(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
銅および／または亜鉛が配位した、１１１位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼのアミノ基の１個以上が下記一般式（Ｉ）
【化１】
0004958556.tif 000011
［式中、Ｒは炭素数８〜３０のアルキル基であり、ｎは２〜１０の整数である。］
で表されるレシチン残基で置換されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼを含む組成物であり、
該レシチン化スーパーオキシドディスムターゼが、前記アミノ基のｍ個［ｍは１〜４の整数であり、ｍの平均値は１．５〜２．４である。］が前記レシチン残基で置換されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ）を主成分とし、該レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ）が、ｍ＝１であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ１）２５〜４０モル％と、ｍ＝２であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ２）３５〜５０モル％と、ｍ＝３であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ３）１０〜２０モル％と、ｍ＝４であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ４）５〜１５モル％とからなる、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物を製造する方法であって、
下記一般式（ＩＩＩ）
【化２】
0004958556.tif 000012
［式中、Ｒは炭素数８〜３０のアルキル基であり、Ｚは水酸基、または活性エステルを形成する基からカルボニル基を除いた基であり、ｎは２〜１０の整数である。］
で表されるレシチン誘導体の１モルに対し、銅および／または亜鉛が配位した、１１１位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼの０．０５〜０．４倍モルを水とイソプロピルアルコールとの混合溶媒中で反応させて未精製レシチン化スーパーオキシドディスムターゼを得るレシチン化工程を行い、つぎに、該未精製レシチン化スーパーオキシドディスムターゼを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行うことを特徴とするレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項２】
前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、スーパーオキシドディスムターゼのアミノ基の５個以上が前記レシチン誘導体からＺを除いたレシチン残基で置換されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ｂ）を含有する請求項１に記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項３】
前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、高速液体クロマトグラフィーで測定されるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ）の割合が、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量に対して８５％以上（単位はクロマトグラムの面積％である。）である請求項１または２に記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項４】
前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定されるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ）の割合が、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量に対して８０％以上（単位はクロマトグラムの面積％である。）である請求項１〜３のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項５】
前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、チトクロムＣ法により測定される比活性値が、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量１ｍｇあたり２０００ユニット以上である請求項１〜４のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項６】
前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、下記一般式（ＩＩ）
ＲＣＯＯＨ    …（ＩＩ）
［式中のＲは、炭素数８〜３０のアルキル基である。］
で表される脂肪酸を、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼの総量１ｍｇあたり０．０１〜０．１５ｎｍｏｌ含む請求項１〜５のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項７】
前記製造方法で製造されたレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物において、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ）が、ｍが同一または異なるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ）の２分子が会合してなる二量体として含まれる請求項１〜６のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
【請求項８】
精製工程を、レシチン化工程で得られた未精製レシチン化スーパーオキシドディスムターゼをイオン交換樹脂に吸着させ、つぎに、下記溶媒（Ａ）を用いて未反応のスーパーオキシドディスムターゼを溶出させ、つぎに、下記溶媒（Ｂ）を用いて請求項１〜７のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物を溶出させることにより行う請求項１〜７のいずれかに記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物の製造方法。
溶媒（Ａ）：無機塩濃度が５〜１００ｍＭであるｐＨ６〜９の緩衝液（ａ１）と、メタノールとからなり、溶媒（Ａ）に対する該緩衝液（ａ１）量が２０〜９０容量％であり、メタノール量が１０〜８０容量％である溶媒。
溶媒（Ｂ）：無機塩濃度が１５０〜４００ｍＭであるｐＨ６〜９の緩衝液（ｂ１）と、メタノールとからなり、溶媒（Ｂ）に対する該緩衝液（ｂ１）量が２０〜９０容量％であり、メタノール量が１０〜８０容量％である溶媒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドディスムターゼ（以下、ＳＯＤと略記する。）は、動物、植物、微生物などの生体内に広く分布する酵素である。ＳＯＤは、反応性に富む遊離（フリー）の活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカルを不均化分解する活性を有する。ＳＯＤは、抗リウマチ剤、自己免疫性疾患治療剤、心筋梗塞治療剤、臓器移植時の使用、脳梗塞後の抗血栓剤の使用時に生体内で生じるラジカルの除去を目的とする使用、および種々の炎症への適用等が期待されている（非特許文献１参照。）。【０００３】
ＳＯＤについては、様々な誘導体が提案されている。例えば、標的となる患部への集積性、生体内での安定性等が格段に向上した、特定のＳＯＤをレシチン化したレシチン化ス−パーオキシドディスムターゼ（以下、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼをＰＣ−ＳＯＤと略記する。）を用いた製剤が提案されている（特許文献１参照。）。
【特許文献１】特許第３０７０９８０号公報
【非特許文献１】谷口直之編、「活性酸素の臨床への展望」、医薬ジャーナル社、東京  ６１−１１１頁  （１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、該ＰＣ−ＳＯＤを医薬品として用いるためには、実用上、いくつかの問題がある。たとえば、該ＰＣ−ＳＯＤは、特定のＳＯＤとレシチン誘導体とを反応させる方法により製造される。しかし、従来の方法で製造するＰＣ−ＳＯＤの酵素活性は必ずしも安定しない問題があり、製剤化工程および製剤に影響を与える可能性があった。また従来の方法の収率も充分とはいえなかった。【０００５】
本発明は、医薬品原体として有用であり、かつ安定性にすぐれたＰＣ−ＳＯＤ組成物およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討の結果、特定ＳＯＤのアミノ基の１〜４個がレシチン残基に置換されたＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）（以下、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）と記す）を主成分とするＰＣ−ＳＯＤ組成物によって前記課題が解決できることを見出した。また、該ＰＣ−ＳＯＤ組成物を製造するための条件について検討を行ったところ、レシチン誘導体と特定ＳＯＤとを特定の比率で特定溶媒中で反応させ、特定の精製方法を用いて精製することにより、該ＰＣ−ＳＯＤ組成物を高収率で得ることができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、銅および／または亜鉛が配位した、１１１位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼのアミノ基の１個以上が下記一般式（Ｉ）【０００８】
【化１】
0004958556.tif 000002
（式中、Ｒは炭素数８〜３０のアルキル基であり、ｎは２〜１０の整数である。）【０００９】
で表されるレシチン残基で置換されたＰＣ−ＳＯＤを含む組成物であり、
該ＰＣ−ＳＯＤが、前記アミノ基のｍ個（ｍは１〜４の整数であり、ｍの平均値は１．５〜２．４である。）が前記ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）を主成分とし、該ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）が、ｍ＝１であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ１）２５〜４０モル％と、ｍ＝２であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ２）３５〜５０モル％と、ｍ＝３であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ３）１０〜２０モル％と、ｍ＝４であるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ（ａ４）５〜１５モル％とからなることを特徴とするＰＣ−ＳＯＤ組成物である。
また、本発明は、下記一般式（ＩＩＩ）【００１０】
【化２】
0004958556.tif 000003
（式中、Ｒは炭素数８〜３０のアルキル基であり、Ｚは水酸基、または活性エステルを形成する基からカルボニル基を除いた基であり、ｎは２〜１０の整数である。）
で表されるレシチン誘導体の１モルに対し、銅および／または亜鉛が配位した、１１１位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼの０．０５〜０．４倍モルを水とイソプロピルアルコールとの混合溶媒中で反応させて未精製ＰＣ−ＳＯＤを得るレシチン化工程を行い、つぎに、該未精製ＰＣ−ＳＯＤを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行うことにより前記レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ組成物を製造することを特徴とするＰＣ−ＳＯＤ組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、酵素活性の安定性および生体内での安定性に優れ、製剤化も容易である優れた組成物であることから、医薬品原体として有用である。また、本発明の製造方法により、前記ＰＣ−ＳＯＤ組成物を高収率で製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、銅および／または亜鉛が配位した、１１１位システインのメルカプト基がヒドロキシエチルチオ化されたヒト由来のスーパーオキシドディスムターゼ（以下、ヒト由来ＳＯＤと略記することがある。）のアミノ基の１個以上が、下記一般式（Ｉ）で表されるレシチン残基で置換された構造を有するＰＣ−ＳＯＤを含む。
該ＰＣ−ＳＯＤの製造に用いるＳＯＤの入手方法は特に限定されず、ヒト由来のものであっても、他の起源を由来とするものであってもよい。すなわち、本発明におけるヒト由来ＳＯＤは、ヒトに由来するＳＯＤと同一構造を有するものであれば、いずれの起源であってもよい。
なお、本発明において、ＰＣ−ＳＯＤは後述するＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）と、ヒト由来のＳＯＤのアミノ基の５個以上がレシチン残基（Ｉ）で置換されたＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）（以下、ＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）と記す）とからなり、ＰＣ−ＳＯＤの総量とはＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）とＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）との合計量を意味する。【００１３】
【化３】
0004958556.tif 000004
【００１４】
一般式（Ｉ）で表されるレシチン残基（以下、レシチン残基（Ｉ）と記す。）において、Ｒは炭素数８〜３０のアルキル基であり、炭素数１４〜２２のアルキル基が好ましい。
Ｒは直鎖構造または分岐構造が好ましく、直鎖構造が特に好ましい。Ｒとしては、炭素数１３、１５、または１７の直鎖アルキル基が好ましく、炭素数１５の直鎖アルキル基が特に好ましい。
ｎは２〜１０の整数であり、２〜６が好ましく、３が特に好ましい。【００１５】
本発明において、ＰＣ−ＳＯＤ組成物中に含まれるＰＣ−ＳＯＤは、ヒト由来ＳＯＤのアミノ基の１個以上がレシチン残基（Ｉ）で置換された化合物の総称である。ヒト由来ＳＯＤ中にはアミノ基が１２個存在するとされていることから、ＰＣ−ＳＯＤ中のレシチン残基（Ｉ）数は１〜１２である。
なお、「レシチン残基（Ｉ）で置換された」とは、アミノ基（−ＮＨ２）の水素原子の１つがレシチン残基（Ｉ）に置き換わっていることを意味する。【００１６】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、該レシチン残基（Ｉ）数（ｍ）が１〜４の整数であり、かつｍの平均が１．５〜２．４であるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）を主成分とする。ｍは、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）中に存在するアミノ基に結合したレシチン残基（Ｉ）の結合数である。
「ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）を主成分とする」とは、ＰＣ−ＳＯＤ組成物中に含まれるＰＣ−ＳＯＤの量比のうち、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合が最大であることを意味する。ＰＣ−ＳＯＤ組成物中に含まれるＰＣ−ＳＯＤの総量に対するＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は、７５質量％以上が好ましく、８５〜１００質量％が特に好ましい。【００１７】
さらに、本発明において、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）は、ｍの値が１、２、３または４である４種のＰＣ−ＳＯＤを、それぞれ特定の割合で含む。すなわち、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）は、ｍが１であるＰＣ−ＳＯＤ（ａ１）２５〜４０モル％と、ｍが２であるＰＣ−ＳＯＤ（ａ２）３５〜５０モル％と、ｍが３であるＰＣ−ＳＯＤ（ａ３）１０〜２０モル％と、ｍが４であるＰＣ−ＳＯＤ（ａ４）５〜１５モル％とからなる。
そしてｍの平均値は１．５〜２．４である。ｍの平均値はモル平均値として計算される値であり、ＰＣ−ＳＯＤ（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、および（ａ４）の総量に対する各々のモル比から算出できる。【００１８】
ＰＣ−ＳＯＤは、レシチン残基の結合数が多い場合には、疎水性が高くなるため、細胞への接着性が高くなり、脂肪組織等へ吸収されやすくなる。また、生体内での安定性も高くなる。一方、ＰＣ−ＳＯＤのレシチン残基の結合数が少ない場合には親水性が高くなるため、注射剤等の水性製剤への応用が容易になる。また、生体内での酵素活性も高くなる、生体内で抗原として認識される可能性が低くなる等の利点がある。
ＰＣ−ＳＯＤを医薬品とする場合には、生体内での動態、安定性、製剤化の容易さ等のバランスが取れていることが必要である。これらの要因を考慮した結果、本発明者らは、ＰＣ−ＳＯＤにおけるレシチン残基（Ｉ）の結合数の平均値が１．５〜２．４である場合が最適であることを見いだした。さらに本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物の安定性を考慮した場合には、単にＰＣ−ＳＯＤにおけるレシチン残基（Ｉ）の結合平均数を１．５〜２．４とすればよいのではなく、ある程度のレシチン残基（Ｉ）数を有するＰＣ−ＳＯＤと、レシチン残基（Ｉ）の結合数が少ないＰＣ−ＳＯＤとを並存させることが、医薬品原体としての安定性の向上につながり、かつ医薬品原体および製剤の製造においても効率的であることを見いだした。【００１９】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）以外に、ＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）を含有していてもよい。
ＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）中に存在するレシチン残基（Ｉ）数（ｒ）は、５〜１２個である。
ＰＣ−ＳＯＤ中の立体構造の内部に存在するアミノ基は置換されにくいことから、通常の場合、ｒは５〜８が好ましい。
ＰＣ−ＳＯＤ組成物中にＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）が含まれる場合のＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）の量は、ＰＣ−ＳＯＤ組成物中に含まれるＰＣ−ＳＯＤの総量に対して２５質量％未満が好ましく、１５質量％未満が好ましい。該量が２５質量％以上であると前記の理由により本発明の効果が損なわれるおそれがある。【００２０】
本発明において、ＰＣ−ＳＯＤは、ヒト由来ＳＯＤ中のアミノ基の１個以上が、レシチン残基（Ｉ）に置換された化合物であるが、さらに該アミノ基の１つ以上が、レシチン残基（Ｉ）以外の基で置換されていてもよい。該基としては、レシチン残基（Ｉ）の一部が分解して生成した基、またＰＣ−ＳＯＤの合成時に用いるレシチン誘導体中に含まれるレシチン誘導体の分解物がアミノ基に置換した基等が挙げられる。
該レシチン残基（Ｉ）以外の基の具体例としては、以下の基が挙げられる。ただし、下式中のｎは、レシチン残基（Ｉ）における意味と同じ意味を示す。【００２１】
【化４】
0004958556.tif 000005
【００２２】
【化５】
0004958556.tif 000006
【００２３】
【化６】
0004958556.tif 000007
【００２４】
一方、ＰＣ−ＳＯＤ中のアミノ基が、レシチン残基（Ｉ）を含まず、前記の基（ＩＶ）〜（ＶＩ）等のレシチン残基（Ｉ）以外の基に置換された化合物は、本発明におけるＰＣ−ＳＯＤの概念には含まれない。【００２５】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物中に含まれるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は、種々の観点で管理されることが好ましい。
たとえば高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）で測定されるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は、ＰＣ−ＳＯＤの総量に対して８５％以上（ただし、単位はクロマトグラムの面積％）であることが好ましく、８５〜１００％であることが特に好ましく、９０〜１００％であることがとりわけ好ましい。
また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定されるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は、ＰＣ−ＳＯＤの総量に対して８０％以上（ただし、単位はクロマトグラムの面積％）であることが好ましく、８５〜１００％であることが特に好ましい。
ＨＰＬＣおよびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の測定条件は、後述する実施例に記載した条件が採用できる。
ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合が前記特定の割合になるように管理した場合には、酵素活性の安定性および生体内での安定性に優れたＰＣ−ＳＯＤ組成物を恒常的に得ることができる。また、該分析方法による管理はより効率的である。さらに、得られたＰＣ−ＳＯＤ組成物は、安定性により優れることから製剤化も容易である。【００２６】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物において、ＰＣ−ＳＯＤの主成分であるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）は、ｍが同一または異なるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の２分子が会合してなる二量体として含まれることが好ましい。これにより、ＰＣ−ＳＯＤ組成物の酵素活性が充分に発現する。
該二量体としては、ＰＣ−ＳＯＤ（ａ２）の２分子から形成される二量体、ＰＣ−ＳＯＤ（ａ１）の１分子とＰＣ−ＳＯＤ（ａ３）１分子から形成される二量体等が例示されうる。
また、ＰＣ−ＳＯＤ中にＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）が含まれる場合、該ＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）とＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）、および／またはＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）同士が会合して二量体を形成していてもよい。【００２７】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）およびＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）以外の化合物（以下、他の化合物という。）を含んでいる場合がある。
他の化合物としては、下記一般式（ＩＩ）で表される脂肪酸が挙げられる。
ＲＣＯＯＨ    …（ＩＩ）
［ただし、Ｒは前記一般式（Ｉ）におけるＲと同じである。］【００２８】
一般式（ＩＩ）で表される脂肪酸の量は、ＰＣ−ＳＯＤの総量１ｍｇあたり０．０１〜０．１５ｎｍｏｌであることが好ましい。
ＰＣ−ＳＯＤ組成物中の脂肪酸の定量法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、マススペクトロメトリー等の手法が挙げられる。また、ラベル化試薬によりラベル化し、ＨＰＬＣで定量する方法も挙げられる。ＰＣ−ＳＯＤ組成物中の脂肪酸濃度が低い場合は、ラベル化試薬を用いる方法が好ましい。【００２９】
また、他の化合物としては、ヒト由来ＳＯＤのアミノ基の１個以上に、前記一般式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）で表される基からなる群から選択される少なくとも１種が置換し、レシチン残基（Ｉ）が置換しない化合物も挙げられる。【００３０】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物が、他の化合物を含む場合の量は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定される割合として、２０％以下が好ましく、０〜１５％（ただし、単位はクロマトグラムの面積％である。）が特に好ましい。【００３１】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、スーパーオキシドディスムターゼとしての活性（ＳＯＤ活性）を有する。ＳＯＤ活性は、ＰＣ化されていないＳＯＤ、すなわちヒト由来ＳＯＤを基準とした比活性値として求めることが好ましい。
ＰＣ−ＳＯＤ組成物の比活性値の測定方法としては、チトクロムＣ法、ニトロブルー・テトラゾリウム法、エピネフリン法、亜硝酸法などが知られており、チトクロムＣ法を用いて比活性値を測定することが好ましい。チトクロムＣ法による測定は、Ｙ．Ｏｙａｎａｇｉ（ＳＯＤと活性酸素調節剤、ｐ．９５（１９８９））、Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２２４、ｐ．６０４９（１９６９））、Ｋ．Ａｓａｄａ（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３８、ｐ．４７１（１９７４））などの文献に記載される方法により実施できる。
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、製剤化の容易さ、生体内での安定性、効率的な薬効発現の点から、チトクロムＣ法により測定される比活性値が、ＰＣ−ＳＯＤの総量１ｍｇあたり２０００ユニット以上であることが好ましく、２３００〜７０００ユニットであることが特に好ましい。【００３２】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるレシチン誘導体に対し、特定量のヒト由来ＳＯＤを反応させて未精製ＰＣ−ＳＯＤを得るレシチン化工程を行い、つぎに、該未精製ＰＣ−ＳＯＤを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行う方法により製造できる。【００３３】
【化７】
0004958556.tif 000008
【００３４】
一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ、ｎは前記一般式（Ｉ）のＲ、ｎと同様である。
Ｚは、水酸基、または活性エステルを形成する基からカルボニル基を除いた基を表す。後者の基としては、例えば、ｐ−ニトロフェノール、１，３，５−トリクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、８−ヒドロキシキノリン、２−ヒドロキシピリジンなどの水酸基含有化合物の水酸基の水素原子を除いた基が挙げられる。活性エステル体の合成法については公知の方法を用いることができる（特許文献１、および「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋他、１９８５年、丸善（株）発行）等を参照。）。【００３５】
［レシチン化工程］
本工程は、ヒト由来ＳＯＤを適当な溶媒に溶解して得たＳＯＤ溶液に、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるレシチン誘導体を適当な溶媒に溶解して得たレシチン誘導体溶液を添加する方法により行うことが好ましい。具体的には、レシチン誘導体１モルに対し、０．０５〜０．４倍モル、好ましくは０．１〜０．２５倍モルのヒト由来ＳＯＤを水とイソプロピルアルコールとの混合溶媒中で反応させることによって、本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物を高収率で得ることができる。
【００３６】
この際、添加速度、撹拌速度、反応温度、反応時間、反応圧力等の種々の反応条件を調節することにより、本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物をさらに高収率で得ることができる。
レシチン誘導体溶液のＳＯＤ溶液中への添加速度は、レシチン誘導体が短時間で反応系内に分散することができる速度であればよく、通常２０〜１００ｍＬ／分が好ましく、４０〜８０ｍＬ／分が特に好ましい。
撹拌速度は、レシチン誘導体が短時間で反応系内に分散することができる撹拌速度であればよく、通常５０〜５００ｒｐｍが好ましく、１００〜３００ｒｐｍが特に好ましい。
反応温度は、高温になればなるほどＳＯＤ１分子あたりのレシチン誘導体の導入数が多くなるため、上限は＋２０℃とすることが好ましい。反応温度の下限としては、反応液が凍結しない温度であればよい。反応温度としては、０〜＋１０℃が好ましい。
反応時間は、０．５時間〜７２時間が好ましく、２〜２４時間が特に好ましい。
反応圧力は、０．０５〜０．２ＭＰａが好ましく、大気圧付近の圧力が特に好ましい。【００３７】
また、本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物を、さらに安定した品質で、高収率で製造するためには、ＳＯＤ溶液中に含まれるヒト由来ＳＯＤの濃度、レシチン誘導体溶液の添加方法等についても、より厳密な条件を設定することが好ましい。
具体的には、ヒト由来ＳＯＤを１００〜２０００倍量の溶媒で希釈してＳＯＤ溶液を調製し、該溶液に、レシチン誘導体を２０〜１００倍量の有機溶媒で希釈したレシチン誘導体溶液を加えることによるのが好ましい。
ＳＯＤを溶解させる溶媒としては、水、または、水と有機溶媒との混合溶媒が挙げられ、水と有機溶媒との混合溶媒が好ましい。該混合溶媒を用いることにより、レシチン誘導体溶液を添加する際に、反応系を均一にでき沈殿物の発生を防止できる。また、これらの溶媒にはホウ酸等を溶解させ、緩衝能を持たせることが好ましい。
水としては、精製水、イオン交換水、蒸留水、または注射用水が好ましい（以下、これらを総称して単に「水」ともいう。）。有機溶媒としては、イソプロピルアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、スルホラン、ジメチルスルホキシド、アセトン、１，４−ジオキサン、およびメタノール等が挙げられ、イソプロピルアルコールが好ましい。
レシチン誘導体の希釈に用いられる有機溶媒としては、ＳＯＤ溶液の調製に用いられる有機溶媒と同様の溶媒が例示でき、イソプロピルアルコールが好ましい。【００３８】
このようにして得られる反応液（未精製ＰＣ−ＳＯＤ）中には、ＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）のほか、ＰＣ−ＳＯＤ（Ｂ）、未反応のヒト由来ＳＯＤ、未反応のレシチン誘導体、およびその他の成分が共存している。その他の成分としては、レシチン誘導体の合成に用いられる試薬に由来する未反応物等が挙げられる。【００３９】
［精製工程］
つぎに、前記レシチン化工程で得られた未精製ＰＣ−ＳＯＤを、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する精製工程を行う。本精製工程を行うことにより、高収率で本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物を得ることができる。【００４０】
精製工程は、イオン交換樹脂を充填したカラムに前記未精製ＰＣ−ＳＯＤをチャージして吸着させた後、無機塩を含有する緩衝液を含む溶媒を用いて、目的とするＰＣ−ＳＯＤ組成物を溶出させることにより行うことができる。
イオン交換樹脂としては、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれであっても使用できる。【００４１】
溶出に用いる溶媒に含まれる緩衝液としては、無機塩を含有し、緩衝能を有するものであれば特に限定されない。ただし、リン酸系緩衝液を用いる場合においては、ＰＣ−ＳＯＤが不溶化することがあるため、使用前に溶解性を充分確認する必要がある。緩衝液のｐＨは、精製時におけるＰＣ−ＳＯＤの安定性が保持される点から、６〜９であることが好ましい。
無機塩としては、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。これらは単独で用いても、任意の割合の混合物として用いてもよい。【００４２】
また、溶出に用いる溶媒は、ＰＣ−ＳＯＤの溶解性向上を目的として、有機溶媒を含有することが好ましい。
有機溶媒としては、イソプロピルアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、スルホラン、ジメチルスルホキシド、アセトン、１，４−ジオキサン、メタノール等が挙げられる。これらのうち、ＰＣ−ＳＯＤの溶解性が良好であり、精製効率が良い点で、メタノールが好ましい。
該溶媒中に含まれる有機溶媒の量は、ＰＣ−ＳＯＤを不溶化させることなく、かつイオン交換樹脂へのＰＣ−ＳＯＤの吸着を妨げない量とすることが好ましい。有機溶媒の割合は、溶媒の総容量に対し１０〜８０容量％が好ましく、２０〜７０容量％が特に好ましく、４０〜６０容量％がとりわけ好ましい。【００４３】
目的とするＰＣ−ＳＯＤ組成物は、溶媒に含まれる緩衝液の無機塩濃度を変更することにより溶出させることができる。
具体的には、未精製ＰＣ−ＳＯＤをカラムにチャージした後に、未吸着の物質を溶出させる。つぎに下記溶媒（Ａ）を用いて未反応のＳＯＤを溶出させ、つぎに下記溶媒（Ｂ）を用いて本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物を溶出させることにより行うことが好ましい。
溶媒（Ａ）：無機塩濃度が５〜１００ｍＭであるｐＨ６〜９の緩衝液（ａ１）と、メタノールとからなり、溶媒（Ａ）に対する該緩衝液（ａ１）量が２０〜９０容量％であり、メタノール量が１０〜８０容量％である溶媒。
溶媒（Ｂ）：無機塩濃度が１５０〜４００ｍＭであるｐＨ６〜９の緩衝液（ｂ１）と、メタノールとからなり、溶媒（Ｂ）に対する該緩衝液（ｂ１）量が２０〜９０容量％であり、メタノール量が１０〜８０容量％である溶媒。【００４４】
前記の製造方法によって得られたＰＣ−ＳＯＤ組成物を含む画分は、限外濾過を行い該画分に含まれる無機塩および有機溶媒等を除くことが好ましい。限外濾過を行うことにより、ＰＣ−ＳＯＤ組成物および水を含むＰＣ−ＳＯＤ組成物の水性液が得られる。さらに該水性液を乾燥することによってＰＣ−ＳＯＤ組成物を精製してもよいが、ＰＣ−ＳＯＤ組成物の製剤化は通常の場合には水性液を用いて行われるため、水性液として得ることが好ましい。該水性液におけるＰＣ−ＳＯＤ組成物の濃度は０．１〜３００ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜５０ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。【００４５】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、医薬品原体として有用であり、種々の添加剤を添加する、希釈する等の操作を行うことによって製剤とすることができる。
製剤形態としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等が挙げられる。
投与方法は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内等）、経口、吸入等の投与方法が採用できる。投与量は、製剤の調製方法、剤形、疾患の種類、当該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の体重等によって個別に設定され、たとえば、成人一日あたり、０．５〜２００ｍｇを挙げることができる。
【実施例】
【００４６】
以下本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
［例１］ＰＣ−ＳＯＤ組成物の製造例
２０Ｌのフラスコに注射用蒸留水（大塚製薬社製、商品名：大塚蒸留水、以下同様。）（９０００ｍＬ）を添加し、ホウ酸（２７．７ｇ）、ＮａＯＨ（３．６ｇ）、ＫＣｌ（３３．７ｇ）を順次添加し溶解した。つぎに、ＳＯＤ水溶液（１００ｇ、ＳＯＤ濃度１１３．６ｍｇ／ｍＬ）を添加後、２１０ｒｐｍで撹拌しながら、クロマトチャンバー内で８℃にしておいたイソプロピルアルコール（２０００ｍＬ）を３３ｍＬ／分で滴下し、ＳＯＤ溶液を調製した。【００４７】
特許第３０７０９８０号公報に記載の方法に従って製造した下記レシチン誘導体（１５．７ｇ）をイソプロピルアルコール（５００ｍＬ）に溶解した。つぎに、疎水性フィルターで濾過し、不溶物を除去した。濾液にイソプロピルアルコールを添加し、総容量を８０００ｍＬとしてレシチン誘導体溶液を調製した。溶液温度は８℃であった。つぎに、このレシチン誘導体溶液（８０００ｍＬ）を、前記ＳＯＤ溶液中に６６ｍＬ／分で滴下し、２１０ｒｐｍで４時間撹拌した液を反応液とした。【００４８】
【化８】
0004958556.tif 000009
【００４９】
ホウ酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５±０．２）とメタノールとの１：１（容量比）混合溶液であらかじめ平衡化したイオン交換樹脂（Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  ｓｆ  Ａ−５００）を充填したカラムに、反応液全量を担持させた。前記混合溶液で未吸着物質を溶出し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１Ｈ−テトラゾール、およびジシクロヘキシルカルボジイミドを含む画分を得た。
次いで、ＮａＣｌを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５±０．２、ＮａＣｌ濃度＝２５ｍｍｏｌ／Ｌ）とメタノールとの１：１（容量比）からなる溶出溶媒を用いて、未修飾ＳＯＤを溶出させた。
次いで、ＮａＣｌを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５±０．２、ＮａＣｌ濃度＝２００ｍｍｏｌ／Ｌ）とメタノールとの１：１（容量比）からなる溶出溶媒を用いて溶出した画分をＰＣ−ＳＯＤ組成物画分とした。【００５０】
ＰＣ−ＳＯＤ組成物画分を限外濾過することにより塩類およびメタノールを除き、注射用蒸留水に置換し、濃度を調整するために濃縮した。限外濾過膜には、ミリポア社のＰＬＧＣ０００５（分画分子量１０，０００、膜面積０．５ｍ２）を用いた。限外濾過透過側の電気伝導度が、注射用蒸留水と同じになったところで濾過操作を終了し、さらに溶液中のＰＣ−ＳＯＤ濃度を約４０ｍｇ／ｍＬに調整してＰＣ−ＳＯＤ組成物の水性液（Ｌｏｔ．００１）を得た。ここまでの操作は、４℃に保冷したクロマトチャンバー内で、液温を測定しながら実施した。【００５１】
分取用ＨＰＬＣにより、ＰＣ−ＳＯＤ組成物中のＰＣ−ＳＯＤの各ピークに対応する画分を分取した。ＨＰＬＣのカラムには、Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷ−ＲＰ（７５ｍｍ×４．６ｍｍ、東ソー社製）を用い、移動相として０．１％トリフルオロ酢酸と２０％アセトニトリルとの水溶液、０．０７５％トリフルオロ酢酸と９０％アセトニトリルの水溶液を濃度勾配をかけて、０．８ｍＬ／分で流した。検出器としてはＵＶ検出器（波長２２０ｎｍ）を用い、カラム温度は室温とした。
得られた画分についてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、ＰＣ−ＳＯＤの分子量、およびフラグメントを測定した。ＰＣ−ＳＯＤの１分子に結合するレシチン誘導体の結合数（ｍ）と、各結合数に相当するＰＣ−ＳＯＤの比率（モル％）、ｍの平均値、およびＰＣ−ＳＯＤ二量体あたりのｍの平均値を求めた結果を、下表１に示す。
水性液（Ｌｏｔ．００１）に含まれるＰＣ−ＳＯＤには１〜４分子のレシチン誘導体が結合しており、ｍの平均値は２であった。【００５２】
［例２、３］
例１と同様の操作を行い、ＰＣ−ＳＯＤ組成物の水性液（Ｌｏｔ．００２および００３）を得た。各水性液中のＰＣ−ＳＯＤの１分子に結合するレシチン誘導体の結合数（ｍ）、各結合数に相当するＰＣ−ＳＯＤの比率（モル％）、ｍの平均値、およびＰＣ−ＳＯＤ二量体あたりのｍの平均値を求めた結果を下表１にまとめて示す。【００５３】
【表１】
0004958556.tif 000010
【００５４】
［例４］ＨＰＬＣによる純度試験例（その１）
例１で製造した水性液（Ｌｏｔ．００１、５００μＬ）に注射用蒸留水を加え、ＰＣ−ＳＯＤの濃度を３０ｍｇ／ｍＬとした液（５００μＬ）に注射用蒸留水（２５００μＬ）を加えて分析用サンプルを得た。分析用サンプルについてＨＰＬＣ分析を行った結果、ＰＣ−ＳＯＤの総量に対するＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は９６．７％（単位はクロマトグラムの面積％である。）であった。
ＨＰＣＬの分析には、カラムとして、ＹＭＣ  Ａ−５０２  Ｓ−５  １２０Ａ  ＣＮ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、ＹＭＣ社製）を用い、移動相には、０．１％トリフルオロ酢酸と２０％アセトニトリルとの水溶液、および０．０７５％トリフルオロ酢酸と９０％アセトニトリルとの水溶液を、濃度勾配をかけて０．８ｍＬ／分で流した。検出器はＵＶ検出器（波長２２０ｎｍ）を用い、カラム温度を室温とした。【００５５】
［例５］ＨＰＬＣによる純度試験例（その２）
例１と同様の方法で得たＰＣ−ＳＯＤ組成物を含む水性液（Ｌｏｔ．００５）につき、例４と同様にＨＰＬＣ測定を行った結果、ＰＣ−ＳＯＤの総量に対するＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は９７．３％（単位はクロマトグラムの面積％である。）であった。【００５６】
［例６］ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による純度測定例
例１で製造した水性液（Ｌｏｔ．００１、５００μＬ）を水で希釈して濃度を３０ｍｇ／ｍＬとした液（１００μＬ）に水（２９００μＬ）を加えて試料溶液とした。
また、試料溶液（１００μＬ）に水（９００μＬ）を加えた液を比較試料溶液とした。
試料溶液および比較試料溶液の各々２０μＬに、サンプルバッファー（８μＬ）を加え、９５℃で３分間加熱した。サンプルバッファーは、グリセリン（１０ｇ）、ドデシル硫酸ナトリウム（２ｇ）、ブロムフェノールブルー（１００ｍｇ）をトリス・塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解し１００ｍＬとし、この溶液から９５μＬを取り２−メルカプトエタノール（５μＬ）を加え調製した。
前記で処理した試料溶液および比較試料溶液の各々４μＬにつき、電気泳動を行った。泳動終了後、直ちにゲルを染色用チャンバーに移し、染色を行った。染色終了後、３０分間保護液に浸した後、ゲルを乾燥した。保護液は、グリセリン（２０ｍＬ）に水を加え５００ｍＬとして調製した。
試料溶液のメインバンド以外のバンドの大きさと、比較試料溶液のメインバンドの大きさとを比較した結果、ＰＣ−ＳＯＤ組成物に含まれるＰＣ−ＳＯＤ（Ａ）の割合は９０％（単位はクロマトグラムの面積％である。）以上であった。【００５７】
［例７］比活性値の測定例
比活性値は、チトクロムＣ法を用いて測定した。測定方法は、Ｙ．Ｏｙａｎａｇｉ（ＳＯＤと活性酸素調節剤、ｐ．９５（１９８９））、Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２２４、ｐ．６０４９（１９６９））、およびＫ．Ａｓａｄａ（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３８、ｐ．４７１（１９７４））などの文献に記載される方法にしたがった。なお、比活性値が４５００〜５５００の範囲にあるヒト由来ＳＯＤを標品として用いた。
前記例で得たＰＣ−ＳＯＤ組成物を異なる濃度に調製した試料に、キサンチンオキシダーゼ溶液を入れ、紫外光（５５０ｎｍ）に対する吸光度を測定した。濃度と吸光度のデータから、最小二乗法により検量線を得て、１分間当たりの吸光度増加率から試料の比活性値を求めたところ、Ｌｏｔ．００１中のＰＣ−ＳＯＤ組成物の比活性値（Ｕ／ｍｇ−ＳＯＤ）は３４００であった。なお、比活性値の単位「Ｕ／ｍｇ−ＳＯＤ」はＳＯＤの総量（１ｍｇ）に対する値であることを意味する。【００５８】
［例８］脂肪酸の定量例
パルミチン酸（２５６ｍｇ）をエタノールに溶解して２０ｍＬとした液を５０ｍｍｏｌ／Ｌ標準原液とした。該標準原液をエタノールで希釈し、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、および０．０１ｍｍｏｌ／Ｌのパルミチン酸標準試料をそれぞれ調整した。また、（パルミチン酸の秤量値）／（パルミチン酸分子量＝２５６．４３）値をファクター（Ｆｐ）とした。
一方、マルガリン酸（２７ｍｇ）をエタノールに溶解して２００ｍＬとした液を０．５ｍｍｏｌ／Ｌ内部標準溶液とした。
パルミチン酸標準試料（各１００μＬ）、例１で得た水性液（Ｌｏｔ．００１）、例１と同様の方法で得た水性液（Ｌｏｔ．００５、Ｌｏｔ．００８）のそれぞれ（１００μＬ）に、前記内部標準溶液（１００μＬ）を加えた。ブランクとしてエタノール（１００μＬ）を用いた。
それぞれにＡ液〜Ｃ液からなる長鎖・短鎖脂肪酸ラベル化試薬（ワイエムシィ社製）のＡ液およびＢ液を加えて、６０℃の恒温槽で２０分間撹拌した。さらに、Ｃ液（２００μＬ）を加え、６０℃の恒温槽で１５分間撹拌した液を、ＨＰＬＣ測定試料とした。
ＨＰＬＣの測定にはカラムとしてＹＭＣ  Ａ−５１２  Ｓ−５  １２０Ａ  ＣＮ（１５０ｍｍ×６．０ｍｍ、ＹＭＣ社製）を用いた。移動相には、０．０１％トリフルオロ酢酸と２０％アセトニトリルとの水溶液、および０．０１％トリフルオロ酢酸および２０％アセトニトリルとの水溶液を濃度を変化させながら１ｍＬ／分で流した。検出器はＵＶ検出器（波長２３０ｎｍ）を用い、カラム温度は室温とした。
得られたＨＰＬＣクロマトグラムからパルミチン酸の面積％を求め、さらに、内部標準溶液の測定値で換算することにより、パルミチン酸の含有量を求めた。ＰＣ−ＳＯＤ総量に対するパルミチン酸濃度は、Ｌｏｔ．００１においては０．０７４ｎｍｏｌ／ｍｇ、Ｌｏｔ．００５においては０．０９４ｎｍｏｌ／ｍｇ、Ｌｏｔ．００８においては０．０６７ｎｍｏｌ／ｍｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ組成物は、酵素活性の安定性および生体内での安定性に優れ、製剤化も容易である優れた組成物となりうる。よって、抗リウマチ剤、自己免疫性疾患治療剤等の種々の治療剤に有用に用いうる。
なお、２００４年１０月１２日に出願された日本特許出願２００４−２９７５１９号の明細書、特許請求の範囲及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。