(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンモニアを含むアミノ酸溶液を緩衝液とともに分離カラムに送液してアンモニアおよび各種アミノ酸を分離し、該アミノ酸溶液を反応装置内で反応した後、検出器によって前記アンモニアおよび前記各種アミノ酸を検出するアミノ酸分析方法であって、
前記緩衝液の流量、及び分離カラム温度と、緩衝液のｐＨ値と、緩衝液の有機溶媒濃度と、緩衝液のナトリウムイオン濃度と、緩衝液のリチウムイオン濃度とからなる群から選ばれた少なくとも１つのパラメータを、グリシンまたはアラニンが溶出した後で、かつ、アンモニアが溶出する前の任意の時点で変更し、緩衝液の流量及び前記パラメータの変更前の前記アミノ酸溶液中のグリシンまたはアラニンが溶出した後で溶出するアミノ酸成分またはアンモニアの溶出時間ｔ１（ｉ）を、緩衝液の流量及び前記パラメータの値の変更後の前記アミノ酸溶液中のグリシンまたはアラニンが溶出した後で溶出するアミノ酸成分またはアンモニアの溶出時間ｔ２（ｉ）に変更させ、グリシンまたはアラニンが溶出した後で溶出するアミノ酸成分の前記緩衝液の流量及び前記パラメータの値の変更による溶出時間変化率Ｒ（ｊ）よりも前記緩衝液の流量及び前記パラメータの値の変更によるアンモニアの溶出時間変化率Ｒ（ＮＨ３）を大きくし、アンモニアとグリシンまたはアラニンが溶出した後で溶出するアミノ酸成分が分離されたクロマトグラムを形成することを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項２】
前記パラメータは、分離カラム温度であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸分析方法。
【請求項３】
前記パラメータは、緩衝液のｐＨ値であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸分析方法。
【請求項４】
前記パラメータは、緩衝液の有機溶媒濃度であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸分析方法。
【請求項５】
前記パラメータは、分離カラム温度及び緩衝液のｐＨ値であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸分析方法。
【請求項６】
前記パラメータは、分離カラム温度、緩衝液のｐＨ値及び緩衝液の有機溶媒濃度であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸分析方法。
【請求項７】
グリシンまたはアラニンが溶出した後、アンモニアが溶出する前に前記緩衝液の流量を増加させ、その後アンモニアの溶出時間に近い時点で前記緩衝液の流量を低下させることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アミノ酸一斉分析において、イオン交換カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーの手法が利用されてきた。イオン交換クロマトグラフィーでは、分析対象成分を光学検出するための反応試薬として、分析対象成分を発色させる反応試薬が用いられることが多い。アミノ酸分析においては、アミノ酸およびアミノ酸類縁物質の構造中の官能基に特異的に反応する、ニンヒドリン、オルトフタルアルデヒド等の呈色試薬が用いられている。これらの反応試薬と分析対象成分の反応生成物を特定波長の光により検出し、定性・定量分析を行う手法が行われている。
【０００３】
この、イオン交換クロマトグラフィーによるアミノ酸分析方法において、アミノ酸成分は緩衝液の流量、カラム温度、緩衝液組成等の分離パラメータを変更することにより、溶出時間が変化する。ここで、図１に示すように、これらの分離パラメータの変更が溶出時間に与える影響は、各アミノ酸成分で異なることが知られている。これまで、この分離パラメータによる溶離時間への影響の大小を利用してアミノ酸成分の分離能の向上および分析の高速化が図られてきた。この例として特許文献１および２がある。
【０００４】
特許文献１には、アスパラギンとグルタミン酸とグルタミンを分離する緩衝液のリチウムイオン濃度を低濃度に設定するとともにカラム線速度を高速度に設定する分析方法が開示されている。
【０００５】
特許文献２には、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンの３成分が分離カラムから分離溶出するまでは緩衝液の流速を一定とし、前記３成分が分離カラムから分離溶出後は緩衝液の流速を段階的またはリニアグラジエントに上昇させて分析する方法が開示されている。また、特許文献２には、緩衝液の流速の変更以外の手段として、カラム温度、緩衝液のｐＨ、有機溶媒の濃度などを変えることが有効であるということが示唆されている。
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１０８４９号公報
【特許文献２】特開平４−１９４７５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アミノ酸分析において呈色試薬を用いる場合、アミノ酸以外の化合物であっても官能基など分子構造がアミノ酸に類似するものは、呈色試薬と反応し、夾雑ピークとして検出されてしまう場合がある。特に、食品等に多く含まれるアンモニアはアミノ酸成分ではないが、分子構造中にアミノ酸の分子構造と同じく、呈色試薬と反応するアミノ基を有するため、分析対象ではない場合でも検出されてしまう。クロマトグラフィーでは各成分の溶出時間による定性、ピーク面積値による定量が行われるため、分析対象であるアミノ酸成分および夾雑成分であるアンモニアのピークが重なった場合、アミノ酸成分の溶出時間、ピーク面積値の精度が低下し、それにより定性・定量の精度が低下する。
【０００８】
一般に、クロマトグラフィーにおいて、分析値の精度向上のために分析対象成分と他の夾雑成分との分離能の向上を図る場合、分離パラメータの変更による分析対象成分または夾雑成分の溶出時間の変化を利用する。
【０００９】
しかし、アンモニアは任意のアミノ酸成分に比較し、分離パラメータの変更による溶出時間への影響を受けにくいことが知られている。そのため、アンモニアの溶出時間を変化させて任意のアミノ酸成分との分離能の向上を図ることは困難である。
【００１０】
本発明の目的は、アミノ酸分析において、任意のアミノ酸成分に比較して分離パラメータの変更による溶出時間の調整が困難な成分であるアンモニアの溶出時間を変化させ、任意のアミノ酸成分との分離能を改善して分析精度を向上させるとともに、分析時間を短縮して分析を高速化することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、緩衝液の流量の変更と、アンモニアの溶出時間への影響が小さい、その他の分離パラメータの変更とを組み合わせることにより、アンモニアおよび任意のアミノ酸成分の溶出時間を調節することを特徴とする。ここで、アンモニアの溶出時間への影響が小さい分離パラメータとしてカラム温度、緩衝液のｐＨ等がある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アミノ酸分析において、アンモニアおよび任意のアミノ酸成分について分離能を向上させることができ、分析精度を向上させることができる。
【００１３】
また、本発明によれば、アミノ酸分析において、分析時間を短縮して分析を高速化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図および表を用いて実施例を説明する。
【００１５】
以下の説明において、分析対象となるアミノ酸の名称および略号は表１の表記に従った。
【００１６】
【表１】
0005084428.tif 000002
【実施例１】
【００１７】
実施例１では、アンモニア（ＮＨ３）以外のアミノ酸の溶出時間には影響を与えるが、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間には影響を与えない分離パラメータのうち少なくとも一つの分離パラメータと、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間に影響を与える緩衝液の流量とを変更することにより、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の分離能を向上することができるアミノ酸分析方法およびアミノ酸分析装置について説明する。
【００１８】
本実施例は、液体クロマトグラフィーにより複数種類の緩衝液を用いて、試料中のアミノ酸を溶出してクロマトグラムを作成し、該クロマトグラムを解析し、該表示装置にヒスチジン（Ｈｉｓ）、アンモニア（ＮＨ３）、アルギニン（Ａｒｇ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）を含むアミノ酸クロマトグラムを表示することを特徴とする。
【００１９】
図２は本実施例のアミノ酸分析装置の流路系統図である。１〜４はそれぞれ第１〜第４緩衝液、５はカラム再生液である。この中から、電磁弁６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄおよび６Ｅによっていずれかの緩衝液１〜４またはカラム再生液５を選択することができるようになっている。選択された緩衝液は、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８、オートサンプラ９、分離カラム１０の順に送られる。分離カラム１０で分離されたアミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合され、加熱された反応カラム１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸は光度計１５で連続的に検出され、データ処理装置１６と図示しないディスプレイ、プリンタ、ストレージ等によってクロマトグラムおよびデータとして出力され、表示、記録、保存される。
【００２０】
なお、図示していないが、流路を制御する制御装置が付設してあり、緩衝液容器の電磁弁６Ａ〜６Ｄ、カラム再生液容器の電磁弁６Ｅ、ニンヒドリンポンプ１２、オートサンプラ９、緩衝液流量、分離カラム温度を制御するようになっている。この制御は、主として制御装置の記憶装置（図示せず）に格納されたプログラムによって実行される。
【００２１】
図３は、本発明による実施例を示すアミノ酸分析装置の概略構成図である。また、図４は、本発明による実施例を示すアミノ酸分析装置の操作および運転の手順を表すフローチャートである。
【００２２】
図３において、アミノ酸分析装置は、タッチパネル内蔵ディスプレイ１０１、キーボード１０２、マウス１０３およびスピーカー１０４を具備する操作端末１１８、インターフェースボード１１０、ポンプ１１１、１１２、オートサンプラ１１３、カラムオーブン１１４、反応装置１１５および検出器１１６を含む構成としてある。操作端末１１８は、入出力制御部１０５、ハードディスク１０６、中央処理部１０７、ＲＡＭ１０８および通信機器１０９を内蔵し、それらを内部バス１１７で接続してある。通信機器１０９は、インターフェースボード１１０を経由してポンプ１１１、１１２、オートサンプラ１１３、カラムオーブン１１４、反応装置１１５および検出器１１６と接続してあり、入出力制御部１０５が発する信号に従ってそれぞれのハードウェアを制御している。
【００２３】
図４に従って、アミノ酸分析装置の操作および運転の手順を説明する。
【００２４】
まず、図３のタッチパネル内蔵ディスプレイ１０１、キーボード１０２およびマウス１０３を用いて、操作者が分析工程の条件を設定する（Ｓ１）。すると、アミノ酸分析装置は準備運転Ｓ２、試料注入Ｓ３を行い、試料分析を開始する（Ｓ４）。そして、設定流量により、ポンプを運転し（Ｓ５）、フィードバック制御によりカラムオーブンの温度を設定カラム温度に調整する（Ｓ６）。その後、あらかじめ設定した時点において、ポンプの電磁弁を切り替えて設定流量を変更する（Ｓ７）。そして、分析結果を解析し（Ｓ８）、アミノ酸の分離が十分な場合は、自動洗浄（Ｓ９）を行ってポンプを停止し（Ｓ１０）、終了（Ｓ１１）とする。分析結果解析（Ｓ８）において、アミノ酸の分離が不十分とされた場合、操作者が条件設定Ｓ１をやり直して再度分析を行う。
【００２５】
緩衝液１〜緩衝液４および再生液５としては、表２に示すクエン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ニンヒドリン試薬１１は市販のニンヒドリン試薬Ｌ−８９００セット（和光純薬工業（株）製）を用いた。表２に示すクエン酸ナトリウム緩衝液は、一般的なたんぱく質加水分解物であるアミノ酸の分析の緩衝液として使用されるものであり、本実施例に特有のものではない。
【００２６】
【表２】
0005084428.tif 000003
【００２７】
本実施例では、分離パラメータである緩衝液流量の変更とカラム温度の変更とを組み合わせることによりアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の分離能向上を図るものである。まず、各分離パラメータ変更によるアミノ酸溶出時間への影響について示す。カラム温度を６０℃で一定とし、緩衝液の流量を０．１ｍＬ／ｍｉｎ〜０．３ｍＬ／ｍｉｎの範囲で変更すると、各成分の溶出時間は、緩衝液の流量の増加に伴って短くなる。ここで、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アンモニア（ＮＨ３）、アルギニン（Ａｒｇ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）各成分の溶出時間変化を図５に、その変化率を表３に示す。
【００２８】
表３における溶出時間変化率ｒｆは、次の式で示すように、流量０．１ｍＬ／ｍｉｎの溶出時間を基準にした変化量を百分率で表した値である。
ｒｆ＝{１００−（溶出時間／流量０．１ｍＬ／ｍｉｎの溶出時間}×１００
各成分について、この溶出時間変化率ｒｆは緩衝液の流量の変更量に依存し、各成分間で溶出時間変化率ｒｆに有意差は見られない。つまり、どの成分についても、緩衝液流量の変化による溶出時間への影響はほぼ同様であり、成分による特徴は見出されない。
【００２９】
【表３】
0005084428.tif 000004
【００３０】
次に、分離カラムの温度の変化によるアミノ酸溶出時間への影響について示す。緩衝液の流量を０．２７５ｍＬ／ｍｉｎで一定とし、カラム温度を６０℃〜８０℃に変更すると、各成分の溶出時間はカラム温度の上昇に伴って短くなる。ここで、各成分の溶出時間を図６に、その変化率を表４に示す。
【００３１】
表４における溶出時間変化率ｒｔは、次の式で示すように、温度６０℃の溶出時間を基準にした変化量を百分率で表した値である。
ｒｔ＝{１００−（溶出時間／温度６０℃の溶出時間}×１００
表３に示すように、カラム温度一定で緩衝液の流量を変更した場合においては、各成分の溶出時間変化率に差は見られなかったが、表４のようにカラム温度を変更した場合、アンモニア（ＮＨ３）および隣接する任意のアミノ酸成分の溶出時間変化率に差が見られた。特に、アンモニア（ＮＨ３）は任意のアミノ酸と比較して溶出時間変化率が小さい。つまり、カラム温度を変更してもアンモニア（ＮＨ３）の溶出時間は変化しにくく、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間はカラム温度の変更の影響を受けにくいことがわかる。
【００３２】
【表４】
0005084428.tif 000005
【００３３】
以上の結果から、緩衝液の流量の変更によるアンモニア（ＮＨ３）の溶出時間への影響は任意のアミノ酸と同等であるのに対し、カラム温度の変更によるアンモニア（ＮＨ３）の溶出時間への影響は、隣接する任意のアミノ酸成分と比較して少ないという特徴があることがわかる。
【００３４】
ここで、緩衝液組成一定の条件下で、緩衝液の流量とカラム温度の二つの分離パラメータをどちらも変更すると、図７に示すクロマトグラムが得られる。本図において、中段はカラム温度および緩衝液の流量を一定とした場合であり、上段および下段はそれぞれ、オルニチン（Ｏｒｎ）が溶出する直前にカラム温度を変更し、かつ、緩衝液の流量を増加および減少させた場合である。
【００３５】
緩衝液の流量を減少させた場合、表３で示したとおりアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間が一定の割合で長くなるが、この変化にカラム温度の上昇による溶出時間の短縮が加わると、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間変化率に差が生じる。つまり、アンモニア（ＮＨ３）以外の成分の溶出時間は、緩衝液の流量の減少に伴って長くなるが、カラム温度上昇の影響で短くなり、緩衝液の流量だけを減少させた場合よりも短くなる。
【００３６】
これに対して、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間は、他の成分と同様に、緩衝液の流量の減少に伴って長くなるが、表４で示したとおりカラム温度の影響を受けにくいため、本来、緩衝液の流量だけを減少させた場合とほぼ同じ溶出時間となる。このように、カラム温度の変更による溶出時間への影響度の違いにより、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間変化率に差が生じ、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の分離能が向上する。
【００３７】
また、緩衝液の流量を増加させた場合、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間が一定の割合で短くなるが、この変化にカラム温度の上昇による溶出時間の短縮が加わると、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間変化率に差が生じる。本実施例においては、図７上段に示すとおり、アンモニア（ＮＨ３）とヒスチジン（Ｈｉｓ）との分離を損なうことなく分析の高速化が図れる。
【００３８】
以上の結果から、緩衝液の流量を一定にした場合と流量を変更した場合を比較するとオルニチン（Ｏｒｎ）、リジン（Ｌｙｓ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）の溶出時間の変化量よりもアンモニア（ＮＨ３）の溶出時間の変化量が大きいことがわかる。すなわち、緩衝液の流量を増加させても減少させても、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間の変化量の方が大きくなる。
【００３９】
ここで、任意のアミノ酸またはアンモニアの溶出時間変化率を下記の数１でＲと定義する。すなわち、任意のアミノ酸またはアンモニアの溶出時間変化率は、緩衝液の流量を変更した場合の任意のアミノ酸またはアンモニアの溶出時間と、緩衝液の流量を一定とした場合の任意のアミノ酸またはアンモニアの溶出時間との差の絶対値を、緩衝液の流量を変更した場合の任意のアミノ酸またはアンモニアの溶出時間で割って１００を掛けた値である。
【００４０】
【数１】
0005084428.tif 000006
【００４１】
ここで、ｉは任意のアミノ酸またはアンモニアを表し、ｔ１（ｉ）はグリシンまたはアラニンが溶出した後で、かつ、アンモニアが溶出する前の任意の時点に緩衝液の流量を変更しなかった場合における成分ｉの溶出時間であり、ｔ２（ｉ）は上記任意の時点に緩衝液の流量を変更した場合における成分ｉの溶出時間である。ただし、緩衝液の流量を変更する時点はｔ２（ｉ）に達する以前とする。
【００４２】
表５に本実施例におけるアンモニア（ＮＨ３）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）の緩衝液の流量の変更に伴う溶出時間変化率Ｒの例を示す。
【００４３】
【表５】
0005084428.tif 000007
【００４４】
この表において、緩衝液の流量を増加させた場合とは、流量を０．３ｍＬ／ｍｉｎから０．３２５ｍＬ／ｍｉｎに増加させた場合であり、緩衝液の流量を減少させた場合とは、流量を０．３ｍＬ／ｍｉｎから０．２７５ｍＬ／ｍｉｎに減少させた場合である。
【００４５】
緩衝液の流量を増加させた場合、ヒスチジン（Ｈｉｓ）およびアンモニア（ＮＨ３）の溶出時間変化率Ｒはそれぞれ、０．７３５および１．２１２であり、緩衝液の流量を減少させた場合、それぞれ０．６９１および０．９２１である。
【００４６】
したがって、緩衝液の流量を増加させた場合でも、減少させた場合でも、アンモニア（ＮＨ３）の緩衝液の流量の変更に伴う溶出時間変化率Ｒの方が、ヒスチジン（Ｈｉｓ）のＲよりも大きくなり、この２成分の分離能が向上することがわかる。
【００４７】
緩衝液の流量を変更する時点は、グリシン（Ｇｌｙ）またはアラニン（Ａｌａ）が溶出した後で、かつ、アンモニア（ＮＨ３）が溶出する前の任意の時点とすることが適切である。緩衝液の流量を減少させる場合は、緩衝液の流量を減少させる時点をできるだけアンモニア（ＮＨ３）の溶出時点に近づけることが望ましい。これは全体の分析時間を短縮するために有効である。また、アンモニア（ＮＨ３）が分離カラムから分離溶出した後は、カラム温度を更に上昇させるとともに、緩衝液の流量を増加させることにより、分析時間を短縮することもできる。
【００４８】
数１で対象とする任意のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはアルギニン（Ａｒｇ）のいずれかであることが望ましい。
【実施例２】
【００４９】
実施例２では、実施例１の変形例として、緩衝液の流量およびｐＨの変更を組み合わせる分析方法について説明する。
【００５０】
実施例１において図５および表３で示した通り、緩衝液の流量を変更するとアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間は同様の割合で変化し、アンモニア（ＮＨ３）と他の成分に違いが見られない。これに対して、緩衝液のｐＨを変更した場合、アンモニア（ＮＨ３）は任意のアミノ酸に比べて影響を受けにくい。本実施例では、実施例１におけるカラム温度のかわりに緩衝液のｐＨを変更する。緩衝液の流量およびカラム温度を一定として緩衝液のｐＨのみを変更する場合、緩衝液のｐＨを上げる、すなわち、アルカリ性に傾けると、各成分とも溶出時間が短くなる。また、これらの成分の溶出時間変化率を比較すると、アンモニア（ＮＨ３）は緩衝液のｐＨの変更による溶出時間の変化が小さい。すなわち、実施例１におけるカラム温度を変化と同様に、アンモニア（ＮＨ３）溶出時間は緩衝液のｐＨ変化の影響を受けにくいという特徴を有する。ここで、ｐＨとは、溶液中の水素イオン濃度のことである。
【００５１】
図８は本実施例で得られるクロマトグラムである。カラム温度一定の条件下で、緩衝液の流量およびｐＨの二つの分離パラメータをどちらも変更すると、図８に示すとおり緩衝液のｐＨの各成分溶出時間への影響力の違いにより、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間変化率に差が生じ、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の分離能が向上する。本実施例では、ヒスチジン（Ｈｉｓ）とアンモニア（ＮＨ３）の溶離時間変化率の差により、この２成分の分離能が改善する。
【実施例３】
【００５２】
実施例３では、実施例２の変形例として、緩衝液の流量および有機溶媒濃度の変更を組み合わせる分析方法について説明する。
【００５３】
本実施例では、緩衝液組成のうち有機溶媒濃度を変更する。緩衝液の流量、カラム温度一定で緩衝液の有機溶媒濃度のみを変更した場合、緩衝液の有機溶媒濃度を上げると、各成分の溶出時間が短くなる。ここでも、実施例２で緩衝液のｐＨのみ変更した場合と同様に、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間は緩衝液の有機溶媒濃度の影響を受けにくいという特徴を有する。このことから、温度一定の条件下で、緩衝液の流量および有機溶媒濃度の、二つの分離パラメータをどちらも変更すると、実施例１で図７に示したと同様に、緩衝液ナトリウムイオン濃度の各成分溶出時間への影響力の違いにより、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間変化率に差が生じ、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の分離能が向上する。すなわち、本実施例においても、リジン（Ｌｙｓ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）とアンモニア（ＮＨ３）との溶離時間変化率の差により、２成分の分離能が改善する。
【実施例４】
【００５４】
実施例４では、実施例１、実施例２の複合例として、カラム温度、緩衝液のｐＨおよび緩衝液の流量を変更する分析方法について説明する。
【００５５】
図９は、本実施例を示すアミノ酸分析の分析プログラムにおける各パラメータの設定条件を出力したものである。図中左から、時間２２１、緩衝液の切り替え設定２２２、緩衝液の流量２２３、カラム温度２２４、反応液の流量比率２２５、希釈液の流量比率２２６、洗浄液の流量比率２２７および反応液の流量２２８である。Ｂ１〜Ｂ４には表２に示す緩衝液を、Ｂ５にはｐＨ６．２のクエン酸ナトリウム緩衝液を設置した。
緩衝液の流量２２３を、時点０分から３４．６分まで０．３００ｍＬ／ｍｉｎとし、アンモニア（ＮＨ３）の溶出時間に対応する３５．６分から４２．２分までの間、０．２７５ｍＬ／ｍｉｎに減少させ、４５．２分以降は０．３００ｍＬ／ｍｉｎに増加させている。ここで、緩衝液の流量変更に加え、アンモニア（ＮＨ３）溶出前にカラム温度を３３分から８０℃に上昇させるとともに緩衝液をＢ４（ｐＨ４．９）からＢ５（ｐＨ６．２）に切り替え、緩衝液のｐＨを上昇させる。
【００５６】
図１０は、本実施例で得られたクロマトグラムの全体を示したものである。緩衝液流量、カラム温度、緩衝液ｐＨの３つの分離パラメータ変更を組み合わせることにより、アンモニア（ＮＨ３）と任意のアミノ酸成分の分離が良好となる。
【実施例５】
【００５７】
実施例５では、実施例１、実施例２および実施例３の複合例として、カラム温度、緩衝液のｐＨおよび有機溶媒濃度のうちの少なくとも二つおよび緩衝液の流量を変更する分析方法について説明する。このほか、変更可能な分離パラメータとしては、緩衝液のナトリウムイオン濃度などがある。
【００５８】
本実施例では、緩衝液の流量以外の二つ以上の分離パラメータおよび緩衝液の流量を変更することにより、各分離パラメータに関するアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間への影響力の違いが相乗され、実施例１、実施例２および実施例３で示した分離パラメータの一つを変更した場合と比較してアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間変化率の差が大きくなる。このことから、本実施例では実施例１、実施例２および実施例３よりもアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の分離能が改善する。
【実施例６】
【００５９】
実施例６では、実施例１の変形例として、表２に示したクエン酸ナトリウム緩衝液に代えて表６に示すクエン酸リチウム緩衝液を緩衝液に用いた分析方法について説明する。表６に示すクエン酸リチウム緩衝液は、一般的な生体液に含まれるアミノ酸の分析の緩衝液として使用されるものであり、本実施例に特有のものではない。本実施例は実施例１と同様に、緩衝液の流量およびカラム温度の二つの分離パラメータをどちらも変更する場合である。
【００６０】
本実施例においても実施例１で示したように、緩衝液の流量の変更によるアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間への影響はほぼ同等であり、カラム温度の変更による溶出時間への影響は、アンモニア（ＮＨ３）の方が任意のアミノ酸より少ない。このことから、本実施例においても実施例１と同様、カラム温度が各成分の溶出時間に及ぼす影響力の違いにより、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間変化率に差が生じ、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の分離能が向上する。
【００６１】
【表６】
0005084428.tif 000008
【実施例７】
【００６２】
実施例６では表６に示すクエン酸リチウム緩衝液を緩衝液に用い、カラム温度、緩衝液のｐＨおよび有機溶媒濃度のうちの少なくとも一つおよび緩衝液の流量を変更する分析方法について説明する。このほか、変更可能な分離パラメータとしては、緩衝液のリチウムイオン濃度などがある
【００６３】
本実施例でも、実施例２および実施例３と同様に、緩衝液の流量およびその他の分離パラメータの変更を組み合わせることによって、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の溶出時間変化率に差が生じ、分離能が向上する。また、本実施例において、緩衝液の流量およびその他の分離パラメータのうち二つ以上を変更した場合、アンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間に及ぼす各分離パラメータの影響力の違いが相乗され、分離パラメータの一つを変更した場合と比較してアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸成分の溶出時間変化率が大きく異なる。このことから、本実施例においてもアンモニア（ＮＨ３）および任意のアミノ酸の分離能が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】一般的な分離パラメータの変更によるアミノ酸成分の溶出時間の変化を示すグラフである。
【図２】本発明による実施例を示すアミノ酸分析装置の流路系統図である。
【図３】本発明による実施例を示すアミノ酸分析装置の概略構成図である。
【図４】本発明による実施例を示すアミノ酸分析装置の操作および運転の手順を表すフローチャートである。
【図５】実施例１における緩衝液の流量の変更によるアミノ酸成分の溶出時間の変化を示すグラフである。
【図６】実施例１におけるカラム温度の変更によるアミノ酸成分の溶出時間の変化を示すグラフである。
【図７】実施例１における緩衝液の流量およびカラム温度を変更した場合におけるアミノ酸成分の溶出時間の変化を示すクロマトグラムである。
【図８】実施例２における緩衝液の流量および緩衝液ｐＨを変更した場合におけるアミノ酸成分の溶出時間の変化を示すクロマトグラムである。
【図９】実施例４における緩衝液の流量、カラム温度および緩衝液ｐＨを変更した場合の分析プログラムである。
【図１０】実施例４において得られるクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００６５】
１〜４…緩衝液、５…カラム再生液、６…電磁弁シリーズ、７…緩衝液ポンプ、８…アンモニアフィルタカラム、９…オートサンプラ、１０…分離カラム、１１…ニンヒドリン試薬、１２…ニンヒドリンポンプ、１３…ミキサ、１４…反応カラム、１５…光度計、１６…データ処理装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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