(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補薬剤を、形質転換増殖因子β２（ＴＧＦβ２）と、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現する神経細胞、その株化細胞又はその神経系ハイブリッド細胞とを含む培地でインキュベーションし、該細胞の生細胞数を測定し、該細胞の細胞死を抑制する物質を選択することを含む、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞がＡＰＰを過剰発現している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＰが野生型又は変異体である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異体がＶ６４２Ｉ−ＡＰＰである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記候補薬剤が小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記神経細胞がヒト又はマウス由来である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞が脳由来である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＴＧＦβ２とＡＰＰ細胞外ドメインとの結合を阻害して神経細胞の細胞死を抑制することが可能である、ヒトＴＧＦβ２に対する抗体又はヒトＡＰＰ細胞外ドメインに対する抗体、或いはそれらの抗体の断片であってＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ＦｖもしくはｓｃＦｖからなる群から選択されるその該断片、を有効成分として含む、アルツハイマー病治療用の神経細胞死抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬をスクリーングする方法に関する。さらに具体的には、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現する神経細胞上のＡＰＰと形質転換増殖因子β２（ＴＧＦβ２）との結合阻害を指標とすることを含む前記薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  最も一般的な神経変性疾患であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、神経細胞の減少、細胞内の神経原線維変化、細胞外のアミロイド斑という３つの主要な病理学的所見により特徴付けられる。細胞外アミロイド斑の主な成分は、膜貫通型の前駆体ＡＰＰから切り出されたアミロイドβ（Ａβ）である（Ｎｅｖ▲ｅ▼  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ａβの産生と蓄積はＡＤ発症に寄与すると推測されてきた（Ｃｉｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｃａｉｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；ＨａｒｄｙとＳｅｌｋｏｅ，２００２）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、多量のＡβが蓄積すると初代培養神経細胞および数種の神経細胞株は細胞死に至る（Ｙａｎｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇｓｃｈｗｉｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，１９９５；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｇｉｏｖａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。本発明者らは最近、Ａβがｐ７５ＮＴＲおよび／またはＰＬＡＩＤＤへ結合し、Ｇｏ／ｉ、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼを介する神経細胞死の経路を開始させることによって神経細胞死を誘導することを見出した（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
早期に発症する家族性ＡＤ（ＦＡＤ）に関する遺伝学的研究により、ＡＰＰの構造上の変化がＡＤと密接に関係することが示された。ＦＡＤ患者ではＡβ産生が増加している（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＦＡＤ遺伝子を過剰発現させたトランスジェニックマウスと、ＡＰＰの生理的なプロモーターの制御を受けている１コピーのＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ遺伝子を持つノックインマウスにおいて、Ａβ１−４２やＡβ１−４３などの神経毒性を有するＡβの産生が亢進していることが確認された（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｅａｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｉｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｊａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｗａｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＡＰＰは構造的には細胞表面の受容体に類似している（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。ＦＡＤに関連するＡＰＰ変異体を過剰発現させると、細胞内の細胞死シグナル伝達系が活性化されて神経細胞死が誘導されることを複数のグループが見出した（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ，ｂ；Ｗｏｌｏｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。抗ＡＰＰ抗体をＡＰＰに結合させると、ヘテロ三量体Ｇタンパク質であるＧｏ、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼをこの順番に介する神経細胞死が誘発される（Ｒｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  ａ，ｂ）。本発明者らはさらに、ＦＡＤに関連するＡＰＰ変異体の種類により、異なる複数の細胞内メカニズムが神経毒性の原因であることも見出した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＡＰＰリガンドの存在がこのシグナルを調節することを示す直接的な証拠はまだ存在していないが、これらの結果はＡＰＰが細胞死シグナルを伝える特定のリガンドに対する受容体である可能性を示している。
近年ＡＤの発症機序と治療法に関して研究が進み、炎症反応がＡＤ発症に寄与することが示された（ＭｃＧｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｙａｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この仮説は、抗炎症薬がＡＤ病変のリスクを軽減する、というヒトと動物での研究結果により裏付けられた（Ｈｕｌｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈａｌｌｉｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これに関連して、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ−１）を含む、ＡＤ患者で検討された実質上すべてのサイトカインとケモカインは、非痴呆のサンプルと比べてＡＤ患者で増加しているようである（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）は、特定の組合せの標的遺伝子の発現を調節することによって、細胞増殖、細胞死、細胞分化、炎症、免疫反応を含む幅広い生物活性に関連すると考えられてきた（Ｍａｓｓａｇｕ▲ｅ▼  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍａｓｓａｇｕ▲ｅ▼  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＴＧＦβには３つのサブタイプ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３が存在する。これら３つのサブタイプはいずれも、タイプＩとタイプＩＩのＴＧＦβ受容体に結合する。これらの受容体は、セリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、Ｓｍａｄファミリーの転写因子を介して標的遺伝子へのシグナル伝達系を活性化する。一般的には、ＴＧＦβファミリーに属する増殖因子の機能は細胞の状態と細胞のタイプによりさまざまであろうと考えられてきた。ＴＧＦβ１は通常、細胞増殖を阻害し、多種多様な細胞でアポトーシスを誘導する。ＴＧＦβ依存性アポトーシスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで損傷を受けた細胞あるいは異常細胞を正常組織から排除する際に重要である。しかしながら特別な条件では、このサイトカインにはさまざまな悪性の細胞と正常細胞をアポトーシスから保護する能力がある（Ａｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
神経組織では、ＴＧＦβは神経成長因子産生を増加させることにより、神経栄養因子作用を示す（Ｃｈａｌａｚｏｎｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，，１９９２）。この結果と一致して、ＴＧＦβはｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経細胞の生存を延長させる（Ｍａｒｔｉｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｐｏｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋｒｉｅｇｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｋｒｉｅｇｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらに、虚血性脳疾患ではＴＧＦβ１の発現量が増加していることも示された（Ｋｌｅｍｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｌｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｅｈｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＴＧＦβ１は、低酸素障害による神経の変性からも脳を保護している可能性がある。ＴＧＦβ１の神経栄養因子的な活性に加えて、ＡＤにおけるＴＧＦβ１の神経毒性についても示唆されている。アミロイド原性ＡＰＰ変異体を過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、ＴＧＦβ１がＡβの産生を亢進させた（Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｅｓｎ▲ｅ▼  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
ＦＡＤの脳でＴＧＦβ２発現量が増加していることが報告された（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｉｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；ＰｅｒｅｓｓとＰｅｒｉｌｌｏ，１９９５）が、その生物学的意義はいまだ不明である。Ｆｌａｎｄｅｒｓらは、前頭皮質のグリア細胞におけるＴＧＦβ２発現量の著しい増加、ＴＧＦβ２で著しく染色される神経原線維変化、ＴＧＦβ２で強く染色されるアミロイド斑周囲のグリア細胞を報告した（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；ＰｒａｔｔとＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９９７）。また彼らは、ＥＬＩＳＡ法で測定するとＡＤの脳では対照と比較してＴＧＦβ２量が３倍多いことも見出した。Ｂｏｄｍｅｒらは、ＴＧＦβ２がＡＰＰの細胞外ドメインに結合することを最初に報告した（Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
発明の概要
本発明者らは今回、低レベルの野生型ＡＰＰ（ｗｔＡＰＰ）あるいはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰが異所性に発現している場合、ＴＧＦβ２がＡＰＰの細胞外ドメインに結合し、神経細胞死が誘発されること、その一方でＴＧＦβ１とＴＧＦβ３にはそのような作用がないことを見出した。このことは、ＴＧＦβ２が細胞死を誘導するＡＰＰのリガンドであることを示す。また、ＴＧＦβ２誘導性神経細胞死は、ＡＰＰ、ＰＴＸ感受性ヘテロ三量体タンパク質であるＧｏ、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼから成る経路を介することを見出した。この細胞死は、野生型ＡＰＰを発現している神経細胞よりもＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを発現している神経細胞で起こりやすい。さらに、神経細胞とグリア細胞のいずれにおいても、ＴＧＦβ２発現は毒性を有するＡβ１−４２によってのみ誘導され、毒性が弱いＡβ１−４０によっては誘導されないことを見出した。
これらの知見から、ＡＤ患者では毒性を有するＡβの増加によってＴＧＦβ２の発現量が増加し、他に異常な細胞条件が存在すると、このＴＧＦβ２発現量の増加がＡＰＰへの結合を介して神経細胞死の発生と進行の原因となることが推定された。したがって、本発明は以下のように要約される。
本発明は、第１の態様において、候補薬剤と、形質転換増殖因子β２（ＴＧＦβ２）と、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現する神経細胞、その株化細胞又はその神経系ハイブリッド細胞とを含む培地中で、ＴＧＦβ２とＡＰＰとの結合阻害を指標としてアルツハイマー病の予防薬又は治療薬をスクリーングすることを含む、薬剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の実施形態において、前記細胞はＡＰＰを過剰発現しているものである。
本発明の別の実施形態において、前記ＡＰＰは野生型又は変異体である。前記変異体の例は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ（野生型ヒトＡＰＰのアミノ酸配列中６４２位のバリンがイソロイシンに置換されたＡＰＰ変異体（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：４９８−５０９）である。
本発明の別の実施形態において、前記結合阻害が前記細胞の細胞死の抑制と相関する。
本発明の別の実施形態において、前記結合阻害が前記細胞の生細胞数の測定によって行われる。
本発明の別の実施形態において、前記候補薬剤が小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸である。
本発明の別の実施形態において、前記神経細胞がヒト又はマウス由来である。
本発明の別の実施形態において、前記神経細胞が脳由来、例えばヒト又はマウス脳由来である。
本発明は、第２の態様において、候補薬剤と、ＴＧＦβ２を発現する神経細胞、グリア細胞又はそれらの株化細胞とを含む培地中で、ＴＧＦβ２発現の低減を指標としてアルツハイマー病の予防薬又は治療薬をスクリーングすることを含む、薬剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の別の実施形態において、前記別のスクリーニングがアミロイドβ１−４２の存在下で行われる。
本発明の別の実施形態において、前記候補薬剤は小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸である。
本発明は、第３の態様において、ＴＧＦβ２に対する抗体、その断片又はその誘導体、或いはＴＧＦβ２の拮抗剤を有効成分として含む、アルツハイマー病の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
本発明の別の実施形態において、前記誘導体がペグ化誘導体である。ここで、ペグ化とは、少なくとも１つのポリエチエチレングリコール分子をタンパク質の例えばリシンのε−アミノ基及び／又はアミノ末端に共有結合することをいう。
本明細書中で使用する略号は以下の意味を有する。これらの略号は、本明細書中で正式名称の意味をもって互換的に使用される。
アミロイドβ前駆体タンパク質、ＡＰＰ；
アルツハイマー病、ＡＤ；
家族性アルツハイマー病、ＦＡＤ；
アミロイドβペプチド、Ａβ；
百日咳毒素、ＰＴＸ；
野生型ＡＰＰ、ｗｔＡＰＰ；
グルタチオンエチルエステル、ＧＥＥ；
Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ａｓｐａｒｔ−１−ａｌ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯあるいはＤＥＶＤ；
ウシ胎児血清、ＦＢＳ；
ＡＰＰのＨｉｓ６５７−Ｌｙｓ６７６ドメイン、ドメイン２０；
ＡＰＰのＭｅｔ６７７−Ａｓｎ６９５ドメイン、ドメイン１９；
Ｈｉｓ６５７−Ｌｙｓ６７６欠失ＡＰＰ６９５、ｗｔＡＰＰΔ２０；
Ｍｅｔ６７７−Ａｓｎ６９５欠失ＡＰＰ６９５、ｗｔＡＰＰΔ１９。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｗｔＡＰＰを過剰発現している神経系ハイブリッド細胞Ｆ１１でＴＧＦβ２が誘発する細胞死（上図）及びグラフに示した実験でのｗｔＡＰＰあるいはｗｔＡＰＬＰ２の免疫ブロット解析（下図）を示す。６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播き、ｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰあるいはｐｃＤＮＡ３．１ＧＳ−ｍｏｕｓｅ  ＡＰＬＰ２をトランスフェクトして、１００  ｐＭ、１  ｎＭ、１０  ｎＭ、１００  ｎＭのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦαのいずれかで処理した。死細胞数は、ＴＧＦβあるいはＴＧＦαでの処理開始から４８時間後にトリパンブルー排除試験で計測した。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を表す。（Ａ）レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ；レーン４、ｗｔＡＰＰ＋１００ｐＭ  ＴＧＦβ１；レーン５、ｗｔＡＰＰ＋１  ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン６、ｗｔＡＰＰ＋１０  ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン７、ｗｔＡＰＰ＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン８、ｗｔＡＰＰ＋１００ｐＭ  ＴＧＦβ２；レーン９、ｗｔＡＰＰ＋１ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン１０、ｗｔＡＰＰ＋１０  ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン１１、ｗｔＡＰＰ＋１００  ｎＭ  ＴＧＦβ２。  （Ｂ）レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ、レーン４、ｗｔＡＰＰ＋１００  ｐＭ  ＴＧＦβ３；レーン５、ｗｔＡＰＰ＋１  ｎＭ  ＴＧＦβ３；レーン６、ｗｔＡＰＰ＋１０ｎＭ  ＴＧＦβ３；レーン７、ｗｔＡＰＰ  トランスフェクション＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ３；レーン８、ｗｔＡＰＰ  トランスフェクション＋１００ｐＭ  ＴＧＦα；レーン９、ｗｔＡＰＰ＋１ｎＭ  ＴＧＦα；レーン１０、ｗｔＡＰＰ＋１０  ｎＭ  ＴＧＦα；レーン１１、ｗｔＡＰＰ＋１００  ｎＭ  ＴＧＦ  α。（Ｃ）レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ＡＰＬＰ２、レーン４、ＡＰＬＰ２＋１００  ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン５、ＡＰＬＰ２＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン６、ＡＰＬＰ２＋１００  ｎＭ  ＴＧＦβ３；レーン７、ＡＰＬＰ２＋１００  ｎＭ  ＴＧＦ  α。
図２は、ＴＧＦβ２が誘導する細胞死が、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを異所発現しているＦ１１細胞でより起こりやすいことを示す。（Ａ）６ウェルプレートに７×１０４個／ウェルで播いてｐＩＮＤ−ｗｔＡＰＰあるいはｐＩＮＤ−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰをトランスフェクトしたＦ１１／ＥＣＲ細胞を、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２の存在下あるいは非存在下で、１μＭエクジソン（ＥｃＤ）または５μＭ  ＥｃＤ、あるいは同容量のエタノール（ＥｔＯＨ）で処理したときの死細胞％を示す。死細胞数は、ＥｃＤでの処理開始から７２時間後にトリパンブルー排除試験で計測した。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を表す。（Ｂ）グラフに示した実験でＥｃＤが誘導したｗｔＡＰＰあるいはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。ライセート（各レーン２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＡＰＰ検出のための２２Ｃ１１とローディングコントロールとしての内在性アクチン検出のための抗アクチン抗体を使った免疫ブロットでの解析に供した。
図３は、ＴＧＦβ２仲介の細胞死の特徴を示す。６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播いてｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰをトランスフェクトし、１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＤＥＶＤ）あるいは１ｍＭ  ＧＥＥの存在下あるいは非存在下で（Ａ）、あるいは、１μｇ／ｍｌ  ＰＴＸ、１μＭ  ＳＰ６００１２５（ＳＰ）、５０μＭ  ＰＤ９８０５９（ＰＤ）、２０μＭ  ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、３００μＭアポシニン（ＡＰＯ）、１００μＭオキシプリノール（ＯＸＹ）、１ｍＭ  Ｌ−ＮＭＭＡのいずれかの存在下あるいは非存在下で（Ｂ）、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２で処理した。死細胞数は、ＴＧＦβ２とＤＥＶＤ、あるいはＴＧＦβ２とＧＥＥでの処理開始から４８時間後に、トリパンブルー排除試験で計測した（上図）。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を表す。下図は、グラフに示した実験でのｗｔＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。ライセート（各レーン２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＡＰＰ検出のための２２Ｃ１１を使った免疫ブロットでの解析に供した。（Ａ）レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ、レーン４、ｗｔＡＰＰ＋２０ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン５、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１００  μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ；レーン６、ｗｔＡＰＰ＋２０ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１  ｍＭ  ＧＥＥ。（Ｂ）レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ、レーン４、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン５、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１  μｇ／ｍｌ  ＰＴＸ；レーン６、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１  μＭ  ＳＰ６００１２５；レーン７、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋５０  μＭ  ＰＤ９８０５９；レーン８、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋２０  μＭ  ＳＢ２０３５８０；レーン９、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋３００  μＭアポシニン；レーン１０、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１００  μＭオキシプリノール；レーン１１、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１  ｍＭ  Ｌ−ＮＭＭＡ。（Ｃ）６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播いて、ｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰ、ｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰΔ２０、ｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰΔ１９のいずれかをトランスフェクトし、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２で処理し、あるいは無処理とした。死細胞数は、ＴＧＦβ２とＤＥＶＤ、あるいはＴＧＦβ２とＧＥＥでの処理開始から４８時間後に、トリパンブルー排除試験（左図）とＷＳＴ−８アッセイ（右図）で計測した。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの、トリパンブルー陽性細胞の％、あるいは吸光度（４５０ｎｍ）±標準偏差を示す。図３Ｃの下図は、グラフに示した実験でのｗｔＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。（レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ、レーン４、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン５、ｗｔＡＰＰΔ２０；レーン６、ｗｔＡＰＰΔ２０＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン７、ｗｔＡＰＰΔ１９；レーン８、ｗｔＡＰＰΔ１９＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２）。
図４は、ＴＧＦβ２がＡＰＰの細胞外ドメインに結合して細胞死を誘導することを示す。（Ａ）過剰量のＴＧＦβ１（２００ｐｍｏｌ）存在下あるいは非存在下で、ＡＰＰ−Ｆｃタンパクを固定化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズで組換えＴＧＦβ２（２０ｐｍｏｌ）を共免疫沈降させた。免疫沈降物中のＴＧＦβ２は抗ＴＧＦβ２抗体で特異的に検出し、免疫沈降物中のＡＰＰ−Ｆｃタンパクは抗ＡＰＰ−ＥＣＤ抗体である２２Ｃ１１で検出した。（Ｂ）ＴＧＦβが誘導するＦ１１細胞死に対するＴＧＦβ１の作用を示す。６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播いてｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰをトランスフェクトし、２００  ｎＭ  ＴＧＦβ１の存在下あるいは非存在下で２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２で処理した。死細胞数と生細胞数は、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ１での処理開始から４８時間後に、トリパンブルー排除試験（左図）とＷＳＴ−８アッセイ（右図）でそれぞれ計測した。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの、トリパンブルー陽性細胞の％、あるいは吸光度（４５０ｎｍ）±標準偏差を示す。図４Ｂの下図は、グラフに示した実験でのｗｔＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。ライセート（各レーン２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＡＰＰ検出のための２２Ｃ１１を使った免疫ブロットでの解析に供した。レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ；レーン４、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン５、ｗｔＡＰＰ＋２００  ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン６、ｗｔＡＰＰ＋２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２＋２００  ｎＭ  ＴＧＦβ１。（Ｃ）ＴＧＦβ２は、ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤを介した、２０  ｎＭ  ＥＧＦ処理で誘導されるＦ１１細胞の細胞死を促進しないことを示す。６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播いて、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤあるいはｐｃＤＮＡ３．１ベクター骨格をトランスフェクトし、２０  ｎＭ  ＴＧＦβ２の存在下あるいは非存在下に、１ｎＭ  ＥＧＦで処理した。ライセート（各レーン２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＥＧＦＲに対する抗体を使った免疫ブロットでの解析に供した（図４Ｃの下図）。レーン１、空のｐｃＤＮＡ３ベクタートランスフェクション；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクタートランスフェクション＋１ｎＭＥＧＦ；レーン３、空のｐｃＤＮＡ３ベクタートランスフェクション＋２０ｎＭＴＧＦβ２；レーン４、空のｐｃＤＮＡ３ベクタートランスフェクション＋１ｎＭＥＧＦ＋２０ｎＭＴＧＦβ２；レーン５ＥｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤ  トランスフェクション；レーン６、ＥｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤ  トランスフェクション＋１ｎＭＥＧＦ；レーン７、ＥｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤ  トランスフェクション＋２０ｎＭＴＧＦβ２；レーン８、ＥｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤ  トランスフェクション＋１ｎＭＥＧＦ＋２０ｎＭＴＧＦβ２。（Ｄ）ＴＧＦβ２／ｗｔＡＰＰが誘導するＦ１１細胞の細胞死に対する、抗ＴＧＦβ２中和抗体、Ｄ−Ｓｅｒ１４−ＨＮの作用を示す。６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播いて、ｐｃＤＮＡ３−ｗｔＡＰＰをトランスフェクトし、１０μｇ／ｍｌ抗ＴＧＦβ２中和抗体、あるいは１０ｎＭ  Ｄ−Ｓｅｒ１４−ＨＮの存在下あるいは非存在下に、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２で処理した。死細胞数は、ＴＧＦβ１あるいはＴＧＦβ２での処理開始から４８時間後にトリパンブルー排除試験で計測した。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を示す。図４Ｄの下図は、グラフに示した実験でのｗｔＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。レーン１、トランスフェクションなし；レーン２、空のｐｃＤＮＡ３ベクター；レーン３、ｗｔＡＰＰ；レーン４、ｗｔＡＰＰ＋２０ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン５、ｗｔＡＰＰ＋２０ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１０μｇ／ｍｌ  抗ＴＧＦβ２  中和抗体；レーン６、ｗｔＡＰＰ＋２０ｎＭ  ＴＧＦβ２＋１０ｎＭＤ−Ｓｅｒ１４−ＨＮ。
図５は、ＴＧＦβ２は、ｗｔＡＰＰを過剰発現させた大脳皮質初代培養神経細胞で細胞死を引き起こすことを示す。ポリ−Ｌ−リジンコートした９６ウェルプレートにマウスＥ１４ＰＣＮを５×１０４個／ウェルで播いた。培養開始後（ＤＩＶ）３日目に、ｌａｃＺあるいはｗｔＡＰＰをコードするアデノウイルスを５ＭＯＩでＰＣＮに感染させた。培養開始後４日目に、ＰＣＮを２００  ｎＭ  ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のいずれかで処理した。ＴＧＦβでの処理開始から７２時間後に、材料と方法に記載した方法で、生細胞数をＷＳＴ−８アッセイ（Ａ）とカルセインを用いたアッセイ（Ｂ）で計測した。値は、独立した３つのサンプルの吸光度（４５０ｎｍ）あるいは蛍光強度±標準偏差を示す。（Ｃ）はグラフに示した実験における、アデノウイルスを使って過剰発現させたｗｔＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。ＰＣＮのライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＡＰＰ検出のための２２Ｃ１１とローディングコントロールとしての内在性アクチン検出のための抗アクチン抗体を使った免疫ブロットでの解析に供した。レーン１、感染なし；レーン２、感染なし＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン３、感染なし＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン４、感染なし＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ３、レーン５、ｌａｃＺ感染；レーン６、ｌａｃＺ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン７、ｌａｃＺ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン８、ｌａｃＺ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ３；レーン９、ｗｔＡＰＰ感染；レーン１０、ｗｔＡＰＰ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン１１、ｗｔＡＰＰ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン１２、ｗｔＡＰＰ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ３；レーン１３、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ感染；レーン１４、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ１；レーン１５、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ２；レーン１６、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ感染＋１００ｎＭ  ＴＧＦβ３。図５Ｄは、カルセイン染色したＰＣＮの蛍光顕微鏡写真を示す。（Ａ）で示した実験に対応している。独立した３つの実験での代表的な結果を示す。
図６は、ＴＧＦβ２は、ＦＡＤ関連Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰが誘導した大脳皮質初代培養神経細胞の細胞死を促進することを示す。ポリ−Ｌ−リジンコートした９６ウェルプレートにマウスＥ１４  ＰＣＮを５×１０４個／ウェルで播いた。培養開始後３日目に、ｌａｃＺ（Ａ）、ｗｔＡＰＰ（Ｂ）、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ（Ｃ）をコードするアデノウイルスをさまざまなＭＯＩでＰＣＮに感染させた。培養開始後４日目に、アデノウイルスに感染したＰＣＮを２０ｎＭＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のいずれかで処理した。インキュベーション７２時間後に、材料と方法（後述の実施例）に記載した方法で、生細胞数をカルセイン蛍光アッセイにより計測した。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を示す。（Ｄ）は、グラフに示した実験における、さまざまなＭｏＩでアデノウイルスを使って過剰発現させたｗｔＡＰＰの免疫ブロット解析を示す。ＰＣＮのライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＡＰＰ検出のための２２Ｃ１１とローディングコントロールとしての内在性アクチン検出のための抗アクチン抗体を使った免疫ブロットでの解析に供した。
図７は、神経細胞とグリア細胞における、Ａβ１−４２ペプチド処理によるＴＧＦβ２のｍＲＮＡとタンパクの誘導を示す。（Ａ）〜（Ｄ）：すべての実験は３回行った。（Ａ）、（Ｃ）：６ウェルプレートにヒト神経膠芽腫の細胞株Ｂｕ１７（Ａ）、あるいはヒト神経芽細胞腫の細胞株ＳＨＳＹ−５Ｙ（Ｃ）を１×１０５個／ウェルで播いて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養し、その後、細胞を１０ｎＭ  Ａβ（１−４０）あるいは１０ｎＭ  Ａβ（１−４２）で処理し、または無処理とした。（Ｂ）、（Ｄ）：ポリ−Ｌ−リジンコートした６ウェルプレートにマウスＥ１４  ＰＣＮを１×１０６個／ウェルで播いて、Ｎｅｕｒｏｎ培地（住友ベークライト）で培養した。培養開始後３日目に、Ｎ２添加物（ギブコ）を含むＤＮＥＭに培地を交換した。培養開始後４日目に、１０ｎＭ  Ａβ（１−４０）あるいは１０ｎＭ  Ａβ（１−４２）で処理し、または無処理とした。（Ａ〜Ｃ）、指定されたインキュベーション時間にＩＳＯＧＥＮを使って細胞を回収し、メーカーの説明書に従ってトータルＲＮＡを調製した。各インキュベーション時点で、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡの発現量を、内部コントロールとしてのＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量でまず補正した。次に、各時点で、Ａβで処理した細胞中でのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡの発現量を、非処理細胞中での発現量の平均によってさらに補正した。各図の水平バーの数値は、各時点での、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡの補正済み発現量の非処理細胞中での発現量に対する比を表す。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を示す。（Ｄ）ＴＧＦβ２発現量をＰＣＮ調製後１４４時間までモニターした。各インキュベーション時点で、ＴＧＦβ２  ｍＲＮＡの発現量を、内部コントロールとしてのＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量でまず補正した。次に、非処理細胞（白いカラム）あるいはＡβ１−４２で処理した細胞（黒いカラム）、中でのＴＧＦβ２  ｍＲＮＡ発現量を、０時間（インキュベーションなし）の時点で回収した細胞中での発現量の平均によってさらに補正した。水平バーの数値は、ＴＧＦβ２  ｍＲＮＡ発現量の、０時間の時点で回収した細胞中での平均に対する比を表す。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を示す。（Ｅ）Ａβ１−４２で処理した細胞でＴＧＦβ２タンパク発現が増加する。６ウェルプレートにＢｕ１７細胞を１×１０５個／ウェルで播いて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養し、その後、細胞を１０ｎＭ  Ａβ（１−４２）で処理した。指定された時間の後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解用バッファ［１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］で溶解させた。細胞のライセート（２０μｇ／レーン）を、抗ＴＧＦβ２ポリクローナル抗体（５００倍希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使ってウエスタンブロットでの解析に供した。
図８は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のＴｇ２５７６マウス脳での発現を示す。１８カ月齢のＴｇ２５７６雌性マウス（２、４、６、８）と同腹仔の野生型雌性マウス（１、３、５、７）の大脳皮質と海馬の矢状断切片を、ＴＧＦβ２（１、２、３、４、５、６）とＴＧＦβ１（７、８）に対する抗体で免疫染色した結果を示す（Ａ）。対物レンズの倍率は図の右側に示す。スケールバーの数字は、実際のサイズを表す（μｍ）。（１、２）抗ＴＧＦβ２抗体による大脳皮質Ｍ１の免疫染色の比較。（３、４）抗ＴＧＦβ２抗体による海馬の免疫染色。（５、６）８Ａ図の（３）と（４）で示した海馬の網状・分子層（ボックスで囲った部分）の抗ＴＧＦβ２抗体による免疫染色。（７、８）抗ＴＧＦβ１抗体による海馬の網状・分子層の免疫染色。矢印は、抗ＴＧＦβ１抗体により染色されたアミロイド斑を示す。（８）に示した脳の切片は、切片（６）の次に薄切された。したがって、これらは隣接切片であった。（Ｂ）１８カ月齢のＴｇ２５７６雄性マウスとその同腹仔マウス由来の大脳皮質と海馬のホモジネート（各レーン２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＴＧＦβ２に対する抗体を使った免疫ブロットに供した。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年７月２日に出願された米国仮特許出願６０／５８４，４８２号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明の詳細な説明
本発明は、候補薬剤と、形質転換増殖因子β２（ＴＧＦβ２）と、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現する神経細胞、その株化細胞又はその神経系ハイブリッド細胞とを含む培地中で、ＴＧＦβ２とＡＰＰとの結合阻害を指標としてアルツハイマー病の予防薬又は治療薬をスクリーングすることを含む、薬剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング法は、ＡＰＰを発現する前記細胞を準備し、これを適する培地及び培養条件にて培養する工程、前記細胞の培地にＴＧＦβ２と候補薬剤を加えて所定時間の間インキュベーションを行う工程、ＴＧＦβ２とＡＰＰとの結合阻害を指標として該阻害の程度を測定する工程、阻害活性を有する候補薬剤を選択する工程を含む。
本発明の方法で使用可能な神経細胞、その株化細胞又はその神経系ハイブリッド細胞は、ＡＰＰを発現する細胞である。ＡＰＰを過剰発現している細胞が好ましい。神経細胞は、哺乳類、特にヒト又はマウス由来のものが好ましく、その具体例は、マウス初代脳皮質神経細胞、マウス脊髄神経、ヒト神経芽腫細胞などである。また、前記神経細胞から継代された株化細胞の具体例は、ＳＫ−ＳＨ５Ｙ細胞，ＰＣ１２細胞などである。
本発明の方法では、細胞として神経系ハイブリッド細胞の使用も可能である。神経系ハイブリッド細胞は２種類の神経細胞を融合させて株化した細胞であり、ＡＰＰが過剰発現可能である。細胞の具体例は、Ｆ１１細胞（Ｐｌａｔｉｋａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：３４４９９−３５０３）、Ｆ１１／ＥｃＤ細胞（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３４５４１−３４５５１）などである。
ＡＰＰは、野生型でもよいし、或いは変異体（スプライス変異体を含む）でもよい（例えば、Ｔａｎｇ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０２−１０８；Ｋａｎｇ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７３３−７３６；Ｙａｍａｄａ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４９：６６５−６７１など）。変異体はＴＧＦβ２との結合能を有しているべきであり、好ましい変異体の例は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰである。他の具体例は、Ａ６１７Ｇ，Ｅ６１８Ｑ，Ｅ６１８Ｇ，Ｄ６１９Ｎ，Ｔ６３９Ａ，Ｔ６３９Ｉ，Ｖ６４０Ｍ，Ｖ６４０Ａ，Ｉ６４１Ｖ，Ｉ６４１Ｔ，Ｖ６４２Ｌ，Ｖ６４２Ｆ，Ｖ６４２Ｇ，Ｌ６４８Ｐなどである。このような変異体をコードする核酸は、野生型ＡＰＰのヌクレオチド配列において部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲを利用した部位特異的突然変異誘発法などの公知の手法を用いて作製可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｂｅｌ，ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。プラスミド、ウイルスなどのベクターに該核酸を挿入し、目的の神経細胞宿主に形質転換又はトランスフェクションする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）上記；Ａｕｓｂｅｌ，ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）上記）。ＡＰＰが過剰発現するために、宿主−発現系において、例えばＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター，Ｓｒａｌｆａプロモーター，ＥＦ１ａｌｆａプロモーターなどの強力プロモーターや誘導剤などを使用して転写活性を増強することによって達成可能である。
本発明の方法で使用可能なＴＧＦβ２には、天然型又は組換え型のヒトＴＧＦβ２及びマウスＴＧＦβ２、並びにヒトＴＧＦβ２のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつＡＰＰとの結合活性を有する同族体或いは類似体が含まれる（例えば、Ｔｗａｒｄｚｉｋ，ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＤＮＡ  ７：１−８；Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２１２７−１２１３１など）。同族体には例えばラットＴＧＦβ２が含まれる（Ｋｏｎｒａｄ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４１：３６７９−３６８６）。ＴＧＦβ２は、上記文献記載の配列情報に基づいてｃＤＮＡクローニングを行ったのち、プラスミド、ウイルスなどの発現ベクターにＴＧＦβ２  ｃＤＮＡを組み込み、得られたベクターで原核細胞（細菌など）又は真核細胞（酵母、昆虫、鳥類、哺乳類細胞など）を形質転換又はトンスフェクトし、細胞を培養することを含む公知の手順で作製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．上記）。なお、組換え型ヒトＴＧＦβ２は、市販されているため、容易に入手可能である。
細胞の培養は、例えば、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１８％ウシ胎児血清などの培地中、３７℃、ＣＯ２濃度５％、細胞密度１〜２割で培養を開始し、通常４８時間で培地交換するなどの条件で行うことができる。
前記培地に加えるＴＧＦβ２及び候補薬剤の量は２００ｎＭ（２ｘ１０−７Ｍ）程度でよい。
前記インキュベーションは、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で行うことができる。前記結合阻害の程度は、前記細胞の生細胞数を測定することにとって決定できる。これは、結合阻害が前記細胞の細胞死の抑制と相関するからである。対照として、ＴＧＦβ２が含有しない系を使用し、そのときの生細胞数に対する測定生細胞数のパーセントを求める。ＴＧＦβ２及び候補薬剤の存在下での測定における生細胞数のパーセントが高いほど、候補薬剤がアルツハイマー病の予防又は治療に有効であることを示す。必要ならば、ＴＧＦβ２の存在及び候補薬剤の不在下での対照値も決定する。
本発明における候補薬剤には、例えば小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸などが含まれるが、これらに限定されないものとする。
本明細書で使用する「小分子」という用語は、非ペプチド性又は非ヌクレオチド性の任意の有機化合物又は天然物を指し、既知及び新規の化合物のいずれも包含するものとする。小分子の例は、脂肪族化合物、芳香族化合物、脂環式化合物、複素環式化合物、ヘテロ芳香族化合物、多環式化合物、合成ポリマーなどの化合物を含む。
ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、アミド結合によるアミノ酸の連鎖であり、アルキル化、アシル化、ペグ化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ＡＤＰリボシル化などの化学修飾誘導体も含む。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなど）などを含む。
本発明はさらに、候補薬剤と、ＴＧＦβ２を発現する神経細胞、グリア細胞又はそれらの株化細胞とを含む培地中で、ＴＧＦβ２発現の低減を指標としてアルツハイマー病の予防薬又は治療薬をスクリーングすることを含む、薬剤のスクリーニング方法を提供する。
神経細胞及びその株化細胞として、上で例示したものをここで使用できる。グリア細胞の具体例は、Ｂｕ１７神経膠芽腫などである。
本発明の測定系に、アミロイドβ１−４２（Ａβ１−４２）を存在させるときには、ＴＧＦβ２の発現が誘導される。それゆえ、本発明の方法では、候補薬剤とともにＡβ１−４２が測定系に存在することが好ましい。
候補薬剤を加えたときに、ＴＧＦβ２の発現が低減又は抑制又は阻害されるならば、この候補薬剤はアルツハイマー病の予防又は治療薬となりうる。
本発明で使用可能な候補薬剤の例は、上記と同様の、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸などを含むが、これらに限定されない。
そのような候補薬剤として、ＴＧＦβ２の転写、翻訳を抑制するような薬剤、例えばＴＧＦβ２  ｍＲＮＡを切断するｍｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）などが例示される。文献記載のターゲット部位の選択法（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７７：７１７４−７１８１など）を利用してｓｉＲＮＡ配列を予測することができる。公知のヘアピン型又はタンデム型のｓｉＲＮＡ発現系を作製し、本発明のスクリーニング法に用いることができる（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３など）。或いは、リボザイムやアンチセンスＲＮＡもまた、候補薬剤として試験に供することができる。リボザイムは、ｍＲＮＡのＧＵＸ（Ｘは任意のヌクレオチド）部位を切断する作用を有するため、タンパク質合成を阻害することができるＲＮＡであり、ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムが知られている。また、アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡに相補的な配列を有するために、タンパク質への翻訳を抑制することができる。
ＴＧＦβ２の発現レベルは、回収した細胞中のＴＧＦβ２タンパク質又はｍＲＮＡの存在又は量をそれぞれ抗ＴＧＦβ２抗体又は核酸プローブ（ＴＧＦβ２  ｍＲＮＡに相補的な約３０〜１００塩基からなる配列）を用いて測定することができる。検出法には、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ハイブリダイゼーションなどの公知の方法が含まれる。
本発明はさらに、上記２つのスクリーニング方法を組み合わせることを含む。この組み合わせによって、前記ＴＧＦβ２とＡＰＰとの結合を阻害する及び／又は前記ＴＧＦβ２発現を低減する候補薬剤を選択することができる。あるいは、それぞれの方法でスクリーニングされた異なる候補薬剤の組み合わせを決定することもできる。
本発明はさらに、ＴＧＦβ２に対する抗体、その断片又はその誘導体、或いはＴＧＦβ２の拮抗剤を有効成分として含む、アルツハイマー病の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
ＴＧＦβ２に対する抗体は、ＴＧＦβ２を特異的に中和するいずれの抗体も含むが、ヒトへの使用を目的とするときには、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの断片、又はそれらの誘導体（例えばペグ化誘導体）などが好ましく使用される。抗ＴＧＦβ２抗体がＴＧＦβ２と結合することによって、ＴＧＦβ２と細胞上のＡＰＰとの結合が阻害される。ＴＧＦβファミリーにはＴＧＦβ１やＴＧＦβ２やＴＧＦβ３が含まれるため、たとえＴＧＦβ２の作用が阻害されたとしても、ＴＧＦβ１やＴＧＦβ３がＴＧＦβ２の他の生理機能をカバーすると考えられる。一方、抗ＡＰＰ抗体の使用も考えられるが、その副作用のために、本発明では好ましい薬剤ではない。
ヒト化抗体及びヒト抗体の作製は、例えばファージディスプレイ法、人工染色体を利用する方法などによって行うことができる（例えば、ＷＯ  ９１／１０７４１、ＷＯ  ９３／１２２２７、ＷＯ  ９５／１５９８２、ＷＯ  ９７／１３８４４、ＷＯ  ９７／０７６７１、Ｎａｔｕｒｅ  １４８、１５４７−１５５３（１９９４）、再表０２／０９２８１２、特表１１−５１０３７５、特表２００３−５２７８３２など）。
ファージディスプレイ法は、Ｍ１３などの繊維状ファージのコートタンパク質（ｇ３ｐなど）に外来遺伝子を融合タンパクとして発現させる方法である。Ｍａｒｋｓらは、１９９１年に、ファージ上に抗体の可変領域が機能的に提示され、スクリーニングによって特異抗体が分離できることを報告し、その後、この方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの完全ヒト抗体の作製法として利用されるようになっている（Ｍａｒｋｓ，ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）。ヒト抗体ライブラリーには、例えば正常なヒトが保有するＶＨ及びＶＬ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより分離し、ランダムに組合わせたＳｃＦｖやＦａｂとして抗体可変領域を提示したコンビナトリアルライブラリー、ヒトＢ細胞内で実際の抗体産生に使用される機能的なＶ遺伝子断片と相補的決定領域（ＣＤＲ）３に相当する領域に適当な長さのランダムなアミノ酸配列が組み込まれるような合成オリゴＤＮＡを用いて抗体可変領域遺伝子を構築し、抗体の多様性を人工的に創出したライブラリーなどが含まれる（Ｂａｒａｂａｓ  ＩＩＩ，ＣＦ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”ｉｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。抗体ライブラリーからの特異抗体の分離は、精製抗原を用いてスクリーニングする方法などによって行うことができる（Ｚｈｕａｎｇ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：４７４）。
ヒト免疫グロブリン遺伝子をコードするトランスジーンを保持し、内在性の免疫グロブリン遺伝子が不活性化されたトランスジェニック非ヒト動物（例えばマウス、ウシなど）からも、ヒト抗体は産生できる。この方法では、例えばヒト抗体遺伝子座をもつヒト染色体断片を含む人工染色体を作製し、ミクロセル融合を介してＥＳ細胞に人工染色体を移入するか、或いは核移植法によって人工染色体を卵子に導入することによって、ヒト抗体を産生可能なトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現することなく、免疫グロブリン成分の配列を機能的に再配列し、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされている種々のアイソタイプの抗体を発現できる。ヒト抗体は、この非ヒト動物を、目的の抗原で免疫することによって得られる。
或いは、複数のヒト免疫グロブリン遺伝子をゲノムに含むトランスジェニック非ヒト動物のリンパ球細胞から、ヒト抗体鎖をコードする核酸の集団を単離し、核酸をディスプレイベクターに導入し、ディスプレイパッケージのライブラリーを得る。ライブラリーは抗体鎖をコードする核酸を含んでおり、その抗体鎖がパッケージから提示される。スクリーニングによって目的のヒト抗体を発現するクローンを選択する。
本発明で使用される抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、ヒト抗体を産生するマウスをＴＧＦβ２、その断片又はその誘導体、或いはＴＧＦβ２受容体の細胞外ドメインのペプチド断片などで免疫し、そのＢ細胞又は脾臓細胞とミエローマ細胞株との融合、ＨＡＴ培地での選択などを含む公知の手法によって作製すことができる。
モノクローナル抗体は、Ｋ▲ｏ▼ｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ手法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）を用いて、非ヒト動物のＢ細胞をミエローマ細胞株と融合させることによって作製される（岩崎辰夫ら著、単クローン抗体、ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ（１９８７）講談社サイエンティフィク、東京、日本）。ハイブリドーマ作製の方法は、免疫した動物から、脾臓の抗体産生細胞を含む器官を切除しリンパ球を分離する。分離したリンパ球とミエローマ細胞（例えばＰ３細胞）との細胞融合を、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地中、５０％ＰＥＧ溶液の存在下で行う。ハイブリドーマのＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択を行って、融合細胞を選択し、クローンの選択後、ハイブリドーマをクローニングする。目的の抗体の検出は、蛍光抗体法、酵素抗体法などの公知の方法で行うことができる（例えば、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗとＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。抗体の種類は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのクラスでもよいが、好ましくはＩｇＧである。また、サブクラスはいずれの種類でもよく、例えばＩｇＧの場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であり、ＩｇＡの場合、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２である。さらにまた、抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（単鎖可変領域抗体断片）などである。
抗体タンパク質のペグ化は、分子量約５０００以上の高分子量ポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ末端及び／又はリシン残基のεアミノ基に化学的に結合することによって行うことができる。
ＴＧＦβ２の拮抗剤（又はアンタゴニスト）は、上記抗体以外の化合物であって、ＡＰＰとの結合に対してＴＧＦβ２と拮抗する化合物である。拮抗剤の例は、ＡＰＰ以外のＴＧＦβ２受容体の細胞外ドメイン又はそのペプチド断片（Ｆａｈａｏ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｄｅ  Ｍｉｃｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１１，４５１２−４５２）、或いはＴＧＦβ２前駆体由来の小ペプチド、例えばＬａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＧＦβ２及びβ３型受容体エクトドメイン（ＥＤ）、ＴＧＦβ２受容体ＥＤ／Ｆｃキメラなどである（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｇ  ｅｔａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１０：２７６（３２）：２９６３２−４３）。これらの拮抗剤は、ＴＧＦβ２と結合してその活性を抑制することができる。
本発明の医薬組成物の有効成分は、直接的にせよ或いは間接的にせよ、患者の脳内に薬剤投与されねばならない。アミロイドベータ（Ａβ）に対する中和抗体はアルツハイマー病の治療薬として脳内Ａβの沈着を抑制することが知られているが、２０００年前後にヒト患者での治験が始まり５％の頻度で脳炎を副作用として引き起すことが分かり治験が中止されたにも関わらず、その有効性が期待されていて副作用を緩和する研究が続けられている。この事実は、静脈投与によっても中和抗体が脳内移行するあるいは間接的に脳内のＡβ濃度を低下させることができることを示している。これと同じ論理がＴＧＦβ２抗体にも通用する可能性、すなわち脳内へ移行する高い可能性を示している（Ｇｅｌｉｎａｓ，ＤＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１  Ｓｕｐｐｌ２：１４６５７−１４６６２）。
本発明の医薬組成物の有効成分には、本発明の上記方法によってスクリーングされた薬剤も包含される。
本発明の医薬組成物は、製薬業界で公知の種々の方法にて各種製剤形態に製造し、医薬品として提供することができる。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再構成させることができる乾燥形態にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤などの注射剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。さらに、血液脳関門を通過しうるように製剤化（例えばリポソームへの封入）されてもよいし、脊髄や脳室内に投与できるように製剤化されてもよい。
これらの各種製剤は、薬学的に許容される賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。また、医薬組成物中、有効成分の含有量は、例えば約０．００１〜約１０重量％であるが、これに限定されない。あるいは、該組成物中の有効成分の用量は、例えば成人体重（ｋｇ）あたり約１μｇ〜約１０ｍｇであるが、これに限定されない。このような用量を単回又は分割投与することができる。
本発明の医薬組成物の有効成分がポリヌクレオチド又は核酸である場合、対応のＤＮＡを発現可能に組み込んだベクターの形態にすることができる。ベクターの例としては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターを用いて生体に感染させることにより、治療剤をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。あるいは、上記ベクター又はＤＮＡをリポソーム（正電荷リポソーム、正電荷コレステロールなど）に導入することもできる。
上記のベクターやリポソームの投与形態としては、大腿四頭筋、大臀筋などの筋肉、脳室、脊髄等への局所投与、あるいは、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のいずれでもよいが、局所投与が好ましい。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することもできる。
以下の実施例において、図面を参照しながら本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの具体例によって制限されないものとする。
【実施例】材料と方法
細胞株、遺伝子、組み換えタンパク、抗体。神経系ハイブリッド細胞Ｆ１１、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞、ｐｃＤＮＡ３ベクターとｐＩＮＤベクター中のｗｔＡＰＰ  ｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３ベクター中のｗｔＡＰＰΔ１９ｃＤＮＡとｗｔＡＰＰΔ２０ｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３ベクターとｐＩＮＤベクター中のＶ６４２Ｉ−ＡＰＰｃＤＮＡについてはいずれも文献記載のものを使用した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，２００１，２００３ａ，ｂ；Ｔｅｒａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
カルボキシル末端にＶ５タグを付けたマウスＡＰＬＰ２  ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳベクターに組み込まれている。１〜５９０番目のアミノ酸に対応するマウスＡＰＰ６９５の細胞外ドメイン（ＡＰＰ−ＥＤ）のほとんどをコードしているｃＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧのＦｃ領域をコードするｃＤＮＡにインフレームで融合させ（Ｌｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドに組み込んで（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）ｐＥＦ−ＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃと命名した。マウスＡＰＰの細胞内ドメインと融合させた、ＥＧＦＲ細胞外ドメインと膜貫通ドメインをコードするベクターについては文献記載に従って構築した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。
エクジソン（ＥｃＤ）として用いたポナステロンＡは、インビトロジェン社（カールズバッド、カリフォルニア州、米国）から購入した。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン（アポシニン）、オキシプリノールは、シグマ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はハイクローン社（ローガン、ユタ州、米国）から、リポフェクトアミン、Ｎ２添加物、プラス試薬は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社（ゲイサーズバーグ、メリーランド州、米国）から、組み換えヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）とＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ社（ロンドン、英国）から、組み換えヒトＴＧＦαはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、免疫染色用の抗ＴＧＦβ１、抗ＴＧＦβ２、抗ＴＧＦβ３ポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）から、抗ＴＧＦβ２中和ポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、抗ＡＰＰ抗体として用いた２２Ｃ１１と、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識抗Ｖ５抗体は、それぞれケミコン社（テメキュラ、カリフォルニア州、米国）とインビトロジェン社から、プロテインＧセファロース４Ｂは、アマシャムファルマシアバイオテク社（ウプサラ、スウェーデン）から、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニンモノアセテート（Ｌ−ＮＭＭＡ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、ＳＰ６００１２５、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０は、カルビオケムノババイオケム社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）からそれぞれ購入した。他の材料はすべて市販のものを使用した。
トランスフェクション法、細胞死、生細胞数計測
一過性トランスフェクション法については次のように行った。
６ウェルプレートにＦ１１細胞を７×１０４個／ウェルで播き、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２＋１８％ＦＢＳで１２〜１６時間培養した。無血清で３時間、（６ウェルプレート１ウェルあたり、プラスミドＤＮＡ：プラス試薬：リポフェクトアミン＝１μｇ：４μｌ：２μｌという一定の比率で）細胞にｐｃＤＮＡ３プラスミドをトランスフェクトした。次にＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２＋１８％ＦＢＳで２時間インキュベートした後、細胞をＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２＋１０％ＦＢＳで培養した。トランスフェクションの２４時間後、Ｎ２添加物を含む無血清Ｈａｍ’ｓＦ−１２中の細胞を組み換えＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦαのいずれかで処理し、または無処理とした。このプロトコールでのトランスフェクション効率は、通常約７０％であった。ｐＩＮＤプラスミドを一過性にトランスフェクトするため、６ウェルプレートにＦ１１／ＥｃＲ細胞を７×１０４個／ウェルで播いてＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２＋１８％ＦＢＳで１２〜１６時間培養し、無血清で３時間、（６ウェルプレート１ウェルあたり、プラスミドＤＮＡ：プラス試薬：リポフェクトアミン＝１μｇ：４μｌ：２μｌという一定の比率で）ＥｃＤ誘導性ｐＩＮＤプラスミドをトランスフェクトした。次にＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２＋１８％ＦＢＳで１６時間インキュベートした後、Ｎ２添加物を含む無血清Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２中の細胞を組み換えＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦαのいずれかで処理し、または無処理とし、その後ＥｃＤを培地に添加した。トランスフェクションの７２時間後、細胞死をアッセイするため、トリパンブルー排除試験を既報に従って行った。生細胞数計測として、ＷＳＴ−８アッセイを既報に従って行った（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
アデノウイルスの調製とアデノウイルスベクターを用いた発現
非増殖性のアデノウイルスベクター系は、宝酒造（滋賀、日本）から購入した。系の詳細は既に報告されている（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｗｔＡＰＰに用いたコスミドは、完全長ｗｔＡＰＰをｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩサイトに挿入することにより構築した。Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰをコードするアデノウイルスは、既報に従って調製した（Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。すべてのウイルスはＨＥＫ２９３細胞で増殖させ、塩化セシウム密度勾配超遠心法（２回法）によって精製した。ウイルスの力価は、２つの別個の方法で調べた。既述の通り、血清を含む培地に組み換えアデノウイルスを添加することにより感染させた。特記のない限り、指定された感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスを含む培地で６ウェルプレートに播いた細胞（５×１０４個）を３７℃、６０分間インキュベートした。
大脳皮質初代培養神経細胞と生細胞数計測
大脳皮質初代培養神経細胞（ＰＣＮ）は、既報に従い、Ｎｅｕｒｏｎ培地を用いて調製しポリ−Ｌ−リジンコートした９６ウェルプレート（住友ベークライト、秋田、日本）に播いた。培養開始後（ＤＩＶ）３日目に、ｗｔＡＰＰあるいはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰをコードするアデノウイルスを指定されたＭＯＩでＰＣＮに感染させた。培養開始後４日目に２０ｎＭあるいは２００ｎＭのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のいずれかを添加し、処理開始から７２時間後に既報に従ってＷＳＴ−８アッセイとカルセインの蛍光強度アッセイの両方で生細胞数を計測した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，２００３ａ，２００４）。
プルダウンアッセイ
Ｆ１１細胞を播き、無血清で３時間、（６ウェルプレート１ウェルあたり、プラスミドＤＮＡ：プラス試薬：リポフェクトアミン＝１μｇ：４μｌ：２μｌという一定の比率で）ｐＥＦ−ＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃプラスミドをトランスフェクトした。次にＨａｍ’ｓＦ−１２＋１８％ＦＢＳで２時間インキュベーションした後、細胞をＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２＋１０％ＦＢＳで培養した。トランスフェクションの２４時間後、Ｎ２添加物を含む無血清Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２で細胞を培養した。トランスフェクション開始から７２時間後に、培養に用いた培地を回収した。２２Ｃ１１を用いた免疫ブロットで、分泌されたＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃタンパクを確認した後、培養に用いた培地５００μｌ、競合物質としての２００ｐｍｏｌ  ＴＧＦβ１の存在下あるいは非存在下で２０ｐｍｏｌ  ＴＧＦβ２、２０μｌプロテインＧセファロース４Ｂを混合し、４℃で一晩撹拌した。ＰＢＳでビーズを３回洗浄した。その後、ビーズに２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファを加え、３分間ボイルした。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分離されたタンパクをＰＶＤＦメンブレン上に転写した。１０％スキムミルクを含むＰＢＳＴ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）でブロッキングした後、ブロットを抗体で処理した。一次抗体としてＴＧＦβ２については抗ＴＧＦβ２ポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、あるいはＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃについては２２Ｃ１１（２．５μｇ／ｍｌ、ケミコン社）を用い、それぞれの二次抗体として５，０００倍希釈、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体、あるいはホースラディシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（バイオラッド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いた。その後、免疫反応のバンドをＥＣＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社、ウプサラ、スウェーデン）で発色させた。
リアルタイムＰＣＲ
Ａβで処理したヒト神経膠芽腫の細胞株Ｂｕ１７、ヒト神経芽細胞腫の細胞株ＳＨＳＹ−５Ｙ、マウスＥ１４  ＰＣＮからのトータルＲＮＡはメーカーの説明書に従ってＩＳＯＧＥＮで調製した（ニッポンジーン、東京、日本）。ファーストストランドｃＤＮＡは０．５μｇのトータルＲＮＡからＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて合成した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＰＣＲを行った。
ヒト  ＴＧＦβ１用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡＡＴＧ−３’（配列番号１）と５’−ＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号２）である。ヒトＴＧＦβ２用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＧＧＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号３）と５’−ＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号４）である。ヒトＴＧＦβ３用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＡＴＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号５）と５’−ＣＧＡＡＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧ−３’（配列番号６）である。マウスＴＧＦβ１用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＧＡＣ−３’（配列番号７）と５’−ＧＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号８）である。マウスＴＧＦβ２用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号９）と５’−ＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号１０）である。マウスＴＧＦβ３用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＣＧＴＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１１）と５’−ＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１２）である。ヒトおよびマウスＧ３ＰＤＨ用のセンスプライマとアンチセンスプライマはそれぞれ、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１３）と５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１４）である。データ解析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒ．１．９．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のソフトウェアを用いて行った。指定されたインキュベーション時間にＩＳＯＧＥＮを使って細胞を回収し、メーカーの説明書に従ってトータルＲＮＡを調製した。ファーストストランドｃＤＮＡはＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて合成し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＰＣＲ解析を行った。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡの発現量は、各インキュベーション時点で、内部コントロールとしてのＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量で補正した。次に、図面の簡単な説明で記載しているように、Ａβで処理した細胞中での補正済みＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡ発現量を、コントロールの細胞中での発現量の平均によってさらに補正した。例えば、この補正によって、その発現量がコントロールの細胞での発現量に等しいならば、発現率は１である。すべての値は、少なくとも独立した３つのサンプルの平均値±標準偏差を示す。
ウエスタンブロット法
異所発現させたＡＰＰと内因性の細胞内ＴＧＦβ２の免疫ブロットでの解析を、既報に従って行った（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。内因性ＴＧＦβ２の発現を解析するために、Ｂｕ１７細胞を６ウェルプレートに播き、１０ｎＭのＡβ（１−４０）あるいはＡβ（１−４２）で４８、７２、９６時間処理した。これらの時間の後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解用バッファ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］で溶解させた。細胞のライセート（２０μｇ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分離されたタンパクをＰＶＤＦメンブレンに転写した。１０％スキムミルクを含むＰＢＳＴでブロッキングした後、ブロットを抗体で処理した。一次抗体として抗ＴＧＦβ２ポリクローナル抗体（５００倍希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（５，０００倍希釈、バイオラッド社）を用い、その後、免疫反応のバンドをＥＣＬで発色させた。１８カ月齢のＴｇ２５７６雄性マウスと同腹仔の正常マウスの脳から調製した大脳皮質と海馬をプロテアーゼ阻害剤「ｃｏｍｐｌｅｔｅ」（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を含む細胞溶解用バッファ中でポリトロンホモジナイザ（ＫＩＮＥＭＡＴ１ＣＡ  ＧｍｂＨ、スイス）を使ってホモジナイズし、その後、抗ＴＧＦβ２抗体で免疫ブロットを行った。
動物（Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウス）
ハムスターの強力なプリオンタンパクプロモーター（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）の制御下でヒトＡＰＰのスウェーデン型変異体（ＡＰＰ７７０のナンバリングではＫ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ；Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を発現しているＴｇ２５７６トランスジェニックマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（バーハーバー、メイン州）から入手した。これらのマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）と交配して、ヘミ接合体として維持した。動物は、１２時間の明暗サイクル（７：００  ＡＭ〜７：００ＰＭ）で、特別な無菌動物施設（２３±１℃、湿度５０±５％）内で飼育した。マウスには、γ線照射したＰｉｃｏｌａｂＲｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ２０（ＰＭＩ  Ｆｅｅｄｓ  Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州、米国）と、次亜塩素酸ナトリウム（５ｐｐｍ）を添加した滅菌脱イオン蒸留水を自由に摂取させた。この研究は、北米神経科学学会の神経科学研究における動物と人の使用に関する指針、および慶応義塾大学医学部（東京、日本）の実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された。すべての実験手順は、慶応大学実験動物委員会の承認を受けた。
免疫組織化学
１８カ月齢の雌性Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウスとその同腹仔マウスを、ジエチルエーテルで深麻酔した。脳を生理食塩水で潅流して５％酢酸を含むエタノールで固定した後、パラフィン包埋して１０μｍの厚さに薄切した。マウスの脳の矢状断切片を、Ｎｅｗ−Ｓｉｌａｎｅスライドグラス（武藤化学、東京、日本）上に作製した。その後、サンプルをキシレンで脱パラフィンし、１００％エタノール、９０％エタノール、７０％エタノール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の中で順に洗浄した。切片を３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理して内在性ペルオキシダーゼを失活させた。ＰＢＳで洗った後、切片を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。一次抗体とのインキュベーションの後、切片をＰＢＳで洗って、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（バイオラッド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州；１：１００）と共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応を視覚化するために、発色基質としてのジアミノベンジジン（０．２ｍｇ／ｍｌ、和光純薬、大阪、日本）で切片を処理し、その結果、茶色の反応生成物が生じた。用いた抗体は、ウサギ抗ＴＧＦβ１ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、ハイデルベルク、ドイツ；１：１５）、ウサギ抗ＴＧＦβ２ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、ハイデルベルク、ドイツ；１：２０）である。
結果
ＴＧＦβ２は、ｗｔＡＰＰを過剰発現した神経系ハイブリッド細胞Ｆ１１の細胞死を誘導する
本発明者らは、リポフェクション法を応用したトランスフェクションによって、神経系ハイブリッド細胞株Ｆ１１でｗｔＡＰＰを異所発現させた（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。以前の研究で示したように、この方法によるＦ１１細胞へのトランスフェクション効率は約７０〜８０％であった（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ａ）。このプロトコールでＦ１１細胞にｗｔＡＰＰを過剰発現させただけでは神経細胞死は誘導されなかった（図１Ａ）。Ｆ１１細胞にｗｔＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトし、その後１００  ｐＭ、１  ｎＭ、１０  ｎＭ、１００  ｎＭのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦαのいずれかで処理したところ、ＴＧＦβ２存在下でのみ用量依存的に細胞死が誘導され、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、ＴＧＦα存在下では誘導されなかった（図１Ａ、１Ｂ）。図１Ｃに示したように、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦαのいずれも、アミロイド前駆体様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）を過剰発現させたＦ１１の細胞死は促進しなかった。ＴＧＦβ２で処理しても、ＡＰＰ発現量に変化はなかったので、ＴＧＦβ２がｗｔＡＰＰ発現量を増加させることにより細胞死を誘導した可能性は除外される。
ＴＧＦβ２で処理すると、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを非常に低レベルで発現している神経系ハイブリッド細胞Ｆ１１の細胞死が促進される
エクジソン（ＥｃＤ）による誘導で厳密に制御された発現系を用いて、本発明者らは次のことを報告した。ＦＡＤ関連ＡＰＰであるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを内因性ｗｔＡＰＰの２〜２．５倍に相当する低レベルで発現させると、細胞死が誘導される。その一方、ｗｔＡＰＰを低レベルで発現させてもＦ１１細胞での細胞死は誘導されない（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。本発明者らは、ＦＡＤ関連ＡＰＰ変異体とＡＰＰ発現量の視点から、ＴＧＦβ２が誘導する神経細胞死をこの系を用いてさらに検討した。図２Ｂに示したように、１μＭ  ＥｃＤでの処理により内因性ｗｔＡＰＰの約半分、５μＭ  ＥｃＤでの処理により内因性ｗｔＡＰＰとほぼ同量に相当する、ｗｔＡＰＰとＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの非常に低レベルな異所発現がＦ１１細胞で誘導された（図２Ｂ）。本発明者らの以前の結果と合致するのだが（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、Ｆ１１細胞ではＶ６４２Ｉ−ＡＰＰのみの発現により軽度の細胞死が用量依存的に誘導されたが、ｗｔＡＰＰのみの発現によっては誘導されなかった。ＴＧＦβ２で処理すると、発現量依存的に、ｗｔＡＰＰを異所発現しているＦ１１で細胞死が誘導されＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ発現Ｆ１１細胞で細胞死が促進された。ＴＧＦβ２で処理すると、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ発現Ｆ１１細胞では、明らかにｗｔＡＰＰ発現Ｆ１１細胞よりも重度な細胞死が引き起こされた。これらの結果は、ＦＡＤ関連ＡＰＰを有する神経細胞では正常ＡＰＰを有する神経細胞よりもＴＧＦβ２によって容易に細胞死が誘導されることを示した。
ＴＧＦβ２が誘導する神経細胞死の特徴付け
ＴＧＦβ２が誘導する細胞死について実際の細胞内伝達物質に関する情報を得るため、細胞透過性カスパーゼ３／関連カスパーゼ阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＤＥＶＤ）と一般的に使われている細胞透過性抗酸化剤グルタチオンエチルエステル（ＧＥＥ）を用いて薬理学的分析を行った。両者はＴＧＦβ２が誘導する細胞死を完全に阻害した（図３Ａ）。これは、この神経細胞死にカスパーゼ３／関連カスパーゼと活性酸素種（ＲＯＳ）原因酵素が関与することを示す。ｗｔＡＰＰの単純な過剰発現によって誘導される神経細胞死ではＤＥＶＤやＧＥＥに非感受性の細胞死が起こり、ＴＧＦβ２が誘導した細胞死とは全く異なっていることに注目すべきである（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
本発明者らはさらに、ＴＧＦβ２が誘導した細胞死の薬理学的特性を明らかにした。百日咳毒素（ＰＴＸ）を用いてＰＴＸ感受性ヘテロ三量体Ｇタンパク質の関与を明らかにし、またＭＡＰＫファミリー阻害剤としてＪＮＫ特異的阻害剤ＳＰ６００１２５（ＳＰ）、ｐ３８ＭＡＰＫ特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ阻害剤ＰＤ９８０５９（ＰＤ）を用いた（図３Ｂ）。さらに、細胞死シグナル伝達系の進行に関与する活性酸素種産生の原因酵素を特定するために、本発明者らはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤アポシニン（ＡＰＯ）、キサンチンオキシダーゼ阻害剤オキシプリノール（ＯＸＹ）、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤Ｌ−ＮＭＭＡ、という特異的阻害剤を用いて薬理試験を行った（図３Ｂ）。図３Ｂに示したように、ＤＥＶＤ、ＧＥＥ、ＰＴＸ、ＳＰ、ＡＰＯで処理すると、ＴＧＦβ２が誘導した細胞死が阻害される。これは、ＴＧＦβ２が誘導した細胞死がＰＴＸ感受性ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼを介することを示している。
Ｇｏと相互作用するＡＰＰのドメインはＴＧＦβ２／ＡＰＰが誘導する細胞死に関与する
このタイプの細胞死に関与する百日咳毒素感受性ヘテロ三量体Ｇタンパク質を特定するために、本発明者らはＴＧＦβ２が細胞死を誘導するために必須なＡＰＰのドメインを同定した（図３Ｃ）。本発明者らは、完全長ｗｔＡＰＰ、ドメイン２０を欠失したｗｔＡＰＰ（ｗｔＡＰＰΔ２０）、ドメイン１９を欠失したｗｔＡＰＰ（ｗｔＡＰＰΔ１９）のいずれかをＦ１１細胞にトランスフェクトし（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２で処理して、トリパンブルー排除試験で死細胞数計測（左図）とＷＳＴ−８アッセイで生細胞数計測（右図）を行い、Ｈｉｓ６５７−Ｌｙｓ６７６領域に相当するドメイン２０がＴＧＦβ２による細胞死誘導に必須であることを明らかにした。これは、Ｇｏはドメイン２０と結合することが既に示されているので、Ｇｏがシグナル伝達物質であり３つのＧｉタンパクはいずれもシグナル伝達物質ではないことを強く示唆するものである（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
ＴＧＦβ２はＡＰＰの細胞外ドメインに結合し、神経細胞死を誘導する
本発明者らは、ＡＰＰあるいは細胞膜表面にあるその関連タンパク質に結合することでＴＧＦβ２が細胞死を直接的に誘導することを証明するために、ＡＰＰの細胞外ドメイン（ＡＰＰ−ＥＤ）とＴＧＦβ２が直接的あるいはほぼ直接的に会合しているかどうかを、まず共免疫沈降法によって検討した。予想した通り、Ｆ１１細胞にＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃをコードするプラスミドをトランスフェクトし、その後ＴＧＦβ２を添加したときのみ、ＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃの免疫沈降体にＴＧＦβ２が含まれていた（図４Ａ、左から４番目のレーン）。これとは対照的に、Ｆ１１細胞にＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃをコードするプラスミドをトランスフェクトし、ＴＧＦβ１を添加したときは、ＡＰＰ−ＥＤ／Ｆｃの免疫沈降体にＴＧＦβ１は含まれなかった（左から３番目のレーン）。１０倍量のＴＧＦβ１をＴＧＦβ２と共に添加しても、ＡＰＰ−ＥＤ／ＦｃとＴＧＦβ２の会合は阻止されなかった（左から５番目のレーン）。これは、ＴＧＦβ２とＡＰＰ−ＥＤの間に特異的な結合が存在することを意味する。これと合致して、２００μＭ  ＴＧＦβ１はＴＧＦβ２による細胞死誘導に影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。
ＴＧＦβ２がＡＰＰに無関連な細胞膜上の他の分子に結合することでＡＰＰを介する細胞死を促進している可能性を除外するために、本発明者らはＡＰＰを介する細胞死に対するＴＧＦβ２処理の効果を検討した。この実験では、上皮細胞増殖因子受容体の細胞外ドメインと膜貫通ドメイン、ＴＧＦβ２が結合するドメインであるＡＰＰの細胞外ドメインを欠失しているＡＰＰの細胞内ドメインから成る組み換え体（ＥＧＦＲ−ＥＤ＋ＴＭ／ＡＰＰ−ＣＤのハイブリッド）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）を発現させる系を用いた。ＥＧＦＲ−ＥＤ／ＡＰＰ−ＣＤをＦ１１細胞で異所発現させた後、ＴＧＦβ２と共に、あるいはＴＧＦβ２なしでＥＧＦを添加した。ＥＧＦで処理すると、Ｇｏ、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼを介する細胞死が誘導された（図４Ｃ）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。図４Ｃに示したように、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２を添加してもＥＧＦを介する細胞死には全く変化がなかった。これは、ＴＧＦβ２がＦ１１細胞上の他の受容体に結合することでＡＰＰを介する細胞死を促進しているのではないことを示す。ＴＧＦβ２の細胞死における関与をさらに裏付けるため、本発明者らは抗ＴＧＦβ２抗体を用いて中和実験を行った。中和活性を有する抗ＴＧＦβ２抗体を多量に添加すると、ＴＧＦβ２が誘導する神経細胞死が完全に阻害された（図４Ｄ）。これらの結果は、ＴＧＦβ２はＡＰＰあるいはその関連タンパク質に特異的に結合してＡＰＰを介する細胞死シグナルを誘発することを強力に裏付けるものである。
最近、本発明者らはヒューマニン（ＨＮ）ペプチドを同定した。これは、ＡＤに関連する損傷が引き起こす神経細胞死に対する保護因子である（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。図４Ｃに示したように、より強力な誘導体の１つであるＤ−Ｓｅｒ１４−ＨＮペプチド（Ｔｅｒａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）は、ＴＧＦβ２／ＡＰＰが誘導するＦ１１細胞の細胞死を抑制する。
ＴＧＦβ２は、アデノウイルスを使ってｗｔＡＰＰ、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを発現させた初代培養神経細胞で細胞死を誘導する
本発明者らは、ＴＧＦβ２がマウスＥ１４大脳皮質初代培養神経細胞（ＰＣＮ）の細胞死を誘導するか否かを検討した。ｗｔＡＰＰ遺伝子をこの細胞に十分に導入するため、アデノウイルスベクターによる遺伝子発現系を用いた。感染多重度（ＭＯＩ）５でｗｔＡＰＰウイルスとＶ６４２Ｉ−ＡＰＰウイルスを感染させた２４時間後に、２００ｎＭのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３いずれかで細胞を処理した。感染７２時間後にＷＳＴ−８アッセイ（図５Ａ）とカルセインを用いたアッセイ（図５Ｂ）で細胞の生存能力を検討し、２００ｎＭ  ＴＧＦβ２はアデノウイルスを使ってｗｔＡＰＰあるいはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを発現させたＰＣＮの生細胞数を減少させるが、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は減少させないことを見出した。図５Ｃに示したように、５ＭＯＩでｗｔＡＰＰウイルスを感染させると内因性ｗｔＡＰＰと比較して約１〜２倍のｗｔＡＰＰ発現が誘導された。アデノウイルス感染によるＡＰＰ発現は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のいずれの処理でも変化はなかった。Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを異所発現しているＰＣＮでは、ｗｔＡＰＰを異所発現しているＰＣＮよりもより重度な細胞死が誘導されたことに注目すべきである。カルセイン−ＡＭ染色した生存ＰＣＮの代表的な写真を図５Ｄに示す。
ＴＧＦβ２は、ｗｔＡＰＰ発現ＰＣＮよりもＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ発現ＰＣＮでより効率的に細胞死を誘導する
本発明者らはさらに、ＰＣＮのＴＧＦβ２誘導細胞死に対するＦＡＤ関連Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ異所発現による影響を、ｗｔＡＰＰ異所発現による影響と比較した。相違を明確にするため、添加したＴＧＦβ濃度を２０ｎＭと低く保ち、感染させたウイルスのＭＯＩを０から２５まで変化させた（図６Ａ）。細胞の生死は、カルセインの蛍光強度測定で評価した。本発明者らの以前の研究で述べたように（Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、アデノウイルスを用いたＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの過剰発現で、何か他に毒性因子を追加しなくてもＰＣＮの細胞死が引き起こされた。アデノウイルスを用いたｗｔＡＰＰの過剰発現がＰＣＮに細胞死を引き起こすことも報告された（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｕｒｓｚｔａｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
ネガティブコントロールとしてＰＣＮにｌａｃＺを導入したアデノウイルスを１、２．５、５、１０、２５ＭＯＩで感染させ、その後２０ｎＭ  ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３で処理すると、細胞死は全く起こらなかった（図６Ａ）。図６Ｂに示したように、アデノウイルスを用いたｗｔＡＰＰの過剰発現のみで、ｗｔＡＰＰ発現量に依存した軽度な細胞死が誘導される。２０ｎＭ  ＴＧＦβ２で処理するとｗｔＡＰＰ発現量依存的にＰＣＮの生細胞数減少が促進され、２５ＭＯＩの感染で蛍光強度は６２．５％に減少した。これとは対照的に、ＴＧＦβ１あるいはＴＧＦβ３で処理しても、無処理群と比較して生細胞数減少は全く促進されていなかった。これと同様に、しかしさらに顕著に、アデノウイルスを用いたＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現のみで用量依存的にＰＣＮの細胞死が誘導された（図６Ｃ）。ＴＧＦβ２処理により細胞死が促進されたが、ＴＧＦβ１あるいはＴＧＦβ３処理では促進されなかった。２５ＭＯＩで感染させＴＧＦβ２で処理すると、蛍光強度は３２．５％に減少した。同じＭＯＩでウイルスを感染させると、ｗｔＡＰＰとＶ６４２ＩＡＰＰタンパク発現は同様に誘導されていた（図６Ｄ）。
Ａβ  １−４２によるＴＧＦβ２発現のアップレギュレーションと、Ａβ  １−４０によるＴＧＦβ１  ｍＲＮＡ、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡの一過性のアップレギュレーション
上で示したようにＴＧＦβ２がｗｔＡＰＰとＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを介する細胞死を著しく促進することと、ＴＧＦβ２発現がＡＤの脳で増加している場合があると報告されたことから考えて（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｉｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｐｅｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｌｌｏ，１９９５）、ＴＧＦβ２がＡＤでの神経細胞死の発症と進行に関与している症例がある、という仮定を本発明者らは立てた。この仮説を立証するため、本発明者らはまずＴＧＦβ２発現がどのようにしてＡＤの脳で促進されるのかを明らかにする必要があった。本発明者らはＡβがＴＧＦβ２発現を促進すると想定していた。これを検証するため、グリア細胞と神経細胞の両方において、Ａβ処理によりＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のｍＲＮＡ発現が誘導されるか否かを検討した。ヒト神経膠芽腫の細胞株Ｂｕ１７、ヒト神経芽細胞腫の細胞株ＳＨＳＹ−５ＹとマウスＥ１４  ＰＣＮを、アミロイド産生型Ａβで毒性の弱いＡβ１−４０あるいはＡβ１−４２存在下で１４４時間まで培養し、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＡβ添加後の各時点でＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３ｍＲＮＡ発現を検討した。
図７Ａに示したように、Ｂｕ１７細胞を６、４８、９６時間、１０ｎＭ  Ａβ（１−４０）で処理すると、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３のｍＲＮＡ発現量は４８時間後に３〜４倍に増加し、９６時間後にはベースレベルに戻った。しかし、ＴＧＦβ２のｍＲＮＡ発現量は９６時間まで変化がなかった。一方、Ｂｕ１７細胞を１０ｎＭ  Ａβ１−４２で処理すると、ＴＧＦβ２のｍＲＮＡ発現量はインキュベーション時間依存的に徐々に増加し、９６時間後には３倍多い発現量に達した。しかし、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３のｍＲＮＡ発現量は９６時間までベースレベルのままであった。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ｍＲＮＡ発現のＡβによるこのような誘導パターンは、基本的に神経細胞でも同様である。マウスＥ１４  ＰＣＮあるいはＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１０  ｎＭ  Ａβ  １−４０で６、４８、９６時間処理すると、６時間処理後には、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３のｍＲＮＡ発現量は３〜４倍まで増加し、その後９６時間までに徐々にベースレベルに戻った。一方、ＴＧＦβ２のｍＲＮＡ発現量は９６時間までベースレベルのままであった（図７Ｂ、７Ｃ）。図７Ｂと７Ｃに示したように、ＰＣＮあるいはＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を１０  ｎＭ  Ａβ１−４２で処理すると、ＴＧＦβ２のｍＲＮＡ発現量はインキュベーション時間依存的に増加し、９６時間後には３倍に達した。一方、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３のｍＲＮＡ発現量は９６時間までベースレベルのままであった。本発明者らはさらに、ＰＣＮを用いて、ＴＧＦβ２のｍＲＮＡ発現を１０ｎＭ  Ａβ１−４２添加の１４４時間後まで検討した（図７Ｄ）。ＴＧＦβ２のｍＲＮＡ発現は、Ａβ１−４２添加の１２０時間後には最大に達したが、１４４時間後でも依然として促進されていた。
これと一致して、Ｂｕ１７細胞ではＡβ１−４２での処理によって７２時間後と９６時間後にＴＧＦβ２タンパクの発現が促進されていたが、Ａβ１−４０では促進されなかった（図７Ｅ）。これは、ＴＧＦβ２発現が細胞毒性を有するＡβ１−４２によって誘導されることを裏付けるものである。
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＴＧＦβ２の発現はＴｇ２５７６マウスの脳のいくつかの領域でアップレギュレートしている
本発明者らは、ＴＧＦβ２発現がＡβによりｉｎ  ｖｉｖｏでアップレギュレートするか否かを検討した。この疑問に取り組むため、ハムスターの強力なプリオンタンパクプロモーターの制御下でヒトＡＰＰのスウェーデン型変異体（ＡＰＰ７７０のナンバリングではＫ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ；Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を発現している１８カ月齢のＴｇ２５７６トランスジェニックマウスの脳について検討した（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｔｇ２５７６マウスの脳の皮質と海馬で、典型的なアミロイド斑が観察されたことが報告されている。Ｔｇ２５７６雌性マウスと同腹仔の正常雌性マウスの脳の矢状断切片を、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ２に対する抗体で免疫染色した（図８Ａの１〜８）。Ｔｇ２５７６マウスの脳の皮質細胞に含まれるＴＧＦβ２は、同腹仔のマウスと比較して軽度増加していた（図８Ａの１，２）。この傾向は、１５カ月齢の雌性マウスの脳でも確認した。さらに、１８カ月齢のＴｇ２５７６マウスの海馬の網状・分子層（図８Ａの３，４，５，６）と大脳皮質（データ示さず）のアミロイド斑周辺で、ＴＧＦβ２により中程度に免疫染色された一群の細胞が存在する。アミロイド斑周辺にあるＴＧＦβ２が増加した細胞のほとんどは、グリア細胞であると推定される。これらの結果は、ＦＡＤ患者の脳でアミロイド斑周辺のグリア細胞に強い染色が認められる、というこれまでの報告結果と一致する（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；ＰｒａｔｔとＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９９７）。以前にも報告されたように（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、アミロイド斑の中央部分はＴＧＦβ１で強く染色された（図８Ａの７，８）。一方、皮質とアミロイド斑周辺の局所的な領域以外の部位では、ＴＧＦβ２タンパクの著しい増加は認められなかった。
これと一致して、同腹仔の雄性マウスと比べると１８カ月齢のＴｇ２５７６雄性マウスの皮質でＴＧＦβ２タンパク発現が中程度に増加していることが抗ＴＧＦβ２免疫ブロット法で確認されたが、海馬では確認されなかった（図８Ｂ）。
考察
本発明者らはここで、ＴＧＦβ２がＡＰＰリガンドとして作用して神経細胞死を誘導する証拠を提示する。ｗｔＡＰＰおよびＶ６４２Ｉ−ＡＰＰをごく軽度に過剰発現させたＰＣＮと同様、Ｆ１１細胞でも、ＴＧＦβ２によって細胞死が顕著に誘導された。ＴＧＦβ２により活性化される細胞死の経路は、ＰＴＸおよびＧＥＥ感受性である。実際にＴＧＦβ２により活性化される細胞死シグナル伝達系は、ＡＰＰ、Ｇｏ、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼの経路を介して伝えられる。ＡＰＰが介するこの種のシグナル伝達については、厳密に制御された発現系を用いた研究の中で本発明者らも以前に報告した。ＡＰＰを人為的に二量体化して抗ＡＰＰ抗体を加えることによって活性化される細胞死シグナル伝達系も、ＡＰＰ、Ｇｏ、ＪＮＫ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、カスパーゼ３／関連カスパーゼを介して伝えられる（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，２００３ａ，ｂ；Ｒｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＡＤ遺伝子とｗｔＡＰＰのタンパク質発現を厳密に制御するこの系を用いることにより、ＦＡＤ関連細胞死には複数の経路があることを本発明者らは明らかにした（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。低レベルから中レベルのｗｔＡＰＰ発現では、神経細胞死は起こらない。一方、ｗｔＡＰＰを高レベルに発現させると、ＤＥＶＤとＧＥＥに非感受性の細胞死が起こった。以上のことから、ｗｔＡＰＰを低レベルに発現したＦ１１細胞におけるＴＧＦβ２を介する細胞死は、ｗｔＡＰＰを高レベルに過剰発現させることで誘導される細胞死とは完全に異なる。ＦＡＤに関連するＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを発現している神経細胞では、同レベルのｗｔＡＰＰを発現している神経細胞と比べ、より重度な細胞死がＴＧＦβ２によって誘導されたことが報告されている。この結果は、同じ濃度のＴＧＦβ２存在下で、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを有する神経細胞はｗｔＡＰＰを有する神経細胞よりも細胞死を起こしやすいことを示す。したがって、ＦＡＤに関連するさまざまな点突然変異は、ＴＧＦβ２が引き起こす細胞死経路に対するＡＰＰの感受性を増すことによりＡＤ発症に一部寄与していると考えられる。
ＴＧＦβファミリーに属するサイトカインは、非神経細胞に対してだけではなく神経細胞に対しても多くの機能を有する。非神経細胞に対するＴＧＦβの機能とは対照的に、神経細胞に対するＴＧＦβの機能の特徴はあまり明らかにされていない。これまでに報告された複数の論文で、虚血による神経細胞死に対してＴＧＦβ１が拮抗的に働くことが示されている（Ｋｌｅｍｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｌｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｅｈｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。一方、ＴＧＦβ２とＴＧＦβ３に関する研究の数は非常に限られている。本研究は、ＴＧＦβ２がＡＤの脳での神経細胞死の開始を促進することを示し、以前の研究で観察されたＦＡＤの脳でのＴＧＦβ２発現増加（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；ＰｅｒｅｓｓとＰｅｒｉｌｌｏ，１９９５；Ｌｉｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が生物学的に重要である可能性を示唆した最初の研究である。これと一致して、ＡＤ患者の血清と脳脊髄液中でＴＧＦβ濃度が上昇していた（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。しかしながら、本発明者らは最新の研究において神経細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導するために、ＴＧＦβ２を１０〜２００ｎＭ添加する必要があった。これは、ＡＤ患者の血清と脳脊髄液中で観察されたものよりもはるかに高濃度であると考えられる。この点に関して本発明者らは、ＴＧＦβ２はグリア細胞だけではなく神経細胞自体でも産生されるため（図７）神経細胞周辺の体液中のＴＧＦβ２濃度がｉｎ  ｖｉｖｏで十分なレベルまで局所的に高まっていると推測している。
次に、問題点としての、ｗｔＡＰＰあるいはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現が異所的に誘導された場合にのみＴＧＦβ２が神経細胞死誘導活性を有することについて議論する。２００ｎＭ  ＴＧＦβ２によるＰＣＮへの神経毒性誘導には約２倍量のｗｔＡＰＰ発現が必要である（図５）が、２０ｎＭ  ＴＧＦβ２によるＰＣＮへの神経毒性誘導には約５倍量のｗｔＡＰＰ発現が必要である（図６）。しかしながら、ＴＧＦβ２での処理により、ｗｔＡＰＰを発現している神経細胞よりも少量のＶ６４２Ｉ−ＡＰＰしか発現していない神経細胞で細胞死が誘導されることは注目に値する（図２、６）。したがって、生理的なプロモーターの制御を受けるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ遺伝子の対立遺伝子を１本有するＦＡＤの最適なモデルであると考えられるマウス、「ヘテロＶ６４２Ｉ−ＡＰＰノックインマウス」から調製したＰＣＮにＴＧＦβ２での処理によって細胞死を誘導できたと本発明者らは推測する（Ｋａｗａｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。最近、ＴＧＦβ１がＡＰＰ  ｍＲＮＡ発現とＡβ産生を促進することを複数のグループが報告した（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｅｓｎ▲ｅ▼  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本発明者らは現時点では、ＡＰＰ発現あるいはＦＡＤ関連ＡＰＰ変異体の発現がＡＤ患者の脳で増加していることを裏付ける証拠も否定する証拠も持たない。しかしながら、この点と関連して、ＡＤの罹患率が高いダウン症患者でＡＰＰが過剰発現していることはよく知られている。
本発明者らは、Ａβ１−４２は１０  ｎＭでＴＧＦβ２発現を誘導し、Ａβ１−４０は１０  ｎＭでＴＧＦβ１とＴＧＦβ３の発現を一過性に誘導することをｉｎ  ｖｉｔｒｏで証明した（図７）。脳内の可溶性Ａβの局所濃度を推定することは非常に困難である。しかしながら、０．１〜１ｎＭレベルのＡβがラットと健常志願者の脳脊髄液中に存在すると推定されること（Ｓｅｕｂｅｒｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、Ｔｇ２５７６マウス由来神経細胞で細胞毒性を有するＡβ産生が著しく増加すること（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を考えると、神経細胞とグリア細胞周辺での毒性を有するＡβ濃度はＴｇ２５７６マウスの脳で１０ｎＭを上回るレベルに達していると推測される。これと一致して、同腹仔マウスと比べて、Ｔｇ２５７６マウス脳の皮質細胞ではＴＧＦβ２タンパクの発現が軽度増加していることを本発明者らは確認した。Ｔｇ２５７６マウスの脳でのみ観察される特徴的な他の組織学的所見として、ＴＧＦβ２発現が増加した一群の細胞がアミロイド斑周辺で認められることが以前の研究（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；ＰｒａｔｔとＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９９７）で報告されている。この特徴的な所見の原因の１つとして、毒性を有するＡβの濃度がアミロイド斑周辺では他の部位よりも高いことが考えられる。他の原因としては、アミロイド斑周辺での炎症反応が細胞のＴＧＦβ２増加を促進することが考えられる。しかしながら一般的には、毒性を有するＡβ１−４２によるＴＧＦβ２発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増加と比較すると、特に皮質以外の部位では、Ｔｇ２５７６マウスでのＴＧＦβ２タンパク発現のｉｎ  ｖｉｖｏでの増加は比較的小さいようである（図７、８）。この差異は、毒性を有するＡβ濃度の上昇はｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では短時間だけ人工的に引き起こされるがｉｎ  ｖｉｖｏでは徐々に誘導されて生涯継続する、という事実を反映している可能性がある。何らかの防御システムが、Ａβが誘導するマウスでのＴＧＦβ２増加を抑制している可能性がある。
ＡＤに関する研究で最も重要な問題の１つは、Ｔｇ２５７６マウスのようなＦＡＤ遺伝子を過剰発現しているマウスの脳で、多数のアミロイド斑が存在しても神経細胞の減少が起こらないことである（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＴＵＮＥＬ反応を用いた組織学的検査では、ＴＧＦβ２濃度が高いと推測されるアミロイド斑周辺の神経細胞で軽度な細胞死さえ起こっていないことが示された（データは示さず）。家族性ＡＤのトランス遺伝子を発現しているマウスで神経細胞の実質的な減少が認められない理由については、これまでにいくつかの説明がなされてきた。その中には、動物種による神経細胞の脆弱性の違い、ヒトのタウ分子がこれらのマウスには存在しないこと、ヒトでの炎症の伝達物質（例えば、ある種のサイトカイン）に相当する要素が完全には備わっていないこと、Ａβへの曝露が比較的短時間であったことなどが含まれる（Ｈａｒｄｙ  ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ，２００２）。さらに、ＦＡＤ遺伝子を先天的に持つＦＡＤ患者で中年期以降に神経細胞死が起こり始めることを考えると、神経細胞死に対する防御システムが本来備わっており、この防御システムの中年期以降の機能不全が神経細胞死の開始の一因であると推測されるのも当然である。この仮定に基づくと、マウスは比較的短い寿命の間ずっとその防御システムを維持できるが、寿命の長いヒトは中年期以降にはこの防御システムを維持できなくなる傾向があると推測される。ＴＧＦβ２タンパクの発現増加がＴｇ２５７６マウスでは比較的小さいと推定されることから、毒性を有するＡβが誘導するＴＧＦβ２タンパクの発現増加を軽減するメカニズムが防御システムの１つとして考えられる。その他には、何種かの神経栄養因子が介する神経保護作用が考えられる。
本発明者らは、２４アミノ酸から成る神経保護作用を有するペプチド、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１５）を同定し、ヒューマニン（ＨＮ）と命名した。このペプチドは、ＦＡＤ遺伝子の異所発現やＡβなどのＡＤに関連するさまざまな傷害による神経毒性を阻害する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＨＮは、ＡＤ患者の後頭葉由来のｍＲＮＡを用いて構築したｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。ＨＮは、正常なヒト脳のグリア細胞と精巣や結腸など他のいくつかの組織で発現している（Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＡＤの脳では、ＨＮは神経細胞と小円形のグリア細胞で高発現している。ＨＮは防御因子であると考えられる。本研究で本発明者らは、ＴＧＦβ２／ＡＰＰが誘導する神経細胞死はより強力なＨＮ誘導体であるＤ−Ｓｅｒ１４  ＨＮ  １０ｎＭによって抑制されること（Ｔｅｒａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を示しているが、これはＨＮおよび／またはＨＮ誘導体がＡＤの治療薬として有用であるという考えを裏付けるものである。ＨＮは、細胞表面の仮想受容体に結合して特定のチロシンキナーゼに関連する細胞内シグナル伝達経路を活性化することで、ＡＤに関連する傷害による神経毒性に対する保護作用を示す（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。本研究で示された結果から、抗ＴＧＦβ２中和抗体などのＴＧＦβ２／ＡＰＰが誘導する細胞死経路の阻害因子は、ＨＮとは異なるメカニズムでＡＤを抑える有効なＡＤ治療薬となると考えられる。このように、本明細書で述べた本発明者らの知見は、ＡＤの詳細なメカニズムをさらに解明するためだけでなく有効な抗ＡＤ薬の開発にも役立つものである。
本明細書で引用したすべての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明により、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防又は治療に有用な薬剤をスクリーニングすることが可能になった。その結果、本発明は、有効な抗ＡＤ薬の開発に役立つことが期待される。
参考文献
Ａｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，Ｓ４４−Ｓ５１．
Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ２１，３８３−４２１．
Ｂｏｃｈｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ．Ｍｅｔａｂ．２３，１１７４−１１８２．
Ｂｏｄｍｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１，８９０−８９７．
Ｂｏｒｃｈｅｌｔ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｅｕｒｏｎ  １７，１００５−１０１３．
Ｂｕｒｔｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９５，７１３−７２３．
Ｂｕｒｓｚｔａｊｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，９７９０−９７９９．
Ｃａｉｒｎｓ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４９，１３７−１４０．
Ｃｈａｏ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，１０９−１１０．
Ｃｈａｌａｚｏｎｉｔｉｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５２，１２１−１３２．
Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｎａｔｕｒｅ  ３６０，６７２−６７４．
Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，６７−７２．
Ｃｏｏｐｅｒ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２１，１５９−１６５．
Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４５，１５６１−１５６９．
Ｇｉｏｖａｎｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１９０１１−１９０１６．
Ｇｓｃｈｗｉｎｄ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，Ｇ．（１９９５）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５，２９２−３００．
Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７，１−８．
Ｈａｒｄｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，３５３−３５６．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３４５４１−３４５５１．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，６３３６−６３４１．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３ａ）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８４，８６４−８７７．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３ｂ）．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０６，８８９−９０２．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９０，５４９−５５８．
Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８２０，４５−５４．
Ｈｏｃｋ，Ｂ．Ｊ．Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．（２００１）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７，Ｓ７−Ｓ１２．
Ｈｓｉａｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９−１０２．
Ｈｕｌｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ４，２７５−２８２．
Ｊａｎｕｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．１，４５１−４５７．
Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｗ．（２００１）．Ｌａｎｃｅｔ  ３５８，４３６−４３７．
Ｋａｎｅｋｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５，２５８５−２５９３．
Ｋａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）．Ｎａｔｕｒｅ  ３２５，７３３−７３６．
Ｋａｗａｓｕｍｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，２８２６−３８．
Ｋｌｅｍｐｔ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１３，９３−１０１．
Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，７３６−７４２．
Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３，１０８５−１０９０．
Ｌｅｈｒｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３１，１１４−１２３．
Ｌｅｓｎ▲ｅ▼，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１８４０８−１８４１８．
Ｌｉｍ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，５７０９−５７１４．
Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１７，３９５−４００．
Ｌｉｐｐａ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９，５２７−５３３．
Ｌｏｇａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５８７，２１６−２２５．
Ｌｏｏ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，７９５１−７９５５．
Ｌｕｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５，６２９−６４２．
Ｌｙｍａｎ  ＳＤ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｃｅｌｌ．７５，１１５７−６７．
Ｍａｒｔｉｎｏｕ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５２，１７５−１８１．
Ｍａｓｓａｇｕ▲ｅ▼，Ｊ．（１９９８）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，７５３−７９１．
Ｍａｓｓａｇｕ▲ｅ▼，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ  １０３，２９５−３０９．
ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４７，４２５−４３２．
Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（１９９０）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，５３２２．
Ｎｅｖｅ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８６，５４−６６．
Ｎｉｉｋｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７７，５４−６２．
Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，７５−７９．
Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０，１０２−１０５．
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，２３８７−２３９８．
Ｐｅｒｅｓｓ，Ｎ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐｅｒｉｌｌｏ，Ｅ．（１９９５）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５４，８０２−８１１．
Ｐｒａｔｔ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８，２６７−２９２．
Ｐｉｋｅ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７，１７７４−１７７７．
Ｐｏｕｌｓｏｎ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｎｅｕｒｏｎ  １３，１２４５−１２５２．
Ｒｅａｕｍｅ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２３３８０−２３３８８．
Ｒｏｈｎ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．７４，２３３１−４２．
Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｎａｔｕｒｅ  ３５９，３２５−３５７．
Ｓｕｄｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２，５４８−５５６．
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，１３３６−１３４０．
Ｔａｊｉｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３２４，２２７−２３１．
Ｔｅｒａｓｈｉｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８５，１５２１−１５３８．
Ｔｏｍｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，２０２５−２０３０．
Ｔｓｕｊｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２９５１−２９５７．
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７３，６２７−６３６．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ４，６９−７２．
Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．３６，６０７−６０９．
Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１７１０−１７１３．
Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，６０３−６０６．
Ｙａｇａｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３４，６７３−６８１．
Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，４９８−５０９．
Ｙａｍａｔｓｕｊｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１３４９−１３５２．
Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５，４１７−４２０．
Ｚｈａｏ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４７，２５３−２６３．
【図１】
0004931589.tif 000002
【図２】
0004931589.tif 000003
0004931589.tif 000004
【図３】
0004931589.tif 000005
0004931589.tif 000006
【図４】
0004931589.tif 000007
0004931589.tif 000008
【図５】
0004931589.tif 000009
0004931589.tif 000010
0004931589.tif 000011
【図６】
0004931589.tif 000012
0004931589.tif 000013
【図７】
0004931589.tif 000014
0004931589.tif 000015
【図８】
0004931589.tif 000016
【配列表】
0004931589000001.xml