(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）がセリン２３９位においてリン酸化されている（ホスホセリン２３９ＶＡＳＰ）場合にＶＡＳＰにのみ結合することができる、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２３３０を有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体１６Ｃ２またはその断片。
【請求項２】
診断薬としての請求項１記載の抗体１６Ｃ２またはその断片の使用。
【請求項３】
生物学的物質中のホスホセリン２３９ＶＡＳＰを定性的または定量的に測定するための請求項２記載の使用。
【請求項４】
生物学的物質がヒト血小板またはヒト血液である請求項３記載の使用。
【請求項５】
ホスホセリン２３９の測定がウエスタンブロッティング法により実施される、請求項３または４記載の使用。
【請求項６】
ホスホセリン２３９の測定がフローサイトメトリーにより実施される、請求項３または４記載の使用。
【請求項７】
生物学的物質中のｃＧＭＰおよび／またはｃＡＭＰの濃度に作用する物質を検出するための請求項２〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
内皮因子のインビボ活性を測定するための請求項２〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
内皮の機能障害を検出するための請求項２〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
モノクローナル抗体１６Ｃ２を産生するハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２３３０。
【請求項１１】
請求項１記載の抗体１６Ｃ２またはその断片を含有する診断用キット。
【請求項１２】
請求項１記載の抗体１６Ｃ２またはその断片を使用することを特徴とする、生物学的物質中のＶＡＳＰのホスホセリン２３９のリン酸化状態および／またはＶＳＡＰの蛋白質相互作用の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）がリン酸化形態で存在する場合に抗原としてＶＡＳＰにのみ結合する、ＶＡＳＰに対する抗体、その調製用のハイブリドーマ細胞並びに診断薬および／または治療薬としての抗体または抗体断片の使用に関する。
【０００２】
血管系の疾患は、心筋梗塞、脳卒中、動脈性閉塞症および多くの種類の腎不全などの非常に多くの慢性的で生命を危うくする疾患の原因である。
【０００３】
内皮細胞、特に血液凝固系、血小板の機能状態、炎症および腫瘍細胞の血管壁中への移動、平滑筋細胞の収縮および成長、並びにその結果の血圧および血管壁構造の状態、およびさらに新血管形成を制御する内皮細胞は、血管系の調節に特に重要である。最後には心筋梗塞、脳卒中および多くの型の腎不全を導き得る状況である、重大な血管系疾患において、これら血管壁の機能の多くが妨げられる。
【０００４】
内皮細胞は、重要な物質であるプロスタサイクリン（ＰＧｌ2）および一酸化窒素（ＮＯ）を生成し、これは内皮由来の弛緩因子（ＥＤＲＦ）として知られ、血小板および血管筋肉細胞の両方を阻害する物質である。内皮の機能は、プロスタサイクリン（ＰＧｌ2）またはＥＤＲＦ、例えばＮＯのような前記内皮因子によって制御される。
それ故に、特定の様式において内皮の機能障害に関連する疾患を治療するためには、内皮機能障害を診断し、その経過を制御し得る生化学的パラメータを開発する必要がある。
【０００５】
内皮機能不全により引き起こされるアテローム性動脈硬化症病変などの不可逆的損傷を未だ認められない段階で、可能な限り早期に内皮機能不全を認識できるのが望ましい。
初期段階での内皮機能不全の同定は、内皮機能不全の可逆的治療をもたらし得る、新しい治療法の開発を可能にする。
【０００６】
インビボ内皮機能を測定する公知の方法は、定量的血管造影法のような観血的検出法、あるいは非観血的な造影法である。これらの方法の欠点は、これらの検査が直接患者に実施すること、定量が難しく且つ非常に高価なことである。
従って、生体外で生物学的物質、例えば細胞試料または血液試料において、研究室における定型的検査によって内皮の機能を速やかに且つ簡単に測定できる、生化学的／免疫生物学的方法を利用できるものが望ましい。
内皮の機能は、プロスタサイクリン（ＰＧｌ2）またはＥＤＲＦ、例えばＮＯなどの内皮因子によって制御可能な機能である。
【０００７】
本発明の課題は、内皮機能を評価し、且つ調節する試薬を提供することである。本発明のこの課題および他の課題によれば、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）に対するものであり、ＶＡＳＰがリン酸化されている場合にのみＶＡＳＰと結合する抗体が提供される。
【０００８】
本発明の一態様において、ＶＡＳＰがセリン２３９位にてリン酸化されている場合（ホスホセリン２３９ＶＡＳＰ）にのみＶＡＳＰに結合する抗体が開示される。他の態様において、ＶＡＳＰがセリン１５７位にてリン酸化されている場合（ホスホセリン１５７ＶＡＳＰ）にのみＶＡＳＰに結合する抗体が開示される。
本発明の他の態様には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体断片が包含される。別に態様には、ハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２により産生されるモノクローナル抗体、特にＭａｂ １６Ｃ２が包含される。
【０００９】
本発明の他の課題は、本発明の抗体の製造に有用なハイブリドーマ細胞を提供することである。さらに、本発明の課題は、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供することである。一態様において、ハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２（ＤＳＭ ＡＣＣ２３３０）が提供される。
【００１０】
本発明の別の課題は、内皮機能を評価する方法を提供することである。本発明のこの課題によれば、ＶＡＳＰのリン酸化状態を測定する方法が提供される。本発明の一態様において、生物学的物質は、ＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）がリン酸化されている場合にのみ抗原としてＶＡＳＰと結合するＶＡＳＰに対する抗体と接触させられる。
【００１１】
本発明の他の態様において、生物学的物質に結合するＶＡＳＰ抗体を定量することをさらに包含する定量法が提供される。特別な態様には、電気泳動によりＶＡＳＰを分割し、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体と接触させる、ウェスタンブロット法が包含される。他の態様は、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体を試料と接触させることを包含するフローサイトメトリー法である。
【００１２】
本発明の他の態様において、診断方法が提供される。代表的な方法は、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体を試料と接触させ、ＶＡＳＰのリン酸化状態を評価することを伴う。一態様において、この方法は、試料中のＶＡＳＰのリン酸化を定量的に測定することを包含する。別の態様において、抗体をホスホセリン２３９ＶＡＳＰまたはホスホセリン１５７ＶＡＳＰに結合させる方法が記載される。さらに他の態様において、試料はヒト血小板またはヒト全血である。
【００１３】
本発明の別の課題は、内皮機能のマーカーを検出する方法を提供することであり、一態様において、ｃＧＭＰおよび／またはｃＡＭＰ濃度に作用する物質に曝されている患者の試料を検査し、その試料を、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体と接触させ、そして対照試料に対して相対的なＶＡＳＰリン酸化状態を評価することを包含する、ｃＧＭＰおよび／またはｃＡＭＰの濃度に作用する物質を検出する方法が提供される。
【００１４】
さらに別の態様において、患者からの試料を、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体と接触させ、そして正常な対照試料に対して相対的なＶＡＳＰリン酸化状態を評価することを包含する、内皮機能不全を検出する方法が詳述される。
【００１５】
さらに本発明の課題は、本明細書に開示される診断方法を実施するための便利なキットを提供することである。さらにこの課題に対して、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体を含む診断用キットが提供される。
さらに、本発明の別の課題は、内皮機能不全に苦しむ患者の治療方法を提供することである。本発明のこのおよび別の治療の課題によれば、治療を必要とする患者に、リン酸化されている場合にのみＶＡＳＰに結合する、ＶＡＳＰに対する抗体の治療的に有効な量を投与する、治療方法が開示される。
【００１６】
血圧低下（血管拡張）ホルモンおよび薬剤に応答して、血小板および血管壁細胞においてリン酸化されるヒトＶＡＳＰ（血管拡張剤−刺激リン蛋白質）は、最近発見され、単離され、そして分子遺伝学の観点から特徴付けられた（Haffner等，EMBOJ．14，19〜27，1995年）。
【００１７】
ＶＡＳＰは、生理学的、病態生理学的および薬理学的に非常に重要なＡＮＦ／ＮＯ／ｃＧＭＰ／ｃＧＭＰ蛋白質キナーゼシグナル経路の重要な構成成分であり、且つｃＡＭＰ／ｃＡＭＰ蛋白質キナーゼシグナル経路の重要な構成成分である（U．Walter，Blick 1／97 Wurzburg University，pp.79〜81，1997年）。ＶＡＳＰは、ほとんど全てのヒトおよび動物細胞において発現しており、特に血小板、血管平滑筋細胞および繊維芽細胞において高濃度で見出されている。培養細胞においては、ＶＡＳＰはフォーカルコンタクト（細胞／基質接着部位）、細胞／細胞接着、マイクロフィラメントおよび動的膜領域（例えばリーディングエッジ）と関連する（Walter等，Agents and Actions 45S，255〜268，1995年）。
【００１８】
血管系におけるＶＡＳＰのリン酸化は、血小板の接着／凝結の阻害、平滑筋の収縮／移動並びに細胞外質内皮浸透性の阻害と相関する。
ＶＡＳＰは、異なる３つの部位にてリン酸化および脱リン酸化される。（セリン１５７，セリン２３９およびトレオニン２７８；Horstrup等，Eur．J．Biochem．225，21−27 (1994年)を参照）。セリン２３９は、特にＶＡＳＰの最初のメチオニンが数に含まれない場合に、しばしばセリン２３８と表される。
【００１９】
ＶＡＳＰのセリン２３９は、生理学的および薬理学的なＮＯ供与体、および血小板阻害剤および血管拡張薬に応答して、無傷なヒト血管細胞（血小板、内皮細胞および平滑筋細胞）においてリン酸化される。
ＶＡＳＰのセリン２３９のリン酸化は特に、ｃＧＭＰ経由で、ナトリウム排泄増加ペプチドのような重要なホルモンまたはＮＯ放出物質および薬剤により活性化される、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼによって媒介される。ＶＡＳＰのセリン２３９のリン酸化は、さらにｃＡＭＰ増加ホルモンおよび薬剤により活性化される、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼによって媒介される。
【００２０】
ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼは主にセリン１５７位をリン酸化するが、ＶＡＳＰのセリン２３９位もまたリン酸化する。セリン１５７位におけるＶＡＳＰのリン酸化もまた、ヒト血小板におけるフィブリノーゲンの糖蛋白質IIｂ−IIIａとの結合の阻害と密接に相関することが観察される（Horstrup等，Eur．J．Biochem．225，21−27 (1994年)）。
【００２１】
生物学的物質、例えば組織および細胞の抽出物においてＶＡＳＰがリン酸化される程度の測定、特に２３９位および／または１５７位におけるＶＡＳＰのリン酸化の測定は、重要な生化学的パラメータとなり、その測定は、心房性ナトリウム排泄増加因子（ＡＮＦ）、グアニリン［guanylin］、ＮＯ−放出物質および薬剤などのｃＧＭＰ増加および／またはｃＡＭＰ増加ホルモンまたは薬剤の全てを検出する診断システムの開発を可能にし、さらにインビボ内皮機能に関して結論を引き出すことを可能にする。
【００２２】
可逆的にリン酸化された蛋白質に特異的に結合する抗体は、US 5,599,681、W0 93／21230およびU．Walter，Blick 1／97 Wurzburg University，pp.79−81，1997年に記載されている。
【００２３】
本発明の課題は、生物学的物質中におけるＶＡＳＰのリン酸化状態を迅速で単純な手法にて定性的および／または定量的に測定し得る生化学的／免疫生物学的方法を開発することである。
本課題は、ＶＡＳＰがリン酸化形態で存在する場合に抗原としてＶＡＳＰにのみ結合する抗体の供給によって達成される。
故に、本発明は、一般的にはＶＡＳＰがリン酸化形態で存在する場合に抗原としてＶＡＳＰにのみ結合する抗体に関する。
【００２４】
本発明の意味においては、抗体は、ＶＡＳＰにおけるリン酸化領域を特異的に認識する、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の両方およびその断片、さらにＳＣＦＶ断片または他の合成もしくは組換え蛋白質領域と理解される。
【００２５】
抗体の断片には、標的抗原、この場合ＶＡＳＰまたはその特定の部分に結合し得る抗体の任意の部分が包含される。抗体断片には、具体的にはＦ(ａｂ′)2、Ｆａｂ、Ｆａｂ′およびＦｖ断片が包含される。これらは、抗体の任意のクラスから作成することができるが、典型的にはＩｇＧまたはＩｇＭから作られる。これらは、慣用の組換えＤＮＡ技術によって、または古典的方法を用いるパパインもしくはペプシンでの蛋白質分解消化によって作成することができる。CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，chapter2，Coligan等，eds.，(John Wiley & Sons 1991−92）を参照。
【００２６】
Ｆ(ａｂ′)2断片は典型的には約１１０kDa（ＩｇＧ）または約１５０kDa（ＩｇＭ）であり、そしてジスルフィド結合によってヒンジにおいて連結された２つの抗原結合部位を含む。全てではないとしても実質的に全てのＦｃがこれら断片を欠いている。Ｆａｂ′断片は典型的には約５５kDa（ＩｇＧ）または約７５kDa（ＩｇＭ）であり、例えばＦ(ａｂ′)2断片のジスルフィド結合を還元することによって生成させることができる。生じた遊離のスルフヒドリル基は、都合良くＦａｂ′断片を検出試薬（例えば酵素）などの他の分子と結合させるために用いることができる。Ｆａｂ断片は一価であり、（任意の供給源由来で）通常は約５０kDaである。Ｆａｂ断片は、抗体の抗原結合部位の軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖、可変（それぞれＶLおよびＶH）領域および定常（それぞれＣL、ＣH）領域を包含する。ＨおよびＬ部分は、分子内ジスルフィド架橋によって連結されている。
【００２７】
Ｆｖ断片は典型的には約２５kDa（供給源を問わず）であり、軽鎖および重鎖両方の可変領域（それぞれＶLおよびＶH）を含む。通常は、ＶL鎖およびＶH鎖は共に非共有相互作用によってのみ保持され、故にこれらは容易に分離される。しかし、小さいサイズの利点を有しており、より大きいＦａｂ断片と同じ結合特性を保持する。従って、例えばグルタルアルデヒド（または他の化学的架橋剤）、分子間ジスルフィド結合（システインの導入による）およびペプチドリンカーを使用して、ＶL鎖およびＶH鎖を連結するために、方法が開発されてきた。生じたＦｖは、単一鎖（即ち、ＳＣＦｖ）である。
【００２８】
１つの好ましい方法は、組換え法によるＳＣＦｖの生成を包含し、別の抗体源からの可変鎖を混合および適合させることによって新規な特異性を有するＦｖの生成が可能である。典型的な方法において、カセット領域の発現を促進する、適当な制御エレメントを含む組換えベクターが提供される。カセット領域は、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを含み、融合蛋白質を生成するために、リンカーの５′末端および３′末端の両方において好都合な部位を備える。目的の可変領域をコードするＤＮＡをベクター中にクローニングして、リンカーを有する融合蛋白質を生成させる、即ちＳＣＦｖを生成させることができる。
【００２９】
模範的な別法において、２つのＦｖをコードするＤＮＡを、リンカーをコードするＤＮＡに連結することができ、そして生じた３部からなる融合物を慣用の発現ベクター中に直接連結することができる。これらの方法のいずれかにより生成したＳＣＦｖ ＤＮＡは、選択したベクターに依存して、原核細胞または真核細胞において発現させることができる。
【００３０】
好ましくは、ＶＡＳＰがリン酸化形態において存在する場合にのみ抗原としてＶＡＳＰに結合するモノクローナル抗体およびその断片が堤供される。
特に好ましくは、２３９位のセリンがリン酸化されている（ホスホセリン２３９ ＶＡＳＰ）場合にのみ抗原としてＶＡＳＰ、またはＶＡＳＰのセリン２３９周辺のペプチド配列を含むペプチドに結合する、モノクローナル抗体およびその断片がさらに提供される。
【００３１】
本発明の意味の範囲内において、用語ＶＡＳＰは、ＶＡＳＰの誘導体、即ち機能的に等価であるＶＡＳＰの一部分、突然変異体、断片または変異型をも意味すると理解され、例えば、さらにセリン１５７位および／またはトレオニン２７８位においてリン酸化されているホスホセリン２３９ ＶＡＳＰ、並びに例えば、グリコシル化突然変異体、他の共有結合型修飾体および蛋白質／蛋白質相互作用に対して重要な構造エレメントである。本発明の意味の範囲内において、用語ＶＡＳＰは、ヒトＶＡＳＰおよび他の種由来のＶＡＳＰ、特にラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルなどの哺乳類由来のＶＡＳＰを包含する。
【００３２】
抗体は、慣用の方法、例えばKohlerとMilstein（KohlerとMilstein, Nature 256; 495, 1975年）に記載される技術に従って作製することができる。典型的には、リン酸化部位に基づく選択性を所望する場合、抗体はＶＡＳＰのリン酸化形態に対して生じたものである。単離した抗体は、慣用の方法を用いて選択性を確実にするためにスクリーニングすることができる。抗体を、セリン１５７、セリン２３９および／またはトレオニン２７８を含むＶＡＳＰのペプチド断片に対して生じさせるのが好ましい。
【００３３】
抗原性ＶＡＳＰペプチドの長さは、体液応答を引き起こし得る限り、重要ではない。典型的な抗原性ペプチドは、約５０アミノ酸未満の長さである。いくつかの好ましいペプチドは、約２０アミノ酸の長さ未満である。最も好ましいペプチドは、約６〜約１２アミノ酸の範囲の長さである。好ましいペプチドには、ＫＬＲＫＶＳ239ＫＱまたはＲＫＶＳ239ＫＱＥが包含される。ペプチドは、セリン１５７、セリン２３９および／またはトレオニン２７８においてリン酸化されているのが好ましい。ペプチドは組換え法によって得ることができる。典型的には、ペプチドはＶＡＳＰの蛋白質分解またはインビトロ合成のいずれか、そしてリン酸化によって作製される。
【００３４】
さらに、好ましくは上述の特性を示し、且つフローサイトメトリーに使用できるモノクローナル抗体が提供される。これは、フローサイトメトリーにおいて慣用的に使用される固定工程にて予測される、抗原のコンフォメーションを変化させ得る条件下に抗原を供した場合であっても、新規な抗体の特異性が保持されることを要求する。新規抗体は、例えばこれらを簡単に試験することにより、フローサイトメトリーにおける使用に対する適合性につき検査される。
モノクローナル抗体１６Ｃ２が特に好ましい。
【００３５】
新規抗体は、それ自体当業者に知られた方法を用いて調製することができる。KohlerとMilstein（KohlerとMilstein, Nature 256; 495, 1975年）により記載される技術を使用するハイブリドーマ細胞の調製は、特にモノクローナル抗体について述べる。精製した抗体の特異性は、例えば下記の試験方法を用いて調査することができる：
ａ) リン酸化ＶＡＳＰを用いて陽性シグナルを観察できなければならないことのみに関連して、ｃＡＭＰ依存性またはｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼによって異なる程度までリン酸化した、組換えＶＡＳＰを用いるウェスタンブロッティング。
【００３６】
ｂ) ヒトＶＡＳＰまたは異なる様式にて突然変異させ、そしていずれの場合においても３つのリン酸化部位の１つを突然変異させ、これにより消去されたＶＡＳＰ、（Ｓ１５７Ａ）ＶＡＳＰ、（Ｓ２３９Ａ）ＶＡＳＰおよび（Ｔ２７８Ａ）ＶＡＳＰ、並びにいずれの場合においてもヒトｃＧＭＰ蛋白質キナーゼをトランスフェクションした細胞、例えばＰｋｔ２細胞の抽出物を用いるウェスタンブロッティング。これらの抗体は、ウェスタンブロッティングにおける陽性シグナルがＳ２３９Ａ突然変異によって消去されるが、他の２つの突然変異によっては消去されないものが適する。
【００３７】
ｃ) 異なる血管拡張剤（例えばプロスタサイクリンまたはＮＯ供与体）で処理されたヒト血小板またはｃＡＭＰ蛋白質キナーゼまたはｃＧＭＰ蛋白質キナーゼの活性化剤で処理されたヒト血小板を用いるウェスタンブロッティング。その結果、抗体は、リン酸化ＶＡＳＰを有する抽出物においてのみ特定のバンドが検出された場合が適する。抗体はまた、ヒト繊維芽細胞を用いる類似の方法、並びにさらにラットおよびマウスの血小板を用いる類似の方法にてスクリーニングすることができる。
ｄ) 固定したヒト血小板および内皮細胞を用いる免疫蛍光検査法。陽性シグナルは、ＶＡＳＰがリン蛋白質として存在する場合に観察される。
【００３８】
さらに本発明は、新規モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関し、モノクローナル抗体１６Ｃ２を産生するハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２が特に好ましい。
モノクローナル抗体１６Ｃ２を産生するハイブリドーマ細胞株１６Ｃ２は、次の番号：DSM ACC2330において、ブタペスト条約の規定に従って、1997年11月６日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German collection of microorganisms and cell cultures)，Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託されている。
【００３９】
新規抗体は、好ましくはインビトロ条件下にて生じるＶＡＳＰのリン酸化およびインビボ条件下にて生じるＶＡＳＰのリン酸化の両方を定性的および／または定量的、好ましくは定量的に測定し、ＶＡＳＰのセリン２３９および／またはセリン１５７のリン酸化を測定するのに適し、特に好ましくはＶＡＳＰのセリン２３９のリン酸化を測定するのに適する。
【００４０】
抗体を用いる定量法は当業者に知られており、例えば上述のCURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY中において見出すことができる。これらの方法には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノ検定法（ＲＩＡ）などが包含される。
さらに新規抗体は、生物学的物質中のリン酸化されたＶＡＳＰ、好ましくはホスホセリン２３９ ＶＡＳＰおよび／またはホスホセリン１５７ ＶＡＳＰ、特に好ましくはホスホセリン２３９ ＶＡＳＰを定性的および／または定量的、好ましくは定量的に測定するのに適する。
【００４１】
生物学的物質は、例えば血小板、白血球、内皮細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞などの細胞抽出物、組織抽出物、細胞切片、細胞組織および細胞と理解される。生物学的物質は、ヒト由来であるか、またはラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタもしくはイヌなどの哺乳類由来とすることができる。ヒト起源の生物学的物質が好ましい。
【００４２】
新規抗体は、当業者に知られた方法に従ってウェスタンブロッティングのオートラジオグラムを定量的に評価する、例えばＮＩＨゲルブロッティング イメージ １.６［NIH gel blotting Image 1.6］ソフトウェアを用いることによって、または免疫蛍光法によって、生物学的物質中のリン酸化ＶＡＳＰ、特にホスホセリン１５７ＶＡＳＰおよび／またはホスホセリン２３９ＶＡＳＰを定量的に測定するために用いることができる。
【００４３】
ＶＡＳＰのセリン２３９およびセリン１５７のリン酸化とｃＧＭＰ依存性および／またはｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼとの間に存在する相関関係のために、新規抗体は、ｃＧＭＰシグナル経路およびｃＡＭＰシグナル経路の診断、特にｃＧＭＰシグナル経路の診断のための薬剤としての使用にも適する。
【００４４】
ウェスタンブロッティング技術および免疫蛍光法を用いて生物学的物質中のホスホセリン２３９ＶＡＳＰを測定するための新規抗体の使用は、ｃＧＭＰを増大させる物質、ホルモンまたは薬剤を検出する診断方法の開発を可能にする。挙げることのできる例は、ＡＮＦ、グアニリン、ＮＯ−放出物質または薬剤である。例えば、ＮＯ供与体のコースの制御および治療が監視でき、特に進行しうる硝酸耐性現象についての情報を提供する。
【００４５】
ＶＡＳＰのセリン１５７のリン酸化とｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの活性との間にある相関関係のため、新規抗体は、ｃＡＭＰを増大させる物質、ホルモンまたは薬物を診断する薬剤としても使用することができる。
故に、本発明は、診断および／または治療における新規抗体又はその断片の使用にも関する。
新規診断方法は、研究室において人体の外（生体外）で実施することができる方法である。
【００４６】
新規抗体は、異なる種に由来する生物学的物質中のＶＡＳＰのリン酸化の程度を測定するために使用することができる。述べうる例は、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルである。新規抗体を、ヒト、ラット、マウスまたはイヌからの生物学的物質中のリン酸化ＶＡＳＰを測定するために使用するのが好ましい。新規抗体を、ヒトの生物学的物質中のリン酸化ＶＡＳＰを測定するために使用するのが特に好ましい。
【００４７】
新規抗体またはその断片はまた、バイオセンサーにおいて用いることができる。バイオセンサーは、それ自体当業者に知られている。抗体、レクチンまたは受容体などの第２特異的結合パートナーを用いる方法が特に好ましい。この場合において検出および定量するために、特異的結合パートナーの１つに検出可能な標識を行うことができる。これらの標識はそれ自体当業者に知られており、例えば発色団、発光団、蛍光団、酵素、放射性アイソトープまたは着色もしくは無着色粒子とすることができる。未標識の特異的結合パートナーを直接的または間接的に、例えば別の抗体またはビオチン／アビジン架橋によって、それ自体当業者に知られた方法を用いて固相に結合させる方法が好ましい。
【００４８】
新規抗体またはその断片は、当業者に知られた方法によって放射線標識して、イムノシンチグラフィまたは免疫療法に使用することができる。また、これらのモノクローナル抗体は、活性化合物のキャリアとして用いて内皮機能不全に起因する疾患の治療に使用することができる。
Ｍａｂ １６Ｃ２のＶ遺伝子の全ヌクレオチド配列の分析に続いて、例えば超可変領域をヒトＭａｂ骨格に挿入することによって抗体構築物を作製することが技術的に可能である（Jones等, Nature 321, 522-525, 1986年；Verhoyen等, Science 239, 1534-1536, 1988年）。
【００４９】
適当ならば、例えば当業者に知られた方法を用いて固定された全血試料においてフローサイトメトリーを実施することによって、血小板中の抗原に結合した抗体を定量するのが好ましい。フローサイトメトリーの方法は当業者に知られており、例えばG. Otten and W.M. Yokoyama (1992年), “Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan", Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19に記載されるように実施することができる。
【００５０】
新規抗体を使用する、ＶＡＳＰのリン酸化、特にＶＡＳＰセリン２３９のリン酸化のフローサイトメトリー分析はヒト血小板に限定されるものではなく、リンパ球、単球、白血球、内皮細胞および平滑筋細胞などの他のタイプの細胞においても実施することができる。
【００５１】
フローサイトメトリーを使用して、新たに採取したヒト血小板において新規抗体を用いてＶＡＳＰ、特にホスホセリン２３９ＶＡＳＰのリン酸化を測定することは、ＮＯおよびプロスタサイクリンなどの内皮因子のインビボ活性を生体外で測定することを可能にし、その結果、例えば動脈硬化、高血圧、糖尿病、心不全および腎不全などの心臓血管の疾患において観察されるような内皮の機能または内皮の機能不全を評価することを可能にする。
【００５２】
新規抗体を用いることによってＶＡＳＰのリン酸化、特にＶＡＳＰセリン２３９のリン酸化を測定することは、上述した疾患の治療の制御を可能にする。硝酸許容性などの治療に対する抵抗性の進行もまた測定することができる。
新規抗体はまた、生物学的物質中においてＶＡＳＰのリン酸化状態および／またはその蛋白質との相互作用に効果を示す治療薬として用いることができる。
従って、本発明は、少なくとも１つの新規抗体を含む医薬製剤に関する。
【００５３】
新規製剤は、腸内（経口）、非経口（静脈）、直腸または局所（局所）で用いることができる。これらは、溶液、粉末（錠剤またはマイクロカプセルを包含するカプセル）、リポソーム製剤、脂質複合体、コロイド状分散体、注射溶液または坐剤の形態で投与することができる。医薬上慣用な液体または固体充填剤および増量剤、溶媒、乳化剤、滑剤、矯味薬、色素および／または緩衝物質がこの種の製剤化に適する補助的物質である。常用量として０.１〜１００mgを体重kg当たり投与する。これらは、適当には少なくとも新規抗体の有効な日用量、例えば３０〜３０００mgを含む投与単位において投与される。
【００５４】
投与される日用量は、体重、年齢、性別および被検哺乳類の状態に依存する。しかし、より高いまたはより低い日用量を指示してもよい。日用量は、一回につき、単一回の投与単位の形態または幾つかのより少量の投与単位の形態で投与するか、あるいは予め決められた間隔にて小分けされた投与量の形態で複数回で投与することができる。
【００５５】
製剤を調製するために、新規抗体を治療上不活性な有機または無機賦形剤中に入れることができる。ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、獣脂およびステアリン酸またはその塩が、錠剤、被覆錠剤およびハードゼラチンカプセルに対するそのような賦形剤の例である。水、ポリオール、ショ糖、転化糖およびグルコースが溶液の調製に適する賦形剤である。水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油が、注射液に適する賦形剤である。植物油および硬化油、ワックス、脂肪並びに半固体ポリオールは、坐剤に適する賦形剤である。医薬製剤はまた、防腐剤、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、色素、香料、浸透圧を変化させる塩、緩衝剤、被覆剤、酸化防止剤、および適する場合、他の治療上活性のある化合物を含むことができる。
【００５６】
本発明はまた、少なくとも１つの新規抗体が医薬上適し且つ生理学的に許容される賦形剤、適する場合には他の適する活性化合物、添加剤または補助物質と共に適する投与形態とされている、新規医薬の製造方法に関する。
さらに本発明は、ごく一般的には、ＶＡＳＰ特にホスホセリン２３９ ＶＡＳＰのリン酸化配列を特異的に認識するポリクローナル抗体、ＳＣＦｖ断片または他の合成もしくは組換え蛋白質ドメインなどの他の特異的なプローブを用いることよって、ＶＡＳＰのリン酸化、好ましくはＶＡＳＰのセリン２３９のリン酸化を測定する診断方法に関する。
【００５７】
さらに本発明は、リン酸化されたセリン１５７および／またはトレオニン２７８を含むＶＡＳＰの配列を特異的に認識する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＳＣＦｖ断片または他の合成もしくは組換え蛋白質ドメインなどの特異的なプローブを用いることよって、ＶＡＳＰのセリン１５７のリン酸化および／またはトレオニン２７８のリン酸化を測定する診断方法に関する。
【００５８】
ジキシン［zyxin］およびビンクリン［vinculin］などのプロリンに富むペプチドに結合し、そして同時にそれ自身のプロリンに富むアミノ酸ドメインがプロフィリンに結合することによって、アダプター分子としてのＶＡＳＰが作用するようになり、ＶＡＳＰは繊維状アクチンを形成させ得る。この蛋白質／蛋白質相互作用の障害は、不完全な血小板凝結または血管収縮を導き得る。従って、アクチン／ミオシン架橋の形成は、例えば平滑筋細胞の収縮において必須条件である。セリン１５７位におけるＶＡＳＰのリン酸化がフィブリノーゲン受容体糖蛋白質IIb/IIIaの阻害と相関することが見出されている（Horstrup等, Eur. J. Biochem., 225, 21-27, 1994年）。故に、セリン１５７位におけるＶＡＳＰのリン酸化の測定は、ＶＡＳＰとその細胞内結合パートナーとの相互作用に働き、そして例えば血管の損傷に関連する血管疾患の治療に適する物質または薬物の体系的な検索を可能にする。
【００５９】
特に好ましい態様を実施例に記載する。
下記の実施例は本発明を明確にするためのものであり、いずれにしても本発明を制限するものではない。
【００６０】
【実施例】
実施例１
ホスホセリン２３９ＶＡＳＰに対するモノクローナル抗体の単離
各々、セリン２３９の周辺のペプチド配列ＫＬＲＫＶＳ239ＫＱまたはＲＫＶＳ239ＫＱＥを含むリン酸化ペプチドおよび非リン酸化ペプチドを、当業者に知られたＦｍｏｃ化学に従ってApplied Biosystems社製ペプチドシンセサイザー（モデル ４３１Ａ）を用いて合成した。
リン酸化ペプチド中のホスホセリンは、ペプチド合成中にCalbiochemからのＦｍｏｃセリン［ＰＯ(Ｏｂｚｌ)ＯＨ−ＯＨ］を用いて導入した。ＭＳ確認したペプチドをＲＰＣおよびＶＹＤＡＣ ２１８ＴＰカラムを用いて精製した（純度＞９８％）。
【００６１】
ブロモ酢酸またはブロモ酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma）を用いて活性化した後に、この方法で調製したペプチドをチオール化ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin, nanoTools）に結合させた。雌Balb／ｃマウス（６週齢）を、第１回目の注射では完全なFreundのアジュバンドを、続く３回の注射では不完全なアジュバンドを含有するＫＬＨ−ホスホペプチド（１０μｇ／マウス）を用いて、１４日間隔で４回皮下注射で免疫化した。次いで、マウス（２週間後）を連続して３日間、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）中の１０μｇの免疫源の追加免疫注射に供した。最後の追加免疫注射の１日後、マウスを屠殺して脾臓を取り出した。脾臓細胞を単離し、確立されているKohler／Milstein方法論を用いて、非産生ミエローマ細胞（例えば、PAI-Zellen, J.W. Stocker等. (1982年) Res. Disclosure, 21713）と融合させた。リン酸化／非リン酸化ペプチドをリン酸化／非リン酸化組換えヒトＶＡＳＰと同様に用いるデファレンシャルスクリーニング法を使用して、ホスホセリン２３９ＶＡＳＰに対する抗体を分泌する能力につきハイブリドーマ細胞を試験した。
【００６２】
リン酸化／非リン酸化ペプチドを使用する試験について、これらペプチドをDNA-BIND-ELISAプレート（Costar社製）に共有結合させ、ELISA法を用いて、ハイブリドーマの上清をスクリーニングした。
ホスホペプチドを認識する上清を、完全にリン酸化された組換え（E．coli系）ヒトＶＡＳＰを認識するが、脱リン酸化ＶＡＳＰを認識しない能力について、さらに試験した。
上述の方法によって陽性と同定されたハイブリドーマ細胞の上清からのモノクローナル抗体を、親チオ酸吸着クロマトグラフィー（POROS 50-OH，nanoTools）によって血清を含まないハイブリドーマ細胞培養物から精製するのが好ましい。
【００６３】
別の試験方法を用いて、ＶＡＳＰがセリン２３９位においてリン酸化された場合にこの蛋白質のみを認識するマウスＩｇＧ１ｋクラスのモノクローナル抗体として単離した抗体の１つを（クローン １６Ｃ２）を同定し、特徴付けることができた。抗体１６Ｃ２は、使用した条件下では他の蛋白質および他のＶＡＳＰリン酸化位置を認識しない。
それぞれ抗原として、ＶＡＳＰ蛋白質のセリン１５７またはトレオニン２７８周辺の公知のペプチド配列を含むリン酸化ペプチドを使用することによって、上述のものと類似する方法において、ホスホセリン１５７ＶＡＳＰまたはホスホトレオニン２７８ＶＡＳＰを特異的に認識するモノクローナル抗体を単離することができる。
Ｓｅｒ２３９位においてリン酸化されたＶＡＳＰを認識するモノクローナル抗体の作成はまた、Smolenski等, J. Biol. Chem., 237, 32, 20029-20035 (1998年)に記載されている。
【００６４】
実施例２
ＶＡＳＰセリン２３９リン酸化のフローサイトメトリー分析
洗浄ヒト血小板におけるＶＡＳＰセリン２３９リン酸化の分析
ヒト血小板を調製し、記載（Eigenthaler等, Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992年）のように、血管作用物質とインキュベーションすることによってＶＡＳＰリン酸化を刺激した。この反応は、最終濃度約３.５％のホルムアルデヒドで室温で１０分間固定することによって停止させる。洗浄処理（随意）後、細胞をトリトンＸ−１００を用いて浸透化させ、次いで洗浄した。直接蛍光標識したかまたは蛍光標識した第２抗体を用いて着色した適当な抗体とインキュベーションすることによって染色を行った。この目的について１ml当たり、適当には０.５〜５μｇ、好ましくは１〜２μｇの第１抗体を使用する。例えばＭａｂ １６Ｃ２を第１抗体として使用する場合、０.７μｇ／mlが適する。次いで、例えばBecton Dickinson FACScan（Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19）を使用したG．OttenとW.M．Yokoyama（1992年）に記載されるように、抗体１６Ｃ２の結合をフローサイトメトリーにおいて測定し、且つ分析した。
【００６５】
実施例３
ウェスタンブロッティングを用いた細胞抽出物中のＶＡＳＰセリン２３９リン酸化の測定
フローサイトメトリー（実施例２）と平行して、ウェスタンブロッティングを用いて、当業者に知られ、例えばEigenthaler等（Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992年）に記載の方法によって細胞抽出物中のＶＡＳＰのリン酸化を測定した。使用した抗体の濃度は、測定すべき試料中のＶＡＳＰの濃度に依存するが、適当には０.１〜５μｇ／ml、好ましくは０.５〜１.０μｇ／mlの範囲である。例えば、ヒト血小板およびラット血小板については０.５μｇ／mlの抗体を使用するのが有利であるが、ヒト臍帯内皮細胞については１.０μｇ／mlの抗体を使用するのが有利である。原則的には、ウェスタンブロッティング分析による細胞抽出物中の、そしてフローサイトメトリーによる固定した細胞のＶＡＳＰセリン２３９リン酸化の分析では同じ結果が得られた。
【００６６】
実施例４
全血または血小板に富む血しょう（ＰＲＰ）中におけるＶＡＳＰセリン２３９リン酸化の分析
全血またはＰＲＰを血管作用物質とインキュベートし、最終濃度約３.５％のホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定することによってインキュベーションを停止させた。ＰＲＰは、Eigenthaler等（Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992年）に記載されるようにして全血から調製する。ＰＲＰ中の血小板を遠心分離によってペレット化して、生理学的緩衝液（上述のEigenthaler等、1992年を参照）中に再懸濁させる。血小板を透過処理し、次いで洗浄血小板について上述したように染色する。
【００６７】
実施例５
ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）処理後の洗浄ヒト血小板中におけるＶＡＳＰセリン２３９のリン酸化刺激の時間経過
ヒト血小板を１００μＭ ＳＮＰで処理した。細胞試料を０、１、３および５分にて回収した。抗体１６Ｃ２を用いて、平行して、回収した細胞試料の抽出物のウェスタンブロット分析、および上述のように固定し、そして浸透化させたヒト血小板におけるフローサイトメトリー測定によってＶＡＳＰセリン２３９のリン酸化を測定した。ＮＩＨゲル−ブロッティング イメージ１.６ ソフトウェアを使用して、ウェスタンブロットのオートラジオグラムを定量分析した。抗体１６Ｃ２／ホスホセリン２３９ＶＡＳＰ結合における増加（％増加（５分値＝最大効果＝１００％））を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0005031140.tif 000002
【００６９】
実施例６
抗体１６Ｃ２を使用した、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼまたはｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼによる組換えＶＡＳＰのリン酸化の分析
精製した組換えヘキサヒスチジン標識ＶＡＳＰ（２５μｇ／ml）を、精製したｃＡＭＰ蛋白質キナーゼ（ｃＡＰＫ）の触媒サブユニット（１１μｇ／ml）または精製したｃＧＭＰ蛋白質キナーゼ（ｃＧＰＫ；２４μｇ／ml）によってリン酸化した。アリコートを所定の時間において反応混合物から取り出し、即座にＳＤＳ含有停止溶液と混合し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。ＶＡＳＰのリン酸化を、クマシーブルー染色、およびポリクローナルＶＡＳＰ抗体（M4, Halbrugge M.等，J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990年)，Alexis Corporation，Alte Hauensteinstraβe 4, CH-4448 Laufelfingen, Switzerlandから入手可能）またはモノクローナルＶＡＳＰ抗体１６Ｃ２のいずれかを用いたウェスタンブロッティングによって分析した。クマシーブルー染色におけるＶＡＳＰの下のバンドはｃＡＰＫであり、ＶＡＳＰの上方はｃＧＭＰ−ＰＫである。実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、セリン１５７のリン酸化による４６kDaから５０kDaへのＶＡＳＰの移動度における変化を示しており、セリン１５７のリン酸化にはｃＡＰＫが好ましい。セリン２３９のリン酸化（１６Ｃ２抗体によって検出）はｃＧＭＰ−ＰＫによるのが好ましい。
【００７０】
実施例７
種々のリン酸化変異体を含有するＰｔｋ２細胞における、トランスフェクションしたＶＡＳＰのリン酸化の分析
トランスフェクションしたヒトＶＡＳＰおよびＶＡＳＰ変異体のリン酸化をＰｔｋ２細胞において調査した。野生型ＶＡＳＰおよび各々突然変異（不活化）させたリン酸化部位（セリン１５７，セリン２３８またはトレオニン２７７の変更）を含有するＶＡＳＰ変異体を、ヒトｃＧＭＰ蛋白質キナーゼ１βと共にＰｔｋ２細胞にトランスフェクションし、そしてＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。Ｐｔｋ２細胞は、内在性ＶＡＳＰおよびｃＧＭＰ蛋白質キナーゼを非常にわずかしか止めていない。トランスフェクションの２日後、細胞を３０μＭ ８ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰと共に３０分間インキュベーションして、細胞抽出物を単離した。次にこれらの細胞抽出物中におけるＶＡＳＰのリン酸化をポリクローナル抗体Ｍ４およびモノクローナル抗体１６Ｃ２を用いるウェスタンブロットによって調査した。４６kDaから５０kDaへのＶＡＳＰのリン酸化依存性の変化は、セリン１５７を不活化した場合（変異体Ｓ１５７Ａ）には存在しなかった。抗体１６Ｃ２によって認識されるシグナルは、セリン２３９を不活化した場合（変異体Ｓ２３９Ａ）には存在しなかった。これらの分析において、トレオニン２７７の変異体は、野生型ＶＡＳＰと同様な挙動を示した。
【００７１】
実施例８
種々の血管拡張剤およびｃＡＭＰ／ｃＧＭＰアナログで刺激した後のヒト血小板におけるＶＡＳＰのリン酸化の分析
洗浄したヒト血小板（０.７×１０９個細胞／ml）を１μＭ Ｐｇ−Ｉ2（プロスタサイクリン）、０.５mM ５,６−ＤＣＩ−ｃＢＩＭＰＳ（細胞膜浸透性ｃＡＭＰアナログ）、１０μＭ ＳＮＰ（ニトロプルシドナトリウム）または１mM ８ｐＣＰＴｃＧＭＰ（細胞膜浸透性ｃＧＭＰアナログ）とインキュベートした。アリコート（２.８×１０7個細胞）を所定の時間後に取り出し、ＳＤＳ停止溶液と混合し、煮沸し、次いでＶＡＳＰリン酸化についてウェスタンブロット法を用いて調査した。ポリクローナル抗体Ｍ４またはモノクローナル抗体１６Ｃ２を用いて分析を実施した。セリン１５７リン酸化は、４６kDaから５０kDaへのＶＡＳＰのシフトによって定量し、セリン２３９リン酸化は１６Ｃ２抗体によって与えられるシグナルによって定量した。
【００７２】
実施例９
ラット血小板中におけるＶＡＳＰのリン酸化
ラット血小板（０.７×１０9個細胞）を１００μＭニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）、１０μＭプロスタグランジンＥ１（ＰｇＥ１）またはこれらのいずれかを添加せずに５分間インキュベートした。これらラット血小板の抽出物をウェスタンブロッティングによって分析した。ブロットは、４６kDaから５０kDaへのＶＡＳＰのリン酸化依存性シフト（セリン１５７リン酸化）および１６Ｃ２抗体によって与えられるリン酸化依存性シグナル（セリン２３９リン酸化）もまたラット血小板中において起こることを示した。同様な結果は、マウス血小板を用いても得られる。
【００７３】
実施例１０
ヒト血小板において実施したＶＡＳＰおよびホスホ−ＶＡＳＰの免疫蛍光調査
ヒト血小板（血小板に富む血しょう中，ＰＲＰ）をガラススライド上に置き、押さえつけ、そして４５分間拡げた。次にこれらの血小板をガラススライド上で、１００μＭ ８ｐＣＰＴｃＧＭＰ無しに（ＡおよびＣ）またはこれと共に（ＢおよびＤ）１５分間インキュベートした。次いで細胞を直ぐに４％パラホルムアルデヒドで固定し、０.２％トリトンＸ−１００で浸透化させた。これらをポリクローナル抗体Ｍ４（１：１００）またはモノクローナル抗体１６Ｃ２とインキュベートし、次いで通常の第２抗体とインキュベートした。写真は１６Ｃ２抗体を用いた場合におけるリン酸化依存性シグナルの出現を示すのに対して、ポリクローナル抗体Ｍ４を用いたシグナル（免疫蛍光法において、分別されていないために、４６kDaおよび５０kDa ＶＡＳＰの合計）は、リン酸化−非依存性である。
【００７４】
【表２】
0005031140.tif 000003
【００７５】
【表３】
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