(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的条件下で可溶性であり、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、５−ヘリックスタンパク質であって、該ヘリックスがリンカーで分離されている、５−ヘリックスタンパク質。
【請求項２】
リンカーが少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項１記載の５−ヘリックスタンパク質。
【請求項３】
配列番号：１を含む５−ヘリックスタンパク質。
【請求項４】
ＨＩＶ感染の候補インヒビターを同定する方法であって、該方法は、
結合が生じるのに適当な条件下で、化合物または分子と５−ヘリックスタンパク質を合わせる工程、ここで、該５−ヘリックスタンパク質は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、および
該５−ヘリックスタンパク質と該化合物または分子との間で結合が生じるかを決定する工程
を含み、結合が生じている場合には、該化合物または分子がＨＩＶ感染の候補インヒビターである、方法。
【請求項５】
５−ヘリックスタンパク質に結合する化合物または分子が、細胞系アッセイにおいて哺乳類細胞のＨＩＶ感染を阻害するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
個体においてＨＩＶへの免疫応答を誘発するための医薬の製造における、５−ヘリックスタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを含有する組成物の使用であって、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、使用。
【請求項７】
ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合し、哺乳類細胞のＨＩＶ感染を阻害し、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含む、５−ヘリックスタンパク質。
【請求項８】
ヒト細胞のＨＩＶ感染を阻害する、請求項７記載の５−ヘリックスタンパク質。
【請求項９】
ヘアピン構造のＨＩＶ  ｇｐ４１三量体の形成を妨げ、細胞のＨＩＶ感染を阻害し、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含む、５−ヘリックスタンパク質。
【請求項１０】
ウイルス感染性アッセイ、細胞−細胞融合アッセイまたは両者で測定される場合、ＨＩＶ膜と哺乳類細胞膜の融合を阻害し、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含む、５−ヘリックスタンパク質。
【請求項１１】
哺乳類細胞膜がヒト細胞膜である、請求項１０記載の５−ヘリックスタンパク質。
【請求項１２】
ウイルス感染性アッセイまたは細胞−細胞融合アッセイで測定される場合、ナノモルＩＣ50で該タンパク質がＨＩＶ膜融合を阻害する、請求項１０記載の５−ヘリックスタンパク質。
【請求項１３】
個体において中和抗ＨＩＶ応答を誘発するための医薬の製造における、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する５−ヘリックスタンパク質の使用であって、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含む、使用。
【請求項１４】
個体において細胞のＨＩＶ感染を阻害するための医薬の製造における、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する５−ヘリックスタンパク質の使用であって、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、使用。
【請求項１５】
個体においてＨＩＶ膜とヒト細胞膜との融合を阻害するために使用される、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン三量体の形成を阻害する５−ヘリックスタンパク質または５−ヘリックスタンパク質の結合特性を模倣する中和抗体であって、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、５−ヘリックスタンパク質または５−ヘリックスタンパク質の結合特性を模倣する中和抗体。
【請求項１６】
ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン三量体の形成を阻害するために使用される、ＨＩＶウイルスエンベロープタンパク質に結合する５−ヘリックスタンパク質または５−ヘリックスタンパク質の結合特性を模倣する抗体であって、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、５−ヘリックスタンパク質または５−ヘリックスタンパク質の結合特性を模倣する抗体。
【請求項１７】
ＨＩＶエンベロープタンパク質に結合する分子に連結された５−ヘリックスタンパク質を含んでなる５−ヘリックス複合体であって、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、５−ヘリックス複合体。
【請求項１８】
ＨＩＶエンベロープタンパク質に結合する分子が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０に結合する、請求項１７記載の５−ヘリックス複合体。
【請求項１９】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０に結合する分子が、ｓＣＤ４または抗体である、請求項１８記載の５−ヘリックス複合体。
【請求項２０】
個体においてＨＩＶ膜とヒト細胞膜との融合を阻害するための医薬の製造における、ＨＩＶエンベロープタンパク質に結合する５−ヘリックス複合体の使用であって、該５−ヘリックス複合体がＨＩＶエンベロープタンパク質に結合する分子に連結された５−ヘリックスタンパク質を含み、該５−ヘリックスタンパク質が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＮ−ヘリックスと少なくとも２つであるが完全に３つではないＣ−ヘリックスとを含み、かつＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する、使用。
【請求項２１】
エンベロープタンパク質がＨＩＶ  ｇｐ１２０である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
（ａ）配列番号：１、（ｂ）配列番号：７、（ｃ）配列番号：８、および（ｄ）配列番号：９からなる群より選ばれる単離タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｒｏｏｔ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｋａｙ、Ｄａｖｉｄ  Ｃ．ＣｈａｎおよびＰｅｔｅｒ  Ｓ．Ｋｉｍ（１９９９年１２月１６日提出）の「５−ヘリックスタンパク質」という発明の名称の米国特許仮出願６０／１７１，０４２およびＭｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｒｏｏｔ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｋａｙ、Ｄａｖｉｄ  Ｃ．ＣｈａｎおよびＰｅｔｅｒ  Ｓ．Ｋｉｍ（２０００年９月２２日提出）の「ＨＩＶ侵入インヒビターのタンパク質デザイン」という発明の名称の米国特許仮出願６０／２３４，５７２の利点を主張する。参照された両仮出願の教示の全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
政府援助
本発明は、その全体または一部が国立衛生研究所の助成金番号ＰＯ１ＧＭ５６５５２の援助を受けた。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ＨＩＶは、世界的に流行しているＡＩＤＳの原因ウイルスである。ＨＩＶ感染の初期段階は、ウイルス膜と標的細胞膜の融合、ウイルス内容物を細胞の細胞質に注入する過程が含まれる。ウイルス側では、融合活性を担う分子複合体は、表面タンパク質ｇｐ１２０および膜貫通タンパク質ｇｐ４１を含む。これは、現在、ｇｐ１２０が標的細胞上のタンパク質ＣＤ４および補助受容体と相互作用し、高次構造が変化してｇｐ４１のアミノ末端（融合ペプチド領域）を標的細胞膜に挿入すると考えられている。この構造の再編成によりウイルスと細胞膜との融合が促進されるが、その機構についてはあまり理解されていない。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、本明細書中に記載の条件下で安定な構造に折りたたまれ、ＨＩＶ  ｇｐ４１タンパク質のＣ−ペプチド領域に対応するペプチド（Ｃ３４という）またはこの領域の一部に結合し、ヒト細胞などの哺乳動物細胞のＨＩＶ感染を阻害する５−ヘリックスまたは５−ヘリックスタンパク質と呼ばれる新規のタンパク質に関する。５−ヘリックスは、アミノ酸残基リンカーなどのリンカーで分離された３つのＮ−ヘリックスおよび少なくとも２つ、しかし３つではない、ＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピン構造の三量体の３つのＣ−ヘリックスから構成されている。すなわち、５−ヘリックスには、３つのＮ−ヘリックスおよびＨＩＶ  ｇｐ４１の３つのＣ−ヘリックスの少なくとも２つが含まれる。第３のＣ−ヘリックスの一部も含むことができるが、第３のＣ−ヘリックスを全ては含まない。ヘリックスはそれぞれヘリックスの前後がリンカー、好ましくはアミノ酸残基リンカーで分離されている。１つの実施形態では、５−ヘリックスは、以下のように示すことができる：Ｎ−リンカー−Ｃ−リンカー−Ｎ−リンカー−Ｃ−リンカー−Ｎ（式中、ＮはＮ−ヘリックスを示し、ＣはＣ−ヘリックスまたはＣ−ヘリックスの一部を示す）。本明細書中で示されるように、用語５−ヘリックスまたは５−ヘリックスタンパク質は、全てのこのような実施形態（適切なリンカーで分離された３つのＮ−ヘリックスおよび２つまたはそれ以上であるが３つ未満の完全なＣ−ヘリックスを含む）を含む。５−ヘリックスのアミノ酸組成は、５−ヘリックスがＨＩＶ  ｇｐ４１タンパク質のＣ−ペプチド領域に相補的な構造であり、好ましくは全体としてｇｐ４１のペプチドまたは一部としてｇｐ４１のＣ３４またはＣ−ペプチド領域に結合する表面が存在するという条件で、非常に変化し得る。すなわち、５−ヘリックスの残りの（相互作用）表面（Ｃ−ペプチド結合部位、この全てまたは一部がＣ−ペプチドで占められていない）が、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域の結合に利用可能な様式（高次構造）で存在しなければならない。５−ヘリックスのワクチンおよび治療への適用の場合、５−ヘリックスはＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ３４またはＣ−ペプチド領域に結合しなければならない（結合することができる）。５−ヘリックスが薬物スクリーニングツールまたは抗体スクリーニングツールとして使用される場合、５−ヘリックスはＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ３４またはＣペプチド領域に結合する必要は無い（結合することができなくても良い）。
【０００５】
１つの実施形態では、５−ヘリックスは配列番号：１のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、５−ヘリックスは、Ｃ−ペプチド領域に構造が相補的であり、好ましくはＣ−３４またはＣ−ペプチド領域に結合する表面が存在し、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、置換、または変更によって配列番号：１と異なるアミノ酸配列を有する。暴露したタンパク質がＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に構造が相補的な表面が存在するような高次構造であるという条件で、５−ヘリックスのＮ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックスの順序を変化させることもできる。５−ヘリックスタンパク質の高次構造が上記のように保持される場合、リンカーは任意の長さまたは組成であり得る。５−ヘリックスはＬ−アミノ酸タンパク質、Ｄ−アミノ酸タンパク質、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基との組み合わせであってよく、これらの残基は改変残基であり得る。
【０００６】
本発明は、さらに、５−ヘリックスをコードするＤＮＡ；５−ヘリックスの産生法；５−ヘリックスの使用方法（ＨＩＶの、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞への侵入を阻害する方法など）およびヒトなどの個体における免疫応答の誘発方法；遺伝子療法においてなどの５−ヘリックスをコードするＤＮＡの使用方法；５−ヘリックスタンパク質コードＤＮＡを含み且つ発現する細菌、ヒト、および他の哺乳動物ならびに他の真核細胞などの遺伝子操作細胞ならびにこのような細胞の使用方法（例えば、遺伝子療法または５−ヘリックス産生）；５−ヘリックスを含む医薬組成物などの組成物；５−ヘリックスとＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１２０）に結合する成分とを含む５−ヘリックス複合体；５−ヘリックス複合体を含む医薬組成物などの組成物；５−ヘリックスに結合する抗体、特に中和抗体およびＨＩＶ感染減少法などのこのような抗体の使用方法；ならびに細胞のＨＩＶ感染を阻害しするおよび／または５−ヘリックスタンパク質に結合する分子または化合物の同定法に関する。
【０００７】
５−ヘリックスは、抗ＨＩＶ治療剤、予防剤、またはＨＩＶ感染を妨げる薬物、他の抗ＨＩＶ治療薬または予防薬の同定用（スクリーニング用）またはデザイン用試薬、およびＨＩＶ感染を妨げるまたは減少させる抗体の惹起用免疫原として有用である。特定の実施形態では、本発明は、評価すべき化合物または分子を候補インヒビターと呼び、インヒビターと５−ヘリックスとの結合が生じるのに適切な条件下で候補インヒビターと５−ヘリックスとを組み合わせる工程と、結合が生じる場合に決定する工程とを包含し、結合が生じる場合には、前記候補インヒビターは５−ヘリックスに結合する化合物または分子である、５−ヘリックスに結合して哺乳動物細胞のＨＩＶ感染を阻害する化合物または分子の同定法に関する。この方法は、任意に、５−ヘリックスに結合する化合物または分子が細胞ベースのアッセイなどにおいて哺乳動物（例えば、ヒト）細胞のＨＩＶ感染を阻害するかどうかを決定する工程をさらに包含する。このような化合物または分子は、細胞のＨＩＶ感染を（全てまたは部分的に）阻害する（例えば、ヘアピン三量体の形成の妨害または干渉による）。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、適切な経路により５−ヘリックスおよび生理学的に許容されうる担体を含む組成物を個体の免疫応答の誘発に十分な用量で導入する工程を含む個体のＨＩＶに対する免疫応答の誘発方法に関する。生理学的に許容されうる担体中に５−ヘリックス（またはその変異型または一部）を含むワクチンは本発明の主題である。
【０００９】
アミノ酸残基リンカーなどのリンカーによって連結したＨＩＶ  ｇｐ４１の３つのＮ−ヘリックスおよび３つのＣ−ヘリックスを含む６−ヘリックスタンパク質もまた本発明の主題である。１つの実施形態では、６−ヘリックスタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、６−ヘリックスのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、置換、または変更によって配列番号：２の配列とは異なる。６−ヘリックスタンパク質は、５−ヘリックスの産生だけでなく膜融合を阻害する薬物のスクリーニングにおけるネガティブ対照としても有用である。
【００１０】
本特許の提出書類には、少なくとも１つのカラー図面が含まれる。このカラー図面を持つ本特許のコピーは、特許商標庁の要求に応じて作成し、必要な料金を支払っている。
【００１１】
発明の詳細な説明
ｇｐ４１分子の外部ドメインの主要部分の高次構造は、ヘアピン三量体構造からなる。中心の「ヘアピン三量体」は、３つの外側のＣ−ヘリックスに囲まれた中心の三本鎖Ｎ−ヘリックスコイルドコイルから構成され、これが６つの全ヘリックスと束を形成する。ヘアピン三量体は、多数のエンベロープ型ウイルスの融合に関連する共通の構造エレメントであり、これにより、膜融合促進におけるこのモチーフの重要な役割が示唆される。ＨＩＶ  ｇｐ４１では、ヘアピン三量体の中心は、中央の三本鎖コイルドコイル（ｇｐ４１分子のＮ末端領域によって形成）に対して逆平行の様式で封入された６つのαヘリックス（３つのｇｐ４１外部ドメインのＣ末端領域によって形成）の束である（Ｍ．Ｌｕ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０、１０３１〜１０４４（１９９５）；Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  ８９、２６３〜２７３（１９９７）；Ｗ．Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７、４２６〜４３０（１９９７）；Ｋ．Ｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１２３０３〜１２３０８（１９９７））。細胞膜に挿入された融合ペプチド領域がｇｐ４１の極度なＮ末端に存在し、Ｃ末端領域がウイルス膜に固着した膜貫通ヘリックスに隣接するので、ヘアピン三量体モチーフは、２つの膜を互いに導くのに役に立つ。これを図１Ａに図示する。Ｎ−ヘリックス（三量体の各サブユニットのうちの１つ）は、Ｃ−ヘリックスが封入された非常に保存された疎水性の溝を形成する。これは、一般に、この６−ヘリックス構造の形成が膜融合を生じるのに必要であることに一致する。
【００１２】
ＨＩＶ−１侵入におけるヘアピン三量体形成の重要性により、ｇｐ４１のＣ末端領域が潜在的な膜融合インヒビター用の標的として役に立つという仮説が設定される。Ｃ−ペプチドは、インビトロでのＩＣ50値が１ｎＭほどの低さでＨＩＶ−１の細胞への侵入を阻害することが示されている（Ｃ．Ｔ．Ｗｉｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、９７７０〜９７７４（１９９４）；Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１５６１３〜１５６１７（１９９８））。この証明により、Ｃ−ペプチドは、Ｎ−ペプチド領域への結合およびヘアピン三量体形成の破壊によってドミナントネガティブ様式で作用することが示唆される。Ｃ末端領域がヘアピン三量体の形成前に（少なくとも一過性に）接近可能である場合、ｇｐ４１のＮ末端のこの領域に結合する薬剤が膜融合を予防すると予想するのが妥当である。この考えと一致して、ｇｐ４１のＮ末端領域由来のペプチド（Ｎ−ペプチドという）は、ＨＩＶ−１膜融合の適切なインヒビターである。Ｎ−ペプチドの阻害機構は決定されていないが、１つにはこれらのペプチドが強力に凝集する傾向があるためである。
【００１３】
出願人は、折りたたまれたＮ−ヘリックス中心および中心ヘアピン三量体の３つのＣ−ヘリックスのうちの２つを含む１つの可溶性分子が非常に安定であり、高親和性の１つのＣ−ペプチドと結合すると判断した。本明細書中に記載のように、ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域がＨＩＶ−１侵入阻害の標的であるという仮説を調べた。本明細書中にも記載のように、評価の結果は、ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合する５−ヘリックスがＨＩＶ−１に対するおよび種々のエンベロープタンパク質のセットを含むＨＩＶ−１変異型に対する強力な阻害活性を示すことを明らかにした。これらの結果は、膜融合（したがって、細胞のＨＩＶ感染）に必要なヘアピン三量体の形成を阻害するための実行可能な標的としてのＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域を指す。
【００１４】
ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合するタンパク質が細胞へのＨＩＶ侵入を阻害することを示す結果が本明細書に記載されている。このようなタンパク質は、ＨＩＶのインヒビターであり、さらなる抗ＨＩＶ薬の開発の基礎として役立つ。これらを、ｇｐ４１外部ドメインのＮ−末端領域を標的とする中和抗体応答を生じさせるのに使用することができる。
【００１５】
５−ヘリックスは、タンパク質と示されている場合、Ｎ−ヘリックスペプチドコイルドコイルの結合性をうまく利用する一方で、Ｎ−ペプチドが凝集する傾向を最小にする。５−ヘリックスの１つの実施形態では、ｇｐ４１ヘアピン三量体構造の中心を構成する６つのヘリックスのうちの５つが、短いペプチドリンカーと連結（結合）している（図１Ａを参照のこと）。この実施形態では、５−ヘリックスは、第３のＣ−ペプチドヘリックスを欠くので、ｇｐ４１のＣ末端領域に対する高親和性の結合部位を得るための隙間が得られる。５−ヘリックスのさらなる実施形態では、３つのＮ−ペプチドヘリックスおよび２つを越える（しかし３つの完全体未満）Ｃ−ペプチドヘリックスが短いペプチドリンカーで連結されている。これらの実施形態では、３つのＮ−ペプチドヘリックス、２つの完全なＣ−ペプチドヘリックス、および第３のＣ−ペプチドヘリックスの一部がペプチドリンカーで連結されている。第３のＣ−ヘリックスの一部は、第３のＣ−ヘリックスの１アミノ酸残基または、このヘリックスの任意のさらなるアミノ酸残基数少ないものであり得るが、このヘリックスの全てのアミノ酸残基を含まない。本発明の５−ヘリックスタンパク質は、生理学的条件下で可溶性である。
【００１６】
個々のＮ−およびＣ−ペプチドによって形成されたヘアピン三量体の中心は、既に非常に安定であり、融解温度は６５℃である。出願人は、６つのヘリックスのうちの５つが共有結合して５−ヘリックスタンパク質を形成する場合、中心の安定性はさらに増加する（安定性は６−ヘリックス中心の安定性よりも高い）ことを示した。生理学的条件下では、５−ヘリックスは折りたたまれており、水溶性で、安定である。これはデザインから予想される値に密接に一致するαヘリックス含有率を有する（図２Ａおよび２Ｂを参照のこと）。親和性相互作用実験では、５−ヘリックスはエピトープタグ化Ｃ−ペプチドと強力且つ特異的に相互作用する（図２Ｃを参照のこと）。混合前後の円偏光二色性の相違によって判断したところ、この相互作用は結合したＣ−ペプチド中にヘリックス高次構造を含む（図２Ｄを参照のこと）。これらの性質は、５−ヘリックスの所期のデザインと一致する。
【００１７】
ウイルス感染性および細胞−細胞融合アッセイで測定したところ、５−ヘリックスはＨＩＶ−１膜融合を強力に阻害する（ナノモルのＩＣ50）（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。それに対して、Ｃ−ペプチド結合部位が結合したＣ−ペプチドで占められた６−ヘリックスと呼ばれる対照タンパク質（すなわち、実施例１に記載のように、ｇｐ４１のヘアピン三量体を構成する６つ全てのヘリックスが１つのポリペプチドに結合している）は、明らかな阻害活性を示さない。（図３Ａおよび図８および９を参照のこと）。同様に、Ｃ−ペプチド結合部位が４つの境界残基（Ｖ５４９、Ｌ５５６、Ｑ５６３、およびＶ５７０）のＡｓｐの変異によって破壊された５−ヘリックス変異型（５−ヘリックス（Ｄ４）と呼ぶ）は、１μＭでも膜融合をブロックしない（実施例３および図３Ａを参照のこと）。これらの結果は、Ｃ−ペプチド結合が５−ヘリックスの抗ウイルス活性の鍵となる決定基であるという結論を支持する。
【００１８】
５−ヘリックスおよびＣ−ペプチドの阻害活性は拮抗性であると予想される：５−ヘリックスがＣ−ペプチドに結合する場合、各インヒビターの抗ウイルス活性を担うと考えられるアミノ酸残基が結合境界に埋没する。実際、５−ヘリックスとＣ３４との混合物〔十分に特徴づけられ、ＩＣ50が約１ｎＭの強力なペプチドインヒビター〕は、用量依存性拮抗性効果を示す（図３Ｂ）。５−ヘリックスの存在下では、Ｃ３４による高力価の阻害は、ペプチドが化学量論的に過剰である場合に認められるだけである（図３Ｂ）。
【００１９】
５−ヘリックスは、類似の力価を有する種々のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（クレードＡ、Ｂ、およびＤ）で偽型化されたウイルスにより感染を阻害する（図３Ｄ）。この広範囲の阻害は、ｇｐ４１ヘアピン三量体構造内のＮ末端領域とＣ末端領域との間の高度に保存された境界に影響を与えるようである（図４）。５−ヘリックスと接触すると予想されるｇｐ４１のＣ−ペプチド領域中の残基は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ中で非常に保存されている（図４）。
【００２０】
強力で、ウイルス侵入の広範なインヒビターである、５−ヘリックスは、ＨＩＶ−１に対する新規のクラスの治療薬の開発の基礎として貢献し得る。典型的には非経口投与を必要とするにもかかわらず、タンパク質ベースの治療薬、例えばインスリン、成長ホルモン、組織プラスミノゲンアクチベーター、顆粒球コロニー刺激因子、およびエリスロポイエチンは実用的であり得る。あるいは、５−ヘリックスは内因的に（遺伝子治療によって）発現して、血流に分泌することができる。５−ヘリックスがＨＩＶ感染細胞中に内因的に発現する場合、ｇｐ１６０の細胞内折り畳みおよび輸送を阻害することができる。５−ヘリックス、５−ヘリックス（Ｄ４）、および６−ヘリックスはまた、小分子の薬物をスクリーニングする目的のための潜在的な試薬である。５−ヘリックスは、より良好な治療特性を有する変異型のデザインにおいて多くの自由度を有している。原理的には、Ｃ−ペプチド結合部位以外の５−ヘリックスを広範に改変してその免疫原性、抗原性、生物学的利用能、または阻害特性を変化させることができる。例えば、ｇｐ４１外部ドメインの異なる領域の標的化によって阻害力価を至適化するために、ｇｐ４１配列中のＣ−ペプチド結合部位を、延長、短縮、または変化させることができる。
【００２１】
５−ヘリックスの結合特性を模倣する中和抗体を産生することが望ましい。５−ヘリックスの広範な中和能力は、おそらくｇｐ４１のＣ−ペプチド領域中の高度に保存された残基との相互作用に由来するようである（図４）。ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域の線状配列が異なるＨＩＶ−１株の間で変化し得るので、不統一なＣ−ペプチド免疫原は中和抗体を広範に惹起しない場合がある。このような不統一なＣ−ペプチドは、長い領域の保存されたアミノ酸残基を有さない。むしろ、保存されたアミノ酸残基および非保存残基が散在している。しかし、Ｃ−ペプチドまたはＣ−ペプチドアナログをヘリックス構造（例えば、５−ヘリックスに結合する場合のＣ−ペプチド領域中）に制限することは、ＡＩＤＳワクチンを開発しようと努力する際に免疫原として有用となり得る。図４は、ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域と５−ヘリックスとの相互作用を示すヘリックスのホイール図である。示されるように、ヘリックスホイール上の全「表面」は、保存または同一のアミノ酸残基で構成されている。また、示されるようにＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域のａおよびｄの位置の保存度が高い。分子の１つの表面上に高度に保存されているアミノ酸残基（図４中のａ、ｄ、およびｅの位置など）が存在するような様式で制限されたｇｐ４１外部ドメインのＣ末端領域由来のペプチドを産生することができる。これらのペプチドを、対応する無制限のペプチド（ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域）中のこれらのアミノ酸残基におそらく結合して５−ヘリックスの結合特性を模倣する抗体を作製するのに免疫原として使用することができる。例えば、Ｃ３８で高度に保存された（同一および／または保存された）アミノ酸残基（図４を参照のこと）のいくつかまたは全てに結合する抗体を産生することができる。５−ヘリックスの結合を模倣するこのような抗体は、実際に５−ヘリックスの活性（結合）の減少または防止により予防薬またはワクチンとして作用する。ＨＩＶ  ｇｐ４１外部ドメインのＣ末端領域由来の制限されたペプチドに対するこのような抗体は、本発明の主題である。
【００２２】
興味深いことに、２Ｆ５のエピトープ（広範な中和活性を有するｇｐ４１に対して指向される公知のヒトモノクローナル抗体のみ）は、５−ヘリックスによって標的化されたＣ−ペプチド領域のＣ末端に隣接して存在する（Ｔ．Ｍｕｓｔｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、６６４２〜６６４７（１９９３）；Ｍ．Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒら、ＡＩＤＳ  、１０、５８７〜５９３（１９９６））。２Ｆ５エピトープの中心（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ；ＨＩＶ  ＨＸＢ２  ｇｐ１６０配列中の残基６６３〜６６６）は、図４を作成するために使用されたＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ単離物の同一のセットで高度に保存されている（８１％同一）。しかし、２Ｆ５中和に対するいくつかのＨＩＶ−１エスケープ変異型は、エピトープ配列における変異を含んでおらず、これにより２Ｆ５による阻害がさらなる決定基の認識に関与し得ることが示唆される。２Ｆ５結合エピトープの高次構造は未知なままであるが、この配列を含むｇｐ４１のフラグメントで惹起される抗体は、有意なウイルス中和活性をもたない（Ｔ．Ｍｕｓｔｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８、４０３１〜４０３４（１９９４）；Ｌ．Ｅｃｋｈａｒｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７７、２００１〜２００８（１９９６））。２Ｆ５がヘアピン三量体形成の妨害によって感染を阻害するかどうかは不明である。
【００２３】
さらに、５−ヘリックス自体がワクチン候補である。ＨＩＶ−１融合に関連するタンパク質の一時的に暴露した高次構造に対する抗体応答を誘発する可能性が示唆されている（Ｒ．Ａ．ＬａＣａｓｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３、３５７〜３６２（１９９９））。１つの可能性のある十分に規定された標的は、前ヘアピン中間体に暴露されたＮ末端コイルドコイルである（Ｄ．Ｍ．Ｅｃｋｅｒｔら、Ｃｅｌｌ、９９、１０３〜１１５（１９９９））。５−ヘリックス様中間体を融合工程の間暴露することができ、この場合、５−ヘリックスに対して指向される抗体はウイルスの侵入を阻害することができる。
【００２４】
本明細書中に記載の結果は、ヘアピン三量体の形成を阻害するための実行可能な標的としてＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域を指す。構造およびコンピュータによる方法によって、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、レトロウイルス科などを含む多数の異なるファミリーにおけるウィルスの類似のヘアピン三量体のモチーフを予想する。さらに、これらのいくつかの場合では、ｇｐ４１のＣ−ペプチドのペプチドアナログによるウイルス侵入の阻害が証明されている。したがって、５−ヘリックスデザインアプローチは、ウイルス感染を阻害する広く適用されているストラテジーを提供することができる。
【００２５】
さらに、５−ヘリックスは、凝集性Ｎ−ペプチドでは行うことができない形成されたＣ−ペプチド結合部位を詳細に研究する手段を提供する。この５−ヘリックス分子中の暴露したＣ−ペプチド結合部位は、ｇｐ４１のＮ−ヘリックス中心に結合する分子の同定またはデザインに有用であり、さらに、公知の方法を使用してＨＩＶ膜とヒト細胞などの哺乳動物細胞の膜との融合を阻害して細胞感染を阻害（減少または予防）する能力を評価することができる。さらに、５−ヘリックスを、ｇｐ４１のＣ−ヘリックス領域に結合してその作用を阻害する能力について評価することができる。ｇｐ４１のＮ−ヘリックス中心は高度に保存されている（アミノ酸組成に関して）ので、５−ヘリックスおよびその変異型は種々のＨＩＶ臨床株を広範に中和するようであり、これにより治療に有用である。
【００２６】
公知の構造のｇｐ４１外部ドメインに基づく５−ヘリックスタンパク質は、１つの実施形態では、共有結合した３つのＮ−ペプチドおよび２つのＣ−ペプチドからなり、Ｃ−ペプチドで占められる3 つのＣ−ヘリックス結合部位のうちの２つを有するＮ−ヘリックス中心の実質的な部分に折りたたむように配置されている。Ｎ−ペプチドの残りのＣ−ペプチド結合部位は暴露している。この部位は、４０アミノ酸長のエピトープを暴露している。さらに、Ｎ−ペプチド中心が外側の２つのＣ−ペプチドによって固定されているので、この部位の骨格原子は構造化された高次構造中に強固に保持されていると予想される。
【００２７】
アミノ酸の一文字表記により、５−ヘリックスの１つの実施形態のアミノ酸配列を以下に示す：
0004925540.tif 000002
（配列番号：１）
【００２８】
アミノ酸の一文字表記により、６−ヘリックスのアミノ酸配列を以下に示す：
0004925540.tif 000003
（配列番号：２）
【００２９】
５−ヘリックスタンパク質を、種々の方法で作製することができる。例えば、実施例１に記載のように、酵素（トリプシン）消化によってより大きなタンパク質（６−ヘリックスなど）から作製することができる。あるいは、公知の方法および発現系を使用して、全５−ヘリックスタンパク質をコードする１つのＤＮＡまたは２つもしくはそれ以上のＤＮＡ「単位」（それぞれＮ−ヘリックスタンパク質の一部（例えば、１つまたは複数のＮ−ヘリックス、１つまたは複数のＣ−ヘリックス）をコードする）であり得る５−ヘリックスタンパク質コードＤＮＡの発現によって作製することができる。大腸菌などの適切な宿主細胞における５−ヘリックス遺伝子の直接発現によって５−ヘリックスの発現率および精製率を有意に改善することができる。このアプローチでは、５−ヘリックス遺伝子は、最終的な５−ヘリックスタンパク質中に存在する残基をコードする。Ｃ−末端Ｈｉｓタグを結合して精製を容易にすることができる（その後タグを除去するプロテアーゼ開裂部位を有するまたは有しない）。次いで、６−ヘリックスから出発する５−ヘリックスの作製に必要なタンパク質分解を生ずる開裂工程および折りたたみ工程を用いないで直接タンパク質を使用することができる。この５−ヘリックス分子を、折りたたまれた活性分子として発現させることができ、これにより生物学的選択またはスクリーニングで使用してその性質を至適化することができる。あるいは、タンパク質合成法を使用して、５−ヘリックスタンパク質を作製することができる。５−ヘリックスの５つのヘリックスを、（少なくとも１つ（１つまたは複数）のアミノ酸残基のリンカー手段または他の手段などによって）共有結合させて、生理学的条件下で安定で、５−ヘリックスの残りの表面がＣ３４ペプチドの結合に利用可能なように存在するように正確に折りたたまれたタンパク質を形成することができる。３つのＮ−ヘリックスおよび２つを超える（しかし、３つの完全体未満）のＣ−ヘリックスが存在する実施形態では、ヘリックスを同様に結合することができる。
【００３０】
５−ヘリックスは、Ｎ−およびＣ−ヘリックス領域の両方ならびにリンカー成分に広範な種々の配列を有することができ、これは、Ｌ−アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸残基、またはＬ−およびＤ−アミノ酸残基の組み合わせで構成可能である。アミノ酸残基を改変することができる。５−ヘリックスは、ヘリックスおよびリンカーの残基に加えてアミノ酸残基を含み得る（例えば、分子の安定化のため）。本明細書中に記載の５−ヘリックスを安定性および活性を向上させるように変化させることができるようである。Ｎ−およびＣ−ヘリックスに連結させるループのデザイン（長さおよび組成の両方）の小さな変化およびＮ−およびＣ−ヘリックスの正確な境界は、５−ヘリックスの安定性、収量、および活性に有意な効果を有するようである。
【００３１】
現在構築されているものと同様に、５−ヘリックスは、Ｎ−ヘリックス中心に沿って４０個のアミノ酸が取り囲んでいるＣ−ペプチド結合部位を暴露している。５−ヘリックス（あるいは関連分子）上のＣ−ペプチド結合部位のより短いセグメントを暴露するストラテジーには、より長い暴露したエピトープへの短いＣ−ペプチド配列を結合することを含む。この型の分子は、Ｎ−ヘリックス中心に沿ったより短いエピトープに対して特異的に標的化された薬物の開発の一助となり得る。例えば、１つのポケット領域（ＩＱＮ１７に見られるものと類似；Ｄ．Ｍ．Ｅｃｋｅｒｔら、Ｃｅｌｌ、９９、１０３〜１１５（１９９９））を、そこ（Ｃ３４の最初の約１０残基程度）に結合する残基を欠くＣ−ペプチドに結合することによって５−ヘリックス中に暴露されうる。これらの短いＣ−ペプチド配列は、共有結合の架橋または暴露したエピトープの一部を被覆するために５−ヘリックス配列を単に伸長することを含む種々の手段によって５−ヘリックスに結合することができる。
【００３２】
５−ヘリックスは種々の状況で有用である。本明細書中に記載のように、５−ヘリックスは、ウイルス膜融合の強力なインヒビターであるので、ウイルスがＨＩＶ感染細胞に作用する細胞に侵入する前に（現在の実用的治療とは異なる）ウイルスに作用する。５−ヘリックスは可溶性であり、本明細書中に記載の条件下で安定であることが認められた。腎臓でのクリアランス速度を減少させるために分子量を増加させた５−ヘリックス変異型を作製する（オリゴマー形成または巨大タンパク質を結束することによる）ことも可能なはずである。さらに、５−ヘリックス二量体をジスルフィド架橋によって作製して、５−ヘリックス「単量体」よりも小さな範囲に濾過した分子を作製することができる。したがって、Ｃ−ペプチドのものと比較した場合、二量体は生物学的利用能が向上していると予想するのが妥当である。
【００３３】
５−ヘリックスは、ウイルス侵入後のウイルスタンパク質を標的とする標準的な治療と異なり、ウイルスの細胞への侵入を防止するので、５−ヘリックスを予防的に使用して感染を予防するか感染を生じる範囲を減少させることができる。このような治療の１つの用途は、病院などで起こり得るニードルスティックによる損傷またはＨＩＶで汚染した針を共有する状況である。例えば、細胞へのＨＩＶ侵入を予防または減少させるために針を刺し且つＨＩＶに感染しているか感染しているかもしれない個体に十分量の５−ヘリックス（治療有効量）を１回または複数回で投与することができる。５−ヘリックスを、例えば、静脈内注射または筋肉内注射によって投与することができる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態では、５−ヘリックスを使用して、個体のＨＩＶ感染を減少させる。この実施形態では、個体の細胞のＨＩＶ感染を（全体的または部分的に）減少させるのに十分な量で、５−ヘリックス自体または適切な宿主細胞またはベクターでの５−ヘリックスコードＤＮＡの発現を介してのいずれかによって５−ヘリックスを個体に投与する。すなわち、ＨＩＶ感染を減少するのに十分な用量（有効用量）の５−ヘリックスを、細胞へのＨＩＶ侵入を（全体的または部分的に）阻害する様式（例えば、注射、局所投与、静脈内経路）で投与する。１つの実施形態では、個体への５−ヘリックスタンパク質を発現する細胞の導入により遺伝子治療アプローチを使用して有効用量を得る。５−ヘリックスを、さらなる感染を減少させるためにＨＩＶ感染した個体に投与するか、感染を予防するか感染が生じる範囲を減少させるために感染していない個体に投与することができる。
【００３５】
適切な担体（例えば、生理学的に許容されうる緩衝液）中に５−ヘリックスを含む医薬組成物は、本発明の主題である。医薬組成物は、予防および治療目的に有用であり、種々の経路（例えば、注射、局所投与、静脈内経路）を介して投与することができる。
【００３６】
５−ヘリックスは、１つのインタクトなＣ−ヘリックス結合部位を示すので、膜融合を阻害する薬物のスクリーニングに有用である。５−ヘリックスは、ＩＱＮ１７が暴露するよりもより大きく且つ強固な潜在的薬物のスクリーニング標的を暴露している。この分子６−ヘリックスおよび５−ヘリックス（Ｄ４）は、これらの研究における有用なネガティブ対照である。
【００３７】
５−ヘリックス暴露エピトープを、抗体（特に、公知の方法を使用した中和抗体）産生用の抗原として使用することができる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。
【００３８】
５−ヘリックスの血清安定性を、その治療可能性を確認するために公知の方法を用いて試験することができる。５−ヘリックスが分解している場合、最も有望な攻撃／分解部位は、グリシン／セリンリンカー領域である。この場合、異なるリンカー領域を分解して試験することができる（以下を参照のこと）。これらの抗５−ヘリックスの血清および腹水の阻害能力を、標準的な融合アッセイを使用して試験することができる。
【００３９】
５−ヘリックスの外側の表面は例えば、生物学的利用能を向上させ、毒性を減少させ、免疫クリアランスを回避するために変化させることができる。５−ヘリックスは強力な阻害活性を示すが６−ヘリックスの束は示さないので、これは阻害を担うポケット領域を含む暴露した溝である。残りの分子は、単に暴露した溝を表示するための足場を提供している。したがって、この足場を、５−ヘリックスの阻害活性に有害な影響を与えること無く改変することができる。足場の改変により、いくつかの利点を得ることができる。第１に、５−ヘリックスの複数回投与が必要な手順を容易にする。例えば、抗ＨＩＶ治療薬として５−ヘリックスを使用する場合、複数回投与が必要であり得る。投与の延長後、個体は身体からのそのクリアランスを増大させると考えられる５−ヘリックスに対する抗体を産生し得る。複数のバージョンの５−ヘリックスの有用性は、既存の抗体を避けることにより、この問題を回避することを助ける。第２に、例えば、足場があまり免疫原性を示さない外側の表面上のグリコシル化部位の導入によって５−ヘリックスのバージョンを設計可能であり得る。ワクチン研究用に、この改変は、足場とは対照的に暴露した溝に免疫応答を偏向させる一助となる。
【００４０】
ｇｐ４１のＣ−ヘリックス領域の結合によりＨＩＶ感染が防止されるという所見により、ＨＩＶワクチンを構築するためのストラテジーが示唆される。Ｃ−ペプチドによるＨＩＶ阻害アナログである５−ヘリックスは、前ヘアピン中間体と呼ばれるｇｐ４１の融合中間体への結合によってｇｐ４１を阻害するようである。Ｃ−ペプチドインヒビターはこの中間体のＮ−ペプチド領域に結合することによって機能する一方で、５−ヘリックスはＣ−ペプチド領域に結合することによって機能するようである。これらの検討材料により、ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域がＨＩＶ侵入インヒビター開発用の良好な薬物標的であることが強く示唆される。さらに、中和抗体を惹起させるための免疫原としてＣ−ペプチドベースの構築物を使用することが可能である。５−ヘリックスの場合、阻害の標的は、Ｃ−ペプチド領域のヘリックス高次構造であるが、Ｃ−ペプチド領域の他の高次構造を標的する試薬もまた阻害活性を示し得る。
【００４１】
最近のワクチン研究（Ｒ．Ａ．ＬａＣａｓｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３、３５７〜３６２（１９９９））は、エンベロープ媒介融合過程の中間体が中和抗体を強く惹起することができることを示唆している。このような融合中間体に対する抗体は、エンベロープタンパク質の保存領域を標的化し、それゆえ、広範な範囲のウイルス株を中和するようである。Ｃ−ペプチド領域に対する抗体は、高度に保存され且つ融合過程に重要な領域を標的化する。
【００４２】
ヘアピン三量体は、多数のウイルス膜融合タンパク質の共通の特徴である。これは、インフルエンザ、エボラ、ＳＶ５（シミアンパラインフルエンザウイルス５）、およびＲＳＶ（ヒト呼吸器合胞体ウイルス）の結晶構造で認められている。さらに、レトロウイルス、パラミクソウイルス、およびフィロウイルスファミリーの多数の他のメンバーが、このモチーフを含むと予想されている。関連する脊椎動物小胞融合タンパク質に類似の構造が認められている。本明細書中に記載の基本的ストラテジーを、融合を阻害するためにこれらの任意の系に適用することができる。本発明の１つの主題は、ウイルスとウイルスエンベロープタンパク質（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質のＣ−ペプチド領域）に結合してエンベロープ化(enveloped) タンパク質のヘパリン三量体形成を阻害する薬物との接触によるエンベロープを有するウイルス（ウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルス）のヘアピン三量体の形成阻害方法である。
【００４３】
本発明を、以下の実施例によって例示するが、これらは決して本発明の制限を意図しない。
【００４４】
実施例１：５−ヘリックスの産生
５−ヘリックスのデザインは、Ｎ３６／Ｃ３４  ６−ヘリックス束状構造に基づいた（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ、８９、２６３〜２７３、１９９７）。５−ヘリックスのために、各ペプチド領域をそのＮ末端上の３つの残基およびそのＣ末端上の１つの残基によって伸長し（Ｎ３６およびＣ３４と比較）、最終的なＮ４０およびＣ３８セグメントを作製した（それぞれＨＩＶ−１  ＨＸＢ２  ｇｐ１６０の代表的な残基５４３〜５８２および６２５〜６６２）。Ｎ４０の後ろに−ＧＧＳＧＧ−リンカー、Ｃ３８の後ろに−ＧＳＳＧＧ−リンカーを使用して３つのＮ４０および２つのＣ３８セグメントを連結させた。全ての構築物は、翻訳開始用のＮ末端Ｍｅｔを含む。Ｃ末端のみが異なる以下の２つの異なる５−ヘリックスタンパク質をこの研究のために作製した：（ｉ）−ＧＧ（Ｈ）６で終わるＨｉｓタグ化５−ヘリックスおよび（ｉｉ）−ＧＧＲで終わる非タグ化５−ヘリックス。さらに、トリプシン切断リンカー（−ＧＧＲ−）によって５−ヘリックス骨格をＨｉｓタグ化Ｃ−ペプチド（Ｃ３７−Ｈ６）（実施例４を参照のこと）に連結した６−ヘリックスと呼ばれる第３の構築物を作製した（図１０および１１Ａ〜１１Ｃを参照のこと）。
【００４５】
全てのＤＮＡ構築物を、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ株、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｐＡＥＤ４ベクター［Ｄ．Ｓ．Ｄｏｅｒｉｎｇ、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、１２６７７〜１２６８５、１９９６］に連続的にクローン化したＰＣＲカセットから構築した。全てのタンパク質を、ＩＰＴＧ（０．４Ｍ）で３時間誘導する前に２×ＹＴ中で０．５〜０．７のＯＤ（５９０ｎｍ）まで増殖させた大腸菌ＲＰ３０９８株で組換え発現させた。細菌ペレットを、完全無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビタータブレット（Ｒｏｃｈｅ）を補足したＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ｂｏｏｋｌｅｔ、１９９９年３月、Ｑｉａｇｅｎ）に再懸濁し、その後精製する日まで−２０℃で凍結した。解凍した再懸濁物を溶解し（超音波処理またはフレンチプレス）、遠心分離して（３５，０００×ｇで３０分間）、封入体から可溶性画分を分離した。
【００４６】
Ｈｉｓタグ化５−ヘリックス（プラスミドｐ−５ＨｅｌｉｘＨ６から作製）を、８Ｍ尿素のＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ）および１０ｍＭイミダゾール溶液に再懸濁した封入体から直接精製した。混合物を遠心分離（３５，０００×ｇで３０分間）によって明澄化後、室温でＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）カラムに結合させた。４０ｍｌ（約５カラム体積）の６Ｍ尿素／ＴＢＳ／１００ｍＭイミダゾール溶液でタンパク質を溶出した。室温での１リットルの２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）撹拌溶液の滴下によってタンパク質の再折り畳みを行った。次いで、再折りたたみタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムの通過によって再濃縮し、２０ｍｌ（約２カラム体積）の１００ｍＭイミダゾールのＴＢＳ溶液で溶出した。
【００４７】
非タグ化５−ヘリックスを６−ヘリックスのタンパク質分解によって産生し（以下を参照のこと）、５−ヘリックス／Ｃ３７−Ｈ６複合体を作製した。トリプシン消化後（ＴＢＳ中に１：２００の重量比、室温で１時間、Ｓｉｇｍａ）、５−ヘリックス／Ｃ３７−Ｈ６複合体をＮｉ−ＮＴＡアガロースに結合させ、大規模に洗浄して過剰なトリプシンを除去した。ビーズを８ＭのＧｕＨＣｌ／ＴＢＳ中に再懸濁し、加熱（７０℃）して複合体を変性させた。変性５−ヘリックスを含む非結合画分を、８Ｍ尿素／２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）（室温で４時間）および４Ｍ尿素／２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）（４℃で一晩）で連続的に透析した。タンパク質をＤＥＡＥカラム（Ｆａｓｔｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、室温で４時間２０カラム体積で逆尿素勾配（４Ｍ〜０Ｍ尿素の２０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ８．０））で運転した。ＮａＣｌ勾配（０〜３００ｍＭ）の２０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ８．０）（１０カラム体積）を使用してタンパク質をＤＥＡＥ樹脂から溶出した。６−ヘリックス（プラスミドｐ−６へリックスから作製）を、細菌溶解物の可溶性画分から直接精製した。溶液をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムに通し、１０カラム体積のイミダゾール勾配（１０〜２５０ｍＭ）のＴＢＳ溶液で溶出した。
【００４８】
すべてのタンパク質について、ＴＢＳ中でのゲル濾過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００ＨＲまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５）によって凝集物から単量体を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断したところタンパク質は９５％を超える純度であり、少なくとも３ｍｇ／ｍｌに濃縮することができる。すべてのペプチドおよびタンパク質の濃度を、６ＭＧｕＨＣｌ中での２８０ｎｍでの吸光度によって同定した［Ｈ．Ｅｄｉｌｈｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６、１９４８〜１９５４、（１９６７）。］
【００４９】
実施例２：５−ヘリックス／Ｃ−ペプチド相互作用の特異性および膜融合の５−ヘリックスによる阻害の評価
５−ヘリックス／Ｃ−ペプチド相互作用の特異性を、Ｈｉｓタグ化Ｃ−ペプチド（大腸菌中で独立して発現し、逆相ＨＰＬＣで精製したＣ３７−Ｈ６）およびＮｉ−アガロース沈殿を使用して試験した。３０μＭのＣ３７−Ｈ６を含むＴＢＳ中で、Ｎｉ−アガロースによって１６μＭの５−ヘリックスが完全に沈殿する。１５０μＭのＣ３４（Ｈｉｓタグを含まない、化学合成し、ＨＰＬＣで精製）の添加により、５−ヘリックスの沈殿量が実質的に減少する。Ｃ３７−Ｈ６とＣ３４との有効な競争は、５−ヘリックスが特異的様式でＣ−ペプチドに結合することを示す。ＣＤ実験および競合結合アッセイにより、５−ヘリックスが予想された高次構造に折りたたまれていることが示唆される。すなわち、これらの結果は、５−ヘリックスが暴露したＣ−ペプチド結合部位を含むという予想を支持するものである。
【００５０】
５−ヘリックスがｇｐ４１のＣ領域と相互作用して融合タンパク質の融合を阻害する能力を評価するアッセイを行った。５−ヘリックスおよび６−ヘリックスによるこの膜融合の阻害を、細胞ベースアッセイを使用して評価した。タンパク質５−ヘリックスおよび６−ヘリックスを、５％ＦＣＳを含む改変ＤＭＥＭ培地で連続希釈し、スライドチャンバーに等分した。Ｔａｔプロモーターの調節下でＣＤ４および補助受容体を発現し、βガラクトシダーゼ遺伝子を含むＨＥＬＡ細胞（４×１０4 ）を添加する。ｇｐ１６０（ｇｐ１２０／ｇｐ４１の前駆体タンパク質）およびＴａｔを発現するＣＨＯ細胞（２×１０4 ）も添加する。４００μｌのミニ培地を３７℃で８〜２４時間インキュベートし、融合細胞（シンシチウム）はβガラクトシダーゼを転写および翻訳する。グルタルアルデヒド中に細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌ／Ｆｅ溶液に１時間暴露する。βガラクトシダーゼを含むシンシチウムは、青緑色に変色する。このアッセイでは、５−ヘリックスは、シンシチウム形成の強力な阻害を示している（ＩＣ50は１０〜２０ｎＭ；あるアッセイでは１３ｎＭのＩＣ50であった）。６−ヘリックスは１μＭの濃度でさえ感知できるほどには融合を妨害しない。
【００５１】
阻害剤としての５−ヘリックス暴露エピトープの特異性を評価し、汚染物質を除外するために、Ｃ−ペプチドとの混合実験を行った。濃度２００ｎＭの５−ヘリックスを、１００、１６６、１９０、および２１０ｎＭのＣ３４と混合する。使用濃度では、遊離の５−ヘリックスおよび遊離のＣ３４は、ミニ培養物中のほとんど全てのシンシチウムを阻害するはずである。Ｃ３４が５−ヘリックスに対して過剰にある（すなわち、２１０ｎＭ）５−ヘリックス／Ｃ３４混合物ではシンシチウム形成は妨害されるが、Ｃ３４濃度が５−ヘリックス濃度より低い５−ヘリックス／Ｃ３４混合物におけるシンシチウム形成は部分的に妨害されない（図３Ｂ）。それに対して、６−ヘリックスの存在下ではＣ３４は全てのシンシチウム形成をブロックする。
【００５２】
５−ヘリックスおよび６−ヘリックスの阻害可能性を、ウイルス融合実験で再現した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むように改変したＨＩＶを、希釈タンパク質の存在下、３７℃で６時間ＣＤ３４および補助受容体を発現するヒト骨肉種（ＨＯＳ）細胞と混合する。ウイルス溶液を交換し、ＨＯＳ培養物を新鮮な培地中で４８時間以上インキュベートする。ルシフェラーゼ活性はルミノメーターで測定する。このアッセイでは、５−ヘリックスは１０ｎＭ未満のＩＣ50でルシフェラーゼ活性を阻害する。また、６−ヘリックスは、１μＭまで感知できるほどの妨害を示さない（図３Ａおよび３Ｃ）。
【００５３】
実施例３：５−ヘリックス（Ｄ４）のデザインおよび評価
５−ヘリックス（Ｄ４）では、Ｈｉｓタグ化５−ヘリックスのＣ−ペプチド結合部位中の４つの非常に保存された残基（Ｖａｌ５４９、Ｌｅｕ５５６、Ｇｌｎ５６３、およびＶａｌ５７０）を、最後の（第３の）Ｎ４０セグメント中でＡｓｐに変異させた。構築物［ｐ−５Ｈｅｌｉｘ（Ｄ４）］を組換え発現し、Ｈｉｓタグ化５−ヘリックスと同一の様式で精製した。Ｈｉｓタグ化５−ヘリックスおよび５−ヘリックス（Ｄ４）タンパク質は、同一の楕円率を有し：（共に、４℃のＴＢＳ中で［θ］222 ＝−２８，１００±１５００ｄｅｇ  ｃｍ2   ｄｍｏｌ-1（約１００％の推定ヘリックス含有率））、両タンパク質は、ＴＢＳ中での熱変性（９８℃を超えるＴｍ）および２５℃でのＧｕＨＣｌ化学変性（Ｃｍ値は５−ヘリックス（Ｄ４）で約６Ｍ、Ｈｉｓタグ化５−ヘリックスで約７．２Ｍ）に対して非常に安定である。５−ヘリックス（Ｄ４）の安定性がわずかに減少したのは、この状況で５−ヘリックス表面上の大部分が疎水性の溝（groove）の中に存在するＡｓｐ残基のヘリックス傾向の低さおよび電荷に影響を反映しているようである。
【００５４】
実施例４：Ｈｉｓタグ化Ｃ−ペプチドＣ３７−Ｈ６
ペプチドＣ３７−Ｈ６は、以下の配列のＨｉｓタグ化Ｃペプチドである：
ＧＧＨＴＴＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号５）。このペプチドはＨＩＶ−１  ＨＸＢ２残基６２５〜６６１（下線）に由来し、全Ｃ３４配列（Ｗ６２８〜Ｌ６６１）を含む。Ｃ３７−Ｈ６を−ＧＧＲ−リンカーでＣ３７−Ｈ６に結合された１つのＮ４０セグメントからなる組換え発現構築物ｐ４−ＮＣ１．１のトリプシン消化から作製する。発現後、ＮＣ１．１を、６−ヘリックスと同一の様式で細菌溶解物の可溶性画分から精製する。トリプシン消化（非タグ化５−ヘリックスと同一の条件）によりＣ３７−Ｈ６が得られ、次いで、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８カラムおよび直線勾配の、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液を使用した逆相ＨＰＬＣによって均一に精製する。Ｃ３７−Ｈ６の同一性を、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）によって確認した。Ｃ３４と同様に、Ｃ３７−Ｈ６は、ＨＩＶ−１膜融合の強力なインヒビターである（細胞−細胞融合アッセイにおいてＩＣ50は約１ｎＭ）。
【００５５】
図２Ａ〜２Ｄのデータを、５−ヘリックスの非タグ化変形形態を使用して作製したが、Ｈｉｓタグ化変形形態と類似の結果が得られた（実施例３を参照のこと）。特記しない限り、ＴＢＳ緩衝液中でＣＤ（Ａｖｉｖ６２ＤＳ）実験を行った。図２Ｂでは、タンパク質濃度は、ＴＢＳサンプルについては１ｍＭであり、ＧｕＨＣｌ／ＴＢＳサンプルについては０．５４ｍＭであった。図２Ｄでは、１ｍｌチャンバー（４．３７５ｍｍ／チャンバー光路長）を有する石英混合セル（Ｈｅｌｍａ）を使用した。混合前の２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）／２５０ｍＭのＮａＣｌ中のポリペプチド濃度は５．９ｍＭの（５−ヘリックス）および６ｍＭの（Ｃ３７−Ｈ６）であった。
【００５６】
１６ｍＭ非タグ化５−ヘリックス、３０ｍＭのＨｉｓタグ化Ｃ３７−Ｈ６、および／または１５０ｍＭのＣ３４を含む２０ｍｌのＴＢＳ中で５−ヘリックス沈殿実験（図２Ｃ）を行った。Ｎｉ−ＮＴＡに溶液を添加し、室温で１０分間インキュベートした。非結合上清を除去後、１ｍｌのＴＢＳでビーズを２回洗浄し、５００ｍＭのイミダゾールで溶出した。Ｎｉ結合および非結合サンプルを、１６．５％Ｔｒｉｓ−トリシンポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上で泳動し、Ｇｅｌ−ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。
【００５７】
実施例５：Ｈｉｓタグ化５−ヘリックス
図３Ａ〜３Ｃの全てのデータを、Ｈｉｓタグ化５−ヘリックスを使用して作製した（実施例１を参照のこと）。細胞−細胞融合アッセイ（図３Ｂ）を記載のように行った（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５、１５６１３〜１５６１７、１９９８）。以前に詳述されたアッセイ（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１５６１３〜１５６１７、１９９８）を少し改変した組換えルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してウイルス感染阻害を研究した。簡単に述べれば、エンベロープ欠失ＨＩＶ−１ゲノムＮＬ４３ＬｕｃＲ- Ｅ- ［Ｂ．Ｋ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．、６８、６５４〜６６０、１９９４］および以下の４つのｇｐ１６０発現ベクターのうちの１つ：ｐＣＭＶ−ＨＸＢ２（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１５６１３〜１５６１７、１９９８）、ｐＥＢＢ−ＪＲＦＬ（Ｂ．Ｋ．Ｃｈｅｎから提供）、ｐＳＶＩＩＩ−ＵＧ０２４．２、およびｐＳＶＩＩＩ−ＲＷ０２０．５で共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から偽型ウイルスを作製した。プラスミドｐＳＶＩＩＩ−ＵＧ０２４．２およびｐＳＶＩＩＩ−ＲＷ０２０．５を、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム（Ｆ．Ｇａｏ、Ｂ．Ｈａｈｎ、およびＤＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ）から獲得し、これは初代ＨＩＶ−１単離物由来のエンベロープタンパク質をコードする。ウイルスを含む上清を以前に記載のように調製し（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５、１５６１３〜１５６１７、１９９８）、これを使用してＨＯＳ−ＣＤ４細胞（ＨＸＢ２およびＵＧ０２４．２）またはＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞（ＪＲＦＬおよびＲＷ０２０．５）のいずれかを感染させた。ＨＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム（Ｎ．Ｌａｎｄａｕ）から細胞を得た。図３Ａでは、標準的な２４ウェル形式でウイルス感染性アッセイを行った（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５、１５６１３〜１５６１７、１９９８）。図３Ｃのデータを、以下の９６ウェル形式で行ったアッセイから得た：ウイルス含有上清（１０ｍｌ）および培地（９０ｍｌ）を５０％の密集度のＨＯＳ細胞上に被せた。３７℃で２日間のインキュベーション後、１００ｍｌの溶解緩衝液（ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ）中に細胞を回収し、製造者のプロトコールに従ってその１０ｍｌを分析した。ラングミュア関数［標準化ルシフェラーゼ活性＝１／（１＋［５−ヘリックス］／ＩＣ50）］への５−ヘリックス滴定データの適合によってＩＣ50値を計算した。
【００５８】
本発明を、特に好ましい実施形態を参照して表示および記載しているが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を逸脱することなく形態および詳細の種々の変更を行うことができることが当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａおよび図１Ｂは、ＨＩＶ−１膜融合の標的化を示す。図１Ａは、ｇｐ４１ヘアピン三量体の形成を促進する事象を示すＨＩＶ−１膜融合の略図である。天然の状態では接近不可能なｇｐ４１（赤）のＮ末端融合ペプチドを、ＣＤ４および補助受容体とのｇｐ１２０の相互作用後に標的細胞膜に挿入する（示さず）。前ヘアピン中間体の構造は、Ｎ末端コイルドコイル（灰色）（Ｃ−ペプチド阻害の標的）が暴露している。この一過性構造がヘアピン三量体状態に崩壊して、膜が融合して密接に並行に配置される。図１Ｂは、５−ヘリックス構築物のデザインを示す。リボン図（上）は、ヘアピン三量体の中心構造（左およびＤ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  ８９、２６３〜２７３（１９９７））および５−ヘリックスモデル（右）を示す。内側の灰色のヘリックスはＮ３６ペプチドを示し、外側の青色のヘリックスはＣ３４ペプチドを示す。５−ヘリックスモデルでは１つのＣ−ペプチドが取り除かれており、橙色の線を引いてヘリックス間の接続を示す。５−ヘリックスのデザインでは、短いＧｌｙ／Ｓｅｒペプチド配列（図の下の灰色のバー）によってＮ４０およびＣ３８配列（一文字アミノ酸記号で示す）が交互に結合している（実施例１を参照のこと）。
【図２】  図２Ａ〜図２Ｄは、５−ヘリックスの性質を示す。図２Ａは、２５℃での５−ヘリックス（１０μＭ）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルである。このスペクトルは、５−ヘリックスタンパク質がデザインから予想される９５％を超えるヘリックス含有率を使用していることを示している。図２Ｂは、ＴＢＳ（黒四角）および３．７Ｍグアニジン（Ｇｕ）ＨＣｌ／ＴＢＳ（白四角）における２２２ｎｍでの楕円率によってモニターした５−ヘリックスの熱変性のグラフである。ＧｕＨＣｌ溶液で認められた変性は、９０％を超えて可逆性である。図２Ｃは、Ｈｉｓタグ化Ｃ−ペプチドでの５−ヘリックスのニッケル（Ｎｉ）−ＮＴＡ沈殿の結果を示す。非タグ化５−ヘリックスおよびＨｉｓタグ化Ｃ−ペプチド（Ｃ３７−Ｈ６と示す）をＮｉ−ＴＮＡアガロースを添加する前に混合し、Ｃ３７−Ｈ６を含む複合体を沈殿させた（レーン１および５ならびに実施例４）。過剰な非タグ化Ｃ−ペプチド（Ｃ３４）の添加により、５−ヘリックス分子が結合画分から非結合画分に変化する（レーン２および６）。図２Ｄは、混合キュベットでの混合前（黒四角）および混合後（白丸）の５−ヘリックスおよびＣ３７−Ｈ６のＣＤスペクトルである。混合による２２２ｎｍでの楕円率の増加は、全体のヘリックス含有率が増加する（会合したＣ−ペプチドあたりのさらなる２８ヘリックス残基に対応する）２種間の相互作用を示す。
【図３】  図３Ａ〜図３Ｃは、実施例２に記載のＨＩＶ−１エンベロープ媒介膜融合の５−ヘリックス阻害の評価結果を示す。図３Ａは、実施例３および５に記載の５−ヘリックス（黒四角）、６−ヘリックス（白三角）、および５−ヘリックス（Ｄ４）（白丸）によるウイルス感染性の滴定評価の結果を示す。データを、２つまたはそれ以上の個別の実験の平均±ＳＥＭで示す。図３Ｂは、５−ヘリックスおよびＣ３４の拮抗阻害活性のグラフである。シンシチウム数を、表示濃度の５−ヘリックス、Ｃ３４、もしくは５−ヘリックスとＣ３４との混合物の存在下または不在下で行った細胞−細胞融合アッセイで測定した。このアッセイでの５−ヘリックスおよびＣ３４のＩＣ50値は、それぞれ１３±３ｎＭおよび０．５５±０．０３ｎＭである（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、１５６１３〜１５６１７（１９９８））。データは、対照以外の二連の測定の平均および平均の範囲を示している（５つの測定値の平均±ＳＥＭ）。図３Ｃは、異なるＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を含む偽型ウイルスの５−ヘリックス阻害の評価結果を示す。報告したＩＣ50値は、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭで示す。
【図４】  図４は、５−ヘリックスとｇｐ４１のＣ−ペプチド領域との相互作用を示すヘリックスのホイール図である。各ヘリックス中のａ〜ｇの位置は、各配列中の４，３−疎水性の７残基反復中の連続した位置を示す。ｇｐ４１  Ｃ−ペプチド中のａおよびｄの位置は、５−ヘリックスのＮ４０コイルドコイル上に暴露したｅおよびｇの位置と相互作用する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ単離物由来の２４７配列（ＨＩＶ−１配列データベース、２０００年８月、ロスアラモス国立研究所）のアラインメントから決定した保存の程度にしたがって残基を囲む：黒四角（＞９０％同一）、灰色の四角（＞９０％保存的置換）、点線の四角（７０〜９０％保存）、囲み無し（＜７０％保存）。図４の作成において、以下のアミノ酸残基群内の置換を保存的置換とみなした：  ［Ａｓｐ、Ｇｌｕ］、［Ｌｙｓ、Ａｒｇ］、［Ａｓｎ、Ｇｌｎ］、［Ｐｈｅ、Ｔｙｒ］、［Ｓｅｒ、Ｔｈｒ］、および［Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ］。ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域のａおよびｄの位置での高い保存度、Ｃ−ペプチド領域の他の位置（特にｃおよびｇ）で著名に欠如している特性は、５−ヘリックスの結合に直接関与しないことに留意のこと。
【図５】  図５は、ＨＩＶ  ｇｐ４１の構造の編成である。ヘリックス領域（７残基反復）を灰色で示し、Ｎ−（Ｎ３６）およびＣ−（Ｃ３４、ＤＰ１７８）ペプチドの相対的な位置を示す。ヘリックス領域のリボン図では、Ｎ−ペプチドを淡灰色で示し、Ｃ−ペプチドを濃灰色で示す。
【図６】  図６は、６−ヘリックスおよび５−ヘリックスの配列である。推定ヘリックスセグメントを、配列の積み重ねによって示す。
【図７】  図７は、５−ヘリックスの可能なαヘリックス編成の１つのリボン図である。Ｎ−ヘリックス三量体は淡灰色であり、Ｃ−ヘリックス領域は濃灰色であり、伸長ループ領域は黒色である（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎら、（Ｃｅｌｌ  ８９、２６３〜２７３（１９９７）の構造に基づく）。
【図８】  図８は、細胞−細胞融合アッセイ滴定実験の画像を示す。画像中、シンシチウム（融合細胞を示す）は青色、破片は褐色である。
【図９】  図９は、細胞−細胞融合アッセイ競争実験の画像を示す。漸増量のＣ３４ペプチドと共に２００ｎＭの６−ヘリックスまたは５−ヘリックス中でインキュベートした培養物についてのシンシチウムの量を記録する。
【図１０】  図１０は、５−ヘリックス構築物のデザインを示す図である。この略図は、基本的５−ヘリックス構築物の結合パターンを示す。３つの異なるＣ末端を付加した。６−ヘリックスでは、Ｈｉｓタグ化Ｃ−ペプチドを、５−ヘリックスに結合させて、ヘアピン三量体の完全な６−ヘリックス束を模倣する。Ｎ４０およびＣ３８配列（短いＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを使用して交互に連結した）は、ＨＩＶ  ＨＸＢ２  ｇｐ４１のＮ−およびＣ−ペプチド領域に由来する。（赤色および青色で囲んだ残基は、それぞれＮ３６（配列番号：１１）およびＣ３４（配列番号：１２）のペプチド配列を示す。）
【図１１】  図１１Ａ〜図１１Ｃは、本発明のペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１〜１０）を示す。
【図１】
0004925540.tif 000004
【図２】
0004925540.tif 000005
【図３】
0004925540.tif 000006
【図４】
0004925540.tif 000007
【図５】
0004925540.tif 000008
【図６】
0004925540.tif 000009
【図７】
0004925540.tif 000010
【図８】
0004925540.tif 000011
【図９】
0004925540.tif 000012
【図１０】
0004925540.tif 000013
【図１１】
0004925540.tif 000014
0004925540.tif 000015
0004925540.tif 000016