(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えDNA分子の作製方法であって、以下のステップ：
(a) (i)シャトルベクター用の２組の複製起点及び選択マーカーを含むプラスミドであって、一の微生物において機能する第一の複製起点と選択マーカーとの間に、他の微生物において機能する第二の複製起点及び選択マーカーが組み込まれたプラスミドを切断することにより調製された２組の複製起点及び選択マーカーを含有するDNA断片と、
(ii)両端にクローニングベクターと相同な配列を付加したクローニングの目的DNA断片と、
(iii)第一の複製起点及び第一の選択マーカーを含むクローニングベクターのうち第一の複製起点又は第一の選択マーカーの領域内のDNA配列、並びに当該複製起点及び選択マーカー以外の領域内でクローニングの目的DNA断片との相同組換えがおこる部分の中間にある任意の部位のDNA配列をそれぞれ切断することにより得られたDNA断片とを宿主に導入するステップ、並びに
(b) 各DNA断片の一部に相同組換えを起こさせて目的DNA断片をクローニングベクターにクローニングするとともにシャトルベクターを構築するステップ、
を含む前記方法。
【請求項２】
一の微生物が大腸菌である請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一の複製起点が、PUC起点、ColE1起点、pBR322起点、pACYC起点、pSC101起点、f1起点、M13起点、BACベクターの起点、PACベクターの起点、及びコスミドベクター起点からなる群から選択されるいずれかのものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一の選択マーカーが、Ampr、Tetr、Cmr、Kmr、Spcr、Hygr、Gmr、Rifr、Zeocinr、及びBlasticidinrからなる群から選択されるいずれかのものである請求項２記載の方法。
【請求項５】
他の微生物が酵母である請求項１記載の方法。
【請求項６】
酵母がサッカロマイセス・セレビシアエである請求項５記載の方法。
【請求項７】
第二の複製起点が、２μ起点及びARSからなる群から選択されるいずれかのものである請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
第二の選択マーカーが、URA3、TRP1、SUP4、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、KANMX、AUR1-C、CYH2、CAN1、PDR4、及びhphMXからなる群から選択されるいずれかのものである請求項５又は６記載の方法。
【請求項９】
プラスミドが、配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含むプラスミドである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
目的DNA断片が２種類以上含まれることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
２種類以上の目的DNA断片は、クローニングベクターに直列に連結されるように連結部が互いに相同な配列を含むものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
宿主が酵母である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
酵母がサッカロマイセス・セレビシアエである請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、組換えＤＮＡ分子作製法に関し、詳しくはＤＮＡ断片のクローニング及び酵母シャトルベクター構築を同時実行する方法に関する。
【背景技術】  伝統的な大腸菌を用いた異種ＤＮＡのクローニング法、いわゆるＣｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法（文献１）は、クローニングベクターとクローン化するＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、それらをＤＮＡ連結酵素で連結させ、大腸菌に形質転換し、大腸菌で増幅させる方法であり、分子生物学研究の基盤となっている。また、現在、様々な生物のゲノム配列が決まったことによって、所望のＤＮＡ断片をクローニングベクターにクローン化する研究手法の重要性が、より高まっている。しかし、伝統的なＤＮＡのクローニング法は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作を含むため、熟練を要する。また、所望のＤＮＡ断片をクローニングすることができたとしても、多数の大腸菌コロニーの中から選抜する操作に時間を要するため、クローン化の効率が悪い。従って、伝統的なＤＮＡのクローニング法は、分子生物学研究の障害となり、ポストゲノム解析で必要とされるハイ・スループットな網羅的遺伝子解析には、不適当である。
このようなことから、伝統的なＤＮＡのクローニング法に代わる、よりクローン化の効率が高い新たなＤＮＡのクローニング法がいくつか開発された。１）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙ法、あるいは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＣｒｅ−ｌｏｘＰ法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え法、２）大腸菌を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法（文献２および３）、および、３）パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法（文献４および５）などである。
１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え法は、ＤＮＡ断片をクローニングベクターにクローン化する際に、ＤＮＡ配列特異的組換え酵素を用いる方法である。
しかし、クローニングベクター側、および、クローン化するＤＮＡ断片側に、特定のＤＮＡ配列が必要である。クローン化したいＤＮＡ断片の両端にこの特定のＤＮＡ配列をＰＣＲ等により付加することは可能であるが、クローニングベクターがこの特定のＤＮＡ配列をもっていない場合は、クローニングベクターにこの配列を付加することは、伝統的なＤＮＡのクローニング法によって行う必要があるため必ずしも容易ではない。また、ＤＮＡ配列特異的組換え酵素は、高価である。
２）の大腸菌を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法（文献２および３）は、ファージに由来する複数のタンパク質を発現させた大腸菌株が、高い相同組換え能をもつことを利用する方法である。この方法は、図１のパン酵母相同組換え法とよく似ている。まず、クローニングベクターと相同な配列をもったプライマーでＰＣＲを行うことにより、クローン化したいＤＮＡ断片の両端にクローニングベクターと相同な配列を付加する。また、相同組換えがおこる部分の中間に位置する任意の部位で、クローニングベクターを制限酵素などで切断しておく。つぎに、両端にクローニングベクターと相同な配列をもつクローン化の目的ＤＮＡ断片、および、切断したクローニングベクターを、相同組換え能が高い大腸菌株に形質転換すると、細胞内（すなわちｉｎ  ｖｉｖｏ）で相同組換えが起こり、所望のＤＮＡ断片をクローニングベクターにクローン化できる。この反応は、制限酵素部位とは無関係に起こるため，ベクター配列中の様々な位置に、ＤＮＡ断片を挿入することが可能である。また、伝統的なＤＮＡのクローニング法では、クローン化したいＤＮＡ断片の大きさが大きくなればなるほど、クローン化の効率が下がるのに対して、この方法は、クローン化したいＤＮＡ断片の大きさにあまり依存しない点も特長である。
しかしながら、この方法は、高い形質転換効率を得るために電気的形質転換（エレクトロポーレーション）を行う必要がある。エレクトロポーレーションの装置およびエレクトロポーレーション用キュベットが高価である上に、エレクトロポーレーションの作業中に短絡がおこりアークが飛ぶ等の事故が生じやすい。このような事故を防ぐために、ＤＮＡ溶液中から徹底的に塩を除く操作が必要であるが、この操作は煩雑である。
３）のパン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法（文献４および５）は、パン酵母が極めて高い相同組換え能をもつことを利用する方法である（図１）。この方法では、まず、クローニングベクターと相同な配列をもったプライマーでＰＣＲを行うことにより、クローン化したいＤＮＡ断片の両端にクローニングベクターと相同な配列を付加する。また、相同組換えがおこる部分の中間に位置する任意の部位で、クローニングベクターを制限酵素などで切断しておく。つぎに、両端にクローニングベクターと相同な配列をもつクローン化の目的ＤＮＡ断片、および、切断したクローニングベクターを、パン酵母に形質転換する。その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏで相同組換えがおこり、望むＤＮＡ断片がクローニングベクターにクローン化できる。この反応は、２）の大腸菌を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法と同様に、制限酵素部位とは無関係に起こるため，ベクター配列中の様々な位置に、ＤＮＡ断片を挿入することが可能である。また、大腸菌を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法と同様に、伝統的なＤＮＡのクローニング法では、クローン化したいＤＮＡ断片の大きさが大きくなればなるほど、クローン化の効率が下がるのに対して、この方法は、クローン化したいＤＮＡ断片の大きさにあまり依存しない点も特長である。この方法は、パン酵母が極めて高い相同組換え能をもつため、エレクトロポーレーションによらず、化学的形質転換法（酢酸リチウム法）によって、形質転換を行っても、十分な数の形質転換体が得られる。また、パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法を用いたクローニングの最も大きな特長として、図２の多断片連結が容易であることがあげられる（文献４）。すなわち、３０ｂｐ程度の相同配列を持ったＤＮＡ断片を複数組み合わせることによって、複数のＤＮＡ断片を連結して、クローニングベクターへクローン化できる。多断片連結により融合タンパク質を容易に作成することができるので、遺伝子・タンパク質の機能解析にとって有用である。例えば、研究対象の遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合、タンパク質のドメインの置換などに活用できる。また、この方法は、タンパク質への部位特異的突然変異導入にも適用できる。すなわち、図２の中央の朱赤の部分に相当するプライマーに変異を入れておいてＰＣＲでＤＮＡ断片を増幅し、パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法で、多断片連結を行うことにより可能になる。
上記説明した通り、パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法は多くの優れた効果を有する。
しかしながら、パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法は、ＤＮＡを大量に調製する操作を行う際に、大腸菌に移し替える必要があるため、パン酵母−大腸菌シャトルベクターが必要とされる。研究者等に使用されているベクターは、多くの場合、パン酵母−大腸菌シャトルベクターではないため、大腸菌では複製可能であってもパン酵母では複製できないことが多い。従って、使用の目的となるベクターでパン酵母相同組換え法を行うには、まず、使用したいベクターをパン酵母−大腸菌シャトルベクターに変換した後に、パン酵母相同組換え法で所望のＤＮＡ断片をクローニングベクターに入れる必要がある。このような操作は時間がかかり、煩雑である。
【発明の開示】
そこで、本発明は、酵母シャトルベクターでない一般的なベクターに、パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法によってＤＮＡ断片のクローニングする方法を提供することを目的とする。本発明は、クローニングおよび酵母シャトルベクター構築を同時に行う方法である。この方法は、市販されているベクター、あるいは、各研究者が独自に開発したベクターの多くに適用可能である。
これまで、一般的なクローニングベクターを用いて遺伝子をクローニングするとともに、異宿主間において増殖可能なベクターを簡便に作製する方法の開発が望まれていた。本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、異宿主間で増殖不可能である一般的なクローニングベクターを異宿主間で増殖することを可能とするプラスミドを開発し、当該プラスミドを用いることにより遺伝子のクローニング及びシャトルベクターの構築を同時に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）シャトルベクター用の２組の複製起点及び選択マーカーを含むプラスミドであって、一の微生物において機能する第一の複製起点と選択マーカーとの間に、他の微生物において機能する第二の複製起点及び選択マーカーが組み込まれたプラスミド。
上記プラスミドにおいて、一の微生物としては大腸菌が挙げられる。大腸菌において機能する複製起点としては、例えばＰＵＣ起点、ＣｏｌＥ１起点、ｐＢＲ３２２起点、ｐＡＣＹＣ起点、ｐＳＣ１０１起点、ｆ１起点、Ｍ１３起点、ＢＡＣベクターの起点、ＰＡＣベクターの起点、及びコスミドベクター起点からなる群から選択されるいずれかのものが挙げられ、選択マーカーとしては、例えばＡｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、Ｓｐｃｒ、Ｈｙｇｒ、Ｇｍｒ、Ｒｉｆｒ、Ｚｅｏｃｉｎｒ、及びＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒからなる群から選択されるいずれかのものが挙げられる。
また、上記プラスミドにおいて、他の微生物としてはサッカロマイセス・セレビシアエなどの酵母が挙げられる。酵母において機能する複製起点としては、例えば２μ起点、及びＡＲＳからなる群から選択されるいずれかのものが挙げられ、選択マーカーとしては、例えばＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＳＵＰ４、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＫＡＮＭＸ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＣＹＨ２、ＣＡＮ１、ＰＤＲ４、及びｈｐｈＭＸからなる群から選択されるいずれかのものが挙げられる。
上記プラスミドは、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものであることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシャトルベクターとして機能し得るプラスミド。
（２）組換えＤＮＡ分子の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記（１）に記載のプラスミドを切断することにより調製された２組の複製起点及び選択マーカーを含有するＤＮＡ断片と、クローニングの目的ＤＮＡ断片と、複製起点及び選択マーカーを含むクローニングベクターのうち複製起点又は選択マーカーの領域内のＤＮＡ配列、並びに当該複製起点及び選択マーカー以外の領域内のＤＮＡ配列をそれぞれ切断することにより得られたＤＮＡ断片とを宿主に導入するステップ、並びに
（ｂ）各ＤＮＡ断片の一部に相同組換えを起こさせて目的ＤＮＡ断片をクローニングベクターにクローニングするとともにシャトルベクターを構築するステップ、
を含む前記方法。
本発明の方法においては、目的ＤＮＡ断片は１種類に限定されるものではなく、２種類以上含まれてもよい。この場合、２種類以上の目的ＤＮＡ断片は、クローニングベクターに直列に連結されるように連結部が互いに相同な配列を含むものである。上記ＤＮＡ断片を組込むための宿主としては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ等の酵母が挙げられる。
（３）上記（２）に記載の方法により作製された組換えＤＮＡ。
（４）上記（３）に記載の組換えＤＮＡを含む形質転換体。
本発明の方法は、目的ＤＮＡのクローニング及びシャトルベクター同時構築のために、市販のベクター又は独自に開発されたベクターの多くに適用できる点で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、酵母における相同組換え法を示す図である。
図２は、多断片連結の概要を示す図である。
図３は、多くのベクターの共通構造を示す図である。
図４は、本発明の仲人プラスミドｐＳＵ０を示す図である。
図５は、本発明の方法の概要を示す模式図である。
図６は、本発明の仲人プラスミドｐＳＵ０のＤＮＡ配列（配列番号１）及びその注釈付けを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＤＮＡ断片のクローニング及び酵母シャトルベクター構築を同時実行する方法に関する。
本発明者は、酵母シャトルベクターではない一般的なベクターに、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母、ビール酵母又はワイン酵母ともいう）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法でＤＮＡ断片を高効率でクローン化できる方法を開発した。まず、本発明者は、クローニングおよび酵母シャトルベクター構築を同時に行うことができるのではないかと考え、この目的のために最適な仲人プラスミドを構築した。「仲人プラスミド」とは、クローニングベクターとクローニングの目的ＤＮＡ断片との結合を媒介するプラスミドという意味である。クローニングベクターと目的ＤＮＡ断片との結合を「結婚」に例えて「仲人プラスミド」と命名したものである。
クローニングベクターとして市販されているベクター、あるいは、研究者が独自に開発したクローニングベクターの大部分は、共通の構造としてアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ、βラクタマーゼをコード）の等の選択マーカーの３’側に複製に必要な配列であるＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎまたはＣｏｌＥ１  ｏｒｉｇｉｎ等をもっている（図３）。この共通の構造は、多くのベクターの起源となるベクターｐＢＲ３２２（文献７）に由来するものである。なお、ＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎは、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉｇｉｎに一塩基の置換がおこったものであるため、相同組換えという点では両者の間にほとんど違いはない。
本発明者は、この多くのベクターに共通する構造に着目し、図４に示すような仲人プラスミドを用いれば、市販のクローニングベクター、あるいは、各研究者が独自に開発したクローニングベクターの大部分を、パン酵母−大腸菌シャトルベクターに容易に変換できると考えた。
１．仲人プラスミド
本発明の仲人プラスミドは、シャトルベクターとして機能できるように、シャトルベクターとして利用される選択マーカー及び複製起点を２組含有する。１つは、第一の宿主（例えば大腸菌等）において複製機能を有する選択マーカー及び複製起点である。他の１つは、第一の宿主とは異なる第二の宿主（例えば酵母等）において複製機能を有する選択マーカー及び複製起点である。
ここで、「選択マーカー」とは、形質導入や形質転換などの実験において、組換え体を非組換え体から選別するのに用いられるＤＮＡを意味し、薬剤耐性のものや栄養要求性のものが含まれる。「複製起点」とは、染色体やプラスミド上に存在する複製制御因子を意味し、ＤＮＡの複製開始反応が起こるＤＮＡ領域を意味する。「シャトルベクター」とは、遺伝子の複製や発現の機構が異なる２種の生物種のどちらの細胞でも自立増殖できるベクターを意味し、例えば、大腸菌−酵母シャトルベクターは、酵母用のＤＮＡ複製機構として酵母プラスミドであるＤＮＡ又は酵母染色体の複製単位（ＡＲＳ）を大腸菌プラスミドベクターに挿入したものである。
本発明の仲人プラスミドは、第一の宿主において機能する選択マーカーと複製起点との間に、第二の宿主において機能する選択マーカー及び複製起点が連結された構造をとっている（図４）。従って、本発明の仲人プラスミドは、基本的には第一の宿主において機能する選択マーカー、第二の宿主において機能する複製起点、第二の宿主において機能する選択マーカー及び第一の宿主において機能する複製起点を、この順で含む構造を有する。但し、このような順序に限定されるものではなく、第一の宿主において機能する選択マーカーと複製起点とを並べ替えた構造であってもよく、第二の宿主において機能する選択マーカーと複製起点とを並べ替えた構造でもよい。
図４は、大腸菌において機能する選択マーカー及び複製起点として、それぞれＡｍｐｒ、ＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を示しており、酵母において機能する選択マーカー及び複製起点としてそれぞれＵＲＡ３、２μ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を示しているが、これらに限定されるものではない。従って、第一の宿主として大腸菌を使用する場合は、第二の宿主として酵母を使用することができる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシアエのほか、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などが挙げられる。また、第一の宿主として酵母を使用する場合は第二の宿主として大腸菌、哺乳類細胞などを使用することができる。従って、これらの宿主において機能する選択マーカー及び複製起点は、例えば以下のものが挙げられる。
大腸菌において機能する複製起点：ＰＵＣ起点、ＣｏｌＥ１起点、ｐＢＲ３２２起点、ｐＡＣＹＣ起点、ｐＳＣ１０１起点、ｆ１起点、Ｍ１３起点、ＢＡＣベクターの起点、ＰＡＣベクターの起点、コスミドベクター起点
大腸菌において機能する選択マーカー：Ａｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、Ｓｐｃｒ、Ｈｙｇｒ、Ｇｍｒ、Ｒｉｆｒ、Ｚｅｏｃｉｎｒ、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒ
サッカロマイセス・セレビシアエにおいて機能する複製起点：２μ起点、ＡＲＳ
サッカロマイセス・セレビシアエにおいて機能する選択マーカー：ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＳＵＰ４、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＫＡＮＭＸ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＣＹＨ２、ＣＡＮ１、ＰＤＲ４及びｈｐｈＭＸ
シゾサッカロマイセス・ポンベにおいて機能する複製起点：ＡＲＳ、２μ起点
シゾサッカロマイセス・ポンベにおいて機能する選択マーカー：ＬＥＵ１、ＵＲＡ４、ＡＤＥ６、ＨＩＳ２、ＫＡＮＭＸ、ＡＵＲ１ｒ
哺乳類細胞において機能する複製起点：ＳＶ４０起点
哺乳類細胞において機能する選択マーカー：Ｚｅｏｃｉｎｒ、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒ、Ｈｙｇｒ、Ｎｅｏｍｙｃｉｎｒ
仲人プラスミドは、後述するようにＤＮＡを宿主内に導入して相同組換えを起こさせるため、直鎖状のＤＮＡ断片にする必要がある。そこで、仲人プラスミドには制限酵素による切断部位を有していることが好ましい。制限酵素部位は、２組の複製起点及び選択マーカー以外の領域に存在させることが好ましい。切断制限酵素としては、Ｅｃｏ  ＲＩ、ＢａｍＨ１、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉなど用いられるが、これらに限定されるものではない。図４においてはＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断部位を例示した。
本発明においては、汎用性に圧倒的に優れている点で図４に示すｐＳＵ０仲人プラスミド（ｐＳＵ０プラスミド）であることが好ましい。ｐＳＵ０プラスミドのＤＮＡ配列（配列番号１）及びその注釈付けを図６に示す。ｐＳＵ０プラスミドは、市販のベクター等に共通な選択マーカーであるＡｍｐｒと市販のベクター等に共通な複製起点であるＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎとの間に、酵母の複製起点である２μ  ｏｒｉｇｉｎ及び酵母の選択マーカーであるＵＲＡ３を含んでおり、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断される制限酵素部位を有する。このｐＳＵ０プラスミドは、酵母シャトルベクター作製を単独で行う際にも有効である。
また、本発明のｐＳＵ０プラスミドは、配列番号１に示される塩基配列のほか、配列番号１に示される塩基配列に対し相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシャトルベクターとしての機能することができるＤＮＡを含む。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。
また、本発明の仲人プラスミドは、上記ｐＳＵ０に限られず、例えば、複製起点ｆ１  ｏｒｉｇｉｎと選択マーカーＡｍｐｒを有するクローニングベクターに対応して仲人プラスミドを設計することができる。従って、図４に例示した仲人プラスミドのほか、ｆ１  ｏｒｉｇｉｎ、酵母由来の複製制御因子２μ  ｏｒｉｇｉｎ、酵母由来選択マーカーＵＲＡ３及びＡｍｐｒをこの順序で含むプラスミドなども、本発明に含まれる。このプラスミドはｐＳＵ０と同様のクローン化効率を示す。
仲人プラスミドは通常の相同組換え法を用いて得ることができる。すなわち、ｐＳＵ０プラスミドは以下の方法で構築できる。Ａｍｐｒを含むＤＮＡ断片、ＵＲＡ３及び２μ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を含むＤＮＡ断片、およびＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法にて増幅する。この際に、Ａｍｐｒを含むＤＮＡ断片の３’側ＤＮＡ配列とＵＲＡ３及び２μ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を含むＤＮＡ断片の５’側ＤＮＡ配列が４０ｂｐにわたって相同になるようしておく。また、ＵＲＡ３及び２μ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を含むＤＮＡ断片３’側ＤＮＡ配列とＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を含むＤＮＡ断片の５’側ＤＮＡ配列が４０ｂｐにわたって相同になるようしておく。同様に、ＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎ（起点）を含むＤＮＡ断片の３’側ＤＮＡ配列とＡｍｐｒを含むＤＮＡ断片の５’側ＤＮＡ配列が６０ｂｐにわたって相同になるようしておく。この６０ｂｐ配列中にＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断部位を含むようにする。これら３つのＤＮＡ断片を酵母に形質転換することで、ｐＳＵ０が構築できる。
２．クローニングベクター
所望の目的ＤＮＡ断片をクローニングするためのベクターは、市販のベクターでもよく、研究者により独自に開発されたベクターでもよい。これらのベクターは、前述の通りｐＢＲ３２２（文献７）を起源とする場合が多く、その場合は、選択マーカーであるアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ、βラクタマーゼをコード）の３’側に、ＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎ又はＣｏｌＥ１  ｏｒｉｇｉｎが位置する共通の構造を有する。ｐＢＲ系統のベクターには、ｐＥＴ系統、ｐＵＣ系統、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系統等の大腸菌プラスミドベクター等が含まれる。但し、本発明においては、上記ｐＢＲ３２２などのｐＢＲ系統のベクターに限定されるものではなく、ｐＡＣＹＣ系統のベクター、ｐＳＣ１０１系統のベクター、ｆ１あるいはＭ１３系統のベクター、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクター、コスミドベクター等の大腸菌プラスミドベクター等を使用することができる。
所望のＤＮＡ断片をクローニングするためのベクター由来の選択マーカーには、上記仲人プラスミドにおいて説明したものと同様にＡｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、Ｓｐｃｒ、Ｈｙｇｒ、Ｇｍｒ、Ｒｉｆｒ、Ｚｅｏｃｉｎｒ、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒ等が含まれるがこれらに限定されるものではなく、適宜選択することができる。
３．クローニングの目的ＤＮＡ
クローニングの目的ＤＮＡは任意の遺伝子であり、特に限定されるものではない。例えば、タンパク質をコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、機能性ＲＮＡをコードする遺伝子等が挙げられる。
タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質などが挙げられる。
酵素をコードする遺伝子としては、例えばアミラーゼ、セルラーゼなどが挙げられる。
機能性ＲＮＡをコードする遺伝子としては、例えば２本鎖ＲＮＡなどが挙げられる。
これらの遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号などの情報を基にして任意の手法により得ることができる（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９を参照）。
４．目的ＤＮＡのクローニング及びシャトルベクター構築の同時実行法
図５は、本発明の仲人プラスミドを用いて、「クローニングおよび酵母シャトルベクター構築の同時実行法」を行うための模式図である。
（１）クローニングの目的ＤＮＡ断片の調製
目的ＤＮＡ断片は、上記３において記載した方法により調製することができる。
また、本発明においては、複数種類の目的ＤＮＡをクローニングすることができる。これを本発明においては「多断片連結」という。例えば２種類の目的ＤＮＡ断片を連結してクローニングする場合は、目的ＤＮＡ断片同士が相同組換えを起こすように、目的ＤＮＡ断片の一方の端に互いに相同な配列を付加させておくとともに、他方の端にクローニングベクターの配列（クローニングベクターの切断部位の配列）と相同な配列を付加しておく。
３種類以上の目的ＤＮＡ断片をクローニングする場合は、これらのＤＮＡ断片がタンデムに連結されるように、目的ＤＮＡのうちクローニングベクターと連結するものについては、その一端にクローニングベクターの配列と相同な配列を付加し、目的ＤＮＡ同士が連結する部分については、互いに相同な配列を付加しておく。
相同な配列を付加する方法は、ＰＣＲ法、あるいは、化学合成したヌクレオチド配列をリガーゼ等で連結する方法などが採用される。
（２）クローニングベクターの処理
クローニングベクターは、制限酵素などで、二カ所で切断する。１カ所目は、クローン化したいＤＮＡ断片との相同組換えがおこる部分の中間に位置する任意の部位である（切断部位１とする）。切断部位は、マルチクローニングサイトを含む場合はその中の１箇所であることが好ましい。また、よりクローン化効率を上げるには、さらにもう１箇所のマルチクローニングサイトで切断することが好ましい。
２カ所目の切断部位は選択マーカー又は複製起点の配列上の任意の場所である（切断部位２とする）。ただし、選択マーカー又は複製起点の切断は、マーカー又は複製起点の端から少なくとも２０ｂｐ、好ましくは３０〜４０ｂｐの長さ分だけ、内側の位置で行うことが好ましい。つまり、クローニングベクターを切断したときの切断部は、マーカー又は複製起点の配列が少なくとも２０ｂｐ、好ましくは３０ｂｐ〜４０が残るようにする。
ここで、クローニングの目的ＤＮＡ断片は、クローニングベクターの上記切断部位１に挿入される。その際にクローニングベクターと相同な配列をもったプライマーでＰＣＲを行い、クローン化の目的ＤＮＡ断片の両端にクローニングベクターと相同な配列を付加する。付加する塩基配列の長さは、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは３０〜４０ｂｐが残るようにする。
（３）仲人プラスミドのＤＮＡ断片の調製
仲人プラスミドは、１種類又は２種類の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により、切断断片を回収・精製する。
（４）宿主への導入
上記（１）〜（３）の各ＤＮＡ断片（合計４つのＤＮＡ断片）を、宿主に導入して形質転換を行う。形質転換は、例えば、化学的形質転換法である酢酸リチウム法、プロトプラスト法等を採用することができる。また、電気的形質転換法を採用することもできる。本発明においては、簡便である点で酢酸リチウム法が好ましい。
形質転換すると、酵母内で図５の「×」印で示した４カ所の位置で相同組換えがおこり、クローニングベクターには上記切断部位１において目的ＤＮＡが結合するとともに、切断部位２の領域に仲人プラスミドが結合することによりクローニングベクターが酵母シャトルベクターにかわる。これは、目的ＤＮＡ断片のクローニングおよび酵母シャトルベクター構築が、同時に実行されることを意味する。「同時に」とは、（ａ）クローニングベクターへの目的ＤＮＡ断片の組込みと、（ｂ）仲人プラスミドへのクローニングベクターの組込みが、１つの処理で行われることを意味し、必ずしも、時間的に同時刻に上記（ａ）及び（ｂ）の内容が行われることのみを意味するものではない。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  目的ＤＮＡのクローニングおよび酵母シャトルベクター構築の同時実行
本実施例では、ｐＳＵ０プラスミド、及びクローン化の目的ＤＮＡ断片としてＧＦＰ遺伝子を用いて、クローニングおよび酵母シャトルベクター構築を同時に実施した。この際、クローニングベクターとして、大腸菌でのタンパク質発現用ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いた。ｐＥＴ３２ａ（＋）は、チオレドキシン融合タンパク質の形で、様々なタンパク質を発現させるのに、様々な研究の場でよく用いられているベクターである。ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより、４０ｂｐのクローニングベクターと相同な配列を両端にもち、且つ、チオレドキシンと読み枠が合うような形で増幅した。
次に、ｐＥＴ３２ａ（＋）を切断したもの、ｐＳＵ０を切断したもの、ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を１：１：６のモル比で混合し、パン酵母に形質転換した。以下、実験例を詳細に説明する。
（１）材料と方法
（１−１）用いた菌株
用いたパン酵母ＹＰＨ４９９はＭＡＴａ，ａｄｅ２−１０１，ｈｉｓ３−Δ２００，ｌｅｕ２Δ１，ｌｙｓ２−８０１，ｔｒｐ１−Δ６３，ｕｒａ３−５２９、用いた大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）はＦ−φ８０ｄ  ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ  １６９  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−，ｍＫ＋）ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１であり、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はＦ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒ−Ｂｍ−Ｂ）ｇａｌ  ｄｃｍｒｎｅ１３１（ＤＥ３）である。
（１−２）ｐＳＵ０仲人プラスミドの構築
ｐＳＵ０仲人プラスミドの構築はパン酵母相同組換えを用いて行った。具体的には、まず、ｐＳＵ０の背骨となるＡｍｐｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片、ＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎを含むＤＮＡ断片、及び、２μ  ｏｒｉｇｉｎ、ＵＲＡ３遺伝子の２つを含むＤＮＡ断片をｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を鋳型にしてＰＣＲ法により増幅させた。Ａｍｐｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片はプライマーｐＳＵ０−１及びｐＳＵ０−４により、ＰＵＣ  ｏｒｇｉｎを含むＤＮＡ断片はプライマーｐＳＵ０−３及びｐＳＵ０−６によりそれぞれ増幅させた。
これらのプライマーの塩基配列を以下に示す。
ｐＳＵ０−１（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧ−３’）（配列番号２）
ｐＳＵ０−４（５’−ＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号３）
ｐＳＵ０−３（ＡＡＴＴＡＴＡＴＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡ−３’）（配列番号４）
ｐＳＵ０−６（ＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣ−５’）（配列番号５）
このＰＣＲ反応は製造者の指示に従いＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃で１分反応させた後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で５分反応させた。続いて、Ａｍｐｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び、ＰＵＣ  ｏｒｉｇｉｎを含むＤＮＡ断片にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトを含む相同配列を付加するため、上のＰＣＲ産物を鋳型として、それぞれ順に、プライマーｐＳＵ０−４とｐＳＵ０−７（ｐＳＵ０−６の相補鎖）、及び、ｐＳＵ０−３とｐＳＵ−８（ｐＳＵ１の相補鎖）を用いてそれぞれＰＣＲ法で増幅させた。このＰＣＲ反応は製造者の指示に従いＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃で１分反応させた後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で５分反応させた。一方で、ｐＹＥＳ２／ＣＴを鋳型にして、２μ  ｏｒｉｇｉｎとＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片をプライマーｐＳＵ０−２（ｐＳＵ０−４の相補鎖）とｐＳＵ０−５（ｐＳＵ０−３の相補鎖）を用いてＰＣＲ反応により増幅させた。この反応は、製造者の指示に従いＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃で１分反応させた後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で５分反応させることにより行った。増幅された３つのＰＣＲ断片をＳｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて製造者の指示に従い精製した。
次にこれらのＰＣＲ断片を混合し、ＴＲＡＦＯのプロトコール（文献６）に従って酵母に形質転換し、ＵＲＡを含有しないプレートに播いた。これによって得られたコロニーからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて製造者の指示に従いプラスミドを抽出、精製した。このプラスミドをＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換し、プラスミドを増殖させた。最後に、コロニーを１つ選んで１晩液体培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを抽出し、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断して、ｐＳＵ０仲人プラスミドが作製されたことを確認した。
ｐＳＵ０仲人プラスミドのＤＮＡ配列およびその注釈付けを付図１に示した。
（１−３）ＰＣＲ
ＰＣＲは製造者の指示に従いＰｙｒｏＢｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて行った。ＧＦＰ遺伝子をｐＥＴ３２ａ（＋）にクローニングする実験では、ＧＦＰ遺伝子の５’側及び３’側に以下の配列を付加した。
５’側付加配列：ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡ（配列番号６）
３’側付加配列：ＡＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡ（配列番号７）
ｐＥＴ３２ａ（＋）にＧＦＰ遺伝子およびＲＦＰ遺伝子を多断片連結する実験では、各遺伝子の５’側及び３’側に以下の配列を付加した。
ＧＦＰ遺伝子
５’側付加配列：ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡ（配列番号６）
３’側付加配列：ＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣ（配列番号８）
ＲＰ遺伝子
５’側付加配列：ＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡ（配列番号９）
３’側付加配列：ＡＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡ（配列番号７）
ＰＣＲ溶液の組成とサイクル条件を以下に示す。
組成：１０×ＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーＩＩ５μｌ，２．５ｍＭ  各  ｄＮＴＰ  ミックス４μｌ，プライマー各４μｌ、水  ３１μｌ、テンプレートＤＮＡ２μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ０．２５μｌ
サイクル条件：（９８℃を１０秒、５５℃を３０秒、７２℃を１分）×３５サイクル
（１−４）ＤＮＡの精製
上記ＰＣＲ増幅断片および制限酵素ＢａｍＨＩで切断したｐＳＵ０仲人プラスミドは、１％アガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて回収・精製した。ｐＥＴ３２ａ（＋）については、制限酵素ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで切断したのみで、更なる精製は行わなかった。
（１−５）形質転換
パン酵母形質転換は、ＴＲＡＦＯプロトコール（文献６）によって行った。大腸菌については、形質転換可能の状態の大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）及び、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を購入し、製造者の指示に従い形質転換を行った。チオレドキシン融合ＧＦＰおよびチオレドキシン融合ＧＦＰ−ＲＦＰの発現の確認は、視認で行った。
（２）結果
形質転換の結果、４０１個のコロニーが得られた。
次に、酵母形質転換体全てをプレートから回収し、液体培養を経ず、直接、プラスミドＤＮＡを抽出しＤＨ５αに形質転換して、酵母の場合と同様にプラスミドを抽出した。なお、具体的な抽出法は以下の通りである。
酵母のプレートにガラスビーズ及び、水を加えて、コロニーを懸濁し、それをチューブに回収した。続いて、酵母を集菌してＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）のバッファーＰ１に懸濁し、細胞破砕用のガラスビーズを加え、強く攪拌し、酵母の細胞を破壊した。それを遠心分離して上清を回収し、後は製造者の指示に従いプラスミドの抽出を行った。そのプラスミドをＤＨ５αに形質転換し、プラスミドを大量に増幅させた後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）で製造者の指示に従いプラスミドを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に形質転換したところ、得られたコロニーの５９％がＧＦＰを発現していた（表１）。
従来の方法では、形質転換効率は、１０％以下である場合が度々あることから、この結果は、比較的高い効率でＤＮＡ断片のクローニングが可能であることを示している。
【表１】
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また、コントロール実験として、（ｉ）ｐＥＴ３２ａ（＋）を切断したもののみを形質転換する実験、および、（ｉｉ）クローン化の目的ＤＮＡ断片を加えずに形質転換する実験を行った。コントロール実験は、ｐＥＴ３２ａ（＋）を切断したもの、ｐＳＵ０を切断したもののモル比を１：１として行った。その結果、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の実験により、それぞれ５０個および１３５個のコロニーが得られた。コロニーの数は、ＧＦＰ遺伝子をクローニングする実験の１２％および３４％と比較的多かったが、これらの実験では非相同末端結合の効果が強く現れるためであると考えられる。
〔実施例２〕  多断片連結
パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法を用いたクローニングの特長として、図２の多断片連結が容易であることがあげられる。そこで、本実施例では、実施例１と同様な実験系により多断片連結を行い、チオレドキシン−ＧＦＰ−ＲＦＰの融合遺伝子を構築した。ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片の５’側およびＲＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片の３’側は、４０ｂｐのクローニングベクターと相同な配列をもつ。ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片の３’側およびＲＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片の５’側は、互いに相同な４０ｂｐの配列をもつ。ｐＥＴ３２ａ（＋）を切断したもの、ｐＳＵ０を切断したもの、ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片、ＲＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を１：１：６：６のモル比で混ぜて、パン酵母に形質転換したところ、３２３個のコロニーが得られた。パン酵母から回収したプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、そこで得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを回収し、さらに、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に形質転換したところ、得られたコロニーの３７％がＧＦＰおよびＲＦＰの活性をもっていた（表１）。この結果は、本発明の方法を用いて、高い効率で多断片連結が可能であることを示している。
〔実施例３〕目的のＤＮＡのクローニングおよび酵母シャトルベクター構築の同時実行（ｐｓＵ０、ｐＥＴ３２ａ（＋）を二種類の制限酵素で切断した場合）
本実施例では、ｐＳＵ０を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩの両方で切断し、且つ、ｐＥＴ３２ａ（＋）のマルチクローニングサイトを二種類の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩで切断し、さらにｐＥＴ３２ａ（＋）のＡｍｐｒ遺伝子に含まれるＰｓｔＩで切断した。実施例１と同様な実験系により目的のＤＮＡのクローニングを行った。ｐＥＴ３２ａ（＋）を切断したもの、ｐＳＵ０を切断したもの、ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を１：１：１のモル比で混ぜて、パン酵母に形質転換したところ、３９６８個のコロニーが得られた。パン酵母から回収したプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、そこで得られたコロニーから回収したプラスミドＤＮＡをさらに、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に形質転換したところ、得られたコロニーの９７％がＧＦＰの活性を有していた（表２）。この結果は、ｐＳＵ０、ｐＥＴ３２ａ（＋）を二種類の制限酵素で切断したほうが、より高い効率で目的ＤＮＡのクローニングが可能であることを示している（表２）。
【表２】
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〔実施例４〕  多断片連結（ｐＳＵ０、ｐＥＴ３２ａ（＋）を二種類の制限酵素で切断した場合）
本実施例では、実施例３と同様な実験系により目的のＤＮＡのクローニングを行った。ｐＥＴ３２ａ（＋）を切断したもの、ｐＳＵ０を切断したもの、ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片、ＲＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を１：１：１：１のモル比で混ぜて、パン酵母から回収したプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られたコロニーから回収したプラスミドＤＮＡをさらに、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に形質転換した。その結果、得られたコロニーの７０％がＧＦＰおよびＲＦＰの活性を有していた（表２）。この結果は、ｐＳＵ０、ｐＥＴ３２ａ（＋）を二種類の制限酵素で切断したほうが、より高い効率で多断片連結が可能であることを示している（表２）。
以上説明した通り、本発明者は、酵母シャトルベクターでない一般的なベクターに、パン酵母を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法でＤＮＡ断片をクローニングする方法を開発した。また、この方法を、市販されているベクター、あるいは、各研究者が独自に開発したベクターの多くに適用可能にするために、ｐＳＵ０仲人プラスミドを開発した。開発した方法を、ＧＦＰ遺伝子をモデルとして試してみたところ、高い効率でＤＮＡ断片のクローニングが可能であることがわかった。また、多断片連結が可能であるかどうかをＧＦＰおよびＲＦＰの融合タンパク質の構築をモデルとして試みたところ、これも、比較的高い効率で実行可能であることがわかった。
Ｇａｔｅｗａｙなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え法は、研究に使いたいクローニングベクターが特定のＤＮＡ配列を持つ必要があるという欠点をもつ。そのため、ベクターに特定の配列を伝統的クローニング法などで付加する必要があった。また、従来のパン酵母相同組換え法でも、同様の欠点があった。すなわち、研究に使いたいベクターをパン酵母−大腸菌シャトルベクターに変換した後に、パン酵母相同組換え法で望むＤＮＡ断片をクローニングベクターに入れる必要があった。
これに対し、本発明の方法は、多くのクローニングベクターに共通の構造を利用しているので、上記欠点の影響を受けない。また、本発明の方法は、高価な酵素を用いないため、Ｇａｔｅｗａｙなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え法に比べて安価である。しかも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの操作が相対的に少なく簡便である点で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え法に比べて優れている。
さらに、本発明の方法は、多断片連結が可能である点で、多断片連結ができないｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換え法よりも優れている。多断片連結により融合タンパク質を容易に作成することができるので、研究対象の遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合、タンパク質のドメインの置換などに適用することができる。また、多断片連結によって、タンパク質への部位特異的突然変異導入も容易に行うことができる。
さらに、本発明の方法は、大腸菌を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え法と比べて、クローニングベクターと相同な配列の長さが相対的に短くて良く、また、エレクトロポーレーション装置などの特別な装置を必要としないなどの点で優れている。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法は、目的ＤＮＡ断片のクローニングとシャトルベクター構築を同時に実行することができる点で有用である。また、本発明のプラスミドを用いると、所望のベクターに目的遺伝子を挿入することができ、また、融合タンパク質作成や部位特異的変異の導入などを行うことができるため、実用的にも極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：ｐＳＵ０プラスミド
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
以下の文献は、参照として本明細書全体に組込まれるものとする。
文献
１．  Ｃｏｈｅｎ  ＳＮ，Ｃｈａｎｇ  ＡＣ，Ｂｏｙｅｒ  ＨＷ，ａｎｄ  Ｈｅｌｌｉｎｇ  ＲＢ．（１９７３）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．７０，３２４０−３２４４．
２．  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｆ，Ｍｕｙｒｅｒｓ  ＪＰ，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＦ．（１９９８）Ａ  ｎｅｗ  ｌｏｇｉｃ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０，１２３−１２８．
３．  Ｙｕ  Ｄ，Ｅｌｌｉｓ  ＨＭ，Ｌｅｅ  ＥＣ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，ａｎｄ  Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ．（２０００）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７，５９７８−５９８３．
４．  Ｍａｒｙｋｗａｓ  ＤＬ，ａｎｄ  Ｐａｓｓｍｏｒｅ  ＳＥ．（１９９５）Ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２，１１７０１−１１７０５．
５．  Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ＫＲ，Ｖｏ  ＫＴ，Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｓ，ａｎｄ  Ｐａｄｄｏｎ  Ｃ．（１９９７）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，４５１−４５２．
６．  Ｇｉｅｔｚ  ＲＤ，ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  ＲＡ（２００２）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ／Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．３５０，８７−９６．
７．  Ｂｏｌｉｖａｒ  Ｆ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＲＬ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＰＪ，Ｂｅｔｌａｃｈ  ＭＣ，Ｈｅｙｎｅｋｅｒ  ＨＬ，ａｎｄ  Ｂｏｙｅｒ  ＨＷ．（１９７７）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ．ＩＩ．Ａ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．２，９５−１１３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−２】
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【図６−３】
0004961563.tif 000011
【図６−４】
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【図６−５】
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【配列表】
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