(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学含有量＞９９％および（６Ｓ）−割合１００％を有する（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶。
【請求項２】
（６Ｓ）−割合９９．９％を有する（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸−ベンゼンスルホン酸−付加塩を極性媒体中でｐＨ−値４．２で結晶化する、化学含有量＞９９％および（６Ｓ）−割合１００％を有する（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶を製造する方法。
【請求項３】
極性媒体として水又は水と極性水溶性有機溶剤から成る混合物を使用する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ−値を結晶化の間一定に保つ、請求項２〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
結晶化を溶液から行う、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
結晶化を懸濁液から行う、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
薬剤の製造のための成分として、化学含有量＞９９％および（６Ｓ）−割合１００％を有する（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶を使用する方法。
【請求項８】
薬剤の製造のための成分として、請求項２〜６のいずれかに記載の方法にしたがって製造された、化学含有量＞９９％および（６Ｓ）−割合１００％を有する（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、結晶性Ｎ- 〔４- 〔〔（２- アミノ -１，４，５，６，７，８- ヘキサヒドロ -４- オキソ-(６Ｓ)-及び-(６Ｒ)-プテリビニル）メチル〕アミノ〕ベンゾイル〕 -Ｌ- グルタミン酸（以下結晶性（６Ｓ)-又は（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸と呼称する。）、その使用方法並びにその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
テトラヒドロ葉酸- 誘導体は２個の不斉中心を含有する。その際葉酸、すなわちＮ-(プテロイル)-Ｌ- グルタミン酸からこの誘導体を合成することに基づきグルタミン酸残基中に含有される光学的に活性なＣ- 原子はＬ- 型で存在し、一方常法でプロテイル−残基の５，６- 位にある二重結合の水素化することによって生じる光学的に活性なＣ- 原子は６位にラセミ性（６Ｒ，Ｓ)-型で存在する。したがってテトラヒドロ葉酸の誘導体は、２個のジアステレオマーの１：１混合物から成る。
【０００３】
薬剤としてテトラヒドロ葉酸塩を主に５- ホルミル -５，６，７，８- テトラヒドロ葉酸（ロイコボリン) の又は５- メチル -５，６，７，８- テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩として巨大赤芽球性葉酸欠乏- 貧血の治療に、解毒薬として癌治療（“抗葉酸救済”）に於けるフッ素- 拮抗剤、特にアミノプテリン及びメトトレキサートの相容性の強化のために、フッ素化されたピリミジンの治療効果の及び自己免疫疾患、たとえば乾癬及びリュウマチ性関節炎の治療の強化のために、特定の駆虫剤、トリメトプリム- スルフアメトキサゾールの相容性の強化のために並びに化学療法に於けるジデアザテトラヒドロホラートの毒性の減少のために使用する。同様にテトラヒドロ葉酸は多様なテトラヒドロ葉酸- 誘導体の製造用基本物質として使用される。
【０００４】
テキラヒドロ葉酸を薬剤として又は多様なテトラヒドロ葉酸- 誘導体の製造のための基本物質として直接使用することは、従来薬学的有効物質として容認できる純度を有するテトラヒドロ葉酸の製造で困難につきあたり、そしてテトラヒドロ葉酸の著しい不安定性が障害となる。この際特に高い酸化敏感性が注目される〔Ａ．Ｌ．フィツフーフ(Fitzhugh)、Pteridines  ４（４），１８７−１９１（１９９３）参照〕。この不安定性の克服するために、種々の方法が開発されている。但しドイツ特許出願公開第２，３２３，１２４号公報には本発明に関連することが特に述べられている。テトラヒドロ葉酸の製造法及び本発明との関連がヨーロッパ特許第６００４６０号明細書中に同様、具体的に述べられている。しかし従来まだ高純度及び優れた安定性を有するテトラヒドロ葉酸の製造に適し、同時にテトラヒドロ葉酸の薬学的使用を可能にする、工業的に実施できる方法を見い出すことができなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
今や、驚くべきことに本発明者は、高い化学的及び光学的純度及び優れた安定性を有する（６Ｓ)-又は（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸が次の様にして得られることを見い出した。すなわち光学的に純粋な（６Ｓ)-又は光学的に純粋な（６Ｒ)-、濃厚な（６Ｓ)-又は濃厚な（６Ｒ）−、又は（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を結晶化する。得られた結晶性（６Ｓ)-及び（又は）（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸は、先ずこれを薬剤として又は高い純度を有する他のテトラヒドロ葉酸- 誘導体の工業的製造のための出発化合物として使用することができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
その際（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の結晶は、極性媒体からｐＨ- 値≧３．５で行われ、（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化は極性媒体からｐＨ- 値≧２で行われる。
【０００７】
極性媒体として、特に水又は水及び水と混和しうる有機溶剤、たとえばアルコール、たとえばメタノール、エタノール、ｎ- プロパノール、イソ- プロパノール、エチレングリコール、低級脂肪族水溶性カルボン酸、たとえばギ酸、酢酸、乳酸又は水溶性アミド、たとえばホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、１- メチルピロリドン、２- メチルピロリドン、２- ピペリジノンから成る混合物が適する。使用される溶剤の種類及び混合割合に関して特別の制限はない。というのは結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸及び結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸が一般に対応する非晶質形に比してより低い溶解度を有するからである。
【０００８】
（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化の開始時には特にｐＨ- 値３．６〜６．５が適する。（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化の開始時には特にｐＨ- 値２〜５．５が適する。結晶化の開始時の最適なｐＨ- 値は、使用される材料及び所望の目的に依存し、簡単な試験によって特定化することができる。一般に塩含有量が出発溶液中で高くなればなるほど、結晶化開始時のｐＨ- 値はますます低下するが、結晶化開始時のｐＨ- 値が低くければ低いほど、結晶化はますますゆっくり行わねばならない。というのは更に約３のｐＨ- 値で非晶質のテトラヒドロ葉酸が沈殿するからである。葉酸の水素化ホウ素- 還元により得られた反応溶液から（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を直接結晶化するために、たとえば結晶化開始時のｐＨ- 値は≦４．８が必ず必要である。結晶化の開始後、ｐＨ- 値を変えることができる。
【０００９】
（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化の間及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化の間も、ｐＨ- 値は増加するか又はｐＨ- 値を酸又は緩衝液の添加によって一定に保つことができる。（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の光学的増加が結晶化の目的の場合、結晶化の間４．５〜５．５のｐＨ- 値が好ましいといえる。安定な結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の製造が結晶化の目的の場合、結晶化の間３．５〜４．５のｐＨ- 値が好ましい。（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化に対して、所望の目的に関係なく結晶化の間のｐＨ- 値３．５〜４．５が好ましい。結晶化は、夫々室温で、高められた温度で、しかしまたより低い温度で実施することができる。
【００１０】
結晶化時間は、２〜３分〜数日である。より長い結晶化時間は、一般に高められた純度及び安定な生成物を生じる。
（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化は、ｐＨ- 値の徐々の調整によって対応する異性体の結晶化の開始時に適するｐＨ- 値よりも小さいｐＨ- 値から又は好ましくは高められたｐＨ- 値から自然発生的に生じる。結晶化を、対応する結晶性テトラヒドロ葉酸を用いて結晶種を注入することによって対応する異性体の結晶化開始時に適するｐＨ- 範囲内で生じることができる。
【００１１】
結晶化の出発材料としてラセミ性（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸、濃厚な（６Ｓ)-又は（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸及び非晶質の（６Ｓ)-又は（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸を使用することができる。その際、単離された固体、たとえば（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸、（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸- 硫酸及びスルホン酸- 付加塩──これらはヨーロッパ特許第４９５，２０４号明細書に従って製造される──及びその場で接触水素化又は水素化ホウ素- 還元によって葉酸から製造されるテトラヒドロ葉酸が出発材料として適する。（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化は（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸- 結晶化の母液から直接行うことができる。２つの異性体の結晶化は、たとえばｐＨ- 値＞７又は＜２の調整によって得られる溶液から及び懸濁液から行うことができる。
【００１２】
非晶質の又は結晶性光学的に純粋なテトラヒドロ葉酸又はその塩を結晶化に対する出発材料として使用することによって、本法によって従来決して得られなかった純度（＞９８％）及び従来同様に決して得られなかった安定性の結晶性テトラヒドロ葉酸が得られる。
【００１３】
本発明は、結晶性（６Ｓ)-及び（又は）（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸を薬剤の製造のための成分として又は他のテトラヒドロ葉酸- 誘導体の製造のための成分として使用することに関する。というのは結晶性（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸が固形でその優れた安定性に基づき、時間的に実質上制限されない、一定の極めて良好な品質を所持するからである。同様に、本発明は結晶性（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸を含有する薬学的調製物にも関する。薬学的調製物の製造は、公知方法、たとえば凍結乾燥によって行われる。その使用は、公知物質の使用と同様にテトラヒドロホラート、たとえば５- ホルミル -５，６，７，８- テトラヒドロ葉酸の領域から行われる。
【００１４】
更に、本発明は、（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を２つのジアステレオマー（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸に分別結晶によって分離する方法に関する。この方法は、極めて簡単かつ生産性が高い。粗ラセミ性（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の最初の結晶ですでに７５％以上の（６Ｓ)-割合を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸が７０％以上の収率で及び８０％以上の（６Ｒ)-割合を有する結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸が５０％以上の収率で得られる。同様な条件下で別の結晶化によって９５％以上の異性体純度を有する結晶性（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸を得ることができる。
【００１５】
（６Ｒ)-又は（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を、単離せずに他のテトラヒドロ葉酸- 誘導体の製造に使用することもできる。したがってたとえば（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸溶液にホルムアルデヒドを添加することによって極めて簡単に濃厚な５，１０- メチレン-(６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を製造することができる。
【００１６】
【実施例】
以下に本発明を説明するために、例によって説明する。例中に記載されるテトラヒドロ葉酸の含有量および異性体割合を、夫々ＨＰＬＣで測定する。すべてのテトラヒドロ葉酸- 含有量は無水のものに対してである。
〔例１〕（安定性）
結晶性（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の安定性測定のために、物質を比較試料と一緒に負荷条件下で６０℃で空気中下に保存する。周期的間隔でテトラヒドロ葉酸の残存含有量を測定し、出発値と比較して記載する。
【００１７】
【表１】
0004898081.tif 000002
【００１８】
結晶性（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸は、比較的長い負荷期間後６０℃で空気中でまだ極めて明るく、ほとんど白である。これに反して他の比較生成物は速やかに、極めて著しく変色する。
【００１９】
安定性試験に使用される物質を下記の様に製造する：
・結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸。
本発明の例６に従って。
・結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸。
【００２０】
本発明の例９に従って。
・“ヤマノウチによる結晶性（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸”。
ドイツ特許出願公開第２，３２３，１２４号明細書例３に従って。
・非晶質の（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸。
【００２１】
（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を酢酸中に溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させる。
・非晶質の（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸。
【００２２】
（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸を酢酸中に溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させる。
・非晶質の（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸。
【００２３】
（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を酢酸中に溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させる。
〔例２〕（粉末Ｘ線図）
結晶性（６Ｓ)-及び(6）−テトラヒドロ葉酸の構造性質（結晶度）を調べるために、これらの物質と比較物質よって同一条件下で粉末Ｘ線図（回析スペクトル）を採用する。
【００２４】
結晶性（６Ｓ)-及び（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸は２つの十分に分割された異なる、鮮明なバンド及び低い基底を有するスペクトルを生じる。これに反して“ヤマノウチによる結晶性（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸”は、不良に分割された不鮮明なバンド（ぼやけ最大）及び高い基底を有するスペクトルを生じる。このスペクトルは、ほんの僅かの結晶性部分を有する、主に存在する非晶質の（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を示す。
【００２５】
粉末Ｘ線の測定のために、使用される物質を下記の様に製造する：
・結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸。
本発明の例６に従って。
・結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸。
【００２６】
本発明の例９に従って。
・“ヤマノウチによる結晶性（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸”。
ドイツ特許出願公開第２，３２３，１２４号明細書例３に従って。
〔例３〕
ａ）（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４ｇを、水１６ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９に調整する。生じる溶液を５０℃で塩酸によりｐＨ５に、その後苛性ソーダ溶液で徐々に所望されるｐＨ- 値に調整する。記載のｐＨ- 値で夫々２ｍｌ- 試料を取り出し、濾取し、少量の水で洗滌する。
【００２７】
0004898081.tif 000003
ｂ）（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４ｇを、水１６ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９に調整する。生じる溶液を５０℃で塩酸によりｐＨ５に、その後塩酸で徐々に所望されるｐＨ- 値に調整する。記載のｐＨ- 値で夫々２ｍｌ  - 試料を取り出し、濾液し、少量の水で洗滌する。
【００２８】
0004898081.tif 000004
ｃ）（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４ｇを、水１６ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９に調整する。生じる溶液を５０℃で塩酸によりｐＨ５に、その後塩酸で徐々に所望されるｐＨ- 値に調整する。記載のｐＨ- 値で夫々２ｍｌ  - 試料を取り出し、濾取し、少量の水で洗滌する。
【００２９】
0004898081.tif 000005
ｄ）（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸１０ｇを、水８０ｍｌ中に懸濁し、１Ｎ塩酸でｐＨ１．３に調整する。生じる溶液を室温で１．８Ｎアンモニアにより徐々に所望されるｐＨ- 値に調整する。記載のｐＨ- 値で夫々２ｍｌ- 試料を取り出し、濾取し、少量の水で洗滌する。
【００３０】
0004898081.tif 000006
表ａ）〜ｄ）中に記載された値は、最適な処理パラメーターに相当しない。というのはすべての試験が、比較しやすくするために一定に実施されているからである。
〔例４〕
（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸５ｇ夫々を水５０ｍｌ中に懸濁し、５日間室温で又は４０℃で放置する。濾取（濾過温度＝結晶化温度）及び洗滌後に、次の値が得られる。
【００３１】
0004898081.tif 000007
１）  ドイツ特許出願公開第２，３２３，１２４号明細書、例３と同様に、（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の懸濁時のｐＨ- 値（未補正）
２）  苛性ソーダ溶液で所望のｐＨ- 値に調整。
【００３２】
表中に記載された値は、最適な処理パラメーターに相当しない。というのはすべての試験が、比較しやすくするために一定に実施されているからである。
〔例５〕
（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４０ｇを水１６０ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９．３に調整する。生じる溶液を５０℃で塩酸で徐々にｐＨ５．１に調整し、引続きの結晶化の間ｐＨ５．１〜５．２に保つ。結晶化を行った後に、０〜５℃に冷却し、濾過し、水洗する。
【００３３】
化学含有量９５．９％及び（６Ｓ）−割合８０．５％を有する結晶性（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸１９ｇが得られる。
母液の半分から、エタノールによる沈殿によって化学含有量６３．３％及び（６Ｒ）−割合７５．９％を有する、濃厚な非晶質の（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸が得られ、母液のもう半分から塩酸でｐＨ−値３．５を速やかに調整することによって、化学含有量８４．８％及び（６Ｒ）−割合７５．９％を有する、濃厚な非晶質の（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸６．３ｇが得られる。
〔例６〕
ヨーロッパ特許第４９５２０４号明細書に従って製造された（６Ｓ）−割合９９．９％を有する（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸−ベンゼンスルホン酸−付加塩６０ｇを水２４０ｍｌ中に懸濁し、１．８Ｎアンモニア６３ｍｌ又は２Ｎ苛性ソーダ溶液５５．２ｍｌでｐＨ５．５に調整する。ｐＨ−値を５．５で保つ。次いで白色の濃い懸濁液を３０％苛性ソーダ溶液でｐＨ９．３に調整し、生じる澄明溶液を５０℃に加熱する。
【００３４】
ｐＨ５．２に塩酸でｐＨ- 値を引続き徐々に調整後、結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を接種後、化学含有量９６．８％及び（６Ｓ)-割合９９．９％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４３．０ｇが得られる。
【００３５】
水１６０ｍｌ中にｐＨ９で得られた結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４０ｇを溶解し、塩酸でｐＨ- 値を４．２で引続き徐々に調整して、結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を接種後、化学含有量９８．５％及び（６Ｓ)-割合１００．０％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸３２．５ｇが得られる。
【００３６】
ｐＨ４．２で更に再結晶して、化学含有量＞９９％及び（６Ｓ)-割合１００．０％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸が得られる。
室温で水中での得られた結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸の溶解度は、０．００２２％である。
〔例７〕
（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４０ｇを水１６０ｍｌ及びメタノール４０ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９．１に調整する。生じる溶液を５０℃で塩酸で徐々にｐＨ５．１に調整し、引続きの結晶化の間ｐＨ５．１〜５．２に保つ。結晶化を行った後に、部分試料２０ｍｌを５０℃で濾取し、水／メタノールで洗滌する。化学含有量９６．１％及び（６Ｓ)-割合８３．０％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸１．３ｇが得られる。
【００３７】
主な量を０〜５℃に冷却し、加圧濾過し、水／メタノールで洗滌する。化学含有量９０．９％及び（６Ｒ)-割合６７．１％を有する、別の結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸１８．６ｇが得られる。
〔例８〕
葉酸６０ｇを水２４０ｍｌ中に懸濁し、３０％苛性ソーダ溶液をｐＨ１１．５に調整する。生じる溶液を水素化ホウ素ナトリウム３０ｇで水１２０ｍｌ及び３０％苛性ソーダ溶液１２ｇ中で７０℃で還元する。約５時間の反応時間後、反応混合物を水１８０ｍｌで希釈し、塩酸で徐々にｐＨ４．５に調整する。引続きの結晶の後、ｐＨを約５．５に上げる。懸濁液を０〜５℃で加圧濾過し、水少量で洗滌する。
【００３８】
化学含有量９４．４％及び（６Ｓ)-割合８２．７％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸２５．５ｇが得られる。乾燥後の水分含有量は４．０％である。
水８０ｍｌ中にｐＨ９で得られた結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸２０ｇを溶解し、塩酸でｐＨ- 値を５．１で引続き徐々に調整して、結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸を接種後、化学含有量９４．０％及び（６Ｓ)-割合９４．７％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４．５ｇが得られる。乾燥後の水分含有量は１．８％である。
〔例９〕
（６Ｒ)-割合９９．４％を有する非晶質の（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸５０ｇを、水６００ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９．０に調整する。生じる澄明な溶液を５０℃に加熱する。
【００３９】
ｐＨ４．４に塩酸でｐＨ- 値を引続き徐々に調整し、この値を保った後、化学含有量９６．２％及び（６Ｒ)-割合９９．５％を有する結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸４２．０ｇが得られる。室温で水中で得られた結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の溶解度は０．０１４％である。
【００４０】
ｐＨ４．４で更に再結晶して、化学含有量＞９８％及び（６Ｒ)-割合９９．５％を有する結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸が得られる。
〔例１０〕
（６Ｒ，Ｓ)-テトラヒドロ葉酸４０ｇを水１６０ｍｌ中に懸濁し、２５％アンモニアでｐＨ９．３に調整する。生じる溶液を５０℃で塩酸で徐々にｐＨ５．１に調整し、引続きの結晶化の間ｐＨ５．１〜５．２に保つ。結晶化を行った後に、室温に冷却し、加圧濾過し、水洗する。
【００４１】
化学含有量９４．０％及び（６Ｓ)-割合７７．８％を有する結晶性（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸１８．２ｇが得られる。
（６Ｓ)-テトラヒドロ葉酸- 結晶の母液を、再び５０℃に加熱し、塩酸で徐々に４．４に調整し、（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸の結晶化を行う間ｐＨ４．０〜４．５に保つ。結晶化を行った後に、室温に冷却し、加圧濾過し、水洗する。
【００４２】
化学含有量７８．０％及び（６Ｒ)-割合７４．８％を有する結晶性（６Ｒ)-テトラヒドロ葉酸１２ｇが得られる。
〔例１１〕
ヨーロッパ特許第６００４６０号明細書中に記載された条件と同様に、ラセミ性テトラヒドロ葉酸から出発して記載の方法をｐＨ５．２及び４５℃でくり返し実施する。その際得られた生成物を化学的にかつ光学的純度について測定する。同様に化学的全収率をその夫々の段階に至るまで記録する。
【００４３】
純度
６Ｓ−割合      含有量ｇ／ｇ  ６Ｓ- 割合・含有量    全収率
出発化合物  ５０    ％    ８９．６％        ４４．８％    １００    ％
１．段階    ８０  ５％    ９６．９％        ７８．０％      ５３．５％
２．段階    ９０．０％    ９７．３％        ８７．６％      ４５．４％
３．段階    ９４．４％    ９７．４％        ９１．９％      ４２．０％
４．段階    ９６．４％    ９６．７％        ９３．２％      ３８．９％
５．段階    ９７．７％    ９６．２％        ９４．０％      ３５．２％
６．段階    ９８．４％    ９５．６％        ９４．１％      ３２．２％
７．段階    ９８．９％    ９６．０％        ９４．９％      ２８．６％
この記載から明らかな様に、この処理の数回の使用によって目的生成物中の（６Ｓ)-割合は十分に上昇し、一方処理の数回の実施が原因となる、生成物含有量の減少は受け入れねばならない。したがって、９８％以上の純度を有する生成物を、この処理の数回の使用によっても製造することができない。
【００４４】
【発明の効果】
本発明による方法によれば、高純度で優れた安定性を有するテトラヒドロ葉酸を製造することができる。