(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトサミンをイミダゾール基を有する化合物を触媒として適当なメディエータ（電子受容体）存在下で酸化した結果生成される還元型メディエータを計測することを特徴とするフルクトサミンの測定方法。
【請求項２】
以下のステップを含むフルクトサミンの測定方法：
１）メディエータの存在下に、ｐＨが６〜１０の反応溶液中で、フルクトサミンを含む試料とイミダゾール基を有する化合物とを反応させる；
２）反応により生成される還元型メディエータを測定する；そして
３）標準濃度のフルクトサミン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトサミン濃度を算出する。
【請求項３】
以下のステップを含む糖化蛋白質の測定方法：
１）糖化蛋白質を酵素的あるいは化学的に分解してフルクトサミンを得る；
２）メディエータの存在下に、ｐＨが６〜１０の反応溶液中で、フルクトサミンを含む試料とイミダゾール基を有する化合物とを反応させる；
３）反応により生成される還元型メディエータを測定する；
４）標準濃度のフルクトサミン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトサミン濃度を算出する；そして
５）フルクトサミン濃度から糖化蛋白質量を算出する。
【請求項４】
イミダゾール基を有する化合物がビニルイミダゾールの重合体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
フルクトサミンをイミダゾール基を有する化合物と反応させた結果生成される還元型メディエータを分光学的手法により計測することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フルクトサミンをイミダゾール基を有する化合物と反応させた結果生成される還元型メディエータを電気化学的手法により計測することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
糖化蛋白質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである請求項３記載の方法。
【請求項８】
イミダゾール基を有する化合物、緩衝液、およびメディエータを含み、さらにキャリブレーションカーブ作製のためのフルクトサミンもしくはその誘導体の標準溶液、および使用の指針から選択される１以上を含んでいてもよいフルクトサミンアッセイキット。
【請求項９】
緩衝液中に、イミダゾール基を有する化合物を固定化した作用電極と、対極および参照電極を備えたフルクトサミン測定用センサーであって、緩衝液中にメディエータを含むフルクトサミン測定用センサー。
【請求項１０】
電極としてカーボンペーストを用いる、請求項９記載のフルクトサミン測定用センサー。
【請求項１１】
イミダゾール基を有する化合物、糖化ヘモグロビンの加水分解試薬または蛋白質分解酵素、緩衝液、およびメディエータを含み、さらにキャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシルバリンもしくはその誘導体の標準溶液、および使用の指針から選択される１以上を含んでいてもよい糖化ヘモグロビンのアッセイキット。
【請求項１２】
イミダゾール基を有する化合物、糖化アルブミンの加水分解試薬または蛋白質分解酵素、緩衝液、およびメディエータを含み、さらにキャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシル−ε−リジンもしくはその誘導体の標準溶液、および使用の指針から選択される１以上を含んでいてもよい糖化アルブミンのアッセイキット。
【請求項１３】
糖尿病の診断に利用するために行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規な糖化蛋白質の測定方法に関する。より詳細には本発明は臨床検査などの分野で利用され、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、糖化アルブミンやその分解産物であるフルクトシルバリンをはじめとするフルクトサミンの測定方法ならびにその方法に基づき構築される測定用試薬ならびにセンサーに関する。
従来技術
蛋白質主鎖および側鎖のアミノ基はグルコースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。血中においては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡ１ｃ）を生ずることが知られている。糖尿病患者では健常人に比べてヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比率が高いこと、およびＨｂＡ１ｃの血中濃度は過去数週間の血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃ血中濃度は糖尿病の診断および糖尿病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験において極めて重要である。また、糖化アルブミンも糖化ヘモグロビンと同様に過去の血糖値の推移を判断できる指標であり、以前から、糖化アルブミンと糖化ヘモグロビンの両者が糖尿病診断に用いられている。以下の化学式は、ヘモグロビンのβグロビンのＮ−末端に存在するバリンとグルコースとの結合によって、アマドリ化合物であるフルクトシルバリンが生じる反応を示したものである。
0004879441.tif 000002
これまでに、種々の菌株からアマドリ化合物に対して作用する酵素、フルクトシルアミン酸化酵素が単離されており、これらの酵素を用いて糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃ等の糖化蛋白質およびフルクトサミンを分析しうることが示唆されている（特開昭６１−２６８１７８、特開昭６１−２８０２９７、特開平３−１５５７８０、特開平５−１９２１９３、特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１），１０３−１１０，１９８９、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（２），３３３−３３８，１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４），２７２９７−２７３０２，１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１２），４４８７−４４８９，１９９５、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（３），４８７−４９１，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１），２１８−２２４，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（５１），３２８０３−３２８０９，１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（６），３４３７−３４４３，１９９７）。
しかし、これまでに報告されているフルクトサアミン酸化酵素は蛋白質であることから安定性の改良が望まれていた。従って、フルクトサミン酸化を触媒する新しい安定な触媒が求められていた。さらには、フルクトサミンを簡便、正確に測定することによって、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）や糖化アルブミンなどの糖化蛋白質を測定する方法、及びこの方法に基づいて臨床検査などの分野で利用することのできる測定用試薬ならびにセンサーを提供することが求められていた。
発明の開示
本発明は糖化蛋白質を測定する方法を鋭意検討した結果、イミダゾールを含む化合物を用いてフルクトサミンを反応させる方法を見出した。
すなわち、本発明はフルクトサミンをイミダゾール基を有する化合物を触媒として適当なメディエータ（電子受容体）存在下で酸化した結果生成される還元型メディエータを計測することを特徴とするフルクトサミンの測定方法を提供する。特に、本測定をメディエータの存在下で反応を行い、かつ反応溶液のｐＨが６〜１０であることを特徴とするフルクトサミンの測定方法を提供する。
本発明はさらに、以下のステップを含むフルクトサミンの測定方法を提供する：
１）メディエータの存在下に、ｐＨが６〜１０の反応溶液中で、フルクトサミンを含む試料とイミダゾールを含む化合物とを反応させる；
２）反応により生成される還元型メディエータを測定する；そして
３）標準濃度のフルクトサミン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトサミン濃度を算出する。
本発明はさらに、以下のステップを含む糖化蛋白質の測定方法を提供する：
１）糖化蛋白質を酵素的あるいは化学的に分解してフルクトサミンを得る；
２）メディエータの存在下に、ｐＨが６〜１０の反応溶液中で、フルクトサミンを含む試料とイミダゾールを含む化合物とを反応させる；
３）反応により生成される還元型メディエータを測定する；
４）標準濃度のフルクトサミン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトサミン濃度を算出する；そして
５）フルクトサミン濃度から糖化蛋白質量を算出する。
本発明はさらに、イミダゾールを含む化合物を含み、さらに緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトサミンもしくはその誘導体の標準溶液、および使用の指針から選択される１以上を含んでいてもよいフルクトサミンアッセイキットを提供する。
本発明はさらに、緩衝液中に、イミダゾール化合物を固定化した作用電極と、対極および参照電極を備えたフルクトサミン測定用センサーを提供する。
本発明はさらに、イミダゾールを含む化合物を含み、さらに糖化ヘモグロビンの加水分解試薬または蛋白質分解酵素、緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシルバリンもしくはその誘導体の標準溶液、および使用の指針から選択される１以上を含んでいてもよい糖化ヘモグロビンのアッセイキットを提供する。
本発明はさらに、緩衝液中に、イミダゾール化合物を固定化した作用電極と、対極および参照電極を備えた糖化ヘモグロビン測定用センサーを提供する。
本発明はさらに、イミダゾールを含む化合物を含み、さらに糖化アルブミンの加水分解試薬または蛋白質分解酵素、緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシル−ε−リジンもしくはその誘導体の標準溶液、および使用の指針から選択される１以上を含んでいてもよい糖化アルブミンのアッセイキットを提供する。
本発明はさらに、緩衝液中に、イミダゾール化合物を固定化した作用電極と、対極および参照電極を備えた糖化アルブミン測定用センサーを提供する。
本発明はさらに、本発明の方法を用いてフルクトサミン又は糖化蛋白質を測定することを含む糖尿病の診断方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、糖化蛋白質とは、蛋白質主鎖又は側鎖のアミノ基がグルコースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して生成される化合物をいい、典型的な糖化蛋白質には糖化ヘモグロビン及び糖化アルブミンを含む。
本発明において、フルクトサミンとは、アミノ酸とグルコースとが反応して形成されるシッフ塩基型のアルジミンがアマドリ転移して生成するアマドリ化合物をいう。好ましいフルクトサミンは、フルクトシルバリン、フルクトジル−ε−リジン、フルクトシルグリシン、フルクトシルアラニン、フルクトシルフェニルアラニンなどを含むが、これに限定されない。
測定方法
本発明はある観点において、フルクトサミンをイミダゾール基を有する化合物を触媒として適当なメディエータ（電子受容体）存在下で酸化した結果生成される還元型メディエータを計測することを特徴とするフルクトサミンの測定方法を提供する。
本発明における糖化蛋白質、たとえば糖化アルブミンあるいはＨｂＡ１ｃ、あるいは糖化アルブミンやＨｂＡ１ｃを酵素的あるいは化学的に分解し生成したフルクトシルバリン等のフルクトサミンを測定する方法は、フルクトサミン等をイミダゾールを含む化合物と作用させることにより達成される。特に、本測定をメディエータの存在下で反応を行い、かつ反応溶液のｐＨが６〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５、最も好ましくはｐＨ７近辺で測定することが望ましい。
糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンからフルクトサミンへと分解するには、蛋白質分解酵素により酵素的に行うか、あるいは酸加水分解により化学的に行うことができる。蛋白質分解酵素としては市販のプロテイナーゼＫ、トリプシン、アミノペプチダーゼなどを用いることができ、条件は通常のこれらの蛋白質加水分解酵素を用いる方法に準じる。酸加水分解では塩酸加水分解などを用いることができる。糖化ヘモグロビンを分解して得られるフルクトサミンはフルクトシルバリンであり、糖化アルブミンを分解して得られるフルクトサミンはεの位置が糖化されているリジンであるフルクトシル−ε−リジンである。
従って、本発明は、好ましい態様においては、以下のステップを含むフルクトサミンの測定方法を提供する：
１）メディエータの存在下に、ｐＨが６．５〜７．５の反応溶液中で、フルクトサミンを含む試料とイミダゾールを含む化合物とを反応させる；
２）反応により生成される還元型メディエータを測定する；そして
３）標準濃度のフルクトサミン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトサミン濃度を算出する。
本発明はさらに、好ましい態様においては、以下のステップを含む糖化蛋白質の測定方法を提供する：
１）糖化蛋白質を酵素的あるいは化学的に分解してフルクトサミンを得る；
２）メディエータの存在下に、ｐＨが６．５〜７．５の反応溶液中で、フルクトサミンを含む試料とイミダゾールを含む化合物とを反応させる；
３）反応により生成される還元型メディエータを測定する；
４）標準濃度のフルクトサミン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトサミン濃度を算出する；そして
５）フルクトサミン濃度から糖化蛋白質量を算出する。
イミダゾールを含む化合物はこの測定においては触媒として機能するが、この反応を達成できる化合物、すなわちフルクトサミンを酸化して、その結果還元される電子受容体（メディエータ）を生じる化合物であれば特に限定されるものではない。フルクトサミン等を測定するために用いるイミダゾールを含む化合物としては、イミダゾールを含む化合物の単量体であっても、重合体であってもよい。イミダゾールを含む化合物の単量体としては、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、Ｎ−アセチルヒスチジン、イミダゾール、２−メチル−４−ヒドロキシル−６−アミノベンズイミダゾール、４−（２’，４’−ジヒドロキシフェニル）イミダゾール、４−ヒドロキシメチルイミダゾール、カルボベンゾキシ−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−チロシンエチルエステル、２メチルベンズイミダゾール、ヒスタミン、６−アミノベンズイミダゾール、４−ヒドロキシ−６−アミノベンズイミダゾール、ベンズイミダゾール、４−ヒドロキシベンズイミダゾール、ヒスチジンメチルエステル、２−メチル−４−ヒドロキシ−６−ニトロベンズイミダゾール、４−メトキシベンズイミダゾール、４−ブロムイミダゾール、６−ニトロベンズイミダゾール、４−ヒドロキシ−６−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロイミダゾール、ビニルイミダゾールなどのイミダゾール化合物に加えて、ピリジン、４−ピコリン、ピロール、３，５−ジメチルピラゾール、１，２，４−トリアゾール、インドール、ベンゾトリアゾールなどのイミダゾールに類似するヘテロ環状化合物も使用できる。好ましくはビニルイミダゾール、さらに好ましくは１−ビニルイミダゾール又は４，５−ジビニルイミダゾールである。イミダゾールを含む化合物の重合体としては、前記のイミダゾールを含む化合物がモノマーとして重合したイミダゾールを含有するポリマー、好ましくはビニルイミダゾールを重合して合成されるポリビニルイミダゾールポリマーを使用できる。また、イミダゾールを含む化合物のモノマーをポリマーの成分として少なくともひとつ含む共重合体（コポリマー）を使用できる。
ポリビニルイミダゾールポリマーを製造するには、当業者に公知のいかなる方法、条件を用いてもよい。重合開始剤として、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔ−ブチル、過硫酸カリウムなどの汎用の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、アゾビスイソブチルアミジン塩酸塩，４，４’−アゾビス−４−シアノ吉草酸、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）などのアゾ系開始剤；レドックス系開始剤などを用いてラジカル重合により製造することができる。あるいはフラビン色素を用いる光ラジカル重合により製造してもよい。
イミダゾールを含む化合物の重合体は架橋剤を用いて架橋してもよい。ビニル単量体の重合の際にあらかじめ添加する架橋剤としては、例えばジビニル化合（ジビニルベンゼン、１，５−ヘキサジエン−３−イン、ヘキサトリエン、ジビニルエーテル、ジビニルスルホンなど）やジアリル化合物（フタル酸アリル、２，６−ジアクリルフェノール、ジアリルカルビノール、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）など）を用いることができる。
本発明の測定方法では、フルクトシルアミンとイミダゾールを含む化合物とをメディエータの存在下で反応させるが、この反応はｐＨが６〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５，最も好ましくはｐＨ７近辺の溶液中で測定することが望ましい。溶液としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの緩衝液をＮａＯＨなどでｐＨ調整して使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液である。
ポリビニルイミダゾールを触媒とし、メディエータとしてフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）とジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いて基質としてフルクトシルバリンを用いたとき、時間とともにフルクトシルバリンが酸化され、ＰＭＳを介してＤＣＩＰが還元され退色していくことが観測される。このＤＣＩＰの退色の速度を指標にすることにより、図１に示すようにフルクトシルバリンの濃度を測定できる。すなわち、ポリビニルイミダゾールを触媒とし、メディエータとしてフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）とジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）の存在下で未知濃度のフルクトシルバリンを１ｍＭ以下の感度で定量できる。フルクトシルバリンを用いたときの本発明の測定原理は以下のように示される。
0004879441.tif 000003
本発明の測定方法では、さらに種々の人工電子メディエータを利用することができる。メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体などを用いることができる。またこれらのメディエータとポリマーに含浸して用いることも可能である。またこれらのメディエータをポリマー重合時に添加して混合することも可能である。さらにこれらのメディエータを含む共重合体を作成し、用いることもできる。例えば、ビニルフェロセンとビニルイミダゾールの共重合体である。
アッセイキット
別の観点においては、本発明は、フルクトサミンの測定キットを提供とする。本発明のフルクトサミン測定キットは、本発明に従うイミダゾールを含む化合物を備えた反応液を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、ポリビニルイミダゾールとｐＨ６．０〜１０に調整された緩衝液、適当なメディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトサミン（例えばフルクトシルバリン）もしくはその誘導体の標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うフルクトサミンアッセイキットは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましいアッセイキットはフルクトシルバリンアッセイキットである。別の好ましいアッセイキットはフルクトシル−ε−リジンアッセイキットである。
さらに別の観点においては、本発明はＨｂＡ１ｃアッセイキットを提供する。ＨｂＡ１ｃを酵素的または化学的に分解することにより種々のフルクトシルペプチドやフルクトシルバリンが生成し、これを本発明のフルクトシルバリンアッセイキットを用いて定量することによりＨｂＡ１ｃをアッセイすることができる。したがって、本発明のＨｂＡ１ｃアッセイキットは、上述のフルクトシルバリンアッセイキットにさらに加水分解試薬または蛋白質分解酵素を含む。
さらに別の観点においては、本発明は糖化アルブミンアッセイキットを提供する。糖化アルブミンを酵素的または化学的に分解することによりフルクトシルペプチドやフルクトシル−ε−リジンが生成し、これを本発明のフルクトシル−ε−リジンアッセイキットを用いて定量することにより糖化アルブミンをアッセイすることができる。したがって、本発明の糖化アルブミンアッセイキットは、上述のフルクトシル−ε−リジンアッセイキットにさらに加水分解試薬または蛋白質分解酵素を含む。
本発明のＨｂＡ１ｃアッセイキットおよび糖化アルブミンアッセイキットは糖尿病の診断用キットとして有用である。
センサー
別の観点においては、本発明は、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトサミン計測用センサーを特徴とする。本発明のセンサーを用いて、イミダゾールを含む化合物によって基質が酸化されたときにメディエータが還元され、還元されたメディエータを電極上で電気化学的に酸化し、得られた電流値を指標に基質の濃度を決定することができる。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の一般塩基触媒であるイミダゾールを含む化合物を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。
本発明の測定原理に従い、以下のようにフルクトサミン計測用センサーが構築できる。
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として一般塩基触媒を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、メディエータを含む緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。またこれらのメディエータをポリマーに含浸して用いることも可能である。またこれらのメディエータをポリマー重合時に添加して混合することも可能である。さらにこれらのメディエータを含む共重合体を作成し、用いることもできる。例えば、ビニルフェロセンとビニルイミダゾールの共重合体である。
さらにカーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわち、作用電極として一般塩基触媒およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエータを吸着あるいは共有結合法により高分子マトリックスに固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。
カーボンペースト電極としてはＢＡＳ社（アメリカ、インディアナ州）から市販されているものが利用できる。同社のカーボンペーストを同社のカーボン電極作成用の電極の穴に充填することにより、カーボンペースト電極が作成できる。このときに本発明で用いるポリビニルイミダゾールに代表されるイミダゾール触媒をカーボンペーストと混錬し同穴に充填することによりセンサーが構築できる。
いずれの電極を用いる場合にも、標準濃度のフルクトシルバリン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトシルバリン濃度を求めることができる。
ＨｂＡ１ｃ計測用センサーとして用いる場合は、上述のフルクトシルバリン計測用センサーに、さらに蛋白質分解酵素（例えばプロテアーゼ）を固定化した膜などを組み合わせて、複合センサーを構築する。このような、複数の酵素の組み合わせによる連続的反応を用いる複合センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｐ．Ｆ．Ｔｕｎｅｒ，Ｉｓａｏ  Ｋａｒｕｂｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒｏｇｅ  Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７に記載されている。
糖化アルブミン計測用センサーとして用いる場合は、上述のフルクトシル−ε−リジン計測用センサーに、さらに蛋白質分解酵素（例えばプロテアーゼ）を固定化した膜などを組み合わせて、複合センサーを構築する。
本発明のＨｂＡ１ｃ計測用センサーおよび糖化アルブミン計測用センサーは糖尿病の診断用センサーとして有用である。
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
１−ビニルイミダゾール３０ｍｍｏｌに重合開始剤として２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｖａｒｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）を０．６ｍｍｏｌ加え、アルゴン置換した後、４５℃で２４時間重合反応を行った。得られたポリマーを乳鉢にてすりつぶし、ふるいによって粒子径４０μｍのポリマーを調製した。
実施例２
実施例１で得られたポリマー１０ｍｇと２ｍＭ  ＰＭＳ，０．０６ｍＭ  ＤＣＩＰの存在下で、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０において、基質としてフルクトシルバリンを添加したときのＤＣＩＰに起因する６００ｎｍの吸光度の減少を計測した。その結果を図１に示す。このように本方法を用いて、フルクトシルバリンが０．５〜２０ｍＭの感度で測定できる。
実施例３
触媒として種々の濃度の１−ビニルイミダゾールと２ｍＭ  ＰＭＳ，６．０６ｍＭ  ＤＣＩＰの存在下で、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０において、基質として１０ｍＭのフルクトシルバリンを添加したときのＤＣＩＰに起因する６００ｎｍの吸光度の減少を計測した。その結果を図２に示す。このように１−ビニルイミダゾールの量とともに反応の速度が進行し、１−ビニルイミダゾールがフルクトシルバリン酸化の触媒として機能していることが示された。
実施例４
１−ビニルイミダゾールと架橋剤であるＥＧＤＭＡの比を１：１、１：３、１：５になるように混合し、（１−ビニルイミダゾール：ＥＧＤＭＡ＝２ｍｍｏｌ：２ｍｍｏｌ，１ｍｍｏｌ：３ｍｍｏｌ，１ｍｍｏｌ：５ｍｍｏｌ）重合開始剤として２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｖａｒｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）を加え（０．１２ｍｍｏｌ，０．１４ｍｍｏｌ，０．２２ｍｍｏｌ）メタノールに溶かし、アルゴン置換した後、４５℃で１２時間重合反応を行った。得られたポリマーを乳鉢にてすりつぶし、ふるいによって粒子径６０μｍのポリマーを調製した。
実施例５
カーボンペースト５０ｍｇに対して実施例１で作成したポリマーを２０ｍｇ混合し、カーボンペースト電極に充填した。この電極を１ｍＭ  １−メトキシフェナジンメトスルフェート（ｍ−ＰＭＳ）を含む１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ  ｐＨ７．４の溶液に浸漬し、印加電圧を１００ｍＶ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）とし、基質にフルクトシルバリンを添加したときの応答を観測した。そのときの応答を図３に示す。また、本センサーを用いて、フルクトシルバリンの測定を行った結果を図４に示す。
実施例６
カーボンペースト５０ｍｇに対して実施例３で作成したポリマーを２０ｍｇ混合し、カーボンペースト電極に充填した。この電極を１ｍＭｍ−ＰＭＳを含む１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ  ｐＨ７．４の溶液に浸漬し、印加電圧を１００ｍＶ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）とし、基質にフルクトシルバリンを添加したときの応答を観測した。また、本センサーを用いて、フルクトシルバリンの測定を行った結果を図５に示す。２０μＭ以下のフルクトシルバリンの定量が行えた。
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリビニルイミダゾールを混合したカーボンペースト電極を用いて、メディエータとして１−メトキシフェナジンメトスルフェート（ｍ−ＰＭＳ）とジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いて、ＤＣＩＰの退色速度を指標にｐＨ７．０の緩衝液中でフルクトシルバリンの濃度を計測した結果を示す。
図２は種々の濃度の１−ビニルイミダゾールを１０ｍＭフルクトシルバリンが存在する溶液に共存させ、ＰＭＳ，ＤＣＩＰの存在下でフルクトシルバリンの酸化の１−ビニルイミダゾール濃度依存性を検討した結果を示す。
図３は実施例１で作成したポリマーを用いたフルクトサミンセンサーのフルクトシルバリンに対する応答図を示す。
図４は実施例１で作成したポリマーを用いたフルクトサミンセンサーの応答のフルクトシルバリン濃度依存性を示す。
図５は実施例３で作成したポリマーを用いたフルクトサミンセンサーの応答のフルクトシルバリン濃度依存性を示す。