置換化合物は、１つまたは２つの、Ｎ−アルキル置換基、Ｎ−アルケニル置換基、Ｎ−シクロアルキル置換基またはＮ−アリール置換基を含み得、これらは、好ましくは最大１０個の炭素原子を含むか、それぞれ最大１０個の炭素原子を含む。Ｒ１および／またはＲ２が、アルキルである場合、好ましい基は、Ｒ１およびＲ２が、１〜６個の炭素原子を含む低級アルキル基（すなわち、メチル、エチル、プロピルなど）からそれぞれ独立して選択される基である。Ｒ１およびＲ２は、両方ともメチルであり得る。Ｒ１および／またはＲ２がアリールである場合、代表的なものは、フェニルおよびトリル（ＰｈＣＨ３；ｏ）である。Ｒ１およびＲ２がシクロアルキルを表わす場合、代表的なものは、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどである。共に連結される場合、Ｒ１およびＲ２は、代表的には４〜６個の炭素原子鎖を生じるアルキレン基を表わし、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を介在させ、例えば、５員環複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジノまたはピペリジノ）を生じる。
【００８６】
アルキル置換基、シクロアルキル置換基、アルケニル置換基およびアリール置換基には、目的の化合物のスルファターゼ阻害活性を妨害しない１つ以上の基を置換基として含む基が含まれる。例示的な非妨害置換基としては、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、アルコキシ、アルキルおよびアリールが挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、スルファメート基は、基Ｘ中または基Ｘ上の１つ以上の原子に縮合される（または結合される）ことにより環構造を形成し得る。
【００８８】
いくつかの実施形態において、１つより多くのスルファメート基が存在し得る。例として、２つのスルファメートが存在し得る（すなわち、ビス−スルファメート化合物）。これらの化合物がステロイド様核を基本とする場合、好ましくは、第２のスルファメート基（またはさらなるスルファメート基の少なくとも１つ）は、ステロイド様核の１７位に位置する。これらの基は、同じである必要はない。
【００８９】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨである。
【００９０】
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２の各々がＨである。
【００９１】
（ホスホネート基）
Ｒｓがホスホネート基である場合、本発明の化合物は、ホスホネート化合物と称される。
【００９２】
代表的には、ホスホネート基は、以下の式：
（Ｒ１）−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−
を有し、ここで好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニルもしくはアリールまたはそれらの組合せであり、ここでアルキルまたはシクロアルキルまたはアルケニルのそれぞれは、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を含む。
【００９３】
置換される場合、本発明のＮ−置換化合物は、１つまたは２つの、Ｎ−アルキル置換基、Ｎ−アルケニル置換基、Ｎ−シクロアルキル置換基、またはＮ−アリール置換基を含み得、好ましくは、最大１０個の炭素原子を含むか、それぞれ最大１０個の炭素原子を含む。Ｒ１がアルキルの場合、Ｒ１は、１〜６個の炭素原子を含む低級アルキル基（すなわち、メチル、エチル、プロピルなど）であり得る。例として、Ｒ１はメチルであり得る。Ｒ１がアリールである場合、代表的なものはフェニルおよびトリル（ＰｈＣＨ３；ｏ）である。Ｒ１がシクロアルキルを表わす場合、代表的なものは、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどである。Ｒ１は、４〜６個の炭素鎖を生じるアルキレン基を含み得、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を介在させて、例えば、５員環複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジノ、またはピペリジノ）を生じる。
【００９４】
これらの基には、目的の化合物のスルファターゼ阻害活性を妨害しない１つ以上の基を置換基として含む、アルキル置換基、シクロアルキル置換基、アルケニル置換基およびアリール置換基が含まれる。例示的な非妨害性置換基としては、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、アルコキシ、アルキルおよびアリールが挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ホスホネート基は、基Ｘ中または基Ｘ上の１つ以上の原子と縮合される（または結合する）ことにより環構造を形成し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、１より多くのホスホネート基が存在し得る。例として、２つのホスホネートが存在し得る（すなわち、ビスホスホネート化合物）。これらの化合物がステロイド様核を基本とする場合、好ましくは、第２のホスホネート基（またはさらなるホスホネート基の少なくとも１つ）は、ステロイド様核の１７位に位置する。これらの基は、同じである必要はない。
【００９７】
（チオホスホネート基）
Ｒｓがチオホスホネート基である場合、本発明の化合物は、チオホスホネート化合物と称される。
【００９８】
代表的には、チオホスホネート基は、以下の式：
（Ｒ１）−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−
を有し、ここで好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニルもしくはアリールまたはそれらの組合せであり、ここでアルキルまたはシクロアルキルまたはアルケニルのそれぞれは、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を含む。
【００９９】
置換される場合、本発明のＮ−置換化合物は、１つまたは２つのＮ−アルキル置換基、Ｎ−アルケニル置換基、Ｎ−シクロアルキル置換基、またはＮ−アリール置換基を含み得、好ましくは、最大１０個の炭素原子を含むか、それぞれ最大１０個の炭素原子を含む。Ｒ１がアルキルの場合、Ｒ１は、１〜６個の炭素原子を含む低級アルキル基（すなわち、メチル、エチル、プロピルなど）であり得る。例として、Ｒ１はメチルであり得る。Ｒ１がアリールである場合、代表的なものはフェニルおよびトリル（ＰｈＣＨ３；ｏ）である。Ｒ１がシクロアルキルを表わす場合、代表的なものは、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどである。Ｒ１は、４〜６個の炭素鎖を生じるアルキレン基を含み得、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を介在させて、例えば、５員環複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジノ、またはピペリジノ）を生じる。
【０１００】
これらの基には、目的の化合物のスルファターゼ阻害活性を妨害しない１つ以上の基を置換基として含む、アルキル置換基、シクロアルキル置換基、アルケニル置換基およびアリール置換基が含まれる。例示的な非妨害性置換基としては、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、アルコキシ、アルキルおよびアリールが挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、チオホスホネート基は、基Ｘ中または基Ｘ上の１つ以上の原子と縮合される（または結合する）ことにより環構造を形成し得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、１より多くのチオホスホネート基が存在し得る。例として、２つのチオホスホネートが存在し得る（すなわち、ビスチオホスホネート化合物）。これらの化合物がステロイド様核を基本とする場合、好ましくは、第２のチオホスホネート基（またはさらなるチオホスホネート基の少なくとも１つ）は、ステロイド様核の１７位に位置する。これらの基は、同じである必要はない。
【０１０３】
（スルホネート基）
Ｒｓがスルホネートである場合、本発明の化合物は、スルホネート化合物と称される。
【０１０４】
代表的には、スルホネート基は、以下の式：
（Ｒ１）−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｏ−
を有し、ここで好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アルケニルもしくはアリール、またはそれらの組合せであり、ここでアルキルまたはシクロアルキルまたはアルケニルは、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を含む。
【０１０５】
置換される場合、本発明のＮ−置換化合物は、１つまたは２つの、Ｎ−アルキル置換基、Ｎ−アルケニル置換基、Ｎ−シクロアルキル置換基またはＮ−アリール置換基を含み得、これらは、好ましくは最大１０個の炭素原子を含むか、それぞれ最大１０個の炭素原子を含む。Ｒ１が、アルキルである場合、Ｒ１は、１〜６個の炭素原子を含む低級アルキル基（すなわち、メチル、エチル、プロピルなど）であり得る。例として、Ｒ１は、メチルであり得る。Ｒ１がアリールである場合、代表的なものは、フェニルおよびトリル（ＰｈＣＨ３；ｏ）である。Ｒ１がシクロアルキルを表わす場合、代表的なものは、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどである。Ｒ１は、４〜６個の炭素原子の鎖を生じるアルキレン基さえ含み得、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子または基を介在させ、例えば、５員環複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジノまたはピペリジノ）を生じる。
【０１０６】
これらの基には、アルキル置換基、シクロアルキル置換基、アルケニル置換基およびアリール置換基には、目的の化合物のスルファターゼ阻害活性を妨害しない１つ以上の基を置換基として含む基が含まれる。例示的な非妨害置換基としては、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、アルコキシ、アルキルおよびアリールが挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、スルホネート基は、基Ｘ中または基Ｘ上の１つ以上の原子に縮合される（または結合される）ことにより環構造を形成し得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、１つより多くのスルホネート基が存在し得る。例として、２つのスルホネートが存在し得る（すなわち、ビス−スルホネート化合物）。これらの化合物がステロイド様核を基本とする場合、好ましくは、第２のスルホネート基（またはさらなるスルホネート基の少なくとも１つ）は、ステロイド様核の１７位に位置する。これらの基は、同じである必要はない。
【０１０９】
（スルホネート／ホスホネート／チオホスホネート／スルファメートの組合せ）
本発明のいくつかの化合物に関して、１つの、本明細書中で規定されるようなスルホネートまたは本明細書中で規定されるようなホスホネートまたは本明細書中で規定されるようなチオホスホネートまたは本明細書中で規定されるようなスルファメート；および別の、本明細書中で規定されるようなスルホネートまたは本明細書中で規定されるようなホスホネートまたは本明細書中で規定されるようなチオホスホネートまたは本明細書中で規定されるようなスルファメートが存在し得る。例としては、本発明の化合物は、１つのスルファメート基および１つのホスホネート基を含み得る。
【０１１０】
本発明のこれらの化合物がステロイド様核を基本とする場合、好ましくは他のこれらの基は、ステロイド様核の１７位に位置する。
【０１１１】
（模倣物（ｍｉｍｉｃ））
１つの局面において、ＸおよびＫは、ステロイド様環構造の模倣物であり得る。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合の用語「模倣物」は、同様または異なる構造を有するが同様の機能的効果を有することを意味する。換言すると、基Ｋおよび環Ｘは、共に、ステロイド環の生体等配電子体（ｂｉｏ−ｉｓｏｓｔｅｒｅ）またはその活性部分であり得る。
【０１１３】
好ましい局面において、基Ｋおよび環Ｘは、共に、エストロン環の生体等配電子体、またはその部分であり得る。
【０１１４】
（ステロイド環構造）
１つの好ましい局面において、ＸおよびＫは、ステロイド環構造を作製する−すなわち、シクロペンタンフェナントレン骨格、またはその生体の等配電子体である。
【０１１５】
当該分野で公知のように、伝統的なステロイド環構造は、一般式：
【０１１６】
【化２】
0004931312.tif 000003
を有する。
【０１１７】
上記の式において、環は、慣例的な様式で標識されてきた。
【０１１８】
生体の等配電子体の例としては、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの任意の１つ以上が複素環式環である場合および／または環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの任意の１つ以上が置換されている場合および／または環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの任意の１つ以上が修飾されている場合であるが、ここで、スルファメート基の非存在下の生体の等配電子体がステロイド特性を有する。
【０１１９】
これに関して、好ましい多環構造の構造は、以下のように示され得る：
【０１２０】
【化３】
0004931312.tif 000004
ここで、各環Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’は、独立してへテロ環式環または非へテロ環式環を示す、この環は、独立して置換されていても置換されていなくてもよく、飽和でもよいし、不飽和でもよい。
【０１２１】
例として、環Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’のいずれか１つ以上は独立して、適切な基（例えば、アルキル基、アリル基、ヒドロキシ基、ハロ基、ヒドロカルビル基、オキシヒドロカルビル基など）で置換され得る。
【０１２２】
Ｄ’の好ましい例は、五員環または六員環の、少なくとも１つの置換基を有する非ヘテロ環式環である。
【０１２３】
１つの好ましい実施形態では、環Ｄ’は、エチニル基で置換される。
【０１２４】
環Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’のいずれか１つがヘテロ環式環である場合、Ｃ原子の組み合わせ、および少なくとも１つのＮ原子、および／または少なくとも１つのＯ原子を包含することが好ましい。他のヘテロ環式環原子は、環中に存在し得る。
【０１２５】
本発明の化合物の適切な、好ましいステロイド核環Ａ’−Ｄ’の例としては、デヒドロエピアンドロステロンおよびエストロンを含むエストロゲンの環Ａ−Ｄが挙げられる。
【０１２６】
本発明の化合物の好ましいステロイド核環Ａ’−Ｄ’は、以下の環Ａ−Ｄを含む：
エストロンおよび置換エストロン、すなわち：
エストロン
４−ＯＨ−エストロン
６α−ＯＨ−エストロン
７α−ＯＨ−エストロン
１６α−ＯＨ−エストロン
１６β−ＯＨ−エストロン
１７−デオキシエストロン
エストロン
エストラジオールおよび置換エストラジオール、すなわち：
４−ＯＨ−１７β−エストラジオール
６α−ＯＨ−１７β−エストラジオール
７α−ＯＨ−１７β−エストラジオール
４−ＯＨ−１７α−エストラジオール
６α−ＯＨ−１７α−エストラジオール
７α−ＯＨ−１７α−エストラジオール
１６α−ＯＨ−１７α−エストラジオール
１６α−ＯＨ−１７β−エストラジオール
１６β−ＯＨ−１７α−エストラジオール
１６β−ＯＨ−１７β−エストラジオール
１７α−エストラジオール
１７β−エストラジオール
１７α−エチニル−１７β−エストラジオール
１７β−エチニル−１７α−エストラジオール
１７−デオキシエストラジオール
エストリオールおよび置換エストリオール、すなわち：
エストリオール
４−ＯＨ−エストリオール
６α−ＯＨ−エストリオール
７α−ＯＨ−エストリオール
１７−デオキシエストリオール
デヒドロエピアンドロステロンおよび置換デヒドロエピアンドロステロン、すなわち：
デヒドロエピアンドロステロン
６α−ＯＨ−デヒドロエピアンドロステロン
７α−ＯＨ−デヒドロエピアンドロステロン
１６α−ＯＨ−デヒドロエピアンドロステロン
１６β−ＯＨ−デヒドロエピアンドロステロン
一般に、用語、環系Ａ’Ｂ’Ｃ’Ｄ’は、種々の非干渉置換基を含み得る。特に、環系Ａ’Ｂ’Ｃ’Ｄ’は、１以上のヒドロキシ、アルキル（特に低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、および他のペンチル異性体、ならびにｎ−ヘキシルおよび他のヘキシル異性体）、アルコキシ（特に低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシなど）、アルキニル（例えば、エチニル）、またはハロゲン（例えば、フルオロ置換基）を含み得る。
【０１２７】
（非ステロイド構造）
代替的な実施態様では、本発明の化合物は、ステロイド核を含まなくてもよいし、ステロイド核に基づかなくてもよい。これに関して、この多環式化合物は、非ステロイド環系（例えば、ジエチルスチルベステロール、スチルベステロール、クマリン、フラボノイド、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）および他の環系）を含み得るかまたはこれに基づき得る。本発明中のかまたは本発明の組成物としての使用のための他の適切な非ステロイド化合物は、米国特許第５５６７８３１号において見出され得る。
【０１２８】
（他の置換基）
本発明の化合物は、Ｒｈ１、Ｒｈ２およびＲｓ以外の置換基を有する。例としては、これらの他の置換は、以下の１つ以上であり得る：１以上のスルファメート基、１以上のホスホネート基、１以上のチオホスホネート基、１以上のスルホンアミド基、１以上のハロ基、１以上のＯ基、１以上のヒドロキシ基、１以上のアミノ基、１以上の硫酸含有基、１以上のヒドロカルビル基（例えば、オキシヒドロカルビル基）。
【０１２９】
（オキシヒドロカルビル）
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビル」基は、少なくともＣ、ＨおよびＯを含む基を意味し、必要に応じて１つ以上の他の適切な置換基を含み得る。そのような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環式基などを包含し得る。置換基が環式基になる可能性に加えて、置換基の組み合わせが環式基を形成し得る。オキシヒドロカルビル基が１つ以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合される必要はない。例えば、少なくとも２つの炭素が、適切な元素または基を介して結合され得る。したがって、オキシヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含み得る。適切なヘテロ原子は、当業者に明白であり、例えば、硫黄および窒素を含む。
【０１３０】
本発明の１つの実施態様において、オキシヒドロカルビル基はオキシヒドロカーボン基である。
【０１３１】
本明細書中において、用語「オキシヒドロカーボン」はアルコキシ基、オキシアルケニル基、オキシアルキニル基（これら基は直鎖、分岐もしくは環状であり得る）またはアリル基を意味する。用語、オキシヒドロカーボンはまたこれらの基を含むが、ここでこれらは必要に応じて置換されている。オキシヒドロカーボンが、その上に置換基を有する分岐構造である場合、置換は炭化水素主鎖上もしくは側鎖上のどちらかにあり得る；あるいは、置換は炭化水素主鎖上および側鎖上にあり得る。
【０１３２】
代表的には、オキシヒドロカルビル基は、式Ｃ１〜６Ｏ（例えば、Ｃ１〜３Ｏ）で表される。
【０１３３】
（癌細胞を使用するＳＴＳ活性を測定するためのアッセイ（プロトコル１））（ＭＣＦ−７細胞におけるステロイドスルファターゼ活性の阻害）
ステロイドスルファターゼ活性を、インタクトなＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を用いてインビトロにおいて測定した。このホルモン依存性細胞株は、ヒト乳癌細胞の増殖のコントロールを研究するのに広く用いられている。それは、顕著なステロイドスルファターゼ活性（ＭａｃＩｎｄｏｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３，１２８１−１２８７（１９８８）；ＰｕｒｏｈｉｔおよびＲｅｅｄ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５０，９０１−９０５（１９９２））を有し、合衆国では、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、および英国では、例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄから入手できる。
細胞を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、非必須アミノ酸ならびに０．０７５％重炭酸ナトリウムを含有する最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で保持する。３０複製まで２５ｃｍ２組織培養フラスコを、上記の培地を用いておおよそ１×１０５細胞／フラスコで播種した。細胞を、８０％コンフルエントまで増殖させ、そして培地を３日ごとに換えた。
【０１３４】
３組の２５ｃｍ２組織培養フラスコにおけるＭＣＦ−７細胞の完全な単一層を、Ｅａｒｌｅの平衡塩溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＩＣＮ  Ｆｌｏｗ，  Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ．  Ｕ．Ｋ．からのＥＢＳＳ）で洗浄し、そしてエストロン−３−スルファメート（１１濃度：０；１ｆＭ；０．０１ｐＭ；０．１ｐＭ；１ｐＭ；０．０１ｎＭ；０．１ｎＭ；１ｎＭ；０．０１ｍＭ；０．１ｍＭ；１ｍＭ）と一緒に無血清ＭＥＭ（２．５ｍｌ）中の５ｐｍｏｌ（７×１０５ｄｐｍ）［６，７−３Ｈ］エストロン−３−スルフェート（比活性６０ｍＣｉ／ｍｍｏｌのものをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）と共に３７℃において３〜４時間インキュベートした。インキュベーションした後、各々のフラスコを、冷却し、培地（１ｍｌ）を、［１４Ｃ］エストロン（７×１０３ｄｐｍ）（比活性９７Ｃｉ／ｍｍｏｌのものをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｕ．Ｋ．から）を含有する別々のチューブにピペットで分けた。混合物を、トルエン（５ｍｌ）とともに３０秒間よく振った。実験は、９０％より多い［１４Ｃ］エストロンおよび０．１％より少ない［３Ｈ］エストロン−３−スルフェートが、この処理によって水相から取り除かれたことを示した。有機相の一部（２ｍｌ）を取り除き、エバポレートし、そして残渣の３Ｈおよび１４Ｃの含有量を、シンチレーションスペクトロメトリーによって決定した。加水分解されたエストロン−３−スルフェートの質量を、得られた３Ｈのカウント（培地の容量および用いた有機相の容量ならびに加えた［１４Ｃ］エストロンの回収容量で修正）および基質の比活性から算出した。実験の各々のバッチ（ｂａｔｃｈ）は、スルファターゼポジティブのヒトの胎盤（ポジティブコントロール）から調製されたミクロソームのインキュベーション、および細胞なしのフラスコ（基質の酵素によらない見かけの加水分解を評価するため）を包含する。フラスコごとの細胞核の数を、サポニン（Ｚａｐｏｎｉｎ）とともに細胞単層を処理した後、コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて決定した。各々のバッチの１つのフラスコを、細胞膜の状態および生存度をトリパンブルー排除法（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｊ．（１９７３）：  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，［Ｋｒｕｓｅ，Ｄ．Ｆ．および  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．編］；４０６−４０８頁；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中）を用いて評価するために用いた。
【０１３５】
ステロイドスルファターゼ活性の結果を１０６細胞に対して計算されるインキュベーション期間（２０時間）の間に形成された総生成物（エストロン＋エストラジオール）の平均値±１  Ｓ．Ｄ．として、および統計的な重要性を示す値のためにエストロン−３−スルファメートを含有しないインキュベーションにおける減少パーセント（阻害）として表現した。片側スチューデントｔ−検定を、結果の統計的重要性を試験するために用いた。
【０１３６】
（胎盤ミクロソームを使用するＳＴＳ活性を測定するためのアッセイ（プロトコル２））
（胎盤ミクロソーム中のステロイドスルファターゼ活性の阻害）
通常の妊娠期間由来のスルファターゼポジティブのヒトの胎盤を、徹底的にはさみで細かく切り刻み、そして一旦冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）で洗浄し、次いで冷リン酸緩衝液（５ｍｌ／ｇの組織）に再懸濁させた。均質化を、氷中での２分冷却時間で間を置いた３回の１０秒の破砕を用いて、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーで達成した。核および細胞の破片を、３０分間２０００ｇで遠心分離（４℃）することによって取り除き、そして上清の一部（２ｍｌ）を−２０℃で保存した。上清のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８−２５４（１９７６））によって決定した。
【０１３７】
インキュベーション（１ｍｌ）を、１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、２０ｍＭ［６，７−３Ｈ］エストロン−３−流酸塩（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．からの比活性  ６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の基質濃度および３７℃で２０分のインキュベーション時間を用いて行う。必要ならば、８つの濃度の化合物を利用する：０（すなわち、コントロール）；０．０５ｍＭ；０．１ｍＭ；０．２ｍＭ；０．４ｍＭ；０．４ｍＭ；０．６ｍＭ；０．８ｍＭ;１．０ｍＭ。インキュベーション後、各サンプルを冷却し、そして培地（１ｍｌ）を［１４Ｃ］エストロン（７×１０３ｄｐｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．からの比活性  ９７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む別のチューブにピペッティングした。混合物をトルエン（５ｍｌ）で３０秒間徹底的に振盪する。実験は、９０％より大きい［１４Ｃ］エストロンおよび０．１％未満の［３Ｈ］エストロン−３−流酸塩は、この処理によって水相から除去されることを示した。有機相の一部（２ｍｌ）は、除去され、エバポレートされ、そして残留物の３Ｈおよび１４Ｃ含量を、シンチレーション分光法によって決定した。加水分解されたエストロン−３−硫酸塩の質量を、（使用された培地および有機相の用量について、および添加された［１４Ｃ］エストロンの回収について補正された）得られた３Ｈカウント数、および基質の比活性から算出する。
【０１３８】
（ＳＴＳ活性を決定するための動物アッセイモデル（プロトコル３））
（インビボでのエストロンスルファターゼの阻害）
本発明の化合物は、動物モデルを使用して、特に卵巣除去されたラットで研究され得る。このモデルにおいて、エストロゲン性（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ）である化合物は、子宮の増殖を刺激する。
【０１３９】
化合物（０．１ｍｌ／Ｋｇ／日で５日間）を、ラットに経口投与し、動物の別の軍は、ビヒクル（プロピレングリコール）のみを受ける。研究の終わりに、肝臓組織のサンプルを得て、そしてエストロン硫酸塩活性を、以前記載されるように、基質として３Ｈエストロン硫酸塩を用いてアッセイした（ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２６３８を参照）。
【０１４０】
（エストロゲン性活性を決定するための動物アッセイモデル（プロトコル４））
（インビボエストロゲン性（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の欠失）
本発明の化合物は、動物モデルを用いて、特に卵巣除去されたラットで研究され得る。このモデルにおいて、エストロゲン（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ）である化合物は、子宮の増殖を刺激する。
【０１４１】
化合物（０．１ｍｌ／Ｋｇ／日で５日間）を、ラットに経口投与し、動物の別の軍は、ビヒクル（プロピレングリコール）のみを受ける。研究の終わりに、子宮を得て、そして測量し、結果を子宮の重量／全体重×１００として表わした。
【０１４２】
子宮の増殖に有意な効果を有さない化合物は、エストロゲン性（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ）ではない。
【０１４３】
（ＳＴＳ活性を決定するための生物学的アッセイ（プロトコル５））
化合物のエストロゲン硫酸塩活性を阻害する能力はまた、例えば、高スループットのスクリーンにおいて、ＳＴＳ、あるいはその活性なフラグメント、誘導体、ホモログまたは改変体をコードするアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を用いて評価され得る。
【０１４４】
任意の１以上の適切な標的（例えば、アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列）は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれにおいても、ＳＴＳを調節し得る因子を同定するために使用され得る。このような試験で利用される標的は、溶液中で遊離し得るか、固体支持体に固定され得るか、細胞表面上に保有され得るか、または細胞内に位置され得る。標的活性の消滅または標的と試験されている因子との間の結合複合体の形成は、測定され得る。
【０１４５】
本発明のアッセイは、スクリーンされ得、それによって、多くの因子が試験される。１つの局面において、本発明のアッセイ方法は、高スループットスクリーンである。
【０１４６】
薬物スクリーニングのための技術は、Ｇｅｙｓｅｎ，１９８４年９月１３日に発表された欧州特許出願８４／０３５６４ニ記載される方法に基づき得る。要約すると、多くの異なる小ペプチド試験化合物を固体基質（例えば、プラスチックピン）またはいくつかの他の表面上に合成する。ペプチド試験化合物を、適切な標的またはそのフラグメントと反応させ、そして洗浄する。次いで、（例えば、当該分野において周知の方法を適切に適用することによって）結合単位を検出する。精製された標的はまた、薬物スクリーニング技術における使用のためにプレートに直接コートされ得る。あるいは、非中和抗体を使用して、ペプチドを捕捉し、そして固体支持体上に固定し得る。
【０１４７】
本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を予期し、ここでは、標的に結合可能な中和抗体が、標的への結合のための試験化合物と特異的に競合する。
【０１４８】
スクリーニングのための別の技術は、キャビテーション質に対して適切な結合親和性を有する因子の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を提供し、そしてＷＯ  ８４／０３５６４に詳細に記載される方法に基づく。
【０１４９】
本発明のアッセイ方法は、試験化合物の小規模と大規模の両方のスクリーニングにとって、そして質量アッセイにおいて適切であることが予期される。
【０１５０】
１つの好ましい局面において、本発明は、ＳＴＳを選択的に調節する因子を同定する方法に関し、この化合物は、式（ｌａ）を有する。
【０１５１】
（レポーター）
種々のレポーターが、本発明のアッセイ方法（およびスクリーン）において使用され得、好ましいレポーターは、好都合なことに（例えば、分光法によって）検出可能なマーカーを提供する。例として、レポーター遺伝子は、光吸収特性を変化させる反応物を触媒する酵素をコードし得る。
【０１５２】
他のプロトコルとしては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）が挙げられる。２つの非干渉のエピトープに対するモノクローナル抗体を使用する２部位のモノクローナルベースのイムノアッセイがさらに使用され得る。これらおよび他のアッセイは、他の場所に、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒら（１９９０、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ  ＭＮ）およびＭａｄｄｏｘ  ＤＥら（１９８３、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５：８：１２１  １）に記載される。
【０１５３】
レポーター分子の例としては、（β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、（−グルクロニダーゼ、エキソ−グルカナーゼおよびグルコアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、放射標識されるかまたは蛍光タグ標識されたヌクレオチドは、発生器の転写物に取り込まれ得、これは、次いで、オリゴヌクレオチドプローブに結合する場合に、同定される。
【０１５４】
さらなる実施例によって、多くの会社（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）は、市販のキットおよびアッセイの手順のためのプロトコルを提供する。適切なレポーター分子または標識としては、放射線核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色性因子および基質、補因子、インヒビター、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する米国特許としては、ＵＳ−Ａ−３８１７８３７；ＵＳ−Ａ−３８５０７５２；ＵＳ−Ａ−３９３９３５０：ＵＳ−Ａ−３９９６３４５；ＵＳ−Ａ−４２７７４３７：ＵＳ−Ａ−４２７５１４９およびＵＳ−Ａ−４３６６２４１が挙げられる。
【０１５５】
（宿主細胞）
本発明に関して、用語「宿主細胞」は、本発明の因子に対する標的を含み得る任意の細胞を含む。
【０１５６】
従って、本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的であるかまたは本発明の標的を発現するポリヌクレオチドで形質転換されるか、あるいはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。好ましくは、このポリヌクレオチドは、標的であるかまたは標的を発現するポリヌクレオチドの複製および発現のために、ベクター内に運ばれる。細胞は、このベクターと適合可能であるように選択され、そして例えば、原核生物（例えば、細菌）細胞、真菌細胞、酵母細胞、または植物細胞であり得る。
【０１５７】
グラム陰性細菌Ｅ．ｃｏｌｉは、異種遺伝子発現のための宿主として広く使用される。しかし、大量の異種タンパク質は、細胞内に蓄積する傾向がある。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内タンパク質バルクからの所望のタンパク質の引き続いての精製は、時々、困難であり得る。
【０１５８】
Ｅ．ｃｏｌｉと対照的に、バチルス属からの細菌は、培養培地へタンパク質を分泌するそれらの能力のため、異種宿主として非常に適切である。宿主として適切な他の細菌は、ストレプトミセス属およびシュードモナス属からの細菌である。
【０１５９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの性質、および／または発現されたタンパク質のさらなるプロセシングのための望ましさに依存して、真核生物宿主（例えば、酵母または他の真菌）が好ましくあり得る。通常、酵母細胞は、操作がより容易なので、真菌細胞以上に好ましい。しかし、いくつかのタンパク質は、酵母細胞からは少ししか分泌されないか、またはいくつかの場合は、適切にプロセシングされない（例えば、酵母における過剰グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）かのいずれかである。これらの場合、異なる真菌宿主生物が選択されるべきである。
【０１６０】
本発明の範囲内の適切な発現宿主の例としては、真菌（例えば、アスペルギルス種（例えば、ＥＰ−Ａ−０１８４４３８およびＥＰ−Ａ−０２８４６０３に記載されるようなもの）ならびにトリコデルマ種）；細菌（例えば、バチルス種（例えば、ＥＰ−Ａ−０１３４０４８およびＥＰ−Ａ−０２５３４５５に記載されるようなもの））；ストレプトミセス種およびシュードモナス種；ならびに酵母（例えば、クリュベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種（例えば、ＥＰ−Ａ−００９６４３０およびＥＰ−Ａ−０３０１６７０に記載されるようなもの））ならびにサッカロミセス種が挙げられる。例として、代表的な発現宿主は、Ａｓｐｅｒｇｕｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｕｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｖｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｄｉａｅから選択され得る。
【０１６１】
適切な宿主の使用（例えば、酵母宿主細胞、真菌宿主細胞、および植物宿主細胞）は、本発明の組換え発現産物において最適な生物学的活性を与えるのに必要とされ得るように、翻訳後の改変（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、切断、脂質化およびチロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化）を提供し得る。
【０１６２】
（生物）
本発明に関して、用語「生物」は、本発明に従う標的および／またはその生物から得られる産物を含み得る任意の生物を含む。生物の例としては、真菌、酵母、または植物が挙げられ得る。
【０１６３】
本発明に関して、用語「トランスジェニック生物」は、本発明に従う標的および／または得られた産物を含む任意の生物を含む。
【０１６４】
（宿主細胞／宿主生物の形質転換）
最初に示されるように、宿主生物は、原核生物または真核生物であり得る。適切な原核生物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。原核細胞宿主の形質転換に関する教示は、当該分野においてよく実証されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。原核生物宿主が使用され、次いで、ヌクレオチド配列は、形質転換前に、（例えば、イントロンの除去によって）適切に改変されることが必要とし得る。
【０１６５】
別の実施形態において、トランスジェニック生物は酵母であり得る。この点に関して、酵母はまた、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして広く用いられている。Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種は、工業利用に関して長い歴史を持ち、異種遺伝子発現のための使用が挙げられる。Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの異種遺伝子の発現については、Ｇｏｏｄｅｙら（１９８７、Ｙｅａｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｒ．Ｂｅｒｒｙら編、４０１〜４２９頁、Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｕｎｗｉｎ、Ｌｏｎｄｏｎ）およびＫｉｎｇら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ、Ｅ．Ｆ．ＷａｌｔｏｎおよびＧ．Ｔ．Ｙａｒｒｏｎｔｏｎ編、１０７〜１３３頁、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｇｌａｓｇｏｗ）により総説される。
【０１６６】
種々の理由から、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、異種遺伝子発現に十分適切である。第１に、ヒトに対して非病原性であり、そして特定の内毒素を産生し得ない。第２に、種々の目的のための商業面での開発の後数世紀にわたる、安全な使用に関する長い歴史を持つ。これにより幅広い公衆の承認が得られた。第３に、この生物に向けられた幅広い商業的な使用および研究により、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝学および生理学、ならびにラージスケールの発酵の特徴付けについての見識の蓄積が得られた。
【０１６７】
Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の原理についての総説は、Ｅ．Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ．Ｋｅｎｎｙ（１９９３、「Ｙｅａｓｔ  ａｓ  ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ」、Ｙｅａｓｔｓ、第５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｈ．ＲｏｓｅおよびＪ．Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）により与えられる。
【０１６８】
種々のタイプの酵母ベクターが利用可能であり、組込みベクター（これらを維持するために宿主ゲノムとの組換えを要求するベクター）、および自律的に複製するプラスミドベクターが挙げられる。
【０１６９】
トランスジェニックＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓを調製するために、酵母で発現するよう設計された構築物にヌクレオチド配列を挿入することにより、発現構築物が調製される。異種発現に用いられる種々のタイプの構築物が開発されてきた。ヌクレオチド配列と融合される酵母において、プロモーター活性を含む構築物（通常は、ＧＡＬ１プロモーターのような酵母起源のプロモーター）が用いられる。通常、酵母起源のシグナル配列（例えば、ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列）が用いられる。酵母においてターミネーター活性は、発現系を終了させる。
【０１７０】
酵母の形質転換に関して、種々の形質転換プロトコルが開発されてきた。例えば、本発明に基づくトランスジェニックＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ７５、１９２９）；Ｂｅｇｇｓ、ＪＤ（１９７８、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、２７５、１０４）；およびＩｔｏ、Ｈら（１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３、１６３−１６８）の教示に従い調製され得る。
【０１７１】
形質転換された酵母細胞は、種々の選択マーカーを用いて選択される。形質転換に使用されるマーカーの中には、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、およびＴＲＰ１のような多くの栄養要求性マーカー、およびアミノグリコシド抗生物質マーカー（例えば、Ｇ４１８）のような多くの優性抗生物質耐性マーカーがある。
【０１７２】
別の宿主生物は植物である。遺伝的に改変された植物の構築における基本的な原理は、植物ゲノムに遺伝子情報を挿入し、挿入された遺伝的物質の安定な保持を獲得することである。遺伝子情報を挿入することに関して種々の技術が存在し、主な２つの原理は、遺伝子情報を直接導入することおよびベクター系を用いて遺伝子情報を導入することである。一般的な技術の総説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５−２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７−２７）の論文に見出され得る。植物の形質転換に関するさらなる教示はＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出され得る。
【０１７３】
したがって、本発明はまた、標的となるかまたは標的を発現するヌクレオチド配列を用いて宿主細胞を形質転換する方法を提供する。このヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされるタンパク質の発現に適切な条件下で培養され得る。組換え細胞により産生されるタンパク質は、細胞の表面に提示され得る。所望の場合および当業者に理解されるように、コード配列を含む発現ベクターは、特定の原核生物または真核生物の細胞膜を通じてコード配列が分泌させるようシグナル配列を含んで設計され得る。他の組換え構築物は、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にコード配列を連結し得る（Ｋｒｏｌｌ  Ｄ．Ｊ．（１９９３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３）。
【０１７４】
（改変体／相同体／誘導体）
本明細書中で言及される特定のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列に加えて、本発明はまた、これらの改変体、相同体、および誘導体の使用を包含する。本明細書において用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と同一視され得る。
【０１７５】
本明細書での関係において、相同な配列は、少なくとも７５、８５または９０％同一（好ましくは少なくとも９５または９８％同一）であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。相同性はまた、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）ともみなされ得るが、本発明の関係において、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。
【０１７６】
相同性の比較は、目視により、またはより通常には容易に利用可能な配列比較プログラムの補助により行なわれ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは２つ以上の間の相同性（％）を計算し得る。
【０１７７】
相同性（％）は、連続した配列全体で計算され得る。すなわち、ある配列が他の配列と並べられ、そしてある配列中のそれぞれのアミノ酸が、一度に１つの残基ずつ、他の配列中の対応するアミノ酸と直接的に比較される。これは、「アンギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。代表的に、このようなアンギャップアラインメントは、比較的少ない残基数にわたる場合のみに実施される。
【０１７８】
これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、別の同一性の対の配列において、１つの挿入または欠失が、次のアミノ酸残基のアラインメントを出される原因になり、したがって潜在的に、全体のアラインメントが実施された場合、大きな相同性（％）の減少を引き起こすことが考慮されない。したがって、たいていの配列比較方法は、過度に全体的な相同性のスコアを悪くすることなく可能性のある挿入および欠失を考慮に入れた最適なアラインメントを生じるよう設計される。このことは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入し、局部的な相同性を最大限に活用する試みをすることにより達成される。
【０１７９】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントで起こるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当て、その結果、同じ数の同一アミノ酸に関して、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメント（これにより、２つの比較される配列間のより高い関連性が反映される）が、多くのギャップを有するアラインメントよりも高いスコアを達成する。「アファインギャップコスト（Ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ）」は代表的に、ギャップの存在およびギャップ中の引き続く残基それぞれに対するより小さいペナルティーの存在について比較的高いコストを要求するよう用いられる。これは、最も共通して用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを生じる。たいていのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーが変更されることを可能にする。しかし、このような配列比較のためのソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照のこと）を用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−１２であり、そしてそれぞれの伸長に対して−４である。
【０１８０】
したがって、最大相同性（％）の計算には、ギャップペナルティーを考慮に入れた最適アラインメントの生成が第１に必要とされる。このようなアラインメントを実施するのに適切なコンピュータプログラムは，ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）。配列比較を実行し得る、それ以外のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９同書、１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３−４１０）および比較ツールの中のＧＥＮＥＷＯＲＫＳパッケージソフトが挙げられるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはオフラインおよびオンライン調査に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９同書、７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかしＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いることが好ましい。
【０１８１】
さらなる有用な参考文献が、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  Ｍａｙ  １５：１７４（２）：２４７−５０（そして公開された誤記が、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  Ａｕｇ  １：１７７（１）：１８７−８で明らかにされている）に見出される。
【０１８２】
最終的な相同性（％）は、同一性に関して測定されるが、アラインメントのプロセス自体は、代表的にオールオアナッシングの対の比較に依存されない。その代わり、測定される類似性スコアマトリクスが、化学的な類似性または進化の面での距離に基づくそれぞれの対の比較にスコアを割り当てるのに一般的に用いられる。このような共通して用いられるマトリクスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（ＢＬＡＳＴパッケージソフトのプログラムのデフォルトマトリクス）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的に公開されているデフォルト値かまたは提供される場合は自前のシンボル比較テーブルのいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージについては公開されているデフォルト値を使用することが好ましい。他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリクスを用いることが好ましい。
【０１８３】
いったんソフトウェアが最適なアラインメントを生じた場合、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）が計算されることが可能である。このソフトウェアは代表的に、これを配列比較の一部として行い、そして実数の結果を生じる。
【０１８４】
配列はまたは、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し、これは静的な変化を生じ、そして機能的に等価な物質を生じる。物質の二次的な結合活性が保持される限り、意図的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてなされ得る。例えば、陰性に荷電したアミノ酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；陽性に荷電したアミノ酸としてリジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する荷電していない極性の先端基を持つアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０１８５】
保存性置換が、例えば、以下の表に従ってなされ得る。２番目のカラムの同じブロックのアミノ酸、そして好ましくは３番目のカラムの同じ列のアミノ酸は、互いに置換され得る。
【０１８６】
【表１】
0004931312.tif 000005
（発現ベクター）
標的として使用されるヌクレオチド配列または標的を発現するヌクレオチド配列は、組換え複製可能ベクターに組み込まれ得る。ベクターを用いて、適合可能な宿主細胞内で、および／または宿主細胞からヌクレオチド配列を複製し、発現し得る。発現は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む制御配列を用いて制御され得る。原核生物プロモーターおよび真核生物細胞中で機能するプロモーターが用いられ得る。組織特異的または刺激特異的なプロモーターが用いられ得る。上記の２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターもまた用いられ得る。
【０１８７】
ヌクレオチド配列の発現により宿主の組換え細胞によって産生されるタンパク質は、用いられる配列および／またはベクターに依存して分泌され得るか、または細胞内に含有され得る。コード配列は、特定の原核生物または真核生物の細胞膜を通じて物質コード配列が分泌されるようシグナル配列を含んで設計され得る。
【０１８８】
（融合タンパク質）
標的アミノ酸配列は、例えば、抽出および精製を補助するために融合タンパク質として産生され得る。融合タンパク質のパートナーの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）および（−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、融合タンパク質のパートナーと目的のタンパク質との間にタンパク質分解性切断部位を含むこともまた、便宜的であり得る。好ましくは融合タンパク質は、標的の活性を妨害しない。
【０１８９】
融合タンパク質は、本発明の物質に融合された抗原または抗原決定基を含み得る。この実施形態において、融合タンパク質は、免疫系の汎用の刺激を提供する意味でアジュバンドとして作用し得る物質を含む、天然に存在しない融合タンパク質であり得る。抗原または抗原決定基は、物質のアミノ末端かまたはカルボキシ末端のいずれかに取り付けられ得る。
【０１９０】
本発明の別の実施形態において、アミノ酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、この物質の活性に影響を与え得る薬剤に対するペプチドライブラリーのスクリーニングに関して、市販の抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることは有用であり得る。
【０１９１】
（治療）
本発明の化合物は、治療剤として、すなわち治療適用に使用され得る。
【０１９２】
用語「治療」は、治癒効果、緩和効果、および予防効果を含む。
【０１９３】
治療は、ヒトまたは動物に対してであり得、好ましくは雌性動物である。
【０１９４】
（薬学的組成物）
１つの局面において、本発明は、薬学的組成物を提供し、この薬学的組成物は、本発明に従う化合物、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤（これらの組み合わせを含む）を含む。
【０１９５】
薬学的組成物は、ヒトの医薬および獣医の医薬におけるヒト用法または動物用法のためであり得、代表的には、任意の１つ以上の薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤を含む。治療用途のための受容可能なキャリアまたは希釈剤は、薬学分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載される。薬学的キャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬学的な実施に関して、選択され得る。薬学的組成物は、キャリア、賦形剤、もしくは希釈剤としてかまたはこれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。
【０１９６】
保存剤、安定剤、色素さらに香味剤が、この薬学的組成物中に提供され得る。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤および懸濁剤がまた、使用され得る。
【０１９７】
異なる送達系に依存した異なる組成物／処方物の要求が存在し得る。例として、本発明の薬学的組成物は、処方されて、ミニポンプを用いてかまたは粘膜経路によって（例えば、吸入のための経鼻スプレーもしくはエーロゾルまたは摂取可能溶液として）送達され得るか、または組成物が送達（例えば、静脈内経路によるか、筋内経路によるか、または皮下経路による）のために注射可能な形態で処方される非経口送達される。
【０１９８】
薬剤が胃腸粘膜を介して粘膜送達される場合、この薬剤は、胃腸管を通した通過の間に安定なままであり得るべきであり；例えば、この薬剤は、タンパク質分解性の分解に対して耐性であり、酸性ｐＨにおいて安定であり、そして胆汁の浄化効果に対して耐性であるべきである。
【０１９９】
適切な場合、薬学的組成物は、坐剤またはペッサリーの形態で吸入によって、ローション、溶液、クリーム、軟膏もしくは粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用によって、デンプンもしくはラクトースのような賦形剤を含む錠剤の形態で経口的に、または単独もしくは賦形剤との混合のいずれかでのカプセルもしくは卵で、または香味剤もしくは着色剤を含むエリキシル、溶液または懸濁剤の形態で投与され得るか、あるいは、これらは、非経口的に、例えば、静脈内的、筋内的または皮下的に注射され得る。非経口投与に関して、この組成物は、滅菌水溶液の形態で最良に使用され得、この滅菌水溶液は、他の物質、例えば、血液とのこの溶液の等張性を作るための十分な塩または単糖を含み得る。頬側投与または舌下投与に関して、この組成物は、従来様式で処方され得る錠剤またはトローチ剤の形態で投与され得る。
【０２００】
（組合わせ医薬）
本発明の化合物は、１つ以上の他の活性な薬剤（例えば、１つ以上の他の薬学的に活性な薬剤）と組合わせて使用され得る。
【０２０１】
例として、本発明の化合物は、他のＳＴＳインヒビターおよび／または他のインヒビター、例えば、アロマターゼインヒビター（例えば、４ヒドロキシアンドロステンジオン（４−ＯＨＡ））および／またはステロイド（例えば、天然に存在するステルニューロステロイド（ｓｔｅｒｎｅｕｒｏｓｔｅｒｏｉｄ）デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡＳ）およびプレグネノロンサルフェート（ＰＳ）および／または他の構造的に類似した有機化合物）と組合わせて使用され得る。
【０２０２】
さらに、または代替的に、本発明の化合物は、生物学的応答の修飾因子と組合わせて使用され得る。
【０２０３】
用語、生物学的応答の修飾因子（「ＢＲＭ」）としては、サイトカイン、免疫調節因子、増殖因子、造血調節因子、コロニー刺激因子、走化性因子、溶血因子および血栓溶解因子、細胞表面レセプター、リガンド、白血球接着分子、モノクローナル抗体、予防ワクチンおよび治療ワクチン、ホルモン、細胞外マトリックス成分、フィブロネクチンなどが挙げられる。いくつかの適応において、好ましくは、生物学的応答の修飾因子は、サイトカインである。サイトカインの例としては、以下：インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１９）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦ−α）；インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ；ＴＧＦ−βが挙げられる。いくつかの適用において、好ましくは、サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。いくつかの適用においてＴＮＦは、任意の型のＴＮＦ、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（これらの誘導体または混合物を含む）であり得る。より好ましくは、サイトカインは、ＴＮＦ−αである。ＴＮＦに関する教示は、当該分野で見出され得る（例えば、ＷＯ−Ａ−９８／０８８７０およびＷＯ−Ａ−９８／１３３４８）。
【０２０４】
（投与）
代表的に、医師は、個々の被験体に対して最も適切である実際の投薬量を決定し、そしてこの投薬量は、特定の患者の年齢、体重および応答によって変化する。より低い投薬量が、平均の場合の典型である。当然、より高いまたはより低い投薬量範囲が正当である個々の例があり得る。
【０２０５】
本発明の組成物は、直接注射によって投与され得る。この組成物は、非経口投与、粘膜投与、筋内投与、静脈内投与、皮下投与、眼球内投与、または経皮投与のために処方され得る。必要性に依存して、薬剤は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量（例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量）で投与され得る。
【０２０６】
さらなる例として、本発明の薬剤は、一日あたり１〜４回、好ましくは１日あたり１回または２回のレジメンに従って投与され得る。任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投薬頻度は、変動し得、そして種々の因子（使用される特定の化合物の活性、この化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与形式および時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、および治療を受ける宿主を含む）に依存する。
【０２０７】
代表的な送達様式（上記に示される）は別として、用語「投与」はまた、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性フェイシャル両親媒性物（ＣＦＡ）およびこれらの組み合わせのような技術による送達を含む。このような送達機構のための経路としては、粘膜経路、鼻経経路、口腔経路、非経口経路、胃腸経路、局所経路、または舌下経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
用語「投与された」は、粘膜経路（例えば、吸入のための経鼻スプレーもしくはエーロゾルまたは摂取可能な溶液として）；送達が注射可能な形態による非経口経路（例えば、静脈経路、筋内経路または皮下経路）による送達が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
従って、薬学的投与に関して、本発明のＳＴＳインヒビターは、従来の薬学的処方技術ならびに薬学的キャリア、アジュバント、賦形剤、希釈剤などを用いて任意の適切な様式で、通常非経口投与のために、処方され得る。おおよその有効用量の割合は、１〜１０００ｍｇ／日、例えば、１０〜９００ｍｇ／日またはさらに１００〜８００ｍｇ／日の範囲であり得、問題の化合物の個々の活性に依存し、そしてこれは、平均体重（７０Ｋｇ）の患者に対してである。好ましくそしてより活性である化合物に関する、より有用な投薬量の割合は、２００〜８００ｍｇ／日、より好ましくは２００〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは２００〜２５０ｍｇ／日の範囲である。これらは、単一投薬レジメンで提供され得、余剰の投薬レジメンおよび／または複数の投薬レジメンが、数日間にわたって続く。経口投与に関して、これらは、単一用量あたり１００〜５００ｍｇの化合物を含む錠剤、カプセル、溶液または懸濁液で処方され得る。あるいは、および好ましくは、この化合物は、適切な非経口的に投与可能なキャリア中に、非経口投与のために処方され、そして２００〜８００ｍｇ、好ましくは２００〜５００ｍｇ、より好ましくは２００〜２５０ｍｇの範囲の単一日投薬量の割合を提供する。しかし、このような有効日用量は、活性成分の本来の活性、患者の体重に依存して変動し、このような変動は、当該分野および医師の判断の範囲内である。
【０２１０】
（細胞周期）
本発明の化合物は、細胞周期障害の処置方法において有用であり得る。
【０２１１】
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第３版、Ｌｏｄｉｓｈら、１７７−１８１頁に考察されるように、異なる真核生物細胞は、非常に異なる速度で増殖し、そして分裂し得る。例えば、酵母細胞は、１２０分毎に分裂し、そしてウニおよび昆虫の胚細胞における受精卵の最初の分裂は、１５３０分しかかからない。なぜなら、１つの大きな既存細胞が、再分されるからである。しかし、最も成長している植物細胞および動物細胞は、数が２倍になるのに１０〜２０時間かかり、そしていくらかの複製物はよりゆっくりとして速度である。成体の多くの細胞（例えば、神経細胞および横紋筋細胞）は、すこしも分裂せず；創傷治癒を補助する線維芽細胞のような他の細胞は、要求に応じて増殖するが、さもなければ休止している。
【０２１２】
さらに、分裂する全ての真核生物細胞は、２つの娘細胞に均等に遺伝物質を提供する用意がなければならない。真核生物におけるＤＮＡ合成は、細胞分裂周期中、常には生じないが、細胞分裂前の一部に制限される。
【０２１３】
真核生物ＤＮＡ合成と細胞分裂との間の関連性は、哺乳動物細胞（これらは全て増殖および分裂し得た）の培養において徹底的に分析されている。細菌と対照的に、真核生物細胞は、ＤＮＡ合成においてその時間の一部のみを費やし、そして細胞分裂（有糸分裂）の前の時間に完了することが見出された。従って、時間のギャップが、ＤＮＡ合成後および細胞分裂前に生じ；別のギャップが、分裂後および次の回のＤＮＡ合成前に生じることが見出された。この分析は、真核生物細胞周期が、Ｍ（有糸分裂）期、Ｇ１期（最初のギャップ）、Ｓ期（ＤＮＡ合成）期、Ｇ２期（第２のギャップ）からなり、そしてＭに戻るという結論を導いた。有糸分裂間の期（Ｇ１、Ｓ、およびＧ２）は、集合的に間期として知られる。
【０２１４】
組織中の多くの非分裂細胞（例えば、全ての休止線維芽細胞）は、有糸分裂後およびＤＮＡ合成のちょうど前に周期を停止し；このような「休止」細胞は、細胞周期から外され（ｅｘｉｔｅ）そしてＧ０状態にあるといわれる。
【０２１５】
細胞が細胞周期の３つの間期のうちの１つにある場合、この細胞の相対的なＤＮＡ含量を測定する蛍光活性化細胞分類器（ＦＡＣＳ）を使用することによって、この細胞を同定することは可能であり；Ｇ１（ＤＮＡ合成前）にある細胞は、規定された量ｘのＤＮＡを有し；Ｓ（ＤＮＡ複製）の間、細胞はｘと２ｘとの間を有し；そしてＧ２（またはＭ）にある場合、細胞は、２ｘのＤＮＡを有する。
【０２１６】
動物細胞における有糸分裂および細胞質分裂の段階は、以下の通りである。
【０２１７】
（（ａ）間期）  間期のＧ２期は、有糸分裂開始の直前である。染色体ＤＮＡは、Ｓ期の間に複製され、そしてタンパク質に結合されるが、染色体はまだ、明確な構造として観察されない。核小体が、光学顕微鏡の下で可視的な唯一の核下部構造である。二倍体細胞では、ＤＮＡ複製前に、各型の２つの形態学的な染色体が存在し、そしてこの細胞は、２ｎであると言われる。Ｇ２では、ＤＮＡ複製後、細胞は４ｎである。４コピーの各染色体ＤＮＡが存在する。これらの姉妹染色体はまだ、互いから分離されていないので、これらは姉妹染色分体と呼ばれる。
【０２１８】
（（ｂ）前期の初期）  中心小体（各々が、新たに形成された娘中心小体を有する）は、細胞の対極への移動を開始させる；染色体は、長い糸として観察され得る。核膜が、小胞へと脱凝集し始める。
【０２１９】
（（ｃ）前期の中期および後期）  染色体凝縮が完了する；各々の可視的な染色体構造は、それらの動原体において互いに保持された２つの染色分体からなる。各染色分体は、２つの新たに複製された娘ＤＮＡ分子のうちの１つを含む。微小管紡錘体は、中心小体に隣接した領域から放射状に伸び始め、これらは、それらの極により近づくように移動する。いくつかの紡錘体線維は、極から極へ達する；大半は、染色分体に移動し、そして動原体で付着する。
【０２２０】
（（ｄ）中期）  染色体は、細胞の赤道の方へと移動し、ここでそれらは、赤道面に整列されるようになる。この姉妹染色分体は、まだ分離されない。
【０２２１】
（（ｅ）後期）  ２つの姉妹染色分体が、個々の染色体に分離する。各々は、それらが移動した１つの極への紡錘体線維に結合された動原体を含む。従って、各染色体の１コピーが、各娘細胞に与えられる。同時に、細胞は、極−極紡錘体と同じように、伸長する。細胞質分裂は、分割溝が形成され始めるにつれて開始される。
【０２２２】
（（ｆ）終期）  新しい膜が、娘核の周囲に形成される；染色体は解かれ、そして明確性がより低くなり、核小体が再び可視的になり、そして核膜が、各娘核の周囲に形成される。細胞質分裂が、ほぼ完了し、そして紡錘体は、微小管および他の線維が解重合するにつれて消滅する。有糸分裂全体を通して、各極の「娘」中心小体は、それが全長になるまで伸長する。終期に、元々の中心小体の各々の複製が完了し、そして新しい娘中心小体が、次の間期の間に生成される。
【０２２３】
（（ｇ）間期）  細胞質分裂の完了時に、細胞は、細胞周期のＧ１期に入り、そして再度、この周期を進行する。
【０２２４】
細胞周期運動が、極めて重要な細胞プロセスであることが理解される。正常な細胞周期運動からの逸脱が、多くの医学的障害を生じさせ得る。増加したおよび／または無制限の細胞周期運動が、癌を生じ得る。細胞周期運動の減少は、変性状態を生じ得る。本発明の化合物を使用することによって、このような障害および状態を処置するための手段が提供され得る。
【０２２５】
従って、本発明の化合物は、癌（ホルモン依存性およびホルモン非依存性の癌を含む）のような細胞周期運動障害の処置における使用に適切であり得る。
【０２２６】
さらに、本発明の化合物は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肉腫、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌などのような癌、および他の固形腫瘍の処置に適切であり得る。
【０２２７】
いくつかの適用について、細胞周期運動は、阻害されるか、および／または妨げられるか、および／または阻止され、好ましくはここで、細胞周期運動は、妨げられるか、および／または阻止される。１つの局面では、細胞周期運動は、Ｇ２／Ｍ期において、阻害され得るか、および／または妨げられ得るか、および／または阻止され得る。１つの局面では、細胞周期運動は、不可逆的に、阻害され得るか、および／または妨げられ得るか、および／または阻止され得、好ましくは、細胞周期運動は、不可逆的に、妨げられるか、および／または阻止される。
【０２２８】
用語「不可逆的に、防止されるか、および／または阻害されるか、および／または阻止される」とは、本発明の化合物の適用後に、この化合物を除去した際に、この化合物の効果（すなわち、細胞周期運動の防止、および／または阻害、および／または阻止）がなお観察可能であることを意味する。より詳細には、用語「不可逆的に、防止されるか、および／または阻害されるか、および／または阻止される」とは、本明細書中に提供される細胞周期運動アッセイプロトコルに従ってアッセイされた場合に、目的の化合物で処理された細胞が、コントロール細胞よりも、プロトコルＩのステージ２の後に、より低い増殖を示すことを意味する。このプロトコルの詳細を、以下に示す。
【０２２９】
従って、本発明は、以下の化合物を提供する：細胞周期運動を妨げ、および／または阻害し、および／または阻止することによって、インビトロにおいて、エストロゲンレセプターポジティブ（ＥＲ＋）およびＥＲネガティブ（ＥＲ−）乳癌細胞の増殖阻害を引き起こす；および／またはインタクトな動物（すなわち、卵巣摘出されていない）において、ニトロソ−メチル尿素（ＮＭＵ）誘導性乳房腫瘍の後退を引き起こし、および／または癌細胞における細胞周期運動を妨げ、および／または阻害し、および／または阻止し；および／または細胞周期運動を妨げ、および／または阻害し、および／または阻止することによってインビボで作用し、および／または細胞周期運動アゴニストとして作用する、化合物。
【０２３０】
（細胞周期運動アッセイ（プロトコル６））
（手順）
（ステージ１）
ＭＣＦ−７乳癌細胞を、１０５細胞／ウェルの密度で、マルチウェル培養プレートに播種する。細胞を付着させ、そしてそれらの細胞を以下のように処理した場合に約３０％コンフルエントとなるまで増殖させた。
【０２３１】
（コントロール−未処理）
（目的の化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＣＯＩ）２０μＭ）
細胞を、ＣＯＩを含む増殖培地中において６日間増殖させる（培地／ＣＯＩの交換は、３日毎）。この期間の終了時に、細胞数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞計数器を使用して計数した。
【０２３２】
（ステージ２）
６日間のＣＯＩでの細胞処理後、細胞を、１０４細胞／ウェルの密度で再播種する。いかなるさらなる処理も付加しない。細胞を、増殖培地の存在下でさらに６日間増殖させ続ける。この期間の終了時に、再度、細胞数を計数する。
【０２３３】
（癌）
示されたように、本発明の化合物は、細胞周期運動障害の処置において有用であり得る。特定の細胞周期運動障害が、癌である。
【０２３４】
癌は、依然として大半の西洋諸国における死亡率の主因である。これまでに開発された癌療法は、ホルモン依存性腫瘍の増殖を阻害するためにホルモンの作用または合成をブロックすることを含んだ。しかし、より攻撃的な化学療法が、ホルモン非依存性腫瘍の処置のために現在では使用されている。
【０２３５】
従って、化学療法に付随する、いくらかまたはすべての副作用を欠くが、ホルモン依存性および／またはホルモン非依存性の腫瘍を抗癌処置する医薬の開発は、治療上の主たる進歩を示す。
【０２３６】
エストロゲンは、その合成後に、多くのヒドロキシル化および結合体化反応を受けることが公知である。近年まで、このような反応は、代謝プロセスの部分であり、このプロセスが究極的に、エストロゲンを水溶性にさせ、そして身体からのそれらの除去を増強させると考えられていた。現在では、いくつかのヒドロキシ代謝産物（例えば、２−ヒドロキシおよび１６α−ヒドロキシ）および結合体（例えば、硫酸エストロン、Ｅ１Ｓ）が、エストロゲンが身体内で有する複雑な作用のいくつかを決定するにおいて重要であることが明らかである。
【０２３７】
研究者らは、乳癌の危険性を改変する状態に関連した２−および１６−ヒドロキシル化エストロゲンの形成を研究してきた。現在では、２−ヒドロキシラーゼ活性を増加させる因子が、癌の危険性の減少と関連するが、１６α−ヒドロキシル化を増加させる因子は、乳癌の危険性を増強し得るという証拠が存在する。エストロゲン代謝産物の生物学的役割に関するさらなる関心は、２−メトキシエストラジオールが、抗有糸分裂特性を有する内因性代謝産物であるという増大する多数の証拠によって刺激された。２−ＭｅＯＥ２は、カテコールエストロゲンメチルトランスフェラーゼ（全身にわたって広範に分布している酵素）によって２−ヒドロキシエストラジオール（２−ＯＨＥ２）から形成される。
【０２３８】
研究者らは、インビボにおいて、２−ＭｅＯＥ２が、Ｍｅｔｈ  Ａ肉腫、Ｂ１６黒色腫、またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５エストロゲンレセプターネガティブ（ＥＲ−）乳癌細胞の皮下注射から生じる腫瘍の増殖を阻害することを示してきた。これはまた、内皮細胞の増殖および移動、ならびにインビトロでの新脈管形成を阻害する。２−ＭｅＯＥ２がインビボで腫瘍増殖を阻害する能力は、腫瘍細胞増殖の直接的な阻害ではなく、腫瘍誘導性の新脈管形成を阻害するその能力に起因し得ることが示唆された。
【０２３９】
２−ＭｅＯＥ２が、その強力な抗マイトジェン作用および抗脈管形成作用を発揮する機構は、依然として解明されていない。高濃度で、それらが微小管重合化を阻害し得、そしてチューブリンに結合するコルヒチンの弱いインヒビターとして作用するという証拠が存在する。しかし、近年、有糸分裂をブロックする濃度で、細胞中のチューブリン糸状構造が、解重合されるのではなく、タキソール処置後に見出される形態と同一の形態を有することが見出された。従って、タキソール（乳癌および卵巣乳癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）の治療に使用される薬物）と同様に、２−ＭｅＯＥ２が、微小管の動力学を安定化させることによって作用する可能性がある。
【０２４０】
新たな癌治療としての２−ＭｅＯＥ２の同定は、重要な進歩を表すが、経口的に投与されたエストロゲンのバイオアベイラビリティは貧弱である。さらに、これらは、それらがまず肝臓を通過する間に、広範な代謝を受け得る。乳癌治療のためのステロイド性スルファターゼインヒビターを開発するための研究プログラムの一部として、エストロン−３−Ｏ−スルファメート（ＥＭＡＴＥ）が、強力で活性な部位特異的インヒビターとして同定された。予想外に、ＥＭＡＴＥは、強力なエストロゲン特性を有することが証明された。ラットにおけるその経口的子宮作用性活性は、エストラジオールの活性よりも１００倍高い。その増強されたエストロゲン性（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）は、その肝臓通過の間の不活性化から防御し、かつその延長した期間のその緩徐な放出のためのレザーバとして作用する赤血球（ｒｂｃｓ）によるその吸着から生じると考えられる。多くのＡ−環改変アナログ（２−メトキシエストロン−３−Ｏ−スルファメートを含む）が、合成され、そして試験された。この化合物は、ステロイド性スルファターゼインヒビターとしてＥＭＡＴＥとして等価であったが、これは、エストロゲン性を欠く。
【０２４１】
本発明者らは、本発明の化合物が、癌、そして特に乳癌の処置のための手段を提供すると考える。
【０２４２】
さらに、または代替的に、本発明の化合物は、癌（白血病を含む）および固形腫瘍（例えば、乳房、子宮内膜、前立腺、卵巣および膵臓の腫瘍）の増殖のブロックにおいて有用であり得る。
【０２４３】
（エストロゲンに関する治療）
本発明者らは、本発明の化合物のいくつかが、身体（特に、雌性における）においてエストロゲンレベルを制御するにおいて有用であり得ると考える。従って、この化合物のいくつかは、受胎能制御手段（例えば、経口避妊錠剤、丸剤、溶液、またはロゼンジ）を提供するとして有用であり得る。あるいは、この化合物は、インプラントまたはパッチとしての形態であり得る。
【０２４４】
従って、本発明の化合物は、エストロゲンに関連したホルモン状態を処置するにおいて有用であり得る。
【０２４５】
さらに、または代替的に、本発明の化合物は、エストロゲンに関連したホルモン状態以外に、ホルモン状態を処置するにおいて有用であり得る。従って、本発明の化合物はまた、ホルモン活性に影響を及ぼし得、そしてまた、免疫応答に影響を及ぼし得る。
【０２４６】
（神経変性性疾患）
本発明の化合物のいくつかは、神経変性性疾患、および類似の状態の処置に有用であり得ると考えられる。
【０２４７】
例えば、ＳＴＳインヒビターは、健忘、頭部傷害、アルツハイマー病、癲癇性痴呆、初老期痴呆、外傷後痴呆、老人性痴呆、血管性痴呆、および脳卒中後痴呆のような病態に罹患した患者、またはさもなければ記憶強化が望ましい個体の記憶機能を強化するのに有用であり得る。
【０２４８】
（ＴＨ１）
本発明者らは、本発明の化合物のいくつかがＴＨ１の意味において有用であり得ると考えている。
【０２４９】
例えば、マクロファージまたは他の抗原提示細胞内のＳＴＳインヒビターの存在は、感作されたＴ細胞がＴＨ１（高ＩＬ−２、ＩＦＮ  低ＩＬ−４）応答を増大する能力を減少させ得る。従って、他のステロイド（例えば、グルココルチコイド）の正常な調節性の影響は優勢である。
【０２５０】
（炎症性状態）
本発明者らは、本発明の化合物のいくつかが、以下のいずれか１つ以上と関連する状態のような、炎症性状態を処置するのに有用であり得ると考えている：自己免疫（例えば、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病、全身エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、甲状腺炎、血管炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、皮膚障害（例えば、乾癬および接触性皮膚炎）；移植片対宿主病；湿疹；喘息および移植後の器官拒絶。
【０２５１】
例えば、ＳＴＳインヒビターは、免疫応答および／または炎症性反応に対するＤＨＥＡまたは関連のステロイドの正常な生理学的効果を妨げ得る。
【０２５２】
本発明の化合物は、内因性グルココルチコイド様効果を救済するための医薬の製造において有用であり得る。
【０２５３】
（他の治療）
本発明の化合物／組成物が他の重要な医学的意味を有し得ることがまた理解される。
【０２５４】
例えば、本発明の化合物または組成物は、ＷＯ−Ａ−９９／５２８９０に列挙される障害の処置において有用であり得る（すなわち）：
さらに（あるいは）本発明の化合物または組成物は、ＷＯ−Ａ−９８／０５６３５に列挙される障害の処置において有用であり得る。参照を容易にするために、そのリストの一部をここに挙げる：癌、炎症または炎症性疾患、皮膚科障害、熱、心血管効果、出血、凝固および急性期反応、悪液質、拒食症、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、宿主対移植片反応、自己免疫疾患、再還流傷害、髄膜炎、片頭痛、およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、侵入および伝播、新脈管形成、転移、悪性、腹水および悪性胸水；脳虚血、虚血性心疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、発作、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰瘍、網膜症および外科創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、うっ血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症または内膜硬化症。
【０２５５】
さらに（あるいは）、本発明の化合物または組成物は、ＷＯ−Ａ−９８／０７８５９に列挙される障害の処置に有用であり得る。参照を容易にするために、そのリストの一部をここに挙げる：サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば、免疫欠損（ヒト免疫不全ウイルスでの感染を含む）；リンパ球増殖の調節を処置するため；癌および多くの自己免疫疾患を処置するため、および移植拒絶または腫瘍免疫誘導を防ぐため）；造血の調節、例えば、骨髄またはリンパ球疾患の処置；骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成長を促進する（例えば、創傷治癒のため）やけど、潰瘍および歯周疾患ならびに神経変性の処置；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化合物（受精の調節）；走化性活性／ケモキネシス活性（例えば、傷害または感染の部位に特異的な細胞型を動員するため）；止血剤および血栓溶解剤活性（例えば、血友病および発作を処置するため）；抗炎症性活性（例えば、敗血性ショックまたはクローン病を処置するため）；抗菌薬として；例えば、代謝または挙動の調節因子；鎮痛薬として；特定の欠損性傷害を処置する；例えば乾癬の処置において（ヒトまたは獣医の医薬において）。
【０２５６】
さらに（あるいは）、本発明の組成物は、ＷＯ−Ａ−９８／０９９８５に列挙される障害の処置において有用であり得る。参照を容易にするために、その列挙の一部をここに挙げる：マクロファージ阻害性活性および／またはＴ細胞阻害性活性、それによる抗炎症性活性；抗免疫活性；すなわち、細胞免疫および／または体液性免疫応答に対する阻害性効果（炎症に関連しない応答を含む）；細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンを固定するマクロファージおよびＴ細胞の能力、ならびにＴ細胞におけるアップレギュレートされたｆａｓレセプター発現を阻害する；以下を阻害する：望ましくない免疫反応および炎症（慢性関節炎を含む関節炎、過敏症に関連する炎症、アレルギー性反応、喘息、全身エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫病を含む）、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性心疾患、再還流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸抑制症候群または他の心肺疾患、消化性潰瘍に関連する炎症、潰瘍性大腸炎および他の胃腸管の疾患、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の分泌腺疾患、糸球体腎炎または他の腎疾患および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉科疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯の疾患、精巣炎または精巣上体炎、不妊症、精巣外傷もしくは他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および／もしくは炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内性炎症、例えば、網膜炎もしくは類嚢胞黄斑水腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性眼底疾患の免疫性および炎症性要素、眼性外傷の炎症性要素、感染により引き起こされる眼性炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血視神経障害、過度の瘢痕形成、例えば、緑内障濾過手術後の、眼内インプラントに対する免疫および／もしくは炎症反応、ならびに他の免疫および炎症関連眼疾患、自己免疫疾患または状態または障害に関連した炎症（ここで、中枢神経系（ＣＮＳ）または任意の他の器官において、免疫および／もしくは炎症の抑制が有益である）、パーキンソン病、パーキンソン病の処置からの合併症および／もしくは副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合ＨＩＶ関連脳障害、ドヴィック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病およびＣＮＳの他の変性疾患、状態、もしくは障害、発作の炎症性要素、ポリオ後症候群（ｐｏｓｔ−ｐｏｌｉｏ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、精神医学的な障害の免疫性および炎症性要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギヤン−バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮外側索硬化、ＣＮＳ圧迫もしくはＣＮＳ外傷もしくはＣＮＳの感染の炎症性要素、筋萎縮およびジストロフィーの炎症性要素、ならびに中枢神経系および末梢神経系の免疫および炎症関連疾患、状態もしくは障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染性疾患、手術の炎症性合併症もしくは副作用、骨髄移植もしくは他の移植合併症および／もしくは副作用、遺伝子治療の炎症性および／もし���は免疫合併症ならびに副作用（例えば、ウイルス担体による感染に起因する）またはＡＩＤＳに関連した炎症、体液性および／もしくは細胞性免疫応答の抑制または阻害、単球もしくはリンパ球の量を減少することによる単球もしくは白血球増殖性疾患（例えば、白血病）の処置または緩和、天然または人工の細胞、組織、および器官（例えば、角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、天然もしくは人工の皮膚組織）の移植の場合の移植片拒絶の予防および／もしくは処置のため。
【０２５７】
（化合物の調製）
本発明の化合物は、適切なアルコールと適切な塩化物との反応によって調製され得る。例えば、本発明のスルファメート化合物は、適切なアルコールと、式Ｒ１Ｒ２ＮＳＯ２Ｃｌの適切なスルファモイル（ｓｕｌｆａｍｏｙｌ）塩化物との反応によって調製され得る。
【０２５８】
この反応を実行するための代表的な条件は以下の通りである。
【０２５９】
水素化ナトリウムおよびスルファモイルクロライド（ｓｕｌｆａｍｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を、０℃で、アルコール含有無水ジメチルホルムアミドの攪拌溶液に添加する。引き続き、この反応物を室温まで暖め、その後攪拌をさらに２４時間続ける。この反応混合物を重炭酸ナトリウムの冷飽和溶液に注ぎ、そして得られた水相をジクロロメタンで抽出する。合わせた有機抽出物を無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過、その後の減圧下での溶媒エバポレーション、およびトルエンでの同時エバポレートによって、粗残滓を得て、これをさらにフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０２６０】
好ましくは、フルファモイルクロライドとの反応前に、適切な場合、アルコールを誘導する。必要な場合、アルコール中の官能基を公知の様式で保護し得、そしてこの保護基は、反応の最後に取り除く。
【０２６１】
好ましくは、スルファメート化合物は、Ｐａｇｅら（１９９０  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４６：２０５９〜２０６８）の技術に従って調製される。
【０２６２】
ホスホネート化合物は、Ｐａｇｅら（１９９０  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４６：２０５９〜２０６８）およびＰＣＴ／ＧＢ９２／０１５８６の技術を適切に組み合わせることによって調製され得る。
【０２６３】
スルホネート化合物は、Ｐａｇｅら（１９９０  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４６：２０５９〜２０６８）およびＰＣＴ／ＧＢ９２／０１５８６の技術を適切に適合させることによって調製され得る。
【０２６４】
チオホスホネート化合物は、Ｐａｇｅら（１９９０  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４６：２０５９〜２０６８）およびＰＣＴ／ＧＢ９１／００２７０の技術を適切に適合させることによって調製され得る。
【０２６５】
（要旨）
要するに、本発明は、ステロイドスルファターゼインヒビターとして用いるための新規な化合物およびそれを含む薬学的組成物を提供する。
【０２６６】
（実施例）
本発明はここで、添付する図面を参照して単に一例として記載される。
【０２６７】
図２に示される一般的合成スキームに従って、本発明による以下の化合物（図４、７、１１および１２を参照のこと）を調製した。詳細には、Ｐａｇｅらにより記載されているように、化合物１、２、３、５、６、８および９（図２のスキームを参照のこと）を調製した（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９０；４６；２０５９〜２０６８）。
【０２６８】
次いで、上記のプロトコルに従って、化合物を試験した。この結果（図、５、６、８、９、１０、１３および１４を参照のこと）は、それらがＳＴＳインヒビターとして働き得ることを示した。
【０２６９】
各化合物４、７、１０および１３のＩＣ５０を、また誘導した。これらの値を以下に示す。
【０２７０】
【表２】
0004931312.tif 000006
（エストロンアセテート  （１））
エステロン（１０ｇ、３６．８２ｍｍｏｌ）、無水酢酸（１７．５ｍｌ）、およびピリジン（７５ｍｌ）の混合物を還流下で２時間加熱した。冷却した反応混合物を減圧（真空）下で濃縮し、次いで水浴でクエンチした。形成された沈殿物をろ過除去し、水で洗浄し、乾燥し、そしてエタノール水（９５％）から再結晶化して、白色結晶として１を得た（１１．２ｇ，９７％）；ｍｐ  １１５〜１１８℃；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１）：
【０２７１】
【数１】
0004931312.tif 000007
（２−ブロモエストロンアセテート（２））
１（２．０ｇ，６．４０２ｍｍｏｌ）を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，５０ｍｌ）溶液に対して、トリフルオロ酢酸タリウム（６．９５８ｇ，１２．８０ｍｍｏｌ）を添加し、そして得られた混合物を窒素下０℃で２４時間攪拌した。４０℃未満での減圧下でのＴＦＡの除去の際、得られた結晶エステロン−タリウム（ＩＩＩ）複合体を、１，２−ジクロロエタンで２回洗浄した。次いで、１，４−ジオキサン（３０ｍｌ）および臭化銅（８．５８ｇ，３８．４１ｍｍｏｌ）をこの洗浄した複合体に添加し、そして得られた今後物を還流下で３時間加熱した。溶媒のエバポレーション後、次に水（１００ｍｌ）をこの洗浄複合体に添加した。この溶媒のエバポレーション後、水（１００ｍｌ）を得られた残滓に添加し、そして粗生成物をジクロロメタン（３×１５０ｍｌ）中に抽出した。この合わせられた有機抽出物を水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過してエバポレートした。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ヘキサン、１：４）によって分画し、そして得られた淡白色の固体（２．０５ｇ）を、メタノールからの再結晶化によってさらに精製し、無色結晶として２を得た（１．７９ｇ，７２％）；ｍｐ  ２２９〜２３１℃；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１およびエチルアセテート／ヘキサン，４：１）；
【０２７２】
【数２】
0004931312.tif 000008
（２−ブロモエストロン（３））
３（１．５ｇ，３．８３２  ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．６５ｇ、１９．１７ｍｍｏｌ）を含有するメタノール（７０ｍｌ）の混合物を還流下で３時間加熱した。溶媒のエバポレーションの際、水（５０ｍｌ）を得られた残滓に添加し、そして組成生成物をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で抽出した。この合わせられた有機抽出物を水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過してエバポレートして、黄色固体（１．３ｇ）を得た。この固体を、エチルアセテート／石油エーテル（６０〜８０℃）（３：２）からの再結晶化によって精製して、淡黄色結晶として３を得た（１．２３ｇ，９３％）ｍｐ１９０〜１９３℃；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１および４：１）：
【０２７３】
【数３】
0004931312.tif 000009
（２−ブロモエストロン３−Ｏ−スルファメート（ｓｕｌｐｈａｍａｔｅ）（４））
スルファモイレーション（ｓｕｌｐｈａｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の際、３（５００ｍｇ，１．４３１ｍｍｏｌ）により粗生成物（６２０ｍｇ）を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／アセテート、８：１）によって分画した。得られたベージュ色残滓（５１０ｍｇ）をアセトン／ヘキサン（１：２）からの再結晶化によってさらに精製し、ベージュ色結晶として３を得た（４０５ｍｇ、６６％）ｍｐ＞１５５℃（ｄｅｃ．）；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１および４：１）：
【０２７４】
【数４】
0004931312.tif 000010
（２−インドエステロンアセテート（５））
これを、ヨウ化銅（１８．２９ｇ，９６．０３ｍｍｏｌ）を用いることを除いて、２の調製と同じ様式で１（５．０ｇ，１６．０１ｍｍｏｌ）から調製した。得られた粗生成物を、エチルアセテート／ヘキサン（１：４）を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、そして得られた黄色固体（６．２５ｇ）をメタノールから再結晶化によってさらに精製し、淡黄色結晶として５を得た（５．８９ｇ，８４％）；ｍｐ  １７０〜１７２℃（結晶は＞１４５℃で褐色に変化した）；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１およびエチルアセテート，４：１）：
【０２７５】
【数５】
0004931312.tif 000011
（２−ヨードエストロン（６））
このブロモアナログ３の調製と同じ様式でこれを５（４．０ｇ，９．１２６ｍｍｏｌ）から調製した。得られた黄色粗生成物をメタノールから再結晶化して淡黄色結晶として６を得た（３．２９ｇ，９１％）；ｍｐ  ２０７〜２０９℃（結晶は＞１６９℃で褐色に変化した）；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１）：
【０２７６】
【数６】
0004931312.tif 000012
（２−ヨードエステロン３−Ｏ−スルファメート（７））
スルファモイレーション（ｓｕｌｐｈａｍｏｙｌａｔｉｏｎ）の際、６（５００ｍｇ，１．２６２ｍｍｏｌ）により粗生成物を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／アセテート、８：１）によって分画した。得られたベージュ色残滓（４５０ｍｇ）をアセトン／ヘキサン（１：２）からの再結晶化によってさらに精製し、ベージュ色結晶として７を得た（３４２ｍｇ、５７％）ｍｐ＞１４５℃（ｄｅｃ．）；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１および４：１）：
【０２７７】
【数７】
0004931312.tif 000013
この表題の化合物（図７に図示される）は、「２−ヨードＥＭＡＴＥ（２−ＩｏｄｏＥＭＡＴＥ）」と呼ばれる。この化合物の結果を表８および９に示す。
【０２７８】
（２−クロロエステロンアセテート（８））
これを、ヨウ化銅（４７５ｍｇ，４．７９８ｍｍｏｌ）を用いることを除いて、２の調製と同じ様式で１（５００ｍｇ，１。６０３ｍｍｏｌ）から調製した。得られた粗生成物を、エチルアセテート／ヘキサン（１：４）を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、そして得られた淡黄色固体（５２６ｍｇ）をメタノールから再結晶化によってさらに精製し、白色結晶として８を得た（４３６ｍｇ，７８％）；ｍｐ  １９５〜１９７℃；ＴＬＣ（クロロホルム／アセトン，８：１およびエチルアセテート，４：１）：
【０２７９】
【数８】
0004931312.tif 000014
（２−クロロエストロン（９））
これを、その臭素アナログ３の調製と同じ様式で８（４００ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）から調製した。得られた淡黄色の粗生成物をメタノールから再結晶して、白色結晶として９（３２０ｍｇ、９０％）を得た；
【０２８０】
【数９】
0004931312.tif 000015
（２−クロロエストロン３−Ｏ−スルファメート（１０））
スルファモイル化の際、６（２００ｍｇ、６５５μｍｏｌ）を、フラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／アセトン、８：１）により分画した粗生成物として得た。得られたベージュ色の残渣（１９０ｍｇ）を、アセトン／ヘキサン（１：２）から再結晶することによりさらに精製して、白色結晶として１０（１７０ｍｇ、６８％）を得た；
【０２８１】
【数１０】
0004931312.tif 000016
（２−フルオロエステロンアセテート（１１））
１，１，２−トリクロロエタン（２４ｍｌ）中のエステロン（１．５０ｇ、５．５．５ｍｍｏｌ）およびＮ−フルオロピリジニウムトリフレート（２．７４ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）を、窒素下で２４時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、そして残渣を水に注ぎ、そしてジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そしてエバポレートして、褐色の粗油状物を得た。この油状物を、ピリジン（１０．５ｍｌ）に溶解し、そして無水酢酸（２．６２ｍｌ）を用いて還流下で２時間処理した。溶媒をエバポレートし、そして残渣を冷水に注いだ。この溶液をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そしてエバポレートして、粗固体を得た。溶出液として、石油エーテル（ｂ．ｐ．６０〜８０℃）：酢酸エチル（９：１〜７：３）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製により、エバポレーション後に粗混合物（０．８５ｇ）を得た。石油エーテル（ｂ．ｐ．６０〜８０℃）：無水エタノール（２：８）からの再結晶により、第１の生成物（ｆｉｒｓｔ  ｃｒｏｐ）として、２−フルオロエステロンアセテート１１（（純度７５〜８０％、１Ｈ−ＮＭＲにより評価）（２１５ｍｇ、収率１２％）無色結晶）を有意に得た。
【０２８２】
【数１１】
0004931312.tif 000017
（２−フルオロエステロン（１２））
２−フルオロエステロンアセテート（１１）（１８５ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、メタノール（５ｍｌ）に溶解し、そしてＫ２ＣＯ３（３８７ｍｇ、５当量）と共に、還流下で３時間加熱することにより脱アセチル化した。溶媒のエバポレーションの後、水（２５ｍｌ）を添加し、そして生成物をジクロロメタン（３×２０ｍｌ）により抽出した。抽出物を、ＭｇＳＯ４により乾燥し、減圧下で乾燥した。石油エーテル（ｂ．ｐ．６０〜８０℃）：無水エタノール（２：８）からの再結晶により、無色結晶（ｍ．ｐ．２２０〜２２７℃）として、２−フルオロエステロン（１２１ｍｇ、１Ｈ−ＮＭＲにより評価した純度、７５％）を得た。ＨＰＬＣ分離（溶媒ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６０：４０、流速２０ｍｌ／分、Ｃｏｌｕｍｎ  Ｗａｔｅｒｓ  Ｒａｐｉｄｉａｌｐａｋ  Ｃ１８  １００×２５ｍｍ、検出２５４および２７０ｎｍ）によるさらなる精製は、溶媒のエバポレーションの後に、白色固体として２−フルオロエステロン１２（７２ｍｇ、収率４５％）を得た。
【０２８３】
【数１２】
0004931312.tif 000018
（２−フルオロエステロン−３−Ｏ−スルファメート（１３））
無水ＤＭＦ（７ｍｌ）中の２−フルオロエステロン１２（６５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、窒素雰囲気下で、室温にて、ＤＭＢＰ（１３９ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を加え、次いでトルエン（１．６１ｍｌ、１．１３ｍｍｏｌ）中の塩化スルファモイル（０．６８Ｍ）の溶液をシリンジを介して加えた。反応混合物を室温で１８時間攪拌した。水（５０ｍｌ）および酢酸エチル（６０ｍｌ）を加え、そして分離の際、有機層を鹹水（３×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートした。得られた組成生物を、溶媒として、クロロホルム：アセトン＝８：１を用いるフラッシュクロマトグラフィー（カラム径＝２．５ｃｍ、ｈ＝２０ｃｍ）により精製して、白色固体として、２−フルオロエステロン−３−Ｏ−スルファメート１３（４７ｍｇ、収率５７％）を得た。
【０２８４】
【数１３】
0004931312.tif 000019
ＨＲＭＳ（＋ｖｅ  ＦＡＢ）ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ２２ＮＯ４ＳＭ＋の計算値３６７．１２５３５８、実測値３６７．１２６６６３。
Ｒｆ  ０．３２（ＣＨＣｌ３：アセトン＝８：１）、ＳＭ  Ｒｆ  ０．５８。
【０２８５】
（胎盤ミクロソームにおけるハロ−ＥＭＡＴＥによるエストロンスルファターゼ活性の阻害）
（スルファターゼ）−陽性ヒト胎盤を胎盤ミクロソームの供給源として使用した。組織をホモジナイズし、そして核および細胞破片を、２０００×ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。胎盤ミクロソームを、生じた上清を１００，０００×ｇで１時間遠心分離することによって得た。
【０２８６】
阻害研究のために、胎盤ミクロソーム（１２５μｇ／ｍｌ）を、インヒビター（１ｐｍ〜１．０μＭ）の不在下または存在下で、３Ｈエストロンスルフェート（Ｅ１Ｓ、非標識Ｅ１Ｓを用いて２０μＭに調整した２×１０５ｄｐｍ）とともに６０分間インキュベートした。［４−１４Ｃ  Ｅ１］（７×１０３ｄｐｍ）を添加して手順上の損失を補正し、そして遊離ステロイドおよび硫酸化ステロイドを、トルエンを使用する溶媒分配によって分離した。この溶媒の一部を取り出し、そして３Ｈおよび１４Ｃの含量を、液体シンチレーション分光法によって決定した。
【０２８７】
得られたデータを、図１３に示す。
【０２８８】
さらなるデータを、以下の表に示す。
【０２８９】
【表３】
0004931312.tif 000020
（Ｔ４７Ｄ細胞増殖に対するハロ−ＥＭＡＴＥの効果（プレートアッセイ））  Ｔ４７Ｄレセプター陽性乳癌細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種し、そして約７０％コンフルエントになるまで増殖させた。細胞を、ビヒクル（コントロール、培地中のテトラヒドロフラン）またはハロ−ＥＭＡＴＥ（１μＭもしくは１０μＭ）のいずれかで処理し、そしてさらに２４時間培養した。この期間の最後に、細胞数に対する薬物の効果を、マイクロタイタープレートアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  ９６細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。このアッセイにおいて、培養期間の最後の非処理細胞による基質の変換を１００％に設定した。
【０２９０】
得られたデータを図１４に示す。
【０２９１】
さらなるデータを、以下の表に示す。
【０２９２】
【表４】
0004931312.tif 000021
＋は、細胞形態に対する効果を有する。
【０２９３】
上記明細書中に言及されるすべての刊行物および特許は、本明細書中において参考として援用される。
【０２９４】
本発明の種々の改変および変化が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求される発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが、理解されるべきである。実際、化学分野、生物学分野または関連分野における当業者に明らかである、本発明を実行するための記載された様式の種々の改変が、上記の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０２９５】
本発明はここで、添付する図面を参照して単に一例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、一般式を示す。
【図２】  図２は、一般的な反応スキームを示す。
【図３】  図３は、一般的反応スキームを示す。
【図４】  図４は、化合物の式を示す。
【図５】  図５は、データの表を示す。
【図６】  図６は、グラフを示す。
【図７】  図７は、化合物の式を示す。
【図８】  図８は、データの表を示す。
【図９】  図９は、グラフを示す。
【図１０】  図１０は、グラフを示す。
【図１１】  図１１は、化合物の式を示す。
【図１２】  図１２は、化合物の式を示す。
【図１３】  図１３は、グラフを示す。
【図１４】  図１４は、グラフを示す。
【図１ａ】
0004931312.tif 000030
【図１ｂ】
0004931312.tif 000031
【図４】
0004931312.tif 000032
【図２】
0004931312.tif 000033
【図３】
0004931312.tif 000034
【図５】
0004931312.tif 000035
【図６】
0004931312.tif 000036
【図７】
0004931312.tif 000037
【図８】
0004931312.tif 000038
【図９】
0004931312.tif 000039
【図１０】
0004931312.tif 000040
【図１１】
0004931312.tif 000041
【図１２】
0004931312.tif 000042
【図１３】
0004931312.tif 000043
【図１４】
0004931312.tif 000044