(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＣＣＲアゴニスト抗体を含んでなる、アレルギー性疾患を治療するための医薬であって、ＴＣＣＲタンパク質が配列番号：１又は２のアミノ酸配列を含む、医薬。
【請求項２】
前記アレルギー性疾患が、アナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物アレルギー、蕁麻疹及び春季カタルからなる群から選択される、請求項１の医薬。
【請求項３】
抗ＴＣＣＲアゴニスト抗体が、ＴＣＣＲ結合抗体断片、二重特異性アゴニスト抗ＴＣＣＲ抗体、ヘテロ抱合体アゴニスト抗ＴＣＣＲ抗体、又は抗ＴＣＣＲアゴニストダイアボディである、請求項１又は２のいずれかの医薬。
【請求項４】
前記抗体又は抗体断片の何れかが、２以上のＴＣＣＲ抗原結合部位を含む、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
二重特異性抗体が２つの異なるＴＣＣＲエピトープに結合する、請求項３に記載の医薬。
【請求項６】
前記抗体又は抗体断片がＴＣＣＲと結合しＴｈ１サイトカイント産生を誘導する、請求項３の医薬。
【請求項７】
抗体が抗ＴＣＣＲモノクローナル抗体又はそのＴＣＣＲ結合断片である、請求項１又は２の医薬。
【請求項８】
抗ＴＣＣＲモノクローナル抗体又はそのＴＣＣＲ結合断片が、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を含んで成る、請求項７の医薬。
【請求項９】
抗ＴＣＣＲアゴニスト抗体が一本鎖抗体又は直鎖状抗体である、請求項３ないし５のいずれかの医薬。
【請求項１０】
ＴＣＣＲ結合抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、又はＦｖ断片を含んで成る、請求項３、４、６ないし９のいずれかの医薬。
【請求項１１】
抗ＴＣＣＲアゴニスト抗体又はＴＣＣＲ結合断片が細胞毒性薬、サイトカイン、抗癌剤又は成長阻害剤と併用して投与される、請求項１ないし１０のいずれかの医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、該ＤＮＡによりコードされる新規なポリペプチドの組換え生産、並びに免疫関連疾患の診断及び治療に関する組成物及び方法、特にＴ細胞分化及びサイトカイン放出の特徴をＴｈ１サブタイプ及びＴｈ２サブタイプへ調節する方法、並びにサイトカインの放出によって示される疾患の宿主に関する。
【０００２】
(発明の背景)
免疫関連及び炎症疾患は、完全な複合現象の症状又は結果であり、これらの殆どは複合的に関連した生物学的経路であり、正常な生理機能において、発作又は損傷へ応答すること、発作又は損傷からの回復を開始すること、並びに外来生物に対する先天性及び後天性の防御を増すことにおいて絶対不可欠である。疾患や病理現象は、これら正常な生理学的経路が付加的発作や損傷を、応答の強度と直接に関連しているものとして、異常な制御又は過度の刺激の結果として、自己への反応として、又はこれらの組み合わせの何れかとして生じせしめる場合に起こる。
これら疾患の起源には、殆どにおいて多段階経路及び複数の異なった生物学的系／経路が関与しているが、これらの一つ又は複数の経路の重要なポイントでの介入は、改善的又は治療的効果をもたらすことができる。治療的介入は、有害なプロセス／経路の拮抗作用又は有益なプロセス／経路の刺激の何れかによって生じることができる。
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、哺乳動物の免疫応答の重要な構成物である。Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）領域中の遺伝子によってコードされている自己分子と結合する抗原を認識する。該抗原は、ＭＨＣ分子とともに抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片などの表面に表示されうる。Ｔ細胞は、宿主哺乳動物の健康へ脅威を与えるこれら改造細胞を除去する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）が含まれる。ヘルパーＴ細胞は、抗原表示細胞上の抗原−ＭＨＣ複合体の認識の後に大々的に増殖する。また、ヘルパーＴ細胞は、種々のサイトカイン、すなわちＢ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及び免疫応答に関与する種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担うリンフォカインを分泌する。
【０００３】
体液性及び細胞性免疫応答の双方における中心的現象は、ヘルパーＴ細胞の活性化とクローン性増殖である。ヘルパーＴ細胞活性化は、抗原表示細胞の表面におけるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体と抗原−ＭＨＣの相互作用によってはじまる。該相互作用は、生成ヘルパーＴ細胞が細胞周期（Ｇ０からＧ１への移行）へ入ること、並びにＩＬ-２及び時にはＩＬ-４のための高親和性レセプターの発現が生じることを含む、生化学現象のカスケードを媒介する。活性化Ｔ細胞は、記憶細胞（免疫記憶細胞,メモリー細胞）又はエフェクター細胞へ増殖及び分化する周期を通して発達する。
哺乳動物の免疫系は、呼応して細菌、ウイルス、毒素及び非宿主基質の侵入から宿主細胞を防御することにおいて機能する多数の特異的な細胞から成る。該免疫系の特異性を主に担う細胞型はリンパ球と呼ばれており、Ｂ及びＴ細胞の二つの型がある。Ｔ細胞は胸腺で発達することから命名され、Ｂ細胞は骨髄で発達する。Ｔ細胞には幾つかのサブセット、例えばサプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及びＴヘルパー細胞がある。Ｔヘルパー細胞のサブセットは、免疫の二つの経路を明示する：Ｔｈ１及びＴｈ２である。ＣＤ４＋細胞の機能的サブセットである Ｔｈ１細胞は、その細胞性免疫を高める能力によって特徴付けられる。Ｔｈ１細胞は、サイトカインＩｌ-２及びインターフェロン-γを生産し、Ｉｌ-１０、Ｉｌ-４、Ｉｌ-５及びＩｌ-６を有しないことによって同定される。
また、Ｔｈ２細胞はＣＤ４＋細胞ではあるが、Ｔｈ１細胞とは異なる。Ｔｈ２細胞は、抗体生産を担い、サイトカインＩｌ-４、Ｉｌ-５、Ｉｌ-１０及びＩｌ-１３を生産する（Ｆｉｇ１を参照のこと）。これらのサイトカインは、Ｔｈ１及びＴｈ２の応答が互いに阻害的にすることにおいて重要な役割を担う。Ｔｈ２細胞によって生産されるＩＬ-１０がインターフェロン-γの生産を抑制する一方で（Ｆｉｇ２）、Ｔｈ１細胞によって生産されるインターフェロン-γはＴｈ２細胞の増殖を阻害する（Ｆｉｇ２）。
【０００４】
共通の前駆体からＴｈ１及びＴｈ２エフェクター細胞の異なる集団へのＴヘルパー細胞の発達と末端分化において、４つのらせん束状構造のサイトカインファミリーのメンバーが（Brazan, J F., 1990, Proc Natl Acad Sci USA, 87:6934-8）重要な役割を担うことが見出されている。O'Garra, A., 1998, Immunity, 8:275-83. ＩＬ-１２がＴｈ１細胞の分化に関与する主要な因子である一方で、ＩＬ-４は、主にＴｈ２細胞の発達に影響を与える。Hsieh, C.S.,ら., 1993, Science, 260:547-9；Seder, R.A.,ら, 1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90:10188-92；Le Gros, G.,ら., 1990, J Exp Med, 172:921-9；Swain, S.L., ら., 1991, Immunol Rev, 123:115-44.  従って、ＩＬ-１２(Magram, J., ら., 1996, Immunity, 4:471-81)、ＩＬ-１２レセプター（ＩＬ-１２Ｒ）１鎖(Wu, C., ら., 1997, J Immunol, 159:1658-65)又はＩＬ-１２特異的転写因子ＳＴＡＴ４(Kaplan, M. H., ら., 1996, Nature, 382: 174-7)を欠くマウスが障害のあるＴｈ１応答を有する一方で、ＩＬ-４（Kuhn, R., ら, 1991, Science, 254:707-10)、ＩＬ-４レセプター鎖（Noben-Trauth, N., ら., 1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 10838-43)、又はＩＬ-４特異的転写因子ＳＴＡＴ６(Shimoda, K.,ら., 1996, Nature, 380: 630-3)を欠くマウスはＴｈ２応答を有しない。
Ｔｈ-１及びＴｈ-２細胞のサブタイプは、Ｔｈ-０細胞と名付けられた共通の前駆体に由来すると考えられている。Ｔｈ-１及びＴｈ-２サブタイプの完全に相互排除的なサイトカインの生産とは対照的に、Ｔｈ-０細胞は殆ど又はすべてのこれらサイトカインを生産する。Ｔｈ-１及びＴｈ-２サブタイプのための異なるサイトカインの放出に関する性質は、エフェクターメカニズム及び細胞傷害性細胞の選択において能動的な役割を担う。Ｔｈ-２細胞によって分泌されるＩｌ-４、Ｉｌ-５、Ｉｌ-６及びＩｌ-１０が、ＩｇＥを含む抗体の生産を促進し細胞傷害性細胞の機能を低下させるのみならず、好酸球及びマスト細胞の生産を増加させる一方で、Ｔｈ-１細胞によって分泌されるＩｌ-２及びγ-インターフェロンは、マクロファージ及び細胞傷害性細胞を活性化する傾向にある。一度確立されると、Ｔｈ-１又はＴｈ-２応答パターンは、他のサブセットの生産を阻害するサイトカインの生産によって維持される。Ｔｈ-２細胞によって生産されるＩｌ-１０がＩｌ-２及びγ-インターフェロンのようなＴｈ-１サイトカインの生産を阻害する一方で、Ｔｈ-１細胞によって生産されるγ-インターフェロンは、Ｉｌ-４及びＩｌ-１０のようなＴｈ-２サイトカインの生産を阻害する。
【０００５】
Ｔｈ１及びＴｈ２サブセットによって生産されるサイトカイン間の微妙なバランスの混乱は、宿主の疾患を引き起こす。例えば、Ｔｈ１サイトカインの過剰生産は、自己免疫炎症性疾患、多発性硬化症及び炎症性腸疾患（例えば、クローン病、限局性腸炎、遠位回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、終末回腸炎）を引き起こす。同様に、Ｔｈ２サイトカインの過剰生産は、アナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、じんま疹及び食物アレルギーを含むアレルギー性疾患を引き起こす。Umetsuら., Soc. Exp. Biol. Med. 215:11-20(1997).
１９９７年５月１９日に出願されたＷＯ９７／４４４５５及びSprecherら., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 82-90(1998)には、ここで取り上げるマウス及びヒトＴＣＣＲ分子とある程度の配列同一性を有するサイトカインレセプター分子について記載されている。先行技術のマウス及びヒトサイトカインレセプターは、胸腺、脾臓、リンパ節及び末梢血白血球を含むリンパ系組織において発現すると言われており、更にはＢ及びＴ細胞の双方に存在していて、恐らくは免疫応答の発達及び制御における免疫細胞の増殖、分化及び／又は活性化に関連する機能を有することが示されている。しかしながら、ＷＯ９７／４４４５５及びSprecherら., 上掲では、ＴＣＣＲの正確な役割及びその相同体でＴｈ１サブタイプとＴｈ２サブタイプへのＴ細胞分化及びサイトカイン放出特性に関与するもの、或いはサイトカインＴ細胞サブタイプの放出によって関連付けられる疾患の宿主のいずれも確かめられていない。
【０００６】
（発明の概要）
本発明では、ヒトの、特にＴｈ１サブタイプ又はＴｈ２サブタイプへのＴ細胞分化経路における偏向に起因する生理現象（例えば，サイトカイン放出の特徴）及び疾患を含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断及び治療方法に関する。本発明は、哺乳動物におけるその不在又は不活性化がＴｈ２サブタイプへのＴ細胞の分化を偏向させるＴＣＣＲ（これまではＮＰＯＲとして知られていた）をコードする遺伝子とアミノ酸配列の同定に基づいている。Ｔｈ１又はＴｈ２サブタイプのいずれかへのＴ細胞の分化を抑制又は高めることによって、ある免疫関連疾患は治療することができる。
更に、本発明は、ＴＣＣＲアンタゴニストの有効量を投与することを含んでなるＴｈ１サブタイプに代わってＴｈ２サブタイプへのＴ細胞の分化を促進、刺激又は増強する方法に関する。随意的に、この方法は哺乳動物で起こり、有効量とは治療的有効量である。随意的に、ＴＣＣＲアンタゴニストによって誘導されたＴｈ２サブタイプ細胞へのＴ細胞の分化は、更に抗原刺激によってＴｈ２サイトカイン放出を引き起こす（例えばＩｌ-４、Ｉｌ-５、Ｉｌ-１０及びＩｌ-１３）。Ｔｈ１サイトカインの過剰生産によって特徴付けられ、分化のＴｈ２サブタイプによる刺激の効果を平衡化すること、並びに生成サイトカインの放出特性に対して応答性の疾患は、自己免疫性炎症疾患（例えば、アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、自己免疫性甲状腺疾患）及び同種移植の拒絶反応を含む。
【０００７】
更に、本発明は、ＴＣＣＲ又はアゴニストの有効量を投与することを含んでなる、Ｔｈ２サブタイプへのＴ細胞の分化を妨げる、阻害する又は弱める方法に関する（すなわち、Ｔｈ１サブタイプへの分化を起こす）。随意的に、該方法は哺乳動物でおこなわれ、有効量とは治療的有効量である。随意的に、該ＴＣＣＲ又はアゴニストによって誘導された分化は、抗原刺激によってＴｈ１サイトカイン放出特性を引き起こす（例えば、γ-インターフェロン）。Ｔｈ２サイトカインの過剰生産（又はＴｈ１サイトカインの不十分な生産）によって特徴付けられ、そしてＴｈ２サイトカイン過剰生産の分化のＴｈ１サブタイプによる刺激の効果を平衡化することに対して応答性の疾患は、感染症の治療（例えば、リーシュマニア・メジャー、マイコバクテリウム・レプラ、カンジダ・アルビカンス 、トキソプラズマ・ゴンディ、RSウイルス及びヒト免疫不全ウイルス）及びアレルギー性疾患（喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル）において有効であることが期待される。
一実施態様では、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチドへ結合する単離された抗体に関する（例えば、抗-ＴＣＣＲ）。一側面では、該抗体はＴＣＣＲポリペプチドの活性を模倣するか（アゴニスト抗体）、又は逆に該抗体はＴＣＣＲポリペプチドの活性を阻害又は中和する（アンタゴニスト抗体）。その他の側面では、該抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及び枠組み構造領域（ＦＲ）残基を有する。該抗体を標識化され、そして個体支持体へ固定化することが可能である。更なる側面では、該抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
【０００８】
その他の実施態様では、本発明は、上記に記載の用途を有する組成物又は薬剤を調製するための本発明のポリペプチド及び抗体の利用に関する。
更なる実施態様では、本発明は、抗-ＴＣＣＲ抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を含んでなるベクターと組み換え宿主細胞に関する。より更なる実施態様では、本発明は、該抗体が発現する条件下において、該抗体をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を培養すること、及び細胞培地から該抗体を回収することによって該抗体を生産する方法に関する。
更に、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチドの一つ又は複数の機能又は活性を阻害するＴＣＣＲポリペプチドのアンタゴニストに関する。あるいは、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチドの一つ又は複数の機能又は活性を刺激又は高めるＴＣＣＲアゴニストに関する。好ましくは、該アンタゴニスト及び／又はアゴニストは、ＴＣＣＲ変異体、ペプチド断片、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、リボザイム又は抗体である（上述のモノクローナル、ヒト化、特異的、一本鎖、ヘテロ抱合又は断片）。その上に、潜在的ＴＣＣＲアンタゴニストは可溶性ＴＣＣＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を包含することができるが、ＴＣＣＲアゴニストは潜在的ＴＣＣＲリガンドを包含することができる。
【０００９】
更なる実施態様では、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイゼーションする単離された核酸、又はその補体に関する。該核酸は、好ましくはＤＮＡであり、そしてハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件下で起こる。当該核酸分子は、ここで同定された増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用し、そしてそれぞれの増幅遺伝子の調節において、又は増幅反応でのアンチセンスプライマーとしての利用を見出すことができる。更には、当該配列は、リボザイム及び／又は三重らせん配列の一部として利用することができ、そして増幅遺伝子の制御に利用できる可能性がある。
その他の実施態様では、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチドを含有すると思われる細胞へ抗-ＴＣＣＲ抗体を曝露し、該細胞への抗体の結合を確定することを含んでなる、ＴＣＣＲポリペプチドの存在を確定する方法に関する。
【００１０】
更なるその他の実施態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞であるコントロール試料からＴＣＣＲポリペプチドをコードする遺伝子の発現を検出することを含んでなる、哺乳動物におけるＴｈ-１媒介又はＴｈ-２媒介疾患の診断方法に関するものであって、コントロール試料に対して試験試料での低い発現レベルは、試験組織細胞が得られた哺乳動物におけるＴｈ-２媒介疾患の存在を示し、コントロール試料に対して試験試料での高い発現レベルは、試験組織細胞が得られた哺乳動物におけるＴｈ-１媒介疾患の存在を示す。
その他の実施態様では、本発明は、（ａ）抗-ＴＣＣＲ抗体を哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料と接触せしめること、及び（ｂ）該試験試料における、該抗体とＴＣＣＲポリペプチドの間の複合体の形成を検出することを含んでなる、哺乳動物における免疫疾患の診断方法に関する。該検出法は、定性的又は定量的でもよく、そして同じ細胞型の既知の正常組織細胞であるコントロール試料において、該複合体の形成をモニターすることと比較して行われうる。該試験試料において形成される大量の複合体は、ＴＣＣＲの存在及びＴｈ-１媒介疾患を示し、より低い量は、試験組織細胞が得られた哺乳動物におけるＴｈ-２媒介疾患を示す。該抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。光学顕微鏡、フローサイトメトリ、蛍光定量法又は当該分野で知られている他の技術によって、複合体の形成をモニターすることが可能である。該試験試料は、通常は、免疫系の異常又は欠損を有すると思われる個体より得られる。
【００１１】
その他の実施態様では、本発明は、適切なパッケージ中の抗-ＴＣＣＲ抗体及び担体（例えばバッファー）を含む、診断キットに関する。該キットは、好ましくは、ＴＣＣＲポリペプチドの検出に抗体を利用するための指示書を含む。
更なる実施態様では、本発明は、
容器；
容器上の標識；及び
容器内に含まれる活性剤を含んでなる組成物；を含んでなる製造品に関し、該組成物は哺乳動物の免疫応答を刺激又は阻害するのに効果的であり、該容器上の該標識は、該組成物を免疫関連疾患の治療に利用することができることを示し、そして該組成物中の該活性剤は、該ＴＣＣＲポリペプチドの発現及び／又は活性を刺激又は阻害する薬剤である。好ましい側面では、該活性剤はＴＣＣＲポリペプチド又は抗-ＴＣＣＲ抗体である。
更なる実施態様は、候補化合物とＴＣＣＲポリペプチドの接触を可能にするのに十分な条件と時間の下で、これら二つの化合物を接触せしめることによって、ＴＣＣＲポリペプチドの発現及び／又は生物活性を調節することが可能な化合物を同定する方法に関する。特別な側面では、該候補化合物又は該ＴＣＣＲポリペプチドのいずれかを固体支持体へ固定化する。その他の側面では、非固定化成分は検出可能な標識を有する。
【００１２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
「免疫関連疾患」とは、哺乳動物の免疫系の構成成分が哺乳動物において病的な状態を引き起こし、仲介し、または寄与するような疾患を意味する。また、免疫反応の促進又は処置が、疾患の進行に対して改善的な効果を有するような疾患をも含む。この用語には、免疫媒介炎症誘発性疾患、非免疫媒介炎症誘発性疾患、感染性疾患、免疫不全性疾患、腫瘍形成等が含まれる。
「Ｔｈ１媒介疾患」という用語は、Ｔｈ１サブタイプへのＴ細胞分化における過剰生産又は偏りに起因する場合を含むＴｈ１サイトカインの過剰生産によって特徴付けられる疾患を意味する。そのような疾患は、例えば、自己免疫性炎症疾患（例えば、アレルギー性筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、甲状腺中毒症、強皮症、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎、末梢回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、終末回腸炎）、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血）及び同種移植の拒絶反応を含む。
「Ｔｈ２媒介疾患」という用語は、Ｔｈ２サブタイプへのＴ細胞分化における過剰生産又は偏りに起因する場合を含むＴｈ２サイトカインの過剰生産によって特徴付けられる疾患を意味する。そのような疾患は、例えば、感染症疾患による感染の悪化（例えば、リーシュマニア・メジャー 、らい菌、カンジダ・アルビカンス 、トキソプラズマ・ゴンディ、ＲＳウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等）及びアレルギー性疾患、例えばアナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、食物アレルギー等を含む。
【００１３】
他の免疫、免疫関連及び炎症性疾患の例として、その幾つかはＴｈ１及びＴｈ２へのＴ細胞分化の効力（例えば、サイトカイン放出特性）によって媒介され、そして全身性エリトマトーデス、間接リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患、（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫炎症性疾患（例えば、アレルギー性筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、甲状腺中毒症、強皮症、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎、末梢回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、終末回腸炎）、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血）及び同種移植の拒絶反応、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症 、特発性脱髄性多発神経障害又はGuillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症誘発性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン疾患）、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性ヒス疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患を含む考案に従って治療することができる。感染性疾患には、ウイルス性疾患、例えばエイズ（ＨＩＶ感染）、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、ヘルペス等、細菌性感染症、真菌性感染症、原生動物感染症、寄生虫感染症、及びＲＳウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等、及びアレルギー疾患、例えばアナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、じんま疹及び食物アレルギー等が含まれる。
【００１４】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防、和らげ、又は改善することが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。免疫関連疾患（例えば、Ｔｈ１媒介及びＴｈ２媒介疾患）治療では、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤による治療、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等に対してより敏感にしうる。
「有効量」とは、Ｔｈ１サブタイプ又はＴｈ２サブタイプのいずれかへのＴ細胞の分化、及び／又はこれらＴ細胞サブタイプが分泌するサイトカイン放出特性における検出可能な偏りを起こす、誘導する又は招くＴＣＣＲポリペプチド、そのアゴニスト及び／又はアンタゴニストの最小濃度である。更には、「治療的有効量」とは、Ｔｈ１媒介又はＴｈ２媒介疾患のいずれかを治療するのに有効なＴＣＣＲポリペプチド、そのアゴニスト及び／又はそのアンタゴニストの最小濃度（量）である。
【００１５】
「慢性」投与とは、急性の形式とは反対に連続的な形式の剤の投与を意味し、最初の生物学的効果を長期の時間に渡って維持する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる処置である。
免疫関連疾患の「病理」は、患者の良好な全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、抗体生産、自己抗体生産、補体の生産と活性化、正常に機能している隣接細胞への干渉、サイトカイン又は他の分泌物の異常なレベルでの放出、如何なる炎症性又は免疫性応答の抑制又は悪化、炎症性細胞の組織空間への浸潤（好中球の、好酸球の、単球性の、リンパ性の）等を含む。
治療目的で「哺乳動物」と言うときは、ヒト、家及び牧場の動物、及び動物園の動物、運動用の動物、愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等々を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００１６】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
【００１７】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ、インビボにおいて細胞の成長を阻害する化合物又は組成物のことを称する。従って、成長阻害剤の例には、Ｓ期の遺伝子を過発現させる細胞の割合を著しく減少させるようなものである。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の時点において)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、トポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００１８】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００１９】
用語「ＴＣＣＲポリペプチド」、「ＴＣＣＲタンパク質」及び「ＴＣＣＲ」は、ここで用いる場合、天然配列ＴＣＣＲ及びＴＣＣＲポリペプチド変異体（ここで更に定義する）を含む。ＴＣＣＲポリペプチドは、ヒト組織型等の種々の供給源から、又は他の供給源から単離しても、組換え及び／又は合成方法により調製してもよい。
「天然配列ＴＣＣＲポリペプチド」は、天然由来の対応するＴＣＣＲポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＴＣＣＲポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＴＣＣＲポリペプチド」という用語には、特に、特定のＴＣＣＲポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ヒトＴＣＣＲは、Ｆｉｇ３(配列番号：１)のアミノ酸１〜６３６を含む成熟又は全長天然配列ＴＣＣＲポリペプチドである。同様に、天然配列マウスＴＣＣＲは、Ｆｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸１〜６２３を含む。また、Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に開示されているＴＣＣＲポリペプチドは、アミノ酸位置１としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、Ｆｉｇ３（配列番号：１）又はＦｉｇ４（配列番号：２）におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＴＣＣＲポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
【００２０】
「ＴＣＣＲポリペプチド細胞外ドメイン」又は「ＴＣＣＲ ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しないＴＣＣＲポリペプチドの型を意味する。通常、ＴＣＣＲポリペプチドＥＣＤは、約１％未満のそのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを、そして好ましくは約０．５％未満のそのようなドメインを有する。本発明のＴＣＣＲポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、本発明の一実施態様では、ヒトＴＣＣＲポリペプチドの細胞外ドメインは、Ｘ１がＦｉｇ３（配列番号：１）の残基５１２〜残基５２２のいずれかのアミノ酸残基である、アミノ酸１又は約３３〜Ｘ１を含む。同様に、マウスＴＣＣＲポリペプチドは、Ｘ２がＦｉｇ４（配列番号：２）の残基５０９〜５１９のいずれかのアミノ酸残基である、アミノ酸１又は約２５〜Ｘ２を含む。
【００２１】
「ＴＣＣＲ変異体ポリペプチド」は、以下に定義するような活性なＴＣＣＲポリペプチドを意味し、（ａ１）Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されたヒトＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約３３〜６３６、；（ａ２）Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されたマウスＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約２５〜６２３；（ｂ１）Ｘ３がＦｉｇ３（配列番号：１）アミノ酸残基２７〜３７のいずれかである、Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されているヒトＴＣＣＲポリペプチドのＸ３〜６３６；（ｂ２）Ｘ４がＦｉｇ４（配列番号：２）アミノ酸残基２０〜３０のいずれかである、Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されているマウスＴＣＣＲポリペプチドのＸ４〜６２３；（ｃ１）Ｘ１がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５１２〜５２２のいずれかである、１又は約３３〜Ｘ１；（ｃ２）Ｘ２がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５０９〜５１９のいずれかである、１又約２５〜Ｘ２；（ｄ１）Ｘ５がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５３３〜５４３のいずれかである、Ｘ５  〜６３６；（ｄ２）Ｘ６がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５２７〜５３７のいずれかである、Ｘ６〜６２３又は（ｅ）Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に示されているアミノ酸配列からその他の特異的に誘導された断片に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２２】
これらのＴＣＣＲ変異体ポリペプチドは、例えば、Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）の配列のＮ-及び／又はＣ-末端並びに一又は複数の内部ドメインにおいて一又は複数のアミノ酸残基が付加又は削除されたＴＣＣＲポリペプチドを含む。通常、ＴＣＣＲ変異体ポリペプチドは、（ａ１）Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されたヒトＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約３３〜６３６、；（ａ２）Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されたマウスＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約２５〜６２３；（ｂ１）Ｘ３がＦｉｇ３（配列番号：１）アミノ酸残基２７〜３７のいずれかである、Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されているヒトＴＣＣＲポリペプチドのＸ３〜６３６；（ｂ２）Ｘ４がＦｉｇ４（配列番号：２）アミノ酸残基２０〜３０のいずれかである、Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されているマウスＴＣＣＲポリペプチドのＸ４〜６２３；（ｃ１）Ｘ１がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５１２〜５２２のいずれかである、１又は約３３〜Ｘ１；（ｃ２）Ｘ２がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５０９〜５１９のいずれかである、１又は約２５〜Ｘ２；（ｄ１）Ｘ５がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５３３〜５４３のいずれかである、Ｘ５〜６３６；（ｄ２）Ｘ６がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５２７〜５３７のいずれかである、Ｘ６〜６２３又は（ｅ）Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に示されているアミノ酸配列からその他の特異的に誘導された断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２３】
ＴＣＣＲ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約２５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、より多くは少なくとも約４００アミノ酸長、より多くは少なくとも約５００アミノ酸長、より多くは少なくとも約６００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００２４】
ここで同定されているポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＴＣＣＲポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表３（Ａ−Ｑ）に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表３（Ａ−Ｑ）に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表３（Ａ−Ｑ）に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２５】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：  分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２（Ａ−Ｂ）は、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００２６】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２７】
また、「本発明のポリペプチド」という用語には、上記のように実施されるアミノ酸配列同一性比較において、比較された配列中のアミノ酸残基で同一のアミノ酸残基のみではなく、類似の特性を有するアミノ酸残基を含むポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドは「陽性（ポジティブ）」である。関心あるアミノ酸残基に対して陽性値（ポジティブ）をスコアするアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基が好ましく置換されたもの（下記の表Ｉに定義）のいずれかである。ここでの目的のために、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する付与されたアミノ酸配列Ａのポジティブ％値(別に、付与されたアミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定の％ポジティブを有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列プログラムALIGN-2によりポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％ポジティブは、Ａに対するＢの％ポジティブとは等しくないと認識されるであろう。
【００２８】
「ＴＣＣＲ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＴＣＣＲ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＴＣＣＲポリペプチドをコードする核酸分子であり、（ａ１）Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されたヒトＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約３３〜６３６、；（ａ２）Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されたマウスＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約２５〜６２３；（ｂ１）Ｘ３がＦｉｇ３（配列番号：１）アミノ酸残基２７〜３７のいずれかである、Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されているヒトＴＣＣＲポリペプチドのＸ３〜６３６；（ｂ２）Ｘ４がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基２０〜３０のいずれかである、Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されているマウスＴＣＣＲポリペプチドのＸ４〜６２３；（ｃ１）Ｘ１がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５１２〜５２２のいずれかである、１又は約３３〜Ｘ１；（ｃ２）Ｘ２がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５０９〜５１９のいずれかである、１又は約２５〜Ｘ２；（ｄ１）Ｘ５がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５３３〜５４３のいずれかである、Ｘ５〜６３６；（ｄ２）Ｘ６がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５２７〜５３７のいずれかである、Ｘ６〜６２３又は（ｅ）Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に示されているアミノ酸配列からその他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する核酸を意味する。通常は、ＴＣＣＲ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、（ａ１）Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されたヒトＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約３３〜６３６、；（ａ２）Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されたマウスＴＣＣＲポリペプチドの残基１又は約２５〜６２３；（ｂ１）Ｘ３がＦｉｇ３（配列番号：１）アミノ酸残基２７〜３７のいずれかである、Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示されているヒトＴＣＣＲポリペプチドのＸ３〜６３６；（ｂ２）Ｘ４がＦｉｇ４（配列番号：２）アミノ酸残基２０〜３０のいずれかである、Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されているマウスＴＣＣＲポリペプチドのＸ４〜６２３；（ｃ１）Ｘ１がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５１２〜５２２のいずれかである、１又は約３３〜Ｘ１；（ｃ２）Ｘ２がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５０９〜５１９のいずれかである、１又は約２５〜Ｘ２；（ｄ１）Ｘ５がＦｉｇ３（配列番号：１）のアミノ酸残基５３３〜５４３のいずれかである、Ｘ５〜６３６；（ｄ２）Ｘ６がＦｉｇ４（配列番号：２）のアミノ酸残基５２７〜５３７のいずれかである、Ｘ６〜６２３又は（ｅ）Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に示されているアミノ酸配列からその他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。
【００２９】
通常は、ＴＣＣＲ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００３０】
ここで同定されるＴＣＣＲコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象の発明ポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表３（Ａ−Ｑ）に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表３（Ａ−Ｑ）に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、表３（Ａ−Ｑ）に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００３１】
ここでの目的ためには、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する与えられた核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表２（Ｃ−Ｄ）は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限り、ここで使用される全ての％核酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して上記前に記載したようにして得られる。しかし、％核酸配列同一性はまた、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。このNCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードして得るか、あるいは米国国立衛生研究所、ベゼスタ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００３２】
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する与えられた核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３３】
他の実施態様では、ＴＣＣＲ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＴＣＣＲポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する全長発明ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。発明変異体ポリペプチドは、発明変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００３４】
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施されたアミノ酸配列同一性比較の中で、比較された配列において同一のアミノ酸残基ばかりではなく、類似の特性を有しているアミノ酸残基を含む。関心あるアミノ酸残基に対して陽性値をスコアするアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基が好ましく置換(以下の表Ｉに定義)されたものである。
【００３５】
この目的において、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する付与されたアミノ酸配列Ａのポジティブ％値(別に、付与されたアミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定の％ポジティブを有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列プログラムALIGN-2によりポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％ポジティブは、Ａに対するＢの％ポジティブとは等しくないと認識されるであろう。
【００３６】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＴＣＣＲポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３７】
ＴＣＣＲポリペプチドをコード化する「単離された」核酸分子は、ＴＣＣＲ-コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離されたＴＣＣＲ-コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＴＣＣＲ-コード化核酸分子とは区別される。しかし、ＴＣＣＲポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＴＣＣＲを通常発現する細胞に含まれるＴＣＣＲコード化核酸分子を含む。
【００３８】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３９】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００４０】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗-ＴＣＣＲモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＴＣＣＲ抗体組成物、単鎖抗-ＴＣＣＲ抗体、及び抗-ＴＣＣＲ抗体の断片を包含する（下記を参照のこと）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。
【００４１】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４２】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００４３】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＴＣＣＲポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００４５】
ここで意図している「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然発生ＴＣＣＲポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する本発明のタンパク質の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＴＣＣＲによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、本発明の天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力以外のもの意味する。同様に、「免疫学的」活性とは、本発明の天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
【００４６】
抗体又はここに開示するスクリーニングアッセイで同定できる他の分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチドなど）の内容における「生物学的活性」は、このような分子の炎症細胞の組織への浸潤を誘導又は阻害する能力、Ｔ細胞の増殖又は分化を刺激又は阻害する能力、並びに細胞によるサイトカイン放出を刺激又は阻害する能力を意味する。その他の好ましい活性は、増大した血管透過性又はその阻害である。最も好ましい活性は、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答の調節である（例えば、Ｔｈ１応答の低下及び／又はＴｈ２応答の上昇、Ｔｈ２応答の低下及び／又はＴｈ１応答の上昇）。
【００４７】
「調節」又は「調節する」という語句は、Ｔｈ１及びＴｈ２サブセットへのＴ細胞の分化によって影響を受ける生理状態のアップレギュレーション、ダウンレギュレーション又は改変を意味する（例えば、サイトカイン放出特性）。この用語の意図される範囲内の細胞プロセスは、限定されないが、特定遺伝子の転写；代謝、増殖、分化、接着、アポトーシス及び生存などの正常な細胞機能、並びに、形質転換、分化及び転移の阻止といった異常なプロセスを含みうる。
【００４８】
「アンタゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する天然ＴＣＣＲポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む（例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞機能のダウンレギュレーション）。同様の方法で、「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する本発明のＴＣＣＲポリペプチドの生物学的活性を模倣、増強又は刺激する任意の分子を含む。適したアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、小有機分子などを含む。ＴＣＣＲポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、ＴＣＣＲポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子と接触させ、そしてＴＣＣＲポリペプチドと正常に関連している一つ又は複数の生物活性の検出可能な変化を測定することである。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義され、一般的に有機分子である。
【００４９】
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持つ糖蛋白質である。抗体は特定の抗原に対する特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、ミエローマによって向上したレベルで生産される。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、例えば、単一の抗-ＴＣＣＲモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体）、及び多エピトープ特異性を有する抗-ＴＣＣＲ抗体組成物、一本鎖抗-ＴＣＣＲ抗体、及び抗-ＴＣＣＲ抗体の断片を包含する（下記を参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。該抗体は、該抗体によって接触されうる本発明のポチペプチドのあらゆるドメインと結合しうる。例えば、該抗体は、ポリペプチドのあらゆる細胞外ドメインと、そしてポリペプチド全体が分泌されると、抗体が結合することができるポリペプチドのあらゆるドメインと結合することができる。
【００５０】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００５１】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の「高頻度可変領域」又は「相補性決定領域(ＣＤＲ）」と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。ＣＤＲを決定する二つ（２）の技術がある：（１）異種間配列可変性に基づく方法（すなわち、Kabatら, Sequences of proteins of immunological(National Instistute of Health, Bethesda, MD 1987)；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法(Chothia, C.ら., Nature 342: 877(1989))。しかしながら、この二つの技術によって異なる残基が描写される限り、ハイブリッドＣＤＲを明らかにするためにこれらの技術を組み合わせることができる。
【００５２】
可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つ又は５つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００５３】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ’)２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５４】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ(ａｂ’)２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。イムノグロブリンの異なるクラスに該当する重鎖不変領域は、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構造が良く知られている。
【００５５】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。特異性に加えて、他のイムノグロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成されることで、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerらによって最初にNature 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は例えば Clacksonら, Nature 352:624-628 (1991) 及び Marksら, J.Mol.Biol. 222：581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。また、ファージミッド及びファージベクターの利用による抗体の調製が記載されている米国特許第５，７５０，３７３、５，５７１，６９８、５，４０３，４８４及び５，２２３，４０９を参照のこと。
【００５６】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；Morrisonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]）。
【００５７】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。幾つかの場合、特にヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の特定の残基が三次元空間における結合部位及び／又は抗体のコンフォメーションへ影響を与える場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最大化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jonesら,Nature 321: 522 -525 (1986)；Reichmannら,Nature 332: 323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 -596 (1992)を参照のこと。又、随意には、このヒト化抗体は、抗体の抗原結合部位が対象とする抗原でマカクザルを免疫化することによって生産された抗体に由来する「primatized 」抗体を含みうる。旧世界ザル（カニクイサル、アカゲサル等）の残基を含有する抗体は、例えば、米国特許第５，６５８，５７０号；５，６９３，７８０号；５，６８１，７２２号；５，７５０，１０５号；及び５，７５６，０９６号に記載されている。
【００５８】
本発明の抗体及びその断片は、結合する抗原に対する抗体又はその断片の親和性を改変するために一つ以上のＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域の配列を変えた抗体である「親和性成熟」抗体をも含む。親和性成熟は、初期抗体に対応する抗原に対する成熟抗体の親和性を結果として増加又は低下させうる。概して、初期抗体はヒト化、ヒト、キメラ又はマウス抗体であり、親和性成熟抗体は初期抗体よりも高い親和性を有する。成熟プロセスの間、任意の標準的方法を利用して、ＣＤＲ又はフレームワーク領域の一つ以上のアミノ酸残基は異なる残基へ変化する。適切な方法には、良く知られたカセット突然変異誘発法（Wellsら, 1985, Gene 34:315）又はオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法（Zollerら, 1987, Nucleic Acids Res., 10:6487-6504）を利用する点変異が含まれる。又、親和性成熟は多くの変異が生産される既知の選択法を利用して実施してもよく、所望する親和性を有する変異は、抗原又はリガンドに対して向上した親和性に基づく変異のプール又はライブラリから選択される。この方法では、既知のファージディスプレイ技術を都合良く利用できる。例えば、米国特許第５, ７５０,３７３号；米国特許第 ５,２２３,４０９号等を参照のこと。
【００５９】
ヒト抗体も本発明の抗体の範囲にある。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することができる。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；米国特許第5,750,373号）。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。抗原による免疫活動の惹起によって、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら,Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００６０】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここでこれらドメインはポリペプチド単鎖中に存在する。一般にＦｖポリペプチドは、ｓＦｖをして抗原結合に対する所望の構造を形成せしめるポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメイン間に更に含む。ｓＦｖのレビューについては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁 (1994)を参照されたい。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００６１】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、それに自然に付随する全ての付随物を持たない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、（１）ローリー法によって、化合物の重量では９５％より高い、そしてもっとも好ましくは重量で９９％より高い程度に、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、或いは（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された化合物には、例えば抗体又はポリペプチドで、自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６２】
「標識」という語は、ここで用いられる場合、直接的又は間接的に化合物、例えば抗体又はポリペプチドと結合して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
【００６３】
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固体相も含む。
【００６４】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば、ここで開示される抗-ＥｒｂＢ２抗体及び、随意には化学療法剤）の送達に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。
【００６５】
ここで用いるように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン（付着因子）」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン（付着因子）部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００６６】
ＩＩ．本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＴＣＣＲポリペプチド
本発明は、部分的に、Ｔｈ１及びＴｈ２サブタイプへのＴ細胞分化の調節を含む免疫関連疾患、そしてそれに関連する宿主の疾患の治療へＴＣＣＲポリペプチドを利用するための新規方法を提供する。特に、ＴＣＣＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離され、Ｔｈ１媒介及びＴｈ２媒介疾患の治療におけるその利用が下記においてより詳細に開示されている。各々Ｆｉｇ３（配列番号：１）及び４（配列番号：２）に示されている一つの天然配列ポリペプチドを、用語ｈＴＣＣＲ及びｍＴＣＣＲが定義する一方で、定義項に提供されている天然配列分子と変異体の両方をＴＣＣＲが定義することを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示したＤＮＡ４１４１９（ｈＴＣＣＲ）及び／又はＤＮＡ１２０６３２（ｍＴＣＣＲ）にコードされるタンパク質並びに上記のＴＣＣＲの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＴＣＣＲ」で呼称する。
【００６７】
ＤＮＡ４１４１９（ｈＴＣＣＲ、配列番号：１）及びＤＮＡ１２０６３２（ｍＴＣＣＲ、配列番号：２）にコードされるタンパク質の予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ＴＣＣＲポリペプチド及びここに記載のコード化核酸に関して、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
上記にて引用されたALIGN-2配列アラインメントプログラムを用いて、全長天然配列ｈＴＣＣＲ（Ｆｉｇ３、配列番号：１）及びｍＴＣＣＲ（Ｆｉｇ４、配列番号：２）が、登録番号４７５３２７及び７７１０１０９を有するDayhoff(GenBank)配列とある程度の配列同一性を有することが見出された。
【００６８】
Ｂ．ＴＣＣＲ変異体
ここに記載した全長天然配列ＴＣＣＲポリペプチドに加えて、ＴＣＣＲ変異体も調製できると考えられる。ＴＣＣＲ変異体は、ＴＣＣＲポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＴＣＣＲポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＴＣＣＲポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【００６９】
天然全長配列ＴＣＣＲ又はここに記載したＴＣＣＲポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＴＣＣＲと比較してＴＣＣＲポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＴＣＣＲポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＴＣＣＲポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＴＣＣＲポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【００７０】
ＴＣＣＲポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＴＣＣＲポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＴＣＣＲ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＴＣＣＲ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＴＣＣＲポリペプチド断片は、Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に示されているＴＣＣＲポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表Ｉに示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Ｉに例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００７１】
0004931310.tif 000002
【００７２】
ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
【００７３】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【００７４】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００７５】
Ｃ．ＴＣＣＲの修飾
ＴＣＣＲポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つの型は、ＴＣＣＲポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＴＣＣＲポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＴＣＣＲを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＴＣＣＲ抗体の精製方法又はその逆で用いるために表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００７６】
本発明の範囲内に含まれる発明ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ポリペプチドに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列には存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００７７】
本発明のポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は１９８７年９月１１日発行 のＷＯ８７／０５３３０及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981)に示されている。
本発明のポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって成される。化学的脱グリコシル化は当該分野において良く知られた技術であり、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdgeほか, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により示されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakuraほか, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
共有結合修飾の他のタイプは、米国特許番第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載されているように、本発明のポリペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含む。
また、本発明のＴＣＣＲポリペプチドは、その他の、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を形成する方法によって修飾してもよい。
【００７８】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって本発明のポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fieldら,Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００７９】
それに換わる実施態様では、キメラ分子は本発明の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００８０】
Ｄ．ＴＣＣＲの調製
以下の説明は、主として、ＴＣＣＲ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＴＣＣＲを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＴＣＣＲを調製することができると考えられる。例えば、ＴＣＣＲ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＴＣＣＲの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＴＣＣＲを生産してもよい。
【００８１】
１．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＴＣＣＲをコードするＤＮＡは、ＴＣＣＲｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＴＣＣＲＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＴＣＣＲ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(本発明のポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら, 上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００８２】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に示されている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００８３】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＴＣＣＲ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。  一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
【００８４】
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００８５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (argF-lac)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (algF-lac)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第４９４６８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【００８６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＴＣＣＲポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol. 154(2)737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００８７】
グリコシル化ＴＣＣＲの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００８８】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＴＣＣＲをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。  ＴＣＣＲは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＴＣＣＲ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は１９９０年１１月１５日に公開されたWO ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００８９】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、本発明のコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００９０】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＴＣＣＲ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahngら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＴＣＣＲをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００９１】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＴＣＣＲ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＴＣＣＲをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＴＣＣＲコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＴＣＣＲをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＴＣＣＲの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979)； ＥＰ １１７，０６０； 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【００９２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＴＣＣＲポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＴＣＣＲ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００９３】
５．ポリペプチドの精製
ＴＣＣＲの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＴＣＣＲのポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＴＣＣＲを精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び生産される特定のＴＣＣＲの性質に依存する。
【００９４】
６．組織分布
本発明のポリペプチドを発現する組織の位置は、、種々のヒト組織でのｍＲＮＡ発現の測定により確認できる。そのような遺伝子の位置によって、本発明のポリペプチドの活性の刺激及び阻害によって最も影響を受ける組織に関する情報が得られる。また、特定の組織中の遺伝子の位置は、下記にて論じる活性遮断アッセイのための試料組織を提供する。
上記したように、種々の組織における遺伝子増幅又は遺伝子発現は、ｍＲＮＡの転写の定量化のための従来のサザンブロット、ノーザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーションにより、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識する抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片及び細胞培地又は体液の免疫組織学的染色などの免疫的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。都合良く、抗体は、本発明のポリペプチドの天然配列に対して、又は本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、或いは本発明のポリペプチドをコードし、特異的抗体エピトープをコードするＤＮＡと融合した外来配列に対して調製してもよい。下記に、抗体を生成するための一般的な技術、並びにノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーションのプロトコールを提供する。
【００９５】
Ｅ．ＴＣＣＲの用途
１．一般的用途
ＴＣＣＲは、ＷＳ（Ｇ）ＸＷＳクラスのサイトカインレセプターであり、ＩＬ-１２βレセプター、Ｇ−ＣＳＦＲ及びＩＬ-６レセプターと相同性を有し、ＩＬ-１２β−２レセプターに対して最も高い相同性を有する（２６％の同一性）。これらのレセプターは、細胞の成長及び分化、特に血液細胞の成長と分化に関与する細胞を制御することができるシグナルを伝達する。例えば、Ｇ−ＣＳＦには、化学療法後に好中球を増殖させる臨床学的応用において幅広い用途が見出されている。これらの型のサイトカインレセプターとそれらのアゴニスト／アンタゴニストは、血液学的及び腫瘍学的疾患の治療において重要な役割を担うと思われる。ＴＣＣＲは、Ｔヘルパー細胞応答、特にＴｈ１及びＴｈ２へのＴ細胞分化の調節において、一役を担うことが見出されている。従って、ＴＣＣＲとそのアゴニスト／アンタゴニストは、所望する治療目的による、哺乳動物の免疫応答をＴヘルパー−１応答（Ｔｈ１）又はＴ−ヘルパー−２（Ｔｈ２）のいずれかへ偏らせる治療方法において有用でありうる。
【００９６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、応答に関与するすべての他の細胞型の補強、成長及び分化を促進することによって、アレルギー性炎症応答において重要な役割を担う。インターロイキン（ＩＬ-４）及びＩＬ-３を含む、マスト細胞の成長、Ｂ細胞におけるＩｇＥ合成の誘導、及びリンパ球、マスト細胞、及び炎症部分への好塩基球の補強を促進する幾つかのサイトカインを分泌することによって、ＣＤ４＋細胞はこの機能を果たす。更には、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、好酸球及びＢ細胞の成長と機能を促進するＩＬ-５、並びにマスト細胞の成長と分化を促進し、γ-インターフェロンの生産を阻害するＩＬ-１０を生産する。ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-１０及びＩＬ-１３の組み合わせは、Ｔｈ２細胞と呼ばれているＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットによって生産され、この細胞はアレルギー症の個体において多量に増加して見出される。
Ｔｈ１細胞は、マクロファージの活性化（ＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β））、並びに細胞性免疫を誘導するのに重要なサイトカインを分泌する。Ｔｈ２細胞は、体液性免疫及びアレルギー性疾患において重要なサイトカインを分泌する（ＩＬ-４、ＩＬ-５及びＩＬ-１０）。Ｔｈ１サイトカインがＴｈ２サイトカインの生産を阻害する一方で、Ｔｈ２サイトカインはＴｈ１サイトカインの生産を阻害する。このネガティブフィードバックループは、免疫応答の間に分極化したサイトカインの生産特性を際立たせる。Ｔｈ１サイトカインの過剰生産が自己免疫疾患と同種移植の拒絶反応を引き起こすことから、これら「対立する」サイトカイン間の生産の微妙なバランスの維持は重要である。これと同時に、アレルギー性炎症疾患、例えばＴｈ２サイトカインの生産は、喘息及びアレルギー性鼻炎、又は細胞内病原体に対する効果の無い免疫を引き起こす。
【００９７】
Umetsu及びDeKruyff，Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 215(1): 11-20(1997)は、感染の疑いは免疫の欠如ではなく、むしろ不適切なサイトカイン特性を分泌するＴ細胞の発生として説明できることを提案している。非アレルギー性の個体は、ＩｇＥ合成及びマスト細胞及び好酸球分化を阻害するＴｈ１サイトカインを分泌するＴ細胞を発生させるので、無症候のままであるが、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２サイトカインを不適切分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞によって起こりる。別の言い方をすると、アレルギー性鼻炎及び喘息は、病理的異常又は経口／粘膜耐性を表うることができ、正常には「Ｔｈ２」制御／抑制細胞へ発達するＴ細胞は、これに代わって、アレルギー性炎症を開始そして強める「Ｔｈ２」細胞へ発達する。
サイトカインレセプターは、一般的には、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含んでなる多ドメイン構造によって特徴付けられる。細胞外ドメインは、通常はリガンドとの結合として機能し、膜貫通ドメインはレセプターを細胞膜へ固着させ、そして細胞内ドメインは、通常は細胞内のシグナル伝達に関与しているエフェクターである。しかしながら、リガンド結合及びエフェクター機能は、多量体レセプターの個々のサブユニットに存在しうる。リガンド結合ドメインそのものは、複合ドメインである。多量体レセプターは、一般的には：（１）ホモ二量体；（２）リガンド結合及びエフェクタードメインの両方があるサブユニットを有するヘテロ二量体；及び（３）異なる機能がある構成サブユニットを有する多量体を含む幅広い用語である。サイトカインレセプターは、Urdahl, Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228(1991)及びCosman, Cytokine 5: 95-106(1993)においてさらに概説そして分類されている。
特定の免疫関連用途（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞媒介生理機能）に加えて、ＴＣＣＲをコードするヌクレオチド配列（又はそれらの補体）には、染色体及び遺伝子マッピング、そしてアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの作製におけるハイブリダイゼーションプローブとしての用途を含む、分子生物学分野における種々の応用がある。また、ここに記載されている組み換え技術によって、ＴＣＣＲ核酸はＴＣＣＲポリペプチドの調製にとって有用である。
【００９８】
Ｆｉｇ３（配列番号：１）及びＦｉｇ４（配列番号：２）に記載されている全長天然配列ＴＣＣＲ遺伝子、又はその一部分は、全長ＴＣＣＲを単離するため、又はＦｉｇ３及び４（各々配列番号：１＆２）に開示されているＴＣＣＲ配列に対して所望する配列同一性を有するさらに他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＣＣＲの天然発生変異体又は他の種由来のＴＣＣＲ）を単離するために、ｃＤＮＡライブラリに対するハイブリダイゼーションプローブとして利用することが可能である。随意には、このプローブの長さは約２０から５０塩基である。このハイブリダイゼーションプローブは配列番号：１＆２のヌクレオチド配列の領域に由来し、これらの領域は、過度の実験をせずに、或いは天然配列ＴＣＣＲのプロモーター、エンハンサーエレメント及びイントロンから決定することが可能である。一つの例として、スクリーニング方法には、約４０塩基の選択プローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を用いることでＴＣＣＲ遺伝子のコード化領域を単離することが含まれる。放射線ヌクレオチド、例えば３２Ｐ又は３５Ｓのような、或いは酵素標識、例えばアビジン／ビオチン共役系を経由してプローブと共役しているアルカリフォスファターゼを含む種々の標識によって、ハイブリダイゼーションプローブは標識されうる。本発明のＴＣＣＲ遺伝子の配列に対して相補的な配列を有する標識されたプローブは、このプローブがハイブリダイゼーションするメンバーを決定するために、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリのスクリーニングへ用いることができる。ハイブリダイゼーション技術は、下記の実施例にさらに詳しく記載されている。ここで開示されている方法を利用して、ここで開示されているあらゆるＥＳＴ又は他の配列断片を、同じようにプローブとして用いることが可能である。
【００９９】
ＴＣＣＲ核酸の他の有用な断片には、標的ＴＣＣＲ ｍＲＮＡ（センス）又はＴＣＣＲ ＤＮＡ（アンチセンス）と結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのどれか）を含んでなるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドには、ＴＣＣＲ ＤＮＡのコード化領域の断片が含まれる。そのような断片には、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドが含まれる。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づくアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えばStein及びCohen, Cancer Res. 48: 2659(1988)及びvan der Krolら, Techniques 6:958(1988)に示されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＣＣＲタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１００】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（WO 90/13641参照）を含む。
【０１０１】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＴＣＣＲコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
【０１０２】
また、ＴＣＣＲをコードする核酸配列は、そのＴＣＣＲをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ＴＣＣＲがレセプターであるために、ＴＣＣＲのコード化配列は、その他のタンパク質と結合するタンパク質をコードする。従って、本発明のＴＣＣＲタンパク質は、結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＴＣＣＲは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＴＣＣＲ又はＴＣＣＲのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１０３】
ここに記載したＴＣＣＲポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したＴＣＣＲポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各ＴＣＣＲ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のＴＣＣＲポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＴＣＣＲポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＴＣＣＲ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１０４】
２．抗体結合の研究
本発明のＴＣＣＲポリペプチドの活性は、組織細胞上でのＴＣＣＲポリペプチドの効果を阻害する抗-ＴＣＣＲ抗体の能力が試験される抗体結合の研究によって更に確認できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の（腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる）標的タンパク質の量は、抗体に結合し始める標準物の量に逆比例する。結合し始める標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
【０１０５】
サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第４，３７６，１１０号参照。第２の抗体は検出可能部分で標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能部分で標識された抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、腫瘍試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【０１０６】
３．細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルを、ここで同定された遺伝子とポリペプチド、並びに免疫関連疾患の発達と病原性との関係をさらに理解するのに用いることができる。
異なる方法では、ここに記載されたｃＤＮＡを特定の免疫関連疾患に関与することが知られているある細胞型の細胞へ形質移入し、これらのｃＤＮＡの免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞は所望の遺伝子で形質移入し、そして免疫機能をモニターすることができる。このような形質移入株化細胞は、例えばＴ細胞の増殖又は炎症性細胞の浸潤を調節する免疫機能を阻害又は刺激するポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに用いることができる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患の治療の候補薬の同定に用いることができる。
さらには、安定な株化細胞が好ましいが、トランスジェニック動物から誘導された一次培地を（下記のような）、ここでの細胞ベースアッセイに使用することができる。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術は、この分野で良く知られている（Smallら, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照）。
【０１０７】
一つの適切な細胞ベースアッセイは、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)である。Current Protocols in Immunology, unit3.12；J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Inc。このアッセイでは、活性Ｔ細胞の増殖を刺激又は阻害する試験化合物の能力が評価される。レスポンダーＴ細胞の懸濁液を同種刺激細胞と培養し、Ｔ細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定する。このアッセイは、Ｔ細胞反応性の一般的な測定法である。活性化によって、Ｔ細胞の大多数がＩＬ-２へ応答し、ＩＬ-２を生産することから、このアッセイでの応答性の相違の一部は、応答細胞によるＩＬ-２生産の違いを反映する。ＭＬＲの結果は、標準的なリンフォカイン（ＩＬ-２）検出アッセイによって確かめられる。Current Protocols in Immunology, 上掲, ３．１５，６．３。
ＭＬＲアッセイにおける増殖性のＴ細胞応答は、アッセイされた分子の直接的な分裂促進特性又は外来性の抗原誘導活性化に起因する。本発明のポリペプチドのＴ細胞刺激性活性の更なる確認は、同時刺激アッセイによって得ることができる。Ｔ細胞活性化には、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して媒介される抗原特異性シグナルと二番目のリガンド結合による相互作用を通して媒介される同時刺激シグナル、例えばＢ７（ＣＤ８０，ＣＤ８６）／ＣＤ２８結合相互作用が必要される。ＣＤ２８架橋は、活性化Ｔ細胞によるリンフォカインの分泌を増加させる。Ｔ細胞活性化は、ネガティブ又はポジティブ効果のあるリガンド結合を通して、ネガティブ及びポジティブコントロールの両方を有する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ-４はＢ７と結合するＩｇスーパーファミリーの関連する糖タンパク質である。Ｂ７へのＣＤ２８の結合には、Ｔ細胞活性化のポジティブ同時刺激効果がある；逆を言えば、Ｂ７へのＣＴＬＡ-４の結合には、ネガティブなＴ細胞非活性化効果がある。Chambers, C.A.及びAllison, J.P., Curr. Opin. Immunol.(1997) 9:396；Schwartz, R.H., Cell(1992) 71: 1065；Linsey, P.S.及びLedbetter, J.A., Annu. Rev. Immunol.(1993) 11:191；June, C.H.ら., Immunol. Today(1994) 15:321；Jenkins, M.K., Immunity(1994) 1:405。同時刺激アッセイでは、Ｔ細胞同時刺激性又は阻害活性について本発明のポリペプチドをアッセイする。
【０１０８】
Ｔ細胞増殖の刺激剤（同時刺激剤）であり、そしてその上ＭＬＲ及び度維持刺激アッセイによって決定されたアゴニスト、例えばアゴニスト抗体である本発明のポリペプチドは、本発明の他の化合物と同じく、例えば、貧弱、最適下限又は不十分な免疫機能として特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。これらの疾患は、Ｔ細胞の増殖及び活性化を刺激すること（例えば、Ｔ細胞性免疫、Ｔｈ１及び／又はＴｈ２サイトカイン生産）、並びに本発明の刺激ポリペプチドのような刺激性化合物の投与を通して哺乳動物での免疫応答を増強することによって治療される。例えば、この刺激性ポリペプチドは、ＴＣＣＲリガンドポリペプチド又はそのアゴニスト抗体でもよい。
本発明での刺激性化合物の直接的用途は、初期Ｔ細胞上に発現するリガンド（４-１ＢＢＬ）と結合し、Ｔ細胞活性化と成長の信号を伝達する、腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである４-１ＢＢ糖タンパク質をともなう実験において確かめられている。Alderson, M.E.ら., J. Immunol. (1994) 24:2219。
アゴニスト刺激性化合物の用途も実験的に確かめられている。アゴニスト抗-４-１ＢＢ抗体による治療での４-１ＢＢの活性化は、腫瘍の根絶を促進する。Hellstrom, I.及びHellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1。下記により詳しく記載されている免疫吸着剤療法による腫瘍の治療は、本発明の刺激性化合物の用途のもう一つの例である。
【０１０９】
ＭＬＲアッセイにおいて阻害することが見出されたタンパク質の活性と拮抗する又はそれを遮断することによって、免疫刺激性又は促進効果も達成される。化合物の阻害活性を打ち消すことは、正味の刺激性効果を生み出す。適切なアンタゴニスト／遮断化合物は、阻害性タンパク質を認識してそれと結合するそれの抗体又は断片であり、このタンパク質のレセプターとの効果的な相互作用を遮断して、レセプターを通してのシグナル伝達を阻害する。恐らくはＣＴＬＡ-４の結合による阻害シグナルを除くことによってＴ細胞の増殖を促進する抗-ＣＴＬＡ-４抗体を用いる実験において、この効果は確認されている。Walunas, T.L.ら, Immunity(1994) 1:405。
一方では、Ｔ細胞増殖／活性化及び／又はリンフォカイン分泌の直接的阻害剤である本発明の他の化合物と同様に本発明のポリペプチドは、免疫応答を抑制へ直接に用いることができる。これらの化合物は、免疫応答の程度を減じること、並びに異常に活発な、並外れに最適な、又は自己免疫性の応答によって特徴付けられる免疫関連疾患を治療するのに有用である。本発明のこの化合物の用途は、レセプターＢ７へのＣＴＬＡ-４の結合がＴ細胞を不活性化させる上記に記載の実験によって確認できる可能性がある。本発明の直接的阻害性化合物は、類似の方法で機能する。
あるいは、例えば、本発明の刺激ポリペプチドと結合し、これら分子の刺激効果を遮断する抗体は、正味の阻害性効果を生成し、Ｔ細胞増殖／活性化及び／又はリンフォカイン分泌を阻害することによってＴ細胞性免疫応答を抑制するために用いることができる。このポリペプチドの刺激効果を遮断することは、哺乳動物の免疫応答を抑制する。この用途は、抗-ＩＬ２抗体を用いる実験において確認されている。これらの実験では、抗体ＩＬ２と結合し、ＩＬ２のそのレセプターとの結合を遮断することでＴ細胞阻害効果を達成する。
【０１１０】
４．動物モデル
細胞ベースインビトロアッセイの結果は、インビトロ動物モデル及びＴ細胞機能向けのアッセイを用いてさらに確かめることができる。免疫関連疾患の発達及び病理におけるここで同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。このようなモデルのインビボの性質によって、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植などにより、細胞を導入することによって作成される。
【０１１１】
移植片対宿主疾患は、免疫担当細胞が免疫抑制又は寛容（トレランス）な患者に移植された際に起こる。ドナー細胞が宿主抗原を認識し、これへ応答する。この応答には、生命を脅かす重篤な炎症から下痢及び体重減少の穏やかな場合にまで変化し得る。移植片対宿主疾患モデルは、ＭＨＣ抗原及び微量の移植抗原に対するＴ細胞の反応性を評価する手段を提供する。好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology unit 4.3に詳しく記載されている。
皮膚移植片拒絶の動物モデルは、Ｔ細胞がインビボ組織破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植片拒絶におけるそれらの役割の基準である。最も普通で許容されるモデルは、マウスの尾の皮膚移植である。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶はＴ細胞、ヘルパーＴ細胞尾キラー効果Ｔ細胞に媒介され、抗体ではないことが示された。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2版, W.E. Paul編, Raven Press, NY, 1989, 889-992。好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.4に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用できる他の移植片拒絶モデルは、Tanabe, M.ら, Transplantation (1994) 58: 23及びTinubu, S.A.ら, J. Immunol. (1994) 4330-4338に記載されている同種心臓移植モデルである。
【０１１２】
遅延型過敏症の動物モデルは、同様に細胞媒介免疫機能のアッセイ法を提供する。詳細な型の過敏症反応は、抗原負荷後時間が経過するまでピークに達しない炎症を特徴とするＴ細胞媒介免疫反応である。これらの反応はまた、組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳのモデル）を起こす。好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.5に詳細に記載されている。
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核球炎症、及びその結果生じた中枢神経系の軸索の脱髄によって特徴付けられるＴ細胞性自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的には、ヒトのＭＳの関連する動物モデルであると考えられる。Bolton, C., Multiple Sclerosis(1995) 1: 143。急性及び再発性軽減モデルの両方が開発されている。Current Protocols in Immunology, unit 15.1及び15.2に記載のプロトコールを用いて、本発明の化合物は、免疫性脱髄疾患に対するＴ細胞刺激性又は阻害性活性について試験することができる。Duncan, I.D.ら, Molec. Med. Today(1997) 554-561に記載されている、オリゴデンドログリア又はシュワン細胞が中枢神経系へ移植されるミエリン疾患のモデルも参照のこと。
【０１１３】
接触過敏症は、細胞性免疫機能の単純な遅延型過敏症インビボアッセイである。この手法では、遅延型過敏症反応を引き起こす外来性ハプテンへの皮膚被爆が測定そして定量化される。接触過敏症には、誘発期が後に続く初期感作期が含まれる。この誘発期は、Ｔリンパ球が以前に接触した抗原と遭遇する際に起こる。腫れと炎症が起こり、それをヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルにする。好適な手法は、Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach及びW. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unit 4.2に詳しく記載されている。Grabbe, S. 及びSchwarz, T, Immun. Today 19(1): 37-44(1998)も参照のこと。
関節炎の動物モデルはコラーゲン誘発関節炎である。このモデルは、ヒトの自己免疫性慢性関節リウマチと臨床的、組織学的及び免疫学的特徴を共有し、ヒトの自己免疫性関節炎の許容されるモデルである。マウス及びラットモデルは、滑膜炎、軟骨及び肋軟骨下骨の浸食を特徴とする。本発明の化合物は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 15.5に記載されているプロトコールを用いて、自己免疫性関節炎に対する活性について試験できる。また、Issekutz, A.C.ら, Immunology (1996) 88: 569に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いたモデルも参照のこと。
【０１１４】
喘息のモデルは記載され、そこでは抗原誘発気道過剰反応性、肺性好酸球増加症及び炎症が、動物をオボアルブミンで感作し、次いで動物にエアロゾルで運ばれる同じタンパク質を負荷することにより誘発される。幾つかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長類）は、エアロゾル抗原で負荷した際にヒトのアトピー性喘息に似た徴候を示す。マウスモデルは、ヒト喘息の多くの特徴を持つ。本発明の化合物の喘息治療における活性及び有効性を試験するための好適な方法は、Wolyniec, W.W.ら, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18: 777 及びその引用文献に記載されている。
さらに、本発明の化合物は、乾癬様疾患の動物モデルでも試験できる。証拠は、乾癬についてのＴ細胞病原を示唆している。本発明の化合物は、Schon, M.P.ら, Nat. Med. (1997)3: 183によって記載された、マウスが乾癬に類似する組織病原学的皮膚疾患を示すscid/scidマウスモデルでも試験できる。他の好適なモデルは、Nickoloff, B.J.ら, Am . J. Pathol. (1995) 146: 580に記載されたように調製されるヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。
【０１１５】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Puttenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Thompsonら, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitranoら, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説としては、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Laskoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
【０１１６】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。
例えば免疫細胞の特定の細胞への浸潤を確定するための組織学的検査によって、免疫疾患病理の兆候に関してこの動物を更に調べてもよい。本発明の化合物によるＴ細胞増殖の刺激又は阻害の程度を確定するために、この化合物で処理したトランスジェニック動物で遮断実験をも行うことができる。これらの実験では、上記に記載のようにして調製した本発明のポリペプチドと結合する遮断抗体が動物へ投与され、そして免疫機能への影響が測定される。
【０１１７】
ＴＣＣＲ又はその修飾型をコードする核酸もトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。用語「ノックアウト」は、例えば相同組み換えの結果として内因性の遺伝子が「ノックアウト」又は除去されているトランスジェニック動物を表すために、当該分野で用いられている。相同組み換えとは、内因性の遺伝子に対して相同的な標的ベクターの領域を表すための専門用語である。これら相同的な領域は互いにハイブリダイゼーションし、共有される相同的な領域によって定められる方向性と位置において、宿主の内因性配列がベクター挿入配列で置き換わることで宿主のゲノムと組み換え結合する。ノックアウト動物の遺伝子型は、「−／−」に続く遺伝子の名前によって表示される。これによって、「−／＋」と称される一つの対立遺伝子のみが「ノックアウト」された（ヘテロ接合型）動物からそれが区別される。動物のすべての細胞において、「ノックアウト」された内因性の遺伝子はもはや発現しない。特定の細胞の詳細な分析によって、除去された遺伝子の機能が同定される。
【０１１８】
トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＴＣＣＲをコードするｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＴＣＣＲをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＴＣＣＲをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＴＣＣＲ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＴＣＣＲをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＴＣＣＲをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過剰発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
【０１１９】
あるいは、「ノックアウト」動物は、ここで同定されたポリペプチドをコードする内在性の遺伝子と、動物の胚性細胞へ導入されたそのポリペプチドをコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の相同組み換えの結果として、ここで同定されたポリペプチドをコードする欠陥又は改変遺伝子を有するものとして構築することができる。例えば、ある特定ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立されている技術によって、そのポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに利用できる。ある特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部は、その他の遺伝子、例えば組み込みをモニターするために利用できる選択可能なマーカーをコードする遺伝子によって置き換え又は除去できる。概して、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターを胚性幹細胞へ(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Liほか, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
本発明では、Ｔｈ１及び／又はＴｈ２免疫応答及びこれによって媒介される疾患のＴＣＣＲアゴナイゼーション／アンタゴナイゼーションの効果を研究するためにノックアウトマウスが作製された。
【０１２０】
５．キメラレセプター
更には、未知のリガンドを有するレセプターによるシグナル伝達の効果を確定するために、キメラレセプターを再作製できる。リガンドを単離せずにレセプターの機能を調べる手段として、キメラレセプターは証明されている。Changら., Mol. Cell Biol. 18(2): 896-905(1998)。
【０１２１】
６．免疫アジュバンド療法
一実施態様では、本発明の免疫刺激化合物を腫瘍（癌）治療のための免疫アジュバンド療法に利用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍の特異的抗原を認識することは、現在は立証されている。ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーの遺伝子によってコードされている腫瘍抗原の一群は、すべての成人の正常組織では沈黙しているが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺癌、頭頸部腫瘍、及び膀胱癌においてかなりの量が発現している。DeSmet. C.ら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7149。インビトロとインビボの双方において、Ｔ細胞の同時刺激によって腫瘍の退行と抗腫瘍応答が誘導されることが示されている。Melero, I.ら., Nature Medicine(1997)3: 682；Kwon, E.D.ら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)94: 8099；Lynch, D.H.ら., Nature Medicine(1997)3:625；Finn, O.J.及びLotze, M.T., J. Immunol.(1998)21: 114。本発明の刺激性化合物は、アジュバンドとして、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原への抗腫瘍応答を刺激するために、単独又は成長制御剤、細胞傷害性剤又は化学療法剤とともに投与することができる。既知の投与処方によって、成長制御、細胞傷害性、又は化学療法剤を従来量で投与してもよい。本発明の化合物による免疫刺激活性によって、成長制御、細胞傷害性、又は化学療法剤の減量が可能となり、それによって患者の毒性が潜在的に低下する。
【０１２２】
７．候補薬ためのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定されたＴＣＣＲ核酸によってコードされるポリペプチドと結合又は複合化する化合物、又はその生物学的に活性な変異体を同定するように、そうでなければコードされているポリペプチドと他の細胞性タンパク質の相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含み、特に、小分子候補薬の同定に適している。考えられる小分子には、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫グロブリン融合物を含む合成有機又は無機化合物を含み、そして特に限定することなく、ヒト抗体及び抗体断片と並んで、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化異形を含む抗体を含む。
アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。ここで確認されるすべての候補薬のスクリーニングアッセイには、候補薬とＴＣＣＲポリペプチドの相互作用を可能にする条件下及び十分な時間に渡って、これら二つの分子を接触せしめることを必要とするという共通の特性がある。
【０１２３】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。本発明のＴＣＣＲポリペプチドがレセプターであることから、ＴＣＣＲ変異体、そのアンタゴニスト及び／又はそのアゴニストを含む候補薬を同定する目的で、ＴＣＣＲ ＥＣＤ断片もうまく用いられる。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１２４】
候補化合物が相互作用するがＴＣＣＲタンパク質に結合しない場合、そのレセプターとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１２５】
ここで同定されたＴＣＣＲポリペプチドの相互作用を妨害する化合物と、試験が可能な他の細胞内又は細胞外成分を見出すために、通常は、遺伝子の生産物及び細胞内又は細胞外成分を含有し、反応混合物はこれら成分の結合及び相互作用を可能に成らしめる時間と条件の下で調整される。試験化合物が上記の相互作用を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害する事を示す。
【０１２６】
８．免疫関連疾患治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患（例えばＴｈ１-及び／又はＴｈ２-媒介疾患）の治療に有用な組成物は、限定されないが、タンパク質、抗体、小有機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子などを含み、免疫機能、例えばＴ細胞増殖／活性化、リンフォカイン放出、又は免疫細胞浸潤を阻害又は刺激する。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO ９７／３３５５１（1997年9月18日発行）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１， 上掲を参照。  これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。
【０１２７】
ここに記載されたＴＣＣＲポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニスト（ＴＣＣＲ分子）も、治療薬として用いてもよい。既知の方法に従って、本発明のＴＣＣＲ分子を製剤化して製薬的に有用な組成物を調整することができ、その場合は、ＴＣＣＲ分子を製薬的に許容可能な担体媒体との組み合わせで混合する。  治療用組成物は、適当な純度を持つ所望のＴＣＣＲ分子を任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編, (1980)）と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２８】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、後に続く凍結乾燥及び再構成の前に、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、関節内又は病巣内経路、局所内投与での注射又は注入、あるいは持続放出系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. の「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
ＴＣＣＲ分子のインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
【０１２９】
ＴＣＣＲ分子の投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＴＣＣＲ分子の持続放出が望まれる場合、ＴＣＣＲ分子のマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン(ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; ＷＯ ９７／０３６９２，ＷＯ ９６／４００７２，ＷＯ ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
ＴＣＣＲ分子の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
【０１３０】
９．ＴＣＣＲのアゴニスト及びアンタゴニストの同定
また、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチドの効果（アゴニスト）を模倣又は促進する、或いはＴＣＣＲポリペプチドの複数の機能又は活性を阻止又は阻害する化合物を同定するための方法を提供する。好ましくは、そのようなアンタゴニスト及びアゴニストは、ＴＣＣＲ変異体、ペプチド断片小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又は抗体（モノクローナル、ヒト化、特異的、一本鎖、ヘテロ抱合又は前述の断片）である。その上に、潜在的ＴＣＣＲアゴニストには可溶性ＴＣＣＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含めることができるが、ＴＣＣＲアンタゴニストには潜在的ＴＣＣＲリガンドが含まれる。
アンタゴニスト／アゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされるＴＣＣＲポリペプチドと結合又は複合化する化合物、又そうでなければコードされているポリペプチドと他の細胞性タンパク質の相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含み、特に、小分子候補薬の同定に適している。
アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
ここで考えられるすべての候補薬のスクリーニングアッセイには、候補薬とＴＣＣＲポリペプチドの相互作用を可能にする条件下及び十分な時間に渡って、これら二つの分子を接触せしめることを必要とするという共通の特性がある。
ＴＣＣＲアンタゴニスト及びアゴニストを同定するのに有用な適したアッセイの例は、上記の７．候補薬のためのスクリーニングアッセイの下で既に確認されている。
【０１３１】
アンタゴニストアッセイの更なる例としては、ＴＣＣＲポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、ＴＣＣＲポリペプチド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力が化合物がＴＣＣＲポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＴＣＣＲポリペプチド及び膜結合ＴＣＣＲポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＴＣＣＲポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプターに結合したＴＣＣＲポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＴＣＣＲポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＴＣＣＲポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＴＣＣＲポリペプチドに暴露する。ＴＣＣＲポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１３２】
アンタゴニストのその他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＴＣＣＲポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＴＣＣＲポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＴＣＣＲポリペプチドの作用を競合的に阻害するＴＣＣＲポリペプチドの変異形態であってもよい。最終的には、その他の潜在的ＴＣＣＲアンタゴニストは、入手可能なリガンドと競合することができるＴＣＣＲ ＥＣＤであり、効果的に天然ＴＣＣＲレセプターシグナルを遊離している。
他の潜在的なＴＣＣＲポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。
【０１３３】
例えば、ここでの成熟ＴＣＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりＴＣＣＲポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＴＣＣＲポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: ボーカラトーン, フロリダ, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＴＣＣＲポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
潜在的アンタゴニストは、ＴＣＣＲポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＴＣＣＲポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
【０１３４】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（1997年9月18日公開）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１，上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１３５】
１０．ＴＣＣＲ及び遺伝子治療
また、ＴＣＣＲポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１３６】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzauら, Trends, in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１３７】
１１．抗体
本発明は、抗-ＴＣＣＲ抗体を更に提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異的、及びＴ細胞の増殖、好産球浸潤等を阻害（アンタゴニスト）又は刺激（アゴニスト）し得る抗体断片を含むヘテロ抱合体抗体が含まれる。
【０１３８】
ｉ．ポリクローナル抗体
抗ＴＣＣＲ抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＴＣＣＲポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１３９】
ｉｉ．モノクローナル抗体
あるいは、ＴＣＣＲ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495(1975)，上掲に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化する(上述したようにして)ことで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１４０】
免疫化剤は、典型的にはＴＣＣＲポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の形質転換細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジン(「ＨＡＴ培地」)を含み、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１４１】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものが望ましい。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurほか, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
ハイブリドーマ細胞を培養する培地を、ＴＣＣＲに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１４２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。更に、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
【０１４３】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4816567；Morrisonほか, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。
【０１４４】
本発明の抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
また、インビトロ法は、一価抗体を調製することに適している。抗体の断片、特にＦａｂ断片を生成するために抗体を消化することは、当該分野における常套技術によって達成できる。
【０１４５】
ｉｉｉ．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＴＣＣＲ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら,Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら,Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１４６】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１４７】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；U.S. 5,750,373 ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Marksら,Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
また、抗体は、上記に記載のような既知の選択及び／又は突然変異誘発法を用いて、親和性が成熟したものであってもよい。好ましい親和性成熟抗体は、成熟抗体が調製される元である初期抗体（一般的には、マウス、ヒト化又はヒト）よりも５倍、より好ましくは１０倍、更により好ましくは２０又は３０倍より高い親和性を有する。
【０１４８】
ｉｖ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースの場合において、結合特異性の一方は本発明のポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のＷＯ ９３／０８８２９、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１４９】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１５０】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81(1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１５１】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１５２】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＴＣＣＲポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＴＣＣＲポリペプチドのアームは、特定のＴＣＣＲポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲI(ＣＤ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＴＣＣＲポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＴＣＣＲ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＴＣＣＲポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１５３】
ｖ．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１５４】
ｖｉ．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolffら, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１５５】
ｖｉｉ．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０１５６】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら,Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１--イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６を参照のこと。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１５７】
ｖｉｉｉ．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら,J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)を参照のこと。
【０１５８】
ｉｘ．抗-ＴＣＣＲ抗体の用途
本発明の抗ＴＣＣＲ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＴＣＣＲ抗体は、ＴＣＣＲの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature, 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗-ＴＣＣＲ抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＴＣＣＲのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＴＣＣＲに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＴＣＣＲを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＴＣＣＲ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＴＣＣＲを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１５９】
ｘ．製薬的組成物
本発明の活性分子、ポリペプチド及び抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＴＣＣＲの細胞内部分を標的とする、或いはＴＣＣＲがまだ細胞内にある場合にそれを標的とするためには、内在化抗体を利用することが可能である。その上に、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに利用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
【０１６０】
活性分子の治療用製剤、好ましくは本発明のポリペプチド又は抗体は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）及び／又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６１】
本発明のスクリーニングアッセイによって同定された化合物は、当該分野において良く知られた技術を用いて、類似の方法で製剤化することができる。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１６２】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１６３】
ｘｉ．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性化合物は、例えば、組織への炎症性細胞の浸潤、Ｔ細胞増殖の刺激、Ｔ細胞増殖の阻害、増加又は減少した血管透過性又はその阻害によって特徴付けられるものを含む、Ｔ細胞媒介疾患のような種々の免疫関連疾患及び症状を治療するのに利用することが可能であると考えられている。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物によって治療される例示的症状又は疾患には、限定されないが、全身性エリテマトーデス、慢性関節リュウマチ、若年性慢性関節炎、変形性関節症、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、特発性脱髄性多発神経障害、Guillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害のような中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス）のような肝胆道疾患、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症誘発性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン疾患）のような炎症誘発性及び線維性肺疾患、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性ヒス疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、喘息のようなアレルギー性疾患、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、好酸球性肺炎のような肺の免疫学的疾患、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患が含まれる。
【０１６４】
全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の生成、及び引き続き起こる免疫媒介炎症である。抗体は、直接又は間接的のいずれかによって組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球が直接に組織傷害へ関与していることは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発生において必須である。従って、疾患の発生はＴリンパ球へ依存する。腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む多臓器及び系が、臨床的に病気で冒される。
【０１６５】
慢性関節リュウマチ(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対称的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１６６】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１６７】
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【０１６８】
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ-１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１６９】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
【０１７０】
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１７１】
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【０１７２】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいては、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
【０１７３】
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン-非-反応性の表現型を産出することができる。
【０１７４】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
【０１７５】
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。ＭＳにおいて、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球の駆動によると思われる。
【０１７６】
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。反応を阻害することは治療的に有益なことである。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、Ｔリンパ球に依存して発生する。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。障害はＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴ細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるＴリンパ球、及びＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
【０１７７】
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、ＭＬＲを刺激する(分子／誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応を増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
【０１７８】
幾つかのヒト癌患者において、腫瘍性細胞上の抗原に対する抗体及び／又はＴリンパ球が発生することが示されている。また、免疫応答の増加によって、その特定の腫瘍の拒絶又は退行を引き起こすことができることが、腫瘍形成の動物モデルにおいて示されている。ＭＬＲにおけるＴリンパ球の応答を高める分子（又はアゴニストの方法で同じレセプターへ影響を与える小分子アゴニスト又は抗体）を、癌治療へ治療的に用いることができる。また、ＭＬＲにおいてリンパ球の応答を阻害する分子は、腫瘍形成の間に、インビボにおいて腫瘍に対する免疫応答を抑制する；このような分子は、腫瘍性細胞そのものによって発現されるか、或いは他の細胞の腫瘍がその発現を誘導できる。このような分子の拮抗効果（抗体、小分子又は他の手段の何れかとともに）は、免疫性腫瘍拒絶反応を高める。
【０１７９】
その上に、炎症誘発性特性を有する分子の阻害作用は、再潅流傷害；発作；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化症；急性肺障害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血性ショック；急性腎尿細管壊死；子宮内膜症；変形性関節疾患及び膵炎にとって治療的に有益である。
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入（鼻腔内、肺内の）経路などにより投与される。ポリペプチド及び抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
【０１８０】
免疫アジュバンド(免疫増強剤)療法では、抗癌剤の投与のような他の治療的養生法を本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせてもよい。また、本発明の免疫アジュバンドで治療される患者は、抗癌剤（化学療法剤）又は放射線治療を受けてもよい。このような化学治療剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams &  Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療剤は、免疫アジュバンドの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。その上に、抗-エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗-プロゲステロン（EP 616812参照）を、これらの分子について知られた用量で与えてもよい。
【０１８１】
また、他の免疫疾患関連又は腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。あるいは、又はその上に、ここで開示される同じ又は二つ以上の異なる抗原と結合する二つ以上の抗体を、患者へ同時投与してもよい。時折、患者にサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドを、成長阻害剤と同時投与する。例えば、まず最初に成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は、現在用いられている量であり、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ（相乗）効果により減少させてもよい。
【０１８２】
免疫関連疾患の治療又は感度の縮小のためには、本発明の化合物の適切な用量は、上記に定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。薬剤は、患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のどちらでも、例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチド又は抗体が、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。従来の技術及びアッセイによって、この治療の進行は容易にモニターされる。
【０１８３】
１２．製造品
本発明のその他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容される緩衝液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１８４】
１３．免疫関連疾患の診断及び予後
細胞表層タンパク質、例えばある免疫関連疾患において過剰発現するタンパク質は、候補薬や疾患療法にとって優れた標的である。免疫関連疾患で増幅した遺伝子によってコードされている分泌タンパク質に加えて、これと同じタンパク質には、これら疾患の診断及び予後において更なる用途があることが見出されている。例えば、多発性硬化症、リュウマチ関節炎、又はその他の免疫関連疾患において増幅した遺伝子のタンパク質生産物に対する抗体は、診断上に又は予後兆候として利用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現した遺伝子（「マーカー遺伝子産物」）によってコードされたタンパク質の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。過剰発現している遺伝子が細胞表層タンパク質をコードする場合には、これらの技術は特に適している。このような結合アッセイは、上記に記載のように原則的に実施される。
【０１８５】
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。また、この手法によって、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布の決定を可能にする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【０１８６】
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体を出典明示によりここに取り入れる。
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.., 1990; Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coliganら, Current Protocols in Immunology, 1991。
【０１８７】
実施例１  ＴＣＣＲの単離及びクローニング
サイトカイインレセプター及び／又はＷＳ（Ｇ）ＸＷＳドメインによって特徴付けられるレセプターは、公的ＥＳＴデータベースを調べるために用いられ、その結果としてｈＴＣＣＲ（配列番号：１）及びｍＴＣＣＲ（ｍＴＣＣＲ）が単離された。
代わって、Ｆｉｇ４（配列番号：２）に示されているマウスＴＣＣＲは、登録番号７７１０１０９としてGenBankに公開されているのと同様に、１９９６年５月２３日に出願したＷＯ９７／４４４５５にて公開されている。先行技術の分子もSprecherら., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(1): 80-90(1998)に記載されている。Ｆｉｇ４（配列番号：２）では、シグナルペプチドは、アミノ酸残基１から約２４、膜貫通ドメインは、およそアミノ酸残基５１４から約５３２、Ｎ−グリコシル化部位はおよそ残基４６−４９、２９６−２９９、３０５−３０８、３６０−３６１、３６８−３７１及び４６１−４６４、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位はおよそ残基１０−１３、９３−９６、１３０−１３３、１７２−１７５、１８４−１８７、２３５−２３８、２７１−２７４、２７２−２７５、３２３−３２６、６０６−６０９及び６１５−６１８、チロシンキナーゼリン酸化部位はおよそ残基２０２−２０９、Ｎ−ミリストイル化部位はおよそ残基４３−４８、１０２−１０７、２９５−３００、３２１−３２６、３３０−３３５、３６７−３４２、３９３−３９８、５２５−５３０及び５２７−５３２、アミド化部位はおよそ残基２４０−２４３、原核生物膜リポタンパク質脂質付着はおよそ残基５１６−５２６、そして成長因子及びサイトカインレセプターファミリーシグネチャー１はおよそ残基３６−４９において同定されている。顕著な相同性のある領域は：（１）約残基１４−５１のヒトエリスロポエチン及び（２）残基２１１−２１９のマウスインターロイキン-５レセプターに存在する。
【０１８８】
Ｆｉｇ３（配列番号：１）に示したヒトＴＣＣＲに対して高い相同性を有するポリペプチドは、登録番号４７５９３２７としてGenBankからも入手可能な１９９６年５月２３日に出願されたＷＯ９７／４４４５５にて公開されている。先行技術の分子もSprecherら., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(1): 80-90(1998)に記載されている。Ｆｉｇ３（配列番号：１）では、シグナルペプチドは、アミノ酸残基１から約３２、膜貫通ドメインは、およそアミノ酸残基５１７から約５３８、Ｎ−グリコシル化部位はおよそ残基５１−５４、７６−７９、３０２−３０５、３１１−３１４、３７４−３７７、３８２−３８５、４６７−４７０、５６３−５６６、Ｎ−ミリストイル化部位はおよそ残基１０７−１１２、２４０−２４５、２４４−２４９、２８１−２８６、２９２−２９７、３７３−３７８、４００−４０５、４５９−４６４、４７０−４７５、５３１−５３６及び５３３−５３８、原核生物膜リポタンパク質脂質付着はおよそ残基５２２−５３２、そして成長因子及びサイトカインレセプターファミリーシグネチャー１はおよそ残基４１−５４において同定されている。また、残基１８３−１９１に、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のレセプターの第二サブユニットと顕著な相同性を有する領域が存在する。
ヒトＴＣＣＲ（配列番号：１）とマウスＴＣＣＲ（配列番号：２）の配列の比較がＦｉｇ５に示されている。この比較は、ヒトとマウスの配列の間の６２％の配列同一性を明らかする。
【０１８９】
実施例２  ＴＣＣＲ「ノックアウト」マウス
１．ターゲッティングベクターの調製
「ターゲッティングベクター」という用語は、遺伝子除去のために構築される核酸配列を呼ぶための技術用語である。Ｆｉｇ９Ａには、この実施例において単離されたＴＣＣＲ分子のために利用されたターゲッティンググベクターが記載されている。特に、 ターゲッティングベクターは、最初の二つのエクソンを含む２．４ｋｂのＸｈｏＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片、及びエクソン９から１４を含む６．０ｋｂのＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ断片を用いて構築された。単離された特異的なＴＣＣＲ遺伝子は、１４のエクソンと１３のイントロンを含む。このターゲッティングベクターでは、エクソン１及び２は無傷のままで、ゲンタマイシン耐性を付与するｐＧＫ-ｎｅｏ遺伝子がエクソン３−８を置換するために用いられている。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ-ＴＫ）コード化領域は、エキソン１の５’に置き換わり、ガンシクロビルによる選択を可能にする。このような薬剤選択可能なマーカー、例えばガンシクロビルは、ターゲッティングベクターを含む安定な形質移入株化細胞の選択を可能にし、そして内因性の遺伝子から核酸断片を区別する、標的構築物に特有の核酸断片を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーを作製することを可能にする。この構築物は、ベクターpBluescript（Stratagene, La Jolla, CA）へ挿入され、そしてＤＨ１０Ｂ細菌へ形質転換された。単一のコロニーが収集され、大量のターゲッティングベクターを調製するために用いられた。
【０１９０】
２．ＴＣＣＲ−／−幹細胞の調製
制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによる消化によってターゲッティングベクターを直線化し、これを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）へ形質移入した。ＥＳ細胞は、その発達段階にある胚の生殖細胞系へ組み込んで、ターゲッティングベクターを子孫へ伝達する能力によって選ぶ。選択の対象である好ましいＥＳ系統は、ＥＳＧＳ系統であるが、Ｄ３系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１９３４）をも用いてよい。エレクトロポレーションは、０．８ｍｌのＰＢＳに懸濁した２−５百万個のＥＳ細胞を利用しておこなう。細胞へ直線化されたターゲッティングベクター（２０μｇ）を添加し、これを無菌のエレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ Bio-Rad, Hercules, CA）へ置く。エレクトロポレーションを、５００μＦ、２４０ボルトにセットしたエレクトロポレーション装置で実施する。このキュベットの内容物を、４１０ｍｌのＥＳ培地へ移す。ＥＳ培地は、高グルコースＤＭＥＭ（Gibco 11960-010）、１０％ＦＢＳ（ＥＳ細胞試験Gibco 16141-061）及び１０００ユニット／ｍｌ ＥＳＧＲＯマウスＬＩＦ（Gibco 13275-0290）で構成されている。続いて、これらの細胞を２０９６ウェルシャーレへ等分量を配する。Ｇ４１８，４００μｇ／ｍｌが即利用される。ターゲッティングベクターの形質移入の後、前出にて言及した薬剤の致死量を用いてＥＳ細胞を選択した。ターゲッティングベクターを有するＥＳ細胞のみが、生存に必要な抗生物質耐性マーカーを有している。次いで、ベクターの正確な組み込みのために、サザンブロット（Ｆｉｇ１０Ａ）、ＰＣＲ（Ｆｉｇ１０Ｂ）、内因性標的遺伝子のｍＲＮＡ発現の欠如（Ｆｉｇ１０Ｃ）によって、選択されたＥＳ細胞コロニーを選択した。上記の判定基準を満たしたＥＳクローンは、次に胚へのマイクロインジェクションに用いられる。
【０１９１】
３．ＴＣＣＲ−／−マウスの注射及びスクリーニング
前段階において、選択されそしてスクリーニングされたＥＳ細胞クローンを、当該分野において適した任意の技術、好ましくはマイクロインジェクションによって発育中の胚へ移す。適切なマイクロインジェクション技術については、Hoganら., Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986に記載されている。後で同定できるという条件ではどの胚を利用してもよいが、マイクロインジェクションのために選択される胚は好ましくは雄であり、ターゲッティングベクターを含有するＥＳ細胞の遺伝子によってコードされる毛色とは反対の毛色を有する。例えば、白い柔毛の動物のＥＳ細胞を、茶／黒柔毛をはやす胚へ注入する。この方法では、成功裏にマイクロインジェクションされた胚は、モザイクの毛色に基づいて成熟した大人として選択される。結果として得られたモザイク動物（創始細胞）はＴＣＣＲ−／＋であり、次いでＴＣＣＲ−／−マウスを作製するために戻し交配される（他のＴＣＣＲ−／＋子孫と交尾）。ＴＣＣＲ−／−遺伝子型を確かめるために、０．５ｍｌの溶解緩衝液で一晩に渡って６０℃で尾部組織をインキュベーションすることによって得られるテール・クリッピングからＤＮＡを抽出する。溶解緩衝液は、０．５％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｃ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Boehringer-Mannheim）から成る。一晩のインキュベーションの後、全反応中で混合した７５μｌの８Ｍ 酢酸カリウムと６００ｍｌＣＨＣｌ３を室温で１０分間、遠心分離する。その水層を取り出して別のエッペンドルフチューブへ配し、これへ６００ｍｌの１００％エタノールを添加して５分間の遠心分離によってＤＮＡを沈殿させる。このＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、空気乾燥させる。残存エタノールを除去した後、ＤＮＡペレットを１５０−２００μｌの水で再懸濁する。そして、このＤＮＡはサザンブロット法及びＰＣＲ分析に用いるられる。サザンブロット法では、ｎｅｏ遺伝子をプローブとして用いてもよい；ＰＣＲでは、ＥＳ細胞のスクリーニングに利用するプライマーが用いられる。
この結果は、Ｆｉｇ１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃに報告されており、それらにはＴＣＣＲ遺伝子が成功裏に除去されたことが示されている。ＴＣＣＲ欠損マウスは、生存能力があり、繁殖力があり、そして顕在性の異常は無かった。詳細な組織学的検査では、明白な欠陥はみられなかった。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＣＤ４０、ＮＫ１．１、ＤＸ５、Ｆ４／８０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＭＨＣＩＩ及びＣＤ４５に対する抗体で染色した二重野生型及びノックアウトマウスの胸腺、脾臓、リンパ節及びバイエル板から得た細胞のフローサイトメトリー分析では、二つの遺伝子型の間になんの著しい違いも示されなかった。
【０１９２】
実施例３  ＴＣＣＲ−／−マウスの増幅したアレルギー性気道炎症
喘息は、気管支閉塞及び炎症を誘発する多くのアレルギー性及び非アレルギー性因子の相互作用の結果として生じる複合疾患である。気道炎症の一つの重要な側面は、Ｔｈ２細胞による気道壁の浸潤である。ここで作製されるＴＣＣＲ−／−マウスはより大きなＴｈ２応答を有するので、それらは、アレルギー性気道炎症を研究するための有用なモデルである。
動物：  １２匹のＴＣＣＲ−／−マウス及び１１匹の野生型同腹子（ＷＴ）ランダムに次ぎの４つのグループへわけた：グループ１−非感作ＴＣＣＲ−／−；グループ２−非感作ＴＣＣＲ ＷＴ（ｎ＝４）；グループ３−感作ＴＣＣＲ−／−（ｎ＝８）；及びグループ４−感作ＴＣＣＲ ＷＴ（ｎ＝７）。
感作：  １５匹のマウス（雄及び雌）を、０日目に腹腔内投与で与えられた０．１ｍｌ容量の１ｍｇ／ｍｌ 水酸化アルミニウムゲルに吸収させた３００ユニット／ｍｌのチリダニ抗原（Bayer Pharmacetical）で感作した。非感作コントロールマウス（ｎ＝８）は、０．１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ及び腹腔内投与の１ｍｇ／ｍｌ水酸化アルミニウムゲルを与えられた。両グループのマウスは、上記に記載のように、抗原（感作されたグループ）又はＮａＣｌ（非感作グループ）の腹腔内投与によって７日目に追加免疫された。
【０１９３】
吸入による試み：感作と追加免疫の後、４つのＤＭＡ吸入の試みが１６日目に始まった。
エアゾール化では、噴霧器中のチリダニの最終濃度は、ダルベッコPBS及び０．１％のＴｗｅｅｎ-２０（登録商標）で希釈後は６０００ユニット／ｍｌであった。すべての吸入の試みは、Plexiglas（登録商標） pie exposure chamber において投与した。ＤＭＡは、最初に、ＰＡＲＩＩＳ-２噴霧器を用いて、２０分間に渡ってエアロゾル化され、その後、１．５ｍｌで１０分間に渡って曝露された。肺の全堆積量は、ＤＭＡの〜６．５ＡＵであった。
ＡＨＲ（痲酔）：  ２４日目に、最後のＤＭＡエアロゾールによる試みからおよそ１８時間後、マウスをペントバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ）とウレタン（１．８ｇ／ｋｇ）の混合物で痲酔し、右頸静脈上の１ｃｍの切開でカテーテル処置した。この頸静脈を自由に解剖し、カテーテル（ＰＥ-５０へ連結したＰＥ-１０）を挿入してそこへ結びつけた。更には、マウスを気管切開した（１ｃｍの頸部切開、気管を自由に解剖してカニューレを挿入してそこへ結びつけた）。次いで、胸動脈の拡張及び気道内圧の測定のために、このマウスをPlexiglas（登録商標）フロープレチスモグラフへ負荷した。１７０ｂｐｍの振動数と９μｌ／ｇｍに同等のＶｔで、１００％酸素によってこのマウスへ通気した。コンピューター化（Buxco Eletronics)データー獲得プログラムを用いて、呼吸装置（肺耐性及び動的コンプライアンス）を連続的にモニターした。ベースラインの測定の後、２００μｇ／ｍｌ ＭＣＨをストック濃度とするメタコリン（５００μｇ／ｋｇのＭＣＨ分量）の一回につき１０秒投与量をマウスは受けた。
【０１９４】
犠牲：  気道の反応性の測定を完了した後に、血清を得るために、眼窩（球）後洞を経由して血液を採取するのにＥＤＴＡチューブを利用した。腹部を開き、下向きの大動脈を切断し、横隔膜を切断した。動物の採血のための時間が経過した後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）がおこなわれた。以前に挿入した気管カニューレを通して、無菌生理的食塩水（３０μｇ／ｇマウス重量）の同じボーラスによって肺を三回洗浄した。このボーラスは、およそ７０％の総肺容量を満たした。ＢＡＬ（元の平均が８０％）の試料は、４℃で１０分間に渡って１０００ｘｇで遠心分離された。上清を移し、直ちに−８０℃で凍結した。この細胞ペレットを２％ＢＳＡ（Sigman, St Louis, MO）を含む２５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、次いで自動カウンター（Baker Instruments, Allentown, PA）を利用して数え上げ、そしてＢＡＬ細胞／μｌの総数として記録した。次いで、この細胞懸濁物を２００細胞／μｌに調製し、１００ｍｌをサイトスピン（cytospin）（Shando, Inc., Pittsburgh, PA）を用いてコーティングされたSuperfrost Plus 顕微鏡用スライド（Baxter Diagnostics, Deerfield, IL）で、１０分間に渡って８００ｘｇで遠心分離した。スライドを空気乾燥させ、１００％メタノールで１分間に渡って固定化し、Diff-Quik（商品名）（Baxter Health Care, Miami, FL）で染色した。白血球分画を得るために、少なくともスライド当たり２００細胞が調べられた。
ＢＡＬの後、ｍＲＮＡ分析のために、右肺、脾臓及び気管支リンパ節を取り除き、そして液体窒素で凍結した（そして次にドライアイスの上へ置いた）。後に遺伝子型を特定するために、尾部切断部を取り出し、そしてドライアイスで凍結した。実験群間の肺における病理的変化の重症度と性質を検査そして比較するために、マウスの残りの左肺を取り除いた。これは、パラフィンに埋め込まれた１０％の中性緩衝ホルマリンへの肺組織の初期固定によって完遂し、３μｍ切片をヘモトキシリン及びエオシンで染色した。肺切片は主気管支に沿って取られ、全切片は手探りで調べられ、そして気道及び血管周辺の炎症の重症度に基づいて記録された。０（炎症及び気道変化が無い）から４（顕著な炎症及び気道変化）のスケールを用いる気道上皮細胞肥大の程度。
【０１９５】
ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ：  全ＩｇＥ サンドイッチＥＬＩＳＡでは、ＢＡＬ流体又は血清試料は、ＥＬＩＳＡ緩衝液中で、希釈せずに、或いは１：２から１：２０（ＢＡＬ）及び１：２５から１：２００（血清）に希釈して用いられた。補足抗体はウサギ抗-マウスＩｇＥ（２μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）であり、プレートを４℃で２４−２８時間に渡ってコーティングした。標準は、連続的に１：２に希釈されたマウスＩｇＥ（PharMingen, San Diego, CA）であり、１００ｎｇ／ｍｌの濃度から開始した。検出抗体であるビオチン化ＦｃεＲＩ-ＩｇＧを１：２０００に希釈して、１−１．５時間に渡って用いた。ＨＲＰ-ＳＡ及び酵素展開ステップは、サイトカインアッセイに用いたものと同一である。
結果では、野生型よりもＴＣＣＲ−／−マウスの肺へのリンパ球の浸潤が極めて増加していることが示されている（Ｆｉｇ１１）。
【０１９６】
実施例４  大腸菌におけるＴＣＣＲの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のＴＣＣＲの非グリコシル化形態の調製を例示する。ＴＣＣＲをコードするＤＮＡ配列を、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、polyhisリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、特定のＴＣＣＲコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
次いで、Sambrookら, 上掲に記載されている方法を用いて、ライゲーション混合物を選択した大腸菌の形質転換に使用する。形質転換体を、ＬＢプレートで成長する能力によって同定し、次いで抗生物質耐性クローンが選択する。プラスミドＤＮＡは、を単離し、制限分析及びＤＮＡ配列分析によって単離し、確認できる。
選択されたクローンを、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地を、続いて大規模培地の播種に用いてもよい。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
【０１９７】
数時間の培養の後、細胞を遠心分離によって採集できる。この分野で知られた種々の試薬を用いて、遠心分離で得られた細胞ペレットを可溶化することができ、次いで金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で、可溶化ＴＣＣＲタンパク質を精製できる。以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＴＣＣＲを発現させてもよい。選択したＰＣＲプライマーを用いて、ＴＣＣＲをコードするＤＮＡを最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、並びに効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、そしてエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅されたポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に用いる。形質転換体は、最初に、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させる。ついで培地をＣＲＡＰ培地（3.57gの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１gのクエン酸ナトリウム・2Ｈ2Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのDifco酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのShefield hycase SF、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５%(ｗ/ｖ)のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中にて５０-１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させる。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって発現を確認するために試料を取り出し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとする。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させる。
【０１９８】
０．５〜１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）の大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８緩衝液中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、この溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman Ultracentrifugeで４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。この上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。条件によって、この透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷する。このカラムを、５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４によって洗浄する。タンパク質は、２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーによって溶離する。所望のタンパク質を含有する分画をプールし、４℃で保存した。そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収度からタンパク質濃度を見積もった。
【０１９９】
２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製したリフォールディングバッファー中で試料を徐々に希釈することによって、タンパク質をリフォールディングさせた。最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように、リフォールディング容量を選択する。リフォールディング溶液を4℃で１２−３６時間に渡ってゆっくりと撹拌する。リフォールディング反応は、最終濃度が０．４％（約ｐＨ３）となるようにＴＦＡを添加することで停止させる。タンパク質の更なる精製の前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターによって濾過し、アセトニトリルを最終濃度が２−１０％となるよう添加した。０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いて、リフォールディングしたタンパク質をPoros R1/H逆相カラム上でクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ分画のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同なリフォールディングしたタンパク質を含有する分画をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しくリフォールディングした種は、最もコンパクトであって、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているために、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。通常、凝集した種は、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤ってリフォールディングした形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望のフォールディングＴＣＣＲタンパク質を含有する分画をプールし、この溶液に向けた窒素の穏やかな気流を当てることでアセトニトリルを除去する。透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５  Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過によって、タンパク質を０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製する。
【０２００】
実施例５  哺乳動物細胞におけるＴＣＣＲの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＴＣＣＲの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターpRK5（1989年3月15日公開のＥＰ 307，247参照）を用いる。場合によっては、ＴＣＣＲ ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＴＣＣＲ ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＴＣＣＲと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約１０μｇのｐＲＫ５-ＴＣＣＲＤＮＡを約1μgのＶＡＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μlの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、滴状の、５００μlの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培地を吸引し、２ｍｌの２０％グリセロールを含むＰＢＳを３０秒間添加する。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
【０２０１】
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＴＣＣＲポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
これに代わる技術において、ＴＣＣＲは、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５-ＴＣＣＲ ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現されたＴＣＣＲを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
【０２０２】
他の実施態様では、ＴＣＣＲをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＴＣＣＲは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＴＣＣＲポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＴＣＣＲを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグＴＣＣＲは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＴＣＣＲはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＴＣＣＲ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入する。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＴＣＣＲを含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またＴＣＣＲは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
【０２０３】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施されてもよい。タンパク質は、例えば、（１）それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ定常領域配列に融合した、ＩｇＧ作成物（イムノアドへシン）、又は（２）ポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現され得る。
ＰＣＲ増幅に続いて、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されているような標準的技術を用いて、対応するＤＮＡをＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucasらに記載されているように成長させた。約３ｘ１０−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
【０２０４】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を吸引し、そして細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μm濾過ＰＳ２０、５％の０．２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させる。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地で満された２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種する。この細胞培地を遠心分離によって新鮮培地に交換し、そして生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている生産培地を使用してもよい。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施する。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０ｍＬとする。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持する。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μmフィルターを通して濾過する。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０２０５】
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物については、タンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム(Qiagen)を用いて精製する。精製の前に、条件培地へイミダゾールを５ｍＭの濃度にまで添加した。０.３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ, ｐＨ７.４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ-ＮＴＡカラムへ、４-５ｍｌ/分の流速で４℃で条件培地をポンプ供給する。充填後、さらに平衡バッファーでカラムを洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーでタンパク質を溶離する。続いて、高度に精製されたタンパク質を１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
以下のようにして条件培地からイムノアドヘシン（Fc含有）作成物を精製する。ｐＨ６．８の２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーで平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）へ、条件培地をポンプ供給する。充填後、１００ｍＭのクエン酸, ｐＨ３．５で溶離する前に、このカラムを平衡バッファーでしっかりと洗浄する。２７５μｌの１Ｍトリスバッファー, ｐＨ９を含む管に１ｍｌの分画を回収することによって、溶離したタンパク質を即座に中性化する。続いて、上記にてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質に関して記した貯蔵バッファー中で、この高度に精製されたタンパク質を脱塩する。その均一性はSDSポリアクリルアミドゲル、及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定によって評価する。
【０２０６】
実施例６  酵母でのＴＣＣＲの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＴＣＣＲの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＴＣＣＲの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＴＣＣＲをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＴＣＣＲの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＴＣＣＲをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＴＣＣＲシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＴＣＣＲの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＴＣＣＲは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＴＣＣＲを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０２０７】
実施例７  バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＴＣＣＲの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＴＣＣＲの組換え発現を記載する。
ＴＣＣＲコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（IgGのFc領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。手短には、ＴＣＣＲ又はＴＣＣＲコード化配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’ 及び３’ 領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Sf9」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
【０２０８】
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＴＣＣＲは、例えばＮｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーによって、次のように精製される。抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25ｍＬのHepes、pH7.9；１２.５ｍＭのＭｇＣｌ２;０.１ｍＭ ＥＤＴＡ;１０%グリセロール;０.１%のＮＰ-４０;０.４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０%グリセロール、ｐＨ７.８）で５０倍希釈し、０.４５μmフィルターで濾過する。Ｎｉ２+-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡する。濾過した細胞抽出物は、毎分０.５ｍＬでカラムに負荷する。分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで、負荷バッファーでカラムを洗浄した。次に、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩;３００ｍＭのＮａＣｌ、１０%グリセロール、ｐＨ６.０）で、カラムを洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、二次洗浄バッファー中での０から５００ｍＭイミダゾール勾配によって、カラムを展開した。１ｍＬの分画は、回収され、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）と結合したＮｉ２+-ＮＴＡでのウェスタンブロットによって分析される。溶離したＨｉｓ１０-タグＴＣＣＲを含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はFcタグ）ＴＣＣＲの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０２０９】
あるいは更に、修飾バキュロウイルス法を用いるＨｉｇｈ５細胞によって、本発明のＴＣＣＲ分子を発現してもよい。この方法では、所望の配列をコードするＤＮＡは、Ｐｆｕ（Stratagene）等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（5'-）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。ｐＩＥ-１（Novagen）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む、種々のプラスミドを用いることができる。このｐＩＥ-１及びｐＩＥ-２ベクターは、安定に形質転換された昆虫細胞におけるバキュロウイルスｉｅ１プロモーターからの組換えタンパク質の構成的発現のために設計される。このプラスミドは複数のクローニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるｉｅ１媒介遺伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにｈｒ５エンハンサー成分を含む。ｐＩＥ-１及びｐＩＥ-２はｉｅ１翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の製造に利用できる。手短には、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲによって、ＰＲＯポリペプチドの所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を増幅する。５’プライマーには、隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。次いで、生成物を選択された制限酵素で消化し、発現ベクターへサブクローニングする。例えば、ｐＩＥ１−１の誘導体は、ヒトＩｇＧ（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）のＦｃ領域又は所望の配列の８ヒスチジン（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）タグ下流（3'-）を含むことができる。好ましくは、確認のために、構築ベクターの配列を確認する。
【０２１０】
２７℃、ＣＯ２無し、ペン／ストレップ無しの条件下で、Ｈｉ-５細胞を５０%の培養飽和密度まで成長させる。各々の１５０ｍｍプレートについて、配列を含む３０μgのｐＩＥベースベクターを1mlのＥｘ-細胞培地（媒質：Ex-細胞401＋1/100のL-Ｇｌｕ JRH Biosciences #14401-78P（注：この媒質は軽感受性））と混合した。別の管において、１００μlのセルフェクチン（CellFECTIN;Gibco BRL #10362-010，ボルテックスで混合）を１ｍｌのＥｘ-細胞培地と混合する。この２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションする。８ｍｌのＥｘ-細胞培地を２ｍｌのＤＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ-細胞培地で１回洗浄したＨｉ５細胞上に層形成させた。次いでこのプレートを暗中室温でインキュベートする。次いでＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ-細胞で１回洗浄して過剰のセルフェクチンを除去する。３０ｍｌの新鮮なＥｘ-細胞培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートする。その上清を回収し、バキュロウイルス感染ベクターの配列発現を、１ｍｌの上清の２５ｍｌのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）のためのＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ-４Ｂビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色によって周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定する。
【０２１１】
形質移入細胞の条件培地（０.５−３Ｌ）を、遠心分離によって細胞を除去して回収し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過した。ポリ-Ｈｉｓタグ作成物のために、配列を含むタンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを４８℃で流速４−５ｍｌ／分とする。負荷後、カラムを更なる平衡バッファーで洗浄し、タンパク質が０.２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０.１４Ｍ ＮａＣｌ及び４%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, ｐＨ６.８中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
また、タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下のようにして条件培地から精製してもよい。２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６.８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）へ、条件培地をポンプ供給する。負荷後、カラムを平衡バッファーでしっかりと洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸, ｐＨ３.５で溶離した。１ｍｌの画分を２７５μｌの１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することによって、溶離したタンパク質を即座に中性化した。続いてpoly-Hisタグタンパク質のために上記の貯蔵バッファー中で、高度に精製されたタンパク質を脱塩した。その均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定よって評価する。
【０２１２】
実施例８  ＴＣＣＲに結合する抗体の調製
この実施例は、ＴＣＣＲに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、当該分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＴＣＣＲ、ＴＣＣＲを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＴＣＣＲを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなく成すことができる。
完全フロイントアジュバントに乳化したＴＣＣＲ免疫原でＢａｌｂ/ｃ等のマウスを免疫化し、そして皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。次いで、１０から１２日後に、免疫化したマウスを選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＴＣＣＲ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイによる試験のために、レトロオービタル出血によってマウスから血清試料を周期的に採取してもよい。
【０２１３】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物へＴＣＣＲの最後の静脈内注射を注入をすることができる。３から４日後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に脾臓細胞を（３５%ポリエチレングリコールを用いて）融合させた。
次いで、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートへプレートできるハイブリドーマ細胞が、この融合で生成される。
ハイブリドーマ細胞は、ＴＣＣＲに対する反応性に関してＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＴＣＣＲに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
抗-ＴＣＣＲモノクローナル抗体を含む腹水を生成させるために、陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ/ｃマウスに腹腔内注入できる。あるいは、組織培養フラスコ又はローラーボトルで、ハイブリドーマ細胞を成長させることができる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを利用できる。
【０２１４】
実施例９  特異的抗体を用いたＴＣＣＲポリペプチドの精製
天然又は組換えＴＣＣＲポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＴＣＣＲポリペプチド、成熟ＴＣＣＲポリペプチド、又はプレ-ＴＣＣＲポリペプチドは、対象とするＴＣＣＲポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは、抗-ＴＣＣＲポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させることによって作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムによる沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）による精製のいずれかによって、免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡによるクロマトグラフィーによって、マウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロース(商品名)（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂へ共有結合的に付着している。この抗体は樹脂へ結合し、樹脂はブロックされ、そして誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０２１５】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＴＣＣＲポリペプチドを含有する細胞からの分画を調製することによって、ＴＣＣＲポリペプチドの精製に利用される。洗浄剤の添加或いはこの分野で公知の他の方法によって、微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分分画の可溶化によって、この調製物は誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＴＣＣＲポリペプチドは、成長する培地にその有用量が細胞が分泌される。
可溶化ＴＣＣＲポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、ＴＣＣＲポリペプチドの好ましい吸着を可能にする条件下でカラムを洗浄する（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）。次いで、抗体／ＴＣＣＲポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨバッファー、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）でカラムを溶離し、ＴＣＣＲポリペプチドを回収される。
【０２１６】
実施例１０  薬剤スクリーニング
あらゆる種々の薬剤スクリーニング技術でＴＣＣＲポリペプチド又はその結合断片を使用することによって、化合物のスクリーニングにとって特に有用である方法が用いられてもよい。そのような試験に用いられるＴＣＣＲポリペプチド又は断片は、溶液中で自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内にあってもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＴＣＣＲポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸によって安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞が用いられる。そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによって、薬剤はスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＴＣＣＲポリペプチド又はその断片と試験される薬剤の間における複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験される薬剤によって生じる、ＴＣＣＲポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプター間の複合体形成の減少を調べることができる。
従って、本発明は、ＴＣＣＲポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬ためのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、この分野で良く知られている方法によって、その試薬をＴＣＣＲポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とＴＣＣＲポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)ＴＣＣＲポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在についてアッセイすることを含む。これらのような競合結合アッセイでは、概して、ＴＣＣＲポリペプチド又は断片が標識される。適切なインキュベーションの後、遊離型のＴＣＣＲポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離型又は未複合標識の量が、特定の試薬がＴＣＣＲポリペプチドと結合する、或いはＴＣＣＲポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０２１７】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適切な結合親和性を持つ化合物ためのハイスループットスクリーニング法を提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。要約すると、多数の異なる小型ペプチド試験化合物を、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成する。ＴＣＣＲポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＴＣＣＲポリペプチドと反応し、そして洗浄される。結合したＴＣＣＲポリペプチドは、この分野で良く知られた方法によって検出される。また、上記の薬剤スクリーニング技術の利用にあたって、精製したＴＣＣＲポリペプチドをプレート上に直接被覆することができる。さらには、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するために、非中和抗体を使用できる。
また、本発明では、ＴＣＣＲポリペプチドに結合可能な中和抗体がＴＣＣＲポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法では、ＴＣＣＲポリペプチドと一つ以上複数の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するために、抗体を利用できる。
【０２１８】
実施例１１  合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＴＣＣＲポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＴＣＣＲポリペプチドのより活性で安定な形態薬剤、或いはインビボでＴＣＣＲポリペプチドの機能を促進又は阻害する薬剤の創作に利用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
１つの方法において、ＴＣＣＲポリペプチド、又はＴＣＣＲポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＴＣＣＲポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＴＣＣＲポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＴＣＣＲポリペプチド様分子の設計或いは効果的なインヒビターの同定に利用される。合理的な薬剤設計の有用な例には、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、或いはAthaudaら, J.Biochem.,113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子が含まれる。
【０２１９】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離し、その結晶構造を解明することもできる。原理的には、この方法は、後に続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的で、薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することによって、タンパク質結晶学を迂回することができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに、抗-ｉｄを利用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するのに十分な量のＴＣＣＲポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したＴＣＣＲポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わって、又はそれに加えて、コンピュータモデル化技術を用いるものにガイダンスを提供する。
【０２２０】
表２（Ａ-Ｄ）は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた％アミノ酸配列同一性（表２（Ａ-Ｂ））及び％核酸配列同一性（表２（Ｃ-Ｄ））を決定するために、下記の方法を使用する仮説的な例を示し、「ＰＲＯ」は対象とする仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は対象とする仮説的ＰＲＯ-コード化核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
【０２２１】
実施例１２  免疫応答におけるＴＣＣＲの役割
Ｔ細胞応答：  抗-ＫＬＨ応答のために、マウスを、１ｍｇ／ｍｌの結核菌株Ｈ３７Ｒａ（Difco Laboratories, Detroit, MI）を含有する、ＣＦＡと１：１割合の乳化物である１００μｇ ＫＬＨの生理的食塩水により後部足蹠において免疫した。９日後、膝窩リンパ節を取り出し、細胞懸濁液を調製した。このリンパ節細胞を、５％ＦＣＳを補充添加した種々の濃度のＫＬＭを含むＤＭＥＭ培地で培養した（ウェル当たり５ｘ１０５ ）。５日間培養の最後の１８時間に１μＣｉの［３Ｈ］-チミジン（ICN、Irvine, CA）を添加することで増殖を測定し、液体シンチレーションカウンティングによって放射能の取り込みをアッセイした。Ｔ細胞によるサイトカイン生産のアッセイは、望ましい量のＫＬＨを含む最終容量が２００ｍｌの９６ウェルプレートで、ＫＬＨによる初回抗原刺激を受けた野生型又はＴＣＣＲ欠損マウスのいずれかの５ｘ１０５の流入領域リンパ節細胞を培養することでおこなった。９６時間の培養後に、各ウェルから１５０μｌの培養上澄み液を取り除き、Pharmingen（San Diego, CA）の抗体を奨励された条件で用いるＥＬＩＳＡ法によってサイトカインのレベルを測定した。
【０２２２】
Ｔ細胞分化のインビトロ誘導：  脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞、及び野生型又はＴＣＣＲ欠損同腹子のリンパ節を、抗-ＣＤ４磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）によって精製した。精製Ｔ細胞（１０６細胞／ｍｌ）を、照射された（３０００ｒａｄ）同質野生型又はノックアウトＡＰＣ（１０６／ｍｌ）及びＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ、Boeheringer Mannheim, Germany）の下で、或いは５μｇ／ｍｌの抗-ＣＤ３及び１μｇ／ｍｌの抗-ＣＤ２８抗体でコーティングしたプレート上にプレートすることによって活性化した。この培養培地には、Ｔｈ１分化のためにＩＬ-２（２０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ-１２（３．５ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems）及び５００ｎｇ／ｍｌの抗-ＩＬ-４抗体（Pharmingen）を、Ｔｈ２分化のためにＩＬ-２（２０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ-４（１０３Ｕ／ｍｌ、R&D Systems）及び５００ｎｇ／ｍｌの抗-ＩＦＮ抗体（Pharmingen）を補充添加した。３日後に、ＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ）の下で又は５μｇ／ｍｌの抗-ＣＤ３抗体でコーティングしたプレート上のいずれかにおいて、細胞をＲＮＡ抽出のために溶解せしめるか、或いは１０６細胞／ｍｌにて十分に洗浄、数を数える、及び再刺激した。２４時間後には、上澄みを回収し、そしてサイトカインの存在について分析した。
【０２２３】
全及びＯＶＡ特異的免疫グロブリンレベル：  １２週齢又はより高齢な免疫されていないマウスを出血させ、ＥＬＩＳＡによる免疫グロブリンの種々のアイソタイプの存在に関して血清を分析した。抗-ＯＶＡ特異的抗体に関しては、６週齢野生型又はＴＣＣＲ欠損マウスを１００μｇのＯＶＡを含む完全フロインドアジュバントで免疫し（腹腔内）、２１日後に、１００μｇのＯＶＡを含む不完全フロインドアジュバントを与えて免疫活動を惹起した（腹腔内）。７日後に、免疫が惹起されたマウスを出血させ、ＯＶＡ-特異的抗体の存在に関して血清を分析した。
【０２２４】
リアルタイムＰＣＲ分析：  マウス脾細胞は、ＦＡＣＳによってＴヘルパー細胞（ＣＤ４ポジティブ、Ｆ４／８０ネガティブ、９７％純粋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９ポジティブ、９７％純粋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ１．１ポジティブ、９９％純粋）、及びマクロファージ（Ｆ４／８０ポジティブ、＞９５％純粋）に、ＭＡＣＳによって細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８ポジティブ、８５％純粋）に分けられる。全ＲＮＡをQiagen RNeasyカラムで抽出し、含有するＤＮＡを除くためにＤＮＡｓｅＩによって消化した。Ｔａｑｍａｎ１８を用いて、ＴＣＣＲに関してＲＮＡを詳しく調べた。すべての反応は複製し、リボゾームのハウスキーピング遺伝子であるｒｐ１１９へ標準化された。ＲＴコントロール反応が含まれず、すべての試料がＤＮＡを含まないことを示した。すべてのプライマー及びプローブの配列が、Ｆｉｇ１９に示されている。
野生型及びＴＣＣＲ-欠損マウスをキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）で免疫し、インビトロでのＫＬＨをともなうインビトロ刺激後のサイトカイン生産に関して、９日後に回収した流入領域リンパ節を評価した（Ｆｉｇ１６Ａ及びＢ）。これらのマウスにおけるＫＬＨで免疫活動が惹起され、その一方でＩＬ-４の生産がかなり増加した場合に、ＴＣＣＲ欠損細胞のＩＦＮを生産する能力はかなり弱められた。ＴＣＣＲ欠損インビボ初回刺激リンパ球細胞の抗原誘導による増殖及びＩＬ-５の生産は、正常であった（Ｆｉｇ１６Ｃ及びＤ）。ＩＦＮ生産に関する本質的な欠陥を持たない思われるＴＣＣＲ欠損マウスのＬＰＳ刺激に基づいて、ＩＦＮ生産の正常なレベルは測定された。これらの結果は、ＴＣＣＲ欠損マウスは、Ｔｈ１応答を高める能力が低下していることを示している。Ｔｈ１応答の損失は、Ｔｈ２応答の増加をともない、これは、ＩＬ-１２等のＴｈ１サイトカインを欠いているマウスに観察されているものと類似している（Magram, J., ら., 1996, Immunity, 4: 471-81；Wu, C., ら., 1997, Immunol., 159: 1658-65）。
【０２２５】
細胞免疫性応答を制御する役割に加えて、ＩＦＮは免疫グロブリン（Ｉｇ）のアイソタイプ制御にも関与している。特に、ＩＮＦは、ＩｇＧ２ａ抗体の生産を、より低いがＩｇＧ３抗体の生産を増大させることが知られている（Snapper, C. M., & Paul, W. E., 1987, Science, 236: 944-7；Huang, S., ら., 1993, Science, 259: 1742-5）。Ｔｈ１細胞による減少したＩＦＮの生産と一致して、他のすべての免疫グロブリンのアイソタイプのレベルは正常である一方で、ＴＣＣＲ欠損マウスは全血清のＩｇＧ２ａ濃度が低下していた（Ｆｉｇ１７Ａ）。さらには、インビボでのオボアルブミン（ＯＶＡ）による免疫活動の惹起に基づいて、ＴＣＣＲ欠損マウスは、ＯＶＡ-特異的ＩｇＧ２ａの力価をかなり低下させた（コントロールの〜２０％；Ｆｉｇ１７Ｂ）。
例えばリステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）のような細胞内病原体に対する防御として、Ｔｈ１応答は重要である。Ｔｈ１応答の制御におけるＴＣＣＲのインビボでの役割を更に確立するために、ＴＣＣＲ欠損マウス及びコントロールの同腹子を、ほぼ致死量に近いリステリア・モノサイトゲネス（３ｘ１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ））で感染させた。細菌力価を感染の３日又は９日後に測定し、ＴＣＣＲ欠損マウスの肝臓において１０６倍まで高くなっていることが見出された（Ｆｉｇ１７Ｃ）。
【０２２６】
次に、インビトロにおけるＴｈ１応答の分化の媒介におけるＴＣＣＲの役割を調査した。Ｔｈ１又はＴｈ２細胞発生のいずれかに有利である条件下で、照射ＡＰＣの存在のもと、ＴＣＣＲ欠損マウス及び野生型のＣＤ４＋はインビボで分化した。３−４日の培養後、細胞は洗浄され、ＣｏｎＡで再刺激され、そして２４時間後に、サイトカインの存在に関して、上澄み液を分析した。Ｔｈ１細胞へ分化すると、ＴＣＣＲ欠損リンパ球は、野生型同腹子より８０％少ないＩＦＮを生産した（Ｆｉｇ１８Ａ）。対照的に、ＩＬ-４及び抗-ＩＦＮ抗体の存在下で生育したＴＣＣＲ欠損リンパ球は、僅かに多くのＩＬ-４を生産した。同様な結果が、ＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂｈｉｇｈ天然Ｔ細胞で得られた。この結果は、二つの理由から、Ｔ細胞に本来備わっているものである：第一に、野生型又はＴＣＣＲ欠損マウスに由来するＡＰＣの存在下でＴ細胞が分化した場合に、同じような結果が得られた。二番目には、プレート固定化抗-ＣＤ３／ＣＤ２８を利用してＴ細胞分化が生じるＡＰＣ遊離系において、この結果は再現可能あった（Ｆｉｇ１８Ｂ）。また、ＩＦＮ生産の減少は、細胞内ＦＡＣＳ染色によって測定されるＩＦＮ生産細胞の数の減少に相関する。ＩＬ-１２レセプターの両サブユニットが、通常は活性Ｔ細胞で発現していたので、観察されたＴｈ１欠損がＩＬ-１２レセプターにおける欠陥の結果であるとは思われなかった。ＩＬ-１２が更に、野生型及びＴＣＣＲ欠損マウスからのＣｏｎＡ刺激Ｔ細胞の増殖を促進できるので、これらマウスには、ＩＬ-１２シグナル伝達経路に欠陥が無いものと思われる（Ｆｉｇ１８Ｃ及びＤ）。
表３（Ａ−Ｑ）は、 ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムの完全なソースコードを提供する。このソースコードはＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するために日常的にコンパイルでき、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを提供する。
【０２２７】
0004931310.tif 000003
【０２２８】
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【０２２９】
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【０２３０】
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【０２３１】
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【０２３２】
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【０２３３】
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【０２３４】
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【０２３５】
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【０２３６】
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【０２３７】
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【０２３８】
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【０２３９】
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【０２４０】
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【０２４１】
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【０２４２】
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【０２４３】
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【０２４４】
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【０２４５】
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【０２４６】
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【０２４７】
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【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】  ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１及びＴｈ２細胞への分化、その分化への作用を担う初期サイトカイン、抗原刺激によって各々のサブセットの分化から放出される初期サイトカイン、並びに放出されたサイトカインの特性により媒介される生理学的効果の図示。
【Ｆｉｇ２】  Ｔｈ１及びＴｈ２Ｔ細胞サブタイプによって放出されるサイトカイン間の相互関係を表す負のフィードバック回路の図示。
【Ｆｉｇ３】  ヒトＴＣＣＲ（ｈＴＣＣＲ）のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。この配列は、１９９６年５月２３日に出願のＷＯ９７／４４４５５で公開され、更には登録番号４７５９３２７で GeneBankより入手可能である。この配列は、更に、Sprecherら., Biochem. Biophysic. Res. Commun. 246(1):82-90(1998)に記載されている。配列番号：１では、アミノ酸残基１から３２にシグナルペプチド、約アミノ酸残基５１７から約５３８に膜貫通ドメイン、約残基５１−５４、７６−７９、３０２−３０５、３１１−３１４、３７４−３７７、３８２−３８５、４６７−４７０、５６３−５６６にＮ−グリコシル化部位、約残基１０７−１１２、２４０−２４５、２４４−２４９、２８１−２８６、２９２−２９７、３７３−３７８、４００−４０５、４５９−４６４、４７０−４７５、５３１−５３６及び５３３−５３８にＮ−ミリストイル化部位、約残基５２２−５３２に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位、そして約残基４１−５４に成長因子及びサイトカインレセプターファミリーシグネチャー１が同定されている。また、残基１８３−１９１には、ヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のレセプターの二番目のサブユニットと顕著な相同性のある領域がある。
【Ｆｉｇ４】  マウスＴＣＣＲ（ｍＴＣＣＲ）のアミノ酸配列を示す（配列番号：２）。この配列も１９９６年５月２３日に出願のＷＯ９７／４４４５５で公開され、更には登録番号７７１０１０９で GenBankより入手可能である。この配列は、更に、Sprecherら., Biochem. Biophysic. Res. Commun. 246(1):82-90(1998)にも記載されている。配列番号：２では、アミノ酸残基１から２４にシグナルペプチド、約アミノ酸残基５１４から約５３２に膜貫通ドメイン、約残基４６−４９、２９６−２９９、３０５−３０８、３６０−３６１、３６８−３７１及び４６１−４６４にＮ−グリコシル化部位、約残基１０−１３、９３−９６、１３０−１３３、１７２−１７５、１８４−１８７、２３５−２３８、２７１−２７４、２７２−２７５、３２３−３２６、６０６−６０９及び６１５−６１８にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、約残基２０２−２０９にチロシンキナーゼリン酸化部位、約残基４３−４８、１０２−１０７、２９５−３００、３２１−３２６、３３０−３３５、３６７−３４２、３９３−３９８、５２５−５３０及び５２７−５３２にＮ−ミリストイル化部位、残基約２４０−２４３にアミド化部位、約残基５１６−５２６に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位、そして約残基３６−４９に成長因子及びサイトカインレセプターファミリーシグネチャー１が同定されている。顕著な相同性の領域としては：（１）約残基１４−５１のヒトエリスロポエチン及び（２）残基２１１−２１９のマウスインターロイキン−５レセプターが存在する。
【Ｆｉｇ５】  ｈＴＣＣＲ（配列番号：１）とｍＴＣＣＲ（配列番号：２）の比較を示す。同一アミノ酸は陰影され、最適アラインメントのために導入したギャップはダッシュで示されている。予測されるシグナルペプチドの切断部位は矢印で示されている。潜在的なＮ−グリコシル化部位は星印で示されている。ＷＳＸモチーフ、膜貫通ドメイン及びｂｏｘ１モチーフは囲いがなされている。
【Ｆｉｇ６】  成人及び胎児組織での発現の特徴を示す、ヒトＴＣＣＲのノーザンブロット。成人では、ｈＴＣＣＲは、肺で弱い発現があるだけでなく、末梢血リンパ球（PBL's）、脾臓においてもシグナルがあるが、胸腺において最も高く発現する。胎児組織では、ＴＣＣＲは、肺及び腎臓において弱い発現を示す。 ＴＣＣＲの発現の特徴は、それが、特に胸腺細胞での血液細胞の発達と増殖に関与している可能性があることを示す。
【Ｆｉｇ７（Ａ−Ｂ）】  ＴＣＣＲ-/-マウスのＴ細胞の表現型及び数の検討。Ｆｉｇ７Ａは、ＴＣＣＲ-/-マウスから取得したＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の等高線プロットで、野生型との比較。Ｆｉｇ７Ｂは、 ＣＤ４＋／ＣＤ８＋／ＴｃＲ＋のＦＡＣＳ分析の等高線プロット。ＴＣＣＲ-/-マウスのＴ細胞の数の間に顕著な違いがないことは、Ｔ細胞の増殖に障害がないことを示す。
【Ｆｉｇ８（Ａ−Ｂ）】  ヒトＴ細胞におけるＴＣＣＲの発現を示す。Ｆｉｇ８Ａは、ヒトＴＣＣＲ、及びヒトＴ細胞上にある皿状のＴ細胞表層マーカーであるＣＤ２のＦＡＣＳ分析による等高線プロット。Ｆｉｇ８Ｂは、ヒトＴＣＣＲ及びヒトＢ細胞上のＢ細胞マーカーであるＣＤ２０のＦＡＣＳ分析による等高線プロット。両図の最も左のプロットは、適切な蛍光色素共役二次抗体を表す。累積的に、Ｆｉｇ８Ａ及びＦｉｇ８Ｂは、ＴＣＣＲはヒトＴ細胞のサブセットに見出され、殆どのＢ細胞には存在しないことを示している。
【Ｆｉｇ９（Ａ−Ｃ）】  相同組み換えを利用するＴＣＣＲ遺伝子ターゲティング法の図示。Ｆｉｇ９Ａでは、固いブロックで印したＴＣＣＲエキソンを有する野生型対立遺伝子、並びに介在線でイントロンを示す。「Ｅ」及び「Ｂ」は、それぞれエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの切断部位を示す。Ｆｉｇ９Ｂは、ＴＣＣＲのエキソン３−８がプラスミドベクターｐＧＫ−ｎｅｏのネオマイシン耐性遺伝子で置き換えられた、ターゲティングベクターを示す。単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子は、エキソン１の５’へ挿入され、この遺伝子はガンシクロビルによる選択圧に対する耐性を付与する。Ｆｉｇ９Ｃは、外来遺伝子とターゲティングベクター間の相同組み換えがおこった後の、最終標的又は「ノックアウト」対立遺伝子の図解。
【Ｆｉｇ１０（Ａ−Ｃ）】  サザンブロット、ＰＣＲ反応のゲル電気泳動イメージ及びノーザンブロットを示し、それぞれにおいてＴＣＣＲターゲティングベクターによる形質移入が確認される。Ｆｉｇ１０Ａでは、ネオマイシン／ガンシクロビル剤選択に対して耐性であるＥＳ細胞からゲノムＤＮＡを取り出し、これをＴＣＣＲに対して特異的な放射線標識プローブでハイブリダイゼーションした。左から二番目のレーンでは、１０Ｋｂ及び１２Ｋｂ断片の双方の存在によって、ＴＣＣＲ対立遺伝子の一つが除かれていることが示されている。Ｆｉｇ１０Ｂは、ＴＣＣＲ-/-マウス尻尾のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅による反応生産物を示す。ＰＣＲプライマーは、野生型ＴＣＣＲ対立遺伝子と組み換え現象に起因する標的（「ノックアウト」）対立遺伝子が見分けられるように設計された。レーン１及び２（左より数えて）は、ＴＣＣＲの野生型を表すバンドのパターンを示す。レーン３はＴＣＣＲ-/-マウスのＰＣＲバンドを示し、レーン５及び６はＴＣＣＲヘテロ接合性マウス(+/-)を示す。Ｆｉｇ１０Ｃは、ＴＣＣＲに対して特異的なプローブによってハイブリダイゼーションしたノーザンブロットである。レーン１はＴＣＣＲ-/-マウスから、そしてレーン２は野生型からのものである。ＴＣＣＲ-/-マウスのどのシグナルの欠如も、ＴＣＣＲの機能的な全長ｍＲＮＡが生産されていないことを示す。
【Ｆｉｇ１１（Ａ−Ｂ）】  ＴＣＣＲ-/-マウスにおける アレルギー性気道炎症の増加を示す。Ｆｉｇ１１Ａは、肺に浸潤する白血球の数の測定によって、チリダニ抗原（ＤＭＡ）で感作されたＴＣＣＲ-/-マウスがより多くのＴｈ２応答を産することを示す。
【Ｆｉｇ１２（Ａ−Ｂ）】  ＩＦＮ-γの生産の測定による、ＴＣＣＲ-/-マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２応答の示すグラフ表示。Ｆｉｇ１２Ａでは、Ｔｈ１経路において分化を引き起こすＩＬ-１２と、ＴＣＣＲ-/-マウスから分離したＴ細胞をインキュベートする。これらの細胞のＩＦＮ-γ、ＩＬ-４及びＩＬ-５の生産をアッセイした。ＴＣＣＲ-/-マウスのＩＦＮ-γの生産がかなり低いことが、Ｆｉｇ１２Ａの薄い斜線棒によって示されている。これは、ＴＣＣＲ-/-マウスにおける、かなり弱ったＴｈ１応答を示す。Ｆｉｇ１２Ｂは、Ｔｈ２経路において分化を引き起こすＩＬ-４とインキュベートしたＴ細胞のグラフ表示。これは、ＴＣＣＲ-/-マウスＴ細胞と野生型コントロール細胞の間には、サイトカインの生産に違いがないことを示している。
【Ｆｉｇ１３】  ＴＣＣＲ-/-マウスにおいて生産されるＩｇレベルのグラフ表示。ＩｇサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ及びＩｇＡのレベルが調べられた。薄い斜線棒で示されているように、ＴＣＣＲ-/-マウスは、野生型より少ないＩｇＧ２ａを生産した。その他のＩｇＧレベルには、顕著な違いは無かった。ＩｇＧ２ａはＴｈ１細胞によって生産され、ＴＣＣＲ-/-マウスにおけるその著しい欠如は、ここで示された他のアッセイで観察されるＴｈ１応答の減少を支持する。
【Ｆｉｇ１４】  前もってオボアルブミンで免疫したＴＣＣＲ-/-マウスから生産されたＩｇＧレベルのグラフ表示。第１日目と第２１日目に、マウスへ１００μｇのＯＶＡを注射し、次いで２６日目に採血した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルは、野生型と比較してホモ接合型のノックアウトで測定した。グラフの左側に示すように、ＩｇＧ１レベルは野生型とノックアウトでは同等であるが、ＩｇＧ２ａのレベルは野生型に比べてＴＣＣＲ-/-ノックアウトマウスで極めて低く、これはＴＣＣＲ-/-マウスの弱いＴｈ１応答を反映している。
【Ｆｉｇ１５（Ａ−Ｂ）】  マウス脾細胞のどの細胞型においてＴＣＣＲの発現が在るのかを示すグラフ表示。Ｆｉｇ１５Ａは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＮＫ１．１及びＦ４／８０細胞における発現レベルを示し、ＣＤ４Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞において最も高いレベルであることを示している。Ｆｉｇ１５Ｂは、Ｔｈ０、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞での発現レベルを示し、Ｔｈ０において最も高い発現であり、ＣＤ４細胞の分化によりＴｈ１及びＴｈ２細胞の双方において下方制御されることが示されている。ＴＣＣＲの発現は、リアルタイムＰＣＲ法によって検出され、リボゾームのハウスキーピング遺伝子であるｒｐｌ１９へ標準化された。Heid, C.A., ら., 1996, Genome Res., 6:986-94。
【Ｆｉｇ１６（Ａ−Ｄ）】  抗原の誘導による、ＴＣＣＲ欠損マウスのリンパ節細胞からのサイトカインの生産及び増殖のグラフ表示。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に含まれるＫＬＨで野生型及びＴＣＣＲ欠損マウスを免疫した。９日後にリンパ節を収集し、これを指示されたようにＫＬＨの存在下で培養し、リンパ節の（Ｆｉｇ１６Ａ）ＩＦＮ、（Ｆｉｇ１６Ｂ）ＩＬ-４、（Ｆｉｇ１６Ｃ）ＩＬ-５を生産する或いは（Ｆｉｇ１６Ｄ）増殖させる能力を分析した。データーは、各グループの五匹の動物から得られた平均＋／−標準偏差値で示されている。両ＫＬＨ濃度でのＷＴとＫＯの間のＩＦＮ？レベルのための対応のないＴ検定では、Ｐ＜０．００４。
【Ｆｉｇ１７（Ａ−Ｃ）】  ＩｇＧサブクラス濃度及びリステリア症菌に対する感受性への効果に関するグラフ表示。血清を野生型及びＴＣＣＲ欠損マウスから収集し、全ＩｇＧサブクラス濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定した（Ｆｉｇ１７Ａ）。ＯＶＡ／ＣＦＡのＯＶＡ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａによって、マウスを初回刺激した。ＣＦＡに含まれるＯＶＡで免疫された野生型及びＴＣＣＲ欠損マウスから血清を収集し、ＯＶＡ特異的ＥＬＩＳＡ法によってＩｇＧ１（１：３２００００希釈）及びＩｇＧ２ａ（１：５０００希釈）のレベルを測定した（Ｆｉｇ１７Ｂ）。五匹のＴＣＣＲ欠損マウス又は野生型同腹子を、３ｘ１０４ＣＦＵのリステリア症菌で皮下感染させた。３又は９日後に、肝臓を取り出し、細菌力価を測定した（Ｆｉｇ１７Ｃ）。データーは、各グループの五匹の動物から得られた平均＋／−標準偏差値で示されている。両時点でのＷＴとＫＯの間の対応のないＴ検定では、Ｐ＜０．００１。
【Ｆｉｇ１８（Ａ−Ｄ）】  インビトロでのＴｈ細胞分化及び増殖の誘導についてのグラフ表示。或いは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を刺激とする、ＣｏｎＡ及び照射野生型ＡＰＣの存在下において、野生型又はＴＣＣＲ欠損マウスの脾臓より精製したＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１又はＴｈ２細胞（Ｆｉｇ１８Ａ）へ分化した（Ｆｉｇ１８Ｂ）。ＩＦＮ及びＩＬ-４の生産は、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。データーは、５匹のマウス／１グループのプールの平均値＋／−標準偏差で示す。ＮＤは非検出。Ｆｉｇ１８Ｃは、野生型及びＴＣＣＲ欠損マウスの脾細胞のＩＬ-１２誘導化増殖を示す。指示されたように、ＩＬ-１２濃度が増加した下で、ＣｏｎＡ活性化脾細胞を２４時間に渡ってインキュベートした。最後の６時間で、［３Ｈ］-チミジンを取り込ませることによって細胞の増殖を測定した。Ｆｉｇ１８Ｄは、非刺激（白棒）及びＣｏｎＡ刺激（黒棒）脾細胞のＩＬ-１２Ｒ ｍＲＮＡレベルを示す。脾臓Ｔ細胞を７２時間に渡ってＣｏｎＡで刺激し、ＩＬ-１２Ｒ及びＩＬ-１２Ｒ２のｍＲＮＡレベルを、リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって測定した。倍数増加は、野生型非刺激細胞のＲＮＡレベルに比例している。
【Ｆｉｇ１９】  Taqman（タックマン）分析に用いられたプライマーとプローブを示す配列番号：ＮＯＳ：５−１６の配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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