(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における低酸素に対する転写応答を調節する化合物を同定するインビトロでの方法であって、該方法は、以下：
ＨＩＦ−１αのペプチド、またはＨＩＦ−１αのＴＡＤ−Ｃ領域を含むそのフラグメントを提供する工程；
該ＨＩＦ−１αのペプチドまたはそのフラグメントを、候補化合物と接触させる工程；
および
該候補化合物が、該ＨＩＦ−１αのペプチドとｐ３００/ＣＢＰのアミノ酸３０２〜４１８からなるペプチドとの相互作用に影響するか否かを決定する工程であって、該候補化合物の非存在下における細胞における低酸素に対する転写応答と比較した、該候補化合物の存在下における該細胞における低酸素に対する転写応答の増加または減少は、該候補化合物が低酸素に対する転写応答を調節することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
細胞における低酸素に対する転写応答を調節する化合物を同定するインビトロでの方法であって、該方法は、以下：
ＨＩＦ−１αのペプチド、またはＨＩＦ−１αのＴＡＤ−Ｃ領域を含むそのフラグメントを提供する工程；
ｐ３００/ＣＢＰのアミノ酸３０２〜４１８からなるペプチドを提供する工程、
該ＨＩＦ−１αのペプチドまたはそのフラグメントを、候補化合物と接触させる工程；ならびに
該候補化合物が、該ＨＩＦ−１αのペプチドと該ｐ３００/ＣＢＰのアミノ酸３０２〜４１８からなるペプチドとの相互作用に影響するか否かを決定する工程であって、該候補化合物の非存在下における細胞における低酸素に対する転写応答と比較した、該候補化合物の存在下における該細胞における低酸素に対する転写応答の増加または減少は、該候補化合物が低酸素に対する転写応答を調節することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記転写応答が、低酸素応答性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子の発現または内因性低酸素応答性遺伝子の発現である、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ＨＩＦ−１αのペプチドがＨＩＦ−１αのＴＡＤ−Ｃ領域を含む、方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ＨＩＦ−１αのフラグメントがＨＩＦ−１αのＴＡＤ−Ｃ領域からなる、方法。
【請求項６】
前記候補化合物がペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記候補化合物が低分子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法であって、前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、または青色蛍光タンパク質をコードする、方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法であって、前記内因性遺伝子が、血管内皮細胞増殖因子、エリスロポイエチン、ヘムオキシゲナーゼ、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、グルコーストランスポーター１、グルコーストランスポーター３、ヘキソキナーゼ、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＡ）、またはトランスフェリンをコードする、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府援助研究に関する声明）
本研究は、一部、米国政府の助成金によって補助された（米国国立衛生研究所の助成金番号ＣＡ１５７５１および５Ｋ０８ＣＡ７２９９３）。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、低酸素に対する転写応答を改変する化合物を同定するための方法に関する。
【０００３】
固形腫瘍が１つの悪性細胞から多細胞の塊に進化するにつれて、存在する血液供給の受動拡散能力が超越されるので腫瘍微小環境中の酸素分圧は低下する（Ｎｏｒｄｓｍａｒｋら、Ａｃｔａ．Ｏｎｃｏｌ．３３：３８３−３８９，１９９４；Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３．１７７−１８２，１９９７；Ａｄａｍら、Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  ２１：１４６−１５３，１９９９）。腫瘍低酸素は、多くの一般的な治療の効力を減少させ（Ｂｒｏｗｎ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ６：１５７−１６２，２０００）、脈管形成についての強力な刺激因子であり（Ｓｈｗｅｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８４３−８４５，１９９２）、そして腫瘍の進行（Ｚｈｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８３０−５８３５，１９９９；Ｈｏｃｋｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４５０９−４５１５，１９９６）および転移（Ｂｒｉｚｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９４１−９４３，１９９６）に関連する。慢性低酸素は、それらの正常組織の細胞から腫瘍細胞を区別するので（Ｚｈｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８３０−５８３５，１９９９）、低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）（Ｚｅｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１２：１２３９−１２４２，１９８６）および低酸素誘導性遺伝子治療プロトコル（Ｂｉｎｌｅｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１７２１−１７２７，１９９９；Ｓｈｉｂａｔａら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：４９３−４９８，２０００）下で選択的に活性化される薬物の設計により、この差異を活用しようとする治療ストラテジーが開発されている。
【０００４】
細胞性低酸素は、主にヘテロ二量体転写因子ＨＩＦ−１により媒介される多面的な適応応答を引き起こす（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５９０７−５９１７，１９９３；Ｍａｌｔｅｐｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４０３−４０７，１９９７）。酸素正常状態（ｎｏｒｍｏｘｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下では、αサブユニット（ＨＩＦ−１α）は、本質的に、ユビキチン−プロテオソームシステムによるその破壊に起因して検出不能である（Ｓａｌｃｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２：２２６４２−２２６４７，１９９７；Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２２５３−３２２５９，１９９６）。これは、一部には、フォン・ヒッペル−リンダウタンパク質によって標的化することによって達成される（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１．３２２５３−３２２５９，１９９６）。低酸素状態下では、なおその機構は不明確であるが、ＨＩＦ−１αは安定化され、そして蓄積する（Ｊｉａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｃ１１７２−１１８０，１９９６）。安定化されたＨＩＦ−１αは、その結合パートナーＡＲＮＴ（アリール炭化水素レセプター核トランスロケーター）（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２３０−１２３７，１９９５；Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７７７１−１７７７８，１９９６）（これは、いくつかのβＨＬＨ−ＰＡＳドメインタンパク質の共通結合パートナーである）と二量体化する。ヘテロ二量体は、ｐ３００／ＣＢＰ（Ａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２９６９−１２９７３，１９９６；Ｅｂｅｒｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８．４０８９−４０９６，１９９８；Ｋａｌｌｉｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６５７３−６５８６，１９９８；Ｃａｒｒｅｒｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４０２−４１５，２０００）およびＳＲＣ−１ファミリーコアクチベーター（Ｃａｒｒｅｒｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４０２−４１５，２０００）と相互作用し、同族低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）に結合し（Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７７７１−１７７７８，１９９６）、それによりＨＲＥ含有プロモーターおよびエンハンサーをトランスアクチベーションする。ＨＩＦ−１標的遺伝子の発現は、少なくとも一部には、嫌気性解糖を促進し、赤血球生成を容易にし、および血管拡張および脈管形成による血液送達を増大させることにより、細胞性ホメオスタシスを維持するように働く（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５：５５１−５７８，１９９９）。ヒト腫瘍形成においてＨＩＦ−Ｉ応答性経路が重要であることは、ＨＩＦ−１αが多発性ヒト癌において過剰発現されるという知見によって強調される（Ｚｈｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８３０−５８３５，１９９９）。
【０００５】
低酸素状態に対する適応は、腫瘍の進行において役割を果たすだけでなく、局所組織低酸素／無酸素の状態（例えば、心筋虚血および発作の病原）において重要である。ＨＩＦ経路はまた、特定の炎症状態（例えば、クローン病）において重要であることが示された。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、細胞（例えば、培養細胞または動物中の細胞）における低酸素に対する転写応答を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法において、細胞または細胞の細胞外環境は、候補化合物と接触される。次いで、この細胞は、低酸素状態に供され、そして低酸素状態に対するこの細胞の転写応答が評価される。この方法において、転写応答は、低酸素応答性プロモーター制御下でのレポーター遺伝子の発現または内因性低酸素応答性遺伝子の発現であり得る。レポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、または青色蛍光タンパク質（ｃｙａｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得る。内因性遺伝子は、例えば、血管内皮増殖因子、エリスロポイエチン、ヘムオキシゲナーゼ、ｉＮＯＳ、グルコーストランスポーター１、グルコーストランスポーター３、ヘキソキナーゼ、ＡＬＤＡ、またはトランスフェリンをコードし得る。細胞が曝露され得る低酸素状態は、低い酸素レベルへの曝露によってであり得るか、または化学的に（例えば、デフェロキサミンまたは塩化コバルトによって）誘導され得る。
【０００７】
本発明はまた、細胞における低酸素に対する転写応答を調節する化合物を同定する方法を提供する。本方法は、細胞における低酸素に対する転写応答に関与する第１の転写因子またはそのフラグメントを提供する工程；第１の転写因子またはそのフラグメントを候補化合物と接触させる工程；および候補化合物が第１の転写因子と第２の転写因子またはそのフラグメントとの相互作用に影響するか否かを決定する工程を包含する。
【０００８】
本発明において提供される別の方法は、細胞における低酸素に対する転写応答を改変する化合物を同定する方法である。この方法は、細胞における低酸素に対する転写応答に関与する第１の転写因子および第２の転写因子またはそれらのフラグメントを提供する工程；第１の転写因子および第２の転写因子またはそれらのフラグメントを、候補化合物と接触させる工程；および候補化合物が第１の転写因子および第２の転写因子の相互作用に影響するか否かを決定する工程を包含する。
【０００９】
すぐ上に記載の２つの方法のいずれかにおいて、第１の転写因子は、ＨＩＦ−１αのペプチド（例えば、ＴＡＤ−Ｃ領域）を含み得、そして第２の転写因子は、ｐ３００／ＣＢＰのペプチド（例えば、ＣＨ１領域、または特にｐ３００／ＣＢＰのアミノ酸３０２−４１８、アミノ酸３０２−４４３、またはアミノ酸３０２−５２８）を含み得る。両転写因子と共に、ペプチドは、上述の領域、またはこれらの領域を含むより大きなセグメント（例えば、タンパク質全体）を含み得る。
【００１０】
本発明はまた、患者における低酸素、局所組織における低酸素、またはＨＩＦ−１経路の活性化によって特徴付けられる状態を処置する方法を提供する。この方法は、患者に、患者における低酸素に対する転写応答を改変（減少または増加）する化合物を投与する工程を包含する。この応答を減少させる化合物の場合、本方法は、例えば、癌または低酸素応答経路によって媒介される異常な新生血管形成の炎症状態を処置するために用いられ得る。応答を増大させる化合物の場合、本方法は、例えば、心筋虚血、発作、またはエリスロポイエチン欠損を処置するために使用され得る。化合物は、例えば、ＨＩＦ−１αに結合し得る。本発明はまた、低酸素に関連した疾患（例えば、本明細書中に記載のような疾患）を処置するための医薬品の調製における、本発明に従って同定された化合物の使用を包含する。
【００１１】
本発明にはまた、患者における低酸素の組織、細胞、または腫瘍を検出する方法が含まれる。本方法は、患者における低酸素に対する転写応答を改変する、検出可能に標識された化合物（例えば、ＨＩＦ−１αに結合する化合物）を患者に投与する工程を包含する。
【００１２】
本発明は、いくつかの利点を提供する。例えば、本発明の方法を用いて同定された化合物は、低酸素によって特徴付けられた状態を予防または処置するための治療用分子として使用され得る。従って、（例えば、ＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰとの間の相互作用を破壊することにより）低酸素に対する転写応答を減少させることが見出された化合物は、癌を処置する方法において使用され得、腫瘍脈管形成、代謝性障害、および腫瘍細胞死の減少を生じ得る。（例えば、ＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰとの間の相互作用を増強することにより）低酸素に対する転写応答を増大させる化合物は、虚血性発作および心筋虚血のような状態を処置するために使用され得る。本発明にしたがって同定された化合物はまた、炎症状態（例えば、クローン病）ならびに（例えば、腎臓移植患者において見出されるような）エリスロポイエチン欠損を処置するために使用され得る。本発明はまた、高感度の画像化試薬および方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から明らかである。
【００１４】
（詳細な説明）
局所組織低酸素は、特定の腫瘍、心筋虚血、発作、特定の炎症プロセス、新生血管形成の状態、および特定の赤血球増加の状態を含む多くの異なる疾患状態と関連する。低酸素に対する多面な適応性応答は、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットの安定化および蓄積によって容易にされる。ＨＩＦ−１αは、その結合パートナーであるアリール炭化水素レセプター核トランスロケーター（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）（ＡＲＮＴ）、ならびにｐ３００／ＣＢＰ転写コアクチベーターと複合体を形成する。この複合体は、低酸素性状態に対して細胞性ホメオスタシスを維持するよう働く遺伝子の転写を誘導する。例えば、ＨＩＦ−１／ｐ３００／ＣＢＰ複合体は、赤血球形成を導くエリスロポイエチン；新脈管形成の初期メディエーターである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；血管拡張において役割を有するｉＮＯＳおよびヘムオキシゲナーゼ；ならびに嫌気性代謝において役割を有するグルコーストランスポーターおよび解糖系の酵素をコードする遺伝子のような、遺伝子の発現の誘導において役割を有する。
【００１５】
ＨＩＦ−１経路を減弱する扱いやすい方法は、これまでには記載されていない。本発明者らは、今回、ｐ３００／ＣＢＰとのＨＩＦ−１αの相互作用を干渉することによって、低酸素誘導性転写を崩壊する方法を同定した。特に、本発明者らは、ｐ３００／ＣＢＰのＣＨ１領域と相互作用するＨＩＦ−１αにおける領域を同定し、そしてこれらの領域の間の相互作用の崩壊が細胞における低酸素に対する転写応答をブロックし得ることを示した。本発明は、ＨＩＦ−１経路を干渉する試薬または化合物（例えば、低分子、ペプチド、タンパク質、アンチセンス分子、リボザイム、三重螺旋、および抗体またはそのフラグメント）を同定する方法を提供する。この崩壊は、例えば、酸素圧の減少、ＨＩＦ−１αの安定化および蓄積、ＡＲＮＴおよびｐ３００／ＣＢＰへのＨＩＦ−１αの結合、低酸素誘導性遺伝子の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）へのＨＩＦ−１α／ＡＲＮＴ／ｐ３００／ＣＢＰの結合、ならびにＨＩＦ−１α／ＡＲＮＴ／ｐ３００／ＣＢＰによるＨＲＥ関連遺伝子のトランスアクチベーションを細胞が感じ取って、この経路における任意の時点で生じ得る。この相互作用をブロックまたは崩壊する試薬は、低酸素誘導性遺伝子発現を防止する方法、従って、例えば、抗新生物治療法に使用され得る。このような試薬はまた、炎症性疾患（例えば、クローン病、網膜症および赤血球増加症）の処置に使用され得る。この相互作用を増強にする試薬は、例えば、虚血性発作または心筋虚血を処置する方法に使用され得る。
【００１６】
（例えば、低酸素に対する細胞性応答に関与するＨＩＦ−１α／ｐ３００／ＣＢＰ  ＣＨ１相互作用の崩壊を通じて）低酸素に対する転写応答を改変する試薬は、インビトロ方法、細胞ベースの方法、およびインビボ方法を含む多くの標準的な方法のいずれかを使用して同定され得る。特に興味あるのは、例えば、チップ上に含まれるライブラリーを利用する高スループットスクリーニング法である。このような方法は、当該分野において周知であり、そして本発明における使用に容易に適応され得る。
【００１７】
本発明において使用され得るスクリーニング法の特定の例は、以下である。例えば、融合タンパク質（例えば、ＨＩＦ−１αに結合する部分ｐ３００／ＣＢＰ（すなわち、ｐ３００／ＣＢＰ  ＣＨ１領域を含むペプチド（例えば、ｐ３００／ＣＢＰ  ３０２−４１８、ｐ３００／ＣＢＰ  ３０２−４４３、ｐ３００／ＣＢＰ  ３０２−５２８、または全長ｐ３００／ＣＢＰまでのアミノ酸３０２−４１８を含む任意のフラグメント；以下を参照のこと））を含むＧＳＴ融合タンパク質）が、細菌系において産生され得る。次いで、標識された（例えば、Ｓ35標識）インビトロ転写／翻訳ＨＩＦ−１αペプチド（例えば、ＴＡＤ−Ｃ、または全長ＨＩＦ−１αまでのＴＡＤ−Ｃを含むペプチドもしくはポリペプチド；以下を参照のこと）が、この融合タンパク質との結合についてアッセイされ得る。この方法の改変において、ＨＩＦ−１αペプチドは、融合タンパク質として作製され、そして標識ｐ３００／ＣＢＰ  ＣＨ１領域含有ペプチドの結合が測定される。本発明において使用され得るインビトロ結合アッセイのこのような例の詳細は、以下に提供される（以下の、実験結果ならびに材料および方法を参照のこと）。
【００１８】
本発明において使用され得るインビトロ方法のさらなる例は、ＥＬＩＳＡベースアッセイである。これにおいて、ＧＳＴ−ＣＨ１が細菌から発現されそして精製され、そしてＨＩＦポリペプチド（例えば、アミノ酸７８６−８２６を含有するＨＩＦペプチド）がビオチン化合成ペプチドとして合成される。ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジンコートしたプレート上へのビオチン化ＨＩＦペプチドの固定化によって構成される。次いで、候補化合物、引き続きＧＳＴ−ＣＨ１が添加される。洗浄後、結合したＧＳＴ−ＣＨ１の量が、酵素連結抗ＧＳＴ抗体の使用によってアッセイされる。このアッセイは、例えば、ＧＳＴ−ＣＨ１を固定化、ビオチン化ＨＩＦペプチドを添加し、そして酵素連結ストレプトアビジンとの結合を検出することによって変更され得る。ＣＨ１およびＨＩＦポリペプチドもまた、上記のアッセイにおいてそれらの役割を入れ替えられ得るか、または、他のエピトープ（例えば、ＨＡ、ｍｙｃ、またはＨＩＳ６）と代替的にタグ化され得、そして活性は、適切な抗体と連結された酵素によって測定され得る。さらに、低酸素誘導性転写の経路における異なる結合パートナーが、上記の方法において使用され得る。例えば、ＨＩＦ−１αおよびＡＲＮＴ、またはＨＩＦおよび低酸素誘導性遺伝子の低酸素応答性エレメントが、これらの方法における標的結合パートナーとして使用され得る。本発明において使用され得るさらなるインビトロ結合法は、当業者に公知である。これらの方法は、候補化合物の存在下および非存在下で実施され、そして結合の変化の検出は、本発明において低酸素に対する細胞性応答を調節するに有用であり得る化合物の同定についての読み取りとして使用され得る。上述のように、結合を崩壊または干渉することが見出される化合物は、低酸素性応答をブロックすることが所望される状態（例えば、新生物形成の疾患；上記を参照のこと）を処置するための候補であり、一方、結合を増加することが見出される化合物は、低酸素性応答を増強することが所望される状態（例えば、心筋虚血および発作）の処置のための候補である。さらに、ＨＩＦ−１はエリスロポイエチン産生の初期調節因子であるから、低酸素に対する転写応答を増加することが見出される化合物は、任意の病因のエリスロポイエチン欠損に関連する状態を有する患者（例えば、腎移植患者および貧血を有する患者）の処置における有用性を有し得る。
【００１９】
上記の方法のようなインビトロ方法に加えて、任意の多数の細胞ベースの方法が使用され、本発明に従う候補化合物を同定し得るかまたは特徴付け得る。例えば、細胞は、候補化合物の存在下または非存在下において低酸素状態に供され得、そして低酸素表現型における差異が検出され得る。例えば、低酸素誘導性遺伝子（例えば、ＶＥＧＦまたはエリスロポイエチン）の発現が、（例えば、ＲＮＡｓｅプロテクション、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲによって）測定され得るか、または、細胞死が測定され得る。あるいは、細胞は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、またはβガラクトシダーゼの遺伝子）および低酸素応答性プロモーター（例えば、エリスロポイエチンプロモーター）を含む構築物を用いてトランスフェクトされ得、そしてレポーター遺伝子の発現に対する化合物の効果が測定され得る。さらなる細胞ベースの方法は、当業者に公知であり、そしてこれらの方法の使用は本発明に含まれる。
【００２０】
例えば、細胞ベースのアッセイは、ＨＩＦ経路に沿った異なる点で作用する化合物を同定するために使用され得る。このようなアッセイは、低酸素応答性プロモーターまたはエンハンサーエレメント（例えば、ＶＥＧＦまたはエリスロポイエチン）の制御下で安定に組み込まれた低酸素誘導性レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、またはβガラクトシダーゼの遺伝子）を有する、細胞株の使用を含み得る。細胞は、マルチウェル形式にプレーティングされ、候補化合物が添加され、次いで、細胞を、真の低酸素（例えば、１％酸素）またはデフェロキサミンもしくはＣｏＣｌ2の添加のいずれかによって低酸素になし、人為的にＨＩＦ経路を活性化する。次いで、低酸素誘導性転写は、蛍光またはルシフェラーゼの活性によって読み取られ得る。この方法の変形において、同一の細胞において、第２の蛍光タンパク質またはレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼが、内部標準としての別のプロモーターの制御下で構成的に発現され得る。このことは、転写の非特異的抑制または非特異的な細胞毒性（これは、構成的なマーカーならびに低酸素応答性マーカーの減少した蛍光を生じる）についての制御を可能にする。また、この方法は、ｐ３００／ＨＩＦ−１αを標的化する化合物の同定の利点を有するが、また、この経路における他の点（ｎｏｄｅ）（例えば、ＡＲＮＴ／ＨＥＭＡ相互作用、ＨＩＦ−１／ＤＮＡ相互作用、およびＨＩＦ−１α安定化）を標的化する化合物を同定するために使用され得る。このアッセイはまた、低酸素経路を上方制御する化合物を同定し得た。このような化合物は、（例えば、冠状動脈疾患を処置するため、ＥＰＯ産生を増加するためなどの）プロ血管形成に関して有用性を有し得る。
【００２１】
任意の２つの特定の標的について、哺乳動物ツーハイブリッドベースのアッセイもまた使用され得る。例えば、黄色蛍光タンパク質に融合された１つのパートナー（例えば、ＹＦＰ−ＣＨ１）および青色蛍光タンパク質と融合された他のパートナー（例えば、ＣＦＰ−ＨＩＦ−１α）が、発現され得る。細胞は安定にトランスフェクトされ、これらの融合タンパク質を発現する。これらのタンパク質の相互作用は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）によってスコア付けされ得る。ＦＲＥＴの喪失を生じる化合物は、タンパク質−タンパク質相互作用を崩壊するとして同定される。あるいは、細胞は操作され、Ｇａｌ４−ＣＨ１、ＨＩＦ−ＶＰ１６およびＧａｌ４−ＧＦＰのレポーターを発現し得る。ＧＦＰシグナルの喪失は、Ｇａｌ４−ＣＨ１とＨＩＦ−ＶＰ１６との間の哺乳動物ツーハイブリッド相互作用を崩壊する化合物の同定を示し、異所性のＧａｌ４プロモーターのＧＦＰ発現の減少を生じる。異所性に発現したタンパク質に依存するこれらのアッセイは、低酸素状態を必ずしも必要としない。
【００２２】
細胞ベースのアッセイの別の例は、潜在的に毒性な遺伝子産物への低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）の連結（例えば、ＨＲＥ−ＴＫ）を含み、次いで、（真のかもしくは化学的に誘導された）低酸素状態下で（例えば、ガンシクロビルで）細胞毒性を妨げる化合物について選択する。このようなアッセイは、低酸素誘導性転写を阻害しそしてそれら自体およびそれらでは毒性ではない化合物について陽性とスコア付けする。
【００２３】
上記のアッセイの全ては、天然および合成化合物のライブラリーの高スループットスクリーニングとして構築され得る。例えば、チップ上に固定された化合物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）のライブラリーが、使用され得る。さらに、細胞ベースのアッセイは特に、低酸素応答を阻害するポリペプチドまたはタンパク質についてのスクリーニングに使用可能である。特に、ポリペプチド、アンチセンスＲＮＡ、またはランダムペプチドをコードする高力価／高度に複雑なレトロウイルスライブラリーが、構築されている。このようなレトロウイルスライブラリーを使用して、安定に組み込まれたＨＲＥ−レセプター細胞を感染し、そして蛍光活性な細胞の選別によって、低酸素応答性が変化した（例えば、減少したかまたは増加した（例えば、蛍光における変化によって選別されるように））細胞は、１００，０００分の１〜１，０００，０００分の１の頻度で探索され得る。組み込まれたレトロウイルスによってコードされる配列は、ＰＣＲを使用して挿入物をレスキューすることによって検出され得る。さらに、ＨＩＦ経路の成分、これらの成分のフラグメント（例えば、ＨＩＦポリペプチド（例えば、ＴＡＤ−Ｃ）、ｐ３００／ＣＢＰ（例えば、ＣＨ１）ならびにｐ３５ｓｒｊ、またはこれらの成分の複合体の結晶構造または溶液構造は、標準的なデータベースを使用して３次元構造を模倣する小分子の同定に使用され得る。
【００２４】
上記のようなインビトロ方法および細胞ベースの方法に加えて、インビボ方法が、本発明に従う化合物の同定または特徴付けするために使用され得る。インビボ方法の１例は、ヌードマウスへの異種移植を含む腫瘍移植モデルである。このような方法において、腫瘍細胞はヌードマウスに移植され、次いでヌードマウスは、候補化合物で処置されるかまたは未処置のままのいずれかである。候補化合物の効果は、例えば、腫瘍サイズの測定または死後の組織学的分析（例えば、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、新脈管形成および細胞死のレベルの分析）によって決定される。さらなる腫瘍モデルは、当該分野において公知であり、そして本発明の方法において使用され得る。化合物が所望の効果（例えば、腫瘍増殖または新血管形成の減少）を有するとして特徴付けられた場合、ヒト疾患のどの型がこの化合物を使用して処置され得るかを決定するために、癌の特定の型のモデルに対する効果について分析され得る。低酸素応答性転写を増強し、従って、心筋虚血または発作の処置についての候補化合物である化合物を同定または特徴付けするために、インビボ方法はまた、使用され得る。
【００２５】
さらなるインビボ方法において、腫瘍細胞は、ルシフェラーゼを発現するように操作され得、このような細胞は、マウスに移植され得、そしてルシフェラーゼ活性が、ルシフェリンの尾静脈注射後に生存動物において検出され得る。特に、高感度ＣＣＤカメラを利用して、光子が動物の皮膚を通して横断し得、そして光放射が、非侵襲性の方法で検出および定量され得る。これは、非致死性技術であるが、動物を長期的に追跡し得る。このような技術の延長として、本発明者らは、低酸素応答性エレメント（マルチマー化したＥｐｏエンハンサーＨＲＥ）によってルシフェラーゼが駆動される腫瘍細胞株を操作した。一旦、ヌードマウスに注射されると、腫瘍低酸素の量は、腫瘍の拡大として定量され得る。所定の腫瘍の体積で、低酸素誘導性ルシフェラーゼ活性の定量後、目的の化合物が注射され得る。次いで、腫瘍細胞における低酸素特異的レポーター活性が、この化合物での処置を継続しながら、同一の動物において連続的に追跡し得る。このように、インビトロでの低酸素誘導性転写を特異的に抑制する任意の化合物は、インタクトな動物においてインビボで低酸素誘導性転写を特異的に抑制する能力についてアッセイされ得る。全ての細胞においてＨＲＥ−ルシフェラーゼが組み込まれたトランスジェニックマウスが作製された。このような動物を使用して、本発明者らは、任意の「通常に」生じる局所組織低酸素に対する所定の化合物の効果（例えば、高酸素依存性組織（例えば、脳および腎臓）において基底の低酸素誘導性転写が存在するか否か、およびこの候補化合物がこの活性にどのように影響するか）を決定し得る。さらなる延長として、ＨＲＥ−レニラルシフェラーゼが組み込まれた腫瘍細胞株が使用され得る。このような腫瘍細胞株は、ＨＲＥ−ルシフェラーゼトランスジェニックマウスに移植され、その結果、腫瘍細胞低酸素および宿主動物低酸素は、別々に測定され得る。このような系は、腫瘍細胞低酸素誘導性転写は減少されるが通常の組織活性は減少されない治療指数を達成する化合物の用量を滴定するために使用され得る。
【００２６】
上記のスクリーニング法に加えて、ペプチド模倣物を調製するための標準法は、（例えば、ＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰとの間の相互作用を崩壊することによって）低酸素に対する転写応答が改変する分子を得るために実施され得る。例えば、ＨＩＦ−１αとＣＨ１との間の相互作用に影響する小分子モディファイアに加えて、ペプチド分子が同定され得る。例えば、ファージディスプレイは、ＣＨ１およびＨＩＦ−１αの結合ドメインのペプチドリガンドを最適化または同定するために使用され得る。これらの方法を使用して同定された化合物は、上記のインビトロ系、細胞ベース系およびインビボ系を使用して試験され得る。
【００２７】
ｐ３５ｓｒｊは、ＨＩＦ−１経路上でのネガティブ調節機能を有するタンパク質である（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３（１）：６４−７５、１９９９）。ｐ３５ｓｒｊは、ｐ３００／ＣＢＰへの結合によってこの経路を干渉し、そしてＨＩＦ−１α／ｐ３００  ＣＢＰ  ＣＨ１相互作用をブロックすることによってＨＩＦ−１トランスアクチベーションを阻害する。従って、ｐ３５ｓｒｊは、ＨＩＦ−１経路を干渉する模範のタンパク質として本発明において使用され得る。
【００２８】
本発明の方法を使用して同定された化合物は、処置の必要な患者（例えば、癌、上記に列挙された任意の他の疾患、または低酸素に関連する任意の他の疾患または状態を有する患者）に、例えば、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与および非経口投与による、標準形態投与のを使用して投与され得る。本発明の方法を使用して同定された化合物の適切な用量は、当業者によって容易に決定され得、そして例えば、１患者あたり０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。さらに、ペプチドベースの化合物は、遺伝子治療法を使用して投与され得る。
【００２９】
本発明の方法を使用して同定された化合物はまた、画像法に使用され得る。上記のように、ＨＩＦ−１αは酸素正常状態下で不安定であり、従って正常細胞は検出可能なレベルのＨＩＦ−１αを含まない。従って、本発明に従って、ＨＩＦ−１αに結合するとして同定された化合物は、癌細胞および腫瘍ならびに例えば、発作または心疾患から生じる虚血組織を検出するための高解像度画像法における使用のために標識され得る。
【００３０】
本発明の方法は、部分的には以下の実験結果に基く。
（実験結果）
ＨＩＦ−１αに対するｐ３００／ＣＢＰ結合のための詳細な構造的要件を、ｐ３００のＣＨ１ドメイン（このタンパク質の主要ＨＩＦ−１α相互作用ユニット）周辺を中心とする、一連のＧＳＴ融合欠失変異体を利用するインビトロアッセイによってマッピングした（Ａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２９６９−１２９７３，１９９６；Ｋａｌｌｉｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６５７３−６５８６，１９９８）。これらの変異体融合タンパク質を、全長のインビトロ翻訳したＨＩＦ−１αへの結合（亜鉛依存性プロセス）についてアッセイした（図１Ｂ）。最小のＨＩＦ−１α結合ドメインは、１１６残基（ｐ３００のアミノ酸３０２〜４１８）を含むことが示され、この１１６残基は、ＣＨ１ドメインおよびいくつかの隣接配列（図１Ａおよび１Ｃ）を含む。ＨＩＦ−１αの最小のｐ３００結合ドメインをマッピングするために、一連のＧａｌ４融合したＣ末端切断変異体を生成した。これらのＧａｌ４融合タンパク質をインビトロで翻訳し、そしてＧＳＴ−ＣＨ１（アミノ酸３０２〜４４３）に結合するそれらの能力について探査した。ＨＩＦ−１αのＣ末端４１残基（いわゆる、Ｃ末端トランスアクチベーション（ＴＡＤ−Ｃ）ドメイン（Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９２５３−１９２６０，１９９７））が、ＧＳＴ−ＣＨ１への結合に必要かつ十分であることが見い出された（図１Ａおよび１Ｄ）。
【００３１】
ＨＩＦ−１α／ＣＨ１結合のための要件をさらに研究するために、一連のＧＳＴ−ＣＨ１（アミノ酸３０２〜５２８）内部置換変異体を生成した。これらの一連の非重複変異体は、ｐ３００の残基３４１〜４２４にわたった。各変異体において、５残基を欠失させ、そして配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ（ＮＡＡＩＲＳ）を挿入した。このＮＡＡＩＲＳ配列は、α−らせんコンフォメーションまたはβ−鎖コンフォメーションをとり得るので（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：５２５５−５２５９，１９８５）、従って、欠失／挿入事象後の全体的なコンフォメーション破壊の可能性は減少される。ほぼ全ての置換が、全長ＨＩＦ−１αに対するＣＨ１結合を消失させ、これは、このＣＨ１ドメインが、ＨＩＦ−１αと相互作用するために、錯体の亜鉛が配位されるコンフォメーションをとらなければならないことを示唆する。
【００３２】
これらの最小結合ドメイン（ＴＡＤ−ＣまたはＣＨ１）に対応するポリペプチドの過剰産生は、低酸素誘導性レポーター活性の減弱を導いた（図２Ａ）。さらに、インビトロでインタクトな標的に結合した（図１Ｃおよび１Ｄ）これらのＴＡＤ−Ｃ変異体およびＣＨ１変異体のみが、インビボでの低酸素誘導性レポーター活性に対してドミナントネガティブな効果を有した（図２Ａ）。力価測定実験において、ＴＡＤ−Ｃポリペプチドが、ＣＨ１含有ドミナントネガティブポリペプチドであるというより、ＨＩＦ機能のより強力なサプレッサーであることが明らかにされた。これは、おそらく、その帰属されるＣＨ１のコンフォメーションの複雑性に起因する。従って、引き続く実験は、野生型ＴＡＤ−Ｃポリペプチド（ＨＩＦ−１αのアミノ酸７８６−８２６）の活性の、８残基切断変異体（ＨＩＦ−１αのアミノ酸７８６−８１８）の活性との比較に焦点をあてた。この変異体は、ＧＳＴ−ＣＨ１に結合することができず（図１Ｄ）、そして低酸素誘導性レポーター活性に対してドミナントネガティブな効果を発揮しなかった（図２Ａ）。
【００３３】
ＨＩＦ−１α媒介転写活性に対するその効果を比較すると、ＴＡＤ−Ｃポリペプチド過剰発現は、ｐ３００／ＣＢＰのＮ末端ドメイン（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：９９−−１０３，１９９６）、ＫＩＸドメイン（Ｏｌｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２９０３−２９１１，１９９６）およびグルタミンリッチドメイン（Ｙａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０６２６−１０６３１，１９９６）とそれぞれ相互作用する、ＲＡＲ、ＳＲＥＢＰ２およびＳＲＣ−１に対して効果を有さなかった（図２）。しかし、ＴＡＤ−Ｃポリペプチドの過剰発現は、ＳＴＡＴ２の転写活性を阻害した。このＳＴＡＴ２は、ＨＩＦ−１αと同様に、ＣＨ１を使用してその同時活性化を媒介する（Ａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２９６９−１２９７３，１９９６；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：３４４−３４７，１９９６）。これらの結果は、インタクトなＴＡＤ−Ｃポリペプチドが、他のｐ３００／ＣＢＰ機能に対して全体的な抑制効果を誘導することなく、ＣＨ１ドメインに結合しそして複数のタンパク質のＣＨ１ドメインへの接近をブロックすることを意味する。
【００３４】
関連するＴＡＤ−Ｃポリペプチドおよび変異体ポリペプチドの発現を容易にするために、ＶＳＶ−Ｇ偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レトロウイルスを、Ｇａｌ４キャリアタンパク質単独、あるいは野生型または変異体ＴＡＤ−Ｃポリペプチドのいずれかに融合されたＧａｌ４を発現するように操作した。ＨｅｐＧ２細胞に、これらのレトロウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）１０で感染させ、正常条件または低酸素条件のいずれかに曝露し、そしてＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルを、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイによって測定した。Ｇａｌ４ポリペプチドおよびＧａｌ４融合ポリペプチドの等価的発現を、この実験および関連する実験において正確に達成した（例えば、図３Ａ、挿入図を参照のこと）。上記のレポーターアッセイと一致して、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ量は、酸素正常（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下および低酸素条件下の両方において、野生型ＴＡＤ−Ｃポリペプチドを発現する細胞中で再現可能に減少されたが、変異体ＴＡＤ−Ｃポリペプチドを発現する細胞中では再現可能に減少されなかった（図２Ｃ）。低酸素条件下でのＨＩＦ−１αの全体量は、ＴＡＤ−Ｃの導入によって変化されなかった。
【００３５】
酸素正常条件下での細胞生存は、Ｇａｌ４単独あるいはＴＡＤ−Ｃポリペプチドまたは変異体ポリペプチドに融合されたＧａｌ４のいずれを発現するＨｅｐＧ２細胞においても、本質的に同じであった（図２Ｄ）。細胞増殖もまた、酸素正常条件下では影響されなかった。しかし、低酸素条件下では、野生型ＴＡＤ−Ｃポリペプチドを発現する細胞において、Ｇａｌ４単独または変異体ポリペプチドを融合したＧａｌ４を発現する細胞と比較して、細胞死が、わずかではあるが有意に増加された（図２Ｄ）。
【００３６】
これらの知見を広げるために、改変したヒト腫瘍細胞の増殖を、ヌードマウス異種移植片モデルにおいてアッセイした。腫瘍細胞を、等しいＭＯＩでレトロウイルス形質導入し、Ｇａｌ４あるいは野生型または変異体ＴＡＤ−Ｃポリペプチドに融合されたＧａｌ４の等価的発現を生じた（図３Ａ、挿入図）。腫瘍増殖は、野生型ＴＡＤ−Ｃポリペプチドを発現するＨＣＴ１１６細胞（図３Ａ）またはＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ細胞（図３Ｂ）において、Ｇａｌ４単独または変異体ポリペプチドに融合されたＧａｌ４を発現する同じ細胞と比較した場合に、有意かつ再現可能に減弱された（図３Ａおよび３Ｂ）。この効果は、ｐ５３状態に非依存的であった。なぜならＨＣＴ１１６細胞は、野生型ｐ５３を有し、一方、ＭＤＡ−ＭＤ４３５Ｓ細胞は、変異体ｐ５３を発現するからである。さらに、ｐ５３についてのイムノブロット分析は、これらの３つの異所性Ｇａｌ４ポリペプチドを発現するＨＣＴ１１６細胞において、ｐ５３量における差異を示さなかった（図３Ｃ）。
【００３７】
本発明者らは、ＴＡＤ−Ｃポリペプチド発現の抗腫瘍効果が、パラクリン効果（ＴＡＤ−Ｃを産生する細胞が、周辺の腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生成する）に起因したか否かを研究することに関心を有した。詳細には、Ｇａｌ４−ＴＡＤ−ＣポリペプチドまたはＧａｌ−４変異体ポリペプチドのいずれかを発現する腫瘍細胞を等しい数で混合し、その後、移植した。腫瘍を３週間の増殖後に摘出した場合に、変異体ポリペプチドを発現する細胞への強い偏りが存在した（図３Ｄ）。これは、ＴＡＤ−Ｃを発現する抗腫瘍効果が、トランス優性の抗腫瘍因子の生成から生じるパラクリン効果の結果ではなかったことを示唆する。
【００３８】
Ｇａｌ４融合ＴＡＤ−Ｃポリペプチドを発現するように操作した腫瘍細胞の注射部位の検死および組織学的試験は、たとえこれらの部位で大まかに測定可能な腫瘍が存在しなくても（図４Ｂ）、皮下組織に隣接する生存腫瘍細胞の小さな縁とともに、広い領域の中心壊死を明らかにした（図４Ａ）。Ｇａｌ４または変異体ポリペプチドに融合されたＧａｌ４を発現する細胞から生じるコントロール腫瘍は、小さい領域の壊死を明らかにしたが、広い領域の生存腫瘍（図４Ａ）が、非常に明白であった（図４Ｂ）。内皮細胞マーカー（ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ）に対する免疫染色は、ＴＡＤ−Ｃ発現腫瘍と比較した、コントロール腫瘍区域内の大量の毛細管形成を明らかにした（図４Ａ）。このことが、一次効果または二次効果のいずれであるか、すなわち、脈管密度の減少に起因して腫瘍細胞の数が少なくなったということか、またはその逆なのかは明らかではない。
【００３９】
いくつかの公知の転写因子が、ｐ３００のＣＨ１ドメインと相互作用し、そしてＴＡＤ−Ｃポリペプチド発現は、一般に、ＣＨ１機能を破壊するようなので（図２Ｂ）、本発明者らは、ＨＩＦ−１αの結合／機能の妨害が、ＴＡＤ−Ｃの抗腫瘍効果の重要な要素であるか否かを調べた。従って、ＨＩＦ−１α対立遺伝子を操作して、その酸素分解ドメインを欠失させ、そしてＴＡＤ−Ｃを、ＶＰ１６で置換して（ＨＩＶ−ＶＰ１６）、構成的に活性なＣＨ１非依存性ＨＩＦ−１α分子を作製した。最初に、ＨＣＴ１１６細胞を、ＶＰ１６単独またはＨＩＦ−ＶＰ１６のいずれかで形質導入した。選択後、これらの細胞を、野生型または変異体ＴＡＤ−Ｃポリペプチドに融合したＧａｌ４で形質導入した。非融合ＶＰ１６の同時発現によって、腫瘍増殖は、変異体ポリペプチドと比較して、ＴＡＤ−Ｃによって減弱された（図５Ｂ）。これは、上記で要約した結果と一致する。しかし、ＨＩＦ−ＶＰ１６の同時発現では、ＴＡＤ−Ｃポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを同時発現するいずれの細胞によっても、同じ腫瘍増殖が生じた（図５Ｂ）。イムノブロット分析によって、ＨＩＦ−ＶＰ１６の同時発現は、ＶＰ１６単独の同時発現と比較して、ＴＡＤ−Ｃポリペプチドまたは変異体ポリペプチドのいずれの発現に対しても効果を有さなかった。従って、他の効果に拘わらず、ＨＩＦ−１αのＣＨ１との相互作用の破壊は、ＴＡＤ−Ｃ媒介腫瘍増殖抑制において必要な事象である。
【００４０】
上記の実験結果は、以下の材料および方法を使用して得られた。
【００４１】
（材料および方法）
（プラスミドおよびレトロウイルス）  プラスミドを、標準技術を使用して生成し（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８））、そして配列決定によって確認した。全ての哺乳動物発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターを利用した。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングすることによって生成した。Ｇａｌ４融合タンパク質は、ｐＣＭＸ−Ｇａｌ４（Ｎ）（Ｒ．Ｅｖａｎｓ）中に作製した。ＧＳＴ−ＣＨ１（アミノ酸３０２〜５２８）のＮＡＡＩＲＳ変異誘発のスキャニングは、一本鎖変異誘発（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、製造業者の説明書に従って使用して行った。ｐＣＭＶ−ＣＨ１変異体は、ＰＣＲ産物をｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｎｕｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングすることによって構築した。チオレドキシン拘束発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡのＰＣＲフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングすることによって作製し、これは、以前の報告に類似する活性ループ内に新しい固有の制限部位を作製する（ＬａＶａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１８７−１９３、１９９３）。インビトロ翻訳に使用したＨＩＦ−１αプラスミド、Ｅｐｏ−ルシフェラーゼレポーター、Ｇａｌ４−ルシフェラーゼレポーター、ならびにｐＣＭＶ−ＬａｃＺ、Ｇａｌ４−ＳＲＣ１、Ｇａｌ４−ＳＲＥＢＰ２、Ｇａｌ４−ＲＡＲ、Ｇａｌ４−ＳＴＡＴ２およびＧａｌ４−ＨＩＦ１α発現ベクターは、以前に記載されている（Ａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２９６９−１２９７３，１９９６；Ｙａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０６２６−１０６３１，１９９６；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：３４４−３４７，１９９６；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：６４−７５，１９９９）。ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスは、ｐＭＭＰ中に構築し、そして２９３Ｔ細胞におけるｐＭＤ−ＭＬＶおよびｐＭＤ−Ｇ（Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ）との同時トランスフェクションによってパッケージングした。力価を、意図される標的細胞株の感染によって決定した。ＨＩＦ−ＶＰ１６レトロウイルスおよびＶＰ１６レトロウイルスは、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ中に構築し、そして上記のように、パッケージングおよび力価測定した。
【００４２】
（インビトロ翻訳およびインビトロタンパク質結合アッセイ）  示される場合を除いて、全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ製であった。インビトロ転写／翻訳（ＩＶＴ）は、ウサギ網状赤血球溶解物を結合したＴ３またはＴ７ポリメラーゼ（ＴＮＴ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って使用して、35Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ）の存在下で行った。ＧＳＴ融合タンパク質を、細菌中で産生し、そしてそこから精製し、そしてＩＶＴタンパク質の結合を以前に記載されるように行った（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：４０５−４１５，１９９８）。示される場合を除いて、結合および洗浄緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭ  ＺｎＣｌ2、２μＭ  ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ  ５０μｇ／ｍｌ、ペプスタチン  １μｇ／ｍｌ、ロイペプチン  １μｇ／ｍｌ、およびアプロチニン  １．９μｇ／ｍｌからなった。示される場合、重金属を、１０ｍＭの１，１０−フェナントロリン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む洗浄緩衝液の３回の交換によってキレート化した。重金属のキレート化後の亜鉛再構成は、超高純度塩化亜鉛（９９．９９９％を超える、Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用した。
【００４３】
（レポーターアッセイ）  ルシフェラーゼアッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイを、以前に記載されるように行った（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：６４−７５，１９９９）。全ての場合において、ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション効率および転写活性における全体的な変化についての内部コントロールとして、β−ガラクトシダーゼ活性に対して補正した。結果は、補正した相対的光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）として表す。各レポーター実験について、少なくとも２つの独立した実験を行った。
【００４４】
（低酸素）  低酸素を、１０％ＣＯ2および１％Ｏ2で維持したＣｅｌｌｓｔａｒ  ３気体インキュベーター（Ｈａｒｒｉｓ）において、３７℃の加湿環境下で、細胞をインキュベートすることによって達成した。正確なＯ2およびＣＯ2調節を、Ｆｒｙｒｉｔｅ気体分析器（Ｂａｃｈａｒａｃｈ）で定期的に確認した。
【００４５】
（細胞培養およびレトロウイルス感染）  腫瘍細胞株を、ＡＴＣＣから入手し、そして１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で培養した。対数増殖期中の細胞に、ＶＳＶ−Ｇ偽型ｐＭＭＰ−Ｇａｌ４レトロウイルスを１２時間間隔で連続的に感染させ、実験に依存して、最終ＭＯＩ  ５または１０に到達させた。選択は全く用いなかった。なぜなら、免疫染色が、これらのＭＯＩでの細胞の１００％感染を慣用的に実証したからである。ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＶＰ１６またはｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＨＩＦ−ＶＰ１６については、細胞を、１未満のＭＯＩで感染し、そしてピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を用いて４日間で選択した。細胞を１日間回復させ、次いで、ｐＭＭＰ−Ｇａｌ４レトロウイルスをＭＯＩ  ５で感染させた。
【００４６】
（イムノブロットアッセイ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、および細胞死アッセイ）  Ｇａｌ４（ＲＫ５Ｃ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ５３（ＤＯ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、およびＨＩＦ−１α（ＯＺ１５（Ａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２９６９−１２９７３，１９９６））についてのイムノブロット分析を、標準技術を使用して行った（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８））。総ＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ）、そしてリボヌクレアーゼプロテクションアッセイを、マルチプローブヒト脈管形成キット（ＲｉｂｏＱｕａｎｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。細胞死は、抗アネキシンＶ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および７−アミノ−アクチノマイシンＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色することによって測定し、そして製造業者の説明書に従ったフローサイトメトリーによって分析した。
【００４７】
（異種移植片腫瘍モデル）  ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を、６〜８週齢で入手し、そして腫瘍移植前の１週間順化させた。腫瘍細胞を、ヌードマウスへの移植前に、レトロウイルス感染後少なくとも４８時間回復させた。指示された数の腫瘍細胞を、マウスの側腹部の両側に皮下注射した。腫瘍をカリパスで測定し、そして腫瘍体積を０．５×Ｌ×Ｗ2として計算した。各細胞株について、少なくとも２つの独立した実験を行った。示される場合、腫瘍を摘出し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水中の４％パラホルムアルデヒド中に固定するか、またはミンスし、そしてＲＩＰＡ／３００緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、０．５％  ＤＯＣ、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビター）中で溶解させた。抗Ｇａｌ４（ＩＫＥ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗ＣＤ３１（ＭＥＣ１３．３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）での免疫染色を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅシステム（Ｖｅｃｔｏｒ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
【００４８】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、参照として援用される。他の実施形態は、上記の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、ＨＩＦ−１αおよびｐ３００の模式図である。各タンパク質について示したアミノ酸番号は、最小相互作用ドメインの境界を定義する。
図１Ｂは、亜鉛がＧＳＴ−ＣＨ１のＨＩＦ−１αとの相互作用に必要であることを示す。ＧＳＴ−ＣＨ１（アミノ酸３０２−５２８）を、細菌からの精製後または１，１０−フェナントロリン（ＯＰ）（重金属キレート剤）を用いる洗浄後のいずれかのネイティブな状態でインビトロ翻訳（ＩＶＴ）全長ＨＩＦ−１αに結合するその能力について、アッセイした。キレート化後の１μＭの硫酸亜鉛の添加は、結合活性を回復した。
図１Ｃは、示されたようなアミノ酸境界を有するＧＳＴ−ＣＨ１のカルボキシ末端およびアミノ末端の切断変異体の、全長ＩＶＴ  ＨＩＦ−１αをプルダウンするそれらの能力についてのアッセイの結果を示す。
図１Ｄは、Ｇａｌ４への融合物として構築され、そしてＧＳＴ−ＣＨ１（アミノ酸３０２−４４３）を用いてインビトロで翻訳された、ＨＩＦ−１αのカルボキシ末端の示された切断変異体の結合アッセイの結果を示す。各結合アッセイについて使用された全ＩＶＴ産物の５分の１（インプット）を、ＧＳＴ−ＣＨ１により結合された量（結合）とともに示す。
図１Ｅは、示されたアミノ酸の代わりに配列ＮＡＡＩＲＳが挿入された、ＧＳＴ融合タンパク質として生成されたＧＳＴ−ＣＨ１（アミノ酸３０２−５２８）の連続的置換変異体の、ＩＶＴ全長ＨＩＦ−１αに結合する能力のアッセイの結果を示す。
【図２】  図２Ａは、ルシフェラーゼアッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果を示すグラフである。これらアッセイでは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞をＥｐｏルシフェラーゼレポーター（１００ｎｇ）、ｐＣＭＶ−ＬａｃＺ（１００ｎｇ）、および示された発現プラスミド（３００ｎｇ）で同時トランスフェクトした。続いて、細胞を、周囲酸素（酸素正常状態、点描の棒（ｓｔｉｐｐｌｅｄ  ｂａｒ））または１％酸素（低酸素、塗りつぶしの棒（ｓｏｌｏｄ  ｂａｒ））のいずれかに、アッセイの前に１８時間、曝露した。結果を、補正した相対的光単位（ＲＬＵ、３つの独立したトランスフェクションの平均±Ｓ．Ｄ．）として表す。
図２Ｂは、ｐ３００／ＣＢＰ依存性トランスアクチベーションに対するＴＡＤ−Ｃ発現の効果を示すグラフである。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、示されたチオレドキシン制限融合タンパク質発現プラスミド（３００ｎｇ）、示されたＧａ１４融合タンパク質（２０ｎｇ）、Ｇａｌ４−ルシフェラーゼレポーター（１００ｎｇ）、およびｐＣＭＶ−ＬａｃＺ（５０ｎｇ）で同時トランスフェクトした。示した場合には、細胞を１８時間、低酸素に曝露した。結果を、補正したＲＬＵ（３つの独立したトランスフェクションの平均±Ｓ．Ｄ．）として表す。
図２Ｃは、ＶＥＧＦおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を決定するために実施されたリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果を示す。このアッセイにおいて、ＨｅｐＧ２細胞に、Ｇａｌ４単独または野生型もしくは変異体（ＭＵＴ）のＴＡＤ−Ｃポリペプチドと融合したＧａｌ４をコードするレトロウイルスをＭＯＩ  １０で感染させた。細胞を、周囲酸素または１％（低酸素）酸素のいずれかに、全ＲＮＡの調製の前に１８時間曝露した。
図２Ｄは、ＨｅｐＧ２細胞を、示されたＧａｌ４融合タンパク質をコードするレトロウイルスにＭＯＩ  ５で感染させた実験における細胞死のレベルを示すグラフである。細胞を、周囲酸素または１％酸素のいずれかに３６時間曝露し、次いでアネキシンＶ染色およびバイタル染料排除を用いるフローサイトメトリー分析によって細胞死についてアッセイした。結果を、３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。＊印は、コントロールに比較した統計学的有意性を示す（ｐ＝０．０５）。
【図３】  図３Ａは、ＴＡＤＣ発現のインビボ効果を示すグラフである。ＨＣＴ１１６細胞を、Ｇａｌ４単独（丸）、変異体ＴＡＤ−Ｃポリペプチドと融合したＧａｌ４（Ｇａｌ４−ＭＵＴ、四角）または野生型ＴＡＤ−Ｃポリペプチドと融合したＧａｌ４（三角）をコードするレトロウイルスにＭＯＩ  ５で感染させた。全部で４×１０6の細胞を、ヌードマウスに皮下移植した。結果を、８〜１０の独立した腫瘍の平均±Ｓ．Ｄ．として表す。挿入画は、感染細胞におけるＧａｌ４についてのイムノブロットを示し、これは、等価の発現レベルを示す。
図３Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ細胞について図３Ａに関連して記載の実験の結果を示すグラフである。
図３Ｃは、示されたレトロウイルスにＭＯＩ  １０で感染させたＨＣＴ１１６細胞におけるｐ５３についてのイムノブロットである。
図３Ｄは、ＨＣＴ１１６細胞を、ＭＯＩ  ５で、Ｇａｌ４−ＭＵＴまたはＧａｌ４−ＴＡＤＣに感染させた実験における、Ｇａｌ４についてのイムノブロットである。次いで、細胞を、等しい割合で混合し、そして６×１０6細胞を、ヌードマウスに移植した。３週間後、腫瘍を摘出し（腫瘍１〜３）、そしてタンパク質抽出物を、移植の前に細胞から調製した抽出物（混合物）と共に、Ｇａｌ４についてのイムノブロッティングによって分析した。
【図４】  図４Ａおよび図４Ｂは、ＴＡＤ−Ｃ発現のインビボ効果が、ＣＨ１独立ＨＩＦ−１α対立遺伝子によってレスキューされ得ることを示す一連の写真である。変異体（ＭＵＴ）または野生型のＴＡＤ−Ｃポリペプチドと融合したＧａｌ４をコードするレトロウイルスにＭＯＩ  ５で感染させたＨＣＴ１１６細胞から生じる腫瘍を、増殖３週間後に摘出した。パラフィン切片をＨ＆Ｅで染色するか、またはＧａｌ４もしくはＣＤ３１／ＰＥＣＡＭについて免疫染色した。皮下組織領域（ＳＱ）、腫瘍領域（Ｔｕｍ）、および壊死領域（Ｎｅｃ）を示す。図４Ｃは、ＨＣＴ１１６細胞にｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＶＰ１６（ＶＰ１６）またはｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＨＩＦ−ＶＰ１６（ＨＩＦＶＰ）のいずれかを感染させ、そしてピューロマイシンで選択した実験の結果を示すグラフである。次いで、これらの細胞を、Ｇａｌ４−ＭＵＴまたはＧａｌ４−ＴＡＤＣのいずれかをコードするレトロウイルスにＭＯＩ  ５で感染させた。全部で６×１０6の細胞を、ヌードマウスに移植した。結果は、８の独立した腫瘍の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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