(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体である単一もしくは複数個のＦＡ2ＰＦ6結晶又はＬｉ−Ｐｃ結晶表面に親油基が吸着し、表面側には親水基が露出する界面活性剤により形成されている
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項２】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体として、単一もしくは複数個の超常磁性体ＹＩＧ表面に親油基が吸着し、表面側には親水基が露出する界面活性剤により形成されている
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項３】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体として、単一もしくは複数個の超常磁性体ＹＩＧ結晶の表面が親水化されるか、結晶表面に親油基が吸着し表面側には親水基が露出する界面活性剤により包摂されて水性溶媒中に分散され、前記ＥＳＲ物体はリポソーム構造を有し、その内部に前記水性溶媒中に分散された複数の前記超常磁性体ＹＩＧ結晶を包摂している
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項４】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体である単一もしくは複数個の超常磁性体ＹＩＧ結晶の表面が疎水化されて油性溶剤中に分散され、該超常磁性体ＹＩＧ結晶の分散溶液を最外表面が親水基で構成される構造体内に包摂した
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項５】
請求項４に記載のＥＳＲ用造影剤において、
前記ＥＳＲ物体がレシチンで形成され、その内部に前記油性溶剤中に分散された複数の前記超常磁性体ＹＩＧ結晶を包摂している
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項６】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体として、単一もしくは複数個のＬｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱ、又はＮａ−ＴＣＮＱ結晶の表面が親水化されるか、結晶表面に親油基が吸着し表面側には親水基が露出する界面活性剤により包摂されて水性溶媒中に分散され、前記ＥＳＲ物体はリポソーム構造を有し、その内部に前記水性溶媒中に分散されたＬｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱ、又はＮａ−ＴＣＮＱを包摂している
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項７】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体がレシチンで形成され、その内部に油性溶媒中に分散された複数のＬｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱ、又はＮａ−ＴＣＮＱ結晶を包摂している
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項８】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体として、単一もしくは複数個のゲル又はゼリー状物質中にＦＡ2ＰＦ6微結晶、Ｌｉ−Ｐｃ微結晶、Ｌｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱ、Ｎａ−ＴＣＮＱ結晶、又はＴＡＭ固体分子を分散させ、前記ＥＳＲ物体の表面に親油基が吸着し、表面側には親水基が露出する界面活性剤により形成されている
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項９】
請求項１、２、３、７及び８のいずれか一項に記載のＥＳＲ用造影剤において、
前記構造体の最表面がポリエチレングリコール付リン脂質を含む物質により形成されている
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項１０】
請求項９に記載のＥＳＲ用造影剤において、前記リン脂質は、L-αdipalmitoylphosphatidylcholine、又はL-αdistearoylphosphatidylethanolamineである
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項１１】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤において、
ＥＳＲ物体として、ＹＩＧ微結晶、ＦＡ2ＰＦ6微結晶、Ｌｉ−Ｐｃ微結晶、Ｌｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱ、Ｎａ−ＴＣＮＱ結晶、又はＴＡＭ固体分子を用い、前記ＥＳＲ物体の表面に疎水性ポリアミノ酸が吸着し、表面側に親水性ポリエチレングリコールが形成された親水性ポリエチレングリコールと疎水性ポリアミノ酸からなるＡＢ型ブロックコポリマーが形成されている
ことを特徴とするＥＳＲ用造影剤。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＥＳＲ用造影剤と、
最表面の化学的構造を前記ＥＳＲ用造影剤を構成するＥＳＲ物体を包摂する第１の構造体と同じくする第２の構造体内に薬物を包摂したＤＤＳ薬物と
が混合されていることを特徴とする造影剤。
【請求項１３】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＥＳＲ用造影剤を構成するＥＳＲ物体を包摂する構造体を構成する物質を含む溶液から第１の薄膜を容器壁面に乾固形成する工程と、
前記構造体を構成する物質と前記ＥＳＲ物体とを含有する溶液から第２の薄膜を前記乾固形成された第１の薄膜上に形成する工程と、
前記構造体を構成する物質を含む溶液から第３の薄膜を前記第２の薄膜上に乾固形成する工程と
を有することを特徴とするＥＳＲ用造影剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は造影剤に係わり、高分解能で高速撮影に好適な電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用造影剤とその造影剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品候補の本流である水溶性低分子量（〜３００）候補化合物が、見つかりづらくなり、医薬品の安全性に対する要求が厳しくなったこともあいまって、上梓までにかかる開発費用がここ１０年飛躍的に増加し、新薬開発のコスト削減が急務の課題になっている。
【０００３】
最近では、抗がん剤などの毒性を緩和させ、適度の薬品量で効果を発揮させるため、治療すべき癌部位へ、直接医薬品を到達せしめるＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム：薬物送達システム）医薬品の上梓が始まり、更にはいくつかのＤＤＳ抗がん剤で治験フェーズＩ，II，IIIの段階に達している。
【０００４】
新規医薬品を開発する場合、薬物の生体内での薬物動態を定量的に把握する必要がある。従来、医薬品開発の動物実験では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＲＩ（ラジオアイソトープ）を用いた放射化分析、質量分析などの分析的手法により各組織分布を調べてきた。ＤＤＳ医薬品などの組織特異的被着性薬物の開発でも、病変組織を取り出し、所望の病変組織での薬物の分布蓄積を分析的手法で調べている。
【０００５】
一方、造影剤を用いた画像診断装置の進歩は著しいものがあり、例えば、放射性元素を造影剤にラベルして、生体内分布を画像化するＳＰＥＣＴ（Single Photon Emission Computed Tomography：単光子放射線コンピュータ断層撮影法）やＰＥＴ（ポジトロン断層法）では、造影剤のガン部位への集積分布画像が得られるようになってきた。また、ＭＲＩ（magnetic resonance imaging：核磁気共鳴画像法）用造影剤やＸ線ＣＴ用造影剤の開発により、形態画像に強いコントラストを強くつけられるようになってきた。薬物投与後の病態組織の形態の経時変化をＭＲＩやＸ線ＣＴにより追跡する事も可能になっている。
【０００６】
ＥＳＲ−ＣＴ（電子スピン共鳴画像法：Electron Spin Resonance Computed Tomography）用造影剤は、生体内ラジカル分布を画像化する目的でスピントラップ剤（例えば、K. Takeshita et. al., Free Radical Biology & Medicine, 26 (1999) 951）として開発されてきたが、吸収線幅ΔＨが１．５Ｇ（ガウス）程度と広く、明瞭な造影剤分布を画像化することは困難であった。この欠点を克服するため、吸収線幅ΔＨが２５０ｍＧ（ガウス）程度と狭い水溶性のＴＡＭ分子（米国特許第５，５３０，１４０号明細書）が開発され、造影剤の生体内強度分布がある程度明瞭な画像として得られるようになっていた。また、リポソームにＳＰＭ（超常磁性：superparamagnetism）磁性体を包摂する方法（米国特許第８，９０５，０４０号明細書）が知られている。
【０００７】
ＥＳＲの分野では、その吸収線幅ΔＨが２０ｍＧ程度と小さい有機結晶としてＦＡ2ＰＦ6（difluoranthenylphosphor-hexafluoride：ＦＡはfluoranthen（フルオランテン；Ｃ16Ｈ10）の省略形；例えば、Appl. Phys., A 30(1983)227）やＬｉＰｃ（リチウムフタロシアニン；Ｃ32Ｈ16ＬｉＮ8）のＸ相（例えば米国特許第５，１１２，５９７号明細書やJ. Phys. Chem. B104 (2000) 4047）が知られている。これらの有機結晶は電解結晶成長法により作製されており、結晶成長装置（結晶成長セルと呼ぶ）は大学などの基礎研究を行う目的で作製されてきた（例えば、「伝導性低次元物質の化学」、日本化学会編、化学総記No.42，1983年、学会出版センター）。強磁性体やフェリ磁性体の電子スピン共鳴の研究から、外形形状が１ｃｍ程度の球形に近い、イットリウム・鉄・ガーネット（ＹＩＧ：Ｙ3Ｆｅ5Ｏ12）の場合、結晶軸の方向によって共鳴周波数は大きく異なるものの、形状効果の反磁性を抑えるとＥＳＲの吸収線幅ΔＨはが２００−５００ｍＧまで小さくなる事は知られていた（例えば、宇野他訳「第４版キッテル固体物理入門下巻」丸善（１９７４年）６０７頁、図１７）。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，５３０，１４０号明細書
【特許文献２】米国特許第８，９０５，０４０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１１２，５９７号明細書
【非特許文献１】Free Radical Biology & Medicine, 26 (1999) 951
【非特許文献２】Appl. Phys. A 30 (1983) 227
【非特許文献３】J. Phys. Chem. B104 (2000) 4047
【非特許文献４】「伝導性低次元物質の化学」、日本化学会編、化学総記No.42，１９８３年、学会出版センター
【非特許文献５】宇野他訳「第４版キッテル固体物理入門 下巻」丸善（１９７４年）６０７頁、図１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
開発費を低く押さえるため、薬効は確認されているが、治験フェーズＩ，II，IIIの段階で、毒性、代謝異常、体内での過度の滞留性などのために、上梓に至らなかった医薬品に対して、ＤＤＳキャリアの中に、その医薬品を詰め込み、治療すべき組織へ送達、徐放できれば、医薬品開発のコストは大幅に低減できるため、あらためてＤＤＳ技術が注目されている。かかるＤＤＳ医薬品が低コストで開発できれば、新薬開発でのボトルネックが解消される可能性が高い。このようなＤＤＳ医薬品では所望の部位以外への蓄積は、かえって毒性などの重篤な問題を引き起こし、薬剤開発のリスクを高めてしまう可能性が高い。
【００１０】
病変組織を取り出して薬物の分布蓄積を分析的手法で、所望の組織以外に薬物が蓄積することはないか？  という点を明らかにするには、薬物投与後の所定時間ごとにマウスなどの動物を殺し、各組織を取り出し、その各組織を細かく分割して、その組織片に分布する薬物を分析する必要がある。そのため、ひとつの医薬品候補の薬物動態解析だけで、１万匹単位のマウスが必要になることも稀ではなく、（１）膨大な手間と時間、費用が掛かり、薬物開発コストを著しく上げてきた。また、（２）一個体の、各組織への薬物分布を時間的に追跡できる訳ではないので、本当の意味での薬物分布を調べる事ができた訳ではなかった。更に（３）動物愛護の観点からも数多くの動物を犠牲にすることには問題が多かった。さらに、マウスでは問題がなかった分布と代謝を調べる目的で行うヒトに分布や代謝機構が近いサルを用いた実験では、動物愛護の点からも、簡単に各組織への分布を調べる事が出来ないので、多くは血中濃度しか測定できないのが現状である。ヒトに近いモデル実験として取り上げられることが多いサルに対するＤＤＳ医薬品などの組織特異的薬物の開発では、サルを殺さざるを得ず、その数を最小限に抑える必要があり、各組織への分布解析は十分に行うことができなかった。
【００１１】
ＤＤＳ医薬品などの組織特異的被着性医薬品の開発では、ターゲットとなる組織は確定しているので、ＤＤＳキャリアの有効性のスクリーニング試験を手軽に行える装置の開発が求められている。このＤＤＳ医薬品など開発では、薬物を封じ込めるキャリアの粒径とキャリア表面の化学的構造が組織特異的被着性を決定するとされており、キャリアの粒径とキャリア表面の化学的構造を様々に変えて実験でき、生きている状態で動物内組織分布を手軽に分析できる手法の開発が望まれていた。
【００１２】
一方で、ＳＰＥＣＴやＰＥＴなどの画像診断用造影剤では、集積部位と非集積部位（バックグラウンド）との信号強度さが３倍程度と低く、誤診率（特定部位への集積を見逃す確率）が高くなりやすく、薬物の動態解析に使用することは難しい。また空間分解能が原理的に悪いため、空間分解能改善には、放射線強度を上げて、コリメータの精度を上げるしかない。そのためには造影剤に使う放射性元素の量を被爆限界前後まで上げる必要があり、小動物の場合でさえ、生体を殺す事になる。また、半減期が短い事もありＤＤＳキャリアを放射性原子核でラベリングする事は容易ではない。ラベリング自身に高価な合成施設を必要とすることや、造影剤中の特別な分子の原子核を放射性元素でラベルにするので、組織特異性が高くないという欠点を有している。画質の決め手になる空間分解能も数ｍｍ程度と空間分解が悪く、測定時間が長くかかるという問題点も抱えている。
【００１３】
また、ＭＲＩ造影剤やＸ線ＣＴ用造影剤では、造影剤の分布を直接画像化しているわけではなく、組織特異的造影剤は実現できていないので、ＤＤＳ医薬品などの組織特異的分布を画像化することには至っていない（例えば、第４回東京理科大学ＤＤＳ研究センターシンポジウム講演録、１７頁、２００６年１２月２０日、京理科大学森戸記念館における「招待講演３ ＭＲＩイメージングのドラッグターゲティングの応用：横山昌幸（財）神奈川科学技術アカデミー）。
【００１４】
ＥＳＲ−ＣＴ用造影剤では、造影剤自身の分布を画像化できる点は大きな長所であるが、ＴＡＭ分子造影剤においても組織特異的造影剤は実現していなかった。リポソームにＳＰＭ磁性体を包摂する方法や市販のＳＰＭ造影剤では、ＭＲＩ造影剤としては、組織特異的被着性は実現できず、ＥＳＲ−ＣＴ用造影剤用としては吸収線幅が、６０−１２４０Ｇ程度（Ｆｅ3Ｏ4など）と桁違いに大きいため、明瞭な分布画像を得ることができず、ＥＳＲ造影剤としては全く不適であった。
【００１５】
有機結晶を作製する従来の結晶成長セルは、新物質探索や物理実験への結晶供給を主たる目的とする結晶成長セルであったため、工業的にナノプローブ剤を作製するには、多量のＦＡ2ＰＦ6結晶とＬｉＰｃ結晶（Ｘ相）が必要になり、従来の結晶成長装置で作成する場合には、結晶成長セルを非常に多数並列にならべるほかはなく、作業性（作業の容易さや作業時間）、大きいセル設置面積、原料利用効率の点で全く不適であった。
【００１６】
また、従来、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4など）などの強磁性体をＳＰＭ磁性体にするには数ナノメータ寸法が必要であり、バルクな大きさを粉砕して小さくすることは難しく、もっぱら化学的手法（共沈法など）で形成されてきた。しかしながら、化学的手法で形成された磁性体は結晶性が悪く、吸収線幅が広がり、大きな磁化を得る事は難しかった。
【００１７】
ＤＤＳ医薬品などの組織特異的被着性薬物の開発では、動物実験の段階から、（１）所望の病変組織に送達されたか？（２）所望の組織以外に蓄積することはないか？  という点を明らかにすることが、医薬品実用化のカギであり、動物実験の段階で、動物を殺して組織への分布を解析する方法ではなく、生きたままの状態で組織特異的被着性を解析する方法の実現がＤＤＳ医薬品を効率的に開発するための大きな課題である。
【００１８】
本発明の主たる目的は、薬物開発の過程で、動物を殺すことなくＤＤＳ医薬品やＤＤＳキャリアの生体内組織特異的被着性（分布）と、想定外の組織への分布の有無を画像イメージング法により直接観察する手段を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の造影剤は、ＥＳＲ信号源（以後、ＥＳＲ物体と呼ぶ）を最外表面が親水基で構成される構造体（以後、ＤＤＳキャリアと呼ぶ）内に包摂し、生体適合水溶液、例えば、生理食塩水中に分散された造影剤であり、本造影剤を生体に投与しＥＳＲ−ＣＴ画像を撮ることで上記目的を達成できる。
【００２０】
本造影剤に用いたＤＤＳキャリアと粒径及びＤＤＳキャリアの最外表面の化学的構造を同じにしたＤＤＳキャリアの中に薬物を閉じ込めたＤＤＳ医薬品を作ると、造影剤の分布が分かれば、薬物を包摂したＤＤＳキャリアの分布が分かり、（１）所望の病変組織に送達されたか？（２）所望の組織以外に蓄積することはないか？  という事が画像的に判別できる。
【００２１】
本発明の造影剤を用いると、医薬品開発では、ＤＤＳの粒径や表面構造を様々に変えて、生体中の被着部位が変化することを容易に画像化できる。ここで重要な点は、医薬品を閉じ込めるＤＤＳキャリアとＥＳＲ物体を閉じ込めるＤＤＳキャリアは、粒径とＤＤＳキャリアの最外表面の化学的構造が同じであることであり、ＤＤＳキャリア自身は両者で必ずしも全て同じである必要はないことである。
【００２２】
小動物やヒトなどの生体を対象にすると、マイクロ波の照射に際して、周波数が上がると誘電損失が問題になり、生体表面からマイクロ波が中心部まで進入できなくなる。ヒトの場合２００ＭＨｚまでは、マイクロ波が全身に進入することが分かっているが、その物理的メカニズムは詳細には理解できていない。ＥＳＲ−ＣＴの共鳴磁場としての上限は５００Ｇ（周波数１．４ＧＨｚに対応）程度と考えられている。一方、共鳴磁場を低くすると生体には侵入し易くなり誘電損失の問題はなくなるが、感度が悪くなるので、共鳴磁場としての下限は５０Ｇ（周波数１４０ＭＨｚに対応）程度である。結局、小動物やヒトなどの生体応用では、共鳴磁場として、５０Ｇから５００Ｇの範囲で用いることになり、この磁場範囲で組織特異性を判別することができる明瞭なＥＳＲ−ＣＴ画像が撮れることが重要である。そのためには、分布の空間分解能として最低でも１ｍｍ以下になることが望ましい。
【００２３】
本発明の実現手段を更に詳しく説明する。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）を示す単一もしくは複数個の物体（ＥＳＲ物体）をＤＤＳキャリア内に包摂し、生体用ＥＳＲ−ＣＴでの実用的な磁場範囲５０Ｇ（ガウス）から５００Ｇ（ガウス）までの静磁場下で、電子スピン共鳴吸収線幅ΔＨを１０００ｍＧ以下にできるＥＳＲ用造影剤を実現する事で本発明の目的を達成できる。ＤＤＳキャリアの粒径と最外表面の化学的構造が組織特異性の有無を決定するので、ＤＤＳ医薬品を開発するときに、ＤＤＳキャリアの粒径とその最外表面の化学的構造をパラメータにして、ＤＤＳキャリア内に上記性質を持つＥＳＲ信号を示す物体を包摂する事で、発明の目的を達成する。ＤＤＳキャリアの粒径としては、生体応用を考える場合、血管系に直接投与する場合や、組織に注射して投与する場合には、毛細血管まで通過させて血管系を血液循環させようとすると、大略１μｍ以下で用いることが多い。固形癌などの新生血管の管壁に発生する１μｍ程度の孔を通して癌組織に薬物を運びたい場合には、大略４００ｎｍ以下の粒径を有するＤＤＳキャリアが効果的であることが知られている。一方、経口薬として用いるＤＤＳキャリアの場合には、粒径の制限は大きく緩和される。例えば、特定の腸壁に異常があり、そこに被着させる用途の場合には、粒径は１００−１０００μｍ程度でも良い。
【００２４】
ＥＳＲ−ＣＴやＭＲＩの場合、空間分解能ａを評価する場合、その上限は吸収線幅ΔＨと傾斜磁場強さＧとの比で表される。
ａ＝ΔＨ／Ｇ                                                    …(1)
【００２５】
傾斜磁場強度Ｇを強くすると、吸収線幅ΔＨの狭いラジカルであれば、原理的には幾らでも空間分解能を向上できるが、現実には幾つかの制限がある。大きな問題の一つは、傾斜磁場強度Ｇを強くすると、必要な傾斜磁場形成電力が極めて大きくなることである。
【００２６】
特開２００６−２４５５９７号公報のＥＳＲ−ＣＴ装置に開示したように、ズームアップ機能を持たせて局所領域のみを拡大して画像化する場合でも、傾斜磁場強度Ｇは１００Ｇ／ｃｍ程度が実用限界であり、空間分解能として１ｍｍ以下を保証しようとすると、式(1)から吸収線幅ΔＨは１０００ｍＧ程度以下が必要である。望むらくは３００ｍＧ以下であれば、傾斜磁場強度Ｇが３０Ｇ／ｃｍ程度になり、ＥＳＲ−ＣＴ装置に大きな負担を掛けずに明瞭な画像を得る事ができる。
【００２７】
このようなＥＳＲ用造影剤の具体的構成として、以下に二種類の基本構造を示す。
その第一は、ＥＳＲ物体それ自身の電子スピン共鳴吸収線幅ΔＨが１０００ｍＧ以下であり、かつＥＳＲ物体の共鳴磁場がＥＳＲ物体と静磁場の成す角度に依存して変化する場合（結晶軸異方性があると呼ぶ）、最大共鳴磁場と最小共鳴磁場の和の１／２を平均共鳴磁場と定義すると、（最大共鳴磁場−最小共鳴磁場）が平均共鳴磁場の１／５００以下であるような非常に小さい共鳴磁場異方性を持つＥＳＲ物体を採用する事である。
（最大共鳴磁場−最小共鳴磁場）≦平均共鳴磁場/500
＝（最大共鳴磁場＋最小共鳴磁場）/1000    …(2)
【００２８】
磁気共鳴を起こすＥＳＲ物体の集合体において、個々のＥＳＲ物体が印加静磁場に対してランダムな配置をとる集合体と見なせる時（本発明のＥＳＲ用造影剤もそのようなＥＳＲ物体の集合体の一つである）、ＥＳＲ物体の集合体では、磁場に対して結晶軸がランダムに分布することが期待されるため集合体全体としては、共鳴吸収線幅ΔＨが上記最大共鳴磁場と最小共鳴磁場の差を単一吸収線幅ΔＨとしてもつピークとして観測される。この場合、共鳴吸収線幅ΔＨ（最大共鳴磁場と最小共鳴磁場の差）が印加磁場に比例するため、印加磁場効果による吸収線幅と呼ぶ事ができる。
【００２９】
一般に電子スピン共鳴の共鳴周波数νと印加静磁場Ｈとの間には、次の関係がある。
ｈν＝ｇ・ｅ／（２Ｍｃ）・ｈ／２π・Ｈ                          …(3)
【００３０】
ここで、Ｍは対象となる電子の質量、ｅは単位電荷、ｃは光の速度、ｈはプランク定数で、電荷の符号（±）は本発明の範囲では問題にならないので特には考慮しない。ｇはｇ値と呼ばれる電子に固有な量で、自由電子では、ｇ＝２．００２３である。結晶中電子や分子内電子では、ｇ値は一般に自由電子の値からシフトする事が知られている。
【００３１】
上記説明の共鳴磁場異方性は、ｇ値異方性Δｇ／ｇが１／５００以下であると言い換えることもできる。
Δｇ／ｇ≦１／５００                                            …(4)
【００３２】
ｇ値異方性が存在する場合、印加磁場強度が強くなるに比例して、結晶方位による共鳴周波数分布は広がり、印加磁場に対して結晶方位がランダムな方向に分布するＥＳＲ物体の集合体においては、ｇ値異方性Δｇ／ｇに従う共鳴吸収線幅ΔＨを持つ物質（本発明のＥＳＲ用造影剤）として振舞う事になる。本発明のＥＳＲ用造影剤は、印加静磁場Ｈとｇ値異方性Δｇ／ｇの積が１０００ｍＧ以下であれば、ＥＳＲ物体としてそれ自身の電子スピン共鳴吸収線幅ΔＨが１０００ｍＧ以下になるからである。本造影剤では、吸収線幅は高磁場では印加磁場に比例し、５０−５００Ｇのような低磁場では、磁場比例部分のΔＨへの寄与が減り、吸収線幅は狭くなる。低磁場の極限では、ＥＳＲ用造影剤を構成するＥＳＲ物体固有の吸収線幅まで狭くなる。
【００３３】
このような性質を持つ材料としてＥＳＲの分野では、ＦＡ2ＰＦ6（difluoranthenyl phosphorhexafluoride）結晶又はＸ相Ｌｉ−Ｐｃ（リチウム フタロシアニン）結晶では、バルク結晶（大略粒径１ｍｍ以上）において吸収線幅ΔＨが非常に狭く、僅かにｇ値の結晶異方性Δｇ（Δｇ／ｇ≒１．８×１０-4）が存在することが知られていた。しかしながら、このような有機結晶では、粒径１μｍ以下の微粒子にする方法も見出されておらず、粒径１μｍ以下にした時、このバルクの性質が保たれているか否かは実証されていなかった。また、これらの結晶は疎水性であり、水溶性の溶液に分散する方法が見出されてはいなかった。造影剤を製造するに当り、多量のＦＡ2ＰＦ6結晶やＸ相Ｌｉ−Ｐｃ結晶が必要になるが、これらの結晶の大量製造方法は知られていなかった。これらについては本発明の具体的実施例において詳しく説明する。
【００３４】
ＦＡ2ＰＦ6結晶やＬｉ−Ｐｃ結晶の表面は疎水性であるが、親水性ＥＳＲ物体を用いても本発明の造影剤を実現できる。吸収線幅が３００ｍＧから１０００ｍＧと狭い親水性ＥＳＲ物体として、Ｌｉ−ＴＣＮＱ（7,7,8,8-tetracyanoquinonedimethane)、Ｋ−ＴＣＮＱ、Ｎａ−ＴＣＮＱ結晶が知られている。これらの粉末結晶を微粒子化し、水溶性液に分散し、この水溶液から本発明のＥＳＲ用造影剤を実現することもできる。本方式については実施例において詳しく説明する。
【００３５】
本発明のＥＳＲ用造影剤を実現する第二の方法は、超常磁性状態（ＳＰＭ）の以下に示す特殊な場合を利用する方法である。強磁性体、もしくはフェリ磁性体の単一磁区を形成する磁気モーメントＭが熱エネルギーにより、それまで固定されていた結晶構造により決まる磁化容易軸の方向からある時間スケールτＮで動く状態であり、異方性エネルギーをＫ1、磁性体の体積をＶ、絶対温度をＴ、ボルツマン定数をｋBと定義すると、
Ｋ1Ｖ≦２５ｋBＴ                                                …(5)
を満たす時を一般にＳＰＭと呼ぶ。時間スケールτＮは大略数十秒より短い時間であって、ネール時間と呼ばれ、
τＮ〜exp（ＫＶ／ｋBＴ）／ｆ0                                   …(6)
で表され、ｆ0は１０9〜１０15（１／ｓ）程度の周波数である。つまり式(5)でＫＶ＝２５ｋBＴでは、τＮ〜７２ｓ−７２μｓのオーダーの時間で磁化が反転する。
【００３６】
４種の典型的強磁性体でのＳＰＭ（superparamagnetism）を実現する最大直径（ｎｍ）の概算値を室温（Ｔ＝３００Ｋ）での球形近似２・（３Ｖ／４π）1/3で求めた。表１に結果を示す。ＹＩＧ（イットリウム・鉄・ガーネット；Ｙ3Ｆｅ5Ｏ12）結晶は、強磁性体の中では磁気異方性が小さいので、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4）などに比べてＳＰＭを実現する粒径が６８ｎｍと大きいのが特徴である。ＳＰＭを実現する粒径の値は、式(5)を用いて異方性エネルギーＫ1と磁性体の体積Ｖから計算している（但し、温度としては室温）。
【００３７】
この直径をＳＰＭ臨界直径と呼ぶと、磁気異方性が小さいほど臨界直径は大きくなる。生体に投与する場合には、温度は３７℃（絶対温度で３１０Ｋ）であるが、室温（Ｔ＝３００Ｋ）での概算値と１％程度しか変化しないので、以下の生体投与では表１の値を参考とする。
【００３８】
【表１】
0004907591.tif 000002
【００３９】
ＳＰＭでは、表１の最大粒径から小さくなると式(5)(6)に従い、あたかも巨大な磁気モーメントが、周囲の熱エネルギーのために高速で動き回れるようになり、この性質を利用してＭＲＩ造影剤に応用されてきた。しかし、従来マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）やヘマタイト（γＦｅ2Ｏ3）では、１−２ｎｍ粒径のＭＲＩ用造影剤として用いられているが、水溶液中に分散されたＳＰＭ微粒子のＥＳＲ吸収線幅ΔＨを測定すると、狭いものでも６０Ｇ（ガウス）とＥＳＲ用造影剤に用いるには圧倒的に広すぎて、ＥＳＲ−ＣＴ用造影剤としては実用にはならなかった。
【００４０】
一方、バルクなＹＩＧなどの酸化物結晶の形態を形状効果（反磁性の効果）が起きないように球形に近づけるのは、技術的にハードルが高かった。しかしながら、湿式粉砕法の急速な進歩により、粉砕するビーズの小さい粒径のものが球形で均一に形成できるようになり、粉砕法でも、数ｎｍ程度のナノ微粒子が作製できるようになって来た。
【００４１】
立方晶系で異方性エネルギーＫ1が小さいことで知られているＹＩＧ結晶は、他の強磁性体と比べて比較的大きい粒径６８ｎｍ以下で超常磁性（ＳＰＭ）を示す。ＹＩＧの粒径をさらに小さくしていった時に、ＥＳＲ吸収線幅ΔＨがどのように変化するか調べているうちに、メジアン粒径４ｎｍになるとＹＩＧナノ微粒子が水溶液中で分散された場合、２ＧＨｚ以下の吸収線幅が１０００ｍＧ以下になることを見出した。
【００４２】
この現象は、氷から水に溶けて固体から液体になるとき、プロトンの核磁気共鳴（ＮＭＲ）吸収線幅が劇的に小さくなるmotional narrowingに類似する物理現象であることを突き止めた。この現象は、いわば「rotational narrowing」と呼ぶべき現象で、微小なＹＩＧナノ微粒子が、水溶液中の分子に衝突されランダムに回転運動を起こす。するとＹＩＧ結晶中の磁気異方性磁場Ｈａがランダムに回転し、ＹＩＧナノ微粒子の磁気モーメントに対して、あたかも局所的な磁場が、速く変動するので、あたかもないかのように振る舞い、吸収線幅ΔＨが非常に小さくなる現象であることを突き止めた。ＹＩＧ結晶のような立方晶系の場合、磁気異方性磁場Ｈａは
Ｈａ＝Ｋ1／３                                                   …(7)
で表される関係が知られている。ＳＰＭを構成する電子の回転磁気比をγｅ（絶対値を以下記す）、磁気異方性磁場Ｈａ、ＹＩＧナノ微粒子の回転緩和時間をτＢとするとrotational narrowingが生じる条件は
γｅ・Ｈａ・τＢ＜１                                            …(8)
で表されることが分かった。これは粒子の角度が変わる相関時間τＢの間に、磁気異方性磁場Ｈａによるスピンの回転角が１ラジアン以下であるという条件である。
本発明の目的である明瞭な画像が得られるための条件は、吸収線幅ΔＨに対して
ΔＨ≦１０００ｍＧであり、吸収線幅ΔＨはrotational narrowingが生じたとき
ΔＨ＝（γｅ・Ｈａ・τＢ）・Ｈａ                                 …(9)
と表されることを見出した。そのため、造影剤が
（γｅ・Ｈａ・τＢ）・Ｈａ≦１０００ｍＧ                        …(10)
の条件を満たす時、本発明の造影剤となる。
【００４３】
ここで回転緩和時間τＢは、ＹＩＧナノ微粒子の体積をＶ、ＹＩＧナノ微粒子と接触している溶液の粘性係数η、絶対温度Ｔ、ボルツマン定数ｋBを用いて
τＢ＝３Ｖη／ｋBＴ                                            …(11)
で表される時定数である。溶液に分散したＹＩＧナノ微粒子のメジアン粒径をｄとすると、式(11)の体積Ｖは次式で近似できる事を見出した。
Ｖ＝４π（ｄ／２）3／３                                        …(12)
【００４４】
このような超常磁性体としてＹＩＧ結晶で、結晶メジアン粒径ｄが比較的大きな粒径５．５ｎｍ以下にすることで、水溶液中に分散した状態で吸収線幅が１０００ｍＧ以下になることを見出した。ＹＩＧ分散液でこのように狭い吸収線幅ΔＨが得られた理由は、強磁性体、もしくはフェリ磁性体の中では、ＹＩＧの磁気異方性磁場Ｈａが極端に小さいため、比較的大きな結晶メジアン粒径５．５ｎｍにおいて、ΔＨが１０００ｍＧと小さくできたためである。
【００４５】
実際フェライト（Ｆｅ3Ｏ4）などの一桁以上大きい磁気異方性磁場Ｈａを持つ強磁性体、もしくはフェリ磁性体では、結晶メジアン粒径２ｎｍでもΔＨが５０Ｇと非常に大きい。
【００４６】
また、超常磁性体ＹＩＧ結晶は、メジアン最小長と最大長の比（最大長／最小長）が１．５以下であるような球形に近いナノ微粒子のほうが狭い吸収線幅を持つ傾向がある。
【００４７】
ＴＡＭ分子の場合、固体にすると吸収線幅ΔＨが４．２Ｇ程度と大きいが、水溶液中のＴＡＭ分子の場合、周囲の分子からの衝突を受けランダムな動きをするので、結果的にΔＨが３００ｍＶ程度に狭くなる。そこで、ＴＡＭ分子水溶液を高濃度にしてミセル内に閉じ込める方法で本発明を構築できる。ＴＡＭ分子についての発明は、実施例に詳しく記述する。
【００４８】
以上のように構成された造影剤は、ＥＳＲの吸収線の立場からは、単一ピークであり、ＥＳＲ−ＣＴ用造影剤としては最適である。造影剤が複数ピークを持つ場合には、特定のピークをモニターし画像化するので、画像構成法が単純に行かなくなるという欠点があるからである。またＥＳＲ物体に要求される最低限の条件は、生体内で少なくとも１時間は安定に存在でき、毒性がほとんど無視できるか、毒性があっても回避できる現実的手段を容易に見つけ出せることである。
以上説明したＥＳＲ物体ではこの性質を有しているので、本発明の目的を達成できる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明の造影剤を用いると、医薬品開発では、ＤＤＳの粒径や表面構造を様々に変えて、生体の中の被着部位が変化することを容易に画像化できるので、最適なＤＤＳキャリアを設計するための支援ツールになる。
【００５０】
本発明によれば、小動物を殺すことなく、生きたままの状態で、ＤＤＳキャリアの生体内分布の画像化が可能になるので、一個体の薬物分布の時間変化を追跡したり、薬効の時間変化を調べるツールとしても有用となる。すなわち、（１）薬物開発者が所望のＤＤＳキャリアの表面構造や粒径を設計することで、動物実験の段階から、所望の病変組織（又は標的部位）に送達されたか？  所望の組織以外に蓄積することはないか？  という点を画像イメージングで明らかにすることができる。（２）吸収線幅３００ｍＧ以下の物質を選ぶ事で、空間分解能１ｍｍ以下で、生体全体からの分布を１５分以内に高速画像化できる。（３）当該物質を用いてナノプローブ剤とＤＤＳ医薬品を同時に投与することで、ＤＤＳ医薬品の所望の病変組織（又は標的部位）に送達されたか？  所望の組織以外に蓄積することはないか？  という点を画像イメージングで明らかにすることができる。
【００５１】
ＤＤＳ医薬品の開発では、ターゲットとなる組織は確定しているので、ＤＤＳキャリアの有効性のスクリーニング試験には極めて有効である。想定外の部位に被着するか否かを画像で判別することには特に有効である。またワイドギャップ永久磁石を用いたＥＳＲ−ＣＴ装置（特開２００６−２４５５９７号公報）においては、コンパクトサイズであり、価格もＰＥＴ、ＭＲＩに比べて安いので極めて有効性が高い。
【００５２】
血中動態のみを観測できるヒトの場合、各組織に蓄積された薬物の分布を調べる事は事実上できないので、特にＤＤＳタイプの薬品の場合、その特異的被着性と想定外の被着生が画像診断で分析できる本発明は有用性が高い。
【００５３】
ＹＩＧを用いた造影剤の場合、ＹＩＧを取り巻く環境が変わると吸収線幅が変化するので、この変化を画像化することで、造影剤の被着場所や生体組織とＤＤＳキャリアの相互作用を解析できる手段を提供できるようになった。
【００５４】
なお、本発明の直接の目的ではないが、造影剤を投与された生体の組織を取り出してＥＳＲ評価することで、造影剤量を評価することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
最初に、本発明の基本的な構成について説明する。図１Ａ〜１Ｃは、本発明によるＥＳＲ用造影剤の基本構造を示す模式図である。
【００５６】
図１Ａは、単一のＥＳＲ物体１（この例では、ＦＡ2ＰＦ6微結晶、ＬｉＰｃ（Ｘ相）微結晶、超常磁性ＹＩＧナノ微粒子など）にリン脂質等の界面活性剤の親油基３がＥＳＲ物体１に吸着し、リン脂質界面活性剤の親水基２がＤＤＳキャリアの表面側に配する構造である。この場合、ＦＡ2ＰＦ6結晶、ＬｉＰｃ（Ｘ相）微結晶の表面は疎水性（親油性と同じ）が強いので問題ないが、超常磁性ＹＩＧナノ微粒子の場合には、疎水性を強くするため、実施例にも示すが、表面処理を行っている。ＥＳＲ物体１の表面が本来疎水性か、疎水性に改質できる場合に有効な構造である。
【００５７】
図１Ｂは、ＥＳＲ物体８（この例では、表面が親水性に改質された超常磁性ＹＩＧナノ微粒子，Ｌｉ−ＴＣＮＱ微結晶，Ｋ−ＴＣＮＱ微結晶，Ｎａ−ＴＣＮＱ微結晶，ＴＡＭ分子など）が、水溶性溶液７中に分散され、それをリポソーム（外側のリン脂質の親水基２１，親油基３１と内側のリン脂質の親水基２１’，親油基３１’の二重膜で構成）に包摂された構造である。この場合、表面が親水性に改質された超常磁性ＹＩＧナノ微粒子としては、図１Ａの構造をとることもできる。
【００５８】
Ｌｉ−ＴＣＮＱ，Ｋ−ＴＣＮＱ，Ｎａ−ＴＣＮＱ結晶を生理食塩水中で粉砕し微粒子状態でリポソーム内に閉じ込めた構造である。高濃度ＴＡＭ分子水溶液をリポソーム内に閉じ込めることでも、図１Ｂの構造を実現できる。
【００５９】
図１Ｃは、大豆油などの油性溶液９にＥＳＲ物体１０（この場合、超常磁性ＹＩＧナノ微粒子，ＦＡ2ＰＦ6微結晶，ＬｉＰｃ（Ｘ相）微結晶など）を分散させ、レシチンなどのリン脂質等の界面活性剤１１で包摂した構造である。
【００６０】
ＦＡ2ＰＦ6結晶、ＬｉＰｃ結晶（Ｘ相）はＥＳＲの立場からは、常磁性体であり、僅かにｇ値の結晶異方性Δｇ（Δｇ／ｇ≒１．８×１０-4）が存在する。しかし、生体用ＥＳＲ−ＣＴでは、共鳴磁場が５０−５００Ｇと低磁場であるためＥＳＲ画像にΔｇが影響を及ぼす事はほとんど見られない。そのため、吸収線は単一ピークに見え、ナノ微粒子化する過程で、微粒子表面近傍の劣化を抑えてバルクな結晶状態の性質（ｇ値や吸収線幅ΔＨ）を保持することでＥＳＲ−ＣＴ用造影剤に適用できる。
【００６１】
一方、ＹＩＧ結晶のバルク結晶は、強磁性体であり、ＥＳＲの立場からは、強い異方性Δｇがあり、固定された単結晶（単一磁区とする）に静磁場を印加した場合、結晶方位と静磁場の相対配位により、共鳴周波数が大きく異なり、結晶方位が様々に混じった粒径数ミクロンの微粉末試料では、吸収線幅ΔＨが２７０Ｇ（Ｘバンド）にまで広がってしまう。生体用ＥＳＲ−ＣＴで使用する低い共鳴磁場７０Ｇの場合でも吸収線幅ΔＨは６Ｇ程度存在する。しかし、ＳＰＭにし、更に粒径を小さくする事で、溶液中に分散した状態で、「rotational narrowing」効果により吸収線幅が著しく小さくできることは、前述したが、より詳細に検討した結果を図１Ｄにより更に詳しく説明する。
【００６２】
図１Ｄは、本発明の第二の形態を詳しく説明する説明図で、超常磁性ＹＩＧナノ微粒子が、粘性係数ηの溶液中に分散された時のメジアン粒径ｄと低磁場（５０Ｇ−５００Ｇ）でのＥＳＲ吸収線幅ΔＨの関係を示している。η0は３７℃の純水の粘性係数７．０×１０-3Ｐａ・ｓであり、３７℃はマウスなどの哺乳類の体温の典型値を示している。生きている動物の組織や体液、血液の粘性係数ηは、η0から１０η0の間に分布しており、造影剤を投与した場合には、この間の粘性が問題になる。但し、大略０．８−１．５ｎｍより粒径が小さくなり始めるとＹＩＧの結晶ユニット体積の数倍程度になり始め、表面の影響を強く受け始め、作成方法などの影響も顕著になり、小さくしすぎるとかえって吸収線幅が急速に広くなり始めるので、再現性のある作製方法が難しくなる。ＹＩＧナノ微粒子の場合、図１Ｄの斜線の領域５０が造影剤として最も適した領域といえる。
【００６３】
ただし、本領域５０は生体溶液温度を３７℃と生きている生体を考えている場合であり、本発明の造影剤は組織を抽出してＥＳＲにより含有量を調べる場合にも有効なので、その場合にはＹＩＧナノ微粒子の粒径は１０ｎｍ程度まで利用できる。
【００６４】
ＹＩＧナノ微粒子の場合の特徴の一つは、ＹＩＧナノ微粒子が生体組織に吸着し、熱的に動けなくなると吸収線幅は非常に広くなることであり、ＥＳＲ−ＣＴ画像の時間変化を追う事でその変化を捉える事ができる。
【００６５】
次に、本発明の造影剤作製方法の基本形態について説明する。その第一は、電解移動型有機結晶であるＦＡ2ＰＦ6結晶とＬｉＰｃ結晶（Ｘ相）の収率（結晶量÷結晶原料）を大幅に向上させる電解結晶成長装置の採用である。電解結晶成長法は、結晶原料を溶解した溶液に電流を流し、陽極に結晶を成長させる手法である。本発明者は、図２Ａに示すように、円周上に複数の陽極６５が配置され、円の中心部に共通陰極６２が配されている縦型結晶成長装置（量産型結晶成長セル）を工夫して、作業性（作業の容易さや作業時間）、大きいセル設置面積、原料利用効率の３点の著しい向上を図った。従来の結晶セルは図２Ｂに示すように、ガラス製三角型フラスコ７１に陽極７２を配置し、円柱状試験管７３に陰極７４を配置し、両者を電解溶液でつなぎ、電解反応で発生する陰極からの異物が陽極側に拡散しないようにフィル７５が形成され、結晶セルを真空引きし窒素置換できるように真空コック７６が形成されている（非特許文献４参照）。
【００６６】
今回開発した結晶セルは、図２Ａに示すように、円柱状ガラス容器６０内に、円柱状フィルタ付き陰極容器６１を同心円状に配置し、円の中心部に共通陰極６２を具備する。円柱状ガラス容器６０の上面には、円形テフロン６３の蓋がシリコングリスなどで接着され、図示していない圧力治具で押さえられている。テフロンの蓋６３には真空引き窓６４が付けられ、容器内を窒素置換できる様に作成している。円柱状フィルタ付き陰極容器６１の外側に、同心円状に複数の陽極６５を配置している。図２Ａの例では、１２本の陽極が等間隔に並べてられている。その理由は、一本の陽極６５と陰極６２間の電気抵抗が同じになるように配置することで、高い結晶収量と高品質結晶を得る事ができるからである。図中、円柱状ガラス容器６０とフィルタ付き陰極容器６１の間に示してある点線部分は、陽極一個あたりの陽極領域６７を現しており、仕切り板を用いて物理的に電解溶液を分離することもできる。フィルタ６６は、ポアサイズ１０−１６μｍのＰ１６を標準的に用いている。
【００６７】
円柱状フィルタ付き陰極容器６１は、フィルタ６６の着く場所が陰極容器の側面、陽極位置に付く横付き型（図２Ｃ）と、容器の底面に付く底面型（図２Ｄ）に大別できる。陰極にできる異物の拡散を押さえるには横付き型が優れているが、装置の作製の容易さでは底面型が優れる。図２Ａは、陽極位置に付く横付き型を設置した例を示している。
図２Ａに示した量産型の結晶セルと図２Ｂに示す従来セルとの相違を、表２に示す。
【００６８】
【表２】
0004907591.tif 000003
【００６９】
表２から分かるように、本発明の結晶セルは図２Ｂに示した従来セルに比べて、結晶収率（同じＦＡ量で得られるＦＡ2ＰＦ6結晶量）で約２．１−２．９倍のＦＡ2ＰＦ6結晶量を得られるようになった。実際の結晶成長は実施例１で詳しく説明する。
【００７０】
製造方法に関する本発明の基本形態の他の一つは、図１Ａ−１Ｃに略示した造影剤を構成するＤＤＳキャルリア構造の作製方法に関するものである。以下では、ＦＡ2ＰＦ6結晶を例にして説明するが、本発明に用いる他のＥＳＲ物体に対してもこの方法は適用可能である。
【００７１】
図３Ａは装置の模式図、図３Ｂは工程の概略図である。図３Ａに示すように、リン脂質等の界面活性剤をクロロホルムやシクロヘキサンなどの有機溶媒を用いて茄子型フラスコなどで溶解させ、窒素ガスを当てつつ回転させながら溶媒を蒸発させ、フラスコ壁面にリン脂質等の界面活性剤の薄膜を形成、乾固する。次に、ＥＳＲ物体を含んだ溶液を加えて窒素ガスを当てつつ回転させながら溶媒を蒸発させ、ＥＳＲ物体を含んだ薄膜をリン脂質等の界面活性剤の薄膜上に形成し、更に再度フラスコ壁面にリン脂質等の界面活性剤の薄膜を形成するプロセスを繰り返し、ＥＳＲ物体を含んだ薄膜上にリン脂質等の界面活性剤の薄膜を形成する。その後、この茄子型フラスコなどの容器に生理食塩水などを加えて、フラスコ壁面の三層膜を剥離し、超高速乳化機によりミセル型の造影剤原料を作製する。その後、粒径を小さくするには、湿式ミル法でナノ微粒子に分散させる工程を踏み、濃度を高くするには遠心分離し、粒径を揃えるためのフィルタ濾過プロセスを経てＥＳＲ造影剤を作成する。
【００７２】
以下、実施例を通して更に詳しく本発明を説明する。
［実施例１］
まず、ＦＡ2ＰＦ6単結晶を用いた場合の実施例について説明する。今回作製した量産型結晶成長セル（図２Ａ）に関して、３種類の具体的寸法を表３に示す。表３中の設計パラメータは図２Ａに対応している。
【００７３】
【表３】
0004907591.tif 000004
【００７４】
この結晶成長装置を用いて、表４の結晶成長条件で結晶を作製した。結晶原料であるＦＡ（フルオランテン）はエタノールを用いて３回の再結晶を行い、不純物を取り除いた。ＴＢＡ−ＰＦ6は比較的純度が良いので、エタノールによる一回の再結晶で十分であった。一個の結晶成長セルあたり、一週間でＦＡ2ＰＦ6単結晶を０．４−１．５ｇ程度確保できた。
【００７５】
実際の収量データを図４に示す。図の横軸は、図２Ａの結晶セルで陰極６２と１本の陽極６５との間の室温での電気抵抗を表し、溶媒はクロロホルムを用いた。図中○は量産セル３号機（フィルタの孔径１６０μｍ）を、△は量産セル３号機（フィルタの孔径１６μｍ）を、■は量産セル２号機（フィルタの孔径１６０μｍ）を、◆は量産セル２号機（フィルタの孔径１６μｍ）をそれぞれ用いた場合である。実際には更に収量を稼ぐため、本結晶成長セルを１０個前後並列に並べてＦＡ２ＰＦ６結晶を量産した。実際の結晶成長では、結晶収量の多い２号機を用いた。横付きフィルタ（図２Ｃ）と底面型フィルタ（図２Ｄ）では、収量については大きな差はなかったので、以後の実施例では底面型フィルタ(孔径16μｍ)を用いた。
【００７６】
【表４】
0004907591.tif 000005
【００７７】
このように作製したＦＡ2ＰＦ6結晶は長さ数ｍｍ、幅０．５ｍｍ程度の針状結晶か、幅１．５ｍｍ程度の板状結晶である。２００ＭＨｚでの吸収線幅は約２０ｍＧであった。
【００７８】
次に、ミセル構造作製手順について開示する。今回作製したＦＡ2ＰＦ6結晶ミセルナノプローブ剤の作成条件の代表例を表５に示す。
【００７９】
【表５】
0004907591.tif 000006
【００８０】
今回先ず作製したのは、図１Ａに示す基本構造であり、ＦＡ2ＰＦ6結晶表面にリン脂質を形成し、生理食塩水に分散させた構造（ＤＰＰＣミセル）である。ＤＰＰＣミセルの場合、表５の条件０で作製し、リン脂質としてＬ−αジパルミトイルホスファチジルコリン（L-αdipalmitoylphosphatidylcholine：ＤＰＰＣ分子量７３４．０）を用いている。具体的作製手順は以下に説明するが、生理食塩水に分散された状態での粒度分布の測定結果は図５に示す様に、メジアン粒径は０．８５μｍであった。
【００８１】
更に、図６Ａに示すように、表面にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）６を配した構造（ＰＥＧ付きミセル）を検討した。ＰＥＧ鎖を表面修飾するミセル構造は、肝臓や脾臓に存在するクッパー細胞からの捕食を回避し、血中滞留性を高めガン組織への蓄積量を増加させるねらいである。ＰＥＧ付きミセルの場合には、混合比を変えた幾つかの条件（表５の条件１−４）で作製した。
【００８２】
ステアリン酸を構成する２本のアルキル基Ｃ17Ｈ35を持つＬ−αジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（L-αdistearoylphosphatidylethanolamine、ＤＳＰＥ：Ｃ41Ｈ82ＮＯ8Ｐ、分子量７４８．１）を基本となるリン脂質に選び、ＰＥＧ付リン脂質ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（SUNBLIGHT DSPE-20CN：日本油脂）を選択した。ＰＥＧ付リン脂質のＦＡ2ＰＦ6単結晶表面への吸着性を向上させる目的で、コレステロール（Ｃ27Ｈ45ＯＨ、分子量３８６．６６：ＣＳと略す）を界面活性剤Ｌ−αジパルミトイルホスファチジルコリン（L-αdipalmitoylphosphatidylcholine：ＤＰＰＣ、分子量７３４．０）と混合して用いた。本実施例ではＰＥＧ付リン脂質と呼び、ＤＰＰＣ単独のリン脂質と区別する。
【００８３】
次に、図３Ａ、３Ｂで説明した低温乾固プロセスを用いて、ＦＡ2ＰＦ6結晶をリン脂質の薄膜でフラスコ壁面に包み込む３層構造を作製する。具体的には、（１）リン脂質のみフラスコの壁面乾固、（２）リン脂質とＦＡ2ＰＦ6単結晶粉末を一緒に乾固、（３）リン脂質のみ壁面乾固の３段階のステップを踏む。この場合、ＦＡ2ＰＦ6単結晶は、電解結晶成長法で得られた数ミリの結晶をそのまま用いても以下のプロセスは実現できる。これは、ＦＡ2ＰＦ6単結晶が柔らかいために、超高速乳化プロセスで引きちぎられて微粒子化されるためである。本プロセスでは、エバポレータ（東京理化器械製：型式Ｎ−Ｎ１−Ｒ、１０００ｍＬ対応）をプログラム恒温器（ヤマト科学製：型式ＩＮ６０２Ｗ）内に設置し、恒温器を１０℃に保温して低温乾固を行った。設定温度の精度と恒温器内での温度分布は、それぞれ±０．３℃と±１℃である。ＦＡ2ＰＦ6単結晶は、ナノ微粒子の作製プロセス検討用に開発した量産結晶成長セル（図２Ａ）により作製した。
【００８４】
低温乾固に使用する溶媒としては、ＦＡ2ＰＦ6単結晶を劣化させない低温（１０℃）のシクロヘキサンを検討した。リン脂質粉末は、シクロヘキサンには溶解しないが、少量のクロロホルムに溶解させた溶液をシクロヘキサンに加えると溶解した。クロロホルムの沸点６１℃（１気圧）はシクロヘキサンの沸点８１℃（１気圧）より低いので、エバポレータによる濃縮過程では、シクロヘキサンより早く蒸発するのでクロロホルムが残留することはない。クロロホルムは、ＦＡ2ＰＦ6単結晶を劣化させるので、シクロヘキサンに比べて無視できる５％とした。低温乾固プロセス終了後は、フラスコを−２０℃の冷凍庫に密封し保存した。低温乾固フラスコは、生理食塩水を３０ｍＬ入れて膨潤させ、フラスコを１０分間ボルテックスにかけよく撹拌し、できた溶液を容器（５０ｍＬ）に移して超高速乳化機を用いて、２００００ｒｐｍの高速回転により、リン脂質がＦＡ2ＰＦ6結晶微粒子に覆われた構造を実現した。ＦＡ2ＰＦ6結晶微粒子を取り込めなかったリン脂質は空ミセルを形成している。
【００８５】
このようにして作製した試料のＦＡ2ＰＦ6結晶粒径は１μｍ程度と、造影剤としては大きい。既に説明したが、この段階の粒度分布は、図５に示すように良くてサブミクロンの粒径である。
【００８６】
固形癌への造影剤の場合には、粒径０．４μｍ以下の微粒子のみが、固形癌にできる新生血管の孔を通じて蓄積することが知られている。多くの抗がん剤は、この性質を利用して癌部位を選択的に攻撃できる薬を目指している。そのため、本発明のＥＳＲ造影剤も更に微粒子化する必要がある。そこで、湿式ビーズミル法により、ＦＡ2ＰＦ6結晶微粒子溶液と粒径０．１ｍｍのＺｒＯ2をビーズとするビーズミルにより、２３００ｒｐｍの回転数で、６０分間微粒子化して、メジアン径３００ｎｍのＦＡ2ＰＦ6結晶ミセル造影剤の原液を作製した。しかし、この溶液に含まれるＦＡ2ＰＦ6結晶濃度は、目標とする３．８ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に届かなかった。目標とする３．８ｍｇ／ｍＬは、ワイドギャップ永久磁石を用いたＥＳＲ−ＣＴ装置（特開２００６−２４５５９７号公報）を用いて投与量の０．１−１％程度が癌部位に蓄積すると仮定して、装置の感度から決めたものである。
【００８７】
そこで、１４３００ｒｐｍの回転数で５分間の遠心濃縮を行い、上澄み液を除去し、５．３ｍｇ／ｍＬのＦＡ2ＰＦ6結晶ミセル造影剤を作製できた。そのときの粒度分布の例を図６Ｂに示す。２００ＭＨｚＥＳＲで測定したＦＡ2ＰＦ6結晶濃度の実測値を、図６Ｃに示す。図中◆印は、遠心濃縮前の測定結果であり、図中〇印は、遠心濃縮後の濃縮状態での測定結果である。図中横軸は、表５の５ＣＬＭ−１、５ＣＬＭ−１／２、５ＣＬＭ−１／４の作製条件で作製したロット番号に対応している。ちなみに表５のミセル作製条件にあるＦＡ2ＰＦ6結晶濃度（名目値）は、最初の溶液中に投与したＦＡ2ＰＦ6結晶量であり、実測値濃度とはかなり異なる。その理由は、造影剤作成中にＦＡ2ＰＦ6結晶の一部が分解しＥＳＲ信号を出せなくなっているためである。
【００８８】
このようにして作製したＦＡ2ＰＦ6単結晶ミセル造影剤（ＰＥＧ付きミセルと呼ぶ）と、図５に示すメジアン粒径０．８５μｍのＤＤＰＣミセルと二種類の造影剤を用意し、図７Ａ（３）に示す担ガンマウス（癌種はコロン２６）に０．２ｍＬ静脈注射して、癌部位へのＦＡ2ＰＦ6単結晶の蓄積を、ワイドギャップ永久磁石ＥＳＲ−ＣＴ装置（特開２００６−２４５５９７号公報の実施例１）により画像化した。
【００８９】
図７Ａ（１）にＰＥＧ付きミセル造影剤を投与した時のＥＳＲ画像と、図７Ａ（２）にＤＰＰＣミセル造影剤を投与した時のＥＳＲ画像をそれぞれ示す。これらのＥＳＲ画像は、図７Ａ（３）に示す担ガンマウスの背中側から見た時のＥＳＲ画像である。図７Ａ（３）中の担ガンマウスには、左右の肺とコロン２６を移植した左腰部分の癌部位の位置を示している。図７Ａ（１）では、ＰＥＧ付きミセルのメジアン粒径が０．３１μｍと小さいため、左右の肺や大静脈以外に癌部位に造影剤が蓄積する様子が画像化されている。図７Ａ（２）では、メジアン粒径が０．８５μｍと大きすぎるためＤＰＰＣミセルは、左右の肺には蓄積するが、癌部位には蓄積していない。二種類の造影剤では、粒径の他に、ミセル最表面にＰＥＧが形成されているか否かの違いもあるが、メジアン粒径の違いにより、癌部位への蓄積の有無が画像化により確認できた。
【００９０】
更に、本マウスのガン部位を含む各臓器を取り出し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）とＥＳＲ法により癌部位へのＦＡ2ＰＦ6単結晶の蓄積を確認した。図７Ｂに、ＰＥＧ付きミセルのＨＰＬＣによるＦＡ分布量の定量的分布を示す。蓄積の絶対量では、心臓、肝臓、腎臓の方が癌部位に比べて多いが、ＥＳＲ画像が取れているのは癌部位のみである。肝臓、腎臓では、ＦＡ2ＰＦ6単結晶が分解して、ＥＳＲ信号を出さないＦＡ（フルオランテン）に分解されていると考えられる。心臓には、ＦＡ2ＰＦ6単結晶が分解された形で血液循環された残りが蓄積していると考えられ、肝臓腎臓でＦＡ2ＰＦ6単結晶が代謝されたＦＡが蓄積していると思われる。癌部位での組織重量あたりのＦＡ量は、心臓、肝臓、腎臓に比べて小さいにもかかわらず、ＥＳＲ画像が取れている理由は、癌組織では、癌中の特別な場所（大きな新生血管が発生している場所）にＦＡ2ＰＦ6単結晶が蓄積したためと思われる。
【００９１】
［実施例２］
次に、ＴＡＭ分子（米国特許第５，５３０，１４０号明細書）を用いた場合の実施例について説明する。ＴＡＭ分子自身はカーボンラジカルとして公知であるが、本実施例では、以下の二種類のＴＡＭ分子であるＣ１３５とＣ１３６を用いて本発明の造影剤を作製した。分子構造を図８に示す。
Ｃ１３５：Tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetramethyl-benzo(1,2-d:4,5-d’)bis(1,3)dithiole-4-yl)methyl sodium salt、
Ｃ１３６：Tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetra(2-(1-hydrokyethl))-benzo(1,2-d:4,5-d’)bis(1,3)dithiole-4-yl) methyl sodium salt
【００９２】
１ｇのＣ１３５又はＣ１３６を１０ｍＬの生理食塩水もしくは純水中に溶かしてＴＡＭ原液を作製し、図３Ａに示した乾固プロセス装置を用いて、リポソーム内にＣ１３５又はＣ１３６を封じこめた。具体的プロセスは、卵黄よりPangbornの方法で抽出されるレシチン（フォスファチジルコリン：Phosphatidylcoline）をクロロホルム／メタノール（９：１）の溶液に溶かし、図３Ａに示した乾固プロセス装置を用いて、茄子型フラスコ壁面に乾固させた。次に、ＴＡＭ原液をフラスコに入れ、窒素ガスの雰囲気下で約４℃に冷却したまま一時間超音波照射すると、乳濁色の安定なリポソーム懸濁液ができた。この懸濁液を遠心分離処理（３００００ｇ（重力加速度）、１時間、４℃）と、ろ過処理（０．１μｍメンブレインフィルター）した後、均一なリポソームを得るために、ゼファローズ４Ｂを用いてゲルろ過処理した。
【００９３】
このようにして、図１Ｂに示す高濃度ＴＡＭ分子内包ルポソーム造影剤を作成した。粒径は１００ｎｍ程度であり、リポソーム型製剤のマウス動態を画像化できるようになった。
【００９４】
［実施例３］
次に、Ｌｉ−ＴＣＮＱ（7,7,8,8-tetracyanoquinonedimethane）微粉末結晶を用いた場合の実施例について説明する。
【００９５】
Ｌｉ−ＴＣＮＱ結晶粉末は、拡散法により合成した。手順は以下の通りである。市販の９８％ＴＣＮＱ ２ｇをアセトニトリル１００ｍＬで２度再結晶を行なった。９８％ＴＣＮＱは黄土色でアセトニトリルに溶解すると緑色になるが、再々結晶により黄色い鱗結晶になり、アセトニトリルに溶解すると不純物を含まない本来の黄色になる。再々結晶したＴＣＮＱ １．２ｇをアセトニトリル１００ｍＬに、ヨウ化リチウム（ＬｉＩ）２．１２１ｇをアセトニトリル１０ｍＬにそれぞれ加熱しながら溶解させると黄色い透明液になる。これらを混ぜ合わせると、黒みがかった紫色のＬｉ−ＴＣＮＱ微粒子が析出した。放置して室温まで冷まし濾紙で分離、アセトニトリルで洗浄後、真空乾燥させて１．０９６ｇの２０−５０μｍの針状Ｌｉ−ＴＣＮＱ微結晶が得られた。乾燥後、窒素ガス中で保管した。
【００９６】
次に、Ｘ−バンドＥＳＲによりＬｉ−ＴＣＮＱ粉末の吸収線幅ΔＨとｇ値を評価した。結果は、ｇ＝２．００２６と自由電子やＦＡ2ＰＦ6に近い値で、吸収線幅ΔＨは、ΔＨ＝６００ｍＧと粉末ＦＡ2ＰＦ6のＸ−バンドＥＳＲの値に近い値であった。２００ＭＨｚＥＳＲでの吸収線幅ΔＨは、ΔＨ＝２３４ｍＧであった。吸収線幅ΔＨは同じＸ−バンドＥＳＲでのＦＡ2ＰＦ6単結晶の吸収線幅ΔＨ（５０−６０ｍＨ）に比べて一桁近く広い。この原因は、Ｌｉ−ＴＣＮＱのｇ値異方性がＦＡ2ＰＦ6に比べて５倍以上大きい事を意味している。
【００９７】
Ｌｉ−ＴＣＮＱ微粒子（粒径２０μｍ）は水に易溶であることが分かり、水に溶けないＦＡ2ＰＦ6微結晶とは、表面の化学的性質が大きく異なることが分かった。そのため、水中で直接ナノ微粒子化することは難しかった。Ｌｉ−ＴＣＮＱよりも溶解度の高い塩が溶けている溶液には、溶解度の低い塩は溶けにくくなる『塩析効果』をＬｉ−ＴＣＮＱのナノ微粒子化に利用できないかと考え、溶解度の高い塩（ＫＣｌやＮａＣｌ）を溶かした水溶液にＬｉ−ＴＣＮＱを溶解させることを思いついた。実験を行った結果、ＫＣｌやＮａＣｌの濃度に依存して、Ｌｉ−ＴＣＮＱの電離が抑えられ、不溶化することを見出したので、Ｌｉ−ＴＣＮＱ針状結晶粉末のナノ微粒子化に応用した。具体的な作製条件を表６に示す。
【００９８】
【表６】
0004907591.tif 000007
【００９９】
ＫＣｌ濃度を０．５ｗｔ％に固定し、他の条件は表６の作製条件に設定して、粉砕時間を変化させた時の粒径分布の測定結果を図９に示す。メジアン径が１７０−１９０ｎｍの水溶液での微粒子分散系を実現でき、その吸収線幅は約３００ｍＧであった。図９の水溶液をＡｌ箔上に乾固した試料についてＳＥＭ（Ｓ−５２００）観察を行なった。その結果ＳＥＭ観察からは、０．１μｍ以下のナノ微粒子が凝集している様子を確認した。
【０１００】
リポソームニ包摂する工程は、実施例２とほぼ同じである。卵黄よりPangbornの方法で抽出されるレシチン（フォスファチジルコリン：Phosphatidylcoline）をクロロホルム／メタノール（９：１）の溶液に溶かし、図３Ａに示す乾固プロセス装置（エバポレータ）を用いて、茄子型フラスコ壁面に乾固させた。次に、この茄子型フラスコ中にＫＣｌ溶液中に分散させたＬｉ−ＴＣＮＱナノ微粒子溶液を加え、窒素ガスの雰囲気下で約４℃に冷却したまま一時間超音波照射すると、乳濁色の安定なリポソーム懸濁液ができた。この懸濁液を遠心分離処理（３００００ｇ（重力加速度）、１時間、４℃）と、ろ過処理（０．１μｍメンブレインフィルター）した後、均一なリポソームを得るために、ゼファローズ４Ｂを用いてゲルろ過処理した。このようにして、図１Ｂ示す高濃度Ｌｉ−ＴＣＮＱナノ微粒子内包ルポソーム造影剤を作成した。つまり、実施例２のリポソーム形成時のＴＡＭ分子水溶液の代わりに、このＬｉ−ＴＣＮＱ分散液を用いてリポソーム内に包摂する事で、図１Ｂに示すＥＳＲ造影剤を製造した。
【０１０１】
Ｋ−ＴＣＮＱやＮａ−ＴＣＮＱ微粉末結晶は、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）とアセトニトリルからＬｉ−ＴＣＮＱと同じようにして容易に合成できる。また『塩析効果』はＬｉ−ＴＣＮＱの代わりに、Ｋ−ＴＣＮＱやＮａ−ＴＣＮＱ微粉末結晶を用いても同様の効果があり、本発明の実施例に示すプロセスを用いることで、図１Ｂに示したＥＳＲ造影剤を製造することができる。
【０１０２】
本実施例では、Ｌｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱ、やＮａ−ＴＣＮＱナノ微粒子を水溶液に分散する場合を説明したが、これらのＴＣＮＱ塩は物性としては水溶性なので、油性溶液（非水溶液）に分散することは易しい。具体的には、大豆油２０ｍＬ中にＬｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱやＮａ−ＴＣＮＱ微粉末結晶１ｇを適当な分散剤、例えば、オレイン酸グリセリルエステル０．１５ｇと混ぜて湿式ビーズミルにより分散させ、大豆油中でＬｉ−ＴＣＮＱ、Ｋ−ＴＣＮＱやＮａ−ＴＣＮＱ微粉末結晶をナノ微粒子化させたナノ微粒子分散大豆油溶液を作製した。その後、生理食塩水２０ｍＬ中に今作製したナノ微粒子を分散し、大豆油溶液２ｍＬ、卵黄由来のレシチン１．５ｇを投与後、超高速乳化器により２００００ｒｐｍの超高速攪拌する事で、図１Ｃに示す構造を作ることができた。
【０１０３】
分散大豆油溶液を用いるリポ製剤（例えばＬＴＴ研究所作製）の血中動態を画像化する手段を提供できた。
【０１０４】
［実施例４］
次に、ＬｉＰｃ（リチウムフタロシアニン；Ｃ32Ｈ16ＬｉＮ8）のＸ相単結晶を用いた場合の実施例について説明する。以下の説明では、実施例１と違う部分のみを記述する。ＬｉＰｃ結晶の作製装置は、同じく図２Ａに示した結晶成長セルである。結晶原料は市販のＬｉ2Ｐｃ（Dilithium phthalocyanine）であり、エタノールによる再結晶を行い高純度化した。
【０１０５】
結晶成長条件を表７に示す。ＬｉＰｃ結晶は、ＦＡ2ＰＦ6単結晶に比べて結晶が脆弱ではないため、図３Ａに示すリン脂質に包む結晶は、ＦＡ2ＰＦ6単結晶粉末のように、電解結晶成長法で得られた数ミリの結晶をそのまま用いることはできない。そのため、０．１−０．９μｍ程度に微粒子化する必要がある。ここでは、湿式ビーズミル法により、０．１−０．９μｍ程度に微粒子化した。
【０１０６】
【表７】
0004907591.tif 000008
【０１０７】
具体的条件例を表８に示す。この方法で、メジアン径０．２μｍのＬｉＰｃ微結晶を得た。シクロヘキサンによる洗浄とクロロホルムにる洗浄後、シクロヘキサンとクロロホルムの混合液に、０．２μｍのＬｉＰｃ微結晶（６０−６００μｍｏｌの範囲）を混ぜ、図３Ａに示したリン脂質で包む工程に適用した。この工程は実施例１と同じである。その後、フラスコ内に生理食塩水をいれ、壁面に形成され薄膜を剥離後、超高速乳化器による超高速攪拌を行い、図１Ａ及び図６Ａに示すようなメジアン径０．２μｍのＬｉＰｃ微結晶造影剤を得る事ができた。
【０１０８】
【表８】
0004907591.tif 000009
【０１０９】
ＬｉＰｃの本発明造影剤は、実施例１と同様な担ガンマウスでのＤＤＳキャリアのガン部位蓄積効果を画像化できるが、ＬｉＰｃは生体中酸素濃度に吸収線幅が敏感である事を利用して、被着部位周辺の酸素濃度を画像化することができる点がＦＡ2ＰＦ6結晶との相違である。
【０１１０】
［実施例５］
次に、ＹＩＧ（Ｙ3Ｆｅ5Ｏ12：イットリウム鉄ガーネット）結晶のナノ微粒子を用いた実施例について説明する。
【０１１１】
ＹＩＧ単結晶微粉末（粒径１−２μｍ）は市販されており、形状も出発点としては望ましい塊形状をしている。微粒子化には、図１０に略示する湿式ビーズミル法を３回繰り返し用いて、ナノ微粒子化した。具体的には微粒子化の第一段階として、水（２０．５ｇ：２０．５ｍＬ）、ＹＩＧ単結晶微粉末（粒径１−２μｍ）（２０．５ｇ：２０．５ｍＬ）、０．１ｍｍＺｒＯ2（１３８ｇ：３７．５ｍＬ）、分散剤ポリアクリル酸ナトリウム｛アロンＴ−４０（１．５ｇ：１．５ｍＬ）｝を回転数２６５０ｒｐｍで１０時間連続粉砕し、１００ｎｍ粒径の微粒子粉末に粉砕した。微粒子化の第二段階として、ＺｒＯ2を取り替えて、水（２０．５ｇ：２０．５ｍＬ）、ＹＩＧ単結晶微粉末（粒径１−２μｍ）（２０．５ｇ：２０．５ｍＬ）、０．０３ｍｍＺｒＯ2（１３８ｇ）、分散剤アロンＴ−４０（１．５ｇ：１．５ｍＬ）を回転数２６５０ｒｐｍで１０時間連続粉砕し、メジアン径１０ｎｍのナノ微粒子粉末に粉砕した。第３段階として、ＺｒＯ2を取り替えて、０．０１５ｍｍＺｒＯ2（１３８ｇ），分散剤アロンＴ−４０（１．５ｇ：１．５ｍＬ）を回転数２６５０ｒｐｍで１０時間連続粉砕し、メジアン径４ｎｍのナノ微粒子粉末に粉砕した。ＹＩＧナノ微粒子作製条件を表９に示す。
【０１１２】
【表９】
0004907591.tif 000010
【０１１３】
このようにして作製したＹＩＧナノ微粒子を流水によりよく洗浄した後、加熱乾燥させＨＭＤＳ（Hexamethyldisilazane）溶液の蒸気をＹＩＧナノ微粒子表面に吹き付けて、ＹＩＧナノ微粒子表面を疎水性に改質した。
【０１１４】
このようなＹＩＧナノ微粒子を用いて、何種類かの造影剤を作製した。その第一は、図１Ａと図６Ａの構造、ＹＩＧミセル、である。具体的には、実施例４のリン脂質によるミセルの作成方法と同じである。即ち、図３Ａに示したリン脂質に包む結晶は、ＹＩＧナノ微粒子である。表５のＦＡ2ＰＦ6量と同程度のＹＩＧナノ微粒子量を用いている。ミセルの作成方法は実施例１と同じである。但し、実施例１と異なり、遠心分離機による濃縮プロセスは用いていない。出来上がったミセルのＹＩＧナノ微粒子造影剤の粒度分布は、図１１Ａに示すように、メジアン径４．０４ｎｍであった。
【０１１５】
第二は、上で作製したＹＩＧナノ微粒子造影剤作製工程で、最後に遠心濃縮プロセスを用いて作製される、図１Ｂの形態の造影剤である。つまり、ＹＩＧナノ微粒子造影剤を構成するミセルは、それ自身が、親水性ＹＩＧナノ微粒子と見なせるので、実効的にＹＩＧナノ微粒子表面を親水化したことと同じである。この濃縮親水性ＹＩＧナノ微粒子造影剤を実施例２に従い、リポソームに包む事で、図１Ｂの形態の造影剤を作製した。
【０１１６】
第三は、ＹＩＧナノ微粒子をＡｒ／Ｏ2プラズマ処理で表面を親水化したり、アンモニヤ水：過酸化水素水：純水＝４：１：６、液温６０［℃］で２分間ディップすることで、ＹＩＧナノ微粒子表面を親水化することにより作製される、図１Ｃの形態の造影剤である。
【０１１７】
実施例３で図１Ｃの形態の造影剤を作製したように、大豆油２０ｍＬ中に親水化したＹＩＧナノ微粒子１ｇを適当な分散剤、例えば、オレイン酸グリセリルエステル０．１５ｇと混ぜて超高速乳化機により分散させ、ＹＩＧナノ微粒子分散大豆油溶液を作製した。その後、生理食塩水２０ｍＬ中に今作製したＹＩＧナノ微粒子分散大豆油溶液２ｍＬ、卵黄由来のレシチン１．５ｇを投与後、超高速乳化器により２００００ｒｐｍの超高速攪拌する事で、図１Ｃに示す構造を作ることができた。
【０１１８】
ＹＩＧナノ微粒子は、表面を親油性と親水性に改変できるので、種々の造影剤を構成できる点が長所である。ＭｎＯＦｅ2Ｏ3を用いても、同様の微粒子を作製できるが、ＥＳＲ造影剤として使用できる粒径が２ｎｍ程度と小さくなり、粒径の制御性が悪くなる難点がある。
【０１１９】
ＹＩＧナノ微粒子造影剤は、ＥＳＲ信号感度が非常に高いので、微小なガン組織での蓄積効果や周波数が２００−３００ＭＨｚと低い場合でも高画質のＥＳＲ画像を撮影できる点が長所である。実施例１の担ガンマウスより腫瘍サイズの小さい０．３ｇのコロン２６がん株においてもＹＩＧナノ微粒子造影剤蓄積の確認をできた。
【０１２０】
［実施例６］
次に、ＥＳＲ物体のナノ微粒子をゲル又はゼリー状物質中にマトリックス状に埋め込んだ造影剤の実施例について説明する。
【０１２１】
図１２Ａに、ゲル又はゼリー状物質９１中にＥＳＲ物体１０１（この場合、ＦＡ2ＰＦ6微結晶、ＬｉＰｃ（Ｘ相）微結晶、Ｌｉ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｋ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｎａ−ＴＣＮＱ微結晶、ＴＡＭ分子固体など）を分散させ、表面１０３を疎水化することで、図１Ａに示すリン脂質等の界面活性剤で包摂した構造を作製できる。具体的作製方法について以下に開示する。
【０１２２】
テングサ（天草）、オゴノリなどの紅藻類の粘液に０．１μｍ程度に微粒子化したＥＳＲ物体１０１（ＦＡ2ＰＦ6微結晶ＬｉＰｃ（Ｘ相）微結晶、Ｌｉ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｋ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｎａ−ＴＣＮＱ微結晶、ＴＡＭ分子固体など）を混ぜて、一様になるまで攪拌し、凍結・乾燥した後、乾式粉砕機で２０μｍ程度に粉砕し、ＨＭＤＳ処理により疎水化し、生理食塩水中に表５に示すリン脂質と一緒に超高速乳化することで、粒径１μｍ程度の図１２Ａに示すミセル造影剤を作製した。
【０１２３】
本方式では、コラーゲン中にＦＡ2ＰＦ6微結晶、ＬｉＰｃ（Ｘ相）微結晶、Ｌｉ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｋ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｎａ−ＴＣＮＱ微結晶、ＴＡＭ分子固体などを分散させ、変成させてゼラチンにしゲル化剤を添加してゼリーを作成して、同様に図１２Ａに示すミセル造影剤を作製することもできる。
【０１２４】
またＤＤＳキャリアとして、図１２Ｂに示す様に、親水性のポリエチレングリコール２２と疎水性のポリアミノ酸３２からなるＡＢ型ブロックコポリマーを用いて、ゲル又はゼリー状物質４１中にＥＳＲ物体５１を分散させたミセル構造を作製することもできる。
【０１２５】
本発明では、既知のＤＤＳキャリアの種類に依存して様々な形のＥＳＲ物体を内包させる事でＥＳＲ造影剤を作製できる。
【０１２６】
本造影剤では、思いがけなくマウスの大静脈にＤＤＳキャリアが吸着することが分かり、ＤＤＳキャリアとして吸着しているのか、ＤＤＳキャリアが壊れて中に存在するマトリックス状に埋め込んだ造影剤が外部に露出した状態なのかが問題になったが、血管壁を取り出して分析した結果ＤＤＳキャリアは壊れてマトリックス状に埋め込んだ造影剤が被着したことが分かった。この例でも分かるように、ＤＤＳキャリアの予期せぬ動態が分かるところに、今までの造影剤と異なる役目がある。ＤＤＳキャリアの作り方（ＥＳＲ造影剤の包み方も含めて）を見直すきっかけを示してくれた。
【０１２７】
［実施例７］
腸壁にできた癌に対して検診するＤＤＳキャリアの例を図１３に示す。本造影剤は、経口造影剤である。構造としては図１３Ａが図１Ａとほぼ同じ構造、図１３Ｂが図１Ｂとほぼ同じ構造をしており、上記実施例１−６で説明した方法によって製造することができる。但し、粒径はそれぞれ大きさが５０μｍから１００μｍと巨大になっており、ＦＡ2ＰＦ6結晶、ＬｉＰｃ（Ｘ相）結晶、Ｌｉ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｋ−ＴＣＮＱ微結晶、Ｎａ−ＴＣＮＱ微結晶、ＴＡＭ分子溶液の微細化プロセスは非常に簡略化される。ＹＩＧのナノ微粒子化は変わらない。また腸壁に存在する癌に対して選択的に被着させるため、ＤＤＳキャリア表面に癌部位と結合する得意な抗体３９を形成している点が図１Ａあるいは図１Ｂの構造と異なる点である。
【０１２８】
他の胃癌を対象とした例として、抗体とリポソームにヒト抗体を修飾し、抗ガン剤塩酸ドキソルビシンを封じしたイムノリポソーム製剤ＭＣＣ４６５の場合、所望のガン組織にイムノリポソーム製剤が到達したか？あるいは意図しない組織に到達したかを観察するには、粒径２００ｎｍ程度の図１３Ｂの構造の造影剤を作ることで、ＤＤＳキャリアの動態を画像化できる。この場合、ＤＤＳキャリアはイムノリポソーム製剤ＭＣＣ４６５と同一に形成する。
【０１２９】
［実施例８］
本発明を用いれば、ＤＤＳ医薬品と混合して用いることで、ＤＤＳの分布を画像化できる。医薬品と一緒に入れる手法としては、例えば、実施例２のリポソームに抗がん剤塩酸ドキソルビシンを包摂する事で、ＥＳＲ造影剤と同じ構造のＤＤＳキャリアに包摂でき、生体内の動態を知る事ができる。別の例では、リポ製剤であるプロスタグランジシンＥ１（ＰＧＥ１）を図１Ｃの油性溶液９中に親油性の医薬品化合物として溶かしておき、医薬品とＥＳＲ造影剤を同時に作製できる。このよう場合、ＥＳＲ造影剤の生体内動態から、着目組織に到達するまでの薬物動態を知る事ができる。投薬後の叙法作用については、造影剤の生体内での崩壊過程を画像化することで、ある程度の情報を得る事ができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】本発明によるＥＳＲ用造影剤の基本構造を示す模式図。
【図１Ｂ】本発明によるＥＳＲ用造影剤の基本構造を示す模式図。
【図１Ｃ】本発明によるＥＳＲ用造影剤の基本構造を示す模式図。
【図１Ｄ】超常磁性ＹＩＧナノ微粒子が、粘性係数ηの溶液中に分散された時のメジアン粒径ｄと低磁場でのＥＳＲ吸収線幅ΔＨの関係を示した図。
【図２Ａ】本発明で使用した結晶成長セルの説明図。
【図２Ｂ】従来の結晶成長セルの説明図。
【図２Ｃ】フィルタ付き陰極容器の例を示す図。
【図２Ｄ】フィルタ付き陰極容器の例を示す図。
【図３Ａ】本発明のＥＳＲ造影剤を作製する装置の模式図。
【図３Ｂ】本発明のＥＳＲ造影剤を作製する工程の説明図。
【図４】本発明の結晶成長セルにより得られたＦＡ2ＰＦ6単結晶収量の具体例を示す図。
【図５】ＤＰＰＣミセルの粒度分布図。
【図６Ａ】ＰＥＧ付ミセルの構造図。
【図６Ｂ】ＦＡ2ＰＦ6結晶ミセル造影剤の粒度分布の例を示す図。
【図６Ｃ】造影剤におけるＦＡ2ＰＦ6単結晶濃度の実測値を示す図。
【図７Ａ】ＰＥＧ付ＦＡ2ＰＦ6単結晶ミセル造影剤を担ガンマウスに投与した場合のＥＳＲ−ＣＴ画像を示す図。
【図７Ｂ】ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）解析により得られた各臓器へのＦＡ分布を示す図。
【図８】ＴＡＭ分子の分子構造図。
【図９】Ｌｉ−ＴＣＮＱナノ微粒子の粒度分布図。
【図１０】湿式ビーズミルの概念図と動作原理の説明図。
【図１１】ＹＩＧナノ微粒子造影剤の粒度分布の例を示す図。
【図１２Ａ】本発明のＥＳＲ造影剤の例を示す図。
【図１２Ｂ】本発明のＥＳＲ造影剤の例を示す図。
【図１３Ａ】本発明のＥＳＲ造影剤の例を示す図。
【図１３Ｂ】本発明のＥＳＲ造影剤の例を示す図。
【符号の説明】
【０１３１】
１，８，５１，１０１…ＥＳＲ物体、２，４，２１，２１’…親水基、３，３１，３２，３１’…親油基（疎水基）、６，２２…ＰＥＧ、７…水溶液、９…非水溶液、４１，９１…ゲル又はゼリー状物質、１１…界面活性剤、１０３…疎水化表面、３２…ポリアミノ酸、３９…抗体、６０…円柱状容器、６１…円柱状フィルタ付き陰極容器、６２…共通陰極、６３…テフロンの蓋、６４…真空引き窓、６５、７２…陽極、６６…フィルタ、６７…陽極領域、６８、７５…フィルタ、７１…三角フラスコ型陽極領域、７３…円柱状陰極領域、７４…陰極、７６…真空コック
【図１Ａ】
0004907591.tif 000011
【図１Ｂ】
0004907591.tif 000012
【図１Ｃ】
0004907591.tif 000013
【図１Ｄ】
0004907591.tif 000014
【図２Ａ】
0004907591.tif 000015
【図２Ｂ】
0004907591.tif 000016
【図２Ｃ】
0004907591.tif 000017
【図２Ｄ】
0004907591.tif 000018
【図３Ａ】
0004907591.tif 000019
【図３Ｂ】
0004907591.tif 000020
【図４】
0004907591.tif 000021
【図５】
0004907591.tif 000022
【図６Ａ】
0004907591.tif 000023
【図６Ｂ】
0004907591.tif 000024
【図６Ｃ】
0004907591.tif 000025
【図７Ａ】
0004907591.tif 000026
【図７Ｂ】
0004907591.tif 000027
【図８】
0004907591.tif 000028
【図９】
0004907591.tif 000029
【図１０】
0004907591.tif 000030
【図１１】
0004907591.tif 000031
【図１２Ａ】
0004907591.tif 000032
【図１２Ｂ】
0004907591.tif 000033
【図１３Ａ】
0004907591.tif 000034
【図１３Ｂ】
0004907591.tif 000035