(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール１００ｍｇ／Ｌに、１０７〜１０８個／Ｌを作用させた場合に、５時間で１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオールの８０％以上を分解する微生物であって、下記の微生物の１種または２種以上であることを特徴とする１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解性微生物。
シュードアミノバクター・サリシラトキシダンス  ＴＡＡ−Ｉ３株（ＦＥＲＭ  Ｂ
Ｐ−１０５１９）
ゴルドニア・テラエ  ＴＡＩ−Ｉ５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５２１）
ズーグレア・スピーシーズ  ＴＭＪ−Ｉ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５２３）
クリプトコッカス・スピーシーズ  ＴＭＮ−Ｙ２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５２５
）
トリコスポロン・ロウビエリ  ＦＦ−Ｙ２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５２６）
【請求項２】
請求項１に記載の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解性微生物を使用し、１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオールを生物学的に分解することを特徴とする１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオールの分解方法。
【請求項３】
排水中または土壌中の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオールを分解するものである請求項２記載の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオールの分解方法。
【請求項４】
固体支持体表面に付着生育させた１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解性微生物を使用するものである請求項２または３記載の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオールの分解方法。
【請求項５】
請求項１に記載の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解性微生物を担持する手段と、当該微生物を排水または土壌と接触させる手段とを具備することを特徴とする１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解用装置。
【請求項６】
請求項１に記載の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解性微生物の１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール分解のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は女性ホルモン物質分解性微生物およびその利用に関し、更に詳細には、生活排水や、家畜の飼育施設からの排水等に含まれる女性ホルモン物質を分解する能力を有する微生物および当該微生物を利用して女性ホルモン物質を生物学的に分解する方法ならびに装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の内分泌系を攪乱するとされる内分泌攪乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）は、コルボーンによる「奪われし未来」（Colborn  T.,  "Our  Stolen  Future"(1996)）の発表以来、大きな社会問題となっている。生体における内分泌系は、男性ホルモン、女性ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質ホルモン等の作用によって、生命体の発生や生殖器の発達、および、身体内諸器官の機能を正常に維持調整するシステムである。内分泌攪乱化学物質は、これら生体における内分泌系に障害を起こす物質群であり、さまざまな人間活動等により、自然界へと大量に排出されており、野生生物に多くの異常を引き起こしている。【０００３】
内分泌攪乱化学物質には、女性ホルモン物質とともに、有機塩素系の殺虫剤、抗菌剤、除草剤、ビスフェノールＡやノニルフェノールに代表される工業用の化学物質が知られている。後者の化学物質群は、その有毒性から水質汚濁防止法、公害関係法規等により使用に対して厳しい規制が設けられ、環境中に放出される物質量は減少傾向を示している。しかし、ヒトや動物の尿中に含まれ環境中に排出される、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール等の女性ホルモン物質は、人口の増加にともない環境中への排出量は増加している。そのため、都市の生活排水が大量に流れ込んでいる河川や湖沼で、棲息する野生生物にメス化の異常が確認され (デボラ・キャドバリー著、井口泰泉監修、「メス化する自然」、集英社(１９９８))、繁殖不能によって生態系バランスを崩す懸念が示唆されている。【０００４】
ところで、下記式（I）で示される１７β−エストラジオールは、卵巣ろ胞から分泌されるステロイドホルモンであり、これは女性ホルモン物質の中でも、生理活性が最も高い物質である。その分泌は、脳下垂体の卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの支配を受けている。またこの１７β−エストラジオールは薬剤として、無月経症、月経周期異常、月経困難症、子宮発育不全、更年期障害の治療等に用いられている。【０００５】
【化１】
0005027649.tif 000002
【０００６】
また、下記式（II）で示されるエストロンは、卵胞ホルモンの一種で、１７β−エストラジオールの代謝産物である。これは強いエストロゲン活性を有し、尿中に出現して生体外へ排出される。このエストロンは女性ホルモン剤として、女性の性機能不全、更年期障害、および、前立腺ガン等の治療に用いられている。【０００７】
【化２】
0005027649.tif 000003
【０００８】
更に、下記式（III）で示されるエストリオールは、生体内では１７β−エストラジオールの代謝産物である女性ホルモンで、エストロンを経由して生成され尿中へ出現する。また、このエストリオールは発情作用を有する。【０００９】
【化３】
0005027649.tif 000004
【００１０】
以上に示すような女性ホルモン物質は、ヒトの医療用薬剤にも用いられており、尿中に含まれて体外に排出される。また、これらの物質は家畜にも投与されることがあるため、家畜の飼育施設からも環境中に排出される。そして、これらの女性ホルモン物質が原因で、河川や湖沼で野生生物や魚類が汚染されているため、排水を河川等に放出する前の段階で、例えば、排水中の女性ホルモン物質を排水処理施設で低減させる必要がある。【００１１】
現在、排水処理施設での排水の処理方法は、物理学的処理、化学的処理、生物学的処理の３つに分けられる。このうち、物理学的処理とは、具体的に示すと、遠心分離法、ろ過法、加圧浮上分離法、吸着法等であり、また、化学的処理とは、化学薬品等の添加による有害物質の無害化処理法、電気透析法、イオン交換法等をさす。その一方で、生物学的処理とは、微生物を用いて、排水中の有機物質を分解し、除去するもので、物理学的処理、化学的処理では処理の困難な物質等の処理にも有効である。【００１２】
このため生物学的処理は、近年、多くの排水処理施設で利用されている方法であり、一般的に次の３つの段階に分けられる。すなわち、予備処理、生物酸化処理、汚泥の処理である。予備処理には、スクリーン、沈砂池、沈殿池、浮上槽等が含まれ、これらの装置は、排水に含まれる粒径の大きい固形物や無機性の浮遊物等を除去するとともに、更に、生物酸化処理施設への有機物質の負荷を減らすために役立っている。【００１３】
一方、生物酸化処理では、微生物を使用することになるが、その際の微生物を利用する手法としては、微生物を固体支持体表面に付着させ生育させる方法と、微生物群を液中に懸濁させる方法とがある。前者は、通常、散水ろ床法等の固定床式の装置により、また後者は、活性汚泥法等の流動床式の装置により実施される。【００１４】
このうち、固定床式の装置を用い、排水を処理する場合には、微生物を固定化する方法として、結合固定化法、包括固定化法等が採用される。結合固定化法とは、共有結合、イオン結合、水素結合、物理的な吸着等により不溶性の担体に微生物を付着させる方法であり、包括固定化法とは、低分子化合物を重合または会合されるか、または高分子化合物を可溶の状態から不溶の状態に変化させることによって生じる高分子ゲルに微生物を包み込んでしまう方法である。前者の素材としては、セラミックス担体、セルロース担体、粒状活性炭等がある。また、後者素材としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カラギーナン等が使用されている。【００１５】
これら活性汚泥処理や散水ろ床処理等は、排水中の汚濁物質を低減するためには非常にすぐれた方法であるため、近年、環境ホルモンの分解にあたっても、こうした生物学的処理によるアプローチが各種なされている。その中では、処理効率の向上や処理の困難な環境ホルモンの分解を目的とした微生物の選別・強化も行われている。これまで、ノニルフェノール分解能を有するスフィンゴモナス属細菌（特許文献１）、ダイオキシン分解能を有するフザリウム属細菌（特許文献２）、合成女性ホルモン物質であるエチニルエストラジオール分解能を有するフザリウム属細菌（特許文献３）等が報告されている。また、本出願人も、１７β−エストラジオール等を分解するロドコッカス属細菌およびスフィンゴモナス属細菌を報告している（特許文献４）。【００１６】
しかしながら、微生物による分解処理が特に困難な女性ホルモン物質をより迅速および効果的に分解することのできる微生物は殆ど発見されておらず、更に高い分解能力を有する微生物を得ることが求められている。【００１７】
また、本出願人も１７−βエストラジオール等を分解するロドコッカス属細菌およびスフィンゴモナス属細菌を報告している。しかしながら、これらの女性ホルモン分解菌は比較的低濃度の女性ホルモンが継続して流入するような状況においては、好適な分解能を示すものの、一次的に高濃度の女性ホルモンが流入するような場合には十分ではなかった。【００１８】
【特許文献１】特開２００１−３３３７６７号公報
【特許文献２】特開平１１−３４１９７８号公報
【特許文献３】特開２００３−５２３５６号公報
【特許文献４】特開２００４−６５００８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、前述の状況を鑑みなされたものであり、女性ホルモン物質の分解能を有する微生物の提供およびこの微生物を用いて女性ホルモン物質を含む生活排水、家畜養殖場からの排水等から女性ホルモン物質を簡便かつ効率よく分解する方法ならびに装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は鋭意研究の結果、後述する選別方法を用いることにより、女性ホルモン物質を有効に分解する能力を有する微生物を見出した。また、これらを用いることで排水中等に存在する女性ホルモン物質を簡便かつ効率よく分解できることを見出し、本発明を完成した。【００２１】
すなわち本発明は、シュードアミノバクター(Pseudaminobacter)属、ゴルドニア
(Gordonia)属、ノカルディア(Nocardia)属、ズーグレア(Zoogloea)属、パンドレア
(Pandoraea)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属またはトリコスポロン(Trichosporon)属に属し、女性ホルモン物質を分解する能力を有することを特徴とする女性ホルモン物質分解性微生物である。【００２２】
また、本発明は、上記の何れかの微生物を使用し、女性ホルモン物質を生物学的に分解すること特徴とする女性ホルモン物質の分解方法である。【００２３】
更に、本発明は、上記の女性ホルモン物質分解微生物を担持する手段と当該微生物を排水または土壌と接触させる手段とを具備することを特徴とする女性ホルモン物質分解用装置である。【００２４】
また更に、本発明は、上記の女性ホルモン物質分解微生物の女性ホルモンの分解のための使用である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の女性ホルモン物質分解性微生物は、１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール等の女性ホルモン物質の分解能を有するものである。【００２６】
従って、上記微生物を利用した女性ホルモン物質を分解する方法および装置により、女性ホルモン物質に汚染された排水や土壌中の女性ホルモン物質を分解し、環境を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の女性ホルモン分解性微生物（以下、単に「本発明微生物」という）は、前記式（I）〜（III）で示される１７β−エストラジオール、エストロンまたはエストリオール等の生体内女性ホルモン物質あるいはその代謝産物等の女性ホルモン物質（以下、これらを総称して「女性ホルモン物質」という）を分解する能力を有するものである。これら女性ホルモン物質は、通常の生物酸化処理では、除去が不可能であり、また化学構造的に安定であるため、化学的に処理しにくいものである。【００２８】
上記性質を有する本発明微生物としては、例えば、シュードアミノバクター
(Pseudaminobacter)属、ゴルドニア(Gordonia)属、ノカルディア(Nocardia)属、ズーグレア(Zoogloea)属、パンドレア(Pandoraea)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属またはトリコスポロン(Trichosporon)属に属するものが挙げられる。より具体的には下記Ａ群に属する微生物の１種または２種以上が挙げられる。
［Ａ群］
シュードアミノバクター・サリシラトキシダンス(Pseudaminobacter
salicylatoxidans)
ゴルドニア・テラエ(Gordonia  terrae)
ゴルドニア・ルブロパルティンクタス(Gordonia  rubropertinctus)
ゴルドニア・アマラエ(Gordonia  amarae)
ノカルディア・アステロイデス(Nocardia  asteroides)
ズーグレア・スピーシーズ(Zoogloea  sp.)
パンドレア・プノメヌーサ(Pandoraea  pnomenusa)
クリプトコッカス・スピーシーズ(Cryptococcus  sp.)
トリコスポロン・ロウビエリ(Trichosporon  loubieri)【００２９】
なお、上記した本発明微生物は、下水処理場等の活性汚泥や返送汚泥中に存在する種々の微生物から女性ホルモン物質を用いた多段階のスクリーニングを行うことにより得ることができる。【００３０】
具体的に、下水処理場等の活性汚泥や返送汚泥中に存在する種々の微生物から本発明微生物を得るには、まず、活性汚泥中に含まれる微生物を、女性ホルモン物質を用いた集積培養を行うことにより、女性ホルモン物質を分解するものと、そうでないものとを分ける。【００３１】
この集積培養は、活性汚泥や返送汚泥等の汚泥と、例えば、女性ホルモン物質を含む下記表１の組成の各ＭＤＧ培地（Modified  DOMINIC  &  GRAHAM's  medium；トレースエレメントとしては表２のものを使用）とを含む培養液を用いて行うことが好ましい。また培養は、試験管等で激しく振盪させながら、例えば２８℃程度で、１代につき１週間で、５代程度行うことが好ましい。【００３２】
【表１】
0005027649.tif 000005
【００３３】
【表２】
0005027649.tif 000006
【００３４】
次に、上記で得られた集積培養液について、女性ホルモン物質が分解されているか否かを、例えば薄層クロマトグラフ等を用いて、検討、確認する。そして、女性ホルモン物質が分解されている集積培養液を選択する。【００３５】
上記のようにして選択された集積培養液に含まれる微生物を、微生物の分離に用いられる一般的な培地、例えば、ＩＳＰ培地、Ｒ２Ａ培地、ＹＭ培地等の市販の培地を用いて単離する。【００３６】
この単離した各微生物を、更に女性ホルモン物質を含む培地中で培養し、培養後の培地中の女性ホルモン物質の残存量を、例えば、薄層クロマトグラフ、ガスクロマトグラフ等で測定することにより、女性ホルモン物質の分解能の高い微生物のスクリーニングを行うことができる。このスクリーニングを複数回行うことにより女性ホルモン物質の分解能の高い微生物を得ることができる。【００３７】
かくして得られる本発明微生物は、女性ホルモン物質を１００ｍｇ／Ｌの濃度で含有する汚泥、汚水、培地等に、前記微生物１０７〜１０８個／Ｌを作用させた場合に、５時間培養した後に、培地に含有する女性ホルモン物質の６５％以上、好ましくは８０％以上分解するものである。また、特に本発明微生物は、女性ホルモン物質の中でも１７β−エストラジオールを８時間で９０％以上、好ましくは９９％以上分解するものである。なお、本発明微生物を作用させる温度は２５〜３０℃、好ましくは２７〜２８℃である。【００３８】
具体的に上記スクリーニング方法により、伏見下水処理場（京都府京都市）、垂水下水処理場（兵庫県神戸市）、多摩川上流処理場（東京都昭島市）、森ヶ崎水処理センター（東京都大田区）、北部第二下水処理場（神奈川県横浜市）、等々力水処理センター（神奈川県川崎市）、立川富士見処理場（東京都立川市）の活性汚泥および返送汚泥から、女性ホルモン物質分解性微生物として下記の９株の微生物が得られた。なお、これらの微生物の菌種同定は微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列を用いて文献記載（Carl  R.  Woese,  Bacterial  Evolution.,  Microbiological  Reviews.,  51:221-271(1987)およびE.  Stackebrandt  and  B.  M.  Goebel,  Taxonomic  Note:  A  Place    for  DNA-DNA  Reassociation  and  16S  rRNA  Sequence  Analysis  in  the
Present  Species  Definition  in  Bacteriology.,  International  Journal  of
Systematic  Bacteriology,  44,  (4):  846-849  (1994)）の分子進化系統解析に基づき行い、その結果、次のように同定された。【００３９】
・シュードアミノバクター・サリシラトキシダンス  (Pseudaminobacter
salicylatoxidans)  ＴＡＡ−Ｉ３株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５１９）
・ゴルドニア・テラエ  (Gordonia  terrae)  ＴＡＩ−Ｉ５株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２１）
・ゴルドニア・ルブロパルティンクタス  (Gordonia  rubropertinctus)  ＴＡＪ−Ｉ４株  
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２０）
・ゴルドニア・アマラエ  (Gordonia  amarae)  ＴＡＪ−Ｉ６株
（ＦＥＲＭ  Ｐ−２００２４）
・ノカルディア・アステロイデス  (Nocardia  asteroides)  ＴＡＪ−Ｉ７株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２２）
・ズーグレア・スピーシーズ  (Zoogloea  sp.)  ＴＭＪ−Ｉ１株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２３）
・パンドレア・プノメヌーサ  (Pandoraea  pnomenusa)  ＴＭＭ−Ｙ４株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２４）
・クリプトコッカス・スピーシーズ  (Cryptococcus  sp.)  ＴＭＮ−Ｙ２株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２５）
・トリコスポロン・ロウビエリ  (Trichosporon  loubieri)  ＦＦ−Ｙ２株
（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５２６）【００４０】
これらの微生物のうち、シュードアミノバクター・サリシラトキシダンスＴＡＡ−Ｉ３株、ゴルドニア・テラエＴＡＩ−Ｉ５株、ゴルドニア・ルブロパルティンクタスＴＡＪ−Ｉ４株、ノカルディア・アステロイデスＴＡＪ−Ｉ７株、ズーグレア・スピーシーズＴＭＪ−Ｉ１株、パンドレア・プノメヌーサＴＭＭ−Ｙ４株、クリプトコッカス・スピーシーズＴＭＮ−Ｙ２株、トリコスポロン・ロウビエリＦＦ−Ｙ２株については平成１６年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にそれぞれ上記番号で国際寄託した。
また、ゴルドニア・アマラエＴＡＪ−Ｉ６株は、平成１６年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に上記番号で国内寄託した。【００４１】
なお、上記微生物のうちシュードアミノバクター・サリシラトキシダンスＴＡＡ−Ｉ３株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
絶対好気性であり、非運動性、菌糸状に生育する。黄色のコロニーを形成することが多い。グラム陰生菌のα−プロテオバクテリア  (Proteobacteria  α-subdivision)に含まれる。
生理学的性質：
オキシダーゼ、カタラーゼに陽性である。
生育の範囲：
生育温度２０〜４０℃であり、１０℃および４５℃では７日間の培養でも生育しない。
糖類の利用性：
Ｄ−グルコース(Glucose)、Ｄ−マンニトール(Mannitol)、ズルシトール(Dulcitol)、メリビオース(Melibiose)、を好気的に利用する。また、Ｄ−グルコース(Glucose)、Ｄ−マルトース(Maltose)、Ｄ−リボース(Ribose)、Ｄ−キシロース(Xylose)などに同化作用を示す。
これら性質は、１９９９年に文献(P.  Kampfer,  Description  of  Pseudoaminobacter    gen.  Nov.  with  two  new  species,  Pseudaminobacter  salicylatoxidans  sp.
Nov.  and  pseudaminobacter  defluvii  sp.  Nov.,  International  Journal  of
Systematic  Bacteriology,  49:887-897  (1999))に報告されたシュードアミノバクター・サリシラトキシダンスを含むシュードアミノバクター・スピーシーズ
(Pseudaminobacter  sp.)と同じであった。【００４２】
また、上記微生物のうち、ゴルドニア・テラエＴＡＩ−Ｉ５株、ゴルドニア・ルブロパルティンクタスＴＡＪ−Ｉ４株、ゴルドニア・アマラエＴＡＪ−Ｉ６株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
絶対好気性であり、非運動性、弱抗酸性で短桿菌または擬球菌である。ゴルドニア・アマラエのみ菌糸状の生育を示し、顕微鏡下で観察できる程度の僅かな気菌糸を着生する。赤色および、黄色のコロニーを形成することが多く、土壌や活性汚泥など環境中から分離される。High-GCグラム陽性球菌のコリネバクテリウム
(Corynebacterium)に含まれる。
生理学的性質：
細胞壁ペプチドグリカンはＡ１γタイプでグリコリル型が多く、アラビノース
(Arabinose)とガラクトース(Galactose)を含む。さらに、呼吸鎖キノンの主要成分はＭＫ−９（Ｈ２）である。菌体脂肪酸は直鎖−モノ不飽和型で１０Ｍｅ−１８：０を含む。奇数酸の含量は種によって異なる。リン脂質としてはＰＥが検出される他、ＤＰＧ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＩＭｓといくらかの糖脂質もみられる。
生育の範囲：
生育至適温度は２８〜３７℃である。
これら性質は、文献（日本放線菌学会編 「放線菌の分類と同定」日本学会事務センター：183-184  (2001)）記載のゴルドニア・テラエ、ゴルドニア・ルブロパルティンクタスおよびゴルドニア・アマラエを含むゴルドニア・スピーシーズ(Gordonia  sp.)と同じであった。【００４３】
更に、上記微生物のうち、ノカルディア・アステロイデスＴＡＪ−Ｉ７株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
絶対好気性であり、非運動性、菌糸状に生育し、弱い抗酸性を示す。胞子は形成せず、伸長した菌糸は培養時間とともに断裂して短桿菌状、または擬球菌状になる。
ミコール酸含有菌群の中では最も顕著に菌糸状の生育を示す。茶色のコロニーを形成することが多い。High-GCグラム陽性球菌であるコリネバクテリウム
(Corynebacterium)グループに含まれる。
生理学的性質：
カタラーゼには陽性であるが、オキシダーゼには陰性である。細胞壁ペプチドグリカンはＡ１γタイプでグリコリル型が多く、アラビノース(Arabinose)とガラクトース
(Galactose)を含む。菌体脂肪酸は直鎖−モノ不飽和型で１６：０、１８：０、１８：１および、１０Ｍｅ−１８：０を含む。リン脂質としてはＰＥが検出される他、ＤＰＧ、ＰＧ、ＰＩ、        ＰＩＭｓといくらかの糖脂質もみられる。
生育の範囲：
生育温度は２０〜３７℃である。
これら性質は、文献（日本放線菌学会編 「放線菌の分類と同定」日本学会事務センター：183-184 (2001)）記載のノカルディア・アステロイデスを含むノカルディア・スピーシーズ(Nocardia  sp.)と同じであった。【００４４】
また更に、上記微生物のうち、ズーグレア・スピーシーズＴＭＪ−Ｉ１株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
絶対好気性であり、非運動性である。菌糸状に生育し、白〜うす黄色のコロニーを形成することが多い。グラム陰性菌のβ−プロテオバクテリア（Proteobacteria  
β-subdivision）に含まれる。汚泥中でフロックを形成して存在する。
生理学的性質：
ウレアーゼ(Urease)、オキシダーゼ(Oxidase)、ゲラチナーゼ(Gelatinase)活性を有する。
生育の範囲：
生育温度は２０〜３７℃である。
これら性質は、文献（Rossello-Mora,R.,  Ludwig,W.  and  Schleifer,K.H.．Zoogloea  ramigera:  a  phylogenetically  diverse  species,  FEMS  Microbiol.  Lett.  114,
129-134  (1993)および、R.  G.  E.  Murray.：  BERGY’S  MANUAL  of  
Systematic  Bacteriology,  Volume  4,214-219  (1992)）記載のズーグレア・スピーシーズ(Zoogloea  sp.)と同じであった。【００４５】
更にまた、上記微生物のうち、パンドレア・プノメヌーサＴＭＭ−Ｙ４株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
絶対好気性であり、非運動性である。菌糸状には生育せず、粘性を有する。白〜黄色のコロニーを形成することが多い。グラム陰性菌のβ−プロテオバクテリア
（Proteobacteria  β-subdivision）に含まれる。
生理学的性質：
カタラーゼに陽性、アルカリフォスファターゼ活性を有する。フェニルアセテート
(Phenylacetate)に同化作用を示す。菌体脂肪酸は環状型で１６：０、１７：０を含む。
生育の範囲：
生育至適温度は４２℃である。
これら性質は、２０００年に文献(T.  Coenye,  Description  of  Pandoraea  gen.
Nov.  with  Pandoraea  apista  sp.  Nov.,  Pandoraea  pulmonicola  sp.  Nov.,
Pandoraea  pnomenusa  sp.  Nov.,  Pandoraea  sputorum  sp.  Nov.  and
Pandoraea  norimbergensis  comb.  Nov.,  International  Journal  of  Systematic
and  Evolutionary  Microbiology,  50:887-899  (2000))に報告されたパンドレア・プノメヌーサ(Pandorea  pnomenusa)を含むパンドレア・スピーシーズ(Pandraea  sp.)と同じであった。【００４６】
また、クリプトコッカス・スピーシーズＴＭＮ−Ｙ２株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
有性世代として、担子器を生じ、その上に担子胞子を外生する。白色のコロニーを形成することが多い。コロニーは速やかに発育し、柔らかく、強いまたは鈍い光沢を放つ。出芽型分生子は１細胞性できょう膜に被われ、球形、卵円形、多極性である。
生理学的性質：
糖を発酵しないがイノシトールを利用し、ウレアーゼを産性する。
生育の範囲：
生育温度は２０〜３７℃である。
これら性質は、文献（Takashima,  M.  and  Nakase,  T.,  Molecular  phylogeny  of  the  genus  Cryptococcus  and  related  species  based  on  the  sequence  of
18S  rDNA  and  internal  transcribed  spacer  regions,  Microbiol.  Cult.  Coll.,
15,  35-47  (1999))記載のクリプトコッカス・スピーシーズと同じであった。【００４７】
更に、トリコスポロン・ロウビエリＦＦ−Ｙ２株の微生物学的性質について調べたところ、以下の通りであった。
形態：
有性生殖で子嚢中に子嚢胞子を生じる。コロニーは速やかに発育し、表面平滑、皺状、隆起性、無毛性〜ビロード状であり、鈍い光沢を有する。蝋様でもろく、白色または黄色系のクリーム色を呈する。仮性菌糸および菌糸は豊富で発達している。
出芽型分生子は１細胞性で形は多様である。分節型分生子は１細胞性で伸長形を呈する。
生理学的性質：
発酵しないまたは発酵が弱い。シュークロース(Sucrose)、ラクトース(Lactose)、
ソルビトール(Sorbitol)、グルコース(Glucose)に陽性であり、ロービリネート(Laevulinate)に陰性を示す。
生育の範囲：
生育温度は２０〜３７℃である。
これら性質は、文献(Wouter  J.  Middelhoven,  Gloria  Scorzetti  and  Jack  W.
Fell,  Trichosporon  porosum  comb.  nov.,  an  anamorphic  basidiomycetous
yeast  inhabiting  soil,  related  to  the  loubieri/laibachii  group  of  species  that  assimilate  hemicelluloses  and  phenolic  compounds,  FEMS  Yeast  Research,      Vol.  1,  15-22  (2001))記載のトリコスポロン・ロウビエリを含むトリコスポロン・スピーシーズ(Trichosporon  sp.)と同じであった。【００４８】
上記において得られた微生物の大量培養に適した条件を検討したところ、１０リットル容量のジャーファーメンターを用いた大量培養については、至適温度は２８〜３０℃であり、至適ｐＨは６.０〜７.０であった。【００４９】
以上説明した本発明微生物は、単独または複数種類の組合せにより、排水中または土壌中の女性ホルモン物質を分解するのに使用することができる。【００５０】
具体的に本発明微生物を用いて排水中の女性ホルモン物質を分解するには、本発明微生物を排水処理における最初沈殿池から最終沈殿池の間に使用することが好ましく、中でも生物酸化処理中の２次処理工程で使用することが特に好ましい。２次処理工程で使用する場合には、微生物を液中に懸濁させる方式よりも固体支持体表面に付着生育させて用いる方式が好ましい。これは、微生物を固体支持体表面に付着させることにより、微生物の流出を防ぐことができ、より濃厚な菌液を得られることが出来るためである。本発明微生物を付着成育させるための固体支持体としては、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）や多孔性セルロース等が挙げられるが、２次処理工程で使用する場合には、多孔性セルロースが好ましい。固体支持体に微生物を固定化するには、ポリプロピレンやセラミック等を用いた結合固定化法およびＰＶＡ−冷凍法等の包括固定化法等が挙げられ、中でも結合固定化法が好ましい。【００５１】
上記排水処理において本発明微生物は、大量培養により１０８から１０９個／ｍＬに増殖させた微生物培養液を直接排水処理層に投入するか、微生物を固定化した担体を処理層に投入することで使用できる。固定化担体は、ジャーファーメンター等で大量培養した装置に、担体を一定量直接投入し、２〜３日間そのまま培養装置を運転し、攪拌して微生物を担体に固着させることにより作製される。この固定化担体は処理槽投入時に培養液から引き上げ、攪拌している処理層にいれればよい。【００５２】
一方、具体的に本発明微生物を用いた土壌中の女性ホルモン物質の分解は、ジャーファーメンターによる大量培養で１０８から１０９個／ｍＬに増殖させた微生物を、遠心分離後、必要により生理食塩水等に懸濁させ、直接汚染土壌に散布して接触させることにより行うことができる。この場合、処理すべき土壌の表面および掘り起こした部分に本発明微生物を１ｍ３当たり１０９〜１０１０個程度になるように調整して散布すればよい。【００５３】
なお、本発明微生物を用いて効率よく女性ホルモン物質を分解するためには、本発明微生物を担持する手段と、当該微生物を排水または土壌と接触させる手段とを具備している装置の利用を挙げることができる。具体的な装置としては、エアリフトタイプやカラム充填タイプ、ラグフロータイプ等のバイオリアクター装置を用いることができる。このような装置は排水処理の２次処理工程中においても使用でき、排水や土壌中の女性ホルモン物質を効率よく分解することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例について本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。【００５５】
実  験  例  １
女性ホルモン物質分解微生物の分離：
（１）集積培養
下記のＭＤＧ培地１ないし４の各々を１０ｍＬづつ試験管に取り、これに女性ホルモン物質として１７β−エストラジオールを０.１％となるように加え、４培地で１群となる集積培養培地を得た。各集積培養培地中に、各々、伏見下水処理場（略記号Ｆ；京都府京都市）、垂水下水処理場（略記号ＴＭ；兵庫県神戸市）、多摩川上流処理場（略記号ＴＪ；東京都昭島市）、森ヶ崎水処理センター（略記号Ｍ；東京都大田区）、北部第二下水処理場（略記号Ｈ；神奈川県横浜市）、等々力水処理センター（略記号ＴＯ；神奈川県川崎市）または立川富士見処理場（略記号ＴＡ；東京都立川市）の処理行程中の活性汚泥または返送汚泥をそれぞれ１ｍＬ添加して、計５６の集積培養液を調製した。次に、この集積培養液を２８℃で１週間振とう培養を実施した。培養終了後、培養液から１ｍＬを採取し、これを新たなＭＤＧ培地１０ｍＬとともに試験管中に加え、１週間振とう培養した。これを５回繰り返し、５代継代を行った。【００５６】
【表３】
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【００５７】
【表４】
0005027649.tif 000008
【００５８】
（２）微生物の単離と１次スクリーニング
上記（１）で集積培養を行った後、各培養液の１００μＬをＩＳＰ培地（Ｄｉｆｃｏ２７７０１０）、Ｒ２Ａ培地（Ｄｉｆｃｏ２１８２６３）またはＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ２７１１２０：いずれもＤｉｆｃｏ製）の入ったシャーレに滴下し、培養した。これにより単一コロニーをそれぞれのスラントに単離した。【００５９】
上記ＩＳＰ培地には１Ｌ当り、酵母抽出物４ｇ、モルト抽出物１０ｇ、デキストロース４ｇを添加し、ｐＨを７.２とした。Ｒ２Ａ培地には１Ｌ当り、酵母抽出物０.５ｇ、プロテオースペプトン０.５ｇ、カザミノ酸０.５ｇ、デキストロース０.５ｇ、可溶性スターチ０.５ｇ、ピルビン酸ナトリウム０.３ｇ、リン酸ニカリウム０.３ｇ、硫酸マグネシウム０.０５ｇを添加し、ｐＨを７.２とした。ＹＭ培地には１Ｌ当り酵母抽出物３ｇ、モルト抽出物３ｇ、ペプトン５ｇ、デキストロース１０ｇを添加し、ｐＨを６.２とした。【００６０】
一方、微生物の単離と並行して、上記（１）の集積培養液を直接薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）で展開させ分析し、基質のエストラジオール（以下、「Ｅ２」ということもある）を消費している培養液を選択した（１次スクリーニング）。薄層クロマトグラフは、以下の条件で実施した。【００６１】
＜クロマトグラフ条件＞
使用ＴＬＣプレート：ＭＥＲＣＫ社（Ｎｏ.１３７２７）
展開溶媒：エタノール−ベンゼン（１：９）
展開溶媒液量：５ｍＬ
展開時間：約１６分／１０ｃｍ
サンプル量：５μＬ
発色試薬：重クロム酸カリウム−硫酸（必要時）【００６２】
それぞれの集積培養液について、ＴＬＣで展開させた際のＥ２の分解活性と分離株数を表５および表６に示した。【００６３】
なお、分解活性の強さは以下の基準で評価した。
（評価）          （内容）
○    ：    強い分解活性あり（Ｅ２のスポットなし）
△    ：    比較的強い分解活性あり（Ｅ２のスポットが極薄く確認できる）
空欄  ：    活性なし（Ｅ２のスポットあり）【００６４】
【表５】
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【００６５】
【表６】
0005027649.tif 000010
【００６６】
１次スクリーニングの結果、ＦＦ、ＴＭＩ、ＴＭＪ、ＴＭＭ、ＴＭＮ、ＭＭ、ＴＯＡ、ＴＯＩ、
ＴＯＮ、ＴＡＡ、ＴＡＩ、ＴＡＪの集積培養液が１７β−エストラジオールを分解していることが明らかとなり、これらの集積培養液から分離された合計１１１株を選択した。【００６７】
（３）２次スクリーニング
上記（２）の１次スクリーニングで選択した微生物１１１株について、１７β−エストラジオールを基質とする培養で、培養後の培地中の残存する１７β−エストラジオールの量が少ない菌株を次の手順で選択した。【００６８】
まず、微生物１１１株のそれぞれをＹＭ平板培地に画線培養した。次いで、その白金耳１画を、１７β−エストラジオールが１００ｍｇ／Ｌとなるように加えた各培養液に植菌した。１日後、増殖した培養液全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ製）で固相抽出し、薄層クロマトグラフにスポティングした。そして、１７β−エストラジオールが完全に分解されている２３株を選択した。【００６９】
（４）３次スクリーニング
上記（３）の２次スクリーニングで選択した微生物２３株について、より強く迅速に１７β−エストラジオールを分解する菌株を選定するとともに、他の天然女性ホルモン物質  （エストロン、エストリオール）の低減能力を次の手順で検討した。【００７０】
まず、微生物２３株をそれぞれＹＭ平板培地に画線培養し、１次スクリーニングと同様の手法で試験管を用いて培養した。培養開始から０、３、５、８、２４時間で培養を終了させ、それぞれを即時、固相抽出を行った。次に、各培養液の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ製）に保持させ、その後、メタノールで溶出させた。溶出液を適当量分取し、サロゲート物質（１７β−エストラジオール−ｄ４）を添加した。更に、窒素気流により乾固させた後、ＢＳＴＦＡ（Ｎ,Ｏ−ビストリメチルシリルトリフルオロアセトマイド）によりＴＭＳ（トリメチルシリル）化体を誘導し、再び乾固させ、ｎ−ヘキサンに溶解させ、その検液をガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）で分析した。培養開始から各時間培養後の女性ホルモン物質の濃度を測定し、分解量を測定した。ＧＣ−ＭＳの分析条件は、表４に示した。【００７１】
【表７】
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【００７２】
本スクリーニングの結果から、５時間で１７β−エストラジオールを６５％以上まで分解する９株を選択した。その選択した微生物のうち、ＴＡＡ−Ｉ３株、ＴＡＩ−Ｉ５株、ＦＦ−Ｙ２株による１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールの分解による残存量の経時変化を図１〜図３に、全９株の５時間後における各女性ホルモン物質の残存率（％）を表８に示した。【００７３】
【表８】
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【００７４】
実  験  例  ２
女性ホルモン物質分解能を有する微生物の同定：
（１）１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を用いた菌種同定
３次スクリーニングで選択した女性ホルモン物質分解性微生物９株について、以下の手順に従い、１６Ｓあるいは１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を用いた系統樹を作製し、菌種同定を行った。【００７５】
（イ）微生物からのＤＮＡ抽出
上記の９株の純培養微生物のそれぞれから、塩化ベンジル法を用いてＤＮＡを抽出した。すなわち、ＹＭ斜面寒天培地を用いて３日間、３０℃で培養後、集菌した微生物と２５０μＬのＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ９.０）、２００μＬのベンジルクロライド、５０μＬの１０％ＳＤＳを加え、５０℃で、激しく３０分間振とうした。１５０μＬの３ｍｏｌ／Ｌ  酢酸ナトリウムを加えた後、遠心し、上清を別のチューブに移し、イソプロパノール沈殿、７０％エタノール洗浄を順に行い、風乾して最後に１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ）に溶解した。【００７６】
（ロ）１６Ｓあるいは１８Ｓ  ｒＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応
増幅プライマーは、１６Ｓの場合、下記の８Ｆと１５Ｒを、１８Ｓの場合には下記のＹ１ＦとＹ１７７０Ｒを用いた。総量を５０μＬとし、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１.５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、２００μＬのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、１ＵのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）５０ｎｇの鋳型ＤＮＡと増幅プライマーを０.４μｍｏｌ／Ｌ含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）により、９４℃で２０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１８０秒を２５サイクル、ＰＣＲ反応を行った。その後、増幅産物は、マイクロコン−ＰＣＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて精製した。【００７７】
＜増幅プライマー＞
８Ｆ：（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）
１５Ｒ：（５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＲＣＣＧＣＡ−３’）
Ｙ１Ｆ：（５’−ＴＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ−３’）
Ｙ１７７０Ｒ：（５’−ＣＴＡＣＧＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ−３’）【００７８】
（ハ）１６Ｓあるいは１８Ｓ ｒＤＮＡ配列の決定
１６Ｓあるいは１８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の解読は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３Ａ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）を使用して行った。１６Ｓおよび１８Ｓの解読に使用したプライマーを表９に示した。配列のアライメントには、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒＴＭ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いた。【００７９】
【表９】
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【００８０】
（ニ）１６Ｓあるいは１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列の系統解析
上記で得られた１６Ｓあるいは１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列とＤＤＢＪ等の遺伝子データベースより得られる近縁な細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をもちいて、系統解析ソフト
（Ｃｌｕｓｔｕｌ  Ｘ）を使用して分子進化系統解析を行った。【００８１】
（ホ）同定結果
菌形態から酵母と思われた菌株に関しては１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列を、それ以外の菌株は１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を用いて配列を決定した。決定した配列をデータベース上の配列と相同性検索したところ、分離した２３菌株のうち４菌株がグラム陽性Ｈｉｇｈ  Ｇ＋Ｃグループに、１菌株がα−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに、２菌株がβ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに、そして２菌株が酵母であることが判明した（表１０）。そこで、それぞれのグループで系統樹を作製した（図４、図５、図６、図７および図８）。【００８２】
【表１０】
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【００８３】
実  施  例  ３
活性汚泥を用いた女性ホルモン物質の分解：
強い女性ホルモン物質分解活性を示し、安全性のレベルが比較的高いと考えられるゴルドニア・テラエ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｔｅｒｒａｅ）ＴＡＩ−Ｉ５株について、実際の稼動下水処理場から生の活性汚泥を入手し、その汚泥中での活性を測定した。【００８４】
（１）微生物固定化担体の選択
市販されている微生物固定化担体を入手し、それぞれの担体にＴＡＩ−Ｉ５株がどの程度固着されるかを検討した。固定化担体の材質は、ポリプロピレン、セラミック、アルミナ・シリカ、ポリビニルアルコール固定化活性炭を用いた。まず、ＴＡＩ−Ｉ５株をジャーファーメンターによる大量培養で１０７個／ｍＬに増殖させた後、１リットルあたり約１５０ｇの上記担体をそれぞれ投入し、２４時間振とうさせて担体にＴＡＩ−Ｉ５株を固着させた。上記投入後２４時間で担体を取り出し、ろ紙上で軽く水分を拭き取った後、担体の重量を測定した。次いで、その担体を生理食塩水に投入し、ボルテックスで十分に撹拌後、超音波で５分程度処理を行い、担体からＴＡＩ−Ｉ５株を溶出させた。この溶出物を生理食塩水で適宜希釈を行い、ＹＧ培地（表１１）で作製した寒天培地（シャーレ）に塗布して２８℃で培養し、担体重量当りの生菌数を測定した。その結果を表１２に示した。【００８５】
【表１１】
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【００８６】
【表１２】
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【００８７】
固着試験の結果、市販の担体製品の中で、ポリプロピレン製のものがＴＡＩ−Ｉ５株をよく固着することが明らかになった。【００８８】
（２）微生物固定化担体による有効性試験
上記（１）と同様の方法で、ＴＡＩ−Ｉ５株を固着させたポリプロピレン製担体を作製し、実際に茨城県で稼動している処理場の活性汚泥を用い、１７b−エストラジオール分解活性を調べた。【００８９】
ポリプロピレン製担体は１２１℃で１０分間滅菌し、１０７個／ｍＬに培養したＴＡＩ−Ｉ５株に１リットル当たり１５０ｇの割合で投入した。そして２４時間振とう培養し、ＴＡＩ−Ｉ５株をポリプロピレン製担体に固着させた。この微生物固定化担体を汚泥１リットル当たり５０ｇとなるように調整して汚泥槽に投入した。【００９０】
このポリプロピレン製担体を含む汚泥槽に１７β−エストラジオールを０.１ｍｇ／Ｌとなるように濃度を調製して添加し、８時間後の１７β−エストラジオール濃度を測定した。その結果を表１３に示した。８時間後の測定濃度は、添加量のほぼ１００％を分解していることが明らかになった。【００９１】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の女性ホルモン物質分解性微生物は、女性ホルモンを短時間で効率よく分解することができる。【００９３】
従って、この微生物を利用すれば、生活排水、家畜養殖場からの排水等に含まれる女性ホルモン物質を短時間に効率よく分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、１７β−エストラジオール残存量の経時変化を示す図面である。
【図２】図２は、エストロン残存量の経時変化を示す図面である。
【図３】図３は、エストリオール残存量の経時変化を示す図面である。
【図４】図４は、分離菌株と分離菌株に近縁なグラム陽性Ｈｉｇｈ  Ｇ＋Ｃグループに属する菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（約１４５０塩基）に基づく、近隣結合法を用いた系統樹を示す図面である（数字は、１００回の反復によるＢｏｏｔｓｔｒａｐ値。左下のバーは５％の塩基置換距離を示す。）。
【図５】図５は、分離菌株と分離菌株に近縁なＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  α−ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎに属する菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（約１４５０塩基）に基づく、近隣結合法を用いた系統樹を示す図面である（数字は、１００回の反復によるＢｏｏｔｓｔｒａｐ値。左下のバーは５％の塩基置換距離を示す。）。
【図６】図６は、分離菌株と分離菌株に近縁なＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  β−ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎに属する菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（約１４５０塩基）に基づく、近隣結合法を用いた系統樹を示す図面である（数字は、１００回の反復によるＢｏｏｔｓｔｒａｐ値。左下のバーは５％の塩基置換距離を示す。）。
【図７】図７は、分離菌株と分離菌株に近縁な酵母の１８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（約１７５０塩基）に基づく、近隣結合法を用いた系統樹を示す図面である（数字は、１００回の反復によるＢｏｏｔｓｔｒａｐ値。左下のバーは３％の塩基置換距離を示す。）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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