(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のターゲット分析物の存在を検出する、またはターゲット分析物の量を測定する方法であって、その方法は、
作業電極と、基準電極と、カウンタ電極を有する基板上の電極を備えるセンサ上に、前記試料を配置するステップと、
前記作業電極を流れる電流を測定する間に、前記基準電極と前記作業電極間の電位差を制御する工程を実施する前記試料の分析を行うステップと、
前記試料内にターゲット分析物が存在するかどうか、またその量を判断するために前記測定した電流を用いるステップと、
から構成され、
前記それぞれの電極は導電性材料より構成され、
前記基準電極と前記作業電極上に形成された自己組織単層はチオール分子を含み、前記チオール分子は、前記基準電極、前記作業電極に直接結合した硫黄を有し、
前記試料内の構成物と作業電極の間に、レドックス反応が生じるように前記電位は制御され、
前記作業電極を流れる電流は前記カウンタ電極に流れる電流によりバランスをとっていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記基板はシリコン、ガリウム砒素、プラスチック、およびガラスからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記作業電極、基準電極およびカウンタ電極のそれぞれは、金の単一層を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記分析はサイクリック・ボルタメントリ分析であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記分析は電流測定分析であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記作業電極と前記基準電極間の前記電位差は前記カウンタ電極に電流を流すことによって制御されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
試料中のターゲット分析物の存在を検出する、またはターゲット分析物の量を測定する電気化学センサであって、そのセンサは、
基板上に設けられた作業電極、基準電極およびカウンタ電極とから構成され、
前記それぞれの電極は導電性材料より構成され、
前記基準電極、作業電極上に自己組織化単層が形成され、
前記自己組織単層はチオール分子を有し、前記チオール分子は、前記基準電極、作業電極に直接結合した硫黄を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項８】
前記基板は、シリコン、ガリウム砒素、プラスチック、およびガラスからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
前記作業電極、前記基準電極、およびカウンタ電極のそれぞれは金の単一層を有することを特徴とする請求項８記載のセンサ。
【請求項１０】
前記電極は前記基板上の１６０μｍ2〜２５ｍｍ2の面積を占有することを特徴とする請求項７記載のセンサ。
【請求項１１】
前記基準電極は、前記作業電極の一部が前記基準電極とは異なる領域間に位置するように、前記作業電極の周辺に配置されていることを特徴とする請求項７記載のセンサ。
【請求項１２】
前記カウンタ電極は、前記作業電極の一部が前記基準電極とは異なる領域間に位置するように、前記作業電極の周辺に配置されていることを特徴とする請求項７記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年５月３日出願の米国仮特許出願第６０／２０１６０３号の特権を特許請求するものである。
【０００２】
（政府出資研究開発に関する陳述）
本発明は、米国海軍省によって与えられたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．Ｎ６６００１−９６−Ｃ−８６３２の下で政府支援を受けた。米国政府は、本明細書にいくらかの権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明の分野は、一般に、イオン分子（例えば、鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、またはカリウム）および高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）を含めた様々なターゲット分析物を感知または検出するための装置および方法に関し、より詳細には、バイオセンサと、バイオセンサを使用する方法と、バイオセンサを作成する方法とに関する。
【０００４】
（発明の背景）
病原性バクテリアなどの生体材料を検出するために様々なバイオセンサが開発されている。バクテリアを検出するための従来の方法は通常、有機体の形態学的評価を含み、そのような評価に必要な数の有機体の成長に依拠している（またはしばしばそれが必要である）。そのような方法は、時間がかかり、通常は現場条件下で実用的でない。高速検出および携帯性の要求が、病原体認識を信号変換と結合するシステムの開発をもたらした。バクテリアの光学検出と電気化学検出の両方が報告されている（イヴニツキ等，１９９９年、Ｔ．ワン等，２０００年）（本明細書で引用する文献に対する完全な引用は本明細書の最後に与える）。しかし、本発明の実体は、電気化学方法のほうが、小型化に関して修正可能であるという利点を有することを突き止めた。
【０００５】
理想的な検出器に対する要件には、比較的短時間で完了させることができるプロトコルを使用する高い特異性および高い感度が含まれる。さらに、小型化し、自動化することができるシステムが、特に現場で検出が必要とされる場合に、現在の技術に勝る大きな利点を提供する。
【０００６】
電気化学方法は、電気回路完成の原理を使用する。電気回路を完成させるために、カウンタ電極を使用して、試料溶液または試薬に対するリターン経路を提供し、基準電極を基準点として使用して、それに対して１つまたは複数の別の電極の電位（典型的には作業電極または測定電極の電位）が求められる。このコンタクトは、電気化学手段、すなわち化学溶液または試薬に浸漬された金属電極によって提供しなければならないので、電極により発生する電位と直列に電位が発生するのを回避するのは不可能である。電気化学方法の従来の理論では、基準電極電位が非常に安定しており、溶液中での化学変化による影響を受けないことが重要である。したがって、非常に安定した基準電位を提供する銀／塩化銀基準電極が、今日基準電極に使用される最も一般的なタイプの電極である。
【０００７】
図１を参照すると、典型的な銀／塩化銀基準電極１０が、塩化銀（ＡｇＣｌ）で飽和された塩化カリウム（３．５Ｍ  ＫＣｌ）の溶液５中に浸漬された塩素処理銀ワイヤ１（塩化銀の層が銀ワイヤ上に被覆されている）を含む。この内部充填溶液５は、有孔セラミック接合２０を介して電極１０から徐々に浸みだし、基準要素１と試料の間の電気接続として作用する。安価であり、通常は測定に干渉しないので、塩化カリウムが使用される。溶液５はまた、基準要素１上のコーティングの溶解を防止するために塩化銀を含む。したがって、充填溶液穴４０を使用して、電極１０内の溶液５のレベルを維持する必要がある。
【０００８】
しかし、本発明の実体は、上述した知られている基準電極電位を有する２層の基準電極（例えば銀で被覆された塩化銀）を必要とせずに、頑強かつ精密な生物学的検出を、電気化学方法を使用して、より正確にはレドックス（酸化還元）方法を使用して達成することができることを突き止めた。
【０００９】
次に図２を参照すると、電気化学方法は、フィードバック・ループ内に試験セルが配置された制御増幅器であるポテンショスタット５０を必要とした。目的は、第３の補助電極（カウンタ電極）８０を介する電流の印加によって、試験電極（作業電極）６０と基準電極７０の電位差を制御することである。実際、最小限の構成要素を使用して、かなり良好なポテンショスタットを構築することができる。ここで示す回路では、９０Ａおよび９０Ｂは、正のパワー・レールと負のパワー・レールの間に接続された１．２２Ｖバンドギャップ基準ダイオードである。次いで、ポテンショメータ１００を使用して、主増幅器１１０の非反転入力に加えられる必要なセル極性を設定する。作業電極６０は回路の接地に接続し、基準電極７０は、主増幅器１１０の反転入力に接続する。出力能力をいくぶん上げるために（ほとんどの動作増幅器が、約２０ｍＡに制限され、容量負荷に良好には耐えられない）、単一の利得バッファ増幅器１２０が使用される。好ましくは、利得バッファ増幅器１２０は増幅器１１０よりもはるかに大きな帯域幅を有する。そうでないと、容量電池を駆動するときに回路が振動しやすい。バッファ増幅器１２０の出力は、電流測定レジスタ１４０を介して補助電極８０に接続する。次いで差動増幅器１３０を使用して、このレジスタ１４０の両端間の電圧降下を測定し、それを接地基準出力電圧に変換する。
【００１０】
マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術は、様々な設計適用例で感知および作動を行うためにトランスデューサを用意する。ＭＥＭＳ技術の重要な点は、電子回路と共に集積し、大量にバッチ製造することができるミクロンサイズの機械部品を可能にすることである。ＭＥＭＳデバイスは、マイクロ加工のプロセスによって製造され、バッチ製造プロセスはリソグラフィを採用する。マイクロ加工は、事前設計レジスト・パターン（マスク）を使用して３次元構造を作成するために、リソグラフィ方法の使用に大きく依拠している（ホーおよびタイ，１９９６年，１９９８年）。ＭＥＭＳは、マイクロ製造デバイスまたはその態様を作成するための１つの適切な技術である。マイクロ製造デバイスは通常、ＭＥＭＳおよび／または集積回路（ＩＣ）技術を使用することによって製造されるデバイスと定義される。集積回路（ＩＣ）は、基板材料の小さなチップと定義され、その上に、電子構成要素およびその相互接続の複合体がエッチングされる、または印刷される。
【００１１】
本発明の実体は、電気化学方法に固有の小型化および携帯性の特徴が、この方法を、ＭＥＭＳデバイスへの集積に優れた候補にすること、さらに様々なイオン分子および高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）を検出するためにＭＥＭＳ技術をバイオセンシング方法と統合することが有利であることを突き止めた。
【００１２】
また、本発明の実体は、バクテリアのバイオセンシングの分野で、高い特異性を達成する最も効果的な手段の１つはバクテリアの遺伝材料（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、変性ＤＮＡ）を検出することであることを突き止めた。ターゲット・バクテリアのｒＲＮＡまたはｓｓＤＮＡのみに配列が相補的である一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プローブを選択することによって、ハイブリダイゼーション・イベントの監視が、ターゲット細胞の選択的センシングを可能にする。感度を最大にするために、ハイブリダイゼーション・イベントと酵素反応の組合せが信号増幅をもたらす。これは、各基質から生成物への転換が信号全体に寄与するためである。酵素反応によって増幅されるＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するためのバイオセンシングは、本発明によれば、依然として比較的短時間で完了することができる。
【００１３】
したがって、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する原型電流測定検出器が、上述した決定および技術に基いて開発されている（チェン等，２０００年、ガウ等，２０００年）。ＭＥＭＳ、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅の技術は全て、小型化された特定の高感度Ｅ．ｃｏｌｉ検出器の設計に寄与する。ＤＮＡ電気化学プローブは、すでに報告されており（ワン等，１９９７年、マラザ等，１９９９年）、通常はグラファイトまたは炭素電極が使用される。使い捨て試験ストリップ上のスクリーン印刷炭素電極を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡの電流測定検出用の市販ユニットも利用可能である。スクリーン印刷は、低コストであるという利点を有するが、高次元精度を達成することは容易でない。そこで、本発明の実体は、金属（例えばＡｕ、Ａｇ）や炭素など広い範囲の材料をμｍサイズ寸法で正確にパターン形成するためにリソグラフィを使用する方法を開発する必要性を突き止めた。さらに、ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨドデカンアミドの自己組織化単層（ＳＡＭ）など表面修正を利用することが、ＭＥＭＳ表面上で分子を選択的に不動化する１つの好ましい方法である。Ａｕ、Ａｇ、および他の金属上へのＳＡＭの形成がよく研究されており（レベル等，１９９８年、モテシャライ等，１９９８年、シャー等，１９９８年、ライリ等，１９９９年）、蛋白質および他の生体分子を、ＳＡＭを使用してＡｕなどの表面上に簡単に不動化することができる（オスツーニ等，１９９９年、ケーン等，１９９９年、スピンケ等，１９９３年、ハウスリング等，１９９１年）。基板上でＳＡＭを使用する電流測定方法は、ターゲット分析物を正常に検出することができることが実証されている（サン等，１９９８年、ホウ等，１９９８年、マーシー等，１９９８年）。
【００１４】
このＥ．ｃｏｌｉ検出システムで、本発明は、各技術に固有のいくつかの利点を識別し、利用する。ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび酵素増幅を使用して、本発明は、必要な特異性および感度を達成する。ＭＥＭＳおよびＳＡＭを使用して、本発明の実体は、携帯型器具内に開発することができる小型システムを製造した。最後に、本発明は、この検出システムが広い範囲の病原性バクテリアに適用可能であることを実証した。例えば、検出モジュールおよびアッセイ・プロトコルを、尿路病原性バクテリアの検出、および中耳炎（中耳感染）をもたらす微生物の同定に適合させることができる。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、新規なバイオセンサと、バイオセンサを使用する新規な方法と、バイオセンサを作成する新規な方法とを提供することである。この目的は、主要な請求項の特徴の組合せによって解決され、従属請求項がさらに、本発明の有利な実施態様を開示する。
【００１６】
（発明の概要）
本発明のこの概要は、本明細書で詳述する全ての必要な特徴を必ずしも説明するものではなく、本発明はまた、ここで説明する特徴、および本明細書の他の場所で説明する特徴の副次的組合せも含む。
【００１７】
本発明の第１の態様は、単一基板（シリコン、ガラス、プラスチックなど）に組み込まれたバイオセンサを使用して、特に高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）およびイオン分子（例えば、鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、またはカリウム）を含めた様々なターゲット分析物を感知または検出する装置および方法を提供する。基板に構成されたバイオセンサ・システムは、通常は、基板上に単一シリーズ・マイクロ製造プロセス・ステップとして一体に製造された少なくとも２つの電極を備える。しかし、システムを製造するために連続マイクロ製造ステップを採用することもできる。
【００１８】
１つの好ましい実施態様では、電極は全て、（例えば従来技術のＡｇ／ＡｇＣｌ電極に比べて）純粋な金属から作成される。別の好ましい実施態様では、基板に構成されたバイオセンサ・システムが、作業電極、基準電極、およびカウンタ（補助）電極を備える。好ましくは、基板に構成されたバイオセンサ・システムは、従来の電気化学バイオセンサと同じ電気化学性能を有する。さらに、基板に構成されたバイオセンサ・システムは、集積回路（ＩＣ）および／またはＭＥＭＳ製造プロセスに適合性があり、かつ小さな領域に構成することができるものにすべきである。
【００１９】
本発明の第２の態様は、小さなスケールでの表面張力を使用して、バイオセンサ内に試薬および／または溶液を閉じ込める装置および方法を提供する。試薬および／または溶液は、生物学的センシングに必要とされる必要な電解質および／または分析物を含む。
【００２０】
１つの好ましい実施態様では、本発明の装置および方法は、制御可能な表面性質および小さなスケールでの表面張力を使用することによって、様々なイオン分子（例えば鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、またはカリウム）および高分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）を感知または検出するために使用される各電極を、電解質および／または分析物が必要とされるときに試薬および／または溶液と選択的に接触できるようにする。
【００２１】
別の好ましい実施態様では、表面張力を使用して試薬および／または溶液（したがって、試薬および／または溶液中の電解質および／または分析物）を閉じ込めるための装置および方法が、携帯型またはハンドヘルド・デバイスに組み込まれ、デバイスの振動に対する耐性をもつ。さらに、試薬および／または溶液は、バイオセンサが逆さになったとしても表面張力を使用してバイオセンサによって定位置に堅く保持されるべきである。
【００２２】
本発明の第３の態様は、集積回路（ＩＣ）技術を用いて、１つおよび／または複数の電気化学センサの構成要素（例えば電極）と、１つまたは複数の電気化学センサ内の追加の必要な電子回路構成要素（例えば増幅器）とを集積する装置および方法を提供する。１つおよび／または複数のセンサ・システム全体を、単一の半導体（例えばシリコンまたはガリウム砒素）基板またはチップなど、単一のＩＣ基板またはチップ上に組み込むことができる。好ましくは、１つまたは複数のシステムを完成させるのに、外部構成要素および／または器具が全く必要ない、またははるかに少数しか必要とされない。１つまたは複数のセンサは、好ましくは、ＩＣプロセスを使用して製造される。
【００２３】
高分子電気化学検出に使用される任意の実施態様で、本発明の好ましい特徴は、少なくとも１つの電極の表面を修正することである。好ましくは、表面は、表面上に高分子を係留するように修正される。好ましくは、表面は、ビオチンストレプトアビジンなど自己組織化単層（ＳＡＭ）を使用して修正される。好ましくは、ＳＡＭは、電気化学センサ内の作業電極の表面上に配置される。任意選択で、ゾルゲルおよび／または炭素ペーストなどの材料を使用して表面を修正することができる（ＳＡＭの代用として、またはＳＡＭと組み合わせて）。
【００２４】
上述した「発明の概要」は、例示のみを表し、限定を与えない。本発明のさらなる実施形態および副次的組合せ、修正、変更、および強化は、本明細書で以下に続く発明の詳細な説明で明らかになろう。
【００２５】
図面中、いくつかの図を通じて同じ参照番号が同じ要素を示す。
【００２６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
次に、本発明の特定の実施形態を図面を参照しながら説明するが、本発明の精神、範囲、および企図から逸脱することなく様々な変更および修正を加えることができることを理解されたい。実際、図面および本明細書での説明は、例として提供されており、限定を与えるものではない。
【００２７】
本発明の第１の形態は、電気化学検出の原理を使用する様々なターゲット分析物、特にイオン分子（例えば、鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、またはカリウム）および高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）の検出に関する。電気化学検出の原理は、レドックス電池の使用と、電池内での電気化学反応とを必要とする。
【００２８】
レドックス電池は、電池内で化学反応が起きたときに化学エネルギーを電気エネルギーに変換する、または電気エネルギーを化学エネルギーに変換するデバイスである。典型的には、この電池は、水溶液（電解質）中に浸漬された３つの電極からなり、電極溶液面で電極反応が生じる。
【００２９】
電池は、イオン伝導相（例えば、水溶液または非水溶液、溶融塩、イオン伝導固体）によって接続された２つの電子伝導相（例えば、固体または液体金属、半導体など）からなる。電流が流れる際、電子電流からイオン電流へモードを変更し、電子電流に戻さなければならない。伝導モードのこの変更には、酸化還元反応が伴う。各モード変更反応は半電池と呼ばれる。
【００３０】
各電気化学反応は、レドックス電池内で生じる酸化還元（レドックス）反応である。例えば、酸素によって水素を酸化して水を生成する間の自発的「化学反応」では、電子は、水素から酸素に直接移る。対照的に、レドックス電池内での自発的電気化学反応では、２つの個別電極反応が、実質的に同時に、または並行して発生する。
【００３１】
レドックス電池の重要な特徴は、同時に発生する酸化還元反応が、空間的に離れていることである。例えば、水素は、電子をアノード電極に移動することによってアノード電極で酸化され、酸素は、電子をカソード電極から受け取ることによってカソード電極で還元される。全電気化学反応は、２つの電極反応を合わせたものである。電極反応で発生するイオン、この場合はプラスの水素イオンとマイナスの水酸イオンが、溶液中で再結合されて、反応の最終生成物である水を生成する。
【００３２】
このプロセス中、電子は、電子電流を測定することができる外部電気回路を介してアノード電極からカソード電極に伝導される。この反応を逆にすることもできる。電解槽内に電力を印加することによって水を水素と酸素に分解することができる。
【００３３】
本発明の３電極システムは、作業電極、カウンタ電極（または補助電極）、および基準電極を含む電気化学電池である。電流が、作業電極とカウンタ電極の間を流れることができ、作業電極の電位が基準電極に対して測定される。このセットアップは、作業電極表面上、または電気分析適用例で発生する電極反応の速度論および機構を検査するために、基本的な研究で使用することができる。本発明の好ましい実施形態での検出モジュールは３電極システムに基づいている。
【００３４】
カウンタ電極は、電流を作業電極に印加することができるように電解質への電気接続を形成するために使用される。カウンタ電極は通常、その溶解を回避するために不活性材料（貴金属または炭素／グラファイト）から作成される。本発明に関連して、大きな電流がカウンタ電極から引き出されたときに、カウンタ電極での小さなフィーチャまたは小さな断面が周囲溶液を加熱することが観察された。電流が連続的にオーバーフローした場合には気泡が発生し、最終的には電極の溶解が生じる。したがって、電流および／または電極サイズを制御することによって気泡発生を回避することができる。本発明の１つの好ましい実施形態では、カウンタ電極の幅を、大きな電流のときでさえこの加熱の問題を回避するのに十分な大きさにする。
【００３５】
基準電極は基準点として使用され、その基準点に対して他の電極の電位（典型的には作業電極または測定電極の電位）を電気化学電池内で測定することができる。銀／塩化銀電極、カロメル電極、または水素電極などいくつかの一般的に使用されている（通常は市販されている）電極アセンブリは全て、電池内で使用される電解質とは無関係に電極電位を有する。しかし、本発明の実体は、金電極の単一層など単一層電極が基準電極に関する要件を満たす場合があることを突き止めた。さらに、銀、銅、白金、クロム、アルミニウム、チタン、ニッケルなど他の材料も、正しい条件下で単一層基準電極として働く場合がある。
【００３６】
作業電極は、本発明の電気化学バイオセンサで中心的な役割をする。作業電極で発生する反応を使用して、電解質溶液の電気化学分析を行うことができる。作業電極は、加えられる極性に応じて、アノードまたはカソードとして働くことができる。いくつかの「従来型２電極」電池における電極の１つも、例えば、（基準電極に対する）測定電極の電位が溶液中の１つの種の濃度の尺度である電位差測定電気分析セットアップでは、「作業」（「測定」、「インジケータ」、または「感知」）電極と考えることができる。
【００３７】
１つの好ましい３電極実施形態では、カウンタ電極および基準電極が、バイオセンサの作業電極の周縁の周りに概して延在するように構成される。適切な構成は、例えば図３、４、５、１２、１３、および２３に見られる。
【００３８】
１つの好ましい実施形態では、電気化学バイオセンサは、マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術を使用して製造される。ここで図３を参照すると、二酸化珪素（ＳｉＯ２、１０００Å）の層が、ベア・シリコン・ウェハ２００（第１級、ｐ型＜１００＞、厚さ５００〜５５０μｍ）上に堆積され、窒化珪素（Ｓｉ３Ｎ４、１０００Å）の下でパッド層として働いて、応力を解放し、接着性を改善する。複数のＭＥＭＳバイオセンサ（バイオセンサ２１０など）が、様々な寸法の作業電極（作業電極２２０など）と共に製造された。好ましくは、各作業電極は、エッチングされて、深さが最大３５０μｍのウェルを形成する。
【００３９】
窒化物被覆シリコン・ウェハ２００は、パターン形成され、［１１１］および［１００］結晶面に沿ってＫＯＨを使用してバルク・エッチングされる。ウェルの深さは、ＫＯＨエッチング時間および温度によって制御される。１００μｍ幅の補助電極（補助電極２３０など）および基準電極（基準電極２４０など）が、対応する作業電極２２０から２００μｍだけ離隔される。図３は、ＭＥＭＳバイオセンサ（バイオセンサ２１０など）を製造する際に使用されるパターンの概略図を示す。
【００４０】
窒化物および酸化物がＨＦエッチングによって除去されて内部応力が解放され、電気絶縁のために別の酸化物層（５０００Å）が堆積された。電極は、ＰＲ５２１４フォト・レジスト・リバース・イメージングおよびＡｕ（２０００Å）／Ｃｒ（２００Å）の電子ビーム堆積を用いた電子リフトオフ・プロセスによってパターン形成された。最後に、ウェハ２００が、１５０℃で１０分のホット・ベークの後、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）蒸気中に３分間浸されて、周囲のＳｉ領域に疎水性表面が生成された。作業電極（作業電極２２０など）の３次元性質と共に、周囲領域の疎水性が、溶液中の対象の分子を作業電極に不動化する初期センシング・ステップ中に、作業電極２２０上での液体水滴の封じ込めを可能にする。この設計は、ＭＥＭＳアレイの他の領域への生体分子の不特定結合を効果的に最小限に抑えた。
【００４１】
好ましくは、全ての電気化学電極に使用される材料が金（Ａｕ）である。ＭＥＭＳ技術で利用可能ないくつかの伝導材料が、リフトオフ・プロセスによってシリコン基板上にパターン形成され、３電極システムの特徴が、フェリシアン化物溶液を用いてサイクリック・ボルタンメトリによって試験された。金、白金、チタン、アルミニウム電極の様々な組合せが試験され、Ａｕ／Ａｕ／Ａｕの３電極システムが最良のＣ−Ｖ曲線およびレドックス特性を与えた。
【００４２】
図４は、バイオセンサ３１０など複数の円形バイオセンサを有する正方形基板３００（シリコン、ガリウム砒素、プラスチック、および／またはガラスなど）上に製造されたバイオセンサの一実施形態を示す。バイオセンサ３１０は、作業電極３２０、基準電極３３０、およびカウンタ（補助）電極３４０を備える。前述したように、好ましくは、電極が、ＭＥＭＳ技術で利用可能な伝導材料の単一層から構成される。さらに、好ましくは、全ての電極を金（Ａｕ）で構成すべきである。
【００４３】
図５は、本発明のさらに別の好ましい実施形態を示す。バイオセンサ４１０が、基板上に製造された作業電極４２０と、基準電極４３０と、カウンタ（補助）電極４４０とを備える。好ましくは、電極は金から作成される。作業電極４２０は、基板内にある、深さが最大３５０μｍのビルトイン・ウェル４５０内に形成される。ウェル４５０は、よく区画された空間内部に所望の試薬を閉じ込めるように設計されている。図５に示されるように、本明細書で説明するマイクロ製造方法によって製造されるウェル４５０は、ＫＯＨエッチングの後に（１１１）シリコン面によって境界を画される。上述したマイクロ製造方法によって形成される作業電極４２０は、ウェル４５０表面全体をカバーする。
【００４４】
動作の際、上述した実施形態は、製造が容易であるという利点を有し、基板上に、単一シリーズ・マイクロ製造プロセス・ステップとしてまとめて製造することができる。しかし、製造に連続マイクロ製造ステップを採用することもできる。さらに、以下に示す分析および実験のように、これらの低コストであり、製造が容易なバイオセンサは、再利用可能であり、従来のバイオセンサと同じ頑強性および可逆電気化学性質を有する。
【００４５】
１つの実験では、サイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）分析技法が使用される。ＣＶは、電気活性種およびバイオセンサの特徴の研究で使用される最も多用途の分析技法の１つである。電気化学システムの基本的な特徴では、産業および学術研究ツールとして広く使用されている。サイクリック・ボルタンメトリでは、制御された（典型的には固定された）掃引速度（Ｖ／秒）で初期電位（Ｅ０）から最大電位（Ｅｍ）に電位が傾斜している。図６はその概念を例示する。分析物の還元および酸化の反復サイクルは、作業電極内外で交互にアノード電流とカソード電流を発生する。溶液および／または試薬が攪拌されないので、様々な分析物濃度および様々なスキャン率で拡散効果が観察される。
【００４６】
アノード電流ピーク（ｉｐａ）とカソード電流ピーク（ｉｐｃ）の離隔距離を使用して、レドックス反応に関わる電子の数を予測することができる。ピーク電流はまた、分析物濃度Ｃ、およびスキャン率ｖに正比例している。実験結果は通常、図７に示したグラフと同様に、電流対電位としてプロットされる。
【００４７】
図７に示されるＣＶスキャンでは、電位が、ｘ軸に沿ってグラフに描かれており、より正（または酸化）の電位が右にプロットされており、より負（または還元）の電位が左にプロットされている。電流は、ｙ軸にプロットされており、カソード（すなわち還元）電流が負の方向に沿って下へプロットされており、アノード（すなわち酸化）電流が正方向にプロットされている。
【００４８】
以下に述べる制御実験で使用された分析物は、窒化カリウムＫＮＯ３（１０１．１１ｇ／ｍｏｌ）の緩衝液中で＋３酸化状態の鉄原子（ＦｅＩＩＩ）を含むフェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６（３２９．２６ｇ／ｍｏｌ）であった。作業電極の表面で、単一の電子をフェリシアン化物陰イオンに追加することができる。これは、その陰イオンを、＋２酸化状態の鉄原子（ＦｅＩＩ）を含むフェリシアン化物陰イオンＦｅＩＩ（ＣＮ）６４−に還元させる。分析物と電極のこの単純な１電子交換は、良好に挙動する可逆反応である。これは、分析物を、ＦｅＩＩ（ＣＮ）６４−に簡単に還元し、その後、酸化してＦｅＩＩＩ（ＣＮ）６３−に簡単に戻すことができることを意味する。
【００４９】
レドックス・カップルは、酸化状態のみが異なる一対の分析物である。ＦｅＩＩＩ（ＣＮ）６３−／ＦｅＩＩ（ＣＮ）６４−レドックス・カップルに関する電気化学半反応は、以下のように書くことができる。
FeIII(CN)63-+e-⇔FeII(CN)64-  E0=+0.358V(NHE)              （１）
【００５０】
図８に示されるボルタモグラムは、一方がカソードのピーク（ｉｐｃ）であり他方がアノードのピーク（ｉｐａ）である２つの非対称ピークを示す。標準水素電極（ＮＨＥ）など標準の基準電極を使用すると、この半反応に関連する見掛電位は＋３５８ｍＶ前後になる。作業電極が、＋４００ｍＶよりもプラス側の電位で保持される場合、分析物は、ＦｅＩＩＩ（ＣＮ）６３−形態に酸化される傾向がある。作業電極でのこの酸化は、溶液から電極内に電子を進めて、アノード電流をもたらす。＋４００ｍＶよりもマイナス側の電位では、分析物がＦｅＩＩＩ（ＣＮ）６４−に還元される傾向がある。作業電極でのこの還元は、電極から溶液中に電子を流して、カソード電流をもたらす。本発明の好ましいセンサ設計実施形態は、ＮＨＥ、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、または飽和カロメル電極（ＳＣＥ）など標準の基準電極を利用しないので、かつ３つの電極全てが金（Ａｕ）であるので、この実験での静止（不偏）電位が０ボルトに近づく。
【００５１】
サイクリック・ボルタモグラムの重要なパラメータは、カソードおよびアノード・ピーク電流（それぞれｉｐｃおよびｉｐａ）、ならびにこれらの電流が観察される電位（それぞれＥｐｃおよびＥｐａ）の大きさである。これらのパラメータを使用して、見掛還元電位（Ｅ０、これはＥｐａとＥｐｃの中間に取られる）、および電荷移動反応で輸送される電子の数（ｎ）を計算することができる。
【００５２】
ピーク電流（ｉｐａまたはｉｐｃ）は、ランドルス・セヴシックの式で表すことができる。
ｉｐ＝０．４４６３ｎＦＡＣ［ｎＦｖＤ／ＲＴ］１／２          （２）
ここで、
ｎ＝レドックス・カップルに関する半反応で現れる電子の数
Ｆ＝ファラデー定数（９６４８５Ｃ／ｍｏｌ）
Ａ＝電極面積（ｃｍ２）
ｖ＝電位が掃引される速度（Ｖ／秒）
Ｄ＝分析物の拡散係数（ｃｍ２／秒）
Ｒ＝一般気体定数（８．３１４Ｊ／ｍｏｌ・Ｋ）
Ｔ＝絶対温度（Ｋ）
である。２５℃で、ランドルス・セヴシックの式は、以下のように変形することができる。
ｉｐ＝（２．６８７×１０５）ｎ３／２ｖ１／２Ｄ１／２ＡＣ      （３）ここで、この定数は単位を有する（すなわち２．６８７×１０５Ｃｍｏｌ−１Ｖ−１／２）。
【００５３】
ランドルス・セヴシックの式は、ボルタモグラムが様々なスキャン率で取られたときに、掃引速度の平方根にピーク電流が比例することを予想している。図９に示されるように、ピーク電流と掃引速度の平方根との関係のプロットは直線になる。ランドルス・セヴシックの式を、以下のように、この直線の傾きに関する表現を与えるように修正することができる。
傾き＝（２．６８７×１０５Ｃｍｏｌ−１Ｖ−１／２）ｎ３／２Ｄ１／２ＡＣ    （４）
ピーク電位およびピーク電流に依存するスキャン率を用いて、レドックス反応に関与する電子の数を評価し、かつ反応全体での可逆性の度合の定性的評価を与える。可逆レドックス・カップルに関して電極反応（ｎ）中に移動される電子の数は、ピーク電位の離隔距離（ΔＥｐ＝Ｅｐａ−Ｅｐｃ）から求められる。単純な可逆（高速）レドックス・カップルでは、アノード・ピーク電流とカソード・ピーク電流の比が１となるはずである。好ましいセンサ設計を使用した実験の結果は、１からわずかしかずれない。大きな逸脱は、電極プロセスに関連する干渉化学反応を示し、しかし１からのわずかな逸脱は、理想的なシステムではないことを単に示唆するにすぎない。図１０は、第１のサイクルからわずかに逸脱した１２の連続サイクルに関するＣＶスキャンを示す。これらの結果は、明らかに、高い可逆性のあるシステムと、頑強な電池設計とを示す。
【００５４】
従来のセンサと同じ性能を有しながら容易に、かつ安価に製造することに加え、本発明の上述した実施形態はまた、集積回路（ＩＣ）およびＭＥＭＳ製造プロセスに適合性があるという利点を有する。さらに、図３および４に示されるように、これらの実施形態は、バイオセンサのアレイ内で、小さい領域内に構成することができる。
【００５５】
本発明の第２の態様は、小さなスケールでの表面張力を使用する、バイオセンサの試薬および／または溶液の閉込めに関する。試薬および／または溶液は、バイオセンシングに必要な（１つまたは複数の）ターゲット分析物および／または（１つまたは複数の）化学物質を含む。
【００５６】
バイオセンサの性能は、その特異性および感度によって主に決定される。シリコンなどの基板上に試薬を閉じ込めるという概念は本発明に関連する研究で発見され、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの分析物または他の試薬もしくは溶液成分が作業電極の周縁の周りの領域上に不特定結合し、高い検出ノイズを生じ、高い偽陽性率を生み出すことによって生じる高レベルの検出ノイズを低減するための解決策となる。ＨＲＰは、本実施形態ではシグナリング酵素として使用される。表面のＨＲＰ残留物からノイズが生じないことを検証するために、簡単な試験を行って、この望ましくない結合の寄与を推定する。ＨＲＰは、ベア・シリコン・チップに導入され、その後、基板溶液の追加前にいくつかの洗浄ステップが行われた。基板溶液を追加した後、非常に高レベルの酵素反応が即座に観察された。
【００５７】
予想されるように、ＨＲＰは、他の蛋白質と同様に、シリコン表面に簡単かつ密接に付着する。不特定結合を低減する大きな改良は行わずに、いくつかの市販されている洗浄溶液および阻止蛋白質が試験された。その結果、望ましくない結合の効果を回避する最良の方法は、まずそれが起こらないようにすることであることが突き止められた。本発明のバイオセンサの作業電極の外側の領域は、生物学的センシングを達成するためにＨＲＰ溶液にさらす必要はない。しかし、従来技術では、常に水成システム中に３つの電極全てを浸漬することが慣例であり、全ての試薬が表面領域全体を介して流れる。
【００５８】
本発明の実体によって発見された、よく区画された空間内部に何らかの試薬を閉じ込めるための最も簡単な方法は、バイオセンサ内にウェルを形成することである。図５に示されるように、マイクロ製造ウェルは、ＫＯＨエッチングの後、シリコン結晶面４００によって境界を画される。リフトオフ・プロセスによって形成される作業電極４２０がウェル表面全体をカバーする。したがって、不特定結合する可能性がある試薬または溶液含有成分（例えばＨＲＰ）を始めはウェル領域に閉じ込めて、ウェル内で電極（好ましくは作業電極）への所望の結合を達成することができ、その一方でバイオセンサの周縁領域への不特定結合を回避する。次いで、試薬または溶液をバイオセンサから洗浄除去し、追加の試薬および／または溶液を後で追加して、センシング・プロセスを完了することができる。
【００５９】
バイオセンサを設計する際に、表面および材料科学の重要性を過小評価することはできない。希釈された試薬がウェハ表面の周りを流れている状態で、受け入れられない量の不特定結合が洗浄プロセス中に依然として生じている場合がある。例えばＨＲＰを含む洗浄溶液が周縁領域に留まる時間は、結合時定数よりもはるかに長い。したがって、ウェル構造を製造するのに加えて、好ましくは、周縁領域の表面を他の機構によって保護すべきである。
【００６０】
したがって、表面が望ましくない試薬または結合成分に接触しないようにする別の方法は、表面を疎水性にすることである。シリコン表面のシラン化は、浮遊構造が表面張力によって基板に付くのを防止するために広く使用されている。ここでは、この手法を使用して、シリコン基板の周縁領域への生体分子の直接接触を防止する。
【００６１】
様々な機能末端基を有するシランベースの分子を使用して、シリコン・ウェハ、窒化珪素チップ、および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップの表面性質を修正した。表面修正のためのシラン化合物は、末端Ｓｉ（Ｃｌ）ｎまたはＳｉＯ−Ｃ２Ｈ５基の加水分解により、シリコン酸化物表面に化学的に繋がれた頑強な単層を形成する。
【００６２】
生体系と接触する人工材料の性能は、２つの材料の表面相互作用によって決定される。表面相互作用は、ノイズ増大および構造損傷をもたらす可能性があるので、表面修正が、この問題を回避するための一方法である。最も簡単な方法は、構造の表面性質を変更すること、またはプラスチックを使用することによるものである。表面を生体適合性または生体不活性表面に変換することにより、表面に堅く繋がれた分子層の生成によって不特定の相互作用を最小限に制限する、またはなくす。最も広く実施されている手法は、主にＣ．Ｄ．ベインおよびＧ．Ｍ．ホワイトサイズによって８０年代に開発されたよく確立された処置に従ってシリコン酸化物表面上にＳＡＭを形成するために、金表面およびシラン分子上への化学吸着によってチオール分子からの自己組織化単層（ＳＡＭ）を使用する。ゾルゲルおよび炭素ペーストなど他の材料を使用して表面を修正することもできる。
【００６３】
次に図１１（ａ）を参照すると、操作の際、試薬は疎水性作業電極によって成形され、小滴が、Ａｕ作業電極表面を覆うように良好に形成される。図１１（ｂ）は、試薬の体積の増大と共に、試薬によってカバーされる領域が徐々に広がり、その後、他の２つの電極をカバーすることを実証している。図１１（ｃ）は、余剰の試薬の流れがピペットによって投与されるときに、疎水性シリコン基板上に広がるのではなく、試薬の玉４６５が形成されることを示す。
【００６４】
次に図１２および１３に移ると、各個別の電極が、制御可能な表面性質および小さなスケールでの表面張力を使用することによって、必要とされるときにのみ電解質および／または分析物、ならびに他の成分５０９に接触する。次に、図１３のみを参照すると、電気化学検出に関して、全ての電極を、検出時間にのみ、電解質および／または分析物５０９中に浸漬しなければならない。ほとんどの適用例で、作業電極５１０上に電解質および／または分析物５０９を不動化するための図１２に示される試料調製に大部分の時間が費やされる。図１２および１３に示されるこの実施形態では、電極の上の電解質および／または分析物５０９のカバー範囲は、表面性質および試薬体積５２０によって制御される。
【００６５】
したがって、上述の実施形態は、小さなスケールでの表面張力を利用して、電解質および／または分析物、ならびに他の成分を閉じ込める。さらに、上述した実施形態は、はるかに少ない試薬（ｐＬ〜ｍＬ程度）しか必要とせず、大量の溶液の必要性をなくする。さらに、少量の試薬使用のため、上述した実施形態は、電極の近く（ｐｍ〜ｍｍ）に分析物を有するという利点を有し、それにより、電極に対する分析物の適切な露出を拡散効果のみを使用して達成することができ、攪拌または他の混合の必要性がなくなる。上述した実施形態の別の利点は、電極に対する電解質および／または分析物のカバー範囲の制御および／または変更が容易であることである。さらに、上述した試薬および／または溶液閉込め実施形態は、不特定結合を大幅に低減することによって、ターゲット分析物の損失を低減し、バイオセンサの感度を改善する。さらに、上述した実施形態は、バイオセンサの振動に対して比較的耐性があり、携帯型またはハンドヘルド・システムに適している。最後に、表面張力閉込め効果により、センサが逆さになったとしても、試薬は表面張力によってしっかりと保持される。
【００６６】
任意選択で、図１２および１３に示されるように、バイオセンサ実施形態は反応ウェル５３０を備え、試薬５２０を定位置に保持する助けをし、試薬５２０の形状を制御することができる。しかし、そのようなウェル５３０は必要ではなく、試薬５２０の閉込めは、単純な平らな表面によって達成することができる。
【００６７】
次に図１４を参照すると、これは、このバイオセンサ（センサチップ）の実施形態の好ましい製造の最初のステップを示す。図１４に示されるように、二酸化珪素（ＳｉＯ２、１０００Å）の層６２０がまず、ベアＳｉウェハ６１０（第１級または試験級、ｐ型またはｎ型＜１００＞、厚さ５００〜５５０μｍ）上に堆積される。二酸化珪素６２０は、窒化珪素６３０（Ｓｉ３Ｎ４、１０００Å）の下でパッド層として働いて、応力を解放し、接着を改善する。
【００６８】
次に、図１５および１６を参照すると、窒化物ウェハ６００は、マスク６４０によってパターン形成され（図１５）、［１１１］および［１００］結晶面に沿ってＫＯＨを使用してバルク・エッチングされる（図１６）。エッチングによりウェル６５０が作成される。ウェル６５０の深さ（最大３５０μｍ）は、ＫＯＨエッチング時間および温度によって制御される。
【００６９】
次に図１７を参照すると、次いで、窒化物６３０および酸化物６２０がＨＦエッチングによって除去されて、内部応力が解放され、電気絶縁のために別の酸化物６６０層（５０００Å）が堆積される。
【００７０】
図１８および１９は、必要な電極を製造するためのリフトオフ・プロセスを示す。バイオセンシング用の電極が、二酸化珪素層６６０上でＰＲ５２１４フォトレジスト層６７０を使用することによって基板６１０上にパターン形成される。次に、マスク６７１を使用して、（望ましくないフォト・レジスト層６７０の除去を含めた）リバース・イメージング・プロセスを使用することによってフォト・レジスト層６７０上に所望のパターンを転写する。金Ａｕ（２０００Å）の層６８０が、所望のフォト・レジスト・パターン層６７０を有する二酸化珪素層６６０上に電子ビーム堆積される。好ましくは、二酸化珪素層６６０上へのＡｕの接着を改善するために、Ａｕ（２０００Å）６８０の堆積の前に、クロム（Ｃｒ  ２００Å）など接着剤６９０の堆積が行われる。さらに、チタンまたは膠など他の材料も接着剤として働く場合がある。最後に、図１９を参照すると、フォト・レジスト６７０および望ましくないＡｕ６８０およびＣｒ６９０が、フォト・レジスト・パターン層６７０を溶解することによって除去される。
【００７１】
最終的に、ウェハ６００は、１５０℃で１０分のホット・ベークの後、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）蒸気中に３分間浸されて、周囲のＳｉ領域に疎水性表面が生成される。
【００７２】
好ましくは、不特定結合を防止するために、表面修正ステップによってバイオセンサ（センサ・チップ）の表面が修正される。一例として、図２０を参照すると、始めに濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２Ｏ２）を用いてＡｕ表面６８０を浄化するステップと、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）を用いて入念にすすぎ洗いするステップとによって、高分子バイオセンサの表面を修正することができる。次に、図２０を参照すると、ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）（ロシュ  ＧｍＢＨ、ドイツ）のＳＡＭなどの表面修正材料が堆積される。ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨのＳＡＭを堆積する際、スピンケ他（１９９３年）の処置が使用され、試料は、４．５×１０−４Ｍ  １１−メルカプト−１−ウンデカノールを有するエタノール中の５０ｍＭビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ溶液（アルドリッチケミカル社  ４４，７５２−８）中で約１８時間インキュベートされ、エタノールおよび水ですすぎ洗いされた。最後に、図２１を参照すると、次いで、ビオチン被覆Ａｕ表面７００が約１０分間、１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液に露出され、やはりｄＨ２Ｏを用いてすすぎ洗いされて、ストレプトアビジン被覆Ａｕ表面７１０が形成された。
【００７３】
本発明の第３の形態は、単一集積回路（ＩＣ）チップ上に電気化学（レドックス）バイオセンサ全体を集積することに関する。集積回路（ＩＣ）は、基板材料の小さなウェハと定義され、その上に、電子構成要素およびその相互接続の複合体がエッチングされる、または印刷される。
【００７４】
ＭＥＭＳデバイスは、小さなフィーチャの結果として特有の性質を有し、しかし、ＭＥＭＳベースのセンサからの信号レベルは、従来センサに比べて比較的低い。オフチップ増幅モジュールを使用することによって感度を改善することができるが、ノイズおよびシステム・サイズも増大する。したがって、本発明の実体は、オンチップ増幅回路（バイオセンサ・チップ自体に組み込まれた増幅回路）および検出回路（例えばバイアス電位、電流測定、順次制御および信号処理を提供する）を設計して、チップ間干渉を低減する。検出回路と増幅回路はどちらも、バイポーラ・トランジスタ（ＢＪＴ）および／または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）デバイスを使用することによって提供することができる。
【００７５】
本発明の一実施形態では、オンチップ増幅デバイスが、通常は電気化学センサ電池の最大領域である作業電極の下に配置される。オープンベース・バイポーラ（ＢＪＴ）フォトセンサに類似して、ベース領域は、電流利得βをもつトランスデューサから電流を受け取り、電流利得βは８０〜１５０の範囲にある。電気化学電池と共に実装することができる２つのタイプのＢＪＴ、すなわち垂直ＢＪＴと水平ＢＪＴが存在する。電流利得はベース領域の長さによって決定される。垂直ＢＪＴでは、これは、イオン注入エネルギーとドーピング濃度の関数である。水平ＢＪＴでは、この長さは、リソグラフィ分解能、イオン注入角度、および熱拡散の関数である。これらの理由から、垂直ＢＪＴは、チップ間またはチップ内利得均一性の点でより信頼性がある。
【００７６】
図２２は、好ましくは電気化学センシングに使用される３つの金属電極を備えるバイオセンサを含むチップ内増幅器回路の一実施形態を断面で示す。好ましくは、３つの電極が集積回路（ＩＣ）プロセスを使用して製造され、相互接続および絶縁のために比較的大きな領域を有する。バイオセンサ・チップ７００全体を、２つのステージ（電気化学センシング・ステージ７３０とバイポーラ・トランジスタ（ＢＪＴ）増幅ステージ７２０）で積層することができ、Ａｕ作業電極７１０が、ＢＪＴデバイス７２０用の電気化学シールドとして働くことができる。作業電極コンタクト（コンタクト７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、および７３８など）は、コンタクト界面７４０に接触し、また、より高い信号のために作業電極７１０の表面積を増大する。全てのコンタクトおよび電極構造を、金などの金属の単一層を備えるように作成することができる。さらに、バイオセンサ・チップ７００はシリコン基板７４４を備える。基板７４４は、ベース領域７４３と、コレクタ７４２と、エミッタ７４１とを含む。ベース領域７４３は、作業電極７１０から電子流を受け取る。コレクタ７４２は、電源に接続され、増幅の理由での何らかのベース条件の下で電流利得を提供する。次いで、ベース７４３およびコレクタ７４２からの、結果として得られる電流がエミッタ７４１で測定される。
【００７７】
引き続き図２２を参照すると、金属相互接続７５０が、信号出力（図示せず）およびエミッタ７４１に接続される。金作業電極７１０は、エッチングによって第１の二酸化珪素層７６０を介してベース領域７４３に接続する。第２の二酸化珪素層７７０が、ＢＪＴ７２０と信号線を絶縁し、第１の層７６０は、３つの電極（作業電極７１０、基準電極７８０、およびカウンタ電極７９０）を絶縁する。作業電極７１０上のコンタクト（コンタクト７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、および７３８など）は、表面積を増大し、またＢＪＴ７２０と共に固体コンタクトを形成する。コンタクトの寸法（それぞれ約数十μｍ）は、作業電極７１０上の任意の蛋白質ＳＡＭのサイズ（約数十Å）よりもはるかに大きく、したがって蛋白質吸着に影響はない。
【００７８】
図２４は、図２３に示された基板８０５上にある複数のバイオセンサの好ましい実施形態を表す、バイオセンサ・ユニット８００の別の好ましい実施形態の断面図である。図２４に見られるように、バイオセンサ・ユニット８００は、ＣＭＯＳおよび／またはＢＪＴ層８３０、電気化学層８４０、および試薬封じ込め層８５０を備え、すでに述べた図２２の実施形態と概して同様である。
【００７９】
したがって、図２２、２３、および２４に示されるように、本発明の第３の形態は、センサ内の構成要素を、生物学的検出に必要な他の構成要素とチップ間接続することなく、直接集積することができるようにするバイオセンシング・システムに関する。このシステムは、完全なシステムを構成するために、外部構成要素（器具）を必要としない、または最小数の外部構成要素しか必要としない。さらに、このオールインワン・バイオセンシング・システムは、生物学的センシングのコストおよびノイズ・レベルを低減し、そのようなセンシングのプロセスを簡略化する。
【００８０】
次に図２５を参照すると、これは、本発明のバイオセンサ（センサチップ）の一実施形態を、好ましくは１つおよび／または複数のＣＭＯＳデバイスと共に集積回路（ＩＣ）技術によって製造することができる方法の一例を示す。さらに、１つおよび／または複数のＢＪＴデバイス（図示せず）を含むこともできる。図２５に示されるように、集積回路（ＩＣ）は半導体基板９００上に製造され、ポリシリコン・ゲート９０７を有する二酸化珪素層９０５が活性ウェル領域９０９の上にある。ポリシリコン・ゲート９０７は、アモルファス・シリコンから製造され、低抵抗ソース９１７およびドレイン９１９を備えるトランジスタを切り換えるために使用される。
【００８１】
次に図２６を参照すると、次いで、電気絶縁のために酸化物層（５０００Å）９２０が基板９００上に堆積される。次に図２７を参照すると、次いで、リソグラフィおよびエッチング方法を使用することによって二酸化珪素層９２０が選択的にエッチングされて、電気接続穴９４０が形成される。次に図２８を参照すると、次いで、伝導プラグ９５０が、コンタクト穴９４０内に取り付けられる。伝導プラグ９５０は、伝導性電極９６０と、低抵抗ソース９１７および／またはドレイン９１９との相互接続として使用される。
【００８２】
図２９は、必要な電極を製造するためのリフトオフ・プロセスを示す。二酸化珪素層９２０上でＰＲ５２１４フォト・レジスト層９７０を使用することによって、バイオセンシング用の電極が基板９００上にパターン形成される。次に、マスク９２１を使用して、（望ましくないフォト・レジスト層９７０の除去を含めた）リバース・イメージング・プロセスを使用することによってフォト・レジスト層９７０上に所望のパターンを転写する。金Ａｕ（２０００Å）および／またはＣｒ（２００Å）の層９６０が、所望のフォト・レジスト・パターン層９７０を有する二酸化シリコン層９２０上に電子ビーム堆積される。最後に、図３０を参照すると、フォト・レジスト９７０および望ましくないＡｕ／Ｃｒ９６０が、フォト・レジスト・パターン層９７０を溶解することによって除去される。
【００８３】
次に図３１を参照すると、これは、本発明のバイオセンサ（センサチップ）１０００の一実施形態を、好ましくは鉄（Ｆｅ）などのイオン分子を検出するために使用することができる方法の一例を示す。この実施形態では、センサ表面１０１０が修正されておらず、上述した製造実施形態で示される製造後浄化の後に、使用できる準備が整う。この実施形態で使用された分析物は、窒化カリウムＫＮＯ３（１０１．１１ｇ／ｍｏｌ）の緩衝液中で＋３酸化状態の鉄原子（ＦｅＩＩＩ）を含むフェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６（３２９．２６ｇ／ｍｏｌ）であった。図示されるように、図３１で、分析物（または電解質を有する試薬）を有する混合溶液１０２０が、３つの電極（作業電極１０３０、基準電極１０４０、カウンタ電極１０５０）全ての上に塗布される。溶液１０２０の体積が調節され、それにより小滴は、表面張力によって３つの電極全ての上に閉じ込められる。
【００８４】
次に、図３２を参照すると、サイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）電流とバイアス電位の関係が、ピコアンプ・ブースタおよびファラデー・ケージを有するＣＨインストゥルメンツ６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーションを使用して測定された。電位は、０．１ボルトと−０．４ボルトの間で掃引され、電流は、作業電極１０３０を介して測定される。
【００８５】
測定後、センサ１０００を再利用する場合は、Ａｕ表面が、アセトン、アルコール、および濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２Ｏ２）を用いて浄化され、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）を用いて入念にすすぎ洗いされた。
【００８６】
図３３は、高分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質）検出のための１つの好ましい実施形態を示す。好ましくは、高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質）の濃度の検出は、ビオチン／ストレプトアビジン層のセンサ表面修正を含む。上述した表面修正プロセスで示したように、センサ表面は、適切な生物化学溶液を用いて修正されて、製造後浄化の後にストレプトアビジン層を形成する。バイオセンサ１１００の表面が修正された後、まず２５０ｍｌのバクテリア溶液の試料に５０ｍｌの溶菌試薬（０．４Ｍ  ＮａＯＨ）を追加することによって病原体の電流測定バイオセンシングが行われ、室温で５分間インキュベートされる。次いで、１００ｍｌのプローブ溶液（アンカリングおよびシグナリング・プローブ）が追加され、混合物が６５℃で１０分間インキュベートされた。次いで、５μＬの溶菌Ｅ．ｃｏｌｉ／プローブ溶液混合物１１２０が、バイオセンサ１１００のストレプトアビジン被覆作業電極１１３０上に配置され、室温で１０分間インキュベートされた。
【００８７】
次に図３４を参照すると、次いで、バイオセンサ１１００が、ビオチン洗浄溶液（キルケゴールアンドペリー・ラボラトリー、５０−６３−０６）を用いて洗浄される。次に、希釈剤（ＰＢＳ／０．５％カゼイン）を用いて０．７５Ｕ／ｍｌまたは０．１５Ｕ／ｍｌまで希釈された５μＬのＡｎｔｉ−Ｆｌ−ＰＯＤ（アンチフルオレセインペルオキシダーゼ、１５０Ｕ、ロシュ社、１４２６３４６）１１４０が、作業電極１１３０上に配置され、室温で１０分間インキュベートされる。
【００８８】
次に図３５を参照すると、次いで、バイオセンサが再び洗浄溶液で洗浄される。洗浄後、３つの電極（作業電極１１３０、基準電極１１４０、カウンタ電極１１５０）全てが基質溶液１１６０によってカバーされるように、１０μＬのＫ−ｂｌｕｅ基質（ネオゲン社  ３００１７６）１１６０がバイオセンサ上に配置される。
【００８９】
最後に、電気化学（より具体的にはレドックス）測定値が即座に行われる。電流測定電流と時間の関係は、ピコアンプ・ブースタおよびファラデー・ケージを有するＣＨインストゥルメンツ６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーションを使用して測定される。バイオセンサ上の試料が順次に測定される。電圧は（基準に対して）−０．１Ｖで固定すべきであり、カソード電流（電流測定信号）読取りは２０秒間で行うべきである。これは、２０秒で電流値が安定状態に到達するはずだからである。細胞濃度（細胞数）は、連続的な希釈および培養皿カウンティングを使用することによって決定される。
【００９０】
測定後、センサ１１００を再利用する場合は、次いでＡｕ表面をアセトン、アルコール、および濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２Ｏ２）で浄化し、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）で入念にすすぎ洗いすべきである。
【００９１】
好ましくは、上述したバイオセンサ実施形態の任意のもので、バイオセンサが、実際の試料検出の前に較正される。バイオセンサは、好ましくは、既知量の（１種または複数種の）ターゲット分析物を含む較正溶液と、検出不可能な量（例えば、ゼロ）の（１つまたは複数の）ターゲット分析物を含む別の較正溶液とを用いて較正される。任意選択で、バイオセンサを、複数の較正溶液を用いて較正することができる。この複数の較正溶液はそれぞれ、既知量のターゲット分析物を含む。好ましくは、較正溶液は、異なる濃度レベルでターゲット分析物を含む。これらの較正溶液を、上述した検出プロセスによってバイオセンサで測定して、１つおよび／または複数の基準信号を得る。次いで、１つおよび／または複数の基準信号が、試料溶液からの測定信号と比較されて、試料試薬中の分析物の存在および量を求める。（１つまたは複数の）分析物の存在および量（例えば濃度または絶対量）の割出しは、従来の生物学的補間方法によって求めることができる。
【００９２】
添付書類Ａは、本発明をさらに特徴付けるために追加の資料を提供する。
【００９３】
本出願の添付書類にある参考文献を含めた本明細書における外部文献への全ての参照を、それらが、本明細書で採用される方法、技法、および／または構成を補足し、説明し、その背景を提供し、または教示する範囲で参照により本明細書に組み込む。さらに、以下に列挙する参考文献も、それが、本明細書で採用される方法、技法、および／または構成を補足し、説明し、その背景を提供し、または教示する範囲で参照により本明細書に組み込む。
【００９４】
（参考文献）
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Ａ．アルマン  ラングミュア・ブラジェットから自己組織化への超薄有機被膜に対する緒言（アカデミックプレス社  米国カリフォルニア州サンディエゴ  １９９１年）
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【００９５】
以上により、新規な「バイオセンシング」システムが図示され、説明された。当然、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な修正を行うことができる。例えば、本明細書で開示したバイオセンサを使用して、非生体要素および化合物を感知または検出することができる。したがって、本発明は、頭書の特許請求の範囲の意図を除いては、制限を受けない。
【００９６】
添付書類Ａ
マイクロ・トータル分析システム２０００写本
ＤＮＡアレイ・チップを有する酵素ベースの電気化学バイオセンサ
要旨
高速生物剤検出のための再利用可能ＤＮＡセンサをシリコン・チップ上に製造した（図１）。ＤＮＡベースのプローブは、抗体を使用する間接プロービングではなく、分析物のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を標的とする。ハイブリダイゼーション・イベントを信号酵素と組み合わせることによって感度が大幅に高まる。自己組織化単層センサ表面の形成、ｉｎ−ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーション、信号測定、およびセンサ再生成を、４０分以内に行うことができる。ＰＣＲを使用しない場合でさえ、このセンサ・アレイを使用して、１６ｓｒＲＮＡによって１０００以上のエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を検出することができる（図２）。各センサ領域の寸法は、２５ｍｍ２〜１６０μｍ２の範囲である。
キーワード：電気化学センサ、マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション
【外１】
0004949589.tif 000002
細胞数
図１  ＤＮＡセンサ・アレイ・チップ  図２  感度および特異性チェック
【００９７】
１．緒言
酵素ベースの電気化学バイオセンサは、現場使用時にバクテリア、ウィルス、または様々な生物学種の濃度の高速監視が可能な、非常に高感度であり選択性のあるプロトコルを求めることによって主に動機付けされている。そのようなプロトコルは、遠隔操作のものであり、十分に自動化されており、コンパクトであり、頑強である［１］。したがって、光学システムよりも、最少電力消費およびより小さなサイズを有する電気化学トランスデューサが好ましい［２］。偽陽性信号および偽陰性信号を低減するためにＤＮＡハイブリダイゼーションを使用することによって高い特異性を達成することができる。グラファイトまたは炭素電極を使用するＤＮＡ電気化学バイオセンサがすでに報告されている［３、４］。しかし、炭素ベース電極は通常、小さな（＜μｍ）寸法が必要とされるときにＭＥＭＳ技術に適合可能でない。本研究では、電極としてＡｕを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒＲＮＡを捕捉するために蛋白質自己組織化単層（ＳＡＭ）を用いた。本研究では、生物学的増幅因子として酵素を使用して、ＰＣＲを用いずに高感度を得る。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ４１００対ボルデテラＳＢ５４に関する感度および特異性チェックが図２に示されている。
【００９８】
２．検出原理
ＨＲＰは、分析目的およびバイオセンサへの塗布に最も広く使用されている酵素の１つである［５］。酵素増幅は、電気化学的に検出することができる反応の高転換数により生じる。ここでは、媒介物として３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を有するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に基づく電流測定バイオセンサを説明する（図３）。電極表面での電子移動が電流測定によって測定されて、ターゲット細胞の１６ｓリボゾームＲＮＡによるＤＮＡハイブリダイゼーションによって不動化される酵素の数を表す。したがって、出力電流は、溶液中のターゲット細胞の数に比例する。
【００９９】
【外２】
0004949589.tif 000003
ＰＲ：還元ペルオキシダーゼ    ＰＯ：酸化ペルオキシダーゼ
ＭＯ：酸化媒介物              ＭＲ：還元ペルオキシダーゼ
図３  ＨＲＰ酵素反応の電子輸送
【０１００】
３．実験
３電極電気化学電池が、作業電極用のマイクロ製造反応ウェルを有して構成される（図４ａ）。導電層として金（Ａｕ）が堆積され、絶縁層としてＳｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２が堆積される（図４ｂ）。周囲のＳｉ表面は、疎水性になるように修正される。３次元反応ウェルは、周囲領域の疎水性と共に、液体小滴を作業電極内によく含むことができるようにする。この設計は、センサ・チップの他の領域への生体分子の不特定結合を最小限に抑える。Ａｕ作業電極は、チオレート化ビオチンＳＡＭによって、または金の上への直接蛋白質吸着によって、基板上に不動化されたストレプトアビジンの単層を有する（図４ｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉを含む試料溶液は溶菌バッファで処理され、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのターゲットＤＮＡ／ＲＮＡが、細胞デブリの存在下でアニーリング温度（約６５℃）で、アンカリングｓｓＤＮＡプローブとラベリングｓｓＤＮＡプローブの両方を用いてハイブリダイゼーションされる（図４ｄ）。アンカリング・プローブ（ビオチンに結合された）とラベリング・プローブ（フルオレセインに結合された）は、２つの明確に異なる保存的配列を認識し、それによりハイブリッドは、ターゲット生物剤からの特定の遺伝子セグメントのみを用いて生成される。次いで、オリゴヌクレイック・ハイブリッドが作業電極上に、ビオチンストレプトアビジン結合によって不動化され、結合されていない成分が洗浄除去される。次いで、ＨＲＰリンク・アンチフルオレセイン抗体が各ハイブリッド上に担持される（図４ｅ）。基質の追加後、酵素反応が、３電極電池を使用して電流測定で測定される電流信号を生じる（図４ｆ）。プロトコル全体が４０分で完了する。
【外３】
0004949589.tif 000004
図４  センサ・ユニット・プロセスの流れ
Anchroring probe:  アンカリング・プローブ
Target strand:  ターゲット鎖
【０１０１】
４．実験結果
ＤＮＡセンサ上のＳＡＭは、単層のみが堆積されたかどうかを判定し、また蛋白質堆積の速度論を求めるための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）によって特徴付けられる。このデータから、一体型流体システム内でのｉｎ  ｓｉｔｕセンサ表面形成に必要な時間スケールを確かめることができる。ストレプトアビジンＳＡＭを堆積するための２つの異なる方法が使用され、一方がチオレート化ビオチンを使用し、他方が直接蛋白質吸着を使用した。どちらの場合にも、ＳＰＲデータは、ただ１つの単層が基板上に堆積されたことを示す（図５）。ストレプトアビジンの結晶単層は、２．８ｎｇ／ｍｍ２の予想表面カバー範囲を有する［６］。本実験の結果は、チオレート化ビオチンを使用して単層全体が得られ、直接蛋白質吸着によって約８０％のカバー範囲が得られたことを示す。さらに、蛋白質結合／吸着は約１０秒以内に生じた。
【外４】
0004949589.tif 000005
図５  ビオチンＳＨ／ＡｕまたはベアＡｕ上のストレプトアビジンの表面プラズモン共鳴
Time(seconds):  時間（秒）
Response Units:  反応ユニット
Streptavidin on biotin-SH/Su SAM/Su:  ビオチン−ＳＨ／Ａｕ  ＳＡＭ／Ａｕ上のストレプトアビジン
Streptavidin on bare Au:  ベアＡｕ上のストレプトアビジン
【０１０２】
５．０ｎＮの力を有するウルトラレバー・チップを使用して接触モードで原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）が行われた。Ａｕ基板は、ワグナー等の方法に従って準備された［７］。ベアＡｕは、トポグラフィ・フィーチャ＜１０Åを有し（図６ａ）、「全」単層のコンタクトＡＦＭは、蛋白質ドラッギングの証拠をもつ滑らかな表面を示した（図６ｂ）。「部分」単層上の蛋白質島の高さは約４５Åであり、ストレプトアビジン蛋白質の寸法と一致した。ＡＦＭ観察により、１つの単層のみが堆積されたＳＰＲ結果を確認する。
【外５】
0004949589.tif 000006
図６  Ａｕ上のＳＡＭ形成のＡＦＭ。
（ａ）ベアＡＵのみ
（ｂ）蛋白質ドラッギングを有する全カバー範囲
（ｃ）蛋白質島を有する部分カバー範囲
【０１０３】
５．結論
ＭＥＭＳ技術と、確立されたＤＮＡ技術との組合せにより、病原性バクテリアに関する高い特異性および感度の検出器が得られる。ＳＡＭを用いた電気化学検出を使用する生物学的同定が、１０００未満のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出することができる感度で、シリコン・ウェハに正常に組み込まれた。
【０１０４】
参考文献
１．Ｙ．Ｆ．チェン，Ｊ．Ｍ．ヤン，Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｃ．Ｍ．ホー，およびＹ．Ｃ．タイ「生物剤検出のためのマイクロ流体システム」技術と流体力学の相互作用に関する第３回国際会議（スイス、チューリッヒ，２０００年）
２．Ｄ．イヴニツキ，Ｉ．アブデルハミッド，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス「レビュー：病原性バクテリアを検出するためのバイオセンサ」バイオセンサアンドバイオエレクトロニクス  １４（１９９９），５９９−６２４
３．Ｇ．マラザ；Ｉ．キアネラ；Ｍ．マシーニ「環境監視のための使い捨てＤＮＡ電気化学バイオセンサ」Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３８７（１９９９），２９７−３０７
４．Ｊ．ワン等「環境監視用のＤＮＡ電気化学バイオセンサ」Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３４７（１９９７），１−８
５．Ｔ．ラズガス；Ｅ．コズレギ；Ｊ．エムニス；Ｌ．ゴートン；Ｇ．マルコバーガ「ペルオキシダーゼ修正電極：基礎と応用」Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３３０（１９９６），１２３−１３８
６．Ｓ．Ａ．ダースト；Ｍ．アーラー；Ｐ．Ｈ．メーラー；Ｅ．Ｗ．クバレク；Ｒ．ブランケンブルク；Ｈ．Ｏ．リビ；Ｈ．リングスドルフ；Ｒ．コルンベルク「ビオチン化脂質層上でのストレプトアビジンの２次元結晶」Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．５９（１９９１）３８７−３９６
７．Ｐ．ワグナー；Ｍ．ヘグナー；Ｈ．Ｊ．グンテロット，Ｇ．セメンサ「超平坦テンプレートストリップ金表面上に化学吸着された単層の形成およびｉｎ  Ｓｉｔｕ修正」ラングミュア  １１（１９９５）３８６７−７５
【０１０５】
ＡＳＭＥ文書
生物学的検出のためのＤＮＡマイクロセンサ・アレイの最適化
ｉ．要旨
本論文は、以前の刊行物で開発されている高速生物剤検出のための再利用可能ＤＮＡマイクロセンサ・アレイの特徴および最適化を示す（図１）［１〜３］。このＭＥＭＳベースのＤＮＡセンサは、不特定結合を最小限に抑えるように新規のマイクロ製造構造を備える標準の３電極電気化学電池構成を利用する。センサ・モジュールは、様々なプロトコルに簡単に適合され、泌尿器中の尿路エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）および中耳炎（中耳感染）をもたらす微生物などターゲットからの高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の高速検出のために使用することができる。尿道感染の患者の尿サンプルから、１０５未満のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出することができる。適切なセンサ特徴および表面修正によって感度が高められる。試料調製を含めた総検出時間は、ＰＯＤ結合オリゴヌクレオチドを使用することにより２５分まで短縮することができる。
【０１０６】
ｉｉ．緒言
従来の電気化学検出は、システム要件および構成により、ＭＥＭＳ技術および製造プロセスに全く適合していない。電気化学電池は、少なくとも２つの電極（作業電極、基準電極）と電解質とからなっていなければならない。電気化学電極は、電荷移動の機構が電子輸送とイオン輸送の間で切り換わる界面である［４］。電解質は、イオンの移動によって電荷移動を行うことができる媒体である。電気化学検出は、基準電極によって供給される第２の不変電位を必要とし、半バッテリーを形成する。典型的な基準電極はＡｇ／ＡｇＣｌである。現在、シリコン基板上にこの基準電極を製造するのは困難である。ほとんどのＭＥＭＳベースの電気化学センサは、作業電極のみをマイクロ製造することに焦点を当てている。本研究は、標準のＭＥＭＳプロセスによって製造されるシリコン上のＭＥＭＳベース電気化学センサの特徴および適用を考察する。電気化学センサ上でのＤＮＡハイブリダイゼーションを伴う臨床尿試料の試験は、シリコン上のＭＥＭＳベース・センサを生医学検出に使用することができることを実証する。
【０１０７】
ｉｉｉ．検出スキーム
化学的に分裂されたターゲット細胞からの核酸分子（ＲＮＡ／ＤＮＡ）が、細胞デブリの存在下で、アンカリングｓｓＤＮＡプローブ（ビオチンに結合）とラベリングｓｓＤＮＡプローブ（フルオレセインに結合）の両方を用いてハイブリダイゼーションされる（図２ａ）。これら２つのプローブは、２つの異なる保存的配列を認識し、したがって、ハイブリッドは、ターゲット生物剤からの特定の遺伝セグメントのみを用いて生成される。次いでオリゴヌクレオチド・ハイブリッドが作業電極上に、ビオチンストレプトアビジン結合によって不動化され、結合されていない成分が洗浄除去される（図２ｂ）。次いで、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）リンク・アンチフルオレセイン抗体が各ハイブリッド上に担持される（図２ｃ）。媒介物（テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ）を有する基質の追加後、酵素反応が、図３に示されるＲＥＤＯＸ反応から電流測定で測定される電流信号を生じる。プロトコル全体を４０分で完了させることができ、センサは、浄化プロセス後に再び活動化される。
【０１０８】
ｉｖ．センサ特性
ほとんどのバイオセンサ・チップがオフチップ光学検出を利用する。本研究は、信号ノイズ比の改善のためにセンサ最適化および表面修正を用いるオンチップ電気化学検出に向かっている。ＭＥＭＳ技術は、小さな寸法の導電金属電極をシリコン基板上に正確に堆積し、パターン形成することができるため、小型電気化学電池の開発を可能にする。本研究から、Ａｕが、３つの電極（作業電極、補助電極、および基準電極）全てに対する適切な候補であり、フェロセンなどよく知られている１電子システムを使用するＡｕ／Ａｕ／Ａｕ電極電池の特徴から、従来の可逆１電子電池が得られることが確認された。
【０１０９】
ｖ．サイクリック・ボルタンメトリ
フェロセンの可逆１電子移動に関するサイクリック・ボルタンメトリは、アノード・ピークとカソード・ピークの間の約５７ｍＶのピーク離隔距離、同じピーク最大値、およびピーク電流と［スキャン率］１／２との線形関係によって特徴付けられる［４］。図４に見られるように、様々なスキャン率でＭＥＭＳベースの電気化学センサを使用するフェロセンのボルタモグラムが、予想される挙動を示し、ピーク最大値でのピーク電流と［スキャン率］１／２とのプロットが線形である。ペルオキシダーゼを使用する電気化学電池のさらなる特徴により、酵素電流測定も実現可能であることが確認された。媒介物で行われるサイクリック・ボルタンメトリは、ＴＭＢに関して予想されるように２電子レドックス移動を示し（図５）、ペルオキシダーゼ酵素の追加により、−０．１Ｖバイアス電位で明らかに測定することができる還元電流の増大がもたらされる。
【０１１０】
ｖｉ．不特定結合の減少
センサ表面は、作業電極上にターゲットＲＮＡ／ＤＮＡを捕捉するために蛋白質自己組織化単層を有し、ＳＡＭは、原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって特徴付けられる［２］。信号対ノイズは、不特定結合を減少させるための適切な表面修正によって大幅に改善することができる。第１の手法は、不特定結合する可能性がある結合部位をなくするために表面阻止蛋白質を導入することである（図６）。第２の手法は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）またはポリイミドのシラン化処理または薄膜コーティングを用いて周辺領域の疎水性修正を追加する。蛋白質カバーされたＡｕ作業電極の疎水性により、試薬は作業電極のみに閉じ込められて、周辺および他の２つの電極に対する酵素の堆積を最小限に抑える（図７、８）。どちらの場合にも、不特定結合によるノイズが低減された。典型的には、第２の手法（疎水性修正）がＭＥＭＳ製造で使用され、第１のものはプローブ試薬に組み入れられる。
【０１１１】
ｖｉｉ．プロトコル簡略化
試料調製は、ほとんどのバイオセンサに関して最も時間のかかるステップである。任意の追加のプロトコル・ステップが、より流動性があるデバイス、およびより長い検出時間を必要とする。簡略化されたプロトコルが図９に示されており、検出器ＤＮＡプローブ上へのＰＯＤ結合を用いた酵素担持のステップがなくなっている。ハイブリダイゼーション条件は、６５℃に加熱した後にＰＯＤ酵素活性を保持するように制御された。次いで、プロトコルを、４０分から２５分に短縮することができ、試薬の必要数を１つだけ減らすことができる。
【０１１２】
ｖｉｉｉ．結果
以前の研究から、マイクロＤＮＡセンサの感度が約１０３個のＥ．ｃｏｌｉ細胞であることが実証されている。近年のデータは、リボゾームＲＮＡ含有によって静止段階で細胞培養から１０未満のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出することができることを示す。次いで、センサが、ＵＣＬＡの感染症科からの臨床尿試料にさらされて試験された。図１０に示されるように、尿試料中のＥ．ｃｏｌｉの最小検出可能細胞数は、離隔することなく予備的結果から１０５である。尿試料での感度は、さらなる最適化によって改善することができる。別のタイプのバクテリア、ボルデテラは、負の制御として使用され、希釈剤を含めた全てのＥ．ｃｏｌｉ試料が、負の制御よりも高い信号を有する。
【０１１３】
マイクロＤＮＡセンサは、従来の基準電極を利用することなく電気化学検出のために使用することができる。これは、バイアス電位が比較的低く（−０．１Ｖ）、検出が、補助電極での電荷の蓄積を回避するのに十分短い（２０秒）ためである。これは、フェロセンおよびＰＯＤ溶液のボルタモグラムを用いて確認された。
【０１１４】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの病原体の電気化学検出のためにマイクロＤＮＡセンサを使用することができることを実証した。ＭＥＭＳ技術によってシリコン上にパターン形成されたＡｕ／Ａｕ／Ａｕ３電極電池は、酵素反応の電流測定で正常に使用された。これらのセンサは、マイクロ・トータル分析システム（μ−ＴＡＳ）または「Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ」内に組み入れることができる見込みを示している。
【０１１５】
ｉｘ．結論
従来のＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いずに伝導電気化学検出が可能であることを実証するために、電流測定によって酵素反応を検出することができ、フェロセンおよびＰＯＤを用いたイクリック・ボルタンメトリを使用することによって特徴付けられたマイクロＤＮＡセンサが製造された。ノイズ低減は、表面修正および阻止蛋白質の導入によって達成された。作業電極内のウェルの構造設計およびシリコン基板上の表面処理が、作業電極を覆う試薬閉込めを可能にする。試薬電極コンタクトを制御して、不特定結合を低減することができ、これは従来のビーカー・セットアップでは可能でない。尿試料試験は、このＤＮＡセンサが、短い検出時間およびより短いシステム・サイズでの臨床診断に適していることを示す。
【０１１６】
ｘ．参考文献
１．Ｙ．Ｆ．チェン，Ｊ．Ｍ．ヤン，Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タイ，２０００年。「生物剤検出のためのマイクロ流体システム」技術と流体力学の相互作用に関する第３回国際会議（スイス、チューリッヒ  ２０００年）の議事録
２．Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｅ．Ｈ．ラン，Ｂ．ダン，Ｃ．Ｍ．ホー  ２０００年。「ＤＮＡアレイ・チップを有する酵素ベースの電気化学バイオセンサ」マイクロ・トータル分析システム（μＴＡＳ）に関する第４回国際シンポジウム（オランダ、エンシェーデ）の議事録
３．Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｅ．Ｈ．ラン，Ｂ．ダン，Ｃ．Ｍ．ホー  ２０００年。「Ｅ．ＣｏｌｉバクテリアのためのＭＥＭＳベース電流測定検出器−自己組織化単層の使用」バイオセンサに関する第６回世界会合（米国サンディエゴ）の議事録
４．Ｂ．エギーン  １９９６年  バイオセンサ（ジョーン・ウィリー・アンド・サンズ，ニューヨーク）
５．Ｅ．Ａ．Ｈ．ホール  バイオセンサ（プレンティス・ホール，ニュージャージー州イーグルウッド・クリフス，ｐｐ．９７−１３９，１９９１）
【０１１７】
【外６】
0004949589.tif 000007
図１  ＤＮＡマイクロセンサ・アレイ・チップ
（ａ）表面体積比を増大するための表面フィーチャを有する４つのセンサ
（ｂ）１ｃｍ２の１４個のセンサ
【０１１８】
【外７】
0004949589.tif 000008
図２  センサおよびプロトコル・プロセスの流れ
（ａ）ハイブリダイゼーション
（ｂ）不動化
（ｃ）ＰＯＤ担持
Labeling ssDNA:  ラベリングｓｓＤＮＡ
16srRNA from E coli:  Ｅ．ｃｏｌｉからの１６ｓｒＲＮＡ
Anchoring ssDNA:  アンカリングｓｓＤＮＡ
Biotin:  ビオチン
florescence:  フルオレセイン
Signaling Enzyme horseradish peroxidase:  シグナリング酵素−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
Streptavidin Self-Assenmbled Monolayer(SAM):  ストレプトアビジン自己組織化単層（ＳＡＭ）
Counter Electrode:  カウンタ電極
Working Electrode:  作業電極
Reference Electrade:  基準電極
【０１１９】
【外８】
0004949589.tif 000009
ＰＲ：還元ペルオキシダーゼ、ＰＯ：酸化ペルオキシダーゼ
ＭＯ：酸化媒介物、          ＭＲ：還元媒介物
図３  ホースラディッシュペルオキシダーゼの酵素反応の電子移動
【０１２０】
【外９】
0004949589.tif 000010
図４  サイクリック・ボルタンメトリによるセンサ特性
Potential:  電位
Current:  電流
Scan Rate:  スキャン率
Peak current:  ピーク電流
【外１０】
0004949589.tif 000011
図５  ＨＲＰ酵素化を伴うセンサ特性
Potential:  電位
Current:  電流
Oxida:  酸化
Reduc:  還元
Substrate:  基質
【外１１】
0004949589.tif 000012
図６  不特定結合をなくするために阻止蛋白質を追加することによるノイズ低減Amperometry Detection Time:  電流測定検出時間（１０秒）
Baseline Current(Anp):  ベースライン電流（アンペア）
No blocking protein:  阻止蛋白質なし
with Bovine Senum Albumin(BSA):  ウシ血清アルブミン使用
with KPL Detector Block:  KPL Detector Block（登録商標）の使用
【０１２１】
【外１２】
0004949589.tif 000013
図７
（ａ）従来のセンサと
（ｂ）マイクロＤＮＡセンサとの間の電極試薬コンタクトの比較
Auxiliary slectrode:  補助電極
Reference electrode:  基準電極
Micro fabricated working electrode:  マイクロ製造作業電極
Electrolyte:  電解質
（ａ）従来のビーカー・セットアップ
・３つの電極が常に溶液中にある
・拡散制限効果
・攪拌が必要
Hydrophobic surface:  疎水性表面
（ｂ）  マイクロＤＮＡセンサ：関連電極のみが電解質小滴によってカバーされる
【外１３】
0004949589.tif 000014
図８  マイクロＤＮＡの電極を覆う電解質閉込めのイメージ
Auxiliary slectrode:  補助電極
Working electrode:  作業電極
Electrolyte:  電解質
Reference electrode:  基準電極
＃１  ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび不動化中にのみ作用電極を覆う電解質
＃２  基質溶液の追加によって、電流測定検出中に、３つの電極全てを覆う電解質
＃３  表面修正によって構築される表面張力により、オーバーシュート小滴が元の構造に戻る
【０１２２】
【外１４】
0004949589.tif 000015
図９  ＰＯＤ結合ラベリング・プローブを用いた簡略化プロトコル
（ａ）ハイブリダイゼーション
（ｂ）不動化
Labeling ssDNA:  ラベリングｓｓＤＮＡ
16srRNA from E coli:  Ｅ．ｃｏｌｉからの１６ｓｒＲＮＡ
Anchoring ssDNA:  アンカリングｓｓＤＮＡ
Biotin:  ビオチン
florescence:  フルオレセイン
Signaling Enzyme horseradish peroxidase:  シグナリング酵素−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
Streptavidin Self-Assenmbled Monolayer(SAM):  ストレプトアビジン自己組織化単層（ＳＡＭ）
Counter Electrode:  カウンタ電極
Working Electrode:  作業電極
Reference Electrade:  基準電極
＃１  シグナリング酵素−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
＃２  フルオレセイン
＃３  ストレプトアビジン自己組織化単層（ＳＡＭ）
【外１５】
0004949589.tif 000016
図１０  尿試料を用いたマイクロＤＮＡセンサの感度チェック
＃１  尿試料のＥ．ｃｏｌｉ細胞数
＃２  電流出力
＃３  検出前にｒＲＮＡを抽出するために溶菌された細胞
＃４  センサ上での５μＬ試料体積
＃５  負の制御：２×Ｅ６  ボルデテラ細胞＝０．１１１ｕＡ
【０１２３】
自己組織化単層を使用するＥ．ｃｏｌｉバクテリア用のＭＥＭＳベースの電流測定検出器
要旨
マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）、自己組織化単層（ＳＡＭＳ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅の統合に基づくエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の電流測定検出のためのシステムを開発した。ＭＥＭＳ技術を使用して、Ｓｉウェハ上に堆積された複数の電極を有する検出器アレイが製造され、完全に再利用可能であった。ＳＡＭを使用して、蛋白質ストレプトアビジンの単層が、Ｅ．ｃｏｌｉからｒＲＮＡを捕捉するために作業電極（Ａｕ）表面上に不動化された。ベアＡｕ上に蛋白質を直接吸着する、Ａｕ上でビオチン化チオールＳＡＭに蛋白質を結合する、Ａｕ上でビオチン化二硫化物単層に蛋白質を結合するという３つの異なる手法を使用して、Ａｕ上にストレプトアビジンを不動化することができる。ビオチン化チオール手法が最良の結果を生んだ。Ｅ．ｃｏｌｉに関する高い特異性は、ｓｓＤＮＡ−ｒＲＮＡハイブリダイゼーションを使用して達成され、高い感度は、酵素としてペルオキシダーゼを用いた酵素増幅を使用して達成された。分析プロトコルは、数マイクロリットル程度の溶液体積で行い、４０分間で完了することができる。検出システムは、Ｅ．ｃｏｌｉと、バクテリアであるボルデテラブロンキセプチカとに関する高い特異性をもって、ポリメラーゼ鎖反応を伴わずに１０００個のＥ．ｃｏｌｉを検出することができた。
【０１２４】
キーワード
マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）、自己組織化単層（ＳＡＭ）、電流測定検出、エシェリキア・コリ・バクテリア、ＤＮＡハイブリダイゼーション
【０１２５】
１．緒言
光学的なものと電気化学的なもの両方の様々なバイオセンサが、病原性バクテリアの検出に関して開発されている（イヴニツキ等，１９９９年，２０００年）。バクテリアを検出するための従来の方法は通常、有機体の形態学的評価、および成長可能性の試験を含むが、そのような方法は非常に時間がかかり、現場条件下で実現可能でない。高速検出および携帯性に関する要求が、病原体認識をシグナル伝達と組み合わせるシステムの開発をもたらした。バクテリアの光学検出と電気化学検出の両方が報告されており、しかし電気化学方法は、小型化に関してより修正可能であるという利点を有する（イヴニツキ等，１９９９年、Ｔ．ワン等，２０００年）。理想的な検出器に関する要件には、比較的短時間で完了させることができるプロトコルを使用した高い特異性および高感度が含まれる。さらに、小型化し、自動化することができるシステムは、特に検出が現場で必要とされる場合に、現行技術に勝る大きな利点を提供する。
【０１２６】
マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術は、様々な設計適用例で感知および作動を行うためにトランスデューサを提供する。ＭＥＭＳ技術の重要な点は、電子回路と共に集積し、大量にバッチ製造することができるミクロンサイズの機械的部品を可能にすることである。ＭＥＭＳデバイスは、マイクロ加工のプロセスによって製造され、バッチ製造プロセスはリソグラフィを採用する。マイクロ加工は、事前設計レジスト・パターン（またはマスク）を使用し、次いで、望ましくない部分を選択的にエッチング除去して３次元構造を作成するために、リソグラフィ方法の使用に大きく依拠している（ホーおよびタイ，１９９６年，１９９８年）。ＭＥＭＳは、小型化デバイスを作成するための権能付与技法であり、本研究では、ＭＥＭＳ技術をバイオセンシング方法と組み合せて、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアを検出する。
【０１２７】
高い特異性を達成する最も効果的な手段の１つは、バクテリアの遺伝物質を検出することである（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、変性ＤＮＡ）。ターゲット・バクテリアのｒＲＮＡまたはｓｓＤＮＡのみに配列が相補的である一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プローブを選択することによって、ハイブリダイゼーション・イベントの監視が、ターゲット細胞の選択的感知を可能にする。感度を最大にするように、ハイブリダイゼーション・イベントと酵素反応の組合せが信号増幅をもたらす。これは、各基質から生成物への変換が信号全体に寄与するからである。酵素反応によって増幅されるＤＮＡハイブリダイゼーションの検出に対するバイオアッセイは、依然として比較的短持間で完了することができる。最後に、電気化学プローブに固有の小型化および携帯性が、それらのプローブを、ＭＥＭＳデバイスへの組込みに優れた候補とする。
【０１２８】
１つの検出システムにいくつかの良く確立された技術を組み合わせることに基づいたエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関するプロトタイプ電流測定検出器を開発した（チェン等，２０００年、ガウ等，２０００年）。ＭＥＭＳ、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅の技術は全て、小型化された特定の高感度のＥ．ｃｏｌｉ検出器の設計に寄与する。ＤＮＡ電気化学プローブは、すでに報告されており（ワン等，１９９７年、マラザ等，１９９９年）、通常はグラファイトまたは炭素電極が使用される。使い捨て試験ストリップ上のスクリーン印刷炭素電極を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡの電流測定検出に関する市販ユニットも利用可能である（アンドケア社、米国ノースカロライナ州ダラム）。スクリーン印刷は、低コストであるという利点を有するが、高次元精度を達成するのは簡単でない。リソグラフィを使用して、金属（Ａｕ、Ａｇ）および炭素を含めた広い範囲の材料の薄膜を、μｍサイズ寸法で正確にパターン形成することができる。さらに、ＳＡＭは、ＭＥＭＳ表面上で分子を選択的に不動化する優れた方法である。Ａｕ、Ａｇ、および他の金属へのＳＡＭの結合は、良く研究されており（レベル等，１９９８年、モテシャライ等，１９９８年、シャー等，１９９８年、ライリ等，１９９９年）、蛋白質および他の生体分子を、ＳＡＭを使用してＡｕなどの表面上に簡単に不動化することができる（オスツーニ等，１９９９年、ケーン等，１９９９年、スピンケ等，１９９３年、ハウスリング等，１９９１年）。さらに、電極上のＳＡＭを使用する電流測定方法は、ターゲット分析物を正常に検出することができることが実証されている（サン等，１９９８年、ホウ等，１９９８年、マーシー等，１９９８年）。
【０１２９】
本Ｅ．ｃｏｌｉ検出システムでは、各技術に固有の利点を活用する。ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび酵素増幅を使用して、必要な特異性および感度を達成する。ＭＥＭＳおよびＳＡＭを使用して、小型システムを製造し、これにより携帯型器具をもたらすことができる。最後に、この検出システムが広い範囲の病原性バクテリアに適用可能であることを実証する。例えば、検出モジュールおよびアッセイ・プロトコルを、尿路Ｅ．ｃｏｌｉの検出、および中耳炎（中耳感染）をもたらす微生物の同定に適合させることができる。
【０１３０】
２．実験
２．１．ＭＥＭＳ検出器アレイ
二酸化珪素（ＳｉＯ２、１０００Å）の層が、ベアＳｉウェハ（第１級、ｐ型＜１００＞、厚さ５００〜５５０μｍ）上に堆積され、窒化珪素（Ｓｉ３Ｎ４、１０００Å）の下でパッド層として働いて、応力を解放し、接着を改善した。ＭＥＭＳアレイは、深さ３５０μｍのウェルを形成するようにエッチングされた３．６ｍｍ×３．６ｍｍの作業電極を有して製造された。窒化物ウェハは、パターン形成され、［１１１］および［１００］結晶面に沿ってＫＯＨを使用してバルク・エッチングされ、ウェルの深さは、ＫＯＨエッチング時間および温度によって制御された。１００μｍ幅補助電極および基準電極が、対応する電極から２００μｍだけ離隔された。図１は、ＭＥＭＳアレイを製造する際に使用されたパターンの概略図を示す。窒化物および酸化物がＨＦエッチングによって除去されて、内部応力が解放され、電気絶縁のために別の酸化物層（５０００Å）が堆積された。電極は、ＰＲ５２１４フォト・レジスト・リバース・イメージングおよびＡｕ（２０００Å）／Ｃｒ（２００Å）の電子ビーム堆積を用いたリフトオフ・プロセスによってパターン形成された。最後に、１５０℃で１０分のホット・ベークの後、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）蒸気中に３分間浸されて、周囲のＳｉ領域に疎水性表面が生成された。作業電極の３次元性質と共に、周囲領域の疎水性が、作業電極内への液体小滴の封じ込めを可能にする。この設計は、ＭＥＭＳアレイの他の領域への生体分子の不特定結合を効果的に最小限に抑えた。
【０１３１】
２．２．Ａｕ上へのストレプトアビジンＳＡＭの堆積
１）ベアＡｕ上にストレプトアビジンを直接吸着する、２）ビオチン化チロール、ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨのＳＡＭを堆積し、後でストレプトアビジンを結合する、３）ビオチン化二硫化物、ビオチン−ＨＰＤＰのＳＡＭを堆積し、後でストレプトアビジンを結合するという３つの異なる方法を使用して、ストレプトアビジン単層をＡｕ上に堆積した。全ての場合に、Ａｕ表面は、濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２Ｏ２）を用いて浄化され、脱イオン水を用いて完全にすすぎ洗いされた。ベアＡｕ上にストレプトアビジンを堆積する際、０．０２Ｍ  Ｎａ燐酸塩緩衝液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液（シグマケミカル社  Ｓ０６７７）が、基板上に配置され、１０分間留めることができ、脱イオン水ですすぎ洗いされた。ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）（ロシュ  ＧｍＢＨ、ドイツ）のＳＡＭを堆積する場合、スピンケ等（１９９３年）の処置が使用され、試料は、４．５×１０−４Ｍ  １１−メルカプト−１−ウンデカノールを有するエタノール中の５０μＭビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ溶液（アルドリッチケミカル社  ４４，７５２−８）中で約１８時間インキュベートされ、エタノールおよび水ですすぎ洗いされた。次いでビオチン被覆Ａｕ表面が約１０分間、１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液に露出され、やはり水ですすぎ洗いされた。ビオチン−ＨＰＤＰのＳＡＭ（Ｎ−［６−（ビオチンアミド）ヘキシル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、ピアス社，２１３４１）を堆積する際、試料は、エタノール中の５０μＭビオチン−ＨＰＤＰ溶液中で約１８時間インキュベートされ（４．５×１０−４Ｍメルカプトプロパノールを用いて、または用いずに）、エタノールおよび水ですすぎ洗いされた。次いで、表面が、約１０分間１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液に露出され、やはり水ですすぎ洗いされた。
【０１３２】
２．３．Ｅ．ｃｏｌｉの電流測定検出に関するアッセイ・プロトコル
アッセイ・プロトコルは以下のように行われた。１）５０μｌの溶菌試薬（アンドケア社、４００２−１１）が、培養媒体中のバクテリアの２５０μｌ試料に追加され、室温で５分間インキュベートされた。２）次いで、１００μｌのプローブ溶液（アンドケア社、４００２−１３）が追加され、混合物が６５℃で１０分間インキュベートされた。３）５μｌの溶菌Ｅ．ｃｏｌｉ／プローブ溶液混合物が、ＭＥＭＳ検出器アレイのストレプトアビジン被覆作業電極上に配置され、室温で１０分間インキュベートされた。４）ＭＥＭＳ検出器アレイがビオチン洗浄溶液で洗浄された（キルケゴールアンドペリー・ラボラトリー、５０−６３−０６）。５）希釈剤（アンドケア社、４００２−１４）を用いて０．７５Ｕ／ｍｌまたは０．１５Ｕ／ｍｌに希釈された５μｌのＡｎｔｉ−Ｆｌ−ＰＯＤ（アンチフルオレセインペルオキシダーゼ、１５０Ｕ、ロシュ社、１４２６３４６）が、作業電極上に配置され、室温で１０分間インキュベートされた。６）ＭＥＭＳアレイ・チップが、やはり洗浄溶液を用いて洗浄された。７）３つの電極（作業電極、補助電極、基準電極）全てが基板溶液によってカバーされるように、１０μｌのＫ−ｂｌｕｅ基質（ネオゲン社  ３００１７６）が検出器アレイ上に配置された。８）電気化学測定値が即座に取られた。全プロトコルが４０分以内に完了した。ピコアンプ・ブースタおよびファラデー・ケージを有するＣＨインストゥルメンツ６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーションを使用して、電流測定電流対時間が測定された。ＭＥＭＳ検出器アレイ上の試料が、順次に測定された。電圧は（基準に対して）−０．１Ｖで固定され、２０秒のカソード電流が電流測定信号として取られた。２０秒で電流値が安定状態に到達した。細胞濃度（細胞数）は、連続的な希釈および培養皿カウンティングを使用して決定された。
【０１３３】
２．４．自己組織化単層の特徴
検出器の性能は、不動化されたストレプトアビジン単層の性質に大きく依存している。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、バイアコアＸシステム、バイアコア社）および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）を行って、単層を特徴付けた。ベアＡｕへのストレプトアビジン結合のＳＰＲ研究では、ベアＡｕチップ（Ｊ１センサ・チップ）が使用された。ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ−１２−ＳＨ／Ａｕまたはビオチン−ＨＰＤＰ／Ａｕへのストレプトアビジン結合の研究では、ビオチンＳＡＭは、ＳＰＲ実験前に、すでに述べたようにベアＡｕチップ上に堆積された。最良の結果として、ベアＡｕを用いてＳＰＲを行う、またはビオチンＳＡＭを堆積する前に、希釈Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２溶液で約２分間、新たなチップが洗浄された。全ての場合に、０．０２Ｍ  Ｎａ燐酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２緩衝液中の１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンが使用された。ベアＡｕ上のストレプトアビジンに関する吸着実験では、流量は１〜５μｌ／分の範囲にあった。ストレプトアビジンおよびビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ／Ａｕに関する実験では、流量は１０〜２５μｌ／分の範囲にあった。ストレプトアビジンおよびビオチン−ＨＰＤＰ／Ａｕに関する実験では、流量が５〜１０μｌ／分の範囲にあった。脱着実験では、以下の溶液２５μｌが、２５μｌ／分でチャネルを介して順次に流れた（総露出時間は１分）。１．０Ｍ  ＫＣｌ、８Ｍ尿素、０．５％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、および４０体積％ホルムアミド。
【０１３４】
ＡＦＭ（オートプローブＣＰ、サーモマイクロスコープ社）は、５．０ｎＮの力を有するウルトラレバー・チップを使用して接触モードで行われた。平坦なＡｕ表面を保証するために、ワグナー等（１９９５年）の方法が使用され、Ａｕがまずマイカ上に電子ビーム蒸着によって堆積され、次いでＳｉに転写された。本実験の場合、マイカは、溶媒を使用せずにＡｕから清潔に除去するためにへき開された。
【０１３５】
３．結果
３．１  マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）
図２は、ＭＥＭＳ検出器アレイの写真を示す。対応する補助電極および基準電極と共に１６個の作業電極が、２．８ｃｍ×２．８ｃｍ領域内にパターン形成された。検出器アレイは、Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２溶液を使用して表面を浄化することができるので、完全に再利用可能であった。表面を適切に浄化し、作業電極上にＳＡＭを再堆積することによって同じＭＥＭＳ検出器アレイを複数回再利用した。
【０１３６】
３．２  ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用するＥ．ｃｏｌｉ検出
本ＭＥＭＳシステムでは、Ｅ．ｃｏｌｉ検出は、ＤＮＡハイブリダイゼーションと、それに続く酵素反応に基づく。電極表面を例示する概略図を図３に示す。ストレプトアビジン単層が、Ａｕ作業電極表面上に不動化されて、Ｅ．ｃｏｌｉからｒＲＮＡを捕捉する。２つのｓｓＤＮＡセグメントがこのシステムで使用される。ストレプトアビジン結合のためにビオチンに結合された捕捉ｓｓＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒＲＮＡの一端にハイブリダイゼーションする。酵素ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にリンクされたアンチフルオレセインへの結合のためにフルオレセインに結合された検出器ｓｓＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒＲＮＡの多端にハイブリダイゼーションする。捕捉ｓｓＤＮＡと検出器ｓｓＤＮＡは、２つの異なる保存的配列を認識し、それによりハイブリッドは、Ｅ．ｃｏｌｉからの特定の遺伝子セグメントを用いてのみ生成される。オリゴヌクレオチド・ハイブリッドはＡｕ作業電極上に、ビオチンストレプトアビジン結合によって不動化され、結合されていない成分が洗浄除去される。ストレプトアビジンは、通常は高い親和力（Ｋｄ  約１０−１５Ｍ）でビオチンに結合する（ウェーバー等，１９８９年）。（Ａｎｔｉ−Ｆｌ−フルオレセイン結合を介する）ハイブリッド上へのＰＯＤの担持後、基質が追加され、酵素反応が電流測定で検出される。基質溶液は、基質Ｈ２Ｏ２と、媒介物である３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）との両方を含む。酵素および電極反応が図４に示される。
【０１３７】
３．３  ｒＲＮＡ捕捉のためのストレプトアビジン自己組織化単層
図５に示すように、電極表面上でストレプトアビジン単層を不動化するために３つの異なる手法を使用した。第１の手法では、ストレプトアビジン単層が、蛋白質吸着によってベアＡｕ上に堆積された。第２の手法では、ビオチン化チオールを使用してビオチンのＳＡＭがＡｕ上に堆積され、その後、ストレプトアビジンがビオチンに結合された。第３の手法では、ビオチンのＳＡＭが、ビオチン化二硫化物を使用してＡｕ上に堆積され、その後、ストレプトアビジンがビオチンに結合された。
【０１３８】
３．４  ストレプトアビジン単層の特徴
ストレプトアビジン単層は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）と原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）の両方を使用することで特徴付けられる。ＳＰＲは、溶液金属界面での分子と金属（Ａｕ、Ａｇ）薄膜との相互作用を監視するための実行可能技法であることが実証されている。この技法を使用して、堆積層の厚さを評価し、会合および解離の速度論を測定することができる（ハウスリング等，１９９１年、スピンケ等，１９９３年、シーガル等，１９９６年、ラオ等，１９９９年、ユング等，１９９９年）。３つの手法全てを使用して、Ａｕ上のストレプトアビジンの堆積を監視するためにＳＰＲを行った。ＳＰＲ結果が図６に示されている。製造業者（バイアコア）による較正に基づくと、ＳＰＲ信号の１０００レゾナンス・ユニット（ＲＵ）が、表面蛋白質濃度中の約１ｎｇ／ｍｍ２の変化に相当する。ストレプトアビジンは、約５５×４５×５０Å（ダースト等，１９９１年）の寸法を有する。ストレプトアビジンの完全な単層は、２次元結晶単層（ユング等，１９９９年、ダースト等，１９９１年）に基づいて計算される約２．８ｎｇ／ｍｍ２の予想密度を有する。図６から、本質的にストレプトアビジンの完全な単層が、ビオチン化チオールＳＡＭ／Ａｕ（約３０００ＲＵ）上に堆積され、約８０％の「カバー範囲」が、ベアＡｕ（約２４００ＲＵ）上に堆積されたストレプトアビジンを用いて得られ、約５２％の「カバー範囲」が、ビオチン化二硫化物ＳＡＭ／Ａｕ（約１５５０ＲＵ）上に堆積されたストレプトアビジンを用いて得られた。ビオチン化二硫化物に関して、溶液中のメルカプトプロパノールの存在は、ＳＰＲ信号がわずか約１０％（約１７００ＲＵ、データは図示せず）しか増大しないので、表面カバー範囲に対する効果を無視できる。全ての場合に、蛋白質溶液の第２の注入時の追加の蛋白質堆積が最小限になった。さらに、流量は、堆積された蛋白質の割合または量に対する効果を無視できる。ＳＰＲ結果は、３つの手法全てで、多層ではなくストレプトアビジンの単層のみがＡｕ上に堆積したことを示す。最後に、これらの結果は、ストレプトアビジンビオチン結合およびＡｕ上へのストレプトアビジン吸着のほとんどが数秒以内で生じ、数分程度で完了させることができることを立証している。
【０１３９】
ストレプトアビジンを脱着することができるかどうか、すなわち表面を再生成するために、ストレプトアビジンをベアＡｕから、またはビオチンへの結合から解離できるかどうかを判定するための実験を行った。表Ｉは、蛋白質リガンド結合および／または変性蛋白質を解離するために知られている様々な試薬を用いた処理後のＳＰＲ信号（ＲＵ）の損失を列挙する。表Ｉに見られるように、わずか８Ｍの尿素、０．５％のＳＤＳ、および０．１Ｍ  ＮａＯＨが、表面からストレプトアビジンを脱着するのに幾分効果的であった。１．０Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍ
【０１４０】
ＨＣｌ、および４０％ホルムアミドは効果的でなかった。ストレプトアビジンは、任意の試薬によって完全には脱着することができず、全ての試薬に表面をさらした後にいくらかの蛋白質が残った。これらの結果は、ストレプトアビジンが、ビオチンＳＡＭとベアＡｕとの両方にかなり良好に結合し、ストレプトアビジンアン単層が比較的安定であったことを示す。
【０１４１】
ＡＦＭの使用により、ベアＡｕに直接吸着されたストレプトアビジンのイメージングによって表面をさらに特徴付けることができる。ベアＡｕは、トポグラフィ・フィーチャ＜１０Åを有し、「部分」単層上の蛋白質島は約４５Åであり、ストレプトアビジンの寸法に適合していた（図７）。ＡＦＭ結果は、Ａｕ上にただ１つの単層が堆積されるというＳＰＲの知見を確証する。「完全な」蛋白質単層に関する接触モードでのＡＦＭが、蛋白質ドラッギングの痕跡があるフィーチャレス表面を示し（データは図示せず）、したがって表面カバー範囲に関する追加の情報は提供しなかった。以前に報告されているように、ビオチン化ＳＡＭを使用し、その後、ストレプトアビジンを結合するときにも単層堆積が得られる（スピンケ等，１９９３年、ユング等，１９９９年）。
【０１４２】
３．５  ＭＥＭＳ検出器アレイを用いた電気化学測定
本ＭＥＭＳ検出器アレイでは、３つの電極、すなわち作業電極、補助電極、および基準電極の全てに関してＡｕを用いた３電極システムを使用した。通常、Ａｇ／ＡｇＣｌまたは飽和カロメル電極（ＳＣＥ）が、基準電極で固定電位での可逆酸化／還元が生じるように、基準電極として使用された。しかし、本ＭＥＭＳ検出器アレイでは、基準電極としてＡｕを使用して、製造を簡略化し、完全に再利用可能なアレイを可能にした。一定の電位の維持は、（２電極システムに対して）３電極システムの使用によって可能になった。ＴＭＢの還元が監視されるこの特定の適用例では、基準電極としてＡｕを正常に使用することができる。これは、低い電圧差（−０．１Ｖ）が短い時間（＜１分）維持されたためである。
【０１４３】
２つの個別の実験によって電気化学検出に関してＡｕ／Ａｕ／Ａｕ電極システムを特徴付けた。第１の実験では、フェロセン被膜が電極上に配置され、サイクリック・ボルタンメトリが、レドックス反応を監視するために行われた。従来の可逆の１電子移動に関するサイクリック・ボルタンメトリは、アノード・ピークとカソード・ピークの間の約５７ｍＶのピーク離隔距離、ピーク最大値での同じピーク電流、およびピーク電流と［スキャン率］１／２との線形関係によって特徴付けられる（ホール，１９９１年）。図８は、様々なスキャン率でフェロセンを用いて得られるボルタモグラムを示す。図８に見られるように、従来のレドックス挙動が観察され、ピーク電流対［スキャン率］１／２のプロットが線形である（図９）。
【０１４４】
Ａｕ／Ａｕ／Ａｕ電極システムを用いた第２の実験では、サイクリック・ボルタンメトリが、基質溶液（Ｈ２Ｏ２＋ＴＭＢ）のみに対して行われ、次いで再びＰＯＤ酵素を用いて同じ溶液に対して行われた。スキャン率１０ｍＶ／秒で−０．２Ｖ〜＋０．５０Ｖでサイクルして、基質溶液が、ＴＭＢの２電子レドックス挙動を示した（図１０）。基質溶液へのＰＯＤの追加は、還元電流の増大をもたらした。次いで、ＰＯＤ酵素活性の測定に関して、（基準に対する）−０．１０Ｖの定電位が選択された。この電位では、電流バックグラウンドがゼロに近く、基質酸化が行われない。この電位は、酵素活性判定に最適であり、少量の生成物（酸化ＴＭＢ）が、高濃度の基質の存在下で測定された。
【０１４５】
３．６  Ｅ．ｃｏｌｉの検出
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒＲＮＡの電流測定検出に関して、まず、３つの異なるストレプトアビジン単層表面の性能を比較した。ストレプトアビジンは、前述した３つの異なる手法を使用してＡｕ上で不動化され、バクテリアＥ．ｃｏｉｌおよびボルデテラブロンキセプチカ（ボルデテラ）に関してアッセイ・プロトコルが行われた。ｓｓＤＮＡプローブはＥ．ｃｏｉｌに特有なものであるので、ボルデテラ・バクテリアは負の制御試料として働いた。この実験の目的は、ビオチン−ｒＲＮＡ−ＰＯＤハイブリッドを捕捉するために不動化ストレプトアビジンの効率を比較することであった。Ｅ．ｃｏｉｌの２つの濃度が使用され、一方の試料を他方の１０倍の濃度にした。さらに、ボルデテラからの信号が、不特定結合のレベルまたは達成可能な「ベースライン」を示す。この実験からの結果が図１１に示される。同じバクテリア溶液（Ｅ．ｃｏｌｉまたはボルデテラ）が使用されたので、異なる表面の直接の比較を行うことができる。図１１に見られるように、ビオチン化チオールによって不動化されたストレプトアビジンが、Ｅ．ｃｏｌｉ検出に関する最良の条件であった。ビオチン−チオールＳＡＭを使用して、ボルデテラからの低いベースライン信号を達成しながらＥ．ｃｏｌｉに関する良好な信号を得た。Ａｕに対してビオチン二硫化物によって不動化されたストレプトアビジンでは、Ｅ．ｃｏｌｉに関する電流信号（両方の濃度）が大幅に低くなり、ベースラインは、ビオチン−チオール／ストレプトアビジンに関するものと同じであった。Ａｕに直接吸着されたストレプトアビジンの場合、ボルデテラからの信号ははるかに高く、表面に対するＰＯＤのより高レベルの不特定結合を示した。
【０１４６】
Ａｕ／ビオチン−ＳＨ／ストレプトアビジンが最適なストレプトアビジン表面になったことを確かめた後、システムの感度を求めるためにＥ．ｃｏｌｉおよびボルデテラを使用してプロトコルを繰り返した。ビオチン−ＳＨ  ＳＡＭによってストレプトアビジンを不動化して、負の制御としてボルデテラを有して、一連のＥ．ｃｏｌｉ希釈液に対するアッセイを行った。その結果を図１２に示した。データは、ＭＥＭＳシステムを使用して少なくとも１０００個のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出することができることを示す。予想されるように、電流信号は、試料溶液中のＥ．ｃｏｌｉ細胞の数の増加の関数として増大した。さらに、アッセイ・プロトコルで使用されるＰＯＤ濃度を低下させる（０．７５Ｕ／ｍｌから０．１５Ｕ／ｍｌに）ことにより、より少ないＥ．ｃｏｌｉ細胞数で、信号のより良い区別を達成した（図１３）。図１３に見られるように、１０００個のＥ．ｃｏｌｉ細胞に関する電流信号は、２．５×１０５のボルデテラ細胞に関するものの２倍よりも大きかった。本ＭＥＭＳシステムを使用する結果は、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアが、バクテリアｒＲＮＡを捕捉するために電流測定およびＳＡＭを使用して正常に検出されたことを確証する。
【０１４７】
４．考察
本結果は、ＭＥＭＳ技術をＳＡＭ、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素電流測定と組み合わせることで、Ｅ．ｃｏｌｉなどのバクテリアに関する高い特異性および感度をもつ電気化学検出器がもたらされることを示す。各成分からの寄与は、システムの全体の正常性に重要である。ＭＥＭＳ技術は、複数の３電極「電池」のアレイをＳｉウェハ上に堆積することができるようにし、説明したＭＥＭＳ検出器アレイは、ＳＡＭを除去することができ、適切な浄化を用いてＡｕ表面が再生成されるので十分に再利用可能である。さらに、マイクロ加工チャネル、弁、ポンプ、および集積電子回路を用いて、試料調製およびアッセイ・プロトコルを完全に自動化することができる。
【０１４８】
ＳＡＭは、捕捉生体分子、例えばストレプトアビジンを不動化するようにＡｕ作業電極を機能させる効果的な手段を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ｓｓＤＮＡプローブの配列をターゲットのみと相補的になるように注意深く選択することができるので、病原性バクテリアに対する高い特異性をもつことができるようにする。ハイブリダイゼーション・イベントを酵素反応と組み合わせることで、信号増幅が提供され、感度が高まる。最終的に、電気化学変換を使用することによって、最少電力消費の小型化携帯型システムを開発することができる。
【０１４９】
高速検出および携帯型器具は、病原体センシングに望ましい。このシステムを使用して約４０分以内で検出を達成することができることが実証された。小さい寸法および小さい試料体積により、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび酵素結合に関して現在使用されているインキュベーション時間（１０分）を短縮することによって、アッセイ時間をさらに短縮することができる。ＭＥＭＳの明らかな利点は、非常に小さな体積（数μｌ）および電極表面積（現在、作業電極では０．１３ｃｍ２、補助および基準電極では＜０．０２ｃｍ２）を使用することができることである。本実験の結果は、少なくとも約１０３個の細胞を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いずにこのシステムを使用して検出することができることを示す。ＭＥＭＳシステムでの小さな体積および作業電極表面積により、絶対細胞数に関する検出限界は、細胞濃度（細胞／ｍｌ）に関する検出限界を報告するよりも適している。１０２〜１０３細胞／ｍｌ程度の検出限界が報告され、しかし通常は、約１ｃｍ２の作業電極表面積を有する約１．０ｍｌの試料体積が使用された（アブデルハミッド等，１９９８年，１９９９年）。電流測定酵素免疫濾過アッセイでは、信号は、１．０ｍｌ試料を使用するときよりも０．１ｍｌ試料を使用するときに１桁以上大きかった。
【０１５０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒＲＮＡを検出するための電流測定実験の結果は、ビオチン化チオールＳＡＭ手法によって不動化されたストレプトアビジン単層が最良の結果を生み出すことを示している。ＳＰＲデータが、ビオチン化チロールを使用するときに最大のストレプトアビジン表面密度または「カバー範囲」を示しているので、この知見は驚くべきものではない。よく秩序化された自己組織化単層は、ビオチン化チオールを用いてのみ生成され、最大のストレプトアビジン表面密度をもたらす可能性が高い。ビオチン化二硫化物の場合、Ａｕ表面へのビオチンの取付けはＡｕ−Ｓ結合によって行われるが、追加の有機基はおそらく稠密単層の形成を妨げる。Ａｕへの直接の吸着によって不動化されたストレプトアビジンは、作業電極に対するＰＯＤ酵素の非常に大きい不特定結合をもたらした。様々な蛋白質（例えばストレプトアビジン、免疫グロブリン）に取り付けられたコロイド状Ａｕ粒子が市販されている（ナノプローブ社、ニューヨーク州ヤップハンク）ので、Ａｕへの蛋白質吸着がよく知られている。ストレプトアビジンは、システインまたはメチオニンの残留物を含まず（ウェーバー等，１９８９年）、したがって、Ａｕ−Ｓ結合によってＡｕに付着しない。Ａｕへの蛋白質吸着は、カルボキシル基とＡｕとの相互作用によって生じる場合があり（オーカ等，１９９９年）、ストレプトアビジンＡｕ付着に関する有望な機構である。ストレプトアビジン単層を直接吸着によってＡｕに付着することができるが、自己組織化または分子秩序が生じるかどうかは疑問である。ＳＰＲ脱着実験は、ストレプトアビジンＡｕ付着がストレプトアビジンビオチン結合と同じくらい頑強になることを示した。すなわち尿素、ＳＤＳ、およびＮａＯＨによって除去されるストレプトアビジンの量は、ビオチンに付着されたストレプトアビジンと異なり、Ａｕ上に直接吸着されたストレプトアビジンの場合と同様であった。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉに関するアッセイ・プロトコルを行うとき、試料溶液は、オリゴヌクレオチド、および溶菌Ｅ．ｃｏｌｉからの細胞デブリを含んでいた。本データは、他の蛋白質および生体分子の存在が、Ａｕからのストレプトアビジンの脱着を加速し、表面への酵素ＰＯＤの不特定結合の増大をもたらしたことを示唆している。
【０１５１】
５．結論
Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアは、ＭＥＭＳにＳＡＭ、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅を組み込むことによって正常に検出された。Ｅ．ｃｏｌｉに関して特有であり、ＰＣＲを用いずに１０００個の細胞を検出することができるＭＥＭＳベースの検出システムを実証した。プロセス時間は４０分以下にすることができる。さらに、数マイクロリットル程度の溶液体積を用いてアッセイを行うことができる。ＳＡＭ、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅方法をＭＥＭＳ技術と統合することにより、病原性検出に関する新世代のデバイスを可能にする。
【０１５２】
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Ｇ．Ｂ．シーガル，Ｃ．バンダッド，Ａ．バルベリス，Ｊ．ストロミンガー，Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ  １９９６年。表面プラズモン共鳴によるヒスチジンタグ付き蛋白質の結合および研究のための自己組織化単層（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８，４９０−４９７）
Ｊ．スピンケ，Ｍ．リリー，Ｈ．Ｊ．グデー，Ｌ．アンゲルマイヤー，Ｗ．クノール  １９９３年。自己組織化単層での分子認識：多成分多層の構成（ラングミュア  ９（７），１８２１−１８２５）
Ｘ．サン，Ｐ．ヘー，Ｓ．リュー，チャンイー，Ｙ．ファン  １９９８年。ＤＮＡ電気化学センサ適用例のための自己組織化アミノエタンチノール単層を用いた金電極上での一本鎖デオキシリボ核酸の不動化（タランタ  ４７，４８７−４９５）
Ｐ．ワグナー；Ｍ．ヘグナー；Ｈ．Ｊ．グンテロット，Ｇ．セメンサ  １９９５年。「超平坦テンプレートストリップ金表面上に化学吸着された単層の形成およびｉｎ  ｓｉｔｕ修正」ラングミュア  １１，３８６７−７５
Ｔ．Ｈ．ワン，Ｙ．Ｆ．チェン，Ｓ．マセット，Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タイ  ２０００年。分子ビーコンベースの微生物検出システム（医学および生物科学における数学および設計技術に関する２０００年国際会議（ＭＥＴＭＢＳ’２０００  米国ネバダ州カリフォルニア）の議事録）
Ｊ．ワン，Ｇ．リバス，Ｘ．カイ，Ｅ．パレセック，Ｐ．ニールセン，Ｈ．シライシ，Ｎ．ドンサ，Ｄ．ルオ，Ｃ．パラド，Ｍ．チッチャロ，Ｐ．Ａ．Ｍファリアス，Ｆ．Ｓ．バレラ，Ｄ．Ｈ．グラント，Ｍ．オズソス，Ｍ．Ｎ．フレア  １９９７年。環境監視用のＤＮＡ電気化学バイオセンサ（Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３４７，１−８）
Ｐ．Ｃ．ウェーバー，Ｄ．Ｈ．オーレンドルフ，Ｊ．Ｊ．ウェンドロスキー，Ｆ．Ｒ．サレメ  １９８９年。ストレプトアビジンに対する高親和力ビオチン結合の構造起源（サイエンス  ２４３，８５−８８）
Ｙ．シー，Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ  １９９８年。ソフトリソグラフィ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７，５５０−５７５）
【０１５３】
【表１】
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【０１５４】
【外１６】
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【外１７】
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【外１８】
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【外１９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  従来の基準電極の一実施形態の概略図である。
【図２】  電気化学方法で使用されるポテンショスタットの一実施形態の概略図である。
【図３】  本発明による円形基板ウェハ上の複数の電気化学バイオセンサの一実施形態の概略図である。
【図４】  本発明による正方形基板上の複数の電気化学バイオセンサの代替実施形態の概略図である。
【図５】  本発明による基板上の電気化学バイオセンサの別の実施形態の概略図である。
【図６】  時間の経過に伴うサイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）スキャン電位のグラフである。
【図７】  本発明によるバイオセンサによって取られる１サイクル・サイクリック・ボルタンメトリ（電流対バイアス電位）である。
【図８】  本発明によるバイオセンサによって取られる様々なスキャン率でのサイクリック・ボルタンメトリ（電流対バイアス電位）である。
【図９】  本発明によるバイオセンサによって取られるスキャン率対ピーク電流の平方根のグラフである。
【図１０】  本発明によるバイオセンサによって取られる一定のスキャン率での複数のサイクルにおけるサイクリック・ボルタンメトリ（電流対バイアス電位）である。
【図１１（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）】  本発明による表面張力および処理による試薬および／または溶液閉込めを示す線図である。
【図１２】  本発明によるバイオセンサ上の作業電極のみを選択的に覆う試薬および／または溶液閉込めを示す線図である。
【図１３】  本発明によるバイオセンサ上の全ての電極を覆う試薬および／または溶液閉込めを示す線図である。
【図１４】  本発明のバイオセンサの一実施形態を製造することができる方法の第１のステップを示す側面図である。
【図１５】  バイオセンサを製造することができる方法の第２のステップを示す線図である。
【図１６】  バイオセンサを製造することができる方法の第３のステップを示す線図である。
【図１７】  バイオセンサを製造することができる方法の第４のステップを示す線図である。
【図１８】  バイオセンサを製造することができる方法の第５のステップを示す線図である。
【図１９】  バイオセンサを製造することができる方法の第６のステップを示す線図である。
【図２０】  不特定結合を防止するように本発明のバイオセンサの一実施形態の表面を修正することができる方法を示す線図である。
【図２１】  図２０での表面修正プロセスのバイオセンサ表面上での最終結果を示す線図である。
【図２２】  バイオセンサが集積回路構成要素と集積されている、バイオセンサ・システムの本発明の一実施形態の断面図である。
【図２３】  集積回路構成要素と集積された複数のバイオセンサの本発明の一実施形態の線図である。
【図２４】  他の同様のユニットと共に、図２４の集積回路構成要素と集積された複数のバイオセンサを作成するバイオセンサ・ユニットの断面図である。
【図２５】  ＣＭＯＳデバイスがバイオセンサ（センサチップ）自体に集積して、本発明のバイオセンサ（センサチップ）の一実施形態を集積回路（ＩＣ）技術によって製造することができる方法の第１のステップを示す線図である。
【図２６】  バイオセンサ（センサチップ）を集積回路（ＩＣ）技術によって製造することができる方法の第２のステップを示す線図である。
【図２７】  バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法の第３のステップを示す線図である。
【図２８】  バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法の第４のステップを示す線図である。
【図２９】  バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法の第５のステップを示す線図である。
【図３０】  バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法の第６のステップを示す線図である。
【図３１】  本発明のバイオセンサの一実施形態を使用してイオン分析物（または分子）を検出することができる方法を示す線図である。
【図３２】  図３１のセンサによって取られたサイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）（電流対バイアス電位）グラフである。
【図３３】  本発明のバイオセンサの一実施形態を使用して高分子（例えばＤＮＳ、ＲＮＡ、蛋白質）を検出することができる方法の第１のステップを示す線図である。
【図３４】  高分子の検出の第２のステップを示す線図である。
【図３５】  高分子の検出の第３のステップを示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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