(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトと固相レセプターのアナライト特異的結合部位との特異的結合によってサンプル中のアナライトを検出するための固相レセプターを含む少なくとも１つの画定された試験領域を有する非多孔質の固相であって、さらに、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも１つの画定されたコントロール領域を含み、アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が試験領域の固相レセプターと同種の非特異的抗体または非特異的抗体フラグメントを含有する該充填溶液の試薬を含むことを特徴とする、固相。
【請求項２】
サンプル中の複数のアナライトを同時に検出するための複数の試験領域を含んでいる、請求項１記載の固相。
【請求項３】
コントロール領域が、アナライトに特異的な結合部位が存在しない点で試験領域上の固相レセプターとは異なる改変された固相レセプターを含有している、請求項１または２に記載の固相。
【請求項４】
リウマチ因子による干渉を検出するための、非特異的ＩｇＧ分子またはそのＦｃγ部分を含む少なくとも１つのコントロール領域を含んでいる、請求項１〜３のいずれか１項記載の固相。
【請求項５】
総ＩｇＥ含量を検出するための少なくとも１つのコントロール領域を含んでいる、請求項１〜４のいずれか１項記載の固相。
【請求項６】
試験領域とコントロール領域が各々１０μｍ〜１ｃｍの直径を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固相。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の固相の、サンプル中のアナライトを検出するための使用。
【請求項８】
固相が複数のアナライトを同時に検出するための複数の試験領域を含んでいる、請求項７記載の使用。
【請求項９】
イムノアッセイにおける、請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターを含む少なくとも１つの画定された試験領域を有する非多孔質の固相を用いてアナライトと固相レセプターとの特異的結合によってアナライトを検出する方法であって、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合によって生起する干渉をさらに検出することを含み、固相が、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも１つの画定されたコントロール領域をさらに含み、アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が試験領域の固相レセプターと同種の非特異的抗体または非特異的抗体フラグメントを含有する該充填溶液の試薬を含む、前記方法。
【請求項１１】
干渉を定量的に修正するためにコントロール領域を使用する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
画定された試験領域の固相レセプターのアナライト特異的結合部位へのアナライトの特異的結合によってアナライトを検出する方法における、非アナライト成分によって生起する干渉を検出するための画定されたコントロール領域の使用であって、アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が試験領域の固相レセプターと同種の非特異的抗体または非特異的抗体フラグメントを含有する該充填溶液の試薬を含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライトを検出するための少なくとも１つの試験領域を有し、さらに干渉を検出するための少なくとも１つのコントロール領域も含む固相に関する。また、本発明は、干渉する反応を検出し、必要であれば修正することができる、本発明の固相を用いて１つ以上のアナライトを検出する方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
結合アッセイによってアナライトを検出する場合、特定のサンプルでは検出反応において干渉が起こり、偽の試験結果が出る。この現象は一般にサンプルのマトリックス効果といわれている。干渉の存在は一般に通常のテストフォーマットでは示すことが出来ない。固相、テストバッファおよび検出試薬の複雑な最適化によって各種サンプルのマトリックス効果を防止するかまたは可能な限り低減することが試みられている。しかし、検出法におけるそのような干渉の低減は複雑であり、費用がかかる。また、残念ながらマトリックス効果を完全に抑制することはできないので、試験の最適化にもかかわらず特定のサンプルでは干渉の適切な低減が起こらないという可能性を完全に排除することはできない。検出法の開発中には未知であった新たな干渉が起こり得、これがまた偽の結果をもたらす。その結果、公知の検出法において、ユーザーが知らないうちに偽の試験結果が得られることがあるという問題がある。この状況は、感染症の検出のための定量試験の場合特に問題となる。すなわち、たとえばマトリックス問題によって生じる偽陽性サンプルは、ＨＩＶテストでは重大な結果をもたらす。
【０００３】
米国特許第4,558,013号には、特異的な試験試薬を塗布した試験領域に加えて、画定されていない非塗布の陰性コントロール領域を含有するテストストリップが記載されている。試験領域で測定された値はコントロール領域における非特異的結合を差し引くことによって修正される。しかしそのような手法では干渉を部分的にしか修正できない。というのは、干渉する成分の試験領域への非特異的結合は通常、干渉する成分の非塗布コントロール領域への結合とは大きく異なるからである。
【０００４】
米国特許第5,356,785号には、いくつかの試験領域があってその各々がアナライト検出用の固相レセプターを異なる量で含有する固相が記載されている。この固相はさらに、試験試薬と共に既知強度の検出可能なシグナルを生成する基準領域も含有している。サンプルと固相との非特異的干渉を決定するためのコントロール領域は開示されていない。
【０００５】
Brown IIIらの米国特許第4,916,056号には、サンプル中のアナライト、特に抗原、抗体またはＤＮＡセグメントの定性または定量のための固相が記載されている。この固相は、試験領域に加えて、試験における陽性シグナルを生成する基準領域と、陽性基準領域と試験領域とを含有する画定されていない陰性コントロール領域とを含んでいる。このデバイスの欠点は、非塗布コントロール領域の表面が試験領域とは大きく異なっているため干渉に対する有効な修正ができないということである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、試験結果を評価する際に干渉を考慮することができるようにこれら干渉の存在を直接表示し、場合によってはそれら干渉のタイプを直接表示できるアナライト検出用のデバイスと方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、本発明に従って、サンプル中のアナライトを検出するための少なくとも１つの画定された試験領域を有する固相であって、干渉を検出するための少なくとも１つの画定されたコントロール領域をさらに含むことを特徴とする固相によって達成される。これに関して、固相上の「画定された試験領域」という用語は、不活性領域により他の試験領域から好ましくは空間的に離隔された固相の画定された領域を試験領域が含むことを意味するものと了解されたい。この画定された試験領域は直径が１０μｍ〜１ｃｍであるのが好ましく、１０μｍ〜５ｍｍであると特に好ましい。直径が１０μｍ〜２ｍｍの微小試験領域が最も好ましい。複数の試験領域を有する固相（アレイシステムともいう）が好ましい。このようなアレイシステムは、たとえばEkinsおよびChu (Clin. Chem. 37 (1995), 1955-1967)ならびに米国特許第5,432,099号、同第5,516,635号および同第5,126,276号に記載されている。アレイシステムの利点は、１つのサンプルで複数のアナライトとコントロールの測定が同時に行えることである。非特異的に結合および／または干渉するサンプルを検出するコントロール領域を使用すると、結果の信頼性、特に小型のアレイテストシステムを用いた場合の結果の信頼性を大幅に改善することができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明において、定性試験における、特に感染（たとえばＨＩＶ）の試験のような特異性に関するストリンジェントな要件がある定性試験における干渉および非特異的結合の検出はきわめて重要である。干渉の表示および試験結果の修正により、偽陽性の結果を大幅に低減することができ、したがって特異性を大幅に改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の固相は検出法に用いられる慣用の任意の支持体であり、非多孔質の支持体、たとえばプラスチック、ガラス、金属または金属酸化物の表面をもつ支持体が好ましい。テストストリップのような多孔質の支持体も適している。この支持体上に空間的に離散した領域（試験領域）を位置させる。固定化された固相レセプターをこれらの試験領域に適用する（付着させる）。固相レセプターは公知の方法により、たとえば直接吸着結合、共有結合、または高親和性結合対（たとえばストレプトアビジン／ビオチン、抗原／抗体または糖／レクチン）により固定化される。サンプル中のアナライトの存在および/または量は、検出媒体からの成分(たとえば測定しようとするアナライトまたはアナライトアナログ)と固相レセプターとの特異的結合によって測定することができる。
【００１０】
アナライトおよび干渉する反応の存在の検出は、本発明の方法で適切なマーカー基、たとえば蛍光マーカー基を用いることにより公知のようにして行う。また、適切な固相を用いて、検出媒体の成分と試験領域およびコントロール領域との相互作用を、それぞれの領域の層厚を、たとえばプラスモン共鳴分光法によって決定することにより検出することも可能である。
【００１１】
サンプルの複数のアナライトを同時に検出するアレイシステムでは、異なる試験領域に対する複数の異なるアナライトの同時検出を可能にする「汎用」マーカー基を使用するのが好ましい。そのような汎用マーカー基の一例は、試験試薬上の相補的レセプター、たとえば測定しようとするアナライトまたはアナライトアナログに対する可溶性レセプターと（たとえば、抗体／抗原またはストレプトアビジン／ビオチンなどのような高親和性結合対によって）特異的に相互作用することができるレセプターを担持しているマーカー基である。
【００１２】
そのような汎用マーカー基の適用を図１に例示する。この場合、抗−ジゴキシゲニン抗体（＜Ｄｉｇ＞標識）と結合した蛍光ラテックスビーズを、単一の固相に対して３つの異なるテストフォーマットに使用する。すなわち、ＨＩＶ抗体、ＨＢｓ抗原および抗−ＨＢｃ抗体を測定する。抗−ＨＩＶ抗体測定の場合、検出しようとする抗−ＨＩＶ抗体と共に固定化された免疫複合体を形成する、固定化されたＨＩＶ抗原とジゴキシゲニル化された可溶性ＨＩＶ抗原とを用いる。マーカー基はこの免疫複合体上に存在するジゴキシゲニン基と結合することができる。ＨＢｓ抗原の測定には、マーカー基と相互作用することができる、固定化された抗体とジゴキシゲニル化された可溶性抗体とを対応する様式で用いる。抗−ＨＢｃの測定には、サンプル中に存在する抗−ＨＢｃ抗体が、固定化されたＨＢｃ抗原に対して、ジゴキシゲニル化された抗−ＨＢｃ抗体と競合する競合テストフォーマットを使用する。試験領域と結合したマーカー基の量はサンプル中の抗−ＨＢｃ濃度に反比例する。
【００１３】
画定された試験領域とコントロール領域はさらに、これらの領域を固相の不活性領域と区別するために、アナライト特異的マーカー基と一緒に検出することができその基と干渉しない検出可能なアナライト非特異的マーカー基も含有することができる。そのようなアナライト非特異的マーカー基の一例は、アナライト特異的マーカー基の蛍光波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光マーカー基である。このアナライト非特異的マーカー基は、固相レセプターと同様に、高親和性結合対、たとえばストレプトアビジン／ビオチンを介して固定化してあるのが好ましい。
【００１４】
本発明の固相は、任意の検出法、たとえばイムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、糖−レクチンアッセイおよび類似の方法で使用することができる。
【００１５】
本発明の固相を用いると、干渉する反応を検出して、干渉を低減するための従来技術で公知の手段が特定のサンプルには適さない場合でも信頼性のある試験結果を得ることが可能になる。コントロール領域は干渉する反応の定性的検出を可能にするばかりでなく、多くの場合その干渉の定量的修正も可能にする。
【００１６】
固相は、異なる干渉を検出するために、干渉反応を検出するための複数の、特に異なるコントロール領域を含むことができる。この様式では、異なるタイプの干渉を特異的に検出することが可能である。それぞれの試験に対してしばしば生じる、および/または特に関連する干渉成分の検出に適した一連のコントロール領域を設けることが特に推奨される。
【００１７】
試験手順の干渉は、一般に、試験領域上の物質と検出媒体の成分との望ましくない非アナライト特異的干渉の結果であり得る。試験領域上のこれらの物質は、特に、固相の成分、固相レセプターの一部、および固相の表面上に位置する他の試薬であり得る。検出媒体の干渉性成分は、主としてサンプルに由来し（マトリックス効果）、場合によっては試験試薬たとえば検出試薬と固相との非特異的結合を起こし、測定されたシグナルを偽ることになる。このように、試験領域と、サンプル成分、試験試薬、反応生成物、またはサンプル成分および試験試薬の複合体との間で干渉性相互作用が起こりうる。
【００１８】
本発明の固相は、検出媒体の成分と、アナライトに対して特異的な固相レセプターとの望ましくない結合に起因する干渉を検出するためのコントロール領域を含んでいるのが好ましい。サンプル中には、固相レセプターとの非特異的結合を起こしやすく、したがって間違った試験結果をもたらす、非アナライト干渉成分（たとえば抗体や抗原）が存在することが多い。したがって、アナライトと特異的に結合することができる領域を除いて試験領域中の固相レセプターと完全に同一である、非アナライト特異的固相レセプターを含んでいるコントロール領域が特に有利である。
【００１９】
固相レセプターがたとえば抗体または抗体フラグメントである場合、試験領域の固相レセプターと同種、好ましくは同じクラス、特に好ましくは同じサブクラスの非特異的抗体または非特異的抗体フラグメントを含有するコントロール領域を使用する。固相レセプターがたとえば抗原、たとえばペプチドやポリペプチドである場合には、たとえば免疫原性エピトープの領域で最小の可能な数のアミノ酸を改変することにより、免疫学的に反応性の抗原とは改変されて異なっている変異「抗原」を含有するコントロール領域を使用する。これらのアミノ酸改変は、挿入、欠失、および好ましくは天然アミノ酸の他の天然アミノ酸または非天然アミノ酸誘導体、たとえばＤ−アミノ酸による置換を含みうる。固相レセプターがたとえば核酸である場合、試験領域上に固定化された核酸とは、核酸配列中の改変、たとえば標的核酸の認識に係わる配列内、好ましくはその中央部での塩基置換の点で異なる「変異」核酸を含有するコントロール領域を使用する。アナライト特異的抗原結合部位を除いて試験領域中の固相抗体と完全に同一である、固相レセプターの変異体(mutein)を使用するのが最も好ましい。
【００２０】
また、コントロール領域に適用される固相レセプターが、試験領域に適用される固相レセプターと同じ処理工程、たとえば誘導体化に供されているのが好ましい。すなわち、たとえばビオチニル化された固相レセプターの場合、固相レセプターと結合するビオチン分子の数は試験領域とコントロール領域とで同一でなければならない。また、試験領域とコントロール領域の固相レセプターは同じ結合化学(coupling chemistry)に供されていなければならない。さらにまた、同じリンカーを使用しなければならない。コントロール領域に適した固相レセプターはアナライトと特異的に結合することができてはならないが、試験領域の固相レセプターの他の領域を全て、したがって結合部位を含んでいるのが好ましい。その結果、干渉する成分と、試験領域およびコントロール領域のそれぞれの固相レセプターとの非特異的結合は本質的に同じであって、コントロール領域の測定値に基づいて試験領域の測定値を定量的に修正することが可能になる。
【００２１】
さらに、固相は、試験領域の他の固定化試薬とサンプルの非アナライト成分との反応によって生起する干渉を検出するための少なくとも１つのコントロール領域も含む。その結果、固相レセプターを適用するために使用した装填溶液の成分と特異的および/または非特異的に反応する干渉性成分が特に検出される。たとえば、そのようなコントロール領域は、テストシステムに使用した装填溶液の試薬、たとえばバッファ、固定化用試薬（ストレプトアビジンなど）、ビオチニル化された物質（たとえばビオチニル化された蛍光マーカー）、非アナライト特異的抗体など、ブロッキング試薬、またはリンカーを含有することができる。
【００２２】
リウマチ因子は試験に干渉することが多い。したがって、固相上に、リウマチ因子を検出するために少なくとも１つのコントロール領域を設けるのが好ましい。リウマチ因子は通常ＩｇＭ分子であるが、まれにはＩｇＧ分子、ＩｇＡ分子およびＩｇＥ分子であることもあり、これら分子は抗体のＦｃ部分と反応し、たとえば試験領域に固定化された抗体および/または可溶性の検出抗体と交差反応すると、たとえば固相と結合した抗体を、非特異的に増大したシグナルを与えることになる標識された検出抗体と架橋することによって試験に干渉する。そのようなコントロール領域としては、非特異的ＩｇＧ分子、好ましくはヒトＩｇＧ分子のＦｃγ部分を固相に付着させる。すると、リウマチ因子は試験中試験領域に結合するだけではなく、コントロール領域にも結合し、したがって干渉を表示する。
【００２３】
比較的頻繁に起こる別の干渉は、サンプル中の異種特異的抗体、すなわち異種の抗体に対する抗体、たとえばヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）によって生起する。したがって、本発明の固相は、異種特異的抗体を試験するための少なくとも１つのコントロール領域を含むことも好ましい。異種特異的干渉性成分、たとえばＨＡＭＡは、たとえば、二重抗体サンドイッチアッセイにおいて、固相抗体と検出抗体との架橋、そして結果的に非特異的に増大したシグナルをもたらす。適切なコントロール領域としては、試験抗体と同種の非特異的抗体を使用するのが好ましい。サンプル中に存在しうるＨＡＭＡ干渉性成分はコントロール領域に付着した抗体と結合し、干渉反応を表示する。
【００２４】
特異的にアナライトと結合可能な領域とは別の試験領域中の検出試薬と同じ固相レセプターの代わりに、検出反応中に形成される複合体、たとえば固相抗体−アナライト−検出抗体（標識なし）をコントロール領域に付着させて、非特異的結合部位が試験領域の結合部位とほとんど同じであるにもかかわらず特異的反応がもはや生じないようにすることもできる。
【００２５】
血清中の、抗体フラグメントのｎｅｏ−エピトープに対する干渉成分も公知である。そのようなｎｅｏ−エピトープは、たとえばＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）2開裂の間に形成される。この場合、試験領域の抗体フラグメントと同じ方法（開裂条件および開裂タンパク質）で生成した非特異的抗体のフラグメントを含有するコントロール領域を提供することが好ましい。これら干渉性成分はこれらの非特異的抗体フラグメントに結合し、したがって検出することができる。
【００２６】
さらに、適切なコントロール領域を用いて、サンプル中に存在しうる干渉性成分、たとえば試験領域上の固定化試薬、たとえばストレプトアビジンに対する干渉性抗体を検出することも可能である。この目的のためには、ストレプトアビジン（ＳＡ）をコントロール領域に付着させ、標識ＳＡを検出試薬に添加する。サンプル中に抗−ＳＡ抗体が存在する場合には、サンドイッチ複合体が形成され、抗体が特異的に検出される。
【００２７】
本発明の固相は、総ＩｇＥ含量を検出するためのコントロール領域をさらに含有していることもできる。そのようなコントロール領域はアレルギーテストに特に推奨される。アレルギー診断サンプルで特異的ＩｇＥを測定する場合、総ＩｇＥ含量が高いサンプルは特定のＩｇＥの特異的検出反応に干渉することが多い。総ＩｇＥ含量は、抗−ＩｇＥ抗体を付着させてあるコントロール領域を用いて、検出法と平行して決定することができる。
【００２８】
最後に、コントロール領域はまた、検出媒体の成分と固相支持体との反応によって生じる干渉を検出するようにも提供することができる。この目的のためには、支持体材料（たとえばポリスチレン）、可塑剤、官能基などのような固相支持体の成分全てをコントロール領域に付着させることができる。
【００２９】
さらに、カットオフ値を決定するためのコントロール領域を特定の試験法、たとえば感染症、アレルギーなどの定性試験や半定量試験に用いることができる。「カットオフ」値は、陽性の値と陰性の値とを区別するために試験法に対して設定された閾値である。そのような「カットオフ」値は感染症に関連する試験法で特に重要である。１つの可能性は、試験試薬を含まない装填溶液または試験試薬の変異体を含有することができる「陰性の」コントロール領域を使用することである。主な利点は、非特異的な結合に対するサンプル特異的な値が各サンプルについて決定され、したがって試験の改善された特異性が得られることである。この様式で別個の陰性コントロールを省略することができる。
【００３０】
図２は、カットオフ値を用いる試験に使用したコントロール領域の影響を示す。多数のサンプルを用いた場合、従来の試験法ではいくつかの偽陰性と偽陽性の結果が得られる（左側）。本発明のコントロール領域を用いると（右側）、陰性サンプルからのシグナルを選択的に低減することができ、そのためカットオフ値が低下する。このようにして、誤差の可能性を大きく低下させて陽性／陰性の識別をすることができる。
【００３１】
アナライトまたはアナライト様試薬を含有する基準領域によって陽性のコントロールをシミュレートすることもできる。主な利点は、陰性のコントロール領域と陽性の基準領域との組み合わせにより、個々の測定に対してサンプル特異的カットオフ値を決定することができることである。このことの利点は、間接的な較正が不要であり、改善された試験特異性が達成されることである。
【００３２】
もちろん、サンプル中に存在すると予想されるかまたは存在する干渉性の成分を検出するために、試験手順に応じて、前述の好ましいコントロール領域に加えて他のおよび/または追加のコントロール領域を提供することが可能である。
【００３３】
本発明に従って提供されるコントロール領域により、干渉反応の定性的検出が可能になるばかりでなく、その干渉の定量的修正も可能になることが多い。試験条件を適切に選択することによって、試験領域で起こる非アナライト成分の非特異的結合がいくつかのコントロール領域で正確に反映される。すなわち、試験領域で測定された値を簡単に修正して正確で偏りのない結果を得ることができる。試験領域とコントロール領域における非特異的結合が同じでないとしても、定性試験では「陽性」か「陰性」の表示が必要であるだけであるのでこの場合には測定されたシグナルを修正することができる。
【００３４】
付加的な利点は、本発明の固相により複数の干渉性成分の存在を別々に検出することが可能であり、また干渉のタイプを決定することが可能であるということである。ユーザーは、１つ以上の干渉性成分の存在により誤った結果が生じうることを即座に認識する。そこでユーザーは、測定されたデータに基づいて測定結果を修正し、別のテストフォーマットで測定を繰り返し、または適当な方法で、たとえば干渉性成分を分離することによってサンプルを前処理することができる。
【００３５】
本発明の固相は、サンプル、たとえば血液、血清、血漿、唾液などのような体液中のアナライトを検出するのに使用することができる。複数のアナライトの同時検出用に複数の試験領域を有する固相、すなわちアレイシステムを使用すると好ましい。そのようなアレイシステムでは各試験領域に対して少なくとも１つのコントロール領域を使用するのが好ましい。本発明の固相は、公知のあらゆる異種試験法において、特にイムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。
【００３６】
したがって、本発明の別の主題は、少なくとも１つの画定された試験領域を有し、さらに干渉反応を検出する少なくとも１つのコントロール領域を含む固相を用いてアナライトを検出する方法である。本発明の方法は、干渉の定量的修正のためのコントロール領域を使用することを含んでいるのが好ましい。
【００３７】
最後に、本発明はまた、干渉の同時検出のためにアナライトの検出方法においてコントロール領域を使用することにも関する。
【００３８】
添付の図面および以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００３９】
実施例１：ＨＢｓＡｇ試験法
ＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体を、ポリスチレン支持体上の約１００μｍの試験領域に付着させる。同じ試薬溶液を数回付着させることによって、一回のサンプルピペッティングで１つの試験を行うときに余分な作業をすることなく複数の測定を行うことができる。サンプルバッファであらかじめ希釈したサンプル３０μｌをピペットで試験領域上に載せ、室温で振盪しながら２０分間インキュベートする。サンプルを吸引し、試験領域を洗浄バッファで洗浄した後、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）−標識抗−ＨＢｓＡｇ抗体を含有する３０μｌの試薬溶液１をピペットで添加し、再び室温で振盪しながら２０分間インキュベートする。試薬溶液１を吸引し、試験領域を洗浄バッファで洗浄した後、検出試薬を含有する３０μｌの試薬溶液２をピペットで試験領域上に載せる。検出試薬として、抗−Ｄｉｇ抗体で共有結合によりコートされた１００ｎｍで蛍光染色したラテックス粒子を用いる。つぎに、この検出試薬を室温で振盪しながら２０分間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄し、吸引乾燥する。試験領域に６３３ｎｍの波長のＨｅ−Ｎｅレーザーを照射し、６７０ｎｍの波長の蛍光をＣＣＤカメラで測定する。このテストフォーマットの代表例を図１の中央に示す。
【００４０】
次の試験特異的試薬を使用した。
固相抗体：モノクローナルマウス抗−ＨＢｓＡｇ抗体１（Ｆａｂ’2フラグメント）ビオチンコンジュゲート １：１ サブタイプＩｇＧ１
検出抗体：モノクローナルマウス抗−ＨＢｓＡｇ抗体２ ＩｇＧ−Ｄｉｇコンジュゲート １：１０
【００４１】
次の試験結果（カウント）が得られた。
【表１】
0005047131.tif 000002
*陰性コントロール領域は、固相レセプターのないコントロール領域における非特異的結合に対応する。
**カットオフ指数：［シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域)]/３×シグナル（陰性コントロール）
【００４２】
この試験はカットオフ＞１で陽性であり、カットオフ＜１で陰性である。
【００４３】
実施例２：ＨＡＭＡ干渉を検出するコントロールスポットを用いたＨＢｓＡｇ試験
ＨＡＭＡ干渉を検出するために、ＨＢｓＡｇ−特異的抗体に加えて追加の非特異的モノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）を付着させた（図３）。クレアチニンキナーゼＭＢ（＜ＣＫ−ＭＢ＞）、トロポニン（＜ＴＮＴ＞）および甲状腺刺激ホルモン（＜ＴＳＨ＞）に対する抗体をＦａｂ’2またはＦａｂ’ビオチンコンジュゲートの形態で使用した。サンプル中のヒト抗−マウス抗体が固相に結合した非特異的ＭＡＢｓと特異的検出抗体とを架橋するという事実に起因して、いわゆるＨＡＭＡ干渉を検出することが可能である。この実験の目的は、ＨＡＭＡ検出に最適なＭＡＢを見出すことであった。６種の異なるＨＡＭＡサンプルを用いてＨＢｓＡｇ／コントロールパネルを測定した。このために、ＨＡＭＡ干渉低減用試薬をサンプルバッファに添加しないかまたは１００μｇ／ｍｌ添加した。
【００４４】
【表２】
0005047131.tif 000003
*シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域）
**カットオフ指数：［シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域)]/３×シグナル（陰性コントロール）
シグナル（陰性コントロール）＝２８カウント
【００４５】
この結果は、６個のＨＡＭＡサンプルのうち５つがＨＢｓＡｇ試験と強く干渉し、偽陽性の結果になることを示している。この干渉はコントロールスポットの存在によって一義的に表示することができる。同じ開裂フラグメント（Ｆａｂ’2）、同じビオチン化学量論および同じ結合化学を有するＴＳＨ−ＭＡＢはこれに最も適している。これに対して、Ｆａｂ’フラグメントをもつ２つのＭＡＢはＨＡＭＡ干渉性サンプルとの反応性がＨＢｓＡｇ−ＭＡＢよりも低く、したがって全てのＨＡＭＡ干渉を同定するにはあまり適していない。
【００４６】
【表３】
0005047131.tif 000004
*シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域）
**カットオフ指数＝［シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域)]/３×シグナル（陰性コントロール）
シグナル（陰性コントロール）＝３４カウント
***カットオフ指数ＨＢｓＡｇcorr.＝［シグナル（試験領域）−シグナル（ＭＡＢコントロール領域）］／３×シグナル（陰性コントロール）；定義：陰性値＝０
【００４７】
きわめて大量（１００μｇ／ｍｌ）の干渉低減用試薬を添加すると（ルーチンの応用としては試験が高価すぎることになるが）、６個のＨＡＭＡサンプルのうちの５つで干渉を排除することが可能になる。しかし、ＨＡＭＡサンプル６は、高濃度の干渉低減用試薬にもかかわらず干渉の問題が低減できないままである。２つのコントロールスポットを用いて、いまだに存在しているＨＡＭＡ干渉を明瞭に示すことができる。ＴＳＨコントロールスポットにおける非特異的結合は特異的ＨＢｓＡｇスポットにおける非特異的結合に対応するので、コントロールスポット中のシグナルを用いて特異的なシグナルを修正することができる。この手段により、このサンプルは明らかに陰性にもなり、このため特異性を大幅に改善することになる。こうして、コントロールスポットを用いて、サンプルバッファ中の干渉低減性タンパク質の濃度、したがって生産コストを大きく低減して特異性を改善することができる。
【００４８】
実施例３：サンプル特異的マトリックス効果を検出するコントロールスポットを用いたＨＢｓＡｇ試験
検出試薬の非特異的結合はさまざまなマトリックス効果により生じうることが一般に知られている。マトリックス効果に対して試験特異的スポットに匹敵する作用を有するコントロールスポットを適用すると、そのようなマトリックス効果を示し、場合によっては修正することさえ可能になる。その結果として特異性が大きく改善される。
【００４９】
次の実験で、顕著なマトリックス効果を基にして選択したさまざまなＨＢｓＡｇ−陰性サンプルを用いてＨＢｓＡｇ試験を再び実施した。
【００５０】
【表４】
0005047131.tif 000005
*シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域）
**カットオフ指数＝［シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域)]/３×シグナル（陰性コントロール）
シグナル（陰性コントロール）＝２８カウント
***カットオフ指数ＨＢｓＡｇcorr.＝［シグナル（試験領域）−シグナル（ＭＡＢコントロール領域）］／３×シグナル（陰性コントロール）；定義：陰性値＝０
【００５１】
測定した９つの顕著な陰性サンプルのうち２つのサンプルで偽陽性の結果が得られた。測定された値を、コントロールスポットを用いて修正することによって全てのサンプルをゼロにし、したがって明確に陰性とした。
【００５２】
実施例４：リウマチ因子による干渉を検出するコントロール領域を用いたＨＢｓＡｇ試験
リウマチ因子による干渉を検出するために、ＨＢｓＡｇ−特異的抗体に加えて、ＩｇＧ１サブタイプの追加のＭＡＢを付着させた。リウマチ因子は抗体のＦｃ部分と反応することができるので、固相に結合した試験特異的ＭＡＢと特異的検出抗体との架橋が生起し、したがって偽陽性反応が生じうる。この実験の目的は、リウマチ因子を検出するのに最適なＭＡＢを見出すことであった。このため、ＩｇＧ１サブクラスの異なるＭＡＢを付着させた。このＨＢｓＡｇ／コントロールパネルを、陰性コントロール、３つの異なる陽性コントロール、４つの通常の陰性サンプル、およびリウマチ因子の量を次第に増大させた５つの陰性サンプル（ＲＦ１〜５）で測定した。陽性コントロール中のＨＢｓＡｇのそれぞれの含量およびリウマチ因子サンプル中のリウマチ因子の含量はＵ／ｍｌで示す。結果は次の通りである。
【００５３】
【表５】
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*カットオフ指数＝［シグナル（試験領域）−シグナル（陰性コントロール領域)]/３×シグナル（陰性コントロール）
カットオフ指数＞１＝陽性
【００５４】
この実施例は、リウマチ因子濃度＞１０００Ｕ／ｍｌの陰性サンプルがＨＢｓＡｇ試験に強く干渉し、偽陽性の結果に至ることを明らかに示している。試験した３つのＭＡＢコントロール領域のうちの２つはＨＢｓＡｇ試験の干渉に類似しており、３つの高力価リウマチ血清と明らかに陽性の反応を生起する。この方法で、試験の干渉が即座に認識され、偽陽性の結果が回避される。ＭＡＢ “２”はリウマチ因子干渉を表示するのに最も適している。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、汎用のマーカー基を用い、固相上で３つのパラメーターを同時に決定することができる小型アレイシステム（微小スポット）の一例を示す。
【図２】図２は、カットオフ値を決定するテストフォーマットにおいて本発明のコントロール領域を使用することによって達成される特異性の改善を示す。
【図３】図３は、試験領域（＜ＨＢｓＡｇ＞）に加えて複数のコントロール領域（＜ＣＫ−ＭＢ＞、＜ＴＮＴ＞および＜ＴＳＨ＞）を含有する、ＨＢｓ抗原を測定するための本発明の固相の概略説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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