(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
隔膜が全体として負に荷電した１種以上の物質を含む両親媒性の隔膜形成性物質からなるガス含有小胞の水性分散体の製造方法であって、当該方法が、
（ｉ）無菌の水性液体を得、
（ii）この液体の、キレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｃａ及びＺｎイオンの全濃度が４７μＭ未満であるか否かを決定し、
（iii）キレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｃａ及びＺｎイオンの全濃度が４７μＭ未満であることが決定された、或いはキレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｃａ及びＺｎイオンの全濃度が４７μＭ未満となるように処理された上記の液体を、ガス含有小胞を含む物質に添加する
ことを含む方法。
【請求項２】
段階（iii）中の無菌の水性液体の処理がキレート化剤の添加を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
両親媒性の隔膜形成性物質が、セリン基を含む物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
両親媒性の隔膜形成性物質が、リン脂質を含む物質を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
両親媒性の隔膜形成性物質が、ホスファチジルセリンを含む物質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
無菌の水性液体が、場合によってはキレート化剤、浸透調節剤及びｐＨ調整剤からなる群から選択される１種以上の溶質を含む無菌水である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、例えば超音波画像形成で造影剤として使用するための、ガスを含有する小胞を含む組成物、特に医薬品組成物での改良に関し、またこの組成物に関する。
【０００２】
ガスを含有する小胞（例えば、微小バルーン、リポソームなど）を含む組成物を超音波画像形成でのエコー発生性造影剤として使用することが近年広範に提案されており、またこのような組成物は利用可能であるか、あるいは臨床試験下にある。
【０００３】
異なるいくつかの種類の小胞隔膜が、例えば、合成ポリマー、タンパク質、リン脂質などが提案されている。本発明は、両親媒性の隔膜を形成する物質、例えば界面活性剤または脂質、特にリン脂質そして最も特定的には負に荷電した基を有する１つまたはそれ以上のリン脂質、殊にホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸のような全体として負に荷電したものを有する小胞に関する。
【０００４】
ガスを含有する小胞は例えば、ガスと隔膜を形成する物質を含有する液状媒体とを震盪し、超音波処理しまたはローター−ステーター混合することにより、このような両親媒性の隔膜を形成する物質から容易に製造されうるが、本発明者は、得られる組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥物を水性媒体で再構成した後、小胞が僅かな程度に集合し、集塊化し、凝集しあるいは融着することを見いだした。
【０００５】
従って、一つの局面からみて本発明は、両親媒性の隔膜を形成する物質を小胞の隔膜が含む、ガスを含有する小胞の水性分散体を含む医薬品組成物を製造する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）両親媒性の隔膜を形成する物質を含む混合物からガスを含有する小胞の液状分散体をつくり、
（ii）このガスを含有する小胞の液状分散体を凍結乾燥し、
（iii）段階(ii)の凍結乾燥された生成物を無菌の水性液体で再構成してガスを含有する小胞の水性分散体を生成し、
（iv）段階(ｉ)または段階(iii)の水性分散体生成物あるいは段階(ii)の凍結乾燥された生成物を処理して、ガスを含有する小胞の、凝集体（aggregate）を実質的に含まない無菌の水性分散体を生成する
ことからなる。
【０００６】
両親媒性の隔膜を形成する望ましい物質には、負の電荷を有する物質、特に全体的に負に荷電したものが含まれる。さらに特に好ましい両親媒性の隔膜を形成する物質は、セリン基を含む物質、そして特にセリン基を含むリン脂質例えば、ホスファチジルセリンである。
【０００７】
凝集体、アグロメレートおよびフロキュレートという用語は、欠陥のない個々の小胞の集合体（associations）をさす。本発明の方法ではこれらの効果が１つまたはそれ以上低減され、従ってまた本明細書では、これらの集合体の１つまたはそれ以上をさすために凝集体（または凝集化）という用語が使用される。
【０００８】
段階(iv)の処理は、特定の基準に合致する無菌の水性液体を再構成段階(iii)に使用するという形をとってよく、あるいはこれには、段階（ｉ）の分散体の、または再構成された水性分散体の化学的および（または）機械的処理が、別法としてまたは追加的に付加されうる。
【０００９】
負に荷電した基を有する両親媒性の隔膜を形成する物質が、多価金属陽イオンを含む懸濁媒体中で集塊化（agglomerate）する傾向は、懸濁媒体中の小胞の含有率の低下とともにますますひどくなるように思われる。小胞の隔膜の両親媒性の隔膜を形成する物質のリン脂質含有率を増大すると、あるいは隔膜を形成する物質の量を増大すると、あるいは隔膜を形成する物質のリン脂質の表面積を増大すると、欠陥のない個々の小胞が集塊化する傾向が低下するように思われる。リン脂質の含有率または表面積のこのような増大は例えば、小胞の製造で使用する成分を対応的に調整し、あるいは微細気泡中に含まれないリン脂質の量を増加するように製造工程を調整することにより実施できる。
【００１０】
さらに、試料バイアルへの充填と試料の凍結との間に要する時間（つまり、浮遊時間）は、小胞の集塊化の程度に影響する最も重要な要因であることが分かっている。例えば、直ちに凍結すると、生成される集塊物のかなりの減少が生じ、またこの減少は工程および小胞の組成に対してなされる任意の調整とは関わりがないことが示されている。従って、小胞の液状分散体の形成および引き続く小胞の浮遊および分別から、液状分散体の凍結乾燥までの時間が最小化されるのが好ましい。
【００１１】
リン脂質含有率または表面積の増加は、粒子寸法分布が下方に移動するように製造工程を調整して、存在する微細気泡の数濃度を増加することによりリン脂質の利用可能な面積を増加することで実施されてもよい。
【００１２】
上記に論じたように、リン脂質のこのような増加は、再構成時の小胞の集合化の低減に正に相関するのみならず、再構成媒体中のカルシウムイオンによって誘発される集塊化に対する感受性の低下（つまりカルシウム許容性の増大）にも正に相関することが示されている。カルシウム許容性の増大とリン脂質含有率の増大とのこの相関は図２に示される。カルシウム許容性は可視的なまたは顕微鏡下での集塊化を生じる最低の濃度と定義される。
【００１３】
負に荷電した基を有する両親媒性の隔膜を形成する物質のモル濃度に対する水性懸濁体中のキレート化されてないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎ（そしてまた特に望ましくはＦｅ）の全モル濃度の比は１：２より小さく、特に１：２．５より小さく、一層望ましくは１：３より小さくそして最も望ましくは１：６より小さいのが好ましい。
【００１４】
従って、別な局面から見ると本発明は、負に荷電した基を有する両親媒性の物質（例えば、リン脂質）を小胞の隔膜が含む、ガスを含有する小胞の水性分散体を含む医薬品組成物を提供し、この場合、負に荷電した基を有する両親媒性の隔膜を形成する物質のモル濃度に対する水性懸濁媒体中のキレート化されてないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎ（そしてまた特に望ましくはＦｅ）イオンの全モル濃度の比は１：２より小さく、特に１：２.５より小さく、一層望ましくは１：３より小さくそして最も望ましくは１：６より小さい。
【００１５】
凝集体の形成を減少させる別な方法は、キレート化されてないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎイオンの全濃度が１００μMより小さく、望ましくは５０μMより小さく、特に４７μMより小さく、より特定的には４５μMより小さく、より特定的には４０μMより小さく、より特定的には３５μMより小さく、より特定的には３０μMより小さくそして最も特定的には２５μMより小さい、無菌水のような水性液体で凍結乾燥物を再構成することである。殊に好ましくは、これらの全体の濃度の限界は、両親媒性の隔膜を形成する物質に対する別な多価の対イオン、例えばＦｅイオンについて適用される。ＭｇイオンとＣａイオンとを合わせたものが５０μMより小さい濃度を有し、特にＭｇイオンとＣａイオンとＡｌイオンを合わせたものが３０μMより小さい濃度を有するのが好ましい。Ｍｇ、Ｃａ、ＢａおよびＺｎのようなキレート化されてない個々の２価のイオンの濃度が３０μMより小さく、またＡｌのようなキレート化されていない３価のイオンの濃度が３０μMより小さいのが好ましい。
【００１６】
従って、さらに別な面からみると、本発明は、無菌の水性媒体中のガスを含有する小胞の分散体を含む、望ましくは腸管外投与のための医薬品組成物を提供し、この場合、得られる水性媒体中のキレート化されてないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎのイオンの全体の濃度は１００μMより小さく、望ましくは５０μMより小さく、特に４７μMより小さく、より特定的には４５μMより小さく、より特定的には４０μMより小さく、より特定的には３５μMより小さく、さらにより特定的には３０μMより小さくそして最も特定的には２５μMより小さい。ＭｇイオンとＣａイオンとを合わせたものが５０μMより小さい濃度を有し、特にＭｇイオンとＣａイオンとＡｌイオンを合わせたものが３０μMより小さい濃度を有するのが最も好ましい。キレート化されていない個々のＭｇ、Ｃａ、ＢａおよびＺｎイオンの濃度が３０μMより小さく、またキレート化されていないＡｌイオンの濃度が３０μMより小さいのがやはり好ましい。
【００１７】
キレート化されていないとは、イオンが遊離しているかあるいはＥＤＴＡによって捕捉されうるほどに弱く結合していることを意味する。
医薬品用として市販で入手できる水は、たとえ無菌水または注射用水といえども上記の金属イオンの濃度基準を必ずしも満足しない。
【００１８】
従って、さらに別な面からみて本発明は、ガスを含有する小胞を含む医薬品組成物（例えば、診断用画像形成手続きが関与する診断法で造影剤として使用するための組成物）を製造するために、負に荷電した基を有する両親媒性の隔膜を形成する物質のモル濃度に対する得られる水性分散体中のキレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎ（そしてまた特に望ましくはＦｅ）の全モル濃度の比が１：２より小さく、特に１：２.５より小さく、一層望ましくは１：３より小さくそして最も望ましくは１：６より小さいか、あるいはキレート化されていないＡｌ、Ｍｇ、Ｃａ、ＢａおよびＺｎイオンの全濃度が１００μMより小さく、望ましくは５０μMより小さいなどのいずれかの場合、無菌の水性液体（望ましくは水）を、ガスの充填された小胞を含む物質に混入することにより使用することを提案する。
【００１９】
さらに別な面からみて本発明は、
（ｉ）無菌の水性液体を得、
（ii）この液体中のキレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎの全濃度を決定し、
（iii）小胞の両親媒性の隔膜を形成する物質のモル濃度に対する得られる水性分散体中のキレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎの全モル濃度の比が１：２より小さく、特に１：２.５より小さく、一層望ましくは１：３より小さくそして最も望ましくは１：６より小さくなるように、ガスを含む小胞を含有する物質に上記の液体を添加する
ことからなるガスを含有する小胞の水性分散体を製造する方法を提供する。
【００２０】
さらに別な面からみて本発明は、
（ｉ）無菌の水性液体を得、
（ii）この液体の、キレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎイオンの全濃度が１００μMより小さい、望ましくは５０μMより小さいかどうかを決定し、
（iii）キレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎイオンの全濃度が１００μMより小さい、望ましくは５０μMより小さいなどが決定された、あるいはキレート化されていないＡｌ、Ｂａ、Ｍｇ、ＣａおよびＺｎイオンの全濃度が１００μMより小さい、望ましくは５０μMより小さいなどのように処理された上記の液体を、ガスを含有する小胞を含む物質例えば、凍結乾燥物に添加する
ことからなるガスを含有する小胞の水性分散体を製造する方法を提供する。
【００２１】
２価または３価の遊離の金属イオンの水中の濃度は、キレート化剤、例えばクエン酸、ＥＤＴＡ、デスフェリオキサミン（desferrioxamine）または他の既知の任意のキレート化剤を添加することにより低下させることができる。特に、使用されるキレート化剤はカルシウムまたはマグネシウムキレート化剤例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＴＭＴ、ＰＬＥＤ、ＤＰＤＰまたはＥＧＴＡ、最も望ましくはＥＤＴＡのようなアミノポリカルボン酸または他の多塩基酸である。好適なキレート化剤の例は文献中に、特にＭＲおよび核画像形成のための診断用造影剤に関するNycomed、Salutar、Sterling Winthrop、Schering、Bracco、Squibb、GuerbetおよびMallinckrodtの公にされた特許出願に見出されることができる。
【００２２】
従って、キレート化剤望ましくは生理学的に許容できるキレート化剤が、再構成媒体が凍結乾燥物と接触される前、最中または後にこれに添加される場合、上記の基準に合致しない水性の再構成媒体が本発明に従って使用されてよい。使用されるキレート化剤の量は、キレート化されていない２価または３価の金属イオンの濃度を上記に規定した限界より低くするようなものであるのが好ましい。市販で入手できる『純粋な』水の場合、キレート化剤は典型的に５〜１０００μM、例えば１０〜５００μM、特に３０〜１００μMの濃度で添加されてよい。
【００２３】
キレート化剤はしばしば、その遊離の形の酸に比較的不溶である酸である。従って、対イオンが１価であるキレート化剤の塩および生理学的に許容できる塩、例えば有機アミン、アンモニウムまたはアルカリ金属（例えば、ナトリウム）の塩を使用するのが好ましい。
【００２４】
キレート化剤は凍結乾燥に先立って、小胞を含有する組成物中に含められてよく、再構成の前に再構成媒体中に添加されてよくあるいは再構成された分散体に添加されてよい。
【００２５】
凍結乾燥された生成物を再構成するために無菌水が使用されるのが好ましいが、いくつかの溶質、例えばキレート化剤、浸透圧調整剤、およびｐＨ制御剤もまた存在してよい。これに関連して、キレート化されていない多価の金属イオンを導入する物質を使用することは明らかに好ましくない。好適な浸透圧調整剤には、蔗糖、ブドウ糖、麦芽糖、グリセロール、マンニトールおよびソルビトールのような糖がある。好適な緩衝剤には、トリスアミンおよび他の有機アミンをベースとする緩衝剤系がある。懸濁媒体のｐＨは４.５を越えるように例えば、６〜９、望ましくは約７に保たれるのが好ましい。
【００２６】
多価金属イオン濃度の制御または、多価金属イオン濃度と両親媒性の隔膜を形成する物質の濃度との比の制御の代わりにあるいはこれに加えて集塊化が、物理的に（例えば、濾過により）そして（あるいは）例えば激しい撹拌、超音波処理または押し出しにより、例えば濾過または直径が制限された開口の通過、例えば直径が１ミリ以下の管の通過により減少されあるいはほとんど無くされることができる。撹乱のためにかなりの剪断力に曝されることが関わるこのような機械的応力は、凍結乾燥物を再構成媒体中に分散させるための手によるゆっくりした震盪、つまり約３０cm・秒-1より小さい応力係数Ｆ（震盪の最大振幅（ピークからピークまで）と震盪の振動数との積）に混合物をさらす震盪を用いるのとは明らかに異なる。対照的に、激しい震盪により凝集化／集塊化を減少する機械的応力は少なくとも５０cm・秒-1、望ましくは少なくとも８０cm・秒-1であろう。これは手による激しい震盪によりあるいは渦流混合機またはキャップミキサー（capmixer）を使用して実施され得る。
【００２７】
再構成された分散体が押し出しによる機械的応力に曝される場合、これは直径が１ミリまでの（望ましくは１００〜８００μm、例えば内径０.５ミリ、長さ４０ミリの寸法の注射針）少なくとも１つの開口または管を通じて実施されるのが好ましくあるいはフィルターの細孔を通じて実施されるのが一層好ましい。フィルターを使用する場合、細孔寸法は小胞の寸法、例えば１〜１０μm、特に３〜６μm、殊に５μmに似ているかそれより僅かに小さいのが好ましい。このようなフィルターは医薬品としてまた材料として使用するための無菌の器具として市販で入手できる。
【００２８】
このようなフィルターを通じて小胞を通過させると、小胞の全含有率、小胞の平均直径および寸法分布、または分散体のエコー発生能に生じる変化は極めて少ない。
フィルターが使用される場合、それがフィルター器具組み立て物内にあるのが好ましい。
【００２９】
従って、さらに別な面からみて本発明は、（ｉ）フィルター器具組み立て物、（ii）ガスを含む両親媒性の隔膜のある小胞の無菌の水性分散体か、無菌の水性再構成媒体のいずれかと、ガスを含む両親媒性の隔膜のある小胞を含有する別個な水分散性物質、場合によっては（iii）上記のフィルター器具組み立て物を装着できる注射器本体そして場合によっては（iv）注射用の針からなる医薬品組成物キットを提供する。(iv)は(ｉ)のフィルター器具組み立て物が注射のために使用される場合に分散体を除去するために使用されてよい。
【００３０】
本発明のキットには、ガスを含有する小胞の無菌の水性分散体が予め充填された注射器本体が含まれるのが有利である。
【００３１】
本発明の方法および製品でのガスを含有する小胞中のガスは、生理学的に許容できる任意のガスまたはガス混合物であってよく、これによって体温、例えば３７℃でガス状である物質がふくめられる。好適なガスには、空気、酸素、窒素、ヘリウム、二酸化炭素、六弗化硫黄、低分子量の炭化水素、および低分子量の弗化炭化水素およびこれらの２つまたはそれ以上の混合物がある。ガスがパーフルオロカーボン、例えばパーフルオロブタンまたはパーフルオロペンタンからなるのが特に好適である。好適な他のガスの例は、ＷＯ−Ａ−９７／２９７８３（Nycomed）中に見出され、これの全開示は、参照によって本記載に加入する。
小胞は単層または多層であってよいが、実質的に単層であるのが好適である。
【００３２】
小胞の隔膜は任意の好適な両親媒性の隔膜を形成する物質、例えばイオン性または非イオン性の界面活性剤、タンパク質またはリン脂質からできていてよい。両親媒性の隔膜を形成する物質は、荷電した親水性部分、特に負に荷電した親水性部分を有するのが特に好ましい。従って、隔膜を形成する物質は、荷電したリン脂質、例えばホスファチジルセリンであるかこれを含むのが好ましい。好適な隔膜を形成する物質の例もＷＯ−Ａ−９７／２９７８３中に見出される。
【００３３】
ガスを含有する小胞は１〜１０μm、特に２〜７μm、殊に２〜５μmの体積基準の寸法中央値を有するのが好ましく、また７〜１０μmの範囲の微細気泡の体積濃度が最小化される。ガスを含有する小胞は０.１〜５０μL／mL、特に１〜３０μL／mL、殊に２〜１５μL／mL、例えば１０μL／mLの濃度で投与されるの好都合であろう。上記に示したように水性分散媒体は、凍結乾燥物から得ることのできる別な物質、例えばｐＨ調整剤、キレート化剤、浸透圧調節剤、安定剤などを含有してよい。
【００３４】
本発明は、ガスを含有する小胞中のガスがパーフルオロブタンまたはパーフルオロペンタンであり、両親媒性の隔膜を形成する物質がリン脂質またはその混合物、好ましくはホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸のように全体として負の電荷を有するリン脂質であり、小胞寸法（体積基準）の中位数が１〜１０μmであり、またすぐ使える形での濃度が０.１〜５０μL／mLである組成物に特に適用可能である。
次に、以下の非限定的な実施例を参照しつつ本発明をさらに説明する。
【００３５】
実施例１
ホスファチジルセリンで安定化された、直径が３±１μm（体積基準）のパーフルオロブタン小胞を含む微細気泡の、蔗糖基質中の分散体〔参照によって、その開示の全体が本記載に加入された、WO−A−97／29783（Nycomed）の実施例２(ｂ)に記載のように製造されたもの〕を、９２mg／mlの蔗糖溶液を使用して１／２および１／４の濃度まで希釈した。得られる分散体の試料２mlをとり、これに０.５mMの原料溶液を用いてＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2またはＦｅＣｌ2を添加した。イオンの最終濃度は、０.０１μM刻みで０.０１〜０.１μMであった。ＦｅＣｌ2については、脂質の最大濃度での集塊化を達するように追加の濃度０.１２、０.１５および０.１７μMで試験した。最終的な希釈物のｐＨは６.２であった。バイアルを視覚的に評価して、イオンの添加の直後そして約２時間および２０時間の後に集塊物が存在するかいなかを決定した。結果を図１に示す。
【００３６】
図１は、約２０時間後に可視的な集塊物が生成される最低のイオン濃度を示す。可視的なまたは顕微鏡下の集塊化を生じる最低のイオン濃度は『閾値』と称される。ＣａおよびＦｅの場合、添加後１〜２０時間に変化はほとんど無いが、Ｍｇの場合、沈殿する最低の濃度はこの期間中に半減した。しかしながら、ＣａおよびＭｇについて、終点の水準は似ており、これら２つのイオンの脱安定化の機構が同一であるが、反応速度は異なることが示される。イオン：脂質のモル比が１：２より小さいとき両方のイオンが脂質を沈殿させる。対照的にＦｅの反応性はより小さく思われまた１：１のモル比で沈殿が起きる。２０時間における閾値は脂質の濃度と直線的に相関する。
【００３７】
実施例２
ホスファチジルセリンでカプセル封入された、直径が３±１μm（体積基準）のパーフルオロブタン小胞を含む、蔗糖基質中の凍結乾燥物〔参照によって、開示の全体が本記載に加入されている、WO−A−97／29783（Nycomed）の実施例２(ｂ)に記載のように製造されたもの〕を、２mlの水（または希釈剤）の１１の試料中にて分散して小胞濃度が１０μL／mLの分散体をつくった。分散体を視覚的に検査して集塊物が有るか無いかを評価した。この検査の結果および再構成に先立つ水試料の遊離金属イオン濃度を下記の表１に示す。
【００３８】
【表１】
0005047415.tif 000002
【００３９】
５および６のバッチは、Kabi Pharmaciaの無菌水の試料であった。８のバッチは、B. Braun Medical ABの無菌水の試料であった。７のバッチは蒸留したての水の試料であった。
【００４０】
実施例３
キット
５μmの規格を有する充填フィルターの無菌の針、２mlの無菌水の入った予め充填され密封された注射器、注射用の針および無菌水で再構成されると１０μL／mLの分散体を生成するのに十分な、実施例１に記載の凍結乾燥物を含むガスを含有する小胞の入った密封されたバイアルからなる超音波造影剤キットをつくった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  微細気泡の分散体を１／２および１／４に希釈することにより達せられるリン脂質含有率の低下と陽イオン許容性との相関を示す。
【図２】  凍結乾燥に先立ってリン脂質含有率を増大すると凍結乾燥された処方物のカルシウム許容性がいかに増大するかを示す。
【図１】
0005047415.tif 000003
【図２】
0005047415.tif 000004