(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ｉ．ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロック、と
ii．生分解性ポリエステルブロック、を含む生分解性グラフト重合体であって、
iii.該ブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している、生分解性グラフト重合体；および
ｂ．水性溶液、
を含む、可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項２】
該ポリエチレングリコ−ル(PEG) が300〜20,000の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項３】
該ポリエチレングリコ−ル(PEG) が500〜10,000の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項４】
該ポリエステル・ブロックが1,000〜30,000の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項５】
該ポリエステル・ブロックが1,000〜10,000の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項６】
生分解性ポリエステル・ブロックが、ポリ(DL-乳酸）、ポリ（L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（γ-ブチロラクトン）、ポリ（γ-バレロラクトン）、ポリ（β-ヒドロキシ酪酸）および、それらの共重合体または三元共重合体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項７】
該共重合体および／または三元共重合体が、ポリ(DL-乳酸‐共‐グリコール酸）、ポリ（L-乳酸‐共‐グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン‐共‐DL‐乳酸）、コポリ（ε-カプロラクトン‐共‐DL‐乳酸‐グリコール酸）からなる群から選ばれる、請求項６に記載の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液。
【請求項８】
ａ．次のｂ．に記載の重合体水溶液中に含まれる、有効量の生物活性試薬；
ｂ．ｉ．ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む生分解性グラフト重合体であって、該ブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している、生分解性グラフト重合体、および、
ii．水性溶液、
を含む可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液、
を含む生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項９】
該生物活性試薬がドラッグである、請求項８に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１０】
該ドラッグが、抗癌剤、ホルモン、抗生物質、麻薬拮抗剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗鬱剤、抗癲癇薬、抗マラリア薬、免疫活性化薬、成長因子、放射線防護薬、ワクチン、遺伝子治療薬、オリゴヌクレオチド、アンチセンス(antisense)、ペプチドおよびタンパク質および、それらの組合せ、からなる群から選ばれる請求項９に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１１】
該ドラッグが抗癌剤である、請求項９に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１２】
該抗癌剤が、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、5-フルオロウラシル、メトトレキセート、タキソール、タキソテレ(taxotere)、およびアクチノマイシン-D、からなる群から選ばれるメンバーである、請求項１１に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１３】
該ドラッグがポリペプチドである、請求項９に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１４】
該ポリペプチドが、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激成長因子(PDGF)、プロラクチン、ルリベリンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン類、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン-α,β,γ(IFN-α,β,γ) 、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロイン、セクレチン、カシトニン、エンケファリン類、エンドルフィン類、アンジオテンシン類、チロトロピン放出ホルモン(TRH) 、腫瘍壊死因子(TNF) 、神経成長因子(NGF) 、顆粒球‐コロニー刺激因子(G-CSF) 、顆粒球マクロファージ‐コロニー刺激因子(M-CSF) 、レニン、ブラジキニン、バシトラシン類、α-1 アンチトリプシン、血小板由来成長因子、アルブミン、アンチスロンビン III、グルコセレブロシダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ(DNAse) 、組織プラスミノゲン・アクチベータ、カルシトニン、血液凝固因子 VII、VIIIおよびIX、LHRH拮抗薬、エリスロポエチン、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラミシジン類および、それらの合成類似体、修飾体および薬理学的活性フラグメント、モノクロナール抗体類および溶性ワクチン、からなる群から選ばれるメンバーである、請求項１３に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１５】
該生物活性試薬が細胞である、請求項８に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１６】
該可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液が、可溶化剤の役をする、請求項８に記載の生分解性生物活性試薬デリバリーシステム。
【請求項１７】
ａ．i.ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む生分解性グラフト重合体であって、該ブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している、生分解性グラフト重合体、および、
ii．水性溶液、
を含む注入可能の可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液、を準備する工程；
ｂ．該熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を有効量の生物活性試薬と混合して重合体‐生物活性試薬混合物を調製する工程；
ｃ．該重合体‐生物活性試薬混合物を該重合体のゲル化温度以下の温度に維持する工程；
ｄ．該溶液を非経口的に温血動物に注入して、その溶液の温度が該重合体のゲル化温度以上である該動物の体温によって上昇すると、該生物活性試薬と生分解性重合体とのゲル・デポーを形成する工程；
を含む、該生物活性試薬を制御して放出するための、熱でゲル化する重合体マトリックス中の生物活性試薬を温血動物に非経口的に送達するための、方法。
【請求項１８】
該生物活性試薬がドラッグである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該ドラッグが抗癌剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該抗癌剤が、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、5-フルオロウラシル、メトトレキセート、タキソール、タキソテレ(taxotere)、およびアクチノマイシン-D、からなる群から選ばれる、メンバーである、請求項１９に記載の方法
【請求項２１】
該ドラッグがポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
該ポリペプチドが、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激成長因子(PDGF)、プロラクチン、ルリベリンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン類、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン-α,β,γ(IFN-α,β,γ) 、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロイン、セクレチン、カシトニン、エンケファリン類、エンドルフィン類、アンジオテンシン類、チロトロピン放出ホルモン(TRH) 、腫瘍壊死因子(TNF) 、神経成長因子(NGF) 、顆粒球‐コロニー刺激因子(G-CSF) 、顆粒球マクロファージ‐コロニー刺激因子(M-CSF) 、レニン、ブラジキニン、バシトラシン類、α-1 アンチトリプシン、血小板由来成長因子、アルブミン、アンチスロンビン III、グルコセレブロシダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ(DNAse) 、組織プラスミノゲン・アクチベータ、カルシトニン、血液凝固因子 VII、VIIIおよびIX、LHRH拮抗薬、エリスロポエチン、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラミシジン類、および、それらの合成類似体、修飾体および薬理学的活性フラグメント、モノクロナール抗体類および溶性ワクチン、からなる群から選ばれるメンバーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ．i.ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む生分解性グラフト重合体であって、該ブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している、生分解性グラフト重合体；および、
ii．水性溶液、
を含む可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体水溶液、を準備する工程；
ｂ．該熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を有効量の生物活性試薬と混合して重合体‐生物活性試薬混合物を調製する工程；
ｃ．該重合体‐生物活性試薬混合物を該重合体のゲル化温度以下の温度に維持する工程；および
ｄ．該重合体‐生物活性試薬混合物を、温血動物に投与し、その液の温度が該動物の体温により、該重合体のゲル化温度以上になるまで上昇すると、該生物活性試薬と生分解性重合体とのゲル・デポーを形成する工程；
を含む、該生物活性試薬を制御して放出するための、熱でゲル化する重合体マトリックス中の生物活性試薬を温血動物に送達するための、方法。
【請求項２４】
該生物活性試薬がドラッグである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該ドラッグが、抗癌剤、ホルモン、抗生物質、麻薬拮抗剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗鬱剤、抗癲癇薬、抗マラリア薬、免疫活性化薬、成長因子、放射線防護薬、ワクチン、遺伝子治療薬、オリゴヌクレオチド、アンチセンス(antisense) 、ペプチドおよびタンパク質および、それらの組合せ、からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該ドラッグが抗癌剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
該抗癌剤が、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、5-フルオロウラシル、メトトレキセート、タキソール、タキソテレ(taxotere)、およびアクチノマイシン-D、からなる群から選ばれる、メンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該ドラッグがポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
該ポリペプチドが、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激成長因子(PDGF)、プロラクチン、ルリベリンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン類、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン-α,β,γ(IFN-α,β,γ) 、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロイン、セクレチン、カシトニン、エンケファリン類、エンドルフィン類、アンジオテンシン類、チロトロピン放出ホルモン(TRH) 、腫瘍壊死因子(TNF) 、神経成長因子(NGF) 、顆粒球‐コロニー刺激因子(G-CSF) 、顆粒球マクロファージ‐コロニー刺激因子(M-CSF) 、レニン、ブラジキニン、バシトラシン類、α-1 アンチトリプシン、血小板由来成長因子、アルブミン、アンチスロンビン III、グルコセレブロシダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ(DNAse) 、組織プラスミノゲン・アクチベータ、カルシトニン、血液凝固因子 VII、VIIIおよびIX、LHRH拮抗薬、エリスロポエチン、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラミシジン類および、それらの合成類似体、修飾体および薬理学的活性フラグメント、モノクロナール抗体類および溶性ワクチン、からなる群から選ばれるメンバーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ａ．ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロック；と
ｂ．生分解性ポリエステルブロック、を含む可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体であって、
ｃ．該ブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造のグラフト重合体を形成している、可逆的に熱でゲル化する生分解性重合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の技術的分野
本発明は、熱でゲル化する生分解性重合体水溶液組成物および、そのような重合体を、インサイチュー（in situ）生成性生分解性インプラント(implants)を提供するために利用する方法に関する。
【０００２】
本発明の背景
インサイチューでゲル化する材料は、最近、有望な埋込み可能なドラッグデリバリーシステムとして、さらにまた注入可能な、生体組織工学(tissue engineering)用マトリックスとして注目を集めている。生体適合性であり、細胞分裂および生合成を促進し、生理的負荷に耐え、そして取扱いが容易で、容易に合成できる材料に対する顕在化した需要が存在する。インサイチューでゲル化する材料は、それらは取扱いが容易で、細胞の成長(cell seeding)を可能にし、それらは任意の希望の形状のインプラントを形成する性能を提供し、そして生分解性で、生体適合性であるように工学的に設計できるので有望である。
【０００３】
インサイチューゲル化は、注入可能なシステムのベースであり、外科的処置の必要を排除し、そして任意の希望の形状のインプラントを形成する能力があるという利点を提供する。分子の会合における変化は、温度、pHまたは溶媒組成の変化により制御し得る。刺激に敏感なシステムの候補の中で、水性溶液の感熱性ゾル→ゲル転移を利用することにより、有機溶媒を含まない注入可能な系が設計される。このような系は、生物活性試薬を容易に取込むことができる。
【０００４】
理想的な注入可能な系として挙動するためには、重合体の水溶液は、調合条件では低い粘度を示し、そして生理的条件で迅速にゲル化すべきである。医用材料としての用途を考える場合、その重合体の生体適合性も重要な問題である。それ故、その材料は、生分解性でなければならず、そしてその分解中、水に富んだヒドロゲルの性質を保持することにより、生体組織の刺激を誘起しないようでなければならない。
【０００５】
注入できるドラッグデリバリーシステム用および生体組織工学用の候補材料として、水性のポロキサマー407(Poloxamer 407)および、N-イソプロピルアクリルアミド共重合体のインサイチューゲル化が研究されている。しかしこれらの材料は、非生分解性であり、そして動物実験で、ポロキサマー407 の水溶液を腹腔内に注射するとトリグリセリドとコレステロールが増加することが明らかになった。9
最近、Jeong 達は、生分解性で、インサイチューでゲル化するポリ（エチレングリコ−ル-b-(DL‐乳酸‐共‐グリコール酸)-b-エチレングリコ−ル）：(PEG-PLGA-PEG)トリブロック共重合体を報告した（米国特許第 6,117,949号明細書参照）。これらは、注入できるドラッグデリバリーシステムとして有望な性質を示した。ラットでのin vivo 試験で、この共重合体ゲルは、一月後でも存在することが明らかになった。その分解中に、最初透明であったゲルは、親水性のPEG に富んだセグメントの分子量が優先的に低下することに因り不透明になった。形態構造のこの変化と界面または相の発生は、タンパク質ドラッグを変性する可能性があり、または生体組織工学での細胞損壊(cell deterioration)の原因になる可能性がある。 In vitro 実験で、このインサイチュー生成ゲルからの豚の成長ホルモン(PGH) およびインスリンの放出は、載せたタンパク質の40〜50％を放出後、停止した。
【０００６】
最近、数種のタンパク質／ペプチド・ドラッグが、臨床試用で素晴らしい効能を発揮し、そして市場に導入された。遺伝子工学の進展と共に、タンパク質／ペプチドは、やがて遥かにより一般的なドラッグになるであろう。しかしその短いプラズマ半減期とタンパク質の不安定性により、適した送達用担体に対する差し迫った需要が存在する。ある種ドラッグ処方では 1〜2 週間のデリバリーシステムを必要とする。さらに 1〜2 日のデリバリーシステムを必要とする場合もある。例えば、生殖細胞精巣癌に用いられるドラッグであるイホスファミド(ifosfamide)は、静脈に 5日続けて投与される。この処置は、三週間毎に、または血液学的毒性から回復後に、繰返し行われる。このような短期間デリバリーシステムを調製するためには、親水性のPEG が骨格である、ポリ（乳酸‐共‐グリコール酸）をグラフト共重合したポリエチレングリコ−ル(PEG-g-PLGA)が設計される。この材料は、 PEG-PLGA-PEGに比べて、異なるゲル化および分解挙動を、従って、異なるドラッグ放出挙動を示すことが期待される。
【０００７】
以下の引用文献は、この技術分野で有用な方法または化合物を開示している：
米国特許第5,702,717 号明細書．
米国特許第6,117,949 号明細書．
Hill-West,J.L.;Chowdhury,S.M.; Slepian,M.J.; Hubbell,J.A. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1994, 91,5967-5971.
Stile,R.A.; Burghardt,W,R.; Healy,K.E.Macromolecules, 1999,32,7370-7379.
Chen,G.H.; Hoffman,A.S.;Nature,1995,373,49-52.
Thomas,J.L.; You,H.; Tirrell,D.J.Am.Chem.Soc.,1995,117,2949-2950.
Malstom,M.; Lindman,B.Macromolecules, 1992,25,5446-5450.
Yang.J.; Pickard,S.; Deng.N.J.; Barlow,R.J.; Attwood,D.; Booth,C. Macromolecules, 1994,27,670-680.
Jeong,B., Bae,Y.H.; Lee,D.S.; Kim,S.W.Nature,1997,388,860-862.
Johnston,T.P.; Punjabi,M.A.; Froelich,C.J.Pharm.Res.,1992,9(3),425-434. Wout,Z.G,M,;Pec,E.A.;Maggiore,J.A.;Williams,R.H.;Palicharla,P.;Johnston,T.P.J.Parenteral Sci.& Tech,1992,46(6),192-200.
Jeong,B.;Bae,Y.H.;Kim,S.W.J.Controlled Releases , 2000,63,155-163.
Jeong,B.;Bae,Y.H.;Kim,S.W.J.Biomed.Mater.Res, 2000,50(2),171-177.
Jeong,B.;Gutowska,A.J.Am.Chem.Soc., 2000，投稿中.
Jeong,B.未公刊データ．2000．
IFEX Prescription,http://www.ifex.com/ifpre.html,A.Bristol-Meyers Squibb Co.,Princeton,NJ O8543.
Bellare,J.R.;Davis,H.T.; Scriven,L.E.;Talmon,Y. J.Electron Microsc.Tech. 1988,10,87-111.
Wanka.G.; Hoffmann,H; Ulbricht,W. Colloid Polym.Sci.,1990,268,101-117.
Tanodekaew,S.;Godward,J.; Heatley,F.; Booth,C. Macromol.Chem.Phys., 1997, 198, 3385-3395.
Odian,G. In Principles of Polymerization 2nded.;  John Wiley & Sons,Inc.Korean Student Ed.,Korea,1981;p513.
Alexandrisdis,P.; Holzwarth,J.F.; Hatton,T.A. Macromolecules, 1994,27,2414-2425.
Discher,B.M.;Won,Y.-Y.;Ege,D.S.;Lee,J.C.M.;Bates,F.S.;Discher,D.E.; Hammer,D.A. Science,1999,284,1143-1146.
Won,Y.-Y.,Davis,H.T.,Bates F.S. Science,1999,283,960-963.
Brown,W.; Schillen,K.; Almgren,M.; Hvidt,S.; Bahadur,P.J.Phys.Chem, 1991,95,1850-1858.
Cau F.; Lacelle,S.Macromolecules, 1996,29,170-178.
Jeong,B.;Bae,Y.H.;Kim,S.W.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,1999, 16:185-193.
Zhou,Z.;Chu,B.J. Colloid and Interface Science,1988,126(1):171-180.
Deng,Y.;Yu,G.E.; Price,C.; Booth,C. J.Chem.Soc.Faraday Trans. 1992, 88(10), 1441-1446.
Yu,G.E.;Deng,Y.;Dalton,S.;Wang,Q.G.;Attwood,D.;Price,C.; Booth,C. J.Chem.Soc.Faraday Trans.1992,88(17),2537-2544.
Jeong,B.;Bae,Y.H.;Kim,S.W.Macromolecules, 1999,32,7064-7069.
Israelachivili,J.N. Intermolecular and Surface Forces,Academic Press,New York,1985.
Feil,H.;Bae,Y.H.;Feijen,J.; Kim,S.W.Macromolecules, 1993,26,2496-2500.
Jeong,B.; Lee,D.S.; Shon,J.I.;Bae,Y.H.; Kim,S.W.J.Polym.Sci.Polym.Chem. 1999,37,751-760.
本発明の概要
本発明は、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを有する熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を提供する。ここで、これらのブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している。
【０００８】
本発明の一つの目的は、生物活性試薬デリバリーシステムとして有用な熱でゲル化する生分解性重合体溶液を提供することである。
本発明のさらなる目的は、非経口的に注入できるドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、その構造の骨格に結合した分岐の数を調節することによって、または式 An(B)を含む第１重合体を、式 An(B)を含む少なくとも一つの他の重合体（ここで、第１重合体は該少なくとも一つの他の重合体と異なっている）と混合することによって、重合体分解速度、またはゲル状態を持ち堪える期間を制御できるドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの目的は、ドラッグの安定性とドラッグの投与を一日から二ヶ月の間に制御することができるドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、生分解性であるブロック共重合体ドラッグデリバリーシステムを提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、望ましい放出速度を明らかに示すブロック共重合体ドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、室温またはそれ未満では溶液状態にあり、そして生理的温度または大体生理的な温度でゲル化する、注入可能なブロック共重合体ドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの目的は、外科的処置の必要を無くし、そして任意の希望の形状のインプラントを形成する能力があるという利点を提供する、注入可能なドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの目的は、水溶液の感熱的ゾル→ゲル転移を利用して設計される、刺激に敏感な有機溶媒を含まない注入可能なドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１５】
本発明のまだもう一つの目的は、調合条件では低い粘度を示し、そして生理的条件で迅速にゲル化する重合体の水溶液を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックの比を変えることにより、希望の放出速度を提供できる、ドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的と利点は、以下の概要と本発明を構成する様々な実施態様の詳細な説明から明らかにされるであろう。
生体適合性で、細胞分裂および生合成を促進し、生理学的負荷に耐え、そして取扱いと合成が容易な材料に対する顕在化した需要が存在する。インサイチューでゲル化する材料は、取扱いが容易で、細胞の成長(cell seeding)を可能にし、そしてそれらは任意の希望の形状のインプラントを形成する性能を提供するので有望である。本発明は、細胞の送達に良く適しており、それにより、この熱でゲル化する生分解性重合体水溶液は、組織の修復と器官の再生のための足場を提供する。本発明は、以下の利点を含む多くの利点を提供する：熱でゲル化する生分解性重合体水溶液の流動性により任意の形状の欠陥を充填できる、組織の統合(integration) を促進する、生きた細胞と様々な治療剤（例えば、成長因子）が容易に混和する、そして最後に、健康な組織を冒す部位の占有を最小にできる。
【００１７】
それ故、本発明のもう一つ目的は、生体組織工学で有用な熱でゲル化する生分解性重合体溶液を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、細胞デリバリーシステムとして有用な熱でゲル化する生分解性重合体溶液を提供することである。
【００１８】
本発明のさらにもう一つの目的は、疎水性ドラッグ用の生分解性可溶化剤を調製することである。PEG-g-PLGAおよびPLGA-g-PEGの界面活性剤としての性質に因り、この重合体は、疎水性ドラッグ調合物用の可溶化剤として用いられる。
【００１９】
本明細書と特許請求の範囲を、用語に与えられる範囲も含めて、明確に且つ簡潔に理解するために、次の定義が提示される：
生物活性試薬：本明細書で用いられる“生物活性試薬”（“bioactive agent”）とは、任意のドラッグ、分子、生体分子、または細胞を意味する。
【００２０】
ドラッグ：本明細書で用いられる“ドラッグ”（“drug”）とは、生物活性を有し、そして治療目的に適した、または治療目的に用いられる任意の有機化合物または物質を意味する。
【００２１】
ポリペプチド：本明細書で用いられる“ポリペプチド”とは、ドラッグとして用いられる任意のペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、および／またはタンパク質を意味し、それらは、分子量、シーケンス、長さ、活性または用途によって限定されない。
【００２２】
非経口：静脈注射または筋肉内注射によるような、消化管を通すより他の方式で体内に投薬すること、または投薬された。
以下の説明および添付した図面を参照することにより、本発明のより完全な評価が容易に得られるであろう。ここで、異なる図での類似の番号は、同じ構造または要素を代表する。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、An(B) の式を含む一般構造の重合体を形成するために連結している、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む生分解性重合体溶液である：式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる。
【００２４】
本発明はさらに、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成するために連結している、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む生分解性重合体溶液と、水溶液を含む熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を提供する。
【００２５】
この熱でゲル化する生分解性重合体溶液は、前述のように式An(B) で調製され、そして nは 3〜10であるのが望ましい。
この生分解性ポリエステル重合体ブロックは、ポリ(DL-乳酸）、ポリ（L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（γ-ブチロラクトン）、ポリ（α-バレロラクトン）、ポリ（β-ヒドロキシ酪酸）および、それらの共重合体または三元共重合体からなる群から選ばれるメンバーであるのが望ましい。また、これら共重合体および／または三元共重合体は、ポリ(DL-乳酸‐共‐グリコール酸）、ポリ（L-乳酸‐共‐グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン‐共‐DL‐乳酸）、コポリ（ε-カプロラクトン‐共‐DL‐乳酸‐グリコール酸）からなる群から選ばれるのが望ましい。上に列挙して示唆した生分解性ポリエステルブロックは、全てを包含することを意図するものではない。これら生分解性ポリエステルブロックは、最大100,000 の分子量を有し、望ましい範囲は、約1,000〜30,000であり、そして最も望ましいのは約1,000〜10,000である。これら生分解性ポリエステルブロックは、溶解度限界に適応するという希望の結果限定されるのであって、分解性により限定されるのではない。
【００２６】
ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックは、約300〜20,000の平均分子量を有し、そして約500〜10,000であるのがより望ましい。10,000より大きい分子量を有するPEG ブロックは、糸球体ろ過(glomeruli filtration)で、ろ過され難い。
【００２７】
本発明は、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと、An(B) の式（式中、nは 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成するために連結している生分解性ポリエステルブロックを含む熱でゲル化する生分解性重合体溶液中に含まれる有効量の生物活性試薬を含む、有効な生分解性生物活性試薬送達用液体を提供する。
【００２８】
本発明は、任意のドラッグ、分子、生体分子、または細胞である任意の生物活性試薬で利用することができると理解される。さらに本発明は、持続的な放出速度を必要とする他の物質に対するデリバリーシステムとして役立ち得る。
【００２９】
この本発明の熱でゲル化する生分解性重合体水溶液は、複数のドラッグに対する担体として役立つドラッグデリバリーシステムとして有用である。ドラッグは、生物活性を有し、そして抗癌剤、ホルモン、抗生物質、麻薬拮抗剤(narcotic antagonists)、鎮痛剤、抗炎症剤、抗鬱剤、抗癲癇薬、抗マラリア薬、免疫活性化薬、成長因子、遺伝子治療薬、オリゴヌクレオチド、治療用ペプチドおよびタンパク質および、それらの組合せ薬、を含む（これらに限定はされないが）治療目的に適した、または用いられる有機化合物または有機物質である。特に、本発明は、短いプラズマ半減期とタンパク質の不安定性により、特異的な持続放出速度の要求に応じるために短い生分解期間を必要とする、ポリペプチドおよびタンパク質ドラッグ用の非常に有用なデリバリーシステムを提供する。
【００３０】
本発明の重合体は、疎水性ブロックおよび親水性ブロックから構成され、界面活性であるので、この重合体は、疎水性ドラッグ調合処方での可溶化剤として用いることができる。この性質は、これらの重合体を疎水性ドラッグの可溶化剤として用いることを可能にする。タキソールのような典型的な癌用ドラッグは、優れた効能を有する一方で、それらは、水中の溶解度が小さい傾向がある。本発明の重合体は、このようなドラッグ用の生体適合性可溶化剤として用いられる。
【００３１】
本発明は、抗癌剤の送達用に十分適している。この抗癌剤は、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、5-フルオウラシル、メトトレキセート、タキソール、タキソテレ(taxotere)、およびアクチノマイシン-D、からなる群から選ばれるのが望ましい。他の抗癌剤も同様に本発明で実施し得ると考えられ、上記のリストは、全てを含んでいることを意味しない。
【００３２】
本発明は、ポリペプチドの送達にも、同様に十分適している。このポリペプチドは、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激成長因子(PDGF)、プロラクチン、ルリベリンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン類、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン-α,β,γ(IFN-α,β,γ) 、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロイン、セクレチン、カシトニン、エンケファリン類、エンドルフィン類、アンジオテンシン類、チロトロピン放出ホルモン(TRH) 、腫瘍壊死因子(TNF) 、神経成長因子(NGF) 、顆粒球‐コロニー刺激因子(G-CSF) 、顆粒球マクロファージ‐コロニー刺激因子(M-CSF) 、レニン、ブラジキニン、バシトラシン類、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラミシジン類、および、それらの合成類似体、修飾体および薬理学的活性フラグメント、モノクロナール抗体類および溶性ワクチン、からなる群から選ばれるのが望ましい。このリストは、全てを包含してはおらず、他のタンパク質も同様に用いられ得ると考えられる。
【００３３】
本発明は、細胞の送達にも十分良く適している。細胞を含む熱でゲル化するこれら生分解性重合体水溶液は、組織修復および器官再生用、さらにまた治療用途用の足場を提供する。
【００３４】
本発明の有用な態様の一つは、熱でゲル化する重合体マトリックス中の生物活性試薬を温血動物に送達するための、その生物活性試薬を制御して放出する方法である。本発明のこの態様にとつて基本的なことは、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む、注入可能な、熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を提供することであり、ここで、これらのブロックは、連結して、An(B) の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、B はポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している。次いで、この熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を、有効量の生物活性試薬と混合して重合体‐生物活性試薬混合物を調製し、その重合体のゲル化温度以下の温度に維持しておき、そして温血動物に注入して、その温度がその動物の体温によって上昇して重合体のゲル化温度以上になると、ゲル・デポー(gel depot) が形成される。本発明のこの態様は、様々な適用形式を持ち得ると考えられる。例えば、その温血動物の体の一部が露出されている外科的処置中に、温血動物に生物活性試薬を適用することが望まれる場合、この適用法を利用することが十分良く適している。外科的処置中に露出されている領域に、この重合体‐生物活性試薬混合物を適用することにより、特定の／希望する領域にデポーを生成させることが可能になる。
【００３５】
本発明のもう一つの態様は、熱でゲル化する重合体マトリックス中の生物活性試薬を温血動物に非経口的に送達するための、その生物活性試薬を制御して放出する方法である。本発明のこの態様にとつて基本的なことは、ポリエチレングリコ−ル(PEG) ブロックと生分解性ポリエステルブロックを含む注入可能な熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を提供することであり、ここで、これらのブロックは、連結して An(B)の式（式中、n は 2より大きく、そして Aはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、Bはポリエチレングリコ−ルブロックと生分解性ポリエステルブロックからなる群から選ばれ、そしてA はB と異なる）を含む一般構造の重合体を形成している。次いで、この注入可能な熱でゲル化する生分解性重合体水溶液を有効量の生物活性試薬と混合し、重合体‐生物活性試薬混合物を調製し、その重合体のゲル化温度以下の温度に維持しておき、そして温血動物に注入して、その温度がその重合体のゲル化温度以上である動物の体温によって上昇すると、ゲル・デポーを形成する。本発明のこの態様は、温血動物を外科的に切開する必要なしに、制御しながら生物活性試薬を提供することが望まれる場合に良く適合する。皮内(intradermalまたは intracutaneous)、皮下(subcutaneous またはhypodermic) 、筋肉内、静脈内および脊髄内、を含む幾つかの注入経路で、非経口的にこの重合体‐生物活性試薬混合物を投与することができる。
【００３６】
本発明を説明するために、以下の実験例が示される。これらの特定の実施例は、本出願に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものでない。
実験の部：
材料：
DL‐ラクチド(Polyscience社）とグリコリド(Polyscience社）は、酢酸エチルから再結晶された。グルタル酸無水物(Aldrich社) 、グルタル酸(Aldrich社) 、オクタン酸第１スズ(Aldrich社) 、エポキシ停止ポリエチレングリコ−ル（分子量：600; Polyscience社）、ポリエチレングリコ−ル（分子量：1000;Aldrich社) および1,6-ジフェニル‐1,3,5-ヘキサトリエン(DPH; Aldrich 社) は、そのまま用いられた。
【００３７】
合成：PEG-g-PLGAの三工程合成（図１）
先ず、PEGs（分子量：1000,38.28g,38.28mmoL)を90mLのトルエンに溶解した。次いで、共沸蒸留によって水を除去するために、最終体積50mLまでトルエンを留去した。触媒量のグルタル酸の存在下で、PEG と過剰量のグルタル酸無水物を反応させることにより、カルボン酸停止PEG(CPEG) を合成した。グルタル酸無水物（7.255g,80.39mmoL) とグルタル酸（0.042g,0.40mmoL)を添加し、そしてこの反応混合物を 120℃で 6時間撹拌した。このスペクトル中の化学シフト(ppm) は、1.9(グルタル酸エステルの中央メチレン）、2.4(グルタル酸エステルのカルボニル基の隣のメチレン）、3.6（PEGのエチレン）および4.2(グルタル酸エステルに結合したPEG のメチレン）である。1.9ppmと4.2ppmでのピークの面積比が 1/1であれば、末端基が定量的に官能化されたことを示す。この反応混合物にジエチルエーテルを添加し、カルボン酸停止PEG(CPEG) を析出させた。この生成物を高真空下（〜10-3mmHg）に48時間置き、残存溶媒を除去した。
【００３８】
第２工程では、エポキシ停止PEG(EPEG) （分子量：600, 5.619g, 9.36mmoL)をCPEG（11.50g, 9.36mmoL) とトルエン中、120 ℃で、24時間反応させ、PEG 骨格に沿ってペンダント・ヒドロキシル基を有するPEG(PEGH) を合成した。得られたPEGHの GPC法で測定した重量平均分子量(Mw)および多分散度指数(PDI) は、ポリスチレン標準試料と比較して、3000と 1.3であった。1.9ppmと2.4ppmでのピークはグルタル酸エステルに由来する。3.6ppmと4.3ppmでのピークは PEGに由来する。PEGHの小さい重なり合った 3.4〜4.2ppmでのピークは、CPEGとEPEGの間の連結メチレンまたはメチン部位に由来する（図２）。
【００３９】
第３工程では、DL‐ラクチド(19.2g,133.3mmoL）とグリコリド(6.4g,55.1mmoL）を、前もって調製したPEGH上で、オクタン酸第１スズ（76μL, 0.187mmol)を触媒として用いて、130 ℃で24時間、インサイチュー重合した。このグラフト共重合体を過剰のエチルエーテル中に沈殿させ、そして減圧下で残存溶媒を除去した。
【００４０】
EPEGとCPEGとの反応時におけるエポキシ基の開環パターンには二つの可能性が存在する。これら親核試薬は、塩基触媒付加反応では、そのエポキシ基の立体障害がより小さい側を優先的に攻撃するが、一方カチオン重合では、開環反応は、位置特異性が小さい(less regiospecific)。図３の GPCクロマトグラムは、CPEGとEPEGからのPEGHの生成によって分子量が増加をすることを示す。PEGHの分子量が約3,000 であると仮定すると、各PEGH当たり 〜2-3 個のペンダントのヒドロキシル基が存在することになる。
【００４１】
オクタン酸第１スズ（触媒）存在下でのDL‐ラクチドとグリコリドの開環重合用の開始剤として、得られたこのPEGHが、用いられた。H-NMR スペクトル（図２）は、3.6ppmにおけるエチレングリコ−ル単位、5.3ppm（メチン）および、1.8ppm（メチル）における乳酸単位そして4.8ppmにおけるグリコール酸単位を示す。 1H-NMR 法により計算したPEG-g-PLGAの組成は、モル比で 2.98/2.35/1.00 （エチレングリコ−ル／DL-乳酸／グリコール酸）であった。H-NMR で、エポキシ基のメチレンプロトンは、2.6ppmと2.8ppmに見られる。PEGHおよびPEG-g-PLGAの H-NMRスペクトル中では、エポキシ・シグナルは、小さ過ぎて定量的に解析できない。GPC 法で測定したPEG-g-PLGAの重量平均分子量(Mw)とPDI は、ポリスチレン標準試料と比較して、それぞれ11,000および1.3 であった。
【００４２】
ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC):
屈折率検出器(Waters 410)と光散乱散検出器 Mini Dawn(Wyatt Technology)を備えた GPC装置(Waters 515)を用いて、分子量と分子量分布を求めた。スチラゲル（登録商標）:Styragel HMW 6EおよびHR 4E カラム(Waters)が直列で用いられた。テトラヒドロフラン(THF) を展開剤として用いた。
【００４３】
クライオ‐透過電子顕微鏡(Cryo-TEM)
Cryo-TEMを用いて、PEG-g-PLGAの1 ％溶液をガラス状フィルムの形状で調べた。その試料調製についての詳細な方法は、別に報告されている(Bellare et. al., Electron Microsc.Tech.1999,10,87-111) 。温度と湿度を完全に制御し、23.7℃で、炭素コートしたレース状重合体基材中のミクロポア−を横断してフリーに張った厚さ10〜300nm の液体フィルムを調製し、そして液体エタンを用いて、その融解点(-180 ℃）で急速にガラス化した。JEOL 1210 を用い120kV で操作して造影した。名目上〜6 ミクロン、アンダー・フォーカスに調整して十分な相コントラストが得られた。映像は、Gatan 724 マルチスキャン・カメラに記録され、そしてバックグラウンド中の光学密度勾配はデジタル方式で補正された。
【００４４】
CMC 測定
疎水性染料：1,6-ジフェニル‐1,3,5-ヘキサトリエン(DPH) を、メタノールに0.4mM の濃度に溶解した。この溶液（20μL）をマクロシリンジを用いて、2.0mLPEG-PLGA重合体水溶液に、0.0032〜0.26重量％の様々な濃度で注入し、そして、 4℃で5 時間、平衡化させた。UV-VIS分光計(HP 8453) を用いて、20℃で 280〜450nm の範囲でのUV-VISスペクトルを得た。377nm と391nm での吸光度の差（ A377 -A391 ）を濃度の対数に対してプロットすることにより CMCを求めた。
【００４５】
粘度：
PEG-g-PLGA水溶液(22 重量％）の粘度を温度の関数として測定した。0.0966センチストークス／秒の粘度計定数を有する、カノン‐フェンスケ(Canon-Fenske)粘度計200を用いて、この重合体溶液の粘度を測定した。
【００４６】
動機械的分析：
このグラフト共重合体水溶液(22 重量％）のゾル‐ゲル転移を、動機械的レオメータ(Rheometric Scientific:SR 2000) を用いて調べた。この重合体溶液を、直径25mmそして間隙間隔0.5mm の平行板の間に入れた。応力(4.0 dyne/cm2 ) および周波数(1.0ラジアン／秒）を制御しながらデータを集めた。加熱および冷却速度は 0.2℃／分であった。
【００４７】
ゾル‐ゲル転移：
試験管転倒法により、工程当たりの温度上昇１℃で、ゾル‐ゲル転移を測定した。内径11mmの 4mLのバイアル中で重合体水溶液(0.5g)を調製した。このバイアルを、各工程、15分間、ウオーターバス中に浸漬した。このバイアルを転倒することにより、そのゾル‐ゲル転移温度を監視し、そして30秒流動しなかったら、それはゲルと見なされた。この転移温度は、± 1℃の精度で測定された。
【００４８】
NMR-研究：
NMR-分光器(Varian(登録商標)VXR 300) を用いて、 1H-NMR および13C-NMR を測定し、ゾル‐ゲル転移中の組成とミクロ環境の変化を調べた。 D2O 中での13C-NMR 測定のために、22重量％のPEG-g-PLGA溶液を調製した。
【００４９】
結果と考察
ミセル生成：
PEG-g-PLGAは、両親媒性共重合体であり、そして水中で、コア‐シェル構造が期待される。その疎水性のPLGA側鎖がコアを形成し、そして親水性のPEG 骨格がシェル領域を形成する。コア‐シェル構造の生成をクライオ‐透過電子顕微鏡(Cryo-TEM)と染料可溶化法で調べた。
【００５０】
ミセルの生成は Cryo-TEM 映像で直接確かめられた。１重量％のPEG-g-PLGA溶液を23.7℃で、急冷処理して、−180 ℃でガラス化形状にした。この Cryo-TEM映像は、密に充填された球状ミセル（図４でＳとして示す）を黒い縞の左側に示している。ミセルの直径は、約 9nmである（図４）。
【００５１】
DPH の濃度を一定にして、この重合体の濃度を0.0032から0.26重量％に上げた。疎水性染料(DPH) の吸光係数は、水中より疎水性環境の中の方が遥かに大きい。かくして、重合体濃度が増加すると、377 および356nm における吸光度が増加し、この重合体が水中でコア‐シェル構造を形成して、疎水性環境を創ったことを示す（図４-a）。臨界ミセル濃度(CMC) は、散乱効果を補償するために、377nmにおける吸光度と391nm における吸光度の差(A377 -A391 ) を濃度の対数に対して外挿することにより求められた（図４-a）。この外挿により求められたCMC の値は、そのライン中での不確定さに因り正確ではないが、20℃で、0.01〜0.05重量％の範囲内にある。図５ａは、20℃水中での重合体のコア‐シェル構造の生成を示すUVスペクトルである。DPH 濃度を 4μMに固定し、重合体濃度を変えた：0.0032、0.01、0.0178、0.032 、0.056 、0.010 、0.178 、0.26重量％。重合体濃度の増加と共に、377nm での吸収帯が増加するのは、水中で、疎水性環境、即ちミセルが生成することを示唆している。図５ｂは、377nm と391nm における吸光度の差の外挿による CMCの決定を示している。
【００５２】
ゾル‐ゲル転移：
高濃度では、PEG-g-PLGA水溶液は、温度が上がるとゾル→ゲル転移を起こす。カノン‐フェンスケ粘度計で測定された、22重量％のPEG-g-PLGA水溶液の粘度は、20℃で27センチポイズであった。この粘度は、この重合体を医薬用試薬と容易に調合するために十分低く、22‐ゲージの針を用いて注射可能である。ゲル化温度以上では、粘度が高過ぎて、この粘度計の毛細管の中を流れない。22重量％の重合体水溶液の動機械的解析の結果は、ゾル→ゲル転移中に、複素粘度の実数部分(η')は 5から500 ダイン・秒／cm2 [P] に増加し、そして弾性モジュラス(G')は、0 から100 ダイン／cm2 に増加することを示す（図６）。η´とG'は、それぞれ、材料が繰返し変形を受けた時の、消散エネルギー(dissipated energy) と貯蔵エネルギーとの尺度である。そして、試験管転倒法で、30℃以上では、事実上、流動は観測されず、ゾル→ゲル転移を示唆した。22重量％の重合体水溶液で、これら二つの方法を比較すると、両方の場合に熱的平衡を仮定した場合、試験管転倒法で測定したゲル化温度は、動機械的解析法で、η´が100Pで、G'が50ダイン／cm2 に到達する温度に対応する。
【００５３】
試験管転倒法で測定したPEG-g-PLGA水溶液の状態図が、図７に示されている。ゾル→ゲル転移は、粘度の急激な増大を伴う。それ以上の濃度でゲル相が現れる臨界ゲル濃度 (CGC)は、約16重量％であった。CGC以下では、この系は、温度が高くなって粘度が増大しても流動はする。約30℃であると推定されるこのゾル→ゲル転移温度は、その重合体溶液濃度により少し影響された。体温(37 ℃）付近にゲル相が存在することは、その材料が、室温で調合できて、皮下または筋肉内注射で、インサイチューでゲルを形成するであろう注入可能なドラッグデリバリーシステム用の有望な候補であることを示唆する。次いで、この医薬用試薬は、インサイチュー生成したゲルから徐々に放出されるであろう。
【００５４】
この状態図をさらに解析して、温度が上昇すると、このゲルは、図７の灰色の三角マークで示したようなシネレシス（離液：syneresis)：幾らかの量の水がそのゲル相からしみ出す重合体相分離を示すことを例示した。シネレシス温度以上では、このゲル相は、水から分離したままである。それ故、このゾル相は、低温では均一の単一相溶液であり、一方、シネレシス以上でのゾル相は、二相系である。この状態図中の傾向線(trend line)の右側のゲル領域は、均一のゲル相が存在する領域を示している。この状態図（図７）を基に、21〜25重量％のPEG-g-PLGA水溶液は、注入可能なドラッグ伝達用調合物として推奨される。
【００５５】
ミセルの凝集数は、このミセルが硬い球体であると仮定することにより、ミセルの大きさから推定できる。ミセルの半径は次式から推定できる。
ａ．  Ｒ＝(3Ｍs.D.υ2 /4πＮA ）1/3
式中、Ｍs.D.は遠心沈降法で得られたミセルの分子量で、重量平均分子量（Mw）に近い。υ2 とＮA は、それぞれ、重合体の部分比体積とアヴォガドロ定数である。ミセル凝集数 (Ｎag）は、次式で与えられる。
【００５６】
ｂ．  Ｎag＝Ｍ／Ｍ0
式中、ＭとＭ0 は、それぞれ、ミセルの分子量と重合体の分子量である。υ2 の値は、ポリエステルまたはポリエーテルの場合に標準的である0.95であると仮定し、Ｒは、Cryo-TEMから約4.5nm(直径〜9nm)であるから、ミセル凝集数は、20℃で40である。このミセルの凝集数は、PEG-PLGA-PEGおよびポロキサマー 407の場合におけるようにゾル領域で、実際には一定であると仮定される。この計算でも、ＭはＭs.D.に等しく、PEG-g-PLGAの分子量（Ｍ0 ）は、GPC のデータから求められたように6000であると仮定される。この推定を基に、エンタルピー（△H0 ）、Gibbs の自由エネルギー (△G0 ）およびゲル化のエントロピー（△S0 ）のような熱力学的関数が計算できる。今、ゲル化プロセスの標準状態は、理想希薄溶液中、単位モル濃度でミセルであり、ゲル状態でミセルであるとする。
【００５７】
ｃ．  △G0 ＝RTgel lnＣm
ｄ．  △H0 ＝R[dln Ｃm/d (1/Tgel )]
ｅ．  △S0 ＝（△G0 −△H0 )/Tgel
式中、Ｃm は、ミセル当たりの凝集数が40であると仮定して計算したミセルの濃度(moL/L）である。 Tgel は、ゾル→ゲル転移温度である。 ln Ｃm 対 1/Tgel の傾斜（図８）から計算した△H0 は、146kJ/moL(ミセル）または△H0 ＝3.65kJ/moL（分子鎖）である。この値は、ポロキサマー 407（△H0 ＝1.5kJ/moL(分子鎖))およびPEG-PLGA-PEGトリブロック共重合体（△H0 ＝1.32kJ/moL( 分子鎖))のゲル化に似ている。 Tgel が30℃である22重量％のPEG-g-PLGA水溶液のゲル化のGibbs の自由エネルギー (△G0 ）とエントロピー（△S0 ）は、それぞれ−0.59kJ/moLと 1.9JmoL-1K-1である。この計算から、エントロピーがゲル化を駆動するという結論になる。このようなエントロピー駆動反応の分子的起源は、疎水性相互作用であると考えられてきた。水分子は、疎水性セグメント（PLGA）を取巻き、その自由エネルギーを減らす傾向がある。結果として、水分子のエントロピーは、疎水体の存在で減少する。それ故、疎水性分子の表面積は、水中で非常に小さくなる。このような疎水性相互作用は、温度が高くなると増大し、そしてPEG-g-PLGAの分子立体配座が変化し、かくしてゲル化を駆動する可能性がある。
【００５８】
ゲルの構造とゲル生成の機構を明らかにするために、この重合体の13C-NMR 分析を異なる複数の温度で行った (図９) 。水およびクロロホルムに溶かした重合体のスペクトルを比較した。 D2O 中22重量％のPEG-g-PLGA溶液の13C-NMR スペクトルを、20℃（ゾル状態）、30℃（ゾル→ゲル転移のすぐ上）、40℃（ゲル状態）および50℃（マクロ相分離状態）で、NMR パラメータを変えることなく、単に、試料の回りの温度を上げることにより測定した。各温度での平衡化時間は15分であった。クロロホルム（CDCl3 ) は、PEG およびPLGAブロックの両方に対する非選択的良溶媒であり、一方、水(D2O)は、PEG に対しては良溶媒であるが、PLGAに対しては貧溶媒である。クロロホルム中でのPEG とPLGAの両方の鋭いピークを、水中での13C-NMR スペクトルの第１および第２列のPLGAの潰れたピークと比べると、水中で、この重合体のコア(PLGA)‐シェル(PEG) 構造を示唆する。水中でのPEG の分子運動は、疎水性PLGAセグメントによるアンカー効果により、クロロホルム中での分子運動に比べて低下する。この事実は D2O 中20℃でのPEG の広がったピークに反映されている。ゾル→ゲル転移での分子会合における変化は、これら重合体の分子運動における変化を含んでいる。温度の上昇（20℃−50℃）による13C-NMR スペクトルにおける変化は、PEG とPLGAのの回りのミクロ環境における、そのような変化を示す。ゲル状態（30℃）での PEGピーク(72ppm)は、ゾル状態（20℃）に比べて幅が広がり、高さが半分になり、一方PLGAピーク（20ppm）の高さは、ゲル状態（30℃）で僅かに高くなる。ピークの高さにおけるこれらの変化は、ゾル→ゲル転移中に、PEG 骨格の分子運動が有意に減少し、そしてPLGA側鎖の熱運動が増大することを示唆する。この挙動は、PLGA-g-PEGの挙動と全く異なる。PLGA-g-PEGは、 D2O 中での13C-NMR で見て、ゾル→ゲル転移中にPEGピークが殆ど変化しない。これらの観測を基にして、PEG-g-PLGA共重合体水溶液のゾル→ゲル転移に対して、次のモデルが提示される。ゾル状態で、この重合体の立体配座は、ミセル状であり、PEGsは、シェルを占拠し、そしてPLGAs は、そのミセルのコアを占拠している。ゾル状態におけるその会合度は三次元網目を形成するには十分でない。温度が高くなると、疎水性相互作用が増大し、そして重合体の会合がPEG 分子の分子運動を減らし、その結果、長距離網目、即ちゲルが生成する。この会合の程度は、37℃のような所定温度で、過剰の水が存在すると、その完全性を保持するために十分強い。それ故、この系は、粘度の増大した溶液というよりもむしろゲルとして定義できる。温度がさらに上がると、この重合体の間の長距離相互作用が増大し PEGとPLGAの間の相混合が起り、その結果、50℃で、水と重合体の間でマクロ相分離が起きる。
【００５９】
この22重量％の重合体溶液(0.5g)を4mL のバイアル（直径 1.1cm）に注入し、37℃の水浴中で5 分間保持する。この時間の間にゲルが生成する。リン酸塩緩衝溶液(37 ℃、pH＝7.4)3mL を添加し、そしてこのバイアルを人体条件に合わせるために水浴中で、振とう（16ストローク／分）する。このゲルは in vitro で一週間完全さを保持し、そして、この最初濁っていたゲルは３〜７日で透明になる。７日後、ゲルは全体的に壊れて透明な重合体溶液になる。
【００６０】
この材料は、医用ドラッグのような生物活性試薬（例えば、タンパク質、抗癌剤）の短期伝達用に、さらにまた生体組織工学で用いられる生物活性試薬用担体またはデリバリーシステム用に適用できる。このドラッグの疎水性とこれら重合体の分子構造は、拡散の程度または分解支配のドラッグ放出挙動に影響する。それ故、適切なドラッグおよびPEG-g-PLGAの分子パラメータを選択することにより、この重合体ヒドロゲルをベースにして短期伝達用システムを設計できる。
【００６１】
合成：PLGA-g-PEGの一段合成
グラフト共重合体：PLGA-g-PEGが、オクタン酸第１スズを触媒とする DL-ラクチド、グリコリドおよびエポキシ停止ポリエチレングリコ−ル(PEG；分子量＝600)の一段開環重合により合成された。H-NMR 法で測定された、この DL-乳酸／グリコール酸／エチレングリコ−ルモル比は 3.2/1/2.8であった。それ故、PEG のグラフト頻度は、モルで 4.7％である。ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC) 法で測定した、この重合体の重量平均分子量(Mw)および多分散度(Mw/Mn) は、展開溶媒としてテトラヒドロフランを用いるポリスチレン標準試料と比較して、それぞれ 4200 と 1.3である。
【００６２】
ゾル‐ゲル転移：
室温で、25‐ゲージの針を用いてその溶液を注射可能な、25重量％水溶液の粘度は約 0.3ポイズ（gm-1s-1）である。温度が上がると、この（25重量％）PLGA-g-PEG水溶液は、30℃でゾル→ゲル転移を起こす。このゲル状態は、伝統的には、試験管転倒法により非流動性の半固体（セミソリッド）と定義されている。実際の適用時には、そのゲルは、その平衡‐膨潤状態を保つべきであり、そして過剰量の溶媒中に溶けない。このPLGA-g-PEG水溶液（25重量％）の温度がさらに高くなると、50℃でゲルと水の間にマクロ相分離、即ちシネレシスを起こす。
【００６３】
動機械的分析：
このグラフト共重合体水溶液のゾル‐ゲル転移を、ポロキサマー水溶液と類似の様式で動的レオメトリー(Rheometric Scientific:SR 2000) を用いて調べた。この重合体溶液を直径25mmそして間隙間隔0.5mm の平行板の間に入れた。応力(4.0 dyne/cm2 ) と周波数(1.0ラジアン／秒）を制御しながらデータを集めた。加熱および冷却速度は 0.2℃／分であった。この動機械的分析を用いると、ゾル‐ゲル転移は、試験管転倒法より、より再現性よく、定量的に同定できる。
【００６４】
このPLGA-g-PEG水溶液のモジュラスが、温度および濃度の関数として、図１０に示されている。その貯蔵モジュラスは、ゾル→ゲル転移で、急激に増大する。このゲルは、約50 dyne/cm2 のモジュラスを有し、そして、22〜29重量％の範囲で濃度によりわずかに影響される。そのゾル→ゲル転移は30℃付近で起るので、室温での調合は容易であると考えられる。。
【００６５】
このゾル‐ゲル転移の可逆性を確かめるために、25重量％のPLGA-g-PEG水溶液で調べた。この重合体溶液の複素粘度の実数部分(η')（繰返し変形が材料に加えられた時の消散エネルギーの尺度である）が、図１１ａに温度の関数として示されている。第１加熱サイクル(H1)中に、ゾル→ゲル転移で、η´は1000倍に増加する。冷却曲線(C1)は、このゲル相は、43〜20℃の温度範囲にわたって、この実験の時間尺度内で、存在し続けることを示している。この事実は、そのゲル相内での分子の再配列が困難なことに起因する；一度その溶液がゲルを生成すると、その分子は、崩壊に耐える。η´は、この系の冷却中のゲル→ゾル転移により、15℃で急激に減少する。第２加熱曲線(H2)は、実質的に第１加熱曲線(H1)と同じ温度でのゾル→ゲル転移を示している。
【００６６】
PLGA-g-PEG水溶液（25重量％）の貯蔵モジュラス(G')（材料に繰返し変形が加えられた時の貯蔵エネルギーの尺度である）は、ゾル状態で実質的に 0であり、そして加熱曲線（図11b;H1) には示されていない。 G' は、加熱曲線に示されているように、32℃でのゾル→ゲル転移中に急激に増加する。G'の最大値は、35〜39℃の間で測定され、in-vivo (37 ℃) 適用のための有望な材料であることを示す。その冷却サイクル(C1)中に、そのゲル・モジュラスは、43〜20℃の温度範囲で増大し、標準的な弾性材料に似た挙動を示し、そしてゲル→ゾル転移により、15℃で急激に低下する。第１(H1)および第２(H2)加熱サイクル中で、G'で、実質的に同じ転移曲線が測定され、可逆的ゲル化を示唆している。40〜45℃以上の温度での G' の減少は、熱運動の増大に因ると考えられる。この傾向は13C-NMRスペクトル（図１２）でも観測される。
【００６７】
NMR-研究：
D2O 中での25重量％共重合体溶液の13C-NMR スペクトルを異なる複数の温度で記録した。ゾル状態（20℃）では、疎水性PLGAのメチルピーク（18ppm)は潰れ、そしてPEG ピーク（72ppm)に比べて広がる、一方CDCl3 中では、メチルピークは鋭いピークとして現れ、水中でのこの重合体のコア‐シェル構造を示唆する。これら両親媒性共重合体のこのコア‐シェル構造は、希薄水溶液中でのミセル生成によっても確かめられた。染料可溶化法で求めた臨界ミセル濃度(CMC) は、20℃で0.03重量％であった。
【００６８】
PLGA-g-PEG共重合体水溶液（25重量％）のゾル→ゲル転移温度(33 ℃) のすぐ上で、疎水性PLGAメチルピークと親水性PEGピークの両方の13C-NMR スペクトルの形は、そのPEG ピークが、低磁場側に約0.3ppmシフトすることを除いて、保持される。温度がさらに高くなると、PLGAメチルピークの高さが高くなり、そしてPEG ピークは、二つのピーク：72.4ppm における鋭いピークと72.7ppm における広いピーク、に分裂する。これらの挙動は、疎水性骨格の分子運動の増大およびPEG とPLGAの間での相混合に起因すると考えられる。PEG とPLGAまたはPLLAの間での相混合は、前に報告されている。温度がさらに上がると、水とこの重合体の間にマクロ相分離が起きる。
【００６９】
このゾル‐ゲル転移の可逆性は、重水素NMR(図13) によっても確かめられた。20℃（ゾル状態）での4.8ppmのピークは、33℃（ゾル→ゲル転移のすぐ上）で4.6ppmに、37℃（ゲル状態）で4.58ppm に、40℃で4.56ppm に、そして50℃（シネレシス）で4.5ppmに、シフトした。化学シフトの変化は、ゾル→ゲル転移中が最も顕著（δ＝0.2ppm) で、次いでシネレシス中であった。この系を20℃に冷却すると、4.8ppmに重水素のピークが再び現れ、この転移が可逆性であることを示唆する。ゾル状態では、ゲル状態中より、水がより自由に動く。ゾル→ゲル転移中に、PEG は、脱水に因り、より疎水性になり、そして水分子と重合体の間の水素結合の程度が変化する。それ故、ゾル→ゲル転移中に、重水素核の回りの時間平均環境(time average environment)が影響を受け、水の化学シフトの変化をもたらすのであろう。この発見は、重水素-NMRが、ゾル‐ゲル転移の測定のための良い方法であり得ることを示唆する。
【００７０】
ゾル→ゲル転移温度は、PEG の長さと組成を変えることにより、20℃〜40℃に調節することができる。PLGA-g-PEGのPEG の分子量が、600 から1000に増加すると、そのゾル→ゲル転移は40℃で起きる。一方そのPEG 組成がモルで20％低下すると、そのゾル→ゲル転移は20℃で起きる。
【００７１】
ゲル耐久性の変化
ゲル耐久性の時間枠(time frame)は、式 An(B)（式中 n＞2)中の二つのブロックの比を調整することにより変えられる。ゲルの耐久性を試験し、そして例示するために、重合体溶液 0.5g(下の表参照）を 4mLバイアル（内径 1.1cm) 中に注入し、そして37℃で 5分保持してゲルを生成させる。ゲル生成後、リン酸塩緩衝溶液（37℃、pH＝7.4)3mL を添加し、そしてそのバイアルを振とう器浴(shaker bath) に入れた（16ストローク／分）。この重合体の完全な分解の間、毎日監視し、監視の時間に緩衝溶液の最上層を取出した。次の表は、各比の重合体について得られたゲル耐久性を示す。PEG-g-PLGAの分子量は11,000で、そしてPLGA-g-PEGの分子量は7,800 であった。
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結論
PEG-g-PLGA共重合体の水溶液は温度の上昇に応じてゾル→ゲル転移を示す。ミセル生成がCryo-TEMと染料可溶化法で確認された。ミセルの直径は約9nm で CMCは0.01-0.05 重量％の範囲であった。13C-NMR は、ゾル→ゲル転移中に、PEG 骨格の分子運動は減少し、一方PLGA側鎖の分子運動は増加することを示す。
【００７２】
21-25 重量％溶液は、室温で低い粘度を示し、そして体温でゲルを生成する。ゲルの形態構造は、濁った状態から透明な状態に変化し、そしてゲルの完全性は、一週間耐えて存続し、短期間ドラッグデリバリーシステム用の有望な候補であることを示唆する。
【００７３】
温度の上昇によって可逆的ゾル→ゲル転移を示すPLGA-g-PEG水溶液系を、動機械的分析とNMR 分光器により調べた。水溶液中でのこの共重合体のレオロジー研究は、約30℃で熱ゲル化が起り、そしてこの弾性ゲルのモジュラスは、体温（37℃）近くで最大になることを示した。ラット・モデルでの予備的in vivo 試験は、0.5mL 水溶液の皮下注射後でのインサイチューゲル生成を確かめた。このゲルは、その注入場所に 2か月後にも存在する。この事実は、この重合体を、一週間で崩壊するポリ（エチレングリコ−ル)-g-ポリ(DL-乳酸‐共‐グリコール酸)PEG-g-PLGA 共重合体ヒドロゲルと明確に区別するものである。
【００７４】
この研究で開発されたこの系は、皮下、腹腔内、眼内、膣内または直腸内投与により、タンパク質、抗癌薬および抗関節炎（antiathritis）薬のような生物活性試薬の局所送達用に非常に有望である。感熱性が、注入時に、インサイチューゲル生成を可能にし、それ故、このドラッグ送達系を埋込むために、外科的処置は必要でなく、そしてドラッグ調合用に有機溶媒は必要でない。軟質ヒドロゲルの物理的性質が、注入部位を取囲む組織の機械的刺激を減らす。また、この重合体は生分解性でもあり、それ故、その医用薬の放出後に、その注入物を外科的に除去する必要がない。
【００７５】
本発明は、その特定の実施態様と関連させて説明されたが、さらなる修飾が可能であることが理解されるであろうし、そして本出願は、一般に、本発明の原理に従う任意の変更、利用あるいは翻案を包含することを意図するものあり、そして、本発明が属する技術分野で既知であるか、または慣用的な実施中に出てくるような、そして本明細書中で前に説明した基本的特徴に適用され得るような、そして付記された請求の範囲に従うような、本発明からの発展を含めることを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、PEG-g-PLGAの合成スキームを表している。
【図２】図２は、PEG-g-PLGA合成の中間および最終生成物の NMRスペクトルをグラフで表している。
【図３】図３は、反応の進行を示す、重合体のGPC クロマトグラムをグラフで表している。
【図４】図４は、水中１重量％の濃度で、23.7℃でのPEG-g-PLGA重合体のミセル生成を示すCryo-TEMイメージである。
【図５】図５ａは、水中、20℃での、重合体のコア‐シェル構造の生成を示すUVスペクトルを示すグラフであり、ここで、DPH 濃度は、4μM に固定され、そして重合体の濃度は、標画内の凡例(key legend)に従って変えられる。図５ｂは、377 および392nm における吸光度の差を外挿することにより求めたCMC を示すグラフである。
【図６】図６は、22重量％のPEG-g-PLGA水溶液の複素粘度の実数部分(n')および弾性モジュラス(G')を温度の関数として示したグラフである。
【図７】図７は、PEG-g-PLGA水溶液の状態図を示すグラフである。
【図８】図８は、PEG-g-PLGA水溶液のゾル→ゲル転移のエンタルピーの計算を示すグラフである。
【図９】図９は、PEG-g-PLGAの D2O 溶液（22重量％）の13C-NMR スペクトルを温度の関数として示したグラフである。
【図１０】図１０は、PLGA-g-PEGの貯蔵モジュラスを温度および濃度の関数として示したグラフである。
【図１１】図１１ａは、PLGA-g-PEG共重合体水溶液（25重量％）のレオロジー研究の結果を示したグラフであり、ここで、この共重合体溶液の複素粘度の実数部分 (η´) は、温度の関数として測定された。図１１ｂは、PLGA-g-PEG共重合体水溶液（25重量％）のレオロジー研究の結果を示したグラフであり、ここで、この共重合体溶液の貯蔵モジュラス(G')は、温度の関数として測定された。
【図１２】図１２は、PLGA-g-PEG共重合体の D2O 溶液（25重量％）の13C-NMR スペクトル(75MHz) を温度の関数として示したグラフであり、ここで、その拡大スペクトル(〜73ppm)が左に示されている。
【図１３】図１３は、そのゾル→ゲル転移の可逆性を示す重水素NMR を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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