(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高圧液体クロマトグラフィーによりインシュリンを単離する方法であって、式（Ｉ）で表されるインシュリンを１.５ＭＰａ〜１０ＭＰａの圧力下で圧力安定性酸性陽イオン交換物質として、Source（登録商標）S15を用いて単離を行う前記方法。
式（Ｉ）：
【化１】
0004975895.tif 000012
（式中、
Ｒ30は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、
Ｘは水酸基又は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、
ｎは０〜１０の整数を示し、
Ｙは水素原子又はＬ−フェニルアラニン残基を示し、
Ｚは遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、及び、
残基Ａ２〜Ａ20はヒト・インシュリン、動物インシュリン又はインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ２〜Ｂ29はヒト・インシュリン、動物インシュリン又はインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する。)
【請求項２】
式（Ｉ）において、
Ｒ30はＬ−アラニン又はＬ−スレオニンを示し、
ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リジン又はＬ−フェニルアラニンからなる群より選択されるＬ−アミノ酸を示し、
ｎは０〜６の整数を示し、
Ｚはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸を示し、
Ａ１〜Ａ20又はＢ２〜Ｂ29は、ヒト、ブタ又はウシ・インシュリンのアミノ酸配列を表す、インシュリン誘導体を単離する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒト・インシュリンを単離する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１０〜５０容量パーセント、好適には２０〜４０容量パーセント、特に好適には２５〜３５容量パーセントの（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノールを含有するＨ2Ｏ／（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノール混合液を用いて溶離を行なう請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ２.５〜５.５、好適には３.５〜４.０にて、カラム容量１リットル当たり５〜１５ｇの蛋白質を圧力安定性酸性陽イオン交換体に負荷する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
溶離に使用されるＨ2Ｏ／（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノール混合液が、（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノールとしてエタノール又はイソプロパノール、特にプロパノールを含有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
溶離液のｐＨを３.５〜４.０に調整する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
負荷及び溶離液が緩衝物質、好適には有機酸をベースとする緩衝物質、特に好適には乳酸をベースとする緩衝物質を含有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
０〜０.８mol／リットル、特に０.１０から０.２５mol／リットルのアンモニウム又はアルカリ金属塩の勾配により溶離が行われる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下で圧力安定性酸性陽イオン交換物質を用いて単離が行われることを特徴とする、クロマトグラフィーによりインシュリンを単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組換インシュリンの調製において、インシュリンの微生物における生合成は、天然インシュリンのＡ及びＢ鎖の配列以外に、連結ペプチド及び融合蛋白質配列からなる一本鎖前駆体分子を経由して、形質転換大腸菌のようなバクテリアにおいて行われる。後者は、遺伝子工学上の理由により完全蛋白質のＮ末端に結合し、形質転換大腸菌において封入体の形で得られるインシュリン含有生産物の発現の原因となる。この作業の目的は、多段階の蛋白質化学製造工程においてこの融合蛋白質からインシュリンを得ることである。すべての場合において、この作業は、膵臓ベータ細胞中におけるインシュリンの天然の生合成と同じように、（プレ）プロインシュリンのフォールディングの工程の経由を伴う。（プレ）プロインシュリンは、（例えばトリプシンを用いた）酵素切断により、ジ−Ａｒｇ−（Ｂ31〜32）−インシュリン及びモノ−Arg −Ｂ31−インシュリンである他のインシュリン前駆体並びに連結ペプチド（３５アミノ酸残基まで）からなる切断混合物へと変換される。不完全な中間体である脱−Ｔｈｒ−Ｂ30−インシュリン又はＡｒｇ−Ａ０−インシュリン及びプレインシュリンのような、トリプシンのプロテアーゼ活性により産生される副産物も製造される。US 5 101 013は、Ｓ−セファロース（登録商標）、フラクトゲル（登録商標）、ＴＳＫ又はＳＰトリアクリル（登録商標）のような強酸性イオン交換体上での大気圧又は中圧クロマトグラフィーによるインシュリン及びインシュリン誘導体の前記混合物の分離を開示している。公知のクロマトグラフィー物質は圧力に安定でなく、1 ＭＰａ以上の圧力下のクロマトグラフィー・カラム中で圧縮され、そしてインシュリン含有混合物の分離が不可能となるのである。
他の公知のインシュリンの単離方法は、脂肪親和的に修飾されたシリカゲル上での高圧液体クロマトグラフィーである（US 5 245 008、EP 0 547 544）。
【０００３】
大気圧を使用する陽イオン交換精製方法では、最適化された慣用のゲル物質を使用しても、要求される程度の組換インシュリンの精製を達成するのに必要な分離効率が得られない。最新の調製用ゲル物質、例えば、Poros ５０μm／Perseptiv、Source ３０μm／Pharmacia又はMakropep ５０μm／BioRadを用いるクロマトグラフィーは、中圧の工程で行われる。小粒子サイズのゲル（例えば、Source１５μm）を用いての中圧クロマトグラフィーは、分離効率に関して僅かに選択性を改良するだけであり、その結果、この場合においてもインシュリン中のごく小さな不純物を除去するために、最終の精製工程として必然的に高圧液体クロマトグラフィー（High-pressure liquid chromatography: HPLC）が行われる。蛋白質の変性の危険性、ＲＰシリカゲル相の滲出（bleeding ）及び洗浄不足などの逆相ＨＰＬＣの不利な点は受け入れなければならず、さらに、平均的以上の費用と時間が必要となる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
酵素的切断反応からインシュリンを得るための改良した分離及び単離方法を提供する本発明の研究において、インシュリン及びインシュリン誘導体混合物の圧力安定性酸性陽イオン交換物質による１.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下でのクロマトグラフィーにより、優れた効果が達成できることが見いだされた。真性糖尿病治療用の注射液において、このように単離されたインシュリンは、精製工程をさらに行うことなく、直接使用するのに適している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、１.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下で圧力安定性酸性陽イオン交換物質を用いて単離が行われることを特徴とする、クロマトグラフィーによりインシュリンを単離する方法に関する。
インシュリンなる用語は、例えばヒト・インシュリンやブタ・インシュリンのような動物起源やヒト起源の化合物、プロインシュリンやプレインシュリンのようなインシュリン前駆体、又は遺伝学的に修飾された微生物により発現される組換インシュリンやインシュリン誘導体を意味する。インシュリンは、例えば、脱−Ｐｈｅ−Ｂ１−インシュリン、ジアルギニン−インシュリン（Ｂ31、Ｂ32）、モノアルギニン−インシュリン、ジフェニルアラニン−インシュリン（Ｂ31、Ｂ32）（US 4 601  852）、又はＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32ヒト・インシュリン（EP 368 187）のように化学的又は酵素的誘導化（derivatization）により修飾され得る。
【０００６】
本発明の方法に好適に用いられるインシュリンは、下記式(Ｉ)：
【化２】
0004975895.tif 000002
（式中、
Ｒ30は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、
Ｘは水酸基又は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、
ｎは０〜１０の整数を示し、
Ｙは水素原子又はＬ−フェニルアラニン残基を示し、
Ｚは遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、及び、
残基Ａ２〜Ａ20はヒト・インシュリン、動物インシュリン又はインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ２〜Ｂ29はヒト・インシュリン、動物インシュリン又はインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する。）を有する。
【０００７】
好適なインシュリンは、上記式(Ｉ)において、
Ｒ30はＬ−アラニンおよびＬ−スレオニンからなる群より選択される残基を示し、
ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リジンおよびＬ−フェニルアラニンからなる群より選択されるＬ−アミノ酸残基を示し、
ｎは０〜６の整数を示し、
Ｚはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸からなる群より選択される残基を示し、
Ａ１〜Ａ20又はＢ２〜Ｂ29は、ヒト、ブタ又はウシ・インシュリンのアミノ酸配列を表す。
特に好適には、ヒト・インシュリン及びＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュリンが単離される。
【０００８】
ヒト・インシュリンのＡ１〜Ａ20のアミノ酸配列は：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys （配列番号１）
である。
ヒト・インシュリンのＢ１〜Ｂ29のアミノ酸配列は：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu
Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys （配列番号２）
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
インシュリンは、比較的汚染された状態又は（例えばゲルクロマトグラフィーによる）前精製段階のいずれも使用し得る。繰り返し結晶化及びゲルクロマトグラフィーに付した後であっても、インシュリンは依然として、分子量が極めて類似しているが、適切に選択されたｐＨにおいてはその電荷がお互いに、そしてインシュリンとは異なる、インシュリンと複合体を形成するインシュリン様随伴物質により汚染されている（ＵＳ 4 129 560）。このような物質の例は：
脱アミド・インシュリン、アルギニン−及びジアルギニン−インシュリン及びインシュリン−エチル−エステル
である。
【００１０】
圧力安定性酸性陽イオン交換物質なる用語は、例えば、ポリスチレンと、スルホ基、特に、Ｒ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＳＯ3−基により変性されたジビニルベンゼンとのコポリマーのような物質を意味する。以下の生産物が特に好適である。
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Swedenにより供給され、圧力に安定で球形かつ多孔性の、粒径約３０μmのSource（登録商標）30S（Downstream, No.19, (1995), Pharmacia Biotech AB, S-751 82 Uppsala, Sweden, pages 3-8）。
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Swedenにより供給され、圧力に安定で球形かつ多孔性の、平均粒径約１５μmのSource（登録商標）15S 。
Perseptivにより供給される、Poros ５０μm。
Bioradにより供給される、Makroprep ５０μm。
【００１１】
溶離液は、溶離液のｐＨを一定に保つ緩衝物質、水及び有機溶媒を含む。適当な緩衝物質は文献に開示されており、例えば、リン酸塩、アルカリ金属、酢酸カリウムのようなアルカリ土類金属塩、クエン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸塩、硫酸塩又は塩化物である。溶離液は、さらに、アルコール、ケトン、酢酸メチル、ジオキサン又はアセトニトリルのような水混和性有機溶媒を含む。ｎ−又はイソ−プロパノール、メタノール、エタノール又はブタノールのような（Ｃ1〜Ｃ4）アルコールが好適に用いられる。
【００１２】
クロマトグラフィーに用いられる水混和性有機溶媒の濃度は、１０〜５０容量パーセント、好適には２０〜４０容量パーセント、特に好適には２５〜３５容量パーセントである。緩衝物質の濃度は、溶媒としての水に基づき約１mmol／リットル〜１４０mmol／リットル、好適には２mmol／リットル〜１２０mmol／リットルである。緩衝液に添加し得るこれ以外の添加物は、例えば、塩、好適には生理学的に許容される鉱酸塩、蟻酸、酢酸、乳酸又はクエン酸、好適には乳酸のような１種以上の有機酸、塩基、好適にはＮａＯＨ、及び／又は防腐剤である。緩衝液の好適なpHは、約ｐＨ２.５〜５.５、特に好適には約３.５〜４.０である。有機酸の濃度は広い範囲で変わり得る。有利な量は、溶媒としての水に基づき１０から１００mmol／リットル、好適には２５〜５０mmol／リットルである。
クロマトグラフィーの温度は０℃〜５０℃、好適には１５℃〜３０℃、特に好適には１５〜２０℃である。クロマトグラフィーの操作圧力は本質的に一定である。クロマトグラフィーは様々な圧力下、例えば、１.１〜４０ＭＰａ、特に１.５〜１０ＭＰａで行うことができる。溶離の流速は、２００〜１０００cm／ｈ、最大２０００cm／ｈである。
【００１３】
カラムへの負荷、クロマトグラフィー並びにインシュリン及びインシュリン誘導体の溶離は、公知の、従来用いられてきた技法により行われる。精製されるべきインシュリン溶液のカラムへの負荷は、好適には、水性アルコール又は純粋に水性の緩衝液を用いて行われる。インシュリン溶液は、約１〜１０％、好適には３％の蛋白質含量を有する。
圧力安定性酸性陽イオン交換体の負荷は、例えば、インシュリン混合液を−好適には前述した組成を有し、前述のｐＨを有する−緩衝液に溶解し、得られた溶液を圧力安定性酸性陽イオン交換体に接触させることにより行うことができる。
【００１４】
溶離液は、原則として前述の緩衝液と類似の組成を有し得るが、好適には３.５〜４.０のｐＨを有する。特に好適な溶離方法は、溶離液が塩濃度の時間的勾配、好適には直線性を示すものである。この濃度勾配は、溶離の開始時には溶離液に低濃度の塩（極限の場合はゼロ）を存在させ、溶離過程の間に塩濃度を増大させることにより得ることができる。このようにして、蛋白質混合液の特に効果的な分離を達成することが可能である。好適な塩濃度勾配は、（溶離の開始時に）０mol塩／リットル付近〜（溶離の終了時に）０.８mol塩／リットル、特に好適には、（溶離の開始時に）約０.１０〜（溶離の終了時に）約０.２５mol／リットルである。添加する塩として好適なものは、多くの有機及び無機塩である。アンモニウム塩やアルカリ金属塩のような生理学的に許容される塩が好適であり、特に好適なものはナトリウム塩であり、特に塩化ナトリウムである。
【００１５】
本発明の分離方法は、カラムの方法で行われる。温度は、好適にはイオン交換クロマトグラフィーで一定に保持されるが、広い範囲で変化し得る。好適な温度範囲は、約−１０℃〜約５０℃であり、特に約１５〜約２５℃である。
クロマトグラフィー後の溶離物のインシュリンの濃縮は、亜鉛塩による沈殿または結晶化により行われる。さらに場合により、減圧下における蒸留法により溶液から予め実質的に溶媒を除去すること、または水で希釈してその濃度を下げることも可能である。いずれにせよ、上清の蛋白質含量を＜５０mg／リットルに保持するために、沈殿又は結晶化の前には溶媒の濃度は１０％以下にしなければならない。得られたインシュリン沈殿物は、デカンテーション、遠心分離又は濾過により単離し、及び乾燥することができる。本発明の方法は、分析用クロマトグラフィーばかりでなく、特に本発明の方法が調製用高圧液体クロマトグラフィー（high-pressure liquid chromatography：ＨＰＬＣ）系で行われる場合に、調製用クロマトグラフィーにも好適である。
「調製用クロマトグラフィー」なる用語は、各々のクロマトグラフィーの実験において純粋な生成物を、単に分析するだけでなく単離する目的の精製方法を意味する。純粋な生成物の量は広い範囲で変化し得、例えば、１mg〜５.０kg、好適には５０mg〜２.５kgである。
【００１６】
【実施例】
本発明の方法は、以下の実施例において詳細に記載される。パーセンテージのデータは、他に示されない限り容量に基づく。
実施例１
緩衝液Ａ：水に３０％ｎ−プロパノール、５０mM乳酸、０.０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ３.５
吸着剤：Source（登録商標）S １５μm
カラム容積：５cm×２５cm
調製用ＨＰＬＣカラム（５cm×２５cm、カラム容量約５００ml）を、５０％水性エタノール中のSource S １５μmの懸濁液で充填し、緩衝液Ａで平衡化した。この目的のため、この緩衝液は流速９８ml／分でポンプでカラムに送られた。この間１.９ＭＰａの圧力が加えられた。この場合において、このカラムはフラクション・コレクター及びＵＶ検出機（２５４／２８０nm）が付属したクロマトグラフィー系の一部であった。
精製されるべき粗製ヒト組換インシュリン５ｇが５００mlの緩衝液Ａに溶解され、上記と同じ流速でカラム上にポンプで送られた。それに続く洗浄の期間において、１０００mlの緩衝液Ａを用いた新たな平衡化が行われた。
溶離に際し、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ）からなる直線的ＮａＣｌ勾配が勾配混合系によりカラムの低圧側にポンプで送られ、ＵＶ溶離図が得られた。溶出物が分画され、個々の画分が従来より用いられている分析的ＨＰＬＣ法により調べられた。要求される純度に相当する画分が集められた。水で希釈した後（１容量の溶出物＋２容量の水）、高度に精製されたインシュリンが、公知の方法によりＺｎ2+インシュリンとしての結晶化により単離された。
収量：３.８ｇ；純度 ＞９８％
【００１７】
ＨＰＬＣの分析
インシュリンを含む１２.５mgの蛋白質が２５mlの溶離液Ｃ（溶離液参照）に溶解された。０.０２mlが高圧液体クロマトグラフィー・カラムに充填された。
0004975895.tif 000003
【００１８】
0004975895.tif 000004
【００１９】
0004975895.tif 000005
勾配の傾斜は、溶離されるインシュリンの主なピークが１７〜２１分になるように調整されなければならなかった。
温度：          ４０℃
総実験時間：    ４５分
流速：          １ml／分
検出：          ２１０nm
【００２０】
実施例２
脱−ＴｈrB30−ヒト・インシュリン（正しいシスチン架橋を有する配列番号１及び３のインシュリン）、Ａｒｇ−Ｂ31−ヒト・インシュリン（正しいシスチン架橋を有する配列番号１及び５のインシュリン）及びＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュリン（正しいシスチン架橋を有する配列番号６及び４のインシュリン）の混合液５ｇが実施例１と同様の方法で精製された。この混合液は、典型的に組換インシュリンの単離で製造される。該混合液はさらに、非特異的な酵素切断により極めて微量の他の不純物を含み、医薬物質として使用するためにはその濃度を下げなければならなかった。
【００２１】
様々な構成成分が実施例１と同様に溶離された。ＵＶ図形はＮａＣｌ勾配が増え等電点が上昇するにつれて個々の構成成分の選択的分離を示した（脱−ＴｈｒB30−ヒト・インシュリン：Ｉ；ＡｒｇB31−ヒト・インシュリン：II；ＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュリン：III）。分画されたカラム溶出物は実施例１と同様に分析され、要求される高純度生成物ＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュリンが結晶化により単離された。
収量：１.７８ｇ；純度 >98.5%
【００２２】
実施例３
（比較例）
実施例２と同様の混合液５ｇが、３９ml／分の溶離液流速で１ＭＰａ（１０bar）下、中圧クロマトグラフィーの条件下で精製された。ＵＶ溶離図形は実施例２と類似した構成成分の分離を示した。しかしながら、この図形の経過だけからでも、個々の構成要素の分離の鮮明さが劣ることが明らかであった。ＨＰＬＣの分析により、個々のインシュリンの不純物が明確に重複していることが確認された。精製された生成物は結晶化により単離された。やや低い収量にかかわらず、純度は医薬物質として要求される規格に一致していなかった。それゆえ調製物は、それに続く逆相シリカゲル上の調製用ＨＰＬＣでの精製が必要であった。
収量：１.５ｇのＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュリン；純度：９７.６％
【００２３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の方法により単離されたインシュリンは、真性糖尿病治療用の注射液において、精製工程をさらに行うことなく、直接使用に対し安定である。
【００２４】
【配列表】
0004975895.tif 000006
【００２５】
0004975895.tif 000007
【００２６】
0004975895.tif 000008
【００２７】
0004975895.tif 000009
【００２８】
0004975895.tif 000010
【００２９】
0004975895.tif 000011