(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質内及び／又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えたペプチドであって、in vivoでアミノグリカンと反応し得ることを特徴とするペプチドにおいて、
配列番号：２；配列番号：３；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：３０；配列番号：３６；配列番号：３８及び配列番号：３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
細胞質内及び／又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えたペプチドであって、アミノグリカンと反応することができ、ヒト由来のタンパク質より生じることを特徴とするペプチドにおいて、
配列番号：２；配列番号：３；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：３０；配列番号：３６；配列番号：３８及び配列番号：３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ペプチド。
【請求項３】
前記対象物質を細胞内に運搬することを意図した組成物を調製する為の、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項４】
アミノグリカンと反応する少なくとも一つのアミノ酸配列により構成されることを特徴とするin vivoにおける細胞質内及び／又は細胞核内への運搬ベクターにおいて、
前記アミノ酸配列が、配列番号：２；配列番号：３；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：３０；配列番号：３６；配列番号：３８及び配列番号：３９からなる群から選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする、運搬ベクター。
【請求項５】
アミノグリカンと反応し、ヒトタンパク質に由来する少なくとも一つのアミノ酸配列により構成されることを特徴とする細胞質内及び／又は細胞核内運搬ベクターにおいて、
前記アミノ酸配列が、配列番号：２；配列番号：３；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２６；配列番号：３０；配列番号：３６；配列番号：３８及び配列番号：３９からなる群から選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする、運搬ベクター。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、自然に又は人為的に細胞及び／又は該細胞の核に組込まれ得る少なくとも一つの対象物質に結合していることを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項７】
前記対象物質はアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に結合していることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記結合は化学結合であることを特徴とする請求項６または７に記載のベクター。
【請求項９】
前記結合は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシニミジル（ＳＭＣＣ）系のホモ官能性架橋試薬又はヘテロ官能性架橋試薬を介して行われることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
前記結合は、遺伝子工学によって行われることを特徴とする請求項６または７に記載のベクター。
【請求項１１】
前記対象物質は、核酸、タンパク質、医薬、抗原、抗体を含む群から選択されることを特徴とする請求項６〜１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
in vitroで細胞をトランスフェクションし得ることを特徴とする請求項６〜１１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３】
前記対象物質に対して強い親和性を有する少なくとも一つの天然固定分子を介して、少なくとも一つの対象物質に結合すること、並びに
前記固定分子は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2断片、抗ペルオキシダーゼＩｇＧ，抗ＲＮａｓｅ  Ｆ（ａｂ’）2、コンカナバリンＡ、ストレプトアビジン及びアビジンのなかから選択されることを特徴とする請求項６〜１２のいずれかに記載のベクター。
【請求項１４】
前記固定分子は、多数の対象物質に対して親和性を有することを特徴とする請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載のペプチドを含むことを特徴とする真核細胞。
【請求項１６】
請求項４〜１４のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする真核細胞。
【請求項１７】
請求項４〜１４のいずれかに記載のベクターによってトランスフェクションされた真核細胞。
【請求項１８】
下記工程：
ａ）前記対象物質を、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド又は請求項４〜１４のいずれかに記載のベクターに結合させる工程、及び
ｂ）前記細胞の能動代謝を可能にする培養温度において、該結合産物と細胞を培養する工程
を包含することを特徴とするin vitroで細胞内に対象物質を運搬する方法。
【請求項１９】
前記工程ｂ）の培養を２５℃〜３９℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程ｂ）の培養を３７℃で行なうことを特徴とする請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項４〜１４のいずれかに記載のベクター又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の細胞を有効成分として含有することを特徴とする生物学的、医薬用、化粧品用、農産物用、診断用又は追跡用組成物。
【請求項２２】
生物学的、医薬用、化粧品用、農産物用、診断用又は追跡用組成物を製剤化及び調製する為の、請求項２１に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
請求項４〜１４のいずれかに記載のベクター及び請求項１５〜１７のいずれかに記載の細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする診断薬。
【請求項２４】
１又はそれ以上の容器中に、あらかじめ定められた量の請求項２１に記載の組成物を含むことを特徴とする診断キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、細胞質内及び／又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えたアミノ酸配列に関するものである。
【０００１】
対象物質を、外来環境から細胞内部へ、より詳細には細胞核内へ有効に運搬し得る手段を提供することは、バイオテクノロジーの分野において、特にタンパク質又はペプチドを生産する為、遺伝子の発現を調節する為、或いは細胞内シグナル伝達の経路を分析して選択する為、更には当該細胞に関与する所定物質の特性を分析する為の、強力な武器となる。
【０００２】
上記手段の更に重要な適用は、遺伝子治療の分野に関係するものである。これまでに実施されている様々な遺伝子治療の方法は、需要が充分に満たされていない以下の問題、即ち、宿主ゲノムも、運搬される有効成分の生物学的特性も変化させること無しに、治療対象である宿主生物の細胞質内及び／又は細胞核内に生物学的活性成分を自由に運搬し得るベクターを提供するという必要性に直面している。
【０００３】
ＤＮＡを細胞内に運搬する為に、これまでに幾つかの手法が開発されたが、いずれも現実問題として満足し得るものではなかった。そのなかの一つの手法である、ＣａＣｌ2処理による大腸菌の形質転換に対する感受性獲得に基づくＭａｎｄｅｌとＨｉｇａの手法に由来する方法は、ＤＮＡをリン酸カルシウム又はＤＥＡ−デキストランと共沈させ、得られた共沈殿物を直接、細胞又は核に導入するというものである。この方法は、毒性があるという事実に加え、選択性がないものである。
【０００４】
もう１つのＤＮＡの直接導入法であるエレクトロポレーションは、細胞に短期間数千ボルトの電気ショックを与えるものであり、これにより、ＤＮＡは細胞膜を通過して細胞内に侵入することができる。この方法は細胞毒性が極めて強く、使用細胞によっては、高い死亡率と大きな変異原性を招くものである。
【０００５】
他の幾つかの方法は、膜上に存在するレセプターによる、細胞内への遺伝子取込みのふるい分けを利用するものである。これらレセプターの特異的リガンド又は膜成分の特異的抗体を介して、ＤＮＡは細胞内に侵入することができる。即ち、ＤＮＡ−リガンド複合体は、エンドサイトーシスの過程によって細胞内に侵入する。この方法は、リソソーム小胞内における複合体の破壊が著しいという事実により、使用が制限されている。これらの問題点を回避する目的で幾つかの方法が開発されたが、いずれも完全に満足し得るものではない。
【０００６】
米国特許第５，６３５，３８３号は、核酸を細胞内に運搬する為の、ポリリシンを主成分とする別タイプの複合ベクターを開示している。
【０００７】
米国特許第５，５２１，２９１号は、抗体を介してＤＮＡに強い親和性を有する物質に結合したウイルスから形成されるコンジュゲートを使用する方法を開示している。この様なコンジュゲートの使用は高度の技術を必要とするものであり、ウイルスの使用は、或る程度の危険を招きかねない。
【０００８】
これらの不具合を克服する試みとして、ＷＯ９７／０２８４０号には、生物活性物質を細胞質内及び／又は核内に運搬する為の免疫ベクターとして、生存細胞の内部に侵入し得るマウス抗ＤＮＡ抗体又はこれらのＦ（ａｂ’）2断片及びＦａｂ’断片を使用することを包含する、in vitroでの試験方法が開示されている。これらのベクターは有用性が高いが、それらの使用が複雑なケースもあり得ると考えられる。更に、抗体という小さくて複雑な分子を使用することは、これらの操作と利用に当たり、重大な不都合を招く可能性もある。
【０００９】
ＷＯ９９／０７４１４号には、生物活性物質の細胞質内及び核内インターナリゼーションベクターとして、上述したＷＯ９７／０２８４０号で開示されたマウス抗ＤＮＡ抗体から誘導したペプチドをin vitroで使用することが可能である旨記載されている。
【００１０】
これらのマウス由来ペプチドベクターは生殖細胞系でコードされており、突然変異を含まない為、抗原的にはヒトで認められるものに近いと考えられるが、ヒトにおける免疫反応の危険性を排除することはできない。
【００１１】
従って、上述した問題点を回避し得るペプチド及びアミノ酸配列、即ち、ヒトにおける細胞インターナリゼーションのベクターとして、またはベクター内で使用することが可能であり、上述した危険性のないペプチド及びアミノ酸配列が切望されている。
【００１２】
極めて多くの細胞調節は、タンパク質と細胞表面のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との相互作用に依存することが知られている（１−６）［括弧内の太字は添付の参考文献の番号を示す］。上記相互作用は、例えば止血の制御（７）、平滑筋細胞の増殖（８）、増殖因子の活性の発現（９）、酵素の脂肪分解活性の発現（１０）、細胞外基質の完全性（１１）等に干渉する。所定の系におけるこれらの生物学的作用は、１個又は特定の数のタンパク質と、細胞表面のＧＡＧとの相互作用に起因する。ＧＡＧは、全ての真核細胞表面上に存在し、進化過程で高度に維持された成分である。ＧＡＧは糖類重合体である；例えばヘパリンはニ糖類重合体であり（α−１、４−２−イズロン酸→Ｄ−グルコサミン）、コンドロイチン硫酸は、ニ糖類Ｎ−アセチルコンドロシンの重合体であり、多数の硫酸基を含む為、負に荷電している。ＧＡＧと特異的に反応するタンパク質は全て、その配列中に、これらのタンパク質とＧＡＧとの相互作用に関与する１個又はそれ以上のペプチドセグメントを含んでいる。これらセグメントの長さは、タンパク質によって異なるが、４個から３０個のアミノ酸である。これらのペプチドの殆ど全部が正に荷電しており、多くの塩基性アミノ酸、特にリシンとアルギニンを含有している。これらのアミノ酸は、上記タンパク質とＧＡＧとの相互作用に支配的に関与することが報告されている（１−６）。
【００１３】
ＧＡＧ、又はより一般的にはアミノグリカン、特にヘパリン、ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸に結合するペプチド（ヘパリンはアミノグリカンの一例であるが、「ヘパリンに結合するペプチド」という意味で総括的にＰＬＨと呼ばれるペプチド）は、上述したペプチドの様に天然由来のもの、または人工的由来のものであり得る。これらは天然の形態又は重合体（二量体、三量体等々）の形態で使用することができる。
【００１４】
本発明によれば意外にも、これらのペプチドがin vitroと同様にin vivoでも細胞内での対象物質のインターナリゼーション作用物質として使用し得ることが確認された。
【００１５】
実際のところ、in vitroで周知の手法をin vivoに適用することは、in vitroという閉塞空間で試験するときには関与しない幾つかのパラメータ（バイオアベイラビリティー、免疫反応、等々）を測定することを包含している。更にin vitroからin vivoへの変更は、数多くの潜在的な相互作用（免疫反応、副作用、有効成分の遮断又は阻害、拒絶反応、等々）がin vivoでの操作に干渉する可能性があるという事実から、多くの危険を伴う作業でもある；その結果、in vitroでの手法をin vivoに適用したとしても所望の結果が得られる見込みは殆どない。
【００１６】
そこで第一の目的によれば、本発明は、細胞質内及び／又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備え、in vivoでアミノグリカンと反応することができることを特徴とするアミノ酸配列に関するものである。
【００１７】
もう１つの目的によれば、本発明は、細胞質内及び／又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えており、ヒト由来のタンパク質から生じ、アミノグリカンと反応することができることを特徴とするアミノ酸配列を対象とするものである。
【００１８】
より詳細には、いずれの場合においても、上記配列はヘパリン、コンドロイチン硫酸及びそれらの誘導体と反応することを特徴とするものである。
【００１９】
本発明の一環として実施された研究結果から、ペプチドの侵入は４℃での細胞培養によって完全に阻止されることが明らかになった。更にアジ化ナトリウム（ＡＴＰａｓｅの阻害因子）、ゲニステイン（チロシンキナーゼ及びＡＴＰへの結合の阻害因子）等の細胞代謝阻害因子によってもペプチドの侵入が部分的に阻害される。本発明のペプチド、更には当該ペプチドに結合した対象物質のインターナリゼーションの機序はエネルギーに依存している。即ち、本発明のペプチドを使用したベクターの調製は、受動系に属するのではなく、反対に、レセプターを介して行われるという点は注目に値すべきことである。本発明のアミノ酸配列は、in vivoでアミノグリカン、アミノグリカン硫酸、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸と反応する能力に加えて、細胞膜のレセプター上に固定されている為、このレセプターにより細胞膜を通過できるという能力によっても特徴付けられる。従って、本発明のアミノ酸配列は、細胞膜を受動的に通過することができる先行技術のペプチド運搬体とは区別される。
【００２０】
この様に本発明のペプチドは、能動的機序により細胞膜を通過することができ、その後、細胞質内及び／又は細胞核内に入り込むことができ、細胞内への通過時に、運搬物質の大きさによって使用が制限されないベクターを使用可能にする能力を備えているという点でも注目すべきである。実際のところ、本発明のベクターは、小さな化学分子（低分子量）からプラスミド型タンパク質又は核酸分子（高分子量）までの薬剤を運搬することができる。従って、上記ベクターの使用は、細胞内タンパク質の治療また遺伝子治療の新しい手段を提供するものである。この様な本発明のベクターによる特殊な侵入能力は、「薬剤」を細胞内に選択的に導入することを可能にし、薬剤による副作用の潜在的な低減と効果指数の潜在的な上昇をもたらすものである。
【００２１】
「ヘパリン又はコンドロイチン硫酸の誘導体」若しくは「ヘパリン又はコンドロイチン硫酸型アミノグリカン」とは、参考文献（１）−（３）で引用する公表文献の中で定義される全ての生成物又は副産物と解釈しなければならない。
【００２２】
「侵入を促進する」とは、外部環境から細胞内環境へ、なかでも特に細胞質内及び／又は細胞核内への物質の通過又は転移であると理解される。この侵入は、例えば培養細胞の存在下にアミノ酸配列を培養する最初の工程と、引続き行なわれる上記細胞の固定と透過性上昇、次いで細胞内における当該アミノ酸配列の存在検出工程とを包含する細胞侵入試験といった様々な方法によって測定することができる。検出工程は、当該配列に対する標識抗体の存在下に新たに培養し、その後、細胞質内又は細胞核のすぐ近く、若しくは更に細胞核の内部で、当該配列と標識抗体との間の免疫反応を検出することによって行なわれる。更に検出は、本発明のアミノ酸配列を標識し、これらの細胞画分において上記標識の存在を検出することによっても行なわれる。細胞侵入試験は、例えば前に引用したＷＯ９７／０２８４０号に記載されている。
【００２３】
「対象物質」とは、特に生物学的、医薬学的、診断上、追跡上、又は農産物上の利益を有する全ての生成物と理解され、様々な起源、特にヒト、ウイルス、動物、真核生物又は原核生物、植物、合成等々に由来しており、簡単なオリゴヌクレオチドからゲノム又はゲノム断片に至る様々な大きさを有する核酸（リボ核酸、デオキシリボ核酸）であり得る。また、ウイルスゲノムまたはプラスミドであっても良い。更に上記物質は、酵素、ホルモン、サイトカイン、アポリポタンパク質、増殖因子、抗原、抗体等々であってもよい。或いは毒素、抗生物質、抗ウイルス分子または免疫調節因子であってもよい。
【００２４】
一般に対象物質は、化学物質、生化学物質、天然物若しくは合成物であり、薬剤の有効成分も含まれる。分子量約５００ダルトンの小さな分子、若しくは数千ダルトンのタンパク質等の大きな分子であってもよい。
【００２５】
対象物質は、アミノ酸配列によって、別の作用物質によって、又は環境条件によってその場で直接活性化され得るか、又は活性化可能となり得る。
【００２６】
本発明の範囲には、上記で定義した対象物質及びアミノ酸配列の結合も包含される。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、上述した危険性を回避する為に、アミノ酸配列は生殖細胞系でコードされており、突然変異（置換、欠失、付加等々）は含まない。
【００２８】
本発明において特に好ましいアミノ酸配列は、ヒト細胞で合成されるタンパク質に由来するものである。ヒト細胞で合成される上記タンパク質は、ヘパリン型アミノグリカン又はコンドロイチン硫酸に結合するタンパク質から選択することが好ましい。例えば、ヒトリポタンパク質Ｂに由来するアミノ酸配列が挙げられる。
【００２９】
一般にアミノ酸配列は、例えばリシン、アルギニン又はヒスチジンの様に多数の塩基性アミノ酸を含む。
【００３０】
「多数」とは、少なくとも３以上を含まなければならない。
【００３１】
本発明を実施する為の好ましいアミノ酸配列の一つのタイプは、下式：
ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）n；ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）n；ｃ）（ＢＢＸmＹＢＢＸo）n；ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）n；及びｅ）（ＢＸＢＢ）n
［式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘは、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、又はチロシン等の、好ましくは疎水性の非塩基性アミノ酸であり、Ｙは直接結合又は１〜２０個のアミノ酸を表わし、ｍは０〜５の整数であり、ｎは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、且つ、ｏは０〜５の整数である］
のいずれかに対応する少なくとも１個のアミノ酸群で構成されるか、又は上記アミノ酸群を含むものである。
【００３２】
一般にアミノ酸配列は１００個以下のアミノ酸、より好ましくは５０個以下のアミノ酸、更に一層好ましくは２５個以下のアミノ酸を含む。
【００３３】
好ましくは本発明のアミノ酸配列は、６〜２５個のアミノ酸を含む。
【００３４】
本発明を実施する為の好ましいアミノ酸配列は、本明細書の一部をなす添付の配列番号：２，３，５，７，９，１０、１３，１６，１７，１９，２０，２１，２３，２５，２６，３０，３３，３４，３５，３６，３７，３８及び３９によって同定されるものである。このうち特に、配列番号：２，３，５，７，９，１０，１３，１６，１９，２０，２１，２３，２５，２６，３０，３６及び３８によって同定される配列が好ましい。
【００３５】
本発明を実施する為の好ましい配列のもう一つのタイプは、ドメインの一方が、式：ａ）ＸＢＢＢＸＸＢＸ；ｂ）ＸＢＢＸＢＸ；ｃ）ＢＢＸmＹＢＢＸo；ｄ）ＸＢＢＸＸＢＸ；又はｅ）ＢＸＢＢのアミノ酸配列を含んでおり、
且つ、ドメインの他方が、式：ａ）ＸＢＢＢＸＸＢＸ；ｂ）ＸＢＢＸＢＸ；ｃ）ＢＢＸmＹＢＢＸo；ｄ）ＸＢＢＸＸＢＸ；ｅ）ＢＸＢＢ；又はｆ）抗体断片
［式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘは、好ましくは疎水性の非塩基性アミノ酸であり、Ｙは直接結合又は１〜２０個のアミノ酸を表わし、ｍは０〜５の整数であり、且つ、ｏは０〜５の整数である］
のアミノ酸配列を含む、少なくとも二つのドメインで構成されるか、又は少なくとも２つのドメインを含むものである。
【００３６】
特に興味深いアミノ酸配列は配列番号：１の配列であり、これは、（１）少なくともダイマーの形態で所望の特性を発揮し、そして（２）モノマー又はポリマーの形態では、それが結合している他のアミノ酸配列に上記特性を付与するか、又は当該配列が上記特性を既に有しているときには、これらの特性を顕著に増強することができる。同様にＨＢＰ３、ＨＢＰ７、（ＨＢＰ３）2、ＨＢＰ６、ＨＢＰ７、ＨＢＰ１０及びＨＢＰ１３と呼ばれるペプチドも、この増強能力を有している。
【００３７】
上記で定義したペプチドは、これらに共有結合又は非共有結合している分子を細胞内に運搬することができる為、対象物質を細胞内に運搬する有効なベクターとなる。
【００３８】
下記表１に示す７個の配列は、細胞質内への運搬に当たり、特に有用である。これらは、（ＨＢ１）3、ＨＢＰ６、（ＨＢＰ３）2、ＨＢＰ７、ＨＢＰ１１、ＨＢＰ１３及びＨＢＰ２配列である。
【００３９】
【表１】
0004912556.tif 000002
【００４０】
核内への運搬に当たっては、このうち２つの配列が特に有用である。即ち、ＨＢＰ１０及びＨＢＰ１５である。これら２つの配列は、塩基性アミノ酸を多く含有しており、より詳細には、細胞質内への運搬に有用な配列とは異なって、リシン残基を含まないという事実によって特徴付けられる。
【００４１】
表１に示す各配列は、配列の総残基数に対して少なくとも２０%のリシン残基を有しており、少なくとも５０%の残基が塩基性アミノ酸である。
【００４２】
本発明により、上記で定義したペプチドと、細胞内に侵入し得るポリペプチドベクターとの結合は、これらベクターの転移能力を顕著に向上することが明らかになった。
【００４３】
更に本発明により、上記で定義したペプチド又はこれらのポリマー形態と、細胞膜上に存在するレセプターと反応する作用を有するリガンドとの結合は、当該リガンドの細胞膜上に固着する能力を顕著に高めることが明らかになった。
【００４４】
もう１つの目的によれば、本発明は、対象物質を細胞内に運搬することを意図した組成物を調製する為の、上記で定義したアミノ酸配列の使用を対象とするものである。この様な本発明ペプチドの能力は、生体膜を通過して、特に血液脳関門、血液網膜関門、腸関門、肺関門を超えて活性物質を運搬するのに有用である。本発明のペプチドは、それらが結合している活性物質及び標的細胞の種類、特に上記関門の通過を必要とする細胞の種類に適合した投与形態によって使用できるという利点を有している。
【００４５】
もう一つの実施態様では、本発明はペプチドベクターにおけるアミノ酸配列の使用に関するものである。上記アミノ酸配列の特性により、これらのベクターはヒトへの危険性も無く、ベクターに結合した対象物質の分解も伴うこと無しに、ヒトの細胞質内及び細胞核内への運搬目的で、容易に使用することができる。
【００４６】
上記目的を達成する為には、特に、比較的大きなサイズの分子を細胞内部に運搬することができなければならず、且つ、ヒト免疫系によって異種抗原として認識されてはならない。
【００４７】
下記表１に、本発明の幾つかのペプチドについて、ビオチン又はフルオレセイン（Ｍａｒｑ）の様にこれらの検出を可能にする低分子量マーカーまたは生物学的対象物質（Ｓｕｂｓｔ）に結合した細胞質内及び／又は細胞核内の侵入レベルを示す。
【００４８】
表１の２に示す結果は、以下に記載の実験データに基づくものである。
【００４９】
【表１−２】
0004912556.tif 000003
【００５０】
これらの結果により、大量に核転移し得るペプチドは、正電荷が特にアルギニンの存在と、リシンのほぼ完全な不在によって構成されることが示唆される。
【００５１】
本発明によるペプチドの１番目の群は、対象物質を細胞内に侵入させることができるが、核内へは殆ど又は全く侵入させないアミノ酸配列を含有している。例えば配列番号：２，３，１７，１８，１９、２０，２１、３３、３４、３７及び３８の配列のペプチドが挙げられる。
【００５２】
本発明によるペプチドの２番目の群は、細胞内及び細胞核内に対象物質を侵入させることが可能なアミノ酸配列を含有している。例えば配列番号：２６、３５及び３９が挙げられる。
【００５３】
本発明によるベクターは、上記で定義したアミノ酸配列で構成されるか、又は当該アミノ酸配列を含有することを特徴とするものである。
【００５４】
或いは上記ベクターは、一方でアミノグリカンと反応するアミノ酸配列と、他方でヒト抗ＤＮＡ抗体の可変部分に由来する核ペプチドと結合するものである。特にアミノグリカンと反応するアミノ酸配列がヒト由来の場合、同一分子内で、アミノグリカンと反応するアミノ酸配列と、ヒト抗ＤＮＡ抗体の可変部分から誘導されるペプチドとが結合することは、対象物質の細胞内転移及び運搬に当たって特に有用なペプチドベクターの調製を実現可能とするものである。
【００５５】
更に上記結合により、特に、ヒトの使用に適合した転移及び運搬ベクターが得られる。実際に上記で指摘した様に、ＷＯ９７／０２８４０号では、既知のマウス由来のペプチドベクターは生殖細胞系でコードされており、突然変異を含まない為、抗原的にヒトに認められるものに近い筈であるが、これらをヒトに注入すると、免疫反応を誘発する可能性がある。本発明によるＰＬＨ形態のペプチドベクター及び抗ＤＮＡ抗体から誘導されるペプチドは、いずれもヒト由来であり、突然変異を含まず、生殖細胞系でコードされている為、上記の問題を回避することができる。
【００５６】
ヒト抗ＤＮＡから誘導される上記ペプチドの一般的特徴は、ＷＯ９９／０７４１４号に記載されているマウス由来のペプチドのものに近いが、これらと区別し得る付加的な特性も有している。即ち：
１）細胞内に侵入する為には細胞の活性代謝（２５〜３９℃、好ましくは３７℃の培養温度）を必要とするのに対し、マウスペプチドの場合は明らかに依存性が低い；
２）マウスベクターに比べ、ＤＮＡとの反応性が非常に弱い；
３）侵入能力は、細胞内に輸送しようとする分子により、有意に影響されない；
４）ヒト由来細胞は、他の由来細胞に比べて容易に侵入する。
【００５７】
本発明に従い、ＰＬＨ、及び、好ましくは多反応性の、１又はそれ以上の抗体断片、より詳細には抗体の超可変領域から生じる１又はそれ以上の断片で構成されるベクターを調製した。本発明の対象であるベクターは、好ましくは、抗体のＨ鎖断片を含むことを特徴とする。
【００５８】
上記で引用したＷＯ９９／０７４１４号では、サイズが小さく分子量も小さい、単量体免疫グロブリンであるモノクローナルＩｇＧの断片のみしか使用していなかった。本発明により、非常に高分子量の、五量体免疫グロブリンであるＩｇＭから生じる断片も使用できることが初めて明らかになった。実際のところ、現在に至るまで、本出願者の知る限り、この様な断片は大きなサイズと高い分子量を有するという特性による制限の為、ＩｇＭ断片の細胞インターナリゼーションベクターとしての使用に関する研究は全く行なわれていなかった。
【００５９】
従って、本発明は、１又はそれ以上のＰＬＨ、及び１又はそれ以上のＩｇＭ、若しくはＩｇＧ断片を含有することを特徴とする、細胞インターナリゼーションベクターを対象とするものである。
【００６０】
好ましくは上記ベクターは、抗体のＣＤＲ２領域の全部又は一部を含有する。或いは上記ベクターは、抗体のＣＤＲ３領域の全部又は一部を含有する。より詳細には上記ベクターは、ＲＴＴ７９、ＮＥ−１及びＲＴ７２よりなる群から選択される、ヒト抗ＤＮＡ抗体の少なくとも一つのＣＤＲ３領域を含むものである。
【００６１】
もう１つの変法では、更に本発明の対象であるベクターは、ＣＤＲ２領域の全部又は一部、若しくはＣＤＲ３領域の全部又は一部も含み得る。
【００６２】
「全部又は一部」とは、ベクターが細胞内に侵入する能力を維持している（機能的同族体）ことを条件として、本発明のベクターが関与するＣＤＲ領域全体、又はその一部のみを含み得るものと解釈しなければならない。「ＣＤＲ領域の一部」とは、１又はそれ以上のアミノ酸末端を欠くＣＤＲ領域と解釈しなければならない。同時に１又はそれ以上の内部残基が欠失されている、若しくは別のアミノ酸、好ましくは同じ性質のアミノ酸（例えば塩基性アミノ酸）で置換されているＣＤＲ領域であってもよい。
【００６３】
本特許明細書に示す例の一部は、ヒトリポタンパク質Ｂから生じる配列番号：１の使用に基づくものであるが、当業者であれば、明らかに、あらゆる天然又は人工ＰＬＨを使用することができる。
【００６４】
上記で述べた様に本発明によるペプチドは、特に、対象物質の細胞内運搬及び転移に非常に適合するものである。
【００６５】
従って、本発明は、自然に又は人為的に、細胞及び／又は当該細胞の核に組込まれ得る対象物質を含有することを特徴とする、上記ベクターの提供を目的とするものである。
【００６６】
より詳細には本発明は、侵入能力が、結合している対象物質の性質に殆ど依存しないベクターを対象とするものである。マウスベクターと比較した場合における上記ヒトベクターに固有の特徴は、これらのベクターの予測される用途に対し、何よりも重要な利点である。しかし、本発明は同時に、結合している対象物質に適合するベクターにも考慮している。
【００６７】
「結合」とは、対象物質とベクターとの間の物理的結合を可能にするあらゆる種類の相互作用であると理解され、生物学的環境及び／又は本発明のペプチドによって運搬される対象物質によって開裂可能な又は非開裂可能な結合、更には活性物質に結合したベクターを投与する生物に適用される物理的手段によって開裂可能な結合も包含される。対象物質の生物学的作用が発現する為には、当該物質がベクターから遊離することが必要な場合がある。ベクターから遊離することが好ましい対象物質の例として、ドキソルビシンが挙げられる。
【００６８】
しかし、ベクターが細胞へ侵入する前に又は侵入中に分離しない様、相互作用は充分強固でなければならない。上記理由により、本発明による好ましい結合は共有結合であるが、非共有結合であっても構わない。対象物質は、両末端のいずれかで、若しくはアミノ酸の１つの側鎖で、ペプチドに直接結合することができる。更に対象物質は、ペプチドの両末端のいずれかで、若しくはアミノ酸の１つの側鎖で、結合鎖を介して間接的に結合することも可能である。
【００６９】
結合は、当業者に周知の化学的、生化学的、又は酵素的若しくは遺伝学的結合といったあらゆる方法によって行なわれるが、一般に４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシニミジル（ＳＭＣＣ）型のホモ又はヘテロ官能性架橋試薬を使用することが好ましい。更に結合手段として、アルキル、アリール、アルアルキル又はペプチド基、エステル、アルキル、アリール又はアルアルキルのアルデヒド又は酸、マレイミル安息香酸、マレイミルプロピオン酸の誘導体及びスクシニミジル誘導体等の無水物、スルフヒドリル又はカルボキシル基、臭化又は塩化シアンの誘導体、カルボニルジイミダゾール、スクシニミドのエステル、又はハロゲン化スルホン酸を含む二又は多官能性作用物質より選択されるものが挙げられる。
【００７０】
本発明のもう一つの実施態様によれば、上記対象物質の結合は、当業者に周知のあらゆる遺伝子工学手法によっても実施することができる。「遺伝子工学」とは、ペプチドベクターをコードするＤＮＡ対象遺伝子の相補的ＤＮＡの５’及び／又は３’の相でクローン化される発現ベクターの使用であると理解される。融合タンパク質の発現はプロモーターの制御下になされる。発現系は、融合タンパク質の生成の為、原核又は真核宿主細胞で使用することができる。
【００７１】
最初の実施態様では、本発明によるアミノ酸配列のＮ末端で上記対象物質の結合を行なう。本発明の第二の実施態様では、上記配列のＣ末端で当該対象物質の結合を行なう。
【００７２】
意外にも本発明の対象であるベクターは、生物活性を増強し得ると共に、結合する上記物質の毒性を、潜在的に低減し得ることが示された。従って、本発明は更に、結合している対象物質の生物活性を高めることができることを特徴とするベクターを対象とするものである。
【００７３】
また、本発明の対象であるベクターは、in vitroで細胞をトランスフェクションし得ることも示された。
【００７４】
本発明の特定の実施態様では、ベクターは、インターナリゼーションする対象物質に対し、強い親和性を有する少なくとも一つの天然の分子（所謂「固定分子」）を介して対象物質に結合される。対象物質に対する天然の固定分子の親和性により、運搬体が上記対象物質と非共有結合的に相互作用し、しかも細胞内転移の際に相互作用することが可能になる。
【００７５】
この種の運搬体における特に興味深いもう一つの利点は、対象物質に対する天然の固定分子の親和性によって、これら二つの結合が、化学的又は生化学的相互作用を伴うこと無く、全く自然に行われるということである。
【００７６】
この種の運搬体は、その大きさ及び／又は構造の為に、アミノ酸配列に直接結合するのが困難であると判明したときに特に有用である。また、この種の運搬体は、対象物質があまり安定でなく、その結合に関与する何らかの化学的相互作用によって物質が破壊され得るか、又はその活性が変化され得るときにも、非常に有用であると考えられる。
【００７７】
更に本発明による運搬体は、一つの対象物質のみに特異的なものではなく、逆に幾つかの異なる対象物質を細胞内及び／又は細胞核内にインターナリゼーションすることができる。
【００７８】
更に本発明は、本発明によるアミノ酸配列を含む真核細胞に関するものである。また本発明は、本発明のベクター及び／又は運搬体を含む真核細胞に関するものである。本発明はまた、本発明のベクター及び／又は運搬体によってトランスフェクションされたあらゆる種類の真核細胞に関するものである。
【００７９】
更に本発明は、in vitroで対象物質を細胞内に運搬し、当該対象物質の生物活性を向上させる方法に関し、以下の工程を包含するものである：
ａ）上記で述べた本発明によるアミノ酸配列、ベクター、又は運搬体へ物質を結合させる工程、及び
ｂ）上記細胞の能動代謝を可能にする培養温度において、上記結合産物と細胞をインキュベーションする工程。
【００８０】
この様な温度は２５〜３９℃、好ましくは３７℃である。
【００８１】
更に本発明は、有効成分として、本発明による少なくとも一つの対象物質を担うベクター若しくは運搬体、又は本発明に従ってトランスフェクションされた真核細胞を含む組成物に関するものである。本発明はまた、上記組成物を、生物学的、医薬、化粧品及び農産物の製剤化及び調製に使用することを対象とするものである。
【００８２】
本発明は、少なくとも一つの対象物質を担うベクター及び運搬体の、医薬的に許容される塩又は酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、前駆物質、代謝産物又は立体異性体を包含するものである。更に本発明は、医薬的に許容される溶媒、希釈剤又は賦形剤と結合する少なくとも一つの対象物質を担うベクター及び運搬体を含む医薬製剤を包含するものである。
【００８３】
「医薬的に許容される塩」という表現は、一般に遊離塩基を適当な有機酸又は無機酸と反応させて調製することが可能な本発明によるアミノ酸配列の無毒性塩を意味する。これらの塩は、遊離塩基の生物学的効果と同等の特性を有している。この様な塩の代表的な例として、酢酸塩、アンソネート（４，４−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホネート）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カムシレート（ｃａｍｓｙｌａｔｅｓ）、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、ジクロロヒドレート、エデト酸塩、エディシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、ブロムヒドレート、クロルヒドレート、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシレート、硝酸塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモエート（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエート、エンボエート）、パントテン酸塩、リン酸塩／ニリン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロネート、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラメート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、吉草酸塩及びＮ−メチルグルカミンアンモニウム塩等の水溶性及び水不溶性の塩が挙げられる。
【００８４】
対象者は、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のペプチド、ベクター又は運搬体の医薬上有効な量で治療することができる。「医薬上有効な量」という表現は、研究者又は担当医師が期待する組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を得る為に、対象物質を充分侵入させることができる量を意味する。
【００８５】
更に本発明は、対象物質の細胞内又は細胞核内への導入に適した医薬組成物を対象とするものである。上記組成物は、単独で、或いは１又はそれ以上の医薬上許容される担体と組合わせて、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるベクター又は運搬体の有効量を含む。上記組成物は、非常に毒性が低いか、又は全く毒性がないという意味で特に有用である。
【００８６】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるベクター若しくは運搬体、またはそれらの塩の投与は、治療薬が許容し得る任意の投与方法によって行なうことができる。これらの方法には、例えば経口、鼻腔、非経口的な全身投与、又は例えば経皮的な局所投与、若しくは更に例えば外科的頭蓋内経路による中枢投与、或いは更に眼内投与が含まれる。
【００８７】
経口投与は、錠剤、ゼラチンカプセル、軟カプセル（遅延又は持続放出性製剤を含む）、丸剤、粉末、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ及び乳剤によって行なわれる。これらの剤型は特に、腸関門の通過に適している。
【００８８】
非経口投与は、一般に皮下、筋肉内又は静脈内注射、或いは持続注入によって行なわれる。注射用組成物は、懸濁液又は溶液の一般形態、或いは液体中への即時溶解に適した固体形態として調製することができる。これらの剤型は特に、血液脳関門の通過に適している。
【００８９】
非経口投与に関する可能性の一つとして、例えばＵＳ−Ａ−３  ７１０  ７９５号では、一定用量レベルの維持を保証する徐放性又は持続放出性システムの移植を使用する。
【００９０】
鼻内投与に当たっては、適切な鼻内ビヒクルを使用することができる。
【００９１】
経皮投与に当たっては、当業者に周知の経皮パッチを使用することができる。経皮放出システムにより、持続的投与が可能になる。
【００９２】
その他の好ましい局所製剤として、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー及びゲルが挙げられる。
【００９３】
予想される投与方法に応じて、化合物は固体、半固体又は液体の形態とすることができる。
【００９４】
遊離状態又はゼラチンカプセルに封入された状態の錠剤、丸剤、粉末又は顆粒剤等の固体組成物では、有効成分を以下に記載のものと組合わて使用することができる：ａ）希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン；ｂ）潤滑剤、例えばシリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール；ｃ）結合剤、例えばケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、アミドンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン；必要に応じてｄ）崩壊剤、例えばアミドン、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩、又は発泡性混合物；及び／又はｅ）吸収剤、着色料、香料及び甘味剤。賦形剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、アミドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び製剤品質上の類似化合物が挙げられる。
【００９５】
坐剤等の半固形組成物では、賦形剤は、例えば乳剤又は脂肪懸濁液であるか、又はポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールを主成分とすることができる。
【００９６】
特に注射用又は軟カプセルに封入する液体組成物は、例えば水、生理的血清、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、油及び類似化合物等の医薬上純粋な溶媒への有効成分の溶解、分散等々によって調製することができる。
【００９７】
更に、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体は、単層小胞、単層大型胞及び多層小胞の形態等の、リポソームタイプの放出系形態で投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含む様々なリン脂質から生成される。一実施態様では、ＵＳ−Ａ−５  ２６２  ５６４号に記載されている様に、液体成分の薄層を薬剤の水溶液で水和し、当該薬剤を包み込む脂質層を形成することができる。
【００９８】
本発明による組成物には、滅菌する、及び／又はアジュバント及び防腐剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、溶解を促進する作用物質、浸透圧を調節する為の塩及び／又は緩衝剤等の無毒性の補助剤が含まれる。更に本発明の組成物には、治療上有用な他の物質が含まれる。上記組成物は夫々、混合、顆粒化又は被覆等の一般的な方法で調製することができ、約０．１−７５％、好ましくは約１−５０％の有効成分を含有する。
【００９９】
更に、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体は、標的可能な薬剤の保持体等の可溶性ポリマーと結合することができる。この様なポリマーとして、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチル−アスパナミド−フェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリ（エチレンオキシド）−ポリリシンが挙げられる。更に本発明の化合物は、制御された薬剤の放出を実施する為に有用な一連の生分解性ポリマー、例えばポリ（乳酸）、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び網状又は両親媒性の連続するヒドロゲルのコポリマーに結合することができる。
【０１００】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体の投与用量は、対象者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的状態；治療状態の重症度；投与経路；対象者の腎及び肝機能の状態、並びに使用する個々の化合物又は塩の性質を含めて、様々な因子に応じて選択される。試験を担当する医師又は獣医師であれば、一般に、治療する医学的状態の進行を予防する、阻止する若しくは停止させる為に必要な対象物質を担うベクター又は運搬内の有効量を容易に決定し、処方するだろう。
【０１０１】
上記医薬組成物の一つは、０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％の有効成分を含み得る。
【０１０２】
一例として、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるベクター又は運搬体の経口投与用量は、指示される作用目的で使用するとき、経口経路で約０．０５〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０及び１，０００．０ｍｇの有効成分を含む錠剤の形態で投与される。少なくとも一つの対象物質を担うベクター又は運搬体の有効血漿レベルは、１日当り０．００２ｍｇ−５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。
【０１０３】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体は、１日１回の用量で投与しても良いし、１日当たりの合計量を１日２回、３回又は４回用量に分けて投与しても良い。
【０１０４】
特定の適用に当たっては本発明は、本発明による少なくとも一つのベクター、運搬体及び／又は細胞によって構成されるか、又はこれらを含む、in vitroで使用する為の診断薬に関するものである。この様な診断薬は、in vivoで使用することもできる。
【０１０５】
従って、本発明は、上記診断薬を含む診断キットも対象とするものである。より詳細には上記診断キットは、一又はそれ以上の容器中に、予め定められた量の本発明組成物を含んでいる。
【０１０６】
同様に本発明によるアミノ酸配列、若しくは上記アミノ酸配列を含むベクター及び／又は運搬体、或いは当該ベクターを用いてトランスフェクションされる細胞は、予防目的で、例えば非制限的に、ウイルス感染、転移、細胞のアポトーシス（変性性疾患、組織虚血…）の予防目的で、或いは治療目的で、例えば感染症（ウイルス、細菌…）、癌及び血管新生性疾患の治療目的で、in vivoで使用され得る。
【０１０７】
本発明の他の利点及び特徴は、添付の図面を参照して、下記の実施例によって明らかになるだろう。
【０１０８】
Ｉ−実験材料及び方法
１）細胞系
ａ）正常細胞：
−ＰｔＫ２、カンガルーラット腎線維芽細胞
−３Ｔ３、マウス胚線維芽細胞
−ＨＵＶＥＣ、ヒト内皮細胞
−ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣細胞
−ＨＵＶＥＣ、細胞増殖遺伝子によってトランスフェクションした内皮細胞
−ＣＨＯ、ハムスター腎細胞
−ＣＨＯ−７４５、キシロシルトランスフェラーゼ合成欠損のＣＨＯ系統細胞
ｂ）腫瘍細胞：
−Ｈ１２９９、ヒト肺癌
−ＨＨ９、増殖因子をコードする遺伝子によってトランスフェクションしたヒト乳房腫瘍上皮細胞
−ＭＣＦ７、ヒト腫瘍上皮細胞
−ｒａｓ  ＭＣＦ７、ｒａｓ遺伝子によってトランスフェクションしたＭＣＦ７細胞
−ＨｅＬａ、ヒト子宮頸癌
−ＨＣＴ１１６、ヒト結腸癌
−ＨＴ−２９、ヒト結腸腺癌
−ＬＳ１７４Ｔ、ヒト結腸腺癌
−Ｂ１６−Ｆ１０、マウス黒色腫細胞
−Ｄａｕｄｉ、ヒトバーキットリンパ腫
ｃ）細胞培養：
−２％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（完全培地）中、５％ＣＯ2の存在下に３７℃で細胞を培養した。−ＣＨＯ及びＣＨＯ−７４５細胞は、２％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び６％ウシ胎児血清を含むαＭＥＭ培地（完全培地）中、５％ＣＯ2の存在下に３７℃で培養した。
【０１０９】
２）ペプチドの調製
ａ）化学合成
当業者に既知の手法に従い、（Ａｌｔｅｒｇｅｎ  ａｎｄ  Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ）ペプチド合成を行った。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ樹脂上の固相で実施した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で開裂させ、ペプチドを半分採取してＨＰＬＣ−ＣＲ  Ｃ５カラムで精製し、０．１％ＴＦＡ溶液及びＴＦＡ中アセトニトリルの勾配（１０−７０％）にかけて溶出した。凍結乾燥したペプチドを０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解した。
【０１１０】
ｂ）本発明のペプチドを含むタンパク質の調製を可能にする分子の構築
分子生物学的手法により、一旦、適切な細胞内に導入すると、ベクター化された高分子の合成が可能なプラスミドを構築することができる。
−組換えタンパク質の発現ベクターの構築：
添付の図１０は、本発明のペプチド配列を含む組換えタンパク質の発現が可能なベクターの調製法を示す。原核生物ｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）は、６ＸＨｉｓ配列との融合タンパク質（又は組換えタンパク質）の形態における遺伝子発現を可能にする。このベクターは、ＣｏｌＥｌ複製起点、ＩＰＴＧによって誘導されるＴ５ファージの強力なプロモーター、アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子及び６ＸＨｉｓ配列の相補的ＤＮＡのクローン化を可能にする、６ＸＨｉｓ標識をコードする配列の３’側のマルチクローニングサイトを担っている。
【０１１１】
６３ｍｅｒの相補的オリゴヌクレオチド：
・ＰＡＶ１Ｕ：
5' gatccgtaaaacgaggactaaaactacgacacgtacgaccacgagtaacacgaatggacgtaa3'
ＰＡＶ１Ｌ：
5' gatcttacgtccattcgtgttactcgtggtcgtacgtgtcgtagttttagtcctcgttttacg 3'をハイブリダイズした。得られたＤＮＡセグメントは、５’側にＢａｍＨＩ部位及び３’側にＢｇｌＩＩ部位を有していた。このセグメントはペプチド配列ＰＡＶ１：ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶをコードする。この断片をｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ部位でクローン化した。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のシマウマウイルスタンパク質（ＢＺＬＦ１）又は３５アミノ酸の核局在ドメインを欠失したシマウマタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＰＣＲによって得た。これらをＨｉｓ−ＰＡＶ１又はｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ部位でクローン化した。生じたプラスミドは、大腸菌の形質転換後Ｈｉｓ6−シマウマ−ＰＡＶ１、Ｈｉｓ6−シマウマΔｎｌｓ−ＰＡＶ１、Ｈｉｓ6−シマウマ及びＨｉｓ6−シマウマΔｎｌｓ組換えタンパク質の発現を可能にする。
【０１１２】
−組換えタンパク質の誘導、抽出及び精製
４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したルリアベルタニ培地中の指数増殖期の菌培養物に、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、３７℃で組換えタンパク質の産生を誘導した。ＩＰＴＧの添加から１２時間後、菌を５７００ｇで１５分間遠心分離にかけた。得られた沈殿物を５溶の変性溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐH７．８；０．５Ｍ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；６Ｍグアニジン−ＨＣｌ）に加えた。ゆっくり攪拌しながら外気温度で２０分間インキュベーションした後、得られた溶解物を４℃、１５０００ｇで３０分間遠心分離にかけて清澄化した。組換えタンパク質を含む上清を−８０℃で保存した。
【０１１３】
組換えタンパク質６ＸＨｉｓを、予め変性溶解緩衝液で平衡化させた「ＴＡＬＯＮ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）樹脂カラムでのアフィニティークロマトグラフィーで精製した。１０ｍＭイミダゾールを含む変性溶解緩衝液１０溶で樹脂を連続して３回洗浄した後、カラムに結合した組換えタンパク質を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐH７．８；０．５Ｍ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ緩衝液中、グアニジン−ＨＣｌの６Ｍから０Ｍまでの勾配にかけて精製した。イミダゾールｐＨ８．０の２０ｍＭから１Ｍまでの勾配によって組換えタンパク質を溶出した。種々の溶出物を１２％変性ＳＤＳ−アクリルアミドゲルで分析した。精製タンパク質を含む分画を収集し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐH７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液に対して４℃で２時間透析した。タンパク質を濃縮し、アリコートに分けて液体窒素中で速やかに冷凍し、−８０℃で保存した。
【０１１４】
３）使用したペプチド
ａ）非官能基化ペプチド
以下の配列（配列番号１−配列番号４８）をＳＴ−２５規格に従って付属物にリストする。
【０１１５】
配列番号１。以下ＨＢＰ１とも称される。ヘパリンと反応し、ヒトリポタンパク質Ｂのアミノ酸配列（３３５８−３３７２）に由来するペプチド（１２）。
【０１１６】
配列番号２。以下（ＨＢＰ１）２とも称される、配列番号１の二量体ヘパリンと反応するペプチド。
【０１１７】
配列番号３。以下（ＨＢＰ１）３とも称される、配列番号１の三量体ヘパリンと反応するペプチド。
【０１１８】
配列番号４。マウス抗ＤＮＡモノクローナル抗体Ｆ４．１の超可変領域ＣＤＲ３に対応するペプチド（１３）。
【０１１９】
配列番号５。配列番号１及び配列番号４を含むペプチド。
【０１２０】
配列番号６。マウスモノクローナル抗体Ｆ４．１のＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域の一部を含むペプチド（１３）。
【０１２１】
配列番号７。配列番号１及び配列番号６を含むペプチド。
【０１２２】
配列番号８。ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴＴ７９の超可変領域ＣＤＲ３に対応するペプチド（１４）。
【０１２３】
配列番号９。配列番号１及び配列番号８を含むペプチド。
【０１２４】
配列番号１０。以下Ｎｏ．１０４７とも称される。ヘパリンと反応し、配列番号１及びヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−１の超可変領域ＣＤＲ３に対応するペプチドの配列を含むペプチド（１５）。
【０１２５】
配列番号１１。配列番号１及びヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴ７２の超可変領域ＣＤＲ３に対応するペプチドの配列を含むペプチド（１６）。
【０１２６】
配列番号１２。３Ｔ３細胞のＮＬＳ（核局在シグナル）配列及び配列番号６を含むペプチド。
【０１２７】
配列番号１３。配列番号１及びヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−１のＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域の配列を含むペプチド。
【０１２８】
配列番号１４。マウスモノクローナル抗体Ｆ４．１のＣＤＲ３領域の一部及び配列番号６を含むペプチド。
【０１２９】
配列番号１５。ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−１の超過片領域ＣＤＲ３に対応するペプチドの配列を２回含むペプチド。
【０１３０】
配列番号１６。配列番号１５中、１３−１９位に配列番号１を含むことから生じるペプチド。
【０１３１】
配列番号１７。ＨＢＰ４とも称される。ヒトリポタンパク質Ｅのアミノ酸配列から誘導される、ヘパリンと反応するペプチド（１２）。
【０１３２】
配列番号１８。神経筋接合部の分化を調節する細胞外基質タンパク質、アグリン（ａｇｒｉｎｅ）（１７）のアミノ酸配列から誘導され、ヘパリンと反応するペプチド。
【０１３３】
配列番号１９。配列番号１８の二量体。
【０１３４】
配列番号２０。「インスリン増殖因子結合タンパク質」のアミノ酸配列から誘導される、ヘパリンと反応するペプチド（１８）。
【０１３５】
配列番号２１。ＨＢＰ６とも称される。血小板増殖因子のＡ鎖のＣ末端部分のアミノ酸配列から誘導される、ヘパリンと反応するペプチド（１９）。
【０１３６】
配列番号２２。１２個のリシン（Ｋ）及び配列番号６を含むペプチド。
【０１３７】
配列番号２３。１２個のリシン（Ｋ）及び配列番号５を含むペプチド。
【０１３８】
配列番号２４。抗菌作用を有するペプチド（２９）。
【０１３９】
配列番号２５。以下ＨＢＰ２とも称される。ヘパリンと反応し、「インスリン様増殖因子結合タンパク質」の配列に対応するペプチド（１８）。
【０１４０】
配列番号２６。以下（ＨＢＰ３）2とも称される。ヘパリンと反応する、ヒトスーパーオキシドジスムターゼの配列のＣ末端部分から誘導されるペプチドの二量体ペプチド（２０）。
【０１４１】
配列番号２７。ヘパリンと反応し、アミノ酸がＤ立体配置にある配列番号２６の配列に対応するペプチド。
【０１４２】
配列番号２８。その配列が配列番号２６の配列から誘導され、αｖインテグリンに選択的に結合するＲＧＤモチーフを含む、ヘパリンと反応するペプチド（２１）。
【０１４３】
配列番号２９。以下ＨＢＰ１−ＨＢＰ４とも称される。ヘパリンと反応し、配列番号１及び配列番号１７のペプチドで構成されるペプチド。
【０１４４】
配列番号３０。以下ＨＢＰ７とも称される。ヘパリンと反応し、表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の配列のＣ末端部分から誘導されるペプチド（２２）。
【０１４５】
配列番号３１。ヘパリンと反応し、その配列が、アミノ酸が表裏の位置にある配列番号１２であるペプチド。
【０１４６】
配列番号３２。ヘパリンと反応し、アミノ酸がＤ立体配置にある配列番号３０の配列に対応するペプチド。
【０１４７】
配列番号３３。以下ＨＢＰ８とも称される。ヘパリンと反応し、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）の配列の一部を含むペプチド（６）。
【０１４８】
配列番号３４。以下ＨＢＰ９とも称される。ヘパリンと反応し、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の配列の一部を含むペプチド（２３）。
【０１４９】
配列番号３５。以下ＨＢＰ１０とも称される。ヘパリンと反応し、腸粘素の配列のＣ末端部分に対応するペプチド（２４）。
【０１５０】
配列番号３６。以下ＨＢＰ１１とも称される。ヘパリンと反応し、ヒトインターフェロンγのＣ末端配列の一部を含むペプチド（２５）。
【０１５１】
配列番号３７。以下ＨＢＰ１２とも称される。ヘパリンと反応し、ヒトインターロイキン１２のサブユニットｐ４０の配列の一部を含むペプチド（２６）。
【０１５２】
配列番号３８。以下ＨＢＰ１３とも称される。ヘパリンと反応し、間質細胞から誘導される１α因子の配列の一部を含むペプチド（２７）。
【０１５３】
配列番号３９。以下ＨＢＰ１５とも称される。ヘパリンと反応し、「ヘパリン結合たんぱく質」（ＣＡＰ３７）の配列の一部を含むペプチド（２８）。
【０１５４】
配列番号４０。Ｎ末端に１３個のリシンが付加された配列番号１０（１０４７）の配列のペプチドに対応する、ヘパリンと反応するペプチド。
【０１５５】
配列番号４１。Ｎ末端に１３個のリシンが付加された配列番号２８（（ＨＢＰ３）２）の配列のペプチドに対応する、ヘパリンと反応するペプチド。
【０１５６】
配列番号４２。Ｎ末端に１３個のリシンが付加された配列番号３９（ＨＢＰ１０）の配列のペプチドに対応する、ヘパリンと反応するペプチド。
【０１５７】
配列番号４３。抗菌作用を有し、配列番号１０（１０４７）及び配列番号２４の配列のペプチドを含むペプチド。
【０１５８】
配列番号４４。抗菌作用を有し、配列番号２４及び配列番号３０（ＨＢＰ７）の配列のペプチドを含むペプチド。
【０１５９】
配列番号４５。抗菌作用を有し、配列番号２４及び配列番号３８（ＨＢＰ１３）の配列のペプチドを含むペプチド。
【０１６０】
配列番号４６。Ｎ末端にグリシン−フタロイルが付加された配列番号２６（ＨＢＰ３）2の配列のペプチドを含むペプチド。
【０１６１】
配列番号４７。Ｎ末端にサリチリルモチーフが付加された配列番号２１（ＨＢＰ６）の配列のペプチドを含むペプチド。
【０１６２】
配列番号４８。Ｃ末端にサリチリルモチーフが付加された配列番号２１（ＨＢＰ６）の配列のペプチドを含むペプチド。
【０１６３】
ｂ）官能基化されたペプチド
これらのペプチドは上記の配列番号１〜４８に対応するが、Ｎ末端側に、対象物質への共有結合を可能にする１個のシステイン（下記参照）若しくはストレプトアビジン又はペルオキシダーゼに複合したアビジンとペプチドの非共有結合を可能にするビオチン（下記の（１）及び（２）参照）を担っている。
【０１６４】
ＩＩ−ペプチドの侵入機序
１）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の関与
ペプチドは、全ての真核細胞の膜上に存在するＧＡＧを介したエンドサイトーシスによって細胞内に侵入する。ペプチドの侵入におけるこれらの役割を調べる為、以下の試験を行なった。
【０１６５】
ａ）ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）を細胞と共に１時間インキュベーションした後、０．２μｇ／ｍｌのペプチド−ペルオキシダーゼ複合体を２時間にわたって加えた。次に細胞を溶解し、ペルオキシダーゼを定量した。
【０１６６】
５０μｇ／ｍｌのヘパリンは、Ｈ１２９９及びＨｅＬａ細胞において全てのペプチドのインターナリゼーションを完全に阻害した。
【０１６７】
これら２つの細胞型について、ペルオキシダーゼに結合したペプチドの侵入の５０％を阻害する為に必要なヘパリンの量を、漸増濃度のヘパリンとペプチド−ペルオキシダーゼ複合体と共に細胞をインキュベーションして評価した。下記表２に、ペプチドのインターナリゼーション阻害結果をヘパリンの濃度（μｇ／ｍｌ）で示す。
【０１６８】
【表２】
0004912556.tif 000004
【０１６９】
これらの実験により、ペプチドの侵入における硫酸ヘパリンの役割が明らかになった。
【０１７０】
ｂ）ＣＨＯ−７４５細胞をＣＨＯ細胞から誘導した。これらは、膜のコンドロイチン硫酸及びヘパランの形成に関与するキシロシルトランスフェラーゼを欠損している。ペプチド−アビジンペルオキシダーゼ複合体は、試験したペプチドに関わりなく、ＣＨＯ−７４５細胞内には侵入しない。
【０１７１】
このことは、ペプチドの侵入における細胞膜のコンドロイチンヘパラン硫酸が重要であることを示している。
【０１７２】
２）細胞代謝の関与
細胞内に侵入するペプチドの生物学的機序及びこれらの分画を理解する為に、或る細胞画分への作用が特異的な薬剤を用いて実験を行った。ペプチド−ペルオキシダーゼを０．２μｇ／ｍｌ濃度のＨ１２９９細胞と共に薬剤の存在下又は不存在下でインキュベーションした。細胞を溶解し、細胞溶解産物中のペルオキシダーゼを定量した。
【０１７３】
下記表３に、薬剤なしでインキュベーションした細胞溶解産物に基づいて得られた数値と対比させることにより算出した、ペプチドのインターナリゼーション阻害率を示す。
【０１７４】
【表３】
0004912556.tif 000005
【０１７５】
試験に用いたペプチドの侵入は、全てのペプチドにおいて、細胞を４℃でインキュベーションすると完全に阻止された。ペプチドの侵入は、アジ化ナトリウム（ＡＴＰａｓｅ阻害因子）、ゲニステイン（チロシンキナーゼ及びＡＴＰへの結合の阻害因子）等の細胞代謝阻害因子によって一部阻害された。従って、インターナリゼーションの機序はエネルギーに依存することが分かる。
【０１７６】
ペプチドＨＢＰ３及びＨＢＰ７の侵入は、クロロキンにより、同程度に阻害されるが、これは、同じ画分（エンドソーム小胞、小胞体）への細胞質のインターナリゼーションを反映しているのに対し、塩素酸ナトリウム及び塩化アンモニウム（細胞内輸送を妨げるエンドソーム小胞の酸性化を回避する）では、配列番号３５のペプチドのインターナリゼーションに対し、遥かに低い割合しか作用しなかった。このことは、上記ペプチドは、種々の毒素が作用するのと同様の機序によるが毒性を発揮すること無く、細胞内に侵入することを示唆している。ゴルジ体までの細胞内経路及び逆行輸送は、ペプチドによって異なるものと思われる。
【０１７７】
ＩＩＩ．結果
ＤＮＡ及びヘパリンと反応するペプチド能の評価
ＤＮＡ上及びヘパリン上への、ペプチド配列番号１〜２１の固定能を、ＤＮＡまたはヘパリンで感作したＥＬＩＳＡプレート上で評価する。ビオチニル化ペプチドの希釈液を上記プレート上に置き、ペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンを用いてその固定能を定量化する。ペルオキシダーゼ活性は、基質としてオルトジアニシジン及びＨ2Ｏ2を用いて定量する。ＤＮＡまたはヘパリンへの各ペプチドの結合活性は、５０％の固定率を得るのに必要なペプチドの量（×１０-6Ｍ）で評価する。得られた結果を下記表４に示す。
【０１７８】
【表４】
0004912556.tif 000006
【０１７９】
この表より、配列番号１のＤＮＡへの親和性は非常に低いのに対し、その二量体（配列番号２）及び三量体（配列番号３）の親和性は非常に高いことが分かる。更に配列番号１とペプチドベクターとの会合は、上記ベクターのＤＮＡへの親和性をかなり高めている様に思われる（配列番号４と５、配列番号６と７、配列番号８と９、及び配列番号１５と１６とを比較すること）。
【０１８０】
同様に配列番号１７及び配列番号１８のＤＮＡ、ヘパリン、及びコンドロイチン硫酸への親和性は非常に低い。これに対し、配列番号１８（配列番号１９）の二量体の上記分子に対する親和性は、非常に高い。配列番号２０及び２１は非常に多数のアミノ酸を含んでおり、そのうち多数の塩基性アミノ酸が、ＤＮＡ、ヘパリン、及びコンドロイチン硫酸に対して優れた親和性を有している。
【０１８１】
様々なプロテオグリカン（Ｋｄ×１０-9Ｍ）、ヘパリン、及びコンドロイチン硫酸に対するペプチド配列番号２５〜３９の結合活性を、様々な抗原上で５０％固定率を得るのに必要なペプチド量で評価する。これらの結果を下記表５に示す。
【０１８２】
【表５】
0004912556.tif 000007
【０１８３】
この表より、ヘパリンへのペプチド配列番号３３（ＨＢＰ８）、３６（ＨＢＰ１１）、及び３７（ＨＢＰ１２）の親和性は、親和性が平均で２０〜８０×１０-9Ｍである他のペプチドに比べて明らかに低い（＞１００×１０-9Ｍ）ことが分かる。コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、及びＣとの様々なペプチドの結合活性は、ヘパリンへの結合活性と概ね同程度である。従って、ペプチド配列番号３４（ＨＢＰ９）及び配列番号３８（ＨＢＰ１３）の結合活性は、ヘパリンに対しても三種のコンドロイチンに対しても４６〜５０×１０-9Ｍであるが、一方、ペプチド配列番号３３（ＨＢＰ８）、３６（ＨＢＰ１１）、及び３７（ＨＢＰ１２）の結合活性は、ヘパリンに対しても三種のコンドロイチンに対しても＞１００×１０-9Ｍである。修飾ペプチド配列番号２８（ＨＢＰ３＋ＲＧＤ）では、ヘパリンへの結合活性が消失している。
【０１８４】
２）細胞内へのペプチドの浸透性評価
Ｎ−末端にビオチンを有する様々なペプチドの存在下に、培養培地中の濃度を漸減させて（５０〜６μｇ／ｍｌ）種々の時間（１〜１８時間）、細胞を培養する。
【０１８５】
培養終了後、上記細胞を、ＰＢＳ（０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐH７．４で緩衝させた０．１５ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した後、エタノール中にて−２０℃で１５分間固定する。ペプチドの浸透性は、ペルオキシドに接合されたストレプトアビジンと３０分間培養させた後、評価する（ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをＳ−ＰＯと略す）。次いで、このＳ−ＰＯを除去し、上記細胞を洗浄する。内部化されたペルオキシダーゼの活性をＨ2Ｏ2の存在下、ジアミノベンジジンで定量し、上記細胞を顕微鏡で検査する（３０）。
【０１８６】
顕微鏡検査により、使用したペプチドの幾つか（配列番号１、４、１１、１２、１７、及び１８）は、細胞内細胞化学検査上、陽性染色が見られないことが分かった。その他のペプチドを用いた場合、陽性染色が認められたが、多様な強度を有していた。配列番号２、６、８、及び１９では、弱い着色が観察されたが、その他のペプチドでは、染色が強く認められた。
【０１８７】
配列番号１を含む全てのペプチド、即ち、ヒトリポタンパク質ＢのＰＬＨでは、配列  番号１それ自体（単量体）及び配列番号１１を除いて陽性染色が見られたことは注目に値し、興味深い。
【０１８８】
配列番号１、１７及び１８においては、リポタンパク質Ｂ及びヒトリポタンパク質ＥのＰＬＨに対応する短いペプチド、及びアグリンが挙げられる。前述した単量体ペプチドとは異なり、これらの二量体（配列番号２）、特に配列番号１の三量体（配列番号３）は、明らかな陽性染色が認められた。
【０１８９】
配列番号１１の場合、これは、配列番号１と、単一の塩基性アミノ酸（Ｋ）しか含まない（生殖系列によってコードされた）抗ＤＮＡ  ＲＴ７２ヒトモノクローナル抗体のＣＤＲ３とから構成されている。配列番号１１とは異なり、配列番号１と、（生殖系列によってコードされた）抗ＤＮＡモノクローナル抗体のＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３とから構成される配列番号５、７、９、及び１０は、多数の塩基性アミノ酸を含んでおり、強い染色が認められる。
【０１９０】
一方、上記結果により導かれる事項は、ペプチドが細胞内部に浸透し得る様になるには、最低で３〜５個の過剰塩基性アミノ酸がペプチド配列内に存在しなけばならないということである。他方で、配列番号１の場合、これらが多数の塩基性アミノ酸を有するときでなければ、抗ＤＮＡ  ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３のトランスロケーション能を高めることはできないということである。
【０１９１】
顕微鏡検査により、全てのペプチド配列番号２５〜４８は、ペプチドによって様々な強度を有しているが、６μｇ／ｍｌの濃度では細胞化学上、陽性染色が認められることが分かった。
【０１９２】
３）ペルオキシダーゼに共役されたペプチド／ストレプトアビジン複合体若しくはペプチド／アビジン複合体、またはペプチド／ペルオキシダーゼ接合体の細胞内への浸透性評価
ａ）以下に示す二つの方法に従い、ビオチニル化ペプチド／Ｓ−ＰＯまたはビオチニル化ペプチド／Ａ−ＰＯ（Ａ−ＰＯはアビジン−ペルオキシダーゼの省略形である）複合体を用時調製する。
【０１９３】
−ペプチド：Ｓ−ＰＯまたはＡ−ＰＯをモル比４：１の比率で（例えば１０μｇのＳ−ＰＯに対して分子量３５００のペプチド１．４μｇ；使用するＳ−ＰＯの重量は、分子量が異なる為、ペプチドによって様々である）；
−或いはペプチド：Ｓ−ＰＯまたはＡ−ＰＯをモル比２５：１の比率で（例えば１μｇのＳ−ＰＯに対して分子量３５００のペプチド１．７μｇ）。
【０１９４】
これらの複合体は、５〜１０μｌの容積下、ＰＢＳ中Ｓ−ＰＯまたはＡ−ＰＯとビオチニル化ペプチドとを実験室温度で１５分間培養して調製する。次いで、これらを完全培養培地１ｍｌ中に希釈し、０．２ミクロンの膜上で濾過し、上記細胞と４時間培養する。次に、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄する。
【０１９５】
上記複合体の浸透性を顕微鏡で評価する目的で、上記細胞を、前述した様にエタノール中にて２０℃で１５分間固定した後、ＰＢＳで洗浄し、内部化されたペルオキシダーゼの活性を、Ｈ2Ｏ2の存在下ジアミノベンジジンで定量する。
【０１９６】
内部化されたペプチド／Ｓ−ＰＯまたはＡ−ＰＯ複合体の量を測定する為、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらを２回遠心分離した後、得られる沈殿物を、溶解緩衝液（トリス緩衝液、０．１Ｍ、ｐH８、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ）２００μｌ中に懸濁させる。１５分後、溶解緩衝液中に含まれているペルオキシダーゼを、Ｓ−ＰＯの標準曲線と対比させ、オルト−ジアニシジン及びＨ2Ｏ2を用いて９６ウエルプレート上で秤量する。読取は４５０ｎｍで行なう。様々な試料中に含まれる量は、１０4細胞に対するピコグラム（ｐｇ）で表わされる。
【０１９７】
一般に、光学顕微鏡で細胞を検査して得られる結果は、内部化されたペルオキシダーゼを測定して得られる結果と良好な相関関係にある。この理由により、以下の記載においては、幾つかのペプチドを用いて得られた定量結果のみを、表６及び７、並びに図１〜３に示す。
【０１９８】
表６に、４：１のペプチド：Ｓ−ＰＯ複合体及び１μｇのペプチド濃度で処理したときにおける、様々なタンパク質から生じる種々のＰＬＨで構成されるペプチドの、Ｈ１２９９細胞内への浸透能の結果を示す。
【０１９９】
【表６】
0004912556.tif 000008
【０２００】
これらの結果により、ベクターがＳ−ＰＯ複合体（分子量＝１００，０００）の細胞内移動で有効である為には、最低で６個の塩基性アミノ酸が存在しなければならないことが明瞭に読取れる（配列番号２、３、１９〜２１）。
【０２０１】
下記表７に、配列番号１と共役されたペプチドのＨ１２９９細胞内への浸透性に及ぼす配列番号１の影響を評価した結果を示す。
【０２０２】
ここで、
濃度ａ：１個のＳ−ＰＯ分子（１μｇ）に対して２５ペプチド、
濃度ｂ：１個のＳ−ＰＯ分子（１０μｇ）に対して４ペプチド。
【０２０３】
【表７】
0004912556.tif 000009
【０２０４】
表７より、配列番号１とヒトまたはネズミ抗ＤＮＡ抗体に由来するペプチドベクターとの共役は、上記ベクターのトランスロケーション能をかなり高めることが分かる。
【０２０５】
図１は、濃度ａ（０．０２ｎモルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼに対する０．５ｎモルのビオチニル化ペプチド）において、３７℃で一晩ビオチニル化された様々なペプチドによって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの内部化を示す棒グラフである。
【０２０６】
上記図１より明らかな様に、配列番号１と或る一定のベクター（配列番号６）との共役は配列番号７に到達するが、これは、上記ベクターの転移能が有意に上昇することを示している。しかしながら、配列番号１と同じ長さを有しており、且つ、アミノ酸組成が近似するペプチドと、上記と同じベクター（配列番号６）との共役は、配列番号１２に到達するが、これは、当該ベクターのトランスロケーション能を殆ど上昇させない。上記配列番号６に対する同一の第二ＣＤＲ３の共役は、配列番号１４に到達するが、これは、配列番号１との共役ほど、高い増加が得られない。一般に配列番号１のヒト起源ベクター（配列番号１０及び１３）またはネズミ起源ベクター（配列番号５）への会合により、特に有効なベクターが得られる。
【０２０７】
図２は、濃度ｂ（０．０１ｎモルのＳ−ＰＯまたはＡ−ＰＯに対して０．２５ｎモルのビオチニル化ペプチド）における、様々なビオチニル化ペプチド（３７℃で２時間）によって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓ−ＰＯ）及びアビジン−ペルオキシダーゼ（Ａ−ＰＯ）の内部化を示す棒グラフである。
【０２０８】
図３は、濃度ｂ（０．０１ｎモルのＳ−ＰＯまたはＡ−ＰＯに対して０．２５ｎモルのビオチニル化ペプチド）にて３７℃２時間、上記と同じビオチニル化ペプチドによるＳ−ＰＯの内部化と、Ａ−ＰＯの内部化との関係を示す棒グラフである。
【０２０９】
図２及び３により、上記ベクターによるＳ−ＰＯ及びＡ−ＰＯの転移を比較すると、転移される物質の性質は、ヒト起源のＰＬＨを含むベクター（配列番号７、１０、及び１３）の場合に比べて、全部がネズミ起源であるベクター（配列番号１４）のトランスロケーション能に重大な影響を及ぼすことを示唆している。
【０２１０】
図４は、３７℃で２時間、４℃で２時間ビオチニル化された２つのペプチドによって輸送されたＳ−ＰＯの内部化の関係を示す棒グラフである。
【０２１１】
上記結果により、ヒト起源ベクター（配列番号１０）のトランスロケーション能は、ネズミ起源ベクター（配列番号１４）の場合に比べて、温度（細胞の活性代謝）に大きく依存することを示している。
【０２１２】
ｂ）アビジン−ペルオキシダーゼのバイアスを防ぐことによってペプチドの浸透性をより直接的に評価する目的で、配列番号２５〜４８のペプチドの幾つかを、システインを介してペプチドのＣ−末端でペルオキシダーゼに共有結合させた。
【０２１３】
ペプチドとペルオキシダーゼとの共役は、以下の様に行なった。
【０２１４】
０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸ナトリウム緩衝液１００μｌ中マレイミド（Ｓｉｇｍａ）で活性化されたペルオキシダーゼ１ｍｇ中に、ペプチド１ｍｇを添加する。実験室温度で２時間経過後、β−メルカプトエタノールを、１．５ｍＭの最終濃度まで１５分間添加する。共役されていないペプチドは、限外濾過膜（切断閾値＝３０，０００ダルトン、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中で３回洗浄することにより除去する。
【０２１５】
これらの接合体とＨ１２９９細胞を、培養培地中ペプチド−ペルオキシダーゼの漸増濃度にて２時間培養した後、ＰＢＳで洗浄する。これらの細胞を溶解し、内部化されたペプチドの量を、ペプチド−ペルオキシダーゼを用いて作成された曲線を参照して、細胞溶解産物中でのペルオキシダーゼを定量することによって評価する。
【０２１６】
下記表８に、培養培地中の接合濃度に従って内部化されたペプチドの量（ｐｇ／１０3細胞）を示す。
【０２１７】
【表８】
0004912556.tif 000010
【０２１８】
培養培地中のペプチド−ペルオキシダーゼ接合体の濃度が高くなればなるほど、内部化された量が多くなることが示唆される。
【０２１９】
細胞型による接合体の浸透性を比較する為、様々な系列の細胞を０．２μｇ／ｍｌペプチド−ペルオキシダーゼ接合体と２時間培養させ、細胞溶解産物中のペルオキシダーゼ量を測定した。以下の表９及び表９の２に、測定結果をｐｇ／１０3細胞で表わす。様々な細胞系列で内部化された各ペプチドの量は、一般的に倍しか違わない。
【０２２０】
立体配置ＤにおけるペプチドＨＢＰ３（配列番号２６）及びＨＢＰ７（配列番号３２）の内部化は、立体配置Ｌにおける相同性ペプチドのものと同程度の大きさを有している。裏表の位置にアミノ酸配列を有する、配列番号３０のペプチド及び配列番号３１の同族体の場合も同様である。
【０２２１】
【表９】
0004912556.tif 000011
【０２２２】
【表９−２】
0004912556.tif 000012
【０２２３】
４）細胞内へのペプチド−ＩｇＧ接合体の浸透性評価
０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７中のモノクローナルＩｇＧ抗体またはその断片Ｆ（ａｂ’）2２ｍｇに、ジメチルスルホキシド１０μｌ中のＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート］２００μｇを添加し、この溶液を、実験室温度で３０分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜［切断閾値＝１０，０００ダルトン（Ｄａ）、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ］上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で３回洗浄することによって除去する。
【０２２４】
次いでペプチドとの共役を、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で、ＩｇＧ１モルに対してペプチド６モルの比率にて実験室温度で３時間行なう。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程において記載した様に膜上で遠心分離して除去する。
【０２２５】
接合体の浸透性を顕微鏡で評価する為に、これらの細胞を培養培地中での漸減濃度（５０〜６μｇ／ｍｌ）で、様々な抗体−ペプチド接合体の存在下に３７℃で４時間培養する。
【０２２６】
培養終了後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、エタノール中にて２０℃で１５分間固定する。ＩｇＧ−ペプチド接合体の浸透性は、ペルオキシダーゼに共役されたマウスの抗ＩｇＧ抗体と１時間培養させた後に評価する。次いで上記細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｈ2Ｏ2の存在下、ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジジンで定量する。
【０２２７】
内部化されたペプチド−ＩｇＧ接合体の量を測定する為に、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらを遠心分離によって２回洗浄し、得られた沈殿物を、溶解緩衝液（トリス緩衝液、０．１Ｍ、ｐH８、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ４０）２００μｌ中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するマウスＩｇＧの量を、ペプチドに接合された同じモノクローナル抗体を用いて作成された標準曲線を参照して、マウス抗ＩｇＧヒツジ抗体を塗布したプレート上のＥＬＩＳＡによって測定し、ペルオキシダーゼと共役されたマウス抗ＩｇＧヒツジ抗体接合体で定量する。
【０２２８】
これらの結果を表１０に再編集する。この表は、ヒトＨ１２９９細胞内部へのネズミモノクローナル抗体またはこれらの断片Ｆ（ａｂ’）2の浸透性を示している。ここで、
ａ：タンパク質ｐ５３の特異的ネズミモノクローナル抗体、及び
ｂ：ラット−ラットハイブリドーマに由来するタンパク質ｐ２１の特異的ネズミモノクローナル抗体。
【０２２９】
【表１０】
0004912556.tif 000013
【０２３０】
この表から明らかな様に、配列番号１と会合されたヒト起源ベクターを使用することにより、ヒト細胞内での抗体を効果的に内部化させることが可能になる。同様に、ベクターが抗体全体にではなくＦ（ａｂ’）2に接合されているときには、より多量の抗体が細胞内に転移されることにも注目すべきである。
【０２３１】
図５は、ヒトＨ１２９９細胞及びハムスターの卵巣ＣＨＯ細胞上で様々なペプチドと共役されたネズミＩｇＧ1モノクローナル抗体の内部化（３７℃で４時間；３０μｇ／ｍｌ配置接合体）を示す棒グラフである。
【０２３２】
このグラフから明らかな様に、ヒト起源のベクター（配列番号１０及び１３）は、配列番号１と共役されたネズミ起源のベクター（配列番号７及び５）に比べ、ヒト細胞内部への物質の転移に対し、より効率的である。更にはヒト起源ベクター（配列番号１０及び１３）は、ハムスター細胞内部よりも、ヒト細胞内部への物質の転移に対し、より有効である。
【０２３３】
５）免疫蛍光法による組換えタンパク質の細胞内浸透性評価
ヒーラ細胞を、各々滅菌ラメラが入っている２４ウエルプレート中に、０．５×１０4細胞の濃度で植付ける。２４時間後、これらの細胞上に５０μｇ／ｍｌ組換えタンパク質を配置する。６時間後または１８時間後、これらの細胞をＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩水）中で２回洗浄し、外気温度で１０分間、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）溶液で固定するか、またはトリプシンで解離させ、ラメラ上で再び１８時間培養した後、固定する。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、これらの細胞を、周囲温度で５分間、ＰＢＳ中０．２５％トリトンＸ−１００溶液で透過性を付与する。ＰＳＢ中で５分間の洗浄を３回行なった後、これらの細胞を、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で１／５０倍に希釈した抗ＲＧＳ．Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）モノクローナル抗体と、湿室にて周囲温度で１時間培養する。ＰＢＳ中で１０分間洗浄する工程を３回行なった後、上記ラメラを、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで１／２００倍に希釈したＦＩＴＣ接合抗マウスＩｇＧヤギ抗血清と、湿室下、周囲温度で３０分間培養する。これらの細胞を、ＰＢＳ中で１０分間洗浄する操作を２回行なった後、スライド用調製液（Ｓｉｇｍａ製スライド作製培地）を用いて、ラメラをブレード上に取り付ける。上記細胞を、共焦顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で観察する。
【０２３４】
ヒーラ細胞を、Ｈｉｓ6−Ｚｅｂｒａ−ＰＡＶ１組変えタンパク質と１８時間培養し、固定するか（図１７Ａ）または解離し、固定前に１８時間再び培養する（図１７Ｂ）。１８時間培養した細胞を共焦顕微鏡で観察すると、これらの表面に大きな蛍光を示すことが明らかになった。この実験では、細胞内蛍光は全く検出されない様であるが、ＤＡＰ１またはＨＯＥＣＨＳＴによる核の対比染色を行なえば、このことが確認されるであろう。低い割合のタンパク質が内部化されることも考えられない訳ではない。更には、組換えタンパク質を細胞表面に送る為には、ペプチドＰＡＶ１ユニット（ｍｏｔｉｆ）のみで充分である様に思われる。これらの細胞を解離した後、蛍光は、様々なサイズのエンドソーム小胞中に限定される。Ｈｉｓ6−Ｚｅｂｒａ−ＰＡＶ１組変えタンパク質が内部化されるが、これは、Ｚｅｂｒａタンパク質のｎｌｓドメインにもかかわらず、核である様には思われない。
【０２３５】
ヒーラ細胞を、Ｈｉｓ6−ＺｅｂｒａΔｎｌｓ−ＰＡＶ１組変えタンパク質と６時間または１８時間培養し、１８時間後固定するか（図１８Ａ及び１８Ｂ）または解離し、固定前に１８時間再び培養する（図１８Ｃ）。６時間経過後、直ちに核蛍光が観察されるが、これは１８時間目で顕著になる。矢印で示される核ゾーンは、より大きな蛍光を示す。解離細胞の場合、より顕著な蛍光は、核小体の周りに限定される。Ｈｉｓ6−Ｚｅｂｒａ−ＰＡＶ１組変えタンパク質とは異なり、ｎｌｓドメインのないＨｉｓ6−ＺｅｂｒａΔｎｌｓ−ＰＡＶ１組変えタンパク質は、核局在を有している。ＰＡＶ１配列は、このタンパク質を核に送る様に思われる。
【０２３６】
対照ヒーラ細胞（タンパク質を含まない）またはＨｉｓ6−Ｚｅｂｒａ及びＨｉｓ6−ＺｅｂｒａΔｎｌｓ組変えタンパク質と培養されたヒーラ細胞では、蛍光は観察されなかった。
【０２３７】
６）in vitroにおける、ペプチドと接合されたリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）の細胞毒性活性評価。
【０２３８】
５ｍｇのウシＲＮａｓｅ  Ａを、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７中に溶解する。
【０２３９】
１ｍｇのＳＭＣＣを、５０μｌのジメチルスルホキシド（最終溶液２０ｍｇ／ｍｌ）中に溶解する。
【０２４０】
ＲＮａｓｅ  Ａの活性化は、２００μｌのＲＮａｓｅ  Ａ溶液中のＳＭＣＣ溶液１２．５μｌを添加して行なう（モル比＝１分子のＲＮａｓｅ  Ａに対してＳＭＣＣ１０分子）。
【０２４１】
反応を、実験室温度で３０分間行なう。
【０２４２】
過剰の反応体は、限外濾過膜（切断閾値＝５，０００  Ｄａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄することによって除去する。
【０２４３】
次いでペプチドとの共役を、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中、ペプチド：ＲＮａｓｅ  Ａを６：１のモル比にて、周囲温度で３時間行なう。
【０２４４】
共役されていない過剰のペプチドを、先行工程で記載した様に遠心分離して除去する。
【０２４５】
ＲＮａｓｅ  Ａに共役されたペプチドの量は、アクリルアミド１５％含有ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で共役させた後、得られたバンドの分子量を測定することによって評価する。
【０２４６】
図６に、ＲＮａｓｅ  Ａ単独（バンド１）、及び配列番号１０と共役されたＲＮａｓｅ  Ａの電気泳動法による結果を対比して示す。この図には２つの共役試験が示されている（バンド２及び３）。
【０２４７】
図７に、同様に実施した電気泳動法の結果を示す。これにより、ＲＮａｓｅ  Ａ単独（バンド５）の泳動、及び配列番号１４単独（バンド６）の泳動、ＲＮａｓｅ  Ａと、配列番号１４（２つの試験：バンド１及び２）と、配列番号５（バンド３）と、配列番号１０（バンド４）との共役生成物の泳動を比較することができる。
【０２４８】
ヒト起源のベクター（配列番号１０、１５、及び１６）と共役されたＲＮａｓｅ  Ａを、天然ＲＮａｓｅ  Ａと比較することによって、培養中のＨＨ９細胞に対する細胞毒性活性を試験した。
【０２４９】
ａ）in vitroにおける、ＨＨ９細胞に対するＲＮａｓｅの細胞毒性活性評価
前日に、上記細胞を、１ウエル当たり１０3細胞の割合で、９６ウエルプレート中に植付ける。
【０２５０】
翌日、上澄み液を採取し、ＲＮａｓｅ  Ａ−ベクターまたは天然ＲＮａｓｅ  Ａの連続希釈液を含む１００μｌの培地に替えて、７２時間培養を続ける。
【０２５１】
次いで上記ウエルに、培養培地中１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムの臭化物）溶液５０μｌを添加し、４時間培養する。
【０２５２】
上澄み液を除去し、これらのウエルにジメチルスルホキシド１００μｌを加える。結晶を溶解した後、５５０ｎｍにおける染色を読取る。
【０２５３】
試験試料の希釈液を含む細胞ウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか含まないウエルの光学密度の結果を、パーセンテージで算出する。これらの結果を図８にグラフ化して示す。
【０２５４】
図８より明らかな様に、天然ＲＮａｓｅ  Ａは、細胞毒性活性が全く見られない。ＲＮａｓｅ  Ａの濃度３３〜１００μｇ／ｍｌ、即ち、２〜７×１０-7Ｍのモル濃度間で、５０％の平均細胞毒性が得られた。
【０２５５】
ｂ）in vitroにおける、ヒーラ細胞に対するペプチド−ＲＮａｓｅ  Ａ接合体の細胞毒性活性評価
多様な細胞系列について、様々なペプチド−ＲＮａｓｅ接合体を試験した。これらの結果をＩＣ５０で示すが、これは、７２時間培養後に細胞増殖を５０％阻害させるペプチド−ＲＮａｓｅ接合体の濃度に相当する。
【０２５６】
表１１に、得られた結果を要約する。全ての接合体で異なる細胞毒性活性が見られ、これらの幾つかは細胞毒性力を殆ど有していない様に思われる。
【０２５７】
【表１１】
0004912556.tif 000014
【０２５８】
７）in vivoにおける、無胸腺（ヌード）マウスに移植されたヒト腫瘍に対する、ペプチドと接合されたＲＮａｓｅ  Ａの細胞毒性活性評価
ａ）プロトコール１
生後６週間のメスのヌードマウスの左わき腹に、５０μｌ容積下、３×１０6ＨＨ９細胞を皮下注射した。移植後１７日目に腫瘍を測定し、マウスを下記３つのグループに分ける。グループ１（７匹のマウス）：５０μｌのＰＢＳ中配列番号１０／ＲＮａｓｅ  Ａの共役体１００μｇを注射する；グループ２（７匹のマウス）：１００μｌのＰＢＳ中５０μｇの天然ＲＮａｓｅ  Ａを注射する；グループ３（６匹のマウス）：５０μｌのＰＢＳを注射する。これらの注射を、同一条件下で１週間に３回続ける。各群における腫瘍を測定し、その容積を、式Ｖ＝４／３π×Ｌ2ｌ（Ｌ＞１）（ここで、Ｌは腫瘍の最大直径であり、ｌは腫瘍の最小直径である）に従って計算する。
【０２５９】
これらの結果を、図９にグラフ化して示す。
【０２６０】
上記図より明らかな様に、配列番号１０と共役されたＲＮａｓｅ  Ａにより、腫瘍容積の増加は３３日目から著しく抑制されている。
【０２６１】
細胞毒性は、ある幾つかの腫瘍細胞の方が、他の腫瘍細胞よりも大きい様に思われる。
【０２６２】
ｂ）プロトコール２
ヌードマウスに、上記の様にＨＨ９腫瘍細胞を皮下移植した。移植後９日目に、上記マウスに、腫瘍周辺注射として、１００μｇのＲＮａｓｅ、または６５μｇのペプチド（ＨＢＰ３）2、または６５μｇのペプチド（ＨＢＰ３）2＋１００μｇのＲＮａｓｅ、または１００μｇのペプチド（ＨＢＰ３）2−ＲＮａｓｅ接合体またはＨＢＰ６−ＲＮａｓｅ接合体を１週間に２回投与した。２６日目にマウスを屠殺し、上記腫瘍の重量を計測した。
【０２６３】
表１２に、ペプチド−ＲＮａｓｅ接合体で処置したＨＨ９腫瘍の増殖阻害率を示す。処置マウスの腫瘍の増殖阻害率は、ＮａＣｌ投与マウスの腫瘍の平均重量に対する比で算出する。
【０２６４】
【表１２】
0004912556.tif 000015
【０２６５】
これら３つのペプチド−ＲＮａｓｅ接合体は、腫瘍の増殖を同程度に阻害するのに対し、単独またはＲＮａｓｅを添加したペプチドでは、殆ど効果が見られない。
【０２６６】
８）in vitroにおける、ペプチドを用いたルシフェラーゼのプラスミドでの細胞トランスフェクション
ａ）ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
使用プラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーターの制御下にルシフェラーゼの遺伝子を有するＰＣＭＶ−ＬＵＣ（６．４ｋｂ）である。
【０２６７】
プラスミド−ペプチド複合体を、０．１５ＭのＮａＣｌ  ５０μｌ中にプラスミド３μｇ及び３．３ｎモルの配列番号２２及び２３を１５分間添加して調製する。これらの複合体は、二番目のコピーとして（ｅｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔａ）調製される。
【０２６８】
ＣＨＯ細胞を、６％の胎児ウシ血清を含む完全アルファＭＥＭ培地中で培養し、試験前日に、２４ウエルプレートの１ウエル当たり５×１０4細胞を植付ける。次いで上記ウエルから培地を取除き、プラスミド−ペプチド複合体（３７℃で５時間、０．５ｍｌの完全培地中３μｇのプラスミド及び３．３ｎモルのペプチド）を加える。次に、この培地を完全培地に取替え、１８〜２０時間培養を続行する。次いで、上記細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１％トリトンＸ−１００及び２ｍＭのＤＴＴを含む溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌで溶解する。
【０２６９】
次に、Ｐｒｏｍｅｇａルシフェリンキットを用いてルシフェラーゼを測定する為に、細胞溶解産物を１５μｌ採取し、当該細胞溶解産物中のタンパク質量をブラドフォードテストによって計算する為に、更に１５μｌ採取する。ルシフェラーゼの相対単位（ＲＬＵ）を、タンパク質ｍｇとの関係で表す。
【０２７０】
これらの結果を下記表１３に示す。
【０２７１】
【表１３】
0004912556.tif 000016
【０２７２】
これらの結果より、プラスミドと上記ベクターのうちの一つとを複合させることによって、ルシフェラーゼの発現が可能であること、及びこの発現は、アポリポタンパク質のＰＬＨの配列番号２２への添加によって６倍増加する（配列番号２３）ことが分かる。
【０２７３】
ｂ）３Ｔ３細胞のトランスフェクション
−技術：Ｑｉａｇｅｎにより供給されたプラスミドｐＣＭＶＬＵＣ（ルシフェラーゼの遺伝子を有する）を、取扱説明書に従って使用する。前日に３Ｔ３細胞を、完全培養培地中の２４ウエルプレート（８×１０4細胞／ウエル）中に植付ける。
【０２７４】
ペプチドとプラスミドを、０．１５ＭのＮａＣｌ  ５０μｌ中１．６ｎモル／μｇの比率にて、実験室温度で２０分間複合させる。次いでこれらの細胞を洗浄し、ペプチド−プラスミド複合体を、０．５ｍｌの完全培地中の細胞に添加する。３７℃で５時間培養した後、反応培地を除去し、細胞中に完全培地を１ｍｌ添加する。２４時間培養した後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１％のトリトンＸ−１００及び２ｍＭのＤＴＴを含む溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌで１５分間溶解する。遠心分離した後、細胞溶解産物についてルシフェラーゼ試験を行なう。上記細胞溶解産物中に含まれるタンパク質の量を、ブラドフォードテスト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定し、ウシの腫瘍マグロブリンを用いて作成された曲線に従って計算する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むルシフェラーゼの反応体１００μｌを添加した細胞溶解産物１５μｌで評価する。ルシフェラーゼの相対単位（ＲＬＵ）を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定し、タンパク質ｍｇとの関係で表す。
【０２７５】
−結果：下記表１４に、トランスフェクションされた細胞で表されるルシフェラーゼの量を示す。
【０２７６】
【表１４】
0004912556.tif 000017
【０２７７】
プラスミドと複合させたペプチドにより、細胞内部への転移、及びルシフェラーゼ遺伝子の発現が可能になる。ルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）で表わされるトランスフェクション効率は、使用するペプチドによって様々である。ペプチド配列番号４２及びペプチド配列番号４０は、ペプチド配列番号４１に比べ、夫々、５．５倍及び２．６倍の高値が得られる。
【０２７８】
９）ペプチドと共役された輸送体を用いた物質の浸透性評価
以下、本発明による輸送体について記載するが、下記表１５に、輸送体及びこれらが強い親和性を示す物質の幾つかの例を示す。
【０２７９】
【表１５】
0004912556.tif 000018
【０２８０】
上記表において、「ペプチド」の総称は、「本発明によるアミノ酸配列」を意味する。
【０２８１】
タンパク質Ａは、分子量４２，０００  Ｄａを有するＳｔａｐHｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから単離されたタンパク質である。このタンパク質の特徴的性質は、ＩｇＧのＦｃ部分に対する親和性が大きいことである。この特性により、上記タンパク質は、抗体の活性部位と相互作用すること無く、２〜４個のＩｇＧ分子を固定することができる。タンパク質Ａは、ヒト、ウサギ、ラットのＩｇＧ、及びマウスの幾つかのＩｇＧに対して有用である。
【０２８２】
タンパク質Ｇは本来、連鎖球菌の細菌株ＣまたはＤの細胞壁より単離される３０，０００〜３５，０００  Ｄａのタンパク質である。ＳＩＧＭＡ社より商品化されているタンパク質Ｇは、ＩｇＧの２つの固定ドメインを含む１７，０００  Ｄａの組換えタンパク質である。タンパク質Ａと同様、タンパク質Ｇは、ＩｇＧのＦｃ画分に対する親和性が高く、特に、ウシ、マウス、及びヒツジのＩｇＧ用として用いられる。
【０２８３】
Ｆ（ａｂ’）2は抗体に由来する。例えばヒツジの免疫血清から得られるマウスの抗ＩｇＧヒツジＩｇＧを使用することができる。これらを、アフィニティークロマトグラフィーで精製する。上記クロマトグラフィーにおいて、固相は、ポリアクリルアミド−アガロース上に固定されたマウスＩｇＧで構成されている。抗原−抗体反応によるマウスの抗ＩｇＧヒツジＩｇＧの特異的固定は、免疫吸収体による精製によって可能になる。この抗原−抗体結合は、ｐHを酸性にすると解離する。タンパク質分解酵素によってＩｇＧの消化を調節することにより、様々な抗体断片を得ることができる。ペプシンを用いると、縮小サイズ（分子量＝９２，０００  Ｄａ）の二価のＦ（ａｂ’）2断片、及び小さいポリペプチドに完全に消化されたＦｃ断片が得られる。Ｆｃ断片のサプレッションによって抗体のサイズを小さくすることができ、ペプチドとの共役を簡略化することができる。ペプチド−抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2輸送体を調製することにより、非常に多様なマウスＩｇＧを多量に内部化することが可能である。
【０２８４】
抗ペルオキシダーゼＩｇＧは、マウスの腹水から単離されるＩｇＧ１イソタイプのモノクローナル抗体である。これは、タンパク質Ｇ（ＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐHａｒｏｓｅ：ＰHａｒｍａｃｉａ）に対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。この抗体は、ペルオキシダーゼに対して、同様にペルオキシダーゼを含むあらゆる分子に対して、高い親和性を有している。ペルオキシダーゼ（ＰＯ）は、分子量４４，０００  Ｄａを有するクロダイコンから抽出される酵素であり、数多くの分子と非常に会合し易い。ペプチド−抗ＰＯ  ＩｇＧ輸送体を調製することによって、ＰＯ及びＰＯを含む全ての物質を、これらの細胞内で内部化することが可能となる。
【０２８５】
Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓより抽出されるコンカナバリンは、タンパク質末端α−Ｄ−マンノシル及びα−Ｄ−グルコシル基に対して親和性を有するレクチンである。この様な特性により、数多くの糖タンパク質と反応することができる。ペプチド−コンカナバリン輸送体を調製することによって、多くの糖タンパク質または解糖された分子を、これらの細胞内で内部化することが可能となる。
【０２８６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉから抽出された６０，０００  Ｄａの分子であるストレプトアビジン、及び卵白より抽出されるアビジンは共に、ビオチンに対する４つの認識部位を有している。これらの小さい分子への親和定数は非常に高く（ＫＤ＝１０-13Ｍ）、これにより、ビオチンを含むあらゆる物質と相互作用することができる。ペプチド−ストレプトアビジンまたはペプチド−アビジン輸送体を調製することにより、ビオチン及びビオチンを含むあらゆる分子を、これらの細胞内で内部化することが可能となる。
【０２８７】
以下に詳述する実施例は、この様な輸送体の調製及び使用を実証するものである。
【０２８８】
ａ）抗ＲＮａｓｅ、ペプチド−Ｆ（ａｂ’）2輸送体によって輸送された細胞内へのウシリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）の浸透性評価
タンパク質分解酵素、即ちペプシンによる抗ＲＮａｓｅ  ＩｇＧの消化を調節することにより、Ｆ（ａｂ’）2断片を得ることができる。酢酸ナトリウム溶液ｐH４．５中、２％ペプシンによる消化を行なえば、抗体の活性部位を改変させることなく、ＩｇＧのＦｃ断片のフラグメント化が可能になる。
【０２８９】
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７．４中の抗ＲＮａｓｅ  Ｆ（ａｂ’）2抗体２ｍｇを、ジメチルスルホキシド１１μｌ中のＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート］１１０μｇに添加する。この溶液を、実験室温度で４５分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜（切断閾値＝１０，０００  Ｄａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上で遠心分離した後、０．５ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で３回洗浄して除去する。
【０２９０】
次いでペプチドとの共役を、０．５ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中、１モルのＦ（ａｂ’）2に対して６モルのペプチドの比率にて、実験室温度で３時間行なう。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程の様に限外濾過膜上で遠心分離することによって完全に除去する。
【０２９１】
これらの輸送体［ペプチド−抗ＲＮａｓｅ  Ｆ（ａｂ’）2］を、完全培養培地中のリボヌクレアーゼに添加し、この溶液を実験室温度で１時間培養する。上記反応のモル比は、２ＲＮａｓｅ／１Ｆ（ａｂ’）2である。
【０２９２】
ＲＮａｓｅ  Ａの浸透性を顕微鏡で評価する為に、これらの細胞を、培養培地中でＲＮａｓｅ  Ａの漸減濃度（１００〜６μｇ／ｍｌ）で希釈した複合体［ペプチド−抗ＲＮａｓｅ  Ｆ（ａｂ’）2］−ＲＮａｓｅ  Ａの存在下に、３７℃で４時間培養する。
【０２９３】
培養終了後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、絶対エタノール中にて２０℃で１５分固定する。ＲＮａｓｅの浸透性を、ペルオキシダーゼに共役された抗ＲＮａｓｅ抗体と１時間培養させることによって評価する。次いでこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【０２９４】
内部化されたＲＮａｓｅ  Ａの量を測定する為に、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをＰＢＳによる遠心分離によって２回洗浄した後、沈殿物を、溶解緩衝液（トリス緩衝液、０．１Ｍ、ｐH８、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ４０）２２０μｌ中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するＲＮａｓｅ  Ａの量を、抗ＲＮａｓｅ  Ａウサギ抗体で感作したプレート上のＥＬＩＳＡによって測定し、ＲＮａｓｅを用いて作成された標準曲線を参照して、ペルオキシダーゼに共役された抗ＲＮａｓｅ  Ａウサギ抗体接合体で定量する。
【０２９５】
表１６に再編集する結果は、抗ＲＮａｓｅ  Ｆ（ａｂ’）2輸送体によるＲＮａｓｅ  Ａの内部化及びヒーラ細胞の内部でペプチドに共有結合的に共役されたＲＮａｓｅの内部化を示している。
【０２９６】
【表１６】
0004912556.tif 000019
【０２９７】
ｂ）細胞内への、マウスの抗ＩｇＧ、ペプチド−Ｆ（ａｂ’）2輸送体によって輸送されたマウス（ＩｇＧ）のＩｇＧの浸透性評価
マウスのペプチド−抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2輸送体は、前述した手段に従って調製することができる。
【０２９８】
これらの輸送体［ペプチド−抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2］を、０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液中のマウスＩｇＧに添加する。この溶液を実験室温度で１時間培養する。上記反応のモル比は、１Ｆ（ａｂ’）2／ｌ  ＩｇＧである。１時間培養した後、形成された複合体を完全培養培地中に希釈する。
【０２９９】
ＩｇＧの浸透性を顕微鏡で評価する為に、これらの細胞を、完全培養培地中のＩｇＧの漸減濃度（１００〜６μｇ／ｍｌ）に希釈された複合体［ペプチド−抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2］−ＩｇＧの存在下に、３７℃で４時間培養する。
【０３００】
培養終了後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで絶対エタノール中にて２０℃で１５分固定させる。ＩｇＧの浸透性は、ペルオキシダーゼに共役された抗ＩｇＧ抗体と１時間培養させた後に評価する。次いでこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼの活性を、Ｈ2Ｏ2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【０３０１】
内部化されたＩｇＧの量を測定する為に、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをＰＢＳで遠心分離して２回洗浄した後、沈殿物を、溶解緩衝液（トリス緩衝液、０．１Ｍ、ｐH８、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ４０）２２０μｌ中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するＩｇＧの量を、抗ＩｇＧヒツジ抗体で感作したプレート上のＥＬＩＳＡによって測定し、ＩｇＧを用いて作成された標準曲線を参照して、ペルオキシダーゼに共役された抗ＩｇＧヒツジ抗体接合体で定量する。ペルオキシダーゼ活性を、オルトジアニシジン及びＨ2Ｏ2で定量する。
【０３０２】
同じ輸送体［ペプチド−抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2］は、細胞内部において非常に多様なマウスＩｇＧを輸送することができる。
【０３０３】
表１７に再編集された結果は、同じ輸送体［ペプチド−抗ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2］を介して、ヒーラ細胞の内部における、マウスまたは場合によってはラットの様々なＩｇＧの内部化を示している。
【０３０４】
【表１７】
0004912556.tif 000020
【０３０５】
ｃ）ペプチド−抗ＰＯ  ＩｇＧ輸送体によって輸送されたペルオキシダーゼ（ＰＯ）またはペルオキシダーゼを含む分子の、細胞内への浸透性評価
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７．４中のペルオキシダーゼまたはこれらの断片Ｆ（ａｂ’）2の特異的モノクローナルＩｇＧ抗体２ｍｇを、ジメチルスルホキシド１１μｌ中のＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート］１１０μｇに添加する。この溶液を、実験室温度で４５分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜（切断閾値＝１０，０００ダルトン（Ｄａ）、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上で遠心分離した後、０．５ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で３回洗浄することによって除去する。
【０３０６】
次いでペプチドとの共役を、０．５ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中、ＩｇＧを１モルまたはＦ（ａｂ’）2を１モルに対してペプチドを６モルの比率にて、実験室温度で３時間行なう。次いで共役されていない過剰のペプチドを、先行工程に記載した様に限外濾過膜上で遠心分離することによって完全に除去する。
【０３０７】
これらの輸送体［ペプチド−抗ＰＯ  ＩｇＧ］を、０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液中、ペルオキシダーゼまたはビオチニル化ペルオキシダーゼに添加する。この溶液を、実験室温度で１時間培養する。上記反応のモル比は、２ＰＯ／１  ＩｇＧまたはＦ（ａｂ’）2である。
【０３０８】
ＰＯまたはＰＯを含む分子の浸透性を顕微鏡で評価する為に、上記細胞を、培養培地中のＰＯまたはＰＯを含む分子の漸減濃度（１００〜６μｇ／ｍｌ）にて複合体［ペプチド−抗ＰＯ  ＩｇＧ］−ＰＯの存在下、３７℃で４時間培養する。
【０３０９】
培養終了後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、絶対エタノール中にて２０℃で１５分固定させる。次いで上記細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＯまたはＰＯを含む分子の浸透性をペルオキシダーゼ活性で評価し、Ｈ2Ｏ2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【０３１０】
内部化されたＰＯの量を測定する為に、上記細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをＰＢＳで遠心分離することによって２回洗浄し、得られた沈殿物を、溶解緩衝液（トリス緩衝液、０．１Ｍ、ｐH８、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ４０）２２０μｌ中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するＰＯの量を、抗ペルオキシダーゼマウス抗体で感作したプレート上のＥＬＩＳＡによって測定し、ＰＯの標準曲線を参照して、オルトジアニシジン及びＨ2Ｏ2で定量する。
【０３１１】
表１８に再編集した結果は、輸送体［ペプチド−抗ＰＯ  ＩｇＧＦ］を介した、ヒーラ細胞の内部におけるＰＯ及びビオチニル化ＰＯの内部化を示している。
【０３１２】
【表１８】
0004912556.tif 000021
【０３１３】
ｄ）ペプチド−タンパク質Ａ輸送体によって輸送されたＩｇＧの、細胞内への浸透性評価
１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液０．５ｍｌ、ｐH７中のタンパク質Ａ１ｇを、ジメチルスルホキシド１２μｌ中のＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート］１２０μｇに添加する。この溶液を、実験室温度で４５分間培養する。過剰の反応体を、限外濾過膜（切断閾値＝１０，０００  Ｄａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で３回洗浄することによって除去する。
【０３１４】
次いでペプチドとの共役を、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中、タンパク質Ａを１モルに対してペプチドを６モルの比率にて、実験室温度で３時間行なう。次いで共役されていない過剰のペプチドを、先行工程において記載した様に限外濾過膜上で遠心分離することによって完全に除去する。
【０３１５】
これらの輸送体［ペプチド−タンパク質Ａ］を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中のＩｇＧに添加する。この溶液を、実験室温度で２０分間培養する。上記反応のモル比は、２ＩｇＧ／１タンパク質Ａである。
【０３１６】
ＩｇＧの浸透性を顕微鏡で評価する為に、上記細胞を、培養培地中のＩｇＧの漸減濃度（１００〜６μｇ／ｍｌ）で希釈された複合体［ペプチド−タンパク質Ａ］−ＩｇＧの存在下に３７℃で４時間培養する。
【０３１７】
培養終了後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、絶対エタノール中にて２０℃で１５分固定する。ＩｇＧの浸透性は、ＰＯに共役された抗ＩｇＧ抗体若しくはＰＯ単独と１時間培養した後における、抗ＰＯ  ＩｇＧを評価することによって行なう。この工程は、ＰＯに接合されたＩｇＧの内部化に当たっては必要でない（例えばウサギＩｇＧ−ＰＯ）。次いで上記細胞をＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼの活性を、Ｈ2Ｏ2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【０３１８】
内部化されたＩｇＧの量を測定する為に、上記細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをＰＢＳで遠心分離して２回洗浄した後、沈殿物を溶解緩衝液（トリス緩衝液、０．１Ｍ、ｐH８、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ４０）２２０μｌ中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するＩｇＧの量を、抗ＩｇＧ抗体で感作したプレート上のＥＬＩＳＡによって測定し、ＩｇＧを用いて作成された標準曲線を参照して、ペルオキシダーゼと共役された抗ＩｇＧ抗体接合体で定量する。ＰＯの活性を、オルトジアニシジン及びＨ2Ｏ2で定量する。表１９に再編成された結果は、輸送体［ペプチド−タンパク質Ａ］を介した、ヒーラ細胞の内部における様々なＩｇＧの内部化を示している。
【０３１９】
【表１９】
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【０３２０】
１０）結腸腫瘍細胞内への抗ＣＥＡ抗体の輸送
ａ）抗ＣＥＡ  Ａｃ  ３５Ａ７、並びに配列番号１０、配列番号３０、及び配列番号３５（これらは夫々、１０４７、ＨＢＰ７、及びＨＢＰ１０とも呼ばれる）のペプチドを用い、実験を行なった。
【０３２１】
ペプチド１０４７を、３５Ａ７及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と共役させた。ＥＬＩＳＡにより接合体の抗体活性をチェック（ｃｏｎｔｒｏｌｅ）した後、３７℃及び４℃における出発抗体との比較免疫蛍光法によって内部化を調べた。ヒト結腸腫瘍ＣＥＡ＋のＬＳ１７４Ｔ細胞上で、３５Ａ７−１０４７接合体は、１時間１５分経過後直ちに内部化されるのに対し、３５Ａ７は５時間まで内部化が全く見られない。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−１０４７接合体では、ヒト卵巣腫瘍ＥｒｂＢ２＋のＳＫＯｖ３細胞上で、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を用いたときの内部化に近似する迅速な内部化が見られる。125Ｉによる放射標識を行なうと、これらの接合体は、セファロース上に固定化されたＡｇ上の出発Ａｃに近い免疫反応性を示す。ゲル濾過による分析を行なったところ、集塊は存在しなかった。
【０３２２】
ｂ）ペプチド１０４７、ＨＢＰ７、及びＨＢＰ１０の比較。この比較は、Ａｃ  ３５Ａ７についてのみ行なった。
【０３２３】
−in vitro試験
ＬＳ１７４Ｔ細胞上における様々な接合体（３５Ａ７−１０４７、３５Ａ７−ＨＢＰ７、及び３５Ａ７−ＨＢＰ１０）の内部化に関する動力学的研究によれば、１０４７及びＨＢＰ１０を用いた場合に比べ、ペプチドＨＢＰ７を用いた場合の方が、より大きい内部化が認められる。これら２つのペプチドは、匹敵し得る結果が得られる。ＳＫＯｖ３細胞、ＣＥＡ−上では、１０４７及びＨＢＰ７は、ＬＳ１７４Ｔ上で得られたものに匹敵し得る程度の内部化を誘発するのに対し、ＨＢＰ１０は、その半分の内部化しか得られない。
【０３２４】
−in vivo試験
ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するヌードマウスを用い、125Ｉで標識した３つの接合体３５Ａ７−１０４７、３５Ａ７−ＨＢＰ７、及び３５Ａ７−ＨＢＰ１０を、標識した３５Ａ７と比較して調べた。131Ｉ−３５Ａ７では、注射後６時間で、１グラム当たりに注射された用量（％ＩＤ／ｇ）の約１３％の腫瘍の取込み（ｃａｐｔａｔｉｏｎ）が認められた。この取り込みは、注射後２４時間で２０〜２５％ＩＤ／ｇに達する。接合体125Ｉ−３５Ａ７−１０４７は131Ｉ−３５Ａ７に比べ、やや迅速な除去が認められ、腫瘍の取り込みは僅かに減少した（２４時間において１８．６対２１．２％ＩＤ／ｇ）。接合体125Ｉ−３５Ａ７−ＨＢＰ７では、６時間経過後直ちに、肝臓の大きな取り込みが認められた。これは、迅速な除去と、腫瘍の取り込みの低下を招くものである（２４時間において８．５％ＩＤ／ｇ）。接合体125Ｉ−３５Ａ７−ＨＢＰ１０は、天然抗体のものと非常に近似する生物分布を有しており、これら３つの接合体に比べ、良好な腫瘍の取り込みが認められる。
【０３２５】
ｃ）ペプチド１０４７による内部化の誘発作用は、特に３５Ａ７上において顕著に見られる。Ａｃは、内部化しないＡｇであるＣＥＡに逆行して進行する。この作用は、ＡｇのＥｒｂＢ２への固定後に迅速に内部化するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）上では、あまり顕著に認められない。
【０３２６】
１０４７、ＨＢＰ７、及びＨＢＰ１０を用いて行なわれたin vitro試験により、これら３つのペプチドは、３５Ａ７の内部化を誘発することが示される。ＨＢＰ７は、最も活性が強い様に思われるが、ＨＢＰ１０は、抗体の特異性を最もよく維持しているペプチドであると考えられる（ＣＥＡ＋細胞に対する顕著な作用、ＣＥＡ−細胞に対する抑制効果）。in vivo実験でも、in vitroでの結果が実証された。
【０３２７】
ｄ）添付の図１１〜１６は、上記結果を例証するものである。
【０３２８】
−ペプチド：
・１０４７：２４２０  Ｄａ⇒抗ＡＣＥ及び抗ｅｒｂＢ２  Ａｃに対して、
・ＨＢＰ７：１８２７  Ｄａ⇒抗ＡＣＥ  Ａｃ単独に対して、
・ＨＢＰ１０：１６９６  Ｄａ⇒抗ＡＣＥ  Ａｃ単独に対して。
【０３２９】
−共役：
調整（ｍｉｓｅ  ａｕ  ｐｏｉｎｔ）後、１つの共役について（抗体の集塊形成を阻止することにより）決定された条件は、１８  ＳＭＣＣ／Ｉｇ及び１２ｐｅｐｔ／Ｉｇ−ＳＭＣＣである。
【０３３０】
−培養中の細胞に対する内部化試験：
図１１Ａ及びＢは、テスト１を表わしている。即ち、Ａ３７５細胞（ＡＣＥ−）及び５Ｆ１２細胞（ＡＣＥ＋）に対して、１ウエル当たり４０，０００細胞（２４ウエルのボックス）。天然抗体（Ａｃ）：３５Ａ７対接合体Ａｃ：３７Ａ７−１０４７との培養、３７℃で４時間。洗浄、固定、第二Ａｃ−ペルオキシダーゼとの培養、ＯＰＤ暴露、４９０ｎｍでの読取り。抗体の濃度（μｇ／ｍｌ）によるＤＯ。
【０３３１】
・図１２に、ヨウ素１２５で標識された抗体を用いたテスト１の結果を示す。
【０３３２】
・図１３Ａ及びＢは、テスト２を表わしている。即ち、Ａ３７５細胞（ｅｒｂＢ２−）及びＳＫＯＶ３（ｅｒｂＢ２＋）に対して、１ウエル当たり４０，０００細胞（２４ウエルのボックス）。天然抗体（Ａｃ）：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎｅ対接合体ＡｃＨＥＲ−１０４７との培養、３７℃で４時間。洗浄、固定、第二Ａｃ−ペルオキシダーゼとの培養、ＰＤ暴露、４９０ｎｍでの読取り。
【０３３３】
・図１４Ａ及びＢは、テスト３を表わしている。即ち、抗体の濃度を減少させ、培養時間を１時間または４時間に変更した。
【０３３４】
・図１５Ａ〜Ｆは、テスト４を表わしている。即ち、プロトコールは同じであるが、ＳＫＯＶ３（ＡＣＥ−）及びＬＳ１７４Ｔ（ＡＣＥ＋）細胞に対して３つのペプチド（１０４７−ＨＢＰ７−ＨＢＰ１０）を比較する。
【０３３５】
図１６Ａ〜Ｆは、in vivo試験を示している。即ち、ヨウ素１２５で放射性標識された抗体３５Ａ７−１０４７、３５Ａ７−ＨＢＰ７、３５Ａ７−ＨＢＰ１０対３５Ａ７−ヨウ素１３１の分布；スイスマウスｎｕ／ｎｕ  ＬＳ１７４Ｔで移植されたもの（ヒト結腸腫瘍、ＣＥＡ＋）；１マウス当たり５μｇのＡｃ−ｐｅｐｔ*と５μｇの天然Ａｃを同時にｉ．ｖ．注射；注射後６時間／２４時間の解剖、組織１グラム当たりの注入量をパーセンテージで表示した結果。黒棒：接合Ａｃ−１２５Ｉ；白棒：天然Ａｃ−１３１Ｉ。
【０３３６】
１１）ペプチド−ＩｇＧ誘導体を用いた粒子の輸送
以下の実施例で使用するベクターは、配列番号１０（１０４７）のペプチドと共役されたマウスのモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）である。モノクローナル抗体への上記ペプチドの共役は、上述した様に実施した。
【０３３７】
ａ）蛍光球：ペプチドＩｇＧ−微小球複合体の調製：
マウス抗ＩｇＧ抗体（Ｅｓｔａｐｏｒ、Ｍｅｒｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ）を表面に有する、７０〜９００ｎｍの蛍光ポリスチレンの微小球を、０．１５ＭのＮａＣｌで１／１００倍に希釈する。この調製物４μｌを、ペプチド配列番号２に接合されたマウスのモノクローナルＩｇＧ  １０μｇを含む５０μｌ容積中に添加し、実験室温度で３０分間培養した後、放置する。この反応培地を、前日に１８時間かけて植付けられたＨ１２９９細胞（５×１０4細胞／ウエル）上に配置する。
【０３３８】
これらの細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察する。ペプチド−ＩｇＧ−蛍光球複合体と共に培養された細胞は、球のサイズにかかわらず、強い標識が認められるのに対し、対照群（ペプチド−ＩｇＧを含まない蛍光球、または正常なＩｇＧを用いたもの）は陰性である。
【０３３９】
−コロイド金：ペプチド−ＩｇＧ−コロイド金複合体の調製
製造業者による使用説明書に従って、１０ｎｍコロイド金の球（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、コロイド金溶液１ｍｌに対してＩｇＧ７５０μｇの割合で、ペプチド１０４７に予め接合されているマウスのモノクローナルＩｇＧに複合させる。細胞内への上記複合体の浸透性を評価する為、懸濁液の沈殿物を、培養培地で半分に希釈する。
【０３４０】
ｃ）電子顕微鏡によるペプチド−ＩｇＧ−蛍光球複合体及びペプチド−ＩｇＧ−コロイド金複合体の内部化の評価
接合工程後、これらの調製物を、前述した様に前日から培養したＨ１２９９細胞上に配置する。ＩｇＧ−蛍光球複合体については１８時間培養した後、またはＩｇＧ−コロイド金複合体については４時間培養した後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の１．６％グルタルアルデヒド溶液にて１時間固定した後、電子顕微鏡検査をする為、常法に従って処理する。
【０３４１】
ｄ）結果：７０ｎｍのペプチド−ＩｇＧ−微小球複合体（図１９）及びペプチド−ＩｇＧ−コロイド金複合体（図２０）は、小胞中及び細胞質の小胞体中において、並びにゴルジ部の周囲において認められた。
【０３４２】
１２）ドキソルビシンの輸送
ドキソルビシン等のアントラシクリンは、ヒト腫瘍の治療に最も有効な薬剤の一つである。これらの細胞内への導入方法は、未だ解決されていない。唯一判明していることは、これらが細胞核に迅速に輸送されるということである。これらは生体内全体に広く拡散して毒性をもたらすと考えられ、その為に大量投与が困難になり、治療の限界を招くものと思われる。
【０３４３】
本発明者らは、ペプチドＨＢＰへのドキソルビシンの共役によって、上記薬剤薬品の毒性を低減しつつ、ヒト腫瘍の増殖阻害能を改善するかどうかを明らかにしたいと考えた。
【０３４４】
ａ）ドキソルビシンへのペプチドの共役
アミノ基が保護されているドキソルビシンを、カルボジイミドの存在下に４−マレイミド酪酸で処理する。これにより、ドキソルビシンのヒドロキシルとマレイミド酪酸のカルボキシルとの間がエステル結合する。この様にしてドキソルビシン中に導入されたマレイミド基は、ペプチドのＣ−末端またはＮ−末端に存在するシステインと反応する。
【０３４５】
一般的手法に従って、以下の接合体を調製した。
【０３４６】
即ち、１０４７−ドキソルビシン；ＨＢＰ１−ドキソルビシン；ＨＢＰ３−ドキソルビシン；ＨＢＰ６−ドキソルビシン；ＨＢＰ７−ドキソルビシン；ＨＢＰ１０−ドキソルビシン；ＨＢＰ１３−ドキソルビシン。
【０３４７】
ｂ）in vitroにおける、ペプチドと接合されたドキソルビシンの生物活性の評価
ペプチド−ドキソルビシン接合体の生物活性を評価する為に、培養中の腫瘍細胞の増殖阻害率を測定する。
【０３４８】
前日に上記細胞を、１ウエル当たり１０3細胞の割合で、９６ウエルプレート中に植付ける。翌日、上澄み液を採取し、ペプチド−ドキソルビシンまたは天然ドキソルビシンの連続希釈液（１０-6Ｍ−１０-8Ｍ）を含む培地１００μｌに替え、４８時間培養を続行する。
【０３４９】
次いで上記ウエルに、培養培地中１ｍｇ／ｍｌでＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）５０μｌを添加し、４時間培養する。上澄み液を除去し、上記ウエルにジメチルスルホキシド１００μｌを添加する。結晶を溶解した後、５５０ｎｍでの染色を読取る。
【０３５０】
これらの結果を、被験試料の希釈液を含む細胞ウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージで算出する。下記表２０に、細胞増殖の５０％阻害率を生じるモル濃度で示した結果を示す。
【０３５１】
【表２０】
0004912556.tif 000023
【０３５２】
in vitroにおける、ペプチド−ドキソルビシン接合体への細胞の感受性は、天然ドキソルビシンのものと同程度である様に思われる。ドキソルビシンに抵抗性のある系統（Ｋ５６２Ｒ及びＭＣＦ７Ｒ）は、より高濃度のドキソルビシンを必要とする。
【０３５３】
ｃ）in vivoにおける、ペプチド−ドキソルビシン接合体の抗腫瘍活性の評価
ヌードマウスのわき腹に、３×１０6ＨＨ９細胞を皮下注射し、細胞移植後１９日目に腫瘍を測定する。１群当たり６匹、合計４群のマウスに、ＮａＣｌ、若しくは天然ドキソルビシン、若しくは１０４７−ドキソルビシン接合体、またはＨＢＰ１−ドキソルビシンを、ドキソルビシン３０μｌまたはこれらの接合体当量の割合で２週間毎に、腫瘍周辺に注射する。腫瘍を測定し、その容積を計算する。６０日目、全部で１２０μｇのドキソルビシンまたは上記当量の注射後、腫瘍の増殖は夫々、１０４７−ドキソルビシン接合体では７７％、ＨＢＰ１−ドキソルビシン接合体では８４％、ドキソルビシン単独では７９％が阻害される。これらの結果により、上記接合体は、in vivoでは天然ドキソルビシンと少なくとも同程度に有効に作用することが証明される。
【０３５４】
ｄ）in vivoにおける、ペプチド−ドキソルビシン接合体の毒性評価
ドキソルビシンまたはドキソルビシン−ペプチドを静脈内注射することにより、様々な調製物の毒性を比較することができる。この評価は、マウスの体重減少を調べることによって行なわれる（１群当たり５匹のマウス）。下記二つの実験を行なった。
【０３５５】
実験１：３日間隔でマウスに２００μｇずつ注射し、全部でドキソルビシン６００μｇまたはペプチド−ドキソルビシン当量を投与した。最終投与の翌日にマウスの体重を計測する。
【０３５６】
実験２：これらのマウスに、１週間間隔でドキソルビシン２００μｇまたはペプチド−ドキソルビシン当量を２回注射し、全部で４００μｇを投与した。最終投与の翌日に体重を計測する。
【０３５７】
下記表２１に、ドキソルビシンまたはペプチド−ドキソルビシン接合体で処理されたマウスの体重減少率を示す。平均体重減少率は、ＮａＣｌを投与したマウスの平均体重に対する比率で計算する。
【０３５８】
【表２１】
0004912556.tif 000024
【０３５９】
６００μｇの投与用量では、天然ドキソルビシン投与マウスは、体重の３１％が減少するのに対し、ペプチド−ドキソルビシン投与マウスは、体重の１８〜８％しか減少しない。４００μｇの投与用量では、天然ドキソルビシン投与マウスは、１５％の体重減少が見られるのに対し、ペプチド−ドキソルビシン接合体を用いた場合は、有意な減少は認められない。
【０３６０】
１３）ユビキチンの輸送
ユビキチンは、進化中に高度に保持された７６アミノ酸からなる分子量８，５００ダルトンのポリペプチドであり、全ての真核生物の生体内に存在している。細胞内ユビキチンは、様々な細胞機能、例えばユビキチンとの連結反応後におけるタンパク質の分解、細胞サイクルの進行、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化の調節に関与している。細胞外ユビキチンは、アポトーシスの誘発により、造血株細胞の増殖を阻害するという特性を有している。
【０３６１】
ａ）ペプチドへのユビキチンの共役
０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液０．３ｍｌ、ｐH７中のユビキチン１ｍｇに、ジメチルスルホキシド３９μｌ中のＳＭＣＣ（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート）３９０μｇを添加し、この溶液を、実験室温度で３０分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜（切断閾値＝５，０００ダルトン、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で３回洗浄することによって除去する。次いでペプチドとの共役を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７中、ユビキチン１モルに対してペプチド５モルの比率にて実験室温度で行なう。次いで共役されていない過剰のペプチドを、先行工程の様にこれらの膜上で遠心分離することによって除去する。
【０３６２】
ｂ）ペプチド−ユビキチン接合体の浸透性評価
ペプチド−ユビキチン接合体の浸透性評価は、Ｎ−末端側にビオチンを有するペプチドによって調製された接合体を用いて実施する。
【０３６３】
前日に、ＨＴ２９細胞を２４ウエルプレートに植付ける（５×１０4／ウエル）。
【０３６４】
様々な（ビオチニル化）ペプチド−ユビキチン接合体を、培養培地中漸減濃度で（１００〜２５μｇ／ｍｌ）３７℃で４時間添加する。培養終了後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、エタノール中にて２０℃で１５分固定する。ペプチド−ビオチン−ユビキチン接合体の浸透性を、ペルオキシダーゼに共役されたアビジンと６０分間培養した後に評価する。ペルオキシダーゼの活性を、Ｈ2Ｏ2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【０３６５】
培養培地中における接合体の濃度に応じた浸透性を、十字印で表示された染色の強度によって顕微鏡で評価する。下記表２２に、細胞内へのペプチド−ユビキチン接合体の浸透性を示す。
【０３６６】
【表２２】
0004912556.tif 000025
【０３６７】
ｃ）ペプチド−ユビキチン接合体の生物活性評価
細胞の増殖をＭＴＴ試験によって測定する。Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０4細胞／ウエル）を、漸減濃度（２００〜１２．５μｇ／ｍｌ）の天然ユビキチンが添加されているか、またはペプチドに接合されている、完全ＲＰＭＩ培養培地中で、９６ウエルプレート中にて３７℃で４８時間培養し、更に培養を４８時間続行する。
【０３６８】
次いでこれらのウエルに、培養培地中１ｍｇ／ｍｌでＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）５０μｌを加え、４時間培養する。
【０３６９】
上澄み液を除去し、これらのウエルに、ジメチルスルホキシド１００μｌを添加する。結晶を溶解した後、５５０ｎｍでの染色を読取る。
【０３７０】
表２３に、ペプチド−ユビキチン接合体によるＤａｕｄｉ細胞の増殖阻害率を示す。表２３に、被験試料の希釈液を含む細胞のウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージを算出した結果を示す。これらは、細胞増殖の５０％阻害率が認められる濃度として表されている。
【０３７１】
【表２３】
0004912556.tif 000026
【０３７２】
天然ユビキチンは、Ｄａｕｄｉ細胞の増殖を阻害しない。ペプチドＨＢＰ１０を用いて調製された接合体は殆ど阻害しないのに対し、ペプチドＨＢＰ７を用いて調製された接合体は効率的であり、５０μｇ／ｍｌで更に３５％の阻害が認められる。ペプチド１０４７を用いて調製された接合体の阻害値は、中間的な値が得られる。
【０３７３】
１４）チトクロムｃの輸送
チトクロムｃは、脂質−ミトコンドリアタンパク質複合体を構成するヘムタンパク質であり、植物及び哺乳動物の細胞酸化において生死に関与する役割を担っている。これは、システイン残基と結合したヘム基を有する１０４アミノ酸（分子量１３，０００ダルトン）のポリペプチド鎖のみから形成されている。サイトゾル中ミトコンドリアのチトクロムｃを塩析すると、カスパーゼの活性化による細胞のアポトーシスが認められた。
【０３７４】
ａ）ペプチドへのチトクロムｃの共役
０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液９３０μｌ、ｐH７中のチトクロムｃ４ｍｇに、ジメチルスルホキシド５４μｌ中のＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート］５４０μｇを添加し、この溶液を、実験室温度で３０分間インキュベーションする。過剰の反応体は、限外濾過膜（切断閾値＝１０，０００ダルトン、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐH７中で３回洗浄することによって除去する。
【０３７５】
次いでペプチドとの共役を、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７中で、チトクロムｃを１モルに対してペプチドを１０モルの比率にて、実験室温度で３時間実施する。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程の様に遠心分離／濾過することによって除去する。
【０３７６】
ｂ）細胞内へのペプチド−チトクロムｃ接合体の浸透性評価
ペプチド−チトクロムｃ接合体の浸透性評価は、Ｎ−末端側にビオチンを有するペプチドで調製された接合体を用いて行なう。
【０３７７】
Ｈ１２９９細胞を、様々な（ビオチニル化）ペプチド−チトクロムｃ接合体の存在下、培養培地中の漸減濃度（１００〜２５μｇ／ｍｌ）にて３７℃で４時間培養する。培養終了後、上記細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、エタノール中にて−２０℃で１５分間固定する。ペプチド−ビオチン−チトクロムｃ接合体の浸透性を、ペルオキシダーゼに共役されたアビジンと６０分間インキュベーションした後に評価する。次いで上記細胞をＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼの活性を、Ｈ2Ｏ2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【０３７８】
培養培地中の接合体濃度に応じた浸透性を、十字印で表示した染色の強度により、顕微鏡下で評価する。下記表２４に、細胞内へのペプチド−チトクロムｃ接合体の浸透性を示す。
【０３７９】
【表２４】
0004912556.tif 000027
【０３８０】
上記表より、天然チトクロムｃは細胞内に浸透しないが、１０４７−チトクロムｃ接合体は２５μｇ／ｍｌまで効率的に浸透することが認められる。
【０３８１】
ｃ）in vitroにおける、ペプチド−チトクロムｃ接合体の生物活性の評価
Ｈ１２９９またはＨＴ２９細胞（３×１０4細胞／ウエル）を、漸減濃度（２００〜３μｇ／ｍｌ）の天然チトクロムｃが添加されているか、またはペプチドに接合されている、完全ＲＰＭＩ培養培地中にて、９６ウエルプレート中、３７℃で４８時間培養し、培養を更に４８時間続行する。
【０３８２】
次いでこれらのウエルに、培養培地中１ｍｇ／ｍｌでＭＴＴ（臭化３−、（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）５０μｌを加え、４時間培養する。
【０３８３】
上澄み液を除去し、これらのウエルに、ジメチルスルホキシド１００μｌを添加する。結晶を溶解した後、５５０ｎｍでの染色を読取る。
【０３８４】
これらの結果を、被験試料の希釈液を含む細胞のウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージとして算出する。表２５に、ペプチド−ユビキチン接合体による細胞の増殖阻害率を示す。
【０３８５】
【表２５】
0004912556.tif 000028
【０３８６】
上記表は、２種類の細胞に対するペプチド−チトクロムｃ接合体の効率を示している。天然チトクロムｃは増殖を阻害しない。５０μｇ／ｍｌにおいて、ＨＴ２９細胞に対して最も効率的なペプチドは、ペプチド１０４７であり、ペプチドＨＢＰ３及びＨＢＰ６は、中間的な値を生じるのに対し、ペプチドＨＢＰ）は、当該濃度では殆ど活性が認められない。
【０３８７】
１５）本発明のペプチドを用いた抗腫瘍及び抗炎症性物質の輸送
ａ）アスピリン誘導体の輸送
治療薬として長年使用されているアスピリン等の鎮痛薬は、アスピリンを長期間、定期的に服用している男性及び女性に対し、例えば結腸腫瘍の抑制作用といった他の作用を発揮することが明らかになった。動物では、様々な腫瘍に対する抗腫瘍作用が証明された。これは、酵素プロスタグランジンＨシンテターゼ及びシクロオキシゲナーゼを阻害して、プロスタグランジンの産生を部分的に阻害する作用に基づくものと考えられる。
【０３８８】
配列番号３０のペプチドに接合されたアスピリンの２つの誘導体、即ち、Ｎ−末端におけるサリシリル−ＨＢＰ６誘導体（ペプチド配列番号４７）、及びＣ−末端におけるＨＢＰ６−サリシリル誘導体（配列番号４８）について、ＨＴ２９腫瘍細胞の増殖阻害能力を、天然ペプチドと対比させて調べた。
【０３８９】
ＨＴ２９細胞（３×１０4細胞／ウエル）を、漸減濃度（２００〜３μｇ／ｍｌ）のアスピリンまたはペプチド−サリシリル接合体が添加されている、完全ＤＭＥＭ培養培地中、９６ウエルプレート中にて３７℃で４８時間培養し、培養を更に４８時間続行する。
【０３９０】
次いでこれらのウエルに、培養培地中１ｍｇ／ｍｌでＭＴＴ（臭化３−、（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）５０μｌを添加し、４時間培養する。
【０３９１】
上澄み液を除去し、これらのウエルに、ジメチルスルホキシド１００μｌを添加する。結晶を溶解した後、５５０ｎｍでの染色を読取る。
【０３９２】
ＨＴ２９細胞の増殖阻害率を表２６に示す。これらの結果を、被験試料の希釈液を含む細胞ウエル中で得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージとして算出する。
【０３９３】
【表２６】
0004912556.tif 000029
【０３９４】
サリチル酸にペプチドを添加すると、アスピリンによる細胞の増殖阻害能が増強される。
【０３９５】
ｂ）フタル酸誘導体の輸送
Ｎ−フタルイミドグルタルイミド（タリドミド）は、例えば奇形を誘発する作用、単核細胞によるＴＮＦ−αの産生低下、血管形成の抑制等、多様な特性を示す分子である。奇形誘発作用は、グルタルイミド残基と関係があり、一方、血管形成作用は、フタロイル基と関係があることが証明された。その為、本発明者らは、Ｎ−末端にグリシルフタロイルを添加したペプチド配列番号２６（ＨＢＰ３）2から誘導されたペプチド配列番号４６を調製した。培地しか受け入れていないウエル、フタロイル−ＨＢＰ３の活性を試験する為に用いた手段は、アスピリンにおいて記載した技術と同じである。
【０３９６】
表２７に示すＨＴ２９細胞の増殖阻害率（％）の結果は、被験試料の希釈液を含む細胞のウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの平均光学密度のパーセンテージとして算出したものである。
【０３９７】
【表２７】
0004912556.tif 000030
【０３９８】
フタロイル誘導体は、ＨＴ２９細胞の増殖を阻害すると考えられる。
【０３９９】
１６）本発明のペプチドを用いた抗菌物質の活性増加
ａ）リゾチーム
リゾチームは、ヒト多核リンパ球の顆粒の主要な成分の一つである。分泌の際にも同様に認められるが、これはムラミニダーゼである。リゾチームは、グラム陽性菌の表面にあるペプチドグリカンを修飾して溶解し、菌を死滅させる。リゾチームは細菌の外部膜に浸透し難いので、ペプチドへのリゾチームの共役は、浸透性を補助する役割を有している。
【０４００】
−リゾチームへのペプチドの共役
０．１５ＭのＮａＣｌを含む１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液２．７ｍｌ、ｐH７中のリゾチーム８ｍｇに、ジメチルスルホキシド１８６ｍｌ中のＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−スクシンイミジルカルボキシレート）１．８ｍｇを添加し、この溶液を、実験室温度で３０分間インキュベーションする。過剰の反応体は、限外濾過膜（切断閾値＝５，０００ダルトン、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上で遠心分離した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐH７中で３回洗浄することによって除去する。
【０４０１】
次いでペプチドとの共役は、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ、ｐH７中で、リゾチーム１モルに対してペプチド５モルの比率にて、実験室温度で３時間実施する。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程に記載した様に膜上で遠心分離することによって除去する。
【０４０２】
−ペプチドに共役されたリゾチームの活性評価
グラム陽性菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で半対数相になるまで培養する。上記菌を遠心分離して収集し、５×１０5ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位／ｍｌ）の濃度で１％バクト−ペプトン培地中に再懸濁する。リゾチームまたはペプチド−リゾチーム接合体を、半分ずつ（ｄｅｍｉ  ｅｎ  ｄｅｍｉ）希釈し（バクト−ペプトン培地中２５６〜０．５μｇ／ｍｌ）、５０μｌを９６ウエルプレート中に分配する。次いで各ウエルに、菌希釈液５０μｌを添加する。３７℃で１６時間インキュベーションした後、各ウエルの１０μｌを、ＬＢ培地の寒天ボックス上に広げる。３７℃で１８時間インキュベーションした後、増殖の７５％を阻害するリゾチームまたはリゾチーム−ペプチドの濃度を最小殺菌濃度（ＭＢＣ）として決定する。
【０４０３】
−結果
表２８に、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖阻害率を示す（ＭＢＣμｇ／ｍｌ）。
【０４０４】
【表２８】
0004912556.tif 000031
【０４０５】
ペプチド−リゾチーム接合体は、天然リゾチームの抗菌活性に比べ、抗菌活性に優れている。
【０４０６】
ｂ）抗菌ペプチド
数年前より、抗菌活性及び抗真菌活性を有する短いペプチドについて、その構造−メカニズムに対する関心が高まっている。動物界及び植物界に多く存在する様々な配列の天然ペプチドは、非常に多様な微生物に対し、同等の作用を有している。
【０４０７】
一般に抗菌ペプチドは、両親媒性ドメイン内部で同等数の極性残基及び非極性残基を有しており、中性ｐH域では全体として正の電荷のペプチドを生じるのに充分な塩基性残基を有している。
【０４０８】
更に本発明のペプチドは、ヘパリンに対する親和性が高い、主として塩基性ペプチドであるが、以下の実施例により、これらのうちの幾つかは、真核生物細胞に対して毒性のない濃度で、in vitroにおいて抗菌活性を有することが証明された。
【０４０９】
−カチオン性ペプチドの抗菌性評価
グラム陽性菌株：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ２９２１２）、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）、及びグラム陰性菌株：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ２７８５３）、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐHｉｍｕｒｉｕｍ（臨床分離物）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉＴｙ２（ＷＨＯ）。これらの菌を、３７℃で一晩中撹拌しながら培養した後、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）新鮮培地中で１：５０の希釈になるまで更に２時間、再培養する。菌濃度が１０６ｃｆｕ／ｍｌとなる様に調整し、その５０μｌをＬＢ培地中に半分ずつ（２５６〜０．５μｇ／ｍｌ）に希釈した等容積のペプチドと共に９６ウエルプレート中に分配する。３７℃で１６時間培養した後、菌の増殖が完全に阻止される（濁度が全くない）最小濃度である最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定する。最小抗菌濃度を決定する為に、各ウエルの１０μｌをＬＢ培地の寒天ボックス上に広げる。３７℃で１８時間インキュベーションした後、生存細菌の０．０１％しか存続させないペプチドの濃度である最小抗菌濃度（ＭＢＣ）を決定する。
【０４１０】
−結果
これらの結果を、ＭＢＣのペプチド濃度（μＭ）として示す。
【０４１１】
【表２９】
0004912556.tif 000032
【０４１２】
上記表の結果より、ペプチド（ＨＢＰ１）3は抗菌活性を有するのに対し、ペプチド（ＨＢＰ１）2及びＨＢＰ１３は抗菌活性を有しないことが分かる。しかしながら、ペプチドＨＢＰ１３（配列番号３８）がペプチド配列番号２４と共役されると、その活性が係数５０〜１００だけ増加する（ペプチド配列番号４５）。この結果は、ペプチド配列番号２４が、それ自体は抗菌活性を有していないペプチド配列番号３０（ＨＢＰ７）と共役されたときも同様に見られる。
【０４１３】
上記表における全てのペプチドの最小抗菌濃度（ＭＢＣ）は、ＭＩＣと同等であるか、または希釈液によって異なる（ＭＢＣ＝２×ＭＩＣ）。これらのペプチドは全て、グラム陽性菌に対して活性を示さない。
【０４１４】
参考文献
【０４１５】
【表３０】
0004912556.tif 000033
【０４１６】
【表３１】
0004912556.tif 000034
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、濃度ａ（０．０２ｎモルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼに対する０．５ｎモルのビオチニル化ペプチド）において、３７℃で一晩ビオチニル化された様々なペプチドによって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの内部化を示す棒グラフである。
【図２】  図２は、濃度ｂ（０．０１ｎモルのＳ−ＰＯまたはＡ−ＰＯに対して０．２５ｎモルのビオチニル化ペプチド）における、様々なビオチニル化ペプチド（３７℃で２時間）によって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓ−ＰＯ）及びアビジン−ペルオキシダーゼ（Ａ−ＰＯ）の内部化を示す棒グラフである。
【図３】  図３は、濃度ｂ（０．０１ｎモルのＳ−ＰＯまたはＡ−ＰＯに対して０．２５ｎモルのビオチニル化ペプチド）にて３７℃で２時間における、ビオチニル化ペプチドによるＳ−ＰＯの内部化と、Ａ−ＰＯの内部化との関係を示す棒グラフである。
【図４】  図４は、３７℃で２時間、４℃で２時間ビオチニル化された２つのペプチドによって輸送されたＳ−ＰＯの内部化の関係を示す棒グラフである。
【図５】  図５は、ヒトＨ１２９９細胞及びハムスターの卵巣ＣＨＯ細胞上で様々なペプチドと共役されたネズミＩｇＧ1モノクローナル抗体の内部化（３７℃で４時間；３０μｇ／ｍｌ配置接合体）を示す棒グラフである。
【図６】  図６は、ＲＮａｓｅ  Ａ単独（バンド１）及び配列番号１０と共役されたＲＮａｓｅ  Ａの電気泳動法による結果を示す。この図には２つの共役試験が示されている（バンド２及び３）。
【図７】  図７は、電気泳動法による結果を示す。
【図８】  試験試料の希釈液を含む細胞ウエルにおいて得られた平均光学密度、及び培地しか含まないウエルの光学密度を、パーセンテージで算出する。これらの結果を図８にグラフ化して示す。
【図９】  生後６週間のメスのヌードマウスの左わき腹に、５０μｌ容積下、３×１０6ＨＨ９細胞を皮下注射した。移植後１７日目に腫瘍を測定し、マウスを下記３つのグループに分ける。グループ１（７匹のマウス）：５０μｌのＰＢＳ中配列番号１０／ＲＮａｓｅ  Ａの共役体１００μｇを注射する；グループ２（７匹のマウス）：１００μｌのＰＢＳ中５０μｇの天然ＲＮａｓｅ  Ａを注射する；グループ３（６匹のマウス）：５０μｌのＰＢＳを注射する。これらの注射は、同一条件下で１週間に３回続行する。各群における腫瘍を測定し、その容積を、式Ｖ＝４／３π×Ｌ2ｌ（Ｌ＞１）（ここで、Ｌは腫瘍の大きい直径に対応し、ｌは腫瘍の小さい直径に対応する）に従って計算する。これらの結果を、図９にグラフ化して示す。
【図１０】  図１０は、本発明のペプチド配列を含む組換えタンパク質の発現が可能なベクターの調製法を示す。
【図１１】  図１１Ａ及びＢは、テスト１を表わしている。即ち、Ａ３７５細胞（ＡＣＥ−）及び５Ｆ１２細胞（ＡＣＥ＋）に対して、１ウエル当たり４０，０００細胞（２４ウエルのボックス）。天然抗体（Ａｃ）：３５Ａ７対接合体Ａｃ：３７Ａ７−１０４７との培養、３７℃で４時間。洗浄、固定、第二Ａｃ−ペルオキシダーゼとの培養、ＯＰＤ暴露、４９０ｎｍでの読取り。抗体の濃度（μｇ／ｍｌ）によるＤＯ。
【図１２】  図１２は、ヨウ素１２５で標識された抗体を用いたテスト１の結果を示す。
【図１３】  図１３Ａ及びＢは、テスト２を表わしている。即ち、Ａ３７５細胞（ｅｒｂＢ２−）及びＳＫＯＶ３（ｅｒｂＢ２＋）に対して、１ウエル当たり４０，０００細胞（２４ウエルのボックス）。天然抗体（Ａｃ）：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎｅ対接合体ＡｃＨＥＲ−１０４７との培養、３７℃で４時間。洗浄、固定、第二Ａｃ−ペルオキシダーゼとの培養、ＰＤ暴露、４９０ｎｍでの読取り。
【図１４】  図１４Ａ及びＢは、テスト３を表わしている。即ち、抗体の濃度を減少させ、培養時間を１時間または４時間に変更した。
【図１５】  図１５Ａ〜Ｆは、テスト４を表わしている。即ち、プロトコールは同じであるが、ＳＫＯＶ３（ＡＣＥ−）及びＬＳ１７４Ｔ（ＡＣＥ＋）細胞に対して３つのペプチド（１０４７−ＨＢＰ７−ＨＢＰ１０）を比較する。
【図１６】  図１６Ａ〜Ｆは、in vivo試験を示している。即ち、ヨウ素１２５で放射性標識された抗体３５Ａ７−１０４７、３５Ａ７−ＨＢＰ７、３５Ａ７−ＨＢＰ１０対３５Ａ７−ヨウ素１３１の分布；スイスマウスｎｕ／ｎｕ  ＬＳ１７４Ｔで移植されたもの（ヒト結腸腫瘍、ＣＥＡ＋）；１マウス当たり５μｇのＡｃ−ｐｅｐｔ*と５μｇの天然Ａｃを同時にｉ．ｖ．注射；注射後６時間／２４時間の解剖、組織１グラム当たりの注入量をパーセンテージで表示した結果。黒棒：接合Ａｃ−１２５Ｉ；白棒：天然Ａｃ−１３１Ｉ。
【図１７】  ヒーラ細胞を、Ｈｉｓ6−Ｚｅｂｒａ−ＰＡＶ１組変えタンパク質と１８時間培養し、固定するか（図１７Ａ）または解離し、固定前に１８時間再び培養する（図１７Ｂ）。
【図１８】  ヒーラ細胞を、Ｈｉｓ6−ＺｅｂｒａΔｎｌｓ−ＰＡＶ１組変えタンパク質と６時間または１８時間培養し、１８時間後固定するか（図１８Ａ及び１８Ｂ）または解離し、固定前に１８時間再び培養する（図１８Ｃ）。
【図１９】  電子顕微鏡によるペプチド−ＩｇＧ−微小球複合体。
【図２０】  電子顕微鏡によるペプチド−ＩｇＧ−コロイド金複合体。
【配列表】
0004912556.tif 000035
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0004912556.tif 000046
0004912556.tif 000047
【図１】
0004912556.tif 000048
【図２】
0004912556.tif 000049
【図３】
0004912556.tif 000050
【図４】
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【図５】
0004912556.tif 000052
【図６】
0004912556.tif 000053
【図７】
0004912556.tif 000054
【図８】
0004912556.tif 000055
【図９】
0004912556.tif 000056
【図１０】
0004912556.tif 000057
【図１１】
0004912556.tif 000058
【図１２】
0004912556.tif 000059
【図１３】
0004912556.tif 000060
【図１４】
0004912556.tif 000061
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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