(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式を持つ一つもしくは複数の化合物または薬学的に許容されるそれらの塩の有効量を含む、被検者の感染症、自己免疫疾患もしくはアレルギー症状を緩和または予防するための薬学的組成物であって、一つまたは複数の化合物または薬学的に許容されるそれらの塩が外因性抗原の非存在下で投与されるように用いられる、薬学的組成物：
【化７】
0005004261.tif 000012
式中、
Ｘが、−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択されるメンバーであり、
Ｒ１及びＲ２が、（Ｃ２−Ｃ２４）アシルからなる群より独立して選択されるそれぞれのメンバーであり、
Ｒ３が、−Ｈ及び−ＰＯ３Ｒ１１Ｒ１２からなる群より選択されるメンバーであって、式中Ｒ１１及びＲ１２が−Ｈ及び（Ｃ１−Ｃ４）アルキルからなる群より独立して選択されるそれぞれのメンバーであり、
Ｒ４が、−Ｈ、−ＣＨ３及び−ＰＯ３Ｒ１３Ｒ１４からなる群より選択されるメンバーであって、式中Ｒ１３及びＲ１４が−Ｈ及び（Ｃ１−Ｃ４）アルキルからなる群より独立して選択されるそれぞれのメンバーであり、並びに
Ｙが、
【化８】
0005004261.tif 000013
であり
式中、下付き文字であるｎ、ｍ、ｐ及びｑがそれぞれ独立して０から６の整数であり、
Ｒ５が、（Ｃ２−Ｃ２４）アシルであり、
Ｒ６及びＲ７が、Ｈ及びＣＨ３からなる群より独立して選択されるメンバーであり、
Ｒ８及びＲ９が、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＯＰＯ３Ｈ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＮＲ１５Ｒ１６、−ＳＲ１５、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｒ１５、−ＣＯＮＲ１５Ｒ１６、−ＰＯ３Ｒ１５Ｒ１６、−ＯＰＯ３Ｒ１５Ｒ１６、−ＳＯ３Ｒ１５及び−ＯＳＯ３Ｒ１５からなる群より独立して選択されるメンバーであって、ここでのＲ１５及びＲ１６がＨ及び（Ｃ１−Ｃ４）アルキルからなる群より独立して選択されるそれぞれのメンバーであり、
Ｚが−Ｏ−または−Ｓ−であり、
ただしＲ３が−ＰＯ３Ｒ１１Ｒ１２の場合、Ｒ４が−ＰＯ３Ｒ１３Ｒ１４以外である。
【請求項２】
細菌またはウイルスの感染症を緩和または予防するための、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
そのような調節を必要とする被検者においてサイトカインの産生を調節するための、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ５が（Ｃ１２−Ｃ２４）アシルからなる群よりそれぞれ独立して選択されるが、ただしＲ１、Ｒ２及びＲ５に存在する炭素原子の合計数が４４個から６０個である、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５】
炭素原子の合計数が４６個から５２個である、請求項４記載の薬学的組成物。
【請求項６】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ５が、（Ｃ７−Ｃ１１）アシルより独立して選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
Ｘ及びＺがともに−Ｏ−である、請求項１〜６のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項８】
化合物が、非経口、経口、静脈内、注入、鼻腔内、吸入、経皮及び経粘膜投与からなる群より選択される経路によって被検者に投与されるように用いられる、請求項１〜７のいずれか一記載の薬学的組成物。
【請求項９】
一つまたは複数の化合物を、薬学的に許容される塩の形態で含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
一つまたは複数の薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
水および一つまたは複数の表面活性剤をさらに含む、水性の組成物である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
一つまたは複数の表面活性剤が、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＭＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＰＭＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＰＭＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）からなる群より選択される、請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
一つまたは複数の化合物と表面活性剤のモル比が１０：１〜１：１０である、請求項１１記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
先天的な免疫系は、主に微生物によって合成される分子のクラスを同定する受容体を介して自己と非自己を識別する系により病原体に対する炎症性の応答を調整する。これらの種類は時に病原体関連分子パターン（PAMP）と言われることもあり、例えばリポポリサッカライド（LPS）、ペプチドグリカン類、リポテイコ酸、及び細菌性リポタンパク質（BLP）を含む。
【０００２】
LPSは、先天的な免疫系によって認識されるグラム陰性細菌由来の豊富な外部細胞壁成分である。LPSの化学構造はかなり以前より知られており、血清タンパク質及び/または細胞によってLPSを認識する分子の根本原理は最近になって解明され始めたにすぎない。一連の最近の報告書では、受容体のファミリーはトール（Toll）様受容体（TLR）と言われていて、LPS及び細菌の他の構成要素に対する強力な先天的な免疫応答に連結していた。TLRファミリーのすべてのメンバーは一個の膜貫通ドメインを持つ膜タンパク質である。細胞質のドメインは約200個のアミノ酸であり、IL-1受容体の細胞質ドメインと類似性を共有している。トールファミリーのタンパク質の細胞外ドメインはかなり大きく（約550アミノ酸〜980アミノ酸）、多数のリガンド結合性部位を含むと考えられる。
【０００３】
LPSに対する免疫応答におけるTLRの重要性は、少なくとも二つのトール様受容体、即ちTlr2及びTlr4について特に証明されている。例えば、胚腎細胞を用いたトランスフェクション研究は、ヒトTlr2がLPSに対する応答性を授与するのに充分であることを明らかにしていた（Yangら、Nature 395: 284-288 (1998）、Kirschningら、J. Exp Med. 11: 2091-97 (1998)）。LPSによる強い反応は、LPSと高い親和性で結合するLPS結合性タンパク質（LBP）及びCD14の両方を必要とすることが明らかであった。LPSのTlr2への直接的結合性はかなり低い親和性で見られたが、このことはインビボでLPSによるTlr2の結合性及び/または活性化を、補助タンパク質によって容易にできることを示唆している。
【０００４】
LPSに対する免疫応答でのTlr4の重要性は、lps突然変異マウス系統でポジショナルクローニングと関連させて証明した。マウスlps遺伝子の二つの突然変異対立遺伝子を同定したが、それはC3H/HeJ系統で生じた半優性対立遺伝子と、第2はC57BL/10ScN及びC57BL/10ScCr系統に存在する劣性の対立遺伝子である。lpsの突然変異対立遺伝子に対してホモ接合性のマウスはグラム陰性細菌による感染症にかかりやすく、LPS誘導性の敗血症ショックに耐性である。これらの系統由来のlps遺伝子座をクローニングしたところ、突然変異によって両方の例に含まれるマウスTlr4遺伝子が変化することが明らかになった（PortorakらのScience 282: 2085-2088 (1998）、QureshiらのJ. Exp. Med. 4: 615-625 (1999)）。Tlr4がLPSに対する反応性に必要とされることが、これらの報告書から結論づけられた。
【０００５】
LSPの生理学的に活性な内毒素性の副構造部分は、リピドA、即ちグラム陰性細菌の外膜にある完全な構造に係留するように機能するリン酸化された多価脂肪酸アシル化グルコサミン二糖類である。我々は以前に、リピドAの毒性作用がリピドAを選択的に化学的修飾することによって弱められ、モノホスホリルリピドA化合物（MPL（登録商標）免疫刺激剤；Corixa Corporation；Seattle、WA）を産生できることについて報告した。ワクチンアジュバント及び他の応用でMPL（登録商標）免疫刺激剤及び構造的に類似した化合物を作成及び使用する方法が記載されている（例えば、米国特許第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号、及び第4,912,094号、第4,987,237号、JohnsonらのJ.Med.Chem. 42: 4640-4649 (1999）、「ワクチン設計：サブユニット及びアジュバントのアプローチ（Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach）」におけるUlrich及びMyers、Powell及びNewman編、Plenum: New York、495-524、1995、これらの開示はその全体が参照文献として本明細書に組み入れられる）。特にこれら及び他の参照文献は、MPL（登録商標）免疫刺激剤及び関連する化合物が、ワクチン製剤においてタンパク質及び炭水化物の抗原とともに用いた場合に重要なアジュバント活性を持つことを示した。
【０００６】
さらに我々は、開示内容がその全体が参照文献として本明細書に組み入れられる、例えば米国特許出願第08/853,826号、第09/074,720号、第09/439,839号及び国際特許出願番号PCT/US98/09385において、アミンアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）とも言われるモノホスホリルリピドAの合成単糖類及び二糖類模倣体のクラスを以前に記述した。モノホスホリルリピドAのようにこれらの化合物は、ワクチン組成物において抗原とともに製剤化した場合に重要なアジュバントの性質を保持していること、またさらに、モノホスホリルリピドAと比較した場合に類似しているか改善されている毒性特性を持つことが示された。AGPによって得られた有意な利点は、合成手段によって商業的な規模でそれらが容易に製造可能なことである。
【０００７】
モノホスホリルリピドA及びAGPは、ワクチン製剤で抗原と組み合わせて使用することについて主に記載されているが、植物及び動物の例えば感染症、自己免疫性及びアレルギーのような疾患及び症状を予防的及び/または治療的に処置するために、抗原のないところで単独治療法としてそれらを使用することは以前に報告されてはいない。
【０００８】
モノホスホリルリピドA及びAGP化合物の活性の根底にある確かな機序について知識を深めた結果として、本発明は、本明細書に記載された新規の治療的機会を可能にする。
【０００９】
発明の概要
一局面における本発明は、以下の化学式を持つ化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩の有効量を投与することによって動物の疾患または症状を治療、緩和、または実質的に予防するための方法を提供する：
【化１０】
0005004261.tif 000002
式中、Xが-O-及び-NH-からなる群より選択されるメンバーであり、R1及びR2がそれぞれ独立して、飽和、不飽和及び分枝状のアシル基を含む(C2-C24)アシル基であり、R3が-H及び-PO3R11R12であり、式中R11及びR12がそれぞれ独立して-Hまたは(C1-C4)アルキルであり、R4が-H、-CH3及び-PO3R13R14であり、式中R13及びR14がそれぞれ独立して-H及び(C1-C4)アルキルから選択され、Yが以下の化学的から選択されるラジカルである：
【化１１】
0005004261.tif 000003
及び
【化１２】
0005004261.tif 000004
式中、下付き文字であるn、m、p及びqがそれぞれ独立して0から6の整数であり、R5が(C2-C24)アシル基（上記のように飽和、不飽和及び分枝したアシル基を含む）であり、R6及びR7がH及びCH3であり、R8及びR9がH、OH、(C1-C4)アルコキシ、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15及び-OSO3R15からなる群より独立して選択され、ここでのR15及びR16がそれぞれ独立してH及び(C1-C4)アルキルから選択され、R10がH、CH3、-PO3H2、ω-ホスホノオキシ(C2-C24)アルキル、及びω-カルボキシ(C1-C24)アルキルであり、Zが-O-または-S-であるが、ただしR3が-PO3R11R12の場合R4が-PO3R13R14以外である。
【００１０】
本発明のある例示的態様では、上記の方法は感染症、自己免疫疾患及びアレルギーを治療、緩和、または実質的に予防する際に用いられる。
【００１１】
別の局面における本発明は、外来性の抗原を含まない状態で製剤化及び/または投与される、適当な賦形剤に入れた一つまたは複数の化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００１２】
発明の例示的態様の説明
実例の予防的及び治療的適用
本発明は広くは、本明細書に記載された一つまたは複数の単糖類もしくは二糖類の化合物、または一つまたは複数のそのような化合物を含む薬学的組成物の有効量を投与することによってある種の疾患及び他の医学的状態に対処する予防的並びに治療的方法に関する。いくつかの単糖類及び二糖類の化合物は、ワクチン製剤で外因的に投与された抗原と組み合わせてアジュバントとして使用されること、また何らかの他の応用法で使用されることについて記載されているが、本発明は好ましくは単独治療的な応用方法で、即ち外因的に投与される抗原のない状態で、その化合物を用いる新規の治療法を提供する。
【００１３】
このように一局面における本発明は、真核生物の被検者、特に動物、好ましくはヒトにおける感染症を治療、緩和及び/または実質的に予防するための方法を提供する。微生物の攻撃に対する先天的な免疫応答でTLRを介するシグナル伝達の重要性が存在するため、そのような経路を選択的に、かつ最小の毒性で刺激する能力によって、広範囲の感染性の物質に対する予防的及び/または治療的処置のモダリティーを求める強力なアプローチが示される。
【００１４】
本明細書に記載された方法は、本質的に任意の種類の感染性病原体、即ち細菌、ウイルス、寄生体、及び真菌などに対して適用できる。例示的に述べると本発明は、シュードモナス（Pseudomonas）、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、プロテウス（Proteus）、セラチア（Seratia）、カンジダ（Candida）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、クラミジア（Chlamydia）、ミクロプラズマ（Mycoplasma）及び数多くの他のものからなる種による細菌感染症の予防的及び/または治療的な処置法に対して有用である。本発明に従って治療できる例示的なウイルスによる症候は、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸合胞体ウイルス（RSV）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、例えばB型及びC型肝炎ウイルス、及びそれ以外のウイルスによって引き起こされる症候が含まれる。例示的な真菌類には、例えばアスペルギルス（Aspergillus）、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）、クリプトコッサス・ネオフォルマンス（Crptococcus neoformans）、コクシジオイデス・イミタス（Coccidiodes immitus）、およびその他が含まれる。
【００１５】
一つの例示的な態様における本発明は、院内細菌感染症及びウイルス性感染症のような感染症を発症しているか、発症する危険性のある被検者、特に免疫無防備状態の患者を治療するための方法を提供する。毎年入院している4千万人のうち約2百万人が入院中に院内感染を発症し、これらの約1％、即ち約400,000人もの患者が院内肺炎を発症してそのうち7000人以上が死亡する。このことが院内肺炎を、病院によってかかった感染症における死の主たる原因にしている。このようにこの態様は、院内感染症の治療で有効な予防的アプローチに対する重要な必要性を満たしている。
【００１６】
関連する態様では本発明は、日和見感染症または抑制性即ち潜伏した感染症の再活性化のいずれかから起こる肺炎を発症しているか、発症する危険性のあるHIV陽性患者のような免疫無防備状態の患者に対して予防的処置法を提供する。1992年には、AIDS患者のニューモシスティスカリニ感染症の約20,000ケースが米国のみで報告された。さらにすべてのAIDS患者の60％〜70％が病気の間に何回かニューモシスティスカリニにかかっている。したがってこの態様における本発明は、危険にさらされている集団でこのために有効な予防的方法を提供する。
【００１７】
別の関連する態様での本発明の方法は、免疫無防備状態及び/または感染性疾患を発症する危険性のある他の患者集団、例えば嚢胞性繊維症、慢性の閉塞性肺疾患並びに他の免疫無防備性であるか及び/または病院に入っている患者などを治療するために用いられる。
【００１８】
本発明のこれら及び他の態様を支持して我々は、免疫無防備状態のマウスに本発明の実例の化合物を攻撃前に投与するとニューモシスティスカリニによる感染症に対して有意な予防的防御作用を提供することを証明した（実施例1参照）。
【００１９】
本発明の別の局面では本明細書に記載された単糖類及び二糖類の化合物は、副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎副鼻腔炎（rhinosinusitis）、喘息、アトピー性皮膚炎及び乾癬のようなアレルギー性疾患及び症状を治療、緩和または実質的に予防するための方法で用いられる。このアプローチは、IL-4の産生、またはIL-4の活性に対する過剰応答性に特徴のある型どおりのアレルギー型のサイトカインの応答と競合できる標的細胞からのサイトカインの生成を活性化できる単糖類及び二糖類の化合物の能力に少なくとも部分的に基づいている。本明細書に開示されたいくつかの単糖類及び二糖類の化合物を投与すると結果的に、抗原を処理し提示する細胞からだけでなく他の細胞からもIFN-γ及びIL-12の発現させることになり、そのためIL-4、5、6、10及び13のようなアレルギー反応と関連するサイトカインの下降調節を行う結果が得られる。
【００２０】
本発明の別の局面では単糖類及び二糖類の化合物は自己免疫疾患及び状態を治療するための方法でも用いられる。この態様で用いられる単糖類及び二糖類の化合物は、所定の状態と関連する自己免疫応答が緩和されたりまたは実質的に予防されたりされるように、一つまたは複数のトール様受容体、特にTlr2及び/またはTlr4に拮抗したり、それらを阻害したり、または他の場合には負に調節することができるものから通常は選択することができる。例示的に言うとこの態様によって示された方法は、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、慢性関節炎、多発性硬化症及び乾癬のような症候の治療で用いることが可能である。
【００２１】
理論に縛られるわけでないが、上記記載の予防的及び治療的な適用法の有効性は、トール様受容体活性の調節における単糖類及び二糖類の化合物の関与に少なくとも部分的に基づいていると考えられる。特にトール様受容体Tlr2、Tlr4、及び他の受容体は、非毒性のLPS誘導体及び本明細書に開示された模倣体によって特異的に活性化されたり、競合的に阻害されたり、または他の方法で影響を受けると考えられている。従って本発明の方法は、正常にそれらの経路を刺激する天然の細菌成分としばしば関連する毒性を生じさせることなく動物に存在する先天的の免疫応答経路を調節するための強力で選択的なアプローチを提供する。
【００２２】
例示的な単糖類及び二糖類の化合物
上記の予防的及び治療的な適用法で用いられる例示的な単糖類または二糖類は、以下の化学式を持つ化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩を含む：
【化１３】
0005004261.tif 000005
式中、Xが-O-及び-NH-であり、R1及びR2がそれぞれ独立して、飽和、不飽和及び分枝状のアシル基を含む(C2-C24)アシル基であり、R3が-Hまたは-PO3R11R12であり、ここでのR11及びR12がそれぞれ独立して-Hまたは(C1-C4)アルキルであり、R4が-H、-CH3または-PO3R13R14であり、ここでR13及びR14がそれぞれ独立して-H及び(C1-C4)アルキルから選択され、Yが以下の化学的から選択されるラジカルである：
【化１４】
0005004261.tif 000006
及び
【化１５】
0005004261.tif 000007
式中、下付き文字であるn、m、p及びqがそれぞれ独立して0から6の整数であり、R5が(C2-C24)アシル基（上記のように飽和、不飽和及び分枝したアシル基を含む）であり、R6及びR7がH及びCH3から独立して選択され、R8及びR9がH、OH、(C1-C4)アルコキシ、-PO3H2、-OPO3H2、-SO3H、-OSO3H、-NR15R16、-SR15、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R15、-CONR15R16、-PO3R15R16、-OPO3R15R16、-SO3R15及び-OSO3R15から独立して選択され、ここでのR15及びR16がそれぞれ独立してH及び(C1-C4)アルキルから選択され、R10がH、CH3、-PO3H2、ω-ホスホノオキシ(C2-C24)アルキル、及びω-カルボキシ(C1-C24)アルキルであり、Zが-O-または-S-であるが、ただしR3が-PO3R11R12の場合R4が-PO3R13R14以外である。
【００２３】
さらにR3が-PO3H2である場合、R4がH、R10がH、R1がn-テトラデカノイル、R2がn-オクタデカノイル及びR5がn-ヘキサデカノイル、その際のXが-O-以外である。
【００２４】
上記の一般式において、通常の脂肪酸アシル残基が結合する3'ステレオジェニック（stereogenic）中心の立体配置はRまたはSであるが、好ましくはRである。R6及びR7が結合する炭素原子の立体化学はRであってもよいし、またはSであってもよい。すべての立体異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びそれらの混合物が本発明の範囲に入ると考えられる。
【００２５】
好ましい態様の一群では、Yが以下の化学式を持っている。
【化１６】
0005004261.tif 000008
【００２６】
この群の態様でのアシル基R1、R2及びR5が、少なくとも二つの基が(C2-C6)アシルであるように選択されうる。R1、R2及びR5に含まれる炭素原子の総数が約6個から約22個、さらに好ましくは約12個から約18個であるような態様がより好ましい。他の好ましい態様ではXがO、ZがOである。下付き文字であるn、m、p及びqが好ましくは0から3の整数、より好ましくは0から2の整数である。残りの置換基のうちR6及びR7が好ましくはHである。本発明はさらに、好ましい置換基が一個の分子において結合している態様も企図している。
【００２７】
別の群の態様におけるR1、R2及びR5が、ただしそのR1、R2及びR5の炭素原子の総数が約44個から約60個であるような(C12-C20)アシルから選択される。より好ましくは、R1、R2及びR5に含まれる炭素原子の総数が約46個から約52個である。X及びZがどちらも-O-であるような態様がさらにより好ましい。
【００２８】
別の群の態様ではYが以下の化学式を持つ。
【化１７】
0005004261.tif 000009
【００２９】
上記に示された態様の好ましい群で用いた場合と同様に、この群でのアシル基R1、R2及びR5も、少なくとも二つの基が(C2-C6)アシルであるように選択されうる。R1、R2及びR5に含まれる炭素原子の総数が約6個から約22個、さらに好ましくは約12個から約18個であるような態様がより好ましい。他の好ましい態様ではXがOである。残りの置換基のうちR3が好ましくはホスホノ(-PO3H2)であり、R4が好ましくはHである。本発明はさらに、好ましい置換基のさまざまざ組み合わせが一個の分子において結合している態様も企図している。
【００３０】
別の群の態様におけるR1、R2及びR5が、ただしそのR1、R2及びR5の炭素原子の総数が約44個から約60個であるような(C12-C24)アシルから選択される。より好ましくは、R1、R2及びR5に含まれる炭素原子の総数が約46個から約52個である。R1、R2及びR3に対する特に好ましい脂肪酸群は、通常のC14、C16及びC18脂肪酸群である。Xが-O-であるような態様がさらにより好ましい。上記に示されたより短いアシル鎖の態様に類似してR3が好ましくはホスホノ(-PO3H2)であり、R4が好ましくはHである。
【００３１】
本発明の別の好ましい態様では、Yが化学式（Ib）のラジカル、XがO、R3がホスホノ、R4がH、R1、R2及びR5が、ただしそのR1、R2及びR5の炭素原子の総数が約46個から約52個であるような(C12-C24)アシルから選択される。さらにより好ましいのは、R2が(C16-C18)アシルであるような化合物である。
【００３２】
それ自体または別の置換基の一部分としての「アルキル」という用語は、別記しない限り直線状か分枝状の鎖、もしくは環状炭化水素ラジカル、またはそれらの組み合わせを意味しており、それは完全に飽和であってもよいし一飽和もしくは多飽和であってもよく、指定された数の炭素原子（即ちC1-C10は1個から10個までの炭素原子を意味する）を持つ二価及び多価ラジカルを含んでいてもよい。飽和の炭化水素ラジカルの例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの相同体及び異性体である、のような基が含まれる。不飽和アルキル基は、一つまたは複数の二重結合または三重結合を持つ基である。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-プロピニル及び3-プロピニル、3-ブチニル、並びにより高次の相同体及び異性体が挙げられる。一般にアルキル基は1個から24個の炭素原子を持つと考えられる。「低級アルキル」は即ちより短い鎖のアルキル基であり、一般に8個またはそれ以下の炭素原子を持っている。
【００３３】
「アルコキシ」「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」(またはチオアルコキシ）という用語は汎用の意味で用いられており、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りの部分に結合したアルキル基を指す。
【００３４】
「アシル」という用語は、水酸基を除去することによって有機酸から誘導される基を指す。アシル基の例としては、アセチル、プロピオニル、ドデカノイル、テトラデカノイル、イソブチリルなどが挙げられる。したがって「アシル」という用語には、-C(O)-アルキルとして別記して定義された基を含むような意味がある。
【００３５】
上記の用語（例えば「アルキル」「アシル」）はそれぞれ、指示されたラジカルの置換型及び非置換型の両方を含むことが意味される。それぞれの種類のラジカルについての好ましい置換基が以下に示されている。
【００３６】
アルキルラジカル及びアシルラジカルのための置換基は、0から（2m'+1）の範囲の数、この場合のm'はそのようなラジカルに含まれる炭素原子の総数であるが、この範囲の数で-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR'''R'''、-NR''C(O)2R'、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NHC(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-CN及び-NO2から選択されるさまざまな群の可能性がある。R'及びR''が同じ窒素原子に結合している場合、それらは5員環、6員環、または7員環を形成する窒素原子と結合していてもよい。例えば-NR'R''は、1-ピロリジニル及び4-モルホリニルを含むことを意味している。置換基についての上記の論考から当業者は、「アルキル」という用語がハロアルキル（例えば、-CF3及び-CH2CF3）などのような置換基を含むものも意味することを理解されると考えられる。
【００３７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載された化合物に見出される特定の置換基に依存して比較的毒性のない酸または塩基を用いて調製される活性な化合物の塩を含むことを意味している。本発明の化合物が相対的に酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩はそのような化合物の中性型を、そのままか適当な不活性溶媒にいれるかそのいずれかで充分量の望ましい塩基と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩または類似の塩が含まれる。本発明の化合物が相対的に塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩はそのような化合物の中性型を、そのままか適当な不活性溶媒にいれるかそのいずれかで充分量の望ましい酸と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素酸、リン酸、リン酸一水素酸、リン酸二水素酸、硫酸、硫酸一水素酸、ヨウ化水素酸、またはホスホン酸などのような無機酸から誘導された塩、並びに酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的毒性のない有機酸から誘導された塩が含まれる。アルギネートなどのようなアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S. M.らの「薬学的塩（Pharmaceutical Salts）」、Journal of Pharmaceutical Science、66、1-19、1977参照）。本発明のある特定の化合物は塩基性と酸性の両方の官能基を含んでいて、塩基付加塩または酸付加塩のいずれかにその化合物が変換することが可能である。
【００３８】
この化合物の中性型は、この塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法でペアレント化合物を単離することによって再形成できる。化合物のペアレント型は極性溶媒への溶解度のような何らかの物理的性質についてはさまざまな塩の形態とは異なるが、別の点ではこの塩は、化合物のペアレント型に本発明の目的では等価である。
【００３９】
塩の形態に加えて本発明は、プロドラッグ型である化合物を提供する。本明細書に記載された化合物のプロドラッグとは、本発明の化合物を提供する生理学的条件下で化学的変化を容易に行う化合物である。さらにプロドラッグは、エキソビボの環境で化学的または生化学的な方法により本発明の化合物に変換できる。例えばプロドラッグは、適当な酵素または化学的試薬とともに経皮用貼着剤容器に入れた場合に本発明の化合物にゆっくりと変換できる。
【００４０】
本発明のある種の化合物は、非溶媒和の形態で存在できるし、同様に水和物の形態を含む溶媒和の形態で存在することもできる。一般に溶媒和の形態は非溶媒和の形態と等価であり、それらは本発明の範囲に含まれることが意図されている。本発明のある種の化合物は多型結晶で存在していてもよいし、またはアモルファス型で存在していてもよい。一般にすべての物理型は本発明によって企画された使用法では等価であり、すべて本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００４１】
本発明のある種の化合物は不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を持っており、即ちラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体及び個々の異性体がすべて、本発明の範囲に包含されると意図されている。
【００４２】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する一つまたは複数の原子に、天然にない比率の原子同位体を含んでいてもよい。例えばこの化合物は、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素-125（125I）または炭素-14（14C）のような放射活性の同位体で放射線標識してもよい。本発明の化合物のすべての同位体の変化は、放射活性であろうとなかろうと、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００４３】
単糖類及び二糖類の化合物は任意の適当な手段によって調製できるが、その手段の多くは記載されている。例えば本発明で有用なある種の化合物は、同時係属出願である米国特許出願第08/853,826号、第09/439,839号（1999年11月12日に提出された）及び国際特許出願番号PCT/US98/09385に記載されており、それらの開示はその全体が参照文献として本明細書に組み入れられる。他の化合物は、米国特許第6,013,640号のRC-552(L34)について記載された方法と類似の方法で調製できる。さらに他の化合物は、ジョンソン（Johnson）らのJ. Med. Chem. 42: 4640-4649 (1999）、ジョンソン（Johnson）らのBioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2273-2278 (1999）、及び国際特許出願番号PCT/US98/50399に概略の記載された方法を用いて調製できる。さらに他の化合物は、例えば米国特許第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号、第4,912,094号、及び第4,987,237号に従って調製できる。一般に上記の参照文献記載の合成方法、及び当技術分野で別の方法でなじみの深い他の合成方法がこれらの化合物を調製するために広く適用できる。例えば異なるアシル基及び置換基を持つ化合物を生成する際には、本明細書に記載された包囲集中的な方法を別のアシル化剤を用いるように修飾してもよいし、または結合させた適当なアシル基を持つ、市販の材料を用いて開始してもよい。
【００４４】
例示的な薬学的組成物及びそれらの送達
別の態様における本発明は、細胞、組織、動物または植物に単独で、または一種もしくはそれ以上の他の治療法のモダリティーと組み合わせて投与するための薬学的に許容される担体/賦形剤に入れた本明細書に開示された一つまたは複数の単糖類及び二糖類の化合物を含む薬学的組成物に関する。好ましい態様では、薬学的組成物は外因性抗原のないところで製剤化され、即ち単一治療用の適用法で用いられる。多くのこのような態様では、本発明の薬学的組成物は本明細書に記載された単糖類化合物の一つまたは複数を含みうる。
【００４５】
薬学的組成物を製剤化する際に用いられる例示的な担体には、例えば水中油型または油中水型の乳濁剤、静脈内（IV）の使用に適した有機系の共溶媒を含有させるか含有させていない水性組成物、リポソームまたは表面活性剤含有小胞、ミクロスフェア、ミクロビーズ及びミクロソーム、粉末、錠剤、カプセル剤、坐剤、水性懸濁剤、エアロゾル、並びに当業者に明らかな他の担体が含まれる。
【００４６】
ある態様においては、薬学的組成物は、一種もしくはそれ以上の緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭化水素類（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、EDTAのようなキレート剤もしくはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤に受容者の血液の持つ等張性、低浸透性、またはわずかに高浸透性を与える溶質、懸濁化剤、濃縮剤及び/または保存剤を含むことができる。
【００４７】
ある適用法に対する水性の製剤は、特に有効量の一つまたは複数の表面活性剤を含む製剤が好ましい。例えば組成物は、少なくとも一つの適当な表面活性剤、例えばリン脂質表面活性剤を含むミセル分散剤の形態であってもよい。リン脂質の実例としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DPMG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）のようなジアシルホスファチジルグリセロール類と、ジミリストイルホスファチジルコリン（DPMC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、及びジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）のようなジアシルホスファチジルコリン類と、ジミリストイルホスファチジン酸（DPMA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、及びジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）のようなジアシルホスファチジン酸類と、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DPME）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）のようなジアシルホスファチジルエタノールアミン類とが挙げられる。一般に、水性製剤に含まれる表面活性剤：単糖類/二糖類のモル比は約10:1から約1:10、より一般的には約5:1から約1:5であるが、しかし如何なる有効量の表面活性剤を、関心対象の特異的な目的に最も適合するように水性製剤に入れて用いることができる。
【００４８】
本発明の化合物及び薬学的組成物は、本質的にどれかの投与経路、例えば注入、口内経路もしくは鼻腔内経路による吸入、直腸、膣内もしくは気管内への注入、経口摂取、または経皮もしくは経粘膜経路などのために製剤化できる。この方法では、本発明の方法及び組成物によって達成できる治療効果は例えば全身性、局所性、組織特異性などであり、本発明の所定の適用法の特異的な必要性に依存している。
【００４９】
例示的な製剤を調製して非経口投与、即ち腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内に投与できる。静脈内投与で使用するための担体の一例示的な例は、10％のUSPエタノール、40％のUSPポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール600、及びバランスUSPの注入用水（WFI）からなる混合液を含む。他の例示的担体は、10％のUSPエタノール及びUSP WFI、USP WFIに入れた0.01％〜0.1％のトリエチルアミン、またはUSP WFIに入れた0.01％〜0.2％のジパルミトイルジホスファチジルコリン、並びに1％〜10％のスクアレン即ち非経口の植物油を水に入れたエマルジョンを含む。薬学的に許容される非経口用の溶媒は一般に、活性成分を除去しないで0.22ミクロンフィルターを通して濾過できる溶液または分散液を提供できるように選択される。
【００５０】
皮下または筋肉内で使用するための担体の実例は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、WFIに入れた5％のデキストロース及び5％のデキストロースに入れた0.01％〜0.1％のトリエタノールアミンもしくはUSP WFIに入れた0.9％の塩化ナトリウム、または10％のUSPエタノールの1から2もしくは1から4の混合液、40％のプロピレングリコール及び5％のデキストロースもしくは0.9％の塩化ナトリウムのような許容されるバランス用等張性溶液、またはUSP WFIに入れた0.01％〜0.2％のジパルミトイルジホスファチジルコリン並びに1％から10％のスクアレン即ち非経口用の植物油を水に入れたエマルジョン含む。
【００５１】
粘膜表面から投与するための担体の例は、特定の経路、例えば口内、舌下、鼻腔内などに依存している。口内投与される場合の実例には、医薬品級のマンニトール、スターチ、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカライド、セルロース、炭酸マグネシウムなどが含まれ、好ましいのはマンニトールである。鼻腔内投与される場合の実例には、ポリエチレングリコール、リン脂質類、グリコール類及び糖脂質類、スクロース、並びに/またはメチルセルロース、ラクトースのようなバルク剤を用いてもよいし用いなくてもよいような粉末状懸濁剤、並びに塩化ベンザルコニウム、EDTAのような保存剤が含まれる。特定して例示的な態様ではリン脂質1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）が、約0.1mg/mlから3.0mg/mlの濃度で対照の発明の化合物を鼻腔内投与するために、約0.01％〜0.2％で等張性水性担体として用いられる。
【００５２】
吸入によって投与する場合の例示的な担体にはポリエチレングリコールまたはグリコール類、DPPC、メチルセルロース、粉末状分散剤、及び保存剤が含まれ、ポリエチレングリコールとDPPCが好ましい。多くの例においては、吸入によって投与する場合には単糖類または二糖類の化合物が噴霧される形態になっていると好ましいと思われる。例示的に言うと、単一使用型送達装置、ミストネブライザー、呼吸活性化粉末吸入装置、エアロゾル用量測定型吸入装置（MDI）または任意の他の当技術分野で入手できる数多くのネブライザー送達装置を使用することによる送達であることができる。さらにミストテントや、気管内チューブを通した直接投与も使用できる。気管内または鼻咽頭を経る送達方式はある適応症には有効であると考えられる。
【００５３】
当業者は、上記の説明が網羅的ではなく、例示的であることを認識すると思われる。実際に、多くの別の製剤化手段、並びに薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液が当業者には周知であり、さまざまな治療計画で本明細書に記載された特定の組成物を用いるための適切な投与法及び治療計画が開発されている。
【００５４】
この化合物は、本発明の所定の適用法に適した最良の特徴を持つ化合物を同定し、かつ選択するためにさまざまなアッセイ形式で評価できる。例えば動物モデルを、単糖類及び/または二糖類の化合物を投与した後、全身への循環にサイトカインが放出される特性を同定しかつ評価するために用いることができる。さらにインビトロとインビボでのさまざまなモデルが、関心対象の特異的免疫応答を刺激するのに最も適した化合物を同定する目的で、異なる抗原成分に対する免疫応答について一つまたはそれ以上の局面における変化を調べるために存在する。例えば化合物を、マクロファージ、樹状細胞またはランゲルハンス細胞のような標的細胞とインビトロで接触させることができ、巧みに生じたサイトカインを測定することができる。さらに遺伝子発現アレイは、関心対象の特定の単糖類または二糖類によって活性化もしくは阻害される特定の経路を同定するために使用できる。
【００５５】
必要に応じて、本明細書に開示された化合物は、抗菌性、抗ウイルス性及び抗真菌性化合物または治療法、種々のDNAに基づく治療法、RNAに基づく治療法、ポリペプチドに基づく治療法のような他の治療モダリティー、及び/または他の免疫作用物質と組み合わせて投与してもよいことが理解されると考えられる。実際に本質的に任意の他の成分が含まれていてもよく、その追加の成分が標的細胞または宿主の組織と接触しても有意な都合の悪い作用を生じないようになっている。したがってこの組成物は、実行されている本発明の特定の態様に対して必要とされたり望まれる場合には、さまざまな他の薬剤とともに送達することができる。
【００５６】
例示的には本発明の薬学的組成物は、一つまたは複数の治療用タンパク質、アンチセンスRNA、リボザイムなどをコードするDNAを含むか、またはそのようなDNAと組み合わせて用いられる。このDNAは、当業者に既知のさまざまな送達系、即ち核酸発現系、細菌及びウイルスの発現系といった送達系のうちのどれかに存在できる。数多くの遺伝子送達技術は、Rolland、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198、1998、及び本明細書に引用されている参照文献によって記載されている技術のように当技術分野で周知である。適切な核酸発現系は、患者において発現させるために必要なDNA配列（例えば適当なプロモーター及び終結シグナルなど）を含んでいる。好ましい態様においてDNAは、非病原性の（不完全な）複製競合ウイルスの使用が関与しているウイルス発現系（例えば、ワクチンまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入することができる。適当な系は、例えばフィッシャー-ホック（Fisher-Hoch）らのProc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321、1989、フレクナー（Flexner）らのAnn. N. Y. Acad. Sci. 569: 86-103、1989、フレクナー（Flexner）らのVaccine 8: 17-21、1990、米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、及び5,017,487号、国際公開公報第89/01973号、米国特許第4,777,127号、英国特許第2,200,651号、欧州特許第0,345,242号、国際公開公報第91/02805号、バークナー（Berkner）、Biotechniques 6:616-627、1988、ローゼンフェルド（Rosenfeld）らのScience 252: 431-434、1991、コルス（Kolls）らのProc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219、1994、カス-アイスラー（Kass-Eisler）らのProc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502、1993、グーツマン（Guzman）らのCirculation 88: 2838-2848、1993、及びグーツマン（Guzman）らのCir. Res. 73: 1202-1207、1993に開示されている。そのような発現系にDNAを組み入れるための技術は当業者に周知である。
【００５７】
DNAはまた、例えばウルマー（Ulmer）らのScience 259: 1745-1749、1993に記載されていて、コーエン（Cohen）、Science 259: 1691-1692、1993によって概説されているように「裸」であってもよい。裸のDNAの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生物崩壊性のビーズにそのDNAを被覆させることによって増加させることができる。本発明の薬学的組成物がポリヌクレオチドとタンパク質成分の両方を含んでいてもよいことが明らかであると思われる。
【００５８】
いずれかの、種々の追加の免疫刺激剤が、本発明の組成物に含まれうる。例えば、GM-CSF、インターフェロンまたはインターロイキンのようなサイトカインは、対象の免疫応答をさらに調節する。例えばある態様では、高レベルのTh1型のサイトカイン（例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2及びIL-12）の誘導をさらに高めるために追加の成分がこの組成物に含まれていてもよい。または、即ち別の場合には、高レベルのTh2型のサイトカイン（例えば、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10）がある種の治療的な応用法で望ましいことがある。これらのサイトカインのレベルは標準的なアッセイを用いて容易に評価できる。サイトカインのファミリーの総説については、モスマン（Mosmann）及びコッフマン（Coffman）のAnn. Rev. Immunol. 7: 145-173、1989を参照のこと。
【００５９】
Th1型のサイトカインの誘導で用いる例示的な組成物は例を挙げると、例えば国際公開公報第96/02555号、国際公開公報第99/33488号及び米国特許第6,008,200号と第5,856,462号に記載されているようにCpG含有オリゴヌクレオチド（この場合、CpGジヌクレオチドはメチル化されていない）の組み合わせを含む。免疫刺激性のDNA配列も、例えばサトウ（Sato）らのScience 273: 352、1996に開示されている。他の適当な免疫刺激剤には、QS21（Aquila Biopharmaceuticals Inc.、Framingham、MA）のようなサポニン、並びに関連するサポニン誘導体及びその模倣体が含まれる。
【００６０】
本発明と関連して用いることのできる他の例示的な免疫刺激剤には、モンタナイドISA 720（Montanide ISA 720） (Seppic、France）、SAF（Chiron、California、United States）、ISCOMS（CSL）、MF-59（Chiron）、SBASシリーズのアジュバント（例えば、SmithKline Beecham、Rixensart、Belgiumから入手できるSBAS-2またはSBAS-4）、及びエンハンジン（Enhanzyn）（商標）免疫刺激剤（Corixa、Hamilton、MT）が含まれる。ポリエチレンエーテル免疫刺激剤は国際公開公報第99/52549A1号に記載されている。
【００６１】
一般的な定義
本明細書で用いた場合の「有効量」とは、ビヒクル即ち陰性対照を超える反応を示す量である。上記記載のように、患者に投与すべき対象の発明の化合物の正確な投与量は、投与経路、薬学的組成物、及び患者に依存すると考えられる。
【００６２】
「薬学的に許容される」という用語は、ヒトに投与した場合にアレルギー性または同様の都合の悪い反応を生じない分子全体、及び組成物を指す。
【００６３】
本明細書で用いた場合の「担体」または「賦形剤」は、いくつか及びすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、皮膜剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性の吸収遅延化剤、緩衝液、担体溶液、懸濁剤、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び試薬の使用法は当技術分野で周知である。任意の便利な培地または試薬が活性成分と両立しない場合以外は、治療用組成物でそれを使用することが考察される。
【００６４】
実施例
実施例1
モノホスホリルリピドAの予防的投与によるニューモシスティスカリニ感染症に対する保護作用
最小2週間（2回の注入/週、0.2mg/注入）または末梢のCD4数が少なくとも約50％に減少するまで、マウスをL3T4抗CD4抗体を用いて前処理した。
【００６５】
1mg/mlの3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドAと108μg/mlの表面活性剤DPPCを水に入れて含有する水性の製剤を調製した。この製剤を小さなカニューレによって-24時間で気管内投与し、続いてこの研究の残りを一週間に二度行った。投与した濃度は表1において下記に示されている。百万個のニューモシスティスカリニを、0日目に気管内経由で接種した。二週間毎の治療を7週間続け、肺を取り出してから痕跡の塗末標本を作製した。スライドをギムザ及び銀を用いて染色し、以下のようにニューモシスティスカリニの存在について計数した。
スコア5  ＞100/1000×視野
4  10-100/視野
3  1-10/視野
2  1-10/10視野
1  1-10/50視野
0  0/50視野
【００６６】
これらの実験の結果が表1において下記にまとめられている。
【表１】
0005004261.tif 000010
【００６７】
この研究を繰り返し、以下の結果が得られた（表2）。
【表２】
0005004261.tif 000011
【００６８】
これらの結果は、モノホスホリルリピドAを肺送達すると、免疫無防備状態のマウスのニューモシスティスカリニによる感染症に対して非特異的な耐性が促進されることを証明している。モノホスホリルリピドAを吸入すると、局所的な（及び遠位の）内在性免疫応答を活性化させ、結果的に非特異的な保護作用を高めることになる。モノホスホリルリピドAは、食細胞の活性を増加させ、かつ免疫刺激性のサイトカインを放出させる抗原提示細胞の活性化を経て主としてこの保護作用を仲介した。肺から得られ、洗浄された細胞のFACS分析では活性化された好中球についてのマーカーが示されたが、大規模の炎症性反応（ARDS）に特徴のある白血球の流入については注目に値しなかった。CD11bまたはCD69について負の発現を示した脾臓細胞についての分析では、モノホスホリルリピドAの製剤及びこの適用法での効果が全身性ではなく、肺に限られていたことを示唆していた。
【００６９】
実施例2
致死的なインフルエンザ攻撃に対するモノホスホリルリピドAの予防的投与による予防作用
用量20μgのモノホスホリルリピドA（MPL）を、致死的なインフルエンザ攻撃よりも2日前またはその日のいずれかに、メスのBALB/cマウスの群に鼻腔内（i.n.）で投与した。すべてのマウスを、約2LD50の感染性インフルエンザA/HK/68を用い、鼻腔投与して攻撃した。インフルエンザ攻撃後21日目に死亡率をモニターした。これらの実験の結果が図1に示されている。これらのデータは、モノホスホリルリピドAの鼻腔内送達がマウスの致死的なインフルエンザ攻撃による感染症に対する非特異的な抵抗性を促進することを証明している。
【００７０】
実施例3
L-セリルアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）の鼻腔内への投与後の臨床的症状
一連のL-セリルアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物（AGP）は、そのそれぞれがその全体が参照文献として本明細書に組み入れられる2000年9月5日に発行された米国特許第6,113,918号、及び1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/439,839号記載のように調製した。
【００７１】
用量20μgのL-セリルAGP（RC-526、RC-554、RC-555、RC-537、RC-527、RC-538、RC-560、RC-512及びビヒクルのみ）を鼻腔内（i.n.）投与によってメスのBALB/cマウスの群に与えた。AGP投与後の最初の4日間、逆立った毛、弓なりになった姿勢及び苦しそうな息づかいを観察することを含む疾患の三つの主観的指標（即ち、疾患の指標）についてそのマウスをモニターした。これらの実験の結果が図2に示されている。これらのデータは、RC-537、RC-527、RC-538及びRC-560の鼻腔内投与では、所定の投与量20μgでマウスに幾分かの毒性が誘導されることを示していた。
【００７２】
実施例4
L-セリルアミンアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）の鼻腔内投与及びインフルエンザ攻撃の後の臨床的症状
用量20μgのL-セリルAGP（RC-526、RC-554、RC-555、RC-537、RC-527、RC-538、RC-560、RC-512及びビヒクルのみ）を、致死的なインフルエンザ攻撃の2日前またはその日に鼻腔内（i.n.）投与によってメスのBALB/cマウスの群に与えた。すべてのマウスを約2LD50の感染性のインフルエンザA/HK/68を用いて鼻腔内投与により攻撃した。疾患指標（逆立った毛、弓なりになった姿勢及び苦しそうな息づかい）を、インフルエンザ攻撃後の4日間〜19日間モニターした。体重低下と死亡率をインフルエンザ攻撃の後の21日間モニターした。これらの実験の結果が図3に示されている。
【００７３】
これらのデータは、インフルエンザ攻撃に対する実質的な保護作用を与えている際にAGP化合物、RC-538、RC-560及びRC-512の有効性を示していた。
【００７４】
実施例5
ヒト全血培養物及びマウス脾培養物を用いたRC552及びMPLの比較
本実施例は、ヒトの全血培養物とマウスの脾臓細胞培養物を用いて合成のリピドA化合物であるRC552によるサイトカインの誘導を、修飾された天然物質であるモノホスホリルリピドA（MPL）と比較して開示している。
【００７５】
リピドA化合物は、0.2％のトリエタノールアミンを入れた洗浄のための滅菌水中で再構成することによって試験し、56℃でインキュベートしてから2×10分間、37℃で超音波処理した。LPS O55B5（Sigma-Aldrich; St Louis、MO）をPBSに希釈した。
【００７６】
化合物を450μlのヒト全血に添加し、攪拌しつつ5時間から24時間インキュベートした。三人のドナーを選択した（図4〜図6、それぞれドナーA〜C）。上清を遠心分離によって収集し、等容量のPBSを用いて1/2に希釈した（この希釈はサイトカインの算出の際、希釈率を企図しなかった）。サイトカインの合成は、必要とされる容量の充分な強度の上清、即ち10倍ほどに希釈された上清を用いてELISA（R&D Systems; Minneapolis、MN）によって測定した。
【００７７】
BALB/c、DBA/2及びC3H/HEJマウスは、ジャクソン研究所（The Jackson Laboratory)（Bar Harbor、ME）より購入した。脾臓は午後2時と午後3時の間にマウスから採取し、別々の単独の細胞懸濁液をそれぞれのマウス系統について得た。赤血球細胞をトリス-塩化アンモニウム溶液（Sigma-Aldrich）を用いて溶菌し、細胞を洗浄したからトリパンブルー（Trypan Blue）（Sigma-Aldrich）排除を用いて計数した。百万個の脾臓細胞を、1.0mLの培地を入れた1つのウェルで培養した。脾臓培養用培地（SCM）はマウスの脾臓細胞を5日間またはそれ以上長く培養するために設計されたものであり、それはRPMI 1640（Sigma-Aldrich）に、5％の胎児ウシ血清（HyClone; Logan、UT）、100ug/mLのゲンタマイシン（Sigma-Aldrich）、250ng/mLのアンホテリシン（InVitrogen Life Technologies; Carlsbad、California）、1×ITS（500ng/mLのウシインシュリン、500ng/mLのヒトトランスフェリン、250ng/mLのセレン化ナトリウム（Sigma）、43nMのβ-メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、1mMのピルビン酸（Sigma-Aldrich）、10mMのHEPES（Sigma-Aldrich）を補充したものから構成された。これらの実験から得られたデータは図8として本明細書に示されている。
【００７８】
ヒトの全血培養物を用いて4つのサイトカイン、即ちIL-10、MIP-1β、TNFα、及びIL-8を測定した。二人のドナーは一度検査し、一人のドナーは二度検査した。二度検査したドナーは検査時には非常に高いTNFαのバックグラウンドを持っていたが、一ヶ月後にはTNFαは非常に低いバックグランドであったことは注目に値する。しかし培養の期間は重要である。高いバックグラウンドのTNFαは5.5時間の培養で得られ、また低いバックグランドのTNFαは一晩、約24時間の培養で得られた。それにもかかわらず、5.5時間の低いバックグランド培養物は、いくらか前の培養物で得られた培養物（5時間の試験で518.2pg/ml、4時間の試験で417pg/ml、4時間で0pg/ml、低い応答）よりも高かった（約600pg/ml）。
【００７９】
RC552は、24時間の3つの培養物のうち2つ、及び1つの5.5時間の培養物中においてのTNFαの合成についてはMPLに似ていた。しかしRC552によるIL-8の誘導は、三つの場合のうちの三つともMPLついてのものとは異なっていた。RC552によるIL-8の誘導はMPLと比較して二晩の培養物では減少していたが、一晩の培養物ではMPLよりも大きかった。
【００８０】
一晩の培養物では、RC552によるIL-10の誘導はMPLの場合の誘導よりも小さい。MIP-1βの誘導は、3つの場合の一晩培養物のうちの一つで減少していた。
【００８１】
BALB/cの反応とC3H/HEJの反応をMPLとRC552について比較した。C3H/HEJマウスは、トール受容体4の突然変異に起因してLPSに対して遺伝的に低反応性である。これらの培養物においてオリゴヌクレオチド刺激剤は、C3H/HEJ培養物に対する陽性対照として用いた。このオリゴヌクレオチドは、BALB/cマウス（1000pg/mL）とC3H/HEJマウス（488.5pg/mL）において大量のIL-6を誘導した。同様に、10ug/mLのMPLまたはRC552に対する応答においてはそれぞれ、IL-10（342pg/mL及び609pg/mL）、及びTNFα（204pg/mL及び30pg/mL）であったように、MIP-1βはBALB/cマウス及びC3H/HEJ培養物において誘導された（589pg/mL及び554pg/mL）。
【００８２】
MPLもRC552もどちらも、C3H/HEJ脾臓細胞を用いてサイトカインの応答を誘導しなかった。しかしBALB/cの脾臓細胞培養物においては、IL-10、MIP-1β、TNFα及びIL-6が誘導された。RC552は同じ濃度でMPLが誘導した場合よりも、ほとんどMIP-1β、TNFα及びIL-6を誘導しなかった。RC552はMPL（1144.1pg/mLから176.6pg/mLに）と比較してほとんどIL-10を誘導しなかった（10.4pg/mLから11.6pg/mL）。
【００８３】
0.2％のトリエタノールアミンの溶液で試験した場合、RC552は、ヒトの全血の三つの一晩培養物のうちの二つ及び一つの短期間培養物において、MPLの場合とTNFαの誘導に対して似てはいるが同一ではない炎症前の特性を持っている。図4〜図6（それぞれドナーA〜Cに対する一晩培養物）及び図7（ドナーAに対する短期間の培養物）を参照のこと。さらにRC552によるMIP-1βの誘導は、三つの一晩培養物のうちの二つで類似であった。一晩培養物におけるIL-10の減少はMPLよりもRC552によって誘導された。IL-8の誘導は試験したすべての場合においてMPLの場合とは異なっていた。
【００８４】
受容体欠陥マウスを用いると、RC552がトール様受容体4を経てシグナル伝達することが明らかであった。リピドA反応性のBALB/cマウスを用いると、RC552は試験した濃度でサイトカインが減少した特性を誘導した。興味深いことに試験した濃度は容量応答関係の高い方の限界であり、RC552は試験した高い濃度（20μg/mL）よりも低い濃度（10μg/mL）でわずかに大きなMIP-1β及びTNFαを誘導した。
【００８５】
ヒトとマウスのサイトカインの特性を比較すると合成リピドA化合物RC552は、高濃度の刺激剤で試験した場合、2日目のマウスの脾臓細胞培養物において、および3人の血液の一晩培養物のうちの一つにおいてIL-10の誘導に対する能力を減少させた。一般にヒト血液の一晩培養物中において、RC552によってTNFαはMPLよりも誘導されなかった。ほぼ等しいレベルのTNFαが、MPLと比較してRC552によってヒトの血液の短時間（5.5時間）培養物中で誘導された。RC552及びMPLを用いて刺激したヒトマクロファージから得られたRNAを用いた微小配列のデータは、両方の化合物に対して初期に（1時間）TNFαRNAを示し、かつ両方の化合物に対して後期にTNFαRNAを示すことはなかった。しかしRC552は、6時間で測定可能なRNAを持つMPLとは対照的に、6時間でTNFαをほとんど誘導しなかった。
【００８６】
実施例6
MPL及びRC552に比較されるRC529の刺激能力
本実施例は、ヒトの末梢血にある単核細胞（PBMC）由来のIL-6、IL-10及びMIP-1βの合成によって評価した場合、RC529がMPLと比較して優れた免疫刺激能力を持っていることを証明している。対照的にIL-8の合成は、MPLの合成と類似していた。
【００８７】
PBMCは使用するまで凍結保存した。PBMCドナーの呼称はAD112であった。48ウェルのプレートのウェル毎に、6.26×105の密度でPBMCを1.0mlの培地に播種した。培地は、RPMI-1640に炭酸水素ナトリウム、10％の胎児ウシ血清、4mMのグルタミン、100ug/mlのゲンタマイシン及び10mMのHEPESを加えたものから構成された。PBMCは二酸化炭素インキュベーター中、37℃で22時間培養した。上清を回収し、IL-6、IL-8、IL-10及びMIP-1βの濃度についてELISA（R＆D Systems）によって試験した。上清中のサイトカイン濃度を、同一条件で培養した非刺激のPBMCから得られた上清と比較した。
【００８８】
試験した用量で、最低用量のIL-6またはIL-8では用量応答性が達成されなかった。MPLと比較してRC529は、MPLで誘導された場合より多くのIL-6、IL-10及びMIP-1βを誘導した。二糖類化合物であるRC529は一般に、大量ベースで刺激性の能力を仲介する。図9を参照のこと。これらのデータは、RC529が凍結したヒトPBMC由来のIL-6、IL-10及びMIP-1βの強力な誘導物質であることを示している。
【００８９】
本明細書に引用したすべての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照文献として組み入れられることを詳細に、かつ個別に指示されているかのように、参照文献として本明細書に組み入れられる。前述の本発明は理解を明確にする目的で例示及び実施例により程度詳細に説明しているが、ある種の変更及び改変を添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくそれに加えることができることは、この発明の開示に鑑みて当業者には容易に明らかになると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  モノホスホリルリピドA（MPL）の投与後、または投与と同時になされる致命的なインフルエンザ攻撃に対するマウスの非特異的保護作用を図示するグラフである。
【図２】  L-セリルアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）をマウスに鼻腔内投与した後の臨床的症候を図示するグラフである。
【図３】  L-セリルアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）単独処置及びインフルエンザの攻撃に続く臨床的症候を図示したグラフである。
【図４〜図６】  三人のドナー（各々ドナーA〜C）から得られる全血の一晩培養物中において、RC552によるサイトカインの誘導をMPLと比較して図示するグラフである。
【図７】  ドナーAから得られた全血の短期間培養物において、RC552によるサイトカインの誘導をMPLと比較して図示するグラフである。
【図８】  マウス（Balb/c及びC3H/HEJ）の脾臓培養物において、MPLと比較してRC552によるサイトカインの誘導を図示するグラフである。
【図９】  ヒト末梢血単核細胞（PBMC）において、MPLと比較してRC529及びRC552によるサイトカインの誘導を図示するグラフである。
【図１】
0005004261.tif 000014
【図２】
0005004261.tif 000015
【図３】
0005004261.tif 000016
【図４Ａ】
0005004261.tif 000017
【図４Ｂ】
0005004261.tif 000018
【図４Ｃ】
0005004261.tif 000019
【図４Ｄ】
0005004261.tif 000020
【図５Ａ】
0005004261.tif 000021
【図５Ｂ】
0005004261.tif 000022
【図５Ｃ】
0005004261.tif 000023
【図５Ｄ】
0005004261.tif 000024
【図６Ａ】
0005004261.tif 000025
【図６Ｂ】
0005004261.tif 000026
【図６Ｃ】
0005004261.tif 000027
【図６Ｄ】
0005004261.tif 000028
【図７Ａ】
0005004261.tif 000029
【図７Ｂ】
0005004261.tif 000030
【図８Ａ】
0005004261.tif 000031
【図８Ｂ】
0005004261.tif 000032
【図８Ｃ】
0005004261.tif 000033
【図８Ｄ】
0005004261.tif 000034
【図９Ａ】
0005004261.tif 000035
【図９Ｂ】
0005004261.tif 000036
【図９Ｃ】
0005004261.tif 000037
【図９Ｄ】
0005004261.tif 000038