(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質中のチウラムの検出方法であって、
（１）YCR102C、YGL184C、YFL057C、YHR139C、YKL071WおよびYPL171Cの酵母遺伝子の６種のプロモーターを含むポリヌクレオチドにGreen Fluorescence Protein（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを作動可能に各々連結した６種のベクターで各々形質転換した６種の酵母を培養し；
（２）（１）の形質転換酵母を被験物質と各々接触させてさらに培養し；
（３）YLL057CおよびYMR004Wの酵母遺伝子の２種のプロモーターを含むポリヌクレオチドにＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを作動可能に各々連結した２種のベクターで各々形質転換した２種の酵母を培養し；
（４）（３）の形質転換酵母を被験物質と各々接触させてさらに培養し；
（５）（２）および（４）における酵母のＧＦＰをコードするｍＲＮＡの発現量を測定し、
（６）（２）および（４）における（被験物質存在下における発現ｍＲＮＡ量）／（被験物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量）を測定し；ついで
（７）（２）におけるすべての酵母からのＧＦＰをコードする発現ｍＲＮＡ比が４６.１倍以上であり、かつ、（４）におけるすべての酵母からのＧＦＰをコードする発現ｍＲＮＡ比が３.４倍以下である場合に、被験物質中にチウラムが存在すると判定する
ことを特徴とする被験物質中のチウラムの検出方法。
【請求項２】
該発現ｍＲＮＡ量をノザンブロッティングによって測定する請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
該発現ｍＲＮＡ量を逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した発現ＤＮＡ量によって測定する請求項１記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的方法を用いた毒性化合物の検出方法に関する。本発明はまた該検出方法に用いるポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
環境庁により昭和４９年から平成１０年度までの２４年間にわたり毎年行われている化学物質環境追跡調査結果によれば、今まで調査した７７５種類の化学物質のうち、約４０％の物質が環境中に放出されている。一方、わが国において現在、工業的に生産されている化学物質は約５万種類とされ、その生産量、種類は年々増加している。また、塩素による水処理、焼却処理等により非意図的に生成された化学物質が環境を汚染することが知られている。これらの事実から、環境中に蓄積されている化学物質は多数あると予測されるが、これら全てを個々に調査することはきわめて困難である。
【０００３】
従来のバイオアッセイ（生物材料を用いてその応答性から有害性を評価する手法）は主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としており、環境中の化学物質による毒性の評価はできるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因するかを判断することはできない。亜硝酸生成細菌または硝酸精製細菌の活性により評価する方法（特開平06-123705号公報、特開2000-206087号号公報）、鉄バクテリアの活性により評価する方法（特開平11-37969号公報）が提案されており、水質安全モニタ（富士電機）のような製品が販売されている。また、国外では、発光微生物の発光強度により評価する製品（MICROTOX、azur社、アメリカ；LUMIS、drlange社、ドイツ）が市販されている。しかし、これらはいずれも従来型のバイオアッセイ法の延長であり、毒性化学物質に関する詳細な情報は得られない。
【０００４】
わが国の化学物質のリスク管理は、新たな汚染が見出されるたびに化学物質の見直しが行われ、さらに規制と自主規制を組み合わせる体制の整備がすすめられている。しかし、トリハロメタンやダイオキシンに代表されるような有害化学物質の非意図的生成および環境放出など、複雑化、多様化する現状に即座に対応する体制は整っていない。また、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」における毒性評価法である動物実験はコストや時間がかかり国際的に受け入れ難くなっている。このように、管理体制についての問題は常に議論されるが、それを解決する具体的な手段が無いことから課題の解決には至っていない。従って、環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は毒性物質が特定の酵母遺伝子のプロモーターを活性化し、該プロモーターに作動可能に連結したマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドからｍＲＮＡの転写を誘導することを発見して本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち本発明は先ず、以下の群から選択される酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドに関する。
【０００７】
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、YGL059W、YNL144C、YOR003W、YAL037W、YAR023C、YBR003W、YBR020W、YBR044C、YBR091C、YBR185C、YBR282W、YCR015C、YCR038C、YCR043C、YDL119C、YDL146W、YDL220C、YDR057W、YDR123C、YDR125C、YDR222W、YDR225W、YDR277C、YDR286C、YDR347W、YDR408C、YDR438W、YDR479C、YDR483W、YEL039C、YEL057C、YEL073C、YER066W、YER076C、YER084W、YER121W、YER189W、YFL017C、YFL046W、YFR006W、YFR008W、YGL115W、YGL208W、YGL214W、YGL218W、YGR021W、YGR023W、YGR024C、YGR064W、YGR076C、YGR096W、YGR108W、YGR174C、YGR182C、YGR236C、YGR288W、YHL042W、YHR195W、YHR210C、YIL006W、YIL012W、YIL028W、YIL050W、YIL057C、YIL089W、YIL102C、YIL113W、YIL122W、YJL100W、YJL169W、YJL199C、YJR039W、YJR050W、YJR101W、YKL003C、YKL016C、YKL061W、YKL093W、YKL121W、YKL160W、YKL170W、YKL194C、YKR034W、YKR067W、YLR006C、YLR016C、YLR030W、YLR036C、YLR112W、YLR125W、YLR128W、YLR204W、YLR211C、YLR233C、YLR257W、YLR288C、YLR326W、YLR334C、YLR395C、YLR408C、YLR414C、YLR444C、YML050W、YML107C、YML120C、YMR031C、YMR053C、YMR073C、YMR162C、YMR204C、YMR206W、YMR284W、YNL010W、YNL025C、YNL127W、YNL139C、YNL217W、YOL116W、YOL118C、YOR053W、YOR100C、YOR103C、YOR122C、YOR150W、YOR187W、YOR251C、YOR312C、YOR327C、YOR348C、YOR352W、YOR388C、YOR394W、YPL001W、YPL033C、YPL066W、YPL148C、YPL230W、YPL275W、YPL276W、YPR005C、YPR014C、YPR192W、YPR194C、YBR005W、YER025W、YFL027C、YGL080W、YGL205W、YHL028W、YHR185C、YIL076W、YJL166W、YLR046C、YMR035W、YMR238W、YMR252C、YNL192W、YNL202W、YOL108C、YOR385W、YPR165W、YAR033W、YBL038W、YBR009C、YBR010W、YBR151W、YCL067C、YCR096C、YDL137W、YDL192W、YDR073W、YDR086C、YDR224C、YDR377W、YDR378C、YER015W、YGL187C、YHR162W、YJL167W、YJL216C、YKR009C、YLR165C、YMR197C、YNL157W、YOL002C、YOL109W、YOR180C、YPL010W、YPL233W、YBR036C、YDR297W、YGR149W、YGR224W、YNL043C、YPL067C、YPL170W、YCR046C、YDR387C、YFL050C、YGL051W、YHR132C、YIL112W、YJL141C、YKR098C、YLR052W、YLR206W、YML129C、YNL203C、YNR014W、YOL043C、YOL096C、YPR184W、YAL028W、YAL055W、YAR062W、YBL095W、YBL102W、YBR122C、YBR157C、YBR161W、YBR251W、YBR298C、YCR039C、YCR083W、YDL018C、YDL067C、YDL078C、YDL091C、YDL215C、YDL216C、YDR022C、YDR067C、YDR079W、YDR181C、YDR186C、YDR196C、YDR262W、YDR306C、YDR319C、YER188W、YGL004C、YGL035C、YGR036C、YGR062C、YGR120C、YGR131W、YGR141W、YGR167W、YGR287C、YHL024W、YHR080C、YHR097C、YIL077C、YJL046W、YJL070C、YJL096W、YJL113W、YJL146W、YJL180C、YJR019C、YJR049C、YKR058W、YLL005C、YLR078C、YLR151C、YLR271W、YLR295C、YLR351C、YLR375W、YMR023C、YMR025W、YMR135C、YMR210W、YMR267W、YMR278W、YMR293C、YNL073W、YNR037C、YNR040W、YNR072W、YOR028C、YOR316C、YOR328W、YOR363C、YPL039W、YPL040C、YPL099C、YPL107W、YPL134C、YPL138C、YPL140C。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
これら酵母遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列は公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されており、インターネットを介して知ることができる。また、プロモーター配列についても公共のデータベース（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae）に開示されている。
【０００９】
上記酵母遺伝子のプロモーターばかりでなく、上記酵母遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子のプロモーターも使用できる。ここに「酵母遺伝子に相同性を有する遺伝子」とは、酵母遺伝子の塩基配列に５０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子であって、該酵母遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を言う。
【００１０】
上記遺伝子のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結してポリヌクレオチド構築物を得る。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は当業者によく知られている（例えばR.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp138-165, pp.234-263, 2000を参照）。
【００１１】
マーカータンパク質の例としてはGFP（Green  Fluorescence  Protein）（Heim, R., Cubitt, A. B. and Tsien, R. Y.（1995） Nature 373, 663-664；Heim, R., Prasher DC. and Tsien, R. Y.（1994） Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504；Warg, S. and Hazerigg, T.（1994）Nature 639, 400-403；Youvan, D.C. and Michel-Beyerle, M.E.（1996）Nature Biotechnology 14 1219-1220；Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. and Prasher, D.C.（1994）Science 263, 802-805）、β-ガラクトシダーゼ（Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211(3):154-6）、ルシフェラーゼ（Arch Toxicol 2002 Jun;76(5-6):257-61、Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.)、及びアセチルトランスフェラーゼ（J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb;21(1):71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors.  Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M.)を挙げることができる。
【００１２】
本発明は上記ポリヌクレオチド構築物を含むベクターにも関する。
酵母遺伝子のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドは、公共のデータベースから知られる上記酵母遺伝子の塩基配列を基に、必要と思われる部分を複写するプライマーを設計し、酵母ゲノムDNAをテンプレートとしてＰＣＲ法で増幅することによって得る。また、目的とする細胞において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質の塩基配列を挿入する。先に作成したプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを、マーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより、目的とするベクターが得られる。
【００１３】
本発明は上記ベクターで形質転換した宿主細胞にも関する。用いる宿主細胞としてはヒト細胞が好ましいのは当然であるが、マウスその他哺乳類の細胞でも良い。また、環境中の毒性評価という面から、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞でも可能である。また、培養が容易であることから微生物の細胞を用いることも好ましい。また、本法は酵母細胞の遺伝子を基にしていること、また酵母の生育は塩濃度その他の環境試料において変動する条件に左右されないことから、好ましい細胞は酵母細胞である。細胞を形質転換する方法はよく知られている（例えば、Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: Lithium acetate yeast transformation, Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp.133-134,1994を参照）。またベクターを用いなくとも当該酵母遺伝子のコード領域をマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で置換することによっても目的は達せられる。上記ポリヌクレオチド構築物を細胞に直接導入することも可能であり、その方法も周知である。
【００１４】
本発明は、
（１）被験物質を、上記の形質転換した細胞と接触させ、
（２）マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出すること、
を含む被験物質中の毒性化合物の検出方法にも関する。
被験物質を、細胞と接触させる場合は、例えば形質転換した細胞をその細胞を培養するに適した条件下で液体培養し、その培養液に直接被験物質を添加する方法により行う。
【００１５】
次にマーカータンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定する。  マーカータンパク質の発現量を測定は、細胞を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定すれば良い。例えばマーカー蛋白質がGFPの場合は、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、細胞を粉砕せずに蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による観察および画像処理、フローサイトメトリーによる計測、さらにエバネッセント光などを用いた検出方法が可能である。
【００１６】
ｍＲＮＡの発現は、１）ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック  改定第２版、羊土社、2000, pp299-301）により検出するか、２）逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊 Tipsシリーズ  改定PCR Tips, 秀潤社、1999, pp25-43）等によって検出することができる。
【００１７】
ノーザンブロット法の手順はＲＮＡを電気泳動して、そのパターンをフィルターに移しとり、アイソト−プで標識した特異的な標識プローブとハイブリダイゼーションをさせることで、標本中のｍＲＮＡの存在と量、およびその長さを解析する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、まずＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いてｃＤＮＡに逆転社し、次にこのｃＤＮＡを出発材料として特定のプライマーセットと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、目的のＲＮＡの存在をそのｃＤＮＡの増幅という形で、検出定量化する方法である。
【００１８】
本発明の方法により検出できる毒性物質は特に限定がないが例えば、Ｎａ２Ａｓ、ＣｄＣｌ２、ＨｇＣｌ２、ＰｂＣｌ２、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２,４,５−トリクロロフェノール、γ−ヘキサクロロシクロへキサン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、２,４,５,６−テトラクロロ−１，３−ベンゼンジカルボニトリル、テトラメチルチウラムジスルフィド、エチレンビス（ジチオカルバメート）亜鉛、８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド、ジンジャオール、アクロレイン、ジメチルスルホオキシド、ラウンドアップ（登録商標、除草剤）（Ｎ−（ホスホメチル）グリシナートアンモニウム４１．０％、界面活性剤５９．０％）、ドデシルベンゾスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、シアン化カリウム、べンゾ（ａ）ピレン、ホルムアルデヒド、ビスフェノールＡ，２,５−ジクロロフェノール、塩化メチル水銀、ｐ−ノニルフェノール、ペンタクロロフェノール、塩化ニッケル（ＩＩ）、重クロム酸カリウム、トリフェニルスズクロライド、フェノール、Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバマート、ヘキサクロロフェン、トリクロサン、硫酸銅等を含む。
【００１９】
２つ以上の細胞、即ち異なる酵母遺伝子のプロモーターにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した２つ以上の細胞を用いて、それぞれについて上記方法を行なうと毒性物質を更に特定することができる。例えば以下の実施例で示すように酵母遺伝子プロモーターとしてＹＬＬ０５７Ｃのものを用いると2，4−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩が検出可能であり、酵母遺伝子としてＹＬＲ３０３Ｗを用いると2，4−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩、ベンゾ(a)ピレン、ホルムアルデヒド、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、水銀塩が検出可能である。従って、例えば、酵母遺伝子としてＹＬＲ３０３Ｗを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されるが、酵母遺伝子としてＹＬＬ０５７Ｃを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されないなら毒性物質はベンゾ(a)ピレン、水銀塩、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン又はホルムアルデヒドと特定される。またいずれの酵母遺伝子を用いた場合にもマーカータンパク質の発現が誘導されるなら毒性物質は2，4−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、又は青酸若しくはその塩と特定される。
以下に本発明を実施例により更に説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは勿論である。
【実施例】
【００２０】
実施例１
毒性物質の検出のためいかなる酵母遺伝子が有用であるかを調べるため以下の実験を行った。
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C(α SUC2mal mel gap2 CUP1)）を２５℃で培養した。対数増殖期に以下の細胞に対して毒性を有する化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。化学物質の濃度は酵母の生育を阻害するが死滅には至らないような濃度を選択した。
【００２１】
化学物質                                    濃度      
（１）Ｎａ２Ａｓ                                    ０．３ｍＭ
（２）ＣｄＣｌ２                                    ０．３ｍＭ
（３）ＨｇＣｌ２                                    ０．７ｍＭ
（４）ＰｂＣｌ２                                        ２ｍＭ
（５）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド            ０．２μＭ
（６）２,４,５−トリクロロフェノール                  １６μＭ
（７）γ−ヘキサクロロシクロへキサン                １．３ｍＭ
（８）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン        ２ｐｐｍ
（９）２,４,５,６−テトラクロロ−１，３−              １０μＭ
ベンゼンジカルボニトリル
（１０）テトラメチルチウラムジスルフィド              ７５μＭ
（１１）エチレンビス（ジチオカルバメート）亜鉛          ２ｐｐｍ
（１２）８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド  ０．８２ｍＭ
（１３）ジンジャオール                              １．３６ｍＭ
（１４）アクロレイン                                ０．２０ｍＭ
（１５）ジメチルスルホオキシド                      １．４１Ｍ
（１６）ラウンドアップ（登録商標、除草剤）１）        １５００倍希釈
（１７）ドデシルベンゾスルホン酸ナトリウム            ０．０２％
（１８）ラウリル硫酸ナトリウム                        ０．０１％      
１）Ｎ−（ホスホメチル）グリシナートアンモニウム４１．０％、界面活性剤５９．０％
【００２２】
培養終了後遠心して集菌した。これに酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit,Takara）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014,GibcoBRL）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを取りこませて標識ｃＤＮＡを得た。
【００２３】
この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（10mM Tris・HCl/1mM EDTA, pH8.0）に溶解し、酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ研究所製）に滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。このＤＮＡチップの蛍光強度をスキャナーで読み取り、化学物質を添加しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量として表１〜９に示した。なおこれらの表中、最右欄の「強度」はコントロール細胞における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を全遺伝子の発現量の平均値で割った値である。コントロールのｍＲＮＡ発現量が小さく、化学物質を添加した場合のｍＲＮＡ発現量が大きい遺伝子が毒性物質の検出に特に有用である。
【００２４】
【表１−１】
0005071807.tif 000002
【００２５】
【表１−２】
0005071807.tif 000003
【００２６】
【表１−３】
0005071807.tif 000004
【００２７】
【表１−４】
0005071807.tif 000005
【００２８】
【表１−５】
0005071807.tif 000006
【００２９】
【表１−６】
0005071807.tif 000007
【００３０】
【表１−７】
0005071807.tif 000008
【００３１】
【表１−８】
0005071807.tif 000009
【００３２】
【表１−９】
0005071807.tif 000010
【００３３】
【表１−１０】
0005071807.tif 000011
【００３４】
【表１−１１】
0005071807.tif 000012
【００３５】
【表１−１２】
0005071807.tif 000013
【００３６】
【表１−１３】
0005071807.tif 000014
【００３７】
【表１−１４】
0005071807.tif 000015
【００３８】
【表１−１５】
0005071807.tif 000016
【００３９】
【表１−１６】
0005071807.tif 000017
【００４０】
【表１−１７】
0005071807.tif 000018
【００４１】
【表１−１８】
0005071807.tif 000019
【００４２】
【表１−１９】
0005071807.tif 000020
【００４３】
【表１−２０】
0005071807.tif 000021
【００４４】
【表１−２１】
0005071807.tif 000022
【００４５】
【表１−２２】
0005071807.tif 000023
【００４６】
【表１−２３】
0005071807.tif 000024
【００４７】
【表１−２４】
0005071807.tif 000025
【００４８】
【表２−１】
0005071807.tif 000026
【００４９】
【表２−２】
0005071807.tif 000027
【００５０】
【表２−３】
0005071807.tif 000028
【００５１】
【表２−４】
0005071807.tif 000029
【００５２】
【表２−５】
0005071807.tif 000030
【００５３】
【表２−６】
0005071807.tif 000031
【００５４】
【表３−１】
0005071807.tif 000032
【００５５】
【表３−２】
0005071807.tif 000033
【００５６】
【表３−３】
0005071807.tif 000034
【００５７】
【表４−１】
0005071807.tif 000035
【００５８】
【表４−２】
0005071807.tif 000036
【００５９】
【表４−３】
0005071807.tif 000037
【００６０】
【表４−４】
0005071807.tif 000038
【００６１】
【表４−５】
0005071807.tif 000039
【００６２】
【表４−６】
0005071807.tif 000040
【００６３】
【表５−１】
0005071807.tif 000041
【００６４】
【表５−２】
0005071807.tif 000042
【００６５】
【表５−３】
0005071807.tif 000043
【００６６】
【表５−４】
0005071807.tif 000044
【００６７】
【表５−５】
0005071807.tif 000045
【００６８】
【表６−１】
0005071807.tif 000046
【００６９】
【表６−２】
0005071807.tif 000047
【００７０】
【表６−３】
0005071807.tif 000048
【００７１】
【表７−１】
0005071807.tif 000049
【００７２】
【表７−２】
0005071807.tif 000050
【００７３】
【表７−３】
0005071807.tif 000051
【００７４】
【表７−４】
0005071807.tif 000052
【００７５】
【表７−５】
0005071807.tif 000053
【００７６】
【表７−６】
0005071807.tif 000054
【００７７】
【表７−７】
0005071807.tif 000055
【００７８】
【表７−８】
0005071807.tif 000056
【００７９】
【表７−９】
0005071807.tif 000057
【００８０】
【表７−１０】
0005071807.tif 000058
【００８１】
【表７−１１】
0005071807.tif 000059
【００８２】
【表７−１２】
0005071807.tif 000060
【００８３】
【表７−１３】
0005071807.tif 000061
【００８４】
【表７−１４】
0005071807.tif 000062
【００８５】
【表７−１５】
0005071807.tif 000063
【００８６】
【表７−１６】
0005071807.tif 000064
【００８７】
【表８−１】
0005071807.tif 000065
【００８８】
【表８−２】
0005071807.tif 000066
【００８９】
【表９−１】
0005071807.tif 000067
【００９０】
【表９−２】
0005071807.tif 000068
【００９１】
【表９−３】
0005071807.tif 000069
【００９２】
【表９−４】
0005071807.tif 000070
【００９３】
【表９−５】
0005071807.tif 000071
【００９４】
【表９−６】
0005071807.tif 000072
【００９５】
【表９−７】
0005071807.tif 000073
【００９６】
【表９−８】
0005071807.tif 000074
【００９７】
【表９−９】
0005071807.tif 000075
【００９８】
【表９−１０】
0005071807.tif 000076
【００９９】
【表９−１１】
0005071807.tif 000077
【０１００】
【表９−１２】
0005071807.tif 000078
【０１０１】
【表９−１３】
0005071807.tif 000079
【０１０２】
【表９−１４】
0005071807.tif 000080
【０１０３】
【表９−１５】
0005071807.tif 000081
【０１０４】
【表９−１６】
0005071807.tif 000082
【０１０５】
機能未知の酵母遺伝子２４００のうち約７００が重金属、農薬、界面活性剤等の毒性を有する化学物質いずれかによりｍＲＮＡの発現が誘導され（表１）、ミトコンドリア局在タンパク質遺伝子１６７(表２）、遺伝子修復系タンパク質遺伝子５２（表３）、エネルギー系タンパク質遺伝子１６１（表４）、トランスポート促進タンパク質遺伝子１４２（表５）、ストレスタンパク質遺伝子９０（表６）、代謝系たんぱく質遺伝子１４２（表７）、脱毒性蛋白質遺伝子６０（表８）、その他のカテゴリーに属する遺伝子５０７（表９）のｍＲＮＡの発現が毒性を有する化学物質のいずれかにより誘導されることが示される。ここで、化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量が２倍以上のものを有意とした。
【０１０６】
このように毒性物質が存在すると特定の酵母遺伝子の発現が誘導されるのは、毒性物質が該遺伝子のプロモーターを活性化することによると考えられる。そこで本発明者は、酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチド配列を含むベクターを調製し、該ベクターで酵母細胞を形質転換した。このような細胞を用いると、発現するマーカータンパク質を検出することにより、毒性物質の検出を簡便に行うことができる（以下このような検出を「プロモーターアッセイ」と呼ぶことがある）。以下の実施例にはそのようなベクターの調製、該ベクターを用いる酵母細胞の形質転換、形質転換した細胞による毒性物質の検出を示す。
【０１０７】
プロモーターアッセイ法はｍＲＮＡの細胞内の変動をマーカー遺伝子の発現レベルに置き換えて，遺伝子発現量を非破壊で測定する方法である。化学物質を検出するために選択した遺伝子は化学物質不存在下においても発現しており，従ってマーカータンパク質も化学物質不存在下においても存在する。本発明の方法は被検試料を付加した時の酵母遺伝子の挙動をマーカータンパク質の発現量の変化によって計測し，毒性化学物質の存在およびその種類を推定するものである。このため，化学物質不存在下においてはマーカータンパク質の産生が少ない方が望
ましく，また化学物質存在下においてマーカータンパク質の産生が多い方が望ましい。このため，プロモーターアッセイにおける酵母遺伝子の選択にあたっては，強度（コントロール細胞における遺伝子の発現量／全遺伝子の発現量の平均値）が、好ましくは１．５以下、より好ましくは１以下、さらに好ましくは０．５以下であり、発現倍率（化学物質存在下の発現ｍＲＮＡ／化学物質不存在下の発現ｍＲＮＡ）が好ましくは３以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上であるものを選択する。
【０１０８】
実施例２
酵母遺伝子ＹＫＬ０７１ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
CGCAATAATACTGGAAACATCAA      （配列番号７）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
ATCGACTTTGTTTGCTTAGAAT       （配列番号８）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分を用いた。まず、ｐYES2の multiple cloning site の中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクタ−作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＫＬ０７１ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号１）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【０１０９】
次にこのプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303を200mlのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μｌずつ分注し10μlの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μｌの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞は、SC-YKL071w-pQBIと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている（受託日：平成14年8月19日、受託番号FERM BP-8161）。
【０１１０】
実施例３
酵母遺伝子ＹＣＲ１０２ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーは、プライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
AGGTGCGATAGTGGGGAATAAGA      （配列番号９）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は
GGTTTCTGGAATTGCAACTTGC      （配列番号１０）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
【０１１１】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat No:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分を用いた。まず、ｐYES2の multiple cloning site の中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクタ−作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＣＲ１０２ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド(配列番号２）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【０１１２】
次にこのプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303を200mlのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250uLを添加する。
４）300ｍｌずつ分注し10ulの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700ｍｌの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
組み込みの確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育した酵母のコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞をSC-YCR102c-pQBIと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている（受託日：平成14年8月19日、受託番号FERM BP-8159）。
【０１１３】
実施例４
酵母遺伝子ＹＯＲ３８２ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
GCTTTTCTCGCTTCGTTATCACC      （配列番号１１）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
TATTATTGTTTTGTGATGGCTT        （配列番号１２）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
【０１１４】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分を用いた。まず、ｐYES2の multiple cloning site の中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクタ−作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＯＲ３８２ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【０１１５】
次にこのプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303を200mlのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μｌずつ分注し10μlの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μｌの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞は、SC-YOR382W-pQBIと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている（受託日：平成14年8月19日、受託番号FERM BP-8160）。
【０１１６】
実施例５
酵母遺伝子ＹＬＬ０５７ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
GCTAACGAACAGGATGGTATTGA      （配列番号１３）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
ATTTTAACTGGGTTACTGTGCT       （配列番号１４）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
【０１１７】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分を用いた。まず、ｐYES2の multiple cloning site の中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクタ−作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＬ０５７ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号４）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【０１１８】
次にこのプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303を200mlのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μｌずつ分注し10μlの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μｌの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞は、SC-YLL057C-pQBIと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成13年7月27日、受託番号：FERM P-18439）。その後、国際寄託へ移管された（受託番号：FERM BP-8158、国際寄託への変更日：平成14年8月19日）。
【０１１９】
実施例６
酵母遺伝子ＹＬＲ３０３ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーは、プライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
TCGTTTTCTACTTTCTTCTGCTG      （配列番号１５）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は
TGTATGGATGGGGGTAATAGAA        （配列番号１６）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat No:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分を用いた。まず、ｐYES2の multiple cloning site の中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクタ−作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＲ３０３ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド(配列番号５）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【０１２０】
次にこのプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303を200mlのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250uLを添加する。
４）300ｍｌずつ分注し10ulの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700ｍｌの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
組み込みの確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育した酵母のコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞をSC-YLR303W-pQBIと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成13年7月27日、受託番号：FERM P-18438）。その後、国際寄託へ移管された（受託番号：FERM BP-8157、国際寄託への変更日：平成14年8月19日）。
【０１２１】
実施例７
実施例２で製造した細胞ＳＣ−ＹＫＬ０７１Ｗ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）中で酵母細胞ＳＣ−ＹＫＬ０７１Ｗ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロへキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）S-4-クロロベンジル-N,N-ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
【０１２２】
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１０に示す。
【０１２３】
【表１０】
0005071807.tif 000083
テトラメチルチウラムジスルフィドの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
【０１２４】
実施例８
実施例３で製造した細胞ＳＣ−ＹＣＲ１０２Ｃ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）中でＳＣ−ＹＣＲ１０２Ｃ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロへキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）S-4-クロロベンジル-N,N-ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
【０１２５】
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１１に示す。
【０１２６】
【表１１】
0005071807.tif 000084
テトラメチルチウラムジスルフィドの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
【０１２７】
実施例９
実施例４で製造した細胞ＳＣ−ＹＯＲ３８２Ｗ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）中でＳＣ−ＹＯＲ３８２Ｗ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
【０１２８】
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロへキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）S-4-クロロベンジル-N,N-ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
【０１２９】
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１２に示す。
【０１３０】
【表１２】
0005071807.tif 000085
【０１３１】
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、ｐ−ノニルフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、マラソン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、塩化ニッケル（ＩＩ）、重クロム酸カリウム、フェノール、ジメチルスルホキシドの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
【０１３２】
実施例１０
実施例５で製造した細胞ＳＣ−ＹＬＬ０５７Ｃ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）中で酵母細胞ＳＣ−ＹＬＬ０５７Ｃ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
【０１３３】
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロへキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）S-4-クロロベンジル-N,N-ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
【０１３４】
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１３に示す。
【０１３５】
【表１３】
0005071807.tif 000086
【０１３６】
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸ナトリウム、塩化カドミウム、シアン化カリウムの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
【０１３７】
実施例１１
実施例６で製造した細胞ＳＣ−ＹＣＲ３０３Ｗ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）中でＳＣ−ＹＬＲ３０３Ｗ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロへキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）S-4-クロロベンジル-N,N-ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
【０１３８】
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１４に示す。
【０１３９】
【表１４】
0005071807.tif 000087
【０１４０】
ベンゾ（ａ）ピレン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ホルムアルデヒド、亜ヒ酸ナトリウム、塩化カドミウム、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、塩化水銀（ＩＩ）、シアン化カリウムの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
SEQ ID NO: 1
Polynucleotide containing promoter of yeast gene YKL071w
SEQ ID NO: 2
Polynucleotide containing promoter of yeast gene YCR102c
SEQ ID NO: 3
Polynucleotide containing promoter of yeast gene YOR382w
SEQ ID NO: 4
Polynucleotide containing promoter of yeast gene YLL057c
SEQ ID NO: 5
Polynucleotide containing promoter of yeast gene YLR303w
SEQ ID NO: 6
Polynucleotide encoding marker protein green fluorescence protein (GFP)
SEQ ID NO: 7
Upper primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YKL071w
SEQ ID NO: 8
Lower primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YKL071w
SEQ ID NO: 9
Upper primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YCR102c
SEQ ID NO: 10
Lower primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YCR102c
SEQ ID NO: 11
Upper primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YOR382w
SEQ ID NO: 12
Lower primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YOR382w
SEQ ID NO: 13
Upper primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YLL057c
SEQ ID NO: 14
Lower primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YLL057c
SEQ ID NO: 15
Upper primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YLR303w
SEQ ID NO: 16
Lower primer for PCR amplification of polynucleotide containing promoter of yeast gene YLR303w
【配列表】
0005071807000001.app