(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、その果汁を得、その果汁についてクロマトグラフィーを行い、それによってプロテアーゼを含有している溶液を溶出し、
次で、その溶出された上記プロテアーゼを含有している溶液について透析を行い、それによって、透析されたプロテアーゼを含有している溶液を得、
次で、その透析されたプロテアーゼを含有している溶液に、凍結乾燥処理を施し、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を線維素溶解剤として得ることを特徴とする線維素溶解剤の製法。
【請求項２】
（ａ）ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、それを圧搾して、清澄な上記果実の果汁を得る工程と、
（ｂ）上記果実の果汁について、陰イオン交換樹脂カラムを用いたクロマトグラフィ−を行い、それにより、上記陰イオン交換樹脂カラムを通過した溶液を得る工程と、
（ｃ）上記陰イオン交換樹脂カラムを通過した溶液について、陽イオン交換樹脂カラムを用いたクロマトグラフィーを行い、それにより、上記陽イオン交換樹脂カラムに上記果実の果汁の成分を吸着させる工程と、
（ｄ）上記果実の果汁の成分を吸着させている陽イオン交換樹脂カラムに、酢酸ナトリウム緩衝液を、それに塩化ナトリウム水溶液によってリニアグラジエントを施して、流し、それによって、上記陽イオン交換樹脂カラムからプロテアーゼを溶解している溶液を溶出させる工程と、
（ｅ）上記陽イオン交換樹脂カラムから溶出されたプロテアーゼを溶解している溶液について透析を行い、それによって、透析されたプロテアーゼを含有している溶液を得る工程と、
（ｆ）上記透析されたプロテアーゼを含有している溶液に、凍結乾燥処理を施し、それによって、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を線維素溶解剤として得る工程とを含むことを特徴とする線維素溶解剤の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳血栓などの血栓の成分であるフイブリン（ｆｉｂｒｉｎ）で形成されている線維素を溶解する、血栓治療薬として用いることができる線維素溶解剤の製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特開昭６１−１６２１８４号公報に、人に広く食されている納豆に、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるナットウキナーゼが含まれ、そのナットウキナーゼが、脳血栓などの血栓の成分であるフイブリンで形成されている線維素（以下、簡単のため、単に線維素と称す）を溶解する活性（以下、簡単のため線維素溶解活性と称す）を有することの知見から、納豆を水溶液中でホモジナイズし、その上清液を濃縮し、その濃縮液を透析する、という工程を経て、納豆から線維素溶解活性を有するナットウキナーゼを含有している剤を精製し、その精製された線維素溶解活性を有するナットウキナーゼを含有している剤を線維素溶解剤とすることが提案されている。従って、従来、納豆から精製された、線維素溶解活性を特有するプロテアーゼであるナットウキナーゼを含有している剤でなる線維素溶解剤（以下、簡単のため、納豆由来の線維素溶解剤と称す）が提案されている。
【０００３】
従来提案されている納豆由来の線維素溶解剤によれば、それが、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤であり、また、その納豆由来の線維素溶解剤が、字句通り、人に広く食されている納豆由来の線維素溶解剤であることから、その納豆由来の線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができる、ということから、血栓治療薬として高い有用性を有する。
【特許文献１】特開昭６１−１６２１８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来提案されている納豆由来の線維素溶解剤の場合、上述したところから明らかなように、納豆から、線維素溶解剤としての、線維素溶解活性を有するプロテアーゼであるナットウキナーゼを含有している剤を精製するのに、工程が少なくて済むといえるものでないとともに、その工程に困難を伴わないとはいえるものでもなく、また、納豆には、プロテアーゼであるナットウキナーゼがごく微量でしか含まれていないことから、線維素溶解活性を有するプロテアーゼであるナットウキナーゼを含有している剤を、納豆からきわめて低い収率でしか精製できず、さらに、納豆自体、それを廉価に入手し得るというものでもないので、線維素溶解剤を、必ずしも、容易、廉価に提供することができるとはいえない、という欠点を有していた。
【０００５】
よって、本発明は、上述した欠点を伴わない、新規な線維素溶解剤の製法を提案せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上述した欠点のない線維素溶解剤を提供すべく種々の実験を重ねたところ、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実自体に、線維素溶解活性を有するプロテアーゼが、納豆の場合と同様に、しかしながら納豆の場合と同じ量で納豆の場合に比し格段的に多量に、含まれていること、従って、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実自体、またはウリ科植物としてのプリンスメロンの果実からその果汁を調製して得たそのウリ科植物としてのプリンスメロンの果汁自体を、線維素溶解剤とすることもでき、そこに、困難を伴うというものでもなく、また、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、それに含まれている線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として、納豆の場合に比し格段的に高い収率で精製することができ、そこに、納豆からそれに含まれているプロテアーゼを含有している剤を精製する場合に比し多くのまたは大きな困難を伴うものであるとはいえないこと、さらに、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実自体、それが納豆の原料である豆に相当していることから、それを、納豆の場合に比し廉価に入手することができることを確認するに到った。
【０００７】
本発明による線維素溶解剤の製法は、上述した確認に基づき提案されたもので、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として精製する、というものである。
【０００８】
この場合のウリ科植物としてのプリンスメロンの果実からの精製は、そのプリンスメロンの果実から、そのプリンスメロンの果汁を得、そのプリンスメロンの果実についてクロマトグラフィを行い、それによってプロテアーゼを含有している溶液を抽出させ、その溶液を透析し、凍結乾燥して目的とする剤を得る、というものとするのを可とする。
【０００９】
上述した本発明による線維素溶解剤の製法によって得られる線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなる線維素溶解剤によれば、それが、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様の線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなり、また、その線維素溶解剤が、ウリ科植物としてのプリンスメロン由来の線維素溶解剤であることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、その線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、血栓治療薬として高い有用性を有する。
【００１０】
また、上述した本発明による線維素溶解剤の製法によって線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤をウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から精製するのは、納豆由来の線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を納豆から精製する場合に比し困難であるとはいえず、また、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、納豆から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を精製する場合に比し格段的に高い収率で精製することができ、さらに、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実自体、それが納豆の原料である豆に相当していることから、それを、納豆の場合に比し廉価に入手することができるので、上述した本発明による線維素溶解剤の製法によれば、線維素溶解剤を、納豆由来の線維素溶解剤の場合に比し、容易、廉価に提供することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による線維素溶解剤の製法によれば、それによって得られる線維素溶解剤が、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様の線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなり、また、その線維素溶解剤が、ウリ科植物としてのプリンスメロン由来の線維素溶解剤であることから、線維素溶解剤を、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、血栓治療薬として高い有用性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明による線維素溶解剤の製法は、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実を用いている。
【実施例１】
【００１３】
次に、本発明による線維素溶解剤の製法の実施例を述べよう。
本発明による線維素溶解剤の製法の実施例は、
（１）まず、ウリ科植物をプリンスメロンとし、そのウリ科植物としてのプリンスメロンの果実の１．５Ｋｇについて、蒸留水で洗浄してから、−２０℃の温度で冷凍し、次いで４℃の温度で解凍し、それによって、細胞の破砕されたプリンスメロンの果実を得、その細胞の破砕されたプリンスメロンの果実を、綿布製袋に入れて圧搾し、それによって、清澄なプリンスメロンの果実の果汁を得、
（２）次で、その清澄なプリンスメロンの果実の果汁について、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭの酢酸水溶液と５０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液との混液でなる）で平衡化したＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロースカラム（陰イオン交換樹脂カラムの一種）を用いたクロマトグラフィーを行い、それにより、そのＤＥＡＥ−セルロースカラムから、それを通過した溶液を得、次いで、そのＤＥＡＥ−セルロースカラムを通過した溶液について、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＣＭ（カルボキシルメチル）−セファロースカラム（陽イオン交換樹脂カラムの一種）を用いたクロマトグラフィーを行い、それにより、そのＣＭ−セファロースカラムに、プリンスメロンの果実の果汁の成分を吸着させ、
（３）次で、そのプリンスメロンの果実の果汁の成分を吸着させているＣＭ−セファロースカラムに、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を、それに、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液によって当該５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が時間とともに直線的に高くなるリニアグラジエントを施して、流し、それによって、そのＣＭ−セファロースカラムから、プロテアーゼを溶解している溶液を溶出させ、
（４）次で、そのＣＭ−セファロースカラムから溶出されたプロテアーゼを溶解している溶液について透析を行い、それによって、透析されたプロテアーゼを溶解している溶液を得、
（５）次いで、その透析されたプロテアーゼを溶解している溶液に、凍結乾燥処理を施し、それによって得られた凍結乾燥処理の施された剤を、目的とする線維素溶解活性を有するプロテアーゼでなる剤として得た。
以上のようにして、プリンスメロンの果実の１．５ｋｇから、４１％の収率で、３６０ｍｇの凍結乾燥処理の施された剤を、目的とする線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た。
【００１４】
以上が、本発明による線維素溶解剤の製法の実施例であるが、いま、その本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た凍結乾燥処理の施された剤が、線維素溶解活性を有することについて述べれば、次のとおりである。
（１）線維素が、［背景技術］で述べているようにフイブリンで形成されていることから、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）を用い、そのフィブリノーゲンの１００ｍｇを、ｐＨ７．４の０．９％塩化ナトリウムを含む６７ｍＭリン酸ナトリウムーカリウム緩衝液の１０ｍｌに溶かし、
（２）次で、その溶液に対し、遠心分離（５０００×ｇ、５分間）を施し、それによって、フィブリノーゲンを溶解しているフィブリノーゲン溶解上清液を得、
（３）次で、そのフィブリノーゲン溶解上清液を、それに０．５ｍｇ／ｍｌメチルオレンジの１ｍｌとトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）の２．２ｍｇとを加えて撹拌後、２４穴マイクロプレート（溶液を保持する穴の２４個を設けている透光性板）の穴に、１穴あたり１００μｌの量で、注入し、
（４）次で、その２４穴マイクロプレートを、室温の温度に、１時間保ち、それによって、その２４穴マイクロプレートの穴内に、それに注入されたフィブリノーゲン溶解上清液による、フィブリンのゲルを得、
（５）次いで、その２４穴マイクロプレートの穴内のフィブリンのゲル内に、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって得た凍結乾燥処理の施された剤の溶液を、２４穴マイクロプレートの１穴あたり１００μｌの量で、注入し、
（６）次いで、２４穴マイクロプレートを室温で３０分間放置し、プロテアーゼでなる剤の溶液中のプロテアーゼによってフィブリンのゲルを構成しているフィブリンを溶解させる状態にし、
（７）次で、その状態で、２４穴マイクロプレートに対応のマイクロプレートリーダー（マイクロプレートの穴に保持されている溶液の吸光度を測定する装置）を用いて、２４穴マイクロプレートの穴内のプロテアーゼを含有している剤の溶液の注入されたフィブリンのゲルの、波長５２０ｎｍの光の吸光度を、測定した。
しかるところ、波長５２０ｎｍの光の吸光度が、１０分間に０．０５の割合で減少する測定結果が得られた。
【００１５】
以上のことから、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼとして得た凍結乾澡処理の施された剤が、線維素溶解活性を有することを確認した。
なお、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た凍結乾燥処理の施された剤について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｓｏｄｉｕｍ
Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を用いた電気泳動上のバンドを観測したところ、その電気泳動上のバンドが単一で得られたことから、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た凍結乾燥処理の施された剤が、高い純度を有することを確認した。
【００１６】
以上で、本発明による線維素溶解剤の製法の実施例が明らかになった。
本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって製造される、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する剤は、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から精製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する剤でなる、というものである。
【００１７】
このような本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって製造される線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する剤によれば、それが、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様の線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤であり、また、その線維素溶解剤が、プリンスメロン由来の線維素溶解剤であることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、その線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、血栓治療薬として高い有用性を有する。
【００１８】
さらに、本発明による線維素溶解剤の製法の実施例は、上述したところであるが、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として精製する、というものであり、その精製は、納豆由来の線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を納豆から精製する場合に比し困難であるとはいえず、また、ウリ科植物であるプリンスメロンの果実から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、納豆から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を精製する場合に比し格段的に高い収率で精製することができ、さらに、ウリ科植物であるプリンスメロンの果実自体、それが納豆の原料である豆に相当していることから、それを、納豆の場合に比し廉価に入手することができるので、線維素溶解剤を、納豆由来の線維素溶解剤の場合に比し、容易、廉価に提供することができる。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明による線維素溶解剤の製法は、血栓治療に用い得る線維素溶解剤の製法として広く使用することができる。