(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサを検出するための酵素基質のインビトロでの使用であって、前記基質が次の化学式で表されるターゲット部とマーカー部で構成され、
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ
（ここで、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−がターゲット部であり、−ＮＨ−Ｒが基質の発色性又は蛍光性のマーカー部である。）
前記基質の加水分解によりターゲット部とマーカー部の分離が可能になり、そのターゲット部が探索する酵素作用に対して特異的で、少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサのβ−アラニンアミノペプチダーゼ酵素作用を示すことを可能にし、前記マーカー部が加水分解反応を示す分子であることを特徴とする酵素基質の使用。
【請求項２】
前記酵素基質のターゲット部がβ−アラニンで構成され、マーカー部が発色性又は蛍光性分子であることを特徴とする請求項１に記載の酵素基質の使用。
【請求項３】
前記酵素基質のマーカー部が、
−β−ナフチルアミン、
−アミノメチルクマリン、
−アミノベンゼン誘導体、
−ｐ−ニトロアニリン、あるいは、
−２−アミノインドキシル、あるいは、３−アミノインドキシル
で構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の酵素基質の使用。
【請求項４】
前記アミノメチルクマリンが−７−アミノ−４−メチルクマリン、前記アミノベンゼン誘導体が−４−アミノ−２，６−ジクロロフェノールであることを特徴とする請求項３に記載の酵素基質の使用。
【請求項５】
ターゲット部とマーカー部で構成された酵素基質であって、該基質の加水分解によりターゲット部とマーカー部の分離が可能になり、そのターゲット部が少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサのβ−アラニンアミノペプチダーゼ酵素作用を示すことを可能にし、前記マーカー部が加水分解反応を示す分子であると共に、前記酵素基質のターゲット部が、β−アラニンで構成され、マーカー部が
−アミノベンゼン誘導体、
−２−アミノインドキシル、あるいは、３−アミノインドキシル
により構成されることを特徴とする酵素基質。
【請求項６】
前記アミノベンゼン誘導体が−４−アミノ−２，６−ジクロロフェノールであることを特徴とする請求項５に記載の酵素基質。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の少なくとも１つの基質及び培地を含む、少なくとも１つの菌株及び／又は微生物種の検出を可能にする成分。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の少なくとも１つの基質、少なくとも１つの別の基質及び培地を含む、少なくとも１つの菌株及び微生物種、あるいは、少なくとも２つの菌株、あるいは、２つの微生物種の検出を可能にする成分。
【請求項９】
培地が、発色剤を含むことを特徴とする請求項７又は８に記載の成分。
【請求項１０】
遊離した前記マーカー部がアミノベンゼン誘導体であるとき、前記発色剤が、−３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であることを特徴とする請求項９に記載の成分。
【請求項１１】
前記アミノベンゼン誘導体がジクロロアミノフェノールであることを特徴とする請求項１０に記載の成分。
【請求項１２】
成分が液体培地、あるいは、寒天培地の形であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか１つに記載の成分。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の酵素基質の使用によりバクテリア種シュードモナスエルジノーサを検出する方法であって、
−少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサを含むと疑われるサンプルに、β−アラニンアミノペプチダーゼの酵素作用を検出できる少なくとも１つの基質を加え、
−着色及び／又は蛍光反応の出現を観察する、
ことを特徴とするバクテリア種シュードモナスエルジノーサの検出方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の酵素基質の使用によりバクテリア種シュードモナスエルジノーサの検出方法であって、
−少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサを含むと疑われるサンプルに、β−アラニンアミノペプチダーゼの酵素作用を検出できる少なくとも１つの基質を加え、
−シュードモナスエルジノーサとは別の少なくとも１つの微生物を含むと疑われるサンプルに、β−アラニンアミノペプチダーゼ以外の酵素作用を検出できる少なくとも１つの基質を加え、この別の酵素作用が別の微生物からシュードモナスエルジノーサを区別することができ、
−着色及び／又は蛍光反応の出現を観察する、
ことを特徴とするバクテリア種シュードモナスエルジノーサの検出方法。
【請求項１５】
培地がゲル化されていることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
得られた着色及び／又は蛍光の移動を減少させる生成物を、前記培地に添加することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素作用β−アラニンアミノペプチダーゼの検出試験に利用できる基質に関するものである。本発明は、同様に、少なくともそうした基質、並びに、バクテリア種シュードモナスエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を検出する方法を含む成分に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多年にわたり、微生物の特徴的な酵素作用の有無を決定するために特定の基質を使用している。反応があるかどうかに従って基質を選択することによって、微生物の種類の性質を特徴付けるか、あるいは、菌株、及び／あるいは、与えられた微生物の種を区別することができる。
酵素の合成基質は、２つの部分、すなわち、ターゲット部と呼ばれる酵素作用の第１の特定の部分、及びマーカー部と呼ばれるマーカーの役割を果たす第２の部分で構成される。
この特定の基質は、蛍光性であっても、あるいは、発色性であっても良い。実際、これは第２のマーカー部、あるいは、１つ、あるいは、複数の別の化合物との反応生成物である。それについては、出願者の名前で提出された、第１のターゲット部には関連しない場合、蛍光性、あるいは、発色性である特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／００７８１を参照すること。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、現状の技術は、その大きな病原性を理由として最も探索されている種であり、その分布頻度が十分重要であり、数々の疾病に関わり合いがあるシュードモナスエルジノーサ種を特徴付ける単純な試験を記述してはいない。
本発明に従って、ターゲット部としてβ−アラニンを主成分とし、選シュードモナスエルジノーサの実際の検出を可能にする一連の基質を提案する。本発明は、また、少なくとも基質を含む成分、並びに、シュードモナスエルジノーサの検出方法に関するものである。
【０００４】
たしかに、β−アラニンは既に良く知られている。また、「パンクレアティックエラスターゼ（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｌａｃｔａｓｅ）によって粘着された発色性基質中のアミノ酸残留物の役割」によって確立されたＫａｓａｆｉｒｅｋ，Ｅｖｚｅｎ他の論文、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８７），５２（６），１６２５−３３では、例えば、β−アラニンｐ−ニトロアラニンといった発色性基質が述べられている（１６３１ページのその合成を参照すること）。
本発明に関して重要と思われる相違は、シュードモナスエルジノーサを検出することを目的としているターゲットを対象としており、膵臓エラスターゼの酵素ではない。
【０００５】
Ｊ．Ｂ．Ｓｕｓｚｋｉｗ，Ａ．Ｓ．Ｂｒｅｃｈｅｒによる「脳のアミノアシルアリラミダーゼ。牛の溶解性酵素の更なる精製及び基質特異性及び可能な活性側残留物」に関する論文、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．９，ｎｏ．２０（１９７０），４００８−４０１７ページは、牛の脳酵素の溶解性抽出物アリルアミダーゼ、β−アラニンβ−ナフチルアミンの精製技術を提案している（４０１０ページ第２パラグラフのその合成を参照すること）。
そこでは、ターゲットは、我々が予測したものとは完全に異なっている。
特許出願ＷＯ−Ａ−９６／４０９８０は、栄養補給生成物のサンプル中の存続可能な全バクテリアの存在、あるいは、その濃度を検出するための方法及び成分を記述している。それを行うために、幾つかの基質を利用するが、それには、塩化水素のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアナニル−Ｌ−アルギニン−７−アミノ−４−メチルクマリンが含まれる。
いずれにせよ、この文書の主目的は、唯一の種、すなわち、シュードモナスエルジノーサの特異性ではなく、バクテリア全体であり、リストは数多くの種を挙げているが、シュードモナス種としてシュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）という２つの特定の種しか示していないので、そのために非常に多くの基質を使用するが、そのいずれも、シュードモナスエルジノーサに特有のβ−アラニンアミノペプチダーゼの作用を検出することはできない；この第１の種は容易に区別できる。というのは、シュードモナスエルジノーサはこの種によるオベルディン（ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ）の生成による緑色の着色を自然に生じるからであり、後者の種は、β−アラニンアミノペプチダーゼ作用を示さない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そのために、本発明は、ターゲット部とマーカー部で構成される酵素基質に関するものであり、基質の加水分解によって、ターゲット部とマーカー部との分離が可能になり、前述のターゲット部は、ターゲット部が少なくとも微生物シュードモナスエルジノーサのβ−アラニンアミノペプチダーゼの酵素作用を示すことができ、マーカー部が加水分解反応を示す分子であることを特徴とする探索された酵素作用を特徴とする。
好ましい実施例バリエーションに従って、ターゲット部は、β−アラニンで構成され、マーカー部は、発色性、あるいは、蛍光性分子である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
常に好ましい実施例バリエーションに従って、基質は、次のような化学式である：
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ， ここで、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−は、ターゲット部であり、−ＮＨ−Ｒは、基質の発色性、あるいは、蛍光性マーカー部である。
また、好ましい実施例バリエーションに従って、マーカー部は、次のもので構成される：
−β−ナフチルアミン、
−７−アミノ−４−メチルクマリンといったアミノメチルクマリン、
−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノールといったアミノベンゼン誘導体
−ｐ−ニトリアニリン、あるいは、
−２−アミノインドキシル、あるいは、３−アミノインドキシル
【０００８】
本発明は、同様に、前記のような少なくとも１つの基質、及び培地を含む少なくとも１つの菌株、及び／あるいは、微生物種の検出を可能にする成分に関するものである。
バリエーションに従って、少なくとも１つの菌株及び微生物種、あるいは、少なくとも２つの菌株、あるいは、２つの微生物種の検出を可能にする成分は前記のような少なくとも１つの基質、少なくとも別の基質及び培地を含む。
バリエーションに従って、培地は、発色剤を含む。
その場合、培地は、発色剤として次のものを含む：
−ジアゾニウム塩、遊離マーカー部がβ−ナフチルアミンである場合、
−３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、遊離マーカー部がアミノベンゼン誘導体である場合、
好ましくは、成分は、液体培地、あるいは、ゲル培地の形である。
【０００９】
本発明は、結局、シュードモナスエルジノーサバクテリア種の検出方法に関するものであり、方法は次のもので構成される：
−少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサを含むと疑われるサンプルと共に、β−アラニンアミノペプチダーゼの酵素作用を検出できる少なくとも１つの基質を加え、
−着色、及び／あるいは、蛍光反応の出現を観察する。
バリエーションに従って、バクテリア種シュードモナスエルジノーサの検出方法は、次のもので構成される：
−少なくとも１つの微生物シュードモナスエルジノーサを含むと疑われるサンプルと共に、β−アラニンアミノペプチダーゼの酵素作用を検出できる少なくとも１つの基質を加え、
−シュードモナスエルジノーサとは別の少なくとも１つの微生物を含むと疑われるサンプルと共に、β−アラニンアミノペプチダーゼの異なる酵素作用を検出できる少なくとも１つの基質を加え、この別の酵素作用が別の微生物からシュードモナスエルジノーサを区別することができる。
【００１０】
−着色、及び／あるいは、蛍光反応の出現を観察する。
下記の図の２つの事例では、培地はゲル化されている。
その場合、得られた着色の移動を減少させる生成物をその培地に添加する。
本発明は、β−アラニンアミノペプチダーゼの作用を有するバクテリア種シュードモナスエルジノーサの多くの菌株に特有な生物学的特性の利用に関するものである。この特性は、別の種ではめったに見られないものである。
本発明は、β−アラニンで構成される酵素の特有なターゲット部に適合されたマーカー部を関連付けることで構成される。そうした作用を示すためのそうしたマーカー部は既に存在しているが、この種と酵素作用との間の関係が記述されたことがなかったので、シュードモナスエルジノーサを検出するための利用は知られていない。
【００１１】
また、基質の第１のグループは、マーカー部としてナフチルアミンを有する分子で構成され、β−アラニル−β−ナフチルアミドに対応する化学式の１つは次のものである：
【化１】
0004907822.tif 000002
そこで、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、水素、臭素、あるいは、塩素、あるいは、ヨウ素の原子、あるいは、その各々の位置に対するタイプ−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＣＨ2ＣＨ3，−ＯＣＨ3，−ＯＣＨ2ＣＨ3、あるいは、ＣＯＯＨのグループを示す。β−アラニンアミノペプチドの作用を検出するためにβ−ナフチルアミンを使用することができ、それは、Ｃｌａｕｄｅ Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｌｙｏｎ Ｉ大学に支援された１９７８年７月４日のＤａｎｉｅｌ Ｍｏｎｇｅｔ工学博士の論文で述べられている（整理番号２９７）。紺タイプの分子は無色であり、ジアゾニウム塩といった発色剤を添加することが望ましい。
【００１２】
現状の技術の第２の基質グループは、そのマーカー部が一旦ターゲット部から遊離すると蛍光性となるアミノメチルクマリンを主成分とする分子で構成される。この基質グループの一般的な化学式は、β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリンに対応する次のような特定の化学式から導出することができる：
【化２】
0004907822.tif 000003
そこで、Ｒ9，Ｒ12，Ｒ13，Ｒ14，及びＲ15は、水素、臭素、あるいは、塩素、あるいは、ヨウ素の原子、あるいは、その各々の位置に対するタイプ−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＣＨ2ＣＨ3，−ＯＣＨ3，−ＯＣＨ2ＣＨ3、あるいは、ＣＯＯＨのグループを示す。このタイプの基質は、ゲル培地での利用に適合させ、その後、液体培地に利用することができる。
【００１３】
第３の基質グループは、マーカー部として２．６−ジクロロアミノフェノールを有するβ−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノールで構成され、その総称的化学式は次のものである：
【化３】
0004907822.tif 000004
そこで、Ｒ16，Ｒ17は、水素、臭素、あるいは、塩素、あるいは、ヨウ素の原子、あるいは、その各々の位置に対するタイプ−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＣＨ2ＣＨ3，−ＯＣＨ3，−ＯＣＨ2ＣＨ3、あるいは、ＣＯＯＨのグループを示す。このタイプの分子は、出願者によって提出された既に先行特許出願ＷＯ−Ａ−９９／５１７６７に記述されており、例えば、３，５ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸といった乾燥発色剤を必要とする。いずれにせよ、この特許出願ＷＯ−Ａ−９９／５１７６７は、塩素の２つの原子及びヒドロキシルグループが、水素、臭素、あるいは、塩素、あるいは、ヨウ素の原子、あるいは、その各々の位置に対してタイプ−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＣＨ2ＣＨ3，−ＯＣＨ3，−ＯＣＨ2ＣＨ3、あるいは、ＣＯＯＨのグループによって置換される別の分子を利用することができるということを示している。
【００１４】
第４の基質グループは、β−アラニルｐ−ニトロアニリド、あるいは、誘導体を主成分とし、マーカー部としてｐ−ニトロアニリンを有する。このタイプの総称的化学式は次のものである：
【化４】
0004907822.tif 000005
そこで、Ｒ18，Ｒ19，Ｒ20，及びＲ21は、水素、臭素、あるいは、塩素、あるいは、ヨウ素の原子、あるいは、その各々の位置に対するタイプ−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＣＨ2ＣＨ3，−ＯＣＨ3，−ＯＣＨ2ＣＨ3、あるいは、ＣＯＯＨのグループを示す。この生成物は、発色剤の存在を必要としない。
【００１５】
第５の基質グループは、マーカー部として２−アミノ−インドール、あるいは、３−アミノ−インドール主成分とする。この基質の総称的化学式は、２−アミノ−インドールについて次のものである：
【化５】
0004907822.tif 000006
３−アミノ−インドールについて次のものである：
【化６】
0004907822.tif 000007
すべての基質は、蛍光性である第２のグループを除いて発色性であり、シュードモナスエルジノーサのβ−アラニンアミノペプチド酵素作用を識別できるすべての分子で構成される。こうした識別によって、臨床的に病原体種を近グラム陰性桿菌種を良好に区別することができる。
１）利用した基質：
利用した酵素基質は、次のような化学式である：
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ，
【００１６】
ここで、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨは、β−アラニン、すなわち、基質のターゲット部であり、−ＮＨ2−Ｒは、発色性、すなわち、前記の基質のマーカー部である。
前述の第１の４つの基質グループに対応する４つの基質試験した。次のものである：
−β−アラニルβ−ナフチルアミド、Ｂａｃｈｅｍ社、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｕｉｓｓｅにより参照番号Ｋ１０３５で市販されている。
−β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリン、Ｂａｃｈｅｍ社、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｕｉｓｓｅにより参照番号Ｉ１０３０で市販されている。
−β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノール、その合成は下記に示す。
【００１７】
−β−アラニンｐ−ニトロアニリド、その合成は更に先に示す。
β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノールの合成は、Ｎ−第３−ブトキシカルボキシル−β−アラニン（１．８９ｇ、１０ｍｍｏｌ）から行う。このＮ−第３−ブトキシカルボキシル−β−アラニンは、下記では無水テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣ等級、３０ｍｌ）中にある。氷と塩の浴を利用して溶液を０℃に冷却し、Ｎ−メチルモルフォリン（２．０２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を添加する。温度を−１０℃以下にして、温度を−８℃以下に保持しながら漸次イシブチル・クロロフォルメート（２．７４ｇ，２０ｍｍｏｌ）を添加する。前記の無水懸濁液に、ジメチルフォルムアミドに溶解された４−アミノ−２．６−ジクロロフェノールの冷溶液（１．７８ｇ，１０ｍｍｏｌ）を添加し、自由塩基を遊離させるためにＮ−メチルモルフォリン（４．０８ｇ，４０ｍｍｏｌ）を用いて処理する。前記の添加前に、溶液を週温度以下に保つ。得られた反応混合液を氷と塩の浴中で１時間撹拌し、その後周囲温度で５時間撹拌する。薄いクロマトグラフィー層は、アミドへのほぼ完全な生成物の転換を示している。Ｎ−メチルモルフォリンの塩酸化物を除去するために懸濁液を濾過し、テトラヒドロフランを添加して残留物を洗浄する。次に、回転蒸気発生器を使用してテトラヒドロフラン及び僅かなジメチルフォルムアミドを回収し、ゆっくり強く撹拌した冷水中に得られた水溶液を注ぐ。灰色の沈殿物を回収し、良く水洗し、３０〜４０℃で真空炉中で乾燥させる。僅かな水を添加して生成物をメタノール中で再結晶させ、１．７２ｇの白色の結晶を得る。Ｎ−α−ｔ−ＢＯＣ−β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノールが得られ、次に、水素の塩化物の最小飽和エチルアセテート中に溶解させる。ほぼ１６℃に２時間放置した後で、粘性溶液をゆっくり２５０ｍｌの無水ジエチルエーテル中に注ぐ。４時間後に、粉末固形物を真空中で濾過して回収し、ジエチルエーテルで洗浄する。最後に生成物を真空乾燥機中で乾燥させ、吸湿性を最少にするために隔離する。
【００１８】
β−アラニンｐ−ニトロアニリドの合成は次のものである。２．７６グラム（ｇ）の質量、すなわち、２０ミリモル（ｍｍｏｌ）の４−ニトリアニリンを４０ミリリットル（ｍｌ）の乾燥ピリジンに撹拌溶解させ、事前に、少なくとも１２℃の温度に冷却する。他方、常に少なくとも１２℃の温度で、三塩化燐（１ｍｌ再希釈）を１２ｍｌのピリジンに添加する。次に、２つの溶液を少なくとも１６℃まで冷却し、三塩化燐を含む第２の溶液をニトリアニリンを含む第１の溶液に撹拌添加する。少なくとも３０分（ｍｎ）少なくとも１４〜１６℃で混合を行い、次に同じ時間だけ周囲温度で混合を行う。次に、連続して２０ｍｍｏｌの少々づつ、仮に４．４６ｇの乾燥ベンジルオキシカルボニル−β−アラニンを少なくとも５ｍｎの間溶液に撹拌、添加する。３０〜４０℃で１４時間（ｈ）撹拌を行う。その後、温度を５０℃に保ち、更に８時間撹拌を行う。希釈サンプルの薄層クロマトグラフィーにより、基本生成物の大部分が誘導されてβ−アミノアシルに変換されたということが判明した。次に、５０℃の回転気化によってピリジンを取り出す。残留粘性オイルをエタノールに加えて砕氷と共に強く撹拌する。そのようにして、一部は容器の壁に黄色っぽい固形物が、一部は結晶が得られる。生成物を取出し、吸引によって濾過し、水洗する。空気で乾かした生成物を熱いエタノール中で再結晶させる。４．３ｇの重量の乾燥生成物は、シリカゲルプレート（溶液−エチルアセテート／トルエン）を利用した薄層クロマトグラフィー（ＣＣＭ）により均質である。効率は、６２．７％である。ベンジルオキシカルボニル−β−アラニン−ｐ−ニトロアニリド中に存在するベンジルオキシカルボニルで構成される保護物が続いて除去される。そのようにして、２．１５ｇの物質を撹拌して最少量の熱い氷酢酸中に溶解する。２５℃に冷却したこの混合の際、撹拌して等しい体積の３０％の臭化水素を氷酢酸中に添加する。１時間半後に、強く撹拌しながら、粘性溶液をゆっくり４００ｍｌの無水ジエチルエーテルに注ぐ。得られた白色の懸濁液を濾過し、残留物を無水エーテルで数回洗浄し、次に、一晩真空乾燥機で乾燥させる。そのようにして、１．５０ｇのβ−アラニンｐ−ニトロアニリドが臭化塩の形で得られる。
【００１９】
２）異なる酵素基質によるβ−アラニンアミノペプチダーゼ酵素作用の証明：
Ａ  −β−アラニルβ−ナフチルアミド基質及びターゲット部の選択性試験：
【００２０】
数が指定されている場合を除いて、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｌａ Ｂａｌｍｅ， ＦｒａｎｃｅのＡＰＩ ＺＹＭタイプのギャラリー内でβ−アラニルβ−ナフチルアミドの存在の下で種当り５菌株の割合で幾つかの種を試験した。ｐＨ７．５で０．０１Ｍの燐酸塩緩衝液中で４ＭｃＦａｒｌａｎｄ（ＭｃＦ）の濃度のバクテリア懸濁液を用いて反応を行った。ＭｃＦａｒｌａｎｄスケールは、バクテリア濃度スケールであり、そこで４ＭｃＦは、ミリリットル当り１２．１０8バクテリアに対応する。各菌株に対して、８０マイクロリットルの懸濁液を各々のギャラリーの核斗に導入する。ギャラリーを４時間３７℃で培養する。参照番号７０４８０でｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社から市販されている少量のＺＹＭＢ（ジアゾニウム塩、Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ）を添加して、β−アラニンアミノペプチダーゼの存在を明示する。オレンジ色の発色が陽性反応を示す。結果は次のものである。下記に列挙した種に関して陰性反応があった。換言すれば、β−アラニンアミノペプチダーゼの反応は検出されなかった：
・エスケリチアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
・シゲラ属（４菌株）（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）
・シゲラソンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ ）
・エドワジェラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）
・サルモネラコレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）
・サルモネラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）
・サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）
・サルモネラパラチフスＡ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）
・サルモネラガリナルム（３菌株）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）
・サルモネラアリゾナエ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｉｚｏｎａｅ）
・シトロバクターフロインディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）
・シトロバクターデヴェルズス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕｓ）
・クラブシエラフモニエ属フモニエ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｓｐｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
・クラブシエラフモニエ属オキシトカ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｓｐｐ． ｏｃｙｔｏｃａ）
・クラブシエラオズエナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚｕｅｎａｅ）
・クラブシエラリノセロマティス
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｈｌｅｒｏｍａｔｉｓ）
・ハフニアアルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）
・エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
・エンテロバクタークロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）
・エンテロバクターサカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）
・エンテロバクターガーゴビア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）
・セラチアマルセッセンス（ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）
・セラチアオドリフェラ（ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）
・セラチアフォンティコラ（ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）
・セラチアプリムシカ（ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）
・プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）
・プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）
・プロテウスモルガニ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉｉ）
・プロテウスレッドゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）
・プロビデンシアアルカリファシエンス
（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）
・プロビデンシアスチュアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）
・エルシニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｔｉｃａ）
・エルシニアシュウドツベルコロジス
（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ）
・シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）
・コマモナスアシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）
・コマモナステストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）
・シュードモナスアルカリジェネス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｎｅｓ）
・シュードモナスシュトゥッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）
・シュワラプトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）
・ステノトロフォモナスマルトフィリア
（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）
・プレバディモナスディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）
・ブレバディモナスベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）
・ラルストニアピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉ）
・シュードモナスウルテオラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ）
・シュードモナスオリハビタンス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）
・スフィンゴモナスパウチモビリス
（Ｓｐｈｉｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）
・スフィンゴバクテリウムムルチボラム
（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）
・アルカリゲネスフェカリス／オドランス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ／ｏｄｏｒａｎｓ）
・アクロモバクタキシロスオキシダンス属デニトリフィカンス
（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｐｐ． ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
・アクロモバクタキシロスオキシダンス属キシロスオキシダンス
（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｐｐ． ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）
・ボルデテラブロンシセプティカ
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）
・オリゲラレオリティカ（２菌株）（Ｏｌｉｇｅｌｌａ ｕｒｅｏｌｙｔｉｃａ）
・ＣＤＣ ＩＶ Ｃ2（ＣＤＣ ＩＶ Ｃ2）
・アエロモナスヒドロフィア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）
・プレシオモナスシゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）
・ビブリオアルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）
・ビブリオパラヘモリティカス（４菌株）
（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）
・クリセオバクテリウム  メニンゴセプティカム
（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）
・エンペドバクタブレビス（３菌株）（ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ）
・クリセオバクテリウムバルスチナム
（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｌｕｓｔｉｎｕｍ）
・クリセオバクテリウムインドロゲネス
（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）
・ヴィクセラビローザ（４菌株）（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ ｖｉｒｏｓａ）
・ミロイデス属（Ｍｙｒｏｉｄｅｓｓｐｐ．）
・パスツレラガリナラム（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）
・パスツレラムトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）
・肺パスツレラ（４菌株）（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）
・アクチノバチルスウレアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｒｅａｅ）
・パスツレラエモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）
・パスツレラエロゲネス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
・パスツレラ近種（４菌株）（ｐｒｏｃｈｅｓ ｄｅ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）
・シクロバクターフェニクロビクズ（４菌株）
（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃｕｓ）
・モラクセラナパラフェニピルビカ（３菌株）
（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｐａｒａｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａ）
・モラクセララクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ）（４菌株）
・モラクセララック属リケファシエンス（７菌株）
（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃ．ｓｐ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
・モラクセラノンリケファシエンス（１３菌株）
（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｎｏｎ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
・ミクロバクターボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）
・アクシノバシラス属（ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）
【００２１】
それとは対照的に、下記に列挙した幾つかの種に関して陽性反応があった。換言すれば、β−アラニンアミノペプチダーゼ反応が検出された：
・セラチアリケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
・シュードモナスエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
・シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
・ブルコデリアセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）
・オクロバクトラムアンソロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ）
ＣＤＣは、疾病監理センターの略である。ＣＤＣグループは、種の名前を待つ菌株グループの名称である。
β−アラニル−β−ナフチルアミド基質、及び、６つの種だけがβ−アラニンアミノペプチダーゼ作用を有するので、特にターゲット部、β−アラニンを特に選択する。それを有しない７９の種について、試験した種のうちでほぼ７１％の種が陽性であった。
【００２２】
ゲル培地で、その種によるオベルディン（ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ）生成物による緑の着色の存在によって、６つの種のうちでシュードモナスエルジノーサを容易に区別することができる。
Ｂ  −β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリン基質試験及びシュードモナスエルジノーサ菌株の検出効率：
次のような方法で、β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリン基質を使用した。次のように、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｆｒａｎｃｅの培地で菌株を分離した：
−羊のコロンビア血統
−羊のＴｒｙｐｔｏｃａｓｅ ｓｏｊａ血統
【００２３】
−Ｍａｃ  Ｃｏｎｋｅｙ（腸内細菌の隔離培地）。
カードＶｉｔｅｋ２（提出商標、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｓａｎｔ  Ｌｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，アメリカ合衆国）の中で、０．３７５〜０．７５０ＭｃＦの濃度に調整されたバクテリア懸濁液を使用して反応を行った。
下記の表１は、既に先行する章で述べた一定の種について、あるいは、新種（例えば、オクロバクトラムアンソロピ  Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）について、試験した基質の意味があるかないかを示している。
【００２４】
アルギニン加水分解（ＡＤＨ）といった単純な試験、あるいは、アセタミドの利用によって、シュードモナスエルジノーサをオクロバクトラムアンソロピ種から分離することができる。
【表１】
0004907822.tif 000008
表１：β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリン基質の効率
基質は、β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリンであるので、特に次のような種を検出するために効果的である：
【００２５】
オクロバクトラムアンソロピ、陽性反応率が１００％であるため。
シュードモナスエルジノーサ、陽性反応率が９７．８％であるため。
−シュードモナスメンドシーナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、陽性反応率が１００％であるため。
試験したサンプルには１３７の種が含まれているので、シュードモナスエルジノーサについて得られた値は特に興味深い。反応しないか、あるいは、反応が悪かった３つの菌株は、その種の生物学的変異性に関連している。
【００２６】
別の種は、β−アラニル−７−アミド−４−メチルクマリンを加水分解する部分的適合性を示している。次のものが問題になる：
−ラルストニアピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉ）、陽性反応率が２０％であるため。
−クロモバクテリウムビオラシューム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、陽性反応率が１０％であるため。
【００２７】
Ｃ  −β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノール基質の試験及びシュードモナスエルジノーサ菌株の検出効率：
羊のコロンビア血統ゲロースで分離後、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びペプトン化及びｐＨ８．５に緩衝した反応地を用いて、β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノール基質を含む、カードＶｉｔｅｋ２（提出商標、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｓａｎｔ Ｌｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，アメリカ合衆国）の液体培地で菌株を試験した。バクテリア懸濁液の濃度は、０．５ＭＦ／ＮａＣｌ４．５ｇ／ｌである。２２〜２４時間の培養後に目視検査を行った。下記の表２は、得られた結果を示している。
【表２】
0004907822.tif 000009
表２：β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノール基質の効率
【００２８】
β−アラニル−４−アミノ−２．６−ジクロロフェノール基質を使用して、シュードモナスエルジノーサ，セルチアリケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ），セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）との非常に有意義な結果を、シュードモナスメンドシーナ及びオクロモバクテリウムビオラセウムとの比較的有意義な結果を得た。従って、この基質を比較的陰性の別の微生物からシュードモナスエルジノーサを区別することができる別の基質と組み合わせる意義がある（第３パラグラフを参照すること）。シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の場合は、操作の問題、あるいは、この種の遺伝的変異性を解釈、発見することは困難である。
【００２９】
しかも、ポリビニールピルビン酸塩（ＰＶＰ）が存在することによって、陽性反応の着色が改善される、ということに言及することができる。
Ｄ  −β−アラニルパラニトロアニリド基質の試験：
先行するパラグラフＣと同じ方法が問題となるが、１９時間の培養後に行う目視検査は除く。β−アラニルパラニトロアニリドを基質として使用した。下記の表３に結果を示した。
【表３】
0004907822.tif 000010
表３：β−アラニルｐ−ニトロアニリド基質の効率
【００３０】
従って、β−アラニンアミノペプチダーゼ酵素作用を持たない別の種に関してシュードモナスエルジノーサの存在を容易に判別できるので、結果は非常に説得力がある。
従って、β−アラニンアミノペプチダーゼ作用を示すことができるβ−アラニンをターゲット部として持つ基質を特にシュードモナスエルジノーサ及び幾つかの別の種（セルチアリケファシエンス Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，シュードモナスマルセッセンス Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ，シュードモナスメドシーナ及びオクロバクトラムアンソロピ）の検出に適合させ、そのサンプル中の存在頻度はシュードモナスエルジノーサに関するよりもはるかに低い。その結果、この酵素作用の存在の検出は、しばしば、被試験生物サンプル中のシュードモナスエルジノーサの存在と関係があるだろう。いずれにせよ、以下のパラグラフに示すように、シュードモナスエルジノーサをβ−アラニンアミノペプチダーゼ作用を有する別の種から区別することができる。
【００３１】
３）その１つがβ−アラニンアミノペプチダーゼ酵素作用である異なる２つの酵素作用を示すための２つの酵素基質の組み合わせた利用：
異なる２つの酵素作用を示すための２つの基質の利用は、特に興味深い。
また、第２章の実例Ａは、シュードモナスエルジノーサ及びシュードモナスメドシーナ種が２つ共β−アラニンアミノペプチダーゼ作用を有するということを示した。いずれにせよ、シュードモナスメドシーナだけが示すβ−グルコソダーゼ作用を探索することによって、この２つの種を区別することができる。例えば、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ．Ｓｔａａｄ，Ｓｕｉｓｓｅから購入できる６−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−グリコピラノシドを用いて、この酵素を明示することができる。
【００３２】
後述のようにゲル培地でこの２つの種の区別を行うことができる。
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｊａ培地に次のものを添加する：
−２００ｍｇの６−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−グリコピラノシド、
−５０ｍｇのβ−アラニルＮ，Ｎ'−ジメチル−ｐ−フェニレン−ジアミン、
−１５ｍｇの３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸
培地を分割し、次のような方法で菌を植え付ける：
−５菌株のシュードモナスエルジノーサ及び５菌株のシュードモナスメドシーナに対応する純粋培養による１０皿、
−２菌株のシュードモナスエルジノーサ及び別のシュードモナスメドシーナの混合液の２皿
【００３３】
ペトリ皿を３５〜３７℃で培養する。１８〜２４時間の培養後に、コロニーの着色を観察する。青色のハローを有する青色コロニーはシュードモナスエルジノーサに対応し、β−アラニンアミノペプチダーゼが存在し、青色のハローを有する紫色のコロニーはシュードモナスメドシーナに対応し、２つのβ−アラニンアミノペプチダーゼ及びβ−グルコソダーゼ作用が存在する。
【００３４】
また、それらが同じサンプル中に存在する場合、同じ培地で、この２つの種に属する菌株混合物を区別することが非常に容易である。この実例は、本発明に従ってシュードモナスエルジノーサを特徴付けるために、同じ反応培地の中で幾つかの酵素反応に応じて幾つかの基質を組み合わせることができる、ということを示している。