(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体DNAを重度複合免疫不全マウス又はラットに導入することを特徴とする、トランスジェニック重度複合免疫不全マウス又はラットの作製方法。
【請求項２】
ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子が霊長類由来のヘパリン結合性EGF遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子がヒトヘパリン結合性EGF遺伝子である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体DNAを重度複合免疫不全マウス又はラットに導入し、当該マウス又はラットにジフテリア毒素を50ng/kg〜50μg/kgの投与量で投与することを特徴とする、糖尿病モデルマウス又はラットの作製方法。
【請求項５】
ジフテリア毒素の投与量が50ng/kgである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体DNAを重度複合免疫不全マウス又はラットに導入し、当該マウス又はラットにジフテリア毒素を50ng/kg〜50μg/kgの投与量で投与して当該マウス又はラットに糖尿病を発症させる方法。
【請求項７】
ジフテリア毒素の投与量が50ng/kgである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項４記載の方法により作製された糖尿病モデルマウス又はラット。
【請求項９】
ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体DNAが導入され、かつ、ジフテリア毒素が50ng/kg〜50μg/kgの投与量で投与されることにより糖尿病を発症した糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラット。
【請求項１０】
ジフテリア毒素の投与量が50ng/kgである、請求項９記載の糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラット。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラットに候補物質を投与することを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
候補物質を接触させた糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラットの血糖値を測定し、当該測定された血糖値が候補物質を接触させない対照の糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラットの血糖値よりも低下したときは、前記候補物質を糖尿病治療薬として選択する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
候補物質を接触させた糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラットのインシュリン濃度を測定し、当該測定された濃度が候補物質を接触させない対照の糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラットのインシュリン濃度よりも増加したときは、前記候補物質を糖尿病治療薬として選択する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のマウス又はラットに他の動物由来の幹細胞を移植することを特徴とする、当該他の動物由来の膵臓細胞を有するトランスジェニックマウス又はラットを作出する方法。
【請求項１５】
(i)ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体DNAを重度複合免疫不全マウス又はラットに導入し、(ii)当該マウス又はラットにジフテリア毒素を50ng/kg〜50μg/kgの投与量で投与して糖尿病を発症させ、及び(iii)当該マウス又はラットに他の動物由来の幹細胞を移植することを特徴とする、当該他の動物由来の膵臓細胞を有するトランスジェニックマウス又はラットを作出する方法。
【請求項１６】
ジフテリア毒素の投与量が50ng/kgである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
造血幹細胞が骨髄由来細胞又は臍帯血由来細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法により作製された、他の動物由来の膵臓細胞を有するトランスジェニックマウス又はラット。
【請求項２０】
請求項９又は１０記載の糖尿病モデル重度複合免疫不全マウス又はラットに、他の動物由来の幹細胞が移植された、他の動物由来の膵臓細胞を有するトランスジェニック重度複合免疫不全マウス又はラット。
【請求項２１】
膵臓細胞が、移植された他の動物の造血幹細胞由来のものである、請求項１９又は２０記載のマウス又はラット。
【請求項２２】
造血幹細胞が骨髄細胞又は臍帯血細胞である、請求項２１記載のマウス又はラット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するプロモーターを含む組換体ＤＮＡが導入された、トランスジェニック非ヒト動物、並びに糖尿病モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、以前ＴＲＥＣＫ法という方法を開発した（国際公開９８／３３８９９号パンフレット、Ｓａｉｔｏ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：７４６−７５０）。すなわち、この方法は、ヘパリン結合性ＥＧＦがジフテリア菌の産生する毒素（ジフテリア毒素）に対する受容体の本体であるという点に着目し、細胞外から加えたジフテリア毒素に対して、マウスの細胞がヒトの細胞に比べ約１，０００倍以上の耐性を有することを利用し、マウスの特定の細胞群のみを特異的に破壊するものである。ＴＲＥＣＫ法の概略は以下の通りである。まず、マウスの細胞・組織特異的プロモーターをヒトに特異的なジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）に結合させた組換え体ＤＮＡを作製し、それをマウス個体に導入することによりトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製する。このＴｇマウスは導入されたプロモーターによりＤＴＲを細胞の表面上に特異的に発現する。そのため、このＴｇマウスにジフテリア毒素（ＤＴ）を投与すると任意の時期に狙った細胞だけを除去したり、一過的な障害を与えたりすることができる。これまでも、この方法を用いることにより、肝炎などのヒト疾患モデルが創出されており、この方法の応用によってさらに様々なモデルが創出可能である。
ところで、糖尿病は生活習慣病のひとつであり、わが国でも推定罹患者数が１６００万人ともいわれている。糖尿病は、インシュリン作用の不足、つまりインシュリンの供給不足と、インシュリン標的臓器での感受性の低下が原因となり、血液中のブドウ糖が増えすぎて（高血糖）尿の中に糖が溢れてきた状態（糖尿）をいう。実際は血液中のブドウ糖の量（血糖値）を測定することにより診断される。さらに、糖尿病は、神経障害、網膜症、腎症などの合併症を引き起こすことも知られており、また、他の生活習慣病である、肥満、高脂血症及び高血圧などと重複した代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、心筋梗塞、脳梗塞などの心血管疾患の主要な原因になるといわれている。したがって、糖尿病の原因解明とそれに立脚した根本的な予防法や治療法の確立がきわめて重要であり、糖尿病のモデル動物の作製が望まれてきた。特に、Ｉ型糖尿病の根本的治療には、再生医学を利用した膵臓β細胞の幹細胞、あるいは前駆細胞の移植が有望視されてきていた。再生医学を利用したＩ型糖尿病のための適当な動物モデルとしては、以下の条件を満たす必要がある。
１）動物の遺伝的背景の違い、あるいは種差、性差にかかわらず、１回の薬剤の投与によって確実に糖尿病を惹起できること。
２）糖尿病を起こした後の短い時間に投与した薬剤が体内から速やかに排泄され、糖尿病以外の何らの影響も及ぼさないこと。
３）ヒトをはじめ、ほとんどの哺乳類細胞を移植することが可能なこと。
しかし、上記の条件を満たす適当な動物モデルは確立されていなかった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するプロモーターを含む組換体ＤＮＡが導入された、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、ＴＲＥＣＫ法を用いてインシュリンプロモーターを含む組換えＤＮＡを導入したトランスジェニック動物を作製したところ、この動物が糖尿病を発症することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体ＤＮＡが導入された、トランスジェニック非ヒト動物。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ジフテリア毒素が投与されることにより糖尿病を発症することを特徴とする。また、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子は霊長類由来のヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子であり、ヒトヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子であることが好ましい。マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群から選択されるいずれか一種であり、マウスであることが好ましい。また、本発明に用いられる動物は、重度複合免疫不全動物であることが好ましい。
（２）ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体ＤＮＡを非ヒト動物に導入することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物の作製方法。
（３）上記（１）のトランスジェニック非ヒト動物又は上記（２）の方法により作製されたトランスジェニック非ヒト動物に、ジフテリア毒素を投与することを特徴とする糖尿病発症動物の作製方法。
（４）上記（１）のトランスジェニック非ヒト動物又は上記（２）の方法により作製されたトランスジェニック非ヒト動物にジフテリア毒素を投与して当該トランスジェニック非ヒト動物に糖尿病を発症させる方法。
（５）上記（３）記載の方法により作製された糖尿病発症動物。
（６）上記（３）の糖尿病発症動物に、候補物質を投与することを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
本発明のスクリーニング方法において、例えば、候補物質を接触させた糖尿病モデル動物の血糖値を測定し、当該測定された血糖値が候補物質を接触させない対照の糖尿病モデル動物の血糖値よりも低下したときは、前記候補物質を糖尿病治療薬として選択することができる。
また、本発明のスクリーニング方法において、候補物質を接触させた糖尿病モデル動物のインシュリン濃度（例えば血中インシュリン濃度）を測定し、当該測定された濃度が候補物質を接触させない対照の糖尿病モデル動物のインシュリン濃度よりも増加したときは、前記候補物質を糖尿病治療薬として選択することも可能である。
（７）上記（５）記載の動物に他の動物由来の幹細胞を移植することを特徴とする、当該他の動物由来の膵臓細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を作出する方法。
移植に使用される幹細胞としては、例えば造血幹細胞が挙げられる。造血幹細胞は、骨髄由来細胞又は臍帯血由来細胞であることが好ましい。
（８）上記（７）記載の方法により作製された、他の動物由来の膵臓細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物。
この非ヒト動物の膵臓細胞は、移植された他の動物の造血幹細胞由来の細胞を含む。造血幹細胞としては、骨髄細胞又は臍帯血細胞であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＴＲＥＣＫ法を用いて糖尿病を発症させる方法の模式図である。
図２は、本発明のトランスジエニックマウスの作製用組換体ＤＮＡの一部を示す。
図３は、ＰＣＲ法による導入遺伝子の検出を示す写真である。
図４Ａは、本発明のトランスジェニックマウスにジフテリア毒素の投与した後の血糖値を測定した結果を示すグラフである。
図４Ｂは、ジフテリア毒素投与による血糖値の上昇を示すグラフである。
図５Ａは、ジフテリア毒素の投与により血糖値が上昇した本発明のトランスジェニックマウスにインシュリンを投与した後の血糖値を測定したグラフである。
図５Ｂは、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇにおける血中インシュリン濃度を示すグラフである。
図５Ｃは、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスの高血糖症が、インシュリン依存性であることを示すグラフである。
図６は、本発明のトランスジェニックマウスの膵臓を組織学的に解析した写真である。
図７は、膵臓組織の抗ｈＨＢ−ＥＧＦ抗体による免疫組織染色の写真である。
図８は、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウス膵臓組織の免疫組織染色の写真である。
図９は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞の移植によって高血糖症が改善することを示す図である。
図１０は、ヒト臍帯血由来細胞を移植した後の血糖値の推移を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本国出願２００５−５１６９２号に記載の明細書、請求の範囲及び／又は図面の内容を包含する。
本発明は、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体ＤＮＡが導入された、トランスジェニック非ヒト動物、及び糖尿病を発症する糖尿病モデル動物に関する。
１．組換え体ＤＮＡ
本発明は、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換え体ＤＮＡが導入されたことにより糖尿病を発症するトランスジェニック動物が獲得されたことを特徴とする。以下に、本発明の組換え体ＤＮＡについて説明する。
（１）ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子
本発明のジフテリア毒素受容体の本体とは、霊長類由来のヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ；ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）である。ヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子には膜結合型と蛋白質分解酵素により遊離型となったものが存在するが、本研究では膜結合型のものを利用する。本発明に用いることのできるヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースを通じて容易に入手することができる。その例示として、ヒトヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子の塩基配列を配列番号１（ＮＭ＿００１９４５）に示す。但し、当業者であれば上記塩基配列の部分断片、例えばコード領域（配列番号１に示す塩基配列の２６２〜８８８番の領域）を選択して使用することが可能である。
また、本発明のヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列又はその部分配列のほか、配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘパリン結合性ＥＧＦ活性を有する領域をコードするＤＮＡを含む。
ヘパリン結合性ＥＧＦ活性とは、上記のように膜結合型のジフテリア毒素受容体として機能する活性を意味しする。
このようなヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。これらの方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））」を参照することができる。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブによるハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。また、配列番号１に示す塩基配列又はその部分配列（例えばコード領域の配列）と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつジフテリア毒素受容体としてのヘパリン結合性ＥＧＦ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列も用いることができる。
（２）インシュリンプロモーター
本発明で用いるインシュリンプロモーターとは、膵臓ランゲルハンス島β細胞における特異的な発現を制御するために必要なＤＮＡエレメントであり、その遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば本発明に用いることのできるインシュリンプロモーターの例示として、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８（８）：１４４５−１４５１に記載されているヒトインシュリンプロモーターの塩基配列（１．９ｋｂ）を配列番号２に示す。
また、本発明のインシュリンプロモーターは、配列番号２に示される塩基配列のほか配列番号２で示される塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインシュリンプロモーター活性を有する領域をコードするＤＮＡを含む。インシュリンプロモーター活性とは、膵臓において、そのプロモーターの下流に連結された遺伝子の発現を促進しうる活性をいう。
このようなインシュリンプロモーターは、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。これらの方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））」を参照することができる。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブによるハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。また、配列番号２に示される塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ上記インシュリンプロモーター活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
（３）遺伝子発現の調節
本発明の組換え体ＤＮＡは、細胞・組織特異的プロモーターであるインシュリンプロモーターを霊長類に特異的なジフテリア毒素受容体であるヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子に結合させたものである。このインシュリンプロモーターによりヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子が細胞の表面上に特異的に発現する。そのような組換え体ＤＮＡが導入された個体にジフテリア毒素（ＤＴ）を投与すると任意の時期にインシュリンプロモーターを発現する細胞を特異的に破壊することが可能になる。以下に、インシュリンプロモーターをヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子に結合させた発現カセットを含むクローニングベクターの作製方法を示す。
本発明のジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子であるヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子及びインシュリンプロモーターは通常の化学合成法または生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、ＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。必要に応じて、ＴＡクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認してもよい。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。なお、得られたＰＣＲ産物は、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等を用いて精製することができる。必要に応じて、シークエンサー等を用いて期待された遺伝子の塩基配列を確認することができる。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子をを公知の制限酵素等で切断する。このように切出したヘパリン結合性ＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入する。そして、プロモーターのＤＮＡを、制限酵素等を用いて切断し、これを先ほど挿入した遺伝子の上流に、上記プロモーターが作動可能な部位に挿入する。ＤＮＡの結合には、ＤＮＡリガーゼを用いることができる。ベクターとしてはｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等の動物ウイルスなどが挙げられ、これらのベクターの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどを用いることができる。本発明においては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔやｐＡＴ１５３などが好ましい。
（４）ＴＲＥＣＫ法
ＴＲＥＣＫ（ｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ）法は、ジフテリア毒素受容体遺伝子を標的細胞群に特異的に発現させたトランスジェニック動物を作製し、ジフテリア毒素を投与することにより任意の時期かつ定量的に障害を与えることができるという、個体内での細胞系列の役割を明らかにするための新しい独創的な手法である。以下にＴＲＥＣＫ法の原理を説明する。
ヒトやサルのような霊長類とマウスやラットなどのげっ歯類動物とでは、ＨＢ−ＥＧＦを構成するアミノ酸配列が微妙に異なっており、ジフテリア毒素が受容体依存的なエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる際のジフテリア毒素に対する結合親和性も異なる。例えば、マウスの細胞は、ジフテリア毒素に耐性を示すが、それは、マウスのＨＢ−ＥＧＦはジフテリア毒素との親和性がヒトなどの受容体に比べ著しく低いために、ジフテリア毒素受容体としての機能が非常に微弱となり、ジフテリア毒素が上記受容体に結合できず、細胞内に入れないためである。しかし、マウス細胞にジフテリア毒素受容体であるヒト由来のＨＢ−ＥＧＦ（ｈＨＢ−ＥＧＦ）を発現させると、マウス細胞も導入されたヒト由来のＨＢ−ＥＧＦにより、ジフテリア毒素がヒトと全く同様に細胞内に取り込まれるため、マウスの細胞もジフテリア毒素感受性にさせることができる。この性質を利用して、標的となる細胞群にｈＨＢ−ＥＧＦを発現させたマウスを作製し、その細胞に障害を与えたい時期にジフテリア毒素を投与すると標的とする細胞だけを除去したり、一過性的な障害を与えたりすることができる。
具体的には、ジフテリア毒素は、分子量５８，０００のタンパク質でフラグメントＡとフラグメントＢからなるが、いったん細胞内に取り込まれると、フラグメントＡが標的分子であるペプチド鎖伸長因子２（ＥＦ−２）をＡＤＰリボシル化し不活化するため、結果としてタンパク質合成が阻害され細胞が死ぬ。マウスの細胞がジフテリア毒素に耐性を示すのは、マウスのＨＢ−ＥＧＦがジフテリア毒素受容体としての機能をもたず、ジフテリア毒素が細胞内に入れないためである。そこで、マウス細胞にジフテリア毒素受容体であるヒト由来のＨＢ−ＥＧＦ（ｈＨＢ−ＥＧＦ）を発現させると、マウスもジフテリア毒素感受性になる。ＴＲＥＣＫ法は、この性質を利用したもので、標的となる細胞群にｈＨＢ−ＥＧＦを発現させたマウスを作製し、その細胞に障害を与えたい時期にジフテリア毒素を投与すると、標的とする細胞だけを除去したり、一過性的な障害を与えたりすることができる。
ＴＲＥＣＫ法の具体的な実験手順は以下のとおりである、すなわち、標的にする細胞群のみに特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域を有するプラスミドを作製する。プラスミドには、必要に応じてエンハンサー領域を含めてもよい。このとき、作製したプラスミドをＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心法等で調製し、導入遺伝子部分を制限酵素で切り出し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、精製する。この導入遺伝子をトランスジェニック動物の作製に供する。
作製したトランスジェニック動物に対するジフテリア毒素の投与方法は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内のいずれも可能である。投与量は、用いる動物によって異なるが、例えば、マウスの場合は、ジフテリア毒素を５０μｇ／ｋｇ投与しても異常は認められないため、通常は、５０μｇ／ｋｇの１／１０００〜１／１０にあたる５０ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ程度である。また、投与時期は、導入遺伝子を破壊させたい時期にあわせて投与することができる。
本発明のＴＲＥＣＫ法を用いて標的組織又は細胞を破壊する場合の模式図を図１に示す。図１において、糖尿病を発症させるには、組織／細胞特異的プロモーター／エンハンサとしてインシュリンプロモーターを使用すればよい。
（５）糖尿病
糖尿病とは、インシュリン作用の不足、つまりインシュリンの供給不足と、インシュリン標的臓器での感受性の低下が原因となり、血液中のブドウ糖が増えすぎて（高血糖）尿の中に糖が溢れてきた状態（糖尿）をいう。糖尿病は、（ｉ）小児期に、膵臓β細胞がなんらかの原因で破壊された結果、インシュリンを分泌できなくなり、高血糖として比較的急激に発症するＩ型糖尿病、（ｉｉ）インシュリンの分泌量が低下しているか、インシュリンの血糖を下げる作用が弱くなって発症するもので、遺伝素因の他に、食生活、運動不足、ストレス等の要因が大きく関わっているインシュリン非依存型であるＩＩ型糖尿病、（ｉｉｉ）妊娠をきっかけに発症する妊娠糖尿病などに分類されている。本発明のトランスジェニック非ヒト動物が発症するのはＩ型糖尿病である。
２．トランスジェニック非ヒト動物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ジフテリア毒素を投与することにより、糖尿病を発症することを特徴とする。以下に本発明のトランスジェニック非ヒト動物の製法及びその表現形質について説明する。
（１）トランスジェニック非ヒト動物の作製方法
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子組換え技術を用いて上記組換体ＤＮＡを非ヒト動物のゲノムに導入することによって得ることができる。本発明に用いられる動物の種類は、特に限定されるものではない。たとえば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びウマなどの実験動物又は家畜が挙げられる。
本発明では取り扱いが容易で繁殖しやすい点でマウスが好ましい。以下、マウスを例に説明する。
トランスジェニック非ヒト動物の作製は、例えばマウスを用いた標準的な方法、すなわち初期受精卵を用いたマイクロインジェクション法、又はＥＳ細胞による導入法で行うことができる。マイクロインジェクション法では、トランスジェニック動物作製のためのマイクロインジェクションに用いる導入遺伝子、例えば本発明における図２に示すごとく作製された発現カセットを含むクローニングベクターを作製し、次いで制限酵素切断等により、該発現ベクターから発現カセットを切り出し、精製したＤＮＡ断片を受精したマウス卵細胞の前核中に例えば、標準的手法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら，（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って注入する。
トランスジェニックマウスの同定のために、耳穿孔片（ｅａｒ−ｐｕｎｃｈｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ）もしくは尾組織からゲノムＤＮＡを調製する。すなわち、穿孔片もしくは尾組織片をＰＣＲ緩衝液／非イオン性界面活性剤及びプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ゼラチン、０．４５％  ＮＰ−４０、０．４５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に入れ、５５℃で一晩インキュベートする。インキュベート後、プロテインキナーゼＫを失活させるために、９５℃で１５分間インキュベートし、得られた溶液をＤＮＡ試料とする。導入遺伝子の確認のために、例えば本発明における導入した遺伝子組換え体の一部を増幅するためのプライマー（例えば下記塩基配列のもの）を使用し、導入した遺伝子組換え体を鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅する。
５’−ＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号４）及び
５’−ＣＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号５）
ＰＣＲの反応組成はＴａＫａＲａ  Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）および付随の反応液を使用し、ＰＣＲ反応は９６℃で２分の後、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のセットを３５サイクル、続き７２℃で７分行うことにより目的とするＤＮＡ断片を増幅することが可能である。
ＥＳ細胞による導入法では、得られた組換体ＤＮＡをＥＳ細胞に導入する。ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株及び新しく樹立した細胞株のいずれをも使用することができる。例えばＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株等を使用することができる。これらのどのＥＳ細胞株を用いるかは、実験の目的又は方法により適宜選択することができる。ＥＳ細胞への遺伝子導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法を採用することができるが、簡便に多数の細胞を処理できる点でエレクトロポレーション法が好ましい。
組換体ＤＮＡをＥＳ細胞中に導入した場合、ＥＳ細胞のゲノム中の、組換体ＤＮＡと相同な部分の特定遺伝子と、組換体ＤＮＡとの間で相同的組換えが起こることによって、組換体ＤＮＡの遺伝子がＥＳ細胞に導入される。
導入遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることによって検定することができる。あるいは、薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子を含むベクターを用いることによってセレクションを行ってもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子などが挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子などが挙げられる。
導入遺伝子の組込みが確認されたＥＳ細胞を同種のマウス由来の胚内に戻すことにより、宿主胚の細胞塊に組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親に移植して発生及び生育させることにより、キメラトランスジェニックマウスが得られる。そして、仮親から生まれた子（マウスの場合は約１７日で子が生まれる）のうちキメラマウスを選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラマウスを正常な動物と交配することにより、生殖系列のキメラマウスであることの確認が可能である。その後、正常な雌と交配し、Ｆ１を得て変異動物系統を樹立する。
上記のようにして得られるキメラトランスジェニックマウスは、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方に組換体ＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ１動物のうち相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。組換体ＤＮＡの導入は、ＰＣＲにより確認することができる。
このトランスジェニックマウスを自然交配あるいは体外受精により継代することにより、本発明のトランスジェニックマウスが作製される。本発明のトランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）は、上記の通り継代（自然交配又は対外受精）により遺伝子型を子孫に引き継ぐことができる。従って、本発明のトランスジェニック動物には、その子孫も含まれる。
（２）重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ；Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）動物
重度複合免疫不全（以下、ＳＣＩＤという場合もある）動物とは、遺伝子組換えによる再構成の段階で断片化したＤＮＡの結合を行うＤＮＡ依存性蛋白質リン酸化酵素のサブユニットＰ３５０の変異により得られ、常染色体劣性の遺伝様式をとる、自然発症の突然変異体動物をいう。この動物は、最初に、Ｄｒ．Ｍｅｌｖｉｎ  Ｂｏｓｍａらによって１９８０年にＣ．Ｂ−１７系統マウスで発見された。このマウスはＴ細胞及びＢ細胞がないことから、重度の免疫不全を呈し、その異種細胞、組織の移植に対する拒絶が少ないため、ヒトの正常造血細胞ですら移植可能である。従って、ＳＣＩＤ動物は、各種疾患モデル動物として有用であるほか、免疫不全であることを利用した感染防御に関する研究、移植ヒト細胞、腫瘍を用いた研究にも応用可能である。このような動物としては、例えば、マウス、ラット、イヌなどが挙げられる。ＳＣＩＤ動物では現在のところマウスのみが市販され、それらＳＣＩＤマウスは動物業者の日本クレアから購入することができる。
このようにＳＣＩＤ動物は、免疫不全であるため、ヒト臓器などを移植することができる。
従来、（ｉ）ＳＣＩＤマウスを用いて、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）投与により、糖尿病を発症することができるというＧｅｒｌｉｎｇらの報告（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４３：４３３−４４０，１９９４）、及び、（ｉｉ）ＳＣＩＤマウスにヒト、あるいは他の動物の膵臓、骨髄その他を移植し、膵臓β細胞の幹細胞、または前駆細胞を検索・同定するといった報告（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  １００：７２５３−７２５８．２００３）等が知られている。
そこで本発明者は、ＳＣＩＤマウスに糖尿病を発症させ、そこにヒトをはじめとする様々な動物種からの膵臓β細胞の幹細胞、または前駆細胞を移植することを試みた。そして、ＴＲＥＣＫ法を上記移植方法に適用すれば、より再現性の高い、技術的にも容易な系が確立できると考えた。
従って、上記ＳＣＩＤ動物を用いて図２に示すような組換え体ＤＮＡを動物のゲノムに導入することにより糖尿病を発症させることができれば、この動物にヒトをはじめとする様々な動物種からの膵臟β細胞の幹細胞、または前駆細胞を移植することができるため、糖尿病発症モデル動物等として好ましい。
（３）糖尿病モデル動物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物にジフテリア毒素を投与することにより、当該動物は、糖尿病を発症する。具体的には、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与するジフテリア毒素は、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ  ＰＷ８）の培養上清ろ液から、限外ろ過により濃縮したものを、硫安沈殿させ、さらにＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーにより精製したのち、適当に希釈したものを使用する。ジフテリア毒素はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（＃Ｄ０５６４）からも入手しうる。
通常、マウスはジフテリア毒素を５０μｇ／ｋｇ投与しても全く異常は認められないので、この量までジフテリアを使用することができるが、通常はその１／１０００〜１／１０量である５０ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ程度投与するのがよい。ジフテリア毒素の投与方法は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内のどれでも可能である。
糖尿病の発症は、マウス尾静脈を注射針で穿刺して得られる血液を、血糖測定機器デキスターＺＩＩ（バイエル社）を用いて血糖値（血液中のグルコース濃度）を測定することで容易に判定できる。血糖値測定用機器は、その他ヒト糖尿病患者用に広く市販されているものを用いても差し支えない。尿中の糖は、プレテスト（和光純薬社）やウリエース（テルモ社）などを用いて検出可能である。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物に糖尿病を発症させるには、たとえば、本発明のトランスジェニックマウス対して、ジフテリア毒素５０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇを腹腔内に投与すればよい。具体的には、本発明のトランスジェニックマウス対して、ジフテリア毒素５０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇを腹腔内に投与後２日以内に血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上に上昇し、尿中に糖およびケトン体が検出されるなど、糖尿病に特有な所見を呈する。糖尿病を発症した当該マウスは、多飲・多尿・体重減少など、ヒトの糖尿病患者の多くに見られる現象も認められる。従って、糖尿病を発症したマウスは糖尿病モデルマウスとして利用することができる。
３．糖尿病治療薬のスクリーニング方法
本発明は、ジフテリア毒素を投与されたことにより糖尿病を発症したトランスジェニック動物に、糖尿病治療のための薬物の候補物質（被験物質）を接触（例えば投与）することにより、糖尿病治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、ジフテリア毒素を投与されたことにより糖尿病を発症した本発明のトランスジェニック非ヒト動物またはその一部に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた非ヒト動物又はその一部において標的とする疾患と相関関係を有する物質の指標値（例えば血糖値、あるいは血中又は他組織のインシュリン濃度）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、糖尿病の症状を軽減または消滅させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。具体的には、候補物質を接触させた非ヒト動物の血糖値を測定し、当該測定された血糖値が候補物質を接触しない対照動物における血糖値よりも低下したときは、前記候補物質を、糖尿病治療薬として選択することができる。
また、候補物質を接触させた非ヒト動物のインシュリン濃度を測定し、当該測定された濃度が候補物質を接触しない対照動物におけるインシュリン濃度よりも増加したときは、前記候補物質を糖尿病治療薬として選択することができる。インシュリンを測定するための組織は特に限定されるものではないが、血中インシュリンが好ましい。
「トランスジェニック非ヒト動物又はその一部」とは、動物の生体の全身、及び限定された組織又は器官の両者を含む。限定された組織又は器官の場合は、動物から摘出されたものも含む。本発明では、膵臓が好ましい。
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、有機酸又は無機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験動物を候補物質で接触させる方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、ある候補物質を投与した場合に、糖尿病の症状が緩和もしくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、糖尿病治療薬として選択することが可能である。
４．細胞移植
本発明は、上記糖尿病モデル動物に、他の動物由来の細胞を移植することを特徴とする、他の動物由来の膵臓細胞を有する動物を作出する方法を提供する。「他の動物」とは、糖尿病モデル動物の作製に使用された動物とは異種の動物、及び同種で異系の動物のいずれをも意味する。「異種の動物」は、例えばヒトのほか、マウス、サル、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、ウマなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「同種で異系の動物」は、同じ動物種ではあるが異なる系統の動物を意味し、例えば、モデル動物の作製に使用したマウスがＣ３Ｈであれば、移植に使用されるマウスとしてＣ５７ＢＬ／６などが挙げられる。
移植に使用される細胞は、膵臓細胞（α細胞、β細胞を含む）、幹細胞などの未分化細胞であるが、造血幹細胞（特に骨髄細胞、臍帯血細胞）が好ましい。幹細胞を移植することにより、レシピエントの破壊された膵臓細胞又は組織においてドナー由来の細胞が再生され、生着して、レシピエントは正常な膵臓機能を有するようになる。本発明は、このようにして作製されたトランスジェニック非ヒト動物も提供する。
ここで、未分化細胞としては、マウス（Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４−１５６，１９８１）、ラット（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３（１）：２８８−２９２，１９９４）、サル（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１７）：７８４４−７８４８，１９９５）、ウサギ（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４５（４）：４３９−４４３，１９９６）についてはＥＳ細胞等が確立している。また、ブタについてはＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍ）細胞が確立している（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ５７（５）：１０８９−１０９５，１９９７）がこれらに限定されない。なお、未分化状態を維持しているか否かは、例えば、哺乳動物（例えばマウス又はウシ）で確立されている、公知の各種マーカーにより確認することができる。
造血幹細胞は、骨髄由来細胞や、臍帯血由来細胞のほか、末梢血造血幹細胞などが含まれる。本発明で用いる造血幹細胞は、骨髄、臍帯血又は末梢血から採取し、純化することが可能であり、細胞表面に存在する様々な表面抗原を用いる方法が知られている。代表的な方法としてＯｓａｗａらの方法（Ｏｓａｗａ  Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉ  Ｎ，Ｔａｋａｈａｓｉ  Ｎ，Ｔｏｋｕｏｍｏｔｏ  Ｙ，Ｉｎｏｕｅ  Ｈ，Ｎａｋａｕｃｈｉ  Ｈ，Ｉｎｖｉｖｏ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ（ｌｏｗ／−）ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７−３２１４，１９９６）が知られている。この方法では骨髄、臍帯血又は末梢血から有核細胞を分離し、これに表面抗原に対する抗体を作用させ、細胞分離器で分離する。ここで得られた細胞はそのまま培養可能である。なお、本発明で用いる造血幹細胞は未分化のものでもよい。
移植する細胞数は限定されるものではないが、レシピエント動物がマウスの場合、ドナー細胞の個数は、例えば１０４〜１０９個、好ましくは１０６〜１０８個である。
また、上記細胞を動物に移植する方法はよく知られており、当業者は公知の方法に従って行うことができる。例えば、骨髄細胞を培養して静脈内へ投与する方法を採用することができる。
移植後は、移植細胞又は本発明のトランスジェニック動物を観察して、移植した幹細胞が目的の細胞へ分化したかどうか、幹細胞が移植した組織等へ定着したどうか、幹細胞が癌化していないかどうか、移植によりクローン動物の健康状態が損なわれていないかどうか、発症させた糖尿病に対し移植細胞が治療効果を発揮したかどうか、移植細胞が体内のどの部分へ移動したか、等の項目を評価する。例えば、本発明のトランスジェニック動物の肉眼による観察、移植細胞やその周辺組織の顕微鏡による観察、マーカー（例えば、糖尿病病態マーカー遺伝子、特定細胞への分化の指標となる遺伝子の発現の検出などを行うことにより評価する。また、上記方法により作出された動物の移植組織がレシピエント由来でなく、ドナー由来の組織であることは、血液中にドナー動物種のインシュリンを検出することで確認できる。例えば、マススペクトル解析を行い、ドナー動物種のインシュリンの分子量と一致する分子の存在を確認すればよい。ドナー動物種のインシュリンの分子量はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）やＳｗｉｓｓＰｌｏｔ等の公共のデータベースを通じて遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列を入手することにより容易に得られる。あるいはレシピエントからＤＮＡを抽出し、ドナー動物種特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっても確認できる。また、ドナー動物種由来のタンパク質を特異的に認識する抗体（例えば、抗サイトケラチン１８抗体、抗ＭａｆＡ抗体、抗Ｐｄｘ１抗体など）を用いて、組織切片の免疫染色を行うことによっても確認できる。マウスおよびラット由来の細胞を移植した場合には、上記動物にＤＴを投与することにより容易に確認できる。具体的には、上記動物にＤＴを投与すると血糖値が低下するか、又は血糖値の上昇が認められないことが確認できればよい。
本発明において、ＤＴを投与して膵臓β細胞を傷害した本発明の上記マウス（ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウス）に、異種動物由来の細胞として、例えば、ヒト膵臓β細胞を移植すると、マウスの生体内にヒト膵臓β細胞が生着する。このようにして、ヒト由来の膵臓β細胞を有するモデル動物（例えば、ＳＣＩＤ−Ｈｕ（ヒト）マウスモデルなど）を作出することが可能となる。
上記のように膵臓細胞又は幹細胞を移植したモデル動物を用いて、ドナー由来の細胞が膵臓細胞の機能を有するに至る分化過程を解析することができ、これにより、膵臓細胞や幹細胞の探索・同定に利用することもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
発現カセットを含むクローニングベクターの構築
糖尿病モデルＳＣＩＤマウスの作製のために構築した遺伝子組み換え体は、ヒトインシュリンプロモーター−ウサギβ−グロビンイントロン−ヒトＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡ−ウサギβ−グロビンポリ（Ａ＋）シグナルの順に配列される。プラスミドｐＲｃＨＢＥＧＦ（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）１３：２３２２−２３３０）を材料にｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓにより、合成されるＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１４８番目のロイシンをセリンに、１４９番目のプロリンをスレオニンに置換する変異を入れ、ヒトＨＢ−ＥＧＦ（Ｌ１４８Ｓ／Ｐ１４９Ｔ）ｃＤＮＡ（配列番号３）を得た。これをプラスミドｐＩｎｓ−１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８：１４４５−１４５１）のヒトインシュリンプロモーター（１．９ｋｂ）の下流に挿入し、プラスミドｐＩｎｓ−ＴＲ２を構築した（図２）。
【実施例２】
【０００７】
トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニック動物作製のために用いるＤＮＡ断片を、実施例１に記載したプラスミドｐＩｎｓ−ＴＲ２のＳｐｈＩ及びＸｈｏＩによる二重切断によって取得し、クローニングベクターからアガロースゲル電気泳動によって分離し、次いでこれをＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）によって精製した。精製したＤＮＡ断片を受精したマウス（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）卵細胞の前核中に標準的手法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら，（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って注入した。トランスジェニックマウスの同定のために、耳穿孔片（ｅａｒ−ｐｕｎｃｈｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ）からゲノムＤＮＡを調製した。すなわち、穿孔片をＰＣＲ緩衝液／非イオン性界面活性剤及びプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ゼラチン、０．４５％  ＮＰ−４０、０．４５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に入れ、５５℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、プロテインキナーゼＫを失活させるために、９５℃で１５分間インキュベートし、得られた溶液をＤＮＡ試料とした。導入遺伝子の確認のためには以下の塩基配列を有するプライマーを使用し、導入遺伝子組み換え体を鋳型としてＰＣＲ反応によって増幅した。
フォワード：５’−ＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号４）
リバース：５’−ＣＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号５）
ＰＣＲの反応組成はＴａＫａＲａ  ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）および付随の反応液を使用し、ＰＣＲ反応は９６℃で２分の後、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のセットを３５サイクル、続き７２℃で７分行うことにより目的とするＤＮＡ断片（０．７ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲ反応後、アガロースゲル電気泳動を行い、導入遺伝子の有無を判定した。
判定結果を図３に示す（レーン１：ＤＮＡサイズマーカー（λＤＮＡ  ＨｉｎｄＩＩＩ消化物＋φＸ１７４ＨａｅＩＩＩ消化物混合液）、レーン２：Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄゲノムＤＮＡ、レーン３：導入遺伝子とＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄゲノムＤＮＡ、レーン４〜６：サンプルＤＮＡ）。４番および５番のマウスゲノムに当該遺伝子が導入されたことを示す。
【実施例３】
【０００８】
ジフテリア毒素の投与
（１）血糖値（血中グルコース濃度）の測定
作製したトランスジェニックマウス（ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウス）に各種濃度のジフテリア毒素（ＰＢＳに溶解）を腹腔内投与した、血糖値の変化を、デキスターＺＩＩ（バイエル社）を用いて測定した。結果を図４Ａに示す。トランスジェニックマウスでは、５０ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇのジフテリア毒素の投与によって、いずれの場合にも投与後２日後には血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上に上昇し、４日目以降は４００ｍｇ／ｄｌ以上の高値が５０日以上持続した。同腹の非トランスジェニックマウスでは毒素投与による血糖値の変化は認められなかった。
また、上記と同様にして、さらにジフテリア毒素の接種量を少ない範囲に設定して（５ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ）腹腔内投与した。
その結果、１回のＤＴ投与によって、２ヶ月以上高血糖状態が持続した。これにより、高血糖を引き起こすために必要な最低ＤＴ量は５０ｎｇ／ｋｇであることが示された（図４Ｂ）。
（２）インシュリン投与による血糖値の降下
ジフテリア毒素投与によるトランスジェニックマウスの血糖値の上昇がインシュリンに依存的なものか否かを調べるため、１μｇ／ｋｇのジフテリア毒素投与により血糖値の上昇したマウスに超速攻型インシュリン（ノボラピッド注；ノボ  ノルディスク  ファーマ社）の投与を行った。糖尿病を発症したトランスジェニックマウス（血糖値５００ｍｇ／ｄｌ以上）は、１００ｍＵのインシュリンの投与によって速やかに正常値まで降下した（図５Ａ）。
さらに、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスの血中インスリン濃度を比較した。ＤＴ非投与時には差は認められなかった。しかし、ＤＴを投与すると、投与後５日目で、非Ｔｇマウスでは変化しないが、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスでは顕著に減少した。これらのマウスにブドウ糖を２ｇ／ｋｇ経口投与して１０分後の血中インスリン濃度を測定すると、非Ｔｇマウスでは速やかに上昇するが、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスでは、インスリンの分泌ができず、血中インスリン濃度に変化は見られなかった（図５Ｂ）。
次に、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−ＴｇマウスにＤＴを１μｇ／ｋｇ投与して７日目の高血糖誘導マウスに、超即効性インスリン（ノボラピッド注）を腹腔内投与した。血糖値が５００ｍｇ／ｄｌの個体では、１００ｍＵの投与で血糖値の正常化が認められた。高血糖症がより重篤な個体（血糖値＞６００ｍｇ／ｄｌ）では、１００ｍＵインスリン投与では血糖値が認められなかったが、１Ｕの投与で正常血糖値まで低下した。従って、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスの高血糖症はインスリン依存性であることが示された（図５Ｃ）。
（３）トランスジェニックマウス膵臓の組織学的解析
ジフテリア毒素投与前およびジフテリア毒素５μｇ／ｋｇ投与後７日目のマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、膵臓を摘出、１０％中性緩衝ホルマリン液にて一晩固定後、定法に従いパラフィンで包埋し、ミクロトームを用いて５μｍ厚の切片を作製した。１次抗体としてＧｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  Ａｎｔｉ−Ｓｗｉｎｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（ＤＡＫＯ社）およびＲａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ（ＤＡＫＯ社）を、２次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて二重染色し、レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察した。毒素投与前のトランスジェニックマウスの脾臓ランゲルハンス島においては正常マウスと同様に約７０％が抗インシュリン抗体で染色されるβ細胞であったが、毒素投与後はインシュリン陽性細胞が著明に減少し、抗グルカゴン抗体で染色されるα細胞の数が増加していた（図６パネルＡ）。
ジフテリア毒素投与前およびジフテリア毒素４０μｇ／ｋｇ投与後７日目のマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、膵臓を摘出、１０％中性緩衝ホルマリン液にて一晩固定後、定法に従いパラフィンで包埋し、ミクロトームを用いて５μｍ厚の切片を作製した。その後、ＨＥ染色を行い、顕微鏡で観察した。その結果、ＤＴ非投与のＴｇマウスのランゲルハンス島は正常であったが、ＤＴを投与したＴｇマウスでは、ランゲルハンス島内の細胞が損傷されていた（図６パネルＢ）。
次に、糖尿病モデルマウス（ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウス）と同腹ＳＣＩＤマウスの膵臓切片を抗ｈＨＢ−ＥＧＦ抗体を用いて免疫染色した。その結果、ＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスのランゲルハンス島にのみ、ｈＨＢ−ＥＧＦ抗体で染色される細胞が認められた（図７）。
さらに、Ｔｇマウスと非Ｔｇ−ＳＣＩＤマウス膵臓切片を抗ｈＨＢ−ＥＧＦ抗体、抗インシュリン抗体、抗グルカゴン抗体でそれぞれ免疫染色を行った。その結果、インシュリン抗体で染色されるβ細胞がｈＨＢ−ＥＧＦ抗体で染色された。非Ｔｇ−ＳＣＩＤマウスのβ細胞には、ｈＨＢ−ＥＧＦの発現は認められなかった（図８）。
【実施例４】
【０００９】
糖尿病モデルマウスへの造血細胞の移植
（１）骨髄細胞の移植
ＤＴ投与後７日目の高血糖誘導マウスに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＴ細胞を除去した骨髄細胞（２ｘ１０７個）を尾静脈より移入した。図９において、Ｔｇマウス−２（■）は移植後９週（５４日）後には血糖値が顕著に低下し、移植後１２週（８２日）でほぼ正常値となった。従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞の移植によって、高血糖症が改善することが示された。
組織化学的にも、膵臓ランゲルハンス島にβ細胞が再生していた（図９、写真のパネル）。この個体に、ＤＴを再投与しても血糖値の上昇が認められなかったことから、再生した膵臓β細胞はレシピエント由来の細胞ではなく、ドナーであるＣ５７ＢＬ／６由来の細胞であることが示された。
（２）ヒト臍帯血由来未分化細胞の移植
ＤＴ投与により高血糖症を誘導したＳＣＩＤ−Ｉｎｓ−ＴＲＥＣＫ−Ｔｇマウスに、ＤＴ投与後７日目にヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ３４陰性細胞を尾静脈より移入し、経時的に血糖値を測定した。ＣＤ３４陰性細胞移入個体は、移入後１００日後でも血糖値３００ｍｇ／ｄｌ以上であったが、ＣＤ３４陽性細胞移入個体は、移入後４０日から血糖値が低下し、移入後７０〜８０日目には２００ｍｇ／ｄｌ以下となった（図１０）。
従って、ヒト臍帯血由来細胞の移植によって、ヒト由来細胞がマウスに生着して膵臓細胞に分化することにより膵臓細胞機能が回復し、高血糖症が改善することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明の糖尿病モデル動物は、再生医学を利用したＩ型糖尿病のための動物モデルとしての３つの条件、すなわち、（ｉ）確実に糖尿病を惹起できること、（ｉｉ糖尿病以外の何らの影響も及ぼさないこと、及び（ｉｉｉ）他の哺乳類細胞を移植することが可能なことを十分にクリアしたものであり、その有用性は高く、糖尿病の病態解明及び糖尿病治療薬の開発に利用できるという極めて優れた効果を有する。
さらに、本発明の糖尿病モデル動物にＤＴを投与して膵臓β細胞を傷害した後にヒト膵臓β細胞を移植すると、マウスの生体内にヒト膵臓β細胞が生着するため、本発明のモデル動物はＳＣＩＤ−Ｈｕ（ヒト）モデルとして極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１１】
配列番号３：変異体
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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