(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスチウイルスゲノムの５’非翻訳領域（ＮＴＲ）のステム−ループｌａ及びｌｂを含有する領域に一つ又は複数の変異を含有するペスチウイルスであって、その変異が、野生型ウイルス株が３〜４ｍｍの平均プラークサイズを生じる場合と同一の条件下で平均プラークサイズが０．２ｍｍと２．０ｍｍの間であるプラークサイズ表現型をもたらすものであり、ウイルスポリタンパク質の発現が同種の内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）の調節下にあり、ゲノムの５’末の配列がＧＵＡＵである、ペスチウイルス。
【請求項２】
５’ＮＴＲに複数の変異を有することを特徴とする、請求項１に記載のペスチウイルス。
【請求項３】
変異が一つ又は複数のヌクレオチドの欠失であることを特徴とする、請求項１に記載のペスチウイルス。
【請求項４】
変異がステム−ループｌａの欠失であることを特徴とする、請求項３に記載のペスチウイルス。
【請求項５】
変異がステム−ループｌａ及びステム−ループｌｂの一部の欠失であることを特徴とする、請求項４に記載のペスチウイルス。
【請求項６】
５’末端配列がＧＵＡＵＡＵ又はＧＵＡＵＣＣＵであることを条件として、変異がステム−ループｌａ及びｌｂの欠失であることを特徴とする、請求項４に記載のペスチウイルス。
【請求項７】
ステム−ループｌｂのループ部分が存在する場合、ループが５個のアデノシン（Ａ）残基からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペスチウイルス。
【請求項８】
ＢＶＤＶ−１又はＢＶＤＶ−２であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペスチウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、小さいプラークサイズにより表される減少した複製能を有する、弱毒化ペスチウイルス変異体に関する。そのようなウイルスは、ウシのウイルス性下痢、古典的なブタの発熱及びヒツジのボーダー病の抑制における生ワクチンとして有用である。本発明は、特に、ウシのための生ワクチンにおいて有用な、宿主における複製を減少させるため遺伝子操作された弱毒化ウシウイルス性下痢ウイルスに関する。
【０００２】
ペスチウイルスは、世界中で、経済的に重要な動物の疾患を引き起こしている。ペスチウイルス属は、フラビウイルス科に属し、ウシウイルス性下痢ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ発熱ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＳＦＶ）、及びボーダー病ウイルス（ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＶＤ）という３つの種を含む。ウシ及びヒツジからの単離物を含む第４の異なるペスチウイルス群の存在が最近記載され、現在この付加的な種をＢＶＤＶ−２と呼ぶことが一般的に認められている。従って、古典的なＢＶＤＶ株はＢＶＤＶ−１と名付けられている。Ｂｅｃｈｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９（１）：２００−２０６（１９９５）を参照のこと。
【０００３】
ＢＶＤＶ−１及びＢＶＤＶ−２はいずれも、ウシにおける急性感染（下痢、発熱、出血性症候群）、並びに（感染が妊娠中に起こった場合には）流産、胎児の奇形及び仔ウシの持続感染を引き起こす。持続感染した動物は、ウイルスの主要な貯蔵所となり、そのような動物は致命的な粘膜病（ＭＤ）で死亡する場合がある。
【０００４】
以前はブタコレラ（ｈｏｇ  ｃｈｏｌｅｒａ）ウイルスと呼ばれていた古典的ブタ発熱ウイルス（ＣＳＦＶ）は、古典的ブタ発熱（ＣＳＦ）又はブタコレラ（ＨＣ）の原因ウイルスである。ボーダー病ウイルス（ＢＶＤ）は、典型的にはヒツジに見出され、ボーダー病（ＢＶ）を引き起こす。ＢＶＤによる仔ヒツジの子宮内感染の後には、ウシにおけるＭＤと類似の症状が起こることも示されている。ペスチウイルスの概説については、Ｆｉｅｌｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄら（編）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）１０５９〜１０７３頁のＴｈｉｅｌら、Ｔｈｅ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ（１９９６）を参照のこと。
【０００５】
生存ウイルス又は死滅ウイルスに基づくワクチン、並びにウイルスタンパク質を発現する組換え発現系のワクチンが、ＢＶＤＶ及びＣＳＦＶについて開発されており、現在使用されている。現在使用されている生ワクチンは、宿主において複製する多少弱毒化された株を含有する。弱毒化は、（準最適温度における）同種又は異種の細胞培養物における複数回の継代により達成されている。しかしながら、これらの株は、依然として、経胎盤感染をきたし、それにより胎児の死亡、成長奇形、及び子孫における持続感染を引き起こす場合がある。
【０００６】
強い弱毒化をもたらす明確な変異を有する生ワクチン株は、現世代のワクチンの欠点を回避するであろう。最近、全長感染性ＤＮＡコピーが、ＢＶＤＶ（Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：８６０６−８６１３（１９９６））及びＣＳＦＶ（Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：１５８８−１５９５（１９９６））について構築された。それらの利用可能性は、研究者らが、ＢＶＤＶ又はＣＳＦＶの弱毒化株を開発するため逆遺伝子操作を実施することを可能にする。しかし、安全かつ効率的なワクチン株を得るために、ゲノムのいずれの領域を修飾すべきであり、そして修飾することができるか、は依然として不明である。
【０００７】
ペスチウイルス感染の安全かつ効率的な予防及び治療の重要性のため、高い免疫誘導能を有する特異的に弱毒化された生ワクチン、及び宿主における複製能の有意な減少をもたらす弱毒化の明確な基礎が強く必要とされている。
【０００８】
従って、本発明の基礎となる技術的問題は、防御免疫を誘導する能力を有する弱毒化生ワクチンとして使用するための、安全な特異的に弱毒化されたペスチウイルスを提供することである。
【０００９】
前記の技術的問題の解決は、ペスチウイルスゲノムの５’非翻訳領域（ＮＴＲ）に変異を含有する弱毒化ペスチウイルスを提供する本発明により達成される。
【００１０】
より具体的には、本発明は、ペスチウイルスゲノムの５’非翻訳領域（ＮＴＲ）のステム−ループｌａ及びｌｂを含有する領域に一つ又は複数の変異を含有するペスチウイルスであって、その変異が小さいプラークサイズ表現型を引き起こすものであり、ウイルスポリタンパク質の発現が同種の内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）の調節下にあり、ＧＵＡＵなる配列がペスチウイルスゲノムの５’末に存在する、ペスチウイルスに関する。
【００１１】
一本鎖ＲＮＡの相補的な塩基は、対を形成し、ヘアピンとも呼ばれるステム−ループ構造を形成することができる。ｌａ及びｌｂと名付けられた（又は、それぞれＢ１’及びＢ１と名付けた著者もいる）そのような２つのステム−ループ構造が、ペスチウイルスの５’非翻訳領域にあらわれ、その後にはＩＲＥＳ因子が存在している。ＢＶＤＶの５’ＮＴＲの二次構造を示している図１Ｂを参照のこと。ＢＶＤＶの場合、ステム−ループ構造Ｉａ及びＩｂは、おおよそ、ＢＶＤＶゲノムのヌクレオチド１〜７３を含む。本発明により、これらのステム−ループ構造を含有する領域はウイルス複製にとって必須ではないことが発見された。
【００１２】
ＩＲＥＳ因子は、ペスチウイルスポリタンパク質の翻訳開始が起こる場所であり、５’ＮＴＲ及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端領域に位置している。ペスチウイルスＩＲＥＳの５’ボーダーは、ヌクレオチド７５の近傍であり、５’末端のステム−ループＩａ及びＩｂはＩＲＥＳ活性にとって必要でない。Ｃｈｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：３７０−３８２（１９９８）を参照のこと。ＩＲＥＳの３’末が、ポリタンパク質のＡＵＧ開始コドンまで延びていることは、一般的に同意されている。
【００１３】
本明細書の実施例は、ＢＶＤＶに関するものであるが、本発明は、全てのペスチウイルスに適用可能であると企図される。これは、特に、ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ及びＢＤＶが、構造的かつ血清学的に相互に関連しているためである。ペスチウイルス間の全体的な遺伝学的関連性は、この属のウイルスのゲノム間の配列相同性の程度が６０〜７０％であることから極めて明確である。より重要なこととして、ペスチウイルスの５’ＮＴＲの一次構造及び二次構造は、類似している。即ち、この領域のステム−ループ構造は同一である。Ｄｅｎｇら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：１９４９−１９５７（１９９３）；Ｂｅｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５１６５−５１７３（１９９８）；及びＰｅｓｔｏｖａら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：６７−８３（１９９８）を参照のこと。
【００１４】
「変異」という用語は、親の野生型ウイルスと比較して核酸配列の変化が存在することを意味し、それは、ヌクレオチドの置換、挿入及び／又は欠失でありうる。（一つ又は複数の）変異は、ウイルスが、典型的な野生型株と比較して小さいプラークサイズ表現型を表すようなものである。変異は、ペスチウイルスゲノムの５’ＮＴＲの、ステム−ループＩａ及びＩｂを含有する領域に作成される。従って、ＩＲＥＳは影響を受けず、ウイルスポリタンパク質は依然として翻訳されうる。従って、変異を導入されたウイルスは、ワクチンとして使用した場合、弱毒化ウイルスの最大の免疫原性を可能にする、完全なペスチウイルスタンパク質を産生することができる。他方、５’ＮＴＲステム−ループＩａ及びＩｂ領域の変異とは別の、ウイルスタンパク質の非機能性又は非発現をもたらす、ペスチウイルスゲノムのポリタンパク質領域に起こる変異も、本発明により企図される。そのようなペスチウイルス変異体は、マーカーワクチンとして機能することができる。
【００１５】
「小さいプラークサイズ」表現型とは、ペスチウイルスが、同一の条件下で、親の野生型ウイルスよりも平均して少なくとも約５０％小さいプラークを表すことを意味する。そのような減少したプラークサイズは、増殖制限表現型の指標となり、従って侵襲性の有意な減少の指標となる。プラークサイズは、以下の方法により決定されうる。宿主細胞系（特に、ＢＶＤＶの場合ＭＤＢＫ）に、全長ｃＤＮＡ感染性クローンからｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された２μｇのＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞の１０倍段階希釈物を、２×１０６個の未処理細胞と共に６穴プレートに播く。３７℃で４時間インキュベートした後、接着した細胞に、０．６％低融点アガロース及び５％ウマ血清を含有する半固体培地を重層する。３７℃で６日間インキュベートした後、アガロース重層物を除去し、例えば免疫染色によりプラークを可視化することができる。プラークサイズを測定し、次いで平均プラークサイズを決定することができる。
【００１６】
典型的には、前記のアッセイによるペスチウイルスの平均プラークサイズは、約３〜４ミリメートルである。従って、本発明の場合、小さいプラークサイズ表現型を有すると見なすためには、前記のプラークアッセイに基づく変異体の平均プラークサイズが、０．２ｍｍと２．０ｍｍの間、好ましくは０．５ｍｍと１．５ｍｍの間、より好ましくは０．７ｍｍと１．２ｍｍの間、最も好ましくは約０．８ｍｍであるべきである。
【００１７】
本発明の変異体は、同種のＩＲＥＳを有するべきである。これは、変異体が、自己のものであっても他のペスチウイルスのものであってもよいペスチウイルスＩＲＥＳを有するべきであることを意味する。従って、変異型ＢＶＤＶは、ＢＶＤＶのＩＲＥＳ因子又はＣＳＦＶもしくはＢＤＶのＩＲＥＳ因子を有することができる。しかしながら、好ましくは、本発明のペスチウイルス変異体は、自己のＩＲＥＳ因子を含有する（即ち、ＢＶＤＶ変異体はＢＶＤＶのＩＲＥＳを有し、ＣＳＦＶはＣＳＦＶのＩＲＥＳを有する等）。
【００１８】
ペスチウイルス変異体のゲノムの５’末は５’−ＧＵＡＵなる配列を有することが必要である。この配列は、複製に必要であり、この配列が存在しない場合には複製が大きく減少し、従ってワクチン製造が不可能となることが、本発明者らにより見出された。しかし、ＩＲＥＳの前に存在する完全な領域（即ち、ステム−ループＩａ及びＩｂ）が欠失した場合には、５’−ＧＵＡＵ配列が存在する場合ですら、複製が大きく減少することも本発明者らにより見出された。（これは、ＧＵＡＵ配列を含有しているがＢＶＤＶステム−ループＩａ及びＩｂは含有しないＢＶＤＶ−ＨＣＶキメラの複製能が、劇的には改変されないことを示したＦｒｏｌｏｖら，ＲＮＡ，４：１４１８−１４３５（１９９８）と対照的である。）従って、そのような変異体は、本発明において企図されない。
【００１９】
好ましくは、本発明のペスチウイルスは、５’ＮＴＲのステム−ループＩａ、又はステム−ループＩａ及びＩｂに一つ又は複数の変異を有する。これらのステム−ループ構造は、ＩＲＥＳの５’側の領域にあり、図１Ｂに示されている。保存配列モチーフ５’−ＧＵＡＵがゲノムＲＮＡの５’末に保持されていれば、ステム−ループＩａの様々な部分の置換もしくは欠失、又はＩａの全部及びＩｂの一部の欠失を有する５’ＮＴＲ配列は、親ウイルスよりは程度が低いが、複製を維持することが、本発明者らにより見出された。他方、Ｉｂのループ領域が完全に欠失すると、複製能はほぼ完全に失われる。
【００２０】
好ましくは、複数の変異がペスチウイルスの５’ＮＴＲに作成される。複数の変異を有するウイルスは、例えば置換又は挿入の場合、ただ一つの変異を有するウイルスよりも遺伝学的に安定であることが知られている。
【００２１】
より好ましくは、本発明のペスチウイルスは、一つ又は複数のヌクレオチドの欠失を有する。特に、ステム−ループＩａのヌクレオチド５〜２８（本明細書において使用される番号付けは、ＣＰ７−９Ａとして図１Ａに示されている配列と同一であるが、ヌクレオチド４４の後のＡ残基が４個少ないＢＶＤＶ−１  ＣＰ７−５Ａ株に基づいている）を欠失させ、所望の複製能の減少を有する変異体を得ることが可能である。さらにより好ましいのは、Δ２−３１（換言すると、５’にＧＵＡＵを有しているステム−ループＩａの欠失）及びΔ５−５７（換言すると、ステム−ループＩａのヌクレオチド１〜４に見出されるＧＵＡＵが保持されている、ステム−ループＩａ及びステム−ループＩｂの一部の欠失）のような、比較的大きい欠失を有する変異体である。他の好ましい変異体は、ヌクレオチド５〜７３が欠失している（即ち、ＩＲＥＳの５’側にＧＵＡＵ配列のみを残しステム−ループＩａ及びＩｂが欠失している）が、ＧＵＡＵとＩＲＥＳの５’末との間にＡＵ又はＣＣＵなる配列が挿入されているものである。即ち、これらの変異体における５’末端配列は、ＧＵＡＵＡＵ又はＧＵＡＵＣＣＵのいずれかである。図６Ｄ、クローンＭ１及びＭ２を参照のこと。欠失変異体のうちで最も好ましいは、Δ２−３１である。
【００２２】
好ましくは、ステム−ループＩｂのループ部分（即ち、ＢＶＤＶ−１  ＣＰ７株の場合ヌクレオチド４４の下流の領域）が本発明の変異体に存在する場合、５個のアデノシン（Ａ）残基のみがその中に存在する。驚くべきことに、本発明者らは、５個のＡ残基が、このループ領域において遺伝学的に安定なＢＶＤＶをもたらすことを見出した。当然、遺伝学的安定性は生ワクチンにとって重要である。
【００２３】
好ましくは、本発明のペスチウイルスは、ＢＶＤＶ−１又はＢＶＤＶ−２である。
【００２４】
本発明に係るペスチウイルスは、いわゆる「逆遺伝学」技術を使用して調製されうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペスチウイルスのＲＮＡの遺伝子操作は現在のところ可能でない。しかし、ウイルスのＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、当分野において既知の技術によりプラスミドへクローニングすることは可能である。ｃＤＮＡクローンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写し、細胞内で感染性ウイルスを生成させることができるため、そのような構築物は、感染性クローンとして知られている。感染性クローンを使用して、変異型ウイルスを作出するためＤＮＡを操作することが可能である。この技術は逆遺伝学と呼ばれる。
【００２５】
ＢＶＤＶ及びＣＳＦＶの感染性クローンは既知であり（前記の２つのＭｅｙｅｒらの参考文献を参照のこと）、同技術に基づきＢＤＶ感染性クローンを構築することは可能であると予想される。感染性クローンは、ウイルスの増殖に適した細胞培養物へとトランスフェクトされうる。例えば、ＢＶＤＶの感染性クローンは、（ＭＤＢＫ細胞のような）ウシ腎細胞へ、ＣＳＦＶの感染性クローンはブタ腎細胞（例えば、ＰＫ−１５又はＳＫ−６）へトランスフェクトされうる。ＢＤＶクローンも、同様に、ヒツジ又はウシの細胞へトランスフェクトされうるであろう。
【００２６】
感染性クローンを使用すれば、部位特異的突然変異導入技術のような標準的な技術を使用して、本発明に従い５’ＮＴＲ内のヌクレオチドを置換、挿入又は欠失させることが可能である。減少した複製能は、比感染価（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）（即ち、ＲＮＡ１μｇ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）数）又は適切な細胞培養物中のＴＣＩＤ５０を測定することにより、変異体を用いて測定されうる。小さいプラーク表現型は、本明細書中の前記のプラークアッセイにより決定されうる。
【００２７】
本発明は、ペスチウイルス変異体を含むワクチンも包含する。「ワクチン」という用語は、本明細書において使用されるように、動物において免疫学的反応を誘導する少なくとも一つの免疫学的活性成分と、必須ではないが、活性成分の免疫学的活性を増強する付加的な成分とを含む薬学的組成物をさす。ワクチンは、薬学的組成物に典型的な付加的な成分も含む。
【００２８】
本発明のペスチウイルス変異体は、有効用量の生存弱毒化ペスチウイルス、即ち、侵襲性ペスチウイルスによる攻撃に対する免疫を、予防接種された動物において誘導するであろう量のペスチウイルスを含み、かつ薬学的に許容される担体又は希釈剤、例えば生理食塩水を含むワクチンへと製剤化されうる。免疫とは、本明細書において、非予防接種群と比較した際の、予防接種後の動物集団における有意な程度に高いレベルの防御の誘導と定義される。正確な用量は、実務者により決定されうる。ウシワクチンのための典型的な生存ウイルスの用量は、例えば、１回当たり５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０と７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の間である。
【００２９】
ワクチン目的のため十分な量のウイルス変異体を作製するためには、適当な細胞培養物中で、そして例えばローラーボトル内、又はマイクロキャリアーを含む、もしくは含まない発酵槽内で、変異体を増殖させることができる。
【００３０】
ワクチン組成物中の担体には、安定剤、保存料及び緩衝剤が含まれうる。適当な安定剤は、例えばＳＰＧＡ、（ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン、グルタメート又はグルコースのような）炭水化物、（粉乳、血清アルブミン、カゼイン、又は植物もしくは微生物等のようなその他の起源のタンパク質のような）タンパク質、又はそれらの分解産物である。適当な緩衝剤は例えばアルカリ金属リン酸塩である。適当な保存料は、チメロサル（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）、メルチオラート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）及びゲンタマイシンである。希釈剤には、水、（緩衝生理食塩水のような）水性緩衝液、アルコール及び（グリセロールのような）ポリオールが含まれる。
【００３１】
所望により、本発明に係る生ワクチン組成物は、アジュバントを含有していてもよい。アジュバント活性を有する適当な化合物及び組成物の例には、これらに限定されないが、アルミニウムの水酸化物、リン酸化物、又は酸化物、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）もしくはＭａｒｃｏｌ（登録商標）のような鉱油、又はビタミンＥアセタートのような植物油に基づく水中油型又は油中水型の乳濁液、及びサポニンが含まれる。
【００３２】
本発明に係るワクチンは、免疫感作を受ける動物にとって病原性である一つ又は複数の他の微生物由来の他の免疫原も含有しうる。例えば、ウシの場合、付加的な免疫源は、ウシロタウイルス、ウシＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、ウシ１型ヘルペスウイルス、ウシコロナウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス及びパスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）のうちの一つ又は複数に由来しうる。ブタの場合、そのような組み合わせワクチンは、口蹄疫ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペラス・ルシオパチエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）及びアクチノバチルス・プルーロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含みうる。ヒツジの場合、付加的な免疫源は、トキソプラズマ及びクラミジア・プシタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）に由来するものでありうる。
【００３３】
ワクチンは、溶液、懸濁液の形態であってもよいし、又は凍結乾燥もしくは凍結された形態であってもよく、標準的な技術を使用して調製されうる。生存ペスチウイルスの調製、及びアジュバントを含む又は含まない他の免疫原とのその製剤化は、いずれも常法であり、生存弱毒化ペスチウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合し、そして場合により他の免疫原と混合し、そして場合によりアジュバントと混合することを含む。ワクチン組成物の調製は、特に、「Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｕｔｚｉｍｐｆｕｎｇｅｎ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｔｉｅｒｍｅｄｉｚｉｎ」（Ｍａｙｒ，Ａ．ら編、Ｖｅｒｌａｇ  Ｐａｕｌ  Ｐａｒｅｙ、Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８４）及び「Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｎａｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｒ．ら編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｌｔｄ．，１９９３）に記載されている。例えば、これに限定されないが、ワクチンは以下のようにして調製されうる。本発明に係る変異型ペスチウイルスを含有する細胞培養上清を、安定剤と混合し、続いて混合物を凍結乾燥させるか、又は他の方法により脱水する。次いで、予防接種の前に、該混合物を水性又は非水性の溶液で再水和する。
【００３４】
本発明は、動物におけるペスチウイルス感染の予防及び治療に特に有用なワクチン又は薬学的組成物を提供する。従って、本発明のさらなる態様は、本発明に係るワクチンを、そのような予防又は治療の必要がある動物へ投与することを特徴とする、動物におけるペスチウイルス感染の予防及び治療のための方法に関する。本発明のワクチンは、筋肉内注射もしくは皮下注射により、又は鼻腔内、気管内、口腔内、皮膚、経皮、もしくは皮内への投与を介して投与されうる。好ましくは、ＢＶＤＶワクチンの場合、予防接種は鼻腔内又は筋肉内に行われ、筋肉内が最も好ましい。ＢＶＤＶの生ワクチンは、好ましくは、乳牛において、約６ヶ月齢と最初の受精との間に投与される。
【００３５】
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに特徴決定されるが、実施例は本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【００３６】
実施例１：ＢＶＤＶの感染性ｃＤＮＡクローンの生成及び得られたＣＰ７−５Ａウイルス
（Ａ）ＢＶＤＶの感染性ｃＤＮＡクローンの生成
ウシウイルス性下痢ウイルスＣＰ７株のゲノムのｃＤＮＡクローニングの後、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ／ＢＶＤＶを構築した（Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８６０６−８６１３に詳述されている）。５’近位の２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）及び３’末端の３３ｎｔ（他のＢＶＤＶ株の公開された配列と比較した場合）を含むＣＰ７ゲノムＲＮＡの５’末端配列は決定されなかった。その代わりに、異種のＢＶＤＶ−１  ＮＡＤＬ株の各末端配列を、ｐＡ／ＢＶＤＶへ導入した。
【００３７】
（Ｂ）感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＰ７−５Ａの生成
ＢＶＤＶ  ＣＰ７の真正感染性ｃＤＮＡクローンを確立するため、このウイルスの５’及び３’の末端配列を決定した。ウイルスゲノムＲＮＡのライゲーションの後、ネスティッドＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ゲノムの３’末に位置するセンスプライマー及びゲノムの５’ＮＴＲに位置するアンチセンスプライマーを使用）により、予想サイズのｃＤＮＡ断片を特異的に増幅し、続いてそれを細菌ベクターへクローニングした。配列分析により、未知の５’末端の２１ｎｔが、ＢＶＤＶ−１  ＮＡＤＬ株及びＯｓｌｏｓｓ株の配列と９個の位置で異なっていることが明らかとなった（図１Ａ）。驚くべきことに、ＢＶＤＶ  ＣＰ７の５’及び３’の末端配列の決定のため分析された１０個のクローンは、ヌクレオチド４４位の後のＡ残基数に関して顕著なばらつきを顕示した。以前に報告されたＣＰ７全長ｃＤＮＡクローンｐＡ／ＢＶＤＶは、この位置に８個のＡ残基を含んでいたが、本研究において得られたｃＤＮＡクローンには９個から２６個のＡ残基が存在した。ＣＰ７ゲノムの３’末端の３３ｎｔに関しては、ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬの３’末端と比較した場合、６個のヌクレオチドの差異が見出されたが、ＢＶＤＶ  Ｏｓｌｏｓｓ株の配列とは２個のヌクレオチドしか異なっていなかった。
【００３８】
本明細書に記載のＢＶＤＶ  ＣＰ７全長ｃＤＮＡクローンは、ｐＡ／ＢＶＤＶ（前記参照を参照のこと）、並びにウイルスｃＤＮＡの直上流にＮｈｅＩ部位及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するサブゲノムｃＤＮＡクローンＨＨＤ１９（Ｔｒａｕｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，９４２２−９４３２に詳述されている）に基づき構築された。ＨＨＤ１９は、構造タンパク質をコードするゲノム領域並びにｐ７及びＮＳ２を欠いている。ＨＨＤ１９の５’末端の２１塩基及び３’末端の３３塩基は、ＢＶＤＶ  Ｏｓｌｏｓｓ配列に由来していた。ｐＡ／ＢＶＤＶ由来のＸｈｏＩ（ＣＰ７−５Ａ配列のｎｔ２２２〜２２７）／ＣｌａＩ（ＣＰ７−５Ａ配列のｎｔ１１０７５〜１１０８０）断片を、予めＸｈｏＩ及びＣｌａＩで消化されたプラスミドＨＨＤ１９に挿入し、プラスミドｐＣＰ７−Ｏｓを得た。真正５’末端及び４４位の下流の９個、２０個、及び２６個のＡ残基を保持するＣＰ７全長ｃＤＮＡクローンの構築のため、ＲＮＡライゲーション／ＲＴ−ＰＣＲの後に得られた各ｃＤＮＡクローンを、Ｏｌ２００Ｒ（ＣＰ７−５Ａ配列のｎｔ２３５〜２５２に相当）及びＯｌＣＰ７−ＳＰ６（５’−ＴＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＴＡＴＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＧＣＡＡＧＴＴＣ−３’；下線領域はＣＰ７−５Ａ配列のｎｔ１〜２２に相当する；ＮｈｅＩ部位より後に存在するＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＣＰ７特異的配列の直上流に位置する）を用いたＰＣＲの鋳型として使用した。最後に、ｐＣＰ７−ＯｓのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片を、４４位の後に９個、２０個、及び２６個のＡ残基を保持するＣＰ７特異的ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片と交換し、全長ｃＤＮＡクローンｐＣＰ７−９Ａ、ｐＣＰ７−２０Ａ及びｐＣＰ７−２６Ａを得た。
【００３９】
ｃＤＮＡ構築物ｐＣＰ７−９Ａ、ｐＣＰ７−２０Ａ及びｐＣＰ７−２６Ａからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された全長ＲＮＡのトランスフェクションの後、感染性ＢＶＤＶを回収した。ＲＮＡの転写のため、全長ｃＤＮＡクローンをＳｍａＩで完全に消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。１マイクログラムの直鎖化されたプラスミドＤＮＡを、標準的な条件を使用して、２０μｌでＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼで転写した。鋳型ＤＮＡの分解のため、反応混合物を５ＵのＤＮａｓｅＩで３７℃で１時間消化し、その後フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。転写されたＲＮＡの測光定量を、光度計で実施した。各ＲＮＡの質及び計算量を、アガロースゲル電気泳動の後、試料の臭化エチジウム染色により調節した。トランスフェクションに使用されたＲＮＡ転写物は、＞６０％の全長ＲＮＡを含有していた。ＭＤＢＫ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、ＵＳＡより入手）を、電気穿孔によりトランスフェクトした。トランスフェクションのため、直径１０ｃｍのプレートからの集密細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない０．４ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、パルス（９５０μＦ及び１８０Ｖ）直前に、２μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡと混合した。トランスフェクトされた細胞を２つの６穴プレートに播き、１０％ウマ血清を含有する培地で２ｍｌに調整した。細胞のトランスフェクションの後、子孫ウイルスの産生が、細胞病理の発生により示された。トランスフェクトされた細胞の感染は、Ｅｒｎｓ、Ｅ２及びＮＳ３／ＮＳ２−３に対するモノクローナル抗体を使用した免疫蛍光分析（ＩＦＡ）、及び回収された感染性ウイルスの継代により確認された。
【００４０】
５’ＮＴＲ変異体の遺伝学的安定性を調査するため、得られたウイルスｐＣＰ７−９Ａ、ｐＣＰ７−２０Ａ及びｐＣＰ７−２６Ａを、ＭＤＢＫ細胞において繰り返し継代し、１０回の継代の後、プライマーＯｌ２００Ｒ及びＯｌＣＰ７−ＳＰ６を使用したＲＴ−ＰＣＲ分析及びそれに続くクローニングされたｃＤＮＡ断片の配列分析により、５’ＮＴＲ断片の長さを決定した。各異型について、１２個の独立のクローンの配列を決定した。ヌクレオチド配列分析により、４４位の下流のＡ残基の複数の挿入（及び欠失）が示され、ＣＰ７−２６Ａの場合には最大５４個のＡが観察された（図２）。このことは、各異型が遺伝学的に不安定であることを証明している。
【００４１】
この現象をさらに特徴決定するため、４４位の下流の５４個のＡ残基のストレッチを保持する全長ｃＤＮＡクローン（ｐＣＰ７−５４Ａ）を構築した。ｐＣＰ７−５４Ａから転写されたＲＮＡのトランスフェクションにより、感染性ウイルスが回収され、それをＭＤＢＫ細胞において１０回継代し、次いで５’ＮＴＲのヌクレオチド配列分析を行った。興味深いことに、Ａ残基の欠失は、調査した１２個のクローンのうち１１個に検出された。４４位の後にわずか５個のＡ残基が見出されたものもあった（図２）。次の工程として、本発明者らは、前記の例えばｐＣＰ７−９Ａの構築の場合と同一のクローニング法を使用して、４４位の後に５個のＡ残基を保持する全長ｃＤＮＡクローンｐＣＰ７−５Ａを構築した。ｐＣＰ７−５Ａから転写されたＲＮＡのトランスフェクションにより、感染性ウイルスＣＰ７−５Ａが回収された。
【００４２】
（１）４４位の後に５個のＡ残基を有するウイルスが遺伝学的に安定であることを証明する実験の説明
ＭＤＢＫ細胞において繰り返し継代を行った後、ｐＣＰ７−５Ａの遺伝学的安定性を調査した。１０回の継代の後、プライマーＯｌ２００Ｒ及びＯｌＣＰ７−ＳＰ６を使用したＲＴ−ＰＣＲ分析及びそれに続くクローニングされたｃＤＮＡ断片の配列分析により、５’ＮＴＲ断片の長さを決定した。配列分析により、調査した１２個のクローンが全て、４４位の後に５個のＡ残基を保持することが明らかとなった（図２）。このことは、ｐＣＰ７−５Ａが、ＢＶＤＶ  ＣＰ７の遺伝学的に安定な異型であることを証明しているが、他の異型の５’ＮＴＲにはＡ残基の複数の挿入及び欠失が急速に起こった。変動しやすいＡ残基数の他には、分析した５’ＮＴＲクローンに差異は観察されなかった。
【００４３】
実施例２：５’ＮＴＲ変異型ウイルスを生成させるための材料及び方法
ヘアピンＩａのヌクレオチド配列及び推定ＲＮＡ二次構造の両方を、様々な位置で改変するため、ｐＣＰ７−５Ａの５’末端の３０ｎｔ内の第一の変異のセットを設計した。ヘアピンＩａは、ＣＰ７ゲノムのｎｔ１〜１０のｎｔ２１〜３０の相補的配列との塩基対形成により形成されるステムを含み、残りの１０ｎｔ（１１〜２０）は頂部ループを形成する。変異体ＳＬ−１、ＳＬ−２及びＳＬ−３のＲＮＡは、それぞれヌクレオチド２、６〜７、及び１４〜１７を欠いている。さらに、２〜４位（ＳＬ−４）、５〜７位（ＳＬ−５）、１０〜１３位（ＳＬ−６）及び２７〜２９位（ＳＬ−７）にヌクレオチド置換を含有するいくつかの変異体を構築した。ＳＬ−８、ＳＬ−９、デルタ２−３１、デルタ５−５７及びデルタ５−７３のＲＮＡは、ヌクレオチド１〜２４、２〜２９、２〜３１、５〜５７及び５〜７３を欠いている。（改変された）ヘアピンＩａの推定ＲＮＡ二次構造を図５Ａに示す。５’ＮＴＲに変異を保持する全てのＣＰ７全長ｃＤＮＡクローンの構築は、遺伝学的に安定なｃＤＮＡクローンｐＣＰ７−５Ａに基づいていた。変異型ｃＤＮＡの生成は、連続的な２工程で実施した。第一に、ｐＣＰ７−５Ａを鋳型として使用して、センスプライマーＯｌ−ＳＬ１、Ｏｌ−ＳＬ２、Ｏｌ−ＳＬ３、Ｏｌ−ＳＬ４、Ｏｌ−ＳＬ５、Ｏｌ−ＳＬ６、Ｏｌ−ＳＬ７、Ｏｌ−ＳＬ８、Ｏｌ−ＳＬ９、Ｏｌ−デルタ２−３１、Ｏｌ−デルタ５５７又はＯｌ−デルタ５−７３（それぞれ、ＮｈｅＩ部位及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの後に存在する変異を導入された各配列を包含する）及びアンチセンスプライマーＯｌ２００Ｒを用いたＰＣＲにより、ＣＰ７の５’末端配列に各変異を導入した。第二の工程において、得られたクローンのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片を、予めＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化されたｐＣＰ７−５Ａへ導入した。センスプライマーの配列は以下の通りである。
【００４４】
【化１】
0004937460.tif 000002
0004937460.tif 000003
５’ＮＴＲに変異を保持する全てのＣＰ７全長ｃＤＮＡクローンについて、ヌクレオチド配列決定により完全な５’ＮＴＲの配列を確認した。変異を保持するｃＤＮＡクローンから転写された全長ゲノムＲＮＡのトランスフェクションにより、感染性ウイルスが回収された。ＲＮＡの転写及びＭＤＢＫ細胞のトランスフェクションは、前記と同様にして実施された。
【００４５】
実施例３：変異体の特性の説明
ＢＶＤＶ５’ＮＴＲ変異体の特性の比較分析のため、変異体の全セットを使用した転写／翻訳実験を、平行して実施し、数回繰り返した。これらの分析には、各ゲノムＲＮＡの比感染価の決定、ＩＦＡ、及びトランスフェクション後のウイルス収量の決定、並びに平均プラークサイズ、増殖速度及び回収された変異型ウイルスの収量の決定が含まれていた。
【００４６】
ＭＤＢＫ細胞（前記と同様）の２μｇのゲノムＲＮＡによるトランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞の１０分の１を、ＲＮＡの比感染価及び回収されたウイルスのプラークサイズを決定するためのプラークアッセイに使用した。トランスフェクトされた細胞の１０倍段階希釈物を、２×１０６個の未処理ＭＤＢＫ細胞と共に、６穴プレートに播いた。３７℃で４時間インキュベートした後、接着した細胞に、０．６％低融点アガロース（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及び５％ウマ血清を含有する半固体培地を重層した。変異型ウイルスは、免疫染色により可視化される小さいプラーク（０．５〜１．４ｍｍ）を産生した。３７℃で６日間インキュベートした後、アガロース重層物を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでアセトン−メタノール（１：１）で−２０℃で１時間固定した。ＢＶＤＶ  Ｅ２−特異的モノクローナル抗体の混合物と共に２時間インキュベートした後、単層をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１／５００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。１時間後、単層をＰＢＳで２回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質である３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）を使用することによりプラークを可視化した。
【００４７】
比感染価とは、ＲＮＡ１μｇ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）数をさす。このパラメータを、明確な量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたゲノムＲＮＡをＭＤＢＫ細胞にトランスフェクトした後、独立に産生されたウイルスプラークの数を計数することにより決定した。ＣＰ７−５Ａ、ＣＰ７−９Ａ、ＣＰ７−２０Ａ及びＣＰ７−２６Ａについて、感染価は、２．４×１０５ＰＦＵ／μｇと６．０×１０５ＰＦＵ／μｇの間であったが、ＣＰ７−５４Ａ及びＣＰ７−Ｔから転写されたＲＮＡについては、それぞれ８．０×１０４ＰＦＵ／μｇ及び８．０×１０２ＰＦＵ／μｇが得られた（図３は、代表的な実験の結果を示している）。推定ヘアピンＩａ及びＩｂを含む領域に置換又は欠失を有する他の全ての５’ＮＴＲ変異体の比感染価が、親構築物ＣＰ７−５Ａと比較した場合、有意に減少していた。ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、ＳＬ−８、デルタ２−３１、及びデルタ５−５７の比感染価は、５．２×１０３ＰＦＵ／μｇ〜６．４×１０４ＰＦＵ／μｇの間であり、適度な量の感染性子孫ウイルスの回収が可能であった（下記参照）。対照的に、ＳＬ−１、ＳＬ−４、ＳＬ−９及びデルタ５−７３については、比感染価が検出レベルに近いか、又はそれ未満であった。これらの差異は、Ｅｒｎｓ、Ｅ２、及びＮＳ３に対するＭａｂを使用した免疫蛍光により２４ｈｐ．ｔ．に決定された、ＢＶＤＶ抗原を発現する細胞の量と良好に相関していた（図３、５、及び６を参照のこと）。全ての変異体の比感染価及びＩＦＡの結果が、図３、５、及び６に示されている。少なくとも２倍減少した感染価を有する変異体（例えば、ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、ＳＬ−８、デルタ２−３１、及びデルタ５−５７）は、弱毒化されていると予想され、従って生ワクチンとして有用であろう。
【００４８】
さらに、トランスフェクション後の異なる時点で得られたウイルス力価を、全ての５’ＮＴＲ変異体について決定した（図４、５、及び６）。示された期間の後、細胞培養上清の一部（２００μｌ）を取り出し、ＭＤＢＫ細胞における力価測定のため使用した。ウイルス収量は、５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌの力価として決定された。ＣＰ７−５Ａと比較した場合、トランスフェクション後１日目に得られたウイルス力価は、全ての５’ＮＴＲ変異体について少なくとも８倍減少していた。各差異は、２４ｈｐ．ｔ．に決定された比感染価及びＢＶＤＶ抗原陽性細胞の割合と良好に相関していた。
【００４９】
ＣＰ７−５Ａ、ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、ＳＬ−８、デルタ２−３１、及びデルタ５−５７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡから回収された子孫ウイルスを、トランスフェクトされた細胞の希釈物を使用したＭＤＢＫ細胞におけるプラークアッセイにより特徴決定した。転写物に由来する親ウイルスＣＰ７−５Ａは、２．７ｍｍという平均サイズを有するプラークを形成した。各変異体は、比較的小さいプラークを産生した。ＳＬ−２、ＳＬ−５、及びＳＬ−７は、１．２〜１．４ｍｍの範囲の平均サイズを有するプラークを産生し、ＳＬ−３、ＳＬ−６、ＳＬ−８、デルタ２−３１及びデルタ５−５７により生成したプラークは≦０．８ｍｍの平均サイズを有していた。個々の変異体の平均プラークサイズは、図７に示されている。小さいプラーク表現型は、全ての５’ＮＴＲ変異体の重要な特性であり、各ウイルスの増殖が阻止されており、従ってそれらが生ワクチンウイルスとして使用されうることを証明している。実用上の目的のためには、そのような変異体は、好ましくは、少なくとも１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価に増殖する。変異型ウイルスをＭＤＢＫ細胞で継代した後、例えばデルタ２−３１及びデルタ５−５７が＞１０６ＴＣＩＤ５０の力価に達することを、我々は証明した。これらの継代されたウイルス変異体のプラーク表現型は、トランスフェクション直後に観察されたものと同一である（前記参照）。
【００５０】
増殖キイネティクスの決定のため、個々の変異型ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からの上清を力価測定し、次いで、０．０５というＭＯＩで（６穴プレートにおいて）１×１０６個のＭＤＢＫ細胞へ感染させるため使用した。室温で１時間吸着させた後、細胞をＰＢＳで６回洗浄し、次いで１０％ウマ血清を含有する培地を重層し、その後４日間にわたりインキュベートした。示された期間の後、細胞培養上清の一部（２００μｌ）を取り出し、ＭＤＢＫ細胞における力価測定に使用した。ウイルス収量は、５０％組織培養感染性用量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌの力価として決定された。ＣＰ７−５Ａ及び５’ＮＴＲ変異体のピーク力価は、感染後３日目に達成された。変異体ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６及びＳＬ−７は、ピーク力価が約１０倍減少していたが、変異体デルタ２−３１及びデルタ５−５７が達したピーク力価は、ＣＰ７−５Ａと比較して約１００倍低かった（図８Ａ）。３３℃及び４０．５℃における増殖曲線の確立は、ＣＰ７−５Ａも、いずれの変異体も、少なくともこれらの温度に関しては温度感受性表現型を表わさないことを示した。これらの結果は、増殖キイネティクスの差異が、観察されたプラークサイズと相関していることを証明している。さらに、変異型ウイルスの増殖の制限は、個々のＲＮＡについて検出された比感染価の減少を反映している（図７；図５及び６も参照のこと）。そのような増殖を制限されたウイルスは、生ワクチンウイルスとして使用されうる。
【００５１】
ウイルスＲＮＡ合成の分析のため、１×１０６個のＭＤＢＫ細胞に、０．０５というＭＯＩで転写物由来ウイルスを感染させ、増殖キイネティクスの決定に使用された細胞と平行して処理した。全細胞ＲＮＡを感染後２日目に調製し、ノーザンブロット分析のため使用した。５マイクログラムのグリオキシル化ＲＮＡを、５．５％ホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝１．０％アガロースゲル中で分離し、Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶ膜（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へ転写した。プローブの放射性標識、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、記載されている通りであった（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８６９７−８７０４）。ｃＤＮＡクローンｐＡ／ＢＶＤＶ由来の２．５ｋｂのＮｏｔＩ−ＮｓｉＩ断片をプローブとして使用した。ウイルスゲノムＲＮＡをオートラジオグラフィーにより可視化し、バンドの強度をホスホールイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いて決定した（図８Ｂ）。ＣＰ７−５ＡのＲＮＡは、いずれの変異型ウイルスのＲＮＡよりも多量であった。その次に多量であったのはＳＬ−７のＲＮＡであり、ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、及びＳＬ−６のＲＮＡ量は比較的少なかった。その複製動態に基づき予想されるように、デルタ２−３１及びデルタ５−５７のＲＮＡは、最も少量であった。感染後３日目に調製されたＲＮＡのノーザンブロット分析は、極めて類似した結果をもたらした。検出されたウイルスＲＮＡの量は、得られたウイルス力価と相関していた、と結論付けることができる。
【００５２】
遺伝学的安定性を調査するため、ＭＤＢＫ細胞において各変異体を繰り返し継代した。３回目の組織培養継代物由来のＲＮＡを使用して、前記のＲＮＡライゲーション／ＲＴ−ＰＣＲ法により５’及び３’の末端配列を増幅し、細菌ベクターへクローニングした。各変異体について、少なくとも１０個の独立のクローンを特徴決定した。配列分析により、変異体ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、ＳＬ−８、デルタ２−３１及びデルタ５−５７の分析したゲノム領域には、二次変異が存在しないことが示された。対照的に、ＳＬ−１、ＳＬ−４、ＳＬ−９、及びデルタ５−７３については、復帰又は二次変異が見出された。遺伝学的安定性は、遺伝子操作された生ウイルスワクチンのための重要な要件であると考えられる。
【００５３】
Δ５−７３のトランスフェクション上清の２回の組織培養継代の後、比較的高い感染性ウイルスの力価（＞１０５／ｍｌ）が得られた。１２個の独立のクローンに由来する５’末端配列の分析により、ゲノムの５’末端近傍に２ｎｔ（Ｍ１）又は３ｎｔ（Ｍ２）の重複を有する変異体の出現が示された（図６Ｄ）。これらの結果は、ウイルスＲＮＡの５’末端に配列モチーフ５’−ＧＵＡＵが残存しているのであれば、ヘアピンＩａ及びＩｂがペスチウイルスの複製にとって必要でないことを示唆している。
【００５４】
デルタ５−７３ＲＮＡでのトランスフェクションの後に出現した変異型ウイルスＭ１又はＭ２の５’末端配列を含有するＣＰ７−５Ａ由来ｃＤＮＡクローンから転写されたＲＮＡのトランスフェクションの後、２つの付加的な変異体が生成し、Ｒ１及びＲ２と名付けられた。変異型ウイルスＲ１及びＲ２は、５’ＧＵＡＵを依然として含有しているが、ヘアピンＩａ及びＩｂは欠いている。Ｒ１及びＲ２の比感染価は、親構築物ＣＰ７−５Ａと比較した場合、有意に減少していた。Ｒ２を用いて、さらなる分析を実施した。Ｒ２は、小さいプラーク表現型を表した（平均サイズ＜１．２ｍｍ）。ウシ細胞において達したＲ２のピーク力価は、ＣＰ７−５Ａと比較して、＞１０倍低かった。さらに、蓄積したＲＮＡの量は有意に減少していた。
【００５５】
実施例４：デルタ２−３１、デルタ５−７５及びＲ２の遺伝学的安定性に関するさらなる研究
遺伝学的安定性をさらに研究するため、変異型ウイルス、デルタ２−３１、デルタ５−７５及びＲ２を、ＭＤＢＫ細胞において１０回継代した。１０回目の組織培養継代物からのＲＮＡを使用して、記載されたＲＮＡライゲーション／ＲＴ−ＰＣＲ法により５’及び３’の末端配列を増幅し、細菌ベクターへクローニングした。３個の各変異体についての少なくとも４個のクローンの配列分析により、分析した５’ＮＴＲの部分に二次変異が存在しないことが示された。さらに、１０回の組織培養継代の後得られた変異型ウイルス、デルタ２−３１、デルタ５−７５及びＲ２を用いて実施されたプラークアッセイにより、小さいプラーク表現型の安定性が明らかとなった。ウシ細胞において達したこれらの変異体の力価は、＞１０００．０００／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ペスチウイルス、特にＢＶＤＶ−１  ＣＰ７株の５’配列。（Ａ）４つのペスチウイルス種の代表的な株の５’末端配列のアラインメント。ＢＶＤＶ−１  ＣＰ７については、１０個の独立のクローンからコンセンサス配列を決定した。その他の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースから抽出した（ＢＶＤＶ−１  Ｏｓｌｏｓｓ、ＢＶＤＶ−１  ＮＡＤＬ、ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ−Ｔ、ＣＳＦＶ  Ｂｒｅｓｃｉａ、ＢＤＶ  Ｘ８１８、ＢＶＤＶ−２  ８９０）。保存ヌクレオチドはアスタリスクで示されている。（Ｂ）ＢＶＤＶ−１  ＣＰ７−９Ａの５’ＮＴＲの推定ＲＮＡ二次構造。モデリングは、コンピュータプログラムＲＮＡＦＯＬＤ、ＭＦＯＬＤ及びＦＯＬＤＤＡＮＡＬＹＺＥを用いて実施された。さらに、提唱された構造は比較配列分析に基づいている。開始コドンＡＵＧが示されている。
【図２】ウシ細胞におけるＢＶＤＶ５’ＮＴＲ変異体の伝播における４４位の下流のＡ残基の複数の挿入及び欠失。操作された全長ＲＮＡによるトランスフェクションの後、回収されたＢＶＤＶ変異体ＣＰ７−９Ａ、ＣＰ７−２０Ａ、ＣＰ７−２６Ａ、ＣＰ７−５４Ａ及びＣＰ７−５Ａを、ＭＤＢＫ細胞において繰り返し継代した。１０回の継代の後、１２個の独立のクローンの配列分析により、各変異体について、５’ＮＴＲ配列及び４４位の後のＡ残基数を決定した。
【図３】ＣＰ７−５Ａ、ＣＰ７−９Ａ、ＣＰ７−２０Ａ、ＣＰ７−２６Ａ、ＣＰ７−５４Ａ及びＣＰ７−Ｔへの操作された全長ＲＮＡの感染後（ｐ．ｔ）２４時間におけるＭＤＢＫ細胞の免疫蛍光（ＩＦ）分析（拡大率×１００）。ＢＶＤＶ  ＣＰ７変異型ＲＮＡの比感染価が示されている。
【図４】感染後２４、４８及び７２時間におけるＢＶＤＶ５’ＮＴＲ変異体ＣＰ７−５Ａ、ＣＰ７−９Ａ、ＣＰ７−２０Ａ、ＣＰ７−２６Ａ、ＣＰ７−５４Ａ及びＣＰ７−Ｔについて得られたウイルス力価。放出されたウイルスの力価がＭＤＢＫ細胞において決定された。
【図５】ヘアピンＩａ変異体。（Ａ）ＢＶＤＶヘアピンＩａ変異のコンピュータにより推定されたＲＮＡ二次構造、並びにＣＰ７−５Ａ、ＳＬ−１、ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−４、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、ＳＬ−８及びＳＬ−９への全長ＲＮＡの感染後（ｐ．ｔ．）２４時間におけるＭＤＢＫ細胞のＩＦ分析（拡大率×１００）。モデリングは、コンピュータプログラムＲＮＡＦＯＬＤ及びＭＦＯＬＤを用いて実施された。ヘアピンＩａ内の欠失したヌクレオチド（Δ）及び置換されたヌクレオチドが示されている。（Ｂ）ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶ変異型ＲＮＡの比感染価、並びに２４、４８及び７２ｈｐ．ｔ．において得られたウイルス力価。
【図６】ヘアピンＩａ及びＩｂの欠失。（Ａ）ＢＶＤＶ  ＣＰ７−５Ａ及び欠失変異体Δ２−３１、Δ５−５７及びΔ５−７３の５’ＮＴＲの概略図。（Ｂ）感染後２４時間におけるＭＤＢＫ細胞のＩＦ分析（拡大率×１００）。（Ｃ）ＭＤＢＫ細胞における比感染価、並びに２４、４８及び７２ｈｐ．ｔ．において得られたウイルス力価。（Ｄ）ＣＰ７−５Ａ、Δ５−７３、並びにΔ５−７３ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞由来の上清の継代後に進化した変異型ウイルスＭ１及びＭ２の５’末端配列。Ｍ１及びＭ２については、挿入されたヌクレオチドが強調されている。
【図７】６日ｐ．ｔ．におけるＢＶＤＶ５’ＮＴＲ変異体により産生されたプラーク。
（Ａ）ＭＤＢＫ細胞におけるＣＰ７−５Ａ、ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、ＳＬ−８、Δ２−３１及びΔ５−５７のプラークサイズ。（Ｂ）例として、ＣＰ７−５Ａ、ＳＬ−７及びＳＬ−８により生成したプラークが示されている。
【図８】（Ａ）０．０５というＭＯＩで感染させたＭＤＢＫ細胞において決定された、ＢＶＤＶ  ＣＰ７−５Ａ、並びに変異型ＢＶＤＶ株ＳＬ−２、ＳＬ−３、ＳＬ−５、ＳＬ−６、ＳＬ−７、Δ２−３１及びΔ５−５７の増殖曲線。放出されたウイルスの力価が４日間にわたり決定された。（Ｂ）０．０５というＭＯＩでＢＶＤＶ  ＣＰ７−５Ａ及び示された変異型ＢＶＤＶ株を感染させたＭＤＢＫ細胞由来の全ＲＮＡのノーザンブロット分析。感染細胞は、増殖速度を決定するために使用された細胞と平行して処理された。ＲＮＡは、感染後４８時間目に抽出された。ブロットを、ＢＶＤＶ  ＣＰ７特異的ｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。キロ塩基（ｋｂ）のＲＮＡラダーサイズが左側に示されている。バンドの強度は、ホスホールイメージャーを用いて決定された。ウイルスゲノムＲＮＡの相対量がブロットの下に示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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