(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液組成及び／又は溶液温度の変化に伴い、液相状態から固相状態に可逆的に変化する化合物である晶析分離用担体を用いた液相ペプチド合成反応に用いられる液相ペプチド合成用反応装置であって、
一以上の反応室と、
一以上の前記反応室のそれぞれに、第一のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体、これと反応する第二のアミノ酸、及び反応溶媒を注入するための溶液注入手段と、
前記反応室に含まれる溶液を排出するための溶液排出手段と、
一以上の前記反応室の前記溶液排出手段側に設けられるフィルターと、を備え、
一以上の前記反応室のそれぞれの容積が、２００μｌ以上２ｍｌ以下であり、
前記フィルターが、大気圧下で、前記反応室内に含まれる反応溶液を、少なくとも２０分以上保持可能なフィルターである液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項２】
前記フィルターの孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である、請求項１に記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項３】
前記フィルターの膜厚が１００μｍ以上５ｍｍ以下である、請求項１又は２に記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項４】
前記フィルターが、ガラスフィルター、ポリエーテルスルホンフィルター、親水性ポリプロピレンフィルター、又はナイロンフィルターである、請求項１から３のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項５】
前記フィルターの前記溶液排出手段側を加圧することによって、一以上の前記反応室に注入された溶液を保持する溶液保持手段を更に備える、請求項１から４のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項６】
一以上の前記反応室に注入された溶液を振とうする溶液振とう手段を更に備える、請求項１から５のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項７】
少なくとも前記溶液注入手段及び前記溶液排出手段を制御する制御手段を更に備える、請求項１から６のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置を用いて行われる液相ペプチド合成方法であって、
一以上の前記反応室のそれぞれに、前記反応室ごとに異なっていてもよい第一のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体を注入する晶析分離用担体注入工程と、
前記晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基と結合可能であり、前記反応室ごとに異なっていてもよい第二のアミノ酸、及び前記反応溶媒を注入する第一の溶液注入工程と、
前記反応室内において、前記晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸とを反応させる第一の反応工程と、
末端に第二のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体を晶析させる第一の晶析工程と、
末端に第二のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体が分散した溶液を前記フィルターにより濾過する第一の分離工程と、を有する液相ペプチド合成方法。
【請求項９】
第一の分離工程の後に、
前記晶析分離用担体の末端に結合した第二のアミノ酸残基と結合可能であり、前記反応室ごとに異なっていてもよい第三のアミノ酸、及び反応溶媒を注入する第二の溶液注入工程と、
前記反応室内において、前記晶析分離用担体の末端に結合した第二のアミノ酸残基及び第三のアミノ酸を反応させる第二の反応工程と、
末端に第三のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体を晶析させる第二の晶析工程と、
末端に第三のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体が分散した溶液を前記フィルターにより濾過する分離工程と、を有する請求項８に記載の液相ペプチド合成方法。
【請求項１０】
更に、アミノ酸が順次結合した前記晶析分離用担体において、第一のアミノ酸残基と前記晶析分離用担体との結合を切断する生成物回収工程を有する、請求項９に記載の液相ペプチド合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、晶析分離用担体を用いた液相ペプチド合成反応に好適に用いられる液相ペプチド合成用反応装置及び当該液相ペプチド合成用反応装置を用いた液相ペプチド合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、化学プロセスにおいては、液体に溶解した特定成分を固体として分離する方法が広く用いられている。特定成分のみを固体化（結晶化）することにより、反応後の分離・精製が容易となるためである。特に、近年、医薬品の開発研究等で用いられている化合物ライブラリー合成等の逐次多段階合成においては、反応終了ごとに、必要又は不要な化合物を固体化（結晶化）して、固体化（結晶化）した物質を分離することにより、煩雑な工程を介さずに目的の化合物を精製している。
【０００３】
このような、溶液に溶解した特定成分の固体化（結晶化）は、化合物の化学的性質、物性、及び溶媒との関係において、一定の条件を満たすことにより実現される。
【０００４】
しかしながら、固体化（結晶化）の条件は、多くの場合、試行錯誤を行い、経験的に探索せねばならない。特に逐次多段階合成においては、それぞれの段階において合成された化合物に特有な性質に基づいて、固体化（結晶化）条件の検討が必要となるため、プロセス開発に多大なコストと時間を要していた。
【０００５】
そこで、溶液組成の変化を敏感に感知して、溶解状態と不溶化（結晶化）状態とに可逆的に変化する、リンカーを有する担体分子が提案されている（例えば、特許文献１参照）。このような担体分子には、リンカーを介して種々の化合物を結合させることができ、結合された化合物は、担体分子に伴って、溶解状態から不溶化（結晶化）状態、又はその逆に、容易に状態変化することができる。また、このような担体に結合した化合物は、逐次化学反応によって化学構造が変化した場合であっても、ほぼ同一の条件により、溶解状態と不溶化（結晶化）状態を可逆的に繰り返すことができる。
【０００６】
ところで、逐次多段階合成の一例であるペプチド合成の分野においては、従来、固相担体を用いた固相ペプチド合成法が代表的に行われていた。固相ペプチド合成法を用いたペプチド合成反応は自動化が容易であり、現在、固相ペプチド合成法を用いた多くのペプチド合成装置が開発されている。
【０００７】
例えば、特許文献２には、内部に収容された固相支持体と試薬とを不活性ガスのバブリングにより撹拌し、固相法によるペプチド合成を実施するための固相ペプチド合成用反応装置であって、前記固相支持体と前記試薬とを収容するための反応室と、前記反応室に前記不活性ガスを導入するためのガス導入口を有する容器本体と、前記反応室内に配置された、前記不活性ガスのバブリングによる前記固相支持体及び前記試薬の散逸を防止するための規制部材と、を備えた固相ペプチド合成用反応装置が開示されている。特許文献２に記載の発明は、容器本体の反応室内に規制部材を備えているため、ペプチドの合成効率を高めることができるとされる。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／１０４１６６号パンフレット
【特許文献２】実開平０５−０６２５４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献２に記載の発明は、固相ペプチド合成法を利用したペプチド合成用反応装置である。固相ペプチド合成法においては、固相−液相界面において生じる化学反応を利用してペプチドを合成するため、当然のことながら液相ペプチド合成法に比べて反応効率が低く、液相反応の知見をそのまま利用することもできない。
【０００９】
また、特許文献２に記載のペプチド合成用反応装置は、比較的大容量の反応室を備えるものである。ここで、多種類のペプチドを同時に合成する場合等においては、このようなペプチド合成用反応装置をそのまま利用することは非効率である。加えて、大容量のペプチド合成用反応装置の知見を小容量のペプチド合成用反応装置へとそのまま応用することもできず、例えば、溶液の保持手段等について、大容量のペプチド合成用反応装置で用いられていた手段に代替する手段を検討する必要がある。
【００１０】
本発明は以上の課題に鑑みてなされたものであり、液相ペプチド合成法を利用した液相ペプチド合成用反応装置であって、小容量で多種類のペプチド合成反応を行う上で好適なペプチド合成用反応装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。その結果、一以上の反応室と、溶液注入手段と、溶液排出手段と、一以上の反応室の溶液排出手段側に設けられるフィルターと、を備える液相ペプチド合成用反応装置において、反応室の容積を所定の容積とし、更に所定のフィルターを用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
具体的には、本発明は以下のものを提供する。
【００１３】
（１）  溶液組成及び／又は溶液温度の変化に伴い、液相状態から固相状態に可逆的に変化する化合物である晶析分離用担体を用いた液相ペプチド合成反応に用いられる液相ペプチド合成用反応装置であって、一以上の反応室と、一以上の前記反応室のそれぞれに、第一のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体、これと反応する第二のアミノ酸、及び反応溶媒を注入するための溶液注入手段と、前記反応室に含まれる溶液を排出するための溶液排出手段と、一以上の前記反応室の前記溶液排出手段側に設けられるフィルターと、を備え、一以上の前記反応室のそれぞれの容積が、２００μｌ以上２ｍｌ以下であり、前記フィルターが、大気圧下で、前記反応室内に含まれる反応溶液を、少なくとも２０分以上保持可能なフィルターである液相ペプチド合成用反応装置。
【００１４】
（１）に記載の発明は、晶析分離用担体を用いた液相ペプチド合成反応に用いられる液相ペプチド合成用反応装置である。本発明の液相ペプチド合成用反応装置は、晶析分離用担体を用いているので、反応効率が高く、液相反応の知見をそのまま利用することができる。また、本発明の液相ペプチド合成用反応装置においては、２００μｌ以上２ｍｌ以下の比較的低容量の容積の反応室を備えているため、多種類のペプチドを同時に合成する場合にも効率よく反応を進められると共に、溶質の拡散により、別途撹拌手段を設けることなく溶液を均一化することが可能である。更に、本発明の液相ペプチド合成用反応装置においては、所定のフィルターを用いているため、ペプチド合成反応中における反応溶液の保持が容易である。
【００１５】
なお、ここでいう「反応溶液」とは、具体例を挙げれば、テトラヒドロフラン等、ペプチド合成反応において汎用される溶媒、又はこれに特定の溶質を溶解させたものである。
【００１６】
（２）  前記フィルターの孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である、（１）に記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【００１７】
（３）  前記フィルターの膜厚が１００μｍ以上５ｍｍ以下である、（１）又は（２）に記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【００１８】
（４）  前記フィルターが、ガラスフィルター、ポリエーテルスルホンフィルター、親水性ポリプロピレンフィルター、又はナイロンフィルターである、（１）から（３）のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【００１９】
（２）から（４）に記載の発明は、本発明の液相ペプチド合成用反応装置において、特に好適に用いられるフィルターの条件を限定したものである。フィルターの孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下であることにより、また、フィルターの膜厚が１００μｍ以上５ｍｍ以下であることにより、ペプチド合成反応中の反応溶液を容易に保持できると共に、溶液の排出も効率的に行うことができる。
【００２０】
更に、本発明の液相ペプチド合成用反応装置に用いられるフィルターとしては、ガラスフィルター、ポリエーテルスルホンフィルター、親水性ポリプロピレンフィルター、又はナイロンフィルターを好適に用いることができる。
【００２１】
（５）  前記フィルターの前記溶液排出手段側を加圧することによって、一以上の前記反応室に注入された溶液を保持する溶液保持手段を更に備える、（１）から（４）のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【００２２】
本発明においては、液相ペプチド合成用反応装置に特定のフィルターを用いることによって、ペプチド合成反応中の反応溶液を保持することが可能である。ここで、（５）に記載の発明においては、上記のようなフィルターの特性を限定することに加え、溶液保持手段を採用するものである。これにより、ペプチド合成反応中の反応溶液の保持をより確実にすることができる。
【００２３】
（６）  一以上の前記反応室に注入された溶液を振とうする溶液振とう手段を更に備える、（１）から（５）のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【００２４】
本発明においては、液相ペプチド合成用反応装置に備えられる反応室の容積を所定の容積とすることにより、溶質の拡散のみによっても溶液の均一性を保つことができる。ここで、（６）に記載の発明においては、上記のような拡散による溶液の均一化手段に加え、溶液を振とうする溶液振とう手段を設けるものである。これにより、溶液の均一化をより確実にすることができる。
【００２５】
（７）  少なくとも前記溶液注入手段及び前記溶液排出手段を制御する制御手段を更に備える、（１）から（６）のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置。
【００２６】
（７）に記載の発明によれば、少なくとも溶液注入手段及び溶液排出手段を制御する制御手段が備えられているため、本発明の液相ペプチド合成用反応装置を自動化することができ、ペプチド合成反応の効率化を図ることができる。
【００２７】
（８）  （１）から（７）のいずれかに記載の液相ペプチド合成用反応装置を用いて行われる液相ペプチド合成方法であって、一以上の前記反応室のそれぞれに、前記反応室ごとに異なっていてもよい第一のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体を注入する晶析分離用担体注入工程と、前記晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基と結合可能であり、前記反応室ごとに異なっていてもよい第二のアミノ酸、及び前記反応溶媒を注入する第一の溶液注入工程と、前記反応室内において、前記晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸とを反応させる第一の反応工程と、末端に第二のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体を晶析させる第一の晶析工程と、末端に第二のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体が分散した溶液を前記フィルターにより濾過する第一の分離工程と、を有する液相ペプチド合成方法。
【００２８】
（９）  第一の分離工程の後に、前記晶析分離用担体の末端に結合した第二のアミノ酸残基と結合可能であり、前記反応室ごとに異なっていてもよい第三のアミノ酸、及び反応溶媒を注入する第二の溶液注入工程と、前記反応室内において、前記晶析分離用担体の末端に結合した第二のアミノ酸残基及び第三のアミノ酸を反応させる第二の反応工程と、末端に第三のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体を晶析させる第二の晶析工程と、末端に第三のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体が分散した溶液を前記フィルターにより濾過する分離工程と、を有する（８）に記載の液相ペプチド合成方法。
【００２９】
（１０）  更に、アミノ酸が順次結合した前記晶析分離用担体において、第一のアミノ酸残基と前記晶析分離用担体との結合を切断する生成物回収工程を有する、請求項９に記載の液相ペプチド合成方法。
【００３０】
（８）から（１０）の発明は、（１）から（７）の発明を液相ペプチド合成方法の発明として捉えたものである。従って、（８）から（１０）の発明によれば、（１）から（７）の発明と同様の効果を得ることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の液相ペプチド合成用反応装置においては、ペプチド合成反応に晶析分離用担体を用いているので、反応効率が高く、液相反応の知見をそのまま利用することができる。また、本発明の液相ペプチド合成用反応装置においては、２００μｌ以上２ｍｌ以下の比較的低容量の容積の反応室を備えているため、多種類のペプチドを同時に合成する場合にも効率よく反応を進められると共に、溶質の拡散により、別途撹拌手段を設けることなく溶液を均一化することが可能である。更に、本発明の液相ペプチド合成用反応装置においては、所定のフィルターを用いているため、ペプチド合成反応中における反応溶液の保持が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施形態について図面に基づいて詳細に説明する。図１（ａ）は本発明の液相ペプチド合成用反応装置の側面概略図、図１（ｂ）は本発明の液相ペプチド合成用反応装置の上面概略図である。
【００３３】
＜液相ペプチド合成用反応装置１＞
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、溶液組成及び／又は溶液温度の変化に伴い、液相状態から固相状態に可逆的に変化する化合物である晶析分離用担体を用いた液相ペプチド合成反応に用いられる液相ペプチド合成用反応装置１である。この液相ペプチド合成用反応装置１は、一以上の反応室２と、一以上の前記反応室２のそれぞれに、各種試薬を注入するための溶液注入手段３と、前記反応室２に含まれる溶液を排出するための溶液排出手段４と、一以上の前記反応室２の前記溶液排出手段４側に設けられるフィルター５と、を備える。
【００３４】
［反応室２］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、晶析分離用担体を用いたペプチド合成反応が進行する一以上の反応室２を備える。反応室２においては、反応室２内の溶液に溶解され、第一のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体と、これと反応する第二のアミノ酸とを反応させることができ、更に、反応後に溶液組成及び／又は溶液温度を変化させることにより、末端に第二のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を晶析させることができる。
【００３５】
反応室２の容積は、２００μｌ以上２ｍｌ以下である。反応室２の容積を上記範囲内のものとすることにより溶質の拡散により溶液が十分に均一化され、別途撹拌手段を設けなくとも効率的にペプチド合成反応を行うことができる。
【００３６】
反応室２は、一定の時間、反応溶液を貯留させることができる構造となっている。特に本発明の液相ペプチド合成用反応装置１を用いて多種類のペプチドを同時に合成する場合には、複数の反応室２が連なった構造となっていることが好ましい。
【００３７】
また、反応室２は更に、温度調節手段により、反応溶液を加熱・冷却できる構造となっていてもよい。本発明の液相ペプチド合成用反応装置１においては、晶析分離用担体が溶解した反応溶液を冷却することにより、ペプチド鎖が結合した晶析分離用担体を晶析させることができると共に、吸熱反応である化学反応を行う場合には、反応溶液を加熱することにより、反応の進行を促進することもできる。
【００３８】
反応室２の形状としては、特に限定されるものではないが、円筒形及び角柱形等の形状を挙げることができる。これらの形状の中でも、溶液の注入、排出が容易であるという観点から、円筒形であることが好ましい。
【００３９】
反応室２が円筒形である場合、反応室２の底面の直径は５ｍｍ以上７ｍｍ以下であることが好ましい。反応室２の底面の直径が５ｍｍ以上であることにより、反応液が鉛直方向に亘って十分に均一化されやすくなる。一方、反応室２の底面の直径が７ｍｍ以下であることにより、反応溶液の体積が少量である場合においても、十分な水位の高さを保つことができ、反応溶液の取り扱いが容易となる。
【００４０】
反応室２を構成する素材としては、ガラス、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素樹脂、及び金属等の素材を挙げることができるが、反応溶液に対する耐食性、製造の容易性、及び使い捨て利用の際の経済性等の観点から、ポリプロピレン樹脂及びフッ素樹脂が好ましい。
【００４１】
［溶液注入手段３］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は溶液注入手段３を備える。溶液注入手段３は、第一のアミノ酸残基が結合した前記晶析分離用担体、これと反応する第二のアミノ酸、及び反応溶媒を初めとして、析出用溶媒、保護されたアミノ酸から保護基を除去するための脱保護剤、及び脱保護剤を失活させるための酸等を、反応室２内に注入するために用いられる。溶液注入手段３は、図１に示されるように、液相ペプチド合成用反応装置１に備えられる試薬瓶３２から、直接試薬を分取し、反応室２に注入するものであってもよいし、試薬瓶３２から分取した試薬を溶媒等と混合させる形で、一旦試薬混合部３１で混合し、試薬混合部３１で混合された試薬を分取して反応室２内に注入するものであってもよい。
【００４２】
溶液注入手段３の具体的構成としては、特に限定されるものではないが、例えば、マイクロピペッター３４や、比較的容量の大きなニードル３５等を用いて各種試薬を分取・注入する手段を挙げることができる。溶液注入手段３としては、マイクロピペッター３４及びニードル３５の両者が備えられていてもよい。なお、マイクロピペッターには公知のチップ脱着機構を設けてチップ３３を脱着可能なものとし、少数のマイクロピペッターで多種の試薬を扱えるようにすることが好ましい。
【００４３】
［溶液排出手段４］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は溶液排出手段４を備える。溶液排出手段４は、反応室２に含まれる反応溶液を必要に応じて排出するために用いられる。溶液排出手段４の具体的構成としては、特に限定されるものではないが、例えば、フィルター５の溶液排出手段４側を減圧する手段４１と、減圧によりフィルター５から漏出した濾液を回収する手段４２を挙げることができる。減圧によりフィルター５から濾液を漏出させる場合には、フィルター５の溶液排出手段４側を０．２Ｐａ以上０．５Ｐａ以下の圧力差で減圧することが好ましい。このような減圧を行うための手段としては、特に限定されるものではないが、真空ポンプやアスピレーターを挙げることができる。
【００４４】
［フィルター５］
本発明の液相ペプチド合成用装置は、反応室２の溶液排出手段４側にフィルター５を有する。当該フィルター５は、大気圧下で、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１の反応室２内に含まれる反応溶液を、少なくとも２０分以上保持可能なフィルター５である。フィルター５が上記条件を充足することにより、ペプチド合成反応における通常の反応時間の間、ペプチド合成反応が行われる反応溶液を保持することができる。上記保持時間は、３０分以上であることが好ましい。
【００４５】
なお、ここでいう「反応溶液」とは、具体例を挙げれば、テトラヒドロフラン等、ペプチド合成反応において汎用される溶媒、又はこれに特定の溶質を溶解させたものである。
【００４６】
上記条件を充足するフィルター５の具体的構成としては、例えば、０．１μｍ以上１．０μｍ以下の孔径を有するフィルター５を挙げることができる。フィルター５の孔径が０．１μｍ未満であると、溶液を排出する際において目詰まりを起こしやすく、排出時間がかかりすぎるため、好ましくない。また、フィルター５の孔径が１．０μｍを超えると、ペプチド合成反応に通常必要とされる反応時間の間、反応溶液を十分に保持できず、反応室２から流れ落ちてしまうため好ましくない。
【００４７】
また、フィルター５の膜厚としては、１００μｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましい。フィルター５の膜厚が１００μｍ以上であることにより、ペプチド合成反応に通常必要とされる反応時間の間、反応溶液を十分に保持できる。フィルター５の膜厚が５ｍｍ以下であることにより、溶液を排出する際においても目詰まりを起こすことがない。
【００４８】
フィルター５は、上記孔径の好ましい条件と、上記膜厚の好ましい条件の両方を充足することがより好ましい。これにより、フィルター５の透水性及び溶液保持性能をより良好に維持することができる。
【００４９】
（フィルター５の材質）
前記フィルター５としては、特に限定されるものではないが、ガラスフィルター、ポリエーテルスルホンフィルター、親水性ポリプロピレンフィルター、又はナイロンフィルター等のフィルターを好適に用いることができる。これらのフィルターは、十分な強度を有するものであるため、フィルターの前後に圧力差を形成してもフィルターの濾過性能を損なうことがない。上記フィルター５としては、これらの中でもガラスフィルター及びナイロンフィルターが更に好ましい。
【００５０】
［溶液保持手段］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、フィルター５の溶液排出手段４側を加圧することによって、一以上の反応室２に注入された溶液を保持する溶液保持手段を更に備えていてもよい。フィルター５の溶液排出手段４側を加圧する手段としては、具体的には、配管の接続を切り替えることにより、上述したフィルターの溶液排出手段側を減圧する手段４１を図示しない加圧装置に接続し、フィルター５の溶液排出手段４側を加圧する手段を挙げることができる。ここで、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、所定の条件下、所定時間に亘って所定の溶媒を保持可能なフィルター５を用いているため、このような溶液保持手段を用いなくても反応溶液を十分に保持可能である。しかしながら、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１に溶液保持手段を設けることにより、上記フィルター５による溶液の保持性能を更に向上させることができる。
【００５１】
溶液保持手段を設ける場合において、フィルター５の溶液排出手段４側を加圧する際の圧力は、０．１Ｐａ以上０．５Ｐａ以下であることが好ましい。０．１Ｐａ以上であることにより、フィルター５の溶液の保持性能を十分に向上させることができる。また、０．５Ｐａ以下であることにより、フィルター５に過剰な負荷がかかることがなく、フィルター孔からバブルが発生することもない。
【００５２】
［溶液振とう手段］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、一以上の反応室２に注入された溶液を振とうする溶液振とう手段を更に備えていてもよい。ここで、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、反応室２の容積が比較的少量であるため、溶液振とう手段を設けなくとも、溶液中における溶質の拡散により、反応溶液が十分に均一化される。しかしながら、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１に溶液振とう手段を設けることにより、より短時間のうちに溶液を均一化できると共に、溶液の振とうに伴う撹拌効果により、反応効率を向上させることもできる。
【００５３】
溶液振とう手段は、反応室２に、反応室２全体を振とうさせる手段を接続することにより、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１に組み入れることができる。反応室２全体を振とうさせる手段としては、従来公知のボルテックスミキサー等において採用されるモーターを挙げることができる。
【００５４】
溶液振とう手段により反応室２を振動させる強度は、１０ｒｐｍ以上５０ｒｐｍ以下であることが好ましい。１０ｒｐｍ以上であることにより、反応室２内の溶液を十分に均一化させることができる。５０ｒｐｍ以下であることにより、過剰に振とうしすぎることによる溶液の飛散等を防止することができる。
【００５５】
［制御手段６］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、少なくとも溶液注入手段３及び溶液排出手段４を制御する制御手段６を更に備えていてもよい。また、この制御手段６は、必要に応じて設けられる溶液保持手段及び溶液振とう手段等を制御可能なものであってもよい。制御手段６としては、溶液注入手段３、溶液排出手段４、溶液保持手段、及び溶液振とう手段等に備えられる各種駆動機構と電源との接続／切断や、当該駆動機構の作動方法の制御等を行う電子計算機を挙げることができる。これらの制御手段６は、制御する対象となる各手段にそれぞれ独立に設けられていてもよいが、単一の制御手段６が統合して、制御する対象となる各手段を制御していることが好ましい。
【００５６】
［ペプチド回収手段７］
本発明の液相ペプチド合成用反応装置１は、ペプチド回収手段７を備えていてもよい。ペプチド回収手段７としては、特に限定されるものではないが、晶析分離用担体と第一のアミノ酸残基との間の結合を切断したあと、一以上の反応室２におけるペプチドを含有する溶液を、それぞれの反応室２に対応したウェルに回収する手段を挙げることができる。ペプチドを含有する溶液を各ウェルに回収するに当たっては、例えば、フィルター５の反応室２側を加圧することにより、ペプチドを含有する溶液をウェルに排出しやすくしてもよいし、図１に示されるように溶液排出手段４中にペプチドを回収する容器を設けて、フィルターの溶液排出手段４側を減圧しながらフィルター５から漏出する溶液を回収してもよい。
【００５７】
＜液相ぺプチド合成方法＞
本発明の液相ペプチド合成方法は、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１を用いて行われる方法であって、一以上の反応室２のそれぞれに、反応室２ごとに異なっていてもよい第一のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を注入する晶析分離用担体注入工程と、晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基と結合可能であり、反応室２ごとに異なっていてもよい第二のアミノ酸、及び反応溶媒を注入する第一の溶液注入工程と、反応室２内において、晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸とを反応させる第一の反応工程と、末端に第二のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を晶析させる第一の晶析工程と、末端に第二のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体が分散した溶液をフィルター５により濾過する第一の分離工程と、を有する。
【００５８】
また、本発明の液相ペプチド合成方法は、第一の分離工程の後に、各種試薬を注入する第二の溶液注入工程と、反応室２内において、晶析分離用担体の末端に結合した第二のアミノ酸残基及び第三のアミノ酸を反応させる第二の反応工程と、末端に第三のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を晶析させる第二の晶析工程と、末端に第三のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体が分散した溶液をフィルター５により濾過する分離工程と、を有する。
【００５９】
加えて、本発明の液相ペプチド合成方法は、アミノ酸が順次結合した晶析分離用担体において、第一のアミノ酸残基と晶析分離用担体との結合を切断する生成物回収工程を有する。
【００６０】
更に、本発明においては、晶析分離用担体注入工程の後、第一の溶液注入工程の前に、或いは、第一の分離工程の後、第二の溶液注入工程の前に、それぞれ第一の脱保護工程、或いは、第二の脱保護工程を有していてもよい。
【００６１】
［晶析分離用担体注入工程］
晶析分離用担体注入工程においては、溶液注入手段３によって、反応室２ごとに異なっていてもよい第一のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を含む溶液を反応室２内に注入する。
【００６２】
（晶析分離用担体）
晶析分離用担体としては、溶液組成及び／又は溶液温度の変化に伴い、液相状態から固相状態に可逆的に変化する化合物であれば、特に限定されるものではないが、国際公開ＷＯ２００６／１０４１６６号パンフレットに記載されている晶析分離用担体を好適に用いることができる。
【００６３】
具体的には、下記化学式（Ａ）から（Ｆ）で示されるものを挙げることができる。
【化１】
0004894047.tif 000002
（式中、
Ｘは、炭素、酸素、硫黄、及び、窒素原子から選ばれる１以上の原子であり、
Ｒ１からＲ３３は、同一でも異なっていてもよく、置換基を有してもよい炭素数１以上６０以下の炭化水素基、置換基を有してもよい炭素数１以上６０以下のアシル基、及び、水素、の群から選ばれるいずれかであり、
且つ、それぞれ、Ｒ１からＲ５の少なくとも１つ、Ｒ６からＲ１０の少なくとも１つ、Ｒ１１からＲ１６の少なくとも１つ、Ｒ１７からＲ２２の少なくとも１つ、Ｒ２３からＲ２７の少なくとも１つ、及び、Ｒ２８からＲ３３の少なくとも１つは、置換基を有してもよい炭素数８以上の炭化水素基、又は、置換基を有してもよい炭素数８以上のアシル基を示す。）
【００６４】
また、本発明の晶析分離用担体として、好ましい別の例としては、下記化学式（Ｇ）で示されるものを挙げることができる。
【化２】
0004894047.tif 000003
（式中、
Ｘは、炭素、酸素、硫黄、又は、窒素原子であり、
Ｙは、炭素、酸素、硫黄、及び、窒素原子から選ばれる１以上の原子を有する反応部位であり、
Ｒ３４は、炭素数１以上６０以下の炭化水素基であり、
ｎは、１以上５以下の整数を示す。）
【００６５】
（アミノ酸）
晶析分離用担体に結合させるアミノ酸としては、特に限定されるものではなく、従来公知のアミノ酸を用いることができる。そのようなアミノ酸としては、具体的には、アラニン、システィン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンを挙げることができる。例えば、ペプチド合成をＣ末端側からＮ末端側に進行させる場合、これらのアミノ酸のアミノ基及びその他の官能基は、保護基により保護されていることが好ましい。そのような保護基としては、具体的には、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、及びフルオロメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）等を挙げることができる。
【００６６】
［第一の脱保護工程、第二の脱保護工程］
本発明の液相ペプチド合成方法は、必要に応じて第一の脱保護工程及び第二の脱保護工程を有していてもよい。即ち、本発明において利用されるアミノ酸を意図した一次配列に従って重合させるため、少なくともＮ末端が保護基により保護されている。保護基により保護されたアミノ酸は、カルボキシル基とアミド結合を形成できないため、保護されたアミノ基に結合すべきアミノ酸を添加する直前に脱保護する必要がある。
【００６７】
脱保護を行う具体的な手法としては、反応室２に脱保護剤を注入して保護基を脱離させ、所定時間後に酸等を加えて脱保護剤を失活させると共に、脱保護されたアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を析出させて失活した脱保護剤を含む反応溶液を洗い流す手法を挙げることができる。
【００６８】
脱保護剤は、用いられる保護基の特性に応じて適宜、選択することが好ましいが、例えば、ピペリジン、モルホリン、及びジエチルアミン等の第２級アミン並びにその誘導体を挙げることができる。また、これらの脱保護剤を失活させるための酸としては、塩酸、ギ酸、及び酢酸を挙げることができる。これらの中でも、脱保護剤としてピペリジン、酸として塩酸を用いることが好ましい。
【００６９】
また、脱保護されたアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を析出させるための手法としては、溶液組成及び／又は溶液温度を変化させる手法を挙げることができる。このような手法としては、特に限定されるものではないが、後述する第一の晶析工程及び第二の晶析工程で採用される手法と同様の手法を採用することができる。
【００７０】
［第一の溶液注入工程、第二の溶液注入工程］
第一の溶液注入工程、及び第二の溶液注入工程においては、それぞれ、溶液注入手段３によって、晶析分離用担体の末端に結合したアミノ酸残基と結合可能であり、反応室２ごとに異なっていてもよいアミノ酸、及び反応溶媒を反応室２内に注入する。反応室２に注入するアミノ酸としては、上述したとおり、必要に応じて保護基により保護されていてもよいアミノ酸を加えることが好ましい。また、反応溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、ハロゲン化炭化水素、鎖状エーテル、環状エーテル、炭素原子数４以上４０以下の環状炭化水素又は鎖状炭化水素等を挙げることができる。より具体的には、例えば、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等を挙げることができる。これらは単独使用してもよく、これらの反応溶媒と、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカリン等とを併用してもよい。
【００７１】
反応溶媒に本発明の晶析分離用担体を溶解させるときの濃度は、用いる溶媒、晶析分離用担体の性質等に応じて適宜選択することが可能であるが、通常０．０１ｇ／ｍｌ以上０．１ｇ／ｍｌ以下である。
【００７２】
［第一の反応工程、第二の反応工程］
第一の反応工程、及び第二の反応工程においては、それぞれ、晶析分離用担体に結合した第一のアミノ酸残基及び第二のアミノ酸、並びに晶析分離用担体の末端に結合した第二のアミノ酸残基及び第三のアミノ酸を反応させる。このような反応を生起させる具体的方法としては、従来ペプチド合成反応の分野において採用されている公知の方法を採用することができるが、カルボジイミド法、酸無水物法、及び活性エステル法等を挙げることができる。これらの中でも、特に活性エステル法が好ましい。
【００７３】
第一の反応工程、及び第二の反応工程においては、必要に応じて、加熱、活性化剤の添加、及び振とう等を行うことが好ましい。これにより、液相ペプチド合成反応の進行を有効に促進することが可能である。液相ペプチド合成反応に用いることができる活性化剤としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、及び２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を挙げることができるが、これらの活性化剤に限定されるものではなく、これらに類似の活性化剤等、従来公知の活性化剤を用いることができる。
【００７４】
［第一の晶析工程、第二の晶析工程］
第一の晶析工程、及び第二の晶析工程においては、それぞれ、末端に第二のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体、及び末端に第三のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体を、結合を保った状態で晶析させる。第一の晶析工程、及び第二の晶析工程を実施するための具体的手法としては、晶析分離用担体に晶析対象となる化合物を結合させた状態を維持したままで晶析させることができれば、特に限定されるものではないが、例えば、溶液組成を変化させる手段及び／又は溶液温度を変化させる手段を挙げることができる。
【００７５】
（溶液組成を変化させる手段）
溶液組成を変化させる手段としては、晶析分離用担体が溶解する溶液の組成を変化させることのできる手段であれば、特に制限されるものではない。
【００７６】
本発明において、溶液組成を変化させる好ましい手段としては、例えば、反応溶液を構成し、晶析分離用担体を溶解するために用いられる溶媒への親和性の高い溶媒（析出用溶媒）を、更に添加する手段が挙げられる。親和性の高い溶媒としては、晶析分離用担体を溶解するために用いられた反応溶媒と同一の溶媒でも、異なった溶媒であってもよい。例えば、反応溶媒として、ジクロロメタン、テトラヒドロフランを単独使用した場合や、これらの反応溶媒と、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカリン等とを併用した場合には、親和性の高い溶媒として、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、メタノール等を用いることができる。
【００７７】
（溶液温度を変化させる手段）
溶液温度を変化させる手段としては、反応溶液の温度を変化させることのできる手段であれば、特に制限されるものではない。本発明においては、例えば、溶液を冷却する手段を挙げることができる。例えば、晶析分離用担体を溶解させる反応溶媒としてシクロヘキサンを用いた場合には、５℃まで冷却することにより、晶析させることが可能となる。また、溶液温度を変化させる手段として溶媒を冷却する手段を用いる場合には、ＯＤＳ粒子（オクタデシル基を表面に結合したシリカゲル）、カラズビース等の結晶化の核となるものを添加することにより、結晶成長を容易とすることが可能となる。
【００７８】
［第一の分離工程、第二の分離工程］
第一の分離工程、及び第二の分離工程においては、それぞれ、末端に第二のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体が分散した溶液、及び末端に第三のアミノ酸残基が結合した晶析分離用担体が分散した溶液を、フィルター５により濾過する。これらの溶液を濾過する際には、上述した溶液排出手段４を用いることができる。この際、フィルター５の溶液排出手段４側を減圧することが好ましい。
【００７９】
第一の分離工程及び第二の分離工程を行った後は、必要に応じて、それぞれ第二の溶液注入工程及び第三の溶液注入工程を行い、晶析分離用担体に結合したペプチドの末端に順次新たなアミノ酸を結合させることが好ましい。これにより、任意の鎖長と一次配列を有するペプチド鎖を合成可能である。
【００８０】
［生成物回収工程］
全てのアミノ酸を反応させることにより、目的とするペプチド鎖を晶析分離用担体上に形成させた後は、第一のアミノ酸残基と晶析分離用担体との結合を切断する。第一のアミノ酸残基と晶析分離用担体との結合を切断する具体的手法としては、使用する晶析分離用担体の種類によらず、酸処理法を採用することができる。酸処理法において用いる酸としては、トリフルオロ酢酸が挙げられる。
【００８１】
以上のように本発明の液相ペプチド合成用反応装置１及び液相ペプチド合成方法においては、ペプチド合成反応に晶析分離用担体を用いているので、反応効率が高く、液相反応の知見をそのまま利用することができる。また、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１及び液相ペプチド合成方法においては、２００μｌ以上２ｍｌ以下の比較的低容量の容積の反応室２を備えているため、多種類のペプチドを同時に合成する場合にも効率よく反応を進められると共に、溶質の拡散により、別途撹拌手段を設けることなく溶液を均一化することが可能である。更に、本発明の液相ペプチド合成用反応装置１及び液相ペプチド合成方法においては、所定のフィルター５を用いているため、ペプチド合成反応中における反応溶液の保持が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の液相ペプチド合成用反応装置の概略を示した図面である。
【符号の説明】
【００８３】
１      液相ペプチド合成用反応装置
２      反応室
３      溶液注入手段
３１    試薬混合部
３２    試薬瓶
３２ａ  試薬瓶（アミノ酸用）
３２ｂ  試薬瓶（脱保護剤、活性化剤、及び酸用）
３３    チップ
３４    マイクロピペッター
３５    ニードル
４      溶液排出手段
４１    フィルターの溶液排出手段側を減圧する手段
４２    濾液を回収する手段
５      フィルター
６      制御手段
７      ペプチド回収手段
【図１】
0004894047.tif 000004