(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）SEQ ID No. 35に示されるヌクレオチド配列；または
（ｂ）SEQ ID No. 35の相補物であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）SEQ ID No. 35の縮重物であるヌクレオチド配列；または
（ｄ）SEQ ID No. 35と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を有し、当該配列が、ナイスタチンＰＫＳ系をコードするヌクレオチド配列またはそれらをコードする配列と相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子。
【請求項２】
SEQ ID No. 35と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、当該配列が、ナイスタチンＰＫＳ系をコードする配列またはそれらをコードする配列と相補的であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
SEQ ID No. 35と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、当該配列が、ナイスタチンＰＫＳ系をコードする配列またはそれらをコードする配列と相補的であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかで定義された核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかで定義された核酸分子を宿主細胞内に導入し発現させることを含むナイスタチンまたはナイスタチン誘導体を産生する方法。
【請求項６】
修飾ナイスタチンＰＫＳ系の調製、またはナイスタチン誘導体の調製における請求項１〜３のいずれかで定義された核酸分子の使用。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかで定義される核酸分子を修飾することを含み；当該修飾核酸分子が、ナイスタチンＰＫＳの自然産物以外のポリケチドを製造する修飾ＰＫＳ系をコードする、修飾ＰＫＳ系または修飾ポリケチド分子の調製方法。
【請求項８】
前記核酸分子が、該核酸分子にコードされる活性をコードするヌクレオチド配列を導入、突然変異、欠失、置換または不活性化することによって修飾される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかで定義される核酸分子が、
（ｉ）Nys Cのモジュール５内のＥＲドメイン（SEQ ID No. 7のアミノ酸4953-5239）が不活性化される；または
（ｉｉ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子であるnysL（SEQ ID No. 40）もしくはnysN（SEQ ID No: 42）が不活性化される
ように修飾される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
Nys Cのモジュール５内の前記ＥＲドメイン（SEQ ID No. 7のアミノ酸4953-5239）が不活性化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ナイスタチン誘導体を産生するために使用され、宿主細胞内で前記修飾核酸分子を発現することを含む請求項７〜１０のいずれかに記載の方法であって、
該修飾が、請求項７〜１０のいずれかに記載されている方法。
【請求項１２】
前記核酸分子が発現されるような条件のもとで前記宿主細胞を成長させること、および、該核酸分子の発現産物（類）がナイスタチンまたはナイスタチン誘導体を合成するようにさせることを含む請求項５または１１に記載の方法。
【請求項１３】
修飾ポリケチドシンターゼ酵素または酵素系をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれかで定義される核酸分子を足場として使用し、酵素活性または他の機能性活性をコードする核酸分子の一以上の部分を修飾すること
を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記部分が、該部分を導入、突然変異、欠失、置換または不活性化することによって修飾される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
修飾ナイスタチンＰＫＳをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の調製方法であって、前記修飾ナイスタチンＰＫＳが請求項１〜３で定義される核酸分子によりコードされたナイスタチンＰＫＳから誘導されるものであり、当該核酸分子が酵素活性または他の機能性活性をコードする第１領域と、足場となるアミノ酸配列をコードする第２領域とを有し、該方法は、
(a) 前記少なくとも一つの第１領域を修飾すること；あるいは
(b) 該ナイスタチンＰＫＳから一以上のモジュールを欠失または不活性化すること；あるいは
(c) 該ナイスタチンＰＫＳに一以上のモジュールを挿入すること
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれかで定義される核酸分子が、
（ｉ）Nys Cのモジュール５内のＥＲドメイン（SEQ ID No. 7のアミノ酸4953-5239）が不活性化される；または
（ｉｉ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子であるnysL（SEQ ID No. 40）もしくはnysN（SEQ ID No: 42）が不活性化される
ように修飾される、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項１７】
Nys Cのモジュール５内の前記ＥＲドメイン（SEQ ID No. 7のアミノ酸4953-5239）が不活性化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかで定義されたように調製された核酸分子を、修飾ナイスタチンＰＫＳが発現するような条件下で宿主細胞内に発現させることを含む、請求項１５〜１７のいずれかで定義された修飾ナイスタチンＰＫＳの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マクロライド抗生物質ナイスタチン（nystatin）の生合成に関与する、モジュール型ポリケチドシンターゼ酵素をコードする遺伝子クラスターのクローニングおよびシーケンシングに関する。従って、本発明は、ナイスタチン生合成に関与する機能的活性を示すタンパク質／ポリペプチドをコードする新規な遺伝子および核酸分子、このような機能的タンパク質／ポリペプチドそのもの、さらにナイスタチン生合成の促進およびナイスタチン誘導体の合成促進の双方におけるそれらの使用、および新規なポリケチドまたはマクロライド構造物に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
ポリケチド(polyketide)は微生物により合成される天然産物であり、その多くは医薬として、または農業用もしくは獣医学用の製剤として利用される可能性がある。医学的治療に使用されるポリケチドの例としては、抗生物質エリスロマイシン（抗細菌剤）、ナイスタチン（抗真菌剤）、アベルメクチン(avermectin)（抗寄生虫剤）ラパマイシン(rapamycin)（免疫抑制剤）およびダウノルビシン（抗腫瘍剤）が挙げられる。グラム陽性菌ストレストマイセス属はポリケチドの主要な生産菌であり、これらの微生物におけるポリケチド生合成の遺伝学および生化学は、かなりよく特性決定されている (Hopwood ら, Chem. Rev. v. 97: 2465-2497 (1997))。マクロライドポリケチド化合物は、モジュール型（Ｉ型）のポリケチドシンターゼ（PKS）によって単純カルボン酸を繰り返し縮合させることにより、脂肪酸の生合成と同様の様式で形成される。Donadio ら, Science, v. 252: 675-679 (1991) により提案されたモジュール仮説は、Ｉ型 PKS が反復単位（モジュール）で組織され、その各々はポリケチド鎖合成における１つの縮合サイクルを担当していることを示唆した。このことは、マクロライドの化学構造において予測可能な変更をもたらすＩ型 PKS 遺伝子操作によって正しいことが証明された。伸長するポリケチド鎖上への次のカルボン酸の縮合（β-ケトアシルシンターゼ（KS）ドメインの触媒活性が請合う）に加えて、Ｉ型 PKS のモジュールは、β-ケトレダクターゼ（KR）活性、デヒドラターゼ（DH）活性およびエノイルレダクターゼ（ER）活性を有するドメインを含有することができ、これらが挿入された伸長単位の還元状態を規定する。各モジュールに存在するアシルトランスフェラーゼ（AT）およびアシルキャリアタンパク質（ACP）ドメインは、それぞれ、伸長単位の選択およびPKS 上での伸長ポリケチド鎖の保持のために関係する。合成が完了すると、ポリケチド鎖はチオエステラーゼ（TE）の作用を通じてPKS から放出され、これは最終生成物の環化にも関係している。従ってＩ型 PKS は、ポリケチド生合成の組立ラインであり、これはモジュールの数、カルボン酸に対するその特異性を変更することにより、あるいは還元的活性でドメインを不活性化するかまたは挿入することにより、操作することができる (Katz, Chem. Rev., v. 97, 2557-2575, 1997)。マクロライドのポリケチド部分が合成され、環化されてマクロラクトン環が形成された後に、このものは、通常ヒドロキシル化、グリコシル化、メチル化および／またはアシル化によって修飾される。これらの修飾は、マクロライドの生物的活性にとって決定的に重要であると信じられている。
【０００３】
ストレプトマイセス属において、マクロライド系抗生物質を生合成するための遺伝子は1以上のクラスターに組織化され、そのような多数のクラスターが既に同定されている。
組換え DNA 技術の開発のおかげで、 PKSをコードする DNA プローブを用いて遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより、抗生物質生合成用の完全な遺伝子クラスターを単離することが可能となった (Schwecke ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 92: 7839-7843, 1995)。分子クローニングおよび完全 DNA シーケンシングが、ストレストマイセス属のマクロライド系抗生物質の遺伝子クラスター（アベルメクチン、ピクロマイシンおよびラパマイシンのためのものを含む）について、幾つか記載されている (Ikeda ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 96: 9509-9514 1999; Xue ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 95: 1211-12116, 1998; Schwecke ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 92: 7839-7843, 1995)。ポリエンマクロライド系抗生物質、ピマリシン (pimaricin) のための遺伝子クラスターの部分的なクローニングおよび DNA シーケンシングが、最近報告された (Aparicio ら, J. Biol. Chem., v. 274: 10133-10139, 1999)。しかしながら、抗真菌剤活性を有するポリエンマクロライド系抗生物質の生合成のための遺伝子についての完全な DNA 配列は、まだ開示されていない。利用可能な抗真菌剤抗生物質のレパートリーを増大させること、および／または現存する薬剤の諸特性（例えば効力、毒性など）を改善することの必要性および要求が存在する。それ故に、新規な抗真菌剤治療法、特に新規な特性または改善された特性を示す処置法を提供することは、当技術分野における著しい進歩を表すであろう。
【０００４】
本発明はこの目的に志向しており、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび DNA シーケンシングに基づいている。これは、そのような抗真菌性抗生物質生合成の遺伝子を同定する最初の例を提供し、ならびにナイスタチンの諸特性および／または産生微生物を変更するための、または有用である可能性を有する新規化合物を獲得するための遺伝子操作のツールを提供する。
【０００５】
ポリエン抗真菌性抗生物質、ナイスタチン A1（その完全な立体構造（図１参照）は Lancelin & Beau, Tetrahedron Lett, v. 30: 4521-4524, (1989) により決定されている）は、ストレプトマイセス・ヌールセイ (Streptomyces noursei) ATCC11455 によって産生される。マクロライド化合物のクラスに属するナイスタチン分子の構造から、本発明者らは、そのポリケチド主鎖がＩ型 PKS 酵素により合成されると予想した。この仮定に基づいて、また下記の実施例に記載するように、特別に設計されたプローブ（これは、既知モジュール型 PKS 酵素の既知β-ケトアシルシンターゼ（KS）およびアシルキャリアタンパク質（ACP）ドメイン内における保存的なアミノ酸配列に基づくプライマーを用いた PCR で得られる）を使用して、ストレプトマイセス・ヌールセイ ATCC11455 のゲノムライブラリーをスクリーニングした。このことは多数のクローンおよび断片の同定に導いた。これらを本発明者らは配列決定し、これらがナイスタチン PKS 遺伝子クラスターの部分または一部を含有することを示した。本発明者らはさらに、コードされた産物を不活性化する断片配列の変更がナイスタチン生合成の廃止に導くことを示し（下記の実施例１参照）、これによってナイスタチン生合成のための同定された PKS の要件を確認した。クローン／フラグメントに関する後続の研究は、PKS 遺伝子クラスターのシーケンシング、およびその中の異なるモジュールおよび酵素ドメイン、調節領域などの同定に導いた。
【０００６】
さらにより詳細は以下に記載するとして、本発明者らが同定した新規ナイスタチン PKS 遺伝子クラスター内の機能的 DNA 配列を操作することが、新規な分子構造物、例えば改善された機能を有するナイスタチン誘導体の合成を導いたことを本発明者らは示した。このことにより有益な新規ナイスタチン誘導体を得るためだけでなく、生合成産生過程を改善して促進するため（例えば収率または産生条件を改善するか、または利用可能なホスト細胞の範囲を拡大するため）、あるいは新規な活性および／または諸特性を有する新規化合物を提供するためにも、ナイスタチン A1 PKS 遺伝子クラスターを操作する刺激的な可能性が開かれる。
【０００７】
より具体的には、ナイスタチン PKS 遺伝子クラスターの２つの主要領域（または "部分" または "一部"）を最初に同定して配列決定した。これらは併せて、ナイスタチン PKS 遺伝子クラスターの約８０％を表していた。また、これらの領域内の機能性配列（例えば PKS 遺伝子、調節領域など、ならびに機能する遺伝子産物、酵素ドメインなども）を同定して特性決定した。
【０００８】
第一領域（"領域１"）（これを "Nys 1" と名付け、その完全 DNA 配列を配列番号１の配列に示す）は、多数の PKS または関連遺伝子または調節領域を含むことが示され、１３の別個の "特徴" またはオープンリーディングフレーム（ORF）が同定された。その翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号（SEQ ID No.）３〜１５に示す。
第二領域（"領域２"）（これを "Nys 2" と名付け、その完全 DNA 配列を配列番号２に示す）もまた、多数の "機能的" 領域を含んでおり、５つの別個の "特徴" または ORF が同定された（その翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１６〜２０に示す）。
【０００９】
Nys 1 および Nys 2（すなわち配列番号１および２、およびこれらがコードする配列）は、2000 年２月８日出願の英国特許出願第 0002840.7 号の対象である。
引続き配列決定に努めた結果、配列番号１および２の間隙（gap）にまたがる DNA 配列の決定、およびこの領域中にある新規な遺伝子の同定に至った。加えて、配列番号１および２に含まれており、遺伝子産物 NysI（配列番号２０）および NysDII（配列番号３）をコードする部分的遺伝子配列（さらには下記参照）を完成した（それぞれ新しい配列番号３６および３７を参照 − さらには下記参照）。従ってこれらを配列決定する努力をした結果、ナイスタチン PKS 遺伝子クラスター全体を含む DNA 領域の同定および配列決定、およびこの領域内にある機能的配列の同定および特性決定に至った。
【００１０】
ナイスタチン生合成遺伝子クラスターについての完全なコーディング配列（すなわち、このクラスターをコードする完全ヌクレオチド配列）を、配列番号３５に示す。この配列は、多数の PKS または関連遺伝子または調節領域を含むことが示され、２３の別個の "特徴" または ORF が同定された（その翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２〜１９および３６〜４２に示す）。
【００１１】
配列番号３５に示した、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターについての完全なコーディング配列（すなわち、このクラスターをコードする完全ヌクレオチド配列）は、2000 年４月１０日出願の英国特許出願第 0008786.6 号および2000 年４月１４日出願の英国特許出願第 0009387.2 号の対象である。
従って、一つの態様において、本発明は、 (a) 配列番号３５に示すヌクレオチド配列；または (b) 配列番号３５の相補物であるヌクレオチド配列；または (c) 配列番号３５による縮退物であるヌクレオチド配列；または (d) 配列番号３５に、配列番号３５の相補物に、または配列番号３５から誘導したハイブリダイゼーションプローブまたはその相補物に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または (e) 配列番号３５と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；または (f) 配列番号３５と少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列（この配列は、ナイスタチン PKS 酵素をコードする配列またはその部分をコードするか、またはその配列と相補性であることが好ましい）
を含む核酸分子を提供する。
【００１２】
"ナイスタチン PKS 酵素" は以下で詳しく定義するが、上記 (f) 部の文脈で簡単に言えば、マクロライド系抗生物質またはポリケチド部分、好ましくはナイスタチンまたはナイスタチン誘導体またはナイスタチン関連分子の合成、輸送または転移において機能的である酵素またはタンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００１３】
もう一つの態様において、本発明はまた、 (a) 配列番号１および／または配列番号２に示すヌクレオチド配列；または (b) 配列番号１および／または配列番号２の相補物であるヌクレオチド配列；または (c) 配列番号１および／または配列番号２による縮重物であるヌクレオチド配列；または (d) 配列番号１および／または配列番号２に、配列番号１および／または配列番号２の相補物に、または配列番号１および／または配列番号２から誘導されたハイブリダイゼーションプローブまたはその相補物に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または (e) 配列番号１および／または配列番号２と少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列（この配列は、ナイスタチン PKS 酵素またはその部分をコードする配列をコードするか、またはその配列と相補性であることが好ましい）
を含む核酸分子を提供する。
【００１４】
本発明の核酸分子は、単離された核酸分子（換言すれば、天然に通常一緒に存在する諸成分から単離されまたは分離されたもの）であってもよく、または組換えまたは合成核酸分子であってもよい。
本発明の核酸分子は、ナイスタチン A1 PKS 酵素ををコードするか、あるいはその一部、例えば単一ドメインをコードする配列をコードするか（またはコードするヌクレオチド配列を含むか）、あるいは機能的または非機能的な遺伝子要素であるナイスタチン A1 PKS 遺伝子クラスター中のヌクレオチド配列を含む。より正確には、本発明の核酸分子は、１個またはそれ以上のポリペプチドをコードするか、またはマクロライド抗生物質またはポリケチド部分、好ましくはナイスタチンまたはナイスタチン誘導体またはナイスタチン関連分子の合成において機能性活性を有する１個またはそれ以上の遺伝子要素を含む。このような機能性活性は、酵素活性、例えばポリケチド部分またはマクロライド分子の合成または輸送または転移に関係する活性であってもよく（これは、マクロライド鎖または環の合成、またはそれに寄与するいずれの段階、またはマクロライド環またはポリケチド鎖の修飾などでありうる）、および／または調節活性、例えば合成に関係する遺伝子またはタンパク質の発現の調節、または合成過程の調節であってもよく、および／または "トランスポーター活性" であってもよい。従って、一般的には、ポリケチドまたはマクロライドの諸々の部分の転移または輸送に、例えば細胞内へ、または細胞から合成された分子の搬入または流出に関連する輸送タンパク質が含まれる。同様に、これに関しては、グリコシル化タンパク質類が含まれ、これらのタンパク質にはサッカライド（例えばマイコサミン(mycosamine)）の生合成および／またはマクロライドまたはポリケチドへのその付着に関係する分子が含まれる。
【００１５】
本発明によれば、所望の産物をコードするヌクレオチド配列が好ましいが、プロモーター、プロモーター-オペレーター領域、エンハンサー、他の調節配列などのような機能性遺伝子要素を含むヌクレオチド配列も包含される。従って、本発明の核酸分子は、全 PKS 遺伝子クラスターを含む必要はないが、それの一部もしくはその部分、例えば特定の機能または調節配列を有するポリペプチドをコードする部分を含んでいてもよい。このことは、１個またはそれ以上の遺伝子、および／または１個またはそれ以上の調節配列、および／または１個またはそれ以上のモジュールまたは酵素ドメイン、または非コードの、またはコード機能性の遺伝子要素（例えば遺伝子の発現、転写、翻訳などを制御する要素）を含んでいてもよいことである。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、配列番号３５の上記ヌクレオチド配列（または上記 (b)〜(f) で規定したような、その変異体（variant））が ORF 1 を含む分子の諸々の部分を含有しないことを特徴とする、上記で定義した核酸分子を提供する（以下の表１参照）。換言すれば、この態様において、配列番号３５のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド 124026〜125222 を含まない。
【００１７】
他のそうした態様において、本発明は、配列番号３５の上記ヌクレオチド配列（または上記 (b)〜(f) で規定したような、その変異体）が ORF 2 を含む分子の諸々の部分を含有しないことを特徴とする、上記で定義した核酸分子を提供する（以下の表１参照）。換言すれば、この態様において、配列番号３５のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド 122812〜123876 を含まない。
【００１８】
もう一つのこのような態様において、本発明は、配列番号３５の上記ヌクレオチド配列（または上記 (b)〜(f) で規定したような、その変異体）が NysF を含む分子の諸々の部分を含有しないことを特徴とする、上記で定義した核酸分子を提供する（以下の表１参照）。換言すれば、この態様において、配列番号３５のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド 454〜1191 を含まない。
【００１９】
その代わりに、本発明は、ORF 1、ORF 2 および／または NysF 遺伝子の産物の発現または機能が除去されるように、ORF 1、ORF 2 および／または NysF の一部分、または ORF 1、ORF 2 および／または NysF の修飾された配列を含有する核酸分子を提供するものである。
配列番号１または２または３５またはその相補物に、またはそれらの部分（すなわち、以下により詳細に論じる、配列番号１または２または３５から派生したハイブリダイゼーションプローブ）に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、そして好ましくは、ナイスタチン PKS 酵素またはその部分をコードする配列をコードするか、またはその配列と相補的であるヌクレオチド配列が、本発明の範囲に含まれる。高ストリンジェンシーの条件は、例えば Sambrook ら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版に記載されたような当分野でよく知られた技術により、容易に決定することができる。本発明の範囲に含まれ、ハイブリダイズする配列は、非ストリンジェントな条件（室温で 6 x SSC/50% ホルムアミド）において結合する配列であり、高ストリンジェンシーの条件（例えば 0.1 x SSC、68℃）においては洗浄されるものである。ここで、SSC ＝ 0.15 M NaCl、0.015 M クエン酸ナトリウム、pH 7.2 である。
【００２０】
ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１または配列番号２または配列番号３５の配列（または相補的配列）の部分であってもよく、この部分は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションが起きるかどうかを決定するためのサンプルまたは検体の核酸配列にハイブリダイズするように機能するのに充分な塩基長および組成のものである。従って、このプローブは、少なくとも１５塩基の長さ、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、７５、１００または２００塩基の長さである。従って、代表的なプローブの長さとしては、３０〜５００塩基、例えば３０〜３００、５０〜２００、５０〜１５０、７５〜１００が挙げられる。
【００２１】
ハイブリダイゼーションプローブは、配列（すなわち、配列番号１または２または３５、またはその相補物）のコードまたは非コードの、機能性または非機能性部分から誘導することができ、例えば遺伝子またはモジュールに、または酵素ドメインに、またはその部分（例えば活性部位をコードする部分）に、または酵素ドメインまたはモジュールを連結する配列に対応していてもよい。従って、ハイブリダイゼーションプローブは、上記で定義したようにポリケチド／マクロライド合成において機能的活性を有することができる。
【００２２】
ヌクレオチド配列の同一性は、ウィスコンシン大学からの Genetics Computer Groups (GCG) Version 10 ソフトウェア・パッケージの BestFit プログラムを用いて決定することができる。このプログラムには、デフォルト値：ギャップ生成ペナルティー ＝ ５０、ギャップ延長ペナルティー ＝ ３、平均マッチ ＝ 10,000、平均ミスマッチ ＝ -9.000 を用いる Smith および Waterman の局部相同性演算法(local homology algorithm)が使用される。
【００２３】
本発明に係るヌクレオチド配列は、配列番号１または２または３５と少なくとも６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を示すことができ、好ましくは、ナイスタチン PKS 酵素またはその部分をコードする配列をコードするか、またはその配列と相補的である。本明細書で定義した％配列同一性の基準を満たすヌクレオチド配列は、"実質的に同一な" 配列と考えることができる。
【００２４】
従って、配列番号１および／または２に関して本発明の核酸分子を定義する場合、本発明の核酸分子は、配列番号１または "配列番号１-変異体" 配列（すなわち、配列番号１と相補的なまたは縮重した配列、または上記で定義したようなハイブリダイズする配列または実質的に同一の配列といった機能的に等価な変異体）、または配列番号２または "配列番号２-変異体" 配列、またはその両方を含むことができる。配列番号１／配列番号１-変異体の配列および配列番号２／配列番号２-変異体の配列の両方を含む核酸分子が好ましい。
【００２５】
本明細書で言及する、"機能的に等価な変異体" または "機能的な等価物" は、これらが関係する本体（entity）（またはこれらが誘導される本体）の少なくとも１つの機能を保持しており、例えば実質的に同一の特性を有するタンパク質をコードするか、あるいは実質的に同一の調節活性または他の機能的特性または機能性活性を示す。
【００２６】
上記のように、配列番号３５または配列番号１および／または２（またはそれらの相補的な、縮重した、または機能的に等価な変異体）のヌクレオチド配列の諸部分または一部（例えばフラグメント）を含む核酸分子もまた、本発明の範囲に包含される。
PKS 遺伝子クラスターのこのような諸々の部分または一部分は、有利には、完全な配列の機能上の等価物と考えることもできる。例えば、配列の一部またはフラグメントは、上記で定義した機能性活性、例えばポリケチドまたはマクロライド生合成における酵素的、調節的またはトランスポーター活性を保持していてもよい。
【００２７】
好都合には、PKS 遺伝子クラスター（例えば配列番号３５、または１および／または２）の諸部分または一部は、少なくとも１５塩基の長さ、好ましくは少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、５０、７０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５０００、１０,０００、１５,０００、２０,０００、３０,０００または５０,０００塩基である。かくして典型的なフラグメントの長さとして、１５〜５０,０００塩基、具体的には５０〜３０,０００塩基、あるいは１００〜２０,０００、１００〜１０,０００、２００〜５,０００、もしくは２００〜２,０００である。この諸部分または一部は、隣接もしくは非隣接のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むか、またはコードすることができる。
【００２８】
PKS 遺伝子配列の機能性部分の諸部分または一部は、以下でより詳細に論じられる。
PKS 遺伝子クラスターの諸部分または一部は、DNA 分子（またはヌクレオチド配列）の非コードのまたは非機能性の部分、例えばプロモーターまたはオペレーター配列、または個々の遺伝子、モジュールまたは酵素ドメインを連結するリンカー配列を含むこともできる。これらは隣接していてもよく、非隣接的であってもよいが、以下で詳細に論じる。
【００２９】
上記のように、配列番号３５、１および２内の多数の遺伝子および ORF を同定した。
このような遺伝子（または上記で定義した、それらの相補的な、縮重した、または機能的に等価な変異体）は、配列番号３５、１および２の好ましい "部分" またはフラグメントである。これらを下記の表１にまとめて示す。
【００３０】
【表１】
0004902925.tif 000002
【００３１】
【表２】
0004902925.tif 000003
【００３２】
上記の表中の "C" は相補性ストランドを指す。
配列番号１の nysD2、D1、A、B、C、E、R1〜R5、ORF1、ORF2、ならびに配列番号２の nysF、G、H および D3、および部分的 nysI 配列は、遺伝子クラスターについての完全コード配列の全体を表す配列番号３５において、それらの指定対応物（counterpart）に対応しており、配列番号１および２のヌクレオチド配列を含むと認識されよう。しかしながら、配列番号２および３５中の対応する特徴部間にあるように、ヌクレオチドの番号付けには相違がある；配列番号１および２の場合は、停止コドンにおける最初のヌクレオチドが遺伝子の終点と考えられる一方で、配列番号３５の場合は、停止コドンの第３番目のヌクレオチドが遺伝子の終点と考えられる。NysD1、D2 および D3 は、NysDI、DII および DIII としても知られており、nysR1〜R5 は nysRI〜RV としても知られている。
【００３３】
配列番号１（nys1）および遺伝子配列 nysRI に関して、表１は、これがヌクレオチド 51405〜54303 を含むことを示している。しかしながら、その後の配列分析から、実際には２つの始点コドン、すなわち GTG をコードするヌクレオチド 51405-51407、 および ATG をコードするヌクレオチド 51408-51410 があることが明らかになった。従って、配列番号１のヌクレオチド 51408 は、nysRI のための代わりの始点ヌクレオチドである。ATG は GTG よりも始点コドンとして好ましく、その結果、51408 は 今後nysRI に関しての始点ヌクレオチドと見なされる。配列番号３５における nysRI の始点は、上記の表１において ATG コドンとして示されており、下記の配列番号９に示す nysRI の翻訳産物は、配列番号１のヌクレオチド 51408-54303 から導き出される。［配列番号１のヌクレオチド 51405 が始点ヌクレオチドである NysRI 翻訳産物の代わりの表示において、配列番号９は追加の "最初の" アミノ酸、Ｖを挿入することによって修飾される。］
配列番号３５および１ならびに遺伝子配列 nysRIV に関して、表１は、これが配列番号３５中のヌクレオチド 120676〜123108（nysRIV 短）を含むことを示している。しかしながら、さらなる配列分析により実際には２つの始点コドン、すなわち GTG をコードするヌクレオチド 120676-120678 および GTG をコードするヌクレオチド 120628-120630 があることが明らかになった。これらの始点コドンは、配列番号１においてnysR4 のためのヌクレオチド 60367-60369（表１に示すとおり）および 60415-60417 での始点コドンに対応している。上流 GTG（配列番号３５中の 120628-120630、これは配列番号１中の 60367-60369 に対応している）は、始点コドンとして好ましく（実施例６参照）、その結果として、120628 は 今後nysRIV に関しての始点ヌクレオチドと見なされる。配列番号３５中の nysRIV の始点は、下流の始点コドン120676-120678として上記の表１に示されており（nysRIV 短）、本明細書で "NysRIV 短" と名付けた nysRIVの推定翻訳産物は、配列番号１２に示されている。また表１には、配列番号３５における nysRIV（nysRIV 長）の代わりの始点コドンが、上流始点コドン 120628-120630 として示されている。従って、本明細書で "NysRIV (長)" と名付けた、 NysRIV 翻訳産物の代わりの好ましい表示は、配列番号４３に示されている。
【００３４】
配列番号３５、または１および／または２の配列のもう一つの代表的部分は、それぞれの "始点" および "終点" ヌクレオチド位置の間にあるヌクレオチドを、個別的にまたはひとまとめに含んでいる。
それぞれの "遺伝子" の翻訳産物が導き出され、アミノ酸配列は下記に示す次の配列番号に表わされる。
【００３５】
【表３】
0004902925.tif 000004
【００３６】
配列番号４、１０、１２、１３、１４、１６、１８、４１および４３は、最初のアミノ酸としてバリン（Ｖ）を示す。この分野の慣行および細菌 DNA の概念上の翻訳によれば、タンパク質（翻訳産物）の最初のアミノ酸は、始点コドンと関係なく、常にメチオニン（Ｍ）である。従って、本発明の翻訳産物およびアミノ酸配列は、提示したように配列番号４、１０、１２、１３、１４、１６、１８、４１および４３だけでなく、最初のＶがＭと置換された上記配列の修飾物をも含んでいる。以下で、配列番号４、１０、１２、１３、１４、１６、１８、４１および４３についての言及は、提示した配列だけでなく、最初のＶがＭに置換された上記配列をも含むと理解されるであろう。
【００３７】
代わりの態様からみると、本発明はまた、配列番号３〜２０または３６〜４３から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはそれと相補的であるか、またはそれと縮重したヌクレオチド配列を含む核酸分子をも提供する。
また、配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１つと少なくとも６０％の配列同一性を示す、１個またはそれ以上のアミノ酸配列（すなわちポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３８】
本発明のもう一つの態様は、上記で定義した本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドが提供される。
より詳細には、本発明のこの態様は、 (a) 配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個またはそれ以上に示されるアミノ酸配列の全部または部分；あるいは (b) 配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個またはそれ以上と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または部分を含むポリペプチドを提供する。
【００３９】
特に、前記アミノ酸配列は、配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個のポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を示すことができる。あるいは前記アミノ酸配列は、配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の類似性を示してもよい。本明細書における％配列同一性または類似性の基準を満たすアミノ酸（ポリペプチド）配列は、"実質的に同一" と考えられる。本発明のポリペプチドは、単離、精製または合成されたポリペプチドであってよい。"ポリペプチド" という用語は、本明細書において、２個またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸配列を包含するために用いられ、すなわち、短いペプチドおよびより長いもの（すなわち、ポリペプチド）の両方が含まれる。
【００４０】
アミノ酸配列の同一性または類似性は、ウィスコンシン大学からの Genetics Computer Groups (GCG) Version 10 ソフトウェア・パッケージの BestFit プログラムを用いて決定することができる。このプログラムには、デフォルト値：ギャップ生成ペナルティー ＝ ８、ギャップ延長ペナルティー ＝ ２、平均マッチ ＝ 2.912、平均ミスマッチ ＝ -2.003 を用いる Smith および Waterman の局部相同性演算法が使用される。
【００４１】
配列番号３〜２０または３６〜４３（または上記で定義した "実質的に同一の" 配列）の何れか１個のアミノ酸配列の "部分" は、少なくとも２０の隣接アミノ酸、好ましくは３０、４０、５０、７０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１,０００、２,０００、５,０００または１０,０００の隣接アミノ酸を含むことができる。
【００４２】
ポリペプチド、および好ましくはその部分についても、上記の定義によれば機能的に活性であり、例えば酵素的に活性であるか、または調節または輸送の機能的活性を有する。この部分は、自らは機能的に活性でないことがあるが、場合によっては全体として機能的特性を有する領域を与えることができ、例えば、酵素活性に必要とされる活性部位または補因子の結合部位である。
【００４３】
以下の実施例に記載する研究では、本発明のヌクレオチドおよびポリペプチド配列が特性決定され、その中にある種々の機能性領域が同定された。このような機能性領域は、本発明の別の態様を形成する。種々の翻訳産物（すなわち配列番号３〜２０および３６〜４３の遺伝子産物）について、これらの機能的領域を下記の表２にまとめて示す。
【００４４】
【表４】
0004902925.tif 000005
【００４５】
【表５】
0004902925.tif 000006
【００４６】
【表６】
0004902925.tif 000007
【００４７】
【表７】
0004902925.tif 000008
【００４８】
【表８】
0004902925.tif 000009
【００４９】
【表９】
0004902925.tif 000010
【００５０】
【表１０】
0004902925.tif 000011
【００５１】
上述したように、「不活性」とは、他のPKS類におけるDHで見られる活性部位モチーフ、H(X3)G(X4)Pを表す保存アミノ酸配列を欠いているDHドメインを表示している。しかしながら、これらのドメインはある活性を有してもよいが、もっともそれはおそらく他のPKS類におけるDHドメインの活性とは、異なっているかも知れないと理解されるだろう。
【００５２】
配列番号５（NysA）、６（NysB）、７（NysC）、20および37（NysI）、38（NysJ）および39（NysK）は、実際の"PKS"酵素、すなわちポリケチド合成に関わる酵素を構成することはわかるであろう。これらの遺伝子産物は、同定可能な酵素のドメインおよびモジュールを含んでおり、これらは、上記の表２ならびに図４，８および９（下記の実施例1および表４、ならびにナイスタチン生合成遺伝子クラスターのDNA配列分析を詳細に記載している実施例４もまた参照のこと。）にも示されている。そうした個々のドメインおよび分子は、本明細書において同定されるように本発明の別の面を形成している。
【００５３】
配列番号3および26（NysDII）、4（NysDI）、8（NysE）、16（NysF）、19（NysDIII）、40（NysL）、41（NysM）および42（NysN）は、ポリケチドまたはマクロライド合成、すなわち、PKSからのポリケチド放出、翻訳後のPKS修飾およびポリケチド修飾に機能する他の酵素類を表す。配列番号10〜15および43（NysRIからNysRVおよびORF2）はそれぞれ転写レギュレーターを表し、配列番号17および18（NysGおよびNysH）は、細胞からのポリケチド輸送に関与していると推測されている「輸送（transport）」タンパク質を表している。このことは、以下の実施例においてもさらに詳細に記載されている。そのような機能的タンパク質は本発明の別個の面を形成するものである。さらにそうしたタンパク質の機能性の部分またはフラグメント、すなわち、それらが由来する「親分子」（すなわちタンパク質全体またはポリペプチド全体の）の生物的活性を（すなわち測定可能なレベルに示す）保持する活性な部分またはフラグメントもまた含まれる。
【００５４】
本発明のヌクレオチド配列は、ナイスタチン生合成を操るため、新しいナイスタチン誘導体または新規なポリケチドもしくはマクロライド構造を合成するため、ならびに新規なもしくは改変PKS系を提供するための多くの方法において利用できる重要なツールと情報を提供する（ここでは「PKS系」によってポリケチド合成系、すなわち遺伝子クラスターまたはタンパク質の複合体、集合体または構築物を意味し、ポリケチド合成において機能するが必ずしもPKS酵素類または酵素上のドメインに限定されるものでなく、他の機能性活性、たとえば他の酵素的（例えば修飾的な）タンパク質、トランスポータータンパク質もしくは調節機能的なタンパク質をもまた含むものである）。
【００５５】
したがって、たとえば、本明細書に提示されるナイスタチンPKS遺伝子クラスター全体またはPKS合成系、またはその部分は修飾を受けてもよく、それにより１以上の遺伝子、１以上のモジュール、酵素ドメインまたはその内部の機能的配列を修飾することとなる。かくして修飾された、または誘導化されたPKS系は、あとでさらに詳細に記述されるように、新規な、または修飾されたポリケチドの諸部分を合成するのに用いることができる。この場面では、本明細書に記載するナイスタチンPKS系、またはそのフラグメント、部分は、修飾のための「原型」または「鋳型」または「起源」の系または配列として機能するに違いない。
【００５６】
さらに具体的には、あるそうした態様において、また後で述べるように、その系の機能的でない部分（たとえば、生物的に活性ではない部分）は、「足場（scaffold）」として利用することができ、また機能性部分（たとえば、酵素部分をコードする配列）は、修飾されて派生的な、修飾されたPKS系を生み出すことができる。ある態様では、１個だけが選択された、または少数しか選択されない機能的（たとえば、酵素的な）領域は修飾されてもよく、残りの配列または構造は大部分がそのままに残されるであろう。
【００５７】
代わりに、そのような機能性部分は、他の「足場」構造の修飾のためのツールまたは材料として利用することができる。たとえば個々のナイスタチン遺伝子、モジュール、またはドメインは、他のPKS足場構造への導入（たとえば挿入か置換）のために使用されてもよい。たとえば他のマクロライド抗生物質（たとえばエリスロマイシンまたはラパマイシンなど）用の、PKS系に由来するPKS足場系である。
【００５８】
合成のもしくは遺伝子組換えのポリケチドシンターゼ酵素は本発明の範囲に含まれ、これはナイスタチン遺伝子クラスターによりコードされる「足場」から派生したものであり、該酵素は、他のモジュール型酵素から誘導される１以上の機能性単位を含むように修飾される。そのような機能性単位は、触媒性もしくは輸送のタンパク質ドメインをコードすることができるかも知れない。たとえば、PKS酵素からのケトレダクターゼドメイン、モジュール型ハイブリッドポリケチド／ペプチド合成酵素からのACPドメインである。そうしたドメインは、酵素ドメインDNA配列、たとえばポリケチド合成酵素、ペプチド合成酵素、ペプチド・ポリケチドハイブリッド合成酵素、脂肪酸合成酵素、あるいは当業界で知られた他の酵素ドメインから誘導され得る。類推的に本発明に含まれるものとして、異なるポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターによりコードされる足場から誘導される合成のもしくは遺伝子組換えのポリケチドシンターゼ酵素、あるいはナイスタチン遺伝子クラスターに由来する１以上の機能性単位を含むように修飾される、モジュール型酵素をコードする遺伝子クラスターである。
【００５９】
したがって、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターについて本明細書に提示される配列および活性の情報は、現存する公知の遺伝子クラスター、結果としてそれらの生産産物を改変するために使用することができる。特に、本明細書に記載される特定のドメインを選別し、現存するPKS遺伝子クラスターへ取り込むこと（あるいは現存配列を修飾すること）は、ナイスタチン遺伝子クラスターに帰着されるべき特定の性質を取り込むこととなるであろう。
【００６０】
かくして、極めて一般的な意味において、本発明は、修飾されたPKS系の調製あるいは修飾を受けたポリケチド分子の調製において、本明細書に記載された本発明の核酸分子の利用を提供する。そうした新規なまたは修飾されたポリケチドまたはマクロライド分子は、本発明の別個の面を形成するものである。
【００６１】
かようにして本発明によれば、ヌクレオチド配列は、ランダムに、または指定されて、または志向的なやり方で利用することができる。たとえば、特定の所定もしくは所与の構造を獲得してテストしたり、あるいはスクリーニング用の（これもあとでさらに詳細に記載する）ポリケチド構造のライブラリーといったランダム分子を創生する目的のためである。
【００６２】
ナイスタチン−PKS足場内の修飾のためであろうと、あるいは代替の足場構造への導入のためであろうと、修飾を受け得る遺伝子または遺伝子要素は、実際のPKS遺伝子（NysA、NysB、NysC、NysI、NysJおよびNysK）、それらの個々の分子もしくはそのドメインだけでなく、ナイスタチンの生合成および輸送に関係している他の酵素もしくは機能的タンパク質をコードする遺伝子をも含むものである（本明細書では一括して「PKS遺伝子（類）」または「ナイスタチン遺伝子（類）」という）。
【００６３】
実際のPKS遺伝子類については、あとでさらに詳細に記載するように、これらは修飾されて、それによりスターター単位（starter unit）の性格、モジュールの数、エクステンダー（extender）の性格を決定する負荷(loading)ドメイン分子の性質のみならず、ポリケチド鎖の構造を決定する様々なデヒドラターゼ、レダクターゼおよびシンターゼの活性を変更することとなる。
【００６４】
修飾を受け得る他の遺伝子として、チオエステラーゼ遺伝子（配列番号８のNysEをコードする）が挙げられ、これはPKS系の効率が上昇するように修飾され得るものである（PKSから不適切な基質を取り除く「編集機能」の活性を有するチオエステラーゼの場合）。該チオエステラーゼが単にPKSの最終産物を切り離すだけならば、該酵素はナイスタチンPKSの頭部を切断し、遺伝子工学によって、該エステラーゼをその頭部切断されたタンパク質末端に融合することによって、より小さいマクロラクトン環を有するナイスタチン誘導体を作成するために使用できる。
【００６５】
ポリケチドまたは抗生物質の産生を亢進させるため、調節遺伝子のアクチベーターは、強発現され得るし、リプレッサーは不活性化され得る。このことは、組換え株において新しいナイスタチン誘導体を産生するためには特に重要である（それは極めて僅かな量しか生産されないかも知れない）。
推定の４'−ホスホパンテテイン（PPT）トランスフェラーゼ遺伝子（配列番号16のNysFをコードする）は、PKSの効率的な翻訳後修飾および完全な機能性を達成するために、強発現され得る。特異的なPPT活性を欠いている異種の宿主におけるナイスタチン（または他の）PKSの発現に使用することも可能である。そのような宿主として、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシイなどが挙げられる。
【００６６】
合成された分子、たとえば新規なナイスタチン誘導体のグリコシル化を亢進させるように、デオキシ糖遺伝子：グリコシルトランスフェラーゼ（配列番号４のNysDIをコードする）は、強発現され得る。それは、新しい基質に対する特異性を増加するためにインビトロの突然変異誘発によっても修飾を受け得る。このグリコシルトランスフェラーゼの不活性化は、非グリコシル化ナイスタチン（おそらく何らかの修飾も欠いている）を生産する組換え体菌株をもたらすであろう。それは、たとえば化学修飾または新しい修飾活性をスクリーニングするための酵素的アッセイに使用することができる。
【００６７】
アミノトランスフェラーゼ（配列番号３および36のNysDII）は、不活性化されてナイスタチン誘導体を与え得る。この酵素は、デオキシ糖マイコサミン(deoxysugar mycosamine)にアミノ基を付着させると推定されている。この遺伝子もまた、通常はアミノ基を欠いている別のデオキシ糖との同じ反応を遂行するように、他のストレプトマイセス属においても発現され得る。
【００６８】
ABCトランスポーター（具体的には、配列番号17および18のNysHおよびNysG）は、ナイスタチンの流出とその誘導体の流出をもっと効率的にするように強発現され得る。これらは、異なる化合物に対してその特異性をシフトするように突然変異を受け得る。もし、何らかの理由により細胞内にナイスタチンまたはその誘導体を蓄積することを所望するならば、これらは不活性化させることができる。
【００６９】
モノオキシゲナーゼ、NysLおよびNysN（配列番号40および42）をコードする遺伝子は、ヒドロキシル化および酸化をともにされていないナイスタチン誘導体が得られるように、S. nourseiにおいて不活性化され得る。代わりにこれらの遺伝子は、ナイスタチン前駆体に対するそれらの特異性を変更することをねらって、変異を起こさせ得る。もし上記のヒドロキシル化および／または酸化の段階がナイスタチン生合成経路において律速であるならば、nysLおよびnysNの強発現は、おそらくナイスタチンまたはその誘導体の収率の上昇をもたらすようになるに違いない。ナイスタチン前駆体の修飾のためのインビトロP450ヒドロキシラーゼ系を確立しようと望むならば、フェレドキシン（配列番号41）をコードするnysMを用いる遺伝子操作も有用であるかもしれない。
【００７０】
かくして、「ナイスタチン」遺伝子を使用することにより、ナイスタチンPKS系の修飾または他のPKS系の修飾に加えて、本発明の核酸分子は、たとえば宿主の範囲を拡張したり、あるいは収率もしくは生産効率の上昇によって、生合成過程を操るかまたは促進するためにも用いることができる。
上記の原理に従って、本発明の実施を可能とするために、本発明はさらに発現ベクター、本明細書で定義した核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【００７１】
ポリケチドまたはマクロライド分子（具体的にはナイスタチンまたはナイスタチン誘導体）を産生するための方法もまた提供される。その方法は、上記のような核酸分子を宿主細胞内で発現することを含むものである。該核酸分子の発現結果として（すなわち、導入された「PKS合成装置機構」の発現）、宿主細胞内で、ポリケチドまたはマクロライド分子が産生され、宿主細胞により分泌されるか、または輸送され、その後回収される。
【００７２】
したがって、本発明の方法は、核酸分子が発現されるような条件のもとで宿主細胞を成長させるか培養すること、および核酸分子の発現産物（類）がポリケチド／マクロライド分子を合成するようにさせること、換言すれば、ポリケチドまたはマクロライド分子が産生される条件下で、宿主細胞を成長させるか、または培養することを含むものである。
【００７３】
本発明によれば、組換え核酸分子を調製する方法もまた提供され、その方法は、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子を別の核酸分子、たとえばベクターの核酸、具体的にはベクターDNA内に挿入することを含むものである。
本発明の発現ベクターは、適当な調節配列を含めることができる。たとえば翻訳調節エレメント（たとえば開始コドンおよび停止コドン、リボソーム結合部位）ならびにリーディングフレームを本発明の核酸分子とマッチさせることに関係する転写調節エレメント（たとえばプロモーターオペレーター領域、終結停止配列）である。
【００７４】
本発明のベクターは、当業界で周知であり文献に記録された諸技術によるプラスミドおよびウィルス（バクテリオファージおよび真核生物のウィルスの両方を含む）を含んでもよく、さらに、当業界で周知であり文献に記録された様々な異なる発現システムで発現させることもできる。
発現目的で、原核生物の細胞または真核生物の細胞内にそうしたベクターを導入するための、あるいは形質転換動物を作成するために生殖系細胞菌株または体細胞内に導入するための、様々な技術が知られており、そして用いることができる。適切な形質転換またはトランスフェクション技術が文献に充分に記載されている。
【００７５】
上記で規定された本発明の核酸分子を含むトランスジェニック生物体用に、本発明は、形質転換された、あるいはトランスフェクションされた原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞をも含むものである。そのような宿主細胞には、たとえば、大腸菌、ストレプトマイセスおよび他の細菌といった原核生物細胞、酵母またはバキュロウィルス−昆虫細胞系といった真核生物細胞、形質転換された動物細胞およびトランスジェニック動植物細胞が挙げられる。
【００７６】
上記の発現ベクター、宿主細胞および生物体等の内部に含まれる核酸分子は、あとでさらに詳細に記載するように、上記で定義された核酸分子に由来する派生的な核酸分子であってもよく、そうした分子またはその部分を修飾することによるか、あるいは他の核酸分子に導入したり、または結合するかによって得られる。
よって、ある面で本発明は、ポリケチド類のコンビナトリアル・ライブラリーの製造のため、組換え体の材料を提供する。該ライブラリーのポリケチド構成員は、天然に存在するナイスタチンA1系（本明細書において提示される）から、この系を足場として用いることにより誘導される修飾PKS系によって合成される。一般的には、該ライブラリーの多くの構成員自体が新規な化合物であり、本発明はこれらのライブラリーの新規なポリケチド構成員を含むものである。それゆえ、本発明の方法は個々のポリケチドの調製に適用されてもよい。ポリケチドが新規であろうとなかろうと、該調製方法はそれを調製するためのより便利な方法であってもよい。生成するポリケチドは、さらに修飾を受けてから抗生物質に変換されてもよい。それは典型的にはグリコシル化を通じてである。本発明のライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の結合活性を有する新規なポリケチドを取り出すための方法も本発明に含まれる。
【００７７】
したがって、ある面で本発明は、修飾ポリケチドシンターゼ酵素または酵素系をコードするヌクレオチド配列から構成されるか、または含む核酸分子を調製する方法にも適用される。その方法は、本明細書において提示される配列をコードするナイスタチンPKSを足場として用いること、ならびに酵素的または他の機能的活性をコードするヌクレオチド配列の部分を、たとえば突然変異、不活性化（具体的には欠失もしくは挿入による）または置換により修飾することを含むものである。このようにして修飾されたヌクレオチド配列（修飾PKSをコードする）は、適当な宿主細胞を改変するために用いることができ、さらにこのようにして改変された細胞は、未変性のナイスタチンPKSにより産生されるポリケチドとは異なるポリケチドを産生するために用いることができる。未変性ナイスタチンPKSの「足場組み」は，酵素的活性の修飾を支援するために用いられてきた。
【００７８】
代わりに酵素的または他の機能的活性をコードするヌクレオチド配列の１つ以上の部分は、代替的な（すなわち、異なる「二番目」の）PKS足場（すなわち、「二番目」のPKS系に由来する足場であり、ナイスタチンPKSシステムとは相違している）に導入されてもよい。
本発明は、このようにして産生されたポリケチドおよびそれらが次に変換され得る抗生物質に対しても適用される。
【００７９】
本発明は、別の面で、細胞コロニーのライブラリーを含む多数の細胞コロニーにも適用される。そのライブラリーでは、各々のコロニーは、異なるモジュール型PKSを産生するための発現ベクターを含んでいるが、上記のように本発明のナイスタチンPKSに由来している。異なるモジュール型PKSのライブラリーは、ある酵素的活性をコードしている天然産「ナイスタチン」遺伝子または遺伝子クラスターの1つ以上の領域を修飾することにより得ることができ、その結果、その活性を変更するが、該天然産遺伝子の足場部分をもとのままにしておく。
【００８０】
他の側面では、本発明は、コロニー・ライブラリーを含む細胞コロニーの多様性に関し、ここでライブラリーの各コロニーは、本発明のナイスタチンＰＫＳから誘導された異なるモジュール型ＰＫＳを含む。また本発明は、ＰＫＳ複合体ライブラリーの製造方法およびこれらコロニーの培養によるポリケチド・ライブラリーの製法、ならびにこのようにして製造されたライブラリーに関する。さらに、本発明は、このようにして得られるポリケチド・ライブラリーのスクリーニング方法およびそこに含まれる新規ポリケチドに関する。
【００８１】
上述したように、ナイスタチンＰＫＳ遺伝子クラスター／系の構造的および機能的な配列解析は、下記実施例に与えられ、またＤＮＡ配列は配列番号 1, 2および35に示され、また上記表１および２でさらに解析され、配列番号 3〜20および36〜42は、また 図２，３，７，８および９でさらに解析された。「ＰＫＳ」遺伝子のモジュールで「ドメイン」をコードする構造が見られるだろう。モジュールは典型的には、ケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）およびアシルキャリア・タンパク質（ＡＣＰ）を含有してもよい。これらの三つの機能は、伸長単位を活性化するのに十分であり、それを大きくなる分子の残余部に結合する。モジュールに含めてもよい付加的な活性は、クライゼン縮合以外の反応に関係しており、デヒドラターゼ活性（ＤＨ）、エノイルレダクターゼ活性（ＥＲ）およびケトレダクターゼ活性（ＫＲ）を含む。付加モジュールは初期の縮合反応を触媒作し、すなわち、それはＡＴおよびＡＣＰによって表わされる「ローディング・ドメイン」で始まり、これはスターター単位の性質を決める。分子の「仕上げ」は、チオエステラーゼ活性（ＴＥ）により調整されると信じられ、これはＮｙｓＫに組み込まれたＴＥ活性により達成されると信じられている。このチオエステラーゼは、マクロライド環の環化を触媒すると思われ、それによりポリケチド生成物の収率を上昇させる。ＮｙｓＥ ＴＥ活性は、「編集」活性であると信じられ、ナイスタチンＰＫＳ複合体からのある種の実体物のの開裂に関与する。
【００８２】
上記および後記の配列、図面、および表から、酵素活性をコードする遺伝子の領域およびモジュールは、リンカーまたは「足場」コード領域により分け隔てられていることがわかる。これらの足場領域は、適切な距離および正しい順序で、酵素的／機能性の活性を分けるアミノ酸配列をコードする。したがって、これらのリンカー領域は、全体として種々の活性が、特定の順序および空間的配置でその中に位置付けられている一つの「足場」をコードすると考えることができる。しかしながら言及すべきは、いくつかの場合に足場の領域が、生成するＰＫＳの活性に深刻な影響を与えることなく、切除あるいは改変されることもあるということである。実際、機能上の活性を有するいくつかのドメインをコードする配列が、意味のある効果がないまま完全に、あるいは部分的に削除されることもある。したがって、ここで用いられている「足場」とは、該ＰＫＳの機能上の、たとえば酵素的活性に直接的に寄与しないが、その全体的な活性を維持すること、たとえば正しい空間的配向または構造を保持することを担うＰＫＳクラスターのある部分を言及している。かかる足場は、ＰＫＳのすべてのリンカーおよび非機能性領域、あるいはその機能上活性である部分（すなわち構造保全の維持）を含んでもよい。このような組織化は、自然界に発生する他のモジュール型ＰＫＳ遺伝子クラスターに類似している。
【００８３】
本発明は、ナイスタチンＰＫＳ遺伝子クラスター中に修飾を発生させ、該クラスターにより生成するタンパク質複合が１以上の点で変更された活性を有するようにすることで、ライブラリーあるいは個々の修飾体、究極的にはポリケチドの改変体を与え、またこうしてＰＫＳの自然産物（すなわちナイスタチンＡ１）以外のポリケチドを製造する。この方法を用いることで、新規ポリケチドが調製され、あるいはポリケチドが概して容易に製造される。自然界に見出されるナイスタチンＰＫＳ遺伝子クラスターから誘導される様々な遺伝子群または遺伝子クラスター、各々が未変性クラスターから種々の方法で修飾もしくは改変されたものを多数与えることによって、、これらの活性における多様な変動の結果として、ポリケチドの効果的なコンビナトリアルライブラリーが製造される。あるいは、ナイスタチンＰＫＳの「機能領域」（たとえば遺伝子、モジュールまたはドメイン）を、別の自然発生的なＰＫＳ系から得られた「足場」に導入するために用いてもよい。したがって、本発明で用いられる、修飾ＰＫＳをコードする配列および系は、自然発生ナイスタチンＰＫＳ「から誘導される」モジュール型ポリケチドシンターゼを示す。
【００８４】
ナイスタチンＰＫＳ「から誘導される」モジュール型ＰＫＳとは、自然発生遺伝子の有用部分全体の足場を維持するモジュール型ポリケチドシンターゼ（あるいはその対応部がコードする遺伝子）を意味する。（その構成中にすべてのモジュールまたは遺伝子が含まれる必要はない）。定常の足場の上では、少なくとも１つの酵素的または機能性活性が、変異を受け、欠失されあるいは置換され、その結果活性が変化する。天然生成物以外のポリケチドがこれらの集合的な活性から生じるように、そうした活性が削除されたり、活性の異なる型に置換されたり、あるいは単純に変異を受けたりされる場合に、変化が起る。これが起るのは、生成物ポリケチド中の対応する位置においてスターター単位および／または伸長単位、および／または立体化学、および／または鎖長または環化および／または還元的もしくは脱水的な環生成に、結果として生じる変化があるためである。削除された活性が置換される場合、置換活性の起源は、異なる自然発生型ポリケチドシンターゼにおける対応活性から、あるいは同じＰＫＳの異なる領域に由来する。あるいはまた、このような「誘導された」モジュール型ＰＫＳは、第２の異なるモジュール型ＰＫＳ（またはその遺伝子）の足場において、本明細書に記載したナイスタチンＰＫＳから得られるか、またはこれに由来する１つ以上の酵素的または他の機能性活性（あるいはこれらがコードするヌクレオチド配列）を取り込む。、
【００８５】
モジュール型ＰＫＳの修飾または改変操作は、たとえば遺伝子またはドメインまたはモジュールの削除またはドメイン／遺伝子／モジュールの交換、付加、不活性化といった、挿入、削除を含む切断（truncation）を包含している。あるいはまた、ランダムまたは指定的な改変（すなわち突然変異）が、選択された部分（たとえば遺伝子／ドメイン／モジュール等において）のヌクレオチド配列で行われてもよい。
【００８６】
前記誘導体は、好ましくは少なくともナイスタチンＰＫＳ遺伝子クラスターからのチオエステラーゼ活性を有する。
有利には、ナイスタチンＰＫＳ「から誘導される」ポリケチドシンターゼは、ナイスタチンシンターゼ遺伝子のすべてまたは利用される一部によってコードされる足場を含んでいてもよく、機能性である少なくとも２個のモジュール、好ましくは４個以上のモジュールを含み、またこれら機能性モジュールの諸活性のうち、１以上について突然変異、欠失または置換を含み、かくして得られるポリケチドの性質は変化する。この定義は、タンパク質レベルおよび遺伝子レベルの双方に適用される。特に好ましい態様には、ＫＳ，ＡＴ，ＫＲ，ＤＨまたはＥＲが不活性化または削除、あるいは異なるＰＫＳから、または同じＰＫＳ中の別の部分からのある活性型により置換されたものが含まれる。また好ましいものとしては、少なくとも１つの非縮合サイクル酵素性活性（ＫＲ，ＤＨまたはＥＲ）が削除されているか、あるいはこれらの活性の何れかかが突然変異され、最終的に得られるポリケチドが変化するようにしたものが挙げられる。
【００８７】
したがって、生成されるポリケチドに関し、ポリケチドシンターゼの構築には５つの自由度がある。第１には、ポリケチド鎖長は、ＰＫＳ系中のモジュールの数により決定されるであろう。第２には、ＰＫＳの炭素主鎖骨格の性質は、各位置におけるマロニル、メチルマロニルまたはエチルマロニルのような伸長単位の性質を決定するアシルトランスフェラーゼの特異性により決定されるであろう。第３には、ローディング・ドメインの特異性はまた、得られるポリケチドの炭素主鎖骨格に影響を及ぼすであろう。したがって、ローディング・ドメインは、アセチル、プロピオニルなどのような異なるスターター単位を使用してもよい。第４には、ポリケチドの様々な位置における酸化状態は、モジュールのデヒドラターゼおよびレダクターゼ部により決定されるであろう。これは、ポリケチド中のケトン、アルコール、二重結合、または単結合の存在と位置を決定するだろう。
【００８８】
最後に、得られるポリケチドの立体化学は、シンターゼの３つの側面の機能である。第１の側面は、伸長単位としての置換マロニルに関係したＡＴ／ＫＳ特異性に関するもので、それは、デヒドラターゼがキラリティを廃止するため、還元サイクルが失われている場合か、あるいはケトレダクターゼのみを含む場合のみに、立体化学に影響を及ぼす。第２に、ケトレダクターゼの特異性は、いずれのβ−ＯＨのキラリティも決定するだろう。最後に、伸長単位としての置換マロニルについてのエノイルレダクターゼ特異性は、完全なＫＲ／ＤＨ／ＥＲが得られる場合に、結果に影響するだろう。
【００８９】
このように、モジュール型ナイスタチンＰＫＳ系は、広範なポリケチドの合成を可能とする。芳香族ＰＫＳ系と比較して、脂肪族単量体（アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソバレリル等）、芳香族類（アミノヒドロキシベンゾイル）、脂環族類（シクロヘキサノイル）およびヘテロ環類（チアゾリル）を含む広範囲のスターター単位が、様々なマクロ環ポリケチド中に見出される。近年の研究によれば、モジュール型ＰＫＳは、これらスターター単位について緩和された特異性を有することが示されている。モジュール型ＰＫＳはまた、各縮合環中の伸長単位の選択に関して、かなりの多様性を示す。縮合反応に続くβ−ケト還元の度合は、遺伝子操作により変更されることが示されている（Donadio, S.ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7119-7123）。同様に、ポリケチド生成物の大きさは、適当な数のモジュールとともに変異体を設計することで変化させ得る（Kao, C. M.ら J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 11612-11613）。最後にこれらの酵素は、高度に制御された方式で、それらの生成物においてみごとな範囲の非対称中心を生み出すことでよく知られている。本発明の方法により製造されるポリケチドおよび抗生物質は、典型的には、単一の立体異性的な形態をとる。本発明の化合物は、立体異性体の混合物として生じ得るが、この系を使用して、個々の立体異性体を発生させることがより実用的である。ナイスタチン、ＰＫＳ足場のような自然発生のモジュールに基づくモジュール型ＰＫＳ経路内におけるコンビナトリアルの可能性は、実質的に制限されない。
【００９０】
一般的に、ＰＫＳのポリケチド生成物は、抗生物質活性を示すようにするために、典型的にはグリコシル化によりさらに改変される必要がある。ポリケチドのグリコシル化の方法は当業界でよく知られており、グリコシル化は、適当なグリコシル化酵素を与えることにより細胞内で行ってもよく、また化学合成の手段でin vitroで行ってもよい。
【００９１】
マクロライド系抗生物質、モジュール型ＰＫＳにより合成されるポリケチド部分は、多くの異なるデオキシ糖（deoxysugars）のいずれかを含んでいてもよい。ナイスタチン分子は、マイコサミンデオキシ糖部（mycosamine deoxysugar moiety）を含んでいる。デオキシ糖の生合成は、典型的には、グルコース−１−ホスフェートで開始され、ｄＴＤＰ−グルコースシンターゼおよびｄＴＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼの作用で進行する。後者の生成物、典型的にはｄＴＤＰ−４，６−ケト−６−デオキシグルコースには、さらに次の諸反応−エピマー化、異性化、還元、脱水、アミノ交換反応あるいはメチル化−のうちの少なくとも２つが施され、その結果ｄＴＤＰ−Ｄ−デオキシ糖を与える。次いで後者は、グルコシルトランスフェラーゼの作用によりマクロラクトン環に結合し、マクロライド化合物のグルコシル化を与える。
【００９２】
グルコシル化は、出発物質として、非グルコシル化マクロライドを用い、放線菌（streptomycetes）の突然変異体あるいはグルコシル化活性を与え得る他の生物（すなわち、ミクソコッカス、シュードモナス、マイコバクテリウム等）を用いて行うこともできる。あるいはまた、上記の生物からの、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、S. nourseiまたは天然または修飾ナイスタチンＰＫＳ遺伝子またはその部分を含む生物に導入することができ、これで所望のグリコシル化を与える。ナイスタチン遺伝子クラスターからのデオキシ糖生合成遺伝子は、別のデオキシ糖用の生合成経路を生み出すためのみならず、別のＰＫＳ生成生物における対応する活性の補充のために用いることができる。
【００９３】
ナイスタチンＰＫＳ誘導体は、関係遺伝子の操作によって、あるいは他のＰＫＳ中にナイスタチン遺伝子またはその部分を導入することによって調製できる。多数のモジュール型ＰＫＳ遺伝子クラスターが、マップ化されおよび／または配列決定されており、それらには完全にマップ化および配列決定されているエリスロマイシン、soraphen A、リファマイシン、avermectinおよびrapamycin、部分的に配列決定されているFK506およびオレアンドマイシン（oleandomycin）、さらにマップ化され、部分的に配列決定されているカンジシジン、pimaricinおよびnemadectinが含まれる。追加のモジュール型ＰＫＳ遺伝子クラスターが、時の経過とともに入手できるようになるであろうと期待される。これらの遺伝子は、標準的な諸技術を用いて操作することができ、その結果活性をコードする領域の削除または不活性化、同一または別のＰＫＳ系からの対応する諸活性をコードする遺伝子領域の導入、あるいは他にも、標準的手法による突然変異により遺伝的改変体が得られる。もちろん、所望の誘導体をコードする配列の一部または全部を、Jaye ら, J. Biol. Chem. (1984) 259:6331に記載されているような標準的な固相合成法で合成することもでき、さらにたとえばApplied Biosystems, Incから市販されている。
【００９４】
天然発生のＰＫＳの多様な誘導体をコードするヌクレオチド配列ならびに、ライブラリー構築のための多様なポリケチドを得るために、所望の数の構築物が、酵素性の活性−コード部を「混合および適合」することによって、また変異を、天然のホスト（すなわちナイスタチン）ＰＫＳ遺伝子クラスターまたはその部分に導入することができる。
【００９５】
突然変異は、従来法を用いて天然の配列に対してもたらすことができる。突然変異の基質は、遺伝子クラスター全体でもよく、またその１または２つの遺伝子のみでもよく、つまり突然変異の基質はこれら遺伝子の１つ以上の部分であってもよい。突然変異の技術は良く知られており、たとえばWO98/49315に記載されており、その文献をここに引用により取り込む。このような技術は、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製することと、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて、ＰＫＳサブユニットをコードする遺伝子内に該変異配列を挿入することを含む。（たとえばKunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder ら BioTechniques (1987) 5:786.参照）あるいはまた、天然のヌクレオチド配列にハイブリダイズする不適合プライマー（一般的に鎖長は１０〜２０ヌクレオチド）を、不適合な二重鎖の融点よりも下の温度で用いることで突然変異を起こさせることもできる。プライマーの鎖長および塩基組成を比較的狭い範囲に保持し、変異塩基を中央部に位置するように保つことで、プライマーを特異的なものにできる（Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468）。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ、生成物はクローン化され、プライマーの伸長鎖の分離により誘導された変異ＤＮＡを含有するクローンが選別される。変異プライマーをハイブリダイゼーション・プローブとして用いることにより選別が達成される。この技術は、多重点突然変異を起こさせることにも適用できる。たとえば、Dalbie-McFarland ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409参照。ＰＣＲ変異誘発は、所望の突然変異を起こさせるための利用の途もあるだろう。
【００９６】
酵素性の諸活性をコードするヌクレオチド配列の選択された部分におけるランダムな突然変異誘発は、いくつかの異なる公知の方法によって達成される。たとえばプラスミド中にオリゴヌクレオチドリンカーをランダムに挿入すること、Ｘ線または紫外線を照射すること、in vitroのＤＮＡ合成中に不正ヌクレオチドを取り込ませること、誤りがちなＰＣＲの突然変異誘発によること、合成変異体を調製することで、あるいは化学物質によってプラスミドにin vitroで損傷を加えることで達成される。突然変異誘発性化学物質としては、たとえば重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ニトロソグアニジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンあるいは蟻酸のように、塩基を損傷するかまたは除去して正常な塩基対の形成を阻害する試薬、５-ブロモウラシル、２-アミノプリンのようなヌクレオチド前駆体の類似体、あるいはプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのようなアクリジン挿入化剤等が挙げられる。一般的に、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、化学物質により処理され、E. coliに形質転換され、変異プラスミドのプールもしくはライブラリーとして増殖される。
【００９７】
酵素的または他の機能性の活性をコードする領域について変異形態を提供することに加えて、所望する諸々の機能性または活性をコードする領域が、同一のナイスタチンＰＫＳの異なる部位から、たとえば適当なプライマーを用いるＰＣＲ技術によって回収され得る。「対応する」活性をコードする領域とは、活性の同一な一般的タイプをコードする領域を意味し、--たとえば、ある遺伝子クラスターの一つの場所におけるケトレダクターゼ活性は、その遺伝子クラスターの別の場所におけるケトレダクターゼをコードする活性に「対応」する。
【００９８】
（ホストのナイスタチンPKS、あるいは「ナイスタチン」配列が挿入されることとなる異なるPKSとするために）このホストのポリケチドシンターゼにおける特定のターゲット領域の置換を行おうとする場合には、この置換は、好適な制限酵素を用いてin vitroで行うか、あるいはドナープラスミドに置換遺伝子を枠構成する相同配列、およびレシピエントプラスミド、ゲノムまたは染色体中にレセプター領域を含む組換え技術を用いてin vivoで行うことが可能である。このような系は、好ましくは異なる温度感受性を持つプラスミドを含むものであり、たとえばPCT出願WO 96/40968に記載されている。
【００９９】
WO 00/77181には、配列においていくつかのDNAユニットを集合させて大きいDNA構築物とする方法が記載されている。これらの方法は、本発明の範囲内の組換えポリケチドシンターゼに対しても適用できる。  ホストPKS遺伝子における酵素的活性を置き換えるか、、あるいはホストPKS遺伝子のそのような領域の変異をサポートする目的で、種々の操作を実施するために使用されるベクターは、次のような調節配列を含むように選択してもよい。コード配列の発現が適当なホスト内で起きるような態様で、該調節配列が、生じたコード配列と作動可能に連結されている。しかしながら、単純なクローニングベクターも同様に使用できる。
【０１００】
誘導PKSをコードしているPKS遺伝子を得るために用いられるクローニングベクターが、コードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された発現調節配列を欠いているならば、そのヌクレオチド配列は好適な発現ベクターに挿入される。これは個別に実施される必要はなく、単離されたコードするヌクレオチド配列のプールを、ホストベクターに挿入することができる。得られるベクターは、宿主細胞内に形質転換され、または形質導入され、その結果、生成する細胞は播種されて各コロニーに培養される。
【０１０１】
好適な調節配列としては、真核および原核宿主細胞内で機能するものが挙げられる。好ましい宿主としては、原核細胞の宿主、および酵母のような菌類が挙げられるが、単一の細胞培養物、たとえば哺乳類の細胞もまた使用できる。しかしながら、そのような系を使用することに有利な点は特にない。Streptomyces sppと適合し得る調節配列を使用する酵母および原核細胞宿主が特に好ましい。種々のタイプの生物についての単一の細胞培養物に好適な調節配列は、当業界でよく知られている。酵母における発現系は、分泌をもたらす調節配列を含み、広く市販されルーチンに使用される。調節因子として、プロモーター、所望によりオペレーター配列も含んでいてもよく、宿主の特質に応じて他の因子、たとえば、リボソーム結合部位などが挙げられる。特に原核細胞宿主に有用なプロモーターとしては、２次的な代謝産物としてのポリケチドを産生することとなるPKS遺伝子クラスターからのプロモーター、たとえば、芳香族（タイプII型）PKS遺伝子クラスターからのものが挙げられる。具体例として、actプロモーター、tcmプロモーター、スピラマイシンプロモーターなどが挙げられる。しかしながら、他の細菌のプロモーター、たとえば、ガラクトース、ラクトース（tac）およびマルトースといった糖代謝酵素から誘導されるものも有用である。追加の例としては、生合成酵素、たとえば、トリプトファンシンターゼ(trp)、β−ラクタマーゼ（bla）、バクテリオファージラムダ FL、T5およびT7などをコードしている遺伝子から誘導されたプロモーターが挙げられる。さらに、合成されたプロモーター、たとえば、tacプロモーター（米国特許明細書4,551,433号）を用いることもできる。
【０１０２】
また、他の調節配列、ホスト細胞の成長に関してのPKS置換配列の発現調節を可能にするものが望ましい。調節配列は公知の技術であり、その例としては、化学的または物理的な刺激（たとえば調節性化合物の存在）に応じて、遺伝子の発現を生じさせたり、させなかったりするものが挙げられる。他のタイプの調節因子もまたベクター内に存在してもよく、たとえば、エンハンサー配列が挙げられる。
【０１０３】
選択可能なマーカーを組換え発現ベクター内に取り込ませることもできる。様々なマーカーが知られ、形質転換された細胞系統を選別する際に有用であり、一般にある遺伝子を含み、その遺伝子の発現は、好適な選択培地で成長させるとき、形質転換細胞に選別可能な表現型を与える。このようなマーカーとしては、たとえば、抗生物質耐性または抗生物質感受性をプラスミドに与える遺伝子が挙げられる。または、いくつかのポリケチドは本来的に着色しており、この特性は、本構築物によって首尾よく形質転換された細胞をスクリーニングするための組み込みマーカーを与える。
【０１０４】
種々のPKSヌクレオチド配列またはそのような配列の混合物は、個別の制御因子とともに、または、たとえば単一のプロモーターの制御下に、個別のカセットとして1以上の組換えベクターへクローン化できる。前記PKSサブユニットまたは成分の混合物は、隣接する制限部位（flanking restriction site）を含み、それにより、容易に欠失を可能とし、また他のPKSサブユニットまたは成分混合物を挿入させる。その結果、ハイブリッドPKSが生成できる。このような独特の制限部位の設計は当業者にとり公知の技術であり、上述した技術を用いて達成することができる。たとえば、位置指定突然変異導入法およびPCRである。
【０１０５】
上述したように、具体的に有用な調節配列は、自らまたは好適な制御系を使用して栄養菌糸体の増殖から定常期までの遷移の間、発現を活性化するものである。プラスミドRM5に含まれる系、すなわち、actI/actIIIプロモーターペアおよびactII−ORF4、活性化遺伝子が、特に好ましい（McDanielら、Science,v.262、P1546-1550,1993）。
【０１０６】
特に好ましい宿主（ホスト）は、ポリケチドを産生する独自の手段を欠いており、それにより明確な結果が得られる。このタイプの宿主細胞の実例としては、PCT出願WO 96/40968に記載された、修飾S.coeticotor CH999培養物およびS.lividans の同様の菌株が挙げられる。
修飾されたPKS系、または異なるポリケチドを生成するための種々のPKS系をコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、その後たとえば、ライブラリーを構築するために好適な宿主細胞へ形質転換してもよい。ある率直なアプローチにおいては、前記ベクターの混合物を選択された宿主細胞へ形質転換し、得られた細胞を個々のコロニーに培養し、首尾よく形質転換体を選別する。各コロニーは、それぞれ特定のPKSシンターゼおよび最終的に特定のポリケチドを産生する能力を有するコロニーを表わすであろう。典型的には、いくつかのコロニーは複製されることになり、形質転換されたコロニー群のサブセットは、コロニーごとにそれぞれ異なるPKSを含有しており、ライブラリーとみなすことができる。または、発現ベクターをそれぞれ宿主を形質転換するように使用することができ、次いで形質転換された宿主は、ライブラリーを構築するために集められる。様々な戦略がコロニーの多様性を獲得するために工夫されるべきであり、各コロニーは、ナイスタチンホスト遺伝子クラスターから誘導されるPKS遺伝子クラスターを含有する。その結果、ライブラリーの各コロニーは、異なるPKS、および最終的に異なるポリケチドを生成する。前記ライブラリーによって生成される異なるポリケチドの数は、典型的には少なくとも３（たとえば、PKS遺伝子中に２つの変異が別個にまたは組み合わせて現れる）、より典型的には少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも５０であり、異なる改変PKS遺伝子クラスターおよびPKS遺伝子産物の数をほぼ反映する。ライブラリーの構成員数は任意に選択できるが、スターターユニット、伸長ユニット、立体化学、酸化状態および鎖長に関して上記の自由度は、著しく大きい。
【０１０７】
本発明の組換えベクターを好適な宿主（ホスト）へ挿入する方法は、当業者にとり公知の技術であり、典型的には、CaCl2または他の試薬、たとえば２価のカチオンの使用、リポフェクション、接合、プロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションが挙げられる。
たとえ、いくつかの宿主が本来的に上記シンターゼのアシルキャリアータンパク質を活性化するための好適な翻訳後のメカニズムを含んでいないとしても、幅広い種類のホストを使用できる。これらのホストには、そのような修飾を実現させるのに好適な組換え酵素、たとえば、NysFを補足することができる。
【０１０８】
ポリケチドを生成するコロニーは、公知の技術を用いて同定し単離することができ、産生されたポリケチドはさらに特徴付けられる。これらのコロニーによって産生されたポリケチドは、ライブラリーを表す枠内で集合的に使用でき、または個々に活性を評価してもよい。
したがって、前記ライブラリーには４つのレベルが考えられる；（１）異なるPKSクラスターを含有し、異なるPKSをコードする配列をそれぞれ有する多数のコロニー（しかしながら、すべてナイスタチンPKSクラスターから誘導される。）、（２）コード配列により生成された、PKSの一員であるタンパク質を含有するコロニー、（３）産生されたポリケチド、（４）ポリケチドから誘導された抗生物質。
【０１０９】
ライブラリーにおけるコロニーは、関連するシンターゼを生成するように誘導することができ、したがって、ポリケチド候補のライブラリーを得るために関連するポリケチドを生成するように誘導することができる。産生されたポリケチドは、抗菌活性、抗癌活性、抗寄生虫活性、免疫抑制活性に関してスクリーニングできると同様に、望ましいターゲット、たとえば、レセプター、シグナルタンパク質などへの結合に関してスクリーニングできる。上清または培養ペレット自体をスクリーニングに用いることができ、あるいはポリケチドの部分的もしくは完全な精製を最初に行うことができる。典型的には、このようなスクリーニング方法は、ライブラリーの各構成員とレセプターまたは他のターゲットリガンドとの結合を検出することを含む。結合は、直接的に検出するか、または競合アッセイを通じて検出することができる。結合に関してそのようなライブラリーをスクリーニングする手段は、当業者によく知られている。
【０１１０】
または、ライブラリーの各ポリケチド構成員を、望ましいターゲットに対して試験することができる。この場合には、ターゲットの生物的応答を測定するスクリーニングがより容易に含め得る。
本発明の方法によって多数の新規なポリケチドを、後述する実施例で代表して説明されるようにして調製することができる。これらの新規なポリケチドは、グリコシル化または上記の反応を通じて、抗菌活性を有する化合物を形成する場合において、有用な中間体となるであろう。上記に示したように、個々のポリケチドは、適当な糖誘導体と反応させて、抗菌活性を有する化合物を得ることができる。抗菌活性は、典型的なスクリーニングアッセイ、たとえばLehrer,R.らJ. Immunol. Meth. (1991) 137 :167-173に提案されているようなものを用いて確認することができる。
【０１１１】
したがって、本発明はさらなる面として、修飾ナイスタチンPKSをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を調製する方法を与える。ここで前記修飾ナイスタチンPKSは、本明細書で定義されたナイスタチンPKS（すなわち、天然に生じるナイスタチンPKS）から誘導されるものであり、酵素活性または他の機能性活性をコードする第一領域と、および足場となるアミノ酸配列をコードする第２領域とを含有する（本明細書で定義された）ヌクレオチド配列によってコードされており、該方法は、（ａ）前記少なくとも１つの第一領域を修飾すること、あるいは（ｂ）前記少なくとも１つの第一領域を、異なるPKSをコードしているヌクレオチド配列からの足場をコードしている第２領域に取り込ませることを含んでなることを特徴としている。
【０１１２】
上述したように本発明の核酸分子に関して、第一領域は本発明のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１または２または35）のいずれかの部分（たとえば、ドメイン、モジュールまたはそれらの部分をコードしている）であってもよい。
また、（ｉ）上記で定義した修飾ナイスタチンPKSを調製する方法も与える。該方法は、上記で定義したように調製した核酸分子を宿主細胞内で、修飾ナイスタチンPKSが発現するような条件下で、発現させること（すなわち、そのような核酸分子を含むホスト細胞を培養または増殖させる）を含んでなる。また、(ii)そのようにして産生されたか、そのようにして得られうる、修飾ナイスタチンPKSをも与える。
【０１１３】
そのような修飾されたPKSによって産生された新しいポリケチドもまた、本発明の範囲内である。一般に、これらのポリケチドのグリコシル化された形態である新しい抗生物質も同様である（もっとも、あるものは異なる翻訳後修飾、たとえばヒドロキシル化または酸化によりグリコシル化されていなくても活性を有する）。
【０１１４】
これより、下記の限定的でない実施例において図を参照しつつ、本発明をより詳細に述べることにする。
【０１１５】
【実施例】
【０１１６】
【実施例１】
ナイスタチン（Nystatin）生合成遺伝子クラスターのクローニング：細菌株、プラスミドおよび増殖条件
この研究で用いられた細菌株およびプラスミドを表3に示す。この研究の中で発育させた新規の細菌株およびプラスミドをここで説明し、図3に示す。S.noursei ATCC 11455およびその変異体を、固体ISP2培地(Difco)および液体TSB培地（Oxoid）中で増殖させた。E.coli ET12567（pUZ8002）からStreprtomyces菌株への属間接合を、「ヒートショック」時間を5分短縮した以外は、FlettらがFEMS Microbial Lett.、155巻、223〜229頁（1997年）に記載したように実施した。50mg/mlの濃度のアプラマイシン（Apramycin）（Fluka）を用い、固体培地上のS.noursei被接合体を選択した。全DNA単離に先立って、S.noursei ATCC11455被接合体の接種のために、20μｇ／mlのアプラマイシンを添加したTSB液体培地を用いた。E.coli菌株を、SambrookらがCold Spring Harbor Laboratory（1989年）に記載したように増殖させ、形質転換させた。E.coli ET12567（pUZ8002）を、20μｇ／mlのクロラムフェニコールおよび50μｇ／mlのカナマイシン（kanamycin）を含有する培地上に保持した。
【０１１７】
【表１１】
0004902925.tif 000012
【０１１８】
Ａｍ−アプラマイシン、Ａｐ−アムピシリ、Ｎｅｏ−ネオマイシン、Ｔｈｉｏ−チオストレプトン、Ｋｍ−カナマイシン、Ｔｃ−テトラサイクリン
二次代謝産物の分析
培養は、グルコース水溶液を90gl-1、NH4NO3を2.5gl-1、コーンフラワーを3.0 gl-1、MgSO4・7H2Oを0.4 gl-1、KH2PO4を0.2 gl-1、CaCO3を7 gl-1、微量元素溶液を3ml含む1.3 1 SAO-23培地が最初に入っているApplicon 3-1培養器中で実施した。微量元素溶液（gl-1）：FeSO4・7H2O、5.0；CuSO4・5H2O、0.39；ZnSO4・7H2O、0.44；MnSO4・H2O、0.15；Na2MoO4・2H2O、0.01；CoCl2・6H2O、0.02；HCl、50。培養は、HCl（2M）およびNaOH（2M）でpHを6.5〜7.0に調節しながら、28℃で実施した。溶存酸素は、攪拌（300〜900rpm）および通気(0.25vvm)により飽和濃度の40％より高くなるように調節した。SAO-23培地を含む培養用の接種物（3 vol%）を振盪フラスコ（100mlの培地を含む、500mlの邪魔板付き三角フラスコ、200rpm）内のTSB培地（TSB、Oxoid CM129、37gl-1）中で、中、28℃で増殖させた。各振盪フラスコに0.2mlの胞子懸濁液を接種し、18〜20時間培養した。培養後、培養物のジメチルホルムアミド抽出物のHPLCによりナイスタチン（Nystatin）産生を分析した（Raatikainen, J.、 Chromatogr.、588巻、356〜360頁（1991年））。
DNA操作
プラスミド、ファージおよび全DNAの調製、エンドヌクレアーゼ消化、核酸連結ならびに分画を、前述（Sambrookら、1989年、上述；Hopwoodら、1985年、上述）したように実施した。QIAGENキット（QIAGEN GmbH）を用いてDNAフラグメントをアガロースゲルから単離し、ベーリンガーマンハイムのdigoxygeninキットを用いて標識化し、供給メーカーの手順書に準拠してサザンブロット分析に用いた。DNA配列の決定は、QIAGEN GmbH（ドイツ）で実施し、そのデータをGCGソフトウェア（Devereuxら、Nucleic Acid Res.、12巻、387〜395頁、1984年）で分析した。
S.noursei ATCC 11455ゲノム由来の、PSKをコードするDNAフラグメントのPCR-支援増幅およびクローニング
ナイスタチン生合成遺伝子をコードするDNAを得るために、S.noursei ATCC 11455遺伝子ライブラリーを、標識化されたPSKをコードするDNAを用いて探索した。DNAプローブを得るために、公知のモジュール型PKSのβ−ケトアシルシンターゼ（KS）およびアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン内の保存アミノ酸領域に相当する、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。増幅に用いられる縮重プライマーは、公知PKSのACPおよびKSドメイン中の保存アミノ酸モチーフに相当し、Streptomyces用のコドン使用表（Wright & Bibb、Gene、113巻、55〜65頁、1992年）に従って設計された。ACPヌクレオチドプライマー（センス）は、Glu (Asp) Leu Gly Phe (Leu, Val) Asp Ser Leuモチーフ（SEQ ID No.SEQ ID No.：21）に相当し、5'-GAG/C CTG/C GGC/GT/CTG/C GAC TCC/G CTG/C-3配列（SEQ ID No.：22）を有した。KSヌクレオチドプライマー（アンチセンス）は、Val Asp Thr Ala Cys Ser Serモチーフ（SEQ ID No.：23）に相当し、5'-G/CGA G/CGA G/ACA/ G/CGC C/GGT GTC G/CAC-3'配列（SEQ ID No.：22）を有した。S.noursei ATCC11455から単離された全DNAを、KSおよびACPオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、この生物のゲノム由来のDNAフラグメントについてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）−支援増幅用鋳型として用いた。モジュール型PKS上の該モチーフの相対位置から、得られたPCR生産物が約0.7kbの大きさであろうと想定された。50μlのPCR混合液は、0.1μg のS.noursei ATCC11455の全DNA、それぞれ25pmのACPおよびKSオリゴヌクレオチドプライマーdNTP（最終濃度350μm）、Expand High Fidelity PCRシステム（ベーリンガーマンハイム）の1 x PCR緩衝液、および同じ反応系の1.5 UのDNAポリメラーゼ混合物を含有していた。PCRは、以下のプログラムによりPerkin Elmer GeneAmp PCR System 2400で実施した。96℃（4分）で1サイクルの変性、94℃（45秒）および70℃（5分）で35サイクルの変性／アニーリング／合成、および72℃（7分）で1サイクルの最終アニーリング／伸長。この手法で得られた0.7kb DNAフラグメントは、E.coli DH5α内のpUC18ベクターでSure Clone Ligationキット（Pharmacia）を用いてクローン化された。得られた組換えプラスミドの1つ3.5kbのpPKS72をDNA配列分析した。
【０１１９】
Escherichia coliベクター、pUC18中における後のクローニングおよび得られた0.7kbのPCR生産物のDNA配列決定は、続いて概念的翻訳（conceptual translation）およびデータベース探索が実施されそれはPKSタイプIの一部分をコードすることが確認された。このDNAフラグメントは、ファージベクターDASHIII（下記参照）中に構築されたS.noursei ATCC11455遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用い、λDASHII-N1と称される１つの組換えファージ（該プローブにハイブリダイズする）が単離された。以下、さらに説明するように、DASHII-N1をさらにプローブを形成するために用いた。
S.noursei ATCC11455遺伝子ライブラリーの構築およびスクリーニング
S.noursei ATCC11455遺伝子ライブラリーを、供給メーカーの指示書に従ってファージλベクターDASHII（Stratagene）に構築させた。S.noursei ATCC11455の全DNAを、上述のHopwoodら（1985年）に記載されているように単離し、特に上述のSambrookら（1989年）に記載されているように、Sau3 AI制限酵素を用いて部分的に消化し、スクロース勾配で分画した。13〜17kbの大きさのフラグメントを含むS.noursei ATCC11455 DNAの画分を、BamHI制限酵素によって消化されたDASHIIベクターのアームとのライゲーション（ligation）に用いられた。E.coli XL1-Blue MRA (P2)（Stratagene）を遺伝子ライブラリーの構築および伝播のための宿主として用いた。
【０１２０】
メーカーの指示書に従って、遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いられるDNAフラグメントを、QIAGENキット（QIAGEN GmbH、ドイツ）を用いてアガロースゲルから精製し、ベーリンガーマンハイム（ドイツ）のdigoxygenin（DIG）キットを用いて標識化した。プローブを、ライブラリーのスクリーニングに用い、関係する組換えファージを発見した。
【０１２１】
【表１２】
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【０１２２】
プローブの説明
1. PKS72プローブ。制限酵素EcoRIおよびHindIIIを用いて、pPKS72プラスミド（上記参照）から単離された0.7kbのDNAフラグメントをPKS72プローブとして用いた。
2. E12.1プローブ。、組換えファージN1の挿入断片(insert)に由来する2.6kbのBamHIフラグメント（その左隣接領域(flanking region)を表わす）をpGEM3Zf(-)にサブクローン化して、プラスミドpGEM(B2.6)-1を得た。このプラスミドをEcoRI/AvaIにより消化し、該N1のDNA挿入断片の左末端に対応する0.55kbのフラグメントを精製し、E12.1プローブとして用いた。
3. E4.7.2プローブ。組換えファージN1由来の4.7kbのEcoRIフラグメント（その右側の隣接領域を示す）を、pGEM3Zf(-)にサブクローン化して、プラスミドpGEM(E4.7)-1を得た。このプラスミドをEcoRI/HindIIIにより消化し、該N1のDNA挿入断片の右末端に対応する1.5kbのDNAフラグメントを精製し、E4.7.2と名づけた。
4. L42E9.1プローブ。組換えファージN42中のDNA挿入断片の左側隣接領域を示す9.0kbのEcoRIフラグメントを、pGEM3Zf(-)にサブクローン化して、プラスミドpH42E9.1を得た。このプラスミドをEcoRI/BamHIにより消化し、該N42のDNA挿入断片の左側隣接に対応する0.6kbのフラグメントを精製し、L42E9.1プローブとして用いた。
5. L58B1.0プローブ。組換えファージN58のDNA挿入断片の右側隣接領域を示す3.0kbのEcoRI断片を、pGEM3Zf(-)にサブクローン化して、プラスミドｐGEM(E3.0)-58を得た。後者のプラスミドから、該N58のDNA挿入断片の右末端に位置する1.0kbのBamHIフラグメントを精製し、L58B1.0プローブとして用いた。
ナイスタチン生合成遺伝子クラスターを用いた遺伝子分裂実験
DASHII-N1組換えファージから単離されたBamHIのDNAフラグメント（4.2kb）を、まずE.coli中のpGEM3Zf(-)ベクターにクローン化し、プラスミドpGEM4.2-1を得た。クローニングされたフラグメントの両末端のDNA配列を決定し、データベースの探索後、PKSタイプIをコードすることを見出した。pGEM4.2-1にクローン化されたS.nourseiのDNAフラグメントを、制限酵素EcoRIおよびHindIIIを用いてこのプラスミドから切り出して、これをベクターpSOK201（表3および図3を参照）に由来する3.0kbのEcoRI/HindIIIフラグメントと連結させ、E.coliに形質転換させた。pKO(4.2)-1と名づけられたプラスミドDNAを、形質転換体から回収した後、「細菌株、プラスミドおよび増殖条件」の実施例1に記載したような接合によってS.noursei ATCC 11455に移行させた。
【０１２３】
pKO(4.2)-1は、S.noursei ATCC 11455中では複製できないので、それは、相同組換え(homologous recombination)を介してS.nourseiのゲノムに統合される自殺ベクター(suicide vector)として機能するであろうと仮定した。そのような組換えの結果として、S.noursei ATCC 11455ゲノム中のPKS遺伝子に対して、pKO(4.2)-1にクローン化された4.2kbBamHIフラグメントが内部にあるものと想定し、該PKS遺伝子は、そのコード領域の分裂によって不活性化されているであろう。3つのS.noursei被接合体(transconjugant)ゲノムへのpKO(4.2)-1の統合を、pGEM4.2-1由来の標識化BamHIフラグメント(4.2kb)をプローブとして用いるサザンブロット分析により確認した。そのゲノムに統合されたpKO(4.2)-1を担持するS.nourseiの分裂変異体の1つを、親株のATCC11455（「二次代謝産物の分析」の方法に関する上記を参照）と平行して、ナイスタチン産生について試験した。後者は期待したレベルでナイスタチンを生産することを示したが、pKO(4.2)-1の分裂変異体においてはナイスタチン産生は検出されず、よってナイスタチン生合成に対する同定されたPKSの必要性が確認された。
ナイスタチン生合成遺伝子クラスターのクローニング
ナイスタチン生合成用の遺伝子クラスター全体をクローン化するために、組換えファージDASHII-N1（N1）内にあるS.noursei DNA挿入断片の末端から誘導され、次いで組換えファージと部分的に一致することが見出されたDNAフラグメントを、遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた（プローブに関する上記を参照）。このふるいわけが、図4に示すように、S.noursei ATCC11455ゲノム（全体で約98kb）の2つの領域（それぞれSEQ ID No.1および2）から構成される組換えファージN14、N41、N42、N44、N45、N48、N58、N64、N69およびN76の単離という結果になった。組換えファージN64から誘導されたEcoRI/BamHIのDNAフラグメント（4.3kb）を用いた遺伝子分裂実験（上述と同様に実質的に実施された）で、第二領域（SEQ ID No.2）もナイスタチン生合成遺伝子をコードすることを確認した。
ナイスタチン生合成遺伝子群のDNA配列分析
上述の組換えファージから由来する完全なるDNA挿入断片を、XbaIまたはEcoRIのいずれかのフラグメントとして、E.coli宿主内のpGEM3Zf(-)ベクターにサブクローン化し、これらフラグメントの両方のDNA鎖についてヌクレオチド配列を決定した。ナイスタチン生合成遺伝子クラスターの2つの領域（それぞれSEQ ID No.1および2）から構成されるDNA配列についてコンピュータ支援解析をした結果が、図４に示され、表４に列挙した遺伝子の同定となった。
【０１２４】
【表１３】
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【０１２５】
ＰＫＳタイプＩをコードする３つの完全遺伝子（nysA、nysBおよびnysC）（SEQ ID NO:1中）および１つの不完全遺伝子（nysI）(SEQ ID NO:2中)が同定された。当該４つの遺伝子でコードされる生成物のアミノ酸(aa)配列が、公知のＰKSタイプＩのaa配列と比較して解析された（分子の特徴は上記表２も参照）。４つのタンパク質は、すべてリファマイシンおよびラパマイシンPKSに高水準の相同性を表すので（AparicioらGene, v. 169: 9-16, 1996、TangらGene, v.216: 255-265, 1998）、ナイスタチンPKSに推定される機能の解析は、前者に対する比較に基づいた。1366 aaのNysAタンパク質は、KSS、AT、DH、KRおよびACPドメインから構成されるPKSの１つのモジュールをコードする。KSSドメインにおいて保存システイン残基を欠くことは、このモジュールが縮合反応を行うことができず、このため、ナイスタチン・ポリケチド主鎖骨格生合成開始のためのアセテート スターター単位を提供するローディングモジュール（負荷モジュール）を表していることを示唆している(Bisangら、Nature,v. 401:502-505, 1999)。NysBの3192 aa配列の解析は、KS、AT、KR、ACPおよび明らかに不活性なDHドメインを有する２つのモジュールを含むことを示した。両NysBモジュールに同定されたATドメインは、メチルマロニルCoA-特異的ATドメインについて特徴的な特性を表わしている (HaydockらFEBS Lett., v. 374: 246-248, 1995)。NysBタンパク質のこの特徴は、ナイスタチン分子中に組み込まれた２つの近接するメチルマロニルCoAのみが最初の２つの伸長単位であるために、ナイスタチン・ポリケチド主鎖骨格生合成経路に関係する第１番目および２番目のモジュールを含むことを示唆している。11096 aaのNysCタンパク質は、我々が知る限りこれまでに見出された最も大きい細菌性ポリペプチドであり、ナイスタチン・ポリケチド鎖生合成（C21-C32の取り込み）における縮合段階３〜８を明らかに担う６つのモジュールから構成される。NysCタンパク質のモジュール５はERドメインを含み、これは、C29とC28との間の二重結合の還元を説明できる（図１参照）。モジュール５の他に、NysCにおける他の全てのモジュールは、これらがすべてKS、AT、DH、KRおよびACPドメインを含む点において類似している。モジュール4および5におけるKRドメインは、aa配列レベルで100% 同一であり、これらのドメインをコードするDNA配列レベルで99.9%同一であることがわかった。こうして、モジュール４および５におけるKRドメインは、おそらく、進化過程において比較的最近になって重複化された一例を表す。NysIのC末端側で切断された7066 aaのタンパク質（C末端でaa配列情報が未だ喪失している）は、少なくとも４つの完全モジュールから構成される。これらモジュールは、全てKS、AT、DH、KRおよびACPドメインを含んでいるが、３つのモジュールにおけるDHドメインは明らかに不活性であり、NysI PKSの知られた部分は伸長ステップ９〜12（C13-C20の組み込み）に関与することを示唆している。この推定は、さらにモジュール11中のATドメイン（配列類似性に基づく）が、メチルマロニルCoAエクステンダー（extender）に特異的であり、一方、NysA、NysCおよびNysIにおける他のすべてのATドメインはマロニルCoAに特異的であるという事実により支持される。こうして、モジュール１１中のATドメインは、おそらくナイスタチン・ポリケチド主鎖骨格のC16位メチル基の存在（後に酸化されてC16に結合したカルボキシルを与える）の原因となる（図１参照）。
【０１２６】
nysC遺伝子の下流に、チオエステラーゼ（おそらくナイスタチンPKSからの成熟ポリケチド鎖放出に関わる）のためのコード配列nysEが見出された。nysR1、nysR2およびnysR3遺伝子がnysEの下流に見つけられた。これらの遺伝子による生成物は、想定される転写レギュレーターに対して相同である。NysR1(966aa)、NysR2(953aa)およびNysR3(927aa)タンパク質はは、すべてそれらのＣ末端で、LuxRタイプの推定ヘリックス-ターン-ヘリックス(HTH)−DNA結合モチーフを含むことが見出だされた。それに加えて、NysR1は明瞭なATP/GTP結合モチーフを含み、NysR3はN末端に「ロイシンジッパー」（推定DNA結合）モチーフを含む。NysR1をコードする遺伝子は、遺伝子の始まりに近接した希TTAコドン（Leu11）を含むことが発見され、S. nourseiではNysR1発現が、bldA様の遺伝子によって、翻訳レベルで調節されているかも知れないことを示唆している（White&Bibb, J. Bacteriol, v. 179: 627-633, 1997）。
【０１２７】
ナイスタチン生合成におけるnysR1遺伝子の関与を確認するため、遺伝子分裂実験を、nysR1コード配列に対して内部にある1379bpApaIDNAフラグメントを使用して行った。nysR1コード配列に対して内部にあり、しかもSEQ ID NO 1のnt 51531-52910を表す1379bp ApaIDNAフラグメントは、pGEM11Zf(-)ベクターのApaIサイトにクローン化され、組換えプラスミドpNRD1を与えた。pNRD1から分離された1430 bp EcoRI/HindIII DNAフラグメントは、pSOK201の3.0kb EcoRI/HindIII フラグメントと連結され、その結果としてpNRD2ベクターとなった。後者は、続いてE. coli ET12567(pUZ8002)から接合を介して、S. noursei ATCC11455におけるnysR1遺伝子分裂に使用された。
【０１２８】
ｎysR1分裂変異体によるナイスタチン産生を検討したところ、ナイスタチンを生成する能力がないことを示した。しかしながら、nysR1分裂変異体から観察された表現形質は、nysR1とともに転写しうるnysR2およびnysR3遺伝子上の変異の極性効果を反映するものであることがわかる。
ｎysR3の下流に、遺伝子nysR4、nysR5、ORF1およびORF2がみつかった。210 aaのｎysR4遺伝子産物（これは、後にSEQ ID No. 35におけるヌクレオチド120628での上流開始コドンから266 aa発現であることを見出された）は、応答レギュレータータイプである転写アクチベーターとの類似性を示し、中心に位置したATP/GTP結合モチーフおよびC-末端に位置したLuxR型のHTH DNA結合モチーフを含む。253 aaのNysR5タンパク質は、転写リプレッサーとの類似性を示し、しかもＮ末端で推定DeoR型HTH DNA結合モチーフを含む。ｎysR4およびnysR5遺伝子の産物は、ナイスタチン生合成遺伝子近傍への局在に基づいてナイスタチン生合成の調節に関係している可能性があるようである。ｎysR5の下流に位置し、かつ反対方向へ転写されるORF2は、転写アクチベーターと類似性を示し、かつ中心に位置した、AsnC型の推定HTH DNA結合モチーフを有する354 aaペプチドをコードする。この遺伝子がナイスタチン生合成の調節に関係しているかどうか明白ではない。は、ORF2のすぐ上流に位置するORF1が推定ペプチターゼをコードするからである。ORF2はむしろORF1の調節に関与することがありそうであるが、その確認のためにはORF2不活性に関する実験が要求されるようである。ペプチターゼをコードする遺伝子（ナイスタチン生合成における役割は何ら与えられていないが）が、配列決定された領域の右側隣接部上に見いだされたという事実は、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターの右側境界が同定されたことを示唆する。
【０１２９】
上記遺伝子を包含する配列決定された領域の左側に、nysAの上流に位置し、かつ、nysAと反対方向に転写される２つの遺伝子が同定された（図４）。506 aaのnysD1遺伝子産物は、ほ乳類からのUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼに対してかなりの相同性を示す。この酵素は、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ系統群に属し、毒性であり得る生体異物の除去プロセスにおいて、それらのグリコシル化の方式で関与している。ｎysD1は、ナイスタチン ポリケチド主鎖骨格へのデオキシ糖部分（ミコサミン）の付加に関わっているグリコシルトランスフェラーゼを示すようである。ｎysD2の産物は、デオキシ糖の生合成プロセスにおいてデオキシ糖へのアミノ基の付加に関与するペロサミンシンテターゼとトランスアミナーゼに対して高度の相同性を示す。こうしてnysD2は、おそらくミコサミン生合成に関係するアミノトランスフェラーゼを示す。
【０１３０】
PKSタイプIをコードするｎysIに加えて、４つの他の遺伝子が、S. noursei ATCC11455のナイスタチン生合成遺伝子クラスターの第２の配列決定済み領域に（SEQ ID NO.2）同定された（図４）。ｎysD3遺伝子によってコードされた344 aaタンパク質は、デオキシ糖形成に必要とされるGDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼに対して高い相同性がある。NysD3タンパク質が、S. noursei ATCC11455におけるナイスタチン ミコサミン部分の生合成に関与していることはあり得る。ｎysＨおよびnysG遺伝子産物である、584 aaおよび605 aaは、それぞれ、ABSファミリーのトランスポーターに高度の類似性を示す。NysＨおよびNysGポリペプチドは両方とも、それらのＣ末端に明瞭なABCトランスポーターの標識、中心に局在したATP/GTP結合モチーフ、およびN末端に局在した膜貫通領域を含む。これらの２つのタンパク質は、おそらくナイスタチンを産生する生物からATPに依存して活発に放出することに責を負い、こうして、疎水性ナイスタチン分子によって膜が塞がれる危険を排除する。nysF遺伝子の産物である245 aaポリペプチドは、4'-ホスホパンテテイントランフェラーゼへの相同性を示す。後者の酵素は、PKS類のACPドメインにおける翻訳後修飾の原因となり、かつ、その充分な機能性が要求される（CoxらFEBS Lett., v. 405:267-272, 1997; KealeyらProc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 95:505-509, 1998）。このため、NysFタンパク質が、ナイスタチンPKSの翻訳後修飾において機能し、かつ、ナイスタチン生合成に要求されることはありそうなことである。
【０１３１】
【実施例２】
新規ポリエン抗生物質の生成に導くナイスタチンPKS遺伝子の遺伝子的処置
ナイスタチンは、３〜８個の共役２重結合をマクロラクトン環内に有することを特徴とするポリエン マロクライド化合物の群に属する。ナイスタチン自体は、テトラエンであり、C20とC27の間に４つの共役二重結合を有する。またナイスタチン分子上には、前記４個の共役二重結合セットからC28-C29により離されている、２個の共役二重結合のセットがC30とC33との間にある（図１参照）。NysC PKSのコンピューター支援解析から、このタンパク質中のモジュール５におけるERドメインは、C28とC29との間における二重結合の還元に関与していることが明らかになった。かくして、この特定ドメインが不活性となることで、C28とC29との間に二重結合を有する化合物を得ることは理論的に可能となり、ナイスタチン分子中に共役二重結合の２セットが加入し、よってヘプタエン マクロライド化合物が創造される。
【０１３２】
NysＣのモジュール５におけるERドメインを不活性にするために、nysＣ遺伝子のなかで"インフレーム"欠損方法が選択された。S.nourseiのNsyCをコードするゲノム領域における遺伝子置換のため、ベクターpERD4.2の構築は、以下のようにされた：
NysCのモジュール５におけるERドメインの不活性
NysCのモジュール５におけるERドメインＣ末端部分についてのコード配列、およびモジュール５(nt32174-32559)におけるKRドメインＮ末端部分についてのコード配列を表わしている394bp DNAフラグメントについてのPCRに基づく増幅が実施された。オリゴヌクレオチドプライマーERD1(5'-GTTGGTACCCCACTCCCGGTCCGCAC-3'、センス)(SEQ ID NO.25)はKpnI制限酵素切断部位を創出するために、5'エンド上の付加ヌクレオチドとともに、nt 32174-32190を含むnysC遺伝子のヌクレオチド配列から選択された。オリゴヌクレオチドプライマー、ERD2 (5'-CCAGCCGCATGCACCACC-3'、アンチセンス(SEQ ID NO.26))は、nysＣをコードするDNA配列から選択され、かつSphI制限酵素切断部位を有する、nt32559-32542(SEQ ID NO.1)間のDNAセグメントを含んでいた。結果として得られるPCRフラグメントは、KpnIおよびSphIで消化され、1828 bp BamHI/KpnI DNA フラグメント(SEQ ID NO.1のnt 29224-31052)および1273 bp SphI/EcoRI DNA フラグメント(SEQ ID NO.1のnt 32548-33821)ともに、EcoRI/BamHIで消化されたpGEM3Zf(-)ベクター中に連結された。その連結混合体はE.coli. DH5αに形質転換され、pERD4.1と命名される6.7kbの組換えプラスミドが形質転換体の１つから回収された。後者は、nysCコード領域のnt 31052とnt 32174との間に内部欠損を有する、nt 29224-33821のSEQ ID NO. 1DNA配列を表すハイブリッドDNAフラグメントを含んでいた。この欠損は、DH-ERドメイン間リンカーの部分および推定NADP(H)結合サイトを含むERドメインのＣ末端部分のため、コード領域（nysＣのaa 4837から5208）を除去した。
【０１３３】
S.nourseiにおけるNysC ER4ドメインの不活性化用のベクターを構築するため、組換えDNAフラグメントがpERD4.1からEcoRIおよびHindIII制限酵素を用いて切り出されさらにこのものはpSOK201からの3.0kb EcoRI/HindIII DNAフラグメントに連結され、該連結混合体はE.coli. DH5αに形質転換された。6.5kbのプラスミドpERD4.2が、その形質転換体の１つから分離され、S. noursei ATCC11455における遺伝子置換手順を実施するために使用された（以下参照）。この手順の後に選択された組換えS.noursei菌株はERD44およびERD48と命名された。
【０１３４】
後者のプラスミドは、S.noursei ATCC11455中に、属間接合によって導入され、１つのトランス接合体、S.noursei(pERD4.2)は、さらなる操作のために選択された。S.noursei (pERD4.2)のゲノム中にpERD4.2の正しい様式による組込みが、サザンブロット解析によって確認された後、二次乗換えイベント（second crossover event）用の選別が、Sekurovaら FEMS Microbil Lett, v.177:297-304, 1999  (および下記参照)に記載されたようにして行われた。
遺伝子置換操作 この方法は、前記Sekurovaら、1999に記載されたようにして行われる。
【０１３５】
上記のように遺伝子置換用に構築されたプラスミドは、S.noursei中にE.coli ET12567(pUZ8002)からの接合によって導入された。相同的組換えを通して、染色体内に組み込まれたプラスミドを担持するクローンの１つは、抗生物質フリーのISP2寒天培地の上で、３巡の胞子形成を行い、３巡後の子孫は、抗生物質抵抗マーカーの欠損がテストされた。適当なプローブを用いて、いくつかの抗生物質感受性菌株から分離された全DNAのサザンブロット解析が、所望の変異を確認するために使用された。
【０１３６】
選別マーカーを喪失し、かくして二次乗換えイベントが行われた８つのコロニーのうち、４つはサザンブロット解析により、野生型遺伝形質に戻ることを示された。２つの菌株は、ナイスタチン遺伝子クラスターの実質的部分を明らかに欠いている大きな欠損を含むことが示され、他の２つの変異体は、所望の1116bp欠失（ERD44）、あるいは期待したより多少大きい欠失(ERD48)のいずれかを含んでいた。菌株ERD44およびERD48によるポリエン抗生物質産生の解析は、それらがナイスタチンを産生しないことを示した。その代わりに、ERD44は、期待していたように、ヘプタエンに特徴付けられるUVスペクトルピークを有するポリエン化合物を生じることが示された。驚くべきことに、ERD48変異体は、NysCタンパク質からのモジュール５全部のインフレーム欠損と一致するのであるが、（分光学的解析により）ヘキサエンのポリエンを生じることが示された。ERD48変異体中で起ったる事象をさらに詳細に調べるために、DNAフラグメントが、S.noursei ERD48変異体のゲノムからPCR増幅された（これは、かかる欠失の推定産物を包含するであろう。）（以下参照）。
S.noursei ERD48ゲノムからのPKSをコードするDNAフラグメントのＰＣＲアシスト増幅およびクローニング
S.noursei ERD48における変異体nysC遺伝子部分の増幅を目的としたPCR反応は、それぞれSEQ ID NO.1のDNA配列のnt 24744-24760およびnt 33818-33833に相当する、オリゴヌクレオチドプライマーKR48.1（センス、5'-CCG CGT CGG ATC CGC CGA C-3'）(SEQ ID NO: 27)およびKR48.2(アンチセンス、5'-AGC CTT CGA ATT CGG CGC C-3')(SEQ ID NO: 28)を用いて行われた。50μlのPCR混合物は0.1μgのS.noursei ERD48全DNA、25pmの各KR48.1およびKR48.2オリゴヌクレオチドプライマー、dNTP（最終濃度350μm）、「エキスパンド・ハイフィデリティPCRシステム」（Boehringer Mannheim）からの1 x PCRバッファー、および同システムからの1.5UのDNAポリメラーゼ混合物を含む。PCRは、下記プログラムを用いるパーキンエルマーGeneAmpPCRシステム2400で行った：96℃（４分）で１サイクル変性、94℃（４５秒）および70℃(10分)での35サイクルの変性/アニーリング/合成および、および72℃(10分)での１フルサイクルの最終アニーリング/伸長。この手順で得られた2.7kb DNAフラグメントは、EcoRIおよびBamHI制限酵素を使用して消化し、これを、同じ酵素を用いて消化されたpGEM3Zf(-)ベクターDNAに連結させた。該連結混合体は、形質転換によってE.coli DH5αに導入され、5.9kbのプラスミドpKR48が形質転換体の１つから分離され、DNA配列解析が行われた。
【０１３７】
pKR48における挿入物のDNA配列は、SEQ ID NO. 29（ここではERD48 seqとして同定される）中に存在している。その翻訳産物は、SEQ ID NO. 30に示され、899aaタンパク質である−SEQ ID NO. 29および30の分子特徴は以下に示される：
【０１３８】
【表１４】
0004902925.tif 000015
【０１３９】
この2700bpフラグメントのクローニングおよびＤＮＡ配列決定により、該フラグメントがハイブリッドＰＫＳモジュールの一部をコードすることが確認され、このことは、ＮｙｓＣのモジュール４および５の相同性の高いＫＲドメインをコードするＤＮＡ配列間の組換えと矛盾しない。この組換えによって、モジュール４のＫＲおよびＡＣＰドメインのＣ末端部、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨおよびＥＲドメイン、およびモジュール５のＫＲドメインのＮ末端部をコードするDNA配列が明らかに削除され、結果としてＮｙｓＣ ＰＫＳからモジュールが一つ完全に失われる。
【０１４０】
Ｓ.ｎｏｕｒｓｅｉ ＥＲＤ４４およびＥＲＤ４８から生成された化合物を予備的に分析した。ＥＲＤ４４変異体により生成されたヘプタエン系化合物は、抗真菌活性試験で使用された菌であるカンジダアルビカンス（Candida albicans）に対して高い抗真菌活性を有することがわかった。この時点では、上記化合物（仮にＳ４４とする）は、まだ充分に精製されておらず、またその正確な濃度も決定することが困難であるため、該化合物の抗真菌活性を正確にアッセイすることは不可能である。しかし、ナイスタチン、Ｓ４４、およびアムホテリシン（ヘプタン系マクロライド）に特有な波長における紫外線吸光度に基づいて概算すると、Ｓ４４はナイスタチンと比較して４〜５倍高い抗真菌活性を有しているようである。ＥＲＤ４８変異体から産生された化合物を高速液体クロマトグラフィーで分析すると、この菌株（混合体をＳ４８とする）によって、保持時間の異なるヘキサエン系マクロライドが少なくとも５つ生成されることがわかる。これは恐らく、Ｃ１９でのグリコシリル化、Ｃ１０での水酸化、またはＣ１６でのメチル基の酸化による、マクロラクトン環の修飾状況の違いを示していると思われる。この予想の根拠は、マクロラクトン環のサイズ縮小が、修飾する酵素の新しい基質に対する低い親和性につながることは大いにあり得るためである。
【０１４１】
Ｓ４８混合体の抗真菌活性を試験した結果、該抗真菌活性はナイスタチンの抗真菌活性の約１０％であることがわかった。検出された抗真菌活性が、環修飾酵素によって完全に修飾されたＥＲＤ４８によって生成されるＳ４８混合体中の化合物の一つのみから由来するようである。よって、精製前にこの化合物の相対的な抗真菌活性を評価することは不可能である。いくつかのヘキサエン抗生物質は抗真菌活性とともに抗菌活性を有することが知られている（Ｃｉｆｔｃｉら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ、ｖ．３７：８７６−８８４、１９８４）。よって、ＥＲＤ４８変異体により生成されるヘキサエン系化合物を、抗菌剤の製造に使用することが可能である。ＥＲＤ４４変異体およびＥＲＤ４８変異体における新ポリエン化合物の産生につながるＮｙｓＣタンパク質の変化、ならびに該変異体のマクロラクトン環の推定構造を図５に示す。
ＮｙｓＣのモジュール８におけるＤＨ８ドメインの不活性化
ナイスタチンＰＫＳを遺伝子的に操作する可能性を、さらにＮｙｓＣのモジュール８におけるＤＨドメインを不活性化することにより実証した。プラスミドｐＮＰＲ１．１とＮｙｓＣ遺伝子とを組み換えると、ＤＨ８ドメインをコードするＤＮＡ領域がフレーム単位で削除される結果となる。上記プラスミドｐＮＰＲ１．１は下記のように構成した。
【０１４２】
３９８９ｂｐのＫｐｎＩ／ＢｃｌＩ ＤＮＡフラグメント（領域１ＤＮＡ配列（SEQ ID No.１）のｎｔ４３００４〜４６９９３）および２４０９ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメント（同上のｎｔ４７６８０〜５００８９）を、組換えファージＮ１のＤＮＡから切り出し、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）ＤＮＡベクターと連結した。該連結混合体をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、形質転換体の一つから組換えプラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ１を分離した。該組換えプラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ１は、領域１ＤＮＡ配列（SEQ ID No.１）のｎｔ４３００４〜５００８９を表すハイブリッドＤＮＡフラグメントを含んでおり、ｎｔ４６９９３からｎｔ４７６８０の間は欠失していた。この欠失により、ＮｙｓＣポリペプチドのａａ１０１５０から１０３７８をコードするＤＮＡ領域が除去され、それによりモジュール８のＤＨ８ドメイン、およびモジュール８のＤＨ８−ＫＲドメイン間リンカーが影響される。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉにおけるＮｙｓＣのＤＨ８ドメインを不活性化するためのベクターを構築するため、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、組換え型ＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ−ＮＰＲ１から切断し、ｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントと連結し（図３および表３参照）、該連結混合体をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。９．４ｋｂのプラスミドｐＮＰＲ１．１を形質転換体の一つから分離し、上記Ｓｅｋｕｒｏｖａら、１９９９に準拠した方法によりＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５の遺伝子組換えを実施する際に使用した。
【０１４３】
上記方法の後に選択された組換えＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株は、ＮＰＲ１．１と名づけた。このＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ組換え菌株ＮＰＲ１．１は、サザンブロット法で分析した結果、ＮｙｓＣのＤＨ８をコードする配列において好ましい欠失の形態を有することがわかった。前記Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ組換え菌株ＮＰＲ１．１の培養物から抽出した抽出物中にある二次代謝生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分析したところ、予想されていたマクロライド化合物の存在が明らかになった。これらの化合物の相対移動度はナイスタチンとは異なり、上記抽出物からは、ナイスタチンに特有な紫外線スペクトルは検出されなかった。分析により、ＮＰＲ１組換え体によって新しく産生された分子内において、ナイスタチン・アグリコン上の４つ一組の二重結合が乱されており、さらにマクロラクトン環がＣ２３に結合した水酸基を含有することが示された（表５）。ＮＰＲ１培養抽出物を用いてなされたカンジダ・アルビカンスに対するバイオアッセイが極めて低い抗真菌活性を示したため、上記化合物をＮＰＲ１から精製する試みはなされなかった。しかし、このＮＰＲ１変異体は、ナイスタチンＰＫＳを用いた更なる操作に有用に使用され得る可能性がある。
モジュール７（ＮｙｓＣ）におけるＫＲドメインの不活性化
４４０４ｂｐのＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩを用いて、組換えファージＮ１のＤＮＡから切り出した。ＥｃｏＲＩ部位は、ファージＮ１のポリリンカーにおいて、領域１ＤＮＡ配列（SEQ ID No.１）のｎｔ３８３９８において開始するＳ．ｎｏｕｒｓｅｉＤＮＡ挿入フラグメントの左側に位置し、一方ＳｍａＩ部位は領域１ＤＮＡ配列のｎｔ４２８０２に対応する。３３０３ｂｐのＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩを用いて、同じ組換えファージのＤＮＡから切り出した。ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位は、それぞれ領域１ＤＮＡ配列（SEQ ID No.１）のｎｔ４３０９９およびｎｔ４６４０２に位置していた。両ＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）ＤＮＡと連結し、該連結混合体を大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。１０．７ｋｂのプラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ２を形質転換体の一つから回収した。該プラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ２は、領域１ＤＮＡ配列（SEQ ID No.１）のｎｔ３８３９８〜４６４０２を表す組換えＤＮＡフラグメントを含有しており、またｎｔ４２８０２からｎｔ４３０９９の間は欠失していた。この欠失により、モジュール７のＫＲドメインにおいて推定ＮＡＤＰ（Ｈ）結合部位を包含するＮｙｓＣタンパク質の、ａａ８７５３から８８５１をコードするＤＮＡ領域が除去される。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉにおけるＮｙｓＣのＫＲ７ドメインを不活性化するためのベクターを構築するため、組換えＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＧＥＭ−ＮＰＲ２から切り出し、ｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントと連結し、該連結混合体をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。１０．７ｋｂのプラスミドｐＮＰＲ２を形質転換体の一つから分離し、上記Ｓｅｋｕｒｏｖａ ら、１９９９に準拠した方法によりＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５の遺伝子組み換えを実施する際に使用した。上記方法の後に選択された組換えＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株は、ＮＰＲ２．１と名づけた。
【０１４４】
前記Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ組換え菌株ＮＰＲ２．１の培養物から抽出した抽出物中にある二次代謝生成物をＴＬＣで分析したところ、予想されていたマクロライド化合物の存在が明らかになった。これらの化合物の相対移動度はナイスタチンとは異なっており、さらにＮＰＲ１変異体から産生された代謝生成物とも異なっていた。上記抽出物からは、ナイスタチンに特有な紫外線スペクトルは検出されなかった。ＮＰＲ２．１組換え体によって新しく生成された分子内において、ナイスタチン・アグリコン上の４つ一組の二重結合が乱されており、さらにマクロラクトン環がＣ２５においてケト基を含有することが示された（表５）。上記化合物をＮＰＲ２．１から精製する試みはなされず、また、ＮＰＲ２．１培養抽出物を使用しての抗真菌活性を検査するバイオアッセイは行われなかった。上記変異体は、生成する代謝物の利点を有するだけでなく、ナイスタチンＰＫＳを用いた更なる操作に使用することができる。
変異ＮｙｓＣタンパク質ＮｙｓＣ＿ＤＨ８のモジュール５におけるＥＲドメインの不活性化
第二の突然変異体を、モジュール８において不活性ＤＨドメイン（ＮｙｓＣ＿ＤＨ７）を有するＮｙｓＣタンパク質に導入するため、プラスミドｐＥＲＤ４．２をＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ変異体ＮＰＲ１．１に導入し、上記文献Ｓｅｋｕｒｏｖａら、１９９９の記載に準拠して遺伝子組換え作業を行った。これにより、ＮｙｓＣの配列をコードするＥＲ５およびＤＨ８中に変異を有する、組換えＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株ＥＲＤＨ９が生成された。この二つの変異の組合せにより、Ｃ２３に水酸基を有するペンタエン系ナイスチン誘導体が生合成されると推測される（表５）。ＥＲＤＨ９培養抽出物を予備分析したところ、数量的にはその紫外線スペクトルを正確に同定することは困難であるが、上記菌株によってポリエン化合物が産生されていることが確認された。この予備分析の結果により、さらに上記化合物が好ましくは培養上清に蓄積され、野生型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉにより産生されるナイスタチンは大部分が菌糸体と結合していることがわかった。このことは、ナイスタチン分子上に水酸基を付加することが、そうした化合物の水溶性増加の要因であるという仮説と合致する。上記新規化合物の精製はなされず、また、バイオアッセイも行われなかった。
【０１４５】
本発明者は、現在のところ突然変異体ＮＰＲ１．１、ＮＰＲ２．１およびＥＲＤＨ９の生成物の構造を確認できていない。
【０１４６】
【表１５】
0004902925.tif 000016
【０１４７】
【実施例３】
ナイスタチンの大量生成につながる調節遺伝子の操作
Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５における、ＰｅｒｍＥ*プロモーター制御下のＮｙｓＲ１の発現
ＮｙｓＲ１遺伝子がナイスタチン生合成遺伝子の転写アクチベーター（活性化因子）をコードすることをさらに確認するため、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５においてＰｅｒｍＥ*プロモーター制御の下、ＮｙｓＲ１遺伝子を発現させた（Ｂｉｂｂら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖ．１４：４３３−５４５、１９９４）。まず、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５ゲノム内に安定的かつ効率的に組込むためのプラスミドｐＳＯＫ８０４を調製した（図２）。上記調製は、ｐＳＥＴ１５２（上記文献Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）からの３．０ｋｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントと、部位特異的組込みに必要な機能を有するバクテリオファージＶＷＢ（上記文献Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔら、１９９８）からの２．３ｋｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとを連結することによりなされた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）からのｐＳＯＫ８０４をＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１４５５と接合したところ、このプラスミドは、特に３〜１０-6の頻度において、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉゲノムの１サイト中に特異的に組込まれることが示された。
【０１４８】
ｐＳＯＫ８０４において、ＰｅｒｍＥ*プロモーター制御の下にＮｙｓＲ１遺伝子をクローンするため、以下の手順を採用した。ＮｙｓＲ１のＮ末端部を、組換えファージＮ１ＤＮＡテンプレートから、オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ１．１（センス）５'−ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＣＧＴ−３'（SEQ ID No.３１）およびＮＲ１．２（アンチセンス）５'−ＧＧＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＧＧＣＣＴ−３'（SEQ ID No.３２）を用いて、ＰＣＲ増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ１．１の配列は、配列標識番号１のｎｔ５１３７６〜５１３９１に対応しており、５'位エンド部においてヌクレオチドＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣが付加されているため、ＳｐｈＩエンドヌクレアーゼ用部位を形成している。オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ１．２は、配列標識番号１のｎｔ５１９６４〜５１９８２に対する相補的な配列と対応しており、ＡｇｅＩエンドヌクレアーゼ用制限部位を包含していた。０．６ｋｂフラグメントを、実施例１に記載の条件下で、ファージＮ１ＤＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅し、ＳｐｈＩおよびＡｇｅＩで消化した。消化した０．６ｋｂのフラグメントを、ファージＮ１挿入フラグメント（ファージのポリリンカーに起源を持つＥｃｏＲＩ部位）からの２．８ｋｂのＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントと共に、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＧＥＭ７Ｚｆ（−）ベクターに連結した。上記連結において使用した２．８ｋｂフラグメントは、配列標識番号１のｎｔ５１９７１〜５４８１４に対応しており、ＮｙｓＲ１のＣ末端部およびＮｙｓＲ２のＮ末端部（ＮｙｓＲ２の最初の１６２ａａをコードする）を包含していた。この連結によって得られた組換えプラスミドをｐＮＲＥ１と名づけた。ｐＮＲＥ１からの３．５ｋｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを、ＰｅｒｍＥ*プロモーターを含有するｐＧＥＭ７ｅｒｍＥＬｉ（表３参照）からの０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩフラグメントと共に、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＯＫ８０４ベクターに連結した。得られたプラスミドｐＮＲＥ２を、接合（実施例１参照）によりＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５中に導入し、組換え菌株Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ（ｐＮＲＥ２）を生成した。低減グルコース培養液の入った振盪フラスコ内での、上記菌株によるナイスタチン生成を分析したところ、上記菌株によるナイスタチン生成は野生型菌株と比較して５０％多いことがわかった。これは、ＰｅｒｍＥ*プロモーターからのＮｙｓＲ１遺伝子の過剰発現が原因であると思われる。以上のことから、ＮｙｓＲ１遺伝子は、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株でのナイスタチンおよびその誘導体の産生を増強させるために使用される正のアクチベーター（活性化因子）をコードすると思われる。
Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５におけるＮｙｓＲ５遺伝子の部分的除去
ナイスタチン生合成の調節において翻訳領域のＤＮＡ配列の分析（実施例１参照）を通して推測された、ＮｙｓＲ５遺伝子の機能を確認するため、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５ゲノムに特定の突然変異を導入した。ここで報告されるヌクレオチド配列のｎｔ６２０３７〜６３３６０を包含するＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５ゲノムからのＤＮＡフラグメントを、プライマーＮＲ５Ｄ１（５'−ＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＣＡＡＣＴＣＡ−３'）（配列認識番号３３）およびＮＲ５Ｄ２（５'−ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣ−３'）（配列認識番号３４）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅の条件は上記の通りである。１３４１ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１６８８ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメント（ｎｔ６０３０１〜６１９８９）およびｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと連結した。得られたプラスミドｐＮＲ５Ｄは、上記Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＤＮＡフラグメントを含有しており、ＮｙｓＲ５遺伝子の翻訳領域における４３ｂｐが欠失していた。この欠失により、ＮｙｓＲ５の翻訳領域においてフレームシフト変異が発生し、生成物の切断(truncation)につながる。そのような切断の結果、ＮｙｓＣＲ５の１６５個Ｃ末端アミノ酸は除去され、別の読み枠でコードされる１４個のアミノ酸で置換される（よって、ＮｙｓＲ５とは異質となる）。ｐＮＲ５Ｄを用いて、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５における遺伝子組換え作業を、上記文献Ｓｅｋｕｒｏｖａら、１９９９の記載に準拠して行った。
【０１４９】
遺伝子組み換えによって導入された変異により、野生型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉと比較して、得られる組換え菌株ＮＲ５Ｄによるナイスタチン生成が５〜１５％増加した。ナイスタチンの生合成に対し、ＮｙｓＲ５のＣ末端側部を除去することの、小さいながらも再現性のあるプラス効果は、コンピュータによる分析（実施例１）に基づき推定される、このタンパク質が担うリプレッサーとしての機能と充分に関連している。ＮｙｓＲ５遺伝子に対して除去を行っても、このタンパク質においてＮ末端の位置に確認される推定上のヘリックス・ターン・ヘリックス モチーフは除去されないことから、切断されたＮｙｓＲ５ポリペプチドの残っているリプレッサー作用が、ナイスタチン産生に対し、上記変異の効果が比較的小さいことの説明になり得る。だが、この結果は、ナイスタチンおよびその誘導体の産生を向上させるためのさらなる手段として、リプレッサーをコードする遺伝子に変異を導入することの利点を確認するものである。
【０１５０】
【実施例４】
ナイスタチン生合成遺伝子クラスター配列決定の完成
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２との間隙に及ぶＤＮＡ配列は、この領域をカバーする組換えバクテリオファージＮ２０，Ｎ３２，Ｎ９５，Ｎ９８およびＮ９９の重複した挿入体の両ＤＮＡ鎖に対して決定された。
【０１５１】
配列決定に用いた手順、プローブ生成およびスクリーニングは実施例１に記載したとおりである。ライブラリー・スクリーニングに用いたプローブおよび発見された関係する組換えバクテリオファージは下記のとおりである：
ＰＫＳ ７２            Ｎ２０，Ｎ３２
Ｌ４４ＥＳ３．５       Ｎ９０
Ｌ７６ＳＮ０．５       Ｎ９５
Ｌ２０Ｓ０．６４       Ｎ９８，Ｎ９９
プローブの記載
６． Ｌ４４ＥＳ３．５プローブ． 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて、バクテリオファージＮ４４から分離された３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが、Ｌ４４ＥＳ３．５プローブとして使用された。
【０１５２】
７． Ｌ７６ＳＮ０．５プローブ． 制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩを用いて、組換えバクテリオファージＮ７６から分離された０．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが、Ｌ７６ＳＮ０．５プローブとして使用された。
８． Ｌ２０Ｓ０．６４プローブ． 制限酵素ＳａｌＩを用いて、プラスミドｐＬ２０ＥＢ３．７から分離された０．６４ｋｂの ＤＮＡフラグメントが、Ｌ２０Ｓ０．６４プローブとして使用された。
【０１５３】
新しい配列情報が、完全なｎｙｓＩおよびｎｙｓＤＩＩ遺伝子のみならず新しい遺伝子であるｎｙｓＪ、ｎｙｓＫ、ｎｙｓＬ、ｎｙｓＭおよびｎｙｓＮの同定と相成った（図７参照）。新しい情報に基づけば、９４７７ ａａのＮｙｓＩタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７）は、６つのモジュールからなるＰＫＳを表し、ナイスタチン ポリケチド主鎖骨格生合成の伸長ステップ９から１４に対し役割を果たす。これら全てのモジュールは、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲおよびＡＣＰドメインを含む。モジュール１１のｍＡＴドメインの存在は、この伸長ステップにおけるメチルマロニル−ＣｏＡエクステンダーの取り込みと一致する。モジュール１０、１１、１２および１４のＤＨドメインは、活性部位モチーフＨ（Ｘ3）Ｇ（Ｘ4）Ｐが存在しないために不活性であるようだ。ＮｙｓＩモジュール１３のＫＲドメインは、保存モチーフａＳＲｒＧを欠き、よって不活性である。後者の特徴は、モジュール１１の不活性ＤＨドメインとともに、ナイスタチン分子の６員ケタリック環（ketalic ring:Ｃ１３とＣ１７との間）の存在を最もよく説明する。
【０１５４】
ｎｙｓＪ遺伝子は、ＰＫＳをコードし、ｎｙｓＩの下流に位置して同じ方向に転写される。ＮｙｓＪ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）におけるモジュールの組織化から判断して、後者はナイスタチンのマクロラクトン環組み立てにおいて伸長ステップ１５から１７にとり必要である。ＮｙｓＪ内のモジュール１６および１７におけるＤＨドメインは不活性らしく、またモジュール１５に局在化したＥＲドメインは、Ｃ８およびＣ９間の二重結合の還元におそらく最も関与している。
【０１５５】
ナイスタチンＰＫＳ系の、最後の１８番目のモジュールは、ｎｙｓＪの下流に見出されるｎｙｓＫによってコードされたＮｙｓＫタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）によって表される。２０６６ ａａのＮｙｓＫタンパク質は、ＫＳ，ＡＴ，不活性ＤＭ，ＡＣＰおよびＴＥドメインから構成される。ＮｙｓＫタンパク質は、ＫＲドメインを欠き、明らかに不活性ＤＨドメインを含む。ＴＥドメインは、ＮｙｓＫのＣ末端に同定され、このタンパク質は最後のエクステンダー単位の縮合に加えて、ＰＫＳ系からの成熟ナイスタチン ポリケチド鎖の放出にも関与することを示唆する。
【０１５６】
クラスターの遺伝子組織化は、図９に示されており、図８は、ナイスタチンの生合成経路においてコードされた種々のタンパク質の提案された関与を表している。
ナイスタチンの生合成において、ｎｙｓＩおよびｎｙｓＪの関与を確認するため、これらの遺伝子は、接合自殺ベクター（conjugative suicide vector）ｐＫＮＩ１およびｐＫＮＪ１を用いて、相同組換えを介して、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ中でに分裂させた。分裂実験のための上記ベクターの構築は下記の如くであった。ｎｙｓＩの内部にある３．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５のヌクレオチド２３７１１−２７５４１に対応しており、Ｎ６４ ＤＮＡから切り取られ、プラスミド ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）の相当部位に連結され、プラスミド ｐＬ６４ＥＢ３．８となった。ｐＬ６４ＥＢ３．８内へクローン化されたＳ．ｎｏｕｒｓｅｉフラグメントは、このプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出され、ベクターｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントに連結され、プラスミド ｐＫＮＩ１となった。
【０１５７】
ｎｙｓＪの内部にある３．７ｋｂの ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５のヌクレオチド４３２８７−４６９９２に対応し、バクテリオファージ Ｎ２０ ＤＮＡから切り出され、プラスミド ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）の相当部位に連結されて、プラスミド ｐＬ２０ＥＢ３．７となった。ｐＬ２０ＥＢ３．７内へクローン化されたＳ．ｎｏｕｒｓｅｉフラグメントは、このプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り取られ、ベクターｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントと連結され、プラスミド ｐＫＮＪ１となった。ｐＫＮＩ１およびｐＫＮＪ１構築物の両者とも、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ １２５６７（ｐＵＺ８００２）に形質転換され、接合により、Ｚｏｔｃｈｅｖら、（２０００） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：６１１−６１９に記載されるように、さらにＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ １１４５５に転移された。ナイスタチンの生成は、ｐＫＮＩ１およびｐＫＮＪ１分裂変異体のいずれにおいても検出されず、したがって、ナイスタチン生合成について同定されたＰＫＳの必要性が確認された。
【０１５８】
ナイスタチン分子の修飾に恐らく関与するであろうタンパク質をコードする３つの遺伝子が、ｎｙｓＫとｎｙｓＤＩＩとの間に同定された。ｎｙｓＬおよびｎｙｓＮの両者の遺伝子ともに、それぞれ３９４ ａａおよび３９８ ａａのＰ４５０ モノオキシゲナーゼ（それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０および４２）をコードし、これらのタンパク質は恐らくナイスタチン ポリケチド部分のＣ１０位の水酸化およびＣ１６位メチル基の酸化に役割を果たす。どのタンパク質がいずれの反応に関与するかは未だ明確ではなく、ナイスタチン生合成経路におけるｎｙｓＬおよびｎｙｓＮの正確な配置には、追加実験が必要とされる。ｎｙｓＭ遺伝子は、明らかに６４ ａａののフェレドキシン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１）をコードし、それは多分、一方または両方のＰ４５０ モノオキシゲナーゼ系の一部を構成し、電子供与体として働く［Ｏ'Ｋｅｅｆｅ，Ｄ．Ｐ ．＆ Ｈａｒｄｅｒ，Ｐ．Ａ． （１９９１）． Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５， ２０９９−２１０５］。
【０１５９】
図７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５）に表示された領域をおよそ１０ｋｂ左側（組換えバクテリオファージ Ｎ９０）および５ｋｂ右側（組換えバクテリオファージ Ｎ６９）に伸長しているＤＮＡ配列がが決定された。ナイスタチンの生合成において、それらしく思われる作用を有する遺伝子は見出せなかったが、これはナイスタチン遺伝子クラスター全体が同定されたことを示唆する。
【０１６０】
このように、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターの完全な配列情報に基づき、以下の遺伝子が同定され、それらの役割を以下に記載する（図８および９も参照）：
【０１６１】
【表１６】
0004902925.tif 000017
【０１６２】
【実施例５】
ナイスタチン生合成遺伝子の操作
以下に、ナイスタチン分子における特異的な化学変化を目標とする、ナイスタチン生合成遺伝子の合理的な遺伝子操作に対する指針を予測的な実施例として表わす。これらの操作は、ポリエン系抗生物質の構造−機能の関係、共役二重結合の数および二つのイオン化可能な基の存在（デオキシ糖部ミコサミンに属するエキソサイクリックなカルボキシル基およびアミノ基）についての現時点での理解に基づく。
共役二重結合の数および位置の変化
ナイスタチンのマクロラクトン環内の共役二重結合は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）およびデヒドラターゼ（ＤＨ）両活性を有するＰＫＳモジュールによって行われる二つの還元ステップの結果として形成される。これらの二重結合のさらなる還元は、このようなＰＫＳモジュールにエノイルレダクターゼ（ＥＲ）活性を導入することによってもたらすことができる。これによりナイスタチン生合成の特定の段階において、二重結合に代えて完全な飽和結合を形成することとなる。以下の操作を提示することができる。（これらの操作の結果として、理論的に生成され得る化合物を図１０に示す。）
−モジュール３へのＥＲドメインの組込み（１）；
−モジュール４へのＥＲドメインの組込み（２）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活およびモジュール３への ＥＲドメインの組込み（３）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活および−モジュール４への ＥＲドメインの組込み（４）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活および−モジュール７への ＥＲドメインの組込み（５）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活および−モジュール８への ＥＲドメインの組込み（６）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活および−モジュール９への ＥＲドメインの組込み（７）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活およびモジュール８および ９へのＥＲドメインの組込み（８）；
−モジュール５でのＥＲドメインの同時的失活および−モジュール７および ８へのＥＲドメインの組込み（９）；
これらの操作は、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ（Ｓｅｋｕｒｏｖａら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １７７： ２９７−３０４、 １９９９）に対して記載された遺伝子置換の技術を用いることにより行うことができる。操作材料は、ナイスタチン遺伝子クラスター自身、あるいは他のＰＫＳ遺伝子クラスターから供給できる。後者が組換え菌株の遺伝的安定性の観点より優先されうる。
ＣＯＯＨ基の脱離／再配置
ポリエン系抗生物質のエキソサイクリック・カルボキシル基は、これらの化合物の選択的毒性に決定的な役割を果たすものと信じられている。より具体的には、イオン化可能なエキソサイクリック・カルボキシルとミコサミン部分のアミノ基との間の分子内および分子間の相互作用が特に重要と考えられる（Ｒｅｓａｔ， Ｈ．， Ｓｕｎｇｕｒ， Ｆ．Ａ．， Ｂａｇｉｎｓｋｉ， Ｍ．， Ｂｏｒｏｗｓｋｉ， Ｅ．， Ａｖｉｙｅｎｔｅ， Ｖ． ２０００． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ａｍｉｄｅ ｄｅｉｖａｔｉｖｅｓ−ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ， ｖ．１４ ｐ６８９−７０３）。ナイスタチン生合成遺伝子の操作を介してエキソサイクリック・カルボキシルを脱離させ、ありはナイスタチン分子上に再配置することは、いずれも理論上可能である。このような操作を経て生成されたナイスタチン誘導体は、それ自身にとって、あるいはさらなる化学修飾のための基質として作用し有益である。
【０１６３】
以下の操作を提示する（結果としての化合物は、図１１に示す）。
−ナイスタチンＰＫＳのモジュール１１のメチルマロニル特異的アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインとマロニル特異的ＡＴドメインとの置換（１０）；
−モジュール１１のメチルマロニル特異的ＡＴドメインとマロニル特異的ＡＴドメインとの同時的置換を伴う、モジュール１２のマロニル特異的ＡＴドメインとメチルマロニル特異的ＡＴドメインとの置換（１１）；
−モジュール１１のメチルマロニル特異的ＡＴドメインとマロニル特異的ＡＴドメインとの同時的置換を伴う、モジュール１０のマロニル特異的ＡＴドメインとメチルマロニル特異的ＡＴドメインとの置換（１２）；
−Ｐ４５０ モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のｎｙｓＬまたはｎｙｓＮの失活（ナイスタチン分子のＣ１６位メチル基の酸素化に役割を果たすことが見出されるいずれか）（１３）。
【０１６４】
エキソサイクリック・カルボキシルの発現に関与するＰ４５０ モノオキシゲナーゼの特異性は、新規な基質に対しその作用を充足するように操作され得ることに注意すべきである。部位特異的、またはランダムな変異生成のような方法は、誤りがちなＰＣＲおよびＤＮＡシャッフリングとともにこの目的にとって有益であることが判明するであろう。
１．３ 付加的な水酸基の導入（水溶性の増加）
ポリエン系抗生物質は、主として高度に疎水性である共役二重結合の組により、水に極めて難溶である。ある場合において薬剤の薬理学的な性質を拡張することから、水溶性を増加させることは有利となり得る「Ｇｏｌｅｎｓｅｒ， Ｊ．， Ｆｒａｎｋｅｎｂｕｒｇ， Ｓ．， Ｅｈｒｅｎｆｒｅｕｎｄ， Ｔ． ＆ Ｄｏｍｂ， Ａ．Ｊ． １９９９． Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ−ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．， ｖ．４３： ２２０９−２２１４）。ナイスタチンの水溶性を増加させるために、ナイスタチン分子に付加的な水酸基（親水性）を導入することを提案する。ナイスタチン生合成遺伝子の以下の修飾は、所望する効果をもたらすことができる（結果としての化合物を図１２に示す）。
【０１６５】
−ナイスタチンＰＫＳモジュール３のデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインの不活性化（１４）；
−モジュール４のＤＨドメインの不活性化（１５）；
−モジュール５のＥＲドメインの同時的不活性化に伴うモジュール３の ＤＨドメインの不活性化（１６）；
−モジュール５のＥＲドメインの同時的不活性化に伴うモジュール４の ＤＨドメインの不活性化（１７）；
−モジュール５のＥＲドメインの同時的不活性化に伴うモジュール７の ＤＨドメインの不活性化（１８）；
−モジュール５のＥＲドメインの同時的不活性化に伴うモジュール８の ＤＨドメインの不活性化（１９）；
−モジュール５のＥＲドメインの同時的不活性化に伴うモジュール９の ＤＨドメインの不活性化（２０）；
マクロラクトン環のエクステンション（伸長）、トランケーション（頭部切断）もしくは再構築
ポリエン系抗生物質ナイスタチンの新規誘導体が、やはりナイスタチンＰＫＳのトランケーション（truncation）を通じて得ることができ、より小さいマクロラクトン環を有する誘導体へと導かれる（ERD48変異体について実施例２で例示したとおり）。これは、ナイスタチンＰＫＳからの一つまたはそれ以上のモジュールの欠失を通じて達成される。このようなトランケーションは、潜在的に新規薬物のさらなる修飾と合成に有用かもしれない、36員-ないし6-員ラクトン環を有するポリケチドの生成へと導くことができる。ナイスタチン・マクロラクトン環の伸長は、付加的なモジュールをナイスタチンＰＫＳへ挿入することを通じて達成される。このような操作は、また薬剤用途のためのリード化合物の生成へと導くこともできる。
【０１６６】
このナイスタチン分子は、ナイスタチンまたは他のＰＫＳの間で、ＰＫＳモジュールをシャッフルする方法により完全に再構築されることができ、よって完全に新しい誘導体が生成する。この点については、WO 00/77181の特許に開示されている方法が、この目的を果たす組換えＤＮＡ構築物を作製するのに有用であることを示せる。
【０１６７】
最後的に、ナイスタチン生合成遺伝子は、他のマクロライド抗生物質生合成経路の操作に有用であることを証明できる。ＰＫＳおよび修飾酵素の両方が、そのような目的に有用であることを証明できる。ナイスタチン生合成遺伝子は、ピマリシン（Aparicio, J.F., Fouces, R., Mendes, M.V., Olivera, N., Martin, J.F. 2000。５つのポリケチドシンターゼ遺伝子でコードされた複合多酵素システムが、ストレプトマイセス・ナタレンシス（Streptomyces natalensis）において、26員ポリエン系マクロライド・ピマリシンの生合成に関与する。Chem Biol, v. 7: 895-905））用のもののように、他のポリエン系抗生物質生合成クラスターの操作にも最も有用になることは確実のようである。ナイスタチンとピマリシン生合成酵素との間の、タンパク質レベルにおける高度の類似性は、それらのハイブリッドが機能することを、最も確実にするであろう。他方では、異種の修飾酵素の異なる特異性は、遺伝子操作がなされた菌株によって製造された分子についてさらなる構造上の変更のための新しいツールを提供するかもしれない。
【０１６８】
【実施例６】
ナイスタチンの産生増加を誘導する調節遺伝子の更なる操作
Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 11455におけるＰｅｒｍＥ*プロモーターの制御下でのｎｙｓＲＩＩの発現
ｎｙｓＲＩＩ遺伝子は、そのコード配列（実施例１参照）の分析を通じて予測される機能を確認するために、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 11455中で、ＰｅｒｍＥ*プロモーターの制御下で発現させた。ファージＮ５８からの2168ｂｐである ＳａｌＩ-ＢｃｌＩフラグメント（ｎｙｓＲＩＩのＣ末端部を示す）は、をＳａｌＩ-ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＭ11Ｚｆ（−）中にクローン化され、結果として構築物ｐＣ１Ａ１となる。ｎｙｓＲＩＩ遺伝子の811ｂｐのＮ末端部は、ファージＮ５８テンプレートから、オリゴヌクレオチドプライマーＮＳＲ２．１（5'-ＧＣＣＧＧＣＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡ ＣＡＧ ＧＡＣＧＡＧＡＧＧＴ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４．）およびＮＳＲ２．３（5'-ＧＣＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＡ ＧＧＣ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５）を用いてＰＣＲ-増幅させた。ＰＣＲのための条件は上述の通りである。そのＰＣＲフラグメントは、ＳｐｈＩおよびＳａｌＩを用いて消化され、ｐＣ１Ａ１からの2168ｂｐのＳａｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと一緒に、をＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）ベクター中に連結させ、その結果、プラスミドｐＣ２Ａ１を生じさせた。。後者からは、３．０ｋｂのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメントが分離され、このものはＰｅｒｍＥ*プロモーターを含む０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントとともに、をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＯＫ８０４ベクター（プラスミドｐＣ３Ａ１を生成する）、あるいはｐＳＯＫ２０１由来の３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（プラスミドｐＣ３Ｅ１を生成する）のどちらかと連結させた。ｐＳＯＫ８０４をベースとするベクターは、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ染色体中に部位特異的に組み込まれるので、ｐＣ３Ａ１プラスミドは、“トランス”でのｎｙｓＲＩＩ発現の構築物と見なし得た。他方、プラスミドｐＣ３Ｅ１は、クローン化されたｎｙｓＲＩＩ遺伝子を通じて相同的組換えのみを介してＳ．ｎｏｕｒｓｅｉゲノム中に組み込まれ得る自殺ベクターであり、よって後者の“シス”の発現をもたらす。プラスミドｐＣ３Ａ１およびｐＣ３Ｅ１の導入は、結果としてそれぞれ組換え菌株Ｃ３Ａ１およびＣ３Ｅ１となる。前者の菌株におけるＰｅｒｍＥ*プロモーターは、ｎｙｓＲＩＩおよびｎｙｓＲＩＩＩ遺伝子の両方の上流に位置し（シス）、一方、後者の菌株中のＰｅｒｍＥ*プロモーターは、ｎｙｓＲＩＩ遺伝子の上流に位置する（トランス）。該Ｃ３Ａ１およびＣ３Ｅ１菌株によるナイスタチン産生は、野生型のＳ．ｎｏｕｒｓｅｉと比較して、それぞれ１８％および２２％だけ増加した。さらに、培養実験の間、該Ｃ３Ｅ１菌株からのナイスタチン産生が野生型菌株よりも２４時間早く最大値に到達したことがわかった。これらのデータは、ｎｙｓＲＩＩ遺伝子が、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株のおいてナイスタチンおよびその誘導体の産生を増大させるために使用できるプラスのアクチベーターをコードするという仮説を裏付ける。
Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 14455中におけるＰｅｒｍＥ*プロモーターの制御下でのｎｙｓＲＩＶの発現
ｎｙｓＲＩＶの開始コドンは再特定され、もともと提示された開始ヌクレオチドの４８ｎｔ上流に位置する可能性がある。このため前に示唆したように、ｎｙｓＲＩＶは、おそらく２１０ａａ（短い）よりもむしろ２２６ａａ（長い）のタンパク質をコードすると推定される。このｎｙｓＲＩＶ遺伝子の長い種類および短い種類は、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ４Ｐ３（5-ＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＧ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６）およびＮＲ４Ｐ５（5'-ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＧＣＧＴ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）を用いてあるいは、ＮＲ４Ｐ４（5'-ＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＧＡＣＣＧＧＣＧＧＧ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）およびＮＲ４Ｐ５を用いて、Ｎ５８組換えファージＤＮＡからＰＣＲ−増幅された。ＰＣＲの条件は、上述の通りである。０．７８ｋｂおよび０．７３ｋｂの対応するＰＣＲ生成物は、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化され、ＰｅｒｍＥ*プロモーターを含む０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ-ＳｐｈＩフラグメントとともに、ＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＯＫ８０４ベクターに連結させた。結果としてそれぞれプラスミドｐＮＲ４ＥＬおよびｐＮＲ４ＥＳになった。両プラスミドは、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 11455中に導入され、変異菌株ＮＲ４ＥＬおよびＮＲ４ＥＳをそれぞれ生成した。ＮＲ４ＥＳ菌株（ＰｅｒｍＥ*プロモーターからの２１０ａａタンパク質を発現する）によるナイスタチン産生は、ｐＳＯＫ８０４のみを係留する野生型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ由来のものと明確には異なっておらず、他方、ＮＲ４ＥＬ組換え体（ＰｅｒｍＥ*プロモーターからの２２６ａａタンパク質を発現する）は、野生種のレベルよりも３６％高いレベルでナイスタチンを産生した。これらのデータは、長い方の種類、すなわち２２６ａａの長さである種類のものは、実際のＮｙｓＲＩＶポリペプチドを表すことを示唆する。さらに、これらのデータは、ｎｙｓＲＩＶ遺伝子が、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株中でナイスタチンおよびその誘導体の産生増加させるために使用できるプラスのアクチベーターをコードするという仮説を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ポリエン系抗真菌性抗生物質であるナイスタチンA1の構造を示す。
【図２】  図２は、実施例１，２および３で使用したE.coli - StreptomycesシャトルベクターpSOK101、pSOK201およびpSOK804の物理地図および機能地図を表す。
【図３】  図３は、ナイスタチン生合成遺伝子（SEQ ID NO.１および２に対応する）をコードしているS.noursei ATCC11455ゲノムの2つの領域を示す模式図である。提示されるDNA配列を含む重複する組換えファージは、領域図の上に重ねて示される（実施例１参照）。
【図４】  図４は、ナイスタチンPKS NysA（SEQ ID NO.5）、NysB （SEQ ID NO.6）、NysC（SEQ ID NO.7）、NysI（SEQ ID NO.20）の機能の組織化およびナイスタチン生合成におけるそれらの役割を示す模式図である。
【図５】  図５は、組換えS.noursei菌株によって新しいポリエン化合物の産生に至るNysC PKSのモジュール５に対する遺伝子操作を示す模式図である（実施例２参照）。
【図６】  図６は、ナイスタチン、ならびに遺伝子改変したNysC PKSを有する組換えS.noursei菌株から得られた新しいポリエン化合物S44およびS48に関するUVスペクトル（DMSO中）を示す（実施例２参照）。
【図７】  図７は、ナイスタチン生合成遺伝子クラスター（SEQ ID NO.35に対応する）をコードしているS.noursei ATC11455ゲノムの領域を示す模式図である。遺伝子クラスター内の遺伝子組織化が示されている。クローン化領域を包含している重複組換えファージからの挿入物は、上記物理地図／遺伝子地図に示されている。nys遺伝子はイタリック体の大文字で示され、他の翻訳領域（ORF）は番号を付けられている。
【図８】  図８は、S.noursei内でのナイスタチン生合成について提唱されているモデルを示す。
【図９】  図９は、ナイスタチンPKS NysA (SEQ ID No.5)、NysB (SEQ ID No.6)、NysC (SEQ ID No.7)、NysI (SEQ ID No.37)、NysJ (SEQ ID No.38)およびNysK (SEQ ID No.39)タンパク質の機能組織化を示す模式図である。KSSは、活性部位においてCysからSerへの置換を有するケトシンターゼである。KSは、ケトシンターゼである。ATは、アセテート特異的アシルトランスフェラーゼである。mATは、プロピオネート特異的アセチルトランスフェラーゼである。DHは、デヒドラターゼである。DHiは、不活性型デヒドラターゼである。ERは、エノイルレダクターゼである。KRは、ケトレダクターゼである。KRiは、不活性型ケトレダクターゼである。ACPは、アシルキャリアータンパク質である。
【図１０】  図１０は、ナイスタチン遺伝子クラスター内における下記の操作から理論的に生成され得る化合物を示す。
モジュール３へのERドメインの挿入（１）；
モジュール４へのERドメインの挿入（２）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール３へのERドメインの挿入（３）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール４へのERドメインの挿入（４）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール７へのERドメインの挿入（５）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール８へのERドメインの挿入（６）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール９へのERドメインの挿入（７）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール８および９へのERドメインの挿入（８）；
モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール７および８へのERドメインの挿入（９）。
【図１１】  図１１は、ナイスタチン遺伝子クラスター内における下記の操作から理論的に生成され得る化合物を示す。
ナイスタチンPKSのモジュール１１内のメチルマロニル特異的アセチルトランスフェラーゼ（AT）ドメインの、マロニル特異的ATドメインによる置換（１０）；
モジュール１２内のマロニル特異的ATドメインのメチルマロニル特異的ATドメインによる置換と、同時に行われるモジュール１１内のメチルマロニル特異的ATドメインのマロニル特異的ATドメインによる置換（１１）；
モジュール１０内のマロニル特異的ATドメインのメチルマロニル特異的ATドメインによる置換と、同時に行われるモジュール１１内のメチルマロニル特異的ATドメインのマロニル特異的ATドメインによる置換（１２）；
P450モノオキシゲナーゼをコードしている遺伝子であるnysLまたはnysN（いずれかが、ナイスタチン分子上でのC16位メチル基の酸素化の原因である）の不活性化（１３）。
【図１２】  図１２は、ナイスタチン遺伝子クラスター内における下記の操作から理論的に生成され得る化合物を示す。
ナイスタチンPKSのモジュール３内のデヒドラターゼ（DH）の不活性化（１４）；
モジュール４内のDHドメインの不活性化（１５）；
モジュール３内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のERドメインの不活性化（１６）；
モジュール４内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のERドメインの不活性化（１７）；
モジュール７内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のERドメインの不活性化（１８）；
モジュール８内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のERドメインの不活性化（１９）；
モジュール９内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のERドメインの不活性化（２０）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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