(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドの含量がそれぞれ０．００２重量％以下である、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶。
【請求項２】
Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドがＤ−アラニル−Ｌ−グルタミンであり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドがアラニルアラニルグルタミンである、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
アミノ酸アミドの含量が０．００２重量％以下である、請求項１または２記載の結晶。
【請求項４】
アミノ酸アミドがアラニンアミドである、請求項３記載の結晶。
【請求項５】
Ｌ−アラニンまたはＬ−グルタミンを生産する能力と、以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質を生産する能力とを有し、かつ、１種類以上のペプチダーゼおよび１種類以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失している微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させる工程を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶の製造法。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
【請求項６】
Ｌ−アラニンまたはＬ−グルタミンを生産する能力、および以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
を生産する能力を有し、かつ、１種類以上のペプチダーゼおよび１種類以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失している微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させた後、以下の［１］または［２］の工程を行うことを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶の製造法。
［１］Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む培養物、または該培養物から調製されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む溶液を加熱処理する工程
［２］Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む培養物からＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む溶液を調製し、該溶液にメタノールを添加することによりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を晶析させる工程
【請求項７】
以下の［１］〜［３］から選ばれる蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有し、かつ、１種類以上のペプチダーゼおよび１種類以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失している微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させ、該水性媒体からＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する溶液を調製した後、該溶液にメタノールを添加してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を晶析させることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶の製造法。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ジペプチドの結晶およびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  一般的に医薬品等人体に摂取される化合物は、できる限り不純物、特に非天然化合物を除去することが求められている。例えば日米ＥＵ三極医薬品承認審査ハーモナイゼーション国際会議（ＩＣＨ）の医薬品原薬ガイドラインでは不純物を０．０５重量％以下にすべきことが記載されている。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは輸液の成分など医薬品原料や化粧品などに用いられているジペプチドであり、医薬品原料等に用いる場合は当該規格が要求される。【０００３】  化学合成法によるジペプチドの製造法、例えばＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの製造法としては、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニンを保護基が付加されたグルタミンと縮合し、脱保護して合成する方法（非特許文献１および非特許文献２）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニンを保護基がないグルタミンと縮合し、脱保護して合成する方法（特許文献１）、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体をアンモニアと反応させて合成する方法（特許文献２および非特許文献３）などが知られている。【０００４】  酵素または微生物を用いたＤ−アミノ酸を構成成分に含まないジペプチドの製造法としては、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸にＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを作用させる方法（特許文献３）、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸に各種微生物を作用させる方法（特許文献４）、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸にプロリンイミノペプチダーゼを作用させる方法（特許文献５）、Ｌ−アミノ酸エステルまたはＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸にエンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属細菌由来の酵素を作用させる方法（特許文献６）、および１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を用いる方法（特許文献７）などが知られている。【０００５】  これらの方法のうち、化学合成法はアミノ基の異性化やトリペプチドの副生が起こりやすく、例えば、非特許文献３には、再結晶を繰り返して得たＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶中にはＤ−アラニル−Ｌ−グルタミンが０．１９％残存していたと記載されている。またアミノ酸エステルやアミノ酸アミドを原料とした酵素合成法でも３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドの生成の可能性が示唆されている（特許文献６）。【０００６】  このため、Ｄ−アミノ酸を構成成分として含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドなどの不純物を含まない、ジペプチドの結晶、およびその製造法が望まれている。
【非特許文献１】Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）
【非特許文献２】Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２）
【非特許文献３】Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，４，１４７（２０００）
【特許文献１】米国特許第５，０３２，６７５号
【特許文献２】特開平６−２３４７１５号
【特許文献３】国際公開第０３／０１０１８７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０１０１８９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／０１０３０７号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／０２２７３３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００４／０５８９６０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の目的は、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、およびトリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶およびその製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は、以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶。
（２）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶。【０００９】  （３）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドがＤ−アラニル−Ｌ−グルタミンであり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドがアラニルアラニルグルタミンである、上記（２）の結晶。
（４）アミノ酸アミドを実質的に含まない上記（１）〜（３）のいずれか１つの結晶。【００１０】  （５）アミノ酸アミドがアラニンアミドである、上記（４）の結晶。
（６）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させる工程を含む上記（１）〜（５）のいずれか１つの結晶の製造法。【００１１】  （７）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質が以下の［１］〜［４］から選ばれる蛋白質である、上記（６）の製造法。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
［４］配列番号１８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（８）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸がＬ−アラニンまたはＬ−グルタミンであり、ジペプチドがＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンである、上記（６）または（７）の製造法。【００１２】  （９）Ｌ−アラニンまたはＬ−グルタミンを生産する能力、およびＬ−アラニンとＬ−グルタミンとからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させた後、以下の［１］または［２］の工程を行うことを含む、上記（２）〜（５）のいずれか１つの結晶の製造法。
［１］Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む培養物、または該培養物から調製されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む溶液を加熱処理する工程
［２］Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む培養物からＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む溶液を調製し、該溶液にメタノールを添加することによりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を晶析させる工程
（１０）Ｌ−アラニンとＬ−グルタミンとからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させ、該水性媒体からＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する溶液を調製した後、該溶液にメタノールを添加してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を晶析させることを特徴とする上記（２）〜（５）のいずれか１つの結晶の製造法。【００１３】  （１１）Ｌ−アラニンとＬ−グルタミンとからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質が以下の［１］〜［４］から選ばれる蛋白質である、上記（１０）の製造法。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する蛋白質
［４］配列番号１８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成活性を有する蛋白質
【発明の効果】
【００１４】  本発明により、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】１．本発明のジペプチドの結晶
本発明のＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶としては、目的とするジペプチドの結晶を構成するアミノ酸のＤ体のアミノ酸を構成成分に含む１種または２種以上のジペプチド、並びに目的とするジペプチドの結晶を構成するアミノ酸および／もしくは該アミノ酸のＤ体のアミノ酸を構成成分に含む３個以上のアミノ酸からなる１種または２種以上のポリペプチド、好ましくは１種または２種以上のトリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶をあげることができる。【００１６】
本発明においてD-アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとしては、D-アラニン（D-Ala）、D-グルタミン（D-Gln）、D-グルタミン酸（D-Glu）、D-バリン（D-Val）、D-ロイシン（D-Leu）、D-イソロイシン（D-Ile）、D-プロリン（D-Pro）、D-フェニルアラニン（D-Phe）、D-トリプトファン（D-Trp）、D-メチオニン（D-Met）、D-セリン（D-Ser）、D-スレオニン（D-Thr）、D-システイン（D-Cys）、D-アスパラギン（D-Asn）、D-チロシン（D-Tyr）、D-リジン（D-Lys）、D-アルギニン（D-Arg）、D-ヒスチジン（D-His）、D-アスパラギン酸（D-Asp）、D-α-アミノ酪酸（D-α-AB）、D-アザセリン（D- Azaserine）、D-テアニン（D-theanine）、4-ヒドロキシ-D-プロリン（4-D-HYP）、3-ヒドロキシ-D-プロリン（3-D-HYP）、D-オルニチン（D-Orn）、D-シトルリン（D-Cit）および6-ジアゾ-5-オキソ-D-ノルロイシン（6-diazo-5-oxo-D-norleucine）などから選ばれるD-アミノ酸を構成成分に含むジペプチドをあげることができる。
【００１７】  また、本発明において３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとしては、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、α−アミノ酪酸（α−ＡＢ）、アザセリン（Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、テアニン（ｔｈｅａｎｉｎｅ）、４−ヒドロキシプロリン（４−ＨＹＰ）、３−ヒドロキシプロリン（３−ＨＹＰ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｄ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）などから選ばれる３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、好ましくはトリペプチドをあげることができる。【００１８】  本発明のＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶としては、上記したＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶であれば、いずれのジペプチドの結晶でもよいが、好ましくはＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（４−Ｌ−ＨＹＰ）、３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（３−Ｌ−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−Ｌ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種または２種のアミノ酸からなるジペプチドの結晶をあげることができる。【００１９】  また、本発明のジペプチドの結晶としては、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとして、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−α−ＡＢ、４−Ｄ−ＨＹＰ、３−Ｄ−ＨＹＰ、Ｄ−Ｏｒｎおよ��Ｄ−Ｃｉｔなどから選ばれるＤ−アミノ酸を構成成分に含む１種または２種以上のジペプチド、並びに３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとして、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、α−ＡＢ、４−ＨＹＰ、３−ＨＹＰ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａなどから選ばれるアミノ酸を構成成分に含む３個以上のアミノ酸からなる１種または２種以上のポリペプチド、好ましくは１種または２種以上のトリペプチドを実質的に含まない、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
［ただし、Ｒ１がＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒまたはβ−Ａｌａであり、Ｒ２がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、４−Ｌ−ＨＹＰ、３−Ｌ−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔまたはＧｌｙである］で表されるジペプチドの結晶をあげることができ、より好ましくは、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとして、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｔｔｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−α−ＡＢおよびＤ−Ｃｉｔなどから選ばれるＤ−アミノ酸を構成成分に含む１種または２種以上のジペプチド、並びに３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとして、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、α−ＡＢ、Ｃｉｔ、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａなどから選ばれるアミノ酸を構成成分に含む３個以上のアミノ酸からなる１種または２種以上のポリペプチド、好ましくは１種または２種以上のトリペプチドを実質的に含まない、式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４  （ＩＩ）
［ただし、Ｒ３がＬ−Ａｌａの場合は、Ｒ４はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢまたはＬ−Ｃｉｔであり、Ｒ３がＧｌｙの場合は、Ｒ４はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢまたはＬ−Ｃｉｔであり、Ｒ３がＬ−Ｍｅｔの場合は、Ｒ４はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓまたはＬ−Ｈｉｓであり、Ｒ３がＬ−Ｓｅｒの場合は、Ｒ４はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓまたはＬ−α−ＡＢであり、Ｒ３がＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ４はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒまたはＬ−α−ＡＢであり、Ｒ３がＬ−Ｇｌｎの場合は、Ｒ４はＬ−ＰｈｅまたはＬ−α−ＡＢであり、Ｒ３がＬ−Ｐｈｅの場合は、Ｒ４はＬ−Ｇｌｎであり、Ｒ３がＬ−Ｔｒｐの場合は、Ｒ４はＧｌｙであり、Ｒ３がＬ−Ｃｙｓの場合は、Ｒ４はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであり、Ｒ３がＬ−Ｌｙｓの場合は、Ｒ４はＬ−Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであり、Ｒ３がＬ−Ａｒｇの場合は、Ｒ４はＬ−α−ＡＢであり、Ｒ３がＬ−Ｈｉｓの場合は、Ｒ４はＬ−Ｍｅｔであり、Ｒ３がＬ−α−ＡＢの場合は、Ｒ４はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであり、Ｒ３がβ−Ａｌａである場合は、Ｒ４はＬ−Ｈｉｓである］で表されるジペプチドの結晶をあげることができる。【００２０】  本発明のジペプチドの結晶としては、さらに好ましくは、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとして、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−α−ＡＢおよびＤ−Ｃｉｔなどから選ばれるＤ−アミノ酸のカルボキシル基とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢおよびＬ−Ｃｉｔなどから選ばれるＬ−アミノ酸のアミノ基がペプチド結合したジペプチド、並びに３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとして、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａなどから選ばれるアミノ酸を構成成分に含む３個以上のアミノ酸からなる１種または２種以上のポリペプチド、好ましくは１種または２種以上のトリペプチドを実質的に含まない、式（ＩＩ）［ただし、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ上記と同義である］で表されるジペプチドの結晶をあげることがでる。【００��１】  本発明のジペプチドの結晶としては、特に好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとして、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとして、アラニルアラニルグルタミン（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ）を実質的に含まない、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶をあげることができる。
また、本発明のＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶としては、上記の結晶に加え、さらにアミノ酸アミドを実質的に含まない結晶をあげることができる。アミノ酸アミドとしては、アラニンアミド（ＡｌａＮＨ２）、グリシンアミドおよびアスパラギン酸−α−アミドから選ばれるアミノ酸アミドをあげることができ、好ましくは、ＡｌａＮＨ２をあげることがでる。【００２２】  本発明のジペプチドの結晶としては、好ましくは、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドとして、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドとして、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ、およびアミノ酸アミドとして、ＡｌａＮＨ２を実質的に含まない、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶をあげることができる。
また、本発明のジペプチドの結晶はどのような結晶形でもよく、例えば針状結晶などをあげることができる。【００２３】  Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないとは、本発明のジペプチドの結晶中における重量％が、
（ａ）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１４重量％未満、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１０重量％以下、より好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００５重量％以下、さらに好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００２重量％以下、またはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００４重量％未満であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０３２重量％未満、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００３重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０２０重量％以下、より好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１０重量％以下、さらに好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００５重量％以下、特に好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２重量％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００２重量％以下であること、をあげることができる。【００２４】  Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、およびアミノ酸アミドを実質的に含まないとは、ジペプチドの結晶中の重量％が、
（ｂ）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００４重量％未満であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０３２重量％未満であり、かつアミノ酸アミドは０．０２３重量％未満であること、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００３重量％以下であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０２０重量％以下であり、かつアミノ酸アミドは０．０１５重量％以下、より好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２重量％以下であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１０重量％以下であり、かつアミノ酸アミドは０．０１２重量％以下、さらに好ましくは、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２重量％以下であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００２重量％以下であり、かつアミノ酸アミドは０．００９重量％以下であること、をあげることができる。【００２５】  また、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないとは、本発明のジペプチドの結晶をＨＰＬＣで分析したときの本発明のジペプチドの結晶のピークに対するエリア％が、
（ｃ）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１８％未満、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１３％以下、より好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００６％以下、さらに好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．０５％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００３％以下であること、またはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００４％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０３２％未満、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００３％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０２６％以下、より好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１８％以下、さらに好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２％以下であり、かつ３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１３％以下であること、をあげることができる。【００２６】  Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、およびアミノ酸アミドを実質的に含まないとは、ジペプチドの結晶をＨＰＬＣで分析したときのジペプチドの結晶のピークに対するエリア％が、
（ｄ）Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００４％未満であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０４１％未満であり、かつアミノ酸アミドは０．００５％未満であること、好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００３％以下であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０２６％以下であり、かつアミノ酸アミドは０．００３％以下、より好ましくはＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２％以下であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．０１３％以下であり、かつアミノ酸アミドは０．００３％以下、さらに好ましくは、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドは０．００２％以下であり、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドは０．００２％以下であり、かつアミノ酸アミドは０．００２％以下であること、をあげることができる。【００２７】
また、本発明のジペプチドの結晶としては、D-アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まず、かつジペプチドの結晶全体に占める目的とするジペプチドのエリア％または重量％が好ましくは99.90％以上、より好ましくは99.91%以上、さらに好ましくは99.92％以上のジペプチドの結晶、並びにD-アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、およびアミノ酸アミドを実質的に含まず、かつエリア％または重量％が好ましくは99.90％以上、より好ましくは99.91%以上、さらに好ましくは99.92％以上のジペプチドの結晶をあげることができる。
【００２８】  本発明のジペプチドの結晶中のＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、アミノ酸アミド、および本発明のジペプチドの結晶の重量％の測定法としては、上記各成分の量を測定することができる方法であれば、いずれの方法であってもよく、例えば本発明のジペプチドの結晶に含まれる各種成分をＨＰＬＣ等で分離し、各成分の量を、標準品のピーク面積と量に基づき、そのピーク面積から算出する方法が好適に用いられる。【００２９】  また、本発明のジペプチドの結晶中のＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、およびアミノ酸アミドの本発明のジペプチドの結晶のピークに対するエリア％は、上記各成分をＨＰＬＣで分離し、本発明のジペプチドの結晶のピーク面積に対する各成分のピーク面積を計算することによって決定することができる。
ＨＰＬＣの分析の条件としては、例えば下記の分析条件、
分析条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ（ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：３０℃
移動相：溶液Ａ［０．０１ｍｏｌ／ｌヘプタンスルホン酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／ｌリン酸一カリウム（ｐＨ２．５）］：メタノール＝９９：１
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
をあげることができるが、分析に供するジペプチドの試料中に含まれるＤ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、３個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、およびアミノ酸アミドの種類に応じて、適宜、移動相の溶液組成の変更、複数の溶液を用いた濃度勾配溶液の使用、検出波長の変更等をすることができ、また試料中の物質をＦＭＯＣ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）等で誘導体化し、その発光を検出する方法等もあげることができる
２．本発明のジペプチドの結晶の製造法
本発明の結晶は、ｉ）Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、並びにＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体からジペプチドの結晶を採取する方法、ｉｉ）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力、およびＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培地からジペプチドの結晶を採取する方法、などにより製造することができる。
（１）本発明の製造法に用いられる蛋白質
（ａ）本発明の製造法に用いられるＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であれば特に限定されないが、例えば以下の［１］〜［４］に記載の蛋白質、
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［４］配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００３０】
配列番号１８で表されるアミノ酸配列は、配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のAla-Ala リガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
よって、配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質もまたジペプチドを生成する活性を有する蛋白質である。
【００３１】  配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質が、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性は、少なくとも６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００３２】  上記において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｒｉｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列からなるジペプチドを生成する活性を有する蛋白質のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００３３】  欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であれば特に限定されないが、通常は１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のいずれかにおいて１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があってもよい。【００３４】  欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００３５】  以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記した１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加が導入される位置は、該変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛋白質がジペプチドの合成活性を有する限り、特に限定されず、例えば配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。【００３６】  また、上記した１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、例えば配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくとも６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質をあげることができる。【００３７】  上記において、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
（ｂ）本発明のＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であれば特に限定されず、例えば以下の［５］〜［８］に記載の蛋白質、
［５］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［６］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［７］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
［８］配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００３８】
配列番号１８で表されるアミノ酸配列は、上記（ａ）の特徴を有する配列である。
よって、配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質もまたジペプチドを生成する活性を有する蛋白質である。
【００３９】  配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質が、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性は、少なくとも６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００４０】  上記において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質は、上記（ａ）と同様、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の方法で取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は、上記（ａ）と同様である。
配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のいずれかにおいて１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、上記（ａ）と同意である。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は上記（ａ）と同様である。【００４１】  また、上記した１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加が導入される位置は、該変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛋白質がジペプチドを生成する活性を有する限り、特に限定されず、上記（ａ）と同様の位置をあげることができる。
また、上記した１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質としては、上記（ａ）と同様の蛋白質をあげることができる。【００４２】  上記において、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
（２）本発明のジペプチドの結晶の製造に用いられる微生物
（ａ）本発明のＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記（１）の（ａ）の蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば上記（１）の（ａ）の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。【００４３】  Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸としては、好ましくはＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、４−Ｌ−ＨＹＰ、３−Ｌ−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−Ｃｉｔ、Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−Ｌ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種以上のアミノ酸、より好ましくはＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、４−Ｌ−ＨＹＰ、３−Ｌ−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａから選ばれる２種のアミノ酸、さらに好ましくはＬ−ＡｌａおよびＬ−Ｇｌｎをあげることができる。【００４４】  上記（１）の（ａ）の［１］〜［４］のいずれかの蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、例えばＷＯ２００４／０５８９６０号に記載されているバシリシン合成酵素遺伝子を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、好ましくはバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、より好ましくはバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（ＡＴＣＣ２３８５７）、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ１５２４５、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ６６３３、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１２１３、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１１０７、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１２１４、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ９４６６、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１０３３、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ３０２２および上記（１）の［１］〜［４］のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物をあげることができる。【００４５】  上記（１）の［１］〜［４］の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、
［９］配列番号９〜１７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１０］配列番号９〜１７のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［１１］配列番号１９で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００４６】  ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。【００４７】  ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。【００４８】  上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００４９】  上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記したいずれかのＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００５０】  塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を酵素源に用い、該酵素源、並びにＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
（ｂ）本発明の製造法で用いられるＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力とを有する微生物としては、該能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば上記（１）の（ｂ）の［５］〜［８］のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であり、かつＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物をあげることができる。【００５１】  Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸としては、好ましくはＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、４−Ｌ−ＨＹＰ、３−Ｌ−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＧｌｙから選ばれる１種以上のアミノ酸、より好ましくはＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢおよびＧｌｙから選ばれる２種のアミノ酸、さらに好ましくはＬ−ＡｌａおよびＬ−Ｇｌｎをあげることができる。【００５２】  Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、およびＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記（１）の（ｂ）の蛋白質を生産する能力、およびＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物をあげることができる。該微生物としては、上記（１）の（ｂ）の［５］〜［８］の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物であり、かつＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力が強化された微生物をあげることができる。【００５３】  （１）の（ｂ）の［５］〜［８］の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、［１２］配列番号９〜１７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１３］配列番号９〜１７のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［１４］配列番号１９で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつ、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００５４】  上記の「ハイブリダイズする」とは、上記（ａ）と同義である。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
（ｃ）本発明の製造法で用いられるＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する微生物、並びにＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生産する能力とを有する微生物は、上記（ａ）または（ｂ）の微生物であるとともに、１）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質と略す）の活性が低下または喪失している微生物、または２）３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物であってもよい。【００５５】  １種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の１種以上のペプチダーゼおよび任意の１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは１種以上９種以下、より好ましくは１種以上７種以下、さらに好ましくは１種以上４種以下のペプチダーゼの活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは１種以上５種以下、より好ましくは１種以上３種以下、さらに好ましくは１種以上２種以下、特に好ましくは１種のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。【００５６】  該微生物としては、より具体的には、該微生物のゲノムＤＮＡ上に存在するペプチダーゼをコードする遺伝子（以下、ペプチダーゼ遺伝子と略す）およびペプチド取込み蛋白質をコードする遺伝子（以下、ペプチド取込み蛋白質遺伝子）のうち、１種以上のペプチダーゼ遺伝子の塩基配列および１種以上のペプチド取込み蛋白質遺伝子の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、または該塩基配列中に塩基の置換または付加があるために該ペプチダーゼおよび該ペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。【００５７】  ペプチダーゼの活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付加がないペプチダーゼに比べ、ペプチド分解活性が低くなっていればよく、好ましくは上記した塩基の欠失、置換または付加がない、野生型の遺伝子にコードされているようなペプチダーゼと比べたとき、ペプチダーゼ活性が少なくとも２０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、低下していることを意味する。【００５８】  微生物のペプチド分解活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド分解反応を行った後、残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。【００５９】  より具体的なペプチダーゼとしては、例えばエシェリヒア・コリに存在する、配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＢ、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＤ、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＮ、ＰｅｐＰ［ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．（以下、ＧｅｎＢａｎｋと略す）ＡＡＣ７５９４６］、ＰｅｐＱ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６８５０）、ＰｅｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６９９１）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４２１１）、Ｄｃｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４６１１）およびＩａｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７７２８４）など、バチルス・サチリスに存在するＡｍｐＳ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０１２２８５）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ９９３３９）、ＹｂａＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１０４）、ＹｃｄＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１０５）、ＹｊｂＧ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１１０）、ＹｋｖＹ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１１１）、ＹｑｊＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１１６）、ＹｗａＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１２３）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９７７３２、ＢＡＢ９７８５８、ＢＡＢ９８０８０、ＢＡＢ９８８８０、ＢＡＢ９８８９２、ＢＡＢ９９０１３、ＢＡＢ９９５９８およびＢＡＢ９９８１９（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマイセス・セレビシエに存在するＯＣＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１１４３）、ＳＰＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００３１４３）、ＳＰＹ２［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｌ０００２８７５］およびＹＩＭ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１１４５）などをあげることができ、ジペプチダーゼとしては、配列番号２０〜２３で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＤおよびＰｅｐＮ、並びにＰｅｐＱ、ＰｅｐＥ、ＩａｄＡをあげることができる。また、配列番号２０〜２３のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。【００６０】  アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠損、置換または挿入がないＤＮＡにコードされるペプチド取込み蛋白質に比べ、ペプチド取り込み活性が低くなっていればよく、好ましくは上記した塩基の欠失、置換または付加がない、野生型の遺伝子にコードされているようなペプチド取込み蛋白質と比べたとき、ペプチド取込み活性が少なくとも２０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、低下していることを意味する。【００６１】  微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体ＤＮＡ上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してジペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。【００６２】  より具体的なペプチド取り込み蛋白質としては、例えばエシェリヒア・コリに存在する配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＢ、配列番号２６で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＣ、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＤ、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＦ、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６９）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６７）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６６）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６５）、ＹｄｄＯ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５６）、ＹｄｄＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５７）、ＹｄｄＱ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５８）、ＹｄｄＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５９）、ＹｄｄＳ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５６０）、ＹｂｉＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７３９１５）、ＭｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４４１１）、ＳａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７６）、ＳａｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７５）、ＳａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７４）、ＳａｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７３）、およびＳａｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７２）など、バチルス・サチリスに存在するＤｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００２）、ＤｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００３）、ＤｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００４）、ＤｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００５）、ＤｐｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００６）、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７８７）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７８８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７８９）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７９０）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７９１）、ＡｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５８）、ＡｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５９）、ＡｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３６０）、ＡｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５６）、ＡｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５７）、ＹｃｌＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＢ１２１７５）およびＹｋｆＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＢ１３１５７）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９９０４８、ＢＡＢ９９３８３、ＢＡＢ９９３８４、ＢＡＢ９９３８５、ＢＡＢ９９７１３、ＢＡＢ９９７１４、ＢＡＢ９９７１５、ＢＡＢ９９８３０、ＢＡＢ９９８３１、ＢＡＢ９９８３２（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマイセス・セレビシエに存在するＯＰＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０１２３２３）、ＯＰＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ���０１５５２０）およびＰＴＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ８２１７２）などをあげることができ、また、ペプチド取り込み活性が高い蛋白質としては、配列番号２４〜２８で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＤｐｐＤ、ＤｐｐＦおよびそれらいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質もペプチド取り込み活性が高いペプチド取り込み蛋白質としてあげることができる。【００６３】  アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは３種以上９種以下、より好ましくは３種以上６種以下、さらに好ましくは３種または４種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。【００６４】  具体的なペプチダーゼとしては、上記したエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス、コリネバクテリウム・グルタミカムおよびサッカロマイセス・セレビシエに存在するペプチダーゼおよびジペプチダーゼをあげることができる。また、配列番号２０〜２３のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。【００６５】  アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
（３）本発明の製造法に用いられる微生物の製造法
（ａ）Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の製造法
ＷＯ２００４／０５８９６０号に記載されているバシリシン合成酵素遺伝子を有するバチルス・サチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コグランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、具体的にはバチルス・サチリスＡＴＣＣ  ２３８５７、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ１５２４５、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ６６３３、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１２１３、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１１０７、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１２１４、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ９４６６、バチルス・サチリス  ＩＡＭ１０３３、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２は、Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有しているので、本発明の製造法に用いることができる。【００６６】  また、Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該蛋白質をコードするＤＮＡで宿主微生物を形質転換することにより取得することもできる。
［１］Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの調製法
Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有するＤＮＡは、ＷＯ２００４／０５８９６０号記載の方法で調製することができ、例えば配列番号９〜１７で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号９〜１７で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］、および各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。【００６７】  取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００６８】  塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。【００６９】  上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号９〜１７で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ  ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００７０】  上記宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＡＴＣＣ  １２４３５、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ  ＭＰ３４７、エシェリヒア・コリ  ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ  ＭＥ８４１５等をあげることができる。【００７１】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
［２］Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物の製造法
上記［１］の方法により取得したＤＮＡをもとにして、必要に応じて、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。【００７２】  該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌および酵母等、目的とする遺伝子を発現できる微生物であればいずれも用いることができる。【００７３】  発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００７４】  発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。【００７５】  プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００７６】  プロモーターとしては、バチルス属細菌中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム属細菌中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８核酸）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００７７】  ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、ＷＯ２００４／０５８９６０号に記載されているｐＰＥ４３をあげることができる。【００７８】  宿主細胞として用いる原核生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、またはコリネバクテリウム属などに属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリ  ＮＭ５２２、バチルス・サチリス  ＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピーＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１４２９７等をあげることができる。【００７９】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
サッカロマイセス属に属する菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。【００８０】  プロモーターとしては、サッカロマイセス属に属する菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。【００８１】  宿主細胞としては、サッカロマイセス属等に属する菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
［３］Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質の製造法
Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質は、上記の［１］の方法で調製することができる該蛋白質をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質転換して取得することができる形質転換体を培地に培養し、培養物から該蛋白質を分離、精製することにより製造することができる。【００８２】  宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、該蛋白質をコードする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、好ましくは細菌、より好ましくは原核生物、さらに好ましくはエシェリヒア属に属する原核生物をあげることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法、および培養物から該蛋白質を分離、精製する方法としては、公知の方法、例えばＷＯ２００４／０５８９６０号に記載の方法をあげることができる。
（ｂ）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物の製造法
本発明の製造法で用いられるＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物は、微生物が元来Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有している場合は、該微生物をＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換する方法で取得することもできるが、例えば（ｉ）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を、公知の方法により人為的に強化する方法、
（ｉｉ）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力が強化されている微生物株を、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換する方法、などにより取得することができる。【００８３】  Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、上記（ａ）のＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の製造法と同様の方法で製造することができる。【００８４】  Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物、並びに該アミノ酸を生産する能力が公知の方法により強化された微生物は、該アミノ酸を生成、蓄積するように、公知の方法により人為的に改変された微生物であってもよく、該公知の方法としては、
［１］Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
［２］該アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
［３］該アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
［４］該アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
［５］野生型株に比べ、該アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。【００８５】  上記［１］の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）およびＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）などに記載されている。上記［２］の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）などに記載されている。上記［３］の具体的な方法は、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３７１−３７７（１９８７）などに記載されている。上記［４］の具体的な方法は、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３８，１８１−１９０（１９７９）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１７７３−１７７８（１９７８）などに記載されている。上記［５］の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６７５−１６８（１９７２）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，１０９−１１６（１９７７）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，２０８９−２０９４（１９８７）などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。【００８６】  さらに上記［１］〜［５］のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．６，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９６）ｓｅｃｔｉｏｎ  １４ａ，１４ｂやＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７９，１−３５（２００３）、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（１９８６）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開２００３−１６４２９７、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１５３−１６０（１９７５）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１１４９−１１５３（１９７５）、特開昭５８−１３５９９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４，２７２−２８３（１９５８）、特開昭６３−９４９８５、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）、ＷＯ９７／１５６７３、特開昭５６−１８５９６、特開昭５６−１４４０９２および特表２００３−５１１０８６など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を製造することができる。【００８７】  上記方法によって製造することができるアミノ酸���生産する能力を有する微生物としては、例えばＬ−グルタミン生産菌として、ｇｌｎＥ遺伝子および／またはｇｌｎＢ遺伝子が欠損した微生物、Ｌ−アラニン生産菌として、アラニン脱水素酵素遺伝子（ａｌｄ遺伝子）の発現が強化された微生物、Ｌ−プロリン生産微生物として、フェニルアラニンの脱感作型ｐｈｅＡ遺伝子および／またはチロシンの脱感作型ａｒｏＦ遺伝子を発現する微生物などをあげることができる。【００８８】  上記したアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記［１］〜［５］の方法が適用することができる微生物または上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａ���ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィカシス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。【００８９】  Ｌ−アラニンまたはＬ−グルタミンを生産する能力を有する微生物の具体例としては、Ｌ−グルタミン生産株として後述するエシェリヒア・コリ  ＪＧＬＥ１およびエシェリヒア・コリ  ＪＧＬＢＥ１など、Ｌ−アラニン生産株としてａｌｄ遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株など、Ｌ−グルタミンおよびＬ−アラニン生産株としてａｌｄ遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＧＬＥ１およびエシェリヒア・コリ  ＪＧＬＢＥ１などをあげることができる。【００９０】  Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の具体的例としては、Ｌ−グルタミン酸生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−５８０７およびＡＴＣＣ１３０３２など、Ｌ−グルタミン生産株としてＦＥＲＭ  Ｐ−４８���６およびＡＴＣＣ１４７５１など、Ｌ−スレオニン生産株としてＡＴＣＣ２１１４８、ＡＴＣＣ２１２７７およびＡＴＣＣ２１６５０など、Ｌ−リジン生産株としてＦＥＲＭ  Ｐ−５０８４およびＡＴＣＣ１３２８６など、Ｌ−メチオニン生産株としてＦＥＲＭ  Ｐ−５４７９、ＶＫＰＭ  Ｂ−２１７５およびＡＴＣＣ２１６０８など、Ｌ−イソロイシン生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−３７５７およびＡＴＣＣ１４３１０など、Ｌ−バリン生産株としてＡＴＣＣ１３００５およびＡＴＣＣ１９５６１など、Ｌ−ロイシン生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−４７０４およびＡＴＣＣ２１３０２など、Ｌ−アラニン生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−４１２１およびＡＴＣＣ１５１０８など、Ｌ−セリン生産株としてＡＴＣＣ２１５２３およびＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７６など、Ｌ−プロリン生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−２８０７およびＡＴＣＣ１９２２４など、Ｌ−アルギニン生産株としてＦＥＲＭ  Ｐ−５６１６およびＡＴＣＣ２１８３１など、Ｌ−オルニチン生産株としてＡＴＣＣ１３２３２など、Ｌ−ヒスチジン生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４およびＡＴＣＣ２１６０７など、Ｌ−トリプトファン生産株としてＤＳＭ１０１１８、ＤＳＭ１０１２１、ＤＳＭ１０１２３およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１７７７など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてＡＴＣＣ１３２８１およびＡＴＣＣ２１６６９など、Ｌ−チロシン生産株としてＡＴＣＣ２１６５２など、Ｌ−システイン生産株としてＷ３１１０／ｐＨＣ３４（特表２００３−５１１０８６記載）など、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン生産株としてＷＯ９６／２７６６９記載のエシェリヒア・コリＳＯＬＲ／ｐＲＨ７１など、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン生産株としてＦＥＲＭ  ＢＰ−５０２６およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０９など、Ｌ−シトルリン生産株としてＦＥＲＭ  Ｐ−５６４３およびＦＥＲＭ  Ｐ−１６４５などをあげることができる。【００９１】  なお、上記のＦＥＲＭ番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ＡＴＣＣ番号で表される菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）、ＶＫＰＭ番号で表される菌株は、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ロシア）、ＤＳＭ番号で表される菌株はＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ドイツ）からそれぞれ入手することができる。【００９２】  上記に代表されるＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物株を、上記（ａ）の［１］の方法で取得できるＤＮＡを用いて、上記（ａ）の［２］の方法で形質転換することにより、本発明の製造法で用いる微生物を製造することができる。
（ｃ）ペプチダーゼおよびペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物の製造法
本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記（ａ）または（ｂ）の方法により製造される微生物において、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取り込み蛋白質と略す）の活性が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物をあげることができる。【００９３】  該微生物は、例えば（ｉ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、上記（ａ）の方法によりジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を付与する方法、（ｉｉ）上記（ａ）の方法により製造することができるジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の、ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質、またはｂ）３種以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法、（ｉｉｉ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、上記（ｂ）の方法によりジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、およびＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する能力を付与する方法、並びに（ｉｖ）上記（ｂ）の方法により製造することができるジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、およびＬ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の、ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質、またはｂ）３種以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法、等により取得することができる。【００９４】  ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体ＤＮＡのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。【００９５】  該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。【００９６】  上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。【００９７】  具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属またはバチルス属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。【００９８】  λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリ  ジェネティック  ストック  センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
［１］塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
［２］塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
［３］塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
［４］上記［１］の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）］が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。【００９９】  薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。【０１００】  ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）］、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）］等をあげることができる。【０１０１】  上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。【０１０２】  酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号３８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。【０１０３】  相同性を有するＤＮＡとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の同一性を有するＤＮＡのことであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【０１０４】  上記塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。【０１０５】  微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記［１］または［２］の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結したＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
ａ）上記［３］の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
ｂ）染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記ａ）で得られた形質転換株に導入する、
ｃ）ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記ｂ）の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
ａ）上記［４］の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
ｂ）上記ａ）で得られた形質転換株にＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記ａ）で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。【０１０６】  上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。【０１０７】  方法２または方法３のｂ）で用いられるＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、上記の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
（４）本発明のジペプチドの結晶の製造法
（ａ）Ｌ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、並びにＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる１種以上のアミノ酸を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体からジペプチドの結晶を採取することにより、本発明のジペプチドの結晶を製造することができる。【０１０８】  該微生物の培養物は、該微生物を培地に培養することにより取得することができ、培養方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。【０１０９】  窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【０１１０】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【０１１１】  また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【０１１２】  上記製造法において、ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を酵素源に用いる場合、該酵素源は基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加し、必要に応じてエネルギー源として０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度のＡＴＰを反応液に加えてもよい。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。【０１１３】  上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【０１１４】  また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、水性媒体としては、上記の水性媒体に加え、酵素源として用いる微生物の培養液も用いることができ、ＡＴＰの供給源として、微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。【０１１５】  さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。【０１１６】  培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり湿菌体重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
本発明の製造法に用いられる微生物の培養物の処理物としては、上記（２）の微生物を培養して得られる培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該微生物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいる培養物の処理物をあげることができる。【０１１７】  ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６５℃、好ましくは２５〜５５℃、より好ましくは３０〜４５℃の条件で通常１分間〜１５０時間、好ましくは３分間〜１２０時間、より好ましくは３０分間〜１００時間行う。
水性媒体中に生成、蓄積した本発明のジペプチドの結晶を採取する方法としては、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチドおよび３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まないジペプチドの結晶、またはさらにアミノ酸アミドを実質的に含まないジペプチドの結晶が得られる限り特に限定されないが、例えば酵素源に蛋白質を用いた場合はそのまま、酵素源に培養物または該培養物の処理物を用いた場合は遠心分離または濾過によって菌体を除いた後、本発明のジペプチドを含む溶液を夾雑のアミノ酸やポリペプチドを分離するための合成吸着剤、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂、活性炭による処理、晶析処理、並びに特定の夾雑物を除去するための処理を必要に応じて単独または組み合わせて行った後、目的とするジペプチドを晶析する方法をあげることができる。【０１１８】  合成吸着剤としては、目的とするジペプチドと夾雑物とを分離できるものであれば特に限定されないが、例えば非極性で多孔質の吸着樹脂をあげることができ、具体的にはＨＰ１０、ＨＰ２０等のダイアイオンＨＰシリーズ（三菱化学社製）、ＳＰ８００、ＳＰ８２５等のダイアイオンＳＰ８００シリーズ（三菱化学社製）、ＳＰ２０５、ＳＰ２０７、ＳＰ２０７Ｓ等のダイアイオンＳＰ２００シリーズ（三菱化学社製）、およびＸＡＤ４、ＸＡＤ１６００等のアンバーライトＸＡＤシリーズ（ローム  アンド  ハース社製）等をあげることができる。【０１１９】  陽イオン交換樹脂としては、目的とするジペプチドと夾雑物とを分離できるものであれば特に限定されないが、強酸性陽イオン交換樹脂としては１２４Ｎａ、２５２Ｎａ等アンバーライトＩＲシリーズ（オルガノ社製）、マラソンＣ、ＸＵＳ−４０２３２．０１等のダウエックス（ダウケミカル社製）等、弱酸性陽イオン交換樹脂としてはＩＲＣ５０、ＩＲＣ７０等のアンバーライトＩＲＣシリーズ（ローム  アンド  ハース社製）、ＷＫ４０等のＷＫシリーズ（三菱化学社製）等をあげることができる。【０１２０】
陰イオン交換樹脂としては、目的とするジペプチドと夾雑物とを分離できるものであれば特に限定されないが、強塩基性陰イオン交換樹脂としてはPA306、PA312、PA412等のダイアイオンPAシリーズ(三菱化学社製)等、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはWA10、WA20、WA30等のダイアイオンWAシリーズ(三菱化学社製)等をあげることができる。
L-アラニル−L-グルタミンの結晶を採取する方法としては、例えば反応終了後、反応液に菌体が含まれている場合は菌体を遠心分離または濾過などにより除いた後、L-アラニル−L-グルタミンを含有する溶液を、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばマラソンCに通塔し、L-アラニル−L-グルタミンが含まれる溶出画分を取得した後、該溶出画分を弱酸性陽イオン、例えばIRC50に通塔してL-アラニル−L-グルタミンが含まれる溶出画分を得、次に該溶出画分を強塩基性陰イオン交換樹脂（例えばPA412）に通塔して得られるL-アラニル−L-グルタミンが含まれる溶液を用いて、L-アラニル−L-グルタミンを結晶化する方法をあげることができる。
【０１２１】  特定の夾雑物を除去するための処理としては、例えば基質として用いるＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれるアミノ酸が水性媒体中に残存している場合、該残存したアミノ酸を除去するための処理をあげることができる。該処理としては、例えばＬ−グルタミンが残存する場合、Ｌ−グルタミンを除去できる処理ならば、いずれの処理でもよいが、好ましくはレジン処理、加熱処理、酸または塩基処理などＬ−グルタミンを分解除去できる処理、より好ましくは加熱処理をあげることができる。【０１２２】  具体的な熱処理方法としては、Ｌ−アラニンとＬ−グルタミンを基質に用いて水性媒体中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生産させた後、該水性媒体を５５℃〜１２０℃で５分間〜２４時間、好ましくは７０℃〜１００℃で１５分間〜６時間処理する方法をあげることができる。
ジペプチドを晶析する方法としては、目的とするジペプチドを晶析できる方法であれば特に限定されないが、メタノール、エタノールおよびプロパノール等の低級アルコール、アセトン等のケトン類、およびテトラヒドロフラン等の溶媒をジペプチドを含有する水溶液に添加する方法をあげることができる。【０１２３】  晶析条件は結晶を析出させることができる条件であれば特に限定されないが、２０〜７０℃で、晶析用の溶媒をジペプチドを含有する水溶液の２〜５倍容量添加し、必要があればその後溶液を１０〜３０℃まで冷却する条件をあげることができる。
例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを晶析する方法としては、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む水溶液に、該水溶液の約２〜５倍容量、好ましくは３〜４倍容量のメタノールを、２０〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃の温度下で該水溶液に添加した後、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃に冷却する方法をあげることができる。【０１２４】  また晶析時には、目的とするジペプチドの結晶を種晶としてジペプチド含有溶液に添加してもよく、例えばＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを晶析する場合、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する水溶液に該水溶液の０．３〜０．５倍容量のメタノールを添加した後、該水溶液に含まれるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの１〜５重量％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を添加し、その後再び総計で元の水溶液の４倍容量になるまでメタノールを添加する方法をあげることができる。
（ｂ）Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有する微生物を培地に培養し、該培地中にジペプチドを生成、蓄積させた後、該培地からジペプチドの結晶を採取することにより、本発明のジペプチドの結晶を取得することができる。【０１２５】  該微生物を培養する方法としては、上記（ａ）の方法をあげることができる。
ただし、該微生物の培養に用いる培地には、目的とするジペプチドを構成するアミノ酸が含まれる必要はないが、天然培地、またはアミノ酸要求性株を培養するための培地には該アミノ酸が含まれている場合もある。本発明の製造法に用いられる培地には、本発明で用いられる微生物が、その成育に必要とする量のアミノ酸が含まれていてもよい。すなわち、通常の培地に含まれるアミノ酸の量は、用いられる微生物によって生成、蓄積される該アミノ酸の量に比べ非常に少ないので、通常の培地に含まれる該アミノ酸の量は、該アミノ酸の有無により、本願発明により製造されるジペプチドの生産量が変わるほどの量ではなく、よって本発明の製造法に用いられる培地にはその程度の該アミノ酸が含まれていてもよい。【０１２６】  本発明に用いられる培地に含まれるアミノ酸量としては、例えば天然培地あれば通常は２．５ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下の該アミノ酸、合成培地であれば通常は１ｇ／ｌ以下、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以下の該アミノ酸は含まれていてもよい。ただし、本願発明の製造法により、２種の異なるアミノ酸からなるジペプチドを製造する場合であって、用いられる微生物が該ジペプチドを構成するアミノ酸うちの１種のアミノ酸を生産する能力しか有していない場合、本発明で用いられる培地に、該微生物が生成、蓄積することができない残りの１種のアミノ酸を添加してもよい。このとき添加するアミノ酸の量は、通常０．５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである。【０１２７】  培地中に生成、蓄積した本発明のジペプチドの結晶を採取する方法としては、上記（ａ）の方法をあげることができる。具体的には培養物を遠心分離または濾過することなどにより培地から菌体を除いた後、上記（ａ）と同様の方法でジペプチドを晶析する方法をあげることができる。
また、Ｌ−アラニンまたはＬ−グルタミンを生産する能力と、Ｌ−アラニンとＬ−グルタミンとからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する能力とを有する微生物を培養し、培地中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させたとき、培地中に残存した夾雑物であるＬ−グルタミンを除去する方法としては、該培地を上記（ａ）の水性媒体と同様に処理する方法、好ましくは加熱処理する方法をあげることができる。【０１２８】  具体的な加熱処理方法としては、培地中にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成、蓄積させた後、該培地を５５℃〜１２０℃で５分間〜２４時間、好ましくは７０℃〜１００℃で１５分間〜６時間処理する方法をあげることができる。
ジペプチドを晶析する方法としては、上記（ａ）と同様の方法をあげることができる。
具体的には、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを晶析する方法としては、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む水溶液に、該水溶液の約２〜５倍容量、好ましくは３〜４倍容量のメタノールを、２０〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃の温度下で該水溶液に添加した後、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃に冷却する方法をあげることができる。【０１２９】  また晶析時には、目的とするジペプチドの結晶を種晶としてジペプチド含有溶液に添加してもよく、例えば上記方法においてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを晶析する場合、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する水溶液に該水溶液の０．３〜０．５培養量のメタノールを添加した後、該水溶液に含まれるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの１〜５重量％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を添加し、その後再び総計で元の水溶液の４倍容量になるまでメタノールを添加する方法をあげることができる。【０１３０】  以下に、市販されているアラニルグルタミンの結晶に含まれる物質を分析した結果を参考例として示す。
参考例  市販のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン結晶の分析
下記表１は、以下の条件下で各市販試薬をＨＰＬＣ分析した結果であり、上段にＨＰＬＣ分析したときのエリア％、下段に該エリア％から算出される重量％を示した。
分析条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ（ＧＬサイエンス社製）
温度：３０℃
移動相：溶液Ａ［０．０１ｍｏｌ／ｌヘプタンスルホン酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／ｌリン酸一カリウム（ｐＨ２．５）］：メタノール＝９９：１
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ【０１３１】
【表１】
0004931801.tif 000002
【０１３２】  いずれの試薬も、ＤＬ体、アラニルアラニルグルタミンおよびアラニンアミドから選ばれる１以上の物質を実質的に含有していた。
以下に、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸を生産する能力と、Ｌ−アミノ酸およびグリシンから選ばれる１種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力とを有し、かつ１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物の製造法の実験例を示すが、該微生物の製造法は該実験例に限定されるものではない。
実験例１  ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って作製した。【０１３３】  以下に記載のプラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリ  ジェネティック  ストック  センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号２９で表される塩基配列を有するｐｅｐＤ遺伝子、配列番号３０で表される塩基配列を有するｐｅｐＮ遺伝子、配列番号３１で表される塩基配列を有するｐｅｐＢ遺伝子、配列番号３２で表される塩基配列を有するｐｅｐＡ遺伝子および配列番号３３で表される塩基配列を有するｄｐｐＡ遺伝子、配列番号３４で表される塩基配列を有するｄｐｐＢ遺伝子、配列番号３５で表される塩基配列を有するｄｐｐＣ遺伝子、配列番号３６で表される塩基配列を有するｄｐｐＤ遺伝子および配列番号３７で表される塩基配列を有するｄｐｐＦ遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用い、エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号３８で表される酵母由来Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列を有するＤＮＡを合成した。ただし、ｄｐｐＡ遺伝子、ｄｐｐＢ遺伝子、ｄｐｐＣ遺伝子、ｄｐｐＤ遺伝子およびｄｐｐＦ遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するＤＮＡを合成した。【０１３４】  すなわち、ｐｅｐＤ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号３９および４０、ｐｅｐＮ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４１および４２、ｐｅｐＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４３および４４、ｐｅｐＢ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４５および４６、ｄｐｐオペロン欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４７および４８で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。【０１３５】  次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ）を含む４０μｌの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１３６】  それぞれの反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
（２）ｐｅｐＤ遺伝子欠損エシェリヒア・コリＪＭ１０１の作製
大腸菌ＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で培養することで選択した。【０１３７】  プラスミドｐＫＤ４６上にはλ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子が挿入されており、またその発現はＬ−アラビノースにより誘導されるよう設計されている。よって、Ｌ−アラビノース存在下で生育させた大腸菌を、直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが起こる。またｐＫＤ４６は温度感受性の複製起点を有するために、４２℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。【０１３８】  １０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加して培養して得られた大腸菌ＪＭ１０１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法により上記で取得したｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、大腸菌ＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン  １０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト  ５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ）に塗布し、３０℃で培養することで選択した。【０１３９】  選択したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、３７℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、ｐＫＤ４６脱落株を取得した。【０１４０】  次に上記で得られたｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０を用いて形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択することにより、ｐＣＰ２０を保持するｐＫＤ４６脱落株を取得した。
プラスミドｐＣＰ２０には酵母由来Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子が挿入されており、該遺伝子の発現は４２℃で誘導されるよう設計されている。
また、上記で作製したｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子及びｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列が存在するため、Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。【０１４１】  さらに、ｐＣＰ２０は温度感受性の複製起点を有しているため、ｐＣＰ２０保持株を４２℃で生育させることにより、Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの発現とｐＣＰ２０の脱落を同時に誘導することができる。
上記で取得したｐＣＰ２０保有ｐＫＤ４６脱落株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加ＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。【０１４２】  上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８ページ、培風館、１９９２年）に従って調製した。欠損の標的遺伝子であるｐｅｐＤ遺伝子の内部塩基配列に基づいて設計した配列番号４９および５０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μｌの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１４３】  上記ＰＣＲにおいて、増幅ＤＮＡ断片が検出されなかった株をｐｅｐＤ遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリＪＰＤ１株と名づけた。
（３）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＤ１株をｐＫＤ４６で形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で培養することにより選択した。得られた形質転換株（エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６）に、電気パルス法によりｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を取得した。【０１４４】  次に、上記（２）と同様の操作を行うことにより、染色体ＤＮＡ上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮ２と名づけた。
（４）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンの欠損株は、上記（１）で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を用い、上記（２）と同様の方法により作製した。【０１４５】  上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号５１〜５８で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。ここで、配列番号５１および５２で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＮ遺伝子欠損確認用、配列番号５３および５４で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＡ遺伝子欠損確認用、配列番号５５および５６で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＢ遺伝子欠損確認用、配列番号５７および５８で表される塩基配列からなるＤＮＡはｄｐｐオペロン欠損確認用プライマーセットである。【０１４６】  上記方法で取得されたｄｐｐオペロン欠損株をエシェリヒア・コリＪＤＰＰ１株、ｐｅｐＮ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮ１株、ｐｅｐＡ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＡ１株、ｐｅｐＢ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＢ７株と名付けた。
また、上記（３）の方法に準じて、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子およびｄｐｐオペロンからなる群より選ばれる２以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。前記方法で取得されたｐｅｐＤ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＰ４９株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮＢ４３株、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＡＰ５株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＢＰ７株と名づけた。表２は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。【０１４７】
【表２】
0004931801.tif 000003
【０１４８】
実験例２  アミノ酸を生成、蓄積する能力を有し、かつジペプチダーゼおよびジペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物の作製
エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6641-6645(2000)］に従って行った。
（１）遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
エシェリヒア・コリK12株のＬ−グルタミンの生合成調節に関与するglnE遺伝子およびglnB遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている［Science, 5331, 1453-1474(1997)］。
【０１４９】  報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、ｇｌｎＥ遺伝子欠損用のプライマーＤＮＡとして配列番号５９および６０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、ｇｌｎＢ遺伝子欠損用のプライマーＤＮＡとして配列番号６１および６２で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。合成したプライマーＤＮＡは、各々の欠失の標的遺伝子の上流と下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列に基づき設計した。【０１５０】  上記合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプラスミドＤＮＡ  １０ｎｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用１０緩衝液４μＬ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／Ｌを含む反応液４０μＬを用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１５１】
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを20μLのTEに溶解した。上記操作により、glnE遺伝子、glnB遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を取得した。
（２）染色体ＤＮＡ上のglnE遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリJPNDDP36株の作製
上記（１）で取得したエシェリヒア・コリJPNDDP36株をpKD46で形質転換した後、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地上でpKD46を保持するエシェリヒア・コリJPNDDP36株（以下、エシェリヒア・コリJPNDDP36/pKD46と称す）を選択した。10mmol/Lの L-アラビノースと50μg/mlのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリJPNDDP36/pKD46を、電気パルス法によりglnE遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、JPNDDP36株の染色体ＤＮＡ上のglnE遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、glnE構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で選択した。
【０１５２】  取得したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、４２℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。次にこのｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０で形質転換し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０１５３】
生育してきたアンピシリン耐性株を薬剤無添加のLB寒天培地にレプリカし、42℃で保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを薬剤無添加、および25mg/Lのクロラムフェニコールと100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にそれぞれレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。ここで得られた各株からそれぞれ染色体DNAを常法(生物工学実験書、日本生物工学会編 97〜98ページ、培風館、1992年)により調製した。欠損の標的となるglnE遺伝子の内部配列を元に設計した、配列番号６３および６４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、コロニーＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲは、200μlのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各0.5μmol/L、PfuDNAポリメラーゼ 2.5units、Pfu DNAポリメラーゼ用10緩衝液 4μL、deoxyNTP各200μmol/Lを含む反応液40μlを用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。ＰＣＲに供した株のうちで遺伝子増幅の見られなかった株は、glnE遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリ JPNDDPGLE1と名づけた。
（３）染色体DNA上のglnE遺伝子およびglnB遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリJPNDDP36株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリ JPNDDPGLE1株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養することによりpKD46を保持するエシェリヒア・コリ JPNDDPGLE1株（以下、エシェリヒア・コリJPNDDPGLE1/ pKD46と称す）を取得した。エシェリヒア・コリJPNDDPGLE1/ pKD46をglnB遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて電気パルス法により形質転換し、染色体DNA上のglnB 遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されglnB構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。glnB遺伝子の内部配列を元に設計した、配列番号６５および６６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、上記（２）の条件下でコロニーＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより遺伝子増幅が見られなかった株は、glnB遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリ JPNDDPGBE1と命名した。
実験例４  L-アラニル−L-グルタミンを生成する活性を有する蛋白質を発現するプラスミドＤＮＡの作製
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号６７〜７０に記載の配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣ、プライマーＤ）を合成した。配列番号６７の配列は、WO 2004/058960号に記載の方法で製造したプラスミドpQE60ywfEのywfE遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について5'側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号６８の配列は、ywfE遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の5'側にBamHI認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号６９の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列について5'側にEcoRI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号７０の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列と相補的な配列の5'側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。
【０１５４】  プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥを鋳型とし、ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢを、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤをそれぞれプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのｐＱＥ６０ｙｗｆＥ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む４０μＬの反応液を調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１５５】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域の断片に相当する約０．３ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。【０１５６】  上記で得られたそれぞれのＤＮＡ溶液５μｌを用い、プライマーＡおよびプライマーＢで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＣおよびプライマーＤで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、それぞれｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０１５７】  ０．２μｇのｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。【０１５８】  該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。該プラスミドは、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥ遺伝子を有する発現プラスミドであることを制限酵素消化により確認し、ｐＰＥ５６と命名した。【０１５９】  発現プラスミドｐＰＥ５６を基に、バチルス・サチルス由来のアラニン脱水素酵素遺伝子（ａｌｄ遺伝子）を同時に構成的に発現する発現プラスミドを以下に示す方法により構築した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号７１および配列番号７２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦと称す）を合成した。配列番号７１で表される塩基配列は、ａｌｄ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加した配列である。配列番号７２で表される塩基配列は、ａｌｄ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加した配列である。【０１６０】  バチルス・サチルスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＥおよびプライマーＦをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１６１】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ａｌｄ遺伝子断片に相当する約１．２ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡの沈殿を取得し、２０μＬのＴＥに溶解した。【０１６２】
該溶解液5μLを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素BamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットにより、ald遺伝子を含む1.2kbのＤＮＡ断片を回収した。
pPE56 0.2μgを制限酵素BamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により6.3kbのＤＮＡ断片を回収した。該6.3kbのＤＮＡ断片の末端脱リン酸化を、60℃で30分間、アルカリホスファターゼ（E.coliC75、タカラバイオ社製）処理することにより行った。反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加、混合して遠心分離した後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
【０１６３】  上記で得られたａｌｄ遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片とアルカリホスファターゼ処理した６．３ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０１６４】  生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ａｌｄ遺伝子がｙｗｆＥ遺伝子と順向きに挿入されたプラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＥ８６と命名した。
実験例５  ジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力、並びにＬ−アラニンおよびＬ−グルタミンを生成する能力を有し、かつジペプチダーゼおよびジペプチド取り込み遺伝子が欠損した微生物の作製
上記実験例２で取得したエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１株を、上記実験例４で作製したｐＰＥ８６で形質転換し、該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ８６を取得した。【０１６５】  以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１６６】Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの発酵生産
上記実験例５で取得したエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ８６を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ  イーストエキストラクト、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム）を含む試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。得られた培養液をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＴＦ培地（１６ｇ／ｌ  リン酸水素２ナトリウム、１４ｇ／ｌ  リン酸２水素カリウム、５ｇ／ｌ  硫酸アンモニウム、１ｇ／ｌ  クエン酸、０．５ｇ／ｌ  カザミノ酸、１ｇ／ｌ  プロリン、２．５ｇ／ｌ  アラニン、２．５ｇ／ｌ  グルタミン、１０ｍｇ／ｌ  ビタミンＢ１、２５ｍｇ／ｌ  硫酸マグネシウム、５０ｍｇ／ｌ  硫酸鉄、１０ｇ／ｌ  グルコース）に１％添加し、３０℃で２４時間培養した。【０１６７】  培養終了後の培養上清をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後ＨＰＬＣにて分析した。ＨＰＬＣによる分析には、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）を用い、溶離液としてＡ液（酢酸  ６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸  ６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）を用い、分析開始５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５分〜２０分までは、２０分に達したときにＡ液：Ｂ液＝１：１になるように
リニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。その結果培養上清中には１ｇ／ｌのアラニルグルタミンが蓄積していることを確認した。
【実施例２】
【０１６８】Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶の製造
エシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰＧＢＥ１／ｐＰＥ８６を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を含む三角フラスコに接種し、２８℃で２４時間培養した。得られた培養液５０ｍｌを１．９５ＬのＪＦ培地（６ｇ／ｌ  リン酸１水素２ナトリウム、３ｇ／ｌ  リン酸２水素１カリウム、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、５ｇ／ｌ  酵母エキス、２ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム、０．２ｇ／ｌ  硫酸第一鉄、０．０１ｇ／ｌ  硫酸マンガン、１ｇ／ｌ  塩化アンモニウム、０．２ｇ／ｌ  プロリン、０．０１ｇ／ｌ  チアミン塩酸塩、１０ｇ／ｌ  グルコース）を含む６Ｌ容のジャーに添加し、通気攪拌しつつ３２℃で培養した。培養中適宜グルコース、Ｌ−グルタミンおよびＬ−アラニンを添加するとともにアンモニア水でｐＨを６．６−７．０に維持し、６０時間培養し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを培養液中に蓄積させた。【０１６９】  上記で得られたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む培養液に塩酸を加えてｐＨ３とし、８０℃で１時間加熱して、残存するグルタミンを分解した。室温まで冷却後、遠心分離によって菌体を除去した後、上清を強酸性陽イオン交換樹脂であるマラソンＣ（ダウケミカル社製）を充填したカラムに１．６ｍｌ上清／ｍｌ樹脂の負荷量で通塔し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを該樹脂に吸着させた。十分に水洗した後、０．７ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムを用いてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを溶出し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む画分を分取した。【０１７０】  該画分を弱酸性陽イオン交換樹脂であるＩＲＣ５０（ローム  アンド  ハース社製）を充填したカラムに１０ｍｌ画分液／ｍｌ樹脂の負荷量で通塔し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを吸着させた後、水を通塔してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを溶出させ、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む画分を分取した。
該画分を強塩基性陰イオン交換樹脂であるＰＡ４１２（三菱化学社製）を充填したカラムに２３ｍｌ分画液／ｍｌ樹脂の負荷量で通塔し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを吸着させた後、水を通塔してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む画分を分取した。【０１７１】  該画分を減圧濃縮し、濃度が約４５０ｇ／ｌのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃縮液を得た。塩酸でｐＨを５．７に調整した後、６０℃で緩やかに攪拌しながらメタノールを添加した。メタノールの濃度が約３３％になった時点で種晶としてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を、濃縮液中に含まれるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの２．５重量％量添加した後、さらにメタノール濃度が８０％になるまでメタノールを添加した。該メタノール溶液を２０℃まで冷却した後、生じた結晶を濾過により分別し、粗結晶を取得した。【０１７２】  次に該粗結晶を水に溶解し、弱塩基性陰イオン交換樹脂であるＷＡ３０（三菱化学社製）を充填したカラムに２８００ｍｌ溶解液／ｍｌ樹脂の負荷量で通塔し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを吸着させた後、水を通塔してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを溶出させ、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む画分を分取した。
該画分を上記と同様に濃縮後、メタノールを添加して結晶を析出させた。得られた結晶を濾別後乾燥し、針状結晶のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの精製標品を取得した。【０１７３】  結晶の分析結果を以下に示す。なお旋光度の測定には、ＨＯＲＩＢＡ  ＳＥＰＡ−２００（堀場製作所社製）、粉末Ｘ線回折にはＲＡＤ−Ｘ（理学電機社製）を用い、測定は各機器の使用説明書に従って行った。
精製標品の旋光度（２０℃）：＋９．７°
粉末Ｘ線回折［回折角（２θ°）、（  ）内は相対強度比（Ｉ／Ｉ０を示す）］：６．８０（４），１１．１０（２），１３．７０（１００），１８．６０（４），１９．５５（５），２０．６５（７５），２１．３６（１７），２１．６０（９），２２．４５（１４），２３．２５（８），２４．０５（４），２４．７５（３），２５．４５（１２），２６．００（２），２７．５５（６），２９．８５（３），３０．４５（２），３２．４０（２），３２．９５（２），３３．９５（２），３４．８０（２５），３５．１５（３），３６．４５（７），３６．８０（３），４２．５５（２），４３．４０（２）
上記で得られたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶に含まれる不純物を参考例と同様の方法で分析した。結果を表３に示す。【０１７４】
【表３】
0004931801.tif 000004
【０１７５】  表３に示すとおり、本発明のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶は、ＤＬ−体、アラニルアラニルグルタミンおよびアラニンアミドを含まないことがわかった。すなわち、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶が取得されたことがわかった。
【実施例３】
【０１７６】メタノールの晶析効果
実施例２で得られたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの粗結晶（アラニルアラニルグルタミンが０．１１１％含まれている）を実施例２と同様に水に溶解後、ＷＡ３０樹脂を用いて分画してから濃縮した。得られた濃縮液を２つに分け、一方には実施例２と同様にメタノールを添加し、他方にはメタノールの変わりにエタノールを用い、エタノール濃度が７５％になるまでエタノールを添加する以外は実施例２と同様の方法でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶を析出させた。【０１７７】  得られた結晶を乾燥後、参考例と同様の方法によりアラニルアラニルグルタミンの量を測定した。結果を表４に示す。【０１７８】
【表４】
0004931801.tif 000005
【０１７９】  表中の結晶化率は、［（溶媒添加前の溶液中のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ量）−（晶析後の上清に残存するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ量）］／（溶媒添加前の溶液中のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ量）×１００で計算された値を示す。
表４に示すとおり、メタノールを用いてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを晶析することにより、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの結晶からアラニルアラニルグルタミンを効率的に除去できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】  本発明により、Ｄ−アミノ酸を構成成分に含むジペプチド、および３個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを実質的に含まない、ジペプチドの結晶を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８１】配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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