(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子キシログルカンを植物組織に組み入れて植物細胞の成長を促進させる低分子キシログルカン組み入れ工程と、高分子キシログルカンを植物細胞に組み入れて植物細胞の成長を抑制する高分子キシログルカン組み入れ工程とを用いることにより植物細胞の成長をコントロールする方法。
【請求項２】
低分子及び高分子キシログルカンが高等植物由来の多糖類である請求項１記載の方法。
【請求項３】
低分子キシログルカンの有効量が１００−１０００００μＭ濃度である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
高分子キシログルカンの有効量が１０−１０００μＭ濃度である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
脂肪、タンパク質、ハイドロコロイド、界面活性剤、多糖類、有機溶剤及び無機溶剤から選択される植物の茎葉処理剤１種又はそれ以上を加える請求項１−４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低分子又は高分子キシログルカンを用いて植物細胞の成長をコントロールする方法に関する。又、本発明は、植物細胞の成長をコントロールする反応に関与するキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼの発現を抑制剤で抑制することにより植物細胞の成長を促進させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシログルカンは高等植物の成長している細胞壁（一次壁）に多く存在する多糖類である。その化学構造は、１，４−β−グルカン主鎖にキシロースが枝状に結合し、グルコース４残基あたり３つのキシロース残基がそれぞれα(1→６)で結合して７糖単位を構成し、規則的な骨格構造を保っている。分岐したキシロース残基にはところどころガラクトース残基がβ（１→２）で結合している。ある種のものは、さらにそのガラクトース残基に所々フコース残基がα（１→２）で結合している。それらの化学構造は、タマリンド〔Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 80, 849-865 (1961)〕、エンドウ〔Plant Physiology, 75, 596-604 (1984)〕、ダイズ〔Plant Cell Physiology, 21, 1405-1418 (1980)〕、ポプラ〔Bioscience Biotechnology Biochemistry, 58, 1707-1708 (1994)〕、イネ〔Plant Cell Physiology, 26, 437-445 (1985)〕、タケノコ〔Carbohydrate Research, 109, 233-248 (1982)〕などについて報告されている。
【０００３】
キシログルカンは、骨格である主鎖がセルロースと同じ１，４−β−グルカンであるため、セルロースと水素結合で結びつくことができる。実際、キシログルカンは植物細胞壁中ではセルロースミクロフィブリルと架橋してネットワークを形成しており、このネットワークは植物細胞の成長に関与していることが示唆されている〔Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol., 40, 139-168 (1989)〕。
【０００４】
キシログルカンの分解物である低分子キシログルカンは、キシログルカンの１，４−βグルカン主鎖がキシログルカナーゼ酵素標品によって分解されることにより生ずる。植物細胞はこの酵素を持っており、生成した低分子キシログルカンによって細胞成長をコントロールしている可能性が示唆される。
【０００５】
低分子キシログルカンの植物細胞に対する作用については、１μＭ以上の濃度のキシログルカンオリゴ糖によりオーキシンなしでもエンドウ上胚軸が伸長する、とのMcDougallらの報告がある〔Plant Physiology, 93, 1042-1048 (1990)〕が、その後誰もその実験結果を再現することができなかった。また、フコース残基を有するキシログルカンオリゴ糖がオーキシンによる植物細胞の伸長を阻害するという報告もある〔Plant Physiology, 75, 295-297 (1984); Journal of Experimental Botany, 40, 233-238 (1989)〕。これらの文献では、フコース残基を含むキシログルカンオリゴ糖の濃度が１０-9から１０-7Ｍの範囲では阻害効果が認められるが、高濃度では認められないことを報告している。さらに、天然オーキシンには阻害効果が認められず、人工（化学合成）オーキシンのみで効果が認められた〔Plant Cell Physiology, 32, 777-782 (1991)〕ため、その効果については疑問視されている。又、多糖（キシログルカンなど）を用いて植物細胞の成長を抑制させた例はこれまでに知られていない。
【０００６】
以上のように、植物細胞の成長を促進又は抑制する技術がこれまでに種々提案されているが、科学的に再現性が認められず、実際の植物における実用化が困難であった。従来から知られているオーキシンやジベレジン等の植物ホルモンを用いる方法では、成長以外に植物に様々な影響を与え、別の有害な作用をもたらすこともあり、その用途は限定されている。
【０００７】
植物組織に広く存在するキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（エンド型キシログルカン転移酵素：ＸＥＴ）は、キシログルカンの１，４−β-グルカン骨格の繋ぎ換えを触媒する糖鎖転移酵素として知られている。植物が成長するためにはその細胞壁が伸長する必要があるが、細胞壁は骨格となるセルロースフィブリルの束とそれを網の目のように架橋する糖鎖であるキシログルカンで構成されているため、そのままでは細胞壁は伸長することができない。細胞壁が伸長するためには、そのようなセルロースフィブリルとキシログルカンの架橋を架け替える作業が必要となり、そのための酵素として、上記エンド型キシログルカン転移酵素があり、その作用メカニズムは該酵素により一旦キシログルカンの架橋を切断し、セルロース微繊維をずらした後に、再びキシログルカンでセルロースフィブリルを架橋し、細胞壁を安定化させる、との報告があるが必ずしも科学的に実証されておらず、様々な矛盾する結果もある。
【０００８】
エンド型キシログルカン転移酵素（ＸＥＴ）、例えばエンドウ由来のものは分子量３２０００であり、その発現はセルロースの合成と併行しており、植物細胞の成長促進時よりも成長抑制時に強く発現している。そのＸＥＴ遺伝子のあるものは既にクローニングされ、その塩基配列も決定されており、アズキ、ダイズ及びトマト等〔Journal of Biological Chemistry, 268, 25364-25368 (1993)〕、ナスタリチュウムの種子〔Plant Journal, 3, 701-711 (1993)〕、アラビドプシス〔Plant Journal, 7, 1555-1567 (1995)〕などについて報告されている。又、このＸＥＴ遺伝子の発現を抑制させてトマトの果実を小さくさせた例が知られている（特開平１１−１６４６８８号公報）。しかしながら、エンド型キシログルカン転移酵素の発現を抑制することによって植物細胞の成長を促進させた例はこれまでに知られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は植物細胞の成長をコントロールする方法、すなわち、植物細胞の成長を促進させる方法及び植物細胞の成長を抑制させる方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、低分子キシログルカン及び高分子キシログルカンを用いて植物細胞の成長をコントロールする方法に関する。
【００１１】
本発明の特徴は、低分子キシログルカンを植物組織に組み入れて植物細胞の成長を促進させる低分子キシログルカン組み入れ工程と、高分子キシログルカンを植物細胞に組み入れて植物細胞の成長を抑制する高分子キシログルカン組み入れ工程とを用いることにより植物細胞の成長をコントロールする方法である。以下に本発明をより詳しく説明する。
【００１２】
本発明は、低分子又は高分子キシログルカンを植物組織に組み入れて、細胞壁にゆるみを与えたり、細胞壁を堅くして、植物細胞の成長をコントロールする方法である。すなわち、本発明は植物組織に有効濃度の低分子又は高分子キシログルカンの水溶液を接触させ、インキュベイト（培養）することにより、低分子又は高分子キシログルカンを植物組織（細胞）の細胞壁中に効率よく組み入れて、植物組織（細胞）の成長をコントロールすることが可能である。低分子キシログルカンを用いるときは植物細胞の成長を促進させることができ、高分子キシログルカンを用いるときは植物細胞の成長を抑制することができる。植物組織の表層にはロウ成分に富む表皮があるため、低分子又は高分子キシログルカンが組織に取り込まれ難いので、より有効に組み入れるために、植物組織の表皮を除去したり、脂肪、タンパク質、ハイドロコロイド、界面活性剤、多糖類、有機溶剤、無機溶剤など公知の茎葉処理剤を加えることができる。これら茎葉処理剤は植物の葉面や茎、根の表面から効率よく望む物質を取り込ませたり、組み入れやすくしたり、水系液剤に適度な粘度を付け植物への付着性を良くすることができる。
【００１３】
本発明に係わる植物の成長とは成長点が水を吸って大きくなる吸水成長を意味する。高等植物では、個体発生のごく初めの時期を除き、新しく細胞を作りだす分裂機能は個体の特定の部位にのみ残存する。このような分裂組織のうち、茎と根の先端（茎頂、根端）に存在するものが成長点と言われ、組織学的には、頂端細胞あるいは頂端分裂組織とそれらから由来した近傍の若い細胞群を指す。植物の成長点は茎頂・根端・葉先の頂端分裂組織によって構成され、その結果生ずるのが先端成長であり、最も多く見られる成長の形式である。この先端成長あるいは伸長成長は細胞壁中でキシログルカンが表層のもともと存在するキシログルカン−セルロースミクロフィブリルに組み込まれ、貼り付くこと及びキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼによるキシログルカン分子の切断と転移反応の関与によって制御されている。したがって、本発明は、キシログルカンが高等植物に含まれ、植物の成長に関係するメカニズムが共通であるため、高等植物に適用することが可能である。
【００１４】
キシログルカンは海草、微生物、きのこ、高等植物などに存在し、特に、高等植物、例えばエンドウ、ダイズ、ポプラ、イネ、タケノコなどの細胞壁より抽出して得ることができる。ある種のキシログルカンは冷水で組織から抽出可能であるが、一般的にアルカリ水溶液を用いてより容易に抽出できる。タマリンド種子由来のキシログルカンは市販品としても入手することができる。本明細書中の「高分子キシログルカン」とは高等植物から得られたキシログルカンそのものであり、分子量が数万から数百万のものを言い、単にキシログルカンと略称することもある。又、「低分子キシログルカン」とは高分子キシログルカンあるいはキシログルカンの１，４−β−グルカン主鎖を部分的に加水分解して得られるものを言い、分子量が５０００以下、好ましくはキシログルカンオリゴ糖である。高分子キシログルカンから低分子キシログルカンを得る方法としては、酵素分解、酸加水分解などの公知の方法が挙げられる。例えば、タマリンド種子キシログルカンから酵素分解により低分子キシログルカンを得る場合には、β−１，４−グルカナーゼ活性を有する植物組織崩壊酵素が用いられ、その酵素に応じた添加量、ｐＨ、温度、時間で反応させることができる。例えば、該酵素としてセルラーゼを用いる場合であれば、０．０１−２．０重量％の酵素量を添加して、ｐＨ３−７、３５−６０℃で３−９６時間反応させ、反応終了後、酵素を失活させ、クロマトグラフィーなどの方法で精製し、低分子キシログルカンを得ることができる。さらに、所望により低分子キシログルカンをさらに低分子化し、高速液体クロマトグラフィーなどにより分画・精製して、キシログルカンオリゴ糖などをそれぞれ得ることができる。本発明に用いる低分子キシログルカンとしては、好ましくはキシログルカンオリゴ糖であり、より好ましくはキシログルカンオリゴ７糖、８糖及び９糖である。
【００１５】
低分子キシログルカンの水溶液の有効濃度は１００−１０００００μＭであり、好ましくは、１００−１００００μＭである。一方、高分子キシログルカンの水溶液の有効濃度は１０−１０００μＭであり、好ましくは、１０−３００μＭである。低分子キシログルカンを用いるときは、さらにオーキシン、ジベレリン、アブシジン酸、ブラシノライドなど他の公知の植物生長促進物質を１種又はそれ以上添加することができる。さらに、低分子又は高分子キシログルカンを植物組織により有効に組み入れるために、脂肪、ハイドロコロイド、界面活性剤、多糖類、タンパク質、有機溶剤、無機溶剤など公知の茎葉処理剤を１種又はそれ以上を添加することもできる。脂肪としては、大豆油、綿実油などが挙げられる。ハイドロコロイドとしては、ゼラチン、微結晶セルロースなどが挙げられる。界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ソルビタン、脂肪酸エステルなどが挙げられる。多糖類としては、タマリンドシードガム、キサンタンガムなどが挙げられる。タンパク質としては、カゼイン、大豆タンパクなどが挙げられる。有機溶剤としては、エタノール、メタノールなどが挙げられる。無機溶剤としては、合成含水酸化珪素、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
【００１６】
又、本発明は植物細胞の成長を促進させる方法であって、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼの発現を抑制する抑制剤を植物組織に与える方法である。すなわち、植物組織の表皮を除去し、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼの発現を抑制する有効量の抑制剤の水溶液を接触させ、インキュベイトすることにより、該抑制剤を植物組織に取り込ませ、植物組織の成長を促進させることができる。抑制剤としては、公知の化合物、例えばキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ抗体、ジクロベニル、イソキサベン及びクマリンが挙げられる。又、これらの抑制剤とともにオーキシン、ジベレリン、アブシジン酸、ブラシノライドなど他の公知の植物生長促進物質を１種又はそれ以上添加することができる。さらに必要に応じて、前記の脂肪、タンパク質、ハイドロコロイド、界面活性剤、多糖類、有機溶剤、無機溶剤などの茎葉処理剤を添加することもできる。
【００１７】
本発明により、低分子キシログルカン又は高分子キシログルカンを有効成分とする、植物細胞の成長をコントロールするための組成物を通常の方法で製造することができる。該組成物には脂肪、ハイドロコロイド、界面活性剤、多糖類、タンパク質、有機溶剤、無機溶剤など公知の茎葉処理剤を１種又はそれ以上を添加することができる。低分子キシログルカンを用いるときは、さらにオーキシン、ジベレリン、アブシジン酸、ブラシノライドなど他の公知の植物生長促進物質を１種又はそれ以上添加することもできる。又、本発明により、植物細胞の成長を促進するために、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼの発現を抑制する抑制剤を有効成分とする組成物も製造することができる。該組成物には、これらの抑制剤とともにオーキシン、ジベレリン、アブシジン酸、ブラシノライドなど他の公知の植物生長促進物質を１種又はそれ以上添加することができる。さらに必要に応じて、脂肪、ハイドロコロイド、界面活性剤、多糖類、タンパク質、有機溶剤、無機溶剤など公知の茎葉処理剤を１種又はそれ以上を添加することができる。これらの組成物は粉末、粉末を油脂などに分散したもの、水系液剤などいかなる使用形態でもよいが、水系液剤としての使用が好ましい。
【００１８】
低分子又は高分子キシログルカンを植物組織に組み入れる方法としては、1)植物の表皮を除去処理した後に低分子又は高分子キシログルカンの水溶液を添加する、2)植物組織を低分子又は高分子キシログルカンの水溶液中でインキュベイトする、3)植物の種子を低分子又は高分子キシログルカンの水溶液中でインキュベイトする、あるいは、4)低分子又は高分子キシログルカンの水溶液の有効量を土壌中に添加したり、葉面散布（噴霧）したり、さらには養液栽培用液体肥料中に混合して水栽培して使用する方法などが可能である。表皮の除去処理は胚軸切片をカミソリで切り込みを入れるか、あるいは、表皮をカミソリを剥ぎ取るなど一般に植物を処理する方法で行うことができる。
【００１９】
低分子又は高分子キシログルカンの植物組織への組み込みについては、公知のキシログルカンの分析方法（例えばヨウ素呈色法）、電子顕微鏡による方法、標識（例えば蛍光標識）を用いる方法などにより確認することができる。
【００２０】
植物の成長の度合いは、例えば単位時間当たりに植物が伸長する長さを直接測定することにより判定することができ、エンドウ種子を暗所で発芽させた幼葉の上胚軸切片を用いることができる。あるいは、この上胚軸切片に縦に切れ込みを入れてペトリ皿中の水に浮かべると成長に伴い切片が外側に屈曲することを利用して、その屈曲の度合いによって成長を判定することができる。この方法では、オーキシンのような成長促進物質をペトリ皿の水中に混合すると、表皮組織も伸長するため、いったん外側に反った切片が内側に屈曲し切片が閉じる。しかしながら、この系にさらに成長を促進する物質が共存すると内部組織の伸長が促進されて切片が閉じなくなる。一方、成長を阻害する物質をペトリ皿の水中に共存させると、反対に内部組織の伸長が阻害されるため切片が強く交差するようになる。これらの試験は古くから知られているエンドウ屈曲試験（スプリットテスト）であり、容易に実施できる。
【００２１】
又、植物の成長をさらに詳しく解析するために、植物を伸張方向に引っ張る方法（引っ張り試験）を用いることができる。植物の組織を引っ張り試験にかけ、引っ張りにより生じた応力（錘をぶら下げたとして、錘の重量に相当）と歪み（伸び）を測定することによって細胞壁の力学的性質を調べることができる。植物の細胞壁の力学的変化は成長時には単位長さ当たりの細胞壁量すなわち厚さが低下し、ゆるみが生じるからで、この時の歪みの速度や応力の低下が植物の成長と結びつけられているので、この試験方法は有効である。この試験方法を応用した、レオロジー測定装置を組み入れた自動引っ張り試験機が市販されている。この試験機には測定のためのソフトウエアが組み込まれているので、前述の植物の上胚軸を用い、オーキシンのような成長促進物質とともにインキュベイトしながら繰り返し引っ張り試験を行い，得られる応力と歪みから相対弾性率（応力÷歪み）を算出し、成長の指標とすることができる。この指標では、成長とともに相対弾性率や歪みは減少する。
【００２２】
本発明により、有用な植物の成長を促進させ、高成長植物として育種することができ、又、雑草等有害な植物の成長を抑制・防止することができ、又、有用な植物の収穫時期を調整することにより効率的に農産物を栽培することができる。低分子又は高分子キシログルカンを組み込んだ植物の栽培は通常の育種方法によって行うことができる。例えば、市販の挿し木用の用土を適当なポリポットや栽培トレイに入れて栽培したり、肥料とともに水耕栽培することができる。又、通常の栽培時に水溶液として土壌中に添加したり、葉面散布を行ったり、さらには養液栽培用液体肥料中に混合して水栽培して使用することができる。本発明に係わる植物は特に限定するものでなく、高等植物に適用でき、例えば、かいわれ大根、レタス、大根、ほうれん草、ジャガイモ、トマト等の野菜類や、イネ、とうもろこし、小麦等の穀物類、花卉、果実、樹木などが挙げられる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定するものではなく、本発明の技術分野における通常の改変が可能である。参考例及び実施例では、高分子キシログルカンを単にキシログルカンと略称する。又、低分子キシログルカンとしてキシログルカンオリゴ糖を使用した。
【００２４】
参考例１  キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖の調製
【００２５】
(1)エンドウ種子由来のキシログルカンは文献〔Plant Physiol., 75, 596-604 (1984）〕記載の方法に準じて調製した。エンドウ種子を８時間水に浸した後、室温・暗所で１週間発芽させた後、成長点である上胚軸第３節間の１ｃｍを切り取った。これをｐＨ７．０のバッファー中でホモジナイズした後７０％エタノールで３回抽出した。さらに、０．１Ｍトリス塩酸バッファー、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０）、４％ＫＯＨ及び０．１％ホウ素化水素ナトリウム（ＮａＢＨ4）で８５℃で５回抽出、さらに、２４％ＫＯＨ及び０．１％ＮａＢＨ4で３０℃以下で３時間抽出・透析した後凍結乾燥して粉末化して得た。このキシログルカンの分子量は５００００であった。
【００２６】
(2)キシログルカンオリゴ糖はタマリンド種子由来のキシログルカン（商品名「グリロイド」大日本製薬株式会社製）から調製した。当該キシログルカン１ｇを１００ｍｌ水溶液（酢酸ナトリウムバッファーでｐＨ５．０に調整）に溶解し、セルラーゼ（商品名「セルラーゼオノズカ」ヤクルト本社製）１５ｍｇを添加し、５０℃で３時間インキュベイトした。５分間沸騰して酵素を失活させた後ゲルクロマトグラフィー（商品名「バイオゲルＰ４カラム」バイオラッド社製）に通してキシログルカン７、８及び９糖をそれぞれ分離した後凍結乾燥して調製した。得られたキシログルカン７糖の分子量は１０６２であった。
【００２７】
参考例２  植物の成長試験に使用するエンドウ上胚軸スプリットの調製
【００２８】
エンドウ上胚軸スプリットはエンドウ種子を１晩水に浸した後、２７℃で１週間暗所で放置し２−３ｃｍになったものを使用した。これに上胚軸１ｃｍ上から切り込みを入れた後氷水に１時間浸すか、又は表皮を剥ぎ取ったものを使用した。これらをオーキシン又はキシログルカンを含む水溶液中に浸し暗所で２５℃所定時間インキュベイトして試験に供した。
【００２９】
実施例１  エンドウ上胚軸へのキシログルカンの組み込み
【００３０】
エンドウ由来のキシログルカン０．１８ｍＭの水溶液中に、エンドウ上胚軸のスプリット上胚軸（１ｃｍ上から切り込みをいれたもの）を１８時間インキュベイトした。切り込み表層上に組み込まれたキシログルカンをヨウ素染色（ヨウ素濃度が０．５％になるように調製した１％ヨウ化カリウム溶液を用いた）した。組み込まれたキシログルカンは青緑色に染色された。
【００３１】
実施例２  エンドウ上胚軸へのキシログルカンの組み込み
【００３２】
エンドウ由来のキシログルカン０．１８ｍＭの溶液中に、表皮を剥いだエンドウ上胚軸（上胚軸１ｃｍ）を入れて１８時間インキュベイトした。細胞表層上に組み込まれたキシログルカンを電子顕微鏡によって観察した。組み込まれたキシログルカンは繊維状に観察された。
【００３３】
実施例３  エンドウ上胚軸への標識キシログルカンの組み込み
【００３４】
(1)蛍光標識キシログルカンの調製：エンドウのキシログルカンの還元末端にフルオサミン（シグマ社製）を結合させた蛍光標識キシログルカンを文献〔Plant Physiology, 83, 384-389(1987)〕記載の方法に準じて得た。すなわち、ブロムシアン（ＢｒＣＮ）１０ｍｇを水０．１ｍｌに溶解し、さらにキシログルカン２０ｍｇを加え水で１ｍｌにした。これをｐＨ１１．０に調整した後０．２ＭＮａＯＨを入れ５分間維持した。０．２Ｍホウ酸ナトリウムでｐＨ８．０とし、セファデックスＧ−５０カラムで脱塩した。これに蛍光標識アミン（シグマ社製）４ｍｇで室温で１夜インキュベートした。ｐＨ７．０の５０ｍｌリン酸バッファーを用い、セファデックスＧ−５０カラムでゲル濾過して蛍光標識キシログルカンを得た。
【００３５】
(2)上記蛍光標識キシログルカン１μＭの溶液中に、エンドウ上胚軸のスプリット（上胚軸１ｃｍに上から切りこみを入れたもの）を入れて１８時間インキュベイトした。インキュベイトした後、エンドウ上胚軸を縦にスライスして、切りこみ表層上に組み込まれた蛍光標識キシログルカンを蛍光顕微鏡によって観察した。標識キシログルカンは蛍光焦点として観察され、切り込みの表層に組み込まれていることが確認された。
【００３６】
実施例４  エンドウ上胚軸への標識キシログルカンオリゴ糖の組み込み
【００３７】
(1)蛍光標識キシログルカンオリゴ糖の調製：文献〔Plant Journal, 11, 1141-1150(1997)〕記載の方法に準じて、キシログルカン７糖の還元末端にルシファイエローＣＨを結合させた蛍光標識キシログルカンを調製した。ルシファーイエローＣＨ（シグマ社製）１０ｍｇとキシログルカン７糖１０ｍｇを２ｍｌの水に加え、密封菅で３日間攪拌した。４℃で一晩冷却した後、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）中５０ｍＭのＮａＢＨ4水溶液１ｍｌを加えた。１時間後反応液をゲルクロマトグラフィー（商品名「バイオゲルＰ２カラム」バイオラッド社製）にアプライした。次いで、ペーパークロマトグラフィー〔ワットマン３ＭＭ濾紙：展開溶媒（ｎ−プロパノール／酢酸エチル／水＝３：２：１)〕で展開した水相から蛍光標識キシログルカンオリゴ糖を得た。
【００３８】
(2)上記蛍光標識キシログルカンオリゴ糖１００μＭの水溶液中に、エンドウ上胚軸のスプリット（上胚軸１ｃｍに上から切りこみを入れたもの）を入れて１８時間インキュベイトした。インキュベイト後、エンドウ上胚軸を縦にスライスして、切りこみ表層上に組み込まれた標識キシログルカンオリゴ糖を蛍光顕微鏡によって観察した。標識キシログルカンオリゴ糖は蛍光焦点として観察され、切りこみの表層に組み込まれたことが確認された。
【００３９】
実施例５  エンドウ上胚軸内部組織に対するキシログルカンの伸長抑制効果及びキシログルカンオリゴ糖の伸長促進効果
【００４０】
表皮を剥いだエンドウ上胚軸（上胚軸１ｃｍ）を各種キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖を含むオーキシン溶液とともにインキュベイトし（氷水に１時間浸した後、２５℃暗所にて）、経時的に内部組織のひずみ速度(Strain rate)（ｍｍ／２０秒）を測定し比較した（図１）。測定は自動引っ張り試験機ＴＭＡＳＳ６１００（セイコーインストルメント社製）を用いて行った。内部組織を２０秒当たり１ｇから７ｇの重量で繰り返し引っ張りながら２０分経過したところで、０．１８ｍＭキシログルカン及び８．５ｍＭキシログルカンオリゴ糖を与えた。さらに、キシログルカンオリゴ糖存在下、内部組織を２０秒あたり1ｇから７ｇの重量で繰り返し引っ張りながら１時間測定したところ、ひずみ速度は２０分間の内に急激に減少し、その後徐々に減少した。
【００４１】
このことから、キシログルカンオリゴ糖の存在下では最初の３０分間に著しい伸長効果が現れ、キシログルカンの存在下では最初の２０分間に著しい伸長抑制効果が現れることが示された。
【００４２】
実施例６  エンドウ上胚軸内部組織に対するキシログルカンの細胞壁強化及びキシログルカンオリゴ糖の細胞壁ゆるみ効果
【００４３】
表皮を剥いだエンドウ上胚軸（上胚軸１ｃｍ）を各種キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖を含むオーキシン溶液とともにインキュベイトし、経時的に内部組織の相対弾性率(Elastic modulus)（応力÷歪み）を測定して比較した（図２）。測定は自動引っ張り試験機ＴＭＡＳＳ６１００を用いて行った。内部組織を２０秒あたり１ｇから７ｇの重量で繰り返し引っ張りながら、２０分経過したところで、０．１８ｍＭキシログルカン及び８．５ｍＭキシログルカンオリゴ糖を与えた。さらにキシログルカン存在下、内部組織を２０秒あたり１ｇから７ｇの重量で繰り返し引っ張りながら１時間測定したところ、相対弾性率はインキュベーション時間とともに増加した。逆に、キシログルカンオリゴ糖存在下、相対弾性率は経時的に減少した。
【００４４】
以上の引っ張り試験から、キシログルカン存在下では内部組織の細胞壁を堅くする反応が生じ、キシログルカンオリゴ糖存在下では内部組織の細胞壁をゆるめる反応が生じることが示された。このことから、キシログルカンオリゴ糖は成長を促進させ、キシログルカンでは成長が抑制されることが示された。
【００４５】
実施例７  エンドウ上胚軸スプリットに対するキシログルカンの内部組織の伸長阻害及びキシログルカンオリゴ糖の内部組織の伸長促進効果
【００４６】
エンドウ上胚軸スプリット（上胚軸１ｃｍに上から切りこみをいれたもの）を各種キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖７糖を含むオーキシン溶液とともにインキュベイトし、内部組織の伸長効果を比較した。コントロールでは、内部組織が伸長した状態で変化はないが、オーキシン〔５μＭ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）〕の存在下に表皮組織が同じように伸長するため、スプリットは閉じる。この反応系に０．１８ｍＭキシログルカンが存在すると、内部組織の伸長が阻害されて、スプリットが強く交差した。逆に、この反応系に８．５ｍＭキシログルカンオリゴ糖が存在すると、内部組織の伸長が促進されて、スプリットは閉じなくなった（図３）。
【００４７】
以上のことから、キシログルカンオリゴ糖では成長を促進し、高分子キシログルカンでは成長が抑制されることが示された。
【００４８】
実施例８  キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖によるエンドウ上胚軸スプリット反応に対するキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（ＸＥＴ）抗体の効果
【００４９】
(1)エンドウ由来ＸＥＴ抗体の作成：エンドウ種子のキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ組換え体は公知の方法により大腸菌でＰｓＥＸＴｃＤＮＡ（ジーンバンク承認番号ＡＢ０４２５３１）とともにｐＥＴ−１５ｂベクター（ノバゲン社製）を用いて発現させた。この組換え体蛋白質をヒスチジン結合樹脂とＳＤＳページ〔硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〕〕で精製し、うさぎに免疫した。抗体は得られた抗血清を２０−５０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿したあと５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．２）に溶解し、４℃に保存した。使用する際には、これを２ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．２）で使用直前に透析して用いた。
【００５０】
(2)エンドウ上胚軸スプリット（上胚軸１ｃｍあたり上から切りこみをいれたもの）を各種キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖７糖を含むオーキシン溶液とともにインキュベイトする際、上記エンドウ由来のキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（ＸＥＴ）抗体を共存させ、それぞれについて、内部組織の伸長効果を比較した。キシログルカン０．１８ｍＭの存在下では、内部組織の伸長阻害が抗体によって抑制されて、スプリットの強い交差が阻害された。一方、キシログルカンオリゴ糖８．５ｍＭの存在下では、内部組織の伸長促進が抑制されて、スプリットはやや閉じるように反応した（図４）。このことから、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ抗体が共存したときにもキシログルカンオリゴ糖では成長を促進し、高分子キシログルカンでは成長が抑制されることが示された。
【００５１】
実施例９  エンドウ上胚軸内部組織に対するキシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖の伸長効果
【００５２】
表皮を剥いだエンドウ上胚軸（上胚軸１ｃｍ）を各種キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖７糖を含むオーキシン（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）溶液とともにインキュベイトし、内部組織の伸長効果をそれぞれ比較した。その結果を表１に示す。表中の略語２，４−Ｄは２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を示す。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
表１から明らかなように、キシログルカンの添加ではエンドウ上胚軸内部組織の伸長を経時的に抑制し、キシログルカンオリゴ糖の添加では逆に伸長を促進させることが示された。
【００５５】
実施例１０  エンドウ上胚軸内部組織に対するキシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖の伸長に対する濃度効果
【００５６】
表皮を剥いだエンドウ上胚軸（上胚軸１ｃｍ）をキシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖７糖を含む５μＭオーキシン（２，４−Ｄ）溶液とともに４０分間インキュベイトし、内部組織の伸長効果をそれぞれ比較した。伸長効果は成長率（伸長した長さ÷全体の長さ×１００％）で示す。結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
表２から明らかなように、キシログルカンの添加では濃度の増加とともに成長阻害の度合いが大きくなり、キシログルカンオリゴ糖の添加では逆に濃度の増加とともに伸長が促進されることが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】エンドウ上胚軸内部組織に対するキシログルカンの伸長抑制効果及びキシログルカンオリゴ糖の伸長促進効果をそれぞれ示す。縦軸は内部組織のひずみ速度(Strain rate)（ｍｍ／２０秒）を示し，横軸は時間(min.)を示す。
【図２】エンドウ上胚軸内部組織に対するキシログルカンの細胞壁の強化及びキシログルカンオリゴ糖の細胞壁のゆるみ効果をそれぞれ示す。縦軸は内部組織の相対弾性率(Elastic modulus)を示し，横軸は時間(min.)を示す。
【図３】エンドウ上胚軸スプリットに対するキシログルカンの内部組織の伸長阻害効果及びキシログルカンオリゴ糖の内部組織の伸長促進効果をそれぞれ経時的に示す。
【図４】キシログルカン及びキシログルカンオリゴ糖によるエンドウ上胚軸スプリット反応に対するキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（ＸＥＴ）抗体の効果を経時的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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