(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンを有効成分として含む、オリゴデンドロサイト細胞の生存賦活化剤。
【請求項２】
エリスロポエチンを有効成分として含む、オリゴデンドロサイト細胞の成熟化促進剤。
【請求項３】
エリスロポエチンを有効成分として含む、オリゴデンドロサイト細胞の生存賦活化に基づく脱髄抑制剤。
【請求項４】
エリスロポエチンを有効成分として含む、オリゴデンドロサイト細胞の成熟化促進を介する再髄鞘形成活性化剤。
【請求項５】
オリゴデンドロサイト細胞の生存賦活化剤を調製するための、エリスロポエチンの使用。
【請求項６】
オリゴデンドロサイト細胞の成熟化促進剤を調製するための、エリスロポエチンの使用。
【請求項７】
オリゴデンドロサイト細胞の生存賦活化に基づく脱髄抑制剤を調製するための、エリスロポエチンの使用。
【請求項８】
オリゴデンドロサイト細胞の成熟化促進を介した再髄鞘形成活性化剤を調製するための、エリスロポエチンの使用。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を有効成分とした脱髄性神経機能障害疾患、特に脱髄性脳機能障害疾患に対する予防・治療薬に関する。
［背景技術］
近年、ＭＲＩ等の画像診断技術の進歩に伴う知見により、脳梗塞の多発と痴呆との間で、必ずしも明らかな対応があるわけでなく、ビンスワンガー（Ｂｉｎｓｗａｎｇｅｒ）型の脳梗塞、及び白質粗化（ｌｅｕｋｏ−ａｒｉｏｓｉｓ）が痴呆症候とよく対応することが指摘されている。さらに、卒中発作を伴わない小血管性病変が進行し、痴呆に至るケースが多いことが我が国の臨床調査により報告されている（秋口ら、１９９５）。ビンスワンガー型の脳梗塞のみならず、高齢者の脳においても、灰白質に比べ白質の脱落は顕著で、とりわけミエリン（ｍｙｅｌｉｎ）の損失が激しいことが指摘されている。これらの報告から、従来、脳血管性痴呆と一括りにしていた疾患の多くが、脱髄による痴呆である可能性が考えられる。ミエリンはオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ：稀突起神経膠細胞）の形質膜が神経軸束を取り囲み形成する髄鞘であり、この髄鞘が一次性に障害される脱髄によって、軸束を伝わるインパルス（ｉｍｐｕｌｓｅ）の精度や伝導速度が低下し、このことが記憶消失などの高次機能障害や運動障害を引き起こすと考えられる。脱髄が進行すると、ついには神経細胞そのものも変成脱落する。従って髄鞘を形成し、神経細胞をサポートするオリゴデンドロサイトを活性化することが神経細胞の機能を維持する上でも重要であり、従来の神経細胞だけを活性化する治療法では、脱髄性疾患の機能修復は望めない。
この様な痴呆を示す脱髄性の疾患は、高齢化が急速に進行する現在では、重要な問題となりつつある。これら疾患を予防・治療するための、オリゴデンドロサイトに対する、従来とは異なる機序の治療薬の開発が急がれている。従って、本発明の目的は、脱髄に伴う各種疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。
［発明の開示］
本発明者らは、分化段階が均一な未成熟オリゴデンドロサイトの培養法を開発し（Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、オリゴデンドロサイトの成熟に伴って特異的に発現してくるミエリン塩基性蛋白（ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＢＰ）の発現や、突起の形態・数を指標として、オリゴデンドロサイトの成熟を促進する因子について鋭意研究を重ねた。その結果、造血因子であるエリスロポエチンが、直接あるいはアストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ：星状神経膠細胞）を介してＭＢＰの発現を促進し、オリゴデンドロサイトの成熟作用があることを見出し、本発明に到達した。
本発明の目的は、脱髄に伴う各種疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。脱髄が起こると再髄鞘化（ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）により修復されることが、キュプリゾーン・モデル（ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ  ｍｏｄｅｌ）（Ｌｕｄｗｉｎ  １９８０；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｌｕｄｗｉｎ，１９８１）、慢性ＥＡＥモデルを用いた実験により（Ｒａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、及びＭＳ患者脳での研究により（Ｈａｒｒｉｓｏｓｎ，１９８３；Ｐｒｉｎｅａｓ，１９７５，１９７８）報告されている。ミエリンは一度作られるとそのまま存在するのでなく、崩壊と再髄鞘化が起きていると考えられるようになってきている。事実、成人においても、未成熟のオリゴデンドロサイトの未分化（ｐｒｏｊｅｎｉｔｏｒ）細胞が脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）のみならず・大脳皮質（ｃｏｒｔｅｘ）の白質領域でも確認されており（Ｇｅｎｓｅｒｔ  ＆  Ｇｏｌｄｍａｎ，１９９６）、ミエリン形成が崩壊と形成の動的平衡の下で、これら未分化なオリゴデンドロサイトの新生−移動−成熟によって担われている可能性が高い（Ｇｅｎｓｅｒｔ  ＆  Ｇｏｌｄｍａｎ，１９９７；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
［発明を実施するための形態］
本発明は、従来の神経細胞のみを標的とした薬物による治療法と異なり、オリゴデンドロサイトに直接に、及び／又はアストロサイトを介して間接的にエリスロポエチンを作用させることにより、脱髄を防ぎ、それによって、未分化なオリゴデンドロサイトを成熟化させることで再髄鞘化を促進する作用が期待できる画期的な脱髄疾患の予防・治療薬及び予防・治療法を提供するものである。
本発明における脱髄疾患とは、広義には髄鞘が一次性に障害される疾患群を意味するものであるが、実際には白質ジストロフィーなどの髄鞘形成不全疾患や原因の明らかな疾患を除いて、原因不明の炎症性の髄鞘病変を主体とする疾患群であると定義される。多発性硬化症（ＭＳ）は脱髄疾患の代表的疾患であり、病理学的には炎症性の脱髄を主体とする変化とグリオーシスが特徴である。病因は不明であるため、診断はその臨床的特徴である中枢神経病変の空間的多発性と時間的多発性によってなされる。さらに、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、炎症性広汎性硬化症、急性、亜急性壊死性出血性脳脊髄炎等が脱髄疾患に含まれる。
末梢神経組織において髄鞘はシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞によりそれらが障害されると末梢性の脱髄疾患が引き起こされる。しかしながら、本発明では中枢性の脱髄疾患について主に説明する。
本発明で使用する活性成分であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、例えば、ヒト再生不良性貧血患者の尿から抽出して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平１−３８，８００号公報）や、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列に対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取し、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで適当な宿主（例えば、大腸菌の如き菌類や、酵母類や、植物の細胞株や、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスＣ−１２７細胞等の動物の細胞株等）で生産させる遺伝子組換技術により製造されたもの〔例えば、特公平１−４４，３１７号公報、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊａｃｏｂｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，８０６〜８１０（１９８５）〕等を挙げることができる。
また、本発明で使用できるＥＰＯは、上記由来のものの外に、それらの改変体であってもよい。ＥＰＯ改変体としては、例えば、特開平３−１５１３９９号公報に記載された改変体が挙げられる。上記ＥＰＯ改変体としては、もとの糖蛋白質のペプチド鎖のＡｓｎがＧｌｎに変異し、結合するＮ結合型糖鎖の結合数が変異したものがある。また他に、アミノ酸変異としては、特開平２−５９５９９号公報、特開平３−７２８５５号公報記載のものが挙げられる。即ち、ＥＰＯの有するＥＰＯレセプターへの作用特性を失わない限り、アミノ酸の変異、欠失、付加は何個でもよい。
本発明のＥＰＯを有効成分とする製剤については、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤等を添加することができる。ここで、懸濁化剤の例としては例えばメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができ、溶解補助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができ、安定化剤としては例えばヒト血清アルブミン、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、等張化剤としては例えばＤ−マンニトール、ソルビトール等を挙げることができ、また、保存剤としては例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができ、更に、吸着防止剤としては例えばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
本発明のＥＰＯを有効成分とし、安定化剤としてある種のアミノ酸を添加することにより、ヒト血清アルブミンや精製ゼラチンを含まない安定なＥＰＯ溶液製剤を使用することもできる。この安定なＥＰＯ溶液製剤は特開平１０−１８２４８１号公報に記載されている。この公報の説明は本明細書の一部に含まれるものとする。
このＥＰＯ溶液製剤で安定化剤として添加するアミノ酸には、遊離のアミノ酸ならびにそのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の溶液製剤には、これらのアミノ酸の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましいアミノ酸は、Ｄ−、Ｌ−およびＤＬ−体のロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにその塩であり、より好ましいのはＬ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リジンならびにその塩である。特に好ましいのは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リジンならびにその塩である。最も好ましいのはＬ−ヒスチジンならびにその塩である。
この安定なＥＰＯ溶液製剤の製法等の詳細については上記公報に記載された通りである。
本発明の目的の予防、治療薬における、これらＥＰＯの投与量については、対象となる疾患やその病状等を配慮して適宜決定できるものであるが、投与量については、通常成人１人当たり０．１〜５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇである。
以下に、本発明の効果を確認するための実験例を示す。
［１］初代培養細胞の調整
１−１：  オリゴデンドロサイトの培養
未熟な段階のオリゴデンドロサイト細胞の培養は胎生１８日ラットを用いて行った。大脳をｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩ（０．３ｎｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）＋０．０５％ＤＮＡｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）溶液［ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）］で酵素的に分散し、得られた分散細胞をＤＭＥＭで洗った後、ポアーサイズ７０μｍ  ナイロンメッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃２３５０）に通して、ポリ−Ｌ−リジン（ＩＣＮ）コートした培養皿（１．４ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／６０ｃｍ）上に蒔き５％ＣＯ２インキュベーター中で７日間培養した（ｐｈａｓｅ  Ｉ）。
その後、細胞を０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）でパッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）し、４℃、１，０００回転で１０分間遠心し、上清を捨て去った後、ＤＭＥＭ／１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）で２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈになるよう懸濁し蒔いた。２日後に無血清培地［ＤＭＥＭ＋グルコース（５ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎａｔｅ）（４０ｎｇ／ｍｌ），トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲストロン（ｐｒｏｇｅｓｔｒｏｎ）（０．０６ｎｇ／ｍｌ）、プトレスシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）（１６μｇ／ｍｌ）、チロキシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）（４０ｎｇ／ｍｌ）、トリヨードサイロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）（３０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）］に交換し、さらに５日間培養した（ｐｈａｓｅ  ＩＩ）。このトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）処理でパッセージをし７日間培養するｐｈａｓｅ  ＩＩのプロセスを３回繰り返した細胞を未熟なオリゴデンドロサイトとして実験に用いた。
１−２：  アストロサイトの培養
新生ラットの大脳を０．２５％トリプシン溶液で３７℃、１０分間処理し、ＤＭＥＭ／５％子牛（ＣＳ）＋０．２％グルコース培地を加えて、ポアーサイズ３２０μｍの４０番ステンレススチールメッシュに通し、培養皿に回収した。この細胞懸濁液を８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り去り沈査を上記培地でピペッティングにより再懸濁し、再び遠心した。遠心−再懸濁を３回繰り返し、最後に細胞を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようＤＭＥＭ／５％ＣＳ＋０．４％グルコース、０．０５％ＮａＨＣＯ３、２９２μｇ／ｍｌグルタミン、１００μｇ／ｍｌカナマイシン培地で組織培養皿に蒔いた。５％ＣＯ２インキュベーターで２〜４週間培養後コンフルエントとなった細胞をセルバンカーで凍結保存した。この凍結細胞を起こし２週間程度培養したものを実験に用いた。
１−３：オリゴデンドロサイトとアストロサイトとの共培養
上記１−２の方法で培養し、ほぼコンフルエントとなったアストロサイトのフィーダーレーヤー（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）上で、上記１−１の方法で調製したオリゴデンドロサイトを蒔き培養した。
１−４：  ニューロンの培養
妊娠１８日目のラットから胎児脳を取り出し、顕微鏡下で、海馬を含む大脳新皮質組織を氷冷ハンクス・バランスド・塩溶液（ＨＢＳＳ）溶液中で単離した。単離組織をポアーサイズ３２０μｍ４０番のメッシュ上でつぶし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ：０．０５％ＤＮａｓｅ／ＨＢＳＳ（１：１）混合溶液で洗い、メッシュに通した。次に、先端を丸く焼いたパスツールピペットを用いて、１０−１５回ピペッテイング後、１００番のステンレススチールメッシュに通した後１５ｍｌの遠心管に回収し、遠心を行った（８００ｒｐｍ、４℃、１０分）。上清を捨て去り、再び上記混合溶液に再懸濁し、ピペッテイング遠心を繰り返した細胞を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）／Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）：Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（１：１）培地に懸濁し、レンズペーパーに通した後、細胞数を計測し、あらかじめポリリジンコートした皿に蒔き５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。２４時間後、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ培地に交換し、その後、５−６日間培養したものを実験に供した。
［２］ＲＴ−ＰＣＲ法によるＥＰＯ受容体の発現検討
上記方法で培養した各種細胞（オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン）及び若い成熟ラットから単離した肝臓、腎臓をトライゾール溶液処理し（Ｇｉｂｃｏ）、マニュアルの指示に従ってトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ（約５００ｎｇ）の逆転写反応はＲＮＡ／ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ社）を用いて４２℃、３０分、９９℃で５分、５℃で５分で反応させ、ｃＤＮＡを合成した（１０μｌ）。この合成ＤＮＡに特異的な以下の各プライマー対を加え、上記ＰＣＲキットを用いて増幅した。対照としてベータアクチン（β−ａｃｔｉｎ）を使用した。
0005053499.tif 000002
［３］免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）による検討
免疫細胞化学の解析には細胞をマイクロカバーガラス（ｍｉｃｒｏｃｏｖｅｒ  ｇｒａｓｓ）上で培養したものを用いた。
３−１：  抗−ＥＰＯ受容体（Ｒ）抗体を用いたＥＰＯ−Ｒの発現検討
細胞をｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＬＰ）溶液で１５分間固定し、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＢ、ＰＢＳ／１０％  Ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ）で３０分ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）の後、オリゴデンドロサイトの場合は抗−Ｏ４モノクローナル抗体（１／４０希釈）、アストロサイトの場合には抗−ＧＦＡＰポリクローナル抗体（１／２０００希釈、Ｄａｋｏ）で一晩或いは１時間処理した後、抗−マウスＩｇＭ（ＦＩＴＣ標識、１／２００希釈）［アストロサイトの場合は抗−ウサギＩｇＧ抗体（ＦＩＴＣ標識、１／２００希釈）］で１時間処理を行った。続いて、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で１５分固定し、抗−ＥＰＯ−Ｒ抗体（１／１００希釈、Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ  ０６−４０６）１時間処理し、抗−ウサギＩｇＧ（ローダミン標識）１／２００希釈溶液で一時間処理し封入した。細胞の写真は蛍光顕微鏡で撮影した。
３−２：  ＭＢＰ発現細胞の割合
ＭＢＰ発現細胞は抗−ＭＢＰ抗体を用いて免疫組織化学の手法により評価した。すなわち薬物添加３日後の上記細胞（オリゴデンドロサイト単独培養及びオリゴデンドロサイトとアストロサイトの共培養）を２％ＰＦＡ溶液で３０分固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ溶液で１０分間処理し、ＢＢで３０分ブロッキングを行った後、抗−ＭＢＰポリクローナル抗体（１／１０希釈、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）で一時間処理、続いて抗−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ＦＩＴＣ標識）１／２００希釈溶液で一時間処理し封入した。細胞の写真を蛍光顕微鏡で撮影し、ＭＢＰ陽性細胞の比率と突起数を算定した。
［４］ＢｒｄＵの取り込み実験
上記１−１、１−２の方法で培養したそれぞれの細胞を、オリゴデンドロサイトの場合は４８時間、アストロサイトの場合は２４時間、ＢｒｄＵ（最終濃度２０μＭ）を取り込ませ、７０％エタノールで−２０℃、１０分間固定し、２Ｎ−ＨＣｌで１０分０．１Ｍ−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７で５分処理後、ＢＢで３０分ブロッキングを行い、１／５００希釈した抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｂ２５３１、１／１０００希釈）を１時間添加し、抗−マウスＩｇＧ抗体（ＦＩＴＣ標識）１時間処理後、蛍光顕微鏡でＢｒｄＵ陽性細胞を計測した。
［５］ＥＰＯの調製
ヒト組換えエリスロポエチン（商品名：エポジン）は培地に添加する際に１００倍希釈となるようＰＢＳ／１０％ＦＢＳ溶液で各濃度を調製し、対照はＰＢＳ／１０％ＦＢＳ溶液を用いた。
（実験結果）
ＥＰＯ−Ｒ及びＥＰＯの発現をＰＣＲ法で調べたところ，腎臓＞オリゴデンドロサイト＞肝臓＞アストロサイトの強さの順で、ＥＰＯの発現が認められ、ニューロンでは極めて薄いバンドが確認された（図１）。ＥＰＯ−Ｒは腎臓、オリゴデンドロサイトでやや強い発現がみられたものの、組織間でほぼ同じレベルであった（図１）。ＥＰＯ−Ｒの発現を蛋白レベルで確認する目的で、免疫蛍光染色を行ったところ、Ｏ４陽性オリゴデンドロサイトで細胞体及び突起全体にわたってＥＰＯ−Ｒの発現が認められた（図２）。また、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトでも、核を除く細胞表面上ほぼ全域にわたって粒状にＥＰＯ−Ｒの存在が確認された（図３）。
これらの結果から、オリゴデンドロサイト及びアストロサイトはｍＲＮＡおよび蛋白レベルでＥＰＯ−Ｒを発現し、ＥＰＯに応答する細胞であることが推察される。そこで、組換えヒトＥＰＯ蛋白を培養した細胞の培地中に添加し、３日後の形態変化およびＭＢＰの発現を調べることでオリゴデンドロサイトの成熟化に対する作用を検討した。その結果、図４から明らかなように対照に比べ処理（０．０００１−０．１Ｕ／ｍｌ）した群で全てＭＢＰ陽性細胞数の割合の増加傾向がみられ、０．００１Ｕ／ｍｌ濃度以上の処理群では有意な増加が認められた（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較）。また、細胞体当たりの突起数も同様にＥＰＯ処理で増加し、ＥＰＯ  ０．１Ｕ／ｍｌ添加では対照と比較し有意であった（ｐ＜０．０５、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較）。
一方アストロサイトでは、高濃度のＥＰＯ添加（１，１０Ｕ／ｍｌ）で顕著なＢｒｄＵの取り込みが認められ（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）、この作用はＥＰＯ中和活性を有する抗ＥＰＯ抗体、あるいは可溶性ＥＰＯ受容体添加で、有意ではないものの減弱した（図５）。この結果と一致して、オリゴデンドロサイトの培養系に１−１０Ｕ／ｍｌの高濃度のＥＰＯを添加すると、用量依存的に共存しているＧＦＡＰ陽性アストロサイト数の有意な増加が認められ、併せてオリゴデンドロサイトの生存性、成熟（Ｏ１発現、突起数）が亢進した（図６）。
次に、アストロサイト／オリゴデンドロサイト共培養系における抗−ＥＰＯ抗体および可溶性ＥＰＯ−Ｒ（ｓＥＰＯ−Ｒ）の効果について調べた。本発明者らはオリゴデンドロサイトをアストロサイトのフィーダーレーヤー上で培養すると、太い突起を形成し、ＭＢＰ陽性が増加し成熟化が促進されることをこれまでに明らかにしている（Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。この共培養系に中和活性をもつ抗−ＥＰＯ抗体あるいはｓＥＰＯ−Ｒを添加し、オリゴデンドロサイトの成熟化を抗−ＭＢＰ抗体による染色性および突起形成（細胞体当たり３本以上突起を有する細胞数）によりオリゴデンドロサイトの成熟度を評価した。図７に示す結果から明かのようにオリゴデンドロサイト単独培養に比べ、アストロサイト上で共培養すると、ＭＢＰ陽性細胞数は顕著に増大し、突起形成の促進も認められた。一方、ｓＥＰＯ−Ｒ添加したものはｃｏｎｔｒｏｌ群と比較し、ＭＢＰ陽性細胞数の減少傾向および突起形成の有意な抑制が認められ（ｐ＜０．０１，Ｄｕｎｎｅｔ多重比較）、抗−ＥＰＯ抗体添加ではＭＢＰ陽性細胞数、突起形成共に有意な減少が認められた（ｐ＜０．０１，Ｄｕｎｎｅｔ多重比較）。これらの結果は、アストロサイトとのｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎによるオリゴデンドロサイトの成熟化に少なくとも部分的にＥＰＯが関与することを示唆している。
以上の結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではあるが脳内でＥＰＯがオリゴデンドロサイトの成熟化を低濃度（０．００１−０．１Ｕ／ｍｌ）では直接促進し、高濃度（＞１Ｕ／ｍｌ）になるとアストロサイトの活性化を介してオリゴデンドロサイトの成熟化に作用する可能性を示唆するものである。このため、本発明は従来報告されているＥＰＯのコリン作動性神経細胞に対する活性化作用（Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｔａｂｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；特開平５−９２９２８号公報；特開平５−２４６８８５号公報）や、グルタミン酸神経毒性に対する神経保護効果（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、脳虚血による神経細胞死抑制効果（Ｓａｋａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓａｄａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｅｒｎａｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）等の神経細胞に対する効果と異なり、オリゴデンドロサイトに対する作用を示した初めてのものである。
近年、多発性硬化症のみなずら脳血管性の痴呆症やアルツハイマー病でも脱髄が指摘され、これまでの神経細胞に作用する薬剤だけでは痴呆を呈するこれらの疾患をケアーすることは困難と考えられる。脱髄が既に起こってしまった神経細胞は、オリゴデンドロサイトの存在がなければやがて死に至る。しかしミエリン形成は成体（成熟後）でも継続し、未分化なオリゴデンドロサイトのプロジェニター（ｐｒｏｊｅｎｉｔｏｒ）細胞が脳室下帯から生まれ、大脳皮質の白質領域へと移動しそこで成熟し新たなミエリン形成を行うことが明らかになりつつあり、ミエリンの崩壊と形成のサイクルの存在が示唆されている（Ｇｅｎｓｅｒｔ  ＆  Ｇｏｌｄｍａｎ，１９９６、１９９７；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。本発明は、このサイクルを活性化することにより、従来の神経細胞に対する保護剤だけでは治癒できなかった脱髄性の疾患を、オリゴデンドロサイトの成熟化によるミエリンの修復によって治療しようとするものであり、脱髄を伴う広範な脳疾患に対する治療薬としてＥＰＯが有効であると考えられる。
以下、製剤に関する実施例を示す。
実施例１
エリスロポエチン                    ８μｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
【００２５】
実施例２
エリスロポエチン                    ８μｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
実施例３
エリスロポエチン                  １６μｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
実施例４
エリスロポエチン                  １６μｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
実施例５
エリスロポエチン                    ８μｇ
ヒト血清アルブミン                  ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
実施例６
エリスロポエチン                    ８μｇ
ヒト血清アルブミン                  ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
実施例７
エリスロポエチン                  １６μｇ
ヒト血清アルブミン                  ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
実施例８
エリスロポエチン                  １６μｇ
ゼラチン                            ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量                ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
実施例９〜１２
実施例５〜８におけるヒト血清アルブミンに代えて５ｍｇのデキストラン４０を用い、これら実施例５〜８と同様にして注射剤を調製した。
実施例１３
注射用蒸留水１００ｍｌ中にＤ−マンニトール５ｇ、エリスロポエチン１ｍｇ、ヒト血清アルブミン１００ｍｇを無菌的に溶解して水溶液を調製し、１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
実施例１４
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                          １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                                  ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                        ８．５ｍｇ
Ｌ−アルギニン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）              １０  ｍｇ
を含み、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（和光純薬社製）にてｐＨ６．０に調整した溶液を、５ｍｌのガラスバイアルに１ｍｌ充填し、打栓、密封し、溶液製剤に供した。
実施例１５
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                          １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                                  ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                        ８．５ｍｇ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）              １０ｍｇ
上記実施例１４と同様に溶液製剤を調製した。
実施例１６
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                          １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                                  ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                        ８．５ｍｇ
Ｌ−リジン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）                  １０ｍｇ
上記実施例１４と同様に溶液製剤を調製した。
［産業上の利用の可能性］
本発明のＥＰＯを有効成分とする製剤は、従来の神経細胞のみを標的とした薬物による治療法と異なり、オリゴデンドロサイトに直接及びアストロサイトを介して間接的にエリスロポエチンを作用させることにより、脱髄を防ぎ、それによって、未分化なオリゴデンドロサイトを成熟化させることで再髄鞘化を促進する作用が期待できる画期的な脱髄疾患の予防・治療薬である。
（引用文献）
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【図面の簡単な説明】
図１は、培養神経系細胞及び単離した腎臓、肝臓組織におけるＥＰＯ及びＥＰＯ−ＲのｍＲＮＡレベルでの発現を示す写真である。
ラット胎児脳から初代培養した神経系細胞（オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン）及びａｄｕｌｔラットから単離した腎臓、肝臓組織を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法でｍＲＮＡレベルでのＥＰＯ及びＥＰＯ−Ｒの発現を調べたところ、用いた全ての細胞・組織でＥＰＯ−Ｒの発現と、腎臓に匹敵する程度の強いＥＰＯの発現がオリゴデンドロサイトに認められた。β−ａｃｔｉｎはコントロールとして用いた。
図２は、オリゴデンドロサイト細胞におけるＥＰＯ−Ｒの発現を示す写真である。Ｏ４陽性オリゴデンドロサイト（ｂ）は、ＥＰＯ−Ｒの発現が細胞体全域および突起に認められた（ｃ）。  写真ａは位相差写真である。
図３は、アストロサイト細胞におけるＥＰＯ−Ｒの発現を示す写真である。ＧＦＡＰ陽性アストロサイト（Ｂ）は、ＥＰＯ−Ｒの発現が核を除く細胞表面上に広く粒状に観察された（Ａ）。写真Ｃは位相差写真である。
図４は、ＭＢＰ陽性オリゴデンドロサイト細胞の割合に対するＥＰＯの影響（Ａ）とＥＰＯによる細胞当たりの平均突起数の変化（Ｂ）を示すグラフである。
各濃度のＥＰＯ（０．０００１−０．１Ｕ／ｍｌ）を３日間処理した後、抗−ＭＢＰ抗体陽性細胞の割合と細胞当たりの突起数を蛍光顕微鏡で写真撮影後計測すると、ＥＰＯ添加によりＭＢＰ陽性の上昇と突起数の増大がみられる。数値は平均値±標準誤差で表し、６つの独立した観察から値を求めた。統計的有意差はＤｕｎｎｅｔの多重比較で検定した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
図５は、アストロサイトのＢｒｄＵ取り込みに対するＥＰＯの作用を示すグラフである。
細胞にＢｒｄＵ（２０μＭ）と薬物を添加し、２４時間後に細胞固定後、抗−ＢｒｄＵ抗体及び抗−ＧＦＡＰ抗体で免疫染色し、ＢｒｄＵ陽性細胞数の割合を計測した。ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ添加により用量依存的なＢｒｄＵの取り込み促進が認められた。数値は３−４つの独立した観察の平均値±標準誤差で表す。統計的有意差はＤｕｎｎｅｔの多重比較で検定した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
図６は、オリゴデンドロサイトの培養系において、共存アストロサイト数の増加に及ぼす高濃度ＥＰＯの影響を示すグラフである。
高濃度のＥＰＯ（１，３，１０Ｕ／ｍｌ）を培養系に添加したところ、１Ｕ／ｍｌ以上のＥＰＯ添加で、用量依存的に共存するＧＦＡＰ陽性アストロサイト数の増加が観察され（Ａ）、併せてオリゴデンドロサイト（Ｏ１陽性）の生存数の増大（Ｂ）や、成熟促進（突起の発達）（Ｃ）も観察された。数値は４−６の独立した観察の平均値±標準誤差で表し、統計的有意差はＤｕｎｎｅｔの多重比較で検定した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
図７は、アストロサイト／オリゴデンドロサイト共培養系における、オリゴデンドロサイトの成熟促進に及ぼす可溶性ＥＰＯ−Ｒ、抗−ＥＰＯ抗体添加の影響を示すグラフである。
アストロサイトのｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ上にオリゴデンドロサイトを培養し、細胞接着後可溶性ＥＰＯ−Ｒ、抗−ＥＰＯ抗体を添加し、３日後に抗−ＭＢＰ抗体による免疫染色を行うことで、ＭＢＰ陽性細胞の割合と、細胞体当たり３本以上の突起を形成しているＭＢＰ陽性細胞の割合を算定した。数値は平均値±標準誤差で表し、４−７つの独立した観察から値を求めた。統計的有意差はＤｕｎｎｅｔの多重比較で検定した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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