(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌以外の血管新生疾患をもつ哺乳動物における血管新生疾患部位での血管新生を阻害するための医薬組成物であって、抗血管新生有効量のＤＢＰ−ｍａｆを含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項２】
免疫無防備状態の哺乳動物における腫瘍部位での血管新生を阻害するための医薬組成物であって、抗血管新生有効量のＤＢＰ−ｍａｆを含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項３】
免疫無防備状態の哺乳動物がＴまたはＢリンパ球欠乏のために免疫無防備状態である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
血管新生疾患をもつ哺乳動物における血管新生疾患部位での血管新生を阻害するための医薬組成物であって、当該血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、トラコーマ、新血管形成性緑内障、乾癬、免疫性炎症、非免疫性炎症、アテローム性動脈硬化症、および過剰創傷修復より成る群から選択され、抗血管新生有効量のＤＢＰ−ｍａｆを含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項５】
血管新生疾患をもつ哺乳動物における血管新生疾患部位での血管新生を阻害するための医薬組成物であって、当該血管新生疾患が免疫性炎症より成り、そこでの当該免疫性炎症が、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、全身性脈管炎、硬皮症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、および原発性胆管性肝硬変より成る群から選択される自己免疫疾患に起因し、そして当該組成物が抗血管新生有効量のＤＢＰ−ｍａｆを含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項６】
部位が、真皮、表皮、子宮内膜、網膜、外科創傷、胃腸管、臍帯、肝臓、腎臓、生殖系、リンパ系、中枢神経系、胸部組織、尿管、循環系、骨、筋肉、または呼吸管である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の医薬組成物であって、さらに有効量の第２の抗血管新生作用物質を含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍部位がカポジ肉腫である、請求項２に記載の腫瘍部位での血管新生を阻害するための医薬組成物。
【請求項９】
ＴまたはＢリンパ球欠乏が先天性または後天性である、請求項３に記載の腫瘍部位での血管新生を阻害するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＮＩＤＤＫＤ  Ｇｒａｎｔ  第ＤＫ  ４４３３７号の下に、一部、米国政府支援により行った。米国政府は、本出願において一定の権利を保有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、血管新生を伴う疾患または障害の治療のための、新規医薬組成物およびその使用の方法を提供する。
【０００３】
発明の背景
血管は、酸素および栄養分が生体組織に供給され、そして廃棄生成物が生体組織から除去される、手段である。血管新生は、新しい血管が形成されるプロセスを指す（３１）。従って、適切な場合には、血管新生は非常に重要な生体プロセスである。それは生殖、発生および創傷修復に不可欠である。しかし、不適切な血管新生は、重大な負の結果をもたらすことがある。例えば、多くの固形腫瘍が血管新生の結果として血管形成された後でのみ、それらの腫瘍は、急速に増殖しそして転移を可能にする酸素および栄養分の十分な供給を受ける。適正な平衡状態で血管新生の速度を維持することは、一連の機能に対して極めて重要なので、健康を維持するために、それは慎重に調節されなければならない。血管新生プロセスは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のようなマイトジェン類により活性化された内皮細胞（ＥＣ）から分泌されるプロテアーゼ類による、基底膜の分解で始まると考えられている。当該細胞は移動しそして増殖し、基質スペース中へ内皮細胞の堅い出芽の形成に至り、次いで、脈管ループが形成され、そして新しい基底膜の緊密な接合および沈着の形成と共に毛細管が発生する。
【０００４】
成人では、内皮細胞の増殖速度は、体内の他の細胞型と比べて、典型的には低い。これらの細胞の代謝回転時間は１，０００日を超えることがある。血管新生が急速な増殖をもたらす生理的な例外は、女性生殖系においてまた創傷治癒の際に見られるような、厳格な調節の下に典型的には起る。
【０００５】
血管新生の速度は、微小血管の増殖の正および負の制御因子間の局所的平衡における変化を伴う。血管新生増殖因子類の治療の示唆は、２０年以上前にＦｏｌｋｍａｎおよび共同研究者達により初めて記載された（３２）。異常な血管新生は、体が血管新生の少なくとも何らかの制御を失う時に起り、過剰あるいは不十分ないずれかの血管成長をもたらす。例えば、潰瘍、卒中、および心臓発作のような容態は、自然治癒に通常必要な血管新生の欠如に由来する可能性がある。それに対して、過剰な血管増殖は、腫瘍増殖、腫瘍拡大、失明、乾癬および慢性関節リウマチを起すことがある。
【０００６】
従って、血液循環、創傷治癒、および潰瘍治癒の増進のように、より一層の血管新生が望ましい場合がある。例えば、最近の研究は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー（３３、３４）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）（３５）、そしてさらに最近では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような組換え血管新生増殖因子を、心筋虚血および後肢虚血の動物モデルにおける副行動脈発生を促進および／または増強するために（３６、３７）、使用することのフィージビリティを確立した。
【０００７】
逆に、血管新生の阻害が望ましい場合がある。例えば、多くの疾患は、「新血管形成」と呼称されることもある、持続性の不調節血管新生により引き起こされる。関節炎では、新しい毛細血管が関節へ侵入し、そして軟骨を破壊する。糖尿病では、新しい毛細管が硝子体へ侵入して、出血し、そして失明を起す。眼の新血管形成は失明の最もありふれた原因である。腫瘍の増殖および転移は血管新生依存性である。腫瘍は、腫瘍自体が増殖するために、新たな毛細血管の増殖を刺激し続けなければならない。
【０００８】
これらの疾患の現行の治療は不適切である。持続性血管新生を阻止する作用物質、例えば薬剤（ＴＮＰ−４７０）、モノクローナル抗体、アンチセンス核酸およびタンパク質（アンギオスタチン（５）、エンドスタチン（６）および抗血管新生剤ＡＴＩＩＩ（７））が、現在テストされている（３８、３９、４０）。抗血管新生タンパク質類についての予備的な結果は有望であるが、それらはサイズが比較的大きく、そして使用および生産することが難しい。さらに、タンパク質は酵素的分解にさらされる。従って、血管新生を阻害する新しい作用物質が必要である。サイズ、生産の容易さ、安定性および／または効力に改善を示す新しい抗血管新生剤が望ましい。
【０００９】
ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）は、そのアミノ末端ドメインでビタミンＤカタボライトおよび代謝産物に、そしてそのカルボキシ末端ドメインでアクチンに、結合するマルチドメインタンパク質である（９）。さらに、当該カルボキシ末端ドメインは、ヒトＤＢＰではトレオニン残基上にＯ−結合型グリコシル化部位を含有する（１０）。この部位は、ガラクトースおよびシアル酸によって２つに分枝したＮ−アセチルガラクトサミンより成る、ムチン型三糖で占められている。末端シアル酸およびガラクトースの逐次除去は、トレオニン残基に付着されたコアのＮ−アセチルガラクトサミンをもつ分子を生じる（１０）。そのような選択的脱グリコシルは、免疫応答の一部として自然に起る。その結果生じる分子は、マクロファージの強力な活性化物質であり、そしてＤＢＰ−ｍａｆ（マクロファージ活性化因子）と名付けられている。
【００１０】
以前のデータは、選択的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）脱グリコシルにより特異的に産生されたＤＢＰ−ｍａｆが、マウスモデルでのエールリッヒ腹水腫瘍の治療において役割を果すことを明らかにしている（１１、１２）。癌の光力学治療に対するアジュバント免疫療法（１３）としての、ＤＢＰ−ｍａｆのさらなる投与は、マウスの扁平上皮細胞癌モデルを用いた腫瘍療法に相乗効果を示した。両腫瘍モデルにおいて、ＤＢＰ−ｍａｆは、炎症プロセス、例えばマクロファージを活性化し、それらが次いで当該腫瘍細胞を攻撃すること、によってその効果を発揮したと仮定された。
【００１１】
発明の要約
本発明者らは、この度、部分的に脱グリコシルされたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−ｍａｆ）が、全面的には免疫機構によるのではなく、一部は抗血管新生機構により、抗腫瘍性であることを発見した。したがって、本発明は、増加したまたは異常な血管新生および／または内皮細胞分化に伴う疾患の治療におけるＤＢＰ−ｍａｆの使用に関する。好ましくは、当該ＤＢＰ−ｍａｆは、徐放性で、またはパルスにより当該患者に投与される。パルス療法は、同一量の組成物の長時間にわたる不連続投与の形式ではなく、低頻度での当該組成物の同一用量の投与または低用量の投与を含んでなることを意味する。
【００１２】
徐放性またはパルス投与は、当該血管新生が腫瘍増殖に関連している時は特に好ましいが、それは、当該腫瘍に給餌している血管の退縮、そしてひいては腫瘍そのものの退縮をもたらすからである。
【００１３】
本発明はまた、免疫無防備状態の哺乳動物における腫瘍部位で血管新生を阻害するために、有効量のＤＢＰ−ｍａｆの投与によって、免疫無防備状態の哺乳動物における腫瘍の部位での血管新生を阻害することの方法に関する。
【００１４】
ＤＢＰ−ｍａｆは、２５（ＯＨ）ビタミンＤおよびその代謝産物１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤおよびカルシトリオールを含む他のカタボライトに結合する。カルシトリオールは、前立腺癌を含むさまざまな癌の薬剤療法として、現在臨床試験中である。ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）でカルシトリオールを使用することの短所の１つは、生理的レベル以上の用量でのカルシウム過剰血症のような副作用である。理論により拘束されることは望まないが、ＤＢＰ−ｍａｆに結合されたカルシトリオールは、成長している腫瘍に見られる増殖性内皮を標的にし、従って２つの面で当該腫瘍を攻撃すると、本発明者らは信じている。この方法は、一層低用量のカルシトリオールおよびＤＢＰ−ｍａｆの使用をさらに可能にし、そしてそれにより、薬剤毒性および後天性薬剤耐性の問題を回避する。
【００１５】
従って、本発明はまた、部分的に脱グリコシルされたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−ｍａｆ）および１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ（カルシトリオール）またはその誘導体を含む組成物を提供する。
【００１６】
本組成物は、ホルモン依存性癌を治療するための方法において有用である。当該方法は、ホルモン依存性癌をもつ宿主に対し、脱グリコシルされたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−ｍａｆ）および１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤまたはその誘導体を含む当該組成物の有効量を投与することを含む。好ましいホルモン依存性癌は、乳癌および前立腺癌を含む。
【００１７】
当該発明の他の側面は下部に開示される。
発明の詳細な説明
血管新生は新しい血管の形成である。血管新生は、胚性成長、排卵、子宮内膜の周期的発生、創傷治癒、炎症、糖尿病性網膜症および腫瘍増殖のような各種の生理的および病理的過程で起る。
【００１８】
本発明は、ＤＢＰ−ｍａｆによる、およびＤＢＰ−ｍａｆの類似体、誘導体および断片またはそれらの混合物による、血管新生の阻止に関する。ＤＢＰ−ｍａｆ、その類似体、誘導体および断片は、血管新生疾患により非常に苦しめられている哺乳動物におけるその種の疾患を治療するのに有用である。
【００１９】
ＤＢＰ−ｍａｆおよびその類似体、誘導体および断片を用いる治療が有効な血管新生疾患は、糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、トラコーマ、新血管形成性緑内障、乾癬、血管繊維腫、免疫性および非免疫性炎症、アテロ−ム性動脈硬化斑内の毛細管形成、血管腫、過剰創傷修復、固形腫瘍、カポジ肉腫、その他同種類のものを、非限定的に含む。
【００２０】
ＤＢＰ−ｍａｆおよびその類似体、誘導体および断片は、ある部位における新血管形成を阻害する。ＤＢＰ−ｍａｆおよびその類似体、誘導体および断片は、血管新生の誘発物質の機能を阻害することに、直接的にまたは間接的に有効である。ＤＢＰ−ｍａｆによる調節が有効な、血管新生のそのような誘発物質は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（すなわち、細胞分散因子）、ＩＬ−８、その他同種類のものを、非限定的に含む。
【００２１】
本発明は、免疫無防備状態のＳＣＩＤマウスで証明されたように、免疫無防備または免疫不全の哺乳動物における腫瘍増殖の部位で、ＤＢＰ−ｍａｆが血管新生を阻止することを証明する。これらのマウスはＢおよびＴリンパ球不足である。それ故、免疫無防備状態の哺乳動物における腫瘍増殖に対するＤＢＰ−ｍａｆの阻害効果は、ＢまたはＴリンパ球に依存しない。これらの知見は、ＤＢＰ−ｍａｆの抗腫瘍応答が免疫仲介機構であると教示しているＹａｍａｍｏｔｏら（１１）およびＫｏｇａら（１２）のものとは、極めて異なる。
【００２２】
ＤＢＰ−ｍａｆおよびその類似体、誘導体および断片は、免疫無防備状態の哺乳動物、好ましくはＴリンパ球不全および／またはＢリンパ球不全哺乳動物における腫瘍形成または腫瘍増殖の部位で、血管新生を阻止するための有用な療法である。ＤＢＰ−ｍａｆによる治療が有効な免疫無防備状態の哺乳動物は、遺伝性または後天性免疫不全症候群をもつヒトを含む哺乳動物、移植手術前および後の哺乳動物のような免疫抑制剤を受けている哺乳動物、自己免疫疾患をもつ哺乳動物、ウイルス感染をもつ哺乳動物およびその他同種類のものであって、Ｔリンパ球不全および／またはＢリンパ球不全である哺乳動物を、非限定的に含む。シクロスポリン、抗Ｔまたは抗Ｂ細胞抗体、プレドニソン、照射、その他同種類のもののような免疫抑制剤での長期間にわたる哺乳動物の治療は、当該哺乳動物を腫瘍の発生の危険に曝すことになる。本発明のＤＢＰ−ｍａｆは、これらの免疫抑制された哺乳動物における腫瘍形成または腫瘍増殖の部位での血管新生を阻止するのに、そしてさらには腫瘍増殖を予防または阻止するのにもまた有用である。
【００２３】
ＤＢＰ−ｍａｆによる治療から恩恵を受ける可能性がある先天性免疫不全症候群をもつ患者は、重度合併型免疫不全症、アデノシンデアミナーゼ不全症、ディ・ジョルジ症候群、胸腺腫を伴う免疫不全症、エプスタイン−バールウイルスに対する遺伝性欠陥応答後の免疫不全症（プルチロ症候群）、毛細管拡張性運動失調、ウィスコット−アルドリッチ症候群、または腸リンパ管拡張症に罹っている者を含む。
ＤＢＰ−ｍａｆによる治療から恩恵を受ける可能性がある後天性免疫不全症候群をもつ患者は、免疫抑制の原因によってグループ分けが可能である。
【００２４】
Ａ．  当該免疫抑制が、非限定的に、ａ）コルチコステロイド類；ｂ）アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、クロラムブシルおよびナイトロジェンマスタード）、プリン類似体（例えばアザチオプリン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）および葉酸アンタゴニスト（例えばメトトレキセート、および５−フルオロウラシル、ビンカアルカロイド、ヒドロキシ尿素、および抗生物質免疫抑制剤のような他の薬剤）を含む薬剤のファミリーである、細胞障害性薬剤；ｃ）電離放射線；ｄ）抗リンパ球血清またはモノクローナル抗体による抗体療法；シクロスポリンＡのような免疫抑制剤；およびインターフェロンアルファ、ＴＧＦベータ、およびインターロイキン１０を含む免疫抑制サイトカイン類を含む、さまざまなクラスの作用物質での治療の結果と思われるものである。
【００２５】
Ｂ．  当該免疫抑制が、後天性疾患／症候群の結果と思われるものである。これは非限定的に、エイズ、カポジ肉腫、リンパ腫、および中枢神経症候群のような免疫特権部位における他の悪性疾患、骨髄、幹細胞、または固形臓器移植体の受容者、ホジキンリンパ腫、ＨＴＬＶ−１関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、全身性脈管炎、結節性紅斑、硬皮症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、および原発性胆管性肝硬変を含む。
【００２６】
Ｔおよび／またはＢ細胞免疫不全症の存在は、ＤＢＰ−ｍａｆの使用に対する禁忌を表さないが、それはＤＢＰ−ｍａｆが、血管新生を阻止するために、Ｔ細胞またはＢ細胞またはそれらの産物を必要としないことが明らかにされたからである。実際、ＤＢＰ−ｍａｆの抗血管新生作用は、有意な数のＴまたはＢ細胞およびＴまたはＢ細胞機能が存在しない免疫無防備状態のマウスで、再現的に証明された。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内皮細胞増殖検定およびＣＡＭ検定は、ＤＢＰ−ｍａｆの抗血管新生性質が免疫機構によらないことを、証明している。
【００２７】
したがって、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１１）およびＫｏｇａら（１２）の観察と異なり、本発明は、ＤＢＰ−ｍａｆによる治療から恩恵を受ける可能性があり、そしてさまざまなレベルの先天性または後天性Ｔおよび／またはＢ細胞免疫不全症を示す、すべての患者を包含する。
【００２８】
本発明は、ＤＢＰ−ｍａｆが、血管新生を阻止するためのもう１つの抗血管新生剤と共に、投与される組合せ療法を包含する。ＤＢＰ−ｍａｆと共に投与してもよい他の抗血管新生剤は、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＰＦ４，ＩＦＮ−γ，ＴＮＰ−４７０，トロンボスポンジン、その他同種類のものを、非限定的に含む。
【００２９】
組合せ療法はまた、タキソール、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビル、その他同種類のもののような化学治療剤との組合せで、ＤＢＰ−ｍａｆの使用を包含する。そうした療法は、治療予定の哺乳動物が、十分に血管形成されている大きな既存の腫瘍塊をもつ状況では、特に有用である。当該化学治療剤は腫瘍塊を縮小するのに役立ち、そしてＤＢＰ−ｍａｆは当該腫瘍塊の内部または周囲の新血管形成を予防または阻止する。化学治療剤は、通常使用されるより低用量で投与してもよく、またそうした用量では、抗血管新生剤として働く可能性もある。
【００３０】
本発明での使用のためのＤＢＰ−ｍａｆは、天然源、組換え源、または合成源から入手可能である。本タンパク質の部分グリコシル化は、その抗血管新生機能のための必要条件であることを、留意することが大切である。ＤＢＰ−ｍａｆは、米国特許第５１７７００１号に述べられた方法により、得ることも可能である。天然源の場合、ＤＢＰ−ｍａｆはどんな哺乳動物種からでも、好ましくはヒト源から精製および単離してもよい。本発明の類似体は、当該ＤＢＰ−ｍａｆの抗血管新生活性を低下させない、保存性アミノ酸置換または非保存性アミノ酸の置換、欠失または挿入をもつペプチドを含んでもよい。本発明はまた、類似体がその抗血管新生機能を保持する限り、ＰＥＧまたはタンパク質キャリヤーのような炭水化物に結合されたＤＢＰ−ｍａｆを含む。ＤＢＰ−ｍａｆの合成断片は、当該技術分野において知られているペプチド合成の標準的方法により作ってもよい。
【００３１】
本発明のＤＢＰ−ｍａｆは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で標的細胞の血管新生機能を阻止するのに有用である。本発明のＤＢＰ−ｍａｆは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で内皮細胞の血管新生機能を阻害するのに、特に有用である。特に興味深いのは、毛細管構造への内皮細胞分化の予防または阻止である。ＤＢＰ−ｍａｆによる阻止を受け易い内皮細胞は、哺乳動物中のいくつかの部位に存在し、真皮、表皮、子宮内膜、網膜、外科的部位、胃腸管、肝臓、腎臓、生殖系、皮膚、骨、筋肉、内分泌系、脳、リンパ系、中枢神経系、呼吸系、臍帯、胸部組織、尿管、その他同種類のものを、非限定的に含む。ＤＢＰ−ｍａｆを用いる本発明の治療の方法は、炎症および腫瘍形成の部位で、内皮細胞による血管新生を予防または阻止するのに特に有用である。
【００３２】
自己免疫疾患に随伴する血管新生は、ＤＢＰ−ｍａｆを用いて治療可能である。当該自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、全身性脈管炎、硬皮症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、原発性胆管性肝硬変、その他同種類のものを、非限定的に含む。
【００３３】
創傷修復に随伴する血管新生も、ＤＢＰ−ｍａｆを用いて治療可能である。過度の血管新生に由来する過度の瘢痕化は、皮膚外傷または外科的部位の箇所に生じることが多い。当該部位でのＤＢＰ−ｍａｆの投与は、瘢痕化を排除または軽減するために、当該部位での血管新生を予防または阻止するのに有用である。
【００３４】
ＤＢＰ−ｍａｆはまた、哺乳動物における腫瘍形成の部位での血管新生を阻止するための方法に有用である。そうした部位に投与されたＤＢＰ−ｍａｆは、当該部位における血管形成を予防または阻止し、それによって当該腫瘍の発生および増殖を阻止する。ＤＢＰ−ｍａｆで血管新生を予防または阻止することによって、予防または阻止されるであろう腫瘍は、黒色腫、転移、腺癌、肉腫、胸腺腫、リンパ腫、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮腫瘍、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、腎性腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、脳腫瘍、精巣腫瘍、骨腫瘍、筋腫瘍、胎盤の腫瘍、胃性腫瘍、その他同種類のものを、非限定的に含む。
【００３５】
好ましくは、ＤＢＰ−ｍａｆは患者に徐放性またはパルス方式で投与される。パルス療法は、同一量の組成物の長時間にわたる不連続投与の形式ではなく、低頻度での当該組成物の同一用量の投与または低用量の投与を含んでなる。徐放性またはパルス投与は、当該血管新生が腫瘍増殖と随伴している時は、特に好ましいが、それは、当該腫瘍に給餌している血管の退縮、そしてひいては腫瘍そのものの退縮をもたらすからである。各パルス用量は減らすことも可能で、そして治療の過程を通じて当該患者に投与される薬剤の総量は最少になる。
【００３６】
個々のパルスは、約２、４、６、８、１０、１２、１４または１６時間のように数時間、または２、３、４、５、６、または７日のように数日間、好ましくは約１時間から約２４時間そしてさらに好ましくは約３時間から約９時間、の期間にわたって連続的に、当該患者に送達することが可能である。
【００３７】
パルス間の間隔または無送達の間隔は、２４時間より大きく、そして好ましくは４８時間より大きく、そして３、４、５、６、７、８、９または１０日間、二、三または四週間またはさらに長いような、さらに長期間さえありえる。達成される結果は目覚ましい可能性があるので、パルス間の間隔は、必要であれば、当業者によって決定されてもよい。しばしば、パルス間の間隔は、当該組成物または当該組成物の活性成分が、次のパルスの送達の前に、当該患者にもはや検出できない場合、当該組成物のもう１回の用量を投与することにより、見積もることも可能である。間隔はまた、当該組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期から見積もることもできる。間隔は、当該ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期より大きいとして、または当該組成物半減期より２、３、４、５倍、そして１０倍も大きいとして、見積もってもよい。
【００３８】
単一治療処方中のパルスの数は、２回のように少なくてもよいが、典型的には約５から１０、１０から２０、１５から３０回またはそれ以上である。実際、患者は、現行の治療に伴う問題や不便を起さずに、本発明の方法に従って生涯薬剤を受けることも可能である。組成物はほとんどどのような手段によっても投与可能であるが、好ましくは注射（例えば、静脈内、皮下、動脈内）、注入または点滴として患者に送達される。注入または他の形式の送達により、組成物を患者にパルスするためのさまざまな方法および装置は、米国特許第４７４７８２５号；第４７２３９５８号；第４９４８５９２号；第４９６５２５１号および第５４０３５９０号に開示されている。
【００３９】
ＤＢＰ−ｍａｆを含む組成物は、徐放性により投与することも可能である。徐放性は浸透ポンプの手段によって達成してもよい。好ましくは、ＤＢＰ−ｍａｆは、２、３、４、５、６または７日間のように数日の期間にわたって投与される。
【００４０】
治療の当該方法において、ＤＢＰ−ｍａｆ、その類似体、誘導体または断片の投与は、「予防的」または「治療的」目的のいずれのためであってもよい。予防的に提供される場合、当該ＤＢＰ−ｍａｆは、何らかの症状がでる前に提供される。当該ＤＢＰ−ｍａｆの予防的投与は、ある部位における何らかの血管新生を予防または阻害するのに役立つ。治療的に提供される場合、当該ＤＢＰ−ｍａｆは、血管新生の症状または指標の開始時（またはその後で）提供される。このように、ＤＢＰ−ｍａｆは、ある部位において予期される血管新生の前か、あるいはある部位において血管新生が始まった後の、いずれかに提供してよい。
【００４１】
接種材料に関する場合の用語「単位用量」は、哺乳動物に対する単一の薬用量として適当な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、希釈剤も含めて所望の阻害作用を発揮するように計算された、ＤＢＰ−ｍａｆ、その類似体、誘導体または断片の既定量を含有する。本発明の接種材料の新規単位用量についての仕様は、当該ＤＢＰ−ｍａｆの独特な特徴および達成予定の特定の効果によって指定され、およびそれらに依存する。
【００４２】
当該接種材料は、水溶性医薬組成物をつくるために、塩類液、リン酸緩衝食塩水または他の生理的に許容可能な希釈剤および同種類のもののような、許容可能な（受容可能な）希釈剤中に溶液として典型的には調製される。さらに、当該ＤＢＰ−ｍａｆ、その類似体、誘導体または断片は、固体型および凍結乾燥型に製剤し、そして使用前に再溶解または懸濁してもよい。
【００４３】
投与のルートは、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、鞘内（Ｉ．Ｔ．）、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所、腫瘍内、その他同種類のものが可能である。
【００４４】
投与は、経粘膜または経皮手段によってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、透過予定のバリヤーに適切な透過剤が製剤の際に使用される。その種の透過剤は、技術分野では一般に知られており、例えば、経粘膜投与については胆汁酸塩およびフシジン酸を含む。加えて、透過を助けるために、界面活性剤を使ってもよい。経粘膜投与は、鼻噴霧によるか、例えば、あるいは座薬を使用してもよい。経口投与の場合、ＤＢＰ−ｍａｆは、カプセル、錠剤およびトニックのような通常の経口投与形式へ製剤される。
【００４５】
局所投与の場合、ＤＢＰ−ｍａｆは、技術分野で一般に知られているように、軟膏、ロウ剤、ゲル、またはクリームに製剤される。
ＤＢＰ−ｍａｆを哺乳動物、好ましくはヒトに、提供する場合、投与されるＤＢＰ−ｍａｆの薬用量は、当該哺乳動物の年令、体重、身長、性別、一般的な健康状態、既往病歴、病気の進行状態、腫瘍の程度、投与のルート、処方などのような要因次第で変動する。
【００４６】
一般に、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ，好ましくは少なくとも約２５μｇ／ｋｇ，より好ましくは少なくとも約５０μｇ／ｋｇまたはそれ以上のＤＢＰ−ｍａｆの薬用量をレシピエントに提供することが望ましい。約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇまでの範囲が好ましいが、それより低いまたは高い用量を投与してもよい。当該用量は、ＤＢＰ−ｍａｆの有効な抗血管新生血清または組織濃度を与える。当該用量は少なくとも一度は投与され、巨丸剤、連続投与または除放性として提供されてもよい。数週間または数カ月間の期間にわたる多回投与も好ましい。少なくとも週一回ＤＢＰ−ｍａｆを投与することも好ましく、そしてなお一層頻繁な（例えば毎日）投与は、なお一層好ましい結果を生む可能性がある。その後の用量は、示したように投与されてもよい。
【００４７】
その抗血管新生性質を損なわずにその半減期を延長するために、非限定的にＰＥＧのような付着性化合物により、ＤＢＰ−ｍａｆを修飾することは、適切であろう。
【００４８】
組合せ療法の場合、ＤＢＰ−ｍａｆの用量は、第２の抗血管新生剤または化学治療剤の投与の前に、同時に、または後に、投与してもよい。
ＤＢＰ−ｍａｆと組合せての投与のための第２の抗血管新生剤または化学治療剤の用量は、当該技術分野で日常的に用いられている用量である。
【００４９】
本発明はまた、医薬的に許容可能なキャリヤー中にＤＢＰ−ｍａｆ、その類似体、誘導体または断片を含んでなる、血管新生を阻止できる医薬組成物を包含する。当該医薬組成物は、アンギオスタチン、ＰＦ４，ＩＦＮ−γ，ＴＮＰ−４７０，トロンボスポンジン、および同種類のものまたはそれらの混合物を非限定的に含む、第２の抗血管新生剤を付加的に含んでなるのでもよい。
【００５０】
もう１つの態様において、当該医薬組成物は、タキソール、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビル、および同種類のものまたはそれらの混合物のような化学治療剤も含む。
【００５１】
治療の効力は、１）（黒色腫、カポジ肉腫などのような）皮膚塊の測定、Ｘ線、走査および他の腫瘍サイズ評価の手段により決定されるような、腫瘍サイズの縮小；２）腫瘍進行の欠如；３）表面病変の測定および評価により決定されるような、ケロイド形成縮小；４）網膜基底の写真の比較分析および他の適切な評価方法により決定されるような、糖尿病性網膜症に随伴する網膜病巣の改善；５）糖尿病性網膜症の進行の欠如を含む、さまざまなパラメーターにより評価してもよい。ＤＢＰ−ｍａｆの血中薬理学的レベルは、ＥＬＩＳＡ、捕捉検定法、放射線免疫検定法、および受容体結合検定法などで決定してもよい。
【００５２】
本明細書に記載された方法は、抗血管新生活性について、ＤＢＰ−ｍａｆの類似体、誘導体、断片およびキメラタンパク質をスクリーニングするのに有用である。
【００５３】
加えて、選択的にＤＢＰ−ｍａｆは、２５（ＯＨ）ビタミンＤ、その代謝産物１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤおよびカルシトリオールを含む他のカタボライトに結合する。カルシトリオールは、前立腺癌を含むさまざまな癌の薬剤療法として、現在臨床試験中である。ｉｎ  ｖｉｖｏでカルシトリオールを使用する短所の１つは、生理的レベル以上の用量でのカルシウム過剰血症のような副作用である。理論により拘束されることを望まないが、ＤＢＰ−ｍａｆに結合されたカルシトリオールが、増殖中の腫瘍に見られる増殖性内皮を標的にし、従って２つの前面で当該腫瘍を攻撃すると、本発明者らは考えている。この方法は、一層低用量のカルシトリオールおよびＤＢＰ−ｍａｆの使用をさらに可能にし、そしてそれにより、薬剤毒性および後天性薬剤耐性の問題を回避する。
【００５４】
従って、本発明はまた、部分的に脱グリコシルされたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−ＭＡＦ）および１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ（カルシトリオール）またはその誘導体を含んでなる組成物を、提供する。カルシトリオールの誘導体は、例えば米国特許第５９７６７８４号に開示されている。
【００５５】
この組成物は、ホルモン依存性癌を治療するための方法において有用である。当該方法は、ホルモン依存性癌をもつ宿主に対し、脱グリコシルされたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−ｍａｆ）および１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤまたはその誘導体を含む組成物の有効量を投与することを、含んでなる。好ましいホルモン依存性癌は、乳癌および前立腺癌を含む。
【００５６】
用語「医薬的に許容可能な」は、不都合な毒性を伴わずに、哺乳動物に投与可能な化合物および組成物を指す。典型的な医薬的に許容可能な塩類は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、その他同種類のもののような鉱酸の塩類；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、その他同種類のもののような有機酸の塩類を含む。
【００５７】
本発明の組成物は、経口的に、局所的に、または皮下および筋肉内注射、徐放性デポー剤の移植、静脈内注射、鼻腔内投与、その他同種類のものを含む、非経口的手段による。従って、本発明の組成物は、医薬的に許容可能なキャリヤーと組合わせて本発明のＤＢＰ−ｍａｆ／ｃａｌを含んでなる医薬組成物として、好ましくは投与される。そのような組成物は、水溶液、エマルジョン、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソームの懸濁液、その他同種類のものでよい。適当なキャリヤー（賦形剤）は、水、塩類液、リンガー液、デキストロース液、およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ登録商標）、植物油、その他同種類のものの溶液を、含む。適当な保存剤、安定剤、抗酸化剤、抗菌剤および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ，ＢＨＴ，クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリン、その他同種類のものを付加的に含んでもよい。製剤に有用なクリームまたは軟膏基剤は、ラノリン、シルバデン（Ｓｉｌｖａｄｅｎｅ登録商標）（Ｍａｒｉｏｎ）、アクアフォア（Ａｑｕａｐｈｏｒ登録商標）（Ｄｕｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、その他同種類のものを含む。他の局所処方は、エアロゾール剤、包帯、およびその他の創傷包帯剤を含む。あるいは、当該発明の治療用化合物を適当なポリマーマトリックスまたは膜に取込むか、あるいは被包して、それにより、局所的に治療予定の部位近くの移植に適切な、徐放性送達ディバイスを提供してもよい。その他のディバイスは、留置カテーテルおよびＡｌｚｅｔ（登録商標）ミニポンプのようなディバイスを含む。さらに、本発明の治療用化合物を、固体型、特に凍結乾燥粉末として提供してもよい。凍結乾燥製剤は、典型的に安定剤およびバルク剤、例えばヒト血清アルブミン、スクロース、マンニトール、その他同種類のものを含む。医薬的に許容可能な賦形剤についての詳細な論考は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）で入手できる。
【００５８】
ホルモン依存性癌を治療するのに必要な本発明の組成物の量は、当該障害の性質および重度、対象者の年令および容態、当業者により容易に決定される他の要因次第で当然変動する。
【００５９】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つまたは１つより多い成分で充填された１つまたは１つより多い容器を含む、医薬品パックまたはキットも提供する。場合により、そうした容器に、医薬品または生体産物の製造、使用または販売を統制する政府当局により規定された形式での通知書であって、ヒト投与についての製造、使用または販売の当該当局による認可を反映する通知書を、随伴させることが可能である。
【００６０】
本出願を通じて引用されている参考文献は、参考文献によって本明細書に援用される。
本明細書で述べられている文書は、参考文献によって本明細書に援用される。
【００６１】
上記の詳細な説明および下記の実施例は、あくまでも例証であって、本発明の範囲に関する制限ととるべきでないと解釈される。当業者には明白なはずの、開示実施態様に対するさまざまな変更および修飾を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、行ってもよい。さらに、本明細書に引用されたすべての特許、特許出願および公告は、参考文献によって本明細書に援用される。
【００６２】
【実施例】
材料および方法
細胞培養およびならし培地収集
ヒト膵臓腺癌細胞株ＢｘＰＣ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，メリーランド州）を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ），１００μｇ／ｍｌ  ペニシリンＧ、および１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中でインキュベートした。細胞は、Ｔ−７５組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）に維持し、そして加湿インキュベーター中３７℃で、５％ＣＯ2／９５％空気中で増殖させた。ならし培地は、９００ｃｍ2回転びん（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の近集密状態のＢｘＰｃ３細胞にＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＣＳ（１００ｍｌ）を加え、そして７２時間インキュベートすることにより、産生した。ならし培地は、収集して、濾過（０．４５μｍ）し，そして４℃に貯蔵した。無血清ならし培地は、ＰＢＳで２回洗浄後の９０−９５％集密細胞への対応する無血清培地の添加により、作製した。２４時間のインキュベーション後、当該無血清ならし培地を収集して、濾過し、そして直ちに使用した。
【００６３】
ＢＣＥ検定法
ウシ毛細管内皮細胞を、１０％熱不活性化ＢＣＳ，抗生物質、および３ｎｇ／ｍＬ組換えヒトｂＦＧＦ（Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ，カリフォルニア州）と共にＤＭＥＭ中に維持した。細胞は、ＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシンの０．０５％溶液中に分散した。細胞懸濁液はＤＭＥＭ／１０％ＢＣＳ／１％抗生物質で作り、そしてその濃度は２５，０００細胞／ｍｌに調整した。細胞は、ゼラチン化２４ウエル培養プレート（０．５ｍＬ／ウエル）上にプレートし、そして１０％ＣＯ2中３７℃で２４時間インキュベートした。当該培地を０．２５ｍＬのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％抗生物質と交換し、そして試験試料を適用した。２０分間インキュベーション後、各ウエルに培地およびｂＦＧＦを添加し、ＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％抗生物質／１ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦの０．５ｍＬの終容量とした。７２時間後、細胞をトリプシン中に分散し、Ｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルバニア州）中に再懸濁して、そしてコールターカウンターにより計数した。
【００６４】
ヒトおよびウシＤＢＰの精製
ヒトおよびウシＤＢＰは、適当な修正を加えて記載（２９）のように２５−ヒドロキシビタミンＤ3アフィニティクロマトグラフィーを用いて、それぞれの血清から精製した。ヒトまたはウシ血清を等容量のカラム緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．３，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で希釈し、４℃で２５−ヒドロキシビタミンＤ3アフィニティカラムに付した。当該カラムは前記カラム緩衝液で洗浄し（ベッド容量の２０倍）、そして結合タンパク質類を１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で溶出した。塩類は透析して除き、そしてタンパク質類は、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．０で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム上でさらに分画した。カラムは過剰の平衡化緩衝液で洗浄し、そして結合ＤＢＰを７５ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．０で溶出した。
【００６５】
ＢｘＰＣ３ならし培地からのＤＢＰ−ｍａｆの精製
ＢｘＰＣ３ならし培地を２５−ヒドロキシビタミンＤ3アフィニティカラム（４℃で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．３緩衝液で平衡化）に付した。カラムは、ＲＰＭＩ１６４０で、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．３緩衝液により洗浄した。結合ＤＢＰ／ＤＢＰ−ｍａｆは１Ｍ酢酸緩衝液，ｐＨ５．０で溶出した。当該タンパク質類は、上記のようにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。
【００６６】
ＤＢＰからＤＢＰ−ｍａｆの生成
シアリダーゼおよびβガラクトシダーゼ（各２ユニット）を、製造会社の説明書に従って、０．６ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結した。当該固定化酵素類は、連結用緩衝液で最終洗浄後、４℃で必要になるまで貯蔵した。
【００６７】
ＤＢＰ（１００μｇ）は、ＰＢＳ−Ｍｇ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５，０．９％塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＭｇＳＯ4）中、３７℃で両端間振盪機上２時間、固定化シアリダーゼおよびβガラクトシダーゼ（各０．２ユニットの活性）の混合物と共にインキュベートした。ゲルを４℃で５分間、６００ｘｇでの遠心分離により沈降させた。その上澄み（ＤＢＰ−ｍａｆ／２５−ＯＨ−Ｄ3−ＤＢＰ−ｍａｆを含有する）を集め、そして０．２２ミクロンフィルター（１０）7を通して濾過することにより殺菌した。当該ＤＢＰ−ｍａｆ調製物のエンドトキシン汚染の可能性は、Ｄｅｔｏｘｉ  ＧｅｌTM（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてエンドトキシンを除くことにより排除した。
【００６８】
ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）検定法
ニワトリ胚は報告されたように調製した。マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（１０μｌ）に溶解した試料を、６日齢胚の漿尿膜の外側３分の１の上にマイクロピペットした。この処置は３ｘ−６ｘ立体鏡を用いて実行した。抗血管新生活性は、４８から９６時間の間に当該試料周囲の無血管性帯の直径により測定した。無帯は「−」と採点し、メッシュの縁を超えて２ｍｍの直径をもつ帯を「＋」と採点し、２ｍｍ増す毎に追加の「＋」として採点した。ＣＡＭ検定は、当該試料の本体を知らされていない研究者により採点された。
【００６９】
動物研究
すべての動物研究は、連邦、地方、および機関の指針に従って、ボストンの小児病院にある動物施設で実施した。雄６−８週齢の免疫無防備状態のマウス（ＳＣＩＤ，マサチューセッツ総合病院、ボストン、マサチューセッツ州）またはＣ５７ＢＬ６／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，メイン州）マウスを馴致し、バリアケア（ｂａｒｒｉｅｒ  ｃａｒｅ）施設で4匹またはそれ以下の群としてかご中に収容して、そしてそれらの背中を剃った。全マウスは動物飼料と水との食餌を自由に摂取させた。すべての処置の前に動物はメトキシフルラン（ｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｒａｎｅ）（Ｐｉｔｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，イリノイ州）で麻酔し、そして完全に回復するまで観察した。動物はＣＯ2窒息で屠殺した。
【００７０】
マウス腫瘍モデル
マウスにおける移植のための腫瘍細胞の調製
上記のように細胞培養で増殖させた膵臓癌細胞およびＨＴ１０８０細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンの０．０５％溶液中に分散し、そして再懸濁した。遠心分離（室温で４０００ｒｐｍ、１０分間）後、細胞ペレットをＲＰＭＩ中に再懸濁し、そしてその濃度を１２．５ｘ１０6細胞／ｍｌに調整した。当該部位をエタノールで清潔にした後、腫瘍細胞を、０．２ｍｌ  ＲＰＭＩ中２．５ｘ１０6細胞を皮下注射した。
【００７１】
マウスにおける移植のためのルイス肺細胞の調製
６００−１２００ｍｍ3のルイス肺癌腫腫瘍をもつ動物を屠殺し、そして当該腫瘍を覆う皮をベタジンとエタノールで清潔にした。層流フード中、腫瘍組織を無菌条件下で切除した。ふるい、および直径が２２−規格から３０−規格へと逐次的に径を小さくする一連の皮下注射針を介して生腫瘍組織を通過させることにより、０．９％標準塩類液中に腫瘍細胞の懸濁液を作った。その終濃度を１ｘ１０7細胞／ｍｌに調整し、そして氷上に置いた。エタノールで当該部位を清潔にした後、マウスは０．２ｍｌ  ＰＢＳ中の２．５ｘ１０6細胞を注射された。
【００７２】
両側腫瘍モデル
膵臓癌細胞の一次腫瘍を、左脇腹に２．５ｘ１０6細胞（０．２ｍｌ）注射することにより生成させた。腫瘍はダイアル式ノギスで測定し、そして容積を、式（幅2ｘ長さｘ０．５２）を用いて決定した。腫瘍容積が少なくとも４００−５００ｍｍ3（体重の２−２．５％）になった時点で、それは１４−２１日以内に起ったが、二次腫瘍を反対側の脇腹に移植した（０．２ｍｌ中２．５ｘ１０6細胞）。対照マウスは、二次腫瘍細胞の同一注射を同時に受けた。腫瘍は３日毎に測定した。一次腫瘍により誘導される抑圧速度は、対照群に比して、二次腫瘍の増殖の遅延、減少、または消失として見られた。別に、膵臓癌細胞を両脇腹に注射した（０．２ｍｌ中２．５ｘ１０6細胞）。腫瘍は３日毎に日常的に測定した。６−８週齢の雄マウスは、近位背部に１００μｌのＲＰＭＩ中に懸濁された４ｘ１０6腫瘍細胞の皮下（ｓ．ｃ）注射を受けた。さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ通過のために、ｓ．ｃ．腫瘍を無菌条件下に切除し、切刻み、そして新しい動物にｓ．ｃ再移植した。ヒト膵臓癌、およびＨＴ１０８０またはルイス肺癌腫を、ＳＣＩＤまたはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの中位背部皮下に接種した。
【００７３】
組織学
標本は、１０％中性緩衝化ホルマリン中で４℃一晩固定し、そしてパラフィン中に包埋した。５ミクロン切片を作り、そしてごく普通にヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。内皮細胞を視覚化するために、切片は、マウスｃｄ３１に対するラット抗血清（ｐｅｃａｍ；１：２５０；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，サンディエゴ）中で４℃一晩インキュベートした。二次抗体のビオチニル化家兎抗ラット、マウス吸着（１：２００，Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カルフォルニア州）に続いて、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼおよびチラミド  シグナル増幅（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，ボストン）を行った。ＡＥＣ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，カルフォルニア州）およびＧｉｌｌのヘマトキシリンが色素原および対比染色であった。マクロファージのような造血起源の細胞は、ラット抗マウスｃｄ４５抗血清（白血球共通抗原、Ｌｙ−５’１：１００，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で免疫染色した。上記と同一の二次抗体の後、アビジン／アルカリ性ホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ）に結合させたビオチンを、Ｎｅｗ  Ｆｕｓｃｈｉｎ色素原（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，カルフォルニア州）と共に使用した。
【００７４】
結果
膵臓癌細胞ならし培地からの抗内皮ＤＢＰ−ｍａｆの精製
膵臓癌細胞ＢｘＰＣ３は、当研究室で広範に使用されているｉｎ  ｖｉｖｏモデルで決定されたように、二次腫瘍移植体の増殖を最高８０％まで阻害することができた（表１）。別の膵臓癌細胞株（ＡＳＰＣ−１）は二次腫瘍の増殖を阻害できなかったことより、ＢｘＰＣ３は抗血管新生因子を産生していることが示唆された。しかし、ＢｘＰＣ３細胞から得たならし培地は、内皮細胞の増殖を阻止できなかった（データ不掲示）。これは恐らく、２４−４８時間後に当該ならし培地中に存在するｂＦＧＦ（６−８ｐｇ／ｍＬ）およびＶＥＧＦ（３０００−６０００ｐｇ／ｍＬ）のような増殖因子類の比較的高い濃度によるものと思われる。これらのプロ血管新生サイトカイン類はヘパリンに結合する（５）。そこで本発明者らは、当該ならし培地をヘパリン−セファロース上で分画した。内皮細胞増殖検定法で決定したところ、ヘパリン−セファロースに結合しなかった物質が抗内皮活性を示した。この活性は、Ｑ−セファロースおよびモノＱ陰イオン交換クロマトグラフィーの組合わせ（材料および方法を参照）を用いて、さらに精製した。モノＱカラムから溶出する抗内皮画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つのバンドを示した（図１Ｃ）。これら２つのタンパク質はＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離した。質量分析および配列分析は、当該タンパク質の１つ（分子量６６，０４２）はＢＳＡで、一方もう１つののタンパク質（分子量５３，４５４）はアミノ末端配列ＬＥＲＧＲＤＹＥＫＤをもつことを示した。この配列は、ヒトビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）のアミノ末端配列に、９０％類似している。本発明者らは、ウシＤＢＰを本発明者らの抗内皮タンパク質に同一とした。
【００７５】
選択的脱グリコシルはＤＢＰを抗血管新生因子へ変換する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系で発現されたヒトＤＢＰは、ＣＡＭ中の血管新生を阻止できなかった（表２）。したがって、前記ＢｘＰＣ−３細胞は、抗内皮タンパク質を生成するために、何らかの仕方でウシＤＢＰを修飾していると、本発明者らは仮定した。ＤＢＰの既知の生化学的修飾は、ＤＢＰ−ｍａｆを産生するための脱グリコシルである。さらに、癌細胞がグリコシダーゼ類を産生することはよく知られている。ＢｘＰＣ−３細胞は、シアリダーゼおよびβガラクトシダーゼを産生する（表３）。この仮説を検証するために、本発明者らは、ヒトＤＢＰを精製し、記載のように（材料および方法を参照）固定化βガラクトシダーゼおよびシアリダーゼを用いて脱グリコシルし、そしてＣＡＭ検定でこのＤＢＰ−ｍａｆをテストした。ＤＢＰ−ｍａｆはＣＡＭ検定で血管新生を阻止することができた（表２および図６Ａおよび６Ｂ）。
【００７６】
ＢｘＰＣ３ならし培地から精製されたＤＢＰはヒトおよびウシＤＢＰ−ｍａｆと同様な仕方でマクロファージを活性化できる
ヒトおよびウシＤＢＰは記載のように精製し、そして酵素的にＤＢＰ−ｍａｆへ変換した。これらのＤＢＰ−ｍａｆタンパク質は、スーパーオキシド生成検定法（材料および方法を参照）により決定したところ、マクロファージを活性化することができた（図２）。ＤＢＰ−ｍａｆに曝露されたマクロファージによるスーパーオキシド生成の増加は、３−４倍であった。ＢｘＰＣ３ならし培地から精製されたＤＢＰは、ウシＤＢＰの３−4倍のスーパーオキシド産生という同様な増加で、マクロファージを活性化することができた（図２）。これらのデータ、内皮細胞増殖の阻害、およびマクロファージの活性化は、ＢｘＰＣ３ならし培地から精製されたＤＢＰがＤＢＰ−ｍａｆ型へ変換されたことを示している。
【００７７】
全身的に投与されたＤＢＰ−ｍａｆは固形腫瘍の増殖を阻止することができる
腫瘍がマウスの脇腹に移植され、そして当該腫瘍が１００ｍｍ3の容積に達した時に、療法を開始した。対照動物は、塩類液、またはＥ．ｃｏｌｉが発現したヒトビタミンＤ結合タンパク質を受け、そして治療される動物は、ＤＢＰ−ｍａｆの皮下注射（４ｎｇ／Ｋｇ／日）を２８−３０日間受けた。免疫無防備状態のマウスにおけるヒト膵臓腫瘍（ＢｘＰＣ３およびＳＵ８８．８６）の増殖は、劇的に阻害され（図３Ａ−Ｃ）、前記治療腫瘍の増殖は当該実験の過程を通じて実質的に観察されなかった。正常Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおけるルイス肺癌腫の増殖も、この用量のＤＢＰ−ｍａｆにより顕著に阻害されたが、当該実験の過程を通じて治療腫瘍の容積に測定可能な増加があった。本発明者らは、ＢｘＰＣ３腫瘍を治療した際、当該療法に対する用量反応を観察した（図４Ａ−Ｂ）。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたヒトＤＢＰを受けた動物は腫瘍増殖を示したが、一方本実験での最大用量（４μｇ／Ｋｇ／日）を受けた動物は、確立された腫瘍の増殖を全く示さず、確立腫瘍の退縮の証拠を得た。４ｎｇ／Ｋｇ／日を受けた動物も、治療２４日後でも腫瘍増殖をほとんどあるいは全く示さなかったが、一方4日毎に４ｎｇ／Ｋｇを受けた動物は、確立された腫瘍に多少の増殖を示した（図４Ａ−Ｂ）。
【００７８】
組織学結果
組織学的分析は、治療腫瘍が、健康な結合組織の層に接した外周に、生きた腫瘍細胞の層をもつ小さな壊死シストを主に含んでなることを示した（図５Ｂ，矢印）。無治療の腫瘍（図５Ａ）は、そのような形態を示さず、その代り多数の生腫瘍細胞を含んでいた。内皮細胞特異的マーカーＣＤ３１についての免疫染色は、無治療腫瘍（図５Ｃ，矢印）が、治療腫瘍（５Ｄ、矢印）に比べて、より高い微小血管密度をもつことを明らかにした。治療腫瘍では結合組織の隣接層が血管形成されているらしいことに注目されたい（図５Ｄ）。さらに、マクロファージ特異的マーカーＭａｃ−３に対して向けられた免疫染色は、治療腫瘍がマクロファージによって浸潤されている（図５Ｆ，矢印）、のに対して対照腫瘍がこの抗原に対する染色がずっと薄いこと（図５Ｅ）を明らかにした。ＮＫ細胞を同様に染色する他のマクロファージマーカーである白血球共通抗原（ＬＣＡ）の染色も、白血球起源の細胞による当該治療腫瘍の浸潤を示した（図５Ｇおよび５Ｈ）。
【００７９】
考察
本発明者らは、ヒト膵臓癌細胞株のならし培地からＤＢＰの抗内皮型を精製した。当該タンパク質の抗内皮型は、当該タンパク質のカルボキシ末端ドメイン中のＯ−結合性オリゴ糖の選択的脱グリコシルにより、全身性ＤＢＰから変換される。当該膵臓細胞はこの変換に必要なグリコシダーゼ類を産生している。このことは、ヒト膵臓癌が、ウシ血清存在下の組織培養条件で、ＤＢＰ−ｍａｆのウシ型を産生する理由を説明している。
【００８０】
ＤＢＰ−ｍａｆのこの抗内皮型は、内皮細胞の増殖を直接阻害し、そしてＣＡＭ検定において血管新生を阻害することができる。ＤＢＰ−ｍａｆはヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ３）または平滑筋細胞の増殖に何らの影響も及ぼさないことから、内皮細胞特異性が示唆される。精製ヒトＤＢＰから生成されたＤＢＰ−ｍａｆは、抗腫瘍形成剤として有効であった。ＤＢＰ−ｍａｆの毎日の低用量（４ｎｇ／Ｋｇ）の投与は、マウスモデルで固形腫瘍増殖の顕著な阻害を起した。さらに、ＤＢＰ−ｍａｆは、より高用量で投与された場合、免疫無防備状態のマウス中に確立された膵臓腫瘍を退縮することができた。ヒトＤＢＰ−ｍａｆの投与はＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおけるルイス肺癌腫の増殖の阻害を起したが、その阻害は免疫無防備状態のマウス中のヒト膵臓癌の治療ほどに顕著ではなかった。この観察には２通りの説明が考えられる：ルイス肺癌腫は、より攻撃的な治療処方を要する増殖のより速い腫瘍である、あるいは前記Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスは、免疫化のための強力なアジュバントであることが示されたヒトタンパク質に対する免疫応答を装備している（１４）。
【００８１】
ＤＢＰ−ｍａｆは、マウスモデルにおけるエールリッヒ腹水腫瘍を治療するのに、成功裏に使用されたことがある（１１、１２）。低用量のＤＢＰ−ｍａｆ（１００ｐｇ／マウス）によるマウスの治療は、対照マウスに比べて、有意な生残り時間の延長をもたらした（１１）。さらに、ＤＢＰ−ｍａｆによる治療は、治療の終りに腹腔内腫瘍細胞数により測定したところ、当該腫瘍を根絶した（１２）。ＤＢＰ−ｍａｆは、単独で投与された場合、マウスモデルにおける扁平上皮細胞癌腫に対して効力を示さなかったが（１３）、光力学的療法に対するアジュバントとして投与された場合には、治癒的なことが証明された。
【００８２】
当該タンパク質のこの選択的に脱グリコシルされた形も、マクロファージを活性化する（１５）。本発明者らはまた、酵素的に生成されたもの、またはＢｘＰＣ３ならし培地から精製されたたもののいずれでも、ＤＢＰ−ｍａｆがマクロファージを活性化できることを示した。マクロファージ類は、多数の強力な血管新生サイトカイン類および増殖因子類、ならびにＥＣＭ分解酵素類を産生する、末端分化した細胞である。したがって、マクロファージ類は、血管新生のさまざまな段階で正負いずれの方向にも、影響する可能性がある（１６）。また、古典的方法で、あるいは別の仕方で、活性化されたマクロファージ類の血管新生力にも違いがある（１７）。別の仕方で活性化されたマクロファージリッチな病巣は高度に血管形成される傾向があるが、一方古典的方法で活性化されたマクロファージリッチな病巣には、その傾向はない14。
【００８３】
活性化されたマクロファージ類は、本分子の効力に寄与する抗血管新生因子を分泌する可能性がある。本因子の正体は現在不明だが、それを同定するための努力が進められている。本発明者らは、血管新生に役目を果していることが知られるサイトカイン類について、ＤＢＰ−ｍａｆ刺激マクロファージならし培地を検定した。ＤＢＰ−ｍａｆはＩＦＮｇまたはＩＬ−１２の分泌を誘導せず、両者は当該マクロファージならし培地中ではＥＬＩＳＡにより検出できなかった（データ不掲示）。マクロファージならし培地中のＩＦＮｇの欠如は、このサイトカインの直接関与およびＩＬ−１８の何らかの関与にも反するという議論になる。ＩＬ−１８は、抗血管新生性および抗腫瘍発生性であると報告されている。しかし、それは強力なＩＦＮｇ誘導性サイトカインであり、それ故、もしＩＬ−１８が関与するのであれば、ＩＦＮｇを見い出すことが期待されるはずである。ＩＬ−１２も、ＩＦＮｇを誘導することにより、やはりその作用を仲介する強力な抗血管新生サイトカインであることが示されている。本発明者らは、ＤＢＰ−ｍａｆに曝露されたマクロファージのならし培地中のＩＬ−１２の欠如を直接証明した。
【００８４】
抗原提示細胞として働くマクロファージ、および腫瘍抗原に対する抗体を生成するリンパ球、を伴う免疫発生プロセスにおける第一段階として、ＤＢＰ−ｍａｆがマクロファージを活性化すると仮定されてきた（１３、２１）。エールリッヒ腹水腫瘍に対するＤＢＰ−ｍａｆの多回投与の有効性は、当該腫瘍に対して発生した免疫によると示唆されてきた（１１）。この考えを支持して、エールリッヒ腹水腫瘍細胞は、死滅エールリッヒ腹水で予め免疫されたマウスでは増殖できない（２２）。マクロファージの殺腫瘍能は、選択的にＩｇＧ（Ｆｃ受容体）仲介経路を通じて観察され（２３、２４、２５）、そしてＤＢＰ−ｍａｆは抗体産生のための免疫化における強力なアジュバントであることも知られている。しかし本発明者らは、ＢおよびＴリンパ球を欠失する免疫無防備状態のマウスで、ＤＢＰ−ｍａｆによる抗腫瘍発生活性を観察した。そうした観察は、完全免疫仲介機構に反する議論をもたらす。さらに本発明者らは、ＤＢＰ−ｍａｆそのもの、またはＤＢＰ−ｍａｆ刺激マクロファージのならし培地のいずれによっても、膵臓癌細胞に対する抗増殖作用を認めなかった。これらの観察は、ＤＢＰ−ｍａｆおよびＤＢＰ−ｍａｆ刺激マクロファージのならし培地に観察された抗内皮活性および抗血管新生活性に基づき、抗血管新生であると本発明者らが仮定する、もう１つの機構を支持する議論をもたらす。
【００８５】
癌はエンドおよびエキソグリコシダーゼ類を分泌することがあると報告されている（２６、２７、２８）。癌性細胞が、ＤＢＰから全Ｏ−結合型オリゴ糖を切断するＩ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを分泌する、ことを示す証拠が提示された。そのような脱グリコシルは、当該分子がＤＢＰ−ｍａｆへ変換されるのを不能にする。これは、癌が炎症性応答を逃れることができる機構であろうと、推測されてきた（２２）。事実、癌患者の血流中のＩ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性の存在は、当該疾患の予後インデックスとして役立つ可能性がある（２２）。そうなると、癌細胞が、ＤＢＰのＤＢＰ−ｍａｆへの有効な変換を起す酵素類も分泌できるとしても、驚くにあたらない。したがって、ＢｘＰＣ３は、ＤＢＰからＤＢＰ−ｍａｆを生成できるグリコシダーゼ類を分泌することで、自縄自縛に陥っているのかも知れない。
【００８６】
要するに、ヒト膵臓癌細胞系はＤＢＰからＤＢＰ−ｍａｆを生成できる。この分子は固有の抗内皮活性をもつ。ＤＢＰ−ｍａｆの全身投与は、さまざまな固形腫瘍の腫瘍増殖の速度を阻害することが可能で、そして場合によっては、確立された腫瘍の退縮を起すこともある。そのような腫瘍阻害および退縮は、免疫無防備状態のマウスで観察されたことから、完全免疫応答仲介機構に反する議論をもたらす。ＤＢＰ−ｍａｆは、少なくとも一部は、抗血管新生機構を通じて働いており、そしてこの抗血管新生機構は、マクロファージにより分泌される強力な未知抗血管新生因子により増幅されると、本発明者らは考えている。この仮説に対する本発明者らの証拠は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内皮細胞増殖検定およびＣＡＭ検定から得ている。本発明者らは現在、マクロファージにより分泌される未知因子の精製および特徴づけを試みているが、それはＩＬ−１２、ＩＦＮγ、またはＴＮＦαではないようである。ＤＢＰ−ｍａｆは、他の抗血管新生療法に比べて、マウスにおいて比較的低用量で抗腫瘍形成療法として効力をもっている（１、２）。
【００８７】
【表１】
0004907032.tif 000002
記載のように、腫瘍細胞を調製し、そしてＳＣＩＤマウスに移植した。当該実験の終りに、腫瘍容積を測定した。阻害された腫瘍の容積を、非阻害の対照腫瘍の容積に比較し、そしてその割合を百分率として表した。
【００８８】
【表２】
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材料および方法に記載されたように、ＣＡＭ検定を実施し、そして等級付けをした。
【００８９】
【表３】
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記載のように、ヒト膵臓癌細胞をシアリダーゼおよびβガラクトシダーゼの存在について検定した。活性は暫定的な蛍光単位として表す。
下記の参考文献は本明細書を通じて引用され、そして参考文献により本明細書に援用される。
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１１．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ，Ｎａｒａｐａｒａｊｕ  ＶＲ，（１９９７），ビタミンＤ結合タンパク質由来マクロファージ活性化因子によるエールリッヒ腹水腫瘍をもつＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫療法。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，２１８７−９２．
１２．  Ｋｏｇａ  Ｙ，Ｎａｒａｐａｒａｊｕ  ＶＲ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ（１９９９）エールリッヒ腹水腫瘍をもつマウスに対するビタミンＤ結合タンパク質由来マクロファージ活性化因子の抗腫瘍作用。Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２２０，２０−６．
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１５．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，およびＨｏｍｍｍａ  Ｓ．，（１９９１），ビタミンＤ３結合タンパク質（群特異的成分）はリゾホスファチジルコリン処理リンパ球からのマクロファージ活性化シグナル因子に対する前駆体である。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８５３９−４３．
１６．  Ｏｎｏ  Ｍ，Ｔｏｒｉｓｕ  Ｈ，Ｆｕｋｕｓｈｉ  Ｊ，Ｎｉｓｈｉｅ  Ａ，Ｋｕｗａｎｏ  Ｍ，（１９９９），ヒト腫瘍血管新生におけるマクロファージ浸潤の生体的意味。Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４３  ｓｕｐｐｌ．，６９−７１．
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２５．  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＡＮ，Ｍｉｎｔｚｅｒ  Ｄ，Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，Ｗｅｌｔ  Ｓ，Ｆｌｉｅｇｅｌ  Ｂ，Ｖａｄｈａｎ  Ｓ，Ｃａｒｓｗｅｌｌ  Ｅ，Ｍｅｌａｍｅｄ  ＭＲ，Ｏｅｔｔｇｅｎ  ＨＦ，Ｏｌｄ  ＬＪ，（１９８５），ＧＤ３ガングリオシドを検出するマウスモノクローナルＩｇＧ３抗体：悪性黒色腫をもつ患者でのフェイズＩ試験。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２４２−６．
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２７．  Ｙａｎｇ  Ｆ，Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ＪＭ，Ｌｉｎｅｈａｎ  ＬＡ，Ｌａｌｌｅｙ  ＰＡ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ＡＹ，Ｂｏｗｍａｎ  ＢＨ（１９９０）マウスにおける群特異的成分遺伝子のマッピングと保存。Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７，５０９−１６．
２８．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｎ，Ｌｉｎｄｓａｙ  ＤＤ，Ｎａｒａｐａｒａｊｕ  ＶＲ，Ｉｒｅｌａｎｄ  ＲＡ，Ｐｏｐｏｆｆ  ＳＮ，（１９９４），大理石骨病ラットにおける炎症感作マクロファージ活性化カスケードの欠陥。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，５１００−７．
２９．  Ｓｗａｍｙ  Ｎ．  Ｒｏｙ  Ａ．  Ｃｈａｎｇ  Ｒ．  Ｂｒｉｓｓｏｎ  Ｍ．  Ｒａｙ  Ｒ．，（１９９５），ヒト血漿ビタミンＤ結合タンパク質のアフィニティー精製。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．，６：１８５−１８８．
３０．  Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｍ，Ｒｉｓａｕ  Ｗ，Ｈａｌｌｍａｎｎ  Ｒ，Ｇａｕｔｓｃｈｉ  Ｐ，Ｂｏｈｌｅｎ  Ｐ，（１９８７），ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮細胞増殖の強力な阻害剤、腫瘍壊死因子アルファ型はｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生性である。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，５２７７−８１．
３１．  ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１６），１０９３１−１０９３４（１９９２）．
３２．  Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎ．，Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８５：１１８２−１１８６（１９７１）．
３３．  Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１４０１−１４０３（１９９２）．
３４．  Ｂａｆｆｏｕｒら，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１６：１８１−９１（１９９２）．
３５．  Ｐｕら，Ｊ．Ｓｕｒ．Ｒｅｓ．，５４：５７５−８３（１９９３）．
３６．  Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：２２８−２３４（１９９４）．
３７．  Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３：６６２−７０（１９９４）．
３８．  Ｂａｔｔｅｇａｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，３３３−３４６（１９９５）．
３９．  Ｈａｎａｈａｎら，Ｃｅｌｌ，８６，３５３−３６４（１９９６）．
４０．  Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎ．，Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３，１７５７−１７６３（１９９５）．
上述の発明は、理解の明快化の目的で、図解および実施例を通して多少詳しく説明したが、ある種の変更および修飾は、添付の請求事項の精神および範囲を逸脱せずに実行可能なことを、当業者は容易に確かめるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−Ｃは、ヒト膵臓癌細胞、ＢｘＰＣ３からの抗内皮因子の精製を示す。ＢｘＰＣ３ならし培地（５％ＦＣＳの存在下で３７℃、４８時間ならした１Ｌ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＴｒａｐ（５ｍＬ）ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に付した。内皮細胞増殖検定法により検定したところ、非結合物質が抗内皮活性を含有していた。この活性（●−●）は、Ｑ−セファロース（図１Ａ）およびモノＱ陰イオン交換クロマトグラフィー（図１Ｂ）を用いて、さらに精製した。５％ウシ胎児血清を含む対照培地は、分画プロトコールにかけたとき、抗内皮活性を示さなかった（○−○）ことに注目されたい。モノＱから〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ＮａＣｌの連続グラジエントから）で溶出する抗内皮活性を示す画分（●−●）は、２つのバンドを含んでいた（図１Ｃ）。これらのバンドは移動および等電点（ｐＩ）において非常によく似ていた。それらはＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて相互に分離し、そして質量分析と組合わせた配列分析は、それらがＢＳＡおよび、ヒトビタミンＤ結合タンパク質とアミノ末端１０残基の範囲内で９０％相同性をもつタンパク質であると、決定した。したがって本発明者らは、このバンドをウシビタミンＤ結合タンパク質に同一とした。
【図２】  図２は、ＤＢＰ−ｍａｆによるマクロファージの活性化を示すグラフである。各種ＤＢＰ調製物を生成し、スーパーオキシド産生検定法により測定される、マクロファージを活性化するそれらの能力をテストしたところ、／ヒトＤＢＰおよびウシＤＢＰはマクロファージを活性化できなかった。選択的および特異的脱グリコシルにより生成された、ヒトＤＢＰ−ｍａｆおよびウシＤＢＰ−ｍａｆはマクロファージを活性化できた。ＢｘＰＣ３ならし培地から精製したウシＤＢＰも、マクロファージを活性化することができた。
【図３】  図３Ａは、ＤＢＰ−ｍａｆによるＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍の治療を示すグラフである。ＢｘＰＣ３細胞をＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植した。当該腫瘍が１００ｍｍ3の容積に達した時点で、治療を開始した。動物は４ｎｇ／Ｋｇ／日のＤＢＰ−ｍａｆを受けた（○−○）。治療は腹腔内投与であった。対照動物（●−●）は塩類液の注射のみを受けた。ｎ＝３
図３Ｂは、ＤＢＰ−ｍａｆによるＳＵ８８．８６ヒト膵臓腫瘍の治療を示すグラフである。ＳＵ８８．８６細胞をＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植した。当該腫瘍が１００ｍｍ3の容積に達した時点で、治療を開始した。動物は４ｎｇ／Ｋｇ／日のＤＢＰ−ｍａｆを受けた（○−○）。治療は腹腔内投与であった。対照動物（●−●）は塩類液の注射のみを受けた。ｎ＝３
図３Ｃは、ＤＢＰ−ｍａｆによるルイス肺癌腫の治療を示すグラフである。ルイス肺癌腫細胞をＣ５７／Ｂ１６マウスの脇腹に皮下移植した。当該腫瘍が１００ｍｍ3の容積に達した時点で、治療を開始した。動物は４ｎｇ／Ｋｇ／日のＤＢＰ−ｍａｆを受けた（○−○）。治療は腹腔内投与であった。対照動物（●−●）は、大腸菌で発現された（そのためＯ−結合型糖を全く欠く）ＤＢＰの対応量を受けた。ｎ＝３
【図４】  図４Ａは、ＤＢＰ−ｍａｆの用量増加に伴うＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌の治療を示すグラフである。ＢｘＰＣ３細胞をＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植した。当該腫瘍が１００ｍｍ3の容積に達した時点で、治療を開始した。動物は４ｎｇ／Ｋｇ／４日（○−○）、４ｎｇ／Ｋｇ／日（■−■）、または４μｇ／Ｋｇ／日（□−□）でＤＢＰ−ｍａｆの腹腔内注射を受けた。対照動物は４μｇ／Ｋｇ／日の大腸菌発現ヒトＤＢＰを受けた（●−●）。ｎ＝５。
図４Ｂは、ＤＢＰ−ｍａｆの用量増加に伴うＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌の治療を示す写真である。腫瘍は実験の終わりに切取った。上段は、４μｇ／Ｋｇ／日の大腸菌発現ヒトＤＢＰを受けた動物から切除された腫瘍を示す（図４Ａ●−●を参照）。下段は、４μｇ／Ｋｇ／日のヒトＤＢＰ−ｍａｆを受けた動物から切除された腫瘍を示す（図４Ａ□−□参照）。
【図５】  図５Ａ−５Ｈは、対照および治療腫瘍の組織学的検査の写真である。対照の非治療のＢｘＰＣ３腫瘍（図５Ａ）およびＤＢＰ−ｍａｆ治療腫瘍（図５Ｂ）はＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）で染色した。切片はＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）に対して向けられた抗体で染色したが、対照腫瘍（図５Ｃ）では、当該腫瘍は血管形成している（矢印）のに対して、治療腫瘍（図５Ｄ）では、当該腫瘍に隣接する結合組織に多少の血管形成が見られるものの（矢印）、当該腫瘍細胞はほとんど血管形成していない、ことに注目されたい。抗原ＣＤ４５に対する染色は、対照腫瘍で単球系列のごく少数の細胞を示したが（図５Ｅ）（矢印）、一方治療腫瘍中への単球様細胞の重度の浸潤（図５Ｆ）が明らかであった（矢印）。白血球共通抗原（ＬＣＡ）に対する染色も、白血球起源の細胞によるＤＢＰ−ｍａｆ治療腫瘍の重度の浸潤を示した（図５Ｇ）。対照腫瘍はこの抗原に対してほとんど染色しなかった（図５Ｈ）。
【図６】  図６Ａおよび６Ｂは、ヒトＤＢＰおよびＤＢＰ−ｍａｆによるＣＡＭにおける血管新生の阻害を示す。ヒトビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）は、上記のように、ヒト血漿からビタミンＤセファロースアフィニティクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組合わせを用いて精製した。次いで、記載（材料および方法を参照）のように、当該精製タンパク質をガラクトシダーゼおよびシアリダーゼによりＤＢＰ−ｍａｆへ変換した。ＤＢＰ−ｍａｆは、５００ｎｇ／卵（図６Ａ）、および５μｇ／卵（図６Ｂ）の用量でＣＡＭ検定において血管新生を阻害した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図５Ｅ−Ｈ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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