(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母菌体を必要に応じた真空下で、（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの安定化剤の非存在下で、２０〜４０℃の範囲の温度で水分含量を０．５重量％以下に乾燥させることにより得ることができ、かつ遊離塩基としての（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを７〜２０％（重量／乾燥重量）の高含量で含む、乾燥および／またはマイクロカプセル化サッカロマイセス・セレヴィシエ菌体。
【請求項２】
乾燥状態にある請求項１に記載の菌体。
【請求項３】
マイクロカプセル化された形態を有する請求項１または２に記載の菌体。
【請求項４】
前記酵母菌体として、前定常培養での工業的発酵から採られた培養ブロス（culture broth）のＹＭ寒天培地での平板培養、及びそれに続く（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの生産能力のチェックによるコロニーのスクリーニングにより得ることができる酵母菌体を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の菌体。
【請求項５】
前記酵母菌体が、ＤＢＶＰＧコレクションに寄託番号  ＤＢＶＰＧ  ８Ｐで寄託されている、請求項１〜４のいずれかに記載の菌体。
【請求項６】
前記酵母菌体が、発酵期間の終了時での２．０〜６．０％（重量／乾燥重量）、強化段階終了時での７〜２０％（重量／乾燥重量）の（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの生産性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の菌体。
【請求項７】
活性成分として請求項１〜６のいずれかに記載の菌体を、好適な賦形剤と混合した医薬組成物。
【請求項８】
錠剤、胃での耐性を有する錠剤及びカプセルの形態を有する請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
１００ｍｇから４００ｍｇの活性成分（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの含量を有する請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の菌体を調製するための方法において、
パン製造用の糖蜜を基礎とする培地へ０．５％〜４．０％（ｗ／ｖ）の量のＤＬ−メチオニンを添加し、培養する工程、
前記培地からのバイオマスを遠心分離し、洗浄し、再けん濁させ、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、カルシウム塩、グルコース、及びＬ−メチオニンもしくはＤＬ−メチオニンを含む活性化培地で活性化する活性化工程、及び
前記活性化工程からのバイオマスを、遠心分離または精密濾過（microfiltraton）し、滅菌水またはりん酸緩衝液ｐＨ５．２（±０．２）で数回洗浄し、（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンイオンの安定化剤の非存在下で、２０〜４０℃の範囲の温度で水分含量を０．５重量％以下に乾燥させる工程、
を有し、
前記活性化工程は０．１〜１．５ｖ／ｖ／ｍの通気及び２５℃〜３５℃、６〜２４時間の条件で、２〜５回の可能な回数で繰り返し行われ、かつ前記活性化培地中でのバイオマス濃度を２．５％から１８％乾燥重量／容量とする、
菌体調製方法。
【請求項１１】
前記乾燥された酵母菌体を造粒する工程を更に有する請求項１０に記載の菌体調製方法。
【請求項１２】
ＤＢＶＰＧコレクションに寄託番号ＤＢＶＰＧ  ８Ｐで寄託されているサッカロマイセス・セレヴィシエ菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高含量の（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを有する乾燥および／またはマイクロカプセル化サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）菌体、その調製方法および該菌体を含む組成物に関する。
【０００２】
特に、本発明は、ジアステレオ異性体遊離塩基である（Ｒ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（以下(R)-(+)-SAMeと称する）の量が、ジアステレオ異性体遊離塩基である（Ｓ）−（＋）−Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（以下(S)-(+)-SAMeと称する）の量の１０％に等しいかまたはそれよりも少ない、サッカロマイセス・セレヴィシエ菌体に関する。
【背景技術】
【０００３】
(S)-(+)-SAMeイオンは極めて不安定であり、したがって生産細胞から抽出されると急速に分解されうることが知られている。実際に、SAMeが発見（Cantoni et al. “リン代謝”  ボルチモア  1952 2, 129；Cantoni et al. J. Biol. Chem, 1953, 204, 403）されてから市販されるまでには長い年月が経過している。
【０００４】
この安定性の問題は、まずは塩形成、特に硫酸塩の形態とすることにより解決されていた。しかしながら、SAMeの硫酸塩は、その固有の酸性が原因となって、時には、とりわけ胃粘膜において副作用を引き起こす。
【０００５】
(R,S)SAMeは、メチル基移転の酵素反応に関与するメチルの生理学的な供与体であって、すべての生命体中に存在し、慢性肝臓疾患、脂肪過多、脂肪血症およびアテローム性動脈硬化に対して治療効果を有する。
【０００６】
(R,S)SAMeの製品が、下記の分子構造を有する(R)-(+)-SAMeおよび(S)-(+)-SAMeの２つのジアステレオ異性体の混合物からなることも知られている（J.W.Cornforth, J.A.C.S., 1977, 99, 7292-7300; Stolowitz et al., J.A.C.S., 1981, 103, 6015-6019)。
【０００７】
【化１】
0005037501.tif 000002
【０００８】
これらの２つのジアステレオ異性体のうち一方のみ、すなわち(S)-(+)-SAMeのみが自発的なメチル基移転とラセミ化により酵素的に活性であることも立証されており（De La Haba et al., J.A.C.S. 1959, 81, 3975-3980）、したがって約２０％に達する不活性のジアステレオ異性体(R)-(+)-SAMeの構造が作り出される（Wu et al., Biochemistry 1983, 22, 2828-2832）。
【０００９】
すべての市販されているSAMeを含有する製品において、不活性のジアステレオ異性体(R)-(+)-SAMeは少なくとも２０％存在することが観察されており、さらにこの割合は自発的なラセミ化によって長期的には４０％またはそれ以上に達する。
【００１０】
細胞はほぼ１００％の(S)-(+)-SAMeを天然に含むが、工業的な抽出および精製手順が部分的に劣化した製品をもたらし、したがって２０％以上の(R)-(+)-SAMeと８０％以下の(S)-(+)-SAMeの混合物となる。
【００１１】
これらの要因は、ジアステレオ異性体の混合物が長期的には不安定であることを裏付けるものであり、このことは溶液中の製品については既に知られていた（（G.L.Creason et al.,Phytochemistry（植物化学）， vol. 24, N. 6, 1151-1155, 1985； H.C. Uzar, Liebigs Ann. Chem. 1989, 607-610）。
【００１２】
(R,S)SAMe、およびその製薬学的用途のために認可された塩の形態においても、調製および精製プロセスの複雑さに加えて不安定性の問題が存在することが観測されてきた。
【００１３】
既知の精製プロセスは強酸性樹脂（JP 13680/1971）、キレート樹脂（JP 20998/1978）またはピクリン酸やピコリン酸のような高価な 特殊試薬（US 3707536 および US 3954726）の使用が必要である；しかしながら、これらはSAMe硫黄の部分的なラセミ化を招き、それによって最終製品に含まれる不活性のジアステレオ異性体の量は２０％を超える。
【００１４】
とはいえ、弱酸性樹脂（JP 14299/1981、FR-A-2531714、EP-A-0141914）を使用した精製プロセスでは得られた活性ジアステレオ異性体の部分的な分離しかできず、したがって薬剤の目的のためには純度が不十分なものしか得られない。
【００１５】
前記プロセスのあるものを用いればより高い純度のものが得られるが、いずれにしても部分的なラセミ化は、ジアステレオ異性体が少なくとも２０％存在することを暗示する；加えて、場合によっては（FR 2531714）、炭酸水素カリウムが細胞から生産物を抽出することに用いられるが、その結果として過塩素酸カリウムの沈殿が生じ、これは製品からの分離とそれに続く除去が困難なものである。
【００１６】
EP-A-0141914では、ＳＡＭｅを含有する酵母細胞の溶解が有機溶媒（例えば酢酸エチル、アセトンなど）の存在下で、粒径１００〜２００メッシュの樹脂の使用を必要とするクロマトグラフィーカラムをも使用して行われるが、再生と洗浄のために多額の投資と維持費が必要となる。
【００１７】
SAMeを抽出するに溶剤を使用すると、必然的に耐炎性のプラント、溶剤回収および蒸留システムが必要になる。もちろん分離および劣化したバイオマスの乾燥も残余の溶媒が一緒に除かれてしまうのを防ぐために必要である。
【００１８】
これらすべての要因は明らかに支出と運転コストの上昇を伴う。
【００１９】
Ｍｏｒａｎａらは、Biochimica Biophysica Acta, 1573 (2002), 105-108頁において、ＳＡＭｅが凍結乾燥された酵母抽出物中において、それほどではないにせよ、凍結乾燥された酵母細胞中において、トレハロースにより安定化されることを開示している。
【００２０】
凍結乾燥は、しかしながら、細胞がストレスの多い条件（−２０°Ｃで凍結され、その後３７°Ｃで解凍される）に曝されるため不利である。そしてトレハロースはいずれにせよ安定化する細胞内のＳＡＭｅを安定化するためには必須であると推定される。
【００２１】
トレハロースの添加は、さらに、経済的および調節の問題を伴う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、活性(S)-(+)-SAMeジアステレオ異性体の割合が明らかに不活性の(R)-(+)-SAMe異性体よりも多く、かつその割合が長期的に安定な、ＳＡＭｅの誘導体もしくは投薬形態が必要とされている。
【００２３】
さらなる重要な目標は、塩の形成および／または分解防止剤使用を繰り返すことなく、また酵母細胞をストレスの多い条件におくことなく、(S)-(+)-SAMeを遊離塩基として、安定した投与形態にすることになろう。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
今まさに、SAMe遊離塩基は生産細胞中では分解防止剤なしでも安定であることが見出された。
【００２５】
酵母の健全な細胞壁によりもたらされる保護は、常温で長期的に非常な安定性を促進する。
【００２６】
したがって本発明は、酵母細胞、特に、高い(S)-(+)-SAMe生産性を特徴とするサッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）菌株を任意に減圧下で２０〜４０℃の範囲の温度で単純に乾燥することで得られる遊離塩基の形態の(S)-(+)-S-アデノシル-L-メチオニンを多く含む、乾燥したおよび／またはマイクロカプセル化したサッカロマイセス・セレヴィシエ細胞に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明による細胞は、適切な薬剤の形態、とりわけカプセル、錠剤、耐胃液錠剤などの形態で投与しうる。
【００２８】
サッカロマイセス・セレヴィシエの適切な菌株は、前定常（静止培養）段階において工業醗酵から採取された培養用肉汁の試料をＹＭ寒天培地上で平板培養したものから得られるコロニーをふるいわけ、続いて(S)-(+)-ＳＡＭｅの産生能をチェックすることによりにより選択されたものである。
【００２９】
ここで選択されるＧＮＬ２４／４９７と呼ばれる菌株のＳＡＭｅ生産性は、発酵が終了した段階で乾燥重量あたり２．０重量％〜６．０重量％、さらに具体的には３重量％〜４重量％であり、濃縮が終了した段階で乾燥重量あたり７重量％〜２０重量％、さらに具体的には乾燥重量あたり１０重量％〜１６重量％である。
【００３０】
酵母サッカロマイセス・セレヴィシエＧＮＬ２４／４９７は、Ｐｅｒｕｇｉａ総合大学により「工業的な酵母コレクションＤＢＶＰＧ」として、形態特性とＤＮＡ−ＤＮＡ再結合技術に基づいて分類されたものである。
【００３１】
菌株サッカロマイセス・セレヴィシエＧＮＬ  ２４／４９７は、特許の目的でブダペスト条約に基づきアクセス番号ＤＢＶＰＧ  ８Ｐとして２００５年４月２７日にＤＢＶＰＧコレクションに寄託されたものであるが、本発明のさらなる主題を構成する。
【００３２】
酵母は、工業的なレベルで、製パン用バイオマスの調製に用いられる公知の技術と条件で発育する、ここでＤＬメチオニンを０．５％−４．０％ｗ／ｖで、さらに具体的には１．０％−３．０％ｗ／ｖで、糖蜜ベースの通常の培養培地に加える（F.Schlenk and R.E.De Palma, J.Biol.Chem. 1957 229, 1051頁； F.Schlenk, J.L.Dainko and S.M.Stanford, Archives of Biochemistry and Biophysics 1959, 83, 28-34頁）。
【００３３】
バイオマスは遠心分離により集められ、洗浄された上で再懸濁され、リン酸カリウム；硫酸アンモニウム；クエン酸のナトリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびカルシウム塩；グルコースおよびＬ−メチオニンまたはＤＬ−メチオニンを含む培地（以下「活性化培地」と称する）中での活性化工程に置かれる（F. Schlenk and R.E. De Palma, J. Biol. Chem, 1957, 229, 1051-F. Schlenk et al., Enzymologia 29, 283, 1965）。
【００３４】
活性化工程は２〜５回、さらに具体的には２〜３回、無菌または非殺菌条件下で、常圧もしくは微加圧条件下で、調整されたもしくはそのままのｐＨで、０．１〜１．５ｖ／ｖ／ｍさらに具体的には０．２〜１．０ｖ／ｖ／ｍで通気され；温度は２５°Ｃ〜３５°Ｃ、またはさらに具体的には２８°Ｃ〜３２°Ｃで；６〜２４時間、さらに具体的には８〜１８時間で行われる。
【００３５】
活性化培地中のバイオマス濃度は体積あたり２．５％〜１８％乾燥重量、さらに具体的には体積あたり５％〜１５％乾燥重量の範囲をとることができる。
【００３６】
濃縮後、バイオマスを遠心分離または精密濾過により集め、滅菌水またはｐＨ  ５．２（±０．２）のリン酸緩衝液で数回洗浄し、従来技術により乾燥し、または微粒子状にする。
【００３７】
好ましい形態においては、微粒子化は以下の工程で行われる：
ａ）培養用肉汁からの酵母細胞の遠心分離または精密濾過；
ｂ）酵母細胞の水による洗浄と滅菌水中への再懸濁化；
ｃ）場合によっては、ｂ）で得られた再懸濁液にベントナイト、カオリン、シリカ、微細セルロース、ナトリウムレシチン塩、および／または天然のもしくは水素添加した植物または動物油を加える；
ｄ）ｃ）で得られた混合物を減圧下で２０°Ｃ〜４０°Ｃの温度で、水の含有量が０．５〜５％になるまで乾燥する；
ｅ）乾燥した材料に賦形剤を加え、混合物を直接圧縮する；
ｆ）ｅ）で得られた錠剤を顆粒化する；
ｇ）ｆ）で得られた顆粒を溶融した蝋で被覆する。
【００３８】
このプロセスは出願人により、欧州特許出願番号０５４２５０８４．０（２００５年２月１８日）として開示されている。
【００３９】
乾燥した、微粒子状の酵母のバイオマス（菌体）は、重量が１．０〜２．５ｇの、さらに具体的には１．３〜１．８ｇの重量の錠剤を調製するのに用いられ、含有される活性成分(S)-(+)-SAMeの量は１００〜４００ｍｇ、さらに具体的には１５０〜３００ｍｇである。
【００４０】
錠剤は、(S)-(+)-SAMe含有量の高い乾燥した酵母を用いて公知の技術により、あるいは微細結晶セルロース、シリカ、グリセロールベヘネート（glycerol behenate)、ステアリン酸マグネシウムなどのような賦形剤（excipient)を添加することにより調製することができる。このようにして得られた錠剤は、BIOGAPRESS（登録商標）VEGETAL、Labrafac（登録商標）CC、EUDRAGIT  L30D-55、酸化チタニウム、タルク、コロイダルシリカ（酸化ケイ素）、クエン酸トリエチル（triethyl citrate）、FD＆Cイエロー５などの賦形剤（excipient)により胃中での耐性に規格化するためにコーティングしてもよい。
【００４１】
本発明についてその詳細を以下の実施例により説明する。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
サッカロマイセス・セレヴィシエ酵母GNL-24/497（DBVPG8P）を、30ｇ/lのDL−メチオニンを添加したパン製造用酵母に用いられている糖蜜（molasses）を基礎とする工業用培地で、28℃で24時間増殖させる。得られたバイオマス（菌体）は遠心分離により集められ、水道水で２回洗浄される。２０％±２ｇ乾燥重量／容量及び総SAMe含有量３重量％（±０．５％）／乾燥重量のクリームが得られる。１０リットルの培養容器に対する培地が調製され、これは以下を含む。
グルコース８２g/l、DL-メチオニン１２ｇ／ｌ、Ｎａ2ＮＯ3１０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4３．５ｇ／ｌ、ＫＯＨ０．３８５ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4７．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4０．５ｇ／ｌ、脱泡剤０．０３ｇ／ｌ
培地は、２８℃に加熱され、クリームは、１００ｇ／ｌ（乾燥重量）の濃度が得られるまで添加される。
活性化条件：
撹拌２００ｒｐｍ、通気０．２５v/v/分
約１２時間後のグルコース消費の終了時に、菌体は遠心分離により集められ、４．５％が（R)-(+)-SAMeアイソマーおよび９５．５％が（S)-(+)-SAMeアイソマーである総SAMe（１１．５％）を含むバイオマスの１００〜１０２ｇ／ｌ（乾燥重量）が回収される。
【００４３】
バイオマスは２８℃で水分含有量０．５％以下（重量／重量）まで乾燥された。
【００４４】
分析により、（R)-(+)-SAMeアイソマーの含有量が５％より低く、（S)-(+)-SAMeアイソマーが９５％を越えていることが確認された。
【００４５】
（実施例２）
バイオマスは２回活性化される以外は実施例１に従った。４．３％（重量／重量）の（R)-(+)-SAMeアイソマーと９５．７％の（S)-(+)-SAMeアイソマーである、１４．２重量％／乾燥重量の総SAMeが得られる。
【００４６】
（実施例３）
バイオマスは３回目の強化工程にかける以外は実施例１及び２に従った。４．４％（重量／重量）の（R)-(+)-SAMeアイソマーと９５．６％の（S)-(+)-SAMeアイソマーである、１５．１重量％／乾燥重量の総SAMeが得られる。
【００４７】
（実施例４）
ベンチナイトを添加し、５ミリバールでの真空下３２℃（±２℃）で乾燥させ、微細粉に粉砕し、以下に示す成分でのマイクロカプセル化のための造粒を行うことによるマイクロカプセル化をする以外は実施例１及び２に従った。
・サッカロマイセス・セレヴィシエ粉体：１０（ｇ％）
・マンニトール：５０
・微細結晶（microcrystalline)セルロース：１０
・コロイダルシリカ（酸化ケイ素）：２
・ステアリン酸マグネシウム：３
・グリセロール  ベヘナート：５
・水素化植物脂肪（hydrogenerated vegetable fat:BiogapressVegetal 8M297、GATTEFOSSE)２０
【００４８】
粉体は、水素化植物脂肪以外の全ての成分とよく混合される。混合物は直径２０〜２５ｍｍの錠剤の形成に用いられ、これは更に、直径３００〜１５００μｍの粒に振動造粒機により造粒される。得られた粒剤は、再回転スクリュー混合機（recirculating screw mixer)を用いて溶融水素化植物脂肪によりコーティングされ、環境温度（室温）で冷却されて、５００〜１６００μｍの３．０（±５％）×１０9CFU／ｇのマイクロカプセルを製造する。
【００４９】
（実施例５）
実施例１に記載のとおりサッカロマイセス・セレヴィシエ酵母GNL-24/497（DBVPG8P）を調製し、乾燥した。
【００５０】
乾燥バイオマスは環境温度（室温）（T=２５±２℃、RH＝６０±５％）での安定化プログラムにかけた。分析用として、菌体を４℃で機械的に溶解させた。以下の表はその結果を示す。
【００５１】
【表１】
0005037501.tif 000003
【００５２】
（実施例６）
実施例１〜４に示されるとおり、乾燥バイオマスから公知の技術に従って以下の組成の錠剤が調製された。
【００５３】
【表２】
0005037501.tif 000004
【００５４】
（実施例７）
実施例１〜４に示されるとおり、乾燥バイオマスから公知の技術に従って以下の組成の錠剤が調製された。
【００５５】
【表３】
0005037501.tif 000005
【００５６】
＊LABRAFAC(トリグリセリド鎖）
＊＊EUDRAGIT（メタクリル酸の共重合体）
＊＊＊FD（tartrazine）
【００５７】
（実施例８）
実施例７にかかる錠剤を、PHARMATEST PTL-5を用いたヨーロッパ薬局方に従って胃耐性試験にかけた。１時間後において錠剤は完全な状態を保っていた。