(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚潰瘍、術後の外傷及び火傷からなる群から選択される傷の治療のための薬剤の調製における、薬理学的に許容しうる酸性化剤及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源からなる組み合わせの使用であって、前記酸性化剤は有機酸であり、かつ薬剤の適用部位においてｐＨをｐＨ２〜ｐＨ７の範囲のｐＨに低下させるように適応される、使用。
【請求項２】
前記有機酸がアスコルビン酸である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
亜硝酸イオン源が亜硝酸アルカリ金属又は亜硝酸アルカリ土類金属である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤が気体透過性膜をさらに含むものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記膜が酸化窒素の通過に対して完全に透過性である、または部分的に透過性である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
皮膚潰瘍、術後の外傷及び火傷からなる群から選択される傷の治療における同時使用、分離使用又は逐次使用のための組合せ調製品としての、薬理学的に許容しうる酸性化剤及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源からなる組成物であって、前記酸性化剤は有機酸であり、かつ組成物の適用部位においてｐＨをｐＨ２〜ｐＨ７の範囲のｐＨに低下させるように適応される、組成物。
【請求項７】
皮膚潰瘍、術後の外傷及び火傷からなる群から選択される傷の治療において組合せ調製品として使用するための、薬理学的に許容しうる酸性化剤及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源からなるキットであって、前記酸性化剤は有機酸であり、かつキットの適用部位においてｐＨをｐＨ２〜ｐＨ７の範囲のｐＨに低下させるように適応される、キット。
【請求項８】
気体透過性膜をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
薬理学的に許容しうる酸性化剤及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源からなる組み合わせが適用されている、皮膚潰瘍、術後の外傷及び火傷からなる群から選択される傷の治療における使用のための、気体透過性膜であって、前記酸性化剤は有機酸であり、かつ適用部位においてｐＨをｐＨ２〜ｐＨ７の範囲のｐＨに低下させるように適応される、気体透過性膜。
【請求項１０】
前記有機酸がアスコルビン酸である請求項９に記載の気体透過性膜。
【請求項１１】
亜硝酸イオン源が亜硝酸アルカリ金属又は亜硝酸アルカリ土類金属である、請求項９または１０に記載の気体透過性膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は酸性化された亜硝酸塩の新たな医薬的使用に関する。この酸性化された亜硝酸塩は虚血性潰瘍形成や関連状態の治療として傷の癒合を促進するために皮膚に酸化窒素を通過させる送達系の内部に含まれている。
【０００２】
酸化窒素（ＮＯ）は血管内皮細胞により合成され放出される強力な血管拡張神経薬であり、血管の局所的抵抗や血液の流れを調節する際に重要な役割を果している。哺乳類細胞では、ＮＯは主としてＬ−アルギニンの酵素酸化によりＬ−シトルリンと共に産生される。酸化窒素は、血小板及び白血球両者の凝集及び接着の阻害、細胞の増殖の阻害、スーパーオキシド・ラジカルの除去及び内皮層の透過性にも関与する。酸化窒素が、エフ．シー．ファング（１９９７）（J. Clin. Invest. 99 (12) 2818-2825 (1997))の総説にあるように、抗微生物特性を持つことも示された。
【０００３】
ＮＯの抗微生物特性の潜在的な治療上の有用性はＷＯ９５／２２３３５に記述されている。不活性担体であるクリーム又は軟膏中の亜硝酸塩とサリチル酸を含む医薬組成物は大腸菌及びＣ．アルビカンスを含む培養物を殺すことを示すために用いられた。この活性は足の真菌感染（「足白癬」又はティデア・ペディス）を患う患者に対してさらに試験され、そしてこの状態が酸性化された亜硝酸塩組成物での治療に敏感に反応することが示された。しかしながら、亜硝酸塩と有機酸の組成物は皮膚の紅斑（発赤）を惹き起こした。
【０００４】
内部細胞に媒介される産生に加えて、ＮＯは、酵素ＮＯシンターゼとは無関係に見えるある機作により皮膚の表面から外部的にも連続的に放出される。汗に分泌される硝酸塩は未知の機作により亜硝酸塩に還元される。この未知の機作は皮膚の共生細菌により発現される酵素亜硝酸塩リダクターゼを含むかも知れない。または、皮膚表面上で亜硝酸塩をＮＯに迅速に還元しうるであろう哺乳類の亜硝酸塩リダクターゼ酵素が皮膚に存在するのかも知れない。
【０００５】
亜硝酸塩からＮＯの産生は次の機作によると考えられている。
ＮＯ2 -   ＋  Ｈ+   ←→  ＨＮＯ2       ・・・・・・    〔１〕
２ＨＮＯ2     ←→    Ｎ2 Ｏ3   ＋  Ｈ2 Ｏ    ・・・    〔２〕
Ｎ2 Ｏ3       ←→    ＮＯ      ＋  ＮＯ2     ・・・    〔３〕
この生理学的機作により生成するＮＯの量は皮膚血液流に影響を与えるには十分ではないが、硝酸塩及び酸の局所適用により極めて大量のＮＯを形成させることができることは明らかである。
【０００６】
今や、驚くべきことに、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などの有機酸と混ぜ不活性担体であるクリーム又は軟膏中の４％までの濃度の亜硝酸塩を皮膚に局所適用すると、反応して窒素の酸化物を生産し、大した炎症もなしに、微小循環血管の持続した血管拡張をもたらす酸化窒素の放出を惹き起こすことが見出された。亜硝酸塩を含む酸性化された組成物のこの新しい用途は、抗微生物剤としてのこの組成物のこれまで知られた用途とは逸脱している。足の真菌感染の治療と関連する組成物中の酸による皮膚の紅斑及び刺激という副作用は、該組成物が裂けた皮膚の上や直接的且つ短期間の治療的処置を必要とする感染部位から離れた場所で使用されるべきでないことを示唆するものと考えられてきた。さらに、足の上の皮膚は哺乳類の身体の他の部分よりもかなり厚くそして丈夫であり、従って、皮膚の別の箇所の他のより薄い領域よりもより長期の紅斑に耐えることができる。さらに、開いた傷の中又は裂けた皮膚の上に軟膏又はゲルを挿入することに対する広範に且つ一般的に受入れられた偏見がある。このような実務は感染又は敗血症（敗血症）を現実に惹き起こす危険のために反対であると忠告する。
【０００７】
血管拡張を惹き起こす該組成物の能力も驚くべきものである。何故なら、ＮＯ分子は正常では皮膚の外層から表皮の内層中まで横切って血管及び微小毛細管に作用するとは予想されないであろうからである。
【０００８】
本発明の第一の側面によれば、皮膚虚血症及び関連状態の治療のための薬剤の調製における、薬理学的に許容しうる酸性化剤、薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源又は亜硝酸塩前駆体の使用が提供される。
【０００９】
薬理学的に許容しうる酸性化剤は適用部位においてｐＨを低下させるように適応し、そしてこれらには２０％ｗ／ｗまで、適切には０．２５から１０％ｗ／ｗまで、好ましくは４から６％ｗ／ｗまでの濃度のアスコルビン酸（ビタミンＣ）、サリチル酸、アセチルサリチル酸、酢酸又はそれらの塩若しくは誘導体などの任意の適切な有機酸が含まれる。特に好ましい濃度は４％又は５％ｗ／ｗの濃度である。好ましいｐＨ範囲はｐＨ２からｐＨ７であり、好ましくはｐＨ４である。他の酸性化剤には、アンモニウム塩又はアルミニウム塩、フェノール、安息香酸が挙げられるが、これらに限定されない。塩酸などの無機酸は十分に希釈し及び／又は適当に緩衝化すれば使用しうる。酸性化剤は溶解した塩又は液状で存在してもよい。
【００１０】
亜硝酸イオンの薬理学的に許容しうる供給源は亜硝酸アルカリ金属、又は亜硝酸アルカリ土類金属であってもよい。例えば、ＬｉＮＯ2 、ＮａＮＯ2 、ＫＮＯ2 、ＲｂＮＯ2 、ＣｓＮＯ2 、ＦｒＮＯ2 、Ｂｅ（ＮＯ2 ）2 、Ｍｇ（ＮＯ2 ）2 、Ｃａ（ＮＯ2 ）2 、Ｓｒ（ＮＯ2 ）2 、Ｂａ（ＮＯ2 ）2 、又はＲａ（ＮＯ2 ）2 である。または、例えば、硝酸の希釈溶液などの亜硝酸塩前駆体は該組成物において亜硝酸イオンの供給源として使用しうる。亜硝酸イオンの他の供給源は亜硝酸塩に酵素転換できるアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩から誘導される硝酸塩である。例えば、ＬｉＮＯ3 、ＮａＮＯ3 、ＫＮＯ3 、ＲｂＮＯ3 、ＣｓＮＯ3 、ＦｒＮＯ3 、Ｂｅ（ＮＯ3 ）2 、Ｍｇ（ＮＯ3 ）2 、Ｃａ（ＮＯ3 ）2 、Ｓｒ（ＮＯ3 ）2 、Ｂａ（ＮＯ3 ）2 、又はＲａ（ＮＯ3 ）2 である。硝酸イオン源の濃度は２０％ｗ／ｗまで、適切には０．２５から１０％まで、好ましくは４から６％までであればよい。特に好ましい濃度は４％又は５％ｗ／ｗである。
【００１１】
該組成物に存在する亜硝酸イオンの最終濃度は２０％ｗ／ｗまで、一般的には０．２５％から１５％ｗ／ｗまでの範囲で、適切には２％から１０％ｗ／ｗまで、好ましくは４から６％ｗ／ｗまでであることが適切である。特に好ましい亜硝酸イオン濃度は４％又は５％ｗ／ｗである。
【００１２】
虚血症は身体の一部への血液の流れの不適切又は減少として定義される。本発明は皮膚虚血症及びその関連末梢皮膚状態の治療における組成物の使用を提供することを求める。例えば、レイノード現象及び重篤な一次血管痙攣などの疾病状態は皮膚への貧弱な血液の流れにより特徴付けられる。個体の皮膚の損傷も、身体自体の修復機作又は防御機作によりその血液供給が減少又は阻止されるので、皮膚虚血症をもたらす。
【００１３】
本発明のこの側面で規定される組成物の治療的使用から利益を受ける虚血性皮膚状態には、皮膚潰瘍や術後の外傷、火傷を含む傷が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明のこの側面は血小板及び／又は白血球の凝集及び接着、細胞増殖、スーパーオキシド・ラジカルの除去及び内皮層透過性にも及ぶ。皮膚虚血症と関連する座瘡などの他の皮膚科学的状態もこれらの組成物により治療することができる。
【００１４】
本発明のこの側面の薬剤の調製においては、酸性化剤及び亜硝酸イオン若しくはその供給源が不活性なクリーム又は軟膏であってもよい薬理学的に許容しうる担体若しくは希釈剤中で製剤化される。本発明の特に好ましい剤形では、酸性化剤と亜硝酸イオン若しくはその前駆体の供給源は、該クリーム若しくは軟膏中に別々に配置され、使用の環境下でイオンを放出させるため混合される。
【００１５】
この医薬組成物は任意の適切な局所経路により投与されるべく適応される。これらの局所経路には、バッカル、舌下、又は経皮が含まれる。このような組成物は薬学の分野における既知の任意の方法により、例えば、活性成分を担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）と無菌条件下で混合することにより調製しうる。
【００１６】
経皮投与に適応された医薬組成物は、患者の表皮と長期間直接接触した状態にあることを意図した個別の貼り薬として提供してもよい。例えば、活性成分は、Pharmaceutical Research, 3 (6): 318 (1986)に一般的に記述されたようにイオントホレシスにより該貼り薬から送達されうる。
【００１７】
局所投与用に適応された医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル又は油として製剤化されうる。眼又は他の外部組織、例えば、口及び皮膚の治療には、該組成物は局所用軟膏又はクリームとして適用されることが好ましい。軟膏中に製剤化されるときは、該活性成分はパラフィン又は水溶性軟膏基材のいずれかと共に用いられる。または、該活性成分は水中油クリーム基材又は油中水基材を用いてクリーム中に製剤化してもよい。眼への局所適用のために適応された医薬組成物には、活性成分が適切な担体、特に水性溶媒中に溶解若しくは懸濁されている目薬が挙げらる。口に局所適用するように適応された医薬組成物には、菱形トローチ剤、パステルトローチ剤及び口内洗浄剤が含まれる。
【００１８】
該医薬組成物は保存剤、可溶化剤、安定化剤、加湿剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、塩類（本発明の物質はそれ自体薬学的に許容しうる塩の形で提供される）、緩衝液、被覆剤又は抗酸化剤を含んでもよい。これらの医薬組成物は本発明の物質に加えて治療上活性な薬剤を含んでもよい。
【００１９】
本発明の物質の用量は、治療すべき疾病又は障害、該状態の重篤度、及び治療される個体の年齢及び健康等に応じて広い範囲の間で変えることができ、医師が使用すべき適切な用量を最終的に決定することになる。
【００２０】
この用量は適切なものとしてしばしば繰り返し用いられうる。若し副作用が発生するときは、該用量の量及び／又は頻度を、通常の臨床的実務に従って、減少させ又は他の方法で変更若しくは修正できる。
【００２１】
このような組成物はヒト用又は動物用医薬として製剤化しうる。本適用は、論旨が明らかに別意を示さない限り、ヒトにも動物にも等しく適用されるものと解すべきである。
【００２２】
本の第二の側面によれば、皮膚虚血症により特徴付けられる状態の治療のための方法であって、薬理学的に許容しうる酸性化剤、及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源若しくはそのための亜硝酸塩前駆体を含む組成物の投与を含む方法が提供される。
【００２３】
本発明の第三の側面によれば、皮膚虚血症の治療における同時使用、分離使用又は逐次的使用のための組合せ調製品としての、薬理学的に許容しうる酸性化剤、及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源若しくはそのための亜硝酸塩前駆体を含む組成物が提供される。
【００２４】
本発明の第四の側面によれば、皮膚虚血症の治療における組合せ調製物として使用するための、薬理学的に許容しうる酸性化剤及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源若しくはそのための亜硝酸塩前駆体を含むキットが提供される。
【００２５】
本発明の第五の側面によれば、薬理学的に許容しうる酸性化剤及び薬理学的に許容しうる亜硝酸イオン源若しくはそのための亜硝酸塩前駆体を含む膜が提供される。該膜は、酸化窒素の通過に対して完全に透過性であってもよく、又は半透過性若しくは選択的透過性を含む部分的に透過性であってもよい。このような膜は皮膚と該組成物の直接的接触を防ぐことができ、しかも皮膚への酸化窒素の拡散を可能とすることができる。
【００２６】
これは、裂けた皮膚の部分、開いた傷又は深刻な火傷の治療において特に有利である。この方法では、傷部分の完全性が保存される。適切な膜としては、ニトロセルロース、セルロース、アガロース、アルギン酸塩ゲル、ポリエチレン、ポリエステル（例えば、親水性ポリエステルブロック・コポリマー）などのポリマー物質が挙げられるが、これらに限定されない。実用的に使用可能な適切な膜は、 Sympatex （商標) である。これは親水性のポリエステル・ブロック・コポリマーの繊維から構成される。従って、本発明は、これら及びその他の疾病状態、例えば、皮膚虚血症及び／又は細菌、酵母若しくは真菌感染などの微生物感染の治療におけるこのような膜の使用に及ぶ。
【００２７】
本発明の第二及びその後の側面の好ましい特徴は必要な変更を加えて第一の側面にも当てはまる。
【００２８】
本発明はここに下記の実施例及び図を参照して記述されるが、これらは例示の目的でのみ提供されるものであり、本発明を限定するものと解すべきではない。
【００２９】
実施例
実施例１：健常人でのＮＯ発生ゲルの局所適用への微小循環の応答
酸化窒素発生ゲル（ＮＯ発生ゲル）は次のようにして調製した。亜硝酸ナトリウム（Analar（商標) グレード、シグマ，プール，ドーセット，ＵＫから）をＫＹjelly(商標)(ジョンソン・アンド・ジョンソン）に添加して５％ｗ／ｗ溶液を作成した。アスコルビン酸（シグマ）もＫＹjelly(商標）に添加して５％ｗ／ｗ溶液を作成した。各溶液の約０．５ｍｌを滅菌綿棒を用いて患者の皮膚の上で混合した。この二つの溶液を接触させると、結果として起こる反応は酸化窒素を発生させる。この反応はエチルアルコールに浸した紙又は綿棒でその皮膚をクリーニングすることにより停止する。
【００３０】
図１を参照すると、健常人１０名でＮＯ発生ゲルの局所適用への微小循環の応答が測定された。偽薬の処置の効果は反対がわ手の上で同時に測定した。皮膚の微小循環容積は赤外ホトプレチスモグラフィ（ＰＰＧ）で測定し、微小循環速度はレーザー・ドップラー・フラクシメトリー（ＬＤＦ）で測定した。全ての試験は、各被験者について、午前のほぼ同じ時間に、静かな、隙間風のない、温度及び湿度の制御された実験室（２４℃±１℃、相対湿度３０〜４０％）で行われた。
【００３１】
偽薬による処置は正常被験者の前腕にも指にも微小循環血流に対して如何なる効果も持たなかった。活性ゲルによる処置への血管拡張薬応答は、全ての患者において活性ゲル適用の１０分以内にプラトーに達した。健常人ボランティアにおいて、前腕皮膚及び指パルプの血流はＮＯ発生ゲルの局所適用の後に顕著に増加した。この活性ゲルが前腕皮膚に適用されたとき、全ての被験者は容積及び流量の両方で活性ゲル処置に対する大きな血管拡張薬応答を示した。この血流の増加は活性ゲルの除去後にも持続した。この活性ゲルは指の微小循環容積（ＰＰＧ）には有意の効果を示さなかった（図１、指パルプ）。しかしながら、微小循環流量は有意に増加し（ｐ＜０．０１）、除去後も増加し続けた（（ｐ＜０．０１、図１，指パルプ）。
【００３２】
実施例２：重篤な一次血管痙攣を患う患者におけるＮＯ発生ゲルの局所適用への微小循環の応答
図２は重篤な一次血管痙攣を患う２０名の患者で測定されたＮＯ発生ゲルの局所適用への微小循環の応答を示す。偽薬による処置の効果は反対側の手の上で同時に測定された。条件は図１における健常人被験者への該処置の適用の条件と同一であった。皮膚の微小循環容積は赤外ホトプレチスモグラフィ（ＰＰＧ）により測定し、微小循環速度はレーザー・ドップラー・フラクシメトリー（ＬＤＦ）で測定した。
【００３３】
偽薬による処置は全ての患者において前腕でも指でも微小循環血流には如何なる効果も及ぼさなかった。活性ゲルでの処置への血管拡張薬応答は活性ゲルの適用の１０分以内に全ての患者でプラトー相に達した。このゲルが前腕の皮膚に適用されたとき、全ての患者は容積及び流量の両方で活性ゲルによる処置への大きな血管拡張薬応答を示した。血流におけるこの増加は両方の群（図２，前腕と指パルプ）で該活性ゲルの除去後にも持続した。指パルプへの活性ゲルの適用は微小循環容積の有意の増加（ｐ＜０．０５）を示したが、これはゲルを除去すると急速に休止レベルに戻った。活性ゲルは指微小循環流量をも有意に（ｐ＜０．０１）増加させ、正常値に達した。この増加は、ゲルの除去後、減少したものの、持続した（ｐ＜０．０５）。
【００３４】
実施例３：膜を通してもたらされる酸化窒素の発生
図３は先に詳述した反応から膜を通してもたらされる酸化窒素の発生を示す。酸化窒素の濃度は酸化窒素感受性メーター、データ取得システム及びＩＢＭ計算機に連結したモデル４２ＣケミルミネセンスＮＯ−ＮＯ2 −ＮＯx アナライザー（サーモ・エンバイロンメンタル・インストルーメント・インク、ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。測定は連続して行い、読みは１０秒毎に２７５分間行った。材料１は家庭のクリングフィルム、材料２は Saranwrap (商標) ( シグマ) 、そして材料３は Sympatex(商標) （アクゾー・ノーベル）であった。
【００３５】
実施例４：三つの異なる膜材料へのＮＯ発生ゲルの適用の微小循環の応答
図４は三つの異なる膜へのＮＯ発生ゲルの適用、次いでこれを健常被験者の前腕皮膚への適用、への微小循環の応答を示す。条件は図１で健常被験者への該処置の適用に用いたものと同一であった。皮膚の微小循環容積は赤外ホトプレチスモグラフィ（ＰＰＧ）により測定した。材料１は家庭のクリングフィルム、材料２は Saranwrap (商標) ( シグマ) 、そして材料３は Sympatex(商標) （アクゾー・ノーベル）であった。
【００３６】
微小循環血容積の増加は皮膚への膜を通しての酸化窒素の拡散の反映である。酸化窒素の膜を通る移動はその膜の物理的特性を反映し、大きく変動しうる。材料番号３（ Sympatex(商標) ，アクゾー・ノーベル）は優れた拡散特性を持っていた。
【００３７】
実施例５：三つの異なる膜材料へのＮＯ発生ゲルの適用の微小循環の応答
図５は三つの異なる膜へのＮＯ発生ゲルの適用、次いでこれを健常被験者の前腕皮膚に適用、への微小循環の応答を示す。条件は図１における健常被験者への該処置の適用に用いたものと同一であった。皮膚微小循環速度はレーザー・ドップラー・フラクシメトリー（ＬＤＦ）により測定した。
【００３８】
微小循環速度の増加は皮膚への膜を通しての酸化窒素の拡散の反映である。膜を通しての酸化窒素の移動は膜の物理的特性の反映であり、大きく変動しうる。材料番号３（ Sympatex(商標) ，アクゾー・ノーベル）は優れた拡散特性を持っていた。
【００３９】
実施例６：膜を通る酸化窒素の発生の比較
図６は、１０μｍ Sympatex(商標) 膜を通る上述の反応由来の酸化窒素の発生を示す。酸化窒素濃度は酸化窒素感受性メーター、データ取得システム及びＩＢＭ計算機に連結したモデル４２ＣケミルミネセンスＮＯ−ＮＯ2 −ＮＯx アナライザー（サーモ・エンバイロンメンタル・インストルーメント・インク、ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。測定は連続して行い、読みは１０秒毎に１３５０分間行った。
【００４０】
図６に示す結果は、膜を通る拡散係数が亜硝酸イオン源と酸性化剤両者の濃度の直接の積である酸化窒素の生産に密接に関連することを示す。さらに、この結果は酸化窒素の基礎生産が、これらの試薬の混合の後、相当の期間持続することを証明する。
【００４１】
実施例７：ＮＯ発生ゲルの適用への微小循環の応答
ＫＹjelly(商標) 中に亜硝酸ナトリウムとアスコルビン酸両者の３３０ｍＭを含む酸化窒素発生ゲルを、９名の健常被験者の前腕皮膚に直接適用し、同時に Sympatex(商標) １０μｍ膜（アクゾー・ノーベル）に適用し、これを次に被験者の反対側の手の前腕皮膚に適用した。条件及び実験方法は図１、２、４及び５で健常被験者へのＮＯ発生ゲルの適用に用いられたものと同一であった。その結果を図７に示す。図７では混合の濃度が異なる単位である（即ち、％ｗ／ｗの代わりにｍＭが使用）ことに注意すべきである。レーザー・ドップラー・フラクシメトリー（ＬＤＦ）により皮膚の微小循環流量を測定した。
【００４２】
微小循環流量における基底線からの統計学的に有意な増加は皮膚への膜を通しての酸化窒素の拡散の反映である。膜を通過するＬＤＦにより示されたこの血管拡張は、ＮＯ発生ゲルが前腕の皮膚に直接適用された場合に観察されたものの６０〜７５％（平均６４％）に及んだ。図７に示す結果は、直接適用への血管拡張薬応答がゲル適用の１０分以内に全ての患者でプラトー相に到達したということを示す図１で記述した観察を支持する。量においては減少するもののプラトー相は、ＮＯ発生ゲルが膜に適用された場合にも１６分以内に達成された。そしてこのプラトー相は膜拡散特性に関連する遅延相を反映する。
【００４３】
実施例８：ＮＯ発生ゲルの抗微生物特性
１０μｍ Sympatex(商標) 膜を通過する拡散の後のＮＯ発生ゲルの抗微生物特性は次のようにして研究した。ＮＯは、１％塩化ナトリウムを中間物として用いて、０．８％寒天ゲル中で亜硝酸ナトリウムとアスコルビン酸を混合することにより発生させた。この調製物を、ある濃度範囲の亜硝酸ナトリウムとアスコルビン酸を用い、Ｓ．アウレウスＮＣＴＣ９３５３及び大腸菌ＮＣＴＣ１０１４８について試験した。Ｓ．アウレウスと大腸菌の培養は２〜３コロニーを用いて２０ｍｌのＬＢ（ルーリア−ベルタニ：バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−イーストエキストラクト５ｇ、及び塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）ブロスに接種し、３７℃で一晩インキュベートして調製した。ＮａＣｌ中１．５％寒天の２４ｍｌにＳ．アウレウスか又は大腸菌の１ｍｌを接種し、ペトリ皿に注いだ。膜のディスク（直径１００ｍｍ）を７０％エタノールで滅菌し、次にこのディスクを層流キャビネット中に置いてエタノールを蒸発させた。亜硝酸ナトリウムかアスコルビン酸のいずれかを最終濃度で５００ｍＭ、２５０ｍＭ、１６５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ又は０．５ｍＭ含む１％ＮａＣｌ中０．８％寒天の５ｍｌを調製した。使用時の最終濃度はその半分であった。
【００４４】
無菌の逆さにしたペトリ皿の蓋の部分の中央に、亜硝酸ナトリウムとアスコルビン酸の各濃度の１ｍｌを添加し混合した。次に、無菌のピンセットを用いて消毒した膜をこの上に直接置いた。いずれの方向にも均等に蓋の端からはみ出るように膜を注意深く配置した。次に、ペトリ皿の底の部分を逆さにして蓋／混合物／膜の配列の上部の上に置き、膜と逆さにした接種した寒天の間に２〜３ｍｍの隙間を残すようにした。
【００４５】
この装置を３７℃で一晩インキュベートした後取り出した。（逆さにした）そのペトリ皿の底の部分を除去し、寒天の中央部分を滅菌プラスチック計量コップを用いて円状にカットして試料とした。この寒天を、次に、１０ｍｌのＬＢブロスと５ｍｌの滅菌ガラスビーズ中で摩砕した。連続希釈を行い、試料を血液寒天平板上に塗布し、それを３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、生存コロニーを数えた。
【００４６】
酸化窒素の抗微生物特性は５０ｍＭを越える濃度で見られた。この濃度未満では、部分的又は全く抗微生物活性は見られなかった。この濃度を越えると、細胞溶解が起こり、該細菌の完全な死滅に至る。図８に示す結果は種々の濃度のＮＯ発生ゲル及び Sympatex(商標) １０μｍ膜を通過して得られる拡散の抗微生物効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、健常人の前腕の皮膚及び指のパルプにおける微小循環血流に及ぼす該治療の直接適用及びその後の適用除去の効果を示す。垂直軸は血流、即ち、微小循環容積に関するホトプレスチモグラフィー（ＰＰＧ，光学的容積変動記録法）及び微小循環流量（赤血球カウント×速度）に関するレーザー・ドップラー・流量測定法（ＬＤＦ）である。水平軸は分で表した時間である。ＮＳ＝有意でない。示した点は平均値を表す。誤差のバーは９５％信頼性である。* ＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１、*** ＝ｐ＜０．００１、↑＝ゲルの適用、そして↓＝ゲルの除去。
【図２】  図２は、重篤なレイノード現象を患う患者の前腕及び指のパルプにおける微小循環血流に及ぼす該治療の直接適用及びそれに続く適用の除去の効果を示す。垂直の軸は血流、即ち、微小循環容積に関するホトプレスチモグラフィー（ＰＰＧ）及び微小循環流量に関するレーザー・ドップラー・流量測定法（ＬＤＦ）である。水平軸は分で表した時間である。
【図３ａ】  図３ａは、Saranwrap(商標)(ＳＷ−０１）を通過する酸化窒素の拡散を示す。ここで、垂直軸は酸化窒素の濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。用いた結果を示す。
【図３ｂ】  図３ｂは、クリングフィルム（ＣＦ−０２）を通過する酸化窒素の拡散を示す。ここで、垂直軸は酸化窒素の濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。用いた結果を示す。
【図４】  図４は、健常人における前腕皮膚の微小循環血流に及ぼす膜を通した処置の拡散効果を示す。垂直軸は微小循環容積に関する血流、即ち、ホトプレスチモグラフィー（ＰＰＧ）であり、水平軸は分で表した時間である。
【図５】  図５は、健常人における前腕皮膚の微小循環血流に及ぼす膜を通した処置の拡散効果を示す。垂直軸は血流、即ち、微小循環流量に関するレーザー・ドップラー・流量測定法（ＬＤＦ）であり、水平軸は分で表した時間である。
【図６ａ】  図６ａは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（５００ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。この図の最初のピークは検出装置の全スケール振り切れのため、人為的に平坦化している。
【図６ｂ】  図６ｂは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（２５０ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。この図の最初のピークは検出装置の全スケール振り切れのため、人為的に平坦化している。
【図６ｃ】  図６ｃは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（１６５ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図６ｄ】  図６ｄは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（５０ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図６ｅ】  図６ｅは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（２５ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図６ｆ】  図６ｆは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（５ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図６ｇ】  図６ｇは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（２．５ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図６ｈ】  図６ｈは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸ナトリウム（０．５ｍＭ）及びアスコルビン酸の膜透過拡散を示す。この数値は Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜を通過する酸化窒素の拡散を示す。垂直軸はパートパーミリオン（ＰＰＭ）での酸化窒素濃度を示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図６ｉ】  図６ｉは、１％の塩化ナトリウムを中間体として用いる、０．８％寒天ゲル中の亜硝酸塩（対照）の膜透過拡散を示す。
【図７】  図７は、前腕皮膚への、ＫＹjelly(商標) 中の３３０ｍＭの亜硝酸ナトリウムとアスコルビン酸から成る酸化窒素発生ゲルの適用、及び同時に Sympatex(商標) １０μｍ（アクゾー・ノーベル）膜への適用、次いでこれを９名の健常人の反対側の手の前腕皮膚に適用したものの結果を示す。条件及び実験方法は図１、２、４及び５における健常人へのＮＯ発生ゲルの適用の場合と同じであった。垂直軸はレーザー・ドップラー・流量測定ユニットを示し、水平軸は分で表した時間を示す。
【図８】  図８は、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＴＣ９３５３及び大腸菌ＮＣＴＣ１０１４８に対する異なる亜硝酸イオン濃度でのＮＯ発生ゲルの抗微生物活性を示す。垂直軸は百分率として微生物の生存率を示し、水平軸はＮＯゲル濃度をｍＭで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６ｈ】
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【図６ｉ】
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【図７】
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【図８】
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