(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原虫病発病防御抗原を発現させた植物細胞、または該植物細胞を含む植物体を成分とする抗原虫病経口ワクチンであって、該原虫がロイコチトゾーン・カウレリーである経口ワクチン。
【請求項２】
請求項１の抗原虫病経口ワクチンを非ヒト動物に経口投与する工程を含む、該動物に原虫に対する免疫を賦与する方法であって、該原虫がロイコチトゾーン・カウレリーである方法。
【請求項３】
原虫病発病防御抗原を発現させた植物細胞、または該植物細胞を含む植物体の、抗原虫病経口ワクチン製造における使用であって、該原虫がロイコチトゾーン・カウレリーである使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体において発現させた原虫病発病防御抗原を用いる、抗原虫病経口ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏のロイコチトゾーン症は、住血胞子虫類であるロイコチトゾーン・カウレリー（Leucocytozon caulleryi）の感染によって引き起こされる疾病である。L.caulleryiは、最初、1909年ベトナムにおいて、鶏の血液中にマラリア顆粒を持たない円形のガメトサイト（生殖母体）として認められ、ロイコチトゾーン属の原虫としてそのように命名がなされたものである。【０００３】
わが国における鶏のロイコチトゾーン症は、1954年に兵庫県下で初めて確認され、その病原体は、L.caulleryiと同定され、その後、本原虫は吸血昆虫の一種である双翅目Dipteraのヌカカ科Ceratopogonidaeに属するニワトリヌカカCulicoides arakawae（以下ヌカカと略称する）によって生物学的に伝播されることが実験的に証明され、その生活環がほぼ明らかにされた。ロイコチトゾーン・カウレリーは、宿主の鶏の体内でのシゾゴニー（増員生殖）とガメトゴニー（生殖体形成生殖）、伝播者であるヌカカの体内でのスポロゴニー（胞子形成生殖）の３つの発育期を持っている。【０００４】
本原虫に感染したヌカカの吸血の際にその唾液と共に鶏の体内に侵入したスポロゾイト（種虫）は、主として肺、肝、脾、腎などの血管内皮系の細胞に寄生して第１代シゾント（分裂体）を形成する。感染後５〜７日目にはそれより第１代メロゾイト（分裂小体）が血液中に放出され、それらは全身に分布する血管内皮系細胞に再び侵入して第２代シゾントとして増殖し、後期には宿主細胞から離れて細胞間隙でさらに発育する。14日目にはこれらシゾントから第２代メロゾイトが血液中に放出され、次いでそれらは赤血球細胞に侵入して発育、18〜19日目には宿主細胞から遊離してそれぞれマクロガメトサイト（雌性生殖母体）、ミクロガメトサイト（雄性生殖母体）として成熟する。【０００５】
両ガメトサイトはヌカカの吸血時に鶏の血液と共にその中腸内に取り込まれ、マクロガメート（雌性生殖体）とミクロガメート（雄性生殖体）を形成して融合（受精）し、チゴート（融合体）を経てオオキネート（虫葉体）となり、虫腸壁の細胞間隙に侵入し、次いでその外膜下に移行してオオシスト（胞のう体）に発育する。オオシストの内部には数十個のスポロゾイトが形成され、それらはオオシスト壁の崩壊に伴ってヌカカの対腔に出た後の唾液腺に移動してその発育環を完了する。【０００６】
本原虫感染による鶏の症状と病変は、主として第２代シゾントが発育するシゾゴニーの末期と第２代メロゾイトが赤血球系細胞に寄生してガメトサイトに発育する過程のガメトゴニーの時期に認められる。本症の最も特徴的な各臓器及び組織の出血病変と貧血症状は、第２代シゾントによる血管栓塞に伴う出血とガメトゴニーの原虫の寄生によって赤血球が破壊されるために引き起こされるものと考えられている。【０００７】
本原虫の媒介体であるヌカカは、水田などに生息するため水田を有する東南アジア、中国、北朝鮮、韓国が流行地と認められている。わが国においても初めてロイコチトゾーン症が確認されて以来、毎年夏期にその流行が繰り返され、鶏の生産性に対して多くの損失を与えてきたが、1964年以降にはピリメタミンが、1968年からはピリメタミンとサルファ剤の合剤が本症の予防薬として飼料に添加されるようになってからはその発生は激減した。しかしその後、原虫のこのような薬剤に対する耐性の獲得や薬剤の残留性の問題から、有効薬剤の使用期間が限定されたこと、また一部有効薬剤が安全性の問題により、その使用が禁止になったこと等によりその防圧は困難なものとなってきており、被害も恒常的なものになってきている。【０００８】
鶏ロイコチトゾーン症に対し従来試作されていたワクチンには、スポロゾイトを用いた生ワクチンと虫体由来物質を抗原とする不活化ワクチン、さらには原虫感染した鶏の臓器乳剤を材料とした不活化ワクチンがある。スポロゾイトを用いた生ワクチンはヌカカの唾液腺よりスポロゾイトを分離し、その少数で鶏を免疫するものである〔非特許文献１参照〕。また虫体由来物質を抗原とした不活化ワクチンは次のようなものである。【０００９】
虫体由来抗原には鶏体及び発育鶏卵由来の第１代シゾント、第１代メロゾイト、第２代シゾント、第２代メロゾイトならびに可溶性抗原などがあるが、この中スポロゾイト接種後10〜15日目に感染鶏の血清中に検出される可溶性の抗原は第２代シゾントと抗原性状がほぼ同じで、それと同様に比較的強い免疫原性が認められている。そこで、この血清抗原材料をホルマリンで不活化して試作したワクチンで、その有用性が認められている〔非特許文献２参照〕。【００１０】
更に臓器乳剤不活化ワクチンは、上述のような原虫抗原を大量に得る困難さを改善するためになされたもので、スポロゾイト接種後13日目の感染鶏より胸腺、肺、肝、脾、腎、Ｆ嚢を採取して臓器乳剤とし、これをホルマリンで不活化した材料でワクチンを試作するものであり、やはりその効果が認められている〔非特許文献３参照〕。【００１１】
また、安定かつ大量のワクチン供給を可能とするために、本発明者らにより、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性蛋白質を発現させた遺伝子組換え微生物を利用したワクチンが提供されている〔特許文献１参照〕。【００１２】
しかしながら、これまでのワクチンは、いずれも注射による投与を前提としており、そのコストと不便さから、利用が制限されるという問題がある。
【特許文献１】特許第3582663号公報
【非特許文献１】椎原ら、静岡県養鶏試験場研究報告、13:25-27(1978)
【非特許文献２】Isobe and Suzuki,Jpn,J.Parasitol.,37:214-219(1988)
【非特許文献３】Morii,T.et al.,J.Parasitol.Res.,76:630-632(1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、安価で、かつ簡便に投与しうる抗原虫病ワクチンを提供することにある。より詳しくは、本発明は、植物体において発現させた原虫病発病防御抗原を用いる、抗原虫病経口ワクチンの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために、形質転換植物体を利用した抗原虫病経口ワクチンの開発を試みた。具体的には、抗原遺伝子として、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性タンパク質遺伝子R7（特開H07-284392、特許第3582663号公報）を選択し、この遺伝子を発現するベクターを、アグロバクテリウムを介して、ジャガイモ塊茎に導入し、この塊茎から再生個体を作製した。次いで、形質転換個体の葉を乾燥させ、鶏用配合飼料と混合して、大腸菌由来のロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性R7タンパク質で既にワクチン接種されている鶏に対し、経口投与を行なった。その結果、経口投与により、鶏の抗体価を上昇させることに成功した。抗体価の上昇は、特に、試験開始時に、高いレベルの抗体価を有していた個体ほど顕著であった。同様の手法を他の原虫防御抗原に適用することが可能である。【００１５】
即ち、本発明は、植物体において発現させた原虫病発病防御抗原を用いる抗原虫病経口ワクチン並びにその製造及び利用に関するものであり、より詳しくは、以下の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。
〔１〕植物細胞で転写可能なプロモーターの下流に機能的に結合された原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子を含むベクター。
〔２〕原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子が導入された形質転換植物細胞。
〔３〕〔２〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔４〕〔３〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔５〕〔３〕または〔４〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔６〕原虫病発病防御抗原を含む、〔３〕若しくは〔４〕に記載の形質転換体またはその繁殖材料の処理物または抽出物。
〔７〕〔２〕に記載の形質転換植物細胞、〔３〕若しくは〔４〕に記載の形質転換植物体、または〔５〕に記載の繁殖材料から原虫病発病防御抗原を単離する工程を含む、原虫病発病防御抗原の製造方法。
〔８〕〔２〕に記載の形質転換植物細胞、〔３〕若しくは〔４〕に記載の形質転換植物体、〔５〕に記載の繁殖材料、〔６〕に記載の処理物若しくは抽出物、または〔７〕に記載の方法により得られた原虫病発病防御抗原を動物に経口投与する工程を含む、該動物に原虫に対する免疫を賦与する方法。
〔９〕〔２〕に記載の形質転換植物細胞、〔３〕若しくは〔４〕に記載の形質転換植物体、〔５〕に記載の繁殖材料、〔６〕に記載の処理物若しくは抽出物、または〔７〕に記載の方法により得られた原虫病発病防御抗原を含む、抗原虫病経口ワクチン。
〔１０〕〔２〕に記載の形質転換植物細胞、〔３〕若しくは〔４〕に記載の形質転換植物体、〔５〕に記載の繁殖材料、〔６〕に記載の処理物若しくは抽出物、または〔７〕に記載の方法により得られた原虫病発病防御抗原の、抗原虫病経口ワクチンの製造における使用。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子を導入した遺伝子組換えジャガイモ並びに非遺伝子組換えジャガイモにおけるELISAの結果を示す図である。
【図２】ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子を導入した遺伝子組換えジャガイモにおけるジェノミックPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図３】ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子を導入した遺伝子組換えジャガイモを経口摂取した注射免疫歴のあるニワトリにおける、血中抗体の再誘導を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子が導入された形質転換植物細胞を提供する。【００１８】
原虫病とは、生体への、単細胞の真核生物である原虫の寄生によって生じる疾病である。1975年にWHOは、その防除対策が急務であると定めた６大熱帯病、即ちマラリア、トリパノゾーマ病、リーシュマニア病、フィラリア症、住血吸虫症、らい病を挙げているが、このうちの３疾病は原虫病であり、人獣を問わず多くの原虫病が猛威を振るっている。【００１９】
このうちコクシジウム亜網住血胞子虫亜目に属する原虫による感染症としては、ロイコチトゾーン・カウレリーの感染によって引き起こされるロイコチトゾーン症、プラスモディウム属原虫の感染によって引き起こされるマラリア（熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、四日熱マラリア、卵形マラリア）等が例示できる。また、肉質鞭毛虫門に属する住血原虫による感染症としてはリーシュマニア症、トリパノゾーマ病等が、ピロプラズマ亜網に属する住血原虫による感染症としてはバベシア症、タイレリア症等が例示できる。【００２０】
「原虫病発病防御抗原」とは、このような原虫病の発病を防御する抗原である。例えば、ロイコチトゾーン症に対しては、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来のR7抗原（アミノ酸配列／配列番号：１、塩基配列／配列番号：２参照）が、マラリアに対しては、AMA-1(apical membrane antigen 1)抗原（Cheng,Q. and Saul,T.,Mol.Biochem.Parasitol.,65:183-187(1994)参照）、CSP(circum sporozoite protein)抗原（Haeseleer,F.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.,57:117-126(1993)参照）、LSA-1(liver stage specific antigen-1)抗原（Yang,C.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.,71:291-294(1995)参照）、MSP-1(merozoite surface protein-1)抗原（Ranford-Cartwright,LC.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.,46:185-187(1991)参照）、PfEMP1(Plasmodium falciparum infected erythrocyte membrane protein 1)抗原（Ward,CP.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.,102:167-177(1999)参照）、SERA(serine repeat antigen)抗原（Li,WB.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.,33:13-25(1989)参照）、TRAP(thrombospondin related adhesion protein)抗原（Trottein,F.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.,74:129-141(1995)参照）が挙げられるが、本発明の原虫病発病防御抗原はこれらに限定されない。また、これらの防御抗原には遺伝子配列やアミノ酸配列が変化している変異体防御抗原が含まれる。自然または人工的に作出された変異体防御抗原も含まれる。【００２１】
本発明の形質転換植物細胞の由来する植物としては、経口投与に適している限り、特に制限はなく、例えば、ジャガイモ、トマト、ダイズおよび小豆等の豆類、イネ、コムギおよびトウモロコシ等の穀類、イチゴ等の果実類ならびに牧草類などが挙げられる。【００２２】
本発明の形質転換植物細胞は、原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入し、発現させることで作製できる。植物細胞における遺伝子発現に用いるベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーターと転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などが挙げられる。植物細胞で転写可能なプロモーターとしては、例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを用いることが可能である。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol.Biol. 23:567）などが挙げられる。これらプロモーターに機能的に結合した原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入することにより、植物細胞内で原虫病発病防御抗原を発現させることができる。ここで「機能的に結合」とは、植物細胞内で原虫病発病防御抗原が発現するように、プロモーターと原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子とが結合していることを意味する。本発明は、このような原虫病発病防御抗原を組み込まれた形質転換植物細胞を製造するためのベクターをも提供するものである。【００２３】
形質転換される「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。【００２４】
植物細胞へのベクターの導入は、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。【００２５】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、ジャガイモであればVisserらの方法（Theor.Appl.Genet 78:594 (1989)）、チユーバーディスク法によって植物体を再生させる方法など、イネ等の単子葉穀類であればHieiらの方法（Hiei Y, Komari T, Kubo T :Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol 1997  35:1-2 205-18）、Ishidaらの方法（Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T :High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol 1996 Jun 14:6 745-50）、エレクトロポレーション法（Shimamoto,K., Terada, R., Izawa, T.et al. :Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature 338,274-276(1989)）など、イチゴであればAsaoらの方法（Asao,H.,Y.Nishizawa,S.Arai,T.Sato,M.Hirai,K.yoshida,A.Shinmyo and T.Hibi. :Enhanced resistance against a fungal pathogen Sphaerotheca humuli in transgenic strawberry expressing a rice chitinase gene. Plant Biotechnology.14(3):145-149(1997)）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。【００２６】
一旦、ゲノム（染色体）内に原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の形質転換植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。【００２７】
経口投与ワクチンとしては、このようにして作出された形質転換植物細胞、形質転換植物体、あるいはその繁殖材料を直接用いることも可能であるが、原虫病発病防御抗原を含むそれらの処理物若しくは抽出物を用いることも可能である。ここで「処理物」とは、形質転換植物細胞、形質転換植物体、あるいはその繁殖材料をワクチン投与に適した形態に処理した物を意味し、例えば、形質転換ジャガイモであれば、その葉を凍結乾燥処理したものを例示することができる。また、「抽出物」とは、形質転換植物細胞、形質転換植物体、あるいはその繁殖材料から原虫病発病防御抗原を含む成分を抽出した物を意味し、粗精製物および精製物も含まれる。形質転換植物細胞、形質転換植物体、あるいはその繁殖材料から原虫病発病防御抗原を単離（精製）するには、塩析法、限外濾過法ならびにイオン交換クロマトグラフィー及びゲルクロマトグラフィー等の一般的な蛋白質の精製法を用いることができる。【００２８】
本発明は、このような原虫病発病防御抗原を単離する工程を含む、原虫病発病防御抗原の製造方法をも提供する。【００２９】
また、本発明は、上記形質転換植物細胞、形質転換植物体、繁殖材料、それらの処理物若しくは抽出物、または上記方法により単離された原虫病発病防御抗原を動物に経口投与する工程を含む、該動物に原虫に対する免疫を賦与する方法も提供する。【００３０】
本発明において原虫病発病防御抗原の投与対象となる動物としては、例えば、原虫病がロイコチトゾーン症であれば鳥類が、マラリアであればヒト及びサル並びに鳥類が例示される。また、リーシュマニア症であればヒト、イヌが、トリパノゾーマ病であればヒト、ウシ、ウマが、バベシア症であればイヌ、ネコ、ウシ、ウマが、タイレリア症であればウシが例示される。【００３１】
本発明の原虫病発病防御抗原遺伝子が組み込まれた植物体を経口的に投与する場合、上記形質転換植物細胞、形質転換植物体、繁殖材料、それらの処理物若しくは抽出物、または単離された原虫病発病防御抗原自体を投与することも可能であるが、他の成分を配合して投与してもよい。他の成分としては、粘膜免疫アジュバント物質（コレラトキシン、サイトカイン等）、投与対象の動物の飼料、嗜好性を向上させるための添加剤（ラクトース等）との併用を例示することができる。【００３２】
投与量は投与対象動物によっても異なるが、例えば、鶏においては、原虫病発病防御抗原遺伝子が組み込まれた植物体を通常の餌に混合して、１日あたり2g〜5g摂取させることが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重に換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができるが、これらの量に限定されない。好適な投与量は、防御抗原発現量や至適抗体産生、配合飼料の性質などを考慮して決定することができる。【００３３】
本発明の経口ワクチンは、既にワクチン投与（例えば、注射による投与）により抗体価が高められた個体に投与することも可能であり、これにより該個体の抗体価をさらに高めることができる。例えば、本実施例においては、大腸菌で発現させた抗原を既に接種され、高いレベルの抗体価を有している個体（3200倍希釈した血清のELISA吸光度値で0.4以上、好ましくは0.7以上の個体）に経口投与することにより、顕著な抗体価の上昇を確認できた。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００３５】
[実施例１]  ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性タンパク質をコードするR7遺伝子の植物体発現用プラスミドへの移入
ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性タンパク質遺伝子R7（特開H07-284392、特許第3582663号公報）を含むpTH-R7プラスミドベクターを制限酵素SmaI及びSacIを用いて切断し、得られたR7遺伝子DNA断片（配列番号1及び2）を、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ノパリンシンターゼターミネーターを持つプラスミドベクターpBI121（Clontech社製）を制限酵素SmaI及びSacIを用いて切断した部位にクローニングして、本発明発現ベクターであるpBI-R7を得た。【００３６】
[実施例２]  ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子のジャガイモへの導入と発現
１.  アグロバクテリウムへのロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子の導入
上記[実施例１]のようにして得られた、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子発現プラスミドpBI-R7を、凍結溶解による直接導入法によって、Agrobacterium tumefaciens LBA 4404（Clontech社製）に導入した。【００３７】
即ち、Agrobacterium tumefaciens LBA 4404を、50mLのLB液体培地中（1％ Bacto torypton , 0.5％ Yeast extracts , 1％ 塩化ナトリウム）で、A600の吸光値が、約1.0になるまで28℃で振とう培養した。氷上で冷却後、4℃で3000gの遠心分離（Kubota RA-6を用いた）を行い、集菌後、1mLの氷冷した20mMの塩化カルシウム溶液に浮遊させた。これを、0.1mL毎にエッペンドルフチューブに分注した。【００３８】
これに組換えプラスミドpBI-R7を1μg加え、液体窒素中で急速に凍結した。次に、得られた凍結細胞を、37℃で溶解した後、5分間静置した。これに、1mLのLB培地を加え、28℃で2〜4時間振とう培養した。約10000gで1分間遠心分離（Kubota KM-15200を用いた）して集菌し、0.1mLのLB培地に浮遊させた後、リファンピシン（100μg／mL）、カナマイシン（25μg／mL）及びストレプトマイシン（300μg／mL）を含むLB固形培地に広げた後、2〜3日間、28℃で培養して、pBI-R7が組み込まれた形質転換菌を得た。【００３９】
上記で得られた形質転換されたAgrobacterium tumefaciens LBA4404は、LB液体培地で28℃で振とう培養後、4℃で3000gの遠心分離（Kubota RA-6を用いた）を行い、集菌し、MS培地〔Physiol. Plant.15:473(1962)〕中に浮遊させ、これを植物の形質転換操作に用いた。【００４０】
２.  アグロバクテリウム法によるジャガイモへの導入
ジャガイモへのロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子の導入は、上記において作出したアグロバクテリウムとチユーバーディスク法により行った。【００４１】
すなわち、ジャガイモ塊茎の皮を剥き、1％次亜塩素酸ナトリウム溶液で15分間殺菌し、滅菌蒸留水で6回洗浄した。この塊茎から、殺菌したコルクボーラーで直径1cmの円柱状にくり抜き、さらに2〜3mm厚の平板状にスライスした。このディスクを、上記１.で作出したpBI-R7を保有するAgrobacterium tumefaciens LBA4404のMS液体培地懸濁液に15分間浸した。この後、MS培地〔3％蔗糖、0.1μg／mLインドール酢酸、0.1μg／mLジベレリン、0.1μg／mLアブシジン酸、2μg／mLゼアチンリボシドを含む（pH5.9）〕上で、28℃で3日間培養後、抗生物質カナマイシン100μg／mL及びカーベニシリン500μg／mL（いずれもシグマ社製）を含むMS液体培地でディスクを洗浄した。【００４２】
洗浄後のディスクは、上記抗生物質を含むMS固形培地（3％蔗糖を含む）上で、25℃で2週間毎に継代培養した（16時間照明、8時間暗期）。培養4〜8週目にディスク表面上にカルスが形成され、さらに継代培養することによりシュートが誘導された。【００４３】
このシュートを根本から切り取り、ホルモンを含まないMS固形培地〔3％蔗糖、カナマイシン100μg／mL、カーベニシリン500μg／mLを含む（pH5.9）〕上に移植し、培養した。2〜4週間後に発根してきた植物体は、培養土をいれたポット（径10cm）に移植し、人工気象器の中で栽培した。【００４４】
３.  再分化植物体におけるロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子の導入確認及び遺伝子の発現確認
(1)ELISAによるロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子発現の確認
再分化したジャガイモの葉を、生量の3倍量のPBS-T緩衝液〔135mM塩化ナトリウム、1.5mMリン酸二水素ナトリウム、2.7mMリン酸水素二ナトリウム、0.05％（v／v）Tween20、pH7.2〕で磨砕後、3000gで15分間の遠心分離（Kubota KS-5000を用いた）により得られた上清を粗汁液とした。【００４５】
0.05Mの炭酸ナトリウム緩衝液〔1リットル中、炭酸二ナトリウム1.59g、炭酸水素ナトリウム2.93g、（pH9.6）〕で、2μg／mL濃度に希釈した抗ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾントモノクローナル抗体〔Gotanda, T. et al., J. Vet. Med. Sci. 64(3):281-283 (2002)〕を、96穴ELISAプレート（IWAKI社製）に分注し、4℃で一晩放置してコーティングした。【００４６】
コーティングしたプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミンが最終濃度3％（w／v）となるようPBS-T緩衝液に加えたブロッキング液をプレートに分注し、37℃で1時間静置して、ブロッキング処理した。【００４７】
ブロッキング処理後、PBS-T緩衝液で洗浄し、その後、葉の粗汁液をプレートに添加し、37℃で1時間静置して、抗体と反応させた。このプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミンが最終濃度0.3％（w／v）となるようPBS-T緩衝液に加えた抗体希釈用液で4000倍希釈したHRPO標識抗ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾントモノクローナル抗体〔Ito, A. et al., J. Vet. Med. Sci. 64(5):405-411 (2002)〕をプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。このプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、基質溶液（1L中にリン酸水素二ナトリウム14.6g、クエン酸一水和物10.2g、O-フェニレンジアミン1g、過酸化水素水1mLを含む）をプレートに添加して、37℃で15分間暗所で静置し反応させた。反応は停止液（5N硫酸水溶液）で停止後、A492の吸光度値をマイクロプレートリーダー（Corona MTP-120を用いた）で測定した。その結果、幾つかの再分化ジャガイモ個体で、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7タンパク質が発現していることが明らかになった（図１参照のこと）。【００４８】
(2)ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子のジャガイモ体内への遺伝子導入の確認
ELISAで反応の認められた、幾つかの個体の葉を、液体窒素存在下で乳鉢を用いてパウダー状に磨砕した。これに試薬RED Extract-N-Amp Plant PCR Kit（SIGMA社製）をその説明書の記載に従って用い、前述のジャガイモの葉の全DNAの抽出、並びにR7遺伝子を特異的に増幅するプライマーR7f（5'-GGAAATGTGTCCTTAACTTC-3'：配列番号3）とプライマーR7r（5'-CTTCTTCTTCATTACTTTTTC-3'：配列番号4）を用いて、ジェノミックPCRを行った。反応後の試料の一部を、1.2％アガロースゲル電気泳動した結果、R7遺伝子と同一位置にバンドが確認され、これらのジャガイモ体内の染色体上に、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子が導入されていることが確認された（図２の電気泳動写真参照のこと：図中、矢印は、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子のバンドの位置を示す）。【００４９】
[実施例３]  ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子導入ジャガイモの抗原性の確認
ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来R7遺伝子を導入したジャガイモの葉を、乾燥重量として生重量の約1／12になるまで凍結乾燥（共和真空技術株式会社製RLE-204を用いて48時間工程で実施）した。乾燥した葉を、パウダー状に磨砕後、鶏用配合飼料（船橋農場製）と混合して、経口投与材料とした。【００５０】
経口投与試験に供試したSPF鶏（日生研株式会社製）は、現在野外で広く使われている鶏ロイコチトゾーン病ワクチン〔ワクチン抗原成分として大腸菌で発現させたロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来のR7タンパク質を用いている（特開H07-284392）〕を注射されて17週目の雌鶏3羽を用いた。経口投与材料は、給餌総量として1日1羽当り60g（このうち、4gが凍結乾燥したR7遺伝子導入ジャガイモの葉とした）給餌し、5日間連続で経口投与（自発的に摂食させた）した。R7遺伝子導入ジャガイモの葉を含む給餌が終了した後は、1日1羽当り60gの鶏用配合飼料（船橋農場製）を与えた。なお、通常の鶏用配合飼料のみを1日1羽当り60g、試験開始より投与した対照鶏1羽を設定した。経口投与材料の給餌時より、随時対照鶏を含む全試験鶏の翼下静脈より血液を採取し、遠心分離により血清を得た。これらの血清を用いて、下記に示すELISA法で抗体検査を実施した。【００５１】
0.05Mの炭酸ナトリウム緩衝液〔1リットル中、炭酸二ナトリウム1.59g、炭酸水素ナトリウム2.93g（pH9.6）〕で、0.1μg／mL濃度に希釈したロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント超音波処理可溶化抗原〔Ito, A. et al., J. Vet. Med. Sci. 64(5):405-411 (2002)〕を、96穴ELISAプレート（IWAKI社製）に分注し、4℃で一晩放置してコーティングした。【００５２】
コーティングしたプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミンが最終濃度3％（w／v）となるようPBS-T緩衝液に加えたブロッキング液をプレートに分注し、37℃で1時間静置して、ブロッキング処理した。【００５３】
ブロッキング処理後、PBS-T緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミンが最終濃度0.3％（w／v）となるようPBS-T緩衝液に加えた抗体希釈用液で、100倍から51,200倍まで2倍階段希釈した血清をプレートに分注し、37℃で1時間静置して、抗体と反応させた。このプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、抗体希釈用液で12,000倍希釈したHRPO標識抗ニワトリIgG（ZYMED社製のものを用いた）をプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。このプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、基質溶液（1L中にリン酸水素二ナトリウム14.6g、クエン酸一水和物10.2g、O-フェニレンジアミン1g、過酸化水素水1mLを含む）をプレートに添加して、37℃で15分間暗所で静置し反応させた。反応は停止液（5N硫酸水溶液）で停止後、A492の吸光度値をマイクロプレートリーダー（Corona MTP-120を用いた）で測定した。【００５４】
この試験の結果を図３に示す。図３より、供試した全ての鶏で、R7遺伝子導入ジャガイモの葉を経口投与後、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾントに対する抗体の再誘導が確認された。特に、試験開始時に高いレベルの抗体価を保有していた個体ほど、その上昇は顕著であった。
【産業上の利用の可能性】
【００５５】
本発明により、（１）原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子を含む植物細胞用発現ベクター、（２）原虫病発病防御抗原をコードする遺伝子が導入された形質転換植物細胞、（３）該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体およびその子孫またはクローンである形質転換植物体、（４）該形質転換植物体の繁殖材料、（５）該形質転換体またはその繁殖材料の処理物または抽出物、（６）該形質転換植物細胞、該形質転換植物体、または該繁殖材料から原虫病発病防御抗原を単離する工程を含む、原虫病発病防御抗原の製造方法、並びに（７）上記の形質転換植物細胞、形質転換植物体、繁殖材料、若しくはそれらの処理物若しくは抽出物、または上記方法により得られた原虫病発病防御抗原を動物に経口投与する工程を含む、該動物に原虫に対する免疫を賦与する方法、が提供される。これにより、コストパフォーマンスに優れ、簡便に投与できる抗原虫病ワクチンを開発することが可能となった。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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