(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステージ上に載置された試料上にレーザ光を走査して試料を観察する走査型顕微鏡装置において、
レーザ光の波長域を連続的に可変可能なレーザ光源と、
前記波長域の中から設定された、蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報が記憶された記憶手段と、
前記レーザ光の波長域を、指定された蛍光試薬に対応する励起波長になるように前記レーザ光源を制御する制御手段と、
を有し、
前記レーザ光源は、多光子励起により蛍光を観察可能にする極短パルスレーザ光を発振する、
ことを特徴とする走査型顕微鏡装置。
【請求項２】
前記記憶手段に記憶された前記蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報は、任意に設定可能な情報であることを特徴とする請求項１記載の走査型顕微鏡装置。
【請求項３】
前記記憶手段に記憶された前記蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報は、過去の観察結果を基に設定された情報であることを特徴とする請求項１記載の走査型顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はレーザ光（レーザビーム）を観察対象である標本に照射する走査型レーザ顕微鏡装置に関し、特に標本の多光子吸収による化学反応及び蛍光を検出するための多光子励起走査型レーザ顕微鏡装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多光子励起走査型レーザ顕微鏡では、通常の１光子（単光子）で行われる励起が多光子で行われる。例えば、２光子励起走査型レーザ顕微鏡では、４００ｎｍ（単光子）の波長で行われる蛍光励起が、２倍の波長である８００ｎｍで行われる。すなわち、この波長８００ｎｍにおいては、２光子を用いて蛍光励起が行われる。
【０００３】
通常、蛍光顕微鏡に使用される水銀ランプや連続発振のレーザ光は、単位時間当たりの光子密度が低いために、多光子励起現象を発生させるには莫大な光強度が必要とされ、また、光学系や標本へのダメージが大きくなる等の問題も有しているために、多光子励起現象を発生させる光源としては、実用に適さない。
【０００４】
このため、２光子励起走査型レーザ顕微鏡の光源には、例えばサブピコ秒のパルスレーザビームを発振するものが使用されている。これは、このサブピコ秒のパルスレーザビームを使用することにより、２光子励起現象が、その単位面積、単位時間当たりの光子密度の２乗にほぼ比例した確率で発生し、２光子励起現象の発生する確率が高くなるからである。
【０００５】
例えば、特表平５−５０３１４９号公報には、サブピコ秒のパルスレーザビームを出射するレーザ光源と、このレーザ光源から出射されたパルスレーザビームで標本面（焦点面）を走査するための走査光学ユニットとを組み合わせた２光子励起走査型レーザ顕微鏡が記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
一般的に、このような２光子励起走査型レーザ顕微鏡は、その構成が複雑であるが故に高価で、ユーザにとって非常に扱い難いものであった。特に、このような２光子励起走査型レーザ顕微鏡では、レーザ光の発振波長が調節可能に構成されているために、様々な励起波長での観察が可能になる反面、そのレーザ光の発振波長の調節作業（変更作業）が非常に煩雑になるという問題があった。また、２光子励起に用いる励起波長は通常の１光子励起に用いる波長の２倍の波長が適していると考えられるが、実際にはブルーシフトという現象により、２倍の波長よりも短い波長で励起させなければならなかった。従って、どの程度の波長が適切な励起波長（発振波長）であるかが解り難く、観察の度に発振波長の選択に試行錯誤が必要となり、その発振波長の設定が煩雑になるという問題があった。特に、蛍光試薬に対する励起波長の関係やレーザ光の発振波長の調節等の知識の無いユーザにとっては顕著な問題であった。
【０００７】
本発明の課題は、上記実情に鑑み、レーザ光の発振波長の設定を容易にする走査型顕微鏡装置を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、ステージ上に載置された試料上にレーザ光を走査して試料を観察する走査型顕微鏡装置において、レーザ光の波長域を連続的に可変可能なレーザ光源と、前記波長域の中から設定された、蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報が記憶された記憶手段と、前記レーザ光の波長域を、指定された蛍光試薬に対応する励起波長になるように前記レーザ光源を制御する制御手段と、を有し、前記レーザ光源は、多光子励起により蛍光を観察可能にする極短パルスレーザ光を発振する、ことを特徴とする走査型顕微鏡装置である。
【０００９】
上記の構成によれば、蛍光試薬が指定されると、記憶手段に記憶された、蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報に基づいて、その指定された蛍光試薬に対応する最適なレーザ光の励起波長がレーザ光源の発振波長として自動的に設定されるようになる。従って、発振波長の設定が容易になる。
【００１０】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記記憶手段に記憶された前記蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報は、任意に設定可能な情報である構成である。この構成によれば、蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報を、任意に設定（変更、編集）することができる。
【００１１】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記記憶手段に記憶された前記蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報は、過去の観察結果を基に設定された情報である構成である。この構成によれば、蛍光試薬に対応する多光子による励起波長の情報を、過去の観察結果を基に設定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る走査型顕微鏡装置のシステム構成を示す図である。
【００１４】
同図に示した走査型顕微鏡装置は、標本の多光子吸収による化学反応及び蛍光を検出するための多光子励起走査型レーザ顕微鏡装置であり、走査型レーザ顕微鏡１、操作パネル２、コントローラ３、記憶手段（メモリ）４、及び画像モニタ５を含んで構成されている。
【００１５】
走査型レーザ顕微鏡１は、更にレーザ光源６、ミラー７、ダイクロイックミラー８、走査ユニット９、レボルバ１０、対物レンズ１１、ステージ１２、試料１３、レンズ１４、ピンホール板１５、及び光検出器１６を有している。
ここで、レーザ光源６は、標本となる試料１３の表面を走査するスポット光としてのレーザ光を発生（発振）するためのもので、例えば、多光子励起により蛍光を観察可能にする極短パルスレーザ光を発振する。また、このレーザ光源６は、そのレーザ光の波長域を連続的に可変可能に構成され、コントローラ３により設定される発振波長（励起波長）に応じたレーザ光を発生する。このレーザ光源６からのレーザ光は、ミラー７により反射され、ダイクロイックミラー８を介して走査ユニット９に導かれる。
【００１６】
走査ユニット９は、コントローラ３からの制御指令に基づいて、ミラー７より与えられたレーザ光源６からのレーザ光を試料１３上に２次元走査するためのもので、例えばＸ軸方向走査用のガルバノミラーとＹ軸方向走査用のガルバノミラーを有していて、これらガルバノミラーをＸ軸方向およびＹ軸方向に振ることで対物レンズ１１に対するスポット光の光路をＸＹ方向に振らせるように構成されている。
【００１７】
レボルバ１０は、倍率の異なる複数の対物レンズ１１を保持するもので、レボルバ１０の切換えにより、複数の対物レンズ１１のうち所望の倍率を持つものが顕微鏡の観察光路中に選択挿入される。そして、この選択挿入された対物レンズ１１を通して走査ユニット９により２次元走査されたスポット光は、ステージ１２上の試料１３に照射される。
【００１８】
試料１３からの反射光の画像情報又は試料１３から発生した蛍光の画像情報は、対物レンズ１１を通して走査ユニット９に戻され、この走査ユニット９を介してダイクロイックミラー８に戻される。ダイクロイックミラー８は、走査ユニット９に対するレーザ光源６の出射光路上に設けられた半透明鏡であって、走査ユニット９を介して与えられる試料１３からの画像情報を光検出系に導くためのものである。
【００１９】
ダイクロイックミラー８を介して得られた走査ユニット９からの画像情報は、レンズ１４で集光され、共焦点光学系を形成するピンホール板１５に与えられる。ピンホール板１５は、所定径のピンホールを開けたもので、光検出器１６の受光面の前面の結像位置に、そのピンホールを位置させるように配置されている。光検出器１６は、ピンホール板１５のピンホールを介して得られる光を、その光量対応の電気信号に変換する光検出素子から構成されている。
【００２０】
また、操作パネル２は、キーボードの他に、トラックボールやジョイスティク或いはマウスなどのポインティングデバイス等を含んでおり、ユーザからの指示によりコントローラ３に対して走査指示、及び画像入力指示等の各種指示を出力する。
【００２１】
コントローラ３は、必要に応じて各所に制御指令を出力し、走査型顕微鏡装置全体の制御を行う。例えば、レーザ光源６に所定の制御指令を出力することによりレーザ光源６に所定のレーザ光の発振波長を設定する。また、操作パネル２を介して受け付けた走査指示により、走査ユニット９に対し走査指令を出力し、光検出器１６より検出される試料１３の画像情報を取り込み、その画像情報を記憶手段４に転送すると共に、その画像情報に基づく画像を画像モニタ５に表示する。
【００２２】
記憶手段４には、各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報が記憶されている。また、この記憶手段４には、前述のコントローラ３を介して転送される光検出器１６からの試料１３の画像情報が記憶される。本実施形態では、記憶手段４は、各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報が記憶されているメモリ部と、試料１３の画像情報が記憶されるメモリ部等を有している。
【００２３】
また、画像モニタ５には、記憶手段４に記憶された試料１３の画像情報に基づく画像や、各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報に基づく蛍光試薬の一覧等が表示される。
尚、前述の記憶手段４に記憶されている、各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報とは、所定の蛍光試薬が指定されることにより、その指定された蛍光試薬に対応する最適な励起波長を決定可能にする情報である。但し、このときの励起波長は、レーザ光源６により可変可能な波長域内の波長であるとする。この各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報は、例えば、蛍光試薬と励起波長との対応テーブルとして記憶手段４に記憶される。
【００２４】
図２は、その蛍光試薬と励起波長との対応テーブルの一例を示す図である。
同図に示したように、対応テーブルには、蛍光試薬名（ Name ）毎に最適な励起波長（ WaveLength ）が示されている。従って、このテーブルにより、所定の蛍光試薬が指定されることにより、その指定された蛍光試薬に対応する最適な励起波長を一意に決定することが可能になる。尚、この対応テーブルでは、蛍光試薬名に対し、それに対応する励起波長が記述されるものであるが、対応元は蛍光試薬名に限られるものではなく、蛍光試薬名の代わりに、例えばユーザ（観察者等）の名前や実験番号等であっても良い。
【００２５】
次に、上述の如く構成された走査型顕微鏡装置の動作例について説明する。尚、本例では、各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報として、前述の図２に示した対応テーブルが記憶手段４に記憶されているものとする。
まず、レーザ光源６のレーザ光の発振波長を設定するため、コントローラ３は、記憶手段４に記憶されている、蛍光試薬と励起波長の対応テーブルに基づいて蛍光試薬の一覧を画像モニタ５に表示し、その表示画面に示された蛍光試薬の一覧の中から観察対象である試料１３に使用されている蛍光試薬をユーザに選択指示させるように促す。
【００２６】
このとき、ユーザは、画像モニタ５に表示されている蛍光試薬の一覧の中から、試料１３に使用されている蛍光試薬の選択指示が可能になる。尚、このユーザによる選択指示は、操作パネル２を介して行われる。
コントローラ３は、操作パネル２を介して、ユーザからの所定の蛍光試薬の選択指示を受け付けると、記憶手段４に記憶されている対応テーブルを参照し、その選択指示された蛍光試薬に対応する励起波長を読み出す。例えば、ユーザが蛍光試薬として”ＴＲＩＴＣ”を選択指示したときには、図２に示した対応テーブルから、対応する励起波長として”１０００”が読み出される。
【００２７】
そして、読み出した励起波長をレーザ光源６の発振波長として設定する。尚、この発振波長の設定は、コントローラ３がレーザ光源６に所定の制御指令を出力することにより行われる。
続いて、コントローラ３は、操作パネル２を介して、ユーザからの走査開始指示を受け付け、これを受け付けると、走査ユニット９に対し走査指令を出力し、実際に試料１３の走査を実行し、その試料１３の画像情報を光検出器１６より検出して、その画像情報に基づく画像を画像モニタ５に表示する。
【００２８】
このように、以上に示した動作によれば、ユーザは、画像モニタ５に表示された各種蛍光試薬の一覧の中から標本である試料１３に使用されている蛍光試薬を選択指示するだけで、その蛍光試薬に最適な励起波長をレーザ光の発振波長として設定することが可能になる。従って、ユーザは、蛍光試薬に対する励起波長の関係やレーザ光の発振波長の調節等の知識が無くても、レーザ光の発振波長を容易に設定することが可能になる。また、蛍光試薬に対応する励起波長が一意に決定されるため、常に同じ条件下での観察が可能になる。
【００２９】
尚、本実施形態において、記憶手段４に記憶されている各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報の内容をユーザにより自由に編集可能とし、ユーザが蛍光試薬に対応する励起波長の情報を任意に設定可能に構成しても良い。これにより、ユーザは、蛍光試薬に対応する励起波長を自由に設定することができ、様々な蛍光試薬を使用した実験に適用させることが可能になる。
【００３０】
また、記憶手段４に記憶されている各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報の内容を、過去の観察結果（実験結果）に基づいて設定するようにしても良い。例えば、次のようにして設定することが可能である。発振波長を所定の波長域で連続的に変更しながらレーザ光を試料１３に照射し、その間の各発振波長に対する蛍光強度を測定し、その蛍光強度が最大となるところの発振波長を、その蛍光試薬に対応する最適な励起波長として設定する。例えば、図３に示したような、レーザ光の各発振波長に対する蛍光強度が測定されたときには、その蛍光強度が最大（Ｉmax ）となるところの発振波長（Ｗ）を、その蛍光試薬に対応する最適な励起波長として設定すれば良い。
【００３１】
また、この各種蛍光試薬に対応する励起波長の情報は、記憶手段４に限定されて記憶されるものではなく、例えばコンピュータのハードディスクや可搬記憶媒体（フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−Ｒ等）等の記憶媒体に記憶しておき、その記憶媒体から読み出されて使用されるものであっても良い。この場合、その情報を汎用的なファイルフォーマットのファイルとして記憶しておけば、そのファイルを編集することにより、その情報をより簡単に変更することが可能になる。また、その情報を外部装置の記憶媒体に記憶しておき、通信により転送されて読み出されて使用されるようにしても良い。
【００３２】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、指定される蛍光試薬に対応する最適な励起波長をレーザ光の発振波長として自動的に設定することが可能になるので、ユーザは、蛍光試薬に対する励起波長の関係やレーザ光の発振波長の調節等の知識が無くても、レーザ光の発振波長を容易に設定することが可能になる。また、蛍光試薬に対応する励起波長が、レーザ光の発振波長として一意に決定されるため、常に同じ条件下での観察が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係る走査型顕微鏡装置のシステム構成を示す図である。
【図２】蛍光試薬と対応する励起波長の対応テーブルの一例を示した図である。
【図３】各レーザ発振波長における蛍光強度の測定結果を示すグラフの一例である。
【符号の説明】
１      走査型顕微鏡装置
２      操作パネル
３      コントローラ
４      記憶手段（メモリ）
５      画像モニタ
６      レーザ光源
７      ミラー
８      ダイクロイックミラー
９      走査ユニット
１０    レボルバ
１１    対物レンズ
１２    ステージ
１３    試料
１４    レンズ
１５    ピンホール板
１６    光検出器
【図１】
0004914542.tif 000002
【図２】
0004914542.tif 000003
【図３】
0004914542.tif 000004