(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上のＣ型肝炎ウイルス株のゲノムRNAからなり、
遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株の5'非翻訳領域と、
遺伝子型1bのＣ型肝炎ウイルス株の、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列及びp7タンパク質コード配列と、
遺伝子型1b又は2aのＣ型肝炎ウイルス株のNS2タンパク質コード配列と、
配列番号１で示されるJFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質をコードするRNA部分配列と、
遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株の3'非翻訳領域と、
を含み、自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項２】
２種以上のＣ型肝炎ウイルス株のゲノムRNAからなり、5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、配列番号２で示されるJFH1株のNS5Bタンパク質コード配列及び3'非翻訳領域を含み、自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAであり、
前記２種以上のＣ型肝炎ウイルス株は、遺伝子型2a又は1bのＣ型肝炎ウイルス株である、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項３】
前記遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株はJFH1株である、請求項１又は２記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項４】
前記遺伝子型1bのウイルス株は、HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株、HCV-JT及びHCV-BK株から選ばれるＣ型肝炎ウイルス株である、請求項１〜３のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項５】
JFH1株の5'非翻訳領域と、HCV-con1株のcoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列及びNS2タンパク質コード配列と、JFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質をコードする配列と、JFH1株の3'非翻訳領域と、を5'から3'方向へこの順番で配置してなる塩基配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項６】
JFH1株の5'非翻訳領域と、HCV-TH株のcoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列及びp7タンパク質コード配列と、JFH1株のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質をコードする配列と、JFH1株の3'非翻訳領域と、を5'から3'方向へこの順番で配置してなる塩基配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項７】
配列番号１１に示される塩基配列を含み、自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項８】
JCH株のゲノムの1〜3866番の領域とJFH1株のゲノムの3867〜9678番の領域とが連結された塩基配列を含み、自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを含む、肝細胞指向性ウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを導入され、該Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAを複製しかつウイルス粒子を産生しうる細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の細胞を培養した培養物中から得られるＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１２】
請求項１１記載のＣ型肝炎ウイルス粒子を含有する液体又は細胞破砕物から、カラムクロマトグラフィ及び／又は密度勾配遠心を組み合わせることによりＣ型肝炎ウイルス粒子を精製する方法。
【請求項１３】
前記記載のカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィである請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、陰イオンクロマトグラフィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のゲル濾過クロマトグラフィがＳｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ３００（登録商標）、Ｓｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ４００（登録商標）又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ５００（登録商標）から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のアフィニティークロマトグラフィが硫酸化セルロファイン、ヘパリン及びレクチンの中から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィである請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記記載のクロマトグラフィが硫酸セルロファインクロマトグラフィである請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記記載の密度勾配遠心が、塩化セシウム、ショ糖及び糖の重合体より選ばれる一つ以上の溶質を用いて行われる請求項１２の方法。
【請求項１７】
前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、硫酸セルロファインクロマトグラフィ、及びショ糖密度勾配遠心をそれぞれ一回以上任意の順番で組み合わせた請求項１２の方法。
【請求項１８】
請求項１１記載のＣ型肝炎ウイルス粒子を含有する液体あるいは細胞破砕液から、カラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心を組み合わせるＣ型肝炎ウイルス粒子の精製方法により得られたＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１９】
前記記載のカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ及びアフィニティークロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィで精製された請求項１８のＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項２０】
前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、陰イオンクロマトグラフィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のゲル濾過クロマトグラフィがＳｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ３００（登録商標）、Ｓｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ４００（登録商標）又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ５００（登録商標）から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のアフィニティークロマトグラフィが硫酸化セルロファイン、ヘパリン及びレクチンの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィにより精製された請求項１９のＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項２１】
前記記載のクロマトグラフィが硫酸セルロファインクロマトグラフィで精製された請求項１８のＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項２２】
前記記載の密度勾配遠心が、塩化セシウム、ショ糖及び糖の重合体より選ばれる一つ以上の溶質を用いて精製された請求項１８のＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項２３】
前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、硫酸セルロファインクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせて精製された請求項１８のＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項２４】
請求項１１及び１８〜２３のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルス粒子が感染したＣ型肝炎ウイルス感染細胞。
【請求項２５】
請求項１０記載の細胞を培養し、培養物中からウイルス粒子を回収することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
【請求項２６】
請求項１０記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法。
【請求項２７】
被験物質の存在下で請求項１０又は請求項２４記載の細胞を培養し、培養物中のＣ型肝炎ウイルスRNA又はウイルス粒子を検出することにより、該被験物質の抗Ｃ型肝炎ウイルス効果を評価することを特徴とする、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質のスクリーニング方法。
【請求項２８】
外来遺伝子をコードするRNAを請求項１〜８のいずれか１項記載のＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA中に挿入し、これを目的とする細胞中に導入して複製又は発現させることを特徴とする、細胞内で外来遺伝子を複製及び／又は発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種遺伝子型のヒトＣ型肝炎ウイルス（HCV）を培養細胞系で自律複製させる方法と、そのための改変HCVゲノムRNA、及び該HCVゲノムRNA複製細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究により、Ｃ型肝炎ウイルスは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが分かってきた。現在主流のHCV遺伝子型分類法である、SimmondsらによるHCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、HCVは遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型3a、遺伝子型3bの６タイプに分類され（非特許文献１）、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、HCVの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（特許文献１、及び非特許文献２〜４）。
【０００３】
HCVは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がHCV持続感染である。実際、持続感染者の５０％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約２０％の患者が１０年〜２０年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
【０００４】
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけで、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。インターフェロンの治療効果は、HCVの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型1bに対しては効果が低く、遺伝子型2aに対してはより効果が高いと言われている（非特許文献５）。また、遺伝子型により、HCVが有するプロテアーゼの基質特異性が異なり、遺伝子型１bのNS3プロテアーゼを用いて開発した阻害薬は、他の遺伝子型のNS3プロテアーゼについては、その阻害活性が５０倍以上悪くなる（非特許文献６）。従って、効率の良いHCV治療薬を開発するためには、HCVの各遺伝子型での反応性を確認しながら、開発を行う必要がある。
【０００５】
最近になって、HCV由来の自律複製能を有するRNAとして、HCVサブゲノムRNAレプリコンが作製されたことにより（特許文献２、３、及び非特許文献７〜９）、培養細胞を用いてHCVの複製機構を解析することが可能となった。これらのHCVサブゲノムRNAレプリコンは、HCVゲノムRNAの5'非翻訳領域中のHCV IRESの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結したEMCV-IRESによって置換したものである。このRNAレプリコンは、ヒト肝癌細胞Huh7に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Huh7細胞内で自律複製することが証明された。さらに一部のHCVサブゲノムRNAレプリコンは、Huh7に限らずヒト子宮頸部癌細胞HeLa、ヒト肝癌細胞HepG2などの細胞内でも自律複製することが証明された（特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、このようなHCVの細胞内RNA複製系は、未だ限られた遺伝子型についてのもの、というよりはむしろ、限られたHCV株のゲノムRNAを用いたものしか作製されていない。従って、数多くの遺伝子型が存在するHCVについて、開発したHCV治療薬の遺伝子型の違いによる治療効果の違いを検討することは極めて困難である。また、RNAレプリコンは、HCVウイルスの増殖複製過程における、ウイルスRNA複製のみ評価可能な実験系であり、HCVウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価することはできない。
【０００７】
現在、HCVウイルス粒子の形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価する方法は、チンパンジーなどの動物を用いた実験系に限られる（非特許文献１０）。しかしながら、動物という生体をそのまま用いた実験系は、操作が煩雑で解析が極めて困難である。従って、HCVウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程の解析や、これらの過程の阻害を作用メカニズムとした抗HCV薬の開発には、これらの過程を再現できる極めて単純化された実験系、すなわち、培養細胞系を用いたHCVウイルス粒子の複製系を構築する必要がある。
【０００８】
また、培養細胞系による安定したHCVウイルス粒子の供給が可能になれば、ウイルスを弱毒化したり、分子生物学的手法を用いて非感染性のHCVウイルスを作製して、ワクチンに利用することもできる。しかしながら、HCVは遺伝子型によりタンパク質の配列が異なるため、HCVの抗原性も遺伝子型ごとに異なる。実際、多様な遺伝子型の存在はHCVワクチンの生産における大きな障害となっている（非特許文献１１）。従って、効率の良いHCVワクチンの生産のためにも、培養細胞系による、各遺伝子型のHCVウイルス粒子の安定した生産が望まれる。
【０００９】
HCVは、55〜65 nmの球状粒子でありＨＣＶ感染患者の血中に存在することが知られている。ヒト血清中に存在するＨＣＶを精製する方法として、レクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィ（非特許文献１２）及びヘパリンを用いたクロマトグラフィ（非特許文献１３）が知られている。しかし、これらの方法では、およそ1 Mコピー/mL程度の濃度で1 mLに満たない量のウイルスしか精製できないことから、工業的な利用には全く結びつかない。
【００１０】
HCV以外でウイルス粒子を精製する方法が現在までに複数発明されている（例えば特許文献４、５、及び６）。しかし、これらの文献をみてわかるようにウイルス粒子の性質は様々であり、ヒトＣ型肝炎ウイルスの精製に至適である方法についてなんら参考になる情報を与えない。また、同じ肝炎ウイルスであるヒトＡ型肝炎ウイルスについて特許文献７において、陰イオン交換クロマトグラフィによりＤＮＡを除去することによりヒトＡ型肝炎ウイルスを精製することができることを開示している。しかし、肝炎ウイルスであってもＡ型はＤＮＡを遺伝子としてもつウイルスであり、Ｃ型はＲＮＡを遺伝子としてもつウイルスであることからもわかるように全く類似点はなく、精製する方法についてなんら参考になる情報を与えない。今後、ヒトＣ型肝炎ウイルス粒子をワクチンなどに工業的に用いるためには大量かつ高度に精製する必要があることから、精製方法の開発が待たれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−１７１９７８号公報
【特許文献２】特開２００１−１７１８７号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／１０４１９８Ａ１
【特許文献４】特許３３１３１１７号
【特許文献５】特表２００２−５０３４８４号
【特許文献６】特表２０００―５１０６８２号
【特許文献７】特公平6-48980
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) p1321-1324
【非特許文献２】Choo, Q.L et al., Science, 244 (1989) p359-362,
【非特許文献３】Okamoto, H et al., J. Gen. Virol., 73(1992) p673-679
【非特許文献４】Mori, S. et al Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334-342
【非特許文献５】Yoshioka, K. et al., Hepatology, 16 (1992) p293-299
【非特許文献６】Thibeault, D. et al., J.Virol., 78 (2004)  p7352-7359
【非特許文献７】Blight et al., Science, 290(2000)  p1972-1974
【非特許文献８】Friebe et al., J. Virol., 75(2001) p12047-12057
【非特許文献９】Kato, T. et al., Gastroenterology , 125(2003) p1808-1817
【非特許文献１０】Kolykhalov et al., Science, 277(1997) p570-574
【非特許文献１１】Farci, P., et al., Semin Liver Dis 20(2000) p103-126
【非特許文献１２】Virology、196(1993) p354-357
【非特許文献１３】Journal of General Virology 86(2005) p677-685
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、各種遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスを培養細胞系で複製増幅するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、自律複製能を有するHCV JFH1株のゲノムRNAと、in vitroで自律複製能を有しないHCV株のゲノムRNAとを組み合わせた改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを作製し、これが培養細胞系で自律複製可能なことを見出した。具体的には前記発明は、JFH1株のNS3タンパク質コード配列から3’末端までのゲノムを導入することにより、in vitroで自律複製能を有しないHCVゲノムRNAを培養細胞系で自律複製可能なRNAに改変しうることを見出した。
【００１５】
すなわち、本発明は、２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNAの、5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、ならびにJFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bの各タンパク質コード配列、及び3'非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAに関する。
【００１６】
具体的には、本発明は１つの実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAのNS3タンパク質コード配列から3'末端までのゲノム配列NS5Bタンパク質コード配列が配列番号１に示されるJFH1株のNS3、NS4、NS5A、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA部分配列（Genbank Accession No. AB047639のDNA配列3867-9678で示される配列のTをUに置換したRNA配列）に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを提供する。
【００１７】
さらに別な実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAのNS5Bタンパク質コード配列が配列番号２で示されるJFH1株のNS5Bタンパク質コード配列に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを提供する。
【００１８】
２種以上のＣ型肝炎ウイルスとしては、遺伝子型1b及び遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルスを用いることが好ましい。遺伝子型1bのウイルス株としては、HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株、HCV-JT及びHCV-BK株を挙げることができ、また遺伝子型2aのウイルス株としては、HCV-J6株、HCV-JFH1株、及びHCV-JCH1株を挙げることができる。
【００１９】
本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAは、さらに、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのIRES配列とを含んでいてもよい。
【００２０】
この場合、前記5'非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子、少なくとも１つのIRES配列、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列、及び3'非翻訳領域は、5'から3'方向へこの順番で改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAに含まれる。
【００２１】
本明細書では、この改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAの一例として、
(a) 配列番号11に示す塩基配列からなるRNA、又は
(b) 配列番号11に示す塩基配列において１又は複数個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは１０個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるRNAを含み、自律複製能及びＣ型肝炎ウイルス粒子産生能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを挙げることができる。
【００２２】
本発明はまた、本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを導入され、該Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAを複製しかつウイルス粒子を産生しうる細胞を提供する。ここで、宿主細胞は増殖性細胞であることが好ましく、特に、真核細胞、例えば、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、又は293細胞等のヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞が好ましい。
【００２３】
本発明は、前記細胞を培養し、培養物中からウイルス粒子を回収することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法、及び該方法によって製造されるＣ型肝炎ウイルス粒子も提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法、及び該方法によって製造されるＣ型肝炎ウイルス感染細胞も提供する。
本発明は、カラムクロマトグラフィ及び／又は密度勾配遠心を用いてHCV粒子を精製することにより工業的に医薬に用いることが可能な精製度をもつHCV粒子を得ることができる。その際に用いるカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィから選ばれるひとつ又は複数のクロマトグラフィであり、密度勾配遠心を、塩化セシウム、ショ糖及び糖重合体のより選ばれるひとつ又は複数の溶質を含んだ溶媒を用いて行うことによりHCVを精製することができる。
【００２５】
本発明は、本発明の細胞やＣ型肝炎ウイルス感染細胞を利用した抗Ｃ型肝炎ウイルス物質のスクリーニング方法も提供する。該方法は、被験物質の存在下で本発明の細胞又はＣ型肝炎ウイルス感染細胞を培養し、培養物中のＣ型肝炎ウイルスRNA又はウイルス粒子を検出することにより、該被験物質の抗Ｃ型肝炎ウイルス効果を評価することを特徴とする。
【００２６】
また本発明は、本発明のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、Ｃ型肝炎ワクチンを製造する方法を提供する。
【００２７】
さらに本発明は、外来遺伝子をコードするRNAを本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA中に挿入し、これを目的とする細胞中に導入して複製又は発現させることを特徴とする、細胞中で外来遺伝子を複製及び／又は発現する方法、並びに、本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを含む肝細胞指向性ウイルスベクターを提供する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、培養細胞系を用いて、感染性を有するHCVウイルス粒子を作製することができる。さらに、患者から分離した自律複製能を有さないHCV株においても、そのNS3領域より3’側の領域をJFH1のウイルスゲノムRNAに置換することにより、あるいはNS5B領域をJFH1のNS5Bに置換することにより、in vitroで自律複製させることができる。従って、種々の遺伝子型のHCV株のウイルス粒子を培養細胞系により作製することができ、HCV感染過程の研究、HCV感染に影響を及ぼす各種物質のスクリーニング系、及びHCVワクチンの製造等に有用である。
【００２９】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００４−２４３９７５号、特願２００４−２９０８０１号、特願２００５−６９５２７号、及び特願２００５−６９７２５号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．改変されたキメラＣ型肝炎ウイルスゲノムRNA
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(+)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTRとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTRとも表記する）からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
【００３１】
このようなHCVの構造タンパク質（core、E1、及びE2）と非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、HCVのウイルスタンパク質）のうち、coreはコアタンパク質であり、E1及びE2はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、NS2はメタロプロテアーゼ活性、NS3はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、NS4AはNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、NS5BはRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
【００３２】
現在、HCVの遺伝子型としては、少なくとも１型から６型まで知られており、HCVはその配列から、Simmondsら（Simmonds, P. et al, Hepatology, (1994) 10, p. 1321-1324を参照）による国際分類に従って各種遺伝子型（HCV1a、HCV1b、HCV2a、HCV2b等）に分類されている。本発明において、自律複製能を有しないHCVゲノムRNAは、これらの既知のウイルス型に限定されず、全ての自律複製能を有しない、つまり感染性粒子を細胞外に放出する能力を有しないHCVゲノムRNAを含むものとする。なお、本発明においてRNAが「自律複製能を有する」あるいは「自律的に複製する」とは、HCVゲノムRNAを細胞中に導入したときに、そのHCVゲノムRNAが自己増殖すること、つまり感染性粒子を細胞外に放出する能力を有することを意味する。
【００３３】
本明細書では、上記のような培養細胞系自律複製能を有するHCVゲノムRNAを含むRNAを、「レプリコンRNA」又は「RNAレプリコン」と称する。本明細書では、レプリコンRNAの全長を含む本発明のレプリコンRNAを、「全長HCVレプリコンRNA」と呼ぶ。本発明の全長HCVレプリコンRNAは、ウイルス粒子産生能を有する。また、本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAは、全長HCVレプリコンRNAである。
【００３４】
本発明にかかる改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAは、２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNAの、5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、ならびにJFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bの各タンパク質コード配列、及び3'非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを含む。具体的には、本発明は１つの実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAのNS3タンパク質コード配列から3'末端までのゲノム配列NS5Bタンパク質コード配列が配列番号１に示されるJFH1株のNS3、NS4、NS5A、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA部分配列（Genbank Accession No. AB047639のDNA配列3867-9678で示される配列のTをUに置換したRNA配列）に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを含む。
【００３５】
また別の実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAのNS5Bタンパク質コード配列が配列番号２で示されるJFH1株のNS5Bタンパク質コード配列に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを提供する。
【００３６】
好適には、遺伝子型1b及び遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルスを用いた、5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、ならびにJFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bの各タンパク質コード配列、及び3'非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを含む。
【００３７】
前記の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAは、さらに、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのIRES配列とを含んでいてもよい。
【００３８】
本発明では、２種以上のＣ型肝炎ウイルスとして、培養細胞系で自律複製能を有するHCV株と培養細胞系で自律複製能を有しないHCV株とを組み合わせることにより、自律複製能を有しないHCV株を自律複製可能なものに改変することができる。あるいは、自律複製効率が低いウイルス株を複製効率の高いウイルス株に改変することができる。
【００３９】
HCV株としては、具体的には、1a型にはHCV-１株、HCV-H株、HCV-J1株など、1b型には、HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-Ｊ株、HCV-JT株、HCV-BK株など、2a型にはHCV-J6株、JFH-1株、JCH１株など、2b型にはHC-J8株、3a型にはE-b1株などが知られている。これらのウイルスの構造は、基本的には、5'-UTRから、core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、3'-UTRからなる（前掲）。上記各HCV株の各領域の塩基配列も明らかになっており、例えば、TH株の全長配列上、core、E1、E2、p7、NS2の領域は明らかになっている。また、HCV-JT株では、core、E1、E2、p7、NS2の領域が明らかになっている。本発明に係るレプリコンRNAの１つの実施形態として、HCV2a型のJFH1株と、JFH-1株を除く他の株、例えば、HCV-１株、HCV-H株、HCV-J1株、HCV-con1株、HCV-TH株（Wakita et al., J.Biol.Chem., (1994) 269, p.14205-14210, 及びMoradpour et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 246, p.920-924）、HCV-Ｊ株、HCV-JT株、HCV-BK株、HCV-J6株、JCH１株、HC-J8株、E-b1株を用いたキメラHCVレプリコンRNAを挙げることができる。
【００４０】
さらに、本発明の改変されたHCVゲノムRNAの好適な実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスであるJFH1株のHCVゲノムRNA中のNS3領域より3’側の領域をJFH1のウイルスゲノムRNAに置換した、あるいはNS5Bタンパク質コード配列を他のHCVゲノムRNA中のNS5Bタンパク質コード配列に置換もしくは挿入されたHCVゲノムRNAを挙げることができる。例えば、in vitroにおいて、複製する事が出来ないことが知られている、HCVゲノムRNAであるJCH1（ref）のNS3領域より3’側の領域をJFH1のウイルスゲノムRNAに置換することにより、HCVゲノムRNAを自律複製し得るHCVゲノムRNAに改変することが可能となる。
【００４１】
またHCVゲノムRNAであるHCV遺伝子型1bのCon-1クローン（ref）（EMBL  Accession No.AJ238799）のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分を、JFH1株のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列に置換することにより、又はHCV遺伝子型1bのCon-1クローン（ref）のNS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分のみを、JFH1株のNS5Bタンパク質をコードするRNA配列に置換することによりHCVゲノムRNAを自律複製し得るHCVゲノムRNAに改変する事が可能となる。
【００４２】
Con-1クローンの遺伝子を利用した全長レプリコンは、自律複製能はあるが、HCV粒子形成しない(Pietschmann et al, Jouranl of Virology, (2002) 76, p. 4008-4021を参照)。しかしながら、本発明の実施例に示すように、NS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分を、JFH1株のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列に置換することにより粒子が形成される。すなわち、本発明の方法により、自律複製能はあっても粒子形成不可能なＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを粒子形成が可能な改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAにすることが可能となる。
【００４３】
また、TH株やJCH株のように自律複製能をもつレプリコンを作製できないHCVにおいてもが、本発明の実施例に示すようにJFH-1株とのキメラ遺伝子を作製することにより粒子が形成された。従って、自律複製能しないHCVゲノムRNAから粒子形成が可能な改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAにすることが可能となる。
【００４４】
さらに、JFH1株のRNA配列部分のうち、NS5Bに変異をいれることによりHCVのゲノムRNAの増殖が無くなりHCVの粒子産生がなくなることから、自律複製能及び粒子産生能を与えるのにNS5Bが重要であることは明白である。
【００４５】
現在、HCVはその配列から、Simmondsら（Simmonds, P. et al., Hepatology, (1994) 10, p1321-1324を参照）による国際分類に従って各種遺伝子型（HCV1a、HCV1b、HCV2a、HCV2b等）に分類されている。本発明において、自律複製能のないHCVゲノムRNAは、これらの既知のウイルス型に限定されず、全ての自律複製能をもたないHCVゲノムRNAを含むものとする。
【００４６】
本明細書に係る、NS5Bタンパク質コード配列はJFH1株由来のNS5Bタンパク質（配列番号３）のコード配列であって、配列番号２に示される塩基配列を有する。しかしながら、配列番号２に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列も、それがNS5Bタンパク質として機能するアミノ酸（例えば、保存的置換を含むNS5Bタンパク質）をコードする限り、本発明のNS5Bタンパク質コード配列に包含される。
【００４７】
なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が300-2000mMで温度が40-75℃、好ましくはナトリウム濃度が600-900mMで温度が65℃の条件をいう。当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、前記のようなNS5Bホモログを容易に取得することができる。
【００４８】
本発明に係るHCVゲノムRNAは、JFH1 HCVゲノムRNA中のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分を有する、あるいはNS5Bタンパク質コード配列を有する。
【００４９】
一つの実施形態において、本発明のHCVゲノムRNAは、Ｃ型肝炎ウイルス株のゲノムRNA上の5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列、及び3'非翻訳領域を含む塩基配列からなるRNAであって、かつ、前記NS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分が外来性に導入されたJFH1 HCVゲノムRNA由来のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分であるRNAである。好ましくはNS5Bタンパク質コード配列が、外来性に導入されたJFH1 HCVゲノムRNA由来のNS5Bタンパク質コード配列であるRNAである。
【００５０】
本願明細書において、「5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTR）」、「coreタンパク質コード配列（core領域又はＣ領域）」、「E1タンパク質コード配列（E1領域）」、「E2タンパク質コード配列（E2領域）」、「N2タンパク質コード配列（NS2領域）」、「NS3タンパク質コード配列（NS3領域）」、「NS4Aタンパク質コード配列（NS4A領域）」、「NS4Bタンパク質コード配列（NS4B領域）」、「NS5Aタンパク質コード配列（NS5A領域）」、「NS5Bタンパク質コード配列（NS5B領域）」、及び「3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTR）」、並びにその他の特定の領域若しくは部位は、種々の遺伝子型において既に公知である。未知のHCV株についての上記各領域若しくは部位は、既知のHCVの全長ゲノムRNA配列と当該HCV株の全長ゲノムRNA配列をアライメントすることにより、容易に決定することができる。
【００５１】
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンTn9由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のエクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（SEAP）遺伝子等が挙げられる。但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
上記の選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子は、レプリコンRNA中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAに１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。
【００５４】
本発明に係るHCVゲノムRNAは、その全HCVゲノムRNAを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子をコードするRNAをさらに含んでもよい。外来遺伝子をコードするRNAは、5'非翻訳領域の下流に連結してもよいし、3'非翻訳領域の上流に連結してもよい。また、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、及びNS5Bタンパク質コード配列のいずれかの間に挿入してもよい。
【００５５】
外来遺伝子をコードするRNAを含むHCVゲノムRNAは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現することができる。従って外来遺伝子をコードするRNAを含むHCVゲノムRNAは、外来遺伝子の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
【００５６】
本発明に係るHCVゲノムRNAにおいては、上述したようなウイルスタンパク質をコードする配列、並びに外来遺伝子等が、HCVゲノムRNAから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。HCVゲノムRNAにコードされるタンパク質は、一続きのポリペプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼによって各タンパク質へと切断され、遊離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。
【００５７】
こうして作製されたJFH1株のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分を含むHCVゲノムRNAを、適当な宿主細胞に導入すれば、HCVゲノムRNAを自律複製、好ましくは持続的に自律複製できる（すなわち、HCVゲノムRNAの複製能を有する）組換え細胞を得ることができる。以下、本明細書において、JFH1株のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分を含むHCVゲノムRNAの複製能を有する組換え細胞を「HCVゲノムRNA複製細胞」と称することとする。
【００５８】
「HCVゲノムRNA複製細胞」のための宿主細胞は、継代培養可能な細胞であれば特に限定されないが、真核細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好ましい。また、細胞としては、癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、又は293細胞等が特に好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
【００５９】
HCVゲノムRNAの宿主細胞内への導入は、公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、DEAEセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
【００６０】
HCVゲノムRNAは、単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するRNA量を一定にしながらHCVゲノムRNAの導入量を変更したい場合には、所望の導入量のHCVゲノムRNAを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して一定のRNA総量とし、それを細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるHCVゲノムRNAの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
【００６１】
「HCVゲノムRNA複製細胞」中でのHCVゲノムRNAの複製の確認は、公知の任意のRNA検出法に従って行うことができ、例えば、細胞から抽出したトータルRNAについて、導入されたHCVゲノムRNAに対して特異的なDNA断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法、あるいは導入したHCVゲノムRNAに特異的なプライマーを用いたRT-PCR法を用いることができる。
【００６２】
さらに、「HCVゲノムRNA複製細胞」から抽出したタンパク質中からHCVタンパク質が検出されれば、その細胞は、HCVゲノムRNAを複製しているものと判断することができる。HCVタンパク質の検出は、公知の任意のタンパク質検出法に従って行うことができ、例えば、導入されたHCVゲノムRNAから発現されるべきHCVタンパク質に対する抗体を、細胞から抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。より具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗HCVタンパク質抗体（例えば、抗NS3特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗HCVタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。
【００６３】
限定するものではないが、HCVゲノムRNAの自律複製能は、例えば、対象とするRNAをHuh7細胞中にトランスフェクションし、そのHuh7細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したRNAについて、導入したRNAを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたHCVタンパク質の発現確認、HCVゲノムRNAの検出等の記載に例示される。
【００６４】
２．HCV粒子の作製
上記のようにして作製されるHCVゲノムRNA複製細胞は、HCVウイルス粒子をin vitroで産生することができる。すなわち、本発明のHCVゲノムRNA複製細胞を適当な培地で培養し、その培養物（好ましくは培養液）中から産生されたウイルス粒子を採取することにより、HCV粒子を簡単に取得することができる。
【００６５】
HCVゲノムRNA複製細胞のウイルス粒子産生能は、公知の任意のウイルス検出法を用いて確認することができる。例えば、ウイルス粒子を産生していると思われる細胞の培養液をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度、HCVコアタンパク質濃度、及びHCVゲノムRNAの量を測定した結果、HCVコアタンパク質とHCVゲノムRNAのピークが一致し、しかもそのピークが検出される画分の密度が、培養上清を0.25％ NP40（ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル[Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether]）で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い（例えば、1.15〜1.22 mg）場合には、該細胞はウイルス粒子産生能を有すると判定することができる。
【００６６】
培養液中に放出されたHCVウイルス粒子は、例えば、coreタンパク質、E1タンパク質、又はE2タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養液中のHCVウイルス粒子が含有するHCVゲノムRNAを、特異的プライマーを用いたRT-PCR法により増幅して検出することによって、HCVウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。
【００６７】
３．本発明のHCV粒子の他の細胞への感染
本発明の方法で産生されるHCVウイルス粒子は、細胞（好ましくはHCV感受性細胞）への感染能を有する。本発明は、HCVゲノムRNA複製細胞を培養し、得られた培養物（好ましくは、培養液）中のウイルス粒子を他の細胞（好ましくはHCV感受性細胞）に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、HCV感受性細胞とは、HCVに対し感染性を有する細胞であり、好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものでは無い。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、203細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞や、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
【００６８】
本発明のHCVゲノムRNA複製細胞において産生されたHCV粒子を細胞（例えば、HCV感受性細胞）に感染させると、その感染細胞中ではHCVゲノムRNAが複製され、さらにウイルス粒子が形成される。本発明のHCVゲノムRNA複製細胞において産生されたウイルス粒子を細胞に感染させることにより、HCVゲノムRNAが細胞内で複製され、ウイルス粒子をさらに製造することができる。
【００６９】
本発明のHCVゲノムRNA複製細胞において産生されたHCVウイルス粒子は、チンパンジーなどのHCVウイルスに感染しうる動物に感染して、HCV由来の肝炎を引き起こすことができる。
【００７０】
４．HCV粒子の精製
HCV粒子を精製するにあたり、そのウイルスを含む溶液はHCV感染患者由来血液ならびに、HCV感染培養細胞ならびに組換え遺伝子技術によりHCV粒子を産生する細胞の培養液及び細胞破砕液のいずれか一つ又は複数を由来としてよい。
【００７１】
HCVウイルスを含む溶液を遠心及び／もしくはフィルターなどを用いて細胞及び細胞の残渣を除去した。残渣を除去した溶液は、分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて１０から１００倍程度に濃縮することもできる。
【００７２】
残渣を除去したHCVを含んだ溶液は、以下に記載するクロマトグラフィ及び／もしくは密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせてもしくは単独で精製することができる。以下に代表的なクロマトグラフィや密度勾配遠心の方法について記載するが、本発明はそれに限られるものではない。
【００７３】
ゲル濾過クロマトグラフィは、好ましくはアリルデキストランとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーをゲルマトリックスとするクロマトグラフィ担体で、さらに好ましくはＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）  Ｓ−３００、Ｓ−４００及びＳ−５００からなるクロマトグラフィを用いることにより、HCV粒子の精製を行うことができる。
【００７４】
イオン交換クロマトグラフィは、陰イオン交換樹脂として好ましくはＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）など、及び陽イオン交換樹脂として好ましくはＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）などをもちいてHCV粒子の精製を行うことができる。
【００７５】
アフィニティクロマトグラフィは、リガンドとして好ましくはヘパリン、硫酸化セルロファイン、レクチン、及び様々な色素から選ばれる基質を結合させた樹脂を担体として用いて、HCV粒子の精製を行うことができる。さらに好ましくは、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ（登録商標）、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰ（登録商標）、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＦＦ（登録商標）、硫酸化セルロファイン、ならびにＬＣＡ、ＣｏｎＡ、ＲＣＡ−１２０及びＷＧＡが結合した担体を利用して、HCV粒子を精製することができる。最も好ましくは、硫酸化セルロファインを担体として利用してHCV粒子を精製することであり、精製前と精製後で溶液中の総タンパク質量とHCVのRNA copy数の比率としてなんと３０倍以上も精製されていた。
【００７６】
密度勾配遠心による精製は、密度勾配を形成する溶質として好ましくは塩化セシウム、スクロース、ナイコデンツ（登録商標）ならびに、フィコール（登録商標）及びパーコール（登録商標）といった糖重合体を用いることができる。さらに好ましくは、スクロースを用いることができる。また、用いる溶媒として好ましくは水もしくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、又はグリシン緩衝液といった緩衝液を用いることができる。
【００７７】
精製を行う際の温度が好ましくは０〜４０℃であり、さらに好ましくは０〜２５℃であり、最も好ましくは０〜１０℃である。
【００７８】
密度勾配遠心による精製を行う際の遠心力が、好ましくは１ｘ１０４〜１ｘ１０９ｇであり、さらに好ましくは５ｘ１０４〜１ｘ１０７であり、最も好ましくは５ｘ１０４〜５ｘ１０５であるような精製方法。
【００７９】
精製方法の組み合わせは、密度勾配遠心とカラムクロマトグラフィはどのような順番にどのように組み合わせても良いが、好ましくは複数のカラムクロマトグラフィにより精製した後に密度勾配遠心を用いる組み合わせであり、更に好ましくは陰イオン交換カラムに次いでアフィニティークロマトグラフィを用いて得られたHCV粒子を含むフラクションを密度勾配遠心を用いて精製する組み合わせであり、最も好ましくはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を用いたカラムにより得られたHCV粒子を含むフラクションを硫酸セルロファインを用いたカラムを用いて更に精製して得られたHCV粒子を含むフラクションを密度勾配遠心により精製する組み合わせである。なおカラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心の工程の間に透析や限外濾過を用いることによりHCV粒子を含む溶液の溶質の置換及び／又はHCV粒子の濃縮を行うことができる。
【００８０】
５．本発明の他の実施形態
本発明のHCVゲノムRNA複製細胞では、HCVゲノムRNAが高効率で複製される。従って、本発明のHCVゲノムRNA複製細胞を用いて、HCVゲノムRNAを高効率で製造することができる。
本発明では、HCVゲノムRNA複製細胞を培養し、培養物（培養細胞及び／又は培養液）からRNAを抽出し、それを電気泳動法により、分離されたHCVゲノムRNAを単離精製することによって、HCVゲノムRNAを製造することができる。このようにして製造されるRNAは、HCVのゲノム配列を含む。HCVのゲノム配列を含むRNAの製造方法が提供されることにより、HCVゲノムに関してより詳細な分析が可能となる。
【００８１】
さらに本発明のHCVゲノムRNA複製細胞は、HCVタンパク質を製造するために好適に使用することができる。HCVタンパク質の製造は、公知の任意の方法によって行えばよいが、例えば、HCVゲノムRNAを細胞に導入して組換え細胞を作製し、該組換え細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び／又は培養液）から常法によりタンパク質を回収することによって行えばよい。
【００８２】
HCVウイルス粒子は、肝細胞指向性を有しうる。そのため本発明のHCVゲノムRNAを使用して、肝細胞指向性ウイルスベクターを製造することができる。このウイルスベクターは、遺伝子治療用に好適に用いられる。本発明では、外来遺伝子をコードするRNAをHCVゲノムRNAに組み込み、そのRNAを細胞に導入することにより、該外来遺伝子を細胞中に導入し、細胞内で複製させ、さらに発現させることができる。
【００８３】
さらに、HCVゲノムRNA中のE1タンパク質コード配列、及び／又はE2タンパク質コード配列を、他の生物種由来のウイルスの外殻タンパク質に変換したRNAを作製し、細胞内に導入して、ウイルス粒子を作製することにより、そのRNAを様々な生物種の細胞に感染させることも可能となる。この場合にも、HCVゲノムRNAにさらに外来遺伝子を組み込んで、それを、該外来遺伝子を組み換えたウイルス外殻タンパク質の指向性に依存して、各種細胞で発現させるための細胞指向性ウイルスベクターとして使用することができる。
【００８４】
本発明は、HCVゲノムRNAに外来遺伝子をコードするRNAを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法にも関する。
【００８５】
本発明は、本発明に係るHCV粒子又はその一部分を抗原として、あるいは細胞指向性を変えるためにウイルス外殻タンパク質を組み換えて作製した粒子又はその一部分を抗原として、Ｃ型肝炎ワクチンあるいは、外殻タンパク質を組み換えるに使用したウイルスに対するワクチンを製造する方法も提供する。さらに本発明に係るHCV粒子又はその一部分を抗原として、あるいは細胞指向性を変えるためにウイルス外殻タンパク質を組み換えて作製した粒子又はその一部分を抗原として利用してHCVの感染中和抗体を作成することもできる。
【００８６】
本発明のHCVゲノムRNA複製細胞、又はそれらの細胞において産生されるウイルス粒子を感染させたHCV感染細胞は、例えばHCVの複製、ウイルス粒子の再構築、ウイルス粒子の放出を促進又は抑制する物質（抗Ｃ型肝炎ウイルス物質）をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でそれらの細胞を培養し、得られる培養物中のHCVゲノムRNA又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がレプリコンRNA若しくはHCVゲノムRNAの複製又はウイルス粒子の形成若しくは放出を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、培養物中のHCVゲノムRNAの検出は、上記細胞から抽出したRNA中のHCVゲノムRNAの量、割合若しくは有無を測定することによるものであってよい。培養物（主として培養液）中のウイルス粒子の検出は、培養液中に含まれるHCVタンパク質の量、割合若しくは有無を検出するものであってよい。
【００８７】
本発明のHCVゲノムRNA複製細胞において産生されたHCV粒子とHCV感受性細胞とを、HCVの細胞への結合を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には例えば、被験物質の存在下で、本発明のHCVゲノムRNA複製細胞において産生されたHCV粒子とともにHCV感受性細胞を培養し、得られる培養物中のHCVゲノムRNA又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がHCVゲノムRNAの複製又はウイルス粒子の形成を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００８８】
このようなHCVゲノムRNA又はウイルス粒子の検出は、上述の手法又は後述の実施例に従って行うことができる。上記試験系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防剤、治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のためにも使用することができる。
【００８９】
具体的には、本発明の上記試験系の利用例としては以下が挙げられる。
(1) HCVの増殖及び感染を抑制する物質の探索
HCVの増殖及び感染を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にHCVの増殖及び感染に影響を及ぼす有機化合物、あるいはHCVゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりHCVの増殖若しくはHCVタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
(2) 細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば単離精製された酵素）等が挙げられる。
(3) HCVに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばHCVウイルス複製のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るHCVゲノムRNA複製細胞を使用することができる。
(4) HCVウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
(5) Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
(6) Ｃ型肝炎ウイルス感染のワクチンの開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質及び弱毒化HCVの製造
【実施例】
【００９０】
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９１】
[実施例１]  HCVゲノムRNAの作製
１．発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスJFH1株（遺伝子型2a）のウイルスゲノム全領域に対応するDNAを、該ウイルス株の全長ゲノムcDNAを含むJFH1クローン（Kato, T., et al, J. Med. Virol. 64 (2001) p334-339）から取得して、pUC19プラスミドに挿入したT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入した。具体的には、JFH1株のウイルスRNAを増幅したRT-PCR断片をpGEM-T EASY vector (Promega)にクローニングしてpGEM1-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEM1141-2367, pGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, pGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634, and pGEM9594-9678 の各プラスミドDNAを得た（Kato, T. et al., Gastroenterology , 125 (2003) p.1808-1817）。この各プラスミドに含まれるウイルスゲノムのcDNAをPCR法及び制限酵素を用いて連結し、全長ゲノムcDNAをクローニングし、上流にT7R RNAプロモーター配列を挿入し、JFH1クローン（pJFH1）を得た（図１）。なお、pJFH1の全長cDNA配列は、国際DNAデータバンク（DDBJ/EMBL/GenBank）にアクセッション番号：AB047639として登録されている。
【００９２】
次に、pJFH1中のNS5B領域（塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３）について、該領域にコードされるRNAポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフGDDをGNDに変異させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンpJFH1/GNDを作製した。なおpJFH1/GND突然変異クローンは、それにコードされているNS5Bタンパク質の活性部位のアミノ酸配列が変異しているため、HCV RNAを複製するために必要な活性NS5Bタンパク質を発現することができない。
【００９３】
次に、JFH1のE1領域からE2領域を欠損させたpJFH1/ΔE1-E2作製した。また、JFH1株とは異なるJ6CF株（GenBank Accession No. AF177036）及び、JCH1（Kato, T., et al, J. Med. Virol. 64 (2001) p334-339）の全長HCV cDNAをpUC19プラスミドに挿入したT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入した、pJ6CF及びpJCH1を作製した。さらに、pJCH1のNS5Bをコードする領域をJFH1のNS5Bに置き換えた、pJCH1/NS5B(jfh1)を作製した。
【００９４】
２．HCVゲノムRNAの作製
RNA合成に用いる鋳型DNAを作製するために、上記のとおり構築したpJFH1、pJFH1/GND pJFH1/ΔE1-E2、pJ6CF、pJCH1及び、pJCH1/NS5B(jfh1)を、それぞれ制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片のそれぞれ10から20μgを、Mung Bean Nuclease 20U（トータル反応液量 50μl）とともに30℃で30分間インキュベートした。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCUAGの4塩基が3'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean Nucleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCTAGの4塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean Nuclease処理後の溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、CTAGの4塩基が除去されたXbaI切断断片を精製し、これを鋳型DNAとした。
【００９５】
次に、この鋳型DNAから、RNAをin vitro合成した。RNA合成はAmbion社のMEGAscriptを使用し、鋳型DNAを0.5から1.0μg含む反応液20μlを37℃で3時間から16時間反応させた。
【００９６】
RNA合成終了後、反応溶液にDNAse（2U）を添加して、37℃で15分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるRNA抽出を行って、鋳型DNAを除去した。このようにしてpJFH1及び、pJFH1/GNDに由来する上述の鋳型DNAから合成したHCV RNAを、それぞれrJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF、rJCH1及び、rJCH1/NS5B(jfh1)と命名した。
【００９７】
これらのHCV RNAは、rJFH1はGenBank Accession No. AB047639のDNAを鋳型として作製したRNA、JFH1/GNDはGenBank Accession No. AB047639の8618番目のGをAに置換したDNAを鋳型として作製したRNA、rJFH1/ΔE1-E2はGenBank Accession No. AB047639のDNA配列989-2041を欠失したDNAを鋳型として作製したRNA、rJ6CFはGenBank Accession No. AF177036のDNAを鋳型として作製したRNA、rJCH1はGenBank Accession No. AB047640のDNAを鋳型として作製したRNA、rJCH1/NS5B(jfh1)はGenBank Accession No. AB047640のDNA配列1-3866とGenBank Accession No. AB047639のDNA配列3867-9678の配列を制限酵素AvrIIサイトを利用して、連結させたDNAを鋳型として作製したRNAとして、その塩基配列を確認することができる。
【００９８】
[実施例２]  細胞内におけるHCVゲノムRNA複製細胞とウイルス粒子産生
１．細胞内におけるHCVゲノム複製とウイルス粒子産生
上記の合成全長HCVゲノムRNA（rJFH1、rJFH1/GND）のそれぞれについて、RNA総量が10μgとなるように調製した。次いでその混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、12時間、24時間、48時間、72時間培養した後に、細胞を回収して、細胞からRNAを抽出して、ノーザンブロット法により解析した。ノーザンブロット解析は、Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) の記載に従って行った。細胞から抽出したRNAを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後に該RNAをポジティブチャージナイロン膜に転写した。pJFH1から作製した32PラベルしたDNA又はRNAプローブを、前記のとおり膜に転写したRNAに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、HCVゲノム特異的なRNAバンドを検出した。
【００９９】
図２に示すように、JFH1/GNDをトランスフェクションした場合、トランスフェクション4時間後において、導入したRNAバンドは弱いシグナルとして確認できたが、時間の経過とともにシグナルは減弱し、24時間後にはほとんどバンドのシグナルが確認できなかった。
【０１００】
一方、rJFH1をトランスフェクションした場合、トランスフェクション4時間から12時間後では、導入したRNAバンドのシグナルの強さはJFH1/GNDを導入した場合とほぼ同じでいったん減弱したが、24時間以降にははっきりとしたRNAバンドのシグナルが確認できた。このシグナルはHCVに特異的なものであった。つまり導入したrJFH1 RNAの一部が複製増殖したものと考えられた。RNA複製酵素であるNS5Bの活性モチーフを変異させたrJFH1/GNDでは複製はみられず、NS5Bの活性がHCVの全長RNAの複製に重要であることが確認された。また、発明者らが慢性肝炎から分離したJCH1株（Kato, T. et al, J. Med. Virol. 69(2001) p334-339）において、同様の実験をおこなったが、これらの株ではHCV RNAの複製は全く確認できなかった。
【０１０１】
２．HCVタンパク質の検出
rJFH1あるいは、rJFH1/GND RNAをトランスフェクションした細胞から常法により、経時的にタンパク質を抽出して、SDS-PAGE及びウエスタンブロット法により解析した。解析にあたって、NS3、NS5A、Coreあるいは、E2遺伝子を含む発現プラスミドDNAをHuh7細胞にトランジエントにトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照（NS3タンパク質）とした。さらに、トランスフェクションしていないHuh7細胞から抽出したタンパク質を陰性対照とした。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をPVDF膜（Immobilon-P, Millipore社製）にブロッティングし、抗NS3特異的抗体（Dr. Moradpourより分与されたもの； Wolk B, et al, J. Virology. 2000; 74: 2293-2304）、抗NS5A特異的抗体（JFH1のNS5A領域を発現ベクターに挿入して、ネズミでDNA免疫法を用いて作製した）、抗Core特異的抗体（クローン2H9抗体）、抗E2特異的抗体（JFH1 E2領域のGTTTVGGAVARSTN（配列番号４）とCDLEDRDRSQLSPL（配列番号５）のペプチドを合成して、２つの合成ペプチドでウサギを免役して作製した）、を用いてJFH1 RNAにコードされているNS3、NS5A、Core及び、E2タンパク質を検出した。また、内在対照として、抗actin抗体を用いて、actinタンパク質を検出した。
【０１０２】
図３に示されるとおり、rJFH1をトランスフェクションした細胞においては、トランスフェクションの24時間後からNS3、NS5A、Core及び、E2タンパク質が検出でき、経時的に発現量が増加していることが確認された。一方、rJFH1/GNDをトランスフェクションした細胞あるいは、トランスフェクションしていないHuh7細胞でNS3、NS5A、Core及び、E2タンパク質が検出されず、トランスフェクションされたrJFH1が自律複製することにより,これらのタンパク質が発現されていることが判明した。
以上の１及び２の結果から、rJFH1をトランスフェクションして樹立した細胞では、rJFH1が複製されていることが確認された。
【０１０３】
３．トランスフェクション細胞培養液中におけるHCV Coreタンパク質の検出
rJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF及びrJCH1をエレクトロポレーションによって細胞導入をおこなったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、2時間、12時間、24時間、48時間、72時間培養した後の培養液中のHCV Coreタンパク質を測定した。測定はオーソHCV抗原IRMAテストを用いて行った（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37(1999) p.1802-1808）。
【０１０４】
図４に示すとおり、rJFH1をトランスフェクションして48時間から72時間後の培養液中にコアタンパク質が検出された。一方、rJFH1/GND、rJ6CF及びrJCH1をトランスフェクションした細胞の培養液中にはHCV Coreタンパク質は検出されず、rJFH1/ΔE1-E2をトランスフェクションした細胞の培養液中には少量のHCV Coreタンパク質が検出された。rJFH1/GND、rJ6CF及びrJCH1はHuh7細胞中では自律複製ができず、rJFH1及び、rJFH1/ΔE1-E2はHuh7細胞中で自律複製ができる。よって、Coreタンパク質の放出には、導入したHCV RNAの自律複製が必須であり、かつ、安定して多量のCoreタンパク質を細胞外に放出させるにはE1及び、E2が必要であることが示された。
【０１０５】
４．トランスフェクション細胞培養液中におけるHCV粒子の検出
上記の実施例で培養液中に放出されるCoreタンパク質がウイルス粒子として分泌されているかどうかを解析するため、rJFH1をトランスフェクションして6日後の培養液をしょ糖密度勾配により分画した。60%（重量/重量）しょ糖溶液(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解)2ml、50 %しょ糖溶液1ml、40 %しょ糖溶液1ml、30 %しょ糖溶液1ml、20 %しょ糖溶液1ml、10 %しょ糖溶液1mlを遠心チューブに重層し、さらにサンプルの培養上清を4ml重層した。これをベックマンローターS W41Tiで400,000RPM、4℃、16時間遠心し、遠心終了後遠心チューブの底から0.5mlずつ分画回収した。各分画の密度、HCVコア蛋白濃度、HCVRNAコピー数を定量した。レプリコンRNAの定量的RT-PCRによる検出は、Takeuchiらの方法（Takeuchi T. et al., Gastroenterology 116: 636-642 (1999)）に従いHCV RNAの5'非翻訳領域のRNAを検出することにより行った。具体的には、細胞から抽出したRNAに含まれるレプリコンRNAを、以下の合成プライマーとEZ rTth RNA PCR kit（Applied Biosystems）を用いてPCR増幅し、ABI Prism 7700 sequence detector system（Applied Biosystems）により検出した。
【０１０６】
R6-130-S17：5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’（配列番号６）
R6-290-R19：5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’（配列番号７）
TaqMan Probe, R6-148-S21FT：5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’（配列番号８）
【０１０７】
図５Ａに示すように、1.17 mg/mlのフラクションでCoreタンパク質とHCV RNAのピークが一致した。このフラクションの密度は約1.17 mg/mlであり、これまで報告されているCoreタンパク質と核酸の結合物よりも軽い比重であった。もし、1.17 mg/mlのフラクションに存在するCoreタンパク質とHCV RNAがHCV粒子構造を形成しているとすれば、ヌクレアーゼに耐性であると考えられる。そこで次に、JFH1をトランスフェクションして6日後の培養液を10μg/mlのRNAse Aで20分間処理した後にしょ糖密度勾配により分画した。
【０１０８】
その結果、図５Ｂに示すようにHCV RNAは分解され、RNase A未処理の場合と同じように、1.17 mg/mlのフラクションにCoreタンパク質とHCV RNAのピークが検出された。すなわち、1.17 mg/mlのフラクションに存在するCoreタンパク質とHCV RNAはHCV粒子様構造を形成していることが確認された。
【０１０９】
さらに、培養液を0.25% NP40で処理した後に同様の分画を行うと、Coreタンパク質とHCV RNAのピークは比重約1.28mg/mlへとシフトした（図５Ｃ）。さらに、0.25% NP40処理と同時にRNase A処理を行うと、HCV RNAのピークが消失した（図５Ｄ）。つまり、脂質を含み比重の軽い表面膜がNP40によりウイルス粒子から剥離して、ウイルス様構造を保持していない核酸とCoreタンパク質のみのCore粒子となり、比重が重くなったものと考えられた。
【０１１０】
以上の結果から、rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションすることによりウイルスRNAが複製し、さらにウイルス粒子が形成され、培養液中に分泌されたことが確認された。
【０１１１】
５．培養液中のウイルス粒子の感染実験 
rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたHCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。rJFH1あるいは、rJFH1/ΔE1-E2をHuh7細胞にトランスフェクションして3日後に培養上清を回収した。回収した培養液を遠心して遠心上清を回収して、さらに0.45μmのフィルターで濾過した。この培養液存在下で、RNAをトランスフェクションしていないHuh7を培養して48時間後に細胞を抗Core抗体あるいは、抗NS5A抗体で蛍光免疫染色した。図６Ａに示すように、rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションして得た培養液存在下で培養した細胞においては、細胞内にCoreタンパク質及び、NS5Aタンパク質の発現を認めた。一方、JFH1/ΔE1-E2をHuh7細胞へトランスフェクションして得た培養液存在下で培養した細胞においては、細胞内にCoreタンパク質及び、NS5Aタンパク質の発現を認めなかった（データは示さない）。
【０１１２】
次いで、JFH1をrHuh7細胞にトランスフェクションして3日後に培養上清を回収して、限外濾過膜（cut off 1x105 Da）を用いて30倍に濃縮した。濃縮したHCV粒子を含む培養液100μlでRNAをトランスフェクションしていないHuh7を15 mmカバースリップ上で培養して、48時間後に細胞を抗Core抗体で免疫染色して、Core抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図６Ｂに示すように394.0 ± 26.5個の感染細胞が確認された（全細胞中約0.51%）。そこで、この感染がrJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたHCV粒子によるものであるかどうかを確認した。すなわち、感染に用いる培養液をUV処理、あるいは、RNAのトランスフェクションの過程を行わずに調製した培養液を用いて、トランスフェクションしていないHuh7を15 mmカバースリップ上で培養して、48時間後に細胞を抗Core抗体で免疫染色して感染細胞を数えた。その結果、UV処理では感染細胞数が激減し、RNAのトランスフェクションの過程を行わずに調製した培養液では感染細胞が確認されなかった。
【０１１３】
さらに、感染させたHCV粒子が細胞内でRNA増幅して、新たなHCV粒子を培養液中に放出するかどうかを検討した。rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションして48時間後の培養液を濃縮したHCV粒子を含む培養液100μlでRNAをトランスフェクションしていないHuh7を培養して、経日的に細胞及び、培養液を回収して、RNAを回収して、上述した方法でHCV RNA量を定量した。結果は、図６Ｃに示すよう、細胞内でHCV RNAは一定量増幅しており、上清においては経日的にHCV RNA量が増加した。一方、rJFH1/ΔE1-E2をHuh7細胞へトランスフェクションして得た培養液を用いて、同様の検討を行っても、細胞内及び、培養液中でHCV RNAを検出することはできなかった。
【０１１４】
これらの結果から、rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたHCV粒子は感染する能力を有し、さらに感染細胞中でHCV RNAを増幅して、新たなHCV粒子を生産する能力を有することが確認された。
【０１１５】
６．rJCH1/NS5B(jfh1)を用いたHCVウイルス粒子の作製
rJCH1/NS5B(jfh1)をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中にHCV粒子が分泌されるかどうか、また分泌されたHCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。rJCH1/NS5B(jfh1)をHuh7細胞にトランスフェクションして6日後の培養液を５．に記述した方法で濃縮後、この培養液存在下で、RNAをトランスフェクションしていないHuh7を培養して、経時的に細胞内のHCV RNA量を定量したところ、培養開始後12時間後から経時的に細胞内のHCV RNA量が増加していた（図７Ａ）。さらに、RNAをトランスフェクションしていないHuh7を15mmカバースリップ上で培養して、濃縮した培養液存在下で培養48時間後に細胞を抗Core抗体で免疫染色して、Core抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図７Ｂに示すように感染細胞が確認された。これらの結果から、rJCH1/NS5B(jfh1)をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたHCV粒子は感染能力を獲得し、さらに感染細胞中でHCV RNAを増幅して、新たなHCV粒子を生産する能力を有することが示された。
【０１１６】
従って、患者から分離したHCV株のように、in vitroで自律複製能を有さない株についても、その株のNS5B領域をrJFH1のNS5Bに置換することにより、培養細胞系で自律複製し、HCV粒子を産生させることができた。
【０１１７】
［実施例３］
１．Con1/C-NS2/JFH-1を用いたHCVウイルス粒子の作製
HCV遺伝子型1bのCon-1株とJFH-1のNS5B部分を含むキメラHCV RNAをHuh7細胞にトランスフェクションすることにより培養液中にHCV粒子が分泌されるか、また分泌されたHCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。
【０１１８】
JFH-1株の5’UTRの下流にHCV遺伝子型1bのCon-1株の遺伝子番号１から1026の配列（Con 1株のCore、E1、E2、p7及び、NS2領域）を連結して、その下流に、JFH-1株の1031から3030の領域（NS3からNS5b）を連結させ、さらにその下流にJFH-1株の3’UTRを連結させたコンストラクトを作製した。このコンストラクトを用いて、実施例１の２に記した方法で、rCon1/C-NS2/JFH-1キメラHCV RNAを作製し、実施例２の１に記す方法でHuh7にRNAをトランスフェクションした。Huh7細胞にHCV RNAをトランスフェクションして経時的に、上清中のコアタンパクを測定したところ、約48時間以降から、上清中にコアタンパクが検出され、細胞上清中にHCV粒子が産生されていることが確認出来た。次に、その上清を限外濾過により20倍に濃縮後、濃縮液を、Huh7細胞に添加した。培養48時間後に、細胞を、ウサギ抗NS3抗体により細胞を染色した。
【０１１９】
その結果、mock及びrJFH-1/ΔEE1-E2では、抗NS3抗体陽性細胞は認められなかったが、rJFH-1及びrCon1/C-NS2/JFH-1では、抗NS3抗体陽性細胞が検出された。以上の結果から、rCon1/C-NS2/JFH-1はJFH-1同様に感染性HCV粒子を産生出来ることが確認できた。
【０１２０】
[実施例４]  全長キメラHCVゲノムRNA由来の全長キメラHCVレプリコンRNAの作製
(１) 発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスであるJFH-1株（遺伝子型2a）のゲノム全長cDNAを含むDNA（JFH-1クローン：配列番号９）を、pUC19プラスミド中でT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入したプラスミドDNAを作製した。
【０１２１】
具体的には、JFH-1株のウイルスRNAを増幅したRT-PCR断片をpGEM-T EASY vector (Promega)にクローニングしてpGEM1-258、pGEM44-486、pGEM317-849、pGEM617-1323、pGEM1141-2367、pGEM2285-3509、pGEM3471-4665、pGEM4547-5970、pGEM5883-7003、pGEM6950-8035、pGEM7984-8892、pGEM8680-9283、pGEM9231-9634及びpGEM9594-9678の各プラスミドDNAを得た（Kato et al., Gastroenterology, (2003) 125:p.1808-1817）。各プラスミドに含まれるウイルスゲノムRNA由来のcDNAをPCR法及び制限酵素を用いてつなぎ合わせて、全長のウイルスゲノムcDNAをクローニングした。全長のウイルスゲノムの上流にT7R RNAプロモーター配列を挿入した。このようにして構築されたプラスミドDNAを、以下、pJFH1と称する。なお、上記JFH-1クローンの作製については、特開2002-171978号及びKatoら（Kato et al., J. Med. Virol., (2001) 64(3):p.334-339）に記載されている。またJFH-1クローンの全長cDNAの塩基配列は、国際DNAデータバンク（DDBJ/EMBL/GenBank）のアクセッション番号：AB047639に登録されている。
【０１２２】
次に、プラスミドDNAであるpJFH1の5'非翻訳領域とcore領域の間に、EMCV-IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）及びネオマイシン耐性遺伝子（neo；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）を挿入して、プラスミドDNAであるpFGREP-JFH1を構築した。この構築手順は、Ikedaら（Ikeda et al., J. Virol., (2002) 76(6): p. 2997-3006）に従った。
【０１２３】
(２) キメラ発現ベクターの構築
JFH1株は、HCV2a型由来のHCVであるが、HCV1b型由来のTH株（Wakita et al., J.Biol.Chem., (1994) 269, p.14205-14210, 及びMoradpour et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 246, p.920-924）を用いて、キメラHCVベクターを作製した。上記で作製した、pFGREP-JFH1の、コア、E1、E2、p7の部分をTH株由来のコア、E1、E2、p7に置換したキメラHCV、pFGREP-TH/JFH1を作製した。
【０１２４】
なお、本明細書では、前記JFH1株（JFH-1クローン由来）の全長及びキメラに用いたTH株の部分RNA配列（HCV TH株の5’非翻訳領域からNS3領域の一部を含む部分ゲノムRNA(1-3748)）をそれぞれ配列表の配列番号９及び10に示す。前記JFH-1株の全長ゲノムRNA配列（配列番号９）中、「5'非翻訳領域」は１〜340番、「coreタンパク質コード配列」は341〜913番、「E1タンパク質コード配列」は914〜1489番、「E2タンパク質コード配列」は1490〜2590番、「NS2タンパク質コード配列」は2780〜3430番、「NS3タンパク質コード配列」は3431〜5323番、「NS4Aタンパク質コード配列」は5324〜5486番、「NS4Bタンパク質コード配列」は5487〜6268番、「NS5Aタンパク質コード配列」は6269〜7663番、「NS5Bタンパク質コード配列」は7664〜9442番に該当する。
【０１２５】
(３) 全長キメラHCVレプリコンRNAの作製
全長キメラHCVレプリコンRNA合成に用いる鋳型DNAを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターpFGREP-TH/JFH1を、制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片ついて、10〜20μgを50μlの反応液中に含有させ、Mung Bean Nuclease 20 Ｕを用いて30℃で30分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCUAGの4塩基が3'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean Nucleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCTAGの4塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean Nuclease処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、CTAGの4塩基が除去されたXbaI切断断片を精製して、これを鋳型DNAとした。
【０１２６】
次に、この鋳型DNAから、T7 RNAポリメラーゼを用いてRNAをin vitro合成した。このRNA合成にはAmbion社のMEGAscriptを用いた。鋳型DNAを0.5〜1.0μg含む反応液20μlを製造業者の使用説明書に従って反応させた。
【０１２７】
RNA合成終了後、反応溶液にDNase（2U）を添加して37℃で15分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるRNA抽出を行って、鋳型DNAを除去した。このようにしてpFGREP-TH/JFH1に由来する上述の鋳型DNAから合成したRNAを、rFGREP-TH/JFH1と命名した。このrFGREP-TH/JFH中のキメラHCVゲノムRNAの塩基配列を配列番号11に示す。rFGREP-TH/JFH1は、本発明における全長キメラHCVレプリコンRNAの一例である。
【０１２８】
[実施例５]  全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞の作製及び細胞クローンの樹立
(１) 全長キメラHCVゲノムRNAの細胞内への導入
上記の通り合成した全長キメラHCVゲノムRNA（rFGREP-TH/JFH1）を、様々な量で、Huh7細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して、RNA総量が１０μgとなるように調製した。次いでその混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。１６時間から24時間培養した後にG418を様々な濃度で添加した。週に2回培養液を交換しながら培養を継続した。21日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されるコロニー数を計測し、トランスフェクションしたRNA重量あたりに得られたコロニー数を計算した。また、一部の培養ディッシュでは生存細胞のコロニーをクローン化して培養を継続した。クローン化された細胞からRNA、ゲノムDNA、タンパク質をそれぞれ抽出した後、全長キメラHCVレプリコンRNAの検出、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムDNAへの組み込みの有無、HCVタンパク質の発現を検討した。これらの結果の詳細は下記に示す。
【０１２９】
(２) コロニー形成能
上記のトランスフェクションの結果、G418濃度が1.0 mg/mlの場合でも、細胞のコロニー形成が認められた。このことは、rFGREP-TH/JFH1レプリコンRNAをトランスフェクションしたHuh7細胞のコロニー形成能は、rFGREP-TH/JFH1レプリコンRNAが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されG418耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
【０１３０】
[実施例６]  培養上清中のキメラＨＣＶウイルスの感染
培養上清中のキメラＨＣＶウイルス粒子の感染実験
rFGREP-TH/JFH1をHuh7細胞へトランスフェクションし、樹立した全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞クローンの培養上清を回収して、その培養上清をさらに、感染をさせていないHuh7細胞に添加して、培養上清中のウイルス粒子をHuh7細胞に感染させた。感染翌日に感染させたHuh7細胞の培養液にG418を0.3mg/ml添加し、さらに２１日間培養した。培養終了後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色したところ、rFGREP-TH/JFH1をトランスフェクションして得られた全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞クローンの培養上清を用いて感染させた細胞についてコロニー形成が観察された。このことは、rFGREP-TH/JFH1をトランスフェクションして得られた全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞クローンから感染性のHCVが産生されていることを示しており、更に、そのHCVは新たな細胞への感染性を保持していることを示している。
【０１３１】
［実施例７］ＨＣＶ粒子の精製
（１）ゲル濾過
図１１にゲル濾過クロマトグラフィによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示す。用いたゲル担体はセファクリル（登録商標）Ｓ３００、Ｓ４００及びＳ５００である。カラムクロマトグラフィに用いたＨＣＶ粒子を含む溶液をそれぞれのゲル担体を含むカラムクロマトグラフィを利用して精製した。精製する際に緩衝液は、１０  ｍＭ  トリス塩酸塩、１  ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸及び  １００  ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ  ８．０）を用いた。その結果、セファクリル（登録商標）Ｓ−３００ではＨＣＶ粒子はＶｏｉｄ画分と呼ばれる素通り画分に得られた。従って、セファクリル（登録商標）Ｓ−３００を用いることにより分子量が小さなタンパク質と分離し、溶液の塩濃度の変更ができる。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して３．７８となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。一方、セファクリル（登録商標）Ｓ−４００及びＳ−５００ではＨＣＶ粒子は分子量に従って溶出される画分にあることから他の分子量のタンパク質と分離することができる。
【０１３２】
（２）イオン交換クロマトグラフィ
図１２にイオン交換クロマトグラフィによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。用いたゲル担体は、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）及びＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）である。
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）を用いたカラムでは、５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ又は、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）をカラム容量の５倍程度流した（１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画）。その結果、ＨＣＶ粒子は０．１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）画分に溶出した。
【０１３３】
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）では、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ又は、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）をカラム容量の５倍程度流した（１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画）。その結果，ＨＣＶ粒子は０．３  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）画分に溶出した。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して２．３２となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
【０１３４】
（３）アフィニティークロマトグラフィ
図１３にレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、ＲＣＡ−１２０、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ及びＷＧＡがそれぞれ結合した担体を利用した。
ＣｏｎＡ、ＬＣＡ及びＷＧＡアフィニティークロマトグラフィでは、リン酸緩衝生理食塩水でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．３５  Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の３倍程度流した。その後、０．５  Ｍラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の５倍程度流した。その結果、ＬＣＡ及びＣｏｎＡアフィニティークロマトグラフィでは担体への特異的結合はなかった。ＷＧＡアフィニティークロマトグラフィでは、ＨＣＶ粒子は０．３５  Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。
【０１３５】
ＲＣＡ−１２０アフィニティークロマトグラフィでは、リン酸緩衝生理食塩水でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．３８  Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の３倍程度流した。その後、０．３８  Ｍラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の５倍程度流した。ＲＣＡ−１２０アフィニティークロマトグラフィでは、ＨＣＶ粒子は０．３８  Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。
【０１３６】
図１４にヘパリン、硫酸セルロファインによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。
【０１３７】
それぞれのクロマトグラフィでは、２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．１  Ｍ、  ０．３  Ｍ、０．５  Ｍ、もしくは１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の５倍程度流した。その結果、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィでは０．３  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）画分へ溶出した。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して０．３６となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が低下した。硫酸セルロファインアフィニティークロマトグラフィでは、ＨＣＶ粒子は０．１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）画分へ溶出した。
【０１３８】
図１５にブルーダイアフィニティークロマトグラフィーによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。
【０１３９】
ブルーダイアフィニティークロマトグラフィでは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａをアガロース粒子に結合した担体をカラムに利用した。２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、１  Ｍ又は２  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、２  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の５倍程度流した。その結果，ＨＣＶ粒子はカラム非結合画分に溶出した。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して３．３３となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
【０１４０】
（４）ショ糖密度勾配遠心
上記実施例を参考にカラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせてＨＣＶ粒子の精製を行った。
まずＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）を用いてＨＣＶ粒子の精製を行った。５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ又は、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）をカラム容量の５倍程度流した（１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画）。図１６Ａに示すように０．３  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）分画及び１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画にＨＣＶ粒子は溶出した。ＨＣＶ粒子を含んだ分画を収集したところＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して２．２９となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
【０１４１】
次に、硫酸セルロファインクロマトグラフィを用いてＨＣＶ粒子の精製を行った。それぞれのクロマトグラフィでは、２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）でカラムを平衡化した。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）を用いて精製したＨＣＶ粒子を含んだ分画を分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．２５  Ｍ又は１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）をカラム容量の５倍程度流した。図１６Ｂを示すように１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）にＨＣＶ粒子は主に溶出した。１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）においてＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して３１．４となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
【０１４２】
さらに、ショ糖密度勾配遠心を用いて精製を行った。硫酸セルロファインクロマトグラフィを用いた１  Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）分画を分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮しＴＥＮ緩衝液（１０  ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）、  ０．１  Ｍ  塩化ナトリウム、  １  ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ  ８．０））で希釈した。ＨＣＶ粒子を含んだ溶液を、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％及び１０％ショ糖溶液を積層した上に重層し、３９０ｋ×ｇ、１８時間、４℃で遠心をした。ほぼ比重が１．２のあたりにＨＣＶ粒子が集まっていたので、その分画を採取した。採取した分画において、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して１．６９となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
【０１４３】
ショ糖密度勾配遠心により精製されたＨＣＶ粒子を含んだ分画は、精製を開始する前と比較するとＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率は１２０倍程度まで精製された。最終的な分画にＨＣＶ粒子は１０９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ含まれていた。
【０１４４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明により、種々の遺伝子型のHCV株のウイルス粒子を培養細胞系で生産することができる。すなわち、患者から分離したHCV株のように、in vitroで自律複製能を有さないHCV株についても、そのNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分をJFH1のNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分に置換することにより、培養細胞系で自律的に複製させ、HCV粒子を産生させることができる。本発明により精製されたＨＣＶ粒子は、そのまま医療用途のワクチンとして利用することができる。本発明で提供されるHCVゲノムRNAやウイルス粒子は、外来遺伝子のウイルスベクターとしても利用できる。また、本発明の方法は、HCVの感染過程の研究や、HCVの感染過程に影響を及ぼす各種物質のスクリーニング系としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、本発明のHCVゲノムRNAを作製するための鋳型DNAの構築手順を示す概略図で、T7プロモーターの下流に全長HCVゲノムを挿入して作製したプラスミドクローンpJFH1の構造を示す。図中の記号は以下のとおりである。T7: T7 RNAプロモーター、5'UTR: 5'非翻訳領域、C: Coreタンパク質、E1、E2: エンベロープタンパク質。NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B: 非構造タンパク質。3'UTR: 3'非翻訳領域。Age I、Pme I、Xba I: 制限酵素Age I、Pme I及びXba Iの切断部位。GDD: NS5Bタンパク質の活性中心に相当するアミノ酸モチーフGDDの位置。
【図２】図２は、HCVゲノムRNAであるrJFH1を導入したHuh7細胞におけるrJFH1の複製を示すノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
【図３】図３は、培地中のHCV Coreタンパク質、NS3タンパク質、NS5Aタンパク質、E2タンパク質の検出結果を示す。
【図４】図４は、HCVゲノムRNAを導入した細胞の培地中への経時的なCoreタンパク質の放出結果を示す。
【図５】図５は、rJFH1を導入したHuh7細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画した各画分における、HCVCoreタンパク質とHCVゲノムRNA量を示すグラフである。黒塗りの円はHCV Core(core)タンパク質、白抜きの円はHCVゲノムRNAを示す。図５Ａは未処理、図５ＢはRNase処理、図５ＣはNP40処理、図５ＤはNP40+RNase処理したrJFH1導入Huh7細胞の結果を示す。
【図６】図６は、rJFH1導入Huh7細胞の培養液中に分泌されたウイルス粒子の感染性に関する。図６Ａは、抗Core抗体（左）、抗NS5A抗体（右）による免疫染色の結果を示す写真である。図６Ｂは、抗Core抗体染色陽性細胞の数を示すグラフである。図６Ｃは、細胞内（左）及び上清（右）におけるHCV RNA量の経時的変化を示すグラフである。
【図７】図７は、rJCH1/NS5B(jfh1)導入Huh7細胞の培養液中に分泌されたウイルス粒子の感染性に関する。図７Ａは、JCH1/NS5B(jfh1)導入Huh細胞の培養液中に分泌されたウイルス粒子のナイーブなHuh7細胞中でのHCV RNAの増幅についてのグラフである。図７Ｂは、抗Core抗体染色陽性細胞の数を示すグラフである。
【図８】図８は、TH/JFH1キメラレプリコンの構造を示す。
【図９】図９は、rTH/JFH1キメラレプリコンRNAトランスフェクションによるコロニー形成をみた結果である。
【図１０】図１０は、TH/JFH1キメラレプリコン培養上清感染によるコロニー形成をみた結果である。
【図１１】図１１は、ゲル濾過クロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸は波長４９０ｎｍでの吸光度を示している。Ｓ−３００、Ｓ−４００及びＳ−５００はそれぞれＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−３００、Ｓ−４００及びＳ−５００である。また、横軸はカラムからの溶出した溶液量を示している。
【図１２】図１２は、イオン交換クロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸はHCV粒子のコアタンパク質の量を示している。
【図１３】図１３は、レクチンアフィニティークロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸はHCV粒子のコアタンパク質の量を示している。
【図１４】図１４は、ヘパリン及び硫酸セルロファインおける流出プロファイルを示す。縦軸は波長４９０ｎｍでの吸光度を示している。
【図１５】図１５は、ブルーダイアフィニティクロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸はHCV粒子のコアタンパク質の量を示している。
【図１６】図１６は、カラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせた精製プロファイルを示す。縦軸はHCV粒子のコアタンパク質の量を示している。また、ショ糖密度勾配遠心ではHCVのコアタンパク質の量とともに各フラクション溶液の密度が縦軸に示されている。
【配列表フリーテキスト】
【０１４７】
配列番号1：JFH1株のNS3、NS4、NS5A、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA部分配列（cDNA配列）
配列番号2：JFH1のNS5Bタンパク質コード配列（cDNA配列）
配列番号3：JFH1のNS5Bタンパク質
配列番号4：JFH1 E2領域を基に設計した合成ペプチド
配列番号5：JFH1 E2領域を基に設計した合成ペプチド
配列番号6：プライマー（R6-130-S17）
配列番号7：プライマー（R6-290-R19）
配列番号8：TaqManプローブ（R6-148-S21FT）
配列番号9：HCV JFH1株（JFH-1クローン）の全長ゲノムRNA
配列番号10：HCV TH株の5’非翻訳領域からNS3領域の一部を含む部分ゲノムRNA(1-3748)
配列番号11：HCV JFH1株（JFH-1クローン）のゲノムRNAとHCV TH株のゲノムRNAから構成されたキメラHCVゲノムRNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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0004931591.tif 000008
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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