(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化Ｎ-アセチル-3,4,6-トリ-Ｏ-アセチル-α-グルコサミニルであるアシルアミノ糖とフッ化カリウムとを反応させることを特徴とする2-メチル(3,4,6-トリ-Ｏ-アセチル-1,2-ジデオキシ-α-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンである糖オキサゾリン誘導体の製
造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法により糖オキサゾリン誘導体を製造し、次いで、得られた糖オキサゾリン誘導体の保護基の少なくとも一部を除去することを含む、下記一般式（３）で示される糖オキサゾリン誘導体の製造方法。
【化１】
0004866515.tif 000007
（式中、Ｒ1はメチルであり、
Ｒ3及びＲ4はＨであり、
Ｒ2、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に、ＯＨ又はＯ−アセチルである。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖オキサゾリン誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖オキサゾリン誘導体は糖鎖関連酵素を用いた糖鎖合成の基質として注目されており、糖オキサゾリン誘導体を得る方法が検討されている。従来より、塩化Ｎ-アセチル-３,４,６-トリ-Ｏ-アセチル-α-グルコサミニルのアセトニトリル溶液に、求核剤として塩化テトラエチルアンモニウムを用い、酸捕獲剤として炭酸水素ナトリウムを加えて反応させることにより、双環状糖オキサゾリン誘導体を製造する方法が用いられている（特開平９−３０８８）。しかし、当該方法は、反応終了溶液中に残存する過剰な反応試薬の除去が難しく、純度の高い糖オキサゾリン誘導体を得るには、煩雑な精製手技が必要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、生体内物質であるオリゴ糖類やグリコサミノグリカン等の作用が医療分野において注目されており、当該オリゴ糖類やグリコサミノグリカンの酵素合成の基質となりうる糖オキサゾリン誘導体の、工業化可能で、且つ、安価で、より簡便な製造方法が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、反応試薬として金属フッ化物を用いる事により、当該フッ化物が、求核性および酸捕獲性の両作用を発揮し、糖オキサゾリン誘導体の合成が進行すること、また、当該フッ化物の除去も容易であることを見いだし、本発明の完成に至った。
【０００５】
本発明は、下記一般式（１）で示されるアシルアミノ糖と金属フッ化物とを反応させることを特徴とする下記一般式（２）で示される糖オキサゾリン誘導体の製造方法を提供する。
【０００６】
【化５】
0004866515.tif 000002
（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択され、
Ｒ1は、Ｈ及び(ＣＨ2)n−ＣＨ3（n＝０〜５）から選択され、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｎ3、保護基により保護されたＯＨ、保護基により保護されたＮＨ2、及び、Ｙ−Ｒ7（ＹはＯ又はＮＨ又はＳであり、Ｒ7は単糖又はオリゴ糖の残基であって、ＯＨ、ＮＨ2又はＣＯＯＨを有する場合にはそれらの基が保護基により保護されている単糖又はオリゴ糖の残基である）から選択される。但し、Ｒ2とＲ3の少なくとも一方及びＲ4とＲ5の少なくとも一方はＨである。）
【０００７】
【化６】
0004866515.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、前記と同様である。）
【０００８】
また、本発明は、下記一般式（１）で示されるアシルアミノ糖と金属フッ化物とを反応させ、次いで、得られた糖オキサゾリン誘導体の保護基の少なくとも一部を除去することを含む、下記一般式（３）で示される糖オキサゾリン誘導体の製造方法。
【０００９】
【化７】
0004866515.tif 000004
（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択され、
Ｒ1は、Ｈ及び(ＣＨ2)n−ＣＨ3（n＝０〜５）から選択され、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｎ3、保護基により保護されたＯＨ、保護基により保護されたＮＨ2、及び、Ｙ−Ｒ7（ＹはＯ又はＮＨ又はＳであり、Ｒ7は単糖又はオリゴ糖の残基であって、ＯＨ、ＮＨ2又はＣＯＯＨを有する場合にはそれらの基が保護基により保護されている単糖又はオリゴ糖の残基である）から選択される。但し、Ｒ2とＲ3の少なくとも一方及びＲ4とＲ5の少なくとも一方はＨである。）
【００１０】
【化８】
0004866515.tif 000005
（式中、Ｒ1は前記と同様であり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｎ3、保護基により保護されていてもよいＯＨ、保護基により保護されていてもよいＮＨ2、及び、Ｙ−Ｒ7（ＹはＯ又はＮＨ又はＳであり、Ｒ7は単糖又はオリゴ糖の残基であって、ＯＨ、ＮＨ2又はＣＯＯＨを有する場合にはそれらの基が保護基により保護されていてもよい単糖又はオリゴ糖の残基である）から選択される。但し、Ｒ2とＲ3の少なくとも一方及びＲ4とＲ5の少なくとも一方はＨである。）
【００１１】
上記の両製造法において、金属フッ化物は、好ましくはアルカリ金属フッ化物である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の一般式（２）で示される糖オキサゾリン誘導体の製造方法は、上記一般式（１）で示されるアシルアミノ糖と金属フッ化物とを反応させることを特徴とする。
【００１３】
上記一般式（１）で示されるアシルアミノ糖は、当該物質の起源、由来によって特に限定されず、天然から得られるもの、遺伝子工学的に動物細胞、微生物などにより合成したものに必要により通常の方法で保護基を導入したものや人工的に化学合成したものを用いることが可能である。
【００１４】
Ｘは、同じハロゲンに分類されるフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から選択可能であり、特に塩素が好ましい。
【００１５】
Ｒ1は、Ｈ及び(ＣＨ2)n−ＣＨ3 （n＝０〜５）から選択する事ができ、中でも、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3が好ましく、特にＣＨ3が好ましい。これらの基であれば、隣接するアミド（−ＮＨＣＯ−）の電子状態にあまり影響を与えない。
【００１６】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、各々上記規定のＨ、Ｎ3、保護基により保護されたＯＨ、保護基により保護されたＮＨ2、Ｙ−Ｒ7（ＹはＯ又はＮＨ又はＳであり、Ｒ7は単糖又はオリゴ糖の残基であって、ＯＨ、ＮＨ2又はＣＯＯＨを有する場合にはそれらの基が保護基により保護されている単糖又はオリゴ糖の残基である）から選択可能である。但し、Ｒ2とＲ3の少なくとも一方及びＲ4とＲ5の少なくとも一方はＨである。
【００１７】
Ｒ7の単糖又はオリゴ糖の残基は、通常には、単糖の１位またはオリゴ糖の還元末端の１位で残基となっているものである。単糖及びオリゴ糖の構成糖は、アミノ糖若しくは糖酸又はそれらの誘導体であってもよい。単糖としては、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ-マンノサミン、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-グルコース、Ｄ-マンノース、Ｄ-グルクロン酸、Ｌ-イズロン酸及びそれらの誘導体が好ましく、オリゴ糖としては、同じ単糖が重合しているオリゴ糖や、Ｌ-イズロン酸及びＤ-グルクロン酸から選択されるウロン酸と、Ｄ-グルコサミン及びＤ-ガラクトサミンから選択されるヘキソサミンとからなる二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とするグリコサミノグリカン及びそれらの誘導体が好ましい。つまり、還元末端の糖残基が上記一般式（１）として記載されている単糖の構造である二糖またはグリコサミノグリカンも本発明の製造方法に用いることができる。
【００１８】
尚、上記の誘導体とは、単糖又はオリゴ糖の構成糖のＮＨ2をアセチル化したものや、ＯＨを硫酸化したものが挙げられる。
【００１９】
本発明において、オリゴ糖とは２個以上の単糖から構成される通常の意味でのオリゴ糖であり、通常２〜二十数糖、ないし、２〜２０糖である。
【００２０】
単糖及びオリゴ糖の残基を含有する置換基を選択する場合を含め、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6に選択される置換基は、本発明のオキサゾリン形成反応には実質的に関与しておらず、通常の合成反応と同様に、本発明のオキサゾリン形成反応の際に反応性に富むと推測される官能基である場合にはこれらが反応しない様にする必要があり、例えば、本発明の上記反応に供する前に、常法的に用いられる保護基により保護し、反応終了後保護基をはずし、目的物質を得る方法が考えられる。従って、一般式（１）で示されるアシルアミノ糖において、反応性に富むと推測される基は保護されている必要がある。
【００２１】
保護基としては、上記一般式（１）で示されるアシルアミノ糖の金属フッ化物の存在下での本反応を妨げない限り特に限定はされないが、具体的には、アセチル基、ベンゾイル基、メチルベンゾイル基、ピバロイル基、レブリノイル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基などのアシル基、メチル基、エチル基などの低級アルキル基（通常、炭素数１〜５個程度）、ベンジル基、フェネチル基などのアラルキル基、イソプロピリデン基などのアルキリデン基、ベンジリデン基などのアラルキリデン基やアリール基が好ましく用いられ、中でも、水酸基やアミノ基の保護基としては、アセチル基が好ましく用いられ、カルボキシル基の保護基としては、低級アルキル基又はアラルキル基が好ましく用いられる。通常には、保護基は、保護する基の種類に応じて適宜選択され、複数の種類の基を同一の種類の保護基で保護してもよいし、複数の同一の種類の基を複数の種類の保護基で保護してもよい。
【００２２】
本発明に用いるアシルアミノ糖の好ましい例としては、下記が挙げられる。
【００２３】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：Ｈ、Ｒ5：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００２４】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ5：Ｈ、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００２５】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：Ｈ、Ｒ5：Ｏ−β-Ｄ-ガラクトース（ＯＨをアセチル基で保護）、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００２６】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：Ｏ−β-D-グルクロン酸（ＯＨをアセチル基で保護、ＣＯＯＨをベンジル基で保護）、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：Ｈ、Ｒ5：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００２７】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：Ｏ−β-Ｄ-グルクロン酸（ＯＨをアセチル基で保護、ＣＯＯＨをベンジル基で保護）、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ5：Ｈ、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００２８】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：Ｏ−α-Ｌ-イズロン酸（ＯＨをアセチル基で保護、ＣＯＯＨをベンジル基で保護）、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ5：Ｈ、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００２９】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：Ｈ、Ｒ5：Ｏ−β-Ｄ-グルコサミン（ＯＨ及びＮＨ2をアセチル基で保護）、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００３０】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：Ｈ、Ｒ5：Ｏ−β-Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン（ＯＨをアセチル基で保護）、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖。
【００３１】
Ｘ：Ｃｌ、Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＯＣＯＣＨ3、Ｒ3：Ｈ、Ｒ4：Ｈ、Ｒ5：Ｏ−ヘパリンの還元末端側にウロン酸残基(β-Ｄ-グルクロン酸残基又はα-Ｌ-イズロン酸残基）を有する糖残基、硫酸化されていないＯＨ及びＮＨ2をアセチル基で保護、ＣＯＯＨをベンジル基で保護）、Ｒ6：ＯＣＯＣＨ3である一般式（１）で示されるアシルアミノ糖（還元末端に、１位にＣｌを有し、２位のアミノ基がアセチル化されているグルコサミン残基を有し、その他の硫酸化されていない水酸基及びアミノ基がアセチル化されており、カルボキシル基がベンジル化されているヘパリン）。
【００３２】
本発明の製造方法に用いられる金属フッ化物は、特に限定されないが、アルカリ金属フッ化物が好ましく、より好ましくは、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化ルビジウム、フッ化セシウムなどが挙げられる。工業的規模での製造の際には、試薬としての取り扱いや価格等を考慮すると、特にフッ化ナトリウムやフッ化カリウムが好ましい。
【００３３】
一般式（１）で示されるアシルアミノ糖と金属フッ化物との反応の条件については、本発明に用いられるアシルアミノ糖と金属フッ化物が反応し、双環状の糖オキサゾリン誘導体が生成すれば、特に限定されることはなく、当業者が適宜設定する事が出来る。
【００３４】
反応の溶媒としては、用いるアシルアミノ糖及び金属フッ化物と反応せず、用いるアシルアミノ糖を溶解することが出来れば特に限定されないが、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン、キシレン等が好ましく、ＣＨ3ＣＮ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦがより好ましく、中でもＣＨ3ＣＮが特に好ましい。
【００３５】
金属フッ化物の使用量、反応温度及び反応時間などの反応条件は、用いるアシルアミノ糖の量などにより適宜設定されるが、当該アシルアミノ糖と金属フッ化物のモル比は、好ましくは１：２〜１：３０、より好ましくは１：１０であり、反応温度は、好ましくは室温〜溶媒の沸点、より好ましくは３０〜６０℃である。尚、使用する溶媒の沸点にて反応を行う場合は、還流冷却器などの利用が可能である。反応時間としては、０．５時間〜３日間が好ましい。
【００３６】
反応条件の設定の際には、反応の終了を確認することが好ましく、反応の終了を確認する方法の具体例としては、薄層クロマトグラフィーが挙げられる。
【００３７】
一般式（１）で示されるアシルアミノ糖と金属フッ化物との反応は、水との反応を避ける為、アルゴンや窒素などの雰囲気下において、行うことが好ましい。
【００３８】
反応終了液から目的物質である糖オキサゾリン誘導体を精製する方法としては、通常行われている精製方法を適宜選択し用いる事が可能であるが、たとえば、反応終了液より不溶物を取り除き、次いで分液操作により反応終了液中に溶解している水溶解性の物質を取り除いた後、シリカゲルクロマトグラフィーや再結晶等により精製する方法が挙げられる。
【００３９】
反応終了液より不溶物を取り除く方法は、不溶物（固体）と溶液（液体）が分離さえすればよく、通常用いられるグラスフィルターやセライト等を用いた濾過方法の利用が可能である。
【００４０】
一般式（３）で示される糖オキサゾリン誘導体の製造方法は、上記の方法により一般式（２）で示される糖オキサゾリン誘導体を得、得られた糖オキサゾリン誘導体の少なくとも一部の保護基を除去することを特徴とする。この方法により、一般式（２）で示される糖オキサゾリン体の保護基の少なくとも一部が除去された一般式（３）で示される糖オキサゾリン体を得ることができる。保護基の除去は、常法に従って行うことができる。
【００４１】
本発明の製造方法により得られる糖オキサゾリン誘導体は、オキサゾリン環の開環重合を利用した重合体合成の基質としての利用が考えられ、特に、本発明の製造方法のアシルアミノ糖として、Ｒ2〜Ｒ6の少なくとも一つが単糖又はオリゴ糖であるもの（還元末端に、特定の構造を有する二糖またはグリコサミノグリカン）を用いて得られる糖オキサゾリン誘導体は、酵素触媒重付加反応を利用するグリコサミノグリカン類の合成基質として用いることが出来ると考えられる。
【００４２】
例えば、ラクトサミンの二糖で構成される基本骨格を一つ以上含有するラクトサミン鎖の還元末端にオキサゾリン環を有する双環状糖オキサゾリン誘導体を本発明の製造方法により得、得られた当該誘導体を基質としてケラタナーゼを作用させることにより、ラクトサミン鎖の伸張が可能である。同様に、本発明の製造方法により得られる、ヒアルロン酸の二糖で構成される基本骨格を一つ以上含有するヒアルロン酸鎖の還元末端にオキサゾリン環を有する双環状糖オキサゾリン誘導体を基質として、ヒアルロニダーゼを作用させることにより、ヒアルロン酸鎖の伸張が可能である。また、本発明の製造方法により得られるオキサゾリン環を有するグルコサミン又はその非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン若しくはグルコサミンが結合した二糖を基質としてキチナーゼを作用させることによりキチン又はキトサンを得ることも可能であると思われる。
【００４３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００４４】
【実施例１】
金属フッ化物を用いる双環状オキサゾリンの合成
下記表１に記載の各反応条件の下、以下の手順により合成を行った。
【００４５】
アルゴン雰囲気下、フッ化カリウム又はフッ化セシウムに、１．８ｇ(5 mmol)の塩化Ｎ-アセチル-3,4,6-トリ-Ｏ-アセチル-α-グルコサミニルのアセトニトリル溶液７５ml又は１．８ｇ(5 mmol)の塩化Ｎ-アセチル-3,4,6-トリ-Ｏ-アセチル-α-グルコサミニルのジメチルホルムアミド溶液７５mlを加え、環流下、反応させた。薄層クロマトグラフィーにより反応終了を確認後、グラスフィルターＧ４により濾過した。ろ液をエバポレーターにて濃縮し、過剰量のクロロホルムで希釈し、溶液のpHが中性になるまで炭酸水素ナトリウム飽和溶液、次いで冷水にて分液操作を行った。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、硫酸ナトリウムを濾過により取り除き、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた残留物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ゲル：Merck社製 Silika gel６０、粒径0.040-0.063mm、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／３(容量比)）により精製し、展開後の溶液をエバポレーターにより更に濃縮、減圧乾燥し、黄色のシロップ状の２-メチル（３,４,６-トリ-Ｏ-アセチル-１,２-デオキシ-α-グルコピラノ）［２,１-d］-２-オキサゾリンを得た。収率を表１に示す。
【００４６】
【表１】
0004866515.tif 000006
【００４７】
また、得られた生成物（２−メチル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−グルコピラノ）［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン）のＮＭＲデータは以下の通りであった。
【００４８】
1H NMR (250 MHz, CDCl3): 5.95(1H, d, J1,2=7.34 Hz, アノマープロトン), 2.0-2.1(12H, m, アセテートのメチルプロトン及びオキサゾリンのメチルプロトン)
【００４９】
13C NMR (62.9 MHz, CDCl3): 99.4(C-1), 20.7-20.9(3C, アセテートのメチルＣ), 13.9(オキサゾリンのメチルＣ), 169.2-170.6(3C, アセチルのカルボニルＣ）, 166.7(オキサゾリン環のＣ: O-C=N)
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、糖オキサゾリン誘導体の、工業化可能で、且つ、安価で、より簡便な製造方法が提供される。