(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質を含有する細菌ゴーストの製造方法であって、
（ａ）細菌ゴーストを調製する工程と、
（ｂ）細菌ゴーストと作用物質とを接触させる工程と、
を含む、作用物質を含有する細菌ゴーストの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られる、封入された作用物質を含有する細菌ゴースト。
【請求項３】
作用物質が核酸である、請求項２記載の細菌ゴースト。
【請求項４】
作用物質のためのキャリヤー媒介体及び／又はターゲティング媒介体としての、請求項２または３記載の細菌ゴースト。
【請求項５】
作用物質を、薬理学的に作用する物質、標識物質、農業に効果的な物質及び染料から選択する、請求項２から４までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項６】
作用物質が細菌ゴースト中に固定化された形で存在する、請求項２から５までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項７】
固定化を、ゴーストの膜の内側に局在している受容体との相互作用を介して実施する、請求項６記載の細菌ゴースト。
【請求項８】
受容体が、ゴーストの細胞質膜中に組み込まれている異種ポリペプチドである、請求項７記載の細菌ゴースト。
【請求項９】
異種ポリペプチドが、ストレプトアビジン又はアビジンを含有する融合ポリペプチドである、請求項７または８記載の細菌ゴースト。
【請求項１０】
作用物質の直接の固定化を受容体上で行う、請求項６から９までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項１１】
受容体結合基で誘導体化された作用物質を使用する、請求項１０記載の細菌ゴースト。
【請求項１２】
作用物質の間接的な固定化を受容体上で行う、請求項６から９までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項１３】
作用物質の受容体上での間接的な固定化を、該受容体のための少なくとも１つの付加的な結合部位を更に有する、作用物質に結合する物質を介して行う、請求項１２記載の細菌ゴースト。
【請求項１４】
作用物質に結合する物質をポリリジン、デキストラン及びプロタミン硫酸塩から選択する、請求項１３記載の細菌ゴースト。
【請求項１５】
固定化をゴースト内部のマトリクスの形成を介して行う、請求項６記載の細菌ゴースト。
【請求項１６】
マトリクスがゴースト内部でモノマーの重合及び／又は共重合によって生ずる、請求項１５記載の細菌ゴースト。
【請求項１７】
重合を、温度上昇、ＵＶ−照射及び／又は開始剤の添加によって開始させる、請求項１５または１６記載の細菌ゴースト。
【請求項１８】
酵素触媒による重合を実施する、請求項１５または１６記載の細菌ゴースト。
【請求項１９】
ポリヒドロキシ脂肪酸、多糖又はポリペプチドの合成を触媒する酵素を使用する、請求項１８記載の細菌ゴースト。
【請求項２０】
マトリクスを凝集性物質の会合によって形成する、請求項１５記載の細菌ゴースト。
【請求項２１】
ゴーストが、標的細胞又は標的組織に特異的な異種の表面分子を有する、請求項２から２０までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２２】
請求項２から２１までのいずれか１項記載の細菌ゴーストを含む医薬品。
【請求項２３】
病原体によって引き起こされる疾患、腫瘍疾患又は自己免疫疾患の予防及び／又は撲滅のための、請求項２から２１までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２４】
遺伝子治療のための剤としての、請求項２から２１までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２５】
核酸ワクチン接種のための剤としての、請求項２から２１までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２６】
診断目的のための剤としての、請求項２から２１までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２７】
ゴーストの適用を、病原体による生物の自然の感染と同様に実施する剤としての、請求項２２から２６までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２８】
農業分野での、請求項２から２１までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項２９】
ゴーストが、複数の異なる作用物質を含有する、請求項２から２８までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３０】
それぞれ異なる作用物質を有するゴーストの混合物を使用する、請求項２から２９までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３１】
ゴーストが、グラム陰性及び／又はグラム陽性の細菌に由来する、請求項２から２９までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３２】
核酸ワクチンの製造のための、請求項２から２９までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３３】
核酸ワクチンのためのキャリヤー媒介体及び／又はターゲティング媒介体としての、請求項２から２９までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３４】
ゴースト中に封入された核酸が、発現されるべき抗原をコードする配列を発現制御配列と機能的に結合して含有する、請求項３２または３３記載の細菌ゴースト。
【請求項３５】
核酸が更に、細菌性の複製起点、原核性の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子及び／又は免疫調節配列を含有する、請求項３４記載の細菌ゴースト。
【請求項３６】
ゴーストが複数の異なる、抗原をコードする核酸を含有する、請求項３２から３５までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３７】
細菌ゴーストと抗原をコードする核酸との同種の組合せを使用する、請求項３２から３６までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３８】
細菌ゴーストと抗原をコードする核酸との異種の組合せを使用する、請求項３２から３６までのいずれか１項記載の細菌ゴースト。
【請求項３９】
封入される作用物質を含有する請求項２または３記載の細菌ゴーストを有する医薬品組成物。
【請求項４０】
封入される作用物質を含有する請求項２または３記載の細菌ゴーストを有する農業組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は挿入される物質、例えば作用物質のためのキャリヤー媒介体（Traegervehikel）及びターゲティング媒介体（Targetingvehikel）としての細菌ゴーストの使用に関する。
【０００２】
空の細菌外被、いわゆる細菌ゴーストは細胞膜の部分的溶解を引き起こす遺伝子の制御された異種発現によってグラム陰性細菌において製造できる（ＥＰ−Ａ−０２９１０２１号）。そのような溶解性遺伝子のための例は、グラム陰性細菌の細胞壁複合体に挿入され、かつオリゴマー化によって膜貫通トンネル構造が内膜と外膜を通して形成されるポリペプチドをコードするバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の遺伝子Ｅである。トンネル構造の内径は溶解条件に応じて４０〜２００ｎｍ又は５００〜１０００ｎｍである。そのトンネルを通って、細胞の細胞質材料が遊離し、かつインタクトな形態を有する空の細胞外被が残留する。死菌ワクチンまたはアジュバントとしての細菌ゴーストの使用並びに膜中に異種の表面タンパク質を有する組換え細菌ゴーストの製造はＷＯ９１／１３５５５号及びＷＯ９３／０１７９１号に記載されている。
【０００３】
更にゴーストはグラム陽性細菌からもキメラＥ−Ｌ−溶解遺伝子の使用によって製造できる（ＵＳ−Ａ−５０７５２２３号）。
【０００４】
意想外にも細菌ゴーストは作用物質のためのキャリヤー媒介体又はターゲティング媒介体として特に適当であることが確認された。細菌ゴーストの第一の利点は、その適用が容易に天然の病原体の感染経路を介して、例えば呼吸路又は胃腸管を介して可能であることにある。更に、キャリヤーとしてゴーストを介する作用物質の適用系は種々の組織種に関する細菌ゴーストの特異性に基づいて効果的なターゲティングを提供する。それと共に、作用物質は所望の標的部位、例えば出発細菌の相応の潜在的感染部位に高い効率でもたらされる。ベクターとしての病原細菌の天然の外被の利点は別の適用形の場合には、例えばリポソームのように組み込まれた外膜タンパク質と一緒に困難を伴ってかつ不十分にのみ達成することができる。
【０００５】
専ら所望の作用物質を含有する細菌ゴーストを製造できるので、作用物質の高い負荷の程度ひいては高い効率を達成できる。更にゴーストは安全なキャリヤー材料である。それというのも生きている生物でないからである。最後に、ゴーストはリポ多糖及びペプチドグリカンの存在に基づく高い免疫促進作用を有する産物であるので、付加的なアジュバントを添加する必要がない。それというのもゴーストがアジュバント作用自体を満たしているからである。
【０００６】
したがって本発明の対象は作用物質を封入するための細菌ゴーストの使用である。
【０００７】
本発明の他の対象は作用物質のためのキャリヤー媒介体および／またはターゲティング媒介体としての細菌ゴーストの使用である。
【０００８】
作用物質は、それぞれ任意の細菌ゴーストの内部に輸送可能であり、かつそこに有利には固定化可能な作用物質であってよい。有利には作用物質は、薬理学的に作用する物質及び標識物質から選択される。薬理学的に作用する物質のための例は、ポリペプチド、例えば抗体、治療作用を有するポリペプチド、例えばサイトカイン、インターフェロン、ケモカインなど、酵素及び免疫原ポリペプチド又はペプチドである。作用物質のための他の例は、核酸、特に治療的な核酸、遺伝子治療のための、染色体に組み込み可能なベクターの形で存在する核酸、又は核酸ワクチンのための核酸、アンチセンス核酸又はリボザイムである。なお作用物質のなおも他の例は、低分子量の作用物質、ペプチド、ホルモン、抗生物質、抗腫瘍剤、ステロイド、免疫調節剤などである。作用物質は、細菌ゴースト中で溶解された形で、懸濁液および／またはエマルジョンとして、場合により適当な担体材料および／または助剤と組み合わせて存在していてよい。更に作用物質は診断的な標識物質、例えば蛍光物質、色素又はＸ線造影剤であってもよい。
【０００９】
非医学的作用物質も、例えば農業分野からの作用物質、例えば殺虫剤、除草剤、線虫に対する薬剤、土壌改善のための酵素、肥料、成長促進剤、大気中のより良好な湿気の透過又は水結合のための水結合性タンパク質をゴースト中に封入できる。別の使用は印刷工業のための染料の封入、例えば免疫学的に検出が可能な耐偽造インキ及び食品工業のためのビタミン又はプロバイオティカ（Probiotika)の封入である。同様に化粧品薬剤又は塩又は別のイオン性物質のような物質の封入も可能である。
【００１０】
有利には、作用物質は細菌ゴーストにおいて固定化された形で存在し、すなわち生理学的条件下に封入された作用物質は細菌ゴースト中に十分な時間残留し、標的細胞もしくは標的組織への輸送を可能にする。作用物質の固定化は、共有的又は非共有的な相互作用、例えば静電的な相互作用、高い親和性の生物学的相互作用によって、機械的保持又は前記の可能性の２つ以上の組み合わせによって実施できる。
【００１１】
本発明の有利な態様においては作用物質の固定化をゴーストの膜の内側、例えば細胞質膜の内側に組み込み膜成分又は非組み込み膜成分として膜上に固定して所在する受容体との直接又は間接的な相互作用を介して行う。受容体は、例えば１つ以上の膜アンカーを介してゴーストの細胞質膜に組み込まれ、かつ少なくとも１つの膜アンカードメイン並びに少なくとも１つの受容体ドメインを有する相応の融合タンパク質の異種発現によって細菌細胞中に溶解の前にゴーストに生じる異種ポリペプチドであってよい。受容体ドメインのための有利な例は、アビジン又はストレプトアビジンであり、これらはビオチン又はビオチン類似体と高い親和性の結合を形成することができる。ストレプトアビジンが特に有利である。細菌ゴースト中でのストレプトアビジンの固定は、有利にはＣ−末端膜アンカーとのストレプトアビジン融合タンパク質の組換え発現によって細菌の細胞質膜中でゴーストを形成するための溶解の前に実施する。更に受容体ドメインも適当である。例えば結合パートナーと高い親和性の結合を形成する抗体結合部位、レクチンなども適当である。
【００１２】
選択的に、受容体の固定はまずゴーストの溶解の後に膜内側で、例えば２つの結合部位を有する受容体の使用によって可能であり、その際、結合部位は膜の内側の天然又は組換えの構造に高い親和性をもって結合でき、かつ第２の結合部位は作用物質の直接又は間接的な固定化のために使用できる。
【００１３】
ゴーストの膜の内側に局在化する受容体分子は、作用物質の直接又は間接的な固定化をゴーストの内部で引き起こす。直接的な固定化においては、ゴースト中に封入されるべき作用物質を使用して十分に強い相互作用を引き起こすことができ、作用物質のゴースト内部での十分又は完全な保持をもたらす受容体が選択される。このために、例えばビオチン、ハプテンおよび／または糖で変性された作用物質を使用してよく、これらは受容体、例えばストレプトアビジン、抗体又はレクチンによって安定な結合をもたらしうる。有利には１つ以上のビオチン基を有し、かつ高い親和性でストレプトアビジン受容体に結合できる変性された作用物質が使用される。
【００１４】
選択的に、作用物質の受容体への間接的な固定化を実施でき、これらは例えば作用物質に結合し、更に少なくとも１つの付加的な受容体のための結合部位を有する作用物質結合性物質によって媒介することもできる。かかる作用物質結合性の物質の例は、ポリマー、例えばタンパク質、例えばポリリジン又は多糖、例えばプロタミンスルフェート又はデキストランである。作用物質結合性の物質は、更に受容体結合基、例えばビオチン又はビオチン類似体、ハプテン又はレクチン結合性の糖基を有しており、これらは膜上に局在化する受容体への固定をもたらすことができる。
【００１５】
本発明の前記の態様による本発明による作用物質を負荷したゴーストの製造はまず公知の方法、例えば溶解遺伝子、有利にはファージＰｈｉＸ１７４の遺伝子Ｅ又はキメラＥ−Ｌ−遺伝子での細菌細胞の形質転換によって細菌ゴーストを製造することを包含する。細菌細胞中での溶解遺伝子の発現は、有利には制御可能な発現制御配列、例えば温度制御可能なプロモーター／リプレッサー系のλ−ｐＲ／ｃｌ８５７によって実施する。発現制御系において、形質転換された細菌は３０℃未満の温度で培養される。≧４０℃への温度の上昇によって熱感受性λｃｌ８５７のリプレッサーは不活性化され、かつ溶解遺伝子が発現し、細胞外被中に膜貫通のトンネル構造が形成され、その際、細胞は数分内に溶解する。変異されたλ−プロモーター／オペレーター系によって細菌の培養もより低いか又はより高い温度、例えば３７℃でも可能である（ＷＯ９８／０７８７４号）。細菌ゴーストを次いで遠心分離によって回収し、かつ洗浄及び場合により凍結乾燥の後に作用物質の負荷のために使用することができる。このためにゴーストを封入されるべき作用物質を含有する溶液および／または懸濁液と、ゴースト中に十分な作用物質量が侵入できる条件下に接触させる。必要であれば、更にゴーストの膜の内側に作用物質分子を固定化できる受容体物質を添加する。受容体分子の添加はゴーストと封入されるべき作用物質との接触の前、間又は後に実施できる。
【００１６】
選択的および／または付加的に、作用物質の固定化は、ゴースト内部でのマトリクスの形成を介して実施できる。該マトリクスは、有利にはゴースト内部でその場で発生し、かつゴーストからの作用物質の拡散を抑えるポリマーマトリクスである。ポリマーマトリクスは、適当なモノマーの重合および／または共重合により、および／または細菌ゴーストの内部での凝集可能な物質の会合によって生成しうる。重合は、相応の条件の調節、例えば温度上昇、ＵＶ照射および／または適当な開始剤の添加によって開始できる。目的に応じて生理学的に認容性のモノマー、例えばヒドロキシ脂肪酸、アミノ酸、糖又はそれらの誘導体を使用でき、これらは体内で生理学的条件下に分解可能なポリマーを形成する。
【００１７】
特に有利にはマトリクスは酵素触媒によるポリマー形成によって生成しうる。このために適当な酵素を細菌ゴーストの内壁上に、例えば細胞質膜の内壁への組み込み（ストレプトアビジンに関して記載したように）によるか、又は間接的に、例えばビオチン化された酵素をゴースト膜上のストレプトアビジン分子に結合させることによって固定化する。例えば前記の目的のためにポリヒドロキシ脂肪酸、例えばポリヒドロキシ酪酸の合成、例えばＰＨＢ合成、多糖、例えばグルコシルトランスフェラーゼ又はポリペプチド、例えばペプチドグリカン合成において存在する非リボソーム性のポリペプチド合成酵素を触媒するような酵素を使用することができる。適当なモノマー及び、場合により生化学的エネルギー当量、例えばＡＴＰの添加によって酵素の存在下に生ずる作用物質によって、ゴースト内部に見られる作用物質は酵素によって形成されたマトリクス中に固定され、ひいてはゴースト内部に保持される。
【００１８】
選択的にマトリクスは凝集可能な物質、例えば分子又はコロイド粒子の会合によっても生ずることがある。会合は、環境条件の変化、例えば温度変化および／またはｐＨ変化によって開始することもある。
【００１９】
本発明の、作用物質がマトリクスの形成によってゴースト内部に固定化されるような実施態様において、まず封入されるべき作用物質をゴースト中に取り込み、引き続いてマトリクスを形成する。
【００２０】
本発明による、封入される作用物質を有するゴーストは、キャリヤー媒介体及びターゲティング媒介体として特に適当である。それというのもこれらのゴーストはすでに細菌外被としてのそれらの性質に基づいて、有利には規定の細胞型に付加されるか、もしくは免疫系の細胞から取り出される。これらのターゲティングは改変された外被を有するゴースト、すなわちターゲットに特異的、すなわち標的細胞又は標的組織に特異的な表面分子をその膜の外側に有するゴーストの使用によって改善することができる。標的特異的分子、例えば糖、例えばマンノース又はフコースまたはエルシニアからのインバシン又はインバシン誘導体の導入は相応の融合ポリペプチドを細菌細胞中で溶解の前に組換え発現することによるか、および／または適当な受容体系（例えばストレプトアビジン／ビオチン）の使用による付加によって実施できる。
【００２１】
本発明の態様は、作用物質を含有する医学的目的のためのゴーストの使用である。作用物質、例えば薬理学的作用物質、抗原、抗体又は核酸をゴーストを介して投与することは、全ての種類の疾患の予防および／または撲滅のために、例えば病原、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は菌類によって引き起こされる疾患の撲滅のために、又は腫瘍疾患もしくは自己免疫疾患の撲滅のために、又は遺伝子治療のために適当である。作用物質としてはその場合に、それぞれの疾患に効果的であり、標的細胞中への輸送及び、場合により内在化の後に生理学的な効果を引き起こす物質が使用される。また本発明は作用物質の組み合わせの投与も可能であり、すなわちこれらのゴーストは多くの種々の作用物質を含有するか、又はそれぞれ種々の作用物質を有するゴーストの混合物を使用してもよい。更に診断目的（イメージング）のためにもゴーストを介して作用物質を投与することが使用される。
【００２２】
特に有利な使用は、細菌ゴーストを、遺伝子治療のためのキャリヤー媒介体及びターゲティング媒介体として使用することである。核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡをゴースト中に封入することによって、現存の核酸媒介体、例えばリポソームの特異性の欠落を決定的に改善することができる。細菌ゴーストのキャリヤー媒介体としての利点は、これらが核酸での負荷のために高い許容量を有することにある。更にこれらはベクターとしても安全である。それというのもこれらは生きている細胞外被を示さないからである。遺伝子治療での使用のために、ゴーストの核酸を、例えばポリヒドロキシアルカノエート、例えばポリヒドロキシ酪酸又はヒドロキシ酪酸と別のヒドロキシ脂肪酸、例えば３−ヒドロキシトリデカン酸と複合させることができる。その場合、核酸を増大するポリマーマトリクス中に固定化するか、又は核酸及び非晶質のポリヒドロキシ脂肪酸グラニュールからなる複合体を製造することもできる。なお核酸を細菌ゴースト中に封入するための他の可能性は、ＤＮＡ結合性タンパク質、例えばポリリジン又はプロタミン（これらは球状の、強アルカリ性のタンパク質であり、比較的小さい分子量１０００〜５０００を有する）を使用することにある。プロタミンは脱脂したトリ又はサカナの精子から希酸との振盪によって結晶性塩、例えばプロタミン硫酸塩の形で得ることができる。プロタミンはゴースト中で融合タンパク質の形で膜中に組み込まれるか、又は選択的に膜に結合するストレプトアビジン上でのビオチン化によってゴーストに固定できる。
【００２３】
なお特に有利な使用は、核酸ワクチンの製造のため、特にＤＮＡワクチンの製造のために細菌ゴーストを使用すること、及び細菌ゴーストをキャリヤー媒介体および／またはターゲティング媒介体として核酸ワクチン、特にＤＮＡワクチンのために使用することである。
【００２４】
核酸ワクチンのためのキャリヤー媒介体又はターゲティング媒介体としての細菌ゴーストは効果的かつ長期持続型の特異的免疫応答の形成をもたらす。核酸を含有する細菌ゴーストは一次抗体を提示している細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞及びマクロファージから特異的受容体によって作成され、抗原ペプチドに断片化される。付加的に高い効率で、封入されたＤＮＡ配列によってコードされる抗原はＡＰＣ中で発現される。このことは結果として、ＡＰＣの表面上の抗原をＭＨＸ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ構造との関連においてＴ−リンパ球に提示させ、かつ免疫応答を誘導できる。調査は抗原プロセシング及び提示がＭＨＣ−Ｉ及びＩＩ複合体によって行われるということにおいてもたらされ、その際、体液性及び細胞性の免疫応答が誘導され、例えばこのことは生菌での細菌性感染においても観察される。
【００２５】
細菌ゴースト中に封入された核酸は有利には、受容生物中で複製不可能な形である。これらは標的細胞中で発現されるべき抗原をコードする配列を発現可能な形、すなわち標的細胞中で活性な発現制御配列、例えば高い遺伝子発現をもたらすためにプロモーター及び場合によりエンハンサーと機能的な結合で、転写されたｍＲＮＡの厳密な終結を保証するためにポリアデニル化配列と機能的な結合で、および／または高いタンパク質産生を可能にするために翻訳開始配列と機能的な結合で含有する。更に核酸は多量の核酸量の増幅を細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉにおいて可能にする細菌性複製起点に例えば抗生物質耐性のために原核性の選択マーカーを、発現の程度を容易に規定できるリポーター遺伝子、例えばＧＦＰ遺伝子又は免疫調節配列を含有してよい。
【００２６】
有利には核酸はＤＮＡ、特に有利にはプラスミドＤＮＡであり、これらは環状形および／または直鎖形で存在していてよい。しかしながらＲＮＡワクチン又は転写可能であるが、高められた生理学的安定性を示す核酸類似体をベースとするワクチンの使用も考えられる。
【００２７】
抗原をコードする配列の発現を促進するプロモーターは、有利には強力なウイルス性のプロモーター／エンハンサーであり、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０ウイルスプロモーター／エンハンサー及び特に有利にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーである。転写ターミネーターとしてはＳＶ４０からの又はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列、有利にはウサギ−β−グロブリン遺伝子からのポリアデニル化配列を使用することもできる。
【００２８】
抗原としては、その場合、それぞれの疾患に関連するポリペプチド又はそのペプチド断片を使用でき、これは発現後に標的細胞中で免疫応答を誘導する。本発明は、組み合わせワクチンの投与も可能である、すなわちゴーストは多数の種々の抗原をコードする核酸を有し、これらの核酸はそれ自体の病原体に、又は異なる病原体に由来するか、又はそれぞれ種々の抗原をコードする核酸を有するゴーストの混合物を使用することもできる。
【００２９】
本発明の実施態様において、前記の細菌ゴーストと抗原をコードする核酸の同種の組み合わせを使用することができ、その際、例えば細菌ゴーストは同じ種又は同じ生物に由来する表面構造を有する、例えば核酸ワクチンをコードする抗原。場合により、ゴーストはそれどころかその表面上にコードされた抗原に相当する表面構造を有することがある。この同種のゴースト／核酸の組み合わせは、特に細菌性の感染に対するワクチンのために使用されるが、相応の表面構造を有する組換えゴーストの使用においては、別の疾患、例えばウイルス性疾患に対するワクチンにも拡張することができる。
【００３０】
選択的に、更に異種のゴースト／核酸の組み合わせを使用する。そのような異種の組み合わせにいおては、細菌ゴーストは一般にアジュバント機能を満たす。しかしながら、病原性細菌に由来するゴーストを異種の核酸と組み合わせて２つの異なる病原体に対する組み合わせワクチンとして使用する実施態様も可能である。
【００３１】
最後に、細菌ゴーストは農業分野のためのキャリヤー媒介体又はターゲティング媒介体としても適当であり、作用物質、例えば除草剤、殺真菌剤および／または殺虫剤を撒くために使用することができる。
【００３２】
特に有利にはゴーストは、グラム陰性細菌に由来し、例えばこれらはエシェリキア・コリ、クレブシエラ、サルモネラ、エンテロバクター、シュードモナス、ビブリオ、アクチノバシラス、ヘモフィルス、パストレラ、ボルデテラ、ヘリコバクター、フランシセラ、ブラムバメラ（Brambamella）、エルウィニア、パントエア（Pantoea）、ストレプトマイセス、フランキア、セラチア、アグロバクテリウム、アゾトバクター、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブルクホルデリア、リゾビウム、リゾモナス及びスフィンゴモナスから選択される。特に有利なグラム陽性細菌の例は、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びバシラスである。
【００３３】
作用物質を含有するゴーストの医薬的適用は、周知の方法に従って、例えば経口、気道的、たとえば鼻腔内、眼内、局所又は非経口、例えば筋内、腹膜腔内静脈内又は皮下的に実施できる。
【００３４】
ゴーストの適用は、有利には病原体による生物の自然の感染と同様に行う。こうして主要な侵入ゲート（Hautpeintrittspforte）が胃腸管である病原性病原体（Ｅ．ｃｏｌｉ、サルモネラ、ビブリオ又はヘリコバクター）の撲滅のために予定されている作用物質を有する細菌ゴーストを経口で適用することができる。相応の作用物質を含有する、肺炎の病原体、例えばアクチノバシラス、パストレラ、シュードモナス又はヘモフィラスからのゴーストは有利には気道的に適用する。
【００３５】
作用物質を有する細菌ゴーストの本発明による適用は、ヒトの医学に関してだけでなく、獣医学に関しても、特に家畜、例えばブタ、ニワトリなどの保護的種痘のためにも適当である。
【００３６】
農業での使用形のために、ゴーストは土壌、空気を介して、又は種子のカプセルとして適用できる。
【００３７】
細菌ゴーストを介しての作用物質の適用は、従来の適用形と比べて多くの利点を有している。このように既にわずかな作用物質量は強力な作用の達成のために十分である。更に標的細胞／組織に特異的な作用物質の適用も可能である。ほとんど免疫原的に作用する細菌ゴースト外被に基づいて、アジュバント作用が達成される。ゴースト中に含まれている作用物質は、生理学的プロセス、例えば酵素、例えばプロテアーゼ、ヌクレアーゼ又はヒドロラーゼによる分解から保護される。更に他の作用物質との組み合わせも可能である。最後に細菌ゴーストは安価に製造でき、かつ作用物質を容易にかつ廉価に調剤することができる。
【００３８】
なお本発明の他の対象は封入される作用物質を有する細菌ゴーストであり、その際、作用物質は、例えば核酸であってよい。
【００３９】
最後に、本発明は、封入された作用物質を有する細菌ゴーストを含有する製薬又は農業的な組成物にも関する。本発明による製薬学的組成物は、慣用の医薬品調剤の形で、例えば注入可能又は気道的に適用可能な溶液又は懸濁液として、経口調剤、例えば錠剤、カプセル剤又は糖衣錠剤として、クリーム剤又は軟膏剤などとして存在してよい。更に該組成物は再生可能な凍結乾燥物として存在していてよい。
【００４０】
本発明による組成物は、工程：
（ａ）細菌ゴーストを調製する工程及び
（ｂ）細菌ゴーストと作用物質とを、封入をもたらし、かつ，有利には作用物質がゴースト中で固定化する条件下に接触させる工程
を含む方法によって得ることができる。
【００４１】
更に、本発明は以下の図面及び実施例によって説明する。
【００４２】
図１は誘導可能なｌａｃプロモーター（ｌａｃＰＯ）のコントロール下の融合遺伝子Ｅ′−ＦＸａ−ＳｔｒｐＡ、複製起点ＣｏｌＥ１及びアンピシリン耐性遺伝子ｂｌａを有するストレプトアビジン固定プラスミドｐＡＶ１を示している。
【００４３】
図２はストレプトアビジン−ゴースト中に結合されるアルカリ性ホスファターゼの反応キネティックを示している。
【００４４】
実施例
１．材料及び方法
１．１  ストレプトアビジンをコードするプラスミドの製造
プラスミドｐＢＧＧ９（British  Biotechnology  Limited）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。完全なストレプトアビジン遺伝子（Argarana  et  al.,Nucleic  Acids  Res.14(1986),1871-1882）を含有する４９５ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動及び引き続いての電気溶出によって単離した。ＮｄｅＩ制限部位をクレノウポリメラーゼを使用して充填し、断片をＭ１３Ｋ１１ＲＸ（Waye  et  al.,Nucleic  Acids  Res.13(1985),8561-8571）のＨｉｎｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限断片の間に挿入した。得られたファージミドＭ１３ＦＮはストレプトアビジン遺伝子の１６０コドンをプロテアーゼ因子Ｘａ（ＦＸａ）の認識配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードする短い配列の３′−末端に融合して有している。このＦＸａ−ＳｔｒｐＡカセットをＢａｍＨＩでの制限分解によって単離し、かつ得られた５０９ｂｐ長のＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ断片をＢａｍＨＩで直鎖化されたプラスミドｐＳＫ−（Stratagene,Cleveland,Ohio）中にサブクローニングし、プラスミドｐＦＮ６が得られた。その５０９ｂｐ長のＢａｍＨＩによって分解された膜ターゲティングベクターｐＫＳＥＬ５中に挿入し、その際、プラスミドｐＡＶ１ｌはストレプトアビジン遺伝子と、５′−末端の膜固定配列Ｅ′に融合して得られた（図１）。
【００４５】
１．２  ストレプトアビジンゴーストの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２細胞（Stratagene）を溶解プラスミドｐＭＬ１（Szostak  et  al.,J.Biotechnol.44(1996),161-170）及びストレプトアビジンをコードするプラスミドｐＡＶ１で同時に形質転換した。形質転換体をアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのイーストエキストラクト、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）中で２８℃で培養した。１ｌの培地に単一の形質転換体コロニーに由来するオーバーナイト培養を接種し、発酵槽（Typ  MRD  60TE,Meredos  GmbH,Bovenden,Deutschland）のための前培養として使用した。これらの細菌を発酵槽中で１０ｌの容量で通気及び攪拌下で６００ｎｍでの光学密度０．４が達成されるまで培養した。次いでＩＰＴＧを３ｍＭの最終濃度にストレプトアビジンの発現の誘導のために添加した。３０分後に、０．２ＭのＭｇＳＯ４を添加し、その２０分後に溶解タンパク質Ｅの発現を２８℃から４２℃への温度上昇によって誘導した。１時間後に、細胞を４０００ｇでの遠心分離によって回収した。蒸留水中でのペレットの再懸濁（最終容量５ｌ）は即座の溶解をもたらした。これらのゴーストを大量のトリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）で２回洗浄し、引き続き凍結乾燥させた。
【００４６】
１．３  光学鏡検及び電子鏡検
光学顕微鏡による調査をオリンパスＡＸ７０ＴｒｕｅＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍ顕微鏡を使用して実施した。透過型電子顕微鏡写真をジーメンスＥｌｍｉｓｃｏｐ１０１電子顕微鏡で撮影した。走査型電子顕微鏡写真はヒタチＳ−８００電界放出走査型電子顕微鏡で撮影した。細胞の固定及び電子顕微鏡のための調製はＷｉｔｔｅ他（J.Bacteriol.172(1990),4109-4114）で記載されるように実施した。
【００４７】
ストレプトアビジンの検出のためにゴーストを金標識されたアルブミン−ビオチン（10nm,SigmaImmunochemicals）を使用して、トリス緩衝液（１０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に希釈して振盪下に３７℃で２０分間インキュベートし、洗浄し、かつ電子鏡検のために固定した。
【００４８】
１．４  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動及びウェスタンブロット
ゴースト又はタンパク質試料をゲル負荷バッファー（２％のＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール、１０％のグリセリン及び０．００３％のブロムフェノールブルー、０．０６３Ｍのトリス−ＨＣｌ中、ｐＨ６．８）中で５分間煮沸し、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにＬａｅｍｍｌｉの方法（Nature  227(1970),680〜685)に従って分離した。ウェスタンブロットをＴｏｗｂｉｎ他（BIotechnology  24(1992),145-149）によって記載されるように実施した。ブロットを１％のウシ血清を含有するＴＢＳ中でブロッキングし、かつウサギ由来の抗ストレプトアビジン抗血清と一緒にインキュベートした。
【００４９】
１．５  ビオチン化されたアルカリ性ホスファターゼ及び蛍光標識されたビオチンの結合
ビオチン化されたアルカリ性ホスファターゼ（Pierce）をトリス緩衝液中で１：１０００に希釈した。２ｍｇの凍結乾燥されたゴーストを５００μｌのアルカリ性ホスファターゼの希釈溶液中で懸濁し、かつ振盪下に３７℃で３０分間インキュベートした。これらの試料を１００００ｇで遠心分離し、２０ｍｌのトリス緩衝液で３回洗浄し、４回目にジエタノールアミンバッファー（１０ｍＭのジエタノールアミン、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２  ｐＨ９．５）中で洗浄し、引き続き６アリコートに分けた。次いで基質（ジエタノールアミンバッファー中の２．５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート）を添加し、反応を０．５分、１分、２分、４分、８分又は１６分後に同量の７ＭのＮａＯＨの添加によって停止させた。試料を１００００ｇで遠心分離し、４１０ｎｍで上清を測定した。
【００５０】
モル吸光係数ε＝１８．５×１０３×Ｍ-１×ｃｍ-１が測定され、ランベルト−ベール方程式によるｐ−ニトロフェノールの形成量の計算のために使用した。１ゴーストあたりに結合するアルカリ性ホスファターゼ分子の数を、アルカリ性ホスファターゼの活性単位がｐＨ９．５及び３７℃での１分あたりの１マイクロモルのニトロフェノールの遊離に相当すると仮定して計算した。アルカリ性ホスファターゼの単位は０．７μｇに相当し、その分子量は１４００００であり、かつ１ｍｇのゴーストは６．７×１０８の個々の外被を含有する。
【００５１】
蛍光標識されたビオチン（ＦＩＴＣ−ビオチン）の結合のために、ゴーストをＰＢＳ中で繰り返し、上清中の相対的な蛍光強度が５３０ｎｍで０．５未満（４９０ｎｍで励起）になるまで洗浄した。１ｍｇの凍結乾燥したゴーストを０．４０５６μｇのＦＩＴＣ−ビオチン／１００ｍｌのＴＢＳを含有する２ｍｌの溶液中で振盪下に３０分間インキュベートした。これらの試料を１００００ｇで遠心分離し、上清中の蛍光強度を測定した。
【００５２】
１．６  ポリリジンのビオチン化
ポリ−Ｌ−リシン−ヒドロブロミド（分子量１８０００（Sigma））を以下のプロトコールを使用してビオチン化した：６ｍｇのポリリジンを１ｍｌの燐酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中に取った。２００μｌのＤＭＳＯ中の６４０μｇのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer  Mannheim）の溶液５０μｌを添加し、ｐＨ値を０．５ＭのＮａＯＨの使用下に１０に調整した。反応バッチを一晩、室温で攪拌し、引き続き４８時間水で透析した。ＨＡＢＡ試験（Sigma）によって１モルのポリリジンあたり２モルのビオチンの結合比が得られた。
【００５３】
１．７  ＤＮＡの蛍光標識
任意に選択したプラスミド（ｐＵＣ１８）を蛍光標識されたＤＮＡの作成のために使用した。標識をポリメラーゼ連鎖反応及び標識されたヌクレオチド（Cy3-dCTP、Pierce）を使用して実施した。反応バッチは２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、２００μｍのｄＴＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ（そのうち７５％がＣｙ３−ｄＣＴＰ）、それぞれ１μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、０．２ｎｇ／μｌの直鎖状のプラスミドＤＮＡ及び０．０２Ｕ／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをポリメラーゼバッファー中に含有していた。反応プロトコールは以下のようであった：前変性９５℃で４分間；３５サイクル：９５℃で１分／６０℃で１分／７２℃で３分；７２℃で５分間の最終伸長。これらの試料をフェノール処理し、エタノール沈殿し、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し、−２０℃で保管した。
【００５４】
１．８  蛍光標識されたデキストラン及びＤＮＡ／ポリリジンの結合
１ｍｇの凍結乾燥されたストレプトアビジン−ゴーストを１ｍｌのトリス緩衝液中に懸濁した。ビオチン化された蛍光標識されたデキストラン（Molecular  Probes  Europe  BV）の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、その混合物を振盪下に３７℃で１時間インキュベートした。これらのゴーストを１．５ｍｌのトリス緩衝液中で３回洗浄し、光学顕微鏡によって分析した。蛍光標識されたＤＮＡ及びビオチン化されたポリリジンからなる複合体の結合のために、ＤＮＡ（ＨＢＳ［１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３−］中の０．１μｇ／μｌ）及びポリ−Ｌ−リジン（ＨＢＳ中の１μｇ／μｌ）の希釈溶液を製造した。この溶液を１０：１のＤＮＡ／ポリリジン質量比で合し、直ちに混合した。次いでストレプトアビジン−ゴーストをその中に懸濁し、振盪下に３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、かつ光学鏡検によって分析した。
【００５５】
２．結果
２．１  ストレプトアビジンの膜固定
作用物質の輸送のための媒介体としての細菌ゴーストの使用において、作用物質は細菌外被の内部に固定化されるべきである。ストレプトアビジンが外被中に固定されて含有する組換えゴーストはビオチン化された化合物と高い親和性で結合できる。このために、１．１で記載したように、プラスミドｐＡＶ１を製造した。該プラスミドはバクテリオファージＰｈｉＸ１７４（Ｅ′）の遺伝子Ｅの５４個の５′−末端コドンに引き続いてＦＸａ−ＳｔｒｐＡカセットのインフレーム融合（in  frame  fusion）からなるハイブリッド遺伝子を含有する。そのプラスミドは図１に示されている。
【００５６】
２．２  ストレプトアビジンゴーストの製造
異なる遺伝子Ｅ  発現制御配列、複製起点及び選択マーカーを有する多数のＥ−特異的溶解プラスミドを使用する（Szostak  et  al.,J.Biotechnol.44(1996),161-170）。本願で使用されるプラスミドｐＭＬ１は遺伝子ＥをλｐＲ−ｃＩ８５７系の転写調節下に含有する。溶解の開始はＥ．ｃｏｌｉ株ＮＭ５２２／ｐＭＬ１において６００ｎｍでの光学密度の低下によって２８℃から４２℃への培養温度の上昇の約１０分後に観察された。
【００５７】
ゴーストを代替のＥ−溶解プロトコールによって製造するために、０．２ＭのＭｇＳＯ４を培養培地に遺伝子Ｅ発現の誘導の２０分前に添加した。この手順においては、タンパク質Ｅが細菌性細胞壁複合体中に組み込まれるが、細胞溶解は取り巻く培地中の高い塩濃度によって阻害される。ＭｇＳＯ４で処理された培養中で遺伝子Ｅの発現を１時間行い、細胞を引き続き遠心分離によって回収した。水又は低いイオン強度を有する緩衝液中での細胞の再懸濁は迅速な爆発的な溶解を引き起こし、これは正常なＥ溶解よりかなり大きい溶解孔が生じる。
【００５８】
２．３  代替の溶解によってもたらされるゴーストの光学鏡検による表現
ゴーストは生きている細胞から光学鏡検によって区別でき、この場合、これらは明らかにインタクトな細菌より透明に見える。代替のＥ−溶解によってもたらされたゴーストの光学鏡検による調査は切り離された極帽またはこれらを２つに分ける中央の亀裂を有する細胞を示した。これらのゴーストはいくらか伸長して見える。
【００５９】
２．４  金−複合されたビオチンの検出
ゴースト中のストレプトアビジンの局在化の検出のために、ストレプトアビジン−ゴーストを金標識されたアルブミン−ビオチン粒子と一緒にインキュベートし、洗浄し、かつ電子鏡検によって調査した。超薄切片は専らゴースト−内膜に沿って配置されている金粒子が見られる。
【００６０】
２．５  ゴースト中のストレプトアビジン固定の測定
そのストレプトアビジン含量の測定のためにストレプトアビジン−ゴーストをコントロールとして規定量の純粋なストレプトアビジンと一緒にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。これらのゲルをニトロセルロースメンブレン上でトランスファーし、抗ストレプトアビジン抗血清で処理した。ストレプトアビジン−特異的なウェスタンブロットでのバンドのデンシトメトリーによる分析は全細胞質量の約５％のストレプトアビジン含量を示した。
【００６１】
２．６  ビオチン化されたアルカリ性ホスファターゼ及びＦＩＴＣビオチンの機能的結合並びに結合部位の定量
ストレプトアビジン−ゴーストのビオチン結合能力の測定のために、酵素試験を展開した。両者とも代替の溶解プロトコールによって製造されたストレプトアビジン−ゴースト及びストレプトアビジン−ネガティブゴースト（膜に固定したストレプトアビジンのないゴースト）並びに標準的溶解によって製造されたストレプトアビジン−ゴーストをビオチン化されたアルカリ性ホスファターゼと一緒にインキュベートした。徹底的な洗浄の後に、残された酵素の量を基質としてのｐ−ニトロフェニルニトロホスフェートの使用下に測定した。ストレプトアビジン−ネガティブのゴースト試料中では実際的に反応が明らかでないが、代替的に溶解されたストレプトアビジンゴーストは淡黄色の色を呈する。反応を制御された間隔に従って停止させ、かつ試料上清の４１０ｎｍでの吸光を測定した。
【００６２】
１．５に挙げられた計算法に従って、１ゴーストあたりに結合するアルカリ性ホスファターゼ分子の数が約２００で規定された。興味深くは、正常な溶解によってもたらされるストレプトアビジン−ゴーストは酵素試験においてネガティブであった。従って、アルカリ性ホスファターゼのように大きな作用物質分子の場合には、代替の溶解プロトコールによってもたらされる細胞膜に大きな孔が存在し、ゴーストの内部に効果的に拡散できることが必要である。
【００６３】
図２は代替の溶解によってもたらされるストレプトアビジン−ゴーストに結合するビオチン化されたアルカリ性ホスファターゼの反応のキネティックを示している。コントロールとして、代替の溶解によってもたらされるストレプトアビジンにネガティブなゴーストを使用する。
【００６４】
相応の試験を蛍光標識されたビオチンの使用下に実施した。ゴースト試料及びストレプトアビジン−ゴースト試料をＦＩＴＣ−ビオチンと一緒にインキュベートし、遠心分離し、かつ上清中の非結合の標識の残りの蛍光を測定した。多くのより小さな分子（分子量８３２）は１ゴーストあたり２０６０±４００の数で結合した。
【００６５】
２．７  蛍光標識されビオチン化されたデキストラン及び蛍光標識されたＤＮＡの結合
蛍光標識されたビオチン化されたデキストラン及び蛍光標識されたＤＮＡを、ストレプトアビジン−ゴースト中の作用物質のターゲティングのために使用できる化合物の固定化を示すためのモデルとして使用した。このためにストレプトアビジン−ゴーストをビオチン化されたポリ−Ｌ−リシン及び蛍光標識されたＤＮＡの混合物もしくは蛍光標識されたビオチン化されたデキストランと一緒にインキュベートし、かつ蛍光顕微鏡によって分析した。両者の場合には、ゴーストにおける蛍光標識が見られた。ネガティブコントロール（ストレプトアビジン無しのゴースト）は発色しなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は誘導可能なｌａｃプロモーター（ｌａｃＰＯ）のコントロール下の融合遺伝子Ｅ′−ＦＸａ−ＳｔｒｐＡ、複製起点ＣｏｌＥ１及びアンピシリン耐性遺伝子ｂｌａを有するストレプトアビジン固定プラスミドｐＡＶ１を示している。
【図２】  図２はストレプトアビジン−ゴースト中に結合されるアルカリ性ホスファターゼの反応キネティックを示している。
【図１】
0004903937.tif 000002
【図２】
0004903937.tif 000003