(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン資化細菌を用いてポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生する方法であって、前記メタン資化細菌が、S1-20株(平成19年７月10日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に受託番号ＦＥＲＭ  P-21317 号として寄託済み）であり、前記メタン資化細菌の増殖と、前記メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを連続して行わせ、前記メタン資化細菌の培養を、ｐＨ８より高い条件で培養することを特徴とする、ＰＨＢ産生方法。
【請求項２】
前記メタン資化細菌の培養を、ｐＨ９−１１の条件で培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性プラスチックであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性プラスチックは、微生物などの作用により例えば土壌中に埋めた状態で分解されるため、環境破壊を防止する観点から注目されている。生分解性プラスチックは、通常の難分解性プラスチックよりも価格が高く、性能の点で劣っていたが、これらの欠点についても解消されてきており、実用化の段階に入っており、使用量の増大に合わせて生分解性プラスチックの量産技術が求められている。
生分解性プラスチックの一種であるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）は、メタン資化細菌等により産生される。
このメタン資化細菌は、栄養源制限培養など特殊な条件下で菌体内に著量のＰＨＢを蓄積することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、メタン資化細菌は通常酸性条件、せいぜい弱アルカリ性雰囲気でのみ生育することが知られていた（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
また、メチロシナス（Methylosinus）属の特定のメタン資化細菌は、主にマグネシウム制限下で培養すると生育速度はほとんど変わらないが、ＰＨＢを蓄積することが見いだされた（特許文献１）。
【０００４】
一方、メタン資化細菌に他の細菌が混入すると、ＰＨＢの産生効率が低下することがあった。
【特許文献１】特開2005-304484
【非特許文献１】Journal of Biotechnology 86(2001)127-133
【非特許文献２】RICHARDS.HANSON、THOMASE.HANSON “MethanotrophicBacteria”, MICROBIOLOGICALREVIEWS,1996,p.439-471 Vol.60, No.2
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、他の細菌が混入しても安定してＰＨＢを産生する、ＰＨＢの産生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、メタン資化細菌の増殖中においては菌体内にＰＨＢを蓄積できないのか、また、コンタミネーションが起こりにくいアルカリ条件下の培地でメタン資化細菌は生育し、ＰＨＢの蓄積量はどうかを検討し、スクリーニングしたところ、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析で、メチロシスティス属、メチロシナス属、メチロバシルス属フラジェラティウス、メチロヴォラス属の一部のメタン資化細菌が、添加物質の濃度を制限せずに菌体を増殖した場合も菌体内にＰＨＢを蓄積させることが可能であることを見出した。
【０００７】
そして、これらの菌株の培養とＰＨＢ生産の関連を観察した結果、増殖当初ＰＨＢメタン資化細菌は、ごく僅かなＰＨＢ生産しか行わないが、菌体密度が高く(ＯＤ６００＝６
．０)なると２０％以上の著量のＰＨＢを菌体中に蓄積することが判明した。これらの工
程は一連の菌体増殖の中で行われるため、特段の変更操作を必要としない。特にアルカリ条件で生育する菌体については、他のバクテリアが生育し難い条件でメタンのみを炭素源
で生育するため、他のバクテリアのコンタミネーションが抑制され、効率的にＰＨＢを生産することが可能である。
本発明は、以下のＰＨＢの産生方法を提供するものである。
１．メタン資化細菌を用いてポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生する方法であって、前記メタン資化細菌の増殖と、前記メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを連続して行わせることを特徴とするＰＨＢ産生方法。
２．前記メタン資化細菌が、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析で、メチロシナス属(Methylosinus)、メチロシスティス属（Methylocystis）、メチロシナス属(Methylosinus)、メチロバシルス属フラジェラティウス(Methylobacillus flagellatus)、メチロヴォラス属(Methylovorus)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)のいずれかに属することを特徴とする項１に記載のＰＨＢ産生方法。
３．前記メタン資化細菌の培養を、ｐＨ８より高い、望ましくはｐＨ９−１１の条件で培養することを特徴とする項１または２に記載の方法。
４．メタン資化細菌が、メチロシナス(Methylosinus)属S1-20株（平成１９年７月１１日
付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  P-21317号として寄託済み）である項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＰＨＢ産生方法によれば、メタン資化細菌の増殖中においてもＰＨＢの産生に寄与できる。そして、ＰＨＢ産生に際し、従来のように増殖工程と、ＰＨＢ蓄積工程とに分けるバッチ式にする必要が無く、菌体が、増殖を中心とする工程と、ＰＨＢ蓄積を中心とする工程を、自動的、連続的に変換して行うため、増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまでを連続して、省労働力的に行うことが可能となるため、ＰＨＢ産生効率が向上する。
また、ｐＨ８より高い、望ましくはｐＨ９−１１の条件下でのメタン発酵によりＰＨＢを製造することができるため、細菌のコンタミによる影響を抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に使用されるメタン資化細菌としては、メタン資化細菌の増殖と、前記メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを連続して行うことができるものであれば特に限定されない。このようなメタン資化細菌としては、例えば１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析で、メチロシナス(Methylosinus)属、メチロシスティス属（Methylocystis）、
メチロシナス属(Methylosinus)、メチロバシルス属フラジェラティウス(Methylobacillus
flagellatus)、メチロヴォラス属(Methylovorus)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)のいずれかに属するメタン資化細菌が挙げられる。
【００１０】
本発明者は、このようなメタン資化細菌をて土壌などから分離し、以下の菌体得た。
メチロシナス属(Methylosinus)
S1-20
メチロシナス属(Methylosinus)：
S1-1、T5-41、Y9-3；
メチロシスティス属（Methylocystis）またはメチロシナス属(Methylosinus)
T3-2、T7-1
メチロバシルス属フラジェラティウス(Methylobacillus flagellatus)、メチロヴォラス
属(Methylovorus)：
T5-4；
メチロバクテリウム属(Methylobacterium)：
Y9-12
上記10種類のメタン資化細菌は、乾燥菌体あたり２０％以上、条件により２５−３８％以上のＰＨＢを含むため、特に好ましい。
【００１１】
これらの菌体は、培地中のマグネシウム量を制限しない条件下でPHBを菌体内に蓄積す
ることができ、S1-20株はPHBを乾燥菌体重量の38％程度まで蓄積することができるため、特に好ましい。メチロシナス属(Methylosinus)のS1-20株は、平成１９年７月１０日に産
業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  P-21317として寄託済であ
る。
【００１２】
本明細書において、「メタン資化細菌の増殖と、前記メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを連続して行わせる」とは、菌体の増殖(OD600の増加)とPHBの蓄積が同時進行的に起こるか、菌体の増殖(OD600の増加)が先に起こり、PHBの蓄積が菌体の増殖に遅れて進行することを意味する。例えば図1〜3に示されるように、空気培養では菌体の増殖とPHBの蓄積が同時に起こり、OD600が1〜2.5程度であれば菌体内のPHBの割合は10〜25％
程度であり、酸素培養でOD600が6以上になれば菌体内のPHBの蓄積がさらに促進され、乾
燥菌体中の15〜40％のPHBが蓄積される。
【００１３】
本明細書において、「空気培養」としては、空気：メタン=10：1〜1：2程度の割合で混合した密閉雰囲気中での培養を意味し、「酸素培養」としては、酸素：メタン=10：1〜1
：5程度の割合で混合した密閉雰囲気中での培養を意味する。
【００１４】
メタン資化細菌の培養は、通常の培地中で行うことができる。従って、マグネシウムなどの栄養分を制限する必要はない。培養は酸素培養、空気培養のいずれで行ってもよいが、乾燥菌体中のPHBの比率を向上させるためには酸素培養が好ましい。培地には、無機塩
類や窒素源が含まれるが炭素源としてはメタンが利用される。
【００１５】
培養日数は特に制限されないが、OD600が６を超える条件下で培養することにより、菌
体中にPHB蓄積を促進させることができる。
【００１６】
培養液のｐHは、７以上、菌種により好ましくは８以上、さらに好ましくは９〜１１で
ある。
【００１７】
アルカリ条件でメタン資化細菌を培養する場合には、他のバクテリアのコンタミニーションの恐れなく培養が行えるため、低コストでの培養が可能となる。
【００１８】
ここで、アルカリ条件とは、ｐＨ８以上を指し、特にｐＨ９〜１１においては、他の細菌類のコンタミネーションが起こりにくいため、低コストで、粗放的な培養で、確実に菌体内にＰＨＢを蓄積させることができる。例えばS1-20株は、pH10でよく増殖するため、
細菌のコンタミによる影響はほとんどなく、しかも乾燥菌体あたりのＰＨＢが38〜40％程度と高いため特に好ましい。
【００１９】
メタン資化細菌の培養は、密閉系でメタンをバッチ式或いは連続的に供給して行うことができる。メタンは、空気または酸素と混合して該密閉系に導入する。圧力は常圧、減圧、加圧のいずれであっても良い。例えばメタン資化細菌の数を増加させるための培養は空気とメタンの混合気体を用いて培養し、メタン資化細菌の数が増加した段階でメタンと酸素の混合気体に切り替えて、メタン資化細菌中のＰＨＢ含量を高めることもできる。
【００２０】
後述の実施例において、上記属の６種類の属を含むメタン資化細菌のライブラリーのスクリーニングを呈色剤を含む培地で培養し蛍光発光によって調べた。マグネシウムを通常培地濃度(１５０μＭ)含みｐＨ７および１０の培地において実施したところ、今まで知られている文献情報等とは異なり、ＰＨＢの生産が蛍光発光により確認される菌体があることが見いだされた。そこでこれらの菌体について後述のバッチ法で培養し、菌体濁度、Ｐ
ＨＢ含量について調べ、ゲノムＤＮＡを抽出して１６ＳリボゾームＲＮＡの配列解析し、菌株の同定を行った。その結果、上記６種類の属のメタン資化細菌において、乾燥菌体あたり２０％以上、条件により２５−３８％以上のＰＨＢを含むことを見いだした。これらの細菌は、入手が容易であると共に取り扱いも容易であるため、ＰＨＢの産生を行うのに特別な施設等を必要とせず、ＰＨＢの産生を容易に遂行することができる。
【００２１】
尚、上述した細菌と同様の性質を有するメタン資化細菌であれば、上記６属に限らず、本発明のＰＨＢ産生方法を適用できる。
【００２２】
菌体中に蓄積されたＰＨＢは、例えば菌体を破砕後、トリクロロエチレンで抽出するなどの常法に従い回収することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
【００２４】
本実施例では、微生物により産生される脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生する方法について詳述する。
【００２５】
ＰＨＢを産生する微生物として、メタン資化細菌、メタノール資化細菌、及び、アルカリゲネス属細菌等が知られている。これらのうち、原料コストを抑える等の観点から、メタンを炭素源としたメタン資化細菌を用いてＰＨＢを産生する場合を例示する。
【００２６】
メタン資化細菌は、培地中の添加物質である窒素、リン、マグネシウム等の栄養源が制限された状態になるとＰＨＢを菌体内に蓄積する性質を有していると思われていた。本発明は、ある種のメタン資化細菌において、通常の培地組成で培養した場合、増殖を中心とする工程と、ＰＨＢ蓄積を中心とする工程を、自動的、連続的に変換して行い、菌体増殖とＰＨＢ蓄積とが同時に行われることになる。
【００２７】
実施例１
メタン資化細菌のライブラリーより、ＰＨＢの蓄積に好適な菌株の選抜をする実験を行った。  ＰＨＢ生産株の選抜は、非特許文献３に従った。
＜使用培地組成＞
以下の組成の炭素を含まない液体培地を使用した。
ｐＨ７の場合
NaNO3                     0.85   g/l
K2SO4             0.17   g/l
MgSO4・7H2O       0.037  g/l      （１５０μＭ）
CaCl2・2H2O       0.007  g/l
KH2PO4            0.53   g/l
Na2HPO4           0.86   g/l
ZnSO4・7H2O       0.574 mg/l
MnSO4・7H2O       0.446 mg/l
H3BO3                    0.124 mg/l
NaMoO4・2H2O             0.096 mg/l
CoCl2・6H2O       0.096 mg/l
KI                0.166 mg/l
CuSO4・5H2O       0.25  mg/l
FeSO4・7H2O      11.2   mg/l    
【００２８】
ｐＨ１０の場合は、KH2PO4を含まず、NaOHにて、ｐＨ１０に調製した。
【００２９】
プレート培養は、これにアガロース１．０％を加え、ＰＨＢ生産菌を選抜する場合には、さらにナイルレッド0.5 μg/mlを加えて作成した。
【００３０】
【非特許文献３】A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds、Journal Archives of Microbiology 、Issue Volume 171, Number 2 / January, 1999、Pages 73-80
【００３１】
＜ＰＨＢ産生菌の選定＞
土壌よりメタンのみを炭素源としてスクリーニングしたするメタン資化細菌を、ナイルレッド0.5 μg/mlを含むプレートに植菌し、シールできるポリエチレンの袋に、酸素とメタンを等量加えて、２８℃にて、２週間培養した。発生したコロニーを３６５ｎｍの紫外光下で蛍光発光させることで、ＰＨＢを生産する菌体を選抜した。
【００３２】
＜ＰＨＢ産生菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ配列分析結果＞
選抜したＰＨＢ産生菌の１６ＳリボゾームＲＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した精製し、これをテンプレートとして、その配列を解析した。それぞれの配列は以下の通りである。メチロシナス属(Methylosinus)
S1-20株：配列番号１
メチロシスティス属（Methylocystis）：
S1-1株：配列番号２
T5-41株：配列番号３
Y9-3株：配列番号４
メチロシスティス属（Methylocystis）またはメチロシナス属(Methylosinus)
T3-2株：配列番号５
T7-1株：配列番号６
メチロバシルス属フラジェラティウス(Methylobacillus flagellatus)またはメチロヴォ
ラス属(Methylovorus)
T5-4株：配列番号７
メチロバクテリウム属(Methylobacterium)：
Y9-12株：配列番号８
【００３３】
＜ＰＨＢ産生菌のプレ培養＞
プレート培養より、７０ｍＬ容の血清瓶にいれたｐＨ７または１０の液体培地１０ｍｌに、それぞれのメタン資化細菌を植菌し、瓶内部の気体が空気： メタン＝ ５： １ になるようにガス置換を行い、２５ ℃ で１週間振盪培養した。
【００３４】
＜ＰＨＢ産生菌の培養、サンプルの回収など＞
プレ培養した菌体１ｍｌを、１２０ ｍ Ｌ容の血清瓶にいれたｐＨ７または１０の液体培地２５ｍｌに混合して植菌し、密封した。これに、６０ｍｌの空気を抜いた後、メタン３０ｍｌ、酸素３０ｍｌを加え、２５ ℃ で振盪培養した。５日後より３から７日おきに血清瓶を開封し、培養液を１から３ｍｌ回収して、ＯＤ６００、乾燥菌体重量、ＰＨＢ含有量を測定した。培養液は、再度密封し、同様に６０ｍｌの空気を抜いた後、メタン３０ｍｌ、酸素３０ｍｌを加え、２５℃で振盪培養を継続した。
【００３５】
図１，２，３に、菌体濁度ＯＤ６００、菌体乾燥重量あたりのＰＨＢパーセント、培養日数をそれぞれ相対化してプロットした。
【００３６】
＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量を測定するため、非特許文献4の手法を用い以下の
実験を行った。
【００３７】
上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、乾燥させた。この凍結乾燥菌体１〜２ｍｇに、３％Ｈ２ＳＯ４を含むメタノール１．０ｍｌ、クロロホルム１．０ｍｌを加えて、１００℃で３．５時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、蒸留水０．５ｍＬを加え、激しく攪拌した。１０分間遠心分離したのち、クロロホルム層を２μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、ＰＨＢの定量を行った。乾燥菌体重量あたりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）/乾燥菌体（ｇ））を比較した。
【非特許文献４】Production of poly- beta -hydroxybutyric acid from carbon dioxide by Alcaligenes eutrophus ATCC 17697、Ishizaki, A; Tanaka, K 、Journal of Fermentation and Bioengineering  Vol. 71, no. 4, pp. 254-257. 1991.
【００３８】
＜ＰＨＢの平均分子量＞
前記メタン資化細菌の菌体内に蓄積されたＰＨＢの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。
【００３９】
培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、乾燥させた。この凍結乾燥菌体５ｍｇを、クロロホルム０．５ｍＬを加え、７０℃で２時間加熱した。遠心分離後、上澄みを直接ガスパヒュージョンクロマトグラフィ（以下、ＧＰＣと称する）を用いて、平均分子量を測定した。
【００４０】
菌体内に蓄積されたＰＨＢの分子量は、T5-4 ＰＨＢ含量45.3% MN  58万  MW 210万、Y9-12 ＰＨＢ含量 42.7% MN  75.8万  MW 250万を示し、菌体内に蓄積されたＰＨＢの平均分子量は、何れも２ｘ10６程度であることが判明した。
【００４１】
従って、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまで連続して行ったとしても、高分子のＰＨＢを得ることができると認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のＰＨＢの産生方法は、工業的なＰＨＢの産生に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】各種メタン資化細菌の増殖状態を調べたグラフ、培養日数と菌体濁度ＯＤ６００  Ｓ１−２０株は、ｐＨ１０培地、それ以外はｐＨ７
【図２】各種メタン酸化細菌の蓄積されたＰＨＢの割合（ＰＨＢ（ｇ）/乾燥菌体（ｇ））と培養日数を示したグラフ  Ｓ１−２０株は、ｐＨ１０培地、それ以外はｐＨ７
【図３】各種メタン酸化細菌の蓄積されたＰＨＢの割合（ＰＨＢ（ｇ）/乾燥菌体（ｇ））と菌体濁度ＯＤ６００を示したグラフ  Ｓ１−２０株は、ｐＨ１０培地、それ以外はｐＨ７
【図１】
0004931009.tif 000002
【図２】
0004931009.tif 000003
【図３】
0004931009.tif 000004
【配列表】
0004931009000001.app