(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、シグナルペプチド及びレバンビオース生成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、シグナルペプチド及びレバンビオース生成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号１の１１５６の位置（ＡＴＧ）から２７１２の位置（ＧＴＧ）までの塩基配列からなる、請求項１又は２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを包含する、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１の１１６９の位置から３３３５の位置までの塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含んでなる組換えベクター。
【請求項７】
請求項４に記載のＤＮＡを含んでなる組換えベクターｐＬＦ２−Ａ。
【請求項８】
請求項５に記載のＤＮＡを含んでなる組換えベクターｐＬＦ２−Ｂ。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の組換えベクターを導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）／ｐＬＦ２−Ａ、又は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）／ｐＬＦ２−Ｂ（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４８６）。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の形質転換体を培地中で培養し、培養上清液中からレバンビオース生成酵素活性を有するタンパク質を採取すること、を特徴とするレバンビオース生成酵素活性を有するタンパク質の大量生産法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レバンビオース生成酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体及び該形質転換体を用いたレバンビオース生成酵素の製造方法及び当該酵素を用いたレバンビオースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レバンビオースは、フラクトース２分子からなる二糖類であって、これを消化しうる微生物は非常に少なく、難消化性オリゴ糖である。このようなフラクトースからなる難消化性のフラクトオリゴ糖は、新しい低カロリーの甘味料として期待がもたれている。また、抗う蝕性や整腸作用としてビフィズス菌の増殖因子として作用したり、ミネラル吸収促進作用を示すことが示唆されており、多機能な機能性オリゴ糖として期待できる。
【０００３】
レバンからレバンビオースを合成する微生物や酵素（以下、「レバンビオース生成酵素」という。）については、ストレプトマイセス・ｓｐ  ｎｏ．７−３株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ｎｏ  ７−３）（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｈ．ら、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５４，２２４７−２２５６，１９９０）、及びアルスロバクター・ｓｐ  ｎｏ．  ５１Ａ株（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ｎｏ．  ５１Ａ）（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｈ．ら、Ｏｙｏ  Ｔｏｓｈｉｔｓｕ  Ｋａｇａｋｕ  ４１，１７３−１８０，１９９４）が知られている。しかしながら、これらの微生物を使用する場合にはいずれも、目的生産物であるレバンビオースのほかに、他のフラクトオリゴ類、特にフラクトース３個又は４個から成るフラクトオリゴ糖、及びフラクトースが副生するという欠点がある。これに関して本発明者らは、レバンからレバンビオースを特異的に生成せしめ、他のフラクトオリゴ糖及びフラクトースを実質的に生成しないストレプトマイセス・エクスフォリアタスＦ３−２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ  Ｆ３−２）（Ｙｏｋｏｔａ  Ａ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｌｏｃｈｅｍ．  ５７，７４５−７４９、１９９３）及びレバンビオース生成酵素（Ｓａｉｔｏ  Ｋ．ら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ６６，２５２−２５６，２０００）を見出し、それらを用いたレバンビオースの製造方法を完成させた（特許番号１９９６９９２）。
【０００４】
しかしながら、レバンビオース生成酵素の遺伝子を分離しこの塩基配列を決定した報告は知られていない。また、この酵素の生産効率を高めるには、培養法の検討や突然変異法による生産菌株の改良が考えられるが、工業的生産に適した生産効率を達成するには未だ十分ではない。近年、遺伝子工学的方法による酵素生産の効率向上が有効な手段となっていることから、レバンビオース生成酵素の生産においても該酵素の遺伝子の解明が切望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、レバンビオース生成酵素の遺伝子、及び該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体の提供及び該形質転換体を用いたレバンビオース生成酵素の製造及び当該酵素を用いたレバンビオースの製造である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、鋭意研究の結果、レバンビオース生成酵素（ＬＦ２ａｓｅということもある）をコードする遺伝子のクローニング及びその塩基配列の決定にも成功し、更に該遺伝子を含有した形質転換体の作成、該遺伝子の発現、該形質転換体の培養によりレバンビオース生成酵素又はレバンビオース生成酵素活性を有するタンパク質の製造にも成功し、本発明の完成に至った。
【０００７】
更に詳細には、本発明者らは、レバンビオース生成酵素生産菌ストレプトマイセス・エクスフォリアタスＦ３−２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ  Ｆ３−２）の染色体ＤＮＡから、レバンビオース生成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得すべく鋭意研究した結果、レバンビオース生成酵素をコードする１５６０ｂｐを含む４００４ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。この断片は５１９個のアミノ酸をコードしており、大腸菌で発現させた場合にレバンからレバンビオースを生成することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
単離した遺伝子は、レバンビオース生成酵素遺伝子であって、本遺伝子は、ＬＦ２ａｓｅをコードする遺伝子、ＬＦ２ａｓｅ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指すものである（以下、単にＬＦ２ａｓｅ遺伝子ということもある）。本発明においては、このようにして単離したＬＦ２ａｓｅ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、ＬＦ２ａｓｅ又はＬＦ２ａｓｅ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、ＬＦ２ａｓｅ酵素活性を有するタンパク質にはＬＦ２ａｓｅも包含されるものである。
【０００９】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ（ＬＦ２ａｓｅ遺伝子の全領域を含有する）、及び、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質（シグナル配列及び成熟ＬＦ２ａｓｅ遺伝子によってコードされる）に関するものである。
【００１０】
更に、本発明は、上記ＤＮＡを含む組換えベクターであり、更に、本発明は、上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。さらに、本発明は、上記形質転換体を培地中で培養して培養物からレバンビオース生成酵素を採取することを特徴とするレバンビオース生成酵素の製造方法である。さらに、本発明は、上記形質転換体を培地中で培養して培養物から採取したレバンビオース生成酵素を用いることを特徴とするレバンからのレバンビオースの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子を得るための微生物は、レバンビオース生成酵素を生産するものであればいずれのものでもよいが、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物、より好ましくはストレプトマイセス・エクスフォリアタスＦ３−２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ  Ｆ３−２）を用いることができる。本菌株は、Ｆ３−２と命名され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１２７９４）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号：現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に寄託されている。まず、微生物から染色体ＤＮＡを単離する。染色体ＤＮＡの単離は、公知の方法、例えばＳＤＳ法、リゾチームＳＤＳ法またはＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。
【００１２】
次に、染色体ＤＮＡを常法に従って適切な制限酵素で切断し、得られるＤＮＡ断片を、公知のベクターにライゲーションして組換えＤＮＡ分子を作成する。該ＤＮＡ分子を宿主菌に形質転換することによりクローニングする。宿主菌としては、組み込んだ遺伝子が安定に保持できるものであればいかなる微生物も使用できる。例えば、大腸菌ではＪＭ１０９株が挙げられる。ベクターとしては、ｐＵＣ１９が挙げられる。組換えＤＮＡ分子による宿主菌の形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法を用いることができる。
【００１３】
次いで、このようにして得られる組換え微生物のうち、レバンビオース生成酵素遺伝子を含むものをスクリーニングする。このスクリーニングは、レバンビオース生成酵素のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端ペプチドもしくは内部ペプチドに対応するオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマー分子を合成し、該プライマーと染色体ＤＮＡ分子を用いたＰＣＲ法によりレバンビオース生成酵素遺伝子を部分的に増幅し、これをプローブとし組み込んだ遺伝子を有するベクターを含む大腸菌コロニーとのハイブリダイゼーション解析で陽性となるものを選択することにより行う。
【００１４】
このようにして得られる組換え微生物から組換えＤＮＡ分子を抽出する。この抽出は、通常のプラスミド調製法を用いて行うことができる。この組換えＤＮＡ分子の各種制限酵素による切断パターンを電気泳動法等を用いて解析することにより、組換えＤＮＡ分子がベクターＤＮＡ分子とレバンビオース生成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とが結合した物であることを確認できる。さらに、市販のキットを用いたいわゆるジデオキシ法によって、レバンビオース生成酵素遺伝子の塩基配列を決定することができる。
【００１５】
本発明のレバンビオース生成酵素をコードする遺伝子は、図１に示す制限酵素地図を有する約４．０ｋｂのＤＮＡ断片に含まれており、図１において黒帯で示した約１．６ｋｂの部分（Ｉｆ２ｇｅｎｅ）に存在している。また、本発明のレバンビオース生成酵素遺伝子は、図２に示した塩基配列に示されている。なお、該塩基配列（すなわち、レバンビオース生成酵素遺伝子の全領域の塩基配列：４００４ｂｐ）については、配列表の配列番号１（図４、５）にも示されている。
【００１６】
本配列は左側から右側に向けて５’末端から３’末端の方向となるように示したものである。本配列中、ヌクレオチド番号１１５６番のＡＴＧから翻訳を開始し、アミノ酸５１９残基からなる配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が認められる。ＯＲＦの１７べース（ｂ）上流には、大腸菌の１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端の配列と相補性が高いリボゾーム結合配列が存在する。更に上流には大腸菌のＲＮＡポリメラーゼの結合部位に相当するプロモーター配列が存在する。
【００１７】
配列番号１（図４〜図５、図２）で示されるＬＦ２ａｓｅ遺伝子全領域（４００４ｂｐ）の塩基配列中、ヌクレオチド番号１１５６番のＡＴＧから２７１２番のＧＴＧまでの塩基配列（１５６０ｂｐ）（図１におけるＩｆ２ｇｅｎｅ）は、シグナル配列と成熟ＬＦ２ａｓｅ遺伝子を包含している。この１５６０ｂｐの塩基配列は、配列番号２（図６〜図７、図２）の５１９アミノ酸残基を有するタンパク質をコードしている。このアミノ酸配列中、Ｎ末端ペプチドのアミノ酸３７残基はシグナルペプチド、残りのアミノ酸４８２残基は成熟ＬＦ２ａｓｅ遺伝子である。
【００１８】
したがって、本発明において、ＬＦ２ａｓｅ遺伝子は、（１）その全領域を示す４００４ｂｐの塩基配列を有する遺伝子、（２）シグナル配列と成熟ＬＦ２ａｓｅ遺伝子を含む１５６０ｂｐの塩基配列を有する遺伝子、（３）塩基配列のその一部を欠失、置換、若しくは付加してなる遺伝子、の少なくともひとつを指すものである。なお、（３）の例としては、シグナルペプチドをコードする遺伝子の一部を削除したＤＮＡが挙げられ、本ＤＮＡはプラスミドｐＬＦ２−Ｂに含有されている。
【００１９】
レバンビオース生成酵素遺伝子の全領域を含む組換えＤＮＡ分子の好ましい例としては、プラスミドｐＬＦ２−Ａ（図１）が挙げられる。該プラスミドはレバンビオース生成酵素遺伝子を含む約４．０ｋｂの組換えプラスミドである。組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物の好適な例としては、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＬＦ２−Ａ）株が挙げられる。この菌株は組換えプラスミドｐＬＦ２−Ａを大腸菌ＪＭ１０９株に通常の形質転換法を用いて導入したものである。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリ／ｐＬＦ２−Ａ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ／ｐＬＦ２−Ａ）と命名した。
【００２０】
本発明のＤＮＡは、実質的に目的とする酵素活性を発現する配列であれば、配列番号１の配列に限定されず、それぞれ欠失、置換、付加、挿入などによってその塩基配列が変異していてもよい。例えば、Ｎ末端ペプチドのアミノ酸３７残基はシグナルペプチドと考えられ、対応する塩基配列の一部及びターミネーター領域の一部を削除した遺伝子ＤＮＡ分子ｐＬＦ２−Ｂを導入した大腸菌ＪＭ１０９株（本形質転換体は、エシェリヒア・コリ／ｐＬＦ２−Ｂ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ／ｐＬＦ２−Ｂと命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８６として寄託した。）では、大腸菌の培養に通常用いられる培地で培養することにより菌体内にレバンビオース生成酵素を生産する。この菌株を用いることにより、レバンからレバンビオースを元株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ  Ｆ３−２）と同様に生じるレバンビオース生成酵素を生成する（図３）。本発明によればレバンビオース生成酵素遺伝子及びこれを含有する微生物が得られ、これら微生物を利用することにより、該レバンビオース生成酵素を容易に生産することができる。さらに、レバンを原料とするレバンビオースの大量生産も可能となる。
【００２１】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
レバンビオース生成酵素を生産するストレプトマイセス・エクスフォリアタスＦ３−２株１０ｍｇを１０ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に接種し、３０℃で２４時間振とう培養を行った後、この１ｍｌを１００ｍｌの同培地に接種して３０℃で更に２４時間振とう培養した。この後、遠心分離によって菌体を集め、ＴＥＮ溶液に懸濁した。その後の操作はリゾチームＳＤＳ法（Ｈ．Ｓａｋｕｒａｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，８７−９２（１９９７））に従って行い、３ｍｇの染色体ＤＮＡを単離した。
【００２３】
【実施例２】
文献（Ｓａｉｔｏ  Ｋ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，２５２−２５６，２０００）に従い精製したレバンビオース生成酵素１０ｎｍｏｌを、４Ｍ尿素、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）２００μｌ中で９０ｐｍｏｌのリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ、和光）を用い、３７℃、４８時間の条件で分解し、生成したペプチドを下記条件のＨＰＬＣにより分離回収した。
カラム：  逆相Ｃ８カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｃ８Ｐ−５０  ４Ｄ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、昭和電工）
温度：５０℃
溶離液：０１％トリフルオロ酢酸  アセトニトリル
濃度勾配：アプライ５分後から１％／ｍｉｎ
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２１６ｎｍおよび２８０ｎｍ）
【００２４】
精製したレバンビオース生成酵素約１００ｐｍｏｌと以上のようにして得られたペプチドについて一次構造の決定をエドマン分解法に従って行い、Ｎ末端配列Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ（配列番号３、図８）及び中間ペプチドＡｓｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  ＰｒｏＩｌｅ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ（配列番号４、図９）を決定した。Ｎ末端配列及び中間配列は重複する連続配列であり、それに対応するコドンから、５’−ＧＡ（Ｃ／Ｔ）  ＣＡ（Ａ／Ｇ）  ＴＧＧ  ＡＡ（Ａ／Ｇ）  ＡＡ（Ｃ／Ｔ）  ＧＡ（Ｃ／Ｔ）  ＣＣ−３’（配列番号５、図１０）の塩基配列を持つＤＮＡオリゴマーをホスホアミダイド法により合成した。なお、配列番号５において、ｙはｃ又はｔを表わし、ｒはａ又はｇを表わす。
【００２５】
また、ＤＮＡ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＤＩＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ  ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｔｓｕｋｕｂａ）に登録されているレバン分解酵素遺伝子の配列より共通アミノ酸配列Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号６、図１１）を見出し、それに対応するコドンから、５’−ＴＡ（Ａ／Ｇ）  ＴＣＣ  ＣＡ（Ａ／Ｇ）  ＴＴ（Ａ／Ｇ）  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡ−３’（配列番号７、図１２）の塩基配列を持つＤＮＡオリゴマーを合成した。
これらの合成ＤＮＡオリゴマーと実施例１で得られた染色体ＤＮＡを混合しＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いたＰＣＲにより約７００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ法により標識し、レバンビオース生成酵素遺伝子の検出用プローブとした。なお、配列番号７において、ｙはｃ又はｔを表わし、ｒはａ又はｇを表わす。
【００２６】
【実施例３】
実施例１で得られた染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｓｐｈ  Ｉを用いて消化し、あらかじめＳｐｈ  Ｉで消化しておいたｐＵＣ１９にライゲーションしてプラスミドＤＮＡ分子を作成した。ライゲーションにはＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ）を使用した。プラスミド分子を大腸菌ＪＭ１０９にエレクトロポレーション法により導入し、遺伝子ライブラリーとして組換え大腸菌コロニーを得た。このコロニーと実施例２で得られたプローブとのコロニーハイブリダイゼーション解析により、レバンビオース生成酵素遺伝子が導入された可能性のあるコロニーを得た。
【００２７】
【実施例４】
実施例３で得られた菌株から、液体培養法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した（ここで得たプラスミドをｐＬＦ２−Ａと称した）。このプラスミドをＡＢＩＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用い蛍光標識しＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した（図２、配列番号１（図４〜図５））。このようにして得られた、ＬＦ２ａｓｅ遺伝子全領域ｐＬＦ２−Ａを含有する大腸菌ＪＭ１０９（形質転換体）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ／ｐＬＦ２−Ａと命名した。
【００２８】
【実施例５】
実施例４で得られたプラスミドＤＮＡ分子ｐＬＦ２−ＡをＳｍａＩで切断し、あらかじめＳｍａＩで消化しておいたｐＵＣ１９にライゲーションして、プラスミドＤＮＡ分子ｐＬＦ２−Ｂを作成した。したがって、ｐＬＦ２−Ｂは、配列番号１の１１６９（Ｇ）の位置から３３３５（Ｃ）の位置までの塩基配列で示される遺伝子のＤＮＡを包含するものであって、１（Ｃ）の位置から１１６８（Ｃ）の位置までの塩基配列、及び、３３３６（Ｇ）の位置から４００４（Ｃ）の位置までは欠失している。ライゲーションにはＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ）を使用した。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換株を得た。得られた形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ／ｐＬＦ２−Ｂと命名し、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８６として寄託した。
【００２９】
【実施例６】
次いで、この形質転換株のレバンビオース生成酵素活性を測定した。すなわち、形質転換株を５ｍｌのＬＢ培地（表１）を用いて３７℃で２４時間培養したものをシードとし、そのうちの１ｍｌをＩＰＴＧを１ｍＭの濃度で含有するＬＢ培地１００ｍｌを用いて３７℃で２４時間培養した。次いで培養液を遠心（８０００×ｇ、４℃、１５分間）し、細胞と上清液とに分離した。該上清液を酵素溶液Ａとした。さらに、細胞を燐酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）で２回洗浄後、培養液等量の同じ緩衝液に懸濁し、超音波処理した。得られる細胞破砕液を酵素溶液Ｂとした。このようにして得られる酵素溶液Ａおよび酵素溶液Ｂについて、それぞれのレバンビオース生成酵素活性を測定し、その合算値によって、その形質転換株の該酵素の力価を評価した。
【００３０】
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上記培地にそれぞれ濾過滅菌したａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、ＩＰＴＧをそれぞれ最終濃度１００μｇ／ｍＬ、１ｍＭとして添加。
【００３１】
レバンビオース生成酵素活性の測定は、ソモジ・ネルソン法に従って還元糖定量を行った。すなわち、燐酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）に、レバンを２０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解して得られるレバン溶液０．２５ｍｌに、酵素溶液Ａ若しくは酵素溶液Ｂ０．２５ｍｌを加え、合計０．５ｍｌの反応液とした。反応は４０℃で１０分間行い、生成する還元糖量をソモジ・ネルソン法で定量した。１分間に１μｍｏｌのレバンビオースを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義し、培養液当たりの値として算出した。
【００３２】
実施例５に記載の形質転換体を用い酵素溶液Ａおよび酵素溶液Ｂを調製し、レバンビオース生成酵素活性を測定したところ、酵素溶液Ａの活性は０．０１ｕｎｉｔ／ｍｌ、酵素溶液Ｂの活性は０．４７ｕｎｉｔ／ｍｌとなり、合計０．４８ｕｎｉｔ／ｍｌであった。
【００３３】
【実施例７】
実施例６に記載の方法により酵素反応を行い、２４時間後の反応液を薄層クロマトグラフィー（薄層板：シリカゲル；展開溶媒ｎ−ブタノール；２−プロパノール；Ｈ2Ｏ；酢酸／７：５：４：２ｖ／ｖ）により分析した。この結果を図３（図面代用写真）に示す。この図からわかるようにｐＬＦ２−Ｂを大腸菌ＪＭ１０９に導入した形質転換体より調製した酵素溶液では、ストレプトマイセス・エクスフォリアタスＦ３−２株より調製したものと同じくレバンビオースと若干のフラクトースのみが生産されその量比も同じであった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によればレバンビオース生成酵素遺伝子及びこれを含有する微生物が得られ、これらを利用することにより、該レバンビオース生成酵素の大量生産が可能である。さらに、レバンを原料とするレバンビオースの大量生産も可能となる。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＬＦ２−Ａの制限酵素地図を示す図である。
【図２】プラスミドｐＬＦ２−Ａの塩基配列、レバンビオース生成酵素をコードする塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図面代用写真であって、ストレプトマイセス・エクスフォリアタスＦ３−２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ  Ｆ３−２）及びプラスミドｐＬＦ２−Ａ、ｐＬＦ２−Ｂ、ｐＵＣ１９をそれぞれ保持する形質転換体より調製した酵素溶液とレバンとの反応生成物を示す図である。なおこの図において、Ｓはレバンの塩酸加水分解物を示す。Ｆはフラクトース、ＬＦ２はレバンビオース、ＬＦ３はレバントリオース、ＬＦ４はレバンテトラオースをそれぞれ示す。
【図４】レバンビオース生成酵素遺伝子全領域の塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】レバンビオース生成酵素遺伝子に対応するアミノ酸配列を示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】レバンビオース生成酵素遺伝子に対応するアミノ酸配列のＮ末端フラグメントを示す。
【図９】レバンビオース生成酵素遺伝子に対応するアミノ酸配列の中間部フラグメントを示す。
【図１０】Ｎ末端配列及び中間配列の重複する連続配列に対応するコドンを示す。
【図１１】既知のレバナーゼ遺伝子中の共通アミノ酸配列を示す。
【図１２】上記配列に対応するコドンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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