(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエント特異的組織移植片または組織インプラントを調製するための方法であって、
（ａ）合成マトリックスを準備する工程であって、前記合成マトリックスにコロニー形成のために細胞が適用されており、前記細胞は前記組織移植片または組織インプラントのレシピエントの自己細胞であり、結合組織細胞、筋肉細胞、内皮細胞および心臓の細胞から成る群より選択される前記工程、と
（ｂ）前記工程（ａ）の前記合成マトリックスを第１の培養培地中で培養する工程であって、前記第１の培養培地はレシピエントの自己細胞であるマクロファージを含む第２の培養培地とは前記マクロファージによって放出される細胞メディエータ又は因子にとっては透過可能なものであるフィルム、膜または仕切りという手段により分離され、これにより前記組織移植片または組織インプラントが調製される前記工程とを
含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記組織移植片または組織インプラントが心臓弁移植片または心臓弁インプラントであることを特徴とする請求項１に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組織マトリックスおよびそれにコロニー形成したレシピエント寛容性細胞から成るレシピエント特異的組織移植片あるいは組織インプラントを調製するための方法に関する。
【０００２】
移植医学においては、移植片レシピエント内で副作用反応を最小限度にしか引き起こさない適当な移植片に対する大きな需要がある。ある種の場合でのみ、そのレシピエントの身体から移植片を取り出して、そのレシピエントの中にそれを移植して戻すことが可能である。こうした移植は免疫学的見地からもっとも安全であるが、それがある種の血管あるいは臓器あるいは皮膚のかなり大きな面積を取り替えるといった場合には、こうした移植を実施することは不可能である。現在では、外来ドナーからの同種移植片のみ、あるいは整形外科の分野においては頻繁に、プラスチック、金属、セラミック、その他から作られる合成移植片あるいは、さまざまな複合物質から作られる合成移植片がある種の臓器には実際には適当なものとなっている。ドナー臓器などの同種材料が使用される場合は、そのレシピエントの身体にとっては大変なストレスとなるが、恒常的な免疫抑制が必要となる。にもかかわらず、拒絶反応は深刻な合併症として頻繁に起こる。人工的な材料はまた、その外科手術の結果を台無しにしてしまう拒絶反応や炎症プロセスを起こす可能性もある。
【０００３】
さまざまな理由により、現在では、異種材料（動物起源の）を使用することが頻繁に試みられている。このことが有している特別な利点は、同種（ドナー）材料に比較すると、この材料の方がとても利用しやすいということである。さらに、こうした「生物学的な材料」は人工的な材料よりもより柔軟性があり、また、数々の部位において、レシピエントの身体により良好に適合する。しかしながら、異種移植材料は強力な抗原性のものであるという結果として、異種移植材料には問題がある。
【０００４】
したがって、異種、同種あるいは合成移植材料、すなわち、移植、レシピエント寛容性を意図している、多種多様な組織／繊維を作り出すことに関して、かなり長い期間にわたってすでにさまざまな試みが行われてきた。これを達成するために、可能であるとしても、その身体に対する異物であるとしてそのレシピエントによって認識されていない、あるいは存在する自己由来の内在性細胞のお陰でそのレシピエントによっては少なくともより寛容性となっている移植片あるいはインプラントになるために、異種若しくは同種組織（それらは無細胞化によってレシピエントに対して大部分が免疫学的に中性化されているが）又は合成マトリックス材料（例えば、生分解性バイオポリマーからなる）にレシピエント寛容性細胞をコロニー形成させる試みが頻繁に行われている。
【０００５】
例えば、ドイツ特許出願公開明細書（ＤＥ１９８２８７２６  Ａ１）は、ネイティブ細胞が最初に移植片の間質結合組織から除去される、生物人工移植片を調製するための方法を記載している。その後、レシピエント特異的生物移植片が得られるように、そのマトリックスは、そのレシピエント寛容性の細胞により、また、好ましくは自己由来のものである細胞により新たにコロニー形成される。
【０００６】
自然に起こるのと類似の態様で増殖する新しいコロニー形成に使用されるその細胞を賦活するためには、また、連続的な、及び、恒常的な細胞再生を促進するためには、特定のプロセスを行うために、増殖する細胞を刺激するある種の細胞メディエータあるいは因子がその培養培地に供給されるものであれば、それは有利なものとなる。例えば、適用されたレシピエント特異的細胞に線維芽細胞が含まれている場合は、コラーゲンの新しい形成を刺激するために、また、このようにしてその組織マトリックスをそのレシピエントにとっては自己由来のものである形態のものに形質転換するように適当なメディエータ／因子を使用することが可能である。こうした効果が研究調査されたかぎりでは、原則的に個々の因子の効果に慣れ親しんでいる当業者によれば、非常に数多くの因子が化学走化性あるいは増殖加速効果を有している。これらの因子を付加することにより、前記のプロセスが誘導され、加速され、また、それら因子の性質と機能に依拠してそれらプロセスが制御される。
【０００７】
先行技術において開示されている手順に関して言えば、使用されている因子が非常に高価なものであるという短所が存在する。レシピエント寛容性細胞を有する特定の移植片親構造をコロニー形成することによりレシピエント特異的移植片あるいはインプラントを調製することは、すでに高価なものであり、また、その方法は、天然、分離あるいは合成されたメディエータを使用する結果としてさらに高価なものになるため、これは上述の諸方法を使用するための範囲を制限してしまう。
【０００８】
もう1つの問題は、メディエータ／因子および共因子を正確に計量することに関する問題であり、また、最適である時期および部位でそれらが使用されるのを確認することに関する問題である。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、組織マトリックスとそれにコロニー形成されるレシピエント寛容性細胞を構成成分とするレシピエント特異的組織移植片あるいは組織インプラントを調製するための方法における組織培養培地に対するメディエータと、因子と、共因子の供給を簡素化し、その供給コストを削減し、また、それら供給の制御を改良することである。同時に、本方法は、得られるレシピエント特異的移植片あるいはインプラントがさらに自然な設計を有することができるようにする。
【００１０】
この問題を解決するために、本発明は、組織マトリックスおよびそれにコロニー形成されるレシピエント寛容性細胞を構成成分とするレシピエント特異的組織移植片あるいは組織インプラントを調製するための方法において、組織再生を促進するメディエータ、因子あるいは共因子を作り、その環境内に放出する付加的な細胞の参加により実施されうるレシピエント寛容性細胞による組織マトリックスのコロニー形成を提供することである。
【００１１】
本例では、メディエータあるいは因子を放出する付加的な細胞の「参加」は、これら細胞は、コロニー形成プロセス内でコロニー形成に使用されるレシピエント寛容性細胞に加えて、組織培養培地の中に直接導入され、そしてそれを刺激して（それらが直接介入し、また、結果的にコロニー形成プロセスに関与するように）レシピエント特異的細胞と相互作用することにより、そのメディエータと因子を放出させるか、あるいは同一の培養装置（バイオリアクター）内で組織移植片あるいはインプラントの培養と並行して培養されるか、あるいは組織培養培地に直ぐに供給される本発明において用いられる細胞により並行培養培地の中に分泌される産物（メディエータと因子と共因子）とともに別の装置内で同時に培養（共培養）されるかのいずれかであることを意味しているものと理解されるべきである。メディエータにはまた炎症誘導メディエータも含まれる。
【００１２】
メディエータあるいは因子を放出する細胞が並行して培養される場合には、これはそれぞれの細胞タイプを培養するために適当である標準的な培養培地の中で行われ得る。
【００１３】
本発明においては、「メディエータあるいは共因子を放出する細胞」は、比較的良好に活性化されうる細胞、すなわち、刺激されて、組織再生を促進するメディエータ、因子あるいは共因子を放出する細胞を意味するものとして理解される。これら細胞には、とりわけ、マクロファージ、ある種の免疫担当細胞、及びその他が含まれる。その活性化は、コロニー形成細胞から発する刺激（例えば、細胞デトリタス）という手段により好適には実施されうるものであり、代替的には、それはまた、化学的物質あるいは小さな外来性粒子を加えることにより実施されうる。
【００１４】
組織再生は、修復プロセスおよび、その組織の分解と再構築を含むプロセスを意味するものとして理解される。メディエータ放出細胞は、それぞれの細胞タイプに対して表現型である形質転換を実施するために、周囲の細胞を刺激し、また、新合成プロセスおよび組織再生を促進する。
【００１５】
移植片レシピエントに属する自己由来細胞は、メディエータあるいは因子を放出する細胞として使用され得る。以下のものが特に挙げられる。すなわち、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、幹細胞などの白血球、特に、多分化能性幹細胞、あるいは体幹細胞あるいはこれら細胞の混合したものである。現在、マクロファージの使用は特に有利なものと考えられる。
【００１６】
特に、メディエータあるいは共因子を放出する細胞が共培養されるが、しかし、また、それら細胞が直接移植組織培養培地に添加される場合は、適当な物質を付加するという手段により、これら細胞は、特定のメディエータ、因子あるいは共因子を産生するように、あるいはこれら細胞産物の産生を増加させるように、刺激され得る。とりわけ、組織培養培地から回収される細胞デトリタスを、細胞を刺激するために使用することができる。
【００１７】
本方法は好ましくは、コロニー形成時にメディエータあるいは因子を放出する細胞が、直接コロニー形成のために使用される培養培地および／または組織マトリックスに対して少なくとも時折供給されるといったやり方で行われる。
【００１８】
組織移植片あるいはインプラントを形成するために組織培養基層のレシピエント寛容性細胞によるコロニー形成は、それ自体公知の例えばドイツ特許第１９８  ２８  ７２６号に詳細に明細に述べられているように生じる。この関連において、組織培養基層あるいは組織マトリックス、例えば、天然あるいは合成、無細胞化あるいはネイティブコラーゲンマトリックスあるいはバイオポリマー繊維構造あるいはバイオポリマーメッシュ構造などの合成繊維が、一般的にはさまざまな添加物を加えて補充することができる培養培地（調整培地とも呼ばれる。コロニー形成のためにその組織のコンディショニングを行うことを意味する）の中には存在している。培養培地は、例えば、その組織の上で攪拌することができ、また、その組織の上の回路中で循環させることができる。培養培地はまた、間隔をおいて添加され、その後に一定期間、その培養を静置培養して放置することもできる。すなわち、最適条件は、とりわけ、コロニー形成されるべき組織のタイプに拠る。
【００１９】
さまざまな添加物を供給することができる標準栄養培地は、適当なものであれば、培養培地あるいは調整培地として使用することができる。当業者であれば、この目的に適当なものである栄養培地にはよく通じている。
【００２０】
レシピエント特異的細胞は、コロニー形成の初期に、連続的にか、あるいは何回かの回分方式（バッチ法）のいずれかで培養培地の中に導入される。「レシピエント特異的細胞」はレシピエントにとっては自己由来のものである細胞として、あるいはレシピエントにとっては、出来るかぎり免疫学的に寛容性がある、選択された（適合性を有する）同種あるいは遺伝的に改変された同種あるいは異種細胞として理解される。試験によりそれら細胞をレシピエント様のものとして分類されるか、あるいはそれら細胞が、特に遺伝子工学的に改変されることによりそのレシピエントに対して適合した場合には、細胞は、免疫学的に適合性のあるものとしてみなされ得る。
【００２１】
異なる細胞タイプから成る異なる細胞層をその組織上に構築することができるように、コロニー形成および／または処理においては、異なる時点で異なるタイプの細胞を供給することも可能である。さらに、異なる細胞を局所的に適用する、例えば、皮膚移植片の表側および裏側上に異なる細胞を適用する、あるいは、管状血管の内側および外側上に異なる細胞を適用することが可能である。原則的には、体細胞のすべてのタイプがレシピエント寛容性細胞として使用するのに適当なものである。
【００２２】
例えば、結合組織細胞（とりわけ、線維芽細胞および線維細胞）筋肉細胞（筋細胞）、内皮細胞、皮膚細胞（とりわけ、表皮細胞）、臓器細胞に分化した細胞（心臓の細胞、腎臓の細胞、その他）、コラーゲン骨格を有する構造臓器の場合には、好ましくは、移植のために目印を付けた特定の組織を再構築するために有用に示唆することができるすべての細胞である。
【００２３】
組織移植片は、原則的には、移植可能ないかなる組織でありうる。こうした組織には、特に、一般的には、大動脈血管、静脈などの血管、大動脈弁、心臓弁、臓器部分および臓器全体、皮膚部分、腱、角膜、軟骨、骨、喉頭、心臓、気管、神経、半月板、椎間板、尿管、尿道、膀胱、その他が含まれる。
【００２４】
静脈、心臓弁、角膜、膀胱、皮膚に関しては、合成マトリックスあるいは骨格に基づくインプラントは多くのその他の可能性の中では適当なものとなる。上述されているように、メディエータあるいは因子を放出する細胞は、コロニー形成時に組織培養培地および／または組織マトリックスに、少なくとも時折供給され得る。この目的のため、メディエータあるいは因子を放出する細胞を、コロニー形成の初期に1回、あるいは、レシピエント寛容性細胞と一緒に直接供給することが可能である。メディエータあるいは因子を放出する細胞はまた、その培養培地に、バッチ法で、あるいは連続的に、供給され得るし、それとともに、メディエータあるいは因子を放出する細胞を欠く培養培地と、こうした細胞を含有する培養培地との間で交代させることも可能である。
【００２５】
本発明のさらなる形態においては、メディエータあるいは因子を放出する所望の細胞を本来的に含有する血液は、好ましくは、移植片あるいはインプラントレシピエントの自己血液であるが、メディエータあるいは因子を放出する細胞を供給するのに使用することもまた考えられる。ここにおいて、この血液を、所望成分との関連で濃縮することができ、あるいはその他の血液成分を分離することができ、また、その後に使用することができる。
【００２６】
さらに好ましくは、メディエータあるいは因子を放出すために活性化され得る細胞は、コロニー形成時に、細胞培養培地から放出されたメディエータ／因子がコロニー形成時にその組織に供給されるように組織に連結される培養培地の中に維持され得る。上述されているように、メディエータあるいは因子を放出する細胞のこの共培養を、その組織培養のために使用される適用外、あるいはその組織培養のために使用される適用内の並行培養として実施することが可能である。
【００２７】
メディエータあるいは因子を放出する細胞、例えばマクロファージを、レシピエント特異的移植片あるいはインプラントが培養されているあるいは処理されているリアクターに適当な態様で連結されているバイオリアクターの中で培養することができる。バイオリアクターから取り出される因子は、循環しているか、あるいはバッチ法で供給されている調整培地に、適当な量で供給することができる。
【００２８】
代替的には、メディエータあるいは因子を放出するマクロファージ培養培地あるいはその他の細胞の培養培地、あるいはメディエータあるいは因子を放出する細胞の混合培地は、形成されるメディエータおよび／または因子を調整培地の中に連続的に放出することができるように、レシピエント寛容性細胞を処理する工程時に、細胞メディエータおよび／または因子にとっては透過可能であるフィルム、膜あるいは仕切りといった手段により、その調整培地からは別に維持することができる。
【００２９】
移植のために目印を付けた組織の処理は、一般的には、適当なものであれば、その培養培地が特定の空間の中で維持され、また、循環しているバイオリアクターの中で行われる。本発明により使用される細胞あるいはマクロファージを培養するための培養空間は、透過性のある仕切りを使用してこの空間内に設計することができ、それにより、形成されるその細胞メディエータおよび／または因子は、調整培地の中に連続的に移入することができる。
【００３０】
以下のものは、メディエータあるいは因子を放出する細胞として特に使用することができる。すなわち、白血球ファミリー由来の細胞であるが、末梢あるいは中枢幹細胞（血液、脂肪組織、臓器および骨髄由来のもの）であり、好ましくは、白血球、顆粒球、リンパ球、マクロファージ、単球、骨髄細胞、脾臓細胞、記憶細胞および胸腺細胞の全ての形態などの多分化能性幹細胞である。
【００３１】
各場合において、細胞あるいは与えられた組織タイプによく適している細胞あるいは細胞の混合物が、レシピエント寛容性細胞によるコロニー形成のために選択される。レシピエント寛容性細胞、好ましくは自己由来細胞あるいは遺伝子工学的に修飾された同種あるいは異種細胞、またそれによってレシピエント特異的とされたものには所望の組織を合成するのには適当である細胞が含まれ、所望される場合には加えてメディエータあるいは因子を放出する上記の細胞を含む、細胞因子を産生する細胞および／または化学走性の影響を有する細胞などの、組織再構築を共刺激するおよび／または制御することができる細胞が含まれる。
【００３２】
本発明の長所は、レシピエント寛容性細胞によるコロニー形成される移植片あるいはインプラントを培養する際に、メディエータと、因子と、共因子を産生し、また、それらを調整培地に供与する細胞の参加に関するものであり、与えられた目的に特に適当であるメディエータ／因子がいずれの場合においても必要とされる培養工程時に共産生することができることであり、これは付加的な高価な、また、より特異的ではない因子の使用を不要にすることが可能であることを意味している。
【００３３】
適当なものである場合には、メディエータあるいは因子を放出するために活性化され得る特定の細胞を供給するという手段により、これら細胞を適当に刺激するという手段により、そのメディエータ／因子の放出に対して影響を発揮し、またこのようにしてその組織の合成を制御し、また加速することが可能である。
【００３４】
特定の適用に応じて、用いられる組織マトリックスは、例えば、以下の材料の1つあるいはそれ以上から構成され得る、例えば、合成組織マトリックスでありうる。すなわち、ポリグラクチド、ポリジオキサノン、生分解性ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリル系、コラーゲン、フィブリノーゲンである。すでに上述されているように、ネイティブのあるいは無細胞性の異種あるいは同種組織マトリックスを使用することもまた代替的に可能である。
本発明は、実施例を用いて、以下に説明される。
【実施例】
【００３５】
新規な生物人工的組織に対するキャリアー物質（組織マトリックス）としての工業的および生物学的ポリマーの加速再構築
生物分解性ポリマーは、合成マトリックス材料として使用される。合成材料はまた、生物学的起源の精製された材料でもありうる。こうした材料は、「合成」マトリックスに形状化される（無細胞化された生物学的組織との比較において）。そのポリマーは、加水分解的にか、あるいは酵素的にかのいずれかで、分解され得る。
【００３６】
ポリグラクチド、ポリジオキサノン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリル系などの生分解性ポリマーと、特殊生物学的ポリマーと、コラーゲン、あるいはフィブリノーゲンなどの（バイオ）巨大分子、細胞外マトリックスの古典的な成分を使用することが可能である。
【００３７】
標準的な方法によると、合成組織基層（例えば、合成心臓弁）は、選択されたレシピエント特異的細胞でコロニー形成される。培養は、この目的に対しては標準的なものである培地（例えば、ＤＭＢＭ；ＷＥ）の中で行われる。コロニー形成時には、その組織インプラントは時折、間隔をおいて、インプラントレシピエントの自己血液、濃縮されたレシピエントの自己血液、あるいは血液成分が添加された培養培地で洗い流される。この工程では、マクロファージは露出されたマトリックスに選択的に付着する。リンパ球とマクロファージは、ポリマーの切断産物から生じる免疫刺激性インパルスを受け、また、マトリックスを合成するために、自己由来筋線維芽細胞を刺激するように、内在性活性化因子を使用するよう活性化される。この分解は以前に可能であったものよりも実質的に時間的に短くなるような、加速された態様で、例えば、ポリマーの加水分解などの分解が生じるため、これは特に重要なことである。これは、生体内で、急速な、加速的な分解に関連する望ましくない不安定性を誘発する、あるいはそうでなければ異物体反応を誘発することができる残留ポリマーの存在なしに、生体内でさらに最終的な産物を移植することを順々に可能なものにしていく。
【００３８】
血液中での培養に対する代替的なものとして、バイオリアクターの異なる領域で個別に、あるいは、別の装置の中で同時に、血液血小板の調整物（１８００ｇで得られる白血球とともに、およそ３０００ｇで得られる）を共培養することが可能である。後者の場合は、このようなやり方で得られる培養産物は、実際の組織バイオリアクターであるものの中にある組織培養培地に供給される。
【００３９】
正常な細胞生理学的プロフィールを付与するような、心臓弁における再構築の誘導
従来の諸方法では、レシピエントの血管細胞の予備拡張期にはおよそ１０日間を要する。その後、心臓弁はバイオリアクターの中に導入され、また、標準的には、予備拡張された線維芽細胞、平滑筋細胞（ＳＭＣ）と内皮細胞とを使用して管腔内がコロニー形成される。これと並行して、新鮮な分離された骨髄幹細胞が、総プールとして、シリンジを用いてマトリックス上およびその中に適用される。マトリックス中では、その幹細胞の分化は、細胞外マトリックスの空間的な位置に関する局所的な微小環境の圧力下で制御される。幹細胞の活性化状態はさらに、マトリックス細胞分解産物と局所的な細胞分解産物により刺激される。レシピエントから採られた血管内皮細胞と平滑筋細胞を使用した結果として、相互作用が幹細胞に生じる。これによりさらに、生体内原位置で（in situ）組織特異的細胞が生成される。これは、バイオプシーを基礎として、例えば、大動脈の心臓弁を生成する場合には、標的組織から直接得ることができない組織を使用することが必要となることを意味する。これは、例えば、大動脈弁から採られる動脈細胞のそれとは異なる分子および表現型分化能を有する静脈材料から成る。さらに、ニューロン細胞系などの、例えば、小葉様弁膜でのみ見つかるさまざまな細胞のタイプが欠落している。弁の中に存在するマトリックスパラメータの局所的な微小環境の圧力下で（例えば、同種のものである大動脈弁マトリックスに関して理想的には）、その幹細胞は、局所的な神経支配プロセスを司るニューロン細胞系を含む部位特異的細胞タイプに分化する。その生体内移植の後に、その幹細胞は、生じてくる動脈細胞により付加的に再増殖することができる。しかしながら、血管系において塞栓形成が減少するので、ＥＣ（内皮細胞）はそれにもかかわらず、重要なものである。ＦＢ（因子）とＳＭＣ（平滑筋細胞）は、静脈起源のものであっても、少なくともレシピエント特異的マトリックスへの再構築のプロセスの開始を引き起こし、これが続けば、その幹細胞から補充される細胞プールにより、修正され、また完結される。