(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の複数のスポットに、下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合し、
前記ゲノムＤＮＡ断片のサイズが１．５〜３．０ｋｂｐであり、
冗長度が１．５以上２．０以下であり、
醸造用酵母の遺伝子が結合した他のスポットが更に存在し、かつ、当該遺伝子は、それと類似又は同調する発現パターンを示した前記ゲノムＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定するために用いられる、ＤＮＡアレイ。
【請求項２】
下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列している、請求項１に記載のＤＮＡアレイ。
【請求項３】
前記ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットが存在する、請求項２記載のＤＮＡアレイ。
【請求項４】
（ａ）種類又は状態が異なる２種の下面ビール酵母から、それぞれトータルＲＮＡを抽出するステップと、
（ｂ）一方の種の前記トータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方の種の前記トータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、
（ｃ）基板上の複数のスポットに、前記下面ビール酵母と同一又は異なる下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合し、前記ゲノムＤＮＡ断片のサイズが１．５〜３．０ｋｂｐであり、冗長度が１．５以上２．０以下であり、醸造用酵母の遺伝子が結合した他のスポットが更に存在し、かつ、当該遺伝子は、それと類似又は同調する発現パターンを示した前記ゲノムＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定するために用いられる、ＤＮＡアレイ上で、前記２種の標識ｃＤＮＡ又は２種の標識ｃＲＮＡを競合ハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）前記スポットのそれぞれにおいて、前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、
（ｅ）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
（ｆ）蛍光の強度に差の見られたスポットのプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列を解析するステップと、を備える下面ビール酵母の遺伝子発現解析方法。
【請求項５】
（ａ）種類又は状態が異なる２種の下面ビール酵母から、それぞれトータルＲＮＡを抽出するステップと、
（ｂ）前記トータルＲＮＡから以下の（ｂ１）又は（ｂ２）を得るステップと、
（ｂ１）第１の蛍光色素で標識した第１の標識ｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識した第２の標識ｃＤＮＡ
（ｂ２）第１の蛍光色素で標識した第１の標識ｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識した第２の標識ｃＲＮＡ
（ｃ）基板上の複数のスポットに、前記下面ビール酵母と同一又は異なる下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合し、前記ゲノムＤＮＡ断片のサイズが１．５〜３．０ｋｂｐであり、冗長度が１．５以上２．０以下であり、醸造用酵母の遺伝子が結合した他のスポットが更に存在し、かつ、当該遺伝子は、それと類似又は同調する発現パターンを示した前記ゲノムＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定するために用いられる、ＤＮＡアレイを２つ準備し（但し、２つのＤＮＡアレイは同一のもので、一方を第１のＤＮＡアレイ、他方を第２のＤＮＡアレイとする。）、以下の（ｃ１）又は（ｃ２）のようにハイブリダイズさせるステップと、
（ｃ１）第１のＤＮＡアレイに対して第１の標識ｃＤＮＡ、第２のＤＮＡアレイに対して第２の標識ｃＤＮＡ
（ｃ２）第１のＤＮＡアレイに対して第１の標識ｃＲＮＡ、第２のＤＮＡアレイに対して第２の標識ｃＲＮＡ
（ｄ）前記第１のＤＮＡアレイと前記第２のＤＮＡアレイの対応するスポットのそれぞれにおいて、前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、
（ｅ）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
（ｆ）蛍光の強度に差の見られたスポットのプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列を解析するステップと、を備える下面ビール酵母の遺伝子発現解析方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）で用いるＤＮＡアレイにおいて、下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列している、請求項４又は５に記載の遺伝子発現解析方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）で用いるＤＮＡアレイにおいて、前記ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットが存在する、請求項６に記載の遺伝子発現解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡアレイ及び醸造用酵母の遺伝子発現解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下面ビール酵母は、ビールを始めとする酒類の醸造において最も広く用いられている酵母である。近年、下面ビール酵母の遺伝子発現を解析する技術として、ＤＮＡアレイの利用が試みられている（非特許文献１）。
【非特許文献１】ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．２，５６３−５７３（２００２）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、下面ビール酵母のゲノム配列情報は未だ公開されていないため、非特許文献１に開示された技術では、どの遺伝子の発現が解析されたのか不明であり、下面ビール酵母発酵過程の制御に利用するには不十分である。【０００４】
他方、下面ビール酵母は、大きなゲノムサイズ（２４〜２６Ｍｂｐ）と複雑な染色体構造を有し、非サッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子も含んでいるので、そのゲノム配列情報を取得するには膨大な時間とコストが必要である。【０００５】
そこで、本発明は、醸造用酵母のゲノム配列情報を予め取得する必要がなく、かつ、醸造用酵母発酵過程の制御に十分利用することができる遺伝子発現解析方法、及び当該遺伝子発現解析方法に用いるＤＮＡアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、基板上の複数のスポットに、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイを提供する。【０００７】
本発明はまた、
（ａ）種類又は状態が異なる２種の醸造用酵母から、それぞれトータルＲＮＡを抽出するステップと、
（ｂ）一方の種の前記トータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方の種の前記トータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ（以下、蛍光色素で標識したｃＤＮＡを「標識ｃＤＮＡ」、蛍光色素で標識したｃＲＮＡを「標識ｃＲＮＡ」と呼ぶことがある。）を得るステップと、
（ｃ）基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、前記２種の標識ｃＤＮＡ又は２種の標識ｃＲＮＡを競合ハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）前記スポットのそれぞれにおいて、前記第１及び第２の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、
（ｅ）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
（ｆ）蛍光の強度に差の見られたスポットのプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列を解析するステップと、を備える醸造用酵母の遺伝子発現解析方法を提供する。【０００８】
本発明のＤＮＡアレイを用いた上記遺伝子発現解析方法では、種類又は状態が異なる複数の酵母の遺伝子発現状態を比較し、差異が見られた遺伝子についてのみ配列解析を行うので、予め醸造用酵母のゲノム配列情報を取得する必要がない。他方、酵母の種類又は状態の差異と遺伝子発現状態の差異との関係を知ることができるので、醸造用酵母発酵過程の制御に十分利用することができる。更に、エキソン領域やオープン・リーディング・フレームの予測のための一般的な解析プログラムによっても解析することができない塩基配列領域についても、その発現状態を解析することができる。そのような塩基配列領域としては、上記プログラムが解析対象としていないｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ領域（アミノ酸配列をコードしない領域）の他、上記プログラムではその能力上の制約により解析することができない一部のオープン・リーディング・フレームが挙げられる。【０００９】
上記ＤＮＡアレイを構成するプラスミドに含まれる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片としては、ビール醸造において最も広く用いられる下面ビール酵母由来のものが好適である。【００１０】
上記ＤＮＡアレイは、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子（以下、場合により、「既知遺伝子」という。）が結合した他のスポットが更に存在することが好ましい。【００１１】
このようなＤＮＡアレイを用いれば、既知遺伝子が結合したスポットと類似又は同調する蛍光強度のパターン（第１及び第２の蛍光色素の蛍光強度の比率）を示したスポットのゲノムＤＮＡ断片の配列を解析することによって、そのＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定することが可能になる。例えば、醸造上重要な既知遺伝子と機能的に類似し、一方でその既知遺伝子と塩基配列が異なる遺伝子がゲノムＤＮＡ中に存在する場合、蛍光強度のパターン、すなわち２種の酵母間における遺伝子発現状態の差が上記既知遺伝子と類似又は同調しているゲノムＤＮＡ断片の配列を解析することにより、上記遺伝子を同定することができる。すなわち、醸造上重要な既知遺伝子と発酵中の発現パターンが同調しており機能的に類似しているが、遺伝子配列やアミノ酸配列が異なる既知又は新規の遺伝子を見出すことができる。【００１２】
上記構成のＤＮＡアレイではまた、既知遺伝子が醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現しているものである場合に、既知遺伝子のスポットにおける蛍光強度を指標として、その周辺（例えば、そのスポットが含まれるブロック内）のスポットにおけるハイブリダイゼーション実験の良否を容易に判定することができる。【００１３】
既知遺伝子が結合した他のスポットが更に存在するＤＮＡアレイとしては、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、既知遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列しているタイプが使用に適している。このようなタイプのＤＮＡアレイを用いれば、ブロックごとに、既知遺伝子を指標として、ゲノムＤＮＡ断片中の遺伝子の機能を推定し、又はハイブリダイゼーション実験の良否を判定することが可能になる。上記のようなタイプの中でも、ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、既知遺伝子が結合したスポットが存在するタイプは、プラスミド又は既知遺伝子が結合したスポットの位置が判別しやすく、特に好適である。【００１４】
上記ステップ（ｃ）における競合ハイブリダイゼーションは一個のＤＮＡアレイ上で競合的に行うが、ステップ（ｃ）のように競合ハイブリダイゼーションを行う代わりに、酵母の種類又は状態ごとに別々のＤＮＡアレイ（但し、それぞれのＤＮＡアレイの同じ位置には、同一のプラスミド又は既知遺伝子が結合しているものとする。）上でハイブリダイゼーションを行ってもよい。すなわち、本発明は更に、
（ａ）種類又は状態が異なる２種の醸造用酵母から、それぞれトータルＲＮＡを抽出するステップと、
（ｂ）前記トータルＲＮＡから以下の（ｂ１）又は（ｂ２）を得るステップと、
（ｂ１）第１の蛍光色素で標識した第１の標識ｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識した第２の標識ｃＤＮＡ
（ｂ２）第１の蛍光色素で標識した第１の標識ｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識した第２の標識ｃＲＮＡ
（ｃ）基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイを２つ準備し（但し、２つのＤＮＡアレイは同一のもので、一方を第１のＤＮＡアレイ、他方を第２のＤＮＡアレイとする。）、以下の（ｃ１）又は（ｃ２）のようにハイブリダイズさせるステップと、
（ｃ１）第１のＤＮＡアレイに対して第１の標識ｃＤＮＡ、第２のＤＮＡアレイに対して第２の標識ｃＤＮＡ
（ｃ２）第１のＤＮＡアレイに対して第１の標識ｃＲＮＡ、第２のＤＮＡアレイに対して第２の標識ｃＲＮＡ
（ｄ）前記第１のＤＮＡアレイと前記第２のＤＮＡアレイの対応するスポットのそれぞれにおいて、前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、
（ｅ）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
（ｆ）蛍光の強度に差の見られたスポットのプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列を解析するステップと、を備える醸造用酵母の遺伝子発現解析方法を提供する。ここで、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素は、相互に異なる色素であっても、また、同一の色素であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第１実施形態に係るＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。
【図２】第２実施形態に係るＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。
【図３】実施例１で作製したＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。
【図４】実施例１で作製したＤＮＡアレイのブロックの一つを拡大して模式的に示した平面図である。
【図５】浮遊酵母数の経時変化を示すグラフである。
【図６】抽出したトータルＲＮＡの純度をバイオアナライザーで分析した結果を示すチャートである。
【図７】ＤＮＡアレイの短辺方向の最端の一列を構成する４ブロックについて検出された蛍光を示す写真に対応する図である。
【図８】ＤＮＡアレイ上の蛍光パターンに基づいて行ったクラスタリングの結果を示す図である。
【図９】サッカロミセス・セレビシェのゲノムＤＮＡ中におけるＳＢｃ３３Ｐ１７の領域の位置を示す図である。
【符号の説明】
【００１６】
１…基板、２…プラスミド、３…既知遺伝子、４…ブロック、１０,２０,３０…ＤＮＡアレイ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照しながら、本発明のＤＮＡアレイ及び遺伝子発現解析方法の好適な実施形態について説明する。なお、図面の説明においては、同一要素には同一符号を用いるものとし、重複する説明は省略する。【００１８】
（ＤＮＡアレイ）
図１は、第１実施形態に係るＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。第１実施形態に係るＤＮＡアレイ１０は、基板１と、基板１上の複数のスポットに結合したプラスミド２とから構成されている。ＤＮＡアレイ１０では、プラスミド２が結合した複数のスポットが基板１上に格子状に配列している。【００１９】
図２は、第２実施形態に係るＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。第２実施形態に係るＤＮＡアレイ２０は、基板１と、基板１上の複数のスポットに結合したプラスミド２と、基板１上の他のスポットに結合した、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子３とから構成されている。ＤＮＡアレイ２０では、プラスミド２が結合した複数のスポットと、既知遺伝子３が結合したスポットとから構成されるブロック４が、基板１上に複数配列している。また、複数のブロック４が等しい形状を有しており、それぞれのブロック４の同じ位置に、既知遺伝子３が結合したスポットが存在する。ブロック４は格子状に配列したスポットから構成され、かつ、ブロック４は基板１上に格子状に配列している。【００２０】
ＤＮＡアレイ１０又は２０を構成する基板１の材料は、プラスミド２を安定して結合させることができるものであればよく、例えば、ガラス及び合成樹脂や、その他ポリカーボネート、プラスチック等が挙げられる。また、基板１の形状としては、板状又はフィルム状が好ましい。【００２１】
プラスミド２は、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含んでいる。醸造用酵母としては、下面ビール酵母が好ましく、その中でも更に、ビール醸造において最も広く用いられているサッカロマイセス・パストリアヌス・ヴァイヘンステファン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ  Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）３４／７０が好ましい。【００２２】
プラスミド２に含まれるゲノムＤＮＡ断片のサイズは、好ましくは１．５〜３．０ｋｂｐである。１．５ｋｂｐより短いと、醸造用酵母のゲノムＤＮＡが網羅されるようにＤＮＡアレイを作製しようとした場合に、必要なゲノムＤＮＡ断片数が多くなり、ＤＮＡアレイの作製コストが高くなる傾向がある。他方、３．０ｋｂｐより長いと、一個のＤＮＡ断片に含まれる遺伝子又はエキソンの数が多くなり、遺伝子発現解析の過程が煩雑になる傾向がある。【００２３】
ＤＮＡアレイの実質的な冗長度（ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片の長さの合計を、ＤＮＡアレイの作製に用いた醸造用酵母のゲノムサイズで除した値）が１．５以上２．０以下のものが好ましい。実質的な冗長度が１．５未満であると、ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片が全体としてカバーするゲノム領域が小さくなる傾向があり、実質的な冗長度が２．０を超えると、異なるスポットのゲノムＤＮＡ断片間で重複する領域が大きくなり、遺伝子発現解析が煩雑になる傾向がある。【００２４】
なお、プラスミド２の代わりに、そのインサートである醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を上記のＤＮＡアレイに直接結合させてもよい。この場合においても、ゲノムＤＮＡ断片のサイズ及び冗長度は、上記したプラスミド２を用いる場合と同じであることが好ましい。【００２５】
ＤＮＡアレイ２０を構成する既知遺伝子３は、実験者がその目的に応じて選択することができる。既知遺伝子３は、サッカロマイセス・セレビシェ由来の遺伝子が好適であり、その配列情報は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤａｔａＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）より入手することができる。【００２６】
ＤＮＡアレイ２０においては、プラスミド２はブロックによって異なっている方がよい。また、既知遺伝子３は、各ブロックの同じ位置に同じ既知遺伝子が結合しているのが好ましい。【００２７】
各ブロック４に複数種類の既知遺伝子３が存在する場合、少なくとも一種は醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現しているものであることが好ましい。このような遺伝子がブロックごとに存在していれば、各ブロックにおけるハイブリダイゼーション実験の良否を容易に判定することができる。そのような遺伝子として、サッカロマイセス・セレビシェ由来のＡＣＴ１遺伝子が挙げられる。【００２８】
なお、ＤＮＡアレイ１０又は２０のように、プラスミド又は既知遺伝子が結合した複数のスポットが格子状に配列していれば、スポットの位置を座標で表すことができるので、スポットの位置を特定しやすく、遺伝子発現解析に好都合である。また、ＤＮＡアレイ２０においては、各スポットの同じ位置に同じ既知遺伝子が結合しているのが好ましい。【００２９】
本発明のＤＮＡアレイの作製は、醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーから無作為に選んだプラスミドを基板表面に結合させることにより行う。【００３０】
醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーの作製は下記の操作１）〜６）により行うことができる。各操作は、特に断らない限り、公知の方法に従えばよい。
１）醸造用酵母からゲノムＤＮＡを抽出、精製する。
２）抽出、精製したゲノムＤＮＡを断片化する。ゲノムＤＮＡの断片化は、ランダムなＤＮＡ断片を得るために、ＤＮＡ断片化装置を用いて行うのが好ましい。
３）得られたゲノムＤＮＡ断片から、電気泳動により一定のサイズのゲノムＤＮＡ断片を回収する。
４）得られたゲノムＤＮＡ断片を平滑末端化し、適当なプラスミドベクターに連結する。
５）得られた組換えベクターを適当な宿主細胞に導入する。
６）宿主細胞を適当な培地上で培養し、形質転換細胞を選択する。【００３１】
プラスミドの基板表面への結合は、例えば、ゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドを溶解した固定液を、表面処理（ポリリジン処理等）を施した基板上にスポッターでスポッティングし、プラスミドを基板表面上に固定化する方法を用いることができる。ここで、固定液として、アルカリ性固定液を用いれば、二本鎖プラスミドは固定液中で２個の一本鎖プラスミドに分離される。アルカリ性ではない固定液を用いる場合は、加熱処理等によって二本鎖を一本鎖にすればよい。【００３２】
（遺伝子発現解析方法）
本発明の遺伝子発現解析方法は、下記のステップを備えるものである。
（ａ）種類又は状態が異なる２種の醸造用酵母から、それぞれトータルＲＮＡを抽出するステップ
（ｂ）一方の種の前記トータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方の種の前記トータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップ
（ｃ）基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、前記２種の標識ｃＤＮＡ又は２種の標識ｃＲＮＡを競合ハイブリダイズさせるステップ
（ｄ）前記スポットのそれぞれにおいて、前記第１及び第２の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップ
（ｅ）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップ
（ｆ）蛍光の強度に差の見られたスポットのプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列を解析するステップ【００３３】
ステップ（ａ）において、醸造用酵母の「種類又は状態が異なる」とは、醸造用酵母株の種類自体が異なるか、又は醸造用酵母の生育条件（温度、生育時間、培地の成分、培地への通気量等）、発酵条件（発酵温度、発酵時間等）等が異なることを意味する。【００３４】
ステップ（ａ）におけるトータルＲＮＡの抽出は、例えば、ホットフェノール法（加温したフェノールとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で酵母を溶解しながらＲＮＡを抽出する方法）に従って行うこともできるが、分解度の低い高純度ＲＮＡを得るために、酵母を液体窒素で凍結した後、磨砕機で磨砕し、ＲＮＡ抽出試薬でＲＮＡを抽出する方法で行うのが好ましい。ここで、磨砕機としてはクライオプレス（マイクロテック・ニチオン社製）が、ＲＮＡ抽出試薬としてはＩｓｏｇｅｎＴＭ（ニッポンジーン社製）が挙げられる。【００３５】
ステップ（ｂ）における標識ｃＤＮＡ又は標識ｃＲＮＡは、例えば、標識ｃＤＮＡは、上記の醸造用酵母から抽出したトータルＲＮＡにオリゴｄＴプライマーをアニールさせた後、蛍光色素が結合したｄＮＴＰの存在下で逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、未反応の基質をスピンカラムで取り除くことにより調製できる。その際、オリゴｄＴカラムを用いて、トータルＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを単離精製し、上記の逆転写反応を行ってもよい。【００３６】
また、標識ｃＲＮＡは、上記のトータルＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡにＴ７プロモーターの配列が付いたオリゴｄＴプライマーを用いて、逆転写反応で未標識のｃＤＮＡを合成し、蛍光色素が結合したＮＴＰの存在下で、得られたｃＤＮＡにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを反応させてｃＲＮＡを合成し、未反応の基質をスピンカラムで取り除くことにより調製できる。【００３７】
ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの標識に用いる蛍光色素は、酵母の種類又は状態ごとに色（蛍光波長）が区別し得るものであればよいが、Ｃｙａｎｉｎｅ色素が好ましい。互いに色が異なるＣｙａｎｉｎｅ色素としては、例えばＣｙ３（緑色色素）及びＣｙ５（赤色色素）が挙げられる。【００３８】
ステップ（ｃ）で用いるＤＮＡアレイは、既知遺伝子が結合した他のスポットが更に存在することが好ましい。このようなＤＮＡアレイとしては、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、既知遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列しているタイプが使用に適しており、特に、ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、既知遺伝子が結合したスポットが存在するとよい。【００３９】
上記ステップ（ｃ）における競合ハイブリダイゼーションは、一個のＤＮＡアレイ上で競合的に行う。ｃＤＮＡをハイブリダイズさせる場合は、ハイブリダイゼーション前に加熱処理等によって二本鎖を一本鎖にする。ハイブリダイゼーションは、例えば、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載の方法に従って行えばよい。【００４０】
なお、ステップ（ｃ）のように競合ハイブリダイゼーションを行う代わりに、酵母の種類又は状態ごとに別々のＤＮＡアレイ（但し、それぞれのＤＮＡアレイの同じ位置には、同一のプラスミド又は既知遺伝子が結合しているものとする。）上でハイブリダイゼーションを行うこともできる。この場合は、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの標識に用いる蛍光色素は、酵母の種類又は状態ごとに異なっていても、また、同一であってもよい。【００４１】
ステップ（ｄ）における蛍光強度の測定は、ＣＣＤカメラやスキャナで画像データを取得し、これをソフトウエアで数値化することにより行うことができる。【００４２】
ステップ（ｅ）における蛍光強度の比較は、ステップ（ｄ）で測定された第１及び第２の蛍光色素の蛍光強度の比を求めることにより行うことができる。【００４３】
ステップ（ｆ）におけるＤＮＡ断片の配列解析では、ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、そのＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その遺伝子の機能を予測する。具体的には、測定された蛍光強度に差の見られたゲノムＤＮＡ断片について、その塩基配列を決定した後、酵母株の種類又は状態と関連付け、また、データベースリサーチ(相同性検索等)を行うことにより遺伝子を同定し、ゲノムＤＮＡ断片中の遺伝子の機能を予測する。ここで、蛍光強度に差の見られたゲノムＤＮＡ断片の検出は、ステップ（ａ）〜（ｅ）を複数回繰り返し、その結果を発現比率パターンの類似度に基づいてクラスタリングすることにより行うのが好ましい。なお、配列解析は、解析対象のゲノムＤＮＡ断片に対応する、ライブラリー中のプラスミドを用いて行えばよい。【００４４】
ステップ（ｃ）でＤＮＡアレイ２０を用いた場合は、ステップ（ｆ）において、既知遺伝子と類似又は同調する蛍光強度のパターン（第１及び第２の蛍光色素の蛍光強度の比率）を示したゲノムＤＮＡ断片の配列を解析することによって、そのゲノムＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定することができる。この場合、その遺伝子の塩基配列を同定した後、既知遺伝子の機能と関連付け、また、データベースリサーチ(相同性検索等)を行うことにより、ゲノムＤＮＡ断片中の遺伝子の機能を予測する。ここで、既知遺伝子と類似又は同調する蛍光強度のパターンを示すゲノムＤＮＡ断片の検出は、ステップ（ａ）〜（ｅ）を複数回繰り返し、その結果を発現比率パターンの類似度に基づいてクラスタリングすることにより行うのが好ましい。【００４５】
本発明の遺伝子発現解析方法は、ステップ（ｆ）に至る前までに、ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片中の、リボソームＲＮＡの遺伝子領域を特定するステップを備えていることが好ましい。リボソームＲＮＡの遺伝子領域が特定されていれば、配列解析においてそのような領域を除外して、より精度の高い解析を行うことが可能になる。【００４６】
リボソームＲＮＡの遺伝子領域の特定は、下記の操作１）〜３）により行うことができる。
１）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の一部及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の一部をプライマーとして、また、醸造用酵母のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ中の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域に相補的なＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させる。
２）得られたＤＮＡ断片を蛍光色素、放射性同位体等で標識する。
３）得られた標識ＤＮＡ断片をＤＮＡアレイ上のプラスミドとハイブリダイズさせる。
４）標識を検出する。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例を説明する。なお、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。【００４８】
（実施例１：ＤＮＡアレイの作製）
ランダムゲノムライブラリーの作製：
醸造用酵母としてサッカロマイセス・パストリアヌス・ヴァイヘンステファン３４／７０を用いて、醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーを作製した。【００４９】
醸造用酵母からのゲノムＤＮＡの抽出及び精製は、例えば、「酵母遺伝子実験マニュアル（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａ  ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ）」（大矢禎一監修、丸善株式会社、ｐ．１１３−１１９）に記載の方法に準じて行った。【００５０】
ランダムゲノムライブラリーの作製は、次のように行った。１）ＤＮＡ断片化装置（ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ）によってゲノムＤＮＡを断片化した。２）得られたゲノムＤＮＡ断片を電気泳動したアガロースゲルから、約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。３）ゲノムＤＮＡ断片の末端を平滑化した後、ｐＵＣ１９ベクターに連結した。４）得られた組換えベクターを大腸菌に導入し、得られたコロニーよりグリセロールストックを作製した。５）グリセロールストックよりＬＢ培地（１０ｇ／Ｌバクトトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）（液体培地）に大腸菌を移植し、約２００００のプラスミドクローンを抽出した。各プラスミドクローンは約２．５ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を含むので、抽出したプラスミドクローン全体は約５０Ｍｂｐ（２．５ｋｂｐ×２００００クローン）のゲノムＤＮＡ断片を含み、ゲノムサイズ２４〜２６Ｍｂｐの下面ビール酵母ゲノムを約２．０の冗長度で保有していたと推定される。【００５１】
ランダムゲノムライブラリーの評価：
ランダムゲノムライブラリーの評価は、次のように行った。１）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行った。２）９６穴プレート８枚に分注されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ベクタープライマーによる塩基配列解析を行った。その結果、約９０％のクローンは、ゲノムＤＮＡの挿入断片を有することが確認された。すなわち、作製されるＤＮＡアレイの実質的な冗長度は約１．８（２．０×０．９）になると推定される。【００５２】
ＤＮＡアレイの作製：
図３は、実施例１で作製したＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。図３に示されるように、実施例１で作製したＤＮＡアレイ３０では、１２行×４列（計４８個）のブロック４が基板１上に配列している。図４は、ＤＮＡアレイ３０のブロック４の一つを拡大して模式的に示した平面図である。ブロック４はプラスミド２又は既知遺伝子３が結合した２１×２１個のスポットから構成されている。既知遺伝子３が結合した２１個のスポットは、各ブロック４において、ＤＮＡアレイ３０の短辺方向の最端の一列を構成している。なお、図４では、ブランクは便宜上、既知遺伝子３として示している。異なるスポットに結合している既知遺伝子３は、互いに種類が異なっていてもよい。【００５３】
ＤＮＡアレイ３０の作製は、プラスミド２を各ブロック４の２〜２１行目のスポットに、既知遺伝子３を各ブロック４の１行目のスポットに固定化することにより行った。基板１としてはガラス基板を用い、固定化は、アルカリ性固定液に溶解したプラスミド２又は既知遺伝子３を、表面処理（ポリリジン処理）を施したガラス基板上にスポッティングすることにより行った。【００５４】
既知遺伝子３としてはサッカロマイセス・セレビシェ由来のものを用い、これをＰＣＲで増幅させたＤＮＡを固定化した。ＤＮＡアレイに固定化した既知遺伝子の遺伝子名、機能、及びＰＣＲ増幅において使用したプライマーの種類は下記１）〜１０）のとおりである。
１） 遺伝子名：ＡＣＴ１、機能：アクチン生成、プライマー：（５’−ＴＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡ−３’、５’−ＣＣＴＴＡＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡ−３’）
２） 遺伝子名：ＡＴＦ１、機能：酢酸エステル合成、プライマー：（５’−ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴ−３’、５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧ−３’）
３） 遺伝子名：ＡＴＦ２、機能：酢酸エステル合成、プライマー：(５’−ＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’、５’−ＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＧＡＴＴＣ−３’）
４） 遺伝子名：Ｌｇ−ＡＴＦ１、機能：酢酸エステル合成、プライマー：(５’−ＧＧＴＧＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡ−３’、５’−ＡＡＣＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴ−３’）
５） 遺伝子名：ＥＨＴ１、機能：脂質代謝、プライマー：（５’−ＴＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＡＣＧＴＴ−３’、５’−ＴＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＣ−３’）
６） 遺伝子名：ＩＡＨ１、機能：エステラーゼ活性、プライマー：（５’−ＧＡＴＣＡＧＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＣ−３’、５’−ＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡ−３’）
７） 遺伝子名：ＬＥＵ４、機能：イソプロピルマレート合成、プライマー：（５’−ＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧ−３’、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＴＧＧ−３’）
８） 遺伝子名：ＯＬＥ１、機能：脂肪酸の不飽和化、プライマー：（５’−ＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧ−３’、５’−ＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡ−３’）
９） 遺伝子名：ＳＳＵ１、機能：亜硫酸塩の輸送、プライマー：（５’−ＴＧＣＴＣＴＴＡＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧ−３’、５’−ＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＡＡ−３’）
１０） 遺伝子名：Ｌｇ−ＦＬＯ１、機能：凝集性遺伝子、プライマー：（５’−ＣＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧ−３’、５’−ＴＴＡＣＣＡＴＡＣＧＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡ−３’）【００５５】
各ブロック４において、ＤＮＡアレイ３０の短辺方向の最端の一列を構成するスポットには、１：ＡＣＴ１、２：ＡＴＦ１、３：ＡＴＦ２、４：Ｌｇ−ＡＴＦ１、５：ＥＨＴ１、６：ＩＡＨ１、７：ＬＥＵ４、８：ＯＬＥ１、９〜１８：ブランク、１９：ｐＵＣ１９（コントロール）、２０：ＳＳＵ１、２１：Ｌｇ−ＦＬＯ１を順に固定化した。すなわち、ＤＮＡアレイ３０には、５２８個（１１×４列×１２行）の既知遺伝子（コントロールを含む）と、２０１６０個（２０×２１×４列×１２行）個のプラスミドとがガラス基板表面に固定化されている。なお、ＡＣＴ１遺伝子は、醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現している遺伝子である。【００５６】
リボソームＲＮＡ遺伝子領域の特定：
上記ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片中に重複して存在するリボソームＲＮＡ遺伝子領域を特定するために、下記に示した配列を有するＤＮＡ断片を１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子用のプライマーとして、また、下面ビール酵母のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ中の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域に相補的なＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた。
・１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子用プライマー：
（５’−ＣＴＧＧＴＴＧＡＴＹＣＴＧＣＣＡＧＴ−３’、５’−ＣＹＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣＲＧ−３’）
・２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子用プライマー：
（５’−ＲＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＹＷＧ−３’、５’−ＭＲＧＧＣＴＫＡＡＴＣＴＣＡＲＹＲＧＡＴＣＧ−３’）【００５７】
得られたＤＮＡ断片をＣｙ５で標識してプローブとし、このプローブを用いて上記ＤＮＡアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、例えば、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載の方法に従って、６２℃の恒温槽で１４時間行った。【００５８】
その結果、基板に固定化したゲノムＤＮＡ断片２０１６０個の内、１１２９個（約６％）のゲノムＤＮＡ断片をリボソームＲＮＡ遺伝子領域であると判断し、以降の解析ではマスクすることにした。【００５９】
（実施例２：下面ビール酵母の遺伝子発現解析）
トータルＲＮＡの抽出：
下面ビール酵母を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
・麦汁エキス濃度  約１１％
・麦汁容量  ２．５Ｌ
・麦汁溶存酸素濃度  約５〜１０ｐｐｍ
・発酵温度  約１３℃
・酵母投入量  ２０〜２４ｇ湿酵母菌体
・発酵回数  ３回【００６０】
発酵液を経時的にサンプリングし、浮遊酵母数（酵母増殖量）の経時変化を調べた。発酵初期、中期及び後期に浮遊している酵母をサンプリングした。具体的には、発酵開始から４７、９５及び１４３時間が経過した時点でサンプリングを行った。図５は、浮遊酵母数の経時変化を示すグラフである。【００６１】
上記の３種の発酵途中の酵母のそれぞれから、次のようにトータルＲＮＡを抽出した。１）発酵液より回収した酵母（約１ｇ）を遠心チューブごと液体窒素で凍結させた。２）凍結している状態の酵母をクライオプレス（マイクロテック・ニチオン社製）で磨砕した（３０秒間の磨砕を３回行った）。３）磨砕物を約１０ｍｌのＩｓｏｇｅｎＴＭ（ニッポンジーン社製）に溶解し、付属のマニュアルに従ってトータルＲＮＡを精製した。【００６２】
発酵後期の酵母から抽出したトータルＲＮＡについて、吸光度測定によってその濃度を、また、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）によってその品質をチェックした。濃度は、２３１．７９ｎｇ／μＬであった。図６は、抽出したトータルＲＮＡの純度をバイオアナライザーで分析した結果を示すチャートである。図６に示されるように、抽出したトータルＲＮＡ中の１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡの比率は１：１．６であり、かつ、２８ＳリボソームＲＮＡ由来の分解産物は検出されなかった。これらの結果より、高純度のトータルＲＮＡが抽出されたことが分かる。【００６３】
蛍光色素による標識：
上記トータルＲＮＡに対し、オリゴｄＴプライマーをアニールさせた後、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ存在下で逆転写酵素反応を行い、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰが導入されたｃＤＮＡを調製した。カップリング反応を用いてｃＤＮＡをＣｙａｎｉｎｅ色素（Ｃｙ３又はＣｙ５）で標識した。一個のＤＮＡアレイ上のプラスミド及び既知遺伝子にハイブリダイズさせる２種のｃＤＮＡの一方をＣｙ３（緑色色素）で、他方をＣｙ５（赤色色素）で標識した。【００６４】
ハイブリダイゼーション：
一個のＤＮＡアレイにつき２種の蛍光色素標識ｃＤＮＡを、ＤＮＡアレイ上のプラスミド及び既知遺伝子に競合的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、例えば、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載の方法に従って、６２℃の恒温槽で１４時間行った。【００６５】
蛍光強度の測定：
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡアレイを洗浄し、スライドスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でシグナルを取り込んだ。得られたシグナルの画像データは、専用ソフトＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ〈Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて数値データに変換した。バックグラウンドにはネガティブコントロールの蛍光値を用い、各スポットの蛍光値から差し引いた。サンプルとコントロール（ｐＵＣ１９）間のノーマライゼーションは、グローバルノーマライゼーション法（全体のスポットを用いて正規化する方法）によって行った。【００６６】
上記ハイブリダイゼーション実験の良否の確認は、スキャニング後の画像におけるＡＣＴ１遺伝子の４８個（４列×１２行）分の蛍光強度から判断した。図７は、ＤＮＡアレイの短辺方向の最端の一列を構成する４ブロックについて検出された蛍光を示す写真に対応する図である。図７において、既知遺伝子（ブランクを含む。）が結合したスポットは、各ブロック内で、ＤＮＡアレイの短辺側の最端の一列を構成している。図７に示されるように、構成的に発現しているＡＣＴ１遺伝子（図中、白色の丸枠でその位置を示している。）の蛍光強度がどのブロックにおいてもほぼ一定であることから、ハイブリダイゼーション実験の結果が良であると判断した。【００６７】
配列解析：
３回の発酵試験で得られたＤＮＡアレイ上の蛍光パターンに基づいて、クラスタリングを行った。既知遺伝子として、アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＴＦ１を固定化したスポットと蛍光パターンが同調する７つのスポットが選ばれた。これらのスポットについて、ランダムゲノムライブラリー中の相当するゲノムＤＮＡ断片の配列解析を行い、ＢＬＡＳＴ等を用いたデータベースリサーチから遺伝子の機能を推定した。その結果、６つのゲノムＤＮＡ断片（ＳＢｃ４０Ｉ１３、ＳＢｃ４８Ｉ０２、ＳＢｃ１４Ｍ０４、ＳＢｃ４３Ｍ１３、ＳＢｃ２７Ｅ１０及びＳＢｃ２２Ｍ０６）からは、表１の１０個の遺伝子がアノテーションされたが、１つのゲノムＤＮＡ断片（ＳＢｃ１７Ａ１４）は非サッカロミセス・セレビシェタイプであった。図８は、ＤＮＡアレイ上の蛍光パターンに基づいて行ったクラスタリングの結果を示す図である。図８において、ｃｏｎｔｒｏｌ０２はＡＴＦ１遺伝子を表す。【００６８】
【表１】
0004879161.tif 000002
【００６９】
また、クラスタリングにより、発酵工程中に遺伝子発現が上昇し続けるスポットが５つ選ばれた。これらのスポットに対応する５つのゲノムＤＮＡ断片（ＳＢｃ２５Ｊ１８、ＳＢｃ３５Ｏ２０、ＳＢｃ４２Ｎ０４、ＳＢｃ３２Ｎ１６及びＳＢｃ３３Ｐ１７）は、配列解析により、サッカロミセス・セレビシェに同等するゲノムＤＮＡ断片であることが明らかとなった。図９は、サッカロミセス・セレビシェのゲノムＤＮＡ中におけるＳＢｃ３３Ｐ１７の領域の位置を示す図である。図９に示されるように、ＳＢｃ３３Ｐ１７は、サッカロミセス・セレビシェの第ＸＶ染色体の３２２５０ｂｐ〜３４４９２ｂｐの領域に相当するが、本領域にはオープン・リーディング・フレームが存在せず、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ領域であった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、醸造用酵母のゲノム配列情報を予め取得する必要がなく、かつ、醸造用酵母発酵過程の制御に十分利用することができる遺伝子発現解析方法、及び当該遺伝子発現解析方法に用いるＤＮＡアレイが提供される。本発明のＤＮＡアレイ及び遺伝子発現解析方法は、酵母の発酵を用いる酒類の製造に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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