(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）液体試料中の分析物または該分析物に対する結合パートナーに結合した分析物を捕獲することができる固相を用い、（２）未結合物質を該固相から洗浄した後に、該分析物またはその結合パートナーに結合した該分析物を検出する、該分析物の存在または量を測定するアッセイを行うためのデバイスであって、
（ａ）固相ゾーン（ｃ）への試料の進入または送達のための第１の流路；
（ｂ）液体経路材料を含む第２の流路、該流体経路材料は、該液体試料に対して実質的に不浸透性であるが、洗浄試薬との接触によって浸透性とされた場合に、それは該試料についての第２の流路を規定し；
（ｃ）該第１および第２の流路の交点における、該液体試料に対して浸透性である固相ゾーン、ここに、該固相ゾーンは該分析物またはその結合パートナーに結合した該分析物に対する結合パートナーを含み、該固相は該分析物またはその結合パートナーに結合した該分析物の捕獲および検出の双方で用いられ；
それにより、該流体経路材料が該洗浄試薬の第２の流路への導入によって親水性とされるまで、該液体試料は、最初に、該第１の流路に沿ってのみ該流体経路材料へではなく該固相ゾーンへ流動し、それにより、洗浄試薬は第２の流路を通って固相ゾーンから未結合物質を移動させ；および
（ｄ）単一の分析物につき単一の試料をテストするための手段、または複数の分析物につき単一の試料をテストするための手段；
を含む該デバイス。
【請求項２】
第１の流路がキャピラリー空間を通る請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
第１の流路が、少なくとも１つの乾燥されたコンジュゲート可溶性結合試薬を含有する請求項１記載のデバイス。
【請求項４】
コンジュゲート可溶性結合試薬が標識または受容体に結合した請求項３記載のデバイス。
【請求項５】
第１の流路が標識または受容体に結合した分析物を含有する請求項１記載のデバイス。
【請求項６】
さらに、該試料を該デバイスに添加するに先立って、少なくとも１つの標識または受容体に結合した分析物が試料に添加される請求項１記載のデバイス。
【請求項７】
該試料を該デバイスに添加するに先立って、少なくとも１つの該分析物に対する結合パートナーが試料に添加される請求項１記載のデバイス。
【請求項８】
該少なくとも１つの結合パートナーが標識または受容体に結合した請求項７記載のデバイス。
【請求項９】
結合パートナーが抗原、抗体、リガンド、受容体、核酸分子、化学反応体、およびその断片を含む請求項１記載のデバイス。
【請求項１０】
固相が、ガラス繊維マット、不織布合成マット、燒結された粒状構造体、注型された膜材料、押し出された膜材料、成形された開口細孔ナイロン構造体、注型された開口細孔ナイロン構造体、成形された開口細孔ニトロセルロース構造体、注型された開口細孔ニトロセルロース構造体、ガラス粒子の粒状材料、ポリマー粒子の粒状材料、および電気化学的ディテクターよりなる群から選択される請求項１記載のデバイス。
【請求項１１】
該デバイスの活性化の後に、洗浄試薬が少なくとも１つの穿孔可能な容器から送達される請求項１記載のデバイス。
【請求項１２】
該洗浄試薬が少なくとも１つの洗浄試薬、少なくとも１つの基質試薬、少なくとも１つの洗浄／基質試薬、および少なくとも１つの洗浄試薬および少なくとも１つの基質試薬を含む組成物よりなる群から選択される請求項１記載のデバイス。
【請求項１３】
さらに、該流体経路材料とは独立した吸収剤材料よりなる吸収剤ブロックを含む請求項１記載のデバイス。
【請求項１４】
さらに、該固相の上流または該固相の真上に位置する試料進入ポートを含み、試料をカップ構造体または試料吸収チップを介して適用する請求項１記載のデバイス。
【請求項１５】
（ａ）試料を、（ｉ）分析物の第１の結合パートナー（ここに、該第１の結合パートナーは、検出可能な標識を含む）、（ｉｉ）該分析物の第２の結合パートナー（ここに、該第２の結合パートナーは、受容体分子を含む）、および（ｉｉｉ）固相材料（ここに、該受容体分子の結合パートナーは該固相材料に非拡散的に結合している）と接触させ；
（ｅ）該分析物ならびに該第１および第２の結合パートナーならびに該分析物間で免疫複合体を形成し、ここに、該受容体分子は、該固相上でその結合パートナーに結合して、固定化された複合体を形成し、ここに、該固相は、最初は試料に対して非浸透性である第２の流体経路材料と接触し；
（ｆ）該第２の流体経路材料に沿って界面活性剤を含有する洗浄試薬を流動することにより該固相から未結合反応体を除去し、ここに、該界面活性剤は、該洗浄試薬が、該第２の流体経路材料を通して流動するのを可能とし；次いで、
（ｇ）該第１の結合パートナーに結合した標識を検出する
ことを特徴とする液体試料中の分析物の検出のためのアッセイ方法。
【請求項１６】
該検出工程が、第２の流体経路材料を通して基質試薬を流動させることを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該分析物の第１および第２の結合パートナーのうちの少なくとも１つが、該固相と流体連絡した第１の流体経路材料上で乾燥したコンジュゲート可溶性結合パートナーであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該分析物の第１および第２の結合パートナーのうちの少なくとも１つが、該試料と該固相との接触に先立って、該試料に添加されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該界面活性剤が、水混和性有機溶媒であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
該固相が、アビジンまたはストレプトアビジンを含み、該第２の結合パートナーがビオチンを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該第１の結合パートナーが、試料送達チャネルにあることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
該洗浄試薬が少なくとも１つの洗浄試薬、少なくとも１つの基質試薬、少なくとも１つの洗浄／基質試薬、ならびに少なくとも１つの洗浄試薬および少なくとも１つの基質試薬を含む組成物よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）試料と、（ｉ）分析物に対する第１の免疫学的結合パートナー、ここに、該第１の免疫学的結合パートナーは、検出可能な標識を含み、および（ｉｉ）固相に非拡散的に固定化された該分析物の第２の免疫学的結合パートナーとを接触させ；
（ｈ）該第１および第２の免疫学的結合パートナーが該分析物との免疫複合体を形成するのを可能とし、ここに、該固相は、最初は該試料に非浸透性の材料を含む第２の流体経路と接触し；
（ｉ）界面活性剤が、洗浄試薬が該第２の流路を通って流動するのを可能とするように、該第２の流路に沿って界面活性剤を含有する洗浄試薬を流動することにより該固相から未結合反応体を除去し；次いで、
（ｇ）該免疫複合体に結合した標識を検出する
ことを特徴とする液体試料中の分析物の測定のためのアッセイ方法。
【請求項２４】
該検出が、該第２の流路を通って基質試薬を流動させることを含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該洗浄試薬が、少なくとも１つの洗浄試薬、少なくとも１つの基質試薬、少なくとも１つの洗浄／基質試薬、および少なくとも１つの洗浄試薬および少なくとも１つの基質試薬を含む組成物よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該界面活性剤が、水混和性有機溶媒であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該第１の免疫学的結合パートナーが、該第１の流路内で乾燥した可溶性試薬であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
該第１の免疫学的結合パートナーが、該試料が該デバイスに添加される前に該試料に添加されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）試料および分析物に対する第１の結合パートナーの混合物を形成し、ここに、該第１の結合パートナーは検出可能な標識を含み；
（ｋ）該第１の結合パートナーが、該分析物と複合体を形成するのを可能とし；
（ｌ）該複合体と、固相上に非拡散的に固定化された分析物または標識または受容体に結合した分析物とを接触させ、ここに、該固相は、最初は該試料に対して非浸透性である第２の流体経路材料と接触し；
（ｍ）界面活性剤が、洗浄試薬が該第２の流路を通って流動することを可能とするように、第２の流体経路物質に沿って、界面活性剤を含有する洗浄溶液を流動させることにより、該固相から未結合反応体を除去し；
（ｎ）該固相に結合した標識を検出する工程を含む液体試料中の分析物の測定のためのアッセイ方法。
【請求項３０】
該固相に結合した標識の検出が、該分析物の濃度に対して標識の量の阻害を関連付けることを含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）試料および分析物に対する第１の結合パートナーの混合物を形成し、ここに、該第１の結合パートナーは、検出可能な標識、および受容体分子に共有結合した分析物または分析物類似物を含む第２の試薬を含み；
（ｏ）該第１の結合パートナー、該分析物および受容体に結合した該分析物または標識または受容体に結合した分析物が複合体を形成するのを可能とし；
（ｐ）該複合体と、固相に非拡散的に固定化された受容体分子の結合パートナーとを接触させ、ここに、該固相は、最初は該試料に対して非浸透性である第２の流体経路材料と接触し、
（ｑ）界面活性剤が、該洗浄剤が該第２の流路を通って流動することを可能とするように、該第２の流体経路材料に沿って、界面活性剤を含有する洗浄溶液を流動させることにより該固相から未結合反応体を除去し；次いで
（ｒ）該固相に結合した標識を検出することを特徴とする液体試料中の分析物の測定のためのアッセイ方法。
【請求項３２】
さらに、該分析物の濃度に対して該固相に結合した標識の量の阻害を関連付けることを含むことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）試料および検出可能な標識に結合した分析物または標識または受容体に結合した分析物を含むコンジュゲート可溶性結合パートナーの混合物を形成し；
（ｂ）該コンジュゲート可溶性結合パートナーに、該分析物との複合体を形成させ；
（ｃ）該混合物と、固相上に非拡散的に固定化された分析物の結合パートナーとを接触させ、ここに、該固相は、最初は該試料に対して非浸透性である第２の流体経路材料と接触し；
（ｄ）界面活性剤が、該洗浄試薬が該第２の流路を通って流動するのを可能とするように、第２の流路に沿って、界面活性剤を含有する洗浄溶液を流動させることによって該固相から未結合反応体を除去し；次いで
（ｅ）該固相に結合した標識を検出する工程を含むことを特徴とする液体試料中の分析物の測定のためのアッセイ方法。
【請求項３４】
さらに、該分析物の濃度に対して標識の量の阻害を関連付けることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
（ｓ）試料と、検出可能な標識に結合した分析物または標識または受容体に結合した分析物、および受容体分子に結合した分析物に対する可溶性結合パートナーを含む第２の試薬のコンジュゲートとの混合物を形成し；
（ｔ）分析物の該可溶性結合パートナーに、該分析物との、およびコンジュゲート可溶性結合パートナーとの複合体を形成させ；
（ｕ）該混合物と、固相上に非拡散的に固定化された受容体分子の結合パートナーとを接触させ、ここに、該固相は、最初は該試料に対して非浸透性である第２の流体経路材料と接触し；
（ｖ）界面活性剤が、該洗浄試薬が該第２の流路を通って流動するのを可能とするように、該第２の流体経路材料に沿って、界面活性剤を含有する洗浄溶液を流動させることにより、未結合反応体を該固相から除去し；
（ｗ）固相に結合した標識を検出する工程を含むことを特徴とする液体試料中の分析物の測定のためのアッセイ方法。
【請求項３６】
さらに、該分析物の濃度に標識の量の阻害を関連付けることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
（１）液体試料中の分析物または該分析物に対する結合パートナーに結合した分析物を捕獲することができる固相を用い、（２）未結合物質を該固相から洗浄した後に、該分析物またはその結合パートナーに結合した該分析物を検出する、該分析物の存在または量を測定するアッセイを行うための方法であって、
（ａ）液体試料を、その中に少なくとも１つの固定化された試薬を含有する固相と流体連絡して第１の流路と接触させ、ここに、該固相は、第２の流体経路材料とさらに流体連絡し；
（ｂ）最初に該第１の流路から該固相に該液体試料を流動させ、ここに、該第２の流体経路材料は、該液体試料に対して最初は不浸透性あるが、該第２の流体経路材料が洗浄試薬、基質試薬または組み合わされた洗浄／基質試薬と接触すると該試料に対して浸透性とされ、
（ｃ）該第２の流路を通じて洗浄試薬、基質試薬または洗浄／基質試薬を流動させることにより、該固相から未結合物質を除去し、
（ｄ）該固相上の分析物の存在または量を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、流体試料中の対象の特定の分析物の存在または量を測定するアッセイを行うデバイスおよび方法に関する。本発明のデバイスは、単一のユーザー始動工程と同時に開始される少なくとも２つの分離した別個の流路を用いて、測定された量の試料をアッセイする。これらの経路は、反応ゾーンへアッセイ試薬を連続的に送達し、引き続き、洗浄または基質および洗浄試薬を該ゾーンに連続的に送達するように調時される。これら本発明のデバイスおよび方法は、単一のテストフォーマットにおいて、１または複数の分析物の定性的、半定量的または定量的測定に用いることができる。それらは、ＥＬＩＳＡ、ゾル粒子および他のアッセイフォーマットで実行することができ、同時複数分析物アッセイに特に適している。これら本発明のデバイスおよび方法は、調時された工程を含まず、最小限のユーザー介在、ほとんどの場合、単一の始動工程を含む試薬の制御された自己送達を提供する。
【０００２】
２．背景
多くの先行技術アッセイデバイスおよびシステムは、例えば、希釈することによって、ユーザーが該デバイスに添加する試料量を測定または管理することを必要とする。多くの先行技術デバイスまたはシステムは、ユーザーが、調時された工程のシーケンスを実行し、および／または該アッセイを行うために、該デバイスに対して複数の物理的介在を行うことも必要とする。
【０００３】
ベヒラーら(Buechler et al.)、米国特許第５,４５８,８５２および５,８８５,５２７号（それぞれ、１９９５年および１９９９年）は、多孔質膜を用いない診断デバイスを開示する。当該デバイスを用いるアッセイ方法において、流体流動は単一方向性であって、反応および検出は別個のゾーンで行われる。過剰試料／コンジュゲート混合物を用いて該検出ゾーンを洗浄する。本発明のアッセイの多様性を制限するような、独立した非試料洗浄の使用は教示も示唆もされていない。同様にベヒラーは第２の流路の作製を教示も示唆もしていない。ベヒラーにおける時間ゲートは流体経路中の遅延機構として機能し、流体流動を向け直さず、すなわち、異なる流体が反応ゾーンを通って連続的に流動することを許容する。ベヒラーらの方法およびデバイスは、複数の試薬、異なる洗浄および基質試薬を使用することを許容せず、酵素増幅アッセイに用い得ない。
【０００４】
ボンク(Vonk)、米国特許第５,１８５,１２７号は、吸収剤材料上の疎水性膜上の（分析物のバインダーを含有する）親水性膜を含むフィルター積層を開示する。該膜は試料を通さないが、該試料が混合された湿潤剤（例えば、アセトン、表面活性剤、洗剤またはアルコール、最も好ましくはメタノール）を通す。試料を当該デバイスに添加し、該疎水性膜の上でトラップする。その後、該湿潤剤を添加し、混合したときに、該試料混合物が該吸収剤材料まで浸透するようにする。洗浄および基質を添加することができる。このデバイスの他の不利な点は、（１）残留試料または洗浄用に規定された流体経路が教示も示唆もされず、（２）所定量の反応成分または洗浄の制御された送達が許容されず、および（３）そのような成分の連続的送達が許容されないことである。
【０００５】
クラーク(Clark)、米国特許第５,７２６,０１０号、米国特許第５,７２６,０１３号および米国特許第５,７５０,３３３号（１９９８）は、流体試料中の対象の分析物を検出する固相結合三次複合体の形成を使用するアッセイ方法およびデバイスを開示する。クラークの重要な特徴は、クラマトグラフィック結合アッセイにおける可逆流動の使用である。分析物含有溶液は該デバイスに適用され、次いで、延在する流動マトリクスに沿って、先ず１の方向に、次いで反対方向にキャピラリー流動によって搬送される。該流動マトリクスは４つの異なる領域を含む。領域１は、分析物含有溶液が標識抗体と混合される場所である。領域２は、検出ゾーンとも呼ばれ、固相に固定化された別の抗体を含有する。領域３は、洗浄溶液を適用する部位を含有する。領域４は、領域１の近くに位置する吸収性貯蔵器を含有し、該流動を逆方向にする。分析物の存在または量を検出する手段も該デバイスに含まれる。クラークは工程を自動化しない。ユーザーは試料体積を測定し、それを該デバイスに適用し、タイマーを監視および制御し、次いで、物理的に該デバイスを始動させる。流動を逆にするメカニズムは自動化調時を可能としない。
【０００６】
本発明のアッセイおよびデバイスは先行技術の欠点を克服し、ユーザーが試料測定または単一の始動工程以上に介在することなく、最大限の結果を提供する。本発明のアッセイは、試料中の複数の分析物の同時検出が望まれる状況に特に適合する。本発明のアッセイは、安定で、室温保存が可能で、製造および使用が容易で、テストあたり低コストで利用可能な単位剤形である。それらは液体および乾燥試薬の両方のためのパッケージングを完全に統合する。さらに、特許請求されたデバイスは試薬送達のために自己調時するので、オペレータの関与が最小限である。
【０００７】
定義
分析物−検出すべき分子。例えば、本明細書で用いる分析物は、リガンド、単一の化合物または受容体もしくは抗体に対して少なくとも１の抗原決定部位を共通して持つ複数の化合物である。
キャピラリティー−接着力および凝集力ならびに表面張力により生じる固体と接する液体の動き。キャピラリティーは固体表面、液体表面または両方に影響され得る。
疎水性表面−水または水性試料に有効に濡れないいずれの表面。
親水性表面−水または水性試料に濡れるいずれの表面。
コンジュゲート可溶性結合試薬−固体支持体、すなわち、試料送達チャネル上にデポジットされ乾燥され、および対象の分析物に対して特定の結合親和性またはそれと化学反応性を有する試薬。試料適用により、該コンジュゲート可溶性結合試薬は可溶化し、流動し始め得る。コンジュゲート可溶性結合試薬は、該試料中に存在すれば、分析物と反応し得る。アッセイフォーマットに依存して、１のコンジュゲート可溶性結合試薬は検出可能標識で標識し、もう一つは結合試薬で標識し得る。以下、これらの様々なアッセイフォーマットをより詳細に記載する。
【０００８】
固相ゾーン−少なくとも２つの流体流路の断面の材料または表面。
試料／コンジュゲート混合物−試料溶液および可溶化されたコンジュゲート結合試薬を含む液体混合物。
固定化された捕獲試薬−固体サポートに結合され、対象の分析物か、または可能性として、該コンジュゲート試薬のうちの１つの受容体、例えば、アビジン、のいずれかに対して特定の結合親和性またはそれと化学反応性を有する分子。
試料送達チャネル−該コンジュゲート可溶性結合試薬が乾燥され、そこを通って液体試料が流動する親水性手段。
ソックレット−粒状固相を用いる場合、固相を含有する親水性メッシュ材料。
固相−該固定化された捕獲試薬が結合される親水性材料。
第２の流体経路材料−第２の流路を与える疎水性材料。第２の流体経路材料の例は、吸水性材料、プラスチック、またはいずれの他の疎水性ポリマーである。界面活性剤含有洗浄溶液が該第２の流体経路材料を通って流動するとき、その表面張力が低下し、試料／コンジュゲート混合物が、今や親水性になっている該第２の流体経路材料を流動するようにする。
洗浄試薬−未結合の物質を該固相領域から除去するように働く液体試薬。本明細書で用いるとき、該洗浄試薬は、表面活性剤(a surfactant)のごとき界面活性剤(a surface active agent)または該洗浄試薬が疎水性表面に濡れるようにすることが可能ないずれの他の成分を含有する。洗浄試薬のいくつかの他の例は、アルコール、例えば、メタノール、またはいずれの他の水混和性溶媒である。
基質試薬−検出可能な発色反応を引き起こすことによって分析物検出を容易にするように働く液体試薬。基質試薬の２番目の機能は未結合物質を該固相領域から除去することにある。
洗浄／基質試薬−本発明のいくつかの具体例において、該洗浄試薬は検出剤も含有して、単一溶液を該第２の流路を通して該固相ゾーンに送達することができる。
流動橋−該ソックレット、第２の流体経路材料および該吸収性貯蔵器の間に確立された液体流動接続。該流動橋は、該第２の流路中の液体が該吸収性貯蔵器に流動することを可能にする。
ランセット／芯−液体試薬容器、すなわち、該洗浄および基質試薬容器または組合された洗浄／基質試薬容器の封に穿孔することが可能な成分。該ランセットは芯も含み、それはそれらの貯蔵容器からのおよび第２の液体経路材料への該液体試薬の流動を容易にする。
【０００９】
発明の概要
本発明は流体試料中の特定の対象の分析物の存在または量を測定するアッセイを実行するためのデバイスおよび方法に向けられる。本発明のデバイスは、固相を含み、それは当該固相から未結合の物質を洗浄後、該対象の分析物を捕獲することが可能である。該デバイスの１の局面において、２つの分離した流路が、単一のユーザー始動工程で該デバイス内に連続して確立される。第１の流路は（該サンプ中に存在していれば）該対象の分析物を搬送し、可溶性結合試薬を該固相にコンジュゲートさせる。分析物が存在していれば、分析物：コンジュゲート複合体が形成され、固定化される。
【００１０】
この第１の流路によって搬送された試料の量は、該デバイスに添加された試料の量によってではなく、該固相の吸収能によって決定され、ユーザーが該試料を測定する必要を取り除く。該試料／コンジュゲート混合物が第２の流路に流入しないように妨げられている。何故ならば、該キャピラリティーおよび該第２の流路の表面エネルギーが、それがこの混合物に濡れないように妨げているからである。
【００１１】
該第２の流路は、洗浄試薬が未結合コンジュゲートおよび試料を該固相から該吸収剤に移せるようにし、所望により、検出試薬を送達できるようにする。該第２の流路に沿った洗浄試薬の流動は該第１の流路への試料の添加直後に、該デバイスのユーザ始動によって開始される。洗浄試薬が該固相に移動し、それを通って、およびそれの周りを流動したとき、それは未結合試薬を除去し、それを該吸収剤に運ぶ。その結果、該固相中の該試料および試薬のインキュベーション時間は、該第２の流路に沿った洗浄試薬の流動時間によって決定され、特定の時刻にユーザーが介在する要求を取り除く。
【００１２】
一つの具体例において、第１の流路は試料進入ポート、粒状除去用フィルターエレメント、乾燥試薬を含有する開口キャピラリーチャネル、粒状固相を含む。該第２の流路は該第１と交差し、洗浄試薬貯蔵器、吸収剤ブロック、および該貯蔵器から延在する第２の流体経路材料を含み、該固相に接し、最終的に該吸収剤に接する。試料は該第２の流体経路および吸収剤に流入しないように妨げられる。何故ならば、該第２の流体経路材料の表面エネルギーが試料の表面張力と比較して低く、それを疎水性にしているからである。該洗浄溶液は、それが第２の流体経路材料を濡らせるようにする表面活性剤を含有し、かくして、該固相から、試料結合試薬混合物も該第２の流体経路材料に流入するようにする。
【００１３】
本発明は多くのアッセイフォーマットに適用することができ、サンドイッチ免疫アッセイ、コロイド状金またはゾル粒子アッセイ、不均一遺伝子捕獲アッセイおよび競合アッセイを含む。
一つの具体例において、サンドイッチアッセイは分析物結合試薬を該固相上に固定化し、次いで、該第１の流路中で標識化分析物結合試薬を乾燥させることによって実行し得る。競合アッセイの具体例において、該第１の流路は該試料によって溶解された標識化分析物を含有するであろう。また、該分析物結合試薬は該固相上に固定化される。これらの具体例のそれぞれにおいて、該アッセイは、「遺伝子捕獲」フォーマットにおいて実行するようにさらに改良され得る。そこでは、該固相結合試薬が、代りに、ビオチンのごとき遺伝子リガンドにコンジュゲートされ、および（他のアッセイ試薬と共にかまたは別々にかのいずれかで）該第１の流路中で乾燥され、ならびに（アビジンのごとき）遺伝子リガンド結合試薬は該固相上に固定化される。
【００１４】
本発明のもう一つの局面は、プラスチックハウジングおよび流体および／または洗浄溶液を送達する手段を含む免疫アッセイデバイス用のサブアセンブリーを含む。このサブアセンブリーは疎水性ポリマーから形成される構造体を含む。該疎水性ポリマーは、有機溶媒中の溶液として入っている非水溶性界面活性剤で選択的に処理され、表面の部分が親水性になっている。該表面が水性液体に接したとき、それは該処理領域に沿ってのみ流動し、規定された液体流路を作り、それによって、試料／コンジュゲート溶液を該固相に送達する。
【００１５】
特許請求されたデバイスのもう一つの局面はソックレットと呼ばれる固相サブアセンブリーを含む。該ソックレットは、該試料および液体試薬に対して浸透性であるが、粒状固相物質が当該構造体から出ないように妨げる構造体内部に捕獲する粒状固相物質を含む。
【００１６】
好ましい具体例の詳細な記載
アッセイ方法
本発明は、試料中の少なくとも１の標的分析物の存在を検出する診断デバイスおよび方法を含む。図１は、本発明による１の好ましい具体例の側面を示す。一般に、本発明のデバイスは約１〜３０ｍｍの厚さ、約３〜１５ｃｍの長さ、約１〜１０ｃｍの幅を有する。デバイスサイズは審美的、人間工学的および性能的な多数の因子によって決定される；例えば、幅は試料送達チャネル１０２の数に影響され、長さは所望される結果を得るまでの時間に影響され、および厚さは貯蔵器および吸収剤ブロック材料の選択に影響される。図１に描写されたデバイスは本発明のデバイスのいくつかの一般的特徴を示す。該デバイスは種々のエレメント：試料進入ポート１００、プレフィルター１０１、１以上の試料送達チャネル１０２、ソケット１０４、固相１０５、第２の流体経路材料１０８、洗浄試薬貯蔵器１０９、基質試薬貯蔵器１１０を含む。該洗浄試薬貯蔵器１０９および該基質試薬貯蔵器１１０は両方ともランセット１１４ＡおよびＢを有し、それらは開放機構および芯を有する。
【００１７】
図１を参照すると、該試料は該試料進入ポート１００に添加され、プレフィルター１０１を通って流動する。該試料進入ポート１００は、試料を受け、当該アッセイを開始するための望ましい場所にそれを送達するデバイスハウジング中のいずれの開口でもあり得る。複数の試料送達チャネル１０２も該デバイス中に組み込むことができる。例えば、１の試料が複数の分析物の存在につきテストされるならば、一旦該試料が適用されれば、等分割量が複数の試料送達チャネルに入れるように該デバイスを設計する。以下、複数の試料送達チャネルを持つデバイスをより詳細に説明する。一旦、該試料がプレフィルター１０１を通過すれば、該試料は乾燥されたコンジュゲート可溶性結合試薬１０３が配置されている該親水性試料送達チャネル１０２に流入する。該液体試料が試料送達チャネル１０２に進入したとき、該コンジュゲート可溶性結合試料１０３は該試料溶液に溶け込み可動化される。該試料とコンジュゲートとを混合して、結合反応が開始するようにする。アッセイフォーマットに依存して、結合試薬と該試料中の分析物との間で複合体が形成されるであろう。これらの結合相互作用は形成するまで継続し、一方、試薬は該試料送達チャネル１０２を流動し続ける。
【００１８】
一旦、該試料／コンジュゲート混合物が試料送達チャネル１０２の遠位端部に到達すれば、該試料／コンジュゲート混合物は該固相１０５に流動する。この具体例は、粒状固相材料を保持する親水性メッシュであるソックレット１０４を用いる。本発明は、例えば、非粒状固相材料が選ばれた場合、ソックレットなしで実行することができる。図２は固相１０５を収納するソックレット１０４を用いる好ましい具体例を描写する。選択された流体材料の物理的特性、特に、それらのキャピラリティーおよび表面エネルギーが、該試料／コンジュゲート混合物が試料送達チャネル１０２から固相１０５に引き込まれることを保証する。親水性固相１０５の飽和が、（該試料中に存在すれば）該分析物、コンジュゲート結合試薬１０３、（およびこれらの要素のプリフォームド複合体）の間の相互作用を可能にして、固相１０５に不可逆的に結合する固定化された捕獲試薬と組み合わせる。該対象の分析物が該試料中に存在するならば、コンジュゲート可溶性結合試薬−対象の分析物−固定化された捕獲試薬複合体が形成され固相１０５に固定化される。
【００１９】
一旦、該固相が飽和すれば、該第１の流路内の流動が完了し、流動が停止する。何故ならば、該固相１０５は、該試料に濡れていない第２の流体経路材料１０８内部に収納されているからである。第２の流体経路材料１０８は、かくして、該試料の流動に対する「バリア」として作用し、該試料が該第１の流路内のみを流動し、それを飽和させるが、該第２の流路に進入しないようにする。この第２の流体経路材料１０８は該第２の流路の構成要素である。このように、該デバイスによってテストされる試料の体積は、固相１０５に吸収される試料の体積によって正確に制御される。該デバイス自体がテストされる試料の体積を制御するので、当該テストオペレータは、該試料を正確に計り取る必要から免ぜられる。
【００２０】
コンジュゲート可溶性結合試薬１０３を含有する試料での固相１０５の飽和は、前記の結合反応が起るようにする。該結合反応が起っているの時間は、該試料混合物が固相１０５内に滞在する時間によって決定される。該試料滞在時間は該第２の流路の第２の流体経路材料１０８内を流動する洗浄溶液１０９の到着によって制御される。
【００２１】
該第２の流路は、以下のように、洗浄試薬１０９および／または基質試薬１１０を該固相１０５に送達する。該第２の流路に沿った流動は、始動ボタン１０６を押すことによって該デバイスが始動されたときに開始する。図４を参照すると、該洗浄試薬１０９および該基質試薬１１０の貯蔵器はランセット１１４ＡおよびＢによって穿孔され、該洗浄および基質試薬は同時に開放される。洗浄試薬１０９および／または基質試薬１１０は該第２の流体経路材料１０８内に流入し、そこを通って該固相１０５に向かう。該第２の流体経路材料１０８は最初疎水性であるが、洗浄試薬１０９は濡れることが可能であり、この材料１０８を通って流動する。何故ならば、該洗浄試薬は該第２の流体経路材料の表面張力を変化させる界面活性剤を含有し、該第２の流体経路材料１０８を親水性材料に「変換」するからであり、かくして、該洗浄試薬１０９が流動するようにする。該洗浄試薬１０９がソックレット１０４に到達したとき、洗浄試薬１０９の一部は該第２の流体経路材料１０８に沿って流動し続け、該ソックレット１０４を通過し、該芯１１２を通って、該吸収剤１１１に流入する。このように、該ソックレット１０４と該吸収剤との間に、今や該洗浄溶液によって親水性にされた第２の流体経路材料１０８を用いて、流動橋を確立する。この流体性の橋は該第２の流路とソックレット１０４との間の「バリア」を排除し、ソックレット１０４内に含有される試料および未結合試薬を吸収剤１１１に流入させる。一旦、第２の流路が確立されれば、固相１０５の効率的な洗浄が行われる。何故ならば、洗浄試薬１０９は、固相１０５の上方、周囲および内部を流動し、固相１０５内の試料および未結合試薬を吸収剤１１１に流入させるからである。
【００２２】
図３は該第１の流路をより詳細に描写する。矢印は、試料進入ポート１００への試料添加後の流路を示す。図４は該第２の流路をより詳細に描写する。図４は該第２の流路の概略側面図であり、矢印で流体の動きを描写する。この具体例において、該第２の流体経路材料１０８が親水性になり、残留試料は該試料送達チャネル１０２から吸収剤１１１に引き込まれる。何故ならば、該第２の流体経路材料１０８の一部が試料送達チャネル１０２に接しているからである。
【００２３】
該第１および第２の流路に対して選択された材料間の相互作用は該第２の流路を作製するのに重要である。一旦、該流路間の境界が取り除かれると、吸収剤ブロック１１１は充分なキャピラリティーを生じ、該試薬を吸収剤１１１に引き込み、該第１の流路から第２の方向に流動する分離された第２の流路を維持する。液体をこの新たな方向から送達して、該流路間の境界の開口を制御する。
【００２４】
洗浄工程はいずれの未結合試薬の除去に対しても重要であり、非特異的結合を減少させ、それによって、アッセイ能力を増強する。特許請求された本発明のデバイスは清浄な洗浄溶液の制御された送達を可能にするように設計される。一つの好ましい具体例において、この制御された送達は固相１０５および該洗浄試薬貯蔵器の配置（すなわち、両者間の距離）に依存する。
【００２５】
もう一つの好ましい具体例において、該デバイスは、固相１０５の配置を考慮することなく、該洗浄溶液による該流路間の境界の開口を工作するいくつかの異なる方法で製造し得る。例えば、流路を該固相の下方ではなく、該固相接触ゾーンの周囲に工作することができる。いくらかの洗浄／基質試薬が該吸収剤に到達し、それゆえ、試料洗浄を開始し得ることを保証する第２の流路を工作する多くの方法がある。
【００２６】
該コンジュゲート可溶性結合試薬１０３が基質を必要とするならば、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いるならば、該基質試薬は該洗浄試薬の流路に続く。該固相上で発色される色は、該試料中に存在する対象の分析物のレベルに比例する。あるいは、用いるディテクターコンジュゲート結合試薬１０３は、例えば、コロイド状金もしくは蛍光性タグにコンジュゲートした基質または電気化学的ディテクターを必要としない。この場合、該基質試薬貯蔵器は該デバイスのパーツとして含まれないであろう。
【００２７】
図１に対するなおもう一つの代替具体例において、電気化学的センサーで該分析物が検出されるように、該デバイスを修飾し得る。該固相１０５およびソックレット１０４は、該固相担体パーツ上の凹部に印刷された一組の電極（動作、対向および参照電極）に置き替えられる。印刷された導電性経路は該デバイスの端部にまで延在する。試料送達チャネル１０２は、（所望により、キャピラリティー誘導材料または構造体を含有する）電極上の部分に作製されたキャピラリー空間に流入する。疎水性吸収性材料１０８は該空間の上部を含む。該固定化された試薬１０３は該動作電極の表面に付着される。
【００２８】
図１に対するこの代替具体例において、該進入ポート１００に適用された試料はプレフィルター１０１を通り、該試料送達チャネル１０２に沿って移動し、コンジュゲート可溶性結合試薬１０３を溶解する。該試料／コンジュゲート混合物は該電極上の空間に流入し、そこで、流動が停止し、結合反応が起る。該デバイスの始動が該第２の流体経路材料１０８に沿った洗浄溶液の流動を開始させる。該洗浄溶液が該電極上の領域に到達したとき、未結合分析物を含有する試料溶液を該第２の流路に流入させ、該吸収剤１１１に移動させる。さらなる洗浄試薬１０９は該電極上の空間を通って流動し、未結合試薬を効率的に除去する。必要であれば、基質試薬１１０は該第２の流路に沿って連続的に流動し、さらに検出試薬を供給する。結合した分析物の量を電気化学的に検出する。該電極は電極カバー部上に印刷し得、該第１の流路は、該第２の流路材料１０８中のダイカットホール１０７を通過する。なお、表面に依存して他の検出方法がこのデバイスに適用し得るであろう。例えば、当該部分が透明物質で作製されていれば、表面プラズモン共鳴を該結合表面上で測定し得るであろう。
【００２９】
デバイスの構成要素
試料進入ポート
該試料進入ポート１００はプラスチックハウジング中の開口であり、そこから該試料を添加する。一つの具体例において、試料進入ポート１００は固相１０５の上流に位置する。試料を本発明のデバイスに適用することができる様々な方法がある。試料進入の一例は、該デバイスの上部に備えられた試料進入ポートを取り囲む隆起した表面を含むカップ構造を含む。この例において、試料はピペッターまたはシリンジのごとき計量分配装置から該カップ構造に滴下する。該カップ構造は該試料を試料進入ポート１００の周囲に含有させるように働く。もう一つの例において、該試料は試料吸収チップを用いて該デバイスに適用することができる。この例において、該デバイスの狭い端部を該デバイス内に試料を直接吸収するように適合させる。液体浸透性液体チャネルを該装置内部に備えて、該試料を該デバイスの先端から試料送達チャネル１０２に移動させる。この例の利点は、試料を分割するのに計量分配装置が必要でないことである。この例において、該デバイス内に含まれるチャネル構造および固相の総容積は必要とされる試料の体積を制御する。
【００３０】
プレフィルター
試料進入ポート１００はプレフィルター１０１を含有してもしなくてもよい。本発明のデバイスがプレフィルター１０１を含むのであれば、その主な機能は、デバイスを詰まらせ、潜在的にアッセイ結果に干渉し得るいずれの大きな物質をも除去することにある。プレフィルター１０１は、該デバイスの残余部が全血に適用可能であれば、赤血球を除去するのに充分な程の小さい穴が開いている必要はない。しかしながら、赤血球を除去する必要があれば、またはさらなる分離が所望されるのであれば、用いるプレフィルター１０１は、この目的のために当該分野で利用可能なものであろう。好ましい具体例において、単層の親水性媒体を用いる。
多重分析物テストのための好ましい具体例において、該試料は該プレフィルター１０１を通っていくつかの試料送達チャネル１０２に移動する。チャネル１０２のそれぞれは該プレフィルター１０１に接するが、チャネル１０２同士はそうではなくて互いに独立している。この独立が流体的相互作用、および独立したアッセイ間の試薬の相互汚染をを最小限化する。多くの代替が可能であり、望ましいアッセイのタイプに依存する。
【００３１】
試料送達チャネル
好ましい具体例において、該第１の流路は乾燥コンジュゲート可溶性試薬１０３を含有する親水性試料送達チャネル１０２を含む。好ましい具体例は、該試料送達チャネル内に乾燥コンジュゲート可溶性試薬を含み、本発明のいくつかの具体例は、試料が該デバイスに添加される前に、該試料にコンジュゲート可溶性試薬を添加することを含む。該試料送達チャネル１０２の幾何および表面処理は、該試料がプレフィルター１０１から該固相１０５まで移動する時間を制御するように設計される。例えば、プラスチック製キャピラリーチャネルはコロナ処理によって、または非水溶性表面活性剤での処理によって親水性にし得る。該第１の流路も、乾燥コンジュゲート結合試薬を含有する単一または複数の従来の免疫アッセイストリップのごとき吸収性材料を含む他の材料を含む。
該試料送達チャネル１０２は、試料を該プレフィルターから該試料送達チャネルに引き込むのに充分なキャピラリティーを発生するように設計することができる。この場合、システムを設計するとき、各構成要素、プレフィルター１０１および試料送達チャネル１０２の全キャピラリティーを考慮して試料の流動が試料送達チャネル１０２の方向であるようにするべきである。この場合、該システムが作動し、そこで、流体の流動は、流体の流動を誘発する外力に頼るのではなく、該デバイスおよびその構成要素の物理的特性によって決定される。
【００３２】
該試料送達チャネルの主な機能はコンジュゲート結合試薬１０３の貯蔵器として働き、それらが均等に該試料中に分配されることを保証することにあり、また、該試料／試薬混合物の該固相への導管として働くことにある。試料送達チャネル１０２の設計は該コンジュゲートの均等分配を与えるのに重要である。いくつかの具体例において、該試料が該コンジュゲートチャネルを通過するときに、表面トポグラフィーを当該部分に組み込むことによって、該試料の混合を促進することが望まれるであろう。
【００３３】
遺伝子捕獲系において、該試料送達チャネルは、該チャネル内にデポジットされ、乾燥された２つの異なる試薬を有することができる。該試薬は検出可能標識が付着された第１の免疫学的結合試薬（当該コンジュゲート）および受容体分子が付着された第２の免疫学的結合試薬である。
【００３４】
固相材料
該固相１０５は、該結合試薬および該分析物によって形成された反応生成物を結合させる試薬で被覆された材料を含む。固相材料はガラス繊維マット、不織布合成マット、焼結粒状構造体、注型もしくは押出し膜材料または該材料内での接着をの存在で特徴付けられる他の材料であろう。該固相１０５はナイロンまたはニトロセルロースのごとき形成された（成形または注型された）開口細孔構造体であってもよい。該固相１０５はガラス粒子またはポリマー粒子のごとき粒状材料であってもよい。固相１０５は（電極または別の知覚表面のごとき）表面であってよく、該表面と該流路材料とによって境界される規定された流体空間を持つ。
【００３５】
該固相材料は、該デバイスに組み込まれる前に、種々の形状に切り込まれるか、切断されるか、ダイカットされるか、または穿孔されるであろう。生物学的試薬は、所望の形状に形成する前か後に、該材料に塗布することができる。生物学的試薬は不動態的にかまたは共有的にかのいずれかで該材料に付着させることができる。該固相アセンブリーの代替形状の例は、円形、方形／矩形形状、扁平楕円形状または三角形状であろう。
【００３６】
もう一つの具体例において、該固相１０５は粒状材料であり、それは内部接着を含有する構造体に予備形成されない。この具体例において、粒状固相１０５はソックレット内に捕獲される。この具体例において、該固相材料は、無機または有機粒状物、ガラスビーズ、ポリマー粒子よりなる群から選択される。サンドイッチ免疫アッセイの場合、好ましい固相マトリクスは、ビオチン化された結合試薬に対する受容体−結合パートナーであるアビジンで共有的に被覆され、およびそれを有するガラスビーズである。
【００３７】
ソックレット
ソックレット１０４は、液体試薬の流動を阻害することなく固相１０５を物理的に捕獲する親水性メッシュ材料である。この特別の具体例において、ソックレット１０４は該試料および液体試薬に対して浸透性であるが、該粒状固相材料が該構造体から出ないようにする。
【００３８】
第２の流体経路材料
一つの具体例において、該第２の流体経路材料１０８は疎水性媒体によって規定され、その媒体は吸収性材料、プラスチック、不織布ポリエステル繊維材料、または試料／試薬の流動用の経路を備えるように形成されたいずれの他の疎水性構造体を含む。好ましい具体例において、多孔質の第２の流体経路材料１０８は洗浄試薬貯蔵器に接触して配置され、固相１０５に接するように延在し、さらに芯１１２および吸収剤１１１にまで延在する。該第２の流体経路材料１０８は固相１０５を収納するソックレット１０４を取り囲む（図１を引用）。第２の流体経路材料１０８中のダイカットホール１０７は、試料が該試料送達チャネル１０２から固相１０５に移動するようにする。複数の固相１０５アセンブリーの場合、各個数のダイカットホール１０７は該第２の流体経路材料１０８中に作製され、該試料が該第２の流体経路材料１０８を通って固相１０５に送達されるようにする。
好ましい具体例において、該第２の流体経路材料１０８は検出試薬用の流体導管としても働き、洗浄試薬１０９が基質試薬１１０の前に流動することを保証するように構築される。
【００３９】
吸収剤
吸収剤１１１は過剰な試薬の貯蔵器として働き、それは総試料体積および全ての他の液体試薬の総体積のうち過剰体積の液体を収容することが可能である。代替の具体例において、該過剰試薬貯蔵器は、
過剰な液体を保持する成形容器、または折り畳まれているか、もしくは、そうではなくて過剰試薬貯蔵器内に作製されている該第２の流体経路材料の継足し部分である。
【００４０】
試薬系
該コンジュゲート可溶性結合試薬１０３を試料送達チャネル１０２内で乾燥させ、該試料によって溶解させる。サンドイッチ免疫アッセイの例において、好ましい試薬は第１および第２のコンジュゲート可溶性結合試薬１０３を含む。第１のコンジュゲート可溶性試薬１０３は、検出可能標識にコンジュゲートされた抗体（または抗原）であろう。該検出可能標識は、コロイド状金もしくは着色ラテックス粒子のごとき光吸収性粒子、リン光性分子、蛍光性分子または西洋ワサビペルオキシダーゼのごとき酵素であろう。なお、当該検出可能信号は電気化学的またはアッセイ読出しとして当該分野で用いられるいずれの他の信号であり得る。第２のコンジュゲート可溶性試薬１０３は、ビオチンのごとき受容体にコンジュゲートされた抗体（または抗原）であろう。あるいは、本明細書に記載されたアッセイについての結合パートナーは抗原、抗体、リンガンド、受容体、核酸分子、化学反応体、これらの断片、および導通アッセイ(conducting assays)について当該分野で使用される試薬のごとき他のものを含み得る。
該試料中のコンジュゲート可溶性結合試薬１０３の濃度は、該試料による該コンジュゲート可溶性結合試薬１０３の溶解速度、該試料の流速、および試料送達チャネル１０２に適用されたコンジュゲート可溶性結合試薬の量に影響される。
【００４１】
記載された発明のさらなる具体例は、反応体もしくは基質を固相１０５上に固定化し、次いで、生成物質を検出することによるか、または該反応体もしくは基質を該第１の流路に拡散的にもしくは非拡散的に固定化し、次いで、該固相ゾーン中で生成物質を検出することによる酵素的または化学的反応のアッセイを含む。
【００４２】
本発明の様々な具体例
図９に描写されたもう一つの具体例において、該第１の流路は試料進入ポート８１を含み、それは乾燥結合試薬を含有する２つの親水性試料送達／キャピラリーチャネル８２のそれぞれと流体連絡している。各チャネル８２の遠位端部は親水性固相８５の下側と流体連絡している。
【００４３】
該第２の流体経路は、１つの疎水性吸収性材料９０に始まり、それは洗浄試薬を疎水性吸収性材料９０から疎水性チャネル８８へと引き出すキャピラリーアレイ構造体８９に接合されている。このチャネルは２つの疎水性試薬チャネル８７に分れ、それらは該固相８５周囲の環状カップ形状疎水性空間８６に連結する。この空間の遠位側には、１組の疎水性退出チャネル８４が連結され、それらはホール８３に挿入された芯に続く。該芯は該デバイス下の吸収剤ブロック（図示せず）と流体連絡している。
【００４４】
操作において、試料は該ポート８１に進入し、該チャネル８２に流れ落ち、次いで、該乾燥試薬を溶解する。流動は該チャネルまで落ち続け、そこで、該固相８５が飽和したときに、流動が停止する。該試料／試薬混合物の流動は該第２の流路に流入しない。何故ならば、該第２の流路の表面は疎水性だからである。
【００４５】
試料の添加と同時に、該デバイスを始動し、吸収性材料９０に沿って洗浄試薬の流動を開始させる。該洗浄試薬がキャピラリーアレイ構造体８９に到達したとき、それは該疎水性吸収性材料９０から該疎水性チャネル８８に移動する。該流動が環状カップ形状疎水性空間８６に到達したとき、該洗浄試薬の一部が固相８５周囲を通過し、該退出チャネルに行く。これらの表面が該洗浄試薬に濡れることで、それらが親水性になり、次いで、該固相８５中の試薬が該流出チャネル８４へと、および該芯８０へと引き込まれ、引き続き、残留物を洗浄する。酵素増幅アッセイの場合、基質溶液は該第２の流路に沿って、該洗浄試薬の後に続いて流動する。
【００４６】
該コンジュゲート可溶性結合試薬のうち一つの標識が酵素である場合、該基質は該疎水性吸収性材料９０に沿って、該洗浄試薬に引き続いて貯蔵器から流動する。該基質試薬流体経路は該洗浄試薬流体経路に続き、それゆえ、該第２の流路の一部である。該アッセイは、該固相８５中の酵素標識が基質と反応したときに完了する。
【００４７】
図１０に描写された本発明のもう一つの具体例において、全ての流路は疎水性吸収性材料１５０の単一片上に作製される。図１０に示すごとく、疎水性吸収性材料１５０のストリップは非水溶性表面活性剤で印刷されて、試料進入ポート１５１、試料送達チャネル１５２、および固相ゾーン１５３を含む第１の親水性流路を作製する。試料は試料進入ポート１５１に適用され、該該第１の流路に沿って移動し、試料送達チャネル１５２中にデポジットされたコンジュゲート可溶性結合試薬を溶解する。試料／コンジュゲート混合物が固相ゾーン１５３に到達したとき、該試料中の分析物および分析物／試薬複合体は該固相ゾーン１５３に付着された固定化された試薬に結合する。（該非水溶性表面活性剤の限界によって規定される）固相ゾーン１５３は飽和し、流動が停止する。表面活性剤を含有する洗浄試薬は（オペレータによって、または前記例に記載された方法によって）該遠位端部ゾーン１５４に適用され、吸収性材料１５０に沿って移動して、それを親水性にする。該洗浄試薬が固相ゾーン１５３に到達したとき、固相ゾーン１５３内の試料溶液が吸収性材料１５０を通って吸収剤１５５に移動するようにする。さらなる洗浄試薬が固相ゾーン１５３を通って移動し、全ての未結合試薬を除去する。基質試薬が必要ならば、それは該洗浄試薬の後に遠位端部ゾーン１５４に適用され、該洗浄試薬の後に続いて流動する。
あるいは、この具体例における流体経路は親水性吸収性材料のシートから切断し、疎水性吸収性材料１５０に結合させ得る。吸収性材料１５０の下側は親水性吸収剤１５５に接する。
【００４８】
単一または多重分析物テスト用の代替構造体
図５Ａは、単一試料進入ポート１００、単一試料送達チャネル１０２および単一固相１０５アセンブリーを描写する。この構造体は試料あたり単一の分析物をテストするのに有用である。このフォーマットには制御は存在しない。複数単位のこの構造体を単一デバイス内に配置して、複数試料につき単一のテストを実行することができる。複数チャネルの使用は非常に万能である。例えば、コロイド状金サンドイッチアッセイを酵素増幅競合アッセイと並べて設計し得る。あるいは、チャネルを陽性および陰性対照のために用いることができる。
【００４９】
図５Ｂは、単一試料進入ポート１００、２つの分離した試料送達チャネル１０２および２つの分離した固相１０５アセンブリーを持つ構造体を示す。それは２以上の独特の分析物について単一の試料を、または単一の分析物と対照とについて単一の試料をテストするのに用い得る。様々なアッセイフォーマットをこの構造体と同時に用いることができる。複数単位のこの構造体を単一デバイスに組み込んで、複数の分析物について複数の試料をテストすることができる。
【００５０】
図５Ｃは、単一試料進入ポート１００、単一コンジュゲートチャネル１０２および２つの分離した固相１０５アセンブリーを持つ構造体の例を示す。この構造体は、２つの固相１０５に存在する生物学的試薬が異なり、特に１の固相１０５が他方に対する対照として作用する免疫アッセイフォーマットにおいて使用するのに最も有用である。
【００５１】
デバイスの操作
図６は特許請求された本発明のデバイスの１つの具体例を描写する。ユーザーは、少なくとも該試料送達チャネル１０２、プレフィルター１０１および固相１０５を満たすのに充分な体積（例において約３０マイクロリッター）の試料を該試料進入ポート１００に添加し、始動ボタン１０６を押してデバイスを始動する。該始動工程は該ランセット／芯が該洗浄試薬１０９および基質試薬１１０容器上の封を破ってこれらの試薬の流動を開始させる。該試料は該フィルターエレメント１０１通って、該試料送達チャネル１０２に流入する。該試料は乾燥コンジュゲート可溶性結合試薬１０３を溶解し、反応を開始させる。反応混合物は固相１０５に流入し、そこで、第２期の結合反応、すなわち、分析物−コンジュゲート可溶性結合試薬複合体の固相１０５への固定化が起る。該第１の流路は該固相の遠位端部で停止する。該固相１０５中でのインキュベーション時間は該第２流体経路材料１０８に沿った洗浄溶液１０９の通過時間によって決定される。洗浄試薬１０９は該固相１０５から未結合試薬を除去し、基質試薬１１０が該洗浄溶液１０９の後に連続的に続き、そして信号を発する。
【００５２】
任意具体例
他の標識
用いる標識が着色粒子、例えば、コロイド状金、または蛍光性もしくは電気化学的タグである場合、基質は必要なく、アッセイは該洗浄試薬が該固相結合ゾーンから未結合の試薬を除去した後に完了する。
【００５３】
半定量アッセイ
半定量アッセイにおいては、時々、該分析物アッセイ信号を対照反応において発せられたものと比較することによって、デバイスおよび試料のバラツキを補償することが望ましい。この場合、テスト反応および対照反応に対する試薬は該試料送達チャネル中で一緒に乾燥させることができる。この具体例においは、その後、該試料送達チャネルに切り込みを入れ、それぞれが該反応の１に特異的な２つの固相結合ゾーンに供給する。
【００５４】
定量アッセイ
定量アッセイにおいて、該反応の時限工程を正確に制御することによって、正確性および増強された感度を達成することができる。このアッセイデバイスの正確性は、該試料が該試料送達チャネルに滞在する時間、該試料／試薬混合物が該固相に滞在する時間および洗浄後該アッセイが読み出される時間を制御する機器を開発することによって向上させることができる。
【００５５】
実験手順
実施例１
この実施例は、試料中のイヌ心糸状虫抗原を検出するための本発明の方法およびデバイスに関する。
【００５６】
抗心糸状虫−酵素コンジュゲートの調製：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（２０ｍｇ）をｐＨ４．５にて１００倍モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、次いで、１．２５当量量のアフィニティー精製ニワトリ抗心糸状虫抗体と混合する。１．５時間の反応後、該ＨＲＰ−抗体コンジュゲートを１００倍モル当量の水素化ホウ素ナトリウムで還元することよって安定化させ、さらに、０．５時間インキュベートした。コンジュゲート希釈剤中１ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度にてコンジュゲートを貯蔵した。このＨＲＰ−抗体コンジュゲートは、使用前に該デバイスの試料送達チャネル中で乾燥されるコンジュゲート可溶性結合試薬のうちの１つである。
【００５７】
ビオチン化抗心糸状虫抗体の調製：アフィニティー精製ウサギ−抗心糸状虫抗体（２０ｍｇ）をアルカリ性ｐＨにて１５モル当量のビオチン−アミドカプロイル−ＮＨＳエステルと反応させた。未反応ビオチンを透析によって分離した。抗体ビオチン化はアビジン結合のごとき標準方法を用いて決定することができる。このビオチン化抗体は使用前に該デバイスの試料送達チャネル中で乾燥される第２のコンジュゲート可溶性結合試薬である。
【００５８】
固相の調製：１．４ｋｇのホウケイ酸ガラス球（６５μ±１０μ直径）を１．４Ｌの１％アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液（１ｗ／ｖ）と４時間攪拌して、アミノプロピルガラスを製造する。粗孔質焼結ガラスロート上で５Ｌの水で洗浄し、５０℃にて一晩硬化させた後、６００ｇのアミノプロピルガラスを６００ｍＬの５０ｍＭ バルビツール酸バッファー、ｐＨ３．３中４．４％の固体カルボキシルラテックス（８７ｎｍ直径、４３０μ当量／ｇ）５０ｍＬと攪拌した。該ラテックスは、該ガラス懸濁液中に、４０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＡＣ水溶液を３０分間間を開けて２回１０ｍＬ添加して攪拌することによってアミノプロピルガラスを被覆し、次いで、さらなる時間反応させた。２Ｌの０．２Ｍ ＮａＣｌ、引き続き８Ｌの水で洗浄することによって、得られたラテックス被覆ガラスから未結合ラテックスを除去する。ニュートラアビジン(neutravidin)で該ラテックスガラスを被覆するために、洗浄されたラテックス被覆ガラス（６９９ｇ）を６００ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｎ−（モルホリノエチルスルホン酸））バッファー、ｐＨ６．０中に懸濁させ、１０ｍＬの２９ｍｇ／ｍＬ水性ニュートラアビジンと攪拌し、その後、３０分間間を開けて、１４．５ｍＬの４０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＡＣ水溶液を２回添加し、次いで、さらなる時間反応させた。０．１％ツイーン２０を含有する２ＬのバッファーＡ（５ｍＭ リン酸カリウム、０．１％ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、引き続き０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２ＬのバッファーＡ、最後に２ＬのバッファーＡで洗浄することによって、得られたニュートラアビジン−ラテックス−ガラスから未結合ニュートラアビジンを除去した。
【００５９】
記載された固相はいくつかの利点を有する。該ガラス粒子によって決定される孔径は、赤血球が捕えられることなく容易に流動することを許容しつつ、高いキャピラリティーを与える。ラテックス粒子でガラスを被覆することで表面積を増大させて、より大量の試薬を固定化し、かくして、より高速な結合反応を許容する。該ラテックスは非特異的結合も低減し、試薬との容易なカップリングを許容する表面を与える。最後に、原料が安価であり、簡単に入手でき、バルクプロセスで最終固相の調製を許容する。
【００６０】
該アッセイデバイスは以下のように組み立てられる(図１参照）：
１．５．５μｌの固相１０５のスラリーを各２スポット固相担体上にデポジットし、乾固する。
２．予備成形ナイロンメッシュソックレット（Saatitech PA-3121）１０４を該乾燥固相１０５上に熱固着した。
３．２つの０．０９３”ホールの開いた疎水性不織布ポリエステル（Ahlstrom 6627）１０８のストリップを該固相１０５上に熱固着した。この疎水性材料は該デバイスの第２の流体経路材料１０８として働く。
４．各試料送達チャネル１０２は、BioDot QuantiBiojetを用いて、ジアセトンアルコール中のBrij 72界面活性剤の２．５％溶液６８０ｎｌをデポジットすることによって親水性にした。
５．パーツを乾燥させ、２１２ｎｌの５０％スクロースを該表面活性剤層の上にデポジットし、引き続き、乾燥させた。
６．双方ともコンジュゲート可溶性結合試薬１０３として働く、ニワトリ−抗心糸状虫−酵素コンジュゲート（１００ｎｌ、１ｍｇ／ｍｌ）およびビオチン化ウサギ抗心糸状虫抗体（５０ｎｌ、１ｍｇ／ｍｌ）を工程５のパーツの試料送達チャネル１０２の一部中にデポジットし、乾燥させた。
７．ガラス繊維プレフィルター（Ahlstorm 8980）１０１を該試料進入ポート１０１上に置き、プラスチックカバーを該デポジット抗体上に超音波溶接して、試料送達チャネルアセンブリー１０２を作製した。
８．該固相アセンブリー１０５と該試料送達チャネルアセンブリー１０２とを互いに熱固着によって付着させた。
９．吸収剤芯（Filtrona R-14545、接着ポリエステル／ポリエチレン、０．０７８”直径）を該デバイスのホール内に置き、吸収剤酢酸セルロースブロック１１１をこれらの芯に保持した。
【００６１】
イヌ心糸状虫抗原を含有する血清試料を組み立てられたデバイスのプレフィルターに添加した。該試料は該試料送達チャネルに流入し、該デポジット抗体を溶解し、該抗体が該抗原と反応するのを容易にした。反応混合物はさらに、該固相まで該試料送達チャネルを流れ落ち、そこで流動が停止した。該反応混合物中のビオチン化抗体は該固相に結合し、該抗原と抗体−酵素コンジュゲートとの免疫複合体を捕獲した。図９は、この実験で形成された免疫複合体を描写する。
【００６２】
該試料の添加と同時に、疎水性ポリエステルのストリップの端部を０．０２５Ｍクエン酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ケーソン(Kathon)、１％トリトンＸ−１００、０．７５％乾燥ミルク、１５％ ＢＳＡ（３０％液体ストックから）を含有する表面活性剤含有洗浄試薬２５０μｌを含有する貯蔵器に接触させて配置する。該洗浄試薬をｐＨ７．０にし、０．２ミクロンフィルターで濾過する。該洗浄試薬は疎水性ポリエステルのストリップを通って移動し始める。該洗浄試薬が疎水性ポリエステルのストリップの該固相に近接する領域に到達したとき、それは該固相内に移動し、未結合抗体を除去する。該洗浄試薬は疎水性ポリエステルのストリップを通って該吸収剤芯およびブロックへと移動し続け、該抗体を連れて行く。該洗浄試薬貯蔵器が空になったとき、疎水性ポリエステルのストリップは２５０μｌのＴＭＢ基質溶液（Moss、ＴＭＢＭ１０００）を含有する第２の貯蔵器に接触させて配置し、それは該洗浄試薬に続いて該ストリップを通って移動する。該基質試薬が該固相に到達したとき、それは該洗浄溶液と置き替り、該固相中で、結合した抗体−酵素コンジュゲートの量に比例して、青く発色する。陰性血清試料を用いて同様のデバイスを稼動させたときは、可視的な色は発色しなかった（図１０を参照）。
【００６３】
【表１】
0004898061.tif 000002
【００６４】
実施例２
実施例１のデバイスは、コンジュゲートとしてＨＲＰを用いる代りに、蛍光性標識または着色粒子、例えば、コロイド状金をニワトリ−抗心糸状虫抗体に付着させて用いることによって、簡素化し得る。この場合、基質試薬は省略し得、未結合試薬を洗い去った後、信号を見る。
【００６５】
実施例３
単一試薬中で複数の分析物を検出するために、単一試料進入ポートから複数の試料送達チャネルに供給することによって、多重チャネルデバイスを構築する（図７）。各試料送達チャネルは異なるコンジュゲート結合試薬を含有して、異なる分析物を検出する。かくして、４つの固相容器は互いに隣接するように構築される。該アセンブリーは４つの試料送達チャネルでプラスチックパーツに付着される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による一つの具体例の側面図。
【図２】  本発明による好ましい具体例の分解側面図。
【図３】  本発明による好ましい具体例の第１の流路の概略側面図。
【図４】  本発明による好ましい具体例の第２の流路の概略図
【図５】  単一または複数分析物テストのための本発明によるいくつかの代替物を描写する概略図。
【図６】  本発明による一つの具体例の三次元図。
【図７】  本発明による一つの具体例のアッセイ構成要素を描写する概略図。
【図８】  実施例１の具体例を用いたアッセイ結果の写真。
【図９】  本発明によるもう一つの具体例を描写する概略図。
【図１０】  本発明によるもう一つの具体例を描写する概略図。
【符号の説明】
８１・・・図９の具体例を具現するデバイスの試料進入ポート、
８２・・・図９の具体例を具現するデバイスの試料送達／キャピラリーチャネル、
８３・・・図９の具体例を具現するデバイスの芯が通るホール、
８４・・・図９の具体例を具現するデバイスの疎水性退出チャネル、
８５・・・図９の具体例を具現するデバイスの親水性固相材料、
８６・・・図９の具体例を具現するデバイスの環状カップ形状疎水性空間、
８７・・・図９の具体例を具現するデバイスの疎水性試薬チャネル、
８８・・・図９の具体例を具現するデバイスの疎水性チャネル、
８９・・・図９の具体例を具現するデバイスのキャピラリーアレイ構造体、
９０・・・図９の具体例を具現するデバイスの疎水性吸収性材料、
１００・・・試料進入ポート、
１０１・・・プレフィルター、
１０２・・・試料送達チャネル、
１０３・・・コンジュゲート（可溶性）結合試薬、
１０４・・・ソックレット、
１０５・・・固相、
１０６・・・始動ボタン、
１０７・・・第２の流体経路材料中のダイカットホール、
１０８・・・第２の流体経路材料、
１０９・・・洗浄試薬、
１１０・・・基質試薬、
１１１・・・吸収剤、
１１２・・・芯、
１１３・・・プラスチックハウジング、
１１４Ａ・・・ランセット、
１１４Ｂ・・・ランセット、
１５０・・・図１０の具体例を具現する疎水性吸収性材料、
１５１・・・図１０の具体例を具現する試料進入ポート、
１５２・・・図１０の具体例を具現する試料送達チャネル、
１５３・・・図１０の具体例を具現する固相ゾーン、
１５４・・・図１０の具体例を具現する遠位端部ゾーン、
１５５・・・図１０の具体例を具現する吸収剤。
【図１】
0004898061.tif 000003
【図２】
0004898061.tif 000004
【図３】
0004898061.tif 000005
【図４】
0004898061.tif 000006
【図５Ａ】
0004898061.tif 000007
【図５Ｂ】
0004898061.tif 000008
【図５Ｃ】
0004898061.tif 000009
【図６】
0004898061.tif 000010
【図７】
0004898061.tif 000011
【図８】
0004898061.tif 000012
【図９】
0004898061.tif 000013
【図１０】
0004898061.tif 000014