(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラトニンを酸化してメラトニン酸化物を得る酸化工程と、該酸化工程で得られたメラトニン酸化物の蛍光強度を測定してメラトニンの量を求める測定工程とを備えたことを特徴とするメラトニンの分析方法。
【請求項２】
前記メラトニンを過酸化水素で酸化することを特徴とする請求項１に記載のメラトニンの分析方法。
【請求項３】
前記メラトニンを側鎖メチレンのみを酸化する条件下において酸化することを特徴とする請求項１又は２に記載のメラトニンの分析方法。
【請求項４】
前記メラトニンをアルカリ性下において酸化することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のメラトニンの分析方法。
【請求項５】
前記メラトニンを炭酸ナトリウムの存在下において酸化することを特徴とする請求項４に記載のメラトニンの分析方法。
【請求項６】
前記メラトニン酸化物を有機溶媒で抽出する抽出工程を前記酸化工程と前記測定工程の間に備えていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のメラトニンの分析方法。
【請求項７】
内標準物質を加えたことを特徴とする請求項６に記載のメラトニンの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、メラトニンオキサイドが発する強い蛍光を利用したメラトニンの分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
急速に都市化、情報化の進んだ現代社会は２４時間化しており、人々のライフスタイルの多様化と共に睡眠覚醒症候群を含む生体リズム障害が急増している。これらの疾患は成人の社会生活を困難とし、幼児期、高齢者においては生活支援者の生活にも重大な問題を生じる。
【０００３】
また、このリズム障害は投与薬物の副作用の減弱と薬効の増強を目的とする時間治療、すなわち薬物投与のタイミングを最適化する治療の導入を困難とし、様々な疾患において治療法に制限を与える。
【０００４】
更にまた、例えば、未熟児や新生児の医療現場におけるような微量の試料しか採取できない場合において、生体成分や薬物などの微量分析が要請されるときには、蛍光分析法が広く利用されている。特に誘導体化試薬を用いる蛍光誘導体化法はそれ自体吸収や蛍光を持たない様々な分析対象に対して高感度かつ選択的な分析を可能にする極めて有効な手段であるといえる。
【０００５】
また、これまで蛍光標識を目的としてＤＮＳ−Ｃｌ、ＮＢＤ−Ｆなどの数多くの優れた試薬が開発されているけれども、これらの蛍光標識試薬にしても、安定性、感度、溶解性などにおいて問題を有するものも少なくない。例えば、ＤＮＳ誘導体は感度が不足するという欠点が、またＮＢＤ誘導体は光で分解されるという問題を有している。更に、当然のことながら、それらの蛍光標識試薬を用いた分析法や分析装置も問題を有する結果になっている。
【０００６】
上記したようなリズム障害の著効薬として、また生体リズムのマーカーとして最近注目されているのが、松果体から血液中に分泌されるホルモンであるメラトニンがあり、血中メラトニン濃度のモニターは重要である。
【０００７】
メラトニンは松果体においてＬ−トリプトファンからセロトニン、Ｎ−アセチルセロトニンを経て生合成されるインドールホルモンであり、夜間に生合成、分泌が亢進するという顕著な概日リズムを示すことが知られている。
【０００８】
メラトニンの分析方法としては、例えば、メラトニン自身の持つ蛍光を測定してメラトニンの量を求める自然蛍光法や、放射線ラベル体を使用してメラトニンの量を求めるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、哺乳類における内因性メラトニン含量は極微量であり、上述した従来の分析法ではメラトニンなどのインド−ル誘導体の血中濃度を測定するためには数ミリリットルの血液が必要であった。これは注射による静脈採血が必要な血液量であり、被験者に多大な負担を与えることから、特に頻繁に採血が必要な概日リズム測定などは非常に困難であった。
【００１０】
また、ＲＩＡはラジオアイソトープを使用しなければならないので、取り扱いが危険であり、特別の施設が必要である。
【００１１】
また、この発明は、特に蛍光性を有するインド−ルオキサイド誘導体を提供することを主な目的とする。更に、この発明は、強い蛍光性を有し、蛍光標識試薬の母核となり得るインド−ルオキサイド誘導体の製造方法を提供することを別の目的とする。
【００１２】
この発明はできるだけ微量の採血でメラトニンなどのインド−ルオキサイド誘導体の量を分析・測定できるようにした高感度なインド−ルオキサイド誘導体の分析方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化６】
0004873437.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素原子、炭素原子数が１ないし６の低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ５は水素原子またはアルデヒド基を意味し、Ｒ６は水素原子を意味し、Ｒ７は水素原子またはアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味する。ただし、Ｒ５が水素原子を意味するときは、Ｒ７は水素原子またはアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味し、Ｒ５がアルデヒド基を意味するときは、Ｒ７は水素原子を意味する）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を提供する。
【００１６】
また、この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、その好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ２が炭素原子数が１ないし６の低級アルキルオキシ基を意味することを特徴とする。更に好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ２がメチルオキシ基を意味することを特徴とするインド−ルオキサイド誘導体が提供される。
【００１７】
更に、この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、その好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ５が水素原子を意味し、Ｒ７がアセトアミノメチルカルボニル基を意味することを特徴とする。また、別の好ましい１態様として、一般式（Ｉ）において、Ｒ５がアルデヒド基を意味し、Ｒ７が水素原子を意味することを特徴とするが提供される。
【００１８】
更にまた、この発明は、反応式：
【００１９】
【化７】
0004873437.tif 000003
【００２０】
に示すように、一般式（ＩＩ）：
【００２１】
【化８】
0004873437.tif 000004
【００２２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素原子、低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ’５は水素原子を意味し、Ｒ６は水素原子を意味し、Ｒ’７はカルボン酸残基またはアシルアミノアルキレン基を意味する。）で示されるインド−ル誘導体を酸化して、上記一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得ることを特徴とするインド−ルオキサイド誘導体の製造方法を提供する。
【００２３】
この発明に係るインド−ル誘導体の分析方法は、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化工程と、該酸化工程で得られたインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求める測定工程とを備えたことを特徴とするものである。
【００２４】
また、この発明で使用する分析装置は、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化部と、このインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求めるインド−ル誘導体測定部とを備えたことを特徴とするものである。
【００２５】
【発明の実施の形態】
この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、一般式（Ｉ）：
【００２６】
【化９】
0004873437.tif 000005
【００２７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素原子、炭素原子数が１ないし６個の低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ５は水素原子またはアルデヒド基を意味し、Ｒ６は水素原子を意味し、Ｒ７は水素原子またはアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味する。ただし、Ｒ５が水素原子を意味するときは、Ｒ７はアシルアミノ−オキソアルキレン基を意味し、Ｒ５がアルデヒド基を意味するときは、Ｒ７は水素原子を意味する。）で示される。
【００２８】
上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４において示される炭素原子数が１ないし６個の低級アルキルオキシ基の低級アルキルは、炭素原子数が１ないし６個の１価直鎖状もしくは分岐状飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｉ−プロピル基、ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ヘキシル基などが挙げられる。また、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、フッ素原子などが挙げられる。
【００２９】
また、上記一般式（ＩＩ）において、Ｒ'７で示されるカルボン酸残基は、炭素原子数が２ないし７のカルボン酸のアルキル分子から１個の水素原子が脱離して得られた残基を意味し、例えば、カルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基などが挙げられる。
【００３０】
また、Ｒ'７で示されるカルボン酸残基は、アシルアミノアルキレン基のアシルは、炭素原子数が２ないし７の脂肪酸残基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられる。更にまた、アシルアミノアルキレン基のアルキレンは、炭素原子数が２ないし６の２価飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレンなどが挙げられる。
【００３１】
更に、上記一般式（Ｉ）において、Ｒ７で示されるアシルアミノ−オキソアルキレン基は、上記アシルアミノアルキレン基におけるアルキレンにオキソ基か置換基として存在する基を意味し、そのオキソアルキレンとしては、例えば、オキソエチレン、オキソプロピレン、オキソブチレンなどが挙げられる。
【００３２】
この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、強い蛍光を有すると共に、光や熱に対しても安定であることから、優れた蛍光母核となることができる。
【００３３】
この発明に係る上記一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体は、反応式：
【００３４】
【化１０】
0004873437.tif 000006
【００３５】
に示すように、一般式（ＩＩ）：
【００３６】
【化１１】
0004873437.tif 000007
【００３７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素原子、低級アルキルオキシ基またはハロゲン原子を意味し、Ｒ’５は水素原子を意味し、Ｒ６は水素原子を意味し、Ｒ’７はカルボン酸残基またはアシルアミノアルキレン基を意味する。）で示されるインド−ル誘導体を酸化することによって得ることができる。
【００３８】
この発明における酸化反応は、酸化剤を使用して常法に従って行うことができる。使用する酸化剤としては、インド−ル骨格の３位の置換基であるアシルアミノアルキレン基のアルキレン分子にオキソ基を導入することができる酸化剤、またはインド−ル骨格の１位のアミノ基にアルデヒド基を付加するとともに、その３位の置換基であるカルボン酸残基を脱離することができる酸化剤であればいずれでも使用することができるが、特に好ましい酸化剤としては過酸化水素が挙げられる。また、この発明における酸化反応は、水、炭酸ナトリウムなどの無機溶媒中において、加熱下で行うのが好ましいが、これらに何ら限定されるものではなく、適宜条件は変更することができる。
【００３９】
この発明に係るインド−ル誘導体の分析方法は、上記反応式において、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて、一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化工程と、該酸化工程で得られたインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求める測定工程とを備えたことを特徴とするものである。
【００４０】
この発明に係るインド−ル誘導体の分析方法において、前記インド−ル誘導体の酸化は、Ｒ’７で示されるアシルアミノアルキレン基の側鎖アルキレンのみを酸化する条件下またはインド−ル骨格１位のアミノ基にアルデヒド基を置換すると同時に、その３位のカルボン酸残基を脱離する条件下おいて行わせるのが好ましい。また、前記インド−ル誘導体の酸化はアルカリ性下、特にｐＨ１０〜１２で行わせるのが好ましい。
【００４１】
また、インド−ル誘導体の酸化は、例えばＨ２Ｏ２とＮａ２ＣＯ３からなる酸化剤を用いて行うことができるが、これら以外の酸化剤を用いて行ってもよい。
【００４２】
また、前記酸化工程と前記測定工程の間に、前記インド−ルオキサイド誘導体を有機溶媒で抽出する抽出工程を設けてもよい。この場合、抽出工程を加えることによりインド−ル誘導体の定量における再現性が低下するおそれがあるので、内標準物質を加えて分析するのが好ましい。
【００４３】
内標準物質としては、酸化によって蛍光誘導体化されてクロマトグラム上で良好なピークを与える物質、例えば５−メトキシインドール−３−酢酸（ＭＩＡＡ）を使用することができる。
【００４４】
また、この発明で使用する分析装置は、上記反応式において、一般式（ＩＩ）で示されるインド−ル誘導体を酸化させて一般式（Ｉ）で示されるインド−ルオキサイド誘導体を得る酸化部と、このインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定してインド−ル誘導体の量を求めるインド−ル誘導体測定部とを備えたことを特徴とするものである。
【００４５】
ここで、前記酸化部は側鎖アルキレンのみを酸化する条件下においてインド−ル誘導体を酸化させる装置であることが好ましい。また、前記酸化部は前記インド−ル誘導体をアルカリ性下において酸化させる装置であることが好ましい。アルカリ性下としてはｐＨ１０〜１２が、側鎖メチレンのみを酸化できるので、なお好ましい。
【００４６】
また、インド−ル誘導体の酸化は、例えばＨ２Ｏ２とＮａ２ＣＯ３からなる酸化剤を用いて行うことができるが、これら以外の酸化剤を用いて行ってもよい。
【００４７】
また、前記酸化部で得られたものからインド−ルオキサイド誘導体を有機溶媒で抽出し、これを前記測定部に供給する抽出部を設けてもよい。この場合、抽出部を設けることによりインド−ル誘導体定量における再現性が低下するおそれがあるので、内標準物質を加えて分析するのが好ましい。
【００４８】
内標準物質としては、インド−ル誘導体と同様にインドール骨格を持ち、酸化によって蛍光誘導体化されてクロマトグラム上で良好なピークを与える物質、例えばＭＩＡＡを使用することができる。
【００４９】
前記インド−ル誘導体測定部にはミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用し、高感度化して分析することが好ましい。
【００５０】
【実施例】
（実施例１）
メラトニンオキサイド（ＭＥＬ  ｏｘｉｄｅ）の合成法
【００５１】
【化１２】
0004873437.tif 000008
【００５２】
メラトニン（ＭＥＬ）５００ｍｇと炭酸ナトリウム１ｇを水５０ｍｌに溶解し、８０℃加熱下、３Ｍ過酸化水素水１２０ｍｌを添加して１０時間酸化反応を行った。反応の進行は、反応液の蛍光スペクトルを測定することによって追跡した。図１に、反応０時間（Ａ）、６時間後（Ｂ）および１０時間後（Ｃ）におけるスペクトルを示している。また図１の各図において、点線は２８０ｎｍで励起したときのスペクトルを示しており、主として３５０ｎｍに蛍光を示す原料であるメラトニンを示している。一方、実線は２４５ｎｍで励起したスペクトルであり、生成物であるメラトニンオキサイドを示している。このように時間の経過とともにメラトニンが減少し、３７４ｎｍに蛍光を示すメラトニンオキサイドが増加していることが示されている。反応終了後、反応液を酢酸エチルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。
【００５３】
得られたメラトニンオキサイドの物理的性質は次の通りであった。
0004873437.tif 000009
１Ｈ−ＮＭＲ／重メタ（Ｈ１：１．９５ｐｐｍ；Ｈ２：見えない；Ｈ３：４．３０ｐｐｍ；Ｈ４：７．９４ｐｐｍ；Ｈ５：見えない；Ｈ６：７．５１ｐｐｍ；Ｈ７：７．３３ｐｐｍ；Ｈ８：３．９０ｐｐｍ；Ｈ９：７．６８ｐｐｍ）
【００５４】
（実施例２）
１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）の合成法
【００５５】
【化１３】
0004873437.tif 000010
【００５６】
５−メトキシインドール−３−酢酸（ＭＩＡＡ）を、実施例１と同様にして酸化反応をなって１−ホルミル−５−メトキシインドールを得た。
【００５７】
得られた１−ホルミル−５−メトキシインドールの物理的性質は次の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ／重メタ（Ｈ１：見えない；Ｈ２：７．９０ｐｐｍ；Ｈ３：６．３０ｐｐｍ；Ｈ４：７．５０ｐｐｍ；Ｈ５：３．９０ｐｐｍ；Ｈ６：７．３５ｐｐｍ；Ｈ７：７．６５ｐｐｍ）
【００５８】
（実験例１）
メラトニンオキサイドの蛍光測定
メラトニンオキサイドを１０％メタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いてこの化合物の蛍光測定を行った。
【００５９】
なお、コントロールとして、メラトニンを同様にメタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いて蛍光測定を行った。
【００６０】
図２にメラトニンオキサイドについての励起・蛍光スペクトルを示した。図３にコントロールとしてのメラトニンについての励起・蛍光スペクトルを示した。図２および図３に示す励起・蛍光スペクトルから、メラトニンの励起極大波長は２８０ｎｍ、蛍光極大波長は３５０ｎｍであるのに対して、メラトニンオキサイドの励起極大波長は２４７ｎｍ、蛍光極大波長は３７８ｎｍとなり、ストークスシフトの増加が認められた。また蛍光強度は酸化反応によって増加し、メラトニンオキサイドはメラトニンの６．５倍の発光を示した。
【００６１】
（実験例２）
１−ホルミル−５−メトキシインドールの蛍光測定
実験例１と同様にして、１−ホルミル−５−メトキシインドールを１０％メタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いてこの化合物の蛍光測定を行った。
【００６２】
なお、コントロールとして、５−メトキシインドール−３−酢酸をメタノールに溶解して１０μＭの濃度の溶液にした。この溶液を用いて蛍光測定を行った。
【００６３】
図４に１−ホルミル−５−メトキシインドールについての励起・蛍光スペクトルを示した。図５にコントロールとしての５−メトキシインドール−３−酢酸についての励起・蛍光スペクトルを示した。図４および図５に示すように、５−メトキシインドール−３−酢酸においてもメラトニンと同様に波長シフトが認められ、５−メトキシインドール−３−酢酸の励起極大波長は２７９ｎｍ、蛍光極大波長は３５１ｎｍであるのに対して、１−ホルミル−５−メトキシインドールの励起極大波長は２４３ｎｍ、蛍光極大波長は３７４ｎｍとなり、ストークスシフトの増加が認められた。また１−ホルミル−５−メトキシインドールも強い蛍光を示し、その蛍光強度は５−メトキシインドール−３−酢酸の６．３倍であった。
【００６４】
（比較実験例１、２）
メラトニンオキサイドおよび１−ホルミル−５−メトキシインドールの蛍光特性と比較するために、市販の蛍光標識試薬のうち現在アミノ酸などの分析に広く用いられているＮＢＤ−ＦならびにＤｎｓ−Ｃｌを用いてアミノ酸を誘導体化して生成した蛍光誘導体の励起・蛍光スペクトルを測定した。ＮＢＤ−Ｆを用いた場合の蛍光誘導体（ＮＢＤ−Ａｌａ）の励起・蛍光スペクトルを図６に示し、Ｄｎｓ−Ｃｌを用いた場合の蛍光誘導体（Ｄｎｓ−Ａｌａ）の励起・蛍光スペクトルを図７に示した。
【００６５】
図６の結果から、蛍光誘導体（ＮＢＤ−Ａｌａ）の励起極大波長は４７２ｎｍ、蛍光極大波長は５３６ｎｍであることが、図７の結果から、蛍光誘導体（Ｄｎｓ−Ａｌａ）の励起極大波長は３２８ｎｍ、蛍光極大波長は５４２ｎｍであることが判明した。またそれぞれの蛍光強度は２３．６４ならびに９．１７３であった。
【００６６】
上記実験例ならびに比較実験例に使用した化合物についての励起・蛍光極大波長、蛍光強度ならびにＳ／Ｎ比を表１に示した。表１に示した結果から明らかなように、メラトニンオキサイドの蛍光強度は、ＮＢＤ−Ａｌａの８０倍、Ｄｎｓ−Ａｌａの２００倍であり、１−ホルミル−５−メトキシインドールの蛍光強度もＮＢＤ−Ａｌａの７０倍、Ｄｎｓ−Ａｌａの１８０倍であることが判明した。
【００６７】
なおＳ／Ｎ比は、各化合物の蛍光強度とそれぞれの測定波長における測定溶媒の蛍光強度の比を表したものであって、ＨＰＬＣで測定する際の感度の指標となると考えられる。ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａにおいては、それぞれの蛍光特性は低かったが、これらはノイズレベルも低かったためにＳ／Ｎ比はそれぞれ高い値を示した。しかし、メラトニンオキサイドならびに１−ホルミル−５−メトキシインドールはＳ／Ｎ比についてもより高い値を示した。したがって、この発明に係るインドールオキサイド誘導体は高感度分析に使用できる。
【００６８】
【表１】
0004873437.tif 000011
【００６９】
（実験例３）
メラトニンオキサイドと１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）との安定性
メラトニンオキサイドならびにと１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）との安定性を測定するために、これらの化合物を２０％アセトニトリル水溶液に溶解し、採光下において２５℃で所定時間放置して、それぞれの残存率を逆相ＨＰＬＣによって測定した。分離カラムにはＯＤＳ−１２０ＴＳ  ＱＡ(4.6 mm i.d. x 150 mm)を用い、移動相は０．０１％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液（ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ＝２０／０．０１／８０(v/v)）を１ｍｌ／ｍｉｎの割合で４０℃で送液した。検出は２１０ｎｍの紫外吸収で行った。その結果を図８に示す。図８において、（Ａ）は各化合物の混合物を調製した直後、（Ｂ）はその混合物を１日放置した後、（Ｃ）はその混合物を３日放置した後の結果を示している。
【００７０】
（実験例４）
ＮＢＤ−ＡｌａとＤｎｓ−Ａｌとの安定性
ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａを、採光下において２５℃で所定時間放置した以外は実験例３と同様にしてそれぞれの安定性を測定した。測定結果を図９に示す。図９において、（Ａ）は各化合物の混合物を調製した直後、（Ｂ）はその混合物を１日放置した後、（Ｃ）はその混合物を３日放置した後の結果を示している。
【００７１】
（実験例５）
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａの安定性
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａを、採光下において４℃、２５℃、６０℃で所定時間それぞれ放置した以外は実験例３と同様にしてそれぞれの安定性を測定した。測定結果を図１０に示す。図１０において、（Ａ）は各化合物の混合物を４℃で放置した後、（Ｂ）はその混合物を２５℃で放置した後、（Ｃ）はその混合物を６０℃で放置した後の結果を示している。図示する結果から、ＮＢＤ−Ａｌａはいずれの温度においても採光下６時間で完全に分解した。これに対して、メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドールおよびＤｎｓ−Ａｌａは、ほとんど分解されなかった。
【００７２】
（実験例６）
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａの安定性
メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）ならびにＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａを、遮光下で放置する以外は実験例５と同様にしてそれぞれの安定性を測定した。その測定結果を図１１に示す。図１１において、（Ａ）は各化合物の混合物を４℃で放置した後、（Ｂ）はその混合物を２５℃で放置した後、（Ｃ）はその混合物を６０℃で放置した後の結果を示している。図示するように、遮光下では４℃、２５℃においては、各化合物ともほとんど分解されずほぼ１００％の残存率を示したが、６０℃で加熱して３日間放置した場合には、ＮＢＤ−Ａｌａの残存率はほぼ５０％になった。これに対して、メラトニンオキサイド、１−ホルミル−５−メトキシインドール（ＭＩＡＡ  ｏｘｉｄｅ）およびＤｎｓ−Ａｌａはいずれの条件下においてもほぼ１００％の残存率を示した。
【００７３】
これらの結果からして、メラトニンオキサイドは光ならびに熱に対して著しく安定であるのに対して、市販されているＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Ａｌａは光ならびに熱に対して不安定であるといえる。
【００７４】
（実施例３）
図１２に示す工程図に従って、実施例３を説明する。
メラトニン標品の水溶液１００μｌに３００ｍＭのＮａ２Ｃｏ３水溶液１０μｌと１０ｍＭのＨ２Ｏ２水溶液１０μｌを加え、９０℃で３０分間誘導化（酸化）反応を行った。
【００７５】
この反応液２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、励起波長２４５ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出した結果、図１３のクロマトグラムが得られた。クロマトグラム中でmelatoninと表記したピークがメラトニンオキサイドである。
【００７６】
（比較例１）
一方、比較のために、酸化処理をしないメラトニン（５０ｆｍｏｌ）について、上記実施例３と同様に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてメラトニンを分析したところ、図２０のクロマトグラムが得られた。
【００７７】
図１３と図２０のメラトニンの強度を比較してみると、この実施例３による強度は比較例１による強度の１０倍になっていることがわかる。
【００７８】
（実施例４）
図１４に示す工程図に従って、実施例４を説明する。
まず、Wistar系雄性ラット（６週齢、ＳＰＦ）から松果体を１個摘出し、これを氷冷したメタノール（５００μｌ）と共にミクロホモジナイザーですりつぶし、得られたホモジネートを遠心分離器にかけ、遠心力４５００Ｇ、５分で分離し、上澄み液（上清）をマイクロピペットで採取した。
【００７９】
次に、遠心分離した上清をマイクロピペットで採取し、これをミクロガラスチューブ内に入れ、１００℃で乾固させた。
【００８０】
次に、この残渣に水４０μｌ加えて良く撹拌した後、２ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液を５μｌ、５０ｍＭのＨ２Ｏ２水を５μｌ加え、１００℃で３０分間誘導化（酸化）反応を行なわせた。
【００８１】
この誘導体化反応で得られた反応溶液の一部を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１５のクロマトグラムのようになった。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００８２】
次に、この反応溶液に水で飽和させた酢酸エチル２５０μｌを加え、メラトニン誘導体の抽出を行った。この抽出操作は３回繰り返し、上層を合わせて蒸発乾固した。
【００８３】
次に、この残渣に１０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを４０μｌ加えて良く撹拌し、その２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１６のクロマトグラムが得られた。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００８４】
図１５と図１６のクロマトグラムを比較してみると、抽出操作により抽出前に存在した様々な夾雑成分が除去され、メラトニンの選択的分析が可能になっていることがわかる。
【００８５】
（実施例５）
図１７に示す工程図に従って、実施例５を説明する。
実施例４と同様に、まず、Wistar系雄性ラット（６週齢、ＳＰＦ）の松果体を１個摘出し、これを氷冷したメタノール（５００μｌ）と共にミクロホモジナイザーですりつぶし、得られたホモジネートを遠心分離器にかけ、遠心力４５００Ｇ、５分で分離し、上清をマイクロピペットで採取した。
【００８６】
次に、遠心分離した上清に５ｎＭのＭＩＡＡ（５−メトキシインドール−３−酢酸）／ＭｅＯＨ溶液を５０μｌ加え、マイクロガラスチューブ内に入れ、１００℃で乾固させた。
【００８７】
次に、この残渣に水４０μｌ加えて良く撹拌した後、２ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液を５μｌ、５０ｍＭのＨ２Ｏ２水を５μｌ加え、１００℃で３０分間誘導化（酸化）反応を行なわせた。
【００８８】
次に、この反応溶液に水で飽和させた酢酸エチル２５０μｌを加え、メラトニン誘導体の抽出を行った。この抽出操作は３回繰り返し、上層を合わせて蒸発乾固させた。
【００８９】
次に、この残渣に１０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを４０μｌ加えて良く撹拌し、その２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１８のクロマトグラムのようになった。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００９０】
また、遠心分離したものの上澄み液であって、ＭＩＡＡを添加しないものを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、励起波長２４５ｎｍの光を照射し、蛍光波長３８０ｎｍの光の強度を測定したところ、図１９のクロマトグラムのようになった。このクロマトグラム中、矢印で示したピークがメラトニンである。
【００９１】
図１８のクロマトグラムと図１９のクロマトグラムを対比してみると、ＭＩＡＡ誘導体の保持時間付近に妨害ピークは存在せず、ＭＩＡＡ誘導体はクロマトグラム上で良好に定量可能であることがわかる。
【００９２】
（実施例６）
図２１、図２２に示す実施例６について説明ずる。
図２１は１ｆｍｏｌのメラトニンを酸化させ、通常の逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析したものである。図２２は同じく１ｆｍｏｌのメラトニンを酸化させ、ミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析したものである。共にメラトニンピークは矢印で示した。図２１と図２２を比較すると、ミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の導入によって検出感度が１０倍以上向上していることが分かる。従って前記酸化工程とミクロＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の導入によって従来法と比較し、１００倍以上高感度なメラトニン分析が可能である。
【００９３】
【発明の効果】
この発明に係るインド−ルオキサイド誘導体は、強い蛍光を有すると共に、光ならびに熱にも安定であるなどという優れた特性を有している。
【００９４】
また、この発明にかかる分析方法は、メラトニンなどのインド−ル誘導体を酸化させて、インド−ルオキサイド誘導体として、このメラトニンオキサイドなどのインド−ルオキサイド誘導体の蛍光強度を測定するので、メラトニンなどのインド−ル誘導体の微量測定が可能になるという効果がある。
【００９５】
従って、この発明によれば、血中メラトニン定量が数十ミリリットルと極めて微量の血液で可能となり、指尖からの非疼痛性採血法が適用可能になり、被験者の負担を極めて軽減し、個人レベルでのメラトニン日内リズム解析などが可能になり、生体リズム障害時における詳細なメラトニンリズム計測が可能となり、リズム障害時における原因究明と従来経験的に行われてきたメラトニン治療に科学的指針を与え、効果的な投薬設計が可能になるという効果がある。
【００９６】
また、この発明によれば、夾雑物を含む実際のヒト血液について夾雑物の影響を受けず、メラトニンなどの濃度を正確に定量分析することができるという効果がある。
【００９７】
また、この発明によれば、メラトニン血中濃度を生体リズムのマーカーとして様々な疾病における時間治療の導入が可能となるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】メラトニンオキサイドの蛍光強度を示し、（Ａ）は反応時間０時間、（Ｂ）は反応時間６時間後、（Ｃ）は反応時間１２時間後の蛍光強度を示す。
【図２】メラトニンオキサイドの励起・蛍光極大波長を示す。
【図３】メラトニンの励起・蛍光極大波長を示す。
【図４】１−ホルミル−５−メトキシインドールの励起・蛍光極大波長を示す。
【図５】５−メトキシインドール−３−酢酸の励起・蛍光極大波長を示す。
【図６】ＮＢＤ−Ａｌａの励起・蛍光極大波長を示す。
【図７】Ｄｎｓ−Aｌaの励起・蛍光極大波長を示す。
【図８】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の残存率を示すクロマトグラム。
【図９】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の遮光下での残存率を示すクロマトグラム。
【図１０】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の採光下での分解率を示す。
【図１１】メラトニンオキサイド、ＮＢＤ−ＡｌａおよびＤｎｓ−Aｌaの混合物の遮光下での分解率を示す。
【図１２】実施例３の操作を示す工程図である。
【図１３】実施例３の操作で処理された反応液のクロマトグラムである。
【図１４】実施例４の操作を示す工程図である。
【図１５】実施例４の操作において溶媒抽出される前の液のクロマトグラムである。
【図１６】実施例４の操作で処理された抽出液のクロマトグラムである。
【図１７】実施例５の操作を示す工程図である。
【図１８】実施例５の操作で処理された抽出液のクロマトグラムである。
【図１９】実施例５の操作でＭＩＡＡを添加しなかった抽出液のクロマトグラムである。
【図２０】比較例１の操作で酸化せずに分析したメラトニン標品のクロマトグラムである。
【図２１】メラトニンオキサイドを通常の逆相ＨＰＬＣで分析したクロマトグラムである。
【図２２】メラトニンオキサイドをミクロＨＰＬＣで分析したクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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