(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルカノールまたは炭素数２〜２４のアルケノールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルまたはこれらの混合物を５０〜９０重量％；
Ｂ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド５〜２０モル付加物からなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｃ）グリセリン、ジグリセリン、ソルビタン、ソルビトール、ソルバイト、マンニタン、マンニトールおよびスクロースから選ばれる多価アルコールとラウリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸から選ばれる脂肪酸との部分エステルまたはこれらの混合物であり、該部分エステルが４０℃で液体である乳化剤を０〜２０重量％；および
Ｄ）水を５〜２０重量％；
を含有し、かつ分散相の平均粒子径が５０〜５００ｎｍのＷ／Ｏエマルションである、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物。
【請求項２】
Ａ）成分のエステルが、２−エチルヘキサン酸セチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ブチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソセチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、パルミチン酸イソステアリル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸イソセチル、ステアリン酸２−エチルへキシル、オレイン酸エチル、オレイン酸デシル、オレイン酸オレイル、オレイン酸オクチルドデシル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、ホホバ油、オレンジラフィー油またはこれらの混合物である、請求項１に記載の希釈用乳化組成物。
【請求項３】
Ｃ）成分の乳化剤が、グリセリンモノオレート、グリセリンジオレート、ジグリセリンモノオレート、ジグリセリンジオレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンジオレート、ソルビタントリオレート、またはこれらの混合物である、請求項１に記載の希釈用乳化組成物。
【請求項４】
Ｃ）成分の乳化剤を１〜２０重量％；
を含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の希釈用乳化組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の希釈用乳化組成物１容量部で、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相０．２５〜１容量部を希釈する、癌ワクチン組成物の調製方法。
【請求項６】
Ａ）成分を構成する脂肪酸がオレイン酸、ミリスチン酸または２−エチルヘキサン酸である請求項１記載の希釈用乳化組成物。
【請求項７】
Ａ）成分のエステルが、オレイン酸エチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、２−エチルヘキサン酸セチル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、オレイン酸オレイルまたはホホバ油である請求項１〜４のいずれか一項に記載の希釈用乳化組成物。
【請求項８】
Ａ）成分のエステルが、オレイン酸エチル、ミリスチン酸オクチルドデシルまたは２−エチルヘキサン酸セチルである請求項１〜４のいずれか一項に記載の希釈用乳化組成物。
【請求項９】
Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルカノールまたは炭素数２〜２４のアルケノールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルまたはこれらの混合物を３０〜８０重量％；
Ｂ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド５〜２０モル付加物からなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｃ）グリセリン、ジグリセリン、ソルビタン、ソルビトール、ソルバイト、マンニタン、マンニトールおよびスクロースから選ばれる多価アルコールとラウリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸から選ばれる脂肪酸との部分エステルまたはこれらの混合物であり、該部分エステルが４０℃で液体である乳化剤を０〜２０重量％；および
Ｅ）アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を１０〜６０重量％；
を含有し、当該組成物がＷ／Ｏエマルションである、癌ワクチン組成物。
【請求項１０】
Ａ）成分を４０〜６０重量％；
Ｂ）成分を１．０〜５．０重量％；
Ｃ）成分を５．０〜１０．０重量％；および
Ｅ）成分を３０〜５０重量％；
を含有する請求項９に記載の癌ワクチン組成物。
【請求項１１】
Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルカノールまたは炭素数２〜２４のアルケノールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルまたはこれらの混合物を３０〜８０重量％；
Ｂ）ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド５〜２０モル付加物からなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｃ）グリセリン、ジグリセリン、ソルビタン、ソルビトール、ソルバイト、マンニタン、マンニトールおよびスクロースから選ばれる多価アルコールとラウリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸から選ばれる脂肪酸との部分エステルまたはこれらの混合物であり、該部分エステルが４０℃で液体である乳化剤を０〜２０重量％；および
Ｅ）アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を１０〜６０重量％；
を含有し、当該組成物がＷ／Ｏエマルションである、特異的細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項１２】
Ａ）成分を４０〜６０重量％；
Ｂ）成分を１．０〜５．０重量％；
Ｃ）成分を５．０〜１０．０重量％；および
Ｅ）成分を３０〜５０重量％；
を含有する請求項１１に記載の特異的細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項１３】
アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相と、前記水相を希釈するための請求項１に記載の希釈用乳化組成物とを含む、癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤を用時調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌免疫療法の分野に属し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用の乳化組成物に関する。さらに詳細には、特定のエステル、界面活性剤、乳化剤、および水相を含有し、安定なＷ／Ｏエマルションの形態を有する、癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物に関する。また、本発明は、特定のエステル、界面活性剤、乳化剤、および特定のアミノ酸組成よりなる癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を含有し、安定なＷ／Ｏエマルションの形態を有する、癌ワクチン組成物または特異的細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、特に細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡ抗原と称する）とにより、癌細胞上に形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃・破壊する。
癌抗原タンパク質は、イムニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第１０巻、第２８１頁、１９９９年の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、およびチロシナーゼなどのメラノソームタンパク質が挙げられる。また、メラノーマ以外の癌抗原タンパク質として、ＣＥＡ、ＰＳＡ、およびＨＥＲ２／ｎｅｕなどの癌マーカーが挙げられる。また、癌で発現が増加しているＴＥＲＴなどがある。さらに、多くの癌種で高発現しているＷＴ１も白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質として知られている。
癌抗原ペプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成されるペプチドである。前記のように、この生成された癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）との複合体が細胞表面に提示され、ＣＴＬにより認識される。しかし、ＣＴＬによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、癌抗原ペプチドのみでは、一般に免疫原性が低いためにＣＴＬを効率良く誘導することが困難であった。従って、ＣＴＬの誘導を活性化できる製剤の開発が望まれている。
そのため、ＣＴＬの誘導を活性化する製剤について、これまで多くの検討がなされてきた。特に、エマルション型製剤については多くの検討がなされてきた。
一般に、エマルション製剤としては、Ｏ／ＷエマルションとＷ／Ｏエマルションがある。
このうち、Ｏ／Ｗエマルションでは抗原となるペプチドを内相に保持できず、治療上有効な特異的ＣＴＬ誘導活性を示さなかった。
一方、水相が内相となるＷ／Ｏエマルションは、抗原となるペプチドを内相に保持しやすいことから、優れたＣＴＬ誘導活性が期待できるが、実用化するには多くの課題がある。
例えば、癌抗原ペプチドのキャリアのためのＷ／Ｏエマルションとしては、フロイントの不完全アジュバントが知られているが、安定性が十分でないために有効な活性が得られない場合がある。また、粘稠度が高いため、投与し難いこと等の問題があった。
フロイントの不完全アジュバントは、不活化細菌や不活化ウイルスを包含させ、抗体産生を誘導する免疫賦活アジュバントとして古くから知られており、これに代わるＷ／Ｏ乳化型ワクチン組成物が検討され、例えば、特表平７−５０９７３３号公報、国際公開第９４／２００７１号パンフレット、及び特開平９−２６８１３０号公報に記載されるような組成物が提案されている。
また、フロイントの不完全アジュバントに代わるものとして、特開２００１−１３１０８７号公報にはＷ／Ｏ／Ｗ複合エマルションのワクチンに対する応用が提案されている。
しかし、フロイントの不完全アジュバントに代わる癌抗原ペプチドのキャリアとして、ＣＴＬの誘導を治療上有効に活性化できるＷ／Ｏエマルションは知られていない。
一般に、癌抗原ペプチドは低分子であることから、Ｗ／Ｏエマルション中で安定に保持させることは容易でない。さらに乳化する際のエネルギーで癌抗原ペプチドが分解や凝集等を起こす懸念がある。さらに、癌抗原ペプチドは、アミノ酸組成により水溶性の高いものから難溶性のものまである。したがって、癌抗原ペプチドの物性によらず、ＣＴＬの誘導を治療上有効に活性化する汎用性の高いＷ／Ｏエマルションの癌ワクチンの開発が望まれている。
本発明の課題は、さまざまな癌抗原ペプチドにおいて、イン・ビボで有効なＣＴＬ誘導活性を示し、更に、低粘度で、かつ安定性に優れた、癌ワクチン組成物を調製するための、希釈用乳化組成物を提供することにある。また、本発明の課題は、上記の希釈用乳化組成物を用いて、含有する癌抗原ペプチドに応じてイン・ビボで特異的にＣＴＬ誘導を活性化する、新たな癌ワクチンの調製方法およびその組成物を提供することにある。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、癌抗原として知られている種々のペプチドを、特定のエステルと特定の界面活性剤とを含有する特定の乳化組成物で希釈することによって、ペプチドの種類や物性によらず、それぞれの抗原に特異的なＣＴＬの誘導活性を示すことを見出し、更に鋭意検討を加えた結果、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルを５０〜９０重量％；
Ｂ）エチレンオキサイド５〜２０モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｄ）水を５〜２０重量％；
を含有する、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物。
［２］Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルを５０〜９０重量％；
Ｂ）エチレンオキサイド５〜２０モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｃ）多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが４０℃で液体である乳化剤を０〜２０重量％；および
Ｄ）水を５〜２０重量％；
を含有する、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物。
［３］Ａ）成分を６０〜８０重量％；
Ｂ）成分を１〜１０重量％；
Ｃ）成分を５〜１５重量％；および
Ｄ）成分を５〜２０重量％；
を含有する、［２］に記載の希釈用乳化組成物。
［４］希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径が５０〜５００ｎｍである［１］〜［３］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。
［５］Ａ）成分を構成する脂肪酸がオレイン酸、ミリスチン酸または２−エチルヘキサン酸である［１］〜［４］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。
［６］Ａ）成分のエステルが、オレイン酸エチル、ミリスチン酸オクチルドデシルまたは２−エチルヘキサン酸セチルである［１］〜［５］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。
［７］Ｂ）成分の非イオン性界面活性剤を構成するヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドがヒマシ油または硬化ヒマシ油である［１］〜［６］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物１容量部で、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相０．２５〜１容量部を希釈する癌ワクチン組成物の調製方法。
［９］Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルを３０〜８０重量％；
Ｂ）エチレンオキサイド５〜２０モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｃ）多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが４０℃で液体である乳化剤を０〜２０重量％；および
Ｅ）アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を１０〜６０重量％；
を含有し、当該組成物がＷ／Ｏエマルションである、癌ワクチン組成物。
［１０］Ａ）成分を４０〜６０重量％；
Ｂ）成分を１．０〜５．０重量％；
Ｃ）成分を５．０〜１０．０重量％；および
Ｅ）成分を３０〜５０重量％；
を含有する、［９］に記載の癌ワクチン組成物。
［１１］Ａ）炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルを３０〜８０重量％；
Ｂ）エチレンオキサイド５〜２０モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非イオン性界面活性剤を０．５〜２０重量％；
Ｃ）多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが４０℃で液体である乳化剤を０〜２０重量％；および
Ｅ）アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を１０〜６０重量％；
を含有し、当該組成物がＷ／Ｏエマルションである、特異的ＣＴＬ誘導剤。
［１２］Ａ）成分を４０〜６０重量％；
Ｂ）成分を１．０〜５．０重量％；
Ｃ）成分を５．０〜１０．０重量％；および
Ｅ）成分を３０〜５０重量％；
を含有する、［１１］に記載の特異的ＣＴＬ誘導剤。
［１３］アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相と、前記水相を希釈するための［１］〜［７］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物とを含む、癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤を用時調製するためのキット。
［１４］アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相と、［１］〜［７］のいずれかに記載の希釈用乳化組成物と、上記水相を希釈用乳化組成物で希釈して得られるＷ／Ｏエマルションを癌の治療または予防に使用しうるか、または使用すべきであることを記載した書類とを含む、商業用パッケージ。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＴＥＲＴペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
図２は、ＭＡＧＥ−１ペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
図３は、ＰＳＡペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
図４は、ＰＳＡペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
図５は、ＣＥＡペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
図６は、各種癌抗原ペプチドを含有させた癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
図７は、希釈用乳化組成物８の粒度分布を示す。
図８は、希釈用乳化組成物２９の粒度分布を示す。
図９は、癌抗原ペプチド２種を混合含有させた癌ワクチン組成物のそれぞれのペプチドに対する特異的ＣＴＬ誘導の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の希釈用乳化組成物について詳細に説明する。
本発明の「希釈用乳化組成物」とは、癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを希釈するために用いられる組成物をいう。本発明の「癌ワクチン組成物」とは、本発明の希釈用組成物で癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを希釈した組成物をいう。
本発明の希釈用乳化組成物はＷ／Ｏ型に予備乳化されたエマルションである。また、本発明の希釈用乳化組成物は、アミノ酸数８〜１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を希釈するための組成物であり、そのように希釈することにより、それぞれの癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ誘導を活性化する癌ワクチン組成物を調製することができる。
本発明の希釈用乳化組成物において、Ａ成分は脂肪酸とアルコールとのエステルであり、好ましくは、炭素数８〜２２の脂肪酸と炭素数２〜２４のアルコールとのエステルであって、かつ該エステルの凝固点が１０℃以下であるエステルである。
Ａ成分として用いる脂肪酸とアルコールとのエステルは、凝固点が１０℃以下となるものを選択すればよい。Ａ成分の凝固点が１０℃を超えると、希釈用乳化組成物の安定性、特に低温下での安定性が低下するおそれがあり好ましくない。
炭素数８〜２２の脂肪酸としては、例えば、炭素数８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸が挙げられ、具体的には、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、パルミトレイン酸、イソステアリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、ネルボニン酸などが挙げられる。炭素数２〜２４のアルコールとしては、例えば、炭素数２〜２４のアルカノール、炭素数２〜２４のアルケノールが挙げられ、具体的には、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、ブタノール、ヘキサノール、オクタノール、２−エチルヘキサノール、デカノール、ドデカノール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、イソセチルアルコール（２−ヘキシルデカノール）、イソステアリルアルコール、オレイルアルコール、イコセノール、ドコセノール、テトラコセノール、２−オクチルドデカノールなどといったアルコールなどが挙げられる。
本発明で用いるＡ成分としては、具体的には、例えば、２−エチルヘキサン酸セチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ブチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソセチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、パルミチン酸イソステアリル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸イソセチル、ステアリン酸２−エチルへキシル、オレイン酸エチル、オレイン酸デシル、オレイン酸オレイル、オレイン酸オクチルドデシル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピルなどが挙げられる。
本発明で用いるＡ成分は、エステルとして合成されたものでもよいし、天然油脂から抽出・精製されたものでもよい。天然由来のエステル油としては、例えば、ホホバ油やオレンジラフィー油などが挙げられる。これらのエステルは一般に市販されており、目的に応じて、医薬品用途に適したものを選択すればよい。
本発明で用いるＡ成分は、好ましくはオレイン酸エステル、ミリスチン酸エステルまたは２−エチルへキサン酸エステルであり、より好ましくはオレイン酸エチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、または２−エチルヘキサン酸セチルであり、さらに好ましくはオレイン酸エチルである。
本発明の希釈用乳化組成物において、Ａ成分の含有量は５０〜９０重量％であり、好ましくは５５〜８５重量％であり、より好ましくは６０〜８０重量％である。Ａ成分の含有量が５０重量％未満であると、癌抗原ペプチドを希釈して得られる最終的な癌ワクチン組成物が不安定になる可能性があるため好ましくない。
本発明の希釈用乳化組成物において、Ｂ成分はヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド５〜２０モル付加物からなる非イオン性界面活性剤である。
ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物は、乳化や可溶化等に広く用いられている界面活性剤の一つであり、エチレンオキサイド５〜１００モル付加物が市販されている。５モル未満のエチレンオキサイド付加物からなる界面活性剤は、界面活性作用が低すぎて、良好な乳化状態を呈する希釈用乳化組成物が形成できなくなる可能性があり、好ましくない。２０モル超のエチレンオキサイド付加物からなる界面活性剤は、親水性が高いため、乳化組成物を希釈して得られる癌ワクチン組成物において、水相粒子の凝集等により乳化安定性が低下するおそれがあるだけでなく、癌ワクチン組成物としてのＣＴＬ誘導活性が低下する可能性があり、好ましくない。
Ｂ成分として用いる非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド５〜２０モル付加物から構成される。そのような非イオン性界面活性剤を使用することにより、安定性に優れた希釈用乳化組成物を得ることができ、さらに、該希釈用乳化組成物で癌抗原ペプチドを希釈した場合に優れた安定性と高いＣＴＬ誘導活性を発揮する癌ワクチン組成物を調製することができる。ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド５〜２０モル付加物から構成される非イオン性界面活性剤を使用することにより、投与局所への安全性に優れた癌ワクチン組成物を最終的に調製することができる。このうち、本発明のＢ成分として好ましいのは、硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド１０〜２０モル付加物である。さらに本発明においては、これらのうち、硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド１０モル付加物を用いることが最も好ましい。
本発明の希釈用乳化組成物において、Ｂ成分の含有量は０．５〜２０重量％であり、好ましくは１〜１５重量％であり、より好ましくは１〜１０重量％である。Ｂ成分の含有量が０．５重量％未満であると、界面活性作用が低くなりすぎる結果、安定な希釈用乳化組成物が得られなくなる可能性があり、好ましくない。逆に２０重量％を超えると、癌抗原ペプチドを希釈したときに転相して、良好な癌ワクチン組成物が最終的に得られなくなるだけでなく、投与局所に対する癌ワクチン組成物の安全性が低下するおそれがあるため、やはり好ましくない。
本発明の希釈用乳化組成物が任意的に含むＣ成分は、多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであって、かつ該部分エステルが４０℃で液状を呈する乳化剤である。
本発明においては、上記のＢ成分に加えて、Ｃ成分を含有させることにより、癌抗原ペプチドを希釈した場合に、乳化状態がさらに良好であり、かつ安定性に優れた癌ワクチン組成物を調製でき、その結果、優れたＣＴＬ誘導活性を広い範囲のペプチドで発揮する癌ワクチン組成物とすることができる。
本発明のＣ成分を構成する多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、ソルビタン、ソルビトール、ソルバイト、マンニタン、マンニトール、スクロースなどが挙げられる。Ｃ成分を構成する脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸などが挙げられる。本発明のＣ成分としては、これらの多価アルコールと脂肪酸との部分エステルから、４０℃で液状を呈するものを選択すればよい。
好適なＣ成分の具体例としては、グリセリンモノオレート、グリセリンジオレート、ジグリセリンモノオレート、ジグリセリンジオレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンジオレート、ソルビタントリオレート、またはこれらの混合物などが挙げられる。その中でも特に好適なものは、グリセリンモノオレート、グリセリンジオレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンジオレート、またはこれらの混合物である。これらは一般に広く販売されており、医薬用途に適したものから選択することができる。
本発明の希釈用乳化組成物において、Ｃ成分の含有量は０〜２０重量％の範囲から選択される。その中でも１〜２０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましい範囲は５〜１５重量％である。このとき、２０重量％を超えると、希釈用乳化組成物としての粘度が高くなり、本発明の癌抗原ペプチドを希釈する場合に良好な癌ワクチン組成物が得られなくなるだけでなく、投与局所に対する癌ワクチン組成物の安全性が低下するおそれがあるため、好ましくない。また、Ｃ成分の含有量が１重量％以上であれば十分な添加効果を呈するので好ましい。
本発明の希釈用乳化組成物を構成するＤ成分は、乳化型を形成するための水相である。本発明のＤ成分としては、一般的に医薬品に使用される水成分から選択すればよく、例えば、精製水、注射用水、リン酸緩衝水溶液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。本発明の希釈用乳化組成物におけるＤ成分の含有量は、５〜２０重量％、好ましくは８〜１６重量％である。
本発明の希釈用乳化組成物においては、上記の各成分に加えて、乳化安定性に影響しない範囲で、抗酸化剤や安定剤などを添加することもできる。
抗酸化剤としては、例えば、α−トコフェロールやδ−トコフェロール等のトコフェロール類、没食子酸エステル類、ジブチルヒドロキシトルエンなどが挙げられる。
安定剤としては、グリセリンやプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類などが挙げられる。
本発明の希釈用乳化組成物は、一般的な乳化組成物の製造方法を適宜取り入れて製造することができる。通常は、Ａ成分、Ｂ成分およびＣ成分をあらかじめ混合し、これを攪拌しながら、徐々にＤ成分を加えていき、最終的にホモジナイザー等の乳化装置によって攪拌、乳化する方法が選択される。
本発明の希釈用乳化組成物は、好ましくは、非常に低粘度でかつ微細な粒子径を有するＷ／Ｏエマルションの形態として得られる。
本発明の希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径は、好ましくは１０００ｎｍ以下であり、より好ましくは５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５０〜５００ｎｍであり、特に好ましくは５０〜３００ｎｍである。
本発明では、希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径を、動的光散乱法により測定される全粒子（分散相）の粒子径の平均値で表現する。具体的には、測定対象の乳化組成物をＡ成分で適宜希釈して得られるサンプルを、例えば、ＭＡＬＶＥＲＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製のＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯ−Ｓ等に供することより測定することができる。
分散相の平均粒子径が１０００ｎｍを超えると、希釈用乳化組成物としての安定性が低下するだけでなく、癌抗原ペプチドを含む水相を希釈して最終的に得られる癌ワクチン組成物の均一性、安定性、さらにはＣＴＬ誘導活性が低下するおそれがあり、好ましくない。分散相の平均粒子径が５０〜３００ｎｍであれば、乳化組成物をＷ／Ｏエマルションの状態でろ過滅菌することもできる。ろ過滅菌を行う場合のフィルターには、油性液体のろ過に適したものを選択すればよい。具体的には、０．２μｍの孔径の疎水性フィルター（ポリテトラフルオロエチレン製）などが挙げられる。
本発明の希釈用乳化組成物は、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーと組み合わせることにより、それぞれの抗原に特異的なＣＴＬの誘導を活性化する癌ワクチンまたは特異的ＣＴＬ誘導剤を得るために使用される。そのように癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤を調製する際には、希釈用乳化組成物１容量部で、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相０．２５〜１容量部を希釈すればよい。このとき、癌抗原ペプチドまたはそのダイマーは水相中に溶解していてもよいし、分散していてもよい。
本発明の希釈用乳化組成物は、水粒子が微細に分散しているＷ／Ｏエマルションであり、しかも非常に低粘度である。よって、この希釈用乳化組成物でペプチドを含む水相を希釈すると、速やかに安定なＷ／Ｏエマルションを得ることができる。本発明の乳化組成物は、それ自体が安定なＷ／Ｏエマルションである。そして、癌抗原ペプチドを含有する水相を本発明の乳化組成物で上記のように希釈して得られる癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤もまた、安定なＷ／Ｏエマルションである。
したがって、本発明の希釈用乳化組成物で癌抗原ペプチドを含む水相を希釈する際の攪拌手段としては、ホモジナイザーやホモミキサー等の一般的な乳化装置を用いてもよいし、乳化には通常用いられないような簡便な攪拌装置、例えば、試験管ミキサーなどを用いてもよい。また、実験室で簡便に操作できるシリンジ連結法により上記の希釈を行うこともできる。そのため、目的に応じて投与直前に用時調製することも可能である。
好ましくは、希釈用乳化組成物と癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相とを容量比１：０．２５〜１：１で加えた後、試験管ミキサーを用い、攪拌速度に応じて３０秒〜３分程度攪拌することにより、安定で良好な癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤を得ることができる。このとき、希釈用乳化組成物を試験管ミキサーで攪拌しながら癌抗原ペプチドを含む水相を徐々に加えていき、加えるべき全量を加えた後、さらに３０秒以上攪拌するのが好ましい。
本発明における癌ワクチン組成物、または特異的ＣＴＬ誘導剤とは、このように、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を、本発明の希釈用乳化組成物で希釈、混合して得られるものであり、前述のとおり、安定なＷ／Ｏエマルションの形態を有している。
ペプチドは一般に熱に弱く、さらに水中で長期間安定に保つことが困難な場合が多い。上述したように、本発明では簡便な手段で用時調製を行うことも可能であるから、熱や水中での安定性が比較的低いペプチドを用いる場合であっても、乳化操作中や保存中の該ペプチドの分解や凝集を低減する。つまり、本発明の希釈用乳化組成物を用いることにより、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーの好ましくない変質を伴うことがないため、その種類や物性を問わず、種々のペプチド（そのダイマーを含む）を安定に保持した癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤を調製することが可能になる。
本発明において、癌抗原ペプチドとは、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーであり、ＭＨＣクラスＩ抗原に提示され、かつＣＴＬにより抗原認識されるペプチドを含有するものである。
本発明において、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドとしては、公知のものから選択することができる。例えば、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、およびチロシナーゼなどのメラノソームタンパク質由来の部分ペプチドが挙げられる。また、他の癌抗原ペプチドとして、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕなどの癌マーカー由来の部分ペプチド、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１などの癌・精巣抗原由来の部分ペプチド、ＭＵＣ−１やＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３などの上皮性癌細胞タンパク質由来の部分ペプチド等が挙げられる。さらに、癌で発現が増加しているＴＥＲＴ由来の部分ペプチドや、ＷＴ１由来の部分ペプチド、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ由来の部分ペプチド等も好適な癌抗原ペプチドとして挙げられる。
これらは、最終的に得られる癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤において、それぞれの癌抗原に対する、治療上有効な特異的ＣＴＬの誘導を妨げない限り、天然体でも一部のアミノ酸が改変された改変体であってもよい。
また、これら癌抗原のペプチドは、癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤において、一種のみならず二種以上を含有していてもよい。
これらの癌抗原ペプチドは、Ｆｍｏｃ法等による固相合成法やその他公知の方法により得ることができる。
各癌抗原ペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、以下のものが挙げられる。尚、以下に列挙するアミノ酸配列をもつ癌抗原ペプチドは公知である。
（１）ｇｐ１００由来ペプチドであれば、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号１）、ＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶ（配列番号２）、ＭＬＧＴＨＴＭＥＶ（配列番号３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号５）、ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（配列番号６）、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（配列番号７）、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ（配列番号８）、ＲＬＭＫＱＤＦＳＶ（配列番号９）、ＲＬＰＲＩＦＣＳＣ（配列番号１０）、ＶＹＦＦＬＰＤＨＬ（配列番号１１）など；
（２）ＭＡＲＴ−１由来ペプチドであれば、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１２）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１３）、ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ（配列番号１４）など；
（３）チロシナーゼ由来ペプチドであれば、ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ（配列番号１５）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号１６）、ＡＦＬＰＷＨＲＬＦ（配列番号１７）、ＡＦＬＰＷＨＲＬＦＬ（配列番号１８）など；
（４）ＣＥＡ由来ペプチドであれば、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（配列番号１９）、ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号２０）、ＬＬＴＦＷＮＰＰＴ（配列番号２１）、ＱＹＳＷＦＶＮＧＴＦ（配列番号２２）、ＴＹＡＣＦＶＳＮＬ（配列番号２３）など；
（５）ＰＳＡ由来ペプチドであれば、ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ（配列番号２４）、ＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹ（配列番号２５）、ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号２６）、ＣＹＡＳＧＷＧＳＩ（配列番号２７）など；
（６）ＭＵＣ−１由来ペプチドであれば、ＳＴＡＰＰＶＨＮＶ（配列番号２８）など；
（７）ＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ペプチドであれば、ＱＩＩＳＡＶＶＧＩＬ（配列番号２９）、ＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号３０）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号３１）、ＣＬＴＳＶＱＬＶ（配列番号３２）、ＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（配列番号３３）、ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ（配列番号３４）、ＰＹＶＳＲＬＬＧＩ（配列番号３５）、ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ（配列番号３６）など；
（８）ＭＡＧＥ−１由来ペプチドであれば、ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ（配列番号３７）など；
（９）ＭＡＧＥ−３由来ペプチドであれば、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号３８）、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号３９）、ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ（配列番号４０）、ＴＦＰＤＬＥＳＥＦ（配列番号４１）など；
（１０）ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドであれば、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号４２）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号４３）、ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番号４４）など；
（１１）ＳＡＲＴ−１由来ペプチドであれば、ＥＹＲＧＦＴＱＤＦ（配列番号４５）など；
（１２）ＳＡＲＴ−３由来ペプチドであれば、ＶＹＤＹＮＣＨＶＤＬ（配列番号４６）など；
（１３）ＴＥＲＴ由来ペプチドであれば、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号４７）ＶＹＡＥＴＫＨＦＬ（配列番号４８）、ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ（配列番号４９）など；
（１４）ＷＴ１由来ペプチドであれば、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号５０）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号５１）、ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（配列番号５２）など；
（１５）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ由来ペプチドであれば、ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ（配列番号５３）など：
本明細書において、上記のペプチドは左側がＮ末端であり、各アミノ酸記号はそれぞれ以下のアミノ酸残基であることを示している。
Ａ：アラニン残基
Ｇ：グリシン残基
Ｍ：メチオニン残基
Ｓ：セリン残基
Ｃ：システイン残基
Ｈ：ヒスチジン残基
Ｎ：アスパラギン残基
Ｔ：スレオニン残基
Ｄ：アスパラギン酸残基
Ｉ：イソロイシン残基
Ｐ：プロリン残基
Ｖ：バリン残基
Ｅ：グルタミン酸残基
Ｋ：リジン残基
Ｑ：グルタミン残基
Ｗ：トリプトファン残基
Ｆ：フェニルアラニン残基
Ｌ：ロイシン残基
Ｒ：アルギニン残基
Ｙ：チロシン残基
これらの癌抗原ペプチドは癌抗原タンパク質の部分ペプチドであるが、そのアミノ酸配列中、Ｎ末端がシステインであるものも存在する。このような癌抗原ペプチドは、水中でダイマー化しやすく、投与する際に、その含量の一部またはそのほとんどがダイマー化している場合がある。本発明においては、そのようにアミノ酸数８から１２のペプチドがダイマー化した場合においても同様のＣＴＬ誘導活性を示すため、癌抗原ペプチドとしては、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーから目的に応じて選択することができる。本発明における癌抗原ペプチドとしては、イン・ビボで効率的にＣＴＬを誘導させるため、アミノ酸数８から１２の癌抗原ペプチドのうちでも、ＨＬＡ−Ａ２４０２（単にＨＬＡ−Ａ２４ともいう）またはＨＬＡ−Ａ０２０１（単にＨＬＡ−Ａ２ともいう）拘束性のエピトープ配列であるものが好ましい。そのような癌抗原ペプチドを用いることにより、最終的にイン・ビボで細胞傷害性Ｔ細胞を誘導、活性化する、有効な癌ワクチン組成物を調製することができる。
本発明の希釈用乳化組成物と混合する場合の水相中の癌抗原ペプチド（そのダイマーも含む。以下同じ）の濃度は、最終的に得られる癌ワクチン組成物中の含有量がＣＴＬの誘導を活性化するために適切な範囲の量となるように、用いるペプチドの種類に応じて選択すればよい。本発明の癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤（以下、単に癌ワクチン組成物ともいう）は、希釈用乳化組成物を用いることにより、ペプチドの種類や物性によらず安定に保持することが可能であるため、含有させるペプチド濃度は広い範囲で設定することができる。具体的には、投与経路や投与手段によって異なるものの、通常、最終的に得られる癌ワクチン組成物中のペプチド濃度は０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬである。
本発明の癌ワクチン組成物の投与経路としては、用いる癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ誘導の活性化が可能な限り、通常用いられる投与方法を選択すればよい。その投与経路の例としては、例えば、皮下、皮内、筋肉内などが挙げられる。
また、癌抗原ペプチドの投与量としては、治療目的の疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって適宜調整することができるが、０．００１〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
本発明の癌ワクチン組成物は、Ｗ／Ｏエマルションである。本発明の癌ワクチン組成物は、Ａ成分を３０〜８０重量％、Ｂ成分を０．５〜２０重量％、Ｃ成分を０〜２０重量％、Ｅ成分を１０〜６０重量％含有し、好ましくは、Ａ成分を４０〜６０重量％、Ｂ成分を１．０〜５．０重量％、Ｃ成分を５．０〜１０．０重量％、Ｅ成分を３０〜５０重量％含有するＷ／Ｏエマルションである。保存や注射用シリンジによる投与を考慮すると、本発明の癌ワクチン組成物は、好ましくは５℃で液状を呈し、かつ２５℃における粘度が３００ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２５℃における粘度が２００ｍＰａ・ｓ以下である。
本発明のＥ成分である水相中には、癌抗原ペプチドの物性に応じて、最終的に得られる癌ワクチン組成物の安定性に影響を与えない範囲で、安定剤、溶剤、溶解補助剤、分散剤、賦形剤、緩衝剤、等張剤、ｐＨ調節剤などが含まれていてもよい。したがって、希釈用乳化組成物で、抗原ペプチドを含む水相を希釈する場合には、抗原ペプチドの物性に応じて、上述の各成分を適宜選択すればよい。
本発明の癌ワクチン組成物は、含有する癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬの誘導を活性化し、癌細胞を攻撃する。
ＣＴＬ誘導活性は、ＨＬＡテトラマー法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２））または限界希釈法（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．：４，３２１−３２７（１９９８））によりＣＴＬの数を測定することにより確認することができる。あるいは、例えばＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性は、国際公開第０２／４７４７４号パンフレットおよびＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることなどにより確認することができる。
本発明の癌ワクチン組成物は、含有させる癌抗原ペプチドに応じて、特異的なＣＴＬの誘導能を有していて、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を示す。従って、本発明の癌ワクチン組成物は、癌の治療または予防のための癌免疫療法製剤として使用することができる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明するが、これらの例は本発明を何ら限定するものではない。
〈希釈用乳化組成物の調製〉
［実施例１］
Ａ成分としてオレイン酸エチル（医薬品添加物規格適合品）、Ｂ成分としてポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０（医薬品添加物規格適合品；エチレンオキサイド１０モル付加）、Ｃ成分としてセスキオレイン酸ソルビタン（日本薬局方適合品）をそれぞれ表１に記載の量で混合した。次に、これを攪拌しながら、Ｄ成分として、表１に示した量の注射用水（日本薬局方適合品）を徐々に加えた。乳化は、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  １．５Ｓ（（株）エムテクニック製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで５分間、室温下で攪拌することにより行った。これにより、希釈用乳化組成物１を得た。この乳化組成物を調製後２４時間室温下で静置したところ、外観上の変化は認められなかった。
［実施例２〜３５］
実施例１と同様に、あらかじめＤ成分以外の成分を混合した。この混合物を攪拌しながら、Ｄ成分を徐々に加えて乳化を行った。乳化は、全てＣＬＥＡＲＭＩＸ  １．５Ｓ（（株）エムテクニック製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで５分間、室温下で攪拌することにより行った。Ｄ成分としては、注射用水、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）をそれぞれ表１〜７にしたがって用いた。また、表１〜７に記載した各成分は日本薬局方、医薬品添加物規格、または化粧品原料基準に適合したものを用いた。これにより、乳化組成物２〜３５を得た。得られた希釈用乳化組成物２〜３５について、調製後２４時間室温下で静置した際の外観上の変化を調べた結果、いずれの乳化組成物も分離等の変化は認められなかった。
〔比較例１〜２５〕
実施例１と同様に、オレイン酸エチル（医薬品添加物規格適合品）、表８〜１２の各種ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（医薬品添加物規格適合品）、セスキオレイン酸ソルビタン（日本薬局方適合品）をそれぞれ表８〜１２に記載の量となるように混合した。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０やポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０等は５０℃に加温し、溶融させたものを混合した。なお、乳化組成物４６（比較例１１）の調製に用いたポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールについては、混合が容易でないため、あらかじめ水相に溶解して乳化時に混合した。次に、これを攪拌しながら、注射用水、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）をそれぞれ表８〜１２にしたがって徐々に加えた。乳化は、ＣＬＥＡＲＭＩＸ  １．５Ｓ（（株）エムテクニック製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで５分間、室温下で攪拌することにより行った。これにより、希釈用乳化組成物３６〜６０を得た。なお、表に記載した各成分は日本薬局方、医薬品添加物規格、または化粧品原料基準に適合したものを用いた。いずれの公定書にも収載されていないものは医薬用途に準じたグレードを使用した。得られた乳化組成物を調製後２４時間静置したところ、乳化組成物３６〜３９、および５６、５７については分離等の変化は認められなかったが、乳化組成物４０〜５５、および５８〜６０については、油相と水相の分離（クリーミングを含む）が認められた。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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〔試験例１〕
〈癌ワクチン組成物の調製〉
実施例で得られた各希釈用乳化組成物のうち、調製後２４時間静置により外観上分離が見られなかったものを用いて、各種の癌抗原ペプチドを含有する癌ワクチン組成物を調製した。調製に用いた癌抗原ペプチドを表１３に示す。これらのペプチドはいずれもＨＬＡ−Ａ２４拘束性である。
【表１３】
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表１３に記載の癌抗原ペプチドのうち、ＴＥＲＴ、ＭＡＧＥ−１、ＣＥＡについては、１．２ｍｇの合成ペプチドを１０．８μＬのＤＭＳＯに溶解した後、注射用水３４９．２μＬに希釈し、析出物が無いことを目視で確認した（ＤＭＳＯ濃度３％）。また、ＰＳＡについては、１．２ｍｇの合成ペプチドを注射用水で３６０μＬに希釈し、析出物が無いことを目視で確認した。別途、実施例で得られた乳化組成物を試験管ミキサー（タッチミキサーＭＴ−５１、ヤマト科学製）にて充分混合した（使用前に十分に攪拌し均一化した）。
次に、乳化組成物７００μＬを１０００μＬ用エッペンドルフピペットを用いて、５ｍＬ容セラムチューブ（住友ベークライト社製）に採取した。次いで、そのチューブを試験管ミキサーで攪拌しながら、上記のペプチド含有水相３００μＬを滴下し、混合した。試験管ミキサーの攪拌速度は最大に設定した。ペプチド含有水相を滴下後、さらに２分間試験管ミキサーにて攪拌し、癌ワクチン組成物を得た。
以下の試験では、調製した癌ワクチン組成物を用いて実際にＣＴＬ誘導活性を評価するが、特に記載のない限り、評価に用いた癌ワクチン組成物は上記方法に従って調製されたものである。
〔試験例２〕
〈ＴＥＲＴペプチド含有癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導〉
試験例１にて調製したＴＥＲＴペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導能をＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウス（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：ｌ００，５６５，２００２）を用いて評価した。
癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物７、８、３７、３８、３９、４５を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。評価に際しては、試験例１と別に、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ、和光純薬工業製）を用いて調製したＴＥＲＴペプチド含有乳濁液、およびペプチド水相のみを投与液とする群を設定し、癌ワクチン組成物を投与液とする群と比較した（いずれの投与群もペプチド投与量が同じになるように調整した）。各投与液２００μＬ（それぞれペプチド投与量２００μｇ）をＨＬＡ−Ａ２４／Ｋｂトランスジェニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは各群３匹用いた。投与７〜８日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を１００μｇ／ｍＬのペプチドで１時間パルスした。パルスとは、ペプチドを脾細胞に添加し、細胞表面上のＨＬＡに抗原ペプチドを結合させることを言う。ペプチドをパルスしていない脾細胞を２４穴プレートに７×１０６個／ｗｅｌｌで播種し、更に上記のペプチドをパルスした脾細胞を７×１０５個／ｗｅｌｌ添加して培養した。培養液には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％  ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを含ませ、５〜６日間培養した。培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的なＣＴＬの活性を５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：１５９，４７５３，１９９７）により測定した。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２４とＨ−２ＫｂのキメラのＭＨＣクラスＩ分子（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５，２００２）を安定的に発現するように、マウスリンパ腫由来細胞株ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ株番号ＴＩＢ−３９）に遺伝子導入して作製した細胞株ＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂを用いた。標的細胞は３．７Ｍｂｑ／１０６個で５１Ｃｒラベル後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍＬになるように添加して更に１時間パルスした。またペプチドをパルスしない（非パルスの）標的細胞を２時間５１Ｃｒラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を１：８０の割合で混合して４時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合よりＣＴＬ活性を求めた。結果を図１に示す。
図１に示すように、本発明の癌ワクチン組成物を投与した群では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン３７、３８、３９、４５を投与した群、ＩＦＡより調製したペプチド乳濁液を投与した群、およびペプチドのみを投与した群では細胞傷害性が低く、ＣＴＬの誘導活性は低かった。このことから、本発明の希釈用乳化組成物は、癌抗原ペプチドと組み合わせることにより、イン・ビボにおいてＣＴＬの誘導を活性化することは明らかである。また、本発明のＡ成分の種類とＢ成分のエチレンオキサイド付加モル数がＣＴＬ誘導活性に影響していることがわかる。
〔試験例３〕
〈ＭＡＧＥ−１ペプチド含有癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導〉
試験例１にて調製したＭＡＧＥ−１ペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導能を試験例２と同様に評価した。
癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物８、３７、３８、４５を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。評価に際しては、試験例１と別に、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ、和光純薬工業製）を用いて調製したＭＡＧＥ−１ペプチド含有乳濁液、およびペプチド水相のみを投与液とする群を設定し、癌ワクチン組成物を投与液とする群と比較した。結果を図２に示す。
図２に示すように、本発明の癌ワクチン組成物を投与した群では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン３７、３８、４５を投与した群、ＩＦＡより調製したペプチド乳濁液を投与した群、およびペプチドのみを投与した群では細胞傷害性が低く、ＣＴＬの誘導活性は低かった。以上の結果は試験例２の結果と同様であり、本発明の希釈用乳化組成物の有用性がわかる。
〔試験例４〕
〈ＰＳＡペプチド含有癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導（１）〉
試験例１にて調製したＰＳＡペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導能を試験例２と同様に評価した。
癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物２、７、１０、２９、３８を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。また、乳化組成物７を用いて、乳化組成物７００μＬと注射用水３００μＬとを試験例１に従って混合し、ペプチドを含まない組成物を調製し、比較を行った。結果を図３に示す。
図３に示すように、本発明の癌ワクチン組成物（２、７、１０、２９）を投与した群では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン３８を投与した群では細胞傷害性が低く、ＣＴＬの誘導活性は低かった。また、ペプチドを含まない組成物を投与した群では細胞傷害性が全く認められなかったことから、乳化組成物のみではＣＴＬを誘導する活性を有しないことがわかる。以上の結果は試験例２の結果と同様であり、本発明の希釈用乳化組成物の有用性がわかる。
〔試験例５〕
〈ＰＳＡペプチド含有癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導（２）〉
試験例１にて調製したＰＳＡペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導能を試験例４と同様に評価した。
癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物１６、１７、２０を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。評価に際しては、試験例１と別に、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ、和光純薬工業製）を用いて調製したＰＳＡペプチド含有乳濁液を投与液とする群を設定し、癌ワクチン組成物を投与液とする群と比較した。結果を図４に示す。
図４に示すように、本発明の癌ワクチン組成物を投与した群では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。また、ＰＳＡペプチドを用いた場合は、ＩＦＡより調製したペプチド乳濁液を投与した群でもペプチド特異的ＣＴＬが誘導された。この結果および試験例２、３の結果から、従来より知られているＩＦＡは一部の癌抗原ペプチドではＣＴＬ誘導を活性化するものの、ペプチドの種類に大きく影響し、汎用性の面で不十分であることが示された。
〔試験例６〕
〈ＣＥＡペプチド含有癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導〉
試験例１にて調製したＣＥＡ含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導能を試験例２と同様に評価した。
癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物１２、１３、２８、２９、３０、３７、３８を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。結果を図５に示す。図５に示すように、本発明の乳化組成物を用いて調製した癌ワクチン組成物を投与した群（１２、１３、２８、２９）では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン３７、３８を投与した群では細胞傷害性が低く、ＣＴＬの誘導活性は低かった。以上の結果は試験例２の結果と同様であり、本発明の希釈用乳化組成物の有用性がわかる。
〔試験例７〕
〈各種癌抗原ペプチドを含有させた癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導〉
乳化組成物２１を用いて、試験例１に従って調製したＴＥＲＴ、ＭＡＧＥ−１、ＣＥＡの各ペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的ＣＴＬ誘導能を試験例２と同様に評価した。結果を図６に示す。図６によれば、本発明の乳化組成物を用いて調製した癌ワクチン組成物を投与した群では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。
以上の結果、本発明の希釈用乳化組成物は、種々の癌抗原ペプチドと組み合わせることにより、イン・ビボにおいてそれぞれの癌抗原に特異的なＣＴＬの誘導を活性化することがわかる。
〔試験例８〕
〈希釈用乳化組成物の安定性評価〉
実施例にて調製した希釈用乳化組成物について、安定性試験を行った。試験には、調製後２４時間静置により外観上分離が見られなかった乳化組成物１〜３９、５６、５７を用いた。具体的には、各乳化組成物２ｍＬを４ｍＬ容のガラス製バイアルに充填、密栓し、２５℃で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月保存後の外観上の変化を観察した。その結果、いずれの乳化組成物も外観上の変化は認められなかった。
〔試験例９〕
〈希釈用乳化組成物の顕微鏡観察〉
試験例８と同様に、調製後２４時間静置により外観上分離が見られなかった乳化組成物（１〜３９、５６、５７）を用いて、希釈前後の乳化状態を顕微鏡下で観察した。まず、各乳化組成物の乳化状態を位相差顕微鏡により２００倍で観察した。その結果、いずれの乳化組成物も微細で良好な乳化状態であった。そこで、各乳化組成物７００μＬと注射用水３００μＬとを５ｍＬ容セラムチューブ（住友ベークライト社製）にとり、試験管ミキサー（タッチミキサー  ＭＴ−５１、ヤマト科学製）を用いて２分間攪拌した後の乳化状態を上記と同様に顕微鏡下で観察した。その結果、乳化組成物１〜３５については、いずれも微細で良好な乳化状態を示したが、乳化組成物３６〜３９、および５６、５７では明らかに水相粒子の凝集が認められた。
〔試験例１０〕
〈希釈用乳化組成物の平均粒子径評価〉
実施例および比較例で得られた希釈用乳化組成物のうち、乳化組成物１、２、４、６、７、８、１０、２１、２９、３６、３９の平均粒子径を測定した。測定は、粒度分布測定装置（ＺＥＴＡ−ＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯ−Ｓ、ＭＡＬＶＥＲＮＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）を用いて、動的光散乱法により行った。なお、測定を適切に行うために、測定時にはそれぞれの乳化組成物を連続相であるオレイン酸エチルで適宜希釈した。結果を表１４に示す。平均粒子径は光散乱強度から算出された全粒子径の平均値である。また、測定結果の例として、乳化組成物８および２９の調製時（イニシャル）の粒度分布をそれぞれ図７、８に示す。
【表１４】
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測定の結果、調製時にはいずれの乳化組成物も５０〜５００ｎｍの範囲であった。このことから、癌抗原ペプチドの希釈用として用いるためには、良好な乳化状態を示すだけでは不十分であることがわかる。すなわち、本発明の希釈用乳化組成物によるＣＴＬ誘導能に必須であるのは、『良好な乳化組成物が調製できる』ことではなく、Ｂ成分である非イオン性界面活性剤のエチレンオキサイド付加モル数が特定の範囲である、ということが本データで示された。
また、上記の希釈用乳化組成物のうち、乳化組成物１、２、４、６、７、８、１０、２１、２９については、５℃で３ヶ月間保存後の平均粒子径を同様に測定した。その結果、いずれの乳化組成物も平均粒子径に大きな変化が認められなかったことから、本発明の希釈用乳化組成物は低温安定性にも優れることがわかる。
〔試験例１１〕
〈癌抗原ペプチド２種を混合含有させた癌ワクチン組成物によるＣＴＬ誘導〉
表１３に記載の癌抗原ペプチドのうち、ＭＡＧＥ−１とＣＥＡ、ＴＥＲＴとＣＥＡ、ＣＥＡとＰＳＡをそれぞれ混合したペプチド２種含有癌ワクチン組成物を調製し、その特異的ＣＴＬ誘導能を評価した。
各癌ワクチン組成物の調製には乳化組成物４を用い、具体的には以下のように行った。
まず、ＭＡＧＥ−１、ＣＥＡ、ＴＥＲＴ、ＰＳＡの各ペプチドについて、１００ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯ溶液を調製した。次に、ＭＡＧＥ−１とＣＥＡ、ＴＥＲＴとＣＥＡ、ＣＥＡとＰＳＡの各ＤＭＳＯ溶液をそれぞれ混合し、さらに注射用水を用いて、各ペプチドが２ｍｇ／６００μＬになるように希釈し、ペプチド混合溶液を調製した（ペプチド合計量として４ｍｇ／６００μＬ）。各溶液は調製後、析出物が無いことを目視で確認した。別途、実施例で得られた乳化組成物を試験管ミキサー（タッチミキサー  ＭＴ−５１、ヤマト科学製）にて充分混合した（使用前に十分に攪拌し均一化した）。
次に、乳化組成物７００μＬを１０００μＬ用エッペンドルフピペットを用いて、５ｍＬ容セラムチューブ（住友ベークライト社製）に採取した。次いで、そのチューブを試験管ミキサーで攪拌しながら、上記のペプチド混合溶液３００μＬを滴下し、混合した。試験管ミキサーの攪拌速度は最大に設定した。ペプチド混合溶液を滴下後、さらに２分間試験管ミキサーにて攪拌し、癌ワクチン組成物３種（ＭＡＧＥ−１／ＣＥＡ混合、ＴＥＲＴ／ＣＥＡ混合、ＣＥＡ／ＰＳＡ混合）を得た。
調製した癌ワクチン組成物３種の特異的ＣＴＬ誘導能をＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウス（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５，２００２）を用いて評価した。
各投与液２００μＬ（それぞれペプチド投与量２００μｇ×２種）をＨＬＡ−Ａ２４／Ｋｂトランスジェニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは各群１匹を用いた。投与７日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を各５０μｇ／ｍＬの対象ペプチド２種（計１００μｇ／ｍＬ）で１時間パルスした。ペプチドをパルスしていない脾細胞を２４穴プレートに７×１０６個／ｗｅｌｌで播種し、更に上記のペプチドをパルスした脾細胞を７×１０５個／ｗｅｌｌ添加して培養した。培養液には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％  ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを含ませ、５日間培養した。培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的なＣＴＬの活性を５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：１５９，４７５３，１９９７）により測定した。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２４とＨ−２ＫｂのキメラのＭＨＣクラスＩ分子（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：ｌ００，５６５，２００２）を安定的に発現するように、マウスリンパ腫由来細胞株ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ株番号ＴＩＢ−３９）に遺伝子導入して作製した細胞株ＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂを用いた。標的細胞は３．７Ｍｂｑ／１０６個で５１Ｃｒラベル後、各ペプチドを１００μｇ／ｍＬになるように添加して更に１時間パルスした。またペプチドをパルスしない（非パルスの）標的細胞を２時間５１Ｃｒラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を１：８０の割合で混合して４時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合よりＣＴＬ活性を求めた。結果を図９に示す。
図９に示すように、本発明の希釈用乳化組成物を用いて調製した癌ワクチン組成物を投与した群では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害した。一方、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、癌抗原ペプチドを２種混合させた場合、それぞれのペプチド特異的ＣＴＬが同時に誘導されていることが明らかとなった。このことから、本発明の希釈用乳化組成物は、さまざまな癌抗原ペプチドと組み合わせることにより、イン・ビボにおいてＣＴＬの誘導を活性化することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の希釈用乳化組成物は、それ自体が安定なＷ／Ｏエマルションである。本発明の希釈用乳化組成物で癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを簡便な操作により希釈することで、イン・ビボにおいて、それぞれの癌抗原に特異的なＣＴＬ誘導活性を示し、かつ安定なＷ／Ｏエマルションである癌ワクチン組成物が提供される。
また本発明により、特異的ＣＴＬの誘導を目的とした、癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用の乳化組成物が提供される。さらに、この希釈用乳化組成物により、イン・ビボにおいて、さまざまな癌抗原に特異的なＣＴＬ誘導活性を有する癌ワクチン組成物が提供される。本発明は、多くの癌患者の病態改善に有効であると考えられる。
本出願は、日本で出願された特願２００５−０１２１４０（出願日：２００５年１月１９日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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