(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Gaussiaルシフェラーゼをコードするヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドの配列が、
配列番号１９に示すヌクレオチドの配列；
配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの配列；および
配列番号１９に示す配列と少なくとも９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列
からなる群から選択される、単離核酸フラグメント。
【請求項２】
配列番号１９のコード部分に示すヌクレオチド配列から選択される少なくとも１４連続配列を含む、核酸プローブまたはプライマー。
【請求項３】
配列番号１９のコード部分に示すヌクレオチド配列から選択される少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む、請求項２記載の核酸プローブまたはプライマー。
【請求項４】
配列番号１９のコード部分に示すヌクレオチド配列から選択される少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む、請求項２記載の核酸プローブまたはプライマー。
【請求項５】
配列が
配列番号２０に示すアミノ酸配列；および
配列番号２０に示す配列と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択される、単離された実質的に純粋なGaussiaルシフェラーゼタンパク質。
【請求項６】
製造品；および
請求項１記載の核酸によりコードされるルシフェラーゼを含む生物蛍光生成システム
を含む、組合わせ。
【請求項７】
更に緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む、請求項６記載の組合わせ。
【請求項８】
GFPがRenilla GFPまたはPtilosarcus GFPである、請求項７記載の組合わせ。
【請求項９】
製造品が玩具、化粧品、噴水、パーソナル・ケア・アイテム、フェアリー・ダスト、飲料、ソフトドリンク、食物、織物製品、泡、風船、パーソナル・アイテム、磨歯剤、石鹸、ボディーペイント、泡ぶろ、インクおよび紙製品から選択される、請求項６記載の組合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、“ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用”と題し、Bruce Bryan および Christopher Szent-Gyorgyiにより１９９８年１０月１日に出願された米国仮出願第６０/１０２,９３９に対する優先権を主張する。また、“GAUSSIAルシフェラーゼ、ルシフェラーゼをコードする核酸およびルシフェラーゼを使用する方法”と題し、Bruce Bryan および Christopher Szent-Gyorgyiにより１９９８年１月１５日に出願された米国仮出願第６０/０８９,３６７および“RENILLAグリーン蛍光タンパク質組成物および方法”と題し、Bruce Bryan および Christopher Szent-Gyorgyiにより１９９８年３月２７日に出願された米国仮出願第６０/０７９,６２４に対する優先権も主張する。米国の目的のため、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいてこれらの出願各々に対する優先権の利益を享受する。
【０００２】
本出願はまた、“生物発光新規アイテム”と題し、Bruce Bryanにより１９９６年１１月２５日に出願された米国出願第０８/７５７,０４６であり、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９９５、および“生物発光新規アイテム”と題し、Bruce Bryanにより１９９６年２月６日に出願された米国出願第０８/５９７,２７４の内容に関する。本出願はまた、“新生物組織または他の組織の検出および視覚化”と題し、Bruce Bryanにより１９９７年８月８日に出願された米国出願第０８/９０８,９０９に関する。本出願はまた、“感染因子を検出および同定する装置および方法”と題し、Bruce Bryanにより１９９７年１２月１２日に出願された米国出願第０８/９９０,１０３に関する。
【０００３】
上記の米国出願および米国仮出願の各々の内容はすべて、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、Renilla、Gaussia、Philocarpus および Pleuromamma属からの、単離および精製された核酸およびコードされたタンパク質に関する。より詳細には、これらの属種からのルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸を提供する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
発光は、エネルギーがある分子に特に集中して、励起状態を引き起こす現象である。低エネルギー状態へ戻るには、光量子（ｈｙ）の放射が伴う。発光には、蛍光発光、リン光、化学発光および生物発光が含まれる。生物発光は、生物が他の生物に見える光を放射する方法である。発光は次のように表される：
Ａ＋Ｂ→Ｘ＊＋Ｙ
Ｘ＊→Ｘ＋ｈｖ
式中、Ｘ＊は、電子的に励起された分子であり、ｈｖはＸ＊が低エネルギー状態に戻るときの光放射を表す。発光が生物発光である場合、励起状態の発生は酵素触媒反応から誘発される。生物発光（または化学発光または他の発光）反応において放射される光の色は、励起された分子の特徴を示し、励起および温度の源と関係がない。
【０００６】
生物発光の必要条件は、ルシフェラーゼの存在下において結合または遊離している分子状酸素を使用することである。ルシフェラーゼはオキシゲナーゼであり、分子状酸素の存在下で基質であるルシフェリンに作用し、基質を励起状態に変える。低エネルギーレベルへ戻ると、エネルギーは光の形態で放出される［概説には、例えば、McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in Cell Physiology, Hayashi et al., eds., Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, pp.63-80; Ward et al., Chapter 7 in Chemi-and Bioluminescence, Burr, ed., Marcel Dekker, Inc. NY, pp.321-358; Hastings, J.W. in (1995) Cell Physiology: Source Book, N. Sperelakis(ed.), Academic Press, pp665-681; Luminescence, Narcosis and Life in the Deep Sea, Johnson, Vantage Press, NY, see, esp. pp.50-56を参照］。
【０００７】
全体的には稀であるが、生物発光は陸生生物より海洋生物においてより一般的である。生物発光は３０もの進化論的に異なる起源から進化し、従って、異なる生物において生物発光の原因となる生化学的および生理学的メカニズムが異なるように、生物発光は様々な方法で現れる。生物発光種は多くの属におよび、細菌［ビブリオ種を含む原始海洋細菌］、真菌類、藻類および渦鞭毛虫類などの微生物、節足動物、軟体動物、棘皮動物および脊椎動物を含む海洋生物および環形動物の虫および昆虫を含む陸生動物までを含む。
【０００８】
生物発光を使用するアッセイ
過去２０年間、研究および医学界において使用される高感度の生化学アッセイは、放射性同位元素よりも発光および蛍光発光をますます使用してきた。この変化は、部分的には放射性同位元素の処理費用の上昇により、および部分的には迅速かつ便利なアッセイ方法を発見する必要性により余儀なくされた。最近では、生細胞および全動物においてイン シトゥで生化学アッセイを行う必要があるので、研究者はタンパク質に基づく発光および蛍光発光を使用する。ＡＴＰアッセイのためにホタルルシフェラーゼ、カルシウムリポータとしてエクオリンおよびオベリン（obelin）、神経生理学的指示薬としてVargulaルシフェラーゼおよび、タンパク質追跡子およびｐＨ指示薬としてAequoreaグリーン蛍光タンパク質を使用することは、研究所における生物発光に基づく方法の可能性を示している。
【０００９】
生物発光はまた、医学および生物工学に直接影響を与え始めている；例えば、Aequorea ＧＦＰは、マウスモデルシステムにおける細胞を標識するのに用いられたり、高処理薬物スクリーニングのレポータとして用いられる。Renillaルシフェラーゼは、診断基準において使用するために開発中である。
【００１０】
生物発光を発生するシステム
生物発光は、他のタイプの化学発光と同様に、生物学および医学において特異的な物質の定量に使用される。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子は、多くの目的のために、多数のアッセイにおいてレポータ遺伝子としてクローン化され、活用されてきた。異なるルシフェラーゼシステムは異なる特異的な必要条件を有するので、種々の物質を検出および定量するために使用され得る。工業用生物発光適用の大部分は、ホタル[Photinus pyralis]ルシフェラーゼに基づいている。最初におよびさらに広範に使用されるアッセイの一つは、ＡＴＰの存在を検出するのにホタルルシフェラーゼの使用を必要とする。また、ホタルルシフェラーゼは、反応における他の物質または補助因子を検出および定量するのにも使用される。ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）または長鎖アルデヒドを産生または利用するいかなる反応も、直接または間接的に、細菌性ルシフェラーゼの光放射反応に結び付き得る。
【００１１】
分析目的で工業用に使用される別のルシフェラーゼシステムは、エクオリンシステムである。精製クラゲ発光タンパク質であるエクオリンは、細胞内Ｃａ２＋および種々の実験条件下でのその変化を検出および定量するのに使用される。エクオリン発光タンパク質は、比較的小さく［〜２０ｋＤａ］、非毒性で、広い濃度範囲［３×１０−７から１０−４Ｍ］にわたりカルシウムを検出するのに適切な量で細胞に注入され得る。
【００１２】
その分析における有用性のため、ルシフェラーゼおよび基質は研究され、充分に特徴付けられ、市販されている［例えば、ホタルルシフェラーゼはSigma, St. Louis, MOおよびBoehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, INから入手可能であり；組換えにより産生されたホタルルシフェラーゼおよびこの遺伝子に基づいた他の試薬またはこのタンパク質とともに使用するための他の試薬はPromega Corporation, Madison, WIから入手可能であり；クラゲからのエクオリン発光タンパク質ルシフェラーゼおよびRenillaからのルシフェラーゼは、Sealite Sciences, Bogart, GAから入手可能であり；これらのルシフェラーゼのための天然基質であるセレンテラジンは、Molecular Probes, Eugene, ORから入手可能である］。これらのルシフェラーゼおよび関連の試薬は、診断、品質管理、環境試験および他のこのような分析のための試薬として使用される。
【００１３】
分析システムにおける試薬としてルシフェラーゼが有用であり、高処理スクリーニング系における使用に可能性があるので、現在入手可能なものと比較して改良されたスペクトル特性または異なるスペクトル特性を有する様々なルシフェラーゼを同定し、単離する必要がある。これらすべての理由のため、Gaussiaおよび入手可能な様々なRenilla種など、様々な種からのルシフェラーゼを有することは好都合である。
【００１４】
蛍光タンパク質
リポーター遺伝子は、問題の遺伝子を有するレシピエント細胞に同時形質移入されると、形質移入および他の事象を検出する手段を提供する。蛍光タンパク質をコードするものはリポーター遺伝子の中にある。本明細書に記載の生物発光を発生するシステムは、レポータ遺伝子として使用するものの中にある。感度を上げるために、生物発光を発生するシステムは蛍光化合物およびタンパク質、例えば天然蛍光フィコビリンタンパク質などと併用してきた。また、様々な海洋無脊椎動物に存在する蛍光タンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質およびブルー蛍光タンパク質、特にAequorea victoriaのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、重要である。
【００１５】
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、特定の生物発光腔腸動物のあいだでしか見られないある種類の色素タンパク質を構成する。これらの補助タンパク質は蛍光であり、酵素結合した励起状態のオキシルシフェリン（oxyluciferin）からのエネルギーを受け入れることにより、これらの生物において最大の蛍光発光放出体として機能する（参照、例えばWard et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:781-788; Ward et al. (1978) Photochem. Photobiol. 27:389-396; Ward et al. (1982) Biochemistry 21:4535-4540)。
【００１６】
最も特徴的なＧＦＰは、クラゲ種Aequorea、特にAequorea victoria (A. victoria)およびAequorea forskaleaから単離されたものである（Ward et al. (1982) Biochemistry 21:4535-4540; Prendergast et al. (1978) Biochemistry 17:3448-3453)。精製A.victoria ＧＦＰは、約２７ｋＤａの単量体タンパク質であり、３９５nmの最大励起波長と４７０nmの最小ピークを有する青い光を吸収し、約５１０nmの放射波長と５４０nm近くの最小ピークを有するグリーン蛍光発光を放射する（Ward et al. (1979) Photochem. Photobiol. Rev 4:1-57)。このＧＦＰには一定の限度がある。野生型ＧＦＰの最大励起は、標準的フルオレセイン検出光学の波長範囲内にない。
【００１７】
グリーン蛍光発光の検出は、いかなる外因性の基質または補助因子をも必要としない。代わりに、高レベルの蛍光発光は、タンパク質固有の発色団に起因する。発色団には、ポリペプチド鎖内の修飾アミノ酸残基が含まれる。例えば、A.victoria ＧＦＰの蛍光発色団は、アミノ酸残基６４−６９を包含するヘキサペプチド配列、ＦＳＹＧＶＱによりコードされる。発色団は、残基Ｓｅｒ６５およびＧｌｙ６７でのポリペプチド要素の分子内環化および残基Ｔｙｒ６６のα−β結合の酸化により形成される（参照、例えばCody et al. (1993) Biochemistry 32:1212-1218; Shimomura (1978) FEBS Letters 104:220-222; Ward et al. (1989) Photochem. Photobiol. 49:62S）。中性ｐＨで単離された発色団および変性したタンパク質の放射スペクトルは、天然タンパク質のスペクトルに合わず、発色団の形成が翻訳後に生じていることを示唆している（参照、例えばCody et al. (1993) Biochemistry 32:1212-1218)。
【００１８】
さらに、精製A. victoria ＧＦＰの結晶構造が特定された（参照、例えばOrmoe (1996) Science 273:1392-1395)。タンパク質の優性な構造的特徴は、修飾ｐ−ヒドロキシベンリデンイマダキソリジノン発色団を含有する単一の中央α螺旋を包むほぼ完全な円柱を形成する１１−鎖βバレルである。発色団はバレル構造内の中央に位置し、バルク溶媒への露出から完全に保護されている。
【００１９】
A. victoria ＧＦＰのアイソタイプをコードするＤＮＡは単離され、そのヌクレオチド配列が特定された（参照、例えばPrasher (1992) Gene 111:229-233)。A. victoria ＣＤＮＡは、２６，８８８Ｄａの推定Ｍを有する２３８アミノ酸ポリペプチドをコードする７１４ヌクレオチド読み取り枠を含有する。組換えにより発現されたA. victoria ＧＦＰは、細菌（参照、例えばChalfie et al. (1994) Science 263:802-805; Miller et al. (1997) Gene 191:149-153)、イースト菌および真菌類（Fey et al. (1995) Gene 165:127-130; Straight et al. (1996) Curr. Biol. 6:1599-1608; Cormack et al. (1997) Microbiology 143: 303-311)、ショウジョウバエ属（参照、例えばWang et al. (1994) Nature 369:400-403; Plautz (1996) Gene 173:83-87)、植物（Heinlein et al. (1995); Casper et al. (1996) Gene 173:69-73)、魚類（Amsterdam et al. (1995))および哺乳動物（Ikawa et al. (1995)）を含む非常に様々な生物においてインビボで蛍光発光する能力を保持する。Aequorea ＧＦＰベクターおよび単離されたAequorea ＧＦＰタンパク質は、遺伝子発現、細胞移入および細胞局在化、微小管の形成および機能的イオンチャネルの集合を測定するためのマーカーとして使用されてきた（参照、例えばTerry et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 217:21-27; Kain et al. (1995) Biotechniques 19: 650-655)。しかしながら、A. victoria ＧＦＰは、分析および診断方法における使用に理想的ではない。結果として、ＧＦＰ変異体は、赤色に変化する単一励起スペクトルピークを有する変異体を同定する可能性をもって選択された。
【００２０】
実際、このような変異体の作成において決められた目的は、A. victoria ＧＦＰをRenillaからのＧＦＰのようにするために試みられており、RenillaからのＧＦＰはこのようにほとんどクローン化されないが、分析ツールとして使用するのにそれをさらに理想的にする特性を有する。多くの実際の適用について、Renilla ＧＦＰのスペクトルは、Aequorea ＧＦＰのスペクトルより好ましい。なぜなら、成分スペクトルが低く、広いというより高く、狭い場合、異なる発蛍光団の間の波長識別および共鳴エネルギー移動の検出が容易だからである。さらに、Renilla ＧＦＰの長い波長励起ピーク（４７５nm）は、フルオレセインフィルターセットにほぼ理想的であり、光脱色に耐性であるが、３９５nmの短い波長ピークより低い振幅を有し、光脱色により敏感である［Chalfie et al. (1994) Science 263:802-805］。
【００２１】
系統発生的に異なり、充分に調査されていない生物発光タンパク質の範囲が存在し、将来の開発のために蓄積されている。Renilla ＧＦＰをコードする核酸などこれらの多くは、集中的な努力にもかかわらずまだである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
これらの理由により、様々な新規ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質、特にA.victoria ＧＦＰのムテインを使用するよりも利用可能なRenilla ＧＦＰを有することが望ましい。しかしながら、いかなるRenilla ＧＦＰをもコードする遺伝子をクローン化することは不可能であった。特定の適用のためのシステムを効果的にし、現在の方法を改善するために利用可能な種々のＧＦＰおよびルシフェラーゼを有することも望ましい。従って、本明細書における目的は、これまで利用不可能なルシフェラーゼをコードする単離された核酸とそれによりコードされるタンパク質を提供することである。本明細書の目的はまた、他の種からRenilla ＧＦＰ、ＧＦＰをコードする単離された核酸、様々な種からのルシフェラーゼおよびそれによりコードされるタンパク質を提供することである。本明細書の目的はまた、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびＧＦＰを含む生物発光を発生するシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の要旨）
本発明は、蛍光タンパク質をコードする単離の核酸およびルシフェラーゼをコードする単離の核酸を提供する。Renilla 由来および Ptilosarcus 由来の GFP をコードする核酸分子を提供する。
【００２４】
本発明は、Renilla mulleri ルシフェラーゼ、Gaussia 種ルシフェラーゼおよび Pleuromamma 種ルシフェラーゼをコードする核酸分子を提供する。これから誘導される核酸プローブも提供する。本発明は、機能的に等価の核酸、例えば、開示の分子に高度なストリジェンシイ条件でハイブリドする核酸も意図する。
【００２５】
本発明は、各ルシフェラーゼおよび GFP、およびルシフェラーゼと GFP の組合せをコードする核酸の発現のための宿主細胞（細菌、酵母および哺乳動物の細胞を含む）およびプラスミドも提供する。これらの遺伝子は、ヒトなどの哺乳動物の選択された宿主細胞または宿主における発現を最適化するコドンで置換されて修飾され、または変異生成されて、放出性が変わる。
【００２６】
（ルシフェラーゼ）
本発明は、Renilla mulleri ルシフェラーゼをコードする異種核酸を含有する組換え宿主細胞、およびこの核酸を提供する。好ましい実施態様において、異種核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい実施態様において、異種核酸は配列番号１７のアミノ酸配列をコードする。本発明は、機能的に等価の核酸、例えば、配列番号１７のヌクレオチド配列に高度なストリジェンシイ条件でハイブリドする核酸分子を提供する。特に、本発明で提供されるプローブを用いるときに、提供する。
【００２７】
本発明は、Gaussia 由来のルシフェラーゼをコードする単離の核酸を提供する。特に、Gaussia princeps をコードする核酸断片およびそれから誘導される核酸プローブを提供する。特定の実施態様において、ルシフェラーゼは、配列番号１９のヌクレオチド配列によりコードされる。また、本発明は、配列番号１９のヌクレオチド配列に中程度または高度のストリジェンシイ条件でハイブリドする核酸分子を提供する。特に、本発明で提供されるプローブを用いるときに提供する。本発明は、Gaussia 種由来のルシフェラーゼを単離するために、本発明方法で使用できる核酸から誘導されるプローブを提供する。この核酸は配列番号２０のアミノ酸配列をコードする。
【００２８】
本発明は、Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする核酸を提供する。特に、Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする核酸分子およびコードされたルシフェラーゼを、それぞれ配列番号２８および２９に明示した。Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする核酸の単離も行った。
【００２９】
本発明は、Renilla mulleri、Gaussia または Pleuromamma をコードする DNA 含有の発現ベクターを提供する。この DNA は、ルシフェラーゼの構造的または誘発的発現を可能にするプロモーター・エレメントと操作的に結合しているものである。好ましい実施態様において、ベクターは多様な宿主細胞で Renilla mulleri ルシフェラーゼを発現できる。本発明はまた、キメラ Renilla mulleri ルシフェラーゼ融合タンパク質、好ましくはキメラ抗体ルシフェラーゼまたはアセチルコリン・エステラーゼ融合タンパク質を提供する。このものは、プロモーター・エレメントおよび複数のクローニング部位（Renilla mulleri をコードする DNA の上流または下流に位置する）を含有する。
【００３０】
本発明は、Gaussia ルシフェラーゼをコードする異種核酸含有の組換え細胞も提供する。精製された Gaussia ルシフェラーゼ、および Gaussia ルシフェラーゼのみまたは Renilla 緑色蛍光タンパク質などの生物発光生成システムの他の成分と組み合せた Gaussia ルシフェラーゼを含有する組成物を提供する。この Gaussia ルシフェラーゼは、例えば、新規の物品の蛍光源を提供するのに使用でき、または新形成組織などの組織の検出や視覚化の方法、均質免疫アッセイなどの免疫アッセイ、および多ウエルアッセイ機器でのインビトロ蛍光スクリーニングアッセイを用いる感染の検出方法に使用でき、または上記の方法のいずれかを実施するキットにおいて提供する。特に、Gaussia ルシフェラーゼは、本発明で提供するアッセイにおいて適当な蛍光タンパク質と共に使用できる。
【００３１】
本発明は、Gaussia や Pleuromamma などの種でのルシフェラーゼコード DNA の単離およびクローニングのためのプローブを用いる方法も提供する。好ましい実施態様において、核酸プローブは、少なくとも 14 ヌクレオチド、好ましくは 16-30 ヌクレオチドの変性プローブであり、これらのヌクレオチドは、配列番号１９のアミノ酸および／または配列番号２９のヌクレオチド配列に基づく。
【００３２】
本発明は、Gaussia ルシフェラーゼまたは Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする DNA 含有のベクターを提供する。特に、ルシフェラーゼの構造的または誘発的な発現を可能にするプロモーター・エレメントと操作的に結合しているルシフェラーゼ・コード DNA を含有する発現ベクターを提供する。好ましい実施態様において、ベクターは多様な宿主細胞でルシフェラーゼを発現できる。本発明は、キメラ・ルシフェラーゼ融合タンパク質（参照、例えば、米国特許 5,464,745。これはタンパク質結合ドメインを開示している。参照、配列番号２１および２２。これらは、ドメイン−ルシフェラーゼ融合タンパク質結合セルロースを規定しており、図１および２に表示する）をつくるためのベクターを提供する。このものは、プロモーター・エレメントおよび複数のクローニング部位（Gaussia または Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする DNA の上流または下流に位置する）を含有する。特定の実施態様において、ルシフェラーゼをコードする DNA は、PET ベクター（Novagen；参照、米国特許 5,719,044、5,738,984、5,670,623、5,496,934 および Novagen カタログ；ベクターの購入で提供される各PET ベクターの完全な配列）におけるセルロース結合ドメインのＮ末端をコードする DNA（CBDclos；参照、配列番号２１および２２）に連結している。
【００３３】
本発明は、Gaussia または Pleuromamma のルシフェラーゼをコードする核酸、特に DNA と GFP またはフィコビリタンパク質をコードする DNA との融合も提供する。また、Renilla ルシフェラーゼと Renilla GFP との融合も提供する。これらの融合において、ルシフェラーゼと GFP コード DNA は、隣接していてもよいし、スペーサー・ペプチドで隔てられていてもよい。融合タンパク質をつくるのに使用される融合は、ルシフェラーゼと GFP 対の相互作用により多様な特異的な分析の適用を有する。相互作用の検査は、ルシフェリンおよび適当な結合因子の存在下でルシフェラーゼ−GFP タンパク質対の放射スペクトルによる。
【００３４】
本発明は、Gaussia または Pleuromamma のルシフェラーゼをコードする異種核酸を含有の組換え宿主細胞を提供する。ある実施態様において、ルシフェラーゼをコードする異種 DNA 含有の組換え細胞は、ルシフェラーゼをコードする DNA での遺伝子移入により、またはこのタンパク質をコードする DNA の RNA 転写体導入によりつくる。 DNA は、直線 DNA 断片として導入でき、またはコード DNA の安定的または一時的な発現のための発現ベクターに組み込むことができる。
【００３５】
機能的ルシフェラーゼを発現する細胞は、単独で、または生物発光生成システムと共に、本明細書に記載するような、細胞を基にしたアッセイおよびスクリーニング方法で使用できる。ルシフェラーゼを発現するための現状で好ましい宿主細胞は、細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞である。
【００３６】
本発明は、精製された Gaussia、Pleuromamma、Renilla mulleri のルシフェラーゼを提供する。これらのルシフェラーゼを好都合に得るのは、ルシフェラーゼ・タンパク質をコードする核酸含有の真核細胞または原核細胞における本発明核酸の発現、および発現されたタンパク質の単離による。
【００３７】
本発明は、ルシフェラーゼを含有する組成物を提供する。組成物は、利用のための意図された方法に従って、多数の形態のいずれをも取りうる。ある実施態様において、例えば、組成物は、Gaussia ルシフェラーゼ、Gaussia ルシフェラーゼペプチドまたは Gaussia ルシフェラーゼ融合タンパク質を含有し、発光新規物品、免疫アッセイ、FET（蛍光エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エネルギー移行）アッセイ、HTRF（均質時間分解蛍光）アッセイにおける供与体での使用のために整備され、または本明細書記載のような総合光検出剤を含有する多ウエル機器とともに使用される。
【００３８】
さらに好ましい実施態様において、生物発光生成システムは、ルシフェラーゼに加えて Renilla mulleri または Ptilosarcus GFP を含む。これらの組成物は、種々の方法や系で使用できる。例えば、本明細書に記載のような方法、新形成組織などの組織のインビボ検出のための診断系において使用できる。
【００３９】
本発明は、ルシフェラーゼを含有する第１組成物と生物発光生成システムの１以上の他の成分を含有する第２組成物を含み、製造品と共に新規の物品をつくるのに使用される組合わせを提供する。この新規物品は、娯楽や気晴らし、アミューズメント用に設計され、限定でないが、次のものを含む：玩具、特に、水鉄砲、玩具のシガレット、玩具のハロウィーン卵、フットバッグ、ボード／カードゲーム；フィンガー・ペイントおよび他のペイント、粘液性玩具；織物、特に衣類、例えば、シャツ、帽子、スポーツ用衣服、糸、織糸；泡を作る玩具および他の泡を産生する玩具における泡；風船；小像；人体用の物品、例えば、化粧品、浴槽用粉末、ボディ用のローション、ゲル、粉末、クリーム、爪光沢剤、メークアップ剤、歯磨きなどの歯科用剤、石鹸、ボディペイント、泡沫浴；インクや紙などの物品；ゼラチン、アイシング、フロスティングなどの食品；ルシフェリンおよびトランスジェニック魚、特にルシフェラーゼを発現するトランスジェニック魚を含有する魚食品；ルシフェリンまたはルシフェラーゼを含有する植物食品、特にルシフェラーゼを発現するトランスジェニック植物と用いるルシフェリン；飲物、例えば、ビール、ぶどう酒、シャンペン、ソフトドリンク、立体状などの形態のアイス；噴出物、例えば、液体花火、ジェット、スプレー、エアゾルなどの組成物（溶液、混合液、懸濁液、粉末、ペースト、粒状物などの適当な形態にある）。
【００４０】
本発明で提供され、もって娯楽や気晴らし、アミューズメントを提供する生物発光生成システムと組み合わされる製造品に、ロゴや商標と結びつけた宣伝用物および／または宣伝行為などのリクレーションやアトラクション用の物品の使用がある。このような使用は、これらの物品の通常的または普通の使用に付加して、と共に、または置き換わって、なされる。組合せの結果、物品は、水鉄砲や噴出物などにおけるように液体や粒状物の輝く流出またはスプレーをつくる。新規物品の新規性は生物発光に由来する。
【００４１】
（ GFP ）
本発明は、Renilla 由来の GFP をコードする単離の核酸を提供する。さらに提供されるものは、多数の Renilla 属の生物発光生成システム成分および緑色蛍光タンパク質（ GFP ）をコードする単離・精製の核酸、およびコードされたタンパク質である。特に、本発明は、 Renilla 緑色蛍光タンパク質（ GFP ）および Renilla mulleri ルシフェラーゼをコードする核酸断片、およびそれから誘導される核酸プローブを提供する。
【００４２】
本発明は、Renilla GFP をコードする核酸分子を提供する。本発明は、配列番号１５のヌクレオチド配列のコード部分を含む Renilla GFPまたは配列番号１５のヌクレオチド配列に中程度または高度なストリジェンシイ条件でハイブリドする Renilla GFP をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明で提供されるプローブを用いるときに、提供する。この核酸から誘導されたプローブは、本発明の方法で使用し、Renilla 種から GFP を単離する。例示的な実施態様において、本発明は、Renilla mulleri GFP をコードする核酸を提供する。この核酸は、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする。
【００４３】
検出のために核酸プローブを必要に応じて標識できる。このプローブは、 Renilla GFP、特に Renilla mulleri をコードする核酸配列について少なくとも約 14、好ましくは少なくとも約 16、さらに好ましくは 20、30 またはそれ以上の隣接ヌクレオチドを有する。好ましい実施態様において、Renilla GFP のための核酸プローブを配列番号１５のヌクレオチド配列から選択する。
【００４４】
本発明は、Renilla などの種における GFP コード DNA の単離およびクローニングのためのプローブの使用方法を提供する。好ましい実施態様において、核酸プローブは、配列番号３の GFP の Renilla 種間の保存領域に基づく変性プローブである。かかる変性プローブは、少なくとも 14 ヌクレオチド、好ましくは 16-30 ヌクレオチドを含み、配列番号１６のアミノ酸 51-68、82-98、198-208、配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸 9-20、配列番号２７のアミノ酸 39-53 に基づく。他の好ましい実施態様において、上記の好ましいアミノ酸領域をコードする核酸プローブを、配列番号１５のこれら領域をコードするヌクレオチド配列の中から選択する。あるいは、所望の領域をコードする核酸、特に配列番号１５の核酸を、選択した Renilla 種のライブラリィの PCR 増幅のプライマーとして用い得る。これにより Renilla GFP をコードする DNA を単離する。
【００４５】
Ptilosarcus GFP をコードする核酸を配列番号３０および３１に表示する。コード GFP を配列番号３２に表示する。本発明は、配列番号２８、３０、３１のヌクレオチド配列に中程度または高度なストリジェンシイ条件でハイブリドする核酸分子を提供する。
【００４６】
本発明は、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする DNA 含有の発現ベクターを提供する。特に、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする DNA 含有の発現ベクターは、Renilla または Ptilosarcus のGFP の構造的または誘発的発現を可能にするプロモーター・エレメントと操作的に結合しているものである。天然のRenilla GFP を発現した。
【００４７】
ベクターは多様な宿主細胞で Renilla GFP を発現できる。本発明はまた、キメラ Renilla GFP 融合タンパク質を提供する。このものは、プロモーター・エレメントおよび複数のクローニング部位（Renilla GFP をコードする DNA の上流または下流に位置する）を含有する。
【００４８】
本発明は、Ptilosarcus GFP、Renilla GFP、Renilla mulleri ルシフェラーゼ、Gaussia ルシフェラーゼ、Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする異種核酸含有の組換え細胞も提供する。精製の Renilla mulleri GFP、Renilla reniformis GFP ペプチド、および Renilla GFP および GFP ペプチドをこれらのみ、または Renilla mulleri ルシフェラーゼなどの生物発光生成システムの少なくとも１つの成分と共に含有する組成物を提供する。Renilla GFP および GFP ペプチドの組成物を、例えば、新規の物品の蛍光源を提供するのに使用でき、または新形成組織などの組織の検出や視覚化の方法、均質免疫アッセイなどの免疫アッセイ、および多ウエルアッセイ機器でのインビトロ蛍光スクリーニングアッセイを用いる感染の検出方法に使用でき、または上記の方法のいずれかを実施するキットにおいて提供する。特に、これらのタンパク質は、FP（蛍光極性化）アッセイ、FET（蛍光エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エネルギー移行）アッセイ、HTRF（均質時間分解蛍光）アッセイ、さらにBRETアッセイおよびセンサーで使用できる。
【００４９】
FET、FRET、FP、HTRF アッセイなどの非放射性エネルギー移行反応は、供与発光標識と受容標識との間に起きるエネルギー移行に基づく均質発光アッセイである（参照、例えば、Cardullo et al. (1988) proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8092-8096; 米国特許 4,777,128、米国特許 5,162,508、米国特許 4,927,923米国特許 5,279,943、国際PCT出願 WO 92/01225)。GFPを使用する非放射性エネルギー移行反応は開発されている（参照、国際PCT出願 WO 98/02571 および W0 97/28261）。本発明は、ルシフェラーゼおよびその連結 GFP（またはその多量体）などの GFP およびルシフェラーゼを融合タンパク質などで用いる非放射性エネルギー移行反応を意図する。
【００５０】
本発明は、本発明の核酸と実質的な同一性を有する核酸を意図する。これらの核酸は、保存アミノ酸をコードするコドンでの置換によりつくられ、少なくとも約 80%、好ましくは 90−95% の配列同一性を示す。配列同一性とは、製造業者が提供するような、欠陥ギャップペナルティなどの欠陥を有する標準法を用いて測定した同一性である。
【００５１】
この核酸は、ルシフェラーゼおよび GFP をつくる機会をもたらす。これはルシフェラーゼ/ルシフェリンおよび GFP が利用されるすべての分野において好都合な適用がある。この核酸は、保存領域に対応する本明細書記載のプローブを使用して、GFP および他、特に Renilla 種からの GFP をつくるのに用い得る（参照、例えば、図３）。これらの GFP は、ルシフェラーゼ/ルシフェリンおよび GFP が利用されるすべての分野において好都合な適用がある。例えば、GFP は、生物発光生成システムのアウトプット信号を増幅する手段を提供する。Renilla GFP は、青色光（および約 498nm )に信号励起吸収ピークおよび約 510nm (540 近辺の肩を有し）に顕著な単一放射ピークを有する。このスペクトルは、GFP が青色光を吸収し、緑色光に効率的に変える手段を提供する。その結果、アウトプットが増幅する。AequoreaやRenilla、Vargula(Cypridina)などの青色光を出す生物発光生成システムと共に用いると、診断適用を含む適用のためのアウトプット信号が増幅される。さらに、この緑色光は、蛍光極性化アッセイ、FET（蛍光エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エネルギー移行）アッセイ、HTRF（均質時間分解蛍光）アッセイなどの蛍光によるアッセイにおいてエネルギー供与体として働く。本発明は、BRET（エネルギーがルシフェラーゼの生物発光反応から蛍光タンパク質に移行される生物発光共鳴エネルギー移行アッセイ）とよぶ特定のアッセイを提供する。
【００５２】
FET、FRET、FP、HTRF アッセイなどの非放射性エネルギー移行反応は、供与発光標識と受容標識との間に起きるエネルギー移行に基づく均質発光アッセイである（参照、例えば、Cardullo et al. (1988) proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8092-8096; 米国特許 4,777,128、米国特許 5,162,508、米国特許 4,927,923米国特許 5,279,943、国際PCT出願 WO 92/01225)。GFPを使用する非放射性エネルギー移行反応は開発されている（参照、国際PCT出願 WO 98/02571 および W0 97/28261）。
【００５３】
本発明は、GFPの変異導入を含む。特に、赤色シフト励起および放射スペクトルを有する修飾 GFP を起す変異導入を含む。得た系は、非変異導入形に比べて高いアウトプットを有する。これらの GFP の選択は、変更スペクトルのある GFP についてのランダム変異導入および選択、または GFP の発色団領域の選択的変異導入によってできる。
【００５４】
本発明は、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする異種核酸含有の組換え宿主細胞を提供する。ある実施態様において、 Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする異種 DNA 含有の組換え細胞は、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする DNA での遺伝子移入により、または Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする DNA の RNA 転写体導入によりつくる。DNA は、直線 DNA 断片として導入でき、またはコード DNA の安定的または一時的な発現のための発現ベクターに組み込むことができる。
【００５５】
ある実施態様において、細胞は、Renilla mulleri GFP または Ptilosarcus GFP（特に、P.gurneyi 以外の種に由来） をコードし、組換えRenilla mulleri GFP または Ptilosarcus ペプチドを発現する DNA または RNA を含有する。好ましくは、細胞の選択を、蛍光能を保持し、宿主に毒性のない機能的 GFP を発現するように行う。ある実施態様において、細胞は、生物発光生成システムの成分、好ましくはホトタンパク質やルシフェラーゼをコードする異種の核酸を含み得る。好ましい実施態様において、生物発光生成システム成分をコードする核酸は、Aequorea、Vargula、Pleuromamma、Ptilosarcusma または Renilla種 から単離する。さらに好ましい実施態様において、生物発光生成システム成分は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む Renilla mulleri ルシフェラーゼ、配列番号２８の Pleuromamma ルシフェラーゼ、配列番号１９の Gaussia ルシフェラーゼである。
【００５６】
本発明の GFP は、適当な生物発光生成システムと組み合せて使用できる。好ましい組合せは、Renilla または Aequorea、Pleuromamma または Gaussia のルシフェラーゼとである。
本発明は、精製したRenilla ＧＦＰ、特にRenilla mulleri ＧＦＰおよび精製したRenilla reniformis ＧＦＰペプチドを提供する。本発明の組成物における使用に、現在好ましいRenilla reniformis ＧＦＰは、配列番号１９−２３に記載のアミノ酸配列から選択されるＧＦＰペプチドを含むものである。
Renilla ＧＦＰ、ＧＦＰペプチドおよびルシフェラーゼは、天然源から単離でき、または、Renilla ＧＦＰおよび／またはルシフェラーゼタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトした原核細胞または真核細胞から単離できる。
RenillaまたはPtilosarcus ＧＦＰをコードする核酸、特にＤＮＡと、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡの融合体も提供する。
細胞は、単独でまたは生物発光産生システムと組合せて、本明細書に記載のような、細胞ベースのアッセイおよびスクリーニング法に使用し得る機能的ルシフェラーゼおよび／またはＧＦＰを発現する。
ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するための現在好ましい宿主細胞は、細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞である。
ルシフェラーゼおよびＧＦＰ、または、それらを発現する細胞もまた、細菌汚染物をスクリーニングするための方法および金属汚染物をするクリーニングするための方法に使用し得る。細菌汚染物をスクリーニングするために、ルシフェラーゼおよび／またはＧＦＰを発現する細菌細胞を、オートクレーブに、または、試験が意図される他の領域に入れる。処置または該領域の使用の後、該領域を、発光細菌の存在に関して試験する。このような細菌の存在が、他の細菌の根絶の失敗の指標である。重金属および他の環境汚染物のスクリーニングは、発現が、特定の重金属または汚染物に依存するシステムに連結しているとき、本明細書に記載の核酸を含む細胞で行うことができる。
本明細書に記載のシステムおよび細胞を、高スループットスクリーニング法、細胞内アッセイ、医学診断的アッセイ、環境試験(例えば浄水における細菌の追跡に、重金属を検出するための酵素と共に)、病院内オートクレーブ、食物および産業用オートクレーブを試験するために胞子に使用できる。同システムを含む非病原性細菌を動物の餌に含ませ、動物製品および肉における細菌汚染を検出できる。
RenillaまたはPtilosarcus ＧＦＰを含む組成物を提供する。本組成物は、意図される使用法に依存して、多くの形のいずれかを取り得る。ある態様において、例えば、Renilla ＧＦＰまたはＧＦＰペプチド、好ましくはRenilla mulleri ＧＦＰまたはRenilla reniformis ＧＦＰペプチドを含む組成物を、発光新規物品、免疫アッセイ、FET（蛍光エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エネルギー移行）アッセイ、HTRF（均質時間分解蛍光）アッセイに、または、本明細書に記載のような内蔵光検出器を含む多ウェルアッセイ装置と組み合わせて使用できる。他の例において、ＧＦＰは飲料、食物または化粧品に使用する。
【００５７】
本発明は、Renilla mulleri GFPまたはGFPタンパク質と、生物発光生成システムの少なくとも１つの成分、好ましくはルシフェラーゼやルシフェリン、あるいは発光素としてのルシフェラーゼおよびルシフェリンとを含有する組成物を提供する。好ましい実施態様において、ルシフェラーゼ/ルシフェリン生物発光生成システムは、次のような単離した系から選択する：すなわち、昆虫系、腔腸動物系、クラゲ系、細菌系、軟体動物系、甲殻類動物系、魚類系、環形動物系およびミミズ系である。生物発光生成システムは、Renilla、AequoreaおよびVargula、GaussiaおよびPleuromammaからの単離した系を含む。
【００５８】
本発明は、Renilla mulleri GFPまたはPtilosarcus GFPあるいはそれらの混合物を含有する第１組成物と、生物発光生成システムを含有する第２組成物を含み、無生物による新規物品製造に使用される組成物の組合わせを提供する。これらの新規物品は製品として、気晴らしやアミューズメント、娯楽用に設計され、限定ではないが、次の物品を含む：玩具、特に水鉄砲、玩具のシガレット、玩具のハロウィーン卵、フットバッグ、ボード/カードゲーム；フィンガー・ペイントおよび他のペイント、粘液性玩具；織物、特に衣類、例えば、シャツ、帽子、スポーツ用衣服、糸、織糸；泡を作る玩具および他の泡を産生する玩具における泡、風船；小像；人体用の物品、例えば、浴槽用粉末、ボディ用のローション、ゲル、パウダーおよびクリーム、爪光沢剤、メークアップ剤を含む化粧品、歯磨きおよび他の歯科用剤、石鹸、化粧品、ボディペイント、泡沫浴剤、非合成洗剤(特に、アルブミンその他の無毒性タンパク質)を原料とする泡沫浴剤；釣り具用のルアー、特に、これらの製品は、蛍光タンパク質および/または生物発光生成システム組成物含有のポリアクリルアミド架橋結合体が使用され、水中で発光する；インクや紙などの物品；ゼラチン、アイシング、フロスティングなどの食品；ルシフェリンおよびトランスジェニック魚、特に、ルシフェラーゼを発現するトランスジェニック魚を含む魚食品、ルシフェリンまたはルシフェラーゼ、特に、ルシフェラーゼを発現するトランスジェニック植物を用いるルシフェラーゼを含有する植物食品；飲み物、例えば、ビール、ぶどう酒、シャンペン、ソフトドリンク、アイスキューブおよび他の形態のアイス；噴出物、例えば、液体花火、ジェット、スプレー、エアゾルなどの組成物(これらは溶液、混合液、懸濁液、粉末、ペースト、粒状物などの適当な形態を呈する)。
【００５９】
本発明で提供され、それでもって娯楽や気晴らしおよび/またはアミューズメントを提供する生物発光生成システムと組合わされる製造品には、ロゴや商標と結びつけた宣伝用物品および/または宣伝行為などのリクレーションやアトラクション用に使用するものがある。それらの用途は、通常の用途に対して追加的、関連的、あるいは代替的使用といえる。組合わせの結果、物品は、例えば、水鉄砲や噴出物のように、液体や粒状物の輝く流出物またはスプレーを作り出す。
【００６０】
本発明は、本発明が提供するRenilla mulleri GFPおよび/またはRenilla mulleriルシフェラーゼ含有組成物、あるいはその他のルシフェラーゼおよび/またはGFP含有組成物を使用して、組織をインビボまたはインシトゥで検出や視覚化する方法を提供する。例えば、インシトゥ組織視覚化にあたって、生物発光に依存する検出方法系に関連して、Renilla mulleri GFPタンパク質を使用できる。この方法系は、例えば非侵襲および侵襲工程において、腫瘍性組織および特殊組織の視覚化や検出のために特に有用である。この方法系には、標的物に結合した組織特異的、殊に腫瘍特異的標的剤、Renilla mulleri GFP、ルシフェラーゼまたはルシフェリンを含む共役体含有の組成物が含まれる。この方法系にはまた、生物発光生成反応物の残余成分および/またはRenilla mulleri GFPを含有する第２組成物も含まれる。ある実施態様において、活性物は別にして、すべての成分が単一の組成物に含まれる。これらの成分は、インシトゥで提供されるか、あるいは身体または組織に存在する。
【００６１】
本発明は、Gaussiaルシフェラーゼ含有組成物を使用して、組織をインビボまたはインシトゥで検出や視覚化する方法を提供する。例えば、インシトゥ組織視覚化にあたって、生物発光に依存する検出方法系に関連して、GaussiaルシフェラーゼまたはGaussiaルシフェラーゼ・ペプチドを使用できる。この方法系は、例えば非侵襲および侵襲工程において、腫瘍性組織や特殊組織の視覚化および検出のために特に有用である。この方法系には、標的物と結合した組織特異的、殊に腫瘍特異的標的剤、Gaussiaルシフェラーゼ、GFPまたはルシフェリンが含まれる。この方法系にはまた、生物発光生成反応物および/またはGaussiaルシフェラーゼの残余成分含有の第２組成物も含まれる。ある実施態様において、活性物は別にして、すべての成分が単一の組成物に含まれる。これらの成分は、インシトゥで提供されるか、あるいは身体または組織に存在する。
【００６２】
本検出方法系は、とりわけ２つの組成物を含む。本発明は、好ましい実施態様において、生物発光生成反応成分、ルシフェラーゼまたはルシフェリン、好ましくはルシフェラーゼと共役する腫瘍抗原に対する抗体を含む第１組成物を提供する。ある実施態様において、腫瘍特異的標的剤を含有する共役体は、ルシフェラーゼまたはルシフェリンと連結している。別の実施態様において、腫瘍特異的標的剤は、好ましくは２以上の生物発光生成システム組成物、好ましくは２以上のルシフェラーゼ分子と結合したマイクロ運搬体と連結している。
【００６３】
第２の組成物は、典型的には、ルシフェリンまたはルシフェラーゼの基質である生物発光生成システムの残余成分を含む。ある実施態様において、それらの成分、特にルシフェリンは、血清アルブミンなどの運搬体タンパク質と連結する。運搬体および時間的放射剤形によって、全身的に投与された成分が、ルシフェリンまたはルシフェラーゼを不活性化するヘモグロビンのような血液細胞成分に妨げられずに、標的組織に到達し得る。
【００６４】
本発明は、チップ法(参照、例えば、継続中の米国特許出願 No.08/990,103)によって、ルシフェラーゼ/ルシフェリン生物発光生成システムおよびRenilla mulleriまたはPtilosarcus GFPを使用した疾患の診断、特に感染症の診断方法を提供する。とりわけ、このチップは、生物発光生成システムが放射する光子を検出する統合的光検出器を含み、特に、本発明の核酸がコードするルシフェラーゼおよび/またはRenilla mulleriまたはPtilosarcus GFPを使用する。
【００６５】
１つの実施態様において、このチップは、X-Yアレイのようなアレイを有する光検出器の統合的回路を使用してつくる。この回路の表面を処理して、例えば、抗体のような連結分子の誘導化によって、意図したチップについての診断アッセイの状態に対し表面が不活性化であるようにする。細菌抗原に特異的な抗体のような選択抗体または抗体パネルを、光検出器ごとの上にあるチップの表面に添付する。そのチップを、サンプルと接触させた後に、RenillaまたはPluromamm GFPと連結した第２抗体、キメラ抗体−Renilla GFP融合タンパク質、あるいはルシフェラーゼまたはルシフェリンのような生物発光生成システム成分と連結した抗体と接触させる。これらのものは抗原に特異的である。生物発光生成反応の残余成分を加え、生物発光生成システムの成分と連結した抗体がチップ上にあれば、光が発生し、隣接する光検出器で探知される。光検出器をコンピューターに操作的に繋げ、連結抗体を同定する情報をプログラム化し、事象を記録し、それによってサンプル中に存在する抗原を同定する。
【００６６】
本発明は、キメラ GFP融合タンパク質生成の方法を提供する。その方法には、所望の遺伝子またはその一部分をコードするDNAを、それと同一の翻訳解読枠における GFPコード領域をコードする DNAに連結することが含まれる。所望のコード領域は、GFPのアミノ末端またはカルボキシル末端と枠内で連結する。次いで、キメラ・タンパク質をコードする DNAを、適当な発現ベクターのプロモーター・エレメントと操作的連結で結合させる。あるいは、プロモーター・エレメントを、所望の標的遺伝子から直接的に得ることができ、キメラ GFPタンパク質をつくるためにGFPコード配列の上流とプロモーター含有断片を連結する。
【００６７】
本発明は、所望の遺伝子のプロモーター・エレメントの制御の下にGFPコードの異種DNAを発現する遺伝子組換え細胞を使用して、化合物の同定方法を提供する。遺伝子組換え細胞は、GFP媒介の蛍光度を測定することによって、所望のプロモーターからの転写体のレベルを調節する新規の化合物またはリガンドを同定するために使用できる。キメラRenilla または Ptilosarcus GFPを発現する遺伝子組換え細胞は、また、遺伝子組換え細胞の内での GFP媒介蛍光の局所化領域の同定によって、遺伝子発現あるいはタンパク質交換のモニターのために、または、標的タンパク質の細胞内局在化の輸送のために使用し得る。
【００６８】
本発明は、GFPおよび/またはルシフェラーゼを使用した別のアッセイを意図す。Aequora GFPおよび/またはルシフェラーゼを採用して当業者に使用される既知のすべてのアッセイまたは診断方法も意図する。
【００６９】
本発明は、本明細書中で記述している方法も含む方法で使用されるGFP含有するキットを提供する。１つの実施態様において、製造品および生物発光を生成させるような適当な試薬を含むキットを提供する。本発明は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびGFPを含む、好ましくは中程度のPh [5〜8]の生物発光生成物を含有する石鹸組成物などを含有するキットを提供する。これらのキットは、例えば、泡を吹いたり、泡を作り出す玩具に使用できる。これらのキットはまた、詰換えあるいは交換用カートリッジを備え、または食物といっしょに使用できる。
【００７０】
別の実施態様において、これらのキットは、腫瘍性組織およびその他の組織の検定や視覚化に使用され、第１組成物として、GFPおよび生物発光生成システムの少なくとも１つの成分を有し、第２組成物として、生物発光生成システムの残余成分および必要な活性化剤をすべて有する。
【００７１】
かくして、これらのキットは、典型的に２つの組成物を含む。すなわち、第１組成物として、全身的投与(または、ある実施態様においては、局所的または皮膚的適用)のための GFPを含み、第２組成物として、生物発光生成システムの成分または残余成分を含み、適応にしたがって、全身的、局所的または皮膚的投与に定式化される。投与に関する説明も含む。
【００７２】
別の実施態様において、このキットは、疾患特に感染疾患に関する病因の検出および同定に使用され、複数のウエルを有する多ウエル・アッセイ機器を含む。各ウエルは、１つ以上の感染物に特異的な抗体もしくは抗体パネルが付加された総合光検出器、および感染物に特異的な抗体などの第２抗体を含有する組成物を含む。この感染物は、Renilla mulleriまたはPtilosarcus GFP タンパク質、キメラ抗体−Renilla mulleri(またはPtilosarcus)GFP融解タンパク質、または、F(Ab)２抗体断片−Renilla mulleri GFP融解タンパク質に連結するものである。Renilla mulleriを励起するのにつき、RenillaまたはAequorea種のようなRenilla mulleri GFPの励起範囲内において一定の波長の光を発する生物発光生成システムを含む第２組成物が、緑色光を発し、それを機器の光検出器が感知し、感染物の存在を表す。
【００７３】
上述の通り、本発明は、本発明が提供するルシフェラーゼおよび/または GFPをコードする核酸と別のルシフェラーゼおよびGFPとの融合を提供する。RenillaルシフェラーゼおよびRenilla GFP(またはRenilla GFPのホモダイマーあるいは別の複合体)のような一対のルシフェラーゼとGFPとをコードする融合が特に関心をひく。ルシフェラーゼとGFPとは、結合して蛍光発光を生じる。その発光は、ルシフェリンが存在する場合、GFPの存在しない場合のルシフェラーゼと比較して、赤方偏移する。これらの融合は、GFPおよびルシフェラーゼがペプチドなどの標的によって連結されており、リンカーとの相互作用のすべてを検査する手段として使用できる。
【００７４】
本発明は、GFPおよびルシフェラーゼのムテインを提供する。特に関心をひくのは、感熱ムテインのようなGFPおよびルシフェラーゼのムテインで、例えば、Renilla ルシフェラーゼおよびRenilla GFPにおける変異が臨界温度で相互作用の変異を示すようなムテインである。
【００７５】
本発明は、本発明が提供する核酸でコードされたタンパク質のすべてと特異的に結合する抗体、ポリクローナルおよびモノクローナルの抗体も提供する。これらのポリクローナルおよびモノクローナルの抗体は共に、当業者に既知の標準的技法を採用して製造できる。本発明は特に、本発明が提供するルシフェラーゼまたは GFPまたはそのエピトープ含有断片の実質的に純粋な製造物でもって免疫化した動物の血清から得た免疫グロブリンまたは抗体を提供する。本発明はまた、モノクローナル抗体も提供する。生成された免疫グロブリンは、それが有するいろいろな特性のなかで、生物学的サンプルまたはそのような生物学的サンプル由来の溶液中に存在し得る、GFPまたはルシフェラーゼ、特にRenilla またはPtsilocarpus のGFPまたは Pleuromamma、GaussiaまたはRenilla mulleriのルシフェラーゼと特異的または優先的に結合し、および／または免疫沈降反応を起す効力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、市販のＰＥＴ−３４ベクターの成分（ＥＫはエンテロキナーゼ）を示すものである。
【図２】図２は、挿入したGaussiasをコードするルシフェラーゼを有するベクターの一部を示すものである。
【図３】図３は、Renilla mulleri緑色蛍光タンパク質の推定アミノ酸配列および精製したRenilla reniformis GFPのタンパク質分解の消化によって得られ、単離されたRenilla reniformis GFPペプチドのアミノ酸配列を示すものである。直系同一性のアミノ酸配列における位置は、２つのRenilla 種間の縦線（│）により示される。
【図４】図４は、506nmでピークの放射を持つRenilla mulleri GFPについて蛍光放射および励起スペクトルを示すものである。
【図５】図５は、508nmでピークの放射を持つPtilosarcus GFPについて蛍光放射および励起スペクトル示すものである。
【図６】図６は、Pleuromamma luciferaseに対する塩およびpHの関数としての光電子放出を示すものである。
【図７】図７は、pET-34におけるRenilla mulleri ルシフェラーゼ-GFP融合構築物の成分を示す；rbs：リボゾーム結合配列；CDS：コードドメイン配列；CBD：セルロース結合ドメイン；トロンビン；トロンビン分裂部位；S Tag：RNase-S-ペプチドタグ；およびLIC；ライゲーションの独立クローニング部位を示すものである。
【図８】図８は、Gaussia lusiferaseについて塩およびｐHの関数として光電子放出を示すものである。
【図９】図９は、Gaussia lusiferaseについて光電子放出スペクトルを示すものである。
【図１０】図１０は、Pleuromammaのルシフェラーゼについて光電子放出スペクトルを示すものである。
【図１１】図１１は、生物発光共鳴エネルギー転移の基礎をなす原理（BRET）およびセンサーとしてのその使用を示すものである：A）単離すると、ルシフェラーゼ、好ましくは花虫綱ルシフェラーゼは、コエレンテラジン誘導発色団から青色光を放射する：B）単離すると、ルシフェラーゼに結合し、青色光で励起されているGFP、好ましくは花虫綱GFPは、完全なペプチド基盤の蛍光体から緑色光を放射する；C）ルシフェラーゼおよびGFPがインビボまたはインビトロで複合体として結合すると、ルシフェラーゼは非放射的にその反応エネルギーをGFP蛍光体に移し、これにより緑色光を放射する；D）ルシフェラーゼGFP複合体を崩壊するいかなる分子の相関関係も、緑色から青色光にシフトするスペクトルを観察することにより量的に追跡し得る。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
（発明の詳細）
目次
Ａ.定義
Ｂ．生物発光発生系
１．例示的な生物発光発生系
ａ．一般的説明
１）ルシフェラーゼ
２）ルシフェリン
３）活性化物質
４）反応
ｂ.有櫛動物系
１）エクオリン
a）エクオリンおよび関連の生物発光タンパク質
b）ルシフェリン
２）Renilla系
ｃ．甲殻類、特にCypidina系
１）Vargula ルシフェラーゼ
a）Cypidinaからの精製
b）組換え方法による調製
２）Vargula ルシフェリン
３）反応
ｄ．ホタル、コメツキムシおよび他の昆虫系を含む昆虫の生物発光系
１）ルシフェラーゼ
２）ルシフェリン
３）反応
ｅ．微生物系
１)ルシフェラーゼ
２)ルシフェリン
３)反応
ｆ．他の系
１）渦鞭毛虫生物発光を生じる系
２）軟体動物類、例えばLatiasおよびニオガイ
３）ミミズおよび他の環形動物
４）ツチボタル
５）海洋性多毛類蠕虫類（Marine polycheate worm）系
６）南アメリカのレイル・ウェイ・ビートル（railway beetle）
７）魚
ｇ．蛍光性タンパク質
１）緑および青色蛍光性タンパク質
２）フィコビリンタンパク質
【００７８】
Ｃ．ルシフェラーゼをコードする核酸の単離および同定
Gaussia ルシフェラーゼをコードする核酸の単離および同定
１．Gaussia属の試料の単離
２．Gaussia cDNA発現ライブラリーの調製
３．Gaussia ルシフェラーゼをコードするDNAの単離および同定
Renilla タンパク質をコードする核酸の単離および同定
１．Renilla属の試料の単離
２．Renilla cDNA発現ライブラリーの調製
a）RNAの単離およびcDNA合成
b）cDNA発現ライブラリーの構築
３．Renilla GFPをコードするDNAの単離および同定
４．Renilla ルシフェラーゼをコードするDNAの単離および同定
【００７９】
Ｄ．別の種からルシフェラーゼおよびGFPをコードする核酸の単離およびクローニングするための核酸プロ−ブおよび方法
Gaussia
Renillaの別の種からのGFPをコードする核酸の単離およびクローニングするための核酸プロ−ブおよび方法
他の種
【００８０】
Ｅ．タンパク質の組換による発現
Gaussia
１．Gaussiata タンパク質をコードするDNA
２．Gaussiata タンパク質を組み換えにより製造するためのDNA構築物
３．Gaussiata タンパク質を組み換えにより製造するための宿主生物体
４．Gaussiata タンパク質を組み換えにより製造するための方法
Renilla
１．Renilla タンパク質をコードするDNA
２．Renilla タンパク質を組み換えにより製造するためのDNA構築物
３．Renilla タンパク質を組み換えにより製造するための宿主生物体
４．Renilla タンパク質を組み換えにより製造するための方法
【００８１】
Ｆ．ルシフェラーゼおよびGFPをコードする異種核酸を発現する組換え細胞
Gaussia
Renlliaの緑色蛍光タンパク質および／またはルシフェラーゼおよびGFPをコードする異種核酸を発現する組換え細胞
Ｇ．ルシフェラーゼ
Ｈ．RenillaおよびPtilosarcus GFP
【００８２】
Ｉ．組成物
１．Gaussiaルシフェラーゼ組成物
２．Renlliaのルシフェラーゼ組成物
３．RenlliaのGFP組成物
４．接合体
ａ）リンカー
ｂ）標的剤
抗腫瘍抗原抗体
接合体の調製
５．以下において使用するための組成物の調製
ａ．第一組成物：接合（共役）診断系の調製
ｂ．第二組成物
ｃ．標的剤との組合せにおける反応の実施
Ｊ．組合わせ
Ｋ．使用方法
１．新生物および他の組織の診断方法
２．疾病を診断するための方法
３．キメラRenillaまたはPtilosarcus ＧＦＰ、Renilla mulleriルシフェラーゼ、PleuromammaルシフェラーゼおよびGaussiaルシフェラーゼ融合タンパク質を発生させる方法
４．化合物を確認する細胞基準アッセイ
【００８３】
Ｌ．  キット
１．ＧＦＰおよび生物発光システム成分との組合わせを分配し且つ包装する装置
２．カプセル、ペレット、リポソーム、エンドソーム、液胞、微小化粒子
ａ．一般的カプセル充てん溶剤
ｂ．カプセル充てん溶剤−リポソーム
ｃ．カプセル充てん溶剤−ゼラチンおよび高分子溶剤
ｄ．エンドソームおよび液胞
ｅ．微小化粒子
３．固定化システム
ａ．マトリックス材料
ｂ．固定化および活性化
【００８４】
Ｍ．生物発光共鳴エネルギー移動(ＢＲＥＴ: Bioluminescence Resonance Energy Transfer)システム
【００８５】
Ｎ．実施例
【００８６】
Ａ．定義
特記しない限り、ここで用いる全ての専門的および科学的用語はこの発明の属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここで参照される全ての特許および刊行物はそのままで参照文献により組み入れられている。
【００８７】
ここで用いる限りでは、化学発光とは、エネルギーを分子に特異的に運んで電気的に励起させ続いて光子を放射することにより可視光線を放射するところの化学反応をいう。温度はここで運ばれるエネルギーには寄与しない。よって、化学発光は化学エネルギーの光エネルギーへの直接変換を伴う。
【００８８】
ここで用いる限りでは、発光(ルミネセンス)とは、検出可能なＥＭ放射線、一般的には、高エネルギー化学過程の励起生成物が光の放射を伴って基底状態に戻るときに生成する紫外、赤外、可視のＥＭ放射線をいう。化学発光は化学反応に起因する発光である。生物発光は、生物分子[またはその合成物または類似体]を基質および／または酵素として用いる化学反応に起因する化学発光である。
【００８９】
ここで用いる限りでは、化学発光の一つのタイプである生物発光は生物分子、特にタンパク質による光の放射をいう。生物発光の必須条件は、基質であるルシフェリンに作用するところのオキシゲナーゼであるルシフェラーゼの存在下で結合または遊離している分子状酸素である。生物発光は、分子状酸素の存在下で基質ルシフェリン[生物発光基質]に作用し、そして、その基質を励起状態に転換し、それがより低いエネルギーレベルに戻る際に光の形でエネルギーを放出するオキシゲナーゼであるところの酵素または他のタンパク質(ルシフェラーゼ)により発生される。
【００９０】
ここで用いる限りでは、生物発光を生成する基質および酵素とは、各々、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを一般名的にいう。それらの特定の種をいうときには、明確にするために、それが取り出される生物体の名称に一般名用語を付けて、例えば、細菌ルシフェリンまたはホタルルシフェラーゼのように、用いる。
【００９１】
ここで用いる限りでは、ルシフェラーゼとは、光放射反応を触媒するオキシゲナーゼをいう。例えば、細菌ルシフェラーゼは、光を生成する反応であるところのフラビンモノヌクレオシド[ＦＭＮ]および脂肪族アルデヒドの酸化反応を触媒する。海の節足動物中に見出される一つのクラスのルシフェラーゼはCypridina [Vargula]ルシフェリンの酸化反応を触媒し、そしてもう一つのクラスのルシフェラーゼはColeopteraルシフェリンの酸化反応を触媒する。
【００９２】
よって、ルシフェラーゼとは、生物発光反応[生物発光を生成する反応]を触媒する酵素または光タンパク質をいう。ホタルおよびGaussiaおよびRenillaルシフェラーゼのようなルシフェラーゼは、触媒的に作用して生物発光発生反応の間には変化しない。ルシフェリンが非共有的に結合しているエクオリン光タンパク質のようなルシフェラーゼ光タンパク質は、例えばルシフェリンの放出により、生物発光発生反応の間に変化する。ルシフェラーゼは、生物体またはその変異体または突然変異体、例えば、突然変異誘導により生成し、天然に存在するタンパク質と異なる耐熱性のような性質を一つまたはそれ以上有する変異体中で天然に存在するタンパク質である。ルシフェラーゼおよびその修飾された突然変異体または変異体形はよく知られている。ここでの目的のために、ルシフェラーゼというときには、光タンパク質またはルシフェラーゼをいう。
【００９３】
よって、例えば、“Gaussiaルシフェラーゼ”というのは、Gaussia属のメンバーから単離される酵素または他の関連するとう脚類のような他の起源から得られるかまたは合成的に作成される同等の分子を意味する。これは、活性を実質的に変えない保存的なアミノ酸置換を持つGaussiaルシフェラーゼを包括することを意図している。適切な保存的なアミノ酸置換は当業者に公知であり、且つ、得られる分子の生物活性を変えることなく一般的に作成できる。当業者は、一般的には、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物活性を実質的に変えないことを認識している(例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. Co., p. 224を参照)。
【００９４】
“Renilla ＧＦＰ”とは、Renilla属およびそれの突然変異体または変異体からのＧＦＰを意味する。これは、活性を実質的に変えない保存的なアミノ酸置換を持つRenilla ＧＦＰを包括することを意図している。
【００９５】
そのような置換は下記の表１に表記する置換に従って行うのが好ましい。
【表１】
0004923068.tif 000002
他の置換もまた許容され経験的にまたは公知の保存的置換に従って決定され得る。
【００９６】
ルシフェラーゼおよびルシフェリン並びにそれらのアクチベーターとは、生物発光を発生させる試薬または成分をいう。典型的には、これらの試薬の一部の組が供給されるかまたは製造用品と組合わせられるであろう。この組合わせに残りの試薬を接触させると生物発光が生成されるであろう。よって、ここで用いる限りでは、成分のルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびＯ２、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋の如き他の因子は、また生物発光を発生させる試薬[または試剤または成分]という。
【００９７】
ここで用いる限りでは、生物発光基質とは、ルシフェラーゼおよびどれか必要なアクチベーターの存在下に酸化されて光を発生する化合物をいう。これらの基質は、ここではルシフェリンといい、生物発光反応において酸化を受ける基質である。これらの生物発光基質は、いろんなルシフェリンまたはその類似体若しくはルシフェラーゼがそれと相互に作用して光を発生するいろんな合成化合物を含む。好ましい基質は、光発生反応においてルシフェラーゼまたはタンパク質の存在下に酸化されるものである。生物発光基質は、よって、当業者がルシフェリンと認める化合物を含む。ルシフェリンは、例えば、ホタルルシフェリン、Cypridina[Vargulaとしても知られている]ルシフェリン[コエレンテラジン(coelenterazine)]、細菌ルシフェリン並びにこれらの基質の類似体または生物発光を生成する反応においてルシフェラーゼの存在下に酸化される他の化合物を含む。
【００９８】
ここで用いる限りでは、生物発光基質に変換し得るとは、生物発光基質を生成する、酸化または還元の如き、化学反応を受けやすいことを意味する。例えば、生物発光細菌の発光生成反応は、フラビンモノヌクレオシド基[ＦＭＮ]をフラビンレダクターゼ酵素により還元されたフラビンモノヌクレオシド[ＦＭＮＨ２]にする還元を伴う。この還元されたフラビンモノヌクレオシド[基質]はそれから酸素[アクチベーター]および細菌ルシフェラーゼと反応して中間体の過酸化フラビンを生成し、これは長鎖アルデヒドの存在下にさらに反応を受けて光を発生する。この反応に関しては、還元されたフラビンおよび長鎖アルデヒドが基質である。
【００９９】
ここで用いる限りでは、生物発光発生システムとは、生物発光反応を行うために必要な一組の試薬をいう。よって、特異的なルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび他の基質、溶媒および生物発光反応を終了させるために必要となるかも知れない他の試薬が生物発光システムを形成する。よって、生物発光発生システムとは、適当な反応条件下において、生物発光をもたらす試薬の一つの組をいう。適当な反応条件とは、ｐＨ、塩濃度および温度の如く、生物発光反応を起すのに必要な条件をいう。一般的には、生物発光システムは、生物発光基質、ルシフェリン、酵素ルシフェラーゼおよび光タンパク質を含むルシフェラーゼ、並びに一つまたはそれ以上のアクチベーターを含む。特異的生物発光システムは、それからルシフェラーゼが取り出される特異的生物体を参照することにより確認されるであろう；例えば、Vargula[Cypridinaとも呼ぶ] 生物発光システム(またはVargulaシステム)は、貝虫類のVargulaから単離されるかまたはこれらのルシフェラーゼから組替え手段や修飾を用いて製造するルシフェラーゼの如きVargulaルシフェラーゼを含む。このシステムはまた、酸素の如く生物発光反応を終了させるのに必要な特異的アクチベーターおよびルシフェラーゼが酸素の存在下にこれと反応して光を生成する基質も含むであろう。
【０１００】
ここで供給されるルシフェラーゼは、生物発光発生システムに取り入れられて、そして、ここで供給されるＧＦＰまたは他のＧＦＰと共に適宜使用し得る。同様に、ここで供給されるＧＦＰは公知の生物発光発生システムと共に使用し得る。
【０１０１】
ここで用いる限りでは、ここで現れる種々のアミノ酸配列で出現するアミノ酸は、よく知られた三文字または一文字の略字に従って確認される。種々のＤＮＡ断片に出現するヌクレオチドは、この技術分野で日常的に用いられる標準的な単一の文字名称をもって命名される。
【０１０２】
ここで用いる限りでは、蛍光タンパク質とは、蛍光を放つ能力を有する (例えば、一つの波長でエネルギーを吸収し、他の波長でエネルギーを放出する) タンパク質をいう。これらのタンパク質は、蛍光ラベルまたはマーカーとして用いることができるが更に、このようなラベルが用いる幾らかの応用、例えば、イムノアッセイ、ＣＲＥＴ、ＦＲＥＴおよびＦＥＴアッセイに、且つ、ここでＢＲＥＴアッセイと名付けているアッセイに用いることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質とは、約５１０ｎｍで発光スペクトルのピークを持つポリペプチドをいう。
【０１０３】
ここで用いる限りでは、この用語ＢＲＥＴ(Bioluminescence Resonance Energy Transfer)とは、非放射性のルシフェラーゼからＦＴへのエネルギー移動をいう。これは蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer)とは異なり、後者は歴史的に化学蛍光体間のエネルギー移動に用いられたが最近ではAequorea ＧＦＰスペクトル変異体間のエネルギー移動に応用されている。
【０１０４】
ここで用いる限りでは、ＢＲＥＴシステムとは、共鳴エネルギー移動のためのＦＰとルシフェラーゼとの組合わせをいい、そして、ＢＲＥＴとは、そこでルシフェラーゼがそのとき非放射性的にＦＰへと変換するルシフェリンと反応して光を発生するのに用いられるところの方法をいう。このエネルギーはＦＰ，特にＧＦＰ，に移動し、これはエネルギーを集中させシフトさせて、別の波長でそれを放出する。好ましい形態においては、ＢＲＥＴシステムは、生物発光発生システムおよびこのシステムでルシフェラーゼと同じ起源からのＧＦＰを含む。好ましい一対はRenillaルシフェラーゼとRenilla ＧＦＰであり、これらは特異的に相互に作用する。結合における変更は、ルシフェラーゼにより生成する光の発光スペクトルの変化に反映されるであろう。その結果、この一対は外部イベントのセンサーとして機能する。
【０１０５】
ここで用いる限りでは、バイオセンサー(またはセンサー)とは、ＢＲＥＴシステムを用いるインビトロまたはインビボの環境における変化を検出するために使用するＢＲＥＴシステムをいう。
【０１０６】
ここで用いる限りでは、“厳格には触媒的でなく”とは、光タンパク質は触媒として作用して基質の酸化を促進するが、この反応中に結合した基質は酸化され、結合した分子状酸素は使われるために、このタンパク質が反応で変化することを意味する。このような光タンパク質は、当業者に公知の適当な条件下で基質および分子状酸素の添加により再生される。
【０１０７】
ここで用いる限りでは、核酸プローブは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、これは配列番号、特に、配列番号１５、１９、２１、２８，３０、３１のどれかに表示されている１４またはそれ以上の連続した塩基(またはその補体)と同じであるところの少なくとも１４の連続した塩基、好ましくは少なくとも１６の連続した塩基、典型的には約３０、を含むヌクレオチド配列並びに配列番号２３−２７のどれかをコードする核酸を有する。それからプローブを構築する好ましい領域は、５’および／または３’コーディング配列を含み、これらの配列はRenilla属の中で保存されている領域をコード化すると予測されるものである。Renilla属ＧＦＰの中で保存されている領域からのプローブは、Renillaライブラリーからの核酸をコード化するＧＦＰを単離するためにある。
【０１０８】
好ましい態様では、核酸プローブは少なくとも１４のヌクレオチド、好ましくは１６から３０のヌクレオチドの縮重プローブであり、これらは、配列番号１６に表示されているアミノ酸５１から６８，８２から９８および１９８から２０８、配列番号２４に表示されているアミノ酸配列、配列番号２５に表示されているアミノ酸９−２０および配列番号２７に表示されているアミノ酸３９−５３に基づく。他の好ましい態様では、上述の好ましいアミノ酸領域をコード化する核酸プローブは、配列番号１５に表示されているこれらの領域をコード化するヌクレオチド配列の中で選択される。
【０１０９】
好ましい態様では、核酸プローブは少なくとも１４のヌクレオチド、好ましくは１６から３０のヌクレオチドの縮重プローブであり、これらは、配列番号２０に表示されているアミノ酸に基づく。他の好ましい態様では、上述の好ましいアミノ酸領域をコード化する核酸プローブは、配列番号１９に表示されているこれらの領域をコード化するヌクレオチド配列の中で選択される。
【０１１０】
ここで用いる限りでは、ベクター(またはプラスミド)とは、異種のＤＮＡをその発現または複製のどちらかのために細胞中に導入するために用いられる別個のエレメントをいう。このような伝達体の選択と使用は専門家の技能に十分含まれる。発現ベクターは、プロモーター領域の如く、そのようなＤＮＡ断片を発現させることが可能な制御配列と操作的に連結したＤＮＡを発現することが可能であるベクターを含む。よって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組替えビールスまたは他のベクターの如き組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をいい、これを適当な宿主細胞に導入するとクローン化したＤＮＡの発現をもたらす。適切な発現ベクターは当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能であるものおよびエピソームを残すものまたは宿主細胞中に組込まれるものを含む。Gaussiaルシフェラーゼ、Renilla ＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現のために現在好ましいプラスミドは、細菌および酵母中で発現するここで記載されているようなものである。
【０１１１】
ここで用いる限りでは、プロモーター領域またはプロモーターエレメントとは、それと操作的に連結されているＤＮＡまたはＲＮＡの転写を調節するＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントをいう。このプロモーター領域は、ＲＮＡ認識、結合および転写開始に十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターという。更に、このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始のこの活性をモジュレートする配列を含む。これらの配列はシス作用性であってもよくトランス作用性ファクターに反応的であってもよい。プロモーターは、調節の本質次第で、構成的であっても調節されていてもよい。原核生物で用いるように意図された代表的なプロモーターはバクテリオファージＴ７およびＴ３プロモーター等を含む。
【０１１２】
ここで用いる限りでは、操作的に連結したまたは機能的に結合したとは、ＤＮＡとプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳の停止部位、および他のシグナル配列の如きヌクレオチドの調節およびエフェクター配列との機能的関係をいう。例えば、ＤＮＡのプロモーターへの操作的に連結とは、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的および機能的関係をいうが、そこではＤＮＡのような転写は、ＤＮＡを特異的に認識し、結合しそして転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始される。発現および／またはインビトロ転写を最適化するためには、転写および翻訳のどちらかのレベルにおいて発現を邪魔するか減少させる可能性のあるところの過剰な、潜在的な不適切な代わりの翻訳開始(例えば、出発)コドンまたは他の配列を除去するために、５’未翻訳部分を取り除き、加えまたは変化させることが必要になるかもしれない。その代わりに、共通のリボソーム結合部位(例えば、Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266: 19867-19870を参照)を出発コドンの５’に直ぐ挿入し、発現を強化させることができる。そのような修飾の望ましさ(必要性)は経験的に決定できる。
【０１１３】
ここで用いる限りでは、ルシフェラーゼのような目標試剤を目標に向けることとは、その試剤をそのような試剤に結合させることにより選択した受容体または他の細胞表面タンパク質を発現させる細胞に向けてそれを導くことを意味する。受容体または細胞表面タンパク質への結合または相互作用で、目標試剤は適当な基質および活性化試剤と反応することができるので、生物発光の光が生成しそして腫瘍性組織または細胞が非腫瘍性組織から区別される。
【０１１４】
ここで用いる限りでは、特定の病気を治療するための化合物の有効量は、その病気に関連した症状を改善するかまたは何らかの方法で軽減させるのに十分な量である。そのような量は、有効である限りにおいて、単回投与量として投与してもよくまたは投薬計画に従って投与してもよい。その量は病気を治療するかもしれないが、典型的には、その病気の症状を改善するために投与される。症状を望みどおりに改善するためには繰り返し投与が必要になるかもしれない。
【０１１５】
ここで用いる限りでは、病気を診断するための複合体の有効量は検出可能な組織に帰するであろう量である。この組織は、人間の眼よりも更に敏感な検出器からの助け無しかまたはどの蛍光性生成物も励起する光源を使用するかのどちらかにより視覚化させて検出する。
【０１１６】
ここで用いる限りでは、視覚化とは、正常な手術条件、必要により、特にやや薄暗い光の下における手術の間に、眼により検出可能なことを意味する。
【０１１７】
ここで用いる限りでは、複合体の製薬的に許容される塩、エステルまたは他の誘導体は、当業者がそのような誘導体化に公知の方法を用いて容易に作成することができるところの、そして実質的な毒性作用無しに動物または人間に投与し得る化合物を製造するところの、且つ、どちらも製薬的に活性であるかまたは前駆薬剤であるところの全ての塩、エステルまたは誘導体を含む。
【０１１８】
ここで用いる限りでは、治療とは、体調、機能障害または病気の症状を改善するかまたは、他の方法で、有益に変える方法を意味する。治療はここでの組成物の製薬的使用もまた包括する。
【０１１９】
ここで用いる限りでは、特定の製薬的組成物の投与により特定の機能障害の症状改善とは、その組成物の投与で寄与するか関与し得るところの、永久的または一時的であっても、緩和し、継続しまたは一過性にすることをいう。
【０１２０】
ここで用いる限りでは、実質的に純粋とは、純度を評価するために当業者により使用される薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトマトグラフィー(ＨＰＬＣ)のような標準的分析方法によって測定するときに容易に検出可能な不純物が無いように見えるように十分均一であるか、若しくは、その物質の酵素的および生物的活性の如き、物理的および化学的性質が更に精製しても検出されるほどには変化しないように十分純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は当業者に公知である。実質的に化学的に純粋な化合物は、然しながら、立体異性体または異性体の混合物であってもよい。そのような例においては、更に精製すると化合物の比活性を増加させるかも知れない。
【０１２１】
ここで用いる限りでは、前駆薬剤は、インビボ投与において、この化合物の生物的に、製薬的にまたは治療的に活性な形に代謝されるか、他の方法で、変換されるところの化合物である。前駆薬剤を製造するためには、製薬的に活性な化合物を修飾してその活性な化合物が代謝過程によって再生されるようにする。前駆薬剤は、薬剤の代謝安定性または伝達特性を変えるように、副作用または毒性をマスクするように、薬剤の風味を改善するように、若しくは、薬剤の他の特性または性質を変えるようにデザインしてもよい。インビボにおける薬動学的な過程および薬剤代謝の知識のお陰で、当業者は、一旦製薬的に活性な化合物が公知になると、その化合物の前駆薬剤をデザインすることができる(例えば、Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392を参照)。
【０１２２】
ここで用いる限りでは、生物活性とは、化合物のインビボ活性または化合物、組成物または他の混合物のインビボ投与によってもたらされる生理的応答をいう。生物活性は、よって、そんな化合物、組成物または混合物の治療効果および製薬的活性を包括する。生物活性はそんな活性を試験するか使用するようにデザインしたインビボシステムにおいて観察できる。よって、ここでの目的のためには、ルシフェラーゼの生物活性は、そのオキシゲナーゼ活性であり、これにより基質を酸化すると光を生成する。
【０１２３】
ここで用いる限りでは、目標試剤とは、結合した目標試剤、ルシフェリンまたはルシフェラーゼ、を腫瘍性の細胞または組織に向けて特異的にまたは優先的に目標を定める試剤をいう。
【０１２４】
ここで用いる限りでは、腫瘍抗原とは、腫瘍細胞の表面に発現するか位置する細胞表面タンパク質をいう。
【０１２５】
ここで用いる限りでは、腫瘍性の細胞とは、いろんな型の形質変換したまたは変化した細胞を含むが、それは接触抑制の欠如および腫瘍特異的抗原の獲得などの形質変換した細胞に典型的な特性を示す。そのような細胞は白血病の細胞または腫瘍に由来する細胞を含むがこれらに限定するものではない。
【０１２６】
ここで用いる限りでは、腫瘍性の病気は、腫瘍性の細胞がこの病気に悩まされている個人に存在するところの病気である。このような病気はガンとして特徴付けられるあらゆる病気を含む。
【０１２７】
ここで用いる限りでは、転移性の腫瘍とは、一つの部位に局所化しない腫瘍をいう。
【０１２８】
ここで用いる限りでは、特殊組織とは、場所に関する情報が望まれる非腫瘍性の組織を言う。そんな組織は、例えば、子宮内膜組織、異所性妊娠、ある機能障害に関与する組織および筋障害または病理を含む。
【０１２９】
ここで用いる限りでは、受容体とは、ある配位子に親和性を有する分子をいう。受容体は天然に存在するかまたは合成の分子でもよい。受容体はこの技術分野においては抗配位子としてもよい。ここで用いる限りでは、受容体および抗配位子とは互換性がある。受容体は、そのままの状態または他の種類のものとの凝集体として使用し得る。受容体は、直接的にまたは間接的に、特異的結合物質またはリンカーを経由して、共有的にまたは非共有的に、若しくは物理的接触で、結合メンバーに接着し得る。受容体の例として以下のものを含むが、これらに限定するものではない：抗体、細胞膜受容体、表面受容体および内在化受容体、特異的抗原決定因子[例えば、ビールス、細胞または他の物質上での]と反応性のモノクローナル抗体および抗血清、薬剤、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、多糖、細胞、細胞膜および細胞小器官。
【０１３０】
受容体およびそのような受容体を使用する適用の例として以下のものを含むが、これらに限定するものではない：
ａ)酵素：微生物の生存に必須な特異的輸送タンパク質または酵素で、これらは輸送抗生物質[リガンド]選択用の目標として役立つことができよう；
ｂ)抗体：関心のある抗原のエピトープに結合する抗体分子上におけるリガンド結合部位の確認が調査できる；抗原性エピトープを模擬する配列の決定は、その免疫原が一つまたはそれ以上のそんな配列に基づくワクチンの開発に至るか、若しくは、自己免疫病に対するような治療で有用な関連の診断薬または化合物の開発に至るであろう；
ｃ)核酸：タンパク質またはＲＮＡのようなリガンドの結合部位の確認；
ｄ)触媒性ポリペプチド：高分子、好ましくはポリペプチドで、これらは一つまたはそれ以上の反応物の一つまたはそれ以上の生成物への変換を伴う化学反応を促進することを可能にする；そのようなポリペプチドは、少なくとも一つの反応物または反応中間体に対して特異的な結合部位並びに機能が結合した反応物を化学的に修飾することを可能にする結合部位に隣接した活性機能を一般的に含む(例えば、米国特許番号5,215,899を参照)；
ｅ)ホルモン受容体：高い親和性で受容体に結合するリガンドの決定はホルモン補充療法の開発に有用である；例えば、そのような受容体に結合するリガンドの確認は血圧を調節する薬剤の開発に至るであろう；並びに
ｆ)オピエート受容体：脳中でオピエート受容体に結合するリガンドの決定はモルヒネおよび関連薬に対する低中毒性の置換薬の開発に有用である。
【０１３１】
ここで用いる限りでは、抗体はＦａｂ断片のような抗体断片を含み、それらは軽鎖および重鎖の可変領域から成っている。
【０１３２】
ここで用いる限りでは、抗体複合体とは、目標試剤が抗体であるところの複合体をいう。
【０１３３】
ここで用いる限りでは、抗体活性化とは活性化された抗体が生産される過程をいう。抗体は、異質二元機能性試薬のようなリンカーと反応して活性化される。
【０１３４】
ここで用いる限りでは、外科的観察とは、動物の体を切開する操作を言う。そのような操作は、腹腔鏡検査法および関節鏡検査操作等の慣習的な手術および診断的操作を含む。
【０１３５】
ここで用いる限りでは、人間化抗体とは、人間への投与が免疫反応を引き起こさないように、アミノ酸の“人間”配列を含むように修飾した抗体をいう。そのような抗体の調製方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、非可変領域のアミノ酸構成が人間の抗体に基づくところの抗体を発現するように組換えＤＮＡ技術によって変えられる。そのような領域を確認するコンピュータープログラムがデザインされている。
【０１３６】
ここで用いる限りでは、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨとは、それぞれ、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、ニコチンアミドアデニンヂヌクレオチド(酸化型)およびニコチンアミドアデニンヂヌクレオチド(還元型)をいう。
【０１３７】
ここで用いる限りでは、組換えＤＮＡ方法を用いる組換え手段による生産とは、クローン化したＤＮＡでコード化したタンパク質を発現するために分子生物学のよく知られた方法を使用することを意味する。
【０１３８】
ここで用いる限りでは、生成物に実質的に同一とは、関心のある性質が十分に未変化であるように十分類似していることをいい、そのために実質的に同一な生成物はこの生成物の代わりに用いることができる。
【０１３９】
ここで用いる限りでは、核酸の二つの配列を言うとき、同等とは、問題の二つの配列がアミノ酸または同等なタンパク質の同じ配列をコード化することを意味する。“同等”が二つのタンパク質またはペプチドを指して使われるときには、これは、二つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性および機能を実質的に変えない保存的なアミノ酸置換[例えば、上の表１を参照]だけを持つ実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。“同等”が性質をいうときには、その性質が同じ程度に存在することは必要ではないが[例えば、二つのペプチドは同じタイプの酵素活性を異なる速度で表すことができる]、その活性は好ましくは実質的に同一である。“相補的”とは、二つのヌクレオチド配列を指すときには、ヌクレオチドの二つの配列が向かい合ったヌクレオチドの間で、好ましくは２５％以下で、更に好ましくは１５％以下で、より更に好ましくは５％以下で、最も好ましくは何も無いミスマッチをもってハイブリッド形成を可能にすることを意味する。好ましくは、二つの分子は高度な緊縮性の条件下でハイブリッド形成するであろう。
【０１４０】
ここで用いる限りでは、ミスマッチの百分率を決める際のハイブリッド形成の緊縮性は以下のようである：
１)高度の緊縮性：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２)中程度の緊縮性：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３)低度の緊縮性：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
同等の緊縮性は代わりの緩衝剤、塩および温度を用いて実現され得ると理解される。
【０１４１】
“実質的に”同一または相同または同様の用語は、関連の当業者により理解される状況で変わり、一般的には、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。
【０１４２】
ここで用いる限りでは、組成物とはいろんな混合物をいう。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、それらの水性、非水性またはいろんな組み合わせでもよい。
【０１４３】
ここで用いる限りでは、組合わせとは二つの間またはより多くの品目の間におけるいろんな結合をいう。
【０１４４】
ここで用いる限りでは、流体とは、流れることができるいろんな組成物をいう。よって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそんな組成物の形にある組成物を包括する。
【０１４５】
受容体およびそのような受容体を使用する適用の例として以下のものを含むが、これらに限定するものではない：
ａ)酵素：微生物の生存に必須な特異的輸送タンパク質または酵素で、これらは輸送抗生物質[リガンド]選択用の目標として役立つことができよう；
ｂ)抗体：関心のある抗原性エピトープに結合する抗体分子上におけるリガンド−結合部位の確認が調査できる；抗原のエピトープを模擬する配列の決定は、その免疫原が一つまたはそれ以上のそんな配列に基づくワクチンの開発に至るか、若しくは、自己免疫病に対するような治療で有用な関連の診断薬または化合物の開発に至るであろう；
ｃ)核酸：タンパク質またはＲＮＡのようなリガンドの結合部位の確認；
ｄ)触媒性ポリペプチド：高分子、好ましくはポリペプチド、で、これらは一つまたはそれ以上の反応物の一つまたはそれ以上の生成物への変換を伴う化学反応を促進することを可能にする；そのようなポリペプチドは、少なくとも一つの反応物または反応中間体に対して特異的な結合部位並びに機能が結合した反応物を化学的に修飾することを可能にする結合部位に隣接した活性機能を一般的に含む(例えば、米国特許番号5,215,899を参照)；
ｅ)ホルモン受容体：高い親和性で受容体に結合するリガンドの決定はホルモン補充療法の開発に有用である；例えば、そのような受容体に結合するリガンドの確認は血圧を調節する薬剤の開発に至るであろう；並びに
ｆ)オピエート受容体：脳中でオピエート受容体に結合するリガンドの決定はモルヒネおよび関連薬に対する低中毒性の置換薬の開発に有用である。
【０１４６】
ここで用いる限りでは、相補的とは、トポロジー的適合性またはリガンド分子および受容体の相互に作用する表面を一緒にマッチングすることをいう。よって、受容体およびそのリガンドは相補的と記述することができ、更に、接触表面特性はお互いに相補的である。
【０１４７】
ここで用いる限りでは、リガンド−受容体対または複合体は、二つの巨大分子が分子認識を通じて結合して複合体を生成するときに形成される。
【０１４８】
ここで用いる限りでは、基質とは、化学合成、アッセイおよび他のそんな方法のための固体担体として直接にまたは適切な誘導化の後で使用されるいろんなマトリックスをいう。ここでの好ましい基質は、シリコン基質またはシリコン化基質であり、これらは、抗リガンドおよびリガンド並びに蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質および他の放射シフターを含む他の巨大分子との連鎖を意図して表面上で誘導化される。
【０１４９】
ここで用いる限りでは、マトリックスとはいろんな固体または半固体または不溶性担体を言い、その上で、関心のある分子、典型的には生物分子、巨大分子、有機分子または生体特異的リガンドが連結または接触される。典型的には、マトリックスは硬いかやや硬い表面を持つ基質材である。多くの態様において、基質の少なくとも一つの表面は実質的に平らであろうが、或る態様においては、種々の高分子に対する合成領域を、例えば、穴、浮き出し表面、エッチングした溝またはその他の位相でもって物理的に分離することが望ましいかもしれない。マトリックス材は、化学的および生物的分子の合成および分析のためのアフィニティーマトリックスまたは担体を含み、下記に限定することなく例示される：ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石、ポリテトラフルオロエチレン、アガロース、多糖、デントリマー、バックボール、ポリアクリルアミド、珪藻土−ポリアクリルアミド非共有性複合体、ポリスチレン−ポリアクリルアミド共有性複合体、ポリスチレン−ＰＥＧ[ポリエチレングリコール]複合体、シリコン、ゴムおよび固相合成、アフィニティー分離および精製、ハイブリッド形成反応、イムノアッセイおよび他のそんな応用のための担体として使用されるその他の材料。
【０１５０】
ここで用いる限りでは、連結層とは、それに分子が連結されるチップ装置の表面をいう。典型的には、このチップは半導体装置で、分子を連結するために適切なようにその表面の少なくとも一部分が皮膜され、そして装置が曝されるどんな反応にも不活性である。分子は直接的にまたは間接的に表面に連結されるが、共有結合、イオン性相互作用またはどれかの他の相互作用による吸収または吸着によって連結を達成することができる。必要に応じて、この連結層は、例えば、分子を連結させるための誘導化により改造される。
【０１５１】
Ｂ．生物発光発生システムおよび成分
生物発光発生システムおよびその成分の記述を以下に示す。これらのルシフェラーゼおよびルシフェリンおよび蛍光タンパク質はここで供給されるルシフェラーゼおよびＧＦＰと一緒に用いることができる。
【０１５２】
1．代表的な生物発光発生システム
生物発光発生システムとは生物発光を発生させるために必要で十分である成分をいう。これらはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびいろんな必要な補因子または条件を含む。当業者に公知である実際上どんな生物発光システムでも、ここで供給される装置、システム、組合わせおよび方法において容易に使用できるであろう。生物発光発生システムを選択する際に考慮すべき要素は次のものを含むがこれらに限定されない：生物発光と組み合わせて使用する目標試剤；反応を行う培地；温度またはｐＨ感受性のような成分の安定性；成分の有効期限；一定または間欠的であれ、光放射の継続性；成分の入手の容易さ；要求される光強度；光の色；およびその他のそのような要素。
【０１５３】
ａ．一般的記述
一般的には、生物発光とは、エネルギーを発生する化学反応をいい、ここでは特異的化学基質であるルシフェリンが酵素であるルシフェラーゼを触媒とする酸化反応を受ける。生物発光反応を維持するのは容易で、反応を継続しまたは回復するためには、消費したルシフェリンまたは他の基質または補因子または他のタンパク質を補充することが単に必要である。生物発光発生反応は当業者によく知られていて、どんなそのような反応もここに記述する製造物品と組み合わせて使用し易くすることができる。
【０１５４】
生物発光発生システムの生物体および供給源は数多くあって、生物発光を現わす幾らかの代表的な属および種を以下の表に表示する[部分的にHastings in (1995) Cell Physiology: Source Book, N. Sperelakis (ed.). Academic Press, pp 665-681から転記]：
【表２】
0004923068.tif 000003
【表３】
0004923068.tif 000004
【表４】
0004923068.tif 000005
【０１５５】
ここでの使用を意図する他の生物発光生物体はGonadostomias、Gaussia(とう脚類)、Watensia、Halisturia、吸血イカ、Glyphus、ハダカイワシ(魚)、Vinciguerria、Howella、Florenciella、Chaudiodus、Melanocostusおよびウミエラである。
【０１５６】
生物発光発生システムは上の表にあるものの如き天然起源から単離してもよくまたは合成的に製造してもよいと理解される。これに加えて、ここで使用するためには、これらの成分は、適当な反応条件下において、これらの混合物が外科的操作の間に細胞および組織が目視できるように光を生成するに足るだけの純度であればよい。
【０１５７】
よって、幾らかの態様においては、粗製のエキスまたは単に生物体をすり潰すだけでも適切なこともあり得る。一般的には、しかし、実質的に純粋な成分が使用される。又、成分は天然起源から単離されてはいない合成成分であってもよい。ＤＮＡをコード化するルシフェラーゼが入手可能であり[例えば、配列番号１−１３を参照]、且つ修飾されていて [例えば、配列番号３および１０−１３を参照]、そして合成で代替の基質が創られている。ここでリストされたＤＮＡは、入手可能なＤＮＡをコード化するルシフェラーゼを単に代表するにすぎない。
【０１５８】
表２やここの何処かに表示されまたは当業者に公知である生物発光発生システムは、合成であれまたは天然起源からの単離であれ、ここで提供される組合わせ、システムおよび方法においての使用を意図している。オキシゲナーゼ[ルシフェラーゼ]に頼らない生物発光システムそれ自体はここでは包括されない。
【０１５９】
（１）ルシフェラーゼ
目標試剤はここではルシフェラーゼまたはルシフェリンを含む。ルシフェラーゼとは、必要なアクチベーターの存在下において、遊離のまたは結合した分子状酸素の存在で、生物発光基質(ルシフェリン)を低エネルギー状態から高エネルギー状態へ酸化する反応を触媒するいろんな化合物をいうが、それでその基質は、低エネルギー状態に戻る際に光を放射する。ここでの目的には、ルシフェラーゼは、基質の酸化により光を発生させるために触媒的に作用するタンパク質、並びに、厳密的には触媒的でないが[そのタンパク質が消費されるので]、分子状酸素の存在で基質と連携して光を発生させるように作用する、エクオリンのような、光タンパク質を包括するように広く使用される。エクオリンのような光タンパク質を含むこれらのルシフェラーゼはここではルシフェラーゼの中に又含まれる。これらの試薬に含まれるものは、天然に存在するルシフェラーゼ[光タンパク質を含む]、組替えＤＮＡによって生産されるタンパク質、および、適当な基質、補因子およびアクチベーターの存在下において光を発生する能力を保持するところのそれらの突然変異化または修飾化された変異型、若しくは、基質を酸化するための触媒として作用して光を生成するようなその他のタンパク質である。
【０１６０】
一般名的には、生物発光反応を触媒するか開始するタンパク質はルシフェラーゼと言われ、且つ、酸化され得る基質はルシフェリンと言われる。酸化された反応生成物はオキシルシフェリンと命名され、そして或るルシフェリンの前駆物質はエチオルシフェリンと命名される。よって、ここでの目的のためには、生物発光は、生体タンパク質または類似体、その誘導体または突然変異体によって触媒されるか[酵素的に作用するルシフェラーゼの場合]若しくは開始される[反応で再生されないエクオリンのような光タンパク質の場合]ところの反応により生成される光を包括する。
【０１６１】
ここで明確にすると、触媒的タンパク質はルシフェラーゼと言われそして光を放射してオキシルシフェリンを放出するルシフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼのような酵素を含む。ルシフェラーゼの中に又含まれるのは光タンパク質であり、これはルシフェリンを酸化して光を放射するが、反応中に変化し再び使用するには再生しなければならない。ルシフェラーゼは天然に存在してもよく又或る性質を改良したり変化させたりするために遺伝子工学等で修飾してもよい。ここで得られる分子が生物発光反応を触媒する能力を保持する限り、それはここで包括される。
【０１６２】
ルシフェラーゼ活性を持ついろんなタンパク質[ここで定義するように、光を生成するために分子状酸素の存在下に基質を酸化する反応を触媒するタンパク質]をここでは使用できる。好ましいルシフェラーゼはここで記載されたものまたは軽度の配列変異型を有するものである。限定的ではないが、そのような軽度の配列変異型に含まれるのは、軽度の対立遺伝子的または種の変異型および残基、特にシステイン残基の挿入または欠失である。アミノ酸の適切な伝統的置換は当業者に公知であり、又、ここで得られる分子の生物的活性を変えることなく一般的に実施される。そのような置換は、好ましくは、上述の表１に表示されているものに従って行われる。
【０１６３】
ルシフェラーゼは商業的に得たり、天然起源から単離したり、ルシフェラーゼをコード化するＤＮＡを用いて宿主細胞中に発現させたりまたは当業者に公知のいろんな様式で得たりすることができる。ここでの目的のためには、選択した起源の生物体をすり潰して得られる粗エキスで十分である。大量のルシフェラーゼが望まれるので、宿主細胞からのルシフェラーゼの単離が好ましい。そのような目的のためのＤＮＡはその修飾型として広く入手可能である。
【０１６４】
これらに限定するものではないが、ルシフェラーゼの実例にはctenophores（有櫛動物）である Mnemiopsis（ムネミオプシン）および Beroe ovata（ベロビン）から単離したもの、coelenterate（腔腸動物）である Aequorea（エクオリン）、Obelia（オベリン）、Pelagia から単離したもの、Renilla ルシフェラーゼ、mollusca（軟体動物）である Pholas（フォラシン）から単離したルシフェラーゼ、たとえば Aristostomias、Pachystomias、および Poricthys のような魚類から単離したルシフェラーゼ、たとえば Cypridina（別名 Vargula）のようなostracod（貝虫類）から単離したルシフェラーゼも包含する。本発明で使用するために好適なルシフェラーゼはエクオリンタンパク質、Renilla ルシフェラーゼおよび Cypridina［別名Vargula］ルシフェラーゼである［たとえば配列番号１、２および４〜１３を参照］。また、反応によって赤色および／または近赤外の光を発するルシフェラーゼは好適である。これにはたとえば A. scintillans、Pachystomias、M. niger などのMalacosteusのような Aristostomia 種に存在するルシフェラーゼも包含する。
【０１６５】
［２］ルシフェリン類
本結合体における反応または結合のための基質にはルシフェラーゼと反応して発光するものであればいかなる分子をも包含する。このような分子には天然起源の基質、その修飾体、および合成的基質を包含する［たとえば米国特許第5374534号および米国特許第5098828号参照］。ルシフェリンの例には本明細書に記載するものならびにその誘導体、類似体、たとえばジオキセタン類のような合成基質を包含する［たとえば米国特許第5004565号および米国特許第5455357号参照］および発光反応中にルシフェラーゼによって酸化される他の化合物を包含する［たとえば米国特許第5374534号、米国特許第5098828号および米国特許第4950588号参照］。このような基質はまた生物発光反応中に酸化される化合物を選択することによって実験的に確認してもよい。
【０１６６】
［３］活性化剤
生物発光を発生する系はまた本明細書で検討するものおよび当技術分野における熟練者に知られている他の成分を必要とする。生物発光反応は全て溶解酸素または結合酸素の型における分子状酸素を必要とする。そこで、水に溶解した、または空気中の、または発光プロテインに結合した、分子状酸素は生物発光反応に対する活性化剤である。これらに限定されるものではないが、その他の活性化剤には反応の構成の型に依存して次のようなものを包含する：ＡＴＰ（ホタルルシフェラーゼ）、ＦＭＮからＦＭＮＨ2を再生するフラビン還元酵素［細菌系］、およびＣａ2+またはその他の適当な金属イオン［エクオリン］。
【０１６７】
本明細書が提供する系の殆どはルシフェラーゼとルシフェリンとを混合して空気または水と接触させる時に発光する。しかしながら、たとえばエクオリンのように酸素を結合する発光プロテインを利用する系ではＣａ2+［またはその他の適当な金属イオン］との接触が必要で、これはカルシウム塩の水性組成物の形で供給することもできる。このような例ではルシフェラーゼ［エクオリン］とルシフェリン［セレンテラジンのような］との混合物へのＣａ2+［またはその他の適当な金属イオン］の添加が発光をもたらす。Renilla 系およびその他の Anthozoa（花虫類）系でもＣａ2+［またはその他の適当な金属イオン］が必要である。
【０１６８】
たとえば摩砕 Cypridina［小エビ］または摩砕ホタルのような粗製の製品を使用する時には水を添加することだけが必要なこともある。ホタル［またはホタルまたは昆虫のルシフェラーゼ］を利用する例では反応にはＡＴＰの添加のみが必要なこともある。当技術分野の熟練者には本明細書の開示を参照すれば詳しい構成成分は明白となるか、または実験で容易に決定されるものである。
【０１６９】
これらの混合物には進行させるべき反応に必要な、いかなる追加的な塩または緩衝液またはイオンを含有させられることは理解されることとなる。これらの反応の特性はよく決定されているので、当技術分野の熟練者は正確な比率と必須な成分とを決定することができることとなろう。この成分の選択は装置、製造技術およびルシフェラーゼに依存することとなる。本明細書には様々な態様が記載され、例示されている。これらの記載によればその他の態様も明白となる。
【０１７０】
［４］反応
全ての態様ではルシフェラーゼかルシフェリンかのどちらか一成分を除いて、生物発光系の全構成成分は混合し、または包装してもよく、組み合わせてもよい。残りの成分は標的試薬と結合させ、また動物への投与を意図してもよい。
【０１７１】
外科的手術の前に、結合物はいかなる適当な経路で投与してもよく、それによって器官特異的細胞表面タンパク質との特異的相互作用により標的試薬は標的器官に結合する。外科手術の間に典型的には局所噴霧または局所注射によって組織で残余の構成成分と接触させると結合体が結合した組織が発光することになる。この発光は薄暗または必要なら暗黒の下で目視するために十分でなければならない。
【０１７２】
一般的に言えば、達成すべき結果は裸眼で見える発光であって、定量的でなくて定性的な診断が目的であるから生物発光反応の構成成分の正確な比率および量は厳密に測定したり、調整したりする必要はない。これは発光をするために十分でなければならない。一般的には可視的発光を生じるために十分な量のルシフェリンとルシフェラーゼとの量を使用する。この量は実験によって容易に決定できるが、選択した系と選択した利用目的に依存する。定量的測定が必要な場合には、精度の向上が必要となろう。
【０１７３】
本明細書に記載する目的のためにはこの量は好ましくは少なくとも当技術分野の熟練者が分析的目的のために用いる濃度および比率である。発光の強さが十分でなければ濃度を高める。あるいは、シグナルの発生を増加させるためには複数個のルシフェラーゼ分子を結合させた標的試薬を結合したマイクロキャリアーに結合させてもよい。また、反応に使用する条件は実験室条件ではなく各成分は貯蔵するので高濃度を用いてあり得べき活性の低下を克服してもよい。典型的にはこの量は反応混合物１リットルについてルシフェラーゼ１mg、好ましくは１０mg、さらに好ましくは１００mgであるか、または１mg、好ましくは１０mg、さらに好ましくは１００mgである。組成物には少なくとも約０．０１mg/L、典型的には０．１mg/L、１mg/L、１０mg/Lまたはそれ以上の各成分をその品目に含有してもよい。ルシフェリンの量も約０．０１mg/Lと１００mg/Lとの間、好ましくは０．１mg/Lと１０mg/Lとの間であって、反応持続のためには多くの反応物の場合にルシフェリンを追加することができる。ルシフェラーゼが触媒的に働いて再生する必要がない態様では利用するルシフェラーゼの量を減少させることもできる。反応の間に変化させる場合には追加でき、典型的には高い濃度を選択することになる。リットル当り各成分の濃度範囲［または基質をコーティングする量、組成物と接触する結果］は０．１mgから２０mg、好ましくは０．１mgから１０mg、さらに好ましくは約１mgと１０mgの間であれば十分となろう。本明細書に記載するようにコーティングされた基質を製造する時には、高濃度のルシフェラーゼまたはルシフェリンを含む多量のコーティング組成物を使用してもよい。
【０１７４】
そこで、例えばカルシウム存在下、たとえばセレンテラジンのようなルシフェリン５mgを水１Lにとかし、たとえばエクオリン発光プロテインルシフェラーゼまたは Renilla からのルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ約１０mgを添加すれば水温に依存して少なくとも１０分から２０分間明るく発光するものである。ルシフェラーゼ濃度を例えば１００mg/Lまで増加させれば特に明るく輝いた光を放つ。
【０１７５】
使用する濃度と量とは選択した生物発光発生系に依存することは理解されるがこれは実験的に容易に決定される。特に実験的測定を開始するような時に用いる比率は分析的目的に一般に使用されるもので、その量または濃度は少なくとも分析的目的に使用されるものであって、持続的で明るい発光を所望する時には量を増加できる。
【０１７６】
２．Renilla 系
ソフトコラル・ウミシイタケとも呼ばれる Renilla は腔腸動物 花虫綱に属し、これにはたとえば Cavarnularia、Ptilosarcus、Stylatula、Acanthoptilum および Parazoanthus のように他の生物発光をする属を包含する。花虫綱属で生物発光をするものはルシフェラーゼとルシフェリンを有し、それらは構造的に類似している［たとえばCormier et al.（1973） J. Cell Physiol. 81：291-298参照；また、 Ward et al.（1975） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72：2530-2534参照］。これら 花虫綱属の各生物から得られるルシフェラーゼとルシフェリンは相互に交差反応を起こして特徴的な青い冷光を発する。
【０１７７】
Renilla のルシフェラーゼとその他の腔腸動物および有櫛動物のルシフェラーゼ、たとえばエクオリン発光プロテインのようなものではイミダゾピラジン基質、特に一般にセレンテラジンと呼ばれる基質を利用する［前記Ｂ．１．ｂの式（Ｉ）と（ＩＩＩ）を参照］。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを含有するその他の属には：Chiroteuthis、Eucleoteuthis、Onychoteuthis、Watasenia、コウイカおよび Sepiolina のようなイカ；Oplophorus、Acanthophyra、Sergestesおよび Gnathophausia のようなエビ；Argyropelecus、Yarella、Diaphus、Gonado-stomiasおよび Neoscopelus のような深海魚；を包含する。
【０１７８】
しかしながら、Renilla のルシフェラーゼは結合酸素を持たないので、適当なルシフェリン基質存在下に発光するには溶解酸素を必要とする。Renilla のルシフェラーゼは真正酵素［すなわち、再使用するために再構築する必要がない］として作用するので得られる冷光は飽和濃度のルシフェリンが存在すれば長時間持続する。また、Renilla のルシフェラーゼは熱に対して比較的安定である。
【０１７９】
Renilla のルシフェラーゼ、Renilla reniformis のルシフェラーゼをコード するＤＮＡ、および組換えルシフェラーゼを産生するためのRenilla reniformis ＤＮＡの使用法、ならびに他の腔腸動物のルシフェラーゼをコードするＤＮＡはよく知られており、入手可能である［たとえば配列番号１、米国特許第5418155号および米国特許第5292658号参照；また、Prasher et al.（1985） Biochem. Biophys. Res. Commun. 126：1259-1268；叢書「Bioluminescense and Chemiluminescense」中、225-233のCormier （1981） 「Renilla and Aequorea bioluminescense」；Charbonneau et al.（1979） J. Biol. Chem. 254：769-780；Ward et al.（1979） J. Biol. Chem. 254：781-788；Lorenz et al. （1981） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88：4438-4442；Hori et al.（1977） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74：4285-4287；Hori et al.（1975） Biochemistry 14：2371-2376；Hori et al.（1977） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74：4285-4287；Inouye et al.（1977） Jap. Soc. Chem. Lett. 141-144；およびMatthews et al.（1979） Biochemistry 16：85-91参照］。Renilla reniformis のルシフェラーゼをコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡを有する宿主細胞はたとえば当技術分野の熟練者に知られているもの［たとえば Renilla reniformis ルシフェラーゼの組換え産生法を開示する米国特許第5418155号および米国特許第5292658号参照］のように多量の Renilla reniformis 酵素を製造するために便利な手段を提供する。
【０１８０】
本明細書で使用する Renilla ルシフェラーゼは凍結乾燥形にまとめ、それ自体でまたはルシフェリン基質と組合せて担体中にカプセル化することもできる。使用前にこの混合物を水性組成物、好ましくは燐酸緩衝液食塩水ｐＨ７〜８と接触させるが、溶解Ｏ2酸素が反応を活性化する。発光している混合物中のルシフェラーゼ最終濃度は０．０１から１mg/Lまたはそれ以上のオーダーになると思われる。ルシフェリン濃度は少なくとも約１０-8Mであるが、長時間持続する生物発光をさせるためにはその１倍から１００倍またはそれ以上のオーダーの大きさとすべきである。
【０１８１】
本発明の態様のあるものでは、約１mgから１０mg、または好ましくは２〜５mg、さらに好ましくは約３mgのセレンテラジンを Renilla ルシフェラーゼ約１００mgとともに使用することになろう。もちろん正確な量は実験的に決定でき、また究極的な濃度と利用にある程度は依存するものである。特に、適当な検定用緩衝液１００mLに Renilla を発現する細菌から得られる粗製抽出物約０．２５mLを添加するなら、約０．００５μｇは可視的で持続的な輝きを発光するために十分である［Renilla reniformis ルシフェラーゼの組換え製造を開示する米国特許第5418155号および米国特許第5292658号参照］。
【０１８２】
凍結乾燥混合物および Renilla ルシフェラーゼを含む組成物も提供する。ルシフェラーゼまたはルシフェラーゼとルシフェリンとの混合物もたとえばリポソーム、硝子粒、毛細管、薬剤送達材料、ゼラチン、時間放出コーティングまたはその他の材料のような適当な送達材料中にカプセル化してもよい。このルシフェラーゼはたとえば生物に適合性のある材質のような基質に結合しておいてもよい。
【０１８３】
ｂ．有櫛動物系
たとえば Mnemiopsis（ムネミオプシン）およびBeroe ovata（ベロビン）のような有櫛動物およびたとえば Aequorea（エクオリン）、Obelia（オベリン）および Pelagia のような腔腸動物は同様な化学反応を利用して生物発光する「たとえば Stephenson et al.（1981） Biochimica et Biophysica Acta 678：65-75；Hart et al.（1979） Biochemistry 18：2204-2210；米国特許出願第08/017116号、米国特許第5486455号に基づく国際ＰＣＴ出願 WO 94/18342 号および本明細書に引用するその他の参考文献および特許文献参照」。Aequorin および Renilla 系は代表的なものであって本明細書には例示としておよび現時点での好適な系のものとして詳記する。Aequorin および Renilla 系は同じルシフェリンを使用でき、同じ化学反応を利用して発光するが、それぞれのルシフェラーゼは違っている。Aequorin ルシフェラーゼはエクオリンであり、ならびに、例えばルシフェラーゼであるムネミオプシンおよびベロビンは結合酸素および結合ルシフェリンを含有し、反応開始のためにＣａ+2を必要とし、再利用のためには再生が必要な発光プロテインである。一方では Renilla ルシフェラーゼは真正酵素として作用する。何故なら反応中に変化がなく、溶解した分子状酸素を必要とするからである。
【０１８４】
（１）エクオリン系
エクオリン系についてはよく知られている［たとえば、Tsuji et al.（1986） 「Site-specific mutagenesis of the calcium-binding photoprotein aequorin」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：8107-8111；Prasher et al.（1985） 「Cloning and Expression of the cDNA coding for Aequorin, a Bioluminescent Calcium-Binding Protein」、Biochemical and Biophysical Research Communic-ations 126：1259-1268；Prasher et al.（1986） Methods in Enzymology 133：288-297；Prasher et al.（1987） 「Sequence Comparisons of cDNA Encoding for Aequorin Isotypes」、Biochemistry 26：1326-1332；Charbonneau et al.（1985） 「Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequorin」、Biochemistry 24：6762-6771；Shimomura et al. （1981） 「Resistivity to denaturation of the apoprotein of aequorin and reconstitution of the luminescent photoprotein from the partially denatured apoprotein」、Biochem. J. 199：825-828；Inouye et al.（1989） J. Biochem. 105：473-477；Inouye et al. （1986） 「Expression of Apoaequorin Complementary DNA in Escherichia coli」、Biochemistry 25：8425-8429；Inouye et al.（1986） 「Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin」、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82：3154-3158；Prendergast et al.（1978） 「Chemical and Physical Properties of Aequorin and the Green Fluorescent Protein Isolated from Aequorea forskalea」、J. Am. Chem. Soc. 17：3448-3453；欧州特許出願第0540064A1；欧州特許出願第0226979A2；欧州特許出願第0245093A1；および欧州特許出願第0245093B1；米国特許第5093240号；米国特許第5360728号；米国特許第5139937号；米国特許第5422266号；米国特許第5023181号；米国特許第5162227号；およびアポタンパク質をコードするＤＮＡを示す配列番号５〜１３；および米国特許第5162227号に記載の型、欧州特許出願第0540064A1参照。また、Sealite Sciences Technical Report 3号（1994）にはAQUALITEの名前でジョージア州ボガートの Sealite Sciences から購入できるものを記載している］。
【０１８５】
この系は本発明で利用する好適な系の一つである。明らかとなるようにエクオリン光プロテインには非共有結合ルシフェリンおよび分子状酸素が含まれるのでこの形で貯蔵するには凍結乾燥粉末とするか、選択された送達材料でカプセル化するのが適当である。この系はたとえばリポソームまたはその他の送達材料のようなペレットにカプセル化することができる。使用する時には材料とＣａ2+［またはその他の適当な金属イオン］を含有する組成物（これは生水であってもよい）とを接触させれば発光混合物が製造される。
【０１８６】
（ａ）エクオリンおよび関連発光プロテイン
発光プロテインであるエクオリンはクラゲである Aequorea から単離されたものでＣａ2+またはその他の適当な金属イオンを添加すると光を放射する。エクオリン発光プロテインは結合ルシフェリンおよびＣａ2+によって放出される結合酸素を含有し、溶解酸素を必要としない。冷光放射はカルシウムによって触発されるが、後者は酸素とルシフェリン基質を放出してアポエクオリンを生成する。
生物発光フォトプロテインであるエクオリンは多種のクラゲ Aequorea から単離される。これは分子量２２キロダルトン（ｋＤ）の複合ペプタイドである［たとえば、Shimomura et al.（1962） J.Cellular and Comp. Physiol. 59：233-238；Shimomura et al.（1969） Biochemistry 8：3991-3997；Kohama et al. （1971） Biochemistry 10：4149-4152；およびShimomura et al.（1972） Biochemistry 11：1602-1608参照］。在来型のタンパク質は酸素を含み、ヘテロ環状化合物であってルシフェリンの一種であるセレンテラジンがこれと非共有結合的に結合している［下記参照］。このタンパク質はカルシウム結合部位３箇所を有する。痕跡量のＣａ2+［またはたとえばストロンチウムのようなその他の適当な金属イオン］を発光プロテインに添加すると立体配座が変化し、これがタンパク質に結合している酸素を利用して結合セレンテラジンの酸化を触媒する。この酸化のエレルギーは４６９nmに中心を持つ青色光のフラッシュとして放射される。カルシウムイオンの濃度は１０-6Mまでの低さであってもこの酸化反応を触発するためには十分である。
【０１８７】
天然起源アポエクオリンは単一化合物ではなく、ミクロヘテロジニアスな分子種の混合物である。クラゲ Aequorea の抽出物には１２種もの変種タンパク質を含有する［たとえば、Prasher et al.（187） Biochemistry 26：1326-1332；Blinks et al.（1975） Fed. Proc. 34：474参照］。多数の型をコードするＤＮＡが分離されている［たとえば、配列番号５〜９および１３を参照］。
【０１８８】
この発光プロテインはたとえば E. coli 中で組換え的に産生されたタンパク質のようなアポタンパク質とたとえば合成セレンテラジンのようなセレンテラジンと酸素およびたとえば２−メルカプトエタノールのような還元剤［たとえば、Shimomura et al.（1975） Nature 256：236-238；Shimomura et al. （1981） Biochemistry J. 199：825-828参照］の存在下にＣａ2+と結合して所望の時点まで酸化反応が触発されるのを予防するためのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ［本発明に利用するには約５から約１００mMまたはそれ以上の濃度］を混合することによって再構築できる［たとえば米国特許第5023181号参照］。
【０１８９】
再構築のために２−メルカプトエタノールを必要としないアポタンパク質の修正型をコードするＤＮＡも利用可能である［たとえば米国特許号、第米国特許第5093240号参照］。この再構築発光プロテインは購入可能である［たとえば米国特許第5162227号に開示され、AQUALITE（商標）の名前で販売されている］。
【０１９０】
この光反応はキレート化剤の効果を克服し、１０-6M濃度を達成するために十分な濃度でＣａ2+を添加することによって触発される。このように低濃度なＣａ2+でもこの反応を触発できるので、本発明方法における使用のためにはこの発光プロテイン組成物には高濃度のキレート化剤を添加してもよい。そうすると、カルシウム塩の形での添加すべきＣａ2+は高濃度が必要になろう。正確な量は実験的に決定してもよい。本発明で使用するには濃縮組成物または凍結乾燥型または粉末の形で提供される発光プロテインに単に水を添加するのみで十分なこともある。そこで、本発明の目的では燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはその他の適当な緩衝液または組成物を接触させるべき組織表面の湿気などの中に存在する少量なＣａ2+を添加することが生物発光反応を触発することになる。
【０１９１】
エクオリンアポタンパク質のアイソフォルムは多数が確認され、分離されている。これらのタンパク質をコードするＤＮＡはクローニングされ、このタンパク質およびその修正型は適当な宿主細胞を利用して産生されている［たとえば米国特許第5162227号、米国特許第5360728号、米国特許第5093240号；Prasher et al.（1985） Biochem. Biophys. Res. Commun. 126：1259-1268；Inouye et al.（1986） Biochemistry 25：8425-8429；米国特許第5093240号；米国特許第5360728号；米国特許第5139937号；米国特許第5288623号；米国特許第5422266号；米国特許第5162227号；およびアポタンパク質をコードするＤＮＡを示す配列番号５〜１３；参照。またその一型はAQUALITEの名前でジョージア州ボガートの Sealite Sciences 社から購入できる］。
【０１９２】
アポエクオリンまたはその変種をコードするＤＮＡは多量のアポタンパク質を組換え生産するために有用である。この発光プロテインはルシフェルリンであるセレンテラジン、好ましくはその硫酸塩誘導体またはその類似体、および分子状酸素を添加して再構築される［たとえば米国特許第5023181号参照］。このアポタンパク質およびその他の発光プロテインおよび生物発光生成反応の構成成分は適当な条件下に発光プロテインを再生し、同時に発光プロテインに発光させるために混合することができる。再構築にはたとえばメルカプトエタノールのような還元剤の存在が必要であるが、以下に検討する通りに還元剤が不要なように設計された修正型ではこの点は当てはまらない［たとえば米国特許第5093240号参照］。
【０１９３】
本発明で使用するためにはエクオリンは、たとえば配列番号５〜１３に示し、当技術分野の熟練者に知られているようなＤＮＡまたはその修飾型のようなものを利用して製造するのが好ましい。エクオリンをコードするＤＮＡはたとえば E. coli のような宿主細胞中で発現し、分離し、再構築される［たとえば、米国特許第5418155号、米国特許第5292658号、米国特許第5360728号、米国特許第5422266号、米国特許第5162227号参照］。
【０１９４】
本発明で注目されるものは非修飾アポエクオリンよりも生物発光活性が高くなるように修飾された型のアポタンパク質である［たとえば、米国特許第5360728号、配列番号１０〜１２参照］。非修飾アポエクオリンよりも高い生物発光活性を示すように修飾された型にはアスパラギン酸１２４をセリンに、グルタミン酸１３５をセリンに、およびグリシン１２９をアラニンにおのおの置換した配列番号１０〜１２に示す配列を含むタンパク質を包含する。生物発光活性が増大したその他の修飾型も入手可能である。
【０１９５】
本発明のある態様で利用するためにはエクオリン生物発光発生系のアポタンパク質およびその他の構成成分は包装するかまたは混合物として提供され、所望な時にはアポタンパク質、ルシフェリンおよび酸素から発光プロテインが再構築される条件に付す［たとえば、米国特許第5023181号、および米国特許第5093240号参照］。再構築のためにはたとえば２−メルカプトエタノールのような還元剤を必要としない型のアポタンパク質は特に好適である。例えば米国特許第5093240号に記載されているこれらの型は例えばシステイン残基３個の１個またはそれ以上、好ましくは全部をセリンで置換することによって修飾されている［Tsuji et al.（1986） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：8107-8111 も参照］。置換はたとえば配列番号５に示すようなエクオリンアポタンパク質をコードするＤＮＡの修飾により、およびシステインコドンをセリンで置換することによって行ってもよい。
【０１９６】
たとえば Obelia のような関連する種からの発光プロテインおよびルシフェラーゼも本発明での利用が意図されている。ヒドロポリプである Obelia longissima から得られるＣａ2+−活性化発光プロテインであるオベリンをコードするＤＮＡは知られており、入手可能である［たとえば、Illarionov et al.（1995） Gene 153：273-274およびBondar et al.（1995） Biochim. Biophys. Acta 1231：29-32参照］。この発光プロテインはＭｎ2+によっても活性化できる［たとえばVysotski et al.（1995） Arch. Bioch. Biophys. 316：92-93；Vysotski et al.（1993） J. Biolumin. Chemilumin. 8：301-305参照］。
【０１９７】
本発明に利用するためには一般に生物発光の構成成分は反応を触発させるためには不十分な量の触発性金属イオンが存在するように包装するかまたは提供する。利用する時には痕跡量の金属イオン、殊にＣａ2+を他の構成成分と接触させる。さらに持続的な発光のためにはエクオリンを連続的に再構築するか、または添加するか、または大過剰に提供する、ことができる。
【０１９８】
(ｂ)ルシフェリン
エクオリンルシフェリンは、コエレンテラジンおよびその類似体であり、構造(式(Ｉ))を含む分子を含む：
【化１】
0004923068.tif 000006
[式中、Ｒ１は、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５またはＣＨ３であり、Ｒ２は、Ｃ６Ｈ５であり、そしてＲ３は、ｐ-Ｃ６Ｈ４ＯＨもしくはＣＨ３またはその活性を有する類似体である]。好ましいコエレンテラジンは、Ｒ１がｐ-ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨであり、Ｒ２がＣ６Ｈ５であり、そしてＲ３が既知の方法[例えば、Inouye et al., (1975) Jap. Chem. Soc., Chemistry Lttrs. pp 141-144;およびHart et al., (1979) Biochemistry 18: 2204-2210]により調製され得るｐ-Ｃ６Ｈ４ＯＨである構造を有する。好ましい類似体は、修飾されたものであり、それにより、得られた光のスペクトル周波数が他の周波数に変換する。
【０１９９】
好ましいコエレンテラジンは、構造(式(II))：
【化２】
0004923068.tif 000007
およびその硫酸類似体を有する。
【０２００】
他のコエレンテラジンは、式(Ｖ)：
【化３】
0004923068.tif 000008
を有する[Hart et al., (1979) Biochemistry 18: 2204-2210参照]。ルシフェラーゼ存在下、この誘導体を用いると、すべての光は、ピーク３９０ｎｍの紫外線内に含まれる。ＧＦＰの添加において、すべての放射光は、放射光が２００倍増加するピーク５０９ｎｍの可視範囲内に含まれる。４７０ｎｍカットオフフィルターを用い、ＧＦＰ非存在下の光生成では、約０であると観察され、ＧＦＰ存在下では、検出することができる。これにより、実施例に記述の免疫アッセイの基礎が提供される。
【０２０１】
結合酸素によりエクオリン発光タンパク質に結合するとき、およびＣａ２＋存在下、コエレンテラジンの反応は、以下のように示される：
【化４】
0004923068.tif 000009
【０２０２】
発光タンパク質エクオリン[それは、コエレンテレートルシフェリン分子に結合するアポエクオリンを含む]およびRenillaルシフェラーゼは、以下に考察するように、同じコエレンテレートルシフェリンを使用し得る。エクオリン発光タンパク質は、コエレンテレートルシフェリン[コエレンテラジン]をオキシルシフェリンに、青色[λｍａｘ＝４６９ｎｍ]の発光を伴う、酸化するのを触媒する。
【０２０３】
重要なことに、コエレンテレートルシフェリンの硫酸誘導体[ラウリルルシフェリン]は、特に水に安定であり、そのため、コエレンテレート様-生物発光性システムに用いられる。このシステムでは、アデノシン二リン酸(ＡＤＰ)およびサルファキナーゼを用い、コエレンテラジンを硫酸型に変換する。次いで、スルファターゼを用い、ラウリルルシフェリンを天然コエレンテラジンに再変換する。そのため、更に安定なラウリルルシフェリンを、照射すべきアイテムに用い、スルファターゼを合せたルシフェラーゼを、照射を望むときに、ルシフェリン混合物に加える。
【０２０４】
そのため、Aequoreaの生物発光性システムは、特に本明細書中の方法の使用に適する。特定の量および成分が提供される方法は、視覚化される腫瘍形成または特定組織の型に依存する。このシステムは、凍結乾燥され、Ｃａ２＋の添加により輝き出す。マイクロビーズのような微小担体に結合させ、溶液または懸濁液のような組成物として、好ましくは反応の誘発を防ぐ重要なキレート化剤の存在下、カプセル化し得る。エクオリン発光タンパク質の濃度は変化し、経験的に決定される。典型的濃度、少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌおよびそれ以上、を選択する。ある実施態様では、ルシフェラーゼ１００ｍｇあたり１-１０ｍｇルシフェリンを、選択した体積で使用し、望ましい濃度で用いる。
【０２０５】
ｃ．甲殻類、特にCyrpidinaシステム
Vargula serratta, hilgendorfiiおよびnoctilucaのような、甲皮類は、小さな海洋甲殻類であり、時折、海のホタルと呼ばれる。これら海のホタルは、日本の海岸から離れた海域で見られ、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを水中に噴出することにより、光を放ち、明るい青色の夜光雲を生ずる反応が起こる。当該反応は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび分子状酸素のみを含み、そのため、本明細書の適用に非常に適する。
【０２０６】
Vargula生物発光性システムのような、システムは、特に本明細書において好ましい。当該成分は、乾燥し、粉末状となっても室温で安定であり、そして汚染されているときでさえも、反応は継続する。更に、生物発光性反応は、１：４０ｐｐｂから１：１００ｐｐｂぐらい低い濃度のルシフェリン／ルシフェラーゼ成分のみを必要とし、水および分子状酸素が生ずる。排出システムはルシフェリンの添加により回復する。
【０２０７】
(１)Vargulaルシフェラーゼ
Vargulaルシフェラーゼは、水溶性であり、本明細書の方法の使用に好ましいものである。Vargulaルシフェラーゼは、５５５アミノ酸ポリペプチドからなり、Vargulaから単離され、また、組換え技術を用い、適当な細菌および哺乳類宿主細胞でＤＮＡを発現させることにより、作成する[例えば、Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6567-6571; Inouye et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9584-9587; Johnson et al. (1978) Methods in Enzymology LVII:331-349; Tsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57:364-72; Tsuji (1974) Biochemistry 13:5204-5209; Japanese Patent Application No. JP 3-30678 Osaka; および欧州特許出願番号 EP 0 387 355 A1]。
【０２０８】
(ａ)Cypridinaからの精製
Vargula [Cypridina]ルシフェラーゼを精製する方法は既知である。例えば、活性を有する粗抽出物は、Vargulaエビジャコを磨り潰すか、または破砕することにより容易に調製され得る。他の実施態様では、Cypridina hilgendorfiルシフェラーゼの製剤は、抽出用に０．５-５．０Ｍ塩、好ましくは０．５-２．０Ｍ塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、硫酸アンモニウムを含む蒸留水中に、０-３０℃、好ましくは０-１０℃で、１-４８時間、好ましくは１０-２４時間、保存した凍結C. hilgendorfiを浸し、その後、疎水性クロマトグラフィーし、次いでイオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーを行い、調製され得る[TORAY IND INC, １９９３年９月１４日付け日本国特許出願番号 JP 4258288; また他の方法としてTsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57:364-72参照]。
【０２０９】
(ｂ)組換え方法による調製
ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコード化するクローン化ＤＮＡ[欧州特許出願番号 0 387 355 A1; 国際PCT出願番号 WO 95/001542; また日本国特許出願番号 JP 3-30678 に記載の配列番号５およびThompson et al.  (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6567-6571参照]を発現し、ルシフェラーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡを、適当なベクターを用いE. coliに導入し、標準的な方法を用い単離する。
【０２１０】
(２) Vargulaルシフェリン
天然のルシフェリンは、式(III)：
【化５】
0004923068.tif 000010
の化合物のような置換イミダゾピライン核である。
【０２１１】
ルシフェリンは、抽出物を過熱し、ルシフェラーゼを破壊し、ルシフェリンは未処理のまま残すことにより、磨り潰した乾燥Vargulaから単離し得る[例えば、米国特許番号4,853,327参照]。
【０２１２】
光を生ずる反応においてルシフェラーゼと反応する、その類似体および他の化合物もまた使用し得る。
【０２１３】
Vargulaルシフェリンと反応し得るルシフェラーゼを有する他の生物発光性生物には、Apogon, Parapriacanthus および Porichthys属が含まれる。
【０２１４】
(３)反応
酸素との反応におけるルシフェリンは、ジオキシエタノン中間体(ホタル環状ペルオキシド分子中間体に類似する環状ペルオキシドを含む)を形成する。生物発光性反応の最終段階では、ペルオキシドは、崩壊し、ＣＯ２および励起カルボニルを生ずる。次いで、励起分子は、青色から青-緑の光を発する。
【０２１５】
反応の最適ｐＨは、約７である。本明細書の目的のために、反応が生ずる任意のｐＨを使用し得る。試薬の濃度は、通常分析反応に使用する濃度またはそれよりも高い濃度である[例えば、Thompson et al. (1990) Gene 96:257-262参照]。典型的なルシフェラーゼの濃度０．１と１０ｍｇ／ｌの間、好ましくは０．５から２．５ｍｇ／ｌを用いる。同様の濃度のルシフェリンおよびより高い濃度のルシフェリンを用い得る。
【０２１６】
ｄ．ホタル、コメツキムシ、および他の昆虫システムを含む昆虫生物発光性システム
ホタル生物発光の生化学は、特徴的な第一の生物発光性システムであり[例えば、Wienhausen et al. (1985) Photochemistry and Photobiology 42:609-611; McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in cell Physiology, Hayashi et al., eds. Prentice Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, pp. 63-80参照]、それは、商業的に利用できる[例えば、Promega Corporation, Madison, WI、例えば、Leach et al. (1986) Methods in Enzymology 133:51-70, esp. Table 1参照]。種々の種のホタルのルシフェラーゼは、抗原的に類似する。これらの種には、Photinus, Photurins および Luciola属のメンバーが含まれる。更に、生物発光反応は、２０℃よりも３０℃でより光を生じ、ルシフェラーゼは、少量のウシアルブミン血清により安定化し、当該反応は、トリシンにより緩衝され得る。
【０２１７】
(１)ルシフェラーゼ
種々の昆虫からのルシフェラーゼをコードするＤＮＡクローンおよび当該コード化ルシフェラーゼを生ずる使用は、既知である。例えば、Photinus pyralis、Luciola cruciata からのルシフェラーゼ[例えば de Wet et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7870-7873; de We et al. (1986) Methods in Enzymology 133:3; U.S. Patent No. 4,968,613参照、また配列番号３参照]をコードするＤＮＡクローンが利用できる。当該ＤＮＡはまた、Saccharomyces [例えば、１９８８年１２月２６日発行の日本国出願番号 JP 63317079、KIKKOMAN CORP]およびタバコ中で発現する。
【０２１８】
野生型ルシフェラーゼに加えて、修飾した昆虫ルシフェラーゼが調製された。例えば、ルシフェラーゼを生ずる熱安定性ルシフェラーゼ変異体、ＤＮＡコード化変異体、ベクターおよび形質転換細胞が利用できる。Photinus pyralis、Luciola mingrelica、L. cruciata または L. lateralisからのルシフェラーゼと６０％アミノ酸配列相同性を有し、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質が利用される[例えば、国際PCT出願番号WO 95/25798参照]。それは、３０℃を超える温度で、天然で生ずる昆虫ルシフェラーゼよりも安定であり、また３７℃またはそれ以上で、高い収量で、産生される。
【０２１９】
修飾されたルシフェラーゼは、種々の波長の光を生じ[天然のルシフェラーゼと比較したとき]、そのため、その色彩を生ずる特性が選択され得る。例えば、合成的変異体甲虫ルシフェラーゼ、および野生型ルシフェラーゼとは異なる波長の生物発光を生ずるルシフェラーゼをコードするＤＮＡが知られている[Promega Corp、国際PCT出願番号 WO 95/18853、それは、米国出願番号08/177,081に基く]。変異体甲虫ルシフェラーゼは、１つまたは２つの位置での置換により、相当する野生型Luciola cruciata [例えば、米国特許番号 5,182,202、5,219,737、5,352,598参照、また配列番号３参照]とは異なるアミノ酸配列を有する。変異体ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼにより生ずる場合とは少なくとも１ｎｍ異なるピーク密度の波長を有する生物発光を生ずる。
【０２２０】
他の変異体ルシフェラーゼを作成し得る。野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列を有すると共に、アミノ酸番号２３３でバリンがイソロイシンに置換し、２３９でバリンがイソロイシンで置換し、２８６でセリンがアスパラギンに置換し、３２６でグリシンがセリンに置換し、４３３でヒスチジンがチロシンに置換し、４５２でプロリンがセリンに置換した少なくとも１つの変異を有する変異体ルシフェラーゼが知られる[例えば、米国特許番号 5,219,737および 5,330,906参照]。ルシフェラーゼは、E. coli中に各変異体ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを発現し、タンパク質を単離することにより生ずる。これらルシフェラーゼは野生型とは異なる色の光を発する。変異体ルシフェラーゼは、ルシフェリンを触媒し、赤色[λ６０９ｎｍおよび６１２ｎｍ]、橙色[λ５９５および６０７ｎｍ]または緑[λ５５８ｎｍ]の光を生ずる。変異体ルシフェラーゼの他の物理的または化学的性質は、天然の野生型ルシフェラーゼと実質的に同一である。変異体ルシフェラーゼは、Ser 286をAsnで置換し、Gly 326をSerで置換し、His 433をTyrで置換し、またはPro 452をSerで置換する中から選択される置換(alernation)を有するLuciola cruciataルシフェラーゼのアミノ酸配列を有する。熱安定性ルシフェラーゼもまた利用される[例えば、米国特許番号 5,229,285参照; ３５４位のグルタミン酸をリシンで置換したPhotinus ルシフェラーゼおよび３５６のグルタミン酸をリシンで置換したLuciola ルシフェラーゼを提供する国際PCT出願番号 WO 95/25798も参照]。
【０２２１】
これら変異体ルシフェラーゼおよび野生型ルシフェラーゼを、特に、例えば、種々の色彩が望まれるとき、または高温での安定性が望まれるとき、本明細書のＧＦＰと組合せて用いることができる。
【０２２２】
(２)ルシフェリン
ホタルのルシフェリンはベンゾチアゾールである：
【化６】
0004923068.tif 000011
。
【０２２３】
このルシフェリンの類似体および合成ホタルルシフェリンは、当業者に既知である[例えば、米国特許番号5,374,534 および 5,098,828参照]。これらには、式(IV)が含まれる[米国特許番号5,098,828参照]：
【化７】
0004923068.tif 000012
[式中、Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、直鎖状または分枝状Ｃ１-Ｃ２０アルコキシ、Ｃ２-Ｃ２０アルキレンオキシ、α-アミノ基を介し結合するＬ-アミノ酸残基、末端単位のα-アミノ基を介し連結する１０までのＬ-アミノ酸単位を伴うオリゴペプチド基であり、
Ｒ２は、水素、Ｈ２ＰＯ３、非置換またはフェニル置換直鎖状または分枝状Ｃ１-Ｃ２０アルキルまたはＣ２-Ｃ２０アルケニル、６から１８の炭素原子を含むアリール、Ｒ３-Ｃ(Ｏ)-であり、そして、
Ｒ３は、非置換またはフェニル置換直鎖状または分枝状Ｃ１-Ｃ２０ある基るまたはＣ２-Ｃ２０アルケニル、６から１８までの炭素原子を含むアリール、１から３のリン酸基を有するヌクレオチド基、またはグリコシド化的に結合したモノ-またはジサッカライドである。ただし、式(IV)がＤ-ルシフェリンまたはＤ-ルシフェリンメチルエステルのときである。]
【０２２４】
修飾して、周波数が変化した光を生ずる修飾ルシフェリンは当業者に既知である。
【０２２５】
(３)反応
ホタルルシフェラーゼおよび関連の昆虫のルシフェラーゼにより触媒される反応には、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および分子状酸素が必要とされる。ルシフェリンを外来的に添加しなければならない。ホタルルシフェリンは、ホタルルシフェリン活性を触媒し、その後の段階により励起産物が生ずる。ルシフェリンは、ＡＴＰと反応し、アデニル酸ルシフェリル中間体を形成する。次いで、この中間体を酸素と反応させ、コエレンテレート中間体環状ペルオキシドに類似する環状ルシフェリルペルオキシ種を形成させる。それは、崩壊すると、ＣＯ２および励起状態のカルボニル産物を生成する。次いで、励起分子は、黄色の光を放射するが、その色は、ｐＨの機能である。ｐＨが低いとき、生物発光の色は、黄-緑色から赤色に変化する。
【０２２６】
様々な種のホタルが、様々な色の生物発光を放射し、当該反応の色は、ルシフェラーゼが得られる種に依存する。加えて、当該反応は、ｐＨ７．８で最適化される。
【０２２７】
ＡＴＰおよびルシフェリンを、用い尽くされる反応に添加することにより、更なる光の放射が生ずる。そのため、一旦確立すると、当該システムは、比較的、容易に維持される。そのため、発光の維持が望まれる本明細書の実施態様での使用に相当適する。
【０２２８】
ｅ．細菌性システム
発光性の細菌は、典型的に継続的に光を放射し、通常、青-緑色である。強力に発現するとき、単一の細菌は、秒あたり１０４から１０５の光子を放射し得る。細菌性生物発光システムには、他に、Photobacterium、Vibrio および Xenorhabdus属の生物発光性種において見られるシステムが含まれる。これらのシステムはよく知られており、十分特徴付けられている[例えば、Baldwin et al. (1984) Biochemistry 23:3663-3667; Nicoli et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:2393-2396; Welches et al. (1981) Biochemistry 20:512-517;  Engebrecht et al. (1986) Methods in Enzymology 133:83-99; Frackman et al. (1990) J. of Bacteriology 172:5767-5773;  Miyamoto et al. (1986) Methods in Enzymology 133:70; 米国特許番号 4,581,335参照]。
【０２２９】
(１)ルシフェラーゼ
Vibrio harveyi [EC 1.14.14.3、アルカノール還元ＦＭＮ酸素オキシドレダクターゼ１-ヒドロキシル化、ルミネシング]から誘導されるルシフェラーゼにより例示されるように、細菌性ルシフェラーゼは、混合機能オキシダーゼであり、２種のサブユニットαおよびβの会合により形成される。α-サブユニットは、明らかに約４２，０００ｋＤの分子量を有し、β-サブユニットは、明らかに約３７，０００ｋＤの分子量を有する[例えば、Cohn et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:102-123参照]。これらのサブユニットは会合し、２-鎖複合ルシフェラーゼ酵素を形成し、Vibrio harveyi [米国特許番号 4,581,335; Belas et al. (1982) Science 218:791-793]、Vibrio fischeri [Engebrecht et al. (1983) Cell 32:773-781; Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:4154-4158]および他の海洋性細菌のような生物発光性細菌の光放射反応を触媒する。
【０２３０】
細菌性ルシフェラーゼ遺伝子はクローニングされている[例えば、米国特許番号 5,221,623; 米国特許番号 4,581,335; 欧州特許出願番号 EP 386 691 A]。Vibrio harveyiのような、細菌性ルシフェラーゼを発現するプラスミドには、pFIT001 (NRRL B-18080)、pPALE001 (NRRL B-18082)が含まれ、pMR19 (NRRL B-18081)]が知られる。例えば、Vibiro fisheriの全luxレギュロンの配列が決定された[Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23:3663-3667; Baldwin et al. (1981) Biochem. 20: 512-517; Baldwin et al. (1984) Biochem. 233663-3667; また、例えば、米国特許番号 5,196,318, 5,221,623、および 4,581,335参照]。このレギュロンには、オートインデューサー合成に必要なタンパク質をコードする[例えば、Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:4154-4158参照]luxI遺伝子、アルデヒド基質をルシフェラーゼに提供する酵素をコードするluxC、 luxD および luxE遺伝子、ならびにルシフェラーゼのαおよびβサブユニットをコードするluxA および luxB 遺伝子が含まれる。
【０２３１】
他の細菌由来のｌｕｘ遺伝子もまたクローニングされており、利用できる[例えば、Vibrio harveyi 由来のluxA および luxB 遺伝子の融合を提供するCohn et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:6139-6146参照]。そのため、ルシフェラーゼαおよびβサブユニットをコードするＤＮＡを提供し、ルシフェラーゼの生成に使用し得る。α[1065bp]およびβ[984bp]サブユニットをコードするＤＮＡ、2124bpのルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ、αおよびβサブユニットをコードするＤＮＡ、両方のサブユニットをコードするＤＮＡを含む組換え体ベクターおよび発現するための形質転換体E. coliおよび他の細菌性宿主およびコード化ルシフェラーゼの産生が利用可能である。
【０２３２】
(２)ルシフェリン
細菌性ルシフェリンには、
【化８】
0004923068.tif 000013
が含まれる[式中、還元フラビンモノヌクレオチドを伴うテトラデカナールがルシフェリンとみなされる。両方が光放射反応の間に酸化されるからである]。
【０２３３】
(３)反応
還元フラビンに加えて、細菌システムは、生物発光性反応の完了には５つのポリペプチドを必要とする：細菌性ルシフェリンの２つのサブユニット、αおよびβおよび３ユニットの脂肪酸レダクターゼシステム複合体、それらにより、テトラデカーナルアルデヒドを提供する。本明細書で提供する装置および方法に有用な細菌性生物発光システムの例には、Vibrio fisheri および Vibrio harveyiから誘導されるものも含まれる。このシステムんも１つの利点は、低温での操作能である；ある外科的手法が体を低温にして行われる。
【０２３４】
細菌性ルシフェラーゼは、長鎖のアルデヒドのフラビン仲介加水分解を触媒し、カルボン酸および励起フラビンを生ずる；フラビンは、青緑色の光の付随放射を伴う基準状態に減衰する[λｍａｘ＝４９０ｎｍ；例えば、Legocki et al.  (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:9080参照;米国特許番号 5,196,524参照]。
【化９】
0004923068.tif 000014
【０２３５】
当該反応は、還元フラビンモノヌクレオチド[ＦＭＮＨ２]を、細菌性ルシフェラーゼ、酸素および長鎖アルデヒド、通常ｎ-デシルアルデヒドの混合物と接触させることにより開始し得る。
【０２３６】
蛍光性細菌Alteromonas hanedai 由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡが知られている[CHISSO CORP;また、１９９５年８月２２日発行の日本国特許出願番号JP 7222590]。還元フラビンモノヌクレオチド[ＦＭＮＨ２；ルシフェリン]を、細菌性ルシフェラーゼの存在下、酸素と反応させ、中間体ペルオキシフラビンを生成する。この中間体は、長鎖アルデヒド[テトラデカナール]と反応し、酸および励起状態のルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンを形成する。次いで、当該励起ルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンは、光を放射し、酸化フラビンモノヌクレオチド[ＦＭＮ]としてルシフェラーゼおよび水から解離される。インビトロＦＭＮは再び還元され、再利用され、アルデヒドが酸から生ずる。
【０２３７】
フラビンレダクターゼをクローニングした[例えば、米国特許番号5,484,723; この特許の典型的配列の配列番号１４参照]。これらおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈは、反応に含まれ、細菌性ルシフェラーゼおよび長鎖アルデヒドによる反応用のＦＭＮＨ２を再度生ずる反応に含まれる。フラビンレダクターゼは、ルシフェラーゼ反応であるＦＭＮによるＦＭＮＨ２への反応を触媒し、そのため、ルシフェラーゼおよびレダクターゼが当該反応システムに含まれるならば、生物発光性反応を維持することができる。すなわち、細菌性ルシフェラーゼが何度も回るため、長鎖アルデヒドが反応システム中に存在する限り生物発光は続く。
【０２３８】
生物発光性細菌により生ずる光の色は、生物発光反応におけるタンパク質青-蛍光タンパク質[ＢＦＰ]の関与の結果でもある。よく知られたこのタンパク質[例えば、Lee et al. (1978) Methods in Enzymology LVII:226-234参照]はまた、色彩のシフトの要因となるため、細菌性生物発光性反応に加えられる。
【０２３９】
ｆ．他のシステム
(１) 渦鞭毛藻類の、生物発光を生ずるシステム
渦鞭毛藻類では、生物発光は、シンチロン(scintillon)と名付けられたオルガネラで生ずる。これらオルガネラにより、細胞質から細胞液胞中へ膨出する。シンチロンは、渦鞭毛藻類のルシフェラーゼおよびルシフェリン[その結合タンパク質を伴う]のみを含み、他の細胞質成分はある程度除かれる。渦鞭毛藻類のルシフェリンは、クロロフィル：
【化１０】
0004923068.tif 000015
またはその類似体に関係するテトラピロールである。
【０２４０】
ルシフェリンは、ｐＨ６．５で活性があるが、ｐＨ８では不活性である１３５ｋＤ単一鎖タンパク質である[例えば、Hastings (1981) Bioluminescence and Chemiluminescence, DeLuca et al., eds. Academic Press, NY, pp.343-360参照]。発光活性は、ｐＨ８で生成した抽出物において、ｐＨを８から６に単にシフトすることにより、得られる。これは、可溶化中および微粒子画分中で生ずる。未処理シンチロン内では、発光性のフラッシュは、〜１００ミリ秒生じ、インビボでのフラッシュ時間である。溶液中では、その動力学は、すべての酵素性反応と同様、希釈に依存する。ｐＨ８では、ルシフェリンは、ルシフェリンとルシフェラーゼとの反応を防止するタンパク質[ルシフェリン結合タンパク質]に結合する。しかし、ｐＨ６では、ルシフェリンは、放出され、自由に酵素と反応する。
【０２４１】
(２)LatiaおよびPholasのような軟体動物類由来のシステム
軟体動物Latia neritoidesおよびPholas種は、生物発光性動物である。ルシフェリンは、構造：
【化１１】
0004923068.tif 000016
を有し、合成される[例えば、 Shimomura et al. (1968) Biochemistry 7:1734-1738; Shimomura et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:2086-2089参照]。ルシフェラーゼおよびルシフェリンの他に、当該反応は、第３の成分、“パープルプロテイン(purple protein)”を有する。外来性還元剤により開始され得る当該反応は、以下の概要により表される：
【化１２】
0004923068.tif 000017
ＸＨ２は還元剤である。
【０２４２】
そのため、本明細書での実施の場合、当該反応は、還元剤同様パープルプロテインを必要とする。
【０２４３】
(３)ミミズおよび他の環形動物
Diplocardia longa、Chaetopterus および Harmothoeのようなミミズ種は、生物発光を示す。当該ルシフェリンは、構造：
【化１３】
0004923068.tif 000018
を有する。
【０２４４】
当該反応は、ルシフェリンおよびルシフェラーゼに加えて、過酸化水素を必要とする。ルシフェラーゼは発光タンパク質である。
【０２４５】
(４)発光ミミズ
グレートブリテンで、およびオーストラリアおよびニュージーランドの穴で見つかった発光ミミズ由来のルシフェラーゼ／ルシフェリンもまた本明細書の目的である。
【０２４６】
(５)海洋性多毛類蠕虫システム
Phyxotrix および Chaetopterusのような海洋性多毛類蠕虫の生物発光を生ずるシステムも本明細書での使用を考慮する。
【０２４７】
(６)南アメリカレールウェイビートル
南アメリカレールウェイビートル由来の生物発光を生ずるシステムもまた本明細書の目的とする。
【０２４８】
(７)魚
本明細書の目的は、ルシフェラーゼおよび赤色の光を生ずる生物発光を生ずるシステムである。これらには、A. scintillansのようなAristostomias[例えば、O'Day et al. (1974) Vision Res. 14:545-550参照]、Pachystomias、M. niger のようなMalacosteusが含まれる。
【０２４９】
青／緑放射体には、cyclthone、ハダカイワシ、hatchet fish(agyropelecus)、vinciguerria、howella、florenciella、およびChauliodusが含まれる。
【０２５０】
ｇ．蛍光タンパク質
AequoreaおよびウミシイタケRenilla reniformisのＧＦＰは同じ発色団を共有し、また、エクオレア(Aequorea)ＧＦＰは３９５ｎｍおよび４７５ｎｍの２つの吸収ピークを有するが、RenillaＧＦＰは、４９８ｎｍの単一の吸収ピークを有し、エクオレアタンパク質の主要３９５ｎｍピークよりも約５．５倍大きなモノマーの消衰係数である[Ward, W. W. in Biohtminescence and Chemiluminescence (eds. DeLuca, M. A. & McElroy, W. D.) 235-242 (Academic Press, New York, 1981)]。中性ｐＨでの単離発色団および変性タンパク質のスペクトルは、何れかの天然タンパク質とも一致しない[Cody, C. W. et al. (1993) Biochemistry 32:1212-1218]。
【０２５１】
(１)緑および青蛍光タンパク質
本明細書に記載のように、青色の光は、Ｃａ２＋およびコエレンテラジンルシフェリンまたはその類似体の存在下、RenillaルシフェラーゼまたはAequorea発光タンパク質を用い、生ずる。この光は、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を反応に加えるならば、緑の光に変換され得る。精製され[例えば、Prasher et al. (1992) Gene 111:229-233参照]、またクローニングされた[例えば、米国出願番号08/119,678および米国特許出願番号 08/192,274を基礎とする国際PCT出願番号WO 95/07463、それらは引用によりこの文書に加える]緑色蛍光タンパク質を、刺胞動物によるエネルギー転移アクセプターとして使用する。ＧＦＰは、ルシフェラーゼオキシルシフェリン励起状態複合体またはＣａ２＋活性化発光タンパク質から得られるエネルギーにおいてインビトロで蛍光を発する。発色団をポリペプチドのアミノ酸残基に修飾する。最も特徴的なＧＦＰは、Aequorea および Renilla のものである[例えば、Prasher et al. (1992) Gene 111:229-233; Hart, et al. (1979)Biochemistry 18:2204-2210参照]。例えば、Aequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質[ＧＦＰ]は、２３８アミノ酸を含み、青色の光を吸収し、そして緑色の光を放射する。そのため、このタンパク質が、コエレンテラジンおよび酸素により電荷を帯びたエクオリン発光タンパク質を含む組成物中に含まれると、カルシウム存在下、緑色の光を生ずる。そのため、ＧＦＰは、生ずる生物発光の色を促進または変化させるため、エクオリンまたはRenillaルシフェラーゼまたは他の適当なルシフェラーゼを用いる、生物発光を生ずる反応に含まれ得る。
【０２５２】
ＧＦＰは、青色の光により活性化され、緑色の光を放射し、そのため、本明細書に記載のように、ルシフェラーゼ非存在下、および新規アイテムで、外的光源と共に、使用され得る。同様に、Vibrio fischeri、Vibrio harveyi または Photobacterium phosphoreum由来のもののような青色の蛍光タンパク質(ＢＦＰ)もまた、青色の光を生ずる適当な波長の外的光源と共に使用され得る(例えば、Karatani, et al., "A blue fluorescent protein from a yellow-emitting luminous bacterium," Photochem. Photobiol. 55(2):293-299 (1992); Lee, et al., "Purification of a blue-fluorescent protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum" Methods Enzymol. (Biolumin. Chemilumin.) 57:226-234 (1978); および Gast, et al. "Separation of a blue fluorescence protein from bacterial luciferase" Biochem. Biophys. Res. Commun. 80(1):14-21 (1978)参照、本明細書で引用するそれぞれの参考文献としてを引用によりこの文書に加える)。特に、ＧＦＰおよび／またはＢＦＰまたは他のその蛍光タンパク質を、本明細書で提供の飲料および／または食物の組合せに使用し、蛍光タンパク質から蛍光を生ずる適当な波長の光で空間を照らす。
【０２５３】
ＧＦＰおよび／またはＢＦＰまたは他の蛍光タンパク質を、飲料および泡形成玩具、特に泡形成組成物または混合物を含む玩具のような、本明細書で提供する任意の新規アイテムおよび組合せに使用する。また特定の目的には、化粧、特に顔料(face paint)または化粧品、髪の毛の染料または髪の毛のコンディショナー、ムースまたは他の製品中でのこれらタンパク質の使用がある。そのシステムは、ルシフェラーゼが発光タンパク質の活性化に必要ではなく、当該タンパク質に毒性がなく、安全に皮膚、髪、目に適用でき、摂取できるのため、特に興味が惹かれる。これら蛍光タンパク質がまた、生物発光を生ずるシステムに加えて、使用され、種々の色のアレイを促進するか、または作成する。
【０２５４】
これらタンパク質は、単独でまたは生物発光を生ずるシステムと組合せて使用され、色のアレイが作成される。それらは、例えば飲料の色が経時的に変化するか、または種々の色の層を含むため、組合せで使用される。
【０２５５】
(２)フィコビリンタンパク質
フィコビリンタンパク質は、シアノバクテリアおよび真核性藻類から得られた水溶性蛍光タンパク質である[例えば、Apt et al. (1995) J. Mol. Biol. 238:79-96; Glazer (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36:173-198; および Fairchild et al. (1994) J. of Biol. Chem. 269:8686-8694参照]。これらタンパク質は、免疫アッセイにおいて蛍光標識として使用され[Kronick (1986) J. of Immunolog. Meth. 92:1-13参照]、当該タンパク質は単離され、それらをコード化するＤＮＡをも利用できる[例えば、Pilot et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6983-6987; Lui et al. (1993) Plant Physiol 103:293-294; および Houmard et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5512-5521参照; 当該タンパク質は、例えば、ProZyme, Inc.、San Leandro, CAから商業的に利用可能である]。
【０２５６】
これらの生物では、フィコビリンタンパク質は、フィコビリソームと名付けられた細胞よりも小さい構造で配置され、光合成反応において、可視光を吸収し、直接のエネルギー転移機構を介して誘導エネルギーをクロロフィルに転移することにより関与する付随色素として機能する。
【０２５７】
２つのクラスのフィコビリンタンパク質が、その色彩に基づいて知られる：フィコエリトリン(赤色)およびフィコシアニン(青色)であり、それらは、それぞれ最大４９０から５７０ｎｍの間および６１０から６６５ｎｍの間の吸収があると報告されている。フィコエリトリンおよびフィコシアニンは、１つまたはそれ以上のクラスの直鎖状テトラピロール発色団が共有結合する種々の割合のアルファおよびベータモノマーからなる異種性複合体である。特に、フィコビリンタンパク質には、(αΒ)６凝集タンパク質をしばしば付随する第三のγ-サブユニットも含まれる。
【０２５８】
すべてのフィコビリンタンパク質には、フィコトロンビィンまたはフィコエリトビリン発色団の何れかが含まれ、また、他のビリン(bilin)フィコウロビリン、クリプトビオリンまたは６９７ｎｍビリンを含む。γ-サブユニットは、Ｂ-およびＲ-フィコウロビリンの４９５-５００ｎｍ吸収ピークを生ずるフィコウロビリンと共有結合する。そのため、フィコビリンタンパク質のスペクトル特性は、種々の発色団、アポフィコビリンタンパク質のサブユニット組成物および／またはフィコビリンタンパク質の三次および四次構造に影響する局所環境の組合せにより影響を受ける。
【０２５９】
ＧＦＰおよびＢＦＰについて上述したように、フィコビリンタンパク質は、また、適当な波長の可視光により活性化され、そのため、ルシフェラーゼ非存在下、そして外的光源と共に使用して、本明細書に記載のような新生物および特に組織を発光させる。更に、フィコビリンタンパク質による固体支持体マトリクスへの結合が知られる。(例えば、米国特許番号4,714,682; 4,767,206; 4,774,189 および 4,867,908参照)。上記のとおり、これらタンパク質は、他の蛍光タンパク質および／または生物発光を生ずるシステムと共に使用し、色彩のアレイを生じるか、または経時的に種々の色彩を生ずる。
【０２６０】
上記のとおり、フィコビリンタンパク質による固体支持体マトリクスへの結合が知られている(例えば、米国特許番号4,714,682; 4,767,206; 4,774,189 および 4,867,908参照)。そのため、フィコビリンタンパク質は、生物発光反応、好ましくは生物発光反応から生ずる光の波長を変換するルシフェラーゼの反応の１つまたはそれ以上の成分と結合して微小担体に結合し得る。１つまたはそれ以上のフィコビリンタンパク質に結合する微小担体は、本明細書に提供される任意の方法に使用され得る。
【０２６１】
青色または緑色の光をより長い波長の光、すなわち、赤色または近赤外に変換することは、本明細書に記載のように、腹腔鏡またはコンピューター断層画像化システムを用いる新生物または特に組織の可視化に特に好ましい。
【０２６２】
そのため、放射光の周波数の変化が望まれるとき、フィコビリンタンパク質は、生物発光を生ずる成分中に含まれ得る。
【０２６３】
Ｃ．ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードする核酸の単離および同定
２つの新規緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)および３つのコエレンテラジン使用のルシフェラーゼを含む核酸生物発光タンパク質を提供する。多くの提供、好ましくは分析適用におけるコエレンテラジン使用のルシフェラーゼの利点は、光放射ルシフェリンおよび分子状酸素を必要とし、ＡＴＰまたはＣａ＋＋のような補因子は必要とされないことである。
【０２６４】
これらルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードする核酸をまた使用し、関連種族の関連核酸を単離する。また本明細書では、ルシフェラーゼをコード化する付加遺伝子を単離する方法および、好ましくは、これまでは単離が困難とされてきた関連種族のＧＦＰを単離する方法も提供する。
【０２６５】
Renilla mulleri、Pleuromamma、Gaussia および Ptilosarcus由来のルシフェラーゼをコードする核酸が単離された。これら核酸を、プラスミドおよび発現ベクター中に、および適当な宿主細胞に導入し、または導入し得る。当該宿主細胞を用い、および用い得、本明細書に記載のまたは当業者に既知の任意の適用に使用し得るコード化タンパク質を生成する。
【０２６６】
クローニングしたＤＮＡフラグメントは、細菌性細胞、好ましくはE. coli中で複製可能である。好ましいＤＮＡフラグメントはまた、細菌性複製起点を含み、細菌の世代から世代へＤＮＡフラグメントを維持する。この方法では、多量のＤＮＡフラグメントが細菌中で複製により生じ得る。好ましい細菌の複製起点は、f1-ori および col E1複製起点が含まれるが、これらに限らない。好ましい宿主には、lacUVプロモーターのような誘導プロモーターに操作しやすいように連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染色体コピーを含む(米国特許番号4,952,496参照)。その宿主には、溶原菌E. coli 株 HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)およびBL21(DE3)が含まれるが、これらに限らない。株BL21(DE3)が好ましい。pLys株は、低レベルのＴ７リソチーム、天然のＴ７ＲＮＡポリメラーゼインヒビターを提供する。温度感受性ムテインのようなムテイン(mutuein)の発現および製造のために、真核性細胞、とりわけSaccharomyces のような酵母細胞が好ましい。
【０２６７】
ルシフェラーゼおよびＧＦＰの融合タンパク質も提供する。それらを使用する方法も提供する。
【０２６８】
当該方法は、Renilla および Gaussia の核酸およびタンパク質に関して記載する。同様の方法を用い、本明細書で提供のPtilosarcus および Pleuromamma 核酸およびタンパク質を同定し、単離する。
【０２６９】
Renilla mullereiからクローニングしたＧＦＰは、非常に有用となるスペクトル特性を有する。これらの特性には、非常に高い量子効率、高いモル吸収および一般に利用可能な蛍光フィルターの効果的な使用が含まれる(例えば、Chromaにより販売されているEndo GFPフィルターセット)。Renilla reniformis GFPは、モルに基づくと、野生型のAequorea GFPよりも６倍明るく、最も明るい変異体よりも３倍から４倍明るいことが知られている。本明細書で提供される核酸クローンによりコードされるRenilla mulerei GFPは、同様の機能特性を有し、当該スペクトルは、天然のreniformis GFP由来のものと同一であると思われる。
【０２７０】
励起および放射曲線型に基づくと、本明細書で提供されるPtilosarcus GFPは、R. mullerei GFPのものよりも高いモル吸収を有し、より明るくなる。
【０２７１】
Guassia および Pleuromamma ルシフェラーゼは、クローン化された最初の２つのカイアシ類のルシフェラーゼである；両方とも排出され、そして、分泌タンパク質の効果的マーカーとなる。Guassia ルシフェラーゼは、これまでに見つけられた最も小さなルシフェラーゼである(MW 19,900)。全てのルシフェラーゼは、コエレンテラジンを使用するルシフェラーゼの典型的出力スペクトルを示す。全て、陽イオン濃度に強力に依存するが、二価陽イオンを必要としない(データ示さず)。当該ルシフェラーゼでは、他の種から単離されるルシフェラーゼとは有意な相同性が全くない。
【０２７２】
しかし、PtilosarcusＧＦＰとR. mulleriＧＦＰとの間にはかなりの相同性（−８０％）があるが、A. victoriaＧＦＰとの間には少し（−２５％）しかない。それにもかかわらず、３種の蛋白質は全て長さが２３８ＡＡであり、このことは３種の蛋白質全ての構造が類似していることを示唆する。Aequorea victoria、Renilla mullereiおよびPtilosarcusから単離したＧＦＰ類間の配列の比較から、R. mullereiおよびPtilisarcusの染色体配列は同一であり、A. victoriaからのものと異なっていることが明らかになる。これらの配列の相違は、基本的蛍光特性に影響を与えることなく修飾されうる蛋白質部位を指示するとともに、これらの特性を変える残基を同定する手段を提供する。
【０２７３】
Gaussiaルシフェラーゼを暗号化している核酸の単離および同定
１．Gaussia属試料の単離
Gaussiaの試料は、メキシコ湾、太平洋および大西洋を含む世界の大洋から容易に入手できる。例示した核酸の単離のために本書中で使用した種は、サンペドロおよびサンクレメンテ湾内において南カリフォルニア沿岸を離れた太平洋から単離した。生物は、大洋水の試料を暗所でふるいにかけて光を発するとう脚類を選別することにより同定する。捕獲後、試料は充分洗浄し、発光組織を濃厚化するため切断してもよい。ついで生物体全部または切断した組織を急速冷凍し、液体窒素中に保存する。
【０２７４】
下記の実施例に詳述するように、Gaussiaルシフェラーゼ（例えば、配列番号１９参照）を暗号化している核酸の単離源としては、Gaussia全体を使用した。
【０２７５】
２．GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類の調製
GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類は、本書中に記載した方法にしたがって、またはその他の当業者に既知の方法（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.; U.S.Patent No. 5,292,658参照）により、インタクトなＲＮＡから調製することができる。
【０２７６】
典型的には、ｃＤＮＡライブラリー類の調製は、選択した生物体からのポリアデニル化ＲＮＡの単離と、次いで逆転写酵素を使用した１本鎖ＤＮＡの合成、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の消化、続いて１本鎖ＤＮＡから２本鎖ＤＮＡへの変換を含む。
【０２７７】
ａ．ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
GaussiaのｃＤＮＡ調製のための総細胞質ＲＮＡ源としてGaussia全体を使用した。総インタクトＲＮＡは、当業者に周知の標準的技術（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.参照）を用いて単離することができる。総細胞ＲＮＡを単離後、ポリアデニル化ＲＮＡ分子種は、オリゴデオキシチミジレートセルロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーを用いて（例えば、Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408記載のように）容易に非ポリアデニル化分子種から分離される。
【０２７８】
次いで、精製したGaussia polyA−ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成反応に付して、総polyA−ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成させる。要約すると、逆転写酵素を使用して、アニールしたpolydTプライマーを伸張しＲＮＡ／ＤＮＡ２重体を生成させる。次いでＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ鎖を消化し、第２鎖合成後、ｃＤＮＡ分子をＳ１ヌクレアーゼまたはその他の適当なヌクレアーゼで平滑末端化する。得られる２本鎖ｃＤＮＡ断片は適当な発現ベクターに直接ライゲートすることができ、また別法として、制限エンドヌクレアーゼ部位を暗号化しているオリゴヌクレオチドリンカーをｃＤＮＡ分子の５’−末端にライゲートしてｃＤＮＡ断片のクローニングを容易にすることができる。
【０２７９】
ｂ．ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築
ｃＤＮＡ発現ライブラリー類構築のための最良の確認ベクターはラムダベクター類である。ラムダベースのベクターは約１２ｋｂのｃＤＮＡインサート類に耐え、標準的プラスミドベクター類に比較してライブラリーのスクリーニング、増幅および保存により大きな便宜をもたらす。GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類（および本書中のその他のライブラリー類）調製に現在好ましいベクターは、当業者に既知（例えば、U.S.Pat.No. 5,128,256参照）で市販（Stratagene, La Jolla, CA）されているLambda、Uni-Zap、Lambda-Zap IIまたはLambda-ZAP Express/EcoRI/XhoIベクター類である。
【０２８０】
一般に、Lambda-ZAPベクター類は、バクテリオファージラムダベクター系の高い効率とプラスミド系の融通性を結びつけている。これらのベクター類中にクローンされた断片は、ヘルパーファージを用いて自動的に切断され再環状化されてサブクローンをｐＢＫ由来ファージミド中に生成する。ｐＢＫファージミドは、細菌中での選択用アンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰＲ）および真核細胞中での選択用Ｇ４１８を担持し、またβ−ラクタマーゼ耐性遺伝子を含んでいてもよい。組換えポリペプチドの発現は、細菌のlacZプロモーターおよび真核生物のＣＭＶプロモーターに制御されている。
【０２８１】
さらに具体的に述べると、これらのラムダベースベクター類は、プラスミド系、例えばバクテリオファージラムダの右および左アームのブラケットをつけた周知のｐＢＫブルースクリプト誘導体（Stratageneから入手できる）を含有するイニシエーター・ターミネーターカセットから構成される。ラムダのアームは、複製したＤＮＡの効率的なパッケージングを可能にし、他方切断できるイニシエーター・ターミネーターカセットは、ｃＤＮＡ断片の容易なクローニングおよびプラスミドライブラリー生成を、追加的なサブクローニングなしで可能とする。
【０２８２】
本書中で使用する場合、ｃＤＮＡ断片類は、Lambda-Zapベクターのイニシエーター・ターミネーターカセットに含まれる多重クローニング部位に挿入されて１セットのｃＤＮＡ発現ベクターを作り出す。ｃＤＮＡ発現ベクターのセットは、適当なE. coli細胞に感染させ、次いで糸状ヘルパーファージを同時感染させる。細胞内では、ヘルパーファージにより暗号化されたトランスに作用する蛋白質、例えばM１３の遺伝子ＩＩ蛋白質が、ベクターのラムダアーム内に位置する２個の別のドメインを認識し、イニシエーター・ターミネーターカセットに隣接する１本鎖ニックを導入する。続くＤＮＡ合成期後、存在するニック鎖を置換する新規なＤＮＡ鎖が合成され、イニシエーター・ターミネーターカセットを遊離させる。置換された鎖は次いで環状化され、ヘルパー蛋白質により糸状ファージとしてパッケージされ、細胞から排出される。ｃＤＮＡを含有するＢＫプラスミドは、E. coliのＦ’株に感染させ、感染した細胞をｐＢＫ含有細胞選択用アンピシリン補足固体培地で培養することにより回収される。
【０２８３】
GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリーは、当業者に知られた種々の方法を用いてスクリーニングされる。例えば、Gaussiaルシフェラーゼの同定は、青色光の発光について肉眼でコロニーを観察することによる、または一種もしくはそれ以上の帯域通過フィルターを用いて発光を観察することによる、機能的スクリーニング法によって達成できる。
【０２８４】
３．Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡの同定と単離
Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡは、本書中に記載した方法を用いて、または当業者に既知のその他の方法を用いて、単離することができる。下記に詳述するように、Gaussia A Uni-ZapのｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリーを調製し、コンピーテントなE. coli細胞に形質転換し、背景蛍光を吸収するようにカーボンブラックを含有する改良Ｌ−ブロスプレートで培養した（例えば、実施例参照）。
【０２８５】
形質転換体にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド：et al. Nakamura et al. (1979) Cell 18:1109-1117参照）含有溶液を噴霧して異種ＤＮＡからの組換えGaussiaルシフェラーゼの発現を誘導した。その他の誘導系を使用してもよい。好ましいプロモーター発現領域は、E. coli中で誘導および機能可能なものまたはウイルス起源ベクターの初期遺伝子である。適当な誘導可能プロモーター類およびプロモーター領域類の例には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：et al. Nakamura et al. (1979) Cell 18:1109-1117参照）に応答するE. coliのlacオペレーター；重金属（例えば、亜鉛）誘導に応答するメタロチオネインプロモーターの金属調節エレメント類（例えば、Evans et al. U.S.Patent No. 4,870,009参照）；ＩＰＴＧに応答するファージＴ７のlacプロモーター（例えば、U.S.Patent No. 4,952,496およびStudier et al. (1990) Meth. Enzymol. 185:60-89参照）およびＴＡＣプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。その他のプロモーターとしては、Ｔ７ファージプロモーターおよびＴ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターのようなＴ７様ファージプロモーター類、trp、lppおよびE. coliからのlacUV5のようなlacプロモーター類；Ｐ１０またはバキュロウイルス／昆虫細胞発現系類の多角体遺伝子プロモーター（例えば、U.S.Patent Nos. 5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,041、5,169,784参照）およびその他の真核生物発現系からの誘導可能なプロモーター類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２８６】
特に好ましいE. coli細胞の形質転換用プラスミドには、pET発現ベクター類（U.S.Patent No. 4,952,496参照；NOVAGEN, Madison, WIから入手可能；また系を記載したNovagen発行の文献参照）が含まれる。このようなプラスミド類には、pET34（図１参照）、Ｔ７のlacプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導可能なE. coliのlacオペレーターおよびリプレッサー遺伝子を含有するpET11a；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよびE. coliのompT分泌シグナルを含有するpET12a-c；Hisカラムによる精製に使用するためのHis-Tag（商標）リーダー配列およびカラムによる精製後に開裂を可能にするトロンビン開裂部位を含有するpET15b（NOVAGEN, Madison, WI）；Ｔ７lacプロモーター領域およびＴ７ターミネーターが含まれる。プラスミドpET34は、精製を補助するためにさらにＣＢＤを含む。
【０２８７】
特に好ましいE. coli細胞の形質転換用プラスミドには、pET発現ベクター類（U.S.Patent No. 4,952,496参照；NOVAGEN, Madison, WIから入手可能）が含まれる。例えば、プラスミドpET34-LICは、バクテリオファージのＴ７プロモーターの下流に異種ＤＮＡテンプレートを挿入するための多重クローニング部位を含有する真核性発現ベクターである。Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを発言する細菌性宿主、例えばE. coliのBL21(DL3)株への形質転換により、高水準の異種蛋白質組換え体発現がもたらされる。Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡが、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ：配列番号２１および２２参照）との融合物としてpET34ベクターに挿入され、E. coli宿主細胞で発現されている。
【０２８８】
１２０以上の異なるＣＢＤ配列が同定され、配列の類似性に基づいて少なくとも１0種のファミリーに分類されている（Tommes et al. (1995) in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides；Saddler,J.M. and Panner,M.,Eds.: American Chemical Society, Washington, D.C.:pp 142-161）。ＣＢＤのclos-Tag配列は、Clostrium cellulovoransのセルロース結合プロテインＡ（CbpA）から由来し、結晶セルロースに高い親和性を有する。ルシフェラーゼ発現クローンを同定するため、黒色の寒天上で生育した形質転換体にコエレントラジンを噴霧した。
【０２８９】
強い青緑色を発光する生成コロニーのため、発現は明らかであった。生育するコロニーを選択した。青色光を発光する形質転換体のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定した（例えば、配列番号１９参照）。本書中に記載するように、７６５ＤＮＡインサートはアミノ酸１８５個のポリペプチドを暗号化している。
【０２９０】
Renilla蛋白質を暗号化している核酸の単離および同定
１．Renilla属試料の単離
Renillaの試料は、メキシコ湾、太平洋および大西洋を含む世界の大洋から容易に入手できる。Renillaは、約３０ないし１００フィートの深さの大洋底部に典型的に生活し、掃海により容易に採集することができる。例えば、R.kollikeriの試料は、カリフォルニア、またはバハ、メキシコの海岸から得ることができる。別法として、Renillaの生きた試料は、商業的供給業者（たとえば、Gulf Marine Incorporated, panacea, Fla）から購入してもよい。捕獲または受領後、試料は充分洗浄し、発光組織を濃厚化するため切断してもよい。ついで生物体全部または切断した組織を急速冷凍し、液体窒素中に保存する。
【０２９１】
下記の実施例に詳述するように、Renilla mulleriＧＦＰおよびルシフェラーゼ（例えば、それぞれ配列番号１５および配列番号１７参照）を暗号化している核酸の単離源としては、凍結組織を使用した。
【０２９２】
２．RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類の調製
RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類は、本書中に記載した方法にしたがって、またはその他の当業者に既知の方法（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.; U.S.Patent No. 5,292,658参照）により、インタクトなＲＮＡから調製することができる。
【０２９３】
典型的には、ｃＤＮＡライブラリー類の調製は、選択した生物体からのポリアデニル化ＲＮＡの単離と、次いで逆転写酵素を使用した１本鎖ＤＮＡの合成、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の消化、続いて１本鎖ＤＮＡから２本鎖ＤＮＡへの変換を含む。
【０２９４】
ａ．ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
RenillaのｃＤＮＡ調製のための総細胞質ＲＮＡ源として、Renilla全体または切断したRenilla組織を使用することができる。総インタクトＲＮＡは、例えば、当業者に一般的に知られた改良法（例えば、Chirgwin et al. (1970) Biochemistry 18:5294-5299参照）を用いて、破砕したRenillaの組織から単離することができる。総細胞ＲＮＡを単離後、ポリアデニル化ＲＮＡ分子種は、オリゴデオキシチミジレートセルロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーを用いて（例えば、Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408記載のように）容易に非ポリアデニル化分子種から分離される。
【０２９５】
次いで、精製したRenilla polyA−ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成反応に付して総polyA−ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成させる。要約すると、逆転写酵素を使用して、アニールしたpolydTプライマーを伸張しＲＮＡ／ＤＮＡ２重体を生成させる。次いでＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ鎖を消化し、第２鎖合成後、ｃＤＮＡ分子をＳ１ヌクレアーゼまたはその他の適当なヌクレアーゼで平滑末端化する。得られる２本鎖ｃＤＮＡ断片は適当な発現ベクターに直接ライゲートすることができ、また別法として、制限エンドヌクレアーゼ部位を暗号化しているオリゴヌクレオチドリンカーをｃＤＮＡ分子の５’−末端にライゲートしてｃＤＮＡ断片のクローニングを容易にすることができる。
【０２９６】
ｂ．ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築
ｃＤＮＡ発現ライブラリー類構築のための最良の確認ベクターはラムダベクター類である。ラムダベースのベクターは約１２ｋｂのｃＤＮＡインサート類に耐え、標準的プラスミドベクター類に比較してライブラリーのスクリーニング、増幅および保存により大きな便宜をもたらす。RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類の調製に現在好ましいベクターは、当業者に既知（例えば、U.S.Pat.No. 5,128,256参照）で市販（Stratagene, La Jolla, CA）されているLambda、Uni-Zap、Lambda-Zap IIまたはLambda-ZAP Express/EcoRI/XhoIベクター類である。
【０２９７】
一般に、Lambda-ZAPベクター類は、バクテリオファージラムダベクター系の高い効率とプラスミド系の融通性を結びつけている。これらのベクター類中にクローンされた断片は、ヘルパーファージを用いて自動的に切断され再環状化されてサブクローンをｐＢＫ由来ファージミド中に生成する。ｐＢＫファージミドは、細菌中での選択用ネオマイシン耐性遺伝子および真核細胞中での選択用Ｇ４１８を担持し、またβ−ラクタマーゼ耐性遺伝子を含んでいてもよい。組換えポリペプチドの発現は、細菌のlacZプロモーターおよび真核生物のＣＭＶプロモーターに制御されている。
【０２９８】
さらに具体的に述べると、これらのラムダベースベクター類は、プラスミド系、例えばバクテリオファージラムダの右および左アームのブラケットをつけたｐＢＫブルースクリプト誘導体（Stratagene, San Diego）を含有するイニシエーター・ターミネーターカセットから構成される。ラムダのアームは、複製したＤＮＡの効率的なパッケージングを可能にし、他方切断できるイニシエーター・ターミネーターカセットは、ｃＤＮＡ断片の容易なクローニングおよびプラスミドライブラリー生成を、追加的なサブクローニングなしで可能とする。
【０２９９】
本書中で使用する場合、ｃＤＮＡ断片類は、Lambda-Zapベクターのイニシエーター・ターミネーターカセットに含まれる多重クローニング部位に挿入されて１セットのｃＤＮＡ発現ベクターを作り出す。ｃＤＮＡ発現ベクターのセットは、適当なE. coli細胞に感染させ、次いで糸状ヘルパーファージを同時感染させる。細胞内では、ヘルパーファージにより暗号化されたトランスに作用する蛋白質、例えばM１３の遺伝子ＩＩ蛋白質が、ベクターのラムダアーム内に位置する２個の別のドメインを認識し、イニシエーター・ターミネーターカセットに隣接する１本鎖ニックを導入する。続くＤＮＡ合成期後、存在するニック鎖を置換する新規なＤＮＡ鎖が合成され、イニシエーター・ターミネーターカセットを遊離させる。置換された鎖は次いで環状化され、ヘルパー蛋白質により糸状ファージとしてパッケージされ、細胞から排出される。ｃＤＮＡを含有するＢＫプラスミドは、E. coliのＦ’株に感染させ、感染した細胞をｐＢＫ含有細胞選択用カナマイシン補足固体培地で培養することにより回収される。
【０３００】
RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリーは、当業者に知られた種々の方法を用いてスクリーニングされる。例えば、RenillaＧＦＰの同定は、青色光を使用し、緑色の蛍光発光について肉眼でコロニーを観察すること、または一種もしくはそれ以上の帯域通過フィルターを用いて発光を観察することにより、機能的スクリーニング法によって達成できる。
【０３０１】
３．RenillaＧＦＰを暗号化しているＤＮＡの同定と単離
RenillaＧＦＰを暗号化しているＤＮＡは、本書中に記載した方法を用いて、または当業者に既知のその他の方法を用いて、単離することができる。下記に詳述するように、R. mulleri A Uni-ZapのｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリーを調製し、コンピーテントなE. coli細胞に形質転換し、背景蛍光を吸収するようにカーボンブラックを含有する改良Ｌ−ブロスプレートで培養した（例えば、実施例４参照）。形質転換体にＩＰＴＧ含有溶液を噴霧して異種ｃＤＮＡからの組換えRenillaＧＦＰの発現を誘導した。ＧＦＰ発現クローンを同定するため、形質転換体を青色光、好ましくは４７０ないし４９０ｎｍの光中に置き、緑色の蛍光を発光するコロニーを単離し、純粋培養として成長させた。
【０３０２】
緑色蛍光をもつ形質転換体のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定した（例えば、配列番号１５）。実施例４に記載するように、１，０７９ｃＤＮＡインサートは、分子レベルで確認されている唯一の他のＧＦＰであるA.victoriaのＧＦＰと僅か２３．５％が同一であるアミノ酸２３８個のポリペプチドを暗号化している。組換え蛋白質は、生きたRenilla種で報告されたのと類似する励起および発光スペクトルを示す。
【０３０３】
４．Renillaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡの単離および同定
上記したR. mulleriのｃＤＮＡ発現ライブラリーを、Renillaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡのクローニングにも使用した（実施例５参照）。基本的に上記のようにして、単一コロニーの形質転換体をカーボンブラック含有改良Ｌ−ブロスプレート上で生長させ、異種ＤＮＡからの発現をＩＰＴＧで誘導した。発現時間経過後、形質転換体にコエレンテラジンを噴霧し、青色光を発光するコロニーをスクリーニングした。発光コロニーを単離し、純粋培養として成育させた。
【０３０４】
発光形質転換体に含有されるｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定した。実施例５に記載するように、１，２１７ｃＤＮＡインサートはアミノ酸３１１個のポリペプチドを暗号化している。組換え蛋白質は、生きたRenilla種で報告されたのと類似する励起および発光スペクトルを示す。
【０３０５】
Ｄ．他の種からのルシフェラーゼおよびＧＦＰを暗号化している核酸を単離およびクローニングするための核酸プローブおよび方法
Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化している本書中に例示した核酸は、その他のGaussia種からルシフェラーゼを単離するためのプローブ源として使用することができる。例示したヌクレオチド配列に基づく任意の適当なプローブを、任意の方法で使用できる。このようなプローブは、少なくとも低いストリンジェンシー、より好ましくは中度のストリンジェンシー、最も好ましくは高いストリンジェンシー条件下において、適当なGaussiaのライブラリー中の関連核酸とハイブリダイズするものでなければならない。
【０３０６】
また本書中に、その他のGaussia種からルシフェラーゼを暗号化している核酸を単離しクローニングするための特定の核酸プローブ類が提供される。典型的には、核酸プローブ類は縮重プローブであり、これは選択したGaussia種から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長のGaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡクローンを得るためのハイブリダイゼーションプローブとして使用される。
【０３０７】
好ましい核酸プローブ類は、保存されたアミノ酸位置に基づいて、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは１６ないし３０個のヌクレオチドからなる縮重プローブとなるように、設計されている。例えば、プローブの設計に特に好ましい領域は、配列番号２０中に示したアミノ酸１ないし１８５に基づくものである。その他の好ましい実施態様において、上記の好ましいアミノ酸領域を暗号化している核酸プローブは、配列番号１９に示したこれらの領域を暗号化しているヌクレオチド配列から選択される。
【０３０８】
別法として、これらのアミノ酸位置に対応するペプチドを調製し、当業者に周知の方法（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.）を使用して、動物を免疫しGaussiaルシフェラーゼに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させるための免疫源として使用することができる。抗体は、本書中に記載の方法にしたがって調製したもののようなｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングして、部分長または完全長のクローンを発現しているクローンを同定するために使用することができる。
【０３０９】
他のRenilla種からのＧＦＰを暗号化している核酸を単離するための核酸プローブおよびクローニング法
Renilla mulleriのＧＦＰを暗号化している本書中に例示した核酸は、その他のRenilla種からＧＦＰ類を単離するためのプローブ源として使用することができる。例示したヌクレオチド配列に基づく任意の適当なプローブを、任意の方法で使用できる。このようなプローブは、低いストリンジェンシー条件下において、適当なRenillaのライブラリー中の関連核酸とハイブリダイズするものでなければならない。
【０３１０】
また本書中に、その他のRenilla種からＧＦＰを暗号化している核酸を単離しクローニングするための特定の核酸プローブ類が提供される。これらのプローブ類は、Renilla属の構成員間で共通するRenillaＧＦＰ蛋白質の領域に基づくものである（図１参照）。典型的には、核酸プローブ類は縮重プローブであり、これは選択したRenilla種から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長のRenillaＧＦＰを暗号化しているＤＮＡクローンを得るためのハイブリダイゼーションプローブとして使用される。
【０３１１】
Renilla種間で共通するＧＦＰ領域を解明するため、生成したRenilla reniformisＧＦＰを特定の化学的および蛋白質溶解分解、例えば、トリプシンおよびプロテイナーゼＱ、に付して分析用の種々の短いペプチドを生成させ、Renilla reniformisペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【０３１２】
図１は、Renilla mulleri緑色蛍光蛋白質の推定アミノ酸配列、および単離したRenilla reniformisＧＦＰペプチド類に対して決定したアミノ酸配列の整列を表示する。２個の種は密接に関連するが、Renilla ＧＦＰ類の配列は異なっている。しかし、高度に保存された配列が存在するので、この相違を個々のプローブの構築に利用することができる。R. mulleriおよびR. reniformisの配列は、満足な整列を得るに充分な長さのペプチドとして存在する１８７個の残基中１０３個において同一である。
【０３１３】
２種のアミノ酸配列のある領域は、高度の保存性を示す。例えば、Renilla mulleriの配列の５１ないし６９位に対応する１９個のアミノ酸中１８個が、アミノ酸５１ないし６５位に対応する１６個の同一アミノ酸残基の連続範囲を含めて、２種のRenillaＧＰＳ類間で同一である。また、図１に示すように、Renilla reniformisＧＦＰ（例えば、配列番号２０参照）は、R. mulleriの配列のアミノ酸８１ないし１０６に対応するアミノ酸残基に対しかなり高度の類似性を共有する（６０．９％：２６個の同一アミノ酸中１８個）。
【０３１４】
好ましい核酸プローブ類は、保存されたアミノ酸位置に基づいて、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは１６ないし３０個のヌクレオチドからなる縮重プローブとなるように、設計されている。例えば、プローブの設計に特に好ましい領域は、配列番号１６中に示したアミノ酸５１ないし６８、８２ないし９８および１９８ないし２０８、配列番号２０に示したアミノ酸配列、配列番号２１に示したアミノ酸９−２０、および配列番号２３に示したアミノ酸３９−５３に基づくものである。その他の実施態様において、上記の好ましいアミノ酸領域を暗号化している核酸プローブは、配列番号１５に示したこれらの領域を暗号化しているヌクレオチド配列から選択される。これらの縮重核酸プローブは、Renilla reniformisおよびその他の種におけるＧＦＰを暗号化しているＤＮＡの単離およびクローニング用のハイブリダイゼーションプローブとして、使用することができる。別法として、これらのプローブは、核酸増幅反応のプライマーとして使用してもよい。
【０３１５】
別法として、これらのアミノ酸位置に対応するペプチドを調製し、当業者に周知の方法（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.）を使用して、動物を免疫しRenillaＧＦＰに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させるための免疫源として使用することができる。抗体は、本書中に記載の方法にしたがって調製したもののようなｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングして、Renilla mulleriＧＦＰのアミノ酸残基５１ないし６９の全部または一部分を包含する部分長または完全長のクローンを発現しているクローンを同定するために使用することができる（例えば、図１；配列番号１５および１６参照）。
【０３１６】
その他の種
PtilosarcusおよびPleuromammaの蛋白質を暗号化している本書中に記載の核酸を用いて、同様な方法を使用することができる。
【０３１７】
Ｅ．蛋白質の組換えによる発現
Gaussia
１．Gaussiaの蛋白質を暗号化しているＤＮＡ
上記のように、Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡは、天然源から単離すること、本書中に記載したGaussiaの核酸配列に基づいて合成すること、または数多くの組換えＤＮＡクローニングおよび増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより調製することができる。
【０３１８】
好ましい実施態様において、Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡ断片は、配列番号２０に示したアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態様において、ＤＮＡ断片は、配列番号１９に示したヌクレオチド配列中のヌクレオチド３７−５９１により暗号化されているアミノ酸配列を暗号化している。
【０３１９】
２．Gaussia蛋白質の組換えによる生産のためのＤＮＡ構築物
ＤＮＡを、所望の宿主中の発現用プラスミドに導入する。好ましい実施態様において、宿主は細菌性宿主である。プロモーターおよびオペレーターのような調節領域であるプラスミド中のヌクレオチド配列は、Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているヌクレオチド配列の転写のために互いに動作上の関連性をもつ。また、Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているヌクレオチド配列は、分泌シグナルを暗号化しているＤＮＡを含み、それにより生成するペプチドがGaussiaのルシフェラーゼの前駆体となる。
【０３２０】
好ましい実施態様において、ＤＮＡプラスミドはまた転写終結配列を含む。プロモーター領域および転写終結区は、同一または異なる遺伝子からそれぞれ独立に選択される。
【０３２１】
異種蛋白質の発現に適当な広範囲の多目的ベクターが当業者に既知であり、市販されている。調節可能な領域に連結された誘導可能なプロモーターまたは構成的プロモーターを含む発現ベクターが好ましい。このようなプロモーターには、Ｔ７ファージプロモーターおよびＴ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターのようなＴ７様ファージプロモーター類、trp、lpp、tetおよびE. coliからのlacUV5のようなlacプロモーター類；ＳＶ４０プロモーター；Ｐ１０またはバキュロウイルス／昆虫細胞発現系類の多角体遺伝子プロモーター、レトロウイルスの末端反復配列およびその他の真核生物発現系からの誘導可能なプロモーター類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３２２】
３．Gaussia蛋白質の組換えによる生産のための宿主生物
宿主生物は、細菌（例えば、E. coli）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastoris）、真菌、バキュロウイルス／昆虫系、両生類細胞、哺乳類細胞、植物細胞および昆虫細胞のような、異種蛋白質の組換え体生産が行われた生物を含むが、これらに限定されるものではない。現在好ましい宿主生物は、細菌または酵母の株である。最も好ましい宿主生物は、E. coli株およびSaccharomyces cerevisiaeである。
【０３２３】
４．Gaussia蛋白質の組換えによる生産法
Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡを、選択した宿主生物中におけるポリペプチド発現のための適当なプロモーターと動作的に結合してプラスミドに導入する。Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡ断片は、成熟たんぱく質をペリプラズムまたは培地中を指向するように選択した宿主中で機能する蛋白質分泌シグナルをも含むことができる。生成するルシフェラーゼは、本書で実施例中に記載した方法を含めて、当業界で日常的に使用される精製法により精製することができる。
【０３２４】
適当な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、さらに好ましくはE. coli細胞を形質転換する方法、および異種蛋白質を暗号化している遺伝子を含有する上記細胞の培養に適用できる方法は、一般的に当業界で知られている。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.参照。
【０３２５】
Gaussiaを暗号化している核酸分子が宿主細胞に導入されると、宿主細胞を、プロモーターが誘導され、それにより動作的に結合したＤＮＡが転写される条件下におくことにより、目的とする蛋白質が生産される。蛋白質を含有する溶解細胞の細胞抽出物を製造し、生成する「澄明溶解物」をルシフェラーゼ源として使用することができる。別法として、溶解物を別の精製工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティクロマトグラフィー）に付すことにより、さらに溶解物を高濃度にし、または精製酵素の均質源を作ることができる（例えば、U.S.Patent Nos. 5,292,658および5,418,155参照）。
【０３２６】
Renilla
１．Renillaの蛋白質を暗号化しているＤＮＡ
上記のように、RenillaのＧＦＰまたはRenillaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡは、天然源から単離すること、本書中に記載したRenillaの核酸配列に基づいて合成すること、または数多くの組換えＤＮＡクローニングおよび増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して調製することができる。
【０３２７】
好ましい実施態様において、RenillaのＧＦＰを暗号化しているＤＮＡ断片は、配列番号１６に示したアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態様において、ＤＮＡ断片は、配列番号１５に示したヌクレオチド配列中のヌクレオチド２５９−９７２により暗号化されているアミノ酸配列を暗号化している。
【０３２８】
好ましい実施態様において、Renillaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡ断片は、配列番号１８に示したアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態様において、ＤＮＡ断片は、配列番号１７に示したヌクレオチド配列中のヌクレオチド３１−９６３により暗号化されているアミノ酸配列を暗号化している。
【０３２９】
２．Renilla蛋白質の組換え体生産用ＤＮＡ構築物
ＤＮＡを、所望の宿主中の発現用プラスミドに導入する。好ましい実施態様において、宿主は細菌性宿主である。プロモーターおよびオペレーターのような調節領域であるプラスミド中のヌクレオチド配列は、RenillaＧＦＰまたはルシフェラーゼを暗号化しているヌクレオチド配列の転写のために互いに動作上の関連性をもつ。また、RenillaのＦＧＦ突然変異蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列は、分泌シグナルを暗号化しているＤＮＡを含み、それにより生成するペプチドがRenillaＧＦＰの前駆体となる。
【０３３０】
好ましい具体例では、ＤＮＡプラスミドには転写ターミネーター配列もまた含まれる。プロモーター領域および転写ターミネーターは各々独立に同一または異なる遺伝子から選択される。
【０３３１】
異種タンパク質の発現に好適な広範な多目的ベクターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。調節領域に連結している誘導プロモーターまたは構成プロモーターを含む発現ベクターが好ましい。かかるプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターのようなＴ７ファージプロモーターならびにその他のＴ７様ファージプロモーター、大腸菌(E. coli)由来のｌａｃＵＶ５のようなｔｒｐ、ｌｐｐ、ｔｅｔおよびｌａｃプロモーター；ＳＶ４０プロモーター；バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のＰ１０または多角体遺伝子プロモーター、レトロウイルスの長い末端反復配列および他の真核生物発現系由来の誘導プロモーターが挙げられる。
【０３３２】
原核生物のレニラ・ムレリ(Renilla mulleri)の組換え発現に特に好ましいベクターとしては、十分に公知なＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのようなｌａｃ−およびＴ７プロモーターに基づくベクターがあり、それらは商業的に入手可能である(Stratagene, La, Jolla, CA)。
【０３３３】
３．レニラタンパク質の組換え産生のための宿主生物
宿主生物としては異種タンパク質の組換え産生が行われた生物、限定されるものではないが、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoria)）、真菌類、バキュロウイルス／昆虫系、両生類細胞、哺乳類細胞、植物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。現在のところ好ましい宿主生物は細菌または酵母株である。最も好ましい宿主生物は大腸菌またはサッカロミセス・セレビシエ株である。
【０３３４】
４．レニラタンパク質の組換え産生法
レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリルシフェラーゼをコードするＤＮＡを、選択された宿主生物のポリペプチド発現のための適当なプロモーターへ機能しうる連結でプラスミドへ導入する。レニラＧＦＰまたはルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片にはタンパク質分泌シグナルも含まれ、それが選択された宿主において成熟ポリペプチドを周縁質または培地へ向けるよう機能する。得られたレニラＧＦＰまたはルシフェラーゼは、下記実施例で記載される方法をはじめとする当技術分野で通常使用される方法によって精製できる。
【０３３５】
好適な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、およびさらに好ましくは大腸菌細胞を形質転換する方法、ならびに異種タンパク質をコードする遺伝子を含む該細胞の培養に適用できる方法は一般的に当技術分野では公知である。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照。
【０３３６】
一度レニラがコードするＤＮＡ断片を宿主細胞へ導入されれば、宿主細胞を、プロモーターが誘導され、それによって機能しうる形で連結されたＤＮＡが転写される条件に曝すことによって所望のレニラＧＦＰが産生された。タンパク質を含む溶解細胞の細胞抽出物を調製してもよく、得られた「清澄溶解物」を組換えレニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリルシフェラーゼ源として使用した。あるいは、該溶解物をさらなる精製工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィー）に付してさらに溶解物を濃縮してもよいし、または同種起源の精製酵素を提供してもよい（例えば、米国特許第５，２９２，６５８号および第５，４１８，１５５号を参照）。
【０３３７】
Ｆ．ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードする異種核酸を発現する組換え細胞
これらの細胞、ベクターおよび方法をレニラおよびガウシア(Gaussia)について示す。同細胞、ベクターおよび方法をプルロマムマ(Pleuromamma)およびプチロサルカス(Ptilosarcus)タンパク質の発現に使用してもよい。
【０３３８】
ガウシア
ガウシアルシフェラーゼをコードする異種核酸を含む組換え細胞を提供する。好ましい具体例では、組換え細胞は細胞に対して機能的かつ無毒のコードされたガウシアルシフェラーゼを発現する。さらに好ましい具体例では、ガウシアルシフェラーゼには配列番号２０で示されるアミノ酸配列が含まれる。
【０３３９】
ある具体例では、組換え細胞は生物発光系の別の成分、好ましくは蛍光タンパク質をコードする異種核酸を含んでもよい。好ましい具体例では、生物発光系成分をコードする核酸はエクオリア(Aequorea)、バルグラ(Vargula)またはレニラ種から単離される。さらに好ましい具体例では、さらなる生物発光系成分はレニラ・ムレリまたはレニフォルミス(reniformis)ＧＦＰである。
【０３４０】
レニラＧＦＰおよびＧＦＰペプチドは天然源から単離することもできるし、または前記のもののようなレニラＧＦＰおよび／またはＧＦＰペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした原核細胞または真核細胞から単離することもできる。
【０３４１】
細胞の例としては、細菌（例えば、大腸菌）、植物細胞、哺乳類起源の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞および当業者に公知な他のかかる細胞）、両生類細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス(Xenopus laevis)卵母細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス）などが挙げられる。注入したＲＮＡ転写物を発現するための細胞の例としては、ゼノプス・ラエビス卵母細胞が挙げられる。ＤＮＡのトランスフェクションに好ましい真核細胞は当業者に公知であり、あるいは経験的に同定することがき、ＨＥＫ２９３（受託番号＃ＣＲＬ１５７３としてＡＴＣＣから入手可能）；Ｌｔｋ−細胞（受託番号＃ＣＣＬ１．３としてＡＴＣＣから入手可能）；ＣＯＳ−７細胞（受託番号＃ＣＲＬ１６５１としてＡＴＣＣから入手可能）およびＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞；例えば、Urlaub et al., (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555を参照）が挙げられる。現在のところ好ましい細胞としては細菌および酵母株が挙げられる。
【０３４２】
ガウシアルシフェラーゼをコードする異種ＤＮＡを含んだ組換え細胞は、ガウシアルシフェラーゼをコードするＤＮＡによるトランスフェクションによるか、または当業者に十分に公知な方法を用いてガウシアタンパク質をコードするＤＮＡのＲＮＡ転写物を導入することにより作出される。ＤＮＡは直鎖ＤＮＡ断片として導入してもよいし、またはコーディングＤＮＡの安定発現または一時発現のための発現ベクターに含まれてもよい。
【０３４３】
異種ＤＮＡは、エピソームエレメントとして細胞内で維持してもよく、または細胞の染色体ＤＮＡへ組み込んでもよい。次いで得られた組換え細胞は、かかる培養物またはその二次培養物から培養または二次培養（または哺乳類細胞の場合には継代）してもよい。またＤＮＡを細胞に安定的に組み込んでもよいし、当技術分野で公知の方法を用いて一時的に発現させてもよい。
【０３４４】
該組換え細胞は、野生型または改変Ａ．ビクトリア(A. victoria)ＧＦＰもしくはＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞について記載された方法など（例えば、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７１号参照）、細胞に基づいた広範なアッセイ法に使用できる。
【０３４５】
レニラ緑色蛍光タンパク質および／またはルシフェラーゼをコードする異質核酸を発現する組換え細胞
レニラＧＦＰをコードする異質核酸を含んだ組換え細胞を提供する。好ましい具体例では、該組換え細胞は細胞に対して機能的かつ無毒のコードされたレニラＧＦＰを発現する。
【０３４６】
ある具体例では、該組換え細胞は生物発光系のある成分、好ましくは光タンパク質またはルシフェラーゼをコードする異種核酸を含んでもよい。好ましい具体例では、生物発光系成分をコードする核酸はエクオリア、バルグラまたはレニラ種から単離される。さらに好ましい具体例では、該生物発光系成分は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するレニラ・ムレリである。
【０３４７】
レニラ・ムレリルシフェラーゼをコードする異種核酸を含んむ組換え宿主細胞もまた提供する。好ましい具体例では、該異種核酸は配列番号１８で示されるアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい具体例では、該異種核酸は配列番号１７で示されるヌクレオチド配列をコードする。
【０３４８】
細胞の例としては、細菌（例えば、大腸菌）、植物細胞、哺乳類起源の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞および当業者に公知のその他のかかる細胞）、両生類細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス卵母細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス）などが挙げられる。注入したＲＮＡ転写物を発現するための細胞の例としては、ゼノプス・ラエビス卵母細胞が挙げられる。ＤＮＡのトランスフェクションに好ましい真核細胞は当業者に公知であり、あるいは経験的に同定でき、ＨＥＫ２９３（受託番号＃ＣＲＬ１５７３としてＡＴＣＣから入手可能）；Ｌｔｋ−細胞（受託番号＃ＣＣＬ１．３としてＡＴＣＣから入手可能）；ＣＯＳ−７細胞（受託番号＃ＣＲＬ１６５１としてＡＴＣＣから入手可能）およびＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞；例えば、Urlaub et al. (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555参照）が挙げられる。現在のところ好ましい細胞としては細菌および酵母株が挙げられる。
【０３４９】
レニラＧＦＰをコードする異種ＤＮＡを含んだ組換え細胞は、レニラＧＦＰをコードするＤＮＡによるトランスフェクションによるか、または当業者に十分に公知な方法を用いてレニラタンパク質をコードするＤＮＡのＲＮＡ転写物を導入することにより作出される。該ＤＮＡは直鎖ＤＮＡ断片として導入してもよいし、またはコーディングＤＮＡの安定発現または一時発現のための発現ベクターに含まれてもよい。
【０３５０】
異種ＤＮＡはエピソームエレメントとして細胞内で維持してもよいし、または細胞の染色体ＤＮＡへ組み込んでもよい。得られた組換え細胞は、次ぎにかかる培養物またはその二次培養物から培養または二次培養（または哺乳類の場合には継代）してもよい。また該ＤＮＡは安定的に組み込んでもよいし、当技術分野で公知の方法を用いて一時的に発現させてもよい。
【０３５１】
該組換え細胞は、野生型または改変Ａ．ビクトリアＧＦＰもしくはＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞について記載された方法など（例えば、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７１号参照）、細胞に基づいた広範なアッセイ法に使用できる。
【０３５２】
Ｇ．ルシフェラーゼ
精製ガウシアルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼペプチド、ならびにプルロマムマおよびレニラ・ムレリルシフェラーゼを提供する。該ルシフェラーゼは選択された宿主細胞でタンパク質を発現させ、得られたルシフェラーゼを単離することによって産生される。
【０３５３】
またレニラ・ムレリルシフェラーゼをコードする核酸も提供する。該核酸を使用して、コードされたルシフェラーゼを産生する。現在のところ組成物、組合せおよび方法における使用に好ましいレニラ・ムレリルシフェラーゼは配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有している。該ルシフェラーゼは本明細書に記載されるもののような幅広い最終用途へ適用される組成物および組合せに処方できる。
【０３５４】
Ｈ．レニラおよびプチロサルカスＧＦＰ
精製レニラＧＦＰ、特にレニラ・ムレリＧＦＰおよび精製レニラ・レニフォルミスＧＦＰペプチドを提供する。現在のところ本明細書の組成物における使用に好ましいレニラＧＦＰは配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するレニラ・ムレリＧＦＰである。現在のところ好ましいレニラ・レニフォルミスＧＦＰペプチドとしては、配列番号１９〜２３で示されるアミノ酸配列から選択されたＧＦＰペプチドを含んだものである。
【０３５５】
レニラＧＦＰおよびＧＦＰペプチドは天然源から単離することもできるし、または前記Ｆ節に記載されたもののようなレニラＧＦＰおよび／またはＧＦＰペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした原核または真核生物細胞から単離することもできる。
【０３５６】
Ｉ．組成物
前記のようにガウシアおよびレニラタンパク質ならびに核酸について組成物およびコンジュゲートならびに使用法が記載されている。同組成物ならびにその調製および使用法はプルロマムマおよびプチロサルカスタンパク質ならびに核酸を伴う使用を意図したものである。
【０３５７】
１．ガウシアルシフェラーゼ組成物
ガウシアルシフェラーゼを含有する組成物を提供する。該組成物にはまたレニラＧＦＰまたはＧＦＰペプチドも含まれていてよい。該組成物はそのために意図される使用法に応じていくつかの形態のいずれを採ってもよい。ある具体例では、該組成物は新規な生物発光製品、イムノアッセイまたはＦＲＥＴおよびＦＥＴアッセイに使用するために調製される。該組成物は光検出器内蔵のマルチウェルアッセイ装置と組み合わせて（例えば、同時係属出の米国出願出願番号０８／９９０，１０３参照）、腫瘍検出のために（例えば、米国出願出願番号０８／９０８，９０９参照）または新規な生物発光製品において（米国出願出願番号０８／５９７，２７４および０８／７５７，０４６参照）使用してもよい。
【０３５８】
これらの組成物は、以下に詳細に記載される方法のような、腫瘍性組織および他の組織のインビボ検出のための診断系と組み合わせて含むなど、種々の方法および系にて使用できる。これらの方法および産物にはルシフェラーゼが使用される当業者に公知のいずれのものも含まれ、限定されるものではないが、米国出願出願番号０８／７５７，０４６、０８／５９７，２７４および０８／９９０，１０３、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７１号が挙げられる。
【０３５９】
２．レニラルシフェラーゼ組成物
レニラ・ムレリルシフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて、コードされるルシフェラーゼを産生させるが、これは本明細書に記載される、例えば飲料中の、生物発光系の成分として使用されるとともに、腫瘍形成の診断法および本明細書に記載される診断チップにおいてなど、診断における用途を有する。これらの方法および産物にはルシフェラーゼが使用される当業者に公知のいずれのものも含まれ、限定されるものではないが、米国出願出願番号０８／７５７，０４６、０８／５９７，２７４および０８／９９０，１０３、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７１号が含まれる。
【０３６０】
その他の具体例では、レニラ・ムレリルシフェラーゼと残りの成分は個別の組成物として包装してもよく、混合時に発光する。例えば、レニラ・ムレリルシフェラーゼを含有する組成物を、生物発光基質および生物発光アクチベーターを含有する個別の組成物とは別にではあるがともに使用するために提供してもよい。もう１つの例では、ルシフェラーゼおよびルシフェリン組成物を個別提供し、生物発光アクチベーターを他の２つの組成物の混合後、または混合と同時に加えてもよい。
【０３６１】
３．レニラＧＦＰ組成物
レニラＧＦＰまたはＧＦＰペプチドを含有する組成物を提供する。該組成物はそのために意図される使用法に応じて多くの形態のうちいずれを採ってもよい。ある具体例では、例えば、該組成物は新規な生物発光製品、イムノアッセイまたはＦＲＥＴおよびＦＥＴアッセイに使用するために処方されたレニラＧＦＰまたはＧＦＰペプチド、好ましくはレニラ・ムレリＧＦＰまたはレニラ・レニフォルミスＧＦＰペプチドを含んでいる。また該組成物は本明細書に記載されたもののような光検出器内蔵のマルチウェルアッセイ装置と組み合わせて使用してもよい。
【０３６２】
レニラ・ムレリＧＦＰまたはＧＦＰペプチドおよび生物発光系の少なくとも１つの成分、好ましくはルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはルシフェラーゼとルシフェリンを含有する組成物を提供する。好ましい具体例では、ルシフェラーゼ／ルシフェリン生物発光系は昆虫系、腔腸動物系、有櫛動物系、細菌系、軟体動物系、甲殻類系、魚類系、環形動物系、およびミミズ系から単離されるものから選択される。現在のところ好ましい生物発光系はレニラ、エクオリア、バルグラから単離されるものである。
【０３６３】
さらに好ましい具体例では、生物発光系成分は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するレニラ・ムレリルシフェラーゼである。これらの組成物は、以下に詳細に記載される方法のような、腫瘍性組織および他の組織のインビボ検出のための診断系と組み合わせて含む、種々の方法および系において使用できる。
【０３６４】
これらの方法および産物にはルシフェラーゼが使用される当業者に公知のいずれのものも含まれ、限定されるものではないが、米国出願出願番号０８／７５７，０４６、０８／５９７，２７４および０８／９９０，１０３、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７１号が含まれる。
【０３６５】
４．コンジュゲート
本明細書で提供されるコンジュゲートには、標的化物質であるレニラＧＦＰ、レニラ・ムレリもしくはガウシアルシフェラーゼおよびその他のルシフェラーゼ（光タンパク質またはルシフェラーゼ酵素を含む）またはルシフェリンと直接またはリンカーを介して結合した、組織特異的または腫瘍特異的モノクローナル抗体もしくはその断片などの標的化剤が含まれる。標的化物質は微粒子担体と組み合わせてもよい。該結合は、化学的に、標的化物質がタンパク質である場合には融合タンパク質の組換え発現により、また化学的なものと組換え発現の組合せによるいずれでも達成される。該標的化剤は腫瘍細胞表面抗原またはその他の組織特異的抗原のような選択された組織または細胞種と優先的に結合するものである。
【０３６６】
コンジュゲートの調製法は当業者に公知である。例えば、コンジュゲート形成用に設計されたエクオリンおよびかかるエクオリンを含有するコンジュゲートを製造されている［例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１８３４２参照；またSmith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratoryも参照］。エクオリンはスルフヒドリル反応結合剤によって抗体分子と結合させた(Stultz et al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli. Biochemistry 31, 1433-1442)。かかる方法は、本明細書における使用のために改変して、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したルシフェラーゼを得てもよい。またバルグラルシフェラーゼも他の分子と結合させた［例えば、日本出願第ＪＰ５０６４５８３、１９９３年３月１９日を参照］。かかる方法は、本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用な分子と結合したルシフェラーゼを得てもよい。
【０３６７】
該コンジュゲートを使用し、生物発光反応による発光との直接的相関によって生物学的サンプル中の特定の抗原の存在を検出または定量することができる。
【０３６８】
別法として、選択された基質との結合に特に好適なアミノ酸残基の付加によるなどして、生物発光系の成分を結合に関して改変してもよい。これはＤＮＡを改変し、かかる改変ＤＮＡを発現させることによって容易に達成され、ＮまたはＣ末端に付加的残基を有するルシフェラーゼを得ることができる。
【０３６９】
コンジュゲートの調製法は当業者に公知である。例えば、コンジュゲート形成用に設計されたエクオリンおよびかかるエクオリンを含有するコンジュゲートが製造されている［例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１８３４２を参照；またSmith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratoryも参照］。エクオリンはスルフヒドリル反応結合剤によって抗体分子と結合させた(Stultz et al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli. Biochemistry 31, 1433-1442)。かかる方法は本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したエクオリンを製造してもよい。またバルグラルシフェラーゼも他の分子と結合させた［例えば、日本出願第ＪＰ５０６４５８３、１９９３年３月１９日を参照］。かかる方法は本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したエクオリンを製造してもよい。
【０３７０】
エクオリン抗体コンジュゲートを使用し、生物発光反応による発光との直接的相関によって生物学的サンプル中の特定の抗原の存在を検出または定量した。
【０３７１】
系の選択は、所望の色および所望の生物発光持続時間、ならびに特定の製品といった因子による。標的化剤の選択は、主として視覚化しようとする腫瘍または組織のタイプおよび特徴、ならびに視覚化を行う設定による。例えば、アリストストミズ(Aristomias)から単離されたルシフェラーゼは赤色光を発するが、これは光電子増倍管を用いて組織からの検出が可能であるため、特に術前診断に有益である。
【０３７２】
ａ．リンカー
本明細書においては当業者に公知のいずれのリンカーを使用してもよい。その他のリンカーも化学的に製造するコンジュゲートへの組み込みに好適である。化学的に結合するコンジュゲートに好適なリンカーとして、はジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合、ならびにアミンおよびチオール基のような遊離反応性基間の共有結合が挙げられる。これらの結合はヘテロ二官能価試薬を用いてポリペプチドの一方または両方に反応性チオール基を生じさせ、次いで一方のポリペプチドのチオール基が、他方で反応性マレイミド基またはチオール基が結合し得る反応性チオール基またはアミン基と反応することによってなされる。その他のリンカーとしては、ビスマレイミデオトキシプロパン、酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジドのような酸切断可能リンカー（これらはより酸性の細胞内コンパートメントにおいて切断される）；ＵＶまたは可視光への暴露によって切断される架橋剤および種々のドメイン（ヒトＩｇＧ１の不変領域由来のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３など）のようなリンカー（Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30: 379-386を参照）が挙げられる。いくつかの具体例では、それぞれのリンカーの所望の特性を利用するよう数種のリンカーが挙げられている。
【０３７３】
化学的リンカーおよびペプチドリンカーをリンカーとＴＡおよび標的化された物質に共有結合することによって挿入してもよい。下記のヘテロ二官能価剤を使用してかかる共有結合を達成してもよい。またペプチドリンカーを、融合タンパク質としてリンカーおよびＴＡ、リンカーおよび標的化物質、またはリンカー、標的化物質およびＴＡをコードするＤＮＡを発現することによって結合してもよい。
【０３７４】
可変リンカーおよびコンジュゲートの溶解性を高めるリンカーについての使用も意図され、本明細書では単独または他のリンカーとの併用のいずれかが考えられる。アミノ基およびチオール基間に共有結合を形成して、チオール基をタンパク質に導入するために使用されるいくつかのヘテロ二官能価架橋試薬は当業者に公知である（例えば、PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993を参照、これにはかかる試薬の調製および使用法が記載され、かかる試薬の市販元が示されている；また例えば、Cumberら (1992) Bioconjugate Chem. 3: 397-401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47: 5924-5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 308-312; Walden et al. (1986） J. Mol. Cell Immunol. 2: 191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 163-170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-589も参照）。これらの試薬を使用してＴＡおよび標的化物質間に共有結合を形成してもよい。これらの試薬としては、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ジスルフェートリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；チオ硫酸スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジル（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフィドリンカー）；スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＥ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）； １，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が挙げられる。
【０３７５】
特に標的化された物質がより容易に反応しやすくなるよう切断する必要がある場合には酸切断可能リンカー、光切断可能および熱感受性リンカーを使用してもよい。
【０３７６】
酸切断可能リンカーとしては、限定されるものではないが、ビスマレイミデオトキシプロパン；およびアジピン酸ジヒドラジドリンカー（例えば、Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-589を参照）、ならびにトランスフェリンの十分な部分を含んでおり、細胞内トランスフェリン循環経路へ入ることが許される酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲート（例えば、Welhoner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309-4314を参照）が挙げられる。
【０３７７】
光切断可能リンカーは露光によって切断されるリンカーであり（例えば、Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107、このリンカーは参照することにより本明細書に組み入れられる、を参照）、それにより露光時に標的化された物質を遊離する。露光によって切断される光切断可能リンカーは公知であり（例えば、Hazum et al. (1981) in Pept. Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110、これにはシステインの光切断可能保護基としてのニトロベンジル基の使用について記載されている； Yen et al. (1989) Makromol. Chem 190: 69-82、これにはヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体を含む水溶性光切断可能な共重合体について記載されている； Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107、これには近紫外線（３５０ｎｍ）への暴露時に光分解される架橋剤および試薬について記載されている；およびSenter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42: 231-237、これには光切断可能結合をもたらす塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋試薬について記載されている、を参照）、それにより露光時に標的化された物質を遊離する。かかるリンカーは光ファイバーを用いて露光し得る皮膚病または眼病の治療において特に有用である。該コンジュゲートの投与後、眼または皮膚もしくは他の身体の部分を露光することができ、その結果該コンジュゲートから標的化成分が遊離する。かかる光切断可能リンカーは動物の身体からの迅速に浄化すべき標的化剤の除去が望ましい診断プロトコールに関して有用である。
【０３７８】
ｂ．標的化剤
標的化剤には、標的化物質を腫瘍または特異化組織［標的化された組織］の細胞と相互作用し、局在化させる物質のいずれもが含まれる。かかる薬剤には、標的化された組織において十分に高濃度または高い含量で存在する細胞表面タンパク質または受容体と特異的に相互作用する物質のいずれもが含まれ、それによって適当な生物発光試薬およびアクチベーターと接触した際に光を発する。これらの物質には、限定されるものではないが、取り込まれないよう選択的に改変された成長因子、メトトレキセートおよび抗体、特に腫瘍特異的抗原に対して生じた抗体が挙げられる。いくつかのヒト腫瘍から多くの腫瘍特異的抗原が確認されている。
【０３７９】
抗腫瘍抗原抗体
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を選択された抗原に対して製造してもよい。あるいは、かかる多くの抗体は現在入手可能である。抗体およびそれぞれが向けられた腫瘍抗原例の一覧は米国出願出願番号に示されており、これは参照することにより本明細書にそのまま組み入れられる。挙げられた抗体のいずれもが本明細書にて提供された方法に従って、生物発光成分と結合すると考えられる。
【０３８０】
好ましい抗体のうち、本明細書の方法における使用にはヒト起源のもの、またはさらに好ましくはヒト化されたモノクローナル抗体である。これらはヒトの診断に好ましい。
【０３８１】
コンジュゲートの調製
タンパク質結合法としてはいずれの方法を使用してもよい。例えば、ルシフェラーゼを抗体と結合させる方法については米国特許第５，４８６，４５５号に記載されている。前記のように、標的化剤およびルシフェリンまたはルシフェラーゼを共有結合、すなわちスルフィドリル結合または他の好適な結合によるｂなどして直接結合させてもよいし、またはリンカーによって結合させてもよい。標的化剤当たり１を超えるルシフェラーゼまたはルシフェリン、すなわちルシフェラーゼまたはルシフェリン当たり１を超える標的化剤があってもよい。
【０３８２】
あるいは、抗体、またはそのＦ（Ａｂ）２抗原結合断片もしくは他のタンパク質標的化剤を組換えＤＮＡ手法を用いてルシフェラーゼと（直接または結合ペプチドを介して）融合してもよい。例えば、表３の抗腫瘍抗体のいずれかをコードするＤＮＡを同一翻訳読み取り枠において、前記ルシフェラーゼ、例えば、配列番号１〜１４のいずれかをコードするＤＮＡと結合させ、発現ベクターへ挿入してもよい。発現のためには、組換え抗体ルシフェラーゼ融合物をコードするＤＮＡを細菌または酵母のような適当な宿主へ導入してもよい。
【０３８３】
５．診断系における使用のための組成物の処方
多くの具体例では、本明細書にて提供されるレニラ・ムレリルシフェラーゼのようなレニラＧＦＰおよび診断系の成分は２つの組成物：コンジュゲートを含有する第１の組成物；および生物発光系の残りの成分を含有する第２の組成物に処方する。該組成物は動物、特に哺乳類、さらに特にはヒトへの投与に好適ないずれかの方法で処方する。かかる製剤には局所、局部、腸、非経口、膀胱内、皮内、硝子体内(intravitreal)、皮下、筋肉内または静脈内投与に好適なものが含まれる。
【０３８４】
例えば、好ましい具体例においてルシフェラーゼ（または光タンパク質）と結合した標的化剤であるコンジュゲートを全身または局部投与用に処方する。残りの成分は別の局所または局部用の第２の組成物に処方する。第２の組成物は典型的には反応に加わるスペクトルシフターのような他の物質のいずれもが含まれる。第２の組成物の成分は徐放型または分解および／または血液成分との相互作用を妨げるいくつか別の様式に処方することが好ましい。
【０３８５】
ａ．第１の組成物：コンジュゲートの処方
前記のように、コンジュゲートにはルシフェラーゼまたはルシフェリンのいずれかと標的化剤が含まれる。好ましいコンジュゲートは標的化剤とルシフェラーゼ、特にガウシア、レニラ・ムレリまたはプルロマムマルシフェラーゼ間で処方される。該コンジュゲートは局所、局部、静脈内および全身適用に好適な医薬組成物に処方してもよい。有効濃度の１以上のコンジュゲートを好適な医薬担体またはビヒクルと混合する。有効なコンジュゲートの濃度または量には投与した際に一定量の送達が必要であり、その結果、標的化された細胞または組織と結合した標的化部分は十分量となり、それにより手術処置中に細胞または組織が視覚化できる。典型的には、組成物は単用量投与用に処方される。有効な濃度および量はコンジュゲートを、本明細書にて記載されるもののような公知のインビトロおよびin  vivo系において試験することによって経験的に決定すればよく、次ぎにヒトまたは他の動物に対する用量そこから推定してよい。
【０３８６】
コンジュゲートとビヒクルの混合または添加の際に得られる混合物は溶液、懸濁液、またはエマルションなどであってよい。得られる混合物の形態は意図した投与様式および選択された担体またはビヒクルにおけるコンジュゲートの溶解性をはじめとするいくつかの因子による。有効濃度は注目される部位に十分量の標的化物質を標的化し、それにより、残りの試薬と混合すると手術処置中に該部位が光を放つに十分なものである。かかる濃度または量は、マウス異種移植腫瘍モデルまたはウサギ眼病モデルからのデータのようなインビトロおよび／またはインビボデータに基づいて決定してよい。要すれば、コンジュゲートの医薬上許容される塩または他の誘導体を調製してもよい。
【０３８７】
本明細書にて提供されるコンジュゲートの投与に好適な医薬担体またはビヒクルには、特定の投与様式に好適な当業者に公知のかかる担体のいずれもが含まれる。さらに、該コンジュゲートは組成物中の唯一の医薬上成分として処方してもよいし、または他の有効成分と組み合わせてもよい。
【０３８８】
該コンジュゲートは適当な経路、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、または局所のいずれかによって、液体、半液体、または固体形態で投与でき、各投与経路に好適な形で処方される。現在のところ、静脈内または局部投与が好ましい。典型的には、腫瘍および血管増殖疾患は全身、皮内、または筋肉内投与様式によって視覚化される。
【０３８９】
該コンジュゲートは医薬上許容される担体に、検出可能な組織を作り、患者または動物に望ましくない副作用を生じないよう十分な量で含まれる。副作用の数および程度はコンジュゲートが投与される条件によることが理解される。例えば、腫瘍のような生命を脅かす疾病を診断しようとする場合には、ある有毒で望ましくない副作用が許容されるが、あまり重大でない疾患を診断する際には許容されないであろう。
【０３９０】
組成物中のコンジュゲートの濃度はその吸収、不活性化および排泄速度、投与計画および投与量、ならびに当業者に公知なその他の因子によるであろう。典型的には有効用量は有効成分の血清濃度において約０．１ｎｇ／ｍｌないし約５０〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌとなるべきである。典型的には該医薬組成物は選択されたコンジュゲートによって、１日当たり体重キログラム当たりコンジュゲート約０．０１ｍｇないし約１００〜２０００ｍｇの用量を供すべきである。典型的には静脈内投与には、約０．０５ないし１ｍｇ／ｋｇの用量が十分であろう。眼病組織の視覚化または関節への局部注入などについての局部使用では、単用量投与当たり約１ｎｇないし１０００μｇまで、好ましくは約１μｇないし約１００μｇを提供すべきである。投与する量は選択されるコンジュゲート、兆候、および許容される可能性のある副作用の関数であると理解される。用量は認められたモデルを用い、経験的に決定できる。
【０３９１】
該有効成分は一度に投与してもよいし、またはいくつかの少用量に分けて時間をおいて投与してもよい。投与についての正確な用量および時間は診断される病状の関数であり、公知の試験プロトコールを用いるか、またはインビトロまたはインビボ試験データからの推定により経験的に決定してよいものと理解される。また濃度および用量値は緩和しようとする病状の重篤度によって変わることにも注意すべきである。さらに特定の患者いずれに対しても、個々の必要性および投与するまたは組成物の投与を管理する者の専門的判断によって経時的に特異な用量計画を調整すべきこと、および本明細書で示された濃度範囲は単に例示的なものであり、請求される組成物の範囲または実施を限定するものではないと理解される。
【０３９２】
非経口、皮内、皮下、または局所適用に使用される溶剤または懸濁液には次のいずれの成分：注入用の水、塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤のような無菌希釈剤；ベンジルアルコールおよびメチルパラベンのような抗微生物剤；アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩のようなバッファー；ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような浸透圧調整剤を含んでもよい。親製剤をガラス、プラスチックまたはその他の好適な材料で作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに封入してもよい。
【０３９３】
静脈内投与する場合、好適な担体としては生理的食塩水、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）およびグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、ならびにその混合物のような増粘剤および可溶化剤を含む溶液が挙げられる。またリポソーム懸濁液も医薬上許容される担体として好適である。これらは当業者に公知な方法に従って調製され得る。
【０３９４】
該コンジュゲートは徐放性製剤またはコーティング剤のように身体からの急速な排出を防ぐ担体とともに調製してもよい。かかる担体としては、限定されるものではないが、埋植片およびマイクロカプセル封入送達系のような制御放出製剤、および酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ酢酸およびその他のもののような生分解性、生体適合性ポリマーが挙げられる。
【０３９５】
該コンジュゲートはゲル剤、クリーム剤およびローション剤の形で皮膚および眼などの粘膜への局部塗布のような局所または局部適用に、および眼への適用に、または大槽内または髄腔内適用に処方してもよい。かかる水剤、特に眼病用途のものは適当な塩を用いて０．０１％ないし１０％等張溶液、ｐＨ約５ないし７として処方してもよい。また眼病用組成物にはヒアルロン酸のようなさらなる成分を含めてもよい。該コンジュゲートは局部適用のエアゾル剤として処方してもよい（例えば、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号、および第４，３６４，９２３号を参照）。
【０３９６】
また手術処置中にインビボで該コンジュゲートを活性化するための組成物もエアゾル剤として処方してもよい。これらの組成物にはアクチベーターおよびルシフェリン（コンジュゲートがルシフェラーゼを標的化する場合）またはルシフェラーゼ（コンジュゲートが腔腸アジンのようなルシフェリンを標的化する場合）のような残りの生物発光剤も含まれる。
【０３９７】
経口投与が所望されるならば、該コンジュゲートを胃の酸性環境から保護する組成物で提供すべきである。例えば、該組成物は胃内ではそれを完全に保持し、腸内で有効な化合物を放出する腸溶性コーティングにて処方できる。一般に経口組成物に不活性希釈剤または可食担体を含めて打錠するか、またはゼラチンカプセルに封入してもよい。経口投与の目的のためには、該有効化合物または化合物群に賦形剤を配合し、錠剤、カプセル剤、またはトローチ剤の形で使用できる。医薬上適合する結合剤およびアジュバント物質を組成物の一部として含めてもよい。
【０３９８】
錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ剤などは以下の成分、または類似した性質を持つ化合物のいずれを含んでもよい：微晶質セルロース、トランガカントゴムおよびゼラチンのような結合剤；スターチおよびラクトースのような賦形剤、限定されるものではないが、アルギン酸およびコーンスターチのような分散剤；限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；限定されるものではないが、コロイド二酸化珪素のような滑剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；およびペパーミント、サリチル酸メチルおよび果物香味のような香味剤。
【０３９９】
単位投与形がカプセルである場合、それはさらに前記タイプの物質、脂肪油のような液体担体を含んでもよい。また単位用量形は投与単位の物理形態を改変する他の種々の物質、例えば、糖またはその他の腸溶性薬剤のコーティングを含んでもよい。また該コンジュゲートはエリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハース、チューインガムなどの成分として投与してもよい。シロップには有効な化合物とともに、甘味剤としてのスクロース、および少量の防腐剤、染料ならびに着染料および香味料を含んでもよい。
【０４００】
また該有効物質は、所望の作用を損なうことのない他の有効物質と、または腫瘍の治療のためのシスプラチンのような所望の作用を補う物質と混合してもよい。
【０４０１】
最後に、該化合物は、包装材料、包装材料内の本明細書で提供された１以上のコンジュゲートまたは化合物、および該コンジュゲートが提供される適応症を示すラベルを含んだ製品として包装してもよい。
【０４０２】
ｂ．第２の組成物
第２の組成物には生物発光反応の残りの成分が含まれる。これらの成分が全身投与されるという好ましい具体例では、残りの成分にはルシフェリンまたは基質、および所望によりスペクトルシフターのような添加剤、特に本明細書にて提供されるＧＦＰが含まれる。ルシフェリンのようなこれらの成分は、コンジュゲートについての前記したように処方することができる。いくつかの具体例においてこの組成物中のルシフェリンまたはルシフェラーゼはタンパク質担体または他の担体と結合し、血液細胞または他の細胞成分への分解または溶解が妨げられる。
【０４０３】
第２の組成物が局所または局部的に用いられる具体例では、それをスプレー剤またはエアゾル剤もしくは局所または局部使用に好適な他の手段に処方できる。
【０４０４】
本明細書に記載されるある具体例では、組織に対して標的化した徐放性製剤としてカプセル封入するなど、アクチベーターを除く全ての成分を一緒に処方する。放出される際、該組成物は所望の部位に局在化し、光を放ち始める。
【０４０５】
実施上、２種類の組成物は同時投与しても、連続投与してもよい。典型的には、コンジュゲートを含む第１の組成物を最初に、一般には手術の１または２時間前に投与し、次いで第２の組成物を術前または手術中のいずれかに投与する。
【０４０６】
本明細書にて提供されるコンジュゲートには直接、または標的化される物質、ルシフェラーゼ（光タンパク質またはルシフェラーゼ酵素を含む）またはルシフェリンへのリンカーにより結合する組織特異的または腫瘍特異的モノクローナル抗体もしくはその断片などの標的化剤が含まれる。標的化される物質は微粒子担体と組み合わせてもよい。該結合は、化学的に、標的化される物質がタンパク質である場合には融合タンパク質の組換え発現による、また化学的および組換え発現の組合せによるなどいずれかにより達成される。標的化剤は腫瘍細胞表面抗原または他の組織特異的抗原のような選択された組織または細胞種と優先的に結合するものである。
【０４０７】
コンジュゲートの調製法は当業者に公知である。例えば、コンジュゲート形成のために設計されたエクオリンおよびかかるエクオリンを含有するコンジュゲートが製造されている［例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１８３４２を参照；またSmith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratoryも参照］。エクオリンはスルフヒドリル反応結合剤によって抗体分子と結合させた(Stultz et al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli. Biochemistry 31, 1433-1442)。かかる方法を本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したエクオリン製造してもよい。またバルグラルシフェラーゼも他の分子と結合させた［例えば、日本出願第ＪＰ５０６４５８３、１９９３年３月１９日を参照］。かかる方法を本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したエクオリンを製造してもよい。
【０４０８】
エクオリン抗体コンジュゲートを使用し、生物発光反応による発光との直接手的相関によって生物学的サンプル中の特定の抗原の存在を検出または定量した。
【０４０９】
別法として、選択された基質との結合に特に好適なアミノ酸残基の付加によるなど、レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリもしくはガウシアルシフェラーゼまたは生物発光系の成分を結合するために改変してもよい。これはＤＮＡを改変し、かかる改変ＤＮＡを発現させることによって容易に達成され、ＮまたはＣ末端に付加残基を有するルシフェラーゼを得ることができる。
【０４１０】
系の選択は所望の色および所望の生物発光持続時間、ならびに特定の製品のような因子による。標的化剤の選択については主として視覚化しようとする腫瘍または組織のタイプおよび特徴、ならびに視覚化を行う設定による。
【０４１１】
ｃ．標的化剤と組み合わせた反応の実施
各生物発光系と選択された標的化剤が併用される特定の方法は薬剤および視覚化しようとする腫瘍または組織の関数となる。しかしながら、一般には反応物のルシフェリン、レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリ、プルロマムマもしくはガウシアルシフェラーゼまたは他のルシフェラーゼと標的化剤とを結合し、術前に動物へ投与する。手術中に、注目される組織を生物発光系の残りの成分と接触させる。標的化剤が作用するいずれの組織も光を放つであろう。
【０４１２】
生物発光系によって生じたいずれの色の可視光も本明細書の方法における使用について考えられる。可視光は様々な強度および波長をもつ青、緑および／または赤色光の組合せであることが好ましい。近赤外光の波長約７００ないし１３００ｎｍが柔組織および骨質を透過することが知られているため、組織に深く埋め込まれた哺乳類組織または腫瘍を通して腫瘍または特異化組織を視覚化するには、より長い波長の可視光、すなわち赤色および近赤外光が好ましい［例えば、米国特許第４，２８１，６４５号を参照］。
【０４１３】
他の具体例では、手術中に組織一面に無菌溶液を噴霧し、次いで残りの成分を塗布することによるなどして該コンジュゲートを組織に塗布してもよい。標的化された抗原を発現する組織が光を放つ。
【０４１４】
懸濁液、散剤、ペースト剤または他の好適な無菌形態のいずれかのような組成物において試薬を提供することができる。それらをスプレー剤、エアゾル剤、またはいずれの好適な形態で提供してもよい。該試薬をマトリックス、特にインビボ使用に好適、かつそれらが毛細管を通過するサイズを有するマイクロビーズに結合させてもよい。典型的には反応に必要な成分の１種以上を除くすべて、好ましくは１種を除くずべてが混合され、ともに提供され、Ｃａ２＋、レダクターゼを有するＦＭＮ、ＦＭＮＮＨ２、ＡＴＰ、空気または酸素の添加によるなど、合せた成分を残りの成分と接触させて反応を誘発する。
【０４１５】
好ましい具体例では、ルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ／ルシフェリンを患者への投与の前に標的化剤と組み合わせて提供する。次いで標的化剤コンジュゲートを残りの成分とインビボで接触させる。本明細書にて明らかとなるように、各系を選択された標的化剤と組み合わせる数多くの方法がある。
【０４１６】
Ｊ．組合せ
さらに、前記プルロマムマ、ガウシアもしくはレニラルシフェラーゼおよび／またはレニラおよびプチロサルカスＧＦＰを製品と組み合わせて使用して新規な製品を製造する。かかる製品および調製法は同時係属出願の米国出願出願番号８／５９７，２７４および０８／７５７，０４６に詳細に記載されている。同時係属出願にて提供される方法および製品において本明細書で提供されるルシフェラーゼおよび／またはＧＦＰを使用してもよい。これら新規な製品は工業製品であり、エンターテインメント、レクリエーションおよび娯楽に向けて設計されている。これらには限定されるものではないが、玩具、特に水鉄砲、玩具のシガレット、玩具の「ハロウィーン」卵、フットバッグおよびボード／カードゲーム；フィンガーペイントおよび他のペイント、粘液性玩具；布地、特にシャツ、帽子およびスポーツ用具服のような衣類、糸およびヤーン；泡作製玩具および泡を発生させる他の玩具における泡；風船；小像；バスパウダー、ボディローション、ゲル、パウダーおよびクリーム、ネイルポリッシュ、メーキャップ用品を含む化粧品、練り歯磨きおよび他の磨歯剤、石鹸、ボディーペイント、および泡立て溶剤のような身辺アイテム；インク、紙のような製品；ゼラチン、アイシングおよびフロスティングのような食べ物；ルシフェリンおよびトランスジェニック魚類、特にルシフェラーゼを発現するトランスジェニック魚類を含む魚料理；ルシフェリンまたはルシフェラーゼ、好ましくはルシフェラーゼを発現するトランスジェニック植物を使用するためのルシフェリンを含む植物料理；および飲料、例えばビール、ワイン、シャンパン、ソフトドリンク、および角氷ならびに他の形態の氷；液体「花火」および液剤、混合物、懸濁液、粉剤、ペースト剤、粒剤または他の適当な形の組成物の他のかかる噴射剤、スプレー剤またはエアゾル剤を含む噴水器が挙げられる。
【０４１７】
本明細書で提供される生物発光系と組み合わすことができ、それによってエンターテインメント、レクリエーションおよび／または娯楽を提供できるいずれの製品もレクリエーション用の、またはロゴまたは商標と関連した商品および／またはサービスを広告するためなどの注意を引く製品の使用を含め、本明細書で意図される。かかる使用は、かかる製品の通常または標準使用に加えて、またはそれとともに、もしくはその代わりにというものである。組合せの結果として、水鉄砲および噴水器の場合のようにその製品は光を放ち、発光液もしくは液体または粒子のスプレーを生じる。
【０４１８】
Ｋ．使用法
１．腫瘍および他の組織の診断法
レニラ・ムレリもしくはプチロサルカスＧＦＰおよび／またはレニラ・ムレリ、プルロマムマもしくはガウシアルシフェラーゼを含む組成物を使用して、インビボまたはイン シトゥにて組織を、好ましくは腫瘍組織を診断および視覚化する方法を提供する。例えば、レニラ・ムレリＧＦＰタンパク質を、同時係属出願の出願番号０８／９０８，９０９に記載されるもののようなイン シトゥにおける組織の視覚化を生物発光による診断系と併用することができる。該系は非観血的および侵観血的手法中などの腫瘍組織および特異組織を視覚化および検出するのに特に有用である。該系にはレニラ・ムレリＧＦＰ、ルシフェラーゼまたはルシフェリンのような標的化される物質と結合した組織特異的、特に腫瘍特異的標的化剤を含むコンジュゲートを含有する組成物が含まれる。また該系には生物発光反応の残りの成分および／またはＧＦＰを含む第２の組成物も含まれる。いくつかの具体例においてアクチベーターを除くすべての成分はイン シトゥにて提供されるか、または身体もしくは組織に存在し、単一の組成物に含まれている。
【０４１９】
特に診断系には２つの組成が含まれる。好ましい具体例では、生物発光反応の成分と結合した腫瘍抗原に対して向けられた抗体、ルシフェラーゼまたはルシフェリン、好ましくはルシフェラーゼを含むコンジュゲートを含む第１の組成物を提供する。ある具体例では、腫瘍特異的標的化剤含むコンジュゲートをルシフェラーゼまたはルシフェリンと結合させる。他の具体例では、腫瘍特異的標的化剤を好ましくは１以上の生物発光成分と、好ましくは１以上のルシフェラーゼ分子と結合した微粒子担体と結合させる。
【０４２０】
第２の組成物は生物発光系の残りの成分、典型的にはルシフェリンまたはルシフェラーゼ基質を含む。いくつかの具体例では、これらの成分、特にルシフェリンを血清アルブミンのようなタンパク質、または他のタンパク質担体と結合させる。全身投与された成分は担体および徐放性処方によってルシフェリンまたはルシフェラーゼを失活させるヘモグロビンのような血液細胞成分と相互作用することなく標的化された組織まで移動できる。
【０４２１】
２．疾患の診断法
チップ方法論、ガウシア、プルロマムマもしくはレニラ・ムレリルシフェラーゼおよび／またはプチロサルカスもしくはレニラ・ムレリＧＦＰを含むルシフェラーゼ／ルシフェリン生物発光系を使用して、疾患、特に感染症の診断法を提供する。特に該チップには生物発光系および／またはＧＦＰによって放射される光子を検出する内蔵光検出器が含まれる。
【０４２２】
ある具体例では、該チップは同時係属出願の米国出願出願番号０８／９９０，１０３に記載されたもののように光検出器のＸ−Ｙアレイのようなアレイを有する集積回路を使用して作製される。回路の表面を処理して、それをチップが向けられる目的の診断アッセイの病状に対して不活性にし、抗体のような結合分子の誘導体化によるなどして改変する。特に細菌抗原に特異的な抗体のような選択された抗体または抗体のパネルを各光検出器上のチップ表面に付着させる。チップを試験サンプルと接触させた後、チップをレニラＧＦＰのようなＧＦＰと結合した二次抗体と接触させて、プルロマムマ、ガウシアもしくはＲ．ムレリルシフェラーゼのような生物発光系の成分と結合したキメラ抗体−ＧＦＰ融合タンパク質または抗体を形成する。抗体は抗原に特異的である。生物発光反応の残りの成分を加えて、もし生物発光系の成分と結合するいずれかの抗体がチップ上に存在するならば、光を発生させ、近接する光検出器によって検出される。光検出器は機能しうる形でコンピュータに連結され、結合された抗体を確認する情報によってプログラムが作成され、発生を記録し、それによって試験サンプル内に存在する抗原を同定する。
【０４２３】
３．キメラレニラもしくはプチロサルカスＧＦＰ、レニラ・ムレリルシフェラーゼ、プルロマムマルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼ融合タンパク質の生成方法
キメラＧＦＰおよびルシフェラーゼ融合タンパク質の生成方法を提供する。方法には注目される遺伝子をコードするＤＮＡまたはその一部と、本明細書で提供されるＧＦＰまたはルシフェラーゼをコードするＤＮＡとの同一翻訳読み取り枠での結合が含まれる。注目されるコードされたタンパク質はフレーム内でＧＦＰまたはルシフェラーゼのアミノまたはカルボキシ末端と結合し得る。次いでキメラタンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現ベクターのプロモーターエレメントと機能しうる形で連結させる。あるいは、該プロモーターエレメントは注目される標的化遺伝子とＧＦＰまたはルシフェラーゼコード配列から上流に結合したプロモーター含有断片から直接得られ、キメラＧＦＰタンパク質が産生され得る。
【０４２４】
例えば、セルロース結合ドメインのＮ末端部分に結合したガウシアルシフェラーゼコードＤＮＡを含むキメラ融合体が提供される（配列番号２１および２２を参照）。
【０４２５】
４．化合物を同定するための細胞に基づくアッセイ
注目される遺伝子のプロモーターエレメントの制御下でレニラ・ムレリまたはプチロサルカスＧＦＰをコードする異種ＤＮＡを発現する組換え細胞を使用して、化合物を同定するため方法を提供する。組換え細胞を使用して、ＧＦＰが介在する蛍光性を測定することによって注目されるプロモーターからの転写レベルを変調させる化合物またはリガンドを同定することができる。またキメラＧＦＰを発現する組換え細胞を使用し、組換え細胞内におけるＧＦＰ介在蛍光の分布領域を確認することによって遺伝子発現またはタンパク質の流れをモニターするか、または標的タンパク質の細胞分布を決定してもよい。
【０４２６】
Ｌ．キット
診断およびイムノアッセイ法において、本明細書で記載されるものを含む新規な製品とともに使用するためにガウシア、プルロマムマもしくはレニラ・ムレリルシフェラーゼまたはレニラおよびプチロサルカスＧＦＰを含むキットを製造してもよい。
【０４２７】
ある具体例では、該キットには製品と組み合わせた適当な試薬と生物発光のための製品が含まれる。例えば、これらのキットは泡吹き込みまたは発生玩具とともに、または水鉄砲とともに使用することができる。またこれらのキットは再装填または投入カートリッジを含んでもよい。
【０４２８】
もう１つの具体例では、該キットを腫瘍組織および他の組織を検出し視覚化するために使用することもでき、それにはルシフェラーゼおよび／またはレニラ・ムレリもしくはプチロサルカスＧＦＰと生物発光系の少なくとも１成分を含む第１の組成物と生物発光系の残りの成分と必要な活性化剤のいずれもを含んだ活性組成物を含むの第２の組成物が含まれる。
【０４２９】
他の具体例では、該キットをマルチウェルアッセイ装置の使用により疾患、特に感染病を検出し確認するために使用し、それにはそれぞれが内蔵光検出器を有し、１以上の感染原因物質に特異的な抗体または抗体のパネルを付着させる複数のウェルと、例えば、レニラ・ムレリＧＦＰタンパク質、キメラ抗体−レニラ・ムレリＧＦＰ融合タンパク質、Ｆ（Ａｂ）２抗体断片−レニラ・ムレリＧＦＰ融合タンパク質と、または例えば、ガウシアもしくはレニラ・ムレリルシフェラーゼを含むかかるコンジュゲートと結合する感染原因物質に特異的な抗体のような第２の抗体を含む組成物が入ったマルチウェルアッセイ装置が含まれる。第２の組成物は、レニラ・ムレリルシフェラーゼを励起させ、装置の光検出器によって検出される緑色光を放射させて原因物質の存在を示すためのレニラまたはエクオリア種のようなＧＦＰの励起範囲内の波長光を放射する系などの生物発光系の残りの成分を含む。
【０４３０】
さらなる具体例では、該キットは診断系の成分を含む。該キットはコンジュゲート含有組成物、好ましくはレニラもしくはプチロサルカスＧＦＰまたはガウシア、またはプルロマムマもしくはレニラ・ムレリルシフェラーゼおよび残りの生物発光系成分を含んでなる。典型的には該キットの第１の組成物にはＧＦＰまたはルシフェラーゼと結合した標的化剤が含まれる。第２の組成物には少なくともルシフェリン（基質）および／またはルシフェラーゼが含まれる。両組成物は動物への全身、局所または局部使用用に処方される。もう１つの具体例では、第１の組成物には標的化剤と結合したルシフェリンが含まれ、第２の組成物にはルシフェラーゼもしくはルシフェラーゼとＧＦＰが含まれる。
【０４３１】
一般に包装材はそこに入れられた組成物とは反応性がなく、要すれば発光反応の進行にその物質が必要とされる程度まで水および／または空気を排除すべきである。
【０４３２】
診断への適用は、特別な包装を必要とする。生物発光生成試薬は、ペレットで提供され、マイクロカプセルもしくはマクロカプセルにカプセル化し、マトリックス、好ましくは生物適合性、より好ましくは生物分解性マトリックスに結合させ、そして、製造品中もしくは製造品上に入れ、または、製造品内部の小室または他の何らかの形態中の混合物として含有させることができる。例えば、ルシフェラーゼコンジュゲートを含有する組成物は、生物発光基質および生物発光活性化因子を含有する別個の組成物とは別々に、且つそれらと共に使用するために、提供されるであろう。
【０４３３】
同様に、RenillaまたはPtilosarcusのGFP、Pleuromamma、Renilla mulleriまたはGaussiaのルシフェラーゼまたはルシフェリンは、残りの成分と別個に、または組み合わせて、但し活性化成分の不在下に、混合物、懸濁液、溶液、粉末、ペーストである組成物またはその他の適当な組成物の状態で提供することができる。選択された組織を標的とするコンジュゲートをこの組成物と接触させると、反応が開始し、組織が発光する。好ましい態様において、この組織は、510nm付近の光を放射し緑に発光する。ルシフェラーゼ、GFPおよび生物発光基質は、例えば、水および／または空気、生物発光活性化因子を排除して包装する。投与および標的部位での放出の際、当該部位における塩類またはその他の因子(外科的手段の場合は空気を包含する)との反応が、因子を活性化するであろう。
【０４３４】
1．GFPおよび生物発光系構成成分の組み合わせのための分配および包装装置
本明細書に詳細を記載する生物発光系は、少なくとも3つの構成成分：生物発光基質［例えばルシフェリン］、ルシフェラーゼ［例えばルシフェラーゼまたは発光蛋白］好ましくはGaussia、PleuromammaまたはRenilla mulleriルシフェラーゼ、および生物発光活性化因子(群)［例えば分子状酸素またはCa2+］、そして、所望によりRenillaまたはPtilosarcus GFP、を含んでいる。分配および包装装置は、この構成成分のうち少なくとも1つが、生物発光の生成が望まれるまでは、残りの成分と分離して維持されるよう、形作られる。係る装置の詳細な説明は、同一出願人による同時出願の米国特許出願第08/757046号および08/597274号に記載されており、これらを引用して本明細書の一部とする。
【０４３５】
2．カプセル、ペレット、リポソーム、エンドソーム、液胞、微細粒子
或る態様においては、本組成物の一つの成分を、使用前に環境から隔離すること、または成分を粒子形態、例えば微細粒子の形態で供給することが必要であるかも知れない。係る用途のための好適な手段の例は、例えばカプセル化された材料の分散または溶解により、内容物の放出を可能にする材料でできた、１個のまたはマイクロ［大きさが約100μmまで］もしくはマクロ粒子［100μMより大］内に生物発光生成システムの成分をカプセル化することを包含する。数多くのコンジュゲートを結合させることのできるマイクロ粒子が特に好ましい態様である。このマイクロ粒子は生物適合性であり、好ましくは毛細管壁を通過できる大きさである。
【０４３６】
リポソームおよびその他のカプセル化媒体［例えば、ゼラチン内への化合物のカプセル化を記載している米国特許第4525306号を参照されたく；米国特許第4021364号、4225581号、4269821号、4322311号、4324683号、4329332号、4525306号、4963368号は、種々のポリマー内への生物活性材料のカプセル化を記載している］は当業者に知られており、本明細書に論じられているもの、および、当業者に知られているものを包含する［例えば、可溶性紙。米国特許第3859125号を参照されたい。］。
【０４３７】
a．一般的なカプセル化媒体
酸素または水またはCa2+を除く生物発光生成システムの成分は、選択される系にもよるが、内容物を環境中に放出させるような状態に置かれるまでは、内容物を環境から保護する、リポソームのようなカプセル化材料中に入れることができる。本発明における使用のために企図されるカプセル化材料は、リポソーム、およびドラッグデリバリー媒体のような、化学物質のカプセル化に使用されるその他のこのような材料を包含する。
【０４３８】
b．カプセル化媒体  −  リポソーム
例えば、溶存酸素またはCa2+またはルシフェラーゼ系のためのATPまでをも含有する、血液のような媒質中に成分を溶解させ徐々に放出するリポソームが、本発明において企図される。これは、例えば黒色腫を診断または視覚化する方法といったような局所適用のために、溶液、懸濁液、ゲル、ローション、クリーム、および軟膏といった組成物に調合することができる。リポソームおよびその他の徐放性カプセル化組成物が良く知られており、且つ、生物発光生成成分の徐放性デリバリーへの使用に適合させることができる。典型的には、GFP、ルシフェリンおよび／またはルシフェラーゼを、酸素またはCa2+またはATPまたはその他の活性化成分の不在下にカプセル化することができる。この成分を適当な濃度で含有する環境または媒質中に放出されると、反応が進行し、発光が引き起こされるであろう。一般に、可視化にとって充分な高い局所濃度を放出時に保証するためには、カプセル化された成分の濃度は比較的高くなければならず、ことによると0.1−1mg/mLまたはそれ以上であるべきである。
【０４３９】
リポソームまたはその他の、軟膏もしくは持続放出局所用媒質中に調合される持続放出デリバリー系は、例えば、ボディーペイント、ローションへの使用に好適であろう。懸濁液として調合したものは、スプレーとして有用であろう。多数の軟膏および好適なリポソーム調合物が知られている［例えば、Liposome Technology, Targeted Drug Delivery and Biological Interaction, vol III, G.Gregoriadis編,CRC Press,Inc.,1984；米国特許第5470881号；5366881号；5296231号；5272079号；5225212号；5190762号；5188837号；5188837号；4921757号；4522811号を参照されたい］。例えば、適切な軟膏媒質は、ペトロラタム、鉱油および／または無水液体ラノリンを含むであろう。リポソーム、膜またはコンタクトレンズデリバリー系、またはゲル形成可塑性ポリマーのような持続放出媒質もまた好適なデリバリー媒体であろう。局所デリバリー用リポソームは良く知られている［例えば、米国特許第5296231号；Mezei et al.(1980)  “Liposomes - A selective drug delivery system for the topical route of administration, I. lotion dosage form” Life Sciences 26:1473-1477; Mezei et al.(1981) “ Liposomes - A selective drug delivery system for the topical route of administration: gel dosage form” Journal of Pharmacy and Pharmacology 34:473-474; Gesztes et al.(1988) “Topical anaesthesia of the skin by liposome-encapsulated tetracaine” Anesthesis and Analgesia 67:1079-1081; Patel(1985) “Liposomes as a controlled-release system” Biochemical Soc.Trans. 13:513-516; Wohlrab et al.(1987) “Penetration kinetics of liposomal hydrocortisone in human skin” Dermatologica 174:18-22を参照されたい］。
【０４４０】
リポソームは、選択された混合物を含有し、その内容物を、持続放出的に徐々に放出することのできる、マイクロカプセル［典型的には、直径がほぼ0.1ないし20μm未満］である。標的を持つリポソームまたはその他のカプセル、特に、酸素、空気、水分、可視光もしくは紫外［UV］光または特定のpHもしくは温度に暴露された時に溶解する、時間放出被覆剤［例えば、米国特許第4882165号；Kusumi et al.(1989) Chem.Lett. no.3 433-436; Koch Troels et al. (1990) Bioconjugate Chem. 4:296-304; 米国特許第5482719号；米国特許第5411730号；米国特許第4891043号；Straubinger et al. (1983) Cell 32:1069-1079; およびStraubinger et al. (1985) FEBS Lttrs. 179:148-154; およびDuzgunes et al. 、成書CELL FUSION(A.E. Sowers編)11章；Ellens et al. (1984) Biochemistry 23:1532-1538; Yatvin et al. (1987) Methods in Enzymology 149:77-87を参照されたい］が使用できる。ベーキングにおける使用のためのリポソーム調合物［例えば米国特許第4999208号を参照されたい］が利用できる。これらは、食された時または加熱された時に内容物を放出する。このようなリポソームは、静脈内または局所投与に好適となり得る。
【０４４１】
リポソームは当業者に既知の方法により、製造される［例えば、Kimm et al.(1983) Bioch. Bioph.Acta 728:339-398; Assil et al. (1987) Arch Ophthalmol. 105:400; および米国特許第4522811号、ならびに本明細書に記載され当業者に知られるその他の引用文献を参照されたい］。
【０４４２】
低いpHに対し感受性のリポソーム［例えば、米国特許第5352448号、5296231号；5283122号；5277913号、4789633号を参照されたい］は、アルカリ物質と共に使用するのに特に適している。低いpHの洗浄剤または石鹸組成物または高pH組成物と接触する時、リポソームの内容物が放出される。その他の成分、とりわけCa+または水中の溶存O2の存在は、この成分が放出される際に該成分の発光を惹起するであろう。温度感受性リポソームもまた、浴槽の温水中への放出のための入浴剤への使用に好適である。
【０４４３】
c．カプセル化媒体  −  ゼラチンおよびポリマー媒質
空気もしくは光との接触または温度変化の時にその内容物を溶解または放出する、ゼラチンまたはその他のこのようなポリマーでできたマクロもしくはマイクロカプセルもまた、生物発光生成システムの成分をカプセル化するために使用できる。
【０４４４】
このようなマイクロカプセルまたはマクロカプセルは、さらに、GFPまたはルシフェラーゼおよび生物発光生成成分が該抗体により標的へと運ばれ、次いで発光を導くため該成分が放出されるように、標的物質、例えば抗体とコンジュゲートさせることもできる。
【０４４５】
エクオリン系は、この適用のために特に好適である。これは、生物発光の放射を防止するためのEDTAのような充分なキレート化剤を伴う緩衝液の懸濁液または溶液中に、またはペーストもしくはその他の適当な形態としてカプセル化することができる。緩衝液または血液のような、CA2+を含有する水分にカプセル［マイクロカプセルまたはマイクロカプセル］が暴露すると、放出された成分が発光するであろう。
【０４４６】
このように、カプセル化された生物発光生成成分は、様々な標的物質と組み合わせて使用でき、それにより、例えば空気に暴露した時に光る、Renilla mulleri、Pleuromamma、PtilosarcusまたはGaussia系、といったようなルシフェラーゼ／ルシフェリンを放出する。
【０４４７】
生物発光系と共に使用するための、その他のカプセル化容器または媒体は、水に充分溶解してその内容物を放出するもの、または、手で圧迫すると容易に開口するもの、または、水性混合物と混合する時内容物が拡散するものである。これらの容器は水を排除して製造することができ、その結果、生物発光系の成分は乾燥し、その中に入れることができる。例えば水性組成物溶液または大気中といったように、水に暴露される時、この媒体は内容物を溶解またはその他のやり方で放出し、成分は反応し発光する。同様に、この生物発光生成成分の全体より少ない幾らかの部分をそれ自身ペレット形態で製造することができる。例えば、この成分(群)をゼラチンまたは類似の硬化剤と混合し、必要ならば鋳型に注ぎ、乾燥して、堅い、水溶性のペレットを製造することができる。カプセル化容器または媒体は、生物適合性のゼラチンまたは類似の水溶性材料で生成することができる。
【０４４８】
d．エンドソームおよび液胞
媒体は、RenillaまたはPtilosarcus GFPまたはRenilla mulleri、PleuromammaまたはGaussiaルシフェラーゼが発現される組換え宿主細胞から、エンドソームまたは液胞を使用して、当業者に知られる方法を用いて製造することができる［例えば、米国特許第5284646号、5342607号、5352432号、5484589号、5192679号、5206161号、および5360726号を参照されたい］。例えば、大腸菌のような宿主中で発現することにより産生されるエクオリンは、蛋白合成後に、エンドソームまたは液胞といったようなベシクル内部に分離できる。常法を用いて細胞を溶解し、ベシクルを、その内容物と共に無傷で放出させる。このベシクルは、デリバリーベシクルとしての働きを有する。使用の際、これらには、コエレンテラジンのようなルシフェリン、および溶存酸素が、拡散により、または加圧下に、またはその他の適当な手段により、負荷される。
【０４４９】
e．微細粒子
エクオリン発光蛋白、Renilla系、Ptilosarcus、PleuromammaおよびGaussia系といったような、凍結乾燥に好適な生物発光生成システムの成分は、微粉化して細かい粉末とし、乾燥条件下に、例えば乾燥剤と共に、保存することができる。供給された、または添加された溶液の形の、溶存酸素または空気中もしくはミスト中のCa2+との接触により、この粒子の溶解および発光が惹起される。
【０４５０】
3．固定化系
a．マトリックス材料
幾つかの態様においては、GFP、または生物発光生成システムのうち少なくとも一つの成分をマトリックス基質に結合させ、次いでこれを局所投与または全身投与することが望ましい。このマトリックス基質は生物適合性であろう。所望により、残りの成分を含有する混合物(群)、典型的には液体混合物を、マトリックス基質上に注ぎ、または噴霧することにより適用して、発光を引き出す。例えば、コエレンテラジンを包含するエクオリン発光蛋白および酸素を、基質と結合させる。所望により、Ca2+を含有する液体、例えば水道水または、好ましくは適当な緩衝液中にCa2+を含有する液体混合物を、例えば噴霧によって、ルシフェラーゼを結合させたマトリックスに接触させる。GFPの存在下で接触すると、この材料は緑色に発光する。
【０４５１】
別の態様においては、Renilla GFP、Renilla mulleriまたはGaussia、Pleuromammaルシフェラーゼまたはその他のルシフェラーゼ、例えばVargulaルシフェラーゼを基質材料と結合させ、適当な緩衝液中にルシフェリンを含有する液体混合物と接触させる。接触は、噴霧、注ぎかけまたはその他の適当なやり方で実施することができる。このマトリックス材料は、外科用海綿のような製造品の中にもしくはその表面に取り込まれ、または同製造品に形作られ、またはマイクロビーズの一部とされる。
【０４５２】
正確な成分、および適用または保存の最適手段は、選択された生物発光系の関数であることが理解される。実験的に決定できる成分の濃度は重要ではないが、結合した時に目に見える発光を産むのに充分でなければならない。典型的な濃度はナノモル/Lまで低く、好ましくはmg/L程度またはそれ以上である。基質上の濃度は、このような典型的濃度を含有する組成物が材料に適用される時に生み出される濃度である。さらに、このような理想的な濃度は、第一の組成物を適用し、それを乾燥し、第二の組成物を噴霧し、そして結果を観察することにより、実験的に容易に決定することができる。
【０４５３】
本発明により企図されるマトリックス材料基質は一般に、リガンドおよびその他の分子を固定化するために使用される不溶性材料であり、そして、多くの化学合成および分離に使用される材料である。このようなマトリックスは、好ましくは生物適合性の、より好ましくは生物分解性の材料から製造する。マトリックスとも呼ばれるこのような基質は、例えば親和クロマトグラフィーに、生物活性材料の固定化に、そして蛋白、アミノ酸およびその他の有機分子およびポリマーを包含する生体分子の化学合成中に使用される。マトリックスの製造およびその用途は当業者に良く知られており、このような材料およびその製品は数多く知られている。例えば、アガロースおよびセルロースのような天然に存在するマトリックス材料は、それぞれの供給源から分離し、既知のプロトコルに従って加工することができ、合成材料は、既知のプロトコルに従って製造することができる。本発明に使用するためのその他のマトリックスは、蛋白、例えばアルブミンのような担体分子を含んでよい。
【０４５４】
基質マトリックスは、典型的には、固体の、多孔性の、変形可能な、または堅い、そして、ビーズ、ペレット、円板、毛細管、中空繊維、針状物、固体繊維、不揃いの形、薄膜および膜を包含する、任意の必要な構造および幾何学的配置を有する、不溶性材料である。したがって、この物品は、全表面もしくはその一部を被覆し、または粒子を含浸させることにより、マトリックス材料から製造され、またはそれと合することができる。
【０４５５】
典型的には、マトリックスを粒子化する場合、この粒子は少なくとも約10-2000μMであるが、選択された適用法に応じてこれより小さくても大きくてもよい。マトリックスの選択は、少なくとも部分的には、それらの物理的および化学的性質、例えば溶解性、官能基、機械的安定性、表面領域膨脹傾向、疎水性または親水性、ならびに意図される用途によって決定されるであろう。本発明に係る使用のためには、マトリックスは好ましくは生物適合性の、より好ましくは生物分解性のマトリックスである。
【０４５６】
必要ならば、支持体マトリックス材料を処理して適当な反応性部分を含むように、または、幾つかの場合には、既に反応性部分を含む市販品を入手でき、それにより、分子が結合する時にマトリックス支持体としての働きをすることができる。アミノシラン結合、ヒドロキシ結合またはカルボキシシラン結合といった反応性表面部分を含む材料は、シラン化反応などを含む十分に確立された表面化学技術によって製造することができる。これらの材料の例は、γ−アミノプロピルシランに共有結合した、表面酸化ケイ素部分、およびその他の有機部分を有するもの；N−[3−(トリエチオキシシリル)プロピル]フテラミン酸；およびビス−(2−ヒドロキシエチル)アミノプロピルトリエトキシシランである。アミノ基反応性官能性を含む容易に入手し得る材料の例は、パラ−アミノフェニルトリエチオキシシランを包含するが、これに限定される訳ではない。さらに、誘導体化されたポリスチレン類およびその他のこのようなポリマーが良く知られており、且つ、当業者にとって容易に入手できる［例えば、多数の官能基を有するTentagel(商標)樹脂が入手可能であり、これはRapp Polymere(ツービンゲン、ドイツ)により販売されている；米国特許第4908405号および米国特許第5292814号を参照されたく；また、Butz et al. (1994) Peptide Res. 7:20-23；Kleine et al. (1994) Immunobiol. 190:53-66をも参照されたい］。
【０４５７】
これらのマトリックス材料は、興味のある分子の結合のための支持マトリックスとして作用する任意の材料を包含する。係る材料は当業者に知られており、支持体マトリックスとして使用されるものを包含する。これらの材料は、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、硝子、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼン等と架橋したポリスチレン［Merrifield(1964) Biochemistry 3:1385-1390を参照されたい］、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然海綿を包含し、これらに限定されない無機、天然ポリマー、および合成ポリマーを包含するが、これらに限定される訳ではない。このうち特に興味深いものは、高度多孔性の硝子［例えば、米国特許第4244721号を参照されたい］、ならびにホウケイ酸、アルコールおよび水を混合することにより製造されるその他のものである。
【０４５８】
合成マトリックスは、アクリルアミド、デキストラン誘導体およびデキストランコポリマー、アガロース−ポリアクリルアミド混和物、種々の官能基を有するその他のポリマーおよびコポリマー、メタクリレート誘導体およびコポリマー、ポリスチレンおよびポリスチレンコポリマーを包含するが、これらに限定される訳ではない［例えば、Merrifield(1964) Biochemistry 3:1385-1390；Berg et al. (1990)、Innovation Perspect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., 国際シンポジウム、第1回、Epton, Roger(編), 453-459頁；Berg et al. (1989) Pept. Proc. Eur. Pept. Symp. 第20回、Jung,G et al.(編),196-198頁；Berg et al. (1989) J.Am. Chem. Soc. 111:8024-8026；Kent et al. (1979) Isr. J. Chem. 17:243-247；Kent et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2845-2852；Mitchell et al. (1976) Tetrahedron Lett. 42:3795-3798；米国特許第4507230号；米国特許第4006117号；および米国特許第5389449号を参照されたい］。このようなマトリックスの製造方法は当業者に良く知られている。
【０４５９】
合成マトリックスは、ポリマーおよびコポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、アクリラートおよびアクリル酸、例えばポリエチレン−コ−アクリル酸、ポリエチレン−コ−メタクリル酸、ポリエチレン−コ−エチルアクリラート、ポリエチレン−コ−メチルアクリラート、ポリプロピレン−コ−アクリル酸、ポリプロピレン−コ−メチルアクリル酸、ポリプロピレン−コ−エチルアクリラート、ポリプロピレン−コ−メチルアクリラート、ポリエチレン−コ−ビニルアセタート、ポリプロピレン−コ−ビニルアセタート、および、酸無水物基を含むもの、例えば、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリプロピレン−コ−無水マレイン酸等から製造されるものを包含する。リポソームもまた、親和精製のための固体支持体として使用されている［Powell et al. (1989) Biotechnol.Bioeng. 33:173］。
【０４６０】
例えば、米国特許第5403750号は、ポリウレタンを基礎とするポリマーの製造を記載している。米国特許第4241537号は、鎖を伸長させたポリオールから製造される親水性ポリウレタンゲル組成物を含有する植物成長培地を記載しており；酸化プロピレン単位50%までの無作為共重合が好ましく、その結果、プレポリマーが室温下で液体となるであろう。米国特許第3939123号は、35%までのポリ(プロピレンオキシ)グリコールまたはポリ(ブチレンオキシ)グリコールを伴うポリ(エチレンオキシ)グリコールを含有する、イソシアナートで終了するプレポリマーの、緩く架橋したポリウレタンポリマーを記載している。これらのポリマーを製造する際には、架橋剤として有機ポリアミンを使用する。その他のマトリックスおよびその製造は、米国特許第4177038号、4175183号、4439585号、4485227号、4569981号、5092992号、5334640号、5328603号に記載されている。
【０４６１】
米国特許第4162355号は親和クロマトグラフィーでの使用に好適なポリマーを記載しており、これは、アミンイミドのポリマー、および、少なくとも1個の垂下ハロメチル基を有するビニル化合物である。親和クロマトグラフィーにおける結合部位を与えるアミンリガンドは、この垂下ハロメチル基の一部との反応によりポリマーに結合し、そして残りの垂下ハロメチル基は、垂下親水基を含むアミンと反応する。このポリマーを用いて基質を被覆する方法もまた記載されている。アミンイミドの例は、1,1−ジメチル−1−(2−ヒドロキシオクチル)アミン メタクリルイミドであり、ビニル化合物はクロロメチルスチレンである。
【０４６２】
米国特許第4171412号は、好ましくはマクロ細孔性の、親水性ポリマーゲルを基礎とする特異的マトリックスを記載しており、これは、共有結合したD−アミノ酸またはD−アミノ酸単位を含むペプチドを運搬する。基本的な支持体は、架橋するアクリラートを伴うアクリル酸およびメタクリル酸のヒドロキシアルキルエステルまたはヒドロキシアルキルアミドの共重合によって製造され、または、メタクリラートコモノマーを、ジアミン、アミノ酸またはジカルボン酸との反応により修飾し、そして得られたカルボキシ末端またはアミノ末端基を、アミノ酸またはペプチドのD−類似体と縮合させる。D−アミノ酸を含むペプチドもまた、担体表面上で段階的に合成することができる。
【０４６３】
米国特許第4178439号は、陽イオン交換体およびその製造法を記載している。米国特許第4180524号は、シリカ支持体上での化学合成を記載している。
【０４６４】
固定化した人工膜［IAM；例えば、米国特許第4931498号および4927879号を参照されたい］もまた使用できる。IAMは細胞膜環境を模しており、細胞膜に専ら結合する分子の結合に使用することができる［例えば、Pidgeon et al. (1990) Enzyme Microb.Technol. 12:149を参照されたい］。
【０４６５】
これらの材料はさらに、製造品、外科用海綿、石鹸およびその他の物品の製造に使用でき、よって、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、両者の混合物のいずれかの分子の結合に好適である。例えば、マトリックス粒子を物品に含浸させ、次いでこれを活性化因子に接触させることができる。
【０４６６】
GFPまたは生物発光生成成分の被覆を施したまたは施していないマトリックス材料を包含する部材、および残りの成分を含む組成物、の入ったキットが提供される。
【０４６７】
b．固定化および活性化
蛋白およびその他の生体分子を不溶性または液体支持体上に固定化するための数多くの方法が開発されている［例えば、Mosbach(1976) Methods in Enzymology 44；Weetall(1975) Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides；およびKennedy et al.(1983) Solid Phase Biochemistry, Analytical and Synthetic Aspects, Scouten(編) 253-391頁を参照されたい；一般的には、Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, 34巻、W.B.Jakoby、M.Wilchek(編)、Acad.Press,N.Y.(1974)；Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine and Biology, 42巻、R.Dunlap編、Prenum Press,N.Y.(1974)を参照されたい］。
【０４６８】
中でも、直接に、またはリンカー、例えば当業者により知られている数多くのジスルフィド結合、チオエステル結合、束縛されたジスルフィド結合、および、遊離の反応性基、例えばアミンおよびチオール基の間の共有結合、を介して支持体に共有結合させ、または吸収および吸着させることが最も一般的に用いられる方法である［例えば、PIERCE CATALOG, Immuno Technology Catalog & Handbook,1992-1993(これは、このような試薬の製造および用途を記載しており、係る試薬の商業的供給源を提供している)；およびWong(1993) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Pressを参照されたい。；さらに、Dewitt et al. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90:6909；Zuckermann et al. (1992) J.Am.Chem.Soc. 114:10646；Kurth et al. (1994) J.Am.Chem.Soc. 116:2661；Ellman et al. (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:4708；Sucholeiki (1994) Tetrahedron Lttrs. 35:7307；およびSu-Sun Wang (1976) J.Org.Chem. 41:3258；Padwa et al. (1971) J.Org.Chem. 41:3550およびVedejs et al. (1984) J.Org.Chem. 49:575(これらは光感受性リンカーを記載している)をも参照されたい。］。
【０４６９】
固定化を実施するためには、蛋白またはその他の生体分子の溶液を、アルミナ、炭素、イオン交換樹脂、セルロース、硝子またはセラミックのような支持体材料に接触させる。フルオロカーボンポリマーが支持体として使用されており、生体分子は吸着によってここに結合する［米国特許第3843443号；公開された国際PCT出願WO/86 03840を参照されたい］。本発明の目的のため、支持体材料は生物適合性(即ち、身体への使用に適している)であろう。
【０４７０】
蛋白および核酸を包含する生物学的分子を固体支持体に結合するための多岐にわたる方法が知られている［例えば、米国特許第5451683号を参照されたい］。例えば、米国特許第4681870号は、シリカマトリックス上に遊離のアミノまたはカルボキシ基を導入する方法を記載している。引き続きこれらの基は、カルボジイミドの存在下に、蛋白または他の抗リガンドのようなその他の基に共有結合させることができる。別法として、シリカマトリックスは、アルカリ条件下に、ハロゲン化シアンと処理することにより活性化することができる。抗リガンドは、活性化された表面に添加する時、この表面に共有結合する。もう一つの方法は、ビオチン、アビジンおよび増量剤の多層を連続的に適用することにより、ポリマー表面を修飾することを含み［例えば、米国特許第4282287号を参照されたい］；別の方法は、光感受性の非天然アミノ酸基をポリペプチド鎖中に組み込み、この生成物を低エネルギー紫外光に暴露することにより、ポリペプチド鎖を固体基質に結合させる、光活性化を含んでいる［例えば、米国特許第4762881号を参照されたい］。オリゴヌクレオチドもまた、ソラレン化合物のような光化学的に活性な試薬、および、この光試薬を基質に結合させる結合剤を使用して、結合させた［例えば、米国特許第4542102号および米国特許第4562157号を参照されたい］。光試薬の光活性化は、核酸分子を基質に結合させて、表面に結合したプローブを生成する。
【０４７１】
化学的に活性化された固体マトリックス支持体、例えば硝子、合成ポリマー、および架橋した多糖類への、蛋白またはその他の生体分子または有機分子または生物学的粒子の共有結合は、より頻繁に用いられる固定化技術である。この分子または生物学的粒子は、マトリックス支持体に直接結合させ、または金属といったようなリンカーを介して結合させることができる［例えば、米国特許第4179402号、およびSmith et al. (1992) Methods: A Companion to Methods in Enz. 4:73-78を参照されたい］。この方法の例は、多糖類支持体、例えばアガロースの、臭化シアン活性化である。酵素の固定化のためのペルフルオロカーボンポリマーを基礎とする支持体および親和クロマトグラフィーの使用が米国特許第4885250号に記載されている。この方法では、まず、生体分子を、ペルフルオロアルキル化剤、例えば米国特許第4954444号に記載のペルフルオロオクチルプロピルイソシアナートとの反応により修飾する。次いでこの修飾された蛋白をフルオロカーボン支持体上に吸着させて固定化を実施する。
【０４７２】
マトリックスの活性化および用途は良く知られており、このような既知の方法により実施することができる［例えば、Hermanson et al. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc.、サンディエゴ、を参照されたい］。例えば、アミノ酸の結合は、当業者に良く知られ、且つ、例えばStewartおよびYoung、1984、Solid Phase Synthesis第2版、Pierce Chemical Co.、ロックフォード、に提供されている技術により達成することができる。
【０４７３】
分子を固体支持体に結合させるその他の好適な方法が当業者に良く知られている［例えば、米国特許第5416193号を参照されたい］。これらは、例えば蛋白のような分子を支持体に化学的に結合させるのに好適なリンカーであり、ジスルフィド結合、チオエステル結合、束縛されたジスルフィド結合、ならびに、アミンおよびチオール基のような遊離の反応性基の間の共有結合を包含するが、これらに限定される訳ではない。これらの結合は、片方または両方の部分に反応性チオール基を作り、次いで片方の部分にあるチオール基を、他方にある、反応性チオール基と、または、反応性マレイミド基もしくはチオール基が結合することのできるアミン基と反応させる、ヘテロ二価試薬を使用して生成することができる。その他のリンカーは、酸で開裂し得るリンカー、例えばビスマレイミデオトキシプロパン、酸不安定性トランスフェリンコンジュゲート、および、より酸性の細胞内コンパートメントにおいて開裂する、アジピン酸ジヒドラジド；UVまたは可視光への暴露時に開裂する架橋剤、ならびに種々のドメインといったようなリンカー、例えばヒトIgG1の定常領域由来のCH1、CH2およびCH3を包含する（例えば、Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386を参照されたい）。現在好ましい結合は、分子をマトリックス表面に吸着させることにより行う直接結合である。その他の結合は、光への暴露により活性化させることのできる光開裂可能な結合である［例えば、Goldmacher et al.(1992) Bioconi. Chem. 3:104-107を参照されたく、そのリンカーは引用により本明細書の一部とする］。光開裂可能なリンカーは、開裂する波長が結合した部分を損傷しないように選択する。光開裂可能なリンカーは、光に暴露された時に開裂するリンカーである［例えば、システインのための光開裂可能な保護基としてのニトロベンジル基の使用を記載している、Hazum et al.(1981) Pept., Proc.Eur.Pept.Symp.16th、Brunfeldt,K(編)、105-110頁；ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメチルローダミンコポリマーを包含する、水溶性光開裂可能コポリマーを記載している、Yen et al.(1989) Makromol. Chem. 190:69-82；UV光(350nm)付近に暴露される時、光分解性分解を受ける試薬および架橋剤を記載している、Goldmacher et al.(1992) Bioconi. Chem. 3:104-107；および、光開裂可能な結合を生成するニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋剤を記載している、Senter et al.(1985) Photochem. Photobiol. 42:231-237を参照されたい］。選ばれたリンカーは、その適用に依存し、そして、必要ならば実験的に選択することができる。
【０４７４】
分子を支持体に結合するこれらの方法は、標的を狙う試薬を標的となっている試薬に結合させるための用途に適合させることができる。
【０４７５】
M．生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)系
自然界では、コエレンテラジンを使用するルシフェラーゼは、広域バンドの青緑色光を放射する(最大~480nm)。生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)は、ヒドロ虫類のObeliaの研究から最初に推論された自然現象であり(Morin & Hastings (1971) J.Cell Physiol. 77:313-18)、これにより、インビボで観察される緑色の生物発光の放射が、ルシフェラーゼが非放射的にエネルギーを副次的緑色蛍光蛋白(GFP)に移動させる結果であることが示された。BRETは、その後まもなく、ヒドロ虫類Aequorea victoriaおよび花虫綱Renilla reniformsで観察された。精製されたルシフェラーゼおよびGFPとの間のインビトロでのエネルギー移動は、Aequorea(Morise et al.(1974) Biochemistry 13:2656-62)およびRenilla(Ward & Cormier(1976) J.Phys.Chem. 80:2289-91)系で立証されたが、重要な相違は、溶液中において有効な無放射エネルギー移動は、明らかに、1個のルシフェラーゼ分子と1個のGFPホモダイマーとのプレ結合により、Renillaでのみ起こるということである（Ward & Cormier(1978) Photochem. Photobiol. 27:389-96） 。Renillaルシフェラーゼの青色(486nm)蛍光の放射は、適切な量のRenilla GFPを添加すると、狭いバンドの緑色の放射(508nm)へと完全に変換することができる(Ward & Cormier(1976) J.Phys.Chem. 80:2289-91)。GFPは、励起状態のルシフェラーゼ-基質複合体からエネルギーを受け取り、この光を狭域バンドの緑色光(~510nm)として再放射する。この非放射エネルギー移動により、ルシフェラーゼの量子収量が増加する。
【０４７６】
ルシフェラーゼおよび蛍光蛋白は、蛋白標識および転写レポーターとして、数多くの良く開発され且つ貴重な用途を持っている；BRETは、これらの適用の感度および範囲を増大させる可能性を持っている。GFPは、量子収量を上げることにより、ルシフェラーゼレポーターの感度を増大させる。幾つかのスペクトル上別個のGFPに融合させた単一のルシフェラーゼは、単一のルシフェリンの添加により活性化された多数のルシフェラーゼレポーターの同時使用を可能にする。同一のルシフェラーゼに融合させた異なる放射波長を有するGFPをそれぞれ含有する、2種の融合蛋白を製造することにより、2またはそれ以上のレポーターを、単一の基質の添加と共に使用することができる。したがって、単一の試薬の添加を用いて、多数の事象を監視、または多数の検定を実行することができる。ルシフェリンの分布が均一または再生産可能であるならば、このようなレポーター系は、自己供給性である。
【０４７７】
細胞内の幾つかのマクロ分子的事象を簡便に同時監視できるという事は、現行の生物発光技術に優る、大きな改善である。さらにBRETは、ルシフェラーゼおよび蛍光蛋白の結合または方向の変化を利用することにより、全く新しいレポーティングのやり方を可能にする。融合蛋白を製造することにより、ルシフェラーゼ-GFP受容体の対が生成し、融合部分の結合またはコンホメーションの変化に応答し、これによりセンサーとして働く。
【０４７８】
生理学的レポーターとしての二つの蛍光蛋白の間のエネルギー移動(FRET)が報告されており［Miyawaki et al. (1997) Nature 388:882-7］、ここでは、2つの異なるGFPをカルモジュリンのカルボキシおよびアミノ末端に融合させた。カルシウムイオン濃度の変化がカルモジュリンに充分なコンホメーションの変化を惹起し、GFP部分の間のエネルギー移動のレベルを変化させた。供与体の放射において観察された変化は、~10%であり、変化の割合は~1.8であった。
【０４７９】
本明細書に記載される基質ルシフェリン存在下でのルシフェラーゼ-GFPの同様な用途は、重要な利点を有する。第一に、一次励起光からの受容体のバックグラウンドおよび励起が無い。第二に、ルシフェラーゼの量子収量はGFPへの非放射的移動により大きく増強されるため、供与体の放射からのバックグラウンドはより小さく、そして受容体からのシグナルは相対的により大きくなる。第三に、ルシフェラーゼのピーク放射(~480nm)からGFPのピーク放射(典型的には508-510nm)への波長シフトが大きく、シグナルの重複を最小限とする。これら全ての因子が結びついてシグナル-ノイズ比を大きくする。GFP受容体の濃度は蛍光を用いて個別に確認できる。
【０４８０】
幾つかの適用のためには、インビトロ架橋された、またはそれ以外にインビトロ修飾された天然蛋白が企図される。遺伝的にコード化された融合蛋白は多くの優れた利点を有する：A）インビボの用途  −  化学に基づくルミネセンスまたは放射性に基づく検定と異なり、融合蛋白は生体細胞または生体全体の中に遺伝的に組み込むことができる。この事は、適用の可能性の範囲を著しく増大させる；B）可撓性のある且つ正確な修飾  −  多数の異なる応答修飾要素を、与えられたルシフェラーゼ-GFP対の中に再生産的且つ定量的に組み込むことができる；C）単純な精製  −  精製には一つの試薬が必要であるに過ぎず、その精製は蛍光蛋白部分を介して監視することができる。リガンド結合モチーフを組み込んで、親和精製法を容易にすることができる。
【０４８１】
1．BRETに基づくセンサーの設計
二つの発色団の間の共鳴エネルギーの移動は、供与体および受容体発色団の間の距離およびそれらの空間における相対的方向に、極めて鋭敏である（Wu & Brand (1984) Anal. Biochem. 218:1-13）。エネルギー移動の効率は、発色団の間隙の6倍に逆比例する。実際には、有用な距離範囲は約10ないし100Aであって、これにより、共鳴エネルギー移動が、生物学的マクロ分子の相互作用を研究するための非常に有用な技術となった。様々な蛍光に基づくFRETバイオセンサーが組み立てられており、当初は蛋白または膜性分にコンジュゲートさせた化学的蛍光体を使用していたが、近年は、スペクトル上別個のGFP変異体の対を使用している［Giuliano & Taylor (1998) Trends Biotech. 16:99-146；Tsien (1988) Annu. Rev. Biochem. 67:509-44］。
【０４８２】
これらの遺伝的にコード化されたGFP生物発光に基づくバイオセンサーは、より簡便性の低い且つより正確性の低い化学的コンジュゲートに基づくバイオセンサーに優る利点を持っているが、これらは全て設計に制限がある：発色団が最も近接した位置関係にある場合、エネルギー移動が定量的なバイオセンサーを組み立てることは一般に困難である。コンジュゲート化したまたは内在する発色団が最小の間隔且つ最適な向きに安定に位置するよう、蛋白の複雑な立体化学を自由に操作することは殆ど不可能である。係るバイオセンサーの有効性はまた、しばしば共鳴エネルギー供与体および受容体の間の化学量論的不均衡によっても制限される；供与体および受容体であるマクロ分子は、複合体形成していない発色団から放射されるバックグラウンドシグナルを回避するよう、定量的に複合体化されねばならない。一般的設計におけるこれらの制限は、バイオセンサーが、丈夫であり、簡便であり且つ安価でなければならない場合、重要となる。候補薬物のための高スループットスクリーニング(高スループットスクリーニング(HTS)プロトコルを使用)、バイオチップおよび環境監視系といった開発途上の技術は、微量の標的のシグナルの「ヒット」(例えば、二つのポリペプチド間の複合体形成)が、大過剰の「非ヒット」と明確に(統計学的に)識別可能である、モジュラー様式のバイオセンサーから、多大な利益を得るであろう。現在の遺伝的にコード化されたFRETおよび生物発光に基づくバイオセンサーは、非常にしばしば、非ヒットシグナルの二倍未満、良くて数倍の大きさのヒットシグナルを示すに過ぎない［Xu et al. (1999) Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:151-156；Miyawaki et al. (1997) Nature 388:882-7］。
【０４８３】
これらの問題を解決するために、本発明において提供される花虫綱のGFP、例えばRenilla GFPを、それらと同起源のルシフェラーゼと組み合わせて使用することができる。花虫綱ルシフェラーゼ-GFP複合体は、与えられたバイオセンサーに特異的な生物学的性質を付与する蛋白ドメインがそこに結合する時、「骨格」を提供する。この骨格を基礎とする多くの有用な二成分バイオセンサーを組み立てることができるが、本発明において企図されるバイオセンサーでは、互いに複合体形成する可能性のある独立した蛋白ドメインが、それぞれルシフェラーゼおよびGFPと融合する。
【０４８４】
分離の際、花虫綱ルシフェラーゼは、コエレンテラジン由来の発色団から青色光を放射し(A)、青緑色光で励起された花虫綱GFPは、その完全なペプチドに基づく発蛍光団から緑色光を放射する(B)。ルシフェラーゼおよびGFPがインビボまたはインビトロで複合体として結合する時、ルシフェラーゼはその反応エネルギーをGFO発蛍光団に非放射的に移動させ、これが次に緑色を放射する(C)。したがって、ルシフェラーゼ-GFP複合体を破壊するいかなる分子相互作用も、緑色光に対する青色光の比を観測することによって定量的に監視することができる(D)。
【０４８５】
この主題には多くの可能な変法がある。例えば、三成分系において、ルシフェラーゼまたはGFPのいずれかを、目的とする蛋白またはその他の標的ペプチドまたはその他の目的とする部分由来のリガンド結合ドメインに融合させることができる。この融合蛋白の設計が正しければ、小さな分子または蛋白リガンドの結合が、ルシフェラーゼ-GFP結合を妨害し、BRETを基礎とするバイオセンサーを得たことになる。より複雑な蛋白融合を設計して、数多くの用途のための、二成分BRETバイオセンサーを、そして単一成分BRETバイオセンサーでさえ作り出すことができる。
【０４８６】
図11は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)の基礎原理およびセンサーとしてのその使用を示している：A）分離の際、ルシフェラーゼ、好ましくは花虫綱ルシフェラーゼは、コエレンテラジン由来の発色団から青色光を放射する；B）分離の際、青緑色光で励起されているGFP、好ましくはルシフェラーゼと結合する花虫綱GFPは、その固有ペプチドに基づく発蛍光団から緑色光を放射する；C）ルシフェラーゼおよびGFPがインビボまたはインビトロで複合体として結合する時、ルシフェラーゼはその反応エネルギーをGFP発蛍光団に非放射的に移動させ、これが次に緑色を放射する；D）ルシフェラーゼ-GFP複合体を破壊するいかなる分子相互作用も、緑色光から青色光へのスペクトルのシフトを観測することにより、定量的に監視することができる。
【０４８７】
本発明に係る核酸、ならびに組み立て物およびプラスミドは、同起源花虫綱ルシフェラーゼと共に、花虫綱GFP、例えばRenillaを包含する、融合蛋白の様々なコンフィギュレーションの製造を可能にする。GFPをコード化している核酸は、ルシフェラーゼをコード化している核酸と隣接させて、または例えば目的蛋白のリガンド結合ドメインをコード化している核酸の挿入により、その核酸と離して融合させることができる。GFPおよびルシフェラーゼは結合するであろう。リガンド結合ドメインと被験化合物またはその他の部分との相互作用の際、GFPおよびルシフェラーゼの相互作用が変化し、それにより該複合体の放射シグナルが変化する。必要ならば、GFPおよびルシフェラーゼを、この相互作用を微調整するために修飾し、これをコンホメーションの変化または温度もしくはその他のパラメータに対してさらに鋭敏にすることができる。
【０４８８】
2．BRETセンサーの利点
本発明において提供されるBRETセンサーには数多くの利点がある。例えば、BRETセンサーは自己供給性である。レポーターおよび標的は一つのポリペプチドに統合される。この事により、ルシフェラーゼ、GFPおよび標的の間の1:1:1の化学量論が保証される(または、1以上、典型的にはホモダイマーのGFPがルシフェラーゼに結合できるならば、1:N:1の化学量論)。GFPの蛍光はセンサーの絶対定量を可能とする。零の状態は、センサーの機能性を立証するシグナルを与える。定量可能な零状態は、BRET破壊センサー(DBRET)を促進する。BRETセンサーは、GFP FRETセンサーより、雑音に対すルシグナルの比が良好である。何故なら、細胞の自己蛍光が無く、一次励起光からの受容体の励起が無く、ルシフェラーゼの量子収量が、GFPへの非放射的エネルギー移動により極めて増強され、そして、ルシフェラーゼの放射とGFPの放射の間のシグナル重複が最小限であるためである。さらに、花虫綱のGFPは、AequoreaのGFPよりも6倍高い吸光係数を持っている。
【０４８９】
BRETセンサーは、培養細胞および組織ならびに動物を包含する、インビトロまたはインビボまたはインシトゥのスクリーニング検定において、ヒットの同定および下流評価のために使用することができる。BRETセンサーは熱による終点選択によって作り出すことができ、それは、DBRET(BRETの破壊)に適しており、標的の3D構造および機能動力学についての知識の必要性を減じる。存在している、バイオセンサーを最適化するためのスクリーニングロボット工学。甚大な遺伝的多様性のある花虫綱由来のBRETセンサーの利点によって、効率的なルシフェラーゼ-GFPエネルギー移動系が案出されており、その構成成分は混合し適合させることができる。効率の高いヘテロローガスなルシフェラーゼを、より活性の低いルシフェラーゼに代えて使用することができる。例えば、橈脚類ルシフェラーゼの活性部位を、花虫綱ルシフェラーゼGFP結合ドメインに融合させることができる。多岐にわたる数多くのコエレンテラジン使用ルシフェラーゼがある。
【０４９０】
BRETセンサーは、最適化したセンサーの骨組みを異なる標的と共に使用できるよう、組み立て式である。また、BRET受容体は、シフトした放射を与えるよう、多様であってよく、複数情報の同時読み出しを容易にする。例えばエクオリン(Ca++により活性化された)光蛋白、または条件付き活性化を起こさせるための蛍ルシフェラーゼ(ATPおよび蛍ルシフェリンを必要とする)を使用することにより、花虫綱GFPは突然変異させることができ、GFPまたはその他の蛋白は相異なる化学的蛍光体で修飾することができ、高スループットスクリーニング(HTS)蛍光体修飾FRET受容体は適合させることができ、BRET供与体(ルシフェラーゼ)は多様化させることができる。センサーの骨格は、試薬の容量を減らすことのできる自由フォーマットプレート、再使用可能な微量定量板、微小カラムおよびバイオチップを包含する、様々な固定化モチーフに組み入れることができる。最後に、BRETセンサーは、標準化された蛋白生成により生成でき、精製の最終段階に組み込むことができるため、安価で再生産可能な試薬である。遺伝的にコード化されたレポーターは、化学的に修飾されたレポーターよりさらに再生産可能である。BRETモジュールの直線状翻訳はセンサーの完全性を確実とする。
【０４９１】
以下の実施例は説明目的のためにのみ記載するものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０４９２】
実施例１
Ｉ．毒物学
１．コエレンテラジンの溶解性
コエレンテラジンは非刺激性媒体に溶ける。コエレンテラジンは約０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４００の溶液に少なくとも２００マイクログラム／ｍＬの濃度まで可溶である。この溶液はわずかに高張であるが、媒体を目的とする場合には刺激性ではない。
２．コエレンテラジンの毒物学
【０４９３】
Ａ．局所投与
上記のコエレンテラジン溶液の毒性学を検討するために、標準手法に従い該溶液を麻酔したウサギの眼に投与し、結膜の刺激を測定した。動物をジアゼパム（約２ｍｇ／ｋｇ）で鎮静化させ、コエレンテラジンのＰＥＧ溶液１００μＬを一方の目に点滴し、他方の目にはＰＥＧ媒体のみを点滴した。動物は３０分間観察し、次いで、結膜の刺激並びに角膜の潰瘍がないか注意深く検査した。検査は細隙灯を用い、十分に視覚化することで実施した。媒体による最小の結膜刺激のみが両眼に観察された（ｎ＝３）。このように、この溶液中でコエレンテラジン約２０μｇを眼に直接投与したが、この局所検定では、刺激も潰瘍も、また他の毒性徴候も生じなかった。
【０４９４】
Ｂ．静脈内投与
第二の実験においては、コエレンテラジン（ｎ＝６）１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）または媒体（ｎ＝６）をマウスに７日間投与する。マウスは、その挙動から証明される毒性の肉眼的な徴候につき、研究の全期間にわたり検査した。一週間経過の最終日に、屠殺寸前、心臓穿刺により血液を採集する。動物を屠殺し、死後に１０種の異なる組織サンプルを各動物から取出す。分離した組織を固定し、染色し、ブロックし、切片化する。組織サンプルの病理分析を実施し、毒性データを集めた。コエレンテラジンを３日間毎日投与したが、試験動物に肉眼的な挙動の変化はなかった。
【０４９５】
Ｃ．コエレンテラジンの安定性
コエレンテラジンの安定性は、コエレンテラジンの存在とそれから誘導される代謝産物につき生物サンプルを分析することにより決定することができる。この実験では、血液を採取し、血清を調製するが、この血清はコエレンテラジンおよびその代謝産物についてアッセイすることができる。わずかな干渉がコエレンテラジンに必要な発光波長において血清（マウス）から観察された。
【０４９６】
別法として、肝臓の小葉を各動物から切除し、別々にプールし、固定化し、冷却酸性アセトン中でホモジネートとし、標準的生化学分析法によりコエレンテラジンおよびその代謝産物についてアッセイする。
【０４９７】
Ｄ．コエレンテラジンのアッセイ
コエレンテラジンはそれが本来有する蛍光の性質を用い、定量することができる。例えば、コエレンテラジンはアルコール溶媒中、特定の波長で蛍光を測定することにより測定し得る。これまでの検出限界は１０ｎｇ／ｍｌ未満である。ここで企図した用量であれば、正確な測定のためにはこの感度レベルで十分である。
【０４９８】
コエレンテラジンの濃度は蛍光検出と組合わせたＨＰＬＣを用いて決定してもよい。ＨＰＬＣをベースとする検出システムに加えて、コエレンテラジンおよびその代謝物はガス・クロマトグラフィー（ＧＣ）により、あるいはマス・スペクトロメトリー分析により同定することも可能である。コエレンテラジンおよびその代謝産物同定の最終確認は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により実施することができる。
【０４９９】
発光タンパク質接合体の調製法
生物発光活性を保持する発光タンパク質接合体の調製法については、記載がある（米国特許５，４８６，４５５参照）。一般に、トローツ（Trauts）試薬（２−イミノチオラン）で発光タンパク質を処理することにより、発光タンパク質にさらなるスルフヒドリル基を導入し、スルフヒドリル活性化発光タンパク質を生成させる。スルフヒドリル活性化発光タンパク質はスルフヒドリル反応性結合試薬に接合させる（例えば、マレイミド−またはスルホ−ＳＭＣＣ、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへキサン−１−カルボン酸エステルなど、スルフヒドリル架橋し得るヘテロ二官能性リンカーで化学的に修飾した高分子）。接合した発光タンパク質は粗製の形状で使用してもよいし、またはさらに、例えば、イオン交換もしくはアフィニティクロマトグラフィーなど、当業者既知の方法により精製してもよい。
【０５００】
実施例２
げっ歯類モデル
ヒト腫瘍抗原（例えば、ルイス抗原または癌胎児性抗原［ＣＥＡ］）に対するモノクローナル抗体またはそのヒト化誘導体を、スルフヒドリル結合法により、発光タンパク質、好ましくはエクオリンに、またはヴァーギュラ（vargula）ルシフェラーゼに接合し（米国特許５，４８６，４５５参照）、その接合体を精製する。大よそ１０〜１００マイクログラムの抗体−発光タンパク質接合体を、ヒト腫瘍抗原発現のトランスジェニックマウス尾部血管に静注する。注射は動物が十分に耐え得るものであるべきである。
【０５０１】
抗体結合に十分な時間（２〜４８時間）をとった後、コエレンテラジン約１μｇ、または残りの生物発光生成成分を含む粗製の溶解物１０μＬを、企図した新生物部分に直接ｉ．ｐ．注射する。あるいは、溶解物１０μＬまたはコエレンテラジン１μｇをｉ．ｐ．注射し、コエレンテラジンが標的の部分に循環する時間をとる（２５分ないし２日間）。
【０５０２】
次いで、マウスを麻酔し、新生物を含む部分を暗室にて露出する。光度計または人の目により判定される発光部分を外科的取出し手術の標的とする。あるいは、対象の領域を、新生物部位近辺に腹腔鏡を挿入し、次いで、光を観察する位置に画像カメラを設置して視覚化してもよい。
【０５０３】
実施例３
Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするＤＮＡの単離と同定
１．Renilla mulleriｃＤＮＡ発現ライブラリーの調製
R. mulleriｃＤＮＡ発現ライブラリーは市販入手のラムダ−ＵｎｉＺＡＰ ＸＲベクターキット（ストラタジーン）を用い、提供された指示書に従い調製した。簡単に述べると、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩアダプターをｃＤＮＡフラグメントの５'−末端に結合し、結合したｃＤＮＡフラグメントを残余の未結合アダプターから精製した。精製したｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−とＸｈｏＩ−消化したλＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターに結合し、感応大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞に形質転換し、得られるＤＮＡをλファージ・ヘルパー抽出物（ギガパック・プラス・キット、ストラタジーン）によりウイルス粒子にパッケージ化した。パッケージ化ラムダライブラリーを大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞中で力価測定し、Renilla mulleri ｃＤＮＡ発現ライブラリーの配列複雑度を計算し、約１．７３×１０６独立プラークであるとした。
【０５０４】
プラスミドライブラリーはクローン化したRenillaｃＤＮＡを保持するイニシエーター−ターミネーターカセットの切除によりラムダｃＤＮＡ発現ライブラリーから誘導した。約２×１０８独立プラーク単離体をプールし、大腸菌ＳＯＬＲ細胞（ストラタジーン）を感染するのに用い、これを次いで繊維状ヘルパーファージＶＣＳＭ１３、Ｒ４０８またはエクサシスト（ExAssist）ヘルパーファージ（ストラタジーン）により同時感染させた。ｃＤＮＡ含有プラスミドを、切除ｐＢＫプラスミド含有細胞選択用の２００μｇ／ｍｌアンピシリン補填固形培地上に、感染した細胞を塗付することにより回収した。
【０５０５】
大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞において、ｐＢＫプラスミド内のRenilla mulleriＧＦＰの発現はｌａｃＺプロモーターの制御下にあり、その転写はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加することで誘導されるが、またはスプレーの形態でもしくは他のエーロゾルとして直接コロニーに適用してもよい。
【０５０６】
２．ＤＮＡライブラリースクリーニング
RenillaＧＦＰを発現するクローンを同定するために、青色光（例えば、４９０ｎｍ）を使用する機能的スクリーニング法を用い、RenillaＧＦＰを発現する蛍光ＧＦＰ形質転換体を同定した。RenillaｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリーは、感応性大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞を形質転換し、その形質転換混合物の一部をカーボンブラック含有２００μｇ／ｍｌアンピシリン補填Ｌ−ブロスプレート上に塗付することによりスクリーニングしたが、カーボンブラックはバックグランドの蛍光を（例えば、寒天から）完全に吸収させるために加えた。プレートは４９０ｎｍを中心とする狭いバンド幅の光線で照射し、技術上一般に知られた方法を用いて、５１０ｎｍの狭いバンドパスフィルターを通して観察した（例えば、Ward et al. (1978) J. Biol. Chem. 254: 781-788参照）。
【０５０７】
約３〜４×１０６の個々のコロニーをスクリーニングし、３つの発光コロニーを同定した。上記の株がＧＦＰをエンコードするプラスミドを取込んだことを確認するために、プラスミド−エンコードタンパク質のスペクトル特性を、細胞溶解物および部分的に精製した細胞抽出物を用い、評価した（例えば、実施例４参照）。部分的に精製した組換えRenilla mulleriＧＦＰの蛍光励起スペクトルは、他の種類のウミシイタケについて報告されたものに類似していた（４９８ｎｍ近辺の最大値）；しかし、組換えRenilla mulleriＧＦＰの発光スペクトルは５０６ｎｍ近辺に波長最大値をもち、この値は天然産のRenillaＧＦＰで得られる生体外および生体内発光スペクトルよりも僅かに短い波長最大値である（例えば、５０９ｎｍ；Wampler et al. (1973) Biochem. Biophys. Acta 314: 104-109 参照）。
【０５０８】
３．Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の決定と特性化
プラスミドＤＮＡを蛍光形質転換体の培養物から精製し、RenillaｃＤＮＡプラスミド挿入断片のヌクレオチド配列を当業者周知の方法により決定した（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.)。
【０５０９】
完全長Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするｃＤＮＡフラグメントは１，０７９ｎｔの長さであり、５'非コーディング配列の２５８ｎｔ、２３８個のアミノ酸ポリペプチドをエンコードする７１４ｎｔのオープン読み枠、および３'非コーディング配列の１０７ｎｔを含む。
【０５１０】
RenillaＧＦＰをエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、唯一他の種のＧＦＰであって、その完全なヌクレオチド配列が既知であるA. victoriaＧＦＰのヌクレオチド配列と比較した（例えば、配列番号１参照）。２つの生物体から単離した核酸は同一の長さのタンパク質をエンコードするが、しかし、Renilla mulleriＧＦＰのアミノ末端１３６アミノ酸残基をエンコードするヌクレオチド配列は、A. victoriaに比較して一致するのは４８．８％のみである。さらに、Renilla mulleriＧＦＰのカルボキシ末端１０２アミノ酸残基をエンコードするヌクレオチド配列は、さらにより多様であり、一致するのはわずかに３１．４％である。
【０５１１】
Renilla mulleriＧＦＰとA. victoriaＧＦＰの推定アミノ酸配列を比較すると、タンパク質の配列もまた高次に多様である。推定アミノ酸配列間の２３８アミノ酸残基の内、５６個のみが一致する（すなわち、２３．５％直接アミノ酸同一性）。さらに、Renilla mulleriの推定ヘキサペプチド発色団（ＦＱＹＧＮＲ）の推測配列は、６個の同一アミノ酸残基の内、３個のみをもつA. victoriaのもの（ＦＳＹＧＶＱ）とはまったく異なる。また、Renilla mulleriの発色団はA. victoriaＧＦＰに比べて、ポリペプチド鎖内のわずかに異なる位置に配置されている。Renilla mulleriの発色団はアミノ酸残基６８〜７３によりエンコードされるが、A. victoria発色団はアミノ酸残基６４〜６９によりエンコードされている。このわずかに異なる位置と変化している発色団配列が２つのタンパク質が示す異なるスペクトル特性に恐らく寄与している。
【０５１２】
実施例４
Renilla mulleriルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡの同定と単離
実施例３に記載したRenilla mulleriｃＤＮＡプラスミドライブラリーを大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞に形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリンを補填し、かつ、バックグランドの蛍光を吸収するカーボンブラックをも補填したＬ−ブロスプレート上に、形質転換混合物の一部を塗付することにより、単一のコロニーを得た。このプレートを３７℃で一夜培養した。アンピシリン耐性形質転換体に１ｍＭ−ＩＰＴＧ溶液を噴霧し、ルシフェラーゼ発現を誘発した。細胞がルシフェラーゼを発現するための時間をとった後、プレートの表面に２０ｍＭコエレンテラジン含有溶液を噴霧し、青色光発光コロニーを青バンド幅フィルターにより可視化した。生物発光形質転換体の培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、陽性クローンｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列を決定した。完全長Renilla mulleriルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を配列番号１７に示す。Renilla mulleriルシフェラーゼをエンコードするｃＤＮＡフラグメントは１，２１７ｎｔの長さであり、５'非コーディング配列の３０ｎｔ、３１１個のアミノ酸ポリペプチドをエンコードする９３３ｎｔのオープン読み枠、および３'非コーディング配列の２５４ｎｔを含む。
【０５１３】
実施例５
Renillaルシフェラーゼの組換え産生
１．ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼの組換え産生
ファージミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア）は多目的ＤＮＡベクターであって、生体外での転写用に設計され、バクテリアを宿主とする組換えタンパク質の発現に有用である。このベクターはアンピシリンへの抵抗性による形質転換体の選択を可能とするｂｌａ遺伝子と、ｌａｃＺ’遺伝子に隣接するポリリンカー部位を含む。対象の異種遺伝子をポリリンカーに挿入し、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導によりｌａｃプロモーターから転写する。
【０５１４】
ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡはクローン化されている（例えば、米国特許５，２９２，６５８および５，４１８，１５５参照）。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１は、ｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩとＳｓｔＩ部位に挿入された２．２ＫｂｐのＥｃｏＲＩからＳｓｔＩ ＤＮＡまでのフラグメント上にRenillaルシフェラーゼをエンコードする（プラスミドの構築は米国特許５，２９２，６５８および５，４１８，１５５に記載されている；Lorenz et al.(1991) Isolation and Expression of a cDNA encoding Renilla reniformis Luciferase（ウミシイタケ・ルシフェラーゼをエンコードするｃＤＮＡの単離と発現）、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 4438-4442も参照)。RenillaルシフェラーゼｃＤＮＡの転写開始はｌａｃＺ’プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１を取込む大腸菌株は、生物発光アッセイに機能的であるRenillaルシフェラーゼを発現し、本来の酵素の特性を保持する（例えば、米国特許５，２９２，６５８および５，４１８，１５５参照）。
【０５１５】
ｐＴＺＲＬｕｃ−１の誘導体、ｐＴＺＲＬｕｃ−３．６は、同じ大腸菌宿主に形質転換した場合、ｐＴＺＲＬｕｃ−１よりも約７倍高いレベルの組換えRenillaルシフェラーゼを産生する。感応性大腸菌株ＸＬ−１を、製造業者提供の指示書に従い、精製したｐＴＺＲＬｕｃ−３．６により形質転換した（ＸＬ−１超感応性細胞とプロトコール；ストラタジーン、インク、ラ・ホーラ、ＣＡ）。形質転換体は１００μｇ／ｍｌアンピシリン補填ルリア・ブロス（ＬＢ）上に塗付することにより選択した。
【０５１６】
単一のアンピシリン抵抗性コロニーは１００μｇ／ｍｌアンピシリン補填ＬＢ培地にて、細胞増殖が中間対数期に達するまで、連続的な振盪により外気温にて増殖させた（すなわち、細胞培養がＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜０．８単位に達する）。ｌａｃプロモーターからの転写を１ｍＭのＩＰＴＧ添加により誘発し、細胞培養物をさらに８時間、外気温にて振盪した。
【０５１７】
細胞は１０，０００×ｇで遠心分離して収獲し、−２０℃にて凍結する。細胞のペレットを融解し、リゾチーム４ｍｇ／ｍｌ（シグマ・ケミカル・コープ）含有の１０ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）に１：５の比（ｗ／ｗ）で再懸濁した。細胞を２５℃の水槽に３０分間置き、次いで１時間、氷に移した。この細胞をウルトラソニック・インク細胞破砕機からの１分間のパルスにより０℃で超音波処理して溶解した。
【０５１８】
溶解した細胞破片を３０，０００×ｇで３時間遠心分離して取出し、上清はデカンテーションし保持した。ペレットは上記の溶液に１：５の比で再懸濁し、次いで、培養、溶解および遠心工程を繰返した。２つの上清を併合し、−７０℃に保存した。得られる“浄化溶解物”を組換えルシフェラーゼ源として採用した。あるいは、溶解物はさらなる精製工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは免疫アフィニティクロマトグラフィー）に付してさらに濃縮するか、または均一な精製酵素源としてもよい（例えば、米国特許５，２９２，６５８および５，４１８，１５５参照）。
【０５１９】
別法として、組換えRenilla mulleriルシフェラーゼは、Renilla reniformisルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡを、Renilla mulleriルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１８に示したアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡに置換えて発現させてもよい。
【０５２０】
実施例６
癌細胞の検出
ルシフェラーゼに基づく生物発光検出法は、癌細胞の可視化と正確な位置づけに広く利用し得る。かかる利用において、RenillaＧＦＰ、Renilla mulleriルシフェラーゼまたはルシフェリン分子は標的作因、例えば、抗腫瘍抗原抗体であって、その抗原を発現するある種癌細胞を特異的に認識する抗体に接合することができる。あるいは、ルシフェラーゼを微小担体に結合し、標的作因をルシフェラーゼおよび／または微小担体に接合する。接合体を、例えば、静脈内、腹腔内または皮下注射により、または外科手術に際し腹腔鏡もしくはトロカールを用いて局所投与または直接投与により被験者に導入する。抗体−抗原複合体の形成を経て、ルシフェラーゼまたはルシフェリンは標的癌細胞に結合し、ルシフェリン基質（該接合体がルシフェラーゼを含む場合）またはルシフェラーゼ酵素（該接合体がルシフェリンを含む場合）との相互作用に利用する。このように、基質または酵素は、次いで、例えば、注射または塗付により被験者に導入し、抗体接合体に含まれるパートナー分子と反応させ、接合体が抗体−抗原複合体として安定に存在する的確な領域のみで容易に検出し得る発光を生じさせる。
【０５２１】
この生物発光検出システムの感度と生物適合性は、新生物がより進行した、また潜在的に生命を脅かす段階にまで生長した後にのみ癌細胞を検出し得る他の感度の劣る方法に比べて、癌の初期段階、例えば、少数の癌細胞の発見を可能とする。加えて、本明細書に開示した診断方法は、浸襲的な外科的処置を必要とせずに利用することができる。例えば、外科的観察装置、コンピュータートモグラムまたは縮小型外科的観察用具など、上に見る、患者組織を通して放なたれる低レベルの可視赤光および近赤外光を検出するように修飾されたものを用いて、同時係属共有の米国特許出願番号０８／９９０，１０３に記載されたように、外科処置の助けとなる。
【０５２２】
該生物発光検出システムは、特に、癌病巣を取除くための外科的手法に適用可能である。RenillaＧＦＰ、Renilla mulleriルシフェラーゼおよび／またはルシフェリン分子を、例えば、腫瘍に対して標的化すると、病巣の境界描出が正確となり、それによって周辺の健康な組織を除去せずに、癌のより確実な切除と完全な除去を容易なものとする。このことは、神経組織などの複雑な致命的組織での癌病巣を切除するのに決定的に重要である。また、生物発光生成システムの感度は、それを術後の評価と転移の同定に非常に適したものとし、その場合の少数の残存癌細胞を検出する能力は、癌を根絶する手技の有効性についてのより正確な評価を可能とする。
【０５２３】
該生物発光生成システムは、癌の進行と拡大をモニターするのにさらに使用し得ることが判明している。かかる情報は、癌患者の治療において、治療法の有効性、例えば、化学療法および放射線療法の有効性、ならびに薬物を基本とする療法の効能を評価するのに非常に貴重である。
【０５２４】
子宮頚癌の検出
ルシフェラーゼ・ベースの生物発光検出システムは子宮頚癌の検出に使用することができる。例えば、ルシフェリンまたはルシフェラーゼは、直接またはリンカーもしくは微小担体を介して、子宮頚癌細胞抗原に特異的な抗体に接合する（例えば、表３参照）。該接合体は、次いで、適切な製剤として子宮頚部組織に直接塗付し、次いですすいで未結合の接合体を除去する。生物発光反応の残余の成分、すなわち、もし接合体がルシフェラーゼを含んでいるならばルシフェリンであり、もし接合体がルシフェリンを含んでいるならばルシフェラーゼである成分を、次いで必要な活性化因子と共に子宮頚部組織に塗付し、結合した接合体と相互作用させる。次いで、光放射をモニターする。発光は人の目で検出し得る可視波長であるのがよい。もし認識された抗原を提示する癌細胞が組織中に存在するならば、それらの細胞は赤くなり、それによって可視化される。生物発光はより正確な癌の位置を示すのに役立ち、それが癌病巣の除去において外科医を手引きする。
【０５２５】
癌胎児抗原（ＣＥＡ）の検出
また、ルシフェラーゼに基いた生物発光検出システムは、ＣＥＡを呈する腫瘍性細胞、例えば結腸直腸癌に存在する癌細胞の検出においても使用され得る（例、表３参照）。この適用法では、ルシフェラーゼまたはルシフェリンを、直接的または間接的にＣＥＡに特異的な抗体へコンジュゲートし、子宮頸癌の検出について上述した方法と同じ要領で検出を行う。例えば結腸壁、さらにはリンパ管へのＣＥＡ担持癌細胞の移動についても、この検出システムでモニターすることができる。さらに、強度の低い可視光線でも検出する修正腹腔鏡を用いることにより、ＣＥＡ担持癌細胞の検出および視覚化を向上させることができる。
【０５２６】
膀胱癌の検出
膀胱癌を検出するため、ルシフェラーゼまたはルシフェリンを、ターゲッティング剤、例えば、膀胱癌細胞に現れた抗原を認識する抗体にコンジュゲートすることは、癌病変部へコンジュゲートを結合させるのに役立つ。コンジュゲートを、例えばカテーテルにより膀胱へ導入すると、病変部が視覚化され、それに続いて生物発光反応の残存成分を膀胱へ導入すると、輪郭が明らかにされる。この態様は膀胱の泌尿器癌に特に有用であり、それらは電気メスを用いた膀胱壁に位置する腫瘍の経尿道焼灼により手術中に容易に除去される。この技術により、健康な膀胱組織の焼灼は最小限に抑えられ、転移の可能性がある領域が確認され、さらに標的の完全な外科的除去が確実に行われる。
【０５２７】
別の態様において、ルシフェラーゼ結合微粒子に結合されたターゲッティング剤で腫瘍の存在を検出することにより、腫瘍性膀胱組織の位置および縁が非常に詳細に明確化され得る。ターゲッティング剤コンジュゲートの投与後、生物発光反応が開始される（すなわち、ルシフェリンおよび／または何らかの活性化因子の添加により）。近くの周囲組織に対して指向されるかまたは同一の非腫瘍形成性組織を優先的に標的とするターゲッティング剤に、第２のＧＦＰ結合微粒子を共有結合させる。ＧＦＰコンジュゲートを患者に投与する。すなわち、例えば、腫瘍性組織は、例えばエクオリンまたはRenillaルシフェラーゼ−ターゲッティング剤コンジュゲートを用いると、青色光線を放って輝き、ＧＦＰ−結合周囲組織は青色光線を吸収して緑色光線を放つことによりさらにコントラストを生じさせ、手術で摘出されるべき組織の縁が明確に特定される。
【０５２８】
遊走性癌細胞伝播の検出
例えば皮膚黒色腫、深層胸部腫瘍および結腸癌に端を発する肝臓転移からの遊走性癌細胞によるリンパ系の浸潤は、生物発光検出システムを用いると容易に検出され得る。ターゲッティング剤、例えば癌細胞抗原を認識する抗体にコンジュゲートされたルシフェラーゼまたはルシフェリンは、遊走プロセスのどこに位置しておろうと、細胞と特異的に複合体を形成する。次いで、残存生物発光発生成分を全身に循環させると、それらはコンジュゲートが結合されている細胞のみと相互作用する。癌細胞が皮膚表面またはその付近の上皮組織を侵している場合、コンジュゲートおよび／または相手分子を局所適用することにより生じる発光は、侵襲的方法を用いずとも肉眼で容易に検出できる。さらに、光電子増倍管または外科用拡大透視装置を用いても、皮膚を通した光放射量が増幅され得る。この方法で、手術を試みる前に、腫瘍細胞のリンパ遊走を追跡することが可能となり得る。
【０５２９】
乳癌の検出
乳癌の早期発見の利点、例えば生存率が増加し、処置に関する選択の幅も広がることについては、数多くかつ詳細に立証されている。生物発光検出システムにより、乳癌の早期診断を容易にする高感度の方法が提供される。例えば、上記適用において、ルシフェラーゼまたはルシフェリンは、正常乳房組織とは対照的に乳癌組織で数の多大な増加が見られる分子を標的とする抗エストロゲンまたは抗プロゲステロン受容体抗体にコンジュゲートされ得る。すなわち、この本質的には定量的な検定システムの場合、診断は、例えば胸部組織バイオプシーにおいて検出される発光レベルに依存する。発光レベルは、光度計、光電子増倍管または他の適当な手段を用いて定量され得る。
【０５３０】
別法として、ターゲッティング剤は、赤色光線を発するアリストストミアス（Aristostomias）、マラコステウス（Malacosteus）またはパキストミアス（Pachystomias）から単離されたルシフェラーゼに直接的または間接的に結合され得る［例、Widderら（１９８４）Science ２２５：５１２−５１４］。特に好ましいのは、アリストストミアス・シンチランス（Aristostomias scintillans）およびマラコステウス・ニゲル（Malacosteus niger）といった種類から単離された生物発光成分である。この適用では、ルシフェラーゼ含有ターゲッティング剤を患者に投与した後、生物発光発生系の残存成分（例、ルシフェリンおよび／または活性化因子）を投与する。この波長での光線放射は、光電子増倍管、コンピューター断層撮影機を用いるかまたは赤色光線に対する感度が高い外科的映像装置を用いると侵襲的な外科的方法を講じずとも組織を通して直接検出される。別法として、外科用拡大透視器具が使用され得、その場合、光学検出手段にはＣＣＤ画像装置または赤色光線放射に特に敏感な蛍光倍増管が含まれる。
【０５３１】
実施例７
RenillaＧＦＰを用いた蛍光放射の増幅
RenillaＧＦＰの存在下において、Renillaルシフェラーゼ−コエレンテラジン反応の生物発光量子収量は、６.９％から１３％へ高められ、増幅はほぼ２倍である。コエレンテラジン構造の１個またはそれ以上の基が置換されたコエレンテラジンの誘導体は公知である（例、Hartら（１９７９）Biochemistry １８：２００４参照）。ここで特に興味深いのは、上記で検討された、式（Ｖ）で示されるコエレンテラジンである。
【化１４】
0004923068.tif 000019
【０５３２】
注目されるところでは、Renillaルシフェラーゼの存在下におけるこの化合物の反応により、紫外線、λ最大３９０ｎｍが発生し、その生物発光量子収量は比較的低い（約０.０１２％）。しかしながら、ＧＦＰを加えると、Renillaルシフェラーゼ／ＧＦＰ複合体は緑色光線を発し、生物発光量子収量は２.３％に高められる。従って、ＧＦＰを追加することにより、Renillaルシフェラーゼにより発せられる光線の量は約２００倍増加する。さらに、排除限界が４７０ナノモル未満の帯域通過フィルターを用いると、４７０ｎｍより大きい波長の光線だけが観察され得る。これらの条件下では、光線放射の視覚化がＧＦＰの存在に直接依存的であることにより、光線の青色光子は４７０ｎｍを越えるもの（例，５１０ｎｍ緑色光線）にシフトされる。
【０５３３】
青色光を放つルシフェラーゼと組み合わせたRenillaＧＦＰおよびこのコエレンテラジン誘導体および帯域通過フィルターを使用することにより、検出可能な光線発生がＧＦＰの存在により異なるイムノアッセイが開発され得る。上記イムノアッセイについては若干の立体配置が可能であり、使用される典型的なイムノアッセイでは、反応は固体支持体で行われ、例えばマイクロタイター配列方式は、次の要領で遂行される。
【化１５】
0004923068.tif 000020
【０５３４】
ここで使用されている場合、標的抗原（複数も可）を含む疑いのある試験試料を、個々に壁に結合されている標的化抗原（複数も可）に特異的な複数の抗体を含むマイクロタイタープレートに加える。抗体−抗原複合体を形成後、RenillaＧＦＰに結合されている、抗原に特異的な第２抗体、またはそのＦ（Ａｂ）２フラグメントを含む抗体コンジュゲート、例えば本明細書に記載されているものを加える。具体的には、結合した第２抗体は、ルシフェラーゼ、好ましくはレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）またはレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼを加えることにより検出され、式（Ｖ）で示される化合物および光線発生は４７０ｎｍ帯域通過フィルターを用いて観察される。光線強度は、当然存在するＧＦＰ−Ａｂ２の尺度であり、Ａｂ１に結合した抗原の量の尺度でもある。
【０５３５】
このシステムを用いると、抗体が特異性を示す個々の壁について光線を検出することにより、試料中における抗原の存在が確認される。抗体の特異性を知ることにより、試料中に存在する特異抗原が同定され得る。すなわち、当然、ルシフェラーゼ／ルシフェリン添加前の中間洗浄段階を必要としないイムノアッセイを遂行することが可能である。
【０５３６】
実施例８
ガウシア・ムレリ（Gaussia mulleri）ルシフェラーゼをコードするＤＮＡの同定および単離
１．ガウシア（Gaussia）ＤＮＡ発現ライブラリーの製造
ガウシア（Gaussia）ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、市販されているラムダ−ＵｎｉＺａｐ ＸＲベクターキット（ストラタジーン）を用い備えられた使用説明書に従い製造された。簡単に述べると、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩアダプターを、ｃＤＮＡフラグメントの５'末端に連結させ、連結されたｃＤＮＡフラグメントを残りの非連結アダプターから精製した。精製されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ−およびＸｈｏＩ−消化λ ＵｎｉＺａｐ ＸＲベクターに連結させ、形質転換能エシェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞へ形質転換し、λファージヘルパー抽出物（ギガパック・プラス・キット、ストラタジーン）を用いて、生成したＤＮＡをウイルス粒子に封入した。封入されたラムダライブラリーを、エシェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞で滴定し、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの配列コンプレキシティーを計算した。
【０５３７】
クローン化ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼエンコードＤＮＡを含むイニシエーター‐ターミネーターカセットの切除により、プラスミドライブラリーをラムダｃＤＮＡ発現ライブラリーから誘導した。約２×１０８の独立プラーク分離株をプールし、これらを用いてエシェリキア・コリ（E.coli）ＳＯＬＲ細胞（ストラタジーン）に感染させ、次いで繊維状ヘルパーファージＶＣＳＭ１３、Ｒ４０８またはＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（ストラタジーン）と共感染させた。切除されたｐＢＫプラスミドを含む細胞を選択するために２００μｇ／mlアンピシリンを補った固形培地で感染細胞を平板培養することにより、ｃＤＮＡ含有プラスミドを採取した。
【０５３８】
エシェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞において、ｐＢＫプラスミドでルシフェラーゼをコードするＤＮＡの発現は、ｌａｃＺプロモーターの制御下に置かれており、その転写はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養培地に加えることにより容易に誘導されるか、または噴霧形態または他のエーロゾルでコロニーへ直接適用され得る。
【０５３９】
２．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ガウシア（Gausia）ルシフェラーゼを発現するクローンを同定するため、機能的スクリーニング方法を使用した。ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをエシェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞へ形質転換し、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補い、またバックグラウンドの蛍光を吸収するためのカーボンブラックを補ったＬブロスのプレートで形質転換混合物の一部を平板培養することにより、単一コロニーを得た。プレートを３７℃で一夜インキュベーションした。アンピシリン耐性形質転換体に１ミリモルのＩＰＴＧ溶液を噴霧することにより、ルシフェラーゼ発現を誘導した。細胞にルシフェラーゼを発現する時間を与えた後、プレート表面に２０ミリモルのコエレンテラジンを含む溶液を噴霧し、青色帯域幅フィルターを用いて青色光を発するコロニーを視覚化した。
【０５４０】
生物発光形質転換体の培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、陽性クローンのｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列を決定した。完全長ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号１９および２０に示されている。ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼをコード化するｃＤＮＡフラグメントは７６５ｎｔ長であり、５'非コーディング領域、１８５アミノ酸ポリペプチドをコード化する４５５ｎｔ読み枠、および３'非コーディング配列を含む。
【０５４１】
実施例９
追加的ルシフェラーゼおよびＧＦＰタンパク質のクローニング
先行実施例に記載された方法を用いることにより、プティロサルクス（Ptilosarcus、コルテス海から得られるウミエラ）種に関するＧＦＰをコード化する核酸、およびプレウロマンマ（Pleuromamma、カイアシ）種からのルシフェラーゼが得られた。これらの配列は、配列番号２８−３２に示されている。プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼは、ガウシア（Gaussia）およびプレウロマンマ（Pleuromamma）の混合カイアシライブラリー（「巨大」カレノイド・カイアシ類、各々〜６ｍｍおよび〜３ｍｍ）からクローン化された。プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼは、そのさらに鮮明な緑色のインビボ放射により同定された。
【０５４２】
コード化タンパク質に関する放射スペクトルおよびｐＨおよび塩曲線は、図４−６および８−１０に与えられている。
【０５４３】
実施例１０
ガウシア（Gaussia）、レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）およびプレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼおよびレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）およびプティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰがクローン化された。これらのタンパク質をコード化する核酸を含む様々な核酸構築物およびプラスミドが製造され、本明細書に記載された診断、分析方法および目新しい項目に使用されるコード化タンパク質の発現に使用されている。
【０５４４】
構築物
Ａ．レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼおよびＧＦＰ−エンコード構築物およびプラスミド
宿主プラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ファージミド（ストラタジーン）である。示された構築物は、増幅されたラムダＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン）の大量切除から誘導されたファージミドの大集団の機能的スクリーニングにより単離されたものである。ここに記載されているクローン化生物発光遺伝子の各々は、多重クローニング部位（ＭＣＳ）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位間における挿入体として類似ファージミドで単離された。各挿入体は、機能的タンパク質の全コーディング領域（ＣＤＳ）、並びにコーディング領域の可変数のヌクレオチド５'および３'を包含するＤＮＡを含む。天然タンパク質のアミノ酸に加えて、機能的スクリーニングされた分離株（ここでは、ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼｃＤＮＡ融合体ＣＤＳまたはｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ｃＤＮＡ融合体ＣＤＳ）で発現されたポリペプチドは、追加のＮ−末端残基を含み得る。
【０５４５】
１）ｐBluescript ＳＫ−（ｒ）におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ（４１４７ｂｐ）
ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼコーディングドメイン配列（ＣＤＳ）融合体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ｒ）（ストラタジーン）へクローン化した。このよく知られた市販ベクターは、特に細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（アンピシリン）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、Ｔ３プライマー配列、Ｔ３ ２０量体配列、ＮＩＨオリゴ０４９５配列、Ｔ３プロモーター、ＳＫプライマー配列、Ｔ７プロモーター、ＫＳプライマー配列、Ｔ７プライマー配列、Ｔ７ ２２量体配列、ＮＩＨオリゴ０４３６配列、ファージ−プラスミドＰＣＲ１配列、ファージ−プラスミドＰＣＲ２配列、ファージ−プラスミドＰＣＲ２（ｂ）配列および様々な制限クローニング部位を含む。ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現は、ｌａｃＺプロモーターの制御下にある。
【０５４６】
２）ｐBluescript ＳＫにおけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ（４１４７ｂｐ）
ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼコーディングドメイン配列（ＣＤＳ）融合体を、特に細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（アンピシリン）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、Ｔ３プライマー配列、Ｔ３プロモーター、ＳＫプライマー配列、Ｔ７プロモーター、ＫＳプライマー配列、Ｔ７プライマー配列および様々な制限クローニング部位を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ｒ）（ストラタジーン）へクローン化した。ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現は、ｌａｃＺ−プロモーターの制御下にある。
【０５４７】
Ｂ．哺乳類細胞における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現用プラスミド
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰまたはルシフェラーゼコーディング領域を、核酸増幅（ＰＣＲ）により増幅し、それぞれコーディング配列に対し５'および３'に隣接してＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位が付加された。ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）（インビトロゲン）のポリリンカーにおけるＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、プラスミドＤＮＡの大量生産を目的として細菌（例、ＸＬＩ−ブルー株、ストラタジーン）へ形質転換した。これらのプラスミドは、哺乳類細胞における発現を駆動するためのＣＭＶプロモーター（Ｐｃｍｖ）を含む。
【０５４８】
１）ｐｃＤＮＡ３.１（＋）におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ（６１２２ｂｐ）
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、哺乳類選択マーカー（Ｎｅｏ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ウイルス性複製起点（ＳＶ４０起点）および様々な制限クローニング部位を含む、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）（インビトロゲン、サンディエゴ）へクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【０５４９】
２）ｐｃＤＮＡ３.１（＋）におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ（６３４１ｂｐ）
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、哺乳類選択マーカー（Ｎｅｏ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ウイルス性複製起点（ＳＶ４０起点）および様々な制限クローニング部位を含むｐｃＤＮＡ３.１（＋）（インビトロゲン、サンディエゴ）へクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼの発現は、ＣＭＶプロモーターに制御されている。
【０５５０】
４．酵母細胞における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現に使用されるプラスミド
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰまたはルシフェラーゼを、ＰＣＲ
増幅し、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン）のポリリンカーＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入した。これらのプラスミドは、ＧＡＬ１プロモーターの調節下酵母においてガラクトース誘導発現が行われるように設計されている。
【０５５１】
１）ｐＹＥＳ２におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ（６５４７ｂｐ）
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、酵母複製起点（２ミクロン起点）、酵母選択マーカー（ＵＲＡ３）、ファージ複製起点（ｆ１起点）および様々な制限クローニング部位を含む酵母発現プラスミドｐＹＥＳ２（インビトロゲン、サンディエゴ）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの発現は、酵母ＧＡＬ１の制御下に置かれている。このベクターは、サッカロマイシス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞での発現用に設計されている。
【０５５２】
２）ｐＹＥＳ２におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ（６７６６ｂｐ）
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、酵母複製起点（２ミクロン起点）、酵母選択マーカー（ＵＲＡ３）、ファージ複製起点（ｆ１起点）および様々な制限クローニング部位を含む、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼの発現は、酵母ＧＡＬ１の制御下に置かれている。
【０５５３】
Ｄ．細菌細胞における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰまたはルシフェラーゼ発現に使用されるプラスミド
鋳型としてｐＥＴ−３４ ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼまたはｐＥＴ−３４ ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰプラスミドを使用し、高忠実度の逆ＰＣＲを用いることにより、ＣＢＤおよび天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼまたはＧＦＰ開始コドンまでの他の全てのコーディング配列５'が正確に欠失された。プラスミドを再び環状にし、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ノヴァゲン、マディソン、ウィスコンシン）へ再導入した。これらのプラスミドは、ＩＰＴＧによる誘導後における天然長ポリペプチドの大量発現用に設計されている。発現されたポリペプチドの性質により、タンパク質は適切に折りたたまれ、細胞質ゾルに機能的形態で存在するかまたは培養培地へ放出され得る。この方法で発現されると、ここに記載されている全ての生物発光タンパク質について顕著な機能的活性が観察される。ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼは培養培地中へ放出される。
【０５５４】
１）ｐＥＴ−３４における天然プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ ＣＤＳ（６０１４ｂｐ）
プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、リボソーム結合配列（ｒｂｓ）、ＬＩＣ（連結反応非依存的クローニング）部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５５】
２）ｐＥＴ−３４における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ（６０１４ｂｐ）
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５６】
３）ｐＥＴ−３４における天然ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ（５８５５ｂｐ）
ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５７】
４）ｐＥＴ−３４における天然プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼ（５８９４ｂｐ）
プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５８】
５）ｐＥＴ−３４における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ（６２３３ｂｐ）
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５９】
５．細菌細胞からのセルロース結合ドメイン‐レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼまたはＧＦＰ融合タンパク質の精製に使用されるプラスミド
レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼまたはＧＦＰのコーディング領域を、鋳型としてクローン化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを用いて高忠実度ポリメラーゼ（Ｐｆｕターボ、ストラタジーン）により増幅し、連結反応非依存的クローニング（ＬＩＣ）部位をｐＥＴ−３４ ＬＩＣベクター（ノヴァゲン）へ挿入した。生成したセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）−ルシフェラーゼまたはＣＢＤ−ＧＦＰ融合タンパク質は、ＩＰＴＧによる誘導後ＢＬＩ（ＤＥ３）細胞（ノヴァゲン）において高レベルで発現され得る。ＣＢＤ−ｃｌｏｓの性質故に、発現されたタンパク質の主要部分は、不溶性封入体に存する。封入体は半純粋状態で単離され得、機能的ＣＢＤ−融合タンパク質は復元により採取され得る。融合タンパク質にトロンビンおよびエンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂部位が含まれていることにより、厳密な分析を目的とする高度精製天然または準天然タンパク質が単離され得る。
【０５６０】
１）ｐＥＴ−３４におけるＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ（６８２４ｂｐ）
ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、リボヌクレアーゼ−Ｓ−ペプチド標識（Ｓ標識）ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６１】
２）ｐＥＴ−３４におけるＣＢＤ−ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ（６４４６ｂｐ）
ＣＢＤ−ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６２】
３）ｐＥＴ−３４におけるＣＢＤ−プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼ（６４８５ｂｐ）
ＣＢＤ−プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ配列、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６３】
４）ｐＥＴ−３４におけるＣＢＤ−プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ（６６０５ｂｐ）
ＣＢＤ−プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ配列、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６４】
５）ｐＥＴ−３４におけるＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ（６６０５ｂｐ）
ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ配列、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６５】
Ｆ．レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合タンパク質発現用プラスミド
図７に描かれているように、レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰを、ｐＥＴ−３４ベクター（ノヴァゲン）の連結反応非依存的クローニング部位へ挿入した。通常ｐＥＴ−３４に存在するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を、逆ＰＣＲを用いて欠失した。生成した融合タンパク質の分析用途に関する最適化を容易にするため（例えばＢＲＥＴの場合）、追加制限部位（示されず）がリンカー領域に導入され、所望の結合および標的タンパク質または部分の挿入が行われる。これらの部位の２つを用いて、レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、ＣＢＤの標準位置に挿入した。このプラスミド、またはＣＢＤを保持する類似構築物において、準天然および天然ＧＦＰは、それぞれトロンビンまたはエンテロキナーゼ（ＥＫ）処理により融合タンパク質から開裂され得る。リボヌクレアーゼＳ−ペプチド標識（Ｓ標識ＣＤＳ）により、ＧＦＰまたは融合タンパク質の免疫アフィニティー精製が簡易化され、市販のリボヌクレアーゼアッセイ（ノヴァゲン）を用いることにより粗抽出物におけるこれらのタンパク質の定量が行われる。ルシフェラーゼが第２の分離プラスミドにおいてＳ標識に別々に融合される場合、リボヌクレアーゼドメインによるＳ−タンパク質／ルシフェラーゼおよびＳ−タンパク質／ＧＦＰの会合または共発現により、分子間ＢＲＥＴ用試験システムが作製される。
【０５６６】
Ｇ．哺乳類細胞におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの機能的発現
ＣＭＶプロモーター（上記構築物番号Ｂ（１））の制御下レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３.１（＋）により、ヒーラ細胞をトランスフェクションした。リポフェクタミン（LipofectAMINE）プラスキット（ギブコ）を用いて、１プレート当たり１.５マイクログラムのｐｃＤＮＡ３.１によりヒーラ細胞をバーストトランスフェクションした。
【０５６７】
３０マイクログラムのｐｃＤＮＡ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＤＮＡによりヒーラ細胞をバーストトランスフェクションし、３７℃で８時間増殖させると、細胞のある部分集団は高度蛍光性であることが観察された。蛍光性は、１ラウンドの細胞分裂が行われているか、または最近行われたと見られる細胞対に局在していた。この結果は、天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰが、発現され、折りたたまれ、発色団と適当に複合体を形成し、その機能を保持していることにより、哺乳類細胞において緑色蛍光を発し得ることを示している。これは、生理学的条件下では機能的形態への折り畳みが不十分であるエクオレア（Aequorea）ＧＦＰの場合とは対照的である。
【０５６８】
ヒーラ細胞におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ蛍光の視覚化に使用されるフィルター（４７０／４０励起フィルター、４９５励起二色フィルターおよび５２５／５０放射フィルター）は、クローマ販売のエンド（Endo）ＧＦＰフィルターセットであった。
【０５６９】
当技術分野に精通した者であれば修飾については明白に理解できるため、この発明は後記請求の範囲によってのみ制限されるものとする。
【０５７０】
配列リストの要約
１．配列番号１レニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ルシフェラーゼ［米国特許第５４１８１５５号］
２．配列番号２キプリディナ・ヒルゲンドルフィイ（Cypridina hilgendorfii）ルシフェラーゼ［ＥＰ０３８７３５５］
３．配列番号３修飾ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）ルシフェラーゼ［ホタル、米国特許第４９６８６１３号］
４．配列番号４バルグラ（Vargula）（キプリディナ（Cypridina））ルシフェラーゼ［トンプソンら（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８６：６５６７−６５７１およびＪＰ３−３０６７８ Osakaから］
５．配列番号５アポエクオリンエンコード遺伝子［米国特許第５０９３２４０号、ＰＡＱ４４０］
６．配列番号６コード化エクオリン（Aequorin）ＡＥＱ１［Prasherら（１９８７）“Sequence Comparisons of CDNAS Encoding for Aequorin Isotypes”Biochemistry ２６：１３２６−１３３２］
７．配列番号７コード化エクオリン（Aequorin）ＡＥＱ２［Prasherら（１９８７）］
８．配列番号８コード化エクオリン（Aequorin）ＡＥＱ３［Prasherら（１９８７）］
９．配列番号９エクオリン（Aequorin）発光タンパク質［Charbonneauら（１９８５）“Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequorin” Biochemistry２４：６７６２−６７７１］
１０．配列番号１０生物発光活性が増強されたエクオリン（Aequorin）突然変異体［米国特許第５３６０７２８号、Asp１２４はSerに変更］
１１．配列番号１１生物発光活性が増強されたエクオリン（Aequorin）突然変異体［米国特許第５３６０７２８号、Glu１３５はSerに変更］
１２．配列番号１２生物発光活性が増強されたエクオリン（Aequorin）突然変異体［米国特許第５３６０７２８号、Gly１２９はAlaに変更］
１３．配列番号１３コード化アポエクオリン［シーライト、サイエンシーズ、ボガート（ジョージア）によりアクアライト（AQUALITE、商標）として販売、再構成され、エクオリンを形成］
１４．配列番号１４ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fisheri）フラビンレダクターゼ［米国特許第５４８４７２３号］
１５．配列番号１５レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化する核酸
１６．配列番号１６コード化レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
１７．配列番号１７レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼをコード化する核酸
１８．配列番号１８コード化レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ
１９．配列番号１９ガウシア（Gausssia）ルシフェラーゼをコード化する核酸
２０．配列番号２０コード化ガウシア（Gausssia）ルシフェラーゼ
２１．配列番号２１ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ融合タンパク質をコード化する核酸
２２．配列番号２２コード化ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ融合タンパク質
２３．配列番号２３レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰのアミノ末端付近のアミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド
２４．配列番号２４レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰのアミノ末端付近のアミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド
２５．配列番号２５レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰの中間付近のアミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド
２６．配列番号２６レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰの中間付近のアミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド
２７．配列番号２７レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰのカルボキシ末端付近のアミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド
２８．配列番号２８プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼ＼挿入体８６１ｂｐ
２９．配列番号２９コード化プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼ１９８ａａ
３０．配列番号３０プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ＼挿入体Ａ＼１１０４ｂｐ
３１．配列番号３１プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ＼挿入体Ｂ＼１２７９ｂｐ
３２．配列番号３２プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ２３８ａａ
【０５７１】
【表５】
0004923068.tif 000021
【表６】
0004923068.tif 000022
【表７】
0004923068.tif 000023
【表８】
0004923068.tif 000024
【表９】
0004923068.tif 000025
【表１０】
0004923068.tif 000026
【表１１】
0004923068.tif 000027
【表１２】
0004923068.tif 000028
【表１３】
0004923068.tif 000029
【表１４】
0004923068.tif 000030
【表１５】
0004923068.tif 000031
【表１６】
0004923068.tif 000032
【表１７】
0004923068.tif 000033
【表１８】
0004923068.tif 000034
【表１９】
0004923068.tif 000035
【表２０】
0004923068.tif 000036
【表２１】
0004923068.tif 000037
【表２２】
0004923068.tif 000038
【表２３】
0004923068.tif 000039
【表２４】
0004923068.tif 000040
【表２５】
0004923068.tif 000041
【表２６】
0004923068.tif 000042
【表２７】
0004923068.tif 000043
【表２８】
0004923068.tif 000044
【表２９】
0004923068.tif 000045
【表３０】
0004923068.tif 000046
【表３１】
0004923068.tif 000047
【表３２】
0004923068.tif 000048
【表３３】
0004923068.tif 000049
【表３４】
0004923068.tif 000050
【表３５】
0004923068.tif 000051
【表３６】
0004923068.tif 000052
【表３７】
0004923068.tif 000053
【表３８】
0004923068.tif 000054
【表３９】
0004923068.tif 000055
【表４０】
0004923068.tif 000056
【表４１】
0004923068.tif 000057
【表４２】
0004923068.tif 000058
【表４３】
0004923068.tif 000059
【表４４】
0004923068.tif 000060
【図１】
0004923068.tif 000061
【図２】
0004923068.tif 000062
【図３】
0004923068.tif 000063
【図４】
0004923068.tif 000064
【図５】
0004923068.tif 000065
【図６】
0004923068.tif 000066
【図７】
0004923068.tif 000067
【図８】
0004923068.tif 000068
【図９】
0004923068.tif 000069
【図１０】
0004923068.tif 000070
【図１１】
0004923068.tif 000071
【配列表】
0004923068000001.app