(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
負電荷を有する荷電有機複合体および正電荷を有する荷電タンパク質を含んでなり、
（ａ）前記有機複合体がサポニンを含み、
（ｂ）その有機複合体およびタンパク質が静電気的に結合し、
静電気的相互作用が、前記タンパク質と前記有機複合体との間の引力となる、免疫原複合体。
【請求項２】
前記タンパク質がペプチドを含む、請求項１に記載の免疫原複合体。
【請求項３】
前記有機複合体がリン脂質を含んでなる、請求項１又は２に記載の免疫原複合体。
【請求項４】
リン脂質がホスホグリセリドである、請求項３に記載の免疫原複合体。
【請求項５】
ホスホグリセリドがホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸およびカルジオリピンからなる群から選択される、請求項４に記載の免疫原複合体。
【請求項６】
リン脂質が脂質Ａである、請求項３に記載の免疫原複合体。
【請求項７】
脂質Ａがジホスホリル脂質Ａおよびモノホスホリル脂質Ａからなる群から選択される、請求項６に記載の免疫原複合体。
【請求項８】
複合体が細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導する請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原複合体。
【請求項９】
１種以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤とともに、有効成分として請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原複合体を含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項１０】
哺乳類において病状を処置する方法において用いるための、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原複合体であって、前記方法が哺乳類に有効量の前記免疫原複合体を投与することを含み、複合体の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する、免疫原複合体。
【請求項１１】
免疫応答が細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む、請求項１０に記載の免疫原複合体。
【請求項１２】
処置が治療的または予防的なものである、請求項１０又は１１に記載の免疫原複合体。
【請求項１３】
病状が微生物感染または癌に起因する、請求項１０又は１１に記載の免疫原複合体。
【請求項１４】
微生物感染がＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、結核または寄生虫による症状であり、また癌が黒色腫、前立腺癌または乳癌である、請求項１３に記載の免疫原複合体。
【請求項１５】
哺乳類において病状を処置する方法において用いるため、請求項１０から１４のいずれかに記載の免疫原複合体を含むワクチン組成物であって、病状を処置する方法が哺乳類に有効量の前記ワクチン組成物を投与することを含み、ワクチン組成物の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する、ワクチン組成物。
【請求項１６】
病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止するための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原複合体の使用であって、前記病状が微生物感染又は癌に起因する使用。
【請求項１７】
微生物感染がＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、結核または寄生虫感染であり、また癌が黒色腫、前立腺癌または乳癌である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
治療に用いるための請求項１から８のいずれかに記載の免疫原複合体。
【請求項１９】
負電荷を有する荷電有機複合体及び正電荷を有する荷電タンパク質を含む免疫原複合体を形成する方法であって、
前記方法が、タンパク質を選択する工程、正電荷が増大するようにタンパク質を修飾する工程、及び前記タンパク質を、サポニンを含む有機複合体と反応させる工程を含む方法。
【請求項２０】
前記タンパク質を、有機複合体と反応させる工程の前に、更に、前記有機複合体の負電荷を増大させる工程を含む請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は概して荷電有機担体および荷電抗原、より詳しくは、負電荷を有する有機担体および正電荷を有する抗原を含んでなる免疫原複合体に関する。本発明の複合体は、特に、抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導を促進するための治療薬および／または予防薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
発明の背景
本明細書において著者によって引用される刊行物の文献詳細は記載の最後に収録されている。
【０００３】
同一の抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原およびアジュバントの同時送達は適当な免疫応答の誘導に好ましく、必須である場合もあるという考えが広がりつつある。例えば、サポニンをベースとしたアジュバントのＣＤ３＋ＣＴＬ応答を誘導する能力は、それらの同時送達を必要とする機構である、抗原のエンドソーム逃避を引き起こす能力に起因する。アジュバントと抗原の安定な複合体を含んでなる粒子形成は同時送達を達成するための最も単純な方法である。ＩＳＣＯＭ（商標）技術の有用性はいく分かはサポニンの免疫調節性活性に由来し、いく分かはそれらの疎水性または両親媒性免疫原と複合体を形成する能力に由来する。しかしながら、多数の分子は疎水性領域を欠いており、実際は、かかる分子はそれらのより容易な発現および精製のために組換えタンパク質が好ましい。
【０００４】
従って、抗原と担体の同時送達を促進するが、通常は十分に安定な複合体を形成しない免疫原複合体を開発する必要がある。例えば、疎水性領域を欠く抗原とアジュバントを含んでなる複合体。
【０００５】
本発明の糸口となる研究では、本発明者らは抗原とアジュバントなどの有機担体の静電気的結合に基づく免疫原複合体を開発した。静電気的結合は抗原と有機担体の免疫系への同時送達を可能にする。従って、静電気的結合を確立することによって、例えば抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するという目的ために、注目される抗原（それらの疎水性に関わらず）を有機担体と同時送達できる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本明細書およびその後に続く請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解す必要がない限り、「含む」および「含んでなる」などの語尾変化は示された整数もしくは工程または一連の整数もしくは工程を包含するが、いずれかのその他の整数もしくは工程または一連の整数もしくは工程を除外するものではないことを意味すると理解される。
【０００７】
本明細書はプログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン２．０を用いて作製され、本明細書において文献の後に示されるアミノ酸配列情報を含む。各アミノ酸配列は数値的指標によって＜２１０＞、続いて、配列識別子によって（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）配列を列挙することによって同定される。各アミノ酸配列についての配列の長さ、種類（タンパク質（ＰＲＴ）など）および供給生物はそれぞれ数値的指標フィールド＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞で提供される情報によって示されている。本明細書において参照されるアミノ酸配列は数値的指標フィールド＜４００＞で提供される情報によって、さらに配列識別子（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２など）によって規定される。
【０００８】
本発明の１つの態様は荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体に関する。
【０００９】
より詳しくは、本発明のもう１つの態様は負電荷を有する有機担体および正電荷を有する抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００１０】
本発明のさらにもう１つの態様は負電荷を有する有機担体および正電荷を有するタンパク質を含んでなり、有機担体とタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００１２】
本発明のなおさらなるもう１つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、そのアジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００１４】
本発明のなおさらなるもう１つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、かつ、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する
【００１５】
本発明のさらなる態様は１種以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤とともに、有効成分として荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を含んでなるワクチン組成物に関する。
【００１６】
本発明のもう１つのさらなる態様は哺乳類において抗原に対する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含む方法に関する。
【００１７】
本発明のさらにもう１つのさらなる態様は哺乳類において病状を治療する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含み、組成物の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延、または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法に関する。
【００１８】
本発明のさらにもう１つのさらなる態様は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物の病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止するための医薬の製造における使用に関する。
【００１９】
本発明のなおさらにもう１つのさらなる態様は病状の発症または進行の阻害、停止、遅延または防止に用いる薬剤に関し、薬剤は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物を含んでなる。
【００２０】
本明細書を通して用いられる一文字および三文字略語が表１に定義されている。
【００２１】
0005084984.tif 000002
【００２２】
好ましい具体例の詳細な説明
本発明は一部分は静電気的相互作用を利用して抗原と担体を結合させ、それによって、特に、これらの分子の免疫系への同時送達を促進する免疫原複合体製剤の開発に基づいている。本発明の免疫原複合体は特に、疎水性領域を含まない免疫原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答の刺激の促進に用いるのに好適である。
【００２３】
従って、本発明の１つの態様は荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体に関する。
【００２４】
「複合体」とは２種以上の異なる相互作用性化学成分の実体を表すと理解されるべきである。
【００２５】
「荷電」有機担体または抗原とは全体的に正の電気的電荷または全体的に負の電気的電荷を示す有機担体または抗原として理解されるべきである。「全体的に」とは所与の分子が含んでなる個々の正および負電荷の総計を意味する。個々の正および負電荷の総計が全体的に電気的中性をもたらす場合には、本発明の範囲内では分子は「荷電」とは考えられない。好ましくは、抗原は全体的に正電荷を含んでなり、かつ、有機担体は全体的に負電荷を含んでなる。
【００２６】
従って、より詳しくは、本発明は負電荷を有する有機担体および正電荷を有する抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００２７】
「静電気的に結合した」とは有機担体および抗原が静電気的相互作用を含む手段によって連結、結合または会合していることを指す。従って、静電気的相互作用が抗原および有機担体の複合をもたらす唯一の引力である場合もあると理解されるべきである。しかしながら、その他の例では、静電気的相互作用の形成がまた、その他の相互作用力の形成をもたらすか、またはそれと関連し得る。
【００２８】
「抗原」とはそれに対して免疫応答、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導すると考えられるいずれかの分子を指すと理解されるべきである。抗原はタンパク質性または非タンパク質性分子のいずれであってもよく、この分子は単独で投与される場合には免疫原性であってもそうでなくともよい。本発明の抗原は天然に得ることもできるし、または組換えによってもしくは合成によっても製造できる。抗原はその単離または合成に続いて本発明における使用に先立ってさらなる改変（例えば、その抗原性を向上させるための構造または配列改変）を必要とする場合もある。本発明に用いるのに好適な抗原としては、限定されるものではないが、ウイルスから単離したコアタンパク質または核タンパク質、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などの非コアウイルスタンパク質、悪性および非悪性細胞の抗原、細菌性抗原、寄生虫抗原ならびに合成および組換えポリトープが挙げられる。
【００２９】
好ましくは、抗原はタンパク質である。「タンパク質」とはタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドならびにそれらの誘導体および同等物を包含すると理解されるべきである。タンパク質は種々の程度にグリコシル化もしくは非グリコシル化、リン酸化もしくは脱リン酸化されていてもよく、かつ／または、タンパク質に融合、連結、結合または会合した、アミノ酸、脂質、炭水化物またはその他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質などのある程度のその他の分子含んでいてもよい。前記の「タンパク質」としてはアミノ酸の配列を含んでなるタンパク質ならびにアミノ酸、脂質、炭水化物またはその他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質などのその他の分子と結合したタンパク質を含む。
【００３０】
前記に定義されるように、本発明の抗原はまたポリトープであり得る。本ポリトープは合成または組換え法（例えば、国際特許公開ＷＯ９６／０３１４４を参照）によって製造すればよい。
【００３１】
好ましい具体例によれば、負電荷を有する有機担体および正電荷を有するタンパク質を含んでなり、有機担体とタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が提供される。
【００３２】
これに関しては、本発明の免疫原複合体に含まれる抗原は、その最初の、すなわち天然の形態では正電荷を有しても、負電荷を有してもまたは中性電荷を有してもよい。抗原が正電荷を有する場合であっても、弱く正電荷を有し、従って、その正電荷度を増加させ、その結果、負電荷を有する有機担体との複合体形成がより促進されるための改変を必要とする場合もある。例えば、抗原が弱く正電荷を有する場合には、その正電荷度を増加させることは、限定されるものではないが、抗原へのさらなる正電荷の化学的付加または抗原へのポリリジンの付加などによる正電荷の組換えによる付加をはじめとする当業者に公知のいくつかの方法のいずれか１つによって達成できる。これは特に抗原がタンパク質である場合に用いられる。抗原の正電荷度を増加させるために用いられ得るその他の方法としては、限定されるものではないが、ｐＨ改変、化学修飾または抗原の負電荷のアルギニンなどの正電荷を有する分子での中和が挙げられる。同様に、抗原が中性または負電荷を有する場合には、かかる方法論を用いることによってその全体的な電荷を全体的に正電荷に変換することができる。負電荷を有する抗原の全体的に正電荷を表すための変換は、ほとんどのタンパク質は自然状態では負電荷を有するので抗原がタンパク質である場合には特に重要であり得る。
【００３３】
注目される抗原の電荷が十分に正であれば、正電荷を有する抗原の沈殿が有機担体との複合体形成に先立って起こらないことを確実にすることが必要となる。これに関しては、抗原沈殿を防ぐためのいずれかの好適な方法を用いればよい。例えば、抗原可溶性は抗原凝集を引き起こす力を破壊することによって維持できる。これらの力の破壊は、例えば抗原に尿素およびグアニジンなどの溶液カオトロピック剤、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）およびアセトニトリルなどの溶媒、双性イオンなどの中間体、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＣＨＡＰＳ（３−［（３−コルアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）などの界面活性剤、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）およびシステインなどの還元剤およびＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などのキレート剤を組み込むことによって達成することができる。可溶性はまた、抗原溶液のｐＨを変更することによって、またはアルキル化またはアセチル化などによる極性もしくはイオン性分子を導入するための抗原の化学修飾によって維持することができる。抗原が「有機担体」と接触している時にこれらの沈殿防止剤を漸進的または段階的に除去するか、または抗原を軽く変性させることにより、抗原の制御された沈殿がをもたらされ、同時に有機担体との結合の増加が生じ得る。
【００３４】
「有機担体」とは抗原がそれと結合する場合に抗原に対する免疫応答、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導を促進する、いずれかの分子、分子の凝集塊または複合体、化合物またはその他の実体と理解されるべきである。本担体は「有機的」であり、これに関しては、「有機的」とは天然に、組換えによってまたは合成によって得たかまたは誘導したかの、炭素の化合物と理解されるべきである。特に好ましい具体例では、有機担体はアジュバントである。「アジュバント」とは免疫応答のいずれか１種以上の態様を刺激、増強またはアップレギュレートするよう機能する、いずれかの有機分子、有機分子の凝集塊または複合体、化合物またはその他の実体を意味する。例えば、アジュバントは炎症を誘導し、それにより免疫応答細胞を抗原局在化部位に引きつけ得る。あるいは、アジュバントは抗原をゆっくりと放出し、それによって免疫系の進行中の刺激を提供し得る。本発明に用いるのに好適なアジュバントの例としては、限定されるものではないが、サポニン、サポニン複合体、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）として知られるサポニン、コレステロールおよび脂質からなる免疫刺激性複合体のいずれか１種以上の成分（例えば、サポニン成分、および／またはリン脂質成分）、リポソームまたは水中油エマルションが挙げられる。［ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の組成および製造は国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ８６／００４８０、オーストラリア特許第５５８２５８号および同第６３２０６７号および欧州特許公開第０１８０５６４号に詳細に記載されており、それらの開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる］。アジュバントのさらなる例としては、限定されるものではないが、Cox and Coulter, 1992, 1997 and 1999という刊行物に列挙されるものが挙げられる。本有機担体は天然に生じ得るかまたは合成によってもしくは組換えによって誘導できると理解されるべきである。
【００３５】
従って、本発明はいっそうより好ましくは負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【００３６】
好ましくは、アジュバントはサポニンまたはサポニン複合体を含んでなる。より好ましくは、サポニン複合体はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である。
【００３７】
本発明の有機担体はまた、その最初のまたは天然の形態では負電荷を有しても、正電荷を有してもまたは中性であってもよい。負電荷度を増加させること（例えば、有機担体が弱くしか負電荷を有さない場合には）または中性のまたは正電荷を有する有機担体を負電荷を有する有機担体に変換することもまた、当業者に公知の好適な方法のいずれかによって達成できる。例えば、有機担体が水中油エマルションである場合には、非極性尾部を有するいずれかの陰イオン界面活性剤の組み込みが、界面活性剤の尾部を油的へ挿入し、それにより負電荷を有する頭部を露出させることによりエマルションに全体的な負電荷を付与するであろう。サポニン複合体アジュバントの負電荷は、例えば、複合体形成の際に負電荷を有する脂質を加えることによって増加させることができる。
【００３８】
担体の負電荷を増加させ得る界面活性剤の例としては、限定されるものではないが、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸およびタウロデオキシコール酸が挙げられる。担体の負電荷を増加させ得る脂質の例としては、限定されるものではないが、リン脂質（好ましくはホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジン酸、最も好ましくはカルジオリピン）および細菌脂質（好ましくはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、最も好ましくは国際特許公開ＷＯ９５／１４０２６に記載されるＯＭ１７４などのジホスホリル脂質Ａ）が挙げられる。
【００３９】
本発明を何ら限定するものではないが、本発明者らは本荷電有機担体および荷電抗原がそれぞれ自然状態で負および正電荷を有する場合には本発明の目的が達成され得るということを確定した。しかしながら、いっそうより有効な免疫原複合体は自然状態で負電荷を有する本有機担体がより多くの負電荷を付与され（好ましくはカルジオリピンまたはジホスホリル脂質Ａの添加によって）、かつ／または、自然状態で正電荷を有する本抗原がより多くの正電荷を付与される（好ましくはポリリジン尾部の付加によって）場合に達成される。自然状態で負電荷を有する有機担体がより多くの負電荷を付与され、かつ、自然状態で正電荷を有する抗原がより多くの正電荷を付与されることが好ましい。
【００４０】
従って、１つの好ましい具体例では、負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が
提供される。
【００４１】
もう１つの好ましい具体例では、負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が提供される。
【００４２】
最も好ましい具体例では、負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、かつ、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が提供される。
【００４３】
アジュバントまたはタンパク質がそれぞれ「自然状態で」負または正電荷を有するとは、分子がその生成時に（自然状態で、組換えによってまたは合成によってに関わらず）保持する電荷と理解されるべきである。
【００４４】
電荷度を増加させるための改変は前記で論じられた好適な技術のいずれかによって達成できる。好ましくは、本タンパク質はポリリジン尾部の付加によってより多くの正電荷を付与され、かつ、本アジュバントはカルジオリピンまたはジホスホリル脂質Ａの添加によってより多くの負電荷を付与される。
【００４５】
「誘導体および同等物」とは天然の、合成または組換え供給源に由来する断片、一部、部分、化学的同等物、変異体、相同体および類似体と理解されるべきである。本抗原または担体がタンパク質である場合には、誘導体はアミノ酸の挿入、欠失または置換に由来し得る。アミノ酸挿入誘導体は１個または複数のアミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列変種は１個以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されているものであるが、得られた産物の好適なスクリーニングをともなうランダム挿入も可能である。欠失変種は配列からの１個以上のアミノ酸の除去を特徴とする。置換アミノ酸変種は配列中のある残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。アミノ酸配列への付加はその他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。「同等物」は本担体または抗原の機能的類似体として作用し得る。化学的同等物は必ずしも本担体または抗原に由来しなくてもよいが、一定のコンフォメーションの類似性を共有し得る。あるいは、化学的同等物は本担体または抗原の一定の生理化学的特性を模倣するよう設計してもよい。同等物は化学合成してもよいし、または例えば、天然産物スクリーニング後に検出してもよい。本明細書において考慮される相同体としては、限定されるものではないが、異なる種に由来する分子が挙げられる。
【００４６】
本発明は一部は、好ましくは負電荷を有する有機担体と正電荷を有する抗原の、静電気的結合による免疫原複合体の形成に基づいている。かかる複合体の被験体への投与はアジュバントと抗原が同時にではあるが結合していない形態で投与されて達成されるものよりも有意によりよい免疫応答の誘導を促進する。特に、本発明のアジュバントと結合した抗原の投与は抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導を促進する。しかしながら、体液性およびその他の細胞性応答も増強され得る。
【００４７】
本発明をいずれか１種の理論または作用様式に限定するものではないが、アジュバントと抗原の複合は同一抗原提示細胞へのアジュバントと抗原の同時送達を促進し、それによりこれらの分子が同時送達されないと生じないかまたは効果的には生じないのいずれかである免疫応答の誘導を促進するということが考えられる。例えば、いくらかのＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導はアジュバントが抗原提示細胞における抗原のエンドソーム逃避を誘導する場合に生じると考えられる。これは抗原提示細胞への抗原とアジュバントの同時送達を必ず必要とする。
【００４８】
従って、本発明のさらなる態様は哺乳類において、限定するものではないが、体液性および／または細胞媒介性免疫応答をはじめとする免疫応答を誘導するための本発明の使用に関する。
【００４９】
従って、本発明のもう１つの態様は１種以上の医薬上許容される担体および／または賦形剤とともに、有効成分として荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を含んでなるワクチン組成物に関する。
【００５０】
好ましくは、有機担体はアジュバントであり、いっそうより好ましくは、サポニンまたはサポニン複合体である。好ましくはサポニン複合体はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である。
【００５１】
いっそうより好ましくは、抗原はタンパク質である。
【００５２】
好ましくは、有機担体は負電荷を有し、かつ、抗原は正電荷を有する。
【００５３】
注入可能な使用に好適な医薬形態としては滅菌水溶液（水に可溶性である場合には）または分散物および滅菌注射溶液または分散物のの即時調製用滅菌散剤が挙げられ、あるいはクリームの形態または局所塗布に好適なその他の形態であってもよい。製造および保存の条件下で安定でなくてはならず、かつ、細菌および菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。有機担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は例えば、レシチンなどの被膜の使用によって、分散物の場合には所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用からの保護は種々の抗菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射組成物の持続性吸収は組成物への吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって達成することができる。
【００５４】
滅菌注射溶液は前記に列挙される種々のその他の成分とともに適当な溶媒中の所望の量の有効成分を組み入れ、必要であれば、それに次いで濾過除菌することによって製造する。一般に、分散物は種々の滅菌有効成分を基剤となる分散媒質および前記に列挙されるものから所望のその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み入れることによって製造する。滅菌注射溶液の調製用滅菌散剤の場合には、好ましい製造方法には有効成分およびその予め滅菌濾過した溶液からのいずれかのさらなる所望の成分の散剤を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術がある。
【００５５】
有効成分が好適に保護される場合には、例えば、不活性賦形剤とともにかまたは同化性可食担体とともに経口投与してもよく、あるいはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、あるいは錠剤に打錠してもよいし、あるいは治療食の食物とともに直接取り込んでもよい。経口治療的投与用には、有効成分は賦形剤と混合し、経口摂取可能錠剤、舌下錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で用いてよい。かかる組成物および製剤は少なくとも１重量％の有効成分を含むべきである。組成物および製剤のパーセンテージは当然異なり得、便宜には単位重量の約５〜約８０％の間であり得る。かかる治療上有用な組成物中の有効成分の量は好適な用量にできるようなものである。本発明の好ましい組成物または製剤は経口用量単位形が約０．１μｇと２０００ｍｇの間の有効成分を含むよう製造される。
【００５６】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた前記に列挙された成分：アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸ニカルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤を含んでもよく、またはペパーミント、冬緑油、もしくはチェリー香添加剤などの香料添加剤を加えてもよい。用量単位形がカプセル剤である場合には、上記の種類の物質に加え、液体担体を含んでもよい。種々のその他の物質が用量単位の物理的形態を別途改変するための被膜として存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はシェラック、糖もしくはその双方で被覆してもよい。シロップまたはエリキシルは有効成分、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、着色料およびチェリーまたはオレンジ香などの香料添加剤を含んでもよい。当然、いずれかの用量単位形の製造に用いる物質のいずれも医薬上純粋であり、かつ、用いられる量では実質的に非毒性であるべきである。さらに、有効成分は徐胞性製剤および製剤形態に組み込んでもよい。
【００５７】
本発明の実施を何ら限定するものではないが、本発明の免疫原複合体の同時送達は抗原に対する免疫応答、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導に特に有用であり、免疫応答は特異的（Ｔ細胞および／もしくはＢ細胞）および／または非特異的免疫応答であり得る。
【００５８】
従って、本発明のさらにもう１つの態様は哺乳類において抗原に対する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【００５９】
好ましくは、免疫応答は細胞傷害性Ｔリンパ球応答である。
【００６０】
本細胞傷害性リンパ球応答は単独でまたはヘルパーＴ細胞応答、体液性応答もしくはその他の特異的もしくは非特異的免疫応答とともにのいずれかで生じ得ると理解されるべきである。
【００６１】
本発明のさらなる態様は病状の治療的および／または予防的治療に関する本発明の免疫原複合体の使用に関する。本発明の方法に従って治療され得る病状の例としては、限定されるものではないが、微生物感染または癌に起因するいずれかの病状が挙げられる。例としてはＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、黒色腫、前立腺癌、乳癌、結核および寄生虫による症状が挙げられる。
【００６２】
従って、本発明のさらにもう１つの態様は哺乳類において病状を処置する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含み、組成物の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法に関する。
【００６３】
「有効量」とは所望の免疫応答を得るため、すなわち治療される特定の症状の発症を遅延させるか、または進行を阻害するか、または発症もしくは進行を全く停止させるために少なくともいく分かは必要な量を意味する。この量は治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類学的群、個体の免疫系の抗体合成能、所望の保護度、ワクチンの処方、医学上の状況の評価およびその他の関連する因子によって異なる。量は慣例の試験をとおして決定され得る比較的広範囲になると予測される。
【００６４】
「哺乳類」としてはヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）および捕らえられた野生動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）が挙げられる。好ましくは、哺乳類はヒトまたは実験室試験動物である。いっそうより好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００６５】
処置を受ける哺乳類は病状または潜在的病状の治療的または予防的治療を必要とするヒトまたは動物であってよい。
【００６６】
さらにもう１つの態様では本発明は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物の病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する医薬の製造における使用に関する。
【００６７】
本発明のさらにもう１つの態様は病状の発症または進行の阻害、停止、遅延または防止に用いる薬剤に関する。この薬剤は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物を含んでなる。
【００６８】
本発明のさらなる特徴は、限定されるものではないが以下の実施例でより十分に説明載される。
【００６９】
「ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３」は５０〜９０重量％のＱｕｉｌＡの画分Ａおよび５０重量％〜１０重量％のＱｕｉｌＡの画分Ｃを含んでなるサポニン製剤を指すと理解されるべきである。画分ＡおよびＣはＱｕｉｌＡの親油性画分から製造される。画分「Ａ」および「Ｃ」、それらの製造方法および７０３の製造方法は国際特許公開ＷＯ９６／１１７１１に記載されており、これは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００７０】
実施例１
標準および改変ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）の調製
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（抗原を含まない免疫刺激性複合体）は本質的にはMorein et al. (1989)の方法によって製造した。便宜には、１．７６ｍｌのＰＢＳｐＨ７．２に０．１６ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのトリチウム化（３Ｈ）コレステロールおよび２０％のＭＥＧＡ−１０界面活性剤（ｗ／ｖ）中の１０ｍｇ／ｍｌの脂質を含有する溶液、次いで、０．０８ｍｌのＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍｌのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３を含有する溶液を加えた。溶液を穏やかに混合しながら２５℃で１時間保持した。その後のＰＢＳ／アジ化物に対する透析の際に、コレステロール、ＤＰＰＣおよびＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）を含有するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）が形成された。総てのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【００７１】
脂質：
標準ＤＰＰＣ    ジパルミトイルホスファチジルコリン
改変ＣＤＬ      カルジオリピン
改変ＤＰＬ      ジホスホリル脂質Ａ
改変ＭＰＬ      モノホスホリル脂質Ａ
改変ＤＰＡ      ホスファチジン酸
改変ＤＰＰＧ    ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
【００７２】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％ｗ／ｖ）で精製し、画分を脂質およびコレステロールについて分析した。コレステロールは１ｍｌシンチラント中の１００μｌのサンプルの３Ｈｃｐｍによって検出し、脂質は脂質と結合した場合に蛍光を発するジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ）を用いて検出した。便宜には、ＤＰＨを１ｍｇ／ｍｌでアセトンに溶解し、次いで、ＰＢＳｐＨ７．２で５０分の１に希釈し、次いで、マイクロタイタープレートにおいて５０μｌを５０μｌの各画分と混合した。２０〜２５℃で１５０分間インキュベートした後、プレートを励起３５５ｎｍおよび発光４６０ｎｍを用いて蛍光計で読み取った。ＤＰＨおよび３Ｈピークは総ての製剤について一致し、改変製剤の勾配プロフィールは標準製剤と同様であり、これは脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）への組み込みを示した（図１）。
【００７３】
実施例２
自然状態で正電荷を有するタンパク質：Ｈ．ピロリ(H. pylori)ファミリーＥタンパク質（ＨｐＥ）を用いる、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した抗原の調製
ＨｐＥタンパク質のｐＩは９．２４であり、ｐＨ８で正電荷を有するタンパク質にさせる。ＨｐＥの可溶性は０．５ＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％の１，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＨＰＣ）ｐＨ８を用いて維持した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＨｐＥ製剤はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：５の割合のタンパク質を２０〜２５℃で６０分間混合することによって調製した。用いたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤はＤＰＰＣ、ＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＰＧであった。
【００７４】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、ＨｐＥ、ＨｐＥとＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図２）。ＨｐＥはＰＢＳで１０分の１に希釈した画分をＥＩＡプレートのウェルに吸着させ、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合したＨｐＥに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのＨｐＥに対するモノクローナル抗体および検出するためのＨＲＰが結合したＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって測定した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は３Ｈコレステロールを検出することによって測定した。
【００７５】
ＨｐＥタンパク質はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合されない場合にはＥＩＡによって画分３〜１０に認められた（図２Ｅ）。ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ＨｐＥは大部分は画分２〜８に認められたが、いくらかはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致する画分１２〜２０に認められ、このことは結合が生じたことを示す（図２Ａ）。ＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ＨｐＥは大部分がＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致する画分７〜１６に認められ、このことはほとんど完全な結合が生じたということを示す（図２Ｂ＆Ｃ）。画分２〜８に認められた遊離ＨｐＥはあったとしても極めて少量であった。ＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、結果はＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と同様であった（図２Ｄ）。
【００７６】
これらの結果はＤＰＰＧおよび標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は弱いながらも正電荷を有する抗原と結合し得、ＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いることによって結合能を実質的に高めることができるということを示す。
【００７７】
実施例３
自然状態で正電荷を有するタンパク質：ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＥＳＯ）を用いる、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した抗原の調製
ＥＳＯタンパク質のｐＩは９．１であり、ｐＨ７で正電荷を有するタンパク質にさせる。ＥＳＯの可溶性は８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．１５ＭのＮａＣｌｐＨ７を用いて維持した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したＥＳＯはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：５の割合のタンパク質を２０〜２５℃で６０分間混合することによって調製した。用いたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤はＤＰＰＣおよびＤＰＬであった。
【００７８】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、ＥＳＯ、ＥＳＯとＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図３）。ＥＳＯはＰＢＳで１０分の１に希釈した画分をＥＩＡプレートのウェルに吸着させ、次いで、ＨＲＰが結合したＥＳＯに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのＥＳＯに対するモノクローナル抗体および検出するためのＨＲＰが結合したＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって測定した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は３Ｈコレステロールを検出することによって測定した。
【００７９】
ＥＳＯタンパク質はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合されない場合にはＥＩＡによって画分１〜６に認められた（図３Ｃ）。標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ＥＳＯは画分１〜６および１２〜１６に認められた（図３Ａ）。画分１２〜１６中の存在はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致し、このことは結合があることを示すものであったが、画分１〜６中の存在によって示されるように大部分のＥＳＯは結合していなかった。ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ＥＳＯは大部分がＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致する画分１２〜１６に認められ、このことは結合が生じたということを示す（図３Ｂ）。
【００８０】
これらの結果は標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との正電荷を有するタンパク質の結合がいくらかあったが、ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の使用により結合能が実質的に高まったということを示す。
【００８１】
実施例４
標準ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯでのマウスの免疫化
抗体応答：
１０個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを０日および２８日に０．１ｍｌの５μｇのタンパク質を含有するＥＳＯまたは５μｇのタンパク質および５μｇのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）を含有するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）が結合したＥＳＯで首の首筋で皮下に免疫化した。３５日にマウスから採血し、血清を間接ＥＩＡによってＥＳＯに対する抗体について分析した。便宜には、ＥＳＯをＰＢＳｐＨ７．２中でマイクロタイタープレートに吸着させ、次いで、プレートを０．１％のカゼイン溶液でブロッキングし、乾燥させた。血清の希釈液を２０〜２５℃で１時間インキュベートし、次いで、プレートを洗浄した。ＨＲＰが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａを加え、プレートを２０〜２５℃で１時間インキュベートし、次いで、洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、２０〜２５℃で１０分間インキュベートし、次いで、０．５ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取り、終点力価を算出した。
【００８２】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した場合にはＥＳＯに対するＩｇＧおよびＩｇＧ１応答は２０倍より多く増加し、ＩｇＧ２ａ力価は千倍増加した（図４）。
【００８３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答：
５個体のＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックＨＨＤマウスを０．１ｍｌの５μｇのタンパク質を含有するＥＳＯまたは５μｇのタンパク質および５μｇのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）を含有するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯで尾の付け根で皮下に免疫化した。１４日後、脾細胞を回収し、２４ウェルプレートにおいてＥＳＯペプチド（１０μｇ／ｍｌ、３７℃で１時間）で感作されたＥＬ４ＨＨＤ細胞で５×１０６個の細胞を再刺激し、照射し、２回洗浄した。細胞を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、５×１０−５Ｍのβ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンを添加したＲＰＭＩ培地で培養し、３７℃で６日間５％ＣＯ２中でインキュベートした。４日目に１ｍｌの５Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を含有する培地を加えた。６日目に標準的な６時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて培養物を再刺激のために感作されたＥＬ４ＨＨＤ細胞に対するエフェクターとして用いた。
【００８４】
ＥＳＯ単独で免疫化したマウスではＣＴＬは検出されなかったが、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した場合には、総てのマウスでＣＴＬが検出された（図５）。
【００８５】
これらの結果は細胞性免疫応答の最適な誘導には結合が必要であるということを示す。
【００８６】
実施例５
自然状態で負電荷を有するタンパク質：ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７（Ｅ６Ｅ７）を用いる、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した抗原の調製
Ｅ６Ｅ７タンパク質のｐＩは５．９であり、ｐＨ６．９で負電荷を有するタンパク質にさせる。Ｅ６Ｅ７の可溶性は８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１５０ｍＭのＮａＣｌｐＨ６．９を用いて維持した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したＥ６Ｅ７はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：５の割合のタンパク質を２０〜２５℃で６０分間混合することによって調製した。用いたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤はＤＰＰＣ、ＣＤＬ、ＤＰＬ、ＭＰＬ、ＤＰＡおよびＤＰＰＧであった。
【００８７】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、Ｅ６Ｅ７、Ｅ６Ｅ７とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図８）。Ｅ６Ｅ７は２種のＥ７に対する非競合モノクローナル抗体を用いるＥＩＡによって検出した。結合は捕捉するためのＥ７に対するモノクローナル抗体および検出するためのＨＲＰが結合したＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３に対するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって測定した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は３Ｈコレステロールを検出することによって測定した。
【００８８】
Ｅ６Ｅ７タンパク質単独はＥＩＡによって画分１０〜２２に認められた（図６Ｇ）。標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ほとんどのＥ６Ｅ７は画分１４〜２０に認められたが、結合はほとんど検出されなかった（図６Ａ）。ＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、Ｅ６Ｅ７は大部分は結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する画分に認められ、このことはほとんど完全な結合が生じたことを示した（図６Ｂ、Ｃ、Ｅ）。ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、タンパク質は結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する画分９〜１４に認められ、このことは結合を示すが、画分１７〜２２では相当な量が結合していないとわかった（図６Ｄ、Ｆ）。
【００８９】
これらの結果は負電荷を有するタンパク質は不十分にしか標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しないが、ＣＤＬ、ＤＰＬ、ＭＰＬ、ＤＰＡまたはＤＰＰＧを用いることによって結合能が種々の程度に高まるということを示す。
【００９０】
実施例６
標準および改変ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７でのマウスの免疫化
３個体のＣ５７ＢＬ／６マウスを０日および２１日に０．１ｍｌの１０μｇのタンパク質および６μｇのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）を含むＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７で皮下に免疫化した。７日後、脾細胞を回収し、Ｔ２５組織培養フラスコ中で８ｍＬの２０×１０６個の細胞をＥ７をトランスフェクトしたマイトマイシン−Ｃ処理したＥＬ４細胞（Ｃ２）で再刺激し、３回洗浄した。細胞を１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、５．５×１０−５Ｍのβ−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で培養し、３７℃で５日間５％ＣＯ２中でインキュベートした。６日目にＣ２細胞に対する標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて培養物をエフェクターとして用いた。
【００９１】
ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７は３個体のうち２個体のマウスでＣＴＬ応答を誘導した（図７Ａ）。標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７はいずれのマウスでもＣＴＬ応答を誘導できなかった（図７Ｂ）。ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で陰性のマウス群は最適な読み出しに不十分な細胞を有しており、妥当な応答の基準に応じるものではなかった。他の総てのマウスは妥当な応答の基準を満たしていた。
【００９２】
これらの結果は結合が多いほどＣＴＬ応答がよりよいものとなるということを示す。
【００９３】
実施例７
自然状態で負電荷を有するタンパク質：Ｈ．ピロリファミリーＣタンパク質（ＨｐＣ）を用いる、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した抗原の製造
ＨｐＣタンパク質は５．０５のｐＩを有し、ｐＨ７．２で負電荷を有させる。このタンパク質はＰＢＳｐＨ７．２において可溶性であった。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したＨｐＣはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：５の割合のタンパク質を２０〜２５℃で６０分間混合することによって調製した。用いたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤はＤＰＰＣおよびＤＰＬであった。
【００９４】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、ＨｐＣ、ＨｐＣとＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図８）。ＨｐＣはＰＢＳで１０分の１に希釈した画分をＥＩＡプレートのウェルに吸着させ、次いで、ＨＲＰが結合したＨｐＣに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのＨｐＣに対するモノクローナル抗体および検出するためのＨＲＰが結合したＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって測定した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は実施例１に記載のように３ＨコレステロールまたはＤＰＨの検出のいずれかによって測定した。
【００９５】
ＨｐＣ単独は画分１〜５に認められ、標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ＨｐＣは大部分は画分１〜５に認められ、結合していなかった。ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、相当な割合のＨｐＣがＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致する画分１１〜１７に認められ、このことは結合を示す。
【００９６】
これらの結果は負電荷を有するタンパク質は不十分にしか標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しないが、ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いることによって結合能が高まるということを示す。
【００９７】
実施例８
ｐＨを利用して正電荷を与える自然状態で正電荷を有するタンパク質：Ｅ６Ｅ７を用いる、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した抗原の調製
Ｅ６Ｅ７タンパク質のｐＩは５．９５であり、ｐＨ７．２で負電荷を有するタンパク質にさせる。それはＮ末端にヘキサヒスチジン配列を含みｐＨ６で正電荷を有する。Ｅ６Ｅ７の可溶性は８Ｍの尿素、５０ｍＭのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌｐＨ６を用いて維持した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したＥ６Ｅ７は等量のＥ６Ｅ７をＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）と２０〜２５℃で６０分間混合し、５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌｐＨ６に対して透析して尿素を除去し、次いで、１０，０００ｇで５分間遠心分離して沈殿物のいずれをも除去することによって調製した。
【００９８】
処方後、調製物をスクロース勾配（５０〜１０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、タンパク質、Ｅ６Ｅ７とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図９）。タンパク質はＥ７についてのサンドウィッチＥＩＡを用いて検出した。結合は捕捉するためのＥ７に対するモノクローナル抗体および検出するためのＨＲＰが結合したＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって測定した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は実施例１に記載のように３ＨコレステロールまたはＤＰＨを検出することによって測定した。
【００９９】
Ｅ６Ｅ７は単独で実施した場合には画分１０〜２２に認められた（図９Ｃ）。ｐＨ７．２でＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、Ｅ６Ｅ７は大部分は画分１６〜２２に認められ、結合の証拠がほとんどなかった（図９Ｂ）。ｐＨ６で標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、Ｅ６Ｅ７は大部分はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致する画分１２〜１６に認められ、このことは結合を示す（図９Ａ）。
【０１００】
これらの結果はｐＨを用いて標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の、自然状態で負電荷を有するタンパク質と結合する能力を高めることができるということを示す。
【０１０１】
実施例９
ｐＨ改変したＤＰＰＣと結合したＥ６Ｅ７でのマウスの免疫化
６個体のＣ５７ＢＬ／６マウスを０日および２１日に０．１ｍｌの６μｇのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）および６μｇのＥ６Ｅ７を含むＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７で首の首筋で皮下に免疫化した。
【０１０２】
抗体応答：
２６日にマウスから採血し、血清を間接ＥＩＡによってＥ７に対する抗体について分析した。便宜には、ＧＳＴＥ７を０．１Ｍの炭酸塩ｐＨ９．６中でマイクロタイタープレートに吸着させ、次いで、プレートを０．１％のカゼイン溶液でブロッキングし、乾燥させた。血清の希釈液を２０〜２５℃で１時間インキュベートし、次いで、プレートを洗浄した。ＨＲＰが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ、を加え、プレートを２０〜２５℃で１時間インキュベートし、次いで、洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、２０〜２５℃で１０分間インキュベートし、次いで、０．５ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取り、終点力価を算出した。
【０１０３】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７群のＧＭＴは９４９であった。典型的にはＡｌ（ＯＨ）３を含むＥ６Ｅ７は約１００のＧＭＴを示す。
【０１０４】
サイトカイン応答：
２７日に３個体のマウス各々から脾細胞を回収し、プールし、４８ウェルプレートにおいて１および５μｇのＧＳＴＥ７で、対照としてＣｏｎＡおよびＲＰＭ１で２．５×１０６個の細胞を再刺激した。細胞を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、５×１０−５Ｍのβ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンを添加したＲＰＭＩ培地で培養し、３７℃で２日間５％ＣＯ２中でインキュベートした。上清を回収し、Endogenの試薬を用いてＥＩＡによってγＩＦＮおよびＩＬ５を検出した。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７は７．４ｎｇ／ｍｌまでγＩＦＮを、および１４０ｐｇ／ｍｌまでＩＬ５を誘導した（表２）。典型的にはＡｌ（ＯＨ）３を含むＥ６Ｅ７は検出可能でないγＩＦＮ（＜３０ｐｇ／ｍｌ）またはＩＬ５（＜４ｐｇ／ｍｌ）を誘導する。
【０１０５】
これらの結果はｐＨ改変したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥ６Ｅ７はマウスにおいて免疫原性であり、Ｔｈ１型応答を誘導したということを示す。
【０１０６】
実施例１０
キレート性（ＣＨＬ）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の製造
ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はMacfarlan and Malliaros, (1998)国際特許公開ＷＯ／９８／３６７７２の方法によって製造した。便宜には、１．６ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．６ｍＭのＣｕＣｌ２ｐＨ７．２（バッファーＡ）に０．２ｍｌの２０％のＭＥＧＡ−１０界面活性剤（ｗ／ｖ）中に１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、９ｍｇ／ｍｌのＤＰＰＣ、１．０７４ｍｇ／ｍｌのジパルミトイル−ｒａｃ−グリセロール−３（８−（３，６−ジオキシ）オクチル−１−アミノ−Ｎ，Ｎ−ニ酢酸）（ＤＰＩＤＡ）を含有する溶液、次いで、０．２ｍｌのバッファーＡ中に５０ｍｇ／ｍｌのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３を含有する溶液を加えた。溶液を穏やかに混合しながら２５℃で９０分間保持した。次いで、透析をまずバッファーＡに対してバッファーを２回交換して一晩、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１５０ｍＭのＮａＣｌｐＨ６．９に対してバッファーを２回交換して２日間実施した。透析の際に、コレステロール、ＤＰＰＣ、ＤＰＩＤＡおよびＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）を含むＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）が形成された。ＣＨＬ
【０１０７】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【０１０８】
実施例１１
ヘキサヒスチジン（６Ｈ）±ヘキサリジン（６Ｋ）ＨｐＣの作製、発現および精製
ＨｐＣタンパク質のｐＩは５．０５であり、ｐＨ７．２で負電荷を有させる。６Ｋの付加はｐＩを７．６８に変更し、正電荷を有する尾部を付与するであろう。精製用に、６Ｋを含むか含まない、ＨｐＣおよび６Ｈを与える２種のクローンを構築した。ＣＳＬ６９４ＤＮＡ（Edwards et al. 1998に記載のベクターｐＧｅｘＳｔｏｐ中のＣ末端６Ｈを含むＨｐＣ１３）をＰＣＲ増幅の鋳型として用い、Ｃ末端６Ｋを作製した。ＰＣＲ産物を発現ベクターｐＧｅｘＳｔｏｐＩＶのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、直列型Ｃ末端６Ｋとそれに続く６Ｈタグを作製した。これは大腸菌(E.coli)系統ＥＲ１７９３で作製し、ＣＳＬ１４２４と呼んだ。
【０１０９】
１リットルの培養物をＡ６００＝２において０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、誘導の５時間後に回収した。可溶性組換えタンパク質を金属（ニッケル）アフィニティークロマトグラフィーのためにＣ末端６Ｈタグを利用して精製した。溶出したタンパク質をＰＢＳに対して透析した。
【０１１０】
実施例１２
６Ｈおよび６Ｋタグ：ＨｐＣを用いる、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した抗原の調製
６Ｈを含むＨｐＣタンパク質のｐＩは５．８５であり、ｐＨ７．２で負電荷を有させる。このタンパク質への６Ｋの付加は７．６８のｐＩを与え、ｐＨ７．２で正電荷を有させる。両形態のタンパク質ともＰＢＳｐＨ７．２に可溶性である。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したＨｐＣはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：５の割合のタンパク質を２０〜２５℃で６０分間混合することによって調製した。用いたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤はＤＰＰＣおよびＣＨＬであった。６Ｈタンパク質とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を結合させるための標準法としてＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）技術を用いた。
【０１１１】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、ＨｐＣ、ＨｐＣとＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図１０）。ＨｐＣはＰＢＳで１０分の１に希釈した画分をＥＩＡプレートのウェルに吸着させ、次いで、ＨＲＰが結合したＨｐＣに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのＨｐＣに対するモノクローナル抗体および検出するためのＨＲＰが結合したＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって測定した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は実施例１に記載のようにＤＰＨを検出することによって測定した。
【０１１２】
標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、６Ｈ−ＨｐＣは画分１〜６に認められ、結合の証拠はほとんどなかった（図１０Ｃ）。６Ｋ６Ｈ−ＨｐＣをＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、相当な量のＨｐＣが結合およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する画分７〜１１にあり、このことは結合を示す(図１０Ａ）６Ｈ−ＨｐＣをＣＨＬ
【０１１３】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した場合には、ほとんどのＨｐＣはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および結合ピークと一致する画分７〜１４にあり、このことは結合を示す（図１０Ｂ）。
【０１１４】
これらの結果は６Ｋの負電荷を有するタンパク質への付加はその標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との結合能を高め、達成された結合はＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とともに６Ｈを用いるものに匹敵したということを示す。
【０１１５】
実施例１３
パルミチン酸（ＰＡＬ）、６Ｈ、６Ｋを用いる、および製剤タグを用いない、合成ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したものの調製
ポリトープはValerio et al.によって記載されたマルチピン（商標）クラウンに対するカイロン技術によりアミノ酸のためのＦｍｏｃαアミノ保護スキームを用いて合成し、精製した。側鎖を脱保護し、トリフルオロ酢酸／スカベンジャー溶液中で切断した後、ペプチドをエーテルで沈殿させ、乾燥させた。再溶解したペプチドをアセトニトリルの勾配での溶出を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。イオンスプレー質量分析により求められる、妥当な分子量を有する物質を含有する画分をプールし乾燥させた。
【０１１６】
ポリトープは以下のとおりであった：
公知のＢＡＬＢ／ｃ制限エピト−プを含むタグ−ＹＰＨＦＭＰＴＮＬＲＰＱＡＳＧＶＹＭＴＹＱＲＴＲＡＬＶＳＹＩＰＳＡＥＫＩ−ＯＨ（＜４００＞３）、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ（＜４００＞４）、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ（＜４００＞５）、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（＜４００＞６）およびＳＹＩＰＳＡＥＫＩ（＜４００＞７）。用いたタグはＰＡＬ、６Ｈ、６ＫまたはＨ（タグはない）であった。
【０１１７】
ＰＡＬポリトープについてはMorein et al. (1989)の方法に従って、ＩＳＣＯＭ（商標）（免疫刺激性複合体）への組み込みにより結合を達成した。便宜には、１．７６ｍｌのＰＢＳ中の１０％のＭＥＧＡ−１０界面活性剤（ｗ／ｖ）、５０％のアセトニトリルに可溶化した４ｍｇのポリトープに０．１６ｍｌの２０％のＭＥＧＡ−１０界面活性剤（ｗ／ｖ）中に１０ｍｇ／ｍｌのコレステロールおよび１０ｍｇ／ｍｌのＤＰＰＣを含有する溶液、次いで、０．０８ｍｌのＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３を含有する溶液を加えた。溶液を穏やかに混合しながら２５℃にて１時間保持した。続くＰＢＳ／アジ化物に対する透析の際に、パルミチル化ポリトープ、コレステロール、ＤＰＰＣおよびＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）を含有するＩＳＣＯＭ（商標）が形成された。これらのＩＳＣＯＭ（商標）は電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【０１１８】
６Ｈポリトープを８Ｍの尿素に可溶化し、次いで、ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合し、また６Ｋおよびタグを含まないポリトープをＰＢＳに可溶化し、次いで、標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合した。総ての製剤はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：８の割合のタンパク質で調製し、２０〜２５℃で６０分間インキュベートした。
【０１１９】
調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、タンパク質およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した。タンパク質はMolecular ProvesのＣＢＱＣＡ（＜４００＞８）を用い、製造業者の使用説明書に従って、またはBradford (1976)の方法に従ってクマシーによって検出した。便宜には、１００μｌの各画分をマイクロプレートに加え、次いで１００μｌのクマシー試薬を加え、次いで、プレートを５９５ｎｍで読み取った。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は実施例１に記載のようにＤＰＨによって検出した。
【０１２０】
ポリトープ単独は画分１〜５に認められた（図１１Ｅ）。ＰＡＬポリトープＩＳＣＯＭ（商標）では、ＣＢＱＣＡ（＜４００＞８）によって検出されたタンパク質は大部分はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する画分１１〜１３に認められ、このことは組み込みを示す（図１１Ａ）。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した６Ｋポリトープでは、クマシーによって検出されたタンパク質は大部分は画分１〜５に認められ、これはおそらくはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合していなかった（図１１Ｃ）。相当な割合のポリトープがＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する画分１２〜１４に認められ、このことは結合を示す。ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した６Ｈポリトープでは、クマシーによって検出されたタンパク質は大部分はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する画分４〜１０に認められ、このことは結合を示す（図１１Ｂ）。相当な割合の６Ｈポリトープが画分１〜３に認められたが、これはおそらく結合していなかった。タグを含まないＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したものでは、クマシーによって検出されたタンパク質はほとんど総てが画分１〜５に認められたが、これはおそらくはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合していなかった。
【０１２１】
これらの結果はタグは調べたポリトープのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との結合に必要であり、また標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｋポリトープ結合はＩＳＣＯＭ（商標）への疎水性ＰＡＬポリトープの組み込みに匹敵するが、ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｈポリトープ結合ほどは十分でなかったということを示す。
【０１２２】
実施例１４
合成ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したものでのマウスの免疫化
３個体のＢＡＬＢ／ｃマウスをで０．１ｍｌの６μｇのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）および３．５μｇ〜５μｇの間のタンパク質を含むポリトープＩＳＣＯＭ（商標）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したもので尾の付け根で皮下に免疫化した。
【０１２３】
ＣＴＬアッセイはElliottet al. (1999)の方法に従って実施した。便宜には、各脾臓から脾細胞を１４日めに採取し、加湿インキュベーター中で３７℃にて２４ウェルプレートで１μｇ／ｍｌの個々のペプチド（４種のペプチド／脾臓）とともに１ｍｌの培地で５×１０６細胞／ｍｌで培養した。３日目に、１ｍｌの新鮮培地を加え、次いで、さらに７日目に照射（８００ｒａｄ）ペプチドに感作された（１０μｇ／ｍｌ、１時間３７℃、２回洗浄）Ｐ８１５細胞を刺激物に対する応答物の割合を２０：１で加えてin vitro再刺激を実施し、２×１０６エフェクター／ウェルとした。７日の間隔でこの処置をさらに２回反復し、バルク培養物を６日後に標準の６時間クロム放出アッセイにおいてエフェクターとして用いた。培地は１０％のＦＣＳ(QIMR)、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミンおよびアオカビ属／ストレプトマイセス属抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０を含んでいた。標的細胞は５１Ｃｒ標識ペプチドに感作されたおよび感作されていない（対照）Ｐ８１５細胞とした。エフェクター：標的の割合は５０、１０および２対１とした。アッセイは９６ウェル丸底プレートで二組で実施した。
【０１２４】
ＰＡＬポリトープＩＳＣＯＭ（商標）は４種のエピト−プ総てに対して、ＴＹＱについては３／３のマウスで、ＳＹＩについては１／３で、ＹＰＨについでは２／３でおよびＲＰＱについては２／３でＣＴＬ応答を誘導した（図１２Ａ）。ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した６Ｈポリトープは４種エピト−プ総てについて３／３のマウスに対してＣＴＬ応答を誘導した（図１２Ｂ）。ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合した６Ｋポリトープは４種のエピトープ総てに対して、ＴＹＱ、ＹＰＨおよびＲＰＱについては３／３で、ＳＹＩについては２／３で、ＣＴＬ応答を誘導した（図１２Ｃ）。ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したタグを含まないポリトープはＲＰＱについて２／３のマウスで弱いＣＴＬ応答を誘導したが、その他のエピトープのいずれかに対してはＣＴＬ応答は検出されなかった（図１２Ｄ）。ＳＹＩ配列は弱いエピトープであると知られており、これは総ての製剤について事実であった。
【０１２５】
これらの結果はポリトープのＩＳＣＯＭ（商標）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との結合は最適なＣＴＬ誘導に必要であり、６Ｋを用いる結合はＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）をともなう６Ｈまたは従来の疎水性タンパク質の組み込み（ＰＡＬポリトープＩＳＣＯＭ（商標））と同程度に有効であったということを示す。
【０１２６】
実施例１５
組換え（ｒ）６Ｈ±ポリトープの作製、発現および精製
ｐｓｔｍｐｄｖ  ＤＮＡ（QIMRにより供給された）をマウスポリトープ、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬＴＳＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩＦＡＰＧＮＹＰＡＬＳＹＩＰＳＡＥＫＩＥＥＧＡＩＶＧＥＩＲＰＱＡＳＧＶＹＭ（＜４００＞９）のＰＣＲ増幅の鋳型として用い、Ｃ末端６Ｋを含むか含まないで（それぞれ、ＣＳＬ１４３０および１４２６）作製することが可能となった。ＰＣＲ産物を発現ベクターｐＥＴ２４ｂ(Novagen)のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし、Ｎ末端Ｔ７タグ（同定用）および直列型Ｃ末端６Ｋとそれに続く６Ｈ（精製用）を作製した。
クローンは大腸菌系統ＥＲ１７９３で作製し、次いで発現系統ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。１リットルの培養物をＡ６００＝２にて０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、誘導後４時間で回収した。可溶性組換えタンパク質を金属（ニッケル）アフィニティークロマトグラフィーのためのＣ末端６Ｈタグを利用して精製した。溶出したタンパク質をＰＢＳに対して透析した。
【０１２７】
実施例１６
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したｒポリトープ６Ｈおよび６Ｋの調製
６Ｈを含むマウスポリトープのｐＩは５．８５であり、ｐＨ７．２で負電荷を有させる。これへの６Ｋの付加は７．６８のｐＩを与え、ｐＨ７．２で正電荷を有させる。タンパク質の両形態ともＰＢＳｐＨ７．２で可溶性であった。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したポリトープはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）としてのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）に対して１：５の割合のタンパク質を２０〜２５℃にて６０分間混合することによって調製した。用いたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤はＤＰＰＣ、ＣＤＬ、ＤＰＬおよびＣＨＬであった。配列中に結合を強力に干渉し得るいくつかのＥがあるので、ｐＨ４．３でグルタミン酸（Ｅ）のｐＩ以下である製剤を調べた。
【０１２８】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、タンパク質およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図１３）。タンパク質はＰＢＳで１０分の１に希釈した画分をＥＩＡプレートのウェルに吸着させ、次いで、ＨＲＰが結合した６Ｈに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は実施例１に記載のように３ＨコレステロールまたはＤＰＨを検出することによって測定した。
【０１２９】
ｒ６Ｈ６Ｋポリトープ単独ではタンパク質は画分１〜６に認められた（図１３Ｋ）。ｐＨ７で標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合したｒ６Ｋ６Ｈポリトープでは、タンパク質は大部分は画分１〜９に認められたが、結合の証拠はほとんどなかった（図１３Ａ）。ｐＨ７でＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合したｒ６Ｋ６Ｈポリトープでは、タンパク質は大部分はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と一致する画分に認められ、このことは結合を示す（図１３Ｃ、Ｅ）。ＣＤＬおよびＤＰＬそれぞれについては相当な割合のタンパク質が画分１〜３および１〜６に認められ、これらはおそらくは結合していない。ｐＨ４．３で標準ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合したｒ６Ｋ６Ｈポリトープでは、タンパク質は大部分は画分１〜９に認められたが、画分１０〜１２におけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する結合の証拠がいくらかあった（図１３Ｂ）。ｐＨ４．３でＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合したｒ６Ｋ６Ｈポリトープではタンパク質はＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と一致する画分にほとんど総て認められ、このことはほとんど完全な結合を示した（図１３Ｄ、Ｆ）。ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合したｒ６Ｈポリトープは大部分が画分１〜７に認められ、結合の証拠はほとんどなかった。ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と混合したｒ６ＨポリトープはｐＨ７およびｐＨ４．３の双方での標準ＤＰＰＣおよびＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と同様のパターンの結合を示した。タンパク質は結合していない画分１〜４およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ピークと一致する５〜１０にほとんど等量で認められ、結合を示した（図１３Ｈ、Ｉ、Ｊ）。
【０１３０】
これらの結果は本明細書で用いたｒポリトープは６Ｋを付加してでさえ標準ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しないであろうということを示す。結合は改変ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いて達成でき、これらの製剤の結合能は低ｐＨを利用することによって高まる。改変ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と低ｐＨの組合せは改変ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）または低ｐＨの使用によって高められていない６Ｈ  ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と同程度によいか、またはよりよい結合をもたらした。
【０１３１】
実施例１７
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤と結合したｒポリトープでのマウスの免疫化
３個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを０．１ｍｌの６μｇのＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３および３．５μｇ〜５μｇの間のタンパク質を含むＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したもので尾の付け根で皮下に免疫化した。
ＣＴＬアッセイはElliottet al. (1999)の方法に従って実施した。便宜には、各脾臓から脾細胞を１４日めに採取し、加湿インキュベーター中で３７℃にて２４ウェルプレートで１μｇ／ｍｌの個々のペプチド（４種のペプチド／脾臓）とともに１ｍｌの培地で５×１０６細胞／ｍｌで培養した。３日目に、１ｍｌの新鮮培地を加え、次いで、さらに７日目に照射（８００ｒａｄ）ペプチドに感作された（１０μｇ／ｍｌ、１時間３７℃、２回洗浄）Ｐ８１５細胞を刺激物に対する応答物の割合を２０：１で加えてin vitro再刺激を実施し、２×１０６エフェクター／ウェルとした。７日の間隔でこの処置をさらに２回反復し、バルク培養物を６日後に標準の６時間クロム放出アッセイにおいてエフェクターとして用いた。培地は１０％のＦＣＳ(QIMR)、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミンおよびアオカビ属／ストレプトマイセス属抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０を含んでいた。標的細胞は５１Ｃｒ標識ペプチドに感作されたおよび感作されていない（対照）Ｐ８１５細胞とした。エフェクター：標的の割合は５０、１０および２対１とした。アッセイは９６ウェル丸底プレートで二組で実施した。
【０１３２】
ＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したｒ６Ｋ６ＨポリトープｐＨ４．３はＳＹＩ、ＹＰＨおよびＲＰＱエピトープについては３／３のマウスで、およびＴＹＱエピトープについでは１／３でＣＴＬ応答を誘導した（図１４Ａ）。ＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したｒ６Ｈ  ｐＨ７はＳＹＩ、ＹＰＨおよびＲＰＱエピトープについては３／３のマウスで、およびＴＹＱエピトープについては２／３でＣＴＬ応答を誘導した（図１４Ｂ）。両製剤ともＴＹＱエピトープに対しては極めて低い応答を誘導した。
【０１３３】
これらの結果はＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したｒ６Ｋ６ＨポリトープｐＨ４．３を用いてＣＴＬ応答を誘導でき、これはＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したｒ６Ｈ  ｐＨ７を用いた応答に匹敵するるということを示す。
【０１３４】
実施例１８
自然状態で負電荷を有するタンパク質：Ｅ６Ｅ７を用いる、ＤＰＰＣおよびＤＰＬリポソームの製造
リポソームはTalsma and Crommelin (1992)の方法に従って製造した。便宜には、３Ｈコレステロールをメタノール、クロロホルムに溶解し、次いで、脂質を加え、穏やかに回転させながら回転フラスコ中で溶媒を蒸発させることによってリポソームを形成させた。用いた脂質は標準ＤＰＰＣおよび負電荷を有するＤＰＬであった。次いで、Ｅ６Ｅ７をリポソームに加え、混合物を超音波処理し、次いで２６Ｇ針を通して押し出した。リポソームは電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【０１３５】
処方後、調製物をスクロース勾配（１０〜５０％スクロースｗ／ｖ）で精製し、タンパク質およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）について画分を分析した（図１５）。タンパク質はモノクローナル抗体を用いるＥ７についてのサンドウィッチＥＩＡによって検出した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は３Ｈコレステロールを検出することによって測定した。
【０１３６】
ＤＰＰＣリポソームではＥ６Ｅ７は大部分は画分１〜３に認められたが、ほとんど勾配に存在せず、このことはタンパク質は沈殿していたということを示した。（図１５Ａ）。存在したタンパク質は画分２〜４に認められたリポソームとおそらくは結合していなかった。ＤＰＬリポソームではＥ６Ｅ７は勾配全体に認められ、これは同様に勾配全体に認められたリポソームと一致した（図１５Ｂ）。勾配全体への製剤の広がりはおそらくはリポソームの大きさの範囲を示すものであったが、ほとんど総てのタンパク質はリポソームと結合していると考えられる。
【０１３７】
これらの結果は負電荷を有する脂質をリポソームに用いて標準リポソームとは結合しない負電荷を有するタンパク質と結合させることができるということを示す。
【０１３８】
当業者ならば本明細書に記載される本発明は具体的に記載されるもの以外の変法および改変の影響を受けやすいということを理解するであろう。本発明は総てのかかる変法および改変を含むと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において、個々にまたは集団的に記載されるか、または示される、総ての工程、特徴、組成物および化合物、ならびにいずれか２種以上の工程または特徴の組合せのいずれかおよび総てを含む。
【０１３９】
【表１】
0005084984.tif 000003
文献
【表２】
0005084984.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  ＤＰＰＣ（図１ａ）、ＣＤＬ（図１ｂ）、ＤＰＬ（図１ｃ）、ＭＰＬ（図１ｄ）ＤＰＡ（図１ｅ）およびＤＰＰＧ（図１ｆ）を用いて処方されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および３Ｈは各脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図１ｂ】  ＤＰＰＣ（図１ａ）、ＣＤＬ（図１ｂ）、ＤＰＬ（図１ｃ）、ＭＰＬ（図１ｄ）ＤＰＡ（図１ｅ）およびＤＰＰＧ（図１ｆ）を用いて処方されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および３Ｈは各脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図１ｃ】  ＤＰＰＣ（図１ａ）、ＣＤＬ（図１ｂ）、ＤＰＬ（図１ｃ）、ＭＰＬ（図１ｄ）ＤＰＡ（図１ｅ）およびＤＰＰＧ（図１ｆ）を用いて処方されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および３Ｈは各脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図１ｄ】  ＤＰＰＣ（図１ａ）、ＣＤＬ（図１ｂ）、ＤＰＬ（図１ｃ）、ＭＰＬ（図１ｄ）ＤＰＡ（図１ｅ）およびＤＰＰＧ（図１ｆ）を用いて処方されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および３Ｈは各脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図１ｅ】  ＤＰＰＣ（図１ａ）、ＣＤＬ（図１ｂ）、ＤＰＬ（図１ｃ）、ＭＰＬ（図１ｄ）ＤＰＡ（図１ｅ）およびＤＰＰＧ（図１ｆ）を用いて処方されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および３Ｈは各脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図１ｆ】  ＤＰＰＣ（図１ａ）、ＣＤＬ（図１ｂ）、ＤＰＬ（図１ｃ）、ＭＰＬ（図１ｄ）ＤＰＡ（図１ｅ）およびＤＰＰＧ（図１ｆ）を用いて処方されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭ（商標）のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および３Ｈは各脂質のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図２ａ】  ＨｐＥと混合した後の実施例１の４種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＨｐＥはＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図２ｂ】  ＨｐＥと混合した後の実施例１の４種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＨｐＥはＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図２ｃ】  ＨｐＥと混合した後の実施例１の４種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＨｐＥはＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図２ｄ】  ＨｐＥと混合した後の実施例１の４種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＨｐＥはＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図２ｅ】  ＨｐＥと混合した後の実施例１の４種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＨｐＥはＣＤＬおよびＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図３ａ】  ＥＳＯと混合した後の実施例１の２種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤ののスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥＳＯはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図３ｂ】  ＥＳＯと混合した後の実施例１の２種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤ののスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥＳＯはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図３ｃ】  ＥＳＯと混合した後の実施例１の２種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤ののスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥＳＯはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているが、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図４】  ＥＳＯ製剤に対する抗体応答のグラフである。ＥＳＯが結合したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は特にＴｈ１サブタイプＩｇＧ２ａにおいてＥＳＯ単独よりも高い抗体応答を含有するということがわかる。
【図５ａ】  刺激および標的のために、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（＜４００＞１）（図５ａ、５ｂ）およびＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（＜４００＞２）（図５ｃ、５ｄ）ペプチドを用いるＥＳＯ（図５ａ、５ｃ）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯ（図５ｂ、５ｄ）で免疫化したマウスのＣＴＬ分析のグラフである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯはＣＴＬ応答を誘導するが、ＥＳＯ単独は誘導しないということがわかる。
【図５ｂ】  刺激および標的のために、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（＜４００＞１）（図５ａ、５ｂ）およびＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（＜４００＞２）（図５ｃ、５ｄ）ペプチドを用いるＥＳＯ（図５ａ、５ｃ）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯ（図５ｂ、５ｄ）で免疫化したマウスのＣＴＬ分析のグラフである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯはＣＴＬ応答を誘導するが、ＥＳＯ単独は誘導しないということがわかる。
【図５ｃ】  刺激および標的のために、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（＜４００＞１）（図５ａ、５ｂ）およびＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（＜４００＞２）（図５ｃ、５ｄ）ペプチドを用いるＥＳＯ（図５ａ、５ｃ）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯ（図５ｂ、５ｄ）で免疫化したマウスのＣＴＬ分析のグラフである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯはＣＴＬ応答を誘導するが、ＥＳＯ単独は誘導しないということがわかる。
【図５ｄ】  刺激および標的のために、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（＜４００＞１）（図５ａ、５ｂ）およびＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（＜４００＞２）（図５ｃ、５ｄ）ペプチドを用いるＥＳＯ（図５ａ、５ｃ）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯ（図５ｂ、５ｄ）で免疫化したマウスのＣＴＬ分析のグラフである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合したＥＳＯはＣＴＬ応答を誘導するが、ＥＳＯ単独は誘導しないということがわかる。
【図６ａ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図６ｂ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図６ｃ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図６ｄ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図６ｅ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図６ｆ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図６ｇ】  Ｅ６Ｅ７と混合した後の実施例１の６種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＣＤＬ、ＤＰＬおよびＤＰＡ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しており、ＭＰＬおよびＤＰＰＧ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはあまり結合しておらず、ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図７】  Ｅ６Ｅ７  ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（Ａ）およびＥ６Ｅ７  ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（Ｂ）で免疫化したマウスにおけるＣＴＬ分析のグラフである。Ｅ６Ｅ７  ＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はＣＴＬ応答を誘導するがＥ６Ｅ７  ＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は誘導しないということがわかる。
【図８ａ】  ＨｐＣと混合した後の実施例１の２種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんど結合していないＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とよりもより多くのＨｐＣがＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているということがわかる。
【図８ｂ】  ＨｐＣと混合した後の実施例１の２種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんど結合していないＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とよりもより多くのＨｐＣがＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているということがわかる。
【図８ｃ】  ＨｐＣと混合した後の実施例１の２種のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんど結合していないＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とよりもより多くのＨｐＣがＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合しているということがわかる。
【図９ａ】  ｐＨ６（図６ａ）およびｐＨ７．２（図６ｂ）でＥ６Ｅ７と混合した後の２種のＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ｐＨ６でｐＨ７．２よりもより多くのＥ６Ｅ７がＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合するということがわかる。
【図９ｂ】  ｐＨ６（図６ａ）およびｐＨ７．２（図６ｂ）でＥ６Ｅ７と混合した後の２種のＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ｐＨ６でｐＨ７．２よりもより多くのＥ６Ｅ７がＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合するということがわかる。
【図９ｃ】  ｐＨ６（図６ａ）およびｐＨ７．２（図６ｂ）でＥ６Ｅ７と混合した後の２種のＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ｐＨ６でｐＨ７．２よりもより多くのＥ６Ｅ７がＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と結合するということがわかる。
【図１０ａ】  実施例１１の改変ＨｐＣと混合した後のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ＨｐＣへの６Ｋの付加はＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との結合を６ＨとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤とのものに匹敵するレベルにまで増加させるということがわかる。
【図１０ｂ】  実施例１１の改変ＨｐＣと混合した後のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ＨｐＣへの６Ｋの付加はＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との結合を６ＨとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤とのものに匹敵するレベルにまで増加させるということがわかる。
【図１０ｃ】  実施例１１の改変ＨｐＣと混合した後のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ＨｐＣへの６Ｋの付加はＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との結合を６ＨとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤とのものに匹敵するレベルにまで増加させるということがわかる。
【図１１ａ】  実施例１３の４種のポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。６ＫポリトープはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）といくらか結合しているが、６Ｋが存在しない場合には結合はないということがわかる。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｋポリトープ結合はＰＡＬポリトープのＩＳＣＯＭ（商標）への疎水性組み込みに匹敵するが、６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合よりは少ない。
【図１１ｂ】  実施例１３の４種のポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。６ＫポリトープはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）といくらか結合しているが、６Ｋが存在しない場合には結合はないということがわかる。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｋポリトープ結合はＰＡＬポリトープのＩＳＣＯＭ（商標）への疎水性組み込みに匹敵するが、６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合よりは少ない。
【図１１ｃ】  実施例１３の４種のポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。６ＫポリトープはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）といくらか結合しているが、６Ｋが存在しない場合には結合はないということがわかる。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｋポリトープ結合はＰＡＬポリトープのＩＳＣＯＭ（商標）への疎水性組み込みに匹敵するが、６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合よりは少ない。
【図１１ｄ】  実施例１３の４種のポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。６ＫポリトープはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）といくらか結合しているが、６Ｋが存在しない場合には結合はないということがわかる。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｋポリトープ結合はＰＡＬポリトープのＩＳＣＯＭ（商標）への疎水性組み込みに匹敵するが、６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合よりは少ない。
【図１１ｅ】  実施例１３の４種のポリトープＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。６ＫポリトープはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）といくらか結合しているが、６Ｋが存在しない場合には結合はないということがわかる。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）との６Ｋポリトープ結合はＰＡＬポリトープのＩＳＣＯＭ（商標）への疎水性組み込みに匹敵するが、６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）間の結合よりは少ない。
【図１２ａ（ｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ａ（ｉｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ｂ（ｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ｂ（ｉｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ｃ（ｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ｃ（ｉｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ｄ（ｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１２ｄ（ｉｉ）】  実施例１３の４種の合成ポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はポリトープ中の４種のエピト−プ総てに対してＣＴＬ応答を誘導したが（図１２ｃ）、タグを含まないポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤は１種のエピト−プに対する低いＣＴＬ応答しか誘導しなかった（図１２ｄ）ということがわかる。６ＫポリトープＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）についてのＣＴＬ応答はＰＡＬ、ポリトープＩＳＣＯＭ（商標）（図１２ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１２ｂ）で誘導されたものに匹敵した。
【図１３ａ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｂ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｃ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｄ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｅ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｆ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｇ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｈ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｉ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｊ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１３ｋ】  実施例１６の１０種の組換えＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加６ＫタグとＣＤＬまたはＤＰＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とを組合せることによって６ＫとＤＰＰＣ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）に優って結合を増加させ、次いで、これらを低ｐＨと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。６Ｋ、ＣＤＬ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および低ｐＨを組合せることで達成される結合はポリトープをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）とほとんど完全に結合させ、この結合は６ＨポリトープとＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図１４ａ（ｉ）】  ６ＫポリトープＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ｐＨ４．３（図１４ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１４ｂ）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。ＣＴＬ応答は両製剤についてポリトープ中の４種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はＴＹＱエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図１４ａ（ｉｉ）】  ６ＫポリトープＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ｐＨ４．３（図１４ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１４ｂ）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。ＣＴＬ応答は両製剤についてポリトープ中の４種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はＴＹＱエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図１４ｂ（ｉ）】  ６ＫポリトープＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ｐＨ４．３（図１４ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１４ｂ）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。ＣＴＬ応答は両製剤についてポリトープ中の４種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はＴＹＱエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図１４ｂ（ｉｉ）】  ６ＫポリトープＣＤＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）ｐＨ４．３（図１４ａ）および６ＨポリトープＣＨＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（図１４ｂ）製剤のＣＴＬ分析のグラフである。ＣＴＬ応答は両製剤についてポリトープ中の４種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はＴＹＱエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図１５ａ】  実施例１８のＥ６Ｅ７と混合したリポソームのグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＤＰＬリポソームと結合していたが、Ｅ６Ｅ７はＤＰＰＣリポソームとはほとんど結合していなかったということがわかる。
【図１５ｂ】  実施例１８のＥ６Ｅ７と混合したリポソームのグラフである。ほとんどのＥ６Ｅ７はＤＰＬリポソームと結合していたが、Ｅ６Ｅ７はＤＰＰＣリポソームとはほとんど結合していなかったということがわかる。
【配列表】
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0005084984.tif 000007
0005084984.tif 000008
【図１ａ】
0005084984.tif 000009
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
0005084984.tif 000011
【図１ｄ】
0005084984.tif 000012
【図１ｅ】
0005084984.tif 000013
【図１ｆ】
0005084984.tif 000014
【図２ａ】
0005084984.tif 000015
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
0005084984.tif 000021
【図３ｃ】
0005084984.tif 000022
【図４】
0005084984.tif 000023
【図５ａ】
0005084984.tif 000024
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
0005084984.tif 000026
【図５ｄ】
0005084984.tif 000027
【図６ａ】
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【図６ｂ】
0005084984.tif 000029
【図６ｃ】
0005084984.tif 000030
【図６ｄ】
0005084984.tif 000031
【図６ｅ】
0005084984.tif 000032
【図６ｆ】
0005084984.tif 000033
【図６ｇ】
0005084984.tif 000034
【図７】
0005084984.tif 000035
【図８ａ】
0005084984.tif 000036
【図８ｂ】
0005084984.tif 000037
【図８ｃ】
0005084984.tif 000038
【図９ａ】
0005084984.tif 000039
【図９ｂ】
0005084984.tif 000040
【図９ｃ】
0005084984.tif 000041
【図１０ａ】
0005084984.tif 000042
【図１０ｂ】
0005084984.tif 000043
【図１０ｃ】
0005084984.tif 000044
【図１１ａ】
0005084984.tif 000045
【図１１ｂ】
0005084984.tif 000046
【図１１ｃ】
0005084984.tif 000047
【図１１ｄ】
0005084984.tif 000048
【図１１ｅ】
0005084984.tif 000049
【図１２ａ】
0005084984.tif 000050
【図１２ａ（ｉ）】
0005084984.tif 000051
【図１２ａ（ｉｉ）】
0005084984.tif 000052
【図１２ｂ】
0005084984.tif 000053
【図１２ｂ（ｉ）】
0005084984.tif 000054
【図１２ｂ（ｉｉ）】
0005084984.tif 000055
【図１２ｃ】
0005084984.tif 000056
【図１２ｃ（ｉ）】
0005084984.tif 000057
【図１２ｃ（ｉｉ）】
0005084984.tif 000058
【図１２ｄ】
0005084984.tif 000059
【図１２ｄ（ｉ）】
0005084984.tif 000060
【図１２ｄ（ｉｉ）】
0005084984.tif 000061
【図１３ａ】
0005084984.tif 000062
【図１３ｂ】
0005084984.tif 000063
【図１３ｃ】
0005084984.tif 000064
【図１３ｄ】
0005084984.tif 000065
【図１３ｅ】
0005084984.tif 000066
【図１３ｆ】
0005084984.tif 000067
【図１３ｇ】
0005084984.tif 000068
【図１３ｈ】
0005084984.tif 000069
【図１３ｉ】
0005084984.tif 000070
【図１３ｊ】
0005084984.tif 000071
【図１３ｋ】
0005084984.tif 000072
【図１４ａ】
0005084984.tif 000073
【図１４ａ（ｉ）】
0005084984.tif 000074
【図１４ａ（ｉｉ）】
0005084984.tif 000075
【図１４ｂ】
0005084984.tif 000076
【図１４ｂ（ｉ）】
0005084984.tif 000077
【図１４ｂ（ｉｉ）】
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【図１５ａ】
0005084984.tif 000079
【図１５ｂ】
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