(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヌクレオチド単位、３’末端及び５’末端を持つオリゴヌクレオチド；ならびに
二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのハイブリッドの小溝に約１０3Ｍ-1以上の会合定数で非挿入的に結合する分子量約１５０〜約２０００ダルトンの分子のラジカルである小溝結合物質部分であって、該小溝結合物質部分を上記オリゴヌクレオチドに共有結合させる連結基によって該ヌクレオチドの少なくとも１つに結合した小溝結合物質部分；
を含むオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体であって、連結基を含む小溝結合物質部分が次に挙げる（ａ）及び（ｂ）群からなる群より選択される式を持つオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体：
【化１】
Ｒ1-（ＨＮ-Ｙ1-ＣＯ）n-Ｒ2      （ａ）
［式中、
Ｙ1は、２つの二重結合とＮ及びＳからなる群より選択される０〜２個のヘテロ原子とを持つ５員環を表し；ＮＨ基とＣＯ基は、互いに１環原子によって隔てられた２つの環炭素にそれぞれ結合しており；該２つの環炭素間に位置する環原子は、Ｈでのみ置換されているか、又は非置換であり；残りの各環原子は１又は２個のＲ3基で置換されていてもよく；
Ｒ1は独立して、Ｈ、-Ｒ4、-ＣＯＮＨ2、-ＣＯＮＨＲ4、-ＣＯＮ（Ｒ4）2、-ＣＯＯＲ4、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）mＣＯ-、-Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＨＮ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＣＯＮＨ-、-ＣＯＨ、又は-ＣＯＣＨ2Ｃ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ4）2であり；そして
Ｒ2は独立して、ＯＨ、ＯＲ4、-ＮＨ2、-ＮＨＲ4、-Ｎ（Ｒ4）2、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＮ（Ｒ4）2、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ4）2、又は-ＨＮ（ＣＨ2）mＣＯＯ（ＣＨ2）mＳ（ＣＨ2）mＣ6Ｈ4ＮＮＣ6Ｈ4であるか；若しくはＲ1基とＲ2基の一方は存在せず；
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ2、ＮＨＲ4、Ｎ（Ｒ4）2、Ｎ（Ｒ4）3+、ＯＨ、ＯＲ4、ＳＨ、ＳＲ4、ＣＯＲ4、ＣＯＮＨＲ4、及びＣＯＮ（Ｒ4）2からなる群より選択され；
Ｒ4は、１〜２０個の炭素を持つアルキル基であり；
ｍは、１から１０までの整数であり；
ｎは、１から１０までの整数である］；
【化２】
Ｒ1-（Ｒ6Ｎ-Ｙ2-ＣＯ）n-Ｒ2      （ｂ）
［式中、
Ｙ2は、１つの二重結合を持つ５員環と縮合した６員芳香環からなる環系であり；その縮合環系はＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される０〜３個のヘテロ原子を持ち；Ｒ6Ｎ基とＣＯ基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中の環炭素であって、１つの共通する橋頭環原子からそれぞれ２番目の環原子である環炭素に結合しており；その結果、ＣＯ基とＮＲ6基は、その縮合環系の一方の側でそれら自身の間に２つの非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に３つの非橋頭環原子を配しており；その縮合環系の一方の側にある２つの非橋頭環原子はＲ7基で置換されていてもよく、その縮合環系の他方の側にある３つの非橋頭環原子はＲ3基で置換されていてもよく；
Ｒ1は独立して、Ｈ、-Ｒ4、-ＣＯＮＨ2、-ＣＯＮＨＲ4、-ＣＯＮ（Ｒ4）2、-ＣＯＯＲ4、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）mＣＯ-、-Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＨＮ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＣＯＮＨ-、又は-ＣＯＨであり；そして
Ｒ2は独立して、ＯＨ、ＯＲ4、-ＮＨ2、-ＮＨＲ4、-Ｎ（Ｒ4）2、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-、又は-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-であるか；若しくはＲ1基とＲ2基の一方は存在せず；
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ2、ＮＨＲ4、Ｎ（Ｒ4）2、Ｎ（Ｒ4）3+、ＯＨ、ＯＲ4、ＳＨ、ＳＲ4、ＣＯＲ4、ＣＯＮＨＲ4、及びＣＯＮ（Ｒ4）2からなる群より選択され；
Ｒ4は、１〜２０個の炭素を持つアルキル基であり；
Ｒ6はＨ、１〜５炭素のアルキルであるか、又はＲ6とＲ7が一体となって、４、５又は６員環を形成し、この場合、-Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＨ-、-ＮＣＨ3-又はＮ-低級アルキル基が該環の一部であってもよく；
Ｒ7は、Ｆ、メチル又はエチル；-ＣＨ2-又は-ＣＨ2-ＣＨ2-であり；
ｍは、１から１０までの整数であり；
ｎは、１から１０までの整数である］。
【請求項２】
連結基が、小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドに１５個以下の原子を介して共有結合させるものである請求項１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項３】
連結基を含む小溝結合部分が式（ａ）によって表される請求項２のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項４】
Ｙ1が次の式で表される請求項３のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体：
【化３】
0004948690.tif 000032
【請求項５】
連結基を含む小溝結合部分が式（ｂ）によって表される請求項２のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項６】
Ｙ2が次の式で表される請求項５のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体：
【化４】
0004948690.tif 000033
【請求項７】
小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの５’末端に結合している請求項１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項８】
小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの３’末端に結合している請求項１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項９】
小溝結合物質部分が、オリゴヌクレオチドの３’末端でも５’末端でもないヌクレオチド単位に結合している請求項１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１０】
小溝結合物質部分がヌクレオチド単位の複素環式塩基部分に結合している請求項１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１１】
小溝結合物質部分がヌクレオチド単位の複素環式塩基部分に結合している請求項９のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１２】
連結基を含む小溝結合部分が式：
【化５】
0004948690.tif 000034
（ｎ＝２〜５）
を持つ請求項３のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１３】
小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの３’末端に結合している請求項１２のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１４】
連結基を含む小溝結合部分が式：
【化６】
0004948690.tif 000035
（ｎ＝２〜５）
を持つ請求項５のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１５】
連結基を含む小溝結合部分が式：
【化７】
0004948690.tif 000036
（ｎ＝２〜５）
を持つ請求項５のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１６】
小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの３’末端に結合している請求項１５のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１７】
小溝結合部分が式（ａ）で表され、その５員環が次の構造：
【化８】
0004948690.tif 000037
を持つ請求項３のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１８】
小溝結合部分が式（ａ）で表され、その５員環が次の構造：
【化９】
0004948690.tif 000038
を持つ請求項３のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項１９】
小溝結合部分が式（ｂ）で表され、その縮合環系が次の構造：
【化１０】
0004948690.tif 000039
を持つ請求項５のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２０】
ヌクレオチド単位の少なくとも１つに共有結合した架橋官能基をさらに含む請求項１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２１】
複数のヌクレオチド単位、３’末端及び５’末端を持つオリゴヌクレオチド；ならびに
小溝結合物質部分を上記オリゴヌクレオチドに１５個以下の原子を介して共有結合させる連結基によって該ヌクレオチドの少なくとも１つに結合した小溝結合物質部分；
を含むオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体であって、次の式を持つ複合体であって
【化１１】
0004948690.tif 000040
［式中、
ｘはＯ又はＳであり；
ｑは３から１００までの整数であり；
Ｒ8はＨ、ＯＨ、１〜６個の炭素を持つアルコキシ、Ｏ-Ｃ2-Ｃ6アルケニル又はＦであり；
Ｂは、自然界で核酸中に認められる複素環式塩基、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、２-チオウラシル、２-チオチミン、５-Ｎ4-エテノシトシン、４-アミノピラゾロ[３,４-ｄ]ピリミジン、６-アミノ-４-ヒドロキシ-[３,４-ｄ]ピリミジンからなる群より選択されるアグリコンであり；
Ｗ1はＨ、ＰＯ（ＯＨ）2又はその塩、又は該オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端に結合した小溝結合物質部分（該小溝結合物質部分を該オリゴヌクレオチドに１５個以下の原子を介して共有結合させる連結基を含む）であり；
Ｗ2は存在しないか、アグリコンＢの１つに結合した小溝結合物質部分（該小溝結合物質部分を該アグリコンに共有結合させる連結基を含む）であるか、若しくはＷ2は架橋官能基（該架橋官能基を該アグリコンに共有結合させるリンカーアームを含む）であり；
ここに、小溝結合物質部分とは、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのハイブリッドの小溝に約１０3Ｍ-1以上の会合定数で非挿入的に結合する分子量約１５０〜約２０００ダルトンの分子のラジカルをいい、該Ｗ1基とＷ2基の少なくとも一つは小溝結合物質部分であるものとする］、
ここに、連結基を含む小溝結合物質部分は、次に挙げる（ａ）及び（ｂ）群からなる群より選択される式を持つ、複合体：
【化１２】
Ｒ1-（ＨＮ-Ｙ1-ＣＯ）n-Ｒ2      （ａ）
［式中、
Ｙ1は、２つの二重結合とＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される０〜３個のヘテロ原子とを持つ５員環を表し；ＮＨ基とＣＯ基は、互いに１環原子によって隔てられた２つの環炭素にそれぞれ結合しており；該２つの環炭素間に位置する環原子は、Ｈでのみ置換されているか、又は非置換であり；残りの各環原子は１、２又は３個のＲ3基で置換されていてもよく；
Ｒ1は独立して、Ｈ、-Ｒ4、-ＣＯＮＨ2、-ＣＯＮＨＲ4、-ＣＯＮ（Ｒ4）2、-ＣＯＯＲ4、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）mＣＯ-、-Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＨＮ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＣＯＮＨ-、-ＣＯＨ、又は-ＣＯＣＨ2Ｃ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ4）2であり；そして
Ｒ2は独立して、ＯＨ、ＯＲ4、-ＮＨ2、-ＮＨＲ4、-Ｎ（Ｒ4）2、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＮ（Ｒ4）2、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｒ4）2、又は-ＨＮ（ＣＨ2）mＣＯＯ（ＣＨ2）mＳ（ＣＨ2）mＣ6Ｈ4ＮＮＣ6Ｈ4であるか；若しくはＲ1基とＲ2基の一方は存在せず；
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ2、ＮＨＲ4、Ｎ（Ｒ4）2、Ｎ（Ｒ4）3+、ＯＨ、ＯＲ4、ＳＨ、ＳＲ4、ＣＯＲ4、ＣＯＮＨＲ4、及びＣＯＮ（Ｒ4）2からなる群より選択され；
Ｒ4は、１〜２０個の炭素を持つアルキル基であり；
ｍは、１から１０までの整数であり；
ｎは、１から１０までの整数である］；
【化１３】
Ｒ1-（Ｒ6Ｎ-Ｙ2-ＣＯ）n-Ｒ2      （ｂ）
［式中、
Ｙ2は、１つの二重結合を持つ５員環と縮合した６員芳香環からなる環系であり；その縮合環系はＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される０〜３個のヘテロ原子を持ち；Ｒ6Ｎ基とＣＯ基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中の環炭素であって、１つの共通する橋頭環原子からそれぞれ２番目の環原子である環炭素に結合しており；その結果、ＣＯ基とＮＲ6基は、その縮合環系の一方の側でそれら自身の間に２つの非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に３つの非橋頭環原子を配しており；その縮合環系の一方の側にある２つの非橋頭環原子はＲ7基で置換されていてもよく、その縮合環系の他方の側にある３つの非橋頭環原子はＲ3基で置換されていてもよく；
Ｒ1は独立して、Ｈ、-Ｒ4、-ＣＯＮＨ2、-ＣＯＮＨＲ4、-ＣＯＮ（Ｒ4）2、-ＣＯＯＲ4、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）mＣＯ-、-Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＨＮ（ＣＨ2）mＣＯ-、-ＣＯＮＨ-、又は-ＣＯＨであり；そして
Ｒ2は独立して、ＯＨ、ＯＲ4、-ＮＨ2、-ＮＨＲ4、-Ｎ（Ｒ4）2、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯ-、-ＮＨ（ＣＨ2）mＯＨ、-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-、又は-ＮＨ（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）mＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）mＯ-であるか；若しくはＲ1基とＲ2基の一方は存在せず；
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ2、ＮＨＲ4、Ｎ（Ｒ4）2、Ｎ（Ｒ4）3+、ＯＨ、ＯＲ4、ＳＨ、ＳＲ4、ＣＯＲ4、ＣＯＮＨＲ4、及びＣＯＮ（Ｒ4）2からなる群より選択され；
Ｒ4は、１〜２０個の炭素を持つアルキル基であり；
Ｒ6はＨ、１〜５炭素のアルキルであるか、又はＲ6とＲ7が一体となって、４、５又は６員環を形成し、この場合、-Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＨ-、-ＮＣＨ3-又はＮ-低級アルキル基が該環の一部であってもよく；
Ｒ7は、Ｆ、メチル又はエチル；-ＣＨ2-又は-ＣＨ2-ＣＨ2-であり；
ｍは、１から１０までの整数であり；
ｎは、１から１０までの整数である］。
【請求項２２】
Ｗ1基の少なくとも１つが小溝結合物質部分と連結基であり、Ｗ2が存在しない請求項２１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２３】
Ｗ2が小溝結合物質部分と連結基である請求項２１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２４】
連結基を含む小溝結合部分が式（ａ）で表され、その５員環が次の構造：
【化１４】
0004948690.tif 000041
を持つ請求項２１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２５】
小溝結合部分が式（ａ）で表され、その５員環が次の構造：
【化１５】
0004948690.tif 000042
を持つ請求項２１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２６】
小溝結合部分が式（ｂ）で表され、その縮合環系が次の構造：
【化１６】
0004948690.tif 000043
を持つ請求項２１のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。
【請求項２７】
次の式で示される化合物：
【化１７】
0004948690.tif 000044
［式中、ＲはＣＯＮＨ2またはｔ-ブチルオキシカルボニルであり、Ｒ1は２,３,５,６-テトラフルオロフェニルオキシである］。
【請求項２８】
ＲがＣＯＮＨ2である請求項２７の化合物。
【請求項２９】
Ｒがｔ-ブチルオキシカルボニルである請求項２７の化合物。
【請求項３０】
次の式で示される化合物：
【化１８】
0004948690.tif 000045
［式中、ＲはＣＯＮＨ2またはｔ-ブチルオキシカルボニルであり、Ｒ1は２,３,５,６-テトラフルオロフェニルオキシである］。
【請求項３１】
ＲがＣＯＮＨ2である請求項３０の化合物。
【請求項３２】
Ｒがｔ-ブチルオキシカルボニルである請求項３０の化合物。
【請求項３３】
次の式で示される化合物：
【化１９】
0004948690.tif 000046
［式中、Ｒ1は２,    ３,５,６-テトラフルオロフェニルオキシである］。
【発明の詳細な説明】
1．発明の分野
本発明はオリゴヌクレオチドの新規誘導体に関する。より具体的には、本発明は1又はそれ以上の小溝結合分子がオリゴヌクレオチドに共有結合しているオリゴヌクレオチド誘導体に関する。本オリゴヌクレオチド小溝結合部分複合体は、一本鎖又は二本鎖核酸の相補鎖にハイブリッド形成し、それに強固に結合する強い親和性を示すので、配列特異的プローブとして、またアンチセンス及びアンチジーン治療剤として有効である。
2．先行技術の簡単な説明
当該技術分野では、二本鎖DNAの小溝に非共有結合する小溝結合剤が知られている。また、二本鎖DNA又はRNAに結合する挿入剤も、当該技術分野ではよく知られている。挿入剤は、概して言えば、二本鎖DNA又はRNAの2本の鎖の界面を成すプリン塩基とピリミジン塩基の間に自身を置く（挿入する）ことによって二本鎖DNA又はRNAに非共有結合する平板な芳香族分子である。米国特許第4,835,263号は、挿入基に共有結合したオリゴヌクレオチドを記述している。挿入基を持つこのようなオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成プローブとして有用である。
発明の要約
本発明は、複数のヌクレオチド単位、3’-末端及び5’-末端を持つオリゴヌクレオチドと、該ヌクレオチドの少なくとも1つに共有結合した小溝結合物質部分とを含む、共有結合したオリゴヌクレオチドと小溝結合物質の複合体に関する。この小溝結合物質は、典型的には、15原子を超えない鎖からなる連結基を介してオリゴヌクレオチドに取り付けられる。小溝結合物質部分は、二本鎖DNA、RNA又はそれらのハイブリッドの小溝に約103M-1を超える会合定数で非挿入的に結合する分子量約150〜約2000ダルトンの分子のラジカルである。
もう1つの側面として、本発明は、ある種の共有結合オリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体を合成する方法と、そのような複合体をハイブリッド形成プローブ及び関連する分析、診断用途、並びに治療（アンチセンス及びアンチジーン）用途に使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図1は、スロットブロットハイブリッド形成検定の結果を示すグラフである。
発明の詳細な説明
一般的態様
本発明の新規組成物の顕著な特徴は、小溝結合分子がオリゴヌクレオチドに共有結合していることである。本願の序文で述べたように、小溝結合物質とは、二本鎖デオキシリボ核酸（DNA）の小溝内に結合する分子をいう。既知の小溝結合化合物は極めて多様な化学構造を持つので、それらの全てを表す一般化学式を示すことはできないが、DNAの小溝に結合することができる化合物は、概して、三日月型の三次元構造を持つ。先行技術の小溝結合化合物のほとんどは、B型二本鎖DNAの高A-T（アデニン及びチミジン）含有領域に強い選択性を持つ。本発明の小溝結合化合物、より正確に述べると、本発明のオリゴヌクレオチド-小溝結合複合体の小溝結合化合物部分も、同じ選択性を持つ。（以下、本発明のオリゴヌクレオチド-小溝結合複合体をODN-MGBともいう。）しかし、高C-G（シトシン及びグアニン）含有領域に対する選択性を示す小溝結合化合物も理論的にも考えられる。したがって、C-G領域に対する選択性を持つ小溝結合物質分子から誘導される基又は部分を組込んだODN-MGB化合物も、本発明の範囲に含まれる。既知の小溝結合物質のA-T領域に対する選択性は、現在のところ、グアニンの2-アミノ基といくつかの周知の小溝結合物質の間の不利な立体障害の存在によって説明されている。しかし、後述の説明から明らかになるように、本発明のODN-MGBにおいてグアニンをヒポキサンチンに置換すると、上記の不利な立体障害の可能性が存在しなくなり、そのODN-MGBの相補鎖に対する強固な結合が起こり得る。
概して、先行技術で知られている小溝結合化合物は、二本鎖RNAや、DNAとRNAの二本鎖ハイブリッドには結合しない。しかし、本発明のODN-MGB化合物は一本鎖RNAに結合する潜在能力を示し、上述の特徴は、本発明のもう1つの興味深く新規な側面を形成する。
本発明に従ってODNに共有結合することにより新規ODM-MGB複合体を形成することができる先行技術の既知小溝結合化合物の例は、ある種の天然化合物、例えばネトロプシン（netropsin）、ジスタマイシン（distamycin）及びレキシトロプシン（lexitropsin）、ミトラマイシン、クロモマイシン（chromomycin）A3、オリボマイシン（olivomycin）、アントラマイシン（anthramycin）、シビロマイシン（sibiromycin）その他の関連抗生物質及び合成誘導体である。ある種のビス四級アンモニウム複素環式化合物、ペンタミジン、スチルバミジン（stilbamidine）及びベレニル（berenil）などのジアリールアミジン類、CC-1065及び関連するピロロインドール及びインドールポリペプチド、Hoechst 33258、4’-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、並びに天然アミノ酸又は合成アミノ酸からなるいくつかのオリゴペプチドは、小溝結合化合物である。次の例の化学構造を以下に示す。
0004948690.tif 000002
0004948690.tif 000003
0004948690.tif 000004
0004948690.tif 000005
本発明の目的にとっては、ある分子が103M-1又はそれ以上の会合定数で二本鎖DNAの小溝内に結合できるならば、その分子は小溝結合物質である。このタイプの結合は、十分に確立された分光光度測定法、例えば紫外（u.v.）及び核磁気共鳴（nmr）分光法や、ゲル電気泳動によって検出できる。小溝結合物質分子が結合した時のu.v.スペクトルの変化と、「核オーバーハウザー」（NOSEY）効果を利用するnmr分光法はとりわけよく知られており、この目的にとって有用な技術である。ゲル電気泳動は、二本鎖DNA又はその断片に対する小溝結合物質の結合を検出する。そのような結合が起こると、二本鎖DNAの移動度が変化するからである。
挿入分子又は挿入剤は、小溝結合物質が「三日月型」又は類似の外形を持つのに対して、挿入剤は平板な芳香族（好ましくは多環式）分子であるということに基づいて、小溝結合物質とは容易に区別される。核オーバーハウザー効果を利用するnmr分光法によって、実験的に区別することもできる。
上述のように、本発明の目的にとっては、二本鎖DNAの小溝内におけるある分子の会合定数が103M-1又はそれ以上ならば、その分子は小溝結合物質である。しかし、いくつかの小溝結合物質は、107〜109M-1程度の会合定数で二本鎖DNAの高親和性部位に結合する。
本発明では、小溝結合物質分子を誘導体化して本質的に「ラジカル」として、それを、ODNにその小溝結合物質を結合する適当な共有構造又は原子鎖に連結する。ある意味で、その連結「鎖」は小溝結合物質の一部と見なすことができ、またそのようにみなす場合がある。その結合は、そのODN-MGB分子の小溝結合性に悪影響を与えないような性質を持つからである。しかし、小溝結合物質と、それをODNに共有結合させる基とを概念的に区別した方が、本発明にとっては好都合である。小溝結合物質分子から「生成した」ラジカルを、以下、「小溝結合物質部分」といい、その小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドに結び付ける共有結合（これは約15原子までの鎖であってもよい）を「連結基」と呼ぶ。本発明による小溝部分の好ましい態様については、本発明のODN-MGB複合体化合物のオリゴヌクレオチドを説明した後に、詳細に説明する。
本発明のODN-MGB複合体のオリゴヌクレオチド部分は、概して、約3〜100ヌクレオチド単位を含む。本発明に従ってODNに組込むことができるヌクレオチド単位には、自然界で核酸中に認められる主要な複素環式塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニン及びグアニン）と、これら塩基の天然及び合成修飾体及び類似物、例えばヒポキサンチン、2-アミノアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-N4エテノシトシン、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン及び6-アミノ-4-ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンなどが含まれる。5-N4エテノシトシン、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン及び6-アミノ-4-ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンの2-デオキシリボシドの各構造を下に示す。
0004948690.tif 000006
さらに、本発明のODN-MGB複合体のODNに組込まれるヌクレオチド単位は、その塩基の1又はそれ以上に連結アームを介して共有結合した架橋官能基（アルキル化剤）を持ってもよい。結合した架橋剤を持つODN-MGB複合体は本発明の好ましい態様の重要な一群を成すので、これらの構造について以下により詳しく説明する。
本発明のODN-MGBの「糖」又はグリコシド部分は、デオキシリボース、リボース、2-フルオロリボース、2-O-アルキル又はアルケニルリボース（ここにアルキル基は1〜6個の炭素を持つことができ、アルケニル基は2〜6個の炭素を持つことができる）を含みうる。天然ヌクレオチドと本明細書に記載するその修飾体及び類似物において、そのデオキシリボース又はリボース部分はフラノース環を形成し、そのグリコシド結合（glycosydic linkage）はβ立体配置を持ち、プリン塩基はその9位で、ピリミジン類はその1位で、ピラゾロピリミジン類はその1位で糖部分に結合している。現在のところ、本発明ではオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましいので、好ましい糖は2-デオキシリボースである。ODNのヌクレオチド単位は、当該技術分野で良く知られているように、「リン酸」骨格によって相互に連結される。本発明のODN-MGB複合体のODNは、「天然の」リン酸ジエステル結合に加えて、チオリン酸エステル（phosphorothiotes）及びメチルホスホン酸エステルを含んでもよい。
本発明のODN-MGB複合体のODNは、その3’-又は5’-末端のいずれかに結合した比較的低分子量の「テール部分」を持ってもよい。この文脈における「テール部分」は、やはり3’-又は5’-末端若しくはその両方に結合していることが好ましい小溝結合部分とは区別されるべきものである。したがって、この文脈における「テール部分」が存在するとすれば、それは小溝結合物質部分を保持しないODNの末端に結合している。例えば、テール分子はリン酸、リン酸エステル、アルキル基及びアミノアルキル基又は親油性基などでありうる。
本発明ODN-MGB複合体のODNのヌクレオチド単位、「リン酸骨格」及び「テール」の考えうる異型については、次に挙げることに留意すべきである。本発明のODN-MGB複合体の主たる有用な作用は、その分子のODN部分が一本鎖DNA、RNA、二本鎖DNA及びDNA-RNAハイブリッド中の相補配列に結合することができ、この際に、小溝結合部分が新たに形成された「二重らせん」に組込まれて、その結合を強くすること、すなわち、新たに形成された二重らせんの溶解温度（及び会合定数）を増大させることにある。さらに、架橋剤を含む本発明ODN-MGB複合体の好ましい態様は、その相補DNA又はRNA鎖に対する本ODN-MGB分子の恒久的な共有結合をもたらし、恒久結合型となる。上述の説明から、当業者は、本発明ODN-MGB複合体のODN部分の様々な構成部分の一次構造上の制限は、そのODN部分が特定の標的配列に相補的な鎖を形成できるということにのみあること、及び、それ自体は当該技術分野で知られている多数の構造修飾体が、これらの範囲に含まれうることを、容易に理解するだろう。さらに、本発明のODN-MGB複合体のODN部分を形成しうる種々の複素環式塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、概して、当該技術分野で十分に開発され、よく知られている。N4,N4-エタノ-5-メチルデオキシシチジン、そのヌクレオシド、ヌクレオチド及び/又はこの塩基を組込んだオリゴヌクレオチドは、Webb, T.R.；Matteucci, M.D. Nucleic Acids Res., 1986, 14, 7661-7674, Webb, T.R.；Matteucci, M.D., J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 2764の教示に従って、製造することができる。4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、6-アミノ-4-ヒドロキシピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、それらのヌクレオシド、ヌクレオチド及びこの塩基を組込んだオリゴヌクレオチドは、Kazimierczukら，J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 6479-6382の教示に従って、製造することができる。標的配列に対して相補的になるように予め決定した特定の配列のONDを製造するには、オリゴヌクレオチド合成を当該分野の技術水準に従って行なうことができるのであるが、好ましい方法を以下に記述する。好ましい方法は、既に特許され特許料が納付された出願番号08/090,408号（1993年7月12日出願）の教示を具体化するものである。出願番号08/090,408の明細書は、特に、参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。
連結基とは、本複合体のODN部分を小溝結合物質部分に共有結合させる部分をいう。連結基は、その結合が15原子を超えない鎖を介して起こるような基であることが好ましい。また、本発明では、小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドの3’又は5’末端のいずれかに共有結合することが好ましい。しかし、中間位置にあるヌクレオチドへの結合、具体的には中間位置にあるヌクレオチドの複素環式塩基への結合も、本発明の範囲に含まれる。概して、連結基は、アミン官能基のような一方の官能基を例えばODNの5’末端に結合し、カルボニル基（CO）のような他方の官能基を小溝結合物質部分のアミノ基に結合するべく、二官能性分子から誘導される。別法として、アルコール官能基を例えばODNの3’-リン酸末端に結合し、アミノ官能基を小溝結合物質のカルボニル基に結合するべく、連結基をアミノアルコールから誘導してもよい。連結基のさらなる選択肢には、小溝結合物質のカルボニル基にペプチド結合として連結されるアミノカルボン酸に結合したアミノアルコール（3’-リン酸にエステル結合で結合する）が含まれる。したがって、連結基の好ましい態様は、-HN（CH2）mCO、O（CH2）mCO、及び（CH2）mCH（OH）（CH2）mNHCO（CH2）mNHという式を持つ（ここにmに対する制限は、小溝結合物質部分がODNから約15原子分より遠く離れるべきでないということである）。連結基の好ましい態様は、-O（CH2）6NH、-OCH2CH（OH）CH2NHCOCH2CH2NH、及び-HN（CH2）5COである。上述のように、連結基を小溝結合物質部分の一部として概念化することもできる。その場合、その小溝結合物質部分はODNに直接結合していると見なされる。
小溝結合物質部分に関する基本的な制限については上述したとおりであり、特定の化学構造で定義づけることはできない。小溝結合を引き起こす分子構造に加えて、小溝結合物質部分は、それらの機能が小溝結合能を妨害しない限り、付加的な機能を持ってもよい。例えば、色、uvスペクトルその他の容易に認識できる物理的又は化学的特徴によってその小溝結合物質を容易に検出できるようにするリポーター基を、小溝結合物質部分に共有結合してもよい。そのようなリポーター基の例は、好ましい態様として-HN（CH2）mCOO（CH2）mS（CH2）m-橋を介して小溝結合物質のカルボニル官能基に結合されるジアゾベンゼン官能基である。ここでも、小溝結合物質が保持するリポーター基その他の官能基を、小溝結合物質部分自体の一部として概念化することができる。
ODN-MGBの好ましい態様は、次の化学式1によって定義される。この定義は、本発明に従って小溝結合物質部分の好ましい態様を含み、それは上述のように連結基の一部又は全部及びその他の付随基（リポーター基など）を含んでもよい。
0004948690.tif 000007
［式中、
xはO又はSである。
qは3から100までの整数である。
R8はH、OH、1〜6個の炭素を持つアルコキシ、O-C2-C6アルケニル又はFである。
Bは、自然界で核酸中に認められる複素環式塩基、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-N4-エテノシトシン、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、6-アミノ-4-ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンからなる群より選択されるアグリコンである。
W1はH、PO（OH）2又はその塩、又は該オリゴヌクレオチドの3’又は5’末端に結合した小溝結合物質部分（このW1基は、小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドに15個以下の原子を介して共有結合させる連結基を含む）である。
W2は存在しないか、アグリコンBの1つに結合した小溝結合物質部分（このW2基は、小溝結合物質部分を該アグリコンに共有結合させる連結基を含む）であるか、若しくはW2は、架橋官能基を該アグリコンに共有結合させるリンカーアームを含む架橋官能基である。
ここに、小溝結合物質部分とは、二本鎖DNA、RNA又はそれらのハイブリッドの小溝に約103以上の会合定数で非挿入的に結合する分子量約150〜約2000ダルトンの分子のラジカルをいい、該W1基とW2基の少なくとも一つは小溝結合物質部分であるものとする。
また、連結基を含む小溝結合物質部分は、次に挙げる（a）、（b）、（c）、（d）及び（e）群からなる群より選択される式を持つ。
0004948690.tif 000008
（Y1は、2つの二重結合とN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を持つ5員環を表し、NH基とCO基は、互いに1環原子によって隔てられた2つの環炭素にそれぞれ結合しており、該2つの環炭素間に位置する環原子はHでのみ置換されているか、非置換であり、残りの各環原子は1、2又は3個のR3基で置換されていてもよい。）
0004948690.tif 000009
（Y2は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香環からなる環系であって、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を持つ。R6N基とCO基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1つの共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合しており、その結果、CO基とNR6基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配している。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR7基で置換されていてもよく、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR3基で置換されていてもよい。）
0004948690.tif 000010
（Y3は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR3基で置換されいてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2つの環原子はR7基で置換されていてもよい。）
0004948690.tif 000011
（Y4は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR3基で置換されていてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2つの環原子はR7基で置換されていてもよい。）
0004948690.tif 000012
（Y5は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香族環からなる環系であって、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を持つ。R1基とR2基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1つの共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合しており、その結果、R1基とR2基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配している。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR7基で置換されていてもよく、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR3基で置換されていてもよい。）
ここに、R1とR2は独立して、H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N（R4）2、N（R4）3+、OH、-O-、-S-、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON（R4）2、R4、H2N（CH2）mCO、CONH2、CONHR4、H2N（CH2）mCOO（CH2）mS（CH2）mC6H4NNC6H4、-HN（CH2）mCO、-CONH-、-CONR4、-HN（CH2）mCOO（CH2）mS（CH2）mC6H4NNC6H4、及び、-（CH2）mCH（OH）（CH2）mNHCO（CH2）mNH-であるか、若しくはR1基とR2基の一方が存在しない。
R3は、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N（R4）2、N（R4）3+、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON（R4）2及びR4からなる群より選択されるか、若しくはR3基はY1環に縮合した3、4、5又は6員環を形成してもよい。
R4は、1〜20個の炭素を持つアルキル又はシクロアルキル基、1〜20個の炭素と1〜3個の二重結合を持つアルケニル又はシクロアルケニル基、炭素25個以下の炭素環式芳香族基、炭素25個以下の複素環式芳香族基、炭素25個以下の炭素環式又は複素環式アリールアルキル基であり、R4は1、2又は3個のF、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N（R5）2、N（R5）3+、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON（R5）2又はR5基で置換されていてもよい。
R5は、1〜6炭素のアルキルである。
R6はH、1〜5炭素のアルキルであるか、又はR6とR7が一体となって、4、5又は6員環を形成する。この場合、-O-、-S-、-NH-、-NCH3-又はN-低級アルキル基が該環の一部であってもよい。
R7は、F、メチル又はエチル、-CH2-又は-CH2-CH2-である。
mは、1から10までの整数である。
nは、1から10までの整数である。
pは、1から5までの整数である。］
本発明のODN-MBG複合体のさらに好ましい態様は、その小溝結合物質部分が次のように定義されるものである：
（1）小溝結合部分が上記式（a）によって表され、その5員環が次式の構造を持つ：
0004948690.tif 000013
（2）小溝結合部分が上記式（a）によって表され、その5員環が次式の構造を持つ：
0004948690.tif 000014
（3）小溝結合部分が式（b）によって表され、その縮合環系が次式の構造を持つ：
0004948690.tif 000015
架橋官能基を含有する態様
本発明のODN-MGB複合体の好ましい態様の一種は、1又はそれ以上の架橋官能基をも含み、それによって、ODN-MGB複合体がDNA、RNA又はそれらの断片の相補的標的配列に結合した後に、その架橋官能基がその標的と不可逆的に反応して、それとの共有結合を形成する。標的配列に対するこのような共有結合は、ハイブリッド形成プローブの場合は分析、診断用途に有利であり、また治療的（アンチセンス及びアンチジーン）応用にも有利である。標的配列を相補するODNにも共有結合しているこの小溝結合物質部分は、標的配列に対するODN-MGB複合体の初期の非共有結合を高めるので、その架橋官能基による以降の共有結合化が促進される。次に述べる考察は、この種のODN-MGB複合体に組込まれた架橋官能基又は架橋剤に関する限り、妥当である。
本発明に組込まれる架橋剤は、ODN-MGB上のある部位に共有結合される。その長さと立体的配向は、そのODN-MGBが標的とハイブリッド形成した後に、その標的DNA又はRNA配列中の適当な反応部位に、それが届きうるようにすべきである。定義上、架橋官能基又は架橋剤は、標的DNA又はRNA配列の反応性基と反応する反応性基を持つ。この（又はこれらの）架橋剤は、ODN-MGB複合体の1又はそれ以上の複素環式塩基、糖又は修飾糖残基、リン酸又は修飾リン酸官能基に共有結合させることができる。共有結合剤は、それがその小溝結合能を妨害しない限り、小溝結合物質部分に結合させてもよい。好ましくは、架橋剤又は架橋官能基を複素環式塩基の1つに結合する。
簡単に述べると、架橋剤自体は、概念的に2つの基又は部分、すなわち典型的には（そして好ましくは）求電子脱離基（L）である反応性基と、その脱離基LをODN-MGBの各部位に結合する「アーム」（A）とに分割することができる。脱離基Lは、例えばクロロ、ブロモ、ヨード、SO2R”’又はS+R”’R””（ここに、R”’とR””はそれぞれ独立にC1-6アルキル又はアリールであるか、若しくはR”’とR””が全体としてC1-6アルキレン橋を形成する）などの基から選択することができる。クロロ、ブロモ及びヨードが好ましい。これらの基の中では、-COCH2Iなどのハロアセチル基と、-N-[（CH2）2-Cl]2などの二官能性「窒素マスタード」が好ましい。脱離基はその脱離能によって変更されるだろう。不可逆的に結合するプローブに所望の特異性を与えるために、特定の脱離基の性質と反応性によって、個々のケース毎に使用すべき基を選択する。
上述のように、「アーム」（又はリンカーアーム）Aは、概念的には、ODN-MGBを脱離基Lに共有結合し、かつ、その脱離基LをODN-MGBに対して所望の距離と立体的配向に保つ単一物と見なされるが、実際問題としては、二官能性分子を、その第1官能基を介してODN-MGBに、又は小溝結合物質部分を結合する前のODNに（例えばリン酸エステル結合によって3’又は5’末端に、炭素-炭素結合によって複素環式塩基に、又は炭素-窒素結合によってアミノ置換複素環式塩基に）共有結合させると共に、その第2官能基（例えばアミン）を介して、今度は脱離基Lを保持する「ヒドロカルビル橋」（アルキル橋、アルキルアリール橋又はアリール橋など）に共有結合させる合成反応で構築することができる。
したがって、架橋官能基の一般式は、-A-L又は-A-L2（ここに、Lは上に定義した脱離基であり、AはODN-MGBに共有結合した部分である）となる。このA「アーム」自体は、ODN-MGBと標的配列のハイブリッド形成条件下に、非反応性（脱離基Lによる他は）であるべきで、脱離基Lを所望の立体位置と、所望の反応部位（例えば標的配列中のグアノシン残基のN-7位）から望ましい距離に保つべきである。概して、A基の長さは約2〜20炭素の直鎖アルキル鎖の長さに等しくすべきである。
架橋官能基の好ましい態様の一種に関する典型的でより具体的な式は、
-（CH2）q-Y-（CH2）m-L
（Lは、上に定義した脱離基である。mとqはそれぞれ独立に0から8まで（両端を含む）である。Yは「機能性連結基」と定義される）
である。ここに記載する架橋剤結合用の機能性連結基は、小溝結合物質部分をONDのどちらかの末端に、或いはODNの中間部分にあるヌクレオチドに結合するためにも使用できるが、記述を明解にするには、この「機能性連結基」は、小溝結合物質部分をODNに結合する「連結基」とは区別すべきものである。「機能性連結基」は、（CH2）q橋と（CH2）m橋を連結することができる2つの官能基、例えば-NH2と-OH、又は-COOHと-OH、又は-COOHと-NH2を持つ基である。アセチレン末端（HC≡C-）は後述のようにある種の複素環にカップリングできるので、これもYにとって好適な官能基である。
架橋官能基の好ましい態様の一種に関する他の典型的でより具体的な式は、
-（CH2）q-NH-CO-（CH2）m-（X）n-N（R1）-（CH2）p-L
と、
-（CH2）q’-O-（CH2）q”-NH-CO-（CH2）m-（X）n-N（R1）-（CH2）p-L
（q、m及びLは、架橋官能基の説明に関して上述したように定義される。q’は3から7まで（両端を含む）であり、q”は1から7まで（両端を含む）である。Xはフェニル又は単純な置換フェニル（クロロ、ブロモ、低級アルキル又は低級アルコキシ置換フェニルなど）である。nは0から1までであり、pは1から6までの整数である。R1はH、低級アルキル又は（CH2）p-Lである。）
である。pは2であることが好ましい。-N（R1）-（CH2）2-Lという構造が一群の強力なアルキル化剤である「窒素マスタード」を表すことは、当業者にはわかるだろう。この種類のODN-MGB複合体の中で特に好ましいものは、架橋剤が-N（R1）-（CH2）2-L（ここにLはハロゲン、好ましくは塩素である）という官能基を含むものである。さらに好ましいものは、架橋剤が-N[（CH2）2-L]2（「二官能性」N-マスタード）という基を含むODN-MGB複合体である。
架橋剤の特に好ましい部分構造は、
-CO-（CH2）3-C6H4-N-[（CH2）2Cl]2
という基を含む。好ましい態様として、この架橋基を、ODNの5’及び3’末端にあるn-ヘキシルアミン保持テールに、次の構造式に従って結合する：
R’-O-（CH2）6-NH-CO-（CH2）3-C6H4-N-[（CH2）2Cl]2
（R’は、ODNの末端5’又は3’リン酸基を表す）。
他の末端、又は中間位置にあるヌクレオチドは、小溝結合物質部分を保持する。
他の好ましい態様では、架橋官能基を複素環式塩基（例えばODN-MGB複合体の2’-デオキシウリジル酸構成単位のウラシル部分）に共有結合する。この結合はアミノ基の仲介によって起こりうる。つまり、「アーム-脱離基複合体」（A-L）を、ODNの5-アミノ-2’-デオキシウリジル酸構成単位に結合することができる。さらなる好ましい態様では、「アーム-脱離基複合体」（A-L）を、ODNの2’-デオキシウリジン酸構成単位の5位に、炭素-炭素結合によって結合する。5-置換-2’-デオキシウリジン類は、概して、Robinら（Can. J. Chem., 60:554（1982）；J. Org. Chem., 48:1854（1983））の一般法を適用することによって得られる。この適用により、置換1-アルキンの5-ヨード-2’-デオキシウリジンに対するパラジウム媒介カップリングで、アセチレン結合生成物が得られる。このアセチレンdUrd類似物を、例えばラネーニッケルで還元して飽和化合物を得た後、それを、自動DNA合成装置で使用するための試薬に直接変換する。この方法で5-ヨード-2’-デオキシウリジンとカップリングすることができる試薬の例は、
HC≡CCH2OCH2CH2N（CO）2C6H4（フタルイミドエトキシプロピン；phtalimidoethoxypropyne）とHC≡CCH2OCH2CH2NHCOCF3（トリフルオロアセタミドエトキシプロピン）である。
これらの例では、この方法で得られるヌクレオシドを所望のODNに組込み、各フタル酸（phtalic）又はトリフルオロアセチル遮断基の除去後に、架橋剤のアルキル化部分をその末端アミノ基に結合する。複素環式塩基に架橋剤が結合される他のヌクレオチドの例は、2’-デオキシ-4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン誘導体である。これらの化合物は、公開されたPCT出願WO:90/03370（公開日4/05/90）の教示に従って製造できる。
さらに本発明の修飾ODNの構造を概括的に述べるが、球-棒モデル（ball-and-stick models）と高分解能コンピューターグラフィックスで二本鎖DNAを調べると、プリンの7位とピリミジンの5位が、二本鎖核酸のB型二重らせんの主溝にあることが示される。これらの位置は、かなり大きな側鎖で、それら塩基のハイブリッド形成特性を妨害することなく、置換することができる。これらの側鎖は、dThd又はdCydの誘導体化によって、或いはその複素環式塩基の直接的な全合成とそれに続くグリコシル化によって、導入することができる。これらの修飾ヌクレオシドは、自動DNA合成装置でオリゴヌクレオチドに組込むための適当な活性化ヌクレオチドに変換できる。アデニンの類似物であるピラゾロ[3,4-d]ピリミジン類の場合は、プリンの7位と等価なその3位に、架橋アームを結合する。
架橋側鎖（アーム＝A）は、プリン7位又は8位、ピリミジン5位、ピロロピリミジン5位又はピラゾロピリミジン3位から主溝を横切って届き、その修飾類似物を含有する塩基対の上（オリゴマー3’側）に位置するプリン（好ましくはグアニン）のN-7と反応するに足る長さを持つべきである。架橋側鎖（アーム＝A）は、その塩基が二本鎖錯体内のもう1つの塩基と対を成している時は、その官能基をその塩基から離れた状態に保つ。上述のように、概してアームAは2〜20炭素の直鎖アルキル鎖に等しい長さを持つべきである。このアームは、好ましくは、1〜12炭素原子のアルキレン基、1又は2個のオレフィン結合と2〜12炭素原子のアルケニレン基、1又は2個のアセチレン結合と2〜12炭素原子のアルキニレン基、若しくは末端がオキシ、チオ、アミノなどの求核基又は化学的に遮断されたそれらの誘導体（トリフルオロアセタミド、フタルイミド、CONR’、NR’CO及びSO2NR’など；ここにR’＝H又はC1-6アルキル）で置換された上記の基を含む。脂肪族又は芳香族アミンを含むこれらの官能基は求核性を示し、典型的架橋官能基の成分として上述した-（CH2）m-Lや-CO-（CH2）m-（X）n-N（R1）-（CH2）p-Lなどといった基への結合点として機能することができる。
架橋官能基A-L又はその適当な前駆体（-（CH2）q-NH2又は-（CH2）q-Y基など；YはNH2などの求核基で終わる）を保持するヌクレオシド又はヌクレオチドを製造した後、さらに、当該分野の技術水準に従って、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造を進めることができる。したがって、オリゴヌクレオチドを製造するには、そのヌクレオシド又はヌクレオチド上に保護基を導入し、オリゴヌクレオチド合成で使用するためにその化合物を活性化する。保護活性型への変換は、いくつかの総説で2’-デオキシヌクレオシドについて詳細に記述されている手法に従って行なうことができる。Sonveaux, Bioorganic Chemistry, 14:274-325（1986）；Jones,「Oligonucleotide Synthesis, a Practical Approach」M.J. Gait編，IRL Press, 23-34頁（1984）を参照のこと。
この活性化ヌクレオチドは、DNAヌクレオチド及びRNAヌクレオチドの場合と類似の方法でオリゴヌクレオチドに組込まれ、正しいヌクレオチドが順番に連結されて標的DNA又はRNA中のヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチドを鎖を形成する。ヌクレオチドは酵素的に組込んでもよいし、化学合成によって組込んでもよい。「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」（上記）に記載の手法に従って、ヌクレオチドを、その5’-O-ジメトキシトリチル-3’-（N,N-ジイソプロピル）ホスホルアミダイトシアノエチルエステル誘導体に変換し、合成オリゴヌクレオチドに組込んでもよい。次に、そのN-保護基を他のオリゴヌクレオチド遮断基と共に、合成後アミノリシスによって、当該技術分野で広く知られる手法で除去する。
好ましい態様として、本活性化ヌクレオチドを自動DNA合成装置で、使用する合成装置の手法と指示に従って直接使用してもよい。本オリゴヌクレオチドは、標準的な市販のホスホルアミダイト又はH-ホスホン酸化学を用いる合成装置で製造できる。
ハロアシル基や-CO-（CH2）m-（X）n-N（R1）-（CH2）p-L基（さらに好ましくはCO-（CH2）3-C6H4-N[CH2CH2Cl]2）のような脱離基を含有する部分は、オリゴヌクレオチドへの組込みと遮断基の除去後に、アミノアルキルなどのテール（-CH2）q-Y）に付加することができる。
架橋剤（A-L部分）を、例えば式-（CH2）q-Y（Yはアミンで終わる）のアルキルアミン結合によって、オリゴヌクレオチドの3’又は5’末端に結合する場合は、オリゴヌクレオチド合成を行なって先ず該アミノアルキルテールを持つオリゴヌクレオチドを得た後、それに上記ハロアシル基や-CO-（CH2）m-（X）n-N（R1）-（CH2）p-Lなどのアルキル化部分を導入することができる。
ヌクレオチド塩基の1つに結合した架橋剤を持つODN-MGB複合体の典型的な好ましい態様は、次式によって示される：
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（下線を付した記号「U」（この50マー中26番目のヌクレオチド単位）は、アミノ基に結合したクロラムブシル残基を持つ5-（3-アミノプロピル）-2’-デオキシウリジンを表す）。記号「CDPI3」は、反応式1に関して後述する小溝結合物質部分を表す。この5-（3-アミノプロピル）-2’-デオキシウリジン成分は、Gibson, K.J.及びBenkovic, S.J.（1987）Nucleic Acids Res. 15, 6455の手法に従い、5’-O-トリチル-5-トリフルオロアセタミドプロピル-2’-デオキシウリジン3’-（N,N-ジイソプロピル-シアノエチル-ホスホルアミダイトを用いて、ODNに組込まれる。クロラムブシル残基と小溝結合物質部分は、下記実験項に記述するようにODNに導入される。
小溝結合物質部分とODN-MGB複合体の合成
本発明の小溝結合物質部分の現在最も好ましい態様は、1,2-ジヒドロ-3H-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボン酸（CDPI）から、並びに4-アミノ-N-メチルピロール-2-カルボン酸から誘導される「オリゴペプチド」である。これらは、それぞれ式2及び式4に示す構造の繰り返し単位を持つ合成ペプチドであり、そのペプチドの重合度（m）は好ましくは3から5まで、最も好ましくは式2のペプチドについて5、式4のペプチドについて3である。反応式1は、「CDPI3」と略記される特殊なトリペプチドの製造法を開示している。次いで、このトリペプチドを、わずかな修飾を加えて若しくは修飾することなく、ODNにカップリングすることにより、本発明ODN-MGBの好ましい態様を得ることができる。
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【反応式１】
従って、反応式１を参照すると、この合成反応式における出発物質は、化学文献（D.L.Boger,R.S.Coleman、およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）によって製造することができる３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸または３−ｔ−ブチルオキシカルボニル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸である。出発化合物は、トリフルオロ酢酸のテトラフルオロフェニルエステルで処理することによって、活性エステルに変換される（ＴＦＰ−ＴＦＡ）。反応式に示される化合物１ａにおいては、Ｒ基はＣＯＮＨ2であり、１ｂにおいては、Ｒはｔ−ブチルオキシカルボニル（tＢｏｃ）である。ｔ−ブチルオキシカルボニル（tＢｏｃ）基は、酸によって除去することができるアミノ官能基の既知の保護基である。得られる活性エステル１ａおよび１ｂを、メチル  １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレート（これも化学文献によって得られる。D.L.Boger,R.S.Coleman、およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530を参照）と反応させて、「ダイマー」ペプチド化合物２ａおよび２ｃを得る。カルボキシル官能基のメチル基を、塩基で処理することによって除去して、カルボン酸基が遊離している「ダイマー」ペプチドを得る。このダイマーを再び活性化して、テトラフルオロフェノールで活性エステルを形成する（Ｒ＝ＣＯＮＨ2、ＴＦＰ−ＣＤＰＩ2のとき２ｅ；および、Ｒ＝tＢｏｃ、ＴＦＰ−tＢｏｃ−ＣＤＰＩ2のとき２ｆ）。ＴＦＰ−ＴＦＡで活性化した後に、ダイマーの活性エステルを、対応するトリマーに関して下記に記載するように、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を形成するのに使用することができる。ダイマーペプチドの活性エステルは、メチル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレートのさらに別の分子と反応して、そのカルボン酸官能基がメチルエステルとして保護されている「トリマーペプチド」、３ａ（メチル３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートトリマー）を形成することもできる。塩基で処理することによってメチル基を除去し、得られる「トリマーペプチド」３ｂを、活性テトラフルオロフェニルエステル３ｃ、（２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートトリマー、ＴＦＰ−ＣＤＰＩ3）に再び変換する。活性テトラフルオロフェニルエステル３ｃを用いて、メチル  １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレートとの反応の段階を繰り返し、得られるメチルエステルを鹸化し、および所望であれば、ＴＦＰ−ＴＦＡと再び反応させて、４ＣＤＰＩ成分を組み込むペプチドの活性テトラフルオロフェニルエステルを形成することによって、ペプチド鎖をさらに長くすることができる。容易に理解されるように、これらの段階は、所望の数のＣＤＰＩ成分がペプチドに含まれるまで、さらに繰り返すことができる。本明細書に記載の好ましい具体例においては、ＯＤＮと結合してＯＤＮ−ＭＧＢを形成するために、または反応式４および５に関して下記に記載のように、適切な改質制御孔ガラス（ＣＰＧ）���体サポート（asuitable modified controlled pore glass（CPG）solid suport）においてＯＤＮ−ＭＧＢを合成するために、トリペプチド３ｃの活性テトラフルオロフェニルエステル（ＴＦＰ−ＣＤＰＩ3）が使用される。反応式１は、その最後の段階として、トリペプチド３ｃの活性テトラフルオロフェニルエステル（ＴＦＰ−ＣＤＰＩ3）からの、ヒドロキシプロピルアミド誘導体の製造を示している。トリペプチド３ｄのヒドロキシルプロピルアミド誘導体（３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシ］−１−アミド−３−プロパノールトリマー、ＣＤＰＩ3−３−ヒドロキシプロピルアミド）を、ＯＤＮとの結合に用いて、本発明のＯＤＮ−ＭＧＢを得ることができる。しかし、トリペプチド３ｄは、下記に記載される結合試験において、対照標準として、「フリースタンディング」小溝結合物質分子（”free standing”minor groove binder molecule）としても用いられた。
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【反応式２】
反応式２を参照すると、小溝結合物質ペプチドの他の好ましい具体例の合成が示されており、ここで、「モノマー」は４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸の残基であり、この具体例はジアゾベンゼン成分を含有するリポーター基も担持している。従って、この反応式によって、６−［（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ヘキサン酸が、Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下に、２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エタノールと縮合して、（２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル５−［（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート、１１）を形成する。tＢｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することによって化合物１１から除去し、結果として得られる遊離アミノ官能基を有する化合物を、tＢｏｃ保護４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸の活性エステルと反応させる。前記活性エステル化合物（１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレート）は、L.Grehn,V.Ragnarsson,J.Org.Chem.,1981,46,3492-3497に記載の方法によって得られる１−メチル−４−［ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピロール−２−カルボン酸から形成される。得られる２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル  ５−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート、１２は、ジアゾベンゼン成分を担持するリポーター基に結合した「２−アミノ−Ｎ−メチルピロールカルボン酸」残基のモノマーの１単位を有する。トリフルオロ酢酸を用いてtＢｏｃ保護基を除去した後、所望の数のモノマー残基を含有するペプチドが得られるまで、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレートの１分子またはそれ以上との結合を行うことができる。ｎ個のモノマーおよび遊離アミノ基を有するそのような化合物が、反応式２に１６ａとして示されている。化合物１６ａを、tＢｏｃ保護６−アミノヘキサン酸の活性エステル（例えば、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル活性エステル）と反応させて、反応式２において化合物１６ｂとして示されるオリゴペプチドを得ることができる。tＢｏｃ保護基は、酸性条件下において前記化合物から除去することができ、結果として得られる遊離アミノ官能基を有する誘導体を、従来の合成法によって、ＯＤＮの３’−ホスフェートまたは５’−ホスフェート末端のどちらかに結合させることができる。または、下記に示すような種々の二官能価の結合基を用いて、遊離アミノ官能基を有する誘導体を、オリゴヌクレオチドの３’または５’−ＯＨ末端に結合させることもできる。
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【反応式３】
反応式３を参照すると、３’−アミノ末端または５’−アミノ末端ＯＤＮと、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルで活性化された例示的小溝結合オリゴペプチドとを結合させる一般的方法が示されている。この反応式は、反応式１によって得られるＴＦＰで活性化された例示的小溝結合化合物の使用を示しているが、この一般的方法は、他のＴＦＰ活性化小溝結合化合物とＯＤＮとの結合にも適している。反応式３における１ａ〜３ｃの符号は、反応式１によって得られる例示的化合物を意味している。
３’−または５’−アミノ末端ＯＤＮは、従来法によって合成することができ、例えば、商業的入手可能なＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキシルホスホロアミダイト（N-monomethoxytritylaminohexyl phosphoramidite）を用いることによって、ＯＤＮのどちらかの末端にアミノヘキシル残基を結合させることができる。または、すでに許可され登録料が支払われた１９９３年７月１２日出願の出願第０８/０９０４０８号に記載の方法によって、アミノ末端ＯＤＮを合成することもできる。出願第０８/０９０４０８号に記載の内容は、本発明の開示の一部を構成するものとする。この反応式によればアミノ末端ＯＤＮがセチルトリメチルアンモニウム塩に変換されて、それを有機溶媒中において可溶性にし、テトラフルオロフェニルエステル活性小溝結合物質分子が、好ましくは溶媒としてのＤＭＳＯ中で、それと縮合する。
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【反応式４】
反応式４は、小溝結合物質分子の活性エステルを、５’−アミノ末端ＯＤＮに結合させる他の方法を開示している。この反応式に示されている例は、３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸残基から誘導されるトリペプチドのＴＦＰエステル（ＴＦＰ−ＣＤＰＩ3）の例であるが、本反応式に関して開示されている一般原理は、他の小溝結合物質分子にも用いることができると理解すべきである。この方法においては、ＯＤＮがなおＣＰＧサポートに結合しており、その「アミノ末端」に遊離アミノ基を有している。これは、前記のＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキシルホスホロアミダイトを用いることによって得られる。モノメトキシトリチル基が、ホスホロアミダイトが結合した後に除去されて、所望のＣＰＧ担持「アミノ末端ＯＤＮ」を得る。または、そのようなＣＰＧ−は、前記出願第０８/０９０４０８号の開示およびその中の引用文献に従って得ることができる。簡単に言えば、ＯＤＮが、段階的に合成されてＣＰＧに結合され、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護されたアミノ基を有する末端を有する。ヌクレオチドの所望の配列が形成された後に、ＯＤＮはなおＣＰＧサポートに結合しているままにして、Ｆｍｏｃ基をアミノ基から除去する。本発明の反応式４によって、遊離アミノ基を有するこの「ＣＰＧ担持アミノ末端ＯＤＮ」を、活性エステル（ＴＦＰ−ＣＤＰＩ3、３ｃ）、または小溝結合物質の同様の活性形と、縮合させる。その後、ＯＤＢ−ＭＧＢ複合体を、従来法によって、最も好ましくはアンモニアでの処理によって、ＣＰＧサポートから除去する。
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【反応式５】
反応式５は、本発明のＯＤＮ−ＭＧＢを製造する他の好ましい方法を示している。特に、反応式５は、初めに結合分子をＣＰＧサポートに結合させ、その後に小溝結合物質の活性形態を結合分子に結合させ、その後に前記改質ＣＰＧサポートを用いて、自動ＯＤＮ合成装置中で所望配列のＯＤＮを段階的に形成することによって、ＯＤＮ−ＭＧＢを製造する好ましい合成方法を示している。ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、所望の配列のＯＤＮ成分が形成された後にのみ、ＣＰＧサポートから除去される。この場合の結合分子は、各官能基が異なる反応性を有する三官能価分子であり、これによって、結合分子の異なる官能価をそれぞれ用いる、ＣＰＧへの結合、小溝結合物質成分の活性形態との反応、およびＯＤＮ部分の形成が可能となる。この合成方法およびこの方法において用いられる三官能価結合分子についてのより一般的および詳細な説明が、出願第０８/０９０４０８号に開示されているが、小溝結合物質に関しては何らの記載もされていない。反応式５は、三官能価結合分子としてのβ−アラニリル−３−アミノ−１,２−プロパンジオール、および小溝結合物質の活性形態としてのＴＦＰ−ＣＤＰＩ3（化合物３ｃ）の例を用いて、この合成法を例示している。
従って、反応式５によれば、Ｆｍｏｃ保護β−アラニンが、テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（ＴＦＰ−ＴＦＡ）と反応して、２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）］アミノプロピオネート（４）を得る。活性エステル４が、３−アミノ−１,２−プロパンジオールと反応して、１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２,３−プロパンジオール（５）を得る。その後に５の第一ヒドロキシル基が、ジメトキシトリチル基で保護されて、１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２−［［ビス（メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル］−２−エタノール（６）が得られる。化合物６の第二ヒドロキシル基が無水琥珀酸と反応し、その後、得られる化合物のカルボキシル基が、活性エステル、２,３,５,６−テトロフルオロフェニル  １−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ, Ｓ）−２−［［ビス（メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル］−２−エチルブタンジオエート（７）に変換される。化合物７を次に、商業的入手可能であり、前記出願第０８/０９０４０８号に記載の、長鎖アミノアルキル制御孔ガラスサポート（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、またはアルキルアミンＣＰＧ）に結合させる。得られる「改質ＣＰＧ」は、反応式５において化合物８として示されている。緩塩基（ジメチルホルムアミド中のピペリジン）で処理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を８から除去して、結合分子の一部として遊離第一級アミン官能基を有する「改質ＣＰＧ」９を得る。次の段階において、活性小溝結合物質分子、この場合はＴＦＰ−ＣＤＰＩ3（化合物３ｃ）を、９の第一級アミン官能基と反応させて、小溝結合物質成分を含み、ジメトキシトリチル基で保護された結合基の第一ヒドロキシル基をなお有している改質ＣＰＧ１０を得る。反応式５には示されていないが、次の段階で、ジメトキシトリチル基を除去し、現在この分野において慣習的であると考えられている段階によって、ＯＤＮ合成を自動合成装置中で行う。合成が終了したら、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を、アンモニアでの処理によって、ＣＰＧサポートから除去する。前記段階は、３−アミノ−１,２−プロパンジオール成分の第二ヒドロキシル基をＣＰＧサポートに結合させている結合を開裂させる。
生物学的試験および考察
ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体が、一本鎖ＤＮＡに結合する。それらはリコンビナーゼ酵素（recombinaze enzyme）の存在下に二本鎖ＤＮＡにも結合し、ある場合には、一本鎖ＲＮＡならびにＤＮＡおよびＲＮＡハイブリッドにも結合する。しかし、ＯＤＮ成分が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列に対して、相補的である、またはWatson-Crick意義において実質的に相補的である場合にのみ、結合が起こる。この条件が満たされるとき、ＯＤＮ−ＭＧＢの標的配列への結合は、同じＯＤＮの小溝結合物質なしの結合よりも、かなり強い。前述のことは、下記に記載の試験によって明らかにされ、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のための分析的および診断的ハイブリッド形成ブローブとしての、および治療的アンチセンス（antisense）およびアンチジーン（anchi-gene）用途においての、本発明のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体の有用性を与えるものである。
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表１は、４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基から誘導される小溝結合物質成分を有する相補的オリゴヌクレオチドから形成されるいくつかの複合体の溶融温度を示す。小溝結合物質成分は特に、表１の下の式によってラジカルＸとして示されている。ラジカルＸが、６−アミノヘキサン酸から誘導される結合成分をも含むことに注意すべきである。ここで使用されるオリゴヌクレオチドは、２’−デオキシアデニル酸の８−マー、およびチミジル酸の８−マーである。小溝結合物質Ｘを、３’−ホスフェート末端においてＯＤＮに結合させ、これらのＯＤＮの５’−末端はホスフェートを有していない。これに関して、ＯＤＮが、これらおよび他の表において、この分野において慣習的な方法で、略されていることに注意すべきである。基Ｙは、「β−アラニン」結合成分を介して、３’−ホスフェートに結合したエチジウムブロミド成分を表す。Ｙ基は、挿入基（intercalating group）を表し、小溝結合基との比較のための対照標準としての役割を持つ。記号ｍは、表の各ＯＤＮ−ＭＧＢ中に存在する４−アミノ−Ｎ−メチル−ピロール−２−カルボン酸残基の数を表す。
この分野において既知であるように、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド二本鎖の溶融温度（Ｔm）は、それぞれのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの５０％がその二本鎖、Watson Crick水素結合形から解離する温度であると意義される。溶融温度（Ｔm）が高ければ高いほど、より安定な二本鎖を意味する。既知であるように、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの溶融温度は、溶融温度が測定される溶液中のヌクレオチドの濃度に依存し、より高い濃度は、より高い測定溶融温度となる。これらの表に示されている溶融温度は、表および試験部門に示されている条件下で測定された。ΔＴmは、小溝結合物質成分を有さない（ｄＡｐ）8・（ｄＴｐ）8複合体の溶融温度に対する、改質二本鎖の溶融温度の変化を表す。
表１から分かるように、共有結合小溝結合物質成分は、基Ｘ（小溝結合物質成分）が（ｄＴｐ）8または（ｄＡｐ）8オリゴヌクレオチドのどちらに結合していても、複合体の安定性（溶融温度Ｔm）を顕著に増加させる。この場合、最大安定性（最高溶融温度）は、小溝結合物質成分が、５−マーオリゴペプチドであるときに得られる。挿入基Ｙが（ｄＡｐ）8オリゴマーに結合される比較試験においては、比較的かなり低い程度の安定性が得られる。この試験において、挿入基Ｙをオリゴマーの２本の鎖のそれぞれに結合させても、５個の４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基を有する小溝結合物質成分よりも少なく溶融温度を上昇させる。
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表２は、表１と同様の情報を示している。この表に示されている試験においては、Ｘ（Ｘは表１と同様である）によって表される小溝結合物質成分を有するチミジル酸の１６−マーＯＤＮが、ポリデオキシリボアデニル酸と複合された。比較対照標準として、その３’−ホスフェート末端において６−アミノヘキサン酸に結合したチミジル酸の１６マーＯＤＮ（ｄＴｐ）16も試験した。さらに、チミジル酸の８−マー（ｄＴｐ）８、および種々のペプチド長さの小溝結合物質とそれとの複合体も試験した。これらの試験においても、ＯＤＮに結合した小溝結合物質が、ＯＤＮ−ＭＧＢと相補ＤＮＡ鎖との間の複合の有意な安定を生じさせる。最大の安定化は、小溝結合物質成分中の４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基の数が５である場合に生じる。これと対照的に、１６−マーＯＤＮ上のアミノヘキサン酸末端は、事実上、複合体の安定化を生じさせない。
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表３は、オリゴヌクレオチドが、表に示されているように、５’−ホスフェートまたは３’−ホスフェート末端のどちらかにおいて、それに結合している小溝結合物質成分を有するチミジル酸の８−マーである試験における、溶融温度（Ｔm）および溶融温度の変化（ΔＴm）のデータを示している。この表においてＸおよびＹで表されている小溝結合物質成分は、１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸の残基に基づく「オリゴペプチド」であり（ＣＤＰＩまたはＢｏｃＤＰＩ）、それらの構造が表に示されている。これらの小溝結合オリゴペプチドは、結合成分「Ｌ１またはＬ２」を介してＯＤＮに結合し、それらの構造も表の下に示されている。ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を、相補的リボまたはデオキシリボホモポリマーで培養した。従って、チミジル酸のＯＤＮを含んで成るＯＤＮ−ＭＧＢ複合体に関しては、ポリＡまたはポリ−ｄＡが使用された。溶融温度の変化（ΔＴm）が、ＯＤＮの対応する末端において対応する結合基Ｌ１またはＬ２を担持するが、小溝結合成分は担持していないＯＤＮとの複合体に比較して、示されている。表３から分かるように、これらのＯＤＮ−ＭＧＢ複合体もまた、相補的デオキシリボホモポリマーとの複合体の顕著な安定化を示し、最大安定化は、小溝結合成分が３ＣＤＰＩ単位を有する試験において生じる。驚くべきことに、複合体の安定化は、ＯＤＮ−ＭＧＢが相補的リボホモポリマーで培養される場合でさえも生じる。先行技術において、フリースタンディング（free standing）小溝結合分子がＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに結合しないことが一般に観察されているので、このことは驚くべきことである。
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表４は、２つの相補的オクタマー：ＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴおよびＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧの誘導体間の二本鎖形成の試験結果を示す。各オクタマーを表に示すように改質し、それによって、対応するオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート主鎖を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの、ハイブリッド形成について試験した。ＯＤＮは、構造Ｌ１またはＬ２（Ｘ、Ｌ１およびＬ２は表３と同様）の結合基を介して、３’または５’末端（示されている）のどちらかに結合した１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（ＣＤＰＩ）の残基に基づくトリペプチドも有していた。対照標準として、ＯＤＮが結合基のみを担持している二本鎖に関しても溶融温度求めた。表から分かるように、二本鎖は、小溝結合物質成分の存在によって顕著に安定化され、二本鎖の各鎖が共有結合した小溝結合物質を有する場合に、より高い安定性が生じる。
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表５は、相補的または「準相補的（quasi complementary）」ＯＤＮ−ＭＧＢを培養して、二本鎖形成に関して試験した場合に得られた溶融温度を示している。予想されるように、鎖中でグアニンがイノシン（Ｉ）と置き換えられる場合に、小溝結合成分が存在しなければ、二本鎖の結合は非常に弱い（Ｔmが約０℃である）。しかし、オリゴヌクレオチド中で、グアニンがイノシンで置き換えられる場合に、１つの共有結合小溝結合物質Ｘがハイブリッドをほぼ５０℃安定化させ、逆平行配向の２つのそのような小溝結合物質の存在は、６３℃の安定化を与えた。同じ鎖がグアニンを含む場合、１つの小溝結合物質はＴmを１５℃増加させ、一方、２つの場合にはほぼ４５℃増加させる。本発明の発明者らの知識によれば、８−マーに関して８１℃のＴmは、先行技術においては前例のないものである。
プライマー延長実験
ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体のＯＤＮ部分の、Watson-Crick意義における配列特異性が、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を標的配列に複合させるのに必要であることが、プライマー延長実験において示された。この実験において、鋳型鎖の５’末端から作用する酵素Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマー延長が生じる。Watson Crick意義において鋳型ストランド上の標的配列に相補的な１６−マーＯＤＮ−ＭＧＢを、長い一本鎖ＤＮＡ鋳型およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ酵素で培養した。プライマー延長の封鎖は、小溝結合成分が１６−マーＯＤＮの５’末端上にあった場合に、ＯＤＮ−ＭＧＢとの結合部位において、確認された。小溝結合物質は、本明細書の表５に示されるピロロインドールトリペプチドであった。１６−マーの配列特異性において、標的への単一不適正があった場合、プライマー延長は封鎖されなかった。小溝結合物質成分が１６−マーの３’末端に結合された場合にも、プライマー延長は封鎖されなかった。配列特異的１６−マーおよび遊離小溝結合物質分子（化合物３ｄ、ＯＤＮに共有結合していない）が、鋳型および酵素を用いて培養された場合にも、プライマー延長は封鎖されなかった。これらの実験は、ＯＤＮ−ＭＧＢの配列特異性が複合体形成に重要であること、および小溝結合成分が、付随（appended）ＯＤＮを他の鎖に非特異的に結合させる「アンカー」として単に作用するだけではないということを示している。プライマー延長を阻止するＯＤＮ−ＭＧＢ複合体の性能は、これらの複合体を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）クランピング剤として診断的に使用できることを示している（Nucleic Acid Research（1993）21:5332-5336を参照）。
スロット−ブロット（Slot-blot）ハイブリッド形成分析
本発明のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、ハイブリッド形成ブローブとして有用である。このことは、32ｐ−標識ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を診断プローブとして使用する下記実験の記載によって示される。共有結合小溝結合物質（ＭＧＢ）成分を有さない同じＯＤＮと比較した場合、この複合体は、より優れた、強さ、効率、および特異性をもって、その補体にハイブリッド形成する。スロットーブロットハイブリッド形成分析は、幅広く用いられているＤＮＡブローブ診断分析であり、これらのＭＧＢ−ＯＤＮ複合体の特性が、分析の性能を向上させる。
特に、本明細書に記載されている実験においては、Protocols for Nucleic Acid Blotting and Hybridization,1988,Amersham,United Kingdomに記載のように、標準プロトコールを後に続けた。固定化プラスミドにハイブリッド形成した標識試験ＯＤＮを、１分当たりの計数（cpm）として定量し、ハイブリッド形成の温度に対してプロットした。Ｍ１３ｍｐ１９ ＤＮＡ（ファージＤＮＡ）に対して相補的な４つの１６−マーブローブを評価した。これらのプローブのうちの２つは、ファージＤＮＡにおける部位に対して完全に相補的であり；これらのうちの１つは、３’−結合ＣＤＰＩ3成分を含有し、他の１つは未改質であった。プローブの第二の組は、Ｍ１３ｍｐ１９ ＤＮＡにおける同じ部位に対して標的とされたが、それぞれが単一不適正を含んでいた（図１において下線が付されている）。ここでもまた、１つのＯＤＮは、ＣＤＰＩ3に３’−結合であったが、他方は未改質であった。
スロットハイブリッド形成試験の結果を図１に示す。未改質であるがそれ以外は同一である１６−マーと比較して、ＣＤＰＩ3含有プローブは、３３℃のみに対して５０℃の溶融温度（Ｔm）でハイブリッドを形成した。このより高い溶融温度は、完全な適正のハイブリッドの収量を２倍以上にした。不適正がどちらかのプローブに導入されると、それぞれのハイブリッドの安定性が低下した。ＣＤＰＩ3−改質ブローブは、３７℃〜５０℃の間の良好な配列識別を示した。さらに、ここで使用したバイブリッド形成条件下において、Ｍ１３ｍｐ１９ ＤＮＡ標的における先存する二本鎖領域への、ＣＤＰＩ3成分の結合の形跡はなく、このことは、これらの複合体の完全に非特異的な結合が存在しないことを示すものである。
培養ヒト細胞中の遺伝子の配列特異的アルキル化
共有結合アルキル化剤をも担持する本発明のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体が標的遺伝子中の標的配列に相補的であることを条件として、望ましくない（疾患を引き起こす）遺伝子の発現の抑制のための「抗遺伝子（アンチジーン）」剤として使用することができる。そのような場合に、ＭＧＢ成分が二本鎖遺伝子への結合を向上させ（リコンビナーゼ酵素の存在下）、アルキル化成分が、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体の標的配列への永久的な共有結合を生じるさせる。
例示的実験として、ＣＤＰＩ3基で３’−末端改質され、ナイトロジェンマスタード基（chlorambucil）で内部的に改質された前記５０−マーＯＤＮを、生体ヒトＢＳＭ細胞（ヒトＢ−リンパ球細胞系）に存在する標的遺伝子（ＨＬＡ ＤＱ β１ ０３０２対立遺伝子）中の期待部位に、配列特異的に架橋した。ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を、最終濃度１−５０μＭでＢＳＭ細胞の懸濁液に加えた。３.５時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、熱ピロリジンで処理して、アルキル化事象（alkylation events）をニックに変換した。次に、０３０２対立遺伝子の標的領域を、単一塩基分解（single-base resolution）において開裂事象を検出するために使用できる方法であるＬＭ−ＰＣＲ（連結反応媒介ポリメラーゼ鎖反応（ligation mediated polymerase chain reaction））によっで増幅した。配列ゲル上の生成物の分析は、改質ＯＤＮが、標的部位に結合し、標的部位をアルキル化したことを示した。ＣＤＰＩ3基を欠いた同様のＯＤＮは、標的のアルキル化効率がかなり劣っていた。
前記実験において、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体の認識および相同的二本鎖ＤＮＡへの結合を、核リコンビナーゼの助けによって起こすことも可能である。同様の実験および用途において、内因性リコンビナーゼ酵素（endogenous recombinaze enzymes）が、他の生体細胞中における、ＯＤＮ−ＣＤＰＩ3複合体による２本鎖ゲノムＤＮＡの配列特異的ターゲッティングを、触媒することができる。これらのＯＤＮは付随する（appended）架橋剤を有し、それらは標的ＤＮＡをアルキル化することができる。リコンビナーゼの存在下に形成されるＤ−ループを安定化することによって、ＣＤＰＩ3が架橋反応を促進する。この架橋事象は、標的遺伝子の発現の強力なインヒビターである。従って、架橋ＯＤＮ−ＣＤＰＩ3複合体を、抗遺伝子剤として使用することができる。
特定の具体例、実験部門
一般的実験
全ての空気および水感受性反応をアルゴンの微量正圧下で行った。無水溶媒をAldrich（Milwaukee, WI）から入手した。フラッシュクロマトグラフィーは、２３０−４００メッシュシリカゲル上で行った。融点は、開放毛管中のMel-Temp融点装置で測定し、修正されてない。元素分析はQuantitative Technologies Inc.（Boundbrook, NJ）によって行った。ＵＶ可視吸収スペクトルは、２００〜４００ｎｍの範囲において、UV-2100（Shimadzu）またはLambda 2（Perkin Elmer）分光光度計によって記録した。1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Bruker WP-200またはVarian XL-200分光光度計で２０℃で行った；化学シフトはＭｅ4Ｓｉからのppmダウンフィールドで示す。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート （１ａ）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１０mmol、H.B.Gamper,N.W.Reed,T.Cox,J.S.Virosco,A.D.Adams,A.A.Gall,J.K.SchollerおよびR.B.Meyer,Jr.Nucleic Acids Res.,1993,Vol.21,No.1,145-150）を、無水ＤＭＦ１５ｍＬ中の３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（１.４ｇ、６.１mmol、D.L.Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）およびトリエチルアミン（１.４ｍＬ、１０mmol）の溶液に滴下した。１時間後、反応混合物を真空下に濃縮した（０.２mm）。残留物を乾燥ジクロロメタン２ｍＬですり砕いた。エチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、混合物を０℃で一夜置いた。沈殿物を、焼結ガラス漏斗で濾過することによって集め、初めに５０％エーテル/ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）、次にエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥した。生成物を黄色固形物として得た（１.８ｇ、７５％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6 ２００ＭＨｚ,ppm）１２.３２（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.１３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、８.０１（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、７.４１（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、７.２６（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、６.１７（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ2）、３.９９（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.３０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）。
分析、Ｃ18Ｈ11Ｎ3Ｏ3Ｆ4ｘ２Ｈ2Ｏの計算値：Ｃ、５０.３；Ｈ、３.５２；Ｎ、９.７。実測値：Ｃ、５０.８１；Ｈ、３.６０；Ｎ、９.９５。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート （１ｂ）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１０mmol）を、無水ＣＨ2Ｃｌ2１０ｍＬ中の３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（１.０ｇ、３.７mmol、D.L.Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）およびトリエチルアミン（１.５ｍＬ、１０mmol）の溶液に滴下した。４時間後、ＣＨ2Ｃｌ2を減圧下に留去した。フラッシュクロマトグラフィー（４ｘ２０ｃｍ、ヘキサン−酢酸エチル、１：２）にかけて、１ｂを黄色結晶質固形物として得た（１.２５ｇ、７５％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6 ２００ＭＨｚ,ppm）１２.３９（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.４Ｈｚ,ＮＨ）、８.０２（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、７.９（ｂｒ ｓ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.４５（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.４Ｈｚ,Ｃ８−Ｈ）、７.３３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、４.０２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.２６（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、１.５１（ｓ,９Ｈ,Ｃ（ＣＨ3）3）。
分析、Ｃ22Ｈ18Ｎ2Ｏ4Ｆ4の計算値：Ｃ、５８.６７；Ｈ、４.０３；Ｎ、６.２２。実測値：Ｃ、５８.４５；Ｈ、４.０９；Ｎ、６.１３。
３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸ダイマーメチルエステル（２ａ）。
無水ＤＭＦ１０ｍＬ中の、メチル  １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレート（０.６ｇ、１.５mmol）、１ａ（０.４５ｇ、２.２５mmol）、およびトリエチルアミン（０.２ｍＬ、１.４mmol）の溶液を、室温で２４時間、次に０℃で１２時間で培養した。得られる不溶性固形物を濾過によって集め、ＤＭＦ（１０ｍＬ）およびエーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。真空乾燥によって２ａ（０.６１ｇ、９１％）を淡黄色固形物として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6、２００ＭＨｚ、ppm）１２.００（ｓ,１Ｈ,Ｊ＝１.８Ｈｚ,ＮＨ’）、１１.５４（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.２８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４’−Ｈ）、７.９７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.３３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９ｚ,Ｃ５’−Ｈ）、７.２２（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９ｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.４Ｈｚ,Ｃ８’−Ｈ）、
６.９４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.１Ｈｚ,Ｃ８−Ｈ）、６.０１（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ2）、４.６２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ、（ＮＨ2ＣＨ2）’）、３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.８８（ｓ,３Ｈ,ＣＨ3）、３.４１（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.２９（ｔ,２Ｈ,ＮＣＨ2ＣＨ2,部分的に水によって曇っている）。
分析、Ｃ24Ｈ21Ｎ5０5ｘ１Ｈ2０ｘ１ＤＭＦの計算値：Ｃ、５８.６９；Ｈ、５.８４；Ｎ、１５.２１。実測値：Ｃ、５８.９３；Ｈ、５.７５；Ｎ、１５.８２。
３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸ダイマーメチルエステル（２ｃ）。
無水ＤＭＦ１０ｍＬ中の、メチル  １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレート（０.５ｇ、２.５mmol）、１ｂ（１.０ｇ、２.２mmol）、およびトリエチルアミン（０.１ｍＬ、０.７mmol）の溶液を、室温で１０時間、および０℃で１２時間培養した。得られる不溶性固形物を濾過によって集め、ＤＭＦ（５ｍＬ）およびエーテル（４０ｍＬ）で洗浄した。真空乾燥によって２ｃ（０.８１ｇ、７４％）を灰色がかった白色の固形物として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6、２００ＭＨｚ、ppm）１２.０１（ｓ,１Ｈ,ＮＨ’）、１１.６４（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.２８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４’−Ｈ）、７.８（ｂｒ ｓ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.３２（明白なｔ,２Ｈ,Ｃ５’−Ｈ＋Ｃ５−Ｈ）、７.１３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.１Ｊｚ、Ｃ８’−Ｈ）、６.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.１Ｈｚ,Ｃ８−Ｈ）、４.６２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＨ2ＣＨ2）’）、４.０２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.８８（ｓ,３Ｈ,ＣＨ3）、３.４１（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.２５（ｔ,２Ｈ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、１.５２（ｓ,９Ｈ,Ｃ（ＣＨ3））。
分析、Ｃ28Ｈ28Ｎ4Ｏ5の計算値：Ｃ、６７.１９；Ｈ、５.６４；Ｎ、１１.１９。実測値：Ｃ、６６.７２；Ｈ、５.６９；Ｎ、１１.３１。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートダイマー（２ｅ）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１０mmol）を、無水ＤＭＦ１５ｍＬ中の２ｂの懸濁液（１.２ｇ、２.８mmol、D.L.Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）に滴下した。トリエチルアミン（１.４ｍＬ、１０mmol）を加え、混合物を３時間攪拌した。回転蒸発器を用いて、混合物を真空濃縮した（０.２ｍｍ）。残留物を、乾燥ジクロロメタン２０ｍＬを用いてすり砕いた。得られる生成物を濾過し、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、エーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥して、２ｅを黄色固形物として得た（１.５ｇ、９３％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6 ２００ＭＨｚ,ppm）１２.５１（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.８Ｈｚ,ＮＨ’）、１１.５８（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.３９（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,Ｃ４’−Ｈ）、８.０４（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.５８（ｓ,１Ｈ,Ｃ８’）、７.４２（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ５’−Ｈ）、７.２２（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、６.９８（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１１（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ2）、４.６６（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝７.８Ｈｚ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.９４（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９.１Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.４７（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.２９（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９.１Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）。
分析、Ｃ29Ｈ19Ｎ5Ｏ4Ｆ4ｘ１.５Ｈ2Ｏの計算値：Ｃ、５７.６２；Ｈ、３.６７；Ｎ、１１.５９。実測値：Ｃ、５７.１８；Ｈ、３.３１；Ｎ、１１.５４。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートダイマー （２ｆ）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（０.７５ｇ、２.９mmol）を、無水ＣＨ2Ｃｌ2（８ｍＬ）とＤＭＦ（２ｍＬ）との混合物中の、２ｄ（０.２５ｇ、０.５mmol、D.L.Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）およびトリエチルアミン（０.５ｍＬ、３.５mmol）の懸濁液に滴下した。この混合物を２０時間攪拌した。得られる清澄な溶液を真空濃縮し、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７.５）４０ｍＬに滴下した。沈殿物を遠心分離にかけ、水（２ｘ４０ｍＬ）、エーテル中の１０％ＭｅＯＨ（２ｘ４０ｍＬ）、エーテル（４０ｍＬ）、およびヘキサン（４０ｍＬ）で洗浄した。最終的に、真空乾燥して２ｆを淡黄色固形物として得た（０.２９ｇ、９１％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6 ２００ＭＨｚ,ppm）１２.５１（ｓ,１Ｈ,ＮＨ’）、１１.６６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.３７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈｚ,Ｃ４’−Ｈ）、８.０３（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、７.８（ｂｒ ｓ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.５８（ｓ,１Ｈ,Ｃ８’−Ｈ）、７.４０（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.１Ｈｚ,Ｃ５’−Ｈ）、７.２７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.６Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、４.６５（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、４.０２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.４６（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.２５（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、１.５１（ｓ,９Ｈ,Ｃ（ＣＨ3）3）。
分析、Ｃ33Ｈ26Ｎ4Ｏ5Ｆ4ｘ０.５Ｈ2Ｏの計算値：Ｃ、６１.５９；Ｈ、４.２３；Ｎ、８.７１。実測値：Ｃ、６１.７３；Ｈ、４.１２；Ｎ,８.６１。
３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートトリマーメチルエステル（３ａ）。
無水ＤＭＦ１５ｍＬ中の、メチル  １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレート（１.０ｇ、５mmol）、２ｅ（１.２ｇ、２.１mmol）、およびトリエチルアミン（０.１ｍＬ、  mmol）の溶液を、室温で２４時間、および０℃で１２時間培養した。得られる不溶性固形物を濾過によって集め、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）、およびエーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。真空乾燥によって３ａ（１.１ｇ、８３％）を淡黄色固形物として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6、２００ＭＨｚ、ppm）１２.０２（ｓ,１Ｈ,ＮＨ”）、１１.７５（ｓ,１Ｈ,ＮＨ’）、１１.５６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.２８（明白なｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.３Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ”＋Ｃ４’−Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.４Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.３９−７.３３（２ｄ,２Ｈ,Ｃ５”−Ｈ＋Ｃ５’−Ｈ）、７.２３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.６Ｈｚ,Ｃ８”−Ｈ）、７.１０（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１Ｈｚ,Ｃ８’−Ｈ）、６.９７（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１１（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ2）、４.６５（ｔ,４Ｈ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）”＋（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.８８（ｓ,３Ｈ,ＣＨ3）、３.４８−３.２５（ｍ,６Ｈ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）”＋（ＮＣＨ2ＣＨ2）’＋ＮＣＨ2ＣＨ2部分的にＨ2Ｏによって曇っている）。
分析、Ｃ35Ｈ29Ｎ7Ｏ5ｘ４.５Ｈ2Ｏの計算値：Ｃ、５９.３２；Ｈ、５.０；Ｎ、１３.０３。実測値：Ｃ、５８.９；Ｎ、５.０６；Ｎ、１３.７７。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートトリマー（３ｃ）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１０mmol）を、無水ＤＭＦ１５ｍＬおよびトリエチルアミン（１.４ｍＬ、１０mmol）中の３ｂ（１.１ｇ、１.８mmol）の懸濁液に滴下した。この混合物を３時間攪拌した。混合物を真空濃縮した（０.２ｍｍ）。残留物を、乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）とメタノール（２ｍＬ）との混合物ですり砕いた。得られる生成物を濾過によって集め、ジクロロメタン（２０ｍＬ）、エーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥して、黄緑色固形物１.３ｇ（９５％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6 ２００ＭＨｚ,ppm）１２.５４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１Ｈｚ,ＮＨ”）、１１.７９（ｓ,１Ｈ,ＮＨ’）、１１.５６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.４１（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.３Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ”）、８.２７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.４Ｈｚ,Ｃ４’−Ｈ）、８.０３（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.５６（ｓ,１Ｈ,Ｃ８”−Ｈ）、７.４５−７.３５（ｍ,２Ｈ,Ｃ５”−Ｈ＋Ｃ５’−Ｈ）、７.２３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.２Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１３（ｓ,１Ｈ,Ｃ８’−Ｈ）、６.９７（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１１（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ2）、４.６５（ｍ,４Ｈ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）”＋（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.４５（ｍ,４Ｈ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）”＋（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.２５（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）。
分析、Ｃ40Ｈ27Ｎ7Ｏ5Ｆ4ｘ２Ｈ2Ｏの計算値：Ｃ、６１.５９；Ｈ、４.２３；Ｎ、８.７１。実測値：Ｃ、６１.７３；Ｈ、４.１２；Ｎ、８.６１。
［３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシ］−１−アミド−３−プロパノールトリマー （３ｄ）。
無水ＤＭＦ２.５ｍＬ中の、３−アミノ−１−プロパノール（７０μＬ、１.４mmol）、３ｃ（７５ｍｇ、０.１mmol）、およびトリエチルアミン（０.１ｍＬ、  mmol）の溶液を、室温で１０時間攪拌した。得られる不溶性固形物を濾過によって集め、ＤＭＦ（２ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）およびエーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。真空乾燥して３ｄ（５５ｍｇ、８９％）を淡黄色固形物として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ2ＳＯ−ｄ6 ２００ＭＨｚ,ppm）１１.７６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ”）、１１.６５（ｓ,１Ｈ,ＮＨ’）、１１.５７（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.４７（ｍ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、８.２４（ｍ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.９９（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.４Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.４０−７.３２（２ｄ,２Ｈ,Ｃ５”−Ｈ＋Ｃ５’−Ｈ）、７.２３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１２（ｓ,１Ｈ,Ｃ８”−Ｈ）、７.１０（ｓ,１Ｈ,Ｃ８’−Ｈ）、６.９９（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１２（ｓ,３Ｈ,ＣＯＮＨ2＋ＮＨＣＯ）、４.６６（ｔ,４Ｈ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）”＋（ＮＣＨ2ＣＨ2）’）、３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ2ＣＨ2）、３.５１−３.２５（ｍ,１０Ｈ,（ＮＣＨ2ＣＨ2）”＋（ＮＣＨ2ＣＨ2）’＋ＮＣＨ2ＣＨ2＋ＮＨＣＨ2＋ＣＨ2ＯＨ  部分的にＨ2Ｏによって曇っている）、１.７０（ｐ,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈｚ,ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  ３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）］アミノプロピオネート （４）。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１.７ｇ、６.５mmol）を、無水ＣＨ2Ｃｌ2２０ｍＬ中の、ＦＭＯＣ−アラニン（２.０ｇ、６.４mmol）およびトリエチルアミン（１.０ｍＬ、７mmol）の溶液に滴下した。１時間後、ＣＨ2Ｃｌ2を、回転蒸発器を用いて減圧下に蒸発によって除去し、３０ｍＬエチルアセテート/ヘキサン（１：１）中に再度溶解した。フラッシュクロマトグラフィー（４ｘ２０ｃｍ、ヘキサン/酢酸エチル、３：１）によって、４を白色固形物として得た。ヘキサン/酢酸エチルから再結晶して、４を白色結晶質固形物として得た（２.３ｇ、７８％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm）７.７３（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.１Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.７５（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.７Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.２４−７.４２（ｍ,４Ｈ,芳香族プロトン）、７.０１（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、５.２１（ｂｒ ｓ,１Ｈ,−ＣＯＮＨ−）、４.３８（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.１Ｈｚ,−ＣＨ2ＯＣＯ−）、４.２０（ｍ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.５８（ｍ,２Ｈ,ＮＣＨ2）、２.９３（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝５.４Ｈｚ,−ＣＨ2ＣＯ−）。
分析、Ｃ24Ｈ17ＮＯ4Ｆ4の計算値：Ｃ、６２.７５；Ｈ、３.７３；Ｎ、３.０５。実測値：Ｃ、６２.５２；Ｈ、３.５９；Ｎ、３.０１。
１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）］アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２,３−プロパンジオール （５）。
無水ＣＨ2Ｃｌ2２０ｍＬ中の４（２.０ｇ、４.３５mmol）の溶液を、１０ｍＬＭｅＯＨ中の３−アミノ−１,２−プロパンジオール（０.６、  mmol）の攪拌溶液に加えた。１０分後、酢酸（３ｍＬ）を加え、混合物を蒸発乾燥した。残留物を水１００ｍＬですり砕いた。得られる固形物を濾過し、水で洗浄し、減圧下にトルエン（２ｘ５０ｍＬ）と共に同時蒸発させることによって乾燥した。酢酸エチル５０ｍＬで洗浄し、続いて、一夜真空乾燥して、５を白色結晶質固形物として得た（１.６５ｇ、９９％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3＋ＭｅＯＤ−ｄ４,２００ＭＨｚ,ppm,Ｍｅ4Ｓｉ）７.７７（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.７Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.６１（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.３Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.４５−７.２９（ｍ,４Ｈ,芳香族プロトン）、４.３５（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.１Ｈｚ,−ＣＨ2ＯＣＯ−）、４.２２（ｍ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.７２（ｍ,１Ｈ,ＮＨＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＯＨからの−１Ｈ−）、３.５２−３.２７（ｍ,６Ｈ,ＯＣＯＮＨＣＨ2＋ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＯＨ）、２.４４（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈｚ,−ＣＨ2ＣＯ−）。
分析、Ｃ21Ｈ24Ｎ2Ｏ5の計算値：Ｃ、５.６１；Ｈ、６.２９；Ｎ、７.２９％。実測値：Ｃ、６５.４３；Ｈ、６.２８；Ｎ、７.２１。
１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２−［［ビス（メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル］−２−エタノール （６）。
無水ピリジン３０ｍＬ中の５（１.６ｇ、４.２mmol）の攪拌溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（１.６ｇ、４.７mmol）を加えた。アルゴン下に３時間攪拌後、混合物を蒸発乾燥した。残留ピリジンを、トルエンと共に同時蒸発させることよって除去した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2１００ｍＬに溶解し、水２ｘ１００ｍＬで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾燥した。残留物を、溶離剤として酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィー（４ｘ２０ｃｍ、シリカ）で精製した。純生成物を含有する画分を集め、蒸発乾燥して、１.９ｇ（６６％）の６を無色泡状物として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm,Ｍｅ4Ｓｉ）７.７２（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.５６（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.４０−７.２０（ｍ,１３Ｈ,芳香族プロトン）、６.８０（ｄ,４Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＤＭＴｒプロトン）、５.７６（ｂｒ ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、５.４２（ｂｒ ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、４.３５（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈｚ,−ＣＨ2ＯＣＯ−）、４.１７（ｍ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.８３（ｍ,１Ｈ,ＮＨＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＯＨからの−ＣＨ−）、３.７５（ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ3）、３.６０−３.３０（ｍ,４Ｈ,ＯＣＯＮＨＣＨ2＋ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＯＨ）、３.１３（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝５.４Ｈｚ,ＣＨ2ＯＤＭＴｒ）、２.３０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝５.４Ｈｚ,−ＣＨ2ＣＯ−）。
分析、Ｃ42Ｈ42Ｎ2Ｏ7の計算値：Ｃ、７３.４５；Ｈ、６.１６；Ｎ、４.０８。実測値：Ｃ、６５.４３；Ｈ、６.２８；Ｎ、７.２１。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル  １−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２−［［ビス（メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル］−２−エチルブタンジオエート （７）。
無水ＣＨ2Ｃｌ2１０ｍＬ中の、６（１.２ｇ、１.７５mmol）、トリエチルアミン（０.２ｇ、２mmol）、１−メチルイミダゾール（２０μＬ）の溶液に、無水琥珀酸０.２ｇ（２mmol）を加えた。この溶液を２０時間攪拌した。トリエチルアミン（６０μＬ）を溶液に加え、続いて、０.６ｇ（２.２mmol）の２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートを加えた。１時間後、回転蒸発器を用いてＣＨ2Ｃｌ2を減圧下に蒸発によって除去し、残留物を１５ｍＬエチルアセテート/ヘキサン（１：２）に溶解した。フラッシュクロマトグラフィー（４ｘ２０ｃｍ、ヘキサン/酢酸エチル、２：１）によって、１ｂを淡黄色泡状物（１.２ｇ、７３％）として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm,Ｍｅ4Ｓｉ）７.７１（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.５４（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.４０−７.２０（ｍ,１３Ｈ,芳香族プロトン）、７.００（ｍ,１Ｈ,Ｃ6Ｆ4Ｈ）、６.７８（ｄ,４Ｈ,Ｊ＝７  Ｈｚ,ＤＭＴｒプロトン）、５.７１（ｂｒ ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、５.４２（ｂｒ ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、５.１５（ｍ,１Ｈ,ＮＨＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＯＨからの−ＣＨ−）、４.３１（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝６.２Ｈｚ,−ＣＨ2ＯＣＯ−）、４.１６（ｄ,５.５Ｈｚ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.７４（ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ3）、３.６０−３.３０（ｍ,４Ｈ,ＯＣＯＮＨＣＨ2＋ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＯＨ）、３.２０（ｂｒ ｓ,２Ｈ,ＣＨ2ＯＤＭＴｒ）、２.９８（ｂｒ ｓ,２Ｈ,ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ）、２.７２（ｂｒ ｓ,２Ｈ,ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ）、２.２０（ｂｒ ｓ,２Ｈ,−ＣＨ2ＣＯ−）。
分析、Ｃ42Ｈ42Ｎ2Ｏ7の計算値：Ｃ、６６.８０；Ｈ、４.９６；Ｎ、３.００。実測値：Ｃ、６６.１８；Ｈ、４.９８；Ｎ、２.８６。
ＣＰＧ誘導体の製造  ８。
無水ピリジン２０ｍＬ中の、長鎖アミノアルキル制御孔ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）５.０ｇ、１−メチルイミダゾール０.５ｍＬ、および０.４５ｇ（０.５mmol）の７の混合物を、１００ｍＬフラスコ（オービタルミキサー、１５０rpm）中で渦を巻かせた。３時間後、ＣＰＧを焼結ガラス漏斗で濾過し、それぞれ１００ｍＬのＤＭＦ、アセトン、およびジエチルエーテルで洗浄した。ＣＰＧを真空乾燥し、ピリジン（２０ｍＬ）、無水酢酸（２ｍＬ）、および１−メチルイミダゾール（２ｍＬ）の混合物で処理した。３０分間渦を巻かせた後に、ＣＰＧをピリジン、メタノール、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に真空乾燥した。文献に記載の方法（T.AtkinsonおよびM.Smithによる,M.Gait（ed.）,Oligonucleotide Synthesis,A Practical Approach,IRL Press,1984,Oxford,UK,pp.35-81）によってジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）含有量を分析し、２８μmol/gの荷重を有することを見い出した。
ＣＰＧ誘導体の製造  ９。
ＣＰＧ誘導体８（３.０ｇ）を、乾燥ＤＭＦ中の２０％ピペリジン２０ｍＬで２回、各回ごとに５分間で処理した。ＣＰＧを、それぞれ１００ｍＬのＤＭＦ、メタノール、およびジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。
ＣＰＧ誘導体の製造  １０。
無水ＤＭＳＯ７.５ｍＬ中の、２.５ｇの９、７.５ｍＬのトリエチルアミン、および０.３８ｇ（０.５mmol）の３ｃの混合物を、５０ｍＬフラスコ（オービタルミキサー、１５０漏斗rpm）中で渦を巻かせた。２日後、ＣＰＧを焼結ガラス漏斗で濾過し、それぞれ１００ｍＬのＤＭＳＯ、アセトン、およびジエチルエーテルで洗浄した。ＣＰＧを真空乾燥し、ピリジン（１０ｍＬ）、無水酢酸（１ｍＬ）、および１−メチルイミダゾール（１ｍＬ）の混合物で処理した。３０分間渦を巻かせた後に、ＣＰＧをＤＭＳＯ、ピリジン、メタノール、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に真空乾燥した。
２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル  ５−［（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート（１１）。
６−［（ｔ−ブチルオキシカルボキシアミド］ヘキサン酸（４.１６ｇ、１８mmol）を、乾燥ＤＭＦと共に、同時蒸発させることによって乾燥した（７０℃）。残留物を乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に再度溶解し、２−［４−（フェニルアゾ）−ベンジルチオ］−エタノール（４.０ｇ、１５mmol）、Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３.７１ｇ、１８mmol）、４−ジメチルアミノピリジン（１.８３ｇ、１５mmol）を０℃で加えた。０℃で２時間、２０℃で１２時間攪拌後、反応混合物を、酢酸ブチルと共に同時蒸発させることによって蒸発乾燥し、追加の酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えた。この溶液を、０.７Ｍ ＨＣｌ（１ｘ３０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ3、およびＨ2Ｏ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。エーテル２０ｍＬで洗浄し、濾過して、化合物１１（６.９１ｇ、８９％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm）７.９１（ｍ,４Ｈ）、７.５２（ｍ,５Ｈ）、４.４８（ｔ,２Ｈ）、４.３４（ｓ,２Ｈ）、３.２０（ｔ,２Ｈ）、３.０８（ｍ,２Ｈ）、２.３５（ｔ,２Ｈ）、１.６４−１.２（ｍ,７Ｈ）、１.４１（ｓ,９Ｈ）。
１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレート。
Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１.１ｇ、５.３mmol）を、１−メチル−４−［ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピロール−２−カルボン酸4（１.２ｇ、５.２mmol）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０.６３ｇ、４.７mmol）の溶液に加えた。１時間攪拌後、混合物を焼結ガラスフィルターで濾過して、沈降Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを分離した。濾液を蒸発乾燥し、ＣＨＣｌ3およびペンタン（１：１）の混合物に溶解し、シリカゲルカラムに装填した。純生成物を含有する画分を集め、蒸発乾燥して、所望生成物１.４５ｇ（８０％）を白色固形物として得た。
ｍ.ｐ.＝１３８℃〜１３８.５℃。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ）８.０４（ｄ,１Ｈ）、７.４９−７.４０（ｍ,４Ｈ）、７.０９（ｄ,１Ｈ）、３.８７（ｓ,３Ｈ）、１.５０（ｓ,９Ｈ）。
２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル  ５−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート（１２）。
トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を、０℃で、１１（０.７３ｇ、１.５mmol）に加えた。０℃で２０分間攪拌後、反応混合物を、ＣＨＣｌ3と共に同時蒸発させることによって蒸発乾燥した。残留物を、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレート（０.５９ｇ、１.６５mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.２３ｇ、２.３mmol）を加えた。周囲温度で１５分間攪拌後、ＣＨＣｌ3を加えた（１００ｍＬ）。反応混合物を、５％ＮａＨＣＯ3（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。ＣＨＣｌ3を用いてシリカゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、０.８８ｇ（９１.８％）の１２を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm）７.８８（ｍ,４Ｈ）、７.４６（ｍ,５Ｈ）、６.７４（ｓ,１Ｈ）、６.３８（ｓ,１Ｈ）、６.２６（ｓ,１Ｈ）,５.８７（ｔ,１Ｈ）、４.１８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.８２（ｓ,３Ｈ）、３.７９（ｓ,２Ｈ）、３.３（ｍ,２Ｈ）、２.６３（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、２.３０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４６（ｓ,９Ｈ）。
２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル  ５−［１−メチル−４−（１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート（１３）。
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（８ｍＬ）中の１２（２.４３ｇ、４mmol）の溶液を、トリフルオロ酢酸（４ｍＬ）で０℃で処理した。得られる溶液を、栓をしたフラスコ中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ2ＣＯ3（３０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメタン（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ2Ｏ（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した後に、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発させた。残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（１.４３ｇ、４mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.８ｇ、８mmol）を加えた。周囲温度で３０分間攪拌した後、ＣＨＣｌ3（１００ｍＬ）を加えた。反応混合物を５％ＮａＨＣＯ3（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。ＣＨＣｌ3を用いてシリカゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、１.９５ｇ（６６.８％）の１３を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm）７.８７（ｍ,４Ｈ）、７.４６（ｍ,５Ｈ）、７.０４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.７７（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５２（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５０（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.３１（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、５.９５（ｔ,１Ｈ）、４.１９（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.８５（ｓ,６Ｈ）、３.７８（ｓ,２Ｈ）、３.３２（ｍ,２Ｈ）、２.６４（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、２.３１（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４８（ｓ,９Ｈ）。
２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル  ５−［１−メチル−４−（１−メチル−４−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート（１４）。
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（６ｍＬ）中の１３（１.９０ｇ、２.６mmol）の溶液を、トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）で０℃で処理した。得られる溶液を、栓をしたフラスコ中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ2ＣＯ3（３０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメタン（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ2Ｏ（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した後に、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発させた。残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2（２.５ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（１.４ｇ、３.９mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.８ｇ、８mmol）を加えた。周囲温度で１時間攪拌した後、ＣＨＣｌ3（１００ｍＬ）を加えた。反応混合物を５％ＮａＨＣＯ3（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。ＣＨＣｌ3中の０％〜１.５％メタノールを用いてシリカゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、１.５６ｇ（７０.５％）の１４を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm）７.８７（ｍ,４Ｈ）、７.６８（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、７.６０（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、７.４６（ｍ,５Ｈ）、７.０８（ｂｒ ｓ,２Ｈ）、６.７８（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５６（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.６０（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５５（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.０３（ｔ,１Ｈ）、４.１８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.８６（ｍ,９Ｈ）、３.７８（ｓ,２Ｈ）、３.３２（ｍ,２Ｈ）、２.６３（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、２.３０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４８（ｓ,９Ｈ）。
２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル−５−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート（１５）。
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）中の１４（０.３２ｇ、０.３２mmol）の溶液を、トリフルオロ酢酸（２.５ｍＬ）で０℃で処理した。得られる溶液を、栓をしたフラスコ中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ2ＣＯ3（３０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメタン（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ2Ｏ（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した後に、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発させた。残留物を、ＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（０.１１ｇ、０.３２mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.０６ｇ、０.０３mmol）を加えた。周囲温度で１.５時間攪拌した後、ＣＨＣｌ3（１００ｍＬ）を加えた。この懸濁液を濾過し、濾液を５％ＮａＨＣＯ3（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発乾燥した。１５の収量は０.２５ｇ（８０％）であった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3,２００ＭＨｚ,ppm）８.１７（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、７.９８（ｂｒ ｓ,）、７.９６（ｂｒ ｓ,）、１Ｈ  ７.８５（ｍ,４Ｈ）、７.４４（ｍ,５Ｈ）、７.０９（ｂｒ ｓ,２Ｈ）、７.０２（ｓ,１Ｈ）、６.７８（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.７４（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.６６（ｓ,１Ｈ）、６.５８（ｓ,３Ｈ）、６.２９（ｔ,１Ｈ）、４.１８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.７８（ｍ,１４Ｈ）、３.２８（ｍ,２Ｈ）、２.６０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝Ｈｚ）、２.２６（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４８（ｓ,９Ｈ）。
２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル  ５−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート（１６）。
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中の１５（０.６５ｇ、０.６７mmol）の溶液を、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）で０℃で処理した。得られる黄色がかった溶液を、栓をしたフラスコ中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ2ＣＯ3（３０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメタン（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ2Ｏ（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した後に、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発させた。残留物をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル  １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（０.２４ｇ、０.６７mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.１３ｇ、０.６７mmol）を加えた。周囲温度で３時間攪拌した後、反応混合物を酢酸ブチルと共に同時蒸発して蒸発乾燥した。残留物を、ＣＨＣｌ3中の２.５％ＤＭＦ３ｍＬに溶解した。ＣＨＣｌ3（２.５％ＤＭＦ）中０％〜２.５％メタノールを用いてシリカゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、０.６７ｇ（４５％）の１６を得た。
２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４’−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート（Chlorambucil  ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルエステル）。
乾燥ジクロロメタン５ｍＬ中の、chlorambucil（Fluka A.G.によって供給）０.２５ｇ（０.８２mmol）、２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート０.３ｇ（１.１mmol）の溶液に、乾燥トリエチルアミン０.２ｍＬを加えた。混合物をアルゴン下、室温で０.５時間攪拌し、蒸発させた。残留油を、溶離剤としてヘキサン/クロロホルム（２：１）を用いてシリカゲルでカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、エステルを油状物として得た（０.２８ｇ（７５％））。
シリカゲル上のＴＬＣ（ＣＨＣｌ3）Ｒf  ０.６；ＩＲ（ＣＨＣｌ3中）３０１０、１７８０、１６１３、１５２１、１４８５ｃｍ-1。
オリゴヌクレオチドの第一アミノ基への、chlorambucil残基の導入
オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩の製造：
一般にトリエチルアンモニウム塩のオリゴヌクレオチド（５０μｇ〜５００μｇ）の水溶液１００μＬを、セチルトリメチルアンモニウム形態のDowex 50wx8を装填され、水中の５０％のアルコールで予備洗浄されたカラムに注入した。カラムを５０％水性エタノールで溶離した（０.１ｍＬ/分）。オリゴヌクレオチドを含有する画分を、Speedvacで２時間かけて乾燥し、続く反応に使用した。
オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩（５０μｇ〜１００μｇ）のエタノール溶液（５０μＬ）を、アセトニトリル（５０μＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（３μＬ）中の、２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４’−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート（chlorambucilのテトラフルオロフェニルエステル）の０.０８Ｍ溶液と混合した。室温で３時間攪拌した後、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ4（１.５ｍＬ）を用いて、生成物を沈殿させた。生成物をアセトン中２％ＬｉＣｌＯ4を用いて、水（６０μＬ）から３回再度沈殿させた。最終的に、オリゴヌクレオチドのchlorambucil誘導体を、逆相クロマトグラフィーにかけて約５０％〜８０％の収率で精製した。生成物を含有する画分を概ねブタノールによって濃縮した。分離したオリゴヌクレオチドのchlorambucil誘導体を、ＬｉＣｌＯ4のアセトン溶液中で沈殿させ、アセトンで洗浄し、油ポンプの真空下に乾燥した。集めたクラマトグラフィー画分以降は、生成物を氷冷溶液に入れて、反応性オリゴヌクレオチドの全ての操作を可能な限り素早く行った。
オリゴヌクレオチド合成
全てのオリゴヌクレオチドは、製造業者から供給されるプロトコールを用いて、ABM 394上の適切なＣＰＧサポート１μmolから製造した。−シアノエチルホスホロアミダイト結合化学の標準試薬は、Glen Researchから購入した。５’−アミノヘキシル改質は、Ｎ−ＭＭＴ−ヘキサノールアミンホスホロアミダイトリンカー（Glen Research）を用いて導入した。３’−アミノヘキシル改質は、C.R.Petrie,M.W.Reed,A.D.Adams,およびR.B.Meyer,Jr.Bioconjugate Chemistry,1992,3,85-87に記載のように製造されるＣＰＧを用いて導入した。
複合体の製造（反応式３）
４０μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の、アミノヘキシル改質オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩（３０nmol〜５０nmol、Jost,J.-P.,Jiricny,J.,およびSaluz,H.（1989）Quantitative precipitation of short oligonuclrotides with low concentrations of cetyltrimethylammonium bromide.Nuceic Acids Res.17,2143）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１.５μＬの溶液を、ＴＦＰエステル（１ａ、１ｂ、２ｅ、２ｆ、または３ｃ）の４ｍＭ溶液４０μＬに加えた。反応混合物を室温で１２時間置いた。オリゴヌクレオチド関連物質が、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ4（１.５ｍＬ）を加えることによって、沈殿した。ペレットをアセトンで洗浄し、真空乾燥した。ペレットをＨ2Ｏ中５０％ＤＭＦ（６０μＬ）中に再度溶解し、アセトン中ＬｉＣｌＯ4の２％溶液を用いて、前記と同様に再度沈殿させた。この手順を２回繰り返した。残留物を、５０ｍＭ ＬｉＣｌＯ4の存在下の２０％〜７５％のアセトニトリルの勾配を用いてＨＰＬＣ（４.６ｘ２５０ｍｍ、Ｃ−１８、Dynamax-300A、Rainin）にかけて精製した。純生成物を含有する画分を、Speedvacを用いて真空乾燥した。残留物を、６０μＬ〜８０μＬのＨ2Ｏ中に溶解し、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ4（１.５ｍＬ）を用いて沈殿させた。アセトン（２ｘ１.５ｍＬ）での洗浄および真空乾燥の後、ペレットを１００μＬのＨ2Ｏに溶解した。最終生成物の収率は２０％〜５０％であった。
４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基を担持するオリゴヌクレオチド複合体の製造に、Godovikovaらの改良法（T.S.Godovikova,V.F.Zarytova,T.V.Maltzeva,L.M.Khalimskaya.Bioorgan.Khim.,1989,15,1246-1259）を用いた。１００μＬの乾燥ＤＭＦ中の、３’−ホスフェート含有オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩（５０nmol〜１００nmol）、トリフェニルホスピン（１０ｍｇ）、２,２’−ジピリジルジスルフィド（１０ｍｇ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）、および化合物１１〜１６から選択される類似体のうちの１つの溶液を、室温で２０分間培養した。アセトン中２％ＬｉＣｌＯ4（１.５ｍＬ）を加えることによって、オリゴヌクレオチド関連物質を沈殿させた。ペレットをアセトンで洗浄し、真空乾燥した。残留物を、５０ｍＭ ＬｉＣｌＯ4の存在下の２０％〜７５％のアセトニトリルの勾配を用いてＨＰＬＣによって精製した。純生成物を含有する画分を、Speedvacを用いて真空乾燥した。残留物を６０μＬ〜８０μＬのＨ2Ｏに溶解し、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ4（１.５ｍＬ）で沈殿させた。アセトン（２ｘ１.５ｍＬ）での洗浄および真空乾燥の後に、ペレットを１００μＬのＨ2Ｏに溶解した。最終生成物の収率は、３０％〜５０％であった。
複合体の製造（反応式４）
１μmol規模での合成において得られたＣＰＧ含有５’−アミノヘキシル誘導オリゴヌクレオチドを、ＣＨ2Ｃｌ2中の２％ジクロロ酢酸で処理して、アミノ基から９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を除去し、続いて、アセトニトリルで洗浄し、アルゴンでのフラッシングよって乾燥した。ＣＰＧを１.５ｍＬプラスチック管に移し、無水ＤＭＳＯ中のＴＦＰエステルの５０ｍＭ溶液１００μＬを加えた。プラスチック管を２４時間シェークし、次に３ｘ１.５ｍＬ ＤＭＳＯ、２ｘ１.５ｍＬアセトンで洗浄し、真空乾燥した。ＣＰＧを、濃アンモニアで処理して、標準条件を用いてオリゴヌクレオチドを脱保護した。得られる反応混合物を、前記と同様に逆相ＨＰＬＣによって分離した。典型的な収率は約５０％であった。
熱変性試験
４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基を担持するオリゴヌクレオチド複合体の光学溶融曲線を、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.０）において、この目的のために特別にデザインされた温度調節セル中のMilichrom液体クロマトグラフのＵＶ検出器で得た。データを集め、S.G.Lokhovらによって記載のように（S.G.Lokhov,M.A.Podyminogin,D.S.Sergeev,V.N.Silnikov,I.V.Kutyavin,G.V.Shishkin,V.F.Zarytova.Bioconjugate Chem.1992,3,414）、パソコンで処理した。
１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（ＣＤＰＩ）残基を担持するオリゴヌクレオチド複合体を、１４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７.２）において、ＰＴＰ−６自動マルチセル温度プログラマーを有するLambda 2（Perkin Elmer）分光光度計上で、溶融させた。複合体の溶融温度（Ｔm）を、最大誘導体（derivative maxima）から求めた。
プライマー延長反応
プライマー延長反応を、LeeらによってBiochemistry（1994）33:6024-6030に以前に記載されているように行った。鋳型、プライマー、および封鎖ＯＤＮの最終濃度は、それぞれ、５ｘ１０-10Ｍ、４ｘ１０-8Ｍおよび１０-9Ｍであった。プライマー延長を、４５℃で１５分間で行い、前記文献に記載のように、変性ゲル電気泳動によって、生成物を分析した。
封鎖ＯＤＮの不存在下においては、プライマー延長反応が、配列ゲル中で未分解バンドとして移動する高分子量生成物を発生させた。休止部位（pause sites）または自発的終止事象（spontaneous termination events）に対応する弱いバンドは、全ての反応混合物中において再現的に観察された。標的に対して充分に相補的な、未改質の１６−マーおよび３２−マーＯＤＮは、プライマー延長を封鎖できなかった。また、それぞれＣＤＰＩ3基に３’−結合された相補的８−マーおよび１６−マーＯＤＮも活性がなかった。５’−結合ＣＤＰＩ3を有する充分に相補的な１６−マーＯＤＮだけが、プライマー延長をＴ７ ＤＮＡポリメラーゼによって抑止した。同様の５’改質を有する相補的８−マーＯＤＮは、極微量の封鎖生成物を発生させたたけであった。対照標準ＯＤＮは、プライマー延長の阻止に、相補的ＯＤＮおよび共有結合ＭＧＢの両方が必要であることを確認した。それぞれ５’−結合ＣＤＰＩ3ペプチドを有する２つの単一不適正１６−マーＯＤＮは、完全に適正のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体よりもかなり低い程度に抑止的であった。当モル量の遊離ＣＤＰＩ3と一緒に未改質１６−マーＯＤＮを加えても、プライマー延長に何の効果もなく、このことはＭＧＢとＯＤＮの結合の重要性を強調するものである。５’アクリジン成分が、ＭＧＢの代わりに、充分に相補的な１６−マーＯＤＮに結合したとき、抑止活性の損失が見られた。
細胞培養架橋実験
ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、ＤＱβ１対立遺伝子の鋳型鎖のヌクレオチド８１５−８６４に相補的であった（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:7313-7317）。この実験で用いられたヒトBSM B−細胞は、この対立遺伝子にホモ接合であり、それを構造的に発現する。ＯＤＮを加える前に、ＢＳＭ細胞を、２５ｍＬフラスコ中で、培地１ｍＬにつき細胞４.５ｘ１０6個の密度に増殖させた。各処理のために、培養基の２ｍＬアリコートからの細胞を、ペレット化し、０、１、１０、または５０μＭの５０−マーchlorambucil結合ＯＤＮ（３’結合ＣＤＰＩ3基を有するか有さないかのいずれか）を含有する無血清培地２００μＬに懸濁させた。各サンプルを、４８穴のマイクロタイタープレート中で、５％ＣＯ2で、３７℃で３.５時間で培養した。次に細胞をEppendorf０.５ｍＬ遠心分離管に移し、２０００rpmで５分間でペレット化し、５００μＬ燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、プロテイナーゼK/SDSを用いて３７℃で一夜、除タンパク質化した。フェノール/クロロホルム抽出、およびRnase A消化の後に、ＤＮＡを１Ｍピロリジンを用いて９０℃で３０分間で処理した。ピロリジンをエタノール沈殿によって除去し、連結反応媒介ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（ligation-mediated polymeraze chain reaction（PCR））を、Leeら（Biochemistry（1994）33:6024-6030）によって記載されているように行った。増幅されたＤＮＡを配列ゲルで分析し、chlorombucil含有ＯＤＮによる標的のアルキル化から生じたと考えられる配列特異的ニックを視覚化した。結果は、ＯＤＮ上のクロスリンカーに近接する標的上のヌクレオチドにおいて開裂を示し、ＣＤＰＩ3含有５０−マーが、配列中に0302対立遺伝子を特異的にアルキル化するＭＧＢを持たない同一のＯＤＮよりも１０倍有効であることを示した。
完全培地は下記の成分から調製された（HI-FCSが不足している無血清培地）：
Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含む５００ｍＬのRPMI 1640（Gibco BRL Cat.No.11875-036）。
５０ｍＬのHI-FCS（Gibco BRL Cat.No.26140,５５℃で３０分間の熱不活性化）。
５ｍＬの100X Penn/Strep（Gibco BRL Cat.No.15070-022）。
５ｍＬの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco BRL Cat.No.25030-024）。
５ｍＬの100X ピルビン酸ナトリウム（１１ｍｇ/ｍＬ；Gibco BRL Cat.No.11840-030から製造）。
５ｍＬの１Ｍ HEPES、ｐＨ７.３（Gibco BRL Cat.No.15630-023）。
配列リスト
（１）一般情報
（i）出願人：Microprobe Corporation, Bothell WA 98021
（ii）発明の名称：共有結合オリゴヌクレオチドマイナー
（iii）配列の数：２
（iv）通信住所：
（Ａ）宛名：KLEIN & SZEKERES
（Ｂ）通り：4199 Campus Drive, Suite 700
（Ｃ）市：Irvine
（Ｄ）州：CA
（Ｅ）国：USA
（Ｆ）郵便番号：92715
（v）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PC互換性
（Ｃ）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0,Version #1.25
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：US 08/415,370
（Ｂ）出願日：１９９５年４月３日
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士/代理人情報：
（Ａ）氏名：Szekeres,Gabor L
（Ｂ）登録番号：28,675
（Ｃ）参照/事件番号：491-09-PA
（ix）電気通信情報：
（Ａ）電話：714-854-5502
（Ｂ）ファックス：714-854-5502
（２）配列同定番号１の情報：
（i）配列特徴：
（Ａ）長さ：５０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖構造：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列記載：配列同定番号１
0004948690.tif 000030
（２）配列同定番号２の情報：
（i）配列特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖構造：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列記載：配列同定番号２
0004948690.tif 000031
【図１】
0004948690.tif 000047