(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換えウイルスＤＮＡを含む、ワクチン。
【請求項３】
ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターと一緒に用いられる、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載の組み換えウイルスＤＮＡと、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターとを含む、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡワクチンに関し、例えば、エイズ（ＡＩＤＳ：Acquired Immune Deficiency Syndrome（後天性免疫不全症候群））用のＤＮＡワクチンに関する。より詳細には、本発明は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（本明細書中、ＨＩＶとも記す）またはサル免疫不全ウイルス（本明細書中、ＳＩＶとも記す）などのウイルスの感染の予防、並びに、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズ発症などのようなウイルス感染によるウイルス疾患の発症の予防及び／治療のために用いることができるＤＮＡワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトにおけるエイズの原因となるＨＩＶは、レトロウイルスの一種であり、１型及び２型などが知られている。ＨＩＶは、血液を媒介として例えば感染者との性交渉あるいは患者の血液輸血などによって感染し、そして感染により血液中のＴ細胞が破壊され、免疫機能が著しく低下し、カポシ肉腫、カリニ肺炎等に罹患して死に至る疾患である。
ＨＩＶ感染者数は近年、加速度的に増加しており、特にタイ、アメリカ合衆国などの諸国においては、エイズが国民の死亡原因の上位に位置しており、その予防および治療法を確立することは極めて重要である。エイズに対する予防および治療法については現在までに多くの研究がなされている。中でも、エイズワクチン開発は、社会的にも必要度が高く、最重要課題である。このエイズワクチンに関する研究は、主にマカクサルにおけるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染などの霊長類モデルにおいておこなわれている（Johnson,R.P., Curr.Opin.Immunol. 8, 554-560(1996)；及びAlmond, N.M.他、AIDS 12, 133-140(1998））。
【０００３】
一般に、ワクチンにより誘導される感染防御免疫としては、主に中和抗体による液性免疫とＴリンパ球による細胞性免疫の２つが考えられており、エイズワクチンにおいても両者の重要性は指摘されている(Dittmer, U. 他、Nature Med. 5,189-193 (1999))。このうち、液性免疫については、ＨＩＶの構造上の特異性および多様性の問題等のため、充分有効な免疫誘導が容易ではない(Shibata, R.他、Nature Med. 5,204-210 (1999))。一方、近年特に、ＨＩＶあるいはＳＩＶ感染抑制における細胞性免疫の重要性が指摘されている(Geretti, A.M. 他、J.Gen.Virol, 79, 415-421 (1998); Matano, T. 他、J. Virol, 72, 164-169 (1998); Scmits, J.E. 他、Science 283, 857-860 (1999); Jin, X. 他、J. Exp. Med. 189, 991-998 (1999))。しかし、現時点では、これらの感染防御免疫を充分有効かつ安全に誘導するエイズワクチンは開発されていない。
【０００４】
エイズワクチンの１つとして注目されているものに弱毒化生ウイルスワクチンがある。これは、病原性を持つＨＩＶに遺伝子操作を施すなどして病原性を消失させたウイルスを免疫原として使用する方法である。弱毒化したウイルスは接種された宿主に対して効果が長期間持続する強い免疫原性を誘導する。弱毒化生ウイルスワクチンは霊長類を用いた動物実験レベルにおいて比較的良好な有効性が確認されているが(Daniel,M.D.,他、Science 258, 1938-1941(1992)；Shibata,R.,他、J.Virol. 70, 4361-4369(1996)；及びShibata,R.,他、J.Virol. 71, 814-8148(1997))、ウイルスの病原性が回復したり、他のウイルスにより汚染されている可能性が残る等といった安全性の問題が未解決であるため実用化には至っていない（Baba,T.W.,他、Science 267, 1820-1825(1995)；及びBaba,T.W.,他、Nature Med. 5, 194-203(1999)）。
【０００５】
比較的安全と考えられるエイズワクチンとしては、サブユニットワクチン・ウイルスベクターワクチン・ＤＮＡワクチンが主なものであり、それぞれ、アジュパンドとの併用あるいは他の方法との併用等も試みられてきている(Letvin, N.L. 他、Science 280, 1875-1880(1998))。サブユニットワクチンは、ＨＩＶの蛋白質あるいはそれに含まれるペプチドを合成・精製し免疫原として用いるものであるが、有効な抗エイズ感染防御免疫は誘導できていない。抗原存続時間が短いこと、細胞性免疫誘導機能が弱いこと等の理由が考えられている。ウイルスベクターワクチンはワクシニアウイルスベクター等の組み換えウイルスベクターを用いてＨＩＶ蛋白質を抗原として発現させるものであるが、ウイルスベクター由来のウイルス抗原に対する免疫反応が強く、ＨＩＶ抗原に対する免疫誘導能は不充分である。従って、他の方法との併用を中心に検討されている。ＤＮＡワクチンは、ＨＩＶ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡを投与することにより、ＨＩＶ抗原を発現させるものである。細胞性免疫誘導能が比較的良好なこと等から近年特に注目されているが、充分有効な抗エイズ感染防御免疫は誘導できていない。(ウイルス複製を起こす弱毒化生ウイルスワクチンと比較して、)抗原発現量が低いことおよび抗原発現時間が短いこと等の理由が考えられている。以上のように、現時点では、安全性と有効性の両方を満たすエイズワクチンは開発されていない（Burton,D.R.他、Nature Med. 4, 495-498(1998)；Lu, S.,他、J.Virol. 70, 3978-3991(1996)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は新規なＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、安全性が高いと同時に十分な感染防御免疫を誘導できるＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＳＨＩＶ（ヒトおよびサル由来のキメラの免疫不全ウイルス）のｅｎｖ遺伝子の一部をＦＭＬＶのｅｎｖ遺伝子に置き換えることによって作製した組み換えウイルスＤＮＡとＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡとを一緒にサルに投与することにより、安全かつ有効にＳＩＶ感染防御細胞性免疫を誘導できることを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
【０００８】
好ましくは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、レトロウイルスのＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、レトロウイルスのＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡである。
好ましくは、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
好ましくは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、コードされる蛋白質が免疫原性を有し、当該蛋白質によってウイルス粒子が再構成されるようなＤＮＡである。
好ましくは、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡを含む組み換えウイルスＤＮＡ由来のウイルスがＦＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたはサルの細胞には感染不可能で、ＦＭＬＶレセプターを発現する細胞には感染可能であるようなＤＮＡである。
【０００９】
好ましくは、本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み換えウイルスＤＮＡであり、より好ましくは、レトロウイルスのＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、レトロウイルスのＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み換えウイルスＤＮＡであり、さらに好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み換えウイルスＤＮＡである。
本発明の一態様によれば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
本発明の別の態様によれば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、本発明の組み換えウイルスＤＮＡを含む、ワクチンが提供され、好ましくはエイズワクチンが提供される。
本発明のワクチンは好ましくは、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターと一緒に用いられる。
本発明の別の側面によれば、本発明の組み換えウイルスＤＮＡと、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターとを含むワクチンが提供され、好ましくはエイズワクチンが提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施方法および実施態様について詳細に説明する。
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ（好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのようなレトロウイルスのＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと該ウイルスのＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ）と、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有するキメラＤＮＡであることを特徴とする。
本明細書で言うウイルスの種類は特に限定されず、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウイルスでもよく、また一本鎖ウイルスでも二本鎖ウイルスでもよい。好ましいウイルスの具体例としては、レトロウイルスが挙げられる。
本明細書で言うレトロウイルスは通常の意味を有し、ＲＮＡウイルスの中で遺伝子ＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環をもつウイルスである。レトロウイルスの具体例としては、例えば、マウス白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−II、ある種の癌ウイルス、並びにエイズウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）など）などが挙げられる。レトロウイルスは通常、タンパク質をコードする３種の遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをもっている。
本明細書で言う「ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）」または「サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）」とは、ヒトまたはサルに感染する免疫不全ウイルスの全てを包含する最も広い意味を有し、あらゆるウイルスタイプまたはそれらの変異体の全てを包含する。
【００１２】
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを含み、特に好ましくはＨＩＶまたはＳＩＶなどのレトロウイルス由来のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部とＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを含む。
即ち、本発明のウイルスＤＮＡによりコードされるウイルスのコアタンパク質は完全蛋白質でも部分蛋白質でもよい。Ｇａｇ蛋白質及び／又はＰｏｌ蛋白質などのコアタンパク質の部分蛋白質をコードするＤＮＡを用いる場合には、コードされる部分蛋白質が免疫原性を有するようなＤＮＡが好ましく、またコードされる部分蛋白質によってもウイルス粒子が再構成され得るようなＤＮＡが好ましい。本発明の組み換えウイルスＤＮＡは好ましくは、Ｇａｇ蛋白質の完全蛋白質とＰｏｌ蛋白質の完全蛋白質をコードするＤＮＡを有する。
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは更に、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを有する。Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡについても、コアタンパク質と同様に、完全蛋白質をコードするＤＮＡでも部分蛋白質をコードするＤＮＡでもよいが、好ましくは完全Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡである。また、Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡは、ＨＩＶまたはＳＩＶ由来のＥｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡの一部のみをＦＭＬＶのＥｎｖ蛋白質の一部をコードするＤＮＡに置き換えたものでもよい。この場合、ＦＭＬＶのＥｎｖ蛋白質の一部をコードするＤＮＡを有する本発明の組み換えＤＮＡ由来のウイルスは、ＦＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたはサルの細胞には感染せず、ＦＭＬＶレセプターを発現する細胞のみに感染できることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、コアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、Ｅｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有するが、各々のＤＮＡのコピー数は少なくとも１以上であれば、そのコピー数は限定されず、２コピー以上のＤＮＡ断片を１つの組み換えウイルスＤＮＡ中に含んでいてもよい。
また、上記３種類の蛋白質の少なくとも一部をコードする各々のＤＮＡの位置関係も特には限定されない。
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Adachi,A.,他、J.Virol.59,284-291(1986);及びShibata,R.,他、J.Virol.69,4453-4462(1986)）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（Kestler,H.,他、Science.248,1109-1112(1990)）またはＨＩＶとＳＩＶの一部ずつを含んで成るキメラウイルス（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)等に記載）遺伝子などのような任意の公知のウイルス遺伝子を出発材料として使用して、その中に含まれるＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードする領域を、常法のＤＮＡ組換え技術を用いてフレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡに置き換えることによって作製することができる。
【００１４】
本発明の組み換えウイルスＤＮＡは好ましくは、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターと一緒にワクチンとして用いられる。ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターは好ましくは発現プラスミドベクターである。
発現ベクターの作製において有用なベクターとしては、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターを含むベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１５】
構成性プロモーターの具体例としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のプロモーターなどのウイルス由来の強力なプロモーターが挙げられる。
組織特異的プロモーターの具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター、あるいは抗生物質誘導性プロモーター、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００１６】
ＦＭＬＶレセプターの発現ベクターの構築のために用いるベクターは、プロモーター（例えば、上記の構成性または誘導性プロモーター）ＤＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことが好ましい。ベクターはさらに、エンハンサー要素、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０あるいはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来）、スプライシングシグナル・イントロン配列などのＲＮＡプロセシング配列、あるいはＣｐＧモチーフ等の免疫刺激ＤＮＡ配列の１又は２以上のコピーを含んでいてもよい。
また、ベクターは、細菌の複製起点配列および／または抗生物質耐性（例えば、カナマイシン）あるいは非抗生物質耐性（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）に用いられ得る選択マーカー用のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明はまた、上記した本発明の組み換えＤＮＡを含む、ワクチンを提供する。ウイルスとしてＨＩＶまたはＳＩＶなどのエイズウイルスを選択した場合には、本発明の組み換えＤＮＡを含むワクチンはエイズワクチンとして使用できる。
本明細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味する。本明細書において、「エイズワクチン」という用語は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染予防ワクチン、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズ発症の予防ワクチン、並びにＨＩＶまたはＳＩＶ感染症の治療ワクチンを含む広い意味で用いられる。
【００１８】
本発明のワクチンはヒトまたはサルなどの哺乳動物に投与され、投与を受けた動物には、対応するウイルス疾患に対する免疫が生じる。本発明の組み換えＤＮＡによってコードされるウイルスの蛋白質が生体内で合成され、これが抗原となって細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されて細胞性免疫が喚起され（場合によってはＢ細胞も抗体産生細胞へと分化し、体液性免疫も喚起される）、ウイルスに対する免疫が生じることになる。細胞性免疫が喚起されることは、エイズなどのウイルス疾患の発症や進行の抑制にも有用であることから、本発明のワクチンを用いる免疫は、エイズなどのウイルス疾患の予防のみでなく治療にも役立つものである。
【００１９】
本発明のワクチンは、例えば、薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試薬など）またはアジュバンドと一緒に配合して医薬組成物の形態で提供することができる。
【００２０】
本発明で用いることができる薬学的に許容可能な担体とは、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトランスフェクションするのに適したものである。このような薬学的に許容可能な担体の具体例としては、リポソーム、金粒子、カチオン性ポリマーなどの公知のトランスフェクション試薬が挙げられる。当業者はこのようなトランスフェクション試薬を用いて、本発明で用いるＤＮＡを適宜処方することができる。
【００２１】
医薬組成物を調製するために用いることができる免疫用アジュバントは当技術分野で周知である。当業者は、医薬組成物を形成するための適切なアジュバントを適宜選択することができる。
本発明で用いることができるアジュバントの具体例としては、ＣｐＧアジュバント(Krieg A. 他、Nature 374, 546-549 (1995))などが挙げられる。
本発明のワクチンは、カプセル剤、懸濁液、エリキシル剤又は溶液のような任意の投与形態で用いることができる。
【００２２】
また、本発明のワクチンは、他のワクチンと併用することができる。この場合、同時に投与する場合と前後して投与する場合がありうる。具体例としては、サブユニットワクチン、ウイルスベクターワクチン、他のＤＮＡワクチン等との併用がある。
【００２３】
単回投与量のワクチンＤＮＡを含む医薬組成物を調製するために担体物質と組み合わせるべきワクチンＤＮＡの量は、一般的には、投与経路および投与方法、用いる塩基配列および発現ベクターの種類、発現される抗原タンパク質あるいはペプチドの安定性および活性（免疫原性）、被験者の性別、年齢、体重、全体的な健康状態、予防または治療の対象となるウイルス疾患の種類やタイプ等を含む多くの要因に依存する。投与すべきＤＮＡの量はまた、薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試薬）およびアジュバンドの種類および量にも依存する。
【００２４】
本発明のワクチンをヒトに投与する場合、対象となるウイルス疾患の予防または治療に有効な量で投与されるが、一般的には、１μｇ〜２０００μｇを筋肉あるいは皮膚に直接投与する。遺伝子銃を使用して本発明のワクチンを投与することもできる。皮下注入、皮内導入、経皮圧入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静脈内又は吸入投与、経口投与も可能であり、投与経路は特に限定されない。また、追加免疫接種を行うことも可能である。
【００２５】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのウイルスのｅｎｖ遺伝子をフレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のｅｎｖ遺伝子に置き換えることによって作成したキメラ組み換えウイルスＤＮＡを、ＦＭＬＶのレセプターをコードするＤＮＡと一緒に投与することによって、複製により比較的長期の高い抗原発現量を達成して有効性を獲得すると同時に、感染される細胞をＦＭＬＶのレセプターをコードするＤＮＡを保持する細胞に限定することにより安全性を確保することにも成功したものである。本発明は従来にない全く新しいシステムによるワクチンを提供するものであり、これにより有効性および安全性の両方の面で優れたワクチンを提供することが可能になった。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２６】
【実施例】
（１）材料と方法
（ａ）ＤＮＡの調製
ＳＨＩＶ MD14YE（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)）のＥｎｖ表面蛋白質（ＳＵ）をコードする遺伝子断片を取り除き、ＦＭＬＶｅｎｖ遺伝子（Patuleia,M.C.他、Cancer Res. 27:726-730(1967)；及びMatano,T.,他、J.Virol. 67, 2026-2033(1993)）（フレンドリッチの番号付によるヌクレオチド５７６９−７８０５［GenBank accession no.X02794］（Koch,W.,他、J.Virol. 45:1-9(1983),26））に置き換え、ＦＭＳＩＶ感染性クローンＤＮＡ（ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡ）を得た。ｎｅｆ遺伝子の５’側を欠失させた。即ち、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡは、ＳＩＶ由来のＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ及びｖｐｘと、ＨＩＶ−１由来のｔａｔ及びｒｅｖと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖを有する。図２に、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡの構造を示す。図２において、白い部分はＳＩＶ由来の領域を示し；点線の部分はＨＩＶ−１由来の領域を示し；黒い部分はＦＭＬＶ由来の領域を示す。
なお、参考のために図１には、ＨＩＶ−１由来のｇａｇとｐｏｌと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖとを有するキメラ組み換えウイルスＤＮＡであるＦＭＨＩＶの構造を示す模式図を示す。
【００２７】
２種類のｍＣＡＴ１  ＤＮＡ（ｍＣＡＴ１発現プラスミドＤＮＡ）を使用した。一つ目のｐＪＥＴ（Albritton,L.M.,他、Cell 57, 659-666(1989)）は、J.M. Cunningham氏から供与されたものである。二つ目のｐＣＭＶｍＣＡＴ１は、ｐＣＭＶβ（クローンテック社）からβ−ｇａｌ遺伝子を取り除き、ｍＣＡＴ１をコードする遺伝子に置き換えることによって構築した。
【００２８】
（ｂ）マカクサル
動物個体におけるＦＭＳＩＶの複製の確認実験には、１頭のカニクイサルを使用した。ワクチン接種実験には、年齢が同じ5頭の雄の赤毛サルを使用した。サルは全てＳＩＶ、ＳＲＶ（サルＤ型レトロウイルス）、およびサルＴリンパ球性白血病ウイルス１型に対して陰性であることを試験した。血液採取、リンパ節（ＬＮ）生検、ワクチン接種、およびウイルス接種はケタミン麻酔下で行った。
【００２９】
（ｃ）ＤＮＡ−ＰＣＲ
ＤＮＡはリンパ節（ＬＮ）リンパ球から調製し、ネスティドＤＮＡ ＰＣＲは既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)）行った。１ｓｔＰＣＲで用いたプライマーはTGGCAGATTGAGCCCTGG（配列番号１）およびCCTCTTCCTCTGACAGGCC（配列番号２）である。２ｎｄＰＣＲで用いたプライマーは、AAGCTAGTGTGTGTTCCCATC（配列番号３）およびAACTCGAGCTTCCAAACTCTTCTGGG（配列番号４）である。
【００３０】
（ｄ）ＴＨ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）のＳＩＶ Ｇａｇ特異的誘導
ＰＢＭＣ(末梢血液単核細胞)は、既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)）全血液試料から調製し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Hyclone）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Life Technologies）中で培養した。ＳＩＶＧａｇを発現する組み換えセンダイウイルスベクター（SeV-SIVgag）に感染したＰＢＭＣをＳＩＶ Ｇａｇ特異的刺激用細胞として使用し、対照センダイウイルスベクター（SeV-Control）に感染したＰＢＭＣを非特異的刺激用細胞として使用した（Hasan,M.他、J.Gen.Virol., 78, 2813-2820(1997)）。ＳＩＶ Ｇａｇ特異的刺激培養を、９６ウエルプレートのウエル当たり５×１０5のＰＢＭＣと１×１０5のＧａｇ特異的刺激用細胞とを混合することにより開始し、非特異的刺激培養を、５×１０5のＰＢＭＣと１×１０5の非特異的刺激用細胞とを混合することにより開始した。混合培養開始後３日目から、細胞を１０ユニット／ｍｌのヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Boehringer-Mannheim）を含有する培地中で培養した。上清を３日目と６日目に回収し、上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡ（Biosourse）で定量した。このアッセイにおける検出の下限値は１５ｐｇ／ｍｌである。ＮＤは未測定を示す。
【００３１】
（ｅ）ＣＴＬアッセイ
Ｇａｇ特異的刺激培養におけるＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。それぞれのサル個体から得たＰＢＭＣにヘルペスウイルスパピオを感染させて確立したＢ細胞株に、ＳＩＶ Ｇａｇを発現する組み換えワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−ＳＩＶｇａｇ）を感染させた細胞を、ＳＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＴＬの標的細胞として使用し、対照ワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）を感染させたＢ細胞を、非特異的標的細胞として使用した（Voss,G.,他、J.Virol.Methods 39, 185-95(1992)；及びMackett,M., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79, 7415-9 (1982)）。51Ｃｒ−放出アッセイは既報の通り（Voss,G.,他、Virology 208, 770-775(1995)）行った。アッセイでは１０％を超える値について陽性と判断した。
【００３２】
（ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ
血漿ＲＮＡをHigh Pure Viral RNAキット（Boehringer-Mannheim）を使用して抽出した。逆転写および１ｓｔＰＣＲはＲＮＡ ＰＣＲキット（Takara）を用いて行った。以下のＳＩＶｅｎｖ−特異的プライマーを使用した；１ｓｔＰＣＲで用いたプライマーは、ATGGGATGTCTTGGGAATC（配列番号５）およびCCAAATCTGCAGAGTACCAAG（配列番号６）であり、２ｎｄＰＣＲで用いたプライマーは、CAGCTTGGAGGAATGCG（配列番号７）およびCTTGTTCCAAGCCTGTGC（配列番号８）である。ＲＮＡ試料の定量は、既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373(1997)；及びReed,L.J.,他、Am.J.Hyg.27, 493-497(1938)）、限界希釈法に基づいておこなった。このアッセイにおける検出の下限値は１．０×１０2コピー／ｍｌであった。
【００３３】
（２）方法と結果
（ａ）ＦＭＳＩＶ複製
ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡは、キメラのサル/ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）感染性クローンＤＮＡからそのｅｎｖをＦＭＬＶｅｎｖに置き換えることによって構築した（図２を参照）。ＦＭＳＩＶの発現および感染を培養霊長類細胞株で試験した。
【００３４】
図３には、ＦＭＳＩＶの発現の結果を示す。細胞を１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Life Technologies）中で培養し、６ウエルプレートの各ウエル中のＣＯＳ−１細胞にリポフェクトアミン（Life Technologies）を用いて２μｇの図２に示したＤＮＡをトランスフェクションし、上清を２日後に回収した。上清中のｐ２７の濃度はＥＬＩＳＡ（Coulter）により定量した。図３において、ＦＭＬＶはＦＭＬＶ感染性クローンＤＮＡ（Matano,T.,他、J.Virol.67, 2026-2033(1993)）を示し、ＦＭＳＩＶはＦＭＳＩＶ感染性クローンＤＮＡを示し、ＳＨＩＶはＳＨＩＶ MD14YE感染性クローンＤＮＡを示す。
【００３５】
図４には、ＦＭＬＶＥｎｖの発現の結果を示す。ＤＮＡトランスフェクションまたはＦＭＳＩＶ感染の２日後に、細胞を［35Ｓ］メチオニン及び［35Ｓ］システインを含有する［35Ｓ］Ｐｒｏ−ｍｉｘ（Amersham）で標識した。ポリクローナル抗−ｇｐ７０（ＭＬＶ  ＳＵ）抗体（National Cancer Institute, lot79S000713）を用いて細胞ライセート（レーン１〜４）又はウイルスペレット（レーン５〜６）の免疫沈降を既報の通り（Matano,T.,他、J.Virol.67, 2026-2033(1993)；及びMatano,T.,他、J.Gen.Virol.76, 3165-3169(1995)）行った。図４において、レーン１と６はＦＭＬＶ Ｅｎｖ発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン２はＳＨＩＶ MD14YEＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン３と５はＦＭＳＩＶ  ＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン４はｍＣＡＴ１発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、ＦＭＳＩＶを感染させたＣＯＳ−１細胞の結果を示す。
【００３６】
図３および図４の結果から分かるように、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞は、その上清中にＳＩＶ Ｇａｇキャプシド蛋白質ｐ２７を発現し（図３を参照）、ＦＭＬＶ Ｅｎｖは上清からのウイルスペレットに検出された（図４を参照）。これらの結果は、ＦＭＬＶ Ｅｎｖを有するキメラＳＩＶであるＦＭＳＩＶの産生を示している。
【００３７】
ＦＭＳＩＶ上清を使用して偽トランスフェクションまたはｍＣＡＴ１をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞に感染させ、ＦＭＳＩＶ感染性を試験した。
６ウエルプレートの各ウエルのＣＯＳ−１細胞に偽−またはｍＣＡＴ１−発現プラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、１日後、１ｍｌのＦＭＳＩＶまたはＳＨＩＶ（ＦＭＳＩＶまたはＳＨＩＶ MD14YEをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞からの濾過上清）と一緒に培養した。４時間のインキュベーション後に、上清を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、培養液を加えて培養した。３日後、上清を回収し、そのｐ２７濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５に示す。
【００３８】
図５に示される通り、ｐ２７産生は、ｍＣＡＴ１でトランスフェクションした後ＦＭＳＩＶを加えた細胞のみで観察された。免疫沈降分析によって、ＦＭＬＶＥｎｖの発現をＦＭＳＩＶを感染させたｍＣＡＴ１トランスフェクションＣＯＳ−１細胞で確認した（図４を参照）。これらの結果は、ＦＭＳＩＶはＣＯＳ−１細胞には感染できないが、ｍＣＡＴ１発現ＣＯＳ−１細胞には感染できることを示している。
【００３９】
ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両方を投与した場合にインビボにおいてＦＭＳＩＶの複製を誘導できるかどうかを試験するために、１００μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡと１００μｇのｍＣＡＴ１  ＤＮＡとを１頭のカニクイサルの外科的に露出した左側鼠蹊リンパ節（ＬＮ）に注入した。１００μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみを対照として反対側(右側)の鼠蹊ＬＮに注入した。ＤＮＡ注入の１週間後に得た各ＬＮからＤＮＡを調製し、ネスティドＰＣＲに付した。ＳＩＶ ２−ＬＴＲ環状ＤＮＡ（Coffin,J.M.,他、Retroviruses, CSHL press, N.Y.(1997)）は、右側のＬＮでは検出されず左側のＬＮで検出された（図６を参照）。図６において、レーン１は、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡを注入した右側のＬＮのリンパ球から調製したＤＮＡの結果を示し、レーン２は、ＦＭＳＩＶとｍＣＡＴ１のＤＮＡを注入した左側のＬＮのリンパ球から調製したＤＮＡの結果を示す。２−ＬＴＲ環状ＤＮＡを示す予測されたＰＣＲ産物は、４４５ベースペア（ｂｐ）の長さであった（図６において矢印で示す）。レーン３は、ＤＮＡ分子量マーカーを示す（Life Technologies）。
上記の結果は、インビボでのＦＭＳＩＶ複製を示している。
【００４０】
（ｂ）細胞性免疫応答の誘導
以下の表１に示す通り５頭の年齢が同じ雄の赤毛サルを用いることによって各々のワクチン投与系を評価した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
３頭の赤毛サル（２０２９７１１０２０（＃２０）、２０２９７１１０２１（＃２１）および２０２９７１１０１８（＃１８））にＦＭＳＩＶ  ＤＮＡおよびｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両方をワクチン接種した。マカクサル＃２０には、最初のＤＮＡ注入後０、１、２、６及び１２週目に、１００μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡと１００μｇのｍＣＡＴ１  ＤＮＡの筋肉内投与、および５μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡと５μｇのｍＣＡＴ１  ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。マカクサル＃２１および＃１８には、０、１、２、６及び１２週目に、２００μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡと２００μｇのｍＣＡＴ１  ＤＮＡの筋肉内投与、および１０μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡと１０μｇのｍＣＡＴ１  ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。マカクサル＃１８にはさらに２回の追加の処置を施した。先ず、１μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡと１μｇのｍＣＡＴ１  ＤＮＡを外科的に露出した鼠蹊ＬＮに遺伝子銃によって０週目に注入した。次に、皮膚から調製した同原ファイブロブラスト様細胞にＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡを各々インビトロでトランスフェクションした。２日後に、両方の細胞を混合し、１日間一緒に培養し、マカクサル＃１８に筋肉内注入した。マカクサル２０２９７１１０１７（＃１７）には、０、１、２、６及び１２週目に、２００μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡの筋肉内投与、および１０μｇのＦＭＳＩＶ  ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。このマカクサル＃１７における、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみの投与は、従来のような複製を生じないタイプのＤＮＡワクチンに相当する対照ワクチンとして用いられた。
【００４３】
ワクチン接種により誘発されるＳＩＶＧａｇ特異的細胞性免疫を調べる目的で、ワクチン接種開始後７週目と１４週目にマカクサルから採取した血液より分離したＰＢＭＣ(末梢血液単核細胞）を、ＳＩＶＧａｇ発現細胞との混合培養によって刺激した。混合培養開始後３日目および６日目に回収した上清中におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ)の濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した（この結果を図７に示す）。ＩＦＮ−γは、ＴＨ１サイトカインの一つである（Leonard, W.J., p.741-774, In paul, W.E.(ed.), Fundamental immunology, 4th ed., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)）。図７の黒グラフは、ＳＩＶ Ｇａｇ特異的刺激培養上清中のＩＦＮ−γ濃度であり、白グラフは、対照実験となる非特異的刺激培養上清中のＩＦＮ−γ濃度である。
【００４４】
対照実験としてＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみをワクチン接種したマカクサル＃１７においては、ＳＩＶＧａｇ特異的刺激によるＩＦＮ−γ誘導は認められなかった。一方、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両方をワクチン接種した３頭のマカクサル（＃２０、＃２１及び＃１８）では、３頭すべてにおいて、ＳＩＶＧａｇ特異的刺激によるＩＦＮ−γ誘導が検出された(図７参照)。マカクサル＃２１は、７週目においてマカクサル＃２０よりも効率的なＩＦＮ−γ誘導を示したが、これらはともに１４週目には同様のレベルのＩＦＮ−γ誘導を示した。ＳＩＶＧａｇ特異的ＴＨ１サイトカイン誘導はマカクサル＃１８において最も効率的であった。
【００４５】
さらにＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ(細胞傷害性Ｔリンパ球）活性を測定した。ここでは、ＳＩＶＧａｇ発現組み換えワクシニアウイルスベクター(Ｖｖ−ＳＩＶｇａｇ)を感染させたＢ細胞を、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ反応における標的細胞として使用し（図８中において、Ｏで示す）、対照ワクシニアウイルスベクター(Ｖｖ−Ｃｏｎｔｒｏｌ)を感染させたＢ細胞を、非特異的ＣＴＬ反応における標的細胞として使用した（図８中において、×で示す）。
図８に示す通り、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ活性はＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両方をワクチン接種した３頭のマカクサル(＃２０、＃２１、＃１８)全てにおいて検出されたが、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみを投与したマカクサル＃１７では検出されなかった。これらの結果は、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみによるワクチンと比較して、本発明によるＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両方を用いたワクチンは、ＳＩＶ特異的細胞性免疫を、より効率よく誘導することを示している。
【００４６】
（ｃ）ＳＩＶｍａｃ２３９感染に対する抵抗性
ワクチン接種した４頭の赤毛サル(＃１７、＃２０、＃２１、＃１８)および未接種の対照マカクサル２０２９７１１０２２（＃２２）に対して、２４週目に、１００ＴＣＩＤ50のＳＩＶｍａｃ２３９ウイルス（Kestler,H.,他、Science 248, 1109-1112(1990)；およびLewis,M.G.,他、AIDS Res.Hum.Retroviruses 10, 213-220(1994)）を静脈内接種した（表１を参照）。
ＳＩＶ接種後、血漿中のＳＩＶ ＲＮＡコピー数（図９）、血漿中のｐ２７濃度（図１０）、体重（図１１）、末梢血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数（図１２）を測定した。図１０のｐ２７濃度の検出下限値は１００ｐｇ／ｍｌである。図１１において、体重の相対値(Relative body weight)は、ＳＩＶ接種時点の体重を１００とし、このＳＩＶ接種時点の体重に対する相対値で示した。また、ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の測定（図１２）においては、モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ４抗体（Becton Dickinson, CD4-PE[Leu-3a]）及びモノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ２９抗体（Coulter, 4B4-FITC）を用いてフローサイトメトリーを行って測定した。
【００４７】
ワクチン未接種の対照マカクサル＃２２において、血漿中のＳＩＶウイルス量は、ＳＩＶ接種後２週目にピーク(ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は１×１０7／ｍｌ以上、ｐ２７濃度は１×１０4／ｍｌ以上)を示し、その後も高値(ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は１×１０7／ｍｌ以上、ｐ２７濃度は１×１０3／ｍｌ以上)を維持した（図９、図１０）。ＳＩＶ接種後、著しい体重減少および末梢血中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の減少が認められ（図１１、図１２）、１７週目に重症の下痢を伴って死亡した。解剖所見として、リンパ節・脾臓の萎縮がみられ、リンパ球は脱落(涸渇)していた。
【００４８】
ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみをワクチン接種したマカクサル＃１７は、ワクチン未接種の対照マカクサル＃２２と比較して、ＳＩＶ接種後の血漿ＳＩＶウイルス量は低値を示し、ＳＩＶ接種後２週目のＳＩＶ ＲＮＡコピー数はマカクサル＃２２の約１／１０であった(図９)。血漿ｐ２７も低値であったが、検出可能レベルであった（図１０）。血漿ウイルス量は、ＳＩＶ感染急性期の後、一度は低下したが(ＳＩＶ ＲＮＡコピー数はおおよそ約１×１０5／ｍｌ、ｐ２７は検出限界レベル以下)、１５週目から再び上昇し始めた(図９、図１０)。体重はＳＩＶ感染急性期にわずかな減少を示し、その後増加に転じたが、１５週目に再度減少し始めた（図１１）。マカクサル＃２２と同様、末梢血中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数は、ＳＩＶ接種後減少した（図１２）。これらの結果は、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみによるワクチン接種では、ＳＩＶ感染による疾患(免疫不全)の発病を防止するのに不十分であることを示している。
【００４９】
ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡ及びｍＣＡＴ１  ＤＮＡをワクチン接種した３頭のマカクサル（＃２０、＃２１及び＃１８）では、ＳＩＶ接種後、感染は成立したが、血漿ＳＩＶウイルス量は、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡのみのワクチン接種をしたマカクサル＃１７と比較して有意に低値を示した。血漿中ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は、マカクサル＃１７の場合の１／１０以下であり、マカクサル＃２２の１／１００以下であった（図９）。血漿中ｐ２７は検出されなかった（図１０）。体重変化については、ＳＩＶ感染急性期に若干の増加遅延を示しただけであった（図１１）。末梢血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数については、マカクサル＃２０及び＃２１では、ＳＩＶ感染急性期に一時的な減少を示したが、１２週目には接種前のレベルに回復した（図１２）。マカクサル＃１８では、末梢血液中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の有意な減少は認められなかった。よって、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡおよびｍＣＡＴ１  ＤＮＡのワクチン接種により、ＳＩＶ感染による疾患(免疫不全)の発病を遅延または防止できる可能性が示された。以上の結果は、本発明によるＦＭＳＩＶ  ＤＮＡおよびｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両方を用いたワクチンが、従来の方法より効率よく感染防御免疫を誘導できること、つまりその有効性を示している。
【００５０】
図３、図４、図５、図６に示した結果から、培養細胞レベルだけでなく、サル個体レベルにおいても、ＦＭＳＩＶの複製は、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡ単独投与では誘導できないが、ＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両者を投与することにより可能となることが明らかとなった。従って、このＦＭＳＩＶ複製は、ｍＣＡＴ１発現細胞のみに限局されていると考えられる。さらに、ワクチン接種後３週目、１４週目、２４週目の血漿中ＦＭＳＩＶ ＲＮＡを、ＦＭＬＶｅｎｖ特異的プライマーを用いたＰＣＲにて調べたが、検出レベル以下であった。これらの結果は、このＦＭＳＩＶ複製の安全性を示している。
以上により、本発明によるＦＭＳＩＶ  ＤＮＡとｍＣＡＴ１  ＤＮＡの両者を用いたワクチンは、安全かつ効果的にエイズウイルスに対する防御免疫を付与することができることが確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、ＨＩＶまたはＳＩＶの感染の予防、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズの予防あるいは治療などに効果的でかつ安全なＤＮＡワクチンを提供することができる。
【００５２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１由来のｇａｇとｐｏｌと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖとを有するキメラ組み換えＤＮＡであるＦＭＨＩＶの構造を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例で用いたキメラ組み換えＤＮＡであるＦＭＳＩＶの構造を示す模式図である。
【図３】図３は、ＦＭＳＩＶの発現を示すグラフである。
【図４】図４は、ＦＭＬＶ Ｅｎｖの発現を示す写真である。
【図５】図５は、ＦＭＳＩＶの感染を示すグラフである。
【図６】図６は、サル個体でのＦＭＳＩＶ複製を示す写真である。
【図７】図７は、ＩＦＮ−γのＳＩＶＧａｇ特異的誘導を示すグラフである。
【図８】図８は、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ活性を示すグラフである。
【図９】図９は、ＳＩＶを接種したサルにおける血漿ＳＩＶ ＲＮＡコピー数（コピー／ｍｌ）の変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＳＩＶを接種したサルにおける血漿ｐ２７濃度（ｐｇ／ｍｌ）の変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＳＩＶを接種したサルにおける体重の変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＳＩＶを接種したサルにおける血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数（／μｌ）の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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