(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせであって、その一対のオリゴヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号２に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるか、又は配列番号３に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるプライマーの組み合わせ。
(5´)CATGGAGGAAAAAGG(3´) （配列番号１）
(5´)CCTGTTCGAACGGC(3´) （配列番号２）
(5´)TCCGCATGGAGGAAAAAGG(3´) （配列番号３）
(5´)CGCCCTGTTCGAACGGC(3´) （配列番号４）
【請求項２】
検体に、請求項１記載のプライマーの組み合わせを加え、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするバチルスコアグランスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルスコアグランスの検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することによりバチルスコアグランスを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バチルスコアグランス（Bacillus coagulans）は耐熱性のグラム陽性細菌の一つであり、中でも、缶詰、レトルト製品等の１００℃以上の加熱殺菌が施される容器詰め食品において、フラットサワーを引き起こす細菌として知られている。ここで、フラットサワーとは、容器の外観が正常であるにもかかわらず、内容物が細菌により酸敗している状態をいう。
【０００３】
バチルスコアグランスによる汚染を確認するためには、検査材料が患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料である場合、一般に、増菌培養、分離培養を経て各種確認試験が行なわれる。この方法でバチルスコアグランスによる汚染を確認するまでには、通常、１週間程度が必要である。その際に温度、培地等の環境が適切に調整されていないと培養できない。例えば、バチルスコアグランスの中でも培養中の増殖が遅いものは、共存する微生物により増殖が阻害されることがある。さらに、缶詰中でフラットサワーが起きた場合、バチルスコアグランス自体が産生される酸により死滅し、培養法ではバチルスコアグランスを検出できない場合もある。このため、バチルスコアグランスによる汚染の確認試験の操作は、煩雑で熟練を要するものとなっている。
【０００４】
これに対して、近年、藤原らはＰＣＲ法を使用し、そのプライマーとして、バチルスコアグランスのspoIIＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成した２種のオリゴヌクレオチドを使用することにより、バチルスコアグランスの特定領域のオリゴヌクレオチドを増幅し、これを検出することを試みている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、藤原らのバチルスコアグランスの検出方法は、芽胞形成蛋白をコードする遺伝子（spoIIＡ）を標的としており、蛋白質をコードする遺伝子の一般的性質として、２つおきに保存されにくいヌクレオチドが存在することから、バチルスコアグランス種内でプライマーを規定した特定領域のオリゴヌクレオチドが保存されているとは考えにくい。
【０００６】
本発明は、このような従来技術の課題に対し、ＰＣＲ法でバチルスコアグランスを検出するための新規のプライマーを開発し、雑菌としてバチルス属の異種が存在してもバチルスコアグランスを良好に検出できるようにすることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、バチルスコアグランスにおいて、16SrRNAをコードするヌクレオチド配列では種又は属のレベルで配列が保存され、またこの配列には、保存されにくいヌクレオチドが２つおきに存在することもないので、ＰＣＲ法で標的とするのに好適であり、さらにＰＣＲ法で特定のプライマーを使用することにより、バチルスコアグランスを異属あるいは同属異種と区別して良好に検出できることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CATGGAGGAAAAAGG(3´)      （配列番号１）
(5´)CCTGTTCGAACGGC(3´)       （配列番号２）
を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
また、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、少なくともその一方が上述のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするプライマーを提供する。
【００１０】
さらに、そのようなプライマーを検体に加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするバチルスコアグランスの検出方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明がバチルスコアグランスの検出のために行うＰＣＲ法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Reaction法（Science,230,1350(1985)）に基づくものである。
【００１３】
本発明では、ＰＣＲ法によりバチルスコアグランスを検出するに際して使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CATGGAGGAAAAAGG(3´)      （配列番号１）
(5´)CCTGTTCGAACGGC(3´)       （配列番号２）
を含むオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１４】
これら配列番号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、バチルスコアグランスの同属異種及び異属の16SrRNAの塩基配列を詳細に解析した結果、バチルスコアグランスの異株間に保存され、同属異種及び異属と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列を含む限り、その5´末端側又は3´末端側が延長されていてもよく、連鎖する塩基数が１４〜４０のものが好ましい。例えば、好ましいオリゴヌクレオチドとして、配列番号３又は４に示される塩基配列
(5´)TCCGCATGGAGGAAAAAGG(3´)    （配列番号３）
(5´)CGCCCTGTTCGAACGGC(3´)      （配列番号４）
を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
【００１６】
これに対し、連鎖する塩基数が少なすぎるとバチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列以外の遺伝子と反応し、バチルスコアグランスの検出の選択性が低下するので好ましくない。また、連鎖する塩基数が多すぎるとバチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列との結合が不安定となりやすいので好ましくない。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5´末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したものが含まれる。この他、5´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものや、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセンス化したもの等が含まれる。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法でバチルスコアグランスを検出する場合の１組のプライマーの一方として使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のプライマーとしては、正規鎖側プライマーとして公知のものも使用できるが、前述の配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを一対のプライマーとして使用することが好ましい。
【００１９】
正規鎖側と相補鎖側の１組のプライマーを使用し、バチルスコアグランスに特異的なオリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法自体は公知の方法に従うことができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより検体中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に分離し、これに１組のプライマーを作用させて、相補的な検体のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、ＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）との存在下でプライマーの下流の領域を選択的に合成する。そしてこの操作を２０〜４０サイクル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅することができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラフィー等により確認することができ、これにより検体中のバチルスコアグランスを容易にかつ確実に検出することが可能となる。
【００２０】
なお、このＰＣＲ法を適用する検体としては、患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料等をあげることができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
【００２２】
実施例１
（１）検体の調製
バチルスコアグランスとして、表１中の縦の見出し欄に示したものを用い、それぞれ増菌用の平板培地に接種し、４５℃で一晩培養した。菌体を掻き取り、０．８５％食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０7ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００２３】
（２）プライマーの合成
バチルスコアグランスの16SrRNAをコードするヌクレオチド配列を標的とする、相補鎖側又は正規鎖側プライマーとして、配列番号１、２、３又は４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法により合成した。
【００２４】
（３）反応液の調製とＰＣＲ反応
検体液５μｌに１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、表１に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、相補鎖側プライマーとして配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００２５】
一組のプライマーとして配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを使用する場合、熱変成（９４℃、１分）、アニーリング（５０℃、１分）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し反応させた。また、一組のプライマーとして配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを使用する場合、アニーリングを５５℃、１分で行う以外は同様に繰り返し反応させた。
【００２６】
反応液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は３％のアガロースゲルを使用し、ＴＢＥバッファー中、１００ボルトで３０分行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流すことにより、相対比較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００２７】
結果を表１に示す。表１中の＋は、プライマーの組合せが、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドの場合２８８塩基対、配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合２９５塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたことを示している。
【００２８】
【表１】
0004888622.tif 000002
【００２９】
表１の結果から、バチルスコアグランスを正しく検出できることがわかる。
【００３０】
実施例２
実施例１の各プライマーの組合せで行ったＰＣＲ反応によるバチルスコアグランスの検出結果が、バチルスコアグランスに対し選択的であることを確認するため、臨床検査、食品衛生検査等において高頻度で現れるバチルス属でコアグランス以外の種の菌を表２に示すように選び、バチルスステアロサーモフィルスは５５℃で、他種は３５℃で平板培養後、実施例１と同様にして各プライマーの組合せごとに特定の長さの塩基対が増幅された否かを調べた。
【００３１】
結果を表２に示す。表２中の−は、プライマーの組合せが、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドの場合２８８塩基対、配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合２９５塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されなかったことを示している。
【００３２】
【表２】
0004888622.tif 000003
【００３３】
表２の結果から、各プライマーの組合せとも、バチルスコアグランス以外の細菌は検出できないことがわかる。
【００３４】
実施例３
通常の臨床検体や食品検体の場合、大量の雑菌が共存するので、雑菌の共存条件下でもバチルスコアグランスを検出できることが必要である。そこで、前述の実施例１の操作において、各検体液中に、バチルスコアグランスと同様にバチルス属のフラットサワー原因菌として知られているバチルスステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus IFO12550）２．４×１０7ｃｆｕ／ｍｌと、バチルスコアグランス３．９×１０2〜３．９×１０6ｃｆｕ／ｍｌとを共存させ、実施例１と同様にして特定の長さの塩基対が増幅されたか否かを調べた。結果を表３に示す。なおこの場合、正規鎖側のプライマーとして配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用し、相補鎖側のプライマーとして配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３５】
【表３】
0004888622.tif 000004
【００３６】
表３の結果から、雑菌としてバチルスステアロサーモフィルスが大過剰に共存すると否とを問わず、本発明の方法によりバチルスコアグランスを良好に検出できることがわかる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＣＲ法でバチルスコアグランスを検出するにあたり、高い検出感度と選択性を得ることができる。また試料中に存在する同属異種あるいは異属の細菌の増殖を考慮にいれる必要がなくなり、熟練を必要とすることなく、簡易にバチルスコアグランスを検出することができる。
【配列表】
0004888622.tif 000005
0004888622.tif 000006
0004888622.tif 000007