(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1-1) 配列表の配列番号3における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
(2-1) 配列表の配列番号4における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
【請求項２】
(1-2) 配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
(2-2) 配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
【請求項３】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１又は２記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にくるみが存在しているか否かを検出する工程とを含むくるみの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある特定の植物中のキウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、大豆を検出対象とし、当該特定植物が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出することを可能とする特定植物の検出方法、その方法に使用するPCRプライマー、プライマーセット、及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、特定のアレルギー体質を持つ人の健康危害の発生を防止する観点から、食物アレルギーを引き起こすことが明らかになった食品のうち、特に発症数、重篤度から勘案して表示する必要性の高い小麦、そば、卵、乳、及び落花生の5品目（以下「特定原材料」と
いう。）を含む加工食品については、当該特定原材料を含む旨を商品に記載しなければならない（厚生労働省医薬局食品保健部長通知、食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について、平成13年3月15日、食発
第79号）。また、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバ、鶏肉、豚肉、いくら、牛肉、ゼラチン、オレンジ、キウイフルーツ、くるみ、大豆、まつたけ、もも、やまいも、りんご及び、バナナの20品目（以下「特定原材料に準ずるもの」という。）についても、食物アレルギーの実態及びアレルギー誘発物質の解明に関する研究において、特定のアレルギー体質を持つ人に、過去に一定の頻度で重篤な健康危害が見られていることから、これらを原材料として含む加工食品については、当該食品を原材料として含む旨を可能な限り表示するよう努めることが推奨されている（厚生労働省医薬局食品保健部長通知、食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について、平成13年3月15日、食発第79号）（食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について、平成13年3月15日、食発第79号、改正 平成16年12月24日、食安発第1224002号）。
【０００３】
アレルギーを起こす恐れのある食品原料、特にアレルギー原因動植物は、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品の提供者としては、それらにアレルギー原因動植物が混入されているか否かの品質管理を行うことが重要となる。
【０００４】
「特定原材料」である小麦、そば、卵、乳及び、落花生の検出法としては、ELISA法、
ウェスタンブロッド法あるいはPCR法を用いた方法が確立されており、当該検出法は、検
査キットとして商用的に入手、利用可能となっている（厚生労働省医薬局食品保健部長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成14年11月06日、食発第1106001
号）。一方、「特定原材料に準ずるもの」に対する検出法は、鶏肉、豚肉、牛肉において報告されているが（特開2003-230383号「牛、豚、鶏検出用プライマー」）（Meyer R., C. Hofelein, J. Luthy, and U. Candrian; Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food; Journal of AOAC International, 78: 1542-1551, 1995）（松永孝光、柴田清弘、山田順一、新村裕; マルチプレックスPCR法による食肉及び食肉製品の肉種鑑別; 日本食品科学工学会誌, 46: 187-194, 1999）、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバ、いくら、ゼラチン、オレンジ、キウイフルーツ、くるみ、大豆、まつたけ、もも、やまいも、りんご及び、バナナの検出法については、現在まで明確な報告はない。従って、これらの検出法が定かでない「特定原材料に準ずるもの」に相当する特定動植物の混入の有無に関して、科学的な検証をもって品質管理を行うことは、現在、困難な状況にある。
【０００５】
様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中から検出対象生物を検出する場合、「特定原材料」の検査法で確立されているように、検出対象生物に特徴的な蛋白質を検出する方法（ELISA法やウェスタンブロッド法）や検出対象生物に特徴的なDNA塩基配列を検出する方法（PCR法）が有望な手法となる（厚生労働省医薬局食品保健部長通知、アレルギー物
質を含む食品の検査方法について、平成14年11月06日、食発第1106001号）。一般に、蛋
白質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため
、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。それ故に、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的とし
た検出方法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中から検出対象生物の混入の有無を調べる手法として、有望な方法と考えられる。また、動植物のDNA塩基配列には、rRNA遺伝子クラスターのようにコピー数の多い塩基配列が存在し、このような多コピー数の塩基配列を標的配列に使用できれば、検出法の感度を高めることも可能となる。さらに、細胞中に複数存在するクロロプラスト由来DNAあるいはミトコンドリア由来DNAの塩基配列を標的配列とする場合も、同様に検出法の感度の向上化に寄与する。
【０００６】
遺伝子組換え作物などをPCRで検出する場合、検出対象とするDNA塩基配列は、組換えられたDNA塩基配列に限定される。一方、自然界に存在する動植物の場合、無数にあるDNA塩基配列からどの塩基配列を検出対象に選ぶかという明確な知見はない。また、様々な動植物について、選択した塩基配列を検出対象とした場合にそれが有効であるか否かについては明確な知見は得られていない。検出対象とする動植物に特異的な蛋白質を選定し、その蛋白質をコードするDNA塩基配列を検出するための標的とすることも行われているが、こ
の場合、個々の動植物に対して個別に特異的な蛋白質を選定する必要がある。また、このような特異的な蛋白質が選定できたとしても、そのDNA塩基配列のコピー数が少ない場合
には、必要な検出感度が得られない場合があり、微量に混入する動植物の検出には、不都合となる。
【０００７】
被験試料であるキウイフルーツの種や品種を同定あるいは分類する方法として、RAPD（非特許文献１）やクロロプラストのsimple sequence repeat polymorphismsに基づいたPCR分析法（非特許文献２）が報告されている。これらの方法は、主たる被験試料がキウイフルーツあるいは単一種の植物である試料から抽出したDNAを試料として使用可能であるが、手法の特性上、複数の植物種が混合するような試料の場合、使用されるPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、キウイフルーツを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のキウイフルーツDNAを特異的に検出するために、これらの方法を使用することはできない。
また、くるみ科くるみ属の分子系統分類を行うために、rRNA遺伝子のITS（internal transcribed spacer）領域及び5.8S rRNA遺伝子配列、あるいは、クロロプラストのmatK（maturase-encoding gene）遺伝子配列を比較分析する方法が報告されている（非特許文献３）。これらの方法は、くるみ属以外の各種植物の上記の遺伝子をそれぞれ増幅可能なユニバーサルPCRプライマーによって増幅されたPCR増幅産物の塩基配列分析を比較する方法であり、くるみ属以外の植物DNAを含む場合、当然、そのような植物DNA由来のPCR増幅産物も生じることになる。それ故に、複数の植物種が混在するような試料の場合、これらの方法では、くるみ属を特異的に検出することは非常に困難となる。
【０００８】
具体的に説明すると、既知のDNAデータベース（GenBank nucleotide sequence database）から取得した各種生物のITS領域及び5.8S rRNA遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、上述の文献におけるrRNA遺伝子のITS領域及び5.8S rRNA遺伝子配列を増幅するPCRプライマーセット［ITS5A(F)（ccttatcatttagaggaaggag：配列番号２９）及びITS4(R)（tcctccgcttattgatatgc：配列番号３０）］は、クルミ科クルミ属のくるみ以外に、イネ科（イネ、トウモロコシ）、ナス科（タバコ）、ウコギ科（トレベシアの仲間）やラン科（カキランの仲間）等の植物を幅広く検出すると予測される。
同様に、クロロプラストのmatK遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列
との関係から、上述の文献におけるmatKを増幅するPCRプライマーセット［trnK1(F)（ctcaacggtagagtactcg：配列番号３１）及びtrnK2r(R)（aactagtcggatggagtag：配列番号３２）］は、クルミ科クルミ属のくるみ以外に、イネ科（イネ、トウモロコシ）やナス科（タバコ、ジャガイモ）の植物を検出すると予測される。
【０００９】
また、りんごの種や品種を分類するために、RAPDマーカーを利用した方法、rRNA遺伝子のITS領域や5.8S rRNA遺伝子配列、あるいはクロロプラストのmatK遺伝子配列を比較分析する方法が報告されている（非特許文献４）。これらの方法は、主たる被験試料がりんごあるいは単一種の植物である試料から抽出したDNAを試料として使用可能であるが、手法
の特性上、複数の植物種が混合するような試料の場合、使用されるPCRプライマーは、他
の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、りんごを特異的に検出することは困
難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のりんごDNAを特異的に検出するために、
この方法を使用することはできない。
【００１０】
また、やまいもの種や品種を詳細に分類するために、RAPDマーカーを利用した方法（非特許文献５）が報告されている。この方法は、主たる被験試料がやまいもあるいは単一種の植物である試料から抽出したDNAを試料として使用可能であるが、手法の特性上、複数
の植物種が混合するような試料の場合、使用されるPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、やまいもを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のやまいもDNAを特異的に検出するために、この方法を使
用することはできない。
【００１１】
また、バナナの種や品種を詳細に分類するための方法が、多数報告されている。例えば、rRNA遺伝子のITS領域に関するPCR-RFLP（非特許文献６）を用いた報告では、バナナ属の栽培種バナナや野生種のITS領域を特異的に認識するPCRプライマーを使用している。この方法で使用されるPCRプライマーは、バナナ属植物由来DNAを増幅させることが可能であり、その増幅産物を制限酵素で消化（切断）した後に生じる切断断片の数とその断片長の相違性からバナナ属植物の種や品種を分類することが可能である。しかしながら、その他の生物に対する当該PCRプライマーの交差反応性、すなわち。検出特異性に関する記載は無く、さらに、一般に、加工食品のような複数の動植物を含む試料中からバナナ属植物のDNAを識別できるという記載もなされていない。それ故に、複数の動植物を含むような食品中のバナナ属植物DNAを特異的に検出する方法としては、十分に検証された方法とは言い難い。
【００１２】
大豆を検出する方法としては、ELISA法やPCR法を用いた複数の方法がすでに報告されている。例えば、遺伝子組換え大豆を検出するPCR法においては、被験試料中の大豆DNAの存在を確認するためのPCRプライマーが用いられている。遺伝子組換え大豆検査における、
このPCRプライマーの大豆DNAに対する検出能力は、十分な性能を保有していると考えられるのだが、このPCRプライマーの標的DNAは染色体DNAであり、一般に、その検出感度は、
ミトコンドリア由来DNAやクロロプラスト由来DNAを標的としたPCRプライマーよりも低い
ことが予測される。
【００１３】
対象とする特定植物の食品原料や製品中への混入の有無は、当該植物に特異的な遺伝子配列が食品原料や製品中から検出されるか否かを調べることによって、検査できる。但し、その検査法は、目的とする植物に由来するDNAを検出できるが、食品原料や製品を構成する複数の目的としない動植物由来DNAを検出しないような方法であることが強く望まれる。
【００１４】
上述したように、「特定原材料に準ずるもの」における、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバ、いくら、ゼラチン、オレンジ、キウイフルーツ、くるみ、大豆、まつたけ、もも、やまいも、りんご、及びバナナに対する明確な検出法は、報告されておらず（本発明者らによって、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバについては特許出願されているが、現時点で未公開）、これらの特定動植物が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Huang H., Z. Li, J. Li, T. L. Kubisiak, and D. R. Layne; Phylogenetic Relationships in Actinidia as Revealed by RAPD Analysis; Journal of the American Society for Horticultural Science, 127: 759-766, 2002
【非特許文献２】Weising K, and R. C. Gardner; A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms; Genome, 42: 9-19, 1999
【非特許文献３】Stanford A. M., R. Harden, and C. R. Parks; Phylogeny and biogeography of Juglans (Juglandaceae) based on matK and ITS sequence data; American Journal of Botany, 87: 872-882, 2000
【非特許文献４】Forte A. V., A. N. Ignatov, V. V. Ponomarenko, D. B. Dorokhov, and N. I. Savelyev; Phylogeny of the Malus [apple tree] species, inferred from its morphological traits and molecular DNA analysis; Genetika, 38: 1357-1369, 2002
【非特許文献５】林満、志和地弘信、遠城道雄; ヤムイモ(Dioscorea spp.)における形態的形質およびRAPD 法による系統の分類; Kagoshima University Research Center for the Pacific Islands, Occasional Papers No.34, 145-157, 2001
【非特許文献６】Nwakanma D. C., M. Pillay, B. E. Okoli, and A. Tenkouano; PCR-RFLP of the ribosomal DNA internal transcribed spacers (ITS) provides markers for the A and B genomes in Musa L.; Theoretical and Applied Genetics, 108: 154-159, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある特定の動植物のうち、キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、又は大豆を、食品原料や製品中から特異的に検出できる方法、及びこの方法に用いるPCRプライマー、プライマーセット、及びキットを提供
することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする植物及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、20品目の「特定原材料に準ずるもの」の中から、キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、大豆（本発明において、これらを「特定植物」と称する）を高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。その結果、キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナあるいは大豆の各々に特徴的な塩基配列を見いだし、これらの塩基配列を利用してPCR法など
の核酸分析を行うことで、キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、及び大豆をそれぞれ簡便に検出し得ることを知見し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１８】
即ち、本発明は、以下の特定植物検出法、PCRプライマー、PCRプライマーセット、及びPCRキットを提供する。
【００１９】
項１．  下記の(1)〜(24)のいずれかのPCRプライマー。
(1)  配列表の配列番号1における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(2)  配列表の配列番号2における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(3)  配列表の配列番号3における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(4)  配列表の配列番号4における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(5)  配列表の配列番号5における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(6)  配列表の配列番号6における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(7)  配列表の配列番号7における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(8)  配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(9)  配列表の配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(10) 配列表の配列番号10における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(11) 配列表の配列番号11における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(12) 配列表の配列番号12における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー。
(13) 配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(14) 配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(15) 配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(16) 配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(17) 配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(18) 配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(19) 配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(20) 配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(21) 配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプラ
イマー。
(22) 配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(23) 配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
(24) 配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
【００２０】
項２．  配列表の配列番号1における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２１】
項３．  配列表の配列番号2における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２２】
項４．  配列表の配列番号3における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２３】
項５．  配列表の配列番号4における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２４】
項６．  配列表の配列番号5における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２５】
項７．  配列表の配列番号6における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２６】
項８．  配列表の配列番号7における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２７】
項９．  配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２８】
項１０．  配列表の配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最
大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００２９】
項１１．  配列表の配列番号10における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００３０】
項１２．  配列表の配列番号11における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００３１】
項１３．  配列表の配列番号12における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１に記載のPCRプライマー。
【００３２】
項１４．  配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項２に記載のPCRプライマー。
【００３３】
項１５．  配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項３に記載のPCRプライマー。
【００３４】
項１６．  配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項４に記載のPCRプライマー。
【００３５】
項１７．  配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項５に記載のPCRプライマー。
【００３６】
項１８．  配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項６に記載のPCRプライマー。
【００３７】
項１９．  配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項７に記載のPCRプライマー。
【００３８】
項２０．  配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項８に記載のPCRプライマー。
【００３９】
項２１．  配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項９に記載のPCRプライマー。
【００４０】
項２２．  配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる
項１０に記載のPCRプライマー。
【００４１】
項２３．  配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１１に記載のPCRプライマー。
【００４２】
項２４．  配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１２に記載のPCRプライマー。
【００４３】
項２５．  配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなる項１３に記載のPCRプライマー。
【００４４】
項２６．  下記の(25)〜(36)のいずれかのPCRプライマーセット。
(25) 項２記載のプライマーと項３記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(26) 項４記載のプライマーと項５記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(27) 項６記載のプライマーと項７記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(28) 項８記載のプライマーと項９記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(29) 項１０記載のプライマーと項１１記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(30) 項１２記載のプライマーと項１３記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(31) 項１４記載のプライマーと項１５記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(32) 項１６記載のプライマーと項１７記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(33) 項１８記載のプライマーと項１９記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(34) 項２０記載のプライマーと項２１記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(35) 項２２記載のプライマーと項２３記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
(36) 項２４記載のプライマーと項２５記載のプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【００４５】
項２７．  項２記載のプライマーと項３記載のプライマーとからなるPCRプライマーセ
ット。
【００４６】
項２８．  項４記載のプライマーと項５記載のプライマーとからなるPCRプライマーセ
ット。
【００４７】
項２９．  項６記載のプライマーと項７記載のプライマーとからなるPCRプライマーセ
ット。
【００４８】
項３０．  項８記載のプライマーと項９記載のプライマーとからなるPCRプライマーセ
ット。
【００４９】
項３１．  項１０記載のプライマーと項１１記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５０】
項３２．  項１２記載のプライマーと項１３記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５１】
項３３．  項１４記載のプライマーと項１５記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５２】
項３４．  項１６記載のプライマーと項１７記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５３】
項３５．  項１８記載のプライマーと項１９記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５４】
項３６．  項２０記載のプライマーと項２１記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５５】
項３７．  項２２記載のプライマーと項２３記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５６】
項３８．  項２４記載のプライマーと項２５記載のプライマーとからなるPCRプライマ
ーセット。
【００５７】
項３９．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項２６〜３８記載のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に特定植物が存在しているか否かを検出する工程とを含む特定植物の検出方法。
【００５８】
項４０．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項２７又は３３記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にキウイフルーツが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
【００５９】
項４１．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項２８又は３４記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にくるみが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定植物の検出方法。
【００６０】
項４２．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項２９又は３５記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にりんごが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定植物の検出方法。
【００６１】
項４３．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項３０又は３６記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にやまいもが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定植物の検出方法。
【００６２】
項４４．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項３１又は３７記載
のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にバナナが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定植物の検出方法。
【００６３】
項４５．  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項３２又は３８記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に大豆が存在しているか否かを検出する工程とを含む特定植物の検出方法。
【００６４】
項４６．  項２６〜３８のいずれかに記載のプライマーセットの１セット以上を含むキット。
【発明の効果】
【００６５】
本発明によれば、PCR等を用いた核酸分析による、精度及び検出感度の高い特定植物（
キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、大豆）由来DNAの検出を可能とし
、被験食品原料や被験食品中に、上記特定植物が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。また、食物アレルギーの未然防止、アレルギー症状が生じた際の原因物質の調査等にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明のPCRプライマーセットを用いたPCRにおけるDNAの検出感度を示す図である。
【図２】本発明のPCRプライマーセットを用いたPCRによって、食品中の特定植物の検出を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
以下、本発明を詳細に説明する。
特定植物検出用PCRプライマーセット
本発明の特定植物検出用PCRプライマーセットには、キウイフルーツに対して特徴的な
塩基配列を有するもの、くるみに対して特徴的な塩基配列を有するもの、りんごに対して特徴的な塩基配列を有するもの、やまいもに対して特徴的な塩基配列を有するもの、バナナに対して特徴的な塩基配列を有するもの、及び大豆に対して特徴的な塩基配列を有するものがある。
【００６８】
キウイフルーツ検出用PCRプライマーセット、くるみ検出用PCRプライマーセット、及びりんご検出用PCRプライマーセットは、以下のようにして設計した。即ち、各種植物のク
ロロプラストのmatＫ（maturase-encoding gene）遺伝子配列を既知のDNAデータベース（GenBank nucleotide sequence database）から取得し、りんごについては当該遺伝子配列を独自に解析することによって取得した。また、類縁の植物として、りんご、ナシ、イチゴ、オレンジ、ユズ等の当該遺伝子配列を独自に解析することによって取得した。さらに、それらの厖大な塩基配列の多重並列配列図を作成後、それらの塩基配列の類似性や特異性等の性状を詳細に比較検討することによって、キウイフルーツ、くるみ、及びりんごの各々に特異的な当該遺伝子配列領域を選出し、それらの領域からプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とする生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００６９】
また、やまいも検出用PCRプライマーセット、バナナ検出用PCRプライマーセット、及び大豆検出用PCRプライマーセットは、以下のようにして設計した。即ち、各種植物のミト
コンドリアのrbcL（large subunit gene for riburose-1,5-bisphosphate carboxylase）遺伝子配列を既知のDNAデータベースから取得した。また、バナナについては当該遺伝子
配列を独自に解析することによって取得した。さらに、類縁の植物として、りんご、ナシ、オレンジ、ユズ、ネギ等の当該遺伝子配列を独自に解析することによって取得した。それらの厖大な塩基配列の多重並列配列図を作成後、それらの塩基配列の類似性や特異性等の性状を詳細に比較検討することによって、やまいも、バナナ、及び大豆の各々に特異的な当該遺伝子配列領域を選出し、それらの領域からプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とする生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００７０】
本発明の特定植物検出用PCRプライマーセットを用いたPCR分析では、対象となる試料が加工品である場合も想定される。加工品を分析する場合、DNAが分解または、断片化して
いる可能性があるので、100〜500 bp 程度の短めのPCR増幅産物を形成するようなPCRプライマーが、高感度分析のために好ましい。それ故に、PCRプライマーの設計の際には、PCR増幅産物の長さが500 bp以下となるように工夫して設計した。また、これらのPCRプライ
マーセットのPCR反応条件を同一条件にすることは、実際の分析における、PCR反応回数の低減化に寄与する。それ故に、PCR反応において、その反応条件を最も左右するPCRプライマーのアニーリング温度とアニーリング時間が同一となるように、具体的には64℃で10秒間のアニーリング条件となるように工夫して、PCRプライマーを設計した。さらに、各々
のPCRプライマーセットを設計する際には、センスプライマーとアンチセンスプライマー
のハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するように工夫を施した。
【００７１】
従って、本発明の特定植物検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法、及びそれによる増幅産物を確認する核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれるキウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、及び大豆由来DNAを高感度かつ特異的に検出すること
ができる。
【００７２】
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。
【００７３】
本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。Sはセンスプライマー
を表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。
配列番号１（キウイフルーツS）：GTGGTGTCAACCAGGAAGGATTCAG
配列番号２（キウイフルーツAS）：CTGGCTTACTAACGGGATGTCCTAAG
配列番号３（くるみS）：GATCTATATTGTTGGAAAATGTAGC
配列番号４（くるみAS）：GGTTAGAATCATTAGTGGAAATCAG
配列番号５（りんごS）：GTAATCCACGATTATTCTTGC
配列番号６（りんごAS）：ACGAAGACTTCTTCTACAGGATC
配列番号７（やまいもS）：TTTCAAAGACCTACGAGCC
配列番号８（やまいもAS）：GCATCTCAATAGGGGACGG
配列番号９（バナナS）：TCGTCACCTATTGGGATGC
配列番号１０（バナナAS）：GCTTTAATAAGTGCTTCGGTG
配列番号１１（大豆S）：TTCCGAGTAACTCCTCAACCA
配列番号１２（大豆AS）：CCAGCAACAGGTTCAAGGC
また、上記の各プライマーは、その5'末端側には任意の配列が付加されて全体として最大３０塩基のプライマーであってもよい。この３０塩基のＤＮＡからなるプライマーとしては、例えば、以下の塩基配列のものを挙げることができる。（Ｓはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。また、下記配列番号１３〜２０の小文字の塩基記号は、配列番号1〜１２のプライマーにおいて、それぞれ３０塩基のプライマーにな
るように付加された塩基を表す。）
配列番号１３（キウイフルーツS）：tacatGTGGTGTCAACCAGGAAGGATTCAG
配列番号１４（キウイフルーツAS）：cagaCTGGCTTACTAACGGGATGTCCTAAG
配列番号１５（くるみS）：aaataGATCTATATTGTTGGAAAATGTAGC
配列番号１６（くるみAS）：attttGGTTAGAATCATTAGTGGAAATCAG
配列番号１７（りんごS）：tttcaaaaaGTAATCCACGATTATTCTTGC
配列番号１８（りんごAS）：atcattaACGAAGACTTCTTCTACAGGATC
配列番号１９（やまいもS）：aatgtatttggTTTCAAAGACCTACGAGCC
配列番号２０（やまいもAS）：ggtttaatagtGCATCTCAATAGGGGACGG
配列番号２１（バナナS）：aacaagtatggTCGTCACCTATTGGGATGC
配列番号２２（バナナAS）：tcggcctgcGCTTTAATAAGTGCTTCGGTG
配列番号２３（大豆S）：ttggcagcaTTCCGAGTAACTCCTCAACCA
配列番号２４（大豆AS）：gattttcttccCCAGCAACAGGTTCAAGGC
本発明は、まず第1のプライマーとして、配列表の配列番号1における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。
次に、第2のプライマーとして、配列表の配列番号2における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。第1及び第2
のプライマーは、キウイフルーツ検出用に好適に使用できる。
【００７４】
これら第1のプライマーと第2のプライマーのセットは、PCRに供与されることにより、
双方ともキウイフルーツのクロロプラストのmatK遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来クロロプラストのmatK遺伝子を検出可能に増幅しないので、キウイフルーツDNA
を検出するのためのPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第1のプライマーをセンスプライマーとし、第2のプライマーをアンチセンスプライマーとしたプライマーセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
【００７５】
また、第1のプライマーの好ましい態様としては、配列表の配列番号1の塩基配列を3´
末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（1´）（最も好ましくは配列番号1の塩基配列のDNAからなるプライマー）、第2のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（2´
）（最も好ましくは配列番号2の塩基配列のDNAからなるプライマー）を提案する。これらのプライマーはキウイフルーツ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、30塩基からなる（1´）の具体例としては配列番号１３のプライマー、（2´）の具体例としては配列番号１４のプライマーを例示できる。
【００７６】
また、本発明は、第3のプライマーとして、配列表の配列番号3における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する
。次に、第4のプライマーとして、配列表の配列番号4における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。第3及び第4のプライマーは、くるみ検出用に好適に使用できる。
【００７７】
これら第3のプライマーと第4のプライマーのセットは、PCRに供与されることにより、
双方ともくるみのクロロプラストのmatK遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来クロロプラストのmatK遺伝子を検出可能に増幅しないので、くるみDNAを検出するのため
のPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第3のプライマーをセンスプライマーとし、第4のプライマーをアンチセンスプライマーとしたプライマーセットとするこ
とで、高感度に当該DNAを検出することができる。
【００７８】
また、第3のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号3の塩基配列を3´末
端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（3´）（最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー）第4のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（4´）（
最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー）を提案する。これらのプライマーはくるみ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれを
プライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、30塩基からなる（3´）の具
体例としては配列番号１５のプライマー、（4´）の具体例としては配列番号１６のプラ
イマーを例示できる。
【００７９】
また、本発明は、第5のプライマーとして、配列表の配列番号5における塩基番号7〜21
の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する
。次に、第6のプライマーとして、配列表の配列番号6における塩基番号9〜23の塩基配列
を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。第5及び第6のプライマーは、りんご検出用に好適に使用できる。
【００８０】
これら第5のプライマーと第6のプライマーのセットは、PCRに供与されることにより、
双方ともりんごのクロロプラストのmatK遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来クロロプラストのmatK遺伝子を検出可能に増幅しないので、りんごDNAを検出するのため
のPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第5のプライマーをセンスプライマーとし、第6のプライマーをアンチセンスプライマーとしたプライマーセットとするこ
とで、高感度に当該DNAを検出することができる。
【００８１】
また、第5のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号5の塩基配列を3´末
端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（5´）（最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー）、第６のプライマーの好ましい態様として、配列表
の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（6´
）（最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー）を提案する。これらのプライマーはりんご検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号5のプライマーと配列番
号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、30塩基からなる（5´）の具体例としては配列番号１７のプライマー、（6´）の具体例としては配列番号１８の
プライマーを例示できる。
【００８２】
また、本発明は、第7のプライマーとして、配列表の配列番号7における塩基番号5〜19
の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する
。次に、第8のプライマーとして、配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列
を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。第7及び第8のプライマーは、やまいも検出用に好適に使用できる。
【００８３】
これら第7のプライマーと第8のプライマーのセットは、PCRに供与されることにより、
双方ともやまいものクロロプラストのrbcL遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来クロロプラストのrbcL遺伝子を検出可能に増幅しないので、やまいもDNAを検出するの
ためのPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第7のプライマーをセンスプライマーとし、第8のプライマーをアンチセンスプライマーとしたプライマーセットとす
ることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
【００８４】
また、第7のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号7の塩基配列を3´末
端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（7´）（最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー）、第8のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（8´）
（最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー）を提案する。これらのプライマーはやまいも検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号7のプライマーと配列番
号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、30塩基からなる（7´）
の具体例としては配列番号１９のプライマー、（8´）の具体例としては配列番号２０の
プライマーを例示できる。
【００８５】
また、本発明は、第9のプライマーとして、配列表の配列番号9における塩基番号5〜19
の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する
。次に、第10のプライマーとして、配列表の配列番号10における塩基番号7〜21の塩基配
列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。第9及び第10のプライマーは、バナナ検出用に好適に使用できる。
【００８６】
これら第9のプライマーと第10のプライマーのセットは、PCRに供与されることにより、双方ともバナナのクロロプラストのrbcL遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来クロロプラストのrbcL遺伝子を検出可能に増幅しないので、やまいもDNAを検出するのた
めのPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第9のプライマーをセンスプライマーとし、第10のプライマーをアンチセンスプライマーとしたプライマーセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
【００８７】
また、第9のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号9の塩基配列を3´末
端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（9´）（最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー）、第10のプライマーの好ましい態様として、配列表
の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（10
´）（最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー）を提案する。こ
れらのプライマーはバナナ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号9のプライマーと配
列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、30塩基からなる（9´）の具体例としては配列番号２１のプライマー、（10´）の具体例としては配列番号２２のプライマーを例示できる。
【００８８】
また、本発明は、第11のプライマーとして、配列表の配列番号11における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。次に、第12のプライマーとして、配列表の配列番号12における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。第11及び第12のプライマーは、大豆検出用に好適に使用できる。
【００８９】
これら第11のプライマーと第12のプライマーのセットは、PCRに供与されることにより
、双方とも大豆のクロロプラストのrbcL遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来クロロプラストのrbcL遺伝子を検出可能に増幅しないので、大豆DNAを検出するのためのPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第11のプライマーをセンスプライマーとし、第12のプライマーをアンチセンスプライマーとしたプライマーセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
【００９０】
また、第11のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号11の塩基配列を3´
末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（11´）（最も好ましくは配列番号11の塩基配列のDNAからなるプライマー）、第12のプライマーの好ましい態様として、配
列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
（12´）（最も好ましくは配列番号12の塩基配列のDNAからなるプライマー）を提案する
。これらのプライマーは大豆検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号11のプライマーと配列番号12のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、30塩基からなる（11´）の具体例としては配列番号２３のプライマー、（12´）の具体例としては配列番号２４のプライマーを例示できる。
【００９１】
前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを15から30とするのは、PCR用プライマー
としての塩基配列の適切な長さが15〜30程度であること、また、3´末端側最短15個以上
の塩基配列を特定するのは、3´末端側15個程度がPCRの特異的な増幅反応において重要であって、5´末端側の塩基配列が若干異なっていたり、配列の長さが多少違っていたりし
ても、PCRの反応自体への悪影響が、たいていの場合、小さいためである。
【００９２】
なお、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するような工夫を施して、各々のプライマーを設計した。例えば、プライマーダイマーの形成を回避させるために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換をプライマーに施している。やまいも検出用プライマーのアンチセンスプライマーである配列番号8における塩基番号6の塩基は、本来やまいもの場合にはCであるが、プライマー自身によるプライマーダイマーの形成を回避させるために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換として、Cの代わりにTを採用している。同様に、配列番号9における塩基番号6の塩基をCからAに、配列番号10における塩基番号8の塩基をAからTに置換している。また、センスプライマーとアンチセンスプライマーによるプライマーダイマーの形成を回避するために、配列番号7における塩基番号9の塩基は、本来やまいもの場合にはCであるところをAに置換している。このような置換を施しても実際に各目的植物を特異的に検出できることは予測し難いことである。
【００９３】
以上、本発明が提供するプライマーの塩基配列について網羅的に述べてきたが、理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、意図する性能（検出特異性や検出感度）を保有しえないプライマーが設計される場合がある。例えば、本発明の研究段階において、下記の配列番号２５と配列番号4とからなるくるみ検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、なぜか低い検出感度（100 pg DNA/反応）を示した。また、配列番号２６と配列番号２７とからなるりんご検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、リンゴに特有の塩基配列を利用したにもかかわらず、りんごDNAだけでなく、モモDNAやアーモンドDNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。さらに、配列番号２８と配列番号12とからなる大豆検出用PCRプライマーセットを用いたPCRにおいても、大豆に特有の塩基配列を利用したにもかかわらず、大豆DNAだけでなく、そばDNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば、意図する性能（検出特異性や検出感度）を取得できるとは限らず、必要な性能を保有しない場合も生じうるために、その設計の際には、論理的設計だけでなく、さらなる工夫とその性能評価試験が重要となる。本発明が提供するプライマーは、論理的設計の上に、さらなる工夫を施して設計したものであり、最終的には性能評価試験をクリアーしたものである。
配列番号２５（くるみS）：GATTTAGGCAACATGACTTCCTATC
配列番号２６（りんごS）：GATCCTGTAGAAGAAGTCTTCG
配列番号２７（りんごAS）：GAGACCACACATAAGAATGACAC
配列番号２８（大豆S）：GCATGAAGAAGCAGGTGCC
（Sはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。）
特定植物検出法
本発明の特定植物検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、上記説明した本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にキウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、又は、大豆が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
【００９４】
即ち、上記本発明の特定植物検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR
等で核酸分析することにより、試料中の特定植物を特異的に検出することが可能となる。
このとき、キウイフルーツを検出する場合には、キウイフルーツ検出用PCRプライマーセ
ットを使用し、同様にくるみ、りんご、やまいも、バナナ、及び大豆を検出する場合には、それぞれくるみ検出用PCRプライマーセット、りんご検出用PCRプライマーセット、やまいも検出用PCRプライマーセット、バナナ検出用PCRプライマーセット、及び大豆検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。
【００９５】
検出法（核酸分析）の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、PCR増幅産物をアガロース電気泳動で検出する方法、PCR増幅産物を蛍光検出する方法、PCR増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。
【００９６】
PCR増幅産物をアガロース電気泳動で検出する方法とは、検出目的に応じて選択した上
記本発明の特定植物検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配
列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無をアガロース電気泳動によって検出する方法
である。PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドや
サイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。
【００９７】
PCR増幅産物を蛍光検出する方法とは、リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行い、その
装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認する方法である。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合
したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることがで
きる。さらに、PCR後に、PCR増幅産物の融解曲線分析を行い、その分析からPCR増幅産物
の融解温度（Tm）値を導くことにより、PCR増幅産物が目的の増幅産物であるか否かを確
認できる。状況によっては、このTm値による判断が困難な場合も想定されるが、そのような場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。
【００９８】
具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増
幅産物のTm値は約83.9℃であり、PCR増幅産物のサイズは約242 bpである。融解曲線分析
において、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にキウイフルーツが存在していたことを示唆する。
【００９９】
また、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物
のTm値は約80.1℃であり、PCR増幅産物のサイズは約120 bpである。融解曲線分析におい
て、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にくるみが存在していたことを示唆する。
【０１００】
また、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物
のTm値は約81.8℃であり、PCR増幅産物のサイズは約172 bpである。融解曲線分析におい
て、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にりんごが存在していたことを示唆する。
【０１０１】
また、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物
のTm値は約87.2℃であり、PCR増幅産物のサイズは約139 bpである。融解曲線分析におい
て、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にやまいもが存在していたことを示唆する。
【０１０２】
また、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のTm値は約84.8℃であり、PCR増幅産物のサイズは約186 bpである。融解曲線分析におい
て、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にバナナが存在していたことを示唆する。
【０１０３】
また、配列番号11記載のプライマーと配列番号12記載のプライマーを用いたPCR増幅産
物のTm値は約88.7℃であり、PCR増幅産物のサイズは約158 bpである。融解曲線分析にお
いて、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に大豆が存在していたことを示唆する。
【０１０４】
PCR増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、PCR
増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブを反応液に添加し、該プローブがPCR増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生
じる蛍光量をリアルタイムPCR装置で自動的に検出することによって、PCR増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。この他にも、PCR増幅産物をプローブで検出する方法とし
て、Molecular Beacon法、CycleavePCR法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げら
れる。これらの方法で使用するPCRプライマーは、本発明の特定植物検出用PCRプライマーセットの何れかを使用すればよく、各々のPCRプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。
【０１０５】
本発明の特定植物の検出法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。
【０１０６】
例えば、被験試料としては、食品原料や加工食品等が挙げられる。食品原料としては、特定植物を取り扱う食品原料生産工場において、別途生産される特定植物を意図的に含まない食品原料が挙げられる。加工食品としては、菓子類、麺類、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、特定植物を取り扱う食品製造工場において、別途生産される特定植物を意図的に含まない加工食品が挙げられる。また、特定植物を含む加工食品を製造後、特定植物を含まない加工食品を製造する際には、特定植物残渣の除去を念頭においた食品製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性、並びに、食品製造設備の特定植物残渣の有無を確認する観点から、当該製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。
【０１０７】
また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のDNA抽出法（厚生労働省医薬局食
品保健部長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成14年11月06日、食発第1106001号）や市販の各種DNA抽出キット［例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（Amersham Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、DNAの回収が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。上記のDNA抽出法によって、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA（ミトコンドリアDNAやクロロプラストDNA）を、通常、試料から抽出することができる。
特定植物検出用キット
本発明は、また、特定植物検出キットを提供する。当該キットは、上記説明した本発明の特定植物検出用PCRプライマーセットの少なくとも１セットを含んで成るものであれば
、その構成は特に限定されない。
【０１０８】
具体的には、配列番号1における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号2における塩基番号12〜26の塩基配列を3´末端
側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号3における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAから
なるプライマーと、配列番号4における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号5における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号6における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30
塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号7における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30
塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号10における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；及び
配列番号11における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAから
なるプライマーと、配列番号12における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセットの１セット以上を含む特定植物検出キットが
挙げられる。
【０１０９】
そして、好ましいものとして、配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列
番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列
番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列
番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；
配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列
番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット；及び
配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセットの1
セット以上を含む特定植物検出キットが挙げられる。
【０１１０】
その中でも、特に好ましいものとして、配列番号1の塩基配列からなるプライマーと、
配列番号2の塩基配列からなるプライマーとのセット；配列番号3の塩基配列からなるプライマーと、配列番号4の塩基配列からなるプライマーとのセット；配列番号5の塩基配列からなるプライマーと、配列番号6の塩基配列からなるプライマーとのセット；配列番号7の塩基配列からなるプライマーと、配列番号8の塩基配列からなるプライマーとのセット；
配列番号9の塩基配列からなるプライマーと、配列番号10の塩基配列からなるプライマー
とのセット；及び配列番号11の塩基配列からなるプライマーと、配列番号12の塩基配列からなるプライマーとのセットの1セット以上を含む特定植物検出キットが挙げられる。
【０１１１】
このキットには、上記の各々のプライマーセット、及び当該の各々のプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物を検出するためのプローブ等が含まれていてもよい。さらに、
このキットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、PCRプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、PCR反応用緩衝液、並び
に、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。
実施例
以下に、実施例を用いて、さらに、本発明を詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
実施例1
各種動物、植物、真菌及び、細菌由来DNAに対する特定植物用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
本発明の特定植物用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種生物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。
【０１１２】
ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ、アフリカツメガエル、及びチョウザメの精製DNAは、セ
マイン社（CeMines, LLC, USA）から購入したものを使用した。
【０１１３】
ゴマサバ、サケ（シロザケ）、スルメイカ、ミズダコ、ベニズワイガニ、及びブラックタイガーエビの精製DNAは、商店から購入した各々の試料の（筋）肉質部分を凍結後、マ
ルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant
and fungal DNA extraction kits（Amersham Biosciences Corp., USA）または、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）を用いて調製したものを使用した。
【０１１４】
クロゴキブリの精製DNAは、その脚の部分を70%エタノールで洗浄し、さらに、TBS緩衝
液［150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl（pH 7.6）］で洗浄後、マルチビーズショッカーで粉
砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kitsを用いて調
製したものを使用した。
【０１１５】
キウイフルーツ（グリーン種及びゴールド種）、サルナシ（ベビーキウイ）、マタタビ、チャ、クルミ(アメリカ産、中国産)、クリ、ヘーゼルナッツ、ブドウ、リンゴ（フジ、ジョナゴールド、陸奥、王林及び、紅玉）、ナシ（幸水、ラフランス）、ヤマイモ（長芋、山の芋、及び大和芋）、バナナ（フィリピン産、モンキーバナナ、及びモラードバナナ）、ダイズ（黄色系統、黒色系統、及び緑色系統）、キントキマメ、アズキ、インゲンマメ、ジャガイモ、キャベツ、オレンジ（チリ産、オーストラリア産）、ミカンならびに、ネギは、商店から購入し、モモ（清水白桃、白鳳）、アンズ、アーモンド、ラズベリー、イチゴ、サトイモ、ユズ、スダチ、及びイネは国内栽培農家から入手した。これらの精製DNAは、各々の試料の一部（種子、果皮部、葉部、あるいは塊茎部）を70%エタノールで洗浄し、さらに、TE緩衝液［10 mM Tris-HCL(pH 8.0), 0.1 mM EDTA］で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、 DNeasy plant Mini kits（Qiagen GmbH, Germany）または、DNA Extraction IsoplantII kitを用いて調製したものを使用した。
【０１１６】
ソバの精製DNAは、商店から購入したそば粉をマルチビーズショッカーで、さらに粉砕
した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kitsを用いて調製
したものを使用した。
【０１１７】
コムギ及びトウモロコシの精製DNAは、バイオチェイン・インスティテュート社（BioChain Institute, Inc., USA）から購入したものを使用した。
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger IFO 9642）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae IFO 0282）、大腸菌（Escherichia coli JCM 1649T）、
及びバチルス・セレウス菌（Bacillus cereus DSM 4312）の精製DNAは、各々の菌株を適
切な培地で培養後、その培養液からPuregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit（Gentra Systems Inc., USA）を用いて調製したものを使用した。
なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。
【０１１８】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、及び12に記載の各々のPCRプライマーは、オペロン・バイオテクノジー社（Operon Biotechnologies GmbH, Germany）で合成されたものを、以下のPCRで使用した。
【０１１９】
上述したように準備した各種動物、植物、真菌、及び細菌DNA量を測定後、滅菌水を用
いて、動物、植物、及び真菌DNAの濃度を1 ng/μLに、細菌DNAの濃度を50 pg/μLに調製
した。調製した1 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のEx Taq
キットのR-PCRバージョン（Takara Bio Inc., Japan）を用いて調製した。このキットは、10X R-PCR buffer（Mg2+ free）、250 mM MgCl2 solution, 10 mM dNTP mixture、及び5 unit/μL Taq DNA polymerase（ホットスタートタイプ）を含む。反応液は、R-PCR bufferをベースとし、0.005% SYBR Green I（FMC Bioproducts, USA）、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマー、200 μM dNTP mixture（各々200 μMのdATP、dTTP、dCTP、及びdGTP）、0.05 unit/μL Taq DNA polymerase、及び2.5 mM MgCl2（くるみ及び大豆検出プライマーの場合）、または、2.0 mM MgCl2、（キウイフルーツ、りんご、やまいも、及びバナナ検出プライマーの場合）を含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler（Roche Diagnostics GmbH, Germany）で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で
保温、次に20℃/秒の速度で64℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、20秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回
実施した。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終
ステップに記録した。増幅サイクル終了後、メルティングカーブは、20℃/秒の速度で95
℃まで昇温後、次に20℃/秒の速度で60℃まで降温し、10秒間同温度で保温後、さらに0.2℃/秒の速度で97℃に至るまでのゆるやかな昇温中に、0.2秒毎の蛍光強度を記録することによって得た。同PCR装置のソフトウェアによってメルティングカーブから得られたPCR増幅産物のTm値は、PCRによる特異的な増幅産物の有無を推定するために使用した。さらに、1.6%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の2 μL）を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、UV照射下において増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとして100bp DNA Ladder（New England BioLabs Inc., USA）を使用した。これらのPCRの結果を表1に記載した。
表中の＋（プラス）は電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−（マイナス）は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。
【０１２０】
キウイフルーツ検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、キウイフルーツ（グリーン種、ゴールド種）DNA、サルナシ（ベビーキ
ウイ）DNA、及びマタタビDNAを使用した場合のみ242 bp前後の増幅産物が確認され（表1
）、これらの増幅産物のTm値は、約83.9℃であった。他の植物を含むその他の生物種DNA
を使用した場合には、増幅産物は見られなかった（表1）。マタタビ属キウイフルーツ（Actinidiadeliciosa、Actinidia chinensis）と形態的にも酷似するマタタビ属のサルナシ（ベビーキウイ）（Actinidia arguta）は、キウイフルーツの主要なアレルゲンとして知られるアクチニジンをキウイフルーツより多く含んでいることが知られている（山中美穂、大田忠親、福田哲生、西山一朗; マタタビ属果実における果汁中アクチニジン濃度およびプロテアーゼ活性の品種間差異; 日本食品科学工学会誌, 51: 491-494, 2004）。当該PCRプライマーを用いたPCRは、マタタビ属のキウイフルーツの他に、サルナシ及びマタタビを検出した。なお、既知及び独自に解析した各種生物のクロロプラストのmatK遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツDNA、サルナシ（ベビーキウイ）DNA、シマサルナシDNA、及びマタタビDNAを検出できるが、近縁種である同科Clematoclethra属の藤山柳DNA、及び他の植物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
【０１２１】
また、くるみ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）は、くるみ（アメリカ産、中国産）DNAを使用した場合のみ120 bp前後の増幅産物が確認され（表1）、これらの増幅産物のTm値は、約80.1℃であった。他のナッツ類や植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には増幅産物は見られなかった（表1）。なお、既知及び独自に解析した各種生物のクロロプラストのmatK遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、ブナ目クルミ科クルミ属のくるみDNAの他、同目同科同属のオニグルミDNA、ペルシャグルミDNA、及び同目同科プテロカリア属のサワクルミDNAを検出できるが、近縁種である同目同科ぺカン属のヒッコリーDNA、同目カバノキ科ハシバミ属のへーゼルナッツDNA、及び同目ブナ科クリ属のクリDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
【０１２２】
また、りんご検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、りんご（フジ、ジョナゴールド、陸奥、王林、及び紅玉）DNAを使用し
た場合のみ172 bp前後の増幅産物が確認され（表1）、この増幅産物のTm値は、約81.8℃
であった。近縁種であるナシ（幸水、ラフランス）DNAやモモ（清水白桃、白鳳）DNA、及び他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には増幅産物は見られなかった（表1）。なお、既知及び独自に解析した各種生物のクロロプラストのmatK遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、バラ科ナシ亜科リンゴ属のりんご（フジ、ジョナゴールド、陸奥、王林、及び紅玉）DNAを検出できるが、近縁種である同科同亜科ナシ属のナシDNA、ナシ（ラフランス）DNA、同科同亜科サンザシ属のサンザシDNA、同科サクラ亜科サクラ属のモモDNA、アーモンドDNA、アンズDNA、チョークチェリーDNA、同科バラ亜科バラ属のバラDNA、ハマナスDNA、同科バラ亜科キイチゴ属のラズベリー、クラウドベリー、ブラックベリー、同科バラ亜科イチゴ属のイチゴDNA、及び他の植物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
【０１２３】
また、やまいも検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、やまいも（長芋、山の芋、大和芋）を使用した場合のみ139 bp前後の増幅産物が確認され（表1）、これらの増幅産物のTm値は、約87.2℃であった。他の芋類
や植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には増幅産物は見られなかった（表1）。なお、既知及び独自に解析した各種生物のクロロプラストのrbcL遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、ヤマ
ノイモ科ヤマノイモ属のやまいも（山芋、長芋、山の芋、及び大和芋）DNA、を検出でき
るが、近縁種である同科タシロイモ属のタシロイモDNAや、他の植物を含むその他の生物
種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
【０１２４】
また、バナナ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）
を使用した場合は、バナナ（フィリピン産、モンキーバナナ、モラードバナナ）DNAを使
用した場合のみ186 bp前後の増幅産物が確認され（表1）、これらの増幅産物のTm値は、
約84.8℃であった。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、増幅産物は
見られなかった（表1）。なお、既知及び独自に解析した各種生物のクロロプラストのrbcL遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、ショウガ目バショウ科バショウ属のバナナを検出できるが、近縁種である同科エンセテ属のエンセテDNA、同科ムセラ属のムセラDNA、同目ショウガ科のショウガDNA、及び他の植物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
【０１２５】
さらに、大豆検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、大豆（黄色系統、黒色系統、緑色系統）DNAを使用した場合のみ158 bp前後の増幅産物が確認され（表1）、これらの増幅産物のTm値は、約88.7℃であった。他の豆類等の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった（表1）。なお、既知及び独自に解析した各種生物のクロロプラストのrbcL遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、マメ科ダイズ属の大豆を検出できるが、近縁種である同科インゲンマメ属のインゲンマメDNA、アズキDNA、キントキマメDNA、同科クズ属のクズDNA、同科ラッカセイ属の落花生DNA、同科ソラマメ属のソラマメDNA、エンドウマメDNA、及び他の植物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
【０１２６】
【表１】
0004937304.tif 000002
【０１２７】
実施例2
特定植物用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
実施例1で使用した特定植物用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるた
めに、下記のような実験を実施した。
実施例1で調製したキウイフルーツ（グリーン種）、くるみ（アメリカ産）、りんご（フ
ジ）、やまいも（長芋）、バナナ（フィリピン産）、及び大豆（黄色系統）の各DNAを滅
菌水で希釈し、1 pg/μL、10 pg/μL、100 pg/μL、1000 pg/μLのDNA溶液の希釈系列を
作製し、これらの希釈した被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCR
に供した。PCR反応後、実施例1に記載したようにして、PCR増幅産物のTm値を求め、さら
に、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
図1に示すように、キウイフルーツ検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプ
ライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、くるみ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度
は、10 pg DNA/分析であり、りんご検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、やまいも検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感
度は、1 pg DNA/分析であり、バナナ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10のPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、大豆検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 pg DNA/分析であった。
実施例3
特定植物用PCRプライマーセットを用いたPCRによる特定動植物含有食品中の特定植物由来DNAの検出
キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、あるいは大豆を原料として含有する市販食品等に対する本発明の特定植物用PCRプライマーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。
【０１２８】
キウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナ、あるいは大豆を原料として含有することを明記されている市販食品（表2）を準備し、各々の1〜10 gをマルチビーズショッカーで粉砕した。破砕物の0.1〜1 gから各々のDNAをNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、またはDNeasy plant Mini kits（Qiagen GmbH, Germany）を用いて抽出した。抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。抽出した食品試料DNA量を測定後、滅菌水を用いて、食品試料DNAの濃度を10 ng/μLに調製した。これらの調製DNA液の1 μLを、実施例1で使用した特定植物用PCRプライマーセットを用い、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、実施例2に記載したようにして、PCR増幅産物のTm値を求め、さらに、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。これらのPCRの結果を表2に記載した。表中の＋（プラス）は、アガロース電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−（マイナス）は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。また、これらのPCRのアガロース電気泳動に関する結果を図2（A、B、C、D、E、及びF）に示した。さらに、食品試料DNAから増幅されたPCR増幅産物を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社）を用いて、両方向からダイレクトシーケンス後、Applied Biosystems 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）によって塩基配列を分析した。分析した塩基配列データをGenBank nucleotide sequence database（BLAST search）もしくは、発明者らが保有するDNAデータベースと比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、PCR増幅産物由来DNAの生物種を帰属・同定した。
【０１２９】
その結果、キウイフルーツ検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、キウイフルーツ含有食品である、キウイフルーツヨーグルト（ダノン）由来DNAにおいてのみ、242 bp前後の増幅産物が確認され［表2、図2（A）］、この増幅産物のTm値は、約84.0℃であった。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった［表2、図2（A）］。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、キウイフルーツヨーグルト（ダノン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、キウイフルーツのクロロプラストのmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、キウイフルーツ非含有食品試料からキウイフルーツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、キウイフルーツ含有食品試料からキウイフルーツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１３０】
また、くるみ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、くるみ含有食品である、ミックスナッツ（イオン）及びクルミパン（米麦館タマヤ）由来DNAにおいてのみ、120 bp前後の増幅産物が確認され［表2、図2（B）］）、これらの増幅産物のTm値は、約79.9℃であった。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった［表2、図2（B）］。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ミックスナッツ（イオン）及びクルミパン（米麦館タマヤ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、何れもくるみのクロロプラストのmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、くるみ非含有食品試料からくるみ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、くるみ含有食品試料からくるみ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１３１】
また、りんご検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、りんご含有食品である、ドライフルーツ＆ナッツグラノーラ（イオン）及び果物のチップス（イオン）由来DNAにおいてのみ、172 bp前後の増幅産物が確認され［
表2、図2（C）］、これらの増幅産物のTm値は、約82.2℃であった。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった［表2、図2（C）］。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ドライフルーツ＆ナッツグラノーラ（イオン）及び果物のチップス（イオン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、何れもりんごのクロロプラストのmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、りんご非含有食品試料からりんご由来DNAやその他のDNAを検出しないが、りんご含有食品試料からりんご由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１３２】
また、やまいも検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、やまいも含有食品である、チキンラーメン（登録商標）（日清食品）、どん兵衛（登録商標）きつねうどんの麺部位（日清食品）、及びお好み焼き粉（嵯峨野匠庵由来）DNAにおいてのみ、139 bp前後の増幅産物が確認され［表2、図2（D）］、これらの増幅産物のTm値は、約86.3℃であった。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった［表2、図2（D）］。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、チキンラーメン（登録商標）（日清食品）、どん兵衛（登録商標）きつねうどんの麺部位（日清食品）、及びお好み焼き粉（嵯峨野匠庵由来）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、やまいものクロロプラストのrbcL遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、やまいも非含有食品試料からやまいも由来DNAやその他のDNAを検出しないが、やまいも含有食品試料からやまいも由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１３３】
さらに、バナナ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、バナナ含有食品である、ドライフルーツ＆ナッツグラノーラ（イオン）、果物のチップス（イオン）、ポッキー（登録商標）バナナ（グリコ）、及びポポイスバナナチップス（キタノ）由来DNAにおいてのみ、186 bp前後の増幅産物が確認され［表2、図2（E）］、これらの増幅産物のTm値は、約85.3℃であった。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった［表2、図2（E）］。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ドライフルーツ＆ナッツグラノーラ（イオン）、果物のチップス（イオン）、ポッキー（登録商標）バナナ（グリコ）、及びポポイスバナナチップス（キタノ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、バナナのクロロプラストのrbcL遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、バナナ非含有食品試料からバナナ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、バナナ含有食品試料からバナナ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１３４】
さらに、大豆検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、大豆含有食品である、どん兵衛（登録商標）きつねうどんの油揚げ部位（日清食品）及び日清麺の達人みその添付スープ（日清食品）由来DNAにおいてのみ、158 bp前後の増幅産物が確認され［表2、図2（F）］、これらの増幅産物のTm値は、約88.5℃であった。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった［表2、図2（F）］。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、どん兵衛（登録商標）きつねうどんの油揚げ部位（日清食品）及び日清麺の達人みその添付スープ（日清食品）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、大豆のクロロプラストのrbcL遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、大豆非含有食品試料から大豆由来DNAやその他のDNAを検出しないが、大豆含有食品試料から大豆由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０１３５】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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