(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に対して、該金属膜の上面に第1の電場増強場を発生せしめるように、該誘電体プレートを通して励起光を照射し、
該第1の電場増強場の励起効果によって前記蛍光標識から生じる蛍光を第１の光検出器により検出し、
該第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法において、
前記界面に対して、前記第１の電場増強場が発生している場所と同じ場所に第２の電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プレートを通して、前記励起光の波長よりも長波長の参照光を照射し、
光強度が前記第２の電場増強場の強度に略比例する、該第２の電場増強場の散乱光を、第２の光検出器により検出し、
該第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、前記第１の電場増強場の強度と前記第２の電場増強場の強度との関係から該第１の電場増強場の強度を見積もり、
該第１の電場増強場の強度に対し前記蛍光量を規格化して補正することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記第１の光検出器が前記第２の光検出器を兼ねるものであって、
前記励起光と前記参照光とを別々に照射することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記励起光と前記参照光とを同時に照射することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
誘電体プレートと、
該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に対して、該金属膜の上面に第1の電場増強場を発生せしめるように、該誘電体プレートを通して励起光を照射するように配置された光源と、
該第1の電場増強場の励起効果によって前記蛍光標識から生じる蛍光を検出するように配置された第１の光検出器とを有し、
該第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出装置において、
前記界面に対して、前記第１の電場増強場が発生している場所と同じ場所に第２の電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プレートを通して、前記励起光の波長よりも長波長の参照光を照射するように配置された光源と、
光強度が前記第２の電場増強場の強度に略比例する、前記第２の電場増強場の散乱光を検出するように配置された前記第２の光検出器と、
該第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、前記第１の電場増強場の強度と前記第２の電場増強場の強度との関係から該第１の電場増強場の強度を見積もる手段と、
該第１の電場増強場の強度に対し前記蛍光量を規格化して補正する補正計算機構とを有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
前記第１の光検出器が前記第２の光検出器を兼ねるものであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンを利用した蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものであり、特に詳細には、検出した蛍光量を補正する補正機構を有する蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明を利用した検出方法が注目されている。この検出方法は、屈折率の異なる界面で測定光が全反射する際に界面からしみ出す光、すなわちエバネッセント波と、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている標識との散乱、吸収、発光等の光学的な相互作用を分析ことにより、上記被検出物質の存在またはその量を検出する方法である。
【０００３】
このような検出方法の一例としては、蛍光性標識を用いた蛍光検出方法がある（非特許文献１）。
【０００４】
蛍光検出方法は、冷却ＣＣＤ等光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光性標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光：５２５ｎｍ、蛍光量子収率：０．６）やＣｙ５（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。さらに、表面プラズモンによる電場の増強を用いて、蛍光信号を増大することにより、１ｐＭ（ピコモーラ）を切るような高感度検出も実現されている。
【０００５】
図７を用いて、上記蛍光検出方法の原理を簡単に説明する。
【０００６】
図７は蛍光検出装置の概念図である。説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【０００７】
図７に示す蛍光検出装置は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に設けられた金属膜１２とを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件を満たす入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の側から励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、金属膜１２に接触している試料Ｓ中に蛍光標識Ｆが付与された被検出物質Ａが存在する場合に、この被検出物質Ａに付与された蛍光標識Ｆから生じる蛍光Ｌｆを検出する蛍光検出器３０とを備えている。
【０００８】
この蛍光検出装置において、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜１２上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。そして、このエバネッセント波と表面プラズモンにより金属膜１２の表面に電場増強作用を有する電場増強場Ｅｗが局所的に形成される。
【０００９】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合を考える。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する抗原Ａに対する１次抗体Ｂ１が修飾されている。そして試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合し、かつ蛍光標識Ｆが修飾された２次抗体Ｂ２が流される。このとき、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２による特異的な結合を介して金属膜１２に固定される。
【００１０】
上記の場合には、電場増強場Ｅｗ内に蛍光標識Ｆが存在することとなり、この蛍光標識Ｆが励起されて蛍光Ｌｆを発することとなる。従って、この蛍光Ｌｆを検出することにより、抗原Ａを検出することができる。なお、蛍光Ｌｆによって直接確認しているのは蛍光標識Ｆであるが、抗原Ａが存在しなければ、蛍光標識Ｆは金属膜１２に固定されることがない。つまり、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち抗原Ａの存在を間接的に確認している。
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記のような蛍光検出方法においては、表面プラズモンによる電場増強場の強度のばらつきに寄与する因子が多く、測定ごとにこれらの因子を完全に同一にすることは難しい。これは、試料に実際に含まれている被検出物質が同数であっても、検出される蛍光量がばらつき再現性に乏しいという問題を生じさせる。これらの因子としては、例えば、センサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモン発生条件のずれ等が挙げられる。また、測定環境における温度変化についても、上記のような条件のずれを後発的に生じさせる可能性があるため、充分に考慮する必要がある。
【００１２】
一方、上記のような因子は、測定ごとに最適な部品を選択または交換することにより抑えることはできるが、すべての因子を部品の選択または交換によって抑えるには、非常に多くの手間とコストがかかってしまう。
【００１３】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、再現性のある測定をより簡単かつ低コストに実現する蛍光検出方法および蛍光検出装置の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による散乱光検出方法は、
誘電体プレートと、誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
誘電体プレートと金属膜との界面に対して、金属膜の上面に第1の電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して励起光を照射し、
第1の電場増強場の励起効果によって蛍光標識から生じる蛍光を第１の光検出器により検出し、
第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法において、
界面に対して、第１の電場増強場が発生している場所と同じ場所に第２の電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して、励起光の波長よりも長波長の参照光を照射し、
光強度が第２の電場増強場の強度に略比例する、第２の電場増強場の散乱光を、第２の光検出器により検出し、
第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、第１の電場増強場の強度と第２の電場増強場の強度との関係から第１の電場増強場の強度を見積もり、
第１の電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正することを特徴とするものである。
【００１５】
そして、本発明による蛍光検出方法において、第１の光検出器が第２の光検出器を兼ねるものであって、励起光と参照光とを別々に照射することが好ましく、或いは励起光と前記参照光とを同時に照射することが好ましい。
【００１６】
ここで、「電場増強場」とは、誘電体プレートと金属膜との界面に対してこの界面で全反射条件を満たすように励起光を照射することによって生じるエバネッセント波と、このエバネッセント波に誘起されて金属膜中に生じる表面プラズモンの電場増強効果とによって、局所的に金属膜の上面に発生する電場の増強作用を有する領域を意味するものとする。
【００１７】
そして、「電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化」するとは、ある一定の電場増強場の強度に対して基準となる蛍光量を決め、実測した蛍光量をその基準となる蛍光量から相対的に見積もることを意味するものとする。
【００１８】
一方、本発明による蛍光検出装置は、
誘電体プレートと、
誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
誘電体プレートと金属膜との界面に対して、金属膜の上面に第1の電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して励起光を照射するように配置された光源と、
第1の電場増強場の励起効果によって蛍光標識から生じる蛍光を検出するように配置された第１の光検出器とを有し、
第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出する蛍光検出装置において、
界面に対して、第１の電場増強場が発生している場所と同じ場所に第２の電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して、励起光の波長よりも長波長の参照光を照射するように配置された光源と、
光強度が第２の電場増強場の強度に略比例する、第２の電場増強場の散乱光を検出するように配置された前記第２の光検出器と、
第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、第１の電場増強場の強度と第２の電場増強場の強度との関係から第１の電場増強場の強度を見積もる手段と、
第１の電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正計算機構とを有することを特徴とするものである。
【００１９】
そして、本発明による蛍光検出装置において、第１の光検出器が第２の光検出器を兼ねるものであってもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による蛍光検出方法および蛍光検出装置では、励起光の波長よりも長波長の参照光の照射により生じる第２の電場増強場の散乱光の散乱光量に基づいて、測定ごとに検出した蛍光量を補正している。蛍光量およびこの散乱光量は、それぞれ第１の電場増強場および第２の電場増強場の発生状態（特にそれぞれの電場増強場の強度）に依存している。また、第１の電場増強場および第２の電場増強場の発生状態は、同じ測定環境に依存している。従って、第１の電場増強場および第２の電場増強場の発生状態の指標として、光強度が第２の電場増強場の強度に略比例する第２の電場増強場の散乱光を用いることにより、第１の電場増強場の強度と第２の電場増強場の強度との関係から第１の電場増強場の強度を見積もることができる。そして、この第１の電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正することが可能となる。
【００２１】
以上により、測定ごとにその条件に適した補正が可能となり、電場増強場の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため、測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、より簡単かつ低コストに再現性のある測定を実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２３】
「蛍光検出方法および蛍光検出装置」
＜第１の実施形態＞
図１は、本実施形態による蛍光検出装置の概略図である。
【００２４】
図示の通り、この蛍光検出装置は、誘電体プレート１１と金属膜１２からなるセンサチップ１０と、蛍光標識Ｆを励起する波長６５７ｎｍの励起光Ｌａを発する光源２１ａと、励起光Ｌａの波長よりも長い波長６７０ｎｍの参照光Ｌｂを発する光源２１ｂと、センサチップ１０を設置するプリズム２２と、参照光Ｌｂを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面にプリズム２２を通して照射し金属膜１２上に第２の電場増強場Ｅｗｂを生じさせるように導光する光学系ＤＭと、センサチップ１０上に供給された蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆ等を検出する光検出器３０と、光検出器３０に蛍光等を導光するように配置された２つの平凸レンズ２４と、２つの平凸レンズ２４の間に配置された、第１の電場増強場Ｅｗａの散乱光Ｌｓａは遮断しかつ蛍光Ｌｆおよび第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂは透過させる光学フィルタ２３と、光検出器３０が接続された補正計算機構４０からなる。ここで、光源２１ａは、センサチップ１０上で第１の電場増強場Ｅｗａを生じせしめるように誘電体プレート１１に対してプリズム２２側に配置されており、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜１２に固定されている。また、図１中の符号２５は、２つの平凸レンズ２４と光学フィルタ２３とを含み、光検出器３０が装着されている光学系保持部である。
【００２５】
センサチップ１０は、特に制限されないが、前述した図５のセンサチップ１０と同様のものである。センサチップ１０は、誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属膜１２が形成されたものである。
【００２６】
誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。
【００２７】
金属膜１２は、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光Ｌａとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜１２として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜１２の厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。なお、金属膜１２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００２８】
なお、センサチップ１０上に液体試料を保持する試料保持部が備えられ、センサチップ１０と試料保持部により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されていてもよい。一方、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部を備えない態様であってもよい。
【００２９】
プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂが全反射するように、この界面に励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。
【００３０】
光源２１ａは、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源２１ａは、前述のように、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌａが全反射すると共に金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１ａとプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌａは、表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００３１】
光源２１ｂは、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源２１ｂは、例えばダイクロイックミラー等の光学系ＤＭによって光源２１ａと同様に、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で参照光Ｌｂが全反射すると共に金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１ｂとプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、参照光Ｌｂは、表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００３２】
励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。励起光Ｌａの波長は、特に制限されず蛍光標識Ｆによって適宜選択される。一方参照光Ｌｂの波長は、特に制限されないが、散乱光Ｌｓａと蛍光Ｌｆを分離させるための光学フィルタ２３を透過できるように、励起光Ｌａの波長よりも長いことが好ましい。また、参照光Ｌｂの波長は、本実施形態の場合には蛍光Ｌｆと散乱光Ｌｓｂのスペクトルが重なることを考慮する必要がないため、散乱光Ｌｓｂが光学フィルタ２３を透過し検出できる範囲で励起光Ｌａの波長に近いことがより好ましい。これにより、光学フィルタ２３等を変えずにより実際の測定条件に近い条件で、補正のためのデータを得ることができる。
【００３３】
光検出器３０は、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆが発する蛍光Ｌｆを定量的に検出するものであればよく、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器３０は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。ここで、散乱光Ｌｓａは遮断しかつ蛍光および散乱光Ｌｓｂは透過させる光学フィルタ２３を、２つの平凸レンズ２４の間に配置することにより、ノイズを抑えて効率よく蛍光Ｌｆを検出することができる。すなわち、蛍光Ｌｆを散乱光Ｌｓａと分離して測定することができる。なお、本実施形態では、光検出器３０によって蛍光Ｌｆおよび散乱光Ｌｓｂを別々に検出している。そして、光学系保持部２５は、２つの平凸レンズ２４、光学フィルタ２３および光検出器３０を備えるものとして、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）等を好適に用いることができる。
【００３４】
補正計算機構４０は、光検出器３０によって検出された、光強度が第２の電場増強場Ｅｗｂの強度に略比例する散乱光Ｌｓｂを用いて、第１の電場増強場Ｅｗａの強度と第２の電場増強場Ｅｗｂの強度との関係から第１の電場増強場Ｅｗａの強度を見積もり、第１の電場増強場Ｅｗａの強度に対し、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆの蛍光量を規格化して補正する役割を果たす。具体的にはパーソナルコンピュータが挙げられる。なお、上記補正計算機構と同様の役割を果たせば、特にパーソナルコンピュータに制限されず他の電子計算機等を用いてもよい。
【００３５】
以下、上記蛍光検出装置を用いて、被検出物質としての抗原Ａを含む試料から、抗原Ａを検出する場合における蛍光検出方法について説明する。
【００３６】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料から、抗原Ａを検出する場合を考える。
【００３７】
本実施形態による蛍光検出方法は、抗原抗体反応を利用して蛍光標識Ｆを金属膜１２上に固定し、参照光Ｌｂを用いて全反射測定を行って散乱光Ｌｓｂを検出し、その後励起光Ｌａを用いて全反射測定を行って蛍光Ｌｆを検出し、散乱光Ｌｓｂの散乱光量を用いて蛍光量を補正するものである。
【００３８】
より詳細な本実施形態による蛍光検出方法は、抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１が修飾されている金属膜１２上に試料を流して、抗原Ａと１次抗体Ｂ１とを特異的に結合させ、蛍光標識Ｆで修飾された２次抗体Ｂ２を同様に流して、上記抗原Ａと２次抗体Ｂ２とを特異的に結合させることによって、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜１２上に蛍光標識Ｆを固定し、次に第２の光源２１ｂより発せられる参照光Ｌｂを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射して、金属膜１２上の試料中に第２の電場増強場Ｅｗｂを形成し、この第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂを光検出器３０で検出して、その散乱光量を補正計算機構４０で記憶し、その後同様に、第１の光源２１ａより発せられる励起光Ｌａを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射して、上記第２の電場増強場Ｅｗｂを形成した場所と同じ場所に第１の電場増強場Ｅｗａを形成し、この第１の電場増強電場Ｅｗａで蛍光標識Ｆを励起して蛍光Ｌｆを生じせしめ、この蛍光Ｌｆを光検出器３０で検出して、その蛍光量を補正計算機構４０で記憶し、そして上記散乱光量を用いて、第１の電場増強場Ｅｗａの強度と第２の電場増強場Ｅｗｂの強度との関係から第１の電場増強場Ｅｗａの強度を見積もり、第１の電場増強場Ｅｗａの強度に対し上記蛍光量を規格化して補正するものである。
【００３９】
ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識Ｆであるが、この蛍光標識Ｆは抗原Ａがなければ金属膜１２上に固定されないものと考えて、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、間接的に抗原Ａの存在を確認している。
【００４０】
１次抗体Ｂ１は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原がＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体Ｂ２と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、既存の技術を用いて金属膜１２上に固定することができる。
【００４１】
蛍光標識Ｆは、励起光Ｌａによって励起されて所定波長の蛍光Ｌｆを発するものであり、特に制限なく、測定条件（被検出物質や励起光の波長）に応じて適宜選択することができる。例えば、励起光Ｌａの波長が６５０ｎｍ程度の場合、Ｃｙ５色素（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）等を用いることができる。
【００４２】
電場増強場Ｅｗａ・Ｅｗｂは、励起光Ｌａ或いは参照光Ｌｂが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されて生じるエバネッセント波と、このエバネッセント波に誘起されて金属膜１２中に生じる表面プラズモンの電場増強効果とによって、局所的に金属膜１２の上面に発生する電場の増強作用を有する領域である。
【００４３】
励起光Ｌａと参照光Ｌｂの照射は、別々でも同時でも構わない。ここで、別々に照射する場合は、蛍光Ｌｆと第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂを、そのままで分離して検出することができるため光検出器は１つでもよい。一方、同時に照射する場合は、蛍光Ｌｆと散乱光Ｌｓｂが重なることを避けるため光検出器を２つ用いる必要がある。なお、本実施形態は前者の場合、後述する第２の実施形態は後者の場合の例である。
【００４４】
以下、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【００４５】
蛍光検出方法では、第１の電場増強場Ｅｗａ内に蛍光標識Ｆが存在することとなり、第１の電場増強場Ｅｗａの励起効果によってこの蛍光標識Ｆが励起されて蛍光Ｌｆを発することとなる。このとき、理論的にはこの蛍光量を用いて被検出物質の存在量を算出することが可能であるが、実際はセンサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモン発生条件のずれ等の影響により、第１の電場増強場Ｅｗａの強度にばらつきがあるため補正が必要となる。
【００４６】
そこで、本発明による蛍光検出方法では、誘電体プレート１１や金属膜１２の表面の凹凸等により生じる第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂを用いて蛍光量を補正する。補正は、光強度が第２の電場増強場Ｅｗｂの強度に略比例する散乱光Ｌｓｂを用いて、第１の電場増強場Ｅｗａの強度と第２の電場増強場Ｅｗｂの強度との関係から第１の電場増強場Ｅｗａの強度を見積もり、第１の電場増強場Ｅｗａの強度に対し、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆの蛍光量を規格化して行う。
【００４７】
このような補正が可能となるのは、第１の電場増強場Ｅｗａおよび第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱される割合が、上記のような励起光Ｌａや参照光Ｌｂの入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により変化しないためである。さらには、散乱光Ｌｓｂの強度が第２の電場増強場Ｅｗｂの強度に略比例することと、第１の電場増強場Ｅｗａの強度および第２の電場増強場Ｅｗｂの強度の間の関係性とから、散乱光Ｌｓｂの強度が、第１の電場増強場Ｅｗａの強度を見積もる指標となるためである。
【００４８】
以下、具体的な補正の計算例を説明する。
【００４９】
図２は、ある試料を用いた全反射測定において、６５７ｎｍおよび６７０ｎｍの波長の入射光における入射角度と暗線の関係を示す図である。暗線の位置、すなわち表面プラズモンの共鳴角度では、表面プラズモンを励起するために入射光のエネルギーが吸収されて、反射率が減少している。換言すればつまりこれは、共鳴角度からずれることにより金属膜１２上の電場増強場の強度が減少するということである。
【００５０】
本実施形態の場合図２に示すように、これらの暗線が略同様に変化していることから、光の入射角度のずれに対して第１の電場増強場Ｅｗａおよび第２の電場増強場Ｅｗｂの強度も、略同様に変化することがわかる。
【００５１】
ここで、散乱光Ｌｓｂの強度が変化するということは、散乱光Ｌｓｂの発生の基となる第２の電場増強場Ｅｗｂの強度が変化したためである。通常、光源および光学系等は測定ごとに動かすことがないため、多くの場合このような強度の変化は、センサチップの形状誤差およびセッティング誤差およびセンシング誤差等の後発的人為的要因による入射光の入射角度のずれが原因と考えられる。
【００５２】
したがって、散乱光Ｌｓｂの強度が１／２に減少していることから第２の電場増強場Ｅｗｂの強度が１／２に減少していることがわかり、第２の電場増強場Ｅｗｂの強度が１／２に減少していることから第１の電場増強場Ｅｗａの強度が１／２に減少していることがわかり、第１の電場増強場Ｅｗａの強度が１／２に減少していることから蛍光Ｌｆの強度が１／２に減少していることがわかる。すなわち、例えば本実施形態のような場合には、下記式（１）を用いて測定ごとに得られる蛍光量を補正することができる。ここで、Ｉｆｃ、ＩｆおよびＩｓｂは、それぞれ補正後の蛍光量、蛍光量の実測値および第２の電場増強場の散乱光量の実測値である。  
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓｂ・・・（１）
【００５３】
そして、本発明では励起光Ｌａの波長よりも長波長の参照光Ｌｂを用いている。この場合参照光Ｌｂが、励起光Ｌａと蛍光Ｌｆを分離させるための光学フィルタ２３を透過できるため、補正のためのデータを測定した後に、光学系を変更する必要もなくそのままの状態で本番の測定を行うことができる。また、このような理由から光検出器３０等の受光系は１つで充分である。これにより、非常に簡便な方法で蛍光量を補正することができる。
【００５４】
また本実施形態では、励起光Ｌａと参照光Ｌｂの照射を別々に行っている。これは本実施形態において、励起光Ｌａの波長と比較的近い波長を有する参照光Ｌｂを用いているため、第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂと蛍光Ｌｆの分離を有効に行うためである。例えば本実施形態において、蛍光標識ＦとしてＣｙ５色素（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）を用いた場合には、第１の電場増強場Ｅｗａの散乱光Ｌｓａ（励起光Ｌａ）、第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂ（参照光Ｌｂ）および蛍光Ｌｆのスペクトルの位置関係は図３に示すようになる。なお、図３のような場合では散乱光Ｌｓｂが光学フィルタに一部吸収されるが、散乱光Ｌｓｂは一般的に蛍光Ｌｆよりも２桁以上強度が強いため、７０〜８０％の透過率があれば充分散乱光Ｌｓｂの検出を行うことができる。
【００５５】
以上のように本発明により、電場増強場の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、より簡単かつ低コストに再現性のある測定を実現することが可能となる。
【００５６】
＜第２の実施形態＞
本実施形態は第１の実施形態において、参照光Ｌｂの波長が７８０ｎｍである点と、励起光Ｌａと参照光Ｌｂを同時に照射する点と、２つの光検出器を用いている点で異なる。したがって、その他の第１の実施形態と同様の要素の説明は特に必要のない限り省略する。
【００５７】
本実施形態による蛍光検出装置は、図４に示すように、図１に示す第１の実施形態の蛍光検出装置において、２つの平凸レンズの間かつ光学フィルタの入射側の前に配置されたダイクロイックミラー２３’と、第２の光検出器３０ｂとを有するものである。なお、第２の光検出器３０ｂは光検出器３０（以下、第１の光検出器３０ａという。）と同様に、補正計算機構４０に検出した光信号を伝達できるよう接続され、かつダイクロイックミラー２３’によって反射された光を検出するように配置されている。
【００５８】
ダイクロイックミラー２３’は、第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂを反射し、蛍光Ｌｆおよび第１の電場増強場Ｅｗａの散乱光Ｌｓａを透過させるものである。なお、図４に示すように、ダイクロイックミラー２３’によって反射された散乱光Ｌｓｂを、第２の光検出器３０ｂに集光させるために集光レンズ２６等を用いてもよい。なお、ダイクロイックミラーの代わりに回折格子等を用いてもよい。
【００５９】
第２の光検出器３０ｂは、特に制限されるものではなく、第１の光検出器３０ａ（光検出器３０）と同様のものを使用することができる。そして、第２の光検出器３０ｂは、光学系保持部２５の外部に配置してもよく、内部に組み込むように配置してもよい。
【００６０】
参照光Ｌｂの波長は、特に制限されないが、本実施形態の場合には蛍光Ｌｆと散乱光Ｌｓｂのスペクトルが重なることを考慮する必要があるため、蛍光Ｌｆと散乱光Ｌｓｂを分離できる程度に長いことが好ましい。
【００６１】
一方、本実施形態による蛍光検出方法は、第１の実施形態と同様に蛍光標識Ｆを金属膜１２に固定し、次に第１の光源２１ａおよび第２の光源２１ｂよりそれぞれ発せられる励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で同時に入射して、金属膜１２上の試料中に第１の電場増強場Ｅｗａおよび第２の電場増強場Ｅｗｂを同時に形成し、この第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂをダイクロイックミラー２３’で反射させて第２の光検出器３０ｂで検出すると共に、上記第１の電場増強電場Ｅｗａで蛍光標識Ｆを励起して蛍光Ｌｆを生じせしめ、この蛍光Ｌｆを第１の光検出器３０ａで同時に検出して、これらの散乱光量および蛍光量を補正計算機構４０で記憶し、そしてこの散乱光量を用いて、第１の電場増強場Ｅｗａの強度と第２の電場増強場Ｅｗｂの強度との関係から第１の電場増強場Ｅｗａの強度を見積もり、第１の電場増強場Ｅｗａの強度に対し上記蛍光量を規格化して補正するものである。
【００６２】
以下、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【００６３】
本実施形態では、励起光Ｌａ（６５７ｎｍ）と参照光Ｌｂ（７８０ｎｍ）の波長が大きく異なるため、第１の電場増強場Ｅｗａの強度および第２の電場増強場Ｅｗｂの強度の間の関係性が多少複雑になるが、光強度が第２の電場増強場Ｅｗｂの強度に略比例する散乱光Ｌｓｂを用いて、第１の電場増強場Ｅｗａの強度と第２の電場増強場Ｅｗｂの強度との関係から第１の電場増強場Ｅｗａの強度を見積もり、第１の電場増強場Ｅｗａの強度に対し、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆの蛍光量を規格化することにより第１の実施形態と同様の補正を行うことが可能である。
【００６４】
図５は、ある試料を用いた全反射測定において、励起光Ｌａ（波長６５７ｎｍ）および参照光Ｌｂ（７８０ｎｍ）の反射光の暗線を示す図である。図５に示すように、これらの暗線の変化が大きく異なることから、光の入射角度の一定のずれに対して第１の電場増強場Ｅｗａおよび第２の電場増強場Ｅｗｂの強度も大きく異なることがわかる。
【００６５】
この場合例えば図５より、励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂの入射角度が共にそれぞれのベストな表面プラズモン条件（つまり共鳴角度）から±１度のずれ幅（図５中のΔ１およびΔ２）が生じた場合において、励起光Ｌａの反射率は約０〜０．２の範囲で変化し、参照光Ｌｂの反射率は約０〜０．６の範囲で変化することがわかる。例えば、光の入射角度のずれが±１の場合には、励起光Ｌａおよび参照光Ｌｂの反射率がそれぞれ０．２、０．６となるので、第１の電場増強場Ｅｗａの強度は約８割程度、第２の電場増強場Ｅｗｂの強度は約４割程度減少してしまうことになる。
【００６６】
このように、第１の電場増強場Ｅｗａの強度と第２の電場増強場Ｅｗｂの強度には、ある程度関係性があるため、この関係性をあらかじめ明らかにしこれを検量データとして用いれば、第１の電場増強場Ｅｗａの強度に対し、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆの蛍光量を規格化して補正することができる。
【００６７】
以上により、電場増強効果の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため第１の実施形態と同様の効果を得ることが可能となる。
【００６８】
さらに本実施形態では、励起光Ｌａと参照光Ｌｂの照射を同時に行うことができ、測定に要する時間を短縮し効率よく測定を行うことが可能となる。例えば第１の実施形態と同様に、蛍光標識ＦとしてＣｙ５色素（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）を用いた場合には、第１の電場増強場Ｅｗａの散乱光Ｌｓａ（励起光Ｌａ）、第２の電場増強場Ｅｗｂの散乱光Ｌｓｂ（参照光Ｌｂ）および蛍光Ｌｆのスペクトルの位置関係は図６に示すようになる。
【００６９】
以上のように本発明により、電場増強場の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、より簡単かつ低コストに再現性のある測定を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】第１の実施形態による蛍光検出装置の一例を示す概略断面図
【図２】６５７ｎｍおよび６７０ｎｍの波長の入射光における入射角度と暗線の関係を示す図
【図３】励起光（６５７ｎｍ）、参照光（６７０ｎｍ）および蛍光のスペクトルとフィルタの透過率との関係を示す図
【図４】第２の実施形態による蛍光検出装置の一例を示す概略断面図
【図５】６５７ｎｍおよび７８０ｎｍの波長の入射光における入射角度と暗線の関係を示す図
【図６】励起光（６５７ｎｍ）、参照光（７８０ｎｍ）および蛍光のスペクトルとフィルタの透過率との関係を示す図
【図７】従来法による蛍光検出装置を示す概略断面図
【符号の説明】
【００７１】
１０          センサチップ
１１          誘電体プレート
１２          金属膜
１３          試料保持部
２０          励起光照射光学系
２１、２１ａ・ｂ      光源
２２          プリズム
２３          光学フィルタ
２３’        ダイクロイックミラー
２４          平凸レンズ
２５          光学系保持部
３０、３０ａ   （第１の）光検出器
３０ｂ        第２の光検出器
４０          補正計算機構
Ａ            抗原
Ｂ１          一次抗体
Ｂ２          二次抗体
Ｆ            蛍光標識
Ｌａ          励起光
Ｌｂ          参照光
Ｌｆ          蛍光
Ｌｓａ        第１の電場増強場の散乱光
Ｌｓｂ        第２の電場増強場の散乱光
Ｅｗａ        第１の電場増強場
Ｅｗｂ        第２の電場増強場
ＤＭ          光学系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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