(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞における複製能力を有するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−ＲＮＡ−構築物において、ＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−断片５′ＮＴＲ，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ及び３′ＮＴＲおよび付加的に選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）を少なくともコードする、配列表の配列番号１から配列番号１１までのいずれか１つに記載されたヌクレオチド配列を包含し、前記選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、該ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の代わりに、別の抗生物質耐性遺伝子もしくはその他の耐性遺伝子が含まれていてよい、真核細胞における複製能力を有するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−ＲＮＡ−構築物。
【請求項２】
マーカー遺伝子の代わりに、またはマーカー遺伝子に加えて、組み込まれたリポーター遺伝子を有する、請求項１記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項３】
リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ−遺伝子（クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ−遺伝子）、ｌａｃＺ−遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ＧＦＰ−遺伝子（緑色−蛍光−タンパク質−遺伝子）、ＧＵＳ−遺伝子（グルクロニダーゼ遺伝子）およびＳＥＡＰ−遺伝子（分泌−アルカリ性−ホスファターゼ−遺伝子）からなる群から選択される、請求項２記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項４】
複製に（細胞）代理マーカー遺伝子の発現が影響する、請求項１から３までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項５】
リポーター遺伝子及び選択可能なマーカー遺伝子が、位置的に、融合タンパク質を一緒に発現するように配置されている、請求項１から４までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項６】
組み込まれた外来遺伝子を有し、この外来遺伝子の発現に好適である標的細胞中にこの外来遺伝子を導入するために好適である、請求項１から５までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項７】
真核細胞がヒト肝癌細胞であり、かつ導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が請求項１から６までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料を含有する、真核細胞を包含するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系を、選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を単離することにより得られる、ヌクレオチド突然変異及び／又はアミノ酸突然変異を有し、細胞培養に適合し、高い効率で複製する、請求項１から６までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項８】
細胞クローンから単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を、新たに少なくとも１回継代し、すなわち細胞クローンから単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を、真核細胞がヒト肝癌細胞であり、かつ導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が請求項１から６までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料を含有する、真核細胞を包含するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系の細胞に導入し、この細胞を選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を単離する、請求項７記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項９】
次に記載するアミノ酸置換、すなわち：
１２８３  ａｒｇ  −＞  ｇｌｙおよび／または１３８３  ｇｌｕ  −＞  ａｌａおよび／または１５７７  ｌｙｓ  −＞  ａｒｇおよび／または１６０９  ｌｙｓ  −＞  ｇｌｕおよび／または１９３６  ｐｒｏ  −＞  ｓｅｒおよび／または２１６３  ｇｌｕ  −＞  ｇｌｙおよび／または２３３０  ｌｙｓ  −＞  ｇｌｕおよび／または２４４２  ｉｌｅ  −＞ｖａｌ
［前記アミノ酸置換の位置は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列に基づくものである］を１個またはそれ以上有し、細胞培養に適合し、高い効率で複製する、請求項１から８までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項１０】
表３に記載されたヌクレオチド置換および／またはアミノ酸置換の１つまたはそれ以上を有し、この際表３は該請求項に包含される、請求項１から９までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項１１】
導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料を含有する、真核細胞を包含するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系において、真核細胞がヒト肝癌細胞であり、かつ導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が請求項１から１０までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である、ＨＣＶ細胞培養系。
【請求項１２】
ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を含有する細胞がドイツ微生物保存機関（ＤＳＭＺ：ブラウンシュバイク、ＢＲＤ在）に寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９４（研究所記号 HuBl ９−１３）として寄託されている、請求項１１記載の細胞培養系。
【請求項１３】
ＨＣＶ−感染の治療剤および／または診断剤の製造および／または評価のための、請求項１１または請求項１２記載の細胞培養系および／または請求項１から１０までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の使用。
【請求項１４】
ＨＣＶ−感染に対するワクチンの製造のための、請求項１１または請求項１２記載の細胞培養系および／または請求項１から１０までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の使用。
【請求項１５】
遺伝子治療のための肝細胞特異的遺伝子輸送体の製造のための、請求項１から１０までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の使用。
【請求項１６】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を、このＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体の獲得のために用いる使用であって、該突然変異体が前記ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に比べて高められた複製効率を有する前記使用において、請求項１から６までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を有する請求項１１または請求項１２記載の細胞培養系を、選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を単離することを特徴とする前記使用。
【請求項１７】
単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を新たに少なくとも１回継代し、すなわち単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を請求項１１または請求項１２記載の細胞培養系の細胞に導入し、この細胞を選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を単離する、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を、本来のＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物と比較して高められた複製効率を有するＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−構築物の突然変異体の製造のために用いる使用であって、
−  請求項１６または請求項１７に記載の方法によりＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を製造し、これを単離し、
−  これらの突然変異体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定し、本来のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と比較して、ヌクレオチド突然変異およびアミノ酸突然変異の種類、数、及び位置を決定し、
−  かつこの突然変異を意図的な突然変異誘発により、または該当する突然変異を有する配列断片の置換により、（単離された）ＨＣＶ−全長ゲノムまたはＨＣＶ−部分ゲノムまたは任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中へ導入する、
ことを特徴とする前記使用。
【請求項１９】
高い複製効率を有する細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物において、ヌクレオチド突然変異及び／又はアミノ酸突然変異により請求項１記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物から誘導可能であり、かつ請求項１６から１８までのいずれか１項記載の方法により得ることができることを特徴とする、高い複製効率を有する細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
【請求項２０】
Ｃ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子の作成のための、請求項１から１０までのいずれか１項又は請求項１９記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の使用。
【請求項２１】
請求項２０記載のＣ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子に感染した細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料を含有する、つまりＨＣＶ−特異的遺伝子材料がトランスフェクションされている主に真核細胞を包含するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は世界的規模での慢性及び急性の肝疾患の主要な原因である。たいていのＨＣＶ感染は認識できる臨床的症状なしで進行し、感染者の８０〜９０％が持続的なウイルスキャリアとなり、この持続的ウイルスキャリアの５０％が多様な症状の慢性肝炎になる。この慢性感染者の約２０％が１０〜２０年の経過において肝硬変に進行し、その結果第１次肝細胞ガンが生じることがある。この慢性のＣ型肝炎は今日では肝臓移植が主な感染原因である。原因療法はまだ存在しない。現在提供可能な若干の治療法はインターフェロン−アルファの又はインターフェロン−アルファとプリン−ヌクレオシド類似体のリバビリンとからの組み合わせの高い用量での投与である。全治療者の約６０％がこの治療法に効果を示すだけであり、その際に、全ての事例の半分以上が治療の中止後に新たなウイルス血症に至る。
【０００３】
工業国においても、罹患率が高く、慢性感染の深刻な結果及び原因療法がないために、ＨＣＶ−特異的化学療法の発展が製薬学の研究及び開発の重大な目標である。この際の主要な問題は、今まで、真核細胞中でのウイルス−複製及び発病の研究を可能にする適当な細胞培養系がなかったことである。
【０００４】
血中及び組織中でのわずかなウイルス量のため、適当な細胞培養系又は動物モデル（今日までチンパンジーが唯一可能な試験動物である）がないため、並びにウイルス様の粒子を製造する有効な系もないため、ＨＣＶ−粒子の分子組成は今日まで詳細には研究もしくは解明されていない。現在存在する結果は次のようにまとめることができる：ＨＣＶは、５０〜６０ｎｍの粒子直径及び１．０３〜１．１ｇ／ｍｌの平均密度を有する外被を有するプラス鎖のＲＮＡウイルスである。これは最初に１９８９年に分子的にクローニングされ、特性決定された（Choo et al., 1989: Science, 244, 359-362）。このＨＣＶ−ＲＮＡは約９．６ｋｂ（＝９６００ヌクレオチド）の長さ及び正の極性を有し、約３０１０個のアミノ酸の線状ポリタンパク質をコードする唯一のオープンリーディングフレーム（ORF = open reading frame）を有する（Rice 1996, in Virology, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds. (Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, 1996), vol. 1, pp. 931-960; Clarke 1997, J. Gen. Virol. 78, 2397; and Bartenschlager 1997, Intervirology 40, 378 and Fig. 1 A参照）。ウイルス複製においてこのポリタンパク質は細胞の及びウイルスのプロテアーゼによって成熟した、機能的に活性のタンパク質の形に分解される。
【０００５】
ポリタンパク質の中で、タンパク質は次のように配列されている（アミノ末端からカルボキシ末端へ）：Ｃｏｒｅ-Ｅ１-Ｅ２-ｐ７-ＮＳ２-ＮＳ３-ＮＳ４Ａ-ＮＳ４Ｂ-ＮＳ５Ａ-ＮＳ５Ｂ。このコア−タンパク質（Core-Protein）はヌクレオキャプシドの主成分である。糖タンパク質Ｅ１及びＥ２は膜貫通タンパク質であり、ウイルス外被の主成分である。このタンパク質は宿主細胞へのウイルスの付着の際におそらく重要な役割があると考えられる。この３種のタンパク質のコア、Ｅ１及びＥ２はウイルス粒子を構築し、従って構造タンパク質として表される。タンパク質ｐ７の機能は未だに明らかではない。タンパク質ＮＳ２はおそらくＮＳ２−３プロテアーゼの接触ドメインであり、これはタンパク質ＮＳ２とＮＳ３との間のプロセシング（Prozesierung）に関与している。タンパク質ＮＳ３は２つの機能を有しており、つまり、アミノ末端のドメインにおいてポリタンパク質プロセシングに不可欠のプロテアーゼ活性を有し、かつカルボキシ末端のドメインにおいてはおそらくウイルスＲＮＡの複製の際に重要な役割があると考えられるＮＴＰａｓｅ／ヘリカーゼ−機能を有する。タンパク質ＮＳ４ＡはＮＳ３−プロテアーゼのコファクターである。タンパク質ＮＳ４Ｂの機能はわかっていない。
【０００６】
このオープンリーディングフレームは、５′末端に約３４０個のヌクレオチドの長さの翻訳されない領域（ＮＴＲ＝non-translated region）があり、これは内部のリボソームエントリー位置（ＩＲＥＳ＝internal ribosome entry site）として機能し、３′末端には約２３０個のヌクレオチドの長さのＮＴＲがあり、これは高い可能性でゲノム複製にとって重要である。このような３′ＮＴＲはＰＣＴ／ＵＳ９６／１４０３３の特許出願の対象である。ポリタンパク質のアミノ末端区域中の構造タンパク質は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼにより分解される。非−構造タンパク質（ＮＳ）２〜（ＮＳ）５Ｂは２つのウイルス酵素によって、つまりＮＳ２−３及びＮＳ３／４Ａプロテイナーゼによってプロセシングされる。このＮＳ３／４ＡプロテイナーゼはＮＳ３のカルボキシ末端の向こう側の全ての分解にとって必要である。ＮＳ４Ｂの役割は未だ明らかではない。ＮＳ５Ａは高度にリン酸化されたタンパク質であり、インターフェロンに対する多様なＨＣＶ−遺伝子型の耐性に関与していると考えられ（Enomoto et al. 1995, J. Clin. Invest. 96, 224; Enomoto et al. 1996, N. Engl. J. Med. 334, 77; Gale Jr. et al. 1997, Virology 230, 217; Kaneko et al. 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205, 320; Reed et al., 1997, J. Virol. 71, 7187参照）、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼとして同定された。
【０００７】
この認識をもとにして、ＲＴ−ＰＣＲ（＝逆転写ポリメラーゼ連結反応）を用いた患者の血清中でのＨＣＶ特異的抗体の検出に基づくか又はＨＣＶ特異的ＲＮＡの検出に基づく診断系が開発され、この診断系は通常の及び／又は規定に従い全ての保存血液において適用しなければならない。
【０００８】
Genoms 1989の最初の記載以来、ＰＣＲ法を用いてＨＣＶの多数の部分配列及び完全配列がクローニングされ、特性決定された。この配列の比較は、ウイルスゲノムの特にＮＳ５Ｂ−遺伝子の領域内での高い変異性を示し、これは最終的に６つの遺伝子系に分類され、これらはさらにサブタイプａ、ｂ及びｃに細分化される。ゲノムの分散はゲノムにわたって均質に分布していない。従って、５′ＮＴＲ及び３′ＮＴＲの一部は高い確率で維持されているが、一方で特定のコードする配列、特にコートタンパク質Ｅ１及びＥ２は現在きわめて著しく変化している。
【０００９】
クローニングされ、特性決定されたＨＣＶゲノムの部分配列及び完全配列はさらに見込みのある抗ウイルス性治療薬のための適当な攻撃標的として研究された。この場合、このような攻撃標的として考えられる３つのウイルス性酵素が発見された。これらは（１）ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ複合体、（２）ＮＳ３ヘリカーゼ及び（３）ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ複合体及びＮＳ３ヘリカーゼはすでに結晶化され、その３次元的構造に関して解明することができており（Kim et al., 1996, Cell, 87, 343; Yem et al., 1998, Protein Science, 7, 837; Love et al., 1996, Cell, 87, 311; Kim et al., 1998, Structure, 6, 89; Yao et al., Nature Structural Biology, 4, 463, Cho et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 15045）、ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの解明が今日までなお成功していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
この酵素を用いた重要な攻撃標的は慢性ＨＣＶ感染の治療法の開発のために定義されているにもかかわらず、かつ「合理的ドラックデザイン」を用いて並びに「高いスループットスクリーニング」を用いて世界的に適当な阻害剤を集中的に探しているにもかかわらず、この治療法の発展は著しい欠乏に直面している、つまり、ＨＣＶ−ＲＮＡ又はＨＣＶ−抗原を直接、信頼できるかつ実験室で通常の簡単な方法で検出できる細胞培養系又は簡単な動物モデルの欠乏に直面している。このような細胞培養系の不足は、ＨＣＶ−複製の理解が今日までなおも不備でありかつかなりの部分で未だ仮説であることに対する主要な原因である。
【００１１】
専門分野の解釈によると、ＨＣＶとフラビウイルス及びペスチウイルスとの間に狭い進化的関連があり、多様な細胞系において簡単に複製することができかつこの場合比較的高い収率が示されている自律複製ＲＮＡについて説明されているにもかかわらず（Khromykh et al., 1997, J. Virol. 71, 1497; Behrens et al., 1998, J. Virol. 72, 2364; Moser et al., 1998, J. Virol. 72, 5318参照）、ＨＣＶを用いた同様な試験は今まで成果がなかった。
【００１２】
ＨＣＶ含有の高力価の（hochtitrig）患者の血清で感染させることができる細胞系又は初代細胞培養は多様な刊行物から公知であるが（Lanford et al. 1994, Virology 202, 606; Shimizu et al. 1993, Procedings of the National Academy of Sciences, USA, 90, 6037-6041; Mizutani et al. 1996, Journal of Virology, 70, 7219-7223; M. Ikeda et al. 1998, Virus Res. 56, 157; Fournier et al. 1998, J. Gen. Virol. 79, 2376及びそこで引用された文献, Ito et al. 1996, Journal of General Virology, 77, 1043-1054）、ウイルス感染された細胞系又は細胞培養はＨＣＶ−ＲＮＡ又はＨＣＶ−抗原は直接検出されなかった。この細胞中のウイルス性のＲＮＡはノーザンブロット（ＲＮＡの定量的検出のための標準的方法）においても検出できず、ウェスタンブロットにおいて又は免疫沈降を用いてもウイルス性タンパク質は検出できない。著しく煩雑でかつ間接的方法を用いて、ＨＣＶ複製を証明することができたにすぎない。この不利な状況は、この公知のウイルス感染した細胞系又は細胞培養中での複製が全く不十分であることを明らかに示している。
【００１３】
さらに、Yoo et al. (1995, Journal of Virology, 69, 32-38)及び Dash et al., (1997, American Journal of Pathology, 151, 363-373）の刊行物から、肝癌細胞系を、クローニングされたＨＣＶ−ゲノムのインビトロ転写を用いて得られた合成ＨＣＶ−ＲＮＡでトランスフェクションできることが公知である。この２つの文献においてこの著者は、ウイルス性ＨＣＶ−ゲノムがプラス鎖−ＲＮＡであり、このＲＮＡは細胞中へ導入した後に直接ｍＲＮＡとして機能し、これにリボソームが付着し、翻訳プロセスの進行においてウイルスタンパク質を形成し、このタンパク質から最終的に新規のＨＣＶ−粒子が形成される（できる）という基本思想から出発している。このウイルス複製、つまり新規に形成されたＨＣＶ−ウイルスもしくはそのＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検出された。しかしながら、実施されたＲＴ−ＰＣＲの発表された結果は、記載されたＨＣＶ−トランスフェクションされた肝癌細胞内でＨＣＶ複製の効率は著しくわずかであり、見込みのある抗ウイルス療法を用いた意図的な影響による複製率における変動を質的に、ましてや定量的に測定するためにはいずれの場合も不十分である。さらに、先行技術において、高保存３′ＮＴＲ（hochkonservierte 3' NTR）はウイルス複製のために不可欠であることは公知であり（Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2291-95, 1999）、このことはＨＣＶ−ゲノムの確かな３′末端を知らずに試験したためもっぱら短縮された３′ＮＴＲを有するＨＣＶ−ゲノムを使用したYoo et al.及びDash et al.の主張と明らかに矛盾している。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この課題の解決策は、冒頭に記載した種類の細胞培養系を提供することにあり、その際、真核細胞はヒト細胞、特に市販の肝癌細胞系から由来するが、同様に相応する初代細胞培養から得ることができる肝癌細胞であり、その際、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料がＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物であり、この構築物は主にＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−断片５′ＮＴＲ，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ及び３′ＮＴＲを、有利に前記の順序で、及び少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）を包含する。「ＮＴＲ」は本願明細書中で「非翻訳領域」を意味し、これは当業者に概念並びに略語として公知及び周知である。「ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物」の概念は本願明細書において完全なＨＣＶ−ゲノムを含有する構築物でも、単にそのＨＣＶ−ゲノムの一部、つまりＨＣＶ−サブゲノムを含有する構築物でもある。
【００１５】
実際に著しく有利である本発明による細胞培養系の有利な変異形は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２３９４の番号の元で（実験室記号ＨｕＢｌ９−１３）ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikrooranismen und Zellkulturen GmbH in Braunschwieg, Deutschland）に寄託されている。
【００１６】
本発明による細胞培養系を用いて初めて、ＨＣＶ−ＲＮＡは細胞内で、自律的に及び十分に大量に複製及び発現され、その結果、ＨＣＶ−ＲＮＡ−量並びにＨＣＶ−特異的タンパク質の定量的測定を通常の、信頼できる正確な生化学的測定方法を用いて実施することができるインビトロ系が提供される。つまり、抗ウイルス性医薬の開発及び検査のために必要なほぼ信頼できる細胞ベース（cell-based）の複製系が提供される。この試験系は有効なＨＣＶ特異的な治療法のための潜在的攻撃標的を同定し、かつＨＣＶ化学療法剤を開発及び評価することを可能にする。
【００１７】
本発明は、少なくとも５′及び３′非翻訳領域（ＮＴＲ）及び非構造タンパク質（ＮＳ）３〜５Ｂを包含し、さらに選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物で細胞をトランスフェクションした場合に、ＨＣＶ−ＲＮＡの有効な複製が細胞中で行われるという意想外な認識に基づく。構造遺伝子が複製の進行のためにあまり重要でなく、他方でこのトランスフェクションされた細胞がＨＣＶ−ＲＮＡと結合した選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）により媒介される永続的な選択圧力を被る場合にのみＨＣＶ−ＲＮＡの有効な複製が引き起こされることは明らかである。マーカー遺伝子（選択遺伝子）は従って、一方でＨＣＶ−ＲＮＡを生産複製する細胞の選択を誘発させ、他方でＲＮＡ−複製の効率を著しく高めると考えられる。
【００１８】
本発明の対象は、ＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−断片５′ＮＴＲ，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ及び３′ＮＴＲを、有利に前記の順序で包含し、さらに選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）を包含するセルフリーのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物でもある。
【００１９】
５′ＮＴＲもしくはＮＳ３もしくはＮＳ４ＡもしくはＮＳ４ＢもしくはＮＳ５ＡもしくはＮＳ５Ｂもしくは３′ＮＴＲの概念は、本願明細書において、先行技術においてＨＣＶゲノムのそれぞれ該当する機能的断片についてのヌクレオチド配列として記載されている各ヌクレオチド配列を表す。
【００２０】
このようなＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の提供が、初めて細胞培養中でのＨＣＶ−複製、ＨＣＶ−発病及びＨＣＶ−進化の詳細な分析を可能にする。ＨＣＶ特異的なウイルス性ＲＮＡは、完全なゲノムとして又はサブゲノムとして、任意の量で意図的に製造でき、ＲＮＡ−構築物を操作し、ひいてはＨＣＶ−機能を遺伝学的レベルで研究及び解明する可能性が生じる。
【００２１】
治療法のための主要な攻撃標的として現在研究されている全てのＨＣＶ−酵素、つまりＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ＮＳ３ヘリカーゼ及びＮＳ５Ｂポリメラーゼは本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に含まれているため、該当する全ての研究のために使用することができる。
【００２２】
実地での適用において著しく良好であるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の実施態様は、配列表の配列番号１によるヌクレオチド配列を包含することを特徴とする。実地での使用のために同等に良好な特性を有する他の実施態様は、配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号４又は配列番号５又は配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９又は配列番号１０又は配列番号１１によるヌクレオチド配列を包含することを特徴とする。
【００２３】
本発明によるＨＣＶ−サブゲノム−構築物は、先行技術において今まで未知のヌクレオチド配列、つまり次に記載するヌクレオチド配列（ａ）〜（ｉ）のグループから選択されるヌクレオチド配列を有する３′ＮＴＲを備えることができる。
【００２４】
【外２】
0004903929.tif 000002
【００２５】
本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に含まれる選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）は有利に耐性遺伝子、特に抗生物質耐性遺伝子である。
【００２６】
これは、例えば抗生物質耐性遺伝子の場合には該当する抗生物質を細胞培地に添加することによって、この構成物でトランスフェクションされた細胞が、トランスフェクションされていない細胞から容易に選択することができるという利点を有する。「抗生物質」とは本願明細書中ではトランスフェクションされていない宿主細胞又はＨＣＶ−ＲＮＡをわずかな効率でしか複製していない細胞の生存及び成長を阻害する物質、特に細胞毒、例えばピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン（Zeocin）、ブレオマイシン又はブラストサイジンであると解釈される。
【００２７】
実地において著しく良好であるとされた特に良好な選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）もしくは耐性遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００２８】
抗生物質耐性遺伝子の他のものは、例えばＨＡＴ−選択を用いて実施することができるチミジン−キナーゼ−遺伝子である。
【００２９】
選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）もしくは有利なは耐性遺伝子もしくは特に有利な抗生物質耐性遺伝子のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中の位置は、有利にＨＣＶ５′ＮＴＲの後方に、つまり５′ＮＴＲの下流にもしくはＨＣＶ−読み枠の上流にある。しかしながら、３′ＮＴＲの領域内又はＨＣＶ−ゲノム又はＨＣＶ−サブゲノムの他の部位、例えばポリタンパク質の範囲内にあることも考えられる。
【００３０】
本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のもう一つの実施態様において、選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）、特に抗生物質耐性遺伝子は、リボザイムを介してもしくはリボザイムに対する認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡもしくはＨＣＶ−ゲノム配列又はサブゲノム配列と結合している。
【００３１】
このために、ＨＣＶ−ＲＮＡを産生複製するような細胞の選択を行うことにより、そこから得られた細胞クローンは耐性遺伝子をＨＣＶ−サブゲノム配列のリボザイム媒介性分解により分離することができることが、つまりクローニングにより組み込まれたリボザイムの活性化によるか、又はリボザイムに対する認識部位を有する構築物の場合には細胞中へリボザイムを（例えばリボザイム構築物のトランスフェクション又は相応するリボザイムが導入されたウイルス性発現ベクターでの感染により）導入することにより分離できることが有利である。このように、確かな感染性ウイルス粒子の形成が可能である耐性遺伝子を有する確かなＨＣＶ−ゲノム−構築物が得られる。
【００３２】
本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のもう一つの有利な実施態様は、構築物が少なくとも１つの組み込まれたリポーター遺伝子を有することにより優れている。
【００３３】
リポーター遺伝子とは、このリポーター遺伝子の存在で目的生物中へ導入することにより容易に及び一般的に簡単な生化学的又は組織化学的方法で検出可能である、つまり少量であっても実験室で通常の測定方法を用いて簡単でかつ確実に検出及び定量化することができるタンパク質をコードするような遺伝子であると解釈される。
【００３４】
ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のこの変異形は、この構築物の複製の程度がリポーター遺伝子産物によって簡単にかつ迅速に実験室で通常の方法により測定できるという利点を有する。
【００３５】
このリポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子のグループ、ＣＡＴ−遺伝子（クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ−遺伝子）、ｌａｃＺ−遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ＧＦＰ−遺伝子（緑色−蛍光−タンパク質−遺伝子）、ＧＵＳ−遺伝子（グルクロニダーゼ遺伝子）又はＳＥＡＰ−遺伝子（分泌−アルカリ性−ホスファターゼ−遺伝子(Sezernerte-Alkalische-Phosphatase-Gen)）からの遺伝子が有利である。このリポーター遺伝子もしくはその産物、つまり相応するリポータータンパク質は、例えば蛍光、化学ルミネッセンス、比色法又は免疫法（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて測定することができる。
【００３６】
リポーター遺伝子として、代理マーカー遺伝子（Surrogatmarkergen）も挙げられる。この遺伝子は本願明細書において、細胞タンパク質、核酸又は一般にウイルス複製に依存するバリエーションの影響下にあるような機能をコードし、かつその結果ＨＣＶもしくはＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を増幅する細胞中で抑制又は活性化される遺伝子と解釈される。つまり、この機能の低下もしくは活性化は、ウイルス複製用のもしくはＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の複製用の代用マーカーである。
【００３７】
リポーター遺伝子及び選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）の位置は、両方の遺伝子産物から形成される融合タンパク質を発現するように選択することができる。この場合、両方の遺伝子がＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に配置されており、両方の発現されたタンパク質は、プロテアーゼ（例えばユビキチン）の切断部位又は自己切断するペプチド（例えばピコルナウイルスの２Ａ−タンパク質）を介して融合されていて、後になってタンパク質分解により再び分離されるという有利な可能性が生じる。
【００３８】
同様に、この両方の位置は、両方の遺伝子産物が別々に発現されるように相互に隔てられていてもよい（例えば次の順序：マーカー遺伝子もしくは耐性遺伝子−内部のリボソーム結合部位−リポーター遺伝子）。
【００３９】
リポーター遺伝子の場合には、リポーター遺伝子がＨＣＶ−ゲノム又はＨＣＶ−サブゲノムのオープンリーディングフレーム中へクローニングにより導入されていて、つまりタンパク質分解のプロセシングによって活性形に変換されるような実施態様が特に有利である。
【００４０】
全てのバリエーションにおける本発明による細胞培養系は多様な目的のために使用することができる。これは次のことを包含する：
・  抗ウイルス性に作用する物質の探索。これは例えば、直接又は間接的にウイルス増加に影響する有機化合物（例えばウイルス性プロテアーゼ、ＮＳ３−ヘリカーゼ、ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤）、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物内の任意の標的配列（例えば５′ＮＴＲ）にハイブリダイズし、ウイルス増加に直接又は間接的に影響するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−配列を分解し、それによりウイルス複製を妨害するＨＣＶ−ポリタンパク質又はリボエンザイムの翻訳の減少に基づく）。
【００４１】
・  細胞培養中での抗ウイルス性に作用する各種の物質の評価。このような物質は例えば単離生成された酵素に関して「合理的ドラックデザイン（rational drug design）」を用いて並びに「高いスループットスクリーニング（high-throughput screening）」を用いて見出すことができる。評価とは、特に相応する物質の阻害特性の測定並びにその作用メカニズムの決定であると解釈される。
【００４２】
・  ＨＣＶ特異的抗ウイルス療法のためのウイルス性又は細胞性の起源の新規の攻撃標的の同定。例えば細胞タンパク質がウイルス増殖のために重要である場合には、この細胞タンパク質の阻害によってウイルス増殖に影響を及ぼすことができる。このような補助的因子の探索は本発明による系を用いて可能である。
【００４３】
・  耐性測定のための使用。ＨＣＶ−ゲノムの高い突然変異誘発率に基づき治療法に対する耐性が生じることがある。このような耐性は物質の臨床的認可の際に重要であり、本発明による細胞培養系を用いて測定できる。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物もしくはＨＣＶ−ゲノム又はサブゲノムを複製する細胞系は、相応する物質の濃度を増加させながらインキュベートし、ウイルスＲＮＡの複製を導入したリポーターにより又はウイルス性の核酸又はタンパク質の定性的又は定量的測定により決定する。ＨＣＶ−ＲＮＡの（例えばＲＴ−ＰＣＲを用いた）再クローニング及び配列分析により治療的耐性に原因のあるヌクレオチド−もしくはアミノ酸交換率を算出することができる。
【００４４】
・  診断薬の開発及び／又は評価のための確かなウイルスタンパク質（抗原）の製造。本発明による細胞培養系は細胞培養中でのＨＣＶ−抗原の発現を可能にする。この抗原は、特に診断検出法の構築のためにも使用できる。
【００４５】
・  特に治療法及びワクチンの開発及び製造のため並びに診断目的のためのＨＣＶウイルス及びウイルス様粒子の製造。本発明による細胞培養系を用いて製造することができる特に細胞培養に適合した完全なＨＣＶ−ゲノムは、細胞培養中で高い効率で複製することができる。このゲノムはＨＣＶの全ての機能を有しており、従って感染性のウイルスを製造できる。
【００４６】
想定される本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は、その全てのバリエーションにおいて多方面の目的のために使用することができる。これには特に次のことが属する：
・  弱毒化Ｃ型肝炎ウイルス又はＨＣＶ様粒子の構築及びその細胞培養中での製造：
偶然又は意図的に引き起こされた突然変異、例えば点突然変異、欠失又は挿入により、弱毒化ＨＣＶ粒子又はＨＣＶ様粒子を製造することができる、つまり完全に複製能力を有するが、病原性は少ないか又は失っているウイルスもしくはウイルス様粒子を製造することができる。このような弱毒化ＨＣＶ粒子又はＨＣＶ様粒子は特にワクチンとして使用可能である。
【００４７】
・  例えば遺伝子治療における肝細胞特異的遺伝子輸送体として使用するための外来遺伝子を組み込まれたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の構築。ＨＣＶの優れた向肝細胞性及びそのゲノムの一部を異種配列に置き換えできるという理由から、例えば構造タンパク質を治療上有効な遺伝子に置き換えたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を製造できる。こうして得られたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は欠損するＨＣＶ機能、例えば構造タンパク質を構成的に又は誘導可能に発現する細胞内へ有利にトランスフェクションによって導入される。「トランス相補性（Transkomplementation）」の概念のもとで当業者に公知のこの技術により、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物が組み込まれたウイルス粒子を製造することができる。こうして得られた粒子は有利に肝細胞に感染させるために使用することができる。この細胞内で治療上有効な外来遺伝子を発現させ、それにより治療作用を発揮させる。
【００４８】
・  生産的なウイルスの増加が行われる許容細胞の探索。この目的のために、完全な感染性ウイルスの形成が可能である前記のＨＣＶ−ＲＮＡ−ゲノム構築物の一つを使用するか、又はこれらの構築物は前記のＨＣＶ−サブゲノム−構築物の一つを使用し前記の例に従って欠損する機能を構成的に又は誘導可能に発現する細胞系中へトランスフェクションされる。この全ての場合に、付加的にＨＣＶ−配列に耐性遺伝子及び／又はリポーター遺伝子を有するウイルス粒子が生じる。ＨＣＶを複製することができる細胞を探索するために、この細胞をこうして製造されたウイルスで感染させ、抗生物質により選択するか又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に依存してリポーター遺伝子の発現の検出を調査する。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を複製する場合、抗生物質耐性もしくはリポーター遺伝子の発現は検出可能であるため、こうして見出された細胞は許容性でなければならない。このように、ほぼ任意の細胞系又は初代細胞がその許容性について試験され、探索される。
【００４９】
本発明による細胞培養系は、ＨＣＶ−ＲＮＡ−複製の範囲内で偶然に生じるか又はこの構築物中へ意図的に導入される突然変異に基づき、複製効率の向上を引き起こすＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の探索を可能にする。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の複製を変化させるこのような突然変異は、当業者には適合突然変異（adaptive Mutationen）として公知である。本発明は従って、細胞培養に適した突然変異体を獲得する方法でもあり、その際、この突然変異体はオリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物と比べて高められた複製効率を有する。本発明はさらに、オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−全長ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−部分ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物と比較して高められた複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−全長ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の突然変異体の製造方法を並びにオリジナルの構築物、部分ゲノム又は全長ゲノムと比較して高められた複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物、ＨＣＶ−全長ゲノム及びＨＣＶ−部分ゲノムを包含する。
【００５０】
突然変異体がＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に比べて高められた複製効率を有する本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得するための本発明による方法は、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が請求項２から８までのいずれか１項記載の選択遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である請求項１記載の細胞培養系を、選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を単離することを特徴とする。
【００５１】
この製造方法の有利な実施態様において、単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は新たに少なくとも１回継代される、つまり請求項１による細胞培養系の細胞に導入され、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が選択遺伝子を有する単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である請求項１によるその際得られた細胞培養系を選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、このクローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を単離する。
【００５２】
この変更された方法を用いて適合突然変異の程度ひいては複製効率の程度は該当するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中でなお高めることができる。
【００５３】
オリジナルのＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物と比較して高められた複製効率を有するＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の突然変異体を製造する本発明による方法は、前記の２つの製造方法を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を製造し、これを細胞から単離し、先行技術において公知の方法でクローニングし、配列決定し、オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と比較して、突然変異の種類、数、及び位置を決定し、かつこの突然変異を意図的な突然変異誘発又は該当する突然変異を有する配列断片の置換により、（単離された）ＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中へ導入することを特徴とする。
【００５４】
実際に複製を変化させる及び特に複製を向上させる突然変異の検出もしくは照合のために、特定のヌクレオチド置換及び／又はアミノ酸置換をオリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物内へ導入し、これを再び細胞培養中へ導入する試験を実施することができる。導入された突然変異が実際に複製を向上させる場合には、選択可能なマーカー遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の場合に、人工的に突然変異誘発された構築物において耐性の細胞クローンの数が未処理の構築物の際よりも明らかに高くなる。
【００５５】
高められた複製効率を有する本発明による細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は、ヌクレオチド置換及び／又はアミノ酸置換により請求項２から８のいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物から誘導可能であり、２つの前記製造方法を用いて得ることができることを特徴とする。
【００５６】
この細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は、高められた複製効率を有する任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物又はＨＣＶ−全長ゲノム又は部分ゲノムを製造するために使用することができる。この場合、選択可能な耐性遺伝子を有する構築物並びにこのような耐性遺伝子なしのもしくは選択可能なリポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）を有する構築物を製造することができる、それというのも細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の高い複製効率に基づき、この複製を選択されていない細胞中でも検出することができるためである。
【００５７】
オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物又はオリジナルのＨＣＶ−全長ゲノムと比較して高められた複製効率を有する、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物又はＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノムの本発明による細胞培養に適合した突然変異体は、細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に、配列分析及び配列比較により、突然変異の種類及び数を決定し、この突然変異をＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中へ、特に請求項２から８までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中へ意図的な突然変異誘発によるか又は該当する突然変異を有する配列断片の置換により導入する方法により得られることを特徴とする。
【００５８】
高いか又は著しく高い複製効率及び実地の適用のために著しく良好な適性を有する特に有利なＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物、ＨＣＶ−全長ゲノム及びＨＣＶ−部分ゲノムのグループは、これが表３に記載した全てのアミノ酸置換もしくはヌクレオチド置換及び／又は次の１以上のアミノ酸置換：
１２８３  ａｒｇ  −＞  ｇｌｙ、  １３８３  ｇｌｕ  −＞  ａｌａ、１５７７  ｌｙｓ  −＞  ａｒｇ、１６０９  ｌｙｓ  −＞  ｇｌｕ、１９３６  ｐｒｏ  −＞  ｓｅｒ、２１６３  ｇｌｕ  −＞  ｇｌｙ、２３３０  ｌｙｓ  −＞ｇｌｕ、２４４２  ｉｌｅ  −＞ｖａｌ（この数はＨＣＶ−単離体ｃｏｎ１のポリタンパク質のアミノ酸位置に関する、表１参照）を有することを特徴とする。
【００５９】
配列表に示される配列の個々の特性
配列番号：１
名称：Ｉ３８９／Ｃｏｒｅ−３′／ｗｔ
構造（ヌクレオチド位置）：
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜１０８４２：コアから非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構造タンパク質
６．  ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エンベロープタンパク質１）；構造タンパク質
７．  ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エンベロープタンパク質２）；構造タンパク質
８．  ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７
９．  ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ
１０．  ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
１１．  ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
１２．  ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
１３．  ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
１４．  ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１５．  １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：２
名称：Ｉ３７７／ＮＳ２−３′／ｗｔ
構造（ヌクレオチド位置）：
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１８１：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １１９０〜１８００：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８０１〜８４０３：非構造タンパク質２から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８０１〜２４５１：非構造タンパク質２（ＮＳ２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ
６．  ２４５２〜４３４４：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
７．  ４３４５〜４５０６：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
８．  ４５０７〜５２８９：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
９．  ５２９０〜６６３０：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
１０．  ６６３１〜８４０３：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１１．  ８４０７〜８６３７：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：３
名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／ｗｔ
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜７７６７：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
６．  ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
７．  ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
８．  ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
９．  ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１０．  ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：４
名称：Ｉ３７７／ＮＳ３−３′／ｗｔ
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１８１：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １１９０〜１８００：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８０１〜７７５８：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８０１〜３６９６：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
６．  ３６９７〜３８５８：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
７．  ３８５９〜４６４１：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
８．  ４６４２〜５９８２：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
９．  ５９８３〜７７５５：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１０．  ７７５９〜７９８９：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：５
名称：Ｉ３８９／ＮＳ２−３′／ｗｔ
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜８４１８：非構造タンパク質２から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜２４６３：非構造タンパク質２（ＮＳ２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ
６．  ２４６４〜４３５６：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
７．  ４３５７〜４５１８：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
８．  ４５１９〜５３０１：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
９．  ５３０２〜６６４２：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
１０．  ６６４３〜８４１５：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１１．  ８４１９〜８６４９：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：６
名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／９−１３Ｆ
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜７７６７：細胞培養に適合した突然変異体９−１３Ｆの非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
６．  ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
７．  ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
８．  ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
９．  ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１０．  ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：７
名称：Ｉ３８９／ｃｏｒｅ−３′／９−１３Ｆ
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜１０８４２：細胞培養に適合した突然変異体９−１３Ｆのコアから非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構造タンパク質
６．  ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エンベロープタンパク質１）；構造タンパク質
７．  ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エンベロープタンパク質２）；構造タンパク質
８．  ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７
９．  ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ
１０．  ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
１１．  ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
１２．  ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
１３．  ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
１４．  ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１５．  １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：８
名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／５．１
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜７７６７：細胞培養に適合した突然変異体５．１の非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
６．  ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
７．  ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
８．  ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
９．  ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１０．  ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：９
名称：Ｉ３８９／ｃｏｒｅ−３′／５．１
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜１０８４２：細胞培養に適合した突然変異体５．１のコアから非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構造タンパク質
６．  ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エンベロープタンパク質１）；構造タンパク質
７．  ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エンベロープタンパク質２）；構造タンパク質
８．  ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７
９．  ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ
１０．  ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
１１．  ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
１２．  ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
１３．  ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
１４．  ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１５．  １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：１０
名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／１９
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜７７６７：細胞培養に適合した突然変異体１９の非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
６．  ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
７．  ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
８．  ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
９．  ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１０．  ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域
配列番号：１１
名称：Ｉ３８９／ｃｏｒｅ−３′／１９
構造（ヌクレオチド位置）
１．  １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域
２．  ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；選択可能なマーカー
３．  １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部のリボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする
４．  １８１３〜１０８４２：細胞培養に適合した突然変異体１９のコアから非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質
５．  １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構造タンパク質
６．  ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エンベロープタンパク質１）；構造タンパク質
７．  ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エンベロープタンパク質２）；構造タンパク質
８．  ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７
９．  ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ
１０．  ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（ＮＳ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ
１１．  ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター
１２．  ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）
１３．  ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）
１４．  ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
１５．  １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳領域
本発明を以下に実施例ならびにそれに付属する表および図に基づいて詳細に説明する。挙げられる図は以下のことを示す。
【００６０】
図１Ａ：本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の構造
一番上に、完全な親ＨＣＶゲノムの構造の略図をポリタンパク質内の分割産物コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂのための遺伝子の位置、ならびに５′および３′非翻訳領域（５′ＮＴＲおよび３′ＮＴＲ）（水平のバーとして示した）、およびサブゲノム構築物の製造のために選択される両方の位置、すなわちＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼの“ＧＤＤ触媒ドメイン”の位置（ＧＤＤ）およびＨＣＶ−ＩＲＥＳの３′境界部の位置（ヌクレオチド位置１〜３７７もしくは１〜３８９）（ゲノム略図の上方に示した）と一緒に与えた。ゲノム略図の下方の数字は相当するヌクレオチド位置を示している。
【００６１】
前記略図の下に、５′ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏR）、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（Ｅ−Ｉ）およびＮＳ２もしくはＮＳ３から確かな３′末端までのＨＣＶ配列からなる本発明による２つの改変したＨＣＶ−ＲＮＡ構築物（サブゲノム）の略図を示している。ＮＳ５ＢポリメラーゼＧＤＤモチーフを含む１０アミノ酸の欠失位置をそれぞれ三角形（Δ）で印す。
【００６２】
図１Ｂ：トランスフェクションして継代培養されたＨｕｈ−７細胞クローンにおける複製されたプラス鎖ＲＮＡの検出のための変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動の結果
ＨＣＶ特異的ＲＮＡの位置（矢印）および２８Ｓ ｒＲＮＡの位置をレーン１２の右側に示し、ＲＮＡマーカー（Ｍ）のサイズ（ヌクレオチド数）をレーン１の左側に示した。
【００６３】
図１Ｃ：選択された大部分の細胞クローンにおいて導入されたレプリコンＤＮＡが存在しないことを証明するための引き続きのサザンブロットによるＰＣＲ試験の結果
レーン１およびレーン２はポジティブコントロールを示し、レーン１３はネガティブコントロールを示している。レーン１の左に示された数字はヌクレオチドマーカー分子のサイズを明示している。
【００６４】
図２Ａ：ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を有する細胞クローン（９−１３）における導入されたレプリコンＤＮＡ（プラスミド分子Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔ）の高感度の排除のための引き続きのサザンブロットによるＰＣＲ試験の結果
レーン７〜レーン１１は細胞クローン９−１３の全ＤＮＡを添加しない構築物Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔのＤＮＡ分子の検量の結果を表し、かつレーン２〜レーン６はＰＣＲ前にその都度１μｇの９−１３ＤＮＡを添加した（ＤＮＡ調製におけるＰＣＲのインヒビターの排除のため）同一のプラスミド分子を表す。レーン１３はネガティブコントロール（ＤＮＡプローブ無しでのＰＣＲ）を表す。
レーン１は細胞クローン９−１３の全ＤＮＡ１μｇを使用して得られた結果を示している。
【００６５】
図２Ｂ：ＨＣＶのプラス鎖ＲＮＡおよびマイナス鎖ＲＮＡの定量のためのノーザンブロット試験の結果
矢印はレプリコンＲＮＡの位置を印している。“プラス”および“マイナス”の移行はゲル上に載せられたＲＮＡコントロールの正（プラス）の極性もしくは負（マイナス）の極性を表す。“マイナス鎖”および“プラス鎖”は放射性ＲＮＡプローブの特異性を表す。
【００６６】
図２Ｃ：ＨＣＶ−ＲＮＡ複製のダクチノマイシンに対する耐性を証明するための細胞内で複製されたＨＣＶ−ＲＮＡの放射性標識後のホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動の結果
図３Ａ：代謝放射性標識後の免疫沈降による選択された細胞クローンにおけるＨＣＶ特異抗原の検出
レーン７〜レーン９は確かなサイズマーカー（Ｈｕｈ−７細胞中でのＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の一過性発現後に得られた）を表し、同定されたＨＣＶタンパク質はレーン１の左端に印し、分子量（キロダルトン）はレーン９の右側に示した。
【００６７】
図３Ｂ：ＨＣＶ抗原の細胞内での所在の検出のための免疫蛍光試験の結果
図４：５′ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏR）、異種の、例えば脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ−エレメント（Ｅ−Ｉ）、完全なＨＣＶ読み枠および確実な３′ＮＴＲからなる、本発明による選択可能なＨＣＶ−ＲＮＡ構築物（完全なゲノム）の構造の略図
図５：ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列内に挿入された抗生物質耐性遺伝子（単シストロン性ＲＮＡ）（Ａ）および３′ＮＴＲ内に挿入された抗生物質耐性遺伝子（２シストロン性ＲＮＡ）（Ｂ）を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図
図６：ＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＨＣＶレプリコンの一部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ａ）（そのリポータータンパク質は最終的にはウイルスまたは細胞のプロテアーゼによってポリタンパク質から分離され、かつ選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）もしくは耐性遺伝子は同時トランスフェクションによって細胞中に導入される）、耐性遺伝子およびリポーター遺伝子（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質のための遺伝子）からなる融合遺伝子の一部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｂ）、耐性遺伝子およびリポーター遺伝子（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質のための遺伝子）からなるレプリコンの一部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｃ）（これらはプロテアーゼによって分解できるかまたは自己分解（自己触媒）活性を有するアミノ酸配列（斜線の範囲）をコードするヌクレオチド配列中を介して結合している）、自体の内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）から発現される独立の遺伝子（ここでは緑色蛍光タンパク質）として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｄ）（耐性遺伝子（ここではネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）は自体の内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）から独立して同様に発現される）（複シストロン性構築物）の略図
図７：耐性遺伝子がリボザイムもしくはリボザイムのための認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡ配列と結合しているＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図
太い線はＨＣＶの５′および３′のＮＴＲを意味し、Ｅ−Ｉは耐性遺伝子の発現のために必須の異種の内部リボソーム結合部位であり、灰色の正方形はリボザイムもしくはリボザイムの認識部位を意味する。
【００６８】
図８：耐性遺伝子および組み込まれた外来遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図
図９：全ＲＮＡとインビトロ転写物との比感染力（形成した細胞コロニーの数として示した）の比較のための方法プロセス
ＨＣＶ−ＲＮＡを相応のＲＮＡ構築物のインビトロ転写によって製造し、２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ２６０ｎｍ）の測定によって定量した。これらの分子の規定された数をナイーヴＨｕｈ−７細胞の全ＲＮＡの一定量と混合し、かつこれらの混合物をエレクトロポレーションを使用してナイーヴＨｕｈ−７細胞中に導入した。それに並行して、図１に記載される方法によって製造された細胞クローンの全ＲＮＡを従来の技術において公知の方法で単離し、かつそれに含有されるＨＣＶ−ＲＮＡの量をＨＣＶ特異的なＲＮＡプローブを使用するノーザンブロットおよび引き続きのホスホイメージャー（Phosphoimager）による定量によって決定する。全ＲＮＡの規定された量をインビトロ転写物と類似にネイティブなＨｕｈ−７細胞中にトランスフェクションさせた。次いで両方のバッチ中の細胞はＧ４１８選択を実施し、かつ形成したコロニーの数を、固定およびクーマシーブリリアントブルーでの染色の後に計数することによって決定した。トランスフェクション効率の決定のために、各トランスフェクションバッチにルシフェラーゼの発現を可能にするプラスミド１μｇを添加した。トランスフェクションした細胞のアリコートを２４時間後に収穫し、かつ各細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を決定した。コロニーの数はその都度ルシフェラーゼ発現に基づいて規格化した。
【００６９】
図１０：９−１３クローンの配列分析
ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物Ｉ３７７／ＮＳ３−３′のトランスフェクションによって生じる細胞クローン９−１３の全ＲＮＡを従来の技術において公知の方法を使用して単離し、かつヌクレオチド位置５９〜９３８６までのＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を“長距離ＲＴ−ＰＣＲ（long-distance RT-PCR）”を使用してプライマーＳ５９およびＡ９４１３の使用下に増幅させた。ＰＣＲ断片をクローニングし、かつ１１個のクローン（９−１３Ａ〜Ｋと呼ぶ）を完全に配列決定し、その際、クローンＤおよびクローンＩ、クローンＥおよびクローンＧならびにクローンＨおよびクローンＪは同一であると証明された。再クローニングされたＨＣＶ−ＲＮＡと親構築物の間のＮＳ３−５Ｂ領域におけるアミノ酸差異の位置はそれぞれのクローンにおいて太い垂線で印した。各クローンを制限酵素ＳｆｉＩで消化し、かつそれぞれの断片を親構築物に挿入した。これらのクローンをそれぞれのＨｕｈ−７細胞にトランスフェクションし、該細胞を図１に記載のように選択した。各構築物によって得られる細胞クローンの数は各構築物の右隣に印した。
【００７０】
図１１Ａ：リポーター遺伝子の使用による複製アッセイの原理
この図の上方部分においては、ＨＣＶ５′ＮＴＲ（ヌクレオチド位置１〜３８９）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ、ＨＣＶＮＳ３−５Ｂおよび３′ＮＴＲからなるＨＣＶ−ＤＮＡ構築物Ｉ389／Ｌｕｃ／ＮＳ３−３′が示されている。不活性化するアミノ酸の交換が導入されたＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼの活性中心の位置は“ＧＮＤ”で示した。複製能力のあるＨＣＶ−ＲＮＡ構築物もしくは欠失ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物をコードするプラスミドをＳｃａＩで消化し、かつＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写において使用した。鋳型ＤＮＡの除去後に、それぞれのＨＣＶ−ＲＮＡ構築物をエレクトロポレーションによってナイーヴＨｕｈ−７細胞中に導入し、これらを規則的な間隔で収穫した。
【００７１】
図１１Ｂ：親ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物Ｉ389／Ｌｕｃ／ＮＳ３−３′／ｗｔ（ｗｔ）または以下の変異体：不活性ＲＮＡ（３１８ＤＮ）、変異体９−１３Ｆもしくは変異体５．１でトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性の比較
細胞を、トランスフェクション後の６時間（示されていない）、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間および１６８時間に収穫し、かつルシフェラーゼ活性を発光測定的に決定した。
【００７２】
図１２：選択可能なＨＣＶ全長ゲノム（構築物Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１およびＩ389／ｃｏｒｅ−３′／９−１３Ｆ）
（Ａ）全長構築物の略図。制限酵素ＳｆｉＩのための２つの示される認識部位間の範囲は高度に適合したＲＮＡ変異体５．１または９−１３Ｆの配列に相当する。
【００７３】
（Ｂ）Ａに示される構築物Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１のインビトロ転写されたＲＮＡ各０．１μｇでＨＵＨ７細胞にトランスフェクションした後に得られるコロニーの数。代表的な試験の結果を挙げている。
【００７４】
（Ｃ）相応のインビトロ転写物のトランスフェクション後に得られるＧ４１８耐性細胞クローンにおける自律的に複製されるＨＣＶ−全長ＲＮＡの検出。図はｎｅｏ−耐性遺伝子およびＨＣＶ５′ＮＴＲに対するプローブとハイブリダイズしたノーザンブロットのオートラジオグラムを示している。レーン１およびレーン２に示されるコントロールは、ナイーヴＨｕｈ−７細胞からの全ＲＮＡと混合された挙げられるインビトロ転写物の各１０8分子に相当する。ネガティブコントロールはナイーヴＨｕｈ−７細胞（レーン３）からの全ＲＮＡを専ら有している。レーン４〜９は、インビトロ転写されたＩ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１−ＲＮＡもしくはＩ389／ｃｏｒｅ−３′／９−１３Ｆ−ＲＮＡでトランスフェクションした後に得られたＧ４１８耐性細胞クローンからの全ＲＮＡ３〜１０μｇを含有している。選択のために使用されるＧ４１８濃度をその都度挙げている。示される５個の細胞クローンは高度に適合したＲＮＡ変異体５．１（レーン４〜８）を有し、１個の細胞クローンは適合したＲＮＡ変異体９−１３Ｆ（レーン９）を有している。
【００７５】
図１３：１つのリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物。（Ａ）２シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物。リポーター遺伝子を別々のＩＲＥＳを使用して翻訳した。（Ｂ）単シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物。リポーター遺伝子産物をＨＣＶタンパク質との融合タンパク質として発現させた。２つの成分をウイルスのプロテアーゼもしくは細胞のプロテアーゼのための融合された２つのタンパク質成分のタンパク質分解による分離を可能にする認識配列を介して結合させる。示される例ではリポーター遺伝子産物およびそれぞれのＨＣＶタンパク質をユビキチン（Ｕｂ）のための認識配列を介して融合させた。
【００７６】
図１４：耐性遺伝子に付加的に、挿入された外来遺伝子を有している３シストロン性のＨＣＶ−全長ＲＮＡ構築物。
【００７７】
図１５：耐性遺伝子がＨＣＶ成分を有する融合タンパク質として発現する単シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物。耐性遺伝子（ＲＧ）は融合タンパク質として活性であるか、または該遺伝子を、耐性遺伝子産物がＨＣＶ成分の細胞性もしくはウイルス性のプロテアーゼによって分解されるように、ＨＣＶ成分を有するタンパク質分解可能な配列と融合する。示される例では、耐性遺伝子を、ユビキチン（Ｕｂ）をコードする配列を介してそれぞれのＨＣＶ成分と融合させた。
【００７８】
【実施例】
例１：ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の製造
（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲを用いた完全ＨＣＶ−コンセンサスゲノムの合成およびクローニング
慢性に感染した患者の肝臓から、ＨＣＶ−ゲノム、つまりＨＣＶ−ＲＮＡを以下の通りに単離した：
肝臓約１００ｍｇからChomczynskiおよびSacci(1987, Anal. Biochem. 162, 15)の方法により完全ＲＮＡを単離した。単離したこのＲＮＡ１μｇを用いて、プライマーＡ６１０３（ＧＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣ）またはＡ９４１３（ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧ）を有し、かつエキスパンドリバーストランスクリプターゼ(expand reverse transcriptase)システム（Boehringer Mannheim、ドイツ）を用いた逆転写を製造元の指示に従って実施した。この逆転写（ＲＴ）生成物を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ＝polymerase chain reaction)を、エキスパンドロングテンプレート(expand long template)システム（Boehringer Mannheim、ドイツ）の使用下で実施し、その際、ジメチルスルホキシド２％の含有率を有する緩衝液を使用した。４２℃で１時間の後、この反応バッチの１／８を、プライマーＡ６１０３およびＳ５９（ＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ）、またはＡ９４１３およびＳ４５４２（ＧＡＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＣＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣ）とともに第一のＰＣＲのサイクルにおいて使用した。４０サイクル後に、この反応バッチの１／１０を、プライマーＳ５９およびＡ４９１９（ＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＴＣＡＴＡＧＣＡＣＴＣＧ）、またはＳ４５４２およびＡ９３８６（ＴＴＡＧＣＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧ）とともに第二のＰＣＲのサイクルにおいて使用した。３０サイクル後に分離用アガロースゲル電気泳動を用いてＰＣＲ生成物を精製し、かつその際に溶離した断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）またはｐＢＳＫＩＩ（Stratagene）中でライゲーションした。それぞれの断片からの４つのクローンを分析し、かつ配列決定し、かつコンセンサス配列を確認した。この目的のためにＤＮＡ配列を相互に比較した。断片の１つの配列が残りのものと異なる位置を、不所望の突然変異と見なした。配列が多義性である場合、該当する領域の自体オーバーラップしている比較的短いＰＣＲ断片を増幅し、かつ複数のクローンを配列決定した。このようにしてそれぞれの断片中の数多くの潜在的な突然変異を同定し、ひいては単離物−特異的なコンセンサス配列を確定することができた。確定されたこのコンセンサス配列もしくはこのゲノムは、世界的に普及している遺伝子型１ｂに属する。３′末端における翻訳されなかった領域（＝３′ＮＴＲ）が通常のＰＣＲにより得られ、その際、従来技術において公知の「Ｘ−テール(X-tails)」（Tanaka et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commum. 215, 744およびRice,ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４０３３）の最後の２４のヌクレオチドを覆うアンチセンス−プライマーを使用した。ＰＣＲを用いてＴ７プロモーターの鎖の下流の５′−末端（＝５′ＮＴＲ）における確立された非翻訳領域を発生させ、その際、一方では短縮したＴ７プロモーター（ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ）およびＨＣＶの第一の８８のヌクレオチドに相当するオリゴヌクレオチドを使用し、かつ他方ではゲノムの５′断片の１つを有する前記のプラスミドを使用した。非コンセンサス交換の数が極めて少ないサブゲノム断片から、完全ＨＣＶ−コンセンサスゲノムを構成し、かつ改変したｐＢＲ３２２−ベクターに挿入した。部位特異的突然変異(site-directed mutagenesis)��用いてコンセンサス配列からの差異を排除した。確定された３′末端を有する「ラン−オフ(run-off)」転写を製造するために、単離物の３′−ＮＴＲ（末端ＴＧＴを有する）をＡＧＴに変性し（Kolykhalov et al., 1996, J. Virol. 70, 3363による遺伝子型３＝クローン’ＷＳ’の配列による）、かつさらに付加的なヌクレオチド交換を位置９５６２において行い、ＡＴ塩基対を３′ＮＴＲ（Kolyhalov et al., ibid.）の３′末端におけるヘアピン構造中に保持した。酵素Ｓｃａ１のための内部の制限部位を排除するために、さらにいわゆる発現しない(silent)ヌクレオチド交換を行った。適合した５′ＮＴＲおよび３′ＮＴＲを有する全長のゲノムの連結後に、完全ＨＣＶ配列を調査した。その際、不所望のヌクレオチド交換は発見されなかった。
【００７９】
このようにして製造したＨＣＶゲノムは、定義によれば向肝性(hepatotrop)であるべきである。
【００８０】
（Ｂ）選択可能なＨＣＶ−サブゲノム構築物の合成
（Ａ）に記載したコンセンサスゲノムの使用下に、抗生物質耐性遺伝子のネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）および内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）の２つの配列を有するＨＣＶ−サブゲノム−構築物を製造した。このために使用した生化学的なプロセス技術は、当業者に公知であり、かつ周知である（次の文献を参照のこと：Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecularcloning: a laboratory manual., 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (eds.), 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-3, John Willey & Sons Inc., New York）。抗生物質耐性遺伝子を直接５′ＮＴＲの後ろに挿入し、このことにより２シストロンのＲＮＡが得られた（図１Ａを参照のこと）。しかしまた抗生物質耐性遺伝子はＨＣＶ−サブゲノム−構築物の別の部位、例えばポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列の内部にもまた同様に良好に挿入することができ、このことにより単シストロンのＲＮＡが得られる（図５Ａを参照のこと）か、または３′ＮＴＲ中に挿入する（図５Ｂを参照のこと）。ＩＲＥＳ−エレメントは一方では両方のＨＣＶ−ＩＲＥＳ−変異体ヌクレオチド１−３７７またはヌクレオチド１−３８９の１つであり、かつ他方ではＮＳ２またはＮＳ３に関する遺伝子の鎖の下流にゲノムの確かな３′末端までＨＣＶ配列の翻訳を制御するエンゼファロマイオカルディティス(Enzephalomyocarditis)ウイルスのＩＲＥＳである。
【００８１】
前記の両方のＨＣＶ−ＩＲＥＳ−変異体を以下の通りに確認した：
ＨＣＶ−ＩＲＥＳの３′境界部の欠失分析法（Reynolds et al., 1995, EMBO J. 14, 6010）に基づいて、５′ＮＴＲの種々の断片をＮＰＴ遺伝子と融合し、かつＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有しているプラスミドとの同時トランスフェクションに基づいて、形成されたコロニーの最大数に関して分析した。１−３７７および１−３８９のＨＣＶ配列で最良の結果が得られた。ＨＣＶポリタンパク質のＡＵＧ出発コードは位置３４２に存在し、ひいてはＩＲＥＳ配列中に含有されているので、ＨＣＶ−カプシドタンパク質（コアタンパク質(Core-Proeins)）の１２個もしくは１６個のアミノ酸とネオマイシンホスホトランスフェラーゼとが融合する（図１Ａを参照のこと）。
【００８２】
従ってこの改変されたＨＣＶ−サブゲノム−構築物は名称Ｉ377／ＮＳ２−３′（またはＩ377／ＮＳ３−３′）およびＩ389／ＮＳ２−３′（またはＩ389／ＮＳ３−３′）を有していた。これらは図１Ａに図示されている。
【００８３】
これらの改変された親ＨＣＶ−サブゲノム−構築物Ｉ377／ＮＳ２−３′（またはＩ377／ＮＳ３−３′）およびＩ389／ＮＳ２−３′（またはＩ389／ＮＳ３−３′）のインビトロ−転写を用いて、ヒトの肝細胞の種々の細胞系および一次細胞培養をトランスフェクションした。
【００８４】
すべてのトランスフェクション実験に並行するネガティブコントロールとして、それぞれの改変親ＨＣＶ−サブゲノム−構築物に対して、１つの相応して改変したが、しかしサブゲノムは読み枠中で、ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡポリメラーゼの活性中心を含む１０個のアミノ酸の欠失を有していることにより親サブゲノムから区別される欠損サブゲノムを構成した（Behrens et al., 1996, EMBO J. 15, 12; およびLohmann et al., 1997, J. Virol. 71, 8416）。
【００８５】
（Ｃ）選択可能なＨＣＶ−ゲノム−構築物の合成
５′末端でルシフェラーゼ遺伝子の断片および完全ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳと結合しているＮＳ２−３′サブゲノム構築物を、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩで制限し、かつ分離用アガロースゲル電気泳動を用いて精製した。このようにして得られたベクターを３ファクターライゲーションにおいて、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ＨＣＶ−断片を用いてＨＣＶ−ゲノムのヌクレオチド位置３４２〜１９６８に相応して、およびＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ−断片を用いてヌクレオチド位置１９６８〜９６０５に相応してライゲーションした。その後、完全ＨＣＶ−読み枠および３′ＮＴＲがルシフェラーゼ遺伝子断片およびＥＭＣＶ−ＩＲＥＳの下流に存在している得られた構築物を、ＰｍｅＩおよびＳｐｅＩで制限し、かつ同様に制限したＩ389／ＮＳ３−３′／ｗｔ−サブゲノム構築物ベクターを用いてライゲーションした。選択可能なこのＨＣＶ−ゲノム構築物が図４に記載されている。
【００８６】
（Ｄ）ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に相応したインビトロ転写物の製造
前記の精製したプラスミドＤＮＡを、ＳｃａＩを用いて直線状にし、かつフェノール／クロロホルム−抽出およびイソプロパノール−沈殿後に次の成分の使用下にインビトロ−転写反応で使用した：ＨＥＰＥＳ８０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ2  １２．５ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ジチオトレイトール４０ｍＭ、それぞれのＮＴＰから２ｍＭ、ＲＮａｓｉｎ  １ユニット／μｌ、制限ＤＮＡ５０μｇ／ｍｌおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ約２ユニット／μｌ。３７℃で２時間後にＴ７ポリメラーゼの半量を添加し、かつ反応バッチをさらに２時間インキュベーションした。ＤＮＡの除去のために、該混合物を酸性フェノールで抽出し（U. Kedzierski, J.C. Porte, 1991, Bio Techniques 10, 210）、イソプロパノールで沈殿し、ペレットを水中に溶解し、かつＤＮａｓｅ（ＤＮＡμｇあたり２ユニット）とともに３７℃で６０分間インキュベーションした。酸性フェノール、酸性フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いたその後の抽出およびイソプロパノール−沈殿の後、溶解したＲＮＡを光学密度測定により定量化し、かつその不確定性をホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動により調査した。
【００８７】
例２：肝癌細胞系Ｈｕｈ−７を用いたトランスフェクション実験
すべてのトランスフェクション実験において、それぞれの鋳型ＤＮＡをあらかじめ除去して、該ＤＮＡがトランスフェクションした細胞に導入され、かつＨＣＶの複製とは無関係にこれらにネオマイシン耐性を媒介することができるということを回避することに慎重に注意を払った。従ってインビトロ−転写（例１Ｄ）に引き続き、ＤＮＡμｇあたり、ＤＮａｓｅ２ユニットを用いて反応混合物を３７℃で６０分間処理し、かつ酸性フェノール、酸性フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いて抽出した。トランスフェクションのための使用前に、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動を用いて沈殿したＲＮＡを分析した。
【００８８】
高度に分化したヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ−７を用いて３つの別々のトランスフェクション実験を実施した（Nakabayashi et al., 1982, Cancer Res. 42, 3858）。その際、エレクトロポレーションを用いてその都度ＲＮＡ１５μｇを８×１０6ＨｕＨ−７−細胞中に導入し、かつこれらの細胞を引き続き直径１０ｃｍの培養皿に播種した。播種の２４時間後に、ネオマイシン（＝Ｇ４１８）を最終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加した。培地を週に２回交換した。３〜５週間後に小さいコロニーが認識され、これを単離し、かつ同一の培養条件下で継代した。
【００８９】
第一の実験の経過において得られた細胞クローンを単離し、かつ継代培養した。この手順においてほとんどのクローンが死滅し、かつ最終収率は親ＨＣＶサブゲノム構築物でトランスフェクションされていた細胞クローンがわずか９および欠損ＨＣＶ−ゲノム−構築物、つまり欠損ＮＳ２−３′ＨＣＶ−ＲＮＡでトランスフェクションされていた細胞クローン１（クローン８−１）であった。短縮された倍増時間および不規則に形成された細胞が時折出現すること以外に、これらの９の細胞クローンと１の細胞クローン（クローン８−１）又は親Ｈｕｈ−７細胞の間には安定した形態学的な相違は見られなかった。
【００９０】
機能性ＨＣＶ−ゲノム構築物に関する主な基準は、正確な大きさを有するウイルスＲＮＡの形成およびＧ４１８−耐性を転写されたか、もしくは媒介された可能性のある（組み込まれた）プラスミドＤＮＡの不在である。
【００９１】
Ｈｕｈ−７−細胞中でＨＣＶ−ＲＮＡを決定するために、全ＲＮＡを単離し、かつ慣用のノーザンブロット法を用いてプラス鎖−特異的なリボプローブ(Ribosonde)（ＲＮＡ−プローブ）の使用下に分析した。このためにChomczynskiおよびSacci, 1987, Anal. Biochem. 162, 156の方法によりそれぞれの細胞クローンから全ＲＮＡを単離し、変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動法を用いて全ＲＮＡ含有率０．５〜１×１０6細胞に相当するＲＮＡ１０μｇを分離した（図１Ｂのレーン３〜１２）。確かな配列を有するサイズマーカーとして、Ｉ389／ＮＳ２−３′／ｗｔまたはＩ389／ＮＳ３−３′／ｗｔレプリコンＲＮＡに相応する１０9のインビトロ−複写を同時に分離した（レーン１もしくはレーン２）。分離したＲＮＡをナイロンメンブランに移し、かつヌクレオチド３７７〜ヌクレオチド１の完全ＮＰＴ−遺伝子およびＨＣＶ−ＩＲＥＳに対して相補性に放射性標識したプラス鎖−特異的なＲＮＡ−プローブを用いてハイブリダイゼーションした。ＨＣＶ−特的なＲＮＡ（矢印）および２８ＳｒＲＮＡの位置は、レーン１２の右側に記載されており、ＲＮＡマーカーの大きさ（ヌクレオチドの数）は、レーン１の左側に記載されている。ＲＮＡマーカーの断片は、ＨＣＶ配列を有しており、かつ従ってリボプローブとハイブリダイゼーションする。この分析の結果は図１Ｂに記載されている。
【００９２】
欠損ＨＣＶ−ゲノム−構築物を用いてトランスフェクションしたクローン８−１を例外として、すべての細胞クローンは正確な長さの均質なＨＣＶ−ＲＮＡを産出した（ＮＳ２−３′の場合、約８６４０のヌクレオチドおよびＮＳ３−３′レプリコンの場合、約７９７０のヌクレオチド）。この調査は、機能性レプリコンもしくは機能性ＨＣＶ−ゲノム−構築物が、Ｇ４１８耐性を転写するということの指標である。Ｇ４１８耐性が、Ｈｕｈ−７宿主細胞のゲノムに組み込まれており、かつ細胞プロモーターのコントロール下で転写されるプラスミドＤＮＡに起因するということを排除するために、ＮＰＴ遺伝子特異的なＰＣＲを用いてそれぞれのクローンからＤＮＡを調査した。この場合、選択されたＨｕｈ−７−細胞クローンから、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ中のプロテインキナーゼＫ（４０μｇ／ｍｌ、１ｈ、３７℃）を用いた消化および引き続きフェノール、フェノール／クロロホルムを用いた抽出およびイソプロパノール沈殿によりＤＮＡを単離した。ＤＮＡ沈殿物を１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解し、かつＲｎａｓｅＡを用いて１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に引き続き、４〜８×１０4細胞に相応するＤＮＡ１μｇを、ＮＰＴ−遺伝子−特異的なプライマー（５′−ＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧ  ＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣ−３′および５′−ＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＧＣ−３′）の使用下にＰＣＲを用いて分析し、かつ３７９のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ生成物の特異性をサザンブロット法を用いて検出し、その際、ＮＰＴ遺伝子に相応するジゴキシゲニン標識したＤＮＡ断片を使用した。ポジティブコントロールとして、１０7のプラスミド分子またはネオマイシン耐性遺伝子を用いて安定にトランスフェクションされたＢＨＫ細胞系からのＤＮＡ１μｇを用いてＰＣＲ法を実施し、かつネガティブコントロールとして、同一であるがしかしＤＮＡを添加しなかった反応試薬を用いてＰＣＲを実施した。
【００９３】
この調査の結果は図１Ｃに記載されている。レーン１および２は、ポジティブコントロールを表し、レーン１３は、ネガティブコントロールを表す。レーン１の左側の数の表示は、ヌクレオチド−マーカー−分子の大きさを表している。ＮＳ２−３′レプリコン／ＮＳ２−３′ＨＣＶ−ゲノム−構築物を用いたトランスフェクションによる細胞に由来するクローン７−３（図１Ｃ、レーン３）中、および欠損ＨＣＶ−ゲノム−構築物を用いたトランスフェクションによる細胞に由来するクローン８−１（図１Ｃ、レーン１２）中以外には、いずれの細胞クローンでもＮＰＴ−ＤＮＡを検出できなかった。この調査は、ほとんどのクローンのＧ４１８耐性が複製されたＨＣＶ−ＲＮＡにより媒介されたということのためのさらなる指標である。しかしこの結果とは無関係に、正確な大きさを有するＨＣＶ−ＲＮＡを組み込まれたプラスミドＤＮＡから製造することはあり得ない。というのもインビトロ転写のために使用されるプラスミドは、真核生物プロモーターもポリアデニル化シグナルも有していないからである。従ってクローン７−３の場合、耐性はおそらくＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物もしくは複製するＨＣＶ−ＲＮＡによっても、組み込まれたＮＰＴ  ＤＮＡ配列によっても媒介される可能性は極めて高く、その一方でクローン８−１の細胞の耐性はもっぱら導入されたプラスミドＤＮＡに起因する。
【００９４】
Ｇ４１８耐性が自律的に複製するＨＣＶ−ＲＮＡにより媒介されていることを証明するためにクローン９−１３（図１Ｂ、レーン１１）をさらに試験した。ＮＰＴ−遺伝子の導入されたコピーを有するクローン８−１をあらゆるところでネガティブコントロールとして使用した。クローン９−１３中のＮＰＴ−ＤＮＡの存在を徹底的に排除するという目的で、４００００以下の細胞中のＮＰＴ−遺伝子−コピー１０００未満の検出を可能にするＰＣＲを実施した。このＰＣＲの結果は図２Ａに記載されている。このＰＣＲの場合、詳細には以下の通りに行った：
その都度１０6〜１０2のプラスミド分子（Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔ）を、直接（レーン７〜１１）またはその都度１μｇの９−１３ＤＮＡの添加後（レーン２〜６）に試験で使用した。増幅したＤＮＡ断片の特異性を、ＮＰＴ−特異的なプローブの使用下にサザンブロットを用いて決定した。ＤＮＡ−プローブを有していないＰＣＲを、ネガティブコントロールとして実施した（レーン１２）。
【００９５】
この高感度な方法を用いても細胞クローン９−１３のＤＮＡμｇ中にプラスミドＤＮＡは検出されなかった（レーン１）。これらの細胞中のＨＣＶ−プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡの量を評価するために、プラス鎖およびマイナス鎖特異的な放射性標識したリボプローブ(Ribosonde)（＝ＲＮＡプローブ）の使用下にノーザンブロット法を用いて全ＲＮＡの希釈系列を分析した。このために、その都度、細胞クローン９−１３および８−１から単離された全ＲＮＡ８μｇ、４μｇまたは２μｇを、ノーザンブロット法で公知量のプラス鎖またはマイナス鎖極性（コントロールＲＮＡ）を有する類似のインビトロ転写と並行して分析し、かつ引き続きハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、完全ＮＰＴ遺伝子およびＨＣＶ−ＩＲＥＳを覆うプラス鎖特異的リボプローブ（上部の図版の「プラス鎖」）を用いるか、またはＮＳ３−配列に対して相補的なマイナス鎖特異的なＲＮＡプローブ（下部の図版の「マイナス鎖」）を用いて実施した。矢印はレプリコンＲＮＡの位置を標識している。この分析の結果は図２Ｂに記載されている。
【００９６】
プラス鎖の場合、約１０8コピー／全ＲＮＡμｇが検出され、これは細胞あたり１０００〜５０００のＨＣＶ−ＲＮＡ−分子に相当するが、その一方でマイナス鎖ＲＮＡの量は５〜１０倍低かった。この結果は、マイナス鎖ＲＮＡは、プラス鎖分子の合成のための装入物として使用される複製中間体もしくは中間コピーであるという仮定と一致する。
【００９７】
反応は実質的にウイルスＲＮＡに依存したＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるので、ＨＣＶ−ＲＮＡの合成は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を選択的に抑制するが、しかしＲＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を抑制しない抗生物質であるダクチノマイシンに対して耐性であるべきである。この推測を裏付けるために、［3Ｈ］ウリジンを用いて細胞をダクチノマイシンの存在下でインキュベーションし、放射性標識したＲＮＡを抽出し、変性アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、かつ［3Ｈ］感光板の使用下に市販のバイオ−イメージャー(Bio-Imager)を用いて分析した。このためにその都度、クローン９−１３および８−１の細胞約５×１０5をＣｉ［3Ｈ］ウリジン１００μを用いてダクチノマイシン（Ｄａｃｔ）の不在下（−）または４μｇ／ｍｌの存在下（＋）に１６時間インキュベーションした。この標識反応に引き続き、全ＲＮＡを調整し、かつホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。両方の第一のレーン中で、全ＲＮＡの１／１０が表示されているのみである。放射性標識したＲＮＡを、ＢＡＳ−２５００バイオ−イメージャー（フジ(Fuji)社）を用いて目視できるようにした。
【００９８】
この分析の結果は図２Ｃに記載されている。ＮＳ５Ｂポリメラーゼのインヒビタープロフィールとの一致において（Behrens et al., 1996, EMBOJ. 15, 12およびLohmann et al., 1997, J. Virol. 71, 8416）、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製はダクチノマイシンにより影響を受けることはないが、その一方で細胞ＲＮＡの合成は抑制された。ウイルスＲＮＡの同一性を確認するために、複製した配列の再クローニングのためにＲＴ−ＰＣＲを実施した。再クローニングしたＲＮＡの配列分析は、クローン９−１３中のＲＮＡがＨＣＶ−特異的であり、かつＨＣＶ−構築物Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔの転写した転写物と一致することを示した。
【００９９】
ウイルスタンパク質の分析のために該当する細胞をまず代謝的に［35Ｓ］メチオニン／システインを用いて放射性に標識し、引き続き溶解し、かつその後、免疫沈降を用いてＨＣＶ特異的なタンパク質を細胞−溶解産物から単離した。この分析の結果は図３Ａに記載されている。その際、詳細には以下の通りに行った：細胞クローン９−１３（ｗｔ）および８−１（Δ）の細胞を、当業者に公知であり、かつ市販のタンパク質標識混合物（例えばNEN Life Science）を用いて１６時間処理することにより代謝的に放射性標識した。非変性条件下（例えばBartenschlager et al., 1995, J. Virol, 69, 7519による）または３つの異なった抗血清の使用下（3/4, 5A, 5B、レーン１〜１２の上部の末端における標識による）に免疫沈降（ＩＰ）を用いて、ＨＣＶ特異タンパク質を細胞−溶解産物から分離した。トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて免疫複合体を分析し、かつオートラジオグラフ法を用いて目視できるようにした。確定された大きさのマーカーを得るために、相同レプリコン構築物Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔをワクシニアウイルスＴ７−ハイブリッド系を用いてＨｕｈ−７細胞中で一過性発現させた。その際に得られた生成物をサイズマーカー（レーン７〜９）として、クローン９−１３および８−１の細胞と並行して処理した。同定されたＨＣＶタンパク質は、レーン１の左の端に標識されており、分子量（キロダルトン）は、レーン９の右側の端に記載されている。使用されるＮＳ３／４特異的な抗血清（′３／４′）は、有利にはＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂと反応し、これはＮＳ３の下位表示(Unterrepraesentation)につながることがわかる。
【０１００】
すべてのウイルス抗原は明確に検出可能であり、かつその見かけの分子量は、２シストロンのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の一過性発現により本来のＨｕｈ−７細胞中で確認された分子量に対する差異を示さなかった。ウイルス抗原の細胞内分布を決定するために、ＮＳ３およびＮＳ５Ａ特異的な抗血清の使用下に免疫蛍光法−検出反応を実施した（例えばBartenschlager et al., 1995, J. Vitol, 69, 7519による）。このためにクローン９−１３（ｗｔ）および８−１（Δ）の細胞を、播種の２４時間後にメタノール／アセトンを用いてカバーガラス上に固定し、かつポリクローナルＮＳ３またはＮＳ５Ａ特異的な抗血清とともにインキュベーションした。結合した抗体を市販のＦＩＴＣ−共役した抗ウサギ抗血清を用いて目視できるようにした。非特異的な蛍光シグナルの抑制のために、細胞を色素「エバンスブルー(Evans Blue)」で色分けした。
【０１０１】
この検出の結果は図３Ｂに記載されている。両方の抗血清を用いて細胞質中の強い蛍光を検出することができた。ＮＳ５Ａ特異的な抗血清はさらに弱い細胞核の蛍光につながり、このことは、この抗原の少なくとも少量が細胞核にも達したことを暗示している。しかし細胞質中のウイルス抗原の一般に優勢な存在は、ＨＣＶ−ＲＮＡ複製が、多くのＲＮＡウイルスの場合に該当するように、細胞質中で行われていることに関する著しい指標である。
【０１０２】
これらの結果は、ここに記載されている試験バッチを用いてＨＣＶのための細胞培養系の構築が成功しており、その効率はすべて従来公知のサイズのオーダーに勝っており、かつ通例の、かつ実証済みの生化学的方法で初めてウイルス性の核酸およびタンパク質の検出を可能にしたことを明らかに裏付けている。この効率は初めてＨＣＶの発病学の完全に詳細な調査、種々のＨＣＶ−機能の発生学的分析およびウイルス−／宿主細胞の相互作用の精密な研究を可能にし、このことにより抗ウイルス治療法の開発のための手がかりを定義することができる。
【０１０３】
例３：ＨＣＶゲノム構築物を用いたＨｕｈ−７細胞のトランスフェクション
例２に記載したようにＨｕｈ−７細胞をトランスフェクションし、かつ選択したが、しかしその際、ここで完全なウイルスゲノムを有している選択可能な構築物を使用した。得られた細胞クローンを例２と同様にしてＨＣＶ−ＤＮＡの不在下にＰＣＲを用いて調査し、かつその後、ＨＣＶ−ＲＮＡの産生複製を、ダクチノマイシンの存在下にノーザンブロット、［3Ｈ］ウリジン標識、ウイルスタンパク質もしくは抗原の検出を用いて、有利にはウエスタンブロット、免疫沈降法または免疫蛍光法を用いて検出した。例２に記載されているバッチとは対照的に、ここに記載されている構築物を用いて、さらに完全で、かつ極めて感染力の高いウイルスが得られるが、これは該部位（例２中）に記載されているサブゲノム構築物の場合、該当しない。細胞および細胞培養上清中に存在しているこれらのウイルスは、例えば超遠心分離、免疫沈降またはポリエチレングリコールを用いた沈殿により濃縮し、かつすべての外因性、つまりウイルス粒子中に構築されていない核酸を、ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、単球菌ヌクレアーゼ）を用いたインキュベーションにより消化する。このようにして、保護ウイルス粒子中に含有されていないすべての汚染性の核酸を除去することができる。保護されたウイルスＲＮＡをヌクレアーゼのインキュベーション後に、例えばプロテイナーゼＫを用いたインキュベーションを用いてＳＤＳ含有緩衝液中でフェノールおよびフェノール／クロロホルムを用いた抽出により単離し、かつＨＣＶ特異的なプライマーの使用下にノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲを用いて検出する。この試験バッチでも前記のＨＣＶコンセンサスゲノムと選択マーカーとの組み合わせはウイルスＲＮＡ、ウイルスタンパク質ひいてはＨＣＶ粒子の効果的な生産にとって決定的である。
【０１０４】
例４：耐性遺伝子がリボザイムもしくはリボザイムのための認識部位を介してＨＣＶ−サブゲノム−配列と結合しているＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の製造および適用
例１または例３によりＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を製造し、その際、抗生物質耐性遺伝子がリボザイムもしくはリボザイムのための認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡ−配列と結合している。このような構築物は、図７に図示されている。Ｈｕｈ−７細胞は、例えば例２に記載されているように、これらのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物でトランスフェクションされている。細胞へのトランスフェクション後に、まず、相応する抗生物質を用いた選択を行う。その際に得られる細胞クローン中で、単一クローン性リボザイムが活性化されるか、またはリボザイムのための認識部位を有する構築物の場合、リボザイムが細胞中に導入される（例えばリボザイム構築物のトランスフェクションまたはその中で相応するリボザイムが使用されたウイルス発現ベクターを用いた感染による）。両方の場合においてリボザイム媒介された分解により耐性遺伝子はＨＣＶ−ＲＮＡ配列から分離される。その結果は、ＨＣＶ−ゲノム−構築物の場合、耐性遺伝子を有していない確立されたＨＣＶ−ゲノムであり、これは確立された感染性ウイルス粒子の形成のための能力がある。ＨＣＶ−サブゲノム−構築物の場合、耐性遺伝子を有していないＨＣＶ−レプリコンが生じる。
【０１０５】
例５：別々のルシフェラーゼ−トランスフェクション構築物を用いたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の同時トランスフェクション
例１（Ａ）または例３または例４によりＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を製造する。これと並行して、ルシフェラーゼ遺伝子を含むトランスフェクション構築物を製造し、その際、ＨＣＶ−プロテアーゼ−（例えばＮＳ３−プロテアーゼ−）分割部位に関してコードする第一のヌクレオチド配列を用いて、このルシフェラーゼ遺伝子と、その他のタンパク質またはその他のタンパク質の一部をコードする第二のヌクレオチド配列とが結合している。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物およびトランスフェクション構築物を、任意の宿主細胞、有利には肝癌細胞、特にＨｕｈ−７−細胞に導入する。これは例２に記載の方法で行うことができる。改変されたルシフェラーゼ遺伝子の生成物は、その中でルシフェラーゼが外来成分との融合に基づいて不活性化するルシフェラーゼ−融合タンパク質である。高いＨＣＶ−複製を有するトランスフェクションした細胞中で、ＨＣＶ−プロテアーゼのための切断部位を有する融合タンパク質を分離し、ひいては発光測定(luminometrische Messung)により決定することができるルシフェラーゼの活性型を遊離する。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の複製を抑制すると、融合タンパク質は分離せず、かつ活性ルシフェラーゼは遊離しない。従って、ルシフェラーゼの定量的な測定はＨＣＶ−サブゲノム−構築物の複製のための尺度である。ルシフェラーゼ遺伝子の代わりに、同様にして修飾されているその他のリポーター遺伝子も同様に使用することができるので、このリポーター遺伝子がＨＣＶ−サブゲノム−構築物の成分ではなくても、その発現はウイルス複製に依存する。ＨＣＶ−タンパク質または核酸により不活性化または活性化される細胞タンパク質もまたいわゆる代理マーカー(Surrogatmarker)として使用することができる。この場合、この代理マーカーの発現もしくは活性化は、ウイルスＤＮＡの複製のための尺度である。
【０１０６】
例６：遺伝子治療のために肝癌細胞特異的な遺伝子輸送体として使用するための導入された外来遺伝子を有するＨＣＶ−サブゲノム−構築物の製造
この組み換え型および選択可能なＨＣＶ−サブゲノム−構築物を、トランス相補性ヘルパー細胞系、つまり誘発可能な、または構造的に欠けている機能を発現する細胞系（例えば構造タンパク質）にトランスフェクションする。機能的なＨＣＶ−サブゲノム−構築物を有する細胞クローンを相応する選択により確立することができる。宿主細胞により発現したウイルス−構造タンパク質は、その中へＨＣＶ−サブゲノム−構築物のＲＮＡを導入するウイルス粒子の形成を可能にする。その結果はつまり単一クローンした外来遺伝子も含めて本発明によるＨＣＶ−サブゲノム−構築物を含有し、かつこれを感染によりその他の細胞に移すことができるウイルス様粒子である。このような構築物の例は図８に記載されている。ここに記載した、組み込まれた外来遺伝子を有する本発明によるＨＣＶ−サブゲノム−構築物を直接発現ベクターとして使用する可能性もまた生じる。その場合、前記の方法と同様に行うが、しかしトランス相補性の因子を発現する細胞系をトランスフェクションすることが異なっている。この場合、ＨＣＶ−構築物は単に発現ベクターとして使用されるのみである。
【０１０７】
例７：細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の製造
（Ａ）単離法
適合した突然変異の測定および細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の製造のために、以下の通りに行った：細胞をＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を用いて例１および２に記載されているようにトランスフェクションし、かつＧ４１８−耐性細胞クローンを製造した。複製能力（これはこの関連において、トランスフェクションしたＨＣＶ−ＲＮＡもしくはＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物１μｇあたりに得られるＧ４１８−耐性細胞クローンの数と解釈する）の測定のために模範的に９−１３（図１Ｂ、レーン１１）と称する細胞クローンの１つからの全ＲＮＡを単離し、かつその中に含有されているＨＣＶ−ＲＮＡの量を図２Ｂに記載されているようにノーザンブロットを用いて測定した。引き続き、ＨＣＶ−ＲＮＡを約１０9分子含有している全ＲＮＡの１０μｇをエレクトロポレーションによりナイーヴＨｕｈ−７細胞に導入した（図９）。これと並行してナイーヴＨｕｈ−７細胞から単離した全ＲＮＡを用いて１０μｇの全ＲＮＡ量に満たした類似のｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮＡのインビトロ転写１０9を、ナイーヴＨｕｈ−７細胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８を用いた選択後に、両方のバッチ中の細胞コロニーの数を測定し、これをＲＮＡμｇあたりのコロニー形成単位(colony forming units(cfu))で表した。選択媒体中、Ｇ４１８  ５００μｇ／ｍｌの濃度の場合、単離した全ＲＮＡ中に含有されているＨＣＶ−ＲＮＡにより得られたコロニーの数はＨＣＶ−ＲＮＡμｇあたり約１０００００ｃｆｕであった。これに対してインビトロ転写された同量のＨＣＶ−ＲＮＡを用いてわずか３０〜５０コロニーが得られたのみであった。この結果は、細胞コロニーから単離されたＨＣＶ−ＲＮＡの特異的な感染力が、類似のインビトロ転写の感染力よりも約１０００〜１００００倍高いことを証明している。方法論的プロセスは図９に記載されている。
【０１０８】
「長距離ＲＴ−ＰＣＲ(long-distance RT-PCR)」を用いて、９−１３細胞の全ＲＮＡからのＨＣＶ−ＲＮＡを増幅し、ＰＣＲ−増幅物をクローニングし、かつ数多くのクローンを配列決定した。この再クローニングしたＲＮＡの配列と、本来ナイーヴＨｕｈ−７細胞に導入されたＲＮＡの配列との比較は、再クローニングしたＲＮＡが全ＨＣＶ−配列にわたって分布している数多くのアミノ酸交換を占有していることを明らかにした（図１０）。この再クローニングした突然変異体のＳｆｉＩ−断片を、本来のレプリコン構築物の類似のＳｆｉＩ−断片との交換でこの中に導入し、かつそれぞれの突然変異体のＲＮＡをナイーヴＨｕｈ−７細胞に導入した。次いでＧ４１８を用いた選択後に、それぞれのＨＣＶ−ＲＮＡ−突然変異体に関して形成されたコロニーの数を測定した。出発ＲＮＡではＲＮＡμｇあたりわずか３０〜５０のコロニーが得られたのみであったが、再クローニングした変異体の２つの場合にはコロニー数が明らかにより高かった（図１０）。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物９−１３Ｉおよび９−１３Ｃの場合、特異的感染力はＲＮＡμｇあたり１００〜１０００ｃｆｕであり、かつ９−１３Ｆレプリコンの場合、それどころかＲＮＡμｇあたり１０００〜１００００であった。この結果は、突然変異体９−１３Ｉ、９−１３Ｃおよび特に９−１３Ｆが複製能力の明らかな上昇につながることを示している。これに対してすべてのその他のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物（９−１３Ａ、Ｂ、Ｇ、ＨおよびＫ）は、もはや複製能力がなく、従って致命的な突然変異を有していた。
【０１０９】
９−１３Ｆ−構築物中のアミノ酸交換のいずれが複製の増加につながるかという問いへの回答のために、交換を単独で、または組み合わせて出発−ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に導入し、かつ相応するＲＮＡをナイーヴＨｕｈ−７細胞に導入する。これらのＲＮＡを用いたトランスフェクションの結果は、第１表にまとめられている。ここから本実施例では高い複製能力が複数の突然変異により制限されていることが明らかである。ＨＣＶ−ＲＮＡ−断片ＮＳ５ＡおよびＮＳ４Ｂ中のアミノ酸交換が大いに貢献している。ＮＳ３−領域における個々の交換もまた、おそらくこの個別交換の相助作用に基づいて貢献している。この調査は、ｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物でトランスフェクションされた細胞のＧ４１８−選択により、明らかにより高い複製能力を有するＨＣＶ−ＲＮＡを富化した。ここに記載された試験バッチを用いて極めて異なった複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を選択することができる。その中／上でＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物含有細胞が選択のために培養される選択媒体中の抗生物質濃度が高いほど、細胞が成長することができるためには適応突然変異の程度、ひいては該当するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中での複製効率は高くなくてはならない。低い抗生物質濃度での選択を実施すると、よりわずかな適合突然変異およびよりわずかな高い複製効率を有する細胞もまた生き残り、かつ増殖することができる。
【０１１０】
複数の適合突然変異を有する従来記載されていたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物９−１３Ｆは、疑う余地なく親ＨＣＶ−ＲＮＡより高い複製効率を有していた。さらに高い複製を有するＨＣＶ−ＲＮＡを細胞培養中で得るために、選択された細胞クローンの全ＲＮＡ中に含有されていたＨＣＶ−ＲＮＡを数回、ナイーヴＨｕｈ−７細胞中で継代した。この選択された細胞クローンは、５−１５と呼ばれ、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物Ｉ389／ＮＳ３−３′を用いたトランスフェクションにより得られる（図１）。これは十分に、２２のヌクレオチドの分だけ短いＨＣＶ−ＩＲＥＳを有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を用いたトランスフェクションにより製造された細胞クローン９−１３に相当する（Ｉ377／ＮＳ３−３′、図１）。細胞クローン５−１５から単離された全ＲＮＡ１０μｇを、エレクトロポレーションを用いてナイーヴＨｕＨ−７細胞に導入し、かつＧ４１８  １ｍｇ／ｍｌを用いて細胞を選択した。このようにして得られた細胞クローンから、再度、全ＲＮＡを単離し、ナイーヴＨｕｈ−Ｎ７細胞中にトランスフェクションし、かつ同様にして選択した。この工程を合計して４回繰り返した。４回目の継代の後で、細胞クローンから全ＲＮＡを単離し、かつ「長距離ＲＴ−ＰＣＲ」を用いてｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮＡを増幅した。増幅したＤＮＡ−断片を制限酵素ＳｆｉＩで消化し、かつＳｆｉＩ制限された出発構築物Ｉ389／ＮＳ３−３′に挿入した。合計して１００を越えるＤＮＡ−クローンが得られ、かつまず制限消化を用いて分析した。インビトロで転写した約８０のこれらのクローンのＲＮＡをその都度ナイーヴＨｕｈ−７に導入し、かつＧ４１８  ５００ｍｇ／ｍｌを用いて選択した。調査した８０のｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮＡ−変異体から、大部分が複製欠陥であることが判明した。しかし５．１および１９と呼ばれる２つの突然変異体の場合、ＲＮＡマイクログラムあたりの「コロニー形成単位」と呼ばれる特異的な感染力は、極めて明らかに増大した（第２表）。細胞培養中でのＲＮＡの複数回の継代により、明らかに、その複製効率が、複数のサイズオーダーの突然変異（いわゆる「適合突然変異」）に基づいて本来患者からクローンしたＲＮＡのものよりも高いＨＣＶ−ＲＮＡを製造することができる。
【０１１１】
（Ｂ）改変方法。
【０１１２】
（Ａ）により製造し、かつ同定された適合突然変異を、わずかに複製能力のあるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に移すことができ、かつこの構築物の複製の著しい向上につながる。この向上は極めて高いので、これにより明白に、選択可能なマーカー遺伝子をもはや有していないＨＣＶ−ＲＮＡを細胞培養中で複製することができる。図１２は、ＨＣＶ−ＲＮＡの複製効率の比較を示しており、これは出発配列または適応配列９−１３Ｆもしくは５．１に相応していた。容易な測定のために、ｎｅｏ−遺伝子を除去し、かつルシフェラーゼのための遺伝子により交換した。ネガティブコントロールとして、再び、ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ−ポリメラーゼの不活性化突然変異に基づいて複製欠陥のあるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を使用した。トランスフェクションの２４時間後にすでに、欠損ＲＮＡと９−１３Ｆもしくは５．１−構築物の間のルシフェラーゼ活性における明らかな違いが認識される一方で、欠損ＲＮＡ（３１８ＤＮ）と、適合突然変異を有してない出発−ＲＮＡ−構築物（ｗｔ）との間にはほとんど違いを見ることはできない。全観察時間の間、最も高いルシフェラーゼ活性ひいては最も高い５．１−ＲＮＡを有する複製が得られた。この調査は、このＲＮＡの高い複製効率を証明するのみではなく、適応ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を用いて、そのために選択可能な遺伝子の存在がもはや必要ではない細胞培養系を構築することが可能であることもまた示している。出発構築物と、突然変異体９−１３Ｆ、５．１および１９の間のヌクレオチド−およびアミノ酸の違いの包括的な概要は、第３表に示されている。
【０１１３】
例８：細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−全長ゲノムの製造
例１〜７では常に、ｐ７もしくはＮＳ２までを含むコアの全構造タンパク質領域が欠けているサブゲノムのＨＣＶ−ＲＮＡを使用した。この例８では、適合したＮＳ３−５Ｂ−配列を用いて細胞培養中のＨＣＶ−全長ゲノムを複製することが可能であることを示している。この目的のために、まず例７に従って製造され、高度に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ５．１のＳｆｉＩ−断片を、選択可能なＨＣＶ−全長ゲノムにトランスフェクションした（図１２）。このＨＣＶ−ゲノムをナイーヴＨｕｈ−７細胞にトランスフェクションし、かつ異なったＧ４１８−濃度で選択した。（Ｇ４１８濃度の）選択強度に依存して、異なった大きさの細胞クローンの数が得られた（図１２Ｂ）。これと比較して、適合突然変異を受けなかった未変化のＨＣＶ−全長ゲノムではクローンは得られず、またＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ−ポリメラーゼにおける不活性化突然変異に基づいて複製欠陥のあるネガティブコントロールでも同様であった。生じた細胞クローンが実際に自律的に複製するＨＣＶ−全長構築物を有していることに対する証明のために、全ＲＮＡを複数の細胞クローンから単離し、かつノーザンブロットを用いて分析した。すべての細胞クローンにおいてＨＣＶ−全長ＲＮＡは明確に検出可能であった（図１２）。これにより細胞培養に適合したＨＣＶ−配列を用いて、高い効率で、および自律的に細胞系で複製するＨＣＶ−全長ゲノムを製造することができる、つまり本発明による系を用いて適合したＨＣＶ−全長ゲノムを製造することが可能であることが明確に証明される。さらにこのクローンは、完全なＨＣＶ−配列、つまりウイルス粒子の形成のために必要な構造タンパク質もまた有しているので、この系を用いて大量の感染ウイルス粒子を細胞培養中で製造することが可能である。これらのウイルスの検出のために、細胞不含で、複製ＨＣＶ−全長ゲノムを有する細胞の上清をナイーヴＨｕｈ−７細胞に添加し、かつこうして感染させた細胞をＧ４１８で選択する。前記の条件下で成長するそれぞれの細胞クローンは、感染した細胞に起因する。しかし複製するＨＣＶ−全長ゲノムを有する細胞の細胞培養上清中のウイルスは、従来技術で公知の種々の方法、例えば超遠心分離またはマイクロ透析(Mikrodialyse)で富化し、かつ生成し、かつ次いでナイーヴ細胞の感染のために使用することができる。この方法で、本発明によるＨＣＶ−細胞培養系を用いて、細胞中で高い効率で複製し、かつ感染性のウイルスを産出する細胞培養に適合したＨＣＶ−全長ゲノムを製造することができることが明確に示されている。これらは同様に試験動物、有利にはチンパンジーの感染により検出することができる。
【０１１４】
例９：リポーター遺伝子を有するＨＣＶ−全長−構築物およびＨＣＶ−サブゲノム−構築物の製造
ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を製造したが、その際、抗生物質耐性遺伝子の代わりにリポーター遺伝子を挿入する（図１３）。その際、リポーター遺伝子もしくはリポーター遺伝子産物の量もしくは活性に基づいて複製を決定することができる。リポーター遺伝子は、有利にはルシフェラーゼ遺伝子の群、ＣＡＴ−遺伝子（クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ−遺伝子）、ｌａｃＺ−遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ＧＦＰ−遺伝子（緑色蛍光タンパク質(green fluorescence protein)遺伝子）、ＧＵＳ−遺伝子（グルクロニダーゼ遺伝子）またはＳＥＡＰ−遺伝子（分泌された(sezernierte)アルカリ性ホスファターゼ遺伝子）からの遺伝子である。これらのリポーター遺伝子もしくはこれらの産物、つまり相応するリポータータンパク質を、例えば蛍光法、化学発光法、比色法により、または免疫学的方法（例えば固相酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ）を用いて測定することができる。リポーター遺伝子は、固有のＩＲＥＳにより発現させるか、またはそのままで活性であるか、もしくはタンパク質分解により分解可能なアミノ酸配列によりＨＣＶ−タンパク質と結合している融合タンパク質の形で発現させることができるので、これは細胞性またはウイルス性（ＨＣＶ）プロテアーゼによりタンパク質から分離される。
【０１１５】
例１０：遺伝子治療のための肝細胞特異的な遺伝子輸送体としてまたは発現ベクターとしての使用のための導入された外来遺伝子を有するＨＣＶ−全長−構築物の製造
構築物（図１４）を細胞内に導入し、かつここでその他の細胞の感染のために使用することができるＨＣＶ−ウイルス粒子を形成させる。ウイルス粒子は外来遺伝子を有するＲＮＡを包んでいてもよいので、この外来遺伝子によりコードされたタンパク質の産生のためにこのようにして感染させた細胞中で外来遺伝子を使用することができる。構築物でトランスフェクションされた細胞は、同様に外来遺伝子を発現する。
【０１１６】
例１１：耐性遺伝子産出がＨＣＶ−割合を有する融合タンパク質として発現する単シストロンのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の製造
特定の調査にとって、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物が異種ＩＲＥＳ−エレメントを有していない場合には有利である。このような調査は例えばインターフェロン耐性の決定である。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を有する細胞をインターフェロン−αまたはインターフェロン−βを用いてインキュベーションすると、これはＨＣＶ−ＲＮＡの複製の減少につながる。作用機構の解明のために、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物が異種ＩＲＥＳを有していないことが必要である。というのもさもないとインターフェロン媒介された抑制がＨＣＶ−複製の抑制により媒介されるのか、または異種ＩＲＥＳの抑制により媒介されるのか決定することができないからである。従って、耐性遺伝子がＨＣＶ−タンパク質と融合する構築物を製造する。（図１５）。融合タンパク質がそのままで活性であるか、または細胞性またはウイルス性（ＨＣＶ−）プロテアーゼによりここから分離するように耐性遺伝子産物がタンパク質分解により分解可能なアミノ酸配列によりＨＣＶ−タンパク質と結合している。
【０１１７】
【表１】
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【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
記載は、出発−ＨＣＶ−ＲＮＡ−配列Ｃｏｎ１（ＥＭＢＬ−遺伝子バンク(Genbank)Ｎｏ．ＡＪ２３８７９９）および細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡの配列との間のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の違いである。数はＨＣＶ−単離物Ｃｏｎ１のヌクレオチド位置およびアミノ酸位置に関する。
【０１２２】
【外３】
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【０１２３】
【外４】
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【０１２４】
【外５】
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【０１２５】
【外６】
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【０１２６】
【外７】
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【０１２７】
【外８】
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【０１２８】
【外９】
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【０１２９】
【外１０】
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【０１３０】
【外１１】
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【０１３１】
【外１２】
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【０１３２】
【外１３】
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【０１３３】
【外１４】
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【０１３４】
【外１５】
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【０１３５】
【外１６】
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【０１３６】
【外１７】
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【０１３７】
【外１８】
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【０１３８】
【外１９】
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【０１３９】
【外２０】
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【０１４０】
【外２１】
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【０１４１】
【外２２】
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【０１４２】
【外２３】
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【０１４３】
【外２４】
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【０１４４】
【外２５】
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【０１４５】
【外２６】
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【０１４６】
【外２７】
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【０１４７】
【外２８】
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【０１４８】
【外２９】
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【０１４９】
【外３０】
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【０１５０】
【外３１】
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【０１５１】
【外３２】
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【０１５２】
【外３３】
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【０１５３】
【外３４】
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【０１５４】
【外３５】
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【０１５５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の構造を示している。Ｂはトランスフェクションして継代培養されたＨｕｈ−７細胞クローンにおける複製されたプラス鎖ＲＮＡの検出のための変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動の結果を示している。Ｃは選択された大部分の細胞クローンにおいて導入されたレプリコンＤＮＡが存在しないことを証明するための引き続きのサザンブロットによるＰＣＲ試験の結果を示している。
【図２】ＡはＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を有する細胞クローン（９−１３）における導入されたレプリコンＤＮＡ（プラスミド分子Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔ）の高感度の排除のための引き続きのサザンブロットによるＰＣＲ試験の結果を示している。ＢはＨＣＶのプラス鎖ＲＮＡおよびマイナス鎖ＲＮＡの定量のためのノーザンブロット試験の結果を示している。ＣはＨＣＶ−ＲＮＡ複製のダクチノマイシンに対する耐性を証明するための細胞内で複製されたＨＣＶ−ＲＮＡの放射性標識後のホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動の結果を示している。
【図３】Ａは代謝放射性標識後の免疫沈降による選択された細胞クローンにおけるＨＣＶ特異抗原の検出を示している。ＢはＨＣＶ抗原の細胞内での所在の検出のための免疫蛍光試験の結果を示している。
【図４】図４は５′ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏR）、異種の完全なＨＣＶ読み枠および確実な３′ＮＴＲからなる、本発明による選択可能なＨＣＶ−ＲＮＡ構築物（完全なゲノム）の構造の略図である。
【図５】図５はポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列内に挿入された抗生物質耐性遺伝子（単シストロン性ＲＮＡ）（Ａ）および３′ＮＴＲ内に挿入された抗生物質耐性遺伝子（２シストロン性ＲＮＡ）（Ｂ）を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図である。
【図６】図６はＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＨＣＶレプリコンの一部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ａ）、耐性遺伝子およびリポーター遺伝子からなる融合遺伝子の一部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｂ）、耐性遺伝子およびリポーター遺伝子からなるレプリコンの一部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｃ）、自体の内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）から発現される独立の遺伝子として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｄ）の略図である
【図７】図７は耐性遺伝子がリボザイムもしくはリボザイムのための認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡ配列と結合しているＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図である。
【図８】図８は耐性遺伝子および導入された外来遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図である。
【図９】図９は全ＲＮＡとインビトロ転写物との比感染力の比較のための方法プロセスを示している。。
【図１０】図１０は９−１３クローンの配列分析を示している。
【図１１】Ａはリポーター遺伝子の使用による複製アッセイの原理を示している。Ｂは親ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物Ｉ389／Ｌｕｃ／ＮＳ３−３′／ｗｔ（ｗｔ）または以下の変異体：不活性ＲＮＡ（３１８ＤＮ）、変異体９−１３Ｆもしくは変異体５．１でトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性の比較を示している。
【図１２】図１２は選択可能なＨＣＶ全長ゲノム（構築物Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１およびＩ389／ｃｏｒｅ−３′／９−１３Ｆ）を示しており、Ａは全長構築物の略図であり、ＢはＡに示される構築物Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１のインビトロ転写されたＲＮＡ各０．１μｇでＨＵＨ７細胞にトランスフェクションした後に得られるコロニーの数を示しており、Ｃは相応のインビトロ転写物のトランスフェクション後に得られるＧ４１８耐性細胞クローンにおける自律的に複製されるＨＣＶ−全長ＲＮＡの検出を示している。
【図１３】図１３は１つのリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を示しており、Ａは２シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を示し、Ｂは単シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を示している。
【図１４】図１４は耐性遺伝子に付加的に、挿入された外来遺伝子を有している３シストロン性のＨＣＶ−全長ＲＮＡ構築物を示している。
【図１５】図１５は耐性遺伝子がＨＣＶ成分を有する融合タンパク質として発現する単シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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