(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性体が封入された担体と、前記担体に固定化され、赤血球に非特異的に結合するリガンドとを含み、抗赤血球抗体とは結合しない磁性粒子と、型を判定すべき赤血球とを、前記抗赤血球抗体が固相化された反応容器内で混合して、前記磁性粒子中の前記リガンドを前記型を判定すべき赤血球に結合させることにより、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程と、
磁性標識された前記型を判定すべき赤血球を磁力によって沈降させて反応像を形成させる工程とを含み、前記反応像が、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合した場合は陽性像であり、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合しなかった場合は陰性像である赤血球の型判定方法。
【請求項２】
前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程と前記反応像を形成させる工程との間に、前記反応容器に抗赤血球抗体をさらに加えることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
磁性体が封入された担体と、前記担体に固定化され、赤血球に非特異的に結合するリガンドとを含み、抗赤血球抗体とは結合しない磁性粒子と、型を判定すべき赤血球とを混合して、前記磁性粒子中の前記リガンドを前記型を判定すべき赤血球に結合させることにより、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程と、
磁性標識された前記型を判定すべき赤血球を、前記抗赤血球抗体が固相化された反応容器に加える工程と、
前記磁性標識された型を判定すべき赤血球を磁力によって沈降させて反応像を形成させる工程とを含み、前記反応像が、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合した場合は陽性像であり、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合しなかった場合は陰性像である赤血球の型判定方法。
【請求項４】
前記リガンドは、赤血球に非特異的に結合して該赤血球を凝集させるリガンドである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記磁性体封入担体は、磁性体が封入されたコアセルベートである、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記コアセルベートはゼラチンアラビアゴムコアセルベートである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程において、0.18〜0.69％の濃度で前記磁性粒子を含む磁性粒子含有溶液と、0.5〜1.2％の濃度で前記型を判定すべき赤血球を含む赤血球含有溶液とが等しい量で混合される請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程において、0.18〜1.8％の濃度で前記磁性粒子を含む磁性粒子含有溶液と、0.7〜0.9％の濃度で前記型を判定すべき赤血球を含む赤血球含有溶液とが等しい量で混合される請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球の型判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な血液型判定では、抗血清試薬と検体である赤血球を試験管内或いは皿内で混合し、凝集の有無を観察する。また、ガラスビーズ、セファデックスゲル粒子のような不溶性担体をマイクロカラムに充填し、これに抗血清試薬と赤血球を添加して遠心する方法もある。この方法では、凝集塊をガラスビーズ、セファデックスゲル粒子表面に捕捉させることにより、判定を容易にしている（例えば、特許文献１及び２）。
【０００３】
多数の検体を試験する場合には、マイクロプレートが用いられることもある。反応液をマイクロプレート中に自然放置し、凝集塊を沈殿させる方法（例えば、特許文献３及び４）や、マイクロプレートを遠心する方法がある。
【０００４】
しかしながら、凝集塊を自然沈降させる方法では、判定に時間がかかるという問題があった。遠心機を使用する方法では、自動化する場合に装置が大型化するという問題があり、また、遠心条件の均一化が難しいために判定結果の精度が低下する恐れがあった。また遠心操作に時間がかかるという問題もあった。
【０００５】
さらに、赤血球は天然成分であるために、人為的な加工を施すと赤血球表面の抗原等の反応性が著しく低下したり、失活したりし易い。このため、赤血球を直接加工することにより沈降特性を改変することは非常に困難である。
【特許文献１】特公平8-7215号公報
【特許文献２】EP 725276
【特許文献３】特公昭61-44268号公報
【特許文献４】特公昭63-60854号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明では、赤血球の型判定をより短時間で簡便に行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、磁性体が封入された担体と、前記担体に固定化され、赤血球に非特異的に結合するリガンドとを含み、抗赤血球抗体とは結合しない磁性粒子と、型を判定すべき赤血球とを、前記抗赤血球抗体が固相化された反応容器内で混合して、前記磁性粒子中の前記リガンドを前記型を判定すべき赤血球に結合させることにより、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程と、磁性標識された前記型を判定すべき赤血球を磁力によって沈降させて反応像を形成させる工程とを含み、前記反応像が、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合した場合は陽性像であり、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合しなかった場合は陰性像である赤血球の型判定が提供される。一つの態様において、該方法は、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程と前記反応像を形成させる工程との間に、前記反応容器に抗赤血球抗体をさらに加えることを含む。
【０００８】
他の側面において、磁性体が封入された担体と、前記担体に固定化され、赤血球に非特異的に結合するリガンドとを含み、抗赤血球抗体とは結合しない磁性粒子と、型を判定すべき赤血球とを混合して、前記磁性粒子中の前記リガンドを前記型を判定すべき赤血球に結合させることにより、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程と、磁性標識された前記型を判定すべき赤血球を、前記抗赤血球抗体が固相化された反応容器に加える工程と、前記磁性標識された型を判定すべき赤血球を磁力によって沈降させて反応像を形成させる工程とを含み、前記反応像が、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合した場合は陽性像であり、前記型を判定すべき赤血球と前記抗赤血球抗体とが結合しなかった場合は陰性像である赤血球の型判定方法が提供される。
【０００９】
前記リガンドは赤血球に非特異的に結合して該赤血球を凝集させるリガンドであることが好ましい。前記磁性体封入担体は、磁性体が封入されたコアセルベートであることが好ましい。かかるコアセルベート粒子としては、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートが好ましい。また、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程において、0.18〜0.69％の濃度で前記磁性粒子を含む磁性粒子含有溶液と、0.5〜1.2％の濃度で前記型を判定すべき赤血球を含む赤血球含有溶液とが、等しい量で混合されることが好ましい。或いは、前記型を判定すべき赤血球を磁性標識する工程において、0.18〜1.8％の濃度で前記磁性粒子を含む磁性粒子含有溶液と、0.7〜0.9％の濃度で前記型を判定すべき赤血球を含む赤血球含有溶液とが等しい量で混合されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従えば、赤血球を磁性標識化することによって、磁力により赤血球の沈降速度を速めることができる。よって、短時間で反応像を形成させることができ、判定時間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明では、赤血球を磁性粒子でコーティングしたり赤血球中に磁性粒子を封入したりすることなく、赤血球と磁性粒子との結合体（凝集塊）を結合反応によって形成することにより、赤血球を直接加工する必要が無く、赤血球の磁性体化を簡便に行うことができる。本発明では、赤血球を磁性標識化するのに適した磁性粒子を用いることによって、赤血球の沈降速度を速めることを可能にした。
【００１２】
磁性粒子として、ナノサイズの粒子を使用する方法は、医用磁性ナノビーズの新しい作成技術（応用物理74巻12；1580-2005）でも述べられている。小さな抗原や抗体を結合させる場合は、比表面積が大きいナノ粒子が好ましいが、赤血球のような大きい（８μｍ）粒子を磁力で迅速に動かすには、小さな粒子では、その表面を全て覆うほどに標識しなければならない可能性もあり、赤血球の抗原がマスクされてしまう恐れがある。
【００１３】
そこで、本発明では、本発明者らが開発した赤血球用の磁性粒子を用いる。該磁性粒子は、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを担体として用い、これに磁性体を封入し、磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートとした。これにさらに赤血球と結合する赤血球結合物質を固定化して磁性粒子として用いた。ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、ゼラチンと水溶性多糖類であるアラビアゴムを主成分として形成された複合コアセルベートである。これは例えば、「HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol.2, Amsterdam」によって紹介されている。ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは天然成分に由来するため容易に分解され、環境に優しいという利点がある。また免疫学的な非特異反応が少ないという利点もある。さらに、簡単な設備があれば容易に安価で製造できるため好適に用いることができる。さらに、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、任意の粒径を有するように調製することができるため、赤血球に適するように粒径を大きくすることができる。本発明で用いるゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、赤血球を標識するために用いるので、その粒径が1〜20μｍであることが好ましく、2〜10μｍであることがより好ましく、3〜6μｍであることが最も好ましい。ゼラチンアラビアゴムコアセルベートの製造方法は、公知であり、例えば、特開2004-157040号公報を参照することができる。
【００１４】
ゼラチンアラビアゴムコアセルベートに封入される磁性体は、一個でも良いが複数個であってもよい。ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、粒子内に封入される磁性体の数を容易に調整することができる。従って、この磁性粒子で標識された赤血球の移動速度を磁力によって調整するために、封入される磁性体の数を増減させることも可能である。
【００１５】
ここで述べたように、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは赤血球標識用の磁性粒子に都合よく用いることができるが、現在までにこれを使用して赤血球を磁性標識化した例は報告されていない。
【００１６】
上記のように製造された磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートには、赤血球結合物質を担持させる。ここで赤血球結合物質は、赤血球と抗原抗体反応をし、赤血球を凝集させるリガンドであることが好ましい。
【００１７】
赤血球を凝集させるリガンドは種々のものが知られており、赤血球を非特異的に凝集させるレクチンも数多く市販化されている（例えば、豊年コーポレーションのカタログを参照されたい）。例えば、ウサギ抗グリコフォリン抗体、ニシダレクチン（ＣＳＡ）及びチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）などのリガンドが好適に用いられる。
【００１８】
リガンドは既知の方法によって磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートに担持させることができる。その方法は、例えば、特開2004-157040号公報に記載されたＥＤＡＣ／ＮＨＳ法であってよいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明では、上記リガンドが結合した磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを磁性粒子とし、赤血球の型判定に用いる。以下に、本発明の方法の実施態様を説明する。
【００２０】
第一の実施態様では、固相担体に抗赤血球抗体を予め固相化しておく。例えば反応容器の内壁に固相化してもよい。次いで、反応容器内に検体である赤血球と、磁性粒子を投入し、容器内で反応させる。これを容器の外側から磁石で吸引することによって迅速に沈降させ、予め固相化されていた抗体によって捕捉させる。陽性の場合は、図１（ａ）に示したように容器中に広がった像が生じる。一方、陰性の場合、赤血球は予め固相化されていた抗体によって捕捉されず、図１（ｂ）に示したように容器底面に沈降した像を生じる。
【００２１】
第二の実施態様では、上記第一の実施態様と同様に抗赤血球抗体を固相化した反応容器に、赤血球、磁性粒子と共に、さらに抗赤血球抗体を同時に又は直後に投入する。これらを反応容器中で混合して反応させ、磁石によって吸引して反応を互いに凝集塊に結びつけるために用いる。この抗体には、誤った反応を防ぐために容器に固相化した抗体と同一の抗体を用いてもよく、非同一の抗体であっても特異性が同じ抗体であれば用いることができる。抗赤血球抗体を追加的に投入することにより、抗体価や赤血球量が患者ごとにばらついても、余すことなく特異的な反応を達成できる。
第三の実施態様では、反応容器とは別の容器において、赤血球と磁性粒子を予め反応させておく。次いで、上記第一の実施態様と同様に抗赤血球抗体を固相化した反応容器にこれを投入し、磁石によって吸引して反応像を形成させる。上記と同様に、陽性であれば凝集塊が固相化された抗体と結合して広がった陽性像を生じる。一方、陰性の場合は、赤血球は予め固相化されていた抗体によって捕捉されず、容器底面に沈降した像を生じる。予め反応させることによって、反応容器上の抗体と反応する前に十分な凝集量を得ることができる。
【００２２】
以上に説明したように、本発明の方法に従って、赤血球を磁性粒子と結合させることで磁性標識することによって、実質的に自重が増加するだけでなく磁力により強引に移動させることができ、高い反応性を保ちながら赤血球の凝集塊の沈降速度を速めることができる。しかも、赤血球自身を磁性体で加工しないので、表面抗原の反応性が高いまま、高速で、例えばわずか３分間で反応像を判定することができる。凝集塊の自然沈降では、通常30〜60分要するため、本発明の方法によって大幅に判定時間を短縮することができる。また、容器などの固相担体の表面に固定化された抗体により凝集塊を捕捉するので、陽性、陰性の判定が容易である。
【００２３】
さらに、他の態様において、赤血球を磁性標識化することによって、Ｂ／Ｆ分離が容易になる。そのため蛍光検出などの測定方法を適用することもできる。例えば、磁性標識化赤血球を抗体と反応させて凝集させ、凝集塊を磁石によって反応容器の壁面（底面や側面）に磁気的に捕捉し、未反応抗体を含む液をノズル等で吸引除去する。次いで、蛍光や化学発光などの光マーカーによって標識した抗体を添加して反応させ、再び洗浄した後検出することもできる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の各実施態様の実施例を記載する。
【００２５】
１．磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートの作成
特開2002-324015号公報、特開2003-291402号公報に記載された方法に従って、ゼラチンとアラビアゴムのコアセルベートを作成し、磁性体を取り込ませ、粒径2-12μｍの磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを製造した。
【００２６】
２．磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートへのリガンドの結合
特開2002-324015号公報に記載された方法に従って、上記磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートに、赤血球に対するリガンドであるチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）を結合させた。ＤＳＡの濃度は10μｈ／ｍｌとした。結合反応後、ＢＳＡ（ウシアルブミン）でブロッキングを行い、0.1％ BSA/PBS ｐＨ7.2に、５％濃度で懸濁した。
【００２７】
３．抗Ｂ抗体のマイクロプレートへの固相化
市販の抗血清には、ＢＳＡ等共存タンパクが存在するので、そのままでは使用できない。そこで、プロテインＡカラム（BioRad製）を使用して、Ortho社のバイオクローン抗Ｂから抗Ｂモノクローナル抗体を単離した。この抗体をNuncMaxisorp Ｕ底プレートにＰＢＳバッファーを用いて固相化した。その後、ＢＳＡでブロッキングを行った。
【００２８】
４．血液型判定
（１）Ｂ型ドナー血球（赤血球）をＰＢＳで0.1〜1.2％に希釈した。また、ＤＳＡ感作磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベート（以下ＤＳＡ粒子と称する）を0.18〜2.75％に希釈した。これらを各25μＬずつマイクロプレートに分注し撹拌した。その後、磁石で３分間吸引した。同様にＡ型ドナー血球（赤血球）についても実施した。
【００２９】
その結果を図２に示した。Ｂ型赤血球はＤＳＡ粒子と凝集塊を生じ、マイクロプレート内面に固相した抗Ｂ抗体に捕捉されて広がった陽性像を示した。磁石で吸引したために、３分間で判定が可能であった。Ａ型血球は底面に沈降した陰性像を呈し、抗体によって捕捉されなかったことを示した。
【００３０】
表１に、血球濃度と磁性粒子の濃度を変化させた結果を示した。表１に示されたように、反応像を形成させるためには、血球濃度と磁性粒子濃度の割合が重要であることがわかった。赤血球の濃度が0.5〜1.2％であり、磁性粒子の濃度が0.18〜0.69％である割合で反応に供することが好ましい。また、赤血球濃度が0.7〜0.9％であり、磁性粒子濃度が0.18〜1.8％、好ましくは0.34〜1.8％の範囲の割合で用いることが好ましい。
【表１】
0005047702.tif 000002
【００３１】
（２）Ｂ型ドナー血球をＰＢＳで0.8％に希釈した。また、ＤＳＡ粒子を0.6％に希釈した。これらを各25μＬずつマイクロプレートに分注し、同時に、抗Ｂ抗体を添加した。撹拌後、磁石で３分間吸引した。同様にドナーＡ血球についても実施した。
【００３２】
その結果を表１に示した。Ｂ型赤血球はＤＳＡ粒子と凝集塊を生じ、さらに抗Ｂ抗体と凝集を生じ、凝集塊は磁石で吸引することで沈降し、マイクロプレート内面に固相化した抗Ｂ抗体に捕捉されて広がった陽性像を示した。一方、Ａ型赤血球では底面に沈降した陰性像を呈し、捕捉されなかったことを示した。
【００３３】
（３）市販の抗Ｂ抗抗体とＡ型或いはＢ型ドナー血球（0.7％）を予め別容器で５分間混合した。該混合物をＤＳＡ粒子（0.69％）と共に抗Ｂ抗体を固相化したマイクロプレートウェルに移して、磁石で３分間吸引した。
【００３４】
その結果、Ｂ型ドナー血球では、広がった陽性像を形成せずに崩れてしまった。一方、Ａ型ドナー血球は底面に集まった。結果として、陽性／陰性像の判定はできなかった。これは、凝集塊に磁性粒子が結合できなかったためか、或いは磁性粒子が結合して赤血球の結合サイトが埋まり、固相化抗体と反応できなかったためかと考えられる。
【００３５】
（４）Ａ型或いはＢ型ドナー血球（0.7％）とＤＳＡ粒子（0.69％）を予め別容器で５分間混合し、その混合物を抗Ｂ抗体を固相化したマイクロプレートウェルに移して、磁石で３分間吸引した。
【００３６】
その結果、Ｂ型赤血球はウェルに広がり陽性像を形成した。Ａ型赤血球は底面に沈降し陰性像を形成した。よって、陽性陰性が正しく判定できた。
【００３７】
（５）Ａ型或いはＢ型ドナー血球（0.7％）とＤＳＡ粒子（0.69％）を予め別容器で５分間混合し、その混合物を、抗Ｂ血清（抗赤血球抗体）25μＬと共に、抗Ｂ抗体（抗赤血球抗体）を固相化したマイクロプレートウェルに移して、磁石で３分間吸引した。
【００３８】
その結果、  Ｂ型赤血球はウェルに広がり陽性像を形成した。Ａ型赤血球は底面に沈降し陰性像を形成した。よって、陽性陰性が正しく判定できた。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】凝集塊の沈降の様子を示す模式図。
【図１】
0005047702.tif 000003