(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ腫瘍細胞上のクラスＩＩＭＨＣの発現を増強する因子を誘導する能力、イヌリンパ球の増殖を促進する能力、イヌリンパ球およびイヌ腫瘍細胞上のＦａｓリガンドの発現を増強させる能力、イヌ腫瘍細胞を障害し死滅させる能力、及びイヌ生体に発生した腫瘍を縮小させる能力から選ばれる少なくとも１つの能力を有する、配列番号：１で表されるイヌインターロイキン１８を含んでなるイヌの腫瘍治療薬。
【請求項２】
イヌ腫瘍細胞上のクラスＩＩＭＨＣの発現を増強する因子を誘導する能力、イヌリンパ球の増殖を促進する能力、イヌリンパ球およびイヌ腫瘍細胞上のＦａｓリガンドの発現を増強させる能力、イヌ腫瘍細胞を障害し死滅させる能力、及びイヌ生体に発生した腫瘍を縮小させる能力から選ばれる少なくとも１つの能力を有する、配列番号：１または配列番号：９で表されるイヌインターロイキン１８をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体を培養することを特徴とするイヌインターロイキン１８の製造方法、
により得たイヌインターロイキン１８を含んでなるイヌの腫瘍治療薬。
【請求項３】
配列番号：１または配列番号：９に示すＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルスを昆虫樹立細胞中またはカイコ生体中で増殖させることを特徴とするイヌインターロイキン１８の製造方法、
により得たイヌインターロイキン１８を含んでなるイヌの腫瘍治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１８を遺伝子操作技術により量産し、以って動物用医薬品（抗腫瘍・抗アレルギー・抗ウイルス・ワクチンアジュバント）とする事を目的とした、組換えベクター、組換えウイルス、形質転換体、イヌインターロイキン１８、イヌインターロイキン１β変換酵素およびインターロイキン１８の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫調節作用を示すインターロイキン１２（以下ＩＬ１２と略記する）は、インターフェロンγ誘導活性、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパーＴ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカイン（文献１）で、特に細胞性免疫の強力な活性化作用により、抗腫瘍薬や抗アレルギー薬の候補として非常に有望視されている（文献２、３）。 インターロイキン１８（以下ＩＬ１８と略記する）もＩＬ１２と同様の活性を示すサイトカインとして最近クローニングされ（文献４）、ＩＬ１２との共同作用によりそれらの活性がさらに強まることが報告されている（文献５）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子操作技術によりマウスのＩＬ１８（文献４）に続き、ヒトのＩＬ１８のｃＤＮＡもクローニングされ（文献６）、その遺伝子組換え手法を用いた量産化が検討されている。しかしながら、ＩＬ１８は細胞内から分泌されるためのシグナル配列を持たず、そのため細胞内から活性型で分泌するためには、インターロイキン１β変換酵素（以下ＩＣＥと略記する）によるＩＬ１８前駆体タンパクのプロセシングが必要で、ＩＬ１８の遺伝子を単独で動物細胞に導入しても活性型ＩＬ１８として発現せず（文献７）、細胞を用いた組換え型ＩＬ１８の効率的な大量生産は困難であった。
【０００４】
ＩＬ１８の遺伝子組換え手法を用いた量産により、腫瘍やアレルギー、ウイルス病などの治療薬としての開発が期待される。
【０００５】
また、ヒトと同様ペット、特にイヌにも、乳腺腫瘍など多数の腫瘍、アレルギー性の皮膚炎、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数のウイルス病などが知られており、その治療薬の開発が求められている。
【０００６】
イヌのＩＬ１８がクローニングされたという報告は未だない。そこで、イヌＩＬ１８がクローニングされれば、新たなイヌの治療薬となる可能性がある。
【０００７】
また、ＩＬ１８を細胞で遺伝子組換え手法を用いて容易に量産することが可能になれば、ヒトをはじめ、動物の抗腫瘍薬、抗アレルギー薬、抗ウイルス薬など、ＩＬ１８としての用途が開かれることが期待される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる状況に鑑み、イヌＩＬ１８のｃＤＮＡのクローニングおよびＩＬ１８遺伝子の大量発現を目的とし、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからイヌＩＬ１８をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、またＩＬ１８の前駆体タンパクをコードするＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスを作製し、これを昆虫細胞または幼虫に感染させることによって驚くべきことにＩＣＥの処理無しに活性型ＩＬ１８が生産されることを見出し、また、活性型イヌＩＬ１８をコードする遺伝子の前にシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を作製することにより、更に活性型ＩＬ１８の生産量が向上することを見出した。更にはイヌのｃＤＮＡからイヌＩＣＥをコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、イヌＩＬ１８の前駆体タンパクをコードするＤＮＡとイヌＩＣＥをコードするＤＮＡを同時に含む組換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞または幼虫に感染させることによってイヌＩＬ１８の大量生産にも成功し、以って簡単に大量にＩＬ１８を製造する方法を確立し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、イヌ白血球に作用して抗ウイルス活性因子およびイヌ腫瘍細胞上のクラスＩＩＭＨＣの発現を増強する因子を誘導する能力、イヌリンパ球の増殖を促進する能力、イヌリンパ球およびイヌ腫瘍細胞上のＦａｓリガンドの発現を増強させる能力、イヌ腫瘍細胞を障害し死滅させる能力、イヌ生体に発生した腫瘍を縮小させる能力、およびイヌ白血球を活性化してイヌのアレルギーを抑制する能力から選ばれる少なくとも１つの能力を有するイヌインターロイキン１８に関する。
【００１０】
さらに本発明は、ＩＬ１８を生産させる組換えベクター、これらの組換えベクターを有する大腸菌の形質転換体、および昆虫細胞または幼虫でＩＬ１８を生産させる組換えバキュロウイルス、並びにこれらから得られるＩＬ１８、また、ＩＬ１８の製造方法を提供するものである。さらに本発明はイヌＩＬ１８をコードする遺伝子、イヌＩＣＥおよびイヌＩＣＥをコードする遺伝子も提供する。さらに、ＩＬ１８を含むイヌの腫瘍治療薬を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のイヌＩＬ１８をコードするＤＮＡを組込んだ組換えベクターは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、マウスやヒトのＩＬ１８をコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行い、さらに合成したｃＤＮＡよりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、イヌＩＬ１８ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。イヌＩＣＥｃＤＮＡの全長も同様にしてクローニングすることができる。
【００１２】
イヌの臟器などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献８）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献９），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１３】
イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献１０），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１１）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００１４】
このｃＤＮＡを鋳型としてマウスやヒトの塩基配列をもとにしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、さらに合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、イヌＩＬ１８やイヌＩＣＥをクローニングすることができる。
【００１５】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ），キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ），カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ），動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００１６】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。  発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００１７】
ＩＬ１８を細胞を用いて生産する場合、その前駆体タンパクにシグナル配列が存在しないため、ＩＣＥなどによるＩＬ１８前駆体タンパクのプロセシングが必要である。そのため、ＩＬ１８前駆体タンパクとＩＣＥを同時に発現させることによって活性型ＩＬ１８が生産できる。例えば、配列番号：２に示すイヌＩＣＥをコードする遺伝子とイヌＩＬ１８をコードする遺伝子を同時に含む発現ベクターを用いることによって活性型イヌＩＬ１８を細胞で生産することができる。
【００１８】
また、活性型ＩＬ１８をコードする遺伝子の前にシグナル配列をコードする遺伝子を付加することによって活性型ＩＬ１８が生産できる。例えば、配列番号：９に示すようにシグナル配列をコードする遺伝子を含む遺伝子を用いることによって活性型イヌＩＬ１８を細胞で生産することができる。
【００１９】
イヌＩＬ１８は、例えば、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製することによって、カイコ発現系を用いて生産することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルスは、イヌＩＬ１８の蛋白質をコ−ドするＤＮＡをカイコのクローニングベクターに連結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組み換え体ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。
【００２０】
すなわち、イヌＩＬ１８の蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＫ２８３などのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献１２）とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文献１２）にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別できる。イヌＩＬ１８の生産は、前記の組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増殖させることにより行なう。
【００２１】
カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したＴＣ−１０培地（文献１２）を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培溶液を遠心分離しその上清からイヌＩＬ１８を回収する。
【００２２】
カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、合成飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清からイヌＩＬ１８を回収する。
【００２３】
産生されたイヌＩＬ１８タンパクは，非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約１５〜２０ｋＤである。
【００２４】
イヌＩＬ１８は、以下の実施例で示すように、イヌ白血球からのイヌＩＦＮγの誘導能、腫瘍細胞上のＦａｓリガンド分子の発現増強能、イヌ腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用などの活性により特性化される。イヌＩＦＮγの活性はＣＰＥ法（文献１４）を用いた抗ウイルス活性およびイヌ腫瘍細胞上のクラスＩＩＭＨＣ分子の発現増強活性により測定する。腫瘍細胞上のＦａｓリガンド分子の発現増強活性およびクラスＩＩＭＨＣ分子の発現増強活性は、蛍光を標識したそれら分子に対する抗体を細胞に反応させ、フローサイトメーターなどの蛍光強度を測定できる装置によって蛍光の強度を測定し、それが１０％以上上昇した場合に活性があると判定できる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００２６】
実施例１
イヌＩＬ１８のクローニング
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ膵臓、腎臓、肝臓および鶏ニューカッスル病ウイルスで７時間処理したイヌ脾臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略記する）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２７】
（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリーの調製
上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージを作製した。
【００２８】
（３）イヌＩＬ１８のｃＤＮＡクローニング
マウスＩＬ１８の塩基配列（文献４）をもとに、
５´ａａｃｔｔｔｇｇｃｃｇａｃｔｔｃａｃｔｇｔａｃａａｃｃｇｃａｇｔａａｔａｃｇｇａ３´（配列番号５）
と
５´ｃｃｔｔｃａｔａｃａｇｔｇａａｇａｔｔｃａａａｃｔｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｇｔｇｔｃ３´（配列番号６）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を４５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＭＪＲＥＳＥＲＣＨ社のＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用い、４０サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３６０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１３）に従って調製した。
【００２９】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、挿入したＤＮＡの塩基配列を決定した。次に、この配列を含む、３６０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて32Ｐで標識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ１×１０6ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、イヌＩＬ１８の前駆体をコードする配列を配列番号：１に、全塩基配列を配列番号：３に示す。
【００３０】
（４）イヌＩＣＥのｃＤＮＡクローニング
ヒトＩＣＥの塩基配列（文献１５）をもとに、
５´ａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｇｔｃｃｔｇａａｇｇａｇａａｇａｇａａａｇｃｔｇｔｔｔ３´（配列番号７）
と
５´ａｔｇｔｃｃｔｇｇｇａａｇａｇｇｔａｇａａａｃａｔｃｔｔｇｔｃａａａｇｔｃａｃ３´（配列番号８）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＭＪ  ＲＥＳＥＲＣＨ社のＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。上記（３）と同様にしてこのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、この配列を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、イヌＩＣＥをコードする配列を配列番号：２に、全塩基配列を配列番号：４に示す。
【００３１】
実施例２
イヌＩＬ１８の生産
（１）イヌＩＬ１８の大腸菌での生産
実施例１で得られたイヌＩＬ１８の前駆体タンパクをコードするＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法にてＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を付加した活性型イヌＩＬ１８タンパクをコードするＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ８ｃのプロモーター下流の制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ切断部位に連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーのうち１５個を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地中で８時間培養し、集めた菌体からプラスミドを抽出、精製後、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、約５８０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた活性型イヌＩＬ１８をコードするＤＮＡ断片を含んだプラスミドを得た。この組換えベクターをｐＥＴＣａＩＧとし、これを用いて定法に従い、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥＴＣａＩＧ）と名付けた。
【００３２】
得られたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥＴＣａＩＧ）のシングルコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。ＯＤ６００が約０．７になるまで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、さらに１．５時間培養した。
【００３３】
培養液１．５ｍｌを１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、１２０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、１．５ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを用いて菌体を破砕した。２００００ｒｐｍで３０分間遠心し、可溶性画分（上清）を得、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌後、イヌＩＬ１８が生産された溶液を得た。
【００３４】
また、制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法にてＢａｍＨＩ切断部位を付加した活性型イヌＩＬ１８タンパクをコードするＤＮＡ断片を調製し、制限酵素で切断後、大腸菌発現ベクターであるｐＧＥＸ−５Ｘ（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩ切断部位に連結し、上記と同様の操作により大腸菌ＢＬ２１を形質転換後、可溶性画分を得た。この画分をグルタチオンセファロースカラム（ファルマシア社製）にアプライした。その溶出画分をファルマシア社製のＦａｃｔｏｒ Ｘａを用いて切断し、さらに同じカラムにアプライした。カラムに結合しない活性型イヌＩＬ１８タンパクを含む画分を回収した。こうして精製された活性型イヌＩＬ１８タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、純度が９０％以上であった。また、ワコー社のリムルステストキットを用いた解析によると、このタンパク１ｍｇ中にエンドトキシンは全く検出されなかった。
【００３５】
（２）イヌＩＬ１８産生組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位にイヌＩＬ１８の前駆体をコードする配列番号：１に記載のＤＮＡを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社製のバキュロウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスｒＡｃＣａＩＧー１を得た。
【００３６】
また、同様にして、シグナル配列を含む配列番号：９に記載のＤＮＡをｐＶＬ１３９２に連結し、組換えトランスファーベクターを作製し、組換えバキュロウイルスｒＡｃＣａＩＧー２を得た。
【００３７】
さらに、同様にして、バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩ切断部位にそれぞれイヌＩＬ１８の前駆体をコードするＤＮＡとイヌＩＣＥの前駆体をコードするＤＮＡを連結し、組換えバキュロウイルスｒｐＡｃＣａＩＧＩＣＥを得た。
【００３８】
（３）昆虫細胞でのイヌＩＬ１８の生産
上記（２）で得られたｒＡｃＣａＩＧー１、ｒＡｃＣａＩＧー２およびｒｐＡｃＣａＩＧＩＣＥをファーミンジェン社製のバキュロウイルスＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍで７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｅｒｕｄａ由来、ファーミンジェン社製）にそれぞれ感染させ、４日間培養した後、イヌＩＬ１８が生産された培養上清を得た。
【００３９】
（４）カイコ生産用イヌＩＬ１８産生組換えバキュロウイルスの作製
トランスファーベクターｐＢＫ２８３（フナコシ社製）のプロモーター下流の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位にイヌＩＬ１８の前駆体をコードするＤＮＡを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。文献１２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ  ＣａＣｌ2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ  Ｔ３株（文献１２）のＤＮＡ１０μｇ、組換えトランスファーベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１２）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
【００４０】
限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイルスｒＢｍＣａＩＧを得た。
【００４１】
（５）カイコ生体中でのイヌＩＬ１８の生産
５令２日目のカイコ幼虫に、前記（３）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を５０μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育後、１０頭のカイコの腹部を切り、体液を氷冷したエッペンドルフチューブに採取し、遠心分離後の上清を得、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌後、イヌＩＬ１８が生産された体液を得た。
【００４２】
実施例３
イヌＩＬ１２の調製
（１）イヌＩＬ１２ｃＤＮＡの調製
ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激したイヌ末梢血単核球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。得られたｃＤＮＡを鋳型として、
イヌＩＬ１２の塩基配列（文献１６）をもとに、ＰＣＲ法によってイヌＩＬ１２のＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユニットの各遺伝子を取得し、定法に従い、これらを発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献１７）にそれぞれ連結し、ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を得た。それぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア製）および１００μＭのクロロキン（シグマ社）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）社製）に加えた。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ社、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ2 ，３７℃の条件で４日間培養し、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００４３】
実施例４  イヌＩＬ１８の活性測定
実施例２で生産されたイヌＩＬ１８の活性測定は以下のようにして行った。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）製）に１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）２５０Ｕを６ｃｍディッシュに添加した。これに実施例２（３）で得られたそれぞれの培養上清２．５ｍｌを加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）を用い、文献１４のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、組換えウイルスｒＡｃＣａＩＧ−１を感染させて得られた培養上清で約１０4 希釈単位／ｍｌの抗ウイルス活性が検出され、組換えウイルスｒＡｃＣａＩＧ−２およびｒｐＡｃＣａＩＧＩＣＥを感染させて得られた培養上清で１０6希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。また、実施例２（１）および（５）で得られた大腸菌およびカイコ体液の抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、それぞれ１０3、１０5希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。さらに、実施例２（１）で得られた大腸菌で生産した精製イヌＩＬ１８と実施例３で得られたイヌＩＬ１２が生産された培養上清を用いて、この抗ウイルス活性誘導能における、イヌＩＬ１８とイヌＩＬ１２の相乗作用を検討した。上記と同様にしてヒトＩＬ２を含むイヌリンパ球培養液を調製し、これに精製イヌＩＬ１８を
１μｇ添加したもの、イヌＩＬ１２が生産された培養上清２．５ｍｌを添加したもの、および精製イヌＩＬ１８を１μｇとイヌＩＬ１２が生産された培養上清２．５ｍｌを添加したものを比較検討した。その結果、イヌＩＬ１８単独で約１０5希釈単位／ｍｌ、イヌＩＬ１２が生産された培養上清単独で約３ｘ１０4希釈単位／ｍｌ両方添加したもので、１０6希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が得られた。このことから、イヌＩＬ１８とイヌＩＬ１２は抗ウイルス活性誘導能において相乗作用を有することが判明した。
【００４４】
また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、組換えウイルスを感染させたＳｆ２１細胞の培養液およびカイコ体液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。６ｃｍディッシュに、１０5個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに上記培養液およびカイコ体液で刺激したイヌリンパ球培養液を添加し、５％ＣＯ2、３７℃の各条件で１ューブにて遠心した。これに、１０μｌのラット抗イヌＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体（セロテック社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％のＦＢＳを含むＥＲＤＦ培地で懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌの１０％のＦＢＳを含むＥＲＤＦ培地で懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、Ｓｆ２１細胞およびカイコで産生させたイヌＩＬ１８は、イヌリンパ球を刺激してＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量をそれぞれ約１５％、３５％上昇させた。これらのことから、イヌＩＬ１８はイヌリンパ球に作用して、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有することが判明した。
【００４５】
次にＦａｓリガンドを発現したＦＣＢＲ１を用いて、Ｓｆ２１細胞の培養液およびカイコ体液中のＦａｓリガンドの発現増強活性を測定した。ラビット抗ヒトＦａｓリガンドポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とＦＩＴＣ標識マウス抗ラビットモノクローナル抗体（セロテック社製）を用い、同様にしてＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、Ｓｆ２１細胞およびカイコで産生させたイヌＩＬ１８は、ＦＣＢＲ１上のＦａｓリガンドの発現量をそれぞれ約４０％、５５％上昇させた。
【００４６】
また、Ｓｆ２１細胞の培養液およびカイコ体液中の抗腫瘍活性を検討した。Ｓｆ２１細胞およびカイコで産生させたイヌＩＬ１８はＦＣＢＲ１に作用して、細胞内ＤＮＡの断片化を引き起こし、アポトーシスにより細胞を死滅させた。イヌＩＬ１８はイヌ腫瘍細胞に対して直接、抗腫瘍活性を示すことが判明した。
【００４７】
さらに、イヌＩＬ１８のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を検討した。ＦＣＢＲ１を４週齢のスキットマウス（日本クレア社由来）の背部皮下に移植したところ、腫瘤を形成した４匹の担ガンマウスが作成できた。腫瘍重量を次の式にて算出した。
【００４８】
腫瘍重量＝長径 X 短径2／２
移植から２ヶ月後、腫瘍の大きさが平均３２ｍｍ X １９ｍｍ、腫瘍重量で５．８ｇになったところで、３匹のマウスに大腸菌で生産した実施例２（１）に記載の１０μｇの精製イヌＩＬ１８を２日間隔で２回、尾静脈より投与した。また同時にコントロールとして生理食塩水を１匹のマウスに投与した。コントロールのマウスの腫瘍重量は投与後さらに増加し、投与後１０日目には１．３倍になった。一方、イヌＩＬ１８を投与したマウスの腫瘍重量は投与後減少し、コントロールを１とした相対腫瘍重量で０．０５から０．１になった。イヌＩＬ１８のこの腫瘍退縮効果は抗マウスインターフェロンγ抗体と抗アシアロＧＭ１抗体の同時投与によって阻害されなかった。イヌＩＬ１８はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもイヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を示すことが判明した。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、ＩＬ１８を容易に量産することができる。さらに、イヌの疾病の治療などに有効なイヌＩＬ１８を提供できる。
【００５０】
参考文献
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【００５１】
【配列表】
0004915828.tif 000002
【００５２】
0004915828.tif 000003
0004915828.tif 000004
【００５３】
0004915828.tif 000005
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【００５４】
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0004915828.tif 000010
【００５５】
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0004915828.tif 000012
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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