(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置７６８のタンパク質のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むトキシンであって、
このトキシンが、配列番号４のアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４４９のアミノ酸配列を含むタンパク質との組み合わせにおいて、ディアブロチカ ビルギフェラ（Diabrotica virgifera）幼虫によって摂取された場合、この幼虫に対して殺虫性である、トキシン。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４５７のタンパク質のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むトキシンであって、
このトキシンが、配列番号２のアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置８７１のアミノ酸配列を含むタンパク質との組み合わせにおいて、Diabrotica virgifera幼虫によって摂取された場合、この幼虫に対して殺虫性である、トキシン。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置７６８のタンパク質のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のトキシン。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４５７のタンパク質のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２記載のトキシン。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置７６８又は８７１のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項６】
配列番号２又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４４９又は４５７のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項８】
配列番号４又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１、３、４又は７のいずれか１項記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項２、５、６又は８のいずれか１項記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項１１】
天然のＤＮＡ配列と比較して異なるコドン使用頻度を有するが同じタンパク質配列をコードする人工ＤＮＡ配列を含む、請求項９記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
天然のＤＮＡ配列と比較して異なるコドン使用頻度を有するが同じタンパク質配列をコードする人工ＤＮＡ配列を含む、請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１１記載のＤＮＡと植物発現可能プロモーター領域とを含む、キメラ遺伝子。
【請求項１４】
請求項１２記載のＤＮＡと植物発現可能プロモーター領域とを含む、キメラ遺伝子。
【請求項１５】
前記プロモーター領域が、根組織において優先的に活性である、請求項１３記載のキメラ遺伝子。
【請求項１６】
前記プロモーター領域が、根組織において優先的に活性である、請求項１４記載のキメラ遺伝子。
【請求項１７】
前記プロモーターが、配列番号５又は６のＤＮＡ配列又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイズするＤＮＡを含む、請求項１３記載のキメラ遺伝子。
【請求項１８】
前記プロモーターが、配列番号５又は６のＤＮＡ配列又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイズするＤＮＡを含む、請求項１４記載のキメラ遺伝子。
【請求項１９】
前記キメラ遺伝子が、細胞からの分泌のため又は細胞のオルガネラへのターゲティングのためのシグナルペプチドを更に含む、請求項１３記載のキメラ遺伝子。
【請求項２０】
前記キメラ遺伝子が、細胞からの分泌のため又は細胞のオルガネラへのターゲティングのためのシグナルペプチドを更に含む、請求項１４記載のキメラ遺伝子。
【請求項２１】
前記シグナルペプチドが、葉緑体輸送ペプチドである、請求項１９記載のキメラ遺伝子。
【請求項２２】
前記シグナルペプチドが、葉緑体輸送ペプチドである、請求項２０記載のキメラ遺伝子。
【請求項２３】
請求項１３、１５、１７、１９又は２１のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択されるキメラ遺伝子を含む、植物細胞。
【請求項２４】
請求項１４、１６、１８、２０又は２２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択されるキメラ遺伝子を含む、植物細胞。
【請求項２５】
請求項１３、１５、１７、１９又は２１のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択されるキメラ遺伝子と、請求項１４、１６、１８、２０又は２２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択されるキメラ遺伝子とを含むように形質転換された、植物細胞。
【請求項２６】
請求項１、３、４又は７のいずれか１項記載のタンパク質と、請求項２、５、６又は８のいずれか１項記載のタンパク質とを産生するように形質転換された、植物細胞。
【請求項２７】
その細胞中に組み込まれたキメラ遺伝子を含む植物又は種子であって、そのキメラ遺伝子が、請求項１３、１５、１７、１９又は２１のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択される、植物又は種子。
【請求項２８】
請求項１４、１６、１８、２０又は２２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択されるキメラ遺伝子を含む、植物又は種子。
【請求項２９】
トウモロコシ又はトウモロコシの種子である、請求項２７記載の植物又は種子。
【請求項３０】
トウモロコシ又はトウモロコシの種子である、請求項２８記載の植物又は種子。
【請求項３１】
請求項９記載のＤＮＡ又は請求項１０記載のＤＮＡを含むように形質転換された、微生物。
【請求項３２】
植物の細胞においてタンパク質を発現させることを含む、昆虫の防除方法であって、前記タンパク質が、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質から選択される、方法。
【請求項３３】
植物細胞を第一のキメラ遺伝子及び第二のキメラ遺伝子で形質転換し、昆虫に対して耐性の前記細胞から形質転換された植物を再生させることを含む、植物を甲虫類昆虫に対して耐性にする方法であって、前記第一のキメラ遺伝子が請求項１３、１５、１７、１９又は２１のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択され；前記第二のキメラ遺伝子が請求項１４、１６、１８、２０又は２２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択される、方法。
【請求項３４】
第一のキメラ遺伝子と第二のキメラ遺伝子とで形質転換された植物を植え付け、播種し、又は生育させることを含む、甲虫類有害昆虫を防除する方法であって、前記第一のキメラ遺伝子が請求項１３、１５、１７、１９又は２１のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択され；前記第二のキメラ遺伝子が請求項１４、１６、１８、２０又は２２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子から選択される、方法。
【請求項３５】
前記植物がトウモロコシである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記昆虫が、以下：
根きり虫類、ゾウムシ類、ジャガイモハムシ類、ディアブロチカ（Diabrotica）属、アンソノムス（Anthonomus）属、レプチノタルサ（Leptinotarsa）属、アゲラスチカ  アルニ（Agelastica alni）、アルファルファタコゾウムシ（Hypera postica）、ヒペラ  ブルネイペニス（Hypera brunneipennis）、ハルチカ  トンバシア（Haltica tombacina）、アントノムス  グランジス（Anthonomus grandis）、テネブリオ  モリトー（Tenebrio molitor）、トリボレウム  カスタネウム（Triboleum castaneum）、ジクラジスパ  アルミゲラ（Dicladispa armigera）、トリキスパ  セリカ（Trichispa serica）、オウレマ  オリゼ（Oulema oryzae）、コラスピス  ブルネ（Colaspis brunnea）、リゾロルプトルス  オリゾフィラス（Lissorhorptrus oryzophilus）、フィロトレタ  クルシフェラ（Phyllotreta cruciferae）、フィロトレタ  ストリオラタ（Phyllotreta striolata）、フィリオデス  プンクツラタ（Psylliodes punctulata）、エントモセリス  アメリカナ（Entomoscelis americana）、メリゲテス  アエネウス（Meligethes aeneus）、セウトリンクス（Ceutorynchus）属、フィリオデス  クリソセファラ（Psylliodes chrysocephala）、フィロトレタ  ウンズラタ（Phyllotreta undulata）、レプチノタルサ  デセミリネタ（Leptinotarsa decemlineata）、ディアブロチカ  ウンデシムプンクタタ  ウンデシムプンクタタ（Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata）、ディアブロチカ  ウンデシムプンクタタ  ホワルジ（Diabrotica undecimpunctata howardi）、ディアブロチカ  バルベリ（Diabrotica barberi）、及びディアブロチカ  ビルフェラ（Diabrotica virgifera）からなる群から選択される、請求項３３、３４又は３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
請求項１、３、４又は７のいずれか１項記載のタンパク質と請求項２、５、６又は８のいずれか１項記載のタンパク質とを、トウモロコシ根切り虫からトウモロコシを保護するための同時、別個又は連続的使用のための組み合わされた調製物として含む、製品。
【請求項３８】
トウモロコシ、又はトウモロコシ根切り虫からトウモロコシを保護するための殺虫性組成物である、請求項３７記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、細菌株、好ましくはBrevibacillus種株、最も好ましくはBrevibacillus laterosporus種株から単離された新規の殺虫性分泌タンパク質（「ＩＳＰ（ｓ）」）（これは本発明の別のＩＳＰタンパク質のようなＩＳＰ相補的タンパク質と組み合わせて摂取された場合に殺虫性である）、及びこのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。これらのタンパク質は、畑の植物に対する、特にトウモロコシ根切り虫の、昆虫による被害を防止する又は最小限にするのに有用である。
【０００２】
本発明は、植物の細胞における本発明のＩＳＰタンパク質の発現によって、（好ましくは甲虫類昆虫、特にDiabrotica種、Leptinotarsa種及びAnthonomus種昆虫に対して）殺虫性になった、植物、特にトウモロコシにも関する。
【０００３】
本発明は、Diabrotica種、Leptinotarsa種又はAnthonomus種昆虫、好ましくはDiabrotica種有害昆虫、特にトウモロコシ根切り虫による被害を、本発明のＩＳＰタンパク質、特に配列番号２、４、８又は１０のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質、又はそれらの殺虫剤として有効性のフラグメントをそれらの昆虫に摂取させることによって制御する方法にも関する。
【０００４】
２．従来技術の説明
最も破壊的な害虫のいくつかは、Diabroticaの（Diabroticine）甲虫に見出される。北アメリカにおいては、トウモロコシ根切り虫の３つの重要な種である、Diabrotica virgifera（西部トウモロコシ根切り虫）、Diabrotica barberi（北部トウモロコシ根切り虫）及びDiabrotica undecimpunctata howardi（南部トウモロコシ根切り虫）は、防除することが最も高価な有害昆虫と考えられている（Metcalf、1986、「Methods for the Study of Pest Diabrotica」前文、pp. vii〜xv、Krysan, J. L. and Miller, T.A.編、 Springer-Verlag, New York）。Diabrotica virgifera及びDiabrotica barberiは、米国及びカナダにおける主要なトウモロコシ生産州において最も深刻な有害昆虫であると考えられている（Levine and Oloumi-Sadeghi, 1991, Annu. Rev. Entomol. 36, 229-55）。それらの幼虫は、根を食べ、したがって、トウモロコシの生長及びトウモロコシ収量に直接の被害を与える。トウモロコシの根系に対する幼虫による被害を防除するための土壌殺虫剤及びトウモロコシの毛に対する甲虫の被害を低減するための空中散布のためのコストは、作物の損失と合わせると、年間１０億ドルに達しうる（Metcalf, 1986, 前出）。近年、いくつかの米国の州においては、トウモロコシの後に大豆を植える作物ローテーションプログラムは、トウモロコシ根切り虫がこの状況に適応してきたのにつれて、効果を失ったことが発見された。
【０００５】
トウモロコシ根切り虫に対する毒性を有する細菌株及び／又は遺伝子は、米国特許第６，０２３，０１３号、６，０１５，５５３号、６，００１，６３７号、５，９０６，８１８号及び５，６４５，８３１号に記載されている。また、ＰＣＴ公開公報であるＷＯ００／０９６９７、ＷＯ９９／５７２８２、ＷＯ９８／１８９３２、ＷＯ９７／４０１６２、及びＷＯ００／２６３７８は、Bacillus及びその他の細菌種から得られるトキシン及び遺伝子に関するものであり、それらのいくつかはトウモロコシ根切り虫に対する毒性を有すると記載されている。ＷＯ９８／４４１３７、ＷＯ９４／２１７９５及びＷＯ９６／１００８３は、栄養成長中に産生される殺虫性タンパク質及び補助タンパク質を特徴とする殺虫性のBacillus株に関するものであり、それらのいくつかはトウモロコシ根切り虫に対して毒性を有すると記載されている。米国特許第５，０５５，２９３号は、土壌にBacillus laterosporusのパラスポラル封入体（parasporal inclusion）形成種を接種することによりトウモロコシ根切り虫を防除する方法を記載する。Orlovaら（1998、Applied Environmental Microbiol. 64,2723）は、Bacillus laterosporusの結晶形成株中のタンパク質結晶に付随する蚊に対する殺虫活性を示した。
【０００６】
本発明の目的及び概要
本発明の目的は、昆虫、好ましくはDiabrotica種の昆虫、特にトウモロコシ根切り虫に対して有意な毒性を有する新規タンパク質及びこのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【０００７】
本発明の１つの態様においては、配列番号２のタンパク質の最小活性トキシンのアミノ酸配列を含むタンパク質が提供され、ここで前記最小活性トキシンは：
ａ）配列番号２のタンパク質のフラグメントであり、かつ
ｂ）アミノ酸位置５１〜４５７の配列番号４のタンパク質との組み合わせでDiabrotica virgifera幼虫によって摂取された場合、この幼虫に対して殺虫性である。また、配列番号４のタンパク質の最小活性トキシンのアミノ酸配列を含むタンパク質が提供され、ここで前記最小活性トキシンは：
ａ）配列番号４のタンパク質のフラグメントであり、かつ
ｂ）アミノ酸位置３８〜８７１の配列番号２のタンパク質との組み合わせでDiabrotica virgifera幼虫によって摂取された場合、この幼虫に対して殺虫性である。
【０００８】
特に好ましいのは、アミノ酸位置３８〜アミノ酸位置７６８又は７８１の配列番号２の配列を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるタンパク質であり、好ましくは配列番号２又は配列番号１０のアミノ酸配列によって特徴付けられるタンパク質；及びアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４４９又は４５７の配列番号４の配列を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるタンパク質であり、好ましくは配列番号４又は配列番号８のアミノ酸配列によって特徴付けられるタンパク質、である。
【０００９】
本発明の更なる目的は、受託番号ＬＭＢＰ４００９としてＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに寄託されているｉｓｐ１Ａ  ＤＮＡによってコードされるタンパク質のプロテアーゼ消化フラグメントのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、このプロテアーゼ消化フラグメントがアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４５７の配列番号４のタンパク質との組み合わせでの適用に際してDiabrotica virgiferaに対して殺虫性であるもの；及び受託番号ＬＭＢＰ４００９としてＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに寄託されているｉｓｐ２Ａ  ＤＮＡによってコードされるタンパク質のプロテアーゼ消化フラグメントのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、このプロテアーゼ消化フラグメントがアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置８７１の配列番号２のタンパク質との組み合わせでの適用に際してDiabrotica virgiferaに対して殺虫性であるもの；特に前記プロテアーゼ消化フラグメントが甲虫類消化管液での処理によって得られ得るもの、である。
【００１０】
同様に本発明にしたがって提供されるのは、上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列、特に天然ＤＮＡ配列と比較して異なるコドン使用頻度を有するが同じタンパク質配列をコードする人工ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ、好ましくは植物発現可能なプロモーター領域（すなわち、植物細胞における発現に適したプロモーター領域、これは細菌、ウイルス又は植物起源であることができ、あるいは人工的に作製可能である）；特に根組織において優先的に活性であるプロモーター領域に、作動可能に連結されたキメラ遺伝子に含まれるもの、である。
【００１１】
本発明の１つの態様において、前記キメラ遺伝子中のプロモーターは、配列番号５又は６のＤＮＡ配列あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれらにハイブリダイズするＤＮＡを含む。
【００１２】
本発明の更なる態様においては、キメラ遺伝子は、更に、細胞からの分泌のため又は細胞オルガネラにターゲティングするためのシグナルペプチド、特に葉緑体輸送ペプチドを含む。
【００１３】
同様に提供されるのは、細胞内に組み込まれたこれらのキメラ遺伝子のいずれか、特にＩＳＰ１Ａをコードするキメラ遺伝子又は殺虫剤として有効なそれらのフラグメントと、ＩＳＰ２Ａタンパク質をコードするキメラ遺伝子又は殺虫剤として有効なそれらのフラグメントとの組み合わせを含む、植物細胞、植物又は種子、特にトウモロコシの細胞、植物又は種子である。
【００１４】
本発明の別の態様においては、上記のＤＮＡ配列のいずれかを含むように形質転換された微生物が提供される。
【００１５】
同様に提供されるのは、昆虫を防除する方法、特に、本発明のＩＳＰタンパク質のいずれかを植物の細胞において発現させる工程及び前記細胞から昆虫に対して耐性の形質転換植物を再生させる工程を含む、植物を甲虫類昆虫に対して耐性にする方法である。これらの方法において、昆虫は、好ましくは以下：根切り虫類、ゾウムシ類、ジャガイモハムシ類、Diabrotica種、Anthonomus種、Leptinotarsa種、Agelastica alni、Hypera postica、Hypera brunneipennis、Haltica tombacina、Anthonomus grandis、Tenebrio molitor、Triboleum castaneum、Dicladispa armigera、Trichispa serica、Oulema oryzae、Colaspis brunnea、Lissorhorptrus oryzophilus、Phyllotreta cruciferae、Phyllotreta striolata、Psylliodes punctulata、Entomoscelis americana、Meligethes aeneus、Ceutorynchus種、Psylliodes chrysocephana、Phyllotreta undulata、Leptinotarsa decemlineata、Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata、Diabrotica undecimpunctata howardi、Diabrotica barberi、及びDiabrotica virgiferaのものからなる群から選択される。
【００１６】
本発明の更に別の目的は、本発明のＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換された植物、特にトウモロコシを、植え付け、播種し、又は生育させる工程を含む、植物を甲虫類に対して殺虫性にする方法及び甲虫類を防除する方法を提供することである。この発明の１つの態様においては、ＩＳＰタンパク質は、他の殺虫性タンパク質又はタンパク質の組み合わせ、好ましくはトウモロコシ根切り虫毒性タンパク質と組み合わされている。
【００１７】
同様に本発明にしたがって提供されるのは、好ましくはBrevibacillus laterosporus株由来、特に結晶封入体を形成しないBrevibacillus laterosporus株由来の、ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａ等価物である。これらの等価物は、適切な分子量マーカーを用いて標準的８〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動において決定する場合、好ましくはＩＳＰ１Ａ等価物については約９５〜約１００kD及びＩＳＰ２Ａ等価物については約４５〜約５０kDの分子量を有する。
【００１８】
本発明の好ましい態様の詳細な説明
本発明にしたがって、新規の細菌性トキシン及びそれらをコードするＤＮＡ配列が単離され、特徴づけされている。これらの新規タンパク質は、ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａと名付けられ、それらをコードするＤＮＡ配列は、ｉｓｐ１Ａ及びｉｓｐ２Ａと名付けられた。
【００１９】
本発明に従えば、「ＩＳＰ１Ａタンパク質」は、好適なＩＳＰ相補的タンパク質、特に成熟型ＩＳＰ２Ａタンパク質との組み合わせでの昆虫による摂取に際し、特に甲虫類昆虫、より具体的にはトウモロコシ根切り虫、コットンボールゾウムシ（cotton ball weevil）及びコロラドハムシ、好ましくはDiabrotica種、特に南部、西部及び北部トウモロコシ根切り虫、特にDiabrotica virgiferaに対する殺虫活性を保持する配列番号２のアミノ酸配列の最小タンパク質フラグメントを含む任意のタンパク質を指す。これは、配列番号２における位置３２又は３８のアミノ酸〜アミノ酸位置７６８からアミノ酸位置８７１の位置のアミノ酸のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する任意のタンパク質、特に少なくともアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置７６８の配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する任意のタンパク質を含む。これはまた、Ｎ末端シグナルペプチド配列の一部又は全部を切り落とすことにより配列番号２のアミノ酸配列から得られるタンパク質、又はシグナルペプチド配列が別のもの、例えば植物、ターゲティングペプチド、メチオニンアミノ酸又はメチオニン−アラニンジペプチド、で置き換えられているタンパク質をも含む。特に、これは、分泌又はターゲティングのための、Ｎ末端原核性又は真核性、例えば細菌又は植物の、シグナルペプチドを含むタンパク質を含む。これはまた、上記の最小毒性タンパク質フラグメントを含むハイブリッド又はキメラタンパク質、例えば本発明のＩＳＰ１ＡとＩＳＰ２Ａタンパク質との間のハイブリッドをも含む。更に、ここで用いられる「ＩＳＰ１Ａ」の命名中に含まれるのは、昆虫腸汁、好ましくは甲虫類の腸汁、特に甲虫類の腸プロテアーゼ、好ましくはトウモロコシ根切り虫プロテアーゼ、例えばシステインプロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシン又はトリプシン様プロテアーゼでの処理により得られる、殺虫活性を保持するＩＳＰ１Ａタンパク質のプロテアーゼ耐性フラグメントである。特に、甲虫類は、以下のものからなる群から選択される：トウモロコシ根切り虫、コットンボールゾウムシ及びコロラドハムシ、Diabrotica種、Diabrotica virgifera、Diabrotica barberi、Diabrotica undecimpuncata、Leptinotarsa decemlineata及びAnthonomus grandis。本発明の好ましい態様においては、本発明のＩＳＰ１Ａタンパク質は、同時又は連続的にＩＳＰ２Ａタンパク質のようなＩＳＰ相補的タンパク質を提供することなしに単独で摂取された場合には殺虫性ではない。
【００２０】
本発明にしたがえば、「ＩＳＰ２Ａタンパク質」は、好適なＩＳＰ相補的タンパク質、特に成熟型ＩＳＰ１Ａとの組み合わせでの昆虫による摂取に際し、特に甲虫類昆虫、より具体的にはトウモロコシ根切り虫、コットンボールゾウムシ及びコロラドハムシ、好ましくはDiabrotica種、特にDiabrotica virgifera、Diabrotica barberi、Diabrotica undecimpuncataに対する殺虫活性を保持する配列番号４のアミノ酸配列の最小タンパク質フラグメントを含む任意のタンパク質を指す。これは、配列番号４におけるアミノ酸位置４３又は５１、好ましくは５１から、アミノ酸位置４４９〜位置４５７の位置のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する任意のタンパク質、特に少なくともアミノ酸位置５１〜位置４４９の配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する任意のタンパク質を含む。これはまた、このタンパク質のＮ末端シグナルペプチド配列の一部又は全部を切り落とすことにより配列番号４のアミノ酸配列から得られるタンパク質、又はシグナルペプチドが別のもの、例えば植物、ターゲティングペプチド、メチオニンアミノ酸又はメチオニン−アラニンジペプチド、で置き換えられているタンパク質をも含む。具体的には、これは、分泌又はターゲティングのための、Ｎ末端原核性又は真核性、例えば細菌又は植物の、シグナルペプチドを含むタンパク質を含む。これはまた、上記の最小毒性タンパク質フラグメントを含むハイブリッド又はキメラタンパク質、例えば本発明のＩＳＰ１ＡとＩＳＰ２Ａタンパク質との間のハイブリッドをも含む。更に、ここで用いられる「ＩＳＰ２Ａ」の命名中に含まれるのは、昆虫腸汁、好ましくは甲虫類の腸汁、特に甲虫類の腸プロテアーゼ、例えばシステインプロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシン又はトリプシン様プロテアーゼでの処理により得られる殺虫活性を保持するＩＳＰ２Ａタンパク質のプロテアーゼ耐性フラグメントである。この発明の好ましい態様においては、本発明のＩＳＰ２Ａタンパク質は、同時又は連続的にＩＳＰ１Ａタンパク質のようなＩＳＰ相補的タンパク質を提供することなしに単独で摂取された場合には殺虫性ではない。
【００２１】
ここで用いられる場合、「ＩＳＰ相補的タンパク質」は、成熟型ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質を含むがそれらに限らず、本発明のＩＳＰタンパク質の１つとの組み合わせにおいて、昆虫、特に甲虫類昆虫、好ましくはトウモロコシ根切り虫、コットンボールゾウムシ又はコロラドハムシ、より具体的にはDiabrotica virgifera、Diabrotica barberi、Diabrotica undecimpuncata又はAnthonomus grandis、による摂取に際し、殺虫性であるタンパク質を指す。特に、ＶＩＰタンパク質及びそれらの活性フラグメント、特にＷＯ９８／４４１３７、ＷＯ９４／２１７９５及びＷＯ９６／１００８３に記載されたような、そのシグナル配列が切り取られた成熟型ＶＩＰタンパク質は、本発明に従えばＩＳＰ相補的タンパク質である。ＩＳＰ１Ａタンパク質に対するＩＳＰ相補的タンパク質は、理想的にはＩＳＰ２Ａタンパク質、又は米国特許第５，９９０，３８３号に記載されたようなＶＩＰ２ＡａもしくはＶＩＰ２Ａｂタンパク質又はそれらの活性フラグメント（例えばシグナル配列が除去された成熟型タンパク質）、又はＩＳＰ２もしくはＶＩＰ２タンパク質のいずれか１つに対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ、昆虫、好ましくは甲虫類昆虫、特にトウモロコシ根切り虫により成熟型ＩＳＰ１Ａタンパク質との組み合わせで摂取された場合、殺虫性である任意の細菌性分泌タンパク質である。ＩＳＰ２Ａタンパク質に対するＩＳＰ相補的タンパク質は、理想的には成熟型ＩＳＰ１Ａタンパク質、米国特許第５，９９０，３８３号に記載されたようなＶＩＰ１ＡａもしくはＶＩＰ１Ａｂタンパク質又はそれらの活性フラグメント（例えばシグナル配列が除去された成熟型タンパク質）、又はＩＳＰ１もしくはＶＩＰ１タンパク質のいずれか１つに対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ、昆虫、好ましくは甲虫類昆虫、特にトウモロコシ根切り虫により成熟型ＩＳＰ２Ａタンパク質との組み合わせで摂取された場合、殺虫性である任意の細菌性分泌タンパク質である。疑いを避けるために、ＩＳＰ相補的タンパク質とＩＳＰタンパク質とは、常に、異なるタンパク質である。
【００２２】
本発明の好ましい態様においては、本発明のＩＳＰタンパク質又はそれらの等価物は、単独で、すなわちいかなる相補的ＩＳＰタンパク質の存在もなしに用いられた場合、標準的な昆虫の食餌に対する表面汚染アッセイ（Surface contamination assay）で試験した場合、好ましくはトウモロコシ根切り虫幼虫、特にDiabrotica virgiferaに対し、いかなる有意な殺虫活性ももたらさず、しかも、これは、これらのタンパク質が（各々がその濃度で適用されたとき）組み合わせで、好ましくはトウモロコシ根切り虫幼虫、特にDiabrotica virgiferaに対し、１００％死亡率をもたらす濃度で、である。特に、本発明のＩＳＰ１タンパク質は、標準的なトウモロコシ根切り虫食餌を用いる表面汚染アッセイにおいて７０ng／cm2の濃度でＩＳＰ１タンパク質のみを適用する場合、Diabrotica virgifera幼虫に対して有意な死亡率を示さない（すなわち、緩衝液単独を用いる対照と差がない）し、本発明のＩＳＰ２タンパク質は、標準的なトウモロコシ根切り虫食餌を用いる表面汚染アッセイにおいて３６ng／cm2の濃度でＩＳＰ２タンパク質のみを適用する場合、Diabrotica virgifera幼虫に対して有意な死亡率を示さない（すなわち、緩衝液単独を用いる対照と差がない）が、一方、ＩＳＰ１及びＩＳＰ２タンパク質を同じタイプのアッセイにおいてこれらの濃度で一緒に適用する場合、これらの幼虫に対して１００％の死亡率を示す。
【００２３】
ここで用いる場合、「ＩＳＰ１Ａ等価物」又は「ＩＳＰ２Ａ等価物」は、ＩＳＰ相補的タンパク質との２成分の組み合わせで、このような標的昆虫に適用された場合に、好ましくはこのような昆虫によって摂取された場合に、それぞれＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質と同じ又は実質的に同じ毒性を標的昆虫に対して有し、それぞれＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。また、同様にＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａ等価物の定義に含まれるのは、８〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって決定した場合それぞれ約４５〜約５０kD及び約９５〜約１００kDの分子量の、好ましくはBrevibacillus laterosporus株由来の、特に結晶封入体を形成しないBrevibacillus laterosporus株由来の、細菌性タンパク質であって、単独ではなく組み合わせでトウモロコシ根切り虫幼虫に対して有意な殺虫活性を有するものである。
【００２４】
「組み合わせて」という用語の使用は、殺虫効果を得るための標的昆虫に対するＩＳＰタンパク質（又はその等価物）及びＩＳＰ相補的タンパク質の適用をいう場合、これらのタンパク質がある時点で昆虫腸内に一緒に見出される限りにおいて、本発明のＩＳＰタンパク質（又はその等価物）及びＩＳＰ相補的タンパク質の同時の適用（すなわち、同じ餌、細胞又は組織中で、同じ時に昆虫に適用するか、又は摂取される）及び別個の連続的な適用（すなわち、一方が他方の後に提供されるが同時には適用又は摂取されない）を含む。したがって、本発明のＩＳＰ１Ａタンパク質は、植物の根の所定のタイプの細胞又は所定の区域において発現され得、一方本発明のＩＳＰ２Ａタンパク質は、同じ植物の根の別の種類の細胞又は別の部域において発現され得、それによってこれらのタンパク質は根物質が摂取されて初めて相互作用するようになる。ここに同様に含まれるのは、植物、特にトウモロコシの根におけるＩＳＰタンパク質又はその等価物の発現及びrhizobacteria株のような根関連細菌におけるＩＳＰ相補的タンパク質の発現（又はその逆）である。
【００２５】
ここで用いられる、ＩＳＰタンパク質及びＩＳＰ相補的タンパク質に関して、「標的昆虫に対する同じ毒性」は、好適なＩＳＰ相補的タンパク質の存在下で、ＩＳＰタンパク質の平均死亡率が、同じ好適なＩＳＰ相補的タンパク質の存在下でのＩＳＰ等価物の平均死亡率と有意に異ならないことを意味する。特に、これは、ＩＳＰタンパク質のＬＣ５０の９５％信頼限界（好適なＩＳＰ相補的タンパク質の存在下で試験した場合）がＩＳＰ等価物のＬＣ５０の９５％信頼限界（好適なＩＳＰ相補的タンパク質の存在下で試験した場合）と重複する状況をいう。
【００２６】
ＩＳＰタンパク質及びＩＳＰ等価物タンパク質に関してここで用いられる場合、「標的昆虫に対する実質的に同じ毒性」は、好ましくはそのタンパク質が植物内で発現された場合に、ＩＳＰ及びＩＳＰ等価物タンパク質の間で有意に異なるが、なお関連標的昆虫を防除又は殺虫するのに有用な殺虫活性の範囲内である、標的昆虫に対するこれらのタンパク質の平均死亡率のレベルをいう。本発明の好ましい態様においては、同じアッセイ条件下で行った同じ（重複）インビトロアッセイにおいて、このような標的昆虫についてのＬＣ５０値が互いに２〜１００、好ましくは２〜５０、特に２〜２０、最も好ましくは２〜１０倍異なる場合、タンパク質は、標的昆虫に対して実質的に同じ毒性を有する。
【００２７】
また、機能的に類似のアミノ酸を、ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質中のあるアミノ酸を置換するために用いて、ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａ等価物を得ることができる。例えば、配列内の１又は２以上のアミノ酸を、機能的等価物として作用する同様の極性の他のアミノ酸で置換し、タンパク質の機能性に関してサイレントな変更をもたらすことができる。配列内のあるアミノ酸についての置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。陽性に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン及びヒスチジンが含まれる。陰性に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。元のタンパク質と比較して実質的に同じ殺虫活性を標的昆虫に対して保持する、上記で示した同じクラスのアミノ酸を用いて保存的アミノ酸置換を施されたタンパク質は、ここでは本発明のＩＳＰタンパク質の等価物として含まれる。
【００２８】
ここで用いる場合、ＩＳＰ１Ａタンパク質に対して「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質とは、ＩＳＰ１Ａタンパク質と少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有するタンパク質をいい、ここで、配列同一性パーセンテージは、ＧＣＧのWisconsinパッケージ（Madison, Wisconsin、USA）のＧＡＰプログラム、バージョン１０．０（ＧＣＧデフォルト使用）においてblosum６２スコアリングマトリックスを用いて決定される。この出願を通じて用いられる「配列同一性」は、タンパク質に関連する場合、この特定された分析を用いて同一のアミノ酸のパーセンテージをいう。ここで用いられる「配列同一性」は、ＤＮＡ配列に関連する場合、ＧＣＧのWisconsinパッケージ（Madison, Wisconsin、USA）のＧＡＰプログラム、バージョン１０．０（ＧＣＧデフォルト使用）においてnwsgapdnaスコアリングマトリックスを用いて決定される。
【００２９】
ここで用いられる場合、「ＩＳＰタンパク質」又は「本発明のＩＳＰタンパク質」は、本発明の新規のタンパク質の任意のものをいい、ここでＩＳＰ１ＡもしくはＩＳＰ２Ａ又はそれらの等価物として同定される。「ＩＳＰプロトキシン」は、シグナルペプチドを含め、天然の細菌性ＤＮＡ配列によってコードされるとおりの全長ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質をいう。「ＩＳＰトキシン」は、その殺虫性フラグメント、特にその最小毒性フラグメント又はシグナルペプチドが除去された成熟タンパク質をいう。ここで用いられる場合、「成熟（型）」ＩＳＰは、そのネイティブな細菌性宿主細胞によって分泌される本発明のＩＳＰタンパク質であって、ＩＳＰ相補的タンパク質との組み合わせにおいて殺虫剤として活性なもの（Ｎ末端細菌シグナルペプチド配列なし）をいう。成熟ＩＳＰタンパク質は、完全なネイティブなＣ末端を持つことができ、又はＣ末端の短縮を有することができる。
【００３０】
ＩＳＰタンパク質として同様に本発明に含まれるのは、約９５〜約１００kD、特に約１００kDの成熟型の見かけの分子量を有する第一のタンパク質であり、細菌、好ましくはB.thuringiensis又はB.cereusではない細菌、特にBrevibacillus laterosporusである細菌によって分泌されるもの、又はこの第一のタンパク質の殺虫剤として有効なフラグメントであって、約４５〜約５０kD、好ましくは約４５kDの成熟型の見かけの分子量を有する第二のタンパク質であって、細菌、好ましくはB.thuringiensis又はB.cereusではない細菌、特にBrevibacillus laterosporusである細菌によって分泌される第二のタンパク質又はこの第二のタンパク質の殺虫剤として有効なフラグメントと組み合わされた場合の、有意な殺虫活性によって特徴付けられ、ここで、この第一のタンパク質及びこの第二のタンパク質、又はそれらの殺虫性フラグメント、の組み合わせは、コロラドハムシ、西部トウモロコシ根切り虫、南部トウモロコシ根切り虫、及び北部トウモロコシ根切り虫の幼虫に対して、これらの昆虫によって摂取されたときに有意に殺虫性であり、ここで、このタンパク質の組み合わせは、Ostrinia nubilalis、Spodoptera frugiperda、Heliothis virescens、Helicoverpa zea及びSesamia nonagroidesに対して、これらの昆虫によって摂取されたときに有意に殺虫性ではなく、かつ、ここで、第一のタンパク質単独は昆虫によって摂取されたときに有意な殺虫活性を持たない。また、ここに同様に含まれるのは、上記の第一のタンパク質との組み合わせで昆虫によって摂取された場合に殺虫性である上記のとおりの第二のタンパク質である。
【００３１】
ここで用いられる場合、「見かけの分子量」は、分子量標準との比較でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明される分子量である。当業者には理解されるように、この分子量は、およその決定であり、アミノ酸配列に基づいて決定される実際の分子量に関して約１０〜１５％の変動の範囲を有し得る。
【００３２】
ここで用いられる場合、「ｉｓｐ１Ａ  ＤＮＡ」又は「ｉｓｐ２Ａ  ＤＮＡ」という用語は、それぞれ上記で定義したＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列をいう。これは、上記で定義した新規に単離されたタンパク質又はそのフラグメントをコードする天然、人工、又は合成ＤＮＡ配列、特に植物のコドン使用頻度により密接に一致するように適合させた改変されたコドン使用頻度を有するＤＮＡ配列を含む。ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質をコードする人工ＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号９及び７に示されている（これらのＤＮＡ配列によってコードされるＩＳＰタンパク質は、ここでＩＳＰ１Ａ−１及びＩＳＰ２Ａ−１と定義される）。ここに同様に含まれるのは、配列番号１、３、７又は９のＤＮＡ配列に充分に類似し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらのＤＮＡ配列にハイブリダイズし得る（すなわち、その能力を有する）殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。ここで用いられる場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、特に、ハイブリダイゼーションがなお得られる以下の条件をいう：第一のＤＮＡ配列をフィルター上に固定し、このフィルターを５０％ホルムアミド、５％ＳＳＰＥ、２×Denhardt試薬及び０．１％ＳＤＳ中で４２℃で１〜２時間、又は６×ＳＳＣ、２×Denhardt試薬及び０．１％ＳＤＳ中で６８℃で１〜２時間プレハイブリダイズする。変性させた放射性標識した第二のＤＮＡを、次にプレハイブリダイゼーション液に直接添加し、インキュベーションを１６〜２４時間上記の選択した温度のひとつで行う。インキュベーション後、次にフィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温で２０分間洗浄し、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６８℃でそれぞれ２０分間の洗浄を３回行う。フィルターを、増感スクリーンを用いて−７０℃でＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ−２又は同等物）に２４〜４８時間露出することによりオートラジオグラフを作製する。もちろん、所望のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をなお保持しながら、同等の条件及びパラメーターをこのプロセスにおいて用いることができる。ここで用いられる場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、好ましくは、少なくとも９０〜９５％、好ましくは少なくとも９７％、特に９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列間で起こる。
【００３３】
「ｉｓｐ１  ＤＮＡ」の定義に同様に含まれるのは、配列番号２のタンパク質と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２のタンパク質と実質的に同じ、好ましくは同じ、殺虫活性を有するタンパク質をコードするすべてのＤＮＡ配列であり、ここで、このタンパク質配列同一性は、ＧＣＧのWisconsinパッケージ（Madison, Wisconsin、USA）のＧＡＰプログラム、バージョン１０．０（ＧＣＧデフォルト使用）においてblosum６２スコアリングマトリックスを用いて決定される。「ｉｓｐ２  ＤＮＡ」の定義に同様に含まれるのは、配列番号４のタンパク質と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号４のタンパク質と実質的に同じ、好ましくは同じ、殺虫活性を有するタンパク質をコードするすべてのＤＮＡ配列であり、ここで、このタンパク質配列同一性は、ＧＣＧのWisconsinパッケージ（Madison, Wisconsin、USA）のＧＡＰプログラム、バージョン１０．０（ＧＣＧデフォルト使用）においてblosum６２スコアリングマトリックスを用いて決定される。
【００３４】
ここで用いられる場合、「ｉｓｐ遺伝子」又は「ｉｓｐ  ＤＮＡ」は、本発明に従ったＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、上記のｉｓｐ１Ａ又はｉｓｐ２Ａ  ＤＮＡ配列のあらゆるものをいう。
【００３５】
ここで用いられる場合、「ｉｓｐ  ＤＮＡ等価物」又は「ｉｓｐ遺伝子等価物」は、上記で定義したＩＳＰ等価物タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００３６】
ここで用いられる場合、「配列Ｘを含むＤＮＡ／タンパク質」及び「配列Ｘを含む配列を有するＤＮＡ／タンパク質」という用語は、そのヌクレオチド又はアミノ酸配列中に少なくとも配列Ｘを含有する又は含むＤＮＡ又はタンパク質であって、他のヌクレオチド又はアミノ酸配列、例えばＮ末端輸送ペプチド又はシグナルペプチドが５′（又はＮ末端）及び／又は３′（又はＣ末端）末端に含まれ得るものを指す。ここで用いられる場合、「を含む」という用語は、「含有する」意味において開放的な言語であり、具体的に言及された要素以外の要素もまた存在し得ることを意味する。ここで用いられる場合、「からなる」という用語は、閉鎖的な言語であり、すなわち、具体的に言及された要素のみが存在する。ここで用いられる場合、「配列Ｘを含むタンパク質をコードするＤＮＡ」という用語は、転写及び翻訳後に少なくともアミノ酸配列Ｘを含むタンパク質を生じるコード配列を含むＤＮＡをいう。タンパク質をコードするＤＮＡは、天然のＤＮＡである必要はなく、半合成、全合成又は人工ＤＮＡであることができ、イントロン及び５′及び／又は３′フランキング領域を含むことができる。ここで用いられる場合、「ヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態であることができるＤＮＡ又はＲＮＡ分子の配列を指す。
【００３７】
ここで用いられる場合、「遺伝子」という用語は、５′及び／又は３′調節配列と隣接し、タンパク質に翻訳され得るＲＮＡが転写されることを可能にする、典型的には少なくともプロモーター領域を含む、ＤＮＡコード領域をいう。本発明のｉｓｐ  ＤＮＡに言及する場合、「キメラ遺伝子」は、そのネイティブな宿主細胞においてＩＳＰタンパク質の発現を駆動する天然の細菌性５′及び／又は３′調節配列とは異なる５′及び／又は３′調節配列を有するｉｓｐ  ＤＮＡ配列を指す。
【００３８】
ここで用いられる場合、本発明のＩＳＰタンパク質又はその等価物に言及するときの「殺虫活性」又は「殺虫剤として有効」は、昆虫、好ましくは甲虫類昆虫、特にトウモロコシ根切り虫、特にDiabrotica virgiferaによってそのタンパク質が摂取された際、第二のＩＳＰタンパク質のようなＩＳＰ相補的タンパク質との組み合わせで、同じアッセイ条件下で対照処理において見出されるレベルを超える、昆虫を殺すＩＳＰタンパク質の能力を意味する。好ましくは、第二のＩＳＰタンパク質は、第一のＩＳＰと同じ細菌オペロンによってコードされる別のタンパク質又は殺虫剤として有効なそのフラグメントであり、組み合わせタンパク質の摂取の際、最適の昆虫死亡率を生じる。ここで用いられる場合、ＩＳＰタンパク質の「昆虫防除性の量」は、このようなＩＳＰタンパク質が別のＩＳＰタンパク質のようなＩＳＰ相補的タンパク質、好ましくは第一のＩＳＰと同じオペロンによってコードされる他のタンパク質、又は殺虫剤として有効なそのフラグメントとともに提供された場合、ある植物を食餌とする昆虫によるその植物に対する被害を、例えば昆虫を殺すことによって、又は植物に対するより少ない被害を与え、植物の収量が有意に悪影響を受けないような方式で昆虫の発生又は成育を阻害することによって、商業的に許容可能なレベルに制限するのに充分な、ＩＳＰタンパク質の量をいう。ここで用いられる場合、「殺虫剤として有効なＩＳＰフラグメント」は、別のＩＳＰタンパク質のようなＩＳＰ相補的タンパク質、好ましくは第一のＩＳＰと同じオペロンによってコードされる他のタンパク質との組み合わせで提供された場合に殺虫活性を維持している、本発明のＩＳＰタンパク質のフラグメントを指す。殺虫活性に関連する上記の定義において、昆虫は、好ましくはあらゆる幼虫ステージの幼虫である。この出願を通じて、「ｉｓｐ  ＤＮＡ及び殺虫剤として有効なそのフラグメント又は等価物」に言及することができ、その場合、殺虫活性は、明らかにそのＤＮＡによってコードされるタンパク質の活性を指し、ＤＮＡそれ自体の殺虫活性をいわない。
【００３９】
本発明に従えば、本発明のＩＳＰタンパク質及びその等価物、特に成熟ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質は、以下のものからなる群から選択されるレピドプテラ昆虫に対して有意な殺虫活性を示さないことが見出された：Heliothis virescens、Helicoverpa zea、Manduca sexta、Helicoverpa armigera、Spodoptera littoralis、Spodoptera frugiperda、Sesamia nonagroides及びOstrinia nubilalis。
【００４０】
本発明に従えば、本発明のＩＳＰタンパク質又はその等価物に対して感受性の標的昆虫は、このようなＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列のトランスジェニック植物における発現によって、昆虫防除性の量、好ましくは殺虫性の量のこれらのタンパク質と接触させられる。上記の標的昆虫は、それらが植物組織を摂取した場合にのみ殺虫タンパク質によって影響される。したがって、本発明の別の目的においては、本発明のＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換された植物、特にトウモロコシを植え付け、播種し、生育させることを含む、甲虫類に対して植物を殺虫性にする方法及び甲虫類を防除する方法が提供される。
【００４１】
本発明のＩＳＰタンパク質のシグナルペプチドは、当該技術分野で公知の手順に従って除去又は改変することができ、例えば、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／１００８３を参照されたい。あるいは、それらを、そのタンパク質の葉緑体への輸送を起こす葉緑体輸送ペプチド（例えばVan Den Broeckら、1985、Nature 313、358、又は好ましくは米国特許第５，５１０，４７１号の改変された葉緑体輸送ペプチド）のような別のペプチド、分泌性シグナルペプチド、又はタンパク質を他のプラスチド、ミトコンドリア、ＥＲ又は他のオルガネラにターゲティングするペプチドで置き換えることができ、あるいはそれをメチオニンアミノ酸又はメチオニン−アラニンジペプチドで置き換えることができる。細胞内オルガネラへのターゲティングのため又は植物細胞外もしくは細胞壁への分泌のためのシグナル配列は、天然にターゲティング又は分泌されるタンパク質において見出され、好ましくはKloesgenら（1989、Mol. Gen. Genet. 217, 155-161）、Kloesgen及びWeil（1991, Mol. Gen. Genet. 225, 297-304）、Neuhaus＆Rogers（1998、Plant Mol. Biol. 38、127-144）、Bihら（1999、J. Biol. Chem. 274, 22884-22894）、Morrisら（1999、Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333）、Hesseら（1989、EMBO J. 8, 2453-2461）、Tavladorakiら（1998、FEBS Lett. 426, 62-66）、Terashimaら（1999、Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523）、Parkら（1997、J. Biol. Chem. 272、6876-6881）、Shcherbanら（1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92, 9245-9249）によって記載されたものがあり、これらのすべて、特にトウモロコシのターゲティング又は分泌タンパク質由来のシグナルペプチド配列は参照によりここに援用される。これらの植物シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、植物での発現のためにＩＳＰ１Ａをコードするキメラ遺伝子及びＩＳＰ２Ａタンパク質をコードするキメラ遺伝子中に挿入することができるが、本発明のひとつの態様においては、このようなシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、キメラＩＳＰ２Ａ遺伝子のみに挿入され、ＩＳＰ１Ａキメラ遺伝子は、シグナルペプチドを欠くか、シグナルペプチドの代わりにメチオニンアミノ酸又はメチオニン−アラニンジペプチドを有する。本発明の好ましい態様においては、タンパク質は、Glebaら（1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、25、5973-5977）及びBorisjukら、1999（Nat. Biotechn. 17, 466-469）によって記載されたように、強力な根指向性プロモーター、特にトウモロコシ由来の強力な根指向性プロモーター、及び好ましくはトウモロコシ由来の、根細胞からの分泌のためのＮ末端シグナルペプチド、特に分泌タンパク質のシグナルペプチド、好ましくはエクスパンシン、α−アミラーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、サイトキニンオキシダーゼ、エンドキシラナーゼの群から選択される、トウモロコシ分泌タンパク質を用いて、根から分泌される。
【００４２】
本発明の範囲に含まれる植物は、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、ピース、ビーンズ、レンチルマメ、ジャガイモ、トマト、タバコ、レタス、アブラナ種植物、サトウキビ、イネ、脂肪種子ナタネ、カラシ、アスパラガス、小麦、大麦、コーヒー、茶、つる植物、ゴムノキ、ビート、芝生、モロコシ、オート麦、ライ、タマネギ、ニンジン、リーキ、キュウリ、スクアッシュ、メロン、ヒマワリ、特に甲虫類昆虫、特にトウモロコシ根切り虫、ジャガイモハムシ又はゾウムシ、特にDiabrotica又はLeptinotarsa種の昆虫、最も好ましくはDiabrotica virgifera，Diabrotica barberi，Diabrotica undecimpuncata，Leptinotarsa decemlineata及びAnthonomus grandisからなる群から選択される任意の昆虫による被害に対して感受性の、あらゆる植物、最も好ましくはトウモロコシである。
【００４３】
ここで用いられる場合、「トウモロコシ」は、Zea mays種のすべての植物、ならびにZea maysのあらゆる品種のあらゆる種子、根又は穀物、又はトウモロコシ細胞から直接生産された又はトウモロコシ細胞を含む他の物質をいい、交雑系か近交系かを問わず、青刈り（field）トウモロコシ、スイートコーン、雑種トウモロコシ、ホワイト（white）トウモロコシ、及びデント（dent）トウモロコシを含むがこれらに限らない。好ましくは、本発明において用いられるトウモロコシは、交雑トウモロコシを生産するための好適な親系統であり、最も好ましくは、それらは既にOstrinia nubialalisを含むがそれに限らない主要なトウモロコシのレピドプテラ有害昆虫からの保護をそれらに与える内在性又はトランスジェニック昆虫耐性を担持する。
【００４４】
本発明のＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質は、２０００年１月１１日にブダペスト条約の条項に基づいてＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms-Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie, University of Gent, K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium）に受託番号ＬＭＢＰ４００９として寄託されたE. coli株から従来の方式で単離することができ、より好ましくは、それらは、受託番号ＬＭＢＰ４００９として寄託されたプラスミドｐＵＣＩＢ１２０／ＩＳＰの約７KbのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含むプラスミドで形質転換されたBacillus株、好ましくは結晶マイナスのBacillus thuringiensis株の上清から単離することができる。ＩＳＰタンパク質は、従来の方式でモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製するために使用することができる（Hoefteら、1988、Appl. Environm. Microbiol. 54, 2010）。ＩＳＰタンパク質は、システインプロテアーゼのようなプロテアーゼで処理して、ＩＳＰタンパク質のプロテアーゼ耐性フラグメントを得ることができる。
【００４５】
ＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、寄託された株から従来の方式で単離することができ、又はコードされるアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
【００４６】
本発明に従った他のＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、単離された細菌株からの総ＤＮＡを制限酵素で消化し；そのように生成されたＤＮＡフラグメントを５〜１０Kb、好ましくは７〜１０KbのＤＮＡ画分にサイズ分画し；これらの画分をクローニングベクターに連結し；このクローニングベクターで形質転換されたE. coliを、公知のＩＳＰタンパク質遺伝子のある領域から構築されたＤＮＡプローブ又は公知のＩＳＰタンパク質遺伝子内のある領域に相当するプライマーを用いてｉｓｐ  ＤＮＡから生成された特異的ＰＣＲフラグメントに基づくＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることによって同定することができる。本発明にしたがって単離されたこのような「他のＩＳＰタンパク質」は、本発明のＩＳＰタンパク質のように、以下の特徴のいずれか又はすべて、好ましくはすべてによって特徴付けられる：ａ）ＩＳＰ相補的タンパク質、好ましくは本発明の成熟ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質とともにこれらの他のＩＳＰタンパク質が摂取された際に、南部トウモロコシ根切り虫、Diabrotica undecimpunctataの幼虫に対する、そしてコロラドハムシ、Leptinotarsa decemlimeata幼虫に対する、有意な殺虫活性；ｂ）ＩＳＰ相補的タンパク質、好ましくは本発明の成熟ＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａタンパク質とともにこれらの他のＩＳＰタンパク質が摂取された際に、レピドプテラ昆虫、好ましくはOstrinia nubilalisの幼虫に対する有意な殺虫活性の欠如；ｃ）約１００kD又は約４５kDの成熟形態（シグナルペプチドなし）の見かけの分子量；ｄ）Bacillus thuringiensis又はBacillus cereusではない細菌株培養物の上清中での存在；及びｅ）ＩＳＰ相補的タンパク質の不存在下で摂取された際に、トウモロコシ根切り虫、好ましくはDiabrotica virgiferaに対する毒性の欠如。
【００４７】
もちろん、そのコドン使用頻度において異なるが同じタンパク質又は実質的に同じ殺虫活性を有する同様のタンパク質をコードする他の任意のＤＮＡも、特定の目的に応じて構築することができる。いくつかの原核又は真核発現系においては、コドン使用頻度を宿主細胞のものに変えることは外来宿主における遺伝子発現のために望ましいことが記載されている（Bennetzen＆Hall, 1982, J. Biol. Chem. 257, 3026; Itakura, 1977, Science 198, 1056-1063）。コドン使用頻度の表は、文献（Wadaら、1990、Nucl. Acids Res. 18, 2367-1411; Murrayら、1989、Nucleic Acids Research 17, 477-498）及び主要ＤＮＡ配列データベースにおいて利用可能である。したがって、同じ又は実質的に同じタンパク質が産生されるように合成ＤＮＡを構築することができる。いったん本発明のＩＳＰタンパク質のアミノ酸配列が公知になると、いくつかのＤＮＡ配列を考案することができることは明白である。このような他のＤＮＡ配列としては、例えばネイティブな配列中に存在する所定の潜在的調節又はプロセッシング要素を選択的に不活性化することによって、又は全体的なコドン使用頻度をより関連する宿主生物のもの、好ましくは発現が望まれる宿主生物のものに適合させることによって、遺伝子のある部位を不活性化するために変更された合成又は半合成ＤＮＡ配列が挙げられる。合成ＤＮＡ配列は、ＥＰ０３８５９６２、ＥＰ０６１８９６７、又はＥＰ０６８２１１５に記載された手順に従っても作製し得る。
【００４８】
上述したようなＤＮＡ配列に対する小さい改変は、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発によってルーチンに行うことができる（Hoら、1989、Gene 77, 51-59; Whiteら、1989、Trends in Genet. 5, 185-189）。新規の合成又は半合成遺伝子を、自動化されたＤＮＡ合成及び得られるＤＮＡフラグメントの連結によって作製することができる。
【００４９】
甲虫類昆虫、特にトウモロコシ根切り虫、コットンボールゾウムシ又はコロラドハムシ、好ましくはLeptinotarsa decemlineata，Diabrotica barberi，Diabrotica undecimpuncata，Anthonomus grandis又はDiabrotica virgiferaによる、本発明のＩＳＰタンパク質又はその等価物を発現するトランスジェニック宿主、特に植物に対する耐性の開発を防止又は遅延させるために、同じ宿主、好ましくはトランスジェニック植物において、異なる作用モードを有し、トランスジェニック宿主、好ましくは植物において産生されたとき、第一のトキシン又はトキシン複合体によって標的とされる同じ昆虫に対する高い毒性を有する、別のタンパク質又は別のタンパク質複合体をも発現させることが好ましい。本発明のＩＳＰ１Ａ又はＩＳＰ２Ａと組み合わせるのに好適な候補としては、これらのＶＩＰタンパク質がＩＳＰタンパク質と比較して異なる作用モードを有する場合には、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／１００８３の成熟ＶＩＰ２Ａａ又はＶＩＰ２Ａｂタンパク質と組み合わされた場合の成熟ＶＩＰ１Ａａタンパク質；Photorhabdus又はXenorhabdus種のトウモロコシ根切り虫のトキシン、例えばPhotorhabdus luminescens W-14の殺虫性タンパク質（Guoら、1999、J. Biol. Chem. 274, 9836-9842）；ＷＯ００／２６３７８のＣｒｙＥＴ７０タンパク質；ＷＯ９７／４０１６２に記載されたようなＢｔ株ＰＳ８０ＪＪ１、ＰＳ１４９Ｂ１及びＰＳ１６７Ｈ２によって産生される殺虫性タンパク質、特にＢｔ株ＰＳ１４９Ｂ１の約１４kD及び約４４kDタンパク質；米国特許第６，０２３，０１３号のＣｒｙ３Ｂｂタンパク質；ダイズのＮ２及びＲ１システインプロテアーゼ阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤（Zhaoら、1996、Plant Physiol. 111、1299-1306）又はイネシスタチンのようなオリザスタチン（Genbank  エントリーＳ４９９６７）、Irieら（1996、Plant Mol. Biol. 30, 149-157）によって記載されたような植物において発現されるトウモロコシシスタチンのようなトウモロコシシスタチン（GenbankエントリーＤ３８１３０、Ｄ１０６２２、Ｄ６３３４２）が挙げられる。ここに同様に含まれるのは、上述のタンパク質のいずれかの、殺虫活性を保持している短縮型タンパク質のような、すべての等価物及び変異体である。
【００５０】
このような組み合わせでの発現は、トウモロコシ根切り虫毒性タンパク質又はタンパク質複合体を発現するように既に形質転換されている植物の形質転換によって、又は異なるトウモロコシ根切り虫毒性タンパク質を発現するように形質転換された植物を交配することによって、達成することができる。あるいは、本発明のＩＳＰタンパク質の発現は、例えば、傷誘発性プロモーター領域、好ましくは傷誘発性根指向性プロモーター領域を用いて、根切り虫幼虫が根組織を食餌とする際に根において誘導することができる。
【００５１】
本発明のｉｓｐ遺伝子の総ＤＮＡから調製された、５〜１０、好ましくは７〜１０Kbフラグメントを、好適な発現ベクターに連結し、E. coliにおいて形質転換し、次に、クローンを、従来のコロニーイムノプロービング法（Frenchら、1986、Anal. Biochem. 156, 417-423）によって、ＩＳＰタンパク質に対して作製されたモノクローナル又はポリクローナル抗体でトキシンの発現についてスクリーニングすることができる。また、本発明の細菌株の総ＤＮＡから調製された５〜１０Kbフラグメントを、好適なＢｔシャトルベクターに連結し（Lereclusら、1992、Bio/Technology 10, 418）、結晶マイナスＢｔ突然変異体に形質転換することができる。次に、これらのクローンを（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及び／又は昆虫アッセイによって）ＩＳＰタンパク質の産生についてスクリーニングする。
【００５２】
本発明のＩＳＰタンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡ配列を得るために従来の方式で（Maxam and Gilbert, 1980、Methods in Enzymol. 65, 499-560; Sanger, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）配列決定することができる。配列比較により、遺伝子が、Bacillus又は他の細菌種の栄養成長相の間に分泌されるタンパク質及び甲虫類に対する活性を有するBacillus thuringiensis結晶タンパク質をコードする従来記載された遺伝子（Crickmoreら、1998、Microbiology and Molecular Biology Reviews vol62: 807-813；ＷＯ９８／４４１３７、ＷＯ９４／２１７９５、ＷＯ９６／１００８３、ＷＯ００／０９６９７、ＷＯ９９５７２８２及びＷＯ９７４６１０５）とは異なることが示された。
【００５３】
本発明のＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列のすべて又は殺虫剤として有効な部分を、E. coli、他の細菌株、又は植物において発現させるために、そのＤＮＡ配列に隣接して、好適な制限部位を導入することができる。これは、周知の手順を用いて、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる（例えば、Stanssensら、1989、Nucleic Acids Research 12, 4441-4454; Whiteら、1989、前出）。植物における発現については、本発明のｉｓｐ  ＤＮＡ又はその等価物は、通常、キメラ遺伝子内に含まれ、植物発現可能プロモーター領域及び植物細胞において活性な３′転写終結及びポリアデニル化配列を含む５′及び３′調節配列と隣接する。植物において改良された発現を得るためには、本発明のｉｓｐ  ＤＮＡ又はその等価物のコドン使用頻度を、等価、改変又は人工遺伝子又は遺伝子部分を形成するように改変することができ、あるいは、ｉｓｐ  ＤＮＡ又はその殺虫剤として有効な部分を、葉緑体ゲノム中に挿入して、葉緑体活性プロモーターを用いてそこで発現させることができる（例えば、Mc Brideら、1995、Bio/Technology 13,362）。トウモロコシのような単子葉植物において強化された発現を得るためには、単子葉類イントロンもまたキメラ遺伝子に付加することができ、ｉｓｐ  ＤＮＡ配列又はその殺虫性部分を翻訳的に中性の方式でさらに変更し、遺伝子部分に存在するおそらく阻害性のＤＮＡ配列を部位特異的イントロン挿入及び／又はコドン使用頻度への変更の導入（例えばコードされるアミノ酸配列を有意に変更せずにコドン使用頻度を特異的植物によって最も好まれるコドン使用頻度に適合させること（Murrayら、1989、前出））によって改変することができる。
【００５４】
ＩＳＰタンパク質をコードする、殺虫剤として有効なｉｓｐ  ＤＮＡ又はその等価物、好ましくはｉｓｐキメラ遺伝子は、従来の方式で単一植物細胞の核ゲノムに安定に挿入することができ、そのように形質転換された植物細胞は、従来の方式で昆虫耐性の形質転換植物を産生するために用いることができる。この点に関して、殺虫剤として有効なｉｓｐ遺伝子部分を含む、Agrobacterium tumefaciens中の、無害化された（disarmed）Ｔｉプラスミドは、植物細胞を形質転換するために用いることができ、その後、例えばＥＰ  ０１１６７１８，ＥＰ  ０２７０８２２，ＰＣＴ公開公報ＷＯ８４／０２９１３及び発行されたヨーロッパ特許出願（ＥＰ）０２４２２４６及びGouldら（1991、Plant Physiol. 95, 426-434）において記載された方法を用いて形質転換した植物細胞から形質転換植物を再生させることができる。好ましいＴｉプラスミドベクターは、それぞれ、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの、ボーダー配列の間に、又は少なくとも右のボーダー配列の左側に位置する、殺虫剤として有効なｉｓｐキメラ遺伝子配列を含む。もちろん、他のタイプのベクターも、直接遺伝子移入（例えば、ＥＰ  ０２３３２４７に記載されたもの）、花粉媒介性形質転換（例えば、ＥＰ  ０２７０３５６、ＰＣＴ公開公報ＷＯ８５／０１８５６、及び米国特許第４，６８４，６１１号に記載されたもの）、植物ＲＮＡウイルス媒介性形質転換（例えば、ＥＰ  ００６７５５３及び米国特許第４，４０７，９５６号に記載されたもの）、リポソーム媒介性形質転換（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号に記載されたもの）、及びトウモロコシ（Frommら、1990、Bio/Technology 8,833-839; Gordon-Kammら、1990、The Plant Cell 2,603-618, 米国特許第5,767,367号）及びイネ（Shimamotoら、1989、Nature 338,274-276; Dattaら、1990、Bio/Technology 8,736-740）のある種の系統を形質転換するための方法及び単子葉類一般を形質転換するための最近記載された方法（ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０９６９６）のようなその他の方法のような手順を用いて、植物細胞を形質転換するために用いることができる。
【００５５】
以下に要約するように、異なる従来の手順に従ってトランスジェニック植物において２つのＩＳＰタンパク質の組み合わせでの発現を得ることができる：
【００５６】
Ｉ．２つのＩＳＰ  ＤＮＡ配列及びマーカー遺伝子を単一片のＤＮＡとして植物ゲノムに移入し、ゲノム中の単一遺伝子座内への挿入をもたらす、キメラ遺伝子構築物。
【００５７】
Ｉａ．  遺伝子を、各々別個のプロモーターの制御下の異なる転写単位に操作することができる。
【００５８】
２つのＩＳＰタンパク質及びマーカータンパク質を別の転写単位として発現させるためには、上述のように植物細胞において発現を指示するいくつかのプロモーターフラグメントを用いることができる。１つのＩＳＰ遺伝子についてのキメラ構築物において上述したプロモーターのすべての組み合わせが可能である。本発明の各キメラ遺伝子のＩＳＰコード領域は、インタクトなｉｓｐ遺伝子又は好ましくはインタクトなｉｓｐ遺伝子の殺虫剤として有効な部分であることができる。個別のキメラ遺伝子は、標準的な手順にしたがって（例えばＥＰ  ０１９３２５９）、同じプラスミドベクター中にクローニングされる。
【００５９】
Ｉｂ．  ２以上の遺伝子（例えば、ｉｓｐ及びマーカー遺伝子、又は２つのｉｓｐ遺伝子）を、同じ転写単位内に組み合わせることができる。
同じ転写単位内の２つのｉｓｐ遺伝子を発現させるために、以下の場合を区別することができる：
【００６０】
第一の場合においては、ハイブリッド遺伝子（そこでは１つの遺伝子のコード領域が別の遺伝子のコード領域とフレームを合わせて融合されている）を、単一のプロモーターの制御下に置くことができる。融合は、ｉｓｐ遺伝子とマーカー遺伝子との間、又は２つのｉｓｐ遺伝子間で作製することができる。
【００６１】
また、ＩＳＰ又はその殺虫剤として有効なフラグメントをコードする各遺伝子間に、プロテアーゼ（例えばトリプシン、システイン又はセリンプロテアーゼ）感受性タンパク質部分をコードする遺伝子フラグメント、例えば標的昆虫種の中腸酵素によって活性化された際に除去又は切断されるＩＳＰの部分をコードする遺伝子フラグメントを含ませ得る。あるいは、ＩＳＰ又はその殺虫剤として有効なフラグメントをコードする各遺伝子間に、酵素独立性反応によってそれ自体のＣ末端での切断を媒介する能力を有する約１６〜２０アミノ酸のペプチドをコードする遺伝子フラグメント（Halpinら、1999、Plant J. 17, 453-459、米国特許第5,846,767号）又は標的昆虫に対する有意な毒性を有する組換え細胞の産生を可能にするリンカーペプチド配列をコードする遺伝子フラグメントを含ませることができる。
【００６２】
第二の場合においては、２つの各ｉｓｐ遺伝子のコード領域は、あるプロモーターの制御下に置かれたジシストロン単位に組み合わせることができる。２つのｉｓｐ遺伝子のコード領域は、定義された長さの遺伝子間配列を有して互いの後に置かれる。単一のメッセンジャーＲＮＡ分子が生成され、２つの別個の遺伝子産物への翻訳がもたらされる。改変されたスキャニングモデルに基づけば（Kozak、1987、Mol. Cell. Biol. 7, 3438-3445）、翻訳の再開のコンセプトは、上流ＡＴＧを有するフレーム内の終結コドンが下流ＡＴＧの前に存在する限りにおいて、許容されてきた。実験的なデータもまた、植物翻訳マシーナリーがポリシストロン性ｍＲＮＡからいくつかのポリペプチドを合成することができることを明らかにしている（Angenonら、1989、Mol. Cell. Biol. 9, 5676-5684）。
【００６３】
翻訳の内部的開始のメカニズムに基づくと（Jackson and Kaminski, 1995、RNA 1,985-1000）、第二の遺伝子の翻訳の開始は、特異的遺伝子間配列（内部リボソームエントリー配列；ＩＲＥＳ）への４３Ｓプレ開始複合体の結合によって起こる。実験的データもまた、植物翻訳マシーナリーが遺伝子間ＩＲＥＳ要素を含むポリシストロン性ｍＲＮＡからいくつかのポリペプチドを合成することができることを明らかにしている（Hefferonら、1997、J. Gen. Virol. 78,3051-3059; Skulachevら、1999、Virology 263、139-154；ＰＣＴ特許公開公報ＷＯ９８／５４３４２）。
【００６４】
II．  １つのｉｓｐ遺伝子で既に形質転換された植物のゲノムに移入された１つのｉｓｐ遺伝子を有するキメラ構築物：
【００６５】
第二ラウンドの形質転換のために形質転換体を選択する代替的な系が利用可能であること、又はＤＮＡ組換え技術を用いて植物ゲノムから選択可能マーカー遺伝子を切り出すこと（例えば公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／１７１７６及びＷＯ９１／０９９５７）、を条件として、いくつかの遺伝子を、連続的な形質転換工程（再形質転換）の間に植物細胞に導入することができる。この再形質転換は、ゲノム内の複数の遺伝子座に導入されたｉｓｐ遺伝子の組み合わせの発現をもたらす。好ましくは、２つの異なる選択可能マーカー遺伝子が、２つの連続する形質転換工程において用いられる。第一のマーカーは、第一の形質転換において形質転換された細胞の選択のために用いられ、一方、第二のマーカーは、第二ラウンドの形質転換において形質転換体の選択のために用いられる。カナマイシン及びハイグロマイシンを用いる連続的な形質転換工程が、例えばSandlerら（1988、Plant Mol. Biol. 11, 301-310）及びDelauneyら（1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4300-4304）によって記載されてきた。
【００６６】
III．  独立の形質転換事象において別個の植物の核ゲノムに別個に移入され、交配を通じて単一の植物ゲノム内に後で組み合わせられたｉｓｐ遺伝子を有するキメラ構築物
【００６７】
第一の植物は、第一のｉｓｐ遺伝子で形質転換された植物又は自家受粉を通じてそれから由来したＦ１植物（好ましくはこのｉｓｐ遺伝子についてホモ接合性のＦ１植物）であるべきである。第二の植物は、第二のｉｓｐ遺伝子で形質転換された植物又は自家受粉を通じてそれから由来したＦ１植物（好ましくは第二のｉｓｐ遺伝子についてホモ接合性のＦ１植物）であるべきである。そのゲノム中に存在する２つのｉｓｐ遺伝子を有し（例えばサザンブロット）、その２つのＩＳＰを発現する（例えば免疫学的に異なるＩＳＰの別個のＥＬＩＳＡ検出）植物を選択するための選択方法を、この交配から得られた植物に適用することができる。これは、それぞれ異なるｉｓｐ遺伝子で形質転換された２つの親系統からハイブリッド品種を生産するための、ならびに同じ近交系から２つの独立の形質転換体（又はそのＦ１自家受粉子孫）の交配を通じて２つの異なるｉｓｐ遺伝子を含む近交系を生産するための、有用な戦略である。
【００６８】
IV．  同じ形質転換実験において単一植物のゲノム中へ別個に移入された１又はそれ以上のｉｓｐ遺伝子を有し、それぞれのキメラ遺伝子が同じ又は複数の遺伝子座に挿入されているキメラ構築物
【００６９】
同時形質転換は、１つは第一のｉｓｐ遺伝子を含有し、２番目は第二のｉｓｐ遺伝子を含有する、２つの異なる発現ベクターでの植物の同時の形質転換を包含する。各ｉｓｐ遺伝子とともに、異なるマーカー遺伝子を用いることができ、２つのマーカーを用いて同時に選択を行うことができる。あるいは、単一のマーカーを用いることができ、２つのｉｓｐ遺伝子を有し（例えばサザンブロットによって）、かつ、その２つのタンパク質を発現する（例えばＥＬＩＳＡによって）植物を見つけるために、充分に多数の選択された植物をスクリーニングすることができる。２以上のＴ−ＤＮＡでの同時形質転換は、各々が異なるＴｉプラスミドを有する２つの異なるAgrobacterium株を同時に用いて（Depickerら、1985、Mol. Gen. Genet. 201、477-484）又は別個のプラスミド上に２つのＴ−ＤＮＡを含む１つのAgrobacterium株を用いて（de Framondら、1986、Mol. Gen. Genet. 202、125-131）達成することができる。２つのプラスミド又はそれらのフラグメントの混合物を用いる直接遺伝子移入もまた、選択可能及び非選択可能遺伝子での植物細胞の同時形質転換のために使用することができる（Schocherら、1986、Bio/Technology 4, 1093-1096）。
【００７０】
得られた形質転換植物を、従来の植物育種スキームにおいて、同じ特徴を有する更に多くの形質転換植物を生産するために、又は同じ又は関連植物種の他の品種に殺虫剤として有効なｉｓｐ遺伝子を導入するために、用いることができる。形質転換植物から得られた種子は、安定なゲノム挿入物として、殺虫剤として有効なｉｓｐ遺伝子を含む。形質転換植物の細胞は、昆虫に対する従来の殺虫剤組成物における使用のために回収することができるＩＳＰタンパク質の殺虫剤として有効な部分を生産するために、従来の方式で培養することができる。もちろん、植物における上述のＩＳＰタンパク質の組み合わせた生産の可能性は、本発明のＩＳＰタンパク質又はＩＳＰ等価物の活性フラグメントにも同様に適用可能である。殺虫剤として有効なｉｓｐ遺伝子は、挿入された遺伝子が植物細胞において遺伝子部分の発現を指示することができるプロモーターの下流（すなわち３′側）に、それと作動可能に連結されるように、植物ゲノム中に挿入される。これは、好ましくは、植物細胞ゲノム中に、特に核又は葉緑体ゲノム中に、ｉｓｐキメラ遺伝子を挿入することによって達成される。好ましいプロモーターとしては、以下のものが挙げられる：カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の単離株ＣＭ１８４１（Gardnerら、1981、Nucl. Acids Res. 9, 2871-2887），ＣａｂｂＢ−Ｓ（Franckら、1980、Cell 21, 285-294）及びＣａｂｂＢ−ＪＩ（Hull and Howell、1987、Virology 86, 482-493）の強力な構成的３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；ユビキチンファミリー由来プロモーター（例えば、Christensenら、1992、Plant Mol. Biol. 18, 675-689のトウモロコシユビキチンプロモーター；Cornejoら、1993、Plant Mol. Biol. 23,567-581も参照されたい）、ｇｏｓ２プロモーター（de Paterら、1992、Plant J. 2、837-844）、ｅｍｕプロモーター（Lastら、1990、Theor. Appl. Genet. 81、581-588）、Zhangらによって記載されたプロモーター（1991、The Plant Cell 3、1155-1165）のようなイネアクチンプロモーター；及びＴ−ＤＮＡのそれぞれ１′及び２′遺伝子の発現を駆動するＴＲ１′プロモーター及びＴＲ２′プロモーター（それぞれ「ＴＲ１′プロモーター」及び「ＴＲ２′プロモーター」）（Veltenら、1984、EMBO J. 3、2723-2730）。あるいは、構成的ではなく、むしろ植物の１又はそれ以上の組織又は器官（例えば葉及び／又は根）に特異的なプロモーターを用いることができ、それによって挿入されたｉｓｐ遺伝子はその特異的組織又は器官の細胞においてのみ発現されうる。本発明の好ましい態様においては、殺虫剤として活性なｉｓｐ遺伝子は、その殺虫剤として活性な遺伝子部分を根指向性プロモーター（すなわち、根組織において最も活性なプロモーター、好ましくは花粉、葉及び茎のような非根組織においてほとんど又は全く転写を起こさないプロモーター、より具体的には根組織における検出可能な転写のみをもたらすプロモーター）の制御下に置くことによって、植物、好ましくはトウモロコシ、の根において選択的に発現される。根指向性プロモーターは、根組織において排他的に活性である必要はない。本発明にしたがった根指向性プロモーターとしては、以下のものが挙げられるが、それらに限らない：根特異的ｃＤＮＡに相当するＤＮＡ配列のすぐ上流に位置するプロモー���ー、好ましくはトウモロコシ由来のもの；米国特許第５，８３７，８７６号、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ００／２９５９４，ＷＯ００／７３４７４，ＷＯ０１／００８３３又は米国特許第６，００８，４３６号のプロモーター；米国特許第５，６３３，３６３号及びHeldら（1997、Plant Mol. Biol. 35、367-375、Genbank受託番号U38790）のＺＲＰ２プロモーター；米国特許第５，８１７，５０２号のプロモーター；de Framond（1991、FEBS 290: 103-106; EP 0452269）によって記載されたプロモーター、コムギ由来のペルオキシダーゼ遺伝子ＰＯＸ１の根特異的プロモーター（Hertigら、1991、Plant Molec. Biol. 16、171-174）、米国特許第５，８３７，８４８号のプロモーター、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０１５６６２のプロモーター、Goddemeierら（1998、Plant Mol. Biol. 36, 799-802）のプロモーター。本発明において有用であり得る他の根特異的又は根指向性プロモーターとしては、Hirelら、1992、Plant Mol. Biol. 20, 207; Keller and Baumgartner, 1991, The Plant Cell 3, 1051-1061;Sangerら、1990、Plant Mol. Biol. 14, 433-443; Miaoら、1991、The Plant Cell 3, 11-22; Boguszら、1990、The Plant Cell, 2, 633-641; Leach and Aoyagi, 1991, Plant Science 79, 69-76; Teeriら、1989、EMBO Journal 8, 343-350によって記載されたプロモーターが挙げられ、これらの文献はすべて参照によりここに援用される。
【００７１】
植物の葉における発現は、米国特許第５，２５４，７９９号に開示されたようなエンドウマメのような別の植物の、又はその植物自体の、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターを用いることによって達成することができる。別の代替手段は、その発現が（例えば温度又は化学的因子によって）誘導可能なプロモーターを用いることである。また、トウモロコシについては、特にトウモロコシ根切り虫畑に成虫のトウモロコシ根切り虫が存在する時には、例えば公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５６９５及びＷＯ０１／１２７９９に記載されたプロモーターのような、トウモロコシ花粉における発現をもたらすプロモーター領域を用いることによる、花粉における発現が好ましい。
【００７２】
殺虫剤として有効なｉｓｐ遺伝子は、挿入された遺伝子部分が好適な３′末端転写調節シグナル（すなわち、転写物形成及びポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち５′側）になるように植物ゲノム中に挿入される。
【００７３】
これは、好ましくは植物細胞ゲノム中にｉｓｐキメラ遺伝子を挿入することによって達成される。本発明のキメラ遺伝子における３′調節配列の選択は重要ではない。いくつかの場合には、挿入部位のＤＮＡ配列が３′調節配列として作用し得るため、キメラ遺伝子にそのような領域が存在しない場合に良好な発現が得られ得る。好ましいポリアデニル化及び転写物形成シグナルとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（Mogenら、1990、The Plant Cell 2, 1261-1272）、オクトピンシンターゼ遺伝子（Gielenら、1984、EMBO J. 3, 835-845）、ノパリンシンターゼ遺伝子（Depickerら、1982、J. Mol. Appl. Genet. 1, p. 561）、及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998）のシグナルが挙げられ、これらは形質転換した植物細胞において３′非翻訳ＤＮＡ配列として作用する。
【００７４】
殺虫剤として有効なｉｓｐ遺伝子は、植物が融合タンパク質を発現するように、場合によっては、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子（EP 0242236）のような選択性マーカー遺伝子と同じプロモーターの制御下のハイブリッド遺伝子（米国特許第5,254,799号; Vaeckら、1987、Nature 327, 33-37）として植物ゲノムに挿入することができる。
【００７５】
ｉｓｐ遺伝子の全部又は一部を、レピドプテラ又は甲虫類に対して殺虫活性を有するB.thuringiensis株のような他の細菌、又は根コロニー形成性細菌、例えば根コロニー形成性Pseudomonas putida（Vilchezら、J. Bacteriol. 182, 91-99）を形質転換するために用いることができる。それによって、昆虫と戦うのに有用な、レピドプテラ及び甲虫類の広いスペクトルの有害昆虫に影響し得る、形質転換された細菌株を作製することができる。好適なクローニングベヒクル中に組み込まれた本発明のｉｓｐ遺伝子の全部又は一部あるいはそれらの等価物を用いてのAgrobacterium，Bacillus又はEscherichia属の細菌のような細菌の形質転換は、ヒートショック形質転換（Bergmansら、1981、J. Bacteriol. 146, 564-570）又はMahillonら（1989、FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210）及びＰＣＴ特許公開公報ＷＯ９０／０６９９９に記載された従来のエレクトロポレーション（電気穿孔）技術のような従来の方式で実行することができる。
【００７６】
本発明のｉｓｐ遺伝子を含むBacillus種株、好ましくはBacillus thuringiensis株のような形質転換した細菌株は、高い収率の細胞を提供するために、従来の方法で発酵させることができる（Dulmage, 1981,“Production of Bacteria for Biological Control of Insects” in Biological Control in Crop Production, Paparizas, D. C. 編、Osmun Publishers, Totowa, N.J., USA, pp. 129-141; Bernhard and Utz, 1993,“Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses”、In Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice, pp. 255-267、Entwistle, P.F., Cory, J.S., Bailey, M.J. and Higgs, S.編、John Wiley and Sons, New York）。
【００７７】
本発明の殺虫性、特に抗甲虫類性、好ましくは抗トウモロコシ根切り虫性組成物は、ｉｓｐ遺伝子で形質転換された微生物又は好ましくは活性成分としてそれぞれのＩＳＰタンパク質又はその殺虫剤として有効な部分を用いて、好適なキャリア、希釈剤、乳化剤及び／又は分散剤（例えばBernhard and Utz、1993、前出に記載されたもの）と一緒に、従来の方式で処方することができる。この殺虫剤組成物は、可溶性粉末、ペレット、顆粒又はダストとして、又はフォーム（泡）、ゲル、懸濁液、濃縮物等としての水性又は非水性溶剤を用いた液体製剤として、処方することができる。公知の微生物としては、昆虫への適用の前に安定な環境中にタンパク質を封入するのに役立つPseudomonas又は他の細菌の細胞が挙げられる。同様に本発明に含まれるのは、本発明のＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質を、トウモロコシをトウモロコシ根切り虫から保護するための同時、別個又は連続的使用のための組み合わせの調製物として含む製品であり、特にこのような製品は殺虫性組成物又はトランスジェニックトウモロコシである。
【００７８】
本発明にしたがって昆虫、特に甲虫類を防除する方法は、保護すべき地点（地域）に、本発明のｉｓｐ遺伝子で形質転換された宿主細胞又はＩＳＰタンパク質の殺虫性の量を適用することを含むことができる。保護すべき地点としては、例えば、有害昆虫の生息域又は植生の生育域、又は植生を生育させるべき地域が挙げられる。
【００７９】
ＩＳＰタンパク質を得るためには、ＩＳＰタンパク質を発現する組換え宿主の細胞を好適な培地上で従来の方式で生育させることができ、次に、タンパク質を、従来の手段を用いて培地から得ることができる。次に、ＩＳＰタンパク質を、クロマトグラフィ、抽出、電気泳動等のような標準的な技術によって分離し精製することができる。プロテアーゼ耐性トキシン形態を、次にタンパク質のプロテアーゼ、例えばシステイン又はセリンプロテアーゼ消化によって得ることができる。
【００８０】
殺虫効率をテストするためにバイオアッセイは、当業界で周知である。トウモロコシ根切り虫についてのテスト方法は、Marroneら（1985、J. Econ. Entomol. 78、290-293）に記載されているが、例えば米国特許第５，９９０，３８３号のように、人工的食餌又はトランスジェニック植物で昆虫をテストするために他の多くの方法が利用可能である。好適なバイオアッセイにおいては、バックグラウンドの死亡率を調べるために適正な対照が含まれる。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明又は求められている保護を制限するために提供されているものではない。これらの実施例の多くの変更又は等価物を、本発明の教示及び一般の知識を逸脱することなく当業者は作製又は設計することができる。この出願において言及されている配列表（それはこの出願の一部を形成し、ここに添付されている）は以下のとおりである：
【００８２】
配列表：
配列番号１−ＩＳＰ１Ａタンパク質及びＤＮＡのアミノ酸及びＤＮＡ配列
配列番号２−ＩＳＰ１Ａタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３−ＩＳＰ２Ａタンパク質及びＤＮＡのアミノ酸及びＤＮＡ配列
配列番号４−ＩＳＰ２Ａタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５−短いｚｒｐ２プロモーターフラグメントのＤＮＡ配列（ｎ＝任意のヌクレオチド）
配列番号６−長いｚｒｐ２プロモーターフラグメントのＤＮＡ配列（ｎ＝任意のヌクレオチド）
配列番号７−ＩＳＰ２Ａ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列
配列番号８−ＩＳＰ２Ａ−１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号９−ＩＳＰ１Ａ−１タンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ配列
配列番号１０−ＩＳＰ１Ａ−１タンパク質のアミノ酸配列
【００８３】
実施例に特に述べられていない限り、組換えＤＮＡを作製し、操作するためのすべての手順は、Sambrookら、「Molecular Cloning-A laboratory Manual, Second Ed.」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY（1989）、及びAusubelら（1994）、「Current Protocols in Molecular Biology」, Current Protocols, USAの第１巻及び第２巻に記載された標準的な手順によって行った。植物分子生物学実験についての標準的な材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd（UK）及びBlackwell Scientific Publications（UK）によって共同で出版されたR. R. D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax（1993）に記載されている。ＰＣＲ技術についての手順は、M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky及びT. J. White編、「PCR protocols: a guide to methods and applications」（Academic Press, Inc., 1990）に見出すことができる。
【００８４】
実施例
実施例１：ＩＢ１２０−Ａ株の特徴づけ
ここでＩＢ１２０−Ａ株と名付けられている細菌株は、メキシコのモレロス州の畑で発見された。
【００８５】
この株を、ＬＢ寒天プレート（１．５％寒天を添加したＬＢ培地；ＬＢ培地：１０g／lトリプトン、１０g／l  ＮａＣｌ、５g／lイーストエキストラクト、ｐＨ７．３）上で２８℃で一晩生育させた。小規模培養のためには、２０ml  ＴＢ培地（Terrific Broth：１２g／lトリプトン、２４g／lイーストエキストラクト、３．８g／l  ＫＨ2ＰＯ4、１２．５g／l  Ｋ2ＨＰＯ4、５ml／ｌグリセロール、ｐＨ７．１）に接種し、２８℃で６５時間、約７０回転／分の回転プラットフォーム上で生育させた。６５時間後、プロテアーゼ阻害剤混合物を培養物に添加した。このカクテルは、以下の成分を含んでいる（示した容量は１つの２０ml培養物に添加するのに必要なものである）：２００μl  ＰＭＳＦ（１００mM）、２００μlの塩酸ベンザミジン（１００mM）及びイプシロン−アミノ−ｎ−カプロン酸（５００mM）の混合物、４００μl  ＥＧＴＡ（０．５Ｍ）、４０μlアンチパイン（０．５mg／ml）／ロイペプチン（０．５mg／ml）及び２０μlベータ−メルカプトエタノール（１４Ｍ）。プロテアーゼ阻害剤混合物を添加した培地を、次に３０００rpmで２０分間遠心した。いくつかの場合には、Centriprep YM-10Centrifugal Filter Devices（Milliporeカタログ番号4305）を用いて上清を約４倍濃縮した。長期保存のためには、１ループの胞子形成した細胞を０．５mlの２５％又は５０％グリセロールに添加し、ボルテックス（渦巻き攪拌）後、−７０℃で保存した。胞子形成した細胞は、この株を（光学顕微鏡下で明らかなように）胞子形成するまでＬＢ寒天プレート上で生育させることによって得た。
【００８６】
単一細胞コロニーをＬＢ寒天プレート上で培養した後、ＩＢ１２０−Ａ株培養物の顕微鏡分析により、桿型運動性単一栄養細胞及び楕円形の胞子を含む膨潤した胞子のうの存在が示された。ＩＢ１２０−Ａ株の培養物においてはパラ胞子（parasporal）結晶は検出されなかった。
【００８７】
ＩＢ１２０−Ａ株の上清は、人工食餌（Sutterら（1971、J. Econ. Entomol. 64, 65-67）によって記載された食餌）上での表面汚染アッセイにおいてDiabrotica virgifera幼虫（以下「Ｄｖ」と名付ける）に対して強い毒性を示した。このアッセイは、５０μlトキシン溶液／ウェル（２cm2）での２４マルチウェルCostarプレート中で２４℃（＋／−１℃）で行い、６ウェルを、各サンプルについて１ウェル当り４匹のＬ１（第１齢）幼虫を用いて分析した（７日後に採点した）。
【００８８】
培養の開始後７、２４、３０、４８及び１２０時間に回収した上清のスクリーニングによって、４８時間でＤｖに対する最も強い毒性があることが示され、７時間では有意な毒性が見出されなかった。４８時間では、上清（総タンパク質濃度２１４μg／ml）を１／１０２４に希釈した場合も、なお５０〜６０％の範囲の死亡率が見られた。
【００８９】
熱処理後の、培養開始後４８、６５及び１４４時間に回収したＩＢ１２０−Ａ上清の活性の喪失、及び硫酸アンモニウム沈殿後の活性の維持から、毒性化合物がタンパク質であるらしいことが示された。
【００９０】
ジャイレースＢ遺伝子（Yamadaら、1999、Appl. Environm. Microbiol. 65, 1483-1490）についてのＰＣＲプライマーによるＩＢ１２０−Ａ株の予備的特徴付けは、それが亜種thuringiensis、anthracis又はcereusのBacillus株ではないことを示唆した。また、同様にBacillus lentimorbus及びBacillus popilliae種を認識する、Paenibacillus属の１６Ｓ  ＲＮＡ配列を特異的に特徴付けするＰＣＲプライマーを用いて（Petterssonら、1999、Int. J. Syst Bacteriol. 49（2）, 531-540）、増幅産物が得られなかった。ＮＢ培地（栄養ブロス：３g／l  バクトビーフエキストラクト、５g／l  バクトペプトン、ｐＨ６．８）における生育により、この新規な株がBacillus larvae種ではないことが示された。したがって、このＩＢ１２０−Ａ株は、結晶に含有されない分泌性殺虫タンパク質を産生することが知られている従来単離されたBacillus株とは異なるようである。
【００９１】
桿状の形態及び好気的生育に基づくと、この株は、Bacillus種であり得た。cry3 Bacillus thuringiensis遺伝子のための一般及び特異的プライマーのセットを用いて、ＩＢ１２０−Ａ株を分析した場合、増幅産物は見られなかった。
【００９２】
脂肪酸分析、及びＡＰＩ２０Ｅ試験と組み合わせたＡＰＩ５０ＣＨＢ試験を含む、標準的な微生物同定技術を用いたＩＢ１２０−Ａ株の詳細な分析によって、この株がBrevibacillus laterosporus種株であることが示された。
【００９３】
実施例２：  ｉｓｐ１及びｉｓｐ２ＤＮＡ／タンパク質の単離及び特徴づけ
ＩＢ１２０−Ａの毒性に関連する遺伝子を単離するために、この株からの総ＤＮＡを調製し、Ｓａｕ３Ａで部分消化した。消化されたＤＮＡをショ糖勾配上でサイズ分画し、７ｋｂ〜１０ｋｂにわたるフラグメントを、ＢａｍＨ１消化及びＴｓＡＰ（熱感受性アルカリホスファターゼ）処理をしたクローニングベクターｐＵＣ１９（Yannisch-Perronら、1985、Gene 33、103-119）に連結した。連結混合物をE. coli XL1-Blue細胞中に電気穿孔した。形質転換体を、Ｘｇａｌ及びＩＰＴＧを含有するＬＢ−トリアシリンプレート上にプレーティングし、白いコロニーをフィルターハイブリダイゼーション実験に使用するために選択した。次に、ベクターを含む組換えE. coliクローンを、以下のようにして調製したＤＩＧ標識プローブを用いてスクリーニングした。最初に、ＩＢ１２０−Ａ株由来の細胞を鋳型として用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を、ゲル精製し、第一のＰＣＲ反応におけるのと同じプライマー及びＤＩＧ標識ｄＮＴＰｓを用いる二次ＰＣＲ反応において鋳型として用いた。この増幅産物の適当な量をハイブリダイゼーション反応において使用した。
【００９４】
全長ｉｓｐ遺伝子を有するプラスミドを含む陽性コロニーの同定に続いて、これらの遺伝子の配列を、色素ターミネーター標識法及びPerkin Elmer ABI Prism-377 ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。陽性コロニーのクローニングされたＤＮＡフラグメント中に見出された２つのオープンリーディングフレームの配列を、配列番号１及び３に示す。これらのＤＮＡ配列は、オペロンに編成されており、観察された高い殺虫活性の原因因子であることが見出された新規タンパク質ＩＳＰ１Ａ（配列番号２）及びＩＳＰ２Ａ（配列番号４）をコードすることが見出された。（プラスミドｐＵＣＩＢ１２０／ＩＳＰ中の）毒性に関連する遺伝子を有するｐＵＣ由来プラスミドを含む陽性コロニーは、ブダペスト条約の条項に基づいて２０００年１月１１日にＬＭＢＰ４００９としてE. coli XL1Blue中で寄託された。
【００９５】
陽性コロニーからプラスミド調製物を作製し、このプラスミドを、Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＩを用いて切断し（約７ｋｂのフラグメントを生じる）、同じ制限酵素を用いて切断されていたシャトルベクターｐＳＬ４０に連結した。これは、プラスミドｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰを生じた。次に、プラスミドｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰを、結晶マイナスB.thuringiensis株中に移入した。この組換えＢｔ株由来の上清は、以下のようにして得た。
【００９６】
この株を、エリスロマイシン（２０μg／ml）を含有するＬＢ寒天プレート上で２８℃で一晩生育させた。小規模培養のためには、エリスロマイシン（２０μg／ml）を含有する２０ml  ＴＢ培地に接種し、２８℃で６５時間、約７０回転／分の回転プラットフォーム上で生育させた。６５時間後、プロテアーゼ阻害剤混合物を培養物に添加した。このカクテルは、以下の成分を含んでいる（示した容量は１つの２０ml培養物に添加するのに必要なものである）：２００μl  ＰＭＳＦ（１００mM）、２００μlの塩酸ベンザミジン（１００mM）／イプシロン−アミノ−ｎ−カプロン酸（５００mM）の混合物、４００μl  ＥＧＴＡ（０．５Ｍ）、４０μlアンチパイン（０．５mg／ml）／ロイペプチン（０．５mg／ml）及び２０μlベータ−メルカプトエタノール（１４Ｍ）。プロテアーゼ阻害剤混合物を添加した培地を、次に３０００rpmで２０分間遠心した。いくつかの場合には、Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices（Milliporeカタログ番号4305）を用いて上清を約４倍濃縮した。
【００９７】
上述のＤｖ表面汚染アッセイを用いたプラスミドｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰを含む組換えＢｔ株の培養開始後４８時間の上清の殺虫活性は、この上清が、１／１０２４に希釈した場合も、なお６０％の範囲の有意な死亡率を有しており、一方、対照の死亡率（対照は形質転換されていないＢｔ株の上清を含んでいた）は、０％であったことを示した。これは、単離されたＤＮＡがＩＢ１２０−Ａ株の殺虫性成分をコードしており、別の細菌へ移入しても、発現され、培地中に分泌されることを示す。プラスミドｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰで形質転換された別の独立のＢｔ結晶マイナス株の毒性の分析により、非形質転換対照の殺虫活性と比較してこの上清の殺虫活性が高いことが確認された。
【００９８】
２つのＩＳＰタンパク質を発現するＢｔ株の上清のＬＣ５０値は、ＤＶ幼虫を用いる上述の表面汚染アッセイを用いて４日後に３．５ng／cm2であることが見出された（総上清タンパク質濃度に基づいている）。ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質を発現する組換えＢｔ株によって産生された上清の、選択された甲虫類昆虫に対する毒性の詳細な分析は、以下の表１に示されている。本発明のＩＳＰタンパク質は、西部、北部及び南部トウモロコシ根切り虫幼虫に対して、また、コロラドハムシ及びコットンボールゾウムシの幼虫に対しても、有意な殺虫活性を有することが見出された。
【００９９】
成熟ＩＳＰ１及びＩＳＰ２タンパク質を、見かけの均質になるまで、硫酸アンモニウム沈殿及びその後の異なるクロマトグラフィカラムの通過によって精製した。クロマトグラフィ分析は、ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質が等モル比で存在することを示唆する。ＩＳＰ１Ａタンパク質は、むしろ疎水性の性質であることが見出されており、一方、ＩＳＰ２Ａはむしろ親水性の性質であった。組換え結晶マイナスＢｔ株において産生された成熟ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質のアミノ末端配列決定により、ＩＳＰ１Ａについては配列番号２中のアミノ酸位置３８及びＩＳＰ２Ａについては配列番号４中のアミノ酸位置５１が、このような形質転換されたＢｔ株の上清に存在する活性タンパク質のＮ末端アミノ酸であることが示された。ＩＳＰ１ＡについてのＮ末端は、ＩＡＴＴＱＡＳＫＤであることが見出され、ＩＳＰ２Ａについてのそれは、ＬＶＫＴＴＮＮＴＥＤであることが見出され、これは、単離されたＤＮＡ配列のアミノ酸配列と充分に一致する。
【０１００】
３７、５０、７５、１００及び１５０kDの分子量マーカーを用いて、純粋成熟ＩＳＰ１Ａタンパク質の見かけの分子量は、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動において約１００kDであることが決定され、純粋成熟ＩＳＰ２Ａタンパク質のそれは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動において約４５kDタンパク質であることが決定された。
【０１０１】
組換え株によって産生された成熟ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質の活性を、いくつかの昆虫に対して評価した。選択された甲虫類昆虫に対する結果を、以下の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
0005054267.tif 000002
【０１０３】
表１についての凡例
Ｄｖ：Diabrotica virgifera、西部トウモロコシ根切り虫；Ｄｂ：Diabrotica barberi、北部トウモロコシ根切り虫；Ｄｕ：Diabrotica undecimpunctata howardi、南部トウモロコシ根切り虫；Ｌｄ：Leptinotarsa decemlineata、コロラドハムシ；Ａｇ：Anthonomus grandis、コットンボールゾウムシ；Ｌ１：第１幼虫ステージ；Ｌ２：第２幼虫ステージ；Ｌ３：第３幼虫ステージ；Ｌ１＋２ｄ：孵化後２日；*：９０％ＣＬ（ＣＬ＝信頼限界、ＬＣ５０：５０％の昆虫が殺されるときの総上清タンパク質濃度）。
【０１０４】
用いたバイオアッセイ：Ｄｖ、Ｄｂ、Ｄｕ：人工食餌での表面汚染アッセイ（説明については上記を参照されたい）、２５μg／cm2の比で行い、７日後に採点した；Ｌｄ：ジャガイモ群葉でのディップテスト（切断されたジャガイモ群葉をトキシン溶液に浸漬し、乾燥させ、ペトリ皿（直径９cm）に１０匹の幼虫とともに入れた；１日後、未処理のジャガイモ群葉をこのペトリ皿に加え、５日後に採点した）；Ａｇ：人工食餌取り込みテスト：Moore and Whisnant、「Handobook of Insect Rearing, vol.I」、Pritah Singh and R. F. Moore, Elsevier, Amsterdam, 1985, 217頁によって記載された食餌；アッセイ：２５ml食餌当り２mlのトキシン溶液の取り込み、２４マルチウェルCostarプレート（約１ml／ウェル）、卵１個／ウェル、２０ウェル／サンプル、１４日後にスコアした）。
【０１０５】
表１に報告したアッセイにおいて、対照（未処理食物、非形質転換Ｂｔ結晶マイナス株の上清又は水と一緒に食物を供給した）は、上記の昆虫のいずれについても２０％を超える死亡率を全く示さなかった（幼虫のステージ及び昆虫種によって５〜２０％の対照の死亡率の変動が見られた（２０％は、Ｄｖの第３幼虫ステージについてのものである））。
【０１０６】
上述のバイオアッセイを用いてDiabrotica virgifera幼虫について得られたＬＣ５０値は、等モルの組み合わせのＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質を組換えＢｔ株の上清由来のこれらのタンパク質の精製後に適用した場合、上で得られたものと有意に異ならなかった。
【０１０７】
選択されたレピドプテラ昆虫（Ostrinia nubilialis、Heliothis virescens、Helicoverpa zea、Spodoptera frugiperda、Sesamia nonagrioides、Spodoptera littoralis、Helicoverpa armigera、及びManduca sexta）に対する標準的な表面汚染アッセイにおける成熟ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質の混合物のバイオアッセイは、本発明のＩＳＰタンパク質がこれらの昆虫において対照レベルを超える死亡を何ら引き起こさないことを示した。これは、本発明のタンパク質の甲虫類特異的な性質を証明する。２つのアブラムシ種を用いた予備的なバイオアッセイにおいても、ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａの混合物がこれらの昆虫において有意な死亡を何ら引き起こさないことを示した。
【０１０８】
ｉｓｐ遺伝子のどのフラグメントがDiabrotica幼虫に対して毒性のＩＳＰタンパク質複合体をコードするのに充分かを決定するために、異なる位置でｉｓｐ遺伝子のＯＲＦにストップコドンを挿入する（したがって、異なる３′遺伝子短縮を作製する）ことにより、一連のＣ末端短縮型ＩＳＰタンパク質を作製した。ストップコドンは、Genome Priming System（ＧＰＳ，New England Biolabs，カタログ番号7100）を用いてランダムな位置に挿入した。この系を用いて、１．７ｋｂトランスポゾン（特異的プライマーに相補的な２つの配列及び３つすべてのリーディングフレーム中のストップコドンを含む）を、「標的」ＤＮＡ中にランダムに、しかしたった１回だけ、挿入した。挿入の位置、したがって短縮を、次に、遺伝子特異的プライマー及びトランスポゾン特異的プライマーを用いるＰＣＲスクリーニングによって概算することができ、あるいは、配列決定によって正確に決定することができる。次に、ｉｓｐ遺伝子の１つにおける異なる位置にトランスポゾンを有する構築物のセットで、個別に結晶マイナスＢｔ株を形質転換し、各組換えＢｔ株の上清に対する西部トウモロコシ根切り虫幼虫の感受性を、上述のアッセイを用いて試験した。
【０１０９】
ｉｓｐ２遺伝子の短縮については、この遺伝子を含むフラグメントを、ＢｓｔＢＩ及びＰｍＩＩを用いてｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰから切り出した。ＧＰＳ反応に続いて、このフラグメントを次に同じ酵素で切断されたｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰベクター中に連結した。トランスポゾンの挿入部位の位置を概算するために、組換えE. coliコロニーをＰＣＲスクリーニングした。ｉｓｐ２遺伝子の第二の半分（３′半分）における異なる位置にトランスポゾンを有する１０個のクローンのセットを選択した。これらのクローンのプラスミドＤＮＡを、ｄcm及びｄａｍメチラーゼ陰性E. coli株ＧＭ２１６３を形質転換した。この株から単離したプラスミドＤＮＡを、次に結晶マイナスＢｔ株を形質転換した。上清を調製し、陽性対照としてｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰで形質転換したＢｔ株由来の上清、及び陰性対象として結晶マイナスＢｔ株由来の上清を用いて、バイオアッセイした。ｉｓｐ１遺伝子の短縮については、フラグメントをＰｍＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＳＬＩＢ１２０／ＩＳＰから切り出した。ｉｓｐ２遺伝子の短縮についての場合と同じ方法論にしたがった。
【０１１０】
トランスポゾン挿入分析の結果は、３′末端のｉｓｐ２Ａ遺伝子の比較的大きいセグメントの短縮が毒性を消失させることを示し、ＩＳＰ２Ａタンパク質においては比較的短いＣ末端短縮が許容されるか、又は全く許容されないことが示された。配列決定後、ＩＳＰ１Ａタンパク質との組み合わせで試験した場合にこの研究において毒性を維持している最小のＣ末端短縮型ＩＳＰ２Ａトキシンフラグメントは、配列番号４のアミノ酸位置４４９で終わることが見出された。
【０１１１】
これらの分析の結果は、３′末端でＩＳＰ１Ａタンパク質のより大きい短縮が可能であることを示す：配列決定は、最大のＣ末端短縮を有する毒性フラグメントが配列番号２のアミノ酸位置７６８で終わることを示した。したがって、約３００ｂｐのＩＳＰ１Ａコード領域を、毒性を失うことなく３′側で欠失させることができる。
【０１１２】
上記の研究は、機能的なＩＳＰ１Ａが全く産生されない場合、殺虫活性がバックグラウンドレベルに低減されることも示し、本発明のＩＳＰタンパク質のバイナリーな性質が確認される。
【０１１３】
したがって、配列番号４のアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４４９のＩＳＰ２Ａタンパク質と、配列番号２のアミノ酸位置３８〜アミノ酸位置７６８のＩＳＰ１Ａタンパク質とが、ＩＳＰタンパク質の有用な殺虫性フラグメントである。
【０１１４】
さらに、ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａ遺伝子のＤＮＡ融合物を含むキメラ遺伝子が、結晶マイナスBacillus thuringiensis berliner １７１５株で発現された。Ａｒｇ−Ｌｙｓ−リンカー（ＲＫＲＫＲＫ）をコードするＤＮＡ配列又はＧｌｙ−リンカー（ＧＧＧＧＧＧ）をコードするＤＮＡ配列が、ＩＳＰ２Ａ及びＩＳＰ１Ａタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム間に提供され（ＩＳＰ２ＡはＮ末端シグナルペプチドがなお存在するが、ＩＳＰ１Ａはそのシグナルペプチドを欠いている）、トランスレーショナルな融合タンパク質、すなわち、特定されたリンカーがＩＳＰ２Ａタンパク質（Ｎ末端融合パートナーとして）をＩＳＰ１Ａタンパク質（Ｃ末端融合パートナーとして）に繋げている融合タンパク質、が産生されるようにした。組換えＢｔ株は、Diabrotica virgiferaに対し非形質転換対照株（すなわち、結晶マイナスＢｔ１７１５株）の死亡率よりも有意に高い死亡率を引き起こすことが証明された。これは、単一のキメラ遺伝子を用いることによって組換え宿主細胞中で融合タンパク質として本発明のＩＳＰタンパク質が生産される可能性を示す。明らかに、本発明の説明において記載したように、複数の異なるアプローチを用いて組換え細胞、例えば植物細胞における融合タンパク質の生産を達成することができる。
【０１１５】
実施例３：植物におけるＩＳＰタンパク質の産生
植物において最適な発現を得るために、ｉｓｐ１Ａ及びｉｓｐ２ＡネイティブＤＮＡ配列を、ＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａタンパク質をコードする改変されたＤＮＡ配列を産生するように改変した。そのシグナルペプチドをメチオニン及びアラニンアミノ酸で置換したＩＳＰ１Ａ−１及びＩＳＰ２Ａ−１タンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号９及び７に示す。
【０１１６】
これらのコード領域を、好適な調節配列、例えば標準的な技術を用いた配列番号５又は６の短又は長ｚｒｐ２プロモーター配列に基づくプロモーター、及び適切な３′転写終結及びポリアデニル化配列、に作動可能に連結されたキメラ遺伝子中に挿入した。いくつかの構築物においては、上記のキメラ遺伝子は、プラスチッドへのターゲティング、又は細胞壁を標的とすることを引き起こすシグナルペプチドをもたらす、米国特許第５，５１０，４７１号（又は再発行された米国特許第ＲＥ０３６４４９号）に記載されたような（Ｎ末端細菌性シグナルペプチドの代わりに）最適化された葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。植物細胞において有効な他のシグナルペプチドも同様に用いることができ、好ましくはイネのα−アミラーゼ３遺伝子によってコードされるシグナルペプチド（Sutliffら、1991、Plant Molec.Biol. 16, 579-591）、ホウレンソウ由来のフェレドキシンＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子によってコードされるシグナルペプチド（Oelmuellerら、1993、Mol. Gen. Genet. 237, 261-272）又はジャガイモのプロテイナーゼ阻害剤II遺伝子によってコードされるシグナルペプチド（Keilら、1986、Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650）である。
【０１１７】
トウモロコシ細胞は、Agrobacterium媒介性形質転換（Ishidaら、1996、Nature Biotechnology 14、745-750；及び米国特許第５，５９１，６１６号）、米国特許第５，７９２，９３６号に記載されたようなプロトプラスト形質転換又はＷＯ９２／０９６９６もしくは米国特許第５，６４１，６６４号に記載されたような損傷し酵素分解した胚性カルスを用いるエレクトロポレーション（これらの上記の参考文献はすべて参照によりここに援用される）を用いて、上記のｉｓｐ１Ａ及びｉｓｐ２Ａキメラ遺伝子で安定に形質転換される。トウモロコシは形質転換された細胞から再生され、根における最適な発現レベルについて、及び全体的な作物学的特性について、選択される。このようにして得られた本発明の上記のＩＳＰタンパク質を産生するトランスジェニックトウモロコシは、そのような植物を食餌としようとするDiabrotica virgifera幼虫に対して有意な死亡率をもたらす。
【０１１８】
本発明にしたがって、いくつかのＤＮＡ構築物を含む安定に形質転換されたトウモロコシもまた得られ、そのトウモロコシは、好適な調節制御領域の制御下で、適切なマーカー遺伝子、好ましくは除草剤耐性遺伝子と一緒に、その細胞内で本発明の１つ又は両方のＩＳＰタンパク質を発現することができる。これらのＤＮＡ構築物においては、好ましい３′転写終結及びポリアデニル化配列は、カリフラワーモザイクウイルスから得られた３′転写終結及びポリアデニル化配列を含む２１５ｂｐフラグメントである（Okaら、1981、J. Mol. Biol. 147, 217-226）。いくつかの構築物においては、５′非翻訳リーダー配列を付加することができ、好ましくは、ペチュニア由来のｃａｂ２２遺伝子のリーダー配列（Harpsterら、1988、Mol. Gen. Genetics 212、182-190）又はｚｒｐ２遺伝子（Heldら、1997、Plant Molecular Biology 35、367-375、Genbank受託番号U38790）から選択されるものである。構築物における好ましいプロモーターは、３５Ｓプロモーター（例えばOdellら、1985、Nature 313、810-812）又はｚｒｐ２プロモーター（Heldら、1997、Plant Molecular Biology 35、367-375、Genbank受託番号U38790）のプロモーター有効性部分である。構築物は、上記の最適化された葉緑体輸送ペプチドに加えて、植物細胞において有効なシグナルペプチド、具体的にはイネのα−アミラーゼ３遺伝子によってコードされるシグナルペプチド（Sutliffら、1991、Plant Molec. Biol. 16, 579-591）、ホウレンソウ由来のフェレドキシンＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子によってコードされるシグナルペプチド（Oelmuellerら、1993、Mol. Gen. Genet. 237, 261-272）又はジャガイモのプロテイナーゼ阻害剤II由来のシグナルペプチド（Keilら、1986、Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650）をもまた含むことができる。当業界で当業者に利用可能な技術を用いて上記の好ましい要素からの選択を用いてのＩＳＰキメラ遺伝子での植物の形質転換は、本発明の所望のゴールを達成するために使用することができる。
【０１１９】
好ましくは、植物は、グルホシネート又はグリホサートに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をも含み、それらについて異なるプロモーター及び／又はリーダー配列、例えばｇｏｓ２プロモーター及び／又はｇｏｓ２リーダー（de Paterら、1992、Plant J. 2, 837-844）が用いられる。
【０１２０】
いうまでもなく、本発明は、上記のトウモロコシ、形質転換方法、又は用いられた特定のＩＳＰタンパク質又はＤＮＡ配列に限られない。むしろ、本発明は、本発明のＩＳＰタンパク質のアミノ酸配列を実質的に有し、ＩＳＰタンパク質の殺虫活性を実質的に有するタンパク質のような、殺虫活性を維持しているＩＳＰタンパク質のあらゆる変異体又は等価物をも含む。また、甲虫類昆虫、特にトウモロコシ根切り虫、ゾウムシ又はジャガイモハムシ、特にDiabrotica virgifera又はLeptinotarsa decemlineata、好ましくは以下のものからなる群から選択される昆虫による損傷を受け得るあらゆる植物が、本発明においてＩＳＰタンパク質をコードするＤＮＡでの形質転換のための好ましい標的として含まれる：Agelastica alni、Hypera postica、Hypera brunneipennis、Haltica tombacina、Anthonomus grandis、Tenebrio molitor、Triboleum castaneum、Dicladispa armigera、Trichispa serica、Oulema oryzae、Colaspis brunnea、Lissorhorptrus oryzophilus、Phyllotreta cruciferae、Phyllotreta striolata、Psylliodes punctulata、Entomoscelis americana、Meligethes aeneus、Ceutorynchus種、Psylliodes chrysocephala、Phyllotreta undulata、Leptinotarsa decemlineata、Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata、Diabrotica undecimpunctata howardi、Diabrotica barberi、及びDiabrotica virgifera。
【配列表】
0005054267.tif 000003
0005054267.tif 000004
0005054267.tif 000005
0005054267.tif 000006
0005054267.tif 000007
0005054267.tif 000008
0005054267.tif 000009
0005054267.tif 000010
0005054267.tif 000011
0005054267.tif 000012
0005054267.tif 000013
0005054267.tif 000014
0005054267.tif 000015
0005054267.tif 000016
0005054267.tif 000017
0005054267.tif 000018
0005054267.tif 000019
0005054267.tif 000020
0005054267.tif 000021
0005054267.tif 000022
0005054267.tif 000023
0005054267.tif 000024
0005054267.tif 000025
0005054267.tif 000026
0005054267.tif 000027
0005054267.tif 000028
0005054267.tif 000029
0005054267.tif 000030
0005054267.tif 000031
0005054267.tif 000032