(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子中の特定の塩基の変異を判定する遺伝子検知方法であって、前記標的遺伝子のサンプル、および該標的遺伝子に対して野生型または標準型の塩基配列を有する対照遺伝子のサンプルのそれぞれを、（ｉ）５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを含むプライマー対を用いるＰＣＲ反応に供して増幅し、（ｉｉ）前記ＰＣＲ反応で得られた二本鎖ＤＮＡをインビトロ転写反応に供して一本鎖ＲＮＡを形成し、（ｉｉｉ）前記一本鎖ＲＮＡに、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る第一の一本鎖ＤＮＡに蛍光色素が結合された蛍光標識プローブをハイブリダイゼーションさせてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させ、このとき前記第一の一本鎖ＤＮＡは、前記変異を判定する対象となる塩基を５’末端塩基から３塩基以内又は３’末端から３塩基以内の位置に有し、かつ前記蛍光色素の結合位置が前記第一の一本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端であって、前記変異を判定する対象となる塩基に近接する側であり、（ｉｖ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＲＮアーゼを用いるＲＮＡ分解反応に供して、蛍光標識プローブとハイブリダイズしていないＲＮＡの部分を分解除去した後、（ｖ）標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと対照遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの蛍光強度を比較する、
以上の諸工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記（ｉｉｉ）のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成工程において、前記一本鎖ＲＮＡに、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る第二の一本鎖ＤＮＡに前記蛍光色素を消光する機能を有する消光色素が結合された蛍光消光プローブをさらにハイブリダイゼーションさせるが、このとき前記消光色素の結合位置が、前記第一の一本鎖ＤＮＡが５’末端に前記蛍光色素を有する場合は前記第二の一本鎖ＤＮＡの３’末端であり、前記第一の一本鎖ＤＮＡが３’末端に前記蛍光色素を有する場合は前記第二の一本鎖ＤＮＡの５’末端であり、かつ前記蛍光プローブと前記蛍光消光プローブとが、前記蛍光色素と前記消光色素とが近接して併存するように前記一本鎖ＲＮＡにハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種の目的から、遺伝子中の特定の（位置の）塩基の変異や塩基の存否を判定する遺伝子検知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトの終了により、ヒトの全塩基配列が決定され各種遺伝子の存在とその機能が明らかにされるに従い、それぞれの遺伝子の変異ないしは異常を検出することは、所謂ポストゲノムの薬剤や治療・診断法等の開発における手段としても重要性を増している。例えば、ヒトにおける１塩基レベルの変異、すなわち一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し、このＳＮＰ情報を基にして患者の個人差に合わせたオーダーメード（テーラーメード）医療が可能になるものと期待されている。【０００３】
また、近年は、食品の偽装表示を防止し、安全で消費者の要求に応じた農産物、水産物、畜産物などを確保する点からそれらの食品の原材料をＤＮＡ分析する必要性も高まっている。
さらに、自然または人為的な環境の変化に応じて、地中、水中、大気中などに存在する微生物などの有害性や無毒化や確認する手段として、当該微生物の遺伝子の変化（例えば、有害性に関与する特定の塩基の存否）を知ることも重要になっている。【０００４】
如上の目的で遺伝子検知に従来より主として行なわれてきた技術は、ＰＣＲ反応により標的遺伝子を増幅し、これをダイレクトシークエンシングやキャピラリー電気泳動法により解析して変異の存在を判別するものである。さらに、蛍光色素で標識された核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲ反応をモニタリングすることにより標的遺伝子を定量して多型・変異を解析するリアルタイムＰＣＲ法も知られている〔例えば、特開２００２−２７５号公報（特許文献１）、特開２００２−１１９２９１号公報（特許文献２）〕。【０００５】
しかしながら、これらの従来技術においては、ＰＣＲにより得られるＤＮＡ量には限界があり、再現性および信頼性の高い結果を得るためには、高度な知識と熟練された技術を必要とする。また、ＤＮＡシークエンサーなどの高額な分析機器を必要とし、解析に長時間を有するなどの問題点も有している。電気泳動操作を行なう場合には、分析に更なる手間を要することになる。
【特許文献１】特開２００２−２７５号公報
【特許文献２】特開２００２−１１９２９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、少量のサンプルで高精度の分析を可能とし、遺伝子中の特定の塩基の変異や特定の塩基の存否（有無）を簡便に判定することのできる新しい遺伝子検知技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、検討を重ねた結果、標的遺伝子をＲＮＡに転写し、このＲＮＡを蛍光標識プローブとハイブリダイゼーションさせ、さらに、好ましくは、得られたハイブリッドをリボヌクレアーゼで処理することによる如上の目的が達成され得ることを見出した。【０００８】
かくして、本発明は、標的遺伝子中の特定の塩基の変異または特定の塩基の存否を判定する遺伝子検知方法であって、前記標的遺伝子のサンプル、および該標的遺伝子に対して野生型または標準型の塩基配列を有する対照遺伝子のサンプルのそれぞれを、(i)５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを含むプライマー対を用いるＰＣＲ反応に供して増幅し、(ii)前記ＰＣＲ反応で得られた二本鎖ＤＮＡをインビトロ転写反応に供して一本鎖ＲＮＡを形成し、(iii)前記一本鎖ＲＮＡに、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本鎖ＤＮＡに蛍光色素が結合された蛍光標識プローブをハイブリダイゼーションさせてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させた後、(iv)標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと対照遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの蛍光強度を比較する、以上の諸工程を含むことを特徴とする方法を提供するものである。【０００９】
本発明の好ましい態様に従えば、前記(iii)のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成工程において、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本鎖ＤＮＡに、前記蛍光色素を消光する機能を有する消光色素が結合された蛍光消光プローブを、前記一本鎖ＲＮＡにハイブリダイゼーションさせる。【００１０】
本発明の別の好ましい態様に従えば、前記工程(iii)で得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＲＮアーゼを用いるＲＮＡ分解反応に供した後、工程(iv)の蛍光強度の比較を行なう。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に従えば、遺伝子サンプルのＰＣＲ産物をインビトロ転写反応に供することにより、従来法の100倍以上の濃度で一本鎖ＲＮＡとして遺伝子サンプルを調製することができる。すなわち、ＰＣＲのみによる従来法において問題であったサンプル量の制限による信頼性の低下が克服される。また、発明の方法は電気泳動の操作を回避した技法であり、従来法と比べ分析時間を大幅に短縮することができる。本発明の方法における一連の操作は、特に専門的な知識や熟練された技術を必要とせずに簡便かつ迅速に行なうことが可能である。さらに、本発明は、遺伝子シークエンサーなどの特化された分析機器を必要としない点からも、多岐の研究施設で適応しうる分析技術である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の遺伝子検知方法を構成する各工程を示す。
【図２】本発明の適用例としてＨＢＶの遺伝子配列（Ａ）と、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを示す（実施例１）。
【図３】本発明に従い、ＨＢＶの遺伝子変異が蛍光消光率により検出されることを示す（実施例１）。
【図４】本発明の適用例として、アルデヒドロヒドロゲナーゼの遺伝子配列と、その変異検出に用いられる蛍光標識プローブを示す（実施例２）。
【図５】本発明に従い、ＨＢＶ遺伝子およびＡＤＲＢ２遺伝子の変異が蛍光消光率により同時に検出されることを示す（実施例３）。
【図６】本発明の適用例としてＨＢＶの遺伝子に蛍光標識プローブに加えて、蛍光消光プローブを併存させた場合のハイブリッドを示す（実施例１）。
【図７】本発明に従いＨＢＶ遺伝子の変異を検出するに際して、蛍光標識プローブと蛍光消光プローブを併存させることにより、消光率が大きくなり、より高感度に変異検出ができることを示す（実施例１）。
【図８】本発明に従うマグロの品種判別の実施例における各種マグロの遺伝子配列と、使用した蛍光標識プローブと消光標識プローブを示す（実施例４）。
【図９】本発明に従い、蛍光消光率を測定することによりマグロの品種判別を行った結果を例示する（実施例４）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図１に示す本発明の遺伝子検知方法を構成する各工程に沿って本発明の実施の形態を詳述する。
ＰＣＲ反応
本発明に従う遺伝子検知においても、標的遺伝子のサンプル（被検遺伝子のサンプル）、および対照遺伝子のサンプル（上記の標的遺伝子に対して野生型または標準型の塩基配列を有する遺伝子のサンプル）は、先ず、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）反応に供されるが、本発明の特徴は、後の工程で、ＰＣＲ産物を鋳型にして一本鎖ＲＮＡを大量に合成してサンプル量を飛躍的の増大させることができることにある。このため、それぞれの遺伝子サンプルのＰＣＲ反応による増幅に際して、プライマーとして通常のＰＣＲ反応におけるようにそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーの他に、５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを用いる。【００１４】
本発明におけるＰＣＲ反応は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを用いること以外は、格別のものではなく、二本鎖ＤＮＡから成る標的遺伝子のサンプルまたは対照遺伝子のサンプルのそれぞれに、如上のプライマーの他、ｄＮＴＰ、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを加えて、よく知られているように、二本鎖ＤＮＡの熱変性、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長反応を繰り返す（通常、30〜40サイクル）ことによって行なわれる。【００１５】
本発明に従う遺伝子検知方法のＰＣＲ工程において、プライマーの５’末端に付加するＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（トランスクリプターゼ）のプロモーター配列である。好ましいＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の例としてはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ認識配列〔５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：１）−３’〕が挙げられるが、これに限られるものではなく、この他に、ＳＰ３ＲＮＡポリメラーゼなども使用できる。【００１６】
本発明の方法のＰＣＲ工程において使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、当該分野で一般的に用いられているものが使用でき、例えば、商品名Pyrobestで宝酒造（株）から市販されているものが挙げられるが、これに限られるものではない。【００１７】
インビトロ転写反応
本発明に従えば、如上のＰＣＲ反応で得られた二本鎖ＤＮＡはインビトロ転写反応に供される。ここで、ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡは５’末端側にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有しているので、ＲＮＡポリメラーゼの作用により転写反応を受けて、ＰＣＲ産物を鋳型とする一本鎖ＲＮＡになる。【００１８】
このインビトロ転写反応は、市販のインビトロ転写反応キットを用いて実施することができる。本発明において使用されるのに好適なインビトロ転写反応キットとしては、例えば、「T7 RiboMAXTM Express Large
Scale RNA Production System」（Promega社）が挙げられるが、これに限られるものではない。【００１９】
ＰＣＲ反応のみではＤＮＡの増幅に限界があり得られるＤＮＡは微量であるが、本発明ではＰＣＲ産物をインビトロ転写反応に供することにより遺伝子サンプル（標的遺伝子サンプルおよび対照遺伝子サンプル）の量を一本鎖ＲＮＡとして大幅に増加させる（一般的には100倍以上の濃度に）ことができる。【００２０】
ハイブリダイゼーション
本発明に従う遺伝子検知方法においては、如上のインビトロ転写反応で得られた一本鎖ＲＮＡを、次に、蛍光標識プローブとハイブリダイゼーションさせて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（ダブレックス）を形成させる。蛍光標識プローブは、対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本鎖ＤＮＡに蛍光色素が結合されたものである。ここで、蛍光色素は、当該プローブの末端（５’末端または３’末端）の塩基と共有結合しており、そして、検出対象となる塩基はその蛍光色素の結合している塩基に可及的に近接するように、すなわち、その末端に存在するかまたは末端塩基から３塩基以内の位置にあるように蛍光標識プローブを設計するのが好ましい。【００２１】
図２は、以上のような標的遺伝子の塩基配列と蛍光標識プローブの関係を例示するものである。図２の（Ａ）は、テーラーメード医療を目指す一塩基多型の例として、ラミブジン療法が効果的な野生型のヒト肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子の塩基配列（配列番号：２）と、ラミブジン療法が非効果的な変異型のヒトＨＢＶの塩基配列（配列番号：３）を示しており、野性型における塩基ＧがＴに変異することに応じて野性型におけるアミノ酸Ｍ（リジン）がＩ（イソロイシン）に変異してラミブジン耐性になるものと考えられている。図２の（Ｂ）は、そのような一塩基多型を本発明に従い検出するために設計した蛍光標識プローブを示す。プローブ（５’−ＣＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣ−３’）（配列番号：４）は、５’末端塩基に蛍光色素が結合されて標識（ラベル化）されており、図の例では、該末端塩基に対応する部位に標的遺伝子（ＲＮＡ一本鎖として）の検出対象の塩基が存在している。【００２２】
かくして、被検標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（図２の（Ｂ）では下方に示す）と対照遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（図２の（Ｂ）では上方）の蛍光強度を比較することにより遺伝子の変異を検出することができる。図２の例では、検出対象の塩基がＧである野性型（対照遺伝子）由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、当該部位が変異した（Ｘで示す）変異型由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも蛍光の消光の程度が大きい（後述の実施例参照）。【００２３】
本発明において一本鎖ＤＮＡに共有結合される蛍光色素としては、従来より知られた各種のものが使用される。好ましい蛍光色素の例は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（5−カルボキシテトラメチルローダミン）、ＦＡＭ（5−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン）、ローダミン（Rhodamine）、Ｃｙ３〔インドジカルボシアニン−３−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロパン）〕などであるが、これらに限られるものではない。【００２４】
本発明の好ましい態様に従えば、既述のインビトロ転写反応で得られた一本鎖ＲＮＡに、蛍光標識プローブに加えて、さらに、消光標識プローブをハイブリダイゼーションさせる。消光標識プローブは、対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本鎖ＤＮＡに、蛍光色素を消光する機能を有する消光色素（蛍光色素の蛍光放射領域に重なる吸収帯を有する分子から成る）が結合されたものから成る。【００２５】
一般に、蛍光色素および消光色素は、それぞれ、蛍光標識プローブおよび消光標識の末端に結合される。蛍光色素を蛍光標識プローブの５’末端に結合させた場合は、消光色素を消光標識プローブの３’末端に結合させ、あるいはその逆とする。いずれの場合においても、検出対象となる塩基は、蛍光色素および消光色素の結合している塩基に可及的に近接するように、すなわち、その末端に存在するか、または末端塩基から３塩基以内の位置にあるようにする（図６および図９参照）。【００２６】
使用できる蛍光色素と消光色素の組合せは特に限定されるものではないが、好ましい例として、蛍光色素ＦＩＴＣに対して消光色素ＢＨＱ−１〔４’−（２−ニトロ−４−トルイルジアゾ）−２’−メトキシ−５’−メチル−アゾベンゼン−４’’−（Ｎ−エチル）−Ｎ−エチル−２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロパン））〕が挙げられる。この他に、蛍光色素ローダミン、ＴＡＭＲＡ、またはＣｙ３などに対して消光色素ＢＨＱ−２〔４’（４−ニトロ−フェニルジアゾ）−２’−メトキシ−５’−メトキシ−アゾベンゼン−４’’−（Ｎ−エチル−２−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル））−Ｎ−エチル−２−Ｏ−グリコレート〕なども使用できる。【００２７】
以上のように、ＲＮＡに蛍光標識プローブおよび消光標識プローブをハイブリダイズさせたハイブリッドを用いる蛍光測定系では、著しく大きな消光率が達成され、標的遺伝子中の特定の塩基の変異や存否をより高い精度で検出することができる。【００２８】
一本鎖ＤＮＡに蛍光色素が結合された蛍光標識プローブは、既述のようにＰＣＲ反応をモニタリングするリアルタイムＰＣＲ法におけるプライマーとして従来も用いられていたが（特許文献１および２）、本発明のように、遺伝子サンプルを一本鎖ＲＮＡにし、これに蛍光標識プローブをハイブリダイズさせ、さらに、好ましくは、消光標識プローブもハイブリダイズさせ、遺伝子検知のために蛍光強度を比較するのに使用される例はなかった。【００２９】
本発明の遺伝子検知方法は、１塩基レベルの遺伝子変異、すなわち一塩基多型を検出するのに適している。図１や図２は単一個の１塩基変異が存在する場合を示しているが、本発明の方法は、複数個の１塩基変異が存在する標的遺伝子サンプルについても同様に適用できる。そのような場合、検出対象となる１塩基間は互いに少なくとも約30塩基離れていることが好ましく、それらの検出対象塩基のそれぞれに可及的に近接するように蛍光色素を結合させ、該蛍光色素を互いに別異のものとすることが好ましい。さらに、本発明は、１塩基変異を有する複数の標的遺伝子について、それらの変異を同時に検出する場合にも適用できる。【００３０】
ＲＮＡ分解
本発明に従えば、上記のようにして得られた標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと対照遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの蛍光強度を比較することにより遺伝子変異を検出することができるが、本発明の特に好ましい態様においては、それらのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＲＮアーゼ（RNase：リボヌクレアーゼ）を用いるＲＮＡ分解反応に供した後に、蛍光強度の比較を行なう。これによって、蛍光標識プローブとハイブリダイズしていないＲＮＡの部分が分解除去される結果、蛍光強度（蛍光消光率）の差がより顕著になり、その比較による変異の検出が容易になり精度よく行なわれる。さらに、既述のように、蛍光標識プローブの蛍光放出領域と重複する吸収帯を有する分子を結合させた蛍光消光プローブを近接するように併存させることで、著しく大きな消光率が達成され、より高い精度での変異検出を可能とする。
以下、本発明の特徴を更に具体的に説明するため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
＜Ｂ型肝炎ウイルスに見られる遺伝子変異の検出＞
1.1  DNAサンプルの調製（ＰＣＲ）
検知遺伝子として図２の（Ａ）に示すＢ型肝炎ウイルス遺伝子〔野性型（対照遺伝子）および変異型（標的遺伝子）〕を含むプラスミド遺伝子（pUC18のSmaIサイトに連結されたB型肝炎ウイルス遺伝子）を鋳型としてそれぞれＰＣＲ反応を行い、解析対象（検出対象）部位を含む遺伝子断片を得た。ＰＣＲプライマーには５’末端にT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を付加したプライマー１（配列番号：５）および遺伝子特異的なプライマー２（配列番号：６）を用い、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa）により行った。反応条件を以下に示す。
ＰＣＲ反応組成（100μl）：鋳型ＤＮＡ（＜1μg）、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（2.5 unit）、プライマー１（1μM）、プライマー２（1μM）、dNTP（200μM）、1 x Pyrobest
Buffer II。
ＰＣＲ条件：熱変性（95℃、5min）1サイクルを行った後、［熱変性（95℃、15sec）−アニーリング（55℃、30sec）−伸長反応（72℃、30sec）］35サイクルを行った。
プライマー１：
５’−ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGC−３’
プライマー２：
５’−GGTACCCCAACTTCCAATTACATAT−３’【００３２】
1.2  ＲＮＡサンプルの調製（インビトロ転写反応）
1.1に示す工程により得られたPCR産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖ＲＮＡを調製した。転写反応は、T7 RiboMAXTM Express Large
Scale RNA Production System (Promega)により行った。ＲＮＡ産物はエタノール沈殿を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものをＲＮＡサンプルとした。反応条件を以下に示す。
反応組成（20μl）：ＰＣＲ反応液（2μL）、Enzyme Mix, T7 Express（2μL）、1 x RiboMAXTM Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30℃、30min）の後、Dr. GenTLETM Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いてＲＮＡサンプルを回収した。 【００３３】
1.3.1  ハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ分解
図２（Ｂ）に示すように、５’末端に各種の蛍光色素を結合したオリゴＤＮＡ（５’−CATATAACTGAAAGCCAAAC−３’）を蛍光標識プローブとして用いた。
蛍光標識プローブ（40pmol）を1mLのハイブリダイゼーション緩衝液（10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、pH7.0）に溶解し蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値をF0とした。これにＲＮＡサンプル（15μL）を添加しＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼＡ（0.5μg）を作用させた後の蛍光強度値を測定しＦ１とした。下記の演算式１を用いて補正演算し消光率（Qr）を算出した。
その結果を図３に示す。一連の結果より、ＲＮＡサンプルと蛍光標識プローブが完全相補的であるときにおいて〔すなわち、検出対象部位の塩基がＧである対照（野性型）遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいては〕高い消光率を与え、末端部位において相補性を有さない場合には〔すなわち、検出対象部位の塩基がＧ以外である標的（変異型）遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいては〕消光率を著しく減少させることが示された。このように、ハイブリダイゼーション前後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで遺伝子の変異を検出することができる。【００３４】
1.3.2  蛍光標識プローブと蛍光消光プローブを併存させた変異検出
また、図６に示すように、５’末端に蛍光色素(FITC)を結合したオリゴＤＮＡ（５’−CCATATAACTGAAAGCCAAA−３’）および3’末端に消光分子（ＢＨＱ−１)を結合したオリゴＤＮＡ（５’−GGCCCCCAATACCACATCAT−３’）をそれぞれ蛍光標識プローブおよび蛍光消光プローブとして用いた。【００３５】
蛍光標識プローブ（20pmol）および蛍光消光プローブ（100pmol）を1mLのハイブリダイゼーション緩衝液（10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、pH7.0）に溶解し蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値をF0とした。これにＲＮＡサンプル（15μL）を添加しＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼＡ（0.5μg）を作用させた後の蛍光強度値を測定しＦ１とした。下記の演算式１を用いて補正演算し消光率（Qr）を算出した。【００３６】
その結果を図７に示す。一連の結果より、ＲＮＡサンプルと蛍光標識プローブが完全相補的であるときにおいて〔すなわち、検出対象部位の塩基がＧである正常（野性型）標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいては〕高い消光率を与え、末端部位において相補性を有さない場合には〔すなわち、検出対象部位の塩基がＧ以外である被検（変異型）標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいては〕消光率を著しく減少させることが示された。このように、ハイブリダイゼーション前後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで遺伝子の変異を検出することができる。【００３７】
〔数１〕
演算式１    Ｑｒ＝（Ｆ０−Ｆ１）／Ｆ０×１００（％）
【実施例２】
【００３８】
＜アルデヒドヒドロゲナーゼ遺伝子に見られる変異の検出＞
2.1  ＤＮＡサンプルの調製（ＰＣＲ）
検知遺伝子として図４に示すヒトアルデヒドヒドロゲナーゼ（野性型および変異型）遺伝子を含むプラスミド遺伝子（pUC18のSmaIサイトに連結されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）を鋳型としてそれぞれＰＣＲ反応を行い、検出対象部位を含む遺伝子断片を得た。ＰＣＲプライマーには５’末端にT7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加したプライマー１（配列番号：７）および遺伝子特異的なプライマー２（配列番号：８）を用い、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa）により行った。反応条件を以下に示す。
ＰＣＲ反応組成（100μl）：鋳型ＤＮＡ（＜1μg）、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（2.5 unit）、プライマー１（1μM）、プライマー２（1μM）、dNTP（200μM）、1 x Pyrobest
Buffer II。
ＰＣＲ条件：熱変性（95℃、5min）1サイクルを行った後、[熱変性（95℃、15sec）−アニーリング（55℃、30sec）−伸長反応（72℃、30sec）]35サイクルを行った。
プライマー１：
５’−ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGTCAACTGCTATGATGTG−３’
プライマー２：
５’−CCACACTCACAGTTTTCACTT−３’【００３９】
2.2  ＲＮＡサンプルの調製（インビトロ転写反応）
2.1に示す工程より得られたＰＣＲ産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖ＲＮＡを調製した。転写反応は、T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA
Production System （Promega）により行った。ＲＮＡ産物はエタノール沈殿を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものをＲＮＡサンプルとした。反応条件を以下に示す。
反応組成（20μl）：ＰＣＲ反応液（1μL）、Enzyme Mix, T7 Express（2μL）、1x RiboMAXTM
Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30℃、30min）の後、Dr. GenTLETM Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いてＲＮＡサンプルを回収した。【００４０】
2.3  ハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ分解
図４に示すように、３’末端を蛍光色素ＴＡＭＲＡを結合したオリゴＤＮＡ（５’−ACACTCACAGTTTTCACTTC−３’）（配列番号９）を蛍光標識プローブとして用いた。
蛍光標識プローブ（40pmol）を1mLのハイブリダイゼーション緩衝液（10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH7.0）に溶解し蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値をF0とした。これにＲＮＡサンプル（15μL）を添加しＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼＡ（0.5μg）を作用させた後の蛍光強度値を測定しF1とした。既述の演算式１を用いて補正演算し消光率（Qr）を算出した。結果を図４に示す。図に示されるように、野性型のみからなるＲＮＡサンプル（野性型ホモ接合体）において高い消光率（55%）を与えた。一方、変異型のみからなるＲＮＡサンプル（変異型ホモ接合体）においては消光率を著しく減少させた（2%）。また、野性型および変異型を含むヘテロ接合体においては28%の消光率を与えた。このように、ハイブリダイゼーション前後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで各アレルの変異を検出することができる。
【実施例３】
【００４１】
＜ＡＤＲＢ２およびＨＢＶ遺伝子に見られる変異の同時検出＞
3.1  ＤＮＡサンプルの調製（ＰＣＲ）
検知遺伝子としてヒトのβ２−アドレナリンレセプター（β２−Adrenergic Receptor：ADRB2）遺伝子（野性型および変異型）を含むプラスミド遺伝子を鋳型としてそれぞれＰＣＲ反応を行い、検出対象部位を含む遺伝子断片を得た。ＰＣＲプライマーには５’末端にT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を付加したプライマー１（配列番号：９）および遺伝子特異的なプライマー２（配列番号：10）を用い、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa）により行った。反応条件を以下に示す。
ＰＣＲ反応組成（100μl）：鋳型ＤＮＡ（＜1μg）、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（2.5 unit）、プライマー１（1μM）、プライマー２（1μM）、dNTP（200μM）、1x Pyrobest Buffer
II
ＰＣＲ条件：熱変性（95℃、5min）1サイクルを行った後、［熱変性（95℃、15sec）−アニーリング（55℃、30se）−伸長反応（72℃、30sec）］35サイクルを行った。
プライマー１：
５’−ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAACCCGGGAACGGCAG−３’
プライマー２：
５’−ATTGCCAAACACGATGGCCA−３’
ＨＢＶ遺伝子についても、既述の実施例１の1.1の場合と同様にＰＣＲ反応を行なった。【００４２】
3.2  ＲＮＡサンプルの調製（インビトロ転写反応）
3.2に示す工程より得られた２種類のＰＣＲ産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖ＲＮＡを調製した。転写反応は、T7 RiboMAXTM Express Large
Scale RNA Production System (Promega)により行った。ＲＮＡ産物はエタノール沈殿を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものをＲＮＡサンプルとした。反応条件を以下に示す。
反応組成（20μl）：ＰＣＲ反応液（各1μL）、Enzyme Mix, T7 Express（2μL）、1x RiboMAXTM
Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30℃、30min）の後、Dr. GenTLETM Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いてＲＮＡサンプルを回収した。【００４３】
3.3  ハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ分解
５’末端に蛍光色素FITCを結合したＨＢＶ用オリゴＤＮＡ（５’−CCATATAACTGAAAGCCAAAC−３’）（配列番号：11）および３’末端に蛍光色素TAMRAを結合したADRB2用オリゴＤＮＡ（５’−ACCCACACCTCGTCCCTTTC−３’）（配列番号：１２）を蛍光標識プローブとして用いた。
各蛍光標識プローブ（40pmol）を1mLのハイブリダイゼーション緩衝液（10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH7.0）に溶解しFITCおよびTAMRAに由来する蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値をF0とした。これにＲＮＡサンプル（15μL）を添加しＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼＡ（0.5μg）を作用させた後の蛍光強度値を測定しF1とした。既述の演算式１を用いて補正演算し消光率（Qr）を算出し、これを演算補正した。結果を図５に示す。それぞれのQrは各蛍光プローブの相補性に応答した値を与え、異なる複数のSNPs部位を同時に検出することができた。これらの結果は、本発明の方法により、異なる遺伝子鎖または同一遺伝子鎖内に存在する複数箇所のSNPsを同時に検出可能であることを示している。
【実施例４】
【００４４】
＜遺伝子変異によるマグロの品種判別＞
4.1  ＤＮＡサンプルの調製（ＰＣＲ）
検知遺伝子としてマグロ魚種ミトコンドリアＤＮＡを鋳型としてそれぞれＰＣＲ反応を行い、解析対象（検出対象）部位を含む遺伝子断片を得た。ＰＣＲプライマーには５’末端にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加したプライマー１（配列番号：１３）および遺伝子特異的なプライマー２（配列番号：１４）を用い、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa）により行った。反応条件を以下に示す。
ＰＣＲ反応組成（100μl）：鋳型ＤＮＡ（＜1μg）、Pyrobest（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（2.5 unit）、プライマー１（1μM）、プライマー２（1μM）、ｄＮＴＰ（200μM）、1 x Pyrobest
Buffer II。
ＰＣＲ条件：熱変性（95℃、5min）1サイクルを行った後、［熱変性（95℃、15sec）−アニーリング（55℃、30sec）−伸長反応（72℃、30sec）］35サイクルを行った。
プライマー１：
５’−ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGACTTGCATTCCCTCTCTG−３’
プライマー２：
５’−TTAGAAGGAAAAGTAGGGTTGCTGTTAG−３’【００４５】
4.2  ＲＮＡサンプルの調製（インビトロ転写反応）
4.1に示す工程により得られたPCR産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖ＲＮＡを調製した。転写反応は、T7 RiboMAXTM Express Large
Scale RNA Production System (Promega)により行った。ＲＮＡ産物はエタノール沈殿を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものをＲＮＡサンプルとした。反応条件を以下に示す。
反応組成（20μl）：ＰＣＲ反応液（2μL）、Enzyme Mix, T7 Express（2μL）、1 x RiboMAXTM Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30℃、30min）の後、Dr. GenTLETM Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いてＲＮＡサンプルを回収した。【００４６】
4.3  蛍光標識プローブと蛍光消光プローブを併存させた変異検出
図８に示すように、５’末端に蛍光色素(FITC)を結合したオリゴＤＮＡ（５’−GAAGGACAGTTGCTGCTGTA−３’）（配列番号：１５）および3’末端に消光分子（ＢＨＱ−１）を結合したオリゴＤＮＡ（５’−TACAGTTGGCATTAGTGGTA−３’）（配列番号：１６）をそれぞれ蛍光標識プローブおよび蛍光消光プローブとして用いた。
蛍光標識プローブ（20pmol）および蛍光消光プローブ（100pmol）を1mLのハイブリダイゼーション緩衝液（10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、pH7.0）に溶解し蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値をF0とした。これにＲＮＡサンプル（15μL）を添加しＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼＡ（0.5μg）を作用させた後の蛍光強度値を測定しＦ１とした。既述の演算式１を用いて補正演算し消光率（Qr）を算出した。この例では、太平洋産クロマグロを判別することを目的とし、その遺伝子を標的遺伝子（配列番号：１７）とした。
その結果を図９に示す。一連の結果より、ＲＮＡサンプルと蛍光標識プローブが完全相補的であるときにおいて〔すなわち、検出対象部位の塩基がTである対照遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいては〕高い消光率を与え、末端部位において相補性を有さない場合には〔すなわち、検出対象部位の塩基がT以外である標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいては〕消光率を著しく減少させることが示された。このように、ハイブリダイゼーション前後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで太平洋マグロ魚種を判別することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法は、少量のサンプルから、特化された分析機器を必要とせずに簡便に遺伝子中の特定の塩基の変異や存否の判定を可能にするので、遺伝子解析に基づく疾病の診断、予防または治療のための手段や薬剤の開発、あるいは農水畜産物の品種同定や品種改良、環境変化の評価など産業の多くの分野における利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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