(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Loucy細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）とを添加して、当該細胞のＢＡＦＦの産生を誘発する方法。
【請求項２】
Loucy細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）とを添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量を測定することからなる、ＢＡＦＦの発現を制御することができる物質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
ＢＡＦＦの発現の制御が、ＢＡＦＦの発現の抑制又は阻害である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＢＡＦＦの発現量の測定が、培養液中のＢＡＦＦの量を測定するものである請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
Loucy細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）とを添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量を測定することからなる、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、及びシェーグレン症候群(ＳＳ)からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＢＡＦＦの発現量の測定が、培養液中のＢＡＦＦの量を測定するものである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）とを含有してなるLoucy細胞に対するＢＡＦＦの産生誘発剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＢＡＦＦ抑制剤又は阻害剤のスクリーニング方法に関する。詳細には、本発明は、市販の細胞株に対して適切な刺激条件を加え、細胞外に検出可能な充分量のＢＡＦＦを安定して遊離する系を構築することにより、ＢＡＦＦの発現又は産生を抑制又は阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。さらに詳細には、本発明は、培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して、当該細胞のＢＡＦＦの産生を誘発する方法、及び培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量及び／又はその活性量を測定することからなる、ＢＡＦＦの発現又は活性を制御することができる物質をスクリーニングする方法、並びにＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を含有してなるＢＡＦＦ産生細胞に対するＢＡＦＦの産生誘発剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＡＦＦ(B cell activating factor belonging to the TNF family)は、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞等から産生・分泌され、B細胞上の３種の受容体を介してＢ細胞の分化、活性化、生存等を制御することが知られている（Mooreら Science(1999)285,260-263）。【０００３】
ヒトＢＡＦＦは、２８５個のアミノ酸からなる膜貫通型の蛋白質である。そのアミノ酸配列中には、４６個のアミノ酸からなる細胞質ドメインと２１８個のアミノ酸からなる細胞外ドメインが存在し、また、Ｎグリコシル化部位が２ヶ所有り、３量体を形成するといった構造的な特徴を有する。さらにＣ末端から１５２アミノ酸の細胞外ドメインは、Furinファミリーのプロテアーゼによって切断され、可溶型として遊離される。ヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列は当初、Neutrokineαとの名称で、国際特許出願公開ＷＯ９８／１８９２１号公報中の配列番号１又は２として開示された。この他別名称として、Ｋａｙ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、Ｂｌｙｓ、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ｚＴＮＦ４等も知られている。【０００４】
ＢＡＦＦの受容体としては、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor)及びＢＣＭＡ(B cell maturation antigen)が知られている。ＢＡＦＦ−Ｒ及びＢＣＭＡは主にＢ細胞に発現しており、ＴＡＣＩはＢ細胞と活性化Ｔ細胞に発現している。【０００５】
ＢＡＦＦの生理的作用は、上述のようにＢ細胞の分化、活性化、生存等の制御であるが、近年、病態との関わりも次第に明らかとなった。即ち、ＢＡＦＦを過剰に発現するマウスでは、末梢血Ｂ細胞の増多、リンパ節や脾臓の肥大、血清中ＩｇＧ濃度上昇、抗核抗体産生、腎内に免疫複合体の沈着、蛋白尿、腎炎等の、ＳＬＥ様の症状を示すことが報告されている（Mackayら J.Exp.Med.,(1999)190,1697-1710、Khareら Proc.Natl.Acad.Sci.USA  (2000)97,3370-3375）。さらにこのマウスは、加齢とともに唾液腺炎、唾液腺破壊等の、ＳＳ様の症状を示すことも判明した（Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68）。またＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳの患者において、血清中ＢＡＦＦ濃度が増加していることも報告されており（Zhangら J.Immunol.(2001)166,6-10、 Cheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313-1319、 Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68）、さらにはＲＡ患者の滑液中のＢＡＦＦレベルが血清中に比べて高いこと（Cheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313-1319）や、ＳＳ患者の唾液腺浸潤白血球におけるＢＡＦＦの発現（Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68）、ＳＬＥ患者における血清ＢＡＦＦレベルとイムノグロブリンや抗ｄｓＤＮＡ抗体との相関性（Zhangら J.Immunol.(2001)166,6-10）、ＲＡ患者におけるＢＡＦＦとリウマトイド因子との相関性（Cheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313-1319）等、数多くの報告がある。【０００６】
これらの事実から、ＢＡＦＦの発現又は産生を抑制又は阻害することはＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳ等の自己免疫疾患の予防・治療に繋がるものということができるため、ＢＡＦＦの発現又は産生の抑制又は阻害を的確にスクリーニングする系の確立が望まれている。
そのようなスクリーニング系の確立には、例えば、遺伝子組換え技術により、ＢＡＦＦを発現するよう構築した遺伝子ベクターを培養細胞に導入することにより、安定してＢＡＦＦを発現する細胞を得る方法が考えられる。しかし、ＢＡＦＦが発現したとしても、分泌型として細胞外に遊離されるとは限らないし、またＢＡＦＦ発現、産生において安定な細胞株とすることができるかという問題を有する。このため、従来、上記のような系は全く報告されていない。例えば市販の細胞株に対して適切な刺激条件を加えることにより、細胞内におけるＢＡＦＦ発現の誘導と細胞外に検出可能な充分量のＢＡＦＦ遊離が認められる系を構築できれば、上記のような問題も解決するといえる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、市販の細胞株に対して適切な刺激条件を加え、細胞外に検出可能な充分量のＢＡＦＦを安定して遊離する系を構築することにより、ＢＡＦＦの発現又は産生を抑制又は阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。またそのような系を構築することにより、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法をも提供できる。
【０００８】
そこで本発明者らは、細胞株の選定や刺激の方法などについて鋭意検討した結果、ＣＤ３を高発現している市販のヒトＴ細胞株であるLoucy細胞又はJurkat細胞に対し、抗ＣＤ３抗体及び／又はＴＰＡ(12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate、又はPhorbol 12-myristate 13-acetate：ＰＭＡと表記することもある)とアイオノマイシン（ionomycin）を組み合わせて刺激することにより、細胞において安定したＢＡＦＦ発現誘導が認められ、且つ、培養液中に検出可能な充分量のＢＡＦＦが安定して遊離されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、培養ヒトＴ細胞にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して刺激することによる、ＢＡＦＦの産生系を提供するものである。より詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して刺激することによる、ＢＡＦＦの産生系を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して、当該細胞のＢＡＦＦの産生を誘発する方法に関する。より詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して、当該細胞のＢＡＦＦの産生を誘発する方法に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、培養ヒトＴ細胞にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して刺激したＢＡＦＦの産生系における、ＢＡＦＦの発現又は活性を制御することができる物質をスクリーニングする方法を提供するものである。より詳細には、本発明は、培養ヒトＴ細胞にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して刺激したＢＡＦＦの産生系における、ＢＡＦＦの発現又は活性を抑制又は阻害することができる物質をスクリーニングする方法を提供するものである。さらに詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して刺激したＢＡＦＦの産生系における、ＢＡＦＦの発現又は活性を制御、好ましくは抑制又は阻害することができる物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明のスクリーニング方法は、詳細には、培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量及び／又はその活性量を測定することからなる、ＢＡＦＦの発現又は活性を制御することができる物質をスクリーニングする方法に関する。より詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量及び／又はその活性量を測定することからなる、ＢＡＦＦの発現又は活性を制御することができる物質をスクリーニングする方法に関する。さらに詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量及び／又はその活性量を測定することからなる、ＢＡＦＦの発現又は活性を抑制又は阻害することができる物質をスクリーニングする方法。
【００１３】
さらに、本発明は、培養ヒトＴ細胞にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加して刺激したＢＡＦＦの産生系における、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。より詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞に抗ＣＤ３抗体及び／又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）を組み合わせて刺激したＢＡＦＦの産生系における、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。さらに詳細には、本発明は、Loucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞に、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を添加したＢＡＦＦの産生系に、被検物質を添加して、当該ＢＡＦＦ産生系におけるＢＡＦＦの発現量及び／又はその活性量を測定することからなる、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を含有してなるＢＡＦＦ産生細胞に対するＢＡＦＦの産生誘発剤に関する。より詳細には、本発明は、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を含有してなる培養ヒトＴ細胞に対するＢＡＦＦの産生誘発剤に関する。さらに詳細には、本発明は、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を含有してなるLoucy細胞、又はJurkat細胞などの培養ヒトＴ細胞に対するＢＡＦＦの産生誘発剤に関する。
【００１５】
本発明によれば、培養細胞株を用いたＢＡＦＦの産生を抑制又は阻害する物質をスクリーニングする方法、さらには、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等におけるＢＡＦＦの産生や活性に関与している疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、Loucy細胞又はJurkat細胞を抗ＣＤ３抗体、又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時の、ＢＡＦＦの発現を示す図である。
【図２】図２は、Loucy細胞を抗ＣＤ３抗体、又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時の、ＢＡＦＦ蛋白質の発現を示す図である。
【図３】図３は、抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体(４Ｈ４)及び対照としてChemicon製ウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体(Chem)を用い、常法のウエスタンブロッティング法にてリコンビナントのヒトＢＡＦＦ(Chemicon製)を検出した図である。
【図４】図４は、Loucy細胞をＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時の、ＢＡＦＦの産生を示す図である。
【図５】図５は、Jurkat細胞をＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時の、ＢＡＦＦの産生を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、Loucy細胞又はJurkat細胞を各種の物質で刺激したときのＢＡＦＦの発現を調べた。その結果、後記実施例に示すように、Loucy細胞又はJurkat細胞を抗ＣＤ３抗体、又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）を組み合わせて刺激することにより、細胞において安定したＢＡＦＦ発現誘導が認められ、且つ、培養液中に検出可能な充分量のＢＡＦＦが安定して遊離されることを見出した。【００１８】
従って、本発明のＢＡＦＦの発現又は活性を制御、好ましくは抑制又は阻害することができる物質のスクリーニング方法は、以下のごとく構築することができる。
即ち、市販のヒトＴ細胞を適切な培地に適切な濃度で懸濁し、培養プレート等に播種し、ＴＰＡ（終濃度として０．００１〜１．０μｇ／ｍＬ、好ましくは０．００５〜０．１μｇ／ｍＬ）及びアイオノマイシン（ionomycin）（終濃度として０．０１〜１０．０μｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５〜１．０μｇ／ｍＬ）を添加して刺激し、さらに必要に応じて被験物質（終濃度１０−１５〜１０−３Ｍにおける、任意の濃度勾配列）を添加し、培養を開始する。培養開始後１時間〜７日後、好ましくは３時間〜５日後に培養上清を回収し、上清中のＢＡＦＦ濃度を測定し、これを対照と比較することで、本スクリーニング系における被験物質のＢＡＦＦ抑制又は阻害活性を調べることができる。また、上述の系を実施するにあたり、予め培養プレート等をＰＢＳ等で希釈した抗ＣＤ３抗体（終濃度として０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００μｇ／ｍＬ）にてコーティングしたものを用いてもよい。また抗ＣＤ３抗体にてコーティングした培養プレート等を用いる場合は、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）を用いなくても充分量のＢＡＦＦを検出することができ、より簡便なスクリーニング系として有用である。【００１９】
本発明で用いるヒトＴ細胞株は、市販のものが好ましく、例えば、Loucy細胞（ATCC Cat. No. CRL-2629）、Jurkat細胞（ATCC Cat. No. TIB-152）、TALL-１細胞（JCRB 0086）が挙げられ、このうちＴ細胞受容体を介した細胞活性化が予想できる、ＣＤ３を高発現しているLoucy細胞（ATCC Cat. No. CRL-2629）、Jurkat細胞（ATCC Cat. No. TIB-152）がさらに好ましい。【００２０】
また、本発明で用いる抗ＣＤ３抗体としては、当業者に公知の方法で作製された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体が挙げられるが、このうち抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体が好ましく、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（BD Pharmingen Cat No. 555336、等）がさらに好ましい。【００２１】
また、本発明で用いるＴＰＡは、12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetateの略称であり、別名称としてPhorbol 12-myristate 13-acetate（ＰＭＡと表記することもある）として知られているホルボールエステルであるが、本発明で使用するものとしてはいずれの表記による化合物でもよく、また立体異性体をも包含する。好ましい市販のＴＰＡとしては、例えば4-α-Phorbol 12-myristate 13-acetate(SIGMA Cat. No.P-148)が挙げられる。【００２２】
さらに、本発明で用いるアイオノマイシン（ionomycin）は、Streptomyces conglobatus由来のポリエーテル系抗生物質であり、カルシウムイオノホアとしての作用が知られているが、本発明で使用するアイオノマイシン（ionomycin）としては、製薬的に許容される塩も含まれる。好ましい市販品のアイオノマイシン（ionomycin）としては、例えばIonomycin, calcium salt (SIGMA  Cat. No. IO634)が挙げられる。【００２３】
本発明のＢＡＦＦの産生誘発剤は、ＢＡＦＦの産生を誘発する活性成分として、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせ及び／又は抗ＣＤ３抗体を含有してなることを特徴とするものである。本発明のＢＡＦＦの産生誘発剤は、前記した活性成分のほかに緩衝液などの細胞系に添加可能な担体を含有することができ、このような細胞系に添加可能な担体と共にＢＡＦＦの産生誘発用組成物とすることができる。【００２４】
本発明のＢＡＦＦの産生誘発剤は、ＢＡＦＦを産生する細胞、好ましくは培養細胞に適用することができ、好ましい細胞としては、培養ヒトＴ細胞、より具体的にはLoucy細胞やJurkat細胞が挙げられる。【００２５】
本発明のＢＡＦＦの産生誘発剤は、活性成分としてＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）との組み合わせを用いる場合には、それぞれの活性成分が、ＴＰＡは終濃度として０．００１〜１．０μｇ／ｍＬ、好ましくは０．００５〜０．１μｇ／ｍＬになるような量を、アイオノマイシン（ionomycin）は終濃度として０．０１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬになるような量を、細胞系に添加して使用することができる。また、活性成分が、抗ＣＤ３抗体の場合には、活性成分の濃度が０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬの緩衝液溶液を培養プレートに敷いて使用することができる。【００２６】
以上のごとく得られる本発明のＢＡＦＦの産生系は、後記の実施例に示すように、培養液中に検出可能な充分量のＢＡＦＦが安定して遊離されるという驚くべき特徴を有するので、ＢＡＦＦの発現又は活性を制御することができる物質、好ましくは抑制又は阻害することができる物質のスクリーニング方法はもとより、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を実現することができる。【００２７】
実施例
以下に、実施例を挙げてこの発明をさらに具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
Loucy細胞又はJurkat細胞を抗ＣＤ３抗体又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時のＢＡＦＦの発現
（ａ）ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）による刺激培養
ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より購入したLoucy細胞又はJurkat細胞を１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum)、０．４５％Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１×１０６cells/wellになるように、6 well培養プレートに播種した。これと同時にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）を最終濃度がそれぞれ０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ又は０．１μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養開始後５時間、２４時間、４８時間、７２時間（Loucy細胞）又は４８時間、１２０時間、１６８時間（Jurkat細胞）で細胞を回収した。これら回収した細胞からtotal ＲＮＡを抽出し、次の条件下においてＲＴ−ＰＣＲ法によりＢＡＦＦのｍＲＮＡの解析を行った。ReverTra Dashキット（TOYOBO  Cat. No. PCR-401）を用い、３０℃  １０分、４２℃  ２０分、９９℃  ５分の反応過程を経て、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを、Advantage 2 PCR Enzyme system(BD Biosciences Cat. No. PT3281-1)を用い、９４℃で１分反応後、９４℃  ３０秒、６６℃  １．５分を３５サイクル反応させ、６６℃  ５分の過程を経て、獲得したＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、９７５ｂｐの位置に目的のバンドが認められた。ＰＣＲ反応に使用したヒトＢＡＦＦのプライマー配列は次の通りである。
Forward : 5'aggccccaaccttcaaagttcaag  （配列番号１）
Reverse : 5'cttagaggtacagagaaagggagg  （配列番号２）
この結果を図１に示す。図１の（ａ）はLoucy細胞の場合を示し、図１の（ｂ）はJurkat細胞の場合を示す。また、Ｔ＋ＩはＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）による刺激を示し（（ａ）においてはそれぞれ０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬであり、（ｂ）においてはそれぞれ０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ（向かって右側）又は０．１μｇ／ｍＬ（向かって左側）である）、（−）は無刺激を示す。さらに、各々の図におけるＧ３ＰＤＨは陽性コントロールを示す。図１（ａ）  、（ｂ）に示されるように、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）刺激を受けたLoucy細胞、及びJurkat細胞において、刺激後５時間、及び２日においてＢＡＦＦ ｍＲＮＡの発現が認められ、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）によるＢＡＦＦ ｍＲＮＡの明らかな発現誘導は培養開始７２時間、及び７日（１６８時間）後まで継続して認められた。従って、Loucy細胞又はJurkat細胞をＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）によって刺激培養することにより、安定したＢＡＦＦの発現誘導が認められることから、この培養系を用いて、ＢＡＦＦ発現抑制、あるいは阻害物質のスクリーニングが可能となることがわかった。【００２９】
（ｂ）抗ＣＤ３抗体による刺激培養
ＰＢＳにより１０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＣＤ３抗体を６ウェル培養プレートにしき、４℃一晩で底面吸着させた後、（ａ）と同様に懸濁したLoucy細胞を１×１０６cells/wellになるように播種した。培養開始後５時間、２４時間、４８時間、７２時間で細胞を回収した。これら回収した細胞からtotal ＲＮＡを抽出し、次の条件下においてＲＴ−ＰＣＲ法によりＢＡＦＦのｍＲＮＡの解析を行った。ReverTra Dashキット（TOYOBO  Cat. No. PCR-401）を用い、３０℃  １０分、４２℃  ２０分、９９℃  ５分の反応過程を経て、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを、Advantage 2 PCR Enzyme system(BD Biosciences Cat. No. PT3281-1)を用い、９４℃で１分反応後、９４℃  ３０秒、６６℃  １．５分を３５サイクル反応させ、６６℃  ５分の過程を経て、獲得したＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、９７５ｂｐの位置に目的のバンドが認められた。この結果、図１の(a)の右側にanti-CD3として示されるように、刺激後５時間からＢＡＦＦ ｍＲＮＡの発現が認められ、その後減衰し、培養開始７２時間後に再度発現する２相性を示すことが明らかとなった。このような発現様式はそれぞれに生物学的意義が異なる可能性があると考えられ、Loucy細胞を抗ＣＤ３抗体によって刺激培養することにより誘導されたＢＡＦＦ発現を用いて、さらにユニークなＢＡＦＦ発現の抑制、あるいは阻害物質のスクリーニングが可能となると考えられる。
【実施例２】
【００３０】
Loucy細胞を抗ＣＤ３抗体又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時のＢＡＦＦ蛋白質の発現
ＰＢＳにより１０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＣＤ３抗体を６ウェル培養プレートにしき、４℃一晩で底面吸着させた後、実施例１と同様に懸濁したLoucy細胞を１×１０６cells/wellになるように播種した。培養開始後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間で細胞を回収した。これら回収した細胞を用いて、定法のウェスタンブロット法にてＢＡＦＦ蛋白質の発現を検討した。なお、ＢＡＦＦ蛋白質検出抗体として、ウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体（ＡＢ１６５３０、Chemicon社製）を用いた。この結果を図２に示す。図２の左側の（−）は刺激を行わなかった場合をコントロールとして示し、図２のCD3 stimulationは抗ＣＤ３抗体で刺激した場合を示し、TPA+IonomycinはＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）とで刺激した場合を示す。図２の下段のβ-actinは陽性コントロールを示す。図２に示されるように、抗ＣＤ３抗体による刺激を受けたLoucy細胞おいて、刺激後２４時間からヒトＢＡＦＦに該当する３４ｋＤａのバンドが確認され、この明らかな発現誘導は、培養開始９６時間まで継続して認められた。一方、Loucy細胞を１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum)、０．４５％Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１×１０６cells/wellになるように、6 well培養プレートに播種し、これと同時にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）を最終濃度がそれぞれ０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養開始後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間において細胞を回収した。これら回収した細胞を用いて、定法のウェスタンブロット法にてＢＡＦＦ蛋白質の発現を検討した。この結果、図２に示されるように、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）による刺激を受けたLoucy細胞おいて、刺激後２４時間からヒトＢＡＦＦに該当する３４ｋＤａのバンドが確認され、この明らかな発現誘導は、培養開始９６時間まで継続して認められた。これらの結果より、Loucy細胞を抗ＣＤ３抗体又はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）によって刺激培養することにより、安定したＢＡＦＦ蛋白の発現誘導が培養開始９６時間後まで認められ、この培養系を用いて、ＢＡＦＦ蛋白質発現抑制、あるいは阻害物質のスクリーニングが可能となることがわかった。【００３１】
参考例１
抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体（４Ｈ４）の作製
実施例３に用いる抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体（４Ｈ４）は、以下のようにして作製した。即ち、配列表の配列番号３に示したＢＡＦＦの２８５個のアミノ酸から細胞外ドメインの膜近傍に該当する１３アミノ酸（配列番号４）を選択し、ＭＢＳ法を用いてＫＬＨとコンジュゲートし、抗原とした。１００μｌの１ｍｇ／ｍＬ抗原ペプチド生理食塩水溶液を、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，６週齢）腹腔内に免疫した。２週間後に１００μｌの１ｍｇ／ｍＬ抗原ペプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫し、以降２週間毎に追加免疫を２回行った。初回免疫後２ヶ月目に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地(ペニシリン，ストレプトマイシン入り)中でリンパ球を分離した。分離したリンパ球をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によりマウス骨髄腫由来のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。ハイブリドーマ細胞をフィーダー細胞入りのＨＡＴ培地に懸濁し９６穴プレート（Greiner）に分注し１５日間培養した。ハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay）によって抗原ペプチドと反応がある抗体産生細胞を選択した。即ち、まず９６穴プレートに５０μｌの１０μｇ／ｍＬ抗原ペプチドをしき、４℃、一晩底面に吸着させた後、１００μｌの２％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキングさせた。ハイブリドーマ細胞の上清１００μｌを４℃、１晩反応させた後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを１０００倍希釈して３７℃、１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質に用いて発色させた。５０μｌの２Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定して１．０以上の値が得られたハイブリドーマを選択し，限界希釈法によるクローニングを行った。【００３２】
７日前、３日前にそれぞれ０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に、選択したハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、約１０日後に腹水を採取した。採取した腹水は室温で３０分おいた後、４℃で一晩静置し、１５Ｋｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収し、マウスＩｇＧ画分をプロテインＡ-Sepharoseカラムにて分離精製した。
以上の方法にて、抗ヒトＢＡＦＦ抗体(４Ｈ４、アイソタイプはＩｇＧ１)を産生するハイブリドーマ細胞株、並びに該抗体(４Ｈ４)を得た。得られた４Ｈ４、及び対照としてChemicon製ウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体(ＡＢ１６５３０：図３中、Chemと表記)を、常法のウエスタンブロッティング法にてリコンビナントのヒトＢＡＦＦ(Chemicon製)の検出に用いた結果、図３に示すように可溶性ヒトＢＡＦＦに該当する１７ＫＤａのバンドが確認された。
【実施例３】
【００３３】
Loucy細胞又はJurkat細胞をＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）により刺激した時のＢＡＦＦの産生
実施例１と同様に、懸濁したLoucy細胞又はJurkat細胞を１×１０６cells/wellになるように、６ well培養プレートに播種した。これと同時にＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）を最終濃度がそれぞれ０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養開始後５時間、２４時間、４８時間、７２時間（Loucy細胞）又は１、４、７日（Jurkat細胞）で培養上清を回収した。これらの培養上清中に含有される細胞から産生されたＢＡＦＦを、市販のウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体（Chemicon社  Cat. No. AB16530）と上記参考例１で作製したマウス抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体（４Ｈ４）を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定した。ＥＬＩＳＡ法は次に記載した方法で行った。即ち、１次抗体としてウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体（Chemicon社  Cat. No. AB16530 ）を用い、９６穴プレートに１μｇ／wellで４℃一晩コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後ＢｌｏｃｋＡｃｅ(大日本製薬社)を１５０μＬ／well加え、３７℃、２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、検体５０μＬ及びビオチン標識した４Ｈ４を５０μＬ(８ｎｇ／ｍＬ)加え、室温にて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈したストレプトアビジン標識ＨＲＰ（Horse ＲＡdish peroxidase）を５０μＬ添加し、室温にて３０分反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄後ＴＭＢ One Solution(Clonetech社）を５０μＬ加え、５分間室温にて反応させた後、１Ｎ ＨＣｌ ５０μＬを添加後プレートリーダー(PerkinElmer製)で４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準物質としてリコンビナントのヒトＢＡＦＦ（Chemicon社  Cat. No. GF119）を用い、標準曲線から検体中のＢＡＦＦ濃度を測定した。【００３４】
Loucy細胞を用いた場合の結果をグラフ化して図４に示し、Jurkat細胞を用いた場合の結果を同様にグラフ化して図５に示す。それぞれのグラフにおける縦軸はＢＡＦＦ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、それぞれの棒グラフの左側はＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）による刺激を行わなかった場合のＢＡＦＦ濃度をコントロールとして示している。この結果、図４及び図５に示されるように、ＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）刺激を受けたLoucy細胞又はJurkat細胞において、刺激後５時間又は１日から培養上清中のＢＡＦＦが検出でき、培養開始７２時間又は７日まで継続して認められた。これらの結果より、Loucy細胞又はJurkat細胞をＴＰＡとアイオノマイシン（ionomycin）によって刺激培養することにより、安定したＢＡＦＦ産生誘導が認められ、この培養系を用いて、ＢＡＦＦ産生抑制物質、あるいは阻害物質のスクリーニングが可能となることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患との関係が明らかにされてきているＢＡＦＦの産生を培養ヒトＴ細胞において誘発する方法を提供し、自己免疫疾患の治療や予防に有効な新しい物質をスクリーニングするための手法を提供するものであり、産業上の利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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