(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰを含む試料における、ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質のＡＴＰアーゼ活性を計測するための方法であって、
（１）前記試料中で前記蛋白質をＡＴＰと反応させると共に、当該反応期間中の、少なくとも第一の時点とその後の第二の時点に、当該試料中のイオンを、イオン感応性センサを用いて検出するステップと、
（２）前記第一の時点における検出値と前記第二の時点における検出値の比較に基づき、当該第一の時点と当該第二の時点の間に、前記試料中で、前記蛋白質によるＡＴＰアーゼ活性により生じたリン酸の濃度変化を検出するステップと
を含み、前記イオン感応性センサが、電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）のゲート絶縁膜上にイオンに感応するセンシング部を形成して成るセンサであって、当該センシング部の表面の電位の変化に基づくチャネルの電位レベルの変化量を検出してイオン濃度を検出する構成を有し、かつ、当該センシング部に五酸化タンタルを使用したイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＩＳＦＥＴセンサとして、センシング部の表面電位の変化を累積して前記イオン濃度を検出できる累積型ＩＳＦＥＴセンサを使用することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記イオン感応性センサとして、各センサ上に収容する試料溶液が互いに流通しないようにした一対の電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）センサを使用し、一方のセンサに目的とするＡＴＰ加水分解反応を起こさせる反応混合物を投入し、他方のセンサに対照用成分を投入して、目的の反応によるイオン変化を検出することを特徴とする請求項１又は２の方法。
【請求項４】
ＡＴＰを含む試料における、ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質のＡＴＰアーゼ活性を計測するためのシステムであって、
電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）のゲート絶縁膜上に、イオンに感応するセンシング部を形成して、このセンシング部の表面の電位の変化に基づくチャネルの電位レベルの変化量を検出して、イオン濃度を検出する構成のイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサにおいて、前記センシング部に五酸化タンタルを使用したＩＳＦＥＴセンサを備えたことを特徴とする、ＡＴＰアーゼ活性反応測定システム。
【請求項５】
前記ＩＳＦＥＴセンサとして、センシング部の表面電位の変化を累積して前記イオン濃度を検出できる累積型ＩＳＦＥＴセンサであることを特徴とする請求項４のシステム。
【請求項６】
前記ＩＳＦＥＴセンサとして、各センサ上に収容する試料溶液が互いに流通しないようにした一対の電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）センサを使用したダブルセンサ型のイオン計測装置を使用することを特徴とする請求項４又は５のシステム。
【請求項７】
前記ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質が、ＡＢＣトランスポーターであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載のＡＴＰアーゼ活性反応測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン感応性電界効果トランジスタ（Ion Sensitive Field Effect Transistor：以下、「ＩＳＦＥＴ」と称する）を用いる、ＡＴＰアーゼの活性の計測方法並びにシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中、「ＡＴＰアーゼ」と称するアデノシン三リン酸フォスファターゼ（アデノシントリフォスファターゼは、アデノシン三リン酸 (ＡＴＰ) の末端高エネルギーリン酸結合を加水分解する酵素群（ＥＣ番号３．６．１．３）である。ＡＴＰは生体内のエネルギー通貨であるから、エネルギーを要する生物活動に関連したタンパク質は、この酵素の活性を持っていることが多い。また、ＡＴＰはすべての生物の細胞内に存在し、筋肉の収縮や栄養物の移動などあらゆる生命活動で使用される炭素化合物である。ＡＴＰからＡＤＰ（アデノシン２リン酸）への加水分解の際、７．３ｋｃａｌ／ｍｏｌの高いエネルギーが生じる。
【０００３】
即ち、ＡＴＰアーゼは、この加水分解時に発生するエネルギーを利用して、エネルギーを要する生物体内作用に寄与している。ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰ以外のヌクレオチド三リン酸（ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰなど）にも作用することが知られている。また、ＡＴＰアーゼはＡＴＰの合成（酸化的リン酸化）、筋収縮、細胞内物質輸送、細胞外物質輸送、イオン濃度勾配の作成、解毒作用、発光、発電、膜融合（あらゆる生体膜）、膜タンパク質の品質管理など、エネルギーの関与する全ての反応に寄与していると言ってよい。
【特許文献１】特許第３６２３７２８号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００３／０４２６８３
【非特許文献１】今野久仁彦ほか:平成１２年度水産利用加工研究推進全国会議資料、１４３-１４６(２０００)
【０００４】
ところで、ＡＴＰアーゼの活性を計測するためには、ＡＴＰの加水分解によって生ずる遊離リン酸を定量する方法を用いることが一般的である。
例えば、オルトバナジン酸を利用した呈色反応により遊離リン酸を定量する方法が一般的であり、本法を利用したＡＴＰアーゼ計測キット((株) ジェノメンブレン)が市販されている。また、Cytoskeleton社のアッセイ法は、ＡＴＰ、ＧＴＰの加水分解によって生じた遊離リン酸により、ＭＥＳＧ（２-アミノ-６-メチルプリン リボヌクレオシド）が２-アミノ-６-メルカプト-メチルプリンに変換され、極大吸収波長が３３０〜３６０ｎｍにシフトする反応を利用して定量を行うものである。この反応はＰＮＰにより触媒され、反応後、３６０ｎｍの吸光度を測定し、遊離リン酸の量からＡＴＰアーゼ/ＧＴＰアーゼ活性を測定する。これらは、発色反応による吸光度を光学的な装置により測定する方法である。また、食品分野では、ｐＨスタット法によるＡＴＰアーゼ活性の測定も試みられている（例えば、非特許文献１）。
【０００５】
しかし、吸光度法は感度も低く、ＡＴＰアーゼ反応後に測定を行うものであるため、リアルタイムに、高感度に、極微量のサンプルでの定量解析が望まれている。ｐＨスタット法はさらに感度が低く、多量のサンプルを必要とするものであり、微量分析に対応できるものには至っていない。
また、ＡＴＰアーゼの一種であるＡＢＣトランスポーターにおいては放射性標識した化合物の取り込みから輸送活性を測定することにより高感度にＡＴＰアーゼの活性を計測できるが、本法もＡＴＰアーゼ反応後に計測を行うものであり、さらに、使用する施設が限定されることから、ラジオアイソトープ(ＲＩ)を利用しない分析法への切り替えが望まれている。
【０００６】
ところで、酵素センサとして、電流検出型の電気化学センサが一般的に用いられているが、電流検出の代わりに電界効果トランジスタを用いて電位検出を行う場合もある。また、この目的のために、水素イオン濃度（ｐＨ）のセンサとなるＩＳＦＥＴを利用することが考えられる。このＩＳＦＥＴセンサは、ＩＳＦＥＴのゲート上の窒化ケイ素等のイオン感応膜に溶液が接すると、溶液中のイオン活量に応じて界面電位が発生するしくみを利用している。つまり、このＩＳＦＥＴセンサは、ＩＳＦＥＴのゲート絶縁膜上にイオンに感応するセンシング部が形成されて成り、このセンシング部の表面の電位の変化に基づくチャネルの電位レベルの変化量を検出して、イオン濃度を検出することができる。結果、ＩＳＦＥＴがセンシング部にて水素イオンに感応して、かかるＩＳＦＥＴセンサはｐＨセンサとして機能する（ただし、これは、ＩＳＦＥＴセンサの用途の一つである）。ゲート絶縁膜と試料間の界面電位の変化は、ｐＨ依存性の出力電圧として計測される。かかるＩＳＦＥＴセンサを基に、更に、ゲート部に種々の感応膜を着膜することにより、種々のポテンショメトリックセンサが作製できる。特に、ＩＳＦＥＴを利用したバイオセンサは、集積回路の製造工程により製造されるので、小型化及び規格化が可能であり、大量生産が可能であるという利点があるため、その開発潜在力が期待されている。
しかしながら、ＩＳＦＥＴは感度が低く、経時的に出力が不安定であり、イオン濃度を高精度に検出できないという問題があり、現在のところ、ＩＳＦＥＴを利用したバイオセンサは、電流検出型のバイオセンサに比して、全く普及していない。
【０００７】
ＩＳＦＥＴの欠点を克服するため、いわゆる累積型のＩＳＦＥＴセンサが開発されている（特許文献１）。この累積型ＩＳＦＥＴセンサは、ＩＳＦＥＴのセンシング部の表面電位の変化に基づくセンシング部直下のポテンシャル井戸の深さの変化をドレインに電荷として転送することを繰り返し、ドレインに電荷が累積されるべく構成したことにより、センシング部の表面電位の変化が微量であっても確実に検出し、高感度にイオン濃度の変化を検出することができることを特徴とする。また、かかる技術の応用として、試料中の核酸と一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションの発生の有無を高感度に検出することが可能なＦＥＴセンサ及び塩基配列検出方法が既に開発されており（特許文献２）、これを用いて、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増量させることなく、簡便に、短時間に、低コストに塩基配列を決定することが実現されている。しかし、このような累積型ＩＳＦＥＴがＡＴＰアーゼの存在下におけるＡＴＰ加水分解反応（以後ＡＴＰアーゼ活性反応という）により生じるリン酸の濃度変化を高感度に測定するためのバイオセンサに利用可能であるかどうかは不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＡＴＰ活性反応により生じるリン酸およびその濃度変化を高感度に計測できる方法並びにシステムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、かかる課題を達成するために、鋭意検討した結果、イオン感応膜として窒化ケイ素の替わりに五酸化タンタルを用いたＩＳＦＥＴを利用したセンサシステムにより、ＡＴＰアーゼ活性反応を効率よく追跡できることを見い出した。また、特に前記累積型のＩＳＦＥＴセンサを使用することにより、ＡＴＰアーゼの活性により試料中で生じるリン酸およびその濃度変化を高感度に定量することが可能であることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明の方法は、ＡＴＰを含む試料における、ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質のＡＴＰアーゼ活性を計測するための方法であって、
（１）前記試料中で前記蛋白質をＡＴＰと反応させると共に、当該反応期間中の、少なくとも第一の時点とその後の第二の時点に、当該試料中のイオンを、イオン感応性センサを用いて検出するステップと、
（２）前記第一の時点における検出値と前記第二の時点における検出値の比較に基づき、当該第一の時点と当該第二の時点の間に、前記試料中で、前記蛋白質によるＡＴＰアーゼ活性により生じたリン酸の濃度変化を検出するステップと
を含み、前記イオン感応性センサとして、電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）のゲート絶縁膜上にイオンに感応するセンシング部を形成して成るセンサであって、当該センシング部の表面の電位の変化に基づくチャネルの電位レベルの変化量を検出してイオン濃度を検出する構成を有し、かつ、当該センシング部に五酸化タンタルを使用したイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサを用いることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明は、ＡＴＰを含む試料における、ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質のＡＴＰアーゼ活性を計測するためのシステム（分析や診断を実施するため装置やキット）として、電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）のゲート絶縁膜上に、イオンに感応するセンシング部を形成して、このセンシング部の表面の電位の変化に基づくチャネルの電位レベルの変化量を検出して、イオン濃度を検出する構成のイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサにおいて、前記センシング部に五酸化タンタルを使用したＩＳＦＥＴセンサを備えたシステムをも提供する。
【００１１】
かかる本発明は、半導体ベースの高感度ＩＳＦＥＴイオンセンサを用いることにより、ＡＴＰの加水分解により生じる、試料中のイオンの濃度変化を電気信号として出力することにより、これまで困難とされてきたＡＴＰの加水分解により生じるリン酸およびその濃度変化を、これらが極微量であっても、きわめて短時間で簡便に計測できるものであり、特に、イオンセンサのイオン感応膜に五酸化タンタルを使用したことで、従来に比して感度が向上したものである。
即ち、ＡＴＰは、式：ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏ→ＡＤＰ＋ＨＯＰＯ３２−＋Ｈ＋で表されるように加水分解されて、リン酸イオン（ＨＯＰＯ３２−）を生じるが、従来、特に、ＡＴＰアーゼの活性により生じる微量のリン酸およびその濃度変化を正確に計測することは非常に困難であった。本発明では、このように計測が困難な、ＡＴＰの加水分解により生じたリン酸およびその濃度変化の迅速かつ正確な計測を可能とした画期的なものである。
【００１２】
本発明で計測に供する試料は、ＡＴＰを含むものであればいずれでもよく、例えば、かかる試料としては、例えば、特にヒトを含む脊椎動物、無脊椎動物、植物、微生物等の生体由来のもの、例えば、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿、便、糞、リンパ液、精液、涙液等や、河川、土壌などの環境から採取したもの、食品や医薬品等の加工物由来のもの等が挙げられる。
前記試料は、本発明において計測に供するに際し、超音波処理や界面活性剤処理等により破砕した後に計測に供するか、タンパク抽出および所望により精製操作により前処理を行った後に計測に供することが概して好ましく、このようにすることで、計測感度を向上させることができる。
【００１３】
即ち、本発明では、ＡＴＰアーゼ活性により生じるリン酸の検出は、ＡＴＰの加水分解に伴い生じる水素イオンおよびリン酸イオンをＩＳＦＥＴが検出することによるが、それは特にリン酸イオンをＩＳＦＥＴが検出することによるものと考えられる。
【００１４】
前記ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質は、ＡＴＰを加水分解してイオンの濃度変化を生じるものであれば特に限定されず、例えば、ミオシンＡＴＰアーゼ、ダイニンＡＴＰアーゼ、キネシンＡＴＰアーゼ、ダイナミンＡＴＰアーゼなどの運動性タンパク質ＡＴＰアーゼ、Ｆ型ＡＴＰアーゼ、Ａ型ＡＴＰアーゼ、Ｖ型ＡＴＰアーゼ、Ｐ型ＡＴＰアーゼなどのイオン輸送性ＡＴＰアーゼ、トランスポーター型ＡＢＣタンパク質、チャネル型ＡＢＣタンパク質、レセプター型ＡＢＣタンパク質、ＤＮＡ結合型ＡＢＣタンパク質などのＡＢＣ  ＡＴＰアーゼ、ＡＡＡプロテアーゼ、膜融合ＡＡＡ・ＡＴＰアーゼ等のＡＡＡ・ＡＴＰアーゼ等が挙げられる。
【００１５】
また、前記ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質の形態は、特に限定されず、液状であってもよいし、固形状態であって、試料と混合することにより水分を供給されるものであってもよいし、また適宜キャリア物質等と組み合わせて当該蛋白質を含む組成物、例えば、医薬品、食品および飲料等の形態であってもよい。また、かかる蛋白質は、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工した体外診断薬、バイオセンサ等の形態をとることもできる。
【００１６】
前記ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質は、また、膜などの担体に固定化されていてもよいし、遊離状態で存在してもよい。一般に、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を利用したバイオセンサでは、センシング部の膜に、酵素活性を有する蛋白質を直接あるいは間接的に固定して使用した場合と固定せずに使用した場合では、バイオセンサが示すｐＨ特性が異なる場合がある。これは、固定化により当該蛋白質の立体構造が変化することが原因の１つであるが、他に以下の２点が考えられる。第１に、酵素固定化膜によってｐＨの勾配が生じ、溶液中のｐＨと酵素固定化膜中のｐＨに差が生じることと、第２に、酵素反応等によって生成する酸により酵素近傍のｐＨが変化することである。従って、このような場合は、当該蛋白質は遊離状態で存在することが好ましい。
【００１７】
本発明において、反応系、即ち試料やＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質を含む反応混合物の全体に対するＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質の濃度は特に限定されないが、試料等と混合後の終濃度が０．０００００５〜０．０１Ｕ／μＬとなる様に含有させることが好ましく、終濃度０．００００１〜０．００５Ｕ／μＬとなる様に含有させることがさらに好ましい。
【００１８】
更に、本発明では、前記蛋白質のＡＴＰアーゼ活性を、アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩の存在下でＩＳＦＥＴにより検出するように構成されてもよく、かかる金属塩として、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムを使用することができる。かかる金属塩は、検出シグナルを安定化させる働きを有する。反応系に使用されるアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩の添加濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＭ〜１Ｍであり、１〜１００ｍＭであることが好ましく、１〜５０ｍＭであることがより好ましく、かかる範囲で、優れた検出シグナル安定化効果を得ることができる。
【００１９】
本発明において、反応系には、溶液のｐＨ緩衝作用、タンパク質の安定化などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。１つの実施態様では、バッファー成分として、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液等を使用できる。かかるバッファー成分の反応系全体に対する濃度は特に限定はないが、濃度が高すぎるとイオン濃度が変化しにくく、低すぎると変化が過剰になるので、高い検出感度が達成されるように適切な濃度を選択することが好ましい。かかるバッファー成分の濃度は例えば０．１〜２０ｍＭであり、０．２〜１０ｍＭであることが好ましく、０．５〜１０ｍＭであることがより好ましい。また、反応系には、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコールおよびその誘導体等を添加しても良い。
【００２０】
本発明において、反応系には、さらに、必要に応じてその他の添加剤を含有してもよい。添加剤としては界面活性剤、安定化剤、防腐剤、キレート剤、活性化剤などが挙げられる。かかる添加剤についても何ら限定はないが、具体的には以下のようなものが例示される。例えば、界面活性剤としては、ノニオン性のもの、アニオン性のもの、およびカチオン性のもののいずれも使用でき、例えば、ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類（商品名トリトンＸ−１００など）やポリオキシエチレンアルキルエーテル類等、アニオン界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩や直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩等、カチオン界面活性剤としては、テトラアルキルアンモニウム塩等がそれぞれ挙げられる。安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、サイクロデキストリン等の糖類およびその誘導体、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸等のアミノ酸およびその誘導体、アルブミン等の蛋白質、アルカリ金属やアルカリ土類金属等の塩類、アンモニアイオン、グルコン酸などが挙げられる。防腐剤としては、抗生物質、アジ化化合物、その他防菌剤、防かび剤等が挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。活性化剤としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属等が挙げられる。
【００２１】
かかる本発明では、反応混合物が、ＩＳＦＥＴセンサのセンシング部に直接あるいは間接的に接触することになる。最適な反応混合物の容量は、センサの構成、特にセンシング部の面積に依存することになるが、例えば、０．１〜５００μＬが好ましく、０．１〜３０μＬがより好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、試料中での、ＡＴＰの加水分解により生じたリン酸およびその濃度変化を高感度に定量することできる。また、本発明の方法並びにシステムは、極めて簡単な構成である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を実施するための累積型のＩＳＦＥＴセンサおよびこれを用いるイオン計測装置について、一部図面を参照しながら、更に詳しく説明する。
【００２４】
本発明では、五酸化タンタルを使用した前記ＩＳＦＥＴセンサとして、特にセンシング部の表面電位の変化を累積して前記イオン濃度を検出できる累積型ＩＳＦＥＴセンサを使用するのが好ましい。かかる累積型のＩＳＦＥＴセンサを使用することで、非常に高感度で前記蛋白質のＡＴＰアーゼ活性の計測が可能となる。例えば、特許文献２に記載されるような累積型のＩＳＦＥＴセンサを使用するのがよい。ここでは、ＩＳＦＥＴのセンシング部の表面電位の変化を、電荷として転送することを繰り返し、電荷を累積させることにより、センシング部の表面電位の変化が微量であっても確実に、その変化を検出し、高感度にイオン濃度の変化を検出することができるものである。
【００２５】
また、本発明では、試料中のイオン濃度を計測するための手段として、一対の電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）センサを同一の半導体基板上に併設し、この一対のセンサ間では、その上に収容する試料溶液が互いに流通しないようにしたダブルセンサ型のイオン計測装置を使用してもよい（図５参照）。この場合、一方のセンサに目的とするＡＴＰ加水分解反応を起こさせる反応混合物を投入し、他方のセンサに対照用成分を投入して、目的の反応によるイオン変化を検出することができる。
【００２６】
本発明に使用する累積型のＩＳＦＥＴセンサとしては、例えば、図７に示すようなＰ型又はＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部及び浮遊拡散部と、前記入力ダイオード部から浮遊拡散部までの間に形成されるべき導通チャネルの始端及び終端にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定された入力ゲート及び出力ゲートと、前記チャネルの中間部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部と、前記浮遊拡散部の、前記チャネルから離れた側に連なる前記基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたリセットゲートと、前記リセットゲートにおける前記浮遊拡散部から離れた側の前記基板表面部に形成された、基板と逆型の拡散領域からなるリセットダイオード部とを備え、前記センシング部に、ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質または該蛋白質を含む組成物および試料を添加混合し、その結果、前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を、電位変化として検出するようにしたＦＥＴセンサを構成したものを好適に使用できる。
【００２７】
図７は、本発明で使用する累積型のＩＳＦＥＴセンサの一例を示すものであるが、図７（Ａ）は、ＩＳＦＥＴセンサ素子の構成を示す縦断面図であり、図７（Ｂ）は図７（Ａ）に示すＩＳＦＥＴセンサ素子のエネルギー準位を示す模式図である。また、図８はバイオセンサ計測装置により、図７（Ａ）に示すＩＳＦＥＴセンサ素子の出力特性を計測するときの動作タイミングチャートである。またさらに、図９は、図７（Ａ）に示すＩＳＦＥＴセンサ素子の動作を示す図であって、ポテンシャル状態及び蓄積電荷の推移を示す、図７（Ｂ）と同様のエネルギー準位を示す模式図である。
【００２８】
図７（Ａ）において、典型的にはシリコンにてなるｐ−型の半導体基板１の表側には互いに所定間隔をおいてｎ＋型拡散層からなる電荷供給部としての入力ダイオード２及び浮遊拡散部３が形成され、さらに浮遊拡散部３から小間隔をおいてリセットダイオード４が形成される。半導体基板１上には、この場合、ｎ＋型拡散層上も含めＳｉＯ２又はＳｉ３Ｎ４からなる絶縁膜５が形成される。入力ダイオード２及び浮遊拡散部３間における半導体基板１表面部には、次に述べるゲート構造との関連において導通チャネル（ｎ型反転層）が形成され、その結果、入力ダイオード２をソースとし、浮遊拡散部３をドレインとするＩＳＦＥＴセンサ２０が構成される。絶縁膜５上には、チャネル始端部に対応する入力ダイオード２の隣接位置において入力ゲート６が、またチャネル終端部に対応する浮遊拡散部３の隣接位置において出力ゲート７が、それぞれポリシリコン、又はアルミニウムからなる蒸着層より形成され、さらに浮遊拡散部３とリセットダイオード４との間においてリセットゲート８が同様の蒸着層より形成される。入力ゲート６、リセットゲート８の上面と、これらのゲートを支持したゲート外の絶縁膜５上には、典型的には窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）蒸着層からなる被着膜１０が形成される。Ｓｉ３Ｎ４膜はＳｉＯ２膜に比べて構造が緻密で、酸素の拡散係数が小さいため、それ自身が入力ゲート６と出力ゲート７間に形成する凹部をセンシング部９として、良好なイオン感応膜を構成する。
【００２９】
好ましい態様では、イオン感応膜としては五酸化タンタル（Ｔａ２０５）蒸着層を用いる。本発明の方法並びにシステムにおける、前記蛋白質のＡＴＰアーゼ活性により生じたリン酸をＩＳＦＥＴセンサを用いて検出する系において、センシング部に五酸化タンタル層が設けられていることにより、窒化ケイ素の蒸着層を使用する従来技術に比較して極めて高感度にイオンの濃度変化を検出することができる。ＩＳＦＥＴセンサ素子２０Ａのセンシング部９のイオン感応膜には、本発明の方法並びにシステムにおける反応物質、例えばＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質等が固定化されてもよいが、かかる反応物質は遊離状態で存在してもよい。
【００３０】
なお、半導体基板１の表面Ｘにおいて、入力ダイオード２及びリセットダイオード４の外側には、絶縁膜５と同様なシリコン酸化膜等からなる比較的厚いマスク層１１が形成され、前述したセンシング部９を形成する蒸着膜である被着膜１０は、当該マスク層１１にも被さり、さらに被着膜１０上にはセンシング部９を除き、例えば、リンガラスからなる保護膜１２と、当該保護膜１２上において外表面を面一にした外装膜１３が被着形成される。図７（Ａ）の左側より、入力ダイオード２、入力ゲート電極６及び出力ゲート電極７、浮遊拡散部３、リセットゲート８及びリセットダイオード４の上面には、各々アルミニウム等からなる電極リードが形成され、それらの電極リードを介して計測シーケンスに従った電圧が印加され、又は浮遊拡散部３の電位が検出される。浮遊拡散部３は電極リード端子の出力電圧Ｖｏｕｔ（以下、この出力信号電圧を「シグナル」と称する。）を、ソースフォロワ増幅器を含む計測装置に接続する。
【００３１】
詳しくは、本態様では、ＩＳＦＥＴセンサ素子は、Ｐ−型半導体基板１の表面Ｘ側に所定の間隔をおいて形成された、半導体基板１と逆型であるＮ＋型の拡散領域からなる入力ダイオード部２及び浮遊拡散部３と、リセットダイオード４とを有し、浮遊拡散部３とリセットダイオード４との間の絶縁膜５上には同じくリセットゲート８を有することにより、浮遊拡散部３のためのリセットトランジスタを構成したものである。まず、入力ゲート６、及び出力ゲート７は入力ダイオード部２から浮遊拡散部３までの間に形成されるべき導通チャネルの中間部、及び終端部にそれぞれ対応した絶縁膜９上に固定され、両ゲート６及び７を隣接させるため、比較的細幅で高さを持たせた出力ゲート７が、比較的広幅の入力ゲート６の当該隣接側を覆う被着膜１０によって、当該入力ゲート６と絶縁された構造となっている。出力ゲート７は底面が半導体基板１上の絶縁膜に接するとともに、その上方部が被着膜１０及び保護膜１２を貫通し、上端が外装膜１３内に位置する高さを有している。
【００３２】
このように形成された入力ダイオード２と、入力ゲート６との間の基板表面上の位置、すなわち形成されるべき反転チャネルの入力端に対応した位置には、底面をなす絶縁膜５とともにイオン感応膜となる入力ゲート６側の絶縁膜５と、入力ダイオード２側の被着膜１０及び保護膜１２の断層とに挟まれて凹部をなすセンシング部９が形成される。
なお、計測には市販のオシロスコープ等を使用する。
【００３３】
さらに、図７（Ａ）のＩＳＦＥＴセンサ素子を用いて、イオン濃度を検出する方法について、図８及び図９を参照して説明する。
まず、図８に示すように、センシング部９内の水溶液に例えば２Ｖの電圧Ｖｇｉｎを印加、センシング部９の直下の半導体基板１の表面の電位を一定にする。これがポテンシャル井戸入り口の初期設定値となる。次に、図７に示すように、入力ゲート６に適当な直流電圧Ｖｓｅｎ（例えば、２．０Ｖ）を印加し、その直下の半導体基板１の表面電位を固定するとともに、電荷供給部としての入力ダイオード２に逆バイアス電圧Ｖｉｎ＝５Ｖを、また、リセットゲート８に所定のパルス幅のリセット電圧Ｖｇｒを印加し、浮遊拡散部３の電位の初期値を設定する。このとき、出力ゲート７の電圧Ｖｇｏｕｔは０Ｖである。
【００３４】
図８に示すように、初期状態（ｔ０〜ｔ１）では電荷供給部である入力ダイオード２の電圧Ｖｉｎ＝５Ｖは十分な逆バイアスとして、当該入力ゲート内に残留する電荷を図７（Ｂ）に示すようにごく僅かに抑え、当該電荷プールの上端は、センシング部９のレベルに届かず、センシング部９以降（図７（Ｂ）のセンシング部９の右側）には侵入しない。この場合、水溶液中のマイナスイオン濃度が高くなった場合、センシング部９の表面電位が変化し、当該センシング部９直下の半導体基板１の表面の電位は前記初期設定値ｂ０よりさらに上がり、逆に、マイナスイオン濃度が低くなった場合、又はプラスイオンが高くなった場合には、表面電位はｂ０より下がる。
時間ｔ１に達し、入力ダイオード２に印加する電圧Ｖｉｎが、５Ｖから１Ｖに下がると、逆バイアスが緩和された分、電荷プール量が多くなり、そのレベルは、この場合センシング部９直下の基板表面電位ｂ０（ポテンシャル井戸入ロレベル）を越え、当該入力ダイオード２からの電荷が入力ゲート６直下のポテンシャル井戸に供給される（図８及び図９（Ａ）参照。）。
【００３５】
時間ｔ１からｔ２に達すると、再度、入力ダイオード２に印加する電圧Ｖｉｎが５Ｖに上がり、センシング部９直下の表面電位のレベルで電荷がすりきられ、当該レベル下におけるポテンシャル井戸の容量分だけ電荷が残存、それ以外の電荷は入力ダイオード２を経て、当該ダイオード２に残留する分を残し直流電圧源２１に還流する（図９（Ｂ）参照。）。この場合も、ポテンシャル井戸に残留した電荷の量はマイナスイオン濃度によって変化し、センシング部９の表面電位の変化量がこの電荷の量に変換される。
【００３６】
次に、時間ｔ２からｔ３になるまでの間に、出力ゲート７に電圧Ｖｇｏｕｔが５Ｖ印加されると、当該出力ゲート７が開いて、電荷が予めリセット電位に維持された浮遊拡散部３に転送される（図９（Ｃ）参照。）。時間ｔ３で、この電荷を転送後、出力ゲート７に印加する電圧Ｖｇｏｕｔが０Ｖに下がり、出力ゲート７が閉じられる（図９（Ｄ）参照）。さらに、浮遊拡散部３は、時間ｔ３で電位が読み取られた後は、リセットゲート８にリセットゲート電圧Ｖｇｒを印加し、当該浮遊拡散部３の電荷を、電源電圧＋Ｖｄｄの直流電圧源２１に接続されたリセットダイオード４に導き、さらに直流電圧源２１に吸収せしめて、初期出力電圧Ｖｏｕｔを再設定する。
【００３７】
以上説明したように、図９（Ｂ）から図９（Ｄ）に示したプロセスを繰り返し行うこと（電荷の転送と、出力ゲートの開閉）により、センシング部９の表面電位の変化量が浮遊拡散部３の電荷量として累積される。そして、浮遊拡散部３に蓄積された電位変化量は出力電圧Ｖｏｕｔとして、計測装置に入力された後、表示されかつ記録その他の処理に用いられる。
【００３８】
本発明において、累積型ＩＳＦＥＴセンサのセンシング部の表面積は、センサを小型化し至便性を高めるためには、小さい方が好ましいが、反応混合物の容量を高め、シグナルのレベルを上げるためには、大きい方が好ましい。従って、その使用目的、対象試料種などに応じて、センシング部の表面積を至適化すればよい。概して、センシング部の表面積は、０．０００１ｍｍ２〜５ｍｍ２が好ましく、０．００５ｍｍ２〜１ｍｍ２がより好ましい。
【００３９】
かかる累積型ＩＳＦＥＴをセンサ素子として用いた計測装置により、ＡＴＰアーゼ活性反応によって生じるイオンおよびその濃度変化を計測することができる。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例を用いて本発明を具体的に説明する。ただし、かかる実施例は、本発明を限定するものではない。
【００４１】
[実施例１]本発明の方法による、ＡＴＰアーゼ活性を有する蛋白質の活性の計測
下記の表１に示す計測用試料、蛋白質溶液および緩衝溶液を準備し、下記計測装置を用いて、下記の計測方法により、各試料における当該蛋白質のＡＴＰアーゼ活性を計測した。
【００４２】
【表１】
0005047023.tif 000002
【００４３】
[計測装置]
累積型ＩＳＦＥＴセンサ（ＡＭＩＳセンサ、バイオエックス社製）を用いた計測装置（バイオエックス社製）であって、ＩＳＦＥＴのゲート上のイオン感応膜に五酸化タンタルを使用したもの。センシング部の表面積は０．０５ｍｍ２とした。詳しくは、この計測装置は、図５に示すように、一対のＩＳＦＥＴセンサ（２３、２４）を同一の半導体基板１上に併設し、その一対のＩＳＦＥＴセンサの周縁を一括して包囲する電気化学的に不活性なフッ素樹脂等からなる外周壁２５と、それらのセンサ２３、２４間を仕切って両端が外周壁２５に内接する仕切り壁２６を設けて成るものであり、各センサ２３、２４上に収容する試料溶液が互いに流通しないため、同一基板上で隣接した２センサのうち、一方のセンサにおいて目的のＡＴＰ加水分解反応を起こさせる反応混合物成分を投入し、他方のセンサにおいて、当該反応混合物成分の少なくとも一つを、緩衝液等の、明らかに目的のＡＴＰ加水分解反応を起こさない成分に置き換えて対照用とし、該他方のセンサにより溶液・物性等の経時ドリフトを測定し、このドリフト値を当該一方のセンサの測定値から差し引いて、正確に目的の反応によるイオン変化のみを検出することが可能なものである。また、２つのセンサにおいて異なった試料溶液を収容し、互いに影響なく、各別の測定を行うことも可能である。
【００４４】
[計測方法]
図５に示すダブルセンサ型の計測装置のセンシング部Ａに計測用試料を１８μＬ添加し、センシング部Ｂに対照用試料として緩衝溶液を１８μＬ添加した。３０℃で３分間の予備加温を実施し、温度を安定化した後、経時的にシグナルを計測し、センサの状態を確認した。そしてセンシング部Ａ及びＢに、活性蛋白質溶液（アルカリフォスファターゼを、その活性度が０．１〜５Ｕ／ｍｌになるように濃度を調整したもの）を各２μＬ添加および混合し、シグナルが安定した後（１〜２分後）、３０℃にてシグナル変化量（センシング部Ｂからのシグナルと比較してのセンシング部Ａからのシグナルの減少）を５秒ごとに４〜５分計測した。累積型ＩＳＦＥＴセンサの累積回数は１０回で計測した。
【００４５】
[結果]
各計測試料について計測を実施し、各々のシグナル変化量のタイムコースを計測した結果を図１に示す。計測したシグナル変化量とアルカリフォスファターゼの活性度との関係を図２に示す。試薬中のアルカリフォスファターゼの活性度とシグナル変化量の間に、良好な相関関係が認められる。
【００４６】
[実施例２]本発明の方法による、ＡＢＣトランスポーターの被検物質感受性の評価
本実施例では、膜蛋白であるＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼ活性を本発明の方法を用いて計測することにより、被検物質（本実施例では、カルシウム拮抗剤であるベラパミル）に対するＡＢＣトランスポーターの感受性を計測した。
まず、下記の表２の最上段に示す緩衝溶液を準備し、この緩衝液を用いて下記表に示す反応液、膜蛋白希釈液、被検物質溶液および反応開始試薬を作製し、下記計測装置を用いて、下記計測方法により、ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼ活性を計測した。
【００４７】
【表２】
0005047023.tif 000003
【００４８】
[計測装置]
実施例１で使用したものと同じ累積型ＩＳＦＥＴセンサ（ＡＭＩＳセンサ、バイオエックス社製）を用いた計測装置（バイオセンサ開発用計測装置、バイオエックス社製）であって、ＩＳＦＥＴのゲート上のイオン感応膜に五酸化タンタルを使用したもの。センシング部の表面積は０．０５ｍｍ２とした。
【００４９】
[計測方法]
計測装置のセンシング部Ａに膜タンパク希釈液を９μＬと、被検物質溶液（その濃度を０．１〜５μＭに調整したもの）を９μＬとを添加し、センシング部Ｂに膜タンパク希釈液を９μＬと対照用試薬としての反応液を９μＬとを添加した。３７℃で１０分間経過後のシグナルを計測し、センサの状態を確認した。次いで、センシング部Ａ及びＢに反応開始試薬を各２μＬ添加し、混合し、３７℃にてシグナル変化量（センシング部Ｂからのシグナルと比較してのセンシング部Ａのシグナルの減少）を１分ごとに１０分間計測した。累積型ＩＳＦＥＴセンサの累積回数は１０回で計測した。
【００５０】
[結果]
各被検物質溶液について計測を実施し、各々のシグナル変化量のタイムコースを計測した結果を図３に示す。また、計測したシグナル変化量とベラパミル濃度との関係を図４に示す。試料中のベラパミル濃度とシグナル変化値との間に良好な相関関係が認められる。
ところで、例えば、本実施例に用いた前記計測装置と膜蛋白溶液は、セットにして、膜蛋白質の被検物質に対する感受性を評価するためのシステムとして、キット等の形態で提供できる。
【００５１】
[実施例３]本発明の方法による、試料中のリン酸濃度の計測
下記の表３に示す計測用試料と緩衝溶液を準備し、下記計測装置を用いて、下記の計測方法により、各試料中のリン酸濃度を計測した。
【００５２】
【表３】
0005047023.tif 000004
【００５３】
[計測装置]
実施例１で使用したものと同じ累積型ＩＳＦＥＴセンサ（ＡＭＩＳセンサ、バイオエックス社製）を利用した計測装置（バイオセンサ開発用計測装置、バイオエックス社製）であって、ＩＳＦＥＴのゲート上のイオン感応膜に五酸化タンタルを使用したもの。センシング部の表面積は、０．０５ｍｍ２とした。
【００５４】
［計測方法］
計測装置のセンシング部Ａ及びＢに、緩衝溶液を各１８μＬ添加した。３０℃で３分間の予備加温を実施し、温度を安定化した後、５０秒間シグナルを計測し、センサの状態を確認した。次いで、センシング部Ａに、各種計測用試料（リン酸濃度０〜１μＭのもの）を各々２μＬを添加および混合し、センシング部Ｂには対照用試料として緩衝溶液を２μＬ添加および混合し、３０℃にてシグナル変化量（センシング部Ｂからのシグナルと比較してのセンシング部Ａからのシグナルの減少）を５秒毎に１００秒間計測した。累積型ＩＳＦＥＴセンサの累積回数は、１０回で設定した。
【００５５】
[結果]
結果を、測定したリン酸濃度とシグナル変化の関係として図６に示す(●)。試薬中のリン酸の濃度とシグナル変化量の間に、良好な希釈直線性が認められる。
なお、発明者等は、別途の試験により、本実施例の方法により、例えば試料中に０．０１μＭ〜２００μＭの濃度で含有されるリン酸を計測することができ、試料中に０．０５μＭ〜１００μＭ以下の濃度で含有されるリン酸を確実に計測することができることが確認した。
【００５６】
[比較例１] センシング部に窒化ケイ素層を用いた累積型ＩＳＦＥＴによるリン酸濃度の計測
計測装置におけるＩＳＦＥＴのゲート上のイオン感応膜として、窒化ケイ素を使用したこと以外は、実施例１と同様の試料、計測装置、および条件で、各試料中のリン酸濃度を計測した。
【００５７】
[結果]
各計測試料について計測を実施し、各々のシグナル変化量を計測し、シグナル変化とリン酸濃度との関係を、実施例３と同様に図６に示す（○）。窒化ケイ素層イオン感応膜を使用した際にも、試薬中のリン酸の濃度に応じてシグナル変化値が変化し、希釈直線性が認められるが、その感度は十分でなく、シグナル変化のレベルは五酸化タンタル層イオン感応膜を使用した際の約１／５である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の方法による、アルカリフォスファターゼによるＡＴＰの加水分解により生じたリン酸の濃度変化のタイムコースを示す。
【図２】本発明の方法による、アルカリフォスファターゼのＡＴＰアーゼ活性の計測の検量線を示す。
【図３】本発明の方法による、リン酸の濃度変化のタイムコースを示す。
【図４】本発明の方法によるＡＴＰアーゼ活性の計測に基づくベラパミール濃度の検量線を示す。
【図５】本発明の方法並びにシステムに適したダブルセンサ型のイオン計測装置の平面図を示す。
【図６】本発明の方法によるリン酸濃度計測と、窒化ケイ素層をセンシング部に有するＩＳＦＥＴセンサを使用した比較例によるリン酸濃度計測における、シグナル変化量と試料中のリン酸濃度の希釈直線性を示す。図中、黒丸（●）は本発明の方法による計測値を、白丸（○）は、比較例による計測値を示す。
【図７】本発明の方法並びにシステムに適したＩＳＦＥＴセンサの構成を示す図であり、（Ａ）は当該ＩＳＦＥＴセンサの構成を示す縦断面図であり、（Ｂ）は（Ａ）に示すＩＳＦＥＴセンサのエネルギー準位を示す模式図である。
【図８】図７（Ａ）に示すＩＳＦＥＴセンサの出力特性を計測するときの動作タイミングチャートである。
【図９】図７（Ａ）に示すＩＳＦＥＴセンサの動作を示す図であって、ポテンシャル状態及び蓄積電荷の推移を示す、図７（Ｂ）と同様のエネルギー準位を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…半導体基板
２…入力ダイオード
３…浮遊拡散部
４…リセットダイオード
５…絶縁膜
６…入力ゲート
７…出力ゲート
８…リセットゲート
９…センシング部
１０…被着膜
１１…マスク層
１２…保護膜
１３…外装膜
２０、２３、２４…ＩＳＦＥＴセンサ
２５…外周壁
２６…仕切り壁
Ｘ  …表面
Ａ  …センシング部
Ｂ  …センシング部
【図１】
0005047023.tif 000005
【図２】
0005047023.tif 000006
【図３】
0005047023.tif 000007
【図４】
0005047023.tif 000008
【図５】
0005047023.tif 000009
【図６】
0005047023.tif 000010
【図７】
0005047023.tif 000011
【図８】
0005047023.tif 000012
【図９】
0005047023.tif 000013