(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の環状ヌクレオチドホスフェートの濃度を測定するための競合的検定において；
捕獲抗体が提供された反応室中で、（１）前記環状ヌクレオチドホスフェートとアルカリ性ホスファターゼとの結合体、（２）前記捕獲抗体により結合を受け、その結合の際に前記環状ヌクレオチドホスフェートと結合する第一抗体、及び（３）前記サンプル、以上を混合して反応混合物を形成すること、及び当該反応混合物を前記第一抗体と前記結合体とが結合するようインキュベートすること、
前記のインキュベートした反応混合物を洗浄し、未結合の結合体または抗体を除去すること、
前記の洗浄した反応混合物に、前記結合体中のアルカリ性ホスファターゼと接触して分解及び発光が誘発される、アルカリ性ホスファターゼ誘発性（triggered）１，２−ジオキセタンを加えること、及び、
前記反応混合物によって発せられた化学ルミネセンスシグナルを検出すること、以上を含む検定方法。
【請求項２】
前記捕獲抗体が、反応室の表面上に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応室が、ミクロ滴定量用プレートのウェルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジオキセタンと共に高分子オニウム塩のエンハンサーを加えることで、誘発時の前記ジオキセタンによる発光量が、そのエンハンサー不在下での発光量と比べて高くなるようにする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学ルミネセンスシグナルをルミノメーターによって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応混合物を、前記１，２−ジオキセタンのインキュベーション期間中に少なくとも一回振盪する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記捕獲抗体を供給していない、前記ミクロ滴定量用プレートの壁の部分が、反応混合物の成分と反応しないようにブロックされている、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記環状ヌクレオチドホスフェートが、環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）、環状グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）、環状ウリジンモノホスフェート（ｃＵＭＰ）、または環状シチジンモノホスフェート（ｃＣＭＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記環状ヌクレオチドホスフェートがｃＡＭＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
環状ヌクレオチドホスフェートの濃度を測定する競合的免疫学的検定を行うためのキットにおいて；
前記環状ヌクレオチドホスフェートとアルカリ性ホスファターゼとの結合体；
前記環状ヌクレオチドホスフェートと結合する抗体；
捕獲抗体で被覆されている反応室；及び、
アルカリ性ホスファターゼの存在下で分解し発光するアルカリ性ホスファターゼ誘発性１，２−ジオキセタン、
以上を含む前記キット。
【請求項１１】
前記キットが、そのキットを用いて行う検定において、前記ジオキセタンの分解による発光量を、高分子オニウム塩不在下での発光量と比べて高める、高分子オニウム塩をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記検定を実行する際に試薬と接触する、前記反応室の捕獲抗体が供給されていない部分が、試薬と反応しないようブロックされている、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記環状ヌクレオチドホスフェートと結合する前記抗体が、単クローン性抗体である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記環状ヌクレオチドホスフェートが、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＵＭＰ、またはｃＣＭＰである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記環状ヌクレオチドホスフェートがｃＡＭＰである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記洗浄ステップが、ｐＨ８．０−１１．０の緩衝液を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記洗浄ステップの緩衝液が、炭酸−重炭酸緩衝液であり、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが細胞を含み、前記方法が当該細胞を溶解する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞を溶解する手段をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の領域
本発明は、環状ヌクレオチドモノホスフェートの存在を検出するための、競合的化学ルミネセンス検定に関する。通常、環状ヌクレオチドホスフェートは、化学的構造を考慮すればモノホスフェートとしてのみ存在する。これらの中でも、おそらく環状アデノシンモノホスフェートが、様々な細胞、細胞内及び細胞間経路における第一または第二メッセンジャーとしての意味を持つ、最もよく知られたものであろう。本発明の利点は、従来技術が出くわした感度及び動的範囲の問題点を克服する、化学ルミネセンス１，２−ジオキセタン試薬の高感度にある。
【０００２】
従来技術の背景
広く様々な代謝応答は、細胞間のｃAＭＰ放出がその鍵を握っている。多くの場合これらの応答は、ｃAＭＰが高いレベルで存在した際に多種多様な反応活性化の引き金となる、ｃAＭＰ−依存プロテインキナーゼによって媒介されている。ｃAＭＰが鍵を握る最もよく知られた代謝応答の中に、肝臓におけるグリコーゲンからグルコースへの変換があるが、同様にこのグリコーゲン／グルコースエネルギーサイクルには、様々な活性が鍵となっている。このサイクルにおいて、ｃAＭＰの上昇を誘発する重要なホルモンがエピネフリンである。しかしながら、ｃAＭＰ放出の引き金ともなる他のホルモンも多種あり、これがキナーゼを媒介とする代謝応答の鍵となる場合もある。これらのホルモンには、ＡＣＴＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、上皮小体ホルモン、バソプレッシン及びプロスタグランジンＩが含まれる。従って、人を含めた哺乳動物の特定の細胞において、ｃAＭＰのレベルが、様々なホルモン作用及び相互作用の重要な指標となりうることは明らかである。
【０００３】
ｃAＭＰは、唯一最もよく知られた環状ヌクレオチドである。通常、環状ヌクレオチドはモノホスフェートとして存在する。グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）、ウリジンモノホスフェート（ｃＵＭＰ）及びシチジンモノホスフェート（ｃＣＭＰ）は全て、広く様々なホルモン作用及び細胞間相互作用において重要な役割を担う可能性を有しており、好ましいことに、それらは測定可能である。ｃAＭＰは、これらの“メッセンジャー”環状ヌクレオチドの内で最も研究がなされている。
【０００４】
競合的エリザ検定を含め、ｃAＭＰの検定は既知である。広く報告されている検定は、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎから入手可能で、これが比色検定である。他の免疫学的検定製品は、ＩＧＥＮ及びＮＥＮと同様、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｍｅｄ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社より入手可能（放射免疫定量）である。Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎの態様には、競合的エリザ検定の典型的な例に出てくる検定キット（商標Ｂｉｏｍｏｌでも入手可能）が用いられており、ここでのシグナルの強度は、存在する環状ヌクレオチドの濃度と反比例する。Ｂｉｏｍｏｌによるキットは、吸光度の測定用である。蛍光検定のキットは、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手可能である。
【０００５】
様々な細胞サンプルの中には、検定に必要とされる環状ヌクレオチドの量が極少量のこともあり、そのため、高い感度が要求される。ｃAＭＰ用に市販されている検定製品の多くは、それ自体この感度を持ち合わせておらず、より高い感度を得るには、ｃAＭＰをアセチル化する（抗体結合をより高めるため）必要がある。
【０００６】
従って、高感度で、幅広い動的範囲を提供し、アセチル化を行わないことを含めた単純な方法により手に入れることの出来る試薬を用いる、競合的免疫学的検定を見出すと言う技術熟練者のゴールが残されている。
【０００７】
発明の要約
上記目的、及び下でさらに詳細に検討する他の目的は、１，２−ジオキセタンの高い化学ルミネセンス感度を頼みとする、化学ルミセンス競合的エリザ検定により満たされる。本文に関する共同の譲受人であり、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの一部であるＴｒｏｐｉｘ社により開発されたこれらのジオキセタンは、広く様々な米国特許の主題である。特許を請求する本発明に有用な１，２−ジオキセタンは、通常、式Ｉの一般構造を有している：
【０００８】
【化１】
0005021120.tif 000002
【０００９】
式Ｉ中におけるＹ1、Ｙ2及びＸは、様々な電子−活性部位であり、その際、それらは電子を供与するか、または電子を吸引している。具体的な群には、ハロゲン、特に塩素、アルコキシ、特にメトキシ、アミン、アルキル等が含まれる。別法において、これらの群は水素である。Ｙ1、Ｙ2またはＸのいずれか一つ以上が水素以外であることは可能で、またはそれら全てが水素であってもよい。置換基Ｒは、アルキル、アラルキル、環状アルキル、Ｏ、Ｎ、ＰまたはＳの部位を含むヘテロアルキルであり、それらの炭素原子は一般に２０個未満である。Ｒはアルキルであるのが好ましい。Ｒは、反応性と同様に溶解性を高めるような基で置換が可能であり、それには、一個以上のフッ素原子のようなハロゲン置換基、カルボキシ（ＣＯＯ）置換基、スルホニル置換基等が含まれうる。溶解性を高める同一の置換基が、Ｙ1、Ｙ2またはＸ上に存在することも可能である。Ａｒとはアリール部位のことで、通常はフェニルまたはナフチルであり、フェニルが最も好ましい。Ｚは酵素によって開裂する結合を含む部位のことで、その開裂の際には、アリール部位に付いているＯまたはＮのいずれかが開裂する。この陰イオンがジオキセタンを不安定にし、その分解へと導く。分解の際、ジオキセタンは発光する。本発明の趣旨において、Ｚはホスフェート部位であり、リン酸二ナトリウムが好ましい。このタイプのジオキセタンは、米国特許４，９６２，１９２；４，９３１，５６９；５，１１２，９６０；５，１４５，７７２及び５，６５４，１５４に報告があり、同様に他にも多々報告がある。前記特許は全て、本文中に参考のため記載してある。例えば、米国特許５，１１２，９６０の中で報告されているように、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3.7］デカン−４−フェニルホスフェート及びその塩（ＡＭＰＰＤ）のような酵素誘発性ジオキセタンは、このタイプの高い有効性を持つレポーター分子である。この“置換されていない”１，２−ジオキセタンに、そのアダマンチル環上に塩素原子のような置換基を誘導することにより（ＣＳＰＤ）、その性能を劇的に向上させることが可能になる。同様に、酵素で開裂可能な置換基と隣り合わせのフェニル基上、特にその３位またはメタ位に置換基を導入すると、さらに収率が改善される。本来化学ルミネセンスであるこれらのレポーター分子を酵素誘発性ジオキセタンと呼ぶ。特許を請求する本発明において、その役割を果たす各酵素はアルカリ性ホスファターゼであり、従ってＺをホスフェート部位として選定する。
【００１０】
本文中に参考として記載もした米国特許５，１４５，７７２及び米国特許５，３３６，５９５において記載されているように、エンハンサー分子として高分子オニウム塩（アンモニウム、ホスフォニウム及びスルホニウム）を用いると、分解時のジオキセタンからの発光の度合いを高める結果になる。このことは、これらの高分子ポリマーが、化学ルミネスンス発光を最大限にする非水の“ミクロ環境”において、高い疎水性のジオキセタン陰イオンを隔離する性質を持つことによるものである。さらに米国特許５，１４５，７７２において報告されているように、これらのジオキセタンは、フルオレセインのようにエネルギーを受容する蛍光性分子と併用することも可能であり、そうすることで、分解時にジオキセタンから放出されたエネルギーは蛍光受容体へと移行し、その蛍光が検出される。本発明の検定は、特に化学ルミネセンス発光に適している。
【００１１】
１，２−ジオキセタンも、その製法またはそれ自体の用途も、エンハンスメント剤を単独で用いるか、米国特許５，５４７，８３６で触れられているもののような第二のエンハンスメント剤と一緒に用いるかということも、それ自体、本発明の一局面を成すものではない。
【００１２】
本発明の検定において、ミクロ滴定用ウェルまたは同様な“反応室”は、例えばヤギの抗ラビットＩｇＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘを含む広く様々な所から入手可能）のような捕獲抗体で被覆されている。
【００１３】
本発明に従い、ｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼとの結合体を調製し、これを、ｃＡＭＰ（または他の環状ヌクレオチド）に対する抗体及び検査しようとするサンプル（または標準物質）と共にウェルに入れる。この反応混合物をインキュベートして洗浄する。次に、ＣＳＰＤのようなアルカリ性ホスファターゼ誘発性（triggered）１，２−ジオキセタンを、好ましくはポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）のようなエンハンサー、または他のエンハンスメント剤の存在下で加える。このジオキセタンをインキュベートし、好ましくはルミノメーターまたは他種の感光装置を用いて、反応室の化学ルミネセンスシグナルを検査する。そのシグナルが強ければ強いほど、サンプル中の環状ヌクレオチドの濃度は低い。
【００１４】
本発明の詳細な説明
本発明の検定プロトコルは、他の競合的免疫学的検定のそれと類似しており、検出されたシグナルの強度と環状ヌクレオチドの濃度との間には反比例の関係があることを示している。本発明は、通常、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＣＭＰ、ｃＵＭＰ、ｃＩＭＰ及びｃＴＭＰを含めた環状ヌクレオチドに適応可能であるが、しばしば広く様々な生物物理学的経路において一直線の反比例関係を示す、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰが最も注目を集めている。ｃＡＭＰが最もよく研究され、最も特色のある環状ヌクレオチドであることは明らかであり、従って本発明は、ｃＡＭＰ及びｃＡＭＰ検出試薬を用いて例示する。他の環状ヌクレオチド用に、試薬、特に第一抗体、好ましくは単クローン性抗体を換えることは、本文の記載にあるように技術熟練者にとっては簡単なことであり、容易に達成される。
【００１５】
また本発明は、上記一般式Ｉにおいて、そのアダマンチル基が１個の塩素原子で置換され、Ｘが水素であり、Ｒがメチルであり、さらにＺがホスフェートであるＣＳＰＤを用いて例示される。一般式Ｉに対応する、他のアルカリ性ホスファターゼ誘発性１，２−ジオキセタンを適宜用いることもある。
【００１６】
また本発明は、Ｔｒｏｐｉｘ社から入手可能なエンハンスメント剤を用いて例示した例もある。エンハンスメント剤の例として、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）を選んだ。エンハンスメント剤は好ましいが、本発明の実施に必要なものではない。ウシ血清アルブミンを含めた巨大プロテインのような疎水性の高分子と同様、他の四級オニウムポリマーも同じように用いることができる。
【００１７】
本発明を実施するにあたり、まず、通常のミクロ滴定用プレートのウェルまたは類似の反応室を捕獲抗体で被覆する。本発明の具体例における捕獲抗体はヤギのアンチラビット抗体である。プレートのウェルは捕獲抗体を調製したもので被覆し、一晩インキュベートした後に洗浄する。非特定の結合を避けるため、プレートの残り部分を処理することにより、そこでの相互作用は抑制可能となる。これに従い、洗浄後、各プレートをスーパーブロックブロック緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅより入手可能）または類似薬剤で処理する。その後プレートは乾燥させる。この工程は図１に記載されている。
【００１８】
調製したプレートは、これで競合的検定に用いる反応室またはウェルとしての準備ができた。ｃＡＭＰの供給源は、標準値を設定するために特定の稀釈液に調製した標準物質、または、検査用のサンプルを提供するためにある種の刺激を与え、その後溶解させた細胞のいずれかである。このようにして細胞の溶解物またはｃＡＭＰの標準物質を、ｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼの結合体と共に、本文中で後に記載するウェルに入れる。最後に、第一抗体、すなわちｃＡＭＰの抗体を反応混合物に加える。ｃＡＭＰに対しては、多クローン性及び単クローン性抗体のいずれも可能である。どちらかを有効に用いることができる。ラビットの抗ｃＡＭＰ抗体は、抗原と同様、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手可能である。他の抗体も同様に入手可能である。被覆したウェルの中で反応体を混合した後、抗体が十分結合するまでインキュベートする。通常、インキュベーションは室温、約１時間で行う。次にインキュベートした反応混合物を洗浄緩衝液で繰り返し洗浄するのだが、その緩衝液は、ｐＨが約８．０−１１．０（実例の値は約９．６である）で、０．０５Ｍのカーボネートビカーボネート及び０．０５％のトウィーン−２０であってもよい。出願者は推測して望んでいたわけではなかったのだが、この洗浄緩衝液のアルカリ性は、アルカリ性ホスファターゼの性能を高めることも可能である。検定の緩衝液それ自体は、検定に好都合なｐＨ、すなわち約５．５から６．０の間、好ましくは５．８のｐＨで、酢酸ナトリウム（０．０５モル）と混合したＢＳＡ（０．０２％）である。技術熟練者は、ミクロ滴定用ウェルの被覆に用いられる緩衝液と同様、ブロック緩衝液、洗浄緩衝液及び検定の緩衝液が同一であるということ、それ自体は本発明の確固たる特徴ではなく、むしろそれは普通の技術熟練者によって様々に変えることが可能であり、それでもなお特許を請求する本発明を使用できると認識するであろう。
【００１９】
洗浄後、ジオキセタンを、もし入れるとすればエンハンサーと共に加える。続いて、化学ルミネセンスジオキセタンからの発光が増大して一定のレベルに達するよう、さらに室温で３０分間インキュベーションし、その化学ルミネセンスシグナルを、トロピックス７１７またはノーススタールミノメーター検出器（ＣＣＤ）のような検出器で読み取る。この検定プロトコルそれ自体を図２に示す。
【００２０】
本検定が、高い処理量を提供する自動化されたロボットによる検定システムに最適であることは明らかであろう。図２に示したように、１時間のインキュベーションが標準的なプロトコルである。感度及び動的範囲に関する結果は、インキュベーション期間中、そのミクロ滴定用プレートまたは反応室を振盪すると、著しく向上させることができる。振盪した検定と振盪しなかった検定との性能の比較が後記の図３に記してある。
【００２１】
本検定は、広く様々な条件下で使用するのに適している。その高められた感度及び広げられた動的範囲が、適用を様々な変数と矛盾のないものにしている。標準が設定されている場合、本発明に従って検定されるサンプルは、哺乳類の付着及び非付着細胞系を溶解することによって得ることができる。広範囲にわたる細胞濃度において最適な実施が可能であり、その範囲は、細胞の種類によって決まるが、９６−ウェルプレートの場合、１ウェルにつき細胞は１，０００−１００，０００の範囲である。ウェルの数がより多い他のプレートも使用可能である。化学ルミネセンスシグナル（発光）の検出には、ルミノメーターの使用がお勧めである。ルミノメーターを使用する場合、測定単位は１ウェルにつき１秒が適当である。別法として、ルミノメーターの代わりに、商標トップカウントとして入手可能なもののようなシンチレーション計数計を使用することも可能である。感度が落ち、化学ルミネセンスを直接測定するために同時進行回路を切ることが必要なこともある。
【００２２】
本検定の“競合的”である所以は、ｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼとの結合体（ｃＡＭＰ−ＡＰ結合体）の使用にある。アルカリ性ホスファターゼ−開裂性ジオキセタンを開裂させるのは、ｃＡＭＰに特異的な抗体によって捕獲されたこのｃＡＭＰ−ＡＰ結合体のアルカリ性ホスファターゼである。従って、溶解させたサンプル中のｃＡＭＰの濃度が低ければ低いほど、第一抗体によって捕獲されるｃＡＭＰ／ＡＰ結合体が多くなり、よりシグナルが大きくなる。結合体の調製は簡単で、これにはアルカリ性ホスファターゼと共に、ＮＨＳ活性化ｃＡＭＰが（１モルのＡＰに対して活性化ｃＡＭＰ４モルの比で）合わせ含まれている。この調整法は図４に示してある。
【００２３】
上記のように、標準物質を設定することは必要であり、それによって、設定した濃度を基に溶解したサンプル中の実際の濃度が測定可能となる。代表的な標準曲線を集めたものを図６に記してあるが、これは本検定の非常に優れた性能を示している。
【００２４】
ｃＡＭＰ検出の様々な検定に関する感度及び動的範囲を開示してきた。様々な検出システムの感度及び動的範囲を図７に示す。ジオキセタンの化学ルミネセンス技術をｃＡＭＰ−特異的免疫学的検定技術と合わせることによって得られた感度及び動的範囲における予想外の向上が、たとえアセチル化をしなくても、予想しえなかった極めて優れた成果をもたらしたことは明らかである。
【００２５】
前述のように、本発明の環状ＡＭＰの化学ルミネセンス検定は、ルミノメーターにより検出するのが好ましい。例として二つのルミノメーター、ＴＲ７１７対オリオンＣＣＤを図８で比較している。どちらも、本発明によってもたらされたより優れた成果を示している。
【００２６】
本発明を包括的に、そして特定の実施例に関して開示してきた。特定の実施例は、そのような表示がない限り、限定の意味も持たなければ、そう解釈されるものでもない。特に、普通の技術熟練者にとって、発明の技術を用いることなく、ジオキセタンの性質、緩衝液の成分、シグナルの検出装置、プロトコルの時間、温度及び条件等に変化が生じることもあろう。前記特許請求の範囲の詳説によって除外されない限り、それらの変化も本発明の範疇にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の被覆したプレートまたは反応室の製法を図示したフローチャートである。
【図２】  本発明の検定のステップを図示したフローチャートである。
【図３】  インキュベーションの期間中に、反応混合物を振盪することによって得たシグナルと、振盪しなかった対照のシグナルとの比較を図示して表にしたデータである。
【図４】  本発明のアルカリ性ホスファターゼ／環状ヌクレオチド結合体の製法を図示したものである。
【図５】  省略する。
【図６】  様々な濃度のｃＡＭＰに対する標準的なシグナルを図示したものである。
【図７】  特許を請求する本発明の感度及び動的範囲を、他に市販されているｃＡＭＰの検定と比較した表である。
【図８】  本明細書の本発明に従い、異なる二種のルミノメーターで得たデータを比較したものである。
【図１】
0005021120.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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