(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多細胞生物の細胞のゲノムへ関心対象のポリヌクレオチド配列を部位特異的に組み込むインビトロの方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）第１の組換え部位及び関心対象のポリヌクレオチド配列を含む環状ターゲティング構築物、及び
（ｉｉ）改変された一方向部位特異的リコンビナーゼを細胞内へ導入する段階であって、ここで、該細胞のゲノムが該ゲノム固有の第２の組換え部位を含み、かつ、第１及び第２の組換え部位間の組換えが改変されたリコンビナーゼにより促進され、ここで、該第１の組換え部位がattB組換え部位であり、かつ、該第２の組換え部位が偽性（pseudo）-attP組換え部位である、段階
該第１および第２の組換え部位間の組換えを可能にする条件下で細胞を維持する段階であって、ここで、該組換えが改変されたリコンビナーゼによって媒介され、かつ、組換えの結果が細胞のゲノムへの関心対象のポリヌクレオチド配列の部位特異的組込みであり、ここで、該改変された一方向部位特異的リコンビナーゼが、配列番号：22、配列番号：23、および配列番号：24からなる群より選択されるポリペプチド配列からなり、かつ、インテグラーゼ活性を有するポリペプチド配列からなり、さらにここで、該改変された一方向部位特異的リコンビナーゼが、野生型の一方向部位特異的リコンビナーゼと異なるDNA結合特異性または活性のレベルを有し、かつ、偽性-attP組換え部位およびattB組換え部位間の組換えを媒介し得る、段階。
【請求項２】
前記改変された一方向部位特異的リコンビナーゼが、ポリペプチドとして細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変された一方向部位特異的リコンビナーゼが、前記改変されたリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドとして細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の組換え部位が前記ゲノムにおいて前もって選択された部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが制御領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記制御領域がプロモーターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号：22、配列番号：23、および配列番号：24からなる群より選択されるポリペプチド配列からなり、かつ、インテグラーゼ活性を有するポリペプチド配列からなる改変された一方向部位特異的リコンビナーゼであって、ここで、該改変された一方向部位特異的リコンビナーゼは野生型の一方向部位特異的リコンビナーゼと異なるDNA結合特異性または活性のレベルを有し、かつ、多細胞生物の細胞のゲノムに存在する偽性-attP組換え部位およびattB組換え部位間の組換えを媒介し得る、改変された一方向部位特異的リコンビナーゼ。
【請求項１０】
請求項９に記載の改変された一方向部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸。
【請求項１１】
真核細胞ゲノム内にDNA配列を導入する方法における、請求項９に記載の改変された一方向部位特異的リコンビナーゼ、または、請求項１０に記載の核酸のエクスビボの使用。
【請求項１２】
前記ゲノムが哺乳動物ゲノムである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
真核細胞ゲノム内にDNA配列を導入する方法における使用のための、請求項９に記載の改変された一方向部位特異的リコンビナーゼ、または、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１４】
前記ゲノムが哺乳動物ゲノムである、請求項１３に記載の使用のためのリコンビナーゼまたは核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、米国保健福祉省国立衛生研究所からNIH助成金R01DK55569及びR01DK58187に基づく援助を得て行なわれたものである。したがって、米国政府は、本発明に関し一定の権利を有することができる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野、より詳細には、ゲノム修飾の分野に関する。本明細書に開示されているのは、遺伝子導入細胞、組織、植物及び動物の生成のための、その組成物を含めた改変リコンビナーゼ、発現ベクター、及びその使用方法である。本発明の組成物、発現ベクター及び方法は同様に、遺伝子療法技術においても有用である。
【０００３】
発明の背景
導入（incoming）DNAをより高等な生物体の染色体の中に効率良く部位特異的に組込むことが現在不可能であるために、基礎及び応用生物学の進歩が妨げられている。最近になって、微生物から単離されたリコンビナーゼ酵素の高い効率及び密な配列特異性を利用する染色体組込み戦略が記述されてきている。特に、ΦC31インテグラーゼを含むファージインテグラーゼの1つのクラス（Kuhstoss, S., 及びRao, R. N., J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991); Rausch, H., 及びLehmann, M., Nucleic Acids Research 19, 5187-5189 (1991)）が哺乳動物において機能することが示されてきた（Groth, A. C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000 (2000)）。
【０００４】
このような部位特異的リコンビナーゼは、標準的に哺乳動物細胞の大型ゲノム内でさえ存在しない長いDNA認識部位を有する。しかしながら、最近になって、リコンビナーゼ偽性部位、すなわちリコンビナーゼのための野生型結合部位と著しい同一性度をもつ部位がこれらのゲノム内に存在することが実証されてきた（Thyagarajan, B.ら、Gene 244, 47-54 (2000)）。
【０００５】
本開示は、より高等な細胞の染色体の遺伝子工学処理においてさらに有効に使用できる改変リコンビナーゼを提供するためにリコンビナーゼの特異性を改変するための方法を開示する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、改変リコンビナーゼの同定、単離、クローニング、発現、精製及び使用方法に関する。一局面においては、本発明は、本発明の改変リコンビナーゼを用いて標的細胞のゲノム内に関心対象のポリヌクレオチド配列を部位特異的に組込む方法に向けられている。
【０００７】
一態様においては、本発明は、改変リコンビナーゼを同定する方法に関する。この方法では、内部の細胞が第1のプラスミド（例えば常在性プラスミド）を含んでいる1つの細胞集団が標準的に提供される。第1のプラスミドは、関心対象のコード配列に隣接する第2の組換え部位、それに隣接する転写ターミネーター、それに隣接する第1の組換え部位、またそれに隣接する転写プロモーター領域を含み得る。これらの構成要素の順序は、プロモーター-第1の組換え部位-転写ターミネーター-第2の組換え部位-関心対象のコード配列であり、第1及び第2の組換え部位は第1のリコンビナーゼの基質として作用し、関心対象のコード配列転写の読み過ごしは最小限におさえられるか又は本質的に解消される。プロモーターは細胞内で機能的であり、プロモーターと関心対象のコード配列の機能的な連結が2つの組換え部位間の組換え事象の結果もたらされる（すなわち、転写ターミネーターは除去される）。
【０００８】
細胞集団は、このとき第2のプラスミド（例えばクローニングプラスミド）の群（又は集団）で形質転換される。プラスミド群は、細胞内で機能的なプロモーターに機能的に連結された改変リコンビナーゼのコード配列を含む少なくとも1つの第2のプラスミドを含む。標準的には、該プラスミド群は、リコンビナーゼ又は突然変異誘発されたリコンビナーゼのシャッフリングされたライブラリーを表わす。このようなリコンビナーゼ変異体を生成する方法が、本明細書で記述されている。改変リコンビナーゼのための核酸コード配列は、標準的に第1のリコンビナーゼ（又は親リコンビナーゼ）のコード配列と少なくとも1つの塩基対が異なっており、この差異は、標準的に、改変リコンビナーゼ及び親リコンビナーゼのポリペプチドコード配列間の少なくとも1つのアミノ酸差異を発生させる。
【０００９】
細胞は、第1及び第2の組換え部位の間で組換えが発生することを可能にする条件下に維持され、この組換え事象は、改変リコンビナーゼによって媒介される。形質転換細胞の集団は、次に、関心対象のコード配列によってコードされる産物を同定するためにスクリーニングされる（又は遺伝子選択が適用される）。このような産物には、RNA産物又は最終的にはポリペプチド産物のような、スクリーニング又は選択によって同定可能な産物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。関心対象の配列によってコードされる産物を産生する細胞が次に単離され、これらの細胞によりコードされる改変リコンビナーゼのコード配列が次に単離され、同定される。
【００１０】
好ましい態様においては、改変リコンビナーゼは、第1のリコンビナーゼによって媒介される第1及び第2の組換え部位間の組換え頻度と比較して改善された第1及び第2の組換え部位間の組換え頻度を提供する。組換え頻度が低減されたか又は同等である変異体の同定も、本発明の方法を用いて可能である。
【００１１】
第1又は親リコンビナーゼは、例えば、ΦC31、TP901-1及びR4のような野生型ファージリコンビナーゼであり得る。本発明の方法においては、本発明の方法を用いて前もって行ったスクリーニングサイクルによって同定された改変リコンビナーゼを含めたその他のリコンビナーゼを、第1のリコンビナーゼとして使用することができる。さらに、複数の「第1の」リコンビナーゼを用いて改変リコンビナーゼを得ることもできる（例えばファミリーシャッフリング方法において）。
【００１２】
本発明で基質として用いられる組換え部位としては、野生型attB、野生型attP、偽性attB及び偽性attPが含まれるが、これらに限定されるわけではない。標準的には、組換え部位の少なくとも1つは、第1のリコンビナーゼのための基質を提供する。偽性部位は、本明細書記載の方法を用いて、ヒト及びげっ歯類の細胞を含むが、これらに限定されない、基本的にあらゆる標的細胞のゲノムにおいて同定され得る。
【００１３】
改変リコンビナーゼを同定する方法は、本明細書記載のようないくつかの細胞型において実施可能である。好ましい態様では、この方法は、細菌細胞において実施される。
【００１４】
関心対象のコード配列は、これらに限定されないが、βガラクトシダーゼのようなポリペプチド産物を含む、スクリーニング又は選択によって同定されうる産物をコードすることができる。その他のリポーターマーカーならびに選択可能なマーカーが本明細書に記載されている。
【００１５】
別の局面においては、本発明は、本発明の方法によって産生された改変リコンビナーゼに関する。標準的には、改変リコンビナーゼは、少なくとも1つのアミノ酸が第1のリコンビナーゼの野生型配列と異なり、第1のリコンビナーゼに比べ野生型又は偽性att部位配列に対する改善された組換え効率を有するポリペプチドを含む。上述のように、本発明の方法により同定される改変リコンビナーゼは、親リコンビナーゼに比べて増大した、減少した、又は同等の組換え効率を有する可能性がある。本発明の方法によって同定される改変リコンビナーゼの一例としては、配列番号：22、配列番号：23及び配列番号：24がある。本発明は、改変リコンビナーゼのポリペプチド配列をコードする核酸配列をも含んでいる。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、細胞のゲノム内に関心対象のポリヌクレオチド配列を部位特異的に組込む方法に向けられている。この方法は、（i）第1の組換え部位及び関心対象のポリヌクレオチド配列を含む環状ターゲティング構築物及び（ii）改変部位特異的リコンビナーゼを細胞内に導入する段階を含み、細胞のゲノムは、ゲノム固有の第2の組換え部位を含み、第1及び第2の組換え部位間の組換えは部位特異的リコンビナーゼにより促進される。細胞は、第1及び第2の組合せ部位間の組換えを可能にする条件下で維持され、組換えは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される。組換えの結果は細胞のゲノム内の関心対象のポリヌクレオチド配列の部位特異的組込みである。好ましい態様においては、細胞は真核細胞である。
【００１７】
改変リコンビナーゼを、細胞内に環状ターゲティング構築物を導入する前に、それと同時に、又はその後に導入してもよい。改変リコンビナーゼは例えば、改変リコンビナーゼをコードする（RNA又はDNAのような）核酸又はポリペプチドとして導入され得る。さらに、環状ターゲティング構築物は、細胞の複製起点及び/又は選択可能マーカーのようなその他の有用な構成要素を含むことができる。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本出願全体を通して、さまざまな出版物、特許及び公示済み特許出願は1つの識別用引用によって参照されている。本出願で参照されているこれらの出版物、特許及び公示特許は、本発明が関与する技術分野の現状をより完全に説明する一助となる。
【００１９】
本発明の実施においては、相反する指示のないかぎり、当技術分野内の分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えDNAの従来の技術が利用されることになる。例えば、サムブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）及び、マニアティス（Maniatis）の「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」第2版（1989）；「分子生物学における現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（F.M. Ausubelら編、1987）；「酵素学的方法（Methods in Enzymology）」シリーズ（Academic Press, Inc.）；PCR 2；「実践的アプローチ（A Practical Approach）」（M.J. McPherson, B.D. Hames 及び G.R. Taylor編, 1995）及び「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」（R.I. Freshney編, 1987）を参照のこと。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形態「a」、「an」及び「the」とは、内容が明らかに相反する事実を表わしているのでないかぎり、複数の言及をも含んでいる。したがって例えば「a plasmid」と言及する場合、これは2つ以上のこのようなプラスミドの混合物を含む。
【００２１】
1. 定義
「リコンビナーゼ」とは、そのリコンビナーゼによって認識される特異的DNA配列間の部位特異的組換えを媒介する酵素ファミリーのことである（Esposito, D.およびScocca, J.J., Nucleic Acids Research 25, 3605-3614 (1997)；Nunes-Duby, S.E.ら、Nucleic Acids Research 26, 391-406 (1998)；Stark, W.M.ら、Trends in Genetics 8, 432-439 (1992)）。
【００２２】
「改変リコンビナーゼ」とは、起源の生物体内で発見された天然の野生型リコンビナーゼ遺伝子の1つ以上の位置に変異を受けたリコンビナーゼ酵素を意味する。改変リコンビナーゼは、野生型酵素のものとは異なるDNA結合特異性及び/又は活性レベルを有する。このような改変結合特異性によって、リコンビナーゼが天然酵素とは異なる形で、所与のDNA配列と反応することが可能になり、一方改変活性レベルによって、リコンビナーゼがより高い又はより低い効率で反応することが可能になる。リコンビナーゼ反応は標準的に、認識配列に結合すること、及び切断と連結とを一斉に実施しその結果として2つの組換え認識部位間の鎖交換を得ることを含んでいる。
【００２３】
特に、関心対象のゲノム内で内因性配列を認識する改変リコンビナーゼが、本発明の1つの主題である。改変リコンビナーゼ内に存在する変異は、リコンビナーゼをコードするDNA配列内での塩基置換、欠失、添加及び/又はその他の再配置、及び/又はこのような突然変異の任意の組合せを、単独でか又は群で含む可能性がある。改変リコンビナーゼは、野生型酵素に比べ広い又は狭いDNA認識及び/又は、野生型又は非野生型リコンビナーゼ認識部位を含む特定のDNA配列に対するよりも高い又はより低い触媒活性を有する可能性がある。
【００２４】
「偽性部位」とは、認識部位が野生型リコンビナーゼ認識配列とは1つ以上の塩基対で異なり、かつ/又はリコンビナーゼのための野生型認識配列が常在するゲノムとは異なるゲノム内に内因性配列として存在する、リコンビナーゼ酵素により認識されるDNA配列である。
【００２５】
「偽性attP部位」または「偽性attB部位」とは、それぞれ、ファージインテグラーゼ酵素のための、野生型ファージ又は細菌付着部位配列と類似の偽性部位を意味する。「偽性att部位」とは、偽性attP部位又は偽性attB部位のいずれかを意味することのできるより一般的な用語である。
【００２６】
本明細書で用いられるように、ゲノム「固有の」組換え部位とは、1つの細胞のゲノム内に自然に発生する組換え部位を意味する（すなわち、この部位は、例えば組換え手段によってゲノム内に導入されていない）。
【００２７】
「核酸構築物」とは、自然には一緒に見出されない1つ以上の機能的単位を含むように構築された核酸配列を意味する。例としては、環状、2本鎖、染色体外DNA分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージからのCOS配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが含まれる。
【００２８】
「関心対象の核酸断片」とは、1つのゲノム内に挿入することが望まれるあらゆる核酸断片を意味する。関心対象の核酸断片の適切な例としては、治療用遺伝子、マーカー遺伝子、制御領域、形質産生断片などがある。
【００２９】
「治療用遺伝子」とは、タンパク質、機能的RNA（アンチセンス、ハンマーヘッドリボザイム）などを含めた、宿主に対し何らかの治療的恩典を提供する分子をコードする核酸配列である。周知の1つの例は、膵のう胞性繊維症膜内外伝導度調節（CFTR）遺伝子である。膵のう胞性繊維症における主な生理的欠陥は、肺を含む数多くの器官の上皮にわたる起電性塩素イオン分泌の欠損である。この障害の最も危険な様相の1つは、若年死を結果としてもたらす肺機能を漸進的に破壊する再発性気道感染サイクルである。膵のう胞性繊維症は、CFTR遺伝子内のさまざまな突然変異によって引き起こされる。膵のう胞性繊維症で発生する問題点は、単一の遺伝子における突然変異の結果もたらされることから、肺の上皮内への遺伝子の正常なコピーの導入によってこの疾病の治療を提供する又は遺伝子移入が永続的であった場合には治癒効果を提供する、という可能性がある。
【００３０】
単一の遺伝子内の突然変異の結果もたらされる（単一遺伝子病として知られる）その他の障害としては、α-1-抗トリプシン欠損症、慢性肉芽腫症、家族性高コレステロール血症、ファンコーニ貧血、ゴーシュ病、ハンター症候群、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症、重症複合型免疫欠損（SCID）-ADA、X連鎖SCID、血友病などがある。
【００３１】
その他の障害における治療的恩典は同じく、タンパク質をコードする治療用核酸を付加した結果として得ることができる。例えば、インターロイキン-2のような免疫調節用タンパク質をコードする核酸の付加は、異なるタイプの癌に罹患した患者にとっての治療的恩典をもつものでありうる。
【００３２】
関心対象の核酸断片は、さらには「マーカー核酸」又は「マーカーポリペプチド」であってもよい。マーカー遺伝子は、形質転換を受けた細胞内で容易に検出することができ、したがって、これらの細胞の研究において有用である。マーカー遺伝子は、例えば、骨髄再形成の生物学及び患者における再発のメカニズムを調査するため、骨髄移植研究において使用されている。適切なマーカー遺伝子の例としては、βガラクトシダーゼ、緑色又は黄色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼなどが含まれる。
【００３３】
関心対象の核酸断片は、さらには制御領域でもあり得る。「制御領域」又は「制御要素」という用語は、核酸断片（例えばDNA）に機能的に連結されそこからのタンパク質又はRNAの発現に関与する全ての核酸構成要素を含む。コード配列発現のために必要とされる制御（又は調節）領域の厳密な性質は、生体に応じて変動し得る。このような領域は標準的には、エンハンサー、TATAボックス、キャップ形成配列、CAAT配列などの転写及び翻訳の開始と関連するような5'非コード配列を含む。さらなる制御配列の例としては、複製、転写又は翻訳調節などを調節させるように機能するあらゆる配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例としては、プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、アテニュエーター配列、イントロンスプライス部位配列などが含まれる。
【００３４】
関心対象の核酸断片は、さらには形質産生配列であってもよく、これは、形質産生配列によってコードされるタンパク質が中で発現される生物体又は細胞に対して、何らかの非天然形質を付与する配列を意味する。「非天然」という用語は、形質産生配列といった意味合いで使用される場合、再生された形質が未修飾生物体内で見られるものとは異なるものであることを意味し、このことはすなわち、その生体が未修飾生体と比べて多い量の自然の物質を産生するか又は非自然物質を産生することを意味しうる。例えば、トウモロコシのような作物植物のゲノムは、必須アミノ酸をより大量に産生するように修飾され、こうしてより高い栄養をもつ植物を作り出すこともでき、そうでなければ、抗体のような、植物内で通常産生されないタンパク質を産生するように修飾されうる（米国特許第5,202,422号（1993年4月13日に発行）；米国特許第5,639,947号（1997年6月17日付け）を参照のこと）。同様にして、工業的に重要な微生物のゲノムを修飾して、例えば新規の代謝産物を産生するか又は抗生物質及び工業用酵素の産生のような新規及び既存の両方の工程を改善することを目的として新しい代謝経路を挿入するなどを行いこれらのゲノムをより有用なものにすることが可能である。その他の有用な形質は、除草剤耐性、抗生物質耐性、疾病耐性、不利な環境条件（例えば温度、pH、塩分、干ばつなど）に対する耐性が含まれる。
【００３５】
細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。「形質転換された」という用語は、外来性DNAを取込んだ結果としての細胞内の遺伝性改変を意味する。適切な方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、原形質体融合、電気泳動、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接的微量注射などが含まれる。方法の選択は一般に、形質転換を受けている細胞の型及び形質転換が起こっている状況（すなわちインビトロ、エクスビボ又はインビボ） によって左右される。これらの方法の一般的論述は、「分子生物学（Molecular Biology）」第3版 Wiley & Sons, 1995内のAusubelら、ショートプロトコルの中に見出すことができる。
【００３６】
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドといった任意の長さのヌクレオチドの重合体形態又はその類似体を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有することができ、そして既知のものであれ未知のものであれ、任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの制限的意味のない例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、有枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プロープ及びプライマーが含まれる。
【００３７】
ポリヌクレオチドは標準的には、アデニン（A）；シトシン（C）；グアニン（G）；及びチミン（T）（ポリヌクレオチドがRNAである場合にはチミン（T）に代ってウラジル（U））という4つのヌクレオチド塩基の特異的配列からなる。したがって、ポリヌクレオチド配列という用語は、1つのポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理ユニットをもつコンピュータの中のデータベース内に入力して、機能的にゲノミクス及び相同性検索といったバイオインフォマティクスのアプリケーションのために使用することができる。
【００３８】
「コード配列」又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列とは、例えば適切な調節配列（又は「制御要素」）の制御下に置かれた時点でインビボで1つのポリペプチド内に（DNAの場合は）転写され（mRNAの場合は）翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、標準的に、5'（アミノ）末端にある開始コドン及び3'（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、制限的な意味なく、ウイルス、原核又は真核生物mRNAからのcDNA、ウイルス又は原核生物のDNAからのゲノムDNA配列さらには、合成DNA配列を含み得る。転写終結配列は、コード配列の3'に位置づけされうる。その他の「制御要素」も同様に、コード配列と会合され得る。所望のポリペプチドコード配列のDNAコピーを表わすため選択された細胞により好まれるコドンを使用することによって、選択された細胞内の発現のため、ポリペプチドをコードするDNA配列を最適化することが可能である。
【００３９】
「〜によりコードされた」という用語は、ポリペプチド配列についてコードする核酸配列において、該ポリペプチド配列又はその一部分には核酸配列によりコードされたポリペプチドからの少なくとも3〜5個、より好ましくは少なくとも8〜10個、さらに好ましくは少なくとも15〜20個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が含まれる核酸配列を意味する。配列によってコードされたポリペプチドで免疫学的に同定可能であるポリペプチド配列も同時に含まれる。
【００４０】
「機能的に連結された」という用語は、このように記述された構成要素がその通常の機能を果たすことができるように構成されている要素の配置を意味する。したがって、コード配列に機能的に連結されている所与のプロモーター（例えばリポータ発現カセット）は、適正な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらす能力をもつ。プロモーター又はその他の制御要素は、コード配列の発現を導くように機能するかぎりコード配列と隣接する必要はない。例えば、未翻訳であるが転写されている介入配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在していてもよく、該プロモーター配列をなお、コード配列に「機能的に連結されている」とみなすことができる。
【００４１】
「ベクター」とは、標的細胞に対し遺伝子配列を移入する能力をもつ。標準的には、「ベクター構築物」「発現ベクター」及び「遺伝子移入ベクター」とは、関心対象の遺伝子の発現を導く能力をもち、標的細胞に対し遺伝子配列を移送できるあらゆる核酸構築物を意味する。したがって、この語は、クローニング及び発現担体ならびに組込みベクターを含む。
【００４２】
「発現カセット」とは、関心対象の遺伝子/コード配列の発現を導く能力をもつあらゆる核酸構築物を含む。このようなカセットは、発現カセットを標的細胞内に移入する目的で「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」又は「遺伝子移入ベクター」へと構築され得る。したがって、この語は、クローニング及び発現担体ならびにウイルスベクターを含む。
【００４３】
核酸及びアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術も同様に、当技術分野において既知である。標準的には、このような技術には、1つの遺伝子のためのmRNAのヌクレオチド配列を決定し、かつ/又は、それによりコードされたアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第2のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することが含まれる。一般に、「同一性」とは、それぞれ、2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸対応を意味する。2つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸は、その「同一性の割合」を決定することによって比較され得る。2つの配列の同一性の割合は、核酸又はアミノ酸配列のいずれであるかにかかわらず、2つの整列した配列間の正確な整合の数を、短い方の配列の長さで除し100を乗じたものである。核酸配列についてのおおよそのアラインメントは、Smith 及び Waterman の「応用数学における進歩（Advances in Applied Mathematics）」、2:482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって提供されている。このアルゴリズムは、Dayhoff「タンパク質配列及び構造地図（Atlas of Protein Sequences and Structure）」、M.O. Dayhoff編、別冊5、3:353-358, National Biomedical Research Fundation, Washington D.C., U.S.Aにより開発され Gribskov, Nucl. Acid Res 14 (6):6745-6763 (1986)によって正規化された評点マトリクスを使用することによってアミノ酸配列に応用することができる。1つの配列の同一性百分率を決定するためのこのアルゴリズムの実現例は、Genetics Computer Group (Madison, WI)によって「BestFit」ユーティリティアプリケーションにおいて提供されている。この方法についての省略時パラメータは、（Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能である）「Wisconsin配列分析パッケージプログラムマニュアル（the Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual）」、第8版（1995）の中で記述されている。本発明の状況下で同一性百分率を確立する1つの好ましい方法は、Joh F, Collins及びShane S. Sturrokによって開発され、IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)によって販売されているエジンバラ大学が版権をもつプログラムのMPSRCHパッケージを使用することである。このパッケージソフトから、（例えばギャップオープンペナルティ12、ギャップ拡張ペナルティ1、及びキャップ6といった）評点表のために省略時パラメータが用いられるSmith-Watermanアルゴリズムを利用することができる。産生されたデータから、「整合」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性又は類似性の割合を計算するためのその他の適切なプログラムが一般に当技術分野で知られており、例えばもう1つのアラインメントプログラムは、省略時パラメータと共に用いられるBLASTである。例えば、以下の省略時パラメータを用いて、BLASTN及びBLASTPを使用することができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ（値）＝60；予想値＝10；マトリクス＝BLOSUM62；記述＝50配列；分類基準=高評点；データベース＝非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+Swiss タンパク質+Spupdate+PIR。これらのプログラムについての詳細は、以下のインターネットアドレスで見出すことができる：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
【００４４】
または、相同性は、相同な領域間の安定した2重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションならびに、それに続く1本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化及び消化された断片のサイズ決定によって決定できる。上述の方法を用いて決定されるように、分子の規定の長さ全体にわたって、配列が少なくとも約80％〜85％、好ましくは少なくとも約85％〜90％、より好ましくは少なくとも90％〜95％、そして最も好ましくは少なくとも約95％〜98％を示す場合、2つのDNA又は2つのポリペプチド配列は、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用される実質的に相同であるという用語はまた、特定されたDNA又はポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列も意味する。実質的に相同なDNA配列は、その特定の系について定義されているように、例えばストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義づけすることは、当技術分野内である。例えば、サムブルック（Sambrook）ら前出；「DNAクローニング（DNA  Cloning）」、前出；「核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」、前出、を参照のこと。
【００４５】
2つの核酸断片は、本明細書で記述されている通り「選択的にハイブリダイズする」ものとみなされる。2つの核酸分子の間の配列同一性度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率及び強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、完全に同一の配列が標的分子に対しハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害することになる。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野において周知のものであるハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて査定することができる（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど。Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」、第2版（1989）Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。このようなアッセイ法は、例えば低いストリンジェンシーから高いストリンジェンシーへと変動する条件を用いて、変動する選択度を用いて行なうことができる。低いストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の欠如は、部分的な配列同一性度さえもたない二次プローブ（例えば標的分子と約30％未満の配列同一性をもつプローブ）を用いて査定でき、そのため非特異的結合事象が起こらない場合、二次的プローブは標的に対しハイブリダイズしないと考えられる。
【００４６】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用する場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブが選ばれ、次に適切な条件を選択することによりプローブ及び標的配列は互いに「選択的にハイブリダイズする」か、又は結合してハイブリッド分子を形成する。「中等度のストリンジェンシー」下で標的配列に選択的にハイブリダイズする能力をもつ核酸分子は、選択された核酸プローブの配列を少なくとも約70％の配列同一性をもち長さが少なくとも10〜14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下で一般的にハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、標準的に、選択された核酸プローブの配列と約90〜95％を上回る配列同一性をもち長さが少なくとも約10〜14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ及び標的が特定の配列同一性度をもつプローブ/標的ハイブリダイゼーションにとって有用なハイブリダイゼーション条件を、当技術分野において既知のとおりに決定することができる（例えば「核酸ハイブリダイゼーション；実践的アプローチ（Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach）」編集；B.D.Hames 及びS.J. Higgins, （1985年）Oxford；Washington, DC;IRL Press）。
【００４７】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関しては、例えば、プローブ及び標的配列の長さ及び性質、さまざまな配列の塩基組成、塩及びその他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液内の遮断剤の有無（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン及びポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度及び時間的パラメータならびに変動する洗浄条件といった要因を変動させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために、数多くの等価の条件を利用することができるということは周知である。特定のハイブリダイゼーション条件セットの選択は、当技術分野における標準的方法に従って行なわれる（例えばSambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）（英）」、第2版（1989年）Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。
【００４８】
第1のポリヌクレオチドは、それが第2のポリヌクレオチドの一領域、そのcDNA、その補体と同じ又は実質的に同じ塩基対配列を有する場合、又は、上述の通りの配列同一性を示す場合、第2のポリヌクレオチド「に由来する」。
【００４９】
第1のポリペプチドは、それが（i）第2のポリヌクレオチドに由来する第1のポリヌクレオチドによってコードされている場合又は（ii）上述のように第2のポリペプチドに対する配列同一性を示す場合、第2のポリペプチド「に由来する」。
【００５０】
本発明においては、リコンビナーゼが「ファージに由来する」場合、そのリコンビナーゼはファージ自体から明確に産生される必要はなく、ファージは単純にリコンビナーゼ及びそのコード配列のもとの供給源であるとみなされる。例えば、当技術分野において既知の方法によって、組換えによってあるいは合成的にリコンビナーゼを産生させてもよく、ファージに感染した細菌培養からリコンビナーゼを精製することもできる。
【００５１】
「実質的に精製された」という用語は一般的に、物質が残存している試料の大部分をその物質が構成するような、1つの物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）の単離を意味する。典型的には、試料中で、実質的に精製された成分は、試料の50％、好ましくは80％〜85％、より好ましくは90％〜95％を構成する。関心対象のポリヌクレオチド及びポリペプチドを精製するための技術は当技術分野において周知であり、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び密度に応じた沈降が含まれる。
【００５２】
2. 発明を実施する形態
A. 発明の一般的概観
ゲノム修飾のためにファージインテグラーゼのような部位特異的リコンビナーゼをより効率良く使用するため、それらの配列認識特性は、それらが望ましい場所で関心対象の真核生物ゲノム内に存在する偽性部位配列を有効に認識するような形で改変させる。これらの偽性部位配列はこのとき、導入されたDNAの染色体への組込み及び安定した発現のための場所として使用される。この開示は、ΦC31インテグラーゼのようなリコンビナーゼの特異性を改変し、こうしてこれらの改変リコンビナーゼをより高等な細胞の染色体の遺伝子工学処理において使用できるようにする方法を識別する。このようなゲノム修飾は、遺伝子導入細胞、組織、動物及び植物を生成するために有用であり、同様に遺伝子療法技術においても有用である。
【００５３】
一つの態様においては、本明細書で開示された発明は、関心対象の標的ゲノム内への部位特異的組込みを得るための方法を提供する。この方法において、関心対象のDNA配列は、改変リコンビナーゼのための認識部位を有する環状DNA分子上に存在する。このDNAは、改変リコンビナーゼと共に1つの細胞内に導入される。改変リコンビナーゼのための認識部位を有する環状DNA分子と改変リコンビナーゼによっても認識される細胞ゲノムの中に存在する、天然DNA配列の間で部位特異的組換えが起こり、結果として細胞ゲノム内への関心対象のDNA配列の部位特異的組込みがもたらされる。
【００５４】
または、部位特異的組換えは、改変リコンビナーゼのための認識部位を有する環状DNA分子とゲノム内に挿入された野生型att部位又は偽性att部位のいずれかである認識部位の間で起こることもできる。認識部位のこのような位置づけは、改変部位特異的リコンビナーゼにより媒介された、さらなる組込み事象のための標的として使用するために有用である。
【００５５】
充分な効力と有利な場所を有する自然に発生する偽性部位が稀少なものであることから、標的ゲノム（例えば高等真核生物のゲノム）の中の所望の組込み場所を査定するためにリコンビナーゼ酵素の特異性及び/又は効率を改変させる能力が、ゲノム修飾のリコンビナーゼ戦略を効率良く使用するために重要なものとなっている。このような戦略においては、非同一性付着部位間の一方向組換えを実施し、かつ宿主補因子を必要としないバクテリオファージのインテグラーゼΦC31のようなリコンビナーゼ（Thorpe, H.M., 及びSmith, M.C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505-5510 (1998); Thorpe, H.M.ら、Molecular Microbiology; 38, 232-241 (2000)）が特に有用である。
【００５６】
ΦC31インテグラーゼのようなファージインテグラーゼ酵素のための結合部位は、従来よりattB及びattP（すなわちインテグラーゼの標的部位）と呼ばれている。これらの部位は、約34〜40塩基対（bp）という最小限の長さを有する（Groth, A.C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000 (2000)）。これらの部位は一般的に、以下の通りに配置される。AttBは、attB5'-コア領域-attB3'という相対的順序で、第1のDNA配列attB5'、コア領域及び第2のDNA配列attB3'を含み、（ii）attPは、attP'-コア領域-attP3'という相対的順序で、第1のDNA配列（attP5'）、コア領域及び第2のDNA配列（attP3'）を含み、（iii）リコンビナーゼは、リコンビナーゼのための基質としてもはや作用できない組換え産物部位の産生を媒介し、この組換え産物部位は、例えば、attB5'-組換え-産物部位-attP3'及びattP5'-組換え-産物部位-attB3'という相対的順序を構成する。本発明の実施においては、このようなインテグラーゼは、例えば未修飾リコンビナーゼの固有のattB又はattP標的部位のいずれかに関連する、ゲノム配列といった固有の配列を認識するような形で改変される。したがって、改変リコンビナーゼのための標的配列は、偽性att部位と呼ばれる。このような偽性att部位は、組込みが望まれる細胞ゲノム内に存在する。
【００５７】
したがって、一つの態様において、本発明は、真核細胞のゲノム内に関心対象のポリヌクレオチド配列を部位特異的に組込む方法に向けられている。方法は、（i）第1の組換え部位及び関心対象のポリヌクレオチド配列を含む環状ターゲティング構築物及び（ii）改変部位特異的リコンビナーゼを真核細胞内に導入する段階であって、細胞のゲノムがゲノム固有の第2の組換え部位（すなわち偽性att部位）を含み、第1及び第2の組換え部位間の組換えが改変部位特異的リコンビナーゼにより促進される段階を含む。細胞は、第1及び第2の組合せ部位間の組換えを可能にする条件下で維持され、組換えは改変部位特異的リコンビナーゼによって媒介される。組換えの結果は、真核細胞のゲノム内のポリヌクレオチド配列の部位特異的組込みである。
【００５８】
改変リコンビナーゼは、環状ターゲティング構築物の導入の前、それと同時に、又はその後に細胞内に導入され得る。さらに、環状ターゲティング構築物は細菌複製起点及び/又は選択可能マーカーのようなその他の有用な構成要素を含むことができる。
【００５９】
さらにもう一つの態様においては、改変部位特異的リコンビナーゼは、ΦC31、TP901-1及びR4からなる群より選択されるファージによって、本来コードされたリコンビナーゼである（「親」リコンビナーゼ；例えばΦC31、Kuhstoss and Rao, J. Mol. Biol. 222: 897-908, 1991；TP901-1,Christiansenら、J. Bact. 178: 5164-5173, 1996；R4,Matsuuraら、J.Bact. 178: 3374-3376, 1996）。改変リコンビナーゼは、本明細書で記述された方法によりこれらのリコンビナーゼの各々から生成することができる。さらに、異なる親リコンビナーゼからの配列を組み合わせる改変リコンビナーゼも産生でき、それらの活性は、本明細書に記述された方法によって最適化される。全長ΦC31attP及びattB部位は、図11A及び11Bに示されている。R4attB及びattP部位は、図12A及び12Bに示されている。
【００６０】
改変リコンビナーゼは、例えば以下のような第1及び第2の組換え部位間の組換えを促進することができる：（a）細菌ゲノム組換え部位（attB）及び偽性ファージゲノム組換え部位（pseudo-attP）；（b）偽性-attB部位及びattP部位；又は（d）偽性-attB部位及び偽性-attP部位。これらの部位は、天然に発生する配列又は偽性配列のいずれかについて、以下のように記述することができる。
【００６１】
改変リコンビナーゼは、ポリペプチドとして標的細胞内に導入され得る。別の態様においては、改変リコンビナーゼは、改変リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド及び、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、選択的には一過性の発現ベクター上に保持された発現カセットとして細胞内に導入される。
【００６２】
もう1つの態様においては、本発明は、真核細胞のゲノム内にポリヌクレオチド配列を部位特異的に組込むためのベクターに向けられている。ベクターは、（i）環状バックボーンベクター、（ii）真核生物プロモーターに機能的に連結された関心対象のポリヌクレオチド及び（iii）第1の組換え部位を含み、細胞のゲノムは、ゲノム固有の第2の組換え部位を含み、第1及び第2の組換え部位間の組換えは、改変リコンビナーゼによって促進される。
【００６３】
B. 組換え部位
本発明者らは、天然の組換え部位が（所与のリコンビナーゼについて）必ずしも野生型組換え配列と同一のヌクレオチド配列をもたないものの、このような天然の組換え部位がそれでもリコンビナーゼにより媒介された組換えを促進するのに充分なものであるような、さまざまな生体のゲノム内に存在する天然の組換え部位を発見した。本明細書内においてこのような組換え部位配列を「偽性組換え配列」と呼ぶ。
【００６４】
本発明の実施にあたっては、改変リコンビナーゼの生成において、野生型組換え部位及び偽性組換え部位を利用することができる。例えば、実施例1及び2を参照のこと。
【００６５】
偽性組換え配列の同定は、例えば問い合わせ配列が関心対象の組換え部位である（例えばattP及び/又はattB）配列アラインメント及び分析を用いることによって達成可能である。
【００６６】
標的細胞ゲノムは、例えば、ΦC31又はR4のattP及び/又はattBといった所与のリコンビナーゼについて、選択された組換え部位との配列同一性をもつ配列に関して検索され得る（例えば図11A、11B、11C、12A及び12B）。例えば核酸配列データベースをコンピューターで検索することが可能である。ジェネティクスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）（GCG；Madison, WI）によって開発されたウィスコンシンソフトウェアパッケージ（Wisconsin Software Package）Version9.0のfindpatternsアルゴリズムは、GenBank データベース内の全ての配列をスクリーニングするのに用いられるプログラムの一例である（Bensonら、1998, Nucleic Acids Res. 26. 1-7）。この局面においては、標的細胞内で偽性組換え部位を選択する場合、標的細胞のゲノム配列を、特定のリコンビナーゼ又は改変リコンビナーゼと会合したattP又はattB配列のいずれかを用いて適切な偽性組換え部位について検索することができる。これらの組換え配列内で許容されうる非相同性の量及び機能的サイズは、例えば、本発明の改変リコンビナーゼを用いてターゲティング構築物の組込み効率を評価することにより、経験的に評価することができる（組込み事象を評価する方法の例については、2000年3月2日に公開された国際公開広報第00/11155号を参照のこと）。
【００６７】
機能的偽性部位も、経験的に見出すことができる。例えば、本発明の裏づけとして実施された実験は、ΦC31インテグレーゼを発現するプラスミドと共にネオマイシン耐性遺伝子及びΦC31attBを有するプラスミドをヒト細胞内に同時トランスフェクションした後、attB又はインテグラーゼ遺伝子のいずれかが省略された同時トランスフェクションと比べて得られるネオマイシン耐性コロニーの数が増大することを示した。これらのコロニーの大部分は、天然偽性attP部位内への組み込みを反映していた。このような部位は、例えば、プラスミドレスキューによって回収され、DNA配列レベルで分析され、例えばyAのようなヒトゲムノから偽性attP部位のDNA配列を産生する（図13）。偽性部位の同定のためのこの経験的方法は、たとえリコンビナーゼ認識部位及びそれらに結合するリコンビナーゼの性質についての知識が未知である場合でさえ、使用可能である。
【００６８】
（ヒト又はマウスのような）標的ゲノム内で偽性組換え部位が（attB又はattB検索配列のいずれかを用いて）同定された場合、その偽性組換え部位を、改変リコンビナーゼを生成する目的で本発明の方法において使用することができる。例えば、このような偽性組換え部位は、図1Aで示された常在性ベクター内でattP又はattB部位のいずれかとして使用できる。
【００６９】
このとき、改変リコンビナーゼと共に利用すべきターゲティング構築物の中で、偽性組換え部位に対するattP又はattB部位を使用することが可能である。例えば、選択されたリコンビナーゼのためのattPが標的細胞ゲノム内の偽性組換え部位を同定するために使用される場合には、ターゲティング構築物内で野生型attB配列を使用することができる。別の実施例においては、選択されたリコンビナーゼのためのattBが標的細胞ゲノム内の偽性組換え部位を同定するために使用される場合には、ターゲティング構築物の中で野生型attPを使用することが可能である。
【００７０】
本発明により考慮されているターゲティング構築物は、以下で論述されているように、制御配列、マーカー配列、選択配列などのような付加的な核酸断片を含むことができる。
【００７１】
本発明の一つの局面においては、天然リコンビナーゼ（例えばΦC31）は、組換え部位の5'領域の配列が組換え配列の3'領域の配列と異なる可能性のある1つの組換え部位を認識する（ΦC31、Kuhstoss, S., 及びRao, R.N., J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991)）。例えば、ファージΦC31attP（ファージ付着部位）について、コア領域は5'-TTG-3'であり、いずれかの側にある隣接配列は、本明細書内においてattP5'及びattP3'として表現されており、attP組換え部位の構造は、したがってattP5'-TTG-attP3'である。これに対応して、天然細菌ゲノム標的部位（attB）について、コア領域は5'-TTG-3'であり、いずれかの側の隣接配列は本明細書内においてattB5'及びattB3'として表現されており、attB 組換え部位の構造は、したがってattB5'-TTG-attB3'である。単一部位のΦC31インテグラーゼ媒介型組換え事象が発生した後、結果は、以下の組換え産物である：attB5'-TTG-attP3'｛ΦC31ベクター配列｝attP5'-TTG-attB3'。標準的には、組換えの後、組換え後組換え部位はもはやΦC31リコンビナーゼのための基質として作用できない。この結果、ほとんど又は全くリコンビナーゼ媒介型切除のない安定した組込みがもたらされる。
【００７２】
C. 改変リコンビナーゼ
タンパク質の構造及び機能、並びに、タンパク質を改変させる方法の研究は、近年進展した。改変酵素を作製及びスクリーニングするための興味深い戦略により、見事な結果がもたらされた。特に、タンパク質の変異体の大量のプールを作製し、所望の機能についてそれらをスクリーニングする戦略は、成果があった。
【００７３】
DNA配列を認識する酵素の特異性を改変するためには、これらの戦略は大々的に適用されていない。リコンビナーゼ酵素に関して、Creリコンビナーゼ及びその関連FLPは、いくつかの修飾研究の主題であった。例えば、37℃で天然酵素よりも良好に機能する、無作為なFLP変異体が選択された（Buchholz, Fら、Nature Biotechnology 16, 657-662 (1998)）。DNA結合特性を改変したCreの変異体も作製された（Hartung, M、及びKisters-Woike, B. J. Biol. Chem. 273, 22884-22891 (1998)）。ファージλインテグラーゼの結合特異性を、密接に関連したファージHK022インテグラーゼの結合特異性に変化する変異も報告されている（Dorgai, L.ら、J. Molec. Biol. 22, 178-188 (1995); Yagil, E.ら、J. Molec. Biol. 252, 163-177 (1995)。いかなる場合においても、リコンビナーゼのDNA結合特異性は、内因性真核生物ゲノム配列の結合特異性に一致するようには変化させなかった。
【００７４】
効果的であったタンパク質を改変させる興味深い戦略は、Stemmerにより開発されたDNAシャッフリングプロトコルである。この戦略により、スクリーニング可能となる変異体、すなわち改変タンパク質の数は最大となる（Stemmer, W. P. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751 (1994); Stemmer, W. P. C., Nature 370, 389-391 (1994)）。対象となる遺伝子の変異体の大量のプールは、DNaseI断片化の後、シャッフリング及びPCRによる再構築を含む手順により作製される。
【００７５】
シャッフリングプロトコルは、各々が異なる変異を有する、多くの分子間の配列ブロックの組換えを含むために他のアプローチよりも有効であるように思われる。それ故、この方法は、組合せ的であり、エラープローン（error-prone）PCR又はカセット変異誘発などの単なる線形な方法よりも、はるかに多くの配列空間をサンプリングする。（例えば、以下の米国特許参照：米国特許第5605793号、インビトロでの組換え法；米国特許第5811238号、反復選択及び組換えにより所望の特徴を有するポリヌクレオチドを作製する方法；米国特許第5830721号、無作為断片化及び再構築によるDNA変異誘発；米国特許第6117679号、反復選択及び組換えにより所望の特徴を有するポリヌクレオチドを作製する方法）。
【００７６】
DNAシャッフリングを実施するために、関心対象の遺伝子を最初にPCRにより増幅する。その後、この断片のプールをDnaseIで消化して、無作為断片を作製する。その後、例えば10bp〜50bp長の断片の集合を、プライマーを加えないPCRにかける。断片内の相同領域をアニーリングして、PCR反応を開始させて、結果として遺伝子を再構築する。その後、プライマーを加えて、再構築した産物を集め、これをクローニングして、シャッフリングしたライブラリーを形成する。このライブラリーは、PCR断片に存在する全ての基となる変異とともに結合された多種多様の配列の組合せを含む。この手順は、異なる親分子に由来する配列ブロックを有する、多種多様な分子のプールを作製するのに非常に効果的である。理論的に設計するのは困難であると考えられる、タンパク質構造及び/又は挙動において複雑な変化が必要とされる状況では特に効果的である。
【００７７】
単一又は複数の起源由来の配列をシャッフリングすることができる（実施例1及び4参照）。
【００７８】
本発明において、シャッフリングプロトコルを使用して、改変リコンビナーゼを作製した。本発明において重要なことは、効果的な遺伝子スクリーニングと組み合わせてシャッフリングプロトコルを使用して、所望の改変リコンビナーゼを同定する。
【００７９】
改変インテグラーゼを得る方法を実施例に記載する。ファージΦC31のインテグラーゼに加えて、他のインテグラーゼも、シャッフリング及びスクリーニングプロトコルの基質として作用する。本発明を支持して実施された実験により、ファージR4（Matsuura, Mら、J. Bacteriology 178, 3374-3376 (1996); Shirai, M.ら、J. Bacteriology 173, 4237-4239 (1991)）及びTP901（Brondsted, L.及びHammer, K. Applied and Environmental Microbiology 65, 752-758 (1999); Christiansen, B.ら、J. Bacteriology 178, 5164-5173 (1996); Christiansen, B.ら、J. Bacteriology 176, 1069-1076 (1994)）由来のインテグラーゼはヒト細胞で十分に作用することが示された。これらのインテグラーゼ及びそれらに類似する他のものも、本発明の方法により改変できる。
【００８０】
本発明を支持して実施した実験により、ファージインテグラーゼ酵素のattB及びattPに類似する配列である偽性att部位が、ヒト及びマウスゲノムに存在することが実証された。具体的には、ファージΦC31リコンビナーゼは、染色体外ベクター上のattB及びattPファージ付着部位で、ヒト細胞環境で効率的な組込みを媒介することが示された。さらに、本発明を支持して実施した実験により、ヒト及びマウス染色体の種々の位置で挿入したファージattP部位は、正確な部位特異的組込みの効率的な標的として作用することが実証された。さらに、ヒト及びマウスゲノムの偽性attP部位も、効率的なリコンビナーゼ媒介組込みを媒介することが示された。このゲノム部位は、attPに対して部分的な配列同一性を有することが示された。これらの部位は、天然に生じる組込み標的を構成する。しかし、このゲノム部位での組込み頻度により、ゲノム部位は、野生型att部位よりも、インテグラーゼに対する親和性が低い可能性があることが示唆される。
【００８１】
これらの研究により、ΦC31インテグラーゼにより認識され、attB部位を有するプラスミドのインテグラーゼ媒介組込みの部位として作用する、標的ゲノム中の天然配列の階層が存在することが判明した。これらの天然配列を、ゲノムDNAから回収し、DNA配列レベルで解析した。これらのデータにより、ゲノム部位は、attPと有意な同一性を有し、attB部位を有するプラスミドの組込みを媒介するためにΦC31インテグラーゼにより使用されることが判明した。これらの天然配列は、偽性attP部位と称する。
【００８２】
ヒトΨAと呼ばれる、ヒトゲノム中の偽性attP部位の1つは、組込み部位として優先的に使用されることが判明した。数個の他のヒト偽性部位も、酵素により反復使用された。ヒトゲノム中の偽性attP部位の総数は不明であるが、102の次数のようである。
【００８３】
マウスゲノムへの組込みの類似した研究により、類似の結果が得られたが、どの偽性部位も、ヒトΨAほど優勢ではなかった（図13）。これらの実験により、Creリコンビナーゼを用いた初期の研究が確認され（Thyagarajanら、Gene 244: 47-54 (2000)）、これにより30bp〜40bp長の範囲の認識部位をもつ部位特異的リコンビナーゼは、酵素による組込みに使用できる野生型認識部位に対して部分的同一性をもつ天然ゲノム部位を有することが示唆された。ヒト及びマウスゲノム中の偽性attP部位の数により、酵素は、他の脊椎動物、昆虫、蠕虫及び植物のゲノムなどのように、同様に多くの他の真核生物ゲノム中にも認識部位を有する可能性があることが示唆される。
【００８４】
これらの偽性att部位及び関連配列は、改変リコンビナーゼを作製するための、以下に記載した方法に関する出発物質として使用される。本明細書に開示した方法は、選択した偽性att部位に対する特異性が増強又は減少した、新規の改変インテグラーゼ酵素を生じる。例えば、実施例1記載の方法では、偽性att部位を、例えば、常在性プラスミド中のattB部位として使用できる。
【００８５】
本発明の1つの局面において、大腸菌での組込み効率についての遺伝子スクリーニングを使用して、ファージインテグラーゼなどの改変リコンビナーゼを同定した。例示的スクリーニングでは、細菌コロニーで起こる組込み頻度は、特定の偽性attP又はattB配列を組換え用の基質として使用する場合、Xgalプレート上の青さの程度により決定した。このアッセイ法を使用して、ヒトゲノム中の特定の偽性att部位を優先的に認識し（実施例1）、しばしば同時に、存在し得る他の偽性att部位に対する親和性を欠失している、改変インテグラーゼを見出した。このように、組込みは、良好な遺伝子発現及び天然遺伝子の破壊がないことなどの、望ましい特性を有する好ましい染色体位置上に焦点化している。
【００８６】
このアッセイ法で、組換えに関して試験される2つのatt部位を、大腸菌に存在するプラスミド（図1A；常在性プラスミド）上でクローニングする。2つのatt部位は、転写終結シグナルを含むスタッファー領域だけ離れている。att部位には、プロモーターを含まないlacZのコード領域が隣接する。分子内組込み反応により、lacプロモーターはlacZに回復し、これによりXgalプレート上に青色が生じる。常在性プラスミドは、温度感受性型lacI及び温度感受性複製起点を有する。これらの要素は両方共、37℃での増殖中に比較的不活性である。本発明の方法では、各細胞集団が常在性プラスミドを含む、細胞集団を提供し得る。記載したように、常在性プラスミドは、典型的には、スクリーニングに使用する細胞内で機能的なプロモーターを含み、これは、転写終結因子に隣接する第一の組換え部位に隣接し、これは、第二の組換え部位に隣接し、関心対象のコード配列に隣接している。したがって、常在性プラスミドのこれらの成分の典型的な順序は、プロモーター第一の組換え部位（例えば、attP又は対応する偽性部位）-転写終結因子（リードスルー転写を遮断するのに有効な1つ以上の転写終結配列）-第二の組換え部位（例えばattB又は対応する偽性部位）-関心対象のコード配列（例えば、マーカー又は選択コード配列）である。関心対象のコード配列は、多くの異なる産物（例えば機能的RNA及び/又はポリペプチド、以下参照）をコードし得る。関心対象のコード配列から産生された産物は、スクリーニング及び/又は選択に使用する。
【００８７】
クローニングプラスミド（図1B；クローニングプラスミド）は、シャッフリングしたインテグラーゼ遺伝子のレシピエントであり、そのlacプロモーターが抑制されていない場合にはインテグラーゼを産生する。したがって、クローニングプラスミドは、通常、各プラスミドが少なくとも1つのシャッフリングしたインテグラーゼ遺伝子を含む、プラスミド集団（又は群）であり、複数の異なるシャッフリングした遺伝子が群で示される。シャッフリングした遺伝子（すなわち改変リコンビナーゼ）は、スクリーニングに使用する標的細胞で機能的なプロモーターに作動可能に連結している。
【００８８】
アッセイ法を実施するために、リコンビナーゼ（例えばファージインテグラーゼ）断片を単離し、シャッフリングにかける。シャッフリングするために、例えば、遺伝子を有する制限断片をゲルで精製し、DNaseIで消化する。10〜50bpの断片をゲルで精製し、プライマーを用いずに複数サイクルのPCRにかける。最後に、プライマーを用いるPCRを実施する。得られた変異インテグラーゼ遺伝子のプールを、クローニングプラスミドにライゲーションする。ライゲーション混液を、常在性プラスミドを含む細菌に形質転換し、形質転換した細胞を、適切な条件下で維持し、例えば、カナマイシン、テトラサイクリン、及びXgalを含むプレート上に塗布し、30℃で増殖させる。これらの条件下で、インテグラーゼ遺伝子は発現されない。これは、lacリプレッサーが活性であり、lacオペレーターに結合することによりインテグラーゼ遺伝子を制御しているlacプロモーターを抑制するためである。形質転換細胞を、中程度のサイズのコロニーが得られるまで約24時間増殖する。
【００８９】
その後、プレートを、種々の期間、37℃で放置する。これらの条件下で、常在性プラスミドは複製せず、インテグラーゼは、lacI遺伝子産物（lacリプレッサー）の温度不安定性及びプラスミドrepA複製タンパク質のために発現される。これらの静的条件下で、分子内組込み反応の進行は、Xgalプレート上での青色により表されるような、以下のlacZの発現によりモニタリングする。
【００９０】
異なる組込みレベルにより、組込み事象の時期及び頻度に応じて、生じるコロニーに異なる着色パターンを生じる。図解した例示的な結果を図2に示す。これらのパターンは、変異偽性att部位を認識する、改変インテグラーゼ酵素の能力の指標を与える。
【００９１】
典型的には最も青いコロニーをプールし、プラスミドDNAを精製する。このプール由来のインテグラーゼ遺伝子断片を、さらなる回のシャッフリングにかけ、各回についてスクリーニングアッセイ法を繰り返す。このように、所望の偽性att部位に対する、改変インテグラーゼの親和性は次第に増加する。本明細書に記載の方法により、改変リコンビナーゼのコード配列を同定できる。
【００９２】
上記の方法により作製した改変リコンビナーゼを実施例1に記載する。改良インテグラーゼのスクリーニングアッセイ法を大腸菌で実施した。このスクリーニングから出現した改変インテグラーゼを、ヒト細胞で試験して、細菌で検出された所望の特性が保持されているかどうかを決定した。野生型ΦC31インテグラーゼ及び実施例1に記載の1C1インテグラーゼ変異体を、互いに、哺乳動物組織培養細胞で、attB認識部位（図11B；配列番号：30）及びネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドのヒト染色体への組込み媒介能について比較した。ΨA部位に特異的な組込みが実証された（実施例1及び2）。
【００９３】
本発明の実践に有用な他のスクリーニング法を実施例に記載する。本発明の方法により作製した改変リコンビナーゼは、典型的には、親リコンビナーゼに比べて、標的組換え部位間での組換え頻度の増加をもたらすが；本明細書に記載の方法はまた、親リコンビナーゼにより与えられる組換え頻度に比べて、標的組換え部位間で類似又は減少した組換え頻度を与える、改変リコンビナーゼを同定するのに使用し得る。
【００９４】
D. 本発明の標的化構築物及び方法
本発明はまた、例えば、（i）（第一の組換え部位と第二の組換え部位間の組換えを促進することが可能な）改変リコンビナーゼを提供する段階、（ii）第一の組換え配列及び関心対象のポリヌクレオチドを有する標的化構築物を提供する段階、（iii）核酸に第二の組換え部位を含む細胞に、改変リコンビナーゼ及び標的化構築物を導入する段階であって、この導入段階が、改変リコンビナーゼが第一の組換え部位と第二の組換え部位間の組換え事象を促進できる条件下で実施される段階により、ゲノムに関心対象のポリヌクレオチド（又は核酸配列）を標的化挿入する手段を提供する。
【００９５】
歴史的には、細菌ゲノム中の付着部位は、「attB」と称し、対応するバクテリオファージではこの部位は「attP」と称する。本発明の1つの態様において、選択し改変リコンビナーゼの少なくとも1つの偽性組換え部位を、関心対象の標的細胞で同定する。これらの部位は、選択し改変リコンビナーゼ（例えば上記のような）についての野生型組換え部位（例えばattB又はattP）に対して、関心対象の細胞から得た全ての既知配列を探索することを含む、数個の方法により同定できる。その後、このように同定した偽性組換え部位の機能性を、本明細書の開示に従って経験的に評価して、リコンビナーゼ媒介組換え事象に関与する能力を決定できる。
【００９６】
その後、組込みを偽性組換え部位に指向する標的化構築物は、組換え部位を含み、改変リコンビナーゼは、標的細胞のゲノム中の組換え部位と、標的構築物中の組換え部位間の組換え事象を促進できる。標的化ベクターはさらに、関心対象のポリヌクレオチドを含み得る。関心対象のポリヌクレオチドは、ポリペプチド産物をコードする発現カセットを含むことができるが、これに限定されることはない。標的化構築物は、典型的には環状であり、選択マーカー、複製起点、及び他の要素も含み得る。本発明の標的化構築物は典型的には環状である。
【００９７】
種々の発現ベクターが、原核生物での発現及び真核生物での発現の両方において、本発明の実践に使用するのに適している。一般に、標的化構築物は、以下の特徴の1つ以上を有する：プロモーター、プロモーターエンハンサー配列、選択マーカー配列、複製起点、誘導性要素配列、エピトープ-タグ配列等。
【００９８】
プロモーター及びプロモーターエンハンサー配列は、RNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する、DNA配列である。プロモーターは、どちらの鎖を転写するかを特定することにより、転写物の極性を決定する。細菌プロモーターは、特異的シグマ因子及びRNAポリメラーゼの結合する、転写開始点に関して-35及び-10ヌクレオチドの共通配列からなる。真核プロモーターはより複雑である。発現ベクターに使用する大半のプロモーターは、RNAポリメラーゼIIにより転写される。一般的な転写因子（GTFS）は、最初に、開始点近くの特異的配列に結合し、その後、RNAポリメラーゼIIの結合を補充する。これらの最小プロモーター要素に加えて、小配列要素は、特定のプロモーターの活性を調節する、モジュラーDNA結合/トランス活性化タンパク質（例えばAP-1、SP-1）により特異的に認識される。ウイルスプロモーターは、細菌又は真核プロモーターと同じ機能を果たし、トランス（バクテリオファージT7）の特異的RNAポリメラーゼを提供するか、又は、細胞因子及びRNAポリメラーゼ（SV40、RSV、CMV）を補充する。ウイルスプロモーターは、一般に特に強力なプロモーターであるので好ましいと考えられる。
【００９９】
プロモーターはさらに、構成性又は調節可能であり得る。誘導要素は、プロモーターと共に作用し、リプレッサー（例えば大腸菌のlacO/LAC  Iqリプレッサーシステム）又は誘導因子（例えば酵母のgal1/GAL4誘導因子系）に結合し得る、DNA配列要素である。このような場合、転写は、実質的に、プロモーターが抑制解除又は誘導されるまで「遮断」され、その時点で、転写は「作動開始」となる。
【０１００】
構成性プロモーターの例は、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子配列のblaプロモーター、pPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のCATプロモーター等を含む。誘導性原核プロモーターの例は、バクテリオファージの主な右及び左プロモーター（PL及びPR）、大腸菌のtrp、reca、lacZ、AraC及びgalプロモーター、枯草菌（B. subtilis）のα-アミラーゼ（Ulmanenら、J. Bacteriol. 162: 176-182, 1985）及びシグマ-28-特異的プロモーター（Gilmanら、Gene 32: 11-20(1984)）、バチルス属のバクテリオファージプロモーター（Gryczan：「バチルスの分子生物学（The Molecular Biology of the Bacilli）」、アカデミックプレス社、NY (1982)）、ストレプトミセスプロモーター（Wardら、Mol. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986）等を含む。例示的な原核プロモーターは、Glick（J. Ind. Microtiot. 1:277-282, 1987）；Cenatiempo（Biochimie 68: 505-516, 1986）；及びGottesman（Ann. Rev. Genet. 18:415-442, 1984）により総説されている。
【０１０１】
好ましい真核プロモーターは、以下を含むがこれに限定されない：マウスメタロチオネインI遺伝子配列のプロモーター（Hamerら、J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982）；ヘルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight, Cell 31: 355-365, 1982）；SV40初期プロモーター（Benoistら、Nature（ロンドン）290: 304-310, 1981）；酵母gall遺伝子配列プロモーター（Johnstonら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971-6975, 1982）; Silverら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-59SS, 1984）、CMVプロモーター、EF-1プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター等。
【０１０２】
本発明に使用する例示的プロモーターは、導入する細胞型（及び/又は動物又は植物）で機能的であるように選択する。
【０１０３】
選択マーカーは、ベクターを含む細胞のみの増殖を選択する手段を提供することから、発現ベクターで有用な要素である。マーカーには、典型的には2つの型がある：薬物耐性及び栄養要求性。薬物耐性マーカーにより、細胞は、外的に添加した薬物を解毒することができ、そうでなければ細胞は死滅すると考えられる。栄養要求性マーカーにより、細胞は、その必須成分を欠いている培地中で増殖させても、必須成分（通常はアミノ酸）を合成できる。
【０１０４】
共通な選択マーカー遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ヒグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン（商標）、G418等の抗生物質に耐性であるものを含む。選択可能な栄養要求遺伝子は、例えば、ヒスチジノールの存在下でヒスチジン非含有培地中での増殖を可能とする、hisDを含む。
【０１０５】
発現ベクター中で有用なさらなる要素は、複製起点である。複製起点は、多量体起点結合タンパク質により認識され、起点部位でDNA複製酵素の構築に重要な役割を果たす、複数の短い反復配列を含む固有のDNAセグメントである。本明細書に使用される発現ベクターに使用するに適した複製起点は、大腸菌 oriC、colE1プラスミド起点、2μ及びARS（共に酵母系で有用である）、SV40、及びEBV oriP（哺乳動物系で有用である）等を含む。
【０１０６】
エピトープタグは、エピトープ特異的抗体により認識される、短いペプチド配列である。組換えタンパク質及びエピトープタグを含む融合タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂に結合する抗体を使用して、簡単かつ容易に精製できる。エピトープタグの存在により、さらに、組換えタンパク質それ自体に特異的な抗体を作製する必要なく、ウェスタンブロットなどのその後のアッセイ法で組換えタンパク質を検出できるようになる。一般的に使用されるエピトープタグの例は、V5、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、血球凝集素（HA）、ペプチドPhe-His-His-Thr-Thr、キチン結合ドメイン等を含む。
【０１０７】
発現ベクター中のさらなる有用な要素は、マルチクローニングサイト又はポリリンカーである。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする合成DNAをプラスミドベクター、例えば、プロモーター要素の下流に挿入する。これらの部位は、特定の位置で、ベクターにDNAを簡便にクローニングするために操作されている。
【０１０８】
前記の要素を合わせて、本発明の方法に使用するのに適した発現ベクターを作製できる。当業者は、本明細書の開示を鑑みて、その特定の系で使用するのに適した要素を選択及び合わせることができる。適切な原核ベクターは、大腸菌（例えば、pBR322、ColE1、pSC101、PACYC184、itVX、pRSET、pBAD（CA州カールズバッド所在インビトロジェン）等）で複製できるものなどのプラスミドを含む。このようなプラスミドは、サムブルック（Sambrook）（「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」、第二版、Sambrook著、Fritsch & Maniatis、コールドスプリングハーバーラボラトリー、（1989）参照）により開示され、多くのベクターは市販で入手できる。バチルスプラスミドは、pCl94、pC221、pTl27等を含み、Gryczan（「バチルスの分子生物学（The Molecular Biology of the Bacilli）」、アカデミックプレス、NY（1982）307〜329頁）により開示されている。適切なストレプトミセスプラスミドは、plil0l（Kendallら、J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987）、ストレプトミセスバクテリオファージ、例えばΦC31（Chaterら、「放射線菌生物学に関する第六回国際シンポジウム（Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology）」、Akademiai Kaido、ブダペスト、ハンガリー（1986）、45〜54頁）を含む。シュードモナスプラスミドは、Johnら（Rev. Infect. Dis. 8: 693-704, 1986）及びIzaki（Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742, 1978）により総説されている。
【０１０９】
適切な真核プラスミドは、例えば、BPV、EBV、ワクシニア、SV40、2-ミクロンサークル、pcDNA3.1、pcDNA3.1/GS、pYES2/GS、pMT、pIND、pIND（Sp1）、pVgRXR（インビトロジェン）等、又はその誘導体を含む。このようなプラスミドは当技術分野で公知である（Botsteinら、Miami Wntr. SyTnp. 19: 265-274, 1982；Broach、「酵母サッカロミセスの分子生物学：生活環及び遺伝（The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、NY、445〜470、1981；Broach, Cell 28: 203-204, 1982；Dilonら、J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48, 1980；Maniatis、：「細胞生物学：包括的な論文（Cell Biology: A comprehensive treatise）」、第3巻、遺伝子配列発現、アカデミックプレス、NY、563〜608頁、1980）。
【０１１０】
本明細書に記載の標的化カセットは、明細書の開示を鑑みて、分子生物学の分野で公知の方法論を使用して作製できる（例えば、Ausubel又はManiatis参照）。上記したように、標的化構築物は、適切なベクター骨格に、組換え部位、関心対象のプロモーターに作動可能に連結した関心対象の配列をコードするポリヌクレオチド；及び、選択的に陽性選択マーカーをコードする配列を挿入することにより構築する。
【０１１１】
適切な調節配列（例えばプロモーター）を含むポリヌクレオチドを得る好ましい方法は、PCRである。PCRの一般的な手順は、MacPhersonら、「PCR：実践的なアプローチ（PCR: A Practical Approach）」（オックスフォード大学プレスのIRLプレス（1991））に教示されている。各適用反応におけるPCR条件は実験的に決定し得る。多くのパラメータが反応の成功に影響を及ぼす。これらのパラメータには、アニーリング温度及び時間、伸張時間、Mg2+及びATP濃度、pH、及び、プライマー、鋳型及びデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。増幅後、得られた断片は、アガロースゲル電気泳動、その後、臭化エチジウムでの染色、及び紫外線照射による可視化により検出できる。
【０１１２】
本発明の発現カセット、標的化構築物、ベクター、改変リコンビナーゼ及び改変リコンビナーゼをコードする配列は、キットに製剤化できる。このようなキットの成分は、容器、説明書、溶液、緩衝液、使い捨て物質及びハードウェアを含むことができるがこれに限定されない。
【０１１３】
E. 細胞へのリコンビナーゼの導入
本発明の方法では、部位特異的な改変リコンビナーゼを、ゲノムを修飾したい細胞に導入する。機能的タンパク質を細胞に導入する方法は当技術分野において公知である。精製した改変リコンビナーゼタンパク質の導入により、タンパク質及びその機能が一過的に存在することが確実となり、これは好ましい態様であることが多い。
【０１１４】
あるいは、改変リコンビナーゼをコードする遺伝子を、細胞の形質転換に使用する発現ベクターに含めることができる。一般に、改変リコンビナーゼは、修飾するゲノムに核酸断片を挿入するのに必要な期間だけ存在することが好ましい。したがって、大半の発現ベクターに伴う永久性の欠如は、有害であるとは考えられない。
【０１１５】
本発明の実践に使用される改変リコンビナーゼを、標的化ベクターの導入前、同時又はその後に、標的細胞に導入できる。改変リコンビナーゼを、例えば、リポソーム、コーティング粒子、又はマイクロインジェクションを使用して、タンパク質として、細胞に直接導入できる。あるいは、改変リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、適切な発現ベクターを使用して細胞に導入できる。上記の標的化ベクター成分は、関心対象の改変リコンビナーゼをコードする配列を含む発現カセットの作製に有用である。改変リコンビナーゼの発現は、典型的には、一過性であることが望ましい。したがって、リコンビナーゼの一過的発現を提供するベクターは、本発明の実践に好ましい。しかし、改変リコンビナーゼの発現は、例えば、リコンビナーゼの発現を調節可能なプロモーター（すなわち、発現を選択的に誘導又は抑制できるプロモーター）の制御下に置くことにより、他の方法でも調節され得る。
【０１１６】
本発明の実践において有用な改変リコンビナーゼをコードする配列が本明細書において開示され、これは本明細書の以下の開示に従って得られうる。
【０１１７】
本発明の実践に使用される改変リコンビナーゼは、したように組換え的に産生され又は精製されうる。所望のリコンビナーゼ活性を有するポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈降法、サイズ分画、アフィニティクロマトグラフィー、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティクロマトグラフィー（例えばThorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 5505-5510, 1998）を含むがこれに限定されないタンパク質精製分野で公知の方法により所望の純度まで精製されうる。
【０１１８】
F. 細胞
本発明の方法を使用して修飾するのに適した細胞は、原核細胞及び真核細胞の両方を含み、ただし、細胞のゲノムは、本発明の改変リコンビナーゼにより認識されうる偽性組換え配列を含む。原核細胞は、限定された核を欠失した細胞である。適切な原核細胞の例は、細菌細胞、マイコプラズマ細胞及び古細菌細胞を含む。特に好ましい原核細胞は、種々の型の試験系のどれかで有用なもの、又はいくつかの工業的有用性を有するもの、たとえばクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（エタノール生成）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（ブタノール生成）等を含む（Green及びBennet, Biotech & Bioengineering 58: 215-221, 1998；Ingramら、Biotech & Bioengineering 58: 204-206, 1998参照）。
【０１１９】
適切な真核細胞は、動物細胞（例えば、昆虫、魚、鳥、げっ歯類（マウス及びラットを含む）、ウシ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ヒト等）及び植物細胞（例えば、コメ、トウモロコシ、綿、タバコ、トマト、ジャガイモ等）の両方を含む。特定の目的に適用可能な細胞型は、以下でより詳細に考察する。
【０１２０】
本発明のさらに別の態様は、単離され遺伝子操作された細胞を含む。適切な細胞は、上記に考察したように、原核細胞でも真核細胞でもよい。本発明の遺伝子操作細胞は、単細胞生物でもよく、又は、多細胞生物に由来してもよい。多細胞生物から得られた遺伝子操作細胞に関する「単離」により、細胞は、植物でも動物でも、生体外で、人工的な環境にあることを意味する。単離という用語の使用は、遺伝子操作細胞が、存在する唯一の細胞であることを意味しない。
【０１２１】
1つの態様において、本発明の遺伝子操作細胞は、本発明のいずれか1つの核酸構築物を含む。第二の態様において、組換え配列を特異的に認識する改変リコンビナーゼを、関心対象の核酸配列（群）がゲノムに挿入される条件下で、本発明の1つの核酸構築物を含む遺伝子操作細胞に導入する。したがって、遺伝子操作細胞は、修飾ゲノムを含む。ポリペプチド及びDNA配列をこのような細胞に導入する方法は当技術分野において公知であり、上記に考察する。
【０１２２】
本発明の遺伝子操作細胞を、種々の方法で使用できる。単細胞生物を修飾して、組換えタンパク質、工業的溶媒、工業的に有用な酵素等の商業的に価値ある物質を生成できる。好ましい単細胞生物は、真菌、例えば酵母（例えば、S.pombe、Pichia  pastoris、S.cerevisiae（例えばINVSc1）等）、アスペルギルス等、並びに、細菌、例えばクレブシエラ、ストレプトミセス等を含む。
【０１２３】
昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞を含む、多細胞生物由来の単離細胞は同じように有用であり得る。有用であり得る哺乳動物細胞は、げっ歯類、霊長類等から得られたものを含む。それらは、HeLa細胞、VEROなどの線維芽細胞起源の細胞、3T3又はCHOK1、HEK293細胞又はリンパ腫起源の細胞（例えば32D細胞）及びその誘導体を含む。好ましい哺乳動物宿主細胞は、非付着細胞、例えばCHO、32D等を含む。
【０１２４】
さらに、植物細胞も、宿主として利用可能であり、植物細胞に適合性の制御配列、例えばカリフラワーモザイクウイルス35S及び19S、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列等も利用可能である。適切なトランスジェニック植物細胞を使用して、トランスジェニック植物を産生できる。
【０１２５】
別の好ましい宿主は、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila  larvae）由来である。昆虫細胞を宿主として使用して、ショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを使用できる（Rubin, Science 240: 1453-1459, 1988）。又は、バキュロウイルスベクターを操作して、昆虫細胞中の所望の核酸配列によりコードされる大量のペプチドを発現できる（Jasny, Science 238: 1653 (1987)；Millerら、：「遺伝子工学（Genetic Engineering）」（1986）、Setlow, J. K.ら編、Plenum、第8巻、277〜297頁））。
【０１２６】
本発明の遺伝子操作細胞はさらに、関心対象の核酸断片によりコードされるタンパク質の活性を調節できる物質についてスクリーニングするためのツールとして有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の遺伝子操作細胞を、被験物質と接触させ、被験物質と接触させていない被験細胞と比較した場合の、細胞表現型、細胞増殖、細胞分化、タンパク質の酵素活性、又は、タンパク質とタンパク質の天然結合パートナーの間の相互作用の変化について細胞をモニタリングすることを含む、スクリーニング法を含む。
【０１２７】
ペプチド、タンパク質、抗体、低分子量有機化合物、例えば真菌又は植物細胞から得た天然物等を含む、種々の被験物質を、本発明の遺伝子操作細胞を使用して評価できる。「低分子量有機化合物」とは、一般に500〜1000未満の分子量の化学種を意味する。被験物質の供給源は当業者に公知である。
【０１２８】
細胞を使用した種々のアッセイ法が、当業者には公知である。それらは、例えば、酵素活性についてのアッセイ法（Hirthら、米国特許第5,763,198号、98年9月6日発行）、遺伝子操作細胞により発現されるタンパク質に対する被験物質の結合についてのアッセイ法、リポーター遺伝子の転写活性化アッセイ法等を含む。
【０１２９】
本発明の方法により修飾された細胞を、例えば、以下の条件下で維持できる：（i）生存し続けるが、増殖は促進しない、（ii）細胞の増殖を促進する、及び/又は（iii）細胞の分化もしくは非分化を引き起こす。細胞培養条件は、典型的には、細胞中でのリコンビナーゼの作用に許容可能であるが、リコンビナーゼの活性の調節は、培養条件によっても調節され得る（例えば、細胞を培養する温度を上昇又は下降）。特定の細胞、細胞型、組織又は生物について、培養条件は当技術分野において公知である。
【０１３０】
G. トランスジェニック植物及び非ヒト動物
別の態様において、本発明は、ゲノムが、本発明の方法及び組成物を使用することにより修飾されている、トランスジェニック植物及び非ヒトトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、本発明の方法を使用して作製されうり、種々の疾患の研究用及びこのような疾患を調節する薬物のスクリーニング用のモデル系として作用し得る。
【０１３１】
「トランスジェニック」植物又は動物は、遺伝子工学植物もしくは動物、又は、遺伝子工学植物もしくは動物の子孫を意味する。トランスジェニック植物又は動物は、通常、ウイルスなどからの少なくとも1つの非関連生物由来の物質を含む。トランスジェニック生物に関して使用した「動物」という用語は、ヒトを除く全ての種を意味する。それはまた、胚及び胎児段階を含む、全ての発達段階の個々の動物を含む。家畜動物（例えばニワトリ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等）、げっ歯類（例えばマウス及びラット）、及び家庭内ペット（例えば猫及びイヌ）が、本発明の範囲内に含まれる。好ましい態様において、動物はマウス又はラットである。
【０１３２】
「キメラ」植物又は動物という用語は、異種遺伝子が見られる、又は、異種遺伝子が、全てではないがいくつかの植物もしくは動物の細胞に見られる、植物又は動物を意味する。
【０１３３】
トランスジェニック動物という用語はまた、生殖細胞系トランスジェニック動物も含む。「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、本発明の方法により提供された遺伝子情報が、とりあげられて、生殖系列細胞に取込まれ、それ故、情報を子孫に伝達する能力を付与された、トランスジェニック動物である。事実、このような子孫がいくつか又は全てのその情報を有する場合、それらもトランスジェニック動物である。
【０１３４】
トランスジェニック植物及び動物を作製する方法は当技術分野において公知であり、本明細書の開示と組み合わせて使用されうる。
【０１３５】
1つの態様において、本発明のトランスジェニック動物は、単一の細胞の胚に、細胞を得た生物のゲノム内に見られる組換え部位と組換えできる組換え部位及び関心対象の核酸断片を含む核酸構築物（例えば標的化構築物）を、関心対象の核酸断片が、成熟動物の生殖系列細胞のDNAに安定に組み込まれ、通常のメンデル則で遺伝するような様式で、導入することにより作製される。この態様において、関心対象の核酸断片は、した断片のいずれか1つであり得る。又は、関心対象の核酸配列は、関心対象の内因的に産生されたタンパク質を破壊又はその発現を妨害する外来性産物をコードしうり、関心対象のタンパク質の発現の減少したトランスジェニック動物が生じる。
【０１３６】
トランスジェニック動物の作製には、種々の方法を利用可能である。本発明の核酸構築物を、雄及び雌の前核の融合前に受精卵の前核又は細胞質に注入しても、又は、細胞分裂開始後に胚細胞の核に注入してもよい（例えば2細胞胚の核）（Brinsterら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 4438, 1985）。胚は、組み換え部位において関心対象の核酸配列で修飾された、ウイルス、特にレトロウイルスに感染できる。細胞をさらに、上記した改変リコンビナーゼで処理し、関心対象の核酸配列のゲノムへの組込みを促進できる。この場合、mRNA形の改変リコンビナーゼの導入は特に有利であり得る。そうすれば、導入リコンビナーゼ遺伝子の転写の必要性はなく、リコンビナーゼ遺伝子がゲノムに組み込まれる機会もない。
【０１３７】
単に例示のためだけにトランスジェニックマウスを調製するために、雌マウスを誘導して過排卵とする。交尾後、雌を、CO2窒息又は頸部脱臼により屠殺し、切除した卵管から胚を回収する。周囲の卵丘細胞を除去する。その後、前核胚を洗浄し、注入時まで保存する。無作為に徘徊している（cycling）成体雌マウスを、精管切除術を行なった雄と対にする。レシピエント雌を、ドナー雌と同時に交尾させる。その後、胚を、手術で移す。トランスジェニックラットを作製する手順はマウスの手順と類似している（Hammerら、Cell 63: 1099-1112, 1990参照）。トランスジェニック実験に適したげっ歯類は、Charles River（MA州ウィルミントン）、Taconic（NY州ジャーマンタウン）、Harlan Sprague Dawley（IN州インディアナポリス）等の一般的な市販の供給源から得ることができる。
【０１３８】
げっ歯類胚の操作及び接合子の前核へのDNAのマイクロインジェクションのための手順は、当業者には公知である（Hoganら、）。魚、両生類卵、及び鳥類のマイクロインジェクション手順は、ウデビン（Houdebine）及びシューロット（Chourrout）（Experientia, 47: 897-905, 1991）が記載している。DNAを動物の組織に導入する他の手順は、米国特許第4,945,050号（Sandfordら、1990年7月30日）に記載されている。
【０１３９】
胚の内細胞塊に由来し培養液中で安定化された全能性又は多能性の幹細胞を、本発明の方法を使用して核酸配列を取込むように培養液中で操作することができる。胚盤胞への注入を介して、トランスジェニック動物をこのような細胞から作製でき、これをその後、育成母に移植して出産させる。
【０１４０】
幹細胞を培養し、続いて、電気穿孔法、リン酸カルシウム/DNA沈降法、マイクロインジェクション、リポソーム融合、レトロウイルス感染等の方法を使用して幹細胞にDNAを導入することによりトランスジェニック動物を作製する方法も、当業者には公知である（例えば、「奇形癌腫及び胚幹細胞、実践的アプローチ（Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells, A Practical Approach）」、E. J. Robertson編、IRLプレス、1987）。異種DNAの哺乳動物（マウス、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ）受精卵へのマイクロインジェクションの標準的な実験手順の総説は、ホーガン（Hogan）ら、「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」（コールドスプリングハーバープレス1986）；クリンペンフォート（Krimpenfort）ら、1991, Bio/Technology 9: 86；パルミター（Palmiter）ら、1985, Cell 41: 343；クラマー（Kraemer）ら、「初期哺乳動物胚の遺伝子操作（Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo）」（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス1985）；ハマー（Hammer）ら、1985, Nature, 315: 680；パーセル（Purcel）ら、1986, Science, 244: 1281；ワグナー（Wagner）ら、米国特許第5,175,385号；クリンペンフォート（Krimpenfort）ら、米国特許第5,175,384号）を含む。
【０１４１】
手順の最終期は、標的化ES細胞を胚盤胞に注入し、胚盤胞を偽性妊娠雌に導入することである。得られたキメラ動物を育成し、子孫をサザンブロットにより解析して、導入遺伝子を有する個体を同定する。非げっ歯類哺乳動物及び他の動物の作製手順は、他の研究者により考察されている（Houdebine及びChourrout、；Purselら、Science 244: 1281-1288, 1989；及びSimmsら、Bio/Technology 6: 179-183, 1988参照）。導入遺伝子を有する動物は、当技術分野において公知の方法により、例えばドットブロット又はサザンブロットにより同定できる。
【０１４２】
本明細書に使用したトランスジェニックという用語は、さらに、ゲノムが、初期胚又は受精卵のインビトロでの操作により、又は、任意のトランスジェニック技術により変化して、特定の遺伝子ノックアウトを誘導した、任意の生物を含む。本明細書に使用した「遺伝子ノックアウト」という用語は、本発明のベクターの使用により達成された、機能の消失を伴う、インビボでの遺伝子の標的化破壊を意味する。1つの態様において、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、遺伝子配列内に位置する偽性組換え部位を標的化することにより、標的遺伝子が非機能的としたい遺伝子に標的化した挿入により非機能的となっている動物である。
【０１４３】
H. 遺伝子療法及び疾患
本発明のさらなる態様は、このような処置の必要な被検者の疾患を処置する方法を含む。方法の1つの態様において、被検者の少なくとも1つの細胞又は細胞型（又は組織等）は、本発明の改変リコンビナーゼの標的組換え配列を有する。この細胞（群）を、第二の組換え配列及び関心対象の1つ以上のポリヌクレオチド（典型的には治療遺伝子）を含む核酸構築物（「標的化構築物」）で形質転換する。関心対象の核酸配列が、組換え事象を介してゲノムに挿入される条件下で、組換え配列を特異的に認識する改変リコンビナーゼを、同じ細胞に導入する。本発明の方法を使用して処置可能な被検者は、ヒト及び非ヒト動物の両方を含む。方法は、本発明の標的化構築物及び改変リコンビナーゼを利用する。
【０１４４】
一遺伝子疾患、感染症、後天性疾患、癌等を含む種々の疾患を、本発明の方法を使用することにより処置できる。例示的な一遺伝子疾患は、ADA欠乏症、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、血友病、慢性肉芽腫症、デュシェンヌ筋肉ジストロフィー、ファンコニー貧血、鎌状赤血球貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、X染色体連鎖SCID等を含む。
【０１４５】
本発明の方法を使用することにより処置できる感染症は、ヒトT細胞リンパ指向性ウイルス、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、免疫不全ウイルス（HIV等）、サイトメガロウイルス等を含む、種々の型のウイルスによる感染を含む。また、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニエ等の他の病原性生物又はプラスマジウム・ファルシパルム等の寄生虫による感染も含まれる。
【０１４６】
本明細書に使用した「後天性疾患」という用語は、非先天性疾患を意味する。この疾患は一般に、一遺伝子疾患よりも複雑と考えられ、1つ以上の遺伝子の不適切又は望ましくない活性から生じ得る。この疾患の例は、末梢動脈疾患、関節リウマチ、冠動脈疾患等を含む。
【０１４７】
本発明の方法を使用して処置可能な後天性疾患の特定の群は、白血病及びリンパ腫などの、固形腫瘍及び造血腫瘍の両方を含む、種々の癌を含む。本発明の方法を使用して処置可能な固形腫瘍は、癌、肉腫、骨腫、線維肉腫、軟骨肉腫等を含む。具体的な癌は、乳癌、脳癌、肺癌（非小細胞及び小細胞）、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、頭頸部癌等を含む。
【０１４８】
ゲノム中の具体的な適所は、一部には、処置する具体的な疾患に依存する。例えば疾患が一遺伝子疾患であり、所望の処置が、疾患の原因因子であると考えられる非変異形の核酸をコードする治療核酸の添加である場合、適所は、既知のタンパク質を全くコードせず、添加する核酸の妥当な発現レベルの可能なゲノム領域であり得る。ゲノム中の適切な場所を同定する方法は当技術分野において公知であり、標的組換え配列の同定は、本明細書に、本発明の改変リコンビナーゼの内容で考察している。
【０１４９】
この態様で有用な核酸構築物（例えば標的化ベクター）はさらに、関心対象の1つ以上の核酸断片からなる。この態様に使用する関心対象の好ましい核酸断片は、した、治療遺伝子及び/又は制御領域である。核酸配列の選択は、処置する疾患の性質に依存する。例えば、凝固因子IXの欠乏により引き起こされる、B型血友病を処置する関心対象の核酸構築物は、機能的因子IXをコードする核酸断片を含み得る。閉塞性末梢動脈疾患を処置する関心対象の核酸構築物は、例えば、血管内皮成長因子、血小板由来成長因子等の、新規血管の成長を刺激するタンパク質をコードする核酸断片を含み得る。当業者は、どの関心対象の核酸断片が、特定の疾患の処置に有用であるかを容易に認識するだろう。
【０１５０】
核酸構築物は、種々の方法を使用して、処置する被検者に投与できる。投与はインビボ又はエクスビボで行うことができる。「インビボ」とは、動物の生体中を意味する。「エクスビボ」とは、細胞又は臓器が生体外で修飾され、該細胞又は臓器は典型的には生体に戻されることを意味する。
【０１５１】
核酸構築物の治療投与法は、当技術分野において公知である。核酸構築物は、カチオン性脂質（Goddardら、Gene Therapy 4: 1231-1236, 1997；Gormanら、Gene Therapy 4: 983-992, 1997；Chadwickら、Gene Therapy 4: 937-942, 1997；Gokhaleら、Gene Therapy 4: 1289-1299, 1997；Gao及びHuang、Gene Therapy 2: 710-722, 1995）を用いて、ウイルスベクター（Monahanら、Gene Therapy 4: 40-49, 1997；Onoderaら、Blood、91: 30-36, 1998）を使用して、「裸DNA」の取込み等により送達できる。細胞のトランスフェクション（上記の考察参照）で当技術分野において公知の技法を、核酸構築物の生体外投与に使用できる。正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の容態を見て個々の医師が選択できる（例えばFinglら、1975「治療薬の薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）」、第1章第1頁参照）。
【０１５２】
担当医師は、毒性、臓器機能不全等により、投与をどのようにいつ終了、中断又は調整するかを知っているべきであることに留意されたい。逆に、担当医師は、臨床応答が適切でない場合（毒性を除いて）、より高いレベルまで処置をどのように調整するかを知っているべきである。処置する疾患の管理における投与量の大きさは、処置する容態の重度、投与経路等により変化する。容態の重度は、例えば一部には、標準的な予後評価法により評価し得る。さらに、投与量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答に応じて変化する。
【０１５３】
一般に、ゲノム修飾のために標的化された細胞の少なくとも1％〜10％が、疾患の処置において修飾されるべきである。したがって、投与の方法及び経路は、最適には、1回の投与あたり、標的細胞の少なくとも0.1％〜1％を修飾するように選択されうると考えられる。このように、投与数を、処置の効率及び簡便性を向上するために、最小に保持することができる。
【０１５４】
処置する具体的な容態に応じて、薬剤を製剤化し、全身又は局所投与することができる。製剤化及び投与の技法は、「レミントンの製薬科学（Remigton's Pharmaceutical Sciences）」、1990、第18版、Mack  Publishing  Co.、PA州イーストン中に見出し得る。適切な経路は、いくつか数えると、経口、直腸、経皮、膣、経粘膜又は腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、並びに、くも膜下腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
【０１５５】
処置される被検者に、さらに、使用のために選択された組換え配列を特異的に認識する、改変リコンビナーゼを投与する。核酸構築物の一部として、又は、ゲノムを修飾したい細胞により取込まれるタンパク質として、それをコードする核酸を含めることにより、特定の改変リコンビナーゼを投与できる。投与の方法及び経路は、関心対象の組換え配列及び核酸配列を含む、標的化構築物の投与について上記したものと類似している。改変リコンビナーゼタンパク質は、関心対象の核酸配列の組込みにおいてわずかな期間しか必要とされないと考えられる。それ故、改変リコンビナーゼをコードする遺伝子として導入する場合、改変リコンビナーゼ遺伝子を有するベクターは、保持延長を媒介する配列を欠失していると考えられる。例えば、慣用的なプラスミドDNAは、大半の哺乳動物細胞で急速に崩壊する。改変リコンビナーゼ遺伝子はまた、その発現を制限する遺伝子発現配列を備えていてもよい。例えば、誘導プロモーターを使用できるため、改変リコンビナーゼ発現は、誘導物質への限定的な暴露により時間的に制限され得る。1つのこのような例示的プロモーター群は、テトラサイクリン応答性プロモーターであり、その発現は、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを使用して調節できる。
【０１５６】
本明細書内において、以下の非制限的な実施例を参照して、本発明をより詳細に記載する。
【０１５７】
実施例
実施例1
シャッフリングしたリコンビナーゼを同定するための熱誘導スクリーニングアッセイ法
このアッセイ法は、常在性プラスミド（図1A）及びクローニングプラスミド（図1B）と呼ばれる2つのプラスミドを使用する。これらのプラスミドの作製は、以下のように実施した。
【０１５８】
常在性プラスミド
温度感受性（TS）プラスミドpTSK30を、最終常在性プラスミドの骨格として使用した。pTSK30（Phillips, G. J. Plasmid 41: 78-81 (1999)）をDrdI及びSmaIで切断して、lacZα遺伝子を取り出した。DrdI末端を、T4ポリメラーゼで平滑とし、ゲル単離し、適合性SmaI平滑末端に再度ライゲーションし、プラスミドpTSK1stを得た。特別な認識部位を提供する特異的リンカーをこのベクターに配置した。このリンカー配列は、
0005033288.tif 000002
（リンカー1；配列番号：1）であった。大文字で示したCGCG配列（すなわち、最初の4つのヌクレオチド）は、MluI突出であり、全ての他の配列は、相補的オリゴヌクレオチドにより作製した二本鎖DNAを示す。pTSK1stプラスミドをEco0109Iで切断し、末端をT4ポリメラーゼで平滑とし、よって、リンカーの平滑末端と適合性となる。一旦Eco0109I末端が平滑化した後、プラスミドをMluIで切断した。リンカーを、ベクターにライゲーションし、pTSK2ndを作製した。
【０１５９】
その後、追加のリンカー（リンカー2）をpTSK2ndプラスミドに加えて、pTSK3rdを作製した。pTSK2ndプラスミドをMluI及びBlpIで切断し、この位置にカスタマイズされたリンカーを受容させた。以下の相補的オリゴヌクレオチドを使用してリンカー2を作製した：
0005033288.tif 000003
。このリンカーは、さらなる固有の制限酵素認識部位を導入した。大文字で示した塩基（配列番号：2、最初の4つのヌクレオチド及び配列番号：3の最初の3つのヌクレオチド）は、リンカー二本鎖の突出を示す。pTSK4thを、PmeI認識部位をpTSK3rdに配置することにより作製した。pTSK3rdをFspIで切断し、以下の平滑末端PmeIリンカー（リンカー3）の位置を提供した。リンカー3は、オリゴヌクレオチド
0005033288.tif 000004
をアニールすることにより作製した。
【０１６０】
pTSK5thは、ファージT5プロモーターをpTSK4thに導入することにより作製した。T5プロモーターは、オリゴヌクレオチド
0005033288.tif 000005
から作製した。pTSK4thを、制限酵素AatII及びAgeIで切断し、T5プロモーターの特異的ライゲーション部位を提供した。その後、「スタッファー（stuffer）配列」をpTSK5thに加えた。スタッファーは、2つの付着部位間のスペーサーとして作用し、転写リードスルーの防止を補助した。スタッファー配列は、pGL3-CMVと呼ばれる修飾プロメガ（WI州マジソン）プラスミドから取り出した。pGL3-CMVは、pGL3-基本プロメガプラスミド内のSmaI部位にCMVプロモーターを配置することにより作製した。pGL3-CMV由来の1.4kbのApoI断片を、pTSK5thの適合性EcoRI部位に配置して、pTSK6thを作製した。
【０１６１】
転写終結配列を、pTSK6thのRsrII及びAvrII部位に加え、pTSK7thを得た。転写終結因子は、相補的オリゴヌクレオチド
0005033288.tif 000006
をアニーリングすることにより作製し、これにより、RsrII及びAvrII突出を有する終結因子二本鎖が得られた。pTSK8thプラスミドは、SphI及びNheI部位にGFPuvリポーター遺伝子を受け、これは、後に全長lacZ遺伝子と交換すると、より高い感受性を提供した。
【０１６２】
lacリプレッサー遺伝子の温度感受性変異体（lacI  TS）を、pTSK8thのPmeI部位に導入した。lacI  TSプロモーター及び遺伝子配列を、EcoRIを用いてpNH401acIqTSプラスミド（Hasan, N., Szybalski, W., Gene 163: 35-40 (1995)）から取り出し、平滑にしてpTSK8thベクター上にPmeI末端を与え、これによりpTSK9thが得られた。59bpの野生型ΦC31 attP部位（
0005033288.tif 000007
図11C、配列番号：33、TTGコアは大文字である）を、pTSK9thの固有のNotI認識部位に配置し、プラスミドpTSK9thを得た（attP-NotI）。このプラスミド中のGFPuv遺伝子を、全長lacZ遺伝子で置き換えて、p10thを得た（attP-NotI）。
【０１６３】
lacZの発現を増強するために、シャイン-ダルガーノ（Shine-Delgarno）及びコザック（Kozac）配列を、PCRにより、ATG翻訳開始位置の上流に導入した。lacZ PCRプライマーも、制限酵素部位NheI及びSphIを導入し、よって、lacZ断片は、前の世代のプラスミドに見られるGFPuvを簡便に置換できる。ΦC31 attB部位を、p10th（attP-NotI）の固有のAscI部位に加えて、プラスミドp11th-PBを得た。attB部位は、以下のオリゴヌクレオチド
0005033288.tif 000008
から作製した。
【０１６４】
その後、このプラスミド中のスタッファー配列をlacZ背景の量をより良好に減少する配列で置換した。配列置換を実施するために、最初のスタッファー配列を除去した。FseI及びRsrIIを使用して、このベクターに固有の残りのPstI部位を作製しつつ、この配列の大半を除去した。末端を、T4ポリメラーゼにより平滑とし、再度ライゲーションしてプラスミドpΔPBを得た。プライマー
0005033288.tif 000009
を使用して、ヒトゲノムDNAからPCRを実施した。このプライマーセットを使用したPCRにより、ヒトFGFR3遺伝子のイントロンから2.3kbのGCリッチ断片が得られた。これらのプライマーのすぐに内部にはPstI部位がある。PCR産物を、PstIで切断し、pΔPBに存在する固有のPstI部位にライゲーションして、プラスミドpPB（+）スタッファー（+）を得た。このスタッファー配列の1つの配向のみが、バックグラウンド発現を防ぐことができた。
【０１６５】
このプラスミドの類似型を、野生型attPをヒトゲノム由来の偽性部位A（ΨA）配列（図13；配列番号：34）で置き換えることにより作製した。ΨAを、プライマー
0005033288.tif 000010
を使用して、PCRによりヒトゲノムから単離した。その後、約470bpのΨAを、pCR2.1トポ（Invitrogen）にクローニングした。ΨA部位をXbaI及びSpeIで除去し、pBC-PBのSpeI部位にクローニングし（Grothら、Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 5995-6000 (2000)）、プラスミドpBC-psEco1-B（+）を得た。このプラスミド由来のΨAを含むEcoRI断片を取り出し、T4ポリメラーゼで平滑とした。野生型attP部位をpPB（+）スタッファー（+）プラスミドから取り出し、ΨAで置換できるようにするために、プラスミドをSacII及びAvrIIで切断し、平滑とした。平滑ΨA-EcoRI断片を、この位置にライゲーションし、プラスミドpRES-psAを得た。
【０１６６】
クローニングプラスミド
pINTプラスミド（Grothら、Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 5995-6000 (2000)）を、このアッセイ法に使用するために改変した。最初にベクターをテトラサイクリン耐性（TcR）とするために、pINTをDraIII及びPflMIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑とした。この段階により、TcR遺伝子の位置が与えられ、カナマイシン耐性（KanR）遺伝子をpINTベクターから取り出した。pBR322から、TcR遺伝子を、EcoRI及びPflMIで取り出し、平滑とし、これを使用してKanR遺伝子を置換し、プラスミドpINT-Tc2nd（+）を得た。pRECと呼ばれるプラスミドは、pINT-Tc2nd（+）から、インテグラーゼ遺伝子の位置にリンカーを配置することにより作製した。pINT-Tc2nd（+）プラスミドをBstEII及びSpeIで切断し、これによりインテグラーゼ遺伝子を取り出した。オリゴヌクレオチド
0005033288.tif 000011
で作製したリンカー（リンカー4）を、これらの部位に配置し、これにより、プラスミドに固有の制限酵素部位（BglII及びXhoI）が導入された。
【０１６７】
変異インテグラーゼライブラリーは、プラスミドを破壊することなくベクターから出し入れして移動することができる。なぜなら、固有の部位がインテグラーゼ遺伝子に隣接するからである。野生型ΦC31インテグラーゼ遺伝子を、pRECプラスミドに再導入し、pINT-CRSプラスミドを作製した。この段階は、BamHI及びSpeIを用いて、pINT-Tc2nd（+）プラスミドからインテグラーゼを取り出すことにより実施した。pRECプラスミドをBglII及びSpeIで切断し、この位置にインテグラーゼ遺伝子を受容させた。ライゲーション反応は、BglII及びBamHI末端が互いに適合性であるので可能であった。XhoI及びSpeI部位は、pINT-CRSベクターに固有であり、これを使用して、ベクターに及びベクターからインテグラーゼライブラリーを往復移動できる。
【０１６８】
アッセイ法の実施
上記の常在性及びクローニングプラスミドを、進化し改良されたインテグラーゼの同定用に開発されたアッセイ系に使用した。スクリーニングにより、野生型又は偽性att部位配列に対して改良された組換え効率を現在示す、改変リコンビナーゼ（例えばインテグラーゼ）の単離が可能となる。att部位のいずれかの対を組換える改良インテグラーゼの効率はこのアッセイ法で決定でき、lacZ遺伝子産物である酵素β-ガラクトシダーゼをより多く産生するコロニーについてスクリーニングすることにより測定する。常在性プラスミドは、インテグラーゼ媒介分子内組込み事象が生じた後にのみβ-ガラクトシダーゼを発現する。この組換え事象がなければ、常在性プラスミドは、att部位を離す転写終結シグナルを含む「スタッファー配列」で構成されている。付着部位配列のすぐ上流には、強力な細菌プロモーターが存在する。att部位及びスタッファー配列の下流にはlacZ遺伝子がある。組換え事象では、スタッファー配列は除去され、プロモーターはlacZの転写を媒介し、β-ガラクトシダーゼを産生する。β-ガラクトシダーゼ産生は、指示薬色素X-galを含むプレート上で細菌を増殖させることにより簡便に検出できる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972）。
【０１６９】
アッセイ法を実施するために、常在性プラスミドを有する細菌を、形質転換に適合性にした。常在性プラスミドはカナマイシン耐性（KanR）であり、複製にpSC101骨格の変異体を使用した。この変異体では、pSC101骨格は、温度感受性にするRepA遺伝子の変異を有していた。常在性プラスミドはまた、選択したatt部位（この実施例では、attB、図11B、及びΨA図13）、lacZ、及び温度感受性lacI遺伝子も有した。このプラスミドを有する細菌は通常30℃で増殖したが、TS変異体RepAのために、42℃では増殖しなかった。同様に、TS lacIは、30℃で完全に機能的であるが42℃では不活性であるlacリプレッサーを産生した。TS成分の両方が、中間温度で中間温度感受的に作用する。例えば、TSプラスミドを有する細菌は、37℃では増殖を停止しなかったが、増殖の量は有意に減少した。同じように、TS lacリプレッサーは、37℃で完全に不活性ではないが、lacプロモーター/オペレーターの完全な抑制を引き起こすに十分なほど安定ではなかった。ΦC31インテグラーゼはより高温で安定性を消失するので、37℃を誘導温度として使用したが、42℃で良好に実施するインテグラーゼ変異体についてスクリーニングすることは可能である。
【０１７０】
このシステムに使用した第二プラスミド（クローニングプラスミド）は、シャッフリングしたインテグラーゼライブラリーを有した。このクローニングプラスミドは、テトラサイクリン耐性（TcR）であり、p15A複製起点を含んだ。システムのプラスミドの両方が、適合性の起点を有し、それ故、同じ細菌細胞中で共に増殖できる。クローニングプラスミドを完全にするために、シャッフリングしたインテグラーゼライブラリーを、lacプロモーター/オペレーターのすぐ下流に位置する、固有のXhoI及びSpeI制限部位にライゲーションした。その後、シャッフリングしたライブラリーを有するクローニングプラスミドを、常在性プラスミドを有する細菌に形質転換した。
【０１７１】
インテグラーゼ遺伝子のシャッフリングを、公表されたプロトコルと同じように実施した（Stemmer, W. P. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751 (1994)；Stemmer, W. P. C., Nature 370, 389-391(1994)）。簡潔には、ΦC31インテグラーゼ遺伝子（コード領域DNA配列は、配列番号：20として示す、図4）を、PCRにより、プライマー
0005033288.tif 000012
を用いて、pINT-CRSベクターからコピーした。これらのプライマーは、固有のXhoI及びSpeI制限部位にすぐに隣接して存在し、これを使用してシャッフリングしたライブラリーをベクターにクローニングして戻した。5μgのインテグラーゼ遺伝子を、2.4UのDNAseで25分間室温で処理した。インテグラーゼ遺伝子断片を、1.6％NuSieveゲル上で1×TAE中で流した。約50bp〜250bp長の範囲の断片をゲルから切り出した。DNA断片を、βアガラーゼを用いて低融点ゲルから取り出した。45サイクルのプライマーを用いない伸張を記載の通り実施した（Stemmer, W. P. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751 (1994)；Stemmer, W. P. C., Nature 370, 389-391(1994)）。シャッフリングしたインテグラーゼライブラリーを増幅するために、プライマーを用いない反応の一部を、上記に示したプライマーに加え、さらなるPCRを実施した。得られたPCR産物の一部を、ゲル電気泳動により解析した。1.9kbの期待されるサイズを得たが、小さな追加のバンドも観察された。全長のシャッフリングしたインテグラーゼ遺伝子のみを有し、非効率的なPCRからの切断型短縮産物を有さない、ライブラリーを作製する確率を高めるために、最終産物のゲル単離を実施した。インテグラーゼ遺伝子ライブラリーを制限酵素XhoI及びSpeIで切断し、インテグラーゼ遺伝子を欠いたクローニングベクター源にライゲーションした。プラスミドライブラリーの作製に使用したライゲーション反応をMinEluteキアゲンカラム（Quiagen、CA州バレンシア）で洗浄し、ヒトゲノムから得た野生型attB部位及びΨA偽性attP部位を有する、上記の常在性プラスミドpRES-ΨAを有する電気コンピテントDH10B細菌（Life Technologies）に形質転換した（図13）。
【０１７２】
形質転換後、細胞を1時間20分間30℃で培地中で回復させた。インテグラーゼの発現は、高レベルのlacリプレッサーが常在性プラスミドから発現されたので、形質転換時に抑制されていた。インテグラーゼ遺伝子は、lacプロモーター/オペレーターの制御下にあるので、高温により活性化されない場合には連続的抑制下にあった。細胞が30℃で維持されている限り、インテグラーゼ発現はオフのままであり、クローニング及び常在性プラスミドの両方を複製し、細菌は正常に増殖した。形質転換体を、テトラサイクリン、カナマイシン、及びX-galを含む寒天プレート上で増殖した。形質転換体を、100mmプレートあたり、≦150コロニーとなるように蒔き、最適な増殖及びスクリーニングを可能とした。
【０１７３】
コロニーを30℃で26〜33時間増殖させ、大きなコロニーを作製した。その後、プレートを誘導期間中37℃に移行した。この期間中、TS lacリプレッサーはより不活性となり、インテグラーゼの発現が可能となった。さらに、コロニー増殖は、常在性プラスミド上のTS複製変異体により遅延した。細菌は二重の抗生物質選択下にあったので、両方のプラスミドを有する細胞のみが生存した。常在性プラスミド上のatt部位に対するインテグラーゼの活性に応じて、37℃での種々の時間が、改良インテグラーゼのアッセイ法に必要であった。
【０１７４】
アッセイ法の例示的結果
上記のスクリーニングアッセイ法及びベクターを使用して、ヒトゲノム由来のattBとΨA偽性attP配列間のより効率的な組換えを媒介した、進化したΦC31インテグラーゼ遺伝子を見出した。ΦC31インテグラーゼ遺伝子を、上記のような1回のDNAシャッフリングにかけ、シャッフリングした断片のセットをクローニングプラスミドにライゲーションした。シャッフリングしたインテグラーゼのプラスミドライブラリーを、pRES-psAを有するPH10B細菌（上記の常在性プラスミド）に形質転換し、スクリーニングアッセイ法を実施した。
【０１７５】
形質転換コロニーを、プレート上で30℃で中程度に大きなコロニーが得られるまで増殖させた。その後、プレートを24時間37℃に移行し、TS lacIを失活させ、クローニングプラスミドによりコードされるインテグラーゼ遺伝子の発現を可能とした。試験att部位を効率的に組換えることのできる変異インテグラーゼはスタッファー配列を切除し、常在性プラスミド上でのlacZの転写が可能となる。その後、プレートを一晩室温まで移行した。この期間により、β-ガラクトシダーゼは、コロニー中に青色を発色するのに必要なプレート中のX-gal基質を切断できる。その後、コロニーを、青の増加について眼で評価した。数個のより青いコロニーを、約1,000個のコロニーをスクリーニングすることから得た。3つのこのようなコロニー由来の、1C1、5C1、及び7C1変異体と称されるプラスミドDNAを精製し、DNA配列及び機能的解析に使用した。変異体には、「C1」を後に続けて数を割り当て、これは変異体が、1サイクルのシャッフリングを受けたライブラリーから得られたことを示す。
【０１７６】
ΦC31リコンビナーゼ（親、配列番号：20として提示した野生型DNA配列、図4；親、配列番号：21として提示した野生型タンパク質配列、図3A及び3B）を使用して上記の手順に従って、3つの改変リコンビナーゼを、1C1、5C1、及び7C1と同定した。野生型及び改変リコンビナーゼのタンパク質配列のアラインメントを図3A及び3Bに提示する。図3A及び3Bでは、改変リコンビナーゼ7C1（配列番号：22）、野生型リコンビナーゼΦC31（配列番号：21）、改変リコンビナーゼ5C1（配列番号：23）、及び改変リコンビナーゼ1C1（配列番号：24）のタンパク質配列を、共通配列（配列番号：25）に対して提示する。図3A及び3B中の配列の最後の星形は停止コドンを示す。図5（配列番号：22）及び図6（配列番号：26）は、それぞれ、改変リコンビナーゼ7C1のペプチド及びDNA配列を示す。図7（配列番号：23）及び図8（配列番号：27）は、それぞれ、改変リコンビナーゼ5C1のペプチド及びDNA配列を示す。図9（配列番号：24）及び図10（配列番号：28）は、それぞれ、改変リコンビナーゼ1C1のペプチド及びDNA配列を示す。
【０１７７】
上記に考察したように、これらの改変リコンビナーゼは、本発明の方法を使用して、さらなる回のスクリーニングに使用し得る。
【０１７８】
以下は、野生型配列に比べて、各変異体インテグラーゼ（すなわち改変リコンビナーゼ）に存在するDNA配列変化の概要を提供する。
1C1変異体：
225bp（G→A）サイレント
511bp（T→C）サイレント
1135bp（G→A）（アミノ酸379位）バリン［V］→イソロイシン［I］
1509bp（A→G）サイレント
1707bp（C→T）サイレント
1810bp（C欠失）新しいリーディングフレームを作製：（605）Arg-（606）Thr-（607）Ala-（608）Arg-（609）Lys-（610）Thr-*｛対、野生型配列：（605）Gln-（606）Asp-（607）Gly-（608）Thr-（609）Gln-（610）Asp-（611）Val-（612）Ala-（613）Ala-*｝
5C1変異体：
171bp（G→A）サイレント
736bp（G→A）（アミノ酸246位）アラニン［A］→スレオニン［T］
1109bp（A→G）（アミノ酸370位）アスパラギン酸［D］→グリシン［G］
1788bp（G→A）サイレント
7C1変異体：
882bp（T→C）サイレント
1678bp（G→A）（アミノ酸560位）バリン［V］→メチオニン［M］
1825bp（G→C）（アミノ酸609位）グルタミン酸［E］→グルタミン［Q］
【０１７９】
第一回のシャッフリングから獲得した変異インテグラーゼの基質認識の相対的改良を大まかに定量するために、それらを個々に時間経過アッセイ法で試験した。プラスミドpREC、pINT-CRS、plC1、p5C1、及びp7C1を、常在性プラスミドpRES-psAを有するDH10b株に形質転換し、33時間30℃で増殖させた。プラスミドpREC及びpINT-CRSは対照であり、それぞれ、インテグラーゼ遺伝子を有さない、又は、野生型ΦC31インテグラーゼ遺伝子を有する、クローニングプラスミドを構成する。3つの変異体1C1、5C1、及び7C1も、クローニングプラスミド中に有した。コロニーを完全に増殖させた後、プレートを37℃で置き、温度感受性タンパク質の活性を減少させた。非誘導対照として、1つの群あたり1つのプレートを、より高い温度にかけず、室温で実験の経過中インキュベートした。コロニーを、37℃での温度によるインテグラーゼ発現誘導を行なうことなく青さについて評価し、再度、16〜39時間の範囲の37℃でのインキュベート期間後に評価した。解析時に、コロニーは、少なくとも小さな領域の青色を含んでいる場合に青であると評価した。
【０１８０】
この時間経過解析の結果は以下の通りであった。pREC対照は、予期されたように、どの時点でも青コロニーを与えなかった。なぜなら、このプラスミドはインテグラーゼ遺伝子を含まないからである。野生型インテグラーゼを有するpINT-CRSは、低いレベルの組換えを生じ、これは、いくつかのコロニーにおける青の存在により反映される。37℃で16〜39時間の誘導で、10〜30％のpINT-CRSコロニーがいくつかの青い領域を含んでいた。より長い誘導時間で、青い領域をもつコロニーの比率はより高くなったが、1コロニーあたりの青の量は少なく、時点間で比較的類似していた。比較により、1C1変異体は、37℃で16時間のインキュベートで、コロニーのほぼ100％に青の領域を生じた。この変異体では、37℃で時間を増やしても、青コロニーの数は増加しなかったが、コロニー内に存在する青の量は増加しなかった。コロニー内に存在する青の領域は、37℃での誘導時間の増加につれて着実に増加した。5C1変異体インテグラーゼは、1C1変異体に比べて、僅かに低い効率で機能した。37℃16時間で、コロニーの約70％が、青の領域を含み、24時間の誘導で100％に到達した。青と白のコロニーの比率は、コロニー内の青の量と同様に、誘導時間と共に増加した。7C1変異体は、野生型インテグラーゼと同じように機能した。この変異体は、野生型で有意に改良されてなかったようであるが、最初のスクリーニングプレート上でより青く見えた変異体であった。野生型インテグラーゼは、ΨAに対して残留活性レベルを有するのでこの結果は可能である。7C1のような変異体の拾い上げは、誘導時間を減少することにより回避でき、これにより、改良遺伝子についてのよりストリンジェントなスクリーニングをもたらす。
【０１８１】
これらの結果は、親リコンビナーゼ（例えばΦC31インテグラーゼ）から開始して、進化リコンビナーゼを産生するための本発明の方法の能力を実証する。標的生物中の、例えばattBとゲノム部位間の、より効率的な組換えを媒介する、このような改変リコンビナーゼを選択できる（例えば、ヒトゲノムから得たΨA偽性attP配列）。このような改変リコンビナーゼの核酸コード配列は、典型的には、少なくとも1塩基対、その親リコンビナーゼ（群）のコード配列とは異なり、親に比べて、改変リコンビナーゼのポリペプチドコード配列の少なくとも1つのアミノ酸差異を生じる。さらに、異なる改変リコンビナーゼ中に同定されたコード配列の多様性を組み合わせて、単一の変化したリコンビナーゼのコード配列にすることができる。
【０１８２】
実施例2
哺乳動物細胞での改変インテグラーゼのアッセイ法
改良インテグラーゼのスクリーニングアッセイ法は大腸菌で実施した。このスクリーニングから出現した改変インテグラーゼを他の種で試験して、細菌で検出された望ましい特性が保持されているかどうかを決定できる。実施例1に記載の野生型ΦC31インテグラーゼ及び1C1インテグラーゼ変異体を、互いに、哺乳動物組織培養細胞中で、attB認識部位（図11B；配列番号：30）及びネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドのヒト染色体への組込みを媒介する能力について比較した。インテグラーゼの効率は、G418選択後に形成されたネオマイシン耐性コロニーの数を評価することにより決定した。
【０１８３】
293ヒト胚腎臓細胞系を、これらの実験に使用した（Graham, F. L.ら、J. Gen. Virol. 36, 59-72 (1977)）。細胞を直径60mmの皿で50〜80％集密度となるまで増殖させ、50ngのドナーattB  neoプラスミドpNC-attB及び5μgのpCMVInt（Groth, A. C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000 (2000)）、pCMV-1C1、又はpCMVSPORTβGal（Life Technologies、MD州ゲーサーズバーグ）を用いてリポフェクタミン（Life Technologies）を使用してトランスフェクトした。pNC-attBは、（以下の順で）CMVプロモーター、ΦC31 attB配列（図11B、配列番号：30）、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列、及び緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする配列を含むプラスミドであった。pCMV-1C1は、野生型ΦC31インテグラーゼ遺伝子の代わりに、1C1変異体インテグラーゼをCMVプロモーターの制御下に有することを除き、pCMVIntに同一である。pCMVSPORTβGal陰性対照プラスミドは、インテグラーゼ遺伝子を全く有さない。トランスフェクトの24時間後、細胞を直径100mm皿に移し、350μg/mlのジェネテシン（G418、ネオマイシン類似体；Life Technologies）を含む培地と交換する前に、さらに24時間増殖させた。典型的には、5μgのDNAは、識別可能な毒性なく、直径60mm皿のの293細胞のトランスフェクションに対する上限近くであった。
【０１８４】
選択を14日間続け、その後、個々のネオマイシン耐性コロニーを計測した。インテグラーゼ遺伝子を欠失したpCMVSPORTβGalを、pNC-attBで同時トランスフェクトする場合、いくつかのネオマイシン耐性コロニーが得られ、無作為な組込みによるバックグラウンドと考えた。pNC-attBのpCMVInt及びpCMV-1C1による同時トランスフェクションにより、両方共、バックグラウンドよりも10倍より多くコロニー数は増加した。さらに、本発明者らは、pCMV-1C1でトランスフェクトしたプレートは、野生型インテグラーゼプラスミドを有するpCMVIntでトランスフェクトしたものよりも2倍多いコロニーを与えることを見出した。この実験は、2回繰返し、類似の結果を得た。
【０１８５】
これらの結果は、DNAシャッフリングから生じ、実施例1に記載のスクリーニングアッセイ法を使用して検出した、改変1C1インテグラーゼ変異体も、哺乳動物細胞でよく機能することを実証する。変異インテグラーゼはゲノムへの効率的な組込みを媒介し、野生型インテグラーゼと類似又はより高い頻度でゲノム修飾を行なう。ΨA部位に特異的な組込みは、PCRによる個々のネオマイシン耐性コロニーの解析により実証した。このアッセイ法のために、ドナーpNC-attBプラスミドとΨA近くのヒトゲノムDNAの間の組込み接合部に特異的なプライマーを使用した。
【０１８６】
実施例3
改変リコンビナーゼを同定するための追加の方法
以下は、例えば実施例1に概略を示した、リコンビナーゼ遺伝子のシャッフリングしたライブラリーから所望の改変リコンビナーゼを同定するために、異なる状況で有用な4つの追加のスキームである。
【０１８７】
A. 改変リコンビナーゼを同定するための染色体法
改変特異性をもつリコンビナーゼ変異体を見出す追加のスキームは、偽性attB部位を有するアッセイプラスミドを、挿入attP部位で大腸菌染色体に組込む段階を含む。組込みにより、lacZ遺伝子の転写活性化が生じ、これは、蛍光活性化セルソーターで検出する。シャッフリングしたリコンビナーゼ遺伝子は、アッセイ株に形質転換し、蛍光活性化セルソーター上での選別にかける。最も発現の多い細胞からのプラスミドを、次回のシャッフリング、その後のアッセイ法の繰返しのリコンビナーゼ断片源として使用する。これは、選択した偽性att配列に最適な特異性をもつ酵素への漸進的なアプローチを提供する。
【０１８８】
このアッセイ法はまた、染色体挿入attB部位に組込むattPプラスミドを用いて実施できる。
【０１８９】
B. 改良リコンビナーゼを検出するためのカナマイシン選択スキーム
シャッフリングしたリコンビナーゼの、野生型酵素がほとんど又は全く活性を示さない基質（すなわち選択された）att部位に対する活性を検出するために、以下の細菌選択スキームを使用できる。アッセイプラスミドで、2つのatt部位（この間での組換えが望ましい）を、プロモーターを含まない抗生物質耐性遺伝子、この場合カナマイシン耐性遺伝子に隣接したプラスミドに配置する。att部位は逆の配向にあり、よって組込みが起こるとカナマイシン遺伝子は反転し、細菌プロモーター（例えばlacZプロモーター）の制御下に配置される。組換えが2つのatt部位間で起こることを確実にするために、転写終結因子を、第二att部位の下流に配置し得る。
【０１９０】
その後、シャッフリングしたリコンビナーゼを含むプラスミドライブラリーを、このアッセイプラスミドを含む細菌に形質転換する。形質転換した細菌がカナマイシン上で増殖すると、組換え事象が、2つの付着部位の間で生じた。出発リコンビナーゼが試験att部位を全く認識しない場合、カナマイシン上での増殖は、望ましいatt部位での組換え頻度の改良を示す。出発リコンビナーゼが試験att部位間の組換えを非常にゆっくりと引き起こす場合、改良酵素は、組換えを起こすためにほんの短い時間をかけた後に、カナマイシン上での増殖により示される。
【０１９１】
アッセイ法は2通りの方法で使用する。一定時間（例えば6時間）カナマイシンを用いずに形質転換及びインキュベートした後、細菌を蒔き、形成した任意のコロニーは組換え事象から生じる。または、全形質転換ライブリーを液体培養液中で増殖し、これにカナマイシンを一定時間で加え、その後一晩増殖させる。どちらの場合でも、DNAを、カナマイシンの存在下で増殖した細胞から調製し、次回のシャッフリングに使用する。漸進的に改良された酵素が見出されるので、カナマイシン添加前のインキュベート時間は減少する。
【０１９２】
C. すでに活性である部位での組換えについて改良されたリコンビナーゼの検出のための、2つのプラスミドFACSアッセイ法
野生型酵素がすでに効率的に認識するatt部位（例えば、野生型att部位）に対する、シャッフリングしたリコンビナーゼの活性の増加を検出するために、FACS（蛍光活性化セルソーター）に基づく細菌スクリーニングを使用する。アッセイ法により測定した組込み事象は、FACSにより検出可能である例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）などのマーカー遺伝子の発現をもたらすカセット交換である。細菌は、同じ配向の2つのatt部位（この実施例ではattP）により隣接される、プロモーターを含まないマーカー遺伝子（GFP）を含む、DH複製起点をもつ常在性高コピー数プラスミド（Phillips, G. J.ら、BioTechniques 28, 400-408 (2000)）を含む。転写終結因子は、GFP発現の欠失を確実にするために、全カセットの上流に配置する。導入プラスミドライブラリー（シャッフリングしたリコンビナーゼをクローニングする）は、ColE1起点を有する、適合性の高コピー数プラスミドを有する。リコンビナーゼライブラリーを有するプラスミドはまた、GFP遺伝子とほぼ同じサイズのフィラー（filler）配列に隣接する、attPと同じ配向の2つのatt配列（この実施例ではattB）を含む。attP及びattBプラスミドは、ほぼ同じサイズである。第一attBの上流にはプロモーターがある（この場合lacZプロモーター）。組換え事象がattBとattPの間で起こる場合、中間プラスミドを、2つのattB/attPハイブリッドatt部位、attB、及びattPを用いて作製する。ΦC31リコンビナーゼは、attBとattPの間の組換えにより、このようなプラスミドを急速に2つの別のプラスミドに分割する。最初の組換えが第一attBと第一attPの間で、又は第二attBと第二attPの間で起こる場合、最終産物は、lacZプロモーターにより駆動されている、リコンビナーゼ及びGFP遺伝子を含むプラスミドを含む。細胞中で起こる組換え事象が多ければ多いほど（すなわち組込み頻度がより良好）、より多くのGFPが発現される。
【０１９３】
大量のGFPを発現する細菌を、FACSにより集団から選別し、増殖させる。DNAをこれらの細菌から回収する。
【０１９４】
このアッセイ法では、半分の事象では、GFPは発現しない（第一attBが第二attPと組換わる、又はその逆の場合）。集団のこの割合を下げるために、短縮した付着部位を、第二attB及び第二attP配列と置換する。35bpのattBと全長attPの間よりも、全長att部位間で組込み頻度がより高い（Groth, A. C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000 (2000)）。切除反応にはこのような選択性は実証されていない。
【０１９５】
D. SacB選択スキーム及び、インビトロでの改良シャッフルリコンビナーゼのアッセイ法
機能的リコンビナーゼの単一プラスミド選択スキームは、枯草菌（Bacillus subtilus）由来の陰性選択マーカー遺伝子sacBを利用する。スクロースの存在下、sacB遺伝子産物は、溶解を引き起こす大腸菌細胞壁の正常構造を妨害するポリマーにスクロースモノマーを取込む（Quandt, J.及びHynes, M. F. Gene 127, 15-21 (1993)）。構成的に発現されるsacB遺伝子は、部位特異的組込み反応がプラスミドからsacB遺伝子を切断するような様式で、リコンビナーゼatt部位に隣接し、よって、スクロース耐性コロニーが生じる。組換えなく、このプラスミドはスクロースの存在下で細菌を殺滅する。
【０１９６】
シャッフリングしたリコンビナーゼDNA断片を、T7プロモーターの下流の選択プラスミドにライゲーションし、得られたプラスミドライブラリーを、調節可能なT7 RNAポリメラーゼカセットを含む大腸菌に形質転換する。改変リコンビナーゼタンパク質は、プラスミドを受けている大半の細胞で発現されるが、sacBに隣接するatt部位にリコンビナーゼが組換えできるプラスミドを有する細胞のみが、一旦細胞をスクロース含有培地中で増殖した場合に生き残る。
【０１９７】
これらの機能的リコンビナーゼの活性を定量及び比較するために、ハイスループットなインビトロでの組換えアッセイ法を、上記の選択スキームと合わせる。生存細菌（単一コロニー又はクローンのプールとして）を拾い、タンパク質産生のために96ウェル型式で増殖させる。大量のタンパク質が、T7 RNAポリメラーゼのそのプロモーターに対する高い活性を使用して産生される。96ウェルプレートの各ウェルの細胞を回収し、溶解し、変異リコンビナーゼタンパク質を含む粗タンパク質抽出物を放出する（すなわち改変リコンビナーゼ）。変異タンパク質を、シャッフリング時に全ての変異タンパク質に導入したN末端6×ヒスチジンタグを介して、96ウェル型式で迅速に精製する。その後、これらの精製タンパク質を、リコンビナーゼ触媒組換えに好適な条件下で、試験att部位をコードする既知量の線形DNA断片と共にインキュベートする。反応産物を直接アガロースゲル上で解析し、反応の程度を、濃度測定ソフトウェアパッケージを使用して定量する。最善に機能するシャッフルリコンビナーゼを保持し、DNAシャッフリングのその後の回に使用する。
【０１９８】
実施例4
改変リコンビナーゼを同定するためのファミリーシャッフリング
改変リコンビナーゼ酵素の作製におけるシャッフリングの利点をさらに増加させるために、ファミリーシャッフリングとして知られる戦略も使用できる。このアプローチでは、シャッフリング反応用のリコンビナーゼをコードするただ1つの親遺伝子を使用する代わりに、2つまたはそれ以上の相同遺伝子を同時にシャッフリングする。この方法により、異なる遺伝子からのセグメントを共に継ぎ合わせ、より多様な変異体を作製する、より多様な混合物が得られる。このアプローチは、単一遺伝子シャッフリングよりも効果的であることが判明した。例えば、改変酵素は、多様な種由来の4つのセファロスポリナーゼ遺伝子を混合することにより作製した（Crameri, A.ら、Nature 391, 288-291 (1998)）。この実施例では、この方法は、単一遺伝子シャッフリングよりも50倍効果的であった。別の実施例は、2つのチミジンキナーゼ遺伝子をシャッフリングし（Christian, F. C.ら、Nature Biotechnology 17, 259-264 (1999)）、印象的な結果を達成した。リコンビナーゼシャッフリングの場合、ファミリーシャッフリングは、数個の進化的に関連したファージインテグラーゼ遺伝子、例えばΦC31、R4及びTP901インテグラーゼ遺伝子の遺伝子を混合することにより実施する。その後、本明細書に記載したアッセイ法を使用して、改変リコンビナーゼ特異性及び効率について変異体をスクリーニングする。attP及び/又はattB配列は、選択したインテグラーゼ遺伝子の1つ又は複数のattP及び/又はattB部位に対する相同性に基づいて選択し得る。さらに、標的ゲノム（例えばヒト又はマウス）から得た関連attP及び/又はattB配列を使用して、この方法に使用する常在性プラスミドを作製し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  インテグラーゼシャフリング遺伝子スクリーニングにおいて有用なプラスミドを示す。図1Aは、大腸菌内で確立され、転写終結シグナルを含有するスタッファー領域によりそのプロモーターから分離されたlacZ遺伝子を有する、「常在性プラスミド」の一例を示している。スタッファーは2つのattテスト部位すなわちその間で組換えが導かれるatt配列に隣接する。例えばヒトpsi-A偽性attP部位及び野生型attB部位がそれである。組換えの後lacZは転写され、その結果、X-gal指示薬プレート上に青色が見られる。図1Bは、シャッフリングされたインテグラーゼ遺伝子ライブラリを有する「クローニングプラスミド」の例を示す。それは、「常在性プラスミド」を有する受容株へと形質転換される。30℃のプレート上で成長させた後、温度を37℃まで上昇させ、これにより「常在性プラスミド」上にある温度感応性lacIlac抑制遺伝子を不活性化させる。lacプロモーターの制御下で転写されるクローニングプラスミド上のインテグラーゼ遺伝子はその後に発現される。「常在性プラスミド」上のattテスト部位間の組換えを増大させる変異体インテグラーゼが、青色コロニーを発生させることになる。所望の変異体インテグラーゼは、これらのコロニーからクローニングプラスミドを精製することによってそこから回収可能である。
【図２】  Xgalプレート上でのコロニーの着色による、改変リコンビナーゼについてのアッセイ法を概略的に例示する。
【図３Ａ及び図３Ｂ】  図1A及び1Bに描かれ実施例1に記述されている、プラスミドを用いたアッセイ法におけるXgalプレート上のコロニーの青色度の増大によって検出される、3つの改変インテグラーゼにおいて見られるアミノ酸変化を例示する。1C1、5C1及び7C1と呼ばれるこれらの変異体インテグラーゼは、1回のDNAシャッフリングの後に得られた。図3A及び3Bでは、改変リコンビナーゼ7C1（配列番号：22）、野生型リコンビナーゼΦC31（配列番号：21）、改変リコンビナーゼ5C1（配列番号：23）及び改変リコンビナーゼ1C1（配列番号：24）についてのタンパク質配列はコンセンサス配列（配列番号：25）との関係において提示されている。図3A及び3B中の配列の終りにある星印は停止コドンを表わす。
【図４】  野生型ΦC31リコンビナーゼ（配列番号：20）のDNA配列を提示する。
【図５】  改変リコンビナーゼ7C1のペプチド配列を提示する（配列番号：22）。
【図６】  改変リコンビナーゼ7C1のDNA配列を提示する（配列番号：26）。
【図７】  改変リコンビナーゼ5C1のペプチド配列を提示する（配列番号：23）。
【図８】  改変リコンビナーゼ5C1のDNA配列を提示する（配列番号：27）。
【図９】  リコンビナーゼ1C1のペプチド配列を提示する（配列番号：24）。
【図１０】  改変リコンビナーゼ1C1のDNA配列を提示する（配列番号：28）。
【図１１Ａ及び図１１Ｂ】  それぞれ全長ΦC31のattP（配列番号：29）及びattB（配列番号：30）部位のDNA配列を提示する。
【図１１Ｃ】  59bpの野生型ΦC31attP部位（配列番号：33）を提示する。これらの図中、TTGコアは大文字で示されている。
【図１２】  それぞれ、R4リコンビナーゼのためのattB（配列番号：31）及びattP（配列番号：32）を提示する。
【図１３】  ΦC31インテグラーゼ偽性-attP部位yAを包含するヒトの第8染色体に由来する約475bpのDNA配列を示す（配列番号：34）。偽性部位のコアTTG配列は、太字で示されている。コアをとり囲むおよそ40bpが最小attP偽性部位を表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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