(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式の化合物において、
【化１】
0005014959.tif 000010
Xは水酸基（OH）またはメトキシ基（OCH3）であることを特徴とするベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物。
【請求項２】
前記化合物はベニクスノキタケから分離したものであることを特徴とする請求項１記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物。
【請求項３】
前記Xが水酸基（OH）である時、該化合物はアントロキノノールB（Antroquinonol B）であることを特徴とする請求項１記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物。
【請求項４】
前記化合物アントロキノノールB（Antroquinonol B）はベニクスノキタケから分離したことを特徴とする請求項３記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物。
【請求項５】
前記Xがメトキシ基（OCH3）である時、該化合物はアントロキノノールC（Antroquinonol C）であることを特徴とする請求項１記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物。
【請求項６】
前記化合物アントロキノノールC（Antroquinonol C）はベニクスノキタケから分離したことを特徴とする請求項５記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物。
【請求項７】
腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする請求項３記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項８】
前記乳癌細胞はMCF−７またはMDA−MB−２３１細胞系であることを特徴とする請求項７記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項９】
前記肝臓癌細胞はHep ３BまたはHep G２細胞系であることを特徴とする請求項７記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項１０】
前記前立腺癌細胞はLNCaPまたはDU１４５細胞系であることを特徴とする請求項７記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項１１】
腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物において、それは最低、請求項３で示した有効使用量の化合物、及び医学上受け入れ可能な担体を含み、該腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする請求項５記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項１３】
前記乳癌細胞はMCF−７またはMDA−MB−２３１細胞系であることを特徴とする請求項１２記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項１４】
前記肝臓癌細胞はHep ３BまたはHep G２細胞系であることを特徴とする請求項１２記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項１５】
前記前立腺癌細胞はLNCaPまたはDU１４５細胞系であることを特徴とする請求項１２記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物。
【請求項１６】
腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物において、それは最低、請求項５で示した有効使用量の化合物、及び医学上受け入れ可能な担体を含み、該腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新化合物に関するものであり、特に、ベニクスノキタケ（Antrodia camphorata）抽出物中から分離純化した化合物で、腫瘍細胞生長の抑制に応用するものである。
【背景技術】
【０００２】
ベニクスノキタケ（Antrodia camphorata）は、樟芝、牛樟芝、樟芝茸とも呼ばれ、ヒダナシタケ目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）の多年生キノコ菌類、台湾特有の真菌であり、ただ台湾の保護樹木である紅楠（Cinnamoum kanehirai Hay）の空洞部の腐朽した芯材内壁上にのみ生長するものである。紅楠の分布量は極めて少なく、加えて人による盗伐もある故、その中に寄生してこそ生長できる野生のベニクスノキタケの数量は非常に希少である。また、その子実体の生長は非常に緩慢で、生長期は６月から１０月の間だけである為、価格は非常に高価である。
【０００３】
ベニクスノキタケの子実体は多年生、無柄で、木栓質から木質を呈し、強烈なクスノキの香を放っており、形態は、板状、鐘状、馬蹄状、塔状と変化に富む。生長初めの時は、扁平型で深紅色であるが、その後周囲に放射逆巻状が出現し、並びに、四方に広がって生長、色はまた淡紅褐色または淡黄褐色に変化し、多くの細孔を有し、これはベニクスノキタケの薬用価値の最も豊富な部位である。
【０００４】
台湾の民間医学において、ベニクスノキタケは、解毒、腹下し症状軽減、消炎、肝臟関連疾病の治療、抗癌等効用があるとされている。ベニクスノキタケは、一般食用・薬用のキノコ類と同様、多くの複雑な成分を有し、生理活性成分中には、トリテルペノイド化合物（triterpenoids）、多糖体（polysaccharides、例えばβ−D−グルカン）、アデノシン（adenosine）、ビタミン（例えばビタミンB、ニコチン酸）、タンパク質（免疫球タンパクを含む）、スーパーオキシドジスムターゼ（superoxide dismutase, SOD）、微量元素（例えば：カルシウム、リン、ゲルマニウム）、核酸、ステロール、血圧安定物質（例えばアントジア酸（antodia acid）等が含まれていることは周知のとおりであり、これらの生理活性成分には、抗腫瘍、免疫力向上、抗アレルギー、抗病菌、抗高血圧、血糖低下、コレステロール低下等多種効果があるとみなされている。
【０００５】
ベニクスノキタケの多くの成分においては、トリテルペノイド化合物の研究が最も多い。該トリテルペノイド化合物は、３０個の炭素元素が結合して六角形または五角形を形成する天然化合物の総称であり、ベニクスノキタケが持つ苦味は、主にトリテルペノイドの成分から来ている。１９９５年、Cherng氏等が、ベニクスノキタケ子実体抽出物中に、三種の新しいエルゴスタン（ergostane）を骨格とするトリテルペノイド化合物であるアントシンＡ（antcin A）、アントシンB（antcin B）、アントシンC（antcin C）を発見した（引用文献１）。Chen氏等は、エチルアルコールで樟芝の子実体を抽出した後、ジャンクイ酸A（zhankuic acid A）、ジャンクイ酸B（zhankuic acid B）、ジャンクイ酸C（zhankuic acid C）等三種のトリテルペノイド化合物を発見した（引用文献２）。この他、Chiang氏等は、１９９５年に、子実体抽出物中から別の三種、セスキテルペン・ラクトン（sesquiterpene lactone）と二種のビスフェノール誘導体である新トリテルペノイド化合物を発見した。これは即ち、アントロシン（antrocin）、４,７−ジメトキシ−５−メチル−１,３−ベンゾジオキソール（４,７−dimethoxy−５−methy−１,３− benzodioxole）、２,２',５,５'−テラメトオキシ−３,４,３',４'−ビ−メチレンジオキシ−６,６'−ジメチルビフェニル（２,２',５,５'−teramethoxy−３,４,３',４'−bi− methylenedioxy−６,６'− dimethylbiphenyl）である（引用文献３）。１９９６年になって、Cherng氏等は、同様の分析方法を使って再度、四種の新トリテルペノイド化合物を発見した。即ち、アントシンＥ（antcin E）、アントシンＦ（antcin F）、メチルアントシネートG（methyl antcinate G）、メチルアントシネートＨ（methyl antcinate H）である（引用文献４）。また、Yang氏等は、二種のエルゴスタンを骨格とする新化合物zhankuic acid D、zhankuic acid E、及び、三種のラノスタン（lanostane）を骨格とする新化合物を発見した。即ち、１５ α −アセチル−デヒドロスルフレン酸（１５ α −acetyl−dehydrosulphurenic acid）、デヒドロエブリコ酸（dehydroeburicoic acid）、デヒドラサルフレン酸（dehydrasulphurenic acid）である（引用文献５）。
【０００６】
現在多くの実験からベニクスノキタケ抽出物には癌抑制効果がある（例えば引用文献２）ことが知られているが、一体どの有効成分に腫瘍細胞抑制効果があるのかという研究は、現在においてはまだ試験段階であり、具体的な有効成分は発表されていない。よって、該抽出物に更に一歩進んだ純化分析が行われ、癌抑制の真正有効成分が見つけ出されれば、ヒトの癌治療に莫大な利益が与えられることだろう。
【０００７】
[引用文献１]   Cherng, I． H．, and Chiang, H． C． １９９５． Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea． J． Nat． Prod． ５８:３６５−３７１          [引用文献２]   Chen, C． H．, and Yang, S． W． １９９５． New steroid acids from Antrodia cinnamomea, −a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum． J． Nat． Prod． ５８:１６５５−１６６１
[引用文献３]   Chiang, H． C．, Wu, D． P．, Cherng, I． W．, and Ueng, C． H． １９９５． A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia   cinnamomea． Phytochemistry． ３９:６１３−６１６
[引用文献４]   Cherng, I． H．, Wu, D． P．, and Chiang, H． C． １９９６． Triteroenoids from Antrodia cinnamomea． Phytochemistry． ４１:２６３−２６７
[引用文献５]   Yang, S． W．, Shen, Y． C．, and Chen, C． H． １９９６． Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea−a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum． Phytochemistry． ４１:１３８９−１３９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ベニクスノキタケ抽出物中の一体どんな成分が癌抑制効果を持つのかを明瞭にする為、本発明では、ベニクスノキタケ抽出物から下の構造式のような新化合物を分離純化した。
【化１】
0005014959.tif 000002
式（１）構造式の化合物において、Xは、水酸基（OH）またはメトキシ基（OCH3）である。
【０００９】
式（１）構造式の化合物において、Xが水酸基（OH）である時、その構造式は次のとおりである。
【化２】
0005014959.tif 000003
式（２）構造式の化合物では、その化学名はアントロキノノールB（Antroquinonol B）、分子式はC24H38O5、分子量は４０６である。
【００１０】
式（１）構造式の化合物において、Xがメトキシ基（OCH3）である時、その構造式は次のとおりである。
【化３】
0005014959.tif 000004
式（３）構造式の化合物では、その化学名はアントロキノノールC（Antroquinonol C）、分子式はC25H40O5、分子量は４２０である。
【００１１】
本発明中のアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の化合物はベニクスノキタケ水抽出物または有機溶剤抽出物を分離純化したものであり、該有機溶剤には、アルコール類（例えばメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール）、エステル類（例えば酢酸エチル）、アルカン類（例えばヘキサン）、ハロアルカン（例えば塩化メチル、塩化エチル）より分離純化したものであるが、これに制限されるものではなく、その内良好なのはアルコール類、更に良好なのはエチルアルコールである。
【００１２】
前述の化合物により、本発明は、それを腫瘍細胞生長の抑制上に応用し、一歩進めて癌治療の医薬組成分中に応用することができ、癌の治療効果を高めることができる。本発明の化合物が得られる応用範囲は、乳癌腫瘍細胞、肺癌腫瘍細胞、肝臓癌腫瘍細胞、前立腺癌腫瘍細胞等の細胞生長産生抑制効果を含み、それら腫瘍細胞の迅速生長を不可能にし、更に腫瘍増殖を抑制し、腫瘍悪化を緩慢化する。よって、更に、乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等の癌治療に利用することができる。
【００１３】
また、本発明中の式（２）または式（３）、式（２）と式（３）の化合物を乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等を治療する医薬組成物の成分として利用することにより、それら腫瘍細胞の生長を抑制することができる。前述の医薬組成物は、有効使用量のアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）を含む化合物の他、薬学上受け入れ可能な担体を含む。該担体は、賦形剤（例えば水）、充填剤（例えば蔗糖や澱粉）、粘着剤（例えば纖維素誘導体）、希釈剤、崩壊剤、吸收促進剤、甘味剤とすることも可能であるが、これに制限されるものではない。本発明の医薬組成物は、公知の薬学の加工方法に基づいて生産製造される。アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の有効成分使用量と一種類以上の担体相を混合し、必要な剤形に加工する。この剤形には、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、その他液体製剤を含むが、これに制限されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
請求項１の発明は、下記構造式の化合物において、
【化４】
0005014959.tif 000005
Xは水酸基（OH）またはメトキシ基（OCH3）であることを特徴とするベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物としている。
請求項２の発明は、前記化合物はベニクスノキタケから分離したものであることを特徴とする請求項１記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物としている。
請求項３の発明は、前記Xが水酸基（OH）である時、該化合物はアントロキノノールB（Antroquinonol B）であることを特徴とする請求項１記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物としている。
請求項４の発明は、前記化合物アントロキノノールB（Antroquinonol B）はベニクスノキタケから分離したことを特徴とする請求項３記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物としている。
請求項５の発明は、前記Xがメトキシ基（OCH3）である時、該化合物はアントロキノノールC（Antroquinonol C）であることを特徴とする請求項１記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物としている。
請求項６の発明は、前記化合物アントロキノノールC（Antroquinonol C）はベニクスノキタケから分離したことを特徴とする請求項５記載のベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物としている。
請求項７の発明は、腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする請求項３記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項８の発明は、前記乳癌細胞はMCF−７またはMDA−MB−２３１細胞系であることを特徴とする請求項７記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項９の発明は、前記肝臓癌細胞はHep ３BまたはHep G２細胞系であることを特徴とする請求項７記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項１０の発明は、前記前立腺癌細胞はLNCaPまたはDU１４５細胞系であることを特徴とする請求項７記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項１１の発明は、腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物において、それは最低、請求項３で示した有効使用量の化合物、及び医学上受け入れ可能な担体を含み、該腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物としている。
請求項１２の発明は、腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする請求項５記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項１３の発明は、前記乳癌細胞はMCF−７またはMDA−MB−２３１細胞系であることを特徴とする請求項１２記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項１４の発明は、前記肝臓癌細胞はHep ３BまたはHep G２細胞系であることを特徴とする請求項１２記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項１５の発明は、前記前立腺癌細胞はLNCaPまたはDU１４５細胞系であることを特徴とする請求項１２記載の腫瘍細胞生長抑制に利用する化合物としている。
請求項１６の発明は、腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物において、それは最低、請求項５で示した有効使用量の化合物、及び医学上受け入れ可能な担体を含み、該腫瘍細胞は乳癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞であることを特徴とする腫瘍細胞生長抑制の医薬組成物としている。
【発明の効果】
【００１５】
以上説明したように、本発明の化合物は、乳癌腫瘍細胞、肺癌腫瘍細胞、肝臓癌腫瘍細胞、前立腺癌腫瘍細胞等の細胞生長抑制効果を有するものであり、よって、それを腫瘍細胞生長の抑制上に応用でき、また更には癌治療の医薬組成分中に応用することができることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
まず、ベニクスノキタケ（Antrodia camphorata）菌絲体、子実体または二者の混合物において、公知の抽出方法で、水または有機溶剤を使い抽出を行う。これにより、ベニクスノキタケ水抽出物または有機溶剤抽出物を獲得できる。該有機溶剤には、アルコール類（例えばメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール）、エステル類（例えば酢酸エチル）、アルカン類（例えばヘキサン）、ハロアルカン（例えば塩化メチル、塩化エチル）を含んでいるが、これに制限されるものではない。その内良好なのはアルコール類、更に良好なのはエチルアルコールである。
【００１７】
抽出後のベニクスノキタケ水抽出物または有機溶剤抽出物は、更に一歩進めて、高速液体クロマトグラフィーによって分離純化を行い、その後、各分液（fraction）に対して癌抑制効果テストを行う。最後に、癌抑制効果を有する分液を成分分析し、癌抑制効果を生じさせる可能性のある成分について、更にそれぞれ、異なる癌腫瘍細胞の抑制効果テストを行った。結果、本発明のアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）化合物が、乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等の癌腫瘍細胞の生長抑制に効果を有することが発見された。また、公知の文献を調べたところ、該化合物は嘗てベニクスノキタケ中に発見されたことはないことが確認された故、新らしい化合物であることがわかった。
【００１８】
また、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の腫瘍細胞生長抑制効果を実証する為、本発明中においては、MTT分析法により、アメリカ国立癌研究所（National Cancer Institute, NCI）抗腫瘍薬物スクリーニング検査に基づいた、乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等を含む腫瘍細胞に対する細胞生存率テストを行った。これらのテストにより、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の乳癌腫瘍細胞（MCF−７、MDA−MB−２３１を含む）、肺癌腫瘍細胞（A５４９を含む）、肝臓癌腫瘍細胞（Hep ３B、Hep G２を含む）、前立腺癌腫瘍細胞（LNCaP、DU−１４５を含む） 等の生存率を低下させ、これに対し同時に、５０％阻害濃度（即ちIC50値）をも低下させることが実証された。よって、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）を乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等を含む腫瘍細胞の生長抑制上に応用することができ、更に、乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等の治療に利用することが可能である。前述した実施例の詳細説明は次のとおりである。
【００１９】
実施例１：アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の分離。
１００グラム前後のベニクスノキタケ菌絲体、子実体または二者の混合物を、三角フラスコ中に入れ、適当な比率の水とアルコール類（７０％〜１００％アルコール類水溶液）を加え、２０〜２５℃の温度の下、最低１時間以上攪拌抽出し、その後、濾紙及び０．４５ μmの濾過膜で濾過し、抽出液を収集する。
【００２０】
前述において收集したベニクスノキタケ抽出液は、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid chromatography）を用い、RP１８のカラム（column）で分析を行う。並びに、メチルアルコール（A）及び０．１％〜０．５％醋酸水溶液（B）を移動相（mobile phase）とする。（その溶液比率は、０〜１０分、B比率は９５％ 〜２０％、１０〜２０分、B比率は２０％〜１０％、２０〜３５分、B比率は１０％〜９０％、 ３５〜４０分、B比率は１０％〜９５％である。）１分１ mlの速度で溶離し、同時に、紫外可視光線全波長帯測器で分析する。
【００２１】
２１．２分から２１．４分の溶離液を收集濃縮すると淡黄色の液体産生物が得られる。これは即ち、アントロキノノールB（Antroquinonol B）である。分析した結果、該化合物の分子式はC24H38O5、分子量４０６である。核磁気共鳴（NMR）分析値は次に示すとおりである。
1H−NMR（CDCl3）δ（ppm）：１．２１、１．３６、１．６７、１．７１、１．７５、１．９４、２．０３、２．０７、２．２２、２．２５、３．６８、４．０５、５．７１、５．５６。13C−NMR（CDCl3）δ（ppm）：１２．３１、１６．１、１６．１２、１７．６７、２５．６７、２６．４４、２６．７４、２７．００、３０．１０、４０．２７、４３．３４、５９．２２、６０．５９、７１．８、１２０．９７、１２３．８４、１２４．３０、１３１．３２、１３４．６１、１３５．９２、１３８．０５、１６０．４５、１９７．１１。
【００２２】
２３．７分から２４．０分の溶離液を收集濃縮すると淡黄色の液体産生物が得られる。これは即ち、アントロキノノールC（Antroquinonol C）である。分析した結果、該化合物の分子式はC25H40O5、分子量４２０である。核磁気共鳴（NMR）分析値は次に示すとおりである。
1H−NMR（CDCl3）δ（ppm）：１．２１、１．３６、１．７１、１．７５、１．９４、２．０３、２．０７、２．２２、２．２５、３．２４、３．６８、４．０５、５．１２、５．５０、５．６１。13C−NMR（CDCl3）δ（ppm）：１２．３１、１６．１、１６．１２、１７．６７、２４．４４、２６．４４、２６．７４、２７．００、３７．８１、３９．８１、４．０２７、４３．３４、４９．００、５９．２２、６０．５９、１２０．９７、１２３．８４、１２４．３０、１３５．９２、１３８．０５、１６０．４５、１９７．１２。
【００２３】
アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）を化学式データと照合した後、前述と同様の化合物構造は発見されなかった。よって、これらの化合物は新しく過去に発見されたことのない化合物となる。
【００２４】
実施例２：抗乳癌腫瘍細胞の体外活性テスト。実施例１にて発見された化合物の腫瘍細胞抑制効果を更にテストする為に、本実施例はアメリカ国立癌研究所（National Cancer Institute, NCI）の抗腫瘍薬物スクリーニング検査に基づき、まず、実施例１中で分離されたアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）化合物を、ヒト乳癌腫瘍細胞MCF−７とMDA−MB−２３１を含む培養液中に加え、腫瘍細胞生存率をテストする。細胞生存率テストは、公知のMTT分析法により分析を行うものであり、MCF−７とMDA−MB−２３１はどちらもヒト乳癌腫瘍細胞系である。該MCF−７は、原発性乳癌または早期乳癌の癌細胞であり、それはエストロゲンに対して高度過敏性である故、エストロゲン依存性（estrogen−dependent）乳癌細胞と呼ばれる。MDA−MB−２３１はエストロゲンの影響を受けない非エストロゲン依存性（estrogen−independent）乳癌細胞であり、それは臨床医学上の治療が極めて難しく治癒率も非常に低い。
【００２５】
MTT分析法は細胞増殖（cell proliferation）、生存率（percent of viable cells）、細胞毒性（cytotoxicity）の分析によく使われる分析方法である。該MTT（３−[４,５−ジメチルチアゾール−２−イル]２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（３−[４,５−dimethylthiazol−２−yl]２,５−diphenyltetrazolium bromide）は黄色染色剤を用いるものであり、それは生細胞によって吸收され、並びに、ミトコンドリア中のコハク酸塩テトラゾリウム還元酵素（succinate tetrazolium reductase）によって非水溶性且つ青紫色をなすホルマザン色素（formazan）に還元される。よって、ホルマザン（formazan）形成がされるか否かから、細胞の生存率を判断及び計算することができる。
【００２６】
まず、ヒト乳癌細胞MCF−７ （食品工業研究所より購入。細胞株番号：BCRC ６０４３６）とMDA−MB−２３１（国家衛生研究院より購入。細胞株番号：CCRC ６０４２５）をそれぞれ、ウシ胎児血清を含む培養液中にて２４時間培養する。増殖後の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって一回洗浄し、並びに、倍のトリプシン−EDTA溶液によって細胞処理、その後、１,２００ rpmで５分間遠心し、細胞を沈澱させて上済み液を除去する。後、１０mlの新培養液を加え、軽く振り細胞を懸濁させ、更に細胞を９６孔マイクロプレート内に分けて置く。テスト時は、それぞれの各孔内に、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３ μg／mlのベニクスノキタケ粗抽出物（対照体、純化分離していないベニクスノキタケエチルアルコール総抽出物）及びアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）（実験体）を加え、３７℃、５％CO2で４８時間培養する。その後、光を避けた環境の下、各孔内に２．５ mg／mlのMTTを加え、４時間反応させた後、更に各孔内に１００ μlの溶解バッファー（lysis buffer）を加えると反応が停止する。最後に、酵素免疫分析装置にて５７０ nm 吸光波長の下、その吸光値を測定し、これによって細胞生存率を算出し、並びに、その５０％阻害濃度（即ちIC50値）を推測した。その結果は表１（乳癌腫瘍細胞生存率に対する体外テスト結果）に示すとおりである。
【表１】
0005014959.tif 000006
【００２７】
表１中からわかるとおり、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の作用によって、それは、エストロゲン依存性のヒト乳癌腫瘍細胞MCF−７の生存率を効果的に低下させている。対照体のベニクスノキタケ粗抽出物により測定されたヒト乳癌腫瘍細胞MCF−７のIC50値（１１．１３ μg／ml）と比較すると、アントロキノノールB（Antroquinonol B）でヒト乳癌腫瘍細胞MCF−７を処理後、そのIC50値が１．９４ μg／mlにまで低下しており、対照体と比較換算して得られたIC50値低下比率は約８２．５６％となった。また、アントロキノノールC（Antroquinonol C）でヒト乳癌腫瘍細胞MCF−７を処理後、そのIC50値が１．１７ μg／mlとなり、対照体と比較換算して得られたIC50値の低下比率は約８９．４９％となった。これらの結果から、二つの化合物のヒト乳癌腫瘍細胞MCF−７に対する５０％阻害濃度は大幅に対照体より低くなることが示され、よって、ベニクスノキタケ抽出物から分離抽出したアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）は確実にエストロゲン依存性の乳癌腫瘍細胞MCF−７生長抑制に利用できることが実証された。
【００２８】
また、対照体のベニクスノキタケ粗抽出物によって測定されたIC50値（２５．８１ μg／ml）と比較すると、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）はどちらも、非エストロゲン依存性のヒト乳癌腫瘍細胞MDA−MB−２３１生長を効果的に抑制しており、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）でヒト乳癌腫瘍細胞MDA−MB−２３１を処理後、そのIC50値が各々、８．７２ μg／ml、２１．９ μg／mlまで低下し、対照体と比較換算して得られたIC50値の低下比率は各々、約６６．２１％、１５．１５％となった。この結果から、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）のヒト乳癌腫瘍細胞MDA−MB−２３１に対する５０％阻害濃度はどちらも対照体よりかなり低くなり、その内、アントロキノノールB（Antroquinonol B）の抑制効果が最良であることが示された。よって、ベニクスノキタケ抽出物から分離抽出したアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）は確実に、非エストロゲン依存性の乳癌腫瘍細胞MDA−MB−２３１の生長抑制に利用できることが実証された。
【００２９】
実施例３：抗肺癌腫瘍細胞の体外活性テスト。本テストは、アメリカ国立癌研究所の抗腫瘍薬物スクリーニング検査を基に実施されている。実施例１で分離したアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）化合物を、ヒト肺癌腫瘍細胞A５４９を含む培養液中に加え、並びに、前述したMTT分析法により分析を行い、これによって、肺癌腫瘍細胞生存率をテストした。
【００３０】
まず、該ヒト肺癌腫瘍細胞A５４９（食品工業研究所にて購入。細胞株番号はBCRC ６００７４）をそれぞれ、ウシ胎児血清を含む培養液中にて２４時間培養する。増殖後の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって一回洗浄し、並びに、倍のトリプシン−EDTA溶液によって細胞処理した後、１,２００ rpmで５分間遠心し、細胞を沈澱させて上済み液を除去する。その後、１０mlの新培養液を加え、軽く振り細胞を懸濁させ、更に細胞を９６孔マイクロプレート内に分けて置く。テスト時は、それぞれの各孔内に、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３ μg／mlのベニクスノキタケ粗抽出物（対照体。純化分離してないベニクスノキタケエチルアルコール総抽出物）及びアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）（実験体）を加え、３７℃、５％CO2で４８時間培養する。その後、光を避けた環境の下、各孔内に２．５ mg／mlのMTTを加え、４時間反応させた後、更に各孔内に１００ μlの溶解バッファー（lysis buffer）を加えると反応が停止する。最後に、酵素免疫分析装置にて５７０ nm 吸光波長の下、吸光値を測定し、これによって細胞生存率を算出し、並びに、その５０％阻害濃度（即ちIC50値）を推測した。その結果は表２（肺癌腫瘍細胞生存率に対する体外テスト結果）に示すとおりである。
【表２】
0005014959.tif 000007
【００３１】
表２から、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）は、ヒト肺癌腫瘍細胞Ａ５４９の生存率を効果的に低下させることが明らかである。対照体のベニクスノキタケ粗抽出物から測定して得られたIC50値（１３．２１ μg／ml）と比較すると、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）でヒト肺癌腫瘍細胞A５４９を処理後、そのIC50値は、１１．９μg／ml、８．２１μg／mlまで各々低下し、対照体と比較換算して得られたIC50値の低下比率は、約９．９２％、３７．８５％となった。これらの結果から、両化合物はヒト肺癌腫瘍細胞A５４９の５０％阻害濃度はどちらも、対照体より下回っており、特に、アントロキノノールC（Antroquinonol C）の抑制効果は最良であることが明らかにされた。これにより、ベニクスノキタケ抽出物中から分離抽出されたアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）が確実に、ヒト肺癌腫瘍細胞A５４９の生長抑制に利用できることが実証された。
【００３２】
実施例４：抗肝臓癌腫瘍細胞の体外活性テスト。本テストは、アメリカ国立癌研究所の抗腫瘍薬物スクリーニング検査を基に実施されている。実施例１で分離されたアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）化合物を、ヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３BとHepG２を含む培養液中に加え、並びに、前述したMTT分析法により分析を行い、これによって、肝臓癌腫瘍細胞生存率をテストした。該Hep３BとHepG２はどちらもヒト肝臓癌腫瘍細胞系である。
【００３３】
まず、ヒト肝臓癌細胞Hep３B（食品工業研究所より購入。細胞番号はBCRC ６０４３４）とHepG２（食品工業研究所より購入。細胞番号はBCRC６００２５）をそれぞれ、ウシ胎児血清を含む培養液中にて２４時間培養する。増殖後の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって一回洗浄し、並びに、倍のトリプシン−EDTA溶液によって細胞処理し、その後、１,２００ rpmで５分間遠心し、細胞を沈澱させて上済み液を除去する。後、１０mlの新培養液を加え、軽く振り細胞を懸濁させ、更に細胞を９６孔マイクロプレート内に分けて置く。テスト時は、それぞれの各孔内に、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３ μg／mlのベニクスノキタケ粗抽出物（対照体。純化分離されていないベニクスノキタケエチルアルコール総抽出物）及びアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）を加え、３７℃、５％CO2で４８時間培養する。その後、光を避けた環境の下、各孔内に２．５ mg／mlのMTTを加え、４時間反応させた後、更に各孔内に１００ μlの溶解バッファー（lysis buffer）を加えると反応が停止する。最後に、酵素免疫分析装置にて５７０ nm 吸光波長の下、吸光値を測定し、これによって細胞生存率を算出し、並びに、その５０％阻害濃度（即ちIC50値）を推測した。その結果は表３（肝臓癌腫瘍細胞生存率に対する体外テスト結果）に示すとおりである。
【表３】
0005014959.tif 000008
【００３４】
表３中からわかるとおり、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）の作用によって、ヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３B及びHepG２の生存率を効果的に低下させている。対照体のベニクスノキタケ粗抽出物で測定されたヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３BのIC50値（５．１０ μg／ml）と比較すると、アントロキノノールB（Antroquinonol B）処理後のIC50値は１．２１ μg／mlであり、対照体と比較換算したIC50値低下比率は、約７６．２４％となった。また、Antroquinonol Cでヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３B処理後のIC50値は、１．３２μg／mlであり、対照体と比較換算したIC50値低下比率は、約７４．１２％となった。これは、二つの化合物がヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３Bの５０％阻害濃度が大幅に対照体より下回っていることを示している。対照体のベニクスノキタケ粗抽出物によって測定されたヒト肝臓癌腫瘍細胞HepG２のIC50値（１８．６３ μg／ml）と比較すると、アントロキノノールB（Antroquinonol B）処理後のIC50値は３．３２ μg／mlであり、対照体と比較換算して得られたIC50値の低下比率は約８２．１８％となった。また、アントロキノノールC（Antroquinonol C）でヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３Bを処理後のIC50値は、５．１２ μg／mlであり、対照体と比較換算して得られたIC50値の低下比率は、約７２．５２％となった。これは、二つの化合物がヒト肝臓癌腫瘍細胞HepG２の５０％阻害濃度が大幅に対照体より下回っていることを示している。よって、これらの結果から、ベニクスノキタケ抽出物から分離抽出したアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）は、確実に、肝臓癌腫瘍細胞生長の抑制に利用できることを実証している。
【００３５】
また、表３でわかるとおり、アントロキノノールB（Antroquinonol B）で処理後の癌細胞IC50値は、アントロキノノールC（Antroquinonol C）で処理後の癌細胞IC50値より低く、これは比較的低濃度のアントロキノノールB（Antroquinonol B）であっても効果的に半数のヒト肝臓癌腫瘍細胞Hep３BとHepG２の生長を抑制でき、よって、アントロキノノールB（Antroquinonol B）の肝臓癌細胞抑制効果は、アントロキノノールC（Antroquinonol C）より優れていることを示している。
【００３６】
実施例５：抗前立腺癌腫瘍細胞の体外活性テスト。本テストは、アメリカ国立癌研究所の抗腫瘍薬物スクリーニング検査に基づいて実施され、実施例１中で分離されたアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）化合物を、ヒト前立腺癌腫瘍細胞LNCaP、DU−１４５を含む培養液中に加え、並びに、前述のMTT分析法によって分析を行った前立腺癌腫瘍細胞生存率テストである。また、LNCaP、DU−１４５はどちらも、ヒトの前立腺癌腫瘍細胞系であり、該LNCaPは、前立腺腺体上皮細胞に起因する癌で、且つ、癌細胞生長初期は、男性ホルモンに依存しており、よって、男性ホルモン依存性前立腺癌（androgen−dependent prostate cancer）とも呼ばれる。DU−１４５は、再発性前立腺癌細胞であり、男性ホルモンに依存しないでも生長する故、男性ホルモン非依存性前立腺癌（androgen−independent prostate cancer）であり、この種の再発性癌は、今現在、効果的な治療法が発見されていない。
【００３７】
まず、ヒト前立腺癌細胞LNCaP（国家衛生研究院より購入。細胞株番号はCCRC ６００８８）とDU−１４５（国家衛生研究院より購入。細胞株番号はCCRC ６０３４８）をそれぞれ、ウシ胎児血清を含む培養液中において２４時間培養する。増殖後の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって一回洗浄し、並びに、倍のトリプシン−EDTA溶液によって細胞処理した後、１,２００ rpmで５分間遠心し、細胞を沈澱させて上済み液を除去する。その後、１０mlの新鮮な培養液を加え、軽く振り細胞を再度懸濁させ、更に細胞を９６孔マイクロプレート内に分けて置く。テスト時は、それぞれの各孔内に３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３ μg／mlのベニクスノキタケ粗抽出物（対照体。純化分離されていないベニクスノキタケエチルアルコール総抽出物）及びアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）（実験体）を加え、３７℃、５％CO2で４８時間培養する。その後、光を避けた環境の下、各孔内に２．５ mg／mlのMTTを加え、４時間反応させた後、更に各孔内に１００ μlの溶解バッファー（lysis buffer）を加えると反応が停止する。最後に、酵素免疫分析装置にて５７０ nm 吸光波長の下、吸光値を測定し、これによって細胞生存率を算出し、並びに、その５０％阻害濃度（即ちIC50値）を推測した。その結果は表４（前立腺癌腫瘍細胞生存率に対する体外テスト結果）に示すとおりである。
【表４】
0005014959.tif 000009
【００３８】
表４からわかるとおり、Antroquinonol BとAntroquinonol Cの作用によって、ヒト前立腺癌腫瘍細胞LNCaPとDU−１４５の生存率を効果的に低下させている。対照体のベニクスノキタケ粗抽出物において測定されたIC50値（LNCaP：１１．４９μg／ml、DU−１４５：４１．３９μg／ml）と比較すると、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）のヒト前立腺癌腫瘍細胞LNCaPに対するIC50値はそれぞれ、５．６７ μg／mlと８．７２μg／mlまで低下しており、対照体と比較換算したIC50値の低下比率はそれぞれ、５０．６５％、２４．１１％となった。また、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）のヒト前立腺癌腫瘍細胞DU−１４５に対するIC50値はそれぞれ、１０．１２μg／mlと１２．２１μg／mlまで低下しており、対照体と比較換算したIC50値の低下比率はそれぞれ、７５．５５％、７０．５％となった。これは、二つの化合物がヒト前立腺癌腫瘍細胞LNCaPとDU−１４５の５０％阻害濃度がどちらも大幅に対照体を下回っていることを示している。これらの結果より、ベニクスノキタケ抽出物から分離したアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）は、確実に前立腺癌腫瘍細胞生長の抑制に利用することができることを実証している。また、表４からわかるとおり、アントロキノノールB（Antroquinonol B）処理後の癌細胞IC50値は、アントロキノノールC（Antroquinonol C）処理した後の癌細胞IC50値より極めて小さく、これは、アントロキノノールB（Antroquinonol B）の前立腺癌細胞抑制効果がアントロキノノールC（Antroquinonol C）より優れていることを示している。
【００３９】
また、前述結果からわかるとおり、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）はどちらも異なる特性を持つ前立腺癌腫瘍細胞LNCaPとDU−１４５の生長を効果的に抑制することができ、これは、アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）が男性ホルモン依存性前立腺癌細胞LNCaP抑制に応用できるだけでなく、男性ホルモン非依存性前立腺癌細胞DU−１４５の生長抑制にも応用でき、これにより、前立腺癌と再発性前立腺癌の治療に役立つことを示している。
【００４０】
前述をまとめると、本発明のベニクスノキタケ抽出物から分離した新化合物アントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）は乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌等ヒト腫瘍細胞の生長を抑制することが明らかであり、よって、該化合物は、前述の腫瘍細胞生長を抑制する医薬組成物の成分中に応用できるものである。該医薬組成物には、有効使用量のベニクスノキタケアントロキノノールB（Antroquinonol B）とアントロキノノールC（Antroquinonol C）化合物の他、薬学上受け入れ可能な担体も含む。該担体は、賦形剤（例えば水）、充填剤（例えば蔗糖や澱粉）、粘着剤（例えば纖維素誘導体）、希釈剤、崩壊剤、吸收促進剤、甘味剤とすることも可能であるが、これに制限されるものではない。本発明の医薬組成物は、公知の薬学の加工方法に基づいて生産製造される。有効成分使用量のベニクスノキタケ化合物と一種類以上の担体相を混合し、必要な剤形に加工する。この剤形には、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、その他液体製剤を含むが、これに制限されるものではない。