(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、対応する野生型真核生物と比べて、増加したトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ（ＴＰＳ）活性を有する非ヒト真核生物の調製方法：
ａ．植物ＴＰＳタンパク質を準備し、
ｂ．該ＴＰＳタンパク質の配列を、酵母に由来する対応するタンパク質の配列と並べて、ＴＰＳ活性に対する阻害作用と関連するＴＰＳタンパク質のドメインを決定する、
ここで該阻害ドメインは、酵母タンパク質のＮ末端を超えて伸張するＴＰＳタンパク質の該部分に対応する、
ｃ．このＴＰＳタンパク質のＮ末端部分を変異生成または切除することにより、該阻害ドメインの作用を抑制する、
ｄ．構成的、誘導的および／または器官特異的なプロモーターの制御下に、工程ｃ）においてＴＰＳタンパク質のＮ末端部分を変異生成または切除することにより得たかかる改変されたタンパク質に対応する遺伝子を発現ベクターにクローニングする、
ｅ．真核生物の細胞または真核生物の組織を、工程ｄ）において得た発現ベクターでもって形質転換すること。
【請求項２】
少なくとも完全な阻害ドメインが該ＴＰＳタンパク質から削除されている、請求項１の方法。
【請求項３】
真核細胞または組織が植物細胞または組織であって、該形質転換が為され、該形質転換された植物の細胞または組織から完全な植物体を再生せしめる、請求項１または２の方法。
【請求項４】
植物が穀物である、請求項３の方法。
【請求項５】
植物が、コメ、リンゴ、サトウダイコン、ヒマワリ(Helianthus annuus)、タバコ(Nicotiana tabacum)およびダイズ(Glycine max)からなる群から選択される、請求項３の方法。
【請求項６】
該真核生物が真菌類である、請求項１または２の方法。
【請求項７】
該真菌がAspergillus niger、Agaricus bisporus、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、メチロトローフ酵母からなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
該非ヒト真核生物が、タンパク質および低分子の生産に使用される哺乳動物および無脊椎動物の細胞培養物、ならびにバキュロウイルス発現に使用される無脊椎動物の細胞から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
真核生物が、改変されたＴＰＳを持たない対応する真核生物に比して、トレハロース合成活性が増加している、請求項１〜８いずれかの方法。
【請求項１０】
下記工程を含む、改変されたトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ（ＴＰＳ）タンパク質の調製方法：
ａ．植物ＴＰＳタンパク質を準備し、
ｂ．該ＴＰＳタンパク質の配列を酵母に由来する対応するタンパク質の配列と並べて、ＴＰＳ活性に対する阻害作用と関連するＴＰＳタンパク質のドメインを決定する、
ここで該阻害ドメインは、酵母タンパク質のＮ末端を超えて伸張するＴＰＳタンパク質の部分に対応する、
ｃ．このＴＰＳタンパク質のＮ末端部分を変異生成または切除することにより、該阻害ドメインの作用を抑制する。
【請求項１１】
下記工程を含む、改変されたトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ（ＴＰＳ）タンパク質の調製方法：
ａ．植物ＴＰＳタンパク質を準備し、
ｂ．該ＴＰＳタンパク質の配列を酵母に由来する対応するタンパク質の配列と並べて、ＴＰＳ活性に対する阻害作用と関連するＴＰＳタンパク質のドメインを決定する、
ここで該阻害ドメインは、酵母タンパク質のＮ末端を超えて伸張するＴＰＳタンパク質の部分に対応する、
ｃ．このＴＰＳタンパク質の少なくとも完全に阻害ドメインを削除することにより、該阻害ドメインの作用を抑制する。
【請求項１２】
ＴＰＳタンパク質が植物に由来する、請求項１〜１１いずれかの方法。
【請求項１３】
該植物が、テマリカタヒバ(Selaginella lepidophylla)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thalliana)、コメ、リンゴ、サトウダイコン、ヒマワリ(Helianthus annuus)、タバコ(Nicotiana tabacum)およびダイズ(Glycine max)からなる群から選択される、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、トレハロース−６−ホスフェートの活性の増加および／または調節能の変更を有する、植物、動物、真菌類などの真核生物を得る方法に関する。本発明はまた、触媒活性および／または調節能について予想外の変化を発揮するトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼの特異的に修飾された対立遺伝子、およびその構築体を含有する形質転換された植物などの生物に関する。本発明はまた、トレハロース−６−ホスフェートのレベルおよびトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼの活性を測定する新規の方法に関する。
【０００２】
トレハロースの生合成は２つの酵素的工程からなる。すなわち、トレハロース−６−ホスフェートを合成するトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ（ＴＰＳ）により触媒される工程と、トレハロースを形成するトレハロース−６−ホスフェート・ホスファターゼ（ＴＰＰ）により触媒される工程である。トレハロース代謝の遺伝子は最初、トレハロースを蓄積することが長年知られていた酵母や細菌などの生物に発見された。最近、この遺伝子の同族体が、トレハロースが検知されるようなレベルで見つかっていなかった高等植物や高等動物でも発見された。しかし、現在までのところ、これらのＴＰＳ遺伝子産物の酵素的トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性をインビトロで証明することは、不可能であった。異型系におけるこれらの発現も高いトレハロースの蓄積をもたらさない。これらの植物または動物のＴＰＳ遺伝子を用いて、同族系または異型系における商業的に重要な性質を改善することは、報告されていない。
【０００３】
貯蔵糖の蓄積における通常の役割に加えて、トレハロース代謝が、ストレス耐性、グルコースの分解機構への進行の制御、グルコース誘導の情報伝達において主要な役割を果たすことは、知られている。下記するように、これらの表現型の性質は高度に産業上の重要性がある。
【０００４】
強力な、または完全ともいえる脱水の下でも生存適用について感嘆すべき能力が酵母細胞、真菌胞子、ある種の無脊椎動物、甦生植物に存在している。これらの生物は水と接触するとすぐに機能を再開する。これらの無水耐性生物はまた、凍結、高度の真空、大量のイオン照射、高圧、非常な高温に損傷をこうむらないで耐えることができ、その多くは、タンパク質および膜の保護物としてニ糖類トレハロースを減少しないで蓄積する。
【０００５】
トレハロースの保護機能もインビトロで証明されている。トレハロースを細胞、機能質、酵素、抗体、食物に加えると、これらのものを長期間の全脱水下で保存する。また、種々の別のストレス、例えば、高温、高圧、凍結などから保護する。
【０００６】
維管束植物において、極く少数種でトレハロースの存在が確実に証明されている。また、いわゆる砂漠甦生植物 Selaginella lepidophylla に高レベルのトレハロースが存在する。この植物は、農産物を含む他のすべての高等植物と異なり、完全な脱水に耐えることができる。
【０００７】
細胞および酵母におけるＴＰＳ遺伝子の欠失変異体はトレハロースを合成できず、浸透圧耐性、熱耐性、高圧耐性を欠いている。これは、ＴＰＳ遺伝子が種々の型の耐性に関与することを示している。
【０００８】
植物、動物、微生物またはこれらの特殊な部分にストレスに対する耐性を付与するために、これらの生物でトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼの活性を発現することが非常に望ましい。そうすると、農産物を、熱、旱魃、凍結を時にまたは継続的に蒙る地域において栽培することができる。植物や動物に由来する腐りやすい食物は、簡単な脱水で保存でき、長時間および遠距離の輸送における貯蔵ができる。
【０００９】
本発明は初めて、トレハロースが普通はつくられないか、検知され得るようなレベルで蓄積しない生物、例えば、高等植物や高等動物において、高度のトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性および高度のトレハロースの蓄積を得ることを可能にした。従って、本発明は初めて、高等植物や高等動物におけるトレハロース蓄積の高度に効率的で制御された使用を可能にし、ストレス耐性を高める。
【００１０】
本発明におけるこの達成は、特異的に修飾されたＴＰＳ遺伝子の構成的、誘導的および／または器官特異的な発現を示す、植物、動物、真菌類などから選択される真核生物の調製方法による。この方法は次の工程を含む。
【００１１】
ａ）ＴＰＳ遺伝子を準備し、
ｂ）ＴＰＳ遺伝子に対する適切な修飾を、該遺伝子を酵母の対応遺伝子と並べることにより設計し、そして遺伝子のどの部分が酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するかを確証し、
ｃ）トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性の増加を達成するために、酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するＴＰＳ遺伝子のＮ末領域の部分、好ましくはその完全な伸張部分を欠失または不活化し、
【００１２】
ｄ）修飾遺伝子を発現ベクターに構成的、誘導的および／または器官特異的なプロモーターの制御下にクローニングし、
ｅ）得た発現ベクターでもって植物の細胞または組織を形質転換し、
ｆ）形質転換した植物の細胞または組織から完全な生物を再生せしめる。
【００１３】
酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するＴＰＳ遺伝子のＮ末領域の部分不活化は、変異生成によりなし得る。
【００１４】
本発明によって、植物由来の種々の遺伝子の末端切除で、酵母で発現したときに機能を増加できることが分かった。トレハロースの蓄積の増加および高度のトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性が、非切除の遺伝子に比して、認められた。構成的、誘導的および／または器官特異的なプロモーターを用いると、発現を種々の仕方で修飾および制御できる。誘導は、果実などの組織特異的であり、時間特異的であり、環境状態の変化によってなされる。後者の例としては、熱誘導や旱魃誘導がある。
【００１５】
熱耐性を付与するための修飾ＴＰＳ遺伝子の機能は次のシステムで確認できる。トレハロースは酵母における熱耐性の獲得に必要である。ｔｐｓ１△およびｔｐｓ１△ｔｐｓ２△酵母欠失変異体は熱感性であり、表現型が対応同族遺伝子での相補性により修復される。植物または動物のＴＰＳが酵母ＴＰＳ１と機能的に類似かどうかを決定するために、所望の遺伝子を有するプラスミドで形質転換されたｔｐｓ１△およびｔｐｓ１△ｔｐｓ２△酵母変異体を熱耐性の獲得について試験する。細胞の熱耐性獲得能を致死熱ショックで測定する。
【００１６】
酵母においてトレハロース代謝はグルコースについての生長に必須である。ＴＰＳ遺伝子の欠失はグルコースの分解機構への非制御的進行を起こし、糖ホスフェートの過剰蓄積および遊離ホスフェートとＡＴＰの喪失をもたらす。トレハロース−６−ホスフェートはインビトロでヘキソキナーゼ活性を阻害することが知られており、ＴＰＳ酵素がヘキソキナーゼ活性を制限してインビボでもその制御を行うと考えられる。
【００１７】
グルコース誘導情報伝達、およびスクロースなどの関連する糖により直接的または間接的に誘導される情報伝達も、酵母などにおける外因性の糖の利用性や、光合成植物または動物の消化系などにおける糖の内部での産生に対する適切な反応について多くの生物で重要な役割を演じる。酵母において外因性のグルコースまたは関連の糖の存在は、エタノールの最大産生および迅速な生長を起こすいくつかの情報伝達経路を生起する。光合成植物において糖誘導情報伝達は、光合成活性、および供給源（光合成部分）と受容器官（非光合成部分、特定の根、種子、果実における）との糖の分配を調節する。動物において糖誘導情報伝達は、貯蔵器官による糖の吸収速度を調節する。例えば、肝臓による血糖グルコースの吸収速度を調節する。
【００１８】
酵母のＴＰＳ変異体はグルコース誘導情報伝達を欠如する。欠如はヘキソキナーゼ活性のトレハロース−６−ホスフェート阻害の不存在によると考えられる。高等植物において、トレハロースは検知できる量では蓄積しないが、トレハロース代謝遺伝子の機能はよくわかっていない。異種ＴＰＳまたはＴＰＰ遺伝子が発現される植物は、光合成活性および供給源−受容部の糖分配を変えて、糖誘導情報伝達経路に対する正の効果を示す。これは、ＴＰＳまたはＴＰＰ遺伝子の発現により生じたトレハロース−６−ホスフェートのレベル変化に起因すると考えられる（特許出願 Zeneca-Morgan 6047 PCT)。
【００１９】
本発明において、予測できない状態が示すように、植物ＴＰＳ遺伝子のＮ末端を切除すると、その触媒活性および調整能が増加する。従って、本発明は、高等植物および場合により動物における糖誘導情報伝達をより効率的に変化せしめ得る。さらに、これが達成できるのは、いかなる植物および動物の種においても原則的に同族的遺伝子修飾、すなわち、同族ＴＰＳ酵素の末端切除型の発現による。
【００２０】
本発明において、糖誘導情報伝達におけるこの変更は、ストレス耐性の改善について上記したのと同じ工程で達成できる。
【００２１】
グルコースの分解機構への流入についての制御を修復およびグルコース誘導情報伝達を修復するための修飾遺伝子の機能は、次のシステムで確認できる。酵母のＴＰＳ変異体はグルコース上で増殖する能力がない。グルコースの分解機構への流入およびグルコース誘導情報伝達の制御を欠くからである。本発明によって、ｔｐｓ１△酵母株における修飾ＴＰＳ遺伝子の発現がグルコース上での増殖を回復し、増殖に必要な適切なグルコース誘導情報伝達制御の回復を示すことが分かる。
【００２２】
本発明は、そのさらなる態様によって、トレハロース−６−ホスフェートおよびトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼを測定するための新規な方法を提供する。これは、トレハロース−６−ホスフェートの定量について高い信頼性を有する方法である。トレハロース−６−ホスフェートのレベルは、現在まで測定されているすべての生物において、非常に低く、１００−２００μｍの範囲にある。この低濃度のために、通常の方法、例えば、ＨＰＬＣによっては正確な定量が困難であり、信頼性が低い。クロマトグラフィ−法も、サンプルが一度に一つしか測定できないので、長くかかる。別の研究グループは、間接的方法でトレハロース−６−ホスフェートによる酵母ヘキソキナーゼの阻害を用いて、細胞抽出物におけるトレハロース−６−ホスフェートの濃度を検査している（Blazquez M. A., Lagunas R., Gancedo C. and Gancedo J. M ., 1993, FEBS Lett. 329, 51-54)。しかし、一般に、このような検定法は、細胞抽出物中に存在する他の化合物と作用しやすい。特に、酵母には存在しない多くの化合物を含有する植物や動物などの生物から誘導されるとき、その傾向がある。
【００２３】
本発明において、トレハロース−６−ホスフェートのレベルの定量は、精製ホスホトレハラーゼ酵素、好ましくは Bacillus subtilis 由来の酵素を用いる新規の酵素検定法で達成できる。この方法は次の工程を含有する。
【００２４】
ａ）分析すべき細胞の抽出媒体、好ましくは強酸での抽出。これはすべての酵素活性を破壊するが、トレハロース−６−ホスフェートを変性しない、
ｂ）抽出物の中和、
ｃ）抽出物の遠心分離、
【００２５】
ｄ）上澄み液中に存在するトレハロース−６−ホスフェート含有の酸性化合物の、アルカリ性および中性の化合物からの分離。好ましくはアニオン交換カラムによる、
ｅ）酸性化合物を含有するフラクションを Bacillus subtilis 由来の精製ホスホトレハラーゼで処理し、トレハロース−６−ホスフェートをグルコース−６−ホスフェートおよびグルコースに定量的に変性さし、
【００２６】
ｆ）工程ｅ）で産生されたグルコースを、産生されたグルコース−６−ホスフェートおよび残留の糖ホスフェートから、好ましくは２回目のアニオン交換カラムにより分離すること、
ｇ）グルコースの存在を、好ましくはグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ検定法により測定すること。
測定したグルコースレベルは、細胞抽出物中に元々存在するトレハロース−６−ホスフェートのレベルと等しい。
【００２７】
トレハロース−６−ホスフェートの測定に確立した方法を、トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性の測定に拡大できる。現在まで、トレハロース−６−ホスフェート形成の割合に直接的に基づくトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性の測定をするのに利用できる方法はなかった。トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼは、基質グルコース−６−ホスフェートおよびＵＤＰグルコースからのトレハロース−６−ホスフェートおよびＵＤＰを触媒する。
【００２８】
トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性を測定するのに広く使用されている普通の方法では、酵素の第２産物、ＵＤＰのの形成を測定する（Hotiger, T,., Schmutz, P., and Wiemken, A., 1987, J. Bacteriol. 169: 5518-5522)。しかし、細胞抽出物中の他の酵素、例えば、グルコーゲン・シンターゼが存在して、ＵＤＰをつくり得る。トレハロース−６−ホスフェートの形成を直接測定する方法が非常に好ましい。さらに、該方法では、ＵＤＰを測定し得る前に反応の終了を要するので、時間関数で酵素機能を継続的に測定できない。
【００２９】
本発明により今回、精製ホスホトレハラーゼ酵素のよって一度に２つの目標を達成できることが分かった。この目的のために組み合せ検定法を開発した。ここでは、トレハロース−６−ホスフェートをグルコースに精製ホスホトレハラーゼによって直接的かつ継続的に変換し、産生されたグルコースをグルコース・オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法を用いて継続的に測定する。この検定法において、ホスホトレハラーゼ、グルコース・オキシダーゼおよびペルオキシダーゼは過剰に存在し、細胞抽出物中のトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼが着色産物形成の制限因子である。
【００３０】
本発明はさらに、特異的に修飾されたＴＰＳ遺伝子の構成的、誘導的および／または器官特異的な発現を示す植物などの真核生物に関する。この植物などの真核生物は、本発明方法によって得ることができる。本発明はさらに、この植物の種子や植物学的に再生可能構造、例えば、挿木、体細胞胚、原形質、およびこれらの種子および構造に由来する子孫の生成に関する。本発明はさらに、他の真核生物のさらなる子孫にも関する。
【００３１】
ＴＰＳは、植物など種々の源に由来し得る。特に、Selaginella lepidophylla、Arabidopsis thaliana、コメ、リンゴ、サトウキビ、ヒマワリ（Helianthus annus）、タバコ（ Nicotiana tabacum）、ダイズ（Glycine max）に由来する。種々の遺伝子を同族および異種の環境で発現させ得る。
【００３２】
形質転換する真核生物は、植物であり、遺伝子が由来しＴＰＳ活性が得られるように修飾される植物、または異種の植物である。修飾した遺伝子に特に好ましい宿主は、農作植物、特に、本来的にはストレス耐性がないが、本発明方法によりストレス耐性が得られる植物である。あるいは、修飾の目標は、植物の全体または特殊な部分において光合成生産能を増加すること、および／または炭素分配を改善することである。
【００３３】
形質転換する他の真核生物は、真菌、動物、動物細胞である。ＴＰＳ活性の増加に有益な真菌の例として、Aspergillus niger、Agaricus bisporus、Pictia pastoris、Kluyveromyces lactis、メチロトローフ酵母がある。酵母の例は Saccharomyces cerevisiae である。動物細胞は、例えば、タンパク質および低分子の生産に使用される哺乳動物および無脊椎動物の細胞培養物、およびバキュロウイルス発現に使用される無脊椎動物の細胞である。
【００３４】
本発明を下記の実施例でさらに説明するが、制限することを意図するものでない。
【００３５】
実施例
一般材料と方法
試薬
ベーカー（Baker）またはシグマ（Sigma)の分析用特別試薬を使用した。制限酵素および修飾酵素はベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim）からのものであった。ＺＡＰｃＤＮＡ合成キット、Ｕｎｉ−ＺＡＰ・ＸＲベクターおよびギガパック（Gigapack）IIゴールド・パッケージ抽出物はストラタジーン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems)（ＵＳＡ）から入手した。ヌクレオチド配列を決定するシークエナーゼ・バージョン（Sequenase Version）２.０キットは合衆国バイオケミカル・コーポレーション（Biochemical Corporation）（ＵＳＡ）から購入した。
【００３６】
テマリカタヒバ（フッカツソウ）（Selaqunella lepidophylla, Hook. & Grev. Spring.)はメキシコ・モレロス（Morelos）州およびオアハカ（Oaxaca)州の乾燥地帯の岩石土壌から乾燥状態で採集した。次いで、これをコンビロン（Conviron）増殖チャンバーまたは温室内で制御条件（平均５０％の湿度と、２４℃、１６時間の照明）下にて栽培した。植物への給水は２Ｌ植木鉢に隔日に水２０ｍｌとした。テマリカタヒバを脱水ストレス処理するために、全草または小葉をワットマン（Whatman）３ＭＭ濾紙上に置き、風乾した。その時点から脱水時間を決定した。
【００３７】
株
ｃＤＮＡバンクを大腸菌株ＸＬ１−ブルーＭＲＦ１に塗付し、ＳＯＬＲ株を用いて“ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット”（ストラタジーン・クローニング・システムズ、カリフォルニア、ＵＳＡ）添付の指示書に従い、ラムダファージからｐブルースクリプトを切出した。大腸菌ＤＨ５アルファ株を用いてサブクローニングし、構築体を調製した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株を用いタバコを形質転換し、プラスミドｐＲＫ２０１３を担持する大腸菌ＨＢ１０１株（Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721）を用い、すでに記載した三親接合法（Bevan, M. (1984)、上記）により、プラスミドｐＩＢＴ３６を大腸菌からアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）に移入した。
【００３８】
ＤＮＡ操作
細菌の形質転換、プラスミドおよびラムダ・バクテリオファージからのＤＮＡ単離などの組換えＤＮＡ技法は標準手法に従い実施した（Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, New York)。放射活性断片の標識化はオリゴヌクレオチドでの“ランダム・プリンティング”により実施した（Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6.130)。
【００３９】
構築体
発現ベクターｐＢＮ３５はｐＢin１９（Bevan, M. (1984)、上記）の誘導体であって、８５０ｂｐのカリフラワー・ウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Guilley, H., Dudley, K., Jonard, G., Richards, K., & Hirth, L. (1982) Cell 21: 285-294）をｐＢin１９のＨindIIIとＳalI部位間に、またＴ−ＤＮＡノパリン・シンセターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを構成する２６０ｂｐ断片（Bevan, M., Barnes, W. & Chilton, M.D. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 369-385）を同じベクターのＳacIとＥcoＲＩ部位にサブクローニングして構築したものである（図４）。
プラスミドｐＩＢＴ３６（図５）はｓｌ−tps/pｃＤＮＡを発現ベクターｐＢＮ３５のＢamＨＩとＫpnＩ部位にサブクローニングして構築した。
【００４０】
テマリカタヒバ（S. lepidophylla）ｃＤＮＡバンクの構築
ｃＤＮＡクローンを単離するために、発現バンクは、ＺＡＰｃＤＮＡ合成キット、Ｕｎｉ−ＺＡＰ・ＸＲベクターおよびギガパック（Gigapack）IIゴールド・パッケージング抽出物を用い、２.５時間乾燥したテマリカタヒバ（S. lepidophylla）小葉から単離したｍＲＮＡにより調製した。製造元（ストラタジーン・クローニング・システムズ、カリフォルニア、ＵＳＡ；カタログ＃２００４００、２００４０１および２００４０２９）が提供する“ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット”実験室マニュアルに工程毎に従った。ポリＡ＋ＲＮＡは既知法（Chomczyniski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159）に従い、２.５時間乾燥したテマリカタヒバ（S. lepidophylla）小葉から抽出した。バンクの当初の力価は１ｍｌあたり２×１０６バクテリオファージ・プラークであったが、増幅後には１ｍｌあたり１.５×１０１１バクテリオファージ・プラークであった。
【００４１】
プラスミド・ｐブルースクリプトＳＫ（−）は実験室マニュアル“ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット”（ストラタジーン・クローニング・システムズ、カリフォルニア、ＵＳＡ；カタログ＃２００４００、２００４０１および２００４０２９）に基づく“ザッピング”技法により、バクテリオファージから切出した。
【００４２】
ＤＮＡ配列決定
挿入断片の逐次欠失は酵素ＥxoIIIおよびヌクレアーゼＳ１により選択したクローン（Henikoff, S. (1984) Gene 28: 351-359）から創製し、次いでジデオキシヌクレオチドによる鎖成長終結法を用いてそのヌクレオチド配列を決定した（Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)。ＤＮＡ配列はウイスコンシン大学遺伝学コンピュータ・グループ（ＵＷＧＣＧ）ソフトウエア・パッケージ（Devereux, J. Haeberli, P. & Smithies, O. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 387-395）により分析した。疎水性プロットは既知プログラム（Kyte, J. & Doolittle, R. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132）を用いて入手し、ベストフィット（BESTFIT）プログラムによるタンパク質配列平衡整列はＵＷＧＣＧパッケージに含まれていた。
【００４３】
核酸のハイブリダイゼーション
バンクをスクリーニングするために、バクテリオファージ・プラークをハイボンド（Hybond）ナイロン膜（アマーシャム・ライフ・サイエンス（Amersham Life Sciences））に転移し、ＤＮＡを変性する常套法により処理した（Sambrook, J. et al.（上記）Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。濾紙はポリヌクレオチド・キナーゼにより３２Ｐ同位元素で標識したオリゴヌクレオチドにより、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ−ＮaＣlおよび０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム）を３７℃で用い、ハイブリダイズさせた。濾紙は３回洗浄したが、各洗浄同一温度で１０分間とし、以下の条件によった：６×ＳＳＣ；４×ＳＳＣ；および２×ＳＳＣ。
【００４４】
サザンおよびノーザン・ゲルブロット技法は、以下の修飾を加えた標準プロトコール（Sambrook, J. et al. 上記）に従い実施した。ゲノム・サザン法については、ＤＮＡをＴＢＥ緩衝液中０.８％アガロース・ゲル上で分画し、ハイボンドＮ＋ナイロン膜（アマーシャム・ライフ・サイエンス）に転移した。該濾紙は６５℃で２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ−ＮaＣlおよび０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム）を用い、プローブとして３２Ｐ同位元素で標識したｓｌ−tps/pｃＤＮＡによりハイブリダイズした。濾紙は３回洗浄したが、各洗浄同一温度で２０分間とし、以下の条件によった：２×ＳＳＣ；１×ＳＳＣ；および０.５×ＳＳＣ。ノーザン法については、ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒド・緩衝液中で１.２％アガロース・ゲルを使用し、ハイボンドＮ＋ナイロン膜を転移に使用した。ハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミドと２×ＳＳＣ中４２℃とした。濾紙の連続３回の洗浄はそれぞれ５５℃で、２×ＳＳＣ、２×ＳＳＣおよび１×ＳＳＣにより実施した。
【００４５】
タバコの形質転換
タバコ（Nicotania tabacum var. SR1）の形質転換はプラスミドｐＩＢＴ３６を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株を用い、葉ディスク法（Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) Science 227: 1229-1231）により実施した。葉ディスクはビタミン（Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497)、ホルモン（０.１ｐｐｍのＮＡＡおよび１ｐｐｍのＢＡＰ）および抗生物質（１００μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２００μｇ／ｍｌカルベニシリン）を含むＭＳ培地を容れたペトリ皿中で培養し、４ないし６週間で苗条を再生させた。苗条は、抗生物質（１００μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２００μｇ／ｍｌカルベニシリン）を含み、ホルモンもビタミンも含まないＭｓ培地を容れたマゼンタ・ポットに移し、２ないし３週間後に根を再生させた。再生させた植物を土壌入りのポットに移し、増殖チャンバー（２４℃で１６時間の照明）内で栽培し、４ないし６週間内に稔性植物を得た。
【００４６】
トレハロースの定量
トレハロースはトレハラーゼによる分解法により定量した（Araujo, P.S.:, Panek, A.C., Ferreira, R. & Panek, A.D. (1989) Anal. Biochem. 176: 432-436）。可溶性糖類を得るために、新鮮な組織５００ｍｇまたは乾燥組織５０ｍｇ（液体窒素中にて凍結）をミクロ遠沈管用ホモジナイザーにて、１００ｍＭ−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.０）中粉砕した。４倍容量の無水エタノールを加え、サンプルは蒸発を避けるためにネジ式キャップで蓋をしたチューブ内で１０分間沸騰させた。次いで、ミクロ遠沈管に入れて１３,０００ｒｐｍ、２分間遠沈し、上清を回収した。サンプルは等容量の８０％エタノールで再抽出し、ペレットを真空乾燥した。サンプルは５０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ６.５）０.２５０ｍｌに再懸濁した。
【００４７】
トレハロースの定量のために、トレハラーゼ４μｌ（約１５ｍＵ）を該抽出物１０ないし３０μｌに加え（シグマ・カタログＮｏ．Ｔ−８７７８）、３０℃で２時間培養した。負対照として、抽出物を入れたが、トレハラーゼは入れなかったチューブを用い、正対照としては、純トレハロース（シグマ・カタログＮｏ．Ｔ−３６６３）を入れたチューブを用いた。５０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７.０）により容量を０.５ｍｌとし、シグマ・キット（カタログＮｏ．５１０−Ａ）からのグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ０.５ｍｌ加えて、グルコースを定量した。インキュベーションは３７℃で４０分間とし、４２５ｎｍでの吸光度を直ちに測定した。グルコース濃度を計算するために、０ないし７５ｍＭ間の値での標準グルコース曲線を用いた。トレハラーゼを入れていないチューブの値をこの酵素で処理した値から差引き、グルコース１モルがトレハロース１／２モルであることを考慮して、トレハロースの量を計算した。
【００４８】
酵素活性の定量
トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼの活性を定量するために、本質的に３４０ｎｍでのＮＡＤＨのモル吸光度を測定する共役検定法からなる報告された方法（Londesborough, J. & Vuorio, O (1991) J. Gen. Microbiol. 137: 323-330）に従った。反応は、４０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６.８）緩衝液、１０ｍＭグルコース−６−ホスフェート、５ｍＭ−ＵＤＰ−グルコース、１０ｍＭ−ＭgＣl２およびウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含む１００μｌ容量中で実施した。反応混合物を３０℃で１０分間培養し、２分間沸騰させて反応停止した。チューブを冷却後、４０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６.８）緩衝液、１０ｍＭ−ＭgＣl２、ホスホエノールピルビン酸エステル２.５μｇ／ｍｌ、０.２４ｍＭ−ＮＡＤＨ、３.５単位のピルビン酸キナーゼおよび５単位の乳酸デヒドロゲナーゼ（シグマ・カタログＮｏ．Ｐ−０２９４）を含む９００μｌを加えた。上記同様の条件下でインキュベートし、３４０ｎｍのＮＡＤＨの消失を分光光度法により測定した。トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼの比活性を定量するために、タンパク質濃度をブラッドフォード法により測定した（Bradford, m.m. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254)。
【００４９】
実施例１
ＴＰＳ遺伝子の選択
適切なＴＰＳ遺伝子は様々な方法で選択することができた。植物ＴＰＳ遺伝子を単離するためには２つの主たる可能性がある。まず第一に、ＴＰＳ１遺伝子を欠失しているサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞の機能を相補することが直接的で簡便な方法である。この遺伝子の欠失は酵母において多面発現表現型の原因となる（Van Aelst et al., 1993, Mol. Microbiol. 8, 927-943）。表現型の一つはかかる細胞がグルコース上で増殖し得ないことである。対象となる植物からのｃＤＮＡライブラリーを酵母発現プラスミドに構築することで、ＴＰＳ１を欠失している酵母株を形質転換することができる。形質転換体は次いでグルコースでの増殖の回復について調べることができる。他方、形質転換体でのトレハロースの合成も測定することができる。もし形質転換体がグルコース培地上での増殖能を回復しているか、または再びトレハロースを産生していることが判明するならば、プラスミドＤＮＡを単離して、その挿入断片の配列を決定することができる。次いで、その配列に基づいて真のＴＰＳ同族体またはサプレッサーが単離されたか否かを結論することができる。
【００５０】
第二に、報告されたヌクレオチド配列から推定されるトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼのアミノ酸配列について比較することができる。用いる配列は大腸菌、ＥＣ−otsＡ［Kaasen, I., McDougall, J., Strom, A.R. (1994) Gene 145: 9-15]；シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ＳＰ−ＴＰＳ１ [Blazquez, M.A., Stucka, R., Feldman, H & Gancedo, C. (1994) J. Bacteriol. 176: 3895-3902]；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ＡＮ−ＴＰＳ１ [Wolschek, M.F. & Kubicek, C.P. (1994) NCBI: 配列番号５５１４７１; 未公開］；サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ＳＣ−ＴＰＳ１ [McDougall, J., Kaasen, Y. & Strom, A.R. (1993) FEMS Microbiol. Let. 107: 25-30]；クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis)、ＫＬ−ＧＧＳ１ [Luyten, K., de Koning W., Tesseur, Y., Ruiz, M.C., Ramos, J., Cobbaert, P., Thevelein, J.M., Hohmann, S. (1993) Eur. J. Biochem. 217: 701-713] 由来のものである。
【００５１】
植物同族体単離についての一例として、Ｓｌ−ＴＰＳのｃＤＮＡの単離について本明細書にて説明する。
【００５２】
乾燥したテマリカタヒバ（フッカツソウ）（Selaqunella lepidophylla）をメキシコ・モレロス（Morelos）州およびオアハカ（Oaxaca)州の乾燥地帯の岩石土壌から採集した。次いで、これをコンビロン（Conviron）増殖チャンバー内で２Ｌの花卉上、２４℃、１６時間の照明と平均５０％の湿度下にて栽培した。植物への給水は隔日に水２０ｍｌとした。
【００５３】
ｃＤＮＡクローンを単離するために、２.５時間乾燥したテマリカタヒバ（S．lepidophylla）の小葉５０ｇから単離したｍＲＮＡ５μｇを用いて発現バンクを調製した。ｃＤＮＡを合成した後、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクター１μｇを用いてクローン化した。バクテリオファージに生体外でゲノムを詰込み、次いで縮重したオリゴヌクレオチドの混合物について、報告されている大腸菌および酵母の配列のトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼにおいて共通領域をコードしているものを篩い分けした。単離したクローンの一つは完全コーディング領域をもつｃＤＮＡ（ｓｌ−tps）に対応する（配列番号１）。
【００５４】
推定アミノ酸配列の分析結果は、細菌および種々の酵母の報告されているトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼの配列に比較して、トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼについては５３％の同一性、トレハロース−６−ホスフェート・ホスファターゼについては２９％であった。
【００５５】
ＳＬ−ＴＰＳと呼称されるｓｌ−tpsによりコードされるタンパク質のトレハロース−６−ホスフェート・シンターゼに対する相同性は、前者のＮ末端領域でマップ化し、トレハロース−６−ホスフェート・ホスファターゼに対するＳＬ−ＴＰＳの相同性を全配列について見出すことができる。
【００５６】
テマリカタヒバ（S. lepidophylla）について記載した単離操作は、他の植物、好ましくは単子葉および双子葉植物いずれについても使用することができる。この方法は一般的に応用可能な方法であるが、その理由はイワヒバ（Selaginella) ＴＰＳを取出すために使用した分解オリゴヌクレオチドをシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) にて成功裏に試験し得たからである。ＰＣＲ反応を用い、シロイヌナズナ（A. thaliana) ＴＰＳ遺伝子の断片を単離し得た。この断片に基づき、完全なシロイヌナズナ（A. thaliana) ＴＰＳ遺伝子を単離した（配列番号２）。
【００５７】
実施例２
構築体の調製
１．植物ＴＰＳ遺伝子を含む酵母発現ベクターの構築
完全長Ｓ１ＴＰＳ１遺伝子を含む３.１ｋｂの断片は、エキスパンド・ハイ−フィデリティ（Expand High-fidelity) ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー；Boehringer）によるＰＣＲ（９４℃、３分、１サイクル；９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、２分、４０サイクル；７２℃、１０分、１サイクル）により増幅して得た。オリゴヌクレオチドとして、ＳＬＴＰＳ−Ｓ１（
【表１】
0004948704.tif 000002
、太字は開始コドンを示し、下線はＮcoＩ部位を示す）および共通（
【表２】
0004948704.tif 000003
）プライマーを鋳型としてのｐブルースクリプトＳＫにクローン化したＳ１−ＴＰＳ１ｃＤＮＡと共に使用した。ＰＣＲ−断片をＮcoＩおよびＫpnＩで消化し、ｐＳＡＬ４にクローン化した。酵母ｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ変異株を形質転換し、ＳＤＧal（−ｕｒａ）プレート上で選択した。相補性はＳＤＧ１ｃ（−ｕｒａ最少培地プラス１００μＭ−ＣuＳＯ４）にて検定した。
【００５８】
Ｎ末端欠失構築体の構築には、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：オリゴ５’ＳＬＴＰＳ−１００
【表３】
0004948704.tif 000004
、太字は開始コドンを示し、下線はＮcoＩ部位を示す。オリゴ３’共通
【表４】
0004948704.tif 000005
。
【００５９】
２.８ｋｂ断片は、オリゴヌクレオチドＳＬＰＴＰＳ−１００と共通プライマー、および鋳型としてｐブルースクリプトＳＫにクローン化したＳ１−ＴＰＳ１ｃＤＮＡにより、エキスパンド・ハイ−フィデリティ（Expand High-fidelity) ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー；Boehringer）によるＰＣＲ（９４℃、３分、１サイクル；９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、２分、４０サイクル；７２℃、１０分、１サイクル）により増幅して得た。ＰＣＲ−断片をＮcoＩおよびＫpnＩで消化し、ｐＳＡＬ４にクローン化した。酵母ｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ２Δ変異体を形質転換し、ＳＤＧal（−ｕｒａ）にて選択した。相補性はＳＤＧ１ｃ（−ｕｒａ最少培地プラス１００μＭ−ＣuＳＯ４）にて検定した。
シロイヌナズナ（A. thaliana) ＴＰＳ遺伝子を含む酵母発現ベクターの構築のために、ＲＴ−ＰＣＲを用いた。
【００６０】
１００ｍＭ−ＮaＣl含有の液体ＭＳ培地にて２週間生育したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) ｃｖ.コロンビア実生から抽出した総ＲＮＡ（５μｇ）を、オリゴｄＴ（２５マー）プライマーにより、スーパースクリプト（SuperScript) II（ギブコ；GIBCO）を用い逆転写した。ＰＣＲ反応（９４℃、３分、１サイクル；９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、２分、４０サイクル；７２℃、１０分、１サイクル）は、オリゴＡth／ＴＰＳ−５’（
【表５】
0004948704.tif 000006
；太字は開始コドンを示し、下線はＮcoＩ部位を示す）およびＡth／ＴＰＳ−３’（
【表６】
0004948704.tif 000007
；太字は終止コドンを示し、下線はＮotＩ部位を示す）を用いてＡtＴＰＳ１を増幅するために、エキスパンド・ハイ−フィデリティ（Expand High-fidelity) ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー；Boehringer）により実施した。２.８ｋｂ断片は予期どおりのサイズに対応して入手し、ＮcoＩおよびＮotＩで消化して、ｐＳＡＬ６にクローン化した。酵母ｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ変異株を形質転換した。形質転換体はＳＤＧal（−ｈｉｓ最少培地）にて増殖した。相補性はＳＤＧ１ｃ（−ｈｉｓ最少培地プラス１００μＭ−ＣuＳＯ４）にて検定した。
【００６１】
Ｎ末端欠失構築体の構築には、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
オリゴＡth／ＴＰＳ−ΔＮ５’
【表７】
0004948704.tif 000008
；太字は開始コドンを示し、下線はＮcoＩ部位を示す。
オリゴＡth／ＴＰＳ−３’
【表８】
0004948704.tif 000009
；太字は終止コドンを示し、下線はＮotＩ部位を示す。
【００６２】
１００ｍＭ−ＮaＣl含有の液体ＭＳ培地にて２週間生育したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) ｃｖ.コロンビア実生から抽出した総ＲＮＡ（５μｇ）を、スーパースクリプト（SuperScript) II（ギブコ；GIBCO）とオリゴｄＴ（２５マー）プライマーを用い逆転写した。ＰＣＲ反応（９４℃、３分、１サイクル；９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、２分、４０サイクル；７２℃、１０分、１サイクル）は、オリゴＡth／ＴＰＳ−？Ｎ５’およびＡth／ＴＰＳ−３’を用いてＡtＴＰＳ１を増幅するために、エキスパンド・ハイ−フィデリティ（Expand High-fidelity) ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー；Boehringer）により実施した。２.６ｋｂ断片は予期どおりのサイズに対応して入手し、ＮcoＩおよびＮotＩで消化して、ｐＳＡＬ６にクローン化した。酵母ｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ変異株を形質転換した。形質転換体はＳＤＧal（−ｈｉｓ最少培地）にて増殖した。
相補性はＳＤＧ１ｃ（−ｈｉｓ最少培地）にて検定した。
【００６３】
２．植物ＴＰＳ遺伝子含有植物発現ベクターの構築
植物発現ベクターをクローン化するために、植物トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ遺伝子を酵母ｔｐｓ１Δ変異体にて先ず試験し、次いで適切な植物形質転換ベクターにサブクローン化した。２.９ｋｂのＡtＴＰＳ１および２.６ｋｂのΔＮＡtＴＰＳ１コーディング領域を、プラスミドｐＳＡＬ６：：ＡtＴＰＳ１およびｐＳＡＬ６：：ΔＮＡtＴＰＳ１をＮcoＩおよびＫpnＩ酵素により消化して単離した。この後者の部位はｐＳＡＬ６のＮotＩ部位下流に位置する。
【００６４】
３.１ｋｂのＳ１ＴＰＳ１および２.８ｋｂのΔＮＳ１ＴＰＳ１をコーディングする領域は、同様にプラスミドｐＳＡＬ４．Ｓ１ＴＰＳ１およびｐＳＡＬ４．ｄＮＳ１ＴＰＳ１をＮcoＩおよびＫpnＩ酵素により消化して単離した。ＤＮＡ断片はすべてＡtＴＰＳ１ ５’リーダー、ＸbaＩおよびＮcoＩ部位を含む５７ｂｐの断片に結合した。この断片はオリゴヌクレオチドＮＡ４（
【表９】
0004948704.tif 000010
）およびＮＡ５（
【表１０】
0004948704.tif 000011
）をアニーリングして入手した。
【００６５】
各連結リーダー・コーディング領域カセットはさらにＸbaＩおよびＫpnＩで消化した発現ベクターｐＢＮ３５（図１）に連結し、ＡtＴＰＳ１を含むプラスミドｐＩＢＴ１０１（図２）、ΔＮＡtＴＰＳ１を含むｐＩＢＴ１０２（図３）、Ｓ１ＴＰＳ１を含むｐＩＢＴ１０３（図４）、およびΔＮＳ１ＴＰＳ１を含むｐＩＢＴ１０４（図５）に誘導する。ベクターｐＢＮ３５は、強力な構成的プロモーターであるカリフラワーウイルス（ＣaＭＶ）３５Ｓプロモーター（Guilley, H., et al., Cell 21: 285-294 (1982)) の制御下、如何なる遺伝子の発現をも可能とする。
【００６６】
これらのプラスミドは再生成時にトレハロースを産生し得るアグロバクテリウム系により形質転換された遺伝形質転換植物を得るために使用した。これらの構築体はアグロバクテリウム系を用い、あるいは技術上既知の他の方法により形質転換し得る植物において発現し得る。
【００６７】
発現ベクターｐＢＮ３５はｐＢin１９の誘導体（Bevan, M., Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721 (1984)) であって、ｐＢin１９のＨindIIIとＳalＩ部位間の８５０ｂｐのカリフラワーウイルスＣaＭＶ３５Ｓプロモーター（Guilley, H. et al., 上記）およびＴ−ＤＮＡノパリンシ・シンセターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを構成する２６０ｂｐ断片（Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 11: 369-385 (1983)) を同じベクターのＳacＩおよびＥcoＲＩ部位にサブクローニングすることにより構築した（図１）。
【００６８】
３．ＨＡ標識Ｓ１ ＴＰＳ１、Ａt ＴＰＳ１、ΔＮ Ｓ１ＴＰＳ１およびΔＮ Ａt ＴＰＳ１対立遺伝子の構築
完全長植物ＴＰＳ１遺伝子とＮ末端欠失対立遺伝子間の活性の相違が、前者が酵母細胞中で発現される際に正しいＴＰＳ複合体を形成し得ないことのよるのかどうか決定するために、これら遺伝子の標識化体を調製した。図９に示した図式を、これらの構築体を調製するために用いた。図１０は得られたプラスミドを示す。
【００６９】
植物ＴＰＳ遺伝子を含むプラスミドを２つのユニーク制限部位で消化するが、その一つは遺伝子（Ｒ１）の直後で切断すること、第二は遺伝子（Ｒ２）の３’に近接して切断することである。Ｒ１とＲ２の併用によって除かれる断片は、Ｒ１とＲ２で消化されるＰＣＲによって得られる断片と置換える。Ｒ２部位はＰＣＲ産物内に位置し、一方、Ｒ１部位は逆プライマー（ｒｅｖ）の部分である。逆プライマーの構成は以下のとおりである：
関連遺伝子−３’の６種アミノ酸に対する５’Ｒ１−ＳＴＯＰ−ＨＡ標識コドン
【００７０】
表１は、使用したプライマーを示す：
該プライマーは完全長遺伝子並びにΔＮ対立遺伝子両方に使用することができる。
表１
【表１１】
0004948704.tif 000012
表２
表２は、使用した異なるベクターと制限酵素を示す。
【表１２】
0004948704.tif 000013
【００７１】
実施例３
修飾植物ＴＰＳ遺伝子を有する酵母ｔｐｓ変異体の機能的相補性
１．ｔｐｓ１Δとｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ株の増殖欠陥の相補性
完全長またはＮ末端欠失テマリカタヒバ（フッカツソウ）（S. lepidophylla）またはシロイヌナズナ（A. thaliana）ＴＰＳ遺伝子を含む酵母発現ベクターによりｔｐｓ１Δとｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ株を形質転換した。対照として、野生型のｔｐｓ１Δまたはｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ株を空プラスミドにより、または酵母ＴＰＳ１遺伝子を含むプラスミドにより形質転換した。形質転換体はグルコースおよびフルクトース含有培地上での増殖について試験した。図６は完全なもしくは切断したテマリカタヒバ（S. lepidophylla）ＴＰＳ遺伝子を含む酵母発現ベクターにより形質転換した野生型およびｔｐｓ１Δ株のグルコースおよびフルクトース含有培地上での増殖を示す。レーンは以下のとおりである：１．ＷＴ；２．ｔｐｓ１Δ；３．ｔｐｓ１Δ＋ΔＮＴＰＳ１ Ｓ１；４．ｔｐｓ１Δ＋ＴＰＳ１ Ｓ１；５．ｔｐｓ１Δ＋ＴＰＳ１ Ｓｃ；６．ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ；７．ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ＋ΔＮＴＰＳ１ Ｓ１；８．ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ＋ＴＰＳ１ Ｓ１；９．ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ＋ＴＰＳ1 Ｓｃ；１０．ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ＋ＴＰＳ２ Ｓｃ。
【００７２】
完全長クローンはｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ株を相補するのみである。グルコースまたはフルクトース上でｔｐｓ１Δ株の増殖欠陥を相補することはできない。しかし、Ｎ末端部分が欠失するならば、Ｃｕ誘発性プロモーターから発現したテマリカタヒバ（S. lepidophylla）遺伝子がｔｐｓ１Δ株の増殖欠陥を相補することが可能である。このことはＮ末端欠失の有益な効果を明らかに示している。
【００７３】
もし植物遺伝子がより強力なプロモーターの制御下に発現されるならば、完全長クローンもグルコースまたはフルクトース上での増殖のためにｔｐｓ１Δ株を相補することができる（未開示）。
【００７４】
２．ｔｐｓ１Δ株におけるトレハロースレベルの回復
トレハロースはニーベス（Neves）らの方法により酵母細胞中で測定した（Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994))。この方法において、トレハロースはトレハラーゼにより分解され、形成されるグルコースをグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法により測定する。簡潔に説明すると、細胞を減圧フラスコ上、０.２２または０.４５μｍ細孔の濾紙上に捕集し、水洗した。細胞を集め、その重量を量り、液体窒素中で凍結した。トレハロース抽出のために、Ｎa２ＣＯ３（０.２５Ｍ）を細胞に加え（細胞５０ｍｇあたり１ｍｌ）、２０分間沸騰させた。遠沈後、上清１０μｌを用い、トレハロース含量を測定した。各サンプルは１Ｍ酢酸溶液５μｌを加えて中和した。各サンプルに、緩衝液Ｔ１（３００ｍＭ−ＮaＡc＋３０ｍＭ−ＣaＣl２、ｐＨ５.５）５μｌおよびトレハラーゼ溶液（真菌フミコーラ・グリセア（Humicola grisea) から単離）２０μｌを添加した。サンプルは４５℃で４５分間インキュベートした。この工程において、トレハロースはグルコースに分解される。サンプルに平行して、トレハロース標準液および対照サンプルをも測定した。このインキュベーションの後、チューブを簡単に遠心し、その上清３０μｌを用いてグルコースを定量した。
【００７５】
各サンプルに、ｏ−ジアニシジン（０.１ｍｇ／ｍｌ）含有グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ溶液１ｍｌを添加し、その混合物を３０℃で１時間インキュベートした。５６％（ｖ／ｖ）硫酸を加えて反応を停止させた。各サンプルについて、５４６ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７６】
トレハロースレベルは、Ｃｕ誘発性プロモーターの制御下に、Ｓ１ＴＰＳ１、ΔＮＳ１ＴＰＳ１、ＡｔＴＰＳ１またはΔＮＡｔＴＰＳ１遺伝子を含むプラスミドで形質転換したサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）にて測定した。表３は３回の個々の実験結果を示す。略号１Δはｔｐｓ１Δを表す。
表３
【表１３】
0004948704.tif 000014
【００７７】
この表の結果は図６に示した結果を確認するものである。完全長クローンはグルコースまたはフルクトース含有培地上でｔｐｓ１Δ株の増殖欠陥を相補することができない。さらにガラクトース上で、これらの完全長クローンはｔｐｓ１Δ株においてトレハロースを産生することができない。しかし、もしテマリカタヒバ（フッカツソウ）（S. lepidophylla）またはシロイヌナズナ（A. thaliana）ＴＰＳ遺伝子のＮ末端部分が欠失していて、かつｔｐｓ１Δ株がこれらの遺伝子を含むプラスミドにより形質転換されているならば、これらの株はグルコースまたはフルクトース上で増殖可能となり、これらの株も高レベルのトレハロースを産生する。（“−”は細胞がこの条件下で増殖し得ないために測定できなかったことを意味する；“ＮＤ”は検出不可を意味する）
【００７８】
３．Ｎ末端欠失はインビトロ検定においてＴＰＳ活性を得るために必要である。トレハロース−６-ホスフェート・シンターゼ活性はホッティガー（Hottiger）ら記載の共役酵素検定法により測定した（J. Bacteriol., 169: 5518-5522 (1987))。粗製抽出物は５０ｍＭトリシン緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡化した２ｍｌベッド容量のセファデックスＧ−２５カラム上で脱塩した。検定混合物は５０ｍＭトリシン／ＫＣl（ｐＨ７.０）、１２.５ｍＭ−ＭgＣl２、５ｍＭ−ＵＤＰグルコース、１０ｍＭグルコース−６−ホスフェート、酵素サンプルおよび水を含み、総容量２４０μｌであった。対照においては、グルコース−６−ホスフェートを除き、水に置換えた。検定混合物を３０℃で３０分間インキュベートした。５分間沸騰して反応を停止させた。冷却後、検定混合物を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清中の形成されたＵＤＰを酵素法により測定した。検定混合物は６６ｍＭトリシン／ＫＣl（ｐＨ７.６）、１.８６Ｍピルビン酸ホスホエノール、０.３ｍＭ−ＮＡＤＨ、５Ｕ乳酸デヒドロゲナーゼ、およびサンプル６０μｌを含み、総容量９９０μｌであった。反応はピルビン酸キナーゼ１０μｌを添加することにより開始させ、３７℃で３０分間インキュベートした。３４０ｎｍでの吸光度減少を記録し、それを用いて酵素活性を計算した。
【００７９】
0004948704.tif 000015
【００８０】
ＴＰＳ活性の測定結果を表３に示す。その結果は完全長クローンではないＮ末端欠失ＴＰＳ遺伝子のみが、酵母中で発現された場合に、トレハロース−６-ホスフェート・シンターゼの高い活性に至らしめることを示している。
【００８１】
ＨＡ標識対立遺伝子の構築後、これらの対立遺伝子をｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ株に導入した。以下の株が得られた：
【表１４】
0004948704.tif 000016
【００８２】
ＨＡ標識の存在は植物遺伝子の機能を阻害しなかった。完全長植物対立遺伝子のＣＵＰ１プロモーター（ｐＳalベクター）からの発現はｔｐｓ１Δ株のグルコース上増殖欠陥を回復しなかった。Ｎ末端欠失対立遺伝子の発現は、非ＨＡ標識対立遺伝子について観察したと同様に、グルコース上の増殖を回復しなかった。
【００８３】
完全長およびＮ末端欠失ＨＡ標識Ｓ１ ＴＰＳ１遺伝子は、ｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ株両方において試験した。
【００８４】
株ＰＶＤ１６４（ｔｐｓ１Δ＋Ｓ１ ＴＰＳ１−ＨＡ）、ＰＶＤ１６５（ｔｐｓ１Δ＋ΔＮ Ｓ１ ＴＰＳ１−ＨＡ）、ＰＶＤ１７９（ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ＋Ｓ１ ＴＰＳ１−ＨＡ）、およびＰＶＤ１８１（ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ＋ΔＮ Ｓ１ ＴＰＳ１−ＨＡ）はＳＤgal−ＵＲＡ（＋ＣuＳＯ４）において定常期に至るまで増殖した。細胞を抽出緩衝液（１リットルにつき：１０.７ｇのＮa２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、５.５ｇのＮaＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０.７５ｇのＫＣl、２４６ｍｇのＭgＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＭ−ＰＭＳＦ、ｐＨ７.０）で洗浄し、５００μｌの抽出緩衝液に再懸濁した。抽出はガラスビーズの存在下に１分間２回ボルテックスすることにより実施した。抽出液は２０分間遠沈し澄明とした。
【００８５】
抽出液１０μｇを７.５％ＰＡＧＥゲルで泳動させた。ブロッティング後、ニトロセルロース膜を、２％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（５×ＴＢＳ：６ｇのトリス＋４５ｇのＮaＣl、ｐＨ７.４；ＴＢＳＴ＝１×ＴＢＳ＋０.０５％トゥイーン２０）中１時間インキュベートした。次いで、濾紙を２％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴに１：１０００に希釈した抗ＨＡ抗体（抗ＨＡ高親和性、ラットモノクローナル抗体クローン３Ｆ１０，ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim)）と１時間インキュベートした。濾紙をＴＢＳＴ中３×５分洗浄し、次いで、２％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴに１：２００００に希釈した第二抗体（シグマ（Sigma）Ａ−６０６６；抗−ラット）と４５分間インキュベートした。次いで、濾紙をＴＢＳＴ中３×５分洗浄した。その後、濾紙をＴＢＳ中で５分間洗浄した。アルカリホスファターゼ顕色混合物（１０ｍｌの１００ｍＭトリス、ｐＨ９.５；５０ｍＭＭgＣl２；１００ｍＭ−ＮaＣl、３７.５μｌＸ−ホスフェート塩および５０μｌニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ））を濾紙に加え、バンドが見えるようになったところで水を加えて反応を停止させた。結果を図１１に示す。
【００８６】
完全長Ｓ１ Ｔｐｓ１タンパク質（ＨＡ標識なし）の分子量計算値は１０９３５３であり、一方、ΔＮ Ｓ１ Ｔｐｓ１タンパク質の分子量は９９４５３である。
【００８７】
完全長ＴＰＳ１遺伝子とＮ末端欠失ＴＰＳ１遺伝子間の相補能力の差が、完全長タンパク質が正しいＴＰＳ複合体を形成し得ないという事実を原因とするかどうか決定するために、完全長Ｓ１ ＴＰＳ１またはΔＮ Ｓ１ ＴＰＳ１遺伝子で形質転換したｔｐｓ１Δ株から調製した酵母抽出物のＦＰＬＣ分析を実施した。抽出液はゲル濾過カラム（スーパーデックス（Superdex）２００ＨＲ１０／３０）上で分離し、７５０μｌのフラクションをベル（Bell）ら記載のとおりに捕集した（J. Biol. Chem., 373, 33311-33319, 1998)。タンパク質を含む最初のフラクションはフラクション１０である。カラムの特性に基づき、また検定実験に基づくと、フラクション１０−１４のタンパク質は８００，０００ないし４００，０００ダルトンの範囲の巨大タンパク質複合体に相当する。
【００８８】
図１１は抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。ここでは、フラクション１０ないし１５のみを表示する。遊離のＴＰＳ１タンパク質はフラクション２５〜２７に存在する（未開示）。非常に重要なことは完全長およびΔＮ Ｓ１ ＴＰＳ１対立遺伝子の両方がＴＰＳ複合体の他のサブユニットと複合体を形成することができる。このことはＮ末端領域それ自体が植物Ｔｐｓ１タンパク質の残余部分に直接阻害機能を発揮する可能性のあることを示していると思われる。
【００８９】
完全長ＴＰＳ１対立遺伝子が高等植物においてトレハロースの合成を達し得ないという事実は、Ｎ末端の阻害効果を原因とする可能性がある。これらＮ末端欠失構築体での形質転換植物構築は、高トレハロースレベルと良好なストレス抵抗性をもつ植物に至らしめ得る。
【００９０】
実施例４
トレハロース産生シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) 形質転換植物の構築
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) 生態型コロンビアの形質転換は真空浸透法（Bechtold, N. et al., C.R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199 (1993); Bent, A. et al., Science 265: 1856-1860 (1994)) により実施し、その際、ヘルパープラスミドｐＭＰ９０と適切なプラスミド構築体を取込んでいるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８Ｃ１を使用し、ヘルパーとしてプラスミドｐＲＫ２０１３を取込んでいる大腸菌株ＨＢ１０１を用いる三親交配により大腸菌株ＤＨ５−アルファから動員する。
【００９１】
簡潔に説明すると、シロイヌナズナ（A. thaliana) を２２〜２０℃、１６時間の照明下、４〜６週間、花序が出始めるまで成長させる。真空デシケーター内にアグロバクテリウム培養物を注ぎ込んだ後、シロイヌナズナ植物を入れたポットを倒立して置き、５分間真空浸透させる。植物を上記の条件下で成長させる。種子を収獲し、４.４ｇ／ＬのＭＳ塩、１％スクロース、０.５ｇ／ＬのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５.７（ＫＯＨ）、０.８％フィトアガー（phytagar）、および３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを入れたペトリ皿中で選択し、形質転換体を選択する。５００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを同様に加え、細菌増殖を停止する。５〜７日後、形質転換体が緑色植物として目視し得るので、これを１.５％フィトアガーとした以外上記と同じ培地に移植する。６〜１０日後に、真葉をもつ植物を土壌に移植する。
【００９２】
形質転換植物の分析を実施し、サザンブロット法により植物ゲノム内の遺伝子組込みと遺伝子コピー数を定量し、導入遺伝子の転写を標準技法によるノーザンブロット法により実施する（Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989))。Ｓ１−ＴＰＳ１に対する抗体を用い、ウエスタンブロットにより導入遺伝子が正しく翻訳されていることを確認する（Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4353 (1979))。トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性（De Virgilio, C. et al., FEBS Lett. 273: 107-110 (1990)）およびトレハロース含量（Neves, MJ. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994)) を既知方法により測定した。
【００９３】
表４は植物トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ遺伝子を過剰発現する形質転換シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) の表現型を示す。
表４：植物トレハロース−６−Ｐシンターゼ遺伝子を過剰発現する形質転換シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) の表現型
【表１５】
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【００９４】
実施例５
形質転換のジャガイモ、サトウダイコンおよびサトウキビ植物でのトレハロースの大量合成
遺伝子工学は、異種生体におけるほとんどすべての遺伝子発現を可能にした。形質転換植物は、商業的に興味深い化合物の大規模生産にバイオリアクターとして使用できる。これらの化合物は、本来ならば限られた量しか得られないものであって、例えば、生物分解性プラスチック、いろいろな炭水化物、薬用ポリペプチド、工業用酵素などである(Goddijn, O.J.M and Pen, J., Trends Biotech. 13: 379-387 (1995))。経済的重要性の大きい農産物を含む高等植物の形質転換に関して、さまざまな方法が報告されている(Walden, R. and Wengender, R., Trends Biotech. 13: 324-331 (1995))。タバコの形質転換(Horsch, R.B. et al., Science 227: 1229-1231 (1995))およびジャガイモの形質転換(Sheerman, S. and Bevan, M.W., Plant Cell Rep. 7: 13-16 (1988))は、Agrobacterium tumefasciens株を用いて効率的に実施されている。この技術は、該分野に精通する人達が実験室で使用できる。あらゆる植物トレハロース-６-ホスフェート・シンターゼ遺伝子について、植物体における発現のための構造体は、そのＮ末領域欠如のＳｌＴＰＳ１が好ましく、Ｔ-ＤＮＡ発癌性遺伝子を欠くＴｉプラスミドから誘導したベクター内において作られ、そのベクターは、例えば、カナマイシン耐性を与える形質転換植物のための選択マーカーを含む(Bevan, M., 1984, Nucl. Acids Res. 22: 8711-8721)。さらに、形質転換植物に与えられる使用目的によっては、適当なプロモーターを選択しなければならない。Ｔ-ＤＮＡに含まれるノパリン・シンテターゼ遺伝子から得られるポリアデニル化信号が使用できる。(Bevan, M., Barnes, W. and Chilton, M.-D., 1983, Nucl. Acids. Res. 11: 369-385)。
【００９５】
産業用トレハロースの過剰生産には、ジャガイモ、サトウキビおよびサトウダイコンのような植物を使用する。例えば、ジャガイモは大量の炭水化物を塊茎に貯蔵している。植物バイオマスの見地から、ジャガイモは単位面積当たりの最も生産性の高い代表的な農産物の一つである(Johnson, V.A. and Lay, C.L., 1974, Agric. Food Chem. 22: 558-566)。強力な塊茎特異的プロモーターとして、パタチン(patatin)遺伝子のクラスｌプロモーターがあり(Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 14: 4625-4638 (1986); Jefferson, R. et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990))、それを使って大量のトレハロースを生産できる。トレハロースを過剰に生産する方法としてジャガイモやサトウダイコンあるいはサトウキビを使用する利点は、これらの植物が人間の食物であるからであり、したがって、そこから分離したトレハロースが容易に消費者に受けいれられる。植物の過剰生産で得たトレハロースは、制限酵素や修飾酵素 (Colaco, C. et al., Bio/Technology 10: 1007-1111 (1992))、ワクチンまたは加工食品のような産業用生物分子の保存に使用できる。
【００９６】
実施例６
環境ストレス耐性を有する形質転換穀類植物
穀類は、世界中において栄養補給の基本的な食物を構成する。もし穀類が寒冷、酷暑、塩害、旱魃などに耐えてトレハロースを産生すれば、望ましくない気候条件下でも穀類を栽培できる。これを達成するために必要なのは、植物トレハロース-６-ホスフェート・シンターゼ遺伝子、好ましくはＮ末領域欠如のＳｌ-ＴＰＳ１を、これらの環境要因により誘導されるプロモーター制御のもとに、発現せしめることである(Baker, S.S. et al., Plant Mol. Biol. 24: 701-713 (1994); Takahashi, T. et al., Plant J. 2: 751-761 (1992); Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K., Plant Cell 6: 251-264 (1994))。ストレス状況下でのみトレハロース合成が、炭水化物代謝を方向転換させるトレハロースの継続的生産(構成的プロモーターを使用による)を避けるので、結果として穀物の質と生産性が低下する。トウモロコシ(D'Halluin, K. et al., Plant Cell ４： 1495-1505 (1992))、オオムギ(Wan, Y. and Lemaux, P.G., Plant Physiol. 104: 37-48 (1994))、コムギ(Vasil, V. et al., Bio/Technology 10: 667-674 (1992))およびコメ(Shimamoto, K. et al., Nature 338: 274-276 (1989))の形質転換に関する報告がなされている。この方法は当分野の技術者によって実施できる。
【００９７】
実施例７
長い貯蔵寿命を有する形質転換植物からとれる果実
トマト、マンゴー、バナナなどのさまざまなタイプの果実は熟すのが早く、消費者にわたる前に腐敗し易い。この問題を避けるために、果実を早期に収穫したり、冷凍庫や環境調節した倉庫などを慣習的に使用してきた。しかしながら、これらの方法は費用がかかり、果実を遠方に輸送する場合は特に経費の負担が大きい。トマトの貯蔵寿命を延ばすために、果実の熟成に関与するポリガラクツロナーゼ遺伝子をアンチセンスにおいて発現する形質転換植物を用いて、熟成を遅らせる方法が報告されている。しかしながら、熟成の時期を遅らせたとしても、この方法にはまだ問題が残る。ある程度の時間がたっても、熟成過程が続き、生産物が消費者に良好な状態で必ずしも到達しない。
【００９８】
この方法に代わるものとして、形質転換のトマト、マンゴーおよびバナナにおけるトレハロースの製造を今回提案する。例えば、トマトの果実に特異的なプロモーター(Bird, C.R. et al., Plant Mol. Biol. 11: 651-662, (1988))を使用し、植物トレハロース-６-ホスフェート・シンターゼ遺伝子、好ましくはＮ末領域欠如のＳｌＴＰＳ１を過剰発現せしめると、トレハロースがトマトの器官に特異的に蓄積する。トマト植物の形質転換および再生の方法は(McCormick, S. et al., Plant Cell Rep. 5: 81-84 (1996)の記述のごとく)、当業者なら実行できる。トマトなどの果実を熟成状態で収穫し、次にその全部あるいは部分を脱水乾燥して、冷凍の必要もなく長期保存できる。それに水を加えて元にもどすと、果実は消費者の要求する自然な感覚的特性を持つようになる。原則的に、対象の植物について再生および形質転換のシステムが利用可能で、適当な果物特異的プロモーターが存在すれば、上記の方策は、別種の果物においても実施できる。
【００９９】
実施例８
有性または無性の繁殖に関与する細胞、器官あるいは植物部分の生存能の増大
生存能が引き伸ばされた花粉の生産は、植物育成計画や生殖細胞質の保存に大いに役立つ。同様に、長期保存の可能性と、種子、球根、塊茎、接ぎ木、挿し木および花などの生存能の増大は、植物育成と生殖細胞質の保存に大きな影響を与える。形質転換植物の組織、器官あるいは部分にトレハロースが存在する場合、それらの組織、器官あるいは部分は、室温下の脱水状態で、トレハロースの存在しない場合よりかなり長期間の保存が可能である。この目的を達成するために、植物トレハロース-６-ホスフェート・シンターゼ遺伝子、好ましくはＮ末領域欠如のＳｌ-ＴＰＳ１を、組織特異的あるいは器官特異的プロモーターの統制下で植物発現ベクターにクローン化し、この構築体で対象の植物を形質転換することが必要である。この方法は、当業者に知られている。花粉特異的プロモーター（Guerrero, F.D. et al., Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 (1990)）、塊茎特異的プロモーター(Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 14: 4625-4638 (1986); Jefferson, R., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990))、および種子特異的プロモーター(Colot, V. et al., EMBO J. 7: 297-302 (1988))に関する報告がされており、これらを使って、植物においてトレハロース発現のためのハイブリッド遺伝子を作成できる。
【０１００】
実施例９
各種ストレス状態の試験
形質転換植物の各種ストレス状態に対する耐性を下記の方法で試験した。
【０１０１】
１．寒冷
構成的３５Ｓプロモーターの制御のもとで、Ｓｌ-ＴＰＳ１を過剰発現する形質転換植物をサザンブロット法によって分析し、植物ゲノムへの正しいトランスジーン挿入を確認した。Ｓｌ-ＴＰＳ１遺伝子の発現をノーザンブロット法で確証した。形質転換物を調べてトレハロースが蓄積すること、およびべクターのみによる形質転換の対照植物中にトレハロースを検出しないことを確認した。形質転換Arabidopsis Ｔ２世代植物(発芽後２０日)をバーミキュライト培養土入りポットに植え、１６時間明るく、８時間暗くして、２４℃の温室内で水分を十分与えて育成した。対照植物およびトレハロース合成植物を温室に移し、明るさを一定にして４℃で１０日間、次に温度を２４℃にもどして２日間育成した。その他のセットの植物は２４℃のままにした。寒冷処理した植物の損傷は、視覚により判断し(白化現象、葉の活力減退および枯死)、光合成における光阻害の測定(Murata, N. et al., Nature 356: 710-713 (1992))をＩＲＧＡ装置(赤外線ガス分析器)で行なった。寒冷処理植物と非寒冷処理植物との比較の後に、葉の大きさと植物の高さで生長遅滞度を測定した。
【０１０２】
２．冷凍
耐冷凍度を、前記のようにして得た寒冷処理の対照植物およびトレハロース合成植物について電解質漏洩テストによって測定した。切断葉を零下のいろいろな気温で凍らせ、解凍した後に、伝導度メーター(Jaglo-Ottosen, K.R. et al., Science 280: 104-106 (1998))で組織からのイオン漏洩を測定して、細胞膜損傷による細胞の損害を評価した。
【０１０３】
３．熱
形質転換Arabidopsis Ｔ２世代植物(発芽後２０日)を対照およびトレハロース合成に分けて、バーミキュライト培養土入りのポットに植え、１６時間明るく、８時間暗くして、２４℃の温室内で水分を十分与えて育成した。植物を事前調整して、３５℃で２時間インキュベーションの後に、４６℃〜５６℃の範囲でいろいろな温度の熱ストレスに１時間さらし、それぞれ独立した処理を行なった。植物を５日間２４℃の状態にもどした。植物の損傷は、視覚により判断した(白化現象、葉の活力減退および枯死)。２４℃で７日間ペトリシャーレの内側の加湿フィルター上で育成した苗で同様な試験を行なった(Lee, J.H. et al., Plant J. 8: 603-612 (1995))。
【０１０４】
４．乾燥
形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis)Ｔ２世代植物(発芽後２０日)を対照およびトレハロース合成に分けて、バーミキュライト培養土入りのポットに植え、１６時間明るく、８時間暗くして、２４℃の温室内で水分を十分与えて育成した。数日間加水を止めて葉がしおれるまで旱魃状態のストレスを課した後、再び植物に加水した。トレハロース合成植物が正常に生育したのに反して、対照植物は元に戻らなかった。また、切断葉を２０％の湿潤状態で空気乾燥した。４８時間以上、生体重を測定した。トレハロース合成植物は減量が少なかった(Holmstrom, K.-O. et al., Nature 379: 683-684 (1996))。
【０１０５】
５．浸透圧ストレス
形質転換シロイヌナズナ(Arabidopsis)Ｔ２世代植物(発芽後２０日)を対照およびトレハロース合成に分けて、バーミキュライト培養土入りのポットに植え、１６時間明るく、８時間暗くして、２４℃の温室内で水分を十分与えて育成した。別組の植物に１〜３週間、いろいろな濃度のＮａＣｌ(100-300mM)あるいはＰＥＧ(５または１０％)を注水した。植物の高さと生体重の変化を計測して成長度を評価した(Tarczynski, M.C. et al., Science 259: 508-510 (1993))。
【０１０６】
６．貯蔵
植物ＴＰＳ遺伝子を、例えば、エチレンで誘導され、熟した果物のなかで活性が最高に達するトマト果物特異的Ｅ８プロモーター(Lincoln, J.E. & Fischer, R.L. Mol. Gen. Genet. 212: 71-75 (1988); Good, X. et al., Plant Mol. Biol. 26: 781-790 (1994); Tieman, D. et al., Plant Cell 4: 667-679 (1992)の制御下で、ＮＯＳｐＡ ３’末端を含むｐＢＩＮ１９ベクター(Guilley, H. et al., Cell 21: 285-294 (1982))および(Bevan, M. et al., Nucl. Acids Res. 11: 369-385 (1983))においてクローン化する。これらのベクターは三世代交配によってAgrobacterium tumefasciensに動員される。トマトに関する形質転換は、確立しているプロトコールによって実行される(Tieman, D. et al., Plant Cell 4: 667-679 (1992))。形質転換果物の分析は種々の技術を使って行なう。ゲノム・サザン・ゲルにより植物ゲノムにおけるＳｌ-ＴＰＳ１の組込みを測定、また、ノザンブロット法によるＳｌ-ＴＰＳ１転写の測定およびウエスタンブロット法によるＳｌ-ＴＰＳ１タンパク質発現の測定がある。Ｓｌ-ＴＰＳ１酵素活性およびトレハロース容量の計測は標準的な技術で行なう(De Virgilio, C. et al., FEBS Lett. 273: 107-110 (1990))および(Neves, MJ. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 10: 17-19 (1994))。貯蔵寿命についての分析は、成熟度を計るいろいろなパラメーターについて対照トマトおよびトレハロース産生トマトで数週間以上かけて行った。パラメータは、果実の軟化度、エチレン産生および果実の品質(生地、色合い、糖度、サイズなど)などである。
【０１０７】
実施例１０
トレハロース-６-ホスフェートの検定
１.１  存在するトレハロース-６-ホスフェートの検定
Ｔｐｓ１、とりわけその生産物たるトレハロース-６-ホスフェートの重要性を調べるのに必須なのは、サイトソルに明らかに存在するＴｒｅ６Ｐレベルの計測である。これまでに三つのＴｒｅ６Ｐレベル測定方法が記述されている。一番目の方法(Melerio et al., 1993, Analytical Biochemistry 213, 171-2)においては、ＴＣＡ抽出と組み合せてＴｒｅ６Ｐを抽出し、次いでエーテル抽出、バリウムアセテート沈降、および陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。Ｔｒｅ６Ｐは、アルカリ性ホスファターゼによって脱リンされ、トレハラ−ゼによって２つのグルコース分子中に加水分解される。最後にそのグルコースをグルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法で検出する。この方法は、Ｔｒｅ６Ｐの大量生産と精製の手段として評価され開発されてきた。報告された酵母細胞におけるＴｒｅ６Ｐレベルがグルコース、トレハロースおよびＧｌｕ６Ｐより低いので、この方法はバックグラウンドが大きく、感受性に欠ける。
【０１０８】
二番目の方法では、高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によってＴｒｅ６Ｐの検出および定量化を行なう(De Virgilio et al., 1993, Eur J Biochem 212, 315-23)。この方法を用いて熱ショックの後にｔｐｓ2Δ変異体における高Ｔｒｅ６Ｐレベルの定量(Reinders et al., 1997, Mol Microbiol 24, 687-95)および抑制解除の野性型酵母細胞にグルコースを付加した後におけるＴｒｅ６Ｐレベルの一過性増加の検出 (Hohmann et al., 1996, Mol Microbiol. 20, 981-91)が可能になった。検出限度はおよそ２００μＭ Ｔｒｅ６Ｐであった。この検出限度は、細胞の指数増殖期および定常期において報告されている安定状態のレベルに近い(Blazquez et al., 1993, FEBS Lett 329, 51-4)。この方法の感度では、正常の酵母菌株あるいはＴｒｅ６Ｐ合成に影響された菌株における濃度についての信頼できる定量が不可能である。
【０１０９】
三番目の方法は、Ｔｒｅ６Ｐがインビトロ酵母ヘキソキナーゼ活性を阻害する事実の観察に基づいている(Blazquez et al., 1994, FEBS Micorbio. Lett 121, 223-7)。この阻害のレベルは、抽出物のＴｒｅ６Ｐ容量計測に役立つ。ヘキソキナーゼ活性は、その産物の１つであるフルクトース-６-ホスフェート(Ｆｒｕ６Ｐ)の形成率を測定して計れる。定常期および指数増殖期の細胞における細胞内Ｔｒｅ６Ｐは、およそ２００μＭと推定される。報告者達はまた、Ｔｒｅ６Ｐのヘキソキナーゼ活性に対する阻害効果は、グルコースの存在によって抑制されることを観察している。状況によっては、グルコースが高濃度であったり、一般的に、抽出物に他の干渉化合物が存在したりするから、この方法もまた適当ではない。
【０１１０】
１.２  新しい方法の原理
本発明の方法は、既存の方法よりもっと感受性に富み、信頼され得ることを主要な目的とする。この方法は、ｔｒｅＡ遺伝子がコードするBacillus subtilisホスホトレハラーゼ酵素に基づいている。この酵素は、細菌性ＰＴＳ系と機能的に関連し、Ｔｒｅ６ＰをグルコースおよびＧｌｕ６Ｐへの加水分解する(Helfert et al., 1995, Mol Microbiol 16, 111-120; Rimmele & Boos, 1994, J Bacteriol 176, 5654-64)。この反応で産出したグルコースを計測することで、Ｔｒｅ６Ｐの最初の量が計算できる。Ｇｌｕ６Ｐをこの目的には使用しない。その理由は、この化合物がしばしば大量に酵母細胞中に存在するからである。この化合物をＴｒｅ６Ｐから分離するのはいたって困難であり、一方、抽出物に元から存在するグルコースは、陰イオン交換クロマトグラフィーによって糖ホスフェートから容易に分離できる(図１６)。
【０１１１】
１.３  枯草菌(Bacillus subtilis)ホスホトレハラーゼ酵素の精製
ホスホトレハラーゼ酵素はＭ.Ｋ. Ｄａｈｌのグループによって精製され特性が解明された(Gotsche & Dahl, 1995, J Bacteriol 177, 2721-6; Helfert, et al., 1995, 前掲)。このグループは、強い枯草菌(Bacillus subtilis)ｄｅｇＯ３６プロモターの後方に構成的に発現するｔｒｅＡ遺伝子を有するｐＳＧ２プラスミドを調製した。
【０１１２】
高度に安定した発現を得るために、遺伝子を、強いＩＰＴＧ誘発性ｔａｃプロモーターの後方にｐＣＹＢ１ベクター(New England Biolabs)内でクローン化した。ｔｒｅＡ遺伝子を、プライマーＣＶＶ５
【表１８】
0004948704.tif 000018
およびプライマーＣＶＶ６
【表１９】
0004948704.tif 000019
でポリメラーゼ連鎖反応増幅し、ＰＣＲ産物の各末端にＡｓｅＩおよびＳａｐＩ制限部位をそれぞれ導入し、ｐＣＹＢ１プラスミド内でクローンし、ｐＣＶＶ１と名付けた(図７)。’および ，は、制限酵素の挿入部分を示す。
【０１１３】
原型のｐＳＧ２プラスミド(ＥｃＶＶ１)または新規のｐＣＶＶ１プラスミド(ＥｃＶＶ３)で形質転換された菌株のホスホトレハラーゼ活性の比較によると、後者の菌株がｐＳＧ２プラスミドを有する菌株より、１０倍以上の活性を有していた(図１７)。
【０１１４】
これらのＥｃＶＶ３細胞を一夜４ｍｌのＬＢ-アンピシリン培養基で育成した。翌日、この培養基を使用して１００ｍｌのＬＢアンピシリンを接種し、そのまま３時間育成した後にＩＰＴＧ(０.５ｍＭ)で発現を誘導し、培養基を続いて３時間３７℃でインキュベートした。
【０１１５】
細胞を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、３０ｍｌの緩衝液Ａ(２５ｍＭ Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ ｐＨ７、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＮｇＣｌ２)に再懸濁した。再懸濁細胞を２度加圧型細胞破壊装置(フレンチプレス)に通して細胞を破壊した。次に、未精製抽出物を３０分間３５０００ｒｐｍの超遠心分離機にかけて不要物を除いてきれいにし、浮遊物を０.２２μｍのフィルターで濾過した。
【０１１６】
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５/５カラム上の２０カラム量において、１００％緩衝液Ａから５０％緩衝液Ｂ(２５ｍＭ Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ ｐＨ７、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮａＣｌ)までの直線勾配で、陰イオン交換クロマトグラフィーを実行した。５００μｌのフラクションを集めた。各フラクションのＰＮＰＧ加水分解活性を計測し、最も活性の高い２つのフラクションを溜め、２００μｌに凝縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎカラム (Vivascience)によるゲル濾過を行った。ゲル濾過のために、１０％緩衝液を有する定組成溶出をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム上で行った。最も高い活性を有する２つの５００μｌフラクションを溜めて、再びこれを４００μｌに凝縮し、−３０℃でアリコートに貯蔵した。両方のカラムをＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム(Pharmacia)上で作動させた。
【０１１７】
このようにして実行した精製によって、回収３４％の特定の活性が４.５倍増加した。クーマシーブルー染色法によるＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、その予期したサイズからの巨大な過剰発現タンパク質バンドを既に示していた。レーンにつき１０μｇタンパク質の最終精製フラクションにおいて、これ以外のバンドは見られなかった。
【０１１８】
１.４  酵母培養基のサンプリング
３ｍｌの細胞懸濁液を、温度-４０℃で１０ｍｌの６０％メタノールに吹きかけてサンプルを取り出した。これによって、即座に細胞代謝を阻止し、グルコースを抑制解除細胞に加えるなどの実験操作の後に、時間関数として細胞内代謝産物の同定ができる(de Koning & van Dam, 1992, Anal Biochem 204, 118-23)。
【０１１９】
１.５  代謝産物の抽出
冷凍細胞から代謝産物の抽出を過塩素酸抽出法で実行した。
【０１２０】
１.６  最初の陰イオン交換クロマトグラフィー
細胞抽出物中に存在するＴｒｅ６Ｐからグルコースおよびトレハロースを分離するために、弱いＮＥ２-ＳＰＥ陰イオン交換機(International Sorbent Technoloy, UK)を選んだ。
【０１２１】
吸着剤５００ｍｇが再懸濁した３ｍｌの１００％メタノール溶液をカラムに満たし、３ｍｌの１００％メタノールですすいだ。０.５Ｍの酢酸でカラムを均衡させながら弱陰イオンをそれに結合させ、カラムの余剰酸を、３ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で２度すすぎ去った。サンプルをとり、結合サンプルを３ｍｌの２０％メタノールですすいで、特異的結合を除去した。陰イオンを２.５Ｍアンモニア溶液(ｐＨ１２.５)で溶出した。抽出細胞１００ｍｇにつき吸着剤２５０ｍｇを使用した場合に、カラムに対する過負荷の危険性はなかった。塩はグルコース同定を有意に妨げることはなかった。溶出抽出物をＴｒｅ６Ｐの損失なしに蒸発させた。
【０１２２】
１.７  ホスホトレハラーゼ反応の条件
報告で最も望ましいとされるｐＨ４または５の場合に、酵素が不安定であったので、より生理学的なｐＨ７を選んでインキュベーションを実行した。インキュベションのための緩衝剤を５０ｍＭ Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ緩衝剤(ｐＨ７)とした。インキュベーション中の温度を３７℃とした。２０００Ｕのホスホトレハラーゼを加え、サンプルを３７℃で２時間インキュベートした。１ユニットは酵素の量であって、上記の条件下で１分間につき１ｎｍｏｌのＴｒｅ６Ｐを加水分解する。
【０１２３】
１.８  ２番目の陰イオン交換クロマトグラフィー
ホスホトレハラーゼ反応において生産されたグルコースを、他の陰イオン細胞に含まれる化合物から分離するために、２番目の陰イオン交換クロマトグラフィーを、最初のと同様の方法で実行した。今度は、カラムと結合せずグルコースを含む流液を、真空乾燥によって回収し、凝縮した。
【０１２４】
１.９  グルコースの検定
乾燥したグルコースのサンプルを、２５０μｌの５０ｍＭのＢｉｓ-Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７)に再溶解した。各サンプルから、２００μｌの非希釈サンプル、１/５希釈サンプル、１/２５希釈サンプルについて、グルコース濃度を測定した。マイクロタイタープレートにおいて、１５ユニットのグルコース・オキシダーゼ、１０ユニットのペルオキシダーゼおよびオルト-ジアニシジン（１００μｇ)を含有する２０μｌの反応混合物を、２００μｌの量のサンプルに加えた。このプレートを３７℃で４５分間インキュベートし、次いで、４０μｌの５６％硫酸を加えて反応を止めた。吸光度を５３０ｎｍの波長で計測した。
【０１２５】
１.１０  回収および再産生性
過塩素酸抽出の操作手順での回収は５７％である。完全Ｔｒｅ６Ｐ検定での回収は２５％である。この方法による検出限度は１００μＭで、Ｔｒｅ６Ｐの標準直線は生理学的に適切な範囲では直線である(図８)。Ｔｒｅ６Ｐ標準の作成は、過塩素酸抽出の前に、Ｔｒｅ６Ｐシンターゼを欠如したｔｐｓ１Δ菌株の細胞に対して既知の量のＴｒｅ６Ｐを加えて行う。直線勾配の標準誤差と、４つの独立標準直線の切片は、それぞれ２％と９％であった。
【０１２６】
トレハロース-６-ホスフェートの濃度は、全長およびＮ末欠失の植物ＴＰＳ１対立遺伝子を含む酵母株で計測した。菌株は、指数増殖期まで、あるいは定常期までのどちらかで、ガラクトースあるいはグルコース含有の最小培養基で増殖した。この実験にあたって、ｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δのバックグラウンドを使用した。それは、ｔｐｓ１Δのバックグラウンドにおけるトレハロース-６-Ｐのレベルが、あまりにも低いために計測されないからである。使用した菌株は：
ＪＴ６３０８        １Δ２Δ ＋ ｐＳＡＬ４
ＰＶＤ４４          １Δ２Δ ＋ ｐＳＡＬ４/Ｓｃ ＴＰＳ１
ＪＴ６３０９        １Δ２Δ ＋ ｐＳＡＬ４/Ｓｌ ＴＰＳ１
ＰＶＤ４３          １Δ２Δ ＋ ｐＳＡＬ４/ΔＮ Ｓｌ ＴＰＳ１
ＰＶＤ１３８        １Δ２Δ ＋ ｐＳＡＬ６/Ａｔ ＴＰＳ１
ＪＴ２００５０      １Δ２Δ ＋ ｐＳＡＬ６/ΔＮ Ａｔ ＴＰＳ１
ＰＶＤ１５０        ２Δ ＋ ｐＲＳ６(ＨＩＳ３マーカー含有の空きプラスミド)
“１Δ”は“ｔｐｓ１Δ”を表わし、“２Δ”は“ｔｐｓ２Δ”を表わす。
【０１２７】
酵母細胞を集めた後で、抽出物を実施例１０で述べたようにしてつくり、トレハロース-６-Ｐの濃度を計測した。その結果を図１８に示す。
【０１２８】
トレハロース-６-ホスフェートは、植物ＴＰＳ１遺伝子を含有する株から調製した抽出物において、酵母ＴＰＳ１遺伝子を過剰発現している対照菌株と比較して、４倍少なかった。この低いトレハロース-６-ホスフェートのレベルは、それらの菌株における分解機構へのグルコース流入が、未だに調節されていない理由の説明となろう(実施例１２)。このグルコース流入の未調節は、全長あるいはＮ末欠失のどちらかの植物ＴＰＳ対立遺伝子を含有する株について類似し、この事実は本発明で得た結果と適合する。トレハロース-６-ホスフェートのレベルにおいて、菌株が含む対立遺伝子が全長かＮ末欠失かの間に差異はない。
【０１２９】
実施例１１
ＴＰＳとＴＰＰ領域のキメラ融合
トレハロース生合成に関与する効果的な酵素経路を生成するために、一連のキメラ酵素融合を、A.thalianaあるいはS.cerevisiae のいずれかからのＴＰＳ１およびＴＰＳ２由来のＴＰＳ領域とＴＰＰ領域の間につくった。これらの４つの融合体を図１３に示す。
【０１３０】
第１融合体は、オリゴヌクレオチド(
【表１６】
0004948704.tif 000020
、下線がＮｃｏＩ部位で、太字が開始コドン)および(５'-ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＡＧＧＧＣ-ＴＴＧＴＣＣ-３'、下線がＢａｍＨＩ部位)で、エキスパンド・ハイ・フィデリティＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer)を使用して、ＰＣＲ(９４℃、３分間、１サイクル； ９４℃、１分間、５２℃、１分間、７２℃、１.５分間、４０サイクル； ７２℃、１０分間、１サイクル)によって得た、４４２アミノ酸のＮ末切除タンパク質(その最初の１００アミノ酸を欠如する)をコードするＡｔＴＰＳ１(ΔＮＡｔＴＰＳ１)由来の１３３７ ｂｐ ＤＮＡ断片と、オリゴヌクレオチド(５'-ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＡＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧ-３'、下線がＢａｍＨＩ部位)および(
【表１７】
0004948704.tif 000021
、下線がＫｐｎＩ部位で、太字が終止コドン)で、エキスパンド・ハイ・フィデリティＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ(９４℃、3分間、１サイクル； ９４℃、１分間、５２℃、１分間、７２℃、１.５分間、４０サイクル； ７２℃、１０分間、１サイクル)によって得た、３７４アミノ酸の全長タンパク質をコードするＡｔＴＰＰＢ由来の１１３８ ｂｐ ＤＮＡ断片とからなる。
【０１３１】
第２融合体は、ΔＮＡｔＴＰＳ１と、オリゴヌクレオチド(５'-ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＡＴＣＴ-ＡＴＴＡＡＣＡＴＧＧ-３'、下線がＢａｍＨＩ部位)および(５'-ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧ-ＴＧＧＧＴＴＧＡＧＡＣ-３'、下線がＫｐｎＩ部位)で、エキスパンド・ハイ・フィデリティＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer)を使用して、ＰＣＲ(９４℃、３分間、１サイクル； ９４℃、１分間、５０℃、１分間、７２℃、１.５分間、４０サイクル； ７２℃、１０分間、１サイクル)によって得た、Ｃ末から３９７アミノ酸をコードするＳｃＴＰＳ２由来の１３５８ ｂｐ ＤＮＡ 断片とからなる。
【０１３２】
第３の構造体は、オリゴヌクレオチド(５'-ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＴＣ-ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣ-３'、下線がＸｈｏＩ部位)および(５'-ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＡ-ＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣ-３'、下線がＢａｍＨＩ)で、エキスパンド・ハイ・フィデリティＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer)を使用して、ＰＣＲ(９４℃、３分間、１サイクル； ９４℃、１分間、５２℃、１分間、７２℃、１.５分間、４０サイクル； ７２℃、１０分間、１サイクル)によって得た、４９２アミノ酸タンパク質をコードするＳｃＴＰＳ１由来の１５３１ ｂｐ ＤＮＡ 断片と、ａＴｔｔｐｂとの間の融合もたらす。
【０１３３】
第４の融合は、上記の方法で得られるＳｃＴＰＳ１と、ＳｃＴＰＳ２との間のＤＮＡ断片によって作られる。
【０１３４】
ＰＣＲ断片は適当な制限酵素によって消化し(図１３)、ｐＲＳ６ベクター内でサブクローンする。酵母ｔｐｓ１Δ、ｔｐｓ２Δおよびｔｐｓ１Δ２Δ突然変異菌株を形質転換し、ＳＤＧａｌ(-his)内で選択した。ＳＤＧｌｃ(-his 最小培養基)および３８.３℃での成長の相補性を検定した。
【０１３５】
実施例１２
酵母ｔｐｓ１Δ菌株におけるＮ末欠失植物ＴＰＳ１遺伝子の発現は、グルコース上での増殖を回復させるが、糖ホスフェートの過剰蓄積を抑制しない
S.cerevisiaeにおけるＴＰＳ１欠失は、結果として多面発現表現型をもたらす(Van Aelst t al., Mol. Microbiol., 8, 927-943)。表現型の１つは、急速に醗酵可能な糖類上でもはや成長できないような菌株である。なぜｔｐｓ１Δがグルコース上で成長できないのかまだ明らかではない。３つの異なる仮説が提示されている(Hohmann and Thevelein, Trends in Biol. Sciences, 20, 3-10, 1995)。ｔｐｓ1Δ菌株をグリセロールからグルコース含有の培養基に移行させた場合、糖ホスフェートの急速な蓄積とＡＴＰ濃度の急速な降下が起きる。明らかに、ＴＰＳ１遺伝子は、グルコースの糖分解機構への流入を制御する機能を持っている。輸送とリン酸化は共役しているので、細胞に流入するあらゆる糖類はリン酸化される。Ｈｘｋ２の活性を減退させることで、グルコースおよびフルクトース上でｔｐｓ１Δ菌株の増殖欠陥表現型を抑制できる(Hohmann et al., Current genetics 23, 281-289, 1993)。 インビトロ研究により、Ｔｐｓ１タンパク質の産物、すなわちトレハロース-６-ホスフェートがＨｘｋ２の活性を阻害し、そのようにしてグルコースの糖分解機構への流入を制御できることが明らかになった。
【０１３６】
ＴＰＳ１のS.lepidophylla同族体を酵母で発現さした場合、クローン全長を有する構造体とＮ末欠失の構造体との間で、グルコース含有の培養基上における増殖に関して明らかな差異が見られる。ＣＵＰ１プロモーターの制御のもとに全長Ｓｌ ＴＰＳ１で形質転換したｔｐｓ１Δ菌株は、グルコース上では増殖しない。Ｓｌ Ｔｐｓ１の最初の１００アミノ酸をコードする最初の３００ｂｐ削除された構造体のｔｐｓ１Δ菌株における発現は、グルコース上で増殖する。明らかに、全長のクローンがグルコース流入の問題を解決できないが、一方、Ｎ末欠失がグルコース流入を制御できる。
【０１３７】
これを試験するために、糖分解における最初の代謝産物の濃度計測実験を実行した。それには下記の菌株を使用した：
ＰＶＤ７２       Ｔｐｓ１Δ ＋ ｐＳＡＬ４
ＰＶＤ１４       Ｔｐｓ１Δ ＋ ｐＳＡＬ４/Ｓｃ ＴＰＳ１
ＰＶＤ７３       Ｔｐｓ１Δ ＋ ｐＳＡＬ４/Ｓｌ ＴＰＳ１
ＰＶＤ１５       Ｔｐｓ１Δ ＋ ｐＳＡＬ４/ΔＮ Ｓｌ ＴＰＳ１
【０１３８】
糖分解代謝産物の測定のために、細胞を指数増殖期までＳＤグリセロール培養基上で育成した。細胞を遠心分離で採取した。ペレットを一度洗い、再懸濁して、次にＹＰ培養基において３０℃でインキュベートした。グルコースを１００ｍＭの最終濃度に加え、ＣｕＳＯ４を１００μＭの最終濃度に加えた。
【０１３９】
グルコースを加える前後に、表示の間隔でサンプルを取り出して、即座に-４０℃の６０％メタノール内でクエンチした。
【０１４０】
糖分解代謝産物の測定をこれらのサンプルについて、基本的にde Koningおよびvan Dam(Anal. Biochem. 204, 118-123, 1992)の記述にしたがって実行した。Lowry et al.(J. Biol. Chem. 193, 265-275, 1951)に従い測定したサンプルに含まれるタンパク質の全量、および酵母のサイトソルの量をタンパク質１ｍｇにつき１２μｌとする仮定を用いて、サイトソルの濃度をｍＭ単位で計測した。図１４は、代表的な実験の結果を示す。
【０１４１】
結果から明らかなように、グルコースを加えた後の短時間では、S. lepidophyllaＴＰＳ１遺伝子が全長であるかＮ末欠失であるかで代謝産物の濃度に差異がない。グルコースを加えた後に糖ホスフェートの明らかな高い蓄積があり、この事実はｔｐｓ１Δ菌株の場合と同様である。
【０１４２】
Ｎ末欠失構造体についてのこれらの結果からすると、糖ホスフェートの蓄積は、酵母細胞がグルコース上において増殖できるかできないかの事実には関係がない。これは、Ｎ末部分がグルコースの糖分解機構への流入の制御に重要であることを意味する。それはまた、ΔＮ ＳｌまたはΔＮ Ａｔ ＴＰＳ１遺伝子を含有するｔｐｓ１Δ菌株が、糖分解機構への全流入を増加させる手段として使用できることを意味する。この菌株は完全にグルコース上で増殖するが、糖分解機構の上部において代謝産物の高い蓄積が見られる。糖分解機構の下流における酵素の過剰発現は結果として大きな流入をもたらす。
【０１４３】
代謝産物の濃度は、グルコースを加えた後の短時間のあいだにしか計測できないので、別の実験で、代謝産物の濃度を指数増殖期および定常期のあいだに計測した。その結果を図１５に示す。
【０１４４】
これらのデータは、最初の実験で得た結果を立証する。糖ホスフェートの過剰蓄積が、Ｎ末欠失構造体で形質転換したｔｐｓ１Δ菌株にある。図１４および１５から、ｔｐｓ１Δ菌株とΔＮ Ｓｌ ＴＰＳ１発現プラスミドを含んでいるｔｐｓ１Δ菌株との間の差異はＡＴＰレベルであることが立証される。ｔｐｓ１Δ菌株におけるＡＴＰレベルはゼロまで降下するが、他の菌株ではそうではない。残っているＡＴＰレベルが、グルコース上での増殖に明らかに十分である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、発現ベクターｐＢＮ３５を示す。
【図２】  図２は、ＡtＴＰＳ１を含むプラスミドｐＩＢＴ１０１を示す。
【図３】  図３は、ΔＮＡtＴＰＳ１を含むｐＩＢＴ１０２を示す。
【図４】  図４は、Ｓ１ＴＰＳ１を含むｐＩＢＴ１０３を示す。
【図５】  図５は、△ＮＳ１ＴＰＳ１を含むｐＩＢＴ１０４を示す。
【図６】  図６は、完全なもしくは切断したテマリカタヒバ（S. lepidophylla）ＴＰＳ遺伝子を含む酵母発現ベクターにより形質転換した野生型およびｔｐｓ１Δ株のグルコースおよびフルクトース含有培地上での増殖を示す。
【図７】  図７は、ｐＣＶＶ１を示す。
【図８】  図８は、非稀釈および稀釈のグルコースサンプルについての標準直線を示す。
【図９】  図９は、各遺伝子の標識化構築体を示す。
【図１０】  図１０は、標識化構築体で得られたプラスミドを示す。
【図１１】  図１１は、ｔｐｓ１Δまたはｔｐｓ１Δｔｐｓ２ΔバックグランドにおけるＨＡ標識の完全長およびＮ末端欠失Ｓ１ ＴＰＳ１遺伝子についてのウエステンブロットの結果を示す。
【図１２】  図１２は、株ＰＶＤ１６４およびＰＶＤ１６５に関する結果を示す。
【図１３】  図１３は、ＴＰＳとＴＰＰタンパク質のキメラ融合を示す。
【図１４】  図１４は、各糖分解代謝産物の時間変化を示す。
【図１５】  図１５は、各代謝産物の濃度測定の結果を示す。
【図１６】  図１６は、トレハロース−６−ホスフェートの検定法の概略を示す。
【図１７】  図１７は、菌株ＥｃＶＶ１とＥｃＶＶ３とのホスホトレハラーゼ活性の比較を示す。
【図１８】  図１８は、各抽出物のトレハロース−６−ホスフェートの濃度測定の結果を示す。
【図１】
0004948704.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図９】
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【図７】
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【図８−Ｉ】
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【図８−ＩＩ】
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【図８−ＩＩＩ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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