(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無置換の水酸基と、基中のＨが１種または２種以上のアセチル基によって置換された水酸基とを有する、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の４４〜４９％である酢酸セルロース、または、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の４１％であるポリ酢酸ビニルである重合体化合物を含有する顆粒球吸着材。
【請求項２】
請求項１記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイス。
【請求項３】
前記容器が液体の入口および出口を備えたものである請求項２記載のデバイス。
【請求項４】
体外循環のための請求項１記載の顆粒球吸着材。
【請求項５】
請求項４記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイスと、体液を送液するためのポンプと、抗凝固剤注入用ポンプとを備える体外循環用の顆粒球除去システム。
【請求項６】
酢酸セルロースまたはポリ酢酸ビニルをアルカリ性条件下で処理して、エステル結合の一部を切断する工程
を含む、請求項１記載の顆粒球吸着材の製造方法。
【請求項７】
哺乳動物の体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、請求項１記載の顆粒球吸着材に接触させることにより得られる、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液。
【請求項８】
（ａ）哺乳動物から取得された体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、請求項１記載の顆粒球吸着材に接触させる工程、および
（ｂ）顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液を回収する工程
を含む、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液の調製方法であって、前記顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液が、再生医療または細胞医療に用いるための、あるいは、医薬組成物の製造のための、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液中の顆粒球を選択的に吸着除去するための顆粒球吸着材、該吸着材の製造方法、該吸着材を用いた顆粒球吸着用デバイスおよび顆粒球除去システム、並びに該吸着材を用いて調製された、顆粒球が除去された体液に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の血液中から選択的に細胞を分離する技術は、癌治療や細胞の成分輸血を始め、特に近年、細胞医療、再生医療の発展に伴いそのニーズはさらに増大している。特に血液中の顆粒球を除去することは、移植後の炎症やＧＶＤＨ（宿主対移植片反応）を抑制するためにも重要な課題となっている。従来、血液中の顆粒球を分離する方法として、フィコール液やパーコール液などを利用し、細胞の比重差を利用して分離する比重密度勾配遠心法や、顆粒球を選択的に付着させるとされる素材、例えばポリエステル繊維、ナイロン繊維、綿などを利用した方法が開示されている（特開昭５４−４６８１２号、特開昭５７−１１９２０号など）。【０００３】
しかしながら、比重密度勾配遠心法の場合、密度勾配に使用する液の細胞毒性などの安全性の問題、また遠心洗浄操作などに時間を要し、開放系での操作であるためにコンタミネーションを起こしやすいなど操作性の問題、リンパ球の混入が生じるなどして分離効率が悪いという問題など多くの課題を残している。一方、比重密度勾配遠心法に比べ、顆粒球を選択的に吸着させる方法は、閉鎖系での操作が可能など安全面、操作性に優れており、さらに接触面積、材質や形状を工夫して分離効率を向上させる試みもなされている。【０００４】
特公昭５８−５４１２６号には、顆粒球吸着材の表面積を増加させる技術が開示されているが、顆粒球以外にリンパ球も吸着する旨が記載されており、接触面積を増加させただけでは、顆粒球の選択性は発現されない。また特開平２−１９３０６９号には、癌患者の病態変化の判断や癌治療に用い得る顆粒球吸着用担体として、リンパ球に比べて顆粒球に対する親和性が高い担体を用いることにより、顆粒球を選択的に吸着させる旨が開示されている。【０００５】
この担体は、水に対する接触角が５５度から９５度の範囲にある物質からなるとされており、顆粒球と高い親和性を有する材質として、ポリスチレン、酢酸セルロース、６−ナイロン、ポリエチレンテレフタレートなどが例示されている。また顆粒球の主構成細胞である好中球について、接触角と付着率に関する同様の報告がある（第１９回医用高分子シンポジウム講演予稿集、ｐ．５１−５２、高分子学会、１９９０年６月１１日）。本報告では、好中球は、接着基質の水に対する接触角が約７０度である材質と高い親和性を有することを報告しており、顆粒球の選択性を発現させるためには、材質の影響が大きいことを報告している。【０００６】
また一方で、特開平５−１６８７０６には、顆粒球の付着性は、材質の接触角には関係なく、接触表面の表面粗さに規定される旨が開示されている。このように顆粒球に対する選択性を発現させるためには、単に接触面積を増加させただけでは効果がなく、接着基質表面の粗さ、親疎水性（接触角）などの要因が関与していることが明らかになっている。しかしながら、接触角や表面粗さを調整した材質を用いても、顆粒球の選択性は満足のいくものではない。顆粒球の選択性をさらに向上させた顆粒球分離材、顆粒球吸着装置、および処理方法の開発が切望されている。【０００７】
また、従来市販されている顆粒球吸着カラムや白血球吸着カラムに関しては、血小板が粘着するという体液適合性上の問題があった。血小板がカラム入口付近に多く粘着することにより、圧力上昇が発生したり、血液中の血小板濃度の低下をまねく。
【特許文献１】特開昭５４−４６８１２号公報
【特許文献２】特開昭５７−１１９２０号公報
【特許文献３】特公昭５８−５４１２６号公報
【特許文献４】特開平２−１９３０６９号公報
【特許文献５】特開平５−１６８７０６公報
【非特許文献１】第１９回医用高分子シンポジウム講演予稿集、ｐ．５１−５２、高分子学会、１９９０年６月１１日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記の従来技術では達成され得なかった、顆粒球を選択的に除去する効率をより一層向上させた顆粒球吸着材、該吸着材の製造方法、該吸着材を用いた顆粒球吸着デバイス、並びに該吸着材を用いて調製された、顆粒球が除去された体液を提供することを目的とする。【０００９】
本発明はまた、体外循環において体液中の顆粒球を選択的に吸着除去する能力を有しかつ高い体液適合性を有する（例えば血小板粘着作用が抑制された）、体外循環用の顆粒球吸着材、およびそれを用いた顆粒球除去システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、酢酸セルロースのような、顆粒球と親和性があることが報告されている、水酸基を有する重合体化合物を、アルカリ溶液との接触により切断可能な結合を介して他の化合物と結合させた重合体化合物−化合物の結合体について、鋭意検討した。その結果、前記結合体から前記化合物の一部が除去されることにより、顆粒球に対する特異的親和性が、リンパ球および単球を含む単核球細胞に対する親和性と比較して、著しく上昇すること、および、血小板との相互作用が軽減するために安定した直接血液灌流が可能になることを見出した。よって、本発明が提供するのは以下の通りである：
（１）無置換の水酸基と、基中のＨが１種または２種以上の置換基Ｒによって置換された水酸基とを有する重合体化合物を含有する顆粒球吸着材。【００１１】
（２）前記重合体化合物が、無置換の水酸基と、基中のＨが１種または２種以上の置換基Ｒによって置換された水酸基とを有するポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール共重合体または多糖類である（１）記載の顆粒球吸着材。【００１２】
（３）置換基Ｒがアシルである（１）または（２）記載の顆粒球吸着材。【００１３】
（４）水不溶性である（１）〜（３）いずれか１項記載の顆粒球吸着材。【００１４】
（５）置換基Ｒによって置換されている水酸基の割合が全水酸基の３５〜５３％である（１）〜（４）いずれか１項記載の顆粒球吸着材。【００１５】
（６）前記重合体化合物が、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の３５〜５３％である酢酸セルロースである（５）記載の顆粒球吸着材。【００１６】
（７）（１）〜（６）いずれか１項記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイス。【００１７】
（８）前記容器が液体の入口および出口を備えたものである（７）記載のデバイス。【００１８】
（９）体外循環のための（１）〜（４）のいずれか１項記載の顆粒球吸着材。【００１９】
（１０）置換基Ｒによって置換されている水酸基の割合が全水酸基の５〜５３％である（９）記載の顆粒球吸着材。【００２０】
（１１）前記重合体化合物が、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の５〜５３％である酢酸セルロースである（１０）記載の顆粒球吸着材。【００２１】
（１２）（９）〜（１１）のいずれか１項記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイスと、体液を送液するためのポンプと、抗凝固剤注入用ポンプとを備える体外循環用の顆粒球除去システム。【００２２】
（１３）（ａ）複数の水酸基を有する重合体化合物の水酸基と１種または２種以上の他の化合物とがアルカリ性条件下で切断可能な様式で結合して形成された重合体化合物−化合物の結合体を得る工程、および
（ｂ）前記結合体をアルカリ性条件下で処理して、前記重合体化合物の水酸基と前記他の化合物との結合の一部を切断する工程
を含む顆粒球吸着材の製造方法。【００２３】
（１４）前記他の化合物がカルボン酸である（１３）記載の方法。【００２４】
（１５）前記重合体化合物がポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール共重合体または多糖類である（１３）または（１４）記載の方法。【００２５】
（１６）哺乳動物の体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、（１）〜（６）のいずれか１項記載の顆粒球吸着材に接触させることにより得られる、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液。【００２６】
（１７）（ａ）哺乳動物から取得された体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、（１）〜（６）のいずれか１項記載の顆粒球吸着材に接触させる工程、および
（ｂ）顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液を回収する工程
を含む、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液の調製方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により得られる顆粒球吸着材を使用することにより、従来技術では達成され得なかった著しく高い顆粒球分離効率を達成することが可能になる。【００２８】
本発明に係るデバイスを用いることにより末梢血や骨髄などの体液中から顆粒球を高い効率で選択的に除去することが可能となる。【００２９】
本発明に係る顆粒球が除去された体液は、心筋再生や血管再生などの再生医療や細胞医療で用いる細胞ソースとして用いることができる。【００３０】
また本発明により得られる顆粒球吸着材を体外循環において用いることにより、血小板の損失を軽減しつつ体液中から顆粒球を高い効率で選択的に除去することが可能となる。【００３１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２５０７４５号および２００５−９１４４５号の明細書に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明における複数の水酸基を有する重合体化合物は合成物であっても天然物であってもよい。本発明における複数の水酸基を有する重合体化合物の例としては、架橋ポリビニルアルコール単独、あるいはポリビニルアルコールとの共重合体、例えばエチレン−ビニルアルコール共重合体、スチレン−ビニルアルコール共重合体、アクリレート−ビニルアルコール共重合体、アクリルアミド−ビニルアルコール共重合体、および多糖類が挙げられる。また本発明における多糖類としては、これらに限定されるものではないが、セルロース、セファロース、デキストラン、アガロース、キチン、キトサンなどが挙げられる。好ましくは、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、セルロース、キトサンなどを使用する。【００３３】
本発明における「他の化合物」としては、前記重合体化合物の水酸基と反応し、重合体化合物−化合物の結合体を形成し得る任意の化合物を使用し得る。ここで、該結合は、アルカリ性条件下で、特に温和なアルカリ溶液との接触により、切断され得るものが好ましい。具体的には、「他の化合物」の非限定的な例としては、無機酸、例えばリン酸、硫酸；有機酸、例えば、飽和または不飽和の分枝または直鎖脂肪族1価、２価または多価カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸；飽和または不飽和の分枝または直鎖芳香族1価、２価または多価カルボン酸、例えば安息香酸；アミノ酸、例えばグルタミン酸；アルコール、例えば、飽和または不飽和の分枝または直鎖脂肪族１価、２価または多価アルコール、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロピルアルコール、シクロヘキサノール、エチレングリコール、グリセリン；飽和または不飽和の分枝または直鎖芳香族１価、２価または多価アルコール、例えばベンゾイルアルコール；が挙げられる。好ましくは、飽和脂肪族カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン酸、ステアリン酸；または安息香酸を使用することができる。【００３４】
前記酸と、複数の水酸基を有する重合体化合物との反応は、適切な触媒、例えば硫酸の存在下、エステル結合を形成させることによって達成し得る。前記アルコールと、水酸基を有する重合体化合物との反応は、適切な触媒、例えば硫酸の存在下、エーテル結合を形成させることによって達成し得る。【００３５】
本発明における「置換基Ｒ」は、前記水酸基を有する重合体化合物の水酸基のＨを置換しうる任意の原子団を意味する。具体的には、「置換基Ｒ」は、水酸基と前記「他の化合物」との反応（典型的には脱水反応）により生じる、前記「他の化合物」に由来する基であると理解される。あるいは、置換基Ｒのために、当業界周知の水酸基の保護基を利用してもよい。水酸基の保護基は、例えば、Ｔ．Ｈ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９９年）に記載されている。【００３６】
水酸基の保護基の例としては、エーテル系の保護基、アセタール系の保護基、シリル系の保護基またはエステル系の保護基が挙げられる。エーテル系の保護基とは水酸基を保護する目的でエーテル結合を形成する保護基を意味し、水酸基のＨと置換されたメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、オクチル基、アリル基、ベンジル基、ｐ−メトキシメチル基、フルオレニル基、トリチル基、ベンズヒドリル基等を挙げることができる。アセタール系の保護基とは水酸基を保護する目的でアセタール結合を形成する保護基を表わし、例えば、メトキシエチル基、エトキシエチル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基等を挙げることができる。シリル系の保護基とは、水酸基を保護する目的でシリルオキシ基結合を形成する保護基を意味し、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等を挙げることができる。また、エステル系の保護基とは、水酸基を保護する目的でエステル結合を形成する保護基を表わし、アセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基等を挙げることができる。【００３７】
前記水酸基の保護基の前駆体化合物は、前記「他の化合物」に含まれることが理解される。【００３８】
好ましい置換基Ｒの例としては、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の、脂肪族アシル（例えばアルコキシカルボニル、アセチル、オレイルなど）、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の芳香族アシル（例えばアリールオキシカルボニル、ベンゾイル、シンナモイルなど）、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシなどが挙げられ、より好ましい置換基Ｒとしては脂肪族または芳香族の、飽和アシル（例えばベンゾイルなど）が挙げられ、最も好ましくはアセチルが挙げられる。前記置換基は任意の置換基例えばハロゲンで置換されてもよい。【００３９】
本発明に係る顆粒球吸着材は、（ａ）複数の水酸基を有する重合体化合物の水酸基と１種または２種以上の他の化合物とがアルカリ性条件下で切断可能な様式で結合して形成された重合体化合物−化合物の結合体を得る工程、および（ｂ）前記結合体をアルカリ性条件下で処理して、前記重合体化合物の水酸基と前記他の化合物との結合の一部を切断する工程を含む方法により製造することができる。【００４０】
工程（ａ）について。前記重合体化合物−化合物結合体（例えば酢酸セルロース、ポリ酢酸ビニル）は商業的に入手可能である。また前記重合体化合物と他の化合物とを自体公知の方法にしたがって反応させて重合体化合物−化合物結合体を入手することも可能である。例えばパルプ等より得られるセルロースに、無水酢酸等を含むアセチル化剤を添加することによって酢酸セルロースを得ることができる。或いは、水酸基を有する重合体化合物（例えばセルロース）を、自体公知の方法により、他の化合物（例えば酢酸）と反応させることによっても酢酸セルロースを得ることができる。更にまた、水酸基を有する単量体化合物と他の化合物とが結合したものを重合させることにより前記結合体を得ることも可能である。例えば、ポリ酢酸ビニルは、単量体酢酸ビニル、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）などからなる混合物を、水、ポリビニルアルコールなどを含む水相に仕込み、平板状の撹拌翼と２枚の邪魔板を有するセパラブルフラスコ中で室温にて、十分な撹拌混合および窒素置換を行い、内温を６５℃に５時間保持して懸濁重合することにより得ることができる。【００４１】
工程（ｂ）について。前記重合体化合物−化合物結合体には、前記重合体化合物の水酸基と前記他の化合物との結合が複数含まれている。工程（ｂ）では前記結合体を温和なアルカリ性条件下で処理することにより、前記複数の結合の一部を例えば加水分解反応により切断する。切断の程度は結合体の種類および顆粒球吸着材の使用目的に応じて適宜調整できる。本発明の顆粒球吸着材としては、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基（無置換水酸基と置換水酸基を含む）の好ましくは３５〜５３％、より好ましくは３５〜４９％であるポリ酢酸ビニルが使用できる。本発明の顆粒球吸着材としては、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基（無置換水酸基と置換水酸基を含む）の好ましくは３５〜５３％、より好ましくは４０〜５３％、より一層好ましくは４５〜５１％である酢酸セルロースが使用できる。また、本発明の顆粒球吸着材を体外循環の用途で用いる場合には、重合体化合物の全水酸基（無置換水酸基と置換水酸基を含む）のうち置換基Ｒにより置換されている水酸基の割合は５〜５３％であることが好ましく、５〜５０％であることがより好ましい。【００４２】
本明細書において「重合体化合物の全水酸基（無置換水酸基と置換水酸基を含む）のうち置換基Ｒにより置換されている水酸基の割合」を、「水酸基の置換基Ｒによる置換率」、「置換基Ｒによる置換率」または単に「置換率」と称することがある。【００４３】
酢酸セルロースの水酸基のアセチル基による置換率（％）は、例えば以下のように測定することができる。被検物質を十分に乾燥させた後、乾燥重量を精密天秤にて測定し（０．５ｇ前後）、フラスコに入れる。被検物質を溶解し得る溶媒（例えばアセトン水溶液）を５０ｍｌ添加し、室温にて１時間、スターラーにて攪拌する。次に０．２規定水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌを添加し、５分間攪拌後、３時間室温にて静置する。次に０．２規定塩酸５０ｍｌを該フラスコ中に入れ５分間攪拌後、１時間室温にて静置する。次にフェノールフタレイン液２，３滴をフラスコ中に入れ、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液をビュレットにて滴下し、溶液が淡い赤色に変化したときを終点として、滴定量（Ａ（ｍｌ））を求める。また被検物質を入れない以外は前記と同様の操作を行って同様に滴定量（Ｂ（ｍｌ））を求める。以上の測定から酢酸セルロースのアセチル基による置換率（％））は、下式により求めることができる。【００４４】
置換率（％）＝（Ａ−Ｂ）Ｆ×０．６００５／被検物質重量（ｇ）
Ｆ：滴定に使用した０．１規定水酸化ナトリウム水溶液のファクター
温和なアルカリ性条件は、当業者が過度の実験なくして達成できる。【００４５】
酢酸セルロース以外の他の重合化合物（ポリ酢酸ビニル等）の水酸基の置換基Ｒによる置換率（％）は、元素分析や赤外吸収スペクトルなどによる分析により、或いは、公知の方法でケン化率を求めた後にその数値から逆算（置換率＝１００−ケン化率（％））することにより求められる。元素分析により水酸基の置換率を求める場合は、ジェイ・サイエンス・ラボ製の元素分析装置（マイクロコーダーＪＭ１０型）等を使用することができる。【００４６】
工程（ａ）で得られる重合体化合物−化合物の結合体が酢酸セルロース等の水酸基置換多糖類である場合、工程（ｂ）における部分的分解反応は次の条件で行われることが好ましい。アルカリ溶液の規定度は０．０１Ｎ（規定）から２．０Ｎの範囲が好ましく、０．０５Ｎから１Ｎの範囲がより好ましく、０．０７Ｎから０．５Ｎの範囲が最も好ましい。反応時間は１分間から１２０分間の範囲が好ましく、１分間から１００分間の範囲がより好ましく、５分間から６０分間の範囲がより好ましく、１０分間から４０分間の範囲が最も好ましい。反応温度は１０℃から９０℃の範囲が好ましく、１５℃から７５℃の範囲がより好ましく、２０℃から５８℃の範囲が最も好ましい。【００４７】
工程（ａ）で得られる重合体化合物−化合物の結合体がポリ酢酸ビニルである場合、工程（ｂ）における部分的分解反応は次の条件で行われることが好ましい。アルカリ溶液の規定度は０．０１Ｎ（規定）から６．０Ｎの範囲が好ましく、０．１Ｎから５．０Ｎの範囲がより好ましく、１Ｎから３．８Ｎの範囲が最も好ましい。反応時間は約１分間から１０時間の範囲が好ましく、３０分間から６時間の範囲がより好ましく、１時間から５．５時間の範囲が最も好ましい。反応温度は１０℃から９０℃の範囲が好ましく、１５℃から７５℃の範囲がより好ましく、２０℃から５８℃の範囲が最も好ましい。【００４８】
アルカリ溶液中には、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコールが添加されていてもよい。この場合、アルコールの含有率は、０．１％（Ｖ／Ｖ）から９９％（Ｖ／Ｖ）の範囲内にあれば、いずれの含有率で処理してもよいが、５％（Ｖ／Ｖ）から５０％（Ｖ／Ｖ）が好ましく、１０％（Ｖ／Ｖ）から４０％（Ｖ／Ｖ）がより好ましい。【００４９】
所望であれば工程（ｂ）の後、前記切断生成物を精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、例えば水洗等の洗浄により精製を行うことができる。【００５０】
本発明の顆粒球吸着材は水不溶性であることが好ましい。【００５１】
本発明において「体液」には血液、骨髄液、臍帯血、リンパ液、それらの希釈液等が包含される。本発明には前記体液に由来する細胞懸濁液も使用できる。細胞懸濁液とは、血液、骨髄液、臍帯血、リンパ液などを哺乳動物から採取し、所望によりフィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）などを使用し、比重密度遠心分離法により赤血球を除去した画分（単核球画分、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、顆粒球などの細胞が含まれる画分）や、さらにこれらの画分を再度遠心分離して濃縮したものなどを指す。【００５２】
本発明の顆粒球吸着材は、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等の任意の形状に加工することができる。球状または粒状の場合、平均粒径は約５０μｍ〜３０００μｍであることが好ましく、より好ましくは約８０〜２０００μｍ、最も好ましくは約１００〜１０００μｍである。球状または粒状である本発明の顆粒球吸着材は例えば以下の通り調製される。１種または２種以上の原料モノマー化合物を、適当な粘性の溶媒、例えば水中に分散、懸濁させ、懸濁液を攪拌しつつ重合反応に適当な条件下で重合化させ所定の形状の重合体を得る。あるいは、ポリマーを溶媒に溶解し、特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固浴で捕捉することにより凝固させ所定の形状のものを得る。前記工程（ｂ）はこの工程の前後一方または両方の時点で行うことができる。【００５３】
所望により本発明の顆粒球吸着材の表面を、物理的あるいは化学的手段によって粗面化する処理を行ってもよい。【００５４】
本発明の顆粒球吸着材の表面は多孔質体、非多孔質体、あるいはスキン層構造など、あらゆる種類の構造をとり得る。表面が多孔質体の場合、顆粒球吸着と同時に顆粒球を含む他の血液細胞が産生するサイトカイン類、活性化に伴い産生される酵素、惹起物質などの生体にとって好ましくない物質を合わせて吸着除去することもできる。細孔の大きさは、排除限界分子量で規定され、本発明の顆粒球吸着材が多孔質体である場合は、排除限界分子量が１．５×１０５以下であることが好ましい。より好ましくは１．４×１０５以下のものが用いられる。１．４×１０５より大きくなると非特異吸着が大きくなり、体液中の有用蛋白質の損失が起こる場合がある。非特異吸着の影響をより少なくするためには、排除限界分子量１．３×１０５以下のものがより好ましく、１．２×１０５以下のものが更に好ましく、１．０×１０５以下のものが最も好ましい。排除限界分子量とは、例えば「実験高速液体クロマトグラフィ」（波多野博行および花井俊彦著、（株）化学同人発行）などの成書に記載されているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィにおいて細孔内に侵入できない、すなわち排除される分子のうち最も小さい分子量を有するものの分子量をいう。本発明のためには、多孔質体は水不溶性であるのが好ましい。【００５５】
本発明の顆粒球吸着材はそれ自体単独で用いてもよいが、任意の硬質担体、軟質担体と組み合わせて用いることもできる。例えば核となる担体の外表面を本発明の顆粒球吸着材で被覆したものを用いることができる。担体としては、ガラス、シリカゲル、活性炭などの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、さらにはこれらの組み合わせによって得られ得る有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例として挙げられるが、これらのみには限定されない。担体の形状としては、この場合も、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられる。担体が球状または粒状である場合、平均粒径は約５０μｍ〜３０００μｍであることが好ましく、より好ましくは約８０〜２０００μｍ、最も好ましくは約１００〜１０００μｍである。【００５６】
本発明の顆粒球吸着材をカラムに充填して使用する場合は、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要である。そのためには、本発明の顆粒球吸着材は充分な機械的強度が要求される。したがって本発明の顆粒球吸着材は硬質のものであることがより好ましい。例えば本発明の顆粒球吸着材が粒状ゲルの形態である場合、後記参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流量の関係が約０．３ｋｇ／ｃｍ２までの直線関係にあるものであることが好ましい。【００５７】
本発明において「顆粒球」は、哺乳類末梢血、骨髄、臍帯血中の顆粒球、アファレーシスにより濃縮された白血球中の顆粒球、フィコール、バクティナーチューブ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）などを用いた密度勾配遠心法にて分取された白血球画分中の顆粒球、または、これらの方法にて分取された白血球画分を緩衝液中や培養液、生理食塩液中に懸濁した細胞懸濁液中の顆粒球などを指す。【００５８】
本発明の顆粒球吸着材を用いた顆粒球の吸着方法としては種々の方法が可能である。このような方法としては代表的には次の（１）〜（３）の方法が挙げられる。（１）体液または細胞懸濁液の流入口および流出口を有し、体液または細胞懸濁液は通過するが顆粒球吸着材は通過しないフィルターを流出口に装着した容器へ顆粒球吸着材を充填してなるデバイスに、体液または細胞懸濁液を通液して接触させる方法。（２）予め顆粒球吸着材が収容されたバッグに、体液または細胞懸濁液を加え、体液または細胞懸濁液と顆粒球吸着材とを一定時間接触させた後、顆粒球吸着材を濾別する方法。（３）細胞培養系に顆粒球吸着材を共存させ、培養の途中、あるいは終了時に細胞と顆粒球吸着材を濾別する方法。【００５９】
（１）の方法においては種々の接触方法が可能である。接触方法としては例えば、体液または細胞懸濁液を送液ポンプなどにより灌流状態で一定時間接触させる方法や、灌流せずに一定の流速で接触させる方法、灌流せずに一定時間接触させた後に一定流速で押し出す方法などがある。接触時間は、１分間以上であることが好ましい。顆粒球吸着を十分に行うためには、接触時間はより好ましくは約３分間〜４時間、より好ましくは約５分間〜３時間、最も好ましくは約１０分間〜２時間である。【００６０】
（２）の方法としてはより具体的には、予め顆粒球吸着材が収容されたバッグに、採取された体液を加えて顆粒球吸着材と体液とを接触させる方法、予め顆粒球吸着材が収容されたバッグに、血液から遠心分離などで赤血球を除去して得られた赤血球除去画分、または該赤血球除去画分を更に遠心分離等で濃縮して得られた画分を加えて顆粒球吸着材と前記画分とを接触させる方法、アフェレーシス等で分取した白血球画分と顆粒球吸着材をバッグ内に注入して顆粒球吸着材と前記画分とを接触させる方法などがある。接触時間は、約１分間以上であることが好ましい。顆粒球吸着を十分に行うためには、接触時間はより好ましくは約３分間〜４時間、より好ましくは約５分間〜３時間、最も好ましくは約１０分間〜２時間である。【００６１】
（３）の方法としてはより具体的には、体液あるいは血液から遠心分離などで赤血球を除去して得られた赤血球除去画分（細胞懸濁液）を一定期間培養している系に顆粒球吸着材を直接に添加して共存させ、所定時間後に、顆粒球吸着材は通過しないフィルターにて、顆粒球吸着材と細胞懸濁液を濾別する方法が挙げられる。【００６２】
前記（１）及び（２）の方法は操作も簡単であり、体液または細胞懸濁液中から顆粒球を吸着除去する方法として特に好ましい。ただし本発明はこれらに限定されない。【００６３】
本発明はまた顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイスに関する。前記デバイスに用いる容器の形態、材質、大きさには特に限定はない。形態は、球、コンテナ、バッグ、チューブ、カラムなど任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば容量約０．１〜５００ｍｌ程度、直径約０．１〜１０ｃｍ程度の透明または半透明の筒状容器などが挙げられる。容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる。具体的な構造材料としては例えば非反応性ポリマーまたは生物親和性金属もしくは合金が挙げられる。該ポリマーとしては、アクリロニトリルポリマー（例えばアクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等）、ハロゲン化ポリマー（例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレ、ヘキサフルオロプロピレン等）、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン等が挙げられる。容器のために有用な金属材料としては、例えばステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、および窒化チタン被覆ステンレス鋼が挙げられる。耐滅菌性を有する素材が特に好ましく、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどが挙げられる。【００６４】
前記デバイスは、これに限定されるものではないが、好ましくは、液の入口および出口を有し、かつ体液は通過するが顆粒球吸着材は通過しない流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性である本発明の顆粒球吸着材を充填、あるいは懸濁してなるものからなることを特徴とする。前記流出防止具としては、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターが挙げられる。【００６５】
前記デバイスを使用する際には抗凝固剤が用いられることが好ましい。抗凝固剤としては、ヘパリン、低分子量ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキサート、アルガトロバン、アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）やシトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）などのクエン酸含有抗凝固剤などいずれを用いてもよい。なかでもヘパリンは一般的に最も好ましく用いられる抗凝固剤として挙げることができる。【００６６】
本発明はまた、哺乳動物の体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、本発明の顆粒球吸着材に接触させることにより得られる、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液に関する。顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液は、（ａ）哺乳動物から取得された体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、本発明の顆粒球吸着材に接触させる工程、およびその後の（ｂ）顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液を回収する工程を含む方法により調製することができる。前記（ｂ）における回収は、遠心分離、メンブラン濾過、クロマトグラフ等の任意の方法で実施することができる。当業者は回収方法として実験的または経験的に適当な方法を見出すことができる。【００６７】
顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液中の目的とする細胞の濃度は、更に遠心分離操作を行うことにより高めることができる。或いはまた、顆粒球が吸着除去された体液または細胞懸濁液中の目的とする細胞を、フィコール、フィコールハイパック（Ficoll-Hypaque）、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップなどを使用して濃縮することもできる。【００６８】
本発明の顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液中の細胞は、細胞治療や再生医療のための細胞として使用することができる。細胞治療や再生医療の目的としては、血管再生、心筋再生、骨再生、軟骨再生、神経再生、脂肪組織再生などが挙げられる。本発明の顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液は、調製後に直ちに使用してもよいし、冷蔵保存、凍結保存後に解凍して使用してもよい。【００６９】
本発明の顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液は、薬学的に許容される他の担体、賦形剤等と組み合せることにより、医薬組成物として使用することができる。かかる医薬組成物は、典型的には、輸血、点滴、注射等の方法により患部に直接投与する、或いは経血管的に患部に投与するための医薬組成物である。かかる医薬組成物は、許容される薬学的手法に従って製造可能である。【００７０】
本発明はまた、顆粒球が除去された哺乳動物の体液または細胞懸濁液、それらから調製された細胞医療または再生医療のための細胞、あるいは上記医薬組成物を用いた、疾患の予防または治療方法に関する。本方法は、具体的には、閉塞性の動脈硬化症などの血管閉塞症や、心筋梗塞などの心不全を対象とした血管再生、骨、軟骨再生、歯根膜、歯槽骨の再生などに関するものであるが、これらには限定されない。【００７１】
本発明の顆粒球吸着材は体外循環、典型的には血液灌流方式の体外循環により体液中の顆粒球を選択的に除去して疾患を改善するための用途に特に適したものである。本方法により治療される疾患としては顆粒球が関与して炎症が惹起される疾患（例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病）などが挙げられるが、これらには限定されない。【００７２】
本発明はまた体外循環用の顆粒球除去システムに関する。本発明の体外循環用の顆粒球除去システムは、少なくとも、本発明の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイスと、体液を送液するためのポンプと、抗凝固剤注入用ポンプとを備える。デバイスおよび抗凝固剤についてはさきに説明した通りである。【００７３】
本発明の顆粒球除去システムの体外循環における代表的な使用方法としては、前記デバイスに体液を直接接触させる方法がある。該接触方法としては、体液を送液ポンプなどにより灌流状態で一定時間接触させる方法がある。十分な顆粒球吸着のためには接触時間は１分間以上が好ましく、約３分〜４時間がより好ましく、５分〜３時間が更に好ましく、約１０分〜２時間が最も好ましい。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明の方法を実施例に基づいて具体的に説明する。【００７５】
（実施例１）
１．顆粒球吸着材の調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３―１１７０３９号広報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約３００μｍであった。この粒子を沈降体積比で、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液と１：１（Ｖ／Ｖ）の割合で混合し、３０分間接触させることにより、部分加水分解反応を行った。吸着体沈降体積の約２００倍量の蒸留水にて洗浄後、生理食塩液（最終濃度で５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む）にて置換を行った。こうして得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、４９％であった。【００７６】
２．ウサギ骨髄液の調製
ヘパリンを最終濃度２２ ＩＵ／ｍｌになるようにリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に添加し、５０ｍｌ遠沈管に該溶液を６ｍｌ添加した。そこにウサギ（メス  ３．５ｋｇ）上腕骨頭部より採取した骨髄液を約２０ｍｌ加えた。該骨髄液を７０μｍセルストレーナーを通過させることにより血餅、骨粉などを取り除くことにより骨髄液を調製した。【００７７】
３．骨髄液−顆粒球吸着材の接触条件
顆粒球吸着材を沈降体積で１ｍｌ計量した後に、５ｍｌファルコンチューブに移送し、顆粒球吸着材を吸い取らないように生理食塩液を除去した。直後に先に調製した骨髄液を２ｍｌ添加し、回転数２０ｒｐｍ（ＭＩＸローター（ＭＩＸ−ＲＯＴＡＲ  ＶＭＲ−５，  ｉｕｃｈｉ（株）））、３７℃、１Ｈｒ相互作用した。所定時間後、上清を約１ｍｌ採取し自動血液細胞数カウンター（シスメックスＫ４５００）にて細胞数を測定した。また、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ベクトンディッキンソン）にて単核球・顆粒球両画分比率を求めた。【００７８】
その結果、上清中の白血球数は、５１００cells/μlであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が８４．６％、顆粒球画分比率が４．０％となり、顆粒球画分の細胞が該顆粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らかになった。【００７９】
（実施例２）
水酸化ナトリウム溶液の規定度を０．２規定に変えたほかは、実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。こうして得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は４６％であった。その結果、上清中の白血球数は、６１００cells/μlであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が７９．０％、顆粒球画分比率が９．２％となり、顆粒球画分の細胞が該顆粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らかになった。【００８０】
（実施例３）
酢酸ビニル単量体１００重量部、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）２４重量部、酢酸エチル１３１．５重量部、ヘプタン４８．２重量部、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡｃ）（平均重合度８００）１２．８重量部、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）５．０重量部よりなる単量体混合物５０１．６ｇを、水６９１．５重量部、ポリビニルアルコール０．１０３重量部、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム０．０２３重量部、微粒子状の第三リン酸カルシウム５．１５重量部（固形分）、亜硝酸ナトリウム０．０３９重量部を含む水相１０４５．２ｇがあらかじめ仕込まれた、平板状の撹拌翼と２枚の邪魔板を有する２Ｌセパラブルフラスコ中に室温で添加した。十分な撹拌混合および窒素置換を行った後、内温を６５℃に５時間保持して懸濁重合させた。所定時間の重合の後、セパラブルフラスコの内容物を室温まで冷却した。得られた重合スラリーをサンプリングして重量を測定し、重合禁止剤を添加して１２０℃のオーブンで揮発分を乾燥させ、恒量を確認して乾燥重量を測定した。当該乾燥条件では、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）の減量はわずかであることから、乾燥前後の重量より酢酸ビニルの重合転化率を計算したところ５４％であった。【００８１】
次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸を加えてｐＨを２以下に調整し第三リン酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液のｐＨが中性付近になったことを確認した後、水をアセトンで置換し、アセトンを加えて室温で３０分間撹拌する抽出洗浄を２回繰り返した。次いでアセトンを水で置換した後、酢酸ビニル単位に対して過剰量となるよう下式の量の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を水溶液として加えた。【００８２】
ＮａＯＨ（固形分重量）＝粒子乾燥重量／８６．０９×４０×１．５
なお水に対するＮａＯＨ濃度が２重量％になるように水量は調整した。これを撹拌下、反応温度３０℃で２時間保持して部分鹸化を行った。こうして得られたポリ酢酸ビニルのアセチル基による置換率は４１％であった。その後、洗浄液のｐＨが中性付近になるまで水洗し、次いで温水を加えて８０℃で６０分間撹拌する抽出洗浄を４回繰り返した。さらに粒子沈降体積の２倍量の温水を加えて１２１℃のオートクレーブで２０分間の抽出を２回行い、架橋球形粒子を得た。得られたポリマー粒子の粒径は、約３００μｍであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例１と同様の方法でウサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、６３００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が６９．５％、顆粒球画分比率が１９．５％となり、顆粒球画分の細胞が該顆粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らかになった。【００８３】
（比較例１）
水酸化ナトリウム溶液の規定度を０．４規定に変えたほかは、実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、３３％であった。その結果、上清中の白血球数は、８５００cells/μlであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が６０．２％、顆粒球画分比率が２９．６％となり、参考例１（下記）と同等であった。【００８４】
（比較例２）
水酸化ナトリウム溶液による処理を行わなかった以外は、実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、５５％であった。その結果、上清中の白血球数は、７２００ｃｅｌｌｓ/μlであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が６５．６％、顆粒球画分比率が２３．０％となり、参考例１（下記）と同等であった。【００８５】
（比較例３）
水酸化ナトリウムの処理時間を１２０分に変えたほかは、実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、３３％であった。その結果、上清中の白血球数は、９５００ｃｅｌｌｓ/μlであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５４．９％、顆粒球画分比率が３１．３％となり、参考例１（下記）と同等であった。【００８６】
（参考例１）
顆粒球吸着材と接触させていないウサギ骨髄液を使用した以外は実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、１０２００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５６．２％、顆粒球画分比率が３０．９％であった。【００８７】
なお、実施例１〜３、及び比較例１〜３、参考例１の白血球数、及び該白血球の構成細胞である顆粒球画分、単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率を表１にまとめた。
【表１】
0004925829.tif 000002
【００８８】
（実施例４）
水酸化ナトリウムの最終規定度が０．２Ｎになるように調製した混合溶媒（５（蒸留水）：９５（エタノール））を使用した以外は、実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、４４％であった。その結果、上清中の白血球数は、３８００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が８５．８％、顆粒球画分比率が５．５％となり、顆粒球画分の細胞が該顆粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らかになった。【００８９】
（比較例４）
顆粒球吸着材の原料をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）に変えた点およびアルカリ処理を行わなかった点以外は実施例１と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得られたＰＭＭＡの球形粒子の粒径は、約３００μｍであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例１と同様の方法でウサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、５３００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５４．６％、顆粒球画分比率が３７．７％となり、参考例２（下記）と同等であった。【００９０】
（比較例５）
顆粒球吸着材の原料をポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）に変えた点およびアルカリ処理を行わなかった点以外は実施例１と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得られたＰＡＮの球形粒子の粒径は、約３００μｍであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例１と同様の方法でウサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、５６００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５４．１％、顆粒球画分比率が３６．４％となり、参考例２（下記）と同等であった。【００９１】
（比較例６）
顆粒球吸着材の原料をポリスチレン（ＰＳｔ）に変えた点およびアルカリ処理を行わなかった点以外は実施例１と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得られたＰＳｔの球形粒子の粒径は、約３００μｍであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例１と同様の方法でウサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、５１００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５３．７％、顆粒球画分比率が３８．３％となり、参考例２（下記）と同等であった。【００９２】
（比較例７）
顆粒球吸着材の原料をポリスルホン（ＰＳ）に変えた点およびアルカリ処理を行わなかった点以外は実施例１と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得られたＰＳの球形粒子の粒径は、約３００μｍであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例１と同様の方法でウサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、５８００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５４．１％、顆粒球画分比率が３７．１％となり、参考例２（下記）と同等であった。【００９３】
（参考例２）
顆粒球吸着材と接触させていないウサギ骨髄液を使用した以外は、実施例１と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、６３００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が５４．７％、顆粒球画分比率が３７．８％であった。【００９４】
なお、実施例４、及び比較例４〜７、参考例２の白血球数、及び該白血球の構成細胞である顆粒球画分、単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率を表２にまとめた。
【表２】
0004925829.tif 000003
【００９５】
（実施例５）
１．顆粒球吸着材の調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約３００μｍであった。この粒子を沈降体積比で、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液と１：１（Ｖ／Ｖ）の割合で混合し、３０分間接触させることにより、部分加水分解反応を行った。吸着体沈降体積の約２００倍量の蒸留水にて洗浄後、生理食塩液（最終濃度で５ ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む）にて置換を行った。こうして得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、４９％であった。【００９６】
２．血液−顆粒球吸着カラムの接触条件
得られた上記吸着材をヘパリン（ヘパリンナトリウム注射液、吉富製薬（株））加生理食塩水（ヘパリンの最終濃度が５ ＩＵ／ｍｌになるように調製）により洗浄し、ヘパリンの平衡化を行った。次に担体の脱泡を行った後、沈降体積で３．０ｍｌをミニカラム（アクリル製，内径１０ｍｍ，高さ３８ｍｍ）に充填した。カラム入口側にポリ塩化ビニル製のチューブ（内径１ｍｍ，外径３ｍｍ，長さ７０ｃｍ）を装着し、またカラム出口側にも同様のポリ塩化ビニル製のチューブ（長さ３０ｃｍ）を装着した。血液は健常人ボランティアより１８Ｇの注射針を用い上腕部より注意深く採血した。抗凝固剤としてはヘパリンを使用し、血液中のヘパリン濃度は５ ＩＵ／ｍｌとした。抗凝固剤を添加した血液は、テフロン（登録商標）製三角フラスコ内（内容量５０ｍｌ，サンワ（株））に４０ｍｌ入れ、３７℃の恒温槽内に静置し、５ｍｉｎに一度穏やかに攪拌した。次に流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで通血実験を開始した。カラム出口側から血液が出てきた時点を開始時点として、出口側チューブの先端を血液プールに戻し、灌流実験を１２０分間行った。なおカラム出口側からのサンプリング時間は、３０分、６０分、１２０分とした。【００９７】
［血球数の測定］
所定時間後にカラム出口側の血液を採取し、血球数(赤血球，白血球，血小板)を血球計数装置(Ｋ−４５００  シスメックス（株）)にて測定した結果を表３に示した。また顆粒球と単核球（リンパ球，単球）の両画分比率をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ベクトンディッキンソン）にて測定した結果を表４に示した。【００９８】
その結果、カラム出口側の白血球数は平均で約１５００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。一方、吸着材を充填していない空のカラムを用いた場合（参考例３）は平均で約６５００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。このように本発明の実施例ではカラム出口側の白血球数が著しく減少した。赤血球、血小板に関しては参考例と比較してほとんど変化は認められなかった（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、吸着材を充填していない空のカラムを用いた場合（参考例３）が単核球画分比率が約３５％顆粒球画分比率が約６３％であったのに対して、カラム通過後は単核球画分比率が約９６％、顆粒球画分比率が約３％であり、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかになった（表４）。【００９９】
（実施例６）
水酸化ナトリウム溶液の規定度を０．２規定に変えたほかは、実施例５と同様の方法で血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は４６％であった。その結果、カラム出口側の白血球数は平均で約１９００ｃｅｌｌｓ／μｌであり、参考例３に比較して大幅に減少していることが明らかになった。赤血球、血小板に関しては、ほとんど変化は認められなかった（表３）。また白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約９０％、顆粒球画分比率が約９％であり、参考例３に比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかになった（表４）。【０１００】
（実施例７）
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約５００μｍであった。この粒子を実施例５と同様の方法にてアルカリ処理を行い（得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、４８．６％であった）、血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は平均で約２２００ｃｅｌｌｓ／μｌであり、参考例３に比較して大幅に減少していることが明らかになった。赤血球、血小板に関しては、ほとんど変化は認められなかった（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約８７％、顆粒球画分比率が約１０％であり、参考例３に比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかになった（表４）。【０１０１】
（実施例８）
実施例３で調製したポリ酢酸ビニルの球形粒子を用いた以外は実施例５と同様の方法で血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約２２００ｃｅｌｌｓ／μｌと参考例３に比較して大幅に減少していることが明らかになった。赤血球、血小板に関しては、ほとんど変化は認められなかった（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約９０％、顆粒球画分比率が約９％であり、参考例３に比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかになった（表４）。【０１０２】
（比較例８）
水酸化ナトリウム溶液による処理を行わなかった以外は、実施例５と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのアセチル基による置換率は、５４．０％であった。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約３７００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。赤血球数の変化は認められなかったが、血小板数は実施例に比較して、低下傾向を示した（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約７１％、顆粒球画分比率が約２５％であり、参考例３に比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に吸着されているものの上記実施例には及ばなかった（表４）。【０１０３】
（比較例９）
実施例８で得られた粒子を、水酸化ナトリウム処理しない（鹸化反応せず）こと以外は、実施例５と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。得られたポリ酢酸ビニルのアセチル基による置換率は５５％であった。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約３５００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。赤血球数の変化は認められなかったが、血小板数は実施例に比較して、低下傾向を示した（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約４４％、顆粒球画分比率が約５２％であり、顆粒球の選択性はほとんど認められなかった（表４）。【０１０４】
（比較例１０）
実施例８の鹸化条件を、ＮａＯＨ濃度が４重量％、反応温度４０℃、反応時間６時間で処理した以外は実施例８と同様の方法にて、ＰＶＡの球形粒子を得た。得られたポリ酢酸ビニルのアセチル基による置換率は４％であった。粒径は、約３００μｍであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例５と同様の方法で血液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約５７００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。赤血球数の変化は認められなかったが、血小板数は実施例に比較して、低下傾向を示した（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が３１％、顆粒球画分比率が６５％であり、参考例３と同等であった（表４）。【０１０５】
（比較例１１）
粒子の原料をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）に変えた点およびアルカリ処理を行わなかった点以外は実施例５と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約５６００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。赤血球数の変化は認められなかったが、血小板数は減少傾向を示した（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約３１％、顆粒球画分比率が約６５％であり、参考例３と同等であった（表４）。【０１０６】
（比較例１２）
粒子の原料をポリスチレン（ＰＳｔ）に変えた点およびアルカリ処理を行わなかった点以外は実施例５と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約５２００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。赤血球数の変化は認められなかったが、血小板数は著しく減少した（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約３２％、顆粒球画分比率が約６３％であり、参考例３と同等であった（表４）。【０１０７】
（参考例３）
粒子を充填していないカラムを用いた以外は、実施例５と同様の方法で白血球数、及び単核球・顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約６５００ｃｅｌｌｓ／μｌであった。赤血球数の変化は認められなかったが、血小板数は著しく減少した（表３）。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率は、単核球画分比率が約３５％、顆粒球画分比率が約６３％であった（表４）。【０１０８】
以上のことから、本発明の顆粒球吸着材及び顆粒球除去システムを用いることにより、直接血液灌流方式の体外循環にて、体液中から血小板のロスを軽減しつつ顆粒球を高い効率で選択的に除去することが可能となることが明らかとなった。【０１０９】
なお、実施例５から８、及び比較例８から１２、参考例３の各時点でのカラム出口側の血球数を表３にまとめた。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、単核球画分（リンパ球画分＋単球画分）の比率を表４にまとめた。
【表３】
0004925829.tif 000004
【表４】
0004925829.tif 000005
【０１１０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。