(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蘇葉抽出物に蒸留水（水）と有機溶媒を混合した後、有機溶媒層を除去し、水溶層をＸＡＤ−７カラムクロマトグラフィに入れ、アセトンとメタノールを加えて有機溶媒溶出液を得、前記有機溶媒溶出液からシリカカラムクロマトグラフィにより分画液を得、前記分画液から分取薄層クロマトグラフィによりベルベリンを分離することを特徴とする蘇葉抽出物から胃潰瘍予防及び治療効果を有するベルベリンを抽出する方法。
【請求項２】
前記有機溶媒がクロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、及び酢酸エチルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の蘇葉抽出物から胃潰瘍予防及び治療効果を有するベルベリンを抽出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は胃潰瘍の予防及び治療に効果的な蘇葉抽出物とその用途及びそれからベルベリンを得る工程に関し、より具体的には、胃炎、胃潰瘍の原因菌として知られるヘリコバクターピロリに対して抗菌活性を有する胃潰瘍の予防及び治療に効果的な蘇葉抽出物とその用途及びそれからベルベリンを得る工程に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクターピロリは１９８３年ウォレンとマーシャルにより分離された後（Ｌａｎｃｅｔ，１９８３，１，１２７３−１２７５）、胃炎及び十二指腸潰瘍の原因菌と明かされ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９９０，１６１，６２６−６３３；Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，９１，５６６−５７２）、現在は胃癌発病因子の一つと認められ全世界的な関心と研究の対象となっている。ヘリコバクターピロリは胃粘膜上皮細胞間の接合部に棲息するグラム陰性肝菌で、最適ｐＨは７．０〜７．４であり、３０〜３７℃の微好気的条件で生長するが、このような条件が充足されないか又は環境の変化が生ずると、コッコイド（球菌状）形態への変化が観察される。その病原性因子として最も代表的な特徴である強力なウレアーゼの生産能と胃粘膜層に対する付着及び移動を可能にするフラジェラ（鞭毛）などがあり、また、Ｖａｇ  Ａ、Ｃａｇ  Ａ、リポ多糖類などを含む細胞毒が研究されている。
【０００３】
これまでは、ヘリコバクターピロリによる消化器疾患の予防及び治療は３重化学療法に代表される多様な抗生物質に依存しているが、持続的な使用による耐性菌の出現又は再発性疾病の危険により依然としてその限界が指摘されている。これを克服するための努力としてワクチンの開発のための免疫学的方法又は乳酸菌を用いるアプローチ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１９９５，７９，４７５−４７９；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，１９８９，２７，２３２８−２３３０）などが試されている。
【０００４】
最近では、多様な天然物素材からヘリコバクターピロリを抑制し得る活性成分を探し出すための努力が持続されている。オオタ（Ｏｈｔａ）などはニンニク抽出物（ｇａｒｌｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔ）から多様な活性物質を分離報告し（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９９，４３，１８１１−１８１２）、マベ（Ｍａｂｅ）などは緑茶内のカテキン類化合物に対し、試験管内でだけでなく生体内水準でヘリコバクターピロリ抑制能を確認したことがある（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９９，４３，１７８８−１７９１）。そのほかにも、イブキジャコウソウ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１９９６，８０，６６７−６７２）又は多様なフラボノイド（Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，１９９５，４５，６９７−７００）からも強力な活性が報告されている。特に、最近には漢方素材から活性植物を探索するための努力が日本国と韓国を中心に活発に展開されている（Ｊ．Ｔｒａｄ．Ｍｅｄ．，１９９５，１２，１２９−１３６；新薬の臨床，１９９７，４６，４９−５３；Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９９８，２１，９９０−９９２）。
【０００５】
本発明者らは胃潰瘍の予防と治療に食用と薬用に同時に使用される蘇葉を使用しようとした。蘇葉（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ａｃｕｔａ  ＫＵＤＯ）は紫蘇とも言われ、漢方では発汗、止血、鎮咳、風疾（中風）、鎮痛、鎮静、利尿などに使用してきた。蘇葉は紫蘇科（Ｌａｂｉａｔａｅ）に属する１年生草で、花は８〜９月に薄い紫色で咲く。日本国では“シソ”と言われ、香辛料及び食用色素として重要な位置を占めている。蘇葉には主としてアントシアニンが多様に含有されており、ペリロサイド（ｐｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ）などのグルコシド物質が多く報告されている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，１９９４，３７，５４３−５４６；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，１９９２，３１，３２６５−３２６７）。
【０００６】
そこで、本発明者らは食用素材である蘇葉からヘリコバクターピロリに対する抗菌活性、ウレアーゼ活性などの直接的な除菌効果と胃内定着性、インターロイキン−８生成抑制などの効能を確認し、これに対する有効成分を同定しようとした。また、蘇葉抽出物と有効成分を用いる胃潰瘍予防と治療用食品及び薬品を提供しようとした。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主目的は、食用素材である蘇葉から胃炎及び胃、十二指腸潰瘍の原因菌であるヘリコバクターピロリに対して抗菌活性、ウレアーゼ活性、胃内定着性、インターロイキン−８生成抑制などの効能を確認し、これに対する有効成分を同定して提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明のほかの目的は、蘇葉抽出物と有効成分を用いる胃潰瘍予防及び治療用食品と薬品を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは昔から漢方で発汗、止血、鎮咳、風疾（中風）、鎮痛、鎮静、利尿などに使用してきながら食用にも使用した蘇葉を熱水抽出して、国内の胃潰瘍患者から分離したヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＫＳ  ５１菌下部に対する抗菌活性を確認した。この蘇葉抽出物に対してヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制と胃内定着抑制効果、そしてヘリコバクターピロリによる胃炎発生メカニズムに関与するインターロイキン−８の生成抑制効果を確認した。また、蘇葉からカラムクロマトグラフィ（ＸＡＤ−７，シリカ、セファデックス  ＬＨ−２０）と薄層クロマトグラフィを実施して、その有効成分としてベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）を分離、同定した。
【００１０】
本発明は、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性及びヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果、胃上皮細胞定着性抑制効果、インターロイキン−８生成抑制効果を有するように、生薬素材である蘇葉を熱水抽出し濃縮して製造した熱水抽出物と、前記生薬素材である蘇葉を溶媒抽出し濃縮して製造した溶媒抽出物との中で１種以上を含むことを特徴とする胃潰瘍予防及び治療効果を有する蘇葉抽出物を提供する。
【００１１】
前記熱水抽出物は、前記蘇葉に一定量の水を添加し、高温で一定時間熱水抽出した後、その濾液を減圧濃縮することで製造される。好ましくは、蘇葉に添加される水の量は蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０倍添加され、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出され、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造される。
【００１２】
前記溶媒抽出物は、前記蘇葉に一定量のエタノールを添加し、高温で一定時間抽出した後、その濾液を減圧濃縮することで製造される。好ましくは、エタノールは蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０倍添加され、５０〜９０℃で４〜８時間抽出し、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造される。
【００１３】
前記方法により製造された蘇葉抽出物（熱水抽出液及び／又は溶媒抽出液）を有効成分として含有して発酵乳又は飲料に製造できる。また、前記方法により製造された蘇葉抽出物を有効成分として含有し、これに薬剤学的に許容される及び補助剤を混合し、薬剤学的に許容される方法で剤形化して薬学製剤を製造することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
蘇葉抽出物（特に、熱水抽出物）の製造
熱水抽出物は蘇葉に一定量の水を添加し、高温で一定時間熱水抽出した後、その濾液を減圧濃縮することで製造される。好ましくは、蘇葉に添加される水の量は蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０倍添加され、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出され、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造される。
【００１５】
本発明の実施例１においては、蘇葉１５０ｇを加熱循環式抽出タンクに入れ、水１３５０ｍｌを加え９５℃で８時間抽出した後、１４９μｍの濾過布で濾過し、４０〜７０ｃｍＨｇで５０℃で減圧濃縮することにより、６５ｂｒｉｘ°の蘇葉濃縮液３７ｇを得た（実施例１参照）。
【００１６】
蘇葉溶媒抽出物の製造
溶媒抽出物は、蘇葉に一定量のエタノールを添加し、高温で一定時間抽出した後、その濾液を減圧濃縮することで製造される。好ましくは、エタノールは蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０倍添加され、５０〜９０℃で４〜８時間抽出し、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造される。
【００１７】
本発明の実施例２においては、蘇葉１ｋｇを加熱循環式抽出タンクに入れ、５０〜７０％のエタノール１０ｋｇを加え５５〜８５℃で４〜１５時間抽出した後、１４９μｍの濾過布で濾過し、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することにより、固形分が０．１〜２０％である抽出液を得た。これにデキストリンなどの副溶剤を混合して濃縮度１０〜７０ｂｒｉｘ°の蘇葉溶媒抽出物を得た（実施例２参照）。
【００１８】
蘇葉からのベルベリンの分離
蘇葉からベルベリンを分離するためには、蘇葉抽出物に蒸留水（水）と有機溶媒を加えて混合した後、有機溶媒層を除去し、水溶層をＸＡＤ−７カラムクロマトグラフィに入れ、アセトンとメタノールを加えて有機溶媒溶出液を得、前記有機溶媒溶出液からシリカカラムクロマトグラフィより分画液を得、前記分画液から予備ＴＬＣ（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＴＬＣ）によりベルベリンを分離することができる。
【００１９】
前記有機溶媒の好ましい例は、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル及び酢酸エチルである。
【００２０】
多様な天然物が蘇葉の二次代謝産物として報告されたことがあるが、そのなかで抗ヘリコバクターピロリ活性を有する物質は知られていないため、抽出物に存在する種々の成分から抗ヘリコバクターピロリ活性物質をいろいろの分離技法で分離した。蘇葉抽出物に対する有機溶媒分画により非水溶性分画を分離した後、水溶性分画に対してＸＡＤ−７カラムクロマトグラフィを実施して水溶層内に存在する多量の糖成分を除去した。以後、シリカカラムクロマトグラフィと薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）など分離技法により分離された活性分画から単一の有効成分を得ることができる。各分離段階で得られた分画に対して抑制環法で活性を追跡し、活性物質の分離程度はＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により確認した（実施例３参照）。
【００２１】
ベルベリンの同定
クロマトグラフィにより活性成分が単一物質として分離されることにより、ＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）とＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によりその構造を決定して活性物質の構造を確認し、この構造がイソキノリン系列のアルカロイド物質であるベルベリンと同定された。ＥＳＩ−ＭＳ測定で［Ｍ］＋が３３６と観察され、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで水素と炭素の数を確認して分子式がＣ21Ｈ21ＮＯ3であることが分かった。以下、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣなどの２Ｄ−ＮＭＲ実験及びＦＴ−ＩＲスペクトルから物質の構造式を確認し、このような結果がベルベリン標準物質のスペクトルと正確に一致することを確認した（実施例４参照）。
【００２２】
抗菌活性
蘇葉抽出物とその有効成分であるベルベリンがヘリコバクターピロリに対して有する抗菌活性をヘリコバクターピロリの寒天培地と液体培地でそれぞれ確認した。寒天培地を用いる抑制環測定において、蘇葉抽出物は１０ｍｇ／ｍｌ以下の低濃度では抑制環を形成することができなかったが、２０ｍｇ／ｍｌの濃度では直径１８ｍｍの抑制環を形成することが観察された。ベルベリンの場合には、２．０ｍｇ／ｍｌの低濃度でも２５ｍｍの抑制環を形成することにより強力な抗菌活性を表した。前記実験で蘇葉抽出物及びベルベリンが強力な抗菌活性を確認することにより、ヘリコバクターピロリの液体培養を通じて抽出物とベルベリンのヘリコバクターピロリに対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。二倍希釈法により濃度の異なる素材を液体培地にそれぞれ溶かし、各培地に菌を接種した後、菌の生長抑制を、生菌数、ウレアーゼ活性、菌懸濁度の測定により観察した。三つの測定方法とも濃度依存的に素材が菌の生長を抑制することが観察され、蘇葉抽出物とベルベリンはそれぞれ２５０μｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌが最小阻止濃度であることが測定された（実施例５、６参照）。
【００２３】
ヘリコバクターピロリ胃内定着抑制効果
前記抗菌活性とは別にヘリコバクターピロリの胃表皮細胞定着に対する蘇葉抽出物の抑制効果を観察するため、胃上皮腫瘍細胞であるＡＧＳ細胞培養液にヘリコバクターピロリ接種前と接種後にそれぞれ濃度別に素材を添加して予防と治療の２方法で抑制能を測定した。ヘリコバクターピロリ接種に先立って、素材を投与した予防効果測定群においては、２％の素材濃度で９８％の効果を示し、１％と０．５％濃度でも６０％以上の高い効果を示した。素材を接種後に投与した治療効果測定群においても、２％素材濃度で８０％、１％と０．５％の濃度では４０％以上の効果が観察されたが、予防効果よりは抑制能が低いことが判明した（実施例７参照）。
【００２４】
ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるインターロイキン−８生成抑制効果
胃腸及び小腸の上皮細胞がバクテリアに露出されると、サイトカインの生成を誘導することになり、このようなサイトカインの増加はヘリコバクターの感染による炎症反応を起こす原因として知られている。ヘリコバクターピロリの場合、インターロイキン−８が胃上皮細胞に好中球又はマクロファージを活性化させる代表的なサイトカインとして知られている。したがって、感染された組織細胞のインターロイキン−８生成量の減少により素材による感染抑制の効果を確認することができる。ＡＧＳ細胞にヘリコバクターピロリを感染させた後、１％（ｗ／ｖ）濃度の蘇葉抽出物を投与し、インターロイキン−８の生成量を測定した結果、対照群に比べＡＧＳ細胞によるインターロイキン−８の生成量が８５％減少することが観察された（実施例８参照）。
【００２５】
動物実験によるヘリコバクターピロリ感染抑制効果の確認
ヘリコバクターピロリ感染に対する蘇葉抽出物の予防と治療効果を４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスで確認した。その結果、蘇葉熱水抽出物をまず投与してヘリコバクターピロリの感染を予防した場合、ヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性測定とウレアーゼ活性測定の結果、それぞれ９２．５％と８７．５％の予防率を示した。
【００２６】
また、ヘリコバクターピロリをまず感染させた後、選択された乳酸菌を投与した治療の側面では、蘇葉熱水抽出物を投与した場合、生菌水とウレアーゼ活性測定の結果、それぞれ８２．５％と８０．０％の治療率を示した。
【００２７】
したがって、ヘリコバクターピロリの感染に対して蘇葉抽出物を使用すると、高い予防と治療効果が得られることを確認した（実施例９参照）。
【００２８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。しかし、つぎの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲で当業者による通常の変化が可能である。
【００２９】
実施例１
蘇葉の熱水抽出
食用と薬用の両方に使用されている蘇葉から熱水抽出物を製造した。蘇葉１５０ｇを加熱循環式抽出タンクに入れ、水１３５０ｍｌを加えた後、およそ９５℃で８時間抽出して粗抽出液を得た。前記粗抽出液を１４９μｍの濾過布で濾過した後、５５ｃｍＨｇで減圧濃縮して６０ｂｒｉｘ°以上の蘇葉濃縮液３７ｇを得た。
【００３０】
実施例２
蘇葉の溶媒抽出
蘇葉１ｋｇを加熱循環式抽出タンクに入れ、６０％エタノール１０ｋｇを加え６０℃で１０時間抽出した後１４９μｍの濾過布で濾過し、５５ｃｍＨｇで減圧濃縮して固形分１０％の抽出液を得た。これにデキストリンなどの副溶剤を混合して濃縮度が４０ｂｒｉｘ°である生薬濃縮液を製造した。
【００３１】
実施例３
蘇葉からのベルベリン分離
蘇葉に存在する抗ヘリコバクターピロリ活性物質を同定するため、実施例１で製造された蘇葉抽出物に対し、図１に示すように、順次クロマトグラフィ技法を実施して単一の主活性物質を分離した。各分離段階で分けられた分画に対しては抑制環法で活性を確認し、分離の程度をＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析で観察した。
【００３２】
１）抑制環方による抗菌活性の確認
活性を確認しようとする分画物を一定濃度でメタノールに溶かした後、０．４５μｍフィルタで濾過した。濾過液２０μｌを滅菌されたディスク（ＢａｃｔｏＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｋ，  Ｄｉｆｃｏ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）に吸収させ、ディスクが乾燥すると、２０μｌを更に滴下した後、溶媒が完全に除去されるまで無菌条件で放置した。培養２４〜４８時間を経たヘリコバクターピロリをブルセラ寒天培地に塗抹し、その上にディスクを置いた後、プレートを１０％ＣＯ2培養器で３７℃で７２時間培養した。分画物の活性はディスク周囲に形成された抑制環の大きさで確認した。
【００３３】
２）分画物の分析
分画物の分析はＴＬＣとＨＰＬＣにより行われた。ＴＬＣプレートはメルク社の製品（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。展開溶媒はＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ＝７：１：０．５とトルエン／ＣＨＣｌ3＝１：１の２種を使用し、ヨード蒸気とＵＶ（２５４ｎｍ）で確認した。
【００３４】
ＨＰＬＣ分析に使用されたカラムはウォーターズ社の製品（ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋ，Ｃ１８，３００×４．６ｍｍ）であり、移動相は水／ＭｅＯＨを１．０ｍｌ／分の流速にして用いた。分析は２８５ｎｍで行い、２０μｌを注入して分析した。
【００３５】
３）有機溶媒による水溶性物質の分画
有機溶媒に対する溶解度と極性の差を用いて蘇葉抽出物内の物質を水溶層と有機溶媒層に分離した。適切な有機溶媒の選定のため、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチルの４種の有機溶媒を比較した結果、クロロホルムとジクロロメタンでは０．９％（ｗ／ｗ）の物質が移動し、残りの有機溶媒では、０．２％以下しか移動しなかった。また、ジクロロメタンがクロロホルムより人体にもっと有害であるので、クロロホルムを利用し、抽出物を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶かした後、これに同じ容積のクロロホルムを分離ファネル（ｓｅｐａｒａｔｏｒｙ  ｆｕｎｎｅｌ）で２回分画して水層から非極性物質を除去した。
【００３６】
４）ＸＡＤ−７カラムクロマトグラフィ
水溶層を濾過紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．４）で濾過して沈殿物を除去した後、減圧濃縮し、再び蒸留水を加えて２５ｍｇ／ｍｌ濃度の抽出溶液を製造した。アンバーライトＸＡＤ−７（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７）（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔ，  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）をオープンカラム（ｏｐｅｎ  ｃｏｌｕｍｎ）に充填した後、メタノールで十分に洗浄し、再び２倍容積の蒸留水を注いでメタノールを除去した。樹脂に対して１：１４（乾燥抽出物重量／樹脂重量）の抽出物溶液をカラムに滴下した後、標本容積の６０倍の蒸留水でカラムを溶出させて糖類を含む水溶性物質を除去した。標本容積の８０倍のメタノールを再び溶出させて非水溶性物質を得、最後にメタノール容積の半分のアセトンを加えて洗浄した。アセトン分画物とメタノール分画はＴＬＣで確認した結果、同じパターンを示し、抗菌活性も同じ水準であったので、２分画物を合わせた。
【００３７】
各溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を減圧濃縮した後、定量的にヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を測定した結果を以下の表１に示した。水溶層では抗菌活性が全く表われなかったし、活性が有機溶媒層に全て移動されたことが確認できた。溶出液から得られた水溶性分画とメタノール分画に対して１．０ｍｌずつを取った後、フェノール−サルファリック法（ｐｈｅｎｏｌ−ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）を実施して２分画内の総当量を定量した。抽出液溶液をＸＡＤ−７により溶出させた場合、水層での糖含量は９７．０ｍｇ／Ｌと表われ、有機溶媒層では２．９ｍｇ／Ｌの糖含量が測定された。すなわち、ＸＡＤ−７カラムを用いて抽出物から９６％以上の糖を除去することができた。
【００３８】
【表１】
0004888750.tif 000002
【００３９】
５）シリカカラムクロマトグラフィ
ＸＡＤ−７を通過した有機溶媒分画を少量のメタノールに溶かした後、十分な量のセライト（ｃｅｌｉｔｅ）（Ｙａｋｕｒｉ，Ｊａｐａｎ）を注ぎ、減圧濃縮器でメタノールを全て除去して抽出物をセライトに吸着させた。カラムにグラスウールを詰めた後、その上にセライトを表面が水平となるようにパッキングを行った。シリカゲル（Ｃａｔ．Ｎｏ．１．０９３８５，Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を高さ８．０ｃｍとなるように注いだ後真空状態で２０分間圧力を加えて確実にパッキングした。減圧下で２００ｍｌのアセトンを注いで不純物を除去した後、アスピレータ（吸引器）を用いて１２時間乾燥させた。蘇葉抽出物が吸着されたセライトをシリカカラム上に充填した後、減圧下でメタノールの比率が０％から５０％まで段階的に増加したクロロホルム／メタノール溶液を順に溶出させた後、チューブに受けた。各分画をＴＬＣで確認した結果、６分画に分けることができ、このなかでＦｒ．５で高活性が観察された。
【００４０】
６）予備ＴＬＣ（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＴＬＣ）
活性分画を減圧濃縮した後、ＴＬＣ板（ＴＬＣ  ｐｌａｔｅ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．，１．０５７４４，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，０．５ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の出発線上に吸着させ、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3／ＡｃＯＨ＝７：２：０．５に展開した。板を２８０ｎｍで観察したとき、Ｒｆの値がそれぞれ０．１１〜０．１５、０．１５〜０．２１、０．２２〜０．３７、０．３７〜０．６４、０．６９〜０．７１である五つのバンドを確認した後、スクレーパで掻いた。掻き出したシリカはアセトンとクロロホルム／ＭｅＯＨ（７：１，ｖ／ｖ）溶液で溶出して、吸着された物質を分離した。抗菌活性を確認した結果、Ｒｆ値が０．１５〜０．２１である分画（Ｆｒ．５−Ｍ）でのみ活性が表われた。
【００４１】
実施例４
ベルベリンの構造分析
クロマトグラフィの実施により活性成分が単一物質として分離されることによりＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）とＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によりその構造を決定して、活性物質が図２の構造を有することを確認し、この構造はイソキノリン系列のアルカロイド物質であるベルベリンであると同定された。ＥＳＩ−ＭＳ測定で［Ｍ］＋が３３６と観察され、１Ｈ−ＮＭＲ（図３、表２）と１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４、表３）で水素と炭素の数を確認して、分子式がＣ21Ｈ21ＮＯ3であることが分かった。以下、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（図５）、ＤＥＰＴ（図６）、ＨＭＱＣ（図７）、ＨＭＢＣ（図８）などの２Ｄ−ＮＭＲ実験及びＦＴ−ＩＲ（図９）スペクトルから物質の構造式が図２のようであることを確認し、このような結果はベルベリン標準物質のスペクトルと正確に一致した。
【００４２】
【表２】
0004888750.tif 000003
【００４３】
【表３】
0004888750.tif 000004
【００４４】
実施例５
培地分散（Ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）方法によるヘリコバクターピロリ抗菌活性比較
前記実施例１及び２から得られた蘇葉抽出物とベルベリンに対してヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を培地分散（ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）法により確認した。まず滅菌されたシリンダをペトリ皿の適当な位置に立てた後、２５ｍｌのブルセラ寒天培地を注いで固めた。予め培養されたヘリコバクターピロリをブルセラブロスに懸濁して吸光度（４５０ｎｍ）を１．２となるようにした。菌懸濁液２００μｌを液体状態のソフト寒天（０．８％）培地に添加し、これをすぐシリンダ板に注いで均等に分散させた。この板を１０％の二酸化炭素インキュベータ（ＣＯ2  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に入れて培地を固めた後、シリンダをピンセットで除去し、各試料をシリンダにより形成された培地に１７０μｌずつ加えた。この板を３７℃、１０％ＣＯ2の条件で７２時間培養した後、形成されたクリアゾーンの大きさを測定して抗菌効果を比較した。
【００４５】
培地分散法による蘇葉抽出物と蘇葉抽出物とベルベリンのヘリコバクターピロリに対する抗菌活性結果を表４に示した。蘇葉抽出物は２．０ｍｇ／ｍｌと２０．０ｍｇ／ｍｌの２濃度でブルセラブロスに溶かした後、フィルトレーションで除菌して使用し、ベルベリンは２．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶かし除菌して使用した。対照群でＤＭＳＯの抗菌活性の有無を確認した。蘇葉抽出物は２．０ｍｇ／ｍｌの濃度ではクリアゾーンを形成することが全くできなかったが、２０．０ｍｇ／ｍｌの濃度では１８ｍｍ程度のクリアゾーンを形成して高い抗菌活性を表した。その有効成分であるベルベリンの場合は、２．０ｍｇ／ｍｌの濃度でクリアゾーンが２５ｍｍ程度と非常に高い活性を表わした。反面、対照群であるＤＭＳＯはクリアゾーンを全く形成できなかったので、ベルベリン活性に対する溶媒の影響がないことを確認した。
【００４６】
【表４】
0004888750.tif 000005
【００４７】
実施例６
最小阻止濃度測定によるヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）抗菌活性の比較
前記実施例１及び２から得られた蘇葉抽出物とベルベリンに対してヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を最小阻止濃度（ＭＩＣ：Ｍｉｎｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）測定により確認した。
【００４８】
各試料を２４培地板（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に２倍希釈法で希釈して９００μｌ／培地となるようにした。２４時間培養したヘリコバクターピロリブロス培養物から１．０ｍｌを取り、１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度に希釈し各培地に１００μｌずつ添加した（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ，１．０ｍｌ）。板を１０％ＣＯ2条件でシェーキング培養しながら時間別に標本を取り、生菌数、ウレアーゼ活性、細胞懸濁度による最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
【００４９】
１）生菌数の測定による最小阻止濃度（ＭＩＣ）
生菌数の測定は培養３６時間後に板から培地当たり１００μｌを取り１０３倍希釈した後、ブルセラ寒天板に塗抹し、１０％ＣＯ2インキュベータで３７℃、７２時間培養した後、現れた菌の集落を計数した。
【００５０】
２）ウレアーゼ活性測定による最小阻止濃度（ＭＩＣ）
ウレアーゼ活性の測定は培地当たり１００μｌを取り、１．０ｍｌのウレアＲブロスに添加し、これを１０％ＣＯ2インキュベータで６時間培養した後、５６０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５１】
３）細胞懸濁度の測定による最小阻止濃度（ＭＩＣ）
細胞懸濁度の測定は、培養完了後、各培地からブロスを全てエッペンドルフチューブに移し、再度培地に１．０ｍｌの蒸留水で洗浄して加えた。チューブを１２，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上澄み液を捨て、細胞ペレットを４００μｌの蒸留水に懸濁させた後、２００μｌを取り、９６培地板に移し６６０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５２】
ヘリコバクターピロリに対する蘇葉抽出物とベルベリンの抗菌活性を生菌数の測定による最小阻止濃度（ＭＩＣ）結果を表５に示した。蘇葉抽出物の場合、１，０００μｇ／ｍｌ以上の濃度では２．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクターピロリが完全に阻止されることを確認し、ベルベリンの場合は２５μｇ／ｍｌ以上の濃度でヘリコバクターピロリが完全に阻止されることを確認し、１２．５μｇ／ｍｌの濃度でも５０％以上が阻止されることが分かった。
【００５３】
【表５】
0004888750.tif 000006
【００５４】
△対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：２．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌ
＋＋：菌数が多くて計数不可
蘇葉抽出物とベルベリンによるヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制程度による最小阻止濃度（ＭＩＣ）結果を図１０に示した。同図に示すように、各素材のヘリコバクターピロリに対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するため、ヘリコバクターピロリ培養６０時間後、ウレアーゼの活性をＲブロスにより測定した。
【００５５】
図１０に示すように、蘇葉抽出物の場合、ウレアーゼ分析試験により測定された最小阻止濃度（ＭＩＣ）は２５０ｍｇ／ｍｌの濃度と決定され、これは以前の実験結果である１００ｍｇ／ｍｌと違いを表す。このことは、測定時、培養時間（４８ｈｒ  ｖｓ．６０ｈｒ）の違いと測定方法（Ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｖｓ．ｕｒｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）によって違いを表すことで説明される。ベルベリンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）は１２．５μｇ／ｍｌと決定された。ベルベリンに対する溶媒として使用されたＤＭＳＯも高濃度では細胞成長に影響を及ぼすことが分かるが、分画物の活性が依然として存在する低濃度では全く阻害効果が表われないので、分画物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定には影響を及ぼさないことが分かる。
【００５６】
そして、細胞懸濁度による最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定は蘇葉抽出物とベルベリンにより培養されて６０時間後に現われた増殖抑制程度を細胞懸濁度により測定したもので、その結果は図１１に示されたとおりである。蘇葉抽出物は０．５ｍｇ／ｍｌの濃度までは完全な抗菌活性を表し、２５０、１２５ｍｇ／ｍｌの濃度ではそれぞれ５０、３０％の阻止率を表わした。この結果は、以前に生菌数の測定により確認された最小阻止濃度（ＭＩＣ）（１００μｇ／ｍｌ）と一致する結果と考えられる。また、ベルベリンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）は１２．５μｇ／ｍｌで、ウレアーゼ分析試験での結果と同じに決定された。
【００５７】
実施例７
ヘリコバクターピロリ胃内定着抑制効果
ヘリコバクターピロリの胃内定着抑制効果をつぎのように予防治療の観点で確認した。
【００５８】
Ａ．予防効果の測定
ＡＧＳ細胞（ＡＧＳ  ｃｅｌｌ，１０６ｃｆｕ／ｗｅｌｌ）を６−培地板に付着させた後、各素材とＲＰＭＩ  １６４０（１０％  ＦＢＳ）培地を入れ３時間インキュベーションを行った。ヘリコバクターピロリを１０７細胞／ウエル濃度で摂取し再び１時間インキュベーションを行った。板シェーカーで３回ウォッシングした後、滅菌蒸留水１．０ｍｌを入れ１時間反応してＡＧＳ細胞をリシス（溶離）させた。細胞を収集して遠心分離した細胞ペレットにウレアＲブロス１．０ｍｌを入れ、３７℃で１時間反応させてＯ．Ｄ（５６０ｎｍ）を測定した。
【００５９】
Ｂ．処理（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）
ＡＧＳ細胞（１０６細胞／ウエル）を６培地板に付着させた後、ヘリコバクターピロリを１０７ｃｆｕ／ウエル（０．１ｍｌ）接種して３時間インキュベーションを行った。０．２ｍｌの素材と２．７ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（１０％  ＦＢＳ）培地を入れ、１時間反応させた。板シェーカーで３回ウォッシングした後、滅菌蒸留水１．０ｍｌを入れ１時間ＡＧＳ細胞をリシス（溶離）させた。細胞を収集して遠心分離したセルペレットにウレアＲブロス１．０ｍｌを入れ３７℃で１時間反応させてＯ．Ｄ（５６０ｎｍ）を測定した。
【００６０】
蘇葉抽出物をそれぞれヘリコバクターピロリ接種前と接種後にＡＧＳ細胞培地に添加し、その付着阻害率を測定した結果を図１２に示した。同図に示すように、０．５％、１％、２％の添加時、濃度の異なる実験群でヘリコバクターピロリ感染以前に蘇葉を投与した群が感染以後に蘇葉を投与した群よりは高い活性を示すことが分かった。特に、予防と治療群とも２％では９８％と８２％の高い阻害効果を示し、その以下の濃度では活性に大きい違いがないことが示された。
【００６１】
実施例８
ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるインターロイキン−８生成抑制効果
ヘリコバクターピロリの感染により誘導される胃上皮細胞でのインターロイキン−８の生成量の変化により蘇葉抽出物の感染抑制効果を測定した。
【００６２】
まず寒天培地で培養されたヘリコバクターピロリを１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、４℃、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿された細胞を１ｍｌのハンクス液  Ｆ１２培地に懸濁し、懸濁液の少量を取り１：５０に希釈した後、６６０ｎｍで懸濁度を測定して下記のように濃度を実験条件に合わせた。
【００６３】
細胞濃度（細胞集団）＝１６．９５×Ａ６６０×（希釈因子）×１０８／ｍｌヘリコバクターピロリ＝１．０８４×１６．９５×５０×１０８＝９．１８×１０８
ＡＧＳ培養液はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４群に分け２回繰り返して処理した。Ａ群はＡＧＳのみを培養した群であり、Ｂ群とＣ群はそれぞれＡＧＳに蘇葉抽出物とヘリコバクターピロリのみをそれぞれ処理した。Ｄ群は培地に溶かした蘇葉抽出物を１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、１時間後にヘリコバクターピロリ懸濁液１００μｌを７．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌで再び添加した。全群から、培養後０、２、４、６、９時間にそれぞれ培地を取り、４℃、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その上澄み液を取った後、エリザ法（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭＨｕｍａｎ  ＩＬ−８  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）でインターロイキン−８の量を測定した。
【００６４】
Ａ：対照群
Ｂ：蘇葉抽出物処理群
Ｃ：ヘリコバクターピロリ処理群
Ｄ：蘇葉抽出物＋ヘリコバクターピロリ処理群
１）サンプリング
板培地（Ｐｌａｔｅ  ｗｅｌｌ）内の培地を収集した後、４℃、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液をエペンドルフチューブに移した後、−７０℃で貯蔵した。
【００６５】
２）標準溶液
ＲＤ５Ｐ（５×）２．０ｍｌをＤ．Ｗ．で５倍に希釈した後、５．０ｍｌを取り、ＩＬ−８標準溶液バイアルに添加して２，０００ｐｇ／ｍｌのストック（ｓｔｏｃｋ）を製造した。２倍希釈により８濃度の１００μｌ標準溶液を準備した。
【００６６】
３）分析試験（Ａｓｓａｙ）
分析希釈液（Ａｓｓａｙ  ｄｉｌｕｅｎｔ）（ＲＤ１−８）１００μｌを板培地に入れ、５０μｌの標本と標準溶液を添加した。共役（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）溶液１００μｌを加えた後、常温で２時間半の間シェーキングを行った。板を４００μｌのウォッシング緩衝液で６回洗浄し、これに試薬Ａと試薬Ｂをそれぞれ１：１で混ぜ合わせた基質溶液２００μｌを添加した。板を３０分間定置した後、色変化を観察しつつ４９２ｎｍで吸光度を観察した。
【００６７】
ヘリコバクターピロリが胃粘膜の上皮細胞と相互作用するとき、多様なサイトカインの生成を促進することになり、このなかでもＩＬ−８の分泌が最も著しく現れる。そして、ＩＬ−８は胃炎の直接的な原因となる好中球又はマクロファージまで誘導することになる。したがって、ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるＩＬ−８の生成を抑制することが胃炎発生を抑制するための１方法となり得る。
【００６８】
図１３に培養時間による４群でのインターロイキン−８の生成量の変化を示した。ヘリコバクターピロリに感染されていない群（Ａ、Ｂ群）では、９時間経過後にもインターロイキン−８の生成が殆どなかったが、ヘリコバクターピロリ感染群（Ｃ群）では、６時間経過時まで急に増加し、その以後におよそ２，５００ｐｇ／ｍｌ水準でインターロイキン−８の量が維持された。反面、ＡＧＳを蘇葉抽出物とともに１時間培養した後、ヘリコバクターピロリを感染させたとき（Ｄ群）、インターロイキン−８の生成量は著しく減少して、培養９時間後にも３００ｐｇ／ｍｌ程度とＣ群の１５％水準に止まることが現れた。したがって、蘇葉抽出物がヘリコバクターピロリ感染により誘導、生成されるインターロイキン−８の生成量をおよそ８５％程度減少させることにより胃炎の発生率も減少させることを確認することができた。
【００６９】
実施例９
動物実験によるヘリコバクターピロリ感染の予防と治療効果の確認
ヘリコバクターピロリの感染に対する蘇葉抽出物の予防と治療効果をマウスにより確認した。実験に使用されたＢＡＬＢ／ｃマウスはマウスの胃腸管内に存在してウレアーゼ活性を表すヘリコバクターフェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｅｌｉｓ）が存在しないものだけを選別して使用した。使用したＢＡＬＢ／ｃマウスは４週齢の雌性で、予防と治療各群当たり４０匹を使用し、陽性、陰性対照群には群当たり２０匹を使用した。マウスは２５℃、５０％湿度、ＳＰＦ条件で飼育しながら実験した。この際に、陰性対照群としては、ヘリコバクターピロリ懸濁液の代わりに７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液のみを０．５ｍｌずつ経口投与した１５匹のマウスを使用し、陽性対照群としては、ヘリコバクターピロリを７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度に懸濁して経口投与した１５匹のマウスを使用した。
【００７０】
１）予防効果
マウスに蘇葉熱水抽出物を飲用水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合して一日に１匹当たり１０ｍｌずつ１４日間投与した後、７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に懸濁した２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクターピロリ菌液を２日間マウス当たり０．５ｍｌずつ６回にわたり感染させた。感染６週後、各実験群の胃を摘出し、胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性有無を測定することで、ヘリコバクターピロリ感染に対する予防効果を確認した。
【００７１】
２）治療効果
ヘリコバクターピロリを７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度に懸濁し、この菌液を２日間マウスに０．５ｍｌずつ６回にわたり感染させた。ヘリコバクターピロリがマウスの胃内に完全に定着した感染６週後、蘇葉熱水抽出物を飲用水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合して１匹当たり１日に１０ｍｌずつ３週間投与した。投与後、各実験群の胃を摘出し、胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性を測定することで、ヘリコバクターピロリ感染に対する治療効果を確認した。
【００７２】
３）胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性の測定
摘出した胃組織は、胃内固形分を除去した後、迅速に２等分して１／２は１０％馬血清の添加されたブルセラブロスに浸漬させた後、均質化してブルセラ寒天板に分散させておいた。板は湿度の高い１０％ＣＯ2培養器で３７℃で５〜７日間培養した後、現れたコロニーを確認してヘリコバクターピロリの存在有無を確認する。残りの１／２はウレアブロスに浸漬させ、湿度の高い１０％ＣＯ2培養器で３７℃で５日間培養しつつ色の変化を観察してヘリコバクターピロリの存在有無を判断した。
【００７３】
ヘリコバクターピロリの感染に対する蘇葉熱水抽出物の予防と治療効果を下記の表６に示した。陰性対照群の場合、感染６週後にもヘリコバクターピロリは全く感染しておらず、陽性対照群の場合は、感染６週後に１００％ヘリコバクターピロリ感染率を示した。しかし、蘇葉熱水抽出物をまず投与してヘリコバクターピロリの感染を予防した場合、ヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性の測定結果とウレアーゼ活性測定の結果、それぞれ９２．５％と８７．５％の予防率を示した。
【００７４】
また、ヘリコバクターピロリをまず感染させた後、選択された乳酸菌を投与した治療の側面において、蘇葉熱水抽出物を投与した場合、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果、それぞれ８２．５％と８０．０％の治療率を示した。
【００７５】
したがって、ヘリコバクターピロリの感染に対して蘇葉熱水抽出物を使用すると、高い予防、治療効果が得られることを確認した。
【００７６】
【表６】
0004888750.tif 000007
【００７７】
実施例１０
熱、ｐＨ及び消化酵素に対する安定性
蘇葉抽出物が実際胃内でヘリコバクターピロリを阻害するためには、胃内の消化酵素及び胃酸による酸性条件で安定性を維持しなければならない。また、発酵乳のような低酸性条件の食品への利用性を高めるためには、製品自体が低酸性条件で素材の活性が長時間維持されなければならない。また、食品又は薬品の製造工程上加わる熱処理条件でもその活性が維持されなければならない。したがって、蘇葉抽出物に対して熱、ｐＨ、消化酵素に対する安定性を確認した。
【００７８】
１）熱安定性
蘇葉抽出物を５ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶解し五つのキャップチューブ（ｃａｐ  ｔｕｂｅ）に移した。熱処理を行わない対照群を除くそれぞれのキャップチューブを６０、８０及び１００℃で１時間ずつ、１２１℃で１５分間処理し、各サンプルを０．４５μｍ濾過膜で除菌した。除菌されたサンプルをディスク分散テスト（ｄｉｓｃ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いて抗ヘリコバクターピロリ活性を測定した。
【００７９】
２）ｐＨ安定性
蘇葉抽出物７０ｍｇを、ｐＨをそれぞれ２．０、３．０、４．０、５．０に調製した酢酸ナトリウム緩衝液とｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液６．０ｍｌに溶かした後、酢酸と水酸化ナトリウムにてそれぞれのｐＨを合わせ、最終容積が７．０ｍｌとなるようにした。緩衝溶液を３７℃で２時間反応させた後、各サンプルを酢酸と水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和させて容積が１０．０ｍｌとなるようにした。濾過膜にて除菌した後、ディスク分散テストにより活性の変化を測定した。
【００８０】
３）胃液安定性
胃液は４人の成人からそれぞれ食事後３０、６０、９０、１２０分後、そして空腹状態で採取し冷凍させたものを解凍して使用した。胃液４００μｌの入ったテストチューブに１００ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶かした素材５０μｌを添加した。対照群は胃液の代わりにＰＢＳ緩衝液を使用した。各テストチューブを３７℃の水浴で３０分間反応させた後、５％炭酸ナトリウムでｐＨ７に合わせた（最終容積、５００μｌ）。各サンプルに対する活性変化をディスク分散テストで測定した。
【００８１】
蘇葉抽出物をそれぞれの熱処理条件に置いた場合、図１４に示すように、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性は対照群と比較して、変化がないものとして現れた。特に、１２１℃、１５分の殺菌条件でも活性は全然減少しなかったので、蘇葉の活性は製品の生産工程上の加熱処理条件により影響を受けないことを確認した。
【００８２】
また、ｐＨ安定性の場合、ｐＨ２〜５の条件で蘇葉抽出物の活性をｐＨ７の条件で対照群と比較した結果、図１５に示すように、蘇葉抽出物のヘリコバクターピロリに対する抗菌活性は全てのｐＨ条件で安定した。
【００８３】
胃液に対する蘇葉抽出物の安定性を各胃液サンプルと素材を３０分間反応させた後、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を確認した。表７に示すように、蘇葉抽出物の抗菌活性は胃液により全然影響を受けないことが分かり、このことは、実際の胃腸環境でも蘇葉抽出物がヘリコバクターピロリの増殖を抑制することができることを意味する。
【００８４】
【表７】
0004888750.tif 000008
【００８５】
実施例１１
乳酸菌に対する影響
蘇葉抽出物を発酵乳に添加する場合、蘇葉抽出物が有する抗菌活性が乳酸菌の生育には影響を及ぼさず、一方ヘリコバクターピロリにのみ選択的に作用できなければならない。
【００８６】
発酵乳の種菌として使用されるラクトバシルス（乳酸菌）、ストレプトコッカス（連鎖球菌）、ビフィドバクテリウムに対する蘇葉抽出物の影響をつぎのように確認した。まず、ラクトバシルスアシドフィラス、ラクトバシルスカセイ、ストレプトコッカスサーモフィルス、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を１２％スキムミルクに接種し３７℃で９時間混合培養した。培養の完了後、それぞれの選択培地を用いて初期生菌数を測定した。蘇葉抽出物は減圧濃縮して６０ｂｒｉｘ°の濃縮液を製造した後、１．０％（ｖ／ｖ）の濃度で乳酸菌培養液に添加した。蘇葉抽出物が添加された乳酸菌培養液を１０日間４℃で冷蔵保管しながら２日間隔で各乳酸菌に対する選択培地を用いて生菌数を測定した。各乳酸菌に対する生菌数の測定条件は表８のようである。
【００８７】
【表８】
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【００８８】
乳酸菌培養液の初期生菌数はラクトバシルス５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ、ビフィドバクテリウム３×１０６ｃｆｕ／ｍｌ、エス．サームフィリウス３．０×１０９ｃｆｕ／ｍｌであり、６０ｂｒｉｘ°蘇葉抽出物１．０％（ｖ／ｖ）を乳酸菌培養液に添加し１０日間冷蔵保管した後にも、それぞれの乳酸菌数が初期生菌数をそのまま維持していることを確認した。したがって、蘇葉抽出物のヘリコバクターピロリに対する抗菌活性は乳酸菌の影響がなく、ただヘリコバクターピロリに対してのみ選択性を持っていることを確認した。
【００８９】
実施例１２
蘇葉抽出物を用いる発酵乳の製造
脱脂粉乳で無脂乳固形分含有量を８〜２０重量％に調整した原料乳を７２〜７５℃で１５秒間殺菌した。殺菌された原料乳を一定温度に冷却した後、ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７８２を１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種し、培養液がｐＨ４〜５となるまで３７℃で培養し冷却させた。シロップは果汁濃縮液０．１〜５０重量％、食餌繊維０．１〜２０重量％、ブドウ糖０．５〜３０重量％、オリゴ糖０．１〜１５重量、カルシウム０．００１〜１０重量％、ビタミン０．０００１〜５重量％、蘇葉抽出物０．１〜５重量％などを溶かして製造し殺菌してから冷却した。こうして製造されたシロップを前記培養液と一定割合で混合、撹拌して均質化した後、容器に包装して発酵乳を製造した。製造された発酵乳は官能検査の結果、風味、物性、全体的な味において良好な結果を示した。
【００９０】
実施例１３
蘇葉抽出物を用いる胃潰瘍予防、治療用飲料の製造
蘇葉抽出物１４重量％、ナツメのエキス１．５重量％、当帰（馬芹）濃縮液７重量％に液状果糖７．４重量％を混合し、これに精製水を添加、混合してドリンク用瓶に充填し９０〜９５℃で殺菌した後、室温で冷却して飲料を製造した。
【００９１】
実施例１４
蘇葉抽出物を用いる胃潰瘍予防、治療用生薬製剤の製造
蘇葉抽出物０．０１〜３０重量％に栄養補助成分（ビタミンＢ1、Ｂ2、Ｂ5、Ｂ6、Ｅ及び酢酸エステル、ニコチン酸アミド）、オリゴ糖、５０％エタノールを助成分の５〜１０％となるように添加して高速回転混合器で混合した。前記混合物に滅菌精製水１０重量％を添加、混合し、直径１〜２ｍｍの顆粒状に成形した。前記成形された顆粒は４０〜５０℃の真空乾燥機で乾燥させた後、１２〜１４メッシュを通過させて均一に顆粒を製造した。このように製造された顆粒は適量ずつ押出成形されて錠剤又は粉末となるか、硬質カプセルに充填されて硬質カプセル製品に製造できる。
【００９２】
実施例１５
ベルベリンを用いる胃潰瘍予防、治療用生薬製剤の製造
蘇葉抽出物から得られたベルベリン０．００１〜１０重量％に栄養補助成分（ビタミンＢ1、Ｂ2、Ｂ5、Ｂ6、Ｅ及び酢酸エステル、ニコチン酸アミド）、オリゴ糖、５０％エタノールを助成分の５〜１０％となるように添加して高速回転混合器で混合した。前記混合物に滅菌精製水１０重量％を添加、混合し、直径１〜２ｍｍの顆粒状に成形した。前記成形された顆粒は４０〜５０℃の真空乾燥機で乾燥させた後、１２〜１４メッシュを通過させて均一に顆粒を製造した。この製造された顆粒は適量ずつ押出成形されて錠剤又は粉末となるか、硬質カプセルに充填されて硬質カプセル製品に製造できる。
【００９３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は胃潰瘍の予防及び治療に効果がある蘇葉抽出物とその用途及びそれからベルベリンを得る工程に関するもので、生薬素材である蘇葉に対しておよそ５〜２０倍重量の水を添加した後、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出した後、その濾液を４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮して製造した熱水抽出物と、前記生薬素材添加量に対しておよそ５〜１０倍重量の５０〜７０％のエタノールを添加した後、５０〜９０℃で４〜８時間抽出し、その濾液を４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮して製造した溶媒抽出物の１種以上を含むことを特徴として、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性及びヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果、胃上皮細胞定着性抑制効果、インターロイキン−８精製抑制効果を有する。
【００９４】
また、本発明のベルベリンは前記蘇葉抽出物からクロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチルの有機溶媒を用いて得た水溶層をＸＡＤ−７、シリカカラムクロマトグラフィにより分画し、予備ＴＬＣで分離してなったもので、前記蘇葉抽出物の主要有効成分としてベルベリンを容易に得ることができる効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  蘇葉抽出物からクロマトグラフィによるベルベリンの分離過程を示す図
【図２】  ベルベリンの化学構造を示す図
【図３】  分離された活性物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
【図４】  分離された活性物質の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
【図５】  分離された活性物質の１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（２Ｄ  ＮＭＲ）スペクトルを示す図
【図６】  分離された活性物質のＤＥＰＴ（２Ｄ  ＮＭＲ）スペクトルを示す図
【図７】  分離された活性物質のＨＭＱＣ（２Ｄ  ＮＭＲ）スペクトルを示す図
【図８】  分離された活性物質のＨＭＢＣ（２Ｄ  ＮＭＲ）スペクトルを示す図
【図９】  分離された活性物質のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す図
【図１０】  蘇葉抽出物とベルベリンのヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果を示す図
【図１１】  細胞懸濁度測定による蘇葉抽出物とベルベリンのヘリコバクターピロリ増殖抑制効果の比較を示す図
【図１２】  ヘリコバクターピロリ胃上皮細胞付着に対する蘇葉抽出物の抑制効果を示す図
【図１３】  ヘリコバクターピロリ感染により誘導生成されるＩＬ−８に対する蘇葉抽出物の生成抑制効果を示す図
【図１４】  蘇葉抽出物の熱安定性を示す図
【図１５】  蘇葉抽出物のｐＨ安定性を示す図
【図１６】  ラクトバシルスの生育に対する蘇葉抽出物の影響を示す図
【図１７】  ビフィドバクテリウムの生育に対する蘇葉抽出物の影響を示す図
【図１８】  ストレプトコッカスサーモフィルスの生育に対する蘇葉抽出物の影響を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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