(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ反応性蛋白を検出するための競合的免疫測定を実行するための方法において、
（ｉ）サンプルを、Ｃ反応性蛋白に対する親和性が約１０-7Ｍの固定した抗ヒトＣ反応性蛋白抗体および、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３にＫｄ＜１０-8Ｍの親和性で結合することのできるラベル化した抗イディオタイプ抗体と接触させ、ここで、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３に対する結合は、Ｃ反応性蛋白の結合と相互に排他的である、または、
サンプルを、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３にＫｄ＜１０-8Ｍの親和性で結合することのできる固定した抗イディオタイプ抗体およびＣ反応性蛋白への親和性が約１０-7Ｍのラベル化した抗ヒトＣ反応性蛋白抗体と接触させ、ここで、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３に対する結合は、Ｃ反応性蛋白の結合と相互に排他的である
工程と、
（ｉｉ）前記ラベルを検出する工程と、
（ｉｉｉ）前記ラベルの検出結果をサンプル内のＣ反応性蛋白の量に対して相関付ける工程とを備えた方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記抗ヒトＣ反応性蛋白抗体が、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３である、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記抗イディオタイプ抗体が、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３に結合し得る、方法。
【請求項４】
競合的免疫測定のための一式の装置において、
Ｃ反応性蛋白への親和性が約１０-7Ｍの抗ヒトＣ反応性蛋白抗体である第１の抗体と、
当該第１の抗体に結合可能な抗イディオタイプ抗体である第２の抗体と
を含む装置。
【請求項５】
ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託された、ＣＲＰ５−２３として同定される抗ヒトＣ反応性蛋白抗体を生成できるハイブリドーマ細胞系。
【請求項６】
請求項５に記載のハイブリドーマにより生成した抗体。
【請求項７】
抗ヒトＣ反応性蛋白抗体に結合するための抗イディオタイプ抗体であって、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３にＫｄ＜１０-8Ｍの親和性で結合することができ、ＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマが産生するＣＲＰ５−２３に対する結合は、Ｃ反応性蛋白の結合と相互に相互に排他的である、抗イディオタイプ抗体。
【請求項８】
ＰＴＡ−１３５３の名称でＡＴＣＣに寄託されている、Ｃ２３ｉｄ２−６．３として同定される抗イディオタイプ抗体を生成できるハイブリドーマ細胞系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）を検出するためのインビトロ診断用免疫測定に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高濃度および高分子量の分析物の場合の最近の免疫測定は比色定量的または化学発光的な検出システムを使用する臨床化学的な分析器（analyzers）を多様に用いて行うことが困難である。
【０００３】
一般に、市場における高濃度および高分子量の分析物の場合の免疫測定は分析物の多面的な特性に基づいて断定されている。最終的に、分析物は（混濁または比濁測定における）凝集、析出（放射状免疫拡散）、またはサンドイッチ式免疫測定のいずれかによるある種の架橋反応により検出される。これらの種類の免疫測定はそれぞれ自動化システムに翻訳するという相当な手間を要する。すなわち、放射状免疫拡散測定は極めて時間がかかり（数時間乃至数日）、慎重に選択した相当量の抗血清を必要とする。また、凝集反応に基づく測定は初期的な希釈処理および相当量の免疫材料が必要である。さらに、上記の各方法は現在の臨床分析器において通常的に存在していない特別な光学システムを必要とする。加えて、サンドイッチ式または２部位式（two-site）免疫測定は大量の初期的な希釈処理または高価な免疫材料の不所望に大量の濃縮処理のいずれかを必要とする。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
競合的な免疫測定に関するフォーマットの現状での可能性が多くの治療薬または薬物の乱用のような場合における高濃度で低分子量の分析物に対して最も好適に適用されている。これまで、上記のような競合的な免疫測定は遊離の薬物と薬物誘導したハプテンおよびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の化学的結合により調製される酵素ラベルとの間の有限数の薬物特定結合部位（固定化抗体分子）についての競合に基づいて断定されている。一般に、上記の診断検査における試薬の選択基準は、第１に、薬物−抗体複合物の解離定数（Ｋｄ）が血清サンプル中の薬物濃度に（１０の係数以内で）一致する必要があること、第２に、ラベル−抗体複合物の解離定数が同一条件下における薬物−抗体複合物の解離定数よりも相当に（分析物の絶対濃度に基づいて１倍乃至数倍の程度で）低いことを含む。しかしながら、必要な親和性の諸条件を有する抗体およびラベルを作成する場合の困難さにおいて不都合が存在する。
【０００５】
高濃度で高分子量の分析物の場合に上記の諸条件を満足することは困難である。特に、上記の第２の条件（ラベル化した分析物における比較的高い親和性）を達成することが困難である。一方、薬物のような比較的小さな分子の場合は、ラベルに対する抗体の親和性を、「リンカー作用（linker effect）」（抗体とリンカーとの間の相互作用による付加的な結合エネルギー）、ラベルのハプテンに対する多数部位置換（multisubstitution）、および、可能な場合における、ラベル表面上における薬物の好適な配向を含む幾つかの作用により高めることができる。しかしながら、高分子の分析物の場合には、分析物との間の相互作用におけるエピトープおよび分析物−酵素結合が同一であって分析物上の全体に存在しているために、同等の作用は期待できない。別の見方をすれば、このような分析物は溶液中に遊離している状態またはＨＲＰ分子に結合している状態のいずれであっても抗体と同様の作用を示すと考えられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は目的の分析物が高濃度で高分子量である場合に高濃度で低分子量の分析物を検出するための従来手法を採用することにおける欠陥を解消した。従って、本発明の目的は高濃度で高分子量の目的の抗原に対して特異的な抗体に関連する抗イディオタイプの単一クローン抗体母集団を得るための方法を提供することであり、当該方法において、上記の抗イディオタイプの抗体母集団が上記の目的の抗原に対して特異的な選択された抗体に対する広範囲な結合親和性を有しており、上記の抗イディオタイプの抗体母集団の一部分が特定用途に対して必要な親和性を有するように選択できる。好ましい実施形態において、上記の抗イディオタイプの抗体母集団は上記の抗体に対応する目的の抗原の親和性よりも相当に高い目的の抗原に関連する抗体に対する親和性を示すように選択される。さらに、本発明者は上記の目的の抗原に対して低い親和性の抗体を得るための手段を開示する。
【０００７】
別の態様において、本発明は新規なＣＲＰ免疫測定組成物に関する。この組成物は低親和性（ＫD ≒１０-7Ｍ）の抗ヒトＣＲＰ単一クローン抗体（ＣＲＰ５−２３）および当該ＣＲＰ５−２３に対して培養した抗イディオタイプ抗体を含んでいる。本発明者はＣＲＰに対して効果的に結合するＣＲＰ５−２３がイオン化したカルシウムに対して反応しないことを発見した。この抗体用のハイブリドーマはＰＴＡ−１３５４の名称でＡＴＣＣにより寄託されている。
【０００８】
さらに別の態様において、本発明は一般に競合的免疫測定法、ドライ−フィルムおよび溶液を基材とする構成要素およびキットに関し、特に、ＣＲＰについての免疫測定に関する。
【０００９】
目的の分析物（抗分析物性抗体（antianalyte antibody））に対して適当な親和性を有する抗体を用いて開始することにより、抗イディオタイプ抗体を、（ｉ）抗分析物性抗体に対する高い親和性を有していて、（ｉｉ）抗分析物性抗体に対する結合において相互に排他的な様式で目的の抗原に対して競合するように調製して選択できる。
【００１０】
本発明者は本明細書において抗ＣＲＰ性抗体に対応するＣＲＰよりも高い親和性を有する抗イディオタイプ抗体の使用に基づくヒトＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）についての競合的酵素免疫測定の開発について記載している。本発明は２種類の新規な免疫材料を具体化している。すなわち、第１の免疫材料は比較的低親和性の抗ヒトＣＲＰ単一クローン抗体であるＣＲＰ５−２３であり、この材料はＣＲＰとの相互作用がイオン化したカルシウムに対して無反応性である（［Ｃａ++］が０ｍＭ乃至１ｍＭの範囲内で変化する時にＫD が２の係数よりも小さい範囲で変化する）という極めて有用な付加的な特性を有している。このＣＲＰの構造がカルシウムによって決まり、抗体およびＣＲＰの結合がカルシウムに依存していないという事実が有用であり、実際に有利な点である。抗原であるＣＲＰを含有する生物学的な各サンプルにおいてカルシウムの量が変化するので、上記の結合無反応性がＣＲＰについての免疫測定において有効である。
【００１１】
第２の免疫材料はＣＲＰ５−２３に対して培養された抗イディオタイプ抗体であり、ＣＲＰ５−２３に対してヒトＣＲＰと競合してＣＲＰおよびこの抗イディオタイプ抗体のＣＲＰ５−２３に対する結合が相互に排他的になるような機能について選択される。このような抗イディオタイプ抗体を生成することのできるハイブリドーマはＰＴＡ−１３５３の名称でＡＴＣＣにより寄託されている。
【００１２】
１９８９年５月９日に発行された米国特許第４，８２８，９８１号、および１９９３年６月１５日に発行された米国特許第５，２１９，７３０号のような既に発行された少なくとも２件の米国特許が抗イディオタイプ抗体を使用する免疫測定を記載している。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書において使用する「抗イディオタイプ抗体」は、その定義において、同類の（cognate）抗体、この場合においてＣＲＰ５−２３のＶH および／またはＶL ドメインに結合する抗体である。この場合において、抗イディオタイプ抗体はその同類の抗体に対する結合が分析物ＣＲＰの結合により相互に排他的になるという付加的な特性を有している。
【００１４】
本明細書において使用する「サンプル」とは、関与する分析物を含有し得るあらゆる基質を意味する。このサンプルは全血、または赤血球、白血球、血小板、血清およびプラスマ、腹水、尿、脳脊髄流体、および関与する分析物を含有し得るその他の成分を含む全血成分のような生物学的流体とすることができる。必要に応じて、このサンプルは水、土、草木から得ることができる。
【００１５】
また、「競合的免疫測定（competitive immunoassay）」とは、有限数の相互に排他的な結合部位に対して測定する分析物およびラベル化した検出器分子が競合するように構成されている免疫測定を意味する。このような種類の免疫測定においては、分析物が多量にあることが検出器分子の結合と相反的な関係を有する。
【００１６】
この測定は検出器分子に付着してラベル化した検出器分子を形成することのできる任意の酵素ラベルにより行うことができる。例えばグルコース・オキシダーゼ等のオキシダーゼ、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼおよびガラクトシダーゼのような酵素が好ましいラベルである。
【００１７】
さらに、任意のラベルに対する適当な基質を決定することは、例えば、臨床化学分野における作業者等の、通常の熟練者が有する技術の範囲内である。この基質は酵素ラベルにより直接的に作用を受ける材料であるか、ラベルの酵素的反応に関連する一連の反応に関係する材料とすることができる。
【００１８】
本発明において効果的に使用できるその他のラベルは例えばフルオレセイン、ダンシル等の蛍光ラベル、化学発光ラベル、および例えば125 Ｉまたは14Ｃを含む放射性ラベルである。
【００１９】
本発明の効果および利点を以下の各実施例によりさらに説明する。これらの実施例は本発明の趣旨および範囲を説明するためのものであり、本発明の趣旨および範囲を制限するためのものではない。
【００２０】
実施例１：低親和性抗ＣＲＰ単一クローン抗体の調製
ヒト血清中に見られるＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）の濃度範囲は５ｍｇ／Ｌ（４０ｎＭ）よりも小さい正常値から３００ｍｇ／Ｌ（２．６μＭ）よりも大きな値までに及ぶ。ＣＲＰについての適当な競合的免疫測定を構成するためには、同一濃度範囲内、すなわち、４０ｎＭ乃至２．６μＭの範囲内のＣＲＰに対応する解離定数（Ｋｄ）を有する単一クローンの抗体が必要である。そこで、ＣＲＰに対する単一クローン抗体をＣＲＰ−リムルス・ヘモシアニン結合体によるＣＡＦ１マウスの免疫処置に続いて発生させ、ＥＬＩＳＡによりＣＲＰに対する結合についてスクリーニングした。得られたＣＲＰ反応性培養体をクローン化し、これらが分泌した抗体を競合的ＥＬＩＳＡ技法によりＣＲＰに対する親和性について測定した。先ず、この抗体の培養体をＣＲＰ・ＥＬＩＳＡプレート上において滴定して最大の吸光度の値が一定のプラトーに到達する濃度を決定した。このプラトーにおける最大の吸光作用が生じる最小の濃度を競合的ＥＬＩＳＡ技法に用いて抗体濃度が制限されていることを確認した。種々の濃度における可溶性ＣＲＰをサンプルの抗体と共に混合した後に、ＥＬＩＳＡプレートに供給して阻害プロファイルを作成した。この場合の最大吸光度の値の５０％の減少を生じる濃度が抗体−ＣＲＰの相互作用の解離定数に概ね相当する。図１はそれぞれの阻害プロファイルから導いた幾つかの抗体の親和性測定値を示している図である。抗体のＣＲＰ５−２３（ＩｇＧｌ，κ）は０．４μＭの解離定数を示し、この値はＣＲＰについての競合的免疫測定を構成するための第１の必須基準（分析物に対する比較的低い親和性）を満たしている。
【００２１】
実施例２：ＣＲＰ５−２３に対する抗イディオタイプ抗体の調製
ＣＡＦ１マウスをリムルス・ヘモシアニンに対して結合したＣＲＰ５−２３抗体により免疫処置した。これらのマウスを殺して、この免疫処置したマウスから得た脾臓細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と共に融合した。先ず、得られたハイブリドーマをＣＲＰ５−２３により調製した固定Ｆａｂフラグメントに対して結合した抗体の分泌について従来的なＥＬＩＳＡ技法によりスクリーニングした。このスクリーニングによりＣＲＰ５−２３のＦａｂフラグメントに対する公称の反応性を有する母集団を定めることができる。
【００２２】
さらに、選別を行って競合的免疫測定において重要な特性を有する抗体を識別した。適当な抗イディオタイプ抗体を選別するために採用した基準は、
１．比較的高い親和性（Ｋｄ＜１０-8Ｍ）でＣＲＰ５−２３に結合する必要があること、および、
２．そのＣＲＰ５−２３に対する結合が分析物であるＣＲＰの結合により相互に排他的であることが必要であることである。
【００２３】
Biacore装置を使用する表面プラスモン共鳴により陽性クローンを再スクリーニングして（脱離速度（off-rate）において反映される場合の）ＣＲＰ５−２３に対する抗イディオタイプ抗体の親和性および結合の相互排他性を測定した。ラビットの抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）をバイオセンサーの表面上に固定して、ハイブリドーマ培養体の上澄み液から抗イディオタイプ抗体を捕捉するために用いた。０．２ｎＭにおけるＣＲＰ５−２３のＦａｂフラグメントの単独物および０．９ｎＭのＣＲＰが存在している物を固定化した抗イディオタイプ抗体の表面上に注射して相対質量の累積を比較した。その結果、抗イディオタイプ抗体の１種であるＣ２３ＩＤ２−６．３（ＩｇＧｌ，κ）は抗イディオタイプ抗体についての本発明者の基準を満たした。すなわち、この抗イディオタイプ抗体はバイオセンサーの表面からの脱離速度が極めて遅いことにより示される見かけ上において高い親和性でＣＲＰ５−２３のＦａｂフラグメントに結合し、その結合が競合体（competitor）として使用した比較的低濃度のＣＲＰの存在下において約３３％阻害された。
【００２４】
実施例３：従来のＥＬＩＳＡ技法における抗イディオタイプ抗体による競合的免疫測定の調製
抗ＣＲＰ抗体であるＣＲＰ５−２３およびその抗イディオタイプ抗体であるＣ２３ＩＤ２−６．３をこれらのＨＲＰ結合した各相当物と共に用いて２種類のＥＬＩＳＡ技法に基づく競合的免疫測定を開発した。これらの２種類のＥＬＩＳＡフォーマットを図２に示し、ＣＲＰに対するそれぞれの対応する投与応答曲線を図３に示す。これらの図に示すように、フォーマット１はプレート表面上に固定した抗イディオタイプ抗体により構成されており、ＨＲＰラベル化した抗ＣＲＰ抗体が固定した抗イディオタイプ抗体上の部位において可溶性のＣＲＰと共に競合する。フォーマット２は各試薬の逆の配向を採用しており、この方式においては、抗ＣＲＰ抗体が固定されていて、溶液内のＨＲＰラベル化した抗イディオタイプ抗体およびＣＲＰがプレート上の抗ＣＲＰ抗体の部位において競合する。標準的なＦＬＩＳＡ技法を行って抗体を固定し、非特異的部位をブロックし、ラベルを滴定して、信号の発生および検出を行った。この結果、図示のように、ＣＲＰ濃度の増加に伴う投与応答曲線の減少または降下が両方のフォーマットの使用において見られた。
【００２５】
実施例４：可溶性ラベルを含有するドライ−フィルム・フォーマット内の抗イディオタイプ抗体によるＣＲＰに対する投与応答曲線の作成
上記の免疫材料の作用はＥＬＩＳＡフォーマット内において明瞭に示されたので、本発明者はこれらの材料のドライ−フィルム・フォーマットにおける有用性を次に調べた。免疫−速度測定用のコーティング材料を各フォーマットに対して作成した。フォーマット１のコーティング材料はビーズ上に固定されて受容体または散布層のいずれかの形態においてコーティングされた抗イディオタイプ抗体Ｃ２３ＩＤ２−６．３により構成されている。その後、可溶性のＨＲＰラベル化した抗ＣＲＰ抗体のＣＲＰ５−２３を血清サンプルに添加して標準的な免疫速度測定方法に従ってVITROS（登録商標）２５０分析器により処理して各コーティング材料を評価した。フォーマット２のコーティング材料は、これらのコーティング材料がビーズ上に固定した抗ＣＲＰ抗体のＣＲＰ５−２３により構成されていて、ＨＲＰラベル化した抗イディオタイプ抗体を各サンプルに加えたことを除いて、上記と同様に製造して評価した。図４はＣＲＰに対する投与応答曲線の各フォーマットについての実施例を示している図である。これらの両方のフォーマットはＣＲＰ濃度の増加に伴って下降する投与応答曲線を示しており、これらの曲線はＣＲＰ濃度の臨床的に関連する濃度の範囲内において下降している。
【００２６】
実施例５：コーティングしたラベルを含有するドライ−フィルム・フォーマット内の抗イディオタイプ抗体によるＣＲＰに対する投与応答曲線の作成
これらの免疫材料のドライ−フィルム中における有用性を示すために、ＨＲＰラベルをインクジェット印刷処理により両方のフォーマットのコーティング材料の中に混入させた。フォーマット１の場合は、ＨＲＰ結合したＣＲＰ５−２３を、固定したＣ２３ＩＤ２−６．３を含有するドライ−フィルム・コーティング材料上に供給した。１０μＬの血清サンプルによる再塗布処理後の公称濃度は２．５ｎＭ・ＩｇＧであった。同様に、ＨＲＰ結合したＣ２３ＩＤ２−６．３を１０μＬの血清サンプルの再塗布時における最終濃度が約０．５ｎＭ・ＩｇＧになるように固定化したＣＲＰ５−２３を含有するドライ−フィルム・コーティング上に供給した。これらのインクジェット印刷処理したコーティング材料を自然乾燥させた後に、種々のＣＲＰ濃度における血清サンプルをVITROS（登録商標）２５０分析器における免疫速度アッセイとして評価した。この結果、図５に示すように、両方のフォーマットがＣＲＰ濃度の増加に伴って下降する投与応答曲線を示した。
【００２７】
実施例６：完全に製造した免疫速度測定用ドライ・スライド・フィルム・フォーマットにおけるＣＲＰに対する投与応答曲線の作成
このドライ−フィルムの製造方法を説明する。完全な免疫速度測定用コーティング材料を既にフォーマット１について説明したように調製した。その後、抗ＣＲＰ性ＨＲＰラベルを免疫速度測定用グラビア・シリンダー印刷処理によりドライ−フィルム内に混入させた。この完全な機械的に製造したコーティング材料を切断し、VITROS（登録商標）２５０分析器に取り付けて異なるＣＲＰ濃度の血清を基材とする各サンプルと共に測定した。結果として得られたＣＲＰ濃度の増加に伴って下降する投与応答曲線は希釈または予備処理を行うことなくＣＲＰに対応する分析物の範囲内で未知のサンプルのＣＲＰ値を測定するために使用できる（図６を参照されたい）。
【００２８】
実施例７：VITROS（登録商標）ＥＣｉ自動化免疫測定用分析器における抗イディオタイプ抗体によるＣＲＰに対する投与応答曲線の作成
フォーマット１の場合において、従来法により、ＣＲＰ５−２３をＨＲＰに結合させ、Ｃ２３ＩＤ−６．３をビオチンに結合させた。図７（Ａ）に示すように、０．１ｍｇ／Ｌ乃至１０００ｍｇ／Ｌの範囲で変化するＣＲＰ濃度を有する各サンプルを用いて投与応答曲線を作成した。さらに、フォーマット２についての同様のデータを図７（Ｂ）に示す。
【００２９】
以上の結果から、本発明の免疫材料により構成した免疫測定法において以下のような幾つかの利点が見られた。
１．種々のフォーマットに対して容易に適応できる競合的免疫測定。
２．分析範囲：分析範囲は幅において約２倍程度であり、ヒト血清における既知のＣＲＰ濃度の有用な範囲内である。この分析範囲は各主成分の濃度およびいずれの成分が固定または移動可能であるかの選択により適宜変更できる。
３．多様性：本発明の測定方法（アッセイ）は２種類以上の方法で構成できる。
本発明において具体化した構成の例は、
（ｉ）ＣＲＰ５−２３が固定されており、抗イディオタイプ抗体のＨＲＰ結合物が移動可能である構成、および、
（ｉｉ）抗イディオタイプ抗体が固定されており、ＣＲＰ５−２３のＨＲＰ結合物が移動可能である構成である。
４．希釈：無希釈が必要であるが、別の理由で希釈が必要である場合は、類似の免疫材料が分析物の濃度減少に適合するために選択できる。
５．少量の材料の必要性：特定の交換可能な方法が実質的な希釈または不所望に多量の免疫材料を必要とする場合に、これらのフォーマットは１ｎＭ乃至１０ｎＭの各材料（１回の測定当たり数μｇ程度の量）を必要とするだけである。
６．患者サンプルにおける異好性作用に対する感受性の低下：抗ＣＲＰ抗体および抗イディオタイプ抗体は異なる重鎖亜綱となるように選択または修飾できる。
【００３０】
以上、本発明をその好ましい実施形態に基づいて説明したが、上記の実施形態の多数の変更および変形が本発明の範囲および趣旨に逸脱することなく行うことができることを理解するべきである。
【００３１】
本発明の実施態様は以下の通りである。
（Ａ）  Ｃ反応性蛋白を検出するための競合的免疫測定を実行するための方法において、
（ｉ）固定した低親和性の抗ヒトＣ反応性蛋白抗体およびラベル化した抗イディオタイプ抗体にサンプルを接触させる工程と、
（ｉｉ）前記ラベルを検出する工程と、
（ｉｉｉ）前記ラベルの検出結果をサンプル内のＣ反応性蛋白の量に対して相関付ける工程とを備えた方法。
（Ｂ）  Ｃ反応性蛋白を検出するための競合的免疫測定を実行するための方法において、
（ｉ）固定した抗イディオタイプ抗体およびラベル化した低親和性の抗ヒトＣ反応性蛋白抗体にサンプルを接触させる工程と、
（ｉｉ）前記ラベルを検出する工程と、
（ｉｉｉ）前記ラベルの検出結果をサンプル内のＣ反応性蛋白の量に対して相関付ける工程とを備えた方法。
（Ｃ）  競合的免疫測定のための一式の装置において、低親和性の抗ヒトＣ反応性蛋白抗体である第１の抗体と、当該第１の抗体に結合可能な抗イディオタイプ抗体である第２の抗体とを含む装置。
（Ｄ）  ＣＲＰ５−２３として同定される低親和性の抗ヒトＣ反応性蛋白抗体を生成できるハイブリドーマ細胞系。
（Ｅ）  実施態様（Ｄ）に記載のハイブリドーマにより生成した抗体。
（Ｆ）  低親和性の抗ヒトＣ反応性蛋白抗体に対して培養された抗イディオタイプ抗体。
（Ｇ）  Ｃ２３ｉｄ２−６．３として同定される抗イディオタイプ抗体を生成できるハイブリドーマ細胞系。
（１）前記低親和性の抗ヒトＣ反応性蛋白抗体がＣＲＰ５−２３である実施態様（Ａ）または実施態様（Ｂ）に記載の方法。
（２）前記抗イディオタイプ抗体がＣＲＰ５−２３に結合可能な抗体である実施態様（Ａ）または実施態様（Ｂ）に記載の方法。
（３）前記抗体がイオン化したカルシウムに対して無反応性である実施態様（Ｅ）に記載の抗体。
【００３２】
【発明の効果】
従って、本発明によれば、従来に比して優れた有用性を示す新規な免疫測定用の組成物が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＬＩＳＡにおける抗ＣＲＰ抗体および可溶性ＣＲＰの競合プロファイルによる親和性定数の評価を示すグラフである。５種類の抗体による競合プロファイルが示されており、これらは最大吸光度の５０％の減少を生じるＣＲＰ濃度により決定される親和性の範囲を示している。ヒト血清におけるＣＲＰの正常な範囲が縦軸（ｙ軸）により示されている。また、ＣＲＰ５−１０（０．４ｎＭ）およびＣＲＰ５−２３（０．４μＭ）に対する正常な親和性がｘ軸上に突き出した矢印により示されている。
【図２】低親和性の抗ＣＲＰ抗体およびこれに対応する抗イディオタイプ抗体により構成可能な２種類のフォーマットを示す図である。フォーマット１（図２（Ａ））において、ＣＲＰの代理として作用する抗イディオタイプ抗体Ｃ２３ＩＤ２−６．３はプラスチック微量滴定用プレートの表面上に固定されている。ＨＲＰ結合した抗ＣＲＰ単一クローン抗体のＣＲＰ５−２３がＣＲＰを含有するサンプルと共にこのウエルに添加される。このＣＲＰの量が固定された抗イディオタイプ抗体に結合するＨＲＰ−ＣＲＰ５−２３の量に最終的に反映する。フォーマット２（図２（Ｂ））においては、ＣＲＰ５−２３の単一クローン抗体が固定されて、ＨＲＰ結合した抗イディオタイプ抗体がＣＲＰ５−２３結合部位においてサンプル内のＣＲＰに対して競合する。
【図３】従来の微量滴定用プレートにおける各フォーマットの場合のＣＲＰ投与応答曲線を示す図である。両方のフォーマットはＣＲＰ濃度の増加と共に下降する投与曲線を示しており、各投与曲線は臨床的に関連する範囲内に存在している。フォーマット１は図において左側のグラフ（Ａ）に示されており、フォーマット２は右側のグラフ（Ｂ）に示されている。４１４ｎｍにおける吸光度は検出可能なＨＲＰの活性の量を反映する。グラフ（Ａ）において、ダイアモンド形の点で示した曲線は固定したＣ２３ＩＤ２−６．３およびＨＲＰラベル化したＣＲＰ５−２３により得られた投与応答曲線を示しており、正方形の点で示した曲線はＣＲＰ５−２３をＣ２３ＩＤ２−６．３に置換した場合の対照としての投与応答曲線を示している。一方、グラフ（Ｂ）においては、正方形の点で示した曲線は固定したＣＲＰ５−２３およびＨＲＰラベル化したＣ２３ＩＤ２−６．３により得られた投与応答曲線を示しており、ダイアモンド形の点で示した曲線はＣ２３ＩＤ−６．３をＣＲＰ５−２３に置換した場合の対照としての投与応答曲線を示している。各エラー・バー（誤差範囲）は再現実験における平均値および標準偏差を示している。
【図４】スポット状ラベルによる薄膜免疫測定におけるフォーマット１およびフォーマット２のＣＲＰ投与応答曲線を示す図である。各フォーマットにおいて、固定した抗体は当該技術分野において周知のコーティング法により薄いドライ・フイルム内に混入されている。また、ＨＲＰラベル化した試薬はＣＲＰを含有するサンプルと共に混合されて、この混合物を薄膜の中心部に載置した。５分間の培養処理の後に、洗浄流体を調節して加えながらこの薄膜を洗浄して未結合の要素を培養領域の周辺部に移動させた。この際に、結合部分（ＨＲＰ活性）を過酸化物の同時添加により測定し、この過酸化物は薄膜内に予め混入されている色素による色の展開を開始する。色の展開の最大速度（Ｖmax ）を［ＣＲＰ］（ＣＲＰ濃度）の関数としてプロットした。フォーマット１の場合を正方形の点により表現し、フォーマット２の場合を円形の点により示した。
【図５】インクジェット印刷により混入したラベルによるＣＲＰ投与応答曲線を示す図である。フォーマット１の曲線を正方形の点で示し、フォーマット２の曲線をダイアモンド形の点で示した。
【図６】グラビア印刷により混入したラベルによる薄膜免疫測定におけるＣＲＰ投与応答曲線を示す図である。固定した相補的抗体を含有する免疫速度測定用の薄膜コーティング上へのグラビア印刷によりＨＲＰ結合物を混入した。その後、種々の濃度でＣＲＰを含有する血清サンプルを各フォーマットにおいて調製したコーティング上にスポットした。５分間の培養処理後に、洗浄流体を調節して加えながらこの薄膜を洗浄して未結合の要素を培養領域の周辺部に移動させた。この際に、結合部分（ＨＲＰ活性）を過酸化物の同時添加により測定し、この過酸化物は薄膜内に予め混入されている色素による色の展開を開始する。色の展開の最大速度（Ｖmax ）を［ＣＲＰ］（ＣＲＰ濃度）の関数としてプロットした。フォーマット１の場合を円形の点により表現し、フォーマット２の場合を正方形の点により示した。
【図７】  VITROS（登録商標）ECi自動化免疫測定分析器システムに対応して構成された免疫測定によるＣＲＰ投与応答曲線を示す図である。これらの変更様式においては、固定された成分がビオチンに結合して初期的に可溶性の成分として存在している。５０μＬのビオチン処理した試薬を４０μＬのＣＲＰ含有サンプルの添加後で５０μＬのＨＲＰ結合試薬の添加前にストレプトアビジン・コーティング処理したウエルに加えた。８分間の培養処理後に、ウエルをよく洗浄して、このウエルに付随するＨＲＰ活性を化学発光性基質により検出した。フォーマット１の場合の結果をグラフ（Ａ）に示し、フォーマット２の場合の結果をグラフ（Ｂ）に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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