(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式ＩＩ：
Ｗ−Ｘ−Ｇまたは（Ｗ−Ｘ−）２ Ｇ
［式中、Ｇは胆汁酸または胆汁酸塩の基であり、Ｗはアシル基を表し、Ｘは胆汁酸または胆汁酸塩の基とアシル基との間の結合メンバーである。ここで、該アシル基は６〜２６個の炭素原子を有する飽和脂肪酸から誘導されるものであり、胆汁酸核の第３位および/または第７位に結合しており、該結合メンバーは−ＮＨ−基である。]
で示される胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項２】
胆汁酸がコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸およびデオキシコール酸から選択される、請求項１に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項３】
胆汁酸がグリシンまたはタウリンと第２４位で結合している、請求項１または２に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項４】
アシル基が胆汁酸核の第３位に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項５】
アシル基が胆汁酸核の第７位に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項６】
アシル基と胆汁酸の結合がα配置またはβ配置から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項７】
飽和脂肪酸が１４〜２２個の炭素原子を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項８】
飽和脂肪酸がベヘニル酸、アラキジル酸、ステアリン酸、パルミチン酸およびミリスチル酸から選択される、請求項７に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体。
【請求項９】
３β−ベヘニルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸。
【請求項１０】
３β−アラキジルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸。
【請求項１１】
３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸。
【請求項１２】
３β−パルミチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸。
【請求項１３】
３β−ミリスチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸。
【請求項１４】
Ｎ−（−カルボキシメチル）−３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−アミド。
【請求項１５】
Ｗが、胆汁酸核の第３位および第７位で結合している２個のアシル基を表す、請求項１〜４および６〜８のいずれか１項に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪複合体。
【請求項１６】
活性成分として、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の一般式ＩＩで示される胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸誘導体を含む、胆汁内コレステロール胆石の溶解およびその形成の予防、および動脈硬化症の予防および／または軽減を可能にする医薬組成物。
【請求項１７】
剤型が錠剤、カプセル剤、溶液剤およびエマルジョン剤から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
担体、溶媒、エマルゲーター、吸収エンハンサー、およびコレステロール合成阻害剤または胆汁中への分泌阻害剤から選択されるさらなる化合物を含む、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
活性成分０．１〜１．５ｇを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
胆汁内コレステロール胆石を溶解し、その形成を予防する医薬を製造するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体または請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
動脈硬化症を予防し、ならびに／あるいは軽減する医薬を製造するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体または請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体（以後、「ＢＡＦＡＣ」と称する）、胆汁内のコレステロール胆石の溶解におけるその使用、動脈硬化症の軽減または予防におけるその使用および該疾患の処置方法に関する。
【０００２】
用語胆汁酸および胆汁酸塩は類似しており、交換可能に用いられることに注意すべきである。
【０００３】
胆石は先進国の約１５％の人々に認められる。ほとんどの胆石はコレステロール胆石であり、すなわちコレステロールがその主要な成分である。このように、コレステロール胆石は主要な健康上の問題である。胆汁はしばしば、結晶化傾向を示すコレステロールで過飽和している。胆汁内でのコレステロール結晶化の予防は、コレステロール胆石の形成または、砕石術、溶解または石摘出のような手順後のその再発を予防することである。新たに分泌された胆汁が胆嚢に残存する時間は短く、１２〜２４時間以下である。そのような時間の間、胆汁内でのコレステロール結晶化を防ぐことで、胆石の形成を予防できる。
【０００４】
ケノデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸ような特定の胆汁酸塩を用いて、コレステロール胆石を医学的に溶解でき、その再発を予防できることが示された。しかし、胆汁酸塩治療は効力が低く、非常に時間がかかり、大部分が放棄された。したがって、より効率的な治療が必要とされる。
【０００５】
最近の研究では、胆汁内のコレステロール可溶化において、リン脂質が担う主要な役割が示された（T. Gilat et al., Biochimica et Biophysica Acta 1286, (1996), 95-115; Y. Ringel et al.Biochimica et Biophysica Acta 1390, (1998), 293-300,); および J. Hepatology, 28, (1998), 1008-1014)。リン脂質は、胆汁中のコレステロール可溶化脂質凝集物の主要な成分または唯一の成分である。胆汁にリン脂質を段階的に加えると、胆汁中のコレステロールの核形成時間が徐々に長くなることが示された（Z. Halpern et al. Gut 34 (1993) 110-115）。
【０００６】
ヒトまたはモデル胆汁の能力を阻害するコレステロール結晶中のリン脂質分子種の主要な差異が示された。リン脂質は、主に立体特異的な番号（the stereospecific number）ｓｎ−１および／またはｓｎ−２位に存在する脂肪酸およびそのヘッドグループ（head groups）が互いに異なっている。核形成時間の大きな延長、コレステロール結晶成長速度およびトータルのコレステロール結晶量の大きな減少は、リン脂質の絶対量または相対量を変化させずにリン脂質分子種を変化させることによって達成できることが示された。ｓｎ−２脂肪酸が飽和している場合、ヘッドグループがコリンに代わってセリンである場合などは、コレステロールの結晶化が著しく遅くなる（Y. Ringel et al. 上記）。
【０００７】
また、種々のリン脂質成分（完全リン脂質分子ではない）、例えばパルミチン酸またはステアリン酸のような飽和脂肪酸；またはホスファチジルグリセロールは、単独で強力なコレステロール結晶化阻害活性を有することが示された。
【０００８】
したがって、ヒト胆汁を、一般にはリン脂質、または特定のリン脂質またはその成分、例えば脂肪酸で満たすと、胆汁内のコレステロール結晶化が著しく妨害され、所望の結果を達成できる。
【０００９】
問題は、どのようにインビボヒト胆汁をリン脂質またはその成分で豊富にするかである。胆汁酸塩をヒトに与えると、これらは非常に効率的に吸収され、肝臓に取り込まれ、胆汁内に放出される。また、このことは合成胆汁酸塩アナログにも適用可能である。身体には、これらの目的のための特定かつ非常に効率的な輸送機構が存在する。したがって、（通常、ヒト胆汁内に微少量存在する）ウルソデオキシコール酸を規則的に与えると、吸収され、胆汁内に分泌され、最終的に胆汁の胆汁酸の３０〜５０％を構成する。しかし、上に記載するように、コレステロール胆石を溶解させるための胆汁酸塩治療は不十分なものである。
【００１０】
リン脂質およびその成分はよく吸収され、肝臓に取り込まれる。しかし、胆汁内へのリン脂質分泌は肝臓によって厳重に調節され、胆汁塩およびコレステロールの分泌に関連する限られた量および種類のリン脂質だけが胆汁内へ分泌される。現在、定量的または定性的にヒト胆汁リン脂質組成物を、任意の相当な程度にまで調節する効率的な方法は存在しない。食べ物に含まれるリン脂質は肝臓に達すると、代謝され、血液内に分泌されるか、あるいは肝臓内に保存され得る。少量のあらかじめ決められた種類だけが胆汁内に分泌され、調節の可能性は極めて少ない。
【００１１】
したがって、リン脂質またはその成分の１つを胆汁内へ輸送し、胆汁コレステロールの溶解性を改善し、コレステロール胆石の形成を予防するか、あるいは既存の胆石を溶解させる満足な方法を発見することが望ましい。
【００１２】
イスラエル特許明細書第９５６６８号および対応する米国明細書より、一般式Ｉ：
Ｗ−Ｘ−Ｇ
［式中、Ｇは胆汁酸基であり、Ｗは薬物の活性化合物部分であり、Ｘは該胆汁酸基および活性化合物間の直接結合であるか、あるいは結合メンバーである］
で示される既知の胆汁酸誘導体が存在する。該明細書中では、置換分の長いリストが挙げられているが、飽和脂肪酸に関しても不飽和脂肪酸に関しても、アシル基を表すＷは具体的に述べられておらず、すなわち該明細書はＢＡＦＡＣについては何も記載していない。
【００１３】
さらに、このような化合物のすべての対象のうちには、いずれかの化合物を利用して、胆汁コレステロールの溶解性を高め、コレステロール胆石の形成を予防し、既存のコレステロール胆石を溶解し、動脈硬化症を軽減または予防することに対する暗示さえ存在し得ない。
【００１４】
現在、（飽和または不飽和）脂肪酸と連結結合：Ｘを介して結合した胆汁酸または塩（以下、ＢＡＦＡＣと称する）は、胆汁酸および塩の非常に効率的な腸−肝循環を利用して、脂肪酸を胆汁に輸送するビヒクルとして働き得ることを見出した。脂肪酸と胆汁酸との間のエステル結合は、消化液および腸内細菌により分解されてＢＡＦＡＣの分解およびそれら成分の個別吸収を生じるので適切なものではない。また、ＢＡＦＡＣは腸から吸収され、肝臓に取り込まれ、胆汁内に分泌されることが示された。このＢＡＦＡＣは胆汁内のコレステロール溶解性を改善し、その結晶化を著しく妨げた。したがって、ＢＡＦＡＣはコレステロール胆石の形成または再発を予防し、コレステロール胆石を溶解させるのに有用な物質である。
【００１５】
また、ＢＡＦＡＣの投与は、血管樹枝状分岐内のコレステロール結晶化に対する阻害効果を示す。生理的条件では、摂取された胆汁酸または塩は腸内で吸収され、門脈を通して肝臓に輸送され、胆汁を介して腸内へ放出される。したがって、これらは腸−肝循環内を再循環し、微少量だけが全身性循環（血管樹枝状分岐）に達する。ＢＡＦＡＣはより脂質様な性質を示し、腸吸収後、リンパを介して全身性循環へ輸送される。ＢＡＦＡＣは、リンパおよび門脈の両方を介して輸送されることが示された。両経路により、これらは肝臓に取り込まれ、胆汁内に分泌される。それぞれの腸−肝循環時に、これらは腸内に放出され、リンパを介して部分的に再吸収され、血管樹枝状分岐内に再循環した後、肝臓に取り込まれる。１日１０〜１２サイクルの腸−肝循環が行われるので、正味の効果は、血管樹枝状分岐内のＢＡＦＡＣの再循環である。
【００１６】
１日を通して分割量のＢＡＦＡＣを経口投与すると、この作用が高められる。コレステロール結晶化に対するＢＡＦＡＣの阻害作用は証明されている。したがって、血管樹枝状分岐内のコレステロール結晶化の軽減および／または予防、すなわち動脈硬化症の軽減および／または予防に有用である。
【００１７】
したがって、本発明は、一般式ＩＩ：
Ｗ−Ｘ−Ｇ
［式中、Ｇは式Ｉと同じ意義を有し、Ｗは１個または２個のアシル基を表し、Ｘは胆汁酸または胆汁酸塩の基とアシル基との間の結合メンバーである］
で示される胆汁酸または胆汁酸塩脂肪酸複合体に関する。
【００１８】
適当な胆汁酸として、例えばコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸およびデオキシコール酸を挙げることができる。用いられる胆汁酸は未結合であるか、あるいは、胆汁内でのように、グリシン、タウリンまたは適当なアミノ酸と第２４位で結合していてもよい。これらの可能性は胆汁酸の定義の範囲内であり、したがって本発明の範囲内である。アシル基との結合は、用いられる胆汁酸上の核の第３位で生じることがほとんどである。また、異なる位置、例えば第６位、第７位、第１２位および第２４位でアシル基と結合させることが可能である。胆汁酸をグリシンまたはタウリンと結合させた場合、第２４位でアシル基と結合させることはできない。アシル基と胆汁酸間の結合はαまたはβ配置であり得る。
【００１９】
結合メンバー：Ｘは−ＮＨ−基または−Ｏ−基であるのが有益である。
【００２０】
アシル基が誘導される好ましい脂肪酸は、適当には、６〜２６炭素原子、有益には、１４〜２２炭素原子を有する飽和脂肪酸である。好ましい飽和脂肪酸はベヘニル酸（behenylic acid）、アラキジル酸（arachidylic acid）、ステアリン酸、パルミチン酸、およびミリスチル酸（myristylic acid）である。
【００２１】
Ｗが２個のアシル基を表す場合、これらは第３位または第７位で適当に結合している。
【００２２】
本発明はまた、活性成分として、一般式ＩＩで示される胆汁酸脂肪酸誘導体を含む、胆汁内のコレステロール胆石を溶解させることができ、その形成を予防し；動脈硬化症の予防および／または軽減を可能にする医薬組成物に関する。
【００２３】
この組成物は錠剤、カプセル剤、溶液剤、エマルジョン剤などの剤型を有することができる。
【００２４】
この組成物には、担体、溶媒、エマルゲーター（emulgators）、吸収エンハンサー、コレステロール合成阻害剤または胆汁内への分泌阻害剤などのような、さらなる化合物を含ませてもよい。この組成物は、有益には、活性成分０．１〜１．５ｇを含むべきである。
【００２５】
この組成物は、毎日、好ましくは就寝時に１回服用するのが適当である。また、日中に分割量を服用してもよい。
【００２６】
本発明はまた、胆汁中のコレステロール胆石を溶解させ、その形成を予防するための、一般式ＩＩで示される胆汁酸脂肪酸誘導体または、これを含む医薬組成物の使用に関する。
【００２７】
本発明はまた、動脈硬化症を予防および／または軽減するための、一般式ＩＩで示される胆汁酸脂肪酸誘導体または、これを含む医薬組成物の使用に関する。
【００２８】
本発明はまた、一般式ＩＩで示される胆汁酸脂肪酸誘導体またはこれを含む医薬組成物を投与することによって、胆汁内のコレステロール胆石を溶解させる方法およびその形成を予防する方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、一般式ＩＩで示される胆汁酸脂肪酸誘導体またはこれを含む医薬組成物を投与することによる、動脈硬化症の予防および／または軽減方法に関する。
【００３０】
以下の実施例および図面で、本発明を説明するが、これらに限定されない。
【００３１】
実施例Ｉ
３β−ベヘニルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−３）
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１）［Ｆｒ特許 １０１７７５６ １９５２年１２月１８日、Chem. Abstr. 52:1293c ］１．１５ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながらトリエチルアミン１５ｍＬで処理した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド１０ｍＬ中のベヘノイルクロライド１．１３ｇを滴加し、攪拌を一晩継続した。反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させ、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付し、３β−ベヘニルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸のメチルエステル（図５Ａ−２）０．８ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６９（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８８（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９５（ｓ．ＣＨ3−１９)、０．９９（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２５、１．１４［ｓ，ＣＨ2)20]、２．１４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−ベヘニル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．９１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，ＣＨ−７)、３．９６（ｓ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ−１２)、３．９９（ｍ，ＣＨ−３)、５．６０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯ−)。
【００３２】
（ｂ）上記のメチルエステル０．４５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、２４時間室温で放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。水性フラクションを希釈した酸クロライドで酸性化すると、白色沈殿が生じ、これを水で洗浄して、純粋な３β−ベヘニルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−３）０．４１ｇを得た。
【００３３】
実施例ＩＩ
３β−アラキジルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−５）
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−メチルエステル（図５Ａ−１）［実施例Ｉを参照］１．０ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながら、トリエチルアミン１５ｍＬで処理した。得られた溶液に、ジメチルホルムアミド１０ｍＬ中のアラキドイルクロライド１．０ｇを滴加し、攪拌を一晩継続した。この反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させ、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付して、３β−アラキジルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−４）０．６ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．７０（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９５（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９９（ｄ，Ｊ＝３．Ｈｚ，ＣＨ3−２１)１．２５、１．１４［(ｓ，ＣＨ2)18]、２．１４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−アラキジル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．９１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，ＣＨ−７)、３．９６（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ−１２)、４．４（ｍ，ＣＨ−３）、５．６０（ｄ，Ｊ＝４．５  Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯＮＨ)。
【００３４】
（ｂ）３β−アラキジルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−４）０．５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で２４時間放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。次いで水性フラクションを希塩酸（diluted hydrogen chloride）で酸性化し、白色沈殿を得、これを水で洗浄し、純粋な３β−アラキジルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−５）０．７ｇを得た。
【００３５】
実施例ＩＩＩ
３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−７）
方法１
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１）［実施例Ｉ参照］１．１５ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながらトリエチルアミン１５ｍＬで処理した。ジメチルホルムアミド１０ｍＬ中のステアロイルクロライド１．１３ｇを得られた溶液に滴加し、攪拌を一晩継続した。反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させ、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付し、３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−６）０．６８ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６９（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８８（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９５（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９９（ｔ，Ｊ＝３．Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２５、１．４４［(ｓ，ＣＨ2)16］２．１４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−ステアリル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．９１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，ＣＨ−７)、３．９９（ｍ，ＣＨ−３)、４．４（ｍ，ＣＨ−３)、５．６０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯＮＨ)。
【００３６】
（ｂ）３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−６）０．４５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で２４時間放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。次いで水性フラクションを希塩酸で酸性化すると白色沈殿が生じ、これを水で洗浄して、３β−ステアリルアミド ７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−７）０．４１ｇを得た。ｍｐ ６３〜６５℃。
【００３７】
方法２
（Kramer et al., J. of Lipid Research 24, 910, 1983 にしたがって製造された）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸２．５ｇをアセトニトリルに溶解し、同溶媒中のステアリン酸１．２ｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンアミド３．６ｇの攪拌溶液に加えた。８時間後、沈殿をろ過し、溶媒で洗浄し、蒸発乾固した。残留物を、Ｎ−メチルモルホリンおよびＮ，Ｎ'−ジメチルホルムアミド（１：３）１０ｍＬ中のステアリン酸１．２ｇの溶液に加えた。室温で一晩維持した後、この溶液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出し、方法１のものと同一の酸（図５Ａ−７）０．６ｇを得た。
【００３８】
方法３
ステアロイルクロライド６ｇの溶液を、０℃のトルエン中のアミン化合物（図５Ｂ−１８）１．６ｇの攪拌溶液に滴加し、同温度で１時間放置した。得られた溶液を５０℃でもう１時間加熱し、３Ｎ 塩酸で酸性化した後、ろ過した。固形物質を水で洗浄し、４５℃で乾燥して、上記のものと同一の酸（図５Ａ−７）を得た。
【００３９】
実施例ＩＶ
３β−パルミチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−９）
方法１
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１）［実施例Ｉを参照］１．０ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながら、トリエチルアミン１５ｍＬで処理した。ジメチルホルムアミド１０ｍＬ中のパルミトイルクロライド０．８ｇを得られた溶液に滴加し、攪拌を一晩継続した。この反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させ、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付して、３β−パルミチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−８）０．５ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６６（ｓ，ＣＨ3−１１)、０．８８（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９１（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９６（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２２、１．１４［(ｓ，ＣＨ2)14］２．１３（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−パルミチル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．８２（ｄ，Ｊ＝１．５  Ｈｚ−ＣＨ7)、３．９６（ｓ，Ｊ＝３．９  Ｈｚ，ＣＨ−１２)、４．０９（ｍ，ＣＨ−３)、５．６３（ｄ，Ｊ＝４．５  Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯＮＨ)。
【００４０】
（ｂ）上記メチルエステル０．４５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で２４時間放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。次いで水性フラクションを希塩酸で酸性化すると、白色沈殿が生じ、これを水で洗浄して、３β−パルミチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−９）０．４ｇを得た。
【００４１】
方法２
（Kramer et al., J. of Lipid Research 24, 910, 1983 にしたがって製造された）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ｂ−１８）２．５ｇをアセトニトリルに溶解し、同溶媒中のパルミチン酸１．２ｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンアミド３．６ｇの攪拌溶液に加えた。８ｈ後、沈殿をろ過し、溶媒で洗浄し、蒸発乾固した。Ｎ−メチルモルホリンおよびＮ，Ｎ'−ジメチルホルムアミド（１：３）１０ｍＬ中のパルミチン酸１．２ｇの溶液に残留物を加えた。室温で一晩維持した後、この溶液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出して、方法１のものと同一の酸（図５Ａ−９）０．６ｇを得た。
【００４２】
実施例Ｖ
３β−ミリスチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−１１）
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸メチルエステル（１）［実施例Ｉを参照］０．５ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながらトリエチルアミン１５ｍＬで処理した。ジメチルホルムアミド１０ｍＬ中のミリストイルクロライド０．４ｇを得られた溶液に滴加し、攪拌を一晩継続した。この反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させ、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付し、３β−ミリスチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１０）０．４ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６９（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８８（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９５（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９９（ｄ，Ｊ＝３．Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２５［(ｓ，ＣＨ2)12]、２．１４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−ミリスチル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．９１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，ＣＨ−７)、３．９９（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ−１２)、４．４（ｍ，ＣＨ−３)、５．６０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯＮＨ)。
【００４３】
（ｂ）３β−ミリスチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１０）０．４５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で２４時間放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。次いで水性フラクションを希塩酸で酸性化すると、白色沈殿が生じ、これを水で洗浄して、純粋な酸（図５Ａ−１１）０．２６ｇを得た。
【００４４】
実施例ＶＩ
３β−ラウリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−１３）
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１）０．６ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながらトリエチルアミン１５ｍＬで処理した。ジメチルホルムアミド１０ｍＬ中のラウリルクロライド０．６ｇを得られた溶液に滴加し、攪拌を一晩継続した。反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固し、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付し、３β−ラウリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１２）０．５ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６７（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８９（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９４（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９９（ｄ，Ｊ＝３．Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２５［(ｓ，ＣＨ2)10]、２．１４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−ラウリル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．９１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，ＣＨ−７)、３．９９（ｔ，Ｊ＝３．９５Ｈｚ，ＣＨ−１２)、４．４（ｍ，ＣＨ−３)、５．６０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ−ＣＨ2ＣＯＮＨ)。
【００４５】
（ｂ）３β−ラウリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１２）０．４５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で２４時間放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。次いで水性フラクションを希塩酸で酸性化すると、白色沈殿が生じ、これを水で洗浄して、純粋な酸（図５Ａ−１３）０．４１ｇを得た。ｍｐ．８２〜８８。
【００４６】
実施例ＶＩＩ
３β−カプリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ａ−１５）
（ａ）３β−アミノ−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１）［実施例Ｉを参照］１．０ｇを乾燥メチレンクロライド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながらトリエチルアミン１５ｍＬで処理した。メチレンクロライド１０ｍＬ中のカプロイルクロライド酸１．２ｇを得られた溶液に滴加し、攪拌を一晩継続した。反応混合物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出し、次いで有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固し、酢酸エチルおよびヘキサン（６：４および８：２）の混液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーに付し、３β−カプリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１４）０．７ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６９（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８８（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９５（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９９（ｔ，Ｊ＝３．Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２５［(ｓ，ＣＨ2)4]、２．１４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨ3−カプリル)、３．６７（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)、３．９１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，ＣＨ−７)、３．９９（ｔ，Ｊ＝４ＨｚＣＨ−１２)、４．４（ｍ，ＣＨ−３)、５．６０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ−ＣＨ2ＣＯＮＨ)。
【００４７】
（ｂ）３β−カプリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１４）０．５ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で２４時間放置した。次いでメタノールを留去し、水１０ｍＬを加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。次いで水性フラクションを希釈された塩化水素で酸性化すると、白色沈殿が生じ、これを水で洗浄して、純粋な酸（図５Ａ−１５）０．４ｇを得た。
【００４８】
実施例ＶＩＩＩ
Ｎ−（−カルボキシメチル）−３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−アミド（図５Ｂ−１７）
（ａ）３β−ステアリルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（図５Ａ−７）０．５ｇを乾燥１，４−ジオキサン２５ｍＬに溶解し、−１０℃にまで冷却した。この攪拌溶液をトリエチルアミン０．５ｍＬで処理し、次いでクロロエチルホルメート（chloroethyl formate）０．０８５ｍＬで処理し、同温度で１５分間攪拌した。この溶液を室温になるまで放置し、トリエチルアミン０．１ｍＬおよびエチルグリシン塩酸塩１４ｇで処理し、一晩放置した。この反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄した。抽出物を蒸発乾固させ、酢酸エチル：ヘキサン ６０：４０の混液、純粋な酢酸エチル、次いで酢酸エチル：メタノール ９：１の混液を用いてシリカゲルクロマトグラフィーし、生成物（図５Ｂ−１６）０．２７ｇを得た。
【００４９】
（ｂ）上記化合物０．２７ｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理した。２４時間後、メタノールを蒸発乾固し、水に溶解し、酢酸エチルで抽出した。水性フラクションを１Ｎ ＨＣＬで酸性化した。得られた沈殿を水で洗浄し、乾燥し、乾燥物質（図５Ｂ−１７）０．２４ｇを得た。
【００５０】
実施例ＩＸ
３β−オレイルアミド−７α１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ｃ−２０）
（ａ）３β−アミノ−７α１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（図５Ａ−１）１．６ｇを乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、攪拌しながらトリエチルアミン３ｍＬで処理した。乾燥ＤＭＦ１０ｍＬ中のオレイルクロライド１．３８ｇの溶液を滴加し、得られた溶液を室温で一晩放置した。この反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、有機フラクションを希塩酸、重炭酸ナトリウム、次いで水で洗浄することによって精製した。減圧下で蒸発乾固させ、３．１ｇを得、酢酸エチル／へキサン（４：６および１０：８）の混液を用いてこれをシリカゲルクロマトグラフィーし、メチルエステル（図５Ｃ−１９）１．８ｇを得た。
【００５１】
（ｂ）室温において、メタノール２０ｍＬ中のメチルエステル１．２ｇの溶液を１Ｎ 水酸化ナトリウム５ｍＬで処理し、室温で４８時間維持し、次いで蒸発乾固した。残留物を水２０ｍＬに溶解し、酢酸エチル２５ｍＬで３回抽出した。水性抽出物を塩酸溶液で酸性化し、沈殿を得、これをろ過した。酢酸エチル：ヘキサン：酢酸（１０：４：０．３）の混液を用いてこの残留物をシリカゲルクロマトグラフィーし、３β−オレイルアミド−７α１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（図５Ｃ−２０）０．３ｇを得た。
【００５２】
実施例Ｘ
３β，７α−ジステアリルアミド−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸（図５Ｄ−２６）
（ａ）ウルソデスオキシ−コラン−２４−酸（ursodesoxy-cholan-24-oic acid）２０ｇを無水メタノール２００ｍＬに溶解し、濃硫酸１ｍＬで処理し、２４時間攪拌した。溶媒のほとんどを留去し、残留物を水に注ぎ、メチレンクロライドで抽出した。有機抽出物を重炭酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムの溶液で洗浄し、蒸発乾固して、３α，７β−ジヒドロキシ−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸メチルエステル（図５Ｄ−２１）１９．５ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６６（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．９０（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９３（ｓ，ＣＨ3−１９)、０．９４（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、３．５８（ｍ，ＣＨ−３，ＣＨ−７)、３．６５（ｓ−ＣＯＯＣＨ3)。
【００５３】
（ｂ）メチルエステル（図５Ｄ−２１）４．０６ｇを乾燥ピリジン３０ｍＬに溶解し、０℃に冷却した。この反応混合物を攪拌し、ピリジン５ｍＬ中のメタンスルホニルクロライド１．４９ｇの溶液で１５分間滴下処理した。同温度で３時間静置した後、反応混合物を氷および水に注ぎ、次いで酢酸エチルで抽出した。有機相を塩酸、重炭酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ろ過し、減圧下で蒸発させた。酢酸エチルおよびヘキサンの混液を溶離剤として用いて、４化合物から構成される残留物をシリカゲルクロマトグラフィーした。より極性の低い化合物５．３ｇが所望の３α，７β−ジメシル−５β−ウルソデオキシコール−２４−酸メチルエステル（図５Ｄ−２２）であった。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６５（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．９０（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９７（ｓ，ＣＨ3−１９)、１．２（ｔ，Ｊ＝３Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、２．９７（ｓ，ＣＨ3ＳＯ2）２．９８（ｓ，ＣＨ3ＳＯ2)、３．６４（ｓ，ＣＨ3ＳＯ2）４．０９（ｑ，Ｊ＝１２Ｈｚ，Ｈ−７)、４．６２（ｍ，Ｈ−７）。
【００５４】
（ｃ）ジメシル’（dimesyl）誘導体５．６５ｇを乾燥ＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、乾燥アジ化ナトリウムで処理し、１３０℃にまで２時間加熱した。この反応混合物を冷却し、氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。次いでこの抽出物を酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムの溶液で洗浄し、ろ過し、蒸発乾固して、３β，７α−ジアジド−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸メチルエステル（図５Ｄ−２３）４．６ｇを得た。
【００５５】
（ｄ）ジアジド化合物（図５Ｄ−２３）４．５ｇをメタノール１２０ｍＬに溶解し、これに５％パラジウム−炭素１５０ｍｇを加え、大気圧下で４日間水素化した。さらに１５０ｍｇの５％パラジウム−炭素を用いて水素化を繰り返した。水素化混合物をろ過し、減圧下で蒸発させ、３β，７α−ジアミノ−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸メチルエステル（図５Ｄ−２４）３ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６５（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．９２（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９６（ｓ，ＣＨ3−１９)、１．２（ｔ，Ｊ＝３Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、３．６８（ｓ，ＣＯＯＣＨ3)、３．７２，３．９５（ｍ，２Ｈ−７，３）。
【００５６】
（ｅ）３β，７α−ジアミノ−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸メチルエステル（図５Ｄ−２４）１．４７ｇをＤＭＳＯおよびＤＭＦの乾燥１：１混合物５０ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬおよびジメチルアミノピリジン３０ｍｇおよびステアリン酸無水物５．１ｇで処理した。この反応混合物を５０℃にまで加熱し、１８時間攪拌し、氷−水に注ぎ、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を塩酸、重炭酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機溶媒を蒸発させた後、油状残留物２．０５ｇを得た。酢酸エチル：ヘキサン（１：４）を溶離剤として用いてシリカゲル上で分離し、多数のフラクションを得、そのうちの１つは、ＭＳおよび1Ｈ−ＮＭＲによると、所望の３β，７α−ジステアリルアミド−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸メチルエステル（図５Ｄ−２５）８０ｍｇであった。
ＭＳ ＦＡＢ：ＭＨ＋ ９３７（ＭＷ）９３６）
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）δ、ｐｐｍ：０．６６（ｓ，ＣＨ3−１８)、０．８６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ3−２３)、０．９６（ｓ，ＣＨ3−１９)、１．２（ｔ，Ｊ＝３Ｈｚ，ＣＨ3−２１)、１．２６［ｓ，(ＣＨ2)16]、３．６４（ｓ，ＣＯＯＣＨ3)、３．０５（ｄ，Ｊ＝７．Ｈｚ，Ｈ−７）５．７５（ｍ，Ｈ−３）。
【００５７】
（ｆ）メチルエステル（図５Ｄ−２５）７８ｍｇをメタノール２０ｍＬに溶解し、１Ｎ 水酸化ナトリウム２ｍＬで処理し、室温で４８時間放置した。メタノールを減圧下で蒸発させ、残留物を水２５ｍＬに溶解し、ろ過し、次いで希塩酸で酸性化し、３β，７α−ジステアリルアミド−５β−ウルソデオキシコラン−２４−酸（図５Ｄ−２６ｙ）から構成される沈殿を得た。
【００５８】
実施例ＸＩ
物質および方法
コレステロール（Sigma, St. Louis, Mo.）を熱メタノールから２回再結晶し；タウロコール酸Ｎａ塩（Ｎａ−ＴＣ；Sigma, St. Louis, Mo.）をエタノールおよびエーテルから再結晶し（J. L Pope, J. Lipid Res. 8, (1967) 146-147）；卵黄レシチン（ＥＹＬ）（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Al.）をさらに精製せずに用いた。本研究で用いられるすべての脂質は、ＴＬＣ標準によって純粋であった。実施例ＸＩＩからＸＩＶで用いられる合成胆汁酸複合体は、（実施例ＩＶに記載のように製造された）パルミチルアミド−７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（ＰａｌＣ）であった。
【００５９】
１．胆汁の調製
Ａ．モデル胆汁
ＥＹＬ、コレステロールおよびＮａ−ＴＣ混合物をＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（２：１ ｖ／ｖ）に溶解し、Ｎ2下、室温で乾燥し、一晩凍結乾燥し、使用するまでアルゴン下、−２０℃で維持した。乾燥した脂質を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ２ナトリウム、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液を５５℃で１時間インキュベーションすることによってモデル胆汁溶液を調製した。実験中、可溶化された（solubilized）モデル胆汁を、密封容器中、アルゴン下、３７℃でインキュベーションした。モデル由来の部分サンプルを毎日試験した。
【００６０】
すべてのモデルを３回調製し、実験期間中を通して同じ条件下で維持した。
モデル胆汁の組成は以下のようである：
コレステロール１５ｍＭ、ＥＹＬ ３０ｍＭ、Ｎａ−ＴＣ １５０ｍＭ。
コントロール溶液の調製用には、１００％ＥＹＬを用いた。他の試験用モデル胆汁溶液は、合成胆汁酸複合体（ＰａｌＣ）によって、ＥＹＬまたはＮａＴＣを添加または置換（１０〜２０％）することによって調製した。
【００６１】
Ｂ．天然ヒト胆嚢胆汁
胆嚢切除時にコレステロール胆石患者から天然ヒト胆嚢胆汁を得た。結晶化を促進するために、数人の患者からプールされた胆汁を、実験で使用する前に、乾燥コレステロールとインキュベーションするか、あるいは濃縮モデル胆汁と混合することによってコレステロールを豊富にする。
【００６２】
２．コレステロール結晶形成および成長の評価
２．１ 結晶観察時間（ＣＯＴ）アッセイ
ＣＯＴ（「核形成時間」と称されることもある）を、Holan et al., in Gastroenterology 77, (1979) 611-617 に記載のように測定した。各モデル胆汁由来の部分サンプルを偏光顕微鏡によって毎日検査した。ＣＯＴは、拡大率１００倍で顕微鏡領域当たり、少なくとも３個のコレステロール一水和物結晶が検出される初期時間として定義されるものであった。
【００６３】
２．２ 結晶成長速度（ＣＧＲ）アッセイ
結晶成長は、マイクロプレートリーダー（SPECTRA-STL, Austria）を用いる分光光度測定によってモニターした（G.J. Somjen, et. al. J. Lipid Res. 38, (1977) 1048-1052）。脂質溶液の一定量（５０μＬ）を、マイクロプレートウェル中、等容量のタウロデオキシコール酸Ｎａ塩（２００ｍＭ）と混合し、強く振とうした。室温で６０分後、マイクロプレートを再び振とうし、各ウェルの４０５ｎｍでの吸光度を測定した。各モデルを３回調製し、測定用に２回サンプル化した。
【００６４】
データは、ＩＢＭ互換パソコンによって収集し分析して、３個の調製物に関して平均化した光学密度（ＯＤ）を計算した。各溶液に関する平均のＯＤ変化を示すグラフをプロットした。少なくとも３回の測定に合致するような直線回帰により、曲線の最も急勾配の領域の傾きを決定し、これをＣＧＲとして定義した。各モデルに関して０日目と１４日目の間のＣＧＲおよびＯＤの差異を計算した。
【００６５】
２．３ 結晶量の測定
実験の最後の日（１４日目）、前記（G.J. Somjen 上記参照）のように各サンプルに対してコレステロールの化学分析を行った。このサンプルをマイクロウェルから収集し、Airfuge（Beckman）において、７０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。全サンプル（遠心前）および上清溶液に対して別々の測定を行った。総量から上清溶液中の量を引くことによって、沈殿したペレット中のコレステロール量を計算した。偏光顕微鏡によりペレットの結晶性を確認した。また結晶量を分光光度測定により、インキュベーション０日目と１４日目の間のＯＤの差異として測定した。
【００６６】
３．データ分析
各脂質分散物を３回調製し、すべてのサンプルから部分サンプルを２回測定した。ＯＤおよび標準誤差の平均値を計算した。上に説明するように、結晶成長曲線の直線回帰分析から結晶成長速度を計算した。異なるモデル溶液間の比較を分散のワンウェイ（one way）分析によって行った。
【００６７】
実施例ＸＩＩ
モデル胆汁またはヒト胆汁内のコレステロール結晶化動力学に対する、実施例ＩＶにおいて調製された胆汁塩脂肪酸複合体（ＰａｌＣ、以後「試験化合物」）の作用。
置換および添加実験を行った。以下の結果が得られた。
【００６８】
Ａ．モデル胆汁
ａ．モデル胆汁溶液（組成：タウロコール酸Ｎａ塩 １５０ｍＭ コレステロール １５ｍＭ 卵レシチン ３０ｍＭ トータル脂質 １０．３ｇｍ／ｄｌ）では、タウロコール酸Ｎａ塩の２０％を試験化合物（ＰａｌＣ）で置換した場合、核形成時間は１６７％まで長くなり；コレステロール結晶成長速度は６７％まで減少し、１４日間のインキュベーション後のトータルのコレステロール結晶量は５３％まで減少した。
【００６９】
ｂ．全てのモデル胆汁溶液に（胆汁酸塩の２０％濃度で）試験化合物を加えた場合、その効果は以下のようであった：
核形成時間は２００％まで長くなり；コレステロール結晶成長速度は５９％まで減少し、１４日間のインキュベーション後のトータルの結晶量は、５１％まで減少した。
【００７０】
Ｂ．天然ヒト胆汁
（１０ｍＭの濃度の）試験化合物を、プールされた、コレステロール胆石を保持する患者由来の天然ヒト胆嚢胆汁とインキュベーションした場合、その結果は以下のようであった：
あらかじめ２時間超遠心して、コレステロール結晶除去した天然ヒト胆汁では、インキュベーション（３７℃）の２日目から新規コレステロール結晶が観察された。結晶数はだんだん増加し、１４日目には、顕微鏡領域（microscopic field）あたり結晶１５０個以上のピークに達した。１０ｍＭの試験化合物とインキュベーションされた同胆汁では、２１日間のインキュベーション期間を通してコレステロール結晶が全く見られなかった。
【００７１】
実施例ＸＩＩＩ
モデル胆汁中のコレステロール結晶の核形成実験は以下のように行った：
ＰａｌＣを以下の割合（モル％）でモデル胆汁に加えた
ＮａＴＣを１０％、２０％置換（「Ｂ」、「Ｃ」）
ＰＣを２０％置換（「Ｄ」）；および
トータルＮａＴＣの１０％、２０％を添加（「Ｅ」、「Ｆ」）
実施例ＸＩＩおよびＸＩＩＩの実験の結果は、以下の図１から３にまとめる（図１〜３のすべてにおいて、「Ａ」はＰａｌＣを含まないコントロールモデル胆汁を表す）：
図１は結晶観察時間＝核形成時間を示す。この結果は３回の平均として与える。結晶観察時間は、Ｃでは１６７％まで、Ｆでは２００％まで長くなった。
図２はコレステロール結晶量を示す。１４日目のコレステロール量は、Ｂでは１７％まで、Ｃでは５３％まで減少した。Ｆでは５１％まで減少した。
図３は結晶成長速度を示す。結晶成長速度は、Ｂでは７０％まで、Ｆでは５９％まで減少した。
これらの実験データは、胆汁酸塩および脂肪酸の複合体が、モデルおよびヒト胆汁内のコレステロール結晶化を予防するか、あるいは遅らせることを確認するものである。
【００７２】
実施例ＸＩＶ
Ａ．動物
齢６〜７週間で、体重７９〜８３ｇの雄性ハムスターを、動物小屋で、自由に水およびえさを摂取できるようにして維持した。
試験ハムスターに、特別な注射によって、ＯＳ当たり、食塩水１ｍＬに溶解した１０〜１５ｍｇ／動物／日のＰａｌＣを与えた。コントロール動物には、等容量の食塩水のみを与えた。両群は処置過程で正常な性質を示した。２日目、それぞれの動物群に対する、食塩水中のＰａｌＣの適用４時間後、これらをクロロホルムガスの過剰投与によって犠牲にした。腹部を切開し、胆汁管を堅く縛り、胆嚢を摘出し、食塩水で２回すすいだ。次いで、これを円錐プラスチック管の頂点におき、切開した。管の底において胆汁を集めた。
２シリーズの動物を試験した；
Ｉ．コントロール５および、それぞれ１０ｍｇ ＰａｌＣ／日を服用する試験動物５。
ＩＩ．コントロール３および、それぞれ１５ｍｇ ＰａｌＣ／日を服用する試験動物９。
【００７３】
Ｂ．生化学的手順
胆汁サンプルを２０００ｒｐｍで５分間遠心し（Eppendorf 遠心）した。沈殿物を廃棄し、Folch法（クロロホルム：メタノール ２：１）にしたがって上清を抽出した。水と分離した後、シリカゲル６０薄層プレート（Merck）での薄層クロマトグラフィーによって脂質相を分析した。溶離剤はジクロロメタン：メタノール：酢酸（１００：５：１、ｖ：ｖ：ｖ）であった。サンプルを真の標準物、Ｉ2蒸気での展開後のリファレンスフロント（Reference front、Ｒｆ）約０．２と比較した。
【００７４】
Ｃ．結果
シリーズＩでは、コントロール１４０μＬおよび試験胆汁１００μＬを得た。シリーズＩＩでは、コントロール９５μＬおよび試験胆汁２４０μＬを得た。各シリーズのコントロール胆汁および試験胆汁を別々にプールした。抽出された脂質のＴＬＣ分析（図４に示す）は、試験動物の胆汁内にＰａｌＣが存在することを示した。このことは、摂取されたＰａｌＣが吸収され、胆汁に放出されることを示す。
図４は実施例ＸＩＶで行われた実験のＴＬＣ比較を示す：
Ａは、純粋な溶液（左）および胆汁（右）中のＰａｌＣ標準物を示す：
Ｂは、コントロールハムスター（左）；およびＰａｌＣを与えられたハムスター由来のハムスター胆汁を示す。このカラムにはＰａｌＣのバンドが見られる。
図５Ａ、５Ｂ、図５Ｃおよび５Ｄは、それぞれ実施例Ｉ〜Ｘに記載の化合物の式を示す。
【００７５】
実施例ＸＶ
方法
モデル胆汁溶液は以下の組成を有する：
コレステロール１５ｍＭ、ＥＹＬ ３０ｍＬ、ＮａＴＣ １５０ｍＬ。これは実施例ＸＩに記載のように調製する。試験溶液では、２０モルパーセントのＮａＴＣを、等量の、試験される特定脂肪酸／胆汁酸複合体それぞれで置換した。それぞれコール酸とＣ3位で結合している、鎖の長さがＣ14、Ｃ16、Ｃ18およびＣ20の飽和脂肪酸の複合体を用いて得られた結果を図６および図７に示す。
【００７６】
図６は、コントロールおよび試験溶液の１４日間のインキュベーション後のコレステロール結晶量に対するこれらの複合体の作用を示す。すべての上記複合体は、コントロール溶液との比較において最終結晶量を減少させた。Ｃ18複合体は、それをコントロールの１４％まで減少させ；Ｃ20複合体はそれを３８％まで減少させた。
別の実験で試験されたＣ22の複合体はＣ20の複合体と同様の活性を示した。
【００７７】
図７は、コントロール溶液と比較した種々の試験溶液の核形成時間（結晶観察時間）を示す。胆汁酸塩（ＮａＴＣ）の２０％を特定の複合体で置換すると、Ｃ16、Ｃ18およびＣ20複合体を用いた場合に核形成時間が長くなった。Ｃ14は核形成時間を延長させなかった。Ｃ20複合体は核形成時間を３６０％以上まで長くした。
【００７８】
実施例ＸＶＩ
手術時に得られた、プールされたヒト胆嚢胆汁を濃脂質溶液で豊富化（enriched）し、コレステロールの結晶化を高めた。添加された脂質の胆汁内最終濃度は、ＮａＴＣ ６０ｍＭ、ＥＹＬ １８．４ｍＭおよびコレステロール ９．２ｍＭであった。豊富化された胆汁を５０，０００ｒｐｍで１時間超遠心して、コレステロール結晶を除去し、次いで５個のビンに分配した。最初のビンは、豊富化された胆汁のみを含んでいた（コントロール）。他の４個のビンには以下の溶液（５ｍＭ）を加えた：
コール酸、Ｃ−１６（パルミトイル）コレート（cholate）、Ｃ−１８（ステアロイル）コレートおよびＣ−２０（アラキジル）コレート。３７℃で２２日間インキュベーションした後、すべての胆汁を、airfuge 中、７０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。沈殿を除去し、そのコレステロール含量を化学的に測定した。この結果を、沈殿した結晶塊中のコレステロールのμモルとして図８に示す。コール酸を含むか、あるいは含まないコントロール胆汁と比較して、３個の胆汁酸塩／脂肪酸複合体すべてがコレステロール結晶化を非常に著しく減少させることが明らかである。
【００７９】
実施例ＸＶＩＩ
同脂質組成を有するモデル胆汁溶液を実施例ＸＩに記載のように調製し、コントロールとして用いた。すべての他のサンプルでは、２０モル％のＮａＴＣを等モル量の：コール酸、Ｃ6 コレート、Ｃ12 コレート、Ｃ18 コレート、Ｃ20 コレート（これらの飽和脂肪酸はすべて、コール酸のＣ3位で結合している）およびジ−ステアロイル ウルソデオキシコレート（ステアリン酸基が胆汁酸のＣ3位およびＣ7位において等しい割合で結合している）で置換した。
【００８０】
すべてのサンプルを、実施例ＸＩに記載のものと同様に３７℃でインキュベーションし、偏光顕微鏡観察によって核形成時間を測定した。この結果を図９に示す。この結果は、１）試験されたすべての複合体（ＢＡＦＡＣ）が、コントロールモデル胆汁および等モル量のコール酸と比較してコレステロールの結晶化を遅くしたこと；２）より長い脂肪酸を伴うＢＡＦＡＣほど、より短い鎖を伴うものより効率的であること；３）２脂肪酸との複合体（ジ−ステアロイル ウルソデオキシコレート）が特に有効であることを示した。
【００８１】
実施例ＸＶＩＩＩ
ステアロイル−コレート（Ｃ−１８ コレート）の吸収および輸送
体重８０〜１００ｇｍｓの雌性ハムスターの胃内にＣ−１８ コレート３０ｍｇを一回投与した。単一の動物を投与１、２および３時間後に犠牲にした。心臓血液、門脈血および胆嚢胆汁をサンプル化した。２群の動物（ＡおよびＢ）を平行して研究した。ＨＰＬＣ装置（Kontron Switzerland）で、２０６ｎｍでのＵＶ検出装置を用いて、ステアロイル コレートレベルを測定した。
この結果を図１０に示す。
【００８２】
群Ａでは：１、２および３時間後の心臓血液濃度は９９、７、２μＭであり、一方、門脈血濃度はそれぞれ６８、９９および１３３μＭであった。胆嚢胆汁内のＣ−１８ コレート濃度は、２および３時間の時点でそれぞれ５４０および２７０μＭであった。群Ｂの結果は同様であった。
このデータは：１）Ｃ−１８（ステアロイル）コレートが腸から吸収されること；２）これが（リンパを介する）全身性循環および門脈の両方に輸送されること；３）これが胆汁内へ活発に分泌され、そこで濃縮されることを示す。
【００８３】
実施例ＸＩＸ
実施例ＸＩの記載と同様に、モデル胆汁溶液を調製した。これは同じ脂質組成を有し、コントロールとして用いた。
試験溶液中に、コール酸、ステアロイル（Ｃ−１８：０）コレートおよびオレオイル（Ｃ−１８：１）コレートを２０ｍＭ濃度で加えた。
すべてのサンプルを３７℃で１００時間インキュベーションした。（実施例ＸＩに記載のように）１００時間と０時間の間の光学密度差異を用いて、１００時間の時点でのトータルの結晶量を測定した。コントロール溶液（１００％）と比較して、コール酸を用いた場合の結晶量は１１４％であり、ステアロイル−コレートの場合は６２％であり、オレオイル−コレートの場合は５５％であった。
これらの結果は、飽和酸および不飽和（オレイン）酸を伴うＢＡＦＡＣは両方とも、コントロール胆汁および等モル量のコール酸と比較して、コレステロールの結晶化を減少させることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は結晶観察時間を示す。モデル胆汁溶液。パルミトイル−コレート（palmitoyl-cholate、ＰａｌＣ）の作用。
Ａ−コントロール溶液。Ｂ，Ｃ−それぞれ１０％および２０％のタウロコール酸Ｎａ塩（ＮａＴＣ）を等モル量のＰａｌＣで置換。Ｄ−２０％のリン脂質をＰａｌＣで置換。Ｅ Ｆ それぞれ１０ｍＭおよび２０ｍＭ ＰａｌＣを溶液に添加。
【図２】  図２はコレステロール結晶量を示す。モデル胆汁溶液。ＰａｌＣの作用。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびＦ−図１の説明に記載のとおり。
【図３】  図３は結晶成長速度（rate）を示す。モデル胆汁溶液。ＰａｌＣの作用。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびＦ−図１の説明に記載のとおり。
【図４】  図４は薄層クロマトグラフィーを示す。Ａ−純粋な溶液（左）およびハムスター胆汁中のＰａｌＣ標準物。Ｂ−コントロール動物のハムスター胆汁（左）およびＰａｌＣ服用ハムスターの胆汁。
【図５】  図５Ａは以下のものとコール酸（Ｃ−３位）の結合段階を示す：ベヘニル酸（Ｃ−２２）、アラキジン酸（Ｃ−２０）、ステアリン酸（Ｃ−１８）、パルミチン酸（Ｃ−１６）、ミリスチン酸（Ｃ−１４）、ラウリン酸（Ｃ−１２）およびカプロン酸（Ｃ−１６）。
図５Ｂは、グリシン結合ステアロイル−コレートの合成段階を示す。
図５Ｃは、オレオイル−コレートの結合を示す。
図５Ｄは、胆汁酸核のＣ−３およびＣ−７位における、コール酸と２分子のステアリン酸の結合を示す。
【図６】  図６はコレステロール結晶量を示す。モデル胆汁溶液。コール酸（Ｃ−３位）と結合したミリスチン酸（Ｃ−１４）、パルミチン酸（Ｃ−１６）、ステアリン酸（Ｃ−１８）およびアラキジン酸（Ｃ−２０）の作用。試験化合物でコントロール溶液内の２０モル％ＮａＴＣを置換した。
【図７】  図７は核形成時間を示す。モデル胆汁溶液。図６において用いる化合物の作用。
【図８】  図８は、インキュベーション２２日後の、豊富化したヒト胆汁のコレステロール結晶量示す。コントロール胆汁および５ｍＭ コール酸を添加された胆汁と比較した、胆汁に添加された５ｍＭ パルミトイル（Ｃ−１６）コレート、ステアロイル（Ｃ−１８）コレートおよびアラキジル（Ｃ−２０）コレートの作用。
【図９】  図９は核形成時間を示す。モデル胆汁。モデル胆汁で２０％ＮａＴＣがコール酸で置換されていないものと比較した、２０モル％ＮａＴＣを等モル量のカプロイル（Ｃ−６）コレート、ラウリル（Ｃ−１２）コレート、ステアロイル（Ｃ−１８）コレート、アラキジル（Ｃ−２０）コレートおよびジステアロイル ウルソデオキシコレートで置換した場合の作用。
【図１０】  図１０は３０ｍｇを服用したハムスターにおける、１、２および３時間後のステアロイル（Ｃ−１８）コレートレベルを示す。心臓血液、門脈血液および胆嚢胆汁における濃度。
【図１】
0005031942.tif 000002
【図２】
0005031942.tif 000003
【図３】
0005031942.tif 000004
【図４】
0005031942.tif 000005
【図５】
0005031942.tif 000006
0005031942.tif 000007
0005031942.tif 000008
0005031942.tif 000009
【図６】
0005031942.tif 000010
【図７】
0005031942.tif 000011
【図８】
0005031942.tif 000012
【図９】
0005031942.tif 000013
【図１０】
0005031942.tif 000014