(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式を有する化学化合物
ＴＭ−スペーサー−ＨＳＰ
（式中、ＴＭは、エストロゲン、エストラジオール、プロゲスチン、テストステロン、ウォルトマンニンからなる群から選択される標的設定部分であって、これらはエストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプターを包含するステロイドレセプターに特異的に結合し、
スペーサーは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、ＯまたはＰから選択される２個以上の原子長さを有する直鎖を含む、スペーサー部分であり、
ＨＳＰは、ゲルダナマイシン又はヘルビマイシンＡである）。
【請求項２】
上記標的設定部分が、アンドロゲンレセプターに特異的に結合する、請求項１に記載の化学化合物。
【請求項３】
上記標的設定部分が、テストステロンである、請求項２に記載の化学化合物。
【請求項４】
上記標的設定部分が、エストロゲンレセプターに特異的に結合する、請求項１に記載の化学化合物。
【請求項５】
上記標的設定部分が、エストロゲン及びエストラジオールからなる群から選択される、請求項４に記載の化学化合物。
【請求項６】
上記標的設定部分が、ウォルトマンニンである、請求項１に記載の化学化合物。
【発明の詳細な説明】
説明
発明の分野
本出願は、選択された蛋白質の分解に標的を定めた治療剤としてのアンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）抗生物質の使用およびこの使用に適する新規組成物に関する。本発明に従う選択された蛋白質の分解は、癌の処置に使用することができる。
発明の背景
癌を処置するための手段として、治療剤の標的を定めた供給は、かなりの刊行物の著者により提案されている。概念上、この考え方は、癌細胞に対して選択的に毒性物質を供給し、これにより患者に対する一般的毒性を減少させることにある。かなりのタイプの癌細胞は増加したレベルのホルモンレセプターおよび類似のレセプターを有することが見出されていることから、これは理論的には可能である。一例として、乳癌細胞は、癌細胞のホルモン−刺激増殖をもたらす、ＨＥＲ２レセプターまたはエストロゲンレセプターのレベルの上昇を有することがあり、一方、アンドロゲンレセプターは、多くの前立腺癌の増殖に必要であり、またこのアンドロゲンレセプターの変異はしばしば、進行した前立腺癌で生じる。
或る種類の細胞に標的を定めた化学療法剤の直接使用を容易にする研究で、ホルモンレセプターが使用されている。すなわち、例えばＬａｍ等はヒト乳癌に対する強力な細胞毒性薬剤として、エストロゲン−ニトロソ尿素結合体を報告している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７１：９０１〜９０６（１９８７））。一方、Ｂｒｉｘ等は、抗悪性物質転換剤（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）としてアンドロゲン−結合アルキル化剤の使用にかかわる研究を報告している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１６：５３８〜５３９（１９９０））。また、Ｅｉｓｅｎｂｒａｎｄ等によるＡｃｔａ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ，２８：２０３〜２１１（１９８９）を参照することができる。ＭｙｅｒｓおよびＶｉｌｌｅｍｅｚは、切断したジフテリア毒素に結合させた黄体形成ホルモンの利用可能性を開示している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３：１６１〜１６４（１９８９））。
ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）およびヘルビマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ）Ａなどのベンゾキノイドアンサマイシン抗生物質は、ＨＥＲ−２レセプター、インシュリンおよびインシュリン様成長因子レセプターならびにｓｒｃ−族およびｒａｆキナーゼの一員を包含する或る種の蛋白質チロシンキナーゼの分解を誘発させることが知られている。さらにまた、ベンゾキノイド抗生物質は、インビボで、エストロゲン、アンドロゲンおよびプロゲステロンレセプターを包含するレセプターの選択的分解を誘発させることができる。
発明の要旨
我々はここに、蛋白質、レセプターまたはマーカーに特異的に結合する標的設定部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）に結合したアンサマイシン抗生物質を含有する化合物が、蛋白質の分解および標的細胞の死滅を導くことができるアンサマイシン抗生物質の効果的な標的を定めた放出をもたらすことを見出した。これらの複合化合物は、アンサマイシン単独とは相違する特異性を有することができ、治療のより特異的なターゲティングを可能にし、またアンサマイシン単独では効果がない場合にも有効であることができる。従って、本発明は、標的設定部分の種類に応じて、種々の相違する形態の癌の処置に施用することができる全く新規な一群の標的指向化化学療法剤を提供する。このような薬剤はまた、自己免疫障害に付随する抗原およびアルツハイマー病に付随する病原性蛋白質を包含する別種の病気の病因になる蛋白質の選択的分解を促進させるために使用することもできる。
本発明による化合物は、好ましくはスペーサーにより分離されている、標的蛋白質または細胞集団に特異的に結合する標的設定部分およびアンサマイシン抗生物質を含有する。本発明による化合物に使用することができる標的設定部分の例には、テストステロン、エストラジオールおよびタモキシフェンが包含される。好適なアンサマイシン抗生物質は、ゲルダナマイシンおよびヘルビマイシンＡである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による化合物の一般構造を示している；
図２は、ヘルビマイシンＡの構造を示している；
図３、本発明によるテストステロン−ゲルダナマイシン化合物の合成を例示している；
図４は、本発明による化合物の合成に有用なアルキルアミノテストステロンの合成を示している；
図５は、本発明によるアルキルアミノエストラジオール／ＧＭ化合物の合成を示している；
図６は、スペーサー基によりＧＭに結合されているタモキシフェン（ＴＭＸ）を製造するための合成経路を示している；
図７Ａおよび７Ｂは、本発明によるウォルトマンニン−ＧＭ化合物の合成を示している；
図８Ａおよび８Ｂは、ゲルダナマイシンまたはテストステロン−結合ゲルダナマイシンにさらされた後の、前立腺癌細胞中のアンドロゲンレセプターおよびＥｒｂＢ２のレベルを示している；
図９Ａ〜９Ｇは、本発明による種々のゲルダナマイシン−エストラジオール化合物の構造を示している；
図１０は、ＧＭ−４−エストラジオールハイブリッドを合成するための反応経路を示している；
図１１は、ウォルトマンニン異性体の構造および本発明によるゲルダナマイシン−ウォルトマンニンハイブリッド化合物の構造を示している；そして
図１２は、種々の化合物によるＰＩ３キナーゼの抑制を示している。
発明の詳細な説明
本発明による化合物は、癌細胞に標的を定めて化学療法剤を放出させるための新規手段を提供する。標的指向化化学療法にかかわる従来の化合物では、例えばＤＮＡ複製プロセスの破壊により細胞増殖を干渉する毒性物質が放出されるように一般にデザインされているが、本発明による化合物は、本発明による化合物の標的となるレセプターを包含する選択されたペプチドおよび蛋白質の正常なプロセスを破壊する抗生物質に頼るものである。
図１に示されているように、本発明による化合物は、好ましくは当該化合物を構成する２部分の末端を相互に対して柔軟性にすることができるスペーサー架橋を経て結合している、標的設定部分とアンサマイシン抗生物質とから構成されている。図１において、抗生物質分子は、ベンゾキノイドアンサマイシン  ゲルダナマイシンである。しかしながら、ヘルビマイシンＡ（図２）およびマクベシン（ｍａｃｂｅｓｉｎ）などのその他のアンサマイシン抗生物質を使用することもできる。
本発明による化合物に含有される標的設定部分は、蛋白質、レセプターまたはマーカーに特異的に結合するものと見做されるものである。この標的設定部分は、ホルモン、ホルモン類似物質、蛋白質レセプターまたはマーカー特異性抗体、あるいは対象の標的に特異的に結合するいずれかその他のリガンドであることができる。好適な標的設定部分は、エストロゲン、アンドロゲンおよびプロゲステロンレセプターを包含するステロイドレセプターおよび膜透過性チロシンキナーゼ、ｓｒｃ−関連チロシンキナーゼ、ｒａｆキナーゼおよびＰＩ−３キナーゼに結合する。特定のチロシンキナーゼには、ＨＥＲ−２レセプターおよび表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプター一族の他の一員、ならびにインシュリンおよびインシュリン様成長因子レセプターが包含される。標的設定部分の例には、エストロゲン、エストラジオール、プロゲスチン、テストステロン、タモキシフェンおよびウォルトマンニンが包含される。標的設定部分はまた、レセプターに特異的に結合する抗体、例えば国際特許公開番号ＷＯ９６／３２４８０、同ＷＯ９６／４０７８９および同ＷＯ９７／０４８０１（これらの特許を引用して、ここに組み入れる）に記載されているような、ＨＥＲ−２レセプターに結合する抗体であることもできる。その他の特異結合性ペプチドまたはホルモンもまた、標的設定部分として使用することができる。
好ましくは、レセプターのトポロジーに適合するために、当該分子に回転自由性を付与するスペーサーが含まれる。適当なスペーサーは、２個以上の原子長さ、好ましくは４個以上の原子長さを有する直鎖のものである。例において証明されているように、この結合鎖の長さは、当該化合物の特異性および効力に影響することができる。この結合鎖を構成する鎖は、主として炭素であるが、ヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、ＯまたはＰ）を含有していてもよい。追加の反応性が望まれる場合、スペーサー鎖を、例えば二重結合、ケト基またはアミノ基（この場合のヘテロ原子は、線状スペーサー鎖の外部に存在する）により、内部的に官能性にすることができる。図９Ａ〜Ｆは、相違する結合鎖長さおよび官能性化手段を有する各種ＧＭ−エストラジオール化合物の構造を示している。
本発明による化合物は、癌細胞が標的設定部分と相互反応し、またその生存に必要な蛋白質を発現する場合、このような癌の処置に有用である。すなわち、前立腺癌は、アンドロゲンレセプター結合性分子を含有する化合物の投与によって処置することができ、他方、エストロゲンレセプター陽性乳癌は、エストロゲン−レセプター結合性分子を含有する化合物の投与によって処置することができる。
乳癌細胞は、非癌性細胞に比較して、エストロゲンレセプターおよびｅｒｂＢ２（これはまた、ＨＥＲ−２として知られている）を包含する種々のタイプのホルモンレセプターの増加したレベルを示すかなりの個体に見出されており、これらの蛋白質は、相当な割合の乳癌の増殖にとって重要である。エストラジオールがゲルダナマイシンに結合している化合物であるＧＭ−Ｅ２は、これらのレセプターを選択的に破壊し、また別のタイプのレセプター（例えば、アンドロゲンレセプター、その他のチロシンキナーゼレセプターおよびｒａｆ１キナーゼ）に対する効果は、ゲルダナマイシン単独に比較して少ないことが見出された。従って、ＧＭ−Ｅ２を使用して、他のタイプの細胞に対しては小さい毒性をもって、乳癌細胞を選択的に抑制または破壊することができる。
ウォルトマンニン−結合アンサマイシン抗生物質は、抗生物質をＰＩ−３キナーゼに標的を定めるために使用される。ＰＩ−３キナーゼは、各種癌に見出される。ＰＩ−３キナーゼは、標的が定められていないＧＭにさらすことによっては分解されない。しかしながら、我々の研究によって、ＰＩ−３キナーゼに結合するが、ＰＩ−３キナーゼを阻害しないウォルトマンニンの異性体に結合させたＧＭは、この酵素の活性インヒビターであることが証明された。従って、アンサマイシン抗生物質をウォルトマンニンと組合わせて使用し、ＰＩ−３キナーゼ発現性癌細胞用の価値ある化学療法剤を提供することができる。さらにまた、このデータは、標的蛋白質がアンサマイシン抗生物質単独では影響されない場合でさえも、このような抗生物質を別種の標的設定部分と組合わせて使用することによって、標的蛋白質を抑制または分解することができるという結論を支持している。従って、本発明による分子は、標的蛋白質が病原性である場合、治療効果を提供する。
特定のメカニズムに束縛されることは意図しないが、本発明によるハイブリッド化合物は、当該ハイブリッドのアンサマイシン部分とシャペロン（付き添い）蛋白質ｈｓｐ９０との間の相互反応の結果として動作するものと信じられる。ｈｓｐ９０は、アンサマイシンを堅く結合させる深い結合ポケットを有する。このポケットがアンサマイシンにより占拠されると、ｈｓｐ９０は蛋白質と安定なヘテロダイマーを形成し、ここにステロイドレセプターなどが結合し、これらの蛋白質を分解する。本発明により開示されたハイブリッド分子は、ｈｓｐ９０と標的蛋白質との間に細胞内複合体を作り出す架橋体として働き、標的設定部分を標的蛋白質に結合させ、およびアンサマイシンをｈｓｐ９０に結合させる。この結果として、標的蛋白質が抑制され、またかなりの場合に、標的蛋白質が分解される。しかしながら、アンサマイシンの機能は、ｈｓｐ９０を伴って提供されることから、アンサマイシンが標的蛋白質の抑制または分解に直接に有効である必要はない。同様に、標的設定部分は、標的蛋白質への結合にのみ要求される。すなわち、蛋白質の抑制に要求されるものではない。
このメカニズムを理解することによって、本発明がアンサマイシンを含有するハイブリッド化合物に制限されず、実際に、標的設定部分をｈｓｐ９０の同一ポケットに結合する分子に結合させ、同一タイプの架橋を作り出す、全てのハイブリッド化合物を包含するものであることが認識されるものと見做される。アンサマイシンの代わりに使用することができる非アンサマイシンの例には、ラジシコール（Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）がある。さらにまた、アンサマイシンを結合するｈｓｐ９０のポケットと同一の、あるいは非常に類似した結合性ポケットを有する緊密に関連したｈｓｐ９０類似シャペロン分子の一族が存在する。これらの分子に結合しているハイブリッド医薬はまた、本発明の範囲内にある。
アンサマイシン抗生物質複合化合物を用いるＰＩ−３キナーゼに標的を定めた抑制または分解を可能にする同一メカニズムは、蛋白質が病因に関与する別の病気の処置に適用することができる。すなわち、アルツハイマー病に付随する病原性蛋白質に結合する標的設定部分に結合させたアンサマイシン抗生物質を、アルツハイマー病の処置に使用することができる。同様に、自己免疫障害、例えば多発性硬化症に付随する抗原を、標的を定めたアンサマイシン抗生物質を用いて分解させることができる。
本発明による化合物の合成は、標的設定部分の一級または二級アミノ誘導体を、暗所で一夜にわたりＤＭＳＯ中で、アンサマイシン抗生物質と反応させることによって、容易に達成される。すなわち、図３に示されているように、テストステロン−ゲルダナマイシン生成物は、１７−アルキルアミンテストステロンをゲルダナマイシンと反応させることによって得られた。１７−アルキルアミンテストステロン（図４）は、モノ保護されている１７−ケトテストステロンを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＴ）中で、８−ｔｅｒ−ブチルジメチルシリルオキシ−１−オクチンのリチウムアセチリドによりアルキル化することによって製造される。生成するシリルエーテル化合物を、テトラブチルアンモニウムフルオライドによる脱シリル化およびメシル化（ＭｓＣｌ、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2）による２工程で、対応するメシレート化合物に変換した。このメシレート化合物を次いで、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で室温において、ナトリウムアジド（ＮａＮ3）と反応させ、対応するアジド化合物を得る。このアジド化合物を、酸加水分解させ、次いでこのアジド化合物をトリエチルホスファイト還元すると、所望の１７−アミノアルキルテストステロンが良好な収率で得られた。この化合物を、室温で１２時間ＤＭＳＯ中で、ゲルダナマイシン（ＧＭ）と反応させる、１７−テストステロン−結合−１７−デメトキシ−１７−ＧＭが紫色固形物として得られた。ゲルダナマイシンの代わりに、ヘルビマイシンＡを用いる対応する反応は、幾分さらに遅いことを除いて同一様相で進行し、約３：４の割合で、１７位置および１９位置でスペーサーに結合した２種の生成物をもたらす。
図５は、本発明によるアルキルアミノエストラジオール／ＧＭ化合物の合成を示している。この合成は実質的に、テストステロン合成と同一であるが、フェノールヒドロキシに、相違する保護基、すなわちベンジル基を使用する。
図６は、スペーサー基によりＧＭに結合されているタモキシフェン（ＴＭＸ）を製造するための合成経路を示している。この場合、ＧＭをアジリジンと反応させ、新規ＧＭ類縁化合物である１７−アジリジノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンを生成する。この化合物を、還流メチレンクロライド中でヨウ化シアン（ＩＣＮ）と反応させ、１７−（Ｎ−ヨウドエチル−Ｎ−シアノ）−１７−デメトキシＧＭを生成する。このＧＭ類縁化合物は、Ｈｓｐ９０およびＧＭそれ自体に結合することが見出され、放射性標識したＩＣＮの使用により、合成過程中、容易に放射性標識される。この放射性標識した化合物は、ゲルダナマイシンの代わりに、結合性実験に使用することができる。対応する１７−（Ｎ−ヨウドアルキル−Ｎ−シアノ）化合物は、アジリジンの代わりに、アゼチジン（３炭素）、ピロリジン（４炭素）などを使用することによって製造することができる。さらにまた、ヘルビマイシンＡを同一反応に使用することができるが、この場合、１７−および１９−置換生成物の混合物が生成される。
本発明による化合物のもう一つの例には、ＰＩ−３キナーゼインヒビターであるウォルトマンニンに結合させたＧＭがある。この場合、一級アミンおよび二級アミンを有する非対称ジアミンリンカーをスペーサーとして使用すると好ましい。この場合、一級アミンがＧＭの１７−位置に最も迅速に付加し、他方、二級アミンはウォルトマンニンのフラン環の２１−位置と反応し、一級アミンとの反応で得られるＺ配向よりも活性であることが証明されているＥ配向を有する生成物が生成される。
非対称ジアミンリンカーは、図７Ａに示されているように、６−ブロモ−１−ヘキサノールから出発して製造される。この臭素を、ＴＨＦ中でメチルアミンに置き換え、次いで二級アミンを保護すると、中間アルコール化合物が得られる。この中間化合物を、ＤＰＰＡ、ＤＥＡＤおよびＰＰｈ3を用いてアジドに変換する。このアジド基およびベンジルオキシカルボニルの両方を、Ｐｄ／Ｃを用いて還元すると、６−炭素非対称ジアミンが得られる。
この非対称ジアミンを、図７Ｂに示されているように、ＣＨＣｌ3中でＧＭと組合わせ、中間ＧＤＮ−ジアミン化合物を生成する。この化合物を次いで、ウォルトマンニンと反応させ、最終ウォルトマンニン−結合ＧＭを生成する。
これらの合成方法は、別種の標的設定部分および相違する長さおよび組成のスペーサーに容易に適合させることができることは、当業者に認識されることである。必須要件は、アルキルアミンに変換することができるか、またはアンサマイシン抗生物質に予め結合させたスペーサーの一部である一級または二級アミンと反応することができる、標的設定部分中の反応性基の存在のみにある。
例１
テストステロン−ＧＭの合成
図３に示されているように、ＧＭを１７−アルキルアミノテストステロンと反応させることによって、テストステロン−結合ＧＭを製造した。１７−アルキルアミノテストステロンは、慣用の方法で、モノ保護テストステロンジオンにオクチニル結合鎖を付加することによって製造した。後者の化合物は、刊行物に記載の方法に従い、２工程で製造した。この結合鎖は、市販の６−ブロモヘキサノールから出発して合成した。
無水ＤＭＦ  ３３ｍｌ中の６−ブロモヘキサノール（３ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下に、イミダゾール（２．７２ｇ、４０ｍｍｏｌ）で処理し、生成する均一溶液を、０℃に冷却させ、次いでＤＭＦ  １２ｍｌ中のＴＢＳＣｌで処理した。反応の進行を、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）−ヘキサン（Ｈｅｘ）：１−２（ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル（ＳｉＯ2）上での薄層クロマトグラフイ（ＴＬＣ）により監視しながら、温度を徐々に室温まで上昇させた。室温（ｒｔ）で２時間後、出発物質は存在していなかった。次いで、この反応混合物を、水とＥｔＯＡｃとに分配させた。デカンテーション後、水性層をＥｔＯＡｃにより３回、抽出し、集めた有機層をＨ2Ｏで２回およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで減圧濃縮させた。生成する帯黄色油状物を、溶離液としてＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−４を用いる短路シリカゲルカラムクロマトグラフイにより精製し、所望のシリルエーテル化合物を無色油状物として得た（４．４ｇ、収率：９０％）。
リチウムアセチリドエチレンジアミン複合化合物（０．６５ｇ、６ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下に、無水ＤＭＳＯに少しづつ添加した。生成する完全には均一ではない暗褐色の混合物を、約５℃まで冷却させ、この温度で５分間かけて、ブロモシリルエーテル化合物を滴下して導入した。冷却浴を取り除き、反応の進行を冷たい適量のＮＭＲにより監視した。ｒｔで５時間後（通常、１時間で充分である）、出発物質は残留していなかった。フラスコの内容物を、氷含有エーレンメイヤーフラスコに注意して注ぎ入れた。この溶液を、ＥｔＯＡｃにより３回、抽出し、集めた有機層を水で３回（３Ｘ）およびブラインで１回、洗浄した。ＭｇＳＯ4上で短時間乾燥させ、次いで揮発性物質を減圧下に除去し、黄色油状物を得た。ＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−１９を用いる短路シリカゲルカラムクロマトグラフイにより精製し、所望の真性アルキン化合物を無色油状物として得た（０．８８ｇ、収率：９２％）。
このアルキン化合物（８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ  １ｍｌ中の溶液をアルゴン雰囲気下に−７８℃に冷却させ、次いでヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの１．６モル溶液０．２２ｍｌで処理した。これを次いで、２０分間、室温まで温め、次いで−７８℃に戻し、この温度で、新しく蒸留したヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）０．２ｍｌを添加し、次いでモノ保護１７−ケトテストステロン（８０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ０．５ｍｌ中の懸濁液として添加した。室温における一夜の撹拌期間後、反応を飽和アンモニウムクロライドにより静め、デカンテーションに付し、次いでＥｔＯＡｃ（３Ｘ）により抽出した。有機層を集め、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで減圧濃縮し、明るい褐色の油性固形物を得た。ＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−９を用い、短路ＳｉＯ2カラム上のカラムクロマトグラフイに付し、所望のアルコール化合物を無色油状物として得た（５０ｍｇ、収率：３６％）。
このシリルエーテル化合物（５０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下に、無水ＴＨＦ  ２ｍｌ中に稀釈した。生成する無色溶液を、０℃まで冷却させ、テトラブチルアンモニウムフルオライド（１１５マイクロリッター、１．１５ｍｍｏｌ）の１モル溶液で処理し、次いで冷却浴を取り除いた。室温で３時間後、出発物質は残留していなかった。ＴＨＦを減圧で除去し、残留する褐色油状物を最低量のクロロホルム中に稀釈し、次いで短路ＳｉＯ2カラムに添加し、ＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−２〜１−１により溶離した。これにより、アルコール化合物３４ｍｇ（収率：８５％）が無色油状物として得られた。
メチレンクロライド０．５ｍｌ中の上記ジオール化合物（３４ｍｇ、０．０７４５ｍｍｏｌ）を、０℃において、トリエチルアミン（２２．６ｍｇ、３１マイクロリッター、０．２２ｍｍｏｌ）で処理し、次いでメシルクロライド（１２．８ｍｇ、８マイクロリッター、０．１１ｍｍｏｌ）で処理した。この温度で半時間後、出発物質は残留していなかった。この反応混合物を次いで、減圧で濃縮乾燥させ、無水ＤＭＦ  ２ｍｌ中に溶解し、次いで過剰（約５当量）のナトリウムアジドを添加し、生成する懸濁液を室温で一夜にわたり撹拌した。これを次いで、ＥｔＯＡｃとＨ2Ｏとに分配した。デカンテーション後、この水性層をＥｔＯＡｃ（３Ｘ）により抽出し、有機層を集め、水で、次いでブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで減圧濃縮し、無色油状物を得た。所望のアジド化合物２３ｍｇ（２工程の収率：６４％）を、溶離液としてＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−４を用いる短路ＳｉＯ2  カラムにより単離した。
メタノール２ｍｌ中の、上記アジドアセタル化合物（１１ｍｇ、０．０２２８ｍｍｏｌ）を、室温で３時間、１．０規定塩酸０．５ｍｌで処理した。飽和重炭酸ナトリウムを注意して添加することにより、ｐＨをアルカリ性（７〜８）にし、次いでメタノールを減圧で除去した。残留する白色油性固形物を、ＴＬＣがこの水性層中に有機物質の非存在を示すまで、ＣＨＣｌ3により抽出した。有機層を集め、ＭｇＳＯ4上で短時間乾燥させ、次いで減圧下に蒸発させ、油性固形薄膜状物を得た。この生成物を最低量のＣＨＣｌ3中に溶解し、次いで短いＳｉＯ2プラグに添加し、ＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−４により溶離した。これにより、所望のアジドエノン化合物９ｍｇ（収率：９０％）を無色薄膜状物として得た。
無水ＴＨＦ  １ｍｌ中の、上記アジド化合物（３３ｍｇ、０．０７５５ｍｍｏｌ）を、室温で、ＴＨＦ中のトリエチルホスフィンの１．０モル溶液０．２３ｍｌ（０．２３ｍｍｏｌ）で処理した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ2、ＥｔＯＡｃ−Ｈｅｘ：１−１）により監視した。１時間以内に、反応は終了した。これを次いで、水０．２３ｍｌで処理し、次いで撹拌を、一夜にわたり継続した。この僅かに帯黄色の反応混合物を、高減圧下に蒸発乾燥させ、帯黄色薄膜状物を得た。この生成物を、ｐＨを濃アンモニアにより塩基性にしながら、Ｈ2Ｏおよびエーテル中に取り入れた。デカンテーション後、この水性層を、エーテルにより３回抽出し、集めた有機層を次いで、１．０Ｎ  ＨＣｌにより３回抽出した。集めたＨＣｌ抽出液を次いで、アンモニアにより塩基性ｐＨにし、次いでＣＨＣｌ3により抽出した。この水性層は、ニンヒドリン試験で陰性を示した。集めたクロロホルム層を次いで、ＭｇＳＯ4上で短時間乾燥させ、次いで減圧下に濃縮し、帯黄色薄膜状物（２４．６ｍｇ）を得た。
テストステロン−ＧＭ生成物は、ゲルダナマイシン（５．６ｍｇ、１０マイクロモル）を、室温で暗所において、無水ＤＭＳＯ  ０．５ｍｌ中の粗製１７−アルファ−（８−アミノ−１−オクチニル）−テストステロン（２４．５ｍｇ、６０マイクロモル）と反応させることによって得られた。１２時間後、この初期に黄色の溶液は、深い紫色に変化した。この反応混合物を次いで、ＣＨＣｌ3とＨ2Ｏとに分配した。デカンテーション後、この水性層を、ＣＨＣｌ3により抽出した（５Ｘ）。集めた有機層を次いで、水で洗浄し（３Ｘ）、新しく粉砕した亜硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧下に蒸発させた。残留する油状物（ＤＭＳＯを含有する）を、短いＳｉＯ2プラグに添加し、所望の生成物を、クロロホルム中のメタノール２〜１０％の勾配溶離系を用いて精製した。これにより、所望の医薬（３．４ｍｇ、収率：３６％）が、紫色固形物として得られた。
例２
前立腺癌細胞系（ＬＮ−ＣＡＰ）を、培養培地で、０．２５μｌ／ｍｌ〜１μｌ／ｍｌのレベルのゲルダナマイシン単独および例１に記載のとおりに合成されたテストステロン−結合ＧＭ（ＧＭ−Ｔ）にさらした。細胞は、ＧＭにさらされた結果として分解されることが知られているＥｒｂＢ２チロシンキナーゼの存在にかかわり、およびまたアンドロゲンレセプターの存在にかかわり、イムノブロッテッイングにより監視した。３種の処置の全部が、経過時間にわたり、ＥｒｂＢ２レベルを減少させたが、最小の減少はＧＭ−Ｔにより処置された細胞で見出された（図８Ａ）。これに対して、アンドロゲンレセプターの量の最大減少は、ＧＭ−Ｔにより処置された細胞で見出された（図８Ｂ）。このように、ＧＭ−Ｔは、アンドロゲンレセプターに対して、所望の標的設定および特異性を示した。
例３
エストラジオール−結合ＧＭの合成
図５に示されているように、この合成は、テストステロン−結合ＧＭの場合とほとんど同様であるが、現在では改良が進行中である。ターシャリイブチルジメチルシリルオキシエストロンを、−７８℃において、ＴＨＦ中の１−ヘキシン−６−オールのジリチウムアニオンと縮合させ、対応する１７−（１−ヒドロキシヘキシニル）エストラジオールを妥当な収率で得た。メシル化、アジド置き換え、フェノール系アルコールの脱保護、およびこのアジドの一級アミンへの還元により、ＧＭと結合させるための所望の中間体を得た。これは、室温で暗所において、ＤＭＳＯ中で行い、新しいエストラジオールに６個の炭素で結合されたＧＭを得た。８個の炭素で結合された類縁化合物は、テストステロンの場合と同一の方法で得られる。
例４
二重結合を有する４−炭素結合鎖とのエストラジオール−ゲルダナマイシンハイブリッドを、図１０に示されているとおりに合成した。アミン化合物（４０ｍｇ、この化合物はＫａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ等によりＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８７），５２：２４７に開示された方法から製造される）を、ＤＭＳＯ  １ｍｌ中に溶解し、次いでゲルダナマイシン２０ｍｇを添加した。この混合物を、一夜にわたり撹拌し、減圧濃縮し、次いでシリカゲル上のクロマトグラフイにより精製し紫色固形物を得た。この生成物（１７ｍｇ）を次いで、ＴＨＦ１．５ｍｌ中に溶解し、ＡｃＯＨ２滴を、次いでＴＢＡＦ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド、ＴＨＦ中の１．０Ｍ）０．０２ｍｌを添加し、この混合物を一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を次いで、濃縮し、次いでシリカゲル上におけるクロマトグラフイにより精製し、ハイブリッド１３ｍｇを紫色薄膜状物として得た。
図９Ｆおよび９Ｇに示されているように、この化合物の活性を、別のＧＭ−エストラジオール化合物の活性と比較した。ＭＣＦ−７乳癌細胞を、インビトロで、１μＭレベルの化合物に、種々の時間にわたりさらし、次いでイムノブロッティング試験でレセプター特異性抗体を用いて、レセプターの存在にかかわり試験することによって、種々の種類のレセプターに対するこれらの化合物の効果を評価した。これらの結果を、表１にまとめて示す。この表において、ＧＭ−４−Ｅ２は、４−炭素結合鎖を有するゲルダナマイシン−エストラジオール化合物を表わす。表中の＋は、レセプターがイムノブロッティングにより検出されたことを示し、そして−は、検出されなかったことを示し、そして±は、弱いまたは曖昧な結果を表わす。
これらの結果は、結合鎖が長い化合物ほど、活性は小さいことを示しているが、この結果が、結合鎖の長さによるものであるか、またはエストラジオールにおける相違する置換位置によるものであるかを、決定するものではない。しかしながら、本発明による化合物は全部が、ゲルダナマイシン単独に比較して、エストロゲンレセプターおよびＥｒｂＢ２レセプターに対する増大した選択性を示す。この選択性は、ＧＭ−４−Ｅ２で最も際立っている。
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例５
例４のイムノブロッティング試験を、ゲルダナマイシン単独、およびＧＭ−４−Ｅ２を用いて反復した。ただし、被験蛋白質のパネルにインシュリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ１−Ｒ）を包含させた。これらの結果を表２にまとめて示す。同一の活性パターンが見出されるが、ＧＭ−４−Ｅ２は、ゲルダナマイシン単独に比較して、ＩＧＦ１−Ｒに対してはほとんど阻害性ではない。
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例６
例４のイムノブロッティング試験を、前立腺癌細胞系、ＬＮＣａＰを用いて反復し、アンドロゲンレセプターに対するＧＭ−４−Ｅ２の作用を測定した。これらの結果を表３にまとめて示す。ゲルダナマイシン単独は、これらのレセプターを破壊するが、ＧＭ−４−Ｅ２は破壊しない。
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例７
図９Ａ〜９Ｇの化合物を、ｅｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）、ｒａｆ−１およびエストロゲンレセプターに対する活性について試験した。相対活性を表４にまとめて示す。この表において、＋＋＋＋は最高活性を示し、そして−は最低活性を示す。
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例８
タモキシフェン−結合ＧＭの合成
ハライドとの結合にかかわる潜在的存在価値（好ましくは、アミンの四級化中におけるＧＭの安全性を調節するために、イオン交換樹脂上で別種のハライド、Ｃｌ、Ｂｒ、あるいは別種の対向イオンに随意に変換することができるヨウダイド）ばかりでなくまた、結合鎖に電荷を生じさせることによる類縁化合物の水溶性をさらに増加させるために、我々はタモキシフェンのアミノ基を使用することを決定した。このようにするためには、我々は、一級ヨウダイドを有するＧＭ類縁化合物を必要とした。ヨウドアルキルアミンは安定ではなく、また１工程形式の戦略で使用することはできないことから、これは容易なことではなかった。通常、アミノアルコールを使用し、後で、ヨウダイドを導入しなければならない。これは、ＧＭの存在に適合しない。我々は、環状アミンに対するホンブラウン（Ｖｏｎ  Ｂｒａｕｎ）の反応が、正確にＧＭに結合したヨウドアルキルアミンを良好な収率で導くことができることを見出した。
アミノＧＭの合成：室温において、ＧＭ（１０ｍｇ、１７．８５マイクロモル）を、クロロホルム１ｍｌに溶解した。生成する黄色溶液を、ＣＨＣｌ3  １ｍｌ中のアジリジン（１００ｍｇ）で処理した。これを、暗所で２時間、撹拌した。この反応混合物はオレンジ色になる。この反応混合物全体を、短路シリカゲルカラムに添加し、所望の物質（１０ｍｇ、収率：９８％）を、オレンジ色固形物として分離した。
さらに長い結合鎖を製造するために、アジリジンの代わりにアゼチジンを使用することができる。アゼチジンは、刊行物に記載の方法に従い製造することができる（Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈｎｕｒ等によるＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，３８０６，１９９５）。同様に、ＧＭ５．６ｍｇ（１０マイクロモル）を、クロロホルム０．５ｍｌ中のピロリジン３０マイクロリッターと反応させ、室温で１時間後に、１７−デメトキシ−１７−ピロリジノＧＭ  ５ｍｇ（収率：８３％）を、深紫色固形物として得た。
１７−Ｎ−ヨウドアルキル−Ｎ−シアノＧＭ類縁化合物の合成：代表的実験において、１７−アジリジノＧＭ  ２．５ｍｇ（４．３８マイクロモル）を、無水１，２−ジクロロエタン０．２５ｍｌに溶解した。生成するオレンジ色溶液を、ヨウ化シアン（３ｍｇ、１９．６マイクロモル）と反応させ、この反応バイアルをテフロン製キャプによりシールした。温度を次いで、暗所で１２時間、６５〜７０℃まで高めた。この反応混合物は、明るい紫色になった。これを、短いシリカゲルプラグに添加し、クロロホルム中のメタノール５〜１０％勾配溶離系を用いて、所望の物質３ｍｇ（収率：９４％）を、明るい紫色の薄膜状物として分離した。
同様に、１７−ピロリドンＧＭ  ５ｍｇ（８．３４マイクロモル）を、６５℃で３６時間、１，２−ジクロロエタン中の４当量のヨウ化シアンと反応させ、ヨウドブチル類縁化合物５ｍｇ（収率：８０％）を得た。
タモキシフェン−結合ＧＭ類縁化合物の合成：代表的実験において、１７−Ｎ−ヨウドエチル−Ｎ−シアノＧＭ  ３ｍｇ（４．１４マイクロモル）を、アルゴン雰囲気下に、無水アセトニトリル０．５ｍｌに溶解した。生成する紫色溶液を、タモキシフェン１．６ｍｇ（４．１４マイクロモル）で処理した。これにより、懸濁液を得た。反応バイアルをシールし、７５℃にまで１８時間加熱した。反応の進行を、クロロホルム中の１００％メタノールを使用するＴＬＣ（ＳｉＯ2）により監視した。明るい紫色の反応混合物を次いで、０℃に冷却させ、次いで冷却しながら濾過した。この生成物を冷たいアセトニトリルで洗浄し、明るい紫色固形物を得た。このＮ−ヨウドブチル類縁化合物からの生成物は、さらに高い温度を必要とした（１２時間の還流ベンゼン）。
例９
ゲルダナマイシンの代わりに、ヘルビマイシンＡを用いて出発し、例７と同様に、アジリジン、アゼチジン、ピロリジンと反応させ、対応する１７−および１９−アミノヘルビマイシンＡ化合物を得た。これらの化合物は、シリカゲルクロマトグラフイにより分離した。これらの化合物にヨウ化シアンを作用させることにより、対応する１７−Ｎ−シアノ−Ｎ−ヨウドアルキルアミンおよび１９−Ｎ−シアノ−Ｎ−ヨウドアルキルアミンヘルビマイシンＡが得られた。これらの化合物を、ＧＭの場合と同一の条件下に、タモキシフェンと反応させると、対応するタモキシフェンのアンモニウム塩が得られる。
例１０
ウォルトマンニン−結合ＧＭの合成
一級ジアミン：ＣＨＣｌ3  ０．５ｍｌ中のゲルダナマイシン（３ｍｇ、０．００５３ｍｍｏｌ）の溶液に、暗所で１時間かけて、ヘキサメチレンジアミン６．２ｍｇ（１０当量）を添加した。この反応混合物を次いで、水４ｘ５００μｌで洗浄し、次いで高減圧下に３０分間濃縮し、紫色固形物を得た。この生成物を、ＣＨ2Ｃｌ2  ０．２５ｍｌに溶解し、次いでウォルトマンニン２．２ｍｇ（０．００５３ｍｍｏｌ）を、暗所で室温において添加した。２時間後、褐色−オレンジ色反応混合物を、シリカゲル上のクロマトグラフイに直接に付し、ＣＨ2Ｃｌ2中の５％ＭｅＯＨにより溶離し、ゲルダナマイシン−ウォルトマンニンハイブリッド１．５ｍｇ（２７％）を黄−褐色薄膜状物として得た。
非対称一級／二級ジアミン：６−（Ｎ−メチル−Ｎ−カルボベンジルオキシアミノ）−ヘキサン−１−オールを下記のとおりにして合成した。６−ブロモ−ヘキサン−１−オール（２．０ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中のメチルアミンの２．０Ｍ溶液５０ｍｌ（〜１０当量）を添加し、この反応混合物を、一夜にわたり撹拌した。この反応混合物をエーテル３０ｍｌにより稀釈し、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物を次いで、エーテル３０ｍｌおよび飽和ＮａＨＣＯ3溶液５０ｍｌ中に稀釈した。カルボベンジルオキシクロライド（２．５ｇ、５１ｍｍｏｌ）を次いで、添加し、この反応混合物を、２時間激しく撹拌した。この反応混合物を次いで、エーテル１００ｍｌにより稀釈し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで濃縮した。シリカゲルクロマトグラフイ（１０〜５０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）により、生成物３．１ｇ（７６％）を、清明な油状物として得た。
次いで、ＴＨＦ  ２０ｍｌ中のジエチルアジドジカルボキシレート（１．４５ｇ、８．３ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．１８ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を用いて、上記アルコール化合物（１．５２ｇ、６．４ｍｍｏｌ）の溶液を形成し、次いでジフェニルホスホリルアジド（１．７９ｍｌ、８．３ｍｍｏｌ）を、１５分間かけて滴下して添加し、この反応混合物を一夜にわたり撹拌することによって、６−アジド−１−（Ｎ−メチル−Ｎ−カルボベンジルオキシアミノ）を合成した。この反応混合物を濃縮し、次いでシリカゲルクロマトグラフイ（１０〜３０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）により精製し、白−黄色固形物１．０７ｇ（７５％）を得た。
６−アミノ−１−（Ｎ−メチルヘキシルアミン）は、このアジドから下記のとおりにして合成した。ＭｅＯＨ  ５ｍｌ中の１０％Ｐｄ／Ｃ  １００ｍｇおよび上記アジド化合物７５０ｍｇ（２．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、２０ｐｓｉのＨ2下に４５℃において４８時間、水素添加した。この反応混合物を、セライトに通して濾過し、次いで濃縮し、ジアミン化合物を黄色油状物として得た。この生成物を使用し、一級ジアミンにかかわり上記した方法を用いて、ゲルダナマイシン−ウォルトマンニンハイブリッドを製造する。
例１１
２種の配向のどちらかを有する開環フランのアミノ基に結合した結合鎖を有するウォルトマンニン類縁化合物を製造した。これらは、図１１に示されているように、Ｚ−類縁体およびＥ−類縁体で表わされる。これらの化合物をそれぞれ、ゲルダナマイシンに結合させ、本発明によるハイブリド化合物を形成した（図１１参照）。これらの化合物を、ＰＩ３キナーゼ活性の抑制にかかわり試験した。これらの結果を図１２にまとめて示す。当業者に知られているように、ウォルトマンニンは単独では、ＰＩ３キナーゼ活性を抑制し、Ｅ−類縁体２はそのように動作する。しかしながら、Ｚ−類縁体は、ゲルダナマイシン単独の場合と同様に、不活性である。これに対して、驚くべきことに、両方のハイブリッド化合物は、ＰＩ３キナーゼ活性を実質的に抑制することが見出された。すなわち、２種の不活性化合物から形成されたハイブリッド化合物は、ＰＩ３キナーゼの有意の抑制を示すことができる。簡単に言えば、本発明による化合物の作用メカニズムは、分子の１成分と正常標的との単純な相互反応ではなく、ハイブリッド分子の両成分が重要な役割を演じる相乗的相互反応である。さらにまた、これらの結果は、ゲルダナマイシンにより正常では分解に付されない標的に対する、本発明による化合物の効果を証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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