(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞におけるＡＰＲＩＬポリペプチドの生物学的活性を阻害又は中和するための薬剤であって、ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストの有効量を含有してなり、該ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストがＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプターへの結合を阻害するか、あるいはＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターへの結合を阻害するＡＰＲＩＬポリペプチド抗体である、薬剤。
【請求項２】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドがＦｉｇ．４（配列番号：８）のアミノ酸配列を有する天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチド、又はＦｉｇ．４（配列番号：８）に示される天然配列ＡＰＲＩＬの生物学的活性を示すその断片を含む請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストがＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１３４７として寄託された抗ＡＰＲＩＬ抗体３Ｃ６．４．２を含む請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記哺乳類動物細胞が白血球を含む請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
哺乳類動物細胞におけるＡＰＲＩＬポリペプチドの生物学的活性を阻害又は中和するための薬剤であって、Ｆｉｇ．４（配列番号：８）のアミノ酸配列を有する天然配列のＡＰＲＩＬポリペプチド又はその断片の生物学的活性を阻害又は中和するアンタゴニストの有効量を含有してなり、該ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストがＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプターへの結合を阻害するか、あるいはＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターへの結合を阻害するＡＰＲＩＬポリペプチド抗体である、薬剤。
【請求項６】
哺乳動物における免疫関連疾患、多発性硬化症、もしくは癌を治療するための医薬であって、ＡＰＲＩＬアンタゴニストの有効量を含有してなり、該ＡＰＲＩＬアンタゴニストが、ＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプターへの結合を阻害するか、あるいはＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターへの結合を阻害するＡＰＲＩＬポリペプチド抗体である、医薬。
【請求項７】
前記免疫関連疾患が自己免疫疾患である請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記免疫関連疾患が関節リウマチを含む請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
前記癌が白血病、リンパ腫、もしくはミエローマである請求項６に記載の医薬。
【請求項１０】
ＡＰＲＩＬポリペプチドに特異的に結合し、前記ＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプター又はＢＣＭＡレセプターに対する結合をブロックするモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターに対する結合をさらにブロックする請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体がＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１３４７として寄託されたハイブリドーマより分泌される３Ｃ６．４．２抗体を含む請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１３４７として寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される３Ｃ６．４．２モノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体３Ｃ６．４．２を生産し、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１５】
登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体５Ｅ１１．１．２。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１３４６として寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される５Ｅ１１．１．２モノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体５Ｅ１１．１．２を生産し、登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１８】
ＡＰＲＩＬポリペプチドと特異的に結合し、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される３Ｃ６．４．２抗体に由来する配列を含むキメラ抗ＡＰＲＩＬ抗体。
【請求項１９】
ＡＰＲＩＬポリペプチドと特異的に結合し、登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される５Ｅ１１．１．２抗体に由来する配列を含むキメラ抗ＡＰＲＩＬ抗体。
【請求項２０】
ＡＰＲＩＬポリペプチドと特異的に結合し、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される３Ｃ６．４．２抗体に由来する配列を含むヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体。
【請求項２１】
ＡＰＲＩＬポリペプチドと特異的に結合し、登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される５Ｅ１１．１．２抗体に由来する配列を含むヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体。
【請求項２２】
哺乳動物における免疫関連疾患、多発性硬化症、もしくは癌を治療するための医薬であって、治療的有効量の抗ＡＰＲＩＬ抗体と、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤及び抗体からなる群から選択される少なくとも一の付加的な治療剤を含有してなり、該抗ＡＰＲＩＬ抗体がＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプターへの結合を阻害するか、あるいはＡＰＲＩＬポリペプチドのＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターへの結合を阻害する、医薬。
【請求項２３】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、基底細胞癌種、メラノーマ、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭部及び頸部の癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性メラノーマ、急性リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２４】
前記免疫関連疾患が、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、及び感染性疾患からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２５】
前記免疫関連疾患が、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患、多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害、ギラン-バレー症候群、慢性炎症脱髄性多発神経障害、感染性肝炎、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、接触性皮膚炎、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、好球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、拒絶反応、及び移植片対宿主疾患からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２６】
前記自己免疫疾患が、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺炎、関節リウマチ、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、及び炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２７】
前記抗ＡＰＲＩＬ抗体が、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される３Ｃ６．４．２抗体、又は登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される５Ｅ１１．１．２抗体である、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２８】
前記抗ＡＰＲＩＬ抗体が、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される３Ｃ６．４．２抗体由来の配列を含んでなるか、又は登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される５Ｅ１１．１．２抗体由来の配列を含んでなるヒト化抗体である、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２９】
前記抗ＡＰＲＩＬ抗体が、３Ｃ６．４．２抗体又は５Ｅ１１．１．２抗体のＡＰＲＩＬへの結合を競合的に阻害する抗体である、請求項２２に記載の医薬。
【請求項３０】
癌の治療のための医薬であり、付加的な治療抗体がＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４及びＶＥＧＦからなる群から選択される抗原に結合する抗体である、請求項２２に記載の医薬。
【請求項３１】
前記のＣＤ２０に結合する抗体がリツキシマブ抗体である、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
前記のＥｒｂＢ２に結合する抗体がトラスツズマブ抗体である、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３３】
前記抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８及びＣＤ４０からなる群から選択される抗原に結合する抗体である、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３４】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストが、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される３Ｃ６．４．２抗体、又は登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される５Ｅ１１．１．２抗体である、請求項１又は５に記載の薬剤。
【請求項３５】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストがＡＰＲＩＬポリペプチド抗体であり、該抗ＡＰＲＩＬ抗体が、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される３Ｃ６．４．２抗体由来の配列を含んでなるか、又は登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される５Ｅ１１．１．２抗体由来の配列を含んでなるヒト化抗体である、請求項１又は５に記載の薬剤。
【請求項３６】
前記ＡＰＲＩＬポリペプチドアンタゴニストが、３Ｃ６．４．２抗体又は５Ｅ１１．１．２抗体のＡＰＲＩＬへの結合を競合的に阻害するＡＰＲＩＬポリペプチド抗体である、請求項１又は５に記載の薬剤。
【請求項３７】
前記ＡＰＲＩＬアンタゴニストが、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される３Ｃ６．４．２抗体、又は登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される５Ｅ１１．１．２抗体である、請求項６に記載の医薬。
【請求項３８】
前記ＡＰＲＩＬアンタゴニストがＡＰＲＩＬポリペプチド抗体であり、該抗ＡＰＲＩＬ抗体が、登録番号ＰＴＡ−１３４７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される３Ｃ６．４．２抗体由来の配列を含んでなるか、又は登録番号ＰＴＡ−１３４６としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌される５Ｅ１１．１．２抗体由来の配列を含んでなるヒト化抗体である、請求項６に記載の医薬。
【請求項３９】
前記ＡＰＲＩＬアンタゴニストが、３Ｃ６．４．２抗体又は５Ｅ１１．１．２抗体のＡＰＲＩＬへの結合を競合的に阻害するＡＰＲＩＬポリペプチド抗体である、請求項６に記載の医薬。
【請求項４０】
ＡＰＲＩＬポリペプチドに特異的に結合し、３Ｃ６．４．２抗体又は５Ｅ１１．１．２抗体のＡＰＲＩＬへの結合を競合的に阻害するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）関連分子、より特別にはＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡと称されるＴＮＦ及びＴＮＦＲファミリーのメンバーの活性を修飾する一又は複数のアゴニスト又はアンタゴニストを使用する方法に関する。また、本発明は、一又は複数のアゴニスト又はアンタゴニストを使用し、インヴィトロ、インサイツ、及び／又はインヴィボにおけるＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、又はＢＣＭＡに関連する哺乳動物細胞又は病理学的状態の診断及び／又は治療のための方法にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(ＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wiley等, Immunity, 3：673-682(1995)；Browning等, Cell, 72:847-856(1993)；Armitage等 Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開のWO97/01633；1997年7月17日公開のWO97/25428；Marsters等, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Simonet等, Cell, 89:309-319(1997)；Chicheportiche等, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahne等, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開のWO98/28426；1998年10月22日公開のWO98/46751；1998年5月7日公開のWO/98/18921；Moore等, Science, 285:260-263(1999)；Shu等, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneider等, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyay等, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている［Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtry等, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。
【０００３】
ＴＮＦファミリーの様々な分子が免疫システムの発達又は機能の役割を目的としている[Gruss等, Blood, 85:3378(1995)]。Zheng等は、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Zheng等, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。ＣＤ４０リガンドは、増殖、免疫グロブリン分泌、及び生存を含むＢ細胞の多くの機能を活性化する[Renshaw等, J. Exp. Med.,180:1889(1994)］。他の最近同定されたＴＮＦファミリーサイトカイン、ＴＡＬＬ-１(ＢｌｙS)は、ある条件下において、Ｂ細胞増殖及び免疫グロブリン分泌を誘発することが報告されている[Moore等, 上掲；Schneider等, 上掲；Mackay等, J. Exp. Med., 190:1697(1999)]。
【０００４】
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれｌｐｒ及びｇｌｄと呼称される)における変異が幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去の調節においてある役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol.,6：279-289(1994)；Nagata等, Science, 267：1449-1456(1995)］。また、Ａｐｏ-１リガンドは、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammer等, 上掲；Nagata等, 上掲］。Ａｐｏ-１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yonehara等, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。以前、約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されている［Hohman等, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたEP417563；Loetscher等, Cell, 61：351(1990)；Schall等, Cell, 61：361(1990)；Smith等, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。これらのＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有することが分かった。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Y等, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)；Hale等, J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００５】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１から４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。［Schall等, 上掲；Loetscher等, 上掲；Smith等, 上掲；Nophar等, 上掲；Kohno等, 上掲；Banner等, Cell, 73:431-435(1993)］。ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnson等, Cell, 47：545(1986)；Radeke等, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic等, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet等, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Upton等, Virology, 160：20-29(1987)；Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Upton等, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００６】
より最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。Bulow等によるScience, 278:138-141(1997)において、研究者は膜活性剤及びＣＡＭＬ-インタラクターと称される原形質膜レセプター又は「ＴＡＣＩ」を記載している。ＴＡＣＩレセプターはＴＮＦＲファミリーのシステインリッチモチーフ特性を包含すると報告されている。インビトロアッセイにおいて、ＴＡＣＩ-特異性抗体を有する核酸移入されたJurkat細胞の表面上でのＴＡＣＩの架橋結合はＮＦ-ＫＢの活性化を引き起こす[また、1998年9月18日公開のWO98/39361参照]。
Laabi等, EMBO J., 11:3897-3904(1992)は、その発現がＢ細胞末端成熟と一致することが見出されている「ＢＣＭ」と呼ばれる新しい遺伝子の同定を報告した。ＢＣＭ通常ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、単一膜ドメインで１８４アミノ酸長ポリペプチドであると予測された。これらの研究者は後に、この遺伝子を「ＢＣＭＡ」と名付けた[Laabi等, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154(1994)]。ＢＣＭＡｍＲＮＡ発現は、Ｂリンパ球段階前を意味するヒト悪性Ｂ細胞株の非存在であり、よってリンパ球の分化の段階に関わっていると考えられることが報告された[Gras等, Int. Immunology, 7:1093-1106(1995)]。Madry等, Int. Immunology, 10:1693-1702(1998)において、マウスＢＣＭＡｃＤＮＡのクローニングが記載された。マウスＢＣＭＡｃＤＮＡは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに対して６２％同一性を有する１８５アミノ酸長ポリペプチドをコードすることが報告された。マウス及びヒトＢＣＭＡタンパク質配列のアラインメントは、Ｎ末端領域で６システインの保存されたモチーフ、ＢＣＭＡタンパク質はＴＮＦＲスーパーファミリーに属するという予測を示した[Madry等, 上掲]。
Marsters等、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復についてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞死ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、Ａｐｏ-３と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Marsters等,Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ-３はＤＲ３、ｗｓｌ-１、ＴＲＡＭＰ及びＬＡＮＤとも称されている［Chinnaiyan等, Science, 274：990(1996)；Kitson等, Nature, 384：372(1996)；Bodmer等, Immunity, 6：79(1997)；Screaton等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4615-4619(1997)］。
Pan等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；また、1998年7月30日公開のWO98/32856参照］。ＤＲ４は、細胞自殺機構に関与できる細胞死ドメインを含むことが報告された。Pan等は、ＤＲ４がＡｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることをさらに開示している。
【０００７】
Sheridan等, Science, 277: 818-821 (1997)及びパン等, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［1998年11月19日発行のWO98/51793；1998年9月24日発行のWO98/41629を参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と称される(あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも称される［Screaton等，Curr.Biol., 7:693-696(1997)；Walczak等，EMBO J., 16:5386-5387(1997)；Wu等，Nature Genetics, 17:141-143(1997)；1998年8月20日に発行のWO98/35986；1998年10月14日に発行のEP870,827；1998年10月22日WO98/46643；1999年1月21日に発行のWO99/02653；1999年2月25日発行のWO99/09165；1999年3月11日発行のWO99/11791］。ＤＲ４のように、ＤＲ５は細胞死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間で形成された複合体の結晶構造は、Hymowitzら，Molecular Cell, 4:563-571(1999)に掲載されている。
さらに他の細胞死ドメインを含むレセプターであるＤＲ６が最近同定された［Pan等, FEBS Letters, 431:351-356(1998)］。４つの予想される細胞外システインリッチドメイン及び細胞死ドメインの他に、ＤＲ６は細胞質領域におけるプロリンに富むモチーフとオーバーラップするような予想されるロイシンジッパー配列を含むと考えられている。プロリンに富むモチーフはｓｒｃ相同性-３ドメインと結合する配列に類似しており、それは多くの細胞内シグナル伝達分子に見出されるものである。
最近同定されたレセプターのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達分子というよりはむしろ、阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ，ＬＩＴ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；Sheridan等, Science, 277: 818-821 (1997)；McFarlane等, J. Biol. Chem., 272:25417-25420(1997)；Schneider等, FEBS Letters, 416:329-334(1997)；Degli-Esposti等, J. Exp. Med., 186:1165-1170(1997)；及びMongkolsapaya等, J. Immunol., 160:3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marsters等, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Pan等, FEBS Letters, 424:41-45(1998)；Degli-Esposti等, Immunity, 7:813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［Simonet等, 上掲；Emery等, 下記］及びＤＣＲ３［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。
【０００８】
新たに同定されたＴＮＦＲファミリーのさらなるメンバーには、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ-５、ＮＴＲ-１、及びＴＮＦＬ１が含まれる［Brojatsch等, Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery等, Cell, 87:427-436 (1996); Marsters等, J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997); Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221(1997); Emery等, J. Biol. Chem., 273:14363-14367(1998);1999年1月28日公開のWO99/04001; 1999年2月18日公開のWO99/07738; 1999年7月8日公開のWO99/33980]。
Tewari等により最近概説されているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型である［Verma等, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκＢ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。前記したように、同時に同定されたＴＮＦＲメンバーは細胞内死ドメイン領域を含むか、又は欠いている。例えばＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、及びＧＩＴＲのような、死のドメインを欠くいくつかのＴＮＦＲ分子は、ＮＦ-κＢ活性の調節の能力がある[例えばLotz等, J. Leukocyte Biol., 60:1-7(1996)参照]。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプター類の概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997)を参照されたい。
【０００９】
（発明の概要）
出願人は、驚くべきことに、ＴＡＬＬ−１と呼ばれるＴＮＦファミリーリガンドがＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターに結合することを見いだした。また、出願人は、驚くべきことに、ＡＰＲＩＬと呼ばれるＴＮＦファミリーリガンドもＴＡＣＩレセプター及びＢＣＭＡレセプターに結合することを見いだした。ある種のＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬリガンド、及びある種のＴＡＣＩ及びＢＣＭＡレセプターについて既に記述されてはいるが、当該技術分野においてＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬがＴＡＣＩ及びＢＣＭＡレセプターに結合し活性化することは、認められていなかった。従って、当該発明はこれらＴＮＦ関連リガンド及びレセプターのアンタゴニスト又はアゴニストを用いる新規方法を提供する。ここで記述されるアンタゴニスト及びアゴニストは、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、又はＢＣＭＡの存在（又は非存在）に関連した哺乳動物細胞又病理学的状態のインヴィトロ、インサイツ、又はインヴィボの診断又は治療に関する有用性を見いだす。
使用方法は、増強又は増大したＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの発現及び／又は活性と関連し又は結果的に生じる哺乳動物の病理学的状態又は疾患を治療するための方法を含む。治療方法において、ＴＡＬＬ−１アンタゴニストまたはＡＰＲＩＬアンタゴニストはそのような病理学的状態又は疾患に罹患している哺乳動物に対して投与される。本発明の使用が考慮されるＴＡＬＬ−１アンタゴニスト及びＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシン又はＢＣＭＡレセプターイムノアドヘシン、並びにＴＡＣＩレセプター又はＢＣＭＡレセプターに対する抗体が含まれ、それらは、ＴＡＬＬ−１リガンド又はＡＰＲＩＬリガンドによる各々のレセプター結合又は活性化を好適にブロック又は低下させる。例えば、ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシンは関節リウマチ又は多発性硬化症を治療するために用いられる。使用が考慮されるＴＡＬＬ−１アンタゴニスト及びＡＰＲＩＬアンタゴニストは、さらにＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプターに対する各々のリガンドの結合をブロック又は減少させることができる抗ＴＡＬＬ−１抗体または抗ＡＰＲＩＬ抗体をさらに含む。また更なるアンタゴニスト分子には、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡを含む共有結合修飾形態又は融合タンパク質が含まれる。例として、そのようなアンタゴニストは、エピトープタグ又はロイシンジッパーなどの異種性配列と融合しペグ化されたＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ又はＢＣＭＡを含む。場合によっては、この方法において用いられるアンタゴニスト分子は、例えばＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両活性をブロックし中和する二重アンタゴニストなどで、ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ両方の活性をブロックし中和することができるであろう。本方法では、アンタゴニスト分子の単一タイプでの使用又はアンタゴニストの２又はそれ以上のタイプの組合せの使用が考慮される。
【００１０】
本発明の他の実施態様において、ＴＡＬＬ−１及びＴＡＣＩ及び／又はＢＣＭＡ間の相互作用をブロック又は中和するためのＴＡＬＬ−１アンタゴニストの使用方法が提供される。例えば、本発明は、白血球細胞（好ましくはＢ細胞）などの哺乳類細胞をＴＡＬＬ−１リガンドの活性を低下、中和又はブロックするための有効量にて、一又は複数のＴＡＬＬ−１アンタゴニストに暴露することを含む方法を提供する。細胞は、細胞培養又は、例えば免疫関連疾患もしくは癌などに罹患している哺乳動物中に存在するものである。従って、本発明は、有効量の一又は複数のここで開示されるようなＴＡＬＬ−１アンタゴニストを含んでなる、免疫関連疾患もしくは癌などの病理学的状態に罹患している哺乳動物を治療するための方法を含む。
また、本発明はＡＰＲＩＬ及びＴＡＣＩもしくはＢＣＭＡ間の相互作用をブロック又は中和するためのＡＰＲＩＬアンタゴニストの使用に関する方法も提供する。例えば、本発明は、白血球細胞（好ましくはＢ細胞）などの哺乳類細胞をＡＰＲＩＬリガンドの活性を低下、中和又はブロックするための有効量にて、一又は複数のＡＰＲＩＬアンタゴニストに暴露することを含む方法を提供する。細胞は、細胞培養又は、例えば免疫関連疾患もしくは癌などに罹患している哺乳動物中に存在するものである。従って、本発明は、有効量の一又は複数のここで開示されるようなＡＰＲＩＬアンタゴニストを含んでなる、免疫関連疾患もしくは癌などの病理学的状態に罹患している哺乳動物を治療するための方法を含む。
また、本発明は一又は複数のＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む組成物も提供する。場合によっては、本発明の組成物は製薬的に許容可能な坦体又は希釈剤を含みうる。好ましくは、該組成物は、病理学的状態又は疾患を治療するために治療上効果的な量で一又は複数のＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストを含むであろう。
また、本発明は抗ＡＰＲＩＬ抗体を含む特定のアンタゴニスト分子も提供する。そのような抗体には、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が含まれる。一実施態様において、抗ＡＰＲＩＬ抗体には、モノクローナル抗体が含まれ、好ましくは、以下の実施例において開示される抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体が含まれる。種々の抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマがここで更に提供される。
【００１１】
また、本発明は一又は複数のＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストを含む製造品及びキットを提供する。
さらに、本発明は例えば、ＴＡＣＩレセプター又はＢＣＭＡレセプター刺激又は活性化するためにＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストを使用する方法を提供する。そのような方法は、免疫不全又は癌（免疫抗癌反応を促進することなどにより）などのＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの不十分な発現又は活性によって特徴付けられ、又は関連する病理学的状態を治療することに有用であろう。ＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストはアゴニスト性の抗ＴＡＣＩ又は抗ＢＣＭＡ抗体を含んでもよい。ＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストなどのアゴニスト性の活性は、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対する天然のリガンドの活性、又はＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの天然のリガンドの活性を同一又は実質的に同一（模倣する）な活性を増大させることを含んでもよい。
従って、本発明は、一又は複数のＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストを含む組成物も提供する。場合によっては、本発明の組成物は製薬的に許容可能な坦体又は希釈剤を含む。好ましくは、該組成物は、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡによるシグナル伝達を増強するために治療上効果的な量で一又は複数のＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストを含むであろう。
さらに、本発明は、一又は複数のＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストを含む製造品及びキットを提供する。
また、本発明は、ＴＡＬＬ−１及びＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ間の相互作用、又はＡＰＲＩＬ及びＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ間の相互作用に関するアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する小分子化合物、ポリペプチド又は抗体などの候補分子を同定するためのスクリーニングアッセイを実施する方法を提供する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで用いられる場合、「ＴＡＣＩ」又は「ＴＡＣＩポリペプチド」又は「ＴＡＣＩレセプター」という用語は、「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」及び「ＴＡＣＩ変異体」（ここでさらに定義される）を含む。「ＴＡＣＩ」はＦｉｇ．１に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体もしくは断片を含む核酸分子、Ｆｉｇ．１に示される配列及びその変異体断片並びに前述の断片を含む核酸分子によってコードされるこれらのポリペプチドに対して与えられた名称である。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、ヒト組織タイプ又は他のソース由来のような、種々のソースから単離され、組換体及び／又は合成的な方法によって調製される。
「天然配列」ＴＡＣＩポリペプチドは、天然由来の対応するＴＡＣＩポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＴＡＣＩポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換体及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」という用語には、特に、ＴＡＣＩポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＴＡＣＩポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、限定はしないが、von Bulow等, 上掲及び1998年9月11日に発行されたＷＯ９８／３９３６１に記述されたポリペプチド、スプライス変異体（上述にて「ｈＴＡＣＩ（２６５）」と称され、Ｆｉｇ．６（配列番号：９）中に示される）、及びＦｉｇｓ．１Ａ−１Ｂ（配列番号：２）の１−２９３アミノ酸残基の隣接する配列を含むＴＡＣＩポリペプチドを包含する。
【００１３】
ＴＡＣＩ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＴＡＣＩポリペプチドの形態を意味する。通常、ＴＡＣＩポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを約１％未満、好ましくはそのようなドメインを約０．５％未満しか持たない。本発明のＴＡＣＩポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。ＴＡＣＩのＥＣＤ形態はvon Bulow等, 上掲及び1998年9月11日に発行されたＷＯ９８／３９３６１に記載されるものを含む。
【００１４】
「ＴＡＣＩ変異体」とは、全長天然配列ＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ ＥＣＤと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＴＡＣＩポリペプチドを意味する。好ましくは、以下に定義するように、このようなＴＡＣＩ変異体はＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストとして作用する。このようなＴＡＣＩ変異体ポリペプチドには、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＴＡＣＩポリペプチドが含まれる。ＴＡＣＩ ＥＣＤの断片も考慮される。通常、ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは、Ｆｉｇ．１に示される核酸分子又はその特定化された断片によってコードされるＴＡＣＩポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは、天然ＴＡＣＩポリペプチドは含まない。通常、ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約４０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約６０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約７０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約８０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約９０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００１５】
ここで用いられる場合、「ＢＣＭＡ」又は「ＢＣＭＡポリペプチド」又は「ＢＣＭＡレセプター」という用語は、「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」及び「ＢＣＭＡ変異体」（ここでさらに定義される）を含む。「ＢＣＭＡ」はＦｉｇ．２に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、Ｆｉｇ．２に示される配列及びその変異体断片並びに前述の断片を含む核酸分子によってコードされるこれらのポリペプチドに対して与えられた名称である。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、ヒト組織タイプ又は他のソース由来のような、種々のソースから単離され、組換体及び／又は合成的な方法によって調製される。
「天然配列」ＢＣＭＡポリペプチドは、天然由来の対応するＢＣＭＡポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＢＣＭＡポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換体及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」という用語には、特に、ＢＣＭＡポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＢＣＭＡポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、Laabi等, EMBO J.,11:3897-3904(1992)；Laabi等, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154(1994)；Gras等, Int.Immunology, 7:1093-1106 (1995)；Madry等, Int. Immunology, 10:1693-1702(1998)；及びＦｉｇ．２（配列番号：４）の１−１８４アミノ酸残基の隣接する配列を含むＢＣＭＡポリペプチドを包含する。
【００１６】
ＢＣＭＡ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＢＣＭＡポリペプチドの形態を意味する。通常、ＢＣＭＡポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを約１％未満、好ましくはそのようなドメインを約０．５％未満しか持たない。本発明のＢＣＭＡポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。ＴＡＣＩのＥＣＤ形態はLaabi等, EMBO J.,11:3897-3904(1992)；Laabi等, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154(1994)；Gras等, Int.Immunology, 7:1093-1106 (1995)；Madry等, Int. Immunology, 10:1693-1702(1998)に記載されるものを含む。
【００１７】
「ＢＣＭＡ変異体」とは、天然配列ＢＣＭＡ又はＢＣＭＡ ＥＣＤと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＣＭＡポリペプチドを意味する。好ましくは、以下に定義するように、このようなＢＣＭＡ変異体はＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストとして作用する。このようなＢＣＭＡ変異体ポリペプチドには、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。ＢＣＭＡ ＥＣＤの断片も考慮される。通常、ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは、Ｆｉｇ．２に示される核酸分子又は特定化されたその断片によってコードされるＢＣＭＡポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは、天然ＢＣＭＡポリペプチドは含まない。通常、ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約４０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約６０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約７０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約８０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約９０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００１８】
ここで用いられる場合、「ＴＡＬＬ−１」又は「ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」という用語は、「天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」及び「ＴＡＬＬ−１変異体」を含む。「ＴＡＬＬ−１」はＦｉｇ．３に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、Ｆｉｇ．３に示される配列及びその変異体断片並びに天然配列ＴＡＬＬ−１の生物学的活性を有する前述の断片を含む核酸分子によってコードされるこれらのポリペプチドに対して与えられた名称である。ＴＡＬＬ−１の変異体は、Ｆｉｇ．３に示される天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチドと、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＴＡＬＬ−１ポリペプチドは、天然由来の対応するＴＡＬＬ−１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換体及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＴＡＬＬ−１ポリペプチド」という用語には、特に、ＴＡＬＬ−１ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＴＡＬＬ−１ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「ＴＡＬＬ−１」という用語は、Shu等, GenBank 登録番号AF136293；1998年5月7日発行のＷＯ９８／１８９２１；1998年10月7日発行のEP869,180；1998年6月25日発行のＷＯ９８／２７１１４；1999年3月18日発行のＷＯ９９／１２９６４；1999年7月8日発行のＷＯ９９／３３９８０；Moore等, 上掲；Schneider等, 上掲；Mukhopadhyay等, 上掲に記載されるこれらのポリペプチドを含む。
【００１９】
ここで用いられる場合、「ＡＰＲＩＬ」又は「ＡＰＲＩＬポリペプチド」という用語は、「天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチド」及び「ＡＰＲＩＬ変異体」を含む。「ＡＰＲＩＬ」はＦｉｇ．４に示されるポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、Ｆｉｇ．４に示される配列及びその変異体断片並びに天然配列ＡＰＲＩＬの生物学的活性を有する前述の断片を含む核酸分子によってコードされるこれらのポリペプチドに対して与えられた名称である。ＡＰＲＩＬの変異体は、Ｆｉｇ．４に示される天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチドと、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＡＰＲＩＬポリペプチドは、天然由来の対応するＡＰＲＩＬポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換体及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＡＰＲＩＬポリペプチド」という用語には、特に、ＡＰＲＩＬポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＡＰＲＩＬポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「ＡＰＲＩＬ」という用語は、Hahne等, J.Exp.Med., 188:1185-1190(1998)；GenBank 登録番号AF046888；1999年1月7日発行のＷＯ９９／００５１８；1999年3月18日発行のＷＯ９９／１２９６５；1999年7月8日発行のＷＯ９９／３３９８０；1997年9月18日発行のＷＯ９７／３３９０２；1999年3月11日発行のＷＯ９９／１１７９１；1999年3月28日発行のEP911,633；1999年10月7日発行のＷＯ９９／５０４１６に記載されるこれらのポリペプチドを含む。
【００２０】
ここに定義されるリガンド又はレセプターポリペプチド配列に対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後、ここで同定されるようなリガンド又はレセプターポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２１】
0005062606.tif 000002
0005062606.tif 000003
0005062606.tif 000004
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【００２２】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは認識されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、Ｆｉｇ．５Ａ−５Ｂは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００２３】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードしてもよい。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【００２４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有している。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００２５】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インヴィトロ、インサイツ又はインヴィボにおいて、ＴＡＬＬ−１ポリペプチド、ＡＰＲＩＬポリペプチド、又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬポリペプチドの係る生物学的活性の例には、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対する結合、ＮＦ−ＫＢの活性化、及びＢ細胞による増殖とＩｇ分泌の活性化、関節リウマチなどの免疫関連状態、並びに文献中にさらに報告されるものが含まれる。アンタゴニストは直接的又は間接的な様式で機能する。例えば、アンタゴニストは、インヴィトロ、インサイツ又はインヴィボにおいて、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対するその直接的結合の結果として、ＴＡＬＬ−１ポリペプチド、ＡＰＲＩＬポリペプチド又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和するために機能する。また、アンタゴニストは、インヴィトロ、インサイツ又はインヴィボにおいて、例えば、他のエフェクター分子をブロック又は阻害する結果として、ＴＡＬＬ−１ポリペプチド、ＡＰＲＩＬポリペプチド又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和するために間接的にも機能する。アンタゴニスト分子は、該分子がＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和することが可能である、「二重」アンタゴニスト活性を含む。
【００２６】
「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インヴィトロ、インサイツ又はインヴィボにおいて、ＴＡＣＩポリペプチド、ＢＣＭＡポリペプチド、又はＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの両方の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化する任意の分子を含む。ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡポリペプチドの係る生物学的活性の例には、ＮＦ−ＫＢの活性化、イムノグロブリン分子の生産及び分泌の誘導、並びに文献中にさらに報告されるものが含まれる。アゴニストは直接的又は間接的な様式で機能する。例えば、アゴニストは、レセプターの活性化又はシグナル伝達を引き起こす、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡに対するその直接的結合の結果として、インヴィトロ、インサイツ又はインヴィボにおいて、ＴＡＣＩポリペプチド、ＢＣＭＡポリペプチド又はＴＡＬＬ−１及びＢＣＭＡの両方の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化するために機能する。また、アゴニストは、インヴィトロ、インサイツ又はインヴィボにおいて、例えば、その後ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプターの活性化又はシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果として、ＴＡＣＩポリペプチド、ＢＣＭＡポリペプチド又はＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの両方の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化するために間接的にも機能する。アゴニストは、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ活性化又は活性を増強又は増大するために間接的に機能するエンハンサー分子として作用することが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物において内在性ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの活性を増強してもよい。この現象は、例えば、前複合体化ＴＡＣＩもしくはＢＣＭＡによって、又はＴＡＣＩもしくはＢＣＭＡレセプターに対する各リガンドの複合体を安定化する（ＴＡＬＬ−１及びＴＡＣＩ、又はＡＰＲＩＬ又はＴＡＣＩ間に形成される天然複合体を安定化するような）ことによって達成される。
【００２７】
「ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト」又は「ＡＰＲＩＬアンタゴニスト」なる用語は、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ各々、又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和し、限定はしないが、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ、ＴＡＣＩの細胞外ドメイン配列、ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシン、ＢＣＭＡレセプターイムノアドヘシン、ＴＡＣＩ融合タンパク質、ＴＡＣＩレセプターの共有結合的修飾形態、ＢＣＭＡレセプターの共有結合的修飾形態、ＴＡＣＩ変異体、ＢＣＭＡ変異体、ＴＡＣＩレセプター抗体、ＢＣＭＡレセプター抗体、ＴＡＬＬ−１抗体及びＡＰＲＩＬ抗体を含む任意の分子を指す。ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの生物学的活性をブロック、阻害又は中和するかどうかを決定するために、アッセイは、例えば、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対する結合、又は各リガンドによるＮＦ−ＫＢの活性化などにおけるアンタゴニスト分子としての効果を評価するために実施される。このようなアッセイは、例えば、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現している細胞など、既知のインヴィトロ又はインヴィボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるＴＡＬＬ−１アンタゴニストは、少なくとも１タイプのＴＡＬＬ−１活性をブロック又は中和することができ、場合によっては、ここで記述されるようなアッセイにおいて決定されてもよい。ＡＰＲＩＬアンタゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの生物学的活性をブロック、阻害又は中和するかどうかを決定するために、アッセイは、例えば、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対する結合、又はリガンドによるＮＦ−ＫＢの活性化などにおけるアンタゴニスト分子としての効果を評価するために実施される。このようなアッセイは、例えば、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡで形質移入された細胞（又はＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの両方で）（好ましくは比較的低いレベルで形質移入された）を用いて、既知のインヴィトロ又はインヴィボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるＡＰＲＩＬアンタゴニストは、少なくとも１タイプのＡＰＲＩＬ活性をブロック又は中和することができ、場合によっては、結合アッセイ又はＩｇＭ生産アッセイにおいて決定されてもよい。場合によっては、ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは、結合アッセイにおいて、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのいずれか（又はＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方）のＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対する結合をネガティブコントロール分子を比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％、及び最も好ましくは１００％で減少させ又は阻害することができるであろう。一実施態様において、ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対するリガンド又は抗体の結合を競合的に阻害する抗体を含むであろう。競合阻害により抗体の特異性及び親和性を決定するための方法は、当該技術分野において既知である[Harlow等, Antibodies:A Laboratory Mnual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny(1998)；Colligan等, Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc.,NY (1992;1993)；Muller, Meth.Enzym., 92:589-601(1983)]。
【００２８】
「ＴＡＣＩアゴニスト」又は「ＢＣＭＡアゴニスト」なる用語は、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ各々、又はＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの両方の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化し、限定はしないが、抗ＴＡＣＩレセプター抗体及び抗ＢＣＭＡレセプター抗体を含む任意の分子を指す。ＴＡＣＩアゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの生物学的活性を増強、刺激又は活性化するかどうかを決定するために、アッセイは、例えば、ＰＢＬ又はＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ形質移入細胞に対するアゴニスト分子としての効果を評価するために実施される。このようなアッセイは、例えば、既知のインヴィトロ又はインヴィボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるＴＡＣＩアゴニストは、少なくとも１タイプのＴＡＣＩ活性を増強又は活性化することができ、場合によっては、ここで記述されるようなアッセイにおいて決定されてもよい。ＢＣＭＡアゴニスト分子が部分的又は完全にＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの生物学的活性を増強、刺激又は活性化するかどうかを決定するために、アッセイは、例えば、ＡＰＲＩＬ又はＴＡＣＩの活性に対するアンタゴニスト分子としての効果を評価するために実施される。このようなアッセイは、例えば、ＰＢＬｓ又はＴＡＣＩ又はＢＣＭＡで形質移入された細胞を用いて、インヴィトロ又はインヴィボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストは、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプターに対する天然リガンドによって達成される程度まで、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ各々を増強又は活性化することができるであろう。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、又はＢＣＭＡに対する単一のモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、単鎖抗体、及び抗体の断片を特異的にカバーしている。
【００２９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。それらの特性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培地で合成され、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は、また、Clackson等, Nature, 352:624-628(1991)及びMarks等, J. Mol.biol., 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野によいて既知である。
【００３０】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jone等, Nature, 321:522-525(1986)；Reichmann等, Nature, 332:323-329(1998)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., Nature, 2:593-596(1992)参照。ヒト化抗体はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤTMを含み、抗体の抗原結合領域が、対象とする抗原でマカク属サルに免疫性を与えることで精製される抗体から得られる。ヒト化抗体を作製する方法は、当該技術分野によいて既知である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marksほか, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。
【００３１】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３２】
「治療」又は「療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
治療又は療法の目的のための「哺乳動物」という用語は、ヒト、家畜、農場の動物、及び動物園、スポーツのため又はペットとしての動物、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類と分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３３】
「ＴＡＬＬ−１関連病理学的状態」及び「ＡＰＲＩＬ関連病理学的状態」は、正常で健康な哺乳動物における活性のレベルを超えた又はそれに満たないＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ各々の異常な発現レベルと関連した症状又は状態を意味し、このような過剰又は減少したレベルが、全身で、局在して、又は身体の特定の組織もしくは細胞タイプもしくは位置において生じている。ＴＡＬＬ−１関連病理学的状態及びＡＰＲＩＬ関連病理学的状態は急性及び慢性の免疫関連疾患及び癌を含む。
【００３４】
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが  腺癌を含む癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホドキン及び非ホドキンリンパ腫、リンパ腫、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞種などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルム腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌種、メラノーマ、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。場合によっては、癌は、つまり、癌細胞と関連した、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡを発現するであろう。例として、大腸、肺及びメラノーマ癌はＡＰＲＩＬを発現することが文献において報告されている。ここでの治療に対して好ましい癌には、バーキットリンパ腫、多発性メラノーマ、急性リンパ腺種、又はリンパ性白血病、非ホドキン及びホドキンリンパ腫、及び急性骨髄白血病などのリンパ腫、白血病及びメラノーマ、及びそれらのサブタイプが含まれる。
【００３５】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、炎症疾患、感染症及び免疫欠損症が含まれる。本発明により治療可能で、そのいくつかは免疫又はＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ウイルス性疾患、例えばＡＩＤＳ(ＨＩＶ感染)、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス等、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【００３６】
ここで「自己免疫疾患」とは、正常又は健康な組織の破壊が、自身の組織成分に対する個々の哺乳類の体液又は細胞の免疫応答から生じるような、哺乳類の疾患又は状態をついて言及するために広く一般的な意味で、ここでは使用される。例として、限定するものではないが、リンパ性狼瘡、甲状腺炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が含まれる。
【００３７】
ここで使用される「細胞障害剤」という用語は、細胞機能を阻害又は抑制するか、及び／又は細胞の崩壊を引き起こす物質を意味する。その用語は放射性アイソトープ(例えばＩ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６)、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒又はそれらのフラグメントを含むことを意図している。
【００３８】
「化学治療剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(タキソール, Bristol-Myers Squibb Oncology,  Princeton, NJ)及びドキセタキセル(タキソテール, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rrance)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ＣＰＴ−１１、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン(米国特許第４６７５１８７号参照)、メルファラン、及び他の関連したナイトロジェンマスタードが含まれる。またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン及びオナプリストーン(onapristone)も含まれる。
【００３９】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、Ｓ期にそのような細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシン等、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポＩＩのインヒビターが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃは、Ｓ期停止にまで波及する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００４０】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００４１】
ＩＩ．方法及び材料
一般に、哺乳動物細胞においてＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、及び／又はＢＣＭＡ活性を修飾するための本発明の方法は、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬとＴＡＣＩ又はＢＣＭＡとの相互作用に影響を与えるアンタゴニスト又はアゴニストの所望の量に対して細胞を暴露することを含む。好ましくは、用いられるアンタゴニスト又はアゴニストの量は、治療的効果を達成するために各リガンド又は各レセプターの結合及び／又は活性に影響を与える有効量である。これは、例えば、下記及び実施例に記載の方法に従い、インヴィボ及びエクスヴィボで達成され得る。このようなＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬで治療される状態又は疾患の例には、限定はしないが、関節リウマチ、多発性硬化症、感染、及び,狼蒼含む自己免疫疾患又は哺乳動物においてＢ細胞応答が異常に上方制御される癌などの他の病理学的状態として臨床的に言及される哺乳動物の状態を含む。下記の実施例において示されるように、ＴＡＣＩイムノアドヘシン分子は実質的にタイプＩＩコラーゲンの免疫化により誘導される関節疾患を阻害し、関節炎及び抗コラーゲン抗体の形成を減少させ、骨及び軟骨の破壊を防ぎ、自己応答Ｔ細胞の刺激をブロックした。これらの結果は、ＴＡＣＩをＴ細胞媒介自己免疫と関係づけ、ＴＡＣＩのＴＡＬＬ−１及び／又はＡＰＲＩＬとの相互作用のをブロック又は阻害することが、ＲＡなどの自己免疫疾患に対する治療的有用性を有することを示唆する。ＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストで治療される状態又は障害の例には、免疫不全及び癌が含まれる。
また、診断方法もここに提供される。例えば、ＴＡＬＬ−１関連病理学的状態又はＡＰＲＩＬ関連病理学的状態であると思われることが分かっている哺乳動物において、アンタゴニスト又はアゴニストは各リガンド（ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ）又はレセプター（ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ）を検出するために用いられてもよい。アンタゴニスト又はアゴニスト分子は、例えばサンプル中のＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬを検出又は定量するためのイムノアッセイにおいて使用されてもよい。哺乳動物から得られた細胞などのサンプルは、標識化されたアンタゴニスト又はアゴニスト分子の存在下でインキュベートすることができ、サンプル中で結合した標識化されたアンタゴニスト又はアゴニストの検出を実施することができる。このようなアッセイには、種々の臨床的アッセイ方法が含まれ、当該分野において知られており、例えば、Voller等, Immunoassays, University Park, 1981中に記載されている。
【００４２】
Ａ．材料
本方法において用いることができるアンタゴニスト及びアゴニストには、限定はしないが、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡレセプターの可溶性形態、ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシン及びＢＣＭＡレセプターイムノアドヘシン、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡを含む融合タンパク質、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの共有結合的に修飾された形態、ＴＡＣＩレセプター変異体及びＢＣＭＡレセプター変異体、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプター抗体、及びＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ抗体が含まれる。アンタゴニスト及びアゴニストを作製するために用いることができる様々は技術が以下に記述される。
一般に、本発明の組成物は、当該技術分野において既知の組換え技術を用いて調製される。以下の記述は、コード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによって、係るポリペプチドを生産する方法に関する。（Sambrook等, Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；Diffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)）。
所望のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター中に挿入される。様々なベクターが公的に入手できる。通常、ベクターの構成要素には、限定はしないが、以下に示す一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製オリジン、一又は複数のマーカ遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列、以下に記載される各々など。場合によっては、用いられるシグナル配列、複製オリジン、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列は、当該技術分野において既知であり、更に詳細にはＷＯ９７／２５４２８に記載されている。
【００４３】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、コード化核酸配列に作用可能に関連づけられたプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に連結された特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘導的及び構成的な２つのクラスに属する。誘導的なプロモーターは、栄養素の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、コード化ＤＮＡに作用可能に結合している。
原核及び真核宿主との使用に対して適するプロモーターは、当該技術分野において既知であり、さらに詳細にＷＯ９７／２５４２８に記述されている。
【００４４】
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC  31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該技術分野において既知の標準的な技術を用いて配列決定を行った。[Messing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxam等, Methods in Enzymology, 65:499（1980）を参照のこと]。
【００４５】
哺乳類細胞中でのコード化ＤＮＡの一過的な発現を提供する発現ベクターが利用できる。一般に、一過的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積させ、次に発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドの高いレベルを合成するように、宿主細胞中において効率的に複製し得る発現ベクターの使用が必要である[Sambrook等、上掲]。適当な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過的発現系は、クローン化されたＤＮＡによってコードされるポリペプチドの簡便でポジティブな同定、並びに所望の生物学的又は生理学的性質に関する係るポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
組換え脊椎動物細胞培養での所望のポリペプチド合成に適応化するのに適切なさらに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００４６】
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、グラム陰性又はグラム陽性生物体などの真正細菌、例えば大腸菌のような腸内細菌科、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、ネズミチフス菌などのサルモネラ、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans)などのセラチア、及び赤痢菌、並びにバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日公開のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)などの桿菌、緑膿菌などのシュードモナス、及びストレプトマイセスなどを含む。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化されたポリペプチドの発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。全てのそのような宿主細胞は、ＷＯ９７／２５４２８にさらに記述されている。
宿主細胞は、上述の発現又はクローニングベクターで形質移入、好ましくは形質転換させ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように変更を加えた栄養培地中で培養する。
【００４７】
形質移入とは、いずれかのコード化配列が実際に発現されるか否かによらず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを意味する。形質移入に関する多くの方法が、通常、当業者にとって既知であり、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作の何れかの徴候が宿主細胞内で生じたときに、一般に形質移入の成功が認められる。
【００４８】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように、生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換は行われる。Sambrook等のMolecular Cloning：A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）の1.82節に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、通常、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスでの感染が、Shaw等, Gene 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。さらに、1991年1月10日に公開されたＷＯ９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物に形質移入することもできる。
このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb（Virology, 52:456-457(1978)）のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は1983年8月16日に発行されたAxelによる米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら J.Bact., 130:946(1977)及びHsiaoら Proc.Natl.Acad.Sci. USA,76:3829(1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等々での細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の方法については、Keownら Methods in Enzymology(1990),Vol185:pp527-537; 及び Mansourら, Nature,336:348-352(1988)を参照のこと。
【００４９】
原核生物細胞は、一般にSambrook等、上掲に記述されているような適当な培地中で培養される。市販の培地の例には、Ham's F10（Sigma）、最小必須培地（「MEM」, Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）及びダルベッコの修正イーグル培地（DMEM, Sigma）が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンＴＭ剤）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【００５０】
発現されたポリペプチドは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶解液から回収してもよい。該ポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を放出させる。
該ポリペプチドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、ポリペプチドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、実質的に相同である調製物を得るには、通常、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから該ポリペプチドを回収又は精製することが必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去する。ついで、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
ＴＡＣＩレセプター変異体及びＢＣＭＡレセプター変異体は本発明において使用が考慮される。このような変異体は、当該技術分野における何れかの技術を用いて調製することができる。このレセプター変異体は、適当なヌクレオチド置換をレセプターＤＮＡへ導入することによって、及び／又は所望のレセプターポリペプチドの合成によって調製できる。当業者等は、アミノ酸置換が、グリコシル化部位の番号又は位置を変化させたり、又は膜結合性を変える等のレセプターの翻訳後のプロセスを変更するということを理解するだろう。
【００５１】
天然全長配列レセプター又はここに記載したレセプターの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列レセプターと比較してレセプターのアミノ酸配列が変化するレセプターをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のレセプターの１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、レセプターの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を体系的に作成し、完全長又は成熟天然配列によって示される活性について、得られた変異体を試験することにより決定される。
【００５２】
ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡポリペプチド断片が、ここで提供される。そのような断片はＮ末端又はＣ末端で切断されていたり、又は例えば完全長の天然タンパク質を比較した場合、内部の残基が欠失していてもよい。ある断片は、該レセプターポリペプチドの所望の生物学的活性に対して必須ではないアミノ酸残基が欠如している。場合によっては、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡポリペプチド断片は、一又は複数のアミノ酸残基がレセプターＥＣＤ配列のＮ末端又はＣ末端から欠失されたＥＣＤ欠失変異を含む。好ましくは、このようなＥＣＤ欠失配列は、天然レセプター配列と比較して少なくとも１つの生物学的活性を有する。
ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製されてもよい。所望のペプチド断片は、化学的に合成されてもよい。これに代わるアプローチには、酵素的消化、例えば、特定のアミノ酸残基により限定される部位でタンパク質を切断することが知られている酵素によりタンパク質を処理し、又は適切な制限酵素でＤＮＡを切断し、所望の断片を単離することによってレセプター断片を生成することが含まれる。さらに他の適切な技術には、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を限定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’及び３’プライマーに用いられる。
特定の実施態様において、目的の保存的置換は好ましい置換との表題の下、表１において示される。そのような置換が結果的に生物学的活性に変化を起こす場合、表１中の例示的置換と称され、又はアミノ酸クラスに対する文献中に記述されるような、更なる実質的な置換が導入され、その産物がスクリーニングされる。
【００５３】
表１
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【００５４】
レセプターポリペプチドの生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はへリックス構造、（ｂ）標的部位もしくは（ｃ）側鎖全体における分子の電荷又は疎水性、を維持する効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けできる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された（非保存的な）部位に導入されうる。
【００５５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してレセプター変異ＤＮＡを生産することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するためにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244:1080-1085(1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見いだされることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &; Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５６】
また、ＴＡＣＩレセプター又はＢＣＭＡレセプターの可溶性形態も、本発明の方法におけるアンタゴニストとして使用されてもよい。このようなＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの可能性形態は、各レセプターの細胞外ドメイン（及び各レセプターの膜貫通及び細胞内ドメインを欠く）を含み又はから構成される。ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの細胞外ドメイン配列それ自身はアンタゴニストとして用いられ、以下に記述されるように更に修飾されてもよい（イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーに融合されるなど）。ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの特定の細胞外ドメイン領域は文献中に記載されており、当業者に既知の技術を用いて更に描写されてもよい。当業者は、過度の実験を行うことなく、アンタゴニストとして使用されるＴＡＣＩ又はＢＣＭＡのいずれかの所望の細胞外ドメイン配列を選択することができるであろう。
【００５７】
イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシンは、全長ポリペプチドの他に細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列又はＥＣＤ配列フラグメントを含むレセプターの可溶性型のような、ＴＡＣＩの様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＴＡＣＩレセプターと抗体又は抗体の特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、レセプターポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
【００５８】
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合されるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(ｂ)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【００５９】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される：
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ；
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,ＶＬＣＬ-ＡＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ,又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
【００６０】
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【００６１】
そのような可能性ＥＣＤ配列の例には、Ｆｉｇ．１に示されるＴＡＣＩ配列の２−１６６アミノ酸を含むポリペプチドが含まれ、以下の実施例においてされらに記述される。ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシンは当該技術分野において記述されるいずれかの方法に従い作製することができる。
ＢＣＭＡレセプターイムノアドヘシンは、同様にして構築することができる。ＢＣＭＡイムノアドヘシンを構築ための使用に関する可溶性ＥＣＤ配列の例には、Ｆｉｇ．２に示されるＢＣＭＡ配列の５−５１アミノ酸を含むポリペプチドが含まれ、以下の実施例においてさらに記述される。
他の実施態様において、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプターは、米国特許第４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７において公に述べられている様にして、レセプターポリペプチドを、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン、などの種々の非タンパク質性ポリマーの１つにレセプターポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプターのペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
【００６２】
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合し、連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); ＷＯ９４／１０３０８；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパーをＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプター分子のＮ末端又はＣ末端の何れかに融合しうることは理解するであろう。
また、本発明のＴＡＣＩ及びＢＣＭＡポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該レセプターポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＴＡＣＩ又はＢＣＭＡレセプターとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはレセプターポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって該レセプターを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、ポリ−ヒスチジン（poly-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；fluＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５（Fieldほか, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)）；ｃ−ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evanほか, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ（ｇＤ）タグとその抗体が含まれる。Paborskyほか, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)。他のタグポリペプチドも開示されている。例には、フラッグ−ペプチド（Flag-peptide）（Hoppほか, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Matinほか, Science, 255:192-194 (1992)）；αチューブリンエピトープペプチド（Skinnerほか, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグが含まれる。Lutz-Freyermuthほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)。
【００６３】
また、抗ＴＡＣＩレセプター抗体、抗ＢＣＭＡレセプター抗体、抗ＴＡＬＬ−１抗体、又は抗ＡＰＲＩＬ抗体は、今回開示される方法において利用できることも考慮される。そのような分子の例には、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬのＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに対する結合を好適に阻害し得る中和又はブロック化抗体が含まれる。抗ＴＡＣＩ抗体、抗ＢＣＭＡ、抗ＴＡＬＬ−１又は抗ＡＰＲＩＬ抗体はモノクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的にはＴＡＣＩ又はＢＣＭＡポリペプチド、又はＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬポリペプチド又はそれらの融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬｓ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００６４】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。場合によっては、抗ＴＡＣＩ、抗ＢＣＭＡ、抗ＴＡＬＬ−１、又は抗ＡＰＲＩＬ抗体は、結合アッセイにおいて決定されるように、各レセプター又はリガンドに対して少なくとも１０ｎＭ、好ましくは少なくとも５ｎＭ、及びさらに好ましくは少なくとも１ｎＭの結合親和性を有するだろう。
【００６５】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインヴィボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００６６】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【００６７】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインヴィトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインヴィボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００６８】
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００６９】
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を高度可変領域配列で置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))に本質的に従って実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００７０】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
場合によっては、免疫化において、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)及びDuchosal等、Nature, 355:258 (1992)を参照のこと。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーからも誘導できる（Hoogenboom等、J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等、Nature Biotech, 14:309 (1996)）。
【００７１】
以下の実施例において記述されるように、特定の抗ＡＰＲＩＬ抗体が調製されている。これらの抗体のうち４つは、3C6.4.2、5G8.2.2、5E8.7.4、及び5E11.1.2は、ＡＴＣＣに寄託され、登録番号PTA-1347、PTA-1345、PTA-1344及びPTA-1346が付与された。一実施態様において、ここで開示の抗ＡＰＲＩＬ抗体は、登録番号PTA-1347、PTA-1345、PTA-1344及びPTA-1346で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体と同一の生物学的性質を持つであろう。「生物学的特徴」という用語は、モノクローナル抗体のインビトロ及び／又はインビボの活性又は性質、例えばＡＰＲＩＬに結合する能力又はＡＰＲＩＬによるＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの結合もしくは活性化を実質的にブロックし又は低減させる能力を指すために使用される。場合によっては、抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体は、以下の実施例に開示される5G8.2.2抗体、5E8.7.4抗体、3C6.4.2抗体、又は5E11.1.2抗体と同じエピトープに結合するだろう。このようなエピトープ結合特性は、例えば競合阻害結合アッセイにおいて決定することができ、その技術は当該技術分野において既知である。このような抗ＡＰＲＩＬ抗体は、好ましくはＡＰＲＩＬに対する5G8.2.2抗体、5E8.7.4抗体、3C6.4.2抗体、又は5E11.1.2抗体の結合のいずれかを競合的に阻害するであろう。キメラ又はヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体は、前述にて触れた寄託された抗ＡＰＲＩＬ抗体の何れかに由来する選択断片又はドメイン配列を用い又は取り込んで（上述の技術を使用することによる等の）、構築されることが考慮される。
【００７２】
Ｂ．アッセイ方法
リガンド／レセプター結合の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。細胞ベースアッセイ及び動物モデルアッセイは、ここで同定されるリガンド及びレセプター間の相互作用、ここで言及される状態及び疾患の進行及び病因をさらに理解するために用いることができる。
一つのアプローチにおいて、哺乳類細胞はここで記述されるリガンド又はレセプターによって形質移入され、結合又は活性を増強又は阻害するためのアゴニスト又はアンタゴニストが解析される。適切な細胞は、所望の遺伝子によって形質移入され、活性に関してモニターされる。その後、このような形質移入された細胞株は、例えば、Ｂ細胞の増殖又はＩｇの分泌などを阻害又は増強するアンタゴニスト又はアゴニストの能力をテストするために使用することができる。ここで同定される遺伝子のコード配列で形質移入される細胞は、免疫関連疾患又は癌の治療のための薬剤候補を同定するためにさらに使用され得る。
さらに、トランスジェニック動物に由来する初代培養は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できる。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている[Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 (1985)参照]。
一つの適切な細胞ベースアッセイは、エピトープタグ化リガンド（例えば、ＡＰ又はＦｌａｇ）を各レセプターを有するか又は発現させる細胞へ添加することであり、抗タグ抗体を用いてＦＡＣＳ染色することによる結合（予想されるアンタゴニストの存在又は非存在下において）の分析である。その他のアッセイにおいて、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬにより誘導されたＢ細胞の増殖を阻害するアンタゴニストの能力がアッセイされる。Ｂ細胞又は細胞株はＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬと共に予想されるアンタゴニストの存在又は非存在下において培養され、Ｂ細胞の増殖は３Ｈ−チミジンの取込み又は細胞数によって測定され得る。
【００７３】
さらに、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用し、証明することができる。種々の良く知られた動物モデルは、例えば、免疫関連疾患又は癌の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アンタゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性をテストするために、使用できる。これらのモデルのインヴィボの性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
例えば、移植片対宿主疾患に関する動物モデルが知られている。移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、Ｔ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植拒絶におけるそれらの役割の指標である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー-エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。[Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation(1994)58：23及びTinubu, S.A.等,  J. Immunol.(1994)4330-4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
【００７４】
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
関節炎の動物モデルは、コラーゲン-誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及び軟骨下(subchondral)骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.5.に記載されているプロトコールを使用し、自己免疫関節炎に対する活性を試験することができる。また、Issekutz, A.C.等, Immunology(1996)88：569に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。以下の実施例１０にはＣＩＡマウスモデルについてさらに記載する。
抗原誘発性気道反応亢進、肺好酸球増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、エアゾールにより送達される同一のタンパク質に動物を暴露することで誘発される喘息モデルが記載されている。いくつかの動物モデル(モルモット、ラット、非ヒト霊長類)では、エアゾール抗原への暴露時にヒトのアトピー性喘息に類似した徴候が示された。マウスモデルはヒト喘息の多くの特徴を有している。喘息治療における活性と有効性について本発明の化合物を試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.(1998)18：777とそこに引用されている文献に記載されている。
さらに、本発明の化合物は乾癬用疾患の動物モデルにおいて試験することができる。ある証拠によりＴ細胞が乾癬の病原であることを示唆されている。本発明の化合物は、Schon. M.P.等, Nat. Med.(1997)3：183により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.等, Am. J. Path.(1995)146：580に記載されているようにして調製されたヒトskin／scidマウスキメラである。
【００７５】
候補治療組成物の抗癌活性をテストするために、種々の動物が周知である。これらには、胸腺欠損ヌードマウス又はskin／scidマウス、又はｐ５３ノックアウトマウスなどの遺伝学的マウス腫瘍モデルへのヒト腫瘍の異種移植が含まれる。
組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象の動物ゲノムに導入することにより設計することができる。遺伝子組換え操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号)；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985])；胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989])；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983])；精子媒介遺伝子転移(Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989])を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。動物は、さらに、免疫疾患の病原の徴候例えば組織学的検査により特定の組織中への免疫細胞の湿潤について、又は癌性もしくは悪性組織について測定するために、検査してもよい。
【００７６】
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは変更が加えられていないフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入され、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００７７】
Ｃ．製剤
ここで記述されるアンタゴニスト又はアゴニストは、好ましくは担体中で用いられる。適切な担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集された、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５から８、さらに好ましくは約７．４から７．８である。さらに担体には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の徐放性製剤が含まれ、このマトリックスは、例えばフィルム状、リポソーム状又はマイクロ粒子状等の成形物の形態をしている。例えば投与される抗体の投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。担体は凍結乾燥又は水溶液の形態であってもよい。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７８】
また、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。
またアンタゴニスト又はアゴニストは、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.編(1980)に開示されている。
インヴィボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。
【００７９】
Ｄ．治療の形態
ここに記述されるアンタゴニスト又はアゴニストは、免疫関連疾患又は癌などの種々の病理学的状態を治療することにおいて有用である。哺乳動物において、これらの状態は、本発明の一又は複数のアンタゴニスト又はアゴニストの投与を通じて、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに関連する選択された活性を刺激し又は阻害することにより治療することができる。
ここに記載の種々の病理学的状態の哺乳動物の診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。診断技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検知を考慮する技術分野において入手可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診（法）、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ及びその類似を包含する技術を通して同定され得る。また、免疫関連疾患は容易に同定できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受けた。
【００８０】
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもある。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【００８１】
若年性慢性関節炎は、多く場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【００８２】
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【００８３】
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ-１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【００８４】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されてその機能を阻害する。
【００８５】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
【００８６】
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【００８７】
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【００８８】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【００８９】
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン-非-反応性の表現型を産出することができる。
【００９０】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
【００９１】
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。ＭＳにおいて、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマイクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球の駆動によると思われる。
【００９２】
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。反応を阻害することは治療的に有益なことである。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、Ｔリンパ球に依存して発生する。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。障害はＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴ細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるＴリンパ球、及びＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
【００９３】
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、ＭＬＲを刺激する(分子／誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
【００９４】
アンタゴニスト又はアゴニストは、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、病巣内又は吸入（エアゾル化された鼻腔内、肺内への）の経路により、及び持続性又は徐放性の方法により、哺乳類動物、好ましくはヒトへ投与される。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ流入によって実施することもできる。また、アンタゴニスト又はアゴニストは当該技術分野において記述された遺伝子治療技術を用いて利用してもよい。
アンタゴニスト又はアゴニストの投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単独に使用されるＡｐｏ-２の効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordentiら, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
【００９５】
そのアゴニスト又はアンタゴニストのインヴィボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないアンタゴニスト又はアゴニストの用量が、例えば、アゴニスト又はアンタゴニストを受入れる哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療物に依存して変わりうることは理解できるであろう。
【００９６】
細胞の型及び／又は病気の重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が患者への最初の候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。
場合によっては、特定のアンタゴニスト又はアゴニストの投与に先立ち、哺乳動物又は患者をＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ、又はＴＡＣＩ又はＢＣＭＡのレベル又は活性を決定するためにテストすることができる。そのようなテストは、血清サンプル又は末梢血の白血球のエライザ又はＦＡＣＳによって実施してもよい。
本発明の方法において、アンタゴニスト又はアゴニストの単一タイプを用いてもよい。例えば、ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシン分子などのＴＡＬＬ−１アンタゴニストが投与される。場合によっては、熟練した実務者は、その方法において、例えば、ＴＡＣＩレセプターイムノアドヘシン及び抗ＡＰＲＩＬ抗体の組合せのような、アンタゴニストとアゴニストの組合せを利用することを選択してもよい。さらに、二重のアンタゴニスト、即ちＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬの両方を阻害するために作用するアンタゴニストを利用することが望ましい。例えば、このようなアンタゴニスト分子は、ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬ間、又はＴＡＣＩ及びＢＣＭＡ間で保存されたエピトープに結合する。
【００９７】
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。さらに、治療法は、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭなどの腫瘍抗原を標的とする治療的抗体並びに抗ＶＥＧＦなどの抗血管形成抗体に基づく。
化学治療剤に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service, M.C.Perry編, Williams &; Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。また、化学療法剤は、例えばアンタゴニストの投与に先行し、又はその後に行い、又はそれらと共に与えられてもよい。  また、アンタゴニストは、タモキシフェンなどの抗エストロジェン化合物、又はオナプリストン(onapristone)(欧州特許616812号を参照)などの抗プロゲステロンと、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。
【００９８】
また、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体などの他の抗原に対する抗体を投与することも好ましい。他の方法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ここにおけるアンタゴニストは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて当該発明のアンタゴニストを投与する。
アンタゴニスト又はアゴニスト（及び一又は複数の他の治療剤）は同時的又は経時的に投与される。アンタゴニスト又はアゴニストの投与の後、インヴィトロにおいて処理された細胞を分析することができる。インヴィボでの治療の場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、Ｉｇ生産（非特異的又は抗原特異的）などのＢ細胞活性のマーカーをアッセイすることができる。
【００９９】
ＩＩＩ．スクリーニング方法
また、本発明は、ＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ／ＢＣＭＡ相互作用又はＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ／ＢＣＭＡ相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用し得るものを同定するために分子をスクリーニングする方法も含まれる。そのような分子には、抗体を含む小分子又はポリペプチドが含まれる。小分子の例には、限定はしないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物が含まれる。薬剤候補に対するスクリーニングアッセイは、ここで同定されるリガンド又はレセプターポリペプチドと結合又は複合体を形成し、又はそうでなければこれらのポリペプチドと他の細胞内タンパク質との結合を妨害する化合物又は分子を同定するために計画される。このようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能であり、小分子候補薬剤の同定のために特に適したものにするアッセイを含む。
アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々の形式で実施することができ、それらは当該技術分野で十分に特徴付けされている。
例えば、アゴニストのアッセイは、２つのコンポーネントを結合可能にするために十分な条件及び時間の下で、薬剤候補とここで同定されるリガンド又はレセプターポリペプチドとを接触させることが必要である点において共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用とは結合のことであり、形成される複合体は、反応混合物中で単離され検出される。特定の実施態様において、ここで同定されるリガンド又はレセプターポリペプチド、又は薬剤候補は、固体相上、例えばマイクロプレート上に、共有結合又は非共有結合によって固定化される。一般に、非共有結合はリガンド又はレセプターポリペプチド溶液で固体表面をコートし、乾燥させることによって達成される。あるいは、固定化されるべきリガンド又はレセプターポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して、固体表面にそれをアンカーすることもできる。アッセイは検出可能な標識で標識されうる非固定化成分を、検出可能な標識で標識されうる固定化成分、アンカー成分を含有する被覆表面等の固定化成分に添加することにより行われる。反応が完了した時に、非反応成分を、例えば洗浄することにより除去し、固体表面にアンカーされた複合体を検出する。当初は非固定化の成分が検出可能な標識を担持している場合、表面に固定された標識の検出は複合化が生じたことを示している。元々、非固定化の成分が標識を担持していない場合、複合体形成は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することにより検出することができる。
【０１００】
候補化合物がここで同定される特定のリガンド又はレセプターポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、そのタンパク質との相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために周知の方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等(Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることによりモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２−ハイブリッドシステム」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERTM)は、Clontechから購入可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる：通常は、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で２つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。テスト化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応はテスト化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在するテスト化合物と細胞内又は外成分との結合(複合体形成)は上記のようにモニターする。コントロール反応において複合体が形成され、テスト化合物を含む反応混合物ではしないことは、テスト化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１０１】
アンタゴニストについてアッセイするために、リガンド又はレセプターポリペプチドは、特定の活性に関しスクリーニングされる化合物と共に細胞に添加され、リガンド又はレセプターポリペプチドの存在下において、対象の活性を阻害する化合物の能力は、該化合物がリガンド又はレセプターポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、リガンド又はレセプターポリペプチド及び潜在的アンタゴニストと、膜結合ポリペプチドレセプター又は組換体レセプターを競合阻害アッセイにとって適当な条件下で組合わせることによって検出される。リガンド又はレセプターポリペプチドは、レセプターに結合するポリペプチド分子の数が潜在的アンタゴニストの有効性を決定するために用いられ得るように、放射活性などによって標識することが可能である。
レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに暴露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１０２】
他に代わるアプローチとして、標識されたリガンドポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物にフォトアフィニティー結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
【０１０３】
ＩＶ．製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤はＴＡＬＬ−１アンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニスト又はＴＡＣＩアゴニスト又はＢＣＭＡアゴニストである。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器を更に具備する。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。本明細書で引用した全ての文献を、出典明示によりここに取り込む。
【０１０４】
実施例１
ＴＡＬＬ−１リガンドに対するレセプターであるＴＡＣＩの同定及び発現クローニング
「ＡＰ−ＴＡＬＬ−１」と名付けたキメラタンパク質は、Ｆｉｇ．３中に示される１３６−２８５アミノ酸から成るＴＡＬＬ−１ポリペプチドのＮ末端に融合したヒト胎盤アルカリホスファターゼを用いて調製された。ＡＰは、ｐＡＰｔａｇ−５を鋳型として用いた、ＰＣＲ増幅によって得られ、発現ベクター、ｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇ（Sigma）中へ、ＴＡＬＬ−１のＮ末端において融合させ、クローン化した。ＡＰ−ＴＡＬＬ−１は一過的に形質移入され（リポフェクタミン試薬；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）中で発現された。ＡＰ−ＴＮＦ−α（Pennica等, 後掲）も同様に調製された。また、ＡＰ−ＥＤＡ（ＥＤＡのアミノ酸２４１−３９１を含む；Proc.Natl.Acad.Sci, 94:13069-13074(1997)）も同様に調製された。形質移入された２９３細胞からの条件培地は濾過され（０．４５ミクロン）、20 mM Hepes (pH7.0)及び1 mM アジ化ナトリウムを含むバッファー中、４℃で保存され、引き続く細胞染色手段のために用いられた。
さらに、ＴＡＬＬ−１のＮ端Ｆｌａｇタグ化形態はｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇベクターに構築された。このＦｌａｇタグ化ＴＡＬＬ−１の３量体化を促進するために、ロイシンジッパー配列［Science, 262:1401-1407(1993)］の３量体がＦｌａｇタグとＴＡＬＬ−１（Ｆｉｇ．３のアミノ酸１３６-２８５から成る）の間に挿入され、この構築物は「Ｆｌａｇ-ＬＺＰ-ＴＡＬＬ−１」と称した。Ｆｌａｇ−ＬＺＰ−ＴＡＬＬ−１はＭ２-アガロースゲル（Sigma）を用いて、Ｆｌａｇ−ＬＺＰ−ＴＡＬＬ−１発現プラスミドを形質移入した２９３細胞の無血清培地から精製した。
高いレベルのＴＡＬＬ−１結合活性を示すことが明らかにされているＩＭ−９細胞（ＡＴＣＣ）に対して、コントロールのＡＰ条件培地ではなく、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１の条件培地が適用された場合、ＡＰの反応性は容易に検出される（データは示さず）。また、精製されたＦｌａｇ−ＬＺＰ−ＴＡＬＬ−１もＦＡＣＳ分析によって決定されるように、ＩＭ−９細胞に結合した（データは示さず）。重要なことに、ＩＭ−９細胞に対するＡＰ−ＴＡＬＬ−１の結合は、精製されたＦｌａｇ−ＬＺＰ−ＴＡＬＬ−１とのプレインキュベーションによってブロックされ、精製されたＴＮＦ−α[基本的にはPennica等, Nature, 312:724-729(1984)に記載されるように、調製した]ではブロックされなかったが、このことは、ＴＡＬＬ−１の両方の形態が機能的であって、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１及びＦｌａｇ−ＬＺＰ−ＴＡＬＬ−１のＩＭ−９細胞に対するそれぞれの結合は特異的であったことを示唆する。
【０１０５】
ＴＡＬＬ−１に対するレセプターを同定するために、ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ｐＲＫ５ベクター（EP307,247, 1989年3月15日発行）中にＩＭ−９細胞由来のポリＡ＋ｍＲＮＡを用いて構築された[Flanagan等、Cell, 63:185(1990)]。ライブラリー由来の−１０００ｃＤＮＡクローン（Miniprep DNA(Qiagen)）は、６ウェルプレート中のＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ）へ形質移入され（リポフェクチンを用いて）、３６−４８時間後、次に、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１条件培地と共にインキュベートされ、洗浄され、ＡＰ活性についてインサイツで染色された。ポジティブプールは、引き続きより小さなサイズへ分類された。３回のスクリーニングの後、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１結合活性コードする単一のｃＤＮＡが同定された。ｃＤＮＡ挿入物の配列決定により、２６５アミノ酸のタンパク質をコードすることが予想される単一のオープンリーディングフレームが明らかになった。Ｆｉｇ．１に示されるＴＡＣＩ配列（Ｆｉｇ．６において「ｈＴＡＣＩ」と称される）と並べて比較した場合、この２６５アミノ酸ポリペプチド（Ｆｉｇ．６において「ｈＴＡＣＩ（２６５）」と称される）は、高いパーセンテージの同一性を、特にＥＣＤにおいて明らかにした。これら２つのＴＡＣＩ配列のアライメントは、Ｆｉｇ．６に示される。ＴＡＣＩの２６５アミノ酸の形態は、Ｆｉｇ．１に示されるＴＡＣＩ配列のスプライシングされた形態であると考えられる。
インヴィトロアッセイにおいて、ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ）は、１２ウェルプレートに形質移入の２４時間前に播かれた。その後、細胞は、１マイクログラムのＴＡＣＩ（上述のヒトＴＡＣＩの２６５アミノ酸形態で、後述のようにｐＲＫ５Ｂにクローン化された）又はベクタープラスミド（ｐＲＫ５Ｂ）のみで形質転換された。形質移入後１８−２４時間、細胞はＡＰ−ＴＡＬＬ−１；ＡＰ−ＴＮＦ−α；又はＡＰ−ＥＤＡを含む条件培地で、１時間室温にてインキュベートし、Tartaglia等, Cell, 83:1263-1271(1995)中に記載されるように、ＡＰ活性についてインサイツで染色された。
Ｆｉｇ．７に示されるように、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１は、ＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｆｉｇ．７Ｂ）又はＡＰ−ＥＤＡ（Ｆｉｇ．７Ｃ）とは異なり、ＴＡＣＩで形質転換されたＣＯＳ７細胞に結合することが見いだされた。ＡＰ−ＴＡＬＬ−１は、プラスミドのみで形質移入された細胞は染色しなかった（Ｆｉｇ．７Ｄ）ＴＡＣＩで形質転換されたＣＯＳ７細胞に結合するＡＰ−ＴＡＬＬ−１は、ＴＡＬＬ−１のＦｌａｇタグ形態によって有効にブロックされたが、ＬＩＧＨＴ{Mauri等, 上掲）又は他のＴＮＦホモログにはブロックされなかった（データは示さず）。
【０１０６】
実施例２
ＴＡＣＩ−ＩｇＧ及びＢＣＭＡ−ＩｇＧに対するＴＡＬＬ-１又はＡＰＲＩＬの結合
Ｆｌａｇタグ化リガンドは以下のように調製した。ＬＩＧＨＴの８２−２４０アミノ酸（Mauri 等, Immunity, 8:21-30 (1998)）は、Ｆｌａｇシグナルのアミノ酸１−２７とＬＩＧＨＴ配列の上流のタグ配列を融合するためにＮｏｔＩ部位を用いてｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇ（Sigma）へサブクローニングされた。ＡＰＲＩＬのアミノ酸１０５−２５０（Ｆｉｇ．４を参照）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が用いられたこと以外、同様にｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇ（Sigma）へクローン化され、結果的にＦｌａｇシグナルのアミノ酸１−２４とタグ配列との融合体が生じた。ＴＡＬＬ−１のアミノ酸１２４−２８５（Ｆｉｇ．３を参照）は、Ｆｌａｇ−ＬＩＧＨＴについて上述されたように、Ｆｌａｇシグナルのアミノ酸１−２７とタグ配列を融合させた。ＡＰ−ＡＰＲＩＬは、ＡＰＲＩＬのアミノ酸１０５−２５０（Ｆｉｇ．４参照）をヒト胎盤アルカリホスファターゼをコードするｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇベクター中へ、ＡＰＲＩＬコード化配列がＣ末端でＡＰと融合するようにクローニングすることによって調製され、一方、ＡＰはＦｌａｇとＣ末端で融合させた。ＡＰ−ＴＡＬＬ−１は、ＴＡＬＬ−１のアミノ酸１３５−２８５（Ｆｉｇ．３参照）をｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇ、ＡＰベクター中へ、ＡＰ−ＡＰＲＩＬに関し上述したようにクローニングすることによって調製された。次に、それぞれのタグ化されたタンパク質は、２９３細胞又はＣＨＯ細胞中で発現させ、Ｍ２抗Ｆｌａｇレジン（Sigma）を用いて精製した。
精製したヒト又はＦｌａｇ−ＬＩＧＨＴ（コントロール）、Ｆｌａｇ−ＡＰＲＩＬ、又はＦｌａｇ−ＴＡＬＬ−１、又はＦｌａｇ−ＡＰ−ＡＰＲＩＬ又はＦｌａｇ−ＡＰ−ＴＡＬＬ−１の１μgは、ＤｃＲ３（コントロール；Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)）、又はＴＡＣＩ又はＢＣＭＡのＥＣＤのＩｇＧ−Ｆｃ融合体を含む精製したヒトイムノアドヘシンの１μgと一晩、４℃で２組づつインキュベートした。ＴＡＣＩ−ＥＣＤ．ｈＦｃイムノアドヘシンは、Ashkenazi等, Proc.Natl.Acad.Sci., 88:10535-10539(1991)中に記載れた方法によって調整された。このイムノアドヘシンの構築物は、ヒトＴＡＣＩポリペプチド（Ｆｉｇ．１を参照）のアミノ酸２−１６６から構成された。ＴＡＣＩ−ＥＣＤ構築物は、異種結合性シグナル配列（ｐＣＭＶ−１ Ｆｌａｇ（Sigma）のプレプロトリプシンアミノ酸１−１７）を用い、ＴＡＣＩ配列の下流にヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域をコードするようにＣＨＯ細胞で発現され、次いで、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ＢＣＭＡ−ＥＣＤイムノアドヘシンは、Ashkenazi等、上掲中に記載され方法によって調製された。イムノアドヘシン構築物は、ヒトＢＣＭＡポリペプチドのアミノ酸５−５１から構成された（Ｆｉｇ．２を参照）。ＢＣＭＡ−ＥＣＤ構築物は、異種結合性シグナル配列（ｐＣＭＶ−１  Ｆｌａｇ（Sigma）のプレプロトリプシンアミノ酸１−１７）を用い、ＢＣＭＡ配列の下流にヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域をコードするようにＣＨＯ細胞で発現され、次いで、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。
【０１０７】
反応物の１セット（Ｆｉｇ．８；パネルＡ−Ｃ）は、プロテインＡ−アガロース（Repligen）に結合させたレセプター−イムノアドヘシンにより免疫沈降を行った。反応物の第２のセット（Ｆｉｇ．８；パネルＤ−Ｆ）は、抗ＦｌａｇｍＡＢ−Ｍ２アガロース（Sigma）に結合させたＦｌａｇタグ化リガンドにより免疫沈降を行った。反応物の第２のセット（Ｆｉｇ．８；パネルＤ−Ｆ）は、抗Ｆｌａｇ Ｍ２ ｍＡＢアガロース（Sigma）に結合させたＦｌａｇタグ化リガンドにより免疫沈降させた。次に、免疫沈降物は、Ｆｌａｇタグ化リガンド（Ｆｉｇ．８Ａ−Ｃ）を検出するために西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ＦｌａｇｍＡＢ−Ｍ２アガロース（Sigma）、又はレセプター−イムノアドヘシン（Ｆｉｇ．８Ｄ−Ｆ）を検出するために西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧｐＡｂ（Amersham）を用いてウェスタンブロットにより分析された。
データは、Ｆｌａｇ−ＬＩＧＨＴがＤｃＲ３-ＩｇＧに結合したが、ＴＡＣＩ−ＩｇＧ又はＢＣＭＡ−ＩｇＧには結合しないことを示す。Ｆｌａｇ−ＡＰＲＩＬ及びＦｌａｇ−ＡＰ−ＡＰＲＩＬが、ＴＡＣＩ−ＩｇＧ及びＢＣＭＡ−ＩｇＧには結合したが、ＤｃＲ３−ＩｇＧには結合しなかった。同様に、Ｆｌａｇ−ＴＡＬＬ−１及びＦｌａｇ−ＡＰ−ＴＡＬＬ−１はＴＡＣＩ−ＩｇＧ及びＢＣＭＡ−ＩｇＧには結合したが、ＤｃＲ３−ＩｇＧには結合しなかった。これらのアッセイ結果は、ＡＰＲＩＬ及びＴＡＬＬ−１が各々ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡに特異的で安定な様式で結合し得ることを示した。
同様に行われた同時免疫沈降アッセイにおいて、ＴＡＣＩ−Ｆｃ（実施例２において記述）、ＨＶＥＭ−Ｆｃ（Montgomery等, 上掲）；ＤＲ３−Ｆｃ（Chinnaiyan等, Science, 274:990(1996);Marsters等, Curr.Biol., 6:1669(1996)）；又はＤＲ６−Ｆｃ（Pan等, FEBS Letters, 431:351-356(1998)）（１μg/ml）は、Ｆｌａｇ−ＴＡＬＬ−１（１μg/ml；実施例２において記述されるように調製された）と共にインキュベートされた。反応物の１セットは、プロテインＡ アガロースとのレセプター−Ｆｃ融合体により免疫沈降を行った；反応物の第２のセットは、抗Ｆｌａｇ抗体に結合させたリガンドにより免疫沈降を行った。このサンプルは、上述のようにウェスタンブロットにより分析された。Ｆｌａｇ−ＴＡＬＬ−１は抗Ｆｃ同時免疫沈降物中において、ＨＶＥＭ、ＤＲ３、ＤＲ６のＦｃ融合構築物により検出されなかった（Ｆｉｇ．８Ｇ）。逆に、ＴＡＣＩ−Ｆｃは、抗Ｆｌａｇ同時免疫沈降物中において、ＨＶＥＭ−Ｆｃ、ＤＲ３−Ｆｃ、ＤＲ６−Ｆｃにより検出されなかった（Ｆｉｇ．８Ｈ）。
ＴＡＣＩがＴＮＦファミリーリガンドの他のメンバーに対してレセプターとして役目を果たし得るが否かを決定するために、更なるアッセイが行われた。ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ）が、ＴＮＦファミリーの様々なリガンドの膜形態で、一過的に形質移入（リポフェクタミン試薬を使用）された。テストされたリガンドの中には、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＬＬ−１、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＴ−α、ＯＸ−４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが存在した。
【０１０８】
ヒトＴＮＦ−αはｐＲＫ５Ｂベクター（ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280(1991)を参照のこと）中にクローン化された。細胞表面上におけるＴＮＦ−αの発現の検出のために、Ｆｌａｇタグがアミノ酸７０とアミノ酸７１の間に挿入された（Pennica等, 上掲中での配列に従って番号付けを用いる）。ＴＡＬＬ−１（ａａ７５−２８５；Ｆｉｇ．３を参照）、４−１ＢＢＬ（ａａ５９−２５４；Goodwin等, Eur.J.Immunol., 23:2631-2641(1993)）、ＣＤ２７リガンド（ａａ４０−１９３；Goodwin等, Cell, 73:447-456(1993)）、ＣＤ３０リガンド（ａａ６１−２３４；Smith等, Cell, 73:1349-1360(1993)、ＲＡＮＫＬ（ａａ７１−３１７；ＷＯ９８／２８４２６）、Ａｐｏ２リガンド（ａａ４０−２８１；ＷＯ９７／２５４２８）又はＡｐｏ−３Ｌ（ａａ４６−２４９；ＷＯ９９／１９４９０を参照）の細胞外領域は、各々ＢａｍＨＩ部位にクローン化させた。この結果、ＴＮＦ−α由来の細胞内及び膜貫通領域と種々のリガンド由来の細胞外領域とのキメラリガンドが生じた。ＡＰＲＩＬ（Ｆｉｇ．４参照）及びＥＤＡ（Srivastava等, 上掲）に対しては、タグを持たない全長ｃＤＮＡクローンが用いられた
続いて、形質移入されたＣＯＳ７細胞はＴＡＣＩ．ＥＣＤ．ｈＦＣイムノアドヘシン（上述のように調製された）と共にインキュベートされた。細胞は、ＴＡＣＩ  ＥＣＤ−ＩｇＧ（又はAshkenazi等, Proc.Natl.Acad.Sci., 88:10535-10539(1991)中に記載されているように調製されたＴＮＦＲ１−ＩｇＧ構築物）１μg/mlでＰＢＳ中、１時間インキュベートした。次に、細胞はＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞染色は、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体（Jackson Labs, 1:200希釈にて）と共にインキュベーションした後、Ｃｙ３−ストレプタビジン（Jackson Labs, 1:200希釈にて）とインキュベートして視覚化させた。
ＢＣＭＡの潜在的なリガンドを同定するために、ＴＡＣＩに対して上述したのと同様の結合実験が行われた。ＢＣＭＡ．ＥＣＤ．ｈＦＣイムノアドヘシンが上述したように調製された。
ＴＡＣＩと同様に、ＢＣＭＡのみがＡＰＲＩＬ及びＴＡＬＬ−１と相互作用した。Ｆｉｇ．９Ａに示されるように、ＴＡＣＩ−ｈＦｃ及びＢＣＭＡ−ｈＦｃはＴＡＬＬ−１又はＡｐｒｉｌで形質移入された細胞に結合し、ＴＮＦ−αで形質移入された細胞には結合しなかった。逆に、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１又はＡＰ−ＡＰＲＩＬはＴＡＣＩ又はＢＣＭＡで形質移入された細胞に特異的に結合した（Ｆｉｇ．９Ｂ）。
【０１０９】
実施例３
ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬによるＩｇＭ生産の誘導及びＴＡＣＩ−ＩｇＧ及びＢＣＭＡ−ＩｇＧによる誘導の阻害
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、製造者の指示に従ってフィコール濃度勾配で単離された（ＬＳＭ培地、ICN/Cappel, OH）。次に、末梢血白血球（ＰＢＬ）は、可塑性接着細胞の標準的な除去法を使用することによりＰＢＭＣから得た。ＰＢＬｓが４８ウェルディッシュ（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地０．３ｍｌ中に３ｘ１０４細胞／ウェル）にプレートされ、３７℃、５％ＣＯ２、ＰＢＳ（コントロール）、又はＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ、コントロール、R & D Systems, Minneapolis, MN）、又はＦｌａｇ−ＴＡＬＬ−１（前述の実施例２中に記載されたように）（１μg/ml）と共に７２時間、インキュベートされた。阻害分析については、細胞は上述の各々と２０μg/mlのＴＡＣＩ−ＩｇＧ又はＢＣＭＡ−ＩｇＧ（上述の実施例２に記載されたように調製された）、又はアイソタイプの一致したイムノアドヘシンコントロールと組み合わせてインキュベートされた。細胞上清が集められ、製造者の指示に従いＩｇＭエライザキット（Bethyl Laboratories, TX）を用いてＩｇＭレベルについて分析された。
結果はＦｉｇ．１０に示してある。ポジティブコントロールとして用いられたＩＬ−４はコントロールＰＢＳと比較してＩｇＭの生産を誘導した。ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬは少なくともＩＬ−４と同程度のＩｇＭの生産を誘導した。ＴＡＬＬ−１とＡＰＲＩＬとの組合せは、各リガンド単独に比べてＩｇＭの更なる誘導を示さなかった。ＴＡＣＩ−ＩｇＧはＩＬ−４の効果をブロックしなかったが、ＴＡＬＬ−１及び／又はＡＰＲＩＬの効果を完全にブロックした。
ＢＣＭＡ−ＩｇＧはＩＬ−４の効果をブロックしなかったが、ＴＡＬＬ−１及び／又はＡＰＲＩＬの効果を完全ではないが、実質的にブロックした。コントロールのイムノアドヘシンは、いずれのリガンドもブロックしなかった。これらの結果は、ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬがＰＢＬ中でＩｇＭの生産を誘導し得ることを示す。さらに、データは、ＴＡＣＩ−ＩｇＧ及びＢＣＭＡ−ＩｇＧが、ＩｇＭの生産に対するＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの効果をブロックし得ることを示し、このことは各リガンドに結合するそれら各々の能力を実証し、標的細胞上のリガンドの活性をブロックするそれら各々の能力を明らかにする。
【０１１０】
実施例４
ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬとＴＡＣＩ及び／又はＢＣＭＡ間の相互作用の結果ＮＦ−ｋＢの活性化に至る
２９３細胞（ＡＴＣＣ）は形質移入の２４時間前に１ｘ１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレート中へ播かれ、０．２５μgのＥＬＡＭ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、２５ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ（Promega）、及び指示された量の各発現コンストラクトで形質移入された（Ｆｉｇ．１１参照）。形質移入されるＤＮＡの全量は、空のｐＲＫ５Ｂベクターの補充により１ｍｇで一定に保たれた（実施例２を参照）。幾つかのアッセイウェル中、Ｆｌａｇタグリガンド（実施例２において記載されたように調製された）は、指示された濃度で形質移入４時間後に添加された。他のアッセイウェル中、細胞は全長ＴＡＬＬ−１（Ｆｉｇ．３）又はＲＡＮＫＬ（ＷＯ９８／２８４２６）で同時形質移入された。細胞は形質移入２０−２４時間後に回収され、レポーター遺伝子活性は、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega）で決定された。
ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡは低いレベル（０．１ｎｇなど）でのみ発現されたとき、ＮＦ−ｋＢの最小の活性のみが認められた。しかしながら、ＮＦ−ｋＢの活性化は、Ｆｌａｇ−ＴＡＬＬ−１又はＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬのどちらかの添加により（Ｆｉｇ．１１Ａ）、又はＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの同時形質移入により（Ｆｉｇ．１１Ｂ；１１Ｃ）著しく増大された。
形質移入されていないＩＭ−９細胞のＦｌａｇ−ＴＡＬＬ−１による処理も、結果的にＮＦ−ｋＢの活性化に至らしめた（Ｆｉｇ．１１Ｄを参照）。ＩＭ−９細胞（ＡＴＣＣ）はＦｌａｇ−ＴＡＬＬ−１（０．３μg/ml）又はＰＢＳ単独又は２０μg/mlのＴＡＣＩ−ＩｇＧ又はＴＮＦＲ１−ＩｇＧ（実施例２における記載のように調製された）と組み合わせて、インキュベートされた。ＮＦ−ｋＢ活性は、Montgomery等,Cell, 87:427-436(1996);Marsters等, J.Biol.Chem., 272:14029(1997);Chinnaiyan等, Science, 247:990(1996);Marsters等, Curr.Biol., 6:1669(1996);Pan等, FEBS Letters, 431:351(1998)中に記載されているように電気泳動によるモビリティーシフトアッセイによって測定された。
データは、ＴＡＬＬ−１／ＡＰＲＩＬ−ＴＡＣＩ／ＢＣＭＡ相互作用の一つの生理学的結果が、ＮＦ−ｋＢ経路の活性化であることを示す。
【０１１１】
実施例５
胚中心形成の阻害及びＴＡＣＩ−ＩｇＧ又はＢＣＭＡ−ＩｇＧで処理し、免疫化したマウスにおける抗体の生産
インヴィボのアッセイは、ＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ又はＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用のブロックが体液の免疫反応を減じるかどうかを決定するために実施された。６−８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの３グループは、腹腔内（ｉ．ｐ．）にミョウバン(４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル)中で沈殿させた１００μgのアセチル基−結合チキンガンマグロブリン（ＮＰ２３−ＣｇＧ）（Biosource Technologies）で免疫された。動物集団は、１４日間、毎日、１００μｌの生理食塩水中、ｉ．ｐ．インジェクションによって５０μgのＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｆｃ（実施例２中で記載されるように調製された）で処理された（及びコントロールの動物は１００mｌの生理食塩水で処理された）。
１４日後、マウスの血清がＮＰ特異的ＩｇＭ、低親和性ＩｇＧ１、高親和性ＩｇＧ１について、標準的なエライザ法を用いて分析された。ＮＰ特異的ＩｇＧ1、高親和性抗体及び全（高及び低親和性）抗体の両方が、ＮＰ２．５及びＮＰ２３結合ウシ血清アルブミンの各々によってコートされたウェル中でエライザにより定量された。結合した抗体はＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ又はＩｇＧ１（Pharmingen）を用いて検出された。
結果はＦｉｇ．１２に示してある。ＴＡＣＩ−Ｆｃ及びＢＣＭＡ−Ｆｃは、コントロール（Ｆｉｇ．１２Ａ）と比べるとＮＰ特異的ＩｇＭ抗体の生産を実質的に阻害し、このことは、ＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用（及びＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ及びＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ相互作用）がＩｇＭの分泌へと導くＢ細胞の活性化の初期の段階で重要であることを示す。同様に、ＴＡＣＩ−Ｆｃ及びＢＣＭＡ−Ｆｃが低及び高親和性ＮＰ特異的ＩｇＧ１応答を阻害し（Ｆｉｇ．１２Ｂ、Ｃ）、このことはＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用（及びＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ及びＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ相互作用）は、Ｉｇクラススイッチング及び親和性成熟に関しても重要であることを示唆する。
抗原特異的抗体応答の初期の期間、Ｂ細胞は抗体形成細胞（ＡＦＣ）へと分化する。これは、濾胞外動脈周囲リンパ組織鞘（ＰＡＬＳ）で構成される脾臓の濾胞外領域で生じ[Gray等、Immunology, 65:73(1988)；NacLennan, Ann.Rev.Immunol., 12:117(1988)]、そこでは、引き続きＩｇクラススイッチングが起こる。ＰＡＬＳ関連領域が、コントロール、ＴＡＣＩ−Ｆｃ、又はＢＣＭＡ−Ｆｃを用いて１０日間処理されたＮＰ２３ＣｇＧ免疫化マウスの脾臓において、上述と同様にして比較された。次いで、種々の脾臓切片の免疫組織化学的分析が実施された。免疫後１０日に調製され、ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ１で染色された脾臓切片は、Ｆｉｇ．１３−１（パネルＡ）及びＦｉｇ．１３−２（パネルＡ）中に示されている。予想通り、コントロールのマウスは、抗ＩｇＧ１で強く染色され、多くの免疫芽細胞様細胞を包含した数多くのクラスター化したＡＦＣのフォーカスを示した（Ｆｉｇ．１３−１、パネルＡ、左）。これに対し、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理したマウスは、ほんの僅かな、分離した、ＩｇＧ１ポジティブ細胞をＡＦＣフォーカスを形成しない状態で示した（Ｆｉｇ．１３−１、パネルＡ、右）。同様に、ＢＣＭＡ−Ｆｃ処理したマウスは、ほんの僅かな、分離した、ＩｇＧ１ポジティブ細胞をＡＦＣフォーカスを形成しない状態で示した（Ｆｉｇ．１３−２、パネルＡ）。従って、ＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ（及びＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ及びＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ）の相互作用は、脾臓のＰＡＬＳ関連領域におけるＩｇクラススイッチングに先行するＢ細胞の濾胞外分化にとって重要である。
【０１１２】
抗体の親和性成熟におけるＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用の潜在的な役割を研究するために、胚中心（ＧＣ）の形成がＮＰ２３−ＣｇＧで免疫化されたマウスの脾臓において１４日目に検査された。脾臓切片が免疫化後１４日で調製され、ＦＩＴＣ結合抗ＰＮＡ（緑色蛍光）及びテキサスレッド結合抗ＩｇＭ（赤色蛍光）で染色された。予想したように、コントロールからの脾臓の濾胞は、ＧＣのＢ細胞に特異的に結合するレクチンである、ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）による強い染色を示した（Ｆｉｇ．１３−１、パネルＢ、左）。明らかな対照をなして、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスからの脾臓の濾胞はＧＣｓを欠いており、ほんの僅かな、分離した、ＰＮＡ染色細胞を示した（Ｆｉｇ．１３−１、パネルＢ、右）。また、ＢＣＭＡ−Ｆｃ処理マウスからの脾臓の濾胞も、ＧＣを欠いており、ほんの僅かな、分離した、ＰＮＡ染色細胞を示した（Ｆｉｇ．１３−２、パネルＢ）。
ＧＣの欠如にも拘わらず、１４日目の脾臓切片のヘマトキシン−エノシン染色により判断する限り、ＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｆｃ処理マウスの脾臓の濾胞構造中には、異常性は認められなかった（Ｆｉｇ．１３−１パネルＣ、左（コントロール）及びパネルＣ、右（ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理）；及びＦｉｇ．１３−１パネルＣ（ＢＣＭＡ−１処理）。この結果は、ＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｆｃ処理マウスにおいて、幾つかのＢ細胞はＡＦＣに分化できるが、ＧＣの形成を続けることはできないことを示唆する。従って、ＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用（並びにＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ及びＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ相互作用）は、適切なＧＣ形成に重要である。
【０１１３】
初期免疫期間中のマウスにおけるＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用（又はＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ又はＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ相互作用）のブロックキングは、以下のＢ細胞応答の幾つかの局面を阻害した：（ａ）抗原特異的ＩｇＭ生産へと誘導する濾胞外Ｂ細胞の活性化の初期段階；（ｂ）Ｉｇクラススイッチングへと誘導するＢ細胞の分化；（ｃ）親和性成熟が起こり、メモリＢ細胞が生じる、脾臓ＧＣ形成。一方、ＧＣ形成はＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｆｃによって完全にブロックされたが、いくらかの残存したＩｇＭ及びＩｇＧ１生産及び親和性成熟が生じた。ＧＣが存在しないにも拘わらず、減少した抗体反応が進行することは、他のシステムにおいても認められている[例えば、Matsumoto等, Nature, 382:462(1996)；Kato等, J.Immunol., 160:4788(1998)；Futtere等, Immunity, 9:59(1998)を参照のこと。ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ及びＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ以外の他の因子が残存した抗体生産を媒介することはあり得る。あるいは、インヴィボにおける選択されたＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｆｃ処理が、全てのＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ、ＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ又はＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ結合現象を妨げるためには十分ではなかったのかもしれない。これまでの研究において、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０[Foy等, Ann.Rev.Immunol., 14:591(1996)]及びＣＤ８６−ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４[Han等, J.Immunol., 155:556(1995)；Lenschow等, Ann.Rev.Immuno., 14:233(1996)]相互作用は、濾胞外Ｂ細胞のＧＣ領域へのエントリー及びＧＣの確立にとって重要である。遺伝子破壊又はブロッキング抗体もしくはレセプター−Ｆｃ融合体によってこれらの相互作用を阻害すると、抗体生産を減少させ、ＧＣ形成をブロックする[Lane等, J.Exp.Med., 179:819(1994)；Durie等, Immunol. Today, 15:406(1994)；Hathcock等, Science, 262:905(1993)；Linsey等, Science, 257:7992(1992)；Renshaw等, J.Exp.Med.,180:1889(1994)；Xu等, Immunity, 1:423(1994)；Kawabe等, Immunity, 1:167(1994)；Foy等, J.Exp.Med., 180:157(1994)]。ＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ、ＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡとＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０システムの間には著しい類似性が認められる：両リガンドはＴＮＦに関連し、活性化されたＴ細胞上で発現され、両レセプターはＮＦ−ｋＢを刺激するＴＮＦＲホモログであってＢ細胞上で発現される。従って、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬとＴＡＣＩ又はＢＣＭＡとの相互作用は、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４０と同様にＢ細胞に対するＴ細胞のヘルプを媒介するようでもある。また、ＴＡＬＬ−１は、ＴＡＬＬ−１リガンドを発現させる、樹状細胞によるＢ細胞の活性化に貢献するかもしれない。減少したＩｇＧ応答を示すが減少したＩｇＭ応答は示さないＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４０とは異なり、及びハイパー−ＩｇＭ症候群のＣＤ４０Ｌ−欠損患者とは異なり[Callard等, Immunol.Today, 14:559(1993)；Allen等, Science, 259:990(1993)；Aruffo等, Cell, 72:291(1993)]、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理又はＢＣＭＡ−Ｆｃ処理マウスはＩｇＭ及びＩｇＧ両方の生産において著しい欠損を示した。従って、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ及びＴＡＣＩ又はＢＣＭＡは、それらの妨害により体液反応の全ての相が損なわれるため、Ｂ細胞活性化の初期に作用する可能性がある。これに対し、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４０は、それらの妨害により抗体反応の後期過程のみが損な��れるため、Ｂ細胞活性化の後期に作用するのかもしれない。
【０１１４】
実施例６
抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体の調製
1.0μgのＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬ（Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MTから購入したMPL-TDMアジュバントで希釈)を、各々の後足のパッド部分に、１０回注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫化した。免疫化は、一連の６回のインジェクションで構成された（１インジェクション／週で６週間）。その後、動物は２ヶ月間休ませ、引き続き免疫インジェクションが週に１回、４週間行われた。Ｆｌａｇタグ化ＡＰＲＩＬ融合タンパク質は、前述の実施例２に示すように調製され、抗ＦｌａｇＭ２アガロースアフィニティークロマトグラフィー（Sigma）によって精製された。
最終の追加免疫から３日後に、膝窩リンパ節をマウスから取り出し、単細胞懸濁液を、１％のペニシリン-ストレプトマイシンが補われたＤＭＥＭ培地(Biowhitakker Corp.から得たもの)中で調製した。次いで、リンパ節細胞を３５％のポリエチレングリコールを使用してマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１(ATCC CRL 1597)と融合させ、９６穴培養プレートで培養した。融合の結果得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地において選択した。融合から１０日後に、ハイブリドーマ培養の上清は、Ｆｌａｇ−ＡＰＲＩＬタンパク質に結合するモノクローナル抗体の存在をテストするために、エライザによりスクリーニングされた。Ｆｌａｇの部分又は分子に対して結合するモノクローナル抗体を除去するためのネガティブとして、モノクローナル抗体はＦｌａｇタグ化Ａｐｏ−３に対するいずれかの結合についてもスクリーニングされた。
エライザでは、各々のウェルに、50 mM炭酸塩バッファー, pH9.6中、．２５μｇ／ｍｌのＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬ又はＦｌａｇ−Ａｐｏ３の５０μｌ添加して、９６ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Denmark)をコートし、４℃で一晩インキュベートした。次いでプレートを洗浄用バッファー(０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ)で３回洗浄した。次いで、マイクロタイタープレートのウェルを、２．０％のウシ血清アルブミン200μlでブロックし、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄用バッファーで再度３回洗浄した。
洗浄工程に続いて、100μlのハイブリドーマ上清又は様々な濃度のポリクローナル抗血清が指定ウェルに添加された。100μlのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１ミエローマ細胞条件培地を他の指定ウェルにコントロールとして添加した。プレートを振盪装置上で、室温で1時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで３回洗浄した。
次に、アッセイ用バッファー（０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％のチメロサールがＰＢＳ中に入ったもの）で、１：１０００に希釈されたＨＲＰ-結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)の５０μｌを各々のウェルに添加し、プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄用バッファーで３回洗浄し、次いで各々のウェルに50μlの基質(ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質、Kirkegaard &; Perry, Gaithersburg, MD)を添加し、室温で１０分間インキュベートした。50μlのＴＭＢ１−成分終止溶液(ジエチルグリコール、Kirkegaard &; Perry)を各々のウェルに添加して反応を終了させ、４９０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
エライザでポジティブとされた上清は、限界希釈により引き続き２回クローン化された。
Ｆｉｇ．１４Ａに示されるように、３Ｃ６．４．２、５Ｅ８．７．４、５Ｅ１１．１．２及び５Ｇ８．２．２抗体がＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬと結合することが見いだされた。
【０１１５】
実施例７
抗ＡＰＲＩＬ抗体のアイソタイピング
抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体(実施例６を参照)のアイソタイプを、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇ(Fisher Biotech, Pittsburgh, PA)で、マイクロタイタープレートを４℃で一晩かけてコーティングすることにより決定した。非特異的結合を２％ＢＳＡでブロックしたのち、１００μｌのハイブリドーマ培養上清又は０．５μｇ／ｍｌの精製ｍＡｂｓを加えた。プレートを室温で３０分インキュベートしたのち、プレートはＨＲＰ-結合ヤギ抗マウスＩｇと共に室温にて３０分間インキュベートした。プレートに結合したＨＲＰのレベルを、上述のＨＲＰ基質を使用して検出した。
Ｆｉｇ．１４Ｂの表に示すように、抗ＡＰＲＩＬ抗体５Ｅ８．７．４、５Ｇ８．２．２、及び３Ｃ６．４．２がアイソタイプＩｇＧ２ａ抗体であることが明らかになった。抗ＡＰＲＩＬ抗体５Ｅ１１．１．２はアイソタイプＩｇＧ１抗体であることが明らかになった。
【０１１６】
実施例８
抗ＡＰＲＩＬｍＡＢｓのブロッキング活性を明らかにする結合アッセイ
マイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）は、５０μl／ウェルのヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Boehringer Manheim）により炭酸塩バッファー中、５μｇ／ｍｌで、一晩コートされた。次に、プレートはＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、１５０μl／ウェルにより、室温で１時間ブロッキングを行った。各々のイムノアドヘシン、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ又はＴＡＣＩ−ＩｇＧ（実施例２に記載したように調製した）が、ブロックバッファー中５μｇ／ｍｌで５０μl／ウェル体積で添加され、室温で１時間インキュベートされた。全ての抗体（実施例６において記載され、融合体として同定された）は、１：１００に希釈され、２５μl／ウェルが２μｇ／ｍｌ Ｆｌａｇ−ＡＰＲＩＬ（実施例２を参照）の２５μl／ウェルと共にプレートに添加され、室温にて１時間インキュベートされた。シグナルはビオチン化抗Ｆｌａｇ抗体（Sigma Aldrich, Missouri）及びストレプタビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Amersham Life Science, New Jersey）と共に引き続きインキュベートして増幅させた。最初を除く全ての工程は、ＰＢＳ／０．０１％Tween 20による洗浄の段階が先行した。
0005062606.tif 000020
上掲の表に示すように、抗ＡＰＲＩＬ抗体３Ｃ６．４．２は効果的にＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するＡＰＲＩＬ結合をブロックした。本アッセイにおいて、抗体５Ｅ１１．１．２もまたＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対してＡＰＲＩＬＩの部分的なブロックを示した。
【０１１７】
実施例９
競合的結合エライザ
抗ＡＰＲＩＬ抗体、３Ｃ６．４．２、５Ｅ８．７．４、５Ｅ１１．１．２及び５Ｇ８．２．２（上述の実施例中に記述される）が同一の或いは異なるエピトープを認識するのかどうか決定するために、競合的結合エライザがビオチン化抗ＡＰＲＩＬ抗体を用いてJ.Immunol.Methods, 156:9-17(1992)中に記載されるように実施された。抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体はＮ−ヒドロキシサクシンイミドを用いて、J.Immunol.Methods, 156:9-17(1992)中に記載されるようにビオチン化された。マイクロタイターウェルは炭酸塩バッファー、pH9.6中０．５μｇ／ｍｌのＦｌａｇ−ＡＰＲＩＬ（実施例２）、５０μlを用いて４℃にて一晩コートした。洗浄後、非特異的結合部分を２００μlの２％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。洗浄後、至適濃度が既に決定されているビオチン化抗ＡＰＲＩＬ抗体と１００倍過剰量非ラベル化モノクローナル抗体の混合物が各ウェルに添加された。室温にて１時間のインキュベーション後、プレートは洗浄され、ビオチン化抗ＡＰＲＩＬ抗体の量がＨＲＰ−ストレプタビジンを添加することにより決定された。マイクロタイターウェルを洗浄後、結合した酵素が基質の添加により検出され、プレートは、エライザプレートリーダーにより４５０ｎＭで読みとられた。
結果をＦｉｇ．１５に示す。データは、非標識化抗体３Ｃ６．４．２又は５Ｅ１１．１．２が抗体の両ビオチン化形態（Ｂｉｏ−３Ｃ６．４．２、Ｂｉｏ−５Ｅ１１．１．２）の結合を阻害することができるため、抗体３Ｃ６．４．２及び抗体５Ｅ１１．１．２が共有のエピトープを認識することを示す。３Ｃ６．４．２及び５Ｅ１１．１．２の両抗体は、どちらもＢｉｏ−５Ｅ８．７．４及びＢｉｏ−５Ｇ８．２．２の結合をブロックしなかったため、５Ｅ８．７．４及び５Ｇ８．２．２によって認識されるものとは異なるエピトープを認識する。さらに、抗体５Ｅ８．７．４及び５Ｇ８．２．２はそれら自身のビオチン化モノクローナル抗体しかブロックすることができず、他はブロックできなかった。従って、テストされた４つのモノクローナル抗体において、ＡＰＲＩＬの３つの主要なエピトープが検出されたようである。
【０１１８】
実施例１０
マウス関節炎モデルにおけるＴＡＣＩイムノアドヘシンの効果
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおけるインヴィボでのアッセイは、リガンドに対するＴＡＣＩの相互作用を阻害することがＣＩＡの発症を妨げるかどうかを決定するために実施された。
関節リウマチ（ＲＡ）は、複数の関節の滑膜が炎症を起こし、骨及び軟骨を含む関節組織の破壊を導く自己免疫疾患である。ＲＡの滑膜は、実際には高度に炎症を起こしており、典型的にはリンパ球及び単核細胞の浸潤、Ｔ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化、Ｂ細胞イムノグロブリン（Ｉｇ）の分泌及び前炎症サイトカインの生産によって特徴づけられる[Potocnik等, Scand.J.Immunol., 31:213(1990)；Wernick等, Arthritis Rheum., 28:742(1985)；Ridley等, Br.J.Rheumatology, 29:84(1990)；Thomas等, J.Immunol., 152:2613(1994)；Thomas等, J.Immunol., 156:3074(1996)]。慢性炎症滑膜は、通常、大量のＣＤ４Ｔ細胞浸潤を伴う[Pitzalis等, Eur.J.Immunol., 18:1397(1988)；Morimoto等, Am.J.Med., 84:817(1998)]。
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）はヒトのＲＡに対する動物モデルであり、ヒトの疾患に類似し、異種性のタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）で感受性マウスを免疫することにより誘導することができる[Courtenay等, Nature, 283;665(1980)；Cathcart等, Lab.Invest., 54:26(1986)]。ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＩＩに対する抗体は共にＣＩＡの発症に必要である。実験で未使用のマウスに対し抗ＣＩＩを伝達させると、ＣＩＡとは非常に異なる部分的な組織病態のみを誘導し、ＣＩＡの完全な症状が発症しない[Holmdahl等, Agents Action, 19:295(1986)]。これに対して、ＣＩＩ免疫化マウスから実験で未使用のレシピエントへのＣＤ４Ｔ細胞及び抗ＣＩＩ抗体の両方の養子免疫伝達は、古典的ＣＩＡの症状を完全に再構成させる[Seki等, J.Immunol., 148:3093(1992)]。また、ＣＩＡにおけるＴ細胞及び抗体の両方の関与はＣＩＡにおける炎症関節の組織病理学的知見にも一致する。従って、Ｂ細胞又はＴ細胞の機能をブロックし、又はＴ細胞によって誘導される後炎症サイトカインを阻害する薬剤は、関節炎を防ぎ、治療するために効果があるかもしれない。実際に、マウスにおいて、ＣＤ４Ｔ細胞の除去、ＤＣ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の妨害、ＴＮＦ−αの中和、又はＩＬ−１レセプターのブロッキングは、全てＣＩＡの予防を導くことができる[Maini等, Immunol. Rev., 144:195(1995)；Joosten等, Arthritis Rheum., 39:797(1996)；Durie等, Science, 261:1328(1993)]。
【０１１９】
出願人等の研究において、マウスの２集団（７から８週齢のオスＤＢＡ／１マウス（Jackson Laboratory））は、完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）（Difco）中でエマルジョン化した１００μｇウシコラーゲンタイプＩＩ（ＢＣＩＩ）（Sigma Chemical Co.）を用いて皮内に免疫した。続いて、マウスは２１日後に不完全フロイトアジュバント中のＢＣＩＩで再度免疫された。時間経過と共により重篤な形態へと進行する関節炎の臨床的兆候を有する劇的な疾患が該動物において発症した。２４日目での開始において、マウスの１集団は１００μｇのＴＡＣＩ−Ｆｃが腹腔内に週３回、６週間インジェクトされ（Ｎ＝９）、第二集団はコントロール（Ｎ＝１０）として１００μｇのマウスＩｇＧを受容した。ＴＡＣＩ−Ｆｃ構築物は、マウス脾臓ライブラリーからマウスＴＡＣＩｃＤＮＡを増幅させるためにヒトのＴＡＣＩ配列（ここで記述の）に基づくプライマーを用いて調製された。約０．４５ｋｂのＰＣＲ産物がクローン化された。マウスＴＡＣＩの完全なオープンリ−ディングフレームを含むｃＤＮＡクローンは、引き続き同一のライブラリー（GenBank登録番号AF257673）から単離された。マウスＴＡＣＩ−Ｆｃは、マウスＴＡＣＩ（アミノ酸２−１２９）の細胞外ドメインをクローニングすることにより、プロトリプシンシグナル配列及びマウスＩｇＧ１−Ｆｃ配列及びプロトリプシン間に構築され、上述の実施例の記載に従ってイムノアドヘシンが調製された。次に、動物は関節炎の臨床的兆候についてモニターされ、研究の終了時に、以下に記述するように、放射線学的及び組織病理学的検査が実施された。
マウスは、関節炎症の兆候について毎日調査され、以下のようにスコア化された：０，正常；１，紅斑及び足首関節の限定された穏やかな腫脹：２，紅斑及び足首から中足骨／中手骨関節へ拡がった穏やかな腫脹；３，紅斑及び足首から中足指節／中手指節関節へ拡がった中程度の腫脹；４，紅斑及び足首から指に拡がった重篤な腫脹。１足あたりの最大の関節炎スコアは４であり、マウスあたり最大の疾患スコアは１６である；平均の関節炎スコアは、各集団の全ての動物から計算された。
研究の終了時における放射線学的分析のために、X-ray Faxitron Imaging System(Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL)を使用して両前足及び後ろ足のＸ線写真が撮られた。データはデジタル化され、Ｘ線写真の像が作成された。次に、Ｘ線写真は骨の浸食及び軟組織の腫脹について調べられた。組織病理学的分析のために、マウスの足が摘出され、１０％ホルマリンで固定され、石灰質が除去され、パラフィン中に包埋された。関節切片（６−８μｍ）が調製され、標準的な組織化学の手法を用いてヘマトキシリン−エオシンで染色された。関節炎の足の顕微鏡的な評価が、目隠し形式で実施された。足首、中足指節／中手指節、指節間近傍、及び関節における関節炎の変化が関節軟骨及び軟骨下の骨の浸食について調べられた。
【０１２０】
Ｆｉｇ．１６Ａは、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウス（○）、又はコントロールＩｇＧ処理マウスマウス（四角）及び生理食塩水処理マウス（三角）において疾患が生じることを示す。各データ点は、合計９匹（ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理集団）又は１０匹（コントロール集団）からの平均値±ＳＤを表す。ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理集団と他の２集団の各々との間の相違は、統計学的に有意である。コントロール集団のマウスは、、関節炎典型的な臨床的兆候を発症し、約３０日目に始まり、急速に高い非常に関節炎スコアへと進行した（Ｆｉｇ．１６Ａ）。これに対し、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスでは、関節炎の進行は、顕著に阻害された。Ｆｉｇ．１６Ｂは二回目の免疫後３週間の各足の疾患スコアを示す。各データ点は、各足について示す。コントロールとＴＡＣＩ−Ｆｃ処理集団との相違は、統計学的に有意である。ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスにおける関節炎スコアは、僅か１．０にしか達せず、研究の終盤においてのみ生じたが、コントロール集団においては、関節炎スコアが７．０を超えるレベルに達した。これらのデータは、リガンドとのＴＡＣＩの相互作用がＣＩＡの発症に対して重要であることを、明確に示す。
マウスのＴＡＣＩ−Ｆｃ処理が関節の組織病理に対し何らかの影響を及ぼすかどうか決定するために、研究の終了時においてマウスの足についての組織病理学的調査が実施された。研究の終了時点（二回目の免疫後４８日目）において、マウスは堵殺され、足首関節が組織学に関して分析（ＨＥ染色）された。
コントロール集団において、重篤な関節疾患は、指骨間関節において示されるような滑液増殖、大量の白血球浸潤、軟骨関節に生じる羽枝形成、及び骨浸食によって特徴づけられる（Ｆｉｇ．１７Ａ）。Ｆｉｇ．１７Ａは、重篤な滑膜炎、過形成、及び軟骨と骨の破壊の徴候を示すのコントロールマウスの指関節を示す。滑膜肥大、白血球の浸潤、関節軟骨の縮退及び特定の浸食も中手関節に認められた（Ｆｉｇ．１７Ｂ）。Ｆｉｇ．１７Ｂは、滑膜炎又は疾患病理の徴候を示していないＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスの指関節を示す。ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスにおいて、組織病理学的兆候の形跡は存在せず、このことはＴＡＣＩ−ＦｃはＣＩＡの臨床的兆候をブロックするだけでなく、組織病理学的兆候も阻害することを示す（Ｆｉｇ．１７Ｃ、Ｄ）。Ｆｉｇ．１７Ｃは、滑膜炎の顕著な徴候を伴う疾患病理を呈するコントロールマウスの中手骨を示し、Ｆｉｇ．１７Ｄは、疾患病理のないＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスの中手骨関節を示す。
【０１２１】
研究の終了時において、動物の両前及び後足は、Ｘ線撮影及び上述のように骨構造に対する分析も行われた。コンロトール集団において、大量の骨破壊及び損傷が明らかであり、一方ＴＡＣＩ―Ｆｃ処理マウスにおいて、骨の欠損又は損傷の有意な徴候は認められなかった（Ｆｉｇ．１７Ｅ、Ｆ）。Ｆｉｇ．１７Ｅは、大量の骨破壊及び損傷の徴候を示すコントロールマウスからのＸ線写真を示す。Ｆｉｇ．１７Ｆは、骨の欠損又は損傷の有意な徴候を示さないＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスからのＸ線写真を示す。ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスからのＸ線写真を実験未使用のマウスのものと比較した場合；明らかな相違は示されず、このことは、ＴＡＣＩ―Ｆｃ処理が完全に骨及び軟骨障害からマウスを防御したことを示す（データは示さず）。
抗コラーゲン抗体は関節炎の発症に重要な役割を担うと考えられので、マウスのＴＡＣＩ―Ｆｃ処理が結果的に抗コラーゲン体液免疫反応の阻害に至らしめるかどうか決定するために、当該マウスの血清サンプルも分析された。体液免疫反応をテストするために、第二回目の免疫後１４日（Ｆｉｇ．１８Ａ）及び４７日（Ｆｉｇ．１８Ｂ）目に、マウスはレトロオービタル出血が施され、抗コラーゲン抗体の存在について分析された。
抗ＢＣＩＩ ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプの血清レベルは、ＢＣＩＩコラーゲンを抗原に用いてエライザにより測定された。簡単には、マイクロタイタープレートは、１０μｇ／ｍｌの天然ウシＣＩＩでコートされ、ブロッキングされ、連続的に希釈されたテスト血清と共にインキュベートされた。結合したＩｇＧはアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Pharmingen）と共にインキュベーションし、その後基質（ジニトロフェニルホスフェート）によって検出された。光学濃度は、エライザプレートリーダー（Molecular Devices）中、４５０ｎｍで測定された。
結果はＦｉｇ．１８に示される。各データ点は、各集団の５匹のマウスからの平均±ＳＤを示す。コントロール集団のマウスの血清は、抗コラーゲンＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの高いレベルでの存在を示し、一方ＴＡＣＩ―Ｆｃ処理集団においては、抗コラーゲンＩｇＧ及びＩｇＧ２ａの両方の相当量の阻害が、第二回目の免疫後１４日及び４７日目に認められた（Ｆｉｇ．１８Ａ、Ｂ）。Ｆｉｇ．１８Ａは、第二回目の免疫後１４日目の抗コラーゲンＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルを示し、Ｆｉｇ．１８Ｂは、第二回目の免疫後４７日目の抗コラーゲンＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルを示す（白棒、ＢＳＡで処理したマウス；黒棒、ＴＡＣＩ―Ｆｃで処理したマウス）。これらの結果は、少なくとも部分的に、抗コラーゲン抗体をブロックすることにより、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理がＣＩＡの発症を適合させることを示す。
コラーゲン特異的Ｂ及びＴ細胞の両方はＣＩＡを開始させることができるため、ＴＡＣＩ−Ｆｃを介したＣＩＡの予防もＴ細胞エフェクター機能の阻害に関連するかどうかを調べるために、さらにアッセイが行われた。コントロール及びＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスの両方からのリンパ節及び脾臓が、研究の終了時に収集され、コラーゲンに対するＴ細胞のインヴィトロにおけるリコール反応及びエフェクターサイトカインの生産について調べられた。ＢＣＩＩで免疫化されたマウスは第二回目の免疫後４７日目に堵殺され、鼠径リンパ節及び脾臓が収集された。単一細胞の懸濁液が調製され、細胞は９６ウェルプレートにて１ｘ１０６細胞／ｍｌ（２００μl／ウェル）の密度で、５％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｘ１０−５Ｍ ２−ＭＥを含むＤＭＥＭ中で培養された。細胞は培地のみ又は種々の濃度のＢＣＩＩの存在下において培養された。リンパ球の増殖をテストするために（Ｆｉｇ．１８Ｃ）、リンパ節細胞（ウェルあたり１ｘ１０６細胞）が最初に７２時間培養され、次いで１μＣｉの[３Ｈ]チミジン（International Chemical and Nuclear, irvine, CA）が５日目の培養の最後の１８時間添加され、放射活性の取り込みがWalla β- plate couterを用いて液体シンチレーションのカウント（ｃｐｍとして表される）によりアッセイされた。
【０１２２】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウスのコラーゲンに対する増殖性Ｔ細胞反応は、コントロールマウスと比較するとほとんど無視できるものであった（Ｆｉｇ．１８Ｃ；コントロールマウス−四角；ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理マウス−丸）。
サイトカインアッセイのために、リンパ節及び脾臓細胞がＢＣＩＩを含む又は含まない０．２ｍｌの培地中で培養された；１ｘ１０６細胞／ｍｌ（２００μl／ウェル）が上述した培地のみ、又はＢＣＩＩ存在下で培養された。ＩＬ−２の分泌をテストするために、サイトカインの測定にとって視的なインキュベーション時間であることが認められている２４時間後に、及び７２時間後にはＩＦＮ−γの生産をテストするために上清が収集され、分析まで−２０℃にて保存された。ＩＬ―２及びＩＦＮ−γのレベルはPharmingen(San Diego, California)のキットを用い、エライザによって検出された。標準曲線は、マウスの組換体ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを用いて作成した。これらのマウス由来のＴ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの生産が測定される場合、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理集団（Ｆｉｇ．１８Ｄ及び１８Ｅ中、丸で示す）はこれらのサイトカインの生産をほとんど示さず、一方コントロール集団からのＴ細胞（Ｆｉｇ．１８Ｄ及び１８Ｅ中、四角で示す）は、有意なレベルのＩＬ−２及びＩＦＮ−γの両方を分泌した（Ｆｉｇ．１８Ｄ（ＩＬ−２生産）、１８Ｅ（ＩＮＦ−γ生産））
これらのデータは、マウスのＴＡＣＩ−Ｆｃ処理が抗コラーゲン抗体の生産を阻害するだけではなく、エフェクターＴ細胞の機能も制御することを示す。従って、ＴＡＣＩとそのリガンドとの相互作用は、Ｔ細胞媒介免疫反応において重要であるとも考えられる。
また、ＴＡＣＩレセプターはＴ細胞上に発現されることが示され、Ｔ細胞の活性化に関連するＮＦ−ＡＴの活性化に関与するため[von Bulow等, Science, 278:138(1997)]、ＴＡＣＩとそのリガンドとの相互作用をブロックすることが、Ｔ細胞の活性化、及び例えばマウスにおけるＣＩＡの進行等、必要なエフェクターの機能を直接減少させることが考えられる。
【０１２３】
Ｔ細胞の活性化におけるＴＡＣＩの直接的役割を決定するために、Ｔ細胞の抗原特異的活性化のインヴィトロアッセイが行われた。ＴＡＣＩ−Ｆｃの存在下での抗ＣＤ３抗体によるインヴィトロでのＴ細胞の活性化は、増殖及びこれらＴ細胞によるＩＬ−２生産の測定によって調べられた。成体のＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratory）由来の脾臓細胞は、前述の培地中、種々の濃度の１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Pharmingen）と、異なる濃度のＴＡＣＩ−Ｆｃを含む又は含まない条件で培養された。上述したように、増殖は３Ｈチミジンの取り込みにより測定した。また、並行して、上述した２４時間培養システムにおいてＩＬ−２の生産を誘導した抗ＣＤ３抗体の生産に対するＴＡＣＩ−Ｆｃの効果を測定するためにもアッセイがセットアップされた。上清中のＩＬ−２レベルを測定するために、Pharmingenからの抗体及び推奨されるプロトコールを用いてエライザが利用された。ＴＣＲトランスジェニック細胞のインヴィトロにおける刺激に対するＴＡＣＩ−Ｆｃ効果を研究するために、成体ＭＢＰ−ＴＣＲトランスジェニックマウス（Richard Flavell博士、Howard Hughes Medical Institute, Yele Universityより供与された飼育対から生まれた）由来の１ｘ１０６細胞が１０μｇ／ｍｌＭＢＰ−Ａｃ１−１１（最初のアミノ酸がアセチル化されたアミノ酸配列ＡＳＱＫＲＰＳＱＲＳＫ（配列番号：１０）をミエリンベーシックプロテインの合成ＮＨ２末端ペプチド）の存在下において、異なる濃度のＴＡＣＩ−Ｆｃを含む又は含まない条件で、５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中、９６ウェルプレートにて培養された。増殖は、１μＣｉの[３Ｈ]チミジン（International Chemical and Nuclear, irvine, CA）の５日目の培養の最後の１８時間添加により測定され、放射活性の取り込みが液体シンチレーションのカウントによりアッセイされた。
Ｆｉｇ．１９Ａは、ＴＡＣＩ−Ｆｃによる抗ＣＤ１３抗体で誘導される天然Ｔ細胞の増殖の量依存的な阻害を示し、一方Ｆｉｇ．１９Ｂは、量依存的にＴＡＣＩ−Ｆｃによって影響される抗ＣＤ１３抗体で誘導される天然Ｔ細胞によるＩＬ−２の生産を示す。（Ｆｉｇｓ．１９Ａ及び１９Ｂ中において、ＴＡＣＩ−Ｆｃ処理は丸によって示され；コントロール四角によって示される）。
ＴＡＣＩ−Ｆｃの存在下において、インヴィトロでのミエリンベーシックプロテイン（ＭＢＰ）−ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の活性化も、これらのＴ細胞による増殖及びＩＬ−２の生産を測定することによって測定される（上述のように）。再度、ＴＡＣＩ−Ｆｃは用量依存的に、ＭＢＰ−ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞による増殖及びＩＬ−２の生産を阻害した（データは示さず）。これらの結果は、ＴＡＣＩレセプターがＴ細胞の活性化に関与しており、この機能がＴＡＣＩ−Ｆｃでブロックされ得ることを示す。
【０１２４】
実施例１１
マウスＥＡＥモデルにおけるＴＡＣＩイムノアドヘシンの効果
ＥＡＥマウスモデルは、ヒトの多発性硬化症に対するモデルとして文献に記載されている[Grewal等, Science, 273:1864-1867(1996)]。
出願人の研究においては、１０匹のマウス（１０〜１５週齢のオス及びメスのＭＢＰ−ＴＣＲトランスジェニックマウス（実施例１０にて記載））は各々、１００μｌの完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）（Difco）中１０μｇのＭＢＰ Ａｃｌ−１１（上述の実施例１０中にて記載された）を用いて皮下的に免疫された。Ａｃｌ−１１の初期免疫の後、１００μｌの生理食塩水中で２００ｎｇの百日咳毒素（List Biologicals, Campbell, CA）
が、各マウスに２４時間及び４８時間後に腹腔内にインジェクトされた。２日目に開始し２４日目まで、マウスの第１の集団は、１００μｌの滅菌生理食塩水中、１００μｇのＴＡＣＩ−Ｆｃ（実施例１０で記載された）を用いて腹腔内に毎日インジェクトされ、第二の集団は１００μｌの滅菌生理食塩水中、１００μｇのマウスＩｇＧを毎日受容した。その後、動物は、疾患の発症について毎日モニターされた。実験的アレルギー性脳脊髄膜炎（ＥＡＥ）の臨床的兆候は、毎日評価され、確立されたＥＡＥインデックスシステムに基づき１〜５のスコアが各マウスに与えられた：０＝正常な外観；１＝尾のうなだれ（droop）；２＝異常な足取り；３＝足の衰弱；４＝１肢に関する麻痺（部分的な後ろ足の麻痺）；２肢に関する麻痺（後ろ肢全部の麻痺）。これは、Grewal等, 273:1864-1867(1996)中に記述されたものの修正スコアリングシステムである。
結果は、Ｆｉｇ．２０に示される。Ｆｉｇ．２０に示されるデータは、コントロールＩｇＧを受容した動物はＥＡＥの予想された臨床的兆候を発症したことを示す；コントロール処理されたマウスにおいて疾患の発症は、５日目に始まり、１０日以内にピークレベルに達した。これに対し、ＴＡＣＩ−Ｉｇで処理されたマウスは、ＥＡＥ症状の重篤な形態を発症させなかった。疾患スコアはコントロールグループよりもかなり低く、臨床的スコアの２（研究の間、さらに高いスコアには進行しなかった）に達したのみであった。従って、本結果は、ＴＡＣＩ−Ｉｇ処理が明らかなＥＡＥの発症からマウスを防御したことを示唆する。
【０１２５】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, Virginia, USA(ATCC)に寄託した：
0005062606.tif 000021
【０１２６】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ．１】  Ｆｉｇ．１Ａ−１Ｂは、ヒトＴＡＣＩ天然配列（配列番号：１）をコードするポリヌクレオチド配列（逆相補鎖配列は、配列番号：１１中にて提供される）、及びその予想アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【Ｆｉｇ．２】  Ｆｉｇ．２は、ヒトＢＣＭＡ天然配列（配列番号：３）をコードするポリヌクレオチド配列（逆相補鎖配列は、配列番号：１２中にて提供される）、及びその予想アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【Ｆｉｇ．３】  Ｆｉｇ．３は、ヒトＴＡＬＬ−１天然配列（配列番号：５）をコードするポリヌクレオチド配列（逆相補鎖配列は、配列番号：１３中にて提供される）、及びその予想アミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【Ｆｉｇ．４】  Ｆｉｇ．４Ａ−４Ｂは、ヒトＡＰＲＩＬ天然配列（配列番号：７）をコードするポリヌクレオチド配列（逆相補鎖配列は、配列番号：１４中にて提供される）、及びその予想アミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【Ｆｉｇ．５】  Ｆｉｇ．５Ａ−５Ｂは、「比較タンパク質」と表されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と表されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性を計算するための例示的方法を示す。ここでの目的のために、「ＰＲＯ」配列は、各々ここでのＦｉｇ．１、２、３又は４中に示されるＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＬＬ−１、又はＡＰＲＩＬ配列である。
【Ｆｉｇ．６】  Ｆｉｇ．６は、「ｈＴＡＣＩ（２６５）」（配列番号：９）及びスプライシング変異体と考えられ、Ｆｉｇ．１Ａ−１Ｂ（配列番号：２）においても「ｈＴＡＣＩ」として示されるＴＡＣＩレセプターに関する２つのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【Ｆｉｇ．７】  Ｆｉｇ．７Ａ−７Ｄは、ＡＰ活性について染色するインサイツアッセイの結果を示す。ＣＯＳ７細胞がＴＡＣＩ（Ｆｉｇ．７Ａ−７Ｃ）又はプラスミド（Ｆｉｇ．７Ｄ）で形質移入され、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１（Ｆｉｇ．７Ａ、７Ｄ）；ＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｆｉｇ．７Ｂ）；又はＡＰ−ＥＤＡ（Ｆｉｇ．７Ｃ）とインキュベートされた。
【Ｆｉｇ．８】  Ｆｉｇ．８Ａ−８Ｈはウェスタンブロット分析によるＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬとＴＡＣＩ又はＢＣＭＡイムノアドヘシンとの種々の同時免疫沈降アッセイを示し、実施例２中に詳細に記述されている。Ｆｉｇ．８Ａ−８Ｈにおいて、ＴＡＬＬ−１は「Ｂｌｙｓ／ＴＡＬＬ−１」と記されている。
【Ｆｉｇ．９】  Ｆｉｇ．９Ａ−９Ｂは、ＴＡＬＬ−１及びＡＰＲＩＬがＴＡＣＩ及びＢＣＭＡのリガンドであることを実証するための更なる結合アッセイの結果を示す。Ｆｉｇ．９Ａにおいて、ＣＯＳ７細胞はＴＡＬＬ−１（９ａ−９ｃ）；ＡＰＲＩＬ（９ｄ−９ｆ）；ＴＮＦ−α（９ｇ−９ｉ）で形質移入され、ＢＣＭＡ−Ｆｃ（９ａ、９ｄ、及び９ｇ）；ＴＡＣＩ−Ｆｃ（９ｂ、９ｅ及び９ｈ）；又はＴＮＦＲ１−Ｆｃ（９ｃ、９ｆ、及び９ｉ）とインキュベートされた。その後、細胞は洗浄、固定され、Ｆｃタンパク質の結合は、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体、続くＣｙ３−ストレプタビジンによって検出された。Ｆｉｇ．９Ｂにおいて、ＣＯＳ７細胞はＴＡＣＩ（１、２、及び３）；ＢＣＭＡ（４、５、及び６）；又はベクター（７、８、及び９）で形質移入され、ＡＰ−ＴＡＬＬ−１（１、４、及び７）、ＡＰ−ＡＰＲＩＬ（２、５、及び８）又はＡＰ−ＴＮＦ−α（３、６、及び９）とインキュベートされた。その後、細胞は洗浄、固定され、ＡＰ活性に関しインサイツで染色された、Ｆｉｇ．９Ａ−９Ｂにおいて、ＴＡＬＬ−１は「Ｂｌｙｓ／ＴＡＬＬ−１」と記されている。
【Ｆｉｇ．１０】  Ｆｉｇ．１０は、標的ＰＢＬ中のＩｇＭ生産における表示のサイトカイン、リガンド及びレセプターの効果をテストするＩｇＭエライザの結果を示す棒ダイアグラムを表す。
【Ｆｉｇ．１１】  Ｆｉｇ．１１Ａ−１１Ｄは、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬ及びＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ間の相互作用は結果的にＮＦ−ＫＢの活性化を引き起こすことを示すアッセイ結果を表す。Ｆｉｇ．１１Ａにおいて、ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬによるＴＡＣＩ／ＢＣＭＡの刺激がＮＦ−ＫＢの活性化を媒介した。Ｆｉｇ．１１Ｂ及び１１Ｃにおいて、全長ＴＡＬＬ−１又はＡＰＲＩＬの同時形質移入によるＴＡＣＩ／ＢＣＭＡの刺激がＮＦ−ＫＢの活性化を媒介した。Ｆｉｇ．１１Ｄにおいて、電気泳動のモビリティーシフトアッセイで測定されるように、形質移入されていないＩＭ−９細胞のＦｌａｇ−ＴＡＬＬ−１による処理も結果的にＮＦ−ＫＢの活性化を引き起こした。
【Ｆｉｇ．１２】  Ｆｉｇ．１２は、ＮＰ特異的ＩｇＭ、低親和性ＩｇＧ１、及び高親和性ＩｇＧ１産生におけるブロッキングＴＡＬＬ−１／ＴＡＣＩ及びＴＡＬＬ−１／ＢＣＭＡ相互作用の効果をテストするエライザの結果を示す棒ダイアグラムを表す。
【Ｆｉｇ．１３】  Ｆｉｇ．１３−１（パネルＡ、Ｂ及びＣ）及び１３−２（パネルＡ  、Ｂ及びＣ）はＴＡＣＩ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｆｃで処理された免疫化マウス由来の脾臓切片の免疫組織化学的分析を示すが、実施例５にさらに詳細に記述されている。
【Ｆｉｇ．１４】  Ｆｉｇ．１４Ａは、Ｆｌａｇ−ＡＰＲＩＬに対する種々の抗ＡＰＲＩＬ抗体の結合をテストするエライザの結果を示す。Ｆｉｇ．１４Ｂは、アイソタイプ分析を含む、モノクローナル抗体３Ｃ６．４．２；５Ｅ８．７．４；５Ｅ１１．１．２；及び５Ｇ８．２．２、の種々のアッセイ結果を示す表を表す。
【Ｆｉｇ．１５】  Ｆｉｇ．１５Ａ−１５Ｄは、抗ＡＰＲＩＬ抗体３Ｃ６．４．２（「３Ｃ６」）（Ｆｉｇ１５Ａ）；５Ｅ８．７．４（「５Ｅ８」）（Ｆｉｇ１５Ｂ）；５Ｅ１１．１．２（「５Ｅ１１」）（Ｆｉｇ１５Ｃ）；及び５Ｇ８．２．２（「５Ｇ８」）（Ｆｉｇ１５Ｄ）の競合的結合エライザの結果を示す棒ダイアグラムを表すが、実施例９にさらに詳細に記述されている。
【Ｆｉｇ．１６】  Ｆｉｇ．１６Ａ及び１６Ｂは、インヴィボマウスモデルにおけるＴＡＣＩ−Ｆｃによるコラーゲン誘導関節炎の阻害を示すアッセイ結果を表す。関節炎スコアの知見は実施例１０に記載されている。
【Ｆｉｇ．１７】  Ｆｉｇ．１７Ａ−１７Ｆは、ＴＡＣＩ−Ｆｃで処理したＣＩＡマウス又はコントロールの関節の組織化学的及び放射線学的特徴を示す。
【Ｆｉｇ．１８】  Ｆｉｇ．１８Ａ−１８Ｅは、ＴＡＣＩ−ＦｃがＣＩＡマウスモデルにおける抗コラーゲン免疫応答を阻害したことを示すアッセイ結果を表す。Ｆｉｇｓ．１８Ａ及び１８Ｂは抗ＢＣＩＩ ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体の血清レベルを示す；Ｆｉｇ．１８Ｃは増殖性のＴ細胞応答に対するＴＡＣＩ−Ｆｃの効果を示す；Ｆｉｇ．１８ＤはＴ細胞によるＩＬ−２生産に対するＴＡＣＩ−Ｆｃの効果を示す；Ｆｉｇ．１８ＥはＴ細胞によるインターフェロンγに対するＴＡＣＩ−Ｆｃの効果を示す。
【Ｆｉｇ．１９】  Ｆｉｇ．１９Ａ−１９Ｂは、インヴィトロアッセイにおいて測定された、抗ＣＤ３に誘導される未使用（naive）のＴ細胞の増殖（Ｆｉｇ．１９Ａ）及び未使用（naive）のＴ細胞による抗ＣＤ１３に誘導されるＩＬ−２生産に対するＴＡＣＩ−Ｆｃの阻害効果を示す。
【Ｆｉｇ．２０】  Ｆｉｇ．２０は、インヴィボマウスモデルにおけるＴＡＣＩ−Ｆｃ処理による実験アレルギー性脳脊髄膜炎（ＥＡＥ）の阻害を示すアッセイ結果を表す。臨床的ＥＡＥスコアの知見は実施例１１に記載されている。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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