(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛、周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物もしくは酸化物を成分とするか、又は周期表第１１族元素及び周期表第１３族を含む硫化物もしくは酸化物を成分とするナノ粒子であり、該ナノ粒子の表面に、
一般式（１）
（Ｒ1−Ｘ）p−（Ｙ）q−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−Ｒ2
（式中、Ｒ1はメルカプト基、ジスルフィド基、スルフィド基、ジチオカルボキシル基およびアミノ基からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、Ｒ2はカルボキシル基、カルボキシル基誘導体、アミノ基、アミノ基誘導体、ビオチニル基およびビオチニル基を含む官能基からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、Ｘは−（ＣＨ2）11−か、または−（ＣＨ2）10−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）2−を、Ｙは２価の連結基をそれぞれ示す。ｐは１または２、ｑは０または１、ｍは１〜６の整数をそれぞれ示す。）
で表される化合物１を含むナノ粒子。
【請求項２】
一般式（１）のｍが３〜６である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記周期表第１３族元素はインジウムである請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記周期表第１１族元素は銀である請求項１から３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ナノ粒子の表面に、
一般式（２）
Ｒ3−（ＣＨ2）n−Ｒ4
（式中、Ｒ3はメルカプト基、ジスルフィド基、スルフィド基、ピリジルスルフィド基、ジチオカルボキシル基およびアミノ基からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、Ｒ4はスルホン酸、スルホン酸塩、カルボキシル基、カルボン酸塩、四級アミンおよび四級アミン塩からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ示す。）
で表される化合物２を含む請求項１から４のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
一般式（２）におけるｎが２もしくは３、Ｒ4がＳＯ3−またはＮ（ＣＨ3）3＋である請求項１から５のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項７】
亜鉛、周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物もしくは酸化物を成分とするか、又は周期表第１１属元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子に、
一般式（１）
（Ｒ1−Ｘ）p−（Ｙ）q−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−Ｒ2
（式中、Ｒ1はメルカプト基、ジスルフィド基、スルフィド基、ジチオカルボキシル基およびアミノ基からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、Ｒ2はカルボキシル基、カルボキシル基誘導体、アミノ基、アミノ基誘導体、ビオチニル基およびビオチニル基を含む官能基からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、Ｘは−（ＣＨ2）11−か、または−（ＣＨ2）10−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）2−を、Ｙは２価の連結基をそれぞれ示す。ｐは１または２、ｑは０または１、ｍは１〜６の整数をそれぞれ示す。）
で表される化合物１を反応させる工程を含むナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のナノ粒子の製造方法においてさらに、
一般式（２）
Ｒ3−（ＣＨ2）n−Ｒ4
（式中、Ｒ3はメルカプト基、ジスルフィド基、スルフィド基、ピリジルスルフィド基、ジチオカルボキシル基およびアミノ基からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、Ｒ4はスルホン酸、スルホン酸塩、カルボキシル基、カルボン酸塩、四級アミンおよび四級アミン塩からなる群の少なくとも一つを含む置換基を、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ示す。）で表される化合物２を反応させる工程、
を含むナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
一般式（２）のｎが２または３、Ｒ4がＳＯ3−またはＮ（ＣＨ3）3+である請求項８に記載のナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の結合可能かつ水溶化されたナノ粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジーやナノテクノロジーをはじめとする技術の進歩により、物質間の相互作用を検出する様々な技術（以下、「センシング技術」という）が開発・実用化されている。このセンシング技術を用いれば、体内に存在する、または体内で生成される極微量の物質を高感度に検出することができる。これにより、人の健康状態の診断・予測、創薬、その他の分野において、広範囲に活用することができる。センシング技術の検出対象となる標的物質としては、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、ホルモンなどが挙げられる。現在、蛍光色素などの標識体を調べたい検体物質に直接結合して、その検体物質と基板上の固定化物質との相互作用の有無を、その蛍光シグナルから判断する手法が主流となっている。
【０００３】
例えば、核酸を検出する手段として、多数のプローブ核酸を基材に固定したＤＮＡチップが知られている。検体から抽出し標識化した核酸若しくはその複製物を、プローブ核酸に反応させ、ハイブリダイゼーションさせて基材上に固定化する。基材上の標識のシグナルを検出して、物質間の相互作用の有無を検出する。または、非標識のままの核酸若しくはその複製物をハイブリダイゼーションさせて基材上に固定化後に、化学反応などで核酸に結合させてシグナルを検出する方法もある。
【０００４】
また、タンパク質を検出する場合には、タンパク質−タンパク質相互作用、核酸−タンパク質相互作用を用いて、基材上に固定化する。これにより、特定のタンパク質をセンシングすることができる。
【０００５】
現在、一般的に標識体としては有機化合物からなる蛍光色素が用いられているが、微量な検体を用いた場合、検出感度が不足したり、またシグナルが弱くノイズとの明確な判別が困難であったりする問題があった。
【０００６】
この課題を克服するために、高輝度かつ安定性の高い半導体ナノ粒子を生体分子検出の標識体に用いる試みが盛んに行なわれてきている（例えば特許文献１）。半導体ナノ粒子（以降、「ナノ粒子」と略記することがある。）とは、ナノメートルオーダーの半導体からなる粒子で、バンドギャップエネルギーに相当する蛍光を発する。無機半導体であるため有機色素と比較し安定であることなど高い蛍光特性を有することが知られている。また、粒子が小さくなるにつれて材料中の電子の状態が変わって、より短い波長の光を吸収したり放出したりする量子サイズ効果という現象により、粒子径を変化させることにより様々な波長の発光を得ることが可能となる。
【０００７】
半導体ナノ粒子は有機相中で合成されることが多く、多くのナノ粒子は疎水性を有する。生体分子の相互作用の検出用標識体として用いるためには、半導体ナノ粒子を水溶化すること、および表面に生体分子と結合可能な官能基の導入が必要となる。
【０００８】
ナノ粒子表面を親水性の高いリガンドで被覆することより、ナノ粒子の水溶化が可能となるが、ナノ粒子の核（コア）表面に吸着する化合物によっては蛍光が消光してしまうことがあり、この消光を抑制するためにナノ粒子のコアをＺｎＳやＺｎＯなどで被覆した構造（コアシェル構造）にすることが行なわれている。しかし、このコアシェル構造にすることにより、核酸やタンパク質と比較してナノ粒子の粒径が非常に大きくなり、これらを検出する際の標識体としては好ましくない。
【０００９】
この半導体ナノ粒子として非常に高輝度な特性を有するカドミウム（Ｃｄ）系ナノ粒子（ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅなど）が代表として挙げられ、最も一般的に用いられている。しかし、毒性が高いことが実用化に向けて大きな障害になっている。そこで近年、低毒性の半導体ナノ粒子が開発されるようになった。低毒性ナノ粒子の例として、亜鉛、周期表第１１属元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物からなり、常温で発光を生じるナノ粒子が知られている（特許文献２および３）。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第００／０１７６４２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／００９１２４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０７／０２６７４６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ナノ粒子の水溶化および生体分子との反応性基の導入のために表面修飾が必要となるが、ナノ粒子のコアへの表面修飾リガンドを結合させることにより、発光強度が著しく低下することが課題となっていた。本発明は、発光強度を保持しつつ水溶化されたナノ粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、低毒性のナノ粒子を用い、その核の表面に反応する官能基、および生体分子と反応する官能基を有する両親媒性化合物をリガンドとして用いることにより、発光能を保持しつつ、生体分子との反応性基を有するナノ粒子の水溶化が可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。
〔１〕  亜鉛、周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物もしくは酸化物を成分とするか、又は周期表第１１族元素及び周期表第１３族を含む硫化物もしくは酸化物を成分とするナノ粒子であり、該ナノ粒子の表面に、
一般式（１）
（Ｒ1−Ｘ）p−（Ｙ）q−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−Ｒ2
（式中、Ｒ1は含窒素官能基または含硫黄官能基を、Ｒ2は核酸及びタンパク等の生体分子に対し結合能を有する反応性基を含む官能基を、Ｘはへテロ原子を含んでいてもよい炭化水素基を、Ｙは２価の連結基をそれぞれ示す。ｐは１または２、ｑは０または１、ｍは１〜６の整数をそれぞれ示す。）
で表される化合物１を含むナノ粒子。
〔２〕  一般式（１）のＲ1がメルカプト基、ジチオカルボキシル基、およびアミノ基からなる群の少なくとも一つを含む置換基である〔１〕に記載のナノ粒子。
〔３〕  一般式（１）のＲ2がカルボキシル基、カルボキシル基誘導体、ビオチニル基及びビオチニル基を含む官能基からなる群の少なくとも一つを含む置換基である〔１〕または〔２〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔４〕  一般式（１）のＸがアミド結合を有してもよい飽和脂肪族炭化水素基である〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔５〕  一般式（１）のＸが−（ＣＨ2）11−か、または−（ＣＨ2）10−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）2−である〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔６〕  一般式（１）のｍが３〜６である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔７〕  前記周期表第１３族元素はインジウムである〔１〕から〔６〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔８〕  前記周期表第１１族元素は銀である〔１〕から〔７〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔９〕  前記ナノ粒子の表面に、
一般式（２）
Ｒ3−（ＣＨ2）n−Ｒ4
（式中、Ｒ３は含窒素官能基または含硫黄官能基を、Ｒ４はイオン性官能基を、ｎは１〜１１の整数をそれぞれ示す。）
で表される化合物２を含む〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔１０〕  一般式（２）におけるＲ３がメルカプト基、ピリジルチオ基、ジチオカルボキシル基、およびアミノ基からなる群の少なくとも一項から選択される〔１〕から〔９〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔１１〕  一般式（２）におけるｎが２もしくは３、Ｒ4がＳＯ3−またはＮ（ＣＨ3）3＋である〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のナノ粒子。
〔１２〕  亜鉛、周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物もしくは酸化物を成分とするか、又は周期表第１１属元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子に、
一般式（１）
（Ｒ1−Ｘ）p−（Ｙ）q−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−Ｒ2
（式中、Ｒ1は含窒素官能基または含硫黄官能基を、Ｒ2は核酸及びタンパク等の生体分子に対し結合能を有する反応性基を含む官能基を、Ｘはへテロ原子を含んでいてもよい炭化水素基を、Ｙは２価の連結基をそれぞれ示す。ｐは１または２、ｑは０または１、ｍは１〜６の整数をそれぞれ示す。）
で表される化合物１を反応させる工程を含むナノ粒子の製造方法。
〔１３〕  〔１２〕に記載のナノ粒子の製造方法においてさらに、
一般式（２）
Ｒ3−（ＣＨ2）n−Ｒ4
（式中、Ｒ３は含窒素官能基または含硫黄官能基を、Ｒ４はイオン性官能基を、ｎは１〜１０の整数をそれぞれ示す。）で表される化合物２を反応させる工程、
を含むナノ粒子の製造方法。
〔１４〕  一般式（２）のｎが２または３、Ｒ4がＳＯ3−またはＮ（ＣＨ3）3+である〔１３〕に記載のナノ粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
周期表第１１属元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子若しくは亜鉛、周期表第１１属元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子を用い、このナノ粒子の核に、生体分子と反応可能な官能基を有する表面修飾リガンドを反応させることにより、発光能を保持しつつ、ナノ粒子の水溶化および生体分子と反応可能な官能基の導入が可能となる。さらに、ナノ粒子表面に親水性の高い官能基を共存させることにより、ナノ粒子の水溶性をより向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明を実施するための好適な形態について説明する。
【００１６】
［ナノ粒子の作製］
本発明のナノ粒子の核となるナノ粒子は、周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子、または、亜鉛、周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とする。
【００１７】
周期表第１１属元素としては特に限定されるものではないが、銅（Ｃｕ），銀（Ａｇ），金（Ａｕ）が挙げられ、このうちＣｕ，Ａｇが好ましくＡｇが特に好ましい。周期表第１３族元素としては、特に限定されるものではないが、ガリウム（Ｇａ），インジウム（Ｉｎ），タリウム（Ｔｌ）が挙げられ、このうちＧａ，Ｉｎが好ましくＩｎが特に好ましい。
【００１８】
本発明において、周期表第１１属元素及び周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子としては、インジウム、銀の硫化物を成分とするナノ粒子（ＩｎＡｇＳナノ粒子）が好ましい。亜鉛、周期表第１１属元素及び周期表第１３族元素を含む硫化物を成分とするナノ粒子としては、亜鉛、インジウム、銀の硫化物を成分とするナノ粒子（ＺｎＩｎＡｇＳナノ粒子）が好ましい。尚、硫化物を成分とするナノ粒子の場合も、本発明の効果を損なわない程度において、同元素の酸化物が微量または少量含まれていてもよい。また、本発明のナノ粒子には、本発明の効果を損なわない程度において、核となるナノ粒子の原料及び製造段階で混入する可能性がある微量または少量の不純物、例えば金属元素に対する配位子の分解生成物等の成分が含まれていてもよい。
【００１９】
上記の周期表第１１族元素および周期表第１３族元素を含む硫化物若しくは酸化物を成分とするナノ粒子、および該ナノ粒子においてさらに亜鉛を成分とするナノ粒子の作製は、それぞれの族に属する複数の種類の元素の原料塩と、硫黄を配位元素とする配位子もしくは酸素を配位元素とする配位子とを混合する方法によることができる。または亜鉛およびそれぞれの族に属する複数の種類の元素の原料塩と、硫黄を配位元素とする配位子もしくは酸素を配位元素とする配位子とを混合することにより錯体とし、該錯体を加熱することにより熱分解生成物とし、該熱分解生成物を脂溶性化合物と共に加熱することによっても製造が可能であり、これにより脂溶性化合物で被覆されたナノ粒子として得ることができる。
【００２０】
錯体を熱分解する条件としては、使用する元素により異なるが、通常１００〜３００℃の範囲で行い、１５０〜２００℃の範囲で行なうことが好ましい。また、反応時間は反応温度により異なるが、１〜６０分の範囲で設定することが好ましい。
【００２１】
さらに、熱分解生成物を脂溶性化合物と共に加熱する際の条件としては、使用する元素により異なるが、１５０〜２００℃の範囲で行うことが好ましい。また、反応時間は反応温度により異なるが、１〜６０分の範囲で設定することが好ましい。
【００２２】
本ナノ粒子のサイズについては、量子サイズ効果が現れることを考慮し、１００ｎｍ以下が好ましく、５０ｎｍ以下がより好ましく、生体分子との反応を考慮すると２０ｎｍ以下が更に好ましい。
【００２３】
脂溶性化合物としては、前記硫化物もしくは酸化物を成分とする粒子表面に結合可能であればよい。そのときの結合様式は特に限定されるものではないが、例えば共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、ファンデルワールス結合などが挙げられる。脂溶性化合物の具体例としては、例えば炭素数４〜２０の炭化水素基を有する含硫黄化合物、炭素数４〜２０の炭化水素基を有する含窒素化合物、炭素数４〜２０の炭化水素基を有する含酸素化合物などが挙げられる。炭化水素基としては、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基などの飽和脂肪族炭化水素基；オレイル基などの不飽和脂肪族炭化水素基；シクロペンチル基、シクロヘキシル基などの脂環式炭化水素基；フェニル基、ベンジル基、ナフチル基、ナフチルメチル基などの芳香族炭化水素基などが挙げられる。これらのうち飽和脂肪族炭化水素基や不飽和脂肪族炭化水素基が好ましい。含窒素化合物としてはアミン類やアミド類が挙げられ、含硫黄化合物としてはメルカプト基、アルキルジチオ基等のジスルフィド結合を有する基、アルキルチオ基等のスルフィド結合を有する基、ピリジルチオ基、ジチオカルボキシル基などが挙げられ、含酸素化合物としては脂肪酸類などが挙げられる。例えばブチルアミンやヘキシルアミンなどのアルキルアミンや、オレイルアミンなどのアルケニルアミンが好ましい。
【００２４】
硫黄を配位元素とする配位子としては特に限定されるものではないが、例えば、２，４−ペンタンジチオンなどのβ−ジチオン類；１，２−ビス（トリフルオロメチル）エチレン−１，２−ジチオールなどのジチオール類；ジエチルジチオカルバミド酸塩などが挙げられる。酸素を配位元素とする配位子としては特に限定されるものではないが、例えば、アセチルアセトン、ヘキサフルオロアセチルアセトンなどのβ−ジケトン類；トロポロンなどが挙げられる。
【００２５】
［表面修飾リガンド］
本発明における表面修飾リガンドとは、ナノ粒子の表面を修飾するリガンドを意味し、代表的なものとして、生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドと水溶性向上のためのリガンドを指す。本発明においては、ナノ粒子に対し生体分子と反応可能な官能基を有する表面修飾リガンドを反応させることにより、ナノ粒子の発光能を保持しつつ、その水溶化および生体分子と反応可能な官能基の導入が可能となる。更に、これに加えて水溶性向上のためのリガンドを導入することにより、水溶化をより向上させることが可能となる。
【００２６】
（生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンド）
生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドとしては、
一般式（１）
（Ｒ1−Ｘ）p−（Ｙ）q−（ＯＣＨ2ＣＨ2）m−Ｒ2
で表される化合物１を挙げることができる。
【００２７】
一般式（１）において、Ｒ1は含窒素官能基または含硫黄官能基を示す。これらの官能基は、ナノ粒子表面との反応が可能であり、リガンドを粒子表面に安定に結合する役割を有すると推測される。
Ｒ1の含窒素官能基としては例えば窒素原子を含む官能基であればよく、例えばアミノ基、イミノ基、アミド基、イミド基等が挙げられる。含硫黄官能基としては硫黄を含む官能基であればよく、例えばメルカプト基、ジスルフィド結合を有する基、スルフィド結合を有する基、ピリジルチオ基、ジチオカルボキシル基、などが挙げられる。この中で粒子への安定性を考慮すると含硫黄官能基が好ましく用いられる。
Ｒ1の好ましい例としては、メルカプト基、アルキルジチオ基、アルキルチオ基、ピリジルチオ基、ジチオカルボキシル基、アミノ基を挙げることができ、このうちメルカプト基が特に好ましい。
【００２８】
また、一般式（１）中、Ｘはヘテロ原子を含んでいてもよい炭化水素基を示す。ナノ粒子の表面は脂溶性化合物で安定に被覆されることから、表面修飾リガンド中には脂溶性基が存在することが望ましい。この脂溶性基としては、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基などが挙げられ、中でも飽和脂肪族炭化水素基が好ましい。Ｘとして含んでいてもよいヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子、硫黄原子が挙げられるが、窒素原子及び酸素原子が最も好ましい。ヘテロ原子はアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）として含まれることが好ましく、アミド結合の数は０または1つであることが好ましい。このようなＸとしては、アミド結合を０または１つ含む飽和脂肪族炭化水素基が挙げられる。炭化水素基の炭素数は通常は１〜２４であり、好ましくは１〜１８であり、より好ましくは６〜１５である。
好ましいＸとしては、−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）6−、−（ＣＨ2）11−、−（ＣＨ2）10−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）3−を挙げることができる。
【００２９】
一般式（１）中のＹは、２価の連結基を示す。連結基としては、エーテル結合及び芳香環を有する炭化水素基が好ましい。
【００３０】
Ｙの代表的な例は以下の一般式（Ｙ−１）である。
【化１】
0005108568.tif 000002
【００３１】
一般式（Ｙ−１）中のｒ１は１〜１０の整数を示し、１〜５であることが好ましく、１であることが最も好ましい。一般式（Ｙ−１）中のｒ２は０〜１０の整数を示し、０〜５であることが好ましく、０または１であることが最も好ましい。一般式（Ｙ−１）中のＲ5は炭化水素基を示し、飽和脂肪族炭化水素基（直鎖炭化水素基）が好ましく、−Ｃ（ＣＨ3）2−が最も好ましい。
【００３２】
Ｙの最も好ましい具体例を、下記の式（Ｙ−２）と（Ｙ−３）に示す。
【化２】
0005108568.tif 000003
【化３】
0005108568.tif 000004
【００３３】
一般式（１）中、ｐは１または２の整数を示す。また、ｑは０または１の整数を示す。ｐが１のときはｑは０であることが好ましく、ｐが２のときはｑが１であることが好ましい。
【００３４】
さらに、この表面修飾リガンド中には、エチレングリコール基（ＯＣＨ2ＣＨ2）が含まれる。エチレングリコール基は親水性基としてナノ粒子の水溶化のために役立つと推測される。なお、エチレングリコール基は、スルホン酸およびスルホン酸塩、カルボキシル基やカルボン酸塩、四級アミンや四級アミン塩などへの置き換えが可能である。
一般式（１）中ｍは上記エチレングリコール基の繰り返し数を示すが、このｍは１〜６の整数である。好ましくは３〜６の整数である。
【００３５】
一般式（１）中のＲ2は生体分子に対し結合能を有する反応基を含む官能基を示す。生体分子の定義については後述するとおりである。生体分子に対し結合能を有する反応基としては特に限定されるものではないが、カルボキシル基、カルボキシル基を含む官能基やカルボキシル基の誘導体を含む官能基等のカルボキシル基誘導体、アミノ基、アミノ基誘導体、ビオチニル基、ビオチニル基を含む官能基などが挙げられる。この中で生体分子との反応性を考慮すると、カルボキシル基、カルボキシル基誘導体、ビオチニル基、ビオチニル基誘導体が好ましい。Ｒ2に生体分子に対し結合能を有する反応基を含む官能基以外の基が含まれていてもよく、例えば、アミド結合、酸素原子、炭化水素鎖などを挙げることができる。
【００３６】
Ｒ2の具体例として、カルボキシル基を含む官能基としては、−ＯＣＨ2ＣＯＯＨを挙げることができる。カルボキシル基の誘導体を含む官能基としては、スクシンイミドエステルを含む官能基、すなわち式（Ｒ2−１）
【化４】
0005108568.tif 000005
を挙げることができる。また、ビオチニル基を含む官能基としては、式（Ｒ2−２）
【化５】
0005108568.tif 000006
（ビオチニルアミノ基）を挙げることができる。
【００３７】
以上説明したような、生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドとしては、下記の式（１−１）〜（１−６）で表されるものを挙げることができる。
【化６】
0005108568.tif 000007
【化７】
0005108568.tif 000008
【化８】
0005108568.tif 000009
【化９】
0005108568.tif 000010
【化１０】
0005108568.tif 000011
【化１１】
0005108568.tif 000012
【００３８】
（水溶性向上のためのリガンド；水溶化リガンド）
水溶性向上のためのリガンドとしては、
一般式（２）
Ｒ3−（ＣＨ2）n−Ｒ4
で表される化合物２を挙げることができる。
【００３９】
一般式（２）において、Ｒ3はナノ粒子表面との反応可能な官能基であることが好ましく、例えば含窒素官能基または含硫黄官能基が挙げられる。含窒素官能基としては、アミド基、イミド基等が挙げられる。この中で粒子への安定性を考慮すると含硫黄官能基が好ましく用いられる。含硫黄官能基としてはメルカプト基、ジスルフィド基、スルフィド基、ピリジルスルフィド基、ジチオカルボキシル基、などが挙げられる。このうちメルカプト基が好ましい
【００４０】
また一般式（２）において、Ｒ4はイオン性官能基を示す。イオン性官能基としては、特に制限はないが、構造中にイオン対を有し、水中にて電離する構造であればよい。親水性の高い官能基が望ましく、スルホン酸およびスルホン酸塩、カルボキシル基やカルボン酸塩、四級アミン、四級アミン塩などが挙げられる。これらの中でスルホン酸塩、四級アミン、四級アミン塩が好ましく、スルホン酸塩が特に好ましい。
一般式（２）において、ｎは１〜１８の整数を示し、１〜１０であることが好ましく、２または３であることが特に好ましい。
【００４１】
以上説明したような、水溶化リガンドとしては、下記の式（２−１）で表されるメルカプトエタンスルホン酸および式（２−２）で表されるメルカプトプロパンスルホン酸を挙げることができる。
式（２−１）：メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳ）
ＨＳ−（ＣＨ2）2−ＳＯ3−Ｎａ+
式（２−２）：メルカプトプロパンスルホン酸（ＭＰＳ）
ＨＳ−（ＣＨ2）3−ＳＯ3−Ｎａ+
【００４２】
［ナノ粒子表面への表面修飾リガンドの導入］
表面修飾リガンドのナノ粒子への導入方法は、特に限定はないが、ナノ粒子作製時に表面修飾リガンドを添加しても良いし、前記した錯体の熱分解精製物や他の脂溶性化合物と共に加熱しても良い。また、ナノ粒子作製後に表面修飾リガンドと混合し、表面に結合している脂溶性化合物と表面置換により導入しても良い。例えば図１の工程（Ａ）に示すように生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドとナノ粒子を混合・攪拌することにより、ナノ粒子表面へ置換反応により該リガンドを導入することが可能となる。次いで図１の工程（Ｂ）に示すように、水溶化向上リガンドを添加・攪拌することによりナノ粒子の水溶性が向上することが可能となる。生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドと水溶化リガンドは逐次反応で導入しても良いし、これらを予め混合した溶液を用いて反応させ、工程（Ａ）と（Ｂ）を同時に行うものであっても良い。逐次反応の場合、好ましい形態としては、あらかじめ存在しているナノ粒子表面の脂溶性化合物が示す粒子表面への親和性と比べて、表面修飾リガンドが有する親和性が弱いか同程度の場合は、大過剰に加えればよい。あらかじめ存在している脂溶性化合物が示す粒子表面への親和性よりも、表面修飾リガンドが有する親和性が強い方がよい。
【００４３】
［生体分子のナノ粒子への結合］
本発明のナノ粒子には、生体分子を結合させることができる。生体分子としては、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、ホルモンなどを挙げることができ、このうち代表的なものは核酸、タンパク質である。
【００４４】
生体分子が核酸の場合、核酸の一部に反応性基を導入し、その反応性基とナノ粒子の官能基を反応させることにより核酸への結合が可能となる。例えば、末端アミノ基を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）反応を行なうことにより、末端アミノ基を有する二本鎖核酸が作製可能である。この核酸の末端アミノ基とナノ粒子に導入したカルボキシル基と縮合反応をさせることにより、核酸へのナノ粒子の結合が可能となる。この縮合反応の縮合剤としては、特に制限はないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、アミン基とカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。
【００４５】
また生体分子がタンパク質の場合、タンパク質中のリジン残基のアミノ基とナノ粒子中のカルボキシル基と縮合反応させることにより、ナノ粒子とタンパク質を結合することが可能となる。
【００４６】
またカルボキシル基誘導体に含まれる、活性エステルをナノ粒子に導入した場合、縮合剤なしでアミノ基と縮合反応を行なうことができる。この活性エステルの例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルなどが挙げられる。
さらにビオチニル基を有するナノ粒子を用いた場合、アビジン−ビオチン相互作用によりアビジン分子への固定化が可能となる。また、アビジンは1分子に４つ結合部位をもつため、例えば、ビオチニル基を導入した核酸に、まずアビジンを結合させ、さらに、ビオチニル基を有するナノ粒子をアビジンの未結合部位に作用させることにより、核酸をナノ粒子で標識することが可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１−１〜１−３及び参考例１−４〜１−６
（ＩｎＡｇＳナノ粒子の調製）
内径１６ｍｍの試験管にジチオカルバメイト（１．１２６ｇ）、硝酸銀（０．２１２４ｇ）と硝酸インジウム三水和物（０．４４３６ｇ）を純水に加え、３０℃に温め、３０分間マイクロ攪拌子で攪拌した。攪拌後、卓上小型遠心器（ＫＵＢＯＴＡ２４２０、Ｋｕｂｏｔａ社製）により、回転速度２５００ｒｐｍで遠心分離し上澄みを除去、純水で洗浄し、この遠心分離と純水洗浄の操作を４回繰り返した。その後、メタノールで洗浄し遠心分離で上澄みを除去する操作を２回繰り返し、沈殿物をデシケータで一晩乾燥し、金属錯体を得た。次いでこの金属錯体粉末を５０ｍｇ取り、１８ｍｍ長の試験管に入れ、セプタムキャップで栓をし、試験管内をアルゴンで三回置換した。この試験管をオイルバスにより１８０℃で３分間加熱した。次いで、この試験管に液体のオレイルアミンを３ｍｌ加え、アルゴン置換した。この試験管をオイルバスにより１８０℃で３分間加熱し３０分間放冷した。得られた懸濁液を遠心分離にかけて上澄みを回収し、０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ液に３ｍｌのメタノールを加え溶液を懸濁させ、遠心分離後に上澄みを回収し、メタノールで洗浄の工程を３回繰り返した。その後、１ｍｌのクロロホルムを加えナノ粒子を溶解させた。
【００４９】
（ナノ粒子への表面修飾リガンドの導入）
６種類の表面修飾リガンド、モノチオールアルカンエチレングリコール（末端カルボキシル化ＳＰＴ００１２ａ；リガンド１（実施例１−１）、末端スクシンイミド化ＳＰＴ００１２ｃ；リガンド２（実施例１−２）、末端ビオチン化ＳＰＴ００１２ｄ；リガンド３（実施例１−３））、いずれも米国センソパステクノロジー社製）、ジチオールリジッドロッドモノディスパースエチレングリコール（末端カルボキシル化ベンゼン環１つＳＰＴ００１４；リガンド４（参考例１−４））、米国センソパステクノロジー社製）、短鎖アルカンエチレングリコール（Ｔｈｉｏｌ−ｄＰＥＧ4TM−ａｃｉｄ；リガンド５（参考例１−５）、クウォンタバイオデザイン社製）、ジチオールリジッドロッドモノディスパースエチレングリコール（末端カルボキシル化ベンゼン環１つＳＰＴ００１５；リガンド６（参考例１−６））、米国センソパステクノロジー社製）のそれぞれについて、クロロホルム溶液（濃度２００μＭ）を調製した（各リガンドの構造は表１参照）。６つのサンプル瓶と、それぞれナノ粒子のクロロホルム溶液２００μｌに、上記６種類のリガンド溶液１００μｌをそれぞれ加え、マイクロ攪拌子で１６時間攪拌した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
次いで、４００μｌのプロパノール、４００μｌの純水を加え、１６時間攪拌した。その後、反応液をエッペンチューブに移し、遠心分離を１２０００ｒｐｍ、１２分間行い、上澄みを除去し、クロロホルムで残渣を洗浄し、２０００μｌの純水に溶解させた。
【００５２】
（水溶化ナノ粒子の吸光度測定）
ナノ粒子の水溶化を確認するため、ナノ粒子水溶液の光吸収を測定した。測定は紫外・可視分光光度計（ＵＶ−１６５０ＰＣ、島津製作所製）を用い、光路長１ｃｍのセルを用いて行なった。波長５４３ｎｍにおける吸光度を測定した結果を表２に示す。６種類のリガンド１〜６すべてにおいて、ナノ粒子に起因する波長５４３ｎｍの吸収が観察されたことから、６種類すべてにおいて、ナノ粒子は水溶化が可能であることが示された。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
（ナノ粒子への水溶化リガンドの導入）
６種類のリガンド１から６の導入されたナノ粒子を、上記と同様の手順で作製した。次いで、４００μｌのプロパノール、４００μｌの１Ｍメルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ、東京化成社製、ＭＥＳの構造は表３参照）水溶液を加え、１６時間攪拌した。その後、反応液をエッペンチューブに移し、卓上遠心器（ＣＦＭ−２００、ＩＷＡＫＩ社製）を用い、回転数１２０００ｒｐｍで遠心分離を１２分間行い、上澄みを除去し、クロロホルムで残渣を洗浄し、２０００μｌの純水に溶解させた。これらナノ粒子の水溶液を紫外・可視分光光度計により、波長５４３ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表４に示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
【表４】
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【００５７】
この結果、表４から明らかな通り６種類のリガンドすべてにおいて、ＭＥＳでさらに表面修飾することにより、水溶化ナノ粒子に起因する波長５４３ｎｍの吸光度が増加した。このことから、ナノ粒子に対し、生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドによる修飾に加え、さらに水溶化リガンドによる修飾を行うことにより、水溶性が向上することが分かる。
【００５８】
（ナノ粒子水溶液の蛍光強度測定）
水溶化したナノ粒子の発光能を確認するために、水溶液中のナノ粒子の発光強度の測定を行なった。測定は蛍光分光測定装置（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３、Ｈｏｒｉｂａ社製）を用い、４ｍｍ角のセルを用いて行なった。スリット幅は３ｎｍ、励起波長は５４３ｎｍとし、波長７５０ｎｍの蛍光強度（発光強度）を測定した。表５に上記リガンド１から６で表面修飾後のナノ粒子水溶液を用いて蛍光測定を行なった際の、７５０ｎｍの波長の蛍光強度を示す。ここから、いずれの水溶化ナノ粒子も発光能を有していることが示された。また、表６にリガンド１から６で表面修飾およびＭＥＳで表面処理後の７５０ｎｍの波長の蛍光強度を示す。これらの結果から、生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドで表面修飾すると、発光能を保持できること、さらに水溶化リガンドで表面処理後も発光能を保持していることが示された。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
【表６】
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【００６１】
実施例２−１〜２−３及び参考例２−４〜２−６
（ＺｎＩｎＡｇＳナノ粒子の調製）
内径１６ｍｍの試験管にジチオカルバメイト（１．１２６ｇ）、硝酸亜鉛六水和物（０．１０４ｇ）、硝酸銀（０．１８２６ｇ）と硝酸インジウム三水和物（０．３８１５ｇ）を用いて、実施例１−１〜１−３及び参考例１−４〜１−６と同様の手順でナノ粒子の調製を行ない、１ｍｌのナノ粒子のクロロホルム溶液を得た。
【００６２】
（ナノ粒子への表面修飾リガンドの導入）
ＺｎＩｎＡｇＳナノ粒子のクロロホルム溶液を用いて実施例１−１〜１−３及び参考例１−４〜１−６と同様の手順で、ナノ粒子表面へのリガンド１〜６の導入および純水への水溶化を行なった。さらに水溶化リガンドＭＥＳ導入によるナノ粒子の水溶化後、実施例１−１〜１−３及び参考例１−４〜１−６と同様の手順で、リガンド１〜６で表面修飾後のナノ粒子の水溶液、および、リガンド１〜６およびＭＥＳで表面修飾後のナノ粒子水溶液の波長５４３ｎｍの吸光度および波長７００ｎｍの発光強度の測定を行なった。吸光度および発光強度の結果をそれぞれ表２および表５に示す。ここからＺｎＩｎＡｇＳナノ粒子を用いた場合においても、リガンド１〜６すべてにおいて、発光能を保持したままでの水溶化が可能であることが示された。さらに、リガンド１〜６で表面修飾および水溶化リガンドで表面処理後、ナノ粒子を純水へ溶解した水溶液の波長５４３ｎｍの吸光度を表４に、波長７００ｎｍの蛍光強度を表６に示す。これらの結果から、生体分子との反応性基を有する両親媒性リガンドで表面修飾すると、発光能を保持しつつ水溶化できること、さらに水溶化リガンドで表面修飾後も発光能を保持したままでさらに水溶化が可能であり、かつ、水溶化リガンドで表面修飾することにより、ナノ粒子の水溶化効率が向上していることが示された。
【００６３】
実施例３
水溶化向上リガンドとしてメルカプトプロパンスルホン酸（ＭＰＳ、東京化成社製、表３参照）を用いた。５．３４６ｇのＭＰＳを３０ｍｌの純水に溶解した。
【００６４】
実施例２−１と同様の手順でＺｎＡｇＩｎＳナノ粒子作製およびリガンド１の導入を行なった。次いで、４００μｌのプロパノール、４００μｌの１ＭのＭＰＳ水溶液を加え１６時間攪拌した。その後、反応液をエッペンチューブに移し、遠心分離を１２０００ｒｐｍ、１２分間行い、上澄みを除去し、クロロホルムで残渣を洗浄し、２０００μｌの純水に溶解させた。その後このナノ粒子水溶液の波長５４３ｎｍの吸光度および波長５４３ｎｍで励起時の７００ｎｍの発光強度を表７に示す。ここから水溶化リガンドとしてＭＥＳを用いたときとほぼ同等の吸光度および発光強度が得られた。（表４および表６との比較）
【００６５】
【表７】
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【００６６】
比較例１
１１−メルカプトウンデカン酸〔ＭＵＡ〕（ＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＯＯＨ、リガンド７、シグマ社製）０．０１３１ｇを３００ｍｌのクロロホルムに溶解し、濃度２００μＭとした。
【００６７】
このリガンド７のクロロホルム溶液１００μｌに、ナノ粒子のクロロホルム溶液２００μｌを加え、マイクロ攪拌子で１６時間攪拌した。次いで、４００μｌのプロパノール、４００μｌの純水を加え、２時間攪拌した。その後、反応液をエッペンチューブに移し、遠心分離を１２０００ｒｐｍ、１２分間行い、上澄みを除去し、クロロホルムで残渣を洗浄し、２０００μｌの純水に溶解させた。表８に得られたナノ粒子水溶液の波長５４３ｎｍにおける吸光度を示す。
【００６８】
【表８】
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【００６９】
ここからＭＵＡで被覆されたナノ粒子は殆ど水溶化しないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、表面修飾リガンドを用いたナノ粒子表面の修飾の説明図である。
【図１】
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