(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−１，６−グルカンを生合成するアウレオバシジウム属の微生物の培養液及びリンゴから抽出されたポリフェノールを含有する飲料。
【請求項２】
リンゴから抽出されたポリフェノールが、リンゴの未熟果から抽出されたものである請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
更にビタミンＣを配合してｐＨを４〜６に調整してなる請求項１又は２に記載の飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，３−１，６−グルカンを生合成するアウレオバシジウム属の微生物の培養液及びリンゴから抽出されたポリフェノールを含有する健康飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−１，３−１，６−グルカンは、β−１，３グルコース結合及びβ−１，６グルコース結合によって多数のグルコースが相互に結合してなる多糖類である。以下のような多様な効能を有する物質であることが知られており、人体の健康の保持、増進に役立つ物質である。
(１)免疫増強作用：リンパ球の働きを強化し免疫機能を向上させる。
(２)抗腫瘍活性：ガン細胞がすでに発生し、発病してしまった後にそのガン細胞を攻撃する。
(３)ガン細胞増殖抑制作用：ガン細胞が発生した後、その増殖を抑え込む。
(４)抗アレルギー作用：アトピー性皮膚炎等のＩ型アレルギーを抑制する。
(５)抗炎症作用：免疫系の改善による防御機能を増進する。
(６)コレステロール低下作用：血中のコレステロールを低下させる。
(７)食物繊維効果：発ガン物質等を吸着して体外に排出する。
(８)抗血栓作用：血管内部が狭くなったり詰まったりすることを阻止する。
(９)血圧降下作用：心臓から送り出された血液が動脈壁に加える圧力によって異常をきたした時に正常な状態に戻す。
(10)血糖降下作用：血液中の過剰なブドウ糖を下げる。
(11)肝機能亢進：肝機能に対する解毒能力を向上させる。
【０００３】
β−１，３−１，６−グルカンは、例えばカワラタケ、シイタケやスエヒロタケ等のキノコ類に含まれており、これらを食することで摂取することも可能であるし、これらから抽出したものを摂取することも可能である。しかしながら、そのまま食するのではβ−１，３−１，６−グルカンの体内への吸収が不十分であるし、保存も容易ではない。またこれらのキノコ類から、β−１，３−１，６−グルカンを抽出することもできるが、大量のキノコからの長時間の煮出し作業が必要であり、煮出した後も冷蔵庫等に保管する必要がある。
【０００４】
特開昭５７−１４９３０１号公報（特許文献１）には、不完全菌黒色菌科アウレオバシジウム(Aureobacidium)属の微生物が、グルコースがβ−１，３グルコース結合した主鎖から非還元性末端がβ−１，６グルコース結合で分岐した構造を有し、リン酸基がグルコースに結合している高分子多糖を産生する旨が記載されている。ここで用いられている微生物は微工研寄託番号４２５７号(ＦＥＲＭ−Ｐ．４２５７)の菌である。
【０００５】
また、特開平６−３４０７０１号公報（特許文献２）には、オウレオバシディウム  プルランス(Aureobacidium pullulans)ＩＦＯ４４６６菌株の培養によって、β−１，３結合グルコース残基を主鎖として、これにβ−１，６結合グルコース残基の分岐鎖を多数側鎖として有するβ−グルカンが製造される旨が記載されている。
【０００６】
他にも、アウレオバシジウム属の微生物が
β−１，３−１，６−グルカンを産生することは、Acta Chemical Scandinavia 17,
1351-1356(1963)（非特許文献１）、  Agric. Biol. Chem. 47(6),
1167-1172(1983)（非特許文献２）、  Chem. Pharm. Bull., 40,
2215(1992)（非特許文献３）等に記載されている通りである。
【０００７】
このように、特定の微生物を培養することによって、効率的にβ−１，３−１，６−グルカンを得る方法が報告されている。
【０００８】
しかしながら、β−１，３−１，６−グルカンを含有する組成物を健康飲料あるいは皮膚塗布剤など、一般消費者が直接使用する用途に用いる場合、保存中に雑菌の繁殖によって腐敗しやすいという問題があった。一般家庭においては、特別に落下菌対策などは施されないので、いったん殺菌した組成物であっても、使用中に菌が付着することが多い。特に、アウレオバシジウムの培養液を含有する組成物を直接飲用あるいは塗布するような場合には、そもそも微生物の繁殖しやすい組成の液であることから、長期間にわたって腐敗を防止することは困難であった。だからといって、化学合成された制菌剤を使用したのでは、健康飲料として使用するには、天然志向の消費者の抵抗が大きい。
【０００９】
また、β−１，３−１，６−グルカンは酸化を受けやすく、長期保存するためには酸化劣化も防止する必要があった。しかしながら、化学合成された酸化防止剤を使用したのでは、やはり天然志向の消費者の抵抗が大きい。
【００１０】
【特許文献１】特開昭５７−１４９３０１号公報
【特許文献２】特開平６−３４０７０１号公報
【非特許文献１】Acta Chemical Scandinavia 17, 1351-1356(1963)
【非特許文献２】Agric. Biol. Chem. 47(6), 1167-1172(1983)
【非特許文献３】Chem. Pharm. Bull., 40, 2215(1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、これらの課題を解決し、更に体内での抗酸化性や抗アレルギー作用をも増強することの可能な飲料を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題は、β−１，３−１，６−グルカンを生合成するアウレオバシジウム属の微生物の培養液及びリンゴから抽出されたポリフェノールを含有する飲料を提供することによって達成される。天然物であるリンゴから抽出されたポリフェノールが、β−１，３−１，６−グルカン含有組成物の腐敗や酸化を防止し、更に体内での抗酸化性や抗アレルギー作用を増強するものである。このとき、β−１，３−１，６−グルカンがアウレオバシジウムを培養して得られたものである場合に、リンゴから抽出されたポリフェノールを配合する効果が顕著である。また、リンゴから抽出されたポリフェノールとしては、リンゴの未熟果から抽出されたものが好適である。当該組成物は医用組成物あるいは薬用組成物として人体に対して適用される用途に好適に使用される。
【００１３】
本発明の飲料を飲用することで抗腫瘍活性等の各種効能が得られる。このとき、更にビタミンＣを配合してｐＨを４〜６に調整してなる飲料が好適である。
【発明の効果】
【００１４】
β−１，３−１，６−グルカンを生合成する微生物の培養液にリンゴから抽出されたポリフェノールを配合することで、保存中の腐敗、酸化を防止できるとともに、体内での抗酸化性や抗アレルギー作用をも増強することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の飲料はβ−１，３−１，６−グルカンを含有する。ここで、β−１，３−１，６−グルカンとは、β−１，３グルコース結合及びβ−１，６グルコース結合によって多数のグルコースが相互に結合してなる多糖類である。グルコースがβ−１，３結合した主鎖からβ−１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するもの(β−１，６−分枝−β−１，３−グルカン)が好適である。かかる分岐構造を有することで生理活性が増大する。
【００１６】
本発明のβ−１，３−１，６−グルカンはグルコースを主成分とするが、それ以外の構成糖を少量含んでいてもよい。全構成糖中のグルコースの割合は通常90％以上であることが好ましい。また、本発明のβ−１，３−１，６−グルカンは他の官能基を有していても良い。特に、他の官能基として酸基を有することで生理活性が増強される。含有する酸基としてはリン酸基が好ましく、この場合のリン酸基の含有量はグルコース単位に対して１モル％以上であることが好ましい。
【００１７】
本発明のβ−１，３−１，６−グルカンの分子量は特に限定されず、通常100個以上のグルコースの繰り返し構造を有する。好適には、浸透圧法による分子量測定(Zimm-Myerson型浸透圧計を用い、セロファン半透膜を用いて測定)での数平均分子量が50000〜500000程度である。
【００１８】
本発明の飲料中のβ−１，３−１，６−グルカンの含有量は、その使用目的によって適宜調整され、通常0.001〜５重量％の含有量が例示される。ただし製造コストと有効性のバランスを考慮すると、0.01〜0.5重量％であることが好ましく、0.02〜0.3重量％であることがより好ましい。
【００１９】
本発明に使用されるβ−１，３−１，６−グルカンとしては、アウレオバシジウム(Aureobacidium)属の微生物を培養して得られるものが好適である。使用可能なアウレオバシジウム属の微生物は特に限定されないが、微工研寄託番号４２５７号(ＦＥＲＭ−Ｐ．４２５７)の菌や、ＩＦＯ４４６６菌等が例示される。中でも微工研寄託番号４２５７号(ＦＥＲＭ−Ｐ．４２５７)の菌が、生理活性の面から好適である。
【００２０】
本発明では培養液をそのまま飲料に配合して用いるので、不必要に加工処理を施さないものを求める自然派志向の消費者の要求に合致する。また、精製に要するコストを節約できる点からも好ましい。このときの組成物中の当該培養液の含有量は10〜99.999重量％であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明の飲料はリンゴ抽出物を含有する。リンゴには、酸化防止効果、制菌効果、抗アレルギー効果など様々な効果を奏する各種のポリフェノールが含まれており、飲料の腐敗や酸化を防止し、更に体内での抗酸化性や抗アレルギー作用を増強するものである。
【００２２】
β−１，３−１，６−グルカンのみを含有してリンゴから抽出されたポリフェノールを含有しない組成物の場合には、一般家庭においては、長期間にわたって腐敗を防止することは困難であった。これがリンゴから抽出されたポリフェノールを更に含有することで大きく改善される。このことは、後述の実施例において、添加によってブドウ状球菌や大腸菌の増殖が抑えられていることからも裏付けられているとおりである。
【００２３】
ポリフェノールを含有する食品としては茶が良く知られているが、茶抽出物に比べて、リンゴ抽出物のほうが水に対する溶解性が10倍以上も高いため、高濃度に配合しても安定な水溶液を得ることができて好ましい。また、苦味が強い茶抽出物に比べて、リンゴ抽出物のほうが呈味性に与える影響が小さく、飲食する用途に向いている。また、茶抽出物は濃い茶色であり、製品の色調が茶色となってしまうため、飲料とした際に消費者が敬遠するおそれもある。
【００２４】
使用するリンゴ抽出物が、リンゴの未熟果から抽出されたものであることがより好ましい。ここで、未熟果とは１個あたりの重量が５〜20ｇ程度の時期に摘果されたもので、ポリフェノールが最も含有されている時期に摘果されたものである。リンゴの未熟果には、成熟果の約10倍のポリフェノールが含まれている。含まれているポリフェノールは、リンゴ縮合型タンニン、(＋)−カテキン、(−)−エピカテキン、クロロゲン酸、ジヒドロカルコン類、ケルセチン配糖体、ｐ−クマル酸エステル等である。リンゴの未熟果の抽出物は、例えばニッカウヰスキー株式会社から「アップルフェノン(登録商標)」として入手可能である。
【００２５】
リンゴ抽出物の配合量は、その使用目的によって適宜調整され、通常水分を除いた状態で0.001〜５重量％の含有量が例示される。ただし製造コストと有効性のバランスを考慮すると、飲料の重量に対して0.01〜１重量％であることが好ましく、より好適には0.02〜0.5重量％である。５重量％を超えると、飲料として用いる際には苦味が激しくなるし、加熱殺菌を施す際に着色しやすい。一方、0.001重量％未満の場合には、配合の効果が十分でない場合が多い。
【００２６】
本発明の飲料は、上記β−１，３−１，６−グルカンとリンゴから抽出されたポリフェノールを必須成分とするものであり、通常水溶液あるいは含水ペーストとして用いられるものである。これに必要に応じて更に他の成分を配合しても良い。
【００２７】
配合される成分は特に限定されるものではない。ビタミン、ミネラル、葉緑素及び蛋白などの主要栄養素をバランスよく補完する目的で植物起源栄養物である冬虫夏草、熊笹エキス、抹茶又は昆布等；神経伝達物質増殖を補完する目的でビタミンＢ１またはビタミンＢ６等；造血調節を補完する目的でグルコース、クロレラ、スッポン原末、ビタミンＢ１２又は葉酸等；抗ウイルス機能を補完する目的でアルギン酸、カテキン、甘草エキス、グリチルリチン、クロレラ、タンニン、ビタミンＣ又はプロポリス等；過酸化脂質抑制機能を補完する目的でイチョウ葉エキス、γ−オリザノール、カテキン、セサミノール、大豆サポニン、タンニン、ビタミンＥ、ビタミンＢ２又はビタミンＣ等；ビフィズス活性を補完する目的でイソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシルシュクロース、キシロオリゴ糖、キトサン、グリコマクロペプチド、小麦ファイバー、コーンファイバー、ダイズオリゴ糖、ヘミセルロース又は大豆ペプチド等；カルシウム吸収促進を補完する目的でイノシトール、カゼインホスペプチド又はビタミンＤ等；鉄の吸収促進を補完する目的でスッポン原末、ビタミンＣ又はヘム鉄等；消化器吸収調節を補完する目的でオピオイドペプチド、ギムネマ、小麦ファイバー、コーンファイバー、タンニン、マルトオリゴ糖又はヘミセルロース等を加えてもよい。
【００２８】
他にも、アロエ抽出液、アロエベラ抽出液、バラ抽出液、アマチャ抽出液、エンメイソウ、エイジツ、オウゴン、オウバク、オトギリソウ、海草、よもぎ、甘草、キキョウ、熊笹、黒砂糖、ゲンノショウコウ、ごぼう、クロレラ、しいたけ、シコン、しそ、シャクヤク、ジュウヤク、菖蒲、センキョウ、センブリ、ソウハクヒ、チンピ、人参、トウキ、びわ、ブクリュウ、桃、ユキノシタ、柚子、レイシ、ローヤルゼリー、オレンジ、カミツレ、白樺、パセリ、ふき、たんぽぽ、桑、ウイキョウ、にんにく、レモン、杜仲茶等各抽出液、各ビタミン群、イチョウ葉エキス、キトサン、ヘム鉄、ビタミンＤ、ブルーベリーエキス、ムコ多糖蛋白質、核酸エキス、コラーゲン、コンニャク等を加えても良い。
【００２９】
本発明の飲料を飲用することで、腫瘍抑制効果、Ｉ型アレルギー反応抑制の効果が得られ、しかも保存性も向上しているので、健康飲料として好適である。
【００３０】
本発明の飲料は、β−１，３−１，６−グルカン及びリンゴから抽出されたポリフェノールを含有するものである。このとき、β−１，３−１，６−グルカンを含有するだけでリンゴから抽出されたポリフェノールを含有しない場合には、保存性が十分でなく、雑菌が繁殖して腐敗したり、変色したりしやすい。しかも、飲用した場合に、アレルギー性の発疹が出たり、嘔吐を催したりする等の副作用の発生割合が多い。更に、飲用の効果が発現するまでの期間も長い傾向がある。
【００３１】
本発明の飲料に、更にビタミンＣを配合することが好適である。
【００３２】
ビタミンＣは、Ｌ−アスコルビン酸ともいわれる水溶性ビタミンであるが、体内で合成することができず、毎日食品等から摂取する必要のあるものである。抗酸化作用、抗ウイルス作用、解毒作用、抗癌作用があるといわれているが、本発明では、β−１，３−１，６−グルカンの腫瘍抑制作用を増強できる点や、リンゴから抽出されたポリフェノールの抗酸化作用を増強できる点から、特に配合することが好ましいものである。ビタミンＣは保存中に酸化されやすいが、アップルフェノンを併用することでビタミンＣの配合効果を持続させることが可能である。ビタミンＣの配合量は、好適には0.01〜５重量％であり、より好適には0.02〜２重量％である。
【００３３】
また、本発明の飲料は、ｐＨを３〜５に調整してなることが好適である。より好適にはｐＨ3.5〜4.8である。通常、アウレオバシジウム培養液のｐＨは5.2程度であるが、このままでは保存性が劣る場合がある。若干酸性側にｐＨを調整することで、保存性が改善される。また、そうすることで適度な酸味を呈することができ、嗜好性の面からも飲用に適したものとなる。このとき、前述のビタミンＣの添加によってｐＨを調整することが、ビタミンＣの添加効果も併せて得られることから特に好ましい。また、本発明の飲料には、その他、甘味料、香料等を配合することも可能である。
【００３４】
本発明の飲料を健康飲料として使用する際の摂取量は、健康状態や疾病の症状等によって適宜調整されるべきものであるが、β−１，３−１，６−グルカンを0.18重量％含有する飲料を飲用する場合、体重の３／10000〜８／10000の重量を飲用するのが標準である。すなわち60ｋｇの体重の者で１日18〜42ｍｌ程度を飲用するのが標準である。
【００３５】
本発明の飲料は、人間本来の持つ免疫力を回復させ、調整する効果を有することから、多様な症状に対してその症状を改善する効果を有することが期待される。そのような効果を列記すると以下のとおりであり、多岐に亘る効果が期待できる。
(１)アトピー性皮膚炎、花粉症、喘息等の各種アレルギー症状の低減効果。
(２)膠原病、リウマチ、ＨＩＶ等の免疫異常疾患に対する改善効果。
(３)胃がん、肺がん、大腸がん、子宮がん、乳がん等各種のがんに対する抑制効果。
(４)心筋梗塞、脳梗塞等の血管障害疾患に対する改善効果。
(５)Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等のウイルス性疾患に対する改善効果。
(６)糖尿病、排尿障害等の泌尿器系疾患に対する改善効果。
(７)便秘、下痢、口内炎、痔、食欲不振、二日酔い等の消化器系疾患の改善効果。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例によって本発明の飲料を具体的に説明する。
【００３７】
［実施例１］
特開昭５７−１４９３０１号公報に記載された方法に準じて、不完全菌黒色菌科アウレオバシジウム(Aureobacidium)属の微生物［微工研寄託番号４２５７号(ＦＥＲＭ−Ｐ．４２５７)］を培養した。グルコースがβ−１，３グルコース結合した主鎖から非還元性末端がβ−１，６グルコース結合で分岐した構造を有し、リン酸基がグルコースに結合している高分子多糖を0.18重量％含有する培養液を得た。本培養液のｐＨは5.2であった。
【００３８】
本培養液500ｋｇに対して、リンゴ未熟果の抽出物であるニッカウヰスキー株式会社製「アップルフェノン(登録商標)」を500ｇ、及びビタミンＣを750ｇ配合し、練合釜で30分間攪拌した。得られた液体を充填用タンクに移した後、容量500ｍｌガラス製壜に注入し、栓をしてから、30分間85℃でスチーム殺菌して健康飲料を得た。本健康飲料中のβ−１，３−１，６−グルカン、リンゴ抽出物及びビタミンＣの含有量はそれぞれ0.18重量％、0.1重量％及び0.15重量％であり、液のｐＨは4.2であった。
【００３９】
［腫瘍抑制試験１(マウスへの投与)］
・試料の調整法
上記実施例１の健康飲料を超音波破砕機(Ultrasonic Disruptor UR-200P)を用い、sonication処理(200W／20min.)後、超遠心操作(35000rpm／30min．)により上清を得、これをHEPES
Good buffer(ph7.4, μ0.15)にて10倍希釈したものを被験材料とした。
また、比較試料としてアガリクス茸の子実体を乾燥した粉末を10％(w/v)濃度となるようHEPES
Good buffer(ph7.4, μ0.15)に懸濁し、更に超音波破砕機(Ultrasonic Disruptor UR-200P)を用い、sonication処理(200W／10min.)後、２時間熱水抽出操作を行った。その後、超遠心操作(35000rpm／30min．)により上清を得、これを出発材料重量より換算して１％(w/v)濃度になるようにHEPES Good buffer(ph7.4, μ0.15)にて希釈して被験材料とした。
【００４０】
・試験方法
(１)実験動物：
BALB／cマウス(雌、６週齢)を１群５匹の系で使用した。
(２)Sarcoma180固形癌のマウスへの移植：
Sarcoma(肉腫)180細胞株を37C／5％CO2インキュベータ中、10％FCS／RPMI-1640培養液にて継代培養した。対数増殖期(Full seat)にある同細胞をTrypsin-EDTAにより培養フラスクより剥離した後、RPMI‐1640培養液で洗浄し、細胞数を 5,000,000cells／mLとなるように調整したものを使用した。この0．1mlをそれぞれの被験マウス背部皮下に移植した。操作はすべて無菌的に行なった。
(３)抽出成分の投与方法
マウスにSarcoma180固形癌細胞を移植した24時間後より、0．22μmフィルターにて無菌ろ過した前記被験材料を、1日1回(0.1ml)ずつ、それぞれ14日間、腹腔内(ip)投与した。
【００４１】
・試験結果
腫瘍細胞移植３週間後にマウスを屠殺し、移植後生着腫瘍重量(g)を測定し、対照群(control)と比較して腫瘍抑制率(％)を算出した結果を表１に示す。
ここでの対象群は、前記被験材料の代わりにNa-Phosphate Buffered Saline(PBS)を投与したものである。
【００４２】
【表１】
0004975947.tif 000002
【００４３】
結果から明らかなように、本発明に係る健康食品を投与した場合、比較対照群と比べて、明らかに腫瘍抑制率が高いことがわかる。また、本発明に係る健康飲料を用いた場合、従来から抗腫瘍効果が認められているアガリクス茸と比べて、少量(金額ベースになおすと１／30程度の量)で同程度の腫瘍抑制効果が得られることが判明した。
【００４４】
［腫瘍抑制試験２(血液腫瘍細胞増殖抑制)］
・細胞の調製
下記(１)〜(６)の各細胞株を37C／5％CO2インキュベータ中で、10％FCSを含むRPMI1640培養液環境下、25cm2培養フラスク内で浮遊増殖培養を行った。各細胞とも対数増殖期にある時点でRPMI1640培養液環境下に洗浄置換して、細胞数が400,000-800,000cells／mLとなるように調整した。
【００４５】
(１)CCRF-CEM細胞：
Acute lymphoblastic leukemia - T lymphocyte(Human - lympoblast)
(急性リンパ性白血病)
(２)K562細胞：
Chronic myelogenous leukemia - bone marrow(Human - lymphoblast)
(慢性骨髄炎)
(３)MOLT-4CL＃8細胞：
Acute lymphoblastic leukemia - T lymphoblast(Human - lymphoblast)
(急性リンパ性白血病)
(４)U937細胞：
Histiocytic lymphoma - macrophage, histiocyte(Human - monocyte)
(組織リンパ腫)
(５)Raji細胞：
Burkitt lymphoma - EBV infected B lymphocyte(Human - lymphoblast)
(バーキットリンパ腫)
(６)YAC-1細胞：
Natural killer cell - sensitive lymphoma(Mouse - lymphoblast)
(ＮＫ細胞)
【００４６】
・腫瘍細胞と被験材料との反応
前記マウスによる抗腫瘍実験で用いた本願実施例１の健康飲料から得られた被験材料を出発材料として、10倍希釈溶液(原液の1％溶液)、20倍、100倍希釈溶液となるようにNa-Phosphate Buffered Saline(PBS)で希釈したものを作成し、これを0.22μｍフィルターにて無菌ろ過し、被験材料とした。
更に、上記(１)〜(６)の調製培養細胞浮遊液をそれぞれ96well cell culture plate中に100μリットルずつ分注し、この中に被験材料を等量添加し、よく混和した後、再び37C／5％CO2インキュベータ中で36時間反応培養を行った。
次に、これらの各培養細胞を0.5％Trypan blueにて染色し、反応後の生細胞の数を計測し、Control(PBS)と比較することで各腫瘍細胞に対する抗腫瘍(増殖抑制)活性として算出した。
【００４７】
・試験結果
各腫瘍細胞に対して、各濃度の被験材料ごとの生細胞数及び生細胞比を、対照(Control)と比較した結果を表２に示す。結果から明らかなように、本発明に係る健康食品は、血液腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を有している。
【００４８】
【表２】
0004975947.tif 000003
【００４９】
［I型アレルギー反応抑制試験］
・被験飼料
実施例１で得られた健康飲料の、ヒトの１日あたりの摂取量(60kgの体重で40ml)に相当する量を、ヒトとマウス(約20g)の体重比から算出した。この算出量の約25〜30倍の量が摂取濃度(経口投与実験設定濃度)となるように、通常のマウス飼育用紛餌の中に均等に混合した後、固形型打ち及び放射線滅菌して、被験飼料として用いた。マウス飼料中の実質濃度は約５％である。対照(control)群は通常のマウス滅菌固形飼料のみを摂取した。
【００５０】
・実験動物
アトピー性皮膚炎自然発症マウス(NC/Nga mouse, clean, CV；生後４週齢のものを日本SLC株式会社より入手)を用い、雌雄それぞれ１群10匹の系で行い、上記の被験飼料投与群及び対照群の、計４群にて行った。
上記実験動物はすべて入荷後１週間の予備飼育をした後、第５週齢より第16種齢に至るまでの間を観察期間とした。
【００５１】
・試験方法
飼育条件は24±1℃、相対湿度55±5％、明暗各12時間(照明時間：午前７時〜午後７時)ヘパフィルターにより除菌された新鮮空気による換気回数を１時間当たり12回以上に設定されたバリアシステム動物飼育室(マウス、ラット室)で飼育した。飼育には滅菌床敷を入れた滅菌済みのプラスチック製ケージを用いて、４〜６匹飼いで飼育した。ケージの交換は週１回とし、飼料は固形飼料(オリエンタル酵母社製、CFR-1)を給餌器に入れ、飲料水は水道水を滅菌給水瓶に入れてそれぞれ自由に摂取させ飼育した。
【００５２】
血中IgE量の測定については、飼料摂取の１週後(６週齢)、４週後(９週齢)、７週後(12週齢)及び11週後(16週齢)の４回にわたり、マウス眼底静脈層より採血を行い、得られた血清中のIgE総量の経時的変化をマウスIgEに対する特異抗体を用いたサンドウィッチエライサ法(酵素抗体法)により算出した。
また、投与11週後(16週齢)における肉眼的皮膚所見について比較観察した。
【００５３】
・試験結果
雄及び雌のマウスの、血中IgE濃度の加齢による変動について表３に示す。血中IgE濃度の総量は、固体の発育とともに上昇傾向が認められたが、上記被験飼料摂取群においては、対照群とを比較して優位に血中IgE産生の抑制が認められる結果が得られた。特に、投与11週後(16週齢)における血中IgE値では、雌雄の両群において統計学的にｔ検定を行ったところ、危険率ｐ＜0.05上での有意な差異が認められた。
【００５４】
【表３】
0004975947.tif 000004
【００５５】
また、16週齢(通常のアレルギー自然発生週齢)における肉眼的皮膚所見においては、対照群に皮膚症状が外観上現れているのに対し、上記被験飼料投与群は外観的に正常であり、対照群と比較し、被験飼料摂取群において明らかに皮膚アレルギー症状の抑制傾向が認められた。
【００５６】
この結果より、本発明の健康飲料はマウスにおけるI型アレルギー反応の発症抑制に有効であることが明らかにされ、同等成分のヒト摂取におけるアレルギー反応発症抑制にも有用であることが示唆された。
【００５７】
［抗菌力試験］
・検体
検体１；
実施例１と同様に培養されたアウレオバシジウム培養液にニッカウヰスキー株式会社製「アップルフェノン(登録商標)」を0.1重量％配合したもの
検体２；
実施例１と同様に培養されたアウレオバシジウム培養液のみ
【００５８】
・試験菌
試験菌１；
Staphylococcus aureus IFO 12732
試験菌２；
Klebsiella pneumoniae IFO 13277
【００５９】
・試験方法
検体１及び２各10mlに、上記試験菌１及び２の菌液をそれぞれ100,000個/ml程度になるように添加して35℃で保存し、開始時、保存開始６時間後及び24時間後に試験液中の生菌数を測定した。また、対照として菌液のみを同様に保存して生菌数を測定した。
【００６０】
・試験結果
試験結果を表４にまとめて示す。
表から明らかなように、β−１，３−１，６−グルカンを含有する検体１、２ともに抗菌力を示しており、いずれの試験菌に対しても抗菌効果を有することがわかる。しかも、更にリンゴ抽出物を含有する含有する検体１の方がより強い抗菌力を有することが、６時間後の段階での生菌数から明確である。
【００６１】
【表４】
0004975947.tif 000005
【００６２】
以上のように、β−１，３−１，６−グルカン含有組成物の雑菌の繁殖による腐敗を防止するのに、リンゴ抽出物の配合が有効であることが裏付けられたものである。この結果から、リンゴ抽出物の配合による飲料の腐敗防止効果が推認される。