(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
拒絶反応を診断するための遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、cig5遺伝子のmRNA、ペプチド、またはタンパク質であることを特徴とする遺伝子マーカー。
【請求項２】
免疫寛容の有無の判定に用いられることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子マーカー。
【請求項３】
免疫抑制剤の薬効の評価に用いられることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子マーカー
【請求項４】
肝移植後に使用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子マーカー。
【請求項５】
血液から単離されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子マーカー、並びに、拒絶反応の診断方法、免疫寛容の有無を判定する方法、免疫抑制剤の薬効を評価する方法、免疫抑制剤の同定方法、キット、及び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症臓器不全患者に対して、救命したりＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）を向上させたりする治療方法として臓器移植が行われているが、重篤な合併症である拒絶反応により移植臓器が失われ、移植が成功しないことがある。そのため、拒絶反応に対する早期対処を行うための、拒絶反応の迅速な診断方法や、拒絶反応の制御剤（免疫抑制剤）などの開発が求められている。【０００３】
臓器移植後の拒絶反応の診断方法としては、局所麻酔下の組織生検（針生検）が最も信頼性が高いとされているが、この方法は侵襲を伴い、患者に多大な負担を強いるため、頻回の検査が不可能であり、また、施行には熟練した技術と十分な設備が必要であるため、容易に行うことができない。現在では、針生検の代わりに、血液検査（例えば、血中におけるＷＢＣ（白血球数）、ＣＲＰ（C reactive protein）、臓器障害マーカー（ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＧＯＴ）、ＡＬＴ（アミノトランスフェラーゼ；ＧＰＴ）、ビリルビン、γＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、クレアチニン、又はＢＵＮ（血中尿素窒素））などの濃度の変化を測定する方法）や、ドップラー超音波検査（血流量の観察）などの方法が用いられているが、これらの方法は補助的に過ぎず、単独で拒絶反応の有無を診断することができない。そのため、針生検に代わって拒絶反応の有無を診断するためのバイオマーカーの開発が求められている。【０００４】
従来、移植組織の拒絶反応を評価するためのバイオマーカーとして、パーフォリン（perforin）、グランザイムＢ（granzymeB）、Fasリガンドなどが見出されている（特表２００１−５１７４５９号公報参照）。【０００５】
移植後、このような拒絶反応を抑制するため、移植患者に対し、免疫抑制剤が投与される。現在、免疫抑制剤として、シクロスポリン（例えば、特許第３３８２６５６号公報参照）、FK506（タクロリムス；例えば、米国特許第４８９４３６６号公報参照）などが用いられているが、これらの免疫抑制剤は過剰な投与により感染などの副作用の危険性が生じることから、免疫抑制剤の用法（投与方法）・用量（投与量や投与間隔）の厳密な設定が必要不可欠となっている。【０００６】
免疫抑制剤の用量設定は、血中における薬物の濃度が有効血中濃度の範囲内であるか否かをモニタリング（薬物血中濃度モニタリング：ＴＤＭ（Therapeutic drug monitiring）することにより行われているが、この有効血中濃度は経験的に設定されたものであり、科学的に根拠がないため、必ずしも薬効の指標となっていない。【０００７】
一方、臓器移植後に、免疫抑制剤を必要としないレベルにまで拒絶反応が低下し、免疫抑制剤から離脱できる患者が少数存在する。このような免疫寛容誘導が生じるのは、一つには、免疫抑制剤に免疫寛容誘導活性があるためであると考えられている。このように免疫寛容を獲得した患者においては、免疫抑制剤から離脱することができるので、免疫抑制剤の長期投与に伴う、感染症や悪性腫瘍のリスクや臓器障害などの副作用から解放されることになる。そこで、近年、例えばナイーブＴ細胞に発現している CD28 補助刺激分子を抗体や遺伝子組み換えタンパク質投与により阻害するというような、人為的に免疫寛容を誘導する方法の開発が試みられている。あるいは、免疫抑制剤の投与方法を工夫したり、複数の免疫抑制剤を投与することにより、免疫寛容を誘導することも試みられてきた（この場合、免疫抑制剤を免疫寛容誘導剤としても用いていることになる。）。【０００８】
しかしながら、免疫寛容の獲得の有無の判断は、免疫寛容の科学的な指標が無いため正確に行うことができず、免疫寛容の獲得の有無を判断する際の免疫抑制剤投与の中断には、常に拒絶の危険性を伴うという問題があった。そのため、免疫寛容の有無を迅速かつ簡便に判定することができる方法の開発が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、拒絶反応の診断、免疫抑制剤の薬効の評価、及び免疫寛容の有無の判定を行うことができる遺伝子マーカー、並びに、遺伝子マーカーを指標として迅速かつ簡便に行うことができる、拒絶反応の診断方法、免疫抑制剤の薬効を評価する方法、免疫抑制剤の同定方法、免疫寛容の有無を判定する方法、キット、及び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、拒絶反応モデルラットを用い、急性拒絶反応初期及び免疫抑制剤投与時の末梢血液中の遺伝子の発現パターンをマイクロアレイにより解析することにより、拒絶反応により発現量が上昇し、免疫抑制剤の投与により発現量が抑制された遺伝子（Bcl2l1、Best5、Igifbp、Gbp2など）を同定した。これらの遺伝子は、病理学的に拒絶が認められる時期より早く発現量が増加することから、早期マーカーとして有用であることが明らかになった。このようにして、本発明者らは本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明に係る遺伝子マーカーは、拒絶反応の指標となるものであって、前記遺伝子マーカーは、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。前記遺伝子マーカーは、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植による拒絶反応の指標となる。【００１２】
また、本発明に係る遺伝子マーカーは、免疫寛容の指標となるものであって、前記遺伝子マーカーは、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。前記遺伝子マーカーは、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫寛容の指標となる。【００１３】
さらに、本発明に係る遺伝子マーカーは、免疫抑制剤の薬効の指標となるものであって、前記遺伝子マーカーは、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。前記遺伝子マーカーは、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫抑制剤の薬効の指標となる。【００１４】
本発明に係る拒絶反応の診断方法は、脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定することにより、拒絶反応を診断する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明に係る拒絶反応の診断方法は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植による拒絶反応の有無を調べることができる。【００１５】
また、本発明に係る拒絶反応の診断キットは、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体を備え、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明に係る拒絶反応の診断キットは、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植による拒絶反応の有無を調べることができる。【００１６】
本発明に係る免疫寛容の有無を判定する方法は、組織又は器官が移植された脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定することにより、免疫寛容の有無を判定する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。前記組織又は器官は、例えば、肝臓等である。【００１７】
また、本発明に係る免疫寛容の有無を判定する方法は、組織又は器官が移植された脊椎動物において、移植後投与されている免疫抑制剤の投与量を減少させるとともに、前記脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングし、前記投与量の減少に伴い、前記発現量の有意な変化が起こらず、前記免疫抑制剤から離脱できた場合に免疫寛容が生じたと判定することを含んでなる。前記遺伝子マーカーとしては、例えば、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質を用いることができる。前記組織又は器官は、例えば、肝臓等である。【００１８】
また、本発明に係る免疫寛容の有無を判定するキットは、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体を備え、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫寛容の有無を判定するキットであってもよい。【００１９】
本発明に係る免疫抑制剤の薬効を評価する方法は、免疫抑制剤の使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定することにより、免疫抑制剤の薬効を評価する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫抑制剤の薬効を評価する方法であってもかまわない。【００２０】
本発明に係る免疫抑制剤の同定方法は、免疫抑制剤の投与を必要とする脊椎動物において、有効な免疫抑制剤を同定する方法であって、前記脊椎動物に属する複数の個体の各々において、等量の異なる免疫抑制剤を投与する前後で、前記個体から血液を採取し、前記血液中の遺伝子マーカーの発現量を測定し、前記免疫抑制剤を投与する前後で、前記個体から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量を比較し、前記免疫抑制剤の投与により、前記遺伝子マーカーの発現量が最も減少した免疫抑制剤を同定すること、を含み、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する有効な免疫抑制剤を同定する方法であってもかまわない。【００２１】
本発明に係る免疫抑制剤の選択方法は、免疫抑制剤の投与を必要とする脊椎動物個体において、複数の免疫抑制剤の各々について作成された、免疫抑制剤の使用量又は血中濃度と、遺伝子マーカーの発現量との相関関係を示す検量線を用い、前記複数の免疫抑制剤の中から、前記免疫抑制剤を必要とする個体に対して最も有効な免疫抑制剤を選択する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。前記個体は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植を受けているものであることが好ましい。【００２２】
本発明に係る免疫抑制剤の用量決定方法は、免疫抑制剤の投与を必要とする疾患又は拒絶反応を伴う脊椎動物において、前記脊椎動物から血液を採取し、前記血液中における遺伝子マーカーの発現量を測定し、あらかじめ作成した、免疫抑制剤の使用量又は免疫抑制剤の血中濃度と、遺伝子マーカーの発現量との相関関係を示す検量線を用いて、前記脊椎動物の血液中における遺伝子マーカーの発現量を、所定の発現量まで減少させるために必要な免疫抑制剤の用量を決定する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。前記個体は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植を受けているものであることが好ましい。【００２３】
また、本発明に係る免疫抑制剤の薬効を評価するためのキットは、免疫抑制剤の使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体を備え、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。前記免疫抑制剤は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植後に使用するものであってもかまわない。【００２４】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、免疫抑制剤のスクリーニング方法であっても、免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法であってもよく、組織又は器官を移植することにより免疫拒絶を生じる脊椎動物に対して被検物質を投与する工程と、前記脊椎動物から血液を採取する工程と、前記血液中における遺伝子マーカーの発現量をモニタリングする工程とを含み、前記遺伝子マーカーとしては、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質を用いることができる。前記組織又は器官は、例えば、肝臓等である。【００２５】
本発明に係る拒絶反応の抑制方法は、免疫抑制剤の血中濃度をモニタリングしながら、遺伝子マーカーの発現量を測定し、所定値になるまで免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤を投与することを特徴とする。これにより、組織又は器官の移植により生じる拒絶反応を有効に抑制することが可能になる。【００２６】
また、本発明に係る免疫疾患の改善又は治療方法は、免疫抑制剤の血中濃度をモニタリングしながら、遺伝子マーカーの発現量を測定し、所定値になるまで免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤を投与することを特徴とする。これにより、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、アトピー性疾患、リウマチ性疾患、花粉症などの免疫疾患を有効に改善又は治療することが可能になる。【００２７】
なお、本発明において「遺伝子マーカー」とは、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となるものであって、ここではある遺伝子の発現量と相関するときの遺伝子関連物質をいう。例えば、遺伝子それ自体、転写物であるｍＲＮＡ、翻訳物であるペプチド、遺伝子発現の最終産物であるタンパク質などが含まれる。「遺伝子マーカーの発現量」とは、遺伝子マーカーが遺伝子以外の場合は、遺伝子マーカーの由来する遺伝子の転写レベル（マーカーが転写物などの場合）または翻訳レベルにおける発現量（マーカーがポリペプチド、タンパク質などの場合）を意味する。なお、上記各遺伝子は、その由来となる生物種について限定されず、そのホモログ（homolog）やオーソログ（ortholog）もすべて含むものとする。また、本発明において脊椎動物とは、ヒトおよび、ヒト以外のマウス、ラットなどの脊椎動物を意味する。【００２８】
・関連文献とのクロスリファレンス
本願は、2005年1月13日付けで出願した日本国特願2005-6728号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の7PODにおける遺伝子マーカー（Best5及びBcl2l1）の発現量を示す図である。
【図２】本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の血液中における遺伝子マーカー（Best5）の発現量の経時変化を示す図である。
【図３】本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の血液中における遺伝子マーカー（Bcl2l1）の発現量の経時変化を示す図である。
【図４】本発明にかかる一実施例において、3PODまでのデータのうち最も高い遺伝子（Best5）発現量を示した値をピックアップし、各群の平均値を調べた結果を示す図である。
【図５】本発明にかかる一実施例において、3PODまでのデータのうち最も高い遺伝子（Bcl2l1）発現量を示した値をピックアップし、各群の平均値を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の5PODにおける遺伝子マーカー（Igifbp及びGbp2）の発現量を示す図である。
【図７】本発明にかかる一実施例において、生体肝移植症例における急性拒絶時のcig5遺伝子の発現変動（上図）及び肝機能検査値（下図）を示す図である。
【図８】本発明にかかる一実施例において、生体肝移植症例における急性拒絶時のBCL2L1遺伝子の発現変動（上図）及び肝機能検査値（下図）を示す図である。
【図９】本発明にかかる一実施例において、生体肝移植症例における急性拒絶時のIL18BP遺伝子の発現変動（上図）及び肝機能検査値（下図）を示す図である。
【図１０】本発明にかかる一実施例において、生体肝移植症例における急性拒絶時のGBP2遺伝子の発現変動（上図）及び肝機能検査値（下図）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。【００３１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００３２】
＝＝遺伝子マーカーの有用性＝＝
本発明の遺伝子マーカーは、拒絶反応や免疫抑制剤の投与により発現が変化する、遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。例えば、遺伝子マーカーが、Bcl2l1、cig5、Il18bp、及びGbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である場合、それら遺伝子マーカーの発現量は、針生検などによって病理学的に診断される拒絶が生じる前に血液中において増加し、免疫抑制剤により血液中において減少する。従って、本発明に係る遺伝子マーカーは、拒絶反応の早期マーカー（指標）として有用であり、免疫寛容の指標としてあるいは免疫抑制剤の薬効の指標としても有用である。また、本発明に係る遺伝子マーカーの発現量は、拒絶反応の程度及び免疫抑制剤の用量及び血中濃度によって変化するものと考えられる。このことから、これらの遺伝子マーカーの発現量は、拒絶反応の程度及び免疫抑制剤の用量及び血中濃度に対して相関関係を有するのではないかと考えられる。なお、遺伝子マーカーの発現量と拒絶反応または免疫抑制剤は、逆の相関であってもよい。【００３３】
また、複数の遺伝子マーカーを用いて、総合的に拒絶反応の早期診断を行ったり、免疫抑制剤の薬効の指標としたり、免疫寛容の有無を判定したりしてもよく、その場合、より精密に拒絶反応を診断でき、より厳密に薬効を評価でき、より正確に免疫寛容の有無を判定できることが期待される。【００３４】
また、血液中の遺伝子マーカーを用いることにより、血液をサンプルとして用いることができるため、遺伝子マーカーの発現量を定期的に簡便に測定することができる。これは、病理学的に診断される拒絶が生じる前に拒絶反応が起こるかどうかの診断を迅速に行うことを可能にする。この早期診断は、拒絶反応に対して早期に対処することができるようになるため、移植した組織又は器官の拒絶反応による障害を最小限に抑えることができ、非常に重要である。また、血液サンプルの取得は、針生検に比べて侵襲が少なく、針生検のような高度な技術も必要としないので、簡便に行うことができる。同様に、血液をサンプルとして用いることから、本発明に係る薬効の評価や免疫寛容の診断も、迅速、頻回、且つ簡便に行うことができる。【００３５】
＝＝遺伝子マーカーの定量＝＝
本実施の形態において、遺伝子マーカーが遺伝子または遺伝子の転写物（mRNA）である場合、遺伝子マーカーの発現量の測定（定量）は、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、定量的RT-PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction）法などによってmRNA量を測定することにより行うことができるが、微量のRNA（血液から単離）を用いてmRNA量を測定することができる点で定量的RT-PCR法を用いて行うことが好ましい。【００３６】
定量的RT-PCR法に用いるプライマーとしては、遺伝子マーカーを特異的に検出することができるものであれば特に制限されるものではないが、12〜26塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、対象となる脊椎動物の Bcl2l1（BCL2-like 1）、cig5（別名RSAD2（Radical S-adenosyl methionine domain containing 2）；ラットではBest5）、Il18bp（Interleukin 18 binding protein；ラットではIgifbp（Interferon gamma inducing factor binding protein））、及びGbp2（Guanylate binding protein 2）の各遺伝子の配列情報に基づいて決定する。そして、決定した配列を有するプライマーを、例えば、DNA合成機を用いて作製することができる。具体的には、例えば、動物がヒトである場合には、NM001191及びNM138578（BCL2L1）、NM080657（cig5）、NM005699及びNM173042〜NM173044（IL18BP）、NM004120（GBP2）で登録されている配列情報に基づいてプライマーを作製することができ、動物がラットである場合には、NM031535（Bcl2l1）、NM138881（Best5）、NM053374（Igifbp）、NM133624（Gbp2）で登録されている配列情報に基づいてプライマーを作製することができる。【００３７】
一方、遺伝子マーカーが遺伝子の翻訳物（ポリペプチド）又は最終産物（タンパク質）である場合、例えば、遺伝子マーカーに対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などによって遺伝子マーカーの発現量の測定を行うことができるが、これらの方法に限定されるものではなく、ＲＩＡ（radioimmunoassay、放射免疫測定法）、ＥＩＡ（enzyme immunoassay、酵素免疫法）等、様々な手法を用いることができる。以下、ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を例に挙げて遺伝子マーカーの発現量の測定について説明する。【００３８】
脊椎動物から採取した血液をホモジナイズした後、超音波処理を行い、遠心分離して上清を回収し、タンパク質を含む粗抽出液を得る。その後、遺伝子マーカーに対して特異的に結合するポリクローナル抗体を吸着させたELISAプレート（例えば９６穴プレートを用いたもの）を用いて、タンパク質の粗抽出液をプレートのウエルに入れて遺伝子マーカーと反応させ、引き続き一次抗体及び二次抗体（例えば、酵素で標識された抗免疫グロブリン抗体など）とそれぞれ反応させる。反応後、ELISAプレートを洗浄し、酵素に対する基質を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーにより吸光度を測定し、あらかじめ作成した検量線を用いてタンパク質の発現量を定量する。このようにして、遺伝子マーカーの発現量を測定することができる。なお、二次抗体の標識として用いられている酵素としては、例えば、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。【００３９】
＝＝拒絶反応の診断方法＝＝
このような遺伝子マーカーを用いれば、例えば、組織又は器官を移植した脊椎動物から採取した血液における遺伝子マーカーの発現量を定期的に測定し、組織又は器官の移植前に採取した血液における遺伝子マーカーの発現量と比較することにより、拒絶反応の診断を初期段階から行うことが可能になる。即ち、遺伝子マーカーの発現量を測定した結果、移植後の遺伝子マーカーの発現量が移植前と比べて有意に変化しているか、または経時的に有意に変化している場合、拒絶反応が起こっている又は拒絶反応の可能性有りと判断される。例えば、遺伝子マーカーが、Bcl2l1、cig5（Best5）、Il18bp（Igifbp）、及びGbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である場合、その発現量が移植前と比べて有意に増加しているか、または経時的に有意に増加傾向にある場合、そのように判断される。一方、移植後の遺伝子マーカーの発現量が移植前のものと比べて有意に増加していない場合には、拒絶反応が起こっていないと判断される。なお、診断対象となる脊椎動物としては、例えば、ヒトでもよく、マウス、ラット等のヒト以外の脊椎動物でもよい。【００４０】
＝＝免疫抑制剤の薬効の評価方法＝＝
上述したように、本発明に係る遺伝子マーカーの発現量は、拒絶反応の指標としてのみならず、免疫抑制剤の薬効を評価する際の指標として有用である。遺伝子マーカーの発現量を測定することにより、免疫抑制剤の薬効を評価することが可能になれば、個々の疾患に対して科学的根拠に基づく免疫抑制剤の投与方法を容易に決定することができる。例えば、少ない使用量で効果が得られ、副作用の少ない免疫抑制剤又はその投与方法の選択などを行うことができるようになる。【００４１】
なお、免疫抑制剤の対象疾患は、拒絶反応以外にも、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患（アレルギー性皮膚炎、アトピー性疾患、花粉症などを含む）、リウマチ性疾患等の免疫疾患がある。【００４２】
また、免疫抑制剤としては、移植後の生体の拒絶反応などの異常免疫反応を抑制する薬剤、各種疾患において免疫を抑制する薬剤などであればどのようなものでもよく、例えば、ステロイド剤（プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなど）、IL-2の抗体、IL-2分泌抑制剤（ラパマイシン等）、シクロスポリン若しくはFK506（タクロリムス又はプログラフともいう）などのCN抑制剤、代謝拮抗薬（ミコフェノール酸モフェチル）、シクロホスファミド、ＯＫＴ３（ムロモナブＣＤ３ともいう）、抗リンパ球グロブリン（抗胸腺細胞免疫グロブリン）、抗ＣＤ４抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、アザチオプリン、ミゾリビン、スルファサラジン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、メソトレキサート、サイトキサゾン、塩酸グスペリムス、又はこれらの薬剤の組み合わせなどを挙げることができる。【００４３】
＝＝免疫抑制剤の投与方法の決定＝＝
前記疾患に罹患したり、移植手術を受けたりした後、免疫抑制剤を投与された脊椎動物個体に対して、免疫抑制剤の投与量又は免疫抑制剤の血中濃度をモニタリングしながら、動物の血中（又は末梢血液）における遺伝子マーカーの発現量を測定し、遺伝子マーカーの発現量が所定値になる（例えば、正常値との差の２割程度にまで減少する）まで免疫抑制剤を投与することにより、上記免疫疾患の改善又は治療や、拒絶反応の抑制を、最小限の免疫抑制剤の使用によって行うことが可能になる。これにより、免疫抑制剤の過剰使用による感染症などの副作用を有効に予防することができる。なお、免疫抑制剤の最初の投与には、例えば、以下に述べる検量線により設定された最小限の免疫抑制剤の用量を用いることが考えられる。【００４４】
＝＝検量線の作成とその応用＝＝
免疫抑制剤を投与された脊椎動物個体に対して、遺伝子マーカーの発現量と、免疫抑制剤の用量又は血中濃度との相関を示す検量線を作成すると、様々な面から、この免疫抑制剤の有効性を評価することができるようになる。【００４５】
例えば、複数の免疫抑制剤の検量線を作成し、最も少量で遺伝子マーカーの発現量が正常値になる免疫抑制剤や、副作用が生じる量と遺伝子マーカーの発現量が正常値になる量を比較した時その量の差が最も大きい免疫抑制剤を選択することにより、免疫疾患や拒絶反応を伴う各種脊椎動物に対して、最も有用な免疫抑制剤を選択することが可能となる。【００４６】
また、免疫抑制剤の複数の投与方法に対し、同様に作成した検量線を用いることにより、最も有効な投与方法を選択することも可能となる。なお、免疫抑制剤の投与方法としては、例えば、患部、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内等の注射による投与、経口投与、塗布や貼付等による非経口投与などが挙げられる。【００４７】
さらに、免疫抑制剤を必要とする、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、アトピー性疾患、リウマチ性疾患、花粉症などの免疫疾患や、拒絶反応を伴う動物に対して、同様に検量線を用い、各疾患に対する免疫抑制剤の最適投与量を設定することも可能になる。例えば、ある患者や患畜に対し、免疫抑制剤を投与する前の遺伝子マーカーの発現量に対し、正常な遺伝子マーカーの発現量との差を算出し、所定の割合だけ遺伝子マーカーの発現量を減少させられるような免疫抑制剤の投与量を決定することができる。【００４８】
＝＝免疫寛容の有無の判定方法＝＝
本発明にかかる免疫寛容の有無を判定する方法によると、組織又は器官が移植された脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定することにより、免疫寛容の有無を判定することができる。【００４９】
免疫寛容の有無の判定方法の一例として、組織又は器官を移植した脊椎動物に対して免疫抑制剤の投与量を減少させるとともに、当該脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングする方法を挙げることができる。即ち、遺伝子マーカーの発現量を測定した結果、免疫抑制剤の投与量の減少に伴って遺伝子マーカーの発現量が、拒絶反応を起こしていると判定されるのと同様な変化を示す場合は免疫寛容が生じていないと判定し、免疫抑制剤の投与量が減少しても遺伝子マーカーの発現量の有意な変化が起こらず、免疫抑制剤から離脱できた場合に免疫寛容が生じたと判定する。例えば、遺伝子マーカーが、Bcl2l1、cig5（Best5）、Il18bp（Igifbp）、及びGbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である場合には、免疫抑制剤の投与量の減少に伴って遺伝子マーカーの発現量が増加する場合は免疫寛容が生じていないと判定し、免疫抑制剤の投与量が減少しても遺伝子マーカーの発現量の有意な増加が起こらず、免疫抑制剤から離脱できた場合に免疫寛容が生じたと判定する。【００５０】
以上のように、免疫寛容の有無を判定することにより、本来は必要のない免疫抑制剤の投与を中断することが可能となり、免疫抑制剤の長期投与に伴う感染のリスクや免疫抑制剤の副作用を回避することができるようになる。なお、診断対象となる脊椎動物としては、例えば、ヒトでもよく、マウス、ラット等のヒト以外の脊椎動物でもよい。【００５１】
また、本発明にかかる免疫寛容の有無の判定方法は、免疫寛容誘導方法の開発や免疫寛容誘導剤のスクリーニングの際にも利用できる。【００５２】
例えば、マウス、ラット等の脊椎動物に対して組織又は器官を移植して、被検物質を投与するか、または被検方法で処理し、その後、血液を採取して遺伝子マーカーの発現量をモニタリングする。多数の被検物質や被検方法に対し、この方法を繰り返し行うことにより、免疫抑制剤や免疫抑制方法のスクリーニングだけでなく、免疫寛容誘導剤や免疫寛容誘導方法のスクリーニングを行うことができる。【００５３】
例えば、免疫寛容誘導剤としては、免疫寛容を誘導する対象となるペプチドの部分ペプチドを投与することにより、Ｔ細胞脱感作し得るが、その際、様々な部分ペプチドをスクリーニングし、有効な部分ペプチドを選択できる。また、補助シグナル経路であるICOS/B7h 経路、CD28-CTLA4/B7 経路を選択的に阻害する化合物に対するスクリーニング法などにも用いることができよう。また、組織又は器官を移植した脊椎動物に対して、例えば、１又は２種以上の免疫抑制剤を投与するなど、投与する免疫抑制剤の使用形態や投与方法を変化させて免疫抑制剤を投与し、前記脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングすることにより、有効な免疫寛容誘導方法を開発することができる。【００５４】
なお、前記遺伝子マーカーとしては、例えば、Bcl2l1、cig5（Best5）、Il18bp（Igifbp）、及びGbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質を用いることができる。また、脊椎動物としては、例えば、マウス、ラット等の脊椎動物を用いることができる。【００５５】
＝＝＝キット＝＝＝
本発明に係るキットは、遺伝子マーカーの発現量を測定するための試薬又は器具が含まれていればどのようなものでもよく、例えば、定量的RT-PCR法に用いられるプライマーや試薬、ウエスタンブロット法やELISA法に用いられる抗体などが挙げられる。その他、血液からRNAを単離するための試薬、遺伝子マーカーに対するハイブリダイゼーション用プローブ、酵素・蛍光物質・放射性物質などにより標識された抗免疫グロブリン二次抗体、前記酵素に対する基質などを含ませることとしてもよい。なお、酵素としては、例えば、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼなどを用いることができ、蛍光物質としては、Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC（イソチオシアン酸フルオレセイン）、ローダミンなどを用いることができ、放射性物質としては、例えば、3H、32P、35S、121I、125Iなどを用いることができる。【００５６】
前記プライマーとしては、Bcl2l1、cig5（Best5）、Il18bp（Igifbp）、及びGbp2からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子に対するプライマーを挙げることができる。また、前記抗体としては、例えば、Bcl2l1、cig5（Best5）、Il18bp（Igifbp）、及びGbp2などの遺伝子マーカー（ポリペプチド又はタンパク質）に対して特異的に反応するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などを用いることができる。なお、本発明に係るキットは、１又は２種以上の抗体が含まれていることとしてもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。【００５８】
［実施例１］
Lewis系ラットをドナーとし、同種同系（Lewis系）ラットをレシピエントとして同所性肝移植を施行した（非拒絶群；ｎ＝３）。また、BN系ラットをドナーとし、同種異系（Lewis系）ラットをレシピエントとして同所性肝移植を施行した６匹のうち、３匹のラット（免疫抑制群；ｎ＝３）に対して、移植当日（０日目）にシクロスポリン（ノルバティスファーマ株式会社製；生理食塩水に溶解）を体重1kg当たり3 mg筋肉内注射し、その後、毎日、同量のシクロスポリンを筋肉内注射した。残りの３匹には、免疫抑制剤を投与しなかった（拒絶群；ｎ＝３）。なお、上記２系統のラットは、８〜１０週齢、体重200-300gの雄性のものを使用した。【００５９】
病理学的に拒絶反応が認められる移植後７日目（7POD）に、非拒絶群、拒絶群、及び免疫抑制群の各群３個体を開腹し、下大静脈より末梢血液（約5 ml）を採取した。その後、QIAamp RNA Blood Mini（QIAGEN社製）を用いてmRNAを抽出し、DNase処理によりDNAを除去した。得られた末梢血液中のmRNA 20μgを用いて、Label Star Array kit（QIAGEN社製）によりCy5色素でラベル化したcDNAを得た。このcDNAをAtlas Glass Rat 3.8 I Microarray（BD Biosciences Clontech社製）とハイブリダイズさせ、Axon GenePix4000A（Axon Instruments社製）を用いてGenePix Pro3.0 Microarray analysis software（Axon Instruments社製）によりマイクロアレイをスキャンし、データを解析した（グローバル補正）。その結果、非拒絶群又は免疫抑制群と比較して拒絶群において著しく発現量が増加していた遺伝子（Bcl2l1及びBest5）を選択した。【００６０】
ここで選択された各遺伝子に関し、厳密に発現量の変化を調べるため、mRNAの定量を行った。なお、Bcl2l1及びBest5のmRNAの定量は、抽出したmRNA 25ng並びに各プライマー及びプローブ（それぞれ最終濃度で900nM、200nM；Applied Biosystems社製のTaqMan Gene Expression Assays Rn00580568_g1(Bcl2l1)又はRn00594081_m1(Best5)を使用）を用いて、TaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社製）によりcDNAを合成し、ラットβ−アクチンを内部標準としてABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems社製）を用いて行った。なお、ラットβ−アクチン（NM031144）のプローブ（(VIC)-CCATCACACCCTGGTGCC-(MGB)；配列番号１）及びプライマー（5’-GCCGTCTTCCCCTCCAT（配列番号２）及び5’-AGGAGTCCTTCTGACCCATACC（配列番号３））の最終濃度はそれぞれ100nM及び200nMとした。また、このmRNAの定量解析においては、手術前の遺伝子マーカーの発現量を基準として（「１」として）、手術後の遺伝子マーカーの発現量をΔΔCt法により相対的に定量した。【００６１】
その結果、図１に示すように、病理学的に拒絶と判断される7PODにおいて、Bcl2l1やBest5のmRNAの発現量は、同所性肝移植により引き起こされた拒絶反応により上昇し、免疫抑制剤の投与により抑制することが明らかになった。【００６２】
［実施例２］
実施例１により得られた遺伝子が、拒絶反応又は免疫抑制剤の薬効の指標となるかどうかを調べるため、非拒絶群（ｎ＝７）、拒絶群（ｎ＝５）、免疫抑制群（ｎ＝５）の各ラットの頸静脈から、肝移植前、及び移植後６日後まで毎日、血液200μlを採取し、移植後７日目にラット個体を開腹し、下大静脈より血液を200μl採取して、遺伝子マーカー（Best5及びBcl2l1）の発現量を測定した。なお、遺伝子マーカーの発現量は、実施例１に記載の方法と同様に末梢血液からmRNAを採取し、mRNAの定量を行うことにより測定した。【００６３】
図２（Best5の結果）及び図３（Bcl2l1の結果）に示すように、免疫抑制群では、拒絶群に比べて遺伝子マーカーの発現量が抑制され、非拒絶群のものと同等又はそれ以下の発現量まで抑制するのに対し、拒絶群では、拒絶と診断される7PODよりも早期（2POD〜3POD）に遺伝子マーカーBest5およびBcl2l1の発現量が上昇することが明らかになった。このことから、Best5やBcl2l1は拒絶反応の早期マーカーとなりうるのではないかと考え、3PODまでのデータのうち最も高い遺伝子発現を示した日の発現量をピックアップし、各群の平均値を得た。図４（Best5の結果）及び図５（Bcl2l1の結果）に示すように、Best5、Bcl2l1ともに、拒絶群では、肝移植後3日までに発現量の上昇が認められ、拒絶反応の早期マーカーとなりうることが示された。【００６４】
［実施例３］
次に、Lewis系ラットをドナーとし、同種同系（Lewis系）ラットをレシピエントとして同所性肝移植を施行した（非拒絶群；ｎ＝３）。また、ACI系ラットをドナーとし、同種異系（Lewis系）ラットをレシピエントとして同所性肝移植を施行した６匹のうち、３匹のラット（免疫抑制群；ｎ＝３）に対して、移植当日（０日目）にタクロリムス（藤沢薬品工業社製；生理食塩水に溶解）を体重1kg当たり0.64 mg筋肉内注射し、その後、毎日、同量のタクロリムスを筋肉内注射した。残りの３匹には、免疫抑制剤を投与しなかった（拒絶群；ｎ＝３）。なお、上記２系統のラットは、８〜１０週齢、体重200-300gの雄性のものを使用した。【００６５】
拒絶反応の兆候が見られる移植後５日目に、非拒絶群、拒絶群、及び免疫抑制群の各群３個体の頸静脈から末梢血液（約200μl）を採取した。その後、QIAamp RNA Blood Mini（QIAGEN社製）を用いてmRNAを抽出し、DNase処理によりDNAを除去した。得られた末梢血液中のmRNA 5μgを用いて、Rat Expression Array 230A（Affymetrix社製）のプロトコルに従ってハイブリダイズさせ、スキャンし、データを解析した（グローバル補正）。その結果、非拒絶群又は免疫抑制群と比較して拒絶群において著しく発現量が増加していた遺伝子（Igifbp及びGbp2）を選択した。【００６６】
これらの遺伝子が、拒絶反応又は免疫抑制剤の薬効の指標となるかどうかを調べるため、非拒絶群（ｎ＝６）、拒絶群（ｎ＝５）、免疫抑制群（ｎ＝３）の各ラットの頸静脈から、肝移植前、及び移植後７日後まで毎日、末梢血液200μlを採取して、Igifbp及びGbp2のmRNAの発現量を測定した。なお、mRNAの発現量は、末梢血液から抽出したmRNA 25ng並びに各プライマー及びプローブ（それぞれ最終濃度で900nM、200nM；Applied Biosystems社製のTaqMan Gene Expression Assays Rn00584495_g1(Igifbp)又はRn00592467_m1(Gbp2)を使用）を用いて、TaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社製）によりcDNAを合成し、実施例１に記載のようにラットβ−アクチンを内部標準としてABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems社製）を用いて定量した。なお、このmRNAの定量解析においては、手術前の遺伝子マーカーの発現量を基準として（「１」として）、手術後の遺伝子マーカーの発現量をΔΔCt法により相対的に定量した。【００６７】
その結果、病理学的に拒絶と診断される7PODより２日早い5PODにおいて、IgifbpやGbp2のmRNAの発現量が、同所性肝移植により引き起こされた拒絶反応により上昇し、免疫抑制剤の投与により抑制することが明らかになった（図６参照）。【００６８】
［実施例４］
次に、ABO・Rhが適合した肝臓を移植した先天性胆道閉鎖症の患者（13歳；男性；37kg）に対して、図７〜１０に示される日に、シクロスポリンを投与する前に肘静脈から末梢血液（約200μl）を採取し、肝移植による末梢血液中のcig5遺伝子（RSAD2（NM080657）；ラットBest5遺伝子の相同遺伝子）、BCL2L1遺伝子、IL18BP遺伝子（ラットIgifbp遺伝子の相同遺伝子）、及びGBP2遺伝子の発現量の変化をそれぞれ調べた。なお、各遺伝子の発現量は、QIAamp RNA Blood Mini（QIAGEN社製）を用いて末梢血液からmRNAを抽出し、DNase処理によりDNAを除去した後、得られたmRNA 25ng並びに各プライマー及び各プローブ（Applied Biosystems社製のTaqMan Gene Expression Assaysを用いて、TaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社製）によりcDNAを合成し、ヒトβ−アクチンを内部標準としてABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems社製）を用いて行った。【００６９】
なお、cig5遺伝子に対するプライマー（最終濃度でそれぞれ900 nM）としては、5’-GGTGCCTGAATCTAACCAGAAGA（配列番号４）及び5’-ACTTGGAAGGGTCCTTCCGT（配列番号５）を、cig5遺伝子に対するプローブ（最終濃度で200 nM）としては、(FAM)-ATGAATATATGCGCTTTCT-(MGB)（配列番号６）をそれぞれ用いた。BCL2L1遺伝子、IL18BP遺伝子およびGBP2遺伝子の各プライマー及びプローブは、それぞれ最終濃度で900nM、200nM（Applied Biosystems社製のTaqMan Gene Expression Assays Hs00236329_m1（BCL2L1）、Hs00271720_m1（IL18BP）、Hs00269759_m1（GBP2））とした。また、ヒトβ−アクチン（NM001101）に対するプローブ（最終濃度で100nM）としては、 (FAM)-CAGGCACCAGGGCGTGATGGT-(TAMRA)（配列番号７）を、ヒトβ−アクチンに対するプライマー（最終濃度でそれぞれ200nM）としては、5’-GCCGCCAGCTCACCAT（配列番号８）及び5’-AGGAATCCTTCTGACCCATGC（配列番号９）をそれぞれ用いた。さらに、このmRNAの定量解析においては、BD qPCR Human Reference cDNA（BD Biosciences社製）をコントロールとして各遺伝子の発現量をΔΔCt法により相対的に定量した。【００７０】
また、図７〜１０に示される日に患者から血液を採取し、肝機能検査（血中におけるＡＳＴ、ＡＬＴ、及び総ビリルビンの濃度測定）も行った。なお、拒絶診断は肝生検により行った。【００７１】
図７〜１０に示すように、末梢血液中のcig5遺伝子、BCL2L1遺伝子、IL18BP遺伝子およびGBP2遺伝子の発現量は、肝生検で病理学的に拒絶と診断される時期より早く上昇することが明らかになった。また、病理学的に拒絶が認められた移植後23日目に、急性拒絶の治療目的に行われたステロイドパルス療法により、末梢血液中のcig5遺伝子、BCL2L1遺伝子、及びIL18BP遺伝子の発現が抑制されることが明らかになった（移植後25日目以降の各遺伝子の発現量を参照）。これに対して末梢血液中のGBP2遺伝子は、上記ステロイドパルス療法により発現量が一時的に減少することが明らかになった。さらに、肝機能検査では、病理学的に拒絶が認められる時期とは関連せず、非特異的に血中におけるＡＳＴ、ＡＬＴ、及び総ビリルビンの濃度が上昇することがわかった。【００７２】
以上の実施例から、Bcl2l1、cig5（Best5）、Il18bp（Igifbp）、Gbp2等の遺伝子マーカーは、拒絶反応の早期診断、免疫寛容の有無の判定、拒絶反応又は免疫寛容の可能性の予測、又は免疫抑制剤の薬効の指標として有用であることが示唆された。
【産業上の利用の可能性】
【００７３】
本発明によれば、拒絶反応の診断、免疫抑制剤の薬効の評価、及び免疫寛容の有無の判定を行うことができる遺伝子マーカー、並びに、遺伝子マーカーを指標として迅速かつ簡便に行うことができる、拒絶反応の診断方法、免疫抑制剤の薬効を評価する方法、免疫抑制剤の同定方法、免疫寛容の有無を判定する方法、キット、及び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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