(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能をプロモーター領域及びＤＡＰ１２遺伝子のエクソン１〜３を不活性化することにより染色体上で欠損させたホモ接合体非ヒト動物を、オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物として使用する方法。
【請求項２】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能をプロモーター領域及びＤＡＰ１２遺伝子のエクソン１〜３を不活性化することにより染色体上で欠損させたホモ接合体非ヒト動物由来の細胞を被検物質と接触させ、該細胞におけるミエリン塩基性タンパク質の発現を測定・評価することを特徴とするオリゴデンドロサイトの発達促進物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能が染色体上で欠損したオリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物、及び該オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物を用いた、オリゴデンドロサイトの発達促進若しくは発達抑制物質、又はミエリン形成促進若しくは抑制物質などのスクリーニング方法や、精神神経障害治療薬のスクリーニング方法や、精神神経障害の診断方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）は活性化モチーフＩＴＡＭを有する膜貫通タンパク質であり、リン酸化によりＺＡＰ−７０やＳｙｋと結合することが示唆されており、ヒトにおいて１９ｑ１３．１に位置する１コピー遺伝子にコードされ、マウスにおいても存在することが知られている。かかるＤＡＰ１２のｍＲＮＡは単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞などに多く発現され、ＤＡＰ１２は単にＫＡＲ群の活性化シグナリングに関与するだけではなく、ヒトsignal regulatory protein（ＳＩＲＰ）beta1、ヒトやマウスのmyeloid DAP12-associating lectin（ＭＤＬ）-1、triggering receptor expressed on myeloid cells（ＴＲＥＭ）と会合することも知られている。また、ＤＡＰ１２がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃなど、Ｃタイプレクチンファミリーに属するＫＡＲ分子とも会合し、機能していることが報告されている（Immunity 8, 693-701, 1998、J. Immunol. 161, 7-10, 1998、J. Immunol. 160, 4148-52, 1998）。
【０００３】
硬化性白質脳症を伴う多発嚢胞性脂肪膜性骨異形成症、又は那須−ハコラ病（Suppl. 232, 1-173, 1972、Acta Pathol. Jpn. 23, 539-558, 1973、J. Med. Genet. 34, 753-757, 1997）は、日本とフィンランドにおいて発見された稀な中枢神経系疾患である。那須−ハコラ病患者は、骨嚢胞組織の形成に加えて、性格変化などの精神異常の症状を経て初老期痴呆を必発する。フィンランドの患者では、５．３ｋｂのＤＡＰ１２［ＫＡＲＡＰ（Killer activating receptor associated protein）／ＴＹＲＯＢＰ（protein tyrosine kinase binding protein）］遺伝子座が欠損する変異が見られた。別の欠陥をもつ日本の患者は、遺伝子の第３エクソンで単一のヌクレオチドが欠損しており、両患者とも、主に免疫組織にみられる細胞膜アダプター蛋白質（membrane adaptor protein；J. Immunol. 158, 5083-5086, 1997、Nature 391, 703-707, 1998）であるＤＡＰ１２の機能が失われることによるものであることが知られている（Nature Genet. 25, 357-361, 2000）。しかしながら、精神異常の症状がＤＡＰ１２の欠損によるものかどうかは知られていなかった。
【０００４】
他方、痴呆症モデル動物としては、従来、脳虚血を誘導するかアミロイドタンパクを蓄積させるなどの誘導方法しか開発されておらず、かかるモデル動物では痴呆に至るメカニズムを解析し、痴呆進行を予防するベースとしては利用価値が十分ではなかった。近年、ＤＡＰ１２欠損により那須−ハコラ病（Nasu-Hakola）病という若年性痴呆に至る精神神経症状が発症することは知られている（Nature Genet. 25, 357-361, 2000）が、根元的原因は未だ明らかになっておらず、また、ＤＡＰ１２欠損マウスにおいて、前頭葉および視床特異的にミエリン低形成が起こることや、精神分裂病の兆候を示すことは知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように那須−ハコラ病は日本とフィンランドにおいて発見された稀な劣性遺伝病であるが、骨嚢胞形成と精神神経異常の症状を経て初老期痴呆を必発する致死的な疾患である。本発明の課題は、那須−ハコラ病、痴呆、精神分裂病、精神分裂病人格障害、強迫症状群、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群等の精神神経障害に至るメカニズムを解析し、精神神経障害の進行の予防方法や精神神経障害の治療方法を開発することができる、ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能が染色体上で欠損したオリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物、及び該オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物を用いた、オリゴデンドロサイトの発達促進若しくは発達抑制物質、又はミエリン形成促進若しくは抑制物質などのスクリーニング方法や、精神神経障害治療薬のスクリーニング方法や、精神神経障害の診断方法等を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＤＡＰ１２の生理的機能の解明について鋭意研究を進め、ＤＡＰ１２遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＤＡＰ１２ノックアウトマウスを作製して脳所見を検討したところ、特に前頭及び視床において、脱髄、すなわちミエリン形成不全症（hypomyelinosis）を含む髄鞘形成傷害を示すことを見い出し、また、かかる障害がミエリンを形成する役割を担うオリゴデンドロサイトのＤＡＰ１２が欠損したためにこの細胞の分化・発達・脳内移動が阻害されることに起因することを見い出した。さらに上記ＤＡＰ１２ノックアウトマウスの行動学的解析から、筋力などは正常であるにもかかわらず反射能に障害がみられることを見い出し、加齢に伴い精神分裂病に似た精神異常症状を示すことを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能をプロモーター領域及びＤＡＰ１２遺伝子のエクソン１〜３を不活性化することにより染色体上で欠損させたホモ接合体非ヒト動物を、オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物として使用する方法（請求項１）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載の方法（請求項２）に関する。
【０００８】
また本発明は、ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能をプロモーター領域及びＤＡＰ１２遺伝子のエクソン１〜３を不活性化することにより染色体上で欠損させたホモ接合体非ヒト動物由来の細胞を被検物質と接触させ、該細胞におけるミエリン塩基性タンパク質の発現を測定・評価することを特徴とするオリゴデンドロサイトの発達促進物質のスクリーニング方法（請求項３）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項３記載のスクリーニング方法（請求項４）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のオリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物とは、ＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）遺伝子機能が染色体上で欠損することにより、オリゴデンドロサイトの発達を障害する非ヒト動物をいう。かかる非ヒト動物は加齢に伴い、ミエリン塩基性タンパク質の発現を減少させ、中枢神経系のミエリン形成に発達障害を惹起させたり、那須−ハコラ病、痴呆、精神分裂病、精神分裂病人格障害、強迫症状群、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群等の精神神経障害をきたしたりする。また、上記ＤＡＰ１２遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＤＡＰ１２をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＤＡＰ１２を発現する機能を失なった非ヒト動物をいう。また本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＤＡＰ１２遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。メンデルの法則に従い出生してくる、これらのホモ接合体非ヒト動物におけるＤＡＰ１２欠損型とその同腹の野生型は個体レベルで正確な比較実験を行うことができる点で同時に用いることが好ましい。そして本発明のオリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物の好適例としては、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスを、野生型非ヒト動物としては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１１】
ＤＡＰ１２遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＤＡＰ１２ノックアウトマウス（ＤＡＰ１２-/-）を作製する。ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、文献（Cell 76, 519-529, 1994）に記載する方法等によって作製することができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＤＡＰ１２遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＤＡＰ１２遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、ＤＡＰ１２遺伝子の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００１２】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスを得ることができる。そして、かかるＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおけるＤＡＰ１２遺伝子が染色体上で欠損していることを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスの尾からＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法や、このマウスの骨髄マスト細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００１３】
本発明のオリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物は、オリゴデンドロサイトの発達障害をきたすモデルや、中枢神経系のミエリン形成に発達障害をきたすモデルや、ミエリン形成過程を研究するモデルや、オリゴデンドロサイト発達障害に起因する病気の発症過程、ミエリン形成異常により生ずる痴呆症等の精神神経障害の発症過程などを研究するモデル等に有用であり、かかるミエリン形成発達障害モデル非ヒト動物を用いると、オリゴデンドロサイト発達障害に起因する病気、例えば、那須−ハコラ病、痴呆、精神分裂病、精神分裂病人格障害、強迫症状群、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群等の精神神経障害に対する治療に有用な薬剤、すなわちオリゴデンドロサイトの発達促進又は発達抑制物質、ミエリン形成促進又は抑制物質などをスクリーニングすることができる。
【００１４】
本発明における、オリゴデンドロサイトの発達促進又は発達抑制物質、ミエリン形成促進又は抑制物質などのスクリーニング方法としては、本発明のオリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を投与する方法や、オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させる方法を挙げることができる。オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させる方法としては、オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物、例えば、前記ＤＡＰ１２ノックアウトマウス由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触させ、該細胞におけるミエリン塩基性タンパク質の発現を測定・評価する方法を具体的に例示することができ、また、オリゴデンドロサイト発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を投与する方法としては、例えば、前記ＤＡＰ１２ノックアウトマウスに被検物質を投与し、該非ヒト動物由来の組織、器官、又は細胞におけるミエリン塩基性タンパク質の発現を測定・評価する方法や、前記ＤＡＰ１２ノックアウトマウスに被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるミエリン形成の発達又は脱髄の程度を測定・評価する方法や、前記ＤＡＰ１２ノックアウトマウスに被検物質を投与し、該非ヒト動物の聴覚性刺激及び／又は聴覚性プレパルス抑制を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができるが、これらに制限されるものではない。なお、上記スクリーニングに際して、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスと比較評価することが好ましい。
【００１５】
本発明のオリゴデンドロサイトの発達促進又は発達抑制物質、ミエリン形成促進又は抑制物質などのスクリーニング方法により得られる、オリゴデンドロサイトの発達促進又は発達抑制物質の候補物質としては、チロシン脱リン酸化酵素阻害物質、チロシンリン酸化酵素活性化物質などの各種低分子化合物等を挙げることができる。また、本発明の那須−ハコラ病、痴呆、精神分裂病、精神分裂病人格障害、強迫症状群、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群等の精神神経障害に対する治療薬としては、上記のオリゴデンドロサイトの発達促進又は発達抑制物質、ミエリン形成促進又は抑制物質などのスクリーニング方法により得ることができる、オリゴデンドロサイト発達促進物質若しくはミエリン形成促進物質、又はミエリン形成促進若しくは抑制物質などを有効成分とする治療薬であれば特に制限されるものではなく、かかる治療薬を哺乳動物等に適宜量及び方法で投与することにより、上記精神神経障害を治療することができる。
【００１６】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
参考例（ＤＡＰ１２ノックアウト-/-マウスの作製）
ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、文献（Cell 76, 519-529, 1994）記載の方法により、１２９／ＳｖＪ（Ｈ−２b）とＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ−２b）とのハイブリッドにより作製した。１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）からＤＡＰ１２ゲノムＤＮＡを単離し、プロモーター領域及びＤＡＰ１２遺伝子のエクソン１〜３を含む５．１ｋｂのBam HI断片を、ｎｅｏrカセット（ストラタジーン社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図１ａ）。なお、ｎｅｏrカセットは、５．１及び１．２ｋｂの相同配列をフランキング配列として有していた。このベクターを線状化し、エレクトロポレーションすることによってＥＳ細胞（ＲＷ４）に導入し相同的組換えを行った結果、７．１％の頻度でＥＳ細胞の相同組換え体を得ることができた。
【００１７】
上記の相同的組換え体からＥＳクローンを単離し、Ｇ４１８及びＧＡＮＣ（ガンシクロビア）に対してネオマイシン耐性ＥＳクローンをスクリーニングし、サザンブロット法によって相同的組換え体を確認した。かかる相同的組換え体からゲノムＤＮＡを単離して、Kpn I でダイジェストし、ｎｅｏrカセットを含むターゲッティングアレルを含んでいることを確認した。かかる確認されたＥＳクローンを胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製し、作製されたマウスを野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles River社製）とインタークロスさせ、コントロールされた環境下で特異的病原体を遮断した施設において飼育することによってヘテロ接合体マウスを得た。また、ホモ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせて、ＤＡＰ１２遺伝子が染色体上で欠損した欠損マウス及びその野生型マウスを作製した。このようにして作製された本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウスは少なくとも１０ヶ月齢までは、文献（Immunity 13, 345-353, 2000、Immunity 13, 355-364, 2000）記載のように特段の異常を示すことなく、健康に成長した。この得られたＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおいてＤＡＰ１２発現能が欠失しているかどうかの確認は、ＤＡＰ１２+/+、ＤＡＰ１２+/-、ＤＡＰ１２-/-等のマウスの尾から得たゲノムＤＮＡをKpn Iで消化し、図１ａに示されている領域のプローブを用いたサザンブロット法により調べた（図１ｂ）。
【００１８】
また、文献（Cell 76, 519-529, 1994）記載の方法によりＤＡＰ１２+/+及びＤＡＰ１２-/-マウスから骨髄マスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製し、かかるマスト細胞（各レーン２．５×１０5細胞相当）から抽出したタンパク質と、文献（Cell 70, 351, 1992）記載の方法により調製した抗ウサギＤＡＰ１２抗血清（１：５００で希釈）とを用いたイムノブロット分析においても調べてみた（図１ｃ）。その結果、ＤＡＰ１２-/-マウス由来の細胞においてＤＡＰ１２タンパク質が検出されなかった。
【００１９】
上記ＤＡＰ１２と同種の細胞表面適応蛋白質（adaptor protein）であるＤＡＰ１０の遺伝子が、たった０．１ｋｂ離れたＤＡＰ１２遺伝子に対して逆転写方向に同様の染色体ＤＮＡ鎖に位置しているのが報告されている（J. Immunol. 163, 4651-4654, 1999、Science 285, 730-732, 1999）。そこで、上記ＤＡＰ１２ノックアウトマウスがＤＡＰ１０遺伝子に影響を与えていないかどうかを調べるためにＲＴ−ＰＣＲ法を行った。上記ＤＡＰ１２+/+又はＤＡＰ１２-/-マウス由来の骨髄マスト細胞（ＢＭＭＣ）から抽出した全ＲＮＡ３μｇと、逆転写酵素ReverTra Ace（TOYOBO社製）を用いて各ｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させ、ＤＡＰ１０のシグナルを確認した。その結果、ＤＡＰ１２-/-マウスにおいてはＤＡＰ１０の発現は正常だったが、ＤＡＰ１２ｍＲＮＡの発現はみられなかった。上記ＤＡＰ１２に特異的なプライマーとしては、5'-atgggggctctggagccct-3'（配列番号１；Ｐ１）及び5'-tcatctgtaatattgcctct-3'（配列番号２；Ｐ２）を、ＤＡＰ１０に特異的なプライマーとしては、5'-atggaccccccaggcta-3'（配列番号３；Ｐ３）及び5'-tcagcctctgccaggca-3'（配列番号４；Ｐ４）を用いた。
【００２０】
実施例１（ＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおける神経細胞、ニューロフィラメント及びアストロサイトの状態）
生後３ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）又は野生型マウス（＋／＋）を麻酔した後、酸−アルコール溶液（９５％エタノール／酢酸５％；ｖｏｌ％）で潅流し、かかるマウスから脳を単離した後、酸−アルコール溶液で１晩固定し、固定した脳を標準プロトコルによりパラフィン処理（１００％エタノール、メチルベンゾアート、キシレン、キシレンパラフィン、又はパラフィン溶液で各１〜２時間ずつ処理する操作）を施しパラフィン包埋した。包埋した脳をミクロトームで１０μｍの厚さにスライスし、標準プロトコルによりデパラフィン処理（キシレン、１００％エタノール、９０％エタノール、７０％エタノール、ＰＢＳ）を施した。細胞内ペルオキシダーゼ活性を３％のＨ2Ｏ2で１０分間抑制した後、再度ＰＢＳですすぎ、切片を０．５％のスキムミルク（DIFCO社製）を含む、１次抗体を含んだＰＢＳ中で３７℃にて１時間処理した。その後、ＰＢＳで３７℃にて３分間，３回振盪して洗い、１００倍希釈のＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製）を含んだ０．５％のスキムミルク含有ＰＢＳ中で３７℃にて５０分間２次抗体を作用させた。
【００２１】
上記２次抗体により処理した切片をＰＢＳ中で３７℃にて３分間，３回振盪して洗った後、文献（Neurosci. Res. 37, 21-31, 2000）記載の方法と同様にＤＡＢ（ディアミノベンチジン；和光純薬工業社製）を用いて免疫染色を行い視覚化した。また、１次抗体の変わりにメチルグリーンを用いて、上記脳切片をニッスル染色し対比した（図２ａ；Ｎｉｓｓｌ）。それらの結果を図２（参考写真１参照）に示す。なお、図中のスケールバーは２５０μｍを意味する。これらの結果から、ＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）と野生型マウス（＋／＋）における神経細胞（図２ａ；Ｎｉｓｓｌ）、ニューロフィラメント（図２ｂ；ＮＦ）及びアストロサイト（図２ｃ；ＧＦＡＰ）では明らかな変化がみられなかった。
【００２２】
実施例２（ミエリン塩基性タンパク質の減少及びＤＡＰ１２-/-マウスにおけるＣＮＳミエリン形成不全）
１次抗体としてウサギ抗マウスＭＢＰ抗体（ニチレイ社製）を用いて、実施例１と同様の方法により、図３ｂ上部記載の脳の概略側面図における破線ａ（図３ａ）又は実線部分の冠状脳切片（図３ｂ下図）を染色し視覚化した。その結果を図３ａ及びｂに示す（参考写真２参照）。なお、図３ａ中のｃｃは脳梁を、ｅｃは外包を、ｉｃは内包を、ｆｉｍはフィンブリアを、ｔｈｌｍは視床をそれぞれ意味し、スケールバーは２５０μｍを意味する。また、図３ｂの上部図はマウスの概略側面図を示し、影部分は大脳を意味する。図３ｂ中のｃｐは尾状核を、スケールバーは２５０μｍを意味する。これらの結果から、３ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおいて、ミエリンの主要かつ特異的な構成要素であるミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）の染色が脳の一部で減少していること、特に視床において特異的な減少が強調されていた（図中の大きな矢頭）。
【００２３】
上記視床においてみられたＭＢＰ染色の減少は、３ヶ月齢及び１．５ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウスの後部領域よりも、尾状核を含む大脳前頭葉の方がより顕著であった。イムノブロット分析により、７ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウス６匹の脳全体から調製したミエリン画片におけるＭＢＰシグナルの平均強度は、野生型マウスの強度の７４％であることがわかった。この結果から、中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリンにおけるＭＢＰ量が、成育した野生型マウスよりＤＡＰ１２ノックアウトマウスの方が減少していること、特に神経細胞、ニューロフィラメント及びアストロサイトの欠損は伴わずに、大脳前頭葉及び視床において減少していることを強く示唆していた。ミエリンは軸索を取囲む多重層のラメラ膜構造であり、神経インパルスの伝達速度を増し、軸索にとって重要な絶縁体として機能することが良く知られている（Science 280, 1610-1613, 1998）。ＣＮＳではミエリンはオリゴデンドロサイトにより合成され、生まれてすぐミエリン鞘形成が起こる。また、ヒトＮＨＤ患者における多くの剖検では前頭で強調されるミエリンの欠損及び視床の衰退が示されている（Acta Psychiatr. Scand. Suppl. 232, 1-173, 1972、Neuropathol. Appl. Neurobiol. 26, 98-101, 2000）。
【００２４】
ＭＢＰ欠損マウス（shivererとして知られる）は、ＣＮＳ軸索において、全身の震えとともにてんかん発作を伴う深刻なミエリン形成不全をもたらし、３ヶ月以内という早い時期に死亡に至ることが知られている（Neurosci. Lett. 12, 113-118, 1979）。成育したＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）でみられたＭＢＰの減少（図３ａ、ｂ）は、かかる動物において、不完全なミエリン形成によるミエリン形成不全、又は通常の代謝回転機構や炎症などの他の理由による脱髄が原因だと考えられる。そこで次に３ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウト（−／−）マウスから大脳前頭葉の尾状核を採取し、１％のＯsＯ4を含む０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で処理した後、エポン８１２で包埋し、極薄（８５ｎｍ）の大脳切片をＨｉｔａｃｈｉＨ−７１００システムで分析してみた。その結果、ミエリン形成不全が明らかに生じていることが確認できた（図３ｃ；参考写真２参照）。また、各ミエリン鞘の周期線（major dense line）を数えると、−／−マウスの多重層ミエリンラメラにおいて周期線が非常に減少していることがわかった（−／−マウス及び＋／＋マウスにおける平均±ｓ．ｄ．はそれぞれ６．９８±３．１６、８．６４±３．３１であった。ｎ＝１２８、「＊＊」はＰ＝０．０００１を意味する）。一方、周期線に特にゆるみなど見られないことから（図３ｂ上部記載の脳の概略側面図における破線ｂ部分の冠状脳切片）、ラメラ構造はぎっしり詰まった層を形成しているのが確認でき（図３ｄの矢頭；参考写真２参照）、ランビエ絞輪周囲領域では−／−マウスにおける脱髄の徴候はみられなかった（図３ｅの矢頭；参考写真２参照）。なお、図３ｅは４０，０００倍で観測したものであり、図３ｄ及びｅ中のスケールバーは２５０ｎｍを意味する。
【００２５】
実施例３（インビトロ及びインビボにおけるオリゴデンドロサイトでのＤＡＰ１２タンパク質の発現）
脱髄とＤＡＰ１２欠損との関係について、Ｐａｌｏｎｅｖａらはノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析により、マウス由来のミクログリア細胞、アストロサイト及び神経細胞の初期培養におけるＤＡＰ１２のｍＲＮＡの発現を明らかにしている（Nature Genet. 25, 357-361, 2000）。しかし、ＤＡＰ１２タンパク質が実際に上記細胞、及びＣＮＳにおけるマクログリア細胞として分類されるオリゴデンドロサイトで発現するかどうかは明らかにされていない。そこで野生型マウス及びＤＡＰ１２ノックアウトマウス由来の、初期培養によるオリゴデンドロサイトをイムノブロット法で分析した。なお、上記オリゴデンドロサイトの培養は以下に記載の方法で行った。
【００２６】
マウス由来のオリゴデンドログリアの培養は文献（Cell 76, 519-529, 1994）記載の方法により行った。生まれたばかりの野生型マウス（＋／＋）とＤＡＰ１２欠損マウス（−／−）の脳を細断し、分離培養法（J. Cell Biol. 85, 890-902, 1980）によりオリゴデンドログリアを調製した。一つの脳に対して、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む約１０ｍｌのダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）に細胞を播き、文献（Dev. Biol. 83, 311-327, 1981）記載の方法と同様にアストログリア単層に付着したオリゴデンドロサイトをorbital shakingにより分離し精製した。精製した細胞のうち９５％以上の細胞がオリゴデンドロサイト特異的マーカーであるＯ４に対して陽性を示した。また、残りのアストロサイト細胞層をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて分離・精製した。このアストロサイト画分は、フローサイトメトリーにより、約２０％がＯ４+オリゴデンドロサイトを含むことが確認できた。
【００２７】
上記精製された野生型又はＤＡＰ１２欠損マウスからオリゴデンドロサイト（Oligo）及びアストロサイト（Astro）をそれぞれ調製し、かかる細胞（１レーンあたり1×１０5細胞）から抽出したタンパク質を用いて実施例１と同様の方法によりイムノブロット分析を行った。なお、ポジティブコントロールとして参考例１で調製した骨髄マスト細胞（ＢＭＭＣ；５×１０5細胞）を用いた。その結果を図４ａに示す（参考写真３参照）。図中の矢印はＤＡＰ１２の位置を示す。このことから、野生型マウス由来のオリゴデンドロサイトにおけるＤＡＰ１２のシグナル強度は、濃度計測によって同数のマスト細胞にほぼ匹敵しているのが確認でき、また、参考例記載の方法と同様にＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、オリゴデンドロサイト細胞のｍＲＮＡからＤＡＰ１２のシグナルが検出された。
【００２８】
前記精製した野生型マウス由来のオリゴデンドロサイトをマグネティックセルソーター（Miltenyi社製）及び抗Ｏ４モノクローナル抗体を用いてさらに精製し、得られたＯ４+細胞の細胞膜に小さな穴をあけ、その後精製したウサギ抗ＤＡＰ１２  ＩｇＧ抗体（抗ＤＡＰ１２抗体）又はコントロールとしてのウサギＩｇＧ（コントロール）と、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体とを用いて染色し、フローサイトメトリーにより分析した結果、Ｏ４抗原に陽性を示すオリゴデンドロサイトでＤＡＰ１２が発現しているのが確認できた（図４ｂ；参考写真３参照）。
【００２９】
また、３ヶ月齢の野生型マウス（＋／＋）、１０日齢（乳児期）の野生型マウス（＋／＋）、又は１０日齢（乳児期）のＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）由来の大脳におけるＤＡＰ１２及びＭＢＰに対する二重染色プロファイルを調べてみた。上記各マウスから実施例１と同様の方法により、脳切片（図３ｂ上部記載の脳の概略側面図における破線ａ部分の冠状脳切片）を作製し、１次抗体として抗ＤＡＰ１２抗体を用いて４℃で１晩反応させ、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を作用させた後ＤＡＢで免疫染色した。染色後、脳切片をＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）中で１時間攪拌することにより抗体を取り除き、続いて、１次抗体としてウサギ抗マウスＭＢＰ抗体を用い３７℃で１時間反応させ、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を作用させた後４−クロロ−１−ナフトール（和光純薬工業社製）で青色に染色した。その結果を図４ｃ〜ｅに示す（参考写真３参照）。なお、図４ｃ中の矢頭はＤＡＰ１２及びＭＢＰで二重染色された細胞を示し、図４ｃ〜ｅ中の各スケールバーは２５μｍを意味する。
【００３０】
上記のことから、成育した３ヶ月齢の野生型マウスでは、脳梁（図４ｃ）、フィンブリア、外包及び内包、視床（図５ｃ及び参考写真４参照）等において、ＤＡＰ１２とＭＢＰとの両方のタンパク質に対し強く陽性を示すことから、これらタンパク質が共発現していることがわかる。かかる領域においてＭＢＰ及びＤＡＰ１２を発現する細胞を同定し（図４ｃ）、成育したマウスのＣＮＳにおけるオリゴデンドロサイトのＤＡＰ１２発現がほとんどのＭＢＰ発現を伴うことがわかった。これに対して、１０日齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウス由来の脳梁ではＭＢＰ染色における減少（図２ｄ）も、１０日齢の野生型マウスのＣＮＳにおけるＤＡＰ１２の共発現（図２ｅ）も検出することができなかった。これらのことから、ＤＡＰ１２欠損状態では、発育中の脳における早期のミエリン鞘形成は正常であり、ＤＡＰ１２発現は発育段階に応じて制御を受けていることが示唆され、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスではミエリン低形成は発育後期の、遅くとも１．５ヶ月までに起こると考えられる。
【００３１】
実施例４（ＤＡＰ１２発現とミエリン形成とのカップリング）
３ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）（図５ａ；参考写真４参照）又は野生型マウス（＋／＋）（図５ｂ及びｃ；参考写真４参照）から内包（ｉｃ）及び視床（ｔｈｌｍ）領域を含む脳切片を作製し（図３ｂ上部記載の脳の概略側面図における破線ａ部分の冠状脳切片）、ＭＢＰの発現（図５ａ及びｂ）、又はＭＢＰ及びＤＡＰ１２の発現（図５ｃ）を調べてみた。なお、ＭＢＰの発現は実施例２と同様の方法で、ＭＢＰ及びＤＡＰ１２の発現は実施例３と同様の方法により調べた。その結果を図５に示す（参考写真４参照）。なお、図中の矢頭は大脳の内包を、＊印はＤＡＰ１２陽性領域をそれぞれ示し、スケールバーはそれぞれ１００μｍを意味する。これらの結果から、３ヶ月齢（図５ａ）及び１．５ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）において、多くのＭＢＰ陽性オリゴデンドロサイトが大脳の内包（図５ａ中の矢印）、フィンブリア及び視床などの幾つかの領域で確認できた。一方、成育した野生型マウス（＋／＋）の脳におけるオリゴデンドロサイト細胞は、非常に多くのＭＢＰ陽性樹状突起が発達しているため、低倍率ではＭＢＰ染色により同定することがほとんどできなかった（図５ｂ）。しかし、野生型マウスにおけるＤＡＰ１２の染色強度は内包領域において最も顕著であった（図５ｃ中の矢頭）。かかる領域は、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスではオリゴデンドロサイト細胞群が位置していた（図５ａ）。これに対して、野生型マウス（図５ｃ中の＊印）においてＤＡＰ１２が強く発現する領域は、ＤＡＰ１２ノックアウトマウス（図５ａ＊印）ではＭＢＰの発現が弱いことが確認できた。これらのことは、オリゴデンドロサイトによるミエリン鞘形成がＤＡＰ１２の発現と密接に関係しているということを強く示唆している。ＤＡＰ１２ノックアウトマウスでは、野生型マウスにおいてミエリン鞘形成を進行させるオリゴデンドロサイトが、活性化されていなかった。以上のことから、ＣＮＳにおけるＤＡＰ１２は、後発育期段階及び維持期段階におけるミエリン鞘形成の活性化において重要な役割を果たしていると考えられる。
【００３２】
実施例５（ＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおける感覚運動のゲーティングの欠損）
視床は脳の中で最も重要な領域の１つで、全ての感覚器官からの刺激を取り込み、神経伝達の調節により次の反応を決定している。それゆえ、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスの視床における特異的なミエリン形成不全は、行動上の欠陥を引き起こすが、本実験で用いたＤＡＰ１２ノックアウトマウスの行動は正常であった。興味深いことに、以前の文献（Rinsho Shinkeigaku 32, 444-446, 1992）で、ＮＨＤ患者のＭＲＩにより、視床及び被殻において信号の強度が減少することが報告されている。そこで、５ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおける聴覚性驚愕反応及びプレパルス抑制を調べてみた。なお、聴覚性驚愕反応（左図）及びプレパルス抑制（右図）の概略図を図６ａに示す。マウスの聴覚性驚愕反応はＳＲ−ＬＡＢシステム（San Diego Instruments社製）によって測定し、チャンバー内のバックグランドのノイズレベルは６５ｄＢで行った。最初の反射刺激を与える１０分前に野生型マウス（＋／＋）又はＤＡＰ１２ノックアウトマウス（＋／＋）をシリンダーに入れ、バックグラウンドのノイズで順応させた。驚愕反応の振幅を驚愕刺激開始から１００ｍｓｅｃ間だけ記録し、驚愕反応の最大振幅を計測した。聴覚性驚愕反応の測定における実験では、８種類の異なる驚愕刺激（７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、又は１２０ｄＢ；２０ｍｓｅｃ間の刺激）を与え、同じ順序で各刺激を５回繰り返した。なお、実験は平均４０秒の間隔をおいて行なった。その結果を図６ｂに示す。なお、図６ｂ中の測定値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０、「＊」はＰ＜０．０５を意味する）で表した。図６ｂに示すように、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは野生型マウスに比べ、全体的に有意に低レベルの驚愕反応を示した［Ｆ（１、１８）＝５．７９０、Ｐ＜０．０５］。また、この差は主として１００及び１１０ｄＢにおける驚愕反応の低下によりもたらされることが分かった。このことから、５ヶ月齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウスが聴覚性刺激に対して異常な反応を示すことがわかった。
【００３３】
聴覚性プレパルス抑制の測定における実験では、各セッションは７種類の異なった刺激から構成されており、無刺激、驚愕刺激のトライアルのみ、又はプレパルスを驚愕刺激に先行させたが、どの刺激においてもマウスの反応はみられなかった。２種類の驚愕としては、１００又は１２０ｄＢで２０ｍｓｅｃ間驚愕刺激した。なお、驚愕刺激の開始前に、４種類の異なる聴覚性プレパルスと聴覚性驚愕刺激との組み合わせを１００ｍｓｅｃで行った。各２０ｍｓｅｃのプレパルス刺激（７０又は８０ｄＢ）は、両方の聴覚性驚愕刺激の前に与えた。７種類の異なる刺激は９回ランダムに与え、トライアルは平均４０秒の間隔をおいて行なった。驚愕反応のプレパルス抑制の割合を下の式で求めた。この結果を図６ｃに示す。なお、結果はTwo-way ANOVAを用いて繰り返し測定してデータを分析し、Two-way ANOVAの繰り返し測定で決定させ、グループ間の違いをStudent's t-testにより求め、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０、「＊」はＰ＜０．０５を意味する）で表した。その結果、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは有意に低い抑制レベルの聴覚性プレパルス抑制を示しており［Ｆ（１、１８）＝５．０６１、Ｐ＜０．０５］、この効果は１００ｄＢの驚愕刺激において特に観察された。
【００３４】
【数１】
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【００３５】
聴覚性驚愕反射作用は単純な神経回路として知られており、視床からのインプットを受け取り、広い範囲の皮質、中脳、又は後脳の中枢から発生するものである。弱いプレパルスによって驚愕反応を修飾させた驚愕反応のプレパルス抑制は感覚運動ゲーティングの評価系であり、この評価は、生物が視床を経た情報の流れを選別し、その後の行動の閾値を決めているＣＮＳでの中枢抑制過程の理論上の回路（J. Neurosci. 12, 4501-4509, 1992、Brain Res. 499, 7-17, 1989、Brain Res. Bull. 43, 219-228, 1997）と一致している（図４ｄ）。感覚運動ゲーティングの欠陥は、痴呆、精神分裂病、精神分裂病人格障害、強迫症状群、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群等のヒト神経精神病障害の数例でみられる感覚過敏、認知分断及び注意欠陥を引き起こす。従って、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、視床に特異的なミエリン形成不全によって、驚愕反応の低下及び感覚運動ゲーティング障害を引き起こすと考えられる。また、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスが、年老いたとき、その行動や学習能力がより深刻な異常に発展するという可能性も考えられるが、５ヶ月齢でヒトの精神分裂病に似た精神異常症状を示すことが明らかとなった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のミエリン形成発達障害モデル非ヒト動物は、中枢神経系のミエリン形成に発達障害をきたすモデルや、ミエリン形成過程を研究するモデルや、ミエリン形成異常により生ずる痴呆症等の精神神経障害の発症過程を研究するモデル等に有用であり、またかかる実験モデル動物を用いると、那須−ハコラ病、痴呆、精神分裂病、精神分裂病人格障害、強迫症状群、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群等の精神神経障害に至るメカニズムを解析し、精神神経障害の進行の予防方法や精神神経障害の治療方法を開発することができる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図と、各マウスにおけるＰＣＲ法及びサザンブロット法の結果を示す図である。
【図２】本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウスと野生型マウスにおける神経細胞、ニューロフィラメント及びアストロサイトの状態を示す図である。
【図３】本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウスと野生型マウスにおけるミエリン塩基性タンパク質の減少及びＣＮＳミエリン形成不全についての結果を示す図である。
【図４】本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウスと野生型マウスにおけるインビトロ及びインビボにおけるオリゴデンドロサイトでのＤＡＰ１２タンパク質の発現についての結果を示す図である。
【図５】本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＤＡＰ１２発現とミエリン形成についての結果を示す図である。
【図６】本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウス及び野生型マウスにおける感覚運動のゲーティングについての結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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