(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式を有する化合物であって：
【化１】
0005031164.tif 000030
ここで、
ＰＯＬＹは、ポリ（アルキレンオキシド）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ならびにポリ（ビニルアルコール）からなる群より選択される、水溶性の非ペプチド性ポリマーであって；
Ｌは、エーテル、アミン、イミド、エステル、アミド、カルバミド、イミン、およびチオエステルからなる群より選択される結合基を含む結合基であるか、あるいは、Ｌは、−Ｏ−または−ＨＮ−ＣＯ−であって；
Ａｒは、フェニル、置換されたフェニル、ビフェニル、置換されたビフェニル、多環式アリール、置換された多環式アリール、複素環式アリール、および置換された複素環式アリールより選択される芳香族基であって、ここで、該置換されたフェニル、該置換されたビフェニル、該置換された多環式アリール、および該置換された複素環式アリールにおける置換は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドからなる群より選択され；そして
Ｘは、カルバメート結合を形成するように生物学的に活性な因子のアミノ基と反応し得る活性化基であって、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリルオキシ、およびｐ−ニトロフェニルオキシからなる群より選択される活性化基である、化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記ＰＯＬＹが、２００〜１００，０００ダルトンの分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記ＰＯＬＹが、ＯＨ、アルコキシ、および
【化２】
0005031164.tif 000031
からなる群より選択されるキャッピング基をさらに含み、
ここで、
Ｌ’は、エーテル、アミン、イミド、エステル、アミド、カルバミド、イミン、およびチオエステルからなる群より選択される結合基を含む結合基であるか、あるいは、Ｌ’は、−Ｏ−または−ＨＮ−ＣＯ−であって、
Ａｒ’は、フェニル、置換されたフェニル、ビフェニル、置換されたビフェニル、多環式アリール、置換された多環式アリール、複素環式アリール、および置換された複素環式アリールより選択される芳香族基であって、ここで、該置換されたフェニル、該置換されたビフェニル、該置換された多環式アリール、および該置換された複素環式アリールにおける置換は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドからなる群より選択され、そして
Ｘ’は、カルバメート結合を形成するように生物学的に活性な因子のアミノ基と反応し得る活性化基であって、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリルオキシ、およびｐ−ニトロフェニルオキシからなる群より選択される活性化基である、化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記Ｌが、エーテル、アミン、イミド、エステル、アミド、カルバミド、イミン、およびチオエステルからなる群より選択される結合基を含む、化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記Ｌが、−Ｏ−または−ＨＮ−ＣＯ−である、化合物。
【請求項６】
以下の化学式を有する化合物であって：
【化３】
0005031164.tif 000032
ここで、
Ｌは、−Ｏ−または−ＮＨＣＯ−であって；
ＰＯＬＹは、−ＯＨ、アルコキシ、および
【化４】
0005031164.tif 000033
からなる群より選択されるキャッピング基を有するポリ（エチレングリコール）であって、
ここで、Ｌは記載される通りである、化合物。
【請求項７】
以下の化学式を有する化合物であって：
【化５】
0005031164.tif 000034
ここで、
ＰＯＬＹは、ポリ（アルキレンオキシド）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ならびにポリ（ビニルアルコール）からなる群より選択される、水溶性の非ペプチド性ポリマーであって；
Ｌは、エーテル、アミン、イミド、エステル、アミド、カルバミド、イミン、およびチオエステルからなる群より選択される結合基を含む結合基であるか、あるいは、Ｌは、−Ｏ−または−ＨＮ−ＣＯ−であって；
Ａｒは、フェニル、置換されたフェニル、ビフェニル、置換されたビフェニル、多環式アリール、置換された多環式アリール、複素環式アリール、および置換された複素環式アリールより選択される芳香族基であって、ここで、該置換されたフェニル、該置換されたビフェニル、該置換された多環式アリール、および該置換された複素環式アリールにおける置換は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドからなる群より選択され；そして
Ｙは、生物学的に活性な因子である、化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物であって、ここで、前記ＰＯＬＹが、２００〜１００，０００Ｄａの分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、化合物。
【請求項９】
請求項７に記載の化合物であって、ここで、前記ＰＯＬＹが、ＯＨ、アルコキシ、および
【化６】
0005031164.tif 000035
からなる群より選択されるキャッピング基をさらに含み、
ここで、
Ｌ’は、エーテル、アミン、イミド、エステル、アミド、カルバミド、イミン、およびチオエステルからなる群より選択される結合基を含む結合基であるか、あるいは、Ｌ’は、−Ｏ−または−ＨＮ−ＣＯ−であって、
Ａｒ’は、フェニル、置換されたフェニル、ビフェニル、置換されたビフェニル、多環式アリール、置換された多環式アリール、複素環式アリール、および置換された複素環式アリールより選択される芳香族基であって、ここで、該置換されたフェニル、該置換されたビフェニル、該置換された多環式アリール、および該置換された複素環式アリールにおける置換は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドからなる群より選択され、そして
Ｙ’は、生物学的に活性な因子である、化合物。
【請求項１０】
請求項７に記載の化合物であって、ここで、前記Ｌが、エーテル、アミン、イミド、エステル、アミド、カルバミド、イミンおよびチオエステルからなる群より選択される結合基を含む、化合物。
【請求項１１】
請求項７に記載の化合物であって、ここで、前記Ｌが、−Ｏ−または−ＨＮ−ＣＯ−である、化合物。
【請求項１２】
請求項７に記載の化合物であって、ここで、前記Ｙが、タンパク質、ペプチド、アミノ脂質、アミノ基を有する多糖類、およびアミノ−オリゴヌクレオチドからなる群より選択される、化合物。
【請求項１３】
以下の化学式を有する化合物であって：
【化７】
0005031164.tif 000036
ここで、
Ｌは、−Ｏ−または−ＮＨＣＯ−であって；
Ｙは、生物学的に活性な因子であって；
ＰＯＬＹは、−ＯＨ、Ｃ１〜４アルコキシ、および
【化８】
0005031164.tif 000037
からなる群より選択されるキャッピング基を有するポリ（エチレングリコール）であって、
ここで、ＹおよびＬは記載される通りである、化合物。
【請求項１４】
生物学的に活性な因子を用いて哺乳動物を処置するための請求項７に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記ＰＯＬＹが、ポリ（エチレングリコール）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、ポリ（オキシエチル化グルコース）、ならびにポリ（ビニルアルコール）からなる群より選択される、化合物。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記ＰＯＬＹが、直鎖のポリ（エチレングリコール）および分枝ポリ（エチレングリコール）からなる群より選択される、化合物。
【請求項１７】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記Ｌは、−Ｏ−および−ＮＨＣＯ−からなる群より選択される、化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロドラッグとして、そして架橋されたポリマーの分解可能な成分として有用なポリ（エチレングリコール）の加水分解可能な誘導体に関する。
【０００２】
（発明の背景）
生物学的に活性な因子および表面に対する親水性ポリマー（一般にＰＥＧとして称されるポリ（エチレングリコール））の共有結合は、バイオテクノロジーおよび医薬において重要な用途を有する。
【０００３】
ＰＥＧは、一般に水および多数の有機溶媒に可溶性である。ＰＥＧはまた、実質的に無毒であり、通常は、動物においていかなる顕著な免疫応答も認められない。ＰＥＧが、水に不溶性の化合物と化学的に結合する場合、得られた結合体は、一般に、水および多数の有機溶媒中に可溶性である。ＰＥＧと結合するこの因子が生物学的に活性である場合（例えば、薬物）、この因子の活性は、ＰＥＧの結合後にも保持され得、そしてこの結合体は、一般に、変化した薬物動態を示す。
【０００４】
このプロドラッグのアプローチ（ここで、薬物は、生理学的条件下でより複雑な因子（プロドラッグ）の分解によって遊離される）は、薬物送達の有効な構成要素である。Ｒ．Ｂ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，７（６）：６０１−６０９（１９９７）を参照のこと。プロドラッグは、例えば、生理学的条件下で分解し得る結合で、薬物とＰＥＧが結合することによって形成され得る。
【０００５】
しかし、全ての結合が、容易に分解し得、そしてプロドラッグの用途において有用であるわけではない。一般に、エステル結合（ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と薬物におけるアルコール基との間の縮合反応によって形成される）は、生理学的条件下でこの薬物を遊離するように加水分解される。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２３７９４において、パクリタキセルがエステル結合を用いてＰＥＧと結合し得、そして、この結合したパクリタキセルが加水分解によって血清中に遊離され得ることが開示されている。加水分解可能なエステル結合を介してＰＥＧと結合したジヒドロアルテミシニンの抗マラリア活性もまた、実証されている。Ｂｅｎｔｌｅｙら，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，３８（１）：５８４（１９９７）。
【０００６】
従来のアミド結合およびカルバメート結合（薬物におけるアミン基を用いて形成される）は、一般に、安定であり、そして実用化において必要とされる十分に短い時間内で遊離薬物を遊離するように加水分解しない。例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：１５７−１８２（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙら，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９：１１７７−１１８３（１９８３）を参照のこと。例えば、結合体におけるＰＥＧとタンパク質との間のカルバメート結合が、種々の生理学的条件下で安定であることが実証されている。ＬａｒｗｏｏｄおよびＳｚｏｋａ，Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２１：６０３（１９８４）。ペプチド、タンパク質、およびアミン基を有する小因子を含む多数の有用な薬物は、非加水分解性アミド結合および非加水分解性カルバメート結合を介してＰＥＧと結合している。ＰＥＧはまた、ＰＥＧアルデヒドを用いた還元的なアミノ化を介して、薬物におけるアミン基と結合し得、そして得られたアミン結合は、インビボでは非分解性である。
【０００７】
多数の薬物（例えば、タンパク質）が、結合基を形成する反応のために容易に利用可能であるアミン基を有するので、加水分解的に分解可能なこのような結合基が形成され、その結果、遊離タンパク質または他のアミン含有因子がインビボで制御された速度でプロドラッグから遊離され得ることが、所望される。イミンまたはシッフ塩基は、これらが遊離アミンおよびアルデヒドを生じるように加水分解される：
【０００８】
【化１１】
0005031164.tif 000002
（ここで、Ｒ’は、アミノ基を保有する薬物または他の因子）
ので、可能なアプローチを提供する。このアプローチは、イミン結合の加水分解によって生じる薬物の遊離をともなうＰＥＧとドキソルビシンとの結合において用いられる。Ｏｕｃｈｉら，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，３８（１）：５８２−３（１９９７）。イミンの形成は、水中で可逆性であるので、これらの化合物は、有機溶媒において最も良く調製される。従って、多数のタンパク質、ペプチド、および他の因子は、有機溶媒におけるこれらの乏しい溶解性および不安定性に起因して、イミンプロドラッグアプローチに受け入れられない。
【０００９】
結合体は、非加水分解性アミド結合または非加水分解性カルバメート結合を介して、アミン含有薬物と、ＰＥＧ骨格における加水分解的分解可能な結合基を有するＰＥＧ分子とが結合することによって調製され得る。このアミン含有薬物は、ＰＥＧ骨格の分解の際に遊離する。しかし、この遊離薬物は、通常、アミド結合またはカルバメート結合を介して結合したフラグメントを有し、そして天然の薬物または親薬物が遊離されない。
【００１０】
米国特許第４，９３５，４６５号は、カルボキシル基による隣接基関与がアミドの加水分解を補助し、このようにして、この薬物を遊離する水溶性プロドラッグを開示する。ＰＥＧは、その特許において開示されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）プロドラッグの成分であった：
【００１１】
【化１２】
0005031164.tif 000003
米国特許第５，５６１，１１９号および欧州特許番号５９５１３３−Ａは、以下に示されるようなドキソルビシンのプロドラッグを開示しており、このプロドラッグは、ベンジルグルクロニルカルバメート結合を活用する。第２の成分（グルクロニダーゼ）は、グルクロン酸を分離し、そして、ドキソルビシンおよびニトロベンゾキノンメチドを遊離するように添加される必要がある。
【００１２】
【化１３】
0005031164.tif 000004
米国特許第５，４１３，９９２号において開示されるような、なお別のアプローチにおいて、以下に示されるダウノマイシン（ｄａｕｎａｍｙｃｉｎ）のプロドラッグは、スルホン基に隣接するプロトンの引抜により開始される酵素誘導性脱離によって天然の薬物を遊離する。
【００１３】
【化１４】
0005031164.tif 000005
さらに、米国特許第４，７６０，０５７号は、カルバメート結合を含むプロドラッグの酵素的加水分解を記載する：
ＲＲ’ＮＣＯ２ＣＲ１Ｒ２Ｏ２ＣＲ３
ここで、ＲＲ’ＮＣＯ２ＣＲ１Ｒ２Ｏ２ＣＲ３は、薬物成分における第２級アミンを示し、そしてＲ１〜３は、種々の部分（例えば、水素、アルキル、またはシクロアルキル）である。このようなプロドラッグは、ＲＲ’ＮＣＯ２ＣＲ１Ｒ２ＯＨを生成するようエステラーゼによって加水分解され、次いで、このプロドラッグは分解して薬物因子を遊離する。
【００１４】
Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２：３６５７−３６６７（１９９７）は、ＰＥＧ誘導体とカルバメート結合を介して結合する薬物を有するプロドラッグを開示する。１，４または１，６の脱離反応は、遊離薬物を遊離するために必要である。このプロドラッグは、構造的に複雑であり、そして、毒性のキノンメチド中間体が遊離薬物と一緒に遊離され得る。
【００１５】
従って、先行技術におけるプロドラッグは、一般に、それらの実用化を制限する欠点を有する。酵素消化に対する要件は、このプロドラッグをインビボでの使用のために適切でなくするか、または少なくともあまり有用ではなくする。さらに、毒性の中間体の生成は、遊離薬物の遊離に付随し得る。従って、改善された特徴を有するプロドラッグが必要とされている。
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、生物学的に活性な薬剤が、水溶性の非免疫原性ポリマーに、加水分解可能なカルバメート結合によって結合されている水溶性プロドラッグを提供する。この生物学的に活性な薬剤は、酵素または触媒物質を添加する必要なく、インビボでカルバメート結合の加水分解によって容易に放出され得る。一般に、生物学的に活性な薬剤は、加水分解の際に、すなわち、さらなる部分が全くそれに結合されずに、そのもとの状態に放出される。さらに、水溶性の非ペプチドポリマーが使用されるので、実質的に不溶性の生物学的に活性な薬剤でさえ、インビボでプロドラッグにおいて、容易に送達され得る。
【００１７】
従って、本発明に従って、プロドラッグが提供され、このプロドラッグは、以下の式：
【００１８】
【化１５】
0005031164.tif 000006
を有し、ここで、ＰＯＬＹは、水溶性かつ非ペプチドのポリマーであり、Ｌは結合基であり、Ａｒは、芳香族基であり、そしてＹは、生物学的に活性な薬剤である。
【００１９】
この水溶性の、非免疫原性ポリマーは、ＯＨ、アルコキシ、および
【００２０】
【化１６】
0005031164.tif 000007
からなる群から選択されるキャッピング基を有し得、ここで、Ｌ’は結合基であり、Ａｒ’は芳香族基であり、そしてＹ’は生物学的に活性な薬剤である。好ましくは、ＰＯＬＹはポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、約２００〜約１００，０００ダルトンの分子量を有する。
【００２１】
本発明の別の実施形態に従って、化合物が提供され、この化合物は、以下の式：
【００２２】
【化１７】
0005031164.tif 000008
を有する。ここで、ＰＯＬＹは、水溶性の非ペプチドポリマーであり、Ｌは結合基であり、Ａｒは芳香族基であり、そしてＸは、生物学的に活性な薬剤のアミノ基と反応してカルバメート結合を形成し得る活性化基である。
【００２３】
必要に応じて、ＰＯＬＹは、ＯＨ、アルコキシ、および
【００２４】
【化１８】
0005031164.tif 000009
からなる群から選択されるキャッピング基を有し得、ここで、Ｌ’は結合基であり、Ａｒ’は芳香族基であり、そしてＸ’は、生物学的に活性な薬剤のアミノ基と反応してカルバメート結合を形成し得る活性化基である。好ましくは、ＰＯＬＹはポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、約２００〜約１００，０００ダルトンの分子量を有する。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、プロドラッグが提供され、このプロドラッグは、以下の式：
Ｙ−Ａｒ−Ｏ２Ｃ−ＮＨ−ＰＯＬＹ
を有し、ここで、Ｙは芳香族基を有する生物学的に活性な薬剤であり、Ａｒは生物学的に活性な薬剤Ｙの芳香族基（例えば、置換ベンゼンまたは他の芳香族（例えば、置換ナフタレンまたは複素環部分））であり、そしてＰＯＬＹは、水溶性の、非ペプチドポリマー（好ましくは、その形態のいずれかのポリ（エチレングリコール））である。この誘導体の加水分解により、親薬物Ｙ−ＡｒＯＨ、ならびにＰＯＬＹ−ＮＨ２およびＣＯ２を得る。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態に従って、加水分解的に分解可能なヒドロゲルが提供される。このヒドロゲルは、加水分解可能なカルバメート結合を介して、架橋剤に結合された骨格を含む。典型的に、適切な骨格は、アミノ基（好ましくは、少なくとも２つのアミノ基）を有する任意の化合物であり得る。このような骨格の例としては、タンパク質、ペプチド、アミノ炭水化物、アミノ脂質、ポリ（ビニルアミン）、ポリリジン、ポリ（エチレングリコール）アミン、アミノ基を有する薬学的因子などが挙げられるが、これらに限定されない。架橋剤は、以下：
【００２７】
【化１９】
0005031164.tif 000010
からなる群より選択され、ここで、ＰＯＬＹは、非ペプチドの水溶性ポリマーであり、ＬおよびＬ’は結合基であり、ＡｒおよびＡｒ’は、芳香族基であり、Ｚは、中央分枝コアであり、ｎは、２〜約１００であり、そしてＸおよびＸ’は、骨格のアミノ基と反応して、加水分解可能なカルバメート結合を形成し得る活性化基である。好ましくは、ＰＯＬＹはポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、約２００〜約１００，０００ダルトンの分子量を有する。
【００２８】
本発明の上記および他の特徴および利点、ならびにそれらが達成される手段は、特許請求の範囲および図面とともに以下の発明の詳細な説明の考察からより容易に明らかである。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、用語「プロドラッグ」は、規定された条件下で親の生物学的に活性な薬剤を放出または解放し得る生物学的に活性な薬剤の化学誘導体を意味する。親の生物学的に活性な薬剤をプロドラッグに転換することによって、この薬剤の溶解度および免疫原性が改変され得る。さらに、プロドラッグからのこの薬剤の放出の速度を制御することによって、インビボでのこの薬剤の作用の経時的な制御が、達成され得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的に活性な薬剤」は、以下を含むがこれらに限定されない生物学的生物の任意の物理的または生化学的特性に影響し得る任意の物質を意味する：ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒト。特に、本明細書中で使用される場合、生物学的に活性な薬剤は、ヒトまたは他の動物において、疾患を診断、治癒、緩和、処置または予防が意図されるか、あるいはそうでなければ、ヒトまたは動物の物理的または精神的な満足を増強するための任意の物質を含む。生物学的に活性な薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：有機および無機化合物、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖類、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のポリマー、およびその誘導体。生物学的に活性な薬剤の例としてはまた、例えば、抗生物質、殺真菌薬、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心臓血管剤、抗不安剤、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤などが挙げられる。
【００３１】
本発明のプロドラッグは、以下の式：
【００３２】
【化２０】
0005031164.tif 000011
を有し、ここで：
ＰＯＬＹは、実質的に、非免疫原性の水溶性ポリマーであり；
Ｌは共有結合、好ましくは加水分解に対して安定な結合であり；
Ａｒは芳香族基であり；そして
Ｙは生物学的に活性な薬剤である。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「基」、「官能基」、「活性部分」、「反応性部位」、「反応性基」および「反応性部分」は、全て、化学分野において、いくらか同義であり、そして当該分野で使用され、そして本明細書中で、薬剤の個別の規定可能な部分または単位、および何らかの機能または活性を実施し、そして他の薬剤または薬剤の一部分と反応性である単位をいう。
【００３４】
用語「結合基」は、通常化学反応の結果として形成され、そして典型的に、共有結合を含む基をいう。
【００３５】
本発明のプロドラッグにおいて、実質的に水溶性の非免疫原性ポリマーＰＯＬＹは、好ましくは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかし、他の連関ポリマーもまた本発明の実施における使用に適切であり、そして用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用が、この局面に含まれ、そして排除されないことが理解されるべきである。
【００３６】
ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧは、生物学的適用において有用である。なぜなら、それは、高度に所望である特性を有し、そして一般に、生物学的なまたは生物工学的適用について認められたからである。ＰＥＧは、典型的に、無色であり、無臭であり、水溶性であり、熱に安定であり、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解または変質せず、そして一般に非毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であると考えられ、これは、ＰＥＧが、害を与えることなく生きた組織または生物との共存が可能であることをいう。より具体的に、ＰＥＧは、通常、身体における免疫応答を生成する傾向にない。身体における何らかの所望の活性を有する薬剤に結合される場合、このＰＥＧは、この薬剤をマスクする傾向にあり、そして任意の免疫応答を減少し得、その結果、生物が、この薬剤の存在に許容し得る。従って、本発明のプロドラッグは、典型的に、実質的に非毒性であり、そして実質的な免疫応答を生成せず、あるいは凝固または他の所望でない効果を引き起こす傾向にはない。式−ＣＨ２ＣＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、ｎは約８〜約４０００である）を有するＰＥＧは、本発明の実施における１つの有用なポリマーである。好ましくは、約２００〜約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがＰＯＬＹとして使用される。
【００３７】
その最も一般的な形態において、ＰＥＧは、各末端にヒドロキシル基を有する線状ポリマーである：
ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧまたは簡潔にはｍＰＥＧとして一般には、使用され、ここで、一方の末端は比較的不活性なメトキシ基であるが、他の末端は、化学修飾の準備を受けるヒドロキシル基である：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
分枝したＰＥＧもまた、一般に使用される。この分枝したＰＥＧは、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして表され、ここでＲはペンタエリスリトールまたはグリセロールのような中心コア薬剤を表し、そしてｍはアームの数を表す。アームの数ｍは、３〜１００以上の範囲であり得る。ヒドロキシル基は、化学修飾の準備に供される。
【００３８】
ＰＥＧの別の分枝形態は、（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−）ｐＲ−Ｚとして表され得、ここで、ｐは、２または３に等しく、Ｒは、リジンまたはグリセロールのような中央コアを表し、そしてＺは、化学活性化の準備に供される、カルボキシルのような基を表す。この型のＰＥＧは、化学修飾の準備に供される単一の末端を有する。
【００３９】
なお別の分枝形態である、ペンダントＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端よりむしろ、ＰＥＧ骨格に沿って、カルボキシルのような反応性基を有する。
【００４０】
式ＰＥＧ（−ＬＣＨＸ２）ｎによって表されるフォーク型ＰＥＧは、分枝ＰＥＧの別の形態であり、ここで、Ｌは結合基であり、そしてＸは活性化末端基である。
【００４１】
さらに、これらのポリマーはまた、この骨格に、弱いかまたは分解可能な結合基を有するように調製され得る。例えば、ポリマー骨格中に加水分解に不安定なエステル結合を有するＰＥＧが調製され得る。このエステル結合は、このポリマーのより低分子量のフラグメントへの切断を生じる加水分解に感受性である：
【００４２】
【化２１】
0005031164.tif 000012
用語ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧは、上記の形態の全てを表すかまたは含むことが当業者によって理解される。
【００４３】
ＰＥＧ以外のポリマーもまた、本発明に適する。これらの他のポリマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：他のポリ（アルキレンオキサイド）（例えば、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど）；ポリ（オキシエチル化ポリオール）（例えば、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、およびポリ（オキシエチル化グルコース））；ポリ（ビニルアルコール）（「ＰＶＡ」）；デキストラン；炭水化物ベースのポリマーなど。これらのポリマーは、上記のポリマーのモノマーに基づく、ホモポリマーまたはランダムまたはブロックコポリマーおよびターポリマーであり得、直鎖または分枝鎖であり得る。
【００４４】
適切なさらなるポリマーの特定の例は、ポリ（オキサゾリン）、二官能性ポリ（アクリロイルモルホリン）（「ＰＡｃＭ」）およびポリ（ビニルピロリドン）（「ＰＶＰ」）を含むがこれらに限定されない。ＰＶＰおよびポリ（オキサゾリン）は、当該分野で周知のポリマーであり、それらの調製は、当業者に容易に明らかであるべきである。ＰＡｃＭならびにその合成および用途は、米国特許第５，６２９，３８４号および同第５，６３１，３２２号（これらの内容は、本明細書中で、その全体が参考として援用される）に記載される。
【００４５】
ＰＯＬＹの分子量は変化し得るが、それは、典型的に、約１００〜約１００，０００の範囲であり、好ましくは、約２，０００〜約８０，０００の範囲である。
【００４６】
当業者は、実質的に水溶性の非免疫原性ポリマーＰＯＬＹについての上記のリストが、決して徹底的でなく、そして単に例示であり、そして上記の性質を有する全てのポリマー性材料が企図されることを認識する。
【００４７】
このポリマーＰＯＬＹは、生物学的に活性な薬剤Ｙに対して遠位に末端キャッピング基を有し得る。キャッピング基の例としては、ＯＨ、アルコキシ、および
【００４８】
【化２２】
0005031164.tif 000013
が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、Ｌ’は加水分解に安定な結合基であり、Ａｒ’は、芳香族基であり、そしてＹ’は、生物学的に活性な薬剤である。Ｌ’、Ａｒ’およびＹ’は、各々、Ｌ、Ａｒ、およびＹと同じでも、異なってもよい。
【００４９】
プロドラッグ中の芳香族基ＡｒおよびＡｒ’は、任意の化学的に整列された形態の任意のアリール基であり得る。例えば、フェニル、置換フェニル、ビフェニル、置換ビフェニル、多環式アリール、置換多環式アリール、複素環式アリール、置換複素環式アリール、およびその誘導体が、全て使用され得る。ＡｒおよびＡｒ’の芳香族環上の置換は、ＬまたはＬ’に対して、任意の位置であり得る。適切な置換部分の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボアルコキシおよびカルボキサミド。芳香族基に結合されたこれらのさらなる基が、ＡｒとＹとの間、および／またはＡｒ’とＹ’との間のカルバメート結合の加水分解速度に影響し得ることが理解されるべきである。従って、異なる置換部分が、生物学的に活性な薬剤ＹおよびＹ’の放出速度を制御するために選択され得る。好ましくは、ＡｒおよびＡｒ’は、ベンゼンまたは置換ベンゼンである。
【００５０】
結合基ＬおよびＬ’は、芳香族基ＡｒおよびＡｒ’の各々を、非免疫原性ポリマーＰＯＬＹに結合する。典型的に、それらは、ＰＯＬＹの末端基と芳香族基ＡｒまたはＡｒ’の環上の反応性部分を反応させることによって形成される。ＬおよびＬ’は、任意の共有結合であり得る。特に、ＬおよびＬ’は、共有結合（例えば、エーテル、アミン、イミン、イミド、アミド、カルバミド、エステル、チオエステル、カルボネートおよび尿素）を含み得る。例えば、ＬおよびＬ’は、−Ｏ−、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、または置換アルキルである）、−ＣＯ２−、−Ｏ２Ｃ−、−Ｏ２ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−などのような部分から選択され得る。好ましくは、ＬおよびＬ’は、−Ｏ−または−ＮＨＣＯ−である。
【００５１】
ＡｒとＹとの間、およびＡｒ’とＹ’との間のカルバメート結合は、所望の速度でインビボで加水分解可能である。典型的に、本発明のプロドラッグが、身体に送達される場合、このプロドラッグは、最初に、選択された経路（例えば、血液循環）を介して、所望の組織または器官に送達される。親の生物学的に活性な薬剤は、加水分解によって放出される。一旦、親薬剤が放出されると、プロドラッグの成分の残りが、引き続いて生分解または排出によって除去される。最適な結果を達成するために、結合基ＬおよびＬ’は、典型的に、加水分解可能なカルバメート結合より安定である。好ましくは、ＬおよびＬ’は、加水分解に安定な結合基である。さらに、プロドラッグ循環の寿命は、カルバメート結合の加水分解に必要とされる時間より長くあるべきである。
【００５２】
本発明のプロドラッグにおいて、プロドラッグからの親の生物学的に活性な薬剤の放出速度は、多くの様式で改変され得る。カルバメート結合の加水分解的分解の速度は、カルバメート結合付着の位置に対する、上に規定されるようなＬまたはＬ’の、芳香族環への付着の位置によって影響されることが見出されている。すなわち、カルバメート加水分解の速度は、ベンゼン誘導体の場合には、ＬまたはＬ’のオルト、メタ、およびパラ配置の間で変化する。カルバメート結合の加水分解の速度はまた、ＬおよびＬ’の性質によって影響される。例えば、エーテル結合は、アミド結合よりも安定である。さらに、芳香族基に結合するさらなる部分は、カルバメート結合の加水分解速度に影響し得る。従って、異なる置換部分は、生物学的に活性な薬剤ＹおよびＹ’の放出速度を制御するために選択され得る。
【００５３】
１つの好ましい実施形態において、本発明のプロドラッグは、以下の式：
【００５４】
【化２３】
0005031164.tif 000014
を有し、ここで：
Ｌは、−Ｏ−または−ＮＨＣＯ−であり；
Ｙは、生物学的に活性な薬剤であり；
ＰＯＬＹは、キャッピング基を有するポリ（エチレングリコール）であり、このキャッピング基は、−ＯＨ、Ｃ１−４アルキル、および
【００５５】
【化２４】
0005031164.tif 000015
からなる群から選択され、ここで、Ｙ’およびＬ’は、上記のとおりである。
【００５６】
従って、プロドラッグにおけるカルバメート結合の加水分解は、以下のように例示され得る：
【００５７】
【化２５】
0005031164.tif 000016
本発明は、水に不溶性および／または免疫原性である生物学的に活性な薬剤を送達するために特に適切であるが、本発明は、実質的に任意の生物学的に活性な薬剤について使用され得る。しかし、プロドラッグの合成の説明において、以下で明らかなように、本発明のプロドラッグに変換され得る、この生物学的に活性な薬剤は、アミノ基またはアミノ基に変換され得る部分を有さなければならない。適切な生物学的に活性な薬剤は、以下を含むが、これらに限定されない：タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ脂質、アミノ基を有する多糖類、アミノ−オリゴヌクレオチド、およびアミノ基を有する薬学的因子。
【００５８】
一般に、本発明のプロドラッグを合成する方法は、以下の工程を含む：最初に、活性化された水溶性で非ペプチドポリマーが提供される。この活性化されたポリマーは、典型的に、反応性の末端部分を有する。例えば、活性化ポリマーは、ＰＯＬＹ−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＰＯＬＹ−ＮＨ２、ＰＯＬＹ−Ｏ−ＳＯ２−ＣＨ３、またはＣＨ３−ＳＯ２−Ｏ−ＰＯＬＹ−Ｏ−ＳＯ２−ＣＨ３などであり得る。芳香族基に結合した２つの反応性置換基を有するアリール化合物もまた、提供される。このアリール化合物は、例えば、ヒドロキシ安息香酸またはベンジルオキシフェノールであり得る。芳香族基の２つの反応性基のうちの１つは、活性化ポリマーの反応性末端部分と反応して、結合基Ｌを形成し得る。このアリール化合物の他の反応性基は、それ自体、生物学的に活性な薬剤のアミノ基と反応して、加水分解可能なカルバメート結合を形成し得るか、または生物学的に活性な薬剤のアミノ基と反応して加水分解可能なカルバメート結合を形成し得る反応性基に変換され得るかのいずれかである。従って、化合物が提供され、この化合物は、以下の式：
【００５９】
【化２６】
0005031164.tif 000017
を有し、ここで、ＰＯＬＹ、ＬおよびＡｒは、本発明のプロドラッグに関して記述された通りであり、そしてここで、Ｘは、生物学的に活性な薬剤のアミノ基と反応して、加水分解可能なカルバメート結合を形成し得る活性化基である。
【００６０】
好ましくは、Ｌは、−Ｏ−または−ＮＨＣＯ−であり、Ａｒは、置換または非置換のベンゼン部分であり、Ｘは塩素、臭素、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、または１−ベンゾトリアゾリルオキシであり、そしてＰＯＬＹは、ポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、約２００〜約１００，０００ダルトンの分子量を有し、そして−ＯＨ、Ｃ１−４アルキル、および
【００６１】
【化２７】
0005031164.tif 000018
からなる群から選択されるキャッピング基を有し、ここで、Ｌ’は、−Ｏ−または−ＮＨＣＯ−であり、Ａｒ’は、置換または非置換のベンゼン部分であり、そしてＸ’は塩素、臭素、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、または１−ベンゾトリアゾリルオキシである。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、プロドラッグが提供され、これは、以下の式：
Ｙ−Ａｒ−Ｏ２Ｃ−ＮＨ−ＰＯＬＹ
を有し、ここで、Ｙは芳香族基を有する生物学的に活性な薬剤であり、Ａｒは生物学的に活性な薬剤Ｙの芳香族基（例えば、置換ベンゼンまたは他の芳香族（例えば、置換ナフタレンまたは複素環部分））であり、そしてＰＯＬＹは、上記のような、水溶性の、非ペプチドポリマー（好ましくは、その形態のいずれかのポリ（エチレングリコール））である。この誘導体の加水分解により、親薬物Ｙ−ＡｒＯＨ、ならびにＰＯＬＹ−ＮＨ２およびＣＯ２を得る。
【００６３】
本発明の別の局面によれば、加水分解的に分解可能なヒドロゲルが提供される。このヒドロゲルは、加水分解可能なカルバミド結合を介して架橋因子に結合する骨格を含む。
【００６４】
代表的に、このヒドロゲルの骨格は、生体適合性高分子である。この骨格は、架橋因子と反応して加水分解性のカルバミド結合を形成するために利用可能な、アミノ基を有する。好ましくは、この骨格は、少なくとも２つのこのようなアミノ基を有する。このような骨格の例としては、タンパク質、改変タンパク質（例えば、糖タンパク質、リン酸化タンパク質、アシル化タンパク質）、ならびに化学的に改変されたタンパク質、ペプチド、アミノ炭水化物、グリコサミノグリカン、アミノ脂質、ポリ（ビニルアミン）、ポリリジン、ポリ（エチレングリコール）アミン、少なくとも２つのアミノ基を有する薬学的因子などが挙げられるが、これらに限定されない。この骨格の具体的な例としては、フィブリン、線維素原、トロンビン、アルブミン、グロブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、キトサンなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この骨格はまた、ウイルス粒子のような微生物、細菌細胞、または動物もしくはヒトの細胞であり得る。
【００６５】
架橋因子は、以下の式を有する、上記の二官能性ポリマーであり得る：
【００６６】
【化２８】
0005031164.tif 000019
ここで、ＰＯＬＹ、ＰＯＬＹ’、Ｌ、Ｌ’、Ｘ、Ｘ’、ＡｒおよびＡｒ’は、上記のとおりである。あるいは、架橋因子はまた、以下の式を有する、分枝鎖の水溶性の実質的に非免疫原性のポリマーであり得る：
【００６７】
【化２９】
0005031164.tif 000020
ここで、ＰＯＬＹ、ＰＯＬＹ’、Ｌ、Ｌ’、Ａｒ、Ａｒ’、ＸおよびＸ’は、上記のとおりである。Ｚは、中央分枝コア部分である。ｎは、アームの数を表し、そして２〜約１００である。特に、中央分枝コア部分は、アミノ酸リジン、またはグリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールのようなポリオールから誘導され得る。分枝ＰＥＧは、当該分野において公知である。適切な分枝ＰＥＧは、米国特許第５，９３２，４６２号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に従って調製され得る。次いで、これらの分枝ＰＥＧは、本教示に従って改変され得る。例えば、ペンタエリスリトールから調製した４アームの分枝ＰＥＧを、以下に示す：
【００６８】
【化３０】
0005031164.tif 000021
次いで、この分枝ＰＥＧは、プロドラッグを合成する文脈において上記ような方法によりさらに改変されて、分枝架橋因子を形成し得る。
【００６９】
好ましい実施形態において、架橋因子は、以下の式を有する：
【００７０】
【化３１】
0005031164.tif 000022
ここで、ＸおよびＬは、上記のとおりである。従って、ヒドロゲルの形成のためのプロセスにおける、この架橋因子による、複数のアミノ基を有する骨格の架橋は、以下のように示され得る：
【００７１】
【化３２】
0005031164.tif 000023
ここで、ジグザグの表記は、アミン基を有する骨格を表し、そしてここで、Ｌは、上記のとおりである。
【００７２】
明らかであるように、架橋反応から形成される、骨格と架橋因子との間のカルバメート結合は、加水分解性である。従って、本発明のヒドロゲルは、このカルバメート結合の加水分解の結果として、身体内で次第に分解（ｂｒｅａｋ  ｄｏｗｎ）または分解（ｄｅｇｒａｄｅ）し得る。従って、本発明のヒドロゲルを、生物学的に活性な因子の送達のためのキャリアとして、および他の適切な生物医薬用途で、使用し得る。例えば、このヒドロゲルは、治療用薬物を運び得、そして身体の標的領域に移植または注射され得る。このヒドロゲルはまた、栄養剤または画像化分析のための標識因子のような、他の因子を運び得る。
【００７３】
本発明のヒドロゲルの種々の適用において、送達されるべき生物学的に活性な因子は、このヒドロゲルの骨格としてか、またはこの骨格の一部として、使用され得る。あるいは、生物学的に活性な因子は、上記のようなプロドラッグの形態であり得、そして以下に示すように、このヒドロゲルに共有結合され得る：
【００７４】
【化３３】
0005031164.tif 000024
ここで、Ｌは、上記のような結合基であり、Ｙは、このヒドロゲルにおいて送達されるべき生物学的に活性な因子である。代表的に、この場合には、Ｙは、上記のように反応してカルバメート結合を形成し得るアミノ基を有する。また、送達されるべき生物学的に活性な因子または他の物質もまた、例えば、このヒドロゲル構造（すなわち、このヒドロゲルの骨格または架橋因子）に共有結合することなくこのヒドロゲルの空洞またはマトリックスに拡散させることによって、このヒドロゲルの合成の間かまたはその後に、このヒドロゲルに負荷され得る。
【００７５】
このヒドロゲルにおける架橋因子は水溶性であり、かつ実質的に非免疫原性であるので、このヒドロゲルもまた、実質的に水溶性かつ非免疫原性であり得る。さらに、加水分解的に分解可能な多数のカルバメート結合による相互接続に起因して、代表的に、このヒドロゲルの身体内での分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）または分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）は、本質的に段階的である。従って、このヒドロゲルは、生物学的に活性な因子または他の物質の、身体内での徐放のために、特に有用である。
【００７６】
本発明を、以下の実施例にさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するために与えられるが、本発明の限定として考えられるべきではない。
【００７７】
（実施例）
（実施例１：Ｎ−ｍＰＥＧベンズアミド−ｍ−スクシンイミジルカーボネート（１）の合成）
【００７８】
【化３４】
0005031164.tif 000025
ｍＰＥＧアミン５０００（１．５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（４４ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８４ｍｇ）を、２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。この溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで半分まで濃縮し、そしてその残渣を１５０ｍｌのエチルエーテル中に沈殿させた。この沈殿物を濾過により収集し、そして減圧下で乾燥した。収量１．５ｇ（１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、６．９０（ｍ、芳香族）、７．２２（ｍ、芳香族）、８．３７（ｔ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−）、９．６２（ｓ、−Ｃ６Ｈ６−ＯＨ）。
【００７９】
上記生成物（１グラム）およびジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、２００ｍｇ）を、８ｍｌのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、２００μｌのピリジンを添加した。この溶液を窒素下で一晩撹拌し、そして溶媒を減圧下で除去した。得られた固体を１０ｍｌの乾燥クロロホルムに再溶解し、そして不溶性固体を濾過によって除去した。次いで、この溶液を１５０ｍｌの乾燥エチルエーテル中に沈殿させ、そしてこの沈殿物を濾過によって収集し、そして減圧下で乾燥した。収量０．９５ｇ（９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、７．５８（ｍ、芳香族）、７．８３（ｍ、芳香族）、８．６４（ｔ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−）。
【００８０】
（実施例２）
（Ｎ−ｍＰＥＧ−ベンズアミド−ｐ−スクシンイミジルカーボネート（２）の合成）
【００８１】
【化３５】
0005031164.tif 000026
ｍＰＥＧアミン５０００（３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（８７ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６０ｍｇ）を、２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。この溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで半分まで濃縮し、そしてその残渣を１５０ｍｌのエチルエーテル中に沈殿させた。この沈殿物を濾過により収集し、そして減圧下で乾燥した。収量３ｇ（１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、６．７８（ｄ、芳香族）、７．７０（ｄ、芳香族）、８．２３（ｔ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−）、９．９４（ｓ、−Ｃ６Ｈ６−ＯＨ）。
【００８２】
上記生成物（１．５グラム）およびジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、３００ｍｇ）を、１２ｍｌのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、３００μｌのピリジンを添加した。この溶液を窒素下で一晩撹拌し、そして溶媒を減圧下で除去した。得られた固体を１０ｍｌの乾燥クロロホルムに再溶解し、そして不溶性固体を濾過によって除去した。次いで、この溶液を１５０ｍｌの乾燥エチルエーテル中に沈殿させた。この沈殿物を濾過によって収集し、そして減圧下で乾燥した。収量１．４２ｇ（９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、７．４９（ｄ、芳香族）、７．９５（ｄ、芳香族）、８．６０（ｔ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−）。
【００８３】
（実施例３）
（ｍＰＥＧフェニルエーテル−ｐ−スクシンイミジルカーボネート（３）の合成）
【００８４】
【化３６】
0005031164.tif 000027
６０ｍｌのトルエン中のｍＰＥＧメシレート５０００（５ｇ、１ｍｍｏｌ）を、窒素下で共沸的に蒸留した。２時間後、この溶液を室温まで冷却した。４−ベンジルオキシフェノール（０．４４ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、０．４６ｍｌのナトリウムメトキシド（２ｍｍｏｌ、メタノール中２５％）と２５ｍｌの乾燥メタノールとの混合物に添加した。この混合物を窒素下で２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、メタノールを、約５ｍｌの溶液が残るまで次第に蒸発させた。５０ｍｌの乾燥トルエンを添加し、そしてこの溶液を窒素下で蒸留した。この共沸蒸留を、すべてのメタノールが除去されるまで続けた。この混合物を室温に冷却した。前工程からの新たに共沸乾燥したｍＰＥＧメシレートを添加し、そしてこの混合物を窒素下で一晩還流した。この反応混合物を室温に冷却し、トルエンを留去し、そして塩化メチレンを添加した。この固体を濾過により収集し、そしてその濾液を、１０％の塩化ナトリウムを含む１０％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。この乾燥した塩化メチレン溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、そして１００ｍｌのエーテル中に沈殿させた。この生成物を濾過によって収集し、そして減圧下で乾燥した。収量４．５ｇ（９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、４．００（ｔ、−ＰＥＧＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ６Ｈ４Ｏ−）、５．０２（ｓ、−ＰＥＧＯＣ６Ｈ４ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５）、６．９０（ｄ＋ｄ、−ＰＥＧＯＣ６Ｈ４Ｏ−）、７．３５（ｍ、−ＰＥＧＯＣ６Ｈ４ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５）。
【００８５】
ｍＰＥＧ−ｐ−（ベンジルオキシ）−フェニルエーテル（４．５ｇ、０．９ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（４０ｍｌ）に溶解し、次いでＨ２（２気圧）および１．５グラムのＰｄ／Ｃ（１０％）で一晩水素化した。この触媒を濾過によって除去し、そして大部分の溶媒をロータリーエバポレーターで留去した後に、生成物をエチルエーテル中に沈殿させた。収量：３．７グラム（８２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、３．９６（ｔ、−ＰＥＧＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ６Ｈ４ＯＨ）、６．７０（ｄ＋ｄ、−ＰＥＧＯＣ６Ｈ４Ｏ−）、８．８９（ｓ、−ＯＨ）。
【００８６】
ｍＰＥＧフェニルエーテル−ｐ−フェニルアルコール（１．２ｇ）およびジスクシンイミジルカーボネート（ｄｉｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（ＤＳＣ、２１０ｍｇ）を、１５ｍｌのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、０．１２ｍｌのピリジンを添加した。この溶液を窒素下で一晩撹拌し、そして溶媒を減圧下で除去した。得られた固体を１０ｍｌの乾燥クロロホルムに溶解し、そして不溶性固体を濾過によって除去した。次いで、この溶液を１５０ｍｌの乾燥エチルエーテル中に沈殿させた。この沈殿物を濾過によって収集し、そして減圧下で乾燥した。収量１．１５ｇ（９６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、７．４９（ｄ、芳香族）、７．９５（ｄ、芳香族）、８．６０（ｔ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−）。
【００８７】
（実施例４）
（ｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯＯ−薬物の調製）
【００８８】
【化３７】
0005031164.tif 000028
２０ｍｇの上記薬物をピリジン中で共沸により乾燥し、次いでメトキシ−ＰＥＧイソシアネート（１７７ｍｇ、５０００ダルトン）を添加した。この溶液を室温で一晩撹拌し、そして溶媒を減圧下で除去して、残渣シロップを得た。この残渣に１００ｍｌのエーテルを添加し、そして得られた沈殿物を濾過によって収集し、そして減圧下で乾燥した。ＰＥＧ結合体化は、１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＰＣによって、６０％であることが示された。
【００８９】
（実施例５）
（ｍＰＥＧフェニルエーテル−ｐ−メキシレチンカルバメートの合成）
【００９０】
【化３８】
0005031164.tif 000029
ＭＰＥＧフェニルエーテル−ｐ−スクシンイミジルカーボネート（３００ｍｇ、５０００ダルトン）、および塩酸メキシレチン（１６ｍｇ）、ＴＥＡ（２０μｌ）を、８ｍｌの無水塩化メチレンに溶解した。この溶液を一晩撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで濃縮し、そして１００ｍｌのイソプロピルアルコールを残渣のシロップに添加した。得られた沈殿を濾過によって収集し、２０ｍｌのエーテルで洗浄し、そして減圧下で乾燥した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．５（ｂｒ  ｍ、ＰＥＧ）、２．２３（ｓ、ＣＨ３−）、６．９（Ｍ、芳香族Ｈ）、１．２３（ｄ、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−）。結合体化は、ＧＰＣによって９０％より大であると示された。
【００９１】
（実施例６）
（実施例１〜３のＰＥＧ誘導体でのリゾチームの改変）
実施例１〜３で調製したＰＥＧ誘導体の各々の５〜２５ｍｇを、ｐＨ７（０．１Ｍリン酸緩衝液中５ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌのリゾチーム溶液と混合した。この溶液を室温で５時間穏やかに振盪し、次いで後の分析のために＋４℃で貯蔵した。ＰＥＧ化を、キャピラリー電気泳動によってモニタリングした。
【００９２】
（実施例７）
（キャピラリー電気泳動による、リゾチームのＰＥＧ結合体の加水分解のモニタリング）
上記のように調製した結合体を３７℃および室温に置き、そして加水分解をキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によってモニタリングした。ＣＥグラフを図１に示す。
【００９３】
ＣＥ条件：０．１ｍｇ／ｍｌのＰＥＯ  ６００Ｋを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ２．７）を、約１５〜２０分間キャピラリーを通してフラッシュした。１５ｋＶの電圧を、平滑なベースラインが得られるまで印加した。２５ｍＭのリン酸緩衝溶液を再度約５分間フラッシュし、これによりこのキャピラリーはサンプル注入の準備ができた。サンプル（これは、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ２）によってｐＨ２に調整された）を静水圧的に約１０秒間にわたって、約６インチの高さにおいて注入した。１５ｋＶの電圧を、２４μＡと３０μＡとの間の電流での泳動の間中、印加した。タンパク質およびＰＥＧ−タンパク質結合体を、２１４ｎｍでのＵＶモニタによって検出した。ＣＥ機器は、高電圧電源（Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ１０００Ｒ）、溶融シリカキャピラリー（内径７５μｍ、外径３６０μｍ、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）ならびにジュウテリウムランプおよびキャピラリーフローセルを有する線形２００ＵＶ／ＶＩＳモニタを備える。キャピラリーの全長は６４．５ｃｍであり、アノードから４０ｃｍの位置に１ｃｍの光学窓を備えた。ＵＶデータを収集し、そしてＬａｂＶＩＥＷバージョン４．０．１ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して格納した。
【００９４】
（実施例８）
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる加水分解生成物の分析）
各結合体からの加水分解生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって試験して、これらが加水分解中間体間の反応によって引き起こされた何らかの二量化が存在するか否かを決定した。遊離リゾチームをコントロールとして使用した。二量化は観察されなかった。
【００９５】
（実施例９）
（可逆的リゾチーム結合体の生物活性測定）
遊離リゾチーム、リゾチームのＰＥＧ結合体、および結合体の加水分解から回収したリゾチームの生物活性を、ニワトリ卵白（ＨＥＷ）リゾチームＥＣ．３．２．１．１７に対するＳｉｇｍａの標準プロトコルからのアッセイによって、測定した。未改変リゾチームまたはＰＥＧ改変リゾチームを含有する溶液を、６６ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液（ｐＨ６．２４）中で５．５μｇ／ｍｌに希釈した。１０ｍｌの６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２４）中１．５ｍｇのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの懸濁液を、４５０ｎｍにおける吸光度が一定となるまで室温で平衡化させた。次いで、０．１ｍｌのリゾチーム溶液を、２．５ｍｌの基質懸濁液を含む１ｃｍ光路の石英キュベットに入れた。４５０ｎｍにおける吸光度の減少を記録し、そして活性を、最大線形速度から決定した。８２％のリゾチーム生物活性が、ｍ−ＰＥＧ−リゾチーム結合体から回復したが、一方でｍＰＥＧリゾチームは、加水分解の前に検出不可能な生物活性を有した。
【００９６】
（実施例１０）
（二官能性ＰＥＧ３４００ベンズアミド−ｍ−スクシンイミジルカーボネート（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）からのヒドロゲルの調製）
試験管中で、５５ｍｇの二官能性ＰＥＧ３４００ベンズアミド−ｍ−スクシンイミジルカーボネート（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）を、０．３６ｍｌの冷脱イオン水（４℃）に溶解した。次いで、０．３６ｍｌの８アームＰＥＧアミン１０，０００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ，ＡＬ，ＵＳＡ）溶液（ｐＨ７のリン酸緩衝液中１１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。急速な撹拌の後に、この溶液を室温で静置した。透明なゲルが、数分で形成した。
【００９７】
（実施例１１）
（二官能性ＰＥＧベンズアミド−ｍ−スクシンイミジルカーボネート（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）から調製したヒドロゲルの分解）
実施例８から調製したゲルの約０．２ｃｍ３の片を、約１ｍｌのＰＢＳ緩衝液中に入れ、一方で他のものを、同量のヒト血清に入れた。両方のサンプルを、３７℃でインキュベートした。ゲル分解を視覚的にモニタリングして、分解寿命を評価した。ゲルを、分解するまで観察して、約４時間で透明な溶液を得た。
【００９８】
上記本発明は、理解の明瞭さを目的として、説明および実施例によって、いくらか詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、いくらかの変化および変更がなされ得ることが、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｎ−ｍＰＥＧ−ベンズアミド−ｍ−スクシンイミジルカルボネートを用いて調製されたｍＰＥＧ−リゾチーム結合体の加水分解を示すＣＥグラフである。時間０において、少量の遊離リゾチームが、モノ、ジ、およびトリＰＥＧ化リゾチームと混合された（曲線Ａ）。ｐＨ７および３７℃で１０日間の加水分解後、８５％より多い、遊離リゾチームが、放出された（曲線Ｂ）。ピークＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、それぞれ、遊離リゾチーム、モノＰＥＧ化リゾチーム、ジＰＥＧ化リゾチーム、およびトリＰＥＧ化リゾチームを表す。
【図１】
0005031164.tif 000038