(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および
ｉｉ）ＡおよびＢドメインの欠失を含む、エジクソン受容体ポリペプチドからのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、
を含む、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセットと、
ｂ）ｉ）トランス活性化ドメインであって、遺伝子発現調整系によってその発現が調整されるべき遺伝子のプロモーターの活性化を促進するトランス活性化ドメイン、および
ｉｉ）ＡおよびＢドメインの欠失を含む、切断（トランケーテッド）レチノイドＸ受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、
を含む、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセットと、
を含み、
トランス活性化ドメインがエクジソン受容体、レチノイドＸ受容体、またはウルトラスピラクル受容体以外の核受容体からのものであり、および、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメインが異なり、二量体化することを特徴とする遺伝子発現調整系。
【請求項２】
さらに
ｉ）ポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、
ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、
を含む第３の遺伝子発現カセットを含む請求項１記載の遺伝子発現調整系。
【請求項３】
第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた請求項１記載の遺伝子発現調整系。
【請求項４】
第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の遺伝子発現調整系。
【請求項５】
第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた請求項１記載の遺伝子発現調整系。
【請求項６】
第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の遺伝子発現調整系。
【請求項７】
ａ）ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および
ｉｉ）ＡおよびＢドメインの欠失を含む、切断（トランケーテッド）レチノイドＸ受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、
を含む、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現することができる第１の遺伝子発現カセットと、
ｂ）ｉ）トランス活性化ドメインであって、遺伝子発現調整系によってその発現が調整されるべき遺伝子のプロモーターの活性化を促進するトランス活性化ドメイン、および
ｉｉ）ＡおよびＢドメインの欠失を含む、エジクソン受容体ポリペプチドからのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、
を含む、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセットと、
を含み、
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメインが異なり、二量体化することを特徴とする遺伝子発現調整系。
【請求項８】
さらに
ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、
ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
ｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、
を含む第３の遺伝子発現カセットを含む請求項７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項９】
第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた請求項７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１０】
第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１１】
第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた請求項７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１２】
第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１３】
請求項１または７記載の遺伝子発現調整系が導入されている宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
哺乳動物細胞がマウス細胞またはヒト細胞である請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
哺乳動物細胞中で発現する場合、ステロイドリガンドに対するより、ジアシルヒドラジンリガンドに対しより高い感受性を示す請求項１または７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１７】
前記エクジソン受容体リガンド結合ドメインが、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、同翅類（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、ハマキガ科のガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ Ｍｏｌｉｔｏｒ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、クロバエ科およびニクバエ科のハエ（Ｌｕｃｉｌｉａ ｃａｐｉｔａｔａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、チチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トノサマバッタ （Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、シオマネキ（Ｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、およびマダニ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインからなる群から選択される請求項１または７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１８】
前記エクジソン受容体リガンド結合ドメインが、ハマキガ科のガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインである請求項１７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項１９】
前記レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインが、ヒトレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインである請求項１または７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項２０】
前記レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインが、ＲＸＲαアイソフォームリガンド結合ドメイン、ＲＸＲβアイソフォームリガンド結合ドメイン、およびＲＸＲγアイソフォームリガンド結合ドメインから選択される請求項１９記載の遺伝子発現調整系。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ−結合ドメインが、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインまたはＬｅｘＡＤＮＡ−結合ドメインである請求項１または７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項２２】
前記トランス活性化ドメインが、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、ＧＡＬ４トランス活性化ドメイン、ＮＦ−κＢトランス活性化ドメイン、およびＢＰ６４トランス活性化ドメインからなる群から選択される請求項１または７記載の遺伝子発現調整系。
【請求項２３】
請求項１または７記載の遺伝子発現調整系を含むベクター。
【請求項２４】
前記ベクターがウイルスベクターである請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記遺伝子発現調整系がウイルスベクター内に含まれる請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求項２６記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＶ１細胞および２９３細胞からなる群から選択される請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が単離されている請求項１３、１４、１５、２６、２７、または２８記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年３月２２日に出願された同時係属米国仮出願シリアル番号６０／１９１，３５５および２００１年２月２０日に出願された同時係属米国仮出願シリアル番号６０／２６９，７９９に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はバイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子発現の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系およびこの誘導性遺伝子発現系を用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を調整する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な制御は発生および他の生理学的プロセスを研究し、操作し、および制御するための価値あるツールである。遺伝子発現は、多数の特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関連する複雑な生物学的プロセスである。それが蛋白質合成における最初の工程として必要なＲＮＡを生産するように遺伝子発現がトリガーされるためには、転写アクチベータが、遺伝子転写を制御するプロモーターの近隣に運ばれなければならない。典型的には、転写アクチベータそれ自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質に関連する。このように、遺伝子発現が起こるためには、ＤＮＡ結合ドメインから適切な距離に位置するＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含む蛋白質が、遺伝子のプロモーター領域中の正しい位置に運ばれなければならない。
【０００４】
伝統的なトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的プロモーターを利用して設計されたトランスジーンの発現を駆動する。トランスジーンを含むＤＮＡ構築体はまず宿主ゲノムに取り込まれる。転写アクチベータによってトリガーされると、トランスジーンの発現が与えられた細胞型で起こる。
細胞中の外来性遺伝子の発現を調節するためのもう１つの手段は誘導性プロモーターを介するものである。そのような誘導性プロモーターの使用の例はＰＲ１−ａプロモーター、原核生物リプレッサ−オペレータ系、免疫抑制−イミュノフィリン系、およびステロイドホルモン受容体系のような高等真核生物転写活性化系を含むが、それらは後記する。
タバコからのＰＲ１−ａプロモーターは、病原体攻撃後の全身獲得抵抗性応答の間に誘導される。ＰＲ１−ａの使用は限定されるであろう。なぜならば、それは、しばしば、内因性物質および病原体、ＵＶ−Ｂ放射線および汚染物のような外的因子に応答するからである。熱ショック、インターフェロンおよび重金属によって誘導されたプロモーターに基づく遺伝子調節系が記載されている（Ｗｕｒｎら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５４１４〜５４１８、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０  Ｃｅｌｌ  ６２：５１〜６１、Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２７５５０〜２７５６０）。しかしながら、これらの系は非標的遺伝子の発現に対するそれらの効果のため制限を有する。これらの系は漏洩性でもある。
【０００５】
原核生物リプレッサーオペレータ系は、細菌リプレッサ蛋白質およびそれらが結合するユニークなオペレータＤＮＡ配列を利用する。細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）およびラクトース（「Ｌａｃ」）リプレッサーオペレータ系は、共に、遺伝子発現を制御するために植物および動物で用いられてきた。Ｔｅｔ系では、テトラサイクリンがＴｅｔＲリプレッサ蛋白質に結合し、その結果、オペレータからリプレッサ蛋白質を放出する立体配座変化をもたらし、その結果、転写が起こるのを可能とする。Ｌａｃ系はラクトース、またはイソプロピルーｂ−Ｄ−チオガラクトシドのような合成アナログに応答してｌａｃオペロンが活性化される。生憎、そのような系の使用は、リガンド、すなわち、テトラサイクリンおよびラクトースの不安定な化学的性質、それらの毒性、それらの天然での存在、または誘導または抑制に必要な比較的高いレベルによって制限される。同様の理由で、動物におけるそのような系の利用性は制限されている。
ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびサイクロスポリンＡのような免疫抑制分子はイムノフィリンＦＫＢＰ１２、シクロフィリン等に結合することができる。この情報を用い、単に、ＦＫ５０６を２つの蛋白質のうちの各々上に置くことによって、またはＦＫ５０６を１つの上に、およびサイクロスポリンＡをもう１つの上に置くことによって、いずれかの２つの蛋白質を一緒にするための一般的戦略が工夫されてきた。次いで、ＦＫ５０６（ＦＫ１０１２）の合成ホモダイマーまたはＦＫ５０６−サイクロスポリンの融合から得られた化合物（ＦＫＣｓＡ）を用いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９〜２４、Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：４６０４〜７）。ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４  ＤＮＡ−結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータドメイン、およびＦＫＣｓＡ化合物を用いて、Ｇａｌ４結合部位を含むプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化を示した。生憎、この系は、望まない副作用を有し、従って、種々の哺乳動物遺伝子スイッチ適用に対するその使用を制限しかねないイムノサプレッサントを含む。
【０００６】
ステロイドホルモン受容体系のような高等真核生物転写活性化系も使用されてきた。ステロイドホルモン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであって、脊椎動物および非脊椎動物細胞に見出される。生憎、特に植物および動物において遺伝子発現の調節のための受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、そのような生物における多くの他の天然生物学的経路におけるその関与のため制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用い、別の系が開発されてきた。
昆虫における成長、脱皮および発生は、エクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼若ホルモンによって調節される（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５〜５６９）。昆虫におけるエクジソンに対する分子標的は少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトロスピラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）蛋白質（ＵＳＰ）よりなる。ＥｃＲは、シグニチャーＤＮＡおよびリガンド結合ドメイン、および活性化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１，Ｃｅｌｌ，６７：５９〜７７）。ＥｃＲ受容体は、ポナステロンＡおよびムリステロンＡのような多数のステロイド化合物に対して応答する。最近、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙによって世界的に市販されている商業的に入手可能な殺虫剤テブフェノジドおよびメトキシフェノジドを含めた、エクジステロイドアゴニスト活性を持つ非ステロイド化合物が記載されている（例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６および米国特許第５，５３０，０２８号参照）。双方のアナログは他の生物に対して例外的安全性プロフィールを有する。
【０００７】
国際特許出願番号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（ＷＯ９７／３８１１７）は、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築体が、それに対するリガンドの存在下にて、かつ所望によりサイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下にて、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築体によって活性化される外因性遺伝子の発現を調整する方法を開示する。選択されたエクジソン受容体はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離された。典型的には、そのような系は、最適な活性化を供するためには、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を要する。哺乳動物細胞においては、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５（ＷＯ９９／０２６８３）は、絹ガ（ｓｉｌｋ  ｍｏｔｈ）Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されたエクジソン受容体が、外因性ダイマパートナーに対する必要性なくして、哺乳動物系で機能的であることを開示する。
【０００８】
米国特許第５，８８０，３３３号は植物で用いられるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロダイマー系を開示し、ここに、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメインは２つの異なるハイブリッド蛋白質に位置している。生憎、この系は、動物細胞において受容体遺伝子の発現を誘導するには効果的ではない（比較のためには、後記実施例１．２参照）。
これらの場合の各々において、（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５におけるように天然ＥｃＲとして、または国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０におけるように修飾されたＥｃＲとしての）トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメインを単一の分子に組み込み、他のヘテロダイマーパートナー（ＵＳＰまたはＲＸＲいずれか）をそれらの天然状態で用いた。
前記したＥｃＲ−ベースの遺伝子調節系の欠点は、リガンドの不存在下におけるかなりのバックグラウンド活性およびこれらの系が植物および動物双方において用いるには適用できないことを含む（米国特許第５，８８０，３３３号参照）。遺伝子発現の調整に依拠するほとんどの適用では、これらのＥｃＲ−ベースの系は望ましくない。従って、植物および動物双方において外因性遺伝子の発現を正確に調整するための改良された系に対する要望が当該分野に存在する。そのような改良された系は、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミックスおよびトランスジェニック動物における特性の調節のような適用で有用であろう。単純で、コンパクトであって、比較的安価で容易に入手でき、かつ宿主に対して低毒性であるリガンドに依存する改良された系は、生物学的系を調節するのに有用であることが判明しよう。
種々の刊行物が本明細書中で引用されており、その開示は、その全体が本発明の一部として参照される。しかしながら、本明細書中におけるいずれの文献の引用も、そのような文献が本出願に対して「先行技術」として利用できることを認めるものと解釈されるべきではない。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系、該新規な誘導性遺伝子発現系で用いられる新規な受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびこの誘導性遺伝子発現系を用いて宿主内の遺伝子の発現を調整する方法に関する。特に、出願人の発明は、トランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）突然変異を含む受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む改良された遺伝子発現調整系に関する。
具体的には、本発明は、ａ）ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセットと、ｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）ウルトラスピラクル受容体以外の核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセットとを含み、ＤＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインはエクジソン受容体、レチノイドＸ受容体、またはウルトラスピラクル受容体以外のポリペプチドからのものであり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメインは異なり、二量体化する遺伝子発現調整系に関する。
【００１０】
特別の実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメインを含む。
もう１つの特別の実施形態において、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）リガンド結合ドメインを含む。
好ましい実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含み、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。
また、本発明は、さらに、ｃ）ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセットを含む本発明による遺伝子発現調整系に関する。
また、本発明は、トランケーテッド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、トランケーション突然変異はリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
特に、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。もう１つの特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。もう１つの特別の実施形態において、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
また、本発明は、トランケーテッドレチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。特別の実施形態において、該二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。
また、本発明は、出願人の発明によるポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドに関する。特に、本発明は、トランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドは本発明によるポリヌクレオチドによってコードされる。
このように、また、本発明は、該ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドに関する。
【００１３】
また、出願人の発明は、本発明による遺伝子発現調整系を用いて宿主細胞において遺伝子発現を調整する方法に関する。具体的には、出願人の発明は、ａ）宿主細胞に本発明による遺伝子発現調整系を導入する工程、およびｂ）遺伝子発現調整系の第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインと独立して組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する工程を含む、調整されるべき遺伝子を含む宿主細胞において遺伝子の発現を調整する方法であって、発現されるべき遺伝子は、ｉ）第１のポリペプチドからのＤＮＡ−結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子を含むキメラ遺伝子の構成要素であり、それにより、リガンド、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む複合体が形成され、およびそれにより、複合体は宿主細胞において遺伝子の発現を調整する方法を提供する。
また、出願人の発明は、本発明による誘導性遺伝子発現系を含む単離された宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単離された宿主細胞に関する。従って、また、出願人の発明は、本発明による宿主細胞を含む非ヒト生物に関する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
出願人は、今回、リガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するエクジソン受容体またはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ポリペプチドのトランケーション突然変異体を含む改良されたエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系を開発した。この突然変異効果はリガンド結合活性またはリガンド感受性を増加または低下させることができ、それはステロイドまたは非ステロイド特異的とすることができる。このように、出願人の発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現を調整するのに有用な改良されたエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系を提供する。特に望ましい実施形態において、出願人の発明は、低下したレベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、かつ非ステロイドリガンドのマイクロモル下濃度に応答する誘導性遺伝子発現系を提供する。このように、出願人の新規な誘導性遺伝子発現系および宿主において遺伝子発現を調整する方法におけるその使用は、現在入手可能な誘導性発現系の制限を克服し、遺伝子発現を制御するための効果的な手段を当業者に提供する。
本発明は、原核生物および真核生物宿主細胞双方において遺伝子発現を調整するのに用いることができる新規な誘導性遺伝子発現系を提供する。出願人の発明は、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミックスおよびトランスジェニック生物における特性の調節のような適用で有用である。
【００１５】
（定義）
本開示において、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義を供するが、それは本発明の範囲および実施を理解する助けとなるはずである。
特別の実施形態において、用語「約」または「ほぼ」は、与えられた値または範囲の２０％内、好ましくは１０％内、より好ましくは５％内、よりいっそう好ましくは１％内を意味する。
用語「実質的に含まない」は、組成物中の少なくとも約７５重量％の蛋白質、ＤＮＡ、ベクターが「ＡおよびＢが属するスピーシズのカテゴリーに応じて」「Ａ」である場合に、「Ａ」（ここで、「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター、組み換え宿主細胞等である）を含む組成物が、「Ｂ」（ここで、「Ｂ」は１以上の汚染蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物中に少なくとも、Ａ＋Ｂスピーシズの約９０重量％で含まれ、最も好ましくは少なくとも約９９重量％である。また、汚染物を実質的に含まない組成物が、注目するスピーシズの活性または特徴を有する単一の分子量スピーシズのみを含むのが好ましい。
本発明の目的では用語「単離された」は、その元来の環境（それが天然で存在する環境）から取り出されてしまっている生物学的物質（核酸または蛋白質）を示す。
例えば、植物または動物において天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていない。同ポリヌクレオチドが、それが天然で存在する隣接核酸から分離される。用語「精製された」は、物質が、他の化合物の存在を排除して絶対的純度を呈する形態で存在することを要しない。それはむしろ相対定義である。
【００１６】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１オーダーの大きさ、好ましくは２または３、好ましくは４または５オーダーの大きさまでの出発物質または天然物質の精製後に「精製された」状態である。
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合して構成されるポリマー化合物である。核酸はポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、その双方は一本鎖または二本鎖であってよい。ＤＮＡは、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは線状、環状またはスーパーコイルドであってよい。
「核酸分子」とは、一本鎖形態、あるいは二本鎖ラセンいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン、「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいは、ホスホロチオエートおよびチオエステルのようなそのいずれかのホスホエステルアナログをいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡラセンは可能である。用語「核酸分子」、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、それをいずれかの特定の三次形態に限定しない。このように、この用語は、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにおいて、配列は、ＤＮＡの非転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’への方向の配列のみを与える通常の約束に従ってここでは記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００１７】
用語「断片」は、参照核酸に対して長さが減少し、かつ通常の部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味すると理解されるであろう。そのような本発明による核酸断片は、適切な場合には、それがその構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含ませることができる。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０ないし２５，３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００または１５００連続ヌクレオチドの長さの範囲であるオリゴヌクレオチドを含み、またはそのようなオリゴヌクレオチドよりなる。
本明細書中で用いるように、「単離された核酸断片」は、所望により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含む一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含むことができる。
【００１８】
「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリをいい、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」とは、コード配列に先行し（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）調節配列を含めた、特異的蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸断片もいう。「天然遺伝子」とは、その自身の調節配列を持つものとして天然で見出される遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、一緒に天然では見出されない調節および／またはコード配列を含む、天然遺伝子ではないいずれの遺伝子もいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同一源に由来するが、天然で見出されるものとは異なるように配列された調節配列およびコード配列を含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコード配列および／または異なる源に由来する調節配列を含むことができる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に通常は見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子をいう。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」は、形質転換手法によってゲノムに導入されている遺伝子である。
「異種」ＤＮＡとは、細胞において、または細胞の染色体部位において天然には位置しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞に対して外来性である遺伝子を含む。
用語「ゲノム」は、染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００１９】
核酸分子は、該核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのようなもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズできる（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（下記）参照）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）その中の特に第１１章および表１１．１（その全てが本明細書の一部として参照される）に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」を決定する。
ストリンジェンシー条件を調整して、遠縁関係の生物からの相同配列のような中程度に類似する断片ないし、密接に関係する生物からの機能的酵素を複製する遺伝子のような高度に類似する断片までにつきスクリーニングすることができる。相同核酸についての予備的スクリーニングでは、５５°のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルクおよびホルムアミド無し、または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いることができる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣにての４０％ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最高Ｔｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣにての５０％ホルムアミドに対応する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含むことを要する。
【００２０】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記載するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、ここに開示される、または用いられる完全な配列ならびにそれらの実質的に同様な核酸配列に相補的な単離された核酸ヌクレオチドも含む。
特別な実施形態において、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは５５℃のＴｍを言い、前記した条件を利用する。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい実施形態においては、Ｔｍは６５℃である。
ハイブリダイゼーション後洗浄もまたストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、室温にての１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで出発する一連の洗浄を利用し、次いで、４５℃にての３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで反復し、次いで、５０℃にての３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回反復する。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い温度を用い、ここに、洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最終の２回の３０分間洗浄の温度を６０℃まで上昇させたことを除いて前記のものに同一である。高度にストリンジェントな条件のもう１つの好ましい組は６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含むことを要する。
【００２１】
核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当該分野でよく知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の同様性または相同性の程度が大きくなると、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は以下の順番で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、９．５０〜０．５１参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１１．７〜１１．８参照）。
１つの実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、該長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度は、要すれば、プローブの長さのような因子に従って調整することができる。
【００２２】
用語「プローブ」とは、相補的な一本鎖標的核酸とで塩基対合して、二本鎖分子を形成できる一本鎖核酸分子をいう。
本明細書中で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズできる、一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチドまたはビオチンのような標識が共有結合によりコンジュゲートしているヌクレオチドで標識することができる。標識されたオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて核酸の存在を検出することができる。オリゴヌクレオチド（その一方または双方は標識できる）を、全長または核酸の断片いずれかをクローニングするために、あるいは核酸の存在を検出するためにＰＣＲプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡ分子とで三重ラセンを形成させることもできる。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸合成器で合成により調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等のような非天然ホスホエステルアナログ結合にて調製することができる。
【００２３】
「プライマー」は、標的核酸配列にハイブリダイズして、適当な条件下でＤＮＡ合成用の開始点として働くことができる二本鎖核酸領域を作り出すオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーはポリメラーゼ鎖反応で用いることができる。
「ポリメラーゼ鎖反応」はＰＣＲと略され、特異的核酸配列を酵素により増幅するためのイン・ビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、各サイクルが３つの段階：標的分子のストランドを分離するための鋳型核酸の変性、鋳型核酸への一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む温度サイクルの反復シリーズを含む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内でその標的核酸の相対的量を測定する手段を提供する。
「逆転写−ポリメラーゼ鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと略され、ＲＮＡ分子または複数分子から標的ｃＤＮＡ分子または複数分子を酵素的に生産し、続いて、前記したように標的ｃＤＮＡ分子または複数分子内で特異的核酸配列または複数配列を酵素的に増幅するイン・ビトロ方法を意味する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内でその標的分子の相対的量を測定する手段を提供する。
【００２４】
ＤＮＡ「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、イン・ビトロまたはイン・ビボにて細胞において転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適当な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクタ結合部位およびステム−ループ構造を含むことができる。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決定する。コード配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含むことができる。コード配列が真核生物細胞における発現で意図されるならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略され、ＡＴＧまたはＡＵＧのような翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、潜在的にポリペプチド配列に翻訳することができるＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡいずれかのある長さの核酸配列を意味する。
【００２５】
用語「ヘッド−ツー−ヘッド」は、相互に関連する２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために本明細書中で用いられる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドの５’末端から離れるように進行する場合に、ヘッド−ツー−ヘッドの向きで２つのポリヌクレオチドは位置する。用語「ヘッド−ツー−ヘッド」は（５’）−ｔｏ−（５’）と略することができ、記号（←→）または（３’←５’５’→３’）によって示すこともできる。
用語「テール−ツー−テール」は、相互に関連する２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために本明細書中で用いられる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドに向かって進む場合に、２つのポリヌクレオチドはテール−ツー−テールの向きに位置する。用語「テール−ツー−テール」は（３’）−ｔｏ−（３’）と略することができ、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）によって示すこともできる。
用語「ヘッド−ツー−テール」は、相互に関連する２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために本明細書中で用いられる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドのそれと同一方向に進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−ツー−テールの向きに位置する。用語「ヘッド−ツー−テール」は（５’）−ｔｏ−（３’）と略することができ、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）によって示すこともできる。
【００２６】
用語「下流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コード配列または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始点の上流に位置する。
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列に結合し、切断する酵素をいう。
「相同組換え」とは、もう１つのＤＮＡ分子への外来性ＤＮＡ配列の挿入、例えば、ベクターの染色体への挿入をいう。好ましくは、ベクターは、相同組換え用の特異的染色体部位を標的とする。特異的相同組換えでは、ベクターは、染色体の配列に対する相同性の十分に長い領域を含んで、染色体への相補的結合およびそれへのベクターの組込みを可能とする。相同性のより長い領域、および配列同様性のより大きな程度は相同組換えの効率を増加させることができる。
【００２７】
当該分野で知られたいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを増殖させることができる。一旦適当な宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増殖させ、量的に調製することができる。本明細書中に記載するように、用いることができる発現ベクターは、限定されるものではないが、名前を挙げると少数であるが、以下のベクターまたはそれらの誘導体：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを含む。
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のためのいずれかの手段である。ベクターは、もう１つのＤＮＡセグメントをそれに付着させて、付着されたセグメントの複製を行うことができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、イン・ビボでＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製することができるいずれかの遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにて、核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段を共に含む。当該分野で公知の多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子等に組み込むことができる。可能なベクターは、例えば、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはＰＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体のようなプラスミド、またはブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクターを含めたプラスミドまたは修飾されたウイルスを含む。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の適当なベクターへの挿入は、相補的粘着末端を有する選択されたベクターへ適当なＤＮＡ断片を連結することによって達成することができる。別法として、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾することができるか、あるいはいずれの部位もヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによって生じさせることができる。そのようなベクターを作成して、細胞ゲノムにマーカーを取り込んだ細胞の選択を供する選択マーカー遺伝子を含ませることができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされる蛋白質を取り込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能とする。
【００２８】
ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、細胞ならびに生きた動物対象において広く種々の遺伝子送達適用で用いられてきた。用いることができるウイルスベクターは、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ−関連ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純疱疹、エプスタイン−バール、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルスベクターを含む。非ウイルスベクターはプラスミド、リポソーム、電気的に荷電された脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−蛋白質複合体およびバイオポリマーを含む。核酸に加えて、ベクターは核酸導入の結果（その組織への導入、発現の持続等）を選択し、測定しおよびモニターするのに有用な１以上の調節領域および／または選択マーカーも含むことができる。
用語「プラスミド」とは、細胞の中枢的代謝の一部ではない遺伝子をしばしば運び、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外エレメントをいう。そのようなエレメントは、いずれかの源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム取り込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状、環状またはスーパーコイルド）とすることができ、そこでは、適当な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片および選択された遺伝子産物についてのＤＮＡ配列を細胞に導入することができるユニークな構築に多数のヌクレオチド配列が合わせ、または組み換えられている。
【００２９】
「クローニングベクター」は、もう１つの核酸セグメントが付着され、該付着されたセグメントの複製を行うことができる、プラスミド、ファージまたはコスミドのような、順次に複製する核酸、好ましくはＤＮＡの単位長さであって、複製起点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは、１つの細胞型において複製することができ、もう１つの細胞型において発現することができるようにできる（「シャトルベクター」）。
ベクターは、当該分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）によって、遺伝子銃またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる（例えばＷｕら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４、およびＨａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号参照）。
【００３０】
また、本発明によるポリヌクレオチドは、リポフェクションによって、イン・ビボにて導入することができる。過去１０年間、イン・ビトロにて核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためにリポソームが徐々に使用されてきた。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇する困難および危険性を制限するために設計された合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のイン・ビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７．ＰＮＡＳ  ８４：７４１３、Ｍａｃｋｅｙら、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７〜８０３１、およびＵｌｍｅｒら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４８）。カチオン性脂質の使用は負に荷電した核酸のカプセル化を促進することができ、また、負に荷電した細胞膜との融合を促進することもできる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７〜３８８）。核酸の導入のための特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許出願公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来性遺伝子をイン・ビボにて特異的器官に導入するためのリポフェクションの使用はある種の実用的利点を有する。特異的細胞に対するリポソームの分子標的化は１つの有利な領域を表す。特定の細胞型へトランスフェクションを向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような、細胞不均一性を持つ組織で特に好ましいであろうことは明らかである。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる（Ｍａｃｋｅｙら、１９８８，上記）。標的化ペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および抗体のような蛋白質、または非ペプチド分子を化学的にリポソームにカップリングさせることができよう。
【００３１】
また、他の分子は、カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ−結合蛋白質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）のような、イン・ビボでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用である。
また、裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターをイン・ビボで導入するのも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、５，５８９，４６６号、および５，５８０，８５９号参照）。また、受容体−媒介ＤＮＡ送達アプローチも用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４、および、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９８７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２）。
【００３２】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの摂取を意味する。外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内部に導入されてしまっている場合、細胞はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化に影響する場合、細胞は外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＲＮＡまたはＤＮＡは、染色体ＤＮＡに組み込む（共有結合させる）ことができ、細胞のゲノムを形成する。
「形質転換」とは、宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入をいい、その結果、遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物をいう。
用語「遺伝子領域」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域をいう。
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、それらの増幅またはそれらの発現が求められる細胞宿主における複製のための１以上の起点、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性に基づいて選択することができる抗生物質または化学物質抵抗性遺伝子、比色マーカー、酵素、蛍光マーカー等を意味し、ここに、該効果を用いて注目する核酸の遺伝を追跡しおよび／または注目する核酸を遺伝した細胞または生物を同定する。当該分野で知られ用いられる選択マーカー遺伝子の例は：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミド等に対する抵抗性を供する遺伝子、および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等を含む。
【００３３】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を意味し、ここで、該効果を用いて注目する核酸の遺伝子を追跡し、注目する核酸を遺伝した細胞または生物を同定し、および／または遺伝子発現導入または転写を測定する。当該分野で知られ用いられるレポーター遺伝子の例は：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等を含む。選択マーカーはレポーター遺伝子とも考えられる。
「プロモーター」とは、コード配列の発現を制御することができるＤＮＡ配列または機能的ＲＮＡをいう。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターはその全部が天然遺伝子に由来することができるか、あるいは天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成することができるか、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含みさえできる。異なるプロモーターが異なる細胞または細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができるのは当業者によって理解される。遺伝子が種々の時点においてほとんどの細胞型で発現されるようにするプロモーターは、通常は、「構成的プロモーター」といわれる。遺伝子が特異的細胞型で発現されるようにするプロモーターは、通常、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」をいう。遺伝子が発生または細胞分化の特定の段階で発現されるようにするプロモーターは、通常、「発生的に特異的なプロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」という。遺伝子が、プロモーターを誘導する剤、生物学的分子、化学的リガンド、光等での細胞の暴露または処理に続いて誘導され、発現されるようにするプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」という。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片は同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。
【００３４】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、および下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は転写開始部位によってその３’末端が境界となり、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最終数の塩基またはエレメントを含ませるように上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、（便宜には、例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって規定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。
コード配列が、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それは（もしコード配列がイントロンを含めば）トランスーＲＮＡスプライスされ、コード配列によってコードされる蛋白質に翻訳される場合、細胞において転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を供するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列である。真核生物細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
用語「応答エレメント」は、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ−結合ドメインとの相互作用を介して媒介されるプロモーターに応答性を付与する１以上のシスー作用性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントはその配列が回文構造（完全または不完全）とすることができるか、あるいは可変数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフまたはハーフサイト（ｈａｌｆ  ｓｉｔｅ）から構成することができる。ハーフサイトは同様または同一とすることができ、直接的または逆反復繰り返しとして、または単一ハーフサイトまたはタンデムにての隣接ハーフサイトのマルチマーとして配置することができる。応答エレメントは、応答エレメントを取り込むことができる細胞または生物の性質に応じて、異なる生物から単離された最小プロモーターを含むことができる。第１のハイブリッド蛋白質のＤＮＡ−結合ドメインは、リガンドの不存在または存在下において、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントについてのＤＮＡ配列の例は：ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒｂａｓ  Ｌら、（１９９１），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５、１２０〜１３１参照）、Ｎ（ｎ）が１以上のスペーサーヌクレオチドであり得るＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（Ｄ’Ａｖｉｎｏ  ＰＰら、（１９９５），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１１３、１〜９参照）、およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ  Ｃ．ら、（１９９４）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４、４４６５〜４４７４参照）を含む。
【００３５】
用語「作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、１つの機能がもう１つによって影響され得るような、単一核酸断片への核酸配列の会合をいう。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響される場合、コード配列に作動可能に連結している（すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列はセンスまたはアンチセンス向きに調節配列に作動可能に連結することができる。
本明細書中で用いる用語「発現」は、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。発現は蛋白質またはポリペプチドへのｍＲＮＡの転写もいうことができる。
【００３６】
用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特異的制限部位にて、あるいは相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームにてのカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質転換カセット」とは、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ該ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特異的ベクターをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞における注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能とするエレメントも含むこともできる。これらのエレメントは、限定されるものでないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことができる。
【００３７】
本発明の目的では、用語「遺伝子スイッチ」では、プロモーターと会合した応答エレメントと、１以上のリガンドの存在下で、応答遺伝子およびプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を調整するＥｃＲベースの系との組合わせをいう。
用語「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、核酸または遺伝子の発現を誘導し、低下し、または阻害することを意味し、その結果、蛋白質またはポリペプチドの生産の各誘導、低下または阻害がもたらされる。
本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動するのに適した少なくとも１つのプロモーターを含むことができる。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローン化遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常は、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー等のような制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいずれのプロモーターも本発明で適しており、該プロモーター、限定されるものではないが：ウイルスプロモーター、植物プロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリホスファターゼプロモーター（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現で有用）、ＡＯＸ１プロモーター（Ｐｉｃｈｉａでの発現で有用）、ｂ−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでの発現で有用）、および光調節−、種子特異的−、花粉特異的−、卵巣特異的−、病原体または病気関連−、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ  ３５Ｓ最小、キャッサバベインモザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質、リブロース１，５−ビスホスフェイトカルボキシラーゼ、苗条−特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍウイルス、植物スーパープロモーター、タバコロイシンアミノペプチダーゼ、ニトレートレダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞での発現で有用）を含み、当該分野で知られている動物および哺乳動物プロモーターは、限定されるのもではないが、ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター、アデノウイルスのＥ１Ａのプロモーターまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス初期プロモーター、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、延長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列、および転写制御領域、普遍的プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリン等）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ���たは第ＶＩＩＩ、型因子等の）治療剤のプロモーター、および膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域のような、組織特異性を呈し、かつトランスジェニック動物で利用されてきたプロモーター、膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、アルブミン遺伝子、肝臓で活性なＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なアルファーフェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域、骨髄様細胞で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳中の稀突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルベートキナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸蛋白質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーター等を含む。本発明の好ましい実施形態において、プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、キャッサバベインモザイクウイルスプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ最小プロモーター、延長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、およびアルブミンプロモーターよりなる群から選択される。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列等の付加によって修飾することができる。
【００３８】
本発明の実施形態で用いることのできるエンハンサーは、限定されるものではないが、タバコモザイクウイルスエンハンサー、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓエンハンサー、タバコエッチウイルスエンハンサー、リブロース１，５−ビスホスフェイトカルボキシラーゼエンハンサー、イネｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍウイルスエンハンサー、および他の植物およびウイルス遺伝子エンハンサー等を含む。
また、終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列は、好ましい宿主にとって天然の種々の遺伝子に由来することができる。所望により終止部位は不必要であり得るが、もし含ませると最も好ましい。本発明の好ましい実施形態において終止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、アグロカテウムウイルスおよび植物ターミネーター配列等を含むことができるか、あるいはそれらに由来することができる。
【００３９】
用語「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コード配列の下流（３’）に位置したＤＮＡ配列をいい、それはポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる調節シグナルをコードする他の配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸区域のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に影響することによって特徴付けられる。
「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、天然では特定の核酸（同種領域）を発現するのを担う配列を含むことができるか、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質（異種領域）さえを発現することを担う異なる源の配列を含むことができる。特に、該配列は、特異的または非特異的に、および誘導性または非誘導性にて遺伝子の転写を刺激または抑制する、原核生物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列、あるいは誘導配列とすることができる。調節領域は複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路に向けるシグナル配列を含む。
【００４０】
「異種源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関連しない調節領域である。異種調節領域には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、天然では生じないが、当業者によって設計される調節配列が含まれる。
「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写に由来する産物をいう。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写体というか、あるいはそれは一次転写体の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列とすることができ、それは成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンがなく、かつ細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的であって、それに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写体をいう。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写体またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的であって、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写体をいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的遺伝子転写体のいずれかの部分に関するものであり、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列におけるものである。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳されていないが、細胞プロセスに対して影響を有するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または他のＲＮＡをいう。
【００４１】
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基よりなるポリマー化合物である。アミノ酸は以下の構造式：
【化４】
0005031967.tif 000002
を有する。アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有する側鎖、（３）硫黄原子を含有する側鎖、（４）酸性またはアミド基を含有する側鎖、（５）塩基性基を含有する側鎖、（６）芳香族環を含有する側鎖、（７）プロリン、側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４アミノ酸を含む。
「蛋白質」は、生細胞において構造的または機能的役割を実行するポリペプチドである。
「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」は、天然状態ではそれと通常は会合する化合物（例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離された」は、他の化合物との人工的または合成混合物、または生物学的活性に干渉せず、および例えば、医薬上許容される製剤への不完全な精製、安定化剤の添加、または調合により存在するかもしれない不純物の存在を排除することを意図しない。
【００４２】
本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドのそれよりも短く、これらの参照ポリペプチドに関する全部分にわたって、同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのような断片は、適切な場合には、それらが一部であるより大きなポリペプチドに含ませることができる。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、１０、１５、２０、３０ないし４０、５０、１００、２００または３００アミノ酸の長さを有することができる。
ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由来し、かつ該ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的特性を保有するいずれかのアナログ、断片、誘導体または突然変異体である。該ポリペプチドまたは蛋白質の異なる変種は天然に存在し得る。これらの変種は蛋白質につきコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子変種であり得るか、あるいは異なるスプライシングまたは翻訳後修飾を含むことができる。当業者であれば、単一または複数アミノ酸の置換、欠失、付加または置き換えを有する変種を製造することができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変種、（ｂ）１以上のアミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変種、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が血清アルブミンのようなもう１つのポリペプチドと融合した変種を含むことができる。遺伝子的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的および酵素的技術を含めた、これらの変種を得るための技術は当業者に知られている。変種ポリペプチドは好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【００４３】
「異種蛋白質」とは、天然では細胞で生産されない蛋白質をいう。
「成熟蛋白質」とは、翻訳後にプロセッシングされたポリペプチド、すなわち、一次翻訳産物に存在するいずれかのプレ−またはプロペプチドが除去されているものをいう。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物をいい、すなわち、プレ−およびプロペプチドが依然として存在する。プレ−およびプロペプチドは、限定されるものではないが、細胞内局所化シグナルであり得る。
用語「シグナルペプチド」とは、分泌された成熟蛋白質に先立つアミノ末端ポリペプチドをいう。シグナルペプチドは成熟蛋白質から切断されており、従って、成熟蛋白質には存在しない。シグナルペプチドは分泌された蛋白質を細胞膜を横切って方向付けし、転移させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナル蛋白質ともいわれる。
「シグナル配列」は蛋白質のコード配列の最初に含まれて、細胞の表面に発現される。この配列は、宿主細胞に指令してポリペプチドを転移させる、成熟ポリペプチドのＮ−末端側にあるシグナルペプチドをコードする。用語「転移シグナル配列」はこの種のシグナル配列をいうために本明細書中で用いられる。転移シグナル配列は真核生物および原核生物に対して天然の種々の蛋白質と会合して見出すことができ、しばしば、両方のタイプの生物で機能的である。
【００４４】
用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部位の間の同一性のパーセントをいう。もう１つのものに対する１つの部位からの配列の間の相当性は当該分野で知られている技術によって決定することができる。例えば、配列情報を整列させ、容易に入手できるコンピュータープログラムを用いることによって、２つのポリペプチド分子の間の配列情報の直接的比較によって相同性を決定することができる。別法として、相同性は、相同領域の間で安定なデュプレックスを形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いての一本鎖−特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断片のサイズ測定によって決定することができる。
本明細書中で用いるように、全てのその文法的形式およびスペリングの変形における用語「相同な」は、スーパーファミリーからの蛋白質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種からの相同蛋白質（例えば、ミオシン軽鎖等）を含めた、「通常の進化源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７．）。そのような蛋白質（およびそれらのコード配列）は、配列同様性のその高い程度によって反映されるように配列相同性を有する。
【００４５】
従って、全てのその文法的形式における用語「配列同様性（ｓｉｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、共通の進化起源を共有するまたは共有しないかもしれない蛋白質の核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の程度をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７参照）。本明細書中で用いるように、全てのその文法的形式およびスペリング変形における用語「相同な」とは、スーパーファミリーからの蛋白質および異なる種からの相同蛋白質を含めた、「共通の進化起源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋら、上記）。そのような蛋白質（およびそれらのコーディング遺伝子）は、配列同様性のその高い程度によって反映されるように配列相同性を有する。しかしながら、共通の用法において、および本出願において、用語「相同な」は、「高度に」のような副詞で修飾する場合、配列同様性をいい、共通の進化起源をいわない。
特別の実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の規定された長さにわたってマッチする場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」であるかまたは「実質的に同様」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手可能な標準的ソフトウェアを用いて配列を比較することによって、または例えば、その特定の系に対して規定されたストリンジェントでの条件下でのサザーンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は当業者の技量内のものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、（上記）参照。
【００４６】
本明細書中で用いるように、「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化の結果、１以上のアミノ酸の置換がもたらされるが、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能的特性に影響しない核酸断片をいう。また、「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは共−抑制技術によって遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片もいう。また、「実質的に同様な」とは、得られた転写体の機能的特性に実質的に影響しない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のような本発明の核酸断片に対する修飾もいう。従って、本発明は具体的例示配列を超えて含むことが理解される。コードされた産物の生物学的活性の保持の測定が当てはまるように、提案された修飾の各々は当該分野においてルーチン的技量内のものである。
さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に同様な配列は、ストリンジェント条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いての０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄）下で、本明細書中に例示された配列にハイブリダイズするそれらの能力によっても規定されることを認識する。本発明の実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明細書中に報告される核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも７０％同一である核酸断片である。本発明の好ましい実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明細書中に報告した核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも８０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、本明細書中に報告された核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９０％同一である。なおより好ましいのは、本明細書中に報告された核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９５％同一である核酸断片である。
アミノ酸の約４０％を超えて同一であるか、６０％を超えて同様である（機能的に同一である）場合に、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に同様」である。好ましくは、同様または相同アミノ酸は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いる整列によって同定される。
【００４７】
用語「に対応する」とは、正確な位置が、同様性または相同性がそれに対して測定される分子とは同一または異なるに拘わらず、本明細書中では、同様または相同配列をいうのに用いられる。核酸またはアミノ酸配列の整列はスペースを含むことができる。このように、用語「に対応する」とは、配列同様性をいう。アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングをいわない。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価によって、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照）のようなアルゴリズムを用いるコンピューター−自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたはその遺伝子を推定的に同定するために十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、１０以上の連続アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が、公知の蛋白質または遺伝子に相同なポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子の同定（例えば、サザーンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュハイブリダイゼーション）の配列−依存的方法で用いることができる。加えて、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして用いて、プライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当該配列を含む核酸断片を特異的に同定しおよび／または単離するのに十分な配列を含む。
【００４８】
用語「パーセント同一性」は、当該分野で知られているように、配列を比較することによって決定された、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野においては、「同一性」は、かかる配列のストリングの間のマッチによって決定して当てはまるように、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「同様性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されたものを含むがそれらに限定されない公知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、テストした配列の間でのベストマッチを与えるように設計される。同一性および同様性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列整列およびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォーマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて実行することができる（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。配列の複数整列は、デフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）での整列のＣｌｕｓｔａｌ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）を用いて実行することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を用いる対様式（ｐａｉｒｗｉｓｅ）整列のためのデフォルトパラメーターは選択することができる：ＫＴＵＰＬＥ１，ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【００４９】
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析で有用ないずれのコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムもいう。「配列分析ソフトウェア」は商業的に入手可能であるか、独立して開発することができる。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定されるものではないが、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および（ＤＮＡＳＴＡＲ（（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）を含むであろう。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを用いる場合、特記しない限り、分析の結果は引用されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろうことが理解されるであろう。本明細書中で用いるように、「デフォルト値」は、最初に開始されると元来はソフトウェアにロードされる値またはパラメーターのいずれかの組を意味する。
【００５０】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手法を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド形成ブロックから組み立てることができる。これらの形成ブロックを連結し、アニールして遺伝子セグメントが形成され、これは、次いで、酵素的に組み立てられて全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連する「化学的に合成された」とは、成分ヌクレオチドがイン・ビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成はよく確立された手法を用いて達成することができるか、あるいは自動化学合成は、多数の商業的に入手可能なマシーンの内の１つを用いて実行することができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏りを反映するように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適遺伝子発現のために仕立てることができる。当業者であれば、もしコドンの用法が宿主に都合の良いコドンに偏っていれば、成功した遺伝子発現の確率を認識する。好ましいコドンの決定は、配列の情報が入手できる場合、宿主細胞に由来する遺伝子の概観に基づくことができる。
【００５１】
本発明の遺伝子発現調整系
出願人は、今回、トランス活性化およびＤＮＡ−結合ドメインを２つの異なる蛋白質上に置くことによって、分離した結果、リガンドの不存在下での大いに低下したバックグラウンド活性およびリガンドの存在下でのバックグラウンドよりもかなり増加した活性がもたらされることを示した。出願人の改良された遺伝子発現系は２つのキメラ遺伝子発現を含み、第１のものは核受容体ポリペプチドに融合したＤＮＡ−結合ドメインをコードし、第２のものは核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする。第１の蛋白質と第２の蛋白質との相互作用は、ＤＮＡ−結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に連結させる。ＤＮＡ−結合およびトランス活性化ドメインは２つの異なる分子に存在するので、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は大いに低下する。
【００５２】
一般に、本発明の誘導性遺伝子発現調整系は、ａ）ｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞で発現させることができる第１のキメラ遺伝子、およびｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）以外の核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞で発現させることができる第２のキメラ遺伝子を含み、トランス活性化ドメインはＥｃＲ、ＲＸＲまたはＵＳＰ以外からのものであり、および、第１のハイブリッドポリペプチドおよび第２のハイブリッドペプチドからのリガンド結合ドメインは異なり、二量体化する。
この２−ハイブリッド系は、ＤＮＡ−結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ−結合部位に結合する場合に、トランス活性化ドメインがプロモーターをより効果的に活性化するように、ＤＮＡ−結合ドメインに対してより都合の良い位置に転写活性化ドメインを運ぶ相互作用蛋白質の対の能力を開発する（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号参照）。この２−ハイブリッド系は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５に開示されておる２つの系と比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現調整系である。
【００５３】
本発明のエクジソン受容体ベースの遺伝子発現調整系はヘテロダイマーおよびホモダイマーいずれかとすることができる。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリーの２つのメンバー、種々の昆虫から得られたエクジソン受容体蛋白質、およびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）蛋白質またはＵＳＰの脊椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体蛋白質よりなるヘテロダイマー蛋白質複合体をいう（Ｙａｏら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，４７６〜４７９、Ｙａｏら、（１９９２）Ｃｏｌｌ  ７１，６３〜７２参照）。しかしながら、該複合体は後に詳細に記載するごときホモダイマーとすることもできる。機能的エクジステロイド受容体複合体はイムノフィリンのようなさらなる蛋白質（類）を含むこともできる。（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１のような）転写因子として知られた蛋白質のステロイド受容体ファミリーのさらなるメンバーは、ＥｃＲ、ＵＳＰおよび／またはＲＸＲに対するリガンド依存性または非依存性パートナーとすることもできる。加えて、（アダプターまたはメディエーターともいう）コアクチベータとして一般に知られた蛋白質のような他の補因子が必要な場合がある。これらの蛋白質はＤＮＡに配列−特異的には結合せず、基本的な転写には関与しない。それらは、クロマチン構造に影響することによって、またはアクチベータ−開始複合体相互作用を媒介することによって、アクチベータのＤＮＡ−結合の刺激を含めた、種々のメカニズムを介して転写活性化に対してその効果を発揮することができる。そのようなコアクチベータの例はＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに渾然としたコアクチベータＣ応答エレメントＢ結合蛋白質、ＣＢＰ／ｐ３００を含む（レビューには、Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２２２〜２３２，１９９７参照）。また、（リプレッサ、サイレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られた）コリプレッサとして一般には知られた蛋白質補因子が、リガンドの不存在下で転写活性を効果的に阻害するのに必要であろう。これらのコリプレッサは未リガンド化（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）エクジソン受容体と相互作用して、応答エレメントにおいて活性をサイレンス化させることができる。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座を変化させ、その結果、コリプレッサの放出および前記したコアクチベータの動員をもたらし、それにより、それらのサイレンシング活性を無くすることを示唆する。コリプレッサの例はＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴを含む（レビューには、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７〜１１７７，１９９６参照）。これらの補因子は細胞または生物内で内因性であり得るか、あるいはトランスジーンとして外因的に付加されて、調節または未調節様式いずれかで発現させることができる。エクジソン受容体蛋白質、ＵＳＰまたはＲＸＲのホモダイマー複合体もまたある状況下では機能的であり得る。
【００５４】
エクジソン受容体複合体は、典型的には、全てのメンバーがアミノ−末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから分離されたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含む。本明細書中で用いるように用語「ＤＮＡ−結合ドメイン」は、ＤＮＡ−結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り、ＤＮＡ−結合蛋白質の全長まで、ＤＮＡ−結合蛋白質の最小ペプチド配列を含む。核受容体スーパーファミリーのメンバーは４つまたは５つドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびいくつかのメンバーではＦの存在によっても特徴付けられる（Ｅｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８８９〜８９５（１９８８）参照）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ−結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、および「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。該ファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ末端側にもう１つのトランス活性化ドメインを有することもできる。
ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボックスである間の２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは天然のものであり、修飾されており、または異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラであり得る。ステロイド受容体ファミリーのサブセットのように、このＥｃＲ受容体は、ヘテロ二量体化特性を担うようには規定されていない領域も保有する。ＥｃＲ、ＵＳＰおよびＲＸＲのドメインは天然でモジュール式であるので、ＬＢＤ、ＤＢＤおよびトランス活性化ドメインは相互に交換することができる。
【００５５】
エクジソン受容体複合体からの構成物を取り込む遺伝子スイッチ系が知られている。しかしながら、これらの公知の系においては、ＥｃＲが用いられる場合は常に、それは、同一分子上の天然もしくは修飾されたＤＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインと会合している。ＵＳＰまたはＲＸＲは、典型的には、サイレントパートナーとして用いられる。我々は、今回、ＤＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが同一分子上にある場合、リガンドの不存在下でのバックグラウンド活性は高く、そのような活性は、ＤＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが異なる分子上、すなわち、ヘテロダイマーまたはホモダイマー複合体の２つのパートナー各々の上にある場合、劇的に低下することを示した。この２−ハイブリッド系は、ステロイドリガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合、非ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対して改良された感受性を提供する。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイドリガンドはより低い濃度でより高い活性を供する。加えて、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づくトランス活性化はしばしば細胞系依存的であるので、スイッチング系を仕立てて、各適用のために最大トランス活性化能力を得るのは容易である。さらに、この２−ハイブリッド系は、未修飾ＲＸＲをスイッチングパートナーとして用いる場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。この２−ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然ＤＮＡ−結合およびトランス活性化ドメインは排除される。その結果、これらのキメラ分子は、細胞に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスは低く、その結果副作用は低下する。
【００５６】
具体的には、出願人の発明は、ａ）宿主細胞で発現させることができる第１の発現カセット、ここで、該第１の遺伝子発現カセットはｉ）その発現が調整されるべき遺伝子に関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、およびｂ）宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット、ここで、該第２の遺伝子発現カセットは、ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）以外の核受容体からのリガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメイン、を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡ−結合ドメインおよびトランス活性化ドメインはＥｃＲ、ＲＸＲ、またはＵＳＰ以外からのものであり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドからのリガンド結合ドメインは異なり、二量体化する遺伝子発現調整系に関する。
また、本発明は、さらに、ｃ）ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセットを含む本発明による遺伝子発現調整系に関する。
【００５７】
特別の実施形態において、その発現が調整されるべき遺伝子は宿主細胞に関して相同遺伝子である。もう１つの特別の実施形態において、その発現が調整されるべき遺伝子は宿主細胞に関して異種遺伝子である。
特別の実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含む。
もう１つの特別の実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。
特別の実施形態において、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含む。
もう１つの特別の実施形態において、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。
好ましい実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含み、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む。
もう１つの好ましい実施形態において、第１のポリペプチドのリガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体ポリペプチドからのものであり、第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインはエクジソン受容体ポリペプチドからのものである。
好ましくは、リガンド結合ドメインはＥｃＲまたはＲＸＲ関連ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ファミリーメンバーのリガンド結合ドメイン、またはそのアナログ、組合わせもしくは修飾である。より好ましくは、ＬＢＤはＥｃＲまたはＲＸＲからのものである。なおより好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲからのものである。トランケーション突然変異は、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼ消化／欠失、ＰＣＲ−媒介／オリゴヌクレオチド−指向性欠失、化学的突然変異誘発、ＵＶストランド分解等を含めた、当該分野で用いられるいずれの方法によっても作成することができる。
【００５８】
好ましくは、ＥｃＲはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲ、Ｄｉｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲ、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  ＥｃＲ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲおよびＨｅｍｉｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲよりなる群から選択される昆虫ＥｃＲである。より好ましくは、用いられるＥｃＲはハマキガ科のガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  Ｍｏｌｉｔｏｒ  ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ  ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ  ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、絹ガＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、カＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ  ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエ科およびニクバエ科のハエＬｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ  ＥｃＲ（「ＬｃＥｃＲ」）、地中海ショウジョウバエＣｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ  ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、イナゴＬｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ  ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ  ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキＵｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  Ｅｃｒ（“「ＵｐＥｃＲ」）、またはマダニＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）である。尚より好ましくは、ＬＢＤはハマキガ科のガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）からのものである。
【００５９】
好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッド昆虫ＥｃＲからのものである。昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全なおよび／または部分的ドメイン欠失の組合わせも行うことができる。
【００６０】
好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
もう１つの好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。
好ましくは、ＲＸＲポリペプチドはマウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＸＲ（「ＭｍＲＸＲ」）またはヒトＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＸＲ（「ＨｓＲＸＲ」）である。ＲＸＲポリペプチドはＲＸＲα、ＲＸＲβまたはＲＸＲγアイソフォームであり得る。
好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＲＸＲからのものである。ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましくは、ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ドメイン欠失の組合わせも行うことができる。
【００６１】
好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
もう１つの好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインは配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。
本発明の目的では、ＥｃＲおよびＲＸＲは合成およびキメラＥｃＲおよびＲＸＲならびにそれらのホモログも含む。
ＤＮＡ−結合ドメインは、合成およびキメラＤＮＡ−結合ドメイン、またはそのアナログ、組合わせまたは修飾を含めた、公知の応答エレメントを持ついずれのＤＮＡ−結合ドメインでもあり得る。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＥ，細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤまたは酵母ｐｕｔ  ＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ［配列番号：４１（ポリヌクレオチド）または配列番号：４２（ポリペプチド）］またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ［配列番号：４３（ポリヌクレオチド）または配列番号：４４（ポリペプチド））である。
【００６２】
トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略する）はいずれかのステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６  ＡＤ、ＧＡＬ４  ＡＤ、ＮＦ−κＢ  ＡＤ、ＢＰ６４  ＡＤ、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾であり得る。好ましくは、ＡＤは合成またはキメラＡＤであるか、あるいはＶＰ１６、ＧＡＬ４またはＮＦ−κＢから得られる。最も好ましくは、ＡＤはＶＰ１６  ＡＤ［配列番号：４５（ポリヌクレオチド）または配列番号：４６（ポリペプチド）］である。
応答エレメント（「ＲＥ」）は公知のＤＮＡ−結合ドメインを持ついずれもの応答エレメント、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾であり得る。好ましくは、ＲＥはＧＡＬ４（「ＧＡＬ４ＲＥ」）、ＬｅｘＡ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ−結合ドメインを認識する合成ＲＥからのＲＥである。より好ましくは、ＲＥは、配列番号：４７のポリヌクレオチド配列を含むＧＡＬ４ＲＥまたは配列番号：４８のポリヌクレオチド配列を含むＬｅｘＡ  ８Ｘオペロンである。好ましくは、第１のハイブリッド蛋白質はトランス活性化ドメインを実質的に含まず、第２のハイブリッド蛋白質はＤＮＡ−結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的では、「実質的に含まない」は、問題の蛋白質が、活性化または結合活性を供するのに問題のドメインの十分な配列を含まないことを意味する。
【００６３】
後記する本発明で用いるリガンドは、ＥｃＲ、ＵＳＰ、ＲＸＲのリガンド結合ドメイン、または遺伝子に連結した応答エレメントに結合するもう１つのポリペプチドと組み合わせるときに、遺伝子の発現の外的一時的調節のための手段を提供する。本発明の種々の成分が相互に結合する結合メカニズムまたは順番、すなわち、受容体に対するリガンド、応答エレメントに対する第１のポリペプチド、プロモーターに対する第２のポリペプチド等は臨界的ではない。ＥｃＲ、ＵＳＰ、ＲＸＲまたは他の蛋白質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能とする。このメカニズムは、ＥｃＲ、ＵＳＰまたはＲＸＲに対するリガンド結合の可能性、および活性ホモダイマー複合体（例えば、ＥｃＲ＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）の結果としての形成を排除しない。好ましくは、１以上の受容体ドメインはキメラ遺伝子スイッチを生産するように変化させることができる。典型的には３つのドメイン、ＤＢＤ、ＬＢＤおよびトランス活性化ドメインの１以上を、他のドメインの源とは異なる源から選択することができ、従って、キメラ遺伝子および得られたハイブリッド蛋白質は、活性、リガンドの相補的結合、および特異的応答エレメントの認識をトランス活性化するために選択された宿主細胞または生物において最適化される。加えて、応答エレメントそれ自体は、酵母からのＧＡＬ−４蛋白質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５：５６３〜５６４参照）またはＥ．ｃｏｌｉからのＬｅｘＡ蛋白質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８５），Ｃｅｌｌ，４３：７２９〜７３６）、あるいはそのような特異的相互作用につき設計し、修飾しおよび選択して（例えば、Ｋｉｍら、（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：３６１６〜３６２０）キメラ受容体を収容する蛋白質との標的化相互作用につき特異的な合成応答エレメントのような他のＤＮＡ−結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで修飾または置換することができる。キメラ系のもう１つの利点は、それらが、所望の目的結果に従って遺伝子発現を駆動するのに用いられるプロモーターの選択を可能とすることである。そのような二重制御は、特に、細胞毒性蛋白質が生産される場合に遺伝子治療の領域で特に重要であり得る。なぜならば、発現のタイミングおよび発現が起こる細胞は共に制御できるからである。適当なプロモーターに作動可能に連結した遺伝子が対象の細胞に導入されると、本発明の系の存在によって、外因性遺伝子の発現が制御される。プロモーターは構成的にまたは誘導的に調節できるか、あるいは組織特異的（すなわち、特定タイプの細胞でのみ発現される）でありうるか、または生物のある発生段階まで特異的であり得る。
【００６４】
本発明の遺伝子発現カセット
本発明の新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系は、宿主細胞で発現されることができる新規な遺伝子発現カセットを含み、ここに、遺伝子発現カセットはハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このように、出願人の発明は、本発明の遺伝子発現系で用いられる新規な遺伝子発現カセットも提供する。
具体的には、本発明はハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを提供する。該ハイブリッドポリペプチドは、１）応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよび核受容体のリガンド結合ドメインまたは２）トランス活性化ドメインおよび核受容体のリガンド結合ドメインのいずれかを含み、トランス活性化ドメインはＥｃＲ、ＲＸＲまたはＵＳＰ以外の核受容体からのものである。
特別の実施形態において、遺伝子発現カセットは応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハリブリッドポリペプチドをコードし、ＤＮＡ−結合ドメインはエクジソン受容体以外の核受容体からのものである。
【００６５】
もう１つの特別の実施形態において、遺伝子発現カセットは応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよびレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードし、ＤＮＡ−結合ドメインはレチノイドＸ受容体以外の核受容体からのものである。
ＤＮＡ−結合ドメインは、合成およびキメラＤＮＡ−結合ドメイン、またはそのアナログ、組合せまたは修飾を含めた、公知の応答エレメントを持ついずれのＤＮＡ−結合ドメインとすることもできる。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、または酵母ｐｕｔ  ＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ［配列番号：４１（ポリヌクレオチド）または配列番号：４２（ポリペプチド）］またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ［配列番号：４３（ポリヌクレオチド）または配列番号：４４（ポリペプチド）］である。
もう１つの特別の実施形態において、遺伝子発現カセットはトランス活性化ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードし、トランス活性化ドメインはエクジソン受容体以外の核受容体からのものである。
もう１つの特別の実施形態において、遺伝子発現カセットはトランス活性化ドメインおよびレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードし、トランス活性化ドメインはレチノイドＸ受容体以外の核受容体からのものである。
【００６６】
トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略する）はいずれのステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６  ＡＤ、ＧＡＬ４  ＡＤ、ＮＦ−κＢ  ＡＤ、ＢＰ６４  ＡＤ、またはそのアナログ、組合せまたは修飾であってもよい。好ましくは、ＡＤは合成またはキメラＡＤであるか、あるいはＶＰ１６、ＧＡＬ４またはＮＦ−κＢから得られる。最も好ましくは、ＡＤはＶＰ１６  ＡＤ［配列番号：４５（ポリヌクレオチド）または配列番号：４６（ポリペプチド）］である。
好ましくは、リガンド結合ドメインはＥｃＲまたはＲＸＲ関連ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ファミリーメンバーリガンド結合ドメイン、またはそのアナログ、組合せまたは修飾である。より好ましくは、ＬＢＤはＥｃＲまたはＲＸＲからのものである。なおより好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲからのものである。
【００６７】
好ましくは、ＥｃＲはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲ、Ｄｉｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲ、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  ＥｃＲ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲおよびＨｅｍｉｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲよりなる群から選択される昆虫ＥｃＲである。より好ましくは、用いられるＥｃＲはハマキガ科のガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  Ｍｏｌｔｉｏｒ  ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ  ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ  ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、絹ガＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｒ  ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、カＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ  ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエ科およびニクバエ科のハエＬｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ  ＥｃＲ（「ＬｃＥｃＲ」）、地中海ショウジョウバエＣｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ  ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、イナゴＬｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ  ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ  ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキＵｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  Ｅｃｒ（“「ＵｐＥｃＲ」）、またはマダニＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）である。尚より好ましくは、ＬＢＤはハマキガ科のガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ  ｍｅｌａｎｏ  ｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）からのものである。
【００６８】
好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッド昆虫ＥｃＲからのものである。昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましくは、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、昆虫ＥｃＲポリペプチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ドメイン欠失の組合せも行うことができる。
【００６９】
好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
もう１つの好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、ＲＸＲポリペプチドはマウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＸＲ（「ＭｍＲＸＲ」）またはヒトＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＸＲ（「ＨｓＲＸＲ」）である。ＲＸＲポリペプチドはＲＸＲα、ＲＸＲβまたはＲＸＲγアイソフォームであり得る。
【００７０】
好ましくは、ＬＢＤはトランケーテッドＲＸＲからのものである。ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含む。より好ましくはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましくは、ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、ＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、およびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ドメイン欠失の組合せも行うことができる。
【００７１】
好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
もう１つの好ましい実施形態において、レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインは配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：４１）またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：４３）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメインおよび配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【００７２】
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：４２）またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：４４）よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含むＤＮＡ−結合ドメインおよび配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：４１）またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：４３）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメインおよび配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする．
【００７３】
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：４２）またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：４４）よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含むＤＮＡ−結合ドメインおよび配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメインおよび配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたエクジソン受容体リガンドを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４６のポリペプチド配列を含むトランス活性化ドメインおよび配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【００７４】
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメインおよび配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたレチノイドＸ受容体リガンドを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
もう１つの好ましい実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号：４６のポリペプチド配列を含むトランス活性化ドメインおよび配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
本発明の目的では、ＥｃＲおよびＲＸＲは合成およびキメラＥｃＲおよびＲＸＲならびにそれらのホモログも含む。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチド
本発明の新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系はトランケーション突然変異を含むトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含み、宿主細胞内で遺伝子の発現を調整する方法で有用である。
このように、本発明はトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。具体的には、本発明は、リガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
好ましくは、トランケーション突然変異の結果、少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含むトランケーテッドＥｃＲポリペプチドまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られる。より好ましくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的なポリペプチドドメインの欠失を含む。なおより好ましくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメインおよびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。
【００７６】
特別の実施形態において、本発明によるＥｃＲポリヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。特別の実施形態において、本発明によるポリヌクレオチドは配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（Ｃドメインの最後の３３カルボキシー末端アミノ酸を含む、ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）および配列番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエクジソン受容体ポリペプチドをコードする。
【００７７】
もう１つの特別の実施形態において、本発明によるＲＸＲポリヌクレオチドは配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。もう１つの特別の実施形態において、本発明によるポリヌクレオチドは配列番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、および配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトランケーテッドＲＸＲポリペプチドをコードする。
特に、本発明はトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、突然変異はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。特別の実施形態において、本発明は、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、ポリヌクレオチドは配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、または配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含む。もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、ポリヌクレオチドは配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）または配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含む。
【００７８】
また、本発明はトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、突然変異はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させる。特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含むＥｃＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、ポリヌクレオチドは配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含む。
また、本発明は、突然変異したレチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）または配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。特別の実施形態において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。好ましくは、二量体化パートナーはトランケーテッドＥｃＲポリペプチドである。より好ましくは、二量体化パートナーは、ドメインＡ／Ｂ／Ｃが欠失されているＥｃＲポリペプチドである。なおより好ましくは、二量体化パートナーは配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）のアミノ酸配列を含むＥｃＲポリペプチドである。
【００７９】
本発明のポリペプチド
本発明の新規なエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系はトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドをコードし、宿主細胞内で遺伝子の発現を調整する方法で有用である。このように、本発明はポリヌクレオチドまたは本発明による遺伝子発現カセットによってコードされた単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされたリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。
また、本発明はトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。具体的には、本発明はリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。
好ましくは、トランケーション突然変異の結果、少なくとも１、２、３、４、５、１０，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５，１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失を含むトランケーテッドＥｃＲポリペプチドまたはトランケーテッドＲＸＲポリペプチドが得られる。より好ましくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失を含む。より好ましくは、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失を含む。特別の実施形態において、ＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドトランケーションは、少なくともＡ／Ｂ−ドメイン欠失、Ｃ−ドメイン欠失、Ｄ−ドメイン欠失、Ｅ−ドメイン欠失、Ｆ−ドメインおよびＡ／Ｂ／Ｃ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン欠失、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメインおよびＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン欠失の欠失を含む。いくつかの完全はおよび／または部分的ドメイン欠失の組合せも実行することもできる。
【００８０】
好ましい実施形態において、単離されたトランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチドは配列番号：１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：１０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。もう１つの好ましい実施形態において、単離されたトランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチドは配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、単離されたトランケーテッドＲＸＲポリペプチドは配列番号：２１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：２６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：３０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。もう１つの好ましい実施形態において単離されたトランケーテッドＲＸＲポリペプチドは配列番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、ポリペプチドは配列番号：１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ、および配列番号：１０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：２１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：２６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：３０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
このように、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関し、ここにポリペプチドは配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８２】
特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドにも関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、または配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）のアミノ酸配列を含む。
もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）または配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドにも関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）または配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
特に、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、ポリペプチドは配列番号：１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：１０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：２１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：２６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：２７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：３０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、ポリペプチドは配列番号：１１（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１２（ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１４（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：１６（ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：１７（ＤｍＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ）、配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）、配列番号：１９（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、および配列番号：２０（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）、配列番号：３１（ＭｍＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３２（ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３５（ＭｍＲＸＲ−Ｅ）、配列番号：３６（ＨｓＲＸＲ−ＣＤＥＦ）、配列番号：３７（ＨｓＲＸＲ−ＤＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）および配列番号：４０（ＨｓＲＸＲ−Ｅ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８４】
本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドにも関する。
もう１つの特別の実施形態において、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドに関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリペプチドは配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。従って、本発明はＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲまたはＲＸＲポリペプチドにも関する。好ましい実施形態において、本発明はＥｃＲポリペプチドの非ステロイド結合活性または非ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む単離されたＥｃＲポリペプチドに関し、ここに、ＥｃＲポリヌクレオチドは配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）のアミノ酸配列を含む。
【００８５】
また、本発明は突然変異したレチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む単離されたレチノイドＸ受容体ポリペプチドに関する。好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む単離されたレチノイドＸ受容体ポリペプチドは配列番号：２３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：２８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）または配列番号：２９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。より好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含むレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは配列番号：３３（ＭｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：３４（ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）、配列番号：３８（ＨｓＲＸＲ−ＥＦ）または配列番号：３９（ＨｓＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特別の実施形態において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。好ましくは、二量体化パートナーはトランケーテッドＥｃＲポリペプチドである。より好ましくは、二量体化パートナーは、ドメインＡ／Ｂ／Ｃが欠失されているＥｃＲポリペプチドである。なおより好ましくは、二量体化パートナーは配列番号：１３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：１８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥＦ）のアミノ酸配列を含むＥｃＲポリペプチドである。
【００８６】
本発明の遺伝子発現を調整する方法
また、出願人の発明は、本発明による遺伝子発現調整系を用いて宿主細胞において遺伝子発現を調整する方法に関する。具体的には、出願人の発明は、ａ）本発明による遺伝子発現調整系を宿主細胞に導入し、次いで、ｂ）遺伝子発現調整系の第１のポリペプチド゛および第２のポリペプチドのリガンド結合ドメインと独立して組み合わされるリガンドを宿主細胞に導入する、工程を含み、ここに、発現されるべき遺伝子は：ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調整されるべき遺伝子、を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、それにより、リガンド、遺伝子発現調整系の第１のポリペプチドおよび遺伝子発現調整系の第２のポリペプチドを含む複合体が形成され、それにより、該複合体が宿主細胞において遺伝子の発現を調整することを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を調整する方法を提供する。
出願人の方法を用いる宿主細胞における発現のための注目する遺伝子は、内因性遺伝子または異種遺伝子であってよい。望まれる遺伝子または蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列の情報は、多くの公のアクセスデータベースの内の１つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ，ＥＭＢＬ，Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲにおいて、または多くの生物学関連雑誌刊行物において突き止めることができる。このように、当業者であれば、実質的に全ての公知の遺伝子についての核酸配列情報に対するアクセスを有する。次いで、そのような情報を用いて、本明細書中に記載する出願人の方法で用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿入用の所望の構築体を構築することができる。
【００８７】
出願人の方法を用いる宿主細胞における発現のための注目する遺伝子の例は、状態、病気、障害、不全、遺伝子欠陥等を治療するのに重要なポリペプチドを調整し、軽減し、修正しおよび／または回復することができる遺伝子のような、限定されるものではないが、ワクチンのような植物で生産される抗原、アルファ‐アミラーゼ、フィターゼ、グルカンおよびキシランセのような酵素、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルスおよび非生物ストレスに対する抵抗性のための遺伝子、ヌトラシューティカル、医薬、ビタミン、アミノ酸内容、除草剤抵抗性、寒さ、乾燥および熱許容性を修飾するための遺伝子、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性無菌植物、花、燃料、他の出力特性、治療上所望のポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子を含む。
許容されるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへの２ハイブリッド系のＤＮＡ−結合ドメインの結合の結果、遺伝子の発現の活性化または抑制がもたらされる場合に、遺伝子の発現を調整するいずれのものでもある。好ましいリガンドは、米国特許第６，０１３，８３６号、第５，１１７，０５７号、第５，５３０，０２８号および第５，３７８，７２６号に開示されたもののようなポナステロン、ムリステロンＡ、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、欧州出願第４６１，８０９号に開示されたもののようなジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたもののようなＮ−アルキル‐Ｎ，Ｎ’‐ジアロイルヒドラジン、欧州出願第２３４，９９４号に開示されたもののようなＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキルカルボニルヒドラジン、米国特許第４，９８５，４６１号に記載されたもののようなＮ‐アロイル‐Ｎ‐アルキル‐Ｎ’−アロイルヒドラジン（その各々が、本明細書の一部として参照される）および３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド等を含めた他の同様の物質を含む。
【００８８】
好ましくは、遺伝子の発現を調整する出願人の方法で用いるリガンドは、式：
【００８９】
【化５】
0005031967.tif 000003
【００９０】
（式中、
Ｅは第三級炭素を含む（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含むシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり、
Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり、
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、あるいはＲ３とＲ２およびＲ３が結合するフェニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、Ｅｔであるか、あるいはＲ２とＲ２およびＲ３が結合するフェニル炭素とが一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、またはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し、
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである）
の化合物である。
【００９１】
出願人の発明は、原核生物および真核生物宿主細胞において遺伝子発現の調整を提供する。このように、本発明は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される宿主細胞において遺伝子発現を調整する方法にも関する。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、植物細胞、マウス細胞またはヒト細胞である。
トランスジェニック宿主細胞における発現は、限定されるものではないが、治療ポリペプチド、経路中間体を含めた注目する種々のポリペプチドの発現で、宿主を用いて従前では可能でなかった新しい産物の合成用の宿主に既に存在する経路の調整で、細胞ベースのアッセイ等で有用であろう。加えて、遺伝子産物は、宿主のより高い成長率を付与し、または利用されるべき別の成長様式を可能とするために有用であろう。
【００９２】
本発明の宿主細胞および非ヒト生物
前記したように、本発明の遺伝子発現調整系を用いて、宿主細胞において遺伝子発現を調整することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、注目する種々の遺伝子の発現で有用であろう。このように、出願人の発明は、本発明による遺伝子発現系を含む単離された宿主細胞も提供する。また、本発明は、本発明による遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞も提供する。また、出願人の発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単離された宿主細胞も提供する。単離された宿主細胞は原核生物または真核生物宿主細胞であってよい。
好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。好ましい宿主細胞の例は、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａのような真菌または酵母種、あるいは属Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ａｎａｂａｅｎａ，Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ，ＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａにおけるもののような細菌種、植物、動物および哺乳動物宿主細胞を含む。より好ましくは、宿主細胞は酵母細胞、植物細胞、マウス細胞またはヒト細胞である。
特別の実施形態において、宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，  ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａ宿主細胞よりなる群から選択される酵母細胞である。
もう１つの特別な実施形態において、宿主細胞はリンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパヤ、落花生、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ソルガム、大豆、スクワッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカおよび小麦宿主細胞よりなる群から選択される植物細胞である。
もう１つの特別の実施形態において、宿主細胞はマウス細胞である。
もう１つの特別の実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。
【００９３】
宿主細胞形質転換は当該分野でよく知られており、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイルスベクター媒介トランスフェクション、アグロバクテリウムー媒介形質転換、粒子衝撃等を含めた種々の方法によって達成することができる。所望の遺伝子産物の発現は、適当な条件下での形質転換された宿主細胞の培養および形質転換された遺伝子の発現の誘導を含む。原核生物および真核生物細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは当該分野でよく知られている（実施例の一般的方法セクション参照）。細胞を回収し、遺伝子産物に特異的なプロトコルに従って遺伝子産物を単離することができる。
加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現を調整し、望まれる特異的様式でポリペプチド産物を修飾し、加工する宿主細胞を選択することができる。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後プロセッシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、［例えば、シグナル配列の］切断）についての特徴および特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来性蛋白質の所望の修飾およびプロセッシングを保証することができる。例えば、細菌系における発現を用いて、非グリコシル化コア蛋白質産物を生産することができる。しかしながら、細菌で発現されたポリペプチドは適切には折り畳むことができない。酵母における発現はグリコシル化産物を生じさせることができる。真核生物細胞における発現は、異種蛋白質の「天然」グリコシル化および折り畳みの確率を増加させることができる。さらに、哺乳動物細胞における発現は、ポリペプチドの活性を復元または構成するためのツールを提供することができる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、蛋白質分解切断のようなプロセッシング反応に種々の程度影響することができる。
【００９４】
また、出願人の発明は、本発明による単離された宿主細胞を含む非ヒト生物に関する。好ましくは、非ヒト生物は細菌、真菌、酵母、植物、動物および哺乳動物よりなる群から選択される。より好ましくは、非ヒト生物は酵母、植物、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルまたはチンパンジーである。
特別の実施形態において、非ヒト生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａよりなる群から選択される酵母である。
もう１つの特別の実施形態において、非ヒト生物はリンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパヤ、落花生、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ソルガム、大豆、スクワッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカおよび小麦よりなる群から選択される植物である。
もう１つの特別の実施形態において、非ヒト生物はＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓマウスである。
【００９５】
遺伝子発現／トランスフェクションの測定
本発明の出願人の方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ種の同一性および豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を含めた細胞の転写状態のそれである。そのような測定は、便宜には、いくつかの現存する遺伝子発現技術のいずれかによりｃＤＮＡ豊富さを測定することによって行われる。
核酸アレイ（ａｒｒａｙ）技術は、異なるｍＲＮＡ発現を測定するための優良な技術である。そのような技術は、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイを含む。これらの技術は、異なる遺伝子に対応するＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドあるいは固体支持体に固定化され、細胞、組織または全生物から抽出された全ｍＲＮＡプールから調製されたプローブにハイブリダイズし、ｃＤＮＡに変換されたｃＤＮＡに依拠する。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィ技術を用いて基材上で合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００までの遺伝子につき分析できるチップが製造されている。ＤＮＡマイクロアレイは、ロボットにより顕微鏡スライド上にプリントされたＤＮＡ試料、典型的にはＰＣＲ産物のアレイである。各遺伝子は、全長または部分長の標的ＤＮＡ配列によって分析される。１０，０００までの遺伝子を持つマイクロアレイが、今日、商業的にルーチン的に調製される。これらの２つの技術の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、典型的には、短いＤＮＡ分子の分画を可能とする２５−量体オリゴヌクレオチドを利用し、他方、ほぼ１０００塩基対のマイクロアレイのより大きなＤＮＡ標的が、完全なＤＮＡ混合物を分画するにおいてより大きな感受性を提供できることである。
【００９６】
本発明の出願人の方法のもう１つの有用な測定は、当該分野でよく知られたプロセスを用いて細胞に存在する構成要素蛋白質種の豊富さを測定することによって細胞の翻訳状態を測定するそれである。
種々の生理学的機能に関連した遺伝子の同定が望まれる場合、細胞増殖、アポトーシス、老化、分化、接着、特異的分子への結合、もう１つの細胞への結合、細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋肉形成、神経形成および／または造血のような機能の変化が測定されるアッセイを使用することができる。
加えて、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて、出願人の発明を用い、遺伝子発現の調整を測定することができる。
遺伝子発現の産物を検出する他の方法は当該分野でよく知られており、サーザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット（ＲＮＡ）およびＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）分析を含む。より好ましくはないが、標識された蛋白質を用いて、それがハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。
いくつかの場合において、核酸配列の量を増幅する必要がある。これは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ鎖反応（「ＬＣＲ」）、ストランド置換増幅（「ＳＤＡ」）、転写−ベースの増幅等を含めた多数の適当な方法のうち１以上を用いて行うことができる。ＰＣＲは公知の技術に従って行われ、ここに、例えば、ハイブリダイズする条件下で、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下にて、検出すべき特異的配列の各ストランドについての１つのオリゴヌクレオチドプライマーで核酸試料を処理する。合成される各プライマーの延長産物は、２つの核酸ストランドの各々に相補的であり、プライマーは、それにハイブリダイズする特異的配列の各ストランドに対して十分に相補的である。また、各プライマーから合成された延長産物は、同一プライマーを用いる延長産物のさらなる合成のための鋳型として働くことができる。延長産物の合成の十分な数のラウンドに続き、試料を前記したように分析して、検出すべき配列または複数配列が存在するか否かを評価することができる。
本発明の例示として提供される以下の非限定的実施例を参照して、本発明はよりよく理解することができる。
【００９７】
一般的方法
本明細書で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎおよび  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）によって記載されている。
植物組織培養、形質転換、植物分子生物学および植物一般分子生物学のための方法は、ＲＮ  ＴｒｉｇｉａｎｏおよびＤＪ  Ｇｒａｙによって編集されたＰｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅｓ、第２版、２０００  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＫＭＡ  ＧａｒｔｌａｎｄおよびＭＲ  Ｄａｖｅｙによって編集されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ．Ｍａｌｉｇａら、１９９５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出すことができる。
【００９８】
細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法は当該分野でよく知られている。以下の例で用いるのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））または  Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載されているように見出すことができる。宿主細胞の増殖および維持で用いる全ての試薬、制限酵素および材料は、特記しない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
遺伝子配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｍ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なプログラムのスウィートを用いて達成することができる。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いる場合、１２のギャップ創製デフォルト値および４のギャップ延長デフォルト値を用いることができる。ＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いる場合、５０のデフォルトギャップ創製ペナルティおよび３のデフォルトギャップ延長ペナルティを用いることができる。いずれの場合においても、ＧＣＧプログラムパラメーターが促進されない場合、これらのまたはいずれかの他のＧＣＧプログラムにおいて、デフォルト値を用いることができる。
【００９９】
略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモラーを意味し、「ｍＭ」はミリモラーを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力倍を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、および「℃」は摂氏度を意味する。
【０１００】
実施例１
遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用で用いるために、出願人の改良されたＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子調整系を開発した。この実施例は、本発明のＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現系で用いるための、いくつかの遺伝子発現カセットの構築および評価を記載する。
哺乳動物細胞を含めた種々の細胞バックグラウンドにおいて、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を持つ昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）ヘテロダイマーは、リガンドの結合に際して、エクジソン応答エレメントの制御下で遺伝子をトランス活性化させる。ハマキガ科ガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」、全長ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、各々、配列番号：４９および配列番号：５０に記載される）、Ｃ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａウルトラスピラクル（「ＣｆＵＳＰ」、全長ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、各々、配列番号：５１および配列番号：５２に記載される）、およびマウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＸＲα（ＭｍＲＸＲα、全長ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、各々、配列番号：５３および配列番号：５４に記載される）に基づいて、出願人はいくつかのＥｃＲ−ベースの遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築体は，ＥｃＲの、およびＲＸＲの、またはＵＳＰのリガンド結合ドメイン、ＧＡＬ４の、またはＥｃＲのＤＮＡ−結合ドメイン、およびＶＰ１６の活性化ドメインを含む。レポーター構築体は、ＧＡＬ４またはＥｃＲ／ＵＳＰ結合部位（応答エレメント）のいずれかを含む合成プロモーター構築体に作動可能に連結した、レポーター遺伝子、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺを含む。これらの受容体およびレポーター構築体の種々の組合せをＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＶ１および２９３細胞に共トランスフェクトした。遺伝子誘導能力（誘導の大きさ）およびリガンドの特異性および感受性は、４つの異なるリガンド：２つのステロイドリガンド（ポナステロンＡおよびムリステロンＡ）および２つの非ステロイドリガンド（Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンおよびＮ−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン）を用い、トランスフェクトされた細胞におけるレポーター遺伝子発現の用量−依存性誘導において調べた。レポーター遺伝子発現活性は、リガンド添加の２４時間または４８時間後にアッセイした。
【０１０１】
遺伝子発現カセット：エクジソン受容体ベースの化学的に誘導可能な遺伝子発現カセット（スイッチ）を、当該分野で入手可能な標準クローニング方法を用いて以下のように構築した。以下は各スイッチの調製および組成の簡単な記載である。
１．１−ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲ：ハマキガ科ガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲからのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲＤＥＦ」、配列番号：３）をＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン（「ＤＮＡＢＤ」、配列番号：４１）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：５５）の制御下に置いた。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＸＲからのＤＥＦドメイン（「ＭｍＲＸＲＤＥＦ」、配列番号：２２）をＶＰ１６からの活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」、配列番号：４５）に融合し、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：５５）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」、配列番号：４７を含む５、ＧＡＬ４ＲＥを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：５６）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：５７）の上流に置いた。
【０１０２】
１．２−ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＵＳＰ：ＭｍＲＸＲＤＥＦをハマキガ科ガＵＳＰからのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＵＳＰＤＥＦ」、配列番号：５８）で置き換える以外は、この構築体は前記したスイッチ１．１と同様に調製した。この実施例で用いた構築体は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＳＰではなくＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＵＳＰを利用した以外は、米国特許第５，８８０，３３３号に開示したものと同様である。
１．３−ＧＡＬ４ＲＸＲ／ＶＰ１６ＣｆＥｃＲ：ＭｍＲＸＲＤＥＦ（配列番号：２２）をＧＡＬ４ＤＮＡＢＤ（配列番号：４１）に融合させ、ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（配列番号：１）をＶＰ１６ＡＤ（配列番号：４５）に融合させた。
１．４−ＧＡＬ４ＲＸＲ／ＶＰ１６ＤｍＥｃＲ：ＣｆＥｃＲＣＤＥＦをＤｍＥｃＲＣＤＥＦ（配列番号：６）で置き換えた以外は、この構築体はスイッチ１．３と同様に調製した。
１．５−ＧＡＬ４ＵＳＰ／ＶＰ１６ＣｆＥｃＲ：ＭｍＲＸＲＤＥＦをＣｆＵＳＰＤＥＦ（配列番号：５８）で置き換えた以外は、この構築体はスイッチ１．３と同様に調製した。
１．６−ＧＡＬ４ＲＸＲＣｆＥｃＲＶＰ１６：この構築体は、ＧＡＬ４ＤＮＡＢＤおよびＶＰ１６ＡＤを共に同一分子上に置くように調製した。ＧＡＬ４ＤＮＡＢＤ（配列番号：４１）およびＶＰ１６ＡＤ（配列番号：４５）を、各々、Ｎ−およびＣ−末端にてＣｆＥｃＲＤＥＦ（配列番号：３）に融合させた。該融合をＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：５５）の制御下に置いた。
１．７−ＶＰ１６ＣｆＥｃＲ：この構築体は、ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（配列番号：１）がＶＰ１６ＡＤ（配列番号：４５）に融合され、ＳＶ４０Ｅプロモーター（配列番号：５５）の制御下に置かれるように調製した。ｈｓｐ２７遺伝子からの６つのエクジソン応答エレメント（「ＥｃＲＥ」、配列番号：５９）を、プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：５７）の上流に置いた。このスイッチが最も好適に内因性ＲＸＲを用いる。
１．８−ＤｍＶｇＲＸＲ：この系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，から購入した。それはＶＰ１６ＡＤに融合した修飾されたＤＮＡＢＤを持つＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）を含み、ＣＭＶプロモーター（配列番号：６０）の制御下に置いた。全長ＭｍＲＸＲ（配列番号：５３）をＲＳＶプロモーター（配列番号：６１）の制御下に置いた。レポーターｐＩＮＤ（ＳＰＩ）ＬａｃＺは、修飾されたエクジソン応答エレメント（「ＥｃＲＥ」、Ｅ／ＧＲＥ）の５つのコピー、ＳＰ１エンハンサーの３つのコピー、および最小熱ショックプロモーターを含み、その全てがＬａｃＺレポーター遺伝子の上流に置かれた。
１．９−ＣｆＶｇＲＸＲ：この例は、部分的Ａ／Ｂドメインおよび完全なＣＤＥＦドメインを含むトランケーテッドＣｆＥｃＲ［配列番号：６２（ポリヌクレオチド）および配列番号：６３（ポリペプチド）］でＤｍＥｃＲを置き換える以外は、スイッチ１．８と同様に調製した。
１．１０−ＣｆＶｇＲＸＲｄｅｌ：この例は、ＭｍＲＸＲ（配列番号：５３）を欠失させた以外は、スイッチ１．９と同様に調製した。
【０１０３】
細胞系（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）：４つの細胞系：ＣＨＯ、チャイニーズハムスターＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ卵巣細胞系、ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３）マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ細胞系、２９３ヒトＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ腎臓細胞系、およびＣＶ１アフリカミドルザル腎臓細胞系をこれらの実験で用いた。細胞をそれらの各培地中に維持し、それらが６０％コンフルエンシーに達すると継代した。細胞の培養および維持についての標準的な方法は以下の通りであった。
【０１０４】
トランスフェクション：いくつかの商業的に入手可能なリポファクターならびにエレクトロポレーション方法を評価し、各細胞系のトランスフェクションについての最良な条件を開発した。ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３，２９３およびＣＶ１細胞を６０％コンフルエンシーまで増殖させた。実施例１．１ないし１．１０に概説した種々のスイッチ構築体に対応するＤＮＡを、以下に示すように、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞またはＣＶ１細胞にトランスフェクトした。
ＣＨＯ細胞：細胞が６０〜８０％コンフルエンシーに達するとそれらを回収し、各々、１０％胎児ウシ血清を含む増殖培地、２．５、１．０または０．５ｍｌ中で２５０，０００、１００，０００または５０，０００細胞にて６−、１２−または２４−ウエルプレート中で平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｌｉｔｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）は、これらの細胞についての最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。１２−ウエルプレートでは、４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００を１００μｌの増殖培地と混合した。１．０μｇのレポーター構築体および０．２５μｇの受容体構築体をトランスフェクションミックスに添加した。第２のレポーター構築体を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１μｇ／トランスフェクションミックス］、それは作動可能に連結したＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：６４）を含み、チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターの制御下に置き、正規化のために用いた。トランスフェクションミックスの内容物を撹拌ミキサー中で混合し、室温で３０分間放置した。インキュベーションの最後に、４００μｌの増殖培地中に維持した細胞にトランスフェクションミックスを添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳおよびＤＭＳＯ（対照）または適当なリガンドのＤＭＳＯ溶液いずれかを含有する５００μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて２４〜４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を６ウエルプレートについて２倍とし、２４−ウエルプレートについて半分まで減少した以外は、同一の手法を６および２４ウエルプレートにつき行った。
【０１０５】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、３Ｔ３細胞について最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。ＣＨＯ細胞について記載したのと同一の手法を２つの修飾を施して同様に３Ｔ３細胞について行った。細胞が５０％コンフルエンシーに達するとそれらを平板培養した。１２５，０００または５０，０００または２５，０００細胞を、各々、６−または１２−または２４−ウエルプレートのウエル当たりに平板培養した。ＧＡ１４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲおよびレポーターベクターＤＮＡをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、ＰｏｎＡ、ＭｕｒＡ、Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔ−ブチルヒドラジンまたはＮ−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンを含有する培地中でトランスフェクトされた細胞を４８時間増殖させた。リガンド処理は前記ＣＨＯ細胞セクションに記載したように行った。
【０１０６】
２９３細胞：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｌｉｔｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、２９３細胞について最良のリポファクターであることが判明した。細胞をバイオ被覆したプレート中で平板培養してクランピングを回避した以外は、ＣＨＯについて記載したのと同一の手法を２９３細胞で行った。リガンド処理は前記ＣＨＯ細胞セクションに記載したようにに行った。
ＣＶ１細胞：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＣＶ１細胞について最良のリポファクターであることが判明した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞について記載したのと同一の手法をＣＶ１細胞で行った。
【０１０７】
リガンド：ポナステロンＡおよびムリステロンＡはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。２つの非ステロイドＮ−（２−エチル‐３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔ−ブチルヒドラジンまたはＮ−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，４−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンはＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙで合成された合成安定エクジステロイドである。全ての試薬はＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＳＯの最終濃度は対照および処理双方において０．１％に維持した。
【０１０８】
レポーターアッセイ：リガンドを添加して２４〜４８時間後に細胞を回収した。１２５、２５０または５００μｌの受動溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイ系の一部）を、各々、２４−または１２−または２４−ウエルプレートの各ウエルに添加した。プレートをロータリーシェーカー上に１５分間置いた。２０μｌの溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、製造業者の指令に従い、Ｐｒｏｍｅａｇ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイ系を用いて測定した。β−ガラクトシダーゼは、製造業者の指令に従い、ＴＲＯＰＩＸからのＧａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（商標）アッセイキットを用いて測定した。全てのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性は、標準としてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いて正規化した。活性倍率（ｆｏｌｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、リガンド処理細胞における正規化相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞における正規化ＲＬＵ（未処理対照）で割ることによって計算した。
これらの実験の結果を以下の表に掲げる。
【０１０９】
【表１】
0005031967.tif 000004
【０１１０】
【表２】
0005031967.tif 000005
【０１１１】
【表３】
0005031967.tif 000006
【０１１２】
【表４】
0005031967.tif 000007
【０１１３】
【表５】
0005031967.tif 000008
【０１１４】
【表６】
0005031967.tif 000009
【０１１５】
出願人の結果は、非ステロイドエクジソンアゴニストＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンおよびＮ’−（３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）と比較して、ＣｆＥｃＲのより優れたアクチベータであることを示す（表１〜４参照）。また、テストした哺乳動物細胞系では、ＭｍＲＸＲはＣｆＥｃＲについてのヘテロダイマーパートナーとしてＣｆＵＳＰよりも良好に機能した（表１〜４参照）。加えて、出願人の誘導性遺伝子発現調整系は、系が内因性ＲＸＲレベルのみに依拠する場合よりも外因性ＭｍＲＸＲを用いる場合に良好に機能した（表１〜４参照）。
また、出願人の結果は、ＣｆＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現系において、非ステロイドエクジソンアゴニストが、ステロイドリガンド、ポナステロンＡおよびムリステロンＡと比較して、低濃度でレポーター遺伝子発現を誘導したことを示す（表５および６参照）。
テストした１０のＥｃＲベースの遺伝子スイッチのうち、ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲスイッチ（スイッチ１．１）は調べた全ての４つの細胞系においていずれの他のスイッチよりも良好な性能であり、ステロイドよりも非ステロイドに対してより感受性であった。また、結果は、２つのパートナーの内の１つの上にＡＤおよびＤＮＡＢＤを一緒に置くのと比較すると、２つのパートナーの各々上に活性化ドメイン（ＡＤ）およびＤＮＡ−結合ドメイン（ＤＮＡＢＤ）を置くのがバックグラウンドを低下させることを示す。従って、ＡＤおよびＤＮＡＢＤを２つのパートナーの間で分離した場合のスイッチ様式が、ＥｃＲ−ベースの遺伝子スイッチ適用でよく働く。
加えて、ＭｍＲＸＲ／ＥｃＲ−ベースのスイッチは、リガンドの不存在下においてＭｍＲＸＲ／ＥｃＲスイッチよりも高いバックグラウンド活性を有するＣｆＵＳＰ／ＥｃＲ−ベースのスイッチよりも良好な性能であった。
最後に、ＧＡＬ４ＥｃＲ／ＶＰ１６ＲＸＲスイッチ（スイッチ１．１）はステロイドリガンドよりも非ステロイドリガンドに対して感受性であった（表５および６参照）。特に、ステロイドリガンドは５０μＭの濃度でトランス活性化を開始し、他方、非ステロイドリガンドは１μＭ未満の（サブマイクロモラー）の濃度でトランス活性化を開始した。
【０１１６】
実施例２
本実施例は、本発明の改良されたＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現系におけるトランケーテッドＥｃＲおよびＲＸＲポリペプチドの出願人のさらなる分析を記載する。ａ）リガンドの存在下におおける最大誘導、ｂ）リガンドの不存在下における最小バックグラウンド、ｃ）リガンド濃度に対する高い感受性、およびｄ）リガンドおよび受容体の中での最小クロス−トークをスイッチに与える２つの受容体の最良の組合せおよび長さを同定するために、出願人は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＣｆＥｃＲおよびＭｍＲＸＲ受容体ポリペプチドのいくつかのトランケーション突然変異を行い分析した。
簡単に述べると、ＥｃＲまたはＲＸＲ受容体をコードするポリヌクレオチドをＡ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦドメインの接合においてトランケートし、実施例１に記載するように、ＣｆＥｃＲについてはポリヌクレオチド（配列番号：４１）をコードするＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン、またはＭｍＲＸＲについてはポリヌクレオチド（配列番号：４５）をコードするＶＰ１６活性化ドメインのいずれかに融合させた。得られた受容体トランケーション／融合ポリペプチドをＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアッセイした。ルシフェラーゼポリペプチドをコードするプラスミドｐＦＲＬＵＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をレポーター遺伝子構築体として用い、構成的ＴＫプロモーターの制御下にあるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼポリペプチドをコードするｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、前記したようにトランスフェクションを正規化した。分析はトリプリケートで行い、平均ルシフェラーゼカウントを前記したように測定した。
【０１１７】
トランケーテッドエクジソン受容体ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセット
ＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン（配列番号：４１）に融合した全長またはトランケーテッドＣｆＥｃＲポリペプチドいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット：ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ（全長ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、配列番号：４９）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、配列番号：１）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ（ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、配列番号：２）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ（ＣｆＥｃＲＤＥＦ、配列番号：３）、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ（ＣｆＥｃＲＥＦ、配列番号：４）およびＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥ（ＣｆＥｃＲＤＥ、配列番号：５）を、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ（実施例１．１におけるように構築した、図１１）またはＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ［ＭｍＲＸＲＤＥＦをＭｍＲＸＲＥＦ（配列番号：２３）を置き換える以外は実施例１．１におけるように構築した、図１２］、およびｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を０，１，５または２５μＭのＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンまたはＰｏｎＡの存在下で４８時間増殖させた。細胞を回収し、溶解させ、細胞溶解物中でルシフェラーゼレポーター活性を測定した。全ハエルシフェラーゼ相対光単位が示される。各棒線の頂部の数は、その処理についての最大誘導倍率である。
【０１１８】
出願人の結果は、ＭｍＲＸＲのＥＦドメインが十分であり、この受容体のＤＥＦドメインよりも良好な性能であることを示す（図１１および１２参照）。また、出願人は、一般に、ＥｃＲ／ＲＸＲ受容体の組合せがＰｏｎＡに対して感受性でないことも示した（図１１および１２参照）。図１１および１２に示すように、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦハイブリッドポリペプチド（配列番号：７）はいずれかの他のＣｆＥｃＲハイブリッドポリペプチドよりも良好な性能であった。
【０１１９】
トランケーテッドレチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセット
ＶＰ１６トランス活性化ドメイン（配列番号：４５）に融合させた全長またはトランケーテッドＭｍＲＸＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞発現カセット：ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ（全長ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ、配列番号：５３）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ（ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ、配列番号：２１）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ（ＭｍＲＸＲＤＥＦ、配列番号：２２）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ（ＭｍＲＸＲＥＦ、配列番号：２３）、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ（「ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ」または「ＭｍＲＸＲ−トランケーテッドＥＦ」、配列番号：２４）、およびＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ（「ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ」または「ＭｍＲＸＲ−Ｅ」、配列番号：２５）構築体を、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（実施例１．１におけるように構築した、図１３）またはＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ［ＣｆＥｃＲＣＤＥＦをＣｆＥｃＲＤＥＦ（配列番号：３）で置き換える以外は実施例１．１におけるように構築した、図１４］、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共に前記したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を０，１，５および２５μＭのＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンまたはＰｏｎＡの存在下で４８時間増殖させた。細胞を回収し、溶解させ、細胞溶解物中でレポーター活性を測定した。全ハエルシフェラーゼ相対光単位が示される。各棒線の頂部の数は、その処理における最大誘導倍率である。
テストしたＭｍＲＸＲの全てのトランケーションの内、出願人の結果は、ＭｍＲＸＲＥＦ受容体がＣｆＥｃＲについての最良のパートナーであることを示す（図１３および１４）。ＣｆＥｃＲＣＤＥＦは、ＭｍＲＸＲＥＦを用いるＣｆＥｃＲＤＥＦよりも良好な誘導を示した。ＡＦ２（「ＥＦ−ＡＦ２ｄｅｌ」と略する）またはＥドメインのラセン１−３の欠失（「ＥＦ−Ｂａｍｄｅｌ」と略する）の結果、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（図１３）またはＣｆＥｃＲＤＥＦ（図１４）いずれかとパートナーを組むと遺伝子誘導およびリガンド感受性を低下させるＲＸＲ受容体が得られた。一般に、ＣｆＥｃＲ／ＲＸＲ−ベースのスイッチは、ステロイドＰｏｎＡに対するよりも非ステロイドＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンに対してかなり感受性であった。
【０１２０】
実施例３
本実施例は、リガンド結合活性またはリガンド感受性のいずれかまたは双方に影響するトランケーテッドＥｃＲまたはＲＸＲ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットの出願人のさらなる分析を記載する。簡単に述べれば、実施例１および２に記載したように構築したキメラ受容体対の６つの異なる組合せを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において単一の実験でさらに分析した。これらの６つの受容体対の組合せおよびそれらの対応する試料の数を表７に示す。
【０１２１】
【表７】
0005031967.tif 000010
【０１２２】
レポータープラスミドｐＦＲＬｕｃと共に前記した受容体構築体対を前記したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。６つのＣｆＥｃＲトランケーション受容体組み合わせを２つの群に複製し、ステロイド（図１５のＸ−軸上の奇数）または非ステロイド（図１５のＸ−軸上の偶数）いずれかで処理した。特に、細胞は０，１，５または２５μＭのＰｏｎＡ（ステロイド）またはＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（非ステロイド）リガンドを含有する培地中で増殖させた。レポーター遺伝子活性を測定し、全ＲＬＵを示す。各棒線の頂部の数はその処理についての最大誘導倍率であり、３つの複製の平均である。
図１５に示すように、ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ／ＭｍＲＸＲＥＦ受容体組み合わせは、全ＲＬＵおよび倍誘導の双方の項目において最良のスイッチ対であった（欄１〜６を欄７〜１２と比較されたい）。これは、実施例２に記載した出願人の先の知見を確認する（図１１〜１４）。また、トランケーテッドＥｃＲおよびＲＸＲポリペプチドをコードする同一遺伝子発現カセットをヒト肺癌腫細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ）においてアッセイし、同様の結果が観察された（データは示さず）。
【０１２３】
【配列表】
0005031967.tif 000011
0005031967.tif 000012
0005031967.tif 000013
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＶＰ１６ＡＤ−ＭｍＲＸＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．１）である。
【図２】  図２は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＵＳＰＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．２）である。
【図３】  図３は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＭｍＲＸＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．３）である。
【図４】  図４は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＭｍＲＸＲＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＶＰ１６ＡＤ−ＤｍＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．４）である。
【図５】  図５は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＣｆＵＳＰＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．５）である。
【図６】  図６は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲＤＥＦ−ＶＰ１６ＡＤキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．６）である。
【図７】  図７は、実施例１に記載したように調製した、ＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．７）である。
【図８】  図８は、実施例１に記載したように調製した、ＶＰ１６ＡＤ−ＤｍＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＭｍＲＸＲポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．８）である。
【図９】  図９は、実施例１に記載したように調製した、ＶＰ１６ＡＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットおよびＭｍＲＸＲポリペプチドをコードする第２の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．９）である。
【図１０】  図１０は、実施例１に記載したように調製した、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲＣＤＥＦキメラポリペプチドをコードする第１の遺伝子発現カセットを含むエクジソン受容体ベースの遺伝子発現系（スイッチ１．１０）である。
【図１１】  図１１は、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥトランケーション突然変異体の発現データである。
【図１２】  図１２は、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共に３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥトランケーション突然変異体の発現データである。
【図１３】  図１３は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ構築体の発現データである。
【図１４】  図１４は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＣＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＢａｍ−ＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＡＦ２ｄｅｌ構築体の発現データである。
【図１５】  図１５は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬＵｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされた種々のトランケーテッドＣｆＥｃＲおよびＭｍＲＸＲ受容体対の発現データである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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