(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−リン酸三カルシウムからなる多孔質セラミックスの内部に、骨髄細胞を播種し、該骨髄細胞を培養してなることを特徴とする人工骨材。
【請求項２】
前記骨髄細胞に、骨形成に寄与する細胞増殖因子がさらに複合されていることを特徴とする請求項１記載の人工骨材。
【請求項３】
前記多孔質セラミックスは、６０〜９０％の気孔率であり、複数の気孔が連通した大きさ５０〜１０００μｍのマクロポア及び大きさ２μｍ以下のミクロポアを有していることを特徴とする請求項１記載の人工骨材。
【請求項４】
前記多孔質セラミックスは、メカノケミカル法により合成されたβ−リン酸三カルシウム粉末を原料として用い、成形後、焼結して形成されていることを特徴とする請求項１または３記載の人工骨材。
【請求項５】
前記骨髄細胞は、患者から採取して培養した培養細胞であることを特徴とする請求項１または２記載の人工骨材。
【請求項６】
前記培養細胞は、培養中に電気的または／及び機械的刺激が与えられていることを特徴とする請求項５記載の人工骨材。
【請求項７】
前記培養細胞は、下記（ａ）〜（ｃ）の内の少なくとも一つの手段または組み合わせの手段によって多孔質セラミックスの内部に播種されることを特徴とする請求項５または６記載の人工骨材。
（ａ）減圧下または加圧下で培養細胞を播種する。
（ｂ）減圧と加圧を繰り返して培養細胞を播種する。
（ｃ）遠心力を作用させて培養細胞を播種する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨欠損の修復に用いられる人工骨材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、整形外科などの領域においては、様々な疾患によって生じる骨欠損の修復に、人工骨を用いることが普及している。人工骨の材料としては、リン酸カルシウム系のセラミックスが多く用いられている。ところが、リン酸カルシウム系セラミック材料は生体適合性に優れ、良好な骨伝導能を有し骨形成の足場としては作用するものの、骨欠損の重症度が大きい場合に対しては単独での修復は困難である。従って、このような症例に対しては、自家骨を移植する選択肢しかなく、採骨量に限りがある場合などは骨欠損の修復は困難であった。
【０００３】
このような背景から、骨欠損の重症度が高い症例に対しては、より骨形成能の高い、すなわち骨誘導活性を有する移植用材料が求められている。これを背景として、前記リン酸カルシウム系のセラミックス材料をキャリヤーとして骨髄細胞を培養した細胞組込み型人工骨の研究が行なわれている。
【０００４】
吉川らは、ヒト培養骨髄細胞を多孔質ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）と混和し、骨形成培地で３週間培養後、これをヌードマウス腹腔内に移植し、２ヶ月後に摘出、組織学的に評価したところ、有意な骨形成を確認している（日整会誌
７３（３），Ｓ６７２）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
多孔質セラミックスに培養骨髄細胞を組み込む人工骨においては、次のような課題がある。
【０００６】
まず、骨髄細胞を多孔質セラミックスの中心部まで侵入させることであるが、使用する多孔質セラミックスのサイズが大きくなると、骨髄細胞が中心部に入っていくのが困難となる。また、細胞が多孔質セラミックスの中心部まで侵入しても、血管が中心部まで行き渡らないと、酸素分圧が低下して骨芽細胞として機能しない問題がある。
【０００７】
次に、細胞を組み込むキャリヤーとする多孔質材料についての課題は以下の通りである。キャリアーとなる材料は次のような条件を満たしていることが必要である。キャリヤーは生体適合性が高くかつ培養細胞の活性の妨げにならないのはもちろんであるが、骨伝導能を有し、かつ移植後、骨の形成の進行とともにキャリヤー自身が吸収されることが重要である。キャリヤーとしてのコラーゲンやポリ乳酸グリコール酸などは、生分解性であり、キャリヤーとしての条件の内、分解・吸収性は満たしているが、骨伝導能に乏しく、この点で好ましくない。
【０００８】
一方、リン酸カルシウム系セラミックスは、骨伝導能に優れており、この点では好ましい。しかしリン酸カルシウムの中で人工骨としてもっとも一般的なＨＡＰは、生体内では吸収されにくいため、吸収性の点で好ましくない。これに対してβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）は、良好な吸収性を有しており、骨伝導能の性質と併せるとキャリヤーとしては最も好ましい材料である。
【０００９】
このような観点から、以前よりβ−ＴＣＰは単独で骨補填材として用いられている。しかし、Ａｌｔｅｒｍａｔｔらは刊行物「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２，１８０〜１８２」において、多孔質β−ＴＣＰを骨嚢腫に適応して経過観察したところ、最長７年でも依然として材料が補填部に残存していることを報告している。β−ＴＣＰは基本的に吸収される性質を有しているが、このように長期に渡って残存するケースがあることは、一義的にβ−ＴＣＰであれば良いというわけでないことを示している。
【００１０】
実用上において、β−ＴＣＰの純度が問題となるものである。β−ＴＣＰは一般的には、乾式で炭酸カルシウムとリン酸水素カルシウムとを固相反応させる方法や、湿式でカルシウム（Ｃａ）イオンとリン（Ｐ）イオンとを反応させる方法により製造される。
【００１１】
しかしながら、乾式法では、反応が不均質のため未反応物が若干残ったり、生成した粉末は焼結特性に乏しいものとなる。湿式では、温度やｐＨの微妙な調整が必要であるが、ＣａとＰとの比が化学量論値から若干ずれたり、微量な副生成物が含まれる場合がある。素材の性質は、製造されるプロセスの影響を大きく受け、そのプロセスが悪い場合には応用段階、実用段階において所望の結果が得られないことになり、従来ではこの点が全く検討されていない。さらに多孔質からなるβ−ＴＣＰの気孔の性状も骨伝導能と吸収性に影響を与える因子となっている。
【００１２】
本発明は、以上のことを踏まえてなされたものであり、β−ＴＣＰと培養骨髄細胞との複合により、骨形成を促進する理想的な人工骨材を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、請求項１の発明の人工骨材は、β−リン酸三カルシウムからなる多孔質セラミックスの内部に、骨髄細胞を播種し、該骨髄細胞を培養してなることを特徴とする。
【００１４】
請求項２の発明は、請求項１記載の人工骨材であって、前記骨髄細胞に、骨形成に寄与する細胞増殖因子がさらに複合されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項３の発明は、請求項１記載の人工骨材であって、前記多孔質セラミックスは、６０〜９０％の気孔率であり、複数の気孔が連通した大きさ５０〜１０００μｍのマクロポア及び大きさ２μｍ以下のミクロポアを有していることを特徴とする。
【００１６】
請求項４の発明は、請求項１または３記載の人工骨材であって、前記多孔質セラミックスは、メカノケミカル法により合成されたβ−リン酸三カルシウム粉末を原料として用い、成形後、焼結して形成されていることを特徴とする。
【００１７】
請求項５の発明は、請求項１または２記載の人工骨材であって、前記骨髄細胞は、患者から採取して培養した培養細胞であることを特徴とする。
【００１８】
請求項６の発明は、請求項５記載の人工骨材であって、前記培養細胞は、培養中に電気的または／及び機械的刺激が与えられていることを特徴とする。
【００１９】
請求項７の発明は、請求項５または６記載の人工骨材であって、前記培養細胞は、下記（ａ）〜（ｃ）の内の少なくとも一つの手段または組み合わせの手段によって多孔質セラミックスの内部に播種されることを特徴とする。
（ａ）減圧下または加圧下で培養細胞を播種する。
（ｂ）減圧と加圧を繰り返して培養細胞を播種する。
（ｃ）遠心力を作用させて培養細胞を播種する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の人工骨材は、β−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスの内部に、播種した骨髄細胞を増殖させてなるものである。多孔質セラミックスの形状としては、例えば、ブロック状或いは顆粒状とすることができる。
【００２１】
多孔質セラミックスの中心部まで細胞を侵入させるには、多孔質セラミックス材料に培養骨髄細胞を播種する際に、減圧下または加圧下で行なったり、減圧と加圧を繰り返して印加したり、または遠心力を作用させることにより確実に行うことができる。これにより、骨髄細胞が多孔質セラミックスの中心部まで入ることが可能となる。この場合、これらの手段を複数組み合わせて行うことも有効である。
【００２２】
また、細胞培養中に電場を印加する、等方圧を加える、衝撃波を加えるなどの電気的または機械的刺激を施すことにより、細胞の増殖性が増加するため、活性も維持される。
【００２３】
多孔質セラミックスの内部での血管新生は、ＶＥＧＦなどの血管新生に寄与する誘導因子を骨髄細胞に複合することにより可能となる。この場合、ＶＥＧＦの発現ベクターを用いた遺伝子導入により複合することが好ましい。
【００２４】
また培養細胞に加えて、ＶＥＧＦだけでなく、骨形成に寄与する細胞増殖因子を複合することは、さらに良好な骨形成を実現することができる。例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦなどの骨形成に寄与する細胞増殖因子を用いることにより、骨形成を確実に行うことができる。
【００２５】
β−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスと培養骨髄細胞とを複合した人工骨材は骨形成を促進する。この人工骨材において、β−ＴＣＰとしては、高純度で優れた骨伝導能と吸収性を有するものを用いる。
【００２６】
β−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスは、複数の気孔が連通したマクロポア及びこれよりも小さなミクロポアを有しており、その気孔率は６０〜９０％が良好である。マクロポアとしては、５０〜１０００μｍの大きさが良好であり、１００〜５００μｍの大きさがさらに良好である。マクロポアとしては、全気孔の容積率の３０〜７０％程度存在していることが好ましい。このマクロポアは骨髄細胞のセラミックス内での侵入や血管新生などに寄与する。
【００２７】
ミクロポアは２μｍ以下の大きさが良好であり、１μｍ以下がさらに好ましい。また、ミクロポアは全気孔の容積率の１０〜４０％程度存在していることが好ましい。このミクロポアは吸収のされ易さなど化学的な作用を促進するのに寄与する。
【００２８】
高純度なβ−ＴＣＰは湿式粉砕法であるメカノケミカル法で作製するものが、骨組織の代替材料として用いる材料の成分として優れている。このメカノケミカル法は、炭酸カルシウムとリン酸水素カルシウム２水和物とを、ＣａとＰのモル比が１．５となるように秤量し、これらの粉末をボールミルにて湿式粉砕し、これにより得られるスラリーを乾燥し、その後、７２０〜９００℃で焼成してβ−ＴＣＰを得るものである。この方法によれば、原料の秤量値によりＣａとＰの比が制御でき、純度が高くかつ焼結性に優れたβ−ＴＣＰが得られる。
【００２９】
優れた骨伝導能と吸収性を有するβ−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスは、以下のように作製する。湿式粉砕法により得たβ−ＴＣＰ粉末に界面活性剤（解膠剤）を加えて湿式発泡成形した後、乾燥し、９５０〜１０５０℃の温度で焼成して多孔体とする。この方法により、セラミックス全体の気孔率が６０〜９０％であり、複数の気孔が連通した大きさ５０〜１０００μｍのマクロポアが全気孔の３０〜７０％の容積率で存在し、しかも、２μｍ以下の大きさのミクロポアが全気孔の１０〜４０％の容積率で存在する多孔質セラミックスを得ることができる。
【００３０】
以上のようなβ−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスと培養骨髄細胞を複合させて人工骨材とすることにより、良好に骨形成を促進する人工骨材とすることができる。
【００３１】
【実施例】
（実施例１）
炭酸カルシウム粉末とリン酸水素カルシウム２水和物をモル比で１：２の割合で秤量し、純水とともにボールミルポットに入れ、約１日ボールミルで混合粉砕した。得られたスラリーを約８０℃で乾燥し、その後、７５０℃で焼成した。得られた粉末は、焼結性に優れた高純度なβ−ＴＣＰセラミックスであった。
【００３２】
この粉末に純水とアクリル酸アンモニウム系の解膠剤とポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系の界面活性剤を添加し、混合攪拌して発泡スラリーを調製した。この発泡スラリーを乾燥させ、その後１０５０℃で焼成してβ−ＴＣＰの多孔質セラミックスを得た。この多孔質セラミックスは気孔率が７５％であり、気孔径は１００〜５００μｍおよび１〜０．１μｍの２つの領域に分布があるものであった。
【００３３】
（実施例２）
実施例１で作製したβ−ＴＣＰの多孔質セラミックスを足場材料として、骨髄由来初代培養細胞を播種し、インビトロで培養したものを生体内に移植し、移植した組織から多量の骨組織を形成した。具体的な手法は以下のとおりである。
【００３４】
骨髄細胞を採取し、培養フラスコに移しＭＥＭ系培地に１０−１５％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を加えたものを用いて、約１０日間５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養する。次に、トリプシン処理により細胞を培養フラスコから剥がした後、ブロック状のβ−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスに播種する。培地はＭＥＭ系培地に１０−１５％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を加えたものを用いる。
【００３５】
細胞濃度は５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍのブロックに播種する場合、１ｃｃの培地あたり１００万個以上の細胞を必要とする。１−３時間、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃でインキュベートした後、培地をＭＥＭ系培地に１０−１５％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を加えたものをベースに、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとして１０−８Ｍのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１０ｍＭのβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０μｇ／ｍｌのａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄを加えたものに交換し、２日おきの培地交換を行ないながら約２週間、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートする。その後ブロックごと生体内に移植を行なう。
【００３６】
その後、Ｆｉｓｈｅｒ  ｒａｔ大腿骨から採取した骨髄液を、上記の方法で培養し、β−ＴＣＰの多孔質セラミックスからなるブロック上に播種し、２週間培養した後、別のＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔの皮下に移植し、３週間後に摘出した。これを、ＨＥ染色により調べたところ良好な骨形成を確認することができた。
【００３７】
（実施例３）
実施例１で作製したβ−ＴＣＰの多孔質セラミックスに、細胞増殖因子を吸着させて播種した。細胞増殖因子としては、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦをそれぞれ用いた。そして、インビトロで培養したものを、生体内に移植し、移植した組織から多量の骨組織を形成した。具体的な手法は以下のとおりである。
【００３８】
上記細胞増殖因子をそれぞれ採取し、培養フラスコに移しＭＥＭ系培地に１０−１５％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を加えたものを用いて、約１０日間５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養する。次に、トリプシン処理により細胞を培養フラスコから剥がした後、ブロック状のβ−ＴＣＰからなる多孔質セラミックスに播種する。培地はＭＥＭ系培地に１０−１５％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を加えたものを用いる。
【００３９】
播種に際しては、各細胞増殖因子を減圧下で播種、加圧下で播種及び減圧と加圧との繰り返しを行って播種する手法をそれぞれ行うと共に、遠心力を作用させて播種する手法を行い、それぞれの播種条件での試験体を作製した。
【００４０】
細胞増殖因子の濃度は５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍのブロックに播種する場合、１ｃｃの培地あたり１００万個以上の細胞を必要とする。１−３時間、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃でインキュベートした後、培地をＭＥＭ系培地に１０−１５％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を加えたものをベースに、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとして１０−８Ｍのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１０ｍＭのβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０μｇ／ｍｌのａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄを加えたものに交換し、２日おきの培地交換を行ないながら約２週間、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートする。その後ブロックごと生体内に移植を行なう。
【００４１】
その後、Ｆｉｓｈｅｒ  ｒａｔ大腿骨から採取した骨髄液を、上記の方法で培養し、β−ＴＣＰの多孔質セラミックスからなるブロック上に播種し、２週間培養した後、別のＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔの皮下に移植し、３週間後に摘出した。これを、ＨＥ染色により調べたところ良好な骨形成を確認することができた。
【００４２】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、β−ＴＣＰの多孔質セラミックスに骨髄細胞を組み込むことにより、良好に骨形成を促進することが可能な人工骨材とすることができる。また、等方圧等の機械的刺激やＶＥＧＦのような細胞増殖因子を複合することにより、さらに確実に骨形成することができ、これらによって有用性を向上させることができる。