(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を有効成分とする腸管内細胞溶解活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を有効成分とする腸管内での細胞溶解活性抑制剤に関する。また、本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を配合して腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した医薬又は飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の日本型の食事は、人間にとって理想的な食事に近いことから世界的に注目されてきている。しかし、近年、日本人の食事は、従来の日本型から西洋型へと変化してきており、そのことが問題視されてきている。つまり、西洋型の食事は、一般的に肉や脂肪が多く、野菜や穀物が少ない高脂肪・低カルシウムであるからである。
【０００３】
先に Lapreらは、高脂肪・低カルシウムの食事を摂取すると腸管の内容物に含まれる水溶性の胆汁酸と脂肪酸が共に増加し、この水溶性の胆汁酸と脂肪酸が界面活性剤として作用するので、腸粘膜を構成する細胞を破壊すると報告している(Lapre,J.A., De Vries,H.T., Termont,D.S.M.L., Kleibeuker,J.H., De Vries,E.G.E. and Van der Meer,R., Cancer Research, vol.53, pp.248-253, 1993)。なお、 Lapreらは、水溶性の胆汁酸と脂肪酸の作用について、赤血球の溶血反応を利用した細胞溶解活性を測定することにより評価している。
【０００４】
また、遺伝的素因により大腸癌を発病するリスクの高い人々においては、高脂肪・低カルシウムの食事を取り続けることにより腸粘膜の損傷が起こり、大腸癌を発病するリスクがさらに高まる恐れがあることが報告されている(Lipkin,M., Blattner,W.E., Fraumeni,J.F.Jr., Lynch,H.T., Deschner,E. and Winawer,S., Cancer Research, vol.43, pp.1899-1904, 1983; Newmark,H.L., Lipkin,M. and Maheshwari,N., Journal of National Cancer Institute, vol.82, pp.491-496, 1990)。
【０００５】
このように、高脂肪・低カルシウムの食事を取ると、腸管の内容物に含まれる水溶性の胆汁酸と脂肪酸が増加し、腸粘膜が損傷を受け易い腸内環境を誘発することになる。
【０００６】
一方、高脂肪・低カルシウムの食事に起因する腸粘膜の損傷は、カルシウムを大量に経口摂取することにより緩和されることが、前述した Lapreらの報告から知られている。しかし、その有効なカルシウムの摂取量は、一日当たり 1,422mgであり、成人一日当りのカルシウム所要量といわれる 600mgの２倍以上を必要とするものである。したがって、大量のカルシウムを通常の食事で摂取し続けるということは困難であり、腸粘膜を保護するにはカルシウム製剤等に頼らざるを得ないという問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記の現状を鑑み、食生活を大きく変えることなく、安全に腸粘膜を保護することができる安価な食品素材を求めて鋭意研究を進めていたところ、従来より食用として使用され、安全性が立証されている微生物であるビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体が腸管内での細胞溶解活性を抑制する作用を有することを見出した。そして、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物であるビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis) 、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) 、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)及びビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve)の菌体も同様に腸管内での細胞溶解活性を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を有効成分とする腸管内細胞溶解活性抑制剤に関する。また、本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を配合して腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した医薬又は飲食品に関する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明で有効成分として使用するビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物は、発酵乳等のスターターとして使用されており、腸管に定着して感染や腐敗の防止、下痢の予防等に役立っていることが知られている。
【０００９】
このビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体は、例えば、培養基として合成培地等を使用し、嫌気的条件下で培養した後、遠心分離等の処理により生菌体を回収し、そのまま利用することもできるし、また、この生菌体を洗浄した後、凍結乾燥等の処理により乾燥菌体として利用することもできる。
【００１０】
なお、本発明で有効成分として使用することのできるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis) 、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) 、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve)等を例示することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上記のようにして得られたビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体は、そのまま使用しても良いし、あるいは、乳糖等の賦形剤を加え、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の医薬としても良い。また、各種飲食品、例えば、清涼飲料水、果汁飲料、発酵飲料、ゼリー、アイスクリーム、ガム、キャンディー等に配合して使用することもできる。
【００１２】
なお、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体に腸管内での細胞溶解活性抑制作用を発揮させるには、成人の場合、一日当たり乾燥菌体重量として0.5g〜5gを摂取する必要がある。
以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明する。
【００１３】
【実施例１】
表１に組成を示した培地12リットルに、同様の培地で前培養したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) を５重量％接種した後、37℃で16時間、嫌気的条件下で循環培養して、菌体を増殖させた。なお、この培養は、6Nアンモニア溶液を断続的に添加することによりpHが 6.5となるよう調整しながら行った。
【００１４】
【表１】
───────────────────────────────
プロテオースペプトン（雪印乳業製）        10 (g/リットル)
酵母エキス粉末（アサヒビール薬品製）      10
Ｄ−グルコース                            10
リン酸水素二カリウム                       5
リン酸二水素カリウム                       1
Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム               1
───────────────────────────────
【００１５】
培養終了後、この培養液に 0.9％塩化ナトリウム溶液60リットルを通液して菌体を洗浄し、限外濾過膜処理して溶液が７リットルとなるまで濃縮した後、遠心分離(8,000×g 、15分間、４℃) し菌体及び菌体を含んだスラリーを回収した。そして、菌体を含んだスラリーには凍結保護剤として最終濃度１％のグルタミン酸ナトリウムと最終濃度５％のショ糖を添加し、溶解した。そして、菌体とグルタミン酸ナトリウムとショ糖を溶解したスラリーとを混合し、凍結乾燥した後、粉砕してビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体80g を得た。なお、この菌体中の生菌数は３×1011cfu/g であった。
【００１６】
【実施例２】
実施例１と同様の条件で、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis) JCM-7046、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) JCM-1210、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum) JCM-7004 及びビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve) JCM-7016 を培養し、同様に処理して各菌体を得た。
【００１７】
【試験例１】
実施例１及び２で得られたビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の各菌体を使用し、動物実験により、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を調べた。
【００１８】
１，２−ジメチルヒドラジン・２塩酸を体重１kg当たり40mgとなるよう調整して８週齢のWistar系雄ラット16匹に皮下注射した。なお、実験動物に１，２−ジメチルヒドラジン・２塩酸を注射すると大腸癌を発病し易い遺伝的素因が誘導される。そして、これらのラットを群間において体重が等しくなるように配慮しながら１群８匹の２群に分け、表２に示した飼料を15日間自由摂取させると共に、イオン交換水も自由摂取させた。なお、対照飼料及び本発明飼料に配合した脂肪は標準飼料(American Institute of Nutrition: Journal of Nutrition, vol.107, pp.1340-1348, 1977)の４倍であり、対照飼料及び本発明飼料に配合したカルシウムは標準飼料の 1/5であって、高脂肪・低カルシウムとなっている。
【００１９】
そして、15日間の飼育期間中、各群共に体重増加量及び摂取カロリーに有意差は認められなかった。
【００２０】
【表２】
0004852681.tif 000002
【００２１】
また、飼料に配合した塩類混合の組成を表３に、ビタミン混合の組成を表４にそれぞれ示す。
【００２２】
【表３】
───────────────────────────
リン酸水素カルシウム・２水和物      12.3 (重量％)
塩化ナトリウム                       7.4
塩化カリウム                         7.7
炭酸水素カリウム                    10.0
硫酸カリウム                         5.2
酸化マグネシウム                     2.4
硫酸マンガン・５水和物               0.73
硫酸第一鉄・７水和物                 0.51
炭酸亜鉛                             0.16
炭酸水酸化第二銅・１水和物           0.03
セレン酸ナトリウム・５水和物         0.001
ヨウ素酸カリウム                     0.001
クロムミョウバン                     0.055
────────────────────────────────────
ショ糖で全量を 100％とした。
【００２３】
【表４】
──────────────────────
ビタミンＥ・アセテート      750IU/100g
ビタミンＫ3                   5mg/100g
ビタミンＢ1                  60mg/100g
ビタミンＢ2                  60mg/100g
ビタミンＢ6                  70mg/100g
ビタミンＢ12                  0.1mg/100g
Ｄ−ビオチン                  2mg/100g
葉酸                         20mg/100g
パントテン酸カルシウム      160mg/100g
ニコチン酸                  300mg/100g
──────────────────────
ショ糖で全量を100gとした。
【００２４】
飼料摂取を開始して11〜14日目に、糞を定量的に回収し、凍結乾燥した後、粉砕した。そして、この粉砕した糞1.2gに超純水 3.6mlを加えてペースト状にし、37℃で１時間加温した後、遠心分離 (15,000×g 、10分間) して水溶性画分を分離、回収し、この水溶性画分の細胞溶解活性を測定した。
【００２５】
また、飼育が終了したラットはエーテル麻酔下で解剖し、大腸遠位部の内容物を回収し、凍結乾燥して水分（％）を測定した。
【００２６】
一方、13週齢Wistar系雄ラット１匹をエーテル麻酔下で開腹し、後大静脈より血液５mlを回収し、ヘパリン処理した後、遠心分離(1,000×g 、10分間、４℃) し、上清とバフィコートをパスツールピペットで除去して残渣を赤血球画分とした。次に、この赤血球画分に３倍体積量のＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液(pH7.4、1.5mM ＨＥＰＥＳ及び 0.9％塩化ナトリウム含有) を添加し、赤血球膜を壊さないよう良く撹拌した後、遠心分離(1,000×g 、10分間、４℃) し、上層とバフィコートを除去するという操作を４回繰り返し、赤血球を洗浄した。そして、このようにして得られた赤血球に３倍体積量の 0.9％塩化ナトリウム溶液を添加、混合し、糞の水溶性画分の細胞溶解活性を測定する際に使用した。
【００２７】
糞の水溶性画分の細胞溶解活性を測定するに際しては、以下のような検体を調製して使用した。
検体１    糞の水溶性画分  40μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液 120μl
検体２    糞の水溶性画分  80μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液  80μl
検体３    糞の水溶性画分 120μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液  40μl
検体４    糞の水溶性画分 160μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液  ０μl
標準検体１    超純水  ０μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液 160μl
標準検体２    超純水  40μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液 120μl
標準検体３    超純水  80μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液  80μl
標準検体４    超純水 120μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液  40μl
標準検体５    超純水 160μl ＋ 0.9％塩化ナトリウム溶液  ０μl
【００２８】
まず、検体１〜４に 0.9％塩化ナトリウム溶液に混合した赤血球40μl を添加した後、１分間に 100回のストロークで振とうしながら37℃で２時間加温した。また、検体ブランクとして、糞の水溶性画分 160μl と 0.9％塩化ナトリウム溶液40μl を混合したものを同様に加温した。さらに、標準検体１〜５に 0.9％塩化ナトリウム溶液に混合した赤血球40μl を添加した後、同様に加温した。
【００２９】
この加温した検体１〜４、検体ブランク及び標準検体１〜５をそれぞれ遠心分離 (10,000×g 、５分間) し、上清を回収した後、この上清 150μl に超純水６mlを添加し、原子吸光分析機（日立製作所製、180-80型）で鉄濃度を測定した。
【００３０】
そして、以下のような計算により細胞溶解活性を算出した。
（１）次式により、標準検体１〜５の鉄濃度から標準の面積を求めた。
標準の面積=(B-A)×1/2 +((B-A)+(C-A))×1/2 +((C-A)+(D-A))×1/2 +((D-A)+(E-A))×1/2
標準検体１の鉄濃度 (μg/ml) ： A
標準検体２の鉄濃度 (μg/ml) ： B
標準検体３の鉄濃度 (μg/ml) ： C
標準検体４の鉄濃度 (μg/ml) ： D
標準検体５の鉄濃度 (μg/ml) ： E
【００３１】
（２）次式により、検体１〜４及び検体ブランクの鉄濃度から検体の面積を求めた。
検体の面積=(F-J/4)×1/2 +((F-J/4)+(G-J/2))×1/2 +((G-J/2)+(H-3J/4)) ×1/2 +((H-3J/4)+(I-J)) ×1/2
検体１の鉄濃度 (μg/ml) ： F
検体２の鉄濃度 (μg/ml) ： G
検体３の鉄濃度 (μg/ml) ： H
検体４の鉄濃度 (μg/ml) ： I
検体ブランクの鉄濃度 (μg/ml) ： J
【００３２】
（３）次式により、糞の水溶性画分の細胞溶解活性を求めた。
細胞溶解活性(%)=検体の面積× 100×３×(100／（各群の大腸内容物の平均水分含量(%)-1)／標準の面積
その結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】
0004852681.tif 000003
【００３４】
本発明の有効成分であるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の各菌体は、１，２−ジメチルヒドラジン・２塩酸を注射することにより大腸癌を発病し易い遺伝的素因を誘導し、さらに高脂肪・低カルシウム飼料を摂取させたラットから排泄される糞の水溶性画分の細胞溶解活性を対照群に比べ有意に低下させることが判った。
【００３５】
【実施例３】
実施例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体 40gに乳糖900gとコーンスターチ574gを加え、Ｖ型混合機で混合し、混合粉末を得た。そして、ヒドロキシプロピルセルロース 16gに滅菌精製水 150mlを加えて撹拌し溶解した溶液とこの混合粉末とを双軸練合機で練合し、押し出し造粒機で造粒した後、通気乾燥機を使用して60℃で30分間乾燥することにより整粒し、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した顆粒状薬剤1,480gを製造した。
【００３６】
【実施例４】
実施例１で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体500g、リンゴ冷凍濃縮果汁25kg、グラニュー糖92kg、リンゴ酸 2.5kg、クエン酸 0.5kg、アップルアロマ３kg及びエッセンス１kgに水 900kgを加えて混合し溶解することにより、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した清涼飲料 1,000kgを製造した。
【００３７】
【発明の効果】
ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体は、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を有するので、結果的に腸粘膜を保護する効果を発揮し、大腸癌等の発病を予防することが期待される。