(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写に基づく増幅方法により二本鎖ＤＮＡを増幅するための方法であって、前記二本鎖ＤＮＡに、
−  前記二本鎖ＤＮＡに含まれる２つのＤＮＡ鎖の第１鎖の一部に相補的な配列を含む少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターの配列をさらに含み、及び
−  前記二本鎖ＤＮＡに含まれる第２鎖の一部に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドの存在下で加熱及び冷却することで、前記第１の鎖の一部に相補的な配列を含む少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、
−  ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
−  ＲＮアーゼＨ活性を有する酵素、
−  ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
と接触させる工程、および
このようにして得られた反応混合物を、酵素添加後は加熱処理することなく、転写に基づく増幅反応が起こるのに十分な時間、適切な等温条件のもとで維持する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、前記オリゴヌクレオチドの存在下で一回加熱され、その後に増幅用酵素が加えられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆転写酵素が使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーター配列がＴ７プロモーター配列であり、そして使用されるＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらにＲＮアーゼＨ酵素が使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮアーゼＨが大腸菌のＲＮアーゼＨである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、前記オリゴヌクレオチドの存在下で６５℃に加熱され、その後に増幅用酵素が加えられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡが、前記の２つの増幅用オリゴヌクレオチドの存在下、１００℃に一回加熱される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ標的を増幅するための転写に基づく増幅方法に関する。
【０００２】
核酸増幅法は、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の分野で使用されている。このような方法は、存在量が少なく、そして多くの場合には、広範囲の様々な他の核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）もまた存在する環境に存在する特定の核酸配列のコピー数を増やすために使用されている。特に、核酸増幅法は、核酸の検出または定量を容易にするために使用されており、例えば、感染性疾患、遺伝病および様々なタイプのガンを診断するために重要である。核酸増幅法はまた、核酸が微量で存在し得るサンプルが調べられる他の分野、例えば、法廷科学、考古学または父親鑑定などの分野において用途が見出されている。
【０００３】
いくつかの核酸増幅技術が、異なる作用機構に基づいて知られている。核酸増幅に関する１つの方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）として知られている。これは、欧州特許出願ＥＰ２００３６２および同ＥＰ２０１１４８に記載されている。ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡが標的として使用される周期的なプロセスである。ＰＣＲプロセスの各サイクルは、二本鎖ＤＮＡの標的をその２つの相補的な鎖に分けることによって開始される。それぞれの鎖に対して、プライマーがアニーリングし、そして存在するＤＮＡポリメラーゼは、プライマーがアニーリングしたＤＮＡ鎖に沿ってプライマーを伸長させ、その結果、２つの新しいＤＮＡ二重鎖が形成される。反応混合物を加熱すると、このＤＮＡ二重鎖の鎖は再び分離し、そして新しいＰＣＲサイクルが開始できる。従って、ＰＣＲプロセスによって、ＤＮＡ標的の多数のＤＮＡコピーが得られる。一本鎖ＲＮＡがＰＣＲの所望する標的である場合、ＲＮＡは、最初に逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換されなければならない。
【０００４】
本発明は、異なる種類の核酸増幅法、すなわち、「転写に基づく増幅技術」に関連する。この技術は、多数のＲＮＡコピーを、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含むテンプレートから転写することを含む。この方法によって、多数のＲＮＡコピーが、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される機能的なプロモーターを含むＤＮＡテンプレートから転写される。このコピーは再び標的として使用され、そのようなコピーから大量のＤＮＡテンプレートが新しく得られる。そのような方法は、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による国際特許公開ＷＯ８８／１０３１５に、そしてＢｕｒｇ他による国際特許公開ＷＯ８９／１０５０に記載されている。等温での転写に基づく増幅技術が、Ｄａｖｅｙ他による欧州特許ＥＰ３２３８２２（ＮＡＳＢＡ法に関する）に、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による欧州特許ＥＰ３７３９６０に、そしてＫａｃｉａｎ他による欧州特許ＥＰ４０８２９５に記載されている。転写に基づく増幅反応はまた、熱に安定性な酵素を用いて行うことができる。転写に基づく増幅は、通常、４１℃付近の温度で行われる。このような熱に安定な酵素は、反応をより高い温度で行うことを可能にする。そのような熱に安定な方法は、東洋紡績（株）の名で出願された欧州特許ＥＰ６８２１２１に記載されている。
【０００５】
欧州特許ＥＰ３２３８２２、同ＥＰ３７３９６０および同ＥＰ４０８２９５に記載されているような方法は、等温の連続的な方法である。これらの方法の場合、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼ（Ｈ）活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性の４つの酵素活性が、増幅を達成するために必要である。これらの活性のいくつかは１つの酵素において一緒にすることができ、従って、通常は、２つまたは３つの酵素が必要とされるだけである。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡをＲＮＡテンプレートから合成する酵素である。従って、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡをＤＮＡテンプレートから合成する。転写に基づく増幅反応において、ＡＭＶ（ニワトリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素などの逆転写酵素を使用することができる。そのような酵素は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に依存性するＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、固有的なＲＮアーゼ活性もまた有する。さらに、大腸菌のＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼは、転写に基づく増幅反応の反応混合物に加えることができる。
【０００６】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、多数のＲＮＡコピーを、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含むＤＮＡテンプレートから合成する。ＲＮＡポリメラーゼの例は、大腸菌ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６から得られるポリメラーゼである。転写に基づく増幅法により広く使用されているＲＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ７ポリメラーゼである。従って、多数コピーのＲＮＡを転写するために使用されるテンプレートに組み込まれるプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。通常、プロモーターを含むテンプレートは、標的配列を含む核酸から出発して作製しなければならない。そのような核酸は、増幅反応の試験材料として使用される出発材料に存在し得る。出発材料に存在する核酸は、通常、標的配列を、さらにより長い配列の一部として含有する。さらなる核酸配列が、標的配列の３’末端および５’末端の両方に存在していてもよい。増幅反応は、出発材料から得られたこのような核酸、上記の活性を一緒に提供する適切な酵素類、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（しかし、通常は２つのオリゴヌクレオチド）を一緒にすることによって開始させることができる。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、プロモーターの配列を含まなければならない。
【０００７】
転写に基づく増幅法は、試験材料が一本鎖ＲＮＡである場合には特に有用であるが、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを試験材料として同様に使用することができる。転写に基づく増幅法が、標的配列の３’末端および５’末端の両方にさらなる配列を有する（「プラス」センスの）一本鎖ＲＮＡを含むサンプルで行われる場合、先行技術において記載されているような方法により都合よく使用されている１対のオリゴヌクレオチドは下記のものからなる。
【０００８】
−  標的配列の３’末端にハイブリダイゼーションし得る第１のオリゴヌクレオチド（通常は、「プロモーターオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）であって、その５’末端に結合したプロモーター（好ましくは、Ｔ７プロモーター）の配列を有するオリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分は、試験材料として使用されたプラスＲＮＡと逆の極性を有する）
−  標的配列の３末端を含む第２のオリゴヌクレオチド（「プライマー」）（このオリゴヌクレオチドはプラスＲＮＡと同じ極性を有する）。
【０００９】
そのような１対のオリゴヌクレオチドは、適切な活性を有するすべての酵素ならびに十分な量の必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドと一緒に、１つの反応混合物に一緒に入れられ、そして適切な条件（すなわち、適切な緩衝液条件および適切な温度）のもとで十分な時間保たれるときに、等温の連続的な増幅反応が始まる。図１には、この分野で知られている転写に基づく増幅反応の一部について提案されている機構が示されている。この等温の連続的な増幅プロセスは、周期的なプロセスとして図１に描かれている。しかし、実際には、このプロセスのすべての工程は、すべての成分が反応容器中に存在しているので同じ温度で起こる。従って、事象の個々の順序は増幅プロセスの基礎となる考えられる機構をより良く理解するために有益であるようにプロセスが描かれているので、増幅中の反応混合物において実際に起こっていることを実際に反映しているとは考えられない。図１に示されているサイクルは、最初の量の一本鎖ＲＮＡで始まると見なすことができる。サイクルに示されているＲＮＡはマイナスセンスＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、上記オリゴヌクレオチド対の第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることができる。このマイナスＲＮＡは、通常、増幅反応の出発材料においてはそのようなものとして存在しないが、例えば、反応混合物のすべての成分が一緒にされている場合、そのようなオリゴヌクレオチドおよび酵素との反応によって出発材料に存在するプラスＲＮＡから得られる。
【００１０】
上記方法の多くの変化体が先行技術に記載されている。図１に示されている反応図式から、（上記の）第２のオリゴヌクレオチドは、マイナスＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始させるプライマーとして作用していることが理解され得る。プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの伸長生成物の３’末端にアニーリングすることができる。このオリゴヌクレオチドのプロモーター部分は、第２のオリゴヌクレオチドの伸長生成物を伸長させて二本鎖プロモーターを得るためのテンプレートとして作用する。プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）によって伸長し得るが、この酵素は必ずしも必要ではない。プロモーター配列を含有するオリゴヌクレオチドのテンプレートとしての機能を示すために、このテンプレートは、転写に基づく増幅に関連する先行技術のいくつか（例えば、Ｇｅｎｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．の欧州特許ＥＰ４０８２９５）では「スプライステンプレート」と呼ばれている。そのような「スプライステンプレート」の３’末端はブロックすることさえできる。その場合、「スプライステンプレート」がプライマーとして作用する能力は完全に除かれている。
【００１１】
図１は、転写に基づく増幅に関して提案される図式を示す。この図式は、一本鎖ＲＮＡ転写物の合成を含む。上記のように、増幅され得る核酸を含有する出発材料は、この特定の形態の核酸を含有し得ない。出発材料は、特定の長さのマイナスＲＮＡを含有しない。その理由は、図１に示されているような事象からなる提案されたこのサイクルは、おそらくは、出発材料における核酸から最初のＲＮＡ転写工程に至る一連の事象によって進むためである。上記に説明されているように、転写に基づく増幅法は、一本鎖ＲＮＡから始まる増幅に特に有用である。オリゴヌクレオチドの１つ、すなわち、プロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドは、次いで、この一本鎖ＲＮＡにアニーリングすることが考えられ、そしてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素（逆転写酵素など）によって伸長される。ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖がこのようにして得られ、そのＲＮＡ鎖はＲＮアーゼＨによって消化することができる。もう一方のオリゴヌクレオチドは、残ったＤＮＡ鎖にアニリーングし、そしてこの鎖をテンプレートして伸長する。従って、ＲＮＡポリメラーゼに対する機能的な二本鎖プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡテンプレートを作製することができ、そしてこの二本鎖ＤＮＡテンプレートから最初の転写工程を行うことができる。このようにして得られた転写物は、図１に示される提案された反応図式に入れることができる。実際には、サンプル中の一本鎖ＲＮＡから始まるこの一連のすべての事象は、すべての成分を一緒にし、そしてこの混合物を、酵素が十分に活性である適切な温度にすると直ちに起こる。この方法の実施者は、これらの工程のいずれかを達成するために介入する必要はない。
【００１２】
しかし、転写に基づく増幅法を、標的配列が二本鎖ＤＮＡ（環状または線状のいずれか）としてのみ含まれる出発材料について行わなければならない場合、当業者は、出発材料に最初に存在する二本鎖ＤＮＡから一本鎖の核酸を得るための方法を最初に行わなければ、何も増幅され得ないと予想しよう。当業者は、ＤＮＡは二本鎖形態であるので、当業者のオリゴヌクレオチドはどれもＤＮＡにアニーリングし得ないと予想している。転写に基づく増幅法に関する当業者の知識に基づいて、この場合に行われる最も妥当なことは、ＤＮＡを分離するために（１００℃までの）高い温度を加えることによって二本鎖のＤＮＡ鎖を分離し、そしてオリゴヌクレオチドの一方をこの一本鎖の１つにアニーリングさせることである。現在の転写に基づく増幅法により使用されている酵素は、そのような高い温度に耐えることができず、そしてそのような場合、ＤＮＡ鎖が分離された後で加えることできるだけである。オリゴヌクレオチドの１つが一本鎖ＤＮＡにアニリーングして伸長する場合、二本鎖のＤＮＡが再び作製され、そして反応混合物は、二本鎖ＤＮＡをその分離した鎖に再び融解するのに十分に高い高温に供しなければならない。再度ではあるが、このような高温は、存在する酵素を失活させ、そして新しい酵素を、加熱工程が行われた後で再度加えなければならない。第２のオリゴヌクレオチドを次に加えることができ、そして第１の工程で伸長した（プロモーター）オリゴヌクレオチドから作製された鎖にアニーリングさせることができ、従って、二本鎖の機能的なプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡテンプレートが得られ、このテンプレートからＲＮＡ転写の第１工程を行うことができる。得られたＲＮＡ転写物は図１に示されているようなサイクルに入れることができ、そしてプロセスはさらに等温的であり得る。
【００１３】
上記から、転写に基づく増幅法を二本鎖ＤＮＡから始めることは冗長なプロセスであり得ることが明らかである。転写に基づく増幅法は、実施者が行わなければならないいくつかの特定の作業を必要とする；サンプルは加熱および冷却を繰り返し行わなければならず、そして酵素は各加熱工程の後で補給しなければならない。
【００１４】
あるいは、出発材料中の二本鎖ＤＮＡは、増幅を開始する前にＲＮＡに転写することができる。そのようなさらなる工程は、ポリメラーゼ結合部位とも呼ばれているプロモーター配列の非存在下で二本鎖ＤＮＡをＲＮＡに転写する酵素（例えば、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼ）に基づくことができる。転写に基づく増幅法によって二本鎖ＤＮＡの増幅を容易にするさらなる工程のそのようなプロセスは、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９６０２６６８に記載されている。この手順に記載されているさらなる工程は、さらなる取り扱い工程を含むだけでなく、さらなる成分、すなわち、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼを使用することもまた含む。
【００１５】
今回、サンプルが二本鎖ＤＮＡを含む場合に、転写に基づく増幅プロセスが適用できることが見出された。このプロセスは本質的に等温的であり、そしてこのプロセスによってＤＮＡの配列を含む大量のＲＮＡ転写物が得られる。
【００１６】
本発明の方法により、等温の転写に基づく増幅法が、二本鎖ＤＮＡを増幅するために提供される。二本鎖ＤＮＡを増幅するための本発明の方法は、前記二本鎖ＤＮＡを、
−  前記二本鎖ＤＮＡに含まれる２つのＤＮＡ鎖の第１鎖の一部に相補的な配列を含み、そしてＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターの配列をさらに含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
−  前記二本鎖ＤＮＡに含まれる第２鎖の一部に相補的な配列を含む、さらなるオリゴヌクレオチド、
−  ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
−  ＲＮアーゼＨ活性を有する酵素、
−  ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
と接触させる工程、およびこのようにして得られた反応混合物を、増幅が起こるのに十分な時間、適切な条件のもとで維持する工程を含む。
【００１７】
本発明による方法は、小さなＤＮＡ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）を増幅するのに特に有用である。
【００１８】
本発明の方法は、病原性微生物の小さなＤＮＡ分子を検出するのに特に有用であり、そのような検出により診断が可能になる。特に、ＨＩＶ−１ウイルスの複製途中で形成されるＨＩＶ−１の環状ＤＮＡ分子は、本発明の方法によって検出することができる。そのようなＨＩＶ−１の環状ＤＮＡ分子の検出はウイルスの活性な複製を示しており、これは疾患の進行（すなわち、ＡＩＤＳの発症）と相関し得る。別の適用において、本発明は、クラミジア種に天然に存在するプラスミドＤＮＡ分子を検出するために使用することができる。クラミジアのプラスミドはいくつかのビルレンス因子をコードし得る。このことは、プラスミドの検出は、クラミジア感染の存在を示すだけでなく、感染を引き起こすクラミジア細胞がいくつかのビルレンス因子を保有することを示すこともまた意味する。
【００１９】
他のさらなる適用において、本発明の方法は、ＤＮＡの（部分的な）分解および単離を行った後のゲノム配列を増幅するために使用することができる。これは広範囲に適用され、そのような適用の多くは、ゲノムＤＮＡにおける変異の検出および同定と関連し得る。このような変異は、ガンの診断、遺伝性疾患の診断、または疾患に対する素因の診断と関連し得る。
【００２０】
驚くべきことに、転写に基づく増幅は、制限酵素でＤＮＡを処理する必要がなく、あるいはさらに重要なことに、加熱することによって取り扱う前に鎖を分離する必要がなく、二本鎖ＤＮＡから始めることができる。等温の転写に基づく増幅反応により従来から使用されている試薬はすべて、二本鎖ＤＮＡを含有する出発材料について、それが一本鎖ＲＮＡであるかのように、単に使用することができる。
【００２１】
本発明による方法により使用される酵素は、転写に基づく増幅法に好適であるとしてこの分野で知られている任意の酵素であり得る。反応条件は、一本鎖ＲＮＡを増幅するために広く使用されている先行技術の転写に基づく増幅法と本質的には同じである。本発明の場合、転写に基づく増幅反応がそれに従って機能すると考えられる機構の知識に基づいて、本発明の方法が機能し得ないことを当業者が予想したとしても、本質的には同じプロトコルを二本鎖ＤＮＡの等温的な転写に基づく増幅に使用できることが今回見出された。
【００２２】
好ましい実施形態において、ＤＮＡは、増幅用オリゴヌクレオチドの存在下で、しかし増幅用酵素の非存在下で６５℃に加熱される。酵素は、反応混合物が増幅反応のインキュベーション温度（すなわち、４１℃）に冷却された後で反応物に加えられるだけである。本発明の方法の別の実施形態において、ＤＮＡは、２つの増幅用オリゴヌクレオチドが存在するもとで１００℃に加熱することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよび伸長を行った後、新しく生成したＤＮＡ鎖は、第２のオリゴヌクレオチドがアニーリングして伸長し得る前に最初のＤＮＡテンプレートから分離しなければならないという事実のために、本発明の方法が機能することを依然として予想していない。ただ１つの加熱工程を有するこの第２の好ましい実施形態において、酵素は、反応混合物が増幅インキュベーション温度（すなわち、４１℃）に冷却された後で加えられるだけである。
【００２３】
好ましくは、下記の２つのオリゴヌクレオチドが本発明による方法において使用される。
【００２４】
−  二本鎖ＤＮＡの第１鎖において特定の配列にハイブリダイゼーションし得る第１のオリゴヌクレオチド（通常は、「プロモータープライマー」と呼ばれる）であって、その５’末端に結合したプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の配列を有するオリゴヌクレオチド、および
−  二本鎖ＤＮＡの第２鎖における特定の配列に対して十分に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチド（「プライマー」）。
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それらが互いにハイブリダイゼーションできないように選ばなければならない。
【００２５】
二本鎖ＤＮＡを上記の２つのオリゴヌクレオチドおよび適切な酵素と接触させることによって、二本鎖ＤＮＡを構成する２つの鎖を分離するためのいくつかの鎖分離工程を全く必要としない転写に基づく増幅プロセスを行うことができることは驚くべきことである。本発明の方法によって、二本鎖ＤＮＡの配列の一部である標的配列を含む多数の線状ＲＮＡコピーが得られる。
【００２６】
実施例
緒言
下記の実施例は、本発明の機構および有用性を明らかにする。実施例は限定的ではなく、そしてそのように見なすべきではない。下記の実施例において使用されている酵素は、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＲＮアーゼＨである。類似する活性を有する他の酵素および他の起源から得られる酵素を使用することができる。異なるプロモーター特異性を有する他のＲＮＡポリメラーゼもまた使用するのに好適であり得る。
【００２７】
下記の実施例において使用されたＮＡＳＢＡ反応条件は、２０μｌの容量において、４０ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、４２ｍＭのＫＣｌ（または、後の実験では７０ｍＭのＫＣｌ）、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、１．５ｍＭのｒＧＴＰ、０．５ｍＭのＩＴＰ、０．２μＭの各オリゴヌクレオチド、３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５ｇ／ｌのＢＳＡ、６．４ユニットのＡＭＶ−ＲＴ、３２ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０８ユニットの大腸菌ＲＮアーゼＨ、および指定量のテンプレートであった。使用したオリゴヌクレオチド配列は例示であり、そして他の配列がこれらの標的配列および他の標的配列に対して使用されるので限定的ではない。
【００２８】
実施例１
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
ＨＩＶ−１ｇａｇ１  Ｐ１：
【００２９】
【化１】
0005009460.tif 000002
【００３０】
ＨＩＶ−１ｇａｇ１  Ｐ２：
【００３１】
【化２】
0005009460.tif 000003
【００３２】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇ領域の一部を標的とする。増幅用試験物として、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇ領域を含むプラスミドＤＮＡのｐＵＣｐ２４を種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識したＨＩＶ−１ｇａｇプローブの５’ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  Ｇ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、１０５分子の添加プラスミドＤＮＡの感度で得ることができる。同じ結果を、６５℃のインキュベーションを用いることなく同じプロセスで得ることができる。
【００３３】
実施例２
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
ＨＰＶ１６  Ｐ１：
【００３４】
【化３】
0005009460.tif 000004
【００３５】
ＨＰＶ１６  Ｐ２：
【００３６】
【化４】
0005009460.tif 000005
【００３７】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ＨＰＶ１６ゲノムの一部を標的とする。増幅用試験物として、ＨＰＶ１６ゲノムの全長を含有するプラスミドＤＮＡのｐＨＰＶ１６を種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識したＨＰＶ１６プローブの５’ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＧＣ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、１ｐｇの添加プラスミドＤＮＡの感度で得ることができる。
【００３８】
実施例３
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
トラコーマクラミジア天然プラスミド  Ｐ１：
【００３９】
【化５】
0005009460.tif 000006
【００４０】
トラコーマクラミジア天然プラスミド  Ｐ２：
【００４１】
【化６】
0005009460.tif 000007
【００４２】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の天然プラスミドの一部を標的とする。増幅用試験物として、トラコーマクラミジアのプラスミド調製物を、トラコーマクラミジアの封入形成単位（ＩＦＵ）の量に関して種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識したトラコーマクラミジア天然プラスミドのプローブの５’ＣＧＴ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  Ｔ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、０．０１ＩＦＵに対応するプラスミドＤＮＡの量で得ることができる。
【００４３】
実施例４
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
組織因子  Ｐ１：
【００４４】
【化７】
0005009460.tif 000008
【００４５】
組織因子  Ｐ２：
【００４６】
【化８】
0005009460.tif 000009
【００４７】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ヒト組織因子遺伝子の一部を標的とする。増幅用試験物として、組織因子遺伝子の一部を含有するプラスミドＤＮＡのｐＵＣ１３−ＴＦを種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識した組織因子プローブの５’ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＡ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、１０３分子の添加プラスミドＤＮＡの感度で得ることができる。
【００４８】
実施例５
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
ＣＤ１４  Ｐ１：
【００４９】
【化９】
0005009460.tif 000010
【００５０】
ＣＤ１４  Ｐ２：
【００５１】
【化１０】
0005009460.tif 000011
【００５２】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ヒトＣＤ１４遺伝子の一部を標的とする。増幅用試験物として、ＣＤ１４遺伝子の一部を含有するプラスミドＤＮＡのｐπＨ３Ｍを種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識したＣＤ１４プローブの５’ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＴ  ＣＣＴ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、１０３分子の添加プラスミドＤＮＡの感度で得ることができる。
【００５３】
実施例６
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
アクチン  Ｐ１：
【００５４】
【化１１】
0005009460.tif 000012
【００５５】
アクチン  Ｐ２：
【００５６】
【化１２】
0005009460.tif 000013
【００５７】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。括弧内のヌクレオチドは「縮重した」位置を示し、括弧内のヌクレオチドのいずれかが存在し得る。これらのプライマーは、増幅のために、ヒトアクチン遺伝子の一部を標的とする。増幅用試験物として、ＲＮアーゼＡで処理した全ヒトゲノムＤＮＡ（市販のヒト胎盤ＤＮＡ）を４００ｎｇの添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識したアクチンプローブの５’ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  Ａ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果は、増幅用試験物としてヒトゲノムＤＮＡを使用して示され得る。
【００５８】
実施例７
高温での変性工程を用いることなくＮＡＳＢＡによるＤＮＡ標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の２つのオリゴヌクレオチドを、上記のＮＡＳＢＡ反応成分と組み合わせて使用した。
ＣＭＶエキソン４  Ｐ１：
【００５９】
【化１３】
0005009460.tif 000014
【００６０】
ＣＭＶエキソン４  Ｐ２：
【００６１】
【化１４】
0005009460.tif 000015
【００６２】
Ｐ１のＴ７プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ＣＭＶゲノムの一部を標的とする。増幅用試験物として、ＣＭＶ感染ＨＥＬ細胞の全ＤＮＡをＲＮアーゼＡで処理して、このＤＮＡを、０．１細胞と等価な添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドＤＮＡを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、６５℃への加熱、４１℃への冷却、酵素の添加、および４１℃で９０分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、３２Ｐで標識したＣＭＶプローブの５’ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡ３’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果は、増幅用試験物として、０．１細胞当量のＤＮＡを使用して示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、転写に基づく増幅の反応図式である。
【図１】
0005009460.tif 000016