(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の過程（Ａ）〜（Ｃ）を経ることを特徴とする、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（Ａ）互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列、
これら二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に配され、該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子、及び
互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に配した負の選抜マーカー遺伝子を有するベクターを、
植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を、該負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で培養し、増殖させる過程
（Ｃ）（Ｂ）で増殖させた細胞から、所定の染色体が消失した細胞を選抜する過程
【請求項２】
以下の過程（Ａ）〜（Ｃ）を経ることを特徴とする、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（Ａ）点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列、
該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子、及び
負の選抜マーカー遺伝子を有するベクターを、
植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を、該負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で培養し、増殖させる過程
（Ｃ）（Ｂ）で増殖させた細胞から、所定の染色体が消失した細胞を選抜する過程
【請求項３】
以下の過程（Ａ）〜（Ｄ）を経ることを特徴とする、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（Ａ）互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列、及び
該二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に配した負の選抜マーカー遺伝子を有するベクター、又は、
点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列、及び
負の選抜マーカー遺伝子を有するベクターを、
植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、上記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素を、該細胞中で、少なくともその増殖時に、一過的に作用させる過程
（Ｃ）（Ｂ）で部位特異的組換え酵素を作用させた植物細胞を、該負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で培養し、増殖させる過程
（Ｄ）（Ｃ）で増殖させた細胞から、所定の染色体が消失した細胞を選抜する課程
【請求項４】
請求項３に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ｂ）において、部位特異的組換え酵素の一過的作用を、培養されている植物細胞に、この部位特異的組み換え酵素を導入することにより行わせる、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
【請求項５】
請求項３に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ｂ）において、部位特異的組換え酵素の一過的作用を、培養されている植物細胞に、この部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子を導入することにより行わせる、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
【請求項６】
部位特異的組換え酵素遺伝子の導入は、部位特異的組換え酵素遺伝子と負の選抜マーカー遺伝子とを配したベクターを植物細胞に導入することにより行う、請求項５に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
【請求項７】
部位特異的組換え酵素遺伝子を、これがコードしている部位特異的組換え酵素が認識する、互いに同一方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた状態でベクターに配し、このベクターを植物細胞に導入することにより、該部位特異的組換え酵素遺伝子の導入を行う、請求項５に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
【請求項８】
部位特異的組換え酵素遺伝子と共に、負の選抜マーカー遺伝子を、互いに同一方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた状態でベクターに配する、請求項７に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
【請求項９】
負の選抜マーカー遺伝子として、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法に関する。
【背景技術】  多細胞生物において、通常、体細胞の染色体数は２ｎで表すことができる。このような正常体に対して、その染色体数が変異した体細胞や個体は、異数性細胞もしくは異数性個体、又は、単に異数体と呼ばれ、育種学的及び遺伝学的に極めて重要な意味を持っている。
すなわち、これらの異数体は、その多くが正常体とは異なる形質を示すため、野菜や花卉等においては、天然に生じ、又は、人為的に作出された異数体が、更なる育種のための材料として利用されたり、それ自身が新品種として利用されたりする。
また、異数体の中でも、染色体が１本だけ消失しているモノソミックでは、その消失した染色体上にある遺伝子座は、自家交雑により得られるＦ１世代において正常な分離比を示さないので、これを利用し、遺伝子座の位置を決定することができる。この手法はモノソミック分析と呼ばれ、例えば、パン小麦（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ）では、２１対の全染色体に対応したモノソミックシリーズが作成され、これらのモノソミックと、その自殖Ｆ１世代の形質を研究することにより、多くの形質にかかわる遺伝子座の位置が決められた（非特許文献１）。
しかし、異数体の作出は非常に困難である。例えば、上記パン小麦のモノソミックシリーズは、ライ麦をパン小麦に交雑して得られる半数体を利用することで作出されたが、このような手法でモノソミックが得られる生物種は極めて限られる。一方、モノソミック等の異数体は、コルヒチン、ＥＭＳ（エチルメタンスルフォン酸）等の化学物質や放射線に、当該生物の細胞を暴露することによっても得ることができる（非特許文献２）が、これらの手法は、その利用に高度な技術を必要とする上、消失させるべき染色体以外の染色体にも、予期せぬ障害を与えてしまうことが多い。
【非特許文献１】シアーズ（Ｓｅａｒｓ）、“ミズーリ大学研究期報（Ｕｎｉｖ．Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．）”（米国）、１９５４年、第５７２巻、ｐ１−５８
【非特許文献２】鵜飼保雄、植物育種学、２００３年、ｐ２５９−２６１
【発明の開示】
そこで、本発明者らは、生物種を問わず適用することができ、しかも、消失させる染色体以外の染色体に予期せぬ傷害を与えることのない、容易な異数体作出方法を提供することを課題として鋭意研究を行った結果、部位特異的組換え系の利用により、これが解決されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）  以下の過程（Ａ）〜（Ｃ）を経ることを特徴とする、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法（以下、本発明の第一の様態と称す）。
（Ａ）互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列、及び、これら二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に配され、該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、増殖させる過程
（Ｃ）（Ｂ）で増殖させた細胞から、所定の染色体が消失した細胞を選抜する過程
（２）  上記（１）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ａ）において用いるベクターとして、互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に、更に負の選抜マーカー遺伝子を配したベクターを使用し、かつ、過程（Ｂ）において、その負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で植物細胞の培養を行う、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（３）  以下の過程（Ａ）〜（Ｃ）を経ることを特徴とする、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法（以下、本発明の第二の様態と称す）。
（Ａ）点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列、及び、該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、増殖させる過程
（Ｃ）（Ｂ）で増殖させた細胞から、所定の染色体が消失した細胞を選抜する過程
（４）  上記（３）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ａ）において用いるベクターとして、更に負の選抜マーカー遺伝子を配したベクターを使用し、かつ、過程（Ｂ）において、その負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で植物細胞の培養を行う、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（５）  以下の過程（Ａ）〜（Ｄ）を経ることを特徴とする、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法（以下、本発明の第三の様態と称す）。
（Ａ）互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列、又は、点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列を有するベクターを、植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、上記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素を、該細胞中で、少なくともその増殖時に、一過的に作用させる過程
（Ｃ）（Ｂ）で部位特異的組換え酵素を作用させた細胞を培養し、増殖させる過程
（Ｄ）（Ｃ）で増殖させた細胞から、所定の染色体が消失した細胞を選抜する課程
（６）  上記（５）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ａ）において、互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列と、これら二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域の内側もしくは外側に負の選抜マーカー遺伝子とを配したベクター、又は、点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列と負の選抜マーカー遺伝子とを配したベクターを使用し、かつ、過程（Ｃ）において、その負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で植物細胞の培養を行う、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（７）  上記（５）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ｂ）において、部位特異的組換え酵素の一過的作用を、培養されている植物細胞に、この部位特異的組み換え酵素を導入することにより行わせる、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（８）  上記（５）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法であって、前記過程（Ｂ）において、部位特異的組換え酵素の一過的作用を、培養されている植物細胞に、この部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子を導入することにより行わせる、１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（９）  部位特異的組換え酵素遺伝子の導入は、部位特異的組換え酵素遺伝子と負の選抜マーカー遺伝子とを配したベクターを植物細胞に導入することにより行う、上記（８）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（１０）  部位特異的組換え酵素遺伝子を、これがコードしている部位特異的組換え酵素が認識する、互いに同一方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた状態でベクターに配し、このベクターを植物細胞に導入することにより、該部位特異的組換え酵素遺伝子の導入を行う、上記（８）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（１１）  部位特異的組換え酵素遺伝子と共に、負の選抜マーカー遺伝子を、互いに同一方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた状態でベクターに配する、上記（１０）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（１２）  負の選抜マーカー遺伝子として、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を用いる、上記（２）、（４）、（６）、（９）又は（１１）に記載の１以上の染色体を消失させた植物細胞の作出方法。
（１３）  上記（１）〜（１２）に記載の方法により作出された、１以上の染色体が消失した植物細胞。
（１４）  上記（１３）に記載の植物細胞を有する植物組織又は植物。
本発明によれば、１以上の染色体を消失させた植物細胞を、その種を問わず、作出することができる。
その作出にあたっては、植物への遺伝子導入技術、植物組織培養技術として、ごく一般的な技術を使用するだけでよい。ここで、遺伝子導入に使用するベクターも、ごく単純な構造のものである。
また、本発明においては、１以上の染色体を消失させた植物細胞から、生殖細胞を経ることなく、植物個体を再生することができる。
従って、本発明によれば、植物であれば、その種を問わずに適用でき、育種学的又は遺伝学的に重要な、モノソミックを始めとする異数体、即ち、異数性の植物細胞又は植物個体を、容易に作出する方法が提供される。
しかも、上記異数体の作出にあたって、消失させる染色体以外の染色体には、予期せぬ傷害が与えられることはない。
【図面の簡単な説明】  図１は、互いに逆方向を向いた二つの認識配列が染色体上に存在する場合の、染色体消失機構を示す説明図である。
図２は、点対称の塩基配列からなる一つの認識配列が染色体上に存在する場合の、染色体消失機構を示す説明図である。
図３は、本発明の第一の様態により、植物細胞の染色体が消失する機構を示す説明図である。
図４は、本発明の第二の様態により、植物細胞の染色体が消失する機構を示す説明図である。
図５は、本発明の第三の様態により、植物細胞の染色体が消失する機構を示す説明図である。
図６は、本発明の第三の様態において、遊離型組換え酵素遺伝子の働きにより、染色体が消失する機構を示す説明図である。
図７は、本発明の第一の様態において、二つの認識配列及び組換え酵素遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子を配したベクターを用いた場合に、植物細胞の染色体が消失する機構を示す説明図である。
図８は、本発明の第三の様態において、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとして、組換え酵素遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子を配したベクターを用いた場合の、負の選抜マーカー遺伝子の働きを示す説明図である。
図９は、本発明の第三の様態において、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとして、二つの認識配列及び組換え酵素遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子を配したベクターを用いた場合の、負の選抜マーカー遺伝子の働きを示す説明図である。
図１０は、認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの作成スキムを示す図である。
図１１は、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔの作成スキムを示す図である。
図１２は、本発明の実施例１における染色体消失機構を示す説明図である。
図１３は、本発明の実施例１で用いたプライマーと、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮが導入された染色体、又は、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが導入された後、二つの認識配列に挟まれた領域が脱離した染色体との関係を示す図である。
図１４は、実施例１−ＶＩで得られた発根個体の一部について、ＰＣＲ分析を行った結果を示す図である。
図１５は、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔの作成スキムを示す図である。
図１６は、本発明の実施例２で用いたプライマーと、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ導入後の植物細胞に存在し得る染色体との関係を示す図である。
図１７は、実施例２−ＩＩＩで得られた発根個体について、ＰＣＲ分析を行った結果を示す図である。
図１８は、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒ及びｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒの作成スキムを示す図である。
図１９は、本発明の実施例３及び４で用いたプライマーと、ｐＴＬ７３５Ｒ又はｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ導入後の植物細胞に存在し得る染色体との関係を示す図である。
図２０は、実施例３−ＩＩＩ及び実施例４−ＩＩＩで得られた発根個体の一部について、ＰＣＲ分析を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  最初に、本発明の第一の様態について詳細に説明する。
本発明の第一の様態では、まず、互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列（以下、単に認識配列とも記載する。）、及び、これら二つの認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に配され、該認識配列を認識する部位特異的組換え酵素（以下、単に組換え酵素とも記載する。）をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子（以下、単に組換え酵素遺伝子とも記載する。）を有するベクターを、植物細胞に導入する。
部位特異的組換え酵素認識配列は、所定の塩基配列を有するＤＮＡ因子であって、部位特異的組換え系は、この認識配列を部位特異的組換え酵素が認識して作用することで様々に機能する。例えば、ＤＮＡ分子上に、互いに同一の塩基配列を有しているが、これらの塩基配列が、それぞれ逆向きに並んでいる二つの認識配列（すなわち本発明で言う、互いに逆方向を向いた認識配列。）Ｘ−Ｘ’に挟まれた領域が２箇所存在する場合には、これら２箇所の領域が同一ＤＮＡ分子上に存在するか、異なるＤＮＡ分子上に分かれて存在するかに関わらず、組換え酵素の作用によって、そのＸ−Ｘ’に挟まれた領域同士で組換えを起こすので、本発明ではかかる機能を利用する。
なお、部位特異的組換え系において、認識配列とこれを認識して作用する組換え酵素との組合せには、例えば、ファージ、細菌（大腸菌等）、酵母等の微生物から分離されたＣｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、ｃｅｒ系、ｆｉｍ系等が知られている（総説として、Ｎ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：１７．１９８８）。高等生物の部位特異的組換え系は、まだその存在を知られていないが、上記微生物から分離された部位特異的組換え系の認識配列と組換え酵素も、その由来する生物種と異なる生物種、即ち、植物や動物に導入された場合でも、そのそもそもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが明らかとなっている。
本発明において用いる認識配列及び組換え酵素遺伝子は、こうした認識配列とこれを認識して作用する組換え酵素をコードする遺伝子との組合せより、自由に選択して使用することができる。中でも、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系は、動物、植物等で広く用いられており、組換え効率も高いので、本発明において用いる認識配列及び組換え酵素遺伝子の組合せとして好ましい。もっとも、認識配列は、野生型認識配列の塩基配列が人工的に又は天然に一部改変された、変異型を用いても構わない。但し、この場合において変異型認識配列は、これと共に前記ベクター上に存在する、組換え酵素遺伝子のコードする組換え酵素により認識され得るものであることを要する。
さらに本発明は、負の選抜マーカー遺伝子の利用により、染色体が消失した細胞の取得を一層効率の良いものとすることができる。具体的には、前記ベクターの認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に、この負の選抜マーカー遺伝子を配して用いればよい。このとき、組換え酵素遺伝子との位置関係は問わない。すなわち、負の選抜マーカー遺伝子は、組換え酵素遺伝子と共に認識配列の内側又は外側に配してもよいし、組換え酵素遺伝子を内側に、負の選抜マーカー遺伝子を外側に配してもよく，また、その逆にしてもよい。
負の選抜マーカー遺伝子としては、この遺伝子の発現が宿主細胞の正常な増殖・分化を妨げるような遺伝子であれば、何であれ利用することができる。このような遺伝子としては、例えば、致死誘導遺伝子や形態異常誘導遺伝子等を挙げることができる。
致死誘導遺伝子とは、その発現によって、宿主細胞の機能を損ない、死に至らしめる遺伝子全般を意味し、例えば、ＲＮＡｓｅ、ＤＡＭメチラーゼ、シトシンデアミナーゼ（ｃｏｄＡ）、ジフテリアトキシン、Ｂａｘ等をコードする遺伝子が一般に知られている。また、形態異常誘導遺伝子とは、その発現によって、宿主細胞の増殖・分化の方向を狂わせて、通常とは異なる形態分化を引起こす遺伝子全般を意味する。植物の形態異常誘導遺伝子としては、宿主植物に矮化、頂芽優勢の崩壊、色素の変化、根頭癌腫、カルス化、毛状根、葉の波打ち等を引起こす、植物ホルモン合成系遺伝子や植物ホルモンシグナルトランスダクション系遺伝子など、植物ホルモン関連遺伝子を使用することができる。
植物ホルモン合成系遺伝子は、植物ホルモンの合成に関与するタンパク等をコードする遺伝子であって、植物病原菌であるアグロバクテリウム等に存在するｉｐｔ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｏｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（Ａ．Ｃ．Ｓｍｉｇｏｃｋｉ、Ｌ．Ｄ．Ｏｗｅｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５１３１、１９８８）、ｉａａＭ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｈ．Ｊ．Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ、１：８６、１９８７）、ｇｅｎｅ５遺伝子（Ｈ．ｋｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１０：３９８３、１９９１）、ｇｅｎｅ６ｂ遺伝子（Ｐ．Ｊ．Ｊ．Ｈｏｏｙａａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：７９１、１９８８）、及びｒｏｌＡ〜Ｄのｒｏｌ遺伝子群（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４：３３、１９８５）等を始め、シュードモナス・シリンガエの亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）に存在するｉａａＬ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｌｙｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子（Ａ．Ｓｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２７：２０５、１９９１）、更には、種々の植物のホメオボックス遺伝子やフィトクローム遺伝子等が知られている。
一方、植物ホルモンシグナルトランスダクション系遺伝子は、ジベレリン、エチレン、オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモンの存在を認識するセンサーや、そのセンサーからの情報を伝達していく、一連の情報伝達経路に関わるタンパクをコードする遺伝子であって、エチレン受容体遺伝子であるＥＴＲ１遺伝子（Ｃ．Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：５３９、１９９３）、サイトカイニン受容体遺伝子であると考えられているＣＫＩ１遺伝子（Ｔ．Ｋａｋｉｍｏｔｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９８２、１９９６）とその変異体（ｅｘ．ＣＫＩ２遺伝子）及びＧＣＲ１遺伝子（Ｓ．Ｐｌａｋｉｄｏｕ−Ｄｙｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、８：３１５、１９９８）の他、ＩＢＣ６遺伝子及びＩＢＣ７遺伝子（Ｉ．Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｅｂｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１０：１００９、１９９８）等が知られている。
これらの形態異常誘導遺伝子の中では、特に、頂芽優勢の崩壊を引き起こすｉｐｔ遺伝子、並びに、毛状根の形成及び毛状根から再生した植物の矮化や葉の波打ち等を引き起こすｒｏｌ遺伝子群は、特徴的な形態の異常を引き起こし、植物個体の再分化を妨げることから、本発明において使用する形態異常誘導遺伝子として好ましい。
本発明のベクターを植物細胞に導入する方法には直接導入法と間接導入法とがあり、直接導入法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレーション法等の物理的・化学的手法を使用することができ、また、間接導入法としては、植物に感染するウィルスや細菌を介して行う手法を使用することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。間接導入法に用いられるウィルスや細菌の中では、ウィルスとしては、カリフラワーモザイクウィルス、ジェミニウィルス、タバコモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス等が、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス等が代表的である。
ベクター導入後の植物細胞は、その植物細胞に最も適した公知の培養条件及び環境条件にて培養し、増殖させればよい。すると、増殖した細胞の中に、１以上の染色体が消失した細胞が生じるので、増殖後の培養組織を対象として、細胞のＤＮＡを解析すれば、目的とする染色体が消失した細胞や、かかる細胞からなる組織を選抜することができる。このとき、ＤＮＡの解析手法としては、例えば、ＰＣＲ法やサザン解析法等の公知の手法を用いることができる。なお、上記ベクターとして、負の選抜マーカー遺伝子を配したものを用いる場合には、この負の選抜マーカー遺伝子が、これを染色体に有する細胞の正常な増殖・分化を妨げるように機能する条件（本発明においては、このような条件を、負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件という。）下で、ベクター導入後の植物細胞を培養することにより、染色体が消失した細胞の選択的取得が可能となる。
次に、本発明の第二の様態について詳細に説明する。
本発明の第二の様態は、植物細胞に導入するベクターとして、点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列、及び、該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素をコードしている部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを用いる。
ここで、点対称の塩基配列からなる部位特異的組換え酵素認識配列とは、所定の塩基配列が点対称に並んだ、いわゆる回文型の配列を有するＤＮＡ因子である。この点対称の塩基配列からなる認識配列は、この認識配列を認識して作用する組換え酵素との組合せで機能する点では、本発明の第一の様態において用いた認識配列と同じであるが、この認識配列は、単に、ＤＮＡ分子上に二つ存在するだけで、それが同一ＤＮＡ分子上に存在するか、異なるＤＮＡ分子上に存在するかに関わらず、組換え酵素の作用によって、ＤＮＡ分子の組換えが起こる点が異なっている。かかる点対称の塩基配列からなる認識配列としては、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系の組換え酵素との組合せで機能する認識配列ＬｏｘＰｓｙｍが知られている（Ｒｏｎａｌｄ  Ｈ．Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１：１４（５）：２２８７−２３００、１９８６）。
なお、本発明においても、本発明の第一の様態と同様に、負の選抜マーカー遺伝子を利用し、染色体が消失した細胞の取得を一層効率の良いものとすることができる。この場合は、前記ベクターに、上記点対称の塩基配列からなる認識配列及び組換え酵素遺伝子と共に、この負の選抜マーカー遺伝子を配して用いればよい。このとき、認識配列や組換え酵素遺伝子との位置関係は問わない。また、負の選抜マーカー遺伝子としては、上記本発明の第一の様態で負の選抜マーカー遺伝子として用いられるものであれば、本発明でも同様に用いることができる。
以上、特に記載した以外の事項については、本発明は、本発明の第一の様態と同様に実施することができる。すなわち、本発明のベクターは、本発明の第一の様態のベクターと同様にして、植物細胞に導入することができ、本発明のベクターを導入した植物細胞は、本発明の第一の様態の場合と同様にして培養し、増殖させることで、１以上の染色体が消失した細胞を生じ、この細胞は、本発明の第一の様態の場合と同様にして選抜することができる。
さらに、本発明の第三の様態について詳細に説明する。
本発明の第三の様態は、植物細胞に導入するベクターとして、まず最初に、互いに逆方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列、又は、点対称の塩基配列からなる一つの部位特異的組換え酵素認識配列を有するベクターを用いる（以下、このベクターを、認識配列導入用ベクターとも記載する。）。このベクターには、本発明の第一又は第二の様態のベクターとは異なり、これらの認識配列を認識する組換え酵素をコードする組換え酵素遺伝子は配さない。
一方、このベクターには、本発明の第一又は第二の様態のベクターと同様に、染色体が消失した細胞の取得を一層効率の良いものとするため、これらの認識配列と共に、負の選抜マーカー遺伝子を配することもできる。互いに逆方向を向いた二つの認識配列と共に、この負の選抜マーカー遺伝子を配する場合には、認識配列に挟まれた域の内側又は外側に、これを配することができ、点対称の塩基配列からなる一つの認識配列と共に、この負の選抜マーカー遺伝子を配する場合には、その位置関係に関わりなく、これを配することができる。
本発明においては、上記ベクターを植物細胞に導入した後、このベクターに配した認識配列を認識する組換え酵素を、該細胞中で、少なくともその増殖時に、一過的に作用させる。
増殖時の植物細胞に組換え酵素を少なくとも一過的に作用させるには、例えば、組換え酵素自体もしくはこの組換え酵素をコードしている組換え酵素遺伝子を、増殖中の植物細胞に導入し、及び／又は、これらを植物細胞に導入した後、その植物細胞を増殖させる等により、行うことができる。
上記組換え酵素遺伝子の導入にあたっては、この組換え酵素遺伝子を、単に、適当なベクターに配して、植物細胞に導入するだけで、該細胞中で組換え酵素を一過的に作用させることができる。（以下、認識配列の導入後に、組換え酵素遺伝子を植物細胞に導入するため用いるベクターを、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとも記載する。）植物細胞に導入された組換え酵素遺伝子は、染色体に組込まれないままでも発現し、しかも、かかる遊離型の組換え酵素遺伝子は、ある程度組換え酵素を生産した後、消失し、該細胞中での組換え酵素の生産は停止するので、結果的に、この組換え酵素による作用も一過的なものとなるからである。
しかし、このような組換え酵素による一過的作用を確実なものとするには、組換え酵素遺伝子を、これがコードしている組換え酵素が認識する、互いに同一の塩基配列を有し、これらの塩基配列がそれぞれ同一の向きに並んでいる二つの認識配列（すなわち本発明で言う、互いに同一方向を向いた認識配列。）に挟まれた状態でベクターに配して、植物細胞に導入すればよい。こうして植物細胞に導入された組換え酵素遺伝子は、その植物細胞の染色体に組込まれた場合でも、上記二つの認識配列に挟まれた状態で組込まれ、発現するので、細胞中で組換え酵素をある程度生産した後、自らが生産した組換え酵素の作用により、染色体から脱離して遊離し、その後消失するからである。
なお、組換え酵素遺伝子を植物細胞に導入することにより、組換え酵素を該細胞中で一過的に作用させる場合においては、組換え酵素遺伝子と共に、負の選抜マーカー遺伝子を植物細胞に導入すれば、組換え酵素遺伝子が導入された細胞の中から、確実に、組換え酵素が一過的に作用した細胞を取得することができる。負の選抜マーカー遺伝子としては、上記本発明の第一又は第二の様態で負の選抜マーカー遺伝子として用いられるものであれば、本発明でも同様に用いることができる。
上記の場合において、組換え酵素遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子を植物細胞に導入するには、単に、この組換え酵素遺伝子と負の選抜マーカー遺伝子とをベクターに配し、このベクターを植物細胞に導入してやればよい。組換え酵素遺伝子を、互いに同一方向を向いた二つの認識配列に挟まれた状態でベクターに配する場合には、負の選抜マーカー遺伝子は、組換え酵素遺伝子と共に、互いに同一方向を向いた二つの認識配列に挟んだ状態でベクターに配すればよい。
また、組換え酵素遺伝子を植物細胞に導入することにより、組換え酵素を該細胞中で一過的に作用させる場合においては、更に、組換え酵素遺伝子と共に、選抜マーカー遺伝子を植物細胞に導入することが好ましい。具体的には、上記した負の選抜マーカー遺伝子の場合と同様に、組換え酵素遺伝子と共に、又は、組換え酵素遺伝子及び負の選抜マーカー遺伝子と共に、選抜マーカー遺伝子をベクターに配し、このベクターを植物細胞に導入してやればよい。このとき、選抜マーカー遺伝子の配置、種類及び数等に、特に制限はない。例えば、組換え酵素遺伝子を、互いに同一方向を向いた二つの認識配列に挟まれた状態で配する場合には、選抜マーカー遺伝子は、認識配列で挟まれた領域の内側に配しても、外側に配してもよく、また、組換え酵素遺伝子が脱離することで選抜マーカー遺伝子が発現するように、選抜マーカー遺伝子のプロモーター部分と構造遺伝子部分との間に、認識配列で挟まれた領域が障害物として存在するように配してもよい。
選抜マーカー遺伝子としては、カナマイシンに対する耐性を植物に付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する耐性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子や、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等の除草剤耐性遺伝子など、公知のものを１種類以上用いることができる。このようにして、組換え酵素遺伝子と共に選抜マーカー遺伝子を植物細胞に導入することで、組換え酵素遺伝子が導入された細胞を選択的に増殖することができるようになる。
組換え酵素又はこの組換え酵素をコードしている組換え酵素遺伝子を導入し、その増殖時において、この組換え酵素を一過的に作用させた後の植物細胞は、その植物細胞に最も適した公知の培養条件及び環境条件にて培養し、増殖させればよい。すると、増殖した細胞の中に、１以上の染色体が消失した細胞が生じるので、増殖後の培養組織を対象として、細胞のＤＮＡを解析すれば、目的とする染色体が消失した細胞や、かかる細胞からなる組織を選抜することができる。なお、上記認識配列導入用ベクターや、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとして、負の選抜マーカー遺伝子を配したものを用いる場合には、この負の選抜マーカー遺伝子が機能する条件下で、組換え酵素遺伝子導入用ベクター導入後の植物細胞を培養することにより、染色体が消失した細胞及び／又は組換え酵素が一過的に作用した細胞の選択的取得が可能となる。
以上、特に記載した以外の事項については、本発明は、本発明の第一又は第二の様態と同様に実施することができる。すなわち、本発明において、互いに逆方向を向いた二つの認識配列又は互いに同一方向を向いた二つの認識配列とこれを認識して作用する組換え酵素をコードする組換え酵素遺伝子は、本発明の第一の様態のベクターで用いる認識配列と組換え酵素遺伝子を用いることができ、点対称の塩基配列からなる認識配列とこれを認識して作用する組換え酵素をコードする組換え酵素遺伝子は、本発明の第二の様態のベクターで用いる認識配列と組換え酵素遺伝子を用いることができる。また、認識配列導入用ベクターや組換え酵素遺伝子導入用ベクターは、本発明の第一の様態のベクターと同様にして植物細胞に導入することができ、認識配列導入用ベクターを導入した植物細胞の培養も、本発明の第一の様態の場合と同様にして行うことができる。
＜作用＞
互いに逆方向を向いた二つの認識配列が染色体に導入された細胞では、体細胞分裂（有糸分裂）が始まると、この染色体も複製されて倍化する。このとき、組換え酵素が働くと、倍化によって生じた、これら２本の染色体にそれぞれ存在する、二つの認識配列に挟まれた領域同士でＤＮＡの組換えが起こると考えられる。
この組換えが対称的に起こった場合は、組換え後の染色体には、２本とも実質的な変化は生じない。しかし、この組換えが非対称的に起こった場合は、組換え後、点対称に２つの動原体を持つ染色体（二動原体型染色体）と動原体の無い染色体（無動原体型染色体）とが一本づつ生ずることとなる。正常な体細胞分裂においては、倍化後の染色体は、その後生じる紡錘糸の両極に向い、この紡錘糸に沿って各々移動することで分配され、新たに生じる娘細胞の染色体となるが、二動原体型染色体や無動原体型染色体は、紡錘糸に沿って移動することができないため、娘細胞には分配されない。従って、このとき、体細胞分裂後に生じる２つの娘細胞はいずれも、これらに対応する染色体が消失したものとなる（図１）。
また、同様の現象は、点対称の塩基配列からなる一つの認識配列が染色体上に導入された細胞でも起こる。点対称の塩基配列からなる認識配列が染色体上に導入された場合、ＤＮＡの組換えは、倍化によって生じる２本の染色体にそれぞれ存在する、認識配列同士で起こるが、この場合でも、非対照的組換えの結果、二動原体型染色体と無動原体型染色体が生ずることに変わりはないからである（図２）。
本発明者らは、鋭意研究の結果、上記知見に到達し、本発明の第一、第二及び第三の様態を完成させた。
すなわち、本発明の第一の様態では、互いに逆方向を向いた二つの認識配列、及び、これら二つの認識配列に挟まれた領域の内側又は外側に配され、該認識配列を認識する組換え酵素をコードしている組換え酵素遺伝子を有するベクターを、植物細胞に導入し、この細胞を培養して増殖させる。
上記ベクターを植物細胞に導入することにより、この植物細胞の染色体に、互いに逆方向を向いた二つの認識配列と、この認識配列を認識する組換え酵素をコードする組換え酵素遺伝子が導入されれば、この植物細胞を増殖させた場合に、体細胞分裂の開始により、同様の構造が導入された２本の染色体が生じる。このとき、その染色体上の組換え酵素遺伝子の発現により生じる組換え酵素の働きにより、これら２本の染色体にそれぞれ存在する、二つの認識配列に挟まれた領域同士でＤＮＡの組換えが起こり、その結果、二動原体型染色体と無動原体型染色体とが生じて、染色体が消失した娘細胞が生じるのである（図３）。
また、本発明の第二の様態では、点対称の塩基配列からなる一つの認識配列、及び、該認識配列を認識する組換え酵素をコードしている組換え酵素遺伝子を有するベクターを、植物細胞に導入し、この細胞を培養して増殖させる。
この場合も、上記本発明の第一の様態の場合と同様にして、染色体が消失した娘細胞が生じる。本発明の第一の様態の場合と異なるのは、ＤＮＡの組換えが、倍化した２本の染色体にそれぞれ存在する、一つの認識配列同士で起こる点のみである（図４）。
さらに、本発明の第三の様態では、互いに逆方向を向いた二つの認識配列、又は、点対称の塩基配列からなる一つの認識配列を有するベクターを植物細胞に導入した後に、上記認識配列を認識する組換え酵素を、該細胞の増殖時に、一過的に作用させる。
例えば、互いに逆方向を向いた二つの認識配列を有する認識配列導入用ベクターを植物細胞に導入した後、この植物細胞に、互いに同一方向を向いた認識配列に挟まれた状態で組換え酵素遺伝子が配されている組換え酵素遺伝子導入用ベクターを導入することで、該細胞の増殖時に組換え酵素を一過的に作用させた場合について説明すると（図５）、この本発明の第三の様態では、まず、認識配列導入用ベクターを植物細胞に導入することにより、互いに逆方向を向いた二つの認識配列が導入された染色体が生じ、次いで、この細胞中に、組換え酵素遺伝子導入用ベクターを導入することにより、これに配されている組換え酵素遺伝子が発現して、組換え酵素が生産される。この場合において、該細胞を培養し、増殖させた場合には、体細胞分裂の開始により倍化して生じた、互いに逆方向を向いた二つの認識配列をそれぞれ有する２本の染色体は、組換え酵素の働きにより、二つの認識配列に挟まれた領域同士でＤＮＡの組換えを起こし、その結果、二動原体型染色体と無動原体型染色体とが生じて、染色体が消失した娘細胞が生じる。
一方、上記組換え酵素遺伝子導入用ベクターに配され、これにより植物細胞に導入された組換え酵素遺伝子は、その植物細胞の染色体に組込まれた場合でも、互いに同一方向を向いた二つの認識配列に挟まれた状態で組込まれ、発現するので、組換え酵素をある程度生産した後、自らが生産した組換え酵素の作用により、導入された染色体から脱離して遊離し、その後消失する。従って、その組換え酵素の作用も一過的なものとなる。この本発明の第三の様態に係るベクターでは、こうした機構により、組換え酵素による一過的作用を確実なものとするため、目的とする染色体を消失させた後の細胞において、組換え酵素遺伝子が恒常的に発現することによる、ＤＮＡの不安定化等の弊害を防ぐことができる。
しかし、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとしては、単に、この組換え酵素遺伝子が、認識配列なしで配されているものでも用いることができる。前記したように、植物細胞に導入された組換え酵素遺伝子は、染色体に組込まれないままでも発現し、組換え酵素を一過的に作用させる。従って、認識配列なしで組換え酵素遺伝子が配されているベクターであっても、かかる遊離型組換え酵素遺伝子の働きにより、これが導入された植物細胞において、組換え酵素を一過的に作用させることができるからである。こうした機構により、組換え酵素を一過的に作用させた場合には、目的とする染色体が消失し、しかも、認識配列導入用ベクターの痕跡はもちろん、組換え酵素遺伝子導入用ベクターの痕跡も残らない、つまり、遺伝子操作の痕跡が全く残らない細胞を得ることができる（図６）。
なお、上記本発明の第一もしくは第二の様態において用いるベクター、又は、本発明の第三の様態において用いる認識配列導入用ベクターに、負の選抜マーカー遺伝子を配することで、染色体が消失した細胞の取得を一層効率の良いものとすることができる。
例えば、互いに逆方向を向いた二つの認識配列の外側に、組換え酵素遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子を配した、本発明の第一の様態に係るベクターを、植物細胞に導入した場合（図７）、倍化して生じた、互いに逆方向を向いた二つの認識配列をそれぞれ有する二本の染色体が、その二つの認識配列に挟まれた領域同士で対称的組換えを起こして得られる娘細胞には、負の選抜マーカー遺伝子が残存するので、この負の選抜マーカー遺伝子が機能するような条件下で培養すると、正常な増殖や分化が阻害される。従って、非対称的組換えの結果、染色体が消失した娘細胞のみを選択的に取得できるようになる。
また、本発明の第三の様態においては、上記負の選抜マーカー遺伝子を、組換え酵素遺伝子と共に、組換え酵素遺伝子導入用ベクターに配してもよい。
例えば、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとして、組換え酵素遺伝子が認識配列なしで配されているものを用いた場合、このベクターに配されている組換え酵素遺伝子が、認識配列導入用ベクターによって認識配列が導入された染色体とは異なる染色体に導入されてしまうと、目的とする染色体を消失させた後も、組換え酵素遺伝子がその導入された染色体に残存し続けて恒常的に発現し、組換え酵素が生産され続けるため、ＤＮＡの不安定化等の弊害を招くこととなる。
しかし、この場合において、組換え酵素遺伝子導入用ベクターとして、組換え酵素遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子を配したベクターを用いれば、組換え酵素遺伝子が、認識配列導入用ベクターによって認識配列が導入された染色体とは異なる染色体に導入され、残存し続けたとしても、負の選抜マーカー遺伝子もまた、この染色体に導入されて残存し続けるので、負の選抜マーカー遺伝子が機能するような条件下で培養することにより、この染色体を有する細胞の正常な増殖や分化は妨げられる。従って、かかる細胞が排除され、組換え酵素が一過的に作用した細胞を確実に取得できるようになる（図８）。
また、組換え酵素遺伝子導入用ベクターに、組換え酵素遺伝子を、互いに同一方向を向いた二つの認識配列に挟まれた状態で配する場合は、負の選抜マーカー遺伝子を、組換え酵素遺伝子と共に、これら二つの認識配列に挟んだ状態で配することにより、組換え酵素が一過的に作用した細胞を、より確実に取得できるようになる。
組換え酵素遺伝子を、互いに同一方向を向いた二つの認識配列に挟まれた状態で配した組換え酵素遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入した場合、組換え酵素遺伝子は、その植物細胞の染色体に導入された場合でも、通常は、組換え酵素をある程度生産した後、導入された染色体から脱離して遊離し、その後消失するが（図５）、場合によっては、この組換え酵素遺伝子が、導入された染色体から脱離せずに発現し続け、上記弊害を招くことがある。
しかし、この場合においても、組換え酵素遺伝子導入用ベクターに、負の選抜マーカー遺伝子を上記のように配すれば、この負の選抜マーカー遺伝子は、部位特異的組換えに関し、組換え酵素遺伝子と同じ挙動を取るため、組換え酵素遺伝子が、植物細胞の染色体に導入された後、脱離せずに発現し続けた場合には、負の選抜マーカー遺伝子もまた、細胞の染色体に存在し続けて、この負の選抜マーカー遺伝子が機能するような条件下で培養することにより、細胞の正常な分化や増殖を妨げ、かかる細胞を排除するからである（図９）。
以下、実施例に従って発明の詳細を説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）、又は製造業者の取り扱い説明書に従い行った。
【実施例１】Ｉ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）の構築
ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Ｎｏｓ−Ｐ）及びノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル（以下、ポリアデニル化シグナルは全てノパリンシンターゼ由来のものを用いた。）を連結したＮＰＴＩＩ構造遺伝子、並びに、３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）及びポリアデニル化シグナルを連結したｃｏｄＡ構造遺伝子が、互いに逆方向を向いた、部位特異的組換え系Ｒ／ＲＳ由来の認識配列ＲＳに挟まれた構造を有するプラスミド、ｐＣＲＳｃｏｄＮを構築した。なお、ｃｏｄＡ構造遺伝子は、大腸菌（ＤＨ５α、東洋紡（株）より購入）のゲノムＤＮＡをテンプレートに、配列番号１に示すプライマーα（５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｃ  ａｔｇｔｇｇａｇｇｃ  ｔａａｃａｇｔｇ−３’）と配列番号２に示すプライマーβ（５’−ｇｃｇａｇｃｔｃｔｃ  ａｇｔｇｃｔｃｔａｃ  ｇｔａｇｇｃｃｇ−３’）とを用いて、ＰＣＲ法により取得したものである。
ｐＣＲＳｃｏｄＮの構造を図１０Ａに示す。図中、四角形の枠で囲まれた黒色の三角形はＲＳ及びその配列の方向を、Ｔはポリアデニル化シグナルを示している（以下同じ。）。
一方、プラスミドｐＴＳ１（ＷＯ２００４／８７９１０）の制限酵素ＳｍａＩ部位に、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドｓｐｓＵ（５’−ｔｇｃａｇａａｔａａ  ａｔａａａｃｇｃｃａ  ｔｇｇｃａｃｃｃｇｇ  ｇａａａｇａａａｔａ  ａａａｔｇａａａｃｇ  ｃａａａｃａｃａｔｇ  ａｃｃｔｇｃａｇｇｃ  ａｃａｔａａｇａｔｇ  ａｔａｃｇｃａａｇｃ  ｇｃｃｇａｇｃｔｃｔ  ａｃｔａｃｇｃａａｔ  ｇｇｃａｇａｃｇｃａ  ａａａｇｃａｇｇｃｔ  ａｃｇｃａｔｇｃａ）と配列番号４に示すオリゴヌクレオチドｓｐｓＬ（５’−ｔｇｃａｔｇｃｇｔａ  ｇｃｃｔｇｃｔｔｔｔ  ｇｃｇｔｃｔｇｃｃａ  ｔｔｇｃｇｔａｇｔａ  ｇａｇｃｔｃｇｇｃｇ  ｃｔｔｇｃｇｔａｔｃ  ａｔｃｔｔａｔｇｔｇ  ｃｃｔｇｃａｇｇｔｃ  ａｔｇｔｇｔｔｔｇｃ  ｇｔｔｔｃａｔｔｔｔ  ａｔｔｔｃｔｔｔｃｃ  ｃｇｇｇｔｇｃｃａｔ  ｇｇｃｇｔｔｔａｔｔ  ｔａｔｔｃｔｇｃａ−３’）とをアニーリングしたＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＴＳｓｐｓを構築し（図１０Ｂ）、このｐＴＳｓｐｓの制限酵素Ｓｓｅ８３８７０１（以下、ＳｓｅＩと略記する。）部位に、上記ｐＣＲＳｃｏｄＮから制限酵素ＳｓｅＩにて切出した、逆方向を向いた二つのＲＳ及びこれらに挟まれた領域を挿入して、宿主ＤＮＡへの認識配列導入用ベクタープラスミドｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを構築した（図１０Ｃ：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（宛名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１６年１２月３日付にて国内寄託済み、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３１２。また、２００５年１２月８日付にて国際寄託済み。）。
このベクターを植物細胞に導入した場合、図中、小さな黒三角形で示した、Ｔ−ＤＮＡ由来のライトボーダー（ＲＢ）とレフトボーダー（ＬＢ）との間が、染色体中に導入されることとなる。なお、ｃｏｄＡ遺伝子は、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を、細胞に毒性を有する５−フルオロウラシルに変換する酵素をコードする遺伝子であり、ｃｏｄＡ遺伝子が染色体に導入され、発現している植物細胞を、５−ＦＣ添加培地で培養すると、その細胞は死滅するので、本実施例においては、下記１１において詳述するように、この遺伝子を、染色体が消失した細胞を選択的に取得するための負の選抜マーカー遺伝子として利用する。また、ＮＰＴＩＩ遺伝子は、このベクターにより、上記ＲＢ−ＬＢ間の領域が染色体に導入された植物細胞を選抜するための選抜マーカー遺伝子として働く。
ＩＩ．組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の構築
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（Ｒｕｂ−Ｐ）を連結したｉｐｔ遺伝子、並びに、３５Ｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結した部位特異的組換え酵素（Ｒ）構造遺伝子が、互いに同一方向を向いたＲＳに挟まれた構造を有するプラスミド、１２８−３５Ｒｒｕｂｉｐｔを構築した（図１１Ａ）。
一方、プラスミドｐＴＳ１（ＷＯ２００４／８７９１０）の制限酵素ＳｍａＩ部位に、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドｋｐｎｓｓｅＵ（５’−ｃｔｇｃａｃｇｃｔａ  ｃｃｔｇｃａｇｇ−３’）と配列番号６に示すオリゴヌクレオチドｋｐｎｓｓｅＬ（５’−ｃｃｔｇｃａｇｇｔａ  ｇｃｇｔｇｃａｇ−３’）とをアニーリングしたＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＴＳｋｓｓを構築し（図１１Ｂ）、このｐＴＳｋｓｓの制限酵素ｋｐｎＩ部位に、３５Ｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結したハイグロマイシン耐性（Ｈｐｔ）遺伝子の構造遺伝子を挿入して、プラスミドｐＴＳ３５Ｈｙｇを構築した（図１１Ｃ）。
次いで、１２８−３５Ｒｒｕｂｉｐｔから、ＲＳ及びこれに挟まれた領域を制限酵素ＳｓｅＩにより切出して、上記ｐＴＳ３５Ｈｙｇの制限酵素ＳｓｅＩ部位に連結することで、組換え酵素遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを構築した（図１１Ｄ：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（宛名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１６年１２月３日付にて国内寄託済み、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３１３。また、２００５年１２月８日付にて国際寄託済み。）。このベクターを植物細胞に導入した場合、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮと同様に、図中、小さな黒三角形で示した、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢとＬＢとの間が、染色体中に導入されることとなる。
前記認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に、ここで構築した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを導入すると、このｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔに配されているＲ遺伝子が発現して、組換え酵素が生産される。この場合において、該細胞を培養し、増殖させた場合には、体細胞分裂の開始により倍化して生じた、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する互いに逆方向を向いた二つのＲＳをそれぞれ有する２本の染色体は、組換え酵素の働きにより、上記二つのＲＳに挟まれた領域同士でＤＮＡの組換えを起こす。
このようなＤＮＡの組換えが起こった細胞のうち、非対称的組換えが起こった細胞では、二動原体型染色体と無動原体型染色体とが生じて、その結果、上記ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造、即ち、互いに逆方向を向いた二つのＲＳ、及び、この二つのＲＳに挟まれた領域に存在するｃｏｄＡ遺伝子等を有する染色体が消失した娘細胞が生じる。しかし、対称的組換えが起こった細胞では、組換え後の染色体に実質的な変化は生じない。このため、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造を有する染色体が保持されたままとなる。従って、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを導入した後、該細胞を５−ＦＣの存在下で培養すると、対称的組換えが起こった細胞は、その染色体に残存するｃｏｄＡ遺伝子の働きにより死滅し、非対称的組換えによって染色体が消失した細胞のみを選抜できることとなる。
一方、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔに配され、これにより植物細胞に導入されたＲ遺伝子は、その植物細胞の染色体に組込まれた場合でも、互いに同一方向を向いたＲＳに挟まれた状態で組込まれ、発現するので、組換え酵素をある程度生産した後、自らが生産した組換え酵素の作用により、導入された染色体から、ｉｐｔ遺伝子と共に脱離して遊離し、その後消失する。従って、その組換え酵素の作用は一過的なものとなる（図１２）。
なお、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔにおいて、ｉｐｔ遺伝子は、上記機構によりＲ遺伝子が染色体から脱離しなかった場合に、その細胞を排除するための負の選抜マーカー遺伝子として働き、また、Ｈｐｔ遺伝子は、このベクターにより、前記ＲＢ−ＬＢ間の領域が染色体に導入された植物細胞を選抜するための選抜マーカー遺伝子として働く。
ＩＩＩ．アグロバクテリウムへの認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）又は組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の導入
Ａ．ツメファシエンス４４０４株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビーフエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。この培養液を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌し、得られた菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。
次いで、このプラスミド導入用菌液５０μｌと、Ｉ及びＩＩで作成したｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ及びｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ各３μｌを、０．５ｍｌチューブ内で混合し、エレクトロポレーション（ジーンパルサーＩＩシステム［ＢＩＯＲＡＤ社］）を行うことにより、Ａ．ツメファシエンス４４０４株に上記ベクターを導入した。エレクトロポレーション後の菌体は、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で１時間振とう培養してから、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種して２８℃で２日間培養した。この培養の結果、菌コロニーを形成した菌について、更にＹＥＢ液体培地に移植して培養した後、アルカリ法でプラスミドを抽出し、これを制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで分解してポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、制限酵素分解物の長さを解析することにより、Ａ．ツメファシエンス４４０４株へのｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ又はｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔの導入を確認した。ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの導入が確認された菌をＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔの導入が確認された菌をＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）とした。
ＩＶ．タバコへの認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）の導入
培養容器内で成育させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＳＲ１、特に記載する場合を除き、以下同じ。）の葉から、中脈を取り除いて約８ｍｍ角となるようにカットして得られた葉片３６片を、ＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）の菌液（ＯＤ６３０＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一夜培養後、滅菌水で稀釈して菌体濃度を調整。）に約１分間浸してこれに感染させ、滅菌した濾紙の上に置いて余分な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌを添加した植物ホルモンを含まない（ホルモンフリー）ＭＳ寒天培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５：４７３、１９６２、但し、寒天０．８ｗ／ｖ％を添加。）に、葉の裏が上になるように置床して、２５℃、全明（特に記載されない限り、外植片及び植物組織・植物個体の培養はこの条件で行った。）で３日間培養を行った。
上記培養後の葉片を、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン２００ｍｇ／ｌを添加したＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、不定芽２４個が再分化してきたので、この不定芽を分離し、更にカルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン２００ｍｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植して培養することにより発根させ、１２個の不定芽より１２個の発根個体を得て、最終的には、これら１２個の発根個体にそれぞれ由来するカナマイシン耐性組換え体１２系統を得ることができた。
得られたカナマイシン耐性組換え体１２系統につき、順化後の発根個体より種子を採取してカナマイシン２００ｍｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に播種し、カナマイシン耐性を示して発芽し、生育した苗を１系統あたり１株づつ選抜した。
Ｖ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）が導入されたタバコの分析
ＩＶで得られたカナマイシン耐性組換え体１２系統の個体１２株より、ＣＴＡＢ法を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、これを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のアガロースゲルは、アルカリ・酸処理の後、電気泳動面をナイロンメンブランに転写し、このナイロンメンブランについて、ＤＩＧ  ＰＣＲ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より購入）にて予めラベリングしておいた、ｃｏｄＡ遺伝子と相同性を有するプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より購入）により化学発光検出を行ったところ、上記１２系統のうち１系統（ＣｏｄＮ−２３）において、１コピーのｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮが導入されていることが確認された。
ＶＩ．認識配列導入タバコへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の導入
Ｖにおいて、１コピーのｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ導入が確認された認識配列導入タバコＣｏｄＮ−２３株に対し、ＩＶと同様にしてＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の感染処理を行った。感染処理後、３日間ＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）と共存培養した６４葉片を、ナフタレン酢酸１ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシン２０ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、９０個のカルスが得られ、この９０個のカルスを同組成の培地に移植して４週間培養を続けることにより、５０個の不定芽が得られた。これらの不定芽をホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続けたところ、２４個の発根個体を得ることができた。
ＶＩＩ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）及び組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＶＩにおいて得られた２４個の発根個体について、染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）により抽出し、ＮＰＴＩＩ構造遺伝子に結合する配列番号７に示すプライマーＫｍ１（５’−ａｇａｇｇｃｔａｔｔ  ｃｇｇｃｔａｔｇｃａ−３’）及び配列番号８に示すプライマーＫｍ２（５’−ｃｃａｔｇａｔａｔｔ  ｃｇｇｃａａｇｃａｇ−３’）、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮのライトボーダー付近に結合する配列番号９に示すプライマーＲＢＳ１（５’−ａｃｔｇａｔａｇｔｔ  ｔａａａｃｔｇａａｇ  ｇｃｇｇｇ−３’）及びｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮのｓｐｓＵに由来する配列に結合する配列番号１０に示すプライマーＳＰＲ１ａ（５’−ａｔｇｇｃｇｔｔｔａ  ｔｔｔａｔｔｃｔｇｃ−３’）、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮのｓｐｓＬに由来する配列に結合する配列番号１１に示すプライマーＳＰＬ  １ａ（５’−ａｃａｔａａｇａｔｇ  ａｔａｃｇｃａａｇｅ−３’）及びｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮのレフトボーダー付近に結合する配列番号１２に示すプライマーｐＢＳＰｈ０２（５’−ａａｇｃｃｇｇｃｇａ  ａｃｇｔｇｇｃｇａｇ  ａａ−３’）、並びに、Ｈｐｔ遺伝子に結合する配列番号１３に示すプライマーＨｍ１（５’−ｃｇｔｃｔｇｔｃｇａ  ｇａａｇｔｔｔｃｔｇ−３’）及び配列番号１４に示すプライマーＨｍ２（５’−ｃｔａｔｃｇｇｃｇａ  ｇｔａｃｔｔｃｔａｃ−３’）を用いてＰＣＲ分析を行った。
ＰＣＲ反応は、抽出したＤＮＡ１μｇを、プライマー各０．２μＭを含む、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｗ／ｖ％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＣＥＴＵＳ社より購入）を混合したＰＣＲ緩衝液５０μｌ中に溶解し、この混合液を、９４℃で１分３０秒間加温した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の加温サイクルを３０回繰り返すことにより行った。また、ＰＣＲ反応後の反応液は、アガロースゲル電気泳動に供することにより、増幅されたＤＮＡ断片の検出を行った。
この場合において、ＰＣＲ分析に供したタバコ個体に、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が保持された染色体が存在しているときは、約５００ｂｐ（Ｋｍ１−Ｋｍ２）、約２００ｂｐ（ＲＢＳ１−ＳＰＲ１ａ）及び約１００ｂｐ（ＳＰＬ１ａ−ｐＢＳＰｈ０２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる（図１３Ａ）。一方、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ由来の組換え酵素の働きにより、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が導入された染色体が消失しているときは、上記ＤＮＡ断片はいずれも増幅されない。そして、この染色体の消失が、ｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれて起こったときには、約９００ｂｐ（Ｈｍ１−Ｈｍ２）のＤＮＡ断片のみが増幅される（図１２及び図１３Ｂ）。
ＰＣＲ分析の結果、電気泳動に供した２４個体全てにおいて、約９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出された。また、約５００ｂｐ、約２００ｂｐ及び約１００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出されたのは２０個体であり、一方、これら３種類のＤＮＡ断片がいずれも増幅されなかったのは４個体（Ｎｏ．３０、３４、４２、５３）であった。そこで、この４個体を所定の染色体が消失した個体（以下、単に染色体消失個体とも記載する。）として選抜し、引続き、以下の実験を行った。
なお、図１４に、上記ＰＣＲ反応後のアガロースゲル電気泳動の結果の一部を示す。
Ｂ．染色体消失個体のフローサイトメトリー分析
Ａで選抜した染色体消失個体（Ｎｏ．３０、３４、４２、５３）の葉を約５ｍｍ角採取して、植物分析用ＤＮＡ試薬キット（Ｐａｒｔｅｃ社  ０６−５−４００４）のＡ液に浸漬し、この液中に浸漬した状態で、カミソリを用いてこれを細断した後、その５０μｌをＣｅｌｌＴｒｉｃｓフィルター（Ｐａｒｔｅｃ社  ０６−４−２３１７）にて濾過し、濾液を得た。染色体ＤＮＡ量のフローサイトメトリー分析は、この濾液に上記試薬キットのＢ液（Ｐａｃｔｅｃ社０６−５−４００４）３００μｌを加えたものを試料とし、プロイディアナライザーＰＡ型（Ｐａｒｔｅｃ社）を用いて行った。この場合において、染色体ＤＮＡ量は蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＦＬＩ）として検出され、染色体ＤＮＡ量が多いものほど、高い蛍光強度を示すこととなる。
フローサイトメトリー分析の結果を表１に示す。
【表１】
0004912890.tif 000002
表１より明らかなように、Ａで選抜した染色体消失個体（Ｎｏ．３０、３４、４２、５３）は、いずれもそのＤＮＡ含量が、野生種のタバコのＤＮＡ含量に比較して少なく、これらが染色体消失個体であることを示していた。
すなわち、本実施例においては、組換え酵素遺伝子導入用ベクター導入後の植物個体から、４個体÷６４葉片＝６．３×１０−２の確率で、容易に染色体消失個体を作出でき、しかも、その作出は容易であって、生殖細胞を経ることなく、ごく単純な構造のベクター、並びに、ごく一般的な遺伝子導入技術及び植物組織培養技術を使用するだけで可能であった。
【実施例２】Ｉ．組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の構築
実施例１−ＩＩで構築した１２８−３５Ｒｒｕｂｉｐｔから、ＲＳ及びこれに挟まれた領域を制限酵素ＳｓｅＩにより切出して、ｐＴＬ７（Ｈ．Ｅｂｉｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，２２：９５，２００２）の制限酵素ＳｓｅＩ部位に連結することで、組換え酵素遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを構築した（図１５：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（宛名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１７年５月１１日付にて国内寄託済み、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３３。２００５年１２月８日付にて国際寄託済み。）。このベクターを植物細胞に導入した場合、実施例１で構築した、認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮや組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔと同様に、図中、小さな黒三角形で示した、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢとＬＢとの間が、植物細胞中に導入されることとなる。
この組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを、上記認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に導入し、該細胞を培養して増殖させると、実施例１と同様に、倍加して生じた、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する互いに逆方向を向いた二つのＲＳをそれぞれ有する２本の染色体の間でＤＮＡの組換えが起こり、非対称的組換えが起こった場合には、このｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造、即ち、互いに逆方向を向いた二つのＲＳ、及び、この二つのＲＳに挟まれた領域に存在するｃｏｄＡ遺伝子等を有する染色体が消失した娘細胞が生じ、対称的組換えが起こった場合には、これらの構造を有する染色体が保持されたままとなる。従って、本実施例においても、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを導入した後、該細胞を５−ＦＣの存在下で培養すると、対称的組換えが起こった細胞は、その染色体に残存するｃｏｄＡ遺伝子の働きにより死滅し、非対称的組換えによって染色体が消失した細胞のみを選抜できることとなる。
なお、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔにおいて、これに配されているＲ遺伝子及びｉｐｔ遺伝子も、実施例１と同様に働く。すなわち、Ｒ遺伝子は、植物細胞の染色体に組込まれた場合、組換え酵素をある程度生産した後、自らが生産した組換え酵素の作用により、導入された染色体から、ｉｐｔ遺伝子と共に脱離して遊離し、その後消失する。ｉｐｔ遺伝子は、上記機構によりＲ遺伝子が染色体から脱離しなかった場合に、その細胞を排除するための負の選抜マーカー遺伝子として働く。
ＩＩ．アグロバクテリウムへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の導入
上記１にて作成した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを、実施例１のＩＩＩと同様にしてＡ．ツメファシエンス４４０４株に導入し、ＤＮＡ解析によりこれを確認して、この菌をＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）とした。
ＩＩＩ．認識配列導入タバコへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）の導入
上記ＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）を、実施例１のＶにおいて１コピーのｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの導入が確認された、認識配列導入タバコＣｏｄＮ−２３株に感染させることにより、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを認識配列導入タバコに導入した。感染処理は、実施例１のＩＶと同様にして行った。
感染処理後、３日間ＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）と共存培養した３２葉片を、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ及びカルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して１週間培養し、次いで、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及び５−ＦＣ  ０．２ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、２４個のカルスが得られ、この２４個のカルスを同組成の培地に移植して培養を続けることにより、１６個のカルスに由来する１６個の不定芽が得られた。これらの不定芽について、ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続けたところ、６個の発根個体を得ることができた。
ＩＶ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）及び組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＩＩＩにおいて得られた６個の発根個体について、染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）により抽出し、実施例１で用いたプライマーＫｍ１及びＫｍ２、プライマーＲＢＳ１及びＳＰＲ１ａ、プライマーＳＰＬ１ａ及びｐＢＳＰｈ０２、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔのライトボーダー側のＴ−ＤＮＡ上に結合する配列番号１５に示すプライマーＲＢＳ２（５’−ａａａｃｇａｃａａｔ  ｃｔｇａｔｃａｔｇａ  ｇｃｇｇａ−３’）及び配列番号１６に示すプライマーＬｚａ９（５’−ｇｇｃｔｃｇｔａｔｇ  ｔｔｇｔｇｔｇｇａａ  ｔｔｇｔ−３’）、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔのＲ遺伝子に結合する配列番号１７に示すプライマーＲａ（５’−ｃｃａａｇｇａｔａｃ  ｔｇａａａｔｔｔｃａ  ａｃａａｔ−３’）及び配列番号１８に示すプライマーＲｃ（５’−ｔｔａｔｔｔｇａａａ  ｇａｔａｔｇａａｇｃ  ｔｇｔｃａ−３’）、並びに、タバコゲノムＤＮＡ上のＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）遺伝子に結合する配列番号１９に示すプライマーＯＭＴ１（５’−ｔａａｇａｃｃｔａｔ  ａｔｃｃａｃｔｔｃａ  ａａａｃａ−３’）及び配列番号２０に示すプライマーＯＭＴ３（５’−ａｇｃｔａｇｃｃｃｔ  ｇｔｇｇｃｇｔｇｃｃ  ｔｔｃｃａ−３’）を用いて、実施例１と同様の条件でＰＣＲ分析を行った。
この場合において、ＰＣＲ分析に供したタバコ個体に、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が保持された染色体が存在しているときは、約５００ｂｐ（Ｋｍ１−Ｋｍ２）、約２００ｂｐ（ＲＢＳ１−ＳＰＲ１ａ）及び約１００ｂｐ（ＳＰＬ１ａ−ｐＢＳＰｈ０２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる（図１３Ａ）。一方、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ由来の組換え酵素の働きにより、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が導入された染色体が消失しているときは、上記ＤＮＡ断片はいずれも増幅されない。
そして、この染色体の消失が、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれることなく起こったときには、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）のＤＮＡ断片のみが増幅される（図１６Ａ）。また、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれて起こったときには、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）及び約４００ｂｐ（ＲＢＳ２−Ｌｚａ９）、又は、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）、約４００ｂｐ（ＲＢＳ２−Ｌｚａ９）及び約１．０ｋｂ（Ｒａ−Ｒｃ）のＤＮＡ断片が増幅される。つまり、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）及び約４００ｂｐ（ＲＢＳ２−Ｌｚａ９）のＤＮＡ断片が増幅されたときは、いったん染色体に組込まれたｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔに由来する構造が、その後、組換え酵素の作用により脱離したことを示し（図１６Ｃ）、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）、約４００ｂｐ（ＲＢＳ２−Ｌｚａ９）及び約１．０ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたときは、染色体に組込まれたｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔに由来する構造が、その後も脱離せず染色体に保持され続けていることを示している（図１６Ｂ）。
ＰＣＲ分析の結果、電気泳動に供した６個体全てにおいて、約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出される一方、約５００ｂｐ、約２００ｂｐ、約１００ｂｐ及び約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅は、いずれも検出されなかった。また、約４００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出されたのは、この６個体中４個体（Ｎｏ．１、２、４、７、）であり、残り２個体（Ｎｏ．８、１２）では、このＤＮＡ断片の増幅は検出されなかった。
以上の結果より、これら６個体はすべて染色体消失個体であって、うち２個体（Ｎｏ．８、１２）は、その染色体の消失が、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれることなく起こった個体、即ち、前記ＩＩＩにおいてｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを導入した際、これに配されているＲ遺伝子も染色体に組込まれることなく、遊離型のままで発現し、その結果、染色体の消失が起こった細胞を起源とする個体であり、他の４個体（Ｎｏ．１、２、４、７、）は、染色体の消失が、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれて起こった個体、即ち、前記１１１においてｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔを導入した際、これに配されているＲ遺伝子も染色体に組込まれて発現し、その結果、染色体の消失が起こった細胞を起源とする個体であることが示唆された。また、染色体の消失が、ｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれることにより起こった４個体では、いずれも、このｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔが染色体に組込まれた後、Ｒ遺伝子の発現により生産された組換え酵素の作用により、Ｒ遺伝子を始めとするｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔに由来する構造が脱離したものと考えられる。
なお、図１７に、上記ＰＣＲ反応後のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
Ｂ．染色体消失個体のフローサイトメトリー分析
Ａにおいて、染色体消失個体であることが確認された上記６個体（Ｎｏ．１、２、４、７、８、１２）につき、実施例１のＶＩ−Ｂと同様にして、フローサイトメトリー分析を行った。
結果を表２に示す。
【表２】
0004912890.tif 000003
表２より明らかなように、Ａにおいて染色体消失個体であることが確認された６個体（Ｎｏ．１、２、４、７、８、１２）は、いずれもそのＤＮＡ含量が、野生種のタバコのＤＮＡ含量に比較して少なく、これらが染色体消失個体であることを示していた。
すなわち、本実施例においては、組換え酵素遺伝子導入用ベクター導入後の植物個体から、６個体÷３２葉片＝１．９×１０−１の確率で、染色体消失個体を作出でき、しかも、組換え酵素遺伝子導入用ベクターの導入にあたって、導入処理後の組織を５−ＦＣの存在下で培養することにより、染色体消失個体のみを発根個体として得ることができた。また、作出された染色体消失個体６個体のうちの２個体（３３％）は、その染色体の消失が、組換え酵素遺伝子が染色体に組込まれることなく起こった個体であって、その細胞中に、認識配列導入用ベクターの痕跡はもちろん、組換え酵素遺伝子導入用ベクターの痕跡も残らない個体、つまり、遺伝子操作の痕跡が全く残らない個体であった。
そして、これら染色体消失個体の作出は容易であって、生殖細胞を経ることなく、ごく単純な構造のベクター、並びに、ごく一般的な遺伝子導入技術及び植物組織培養技術を使用するだけで可能であった。
【実施例３】Ｉ．組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７３５Ｒ）の構築
３５Ｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結したＲ構造遺伝子をｐＴＬ７の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に連結することで、組換え酵素遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＴＬ７３５Ｒを構築し（図１８Ａ）、これを２００５年１２月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（宛名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）宛に国際寄託に付した（寄託受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４７２）。このベクターを植物細胞に導入した場合も、実施例１で構築した、認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮや組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ、実施例２で構築した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔと同様に、図中、小さな黒三角形で示した、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢとＬＢとの間が、植物細胞中に導入されることとなる。
この組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒを、上記認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に導入し、該細胞を培養して増殖させると、実施例１及び実施例２と同様に、倍加して生じた、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する互いに逆方向を向いた二つのＲＳをそれぞれ有する２本の染色体の間でＤＮＡの組換えが起こり、非対称的組換えが起こった場合には、このｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造、即ち、互いに逆方向を向いた二つのＲＳ、及び、この二つのＲＳに挟まれた領域に存在するｃｏｄＡ遺伝子等を有する染色体が消失した娘細胞が生じ、対称的組換えが起こった場合には、これらの構造を有する染色体が保持されたままとなる。従って、本実施例においても、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に、ｐＴＬ７３５Ｒを導入した後、該細胞を５−ＦＣの存在下で培養すると、対称的組換えが起こった細胞は、その染色体に残存するｃｏｄＡ遺伝子の働きにより死滅し、非対称的組換えによって染色体が消失した細胞のみを選抜できることとなる。
なお、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒに配されているＲ遺伝子は、植物細胞に導入された後、該細胞の染色体に組込まれるか否かに関わらず発現するが、染色体に組込まれないまま発現した場合には、その細胞において、組換え酵素が一過的に作用して、上記機構により染色体が消失し、しかも、認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの痕跡はもちろん、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒの痕跡も残らない細胞を得ることができるので、本実施例では、かかる遊離型Ｒ遺伝子の働きを利用する。
ＩＩ．アグロバクテリウムへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７３５Ｒ）の導入
上記Ｉにて作成した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒを、実施例１のＩＩＩと同様にしてＡ．ツメファシエンス４４０４株に導入し、ＤＮＡ解析によりこれを確認して、この菌をＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７３５Ｒ）とした。
ＩＩＩ．認識配列導入タバコへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７３５Ｒ）の導入
上記ＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７３５Ｒ）を、実施例１のＶにおいて１コピーのｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの導入が確認された、認識配列導入タバコＣｏｄＮ−２３株に感染させることにより、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒを認識配列導入タバコに導入した。感染処理は、実施例１のＩＶと同様にして行った。
感染処理後、３日間ＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７３５Ｒ）と共存培養した３２葉片を、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ及びカルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して１週間培養し、次いで、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及び５−ＦＣ  ０．２ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、１９個のカルスが得られ、この１９個のカルスを同組成の培地に移植して培養を続けることにより、１４個のカルスに由来する１４個の不定芽が得られた。これらの不定芽について、ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続けたところ、１４個の発根個体を得ることができた。
ＩＶ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）及び組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７３５Ｒ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＩＩＩにおいて得られた１４個の発根個体について、染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）により抽出し、実施例１及び実施例２で用いたプライマーＫｍ１及びＫｍ２、プライマーＲＢＳ１及びＳＰＲ１ａ、並びに、プライマーＳＰＬ１ａ及びｐＢＳＰｈ０２、実施例２で用いたプライマーＲａ及びＲｃ、並びに、プライマーＯＭＴ１及びＯＭＴ３を用いて、実施例１と同様の条件でＰＣＲ分析を行った。
この場合において、ＰＣＲ分析に供したタバコ個体に、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が保持された染色体が存在しているときは、約５００ｂｐ（Ｋｍ１−Ｋｍ２）、約２００ｂｐ（ＲＢＳ１−ＳＰＲ１ａ）及び約１００ｂｐ（ＳＰＬ１ａ−ｐＢＳＰｈ０２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる（図１３Ａ）。一方、ｐＴＬ７３５Ｒ由来の組換え酵素の働きにより、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が導入された染色体が消失しているときは、上記ＤＮＡ断片はいずれも増幅されない。
そして、この染色体の消失が、ｐＴＬ７３５Ｒが染色体に組込まれることなく起こったときには、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）のＤＮＡ断片のみが増幅される（図１６Ａ）。また、ｐＴＬ７３５Ｒが染色体に組込まれて起こったときには、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）及び約１．０ｋｂ（Ｒａ−Ｒｃ）のＤＮＡ断片が増幅される（図１９Ａ）。
ＰＣＲ分析の結果、電気泳動に供した１４個体（Ｒ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５）全てにおいて、約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出された。また、そのうち１１個体（Ｒ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１５）においては、約５００ｂｐ、約２００ｂｐ及び約１００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出されず、更に、これら１１個体のうち、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が検出されたのは６個体（Ｒ−３、５、７、９、１１、１５）、検出されなかったのは５個体（Ｒ−１、２、４、６、１０）であった。
従って、本実施例においては、１１個体の染色体消失個体が得られ、うち５個体（Ｒ−１、２、４、６、１０）は、その染色体の消失が、ｐＴＬ７３５Ｒが染色体に組込まれることなく起こった個体、即ち、前記ＩＩＩにおいてｐＴＬ７３５Ｒを導入した際、これに配されているＲ遺伝子も染色体に組込まれることなく、遊離型のままで発現し、その結果、染色体の消失が起こった細胞を起源とする個体であると考えられる。
なお、図２０に、上記ＰＣＲ反応後のアガロースゲル電気泳動の結果の一部を示す。
Ｂ．染色体消失個体のフローサイトメトリー分析
Ａにおいて、染色体消失個体であることが確認された１１個体のうち、ｐＴＬ７３５Ｒが染色体に組込まれることなく染色体の消失が起こった上記５個体（Ｒ−１、２、４、６、１０）につき、実施例１のＶＩ−Ｂと同様にして、フローサイトメトリー分析を行った。
結果を表３に示す。
【表３】
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表３より明らかなように、上記５個体（Ｒ−１、２、４、６、１０）は、いずれもそのＤＮＡ含量が、野生種のタバコのＤＮＡ含量に比較して少なく、これらが染色体消失個体であることを示していた。
すなわち、本実施例においては、組換え酵素遺伝子導入用ベクター導入後の植物個体から、５個体÷３２葉片＝１．６×１０−１の確率で、組換え酵素遺伝子がその染色体に組込まれることなく染色体の消失が起こり、細胞中に、認識配列導入用ベクターの痕跡はもちろん、組換え酵素遺伝子導入用ベクターの痕跡も残らない個体、つまり、遺伝子操作の痕跡が全く残らない個体を得ることができた。
そして、これら染色体消失個体の作出は容易であって、生殖細胞を経ることなく、ごく単純な構造のベクター、並びに、ごく一般的な遺伝子導入技術及び植物組織培養技術を使用するだけで可能であった。
【実施例４】Ｉ．組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の構築
Ｒｕｂ−Ｐを連結したｉｐｔ遺伝子を、実施例３−Ｉで構築したｐＴＬ７３５Ｒの制限酵素ＫｐｎＩ部位に連結することで、組換え酵素遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを構築し（図１８Ｂ）、これを２００５年１２月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（宛名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）宛に国際寄託に付した（寄託受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４７３）。このベクターを植物細胞に導入した場合も、実施例１で構築した、認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮや組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＳｈｙｇＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ、実施例２で構築した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ＭＲＳ３５ＲＲｕｂｉｐｔ、実施例３で構築した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒと同様に、図中、小さな黒三角形で示した、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢとＬＢとの間が、植物細胞中に導入されることとなる。
この組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを、上記認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に導入し、該細胞を培養して増殖させると、実施例１、実施例２及び実施例３と同様に、倍加して生じた、ｐＴＳｓｐＳＲＳｃｏｄＮに由来する互いに逆方向を向いた二つのＲＳをそれぞれ有する２本の染色体の間でＤＮＡの組換えが起こり、非対称的組換えが起こった場合には、このｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造、即ち、互いに逆方向を向いた二つのＲＳ、及び、この二つのＲＳに挟まれた領域に存在するｃｏｄＡ遺伝子等を有する染色体が消失した娘細胞が生じ、対称的組換えが起こった場合には、これらの構造を有する染色体が保持されたままとなる。従って、本実施例においても、ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮを導入した植物細胞に、ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを導入した後、該細胞を５−ＦＣの存在下で培養すると、対称的組換えが起こった細胞は、その染色体に残存するｃｏｄＡ遺伝子の働きにより死滅し、非対称的組換えによって染色体が消失した細胞のみを選抜できることとなる。
なお、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３６Ｒに配されているＲ遺伝子は、実施例３において構築した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７３５Ｒに配されているＲ遺伝子と同様に、植物細胞に導入された後、該細胞の染色体に組込まれるか否かに関わらず発現し、染色体に組込まれないまま発現した場合には、その細胞において、組換え酵素が一過的に作用して、上記機構により染色体が消失し、しかも、認識配列導入用ベクターｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの痕跡はもちろん、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒの痕跡も残らない細胞を得ることができる。
一方、本実施例において構築した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒには、Ｒ遺伝子と共に負の選抜マーカー遺伝子としてｉｐｔ遺伝子も配されているので、このｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを植物細胞に導入することにより、これに配されているＲ遺伝子が該細胞の染色体に組込まれたとしても、ｉｐｔ遺伝子もまた、この染色体に組込まれて発現し、この染色体を有する細胞の正常な増殖や分化は妨げられる。従って、かかる細胞が排除され、組換え酵素が一過的に作用した細胞を確実に取得できるようになる。
ＩＩ．アグロバクテリウムへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の導入
上記Ｉにて作成した組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを、実施例１のＩＩＩと同様にしてＡ．ツメファシエンス４４０４株に導入し、ＤＮＡ解析によりこれを確認して、この菌をＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）とした。
ＩＩＩ．認識配列導入タバコへの組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の導入
上記ＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）を、実施例１のＶにおいて１コピーのｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮの導入が確認された、認識配列導入タバコＣｏｄＮ−２３株に感染させることにより、組換え酵素遺伝子導入用ベクターｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを認識配列導入タバコに導入した。感染処理は、実施例１のＩＶと同様にして行った。
感染処理後、３日間ＬＢＡ４４０４（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）と共存培養した３２葉片を、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ及びカルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して１週間培養し、次いで、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及び５−ＦＣ  ０．２ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、５３個のカルスが得られ、この５３個のカルスを同組成の培地に移植して培養を続けることにより、５個のカルスに由来する５個の不定芽が得られた。これらの不定芽について、ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続けたところ、５個の発根個体を得ることができた。
ＩＶ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮ）及び組換え酵素遺伝子導入用ベクター（ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＩＩＩにおいて得られた５個の発根個体について、実施例３と同様に、染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）により抽出し、実施例１及び実施例２で用いたプライマーＫｍ１及びＫｍ２、プライマーＲＢＳ１及びＳＰＲ１ａ、並びに、プライマーＳＰＬ１ａ及びｐＢＳＰｈ０２、実施例２で用いたプライマーＲａ及びＲｃ、並びに、プライマーＯＭＴ１及びＯＭＴ３を用いて、実施例１と同様の条件でＰＣＲ分析を行った。
従って、この場合においても、ＰＣＲ分析に供したタバコ個体に、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が保持された染色体が存在しているときは、約５００ｂｐ（Ｋｍ１−Ｋｍ２）、約２００ｂｐ（ＲＢＳ１−ＳＰＲ１ａ）及び約１００ｂｐ（ＳＰＬ１ａ−ｐＢＳＰｈ０２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる（図１３Ａ）。一方、ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ由来の組換え酵素の働きにより、ＰＴＳｓｐｓＲＳｃｏｄＮに由来する構造が導入された染色体が消失しているときは、上記ＤＮＡ断片はいずれも増幅されない。
そして、この染色体の消失が、ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒが染色体に組込まれることなく起こったときには、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）のＤＮＡ断片のみが増幅される（図１６Ａ）。また、ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒが染色体に組込まれて起こったときには、約８００ｂｐ（ＯＭＴ１−ＯＭＴ３）及び約１．０ｋｂ（Ｒａ−Ｒｃ）のＤＮＡ断片が増幅される（図１９Ｂ）。
ＰＣＲ分析の結果、電気泳動に供した５個体（Ｉ−２、４、８、１０、１１）全てにおいて、約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出される一方、約５００ｂｐ、約２００ｂｐ、約１００ｂｐ及び約１．０ｋｂのＤＮＡ断片の増幅はいずれも検出されなかった。
従って、本実施例においては５個体（Ｉ−２、４、８、１０、１１）の染色体消失個体が得られ、そのいずれもが、ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒが染色体に組込まれることなく、染色体の消失が起こった個体、即ち、前記ＩＩＩにおいてｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを導入した際、これに配されているＲ遺伝子も染色体に組込まれることなく、遊離型のままで発現し、その結果、染色体の消失が起こった細胞を起源とする個体であると考えられる。
なお、図２０に、上記ＰＣＲ反応後のアガロースゲル電気泳動の結果の一部を示す。
Ｂ．染色体消失個体のフローサイトメトリー分析
Ａにおいて、ｐＴＬ７ｒｕｂｉｐｔ３５Ｒが染色体に組込まれることなく染色体の消失が起こったことが確認された上記５個体（Ｉ−２、４、８、１０、１１）につき、実施例１のＶＩ−Ｂと同様にして、フローサイトメトリー分析を行った。
結果を表３に示す。
表３より明らかなように、上記５個体（Ｉ−２、４、８、１０、１１）は、いずれもそのＤＮＡ含量が、野生種のタバコのＤＮＡ含量に比較して少なく、これらが染色体消失個体であることを示していた。
すなわち、本実施例においては、組換え酵素遺伝子導入用ベクター導入後の植物個体から、５個体÷３２葉片＝１．６×１０−１の確率で染色体消失個体が得られた。しかも、本実施例においては、組換え酵素遺伝子と共にこのベクターに配した負の選抜マーカー遺伝子（ｉｐｔ遺伝子）の働きにより、組換え酵素遺伝子が染色体に組込まれた細胞については、発根個体への再分化が妨げられたため、このとき得られた染色体消失個体のいずれもが、組換え酵素遺伝子がその染色体に組込まれることなく染色体の消失が起こり、細胞中に、認識配列導入用ベクターの痕跡はもちろん、組換え酵素遺伝子導入用ベクターの痕跡も残らない個体、つまり、遺伝子操作の痕跡が全く残らない個体であった。
そして、これら染色体消失個体の作出は容易であって、生殖細胞を経ることなく、ごく単純な構造のベクター、並びに、ごく一般的な遺伝子導入技術及び植物組織培養技術を使用するだけで可能であった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００４年１２月８日出願の日本特許出願（特願２００４−３８２３９４）及び２００５年５月１８日出願の日本特許出願（特願２００５−１７４２２５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。すべての引用される参照は内容として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、生物種を問わず適用することができ、しかも、消失させる染色体以外の染色体に予期せぬ傷害を与えることのない、容易な異数体作出方法を提供される。
【配列表フリーテキスト】配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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