(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球または抗原提示細胞の細胞膜に存在し、リンパ球とリンパ球間もしくはリンパ球と抗原提示細胞間の情報を仲介する機能を有する膜蛋白質の細胞外領域部分が切断されて可溶性となった糖蛋白質分子に対して吸着性のある高分子成型品からなる、異常細胞に対する免疫担当細胞の抗原特異的細胞傷害活性を増強する殺細胞活性増強材。
【請求項２】
前記切断されて可溶性となった糖蛋白質分子が、可溶性ＣＤ４０であることを特徴とする請求項１に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項３】
前記切断されて可溶性となった糖蛋白質分子が、可溶性ＣＤ２８であることを特徴とする請求項１に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項４】
血液と接触させた際、前記切断されて可溶性となった糖蛋白質分子の濃度低下率／アルブミンの濃度低下率比が１以上１００以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項５】
前記高分子成型品は、水不溶性基材に、炭素数総和５以上１０以下の３級アミンに由来する４級アンモニウム化合物が結合されているものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項６】
前記高分子成型品は、水不溶性基材に、炭素数総和５以上１０以下の３級アミンに由来する４級アンモニウム化合物、および３個以上のアミノ基と１個以上の環状構造を含む環状ポリアミノ化合物が結合されているものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項７】
前記環状ポリアミノ化合物が、アミノグリコシド系化合物または環状ペプチド系化合物から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項６に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項８】
前記アミノグリコシド系化合物が、アミカシン、アストロマイシン、イセパマイシン、アルベカシン、トブラマイシン、カナマイシン、ジベカシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、ベカナマイシンから選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項７に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項９】
前記環状ペプチド系化合物が、ポリミキシンＢ誘導体であることを特徴とする、請求項７に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項１０】
前記水不溶性基材が、ビニル芳香族化合物誘導体から構成される重合体を含むことを特徴とする請求項５〜９のいずれか１項に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項１１】
前記水不溶性基材が、芳香族ポリスルホン誘導体から構成される重合体を含むことを特徴とする請求項５〜９のいずれか１項に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項１２】
形状が繊維、膜、中空糸または粒状物であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の殺細胞活性増強材。
【請求項１３】
請求項１２に記載の殺細胞活性増強材を充填してなる体外循環カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染症や癌の治療に使用できる殺細胞活性増強材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先進国では寿命の延長に伴い、癌で死亡する人の割合が急増している。また、近年、ＳＡＲＳコロナウイルスやトリインフルエンザ等の新種のウイルス感染症の出現の増加も問題である。これらの疾患では、癌細胞やウイルスに感染した細胞は正常細胞では出ていない分子を細胞表面に出すので、通常は免疫系により非自己細胞として認識され、排除される。その際、抗体産生細胞や抗原特異的細胞傷害性細胞ができ、免疫ができる。免疫には白血球が主役の細胞性免疫と抗体が主役の液性免疫がある。細胞性免疫を構成する細胞には、特定の抗原を持つ細胞に対し細胞傷害活性を示すキラー細胞（以下キラー細胞と略称する）やキラー細胞を補助するヘルパーＴ細胞、抗原の情報をキラー細胞に提供する抗原提示細胞、異常細胞を記憶するメモリー細胞等がある。これらの細胞間の連絡は主として細胞表面に突出した糖蛋白質を介して直接行われる。例えば、ヘルパーＴ細胞上のＣＤ４０リガンド（以下ＣＤ４０Ｌと略称する）と抗原提示細胞のＣＤ４０の結合、ヘルパーＴ細胞やキラー細胞上のＣＤ２８と抗原提示細胞のＣＤ８０やＣＤ８６との結合等がある。
【０００３】
正常な免疫では非自己細胞は効率よく排除される機構になっているが、癌患者では癌細胞が増殖を続け、エイズやＢ型肝炎、Ｃ型肝炎等の持続感染型ウイルス症ではウイルス感染細胞が殺されずに残って、ウイルスが生存・増殖を続ける。この原因については諸説があり、リンパ球の機能低下や数の減少、免疫調整性細胞の活性化や数の増加等の他、免疫抑制蛋白質産生細胞の活性化・増加等、種々の因子が存在すると考えられている。このように複数の原因があるので、それらの治療にはそれぞれに適した対異常細胞排除方法が複数必要と考えられ、その出現が望まれる。
このような問題を解決するために、非特許文献１にはＣＤ４０等に対するモノクロナール抗体の使用が提案されている。しかし、このような蛋白質試薬は、生体応答としてこの抗体に対する抗体ができる。従って、使用開始直後は効果があるものであっても、繰り返し使用する間に、直ぐに効力が消失するという抗体試薬特有の欠点があり、これらの抗体だけの治療では不十分である。
【非特許文献１】Cancer Science, 2007 Jun8; [Equb ahead of print]
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって本発明は、細胞性免疫を構成するキラー細胞の活性を増強できる材料を提供し、癌やウイルス感染症の治療に役立てることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記従来技術の問題点に鑑み、癌やウイルス疾患において非自己細胞の排除を促進できる材料・手段が得られないか、種々検討した結果、リンパ球または抗原提示細胞の膜表面に存在し、リンパ球−リンパ球間もしくはリンパ球−抗原提示細胞間の情報を仲介する機能を有する蛋白質の細胞表面部分の一部が切断されて可溶性となった糖蛋白質分子に対して吸着性のある高分子成型品を充填したカラムで、担癌ラットを体外循環治療すると、癌細胞に対するキラー活性が増強することを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち本発明は、異常細胞に対する免疫担当細胞の抗原特異的細胞傷害活性を増強することができる殺細胞活性増強材であって、リンパ球または抗原提示細胞の細胞膜に存在し、リンパ球とリンパ球間もしくはリンパ球と抗原提示細胞間の情報を仲介する機能を有する膜蛋白質の細胞外領域部分が切断されて可溶性となった糖蛋白質分子に対して吸着性のある高分子成型品からなることを特徴とする。
【０００７】
切断されて可溶性となった糖蛋白質分子として、可溶性ＣＤ４０あるいは可溶性ＣＤ２８が挙げられる。また、前記高分子成型品は、血液と接触させた際、血液中の前記糖蛋白質分子の濃度低下率／血液中のアルブミンの濃度低下率比が１以上１００以下となるものが好ましい。
【０００８】
前記高分子成型品は、水不溶性基材に、炭素数総和５以上１０以下の３級アミンに由来する４級アンモニウム化合物が結合されているもの、または、水不溶性基材に、炭素数総和５以上１０以下の３級アミンに由来する４級アンモニウム化合物、および３個以上のアミノ基と１個以上の環状構造を含む環状ポリアミノ化合物が結合されているものが好ましい。
【０００９】
前記殺細胞活性増強材を体外循環カラムの充填剤として用いることにより、異常細胞に対する殺細胞活性を増強させて、患者の免疫力を向上させることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、癌やウイルス感染症によって抑制されている殺細胞（キラー細胞）の抗原特異的細胞傷害活性を増強することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明にかかる殺細胞活性増強材とは、特定の抗原を持つ細胞に対する宿主免疫担当細胞の細胞傷害活性、即ち、抗原特異的細胞傷害活性を増強する材料を意味する。このような材料としては、種々の候補が存在する可能性があるが、具体的には、リンパ球または抗原提示細胞の細胞膜に存在し、リンパ球とリンパ球間もしくはリンパ球と抗原提示細胞間の情報を仲介する機能を有する膜蛋白質の細胞表面部分（細胞外領域部分）が切断されて可溶性となった糖蛋白質分子に対して優れた吸着性を持つ高分子成型品が使用できる。
【００１２】
本発明にかかる、リンパ球または抗原提示細胞の細胞膜に存在し、リンパ球とリンパ球間もしくはリンパ球と抗原提示細胞間の情報を仲介する機能を有する膜蛋白質とは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージなどの細胞表面に存在し、細胞間の情報の伝達に携わっている糖蛋白質を意味し、具体例としてＣＤ（cluster of differentiation）分類によるＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ３０等を挙げることができる。また、可溶性となった糖蛋白質分子とはこれら膜蛋白質の細胞表面部分が切断されて可溶性となったものを意味し、具体例として可溶性ＣＤ４４、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ４０Ｌ、可溶性ＣＤ３０、可溶性ＣＤ２８、可溶性ＣＤ２７、可溶性ＣＤ８６、可溶性ＣＤ８０、可溶性ＣＴＬＡ４、可溶性ＰＤ−１、可溶性ＰＤ−Ｌ１等が上げられる。別名、共刺激因子、共抑制分子あるいは、副刺激因子などとも呼ばれることがある。これらは切断されて可溶化する前は細胞の活性を高めたり、抑制したりする機能がある。これらの血中濃度は市販のＥＬＩＳＡキット等で容易に測定することができる。
【００１３】
ＣＤ４０は５０ｋＤの糖蛋白質で、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、繊維芽細胞上に存在し、Ｔ細胞の表面に存在するＣＤ４０Ｌと結合してＴ細胞を活性化する働きを持つ。可溶性ＣＤ４０の血中濃度は、血液癌の一種であるＭＤＳや多発性骨髄腫で高く、患者の予後を悪くし、また、可溶性ＣＤ８６もＣＬＬの予後を悪くすることが報告（Cancer 2006: 106: 2148-2157）されている。ＣＤ４０ＬはＴ細胞上に存在し、ＣＤ４０と結合するが、可溶性ＣＤ４０Ｌの血中濃度は肺癌やアデノカルチノーマで上昇する（Clinical Cancer Research 2004: 10: 610-614）。ＣＤ３０はＴ細胞上に存在するが、ホジキンリンパ腫では可溶性ＣＤ３０の血中濃度が高いと、予後が悪いことが報告(Eur J Haematol 2006: 77: 387-389)されている。ＣＤ２８はＴ細胞上に存在し、Ｔ細胞活性化に寄与する。
ＰＤ−１やＣＴＬＡ４はＴ細胞上に存在し、ＰＤ−Ｌ１は樹状細胞、Ｂ細胞、単球上に存在し、Ｔ細胞活性化の抑制に働いている。ＣＤ２７はＴ細胞上に存在して抗原提示細胞上のＣＤ７０と結合するが、可溶性ＣＤ２７の血中濃度は小児白血病で増加する(Exp Hematol 2005: 33: 1500-1507)。可溶性ＰＤ−１は樹状細胞上のＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の抑制経路をブロックし、免疫を活性化するという提言（Anticancer Res 2005: 25: 3309-3313）もある。しかし、担癌宿主の血液中にはこれら因子が、種々、血液中に高濃度で存在していて、リガンドや受容体に結合して、細胞の反応を抑制したり、活性化したりしている。例えば、腫瘍細胞の排除に関しては、可溶性ＣＤ４０はＣＤ４０Ｌを持つＴ細胞に結合して、Ｔ細胞を活性化することが考えられるし、逆に、ＣＤ４０を持つ樹状細胞のＴ細胞への結合・活性化を阻害している可能性もある。また、可溶性ＣＤ４０Ｌと結合して可溶性ＣＤ４０Ｌの作用を抑制している可能性も考えられる。詳細は不明で、腫瘍排除に役立っているのか、阻害しているのか分からない。しかし、担癌ラットの実験から考察すると、これらを血液中から吸着除去すると、阻害物が除去されたごとく、本来の免疫反応が円滑に進むようになる。例えば、癌のような非自己細胞が存在する時には、それを排除する機構が活性化されると考えられる。
【００１４】
本発明でいう異常細胞に対する免疫担当細胞とは、癌細胞やウイルス感染細胞を抗原特異的に傷害する免疫担当細胞を意味し、具体例としてＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球等で、特定の癌細胞やウイルス感染細胞に対し、抗原特異的細胞傷害活性を有するものが上げられる。
【００１５】
この抗原特異的細胞傷害活性の測定法としては、放射線照射して分裂不能としたターゲット細胞を白血球と一定の比率で混合して培養し、白血球のインターフェロン−γの産生増加率を見る間接法と、ターゲット細胞を白血球と一定の比率で混合して培養し、ターゲット細胞の死亡率を見る直接法がある。ターゲット細胞の死細胞率を求める方法には、ターゲット細胞を放射性元素クロム５１で染色し、白血球との培養後に溶出したクロムの量をシンチレーションカウンターで求め、それから死細胞率を計算する方法、ターゲット細胞を非放射性元素ユーロピウムで染色し、白血球との培養後に溶出したユーロピウムの量を時間分解蛍光測定装置で求め、それから死細胞率を計算する方法、ターゲット細胞を５（６−）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、白血球との培養後にフローサイトメトリーで死細胞率を求める方法などがある。
【００１６】
本発明にかかる高分子成型品は、目標とする切断されて可溶性となった糖蛋白質分子に対する吸着性能が高いことが好ましい。目標とする切断されて可溶性となった糖蛋白質分子の種類および血液中濃度は病態によって変わるものであるが、どの糖蛋白質を目標とする場合でも、キラー細胞の活性を増加させるためには、前記糖蛋白質の血液中濃度を３０％以上、より好ましくは５０％以上低下させることが好ましい。勿論、この濃度低下は成型品の量にも依存するものである。一方、血液中に大量に存在するアルブミンは、栄養の維持、物質の運搬、浸透圧の安定性に寄与しているので、高分子成型品と接触させたとき、アルブミンの濃度が著しく下がるのは好ましくない。下がりすぎると、栄養状態が悪くなり、逆に、免疫が低下する。従って、前記高分子成型品を血液と接触させた時（接触時間は３０分間以上が好ましい。しかし、接触時間は体外循環時間と同じなので、時間が長いと患者の束縛時間が長くなるため、できるだけ短い方が良く、約３０分〜２時間とすることが適当である。）、目標とする切断されて可溶性となった糖蛋白質分子の濃度低下率／アルブミンの濃度低下率比が１以上１００以下、より好ましくは、２．５以上１００以下、さらに好ましくは５以上１００以下であることが望ましい。
【００１７】
本発明にかかる高分子成型品としては、水不溶性基材に、炭素数総和５以上１０以下である３級アミンに由来する４級アンモニウムを結合させた高分子成型品が殺細胞活性増強材として適している。また、水不溶性基材に、３以上のアミノ基と１以上の環状構造を有する環状ポリアミノ化合物、および炭素数総和５以上１０以下である３級アミンに由来する４級アンモニウムを結合させた高分子成型品が殺細胞活性増強材として適している。
【００１８】
前記水不溶性基材の好ましい具体例としては、ポリスチレン、ポリビニルトルエンで代表されるビニル芳香族化合物重合体、芳香族ポリスルホン重合体、ポリエーテルイミド、芳香族ポリイミド重合体等、実質上、水に不溶性の重合体で、かつ、官能基を化学結合で固定化することができる重合体を挙げることができる。具体例をあげると、芳香族化合物重合体の場合、その芳香核の一部が下記一般式（１）
−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−（ＣＨ２）ｍ−Ｙ            （１）
｛式中、ｎは１以上２０以下の整数を表し、ｍは、Ａが酸素原子、硫黄原子、窒素原子の場合、ｍは２以上１１以下の整数であり、Ａが−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基の場合、ｍは１以上５以下の整数であり、Ａがメチレン基の場合、ｍは０以上１１以下の整数である。ｎとｍは同一でも異なっていてもよい。Ａは酸素原子、硫黄原子、窒素原子、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基またはメチレン基を示し、Ｙはアミノ基を有する環状化合物残基または４級アンモニウム残基を示す。｝で置換されているものが挙げられる。
【００１９】
上記一般式（１）の密度は、ビニル芳香族化合物重合体の場合、繰り返し単位あたり、０．０１以上１以下、芳香族ポリスルホン重合体、ポリエーテルイミド、芳香族ポリイミド重合体の場合は０．１以上４以下が好ましい。
【００２０】
上記重合体の分子量は、成型できるものであればよく特に制限はないが、成形性の良さから、通常、１万以上５００万以下、とりわけ、５万以上１００万以下のものが好ましく用いられる。
【００２１】
本発明にかかる環状ポリアミノ化合物とは、３個以上のアミノ基および１個以上の環状構造を持つものを意味し、アミノグリコシド系化合物または環状ペプチド系化合物が好ましい。アミノグリコシド系化合物は、２以上５以下の糖からなり、３個以上７個以下のアミノ基を有するものが好ましく、具体例として、アミカシン、アストロマイシン、イセパマイシン、アルベカシン、トブラマイシン、カナマイシン、ジベカシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、ベカナマイシン等を挙げることができる。また、環状ペプチド系化合物は、３個以上のアミノ基を持つものであり、具体例としてはポリミキシンＢ、コリスチンを挙げることができる。
【００２２】
本発明にかかる４級アンモニウム化合物は、窒素原子と結合しているアルキル置換基の炭素数の総和が５以上１０以下である３級アミンに由来するものであり、具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアンモニウム基、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアンモニウム基、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニウム基、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム基等を挙げることができる。
【００２３】
水不溶性基材に結合している環状ポリアミノ化合物と４級アンモニウム化合物の比率は、環状ポリアミノ化合物の割合が多すぎると、吸着能がさがり、少なすぎると、アルブミン吸着性が増大しすぎてしまうので、モル比で１：１０から１０：１が好ましい。
【００２４】
水不溶性基材に、４級アンモニウム化合物・環状ポリアミノ化合物を結合させて高分子成型品を製造する方法としては、活性ハロゲン基含有多孔質の重合体にＮ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアミン、トリエチルアミン、トリｎ−プロピルアミン基等の３級アミンを反応させることによって、あるいは、該３級アミンと環状ポリアミノ化合物とを同時に反応させることによって容易に得ることができる。反応はジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびＮ−メチルピロリドンなどの重合体を膨潤させる有機溶媒を用い、室温から１００℃の温度で１〜１００時間反応することにより達成できる。
【００２５】
本発明の殺細胞活性増強材の形状は、繊維、膜、フイルム、中空糸、不織布、粒状物およびこれらの高次加工品が好ましく、用途に応じ、適宜、選択される。これらは、体外循環用カラムの充填材として、ウイルス疾患や癌の治療用として用いることができる。
【実施例】
【００２６】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。なお、本実施例中の高分子成形品の吸着性能評価、担癌ラットの調製、ラットの体外循環および細胞傷害活性評価は、特に記載しない限り以下の方法で行った。
１．高分子成形品の吸着性能評価
高分子成形品１００ｍｇを４ｍＬのヒトＡＢ型血清（大日本住友製薬（株）から購入）に浸し、３７℃で１時間緩やかに振とうした。高分子成形品を除去し、血清中の可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ２８をベンダー・メドシステム社のＥＬＩＳＡキットで測定した。また、アルブミンは富士ドライケミスライドＡＬＢ−Ｐを用いて測定した。この血清中の可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ２８、アルブミンの濃度は、それぞれ、３７．２ｐｇ／ｍＬ、６．８ｎｇ／ｍＬ、３．２５ｍｇ／ｄＬであった。
２．担癌ラットの調製
癌細胞ＫＤＨ−８をＰＢＳ（−）に浮遊させ、２×１０６個／ｍＬ濃度の液０．５ｍＬを、ＷＫＡＨ／Ｈｋｍラット（雄、１２−１５週令）の背部皮下に接種して、担癌ラットを調製した。
３．ラットの体外循環
（体外循環カラムの調製）
殺細胞活性増強材（高分子成型品）０．３ｇを内径１ｃｍ、内容積２ｍＬのポリプロピレン製円筒形カラムに充填し、体外循環カラムを作成した。カラムと回路に７０％アルコールを通液して滅菌した後、体外循環直前にヘパリン添加生理食塩液（２０単位／ｍＬ）１５ｍＬを２ｍＬ／分の速度で流して前処理した。
（体外循環）
体重約３５０〜４００ｇの担癌ラットをネンブタールで全身麻酔し、左大腿の動脈と静脈にカニュレーションし、動脈から脱血し、マイクロチューブポンプを用いて、体外循環カラムを通過させ、静脈に返血した。血流速度２ｍＬ／分で１時間体外循環した。体外循環中ヘパリンを１００単位／時間で持続投与した。
４．細胞傷害活性の測定
ターゲット細胞（ＫＤＨ−８）にＸ線を照射して分裂不能とし、ラット脾細胞液と一定の比率で混合して培養し、ラット脾細胞液中の白血球によるインターフェロン−γの産生増加率を測定する間接法、および、ターゲット細胞（ＫＤＨ−８）を５（６−）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色してラベルし、ラット脾細胞液と一定の比率で混合して培養した後、フローサイトメトリーでターゲット細胞の死細胞率を求める直接法を利用した。
（ラット脾細胞）
ラットをネンブタールで麻酔した後、腹部大動脈から失血・屠殺させ、脾臓を採取した。脾臓を完全培地中で細かく砕き、細胞を採取した後、赤血球を除くため低浸透圧液で処理し、赤血球を溶血させた。得られた細胞を完全培地に浮遊させ、脾細胞液とした。
（ＫＤＨ−８細胞の調製）
４−ジメチルアミノアゾベンゼン誘発肝癌細胞ＫＤＨ−８｛矢野  諭、北海道医誌、６８巻５号、６５４−６６４（１９９３）｝を完全培地（ＲＰＭＩ１４００培地：ウシ胎児血清１０％含有、２−メルカプトエタノール５０マイクログラム／Ｌ含有、ストレプトマイシン５０マイクログラム／ｍＬ含有、・ペニシリン−Ｇ５０単位／ｍＬ含有）中で継代した。使用４日前に新しい１５０ｃｍ２の培養フラスコに移して培養し、ＰＢＳ（−）で剥離して用いた。
［間接法］
（照射ＫＤＨ−８細胞の調製）
Ｘ線発生装置ＭＢＲ−１５２０Ｒを用い、１５０ｃｍ２の培養フラスコ内のＫＤＨ−８細胞に１００００レントゲンのＸ線を照射した後、ＰＢＳ（−）中３７℃の炭酸ガスインキュベーター内に３０分間置いて細胞を剥離させ、完全培地中に分散して、細胞浮遊液とした。
（培養液上清中のインターフェロンーγの濃度測定）
培養液上清中のインターフェロンーγ濃度はＲアンドＤ社のラットインターフェロンーγＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
［直接法］
（ＫＤＨ−８細胞の蛍光ラベル）
生細胞の割合が９０％以上のＫＤＨ−８細胞をＰＢＳ（−）中１×１０７細胞／ｍＬ濃度に調整した。この細胞液３ｍＬに９μｌの５（６−）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−フルオレセイン）のジメチルスルホキシド溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で１５分間温めた。完全培地１０ｍＬを加え、反応を停止し、遠心して、細胞ペレットを得た。これを１０ｍＬずつの完全培地で３回遠心・洗浄し、最後に完全培地に浮遊させて、１×１０６細胞／ｍＬ濃度とした。
（フローサイトメーターの測定・解析）
フローサイトメーターはベクトン・ディッキンソン社のＦＡＣＳＣａｉｂｅｒを用いた。ＦＬ−１（ＣＦＳＥ）陽性細胞でゲートをかけ、ＦＬ−３陽性の沃化プロピジウム染色細胞を死ＫＤＨ−８細胞とし、ＦＬ−３陰性細胞を生ＫＤＨ−８細胞とした。
【００２７】
［実施例１］
（水不溶性基材の調製）
３６島の海島複合繊維であって、島が更に芯鞘複合繊維によりなるものを次の成分を用いて、紡糸速度８００ｍ／分、延伸倍率３倍の製糸条件で得た。
島の芯成分；ポリプロピレン
島の鞘成分；ポリスチレン９０％、ポリプロピレン１０％
海成分；５−ナトリウムスルホイソフタル酸を３％共重合したポリエチレンテレフタレート
複合比率；芯：鞘：海＝４０：４０：２０
この繊維の海成分を熱苛性ソーダ水溶液で溶解し、芯鞘型のポリプロピレン補強ポリスチレン繊維として、直径４μｍの原糸１を得た。この原糸１に補強材としての直径４０μｍのポリプロピレン繊維を１０重量％混合して原料不織布１を作成した。
【００２８】
（高分子成型品中間体１の調製）
ニトロベンゼン７００ｍＬと硫酸４６０ｍＬの混合液にパラホルムアルデヒド３．６ｇ（０．２％）を加え、２０℃で溶解した後、０℃に冷却し、９０ｇ（５％）のＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて、５℃以下で溶解した。これに４０ｇの上記原料不織布１を浸し、室温で２時間静置した。その後、不織布を取り出し、大過剰の冷メタノール中に入れ、洗浄した。不織布をメタノールで良く洗った後、水洗し、乾燥して、４６．８ｇのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスチレン繊維不織布（中間体１）を得た。このものの可溶性ＣＤ４０に対する吸着性は認められなかった。
【００２９】
（高分子成型品１の調製）
Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン５０ｇを３６０ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液に、５ｇの中間体１を浸し、２５℃のバス中で４８時間静置した。不織布を取り出して、イソプロパノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、５．９ｇのジメチルヘキシルアンモニウム化不織布を得た。このものの吸着性を測定したところ、可溶性ＣＤ４０の濃度低下が４１．１％、アルブミンの濃度低下が１６．９％であったので、濃度低下率比は２．４であった。
【００３０】
（ラット脾細胞の細胞傷害活性の測定：間接法）
ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に高分子成型品１を充填したカラムで体外循環を１ｈ施行した後、４日後に脾臓を採取した。この脾臓を完全培地中で破砕し、血球細胞を取り出した後、赤血球を溶血させて、完全培地に浮遊させた脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。比較として癌細胞を接種せず、体外循環もしなかった同週令の正常ラット３匹からも同様にして脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。
【００３１】
別に、Ｘ線照射したＫＤＨ−８細胞の２×１０５個／ｍＬ濃度を調製し、上記脾細胞と１：１で混合し、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で３日間培養した。コントロールとしてＸ線照射したＫＤＨ−８細胞の代わりに完全培地を加えたものも同様に培養した。これらの細胞培養液を遠心して培養上清を採取し、その中のインターフェロンーγ濃度を測定した。結果を表１にまとめる。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
この結果から、本発明の殺細胞活性増強材（高分子成型品）が、キラー細胞の誘導に重要な役割を持つインターフェロンーγ産生能を増強させることが分かる。照射ＫＤＨ―８不存下でもインターフェロンーγ濃度が高いのは、担癌ラットでは常に癌細胞の刺激を受けていて、既に、活性化されているためと考えられる。
【００３４】
［実施例２］
（高分子成型品中間体２の調製）
ニトロベンゼン７００ｍＬと硫酸４６０ｍＬの混合液にパラホルムアルデヒド５．４ｇ（０．３％）を加え、２０℃で溶解した後、０℃に冷却し、１２７ｇ（７％）のＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて、５℃以下で溶解した。これに５０ｇの上記原料不織布１を浸し、室温で２時間静置した。その後、不織布を取り出し、大過剰の冷メタノール中に入れ、洗浄した。不織布をメタノールで良く洗った後、水洗し、乾燥して、６０ｇのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスチレン繊維不織布（中間体２）を得た。このものの可溶性ＣＤ４０に対する吸着性は認められなかった。
【００３５】
（高分子成型品２の調製）
カナマイシン硫酸塩１．５ｇを１Ｎ−水酸化ナトリウム１０ｍＬに溶かし、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン３．８ｇと共に７００ｍＬのジメチルスルホキシドに溶かした溶液に、１２．７ｇの中間体２を浸し、２５℃で４８時間静置した。不織布を取り出して、イソプロパノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、１４．３ｇの不織布（高分子成型品２）を得た。このものの吸着性を測定したところ、可溶性ＣＤ４０の濃度低下が７１．７％、アルブミンの濃度低下が１４％であったので、濃度低下率比は５．１であった。
【００３６】
（ラット脾細胞の細胞傷害活性の測定：間接法）
ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に高分子成型品２を充填したカラムで体外循環を１ｈ施行した後、４日後に脾臓を採取した。この脾臓を完全培地中で破砕し、血球細胞を取り出した後、赤血球を溶血させて、完全培地に浮遊させた脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。比較として癌細胞を接種せず、体外循環もしなかった同週令の正常ラット３匹からも同様にして脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。
【００３７】
別に、Ｘ線照射したＫＤＨ−８細胞の２×１０５個／ｍＬ濃度を調製し、上記脾細胞と１：１で混合し、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で３日間培養した。コントロールとしてＸ線照射したＫＤＨ−８細胞の代わりに完全培地を加えたものも同様に培養した。これらの細胞培養液を遠心して培養上清を採取し、その中のインターフェロンーγ濃度を測定した。結果を表２にまとめる。
【００３８】
【表２】
0005051362.tif 000003
【００３９】
実施例１および２の結果から、本発明にかかる殺細胞活性増強材が、キラー細胞の誘導に重要な役割を持つインターフェロンーγ産生能を増強させることが分かる。
【００４０】
［実施例３］
（高分子成型品３の調製）
ポリミキシンＢ硫酸塩１．５ｇを１Ｎ−水酸化ナトリウム５ｍＬに溶かし、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン１８．４ｇと共に７００ｍＬのジメチルスルホキシドに溶かした溶液に、１３．３ｇの中間体２を浸し、２５℃で４８時間静置した。不織布を取り出して、イソプロパノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、１５．４ｇの不織布（高分子成型品３）を得た。このものの吸着性を測定したところ、可溶性ＣＤ２８の濃度低下が４６．０％、アルブミンの濃度低下が４．６％であったので、濃度低下率比は１０であった。
【００４１】
（ラット脾細胞の細胞傷害活性の測定：直接法）
ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に高分子成型品３を充填したカラムで体外循環を１ｈ施行した後、７日後に脾臓を採取した。比較例として中間体２を充填したカラムを用い、ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に体外循環を１ｈ施行した後、７日後に脾臓を採取した。コントロールとして体外循環をせず、癌細胞を接種して２０日後の担癌ラット３匹および同週令の正常ラット３匹からも同様に脾臓を採取した。これらの脾臓を完全培地中で破砕し、血球細胞を取り出した後、赤血球を溶血させて、完全培地に浮遊させた脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。
【００４２】
別にＫＤＨ−８細胞をＣＦＳＥラベルし、５０倍量の上記脾細胞と混合し、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で３６時間培養した。フローサイトメーターでＫＤＨ−８細胞の死亡割合を求め、各脾細胞の殺細胞活性（キラー活性）を求めた。結果を表３にまとめる。
【００４３】
【表３】
0005051362.tif 000004
【００４４】
実施例３の結果から、殺細胞活性増強材カラム群（高分子成型品カラム群）では中間体カラム群および無治療担癌群に比較し、殺細胞活性が増強されていることが分かる。また、中間体カラム群では無治療群より殺細胞活性が下がっており、利点が無いことが分かる。正常ラットに比べ、無治療担癌ラットの殺細胞活性が高いのは、常に癌細胞の刺激を受けているため、活性が低いもののキラー細胞が存在するためと考えられる。
【００４５】
［実施例４］
（高分子成型品４の調製）
アミカシン硫酸塩１．０ｇを１Ｎ−水酸化ナトリウム５ｍＬに溶かし、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン１０ｇと共に７００ｍＬのジメチルスルホキシドに溶かした溶液に、１２．５ｇの中間体２を浸し、２５℃で４８時間静置した。不織布を取り出して、イソプロパノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、１５．２ｇの不織布（高分子成型品４）を得た。このものの吸着性を測定したところ、可溶性ＣＤ４０の濃度低下が７６．６％、アルブミンの濃度低下が１０．８％であったので、濃度低下率比は７．１であった。
【００４６】
（ラット脾細胞の細胞傷害活性の測定：直接法）
ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に高分子成型品４を充填したカラムで体外循環を１ｈ施行した後、７日後に脾臓を採取した。比較例として体外循環をせず、癌細胞を接種して２０日後の担癌ラット３匹からも同様に脾臓を採取した。これらの脾臓を完全培地中で破砕し、血球細胞を取り出した後、赤血球を溶血させて、完全培地に浮遊させた脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。
【００４７】
別にＫＤＨ−８細胞をＣＦＳＥラベルし、５０倍量の上記脾細胞と混合し、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で２０時間培養した。フローサイトメーターでＫＤＨ−８細胞の死亡割合を求め、各脾細胞の殺細胞活性（キラー活性）を求めた。結果を表４にまとめる。
【００４８】
【表４】
0005051362.tif 000005
【００４９】
実施例４の結果から、殺細胞活性増強材カラム群では無治療担癌群に比較し、殺細胞活性が増強されていることが分かる。
【００５０】
［実施例５］
（高分子成型品５の調製）
ストレプトマイシン硫酸塩１．５ｇを１Ｎ−水酸化ナトリウム１０ｍＬに溶かし、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン１４．３ｇと共に７００ｍＬのジメチルスルホキシドに溶かした溶液に、１４．３ｇの中間体２を浸し、２５℃で４８時間静置した。不織布を取り出して、イソプロパノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、１６．１ｇの不織布（高分子成型品５）を得た。このものの吸着性を測定したところ、可溶性ＣＤ２８の濃度低下が３８．１％、アルブミンの濃度低下が７．０％であったので、濃度低下率比は５．４であった。
【００５１】
（ラット脾細胞の細胞傷害活性の測定：直接法）
ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に高分子成型品５を充填したカラムで体外循環を１ｈ施行した後、７日後に脾臓を採取した。コントロールとして体外循環をせず、癌細胞を接種して２０日後の担癌ラット３匹からも同様に脾臓を採取した。これらの脾臓を完全培地中で破砕し、血球細胞を取り出した後、赤血球を溶血させて、完全培地に浮遊させた脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。
【００５２】
別にＫＤＨ−８細胞をＣＦＳＥラベルし、５０倍量の上記脾細胞と混合し、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で２０時間培養した。フローサイトメーターでＫＤＨ−８細胞の死亡割合を求め、各脾細胞の殺細胞活性（キラー活性）を求めた。結果を表５にまとめる。
【００５３】
【表５】
0005051362.tif 000006
【００５４】
実施例５の結果から、殺細胞活性増強材カラム群では無治療担癌群に比較し、殺細胞活性が増強されていることが分かる。
【００５５】
［実施例６］
（高分子成型品６の調製）
ネオマイシン硫酸塩１．５ｇを１Ｎ−水酸化ナトリウム１０ｍＬに溶かし、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン４．４ｇと共に７００ｍＬのジメチルスルホキシドに溶かした溶液に、１４．５ｇの中間体２を浸し、２５℃で４８時間静置した。不織布を取り出して、イソプロパノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、１６．５ｇの不織布（高分子成型品６）を得た。このものの吸着性を測定したところ、可溶性ＣＤ２８の濃度低下が４１．０％、アルブミンの濃度低下が７．７％であったので、濃度低下率比は５．３であった。
【００５６】
（ラット脾細胞の細胞傷害活性の測定：直接法）
ＫＤＨ−８細胞接種１３日後の担癌ラット３匹に高分子成型品６を充填したカラムで体外循環を１ｈ施行した後、７日後に脾臓を採取した。コントロールとして体外循環をせず、癌細胞を接種して２０日後の担癌ラット３匹からも同様に脾臓を採取した。これらの脾臓を完全培地中で破砕し、血球細胞を取り出した後、赤血球を溶血させて、完全培地に浮遊させた脾細胞液（２×１０６個／ｍＬ濃度）を調製した。
【００５７】
別にＫＤＨ−８細胞をＣＦＳＥラベルし、５０倍量の上記脾細胞と混合し、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で２０時間培養した。フローサイトメーターでＫＤＨ−８細胞の死亡割合を求め、各脾細胞の殺細胞活性（キラー活性）を求めた。結果を表６にまとめる。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
実施例６の結果から、殺細胞活性増強材カラム群では無治療担癌群に比較し、殺細胞活性が増強されていることが分かる。
【００６０】
実施例１〜６で用いた殺細胞活性増強材（高分子成型品）を表にまとめると、以下の通りである。
【００６１】
【表７】
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【００６２】
実施例１〜６の結果から、本発明にかかる殺細胞活性増強材を充填した体外循環カラムを用いて体外循環を行うことにより、担癌状態によって抑制されている宿主免疫細胞の抗原特異的細胞傷害活性を増強できることが確認できた。