(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え融合タンパク質が成分Ａ及び成分Ｂを有し、成分ＡがＴＮＦサイトカインの細胞外部分であり、成分ＢがＡＣＲＰ３０タンパク質のマルティマー化する及びオリゴマー化する断片を有し、第３の分子の作用なしで、マルティマー化又はオリゴマー化できる、組み換え融合タンパク質。
【請求項２】
成分Ｂは、ｍＡＣＲＰ３０のアミノ酸１８〜１１１の配列について下記に示したアミノ酸配列：
【化１】
0005031165.tif 000002
又はｈＡＣＲＰ３０のアミノ酸１８〜１０８の配列について下記に示したアミノ酸配列：
【化２】
0005031165.tif 000003
を有する、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項３】
成分ＡがＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ３０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、Ｌｔａ、Ｌｔａｂ２、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１−ＢＢ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡ、ＶＥＧＩ及びＢＡＦＦからなるグループから選択されるＴＮＦ−サイトカインの断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項４】
成分Ａが、ヒトＦａｓＬの１３９〜２６１位のアミノ酸からなる細胞外ドメイン、ヒトＴＲＡＩＬの９５〜２８１位のアミノ酸からなる細胞外ドメイン、ヒトＣＤ４０Ｌの１１６〜２６１位のアミノ酸からなる細胞外ドメイン及びマウス又はヒトＴＮＦαの７７〜２３５位のアミノ酸からなる細胞外ドメインからなる群から選択されるＴＮＦサイトカインの断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項５】
組み換え融合タンパク質が成分Ａ及び成分Ｂの間にリンカー配列を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え融合タンパク質のバイマー又はオリゴマー。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを有することを特徴とする、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターでトランスフェクションされていることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項６に記載のバイマー又はオリゴマーを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１１】
過剰炎症性障害、自己免疫疾患、高アポトーシス反応又は低アポトーシス反応に起因する疾患、感染性疾患、腫瘍疾患、及び／又は内分泌疾患の治療のために用いられる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
感染性疾患がウイルス性の感染性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍がリンパ系の腫瘍である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
腸管外又は経口投与のための、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項６に記載のバイマー又はオリゴマーを含んでなる、インビトロ診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーに関し、その際、前記の組み換え融合タンパク質は少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１つの成分Ｂを有する。さらに、本発明は、医薬品を製造するためのこの種のバイマー又はオリゴマーの使用もしくはインビトロ−診断のためのその使用に関する。最後に、本発明は、成分Ａ及び成分Ｂを有し、その際、成分Ｂは、Ｃ１ｑ−タンパク質又はコレクチンの種類からなるグループから選択されるタンパク質のマルティマー化及びオリゴマー化する断片又はこのような断片の官能性の誘導体を含有する融合タンパク質にも関する。この種の融合タンパク質をコードするＤＮＡ−配列並びにＤＮＡ配列を有する発現ベクター及びＤＮＡ配列もしくは発現ベクターを有する宿主細胞も本発明の対象である。
【０００２】
生理学的にダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーとして出現するタンパク質は自然界においても多数存在する。溶液中でダイマー化又はマルティマー化するタンパク質の表面に関する相互作用に基づき、タンパク質は濃度に依存するか又は環境に依存して、自発的に又は例えば動的に遅れて堆積する。これは、疎水性の相互作用、水素結合及び／又はクーロン力が原因である。
【０００３】
このほかに、特定のタンパク質の場合、特異的な構造に依存する分子間の超二次構造を形成し、それによりタンパク質のダイマー又はタンパク質のマルティマーを形成する構造モチーフが見られる。超二次構造の形成は、このダイマー又はマルティマーを形成するタンパク質の特徴的なアミノ酸配列に起因する。超二次構造として、例えば、いわゆる「コイルド−コイル−ヘリックス（Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ−Ｈｅｌｉｃｅｓ）」が挙げられ、これが、コイルド−コイル形を形成するそれぞれのタンパク質において生じる特徴的なα−ヘリックスの相互作用によりタンパク質のダイマー化又はマルティマー化を引き起こす。タンパク質の分子間の「ダイマー化又はマルティマー化ドメイン」としてのコイルド−コイル−ヘリックスは、構造上二本鎖又は多本鎖の相互にねじれたスーパーヘリックスを示す。この種のコイルド−コイル−モチーフは特に細胞外のタンパク質ダイマー又はタンパク質マルティマーにおいて発生し、特に結合組織のタンパク質又はタンパク質複合体において発生する。
【０００４】
例えば、Ｂｅｃｋら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）  ２５６，９０９−９２３）は結合組織タンパク質、いわゆる軟骨マトリックスタンパク質（ＣＭＰ）を記載しており、この結合組織タンパク質のホモトリマーへの凝集は、コイルド−コイル−モデルを有する三重らせんに起因し、前記の三重らせんは３つの相補的ヘリックス（それぞれポリペプチドの成分として）の堆積の結果である。このような三重らせんを形成するヘリックスのアミノ酸配列についてこの場合７つのモデル（ａｂｃｄｅｆｇ）nが特徴的である。位置ａ及びｄのこのアミノ酸は、通常、無極性の側鎖を有し、それにより上記のスーパーヘリカル構造の形成（この場合、３本のヘリックスからなる三重らせんとして）を可能にする。
【０００５】
さらに、それどころか他の細胞外マトリックスタンパク質（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ））の場合には５本のヘリックスが５本鎖コイルド−コイル−ヘリックスの形で相互に作用し、それによりペンタマーを形成することができることが文献に記載されている。（Ｋａｊａｖａ，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４：２１８−２２６  （１９９６）；Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７４，７６１−７６５，１９９６）。
【０００６】
コラーゲン類からなるタンパク質に所属しないマトリックスタンパク質ＣＯＭＰ及びＣＭＰの他に、さらに、コラーゲン類からなるタンパク質の場合でも、特別な構造によるマルティマー化現象が超二次構造を形成することにより見られる。この場合、コラーゲン繊維の構造は３本のらせん状にねじれたポリペプチドからなるトロポコラーゲンに特徴がある。毛髪のプロトフブリッレ（Ｐｒｏｔｏｆｆｂｒｉｌｌｅ）は、左巻きのモチーフ「コイルド−コイル」を有するα−ケラチンからなる三重らせんから構築されている。
【０００７】
リガンドの活性を高めるために、Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９４，１６６３−１６６８，１９９７）は、リガンド機能とマトリックスタンパク質ＣＯＭＰの「コイルド−コイル−ドメイン」とを有する短いペプチドを有する融合タンパク質を使用することを提案している。このペンタマーについては高められた活性が検出されるが、その際、この方法ではより高い構造の凝集体は得ることができない。
【０００８】
さらに、それぞれのマルティマー化する配列断片内のその配列相同性に基づき、タンパク質Ｃ１ｑ、コラーゲンα１（Ｘ）、α２（ＶＩＩ）、越冬タンパク質、ＡＣＲＰ３０、内部の耳構造タンパク質、セレベリン及びトリマーはタンパク質種としてＣ１ｑ−種の名称の元にまとめられており（Ｋｉｓｃｈｏｒｅ及びＲｅｉｄ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４２  （１９９９）  １５−２１）、前記の種は同様に構造によってダイマー又はマルティマーとして存在する。この種内に現れるマルティマー化特性を有するタンパク質の中で、例えば相補システムから公知のタンパク質Ｃ１ｑの構造は、それぞれ球形の、いわゆる「ヘッド」−ドメイン及び「コラーゲン類似の」ヘリックス配列断片を有するモノマーにより特徴付けられる。コイルド−コイル−三重らせんを形成するこのヘリックス配列断片を介してモノマーはトリマー化する。この６つのＣ１ｑトリマーは１つのオリゴマーを形成し、その際、タンパク質トリマーのオリゴマー化は個々のコイルド−コイル−三重らせんの間の相互作用に起因する。この結果、この構造的配置は、タンパク質もしくはマルティマー化された（オリゴマー化された）タンパク質複合体Ｃ１ｑにおいて、「ブーケ」として表される構造を生じ、その際、１８個の球状のＣ末端配置された「ヘッド」−ドメインが結合してトリマーから六量体になることが確認される。
【０００９】
タンパク質Ｃ１ｑの場合と類似の構造は、タンパク質ＡＣＲＰ３０の場合にも、同様にＣ１ｑ−種からのタンパク質も見られる（Ｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１，Ｎｒ．１８，１０６９７−１０７０３，１９９６）。脂肪細胞から分泌される血清タンパク質は、優勢な確率で、トリマーのクアトロマーであり、この場合、Ｃ１ｑタンパク質の場合でも同様に、球状のＣ末端ドメインはコラーゲン類似の三重らせんを介して結合する。推測によりこの三重らせんの４つは、相応する相互作用により最終的に再びオリゴマーを形成する。Ｓｈａｐｉｒｏ及びＳｃｈｅｒｅｒ  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９８，８：３３５−３３８）の刊行物には、ＡＣＲＰ３０のホモトリマーのＸ線構造分析を用いて測定された構造が示されている。
【００１０】
さらに、この文献からはコレクチンのクラスからのタンパク質が公知であり、このタンパク質はコラーゲン類似ドメイン、頸部領域及びさらに球状のカルボキシ末端のレクチン結合ドメインにより特徴付けられる。コレクチンは生理学的にトリマーのオリゴマーとして出現する。このように、タンパク質の肺界面活性タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）及びマンノース−結合タンパク質（ＭＢＰ）はそれぞれコレクチンの種からのその「コラーゲン類似の」ドメインの相互作用によってトリマー化され、最終的にトリマーのヘキサマーとして存在する（Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１，１９９６，２９−３５）。それに従って、コレクチンの名称で公知のタンパク質もマルティマー（例えばトリマー）のオリゴマー（例えばヘキサマー）を形成する。
【００１１】
さらに、この文献からは、多数の生理学的にシグナル分子として作用するタンパク質が特定の状態においてだけ生物学的シグナルを変換できることが記載されている。例えば膜質に配置されたＦａｓＬは生物学的な、つまりアポトーシスの作用があるが、細胞外タンパク質断片が膜質の断片から脱離（いわゆるｓＦａｓＬ）した後は膜に結合していないｓＦａｓＬ−フラクションは生理学的に目的細胞にアポトーシス作用をもはや及ぼすことができない。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８７，Ｎｏ．８，１９９８，１２０５−１２１３）の刊行物には、前記したように膜質タンパク質断片から脱離した後に得られるｓＦａｓＬ−トリマーの生物学的作用は、それにもかかわらず架橋する抗体の使用によってその生理学的機能に関して再活性することができることが記載されている。このため、ＦａｓＬのトリマー化ドメイン、短いリンカー配列及びフラッグ−マーカー（フラッグ−アミノ酸配列（一文字コード）ＤＹＫＤＤＤＤＫを有する）からなる融合タンパク質を構築し、発現し、この種の構造に制限されない（つまり特別な二次構造−相互作用を介在せずに超二次構造を形成する結果となる）トリマー化された融合タンパク質を、フラッグ−マーカーに対して結合する抗体によって架橋した。
【００１２】
この種の抗体結合により架橋したｓＦａｓＬ−分子は、架橋していないｓＦａｓＬ−トリマーと比較して特異的なアポトーシス活性の明らかな向上を示す。しかしながら  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらが提案したこの手法は、トリマー化ドメインを有する組み換えられた、膜に結合していないＦａｓＬ−タンパク質の他に特異的な抗体を使用しなければならず、つまり生物学的活性の向上は他の分子フラクションの供給によってのみ達成されるという欠点を有する。さらに、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらにより提案された教示により、マルティマーの正確に設定された又は決定可能なオリゴマー化度を保証するのは不可能である。この抗体により、つまりＦａｓＬ−トリマーが結合してダイマーになるか又はオリゴマー化された複合体から巨大なｓＦａｓＬ−／抗体−凝集物までの広い帯域が出現することになる。例えば医学的用途のために、最大の作用を有する正確に定義された生成物が要求されるので、従って、結局、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらにより提案された方法はｓＦａｓＬ−活性を再活性化するかもしくは高めるために有効ではない。
【００１３】
本発明の中心的な課題は、先行技術の欠点を回避し、特に向上された生物学的活性を有するか又は生物学的活性を再活性化させる化合物を提供することであった。
【００１４】
前記の課題は、請求項１記載の対象により、つまり、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーにおいて、組み換え融合タンパク質が少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１つの成分Ｂを有し、その際、成分Ａは生物学的機能を有する、特に結合機能を有するタンパク質又はタンパク質断片を有し、成分Ｂは、生物学的機能を有する組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーを第三の分子を作用させずにバイマー化又はオリゴマー化するか又は融合タンパク質をダイマー又はマルティマーに凝集させ及びこのダイマー又はマルティマーを同時に第三の分子を作用させずに結合させてバイマー又はオリゴマーにするタンパク質又はタンパク質断片を有することにより解決される。
【００１５】
本発明の表現において、ダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーの概念は、マルティマーの名称にまとめられ、これらは２つ、３つ、４つ又は５つのまとめられたポリペプチド（タンパク質）からなるタンパク質複合体であると解釈される。それに対して、より高次の構造の凝集体は、つまり前記の意味のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーの２つ以上の凝集物がバイマー又はオリゴマーとして表される。生物学的機能を有するタンパク質又はタンパク質断片（融合タンパク質中の成分Ａ）とは、抗体又はレセプターにとって全く特別にリガンド機能を有する特別なタンパク質（つまり、１つ又は複数の分子との結合パートナーとして相互作用することができ）、修飾されたアミノ酸配列、例えば共有又は非共有で結合した作用物質（場合により有機化学的性質）を有するアミノ酸配列、抗体又は抗原結合部位を有する抗体の断片又はホルモン、例えばペプチドホルモンであると解釈される。特に、本発明は、融合タンパク質中の成分Ａとして、生物学的にすでにモノマーとして活性でありかつ相応して本発明による複合体の構成成分としてその作用を向上させるシグナルタンパク質のアミノ酸配列であるか又は本発明により誘導されるマルティマー化又はオリゴマー化によるか又は本発明によりもっぱら誘導されるオリゴマー化（融合タンパク質の成分Ａがすでに存在する場合）により始めて活性化されるシグナルタンパク質のアミノ酸配列である。生理学的に膜質のシグナルタンパク質の場合、例えばＴＮＦ−サイトカインの場合、膜外の、特に細胞外のタンパク質断片を有する分解生成物であるのが有利である。しかしながら、抗原として作用することができるアミノ酸配列も、成分Ａとして組み換え融合タンパク質中に使用することができる。最終的に、成分Ａとしてレセプター、例えばＴＮＦ−レセプター種（例えばＦａｓＲ）からのレセプター、又はこのようなレセプターの断片もしくは誘導体を使用することができ、これは同様に結合機能を有し（従って他の分子との結合パートナーとして相互作用する）、かつ本発明の範囲内で従って「リガンド」の概念に相当する。生物学的レセプターのこの種の結合可能な断片は、相補的な生物学的リガンドが患者において非生理的に高い濃度で存在する場合に、特に医薬としての使用に適している。
【００１６】
有利な実施形態において、成分Ａは本発明によるオリゴマー中に存在するマルティマー、つまりダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマー、同様の成分Ａ（ホモダイマー又はホモマルティマーのオリゴマー）又は異なる成分Ａ（ヘテロダイマー又はヘテロマルティマーのオリゴマー）を有することができる。このように、多様な成分Ａを有するタンパク質は、本発明によるオリゴマーのダイマー又はマルティマー内で場合により多様な生物学的機能と結合することができる。バイマー又はオリゴマーの形に凝集した個々のヘテロダイマー又はヘテロマルティマーは、同様に同じ又は異なることができ、つまり本発明によるバイマー又はオリゴマーは場合により多様なヘテロダイマー又はヘテロオリゴマーから構成されることができる。
【００１７】
もちろん、この融合タンパク質はそれぞれのダイマー又はマルティマー中でバイマー又はオリゴマーのサブユニットとして同一であることもでき、それに対してダイマー又はマルティマーとして表される個々のサブユニットはバイマー又はオリゴマー中で異なることもできる（ホモダイマー、ホモトリマー、ホモクアトロマー又はホモペンタマーのヘテロバイマー又はヘテロオリゴマー）。このように、例えばトリマーの本発明によるヘキサマーは成分Ａに関して６種までの異なるホモトリマーが会合していることができる。このように、バイマー又はオリゴマー中での成分Ａの選択、配置、特異的結合及び／又は数によって、一般に繊細に調整された生物学的活性を生じさせることができる。特定の生物学的作用が、少なくとも２つのリガンド（本発明の拡張された範囲内ではなく、生物学的意味において）の相互作用により始めて、所望の生物学的作用、例えば細胞活性を引き起こすことは公知である。これは、例えば特定のインターロイキンとの組み合わせた場合に、その作用に関してＴ細胞活性剤又はＢ細胞活性剤として期待される。本発明の場合に、この種の組み合わせて始めて作用するエフェクターは、本発明による複合体中に配置することができる。一般に、例えばそのそれぞれの成分Ａに関して異なるオリゴマーを含有する組成物を提供することも考えることもできる。
【００１８】
さらに有利な実施形態において、組み換え融合タンパク質中の成分Ａは、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン又はここれらの断片、有利に結合可能な断片である。しかしながら、前記のペプチド及び／又はタンパク質の機能的誘導体も、本発明のオリゴマーの構成成分である組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして使用することができる。
【００１９】
生物学的に活性のタンパク質、タンパク質断片又はペプチドの機能的誘導体として、特に、生物学的機能を維持するが、相応する天然の配列とは配列上に差異があるタンパク質が挙げられる。この配列の差異は、１以上の挿入、欠失又は置換であることができ、この場合、使用された誘導体と天然の配列との間では少なくとも７０％の配列の相同性が有利であり、少なくとも８５％の配列の相同性が特に有利である。特に、機能的誘導体の概念は、生理的配列と比較して同類置換を有するようなアミノ酸配列である。同類置換として、同じクラスから由来するアミノ酸が相互に交換されたような置換が挙げられる。特に、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、正又は負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、側鎖中に脂肪族基を有するアミノ酸又は水素結合を行うことができる側鎖を有するアミノ酸、例えばヒドロキシ官能基を有する側鎖を有するアミノ酸が存在する。このことは、例えば極性の側鎖を有する１つのアミノ酸が、同じ極性の側鎖を有する他の１つのアミノ酸と置き換えられるか又は例えば疎水性側鎖を特徴とする１つのアミノ酸が、同様に疎水性の側鎖を有する他の１つのアミノ酸と置き換えられることを意味する（例えば、セリン（トレオニン）をトレオニン（セリン）と置き換えるもしくはロイシン（イソロイシン）をイソロイシン（ロイシン）と置き換える）。
【００２０】
リガンドとは、本発明の範囲内で、全ての結合反応に関与する分子であると解釈される。リガンドは、従って、通常レセプターとして表されるタンパク質である。レセプターがシグナル分子と結合するような場合でも、このようなレセプターは本発明の範囲内ではリガンドである。
【００２１】
本発明の場合に、組み換え融合タンパク質のトリマーのオリゴマー、特にトリマーのトリマー又はクアトロマー（３×３又は４×３）又はトリマーのヘキサマー（６×３）が有利である。
【００２２】
組み換え融合タンパク質中の成分ＡがＴＮＦ−サイトカインの種類からのサイトカイン、このようなＴＮＦ−サイトカインの断片、又はＴＮＦ−サイトカインの機能性の誘導体又は相応するＴＮＦ−サイトカイン断片である場合に、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーが特に有利である。この場合、使用したＴＮＦ−サイトカインは目標細胞で相応するレセプターに結合することにより、アポトーシス作用、増殖作用又は活性化作用を引き起こすことができる。制限のない列挙において、ＴＮＦ−サイトカインとして、特にタンパク質のＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＣＤ３０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、Ｌｔａ、Ｌｔａｂ２、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１−ＢＢ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡ、ＶＥＧＩ及びＢＡＦＦが挙げられる。組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして、この場合有利に、前記の膜質ＴＮＦ−サイトカインの細胞外断片又はその機能性の誘導体が使用される。それぞれの生物学的機能性、特にそれぞれのレセプターとの結合能力が維持されている場合に、この分解生成物が特に有利である。上記の範囲内で、前記のＴＮＦ−サイトカインの機能性の誘導体又はＴＮＦ−サイトカインの断片も、融合タンパク質の成分Ａとして使用することができる。特に有利な実施形態において、組み換え融合タンパク質の成分Ａは、ｈＦａｓＬ（アミノ酸１３９〜２６１）、ｈＴＲＡＩＬ（アミノ酸９５〜２８１）、ｈＣＤ４０Ｌ（アミノ酸１１６〜２６１）及びｍ又はｈＴＮＦα（アミノ酸７７〜２３５）からなるグループから選択される。
【００２３】
しかしながら、レセプター（膜質の又は細胞内のレセプター）、特にＴＮＦ−サイトカインの種類のタンパク質のレセプター、特に前記のＴＮＦ−サイトカインの生理学的レセプター、もしくはそのレセプターの断片又は誘導体も、有利な実施形態において、組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして使用される。レセプターの断片を成分Ａとして使用する場合には、特に生理学的に膜外に配置されているこの種のレセプターの生理学的タンパク質配列の断片である。この場合、この種のレセプターの細胞外断片が特に有利に挙げられる。例えば、本発明の場合、レセプターの１つ又は複数の結合ドメイン、特にＴＮＦ−サイトカインの種類のサイトカインが結合するレセプター（例えばＦａｓＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＴＮＦ−Ｒ１及び／又はＴＮＦ−Ｒ２）の１つ又は複数の結合ドメインは、ダイマー化する免疫グロブリン（ダイマー化するＦｃ−断片）上に載せられていることができ、このダイマーは、ダイマー又はマルティマーをバイマー化又はオリゴマー化することができる成分Ｂ、例えばコラーゲン類似の断片により、バイマー化又はオリゴマー化されて、本発明によるバイマー複合体又はオリゴマー複合体になることができる。この場合、例えばダイマー又はマルティマーのテトラマー（ＡＣＲＰ３０のテトラマー化する断片により）、ダイマー又はマルティマーのペンタマー（例えばＣＯＭＰ−複合体からのモノマーの、成分Ｂとして使用された相応する配列断片により）又はダイマー又はマルティマーのヘキサマー（例えばＣ１ｑ−複合体のモノマーからのヘキサマー化する断片により）が挙げられる。
【００２４】
本発明により、従って次の可能性が生じる：本発明によるオリゴマーの成分となるべき組み換え融合タンパク質のために選択された成分Ａは、すでにそれ自体溶液の形でダイマー又はマルティマーとして存在する。成分Ｂは、このような場合に、成分Ａのダイマー化又はマルティマー化をさらに強化し、主に組み換え融合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化を生じさせる。この状況は、例えば、成分Ａとして、すでに溶液の形で一般的にトリマー化されている少なくとも１つのＴＮＦ−リガンドもしくはその断片又は誘導体が、融合タンパク質の成分としてオリゴマー化されている場合に見られる。しかしながら、成分Ａがそれ自体溶液の形で表面−相互作用によって媒介されるダイマー化又はマルティマー化を示さない場合には、成分Ｂは本発明の場合に成分Ａのダイマー化又はマルティマー化並びにダイマー化又はマルティマー化された組み換え融合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化も保証しなければならない。これは、例えば一般に、レセプター又はその断片が組み換え融合タンパク質中の成分Ａを形成する場合に必要である。
【００２５】
本発明の範囲内で、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーも開示され、この場合、有利に成分Ａは抗原又は抗原の断片である。この場合、ウイルス、バクテリア又は原虫の病原体の抗原を使用するのが有利である。これは、病原体の任意の典型的な抗原、例えばタンパク質断片及び／又は特異的炭水化物構造体であることができるが、一般に、それぞれの病原体の表面抗原又は同様の抗原特性を有する病原体の表面タンパク質の断片であることもできる。この場合、例えば制限のない列挙において、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、ＨＢｓ−抗原、ｇｐ１２０、ｇｐ４１又は特定のタイプの腫瘍−抗原が考えられる。
【００２６】
しかしながら、組み換え融合タンパク質の成分Ａは、有利な実施形態において、アミノ酸配列であることができ、このアミノ酸配列はレセプターアゴニスト又はレセプターアンタゴニストのためのキャリアとして機能するために適している。薬理作用物質として活性の、小さな有機化学的分子が、一般にこの種のアミノ酸配列と共有結合することもでき、例えばエーテルル結合を介してトレオニン又はセリンと、又はアミド上の結合又はエステル結合を介して結合することもできる。本発明により、例えば１８個の融合タンパク質（例えば３×６個の融合タンパク質）とそれぞれ結合したレセプターアゴニスト又はレセプターアンタゴニストとの大きなオリゴマー複合体が提供される。それにより、例えば医学又は獣医学において薬剤として使用するために、この種の有機化学的分子と、バイマー化又はオリゴマー化されたタンパク質キャリア上に配置されたそのそれぞれのレセプターとの結合活性もしくは有効性の著しい改善が達成される。
【００２７】
ダイマー化又はマルティマー化されてバイマー又はオリゴマーの形で存在する組み換え融合タンパク質の成分Ｂは、一般にＣ１ｑ−タンパク質又はコレクチンの種類からなるタンパク質である。Ｃ１ｑ−又はコレクチンの種類のタンパク質は、このダイマー化配列／マルティマー化配列もしくはバイマー化配列／オリゴマー化配列だけが組み換え融合タンパク質中に転写されるかもしくは翻訳される場合には、組み換え融合タンパク質の成分、つまり成分Ｂとして特に有利である。天然のモノマーの配列中に含まれている少なくとも球状の「ヘッド」−ドメイン（図１４）は、翻訳産物としても、本発明による組み換え融合タンパク質中に出現せず、従って組み換え融合タンパク質中の成分Ｂの構成要素でもない。本発明による組み換え融合タンパク質中の前記の成分Ｂは、一般にダイマー化／マルティマー化もしくはバイマー化／オリゴマー化する機能性を少なくとも重複して有している配列を有する、それというのも、成分Ｂとして使用される、前記の種類のタンパク質のコラーゲン−類似の断片は、例えば三重ヘリックスの結合に関与しており、これはさらに他の三重ヘリックスと共にバイマー構造又はオリゴマー構造（例えば三重ヘリックスのテトラマー又はヘキサマー）を形成することができる。
【００２８】
従って、一般に、Ｃ１ｑ−タンパク質又はコレクチンの種類からのタンパク質の、マルティマー化及びオリゴマー化する融合タンパク質は、ダイマー化又はマルティマー化もしくはバイマー化及びオリゴマー化に関与するドメインを成分Ｂとして有し、そのそれぞれの「ヘッド」−ドメインは成分Ａとして他の同様に生物学的機能を利用するタンパク質又はタンパク質断片により置き換えられる。「組み換え融合タンパク質」の概念は、本発明の範囲内で、少なくとも１種の成分Ａと少なくとも１種の成分Ｂとが組み換え融合タンパク質中に人工的に融合されているものであると、つまり融合タンパク質は、本発明の範囲内で、天然に出現するタンパク質ではないと解釈される。
【００２９】
Ｃ１ｑ−タンパク質の種類又はコレクチンの種類からのタンパク質の機能的な、つまりバイマー化する又はオリゴマー化する誘導体もしくは前記のタンパク質の断片の誘導体のは、バイマー又はオリゴマーを形成するために組み換え融合タンパク質の凝集のための成分Ｂとして使用することができる。この場合、成分Ｂは、タンパク質Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ（肺表面活性タンパク質Ａ）、ＳＰ−Ｄ（肺表面活性タンパク質Ｄ）、ＢＣ（ウシ血清コングルチニン）、ＣＬ４３（ウシコレクチン−４３）及び／又はＡＣＲＰ３０もしくは前記のタンパク質の少なくとも１つ又はこのタンパク質の機能的誘導体又はこの機能的誘導体の断片のバイマー化又はオリゴマー化する断片の１つ以上の配列を含有する。組み換え融合タンパク質の成分Ｂがタンパク質Ｃ１ｑ又はタンパク質ＡＣＲＰ３０のタンパク質断片である場合に、組み換え融合タンパク質のバイマー又はオリゴマーが有利であり、この場合、このようなそれぞれのタンパク質断片は一般に天然のタンパク質Ｃ１ｑ又はＡＣＲＰ３０の球状の「ヘッド」−ドメインを有していない。
【００３０】
本発明の特に有利な実施形態として、成分Ｂが図６Ａによるアミノ酸配列（枠で囲った配列）もしくは図６Ｂによるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列の機能性の誘導体もしくはこの配列の断片を含有する組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーである。これは、一般に、例えばアミノ酸１８〜１１１を有するｍＡＣＲＰ３０（ｍ：マウス）のタンパク質の断片であるか、又は例えばアミノ酸１８〜１０８を有するヒト変異体（ｈＡＣＲＰ３０）の断片である。従って、特に、本発明の場合に融合タンパク質を提供することができ、この融合タンパク質の成分Ａ及びＢはヒト起源であり、その結果、ヒトにおける治療的使用の際に場合による免疫反応を排除することができる。
【００３１】
多様な宿主生物からの配列を有するような融合タンパク質のダイマー又はマルティマーのバイマー又はオリゴマーが特に有利である。本発明による凝集体がキメラ融合タンパク質から由来し、その際、成分Ａは成分Ｂとは異なる動物種から由来する場合に、この本発明による凝集体は特に有利である。このように、成分Ａはマウス、ラット、ブタ又は他の脊椎動物、特にほ乳類からのアミノ酸配列又はその機能的な誘導体であり、成分Ｂはヒト起源であるかもしくはその逆であるのが有利である。成分Ａがウイルス、バクテリア又は原虫からの配列であり、ヒト起源の成分Ｂと組み合わせた融合タンパク質の本発明による複合体も有利である。もちろん、本発明による融合タンパク質中の成分Ａと成分Ｂとの配列は、同じ動物種から由来することもできる。
【００３２】
本発明のもう一つの有利な実施形態において、融合タンパク質のマルティマー化及び／又はオリゴマー化は、組み換え融合タンパク質中に成分Ｂとして存在する６個以上のアミノ酸の、有利に８〜２０個のアミノ酸の短いアミノ酸配列によって行われる。この短いアミノ酸配列により一般に達成される、すでにそれ自体超二次構造によってではなく、表面相互作用によって溶液の形でダイマー又はマルティマーとして存在する融合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化は、有利に、組み換え融合タンパク質中の特異的アミノ酸配列により可能となるジスルフィド架橋の形成に基づく。このことは、成分Ｂが有利に少なくとも１つのシステインを有し、このシステインが酸化条件下で、他の少なくとも１つのダイマー又はマルティマーの融合タンパク質の少なくとも１つのシステインと共有結合を形成できることを意味する。成分Ｂが短いバイマー化又はオリゴマー化する８〜２０個のアミノ酸配列を含有する有利な場合では、例としてアミノ酸配列（一文字コード）ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬが挙げられる。この１８個のアミノ酸を有する配列は位置１１でシステイン残基を有し、このシステイン残基がダイマー又はマルティマーの間でジスルフィド架橋を形成することができる。
【００３３】
この１８個のアミノ酸を有する配列の機能的な誘導体又は断片も成分Ｂとして使用できる。この場合、特に配列ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＳＡＧＩＲＬを挙げることができ、この場合、位置１１でシステイン残基はセリン残基に置き換えられているが、この残基は融合タンパク質−マルティマーのバイマー化又はオリゴマー化を保証することができる。
【００３４】
この融合タンパク質は有利な実施形態においても、ダイマー化した又はマルティマー化した融合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化を介してより高次の構造の凝集体を形成することができるように構成されている。２つ又はそれ以上のバイマー又はオリゴマーを有するより高次の構造のこの凝集体は、例えば抗体を介して架橋することにより提供することができる。この抗体は、本発明による複合体の１つ又は複数の誘導タンパク質上にあるエピトープ、有利に成分Ｂの１つのエピトープに結合する。しかしながら、この融合タンパク質も成分Ａ及びＢの他にさらに、架橋する抗体に対する抗原として作用する配列断片を有することもできる。本発明の範囲内で、この関連において、いわゆるＴａｇ−配列、例えばＦｌａｇ−Ｔａｇ、つまりアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、又は同様に例えばＨｉｓ−Ｔａｇ（複数の連続するヒスチジンを含有）が有利である。
【００３５】
しかしながら、本発明の範囲内で、より高次の構造の凝集体は、１つ以上の成分Ｂを組み換え融合タンパク質中に含有されていることにより提供されるのが特に有利である。従って、より高次の凝集体の形成のために、成分Ｂ１はバイマー又はオリゴマーの形成のために含まれ、さらに一般に成分Ｂ１とは異なっている少なくとももう一つの成分Ｂ（例えば成分Ｂ２）を含むのが有利である。本発明によるバイマー又はオリゴマーの融合タンパク質中に少なくとも出現しなければならない成分Ｂ２は、バイマー又はオリゴマーが架橋してより高次の構造の凝集体になることを保証する。例えば、成分Ｂ１はＣ１ｑ−タンパク質又はコレクチン−タンパク質の種類からのタンパク質のバイマー化する又はオリゴマー化する断片であり、成分Ｂ２は少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成する８から例えば２８個のアミノ酸の長さの配列である。２つのことなるオリゴマーの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成する場合に、より高次の構造の本発明による凝集体、例えばオリゴマーのバイマーが提供される。
【００３６】
さらに、成分Ａと１又は複数の成分Ｂとの間に、又は複数の成分Ｂが融合タンパク質中にが入する場合、少なくとも２つの成分Ｂとの間に、いわゆるリンカー配列を挿入するのが有利である。このリンカー配列は、組み換え融合タンパク質中の異なる機能性成分の構造的な分離のために用いられ、有利に「ヒンジ」−機能も担うことができる、つまりフレキシブルな構造のアミノ酸配列である。
【００３７】
従って、本発明の場合に全く一般的に、より高い生物学的有効性及び／又は相補的タンパク質とのより高い結合活性を特徴とするバイマー又はオリゴマーもしくはより高次の構造の凝集体を開示することができる。このように、本発明の他の対象として存在する、本発明の範囲内でリガンド機能を有する生体分子又は薬剤の生物学的有効性を高めるため及び／又は結合活性を高めるために用いる方法も開示される。この種の方法は、生物学的機能を有するタンパク質又はタンパク質断片である少なくとも１つの成分Ａを、少なくとも１つのダイマー化するか又はマルティマー化しかつバイマー化するか又はオリゴマー化する成分Ｂと組み換えることを特徴としており、その際、成分Ａの生物学的活性の向上及び／又は結合活性の向上は、組み換え融合タンパク質が引き続きマルティマー化及びオリゴマー化によりバイマー化又はオリゴマー化されてダイマー又はマルティマーのバイマー又はオリゴマーになることにより達成される。成分ＡがＴＮＦ−サイトカイン、ＴＮＦ−サイトカインの断片又はこのようなタンパク質又はタンパク質断片の機能的誘導体である場合に、この方法は特に有利である。さらに有利な方法は、少なくとも１つの成分Ａの少なくとも１つの成分Ｂとの組み換えにより組み換え融合タンパク質にすることであり、その際、少なくとも１つの成分Ａはレセプター又は断片、有利にＴＮＦ−レセプターである。本発明によるこのような方法の１つの有利な実施形態に関して、同様に本発明によるバイマー又はオリゴマーについて予め記載された有利な実施形態が該当する。
【００３８】
本発明のバイマー又はオリゴマーは、医薬の製造、もしくは疾患又は障害の治療、医学的、つまりヒト医学的又は獣医学的使用が挙げられる。バイマー又はオリゴマーから本発明により形成されたより高次の構造の凝集体も、医薬としての使用もしくは医薬の製造のために適している。広範囲の疾患又は障害が、本発明の請求項に記載されたバイマー又はオリゴマーもしくはより高次構造の凝集体によって治療することができる。制限のない列挙において、この種のバイマー又はオリゴマーもしくはより高次構造の凝集体は、過剰炎症性障害、自己免疫疾患、高アポトーシス反応又は低アポトーシス反応に起因する疾患、神経変性疾患の治療するための医薬の製造のため、同様に感染性疾患、腫瘍疾患及び／又は内分泌疾患の治療のための医薬の製造のために使用することができる。感染性疾患においては、バクテリア感染又は原虫感染、特にウイルス感染の場合のバイマー又はオリゴマーの投与が挙げられ、この場合、組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして抗体又はパラトープを有する抗体の断片が特に有利である。バイマー又はオリゴマー又はこのより高次の構造の凝集体は、疾患が、例えば腫瘍、特にリンパ系の腫瘍の治療のため又はその治療のための医薬の製造のために、生物学的活性のサイトカインを用いた治療が必要となる場合に特に適している。
【００３９】
さらに、本発明によるバイマー又はオリゴマーを、感染性疾患に対する能動的又は受動的免疫化のためのワクチンとして又はワクチンの製造のために使用することができる。この場合、組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして一般にワクチン化のために適した抗原が、能動的免疫化の場合に使用される。このために、バクテリア、ウイルス又は原虫、例えばプラスモジウム又はトリパノソーマの特別な表面抗原又は表面抗原の断片が提供される。制限のない列挙において、バイマー又はオリゴマー又はその凝集体を含有するワクチン（この場合、組み換え融合タンパク質は少なくとも１つの成分Ａ、つまり病原体の１又は複数の同じ又は異なる抗原を有する）は、風疹、麻疹、ポリオ、狂犬病、破傷風、ジフテリア、ＢＣＧ、結核、マラリア、黄熱、ＨＩＶ又はインフルエンザ、例えばライノウイルスに対するワクチン化のために使用することができる。バイマー又はオリゴマー又はバイマー又はオリゴマーからのより高次構造の凝集体中の多様な抗原の組み合わせも本発明の場合に可能であり、この場合、同じ病原体からの異なる抗原をバイマー又はオリゴマー内で組み合わせるか、又は２以上の病原体からの抗原をバイマー又はオリゴマー内で又はより高次構造の凝集体内で組み合わせることもできる。一般的に、このために２つ以上の成分Ａ１、Ａ２〜ＡＸを、本発明によるバイマー又はオリゴマー又はより高次の構造の凝集体の成分である１つの融合タンパク質内に含有することができるか、又は少なくとも１つの成分Ａに関連して多様な２以上の融合タンパク質をバイマー又はオリゴマー又はより高次の構造の凝集体中に少なくとも１つの成分Ｂによって組み合わせられる。
【００４０】
少なくとも２つの異なる本発明によるバイマー又はオリゴマーを、医薬又はワクチンとして使用するためのもしくはそれらの製造のための組成物中に含有することもできる。
【００４１】
もう一つの本発明による実施形態において、本発明による融合タンパク質内の成分Ａは免疫調節剤、例えばインターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２である。
【００４２】
さらに、本発明の範囲内で免疫化アジュバント及び／又はワクチン化アジュバントとしての本発明によるバイマー又はオリゴマーの使用も開示される。免疫化のために投与される多くの抗体は被験者において不十分な免疫応答を引き起こすだけであることは公知である。アジュバントは免疫作用を高める課題を有する。この種のアジュバントは本発明による融合タンパク質内の成分Ａとして及びそれにより本発明によるバイマー又はオリゴマーの成分として挙げられる。例えば、成分ＡはＣＤ４０−リガンド（ＣＤ４０Ｌ）からなるアミノ酸配列又はインターロイキン、例えばインターロイキン１〜１２のいずれか１つの配列又は配列断片を含有することができる。ＣＤ４０Ｌの生理学的課題は、細胞サイクル中への休止Ｂ−細胞の移行を制御することである。本発明によるバイマー化又はオリゴマー化された複合体内に、インターロイキン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及び／又はＣＤ４０Ｌも組み合わせることができる（バイマー又はオリゴマー内での多様な組み換え融合タンパク質）か又はこれらが組成物の成分として出現し（それぞれ同じ又は異なる融合タンパク質から構成されていてもよい少なくとも２つの異なるバイマー又はオリゴマー）、前記の組成物は一般に１つ又は複数の免疫原のほかに、少なくと１つの、有利に２つ又はそれ以上の本発明によるバイマー又はオリゴマーを含有する。
【００４３】
このような組成物のバイマー又はオリゴマー又はより高次の構造の凝集体は、成分Ａに関して同じ又は異なる融合タンパク質から構成されていることができる。この場合、成分Ａとして、それぞれの共刺激する特性及び／又は免疫系（細胞性又は体液性の免疫応答）を活性化する特性を有する生理学的配列が挙げられる。これは、生理学的化合物又は合成化合物であることができる。従って、１又は複数の本発明によるバイマー又はオリゴマーを、１又は複数の免疫原の他に含有し、この場合、本発明によるバイマー又はオリゴマーは有利に、この種のバイマー化又はオリゴマー化した複合体中で１以上の免疫調節剤／免疫アジュバントを含有するように構成されている、つまりヘテロバイマー又はヘテロオリゴマーであることができるような組成物も開示される。場合により、本発明によるヘテロバイマー又はヘテロオリゴマーは、成分Ａとして免疫原を有する１又は複数の融合タンパク質、並びに成分Ａとしてアジュバント−成分、例えばＣＤ４０Ｌを有する少なくとも１つの融合タンパク質を統合することができる。本発明によるヘテロオリゴマー内でそれぞれ異なるアジュバント成分又は免疫原−成分を有する２又はそれ以上の異なる融合タンパク質も考えられる。従って、この種のホモオリゴマー又はヘテロオリゴマー又は、少なくとも１つの本発明によるヘテロオリゴマー又はホモオリゴマーを含有する組成物の、ヒト医学又は獣医学の医薬又はワクチンとしての使用も開示される。
【００４４】
バイマー又はオリゴマーは本発明の範囲内で、有利に前記の疾患又は障害の治療のため又は医薬の製造のために有利に使用され、この医薬は腸管外の、つまり例えば皮下、筋肉内又は静脈内の投与又は経口又は鼻腔内の投与に適している。ワクチンとしてもしくはワクチンの製造用のベースとしてバイマー又はオリゴマー又はこれらの凝集体を投与することは、同様に、腸管外又は経口投与形で行うのが有利であるが、しかしながら場合により鼻孔内投与形でも行うことができる。
【００４５】
本発明によるバイマー又はオリゴマーもしくはより高次の構造の凝集体は、単独で医薬として用いることができ、又は医薬の製造のために使用することもできる。これは、しかしながら他の活性作用成分と組み合わせて医薬として使用することもできる。本発明によるバイマー又はオリゴマーもしくはより高次の構造の凝集体は、調剤学的に認容性の担持剤、助剤及び／又は添加剤と組み合わせることもできる。相応する製造方法は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ■ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）に開示されており、これは本発明の開示の構成部分である。腸管外投与のために、担持材料として例えば滅菌水、滅菌食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン及び特に生体適合性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン−／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。
【００４６】
本発明によるバイマー又はオリゴマー又は相応するより高次の構造の凝集体は、有利にインビトロ診断の分野で又は例えば生化学精製法のために使用される。バイマー又はオリゴマーもしくはそれらの相応するより高次の構造の凝集体を精製カラム上で使用することも考えられ、前記の精製カラムはこの種の複合体を含有することができる。従って、本発明の範囲内で検出の目的でのこの種の複合体の使用も開示されている。
【００４７】
さらに、本発明の範囲内で、その相互作用に基づきタンパク質表面上で機能し、従ってそれ自体溶液の形でダイマー化又はマルティマー化して存在する特異的に会合するタンパク質を製造するための方法も開示されている。特に、溶液の形でトリマー化したＴＮＦ−サイトカイン又は有利にこの種のサイトカインの可溶性断片の場合に、これは特定の化学量論で純粋なフラクションの形で提供するのが望ましい。相互に会合可能な異なるタンパク質、例えば３つの異なるＴＮＦ−サイトカイン又はこの種のＴＮＦ−サイトカインの多様な断片を簡単に同時発現させる場合には、つまり同時発現したタンパク質の全ての統計学的に可能な分布が、この発現後に会合するトリマーにおいて存在し、つまり例えばタンパク質Ｐ１、Ｐ２及びＰ３からなる所望のトリマー、同様に２つのタンパク質Ｐ１と１つのタンパク質Ｐ３とからなるトリマーなども存在する。
【００４８】
本発明によるオリゴマーは、特定の所望のヘテロマルティマーを得るために、例えばＴＮＦ−サイトカインのヘテロトリマー又はこの種のＴＮＦ−サイトカインの断片を得るために方法に従って使用することができる。このために、異なる融合タンパク質は構築され、有利に宿主細胞内で発現される。ここで発現された融合タンパク質は、成分Ｂとしてこのようなタンパク質の配列断片を有し、このタンパク質はヘテロマルチまーのホモオリゴマーを形成する、つまり３つの異なる鎖からなるトリマーを形成し、この場合、同じトリマーがバイマー化又はオリゴマー化する。有利に、融合タンパク質中のこの成分Ｂは、相補的種類又はコレクチンの種類、例えばＣ１ｑからのタンパク質の配列断片であり、この断片はヘテロトリマーのホモヘキサマーを形成する。従って、一方の融合タンパク質内には、成分Ｂとして、ヘテロマルティマー中で鎖のマルティマー化するための天然タンパク質を想定する配列断片が、成分Ａ、例えばＴＮＦ−サイトカインと組み合わせられており、他の融合タンパク質（ヘテロトリマーの形で出現する）は、他の成分Ａ、つまり例えば他のＴＮＦ−サイトカイン又はその断片と、それぞれ他の天然タンパク質、例えばＣ１ｑ−タンパク質中に存在する、ヘテロマルティマー化するための配列断片とを組み合わせて有している。
【００４９】
有利に宿主細胞内では、ヘテロマルティマーを形成することができる異なる融合タンパク質が発現される。このヘテロマルティマーはホモオリゴマーに堆積される、それというのもこの成分Ｂは同じヘテロマルティマーだけをオリゴマー化することができるためである。本発明により、それぞれ、Ｃ１ｑのマルティマー化する及びオリゴマー化するα−、β−又はγ−鎖と組み合わされて、それぞれ異なる成分Ａ、つまり有利に異なるＴＮＦ−サイトカインを有する例えば異なる３つの融合タンパク質を発現することができる。会合するオリゴマー中には、もっぱら、全て３つのＴＮＦ−サイトカインを有するヘテロマルティマーが存在する。他の化学量論のヘテロマルティマーはそれに対して出現しない。融合タンパク質の選択によってだけ、従って、本発明の場合にその化学量論において特異的でかつ統計的分布の影響下にない生成物が得られる。
【００５０】
さらに、成分Ａと成分Ｂとの間にリンカーを有するような融合タンパク質の使用並びに所定の化学量論のヘテロマルティマーの獲得方法が有利である。リンカーが少なくとも１つのタンパク質加水分解性の断片を含有し、この断片は成分Ａを成分Ｂの（ヘテロマルティマーの）ホモオリゴマーから分離することができる場合に、このリンカーは特に有利である。従って、最終的に、もっぱら３つの異なるＴＮＦ−サイトカインからの所望のヘテロマルティマー、例えばヘテロトリマーからなるフラクションが得られる。リンカー中のタンパク質加水分解性の断片は、有利にトロンビン−コンセンサス配列である。
【００５１】
本発明のもう一つの対象として、本発明の融合タンパク質が記載され、この融合タンパク質は、この組み換え融合タンパク質が少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１つの成分Ｂを有する限り、ダイマー又はマルティマーのバイマー化もしくはオリゴマー化のために適しており、その際、前記の成分Ａは生物学的機能を有する、特に抗体又はレセプターに対してリガンド機能を有するタンパク質又はタンパク質断片、又は抗体又は抗体の断片を含有し、成分Ｂは、Ｃ１ｑ−タンパク質又はコレクチンの種類からなるグループから選択されるタンパク質の、ダイマー化するか又はマルティマー化しかつバイマー化又はオリゴマー化する断片又はこのような断片の機能的誘導体を含有する。組み換え融合タンパク質の成分Ｂが、タンパク質Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ、ＢＣ、ＣＬ４３及びＡＣＲＰ３０を含有する場合、マルティマー化する及び／又はオリゴマー化する断片この種の融合タンパク質が特に有利である。本発明のタンパク質のこのような断片の機能的誘導体も本発明の範囲内で使用することができる。融合タンパク質はこの場合、生物学的活性を付与する成分Ａの他に一般に、もっぱら凝集のために用いられる前記のタンパク質の断片を有する（しかしながら有利に球状の「ヘッド」−ドメインではない）成分Ｂを含有する。
【００５２】
本発明による融合タンパク質の成分Ｂとして有利に、リガンドＥＤＡオリゴマー化するコラーゲンドメインのアミノ酸配列、特に哺乳動物の変異体、さらに特にヒトの変異体、又はこのようなドメインのオリゴマー化する断片又は機能的な誘導体を有する配列も挙げられる。特に有利に、成分Ｂは、ヒトタンパク質ＥＤＡ又はその機能的な誘導体、例えば断片のアミノ酸１６０〜２４２を有する配列断片が使用される。これは有利にヘキサマーである。
【００５３】
本発明のもう一つの対象は、前記の種類の融合タンパク質をコードするＤＮＡ−配列である。この種のＤＮＡ−配列は、発現ベクター中で発現し、この場合、本発明による融合タンパク質に対応するＤＮＡ−配列を含有する相応する発現ベクターも本発明の対象である。さらに、本発明による融合タンパク質をコードするＤＮＡ−配列が導入されているような宿主細胞も本発明に属する。この関連で、発現ベクターがトランスフェクションされている宿主細胞が特に有利であり、この場合、発現ベクターは本発明による融合タンパク質をコードするＤＮＡ−配列を含有する。
【００５４】
本発明のもう一つの対象は、レセプター、特に、ダイマー化又はマルティマーかされて存在するＴＮＦ−サイトカインの種類からシグナル分子−リガンドを形成するレセプターである。この種のレセプター、その誘導体又はレセプター又は誘導体の断片、特にレセプターの細胞外領域を有する断片（この場合結合ドメインが有利である）は、ダイマー又はマルティマーの構成部分である融合タンパク質の成分Ａとして存在することができる。このダイマー化は免疫グロブリンの断片、特にＦｃ−フラグメントと組み換えることにより達成することができ、マルティマー化は、例えばタンパク質の相応するマルティマーかドメインと組み換えることにより達成することができる。このために、例えば、超二次構造の形成によりダイマー又はマルティマーを生じる、例えば「コイルド−コイル−ヘリックス」又は一般的なコラーゲン類似の三重ヘリックス（例えばＣＭＰ、ＣＯＭＰ、コラーゲン、ラミニン）を生じるタンパク質の全ての配列断片が適している。Ｃ１ｑ−種類からのタンパク質又はコレクチンの断片も、一般にレセプター又はレセプター断片のダイマー化又はマルティマー化のために適している。例えば、成分ＡとしてのＴＮＦ−レセプターの種類、例えばＦａｓ−レセプター（ＦａｓＲ）からの構成要素の細胞外断片を、成分ＢとしてのＣＯＭＰの相応するペンタマー化ドメインと置き換えることによりペンタマーの形で発現させることができる。この場合、レセプター又はレセプター断片を有するホモダイマー又はヘテロダイマー又はホモマルティマー又はヘテロマルティマーである。
【００５５】
レセプター又はレセプター断片を含有する成分Ａを備えた組み換えタンパク質のこのダイマー又はマルティマーも、医薬として又は医薬の製造のために用いられる。これは特に、相応するレセプターリガンドの高められた細胞外濃度が疾患症状において生じる場合に用いられる。これは、細胞自体の上の膜質のシグナル分子、例えばＴＮＦ−サイトカイン又は可溶性シグナル分子の高められた濃度の場合でも同様である。一般的な相応する膜質レセプターにより引き起こされるシグナルトランスダクションの連鎖の活性化が、シグナル分子を除去する結合性の外因性の可溶性の本発明による、成分Ａとしてレセプター又はレセプター断片を有するダイマー又はマルティマーの使用により抑制又は減少させられる場合に、この種のマルティマーの使用は、基本的に常に望ましい。
【００５６】
本発明は次の図面によりさらに詳説される。
【００５７】
図１には、１文字コードで、本発明によるオリゴマー（ＦａｓＬ−ヘキサマー）の、つまりトリマーのバイマーの形で出現する組み換えられた本発明による融合タンパク質（２）のアミノ酸配列を示す。成分Ａとして、ｈＦａｓＬ（アミノ酸１０３もしくは１３９〜２８１）の配列断片が表され、成分Ｂとして、配列ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬを有する特異的な（結果としてバイマーを形成する）リンカーが存在する。さらに、図１には組み換え融合タンパク質（１）のアミノ酸配列も示されており、この配列は先行技術によりＦａｓＬ−トリマーの成分としてのみ存在し、つまりこのマルティマー、この場合トリマーは、バイマー又はオリゴマーを形成する成分Ｂを有していない。２つの融合タンパク質（１）及び（２）の組み換えられた断片は、図１においてその配列の記載の上方に、それぞれの機能に関して記されている。
【００５８】
図２は、図２Ａにおいて、本発明による、つまり特異的なリンカー配列（成分Ｂ）を有する融合タンパク質（２）の、還元性の条件下（ｒ）で及び非還元性の条件下（ｎｒ）でのゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。非還元性の条件下で溶液の形で、本発明の場合にオリゴマーが、本発明によるポリペプチド（融合タンパク質（２））からなる天然の複合体として溶出する、それというのも本発明の場合、それぞれの異なるトリマーの成分である２つの本発明による融合タンパク質（２）の成分Ｂの間でジスルフィド架橋が形成されるためである。従って、結果として本発明によるオリゴマーは、モノマーの形の本発明による融合タンパク質（２）のほぼ６倍の分子量に相当する分子量を有するＦａｓＬ−ヘキサマーとして存在する。変性する条件を与えた場合（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で）、本発明による融合タンパク質は還元剤の不在で、２つのモノマー間のジスルフィド架橋の形成によるダイマーとして移動する。還元性でかつ変性する条件下では、それに対して本発明による融合タンパク質はＳＤＳ−ゲル状を移動する。本発明によるオリゴマー、この場合、本発明による融合タンパク質もしくは融合タンパク質（２）のトリマーのバイマーを図１で示したと同様に、図２Ｂに図式的に示した。
【００５９】
図３では、ＦａｓＬ−トリマー（先行技術の３つの融合タンパク質からなるトリマー、例えば図１による、成分Ｂを有していない融合タンパク質（１）からなるトリマー）又は図２Ｂに図式的に示した本発明によるＦａｓＬ−バイマー（ヘキサマー、トリマーのバイマーとして）の濃度に依存する、Ａ２０−細胞もしくはＪｕｒｋａｔ−細胞に対するアンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（■、▲）で又は不在（□、△）での細胞毒性アッセイの結果を示す。４９０ｎｍでの光学密度は、細胞の生存能力についての尺度である（高い光学密度は、添加した物質のわずかなアポトーシス作用に相当し、従って細胞の高い生存能力に相当する）。Ａ２０−細胞（図３Ａ及び３Ｂ）に関して及びＪｕｒｋａｔ−細胞（図３Ｃ及び３Ｄ）に関して、本発明によるトリマーのＦａｓＬ−バイマー（ヘキサマー）（図３Ｂ及び３Ｄ、それぞれ△）のアポトーシス作用は、バイマー化する又はオリゴマー化する成分Ｂなしの融合タンパク質のＦａｓＬ−トリマー（先行技術、図３Ａ及び３Ｃ、それぞれ□）の作用と比較して３倍〜１０倍高い。図１による融合タンパク質（１）及び（２）のフラッグ−配列に対して結合するアンチ−フラッグ−抗体を付加的に添加しかつ架橋により本発明による融合タンパク質のオリゴマー化度をさらに高めた場合に、全てのバッチ（図３Ａ〜３Ｄ、それぞれ■又は▲）においてアポトーシス活性が向上する。
【００６０】
図４では、特異的なリンカー領域（融合タンパク質（３）の成分Ｂ）における（Ｃ→Ｓ）−置換を考慮した、本発明による融合タンパク質（３）のアミノ酸配列を示す（スーパー−ＦａｓＬ）。他の記載箇所は図１の記載を参照する。ゲル濾過試験により、「スーパー−ＦａｓＬ」は本発明によるバイマー化した形でヘキサマーとして溶液中に存在することが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での変性する条件下で、本発明による融合タンパク質（３）は還元剤の不在でも、モノマーとして移動する、それというのも、アミノ酸置換Ｃ→Ｓに基づきリンカー領域内ではジスルフィド架橋が形成できないためである。
【００６１】
図５は図３と同様に、図４による本発明による融合タンパク質（３）の本発明による凝集体（スーパー−ＦａｓＬ）の添加による、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（●）又は不在（○）でのＡ２０−細胞（図５Ｂ）又はＪｕｒｋａｔ−細胞（図５Ｄ）生存能力を示す。本発明による融合タンパク質（３）は、比較のために使用した先行技術による、バイマー化又はオリゴマー化する成分Ｂを有していないＦａｓＬ−トリマー（図３Ａ（Ａ２０−細胞）及び図３Ｃ（Ｊｕｒｋａｔ−細胞））と比べて、少なくともほぼ１０００倍強いアポトーシス作用を引き起こした。アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２（●）の添加は、「スーパー−ＦａｓＬ」の十分なオリゴマー化により本発明によるより高次構造の凝集体を形成することで、Ａ２０−細胞でも及びＪｕｒｋａｔ−細胞でも、アンチ−フラッグ−抗体なしのバッチに対してアポトーシス活性を、わずかに、約２倍、有利に少なくとも１．５倍上昇させる（図５Ｂ及び５Ｄ）。このことから、成分Ｂとして使用された、本発明による融合タンパク質（３）の特異的リンカーにより生じたオリゴマー化度（この場合、トリマーのバイマーとして）は、アポトーシス作用について、場合により細胞表面でのオリゴマー化により、かつより高次の構造の本発明による凝集体によってなおわずかに向上することができることを示す。
【００６２】
図６Ａには本発明による融合タンパク質（４）、ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０のアミノ酸配列を示し、この場合、融合タンパク質（４）（Ｎ末端からＣ末端の順序で）、フラッグ−配列、成分Ｂとしてのリンカー配列、タンパク質ｍＡＣＲＰ３０（ｍ：マウス）のアミノ酸１８〜１１１、リンカーＬＱ及び成分ＡとしてのｈＦａｓＬのアミノ酸配列１３９〜２８１を有する。
【００６３】
図６Ｂにはもう一つの融合タンパク質が示されている。これはヒトＡＣＲＰ３０−リガンド（ｈＡＣＲＰ３０−リガンド、アミノ酸１８〜１１１）のコラーゲン−ドメインを有し、この場合、このＮ−末端はフラッグ−標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に融合し、かつこのＣ−末端はヒトＦａｓＬ（アミノ酸１３９〜２８１）の細胞外ドメインと融合している。ｈＡＣＲＰ３０及びｈＦａｓＬのＣ−末端の間にはリンカー配列（ＭＨＶＤ）が挿入されており、同様にフラッグ−標識とｈＡＣＲＰ３０のＮ−末端との間にはリンカー配列（ＧＰＧＱＶＱＬＱ）が挿入されている。全ての前記の記載はアミノ酸の一文字コードに関して参照される。
【００６４】
図６Ｃは曲線の推移を表し、この曲線の推移は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の添加下（＋）で及びアンチ−フラッグ−抗体Ｍ２を添加せずに、一方はＦａｓＬを用いた、及び他方は融合タンパク質ｈＡＣＲＰ３０／ＦａｓＬを用いたＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細胞の力価から得られた。このため、上澄液（ＯＰＴＩＭＥＭ）を一時的にＦａｓＬ又はｈＡＣＲＰ３０／ＦａｓＬでトランスフェクションしかつこのタンパク質を発現する２９３細胞からＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細胞へ移した。連続する実験において、図６Ｃのｘ−軸上に示した減少する前記のタンパク質の濃度が記入され、それぞれＪｕｒｋａｔ−細胞の生存率を他の箇所に記載した標準−細胞毒性試験を用いて決定した。このプロットから、ＦａｓＬは交差架橋するＭ２−抗体なしで不活性であり（◆）、抗体Ｍ２の交差反応する作用が始めて細胞毒効果を引き起こすことは明らかである。それに対して、本発明による融合タンパク質、つまりｈＡＣＲＰ３０／ＦａｓＬの相応する作用は、Ｍ２−抗体の添加なしでもすでに達成されている（▲）。Ｍ２−抗体の添加は、この場合本発明による融合タンパク質の作用をほとんど向上させることができない。
【００６５】
図７は図３と同様に、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）での、バイマー化できない又はオリゴマー化できないＦａｓＬ−トリマー（図１による融合タンパク質（１）をベースとする比較試験、図７Ａ）及び本発明によるオリゴマー、この場合トリマーのテトラマー、図６によるつまり本発明による融合タンパク質（４）のドデカマーの添加によるＢＪＡＢ−細胞の生存能力を示す。本発明によるＦａｓＬ−トリマーはフラッグ−配列との結合によりオリゴマー化する抗体の不在では、ＢＪＡＢ−細胞に対するアポトーシス作用は展開しないが（図７Ａ（△））、本発明による融合タンパク質（４）のドデカマー（トリマーのテトラマー）はすでに約１０ｎｇ／ｍｌ（Ｋ５０＝８ｎｇ／ｍｌ）の濃度で細胞死（図７Ｂ）を誘導する。このことは、４９０ｎｍのＯＤの減少によりさらに明らかである。このアポトーシス活性は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２を、本発明によるＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０−融合タンパク質からなる本発明によるででカマーのバッチに添加することによりわずかに高めることができ、つまり本発明によるドデカマーはアポトーシス活性に関してすでにほぼ最適化された凝集状態である。相応する抗体により引き起こされる、より高次の構造の本発明による凝集体へのさらなる凝集は、それに対してさらなる明らかな生物学的効果を生じることはない。
【００６６】
本発明による融合タンパク質（５）のアミノ酸配列は図８に示されており（ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０）、この融合タンパク質は、成分ＡとしてｈＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１を、成分ＢとしてＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）のオリゴマー化ドメインと組み合わせて含有している。従って、本発明の場合に融合タンパク質（５）はオリゴマーとして、つまりトリマーのテトラマーとして溶液中に存在する。
【００６７】
図９は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）で、バイマー化能力又はオリゴマー化能力のない先行技術によるＴＲＡＩＬ−トリマー（Ｎ−末端にフラッグ配列及びヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１を有する融合タンパク質）（比較試験、図９Ａ）の添加による及び本発明による融合タンパク質（５）、ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０の本発明によるドデカマーの添加によるＪｕｒｋａｔ−細胞の生存能力を示す。図９における実験による観察は、図７で示された結果に一致する。本発明によるＴＲＡＩＬ−トリマーはフラッグ−配列との結合によりオリゴーマー化する抗体の不在では、Ｊｕｒｋａｔ−細胞に対するアポトーシス作用は展開しないが（図９Ａ（△））、この試験でも本発明による融合タンパク質（５）のドデカマーはすでに約１００ｎｇ／ｍｌ（≒Ｋ５０）の濃度で細胞死（図９Ｂ）を誘導する。ＴＲＡＩＬ−ドデカマーとアンチ−フラッグ−抗体とを組み合わせた添加は、さらに、本発明によるオリゴマーからさらにオリゴマー化度がさらに向上されることにより、そのより高次の構造の本発明による凝集体を形成し、この凝集体はこの場合、さらに向上された（少なくとも１０倍の）アポトーシスを誘導する活性を示す（図９Ｂ（▲））。
【００６８】
本発明による融合タンパク質（６）のアミノ酸配列は図１０に示されており（ＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０）、前記の配列は、成分ＡとしてｍＴＮＦα（ｍ：マウス）のアミノ酸７７〜２３５を、成分ＢとしてｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）のオリゴマー化ドメインと組み合わせて含有し、かつＮ−末端にリンカー配列を備えたフラッグ−配列を有する。従って、この融合タンパク質（６）は、ドデカマーとして、つまりマルティマー（トリマー）のオリゴマー（テトラマー）として溶液中に存在する。
【００６９】
図１１中には、細胞増殖試験の結果が示されている。この場合、ＣＴ６−細胞の細胞増殖についての尺度としてマウスのＣＴ６−細胞内への［3Ｈ］−チミジンの取り込みを、成分Ｂなしの先行技術による融合タンパク質のトリマー（Ｎ末端でのフラッグ−配列及びリンカー−配列とそれに続くマウスＴＮＦαからのアミノ酸７７〜２３５）、つまりｍＴＮＦα−トリマーの濃度の関数として、又はｍＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０（図１１Ｂ）の図６による本発明による融合タンパク質（６）の本発明によるドデカマー（４×３）の濃度の関数として測定した。この［3Ｈ］−チミジン−取り込みを「ｃｐｍ」（１分あたりのカウント数）で示した。この試験は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）で行った。この場合、先行技術から公知の、ｍＴＮＦαのトリマーは、ＴＮＦ−レセプター２（ＴＮＦ−Ｒ２）との結合後に、わずかなＣＴ６−細胞に関する増殖効果を示しただけである（図１１Ａ、△）。アンチ−フラッグ−抗体（▲）の添加の後にようやく、その架橋しかつそれによりオリゴマー化する作用により、明らかに高められた増殖効果が観察することができた。
【００７０】
それに対して、本発明によるトリマーのオリゴマー、この場合本発明による融合タンパク質（６）のドデカマーは、図１１Ｂにおいて著しい増殖作用が示され、この増殖作用はすでに５ｎｇ／ｍｌですでに観察することができる（△）。対照としての架橋するアンチ−フラッグ−抗体と本発明によるドデカマーとの組み合わせ（▲）は、本発明によるドデカマーの単独での添加の場合の結果と比較した場合に、それに対して増殖作用のわずかな向上を示しただけであった。このことから、本発明によるオリゴマー（ここではドデカマーの形態で存在する）は、すでにほとんど最適化された増殖作用を引き起こすことが認識できる。
【００７１】
本発明による融合タンパク質（７）のアミノ酸配列が図１２に示されており（ＣＤ４０Ｌ−ＡＣＲＰ３０）、この融合タンパク質は、成分ＡとしてｈＣＤ４０Ｌ（ｈ：ヒト）のアミノ酸１１６〜２６１を、成分ＢとしてＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）のオリゴマー化ドメインと組み合わせて含有している。
【００７２】
図１３中には、図１１においても示したように、細胞増殖試験の結果を示す。この場合、図１１との差異は、ヒトＰＢＬ（末梢血液リンパ球）を使用したことである。トリマーの形で溶液中に存在する従来のＣＤ４０Ｌ（フラッグ−配列及びリンカー−配列、図１２において同様、それに引き続く、ｈＣＤ４０Ｌのアミノ酸１６〜２６１の配列をオリゴマー化する成分Ｂなしで有する、図１３Ａ）の細胞の増殖に関する作用が、図１２による本発明による融合タンパク質（７）の本発明によるドデカマー、ＣＤ４０Ｌ−ＡＣＲＰ３０（図１３Ｂ）の作用と比較して示されている。アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の不在（△）で行った試験は、ＣＤ４０Ｌ−トリマーがほとんど増殖作用を示さないことを示しており、図１３Ｂにおいてはすでにわずかな濃度のｈＣＤ４０Ｌの場合でも相応する増殖作用が検出可能である。ｘ−軸上に、図１３Ｂの場合には、尺度「１／希釈」、つまり絶対的でない濃度がプロットされる、それというのも絶対的な濃度が不明である濃度が高められた上澄液が添加されるためである。対照としての架橋するアンチ−フラッグ−抗体及び本発明による融合タンパク質（７）のドデカマーの組み合わせ（▲）は、より高次の構造の凝集体の形成により、相当する増殖作用がさらに低い濃度にシフトすることを生じさせる。
【００７３】
図１４はオリゴマー化されたマルティマーの構造を図式的に示す。図１４Ａ及び１４Ｂはすでに天然でおオリゴマー化された構造を有する天然の「束状タンパク質の」外観図を示す（図１４Ａ：補体タンパク質Ｃ１ｑを形成するヘッドドメイン−トリマーのヘキサマー、図１４Ｂ：ＡＣＲＰ３０を形成するヘッドドメイン−トリマーのテトラマー、脂肪細胞により産生される血清タンパク質）。従って、Ｃ１ｑ−複合体の場合又はＡＣＲＰ３０−複合体の場合に天然のモノマーのヘッドドメインがマルティマー化又はオリゴマー化されている。Ｃ１ｑオリゴマー化複合体は３つの異なる遺伝子産物から構成されており、ＡＣＲＰ３０−オリゴマー化複合体はホモドデカマー、つまり同じマルティマー化された又はオリゴマー化された遺伝子産物である。２つの前記した天然のオリゴマー化複合体はそれぞれ、基本的に１つのポリペプチド鎖がそれぞれヘッドドメイン、コラーゲン−三重ヘリックスを形成することができる配列領域及び６個（Ｃ１ｑ−複合体）もしくは４個（ＡＣＲＰ３０−複合体）のコラーゲン−三重ヘリックスを最終的に１８もしくは１２個のモノマーからなるヘリックス束にオリゴマー化することができる配列領域を提供する。
【００７４】
図１４Ｃには、本発明による融合タンパク質（例えば図６による融合タンパク質（４）、ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０）の本発明によるオリゴマー化されたマルティマーが示されており、このマルティマーは成分Ａとして４つのトリマー化したＴＮＦ−リガンド（例えばＴＮＦ−リガンドＦａｓＬ）又はＴＮＦ−リガンドの断片を有し、例えば成分Ｂとして本発明による融合タンパク質中に存在するＡＣＲＰ３０−タンパク質のコラーゲン類似の配列領域によってオリゴマー化されて本発明によるホモドデカマーになる。
【００７５】
図１５Ａはもう一つの本発明による融合タンパク質、つまりｈＥＤＡ／ＦａｓＬの構造を記載する。この場合、成分ＢとしてヒトＥＤＡ（アミノ酸１６０〜２４２）のコラーゲンドメインを用い、このＮ−末端にはリンカーを介してフラッグ−エピトープが連結されており及びＣ−末端には成分Ａが連結されており、これは図１５ＡではＦａｓＬ（アミノ酸１３９〜２８１、つまりＦａｓＬの細胞外ドメイン又はその断片）である。本発明による融合タンパク質ｈＥＤＡ／ＦａｓＬはヘキサマー（２×３）として存在する。タンパク質ＥＤＡは、ＴＮＦ−種類のもう一つの構成要素であり、膜貫通−ドメイン及びＴＮＦ−ドメインの他になおコラーゲン−ドメインを有し（図１５Ａの上方の図を参照）及びヒト型の３９１個のアミノ酸を有する。
【００７６】
図１５Ｂは本発明による融合タンパク質ｈＥＤＡ／ＦａｓＬを用いた試験を示す。この融合タンパク質の製造のために、まずヒトＥＤＡのコラーゲンドメイン（アミノ酸１６０〜２４２）を相応するプライマーで増幅させ、相応する配列を用いてＮ−末端及びＣ−末端でフラッグ及びヒトＦａｓＬの細胞外ドメイン（アミノ酸１３９〜２８１）を融合した。図１５Ｂは曲線の推移を示し、この曲線の推移は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の添加下で及びアンチ−フラッグ−抗体Ｍ２を添加せずに、一方はＦａｓＬを用いた、及び他方は融合タンパク質ｈＥＤＡ／ＦａｓＬを用いたＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細胞の力価から得られた。このため、上澄液（ＯＰＴＩＭＥＭ）を一時的にＦａｓＬ又はｈＥＤＡ／ＦａｓＬでトランスフェクションしかつタンパク質を発現する２９３細胞からＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細胞へ移した。連続する実験において、図１５Ｂのｘ−軸上に示した減少する前記のタンパク質の濃度が記入され、それぞれＪｕｒｋａｔ−細胞の生存率を他の箇所に記載した標準−細胞毒性試験を用いて決定した。このプロットから、ＦａｓＬは交差架橋するＭ２−抗体なしで不活性であり（□）、この場合、抗体Ｍ２の交差反応する作用が始めて細胞毒効果を引き起こす（■）ことは明らかである。それに対して、本発明による融合タンパク質、つまりｈＥＤＡ／ＦａｓＬの相応する作用は、Ｍ２−抗体の添加なしでもすでに達成されている（○）。Ｍ２−抗体の添加は、この場合本発明による融合タンパク質の作用をなお向上させることができる（●）。
【００７７】
本発明は次の実施例によりさらに詳説される。
次の実験的な所与性（ａ）〜（ｆ）は、該当するかつ上記の相応する箇所に開示のない変更が、次の６つの実施例に通用する場合には、参照される：
（ａ）  ＦａｓＬ−融合タンパク質、ＴＲＡＩＬ−融合タンパク質、ＴＮＦα−融合タンパク質及びＣＤ４０Ｌ−融合タンパク質についてのベクターの構築
ヘマグルチニンのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ−断片（５−領域中の翻訳されない配列（ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＧＧＣ）の６つの塩基並びにフラッグ−エピトープ（ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＡＡＡ）、リンカー（ＧＧＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ）、制限切断部位ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩを含む）を、塩基７２０から７６９は除去（ＰＳ０３８）されている改良されたＰＣＲＩＩＩ−ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＶ  Ｌｅｅｋ，Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ）の制限切断部位Ｈｉｎｄｌ−ＩＩ及びＢａｍＨＩ間にクローニングした。トリマーのＦａｓＬの発現のために、ヒトＦａｓＬをコードする、制限切断部位Ｐｓｔｌ及びＥｃｏＲＩで囲まれた配列のアミノ酸１３９〜２８１を、ＰＣＲ法で増幅し、改良ＰＣＲＩＩＩ−ベクター中でクローニングした。
【００７８】
ヘキサマーのＦａｓＬのために、両側ともＥｃｏＲＩ切断部位並びにさらにリンカー配列ＧＧＣＴＴの５′−末端の及び停止コドン（ＴＡＡ）の３′−末端で囲まれたアミノ酸１０３〜２８１をコードする配列及び天然の翻訳されない配列（ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ）を、ベクター（ＰＳ０３８）のＥｃｏＲＩ−切断部位内へクローニングした。「スーパー−ＦａｓＬ」（図４、融合タンパク質（３））を、ベクターＰＳ０３８のリンカー配列内での点突然変異の導入により、ＥｃｏＲＩ−切断部位の５′−側の配列ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧを、ＰＣＲ−突然変異法を用いてＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧに置き換えることにより製造した。さらに、前記した方法でＦａｓＬ（アミノ酸１０３〜２８１）を改良されたＰＳ０３８中にクローニングした。
【００７９】
ヒトＴＲＡＩＬ、マウスＴＮＦα及びヒトＣＤ４０Ｌのために、細胞外ドメインの一部（ＴＲＡＩＬ：アミノ酸９５〜２８１、ＴＮＦα：アミノ酸７７〜２３５、ＣＤ４０Ｌ：アミノ酸１１６〜２６１）を、５′−末端でのＰｓｔｌ−制限切断部位及び停止コドン並びに３′−末端でのＳｐｅｌ−制限切断部位及びＥｃｏＲＩ−制限切断部位で、ＰＣＲによって増幅し、ベクターＰＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。トリマーとしてのリガンドの発現のために、まずフラッグ−タグをコードする配列ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＡＡＡ、並びにリンカー配列ＧＧＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧをベクターｐＱＥ−１６（Ｑｉａｇｅｎ）中の切断部位ＢａｍＨＩ及びＰｓｔｌの間に挿入した（ＰＳ３３０）。引き続き、このリガンドをＰｓｔｌ／Ｓｐｅｌ−断片としてＰＳ３３０中にサブクローニングした。
【００８０】
ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０のための発現ベクターとして次のように構築した。ＥＳＴ−クローンＡＡ６７３１５４を用いて、ＰＣＲにより、制限切断部位Ｎｓｉｌ及びＰｓｔｌにより囲まれるマウスＡＣＲＰ３０をコードする配列のアミノ酸１８〜１１１を、トリマーのＦａｓＬをコードするベクターのＰｓｔｌ−切断部位内へクローニングした（融合されたＮｓｉｌ／Ｐｓｔｌ−切断部位はコード化する配列の５′−側にある状態である）。ＡＣＲＰ３０を用いた残りのＴＮＦ−サイトカインの融合タンパク質の発現のためのベクターは、発現ベクターＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０中のＦａｓＬの相応する配列を、それぞれのリガンド配列に制限切断部位Ｐｓｔｌ及びＥｃｏＲＩ内へ置き換えることにより製造した。
【００８１】
（ｂ）  組み換えタンパク質の発現及び精製：
トリマーのＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα及びＣＤ４０Ｌのために、バクテリア（株Ｍ１５、プラスミドｐＲｅｐ４を有する、Ｑｉａｇｅｎ）中での安定なクローンを作成した。それぞれのクローンを、一晩中、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ−ブイヨン中で３７℃で予備インキュベーションし、メイン培養（希釈１：５０、３７℃で生長）の接種のために用い、これを６時間後に発現のために０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて誘導した。このバクテリアを遠心分離により収穫し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、「フレンチプレス」で溶菌し、このライゼートから不溶解物を遠心分離により除去した。全てのＦａｓＬ−タンパク質のために、ＨＥＫ２９３−細胞中で安定なクローンをＧ４１８  ８００μｇ／ｍｌ中での選択によって作成した（前記の箇所：Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８を参照）。
【００８２】
トリマーの及びヘキサマーのリガンドもしくはスーパー−ＦａｓＬは、安定なクローンの上澄み又はバクテリアのライゼートから、アフィニティクロマトグラフィーを用いてＭ２−アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）上で精製し、シトレート−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ（ｐＨ＝２．５）で溶出し、直ちにトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝８）  ０．２容量で中和した。この緩衝液をＰＢＳと濃縮機中で交換した（Ｃｅｎｔｒｉｋｏｎ−３０，Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）。
【００８３】
ＦａｓＬとマウスＡＣＲＰ３０との融合物を次のように精製した。上澄液にＮａＣｌ  ５０ｍＭ及びＣａＣｌ2  １ｍＭを添加し、ｐＨ値を塩酸／苛性ソーダを用いて７．０に調節した。さらに、組み換えられたタンパク質をＭ１−アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）上に結合させ、ＴＢＳ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）中に溶離させた。この緩衝液をＰＢＳと濃縮機中で交換した。精製されたタンパク質の濃度は、ビシンコニン酸−法（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により、標準としてウシ血清アルブミンを使用して測定し、試料の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー−ブルー染色によって測定した。
【００８４】
ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα及びＣＤ４０ＬのＡＣＲＰ３０との融合タンパク質は、それぞれの分析において、濃縮された上澄液の形で提供され、次のように製造した：２９３Ｔ−細胞をそれぞれの発言プラスミドを用いてリン酸カルシウム−法によりトランスフェクションした。この細胞を１６時間沈殿物と一緒にインキュベーションした後、この細胞をＰＢＳで洗浄し、４日間血清不含の培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中でインキュベートした。この上澄液を最初の容量の２０分の１にまで濃縮により減少させ、タンパク質の存在を「ウエスタン−ブロット」により調査した。ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０及びＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０の場合に、組み換えタンパク質のそれぞれの濃度を測定するために、このタンパク質の力価を、精製されたトリマーのＴＲＡＩＬ又はＴＮＦαの力価と比較した。
【００８５】
（ｃ）  ゲル浸透クロマトグラフィーによるマルティマーの分子量の調査
多様な融合タンパク質のサイズを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ１０／３０  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲル濾過により測定した。組み換えタンパク質を、トリマー及びヘキサマーのリガンドの場合に内部標準のカタラーゼ及びオバルブミンと一緒に、ＡＣＲＰ３０−融合タンパク質に対してはフェリチン及びオバルブミンと一緒に、２００μｌの容量のカラムに入れ、次いでＰＢＳ（０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で溶離し、０．２５ｍｌのフラクションを捕集した。多様なフラクション中のタンパク質の存在をトリクロロ酢酸による沈殿の後で「ウェスタン−ブロット」により測定した。このタンパク質のサイズは、チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２６２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オバルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）及びリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）からなる回帰直線を用いて測定した。
【００８６】
（ｄ）  細胞
マウスＢ−リンパ腫Ａ２０−細胞を、５％熱不活性化ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中に保持した。ヒトＴ−リンパ管形成−Ｊｕｒｋａｔ−細胞、ＢＪＡＢ  Ｂｕｒｋｉｔｔ−リンパ腫細胞を、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ中に採った。ヒト−胚の腎細胞２９３を、２％のＦＣＳを有するＤＭＥＭ  Ｍｅｈｅｓｔｏｆｆｍｉｘ  Ｆ１２（１：１）中で培養した。全ての培地は抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、それぞれ５μｇ／ｍｌ及びネオマイシン１０μｇ／ｍｌ）を含有していた。ＩＬ−２依存性のマウス細胞毒性Ｔ−セルラインＣＴ６を、１０％のＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、２メルカプトエタノール５０μＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ及びコンディショニングしたＥＬ−４細胞上澄液  １０％を添加したＲＰＭＩ中に採った。
【００８７】
（ｅ）  細胞毒性アッセイ
この細胞毒性アッセイを、予め主にＳｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８８２７−１８８３３，１９９７）に記載されたと同様に実施した。この場合、５００００個の細胞を１６時間の間に、１００μｌの培地中でインキュベーションし、その際、この培地はＭ２−抗体１μｇ／ｍｌ（ＴＲＡＩＬについては２μｇ／ｍｌ）の存在又は不在で示されたリガンド濃度を含んでいた。細胞生存率を、ＰＭＳ／ＭＴＳ（フェナンジンメトスルフェート  ３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシエトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、塩）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定した。呈色が必要な時間（一般に１〜３時間）で行われた。吸光度を４９０ｎｍで測定した。
【００８８】
（ｆ）  Ｂ−細胞−増殖アッセイ
ＣＤ１９−陽性−細胞を、磁性「ビード」を備えたヒトＰＢＬ（末梢血液リンパ球）のＦＡＣＳ−選別により選択し、精製し、それに対してＣＤ１９−陰性−細胞を３０００ｒａｄで放射線照射した。１０００００個の精製されたＣＤ１９−陽性の細胞を、１０００００個のＣＤ１９−陰性の自己放射線照射されたＰＢＬと一緒に、滴定された可溶性のＣＤ４０Ｌ−融合タンパク質を有し、Ｍ２−抗体（１０μｇ／ｍｌを有する又は有しない培地（ＲＰＭＩ  １０％  ＦＣＳ、抗生物質）１２０μｌ中で７２時間に９６ウェル−プレート中でインキュベーションした。引き続き、この細胞を６時間［3Ｈ］−チミジンと共にパルス負荷し、液体−シンチレーションカウンタ（“Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ”）を用いて組み込みを測定した。
【００８９】
この後は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８７，Ｎｒ．８，１９９８，１２０５−１２１３）に記載された実施例の実施のために使用した方法の記載及び前記文献に参考資料として引用された刊行物を参照する。
【００９０】
第１の実施例
成分ＡとしてｈＦａｓＬ（ｈ：ヒト）のアミノ酸１０３〜２８１を有し、成分Ｂとして成分Ａのアミノ酸１０３からＮ−末端の１８アミノ酸長さの配列（ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬ、いわゆる特異的リンカー）を有する組み換え融合タンパク質（２）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＱが連結している（図１）。
【００９１】
比較試験のために、Ｎ−末端が同様に前記のフラッグ−配列、同じＣ−末端に続くリンカー−配列及びそれのＣ−末端に続くｈＦａｓＬのアミノ酸１３９〜２８１を有する融合タンパク質（１）を発現させた。融合タンパク質（１）は融合タンパク質（２）とは、特異的リンカー及びｈＦａｓＬのアミノ酸１０３〜１３８の欠失により異なる（図１）。
【００９２】
融合タンパク質（１）及び（２）のベクター構築は、（ａ）に記載された方法によって行った。融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【００９３】
精製された融合タンパク質（１）を還元性の条件下に又は非還元性の条件下に置き、引き続きゲル電気泳動により分離し（図２）、それぞれのバンドの分子量のだいたいの測定と関連づけた。
【００９４】
最後に（ｄ）により接種したＡ２０細胞及びＪｕｒｋａｔ−細胞を取り出し、（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。それぞれ２つのセルラインに対してこのアッセイはそれぞれトリマー化した融合タンパク質（１）又は融合タンパク質（２）のトリマーのバイマー（つまりヘキサマー）の濃度の上昇と共に、アンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）の存在又は不在において、実施し（図３）、その間に吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定した。
【００９５】
第２の実施例
成分ＡとしてｈＦａｓＬのアミノ酸１０３〜２８１を有し、成分Ｂとして成分Ａのアミノ酸１０３からＮ−末端の１８アミノ酸長さの配列（（ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＳＡＧＩＲＬ、いわゆる特異的リンカー）を有する組み換え融合タンパク質（３）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＱが連結している（図４）。
【００９６】
比較試験のために、第１の実施例の場合と同様に、融合タンパク質（１）を発現させた（図４）。
【００９７】
融合タンパク質（３）及び（１）のベクター構築は第１の実施例に記載した方法により実施した。融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【００９８】
最後に（ｄ）により接種したＡ２０細胞及びＪｕｒｋａｔ−細胞を取り出し、（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。それぞれ２つのセルラインに対してこのアッセイはそれぞれ融合タンパク質（３）ののトリマーの濃度の上昇と共に、アンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）の存在又は不在において実施し（図５）、その間に吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定した。
【００９９】
第３の実施例
成分ＡとしてｈＦａｓＬのアミノ酸１３９〜２８１及び成分Ａのアミノ酸１３９のＮ末端にまず配列ＬＱを有するリンカー−ダイマー及び次いでさらにＮ末端に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質（４）を発現させた。さらに、この融合タンパク質（４）のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図６）。比較のために融合タンパク質（１）を使用した。
【０１００】
融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１０１】
最後に（ｄ）により接種したＢＪＡＢ−Ｂｕｒｋｉｔｔ−リンパ腫−細胞を取り出し、（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。このアッセイは、それぞれ融合タンパク質（１）のトリマー又は融合タンパク質（４）のオリゴマー化したトリマー（ドデカマー）、つまり組み換えＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０（４×３）の濃度の上昇と共に、アンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，前記参照）の存在又は不在で実施し（図７）、その際、吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定した。
【０１０２】
第４の実施例
成分ＡとしてｈＴＲＡＩＬ（ｈ：ヒト）のアミノ酸９５〜２８１及び成分Ａのアミノ酸９５のＮ末端にまず配列ＬＱを有するリンカー−ダイマー及び次いでさらにＮ末端に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質（５）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図８）。
【０１０３】
比較試験のために、トリマーとして溶液中に存在（ＴＲＡＩＬ−トリマー）する融合タンパク質（図８には示されていない）を発現させた。この比較試験タンパク質はＮ−末端からＣ−末端までフラッグ−配列、配列ＧＰＧＱＶＱＬＨを有するリンカー及び最後にｈＴＲＡＩＬ（アミノ酸９５〜２８１）を有する。融合タンパク質（５）と異なるのは、つまり成分Ｂ（ｍＡＣＲＰ３０：アミノ酸１８〜１１１）及び配列ＬＱを有するリンカーが存在しないところである。
【０１０４】
融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１０５】
最後に（ｄ）により接種したＴ−リンパ芽球−Ｊｕｒｋａｔ−細胞を取り出し、（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。このアッセイは、それぞれＡＣＲＰ３０−配列を有していない融合タンパク質のトリマー（比較のため）又は融合タンパク質（５）のオリゴマー化したトリマー、つまり組み換えＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０（５×３）のドデカマーの濃度の上昇と共に、アンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，前記参照）の存在又は不在で実施し（図９）、その際、吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定した。
【０１０６】
第５の実施例
成分ＡとしてｍＴＮＦα（ｍ：マウス）のアミノ酸７７〜２３５及び成分Ａのアミノ酸８５のＮ末端にまずリンカー−ダイマーＬＱ及び次いでさらにＮ末端に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質（６）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図１０）。
【０１０７】
比較試験のために、トリマーとして溶液中に存在（ＴＮＦα−トリマー）する融合タンパク質（図１０には示されていない）を発現させた。この比較試験タンパク質はＮ−末端からＣ−末端までフラッグ−配列、配列ＧＰＧＱＶＱＬＨを有するリンカー及び最後にｍＴＮＦα（アミノ酸７７〜２３５）を有する。融合タンパク質（６）と異なるのは、つまり成分Ｂ（ｍＡＣＲＰ３０：アミノ酸１８〜１１１）及び配列ＬＱを有するリンカーが存在しないところである。
【０１０８】
融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１０９】
（ｆ）による細胞増殖アッセイを用いて、ＴＮＦα−トリマー又はＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０−オリゴマー（ＴＮＦαのホモドデカマー）の添加によりアンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，上記参照）の存在で又は不在で、ＣＴ６−細胞に対して生じる効果を測定した。
【０１１０】
このためＣＴ６−細胞は増殖試験の前に４日間の間、ＥＬ−４−上澄液（２．５％）の減少させた濃度の存在に置いた。この細胞を９６−ウェル−滴定プレート（４００００細胞／ウェル）中で、１６時間の間に、ＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０−オリゴマー又はｍＴＮＦ−αの示された濃度で、Ｍ２−ｍＡｋ  ２μｇ／ｍｌの存在又は不在でかつＥＬ−４−上澄液の不在でインキュベーションした。この細胞をさらに６時間の間、［3Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）と共にパルスをかけ、凍結及び融解の３回のサイクルにさらに、最後に収穫した。この［3Ｈ］チミジン−組み込みを最終的に液体シンチレーションカウンタにより調査した（図１１）。
【０１１１】
第６の実施例
成分ＡとしてｈＣＤ４０Ｌ（ｈ：ヒト）のアミノ酸１１６〜２６１及び成分Ａのアミノ酸９５のＮ末端にまずリンカー−ダイマーＬＱ及び次いでさらにＮ末端に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質（７）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図１２）。
【０１１２】
比較試験のために、トリマーとして溶液中に存在（ＣＤ４０Ｌ−トリマー）する融合タンパク質（図１２には示されていない）を発現させた。この比較試験タンパク質はＮ−末端からＣ−末端までフラッグ−配列、配列ＧＰＧＱＶＱＬＨを有するリンカー及び最後にｈＣＤ４０Ｌ（アミノ酸１１６〜２６１）を有する。融合タンパク質（７）と異なるのは、つまり成分Ｂ（ｍＡＣＲＰ３０：アミノ酸１８〜１１１）及び配列ＬＱを有するリンカーが存在しないところである。
【０１１３】
融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１１４】
最後に、（ｆ）に記載した細胞増殖アッセイをＰＢＬに関して実施したと同様に実施し、その際、ＣＤ４０Ｌ−トリマー又はＣＤ４０Ｌ−ＡＣＲＰ３０−オリゴマー（ホモドデカマー）はアンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，上記参照）の存在下で又は不在下で添加した（図１３）。
【０１１５】
第７の実施例
７．１  実験的な実施
この第７の実施例は、マルティマー化し及びオリゴマー化する成分Ａ及び成分Ｂとしてレセプターからなる融合タンパク質を扱う。
【０１１６】
（Ａ）  ベクター構築
この融合タンパク質を改良されたＰＣＲ−３−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、交換可能なモジュールの順序として、次の順序（５′から３′）で構築した：
（ａ）  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ−モジュール、このモジュールはレセプターの細胞外ドメインを有しており、その際、Ｋｏｚａｋ−配列ＧＣＣＡＣＣが先行し（ｈＴＮＦ−Ｒ１（アミノ酸１〜２１１）；ｈ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（アミノ酸１〜２３９）、ｈ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（アミノ酸１〜２１２）、ｈ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（アミノ酸１〜２４０）及びｈＣＤ４０（アミノ酸１〜１９３）の場合又はｈＦａｓＲ（アミノ酸１〜１７０）の場合、５′−翻訳されない領域の２４個のヌクレオチドの先行することによる）；（ｂ）  ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ−カセット中の１４−アミノ酸長さのリンカー（ＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰＥ）（例えば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１６６３に記載されている）；Ｘｈｏｌ／ＮｏｔＩ−モジュール中でのオリゴマー化ドメイン、ＯＰＧ（アミノ酸１８７〜４０１、ここではδＮ−ＯＰＧとして記載されている）、ＣＭＰ（アミノ酸４５１〜４９３、ＧｅｎＢａｎｋ  １１５５５５）；ＣＯＭＰ（アミノ酸３２〜７５、ＧｅｎＢａｎｋ  １７０５９９５）の場合に；（ｄ）ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ−カセット、これは組み合わせられたＨｉｓ6−ｍｙｃ−マーキング及び停止コドンを含有する。このオリゴマー化ドメインは、Ｎ−末端もしくはＣ−末端でアミノ酸配列ＧＧＣＣ及びＡＲＴＰＧＧＧＳに囲まれていた。リンカーは全ての構築のために使用した。Ｆｃ−構築物の場合、「ヒンジ」−領域、ＣＨ２及びＣＨ３−ドメイン及びｈＩｇＧ１の停止コドンを、前記（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２，１８８２７；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，１２０５）に記載したようなＳａｌＩ／ＮｏｔＩ−カセットとしてクローニングした。安定なＨＥＫ−２９３を誘導するセルラインは組み換えタンパク質の製造のために、前記した方法（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９７）上記参照）を用いてＧ４１８  ８００μｇ／ｍｌ中で選択することにより準備した。
【０１１７】
（Ｂ）  一時的なトランスフェクション
２９３Ｔ−細胞を前記（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９７）上記参照）に記載したようにＣａＣｌ2−法を用いてトランスフェクションし、ＰＢＳで洗浄し、その後３日間、血清不含の最適化−培地中でインキュベーションした。上澄液を３０倍に濃縮し、使用するまで凍結保存した。Ｆａｓ／δＮ−ＯＰＧ及びＦａｓ／ＣＭＰ−融合タンパク質の濃縮された最適化培地中での濃度は、「ウェスタン  ブロット」での滴定を用いて、標準として精製されたＦａｓ／ＣＯＭＰを用いながら測定した。
【０１１８】
（Ｃ）  組み換えタンパク質の精製
安定にトランスフェクションされた２９３−細胞の上澄液を、Ｍ２−アガロース（リガンドとして）又はタンパク質−Ａ−セファロース（Ｆｃ−融合タンパク質）上に置き、ＰＢＳで洗浄し、シトレート−ＮａＯＨ（ｐＨ２．５）５０ｍＭで溶離した。この溶離液をトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和し、この緩衝液をＰＢＳとＣｅｎｔｒｉｋｏｎ−３０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）中で交換した。ＣＯＭＰ−融合タンパク質及びＣＭＰ−融合タンパク質をＨｉＴｒａｐ−キレートカラムで精製した。このために安定にトランスフェクションされた２９３−細胞の上澄液にＮａＣｌ  ５００ｍＭ及びイミダゾール１０ｍＭを補充し、ＺｎＳＯ4（ｐＨ２．５）０．５Ｍで予め被覆したカラムを通過させ、ＰＢＳ中で平衡化させた。このカラムをＰＢＳで洗浄し、タンパク質をＥＤＴＡ  ５０ｍＭを有するＰＢＳで溶離した。この緩衝液を前記したようにＰＢＳと交換した。
【０１１９】
フラッグ−ＦａｓＬ及びフラッグ−ＴＲＡＩＬは、予め（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１８８２７及びＴｈｏｍｅら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，５１７）に記載されたと同様に製造した。この２つの刊行物は全ての範囲が本発明の対象の開示の構成成分である。フラッグ−ＣＤ４０Ｌ（アミノ酸１１６〜２６１）はバクテリア中で発現させ、フラッグ−ＴＲＡＩＬについて記載されたと同様にＭ２−アガロース上で精製した。このタンパク質濃度はビシンコニン酸法を用いて測定した。この純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー−ブルー−マーキングを用いて調査した。
【０１２０】
（Ｄ）  ゲル浸透クロマトグラフィー
ゲル浸透クロマトグラフィーの範囲内で、それぞれの量の融合タンパク質を２００μｌの体積でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ１０／３０  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に置き、ＰＢＳ中で０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶離させ、その際、同時に２８０ｎｍで吸光度を記録した。個々のフラクション（０．２５ｍｌ）を次に記載したように毒性試験で分析した。分子量の決定のために、カラムを標準タンパク質のチログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２６２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オバルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）及びリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）を用いて校正した。
【０１２１】
（Ｅ）  競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡは次に記載するように実施した。９６「ウェル」−ＥＬＩＳＡ−プレートをレセプター／Ｆｃ−融合タンパク質（ＰＢＳ中で０．２μｇ／ｍｌ、１００μｌ、１６時間、２５℃）で被覆した。この「ウェル」は１時間３７℃でＰＢＳ中で飽和し、その際、ＰＢＳはウシ胎児血清５％（遮断する緩衝液として）を含有した。ｓＣＤ４０Ｌの使用の場合、遮断する緩衝液は脂肪不含のミルク４％及びＴｗｅｅｎ−２０  ０．０５％を含有するＰＢＳであった。競合するＦｃ又はＣＯＭＰ−融合タンパク質を、タンパク質Ａ１μｇ／ｍｌの存在又は不在で、遮断する緩衝液１００ｍｌ中に滅菌して溶かした。このリガンドは一定の濃度で添加され（ｓＦａｓＬ：２μｇ／ｍｌ、３．６ｎＭ、ｓＴＮＦα：０．０２μｇ／ｍｌ、０．３６ｍＭ、ｓＴＲＡＩＬ：０．１μｇ／ｍｌ、１．４ｎＭ、ｓＣＤ４０Ｌ：０．５μｇ／ｍｌ、９．２ｎＭ、全て遮断する緩衝液中で）１時間の間３７℃で結合させることができた。結合したリガンドをＭ２−アンチ−フラッグ−抗体（遮断する緩衝液中で１μｇ／ｍｌ、１００μｌ、４５分、３７℃）、ヤギ−アンチマウス−抗体（ペルオキシダーゼとけつごう、遮断する緩衝液中で１：２０００、１００μｌ、３０分、３７℃）及びｏ−フェニレンジアミンヒドロクロリド（クエン酸５０ｍＭ中で０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4、）１００ｍＭ、Ｈ2Ｏ2  ０．０１％）で同定した。この吸光度は４９０ｎｍで測定した。
【０１２２】
（Ｆ）  細胞毒性試験
この際某毒性試験を９６「ウェル」−プレート中で１００μｌの容量で、主にＳｃｈｎｅｉｄｅｒら，（１９９７）（上記参照）に記載されたように実施した。キメラレセプターは、９５％を越える細胞死を誘導することができる程度の細胞毒性リガンドの量を含有する培地中でシリアルに希釈した。記載されたように、タンパク質Ａを１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ｓＦａｓＬはＭ２  １μｇ／ｍｌの存在で使用し、ｓＴＲＡＩＬはＭ２  ２μｇ／ｍｌの存在で使用した。Ｍ２−抗体は一連の試験においてｓＴＮＦαと一緒に使用しなかった。この細胞を１６時間インキュベーションし、その生存率をＰＭＳ／ＭＴＳ−試験システム（フェナジンメトスルフェート／３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、塩の形で）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用しながら測定した。吸光度を４９０ｎｍで測定した。多様な融合タンパク質のモル濃度を表示するために、分子量を次のように査定した：［（理論上のＭr＋３ｋＤａ／予想したＮ−結合したＧｌｙａｎ）×多重性］。Ｆａｓ：Ｆｃ、：ＣＯＭＰ、：ＣＭＰ、：δＮ−ＯＰＧ：９８，１７２，１００もしくは１０５ｋＤａ。ＴＲＡＩＬＲ２：Ｆｃ、：ＣＯＭＰ、：ＣＭＰ、：δＮ−ＯＰＧ：８６，１４３，８２及び９３ｋＤａ。ＴＮＦＲ１：Ｆｃ、：ＣＭＰ：１０４及び１８７。ＣＤ４０Ｌ：Ｆｃ、：ＣＯＭＰ：１０１及び１８０ｋＤａ。ＴＲＡＩＬＲ２：Ｆｃ：８６ｋＤａ、ＴＲＡＩＬＲ３：Ｆｃ：１２７ｋＤａ。フラッグ−ＴＲＡＩＬ、フラッグ−ＦａｓＬ、フラッグ−ＴＮＦα、フラッグ−ＣＤ４０Ｌ：７１、５５，５６もしくは５４ｋＤａ。
【０１２３】
（Ｇ）  ＢＩＡｃｏｒｅ−測定
ＢＩＡｃｏｒｅ−測定をＣＭ５−カルボキシメチルデキストラン変性センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）で、５μｌ／ｍｉｎの流量速度で実施した。ＣＭ５−チップは、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの１：１混合物の５０μｌ−添加で活性化させた。ＮａＨＣＯ3（ｐＨ５．５）１０ｍＭ中のＭ２−アンチ−フラッグモノクローナル抗体の１００μｇ／ｍｌ溶液６μｌを、次いで活性化した表面上に流した。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌの５０μｌ−添加は残留したＨ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを失活させた。この手順のために消費された固定されたＭ２−抗体の量は、約４６００ユニットであった。ＦａｓＬ−Ｆａｓ：融合タンパク質及びＴＲＡＩＬ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２：融合タンパク質の相互作用の分析のために、一定量の標識したリガンドをＭ２変性表面上に固定した。この達成のために、フラッグ−ＦａｓＬ又はフラッグ−ＴＲＡＩＬ  ２．５μ／ｍｌの７μｌ−添加量をこの表面に塗布した。これにより約１００〜１５０ユニットが結合した。この条件は、その他にＭ２−表面からリガンドの最小の解離を許容し、一方で同時に分析のために十分な次のレセプター結合を許容する。次いでレセプター：融合タンパク質の結合を、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度、１００〜１５０ユニットに相当の精製されたレセプター：融合タンパク質の１５μｌ注入により分析した。この会合速度を３分間測定し、解離速度を３〜５分間測定した。次いで、この表面をシトレート−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）５０ｍＭの５μｌ−添加により（簡単なＭ２−表面に）再生した。３０回連続するまでの結合及び再生の推移を、固定されたＭ２−抗体の結合特性の明らかな変化がなく実施できた。この解離速度及び会合速度は、製造元の反応速度分析プログラムを用いてモデルＡＢ＝Ａ＋Ｂ及びＡ＋Ｂ＝ＡＢを使用しながら分析した。
【０１２４】
（Ｈ）  第１マウス−肝細胞の培養
第１マウス−肝細胞の培養のためにＣ５７ＢＬ／６マウスを犠牲にし、胆管上方の肝臓領域を即座に切除し、これを「肝細胞−アタッチメント−培地」（ＨＡＭ）中に保持した。この肝臓領域をまずＨｅｐｅｓ  １０ｍＭ（ｐＨ７．６）１６ｍｌで灌流させ、赤血球を除外し、次いでＨｅｐｅｓ（４ｍＭ  ＣａＣｌ2）中の０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１２ｍｌで処理し、次いでペトリ皿中でＨｅｐｅｓ中でホモジナイズドした。この細胞をＨｅｐｅｓ中で洗浄し、次いで遠心分離（１００×ｇ、３０秒）し、ＨＡＭ中の６０％の等張パーコール溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に再懸濁させ、さらに遠心分離（７００×ｇ、２分）した。全ての緩衝液及び培地を３７℃で添加した。沈殿した細胞をＨＡＭ中に再懸濁させ、カウントし、平板シャーレ状のマイクロタイタープレート上に置き（ウェル１つあたり１００００、２００μｌ）、相応して付着させることができた。実験混合物（シリアルに希釈したインヒビター、ｓＦａｓＬ、最終濃度：４００ｎｇ／ｍｌ、７ｎＭ）及びＭ２−抗体（最終濃度：１μｇ／ｍｌ）を添加し、この細胞をさらに６時間インキュベーションした。この上澄液を取り除き、新鮮なＨＡＭ（１００μｌ）を添加し、上記したような生存能力試験ＰＭＳ／ＭＴＳを実施した。
【０１２５】
（Ｉ）  活性化誘導された細胞死
平板シャーレ状のマイクロタイタープレートをＰＢＳ中のアンチ−ヒトＣＤ３  ＴＲ６６（１０μｇ／ｍｌ）で３時間３７℃で被覆した。このプレートをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０培地で１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ−細胞（１ｍｌあたり５×１０5細胞、１００μｌ）をインヒビターと混合し、各「ウェル」に分配し、次いで遠心分離（２００×ｇ、３ｍｉｎ）し、２４時間の間３７℃でインキュベーションした。この細胞生存能力（ＯＤ４９０ｎｍで）を、前記したように測定した。特異的な細胞保護率（％で）を次のように計算した：［（アンチ−ＣＤ３＋インヒビター）−（アンチ−ＣＤ３）］／［（対照）−（アンチ−ＣＤ３）］×１００。
【０１２６】
混合した白血球培養の準備のために、パーフォリン−欠損した又はｇｌｄ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）からの脾臓細胞をＢａｌｂ／ｃ−マウス（Ｈ−２d）からの脾臓細胞と一緒に５日間培養した。その使用の前に生命力のない細胞を試料から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で勾配−遠心分離により除去した。マーキングを前記した方法（Ｋａｔａｏｋａら）により実施した。簡単に説明すると、目標細胞（Ａ２０−細胞）をナトリウム［51Ｃｒ］−クロメート（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて１時間の間にマーキングし、次いでＲＰＭＩ  １６４０で３回洗浄した。ＭＬＣ−細胞を目標細胞（「ウェル」あたり１０4個の細胞）とＵ字形のマイクロタイタープレート中でＦａｓ：Ｆｃ及びＦａｓ：ＣＯＭＰの存在又は不在で、４０μｇ／ｍｌの場合に２００ｍｌの最終容量で混合し、このプレートを遠心分離（２００×ｇ、３ｍｉｎ）した。４時間インキュベーションした後に上澄液を除去し、放射能を測定した。この特異的［51Ｃｒ］−遊離率（％で）を次の式を用いて決定した：［（実験による遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）］×１００。
【０１２７】
（Ｋ）  ＦＡＣＳ−マーキング
ＦＡＣＳ−マーキングのために、ＣＤ４０Ｌ+−Ｊｕｒｋａｔ−クローン−Ｄ１．１（５×１０5個の細胞）を、ＦＡＣＳ−緩衝液中のＣＤ４０：ＣＯＭＰ  ２μｇ（ＰＢＳ、ウシ胎児血清１０％及びＮａＮ3  ０．０２％）と一緒にインキュベーションした。Ｆａｓ：ＣＯＭＰをネガティブな対照として使用した。レセプター：ＣＯＭＰを９Ｅ１０アンチ−ｍｙｃ−抗体１μｇを用いて、及び引き続きＦＩＴＣマーキングしたヤギ−アンチ−マウス−抗体（１：１００）を用いる処理で検出した。インキュベーションを４℃で２０分間でＦＡＣＳ−緩衝液５０μｌ中で実施した。
【０１２８】
（Ｌ）  Ｂ−細胞−増殖試験
Ｂ−細胞−増殖アッセイのために、ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）からのＣＤ１９+−細胞を、磁性の「ビード」（小球）を用いて精製し、残りのＣＤ１９-−細胞を照射した（３０００ｒａｄ）。１０5個の精製されたＣＤ１９+−細胞を１０5個のＣＤ１９-自己由来した照射されたＰＢＬと、培地１２０μｌ中で混合し、この培地はｓＣＤ４０Ｌを１００ｎｇ／ｍｌ（１．８ｎＭ）の濃度で、Ｍ２−抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で、プラス又はマイナスのタンパク質Ａを１μｇ／ｍｌの濃度で、及びＣＤ４０：Ｆｃ又はＣＤ４０：ＣＯＭＰの記載された濃度で含有する。この細胞を次いで７２時間９６ウェル−プレート中で培養し、６時間［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）と共にパルスをかけ、収穫した。この［3Ｈ］チミジン組み込みを液体−シンチレーションカウントにより調査した。
【０１２９】
７．２  第７の実施例の結果
ＩｇＧのＦｃ−部分（レセプター：Ｆｃ）に融合したレセプターの細胞外ドメインからなる融合タンパク質はレセプターリガンド−相互作用の研究のためにインヒビター性の抗原として先行技術から公知である。第７の実施例において精製したＦａｓ：Ｆｃ−融合タンパク質のサイズを排除クロマトグラフィーにより調査し、個々のピークを期待された保持時間で溶離した。Ｆａｓ：Ｆｃ含有フラクションは、可溶性ＦａｓＬ（ｓＦａｓＬ）の致死投与量にさらされたＡ２０−細胞を細胞死から保護することができたが、しかしながら、試験においてＦａｓ：ＦｃとＦａｓＬとの評価した割合が約１０００であるように配慮する場合に、保護（５０５まで）の程度は著しく低かった。
【０１３０】
弱い保護活性は溶離液のより早い時期の若干のフラクションにおいても観察され、これらのフラクションはおそらくわずかな検出不可能な量のＦａｓ：Ｆｃの高分子量複合体を有していた。本発明により、融合タンパク質のこの種のより高い凝集体をＦａｓＬにより誘導される細胞死の有力なインヒビターとして機能できることは明らかである。従って、まず免疫グロブリンに交差架橋する薬剤のタンパク質Ａを添加することにより、この凝集したＦａｓ：Ｆｃの高分子量フラクションを高めた。注入したＦａｓ：Ｆｃ約１０％だけを早期に溶離したフラクションにずらした条件でこの分析を実施した場合、高分子量のＦａｓ：Ｆｃ−複合体はＦａｓＬにより誘導される細胞毒性の有効なアンタゴニストであることが明らかとなった。これと比べて、残りのＦａｓ：Ｆｃ−フラクションがいまだにダイマーとして溶離しかつ１０倍より赤い濃度であっても細胞に対して部分的な保護しか提供しないことが明らかになった。本発明の場合に、個のだ７の実施例の結果は、より高いＦａｓ：Ｆｃ−凝集物の形成が特異的な保護活性を著しく高めることを示した。
【０１３１】
この認識に基づいて、従って、Ｆａｓのオリゴマー化度の拡大に基づきＦａｓＬに対してより良好な活性を示しかつインヒビター特性を改善する融合タンパク質からなる本発明による複合体を構築した。本発明による融合タンパク質は例えば、ＴＮＦ−ファミリーのレセプターの細胞外ドメイン、例えばＦａｓ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＮＦ−Ｒ１又はＣＤ４０、１４アミノ酸長さを越えるリンカーと、いわゆる軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（（ＣＯＭＰ）；レセプター：ＣＯＭＰとして表す融合タンパク質）又はいわゆる軟骨マトリックスタンパク質（（ＣＭＰ）；レセプター：ＣＭＰとして表す融合タンパク質）のオリゴマー化するドメインとが融合されているようなものである。このマトリクス−タンパク質もしくはそのドメインは、天然の特性を有し、コイルド−コイル−構造のペンタマーもしくはトリマーを形成する。前記の融合タンパク質（並びに対照としてのレセプター：Ｆｃ−融合タンパク質）は哺乳動物細胞中で発現し、金属キレート化ラム上で又はタンパク質Ａ上でのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。このレセプターＦａｓ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２は第７の実施例において、タンパク質のＣ−末端のダイマー化ドメインにＴＮＦ−ファミリーからのオステオプロテゲリンが結合されていた（レセプター：δＮ−ＯＰＧ）。
【０１３２】
ＣＯＭＰ又はＣＭＰに融合されたこのレセプターは、非還元性の条件下でポリアクリルアミドゲル中でゆっくりと移行させることにより示すことができるようにオリゴマー化する。Ｆａｓ：ＣＯＭＰ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２：ＣＭＰは、ゲル−浸透クロマトグラフィー法を使用した場合に約４００もしくは１７０ｋＤａの明白な分子量を有する十分に限定された「ピーク」として溶離した。この分子量は融合タンパク質のペンタマーもしくはトリマーの構造と一致する。第７の実施例の試験から、従って、前記のマトリックスタンパク質のコイルド−コイル−オリゴマー化ドメインの凝集特性は、ＴＮＦ−レセプターファミリーのタンパク質（又はタンパク質ドメイン）に融合することによっても悪い影響を及ぼさないと結論づけることができる。
【０１３３】
この融合タンパク質Ｆａｓ：ＣＯＭＰは、載せられたＦａｓ：Ｆｃに対してｓＦａｓＬ−結合をめぐって競合することがある場合、この融合タンパク質Ｆａｓ：ＣＯＭＰはＦａｓ：Ｆｃよりも低いＫDを示す。この結果の一致において、ＦａｓＬ−Ｆａｓ：ＣＯＭＰ−相互作用について０．７７ｎＭの解離定数が測定され、これはＦａｓ：Ｆｃに対する比較値よりも約８〜９倍低い。著しく多数の試験されたセルラインにおいて、Ｆａｓ：ＣＯＭＰの阻害活性は、ダイマーの融合タンパク質Ｆａｓ：Ｆｃに対する阻害活性よりも約１０倍〜２０倍高く、交差架橋するタンパク質Ａにより生じたＦａｓ：Ｆｃ−凝集体（Ｆａｓ：Ｆｃ／ＰＡ）に対する結果は、Ｆａｓ：ＣＯＭＰについての値及びＦａｓ：Ｆｃについての値の間の値を示した。ダイマーのＦａｓ：δＮ−ＯＰＧ−融合タンパク質の保護活性は、ダイマーのＦａｓ：Ｆｃ−複合体の保護活性と比較可能であった。トリマーのＦａｓ：ＣＭＰは、ｓＦａｓＬにより媒介された溶菌をほぼＦａｓ：Ｆｃ／ＰＡと同じ程度有効に阻害し、結果として、つまりＦａｓ：ＣＯＭＰよりも５倍少ない有効性であった。Ｆａｓ：ＣＯＭＰの阻害活性は良好であり、ＦａｓＬにより遮断されたモノクローナル抗体Ｎｏｋ−１、４Ｈ９及び４Ａ５よりも良好であった。Ｆａｓ：Ｆｃ−複合体と比較したＦａｓ：ＣＯＭＰの優秀な阻害活性は、初期マウス肝細胞を用いた試験から又はアンチ−ＣＤ３活性化されたＪｕｒｋａｔ−細胞を用いた活性化誘導された細胞死についてのモデルシステムからも明白である。全てのこの試験において、Ｆａｓ：Ｆｃ／ＰＡについては平均的な保護作用値を示した。さらに、Ｆａｓ：ＣＯＭＰが、ＣＴＬｓで発現されたＦａｓＬの作用を阻害するかどうかが試験された。Ａ２０−細胞の４時間の試験系における細胞死は、パーフォリン及びＦａｓＬ−依存性のシグナル伝達経路に依存する、それというのもパーフォリン並びにＦａｓＬ欠損しているＣＴＬｓはこの細胞に関して作用を示さないからである。相応する試験において、Ａ２０−細胞は期待通りにパーフォリン−誘導したＣＴＬｓ並びにＦａｓＬ−誘導したＣＴＬｓを殺した。Ｆａｓ：Ｆｃ及びＦａｓ：ＣＯＭＰは特異的に、パーフォリン−欠損したＣＴＬｓにさらされた細胞に対する一定の程度の保護を引き起こした。
【０１３４】
競合ＥＬＩＳＡによるｓＣＤ４０ＬのＣＤ４０：Ｆｃ、ＣＤ４０：ＦＣ／ＡＣ又は本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰに対する親和性の比較において、ペンタマー化されたレセプターについて親和性の著しい向上（３０倍）が観察され、一方ＣＤ４０：ＦＣ／ＡＣについて中程度の効果（８倍）が生じた。ＣＤ４０：ＣＯＭＰが膜結合するＣＤ４０Ｌも認識できるかどうかの問題に関して、膜タンパク質ＣＤ４０Ｌを構成的に発現するＪｕｒｋａｔ−誘導化されたセルラインＤ１．１はＦＡＣＳ−マーキング分析の実施のためにＣＤ４０−融合タンパク質を試料として使用して実施した。明らかなマーキングが本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰについて観察され、それによりＣＤ４０−ＣＯＭＰは実際に天然のプロセッシングされていないＣＤ４０Ｌと結合できることが示された。ＣＤ４０Ｌ−融合タンパク質の生体システム中での特異的活性を試験するために、アンチ−Ｂ−細胞−レセプターで共刺激されているＣＤ４０Ｌ依存するヒトＢ−細胞の増殖を阻害することを試験した。ＣＤ４０：ＦｃもＣＤ４０：ＦＣ／ＡＣも、高い投与量で投与した場合であっても明らかに増殖に悪い影響を及ぼすことなかった。これとは反対に、本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰは、比較的低い投与量の場合ですでに増殖を遮断することができた。
【０１３５】
要約すると、本発明による実施例の試験から、ＦａｓＬ−誘導化されたアポトーシスの競合するインヒビターによる阻害がオリゴマー化度に依存して増大し、かつ多様なインヒビターの比活性（そのそれぞれのＩＣ50−値の割合として表す）は多様なセルラインに対して比較的一定にとどまることが確認された。本発明によるＦａｓ：ＣＯＭＰのＦａｓ：Ｆｃと比較して高められた阻害作用は、おそらくその高い抗体結合力の結果である。同様の結果が、本発明によるＣＤ４０−融合タンパク質の活性についても測定された。本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰは、インビトロでプライマリーＤ−細胞のＣＤ４０Ｌ−誘導された増殖の阻害においてＣＤ４０：Ｆｃを明らかに上回っている。従って、実施例７の結果は、例えばＦａｓ及びＣＤ４０のようなレセプターに対して、低ナノモーラル領域で解離定数は得られ、これは天然でこのリガンドに対して中程度の親和性を特徴付けており、本発明により考慮されるような融合タンパク質の構成単位である場合、比較的高いオリゴマー化度により特徴付けられることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、１文字コードで、本発明によるオリゴマー（ＦａｓＬ−ヘキサマー）の、つまりトリマーのバイマーの形で出現する組み換えられた本発明による融合タンパク質（２）のアミノ酸配列を示す。
【図２】  図２は、図２Ａに本発明による、つまり特異的なリンカー配列（成分Ｂ）を有する融合タンパク質（２）の、還元性の条件下（ｒ）で及び非還元性の条件下（ｎｒ）でのゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を、そして図２Ｂに本発明によるオリゴマー、この場合、本発明による融合タンパク質もしくは融合タンパク質（２）のトリマーのバイマーを示す。
【図３Ａ】  図３Ａは、Ａ２０−細胞（図３Ａ及び３Ｂ）に関して示す。
【図３Ｂ】  図３ＢはＪｕｒｋａｔ−細胞（図３Ｃ及び３Ｄ）に関して示す。
【図４】  図４は、特異的なリンカー領域（融合タンパク質（３）の成分Ｂ）における（Ｃ→Ｓ）−置換を考慮した、本発明による融合タンパク質（３）のアミノ酸配列を示す（スーパー−ＦａｓＬ）。
【図５Ａ】  図５ＡはＡ２０−細胞生存能力を示す。
【図５Ｂ】  図５ＢはＪｕｒｋａｔ−細胞（図５Ｄ）生存能力を示す。
【図６Ａ】  図６Ａは本発明による融合タンパク質（４）、ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０のアミノ酸配列を示する。
【図６Ｂ】  図６Ｂはもう一つの融合タンパク質が示す。
【図６Ｃ】   図６Ｃは曲線の推移を示す。
【図７】  図７は図３と同様に、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）での、バイマー化できない又はオリゴマー化できないＦａｓＬ−トリマー（図１による融合タンパク質（１）をベースとする比較試験、図７Ａ）及び本発明によるオリゴマー、この場合トリマーのテトラマー、図６によるつまり本発明による融合タンパク質（４）のドデカマーの添加によるＢＪＡＢ−細胞の生存能力を示す。
【図８】  図８は本発明による融合タンパク質（５）のアミノ酸配列を示す。
【図９】  図９は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）で、バイマー化能力又はオリゴマー化能力のない先行技術によるＴＲＡＩＬ−トリマー（Ｎ−末端にフラッグ配列及びヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１を有する融合タンパク質）（比較試験、図９Ａ）の添加による及び本発明による融合タンパク質（５）、ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０の本発明によるドデカマーの添加によるＪｕｒｋａｔ−細胞の生存能力を示す。
【図１０】  図１０は本発明による融合タンパク質（６）のアミノ酸配列を示す。
【図１１】  図１１は、細胞増殖試験の結果を示す。
【図１２】  図１２は本発明による融合タンパク質（７）のアミノ酸配列を図１２す。
【図１３】  図１３は、図１１においても示したように、細胞増殖試験の結果を示す。
【図１４】  図１４はオリゴマー化されたマルティマーの構造を図式的に示す。
【図１５Ａ】  図１５Ａはもう一つの本発明による融合タンパク質、つまりｈＥＤＡ／ＦａｓＬの構造を示す。
【図１５Ｂ】  図１５Ｂは本発明による融合タンパク質ｈＥＤＡ／ＦａｓＬを用いた試験を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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