(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルコシダーゼを用いることを特徴とする、一般式（Ｉ）
【化１】
0004975221.tif 000007
（式中、Ｒ１はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端のグルコース１位に結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を表す）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を用いる生体試料中のα−アミラーゼ活性測定における血糖降下剤の影響抑制方法。
【請求項２】
測定可能な物質が、それ自体で吸光度を示す物質または蛍光物質である請求項１記載の抑制方法。
【請求項３】
Ｒ１が２−クロロ−４−ニトロフェニル基である請求項１または２記
載の抑制方法。
【請求項４】
血糖降下剤が、糖質吸収遅延剤である請求項１〜３のいずれかに記
載の抑制方法。
【請求項５】
糖質吸収遅延剤が、Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−｛［（１Ｓ，４
Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］アミノ｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコピラノース、又は、（＋）−１Ｌ−［１（ＯＨ），２，４，５／３］−５−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ−１−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−１，２，３，４−シクロヘキサンテトラオールである請求項４記載の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料中のα−アミラーゼ活性測定用試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミラーゼは主に膵臓および唾液腺から分泌される消化酵素であり、血中および尿中α−アミラーゼの活性測定は、急性膵炎等の膵疾患や流行性耳下腺炎等の唾液腺疾患の診断に利用されている。α−アミラーゼの活性測定法としては、還元末端のグルコース１位にα−アミラーゼによって切断されて測定可能な物質となる基をアグリコンとして有し、非還元末端のグルコースの４位あるいは６位にβ−ガラクトピラノシル基を有する、グルコース単位が２〜４個のマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いて、α−グルコシダーゼ非存在下に該基質と試料中のα−アミラーゼとを反応させ、遊離した測定可能な物質を定量する、という方法が知られている（特許第２８０７９４９号）。しかしながら、この方法は、生体試料中に血糖降下剤がある場合、当該物質の影響を受け、血糖降下剤を含有しない生体試料を用いた場合に比べて、α−アミラーゼ活性値が低下するという欠点を有している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生体試料中の血糖降下剤の影響を受けないα−アミラーゼ活性測定試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記（１）〜（６）に関する。
（１）  一般式（Ｉ）
【０００５】
【化３】
0004975221.tif 000002
【０００６】
（式中、Ｒ1はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端のグルコース１位に結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を表す）で表されるマルトオリゴ糖誘導体とα−グルコシダーゼとを含有する、生体試料中のα−アミラーゼ活性測定用試薬。
（２）  測定可能な物質が、それ自体で吸光度を示す物質または蛍光物質である（１）記載の試薬。
【０００７】
（３）  Ｒ1が２−クロロ−４−ニトロフェニル基である（１）または（２）記載の試薬。
（４）  一般式（Ｉ）
【０００８】
【化４】
0004975221.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ1はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端のグルコース１位に結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を表す）で表されるマルトオリゴ糖誘導体とα−グルコシダーゼとを含有する試薬をα−アミラーゼを含有する生体試料と反応させて、前記マルトオリゴ糖誘導体から遊離する測定可能な物質の量を測定することを特徴とする生体試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【００１０】
（５）  測定可能な物質が、それ自体で吸光度を示す物質または蛍光物質である（４）記載の方法。
（６）  Ｒ1が２−クロロ−４−ニトロフェニル基である（４）または（５）記載の方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
１．α−アミラーゼの基質
本発明において使用するα−アミラーゼの基質としては、一般式（Ｉ）
【００１２】
【化５】
0004975221.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ1はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端のグルコース１位に結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を表す）で表されるマルトオリゴ糖誘導体［以下、マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）という］が用いられる。マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）は、マルトースを基本構造として有し、マルトースの非還元末端のグルコース４位にβ−ガラクトピラノシル基がＯ−グリコシド結合しており、マルトースの還元末端に、α−アミラーゼによって切断されて測定可能な物質となる基Ｒ1を有している。Ｒ1は還元末端のグルコース１位にα−Ｏ−グリコシド結合を介して結合している。Ｒ1としては、例えば、４−ニトロフェニル基、２−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等の置換フェニル基や、４−メチルウンベリフェリル基等の蛍光性基等が挙げられるが、２−クロロ−４−ニトロフェニル基が好ましく挙げられる。
【００１４】
マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）としては、例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド等が挙げられるが、一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化６】
0004975221.tif 000005
【００１６】
で表される２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド［以下、マルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）という］が好ましく挙げられる。
２．マルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）の合成
マルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）は、市販の化合物から、一般的な合成法で合成することができるが、例えば、特許第３０７０７０９号公報に記載の方法や特開平９−２９１０９６に記載の方法により合成することができる。
【００１７】
３．α−グルコシダーゼ
本発明において使用するα−グルコシダーゼは、酵素番号［ＥＣ３．２．１．２０．］に属する酵素であり、α−グルコシド結合を加水分解するエキソグルコシダーゼである。本発明においては、動物、植物または微生物由来のα−グルコシダーゼだけでなく、遺伝子工学的手法により改変したα−グルコシダーゼも使用することができる。本発明においては、α−グルコシダーゼを使用するので、生体試料中に存在する血糖降下剤の影響を受けずに、生体試料中のα−アミラーゼ活性を測定することができる。
【００１８】
４．生体試料
本発明において使用する生体試料としては、例えば、全血、血漿、血清、汗、唾液、尿、膵液、羊水、髄液等が挙げられるが、好ましくは血漿、血清、尿が挙げられる。本発明の測定方法は、血糖降下剤の影響を受けないため、本発明においては、糖尿病等により血糖降下剤を投与された患者から採取した生体試料も用いることが出来る。
【００１９】
５．血糖降下剤
本発明のα−アミラーゼの測定法に影響を与えない血糖降下剤としては、例えば、Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−｛［（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］アミノ｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコピラノースや（＋）−１L−［１（ＯＨ），２，４，５／３］−５−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ−１−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−１，２，３，４−シクロヘキサンテトラオール等の糖質吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
６．α−アミラーゼ活性測定用試薬
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、上記のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）とα−グルコシダーゼとを含有し、必要に応じて水性溶液、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、反応促進剤等を含有していてもよい。
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、凍結乾燥された状態でも、予め水性媒体に溶解された状態でもよい。該凍結乾燥された状態の試薬を用いてα−アミラーゼ活性を測定する場合には、該凍結乾燥された試薬は水性媒体に溶解して使用される。水性媒体に溶解されたα−アミラーゼ活性測定用試薬中のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）の濃度としては、α−アミラーゼ活性の測定に適した濃度ならば特に制限はないが、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１．０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、水性媒体に溶解されたα−アミラーゼ活性測定用試薬中のα−グルコシダーゼの濃度としては、α−アミラーゼ活性の測定に適した濃度ならば特に制限はないが、好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは１〜２０Ｕ／ｍＬである。
【００２１】
７．α−アミラーゼ活性測定用キット
α−アミラーゼ活性測定用試薬はキットの形態で保存、使用されてもよい。キットの形態としては特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等が挙げられるが、２試薬系が好ましい。２試薬系によるα−アミラーゼ活性測定用キットとしては、例えば、マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を含有する試薬と、α−グルコシダーゼを含有する試薬とからなるキットが挙げられる。α−アミラーゼ活性測定用キットを構成する各試薬には、必要に応じて水性媒体、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、反応促進剤等が含有されていてもよい。
【００２２】
α−アミラーゼ活性測定用キットを構成する各試薬は、凍結乾燥された状態でも、予め水性媒体に溶解された状態でもよい。該凍結乾燥された状態の試薬を用いてα−アミラーゼ活性を測定する場合には、該凍結乾燥された試薬は水性媒体に溶解して使用される。α−アミラーゼ活性測定用キットを構成する各試薬におけるマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）は、水性媒体に溶解された状態での濃度が好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、より好ましくは１．０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように含有される。また、α−アミラーゼ活性測定用キットを構成する各試薬におけるα−グルコシダーゼは、水性媒体に溶解された状態での濃度が好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬとなるように、より好ましくは１〜２０Ｕ／ｍＬとなるように含有される。
【００２３】
水性媒体としては、特に制限はなく、例えば、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有し、マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）およびα−グルコシダーゼを安定に溶解するものならば特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．０〜９．０の２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸［（Ｈ）ＥＰＰＳ］、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、３−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等のグッド緩衝剤等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．０５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００２４】
界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤が挙げられる。安定化剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。反応促進剤としては、例えば、チオシアン酸カリウム、カルシウムイオン、塩素イオン等が挙げられる。
【００２５】
８．α−アミラーゼ活性測定方法
本発明のα−アミラーゼ活性測定方法としては、マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）とα−グルコシダーゼとを含有する試薬をα−アミラーゼを含有する生体試料と反応させて、前記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）から遊離する測定可能な物質を定量する方法であれば特に制限はない。
【００２６】
マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）とα−グルコシダーゼとを含有する試薬と、α−アミラーゼを含有する生体試料との反応は、通常の酵素反応の条件下で行うことができる。該反応における反応温度としては、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３７℃が特に好ましい。該反応における反応時間としては、１〜６０分間が好ましく、２〜３０分間がより好ましく、５〜１５分間が特に好ましい。該反応におけるマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１．０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。該反応におけるα−グルコシダーゼの濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは１〜２０Ｕ／ｍＬである。
【００２７】
また、本発明のα−アミラーゼ活性測定は、例えば、α−アミラーゼ活性測定試薬として、α−グルコシダーゼを含有する試薬［以下、試薬（１）とよぶ］とマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を含有する試薬［以下、試薬（２）とよぶ］とからなる２試薬系のキットを用いて、次のように行うことができる。
まず、試薬（１）をα−アミラーゼを含有する生体試料に添加して反応させ、次いで、該反応液に試薬（２）を添加し、遊離したアグリコンを定量し、得られた定量値から予め作成した検量線（測定可能な物質の濃度とα−アミラーゼ活性とを相関付ける検量線）を基に該生体試料中のα−アミラーゼ活性を測定する。α−アミラーゼ活性の測定においては、試薬（１）と試薬（２）とを同時に生体試料に添加してもよいが、試薬（１）を生体試料に添加した後に試薬（２）を添加する方法が好ましい。
【００２８】
遊離した測定可能な物質の定量方法としては、吸光度法、蛍光法等が挙げられる。遊離した測定可能な物質の定量は、例えば、遊離した該物質がそれ自体で吸光度を示す物質の場合は、該物質の吸光度を測定することにより、また、該物質が蛍光物質である場合は、該物質の蛍光度を測定することにより行うことができる。特に、α−アミラーゼの基質としてマルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）を用いた場合は、測定可能な物質として２−クロロ−４−ニトロフェノールが遊離するので、該フェノール誘導体の定量は、例えば、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより行うことができる。
【００２９】
α−アミラーゼ活性の定量法としては、遊離するアグリコンを連続的に定量することにより求めるレート法、および一定時間反応させた後に遊離するアグリコンを定量することにより求めるエンドポイント法のいずれもが使用され得る。
本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法は、試料中のα−アミラーゼ活性測定に限らず、本発明のα−アミラーゼ活性測定法が組み込まれた試料中のカルシウムイオン、塩素イオン等の測定にも適用可能である。
【００３０】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
尚、ここで使用した試薬、酵素は下記メーカーのものである。
ＭＥＳ緩衝液（同仁化学社製）、酢酸カルシウム一水和物（関東化学社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、マルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）（２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド）（東洋紡績社製）、チオシアン酸カリウム（関東化学社製）、α−グルコシダーゼ（ユニチカ社製）、Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−｛［（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］アミノ｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコピラノース（アカルボースTM；バイエル社製）。
【００３１】
【実施例】
実施例１  α−グルコシダーゼを含有するα−アミラーゼ活性測定用試薬
下記の通り、α−グルコシダーゼを含有するα−アミラーゼ活性測定用試薬をキットとして調製した。
第１試薬
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸カルシウム一水和物                    ６．７ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム                            ４００ｍｍｏｌ／Ｌ
α−グルコシダーゼ                        １０Ｕ／ｍＬ
第２試薬
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
チオシアン酸カリウム                      ５６０ｍｍｏｌ／Ｌ
マルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
比較例１  α−グルコシダーゼを含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬
下記の通り、α−グルコシダーゼを含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬をキットとして調製した。
第１試薬
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム一水和物                    ６．７ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム                            ４００ｍｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
チオシアン酸カリウム                      ５６０ｍｍｏｌ／Ｌ
マルトオリゴ糖誘導体（ＩＩ）              １１．２ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３２】
実施例２  α−アミラーゼ活性測定
実施例１および比較例１で調製したキットを用いて、アカルボースTM含有試料中のα−アミラーゼ活性を測定した。
試料
唾液アミラーゼ（１５００ＩＵ／Ｌ）にアカルボースTMをそれぞれ０、０．０８、０．１６、０．２４、０．３２、０．４０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、試料とした。
測定方法
実施例１および比較例１で調製した第１試薬２．２５ｍＬに試料０．０５ｍＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。それぞれの溶液に、実施例１および比較例１で調製した第２試薬を０．７５ｍＬ添加し、３７℃にて５分間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化を算出した。この吸光度変化を当該組成における２−クロロ−４−ニトロフェノールの分子吸光係数を用いてアミラーゼ活性値に変換した。ブランクとして、試料の代わりに精製水を用いて同様の測定を行った。結果を表１に示した。
【００３３】
【表１】
0004975221.tif 000006
【００３４】
このように、本発明の試薬は、血糖降下剤の存在下でもα−アミラーゼの影響を受けないことが判明した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、試料中の血糖降下剤の影響を受けないα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法が提供される。