(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属微粒子を標識物質として用いるとともに、電気化学測定法を利用する被検物質の測定方法であって、
生物学的相互作用を利用して前記金属微粒子を少なくとも作用極表面に局在化させる工程と、
前記作用極の表面に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化して溶出させる工程とを有し、
少なくとも前記金属微粒子を酸化する工程において前記作用極からの前記溶出物の拡散を抑えることを特徴とする被検物質の測定方法。
【請求項２】
金属微粒子を標識物質として用いる被検物質の測定方法であって、
生物学的相互作用を利用して前記金属微粒子を少なくとも作用極表面に局在化させる工程と、
前記作用極の表面に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化して溶出させる工程と、
電気化学的な酸化による溶出物を電気化学的に還元する際の電流値を前記作用極で測定する工程とを有し、
前記金属微粒子を酸化する工程及び前記還元電流値を測定する工程において前記作用極の表面に平坦な表面を有する対向部材を近接させることを特徴とする被検物質の測定方法。
【請求項３】
前記作用極と前記対向部材との間隔を５０μｍ以下とすることを特徴とする請求項２記載の被検物質の測定方法。
【請求項４】
前記対向部材の前記作用極と対向する表面の算術平均粗さＲａが２０μｍ以下であることを特徴とする請求項２記載の被検物質の測定方法。
【請求項５】
金属微粒子を標識物質として用いる被検物質の測定方法であって、
生物学的相互作用を利用して前記金属微粒子を少なくとも作用極表面に局在化させる工程と、
前記作用極とは異なる対向電極を前記作用極の表面に近接させた状態で、前記作用極の表面に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化して溶出させるとともに、前記対向電極の表面に前記金属微粒子を構成する金属を電気化学的に析出させる工程と、
前記対向電極に析出した金属を電気化学的に酸化して溶出させる工程と、
析出金属を酸化する工程後の電気化学的な酸化による溶出物を電気化学的に還元する際の電流値を前記対向電極で測定する工程とを有することを特徴とする被検物質の測定方法。
【請求項６】
金属微粒子を標識物質として用いる被検物質の測定方法であって、
生物学的相互作用を利用して前記金属微粒子を少なくとも作用極表面に局在化させる工程と、
前記作用極とは異なる対向電極を前記作用極の表面に近接させた状態で、前記作用極の表面に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化して溶出させるとともに、前記対向電極の表面に前記金属微粒子を構成する金属を電気化学的に析出させる工程と、
前記対向電極に析出した金属を電気化学的に酸化する際の電流値を前記対向電極で測定する工程とを有することを特徴とする被検物質の測定方法。
【請求項７】
前記作用極と前記対向電極との間隔を５０μｍ以下とすることを特徴とする請求項５または６記載の被検物質の測定方法。
【請求項８】
前記対向電極の平面形状が前記作用極と略同一であることを特徴とする請求項５または６記載の被検物質の測定方法。
【請求項９】
金属微粒子を標識物質として用いるとともに、一対の櫛型電極により形成された作用極を用いた電気化学測定法を利用する被検物質の測定方法であって、
生物学的相互作用を利用して前記金属微粒子を少なくとも前記櫛型電極表面に局在化させる工程と、
一方の櫛型電極の表面に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化して溶出させるとともに、
他方の櫛型電極の表面に前記金属微粒子を構成する金属を電気化学的に析出させる第１の金属微粒子酸化／還元工程と、
他方の櫛型電極の表面に局在化した金属微粒子及び析出した金属を電気化学的に酸化して溶出させるとともに、一方の櫛型電極の表面に金属を析出させる第２の金属微粒子酸化／還元工程とを有することを特徴とする被検物質の測定方法。
【請求項１０】
前記第２の金属微粒子酸化／還元工程の後、前記一方の櫛型電極に析出した金属を電気化学的に酸化する際の電流値を測定することを特徴とする請求項９記載の被検物質の測定方法。
【請求項１１】
前記第２の金属微粒子酸化／還元工程の後、前記一方の櫛型電極に析出した金属を電気化学的に酸化して溶出させるとともに前記他方の櫛型電極で溶出物を還元する際の電流値を測定することを特徴とする請求項９記載の被検物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属微粒子を標識物質として用いる被検物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試験溶液中の微量物質を簡便且つ高感度に測定する方法の１つとして、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られている。代表的な免疫測定法であるＥＬＩＳＡ法においては、酵素で標識した抗体を用い、酵素反応に由来する発色や発光等の信号を得ることによって被検物質の定性や定量を行っている。しかしながら、ＥＬＩＳＡでは発色や発光等の信号検出時に光学系を必要とするため、大型の測定器が必要となるといった不都合がある。また、正確な定量を行う場合には、発色等の測定結果を電気的な信号に変換するといった複雑な処理が必要となることがある。
【０００３】
そこで、発色標識や蛍光標識のような汎用の標識物質を用いた免疫測定法等において、検出に際して電気化学的測定法を利用することが提案されている。電気化学的測定に用いる装置は、ＥＬＩＳＡ等に用いられる機器に比べて小型化が可能であることから、測定機器の小型化と検出感度の向上との両立が期待される。例えば特許文献１においては、金属微粒子を化学的処理によって溶解した後、電気化学的測定を行い、得られた金属微粒子の酸化に伴うピーク電流に基づいて被検物質の分析を行っている。
【特許文献１】特表２００４−５１２４９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１においては、化学的処理により金属微粒子を完全に溶解する工程が電気化学的測定に先立って必要となるため、測定操作が煩雑になるといった不都合がある。
【０００５】
一方、図１０に示すように、電気化学的に金属微粒子を酸化した後、還元電流値を指標として被検物質を測定する方法も存在する。この方法では、先ず、作用極１０１の表面に固定した一次抗体１０２と金コロイド粒子のような金属微粒子１０５で標識した二次抗体１０４とで被検物質１０３をサンドイッチし、被検物質１０３の濃度に応じた標識金属微粒子１０５を少なくとも作用極１０１の表面に局在化させる（図１０（ａ））。次に、作用極１の表面近傍に局在化させた金属微粒子１０５を測定溶液中で電気化学的に酸化して溶出させる（図１０（ｂ））。最後に、金属微粒子１０５から金属イオンや錯イオン等として溶出した溶出物を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する（図１０（ｃ））。
【０００６】
この方法においては、生物学的相互作用を利用して作用極１０１の表面に金属微粒子１０５を局在化した状態で電気化学的酸化を行うので、被検物質との反応に関与した金属微粒子の全てを作用極表面との電子授受に関与させることができ、結果として被検物質の高感度な測定が実現される。また、作用極１０１表面に局在化させた金属微粒子１０５を直接酸化し、その酸化電流を測定すると、金属微粒子１０５と作用極１０１との距離に起因して金属（ここでは金）の酸化に必要な条件がばらついているため、測定したグラフに酸化ピークが現れない。これに対して、金属微粒子１０５の酸化溶出を行うことにより電極近傍に金錯体が生成され、それらは金の還元に必要な条件がほぼ一定であるため、測定したグラフに還元ピークが現れ、正確な測定が可能となる。さらに、作用極の電位制御により標識金属微粒子を溶出させるため、例えば化学的処理により酸化する場合等に比較して、測定操作の煩雑化が抑えられる。
【０００７】
ところで、図１０に示す方法では、還元電流又は酸化電流を測定する前に金属微粒子を充分に酸化して溶出させることが必要である。しかしながら、この酸化工程において時間経過に伴って溶出物が拡散してしまい、感度の低下を招くことが本発明者らの検討により明らかとなった。
【０００８】
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、測定操作を煩雑とすることなく、高感度且つ正確な測定を行うことが可能な被検物質の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述の目的を達成するために、本発明に係る被検物質の測定方法は、金属微粒子を標識物質として用いるとともに、電気化学測定法を利用する被検物質の測定方法であって、生物学的相互作用を利用して前記金属微粒子を少なくとも作用極表面に局在化させる工程と、前記電極の表面に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化して溶出させる工程とを有し、少なくとも前記金属微粒子酸化工程において前記作用極からの前記溶出物の拡散を抑えることを特徴とする。
【００１０】
前述の測定方法においては、金属微粒子の酸化溶出を行うことにより電極近傍に金属イオンや錯イオンが生成され、それらは酸化溶出する前の状態と比して、反応に必要な条件がほぼ一定としているため、それらを還元析出反応させることにより、その還元反応を測定したグラフに金属微粒子量に対応したピークが現れ、正確な測定が可能となる。さらに、作用極の電位制御により金属微粒子を溶出させるため、例えば化学的処理により酸化する場合等に比較して、測定操作の煩雑化が抑えられる。そして、少なくとも作用極の表面に局在化された金属微粒子を電気化学的に酸化する際、金属微粒子から生成したイオン等の溶出物の作用極等の表面からの拡散を防ぐことにより、作用極表面における溶出物濃度が高濃度で保たれるので、高感度測定が実現される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、例えばＥＬＩＳＡの検出工程において用いられるような大型の測定機器を必要とすることなく、簡便な操作にて試験溶液中の被検物質の高感度且つ正確な測定を実現することができる。また、金属微粒子の電気化学的酸化に際して金属イオンや錯イオン等として溶出した溶出物の拡散を抑制するので、さらなる高感度測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した被検物質の測定方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
＜第１の実施形態＞
第１の実施形態では金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散を抑制するために平坦な表面を有する対向部材を用いる場合について、図１を参照しながら説明する。
【００１４】
先ず、作用極、対極及び参照極が同一面上に形成されたプレナー型電気化学デバイスを用意する。平面形状が略円形状を呈する作用極１の表面に、被検物質（抗原）３を認識する一次抗体２を固定する。電極表面は非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。また、被検物質３上の異なる部位を認識する二次抗体４を用意し、これに金属微粒子５として例えば金コロイド粒子を標識することにより標識抗体を用意しておく。
【００１５】
次に、前記標識抗体及び未知量の被検物質３を含む溶液を作用極１の表面に供給し、一次抗体２と接触させ、作用極１上で抗原抗体反応を行う。標識抗体が被検物質３を介して一次抗体２に結合することにより、被検物質３の濃度に対応した量の金属微粒子５が作用極１の表面に局在化された状態となる（図１（ａ））。その後、作用極１の表面を必要に応じて洗浄する。
【００１６】
被検物質３としては、生体物質、合成物質等のあらゆる物質を選択することができる。本実施形態においては標識物質である金属微粒子５を作用極１の表面に局在化させるために抗原抗体反応を利用したが、生物学的相互作用を利用したものであれば、抗原抗体反応に限定されない。例えば、核酸−核酸、核酸−核酸結合タンパク質、レクチン−糖鎖、又はレセプター−リガンドの特異的結合を利用してもよい。
【００１７】
標識物質である金属微粒子５としては金コロイド粒子の他、標識物質として利用される金属微粒子を任意に用いることができる。例えば金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やそれらのコロイド粒子、量子ドット等を用いることができる。なかでも粒径１０ｎｍ〜６０ｎｍの金コロイド粒子、特に粒径４０ｎｍ程度の金コロイド粒子を用いることが好ましい。
【００１８】
次に、作用極１、対極及び参照極と、電気化学的測定用の測定溶液とを接触させ、作用極１の表面に局在化させた金属微粒子５を電気化学的に酸化し、金属イオンや錯イオン等として溶出させる（図１（ｂ））。金属微粒子５として金コロイド粒子を用い、且つ、測定溶液として塩酸水溶液を用いた場合、電気化学的に酸化されることにより金コロイド粒子はＡｕＣｌ４−等として溶出する。この際、平坦な表面を有する対向部材６を用意し、対向部材６で作用極１の表面を覆うように対向部材６の平坦面を作用極１の表面に近接させることにより、作用極１の表面における測定溶液の厚みを薄くする。
【００１９】
金属微粒子５を電気化学的に酸化し溶出させた後、対向部材６を作用極１の表面に近接させた状態を維持したまま、ＡｕＣｌ４−等の金属イオンや錯イオンとして溶出した溶出物を電気化学的に還元する際に生じる還元電流を作用極１で測定し、測定結果に基づいて、被検物質の有無又は濃度を測定する（図１（ｃ））。具体的には、例えば、作用極１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、金属イオンや錯イオン等の溶出物が還元される際に還元電流が流れるので、これを測定する。作用極１の表面に局在化された金属微粒子５が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいて被検物質３の定量又は検出が実現される。例えば、還元電流値と既知濃度の被検物質と関係を予め求めておき、測定された還元電流値と比較することにより、被検物質３の濃度を求めることができる。また、得られる還元電流値から被検物質３の有無を知ることができる。
【００２０】
酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。
【００２１】
対向部材６としては、作用極１と対向する領域が平坦面とされ、作用極１の表面に測定溶液の薄い層を形成可能であれば、任意の形状のものを用いることができる。イオンの拡散防止によるさらなる高感度化を図るためには、平坦面の算術平均粗さＲａは２０μｍ以下が好ましい。この条件を満たす部材としては、ガラス基板、プラスチック基板等が挙げられる。
【００２２】
作用極１と対向部材６との間隔は、５０μｍ以下とすることが好ましい。５０μｍ以下とすることにより、作用極１と対向部材６との間に形成される測定溶液層の厚みが薄くなり、作用極１の表面付近に金属微粒子５からの溶出物を高濃度に存在させられるため、さらなる高感度化を図ることができる。
【００２３】
測定溶液としては、金属微粒子５を容易に電気化学的に酸化させることができることから、酸性溶液を用いることが好ましい。酸性溶液としては、金属微粒子５の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば塩酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、硫酸等を含む水溶液を用いることができる。金属微粒子５の電気化学的酸化のし易さを考慮すると、０．０５規定〜２規定の塩酸水溶液、特に０．１規定〜０．５規定の塩酸水溶液を用いることが好ましい。
【００２４】
また、測定溶液としては、酸性溶液の他、塩素イオン等のハロゲンイオンを含む中性溶液を用いることも可能である。塩素イオン等のハロゲンイオンを含む中性溶液を用いることにより、酸性溶液を用いる場合に比べて、後述の測定工程において大きな電流変化量が得られ、結果として、より高感度な測定が達成される。また、酸性溶液を用いる場合、例えば低電位側における還元ピークの裾が上昇する等のようにピーク形状が非対称となったり、例えば０．１Ｖ付近においてノイズが発生することがある。これに対して、塩素イオン等のハロゲンイオンを含む中性溶液を用いることで、還元ピークの裾が平坦となるとともに、前記ノイズ発生が抑えられるので、還元ピーク強度検出が簡便となる。さらに、酸性溶液やアルカリ溶液のような取扱いの難しい溶液の使用を回避することができ、測定操作を安全且つ簡便に実施することができる。塩素を含む中性溶液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いたときに前記の効果を得られるが、特にＫＣｌを用いたときに効果が大きい。
【００２５】
金属微粒子５を電気化学的に酸化させるためには、作用極１を、例えば、銀塩化銀参照電極に対して＋１〜＋２Ｖとすることが好ましい。作用極１の電位を前記範囲内にすることにより、作用極１の表面に局在化された金属微粒子５を完全に酸化溶出させることができ、被検物質３の検出感度を確実に向上させることができる。作用極１の電位を前記範囲未満とした場合、測定時に還元電流のピークが現れないおそれがあり、逆に前記範囲を超えた場合、金属微粒子５から溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物の泳動による拡散が起こり、作用極１近傍における前記溶出物の濃度が低下してしまい、これにより還元電流のピークが小さくなるおそれがある。より好ましい範囲は、＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖである。
【００２６】
金属微粒子５を電気化学的に酸化して溶出させるには、作用極１の電位を金属微粒子５が酸化して溶出する電位に所定時間保持することが挙げられる。前記操作は、金属微粒子５を充分に酸化させられるため好ましい方法である。また、前記操作の他、作用極１の電位を時間経過に伴い変化させてもよい。この場合には、金属微粒子５が酸化、溶出する電位の範囲内（例えば銀塩化銀参照電極に対して＋１Ｖ〜＋２Ｖ）において作用極の電位を変化させることが好ましい。さらに、金属微粒子５が電気化学的に酸化、溶出する電位を作用極１に複数回印加してもよい。
【００２７】
例えば、金属微粒子５として粒径１０ｎｍ〜６０ｎｍの金コロイド粒子を使用する場合、金コロイド粒子を電気化学的に酸化させるに際して、０．１規定〜０．５規定の塩酸溶液中で、銀塩化銀参照電極に対する前記作用極の電位を＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖとすることが好ましい。
【００２８】
金属微粒子５を十分に酸化させるに際しては、金属微粒子５の量に応じて最適な電荷量を与えるように注意する必要がある。電荷量は電流を積分した値であるため、作用極１に印加する電位が比較的低い電位であれば、金属微粒子を十分に酸化させるためには当該電位を長時間印加する必要がある。一方、作用極１に印加する電位が比較的高い電位であれば、金属微粒子５を十分に酸化させるために必要な時間は短時間でよい。
【００２９】
金属微粒子５が電気化学的に酸化する電位に作用極１の電位を保持する時間を１秒以上とすることで、金属微粒子を十分に酸化させることができ、検出感度を確実に向上させることができる。一方、印加時間を１００秒以上としても得られる電流値は殆ど変わらない。したがって、１秒以上１００秒以下が好ましい。前記電位の保持時間のさらに好ましい範囲は、４０秒以上１００秒以下である。
【００３０】
本実施形態においては、金属微粒子５の電気化学的な酸化と還元電流の測定に際して、作用極１の表面に対向部材６を近接するように配置することで、測定溶液の厚みが薄くなるので、金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散によるロスが抑えられる。その結果、対向部材６を用いない場合に比較して、高感度な測定が可能となる。また、標識金属微粒子を一旦酸化して溶出させることにより金属イオンの還元に必要な条件がほぼ同一となるので、それらを還元析出反応させることにより、その還元反応を測定したグラフに金属微粒子量に対応したピークが現れ、正確な測定が可能となる。さらには、本実施形態のように還元電流を測定することにより、酸化電流を測定する場合に比べて夾雑物等に由来するノイズの影響を抑えることができる。
【００３１】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態では金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散を防ぐために対向電極を作用極の表面に近接させるとともに、対向電極で還元電流を測定する場合について、図２を参照しながら説明する。なお、以下においては、先の説明と重複する説明は省略する。
【００３２】
先ず、一次抗体２が固定された作用極１を有するプレナー型電気化学デバイスを用意し、金属微粒子５で標識した二次抗体４及び未知量の被検物質３を含む溶液を作用極１の表面に供給し作用極１上で抗原抗体反応を行う（図２（ａ））。ここまでは第１の実施形態と同じである。
【００３３】
次に、作用極１、対極及び参照極と、電気化学的測定用の溶液とを接触させ、作用極１の表面近傍に局在化させた金属微粒子５を電気化学的に酸化し、ＡｕＣｌ４−等の金属イオンや錯イオンとして溶出させる。本実施形態では、このとき、対極及び参照極とは異なる対向電極７を用意し、この対向電極７で作用極１の表面を覆うように対向電極７を作用極１の表面に近接、対向させ、金属微粒子５から溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を電気化学的に還元して対向電極７の表面に金属８として析出させる（図２（ｂ））。
【００３４】
対向電極７は、金属微粒子５から溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を一時的に回収するための電極であり、作用極１との対向面が平坦であることが好ましい。その平面形状は、その表面に金属を析出させることができれば特に限定されないが、作用極１と略同一であることが好ましい。また、対向電極７は、平面視で作用極１と重なるように配置することが好ましい。
【００３５】
対向電極７上に金属８を析出させるためには、対向電極７に金属微粒子５を構成する金属が析出可能な電位を印加すればよい。例えば、金属微粒子５として金コロイド粒子を用いた場合、対向電極７を銀塩化銀参照電極に対して０Ｖ〜−１Ｖとすることが好ましい。なお、金属微粒子５を電気化学的に酸化して溶出させるには、第１の実施形態と同様に、銀塩化銀参照電極に対して＋１Ｖ〜＋２Ｖを作用極１に印加することが好ましい。
【００３６】
作用極１の表面に局在化させた金属微粒子５を電気化学的に溶出させるタイミングと、対向電極７の表面に金属８を析出させるタイミングとは、同時でも異なっていてもよいが、先ず、対向電極７の電位を金属微粒子５を構成する金属が析出する電位に設定し、その後、作用極１の電位を金属微粒子５が溶出する電位に設定することが好ましい。このようなタイミングとすることにより、対向電極７表面への析出をより確実なものとすることができる。
【００３７】
作用極１と対向電極７との間隔、すなわち測定溶液の層の厚みは、５０μｍ以下とすることが好ましい。５０μｍ以下とすることにより、金属微粒子５から溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を対向電極でより効率的に回収できる。
【００３８】
作用極１の表面に局在化させた金属微粒子５の溶出と対向電極７の表面への金属の析出とを行った後、対向電極７を作用極１の表面に近接させた状態を維持したまま、対向電極７表面に析出させた金属８を電気化学的に溶出させる（図２（ｃ））。対向電極７の表面の金属８を電気化学的に再溶出させるためには、対向電極７に金属８が溶出する電位を印加すればよい、対向電極７の表面から金属８を溶出させる際には、例えば金属微粒子５として金コロイド粒子を用いた場合、対向電極７の電位を銀塩化銀参照電極に対して＋１Ｖ〜＋２Ｖとすることが好ましい。また、対向電極７を金属８が溶出する電位に設定する時間は、０．１秒〜１０秒とすることが好ましい。なお、対向電極７の表面に析出させた金属８を金属イオンや錯イオン等として溶出させる際、金属イオンや錯イオン等の溶出物が拡散する懸念があるものの、例えば金属微粒子５を完全に溶出させる場合に比較して溶出に要する時間が短縮されるので、溶出の際の拡散によるロスは小さくて済む。したがって、検出感度の低下は殆ど問題とならない。
【００３９】
対向電極７の表面の金属８を溶出させた後に、溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を電気化学的に還元する際に生じる還元電流値を対向電極７で測定し、これに基づいて被検物質の有無又は濃度を測定する（図２（ｄ））。対向電極７での還元電流の測定は、対向電極７の表面の金属８を溶出させた直後に行うことが好ましい。
【００４０】
本実施形態においては金属微粒子５から溶出した金属イオンや金属錯イオン等の溶出物を対向電極７に析出させて回収するので、溶出物の拡散が妨げられ、作用極１の表面における金属イオンや金属錯イオン等の溶出物濃度が高濃度のまま保たれる。その結果、対向電極７を用いない場合に比較して、高感度な測定が可能となる。また、清浄で活性化された状態の対向電極７で測定することにより、抗体等を固定したり抗原抗体反応を行った作用極１での測定に比較して、高感度な測定が可能となる。また、標識金属微粒子を一旦酸化して溶出させることにより生成される金属イオンや金属錯イオンの還元に必要な条件がほぼ同一となるので、それらを還元析出反応させることにより、その還元反応を測定したグラフに金属微粒子量に対応したピークが現れ、正確な測定が可能となる。さらに、本実施形態のように還元電流を測定することにより、酸化電流を測定する場合に比べて夾雑物等に由来するノイズの影響を抑えることができる。
【００４１】
＜第３の実施形態＞
第１の実施形態〜第２の実施形態においては、最後の電気化学的測定工程において還元電流を測定しているが、任意の電極上に析出させた金属を酸化し、その酸化電流を測定してもよい。本実施形態では、対向電極上に析出させた金属を電気化学的に酸化し、その酸化電流を対向電極で測定する場合について図３を参照しながら説明する。
【００４２】
先ず、一次抗体２が固定された作用極１を有するプレナー型電気化学デバイスを用意し、金属微粒子５で標識した二次抗体４及び未知量の被検物質３を含む溶液を作用極１の表面に供給し作用極１上で抗原抗体反応を行う（図３（ａ））。
【００４３】
次に、作用極１、対極及び参照極と、電気化学的測定用の溶液とを接触させ、作用極１の表面近傍に局在化させた金属微粒子５を電気化学的に酸化し、ＡｕＣｌ４−等の金属イオンや錯イオンとして溶出させる。本実施形態では、このとき対向電極７で作用極１の表面を覆うように対向電極７を作用極１の表面に近接、対向させ、金属微粒子５から溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を電気化学的に還元して対向電極７の表面に金属８として析出させる（図３（ｂ））。ここまでの工程は前述の第２の実施形態と同じである。
【００４４】
次に、対向電極７上に析出した金属８を電気化学的に酸化し、その酸化電流を測定し、これに基づいて被検物質の有無又は濃度を測定する（図３（ｃ））。酸化電流の測定は対向電極７で行う。酸化電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。
【００４５】
本実施形態においては金属微粒子５から溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を対向電極７に析出させて回収するので、溶出物の拡散が妨げられる。その結果、対向電極７を用いない場合に比較して、高感度な測定が可能となる。また、清浄で活性化された状態の対向電極７で測定することにより、抗体等を固定したり抗原抗体反応を行った作用極１での測定に比較して、高感度な測定が可能となる。また、標識金属微粒子を一旦酸化して溶出させることにより生成される金属イオンや金属錯イオンの還元に必要な条件がほぼ同一となるので、それらを還元析出反応させることにより、その還元反応を測定したグラフに金属微粒子量に対応したピークが現れ、正確な測定が可能となる。さらに、本実施形態のように酸化電流を測定することにより、還元電流を測定する第１の実施形態〜第２の実施形態に比して、酸化溶出による拡散がなく、原理的には高感度になると考えられる。
【００４６】
＜第４の実施形態＞
本実施形態においては、作用極１として図４に示すような一対の微小櫛歯電極１ａ、１ｂを用いて金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散を抑制する方法について説明する。
【００４７】
先ず、一対の櫛歯電極１ａ、１ｂが絶縁基板９上に形成されたプレナー型デバイスを用意し、少なくとも櫛歯電極１ａ、１ｂの表面に、被検物質３を認識する一次抗体２を固定する。このとき、微小な櫛歯電極１ａ、１ｂの表面のみに一次抗体２を固定するのは困難であるため、対極（図示は省略する）や櫛歯電極１ａ、１ｂの形成されていない絶縁基板９の表面に一次抗体２が固定されても構わない。
【００４８】
次に、金属微粒子５で標識した二次抗体４及び未知量の被検物質３を含む溶液を、デバイスの櫛歯電極１ａ、１ｂの形成面に供給し、抗原抗体反応を行う。これにより、被検物質３の濃度に対応した量の金属微粒子５が作用極１の表面に局在化された状態となる（図５（ａ））。ここまでの工程は、作用極１の形状が異なることを除き前述の第２の実施形態と同様である。
【００４９】
次に、櫛歯電極１ａ、１ｂ、対極及び参照極と、電気化学的測定用の測定溶液とを接触させる。その後、櫛歯電極１ａ、１ｂのうち一方の櫛歯電極１ａに金属微粒子５を構成する金属が溶出する電位を印加し、表面に局在化させた金属微粒子５を電気化学的に酸化して金属イオンや錯イオン等として溶出させる。それと同時に、他方の櫛歯電極１ｂに金属微粒子５を構成する金属が析出する電位を印加し、一方の櫛歯電極１ａ側から生成した金属イオンや錯イオン等の溶出物を還元して櫛歯電極１ｂ表面に金属８として析出させる（図５（ｂ））。
【００５０】
次に、各櫛歯電極１ａ、１ｂに、先の工程とは反対の電位を印加する。すなわち、他方の櫛歯電極１ｂに金属微粒子５を構成する金属及び析出した金属８が溶出する電位を印加し、これらを電気化学的に酸化して金属イオンや錯イオン等として溶出させる。それと同時に、一方の櫛歯電極１ａに金属微粒子５を構成する金属が析出する電位を印加し、金属イオンや錯イオン等の溶出物を還元して櫛歯電極１ａ表面に析出させる（図５（ｃ））。
【００５１】
次に、一方の櫛歯電極１ａ上に析出した金属８を電気化学的に酸化し、その酸化電流を櫛歯電極１ａで測定する（図５（ｄ））。或いは、一方の櫛歯電極１ａの表面の金属８を電気化学的に溶出させ、その後、溶出した金属イオンや錯イオン等の溶出物を電気化学的に還元し、その還元電流を他方の櫛歯電極１ｂで測定してもよい。
【００５２】
本実施形態においては櫛歯電極１ａ、１ｂを用いて前述の操作を行うことにより、櫛歯電極１ａ、１ｂ間の微小な領域間で金属イオンや錯イオン等の溶出物が交換されるので、金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散が妨げられ、高感度な測定が可能となる。また、標識金属微粒子を一旦酸化して溶出させることにより生成される金属イオンや金属錯イオンの還元に必要な条件がほぼ同一となるので、それらを還元析出反応させることにより、その還元反応を測定したグラフに金属微粒子量に対応したピークが現れ、正確な測定が可能となる。
【００５３】
なお、前述の第１〜第４の実施形態では、電極表面からの金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散を抑える手段として、対向部材、対向電極又は微小櫛歯電極を例示したが、本発明はこれらに限定されることなく、電極表面からの金属イオンや錯イオン等の溶出物の拡散を抑制可能な手段を任意に採用することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明の測定方法について、実験結果を参照しながら説明する。
【００５５】
実験１
先ず、図６（ａ）に示すようなプレナー型の印刷電極デバイスを用意した。この印刷電極デバイスは、短冊状の基板１１の一端の表面に、カーボンからなる作用極１２、カーボンからなる対極（図示は省略する。）及びＡｇ／ＡｇＣｌからなる参照電極１３が形成されて構成される。基板１１上及び参照電極１３と端子（図示は省略する。）とを接続する配線１４上にはレジストからなる絶縁皮膜１５が形成されており、基板面からの絶縁皮膜１５の高さＡは３２μｍとされている。絶縁皮膜１５の端部と基板１１の参照電極１３が形成された側の端部との距離Ｂは３８００μｍである。以下の実施例１〜実施例３及び比較例１の操作に先だって、この印刷電極デバイスの参照電極１３の表面に、電気化学的に金（Ａｕ）を析出させることにより、生物学的相互作用を利用して金の微粒子が作用極１２の表面に局在化された状態を疑似的に作り出した。
【００５６】
＜実施例１＞
実施例１においては、対向部材１６としてのカバーガラスを作用極１２の表面に近接させた状態で、金の電気化学的な酸化と還元電流の測定を行った。すなわち、先ず、前記印刷電極デバイスの作用極１２の表面に測定溶液として０．１規定塩酸水溶液を滴下し、作用極１２の表面に測定溶液の液滴を形成した。次に、一部が絶縁皮膜１５に乗り上げるように対向部材１６としてカバーガラスを載せることにより、測定溶液の厚みを薄くした（図６（ｂ））。次に、作用極１２の電位を＋１．２Ｖに４０秒間保持し、作用極１２表面の金を電気化学的に酸化し、溶出させた。
【００５７】
次に、サイクリックボルタンメトリーにより電位変化に対する電流変化を測定した。サイクリックボルタンメトリーにおいては電位の走査範囲を−０．３Ｖ〜１．２とした。また、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極１２の電位を０．８Ｖから−０．１Ｖへ変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。微分パルスボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス幅０．０５Ｓ、パルス期間０．２Ｓとした。サイクリックボルタンメトリーの結果を図７に、微分パルスボルタンメトリーの結果を図８に示す。
【００５８】
＜実施例２＞
実施例２においては、対向部材１６としてのカバーガラスと作用極１２との間隔を実施例１より広げた状態で、金の電気化学的な酸化と還元電流の測定を行った。すなわち、先ず、比較例１及び実施例１で用いた印刷電極デバイスの、基板１１の参照電極１３が形成された側の端部付近に、対向部材１６と作用極１２との間隔を広げるための凸部１７をシール材により形成した。凸部１７の高さＣは４０μｍである。凸部１７を備える印刷電極デバイスの作用極１２の表面に測定溶液として０．１規定塩酸水溶液を滴下し、作用極１２の表面に測定溶液の液滴を形成した。次に凸部１７と絶縁皮膜１５の上に対向部材１６を載せることにより、測定溶液の厚みを薄くした（図６（ｃ））。その後は、前述の実施例１と同様にして電気化学的な酸化と還元電流の測定を行った。サイクリックボルタンメトリーの結果を図７に、微分パルスボルタンメトリーの結果を図８に示す。
【００５９】
＜実施例３＞
実施例３においては、対向部材１６としてカバーガラスに代えてガラスエポキシ基板を用い、実施例１と同様にして金の電気化学的な酸化と還元電流の測定を行った。微分パルスボルタンメトリーの結果を図８に示す。
【００６０】
＜比較例１＞
比較例１においては、対向部材を用いることなく、金の電気化学的な酸化と還元電流の測定を行った。すなわち、先ず、前記印刷電極デバイスの作用極１２の表面に測定溶液として０．１規定塩酸水溶液を滴下し、作用極１２の表面に測定溶液の液滴を形成した。次に、液滴の状態の測定溶液について、前述の実施例１と同様にして電気化学的な酸化と還元電流の測定を行った。サイクリックボルタンメトリーの結果を図７に、微分パルスボルタンメトリーの結果を図８に示す。
【００６１】
以上、図７及び図８の結果より、対向部材１６としてのカバーガラスを作用極１２の表面に近接させた状態で測定した実施例１及び実施例２では、測定溶液を液滴の状態で測定した比較例１に比べて大きな金の還元に伴うピーク電流が得られた。特に、作用極１２と対向部材１６との間隔を狭くした実施例１では、実施例２に比べてより一層大きな還元ピーク電流が得られた。このことより、作用極の表面に対向部材を近接させることで高感度検出が可能となることがわかる。また、ガラスエポキシ基板を対向部材として用いたとき（実施例３）の還元ピーク電流はカバーガラスを用いたとき（実施例１）に比べて小さいものであったことから、対向部材として作用極と対向する部分の表面の平坦性の高いものを用いることが好ましいとわかった。
【００６２】
実験２
本実験では、抗原抗体反応により作用極に局在させていた金コロイド粒子を電気化学的に溶出・析出によって対向電極に移動させ、且つ、それぞれの電極で酸化・還元により金の量を測定した。
【００６３】
＜実施例４＞
サンドイッチ型免疫測定法のモデル抗原としてｈＣＧを選び、その電気化学的検出を試みた。標識物質として金コロイド粒子を用いた。実験１と同じプレナー型の印刷電極デバイスの作用極の表面に一次抗体（抗α−サブユニット抗体）を固定した。次に、前記抗原を含む緩衝液を作用極上に供給して抗原を捕捉し、その抗原に金コロイド粒子で標識した二次抗体を結合させた。
【００６４】
次に、作用極を含む印刷電極デバイスの表面に飽和ＫＣｌ溶液を滴下した後、対向電極を作用極に近接対向するように設置した。その状態で、作用極に＋１．５Ｖ、対向電極に−１Ｖをそれぞれ１２０秒間印加した。対向電極は、作用電極と同材料のカーボンペーストにより作製したものであり、作用電極とは独立して電位操作が可能で、作用電極と同じ電極面積を有したものである。作用極と対向電極との間隔は約２０μｍとであった。それぞれの電極の表面粗さは５μｍ程度である。
【００６５】
次に、電極を純水で洗浄後、Ｎ２ガンで乾燥させ、対向電極表面に０．１規定ＨＣｌを滴下した。析出した金の溶出のために対向電極に＋１．２Ｖを５秒間印加した。その後、対向電極側にて、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）により電位変化に対する電流変化を測定した。結果を図９に示す。
【００６６】
＜比較例２＞
比較例では、先ず、実施例４と同様に抗原抗体反応を行い、作用極を含む印刷電極デバイスの表面に０．１規定ＨＣｌを滴下した。その後、対向電極を設置することなく、前処理として作用極に１．２Ｖを４０秒間印加した。その後、作用極で、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）により電位変化に対する電流変化を測定した。結果を図９に示す。
【００６７】
図９の結果より、対向電極を用いた実施例４では対向電極を用いない比較例２に比べて３倍ほど大きな還元電流値が得られていることから、本発明の方法が有効であることがわかる。これは、実施例４では、金属微粒子を酸化する場合（比較例２）に比べて酸化還元した金が電極表面に析出しているため酸化の時間が５秒と短くてよく、その分拡散によるロスが少なかったためと推測される。また、ＤＰＶ測定に用いた電極（対向電極）表面が抗原抗体反応によって汚染されることなく活性の高い状態であったためと推測される。なお、図９中には、前処理として対向電極に１．２Ｖを４０秒間印加し、その後、作用極側にて微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）を測定した結果が併記されている（参考例）。作用極側での測定で還元電流ピークが観察されなかったことから、前処理により対向電極側に金属が移ったことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、本発明を適用した測定方法の第１の実施形態を説明するための模式図である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、本発明を適用した測定方法の第２の実施形態を説明するための模式図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、本発明を適用した測定方法の第３の実施形態を説明するための模式図である。
【図４】第４の実施形態で用いられる櫛歯電極の要部概略平面図である。
【図５】（ａ）〜（ｄ）は、本発明を適用した測定方法の第４の実施形態を説明するための模式図である。
【図６】実験１で用いた印刷電極デバイスと対向部材との位置関係を説明するための断面図である。
【図７】実験１のサイクリックボルタンメトリーの結果を示す特性図である。
【図８】実験１の微分パルスボルタンメトリーの結果を示す特性図である。
【図９】実験２の微分パルスボルタンメトリーの結果を示す特性図である。
【図１０】（ａ）〜（ｃ）は、従来の測定方法を説明するための模式図である。
【符号の説明】
【００６９】
１  作用極、２  一次抗体、３  被検物質（抗原）、４  二次抗体、５  金属微粒子、６  対向部材、７  対向電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004915741.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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