(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＧＦを含有する、内因性チオレドキシン発現を誘導することにより光損傷を受けた網膜神経細胞の機能を回復させる、網膜神経細胞機能回復剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、網膜神経細胞機能回復剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経の生存及び分化は細胞の酸化還元条件により影響される。TRX はその活性部位配列; -Cys-Gly-Pro-Cys-内にレドックス活性なジスルフィド／ジチオールを有する小さい 12 kDaの多機能タンパク質であり、タンパク質ジスルフィド還元系としてNADPH及びチオレドキシンレダクターゼにも働く(Holmgren, 1985)。いくつかの報告は、TRX-依存性レドックス制御がAP-1、 NF-kB、p53、ASK1及びp38 MAP キナーゼにより介在されるシグナル伝達に密接に関与することを示した( Hirota et al., 1997; Saitoh et al., 1998; Hashimoto et al., 1999; Ueno et al., 1999). TRXは広く分布し、種々のストレスにより誘導される(Nakamura et al., 1997; Masutani, 1999). TRX発現はまた K562 赤白血病細胞の分化誘発剤であるへミン(Kim et al., 2001), 又は網膜色素上皮細胞のサイクリックAMPアナログ(Yamamoto et al., 1997)により上昇する。TRX 遺伝子の制御領域中には、いくつかのSP-1結合モチーフ、抗酸化剤応答エレメント(ARE) 及びサイクリックAMP応答配列(CRE)がある。神経組織において、TRXは虚血後の星状膠細胞(Tomimoto et al., 1993) 及び神経損傷後の運動ニューロン (Mansur et al., 1998) において誘導される。TRX は酸化ストレスに対して細胞保護作用(Nakamura et al., 1994) 及び神経保護活性(Hori et al., 1994)を有することが知られている。さらに、トランスジェニックマウスにおけるTRXの過剰発現は病巣の虚血脳障害を軽減する(Takagi et al., 1999). TRXはまた中枢コリン作動性ニューロンの神経栄養因子として報告され、神経栄養活性を有するが(Endoh et al., 1993), その効果の分子的基礎は解明されていない。
【０００３】
神経成長因子(NGF)及び脳由来神経栄養因子のようなニューロトロフィンファミリーの他のメンバーはニューロンに対し生存及び分化の促進を含む絶大な効果を有する(Lo, 1992)。NGFは、アルツハイマー病のような加齢に伴う神経変性疾患において可能性のある治療剤として報告された(Connor and Dragunow, 1998)。これらのメカニズムの現在の理解は、褐色細胞腫細胞株PC12についてのＮＧＦ作用の研究に大きく依存している(Greene and Tischler, 1976)。NGFにさらされると、PC12細胞は交感神経ニューロン様細胞に分化する。シグナルは、NGFが細胞膜上のその高活性受容体であるTrkAに結合することにより開始され(Kaplan et al., 1991)、ras及びマイトージェン活性化蛋白質キナーゼ(MAPK)カスケード(Thomas et al., 1992)により導入される。PC12細胞のNGF処理はNGF作用に重要と考えられているc-fosのような遺伝子の活性化をもたらす(Milbrandt, 1986)。NGFは、血清応答エレメント(Treisman, 1986)及びCRE(Ginty et al., 1994; Ahn et al., 1998)を含むいくつかのエレメントによりc-fos遺伝子を活性化する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、網膜神経細胞の機能回復を促進する技術に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＴＲＸが網膜神経細胞の機能回復を促進し、眼科領域での疾患の治療に有用であることを見出した。
【０００６】
本発明は、以下の網膜神経細胞機能回復剤に関する
項１．  ＮＧＦを含有する、内因性チオレドキシン発現を誘導することにより光損傷を受けた網膜神経細胞の機能を回復させる、網膜神経細胞機能回復剤。
【００１５】
【発明の実施の形態】
機能回復される神経としては、視神経などが挙げられ、これらの各種幹細胞に神経成長因子（ＮＧＦ）を作用させることで、ＴＲＸの発現を誘導し、これにより網膜神経細胞の機能を回復し、神経の変性ないし神経細胞死に起因する各種神経系疾患を治療することができる。
【００１６】
神経に分化し得る各種幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞などが例示できる。
【００１７】
本発明者らは、神経幹細胞にＴＲＸが多く発現していることを見出しており、下記の実施例からも、ＴＲＸが網膜神経細胞の機能回復を促進することは明らかである。
【００１９】
本発明に係る網膜神経細胞機能回復剤は、網膜神経細胞に適用することにより、ＴＲＸ発現を誘導し、結果として網膜神経細胞の機能回復を促進することができる。
【００２１】
投与経路としては、経口（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤など）及び非経口（注射剤、吸入剤、点鼻剤、坐剤など）のいずれでも投与することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明する。
実施例１
（１）細胞株及び培養
NGF, ポリエチレンイミン(PEI), PD98059及びNACはSigmaから購入した。ラット褐色細胞腫腫瘍細胞株PC12は、5% CO2 を含む湿気のある雰囲気中３７℃で、１０％熱不活性化ウマ血清及び５％熱不活性化胎仔ウシ血清(FCS)を有し、抗生物質(100 IU/mlのペニシリン及び100 mg/ml のストレプトマイシンを補足したRPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY)中で維持した。
・プラスミド：pTrxCAT プラスミドは公知の方法に従い構築した(Taniguchi et al., 1996)。the pTrxCAT ベクターからのHindIII-BamH I インサートは、pBluescriptII KS (+) (pTRXblue ベクターにサブクローニングした。pTRX(-1148)-Luc、pTRX (-1062)-Luc、pTRX (-352)-Luc及びpTRX (-263)-Luc ベクターはpTRXblueベクターのKpnI/BamHI フラグメントをpGL3 ベイシックベクター(Promega, WI)のKpnI/BglII部位にライゲートすることにより構築した。pTRX(-263)-LucベクターのApaI /PvuIIインサートは、切り出され、埋められ、自己ライゲートされてpTRX (-217)-Lucベクターを得た。pGL3-c-fos (-40, +42) 及びpGL3-c-fos (-99, +42) lucベクターは、Fos-40 lucのMluI/HindIIIフラグメント(Masutani et al., 1997)及びthe pFDE-lucベクターをpGL3 ベイシックベクター(Promega)のMluI/HindIII部位にサブクローニングすることにより構築した。pFDE-lucは、FDE-CAT (Trouche et al., 1993) のBamHI/HindIIIフラグメントをpGL2ベイシックベクター(Promega)のBglII-HindIIIにサブクローニングすることにより構築した。pCDSR a(alpha) -TRX及び pCDSRa -TRX(C32S/C35S)ベクターは、既述の方法により構築した(Hirota et al., 1997)。The pcDNA3TRX (32S/35S)ベクターは、既述の方法により構築した(Nishiyama et al., 1999)。pCDSRa -TRX及びpCDSRa-TRXm (Tagaya et al., 1989; Hirota et al., 1997)からのBamHIインサートは、各々pBluescript II KS (pBS-wtTRX, pBS-dmTRX)のBamHI部位にサブクローニングした。pBI-EGFP-wtTRX及びpBI-EGFP-dmTRX(32S/35S)は、各々pBS-wtTRX及びpBS-dmTRX ベクターのEcoRV/XbaIフラグメントをpBI-EGFPベクター(Clontech)のPvuII/NheI部位にライゲートすることにより構築した。すべての構築物は、Thermo Sequenase II ダイ・ターミネーター・サイクルシークエンシングキット（dye terminator cycles equencing kit）(Amersham Pharmacia)を用いた直接ヌクレオチドシークエンシングによりコントロールした。pRL-TKベクターは、Promegaから購入した。pcDNA3はInvitrogenから購入した。
・ウェスタンブロット分析
細胞を集めて氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で２回洗浄し、次いで可溶化溶液(10 mM.Tris-HCI (pH 7.4), 150 mM NaCI, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 8 mg/mlアプロチニン及び2mg/mlロイペプチン)で氷上３０分間溶解させた。抽出物を遠心分離により清澄にした。細胞可溶化液を９５℃で５分間維持し、次いで15% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離したタンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜(Millipore Co., Bedford,MA)に移した。該膜をT-PBS (0.05% Tween20を含むPBS)中10% (w/v)スキムミルクで終夜処理し、抗マウスTRX ウサギポリクローナル抗体(Takagi et al., 1998c)と１時間インキュベートし、次いでペルオキシダーゼ複合化抗ウサギIgG(Amershan Pharmacia Biotech)と１時間インキュベートした。エピトープをECLウェスタンブロット検出キット(Amershan Pharmacia Biotech)で可視化した。本発明者は、以前にこの抗マウス抗体がラットTRX と交差反応することを報告した(Takagi et al., 1998b)。
・ノーザンブロット分析
全RNAを製造元の仕様書に従いTRIzol試薬を用いて抽出した(Maruyama et al., 1997)。全ＲＮＡ20mg を電気泳動にかけMaximum strength Nytran nylon (Schleicher and Schrul, Knee, NH )にTurbo-Blotterシステム(Schleicher andSchrul)を用いて移した。フィルターを、既述のように(Takagi et al., 1998b)ラットTRX mRNAと交差反応するマウスTRXプローブとハイブリダイズさせた。
・トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
PC12細胞をトランスフェクション前に35-mm ディッシュに70%コンフルエンスで播種した。血清を含まない培地中の細胞をBoussifら(Boussif et al., 1995)に記載されたようにPEI試薬を用いてトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞を50 ng/ml のNGF (Sigma)で処理した。 Renillaルシフェラーゼ活性により規格化したルシフェラーゼ遺伝子発現をアッセイキット(Promega, Madison, WI)を用い、ルミノメーターで２４時間後に分析した。ルシフェラーゼの相対的フォールド活性化を計算した。同じ実験を３回行った。PC12細胞を、TRXの活性部位が不活性化された二方向性発現ベクターpBI-EGFP, pBI-EGFP-wtTRX又はpBI-EGFP-dmTRXでトランスフェクトした(Ueno et al., 1999)。トランスフェクション後、NGFを培地に加えた。24時間後、細胞発現EGFPをレーザー共焦点顕微鏡により調べた。
・免疫蛍光細胞染色
PC12細胞をポリ-L-リシンでコートした培養スライド中70%コンフルエンスで染色する前に播種した。次いで、細胞を10% FCSを含むPBS中3.7%パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定した。これを次にPBS中0.2% (W/V) TritonX-100を用いて１０分間膜透過性化し、5% ウシ血清アルブミン及び10% FCSを含むPBSで20分間ブロッキングした。スライドを2mg/mlのマウスTRX抗体(富士レビオより提供)で60分間インキュベートし、次いでPBSで洗浄した。次いでスライドを1mg/mlのフルオレセインイソチオシアネート標識二次抗体と60分間インキュベートし、再度PBSで洗浄した。染色細胞をレーザー共焦点顕微鏡(Bio-Rad)で調べた。
・結果
PC12細胞中でのNGF誘発TRX発現
本発明者は、NGFのPC12細胞中でのTRX発現についての効果を調べた。該タンパク質発現は、NGFによりPC12細胞中で増加した(図１Ａ)。TRX mRNAもまたNGF処理の２時間後に増加した(図１Ｂ)。NGF 処理による誘導メカニズムをさらに分析するために、本発明者は、TRX プロモータールシフェラーゼレポーターコンストラクト(TRX-Luc)でPC12細胞をトランスフェクトした。NGF による処理は、TRXプロモーター活性を有意に増強した（図１Ｃ）。
TRXプロモーター中のNGF-応答領域の同定
NGFによるTRX遺伝子の活性化のメカニズムを理解するために、TRXプロモーター領域の各種欠失ミュータントを含むルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを使用した。翻訳開始部位に対し−263位〜−217位の遺伝子領域はNGF応答に必要であった。この領域はコンセンサスCREに似ている配列を含み、活性化におけるCREの関与を示す（図２）。TRX発現はPD98059又はNACにより抑制された。
【００２３】
ERK阻害剤であるPD98059及びNAC (Kamata et al., 1996)は NGFによるERK-CRE介在活性化を抑制することが知られている。NGFで２日間処理すると神経突起伸長の出現を伴うPC12細胞のニューロン分化を誘発した。既報告のように、PD98059 (50mM)又はNAC (20 mM)は、PC12 cellsにおける NGF-誘発形態変化を抑制した(図３Ａ)。次いで、本発明者はPD98059またはNACのNGF-介在TRX遺伝子活性化についての効果を試験した。PD98059 またはNACは、TRX遺伝子のNGF-誘発活性化をブロックした(図３Ｂ)。PD98059又はNACはまた、TRXタンパク質発現の減少を生じた（図３Ｃ）。
TRX のNGF-誘発核輸送は、PD98059またはNACによりブロックされる。
【００２４】
ERKは、NGF処理中に細胞質から核に輸送される(Chen et al.,1992). TRXはまた、H2O2又はUV照射にさらされたときにも細胞質から核に輸送される(Hirota et al., 1997)。NGF-誘発シグナリングにおけるTRXの関与を分析するために、本発明者はNGF処理の際のTRXの細胞下局在を研究した。NGFで１６時間処理した後、TRXは核に移動した。該移動はPD98059又はNACによりブロックされた(図４)。優性型TRXの過剰発現は、PC12のNGF-誘発分化をブロックした。
【００２５】
本発明者は、次いでTRXがPC12細胞のNGF-依存性分化に要求されるのかを調べた。本発明者は、PC12細胞をpBI-EGFP, pBI-EGFP-wtTRX又はpBI-EGFP-dmTRX (32S/35S)を用いて一時的にトランスフェクトし、そこでは、TRXのレドックス活性部位は不活性化された。ミュータントTRXは転写因子のTRX依存性活性化を阻害した(Ueno et al., 1999)。トランスフェクション後、NGFが培地に添加された。NGF処理の24時間後、細胞をレーザー共焦点顕微鏡で調べた。ミュータントTRXベクターでトランスフェクトされた細胞は分化の抑制を示し、一方野生型TRXベクターまたはコントロールベクターでトランスフェクトされた細胞はNGF-誘発分化を示した（図５）。
【００２６】
優性なネガティブミュータント型TRXの過剰発現は、NGFによるCRE介在c-fos 誘発をブロックした。TRXは、DNA結合(Hirota et al., 1997) (Ueno et al., 1999) 又はコ−アクチベータ相互作用(Ema et al., 1999)を促進することにより各種の転写因子を制御することが報告された。それゆえ、本発明者はTRXがCREを介したNGF-介在活性化の調節に関与するかについて分析した。４時間の処理後、NGFはpGL3-c-fos (-99, +42)中でルシフェラーゼ活性の４０倍の増大を生じさせたが、pGL3-c-fos (-40, +42)は増大しなかった（図６Ａ）。レポーター遺伝子であるpGL3-c-fos (-99,+42)のNGFに対する応答は,TRXの優性なネガティブミュータントのトランスフェクションにより著しく抑制された。トランス活性化はミュータントTRXにより７５％抑制された（図６Ｂ）
・考察
本研究において、本発明者はNGFがPC12細胞において、タンパク質及びmRNAレベルでTRX発現を誘導することを見出した。本発明者は、ルシフェラーゼアッセイによりTRX遺伝子の−263〜−217 bp に位置するNGF応答領域を同定した。この領域は、CRE をコンセンサスする類似物を保有するCGTCA配列を含んでいた(Montminy et al., 1986)。さらに、本発明者はERK 阻害剤であるPD98059がNGF-誘発TRX発現を抑制することを示した。NGF-誘発CRE活性化は細胞外シグナリング調節蛋白質キナーゼ(ERK) (Impey et al., 1998)により介在される。これらの結果は、TRX遺伝子がERK及びCREカスケードを通してNGFにより誘導されることを示す。さらなる研究が、NGFによるTRX遺伝子誘発メカニズムの分析について進行中である。
【００２７】
本発明者はまた、NGFがPMA (Hirota et al., 1997), UV (Ueno et al., 1999)及びへミン(Kim et al., 2001)と同様にTRXの核移動を誘発することを実証した。本発明者は、ERK阻害剤であるPD98059がNGFのこの効果をブロックすることを示し、この結果はERKがTRXのNGF-誘発核移動の調節に関与することを示唆する。該核移動のメカニズム及び生理学的重要性はさらに詳細に研究されるべきである。TRXのNGF-誘発発現及び核移動はPC12細胞のNGF-誘発分化に関連するようであり、なぜならPD98059及びNACは各々NGF-誘発分化及びTRX発現だけでなく核移動を抑制するからである（図３及び４）。より重要なことには、優勢なネガティブミュータントTRXの過剰発現は、分化をほぼ完全に阻害した（図５）。これらの結果は、TRXがNGFにより誘発されるPC12の分化に必要であることを示す。
【００２８】
c-fosのような遺伝子はNGFの作用に要求されると考えられた。c-fos遺伝子の上流制御領域において、CREは神経分化を誘発する各種の細胞外刺激に応答するc-fos転写の調節に決定的に重要である(Ahn et al., 1998) (Sheng et al., 1988)。本発明者は、TRXの優勢なネガティブミュータント型の過剰発現がCREを含むpGL3-c-fos (-99, +42)レポーター遺伝子のNGF-誘発活性化ブロックするが、pGL3-c-fos (-40, +42)はブロックしないことを示した。これらの結果は、TRXがc-fos発現をもたらすCREを介したNGFシグナリングに必要であることを実証する。TRXはJun/Fos (AP-1)を含むDNA-結合タンパク質の活性を調節し、核内還元分子であるレドックスファクター１(Ref-1) と相互作用する(Hirota et al., 1997)。AP-1及びRef-1は分化に関与することが報告された(Sheng and Greenberg, 1990) (Chiarini et al., 2000)。最近、本発明者は、TRX及びRef-1が転写因子とコアクチベータ間の相互作用を調節すること(Ema et al., 1999)、及びCREBの活性化がTRXにより調節されることを報告した(Hirota et al., 2000)。従って、TRXはCREBのDNA又はコアクチベータとの相互作用を増大させ、NGFシグナリングを促進するかもしれない。さらなる研究は、NGFシグナリング経路におけるTRXの関連メカニズムに必要である。
【００２９】
NGFは、軸索再生を促進することが示された(Hollowell et al., 1990)。Endohらはコリン作動性ニューロンについてのTRXの神経栄養活性を報告した (Endoh et al., 1993)。本結果は、この知見を確認及び発展させ、TRXがニューロンの分化及び再生についてのNGFの効果を増強する神経栄養性コファクターであることを示唆する
NGFはまた、ニューロン生存因子としても働く。NGFは軸索切断した中隔ニューロンの死を予防することが示された(Pallage et al., 1986)。NGFがなくなるとPC12細胞のアポトーシスを生じ、これはp38 MAPK及びアポトーシスシグナリングキナーゼ1 (ASK1)により媒介される (Xia et al., 1995; Kummer et al., 1997; Kanamoto et al., 2000)。TRXはASK1及びp38 MAPKの内因性阻害剤として働くことが報告され(Saitoh et al., 1998; Hashimoto et al., 1999)、NGFの消失はまたPC 12 細胞におけるTRX発現のダウンレギュレーションを生じる(Bai, et al. unpublished observations)。これらの結果は、NGFによるTRXレベルの維持はニューロン死を予防する役割を果たすことを実証する。TRXの神経損傷に対する保護的役割が示された。TRXは虚血後の星状膠細胞で誘導される(Tomimoto et al., 1993)。トランスジェニックマウスにおけるTRXの過剰発現は、病巣の脳虚血障害(Takagi et al., 1999)及び興奮毒性海馬損傷(Takagi et al., 2000)を軽減する。アルツハイマー病患者の脳におけるTRXの減少した発現が報告されている(Lovell et al., 2000)。NGF投与は、アルツハイマー病患者のコリン作動性ニューロンを維持するために提案された(Serrano Sanchez et al., 2001)。これらの結果及び本発明の結果を総合すると、TRXの投与が神経変性疾患のような神経疾患におけるNGFの効果を増強し得ることを示す。神経変性疾患に対するTRXの治療的可能性を明らかにするためのさらなる研究が進行中である。
実施例２（網膜視細胞についてのデータ）
動物
４週齢の雄BALB/c mice (albino) を日本SLC (静岡,日本),から入手し、実験前の２〜５日間本発明者のコロニールームで飼育した。日本ＳＬＣと本発明者の実験室における光強度は300 luxであり、実験室のケージ内の光強度は20−40 luxであった。すべてのマウスを12時間 (8:00 A.M.から8:00 P.M.) の明／暗サイクルにおいて、日本ＳＬＣ及び本発明者のコロニールームで維持した。
光照射
４週齢のマウスを実験前２４時間暗所に置いた。瞳孔を1% 塩酸シクロペントレート点眼剤(参天製薬)で拡張した。麻酔していないマウスを8,000 luxの発散する冷白色蛍光(松下電器産業) に２時間反射インテリア（reflective interior）を備えたケージ中でさらした。すべての光照射は午前１０時に開始した。光照射中の温度は２５±１．５℃に維持した。照射中、両目が.同程度に照射を受けるように特別の配慮をした。
網膜組織切片の調製
ペントバルビタールによる腹腔内注射により深い麻酔を誘導後、マウスをリン酸緩衝生理食塩水(PBS) (pH, 7.4)を用いて左心室を灌流して 固定前に血液を洗い流した。次いで、PBS中0.25%グルタルアルデヒドを含む新たに調製した4%パラホルムアルデヒドで灌流した。次いで、目を取り除いた。すべての組織を既述のものと同じ固定剤で１２時間４℃でパラフィン中に埋入して固定し、視神経円板を含む全網膜を有する１μｍの矢状切片に切断した。7-0 絹縫合糸を目の側頭側のランドマークとしておいた。組織切片をスライドガラス上に集め、３０分間キシレン及び分量を変えた一連のアルコールで処理し、切片のパラフィンを除去した。
形態計測
視神経円板を含む網膜パラフィン切片(1 μm)をヘマトキシリン−エオジン(H-E)で染色し、各切片の４つの位置のデジタル化カラー画像をPDMC le デジタル画像システム（オリンパス）を用いて得た。２つの画像を視神経円板上部100 〜800 μmの上部網膜から、及び２つを視神経円板下部100 〜800 μmの下部網膜から得た。各画像のヘマトキシリン陽性の光受容体細胞核の数をカウントし、ワン−ウェイ（one-way） ANOVA 、次いでBonfferoni/Dunn post hocテストにより比較した。
【００３０】
TdT-介在dUTP ニック末端標識(TUNEL)
TUNELを、in situアポトーシス検出キット（宝酒造）を用い、1-μmパラフィン切片上で行った。3',3'-ジアミノベンゼン(Dako, Carpinteria, CA)を発色剤として使用した。TUNEL-陽性核の数を上記のヘマトキシリン陽性細胞カウントについて使用されたのと同様な方法によりカウントした。
抗体
ウサギ 抗マウスTRX 抗体(ポリクローナル)を既報のように調製した19。
マウス及びヒトTRXの免疫組織化学
マウスTRXの免疫組織化学分析のために、本発明者はイムノペルオキシダーゼ法19を使用した。簡潔に述べると、内因性ペルオキシダーゼ活性を0.6% H2O2で不活性化した。一次抗体又はコントロール正常ウサギ血清を加え、４℃で終夜インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(Biomeda, Foster
City, CA)を二次抗体として使用した。アビジン−ビオチン増幅(Biomeda)を行い、次いで基質である0.1% 3',3'-diaminobenzidine (Dako)でインキュベートした。
マウスTRXのウェスタンブロット
網膜サンプル調製法及びウェスタンブロット法は、既報のように行った15。簡潔に述べると、ペントバルビタールの腹腔内注射により深い麻酔に誘導後、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS) (pH, 7.4)を用いてマウスの左心室を灌流して 固定前に血液を洗い流し、次いで目を除去した。角膜及びレンズを目から取り除き、網膜の内層（網膜神経(neural retina)）を顕微鏡下にアイカップから分離した。氷冷PBSでの灌流後の目において、光受容体細胞層と網膜色素上皮細胞層の間の接着は弱くなり、それらは容易に分離された。網膜神経(neural retina)除去後のアイカップは、網膜色素上皮細胞フラクションとして分析した。従って、このフラクションは脈絡膜及び強膜を含んでいた。等量の網膜タンパク質(5 μg protein/lane)を12%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次いで電気泳動的にポリビニリデンジフルオライド (PVDF)膜(Millipore, Bedford, MA)に移した。ブロッキング後、膜を最初の抗体とインキュベートし、次いでペルオキシダーゼ連結第二抗体とインキュベートした。化学ルミネセンスをECLウェスタンブロット検出キット(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)で検出した。
組換えチオレドキシン(rTRX) の硝子体内注入
５μgのrTRXまたはミュータントrTRX (TRXC32S/C35S)20又は3 μlの0.9%NaClを光照射の２時間前に硝子体内注入した。rTRXを10-μl マイクロインジェクションシリンジを備えた30-G 微細使い捨て針(Hamilton, Reno, NV)を用いて右目の側頭縁から硝子体内注入した。
チロシンリン酸化タンパク質の検出
チロシンリン酸化タンパク質はECL チロシンリン酸化検出システム(RPN 2220/1, Amersham Pharmacia Biotech)を用いて検出した。製造業者の推奨に従い、網膜神経(neural retina)のタンパク質サンプルを調製し、12% SDS-ポリアクリルアミドゲル(10 μg タンパク質/レーン)上で電気泳動し、次いで電気泳動的にPVDF膜に移した。ブロッキング後、膜をペルオキシダーゼ連結抗ホスホチロシン抗体(PY-20, Amersham Pharmacia Biotech) とインキュベートし、次いで化学ルミネセンスをECLウェスタンブロット検出キットで検出した。
酸化タンパク質の検出
酸化タンパク質は、酸化タンパク質検出キット(OxyBlot, Intergen, Purchase, NY)を用いて既報のように検出した１７。OxyBlotはカルボニル基の感受性免疫検出試薬を提供する。製造業者のプロトコールに従い、網膜神経の2,4-ジニトロフェニル(DNP)-ヒドラゾン誘導体化タンパク質サンプルを調製し、12% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(5 μg タンパク質/レーン)で分離し、次いでPVDF膜に移した。ブロッキング後、膜をタンパク質のDNP部分に特異的な一次抗体とインキュベートした。タンパク質バンドをマウスTRXに関するウェスタンブロットと同じ方法で検出した。
DNA ラダー
ヌクレオソーム間DNA切断をQuick Apoptotic DNA ladder Detection Kit (MBL, 名古屋,日本)を用いて検出した。製造業者のプロトコールに従い、網膜DNAを抽出し、1% アガロースゲルにロードして電気泳動した。ゲルをエチジウムブロミドで染色し、DNAバンドを紫外線トランスルミネーターで可視化した。
統計的分析
全ての統計的分析は、StatView ソフトウェア、 バージョン5.0 (SAS, Cary, NC).を用いるマッキントッシュのパーソナルコンピュータ上で行った。
結果
網膜における内因性TRXの発現
網膜損傷の重篤度を決定するために、網膜切片中のトータル及びTUNEL-陽性 光受容体核(図７)を光照射の前、直後、光照射後12, 24, 48及び96時間でカウントした。光照射されていないマウスの光受容体細胞数と比較して(平均± SD; 248.5 ± 11.4 細胞/ 100μm)、該数は光照射の２４時間後(182.0 ± 10.7, P < 0.05)及びその後(178.3 ± 18.3 細胞/ 100μm, P < 0.01 及び 50.0 ± 9.8 細胞/ 100μm, P < 0.01 、各々48時間及び96時間)に有意に減少した。TUNEL-陽性核は光照射の１２時間後に観察され(平均±SD; 8.7 ± 2.2 %)、そして光照射の96時間後まで維持された (44.2 ± 6.9 %, 34.5 ± 2.4 %, 及び38.0 ± 11.7 % 各々24, 48, 及び96 時間において)。.
TRXは様々な酸化ストレスに応答してアップレギュレーションされるので、本発明者は免疫組織化学(図８Ａ)及びウェスタンブロット(図８Ｂ、Ｃ)による光酸化ストレスに網膜が応答する間のTRX発現を分析した。光照射の直後、TRXの核標識が網膜後極の核内層及び核外層において観察された; 標識は虹彩直後の網膜周辺においては有意ではない。核内層中のTRX標識は光照射の24時間後及びそれ以降に消失した。一方、核外層の標識は96時間まで維持された。光照射の２４時間後、強力なTRX標識が後極の網膜色素上皮(RPE)で観察され、それは光照射後９６時間まで維持された。標識は分析された時間経過を通じ、周辺網膜のRPEにおいて有意ではなかった。TRXのウェスタンブロットの結果は、TRXのアップレギュレーションが網膜神経及びRPEフラクションにおいて光照射の12時間後及び24時間後で示された(図８Ｂ及びＣ)。光照射の12時間後及び24時間後で、光照射前の網膜神経及びRPEフラクションの両方においてクマッシーブルー染色されたゲル中の顕著なバンドの変化はなかった（データは示さない）。
ｒTRX注射マウスの網膜サンプルにおける酸化及びチロシンリン酸化されたタンパク質の検出
本発明者は、rTRX, ビヒクル又はミュータントrTRX を硝子体内のキャビティに光照射前に注入したマウスの光照射後の酸化ストレスを評価するために、タンパク質の酸化及びチロシンリン酸化を分析した。
【００３１】
ビヒクル又はミュータントrTRXマウスにおいて、網膜神経中の酸化されたタンパク質量は光照射直後に増大した(図９Ａ)。ビヒクル又はミュータントrTRX処理マウスと比較して、酸化されたタンパク質の量は、rTRX-処理マウスで減少した。光を照射しないマウス由来の網膜標本では、チロシンリン酸化された２本の強い強度のバンド及び３本の弱いバンドが検出された(図９Ｂ)。光照射の直後、強い強度の２つのバンドのうちの１つが増強され、弱い強度の追加の１つのバンドがビヒクル又はミュータントrTRX処理マウスで検出された。ビヒクル又はミュータントrTRX処理マウスと比較して、これらのバンドの増強はrTRX-処理マウスでより顕著ではなかった。
光酸化ストレスに対するrTRXの細胞保護効果
本発明者は、次いで網膜損傷に対するrTRX投与の効果を調べた。rTRX, ビヒクルまたはミュータントrTRXのいずれかを硝子体内のキャビティに光照射前に注入し、生存する光受容体細胞核をこれらの目の間で比較(図１０Ａ，Ｂ)。光照射の９６時間後、光受容体細胞核の数は. ビヒクル(P<0.001)またはミュータント rTRX-処理の目(P<0.001)よりもrTRX-処理の目で有意に高かった。ヌクレオソーム間のDNAラダーはrTRX-, ビヒクル-またはミュータントrTRX-処理の目由来の網膜サンプルで評価した。光照射の３６時間後、DNAラダーはビヒクル-及びミュータントrTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルでは検出されたが、rTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルでは検出されなかった（データは示さない）。
【００３２】
光照射の９６時間後、DNAラダーはビヒクル及びミュータント rTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルで検出された。これに対し、rTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルでは減少した(図１０Ｃ)。
考察
光照射は光受容体核の有意な損失の原因となる（図７）。TUNEL-陽性光受容体細胞核(図７)及びDNAラダー形成(図１０Ｃ)は光照射後の網膜で観察されるので、本発明者の現在のデータはアポトーシスが光受容体細胞の細胞死の主要な経路であり、このことは以前の文献10と一致する。免疫組織化学法によると、TRXは網膜神経及びRPEの両方において、光照射後にアップレギュレートされ、虹彩のごく近傍の網膜周辺（peripheral retina）ではアップレギュレートされなかった(図８Ａ)。ウェスタンブロッティングにおいて、TRXは網膜神経及びRPEフラクションの両方においてアップレギュレートされた(図８Ｂ及び８Ｃ)。これらを合わせると、本発明の結果はTRXが光誘導性の内因性分子であり、TRX が光による網膜神経の再生において重要な役割を果たしていることを示す。タンパク質酸化はフリーラジカル産生により生じ、srcファミリーキナーゼ、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ及びマイトージェン活性化蛋白質キナーゼを含むチロシンキナーゼが酸化ストレスにより活性化される12,22,23。本研究は、酸化及びチロシンリン酸化タンパク質の両方の光照射後の網膜神経における増強がrTRX-処理マウスで減少するが,ミュータント rTRX-処理マウスでは減少せず(図９Ａ，Ｂ),このことはrTRXの硝子体内投与が網膜における光酸化ストレスによる網膜神経の損傷を減少し、その保存された活性部位におけるシステイン残基が光酸化ストレスの減少に重要な役割を担うことを示唆する。
【００３３】
ビヒクル処理されたマウスと比較すると、光受容体細胞核及びDNAラダー形成の減少は、rTRX-処理マウスにおいて有意に除外され、一方、その効果はミュータントTRX-処理マウスで消失した(図１０)。この結果は、TRXが網膜光障害において抗アポトーシス効果を有し、その保存活性部位におけるシステイン残基がこの細胞保護に重要な役割を担うことを示唆する。以前の研究は、外因性rTRXの虚血／再灌流障害の肺16、網膜18及び血管内皮障害24に対する細胞保護効果を示唆する。外因性rTRXが網膜光受容体のダメージを改善するメカニズムは知られていない細胞外空間及び細胞膜における光酸化により誘導される活性酸素種はTRX依存性ペルオキシダーゼ25又は一重項酸素又はヒドロキシラジカルに対するTRXの直接消去作用26により減少される可能性がある。他の可能性は外因性TRXが細胞膜に結合し、細胞内空間に取り込まれることである。
【００３４】
以前に、アスコルビン酸27、ジメチルチオウレア28,29及びWR-779138の様な抗酸化剤に対する細胞保護効果が示された。本発明の結果は、網膜光障害に対する抗酸化剤の役割をさらに強調するものである。さらに、チオレドキシンはレドックスレギュレーター、転写因子の調節機能及びストレスシグナリングキナーゼとしての作用を発揮し得12,13、これらの作用メカニズムは網膜光ストレスに対するチオレドキシンの細胞保護効果に重要であるかもしれない。
【００３５】
過剰な光はヒトの加齢に関係する黄斑変性及びおそらく網膜色素変性のいくつかの形態1,2の進行及び重篤度を増強し得る。眼科のプラクティスにおいて使用される顕微鏡の操作に由来する広いスペクトル光のハザードは光黄斑症の原因となり得る3,4。本発明は外因性TRX投与により網膜光障害保護の可能性を実証した。さらに本発明は、内因性TRXの誘導が網膜光障害に対する増大した耐性と関連することを示唆する。本発明者は、プロスタグランジンE130,31及びゲラニルゲラニルアセトン32が細胞又は組織において効果的に内因性TRXを誘導することを示した。これらのTRX誘導剤を用いたTRX増強は、ヒトの光酸化ストレス関連網膜疾患の保護のための有用な治療的戦略になり得る
実施例２に関するReferences
1.     Cruickshanks KJ, Klein R, Klein BE. Sunlight and age-related macular degeneration. The Beaver Dam Eye Study. Arch Ophthalmol. 1993;111(4):514-518.
2.     Cideciyan AV, Hood DC, Huang Y, et al. Disease sequence from mutant rhodopsin allele to rod and cone photoreceptor degeneration in man. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(12):7103-7108.
3.     Byrnes GA, Chang B, Loose I, Miller SA, Benson WE. Prospective incidence of photic maculopathy after cataract surgery. Am J Ophthalmol. 1995;119(2):231-232.
4.     Minckler D. Retinal light damage and eye surgery. Ophthalmology. 1995;102(12):1741-2.
5.     Wiegand RD, Giusto NM, Rapp LM, Anderson RE. Evidence for rod outer segment lipid peroxidation following constant illumination of the rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1983;24(10):1433-1435.
6.     Penn JS, Naash MI, Anderson RE. Effect of light history on retinal antioxidants and light damage susceptibility in the rat. Exp Eye Res. 1987;44(6):779-788.
7.     Organisciak DT, Wang HM, Xie A, Reeves DS, Donoso LA. Intense-light mediated changes in rat rod outer segment lipids and proteins. Prog Clin Biol Res. 1989;314:493-512.
8.     Reme CE, Braschler UF, Roberts J, Dillon J. Light damage in the rat retina: effect of a radioprotective agent (WR-77913) on acute rod outer segment disk disruptions. Photochem Photobiol. 1991;54(1):137-142.
9.     De La Paz MA, Zhang J, Fridovich I. Antioxidant enzymes of the human retina: effect of age on enzyme activity of macula and periphery. Curr Eye Res. 1996;15(3):273-278.
10.    Hafezi F, Steinbach JP, Marti A, et al. The absence of c-fos prevents light-induced apoptotic cell death of photoreceptors in retinal degeneration in vivo. Nat Med. 1997;3(3):346-349.
11.    Holmgren A. Thioredoxin. Annu Rev Biochem. 1985;54:237-271.
12.    Saitoh M, Nishitoh H, Fujii M, et al. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal- regulating kinase (ASK) 1. Embo J. 1998;17(9):2596-2606.
13.    Hirota K, Murata M, Sachi Y, et al. Distinct roles of thioredoxin in the cytoplasm and in the nucleus. A two-step mechanism of redox regulation of transcription factor NF- kappaB. J Biol Chem. 1999;274(39):27891-27897.
14.    Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation of cellular activation. Annu Rev Immunol. 1997;15:351-369.
15.    Ohira A, Honda O, Gauntt CD, et al. Oxidative stress induces adult T cell leukemia derived factor/thioredoxin in the rat retina. Lab Invest. 1994;70(2):279-285.
16.    Okubo K, Kosaka S, Isowa N, et al. Amelioration of ischemia-reperfusion injury by human thioredoxin in rabbit lung. J Thorac Cardiovasc Surg. 1997;113(1):1-9.
17.    Takagi Y, Mitsui A, Nishiyama A, et al. Overexpression of thioredoxin in transgenic mice attenuates focal ischemic brain damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(7):4131-4136.
18.    Shibuki H, Katai N, Kuroiwa S, Kurokawa T, Yodoi J, Yoshimura N. Protective effect of adult T-cell leukemia-derived factor on retinal ischemia-reperfusion injury in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;39(8):1470-1477.
19.    Takagi Y, Gon Y, Todaka T, et al. Expression of thioredoxin is enhanced in atherosclerotic plaques and during neointima formation in rat arteries. Lab Invest. 1998;78(8):957-966.
20.    Hirota K, Matsui M, Iwata S, Nishiyama A, Mori K, Yodoi J. AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3633-3638.
21.    Oliver CN, Starke-Reed PE, Stadtman ER, Liu GJ, Carney JM, Floyd RA. Oxidative damage to brain proteins, loss of glutamine synthetase activity, and production of free radicals during ischemia/reperfusion- induced injury to gerbil brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(13):5144-5147.
22.    Nakamura K, Hori T, Sato N, Sugie K, Kawakami T, Yodoi J. Redox regulation of a src family protein tyrosine kinase p56lck in T cells. Oncogene. 1993;8(11):3133-3139.
23.    Nakamura K, Hori T, Yodoi J. Alternative binding of p56lck and phosphatidylinositol 3-kinase in T cells by sulfhydryl oxidation: implication of aberrant signaling due to oxidative stress in T lymphocytes. Mol Immunol. 1996;33(10):855-865.
24.    Nakamura H, Matsuda M, Furuke K, et al. Adult T cell leukemia-derived factor/human thioredoxin protects endothelial F-2 cell injury caused by activated neutrophils or hydrogen peroxide [published erratum appears in Immunol Lett 1994 Oct;42(3):213]. Immunol Lett. 1994;42(1-2):75-80.
25.    Chae HZ, Chung SJ, Rhee SG. Thioredoxin-dependent peroxide reductase from yeast. J Biol Chem. 1994;269(44):27670-27678.
26.     Das KC, Das CK. Thioredoxin, a singlet oxygenquencher and hydroxyl redical scavenger: redox independent functions. Biochem Biophys Res Commun.2000; 277(2): 443-447.
27.     Organisciak DT, Wang HM, Li ZY, et al. The protective effect of ascorbate in retinal light damage of rats. Invest Ophthalmol Vis Sci 1985;26(11): 1580-1588.
28.     Lam S, Tso MO, Gurne DH. Amelioration of retinal photic injury in albino rats by dimethylthiourea. Arch Ophthalmol 1990; 108(12): 1751-1757.
29.     Organisciak DT, Darrow RM, Jiang YI, et al. Protection by dimethylthiourea against retinal light damage in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci 1992; 33(5): 1599-1609.
30.    Yamamoto M, Ohira A, Honda O, et al. Analysis of localization of adult T-cell leukemia-derived factor in the transient ischemic rat retina after treatment with OP-1206 alpha-CD, a prostaglandin E1 analogue. J Histochem Cytochem. 1997;45(1):63-70.
31.    Yamamoto M, Sato N, Tajima H, et al. Induction of human thioredoxin in cultured human retinal pigment epithelial cells through cyclic AMP-dependent pathway; involvement in the cytoprotective activity of prostaglandin E1. Exp Eye Res. 1997;65(5):645-652.
32.    Hirota K, Nakamura H, Arai T, et al. Geranylgeranylacetone enhances expression of thioredoxin and suppresses ethanol-induced cytotoxicity in cultured hepatocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2000;275(3):825-830.
実施例３
ＰＣ１２細胞を１０％ウシ血清（ＨＳ）及び５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。細胞を５％ＣＯ2下の湿潤雰囲気で３７℃でインキュベートした。０，０．３，１ｍＭ ＭＰＰ+（１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）とともに３時間インキュベーション後、ＰＣ１２細胞を回収し、細胞ライゼートを調製した。ＴＲＸ発現をＰＣ１２細胞中ウェスタンブロットにより検出した。簡潔に述べると、細胞ライゼートは９５℃で５分間維持し、次に１２％ドデシル硫酸アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動し（５μｇ／レーン）、次にトランスファーメンブラン（Millipore, Bedford, MA）に移した。０．５％Tween２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５％スキムミルクでブロッキング後、該メンブランを１時間、ラットＴＲＸと交叉反応する抗マウスＴＲＸ抗体（Y.Takagi et al. J.Cereb.Blood Flow Metab. 18(1998) pp.206-214）とインキュベートした。次いで、該メンブランをペルオキシダーゼ−複合化抗ウサギイムノグロブリン抗体とインキュベートした。結合したペルオキシダーゼを製造業者の仕様書に従い化学発光(ECLTM（RPN2106, Amersham Pharmacia Biotech）ウェスタンブロット検出キット)で促進した。各サンプルにおけるＴＲＸ量をコンピュータ化されたデンシトメータ、ＮＩＨイメージを用いて各バンドの密度を分析することにより評価した。ＭＰＰ+処理条件下、ＴＲＸ発現はＰＣ１２細胞で減少した（図１１）。類似の実験を３回行った。
【００３６】
次に、本発明者は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによりＰＣ１２細胞の生存度に関するＭＰＰ+の効果を詳細に検討した。損傷細胞から放出されたＬＤＨは細胞培養物のアリコートで測定された。残存する細胞性ＬＤＨをPBS中０．２％Tween２０で細胞を溶解することにより得た。細胞培養物又は細胞ライゼートの５０μｌサンプル中のＬＤＨは、製造業者の方法に従いＬＤＨアッセイキット(kyokuto, Tokyo)を用いて測定した。細胞溶解パーセントを（培地中のＬＤＨ／ウェル当たりの総ＬＤＨ）のＬＤＨ比として測定した。ここで、総ＬＤＨは培地＋細胞ライゼートのＬＤＨを指す。ＭＰＰ+とともに培養すると、細胞生存度は用量依存的に減少した（図１２）。類似の実験を３回繰り返した。
【００３７】
ＴＲＸの過剰発現がＭＰＰ+誘発損傷からのＰＣ１２細胞を保護するかどうかを測定するために、ＰＣ１２細胞（１×１０7／ｍｌ）１０％ＨＳ及び５％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地で終夜培養した。細胞を組織ディッシュから機械的に脱着させ、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、次いで細胞を10μｇのpBI-EGFP-wtTRXと混合した。pBI-EGFP-wtTRXは、pBI-EGFPコントロールベクター（Clontech）にTRX cDNA断片(Y.Tagaya et al. EMBO J. 8 (1989), pp.757-764)を連結することにより構築した。その後、細胞を５分間氷上でインキュベートし、適当な単回電気パルスにさらした。一時的なＴＲＸ過剰発現及び組換えヒトＴＲＸの投与は、ＰＣ１２細胞がＭＰＰ+と２４時間インキュベートしたときのＭＰＰ+誘発損傷を抑制した（図１３Ａ、Ｂ）。
【００３８】
上記の結果は、ＴＲＸが神経細胞の保護効果を有し、それによりＭＰＰ+の損傷誘発作用を抑制したことを示す。
実施例４
チオレドキシントランスジェニック(trx-tg)マウスは、β−アクチンプロモーターの制御下にヒトＴＲＸトランスジーンを保有し、脳を含む全身でヒトＴＲＸを発現するC57BL/6マウス（野生型）である（Takagi Y. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96(1999) 4131-4136）。本発明者は、ヒトＴＲＸがtrx-tgの網膜全体で発現されていることを確認した（図１４Ａ、Ｂ）。網膜サンプルの調製法、免疫組織化学、及びウェスタンブロッティングは、既述のように行った（Takagi Y. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96(1999) 4131-4136; Ohira A. et al., Lab. Invest., 70 (1994) 279-285）。従って、本発明者は、trx-tgマウスが強い光で誘発される網膜損傷により抵抗性であるかについて評価した。本研究の全ての方法は、Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに関するARVOステートメントに従った。
【００３９】
第１に、本発明者は、抗マウスＴＲＸ抗体を用いたウェスタンブロッティングによりtrx-tg及び野生型マウスの網膜への光曝露の前後における内因性マウスＴＲＸを分析した（Takagi Y. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96(1999) 4131-4136; Ohira A. et al., Lab. Invest., 70 (1994) 279-285）。光曝露前、３−４週齢の雄マウスを暗所で４８時間順応させ、その瞳孔を０．５％トロピカミド及び０．５％塩酸フェニレフリン点眼剤（参天製薬）を用いて拡張させた。麻酔していないマウスを、２時間反射型インテリアを備えたケージ中で8000 luxの拡散性の昼白色蛍光線（松下電器産業）に曝した(Wenzel A. et al., J. Neurosci., 20 (2000) 81-88)。照明中、眼が同レベルの光を受けるように注意した。光曝露前、trx-tgマウスの網膜における内因性マウスＴＲＸの発現を野生型マウスのものと比較できた。光曝露の全２４時間後、内因性マウスＴＲＸの２倍のアップレギュレーションがtrx-tg及び野生型マウスの両方において観察され、そこでは両方のマウスにおいて顕著な相違はなかった（データは示さない）。trx-tgマウスの各組織におけるヒトＴＲＸタンパク質の量は内因性マウスＴＲＸタンパク質より３−６倍大きいことが報告されている（Takagi Y. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96(1999) 4131-4136）。さらに、β−アクチンプロモーターの活性は内因性マウスＴＲＸプロモーターの活性と比較して十分高いと考えられる。結果として、網膜における全ＴＲＸタンパク質の量は、光曝露の前後において野生型マウスよりもtrx-tgマウスにおいて相当多いと考えられる。
【００４０】
次に、本発明者は、trx-tg及び野生型マウスの光曝露後の酸化ストレスを評価するためにタンパク質の酸化及びチロシンリン酸化を分析した。酸化されたタンパク質は、既述のように（Takagi Y. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96(1999) 4131-4136）酸化タンパク質検出キット(OxyBlot, Intergen, Purchase, NY)を用いて検出した。該キットはカルボニル基の敏感な免疫検出のための試薬を提供する。製造業者のプロトコールに従い、2,4-ジニトロフェニル（DNP）ヒドラゾン誘導体化網膜タンパク質サンプルを調製し、12%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（10μｇタンパク質／レーン）で分離し、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜に移した。ブロッキング後、膜をタンパク質のDNP部分に特異的な１次抗体とインキュベートした。次いで、タンパク質バンドをヒトＴＲＸと同じウェスタンブロッティング法により検出した。チロシンリン酸化タンパク質をECLチロシンリン酸化検出システム(RPN 2220/l, Amersham Biosciences)を用いて検出した。製造業者の推奨に従い、網膜タンパク質サンプルを調製し、12%SDSポリアクリルアミドゲル（10μｇタンパク質／レーン）で電気泳動し、次に電気泳動的にPVDF膜に移した。ブロッキング後、膜をペルオキシダーゼ連結抗ホスホチロシン抗体(PY-20, Amersham Biosciences)とインキュベートし、化学発光をECLウェスタンブロット検出キットで検出した。野生型マウスにおいて、網膜神経における酸化蛋白量は光曝露前と比較して光曝露直後に増大した（図１５Ａ、レーン２）。野生型マウスと比較して、酸化蛋白量はtrx-tgマウスで減少した（図１５Ａ、レーン４）。野生型マウスの網膜標本において、チロシンリン酸化タンパク質の３つの強いバンド（矢印）が光曝露前に検出された（図１５Ｂ、レーン１）。光曝露直後、これらのバンドは増強され、少なくとも２つの追加のバンド（矢頭）が検出された（図１５Ｂ、レーン２）。野生型マウスと比較して、これらのバンドの増大はtrx-tgマウスではあまり顕著ではなかった（図１５Ｂ、レーン４）。タンパク質酸化はフリーラジカル産生の結果であり（Oliver C.N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87(1990) 5144-5147）、srcファミリーキナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼを含むチロシンキナーゼが酸化ストレスにより活性化される（Nakamura K. et al., Mol. Immunol., 33(1996) 855-865; Saitoh, M. et al., EMBO J., 17(1998) 2596-2606）。従って、この結果は、ＴＲＸの過剰発現が網膜における光酸化ストレスを減少させることを示す。
【００４１】
強力な光は視細胞のDNA損傷を引き起こす(Organisciak D.T. et al., Photochem Photobiol., 70 (1999) 261-268)。光誘発DNA損傷に対する過剰発現されたＴＲＸの細胞保護効果を評価するために、本発明者は、8-ヒドロキシ-2-デオキシグアノシンについての定量的免疫組織化学（8OhdG指数）を用いた。パラフィン処理網膜サンプルの調製法、アルカリホスファターゼ法を用いた8OhdGのための免疫組織化学及び8OhdG免疫染色の定量法は、既知である（Ohira A., et al., Lab. Invest., 70(1994) 279-285; Toyokuni S. et al., Lab. Invest., 76(1997) 365-374）。抗8OhdGモノクローナル抗体をNOF Corporationから購入した。8OhdG指数を計算するために、各マウスの２つの位置（上部及び下部網膜、視神経円板から約１００μｍ）でのデジタル化されたカラー画像をデジタルイメージングシステム(PDMC le, オリンパス)を用いてPICTファイルとして得、マッキントッシュパーソナルコンピュータ上のNational Institutes of Health image version 1.61ソフトウェアを用いて分析した。光曝露前マウス系統間での視細胞の核（外顆粒層）における8OhdG指数の有意な差異はなかった（図１６Ｂ、−２ｈ）。光曝露の１２時間後及び２４時間後、8OhdG指数はtrx-tgマウスよりも野生型マウスで有意に高かった（各々、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０１）（図１６Ｂ、１２ｈ及び２４ｈ）。野生型マウスにおいて、強い染色が光曝露２４時間後で維持された（図１６Ａ、左パネル）。一方、trx-tgマウスの外顆粒層の染色は光曝露２４時間後に減少した（図１６Ａ、右パネル）。主要なDNA塩基改変産物である8OhdGはヒドロキシラジカル、一重項酸素、または光動力作用のいずれかにより誘導され、酸化的ストレス誘発DNA損傷の確立したマーカーである（Toyokuni S. et al., Lab. Invest., 76(1997) 365-374）。従って、この結果は、過剰発現したＴＲＸが光酸化ストレスにより生じる視細胞のDNA損傷を防止することを示す。
【００４２】
網膜電図記録法(ERG)は、視細胞により生じる作用電位（ａ−波）及びMullerグリア細胞と相互作用する内顆粒層の二次ニューロンにより生じる作用電位（ｂ−波）の記録である。従って、ａ−およびｂ−波の振幅はこれらの最初の２つの網膜ニューロンの機能的状態を反映する。網膜機能に関する過剰発現したＴＲＸでの効果をテストするために、本発明者は、両方のマウス系統間でａ−波及びｂ−波を比較した。フラッシュＥＲＧはPE-3000（Tomey, Nagoya）を用いて記録した。金のコンタクトレンズ電極（直径3mm、1.5-mmベースカーブ、京都コンタクトレンズ）を左目上に置き、同一の参照電極を口内に、外側電極を左脚パッド上に置いた。光曝露前、ａ−波およびｂ−波の振幅はこれらの系統間で異ならなかった（図１７，−２ｈ）。光曝露後、ａ−波およびｂ−波の振幅は、６時間（各々、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）及び１２時間（各々、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）で、野生型マウスと比較してtrx-tgマウスで有意に高かった（図１７，６ｈ及び１２ｈ）。従って、この結果は、過剰発現したＴＲＸが光損傷を受けた網膜神経を再生することを示す。
参考文献
Ahn S, Olive M, Aggarwal S, Krylov D, Ginty DD, Vinson C (1998) A dominant-negative inhibitor of CREB reveals that it is a general mediator of stimulus-dependent transcription of c-fos. Mol Cell Biol 18:967-977.
Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JP (1995) A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A 92:7297-7301.
Chen RH, Sarnecki C, Blenis J (1992) Nuclear localization and regulation of erk- and rsk-encoded protein kinases. Mol Cell Biol 12:915-927.
Chiarini LB, Freitas FG, Petrs-Silva H, Linden R (2000) Evidence that the bifunctional redox factor / AP endonuclease Ref-1 is an anti-apoptotic protein associated with differentiation in the developing retina. Cell Death Differ 7:272-281.
Connor B, Dragunow M (1998) The role of neuronal growth factors in neurodegenerative disorders of the human brain. Brain Res Rev 27:1-39.
Ema M, Hirota K, Mimura J, Abe H, Yodoi J, Sogawa K, Poellinger L, Fujii-Kuriyama Y (1999) Molecular mechanisms of transcription activation by HLF and HIF1alpha in response to hypoxia: their stabilization and redox signal-induced interaction with CBP/p300. EMBO J 18:1905-1914.
Endoh M, Kunishita T, Tabira T (1993) Thioredoxin from activated macrophages as a trophic factor for central cholinergic neurons in vitro. Biochem Biophys Res Commun 192:760-765.
Ginty DD, Bonni A, Greenberg ME (1994) Nerve growth factor activates a Ras-dependent protein kinase that stimulates c-fos transcription viaphosphorylation of CREB. Cell 77:713-725.
Greene LA, Tischler AS (1976) Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A 73:2424-2428.
Hashimoto S, Matsumoto K, Gon Y, Furuichi S, Maruoka S, Takeshita I, Hirota K, Yodoi J, Horie T (1999) Thioredoxin negatively regulates p38 MAP kinase activation and IL-6 production by tumor necrosis factor-alpha. Biochem Biophys Res Commun 258:443-447.
Hirota K, Matsui M, Iwata S, Nishiyama A, Mori K, Yodoi J (1997) AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1. Proc Natl Acad Sci U S A 94:3633-3638.
Hirota K, Matsui M, Murata M, Takashima Y, Cheng FS, Itoh T, Fukuda K, Yodoi J (2000) Nucleoredoxin, glutaredoxin, and thioredoxin differentially regulate NF-kappaB, AP-1, and CREB activation in HEK293 cells. Biochem
Biophys Res Commun 274:177-182.
Hollowell JP, Villadiego A, Rich KM (1990) Sciatic nerve regeneration across gaps within silicone chambers: long-term effects of NGF and consideration of
axonal branching. Exp Neurol 110:45-51.Holmgren A (1985) Thioredoxin. Annu Rev Biochem 54:237-271. Hori K, Katayama M, Sato N, Ishii K, Waga S, Yodoi J (1994) Neuroprotection by glial cells through adult T cell leukemia-derived factor/human thioredoxin (ADF/TRX). Brain Res 652:304-310.
Impey S, Obrietan K, Wong ST, Poser S, Yano S, Wayman G, Deloulme JC, Chan G, Storm DR (1998) Cross talk between ERK and PKA is required for Ca2+ stimulation of CREB-dependent transcription and ERK nuclear translocation. Neuron 21:869-883.
Kamata H, Tanaka C, Yagisawa H, Matsuda S, Gotoh Y, Nishida E, Hirata H (1996) Suppression of nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 cells. N-acetylcysteine uncouples the signal transduction from ras to the mitogen-activated protein kinase cascade. J Biol Chem 271:33018-33025.
Kanamoto T, Mota M, Takeda K, Rubin LL, Miyazono K, Ichijo H, Bazenet CE (2000) Role of apoptosis signal-regulating kinase in regulation of the c-Jun N-terminal kinase pathway and apoptosis in sympathetic neurons. Mol Cell Biol 20:196-204.
Kane DJ, Sarafian TA, Anton R, Hahn H, Gralla EB, Valentine JS, Ord T, Bredesen DE (1993) Bcl-2 inhibition of neural death: decreased generation of reactive oxygen species. Science 262:1274-1277..Kaplan DR, Martin-Zanca D, Parada LF (1991) Tyrosine phosphorylation and tyrosine kinase activity of the trk proto-oncogene product induced by NGF. Nature 350:158-160.
Kim YC, Masutani H, Yamaguchi Y, Itoh K, Yamamoto M, Yodoi J (2001) Hemin-induced activation of the thioredoxin gene by Nrf2. A differential regulation of the antioxidant responsive element by a switch of its binding factors. J Biol Chem 276:18399-18406.
Kummer JL, Rao PK, Heidenreich KA (1997) Apoptosis induced by withdrawal of trophic factors is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase.
J Biol
Chem 272:20490-20494.
Lo DC (1992) Signal transduction and regulation of neurotrophins. Curr Opin Neurobiol 2:336-340.
Lovell MA, Xie C, Gabbita SP, Markesbery WR (2000) Decreased thioredoxin and increased thioredoxin reductase levels in Alzheimer's disease brain. Free Radic Biol Med 28:418-427.
Mansur K, Iwahashi Y, Kiryu-Seo S, Su Q, Namikawa K, Yodoi J, Kiyama H (1998) Up-regulation of thioredoxin expression in motor neurons after nerve injury. Brain Res Mol Brain Res 62:86-91.
Maruyama T, Kitaoka Y, Sachi Y, Nakanoin K, Hirota K, Shiozawa T, Yoshimura Y, Fujii S, Yodoi J (1997) Thioredoxin expression in the human endometrium during the menstrual cycle. Mol Hum Reprod 3:989-993.
Masutani H, Magnaghi-Jaulin L, Ait-Si-Ali S, Groisman R, Robin P, Harel-Bellan A.(1997) Activation of the c-fos SRE through SAP-1a. Oncogene 15:1661-1669.
Masutani H, Ueno M, Ueda S and Yodoi J (1999) in Antioxidant and redox regulation of genes (Sen, C.K., Sies, H., Baeuerle, P.A.,eds), pp.297-311, Academic Press, San Diego
Milbrandt J (1986) Nerve growth factor rapidly induces c-fos mRNA in PC12 Rat pheochromocytoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 83:4789-4793.
Montminy MR, Sevarino KA, Wagner JA, Mandel G, Goodman RH (1986) Identification of a cyclic-AMP-responsive element within the rat somatostatin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 83:6682-6686.
Nakamura H, Matsuda M, Furuke K, Kitaoka Y, Iwata S, Toda K, Inamoto T, Yamaoka Y, Ozawa K, Yodoi J (1994) Adult T cell leukemia-derived factor/human thioredoxin protects endothelial F-2 cell injury caused by activated neutrophils or hydrogen peroxide. Immunol Lett 42:75-80.
Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J (1997) Redox regulation of cellular activation. Annu Rev Immunol 15:351-369.
Nishiyama A, Matsui M, Iwata S, Hirota K, Masutani H, Nakamura H, Takagi Y, Sono H, Gon Y, Yodoi J (1999) Identification of thioredoxin-binding protein-2/ vitamin D(3) up-regulated protein 1 as a negative regulator of thioredoxin function and expression. J Biol Chem 274:21645-21650.
Pallage V, Toniolo G, Will B, Hefti F (1986) Long-term effects of nerve growth factor and neural transplants on behavior of rats with medial septal lesions. Brain Res 386:197-208.
Saitoh M, Nishitoh H, Fujii M, Takeda K, Tobiume K, Sawada Y, Kawabata M, Miyazono K, Ichijo H (1998) Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. EMBO J 17:2596-2606.
Serrano Sanchez T, Robinson Agramonte Md M, Lorigados Pedre L, Diaz Armesto I, Gonzalez Fraguela ME, Dorta-Contreras AJ (2001) Endogenous nerve growth factor in patients with Alzheimer s disease. Rev Neurol 32:825-828.
Sheng M, Dougan ST, McFadden G, Greenberg ME (1988) Calcium and growth factor pathways of c-fos transcriptional activation require distinct upstream regulatory sequences. Mol Cell Biol 8:2787-2796.
Sheng M, Greenberg ME (1990) The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system. Neuron 4:477-485.
Tagaya Y, Maeda Y, Mitsui A, Kondo N, Matsui H, Hamuro J, Brown N, Arai K, Yokota T, Wakasugi H, Yodoi J. (1989) ATL-derived factor (ADF), an IL-2 receptor/Tac inducer homologous to thioredoxin; possible involvement of dithiol-reduction in the IL-2 receptor induction. EMBO J 8:757-764.
Takagi Y, Horikawa F, Nozaki K, Sugino T, Hashimoto N, Yodoi J (1998a) Expression and distribution of redox regulatory protein, thioredoxin during transient focal brain ischemia in the rat. Neurosci Lett 251:25-28..Takagi Y, Tokime T, Nozaki K, Gon Y, Kikuchi H, Yodoi J (1998b) Redox control of neuronal damage during brain ischemia after middle cerebral artery occlusion in the rat: immunohistochemical and hybridization studies of thioredoxin. J Cereb Blood Flow Metab 18:206-214.
Takagi Y, Gon Y, Todaka T, Nozaki K, Nishiyama A, Sono H, Hashimoto N, Kikuchi H, Yodoi J (1998c) Expression of thioredoxin is enhanced in atherosclerotic plaques and during neointima formation in rat arteries. Lab Invest 78:957-966.
Takagi Y, Mitsui A, Nishiyama A, Nozaki K, Sono H, Gon Y, Hashimoto N, Yodoi J (1999) Overexpression of thioredoxin in transgenic mice attenuates focal ischemic brain damage. Proc Natl Acad Sci U S A 96:4131-4136Takagi Y, Hattori I, Nozaki K, Mitsui A, Ishikawa M, Hashimoto N, Yodoi J (2000) Excitotoxic hippocampal injury is attenuated in thioredoxin transgenic mice. J Cereb Blood Flow Metab 20:829-833.
Taniguchi Y, Taniguchi-Ueda Y, Mori K, Yodoi J (1996) A novel promoter sequence is involved in the oxidative stress-induced expression of the adult T-cell leukemia-derived factor (ADF)/human thioredoxin (Trx) gene. Nucleic Acids Res 24:2746-2752.
Thomas SM, DeMarco M, D'Arcangelo G, Halegoua S, Brugge JS (1992) Ras is essential for nerve growth factor- and phorbol ester-induced tyrosine phosphorylation of MAP kinases. Cell 68:1031-1040..Tomimoto H, Akiguchi I, Wakita H, Kimura J, Hori K, Yodoi J (1993) Astroglial expression of ATL-derived factor, a human thioredoxin homologue, in the gerbil brain after transient global ischemia. Brain Res 625:1-8.
Treisman R (1986) Identification of a protein-binding site that mediates transcriptional response of the c-fos gene to serum factors. Cell 46:567-574.
Trouche D, Grigoriev M, Lenormand JL, Robin P, Leibovitch SA, Sassone-Corsi P, Harel-Bellan A (1993) Repression of c-fos promoter by MyoD on muscle cell differentiation. Nature 363:79-82.
Ueno M, Masutani H, Arai RJ, Yamauchi A, Hirota K, Sakai T, Inamoto T, Yamaoka Y, Yodoi J, Nikaido T (1999) Thioredoxin-dependent redox regulation of p53-mediated p21 activation. J Biol Chem 274:35809-35815.
Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, Davis RJ, Greenberg ME (1995) Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science 270:1326-1331.
Yamamoto M, Sato N, Tajima H, Furuke K, Ohira A, Honda Y, Yodoi J (1997) Induction of human thioredoxin in cultured human retinal pigment. Exp Eye Res 65:645-652.
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】NGF誘発TRX発現。
図１Ａは、NGFにより生じるTRXタンパク質の増加を示す。NGF (50 ng/ml) で24時間及び48時間処理されたPC12細胞を収穫し、ウェスタンブロッティングにかけて検出した。
【図１Ｂ】NGF誘発TRX発現。
図１Ｂは、NGFにより誘発されたTRX mRNAの増大した発現を示す。NGF処理されたPC12細胞は、示された各時間で収穫され、次いでノーザンブロッティングにより分析した。
【図１Ｃ】NGF誘発TRX発現。
図１Ｃは、NGFによるTRX遺伝子の活性化である。PC12細胞はpTRX-Luc ベクターpTRX (−1148)とpRL-TKでトランスフェクトされ、次いでNGFの存在下又は非存在下に処理された。
【図２】TRXプロモータ中でNGFに応答する領域の同定
PC12細胞は、左パネルに示されるようにpTRX-LucベクターとpRL-TKでトランスフェクトされ、示された値は未処理細胞に対するNGF(50 ng/ml)-処理細胞のルシフェラーゼ活性の比を示す。この結果は、３つの独立した実験の代表例である。
【図３Ａ】PD98059またはNACによるTRX発現の抑制。
図３Ａは、PD98059またはNACによるPC12の分化の遮断を示す。PC12細胞はNGF (50 ng/ml)の存在下又は非存在下で２日間培養し、次いでPD98059 (50 mM)またはNAC (20 mM)の存在下にNGF (50 ng/ml)と培養した。
【図３Ｂ】PD98059またはNACによるTRX発現の抑制。
図３Ｂは、PD98059またはNACの添加によるNGF-誘発トランス活性化の阻害である。PC12細胞はpTRX (−263)-LucベクターとpRL-TKでトランスフェクトされ、次いでNGF(50 ng/ml)及びPD98059(50 mM)またはNAC (20 mM)で処理された。示された値は、NGF 50 (ng/ml)及びPD98059またはNACで処理された細胞の未処理細胞に対するルシフェラーゼ活性の比である。該結果は、３つの独立した実験の代表例である。
【図３Ｃ】PD98059またはNACによるTRX発現の抑制。
図３Ｃは、PD98059またはNACによるTRXタンパク質発現の抑制を示す。 PC12細胞は図３Ａと同様に処理され、タンパク質サンプルは分画され、抗−TRX抗体でスクリーニングされた。
【図４】NGF-誘発TRX核移動の抑制
図４（Ａ）は、ＮＧＦなしで培養したPC12細胞を示し、図４（Ｂ）はNGFで処理したPC12細胞を示し、図４（Ｃ）及び図４（Ｄ）は、NGF及びPD98059（図４Ｃ）またはNAC （図４Ｄ）で処理されたPC12細胞を示す。
これらの細胞は、抗-TRX mAbで染色された。
【図５】ミュータントTRX過剰発現によるNGF誘発分化の阻害。
PC12細胞はpBI-EGFP, pBI-EGFP-wtTRXまたはpBI-EGFP-dmTRX (32S/35S)ベクターでトランスフェクトされ、次いでNGF 50 (ng/ml)で処理された。24時間後、これらの細胞をレーザー共焦点顕微鏡で調べた。
【図６Ａ】優性ネガティブミュータント型のTRXによるCRE-介在c-fos誘発の抑制。
図６Ａは、NGFがCREを通してc-fosを誘導することを示す。PC12細胞は、pRL-TK とともに上部パネルで示されたようにpGL3-c-fos (-40, +42)またはpGL3-c-fos (-99, +42)でトランスフェクトされ、次いでNGFで４時間処理された。示された値は未処理細胞に対するNGF処理細胞のルシフェラーゼ活性の比である。
【図６Ｂ】優性ネガティブミュータント型のTRXによるCRE-介在c-fos誘発の抑制。
図６Ｂは、NGFによるc-fosの活性化のミュータント型TRXによる抑制を示す。PC12細胞は、上部パネルに示されるように、pRL-TKとともに、pGL3-c-fos (-99, +42)及びpcDNA3 (1g)またはpcDNA3-TRX (32S/35S) (1g)ベクターで共トランスフェクトされた。トランスフェクトされたPC12細胞はNGFで４時間処理された。示された値は、未処理細胞に対するNGF処理細胞のルシフェラーゼ活性の比である。
【図７】光照射された網膜のH-E及びTUNEL染色。網膜標本における代表的なH-E及びTUNEL染色が示される。光受容体細胞核の有意な減少が24時間後及びその後に観察された。TUNEL-陽性細胞は12時間後及びその後に観察された（矢印）。INLは核内層であり、ONLは核外層である。
【図８】網膜サンプルのTRX発現についての免疫組織化学及びウェスタンブロット。TRXについての代表的免疫組織化学が(A)に示される。TRXの核標識は光照射直後に核内層 (INL) で観察されるが(短い矢) ,24時間後或いはその後に消失した。核外層(ONL)の核標識は、光照射直後に観察され（長い矢）96時間後まで維持された。免疫標識は光照射直後（０時間）では毛様体近傍の周辺網膜(peripheral retina) では顕著ではない。TRX標識は24時間後或いはその後にRPEで観察されるが（矢印）、網膜周辺では顕著ではない（白い矢印、12時間後及び24時間後）。網膜神経及びRPEフラクションにおけるTRXについての代表的なウェスタンブロット(B), 及びバンド強度の半定量的分析(C)が示される。光照射の12時間後及び24時間後のバンド強度は光照射されていないマウスのそれと比較した誘導倍率により表される。
【図９】ビヒクル, rTRX (5 μg)またはミュータント rTRX (5 μg)で硝子体内前処理された目からの網膜サンプルの酸化された(A)及びチロシン−リン酸化された(B)タンパク質の検出. (A)網膜神経においてる酸化されたタンパク質についての代表的ウェスタンブロットが示される。光照射前（第１レーン）及びビヒクル, rTRX及びミュータントrTRX処理された目(各々第２レーン、第３レーン及び第４レーン)である。(B) 網膜神経においてチロシンリン酸化タンパク質についての代表的なウェスタンブロットが示される。光照射前（第１レーン）及びビヒクル, rTRX及びミュータントrTRX処理された目(各々第２レーン、第３レーン及び第４レーン)である。強い強度の２つのバンド及び弱い強度の３つのバンド（矢印）が光照射前に検出された。光照射直後、強い強度を有する２つのバンドの１つ（上部矢印）が増強され、弱い強度を有する１つの追加的バンド（下部矢印）がビヒクル又はミュータントrTRX-処理マウスで検出された。
【図１０】組換えTRXの細胞保護効果。ビヒクル、rTRX (5 μg)またはミュータント rTRX (5 μg)で硝子体内前処理された目からの網膜サンプルの代表的H-E染色(A)及び光受容体核の数(B)が示される。光照射の96時間後 rTRX 処理された目の光受容体核の数(平均±SE, 101.3±5.1 細胞/ 100μm; n=6)はビヒクル- (63.3 ± 2.7 細胞/100μm; n=6)及びミュータント rTRX-処理された(51.4 ± 3.3 細胞/100μm; n=4) 目におけるよりも有意に大きい。P値はワン−ウェイANOVA 及びその後のBonferroni /Dunn post hocテストにより計算した。網膜サンプルにおける代表的なDNAラダー検出が(C)に示される。DNAラダー形成の分析は、ビヒクル、rTRXまたはミュータント rTRX処理された目での光曝露96時間後で検出した。ONLは核外層であり; n.s.,は統計的に有意差はないことである。
【図１１】ＭＰＰ+は、ＰＣ１２細胞中でのＴＲＸを減少する。３５ｍｍディッシュで終夜プレ培養されたＰＣ１２細胞（２×１０5／ｍｌ）は、０，０．３及び１ｍＭ ＭＰＰ+を含む培地中で３時間培養し、次いで細胞ライゼートを集めた。ＴＲＸはウェスタンブロッティングにより１２ｋＤａのバンドとして認識される。
【図１２】ＭＰＰ+は、ＰＣ１２細胞の生存度を減少する。ＰＣ１２細胞（２×１０4／ｍｌ）は、０，０．３及び１ｍＭ ＭＰＰ+とともに２４時間培養された。細胞溶解パーセントはＬＤＨ放出アッセイにより測定した。
【図１３】ＴＲＸ過剰発現及び組換えＴＲＸの投与はＭＰＰ+誘発損傷を抑制する。ＴＲＸ過剰発現の２４時間後、１ｍＭ  ＭＰＰ+を培地中に加え２４時間インキュベートした。細胞溶解パーセントはＬＤＨ放出アッセイにより測定した。
ＴＲＸ過剰発現ＰＣ１２細胞はＬＤＨ放出アッセイにより測定されるようにＭＰＰ+誘発損傷に抵抗性であった（図１３Ａ）。さらに、１００μｇ／ｍｌのｒＴＲＸの投与はまた、ＰＣ１２細胞がＭＰＰ+と２４時間インキュベートされたとき０．３及び１ｍＭ  ＭＰＰ+誘発損傷を抑制した。２つのアスタリスク（＊）は統計的に有意であることを示す（**Ｐ＜０．００１）
【図１４】代表的免疫組織化学（Ａ）；及び、野生型及びtrx-tgマウスの眼の網膜サンプルにおけるヒトＴＲＸ発現についてのウェスタンブロット（Ｂ）。ＧＬＣはガングリオン細胞層；ＩＮＬは内顆粒層；ＯＮＬは外顆粒層；及びＲＰＥは網膜色素上皮層であり、スケールバーは１００μｍである。
【図１５】野生型及びtrx-tgマウスの網膜神経における酸化された（Ａ）及びチロシンリン酸化された（Ｂ）タンパク質の代表的ウェスタンブロット。野生型及びtrx-tgマウスの光曝露前（−２ｈ）（各々レーン１及び３）、並びに野生型及びtrx-tgマウスの光曝露直後（０ｈ）（各々レーン２及び４）。
【図１６】視細胞顆粒層中の8OhdGの定量的免疫組織化学分析。
（Ａ）野生型マウス（左パネル）及びtrx-tgマウス（右パネル）の光曝露２４時間後の標本における8OhdGの代表的免疫組織化学分析を示す。ＯＮＬは外顆粒層；スケールバーは２０μｍである。
（Ｂ）8OhdG指数が要約される。各カラムは平均±ＳＥとして表される（各群でｎ＝５）。Ｐ値はMann-Whitney U-testにより計算した。
【図１７】ＥＲＧ。平均ａ−及びｂ−波振幅が要約される。各カラムは平均±ＳＥとして表される（各群でｎ＝５）。Ｐ値はMann-Whitney U-testにより計算した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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