(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝性骨疾患治療用薬剤組成物において、第１および第２の顆粒剤の混合物を含有し、前記第１顆粒剤は、有効成分として有効量のカルシトリオール、および少なくとも１種の賦形剤を含有し、前記第２顆粒剤は、有効成分として有効量のアレンドロネイト、および少なくとも１種の賦形剤を含有し、前記組成物がカルシトリオール１重量部に対してアレンドロネイトを1,000〜50,000重量部を含有し；さらに両方の顆粒剤中の前記賦形剤がマンニトールを含有し、前記マンニトールが全体の薬剤組成物の10から98重量％含まれ、全マンニトールの40〜60重量％が前記アレンドロネイトと配合された、ことを特徴とする代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項２】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物が、裸錠、腸溶コーティング錠、腸溶コーティグ顆粒剤、カプセル剤又は腸溶コーティングカプセルの剤型であることを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項３】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物は、吸収強化剤として使用される添加剤として、ソジウムラウリルサルフェートを全体の薬剤組成物に対しての0.01~10重量％含むことを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの前記顆粒剤には、さらにエタノールが含まれることを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項５】
腸溶コーティグ顆粒剤であることを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項６】
前記マンニトールがＤ−マンニトールであることを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項７】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物が、さらに、ステアリン酸カルシウムを全体の薬剤組成物に対して0.1〜20重量％含むことを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項８】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物が、さらに、ステアリン酸マグネシウムを全体の薬剤組成物に対して0.1〜20重量％含むことを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項９】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物は、前記マンニトール、前記カルシトリオールおよびアレンドロネイトを、マンニトール：（カルシトリオール＋アレンドロネイト）の混合比率が９：１となるように含むことを特徴とする、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項１０】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびエチルセルロースからなる群から選択される、さらなる徐放化剤を含有する、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項１１】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物は、さらに、ブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソールを含有する、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【請求項１２】
前記代謝性骨疾患治療用薬剤組成物は、さらに、ポビドン、ステアリン酸カルシウム、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールおよびラウリル硫酸ナトリウムを含有する、請求項１記載の代謝性骨疾患治療用薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の目的）
（発明の属する技術分野及びその分野の従来の技術）
本発明は代謝性骨疾患治療用薬剤組成物及びこの製造方法に関するもので、さらに詳しくは有効成分に脊椎骨折率の減少と骨密度の増加効果を持つカルシトリオール(Calcitriol)と骨吸収抑制剤のアレンドロネイト(Alendronate)を投与するものの、最も大きい上昇作用を持つ最適の投与比率で投与し、これと共にアレンドロネイトの吸収強化剤等の添加剤を適正量添加した後、それぞれの成分を一つの剤形に最適化させ複合製剤に製造することにより、カルシトリオールを使うことにより誘発される副作用である、高カルシウム血症を抑制すると共に、アレンドロネイトの使用によって誘発される骨生成妨害作用をカルシトリオールが補償させながら服用方法の難易性と食道副作用等の問題点等に伴う、低下したコンプライアンスを数等向上させることができ、効果的に骨粗鬆症の発生が抑制できるように改善された代謝性骨疾患治療用薬剤組成物及びこの製造方法に関する。
【０００２】
‘骨粗鬆症'とは全身性から来る骨の代謝性疾患として、多様な原因により骨の化学的造成には変わりなく骨の量(骨量)が減少され、微細構造の変化が起こり、結果的に骨が折れやすくなる疾患である。特に、高齢患者の場合は、軽微な衝撃によっても骨折になりやすいが、米国の場合、人口10%に当たる2千5百万人の骨粗鬆症患者中、毎年130万人が骨折で苦労していることが知られている。
【０００３】
このような骨粗鬆症は大きく第1型骨粗鬆症と2型骨粗鬆症に分類できる。まず、第1型骨粗鬆症は閉経期女性に主に発生するもので、エストロゲンの欠乏で骨の吸収(resorption)が大きく増加することを特徴とし、骨小柱(trabecular bone)の消失が観察でき、これにより脊椎や腕等に骨折が発生しやすい。第2型骨粗鬆症は主に老人や男性に発生するもので、骨吸収の増加よりは骨形成能力が大きく低下することを特徴とする。これを総合してみると、上記第1型骨粗鬆症及び第2型骨粗鬆症とも破骨細胞による骨吸収の増加と一緒にカルシウムの臓内吸収が減少することを特徴とすることが分かる。
【０００４】
上記した理由により、臨床ではこのような骨粗鬆症治療剤として骨形成を促進させる薬剤と骨吸収だけを遮断させる薬剤に分類して使っている。
【０００５】
まず、骨粗鬆症治療剤として骨形成を促進させる薬剤ではアナボリックステロイド、フッ素、ビタミンD及び副甲状腺ホルモン等がここに属する。最近になって、骨の生成機転が明らかになるにつれ、骨質量の均衡が得られるビタミンDの誘導体等が注目されている。上記骨形成の促進剤内でも特に、活性ビタミンD3の一種で1,25-(OH)2-D3で示されるカルシトリオールは腸管でのカルシウム輸送に関与して小腸からカルシウム吸収を増進させ、骨質量の減少を抑制させる効果があり、骨粗鬆症の予防に重要なホルモンとして知られている。しかしながら、カルシトリオールを薬剤に単独で使う場合は、高カルシウム血症の副作用を引き起こす問題がある。ここで、高カルシウム血症は血漿カルシウムの濃度が11.0mg/dl以上で、腫瘍等の疾病と密接に連係され、最も一般的に生命を脅かす代謝性疾患であり、カルシトリオールと関連してはカルシトリオールによる血漿内カルシウムの濃度の増加と骨代謝の非正常的な体内カルシウムの濃度調節によって引き起こされることである。カルシトリオールによる副作用及びビタミンDを過量投与する場合に現れる副作用、つまり、高カルシウム血症症候群またはカルシウム中毒(高カルシウム血症の激しい程度及び持続時間による)と類似する。度々現れる急性症状は食欲減退、頭痛、嘔吐、便秘等があり、慢性症状は栄養失調、感覚異常、葛を随伴した発熱、多尿、脱水、無関心、成長鈍化、尿路感染等がある。
【０００６】
従って、高カルシウム血症で苦労する患者は色々合病症を誘発するようになり、骨粗鬆症等の疾病を治療するに際して、かなり不便になる。
【０００７】
一方、骨粗鬆症治療剤として骨吸収を抑制する薬剤等では、女性ホルモン、カルシトニン、ビスフォスフォネート及びイフリフラボン等がここに属する。従来は骨粗鬆症の治療剤として主に骨吸収を抑制する薬剤等が開発され使われているところ、これをさらに詳細にする。
【０００８】
まず、日本国特許公開平7-330613号にはビスフォスフォネートの一種で、アレンドロネイトを有効成分とし、ジハイドロークシビタミンD3の存在により、條骨細胞の石灰化及び骨基質の生成を促進する骨形成促進剤が公知されている。
【０００９】
また、ヨーロッパ特許出願第88-4628号にはビスフォスフォネートを基剤にして、適当量のナトリウムラウリルサルフェートを含有する経口投与用薬学的組成物が公知されている。
【００１０】
そして、米国特許第125,372号にはビスフォスフォネートを含有する腸溶コーティング錠剤が公知されている。
【００１１】
しかしながら、現在まで蓄積された臨床経験によれば、上記した、よく使われる骨吸収抑制剤だけでは、すでに進行した骨粗鬆症患者の骨量を増加させるには足りなすぎることが明らかになり、骨形成促進剤の開発が従来から求められてきたが、現実的には画期的に有用な物質が開発されなくて残念な実状である。
【００１２】
従って、上記問題点を解決するため、イテリ文献[Clinical Drug Investigation 1998 Mar; 15(3); 235〜244]にはアレンドロネイトとカルシトリオールを併用投与する方法が公知されているところ、これについて詳細にする。
【００１３】
上記イテリ文献に公知された臨床実験はアレンドロネイトとカルシトリオールそれぞれの成分を一つの剤形で最適化させ、複合製剤に製造することとは異なり、それぞれの成分を別々併用投与する。つまり、アレンドロネイトは1日1回投与し、カルシトリオールを1日2回にしてそれぞれの成分を一定時間の間隔を隔てて投与することである。また、食後に服用すると、吸収が落ち、効力が喪失するようになり、食前服用しなければならないという問題がある。
【００１４】
このようなイテリ文献に公知された臨床実験はその服用方法が相当難易である問題があり、骨粗鬆症患者達はたいがい高齢であり、毎日種々の薬物を服用する場合が多いことを勘案すると、上記服用方法の難易性により、服用すべき薬物中1〜2の薬物を除くことがある。従って、薬物投与を通じた効果が得られないという問題がある。
【００１５】
また、アレンドロネイトが上部胃腸管粘膜に局所刺激を起こし、食道炎、食道潰瘍、食道迷乱のような食道副作用を引き起こす問題があり、薬物を迅速に通過させ食道刺激可能性を減少させるため充分水を摂取しなければならない等の問題点もある。従って、患者に対する順応度が低下される問題がある。
【００１６】
患者に対する順応度について詳細にすると、1997年1月にバンクーバーで開催された'Japanese and American Glaucoma Societies'学会でも患者のコンプライアンスの向上が復号製剤開発の最終の目標と発表され、1998年2月4日にシカゴで開催された'Fifth Conference on Retroviruses and opportunistic infection'では相互に異なる薬理機転を有したラミブジンとジドブジン成分のそれぞれの投与より、これらの複合剤であるコンビビル(Combivir)の効果が72%から96%に向上された対照結果を見せたが、この結果を通じて上記得られた効果は患者のコンプライアンスの向上に起因するものと判断される。
【００１７】
また、現在このような概念、即ち、カルシトリオールとアレンドロネイトを複合製剤化する概念を持つ骨粗鬆症治療剤の研究は全くなく、ただ、ビタミンDによる高カルシウム血症の治療としてアレンドロネイト製剤の効果に対する多い試図だけが成されている実情である。従って、新たな骨粗鬆症治療剤の研究開発を通じて商品化が早期に成される複合製剤を開発することにより、高カルシウム血症等の副作用を減少させながら、少ない容量で効果的に骨粗鬆症を予防または治療でき、さらには、服用方法の難易性と食道副作用などの問題点等により低下したコンプライアンスが改善できる最適の容量の複合製剤として製剤技術を経た骨粗鬆症治療用薬剤組成物の開発が切実に要求されている。
【００１８】
（発明の解決しようとする技術的課題）
従って、本発明は上記問題を解決するため、研究・努力した結果、有効成分に脊椎骨折率の減少と骨密度の増加効果を有するカルシトリオール(Calcitriol)と骨吸収抑制製剤であるアレンドロネイト(Alendronate)を投与するものの、最も大きい上昇作用を有する最適の投与比率で投与し、これと同時にアレンドロネイトの吸収強化剤等の添加剤を適正量添加した後、それぞれの成分を一つの剤形に最適化させ、複合製剤に製造することにより、カルシトリオールを使うことにより誘発され、副作用である高カルシウム血症を抑制すると共に、アレンドロネイトの使用により誘発され骨生成妨害作用をカルシトリオールが補償させながら服用方法の難易性と食道副作用等の問題点により低下したコンプライアンスを数等に向上させることができ、効果的に骨粗鬆症の発生が抑制できるように改善された代謝性骨疾患治療用薬剤組成物及びこの製造方法を提供することにその目的がある。
【００１９】
（発明の構成）
本発明は、代謝性骨疾患治療用薬剤組成物において、カルシトリオールとアレンドロネイトを有効成分として含有し、カルシトリオール1重量部に対してアレンドロネイトが1,000〜50,000重量部含有している代謝性骨疾患治療用薬剤組成物を、その特徴とする。
【００２０】
また、本発明はカルシトリオールとアレンドロネイトを有効成分として含有する代謝性骨疾患治療用薬剤組成物を製造する方法において、
A): カルシトリオールとエタノールの混合物にマンニトールを添加し、エタノール、抗酸化剤及び結合剤を上記混合物に添加し、上記混合物を14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕して上記粉砕された混合物を乾燥するという一連の工程を通じてカルシトリオールの顆粒を得る過程と、
B):  マンニトール、吸収強化剤及びアレンドロネイトを混合し、上記混合物にエタノール及び結合剤を添加し、上記混合物を14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕して上記粉砕された混合物を乾燥するという一連の工程を通じてアレンドロネイトの顆粒を得る過程、そして、
C): 上記A)過程を通じて得たカルシトリオールの顆粒1重量部に対して上記B)過程を通じて得たアレンドロネイトの顆粒を1重量部を混合した後、崩解剤及び滑澤剤を上記混合物に添加してその混合物を錠剤とする過程から成ることを特徴とする、代謝性骨疾患治療用薬剤組成物の製造方法を含む。
【００２１】
このような本発明をさらに詳細に説明すると下記の通りである。
本発明は有効成分に脊椎骨折率の減少と骨密度の増加効果を有するカルシトリオール(Calcitriol)と骨吸収抑制剤であるアレンドロネイト(Alendronate)を投与するものの、最も大きい上昇作用を有する最適の投与比率で投与し、これと同時にアレンドロネイトの吸収強化剤を適正量添加した後、それぞれの成分を一つの剤形に最適化させて複合製剤に製造する方法に関する。
【００２２】
まず、本発明の有効成分であるカルシトリオールとアレンドロネイトについて詳細にする。
【００２３】
カルシトリオール
まず、本発明で有効成分に添加されるカルシトリオール(1,25-(OH)2-D3)は上述のように、骨形成促進剤中でも特に、活性ビタミンD3の一種で腸管でのカルシウム輸送に関与して小腸でカルシウムの吸収を促進させ、副甲状腺のホルモン分泌を減少させ閉経後骨粗鬆症女性達の骨損失を減少させるということは既に明らかになった[Aloia JF.]。また、條骨細胞に対して骨の無機質化に重要な骨特異蛋白質であるオステオカルシン生成を促進させることが研究された[Price PA.]。
【００２４】
しかしながら、カルシトリオールを薬剤として使う場合は、高カルシウム血症の副作用が引き起こされる問題があり、これを解決するための研究がなされてきた。
【００２５】
アレンドロネイト
一方、本発明では有効成分にアレンドロネイトを添加するところ、アレンドロネイト(Alendronate, 4-アミノ-1-ハイドロークシブチリジン-1,1-ビスフォフォネート)は骨粗鬆症治療剤として開発された物質中、ビスフォフォネートの一種で、破骨細胞の機能を抑制して骨の消失を防ぎ、骨密度を改善させる効果があることが知られた。
【００２６】
臨床試験の結果、約2〜3%の骨密度改善効果が現れた。例えば、16ヶ国の閉経基女性994人を対象とした臨床試験で段階的に脊椎及び下肢骨のミネラル密度を上昇させた。また、上の薬群に比べて新規脊椎骨折発生率を48%程度減少させた。参考に、骨のミネラル密度は骨の密度と密接な関係があるので、ミネラルの密度が高いほど骨折の発生率は大幅に減ることができるが、アレンドロネイトの治療効果を最も優秀に現わす1日10mgの容量を3年間投与した場合、脊椎と下肢骨のミネラルの密度はそれぞれ8.2%, 7.2%が上昇した反面、同じ期間の間、上の薬群でのミネラルの密度はかえって0.7%が落ちたと報告された。
【００２７】
しかしながら、上記アレンドロネイトは新たな骨の生成速度(bone remodeling rate)を低めて正常的な骨代謝回転に悪影響を及ぼすものと知られているので、このような問題点を補完するための骨形成剤の複合投与が要求される。
【００２８】
カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤
ところが、特異な点はアレンドロネイトは高カルシウム血症が抑制できる作用をするので、骨形成剤であるカルシトリオールと一緒に投与され、骨粗鬆症に対する効力だけ認められれば、カルシトリオールによる最も大きい副作用である高カルシウム血症が解決でき、特に、安全域が非常に狭く、1日投与容量が制限的に使用され、最適の有効容量が投与できないカルシトリオールの短所が解決できる。また、アレンドロネイトによる骨生成(Bone remodeling)に対する阻害作用はカルシトリオールが補償させることができる。
【００２９】
従って、本発明では閉経後の骨粗鬆症女性において、脊椎骨折率の頻度減少と骨密度の増加を現わすものとして知られたカルシトリオール(Calcitriol)と骨吸収抑制剤であるアレンドロネイトとの複合製剤を利用して閉経期の女性から骨粗鬆症の発生を抑制させる薬剤を開発しようと、動物モデルを利用して骨粗鬆症を誘導した後、カルシトリオールとアレンドロネイトの比率をそれぞれ別にして複合投与することにより、効果的に骨粗鬆症を抑制しながら骨形成の速度が抑制されず、同時に血中カルシウムの濃度が正常範囲内で調節できる最適の濃度比を導出した。
【００３０】
このような研究結果、本発明による最適の濃度比はカルシトリオール1重量部に対してアレンドロネイトが1,000〜50,000重量部で含有させた時、最も優れた効果を有することが見いだした。もし、カルシトリオール1重量部に対して含有されるアレンドロネイトの含量が1,000重量部未満である場合は、カルシトリオールによる血漿内カルシウムの濃度の増加で、高カルシウム血症が発生する問題があり望ましくない。反面、50,000重量部を越えて過量含有される場合は、アレンドロネイトにより正常な骨代謝回転に悪影響を及ぼす問題があり望ましくない。
【００３１】
また、本発明により製造された代謝性骨疾患治療用薬剤組成物は裸錠、腸溶コーティング錠、顆粒剤、腸溶コーティング顆粒剤、カプセル剤及び腸溶コーティングカプセル剤の形で剤形できる。このように多様な形で剤形される場合、単位投与の剤形内カルシトリオールの含量は0.1〜5.0μgであり、アレンドロネイトの含量は1〜50mgとする方が望ましい。
【００３２】
一方、本発明による薬剤組成物に添加される当業界に公知されている好適な添加剤中で最適の添加剤を選別するため、研究・努力した結果、最適の添加剤を選別し、これを適正量添加した後、それぞれの成分を一つの剤形に最適化して複合製剤に製造することにより、服用方法の難易性と食道副作用等の問題点等に伴う低下されたコンプライアンス(Compliance)を数等に向上させることができ、効果的に骨粗鬆症の発生が抑制できるように改善された代謝性骨疾患治療用薬剤組成物の製造方法にもその特徴があるところ、これを詳細にする。
【００３３】
A) 過程 :
まず、本発明ではカルシトリオールとエタノールの混合物にマンニトールを混合し、そしてエタール、抗酸化剤及び結合剤を混合して、上記混合物を14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕して30〜50℃の温度で乾燥させカルシトリオールの顆粒を得る過程を経る。この時、もし上記混合物のサイズが14メッシュ未満であれば、顆粒中カルシトリオールが不均一で望ましくなく、反面、35メッシュを越える場合は、製造収率の低下と打錠性が悪くなって望ましくない。
【００３４】
B) 過程 :
本発明では上記A)過程とは別に、アレンドロネイト、マンニトール及び吸収強化剤を混合し、そしてエタノール及び結合剤を混合して、上記混合物を14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕して、30〜50℃の温度で乾燥させアレンドロネイトの顆粒を得る過程を経る。この時、もし上記混合物のサイズが14メッシュ未満であれば顆粒中アレンドロネイトが不均一で望ましくなく、反面、35メッシュを越える場合は、製造収率の低下と打錠性が悪くなって望ましくない。
【００３５】
C) 過程 :
上記A)過程を通じて得たカルシトリオールの顆粒と上記B)過程を通じて得たアレンドロネイトの顆粒を混合し、ここに崩解剤及び滑澤剤を添加して混合して、錠剤とする過程を経ることにより本発明を完成する。
【００３６】
さて、本発明に添加されるそれぞれの添加剤を詳細にする。
上記マンニトールは賦形剤として使われるものであって、上記A)過程とB)過程で使われるマンニトールの使用量を50〜60:40〜60の比率で限定し使用する。このようにマンニトールの使用量を限定した理由は下記の通りである。
【００３７】
カルシトリオールとアレンドロネイトとの混化性試験結果、カルシトリオールの安定性がよくないことが分かった。しかし、カルシトリオールを他賦形剤と混化した後、アレンドロネイトを入れて、配合性試験を行った結果、カルシトリオールの安定性は維持された。従って、製造工程においてカルシトリオールが特にアレンドロネイトとの直接的接触をできるだけ避けるため、カルシトリオールとアレンドロネイトをマンニトールで希釈してそれぞれ独立的に顆粒を作った後、その顆粒を混合する方法を選択した。また、顆粒製造時、マンニトールの使用量の50%ずつでカルシトリオールとアレンドロネイトを各々顆粒した時、その結果物である顆粒で費用的差が観察され、この顆粒を混合し堕睛して得た錠剤は含量均一性が維持されていなかった。従って、顆粒の粒子サイズ分布と含量が均一で、一定になるように考案した結果、カルシトリオールの顆粒に総マンニトール使用量の50〜60%、望ましくは52%、アレンドロネイトの顆粒に総マンニトール使用量の40〜50%、望ましくは48%を使い、二つの顆粒が混合される前の重量が同様になるよう調整した。この方法を利用して製造した錠剤は顆粒で均一な粒子分布図を持ち、その結果、含量均一性が維持できる。ここで、本発明では賦形剤としてマンニトール以外にも白糖、セルロース及びラクトースの中で選択して使用できるが、この中で望ましくはD-マンニトールを使う。このような賦形剤は全体の薬剤組成物に対して10〜98重量%、望ましくは70〜97重量%を含有させる。この時、添加される上記マンニトールの含量が上記範囲を外れる場合は打錠性が悪くなって望ましくない。
【００３８】
また、上記抗酸化剤でブチルヒドロキシトルエン(BHT, Butylated Hydroxytoluene)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA, Butylated Hydroxyanisole)、DL-アルファ-トコフェロール及びレシチンの中で選択して1種以上が使用できるが、この中で望ましくはブチルヒドロキシトルエン(BHT, Butylated Hydroxytoluene)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA, Butylated Hydroxyanisole)を使う。このような抗酸化剤は全体の薬剤組成物に対して0.001〜10重量%、望ましくは0.01〜1.0重量%を含有させる。この時、添加される抗酸化剤の含量が上記範囲を外れる場合は、カルシトリオールの安定性に問題があって望ましくない。
【００３９】
また、結合剤ではポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの中で選択して使用できる。このような結合剤は全体の薬剤組成物に対して0.1〜20重量%、望ましくは1〜10重量%を含有させることができる。この時、添加される結合剤の含量が上記範囲を外れる場合は、均一な粒子分布図を持てず、打錠性に問題があって望ましくない。
【００４０】
崩解剤ではクロスカメロースソジウム(Croscarmellose sodium)、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース及びカルボキシメチルセルロースカルシウム中で選択して使用でき、全体の薬剤組成物に対して0.1〜20重量%、望ましくは1〜10重量%を含有させる。この時、添加される崩解剤の含量が上記範囲を外れる場合は、錠剤の崩解に問題があって望ましくない。
【００４１】
滑澤剤ではステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム及びタルク中で選択して使用でき、全体の薬剤組成物に対して0.1〜20重量%、望ましくは0.1〜10重量%を含有させる。この時、添加される滑澤剤の含量が上記範囲を外れる場合は、打錠性と主成分の含量分析に問題があって望ましくない。
【００４２】
吸収強化剤ではソジウムラウリルサルフェートを使うことができ、全体の薬剤組成物に対して0.01〜10重量%、望ましくは0.1〜1重量%を含有させる。
【００４３】
また、本発明では加えて、徐放化剤としてヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びエチルセルロース中で選択して添加することができる。
【００４４】
また、本発明による薬剤組成物は腸溶コーティング溶液でコーティングすることにより腸溶コーティング剤として、また、通常の型のカプセルに充填させカプセル剤としても製造することができる。ここで、腸溶コーティング液は腸溶皮剤、可塑剤及び溶剤からなっているが、上記腸溶皮剤としてはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸ポリマ及びセルロースアセテートフタレート等があり、可塑剤ではトリエチルシトレート、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールがあり、溶剤ではメチレンクロライド、エタノール、アセトン及び整除水中で選ばれた2種以上を適切に混合して製造することができる。
【００４５】
これにより、本発明により製造された薬剤組成物は代謝性骨疾患において卓越した効能を持つ。この時、上記代謝性骨疾患では骨粗鬆症、パゼット病、佝僂病、骨軟化症、腎不全患者の腎性骨形成異常症、副甲状腺機能の亢進及び低下症がある。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は実施例により限られるものではない。
【００４６】
（参照例）
まず、骨粗鬆症の進行を効果的に抑制しながら、骨形成の速度は抑制せず、血清カルシウムの濃度と尿へのカルシウム排泄量も正常水準に維持できる複合製剤の開発のために下記のように実施して最適の濃度比を算出した。
【００４７】
1) 骨粗鬆症の誘導:
生後12週の成熟したSprague-Dawley雌鼠(220〜250g)を大韓実験動物(株)から供給され、ソウル大学の医科大学動物実験室の清浄室で飼育し、1週間一般飼料(Purina, chow diet)で飼育して順応させた後、体重を測定して類似の分布となるよう均等に各10匹ずつ6群に分けた後、卵巣摘出を施行した。この際、実験動物は餌と水は自由に食べるようにし、標準化された条件(22℃, 50%湿度, 12時間 dark/light cycle)下で飼育した。
【００４８】
2) 薬物投与:
手術後、2日間安定させた後、2ヶ月にかけて週5日ずつ午前中に決まった投与量のカルシトリオールとアレンドロネイトをそれぞれ分別整除した椰子油0.5ml と生理食塩水0.5mlに溶けて経口で単独投与または複合投与した。各群による薬物投与容量は下記の表1に示した。一方、対照群には実験群と同量の椰子油と生理食塩水だけを投与した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
3)試料採取及び前処理:
薬物投与を始めた2ヶ月後、メタボリックケージ(metabolic cage)を利用して24時間尿を得て遠心分離して-70℃で冷凍保管し、一晩中断食させた後、断頭して血液を採取し、遠心分離して血清を得て、-70℃で冷凍保管した。また、脛骨(tibia)を摘出分離して4%フォルマリンpH 7.4に固定した。
【００５１】
4) 統計処理及び評価:
まず、各実験の分析結果を平均値±標準誤差で示し、各群間の差の有意性は SASプログラムを利用してANOVA, Duncan multiple range testをし、p<0.05水準で有意性を判定した。
【００５２】
実験例1 : 骨小柱面積測定(bone histomorphometry)試験
上記参照例において固定させた脛骨を脱石灰するため10%硝酸溶液に6時間入れておき、アルコール80%から100%まで10段階を経ながら脱水した。その後、クシレンとパラピンでそれぞれ2回ずつ包埋した後、骨切断用マイクロトームで近位脛骨部で4μｍ厚さの切片を作り、ヘマトキシレン-エオシン染色を実施した。近位脛骨部が顕微鏡の視野に入るよう40倍率で定量的映像分析体系(quantitative image analysis system)を利用して一定標準面積(2×106μｍ2)内の骨小柱面積を測定してその比率を計算した。
【００５３】
脛骨の骨小柱面積を測定した結果は下記の通りである。
人において、皮質骨(cortical bone)は年2〜3%だけが新しく交替されるが、骨小柱(trabecular bone)は年25%の早い速度で交替されており、脛骨や脊椎骨の骨小柱の発達程度は骨の健康状態に対する最も正確でありながらも直接的な結果を提供することができ、動物実験で利用されている。
【００５４】
本実験では卵巣摘出後、2ヶ月間アレンドロネイトとカルシトリオールを単独投与または複合投与した後、脛骨の骨小柱状態を顕微鏡で観察した結果、卵巣摘出した対照群は正常と比較して、骨小柱が多く減少したことが見えた(図 1)。また、薬物投与による効果をより正確に比較するため、イメージ測定器(image analyzer)で骨小柱面積を測定計量した結果、アレンドロネイト単独投与群、複合投与1, 2及び3群全てが同様な水準で骨小柱面積を大きく増加させる効果を見せた(図 2)。しかし、カルシトリオール単独投与群では増加していなかった。結果的に、脛骨の骨小柱の発達状態はアレンドロネイトにカルシトリオールを複合投与した場合も、アレンドロネイトだけ単独投与した場合と同様な効果を維持しており、複合投与1, 2及び3群間の差はないことが分かった。
【００５５】
実験例 2 : 生化学的検査
まず、上記参照例を通じて得た試料を使ったことを明らかにする。
1) 血清カルシウムの濃度測定:
血清カルシウムの濃度はテクニコン自動測定器(Technicon autoanalyzer)で測定した。血清カルシウムの濃度を測定した結果は下記の通りである。
【００５６】
カルシトリオール単独投与群は血中カルシウムの濃度が有意に増加した反面、アレンドロネイト単独投与群は有意に減少した。その理由はカルシトリオールは小腸でカルシウムの吸収を増加させる作用があり、アレンドロネイトは副甲状腺ホルモンを減少させ骨吸収を抑制させることにより、カルシウムが骨から血中へ抜き出せないようにし、腎臓でのカルシトリオール(1,25-(OH)2-D3)の合成が抑制されることにより、小腸でのカルシウム吸収が減少する作用があるからである。従って、カルシトリオールとアレンドロネイトを複合投与した複合投与1, 2及び3群の血中カルシウムの濃度は予想通りカルシトリオール単独投与群とアレンドロネイト単独投与群の中間水準で良く保持されていた(図３)。
【００５７】
2) 尿へのカルシウム排泄量測定:
24時間尿でカルシウム、クレアチニンの濃度をカルシウムキット(YeongDong製薬製品)を利用してカルシウム/クレアチニンの濃度比を計算した。カルシウムの尿排泄量を測定した結果は下記の通りである。
【００５８】
薬物投与時、血中カルシウムの濃度と共に尿への排泄状態に与える影響を調べるため尿内カルシウム/クレアチニンの濃度比を測定し、その結果を図４に示した。
【００５９】
尿へのカルシウム排泄量はカルシトリオール投与時、大きく増加していたが、アレンドロネイト投与時は変化がなかった。カルシトリオールとアレンドロネイトを複合投与した場合、複合投与1群と複合投与3群はカルシウム排泄量が増加したが、複合投与2群は対照群の水準で保持されていた(図４)。
【００６０】
3) 骨形成指標測定:
血清アルカラインポスタパゼ活性度はテクニコン自動測定器(Technicon autoanalyzer)で測定し、オステオカルシン(osteocalcin)の濃度はRIA方法を利用したキット(OSCAテスト, Brahams, Berlin)を使って測定した。骨形成の速度を測定した結果は下記の通りである。
【００６１】
骨形性の速度の血清オステオカルシン(osteocalcin)の濃度とアルカラインポスタパゼ活性を測定した。オステオカルシン(osteocalcin)の濃度とアルカラインポスタパゼの活性はカルシトリオールの単独投与により少し上昇し、アレンドロネイトの投与により少し減少する傾向を見せたが、統計的に有意的な変化はなかった(図５，６)。また、複合投与によってもオステオカルシン(osteocalcin)の濃度は変化がなく、アルカラインポスタパゼの活性は複合投与3群でだけ有意に減少し、複合投与1群と2群は骨形性の速度が減少していないことが分かった。
【００６２】
4) 骨吸収指標測定:
24時間尿でコラゲン1型の分解産物であるN-テロペプチド(NTx)の濃度をキット(Osteomark, Ostex, USA)を利用したELISA方法で測定し、尿中NTx/クレアチニンの比を計算した。骨吸収の速度を測定した結果は下記の通りである。
【００６３】
骨吸収の速度の指標として尿中のコラゲン1型テロペプチド(NTx)の濃度を測定した結果、薬物投与による有意な変化はなかった(図７)。
【００６４】
上記実験例1〜2に対する結論:
カルシトリオールとアレンドロネイトを複合投与することにより、閉経期後、骨粗鬆症の進行を最大限抑制しながら、骨回転率と血清カルシウムの濃度が正常的に維持できる最適の濃度比を経口で単独投与したり、3つの比率で(複合投与1, 2, 3)複合投与した。
【００６５】
複合投与した場合、全てが同様に脛骨の骨小柱の発達程度がアレンドロネイト単独投与群と同様な水準で維持された。また、血清カルシウムの濃度も複合投与1, 2, 3群全てが正常水準に維持される望ましい効果を見せた。但し、複合投与1群は尿へのカルシウム排泄量を大きく増加させ、複合投与3群は尿へのカルシウム排泄量を増加させると共に骨形性指標であるアルカラインポスタパゼ活性を減少させた反面、複合投与2群はカルシウム排泄量も増加させておらず、アルカラインポスタパゼ活性も抑制させていなかった。
【００６６】
以上の結果を総合してみる時、複合投与2群(カルシトリオール0.1μg/kg＋アレンドロネイト1.0mg/kg)が骨粗鬆症の進行を効果的に抑制しながら、骨形性の速度は抑制しておらず、血清カルシウムの濃度と尿へのカルシウム排泄量も正常水準に維持されるようにし、複合製剤開発のための最適の濃度比で判断された。
【００６７】
上記実験例1〜2を通じて、カルシトリオールとアレンドロネイトの最適の濃度比を算出し、この複合製剤の安全性を下記の実験例3〜4のように評価した。
【００６８】
即ち、本発明によるカルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤に対して医薬品等の毒性試験基準(食品医薬品安全庁告示第98-56号, 98. 4. 29)に好適な急性及び亜急性毒性試験を実施して複合製剤の安全性を確認した。
【００６９】
実験例 3 : カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤の急性毒性試験
カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤を実験動物に単回経口投与時の急性毒性を下記のような条件にして測定した後、この複合製剤の安全性を評価した。この時、 カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤の急性経口毒性を調べるため、白鼠に投与した後、LD50,、一般状態、体重及び摂取量を測定した。また、剖検を実施してこれを観察した。
【００７０】
飼育条件:
4〜5週齢のSprague-Dawley白鼠180匹(雄/雌それぞれ90匹)を中央大学の薬学大学動物飼育場のSPF室(Techniplast Co., Italy)で実温は23±2℃、相対湿度60±2%、換気回数13〜15回/時間、照明12時間/日(午前7時〜午後7時)に設定して飼育した。動物は白鼠用ケージ(cage)に入れて放射線滅菌した固形飼料(HanIl飼料 : グリンピア(株))及び飲料水(加熱滅菌した水)は自由に摂取するようにした。
【００７１】
試料調剤:
遮光容器に入れて冷蔵庫(-20℃)に保管されたカルシトリオール1.0mgを測り、褐色容量フラスコに入れて、使うとき溶媒(100% エタノールMCT = 5:95)を入れて1.0及び 10μg/mlの濃度に調剤し、ここにアレンドロネイトモノソジウムを0.5% CMC-Na水溶液に懸濁液を配合して毎週調剤して使った。
【００７２】
投与容量決定:
カルシトリオールとアレンドロネイトの投与用量は人体の投与容量を考慮してそれぞれ 0.5 μg : 5mgの配合比率で投与する方法を選択した。また、LD50を勘案して一定比例で8群に分類し、対照群を含み総9群を下記の表2のように設定した。この時、薬品の投与用量は1ｍｌになるように調剤して経口投与した。
これら薬物の最低投与群を計算するため、人体の体重と白鼠の投与量との相関性を考慮して、最低投与容量をそれぞれ0.2 μg/ kg及び2.0mg/kgに決定した。
【００７３】
【表２】
0004875818.tif 000003
【００７４】
実験項目:
1) LD50 測定
雌雄白鼠でLD50を測定するため、上記表2のように複合製剤の配合投与群1〜8群と対照群に分けて10匹を1群にしてそれぞれ経口投与し、2週内に死亡した動物数を数えてブレレンス-カーバ(Brehrens-Karber)法を使ってLD50を計算した。カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤のLD50を測定した結果は下記の通りである。
【００７５】
カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤(1μg/kg:10mg/kg)を単回経口投与した時の全ての雌雄白鼠の実験群の死亡率を下記の表3に示した。
【００７６】
【表３】
0004875818.tif 000004
【００７７】
上記表3の結果からBrehrens-Karber法により複合製剤のLD50を計算した。即ち、雄白鼠のLD50はカルシトリオールは77.5 μg/kgであり、アレンドロネイトは775mg/kgであり、雌白鼠のLD50はカルシトリオールは75.0μg/kgであり、アレンドロネイトは750mg/kgであった。
【００７８】
2) 一般状態観察
全動物に対して、カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤を投与した後、最初の6時間は30分毎に観察し、その後は1日1回ずつ一定時間に2週間観察するという方法で毎日観察した。一般状態の観察結果は下記の通りである。
【００７９】
全動物に対して投与した後、6時間まで30分毎に一般状態を観察した結果、雌雄白鼠でLD50以上の投与群では投与直後から足で頭を掻く症状が現れたが、これは食道・胃刺激症状と判断された。その後、投与1時間内に痙攣と呼吸混乱を誘発し、2時間後からは自発運動が低下され、軽度の柔軟状態を見せ、嗜眠状態を維持してからその後、呼吸混乱を起こし、カルシトリオール100 μg/kgとアレンドロネイト1000mg/kg以上の高容量では24時間内に殆ど死亡した。カルシトリオール75μg/kgとアレンドロネイト750mg/kgの投与群では上記表3に示したように雌は60%, 雄は50%が死亡し、カルシトリオール50μg/kgとアレンドロネイト500mg/kgの投与群では全部生存した。
【００８０】
一方、このような症状はカルシトリオール50μg/kgとアレンドロネイト500mg/kgの投与群では雌雄と関係なく10匹中3匹程度で食道・胃刺激症状が現れたが、回復期第1日目に完全に回復された。
【００８１】
3) 体重及び摂取量測定
全動物に対して投与前、投与後2週間、毎日一定時間に体重及び摂取量を測定した。その結果は下記の通りである。
全動物に対して投与前・後、2週間毎日一定時間に測定した結果、雌雄白鼠で死亡した動物以外には14日間の回復期間に体重変化と摂取量において有意な変化は現れなかった(図８，９)。
【００８２】
4) 剖検
死亡した動物の剖検だけでなく、全生存動物をエーテルで麻酔して致死させ目示的所見が得られ、裸眼により検出された異常臓器や組織を10%中性ポルマリン液に固定した後、通常の組織標本を製作し、ヘマトクシレンとエオシンに染色した後、組織所見が得られた。また、その結果は下記の通りである。
【００８３】
高容量の複合投与(カルシトリオール75μg/kgとアレンドロネイト750mg/kg以上)で死亡した実験動物を剖検した結果、脾臓の鬱血以外には異常所見がなかった。また、14日間の回復終了時に生存したカルシトリオールとアレンドロネイトの複合投与群と対照群の全動物をエーテルで麻酔後、剖検して全ての臓器を検査したが、脾臓の軽微な肥大以外は異常所見が見られなかった。併せて、カルシトリオール100μg/kgとアレンドロネイト1,000mg/kg投与群の死亡した動物の脾臓の組織所見では激しい鬱血と出血があったことが確認された(図１０)。
【００８４】
実験例 4 : カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤の亜急性毒性試験  カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤を実験動物に5週反復経口投与時の亜急性毒性を下記のような条件にして測定した後、この複合製剤の安全性を評価した。即ち、毎日1回ずつ5週間反復経口投与する期間と2週間の回復期間で観察した。
【００８５】
この時、カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤の亜急性経口毒性を調べるため白鼠に投与した後、一般状態、体重変化、摂取量、眼科学的検査、聴覚検査、尿検査、血液学的検査、血液化学的検査及び病理組織学的監査を行った。
【００８６】
実験動物及び飼育条件:
急性試験と同様な条件で白鼠を飼育し、試験終了の一日前はメタボリックケージ(metabolic cage)に入れて飼育した。各実験群は雌雄それぞれ20匹を1群として5週間投与した後、また、2週間回復試験後にそれぞれ10匹ずつ試験した。
【００８７】
試料造剤及び投与容量:
上記急性試験と同様な条件で試料を調剤した。また、カルシトリオール及びアレンドロネイトの投与容量はそれぞれ人体の投与容量と既に報告されたLD50を考慮して、臨床で骨粗鬆症の治療と予防に応用される投薬量を考慮し、それぞれ0.5μgと5mgを複合投与する方法を選択して公比5で下記の表4のように薬物投与群4群と溶媒対照群(総5群)を設定して実験した。
【００８８】
【表４】
0004875818.tif 000005
【００８９】
実験項目:
1) 死亡状況検査
カルシトリオール及びアレンドロネイトの複合投与終了時及び回復終了時に雌雄両方の動物が生存して死亡を誘発していなかった。
【００９０】
2) 一般状態観察
投与期間中には投与前、投与直後及び投与2時間後、総3回(但し、休日には投与前と投与直後、総2回)、回復期間中には毎日1回ずつ一般状態を観察した。その結果は下記の通りである。
【００９１】
動物の行動は薬物投与開始後、3日目までは胃・食道刺激症状と嗜眠状態を見せたが、このような症状は5日目以後には現れなかった。他のすべての投与群で投与終了及び回復終了時まで投薬に起因されたと判断される一般状態の変化が現れなかった。
【００９２】
3) 体重変化及び水の摂取量
体重は投与期間及び回復期間を通じて3日毎に測定した。特に、摂取量は原則的に7日間の累積摂取量を毎週1回測定し、一匹の1日摂取量を算出した。また、その結果、カルシトリオールとアレンドロネイトの複合投与終了及び回復終了時まで、全ての実験群において有意性のある体重変化は現れなかった(図 11)。また、カルシトリオールとアレンドロネイトの複合投与終了時及び回復終了時まで全ての実験群で有意性のある摂取量の変化は現れなかった(図12)。
【００９３】
4) 眼科学的剖検
検疫・巡回期間中には全動物に対して投与、第5週は各群の雌雄各5匹ずつ検査した。特に、目の外観を目示的に観察するうち散瞳剤(atropine剤)を点眼し、散瞳を検眼鏡(BX α型)を利用して前眼部、中間投光体及び眼底を観察した。特に、投与第5週目の検査結果、投薬による変化を観察して変化がない場合、回復期間中の検査は実施しなかった。その結果、カルシトリオールとアレンドロネイトの配合投与終了時及び回復終了時まで全ての実験群で薬物投与に起因されたと認められる眼科学的変化は現れなかった。
【００９４】
5) 聴覚検査
投与第5週目に各群の雌雄各10匹ずつガイダンボイズル(約600Hz)を利用して耳系反射を検査した。特に、投与第5週の検査結果、投薬による変化を観察して変化がない場合、回復期間中の検査は実施しなかった。その結果、カルシトリオールとアレンドロネイトの配合投与終了及び回復終了時まで全ての実験群で薬物投与に起因されたと認められる聴覚変化が現れなかった。
【００９５】
6) 尿検査
投与第5週及び回復第2週には各群の雌雄各10匹を絶食させ、水は自由に食べるようにして4時間尿を、その後、自由給食及び自由給水下で20時間尿を採取した。最初の 4時間尿を利用して白血球、亜酢酸塩、ウロビリノーゲン(urobilinogen)、pH、蛋白質、ケトン体、尿糖、潜血、肥重、ビリルビン(bilirubin)(以上AMES尿検査試験紙, N-Nultistix SG-L :日本バイエル, SamKong(株))、色及び鍼砂を検査した。ここで20時間尿を利用してナトリウム、カリウム及び塩素(全量測定法)を測定した。
【００９６】
その結果、投与期間及び回復期間にカルシトリオールとアレンドロネイトの複合投与群両方で尿検査値が正常範囲内にあり、薬物投与に起因されたと認められる尿検査値の変化は現れなかった。
【００９７】
7) 血液学的検査
投与期間及び回復期間終了の翌日、畜殺計画時には前日から一晩(約16時間)絶食させ、動物をエーテル麻酔下で正中線を沿い開腹し、腹大動脈から抗凝固剤(7.5% EDTA-2K)含有採血瓶(Vacutainer : Bechon Dickinson Vacutainer Systems Europe England)に採血して赤血球数(電気抵抗変化検出法)、ヘモグロビン量(シアノメノヘモグロビン法)、 ヘマトクリト値(赤血球数及び平均赤血球容積を算出)、平均赤血球容積(電気抵抗変化検出法)、平均赤血球血色素量(ヘモグロビン量及びヘマトクリト値から算出)、血素板数(電気抵抗変化検出法)、白血球(電気抵抗変化検出法)(以上、自動分析装置Cell-Dyne 3000 :Abbot Co.)、 網状赤血球(Brecher法)及び白血球百分率(May-Giemsa 検定法)を測定した。この時、3.8%ソジウムシートレートで処理して血液を遠心分離(3,000 rpm, 10分間)して得た血漿を利用してプロトロムビン時間(Quick法)で測定した。その結果は下記の通りである。
【００９８】
投与終了時:
カルシトリオールとアレンドロネイトを複合投与終了時に、雌雄両方の薬物投与群で薬物投与に起因した特記するほどの変化が認められなかった。
【００９９】
回復終了時:
カルシトリオールとアレンドロネイトを複合投与後、回復終了時に雌雄両方の薬物投与群で薬物投与に起因する特記するほどの変化が認められなかった。
【０１００】
8) 血液化学的検査
血液学的検査時と同様に腹大整脈から採血してヘパリン処理血液を遠心分離(3,000rpm, 10分)して血清が得られ、GPT及びGOT(以上UV rate法, 自動分析装置, CH16; Texas International INC.), ALP(Bessey-Lowry 法)、全体コレステロール(CEH-COD-POD法)、 全体ビリルビン(アゾバビン法)、血糖(ヘキソキナーゼ PD法)、ウレア-ニトロゼン(ウレア-GL PC法)、無機隣(モリブジン酸法)及び総蛋白質(Biuret法)(以上、UV rate法, 自動分析装置(Monach :Instrumentation Laboratory))を測定した。本試験に使用した検査試薬はStanbio Laboratory, Inc.(USA, Texas)の製品を使用した。その結果は下記の通りである。
【０１０１】
投与終了時:
カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト250mg/kg及びカルシトリオール5μg/kgとアレンドロネイト50mg/kgの複合投与終了時、雄でGPT活性が少し上昇し、全ての実験群でGOT活性が高かったが、薬物投与量と用量依存性がなく、溶媒対照群でも高くなっていることからみて、採血過程において少しの溶血により上昇されたものと判断される。一方、血糖が全ての実験群の雌雄で少しの上昇があったが、用量依存性がなく、溶媒対照群でも少しの上昇があり、尿検査で尿糖が現れなかったので、糖尿病に起因したものではなく、刺激(stress)により一時的に上昇されたものと判断される。以上のように実験群と溶媒対照群で全部GOTと血糖の上昇以外には、薬物投与に関係する特記するほどの変化が認められなかった。
【０１０２】
回復終了時:
カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト250mg/kg及びカルシトリオール5μg/kgとアレンドロネイト50mg/kgの複合投与終了時に、雄でGPT活性が正常になった。しかし、全ての実験群でGOT活性が投与終了時より低下されたが、薬物投与量と用量依存性がなく、溶媒対照群でも高くなっていることからみて、採血過程で少しの上昇があり、尿検査で尿糖が現れなかったので、糖尿病に起因したものではなく、刺激(stress)により一時的に上昇されたものと判断される。以上のように投与終了時と同様に実験群と溶媒対照群で全部GOTと血糖の上昇以外には、特記するほどの変化が認められなかった。
【０１０３】
9) 剖検
死亡した動物の剖検だけではなく、全生存動物をエーテルで麻酔して致死させ目示的所見が得られ、目示的異常臓器や組織は10%中性ホルマリン液に固定した後、通常的な組織標本を製作し、ヘマトクシレンとエオシンに染色した後、組織所見が得れれた。その結果は下記の通りである。
【０１０４】
投与終了時:
カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト250mg/kgの複合投与終了時、雌雄で有意性のある脾臓肥大が観察されたが、それより低容量では有意性のある変化は観察されなかった。他の全ての臓器で薬物投与と関われたと認められる変化は現れなかった。
【０１０５】
回復終了時:
カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト50mg/kgの複合投与後、回復終了時、雌雄で有意性のある脾臓肥大が観察されたが、それより低容量では有意性のある変化は観察されなかった。他の全ての臓器で薬物投与に起因されたと認めるほどの組織所見が全く見えなかった。
【０１０６】
10) 病理学的検査
採血後、全動物を放血して致死させ、全身の諸器官の異常有無を目示的に観察してから、脳、脳下垂体、甲状腺(上皮小体を含み)、唾液線(顎下線、舌下線)、胸線、心臓、肺(気管支含み)、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、精巣、卵巣、前立腺、精嚢、子宮及び胸骨を摘出して器官重量を測定し、剖検当日絶食後、体重から体重100gに対する相対重量を算出する。また、脊髄、左骨神経、胸大動脈、器官、舌、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、膵臓、腸間膜的異常部位を摘出して燐酸緩衝10%ホルマリン液に固定し、骨及び脊髄(胸骨、大腿骨)はBouin's液に固定した後、パラピンに包埋した。主群と回復群で溶媒対照群と実験群の全器官、組織の切片をヘマトクシレンとエオシン(H & E)に染色して検鏡した。その結果、薬物投与に起因されたと認められる特記するほどの変化はなかった。
【０１０７】
上記実験例3〜4に対する結論 :
雌・雄のSD系白鼠でカルシトリオールとアレンドロネイトをそれぞれ1:10,000比率で配合した複合製剤を単回経口投与及び5週間反復経口投与による急性及び亜急性毒性試験を実施した結果は下記の通りである。
【０１０８】
これから、複合製剤の急性毒性試験(単回経口投与試験)について説明する。
雌白鼠でLD50は経口投与でカルシトリオール75.0μgとアレンドロネイト750.0mgであり、雄白鼠でLD50は経口投与でカルシトリオール77.5μg/kgとアレンドロネイト775.0mg/kgであった。
【０１０９】
カルシトリオール50μg/kgとアレンドロネイト500mg/kgを複合して単回経口投与終了時、死亡した動物がなく、胃食道刺激症状と嗜眠状態が現れた以外には、一般状態の異常はなく、体重、摂取量及び尿検査で異常が現れなかった。カルシトリオール75μg/kgとアレンドロネイト750mg/kg以上の経口投与で死亡した動物の肥大した脾臓の剖検で激しい鬱血と出血が観察されたが、他には薬物投与に起因されたと認められる特異な病変は現れなかった。
【０１１０】
これから、複合製剤の亜急性毒性試験(5週反復経口投与試験)について説明する。
反復投与終了時 :
カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト250mg/kgを複合して5週間反復経口投与終了時、死亡した動物がなく、一般状態、摂取量、眼科学的検査、聴覚検査、尿検査、血液学的検査及び血液化学的検査で異常が現れなかった。剖検で脾臓肥大以外の器官重量においても異常が現れなかったが、組織所見で局所的な肺中隔の重程度の肥厚があり、脾臓と肝臓、腎臓等に少しの鬱血があり、食道-胃の粘膜浮腫と炎症細胞浸潤があった。しかし、このような病変は低容量(カルシトリオール5μg/kgとアレンドロネイト50mg/kg 以下)の投与群と対照群でも現れたので、薬物に起因して現れたと認めるほどの特異な病変は現れなかった。その他、脳、骨・脊髄、生殖腺及び消化腺等には全く異常所見が現れなかった。
【０１１１】
回復終了時 :
カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト250mg/kgを複合して5週間反復経口投与後、2週間の回復終了時でも死亡した動物がなく、一般状態、摂取量、眼科学的検査、聴覚検査、尿検査、血液学的検査及び血液化学的検査で異常が現れなかった。剖検で脾臓肥大以外の器官重量でも異常が現れなかったが、組織所見で局所的な肺中隔の軽微な肥厚があり、脾臓と肝臓及び腎臓に軽微な鬱血があり、食道-胃の粘膜浮腫と炎症細胞浸潤があった。しかし、このような軽微な病変は低容量(カルシトリオール5μg/kgとアレンドロネイト50mg/kg以下)の投与群と対照群でも現れたので、薬物に起因して現れたと認めるほどの特異な病変は現れなかった。胃-食道の軽微な炎症は舌被類の毒性評価上可逆的傷害(reversible injury)であって、特異な問題となる変化とは思われない。その他、脳、骨・脊髄、生殖腺及び消化腺等には全く異常所見が現れなかった。
【０１１２】
従って、上記急性・亜急性試験結果を通じてみる時、カルシトリオールとアレンドロネイトを1:10,000で配合した複合製剤の単回経口投与試験でLD50がそれぞれ75μg/kg及び750mg/kg以上で低毒性薬物であり、カルシトリオール25μg/kgとアレンドロネイト250mg/kgを5週間反復経口投与しても投与終了及び回復終了時に亜急性毒性が大きく現れておらず、人体(体重60kg)に投与する場合は、これより3,000分の1(カルシトリオール0.5μgとアレンドロネイト5mg)に当たるので、安全な複合製剤と思量された。
【０１１３】
実験例5 : カルシトリオールとアレンドロネイトの複合製剤の配合変化試験
1) カルシトリオールとアレンドロネイトの混合物と賦形剤等の添加剤との混化性を検討した。カルシトリオールとアレンドロネイトの混合物(5μg : 50mg)に下記の表5及び6に示したような賦形剤を一定比率で混合した。
【０１１４】
2)ここに別途に、再度水分5%を添加した状態で40℃の温度で14日間保管した。
その後、カルシトリオールとアレンドロネイトの混合物との安全性を確認し、その結果を下記の表5及び表6に示した。この時、カルシトリオールの安定性及びアレンドロネイトの安定性をHPLCで定量して測定した。
【０１１５】
【表５】
0004875818.tif 000006
【０１１６】
【表６】
0004875818.tif 000007
【０１１７】
上記表5〜6の結果を通じてみる時、カルシトリオールとアレンドロネイトの混合物と賦形剤との混化性を検討した結果では、賦形剤としてマンニトールを、結合材としてポビドンを、滑澤剤としてステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウムを使うのが最も優れたものと現れた。抗酸化剤はブチルヒドロキシトルエンとブチルヒドロキシアニソールがカルシトリオールの安定性によくない結果を現れたが、追加実験結果、カルシトリオールの分析に影響を及ぼすものであって、実際の薬剤組成物には微量が投与されるので、問題がないものと現れた。
【０１１８】
従って、上記配合変化の実験結果に基づいて薬剤組成物に入る賦形剤としてマンニトール、結合剤としてポビドン、滑澤剤としてステアリン酸カルシウム、抗酸化剤としてブチルヒドロキシトルエンとブチルヒドロキシアニソール、吸収強化剤としてラウリル黄酸ナトリウムを選択した。
【０１１９】
製造例
本発明による代謝性骨疾患治療用薬剤組成物を使って裸錠、腸溶コーティング錠、顆粒剤、腸溶コーティング顆粒剤、カプセル剤及び腸溶コーティングカプセル剤の形で剤形化した。
【０１２０】
製造例1〜3 : 裸錠の製造
下記の表7に示した造成及び含量で裸錠を製造したことを明らかにする。
まず、カルシトリオールとエタノールの混合物にD-マンニトールを混合し、そしてエタノール、抗酸化剤及び結合剤を添加した。
【０１２１】
一方、上記カルシトリオールの顆粒を得る過程とは別に、アレンドロネイト、 マンニトール及び吸収強化剤を混合した後、ここで再度エタノール及び結合材を混合した。その後、上記カルシトリオールの混合物と上記アレンドロネイトの混合物を再混合した後、ここに崩解剤及び滑澤剤を添加して混合した後、打錠した。
【０１２２】
【表７】
0004875818.tif 000008
【０１２３】
製造例4〜6 : 腸溶コーティング錠の製造
下記の表8に示した造成及び含量で腸溶コーティング錠を製造するものの、上記製造例1〜3より得た裸錠を下記の表8に示した造成及び含量を有する腸溶コーティング溶液でコーティングすることを除いては上記製造例1〜3と同様に行った。
【０１２４】
【表８】
0004875818.tif 000009
【０１２５】
製造例7〜9 : 顆粒剤の製造
下記の表9に示した造成及び含量で顆粒剤を製造したことを明らかにする。
まず、カルシトリオールとエタノールの混合物にD-マンニトールを混合した後、ここに再度追加的にエタノール、抗酸化剤及び結合剤を混合した後、上記混合物を通常の粉砕器を使って14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕した。また、40℃の温度で乾燥させカルシトリオールの顆粒が得られた。
【０１２６】
一方、上記カルシトリオールの顆粒を得る過程とは別に、アレンドロネイト、マンにトール及び吸収強化剤を混合した後、ここに再度エタノール及び結合剤を混合した後、上記混合物を通常の粉砕器を使って14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕した。また、40℃の温度で乾燥させアレンドロネイトの顆粒が得られた。
【０１２７】
次に上記カルシトリオールの顆粒と上記アレンドロネイトの顆粒を混合した後、ここに崩解剤及び滑澤剤を添加して混合した後、打錠した。
【０１２８】
【表９】
0004875818.tif 000010
【０１２９】
製造例10〜12 : 腸溶コーティング顆粒剤の製造
下記の表10に示した造成及び含量で腸溶コーティング顆粒剤を製造するものの、上記製造例7/9より得た顆粒剤を下記の表10に示した造成及び含量を持つ腸溶コーティング溶液でコーティングすることを除いては、上記製造例7〜9と同様に行った。
【０１３０】
【表１０】
0004875818.tif 000011
【０１３１】
製造例13〜15 : カプセル剤の製造
下記の表11に示した造成及び含量でカプセル剤を製造したことを明らかにする。
まず、カルシトリオールとエタノールの混合物にD-マンニトールを混合し、そしてエタノール、抗酸化剤及び結合剤を添加した後、上記混合物を通常の粉砕器を使って14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕した。また、40℃の温度で乾燥させカルシトリオールの顆粒が得られた。
【０１３２】
一方、上記カルシトリオールの顆粒を得る過程とは別に、アレンドロネイト、マンニトール及び吸収強化剤を混合した後、ここに再度エタノール及び結合剤を混合した後、上記混合物を通常の粉砕器を使って14〜35メッシュ(mesh)サイズに粉砕した。また、40℃の温度で乾燥させアレンドロネイトの顆粒が得られた。
【０１３３】
次に上記カルシトリオールの顆粒と上記アレンドロネイトの顆粒を混合した後、ここに崩解剤及び滑澤剤を添加して混合した後、カプセル剤に充填した。
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
製造例16〜18
下記の表12に示した造成及び含量で上記製造例13〜15と同様に製造するものの、下記の表12に示した造成及び含量を持つ腸溶コーティング溶液でコーティングした後、カプセル剤に充填することを異にした。
【０１３６】
【表１２】
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【０１３７】
実験例6 : 腸溶コーティング錠剤の安定性試験
上記製造例5により製造した腸溶コーティング錠剤を加速条件(40℃, 相対湿度 75%)で2ヶ月間保管した後、錠剤の安定性を3回にかけて試験した。また、その結果を下記の表13に示した。
【０１３８】
この時、錠剤の安定性評価中で1)成状は目示で観察して評価し、2)確認試験はHPLC方法を使って測定し、3)含量カルシトリオールはHPLC方法で測定した。また、4)含量アレンドロネイトもHPLC方法で測定した。
【０１３９】
【表１３】
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【０１４０】
上記表13の結果を通じてみる際、2ヶ月間実温及び加速条件で錠剤を成状、確認含量試験を通じて安定性試験をした結果、安定なものと現れた。
【０１４１】
（発明の効果）
上述のように、本発明の組成物は、有効成分に脊椎骨折率の減少と骨密度の増加効果を有するカルシトリオール(Calcitriol)と骨吸収抑制製剤であるアレンドロネイト(Alendronate)を２つの主要活性成分として含む複合薬剤として製造され、その比率は最大の相乗的な治療効果を発揮する様に最適比率であって、更にアレンドロネイトの吸収強化剤等の添加剤を適正量を含み、本発明の薬剤組成物は、カルシトリオールを単独で使うことにより誘発される高カルシウム血症を抑制し、カルシトリオールが存在することによりアレンドロネイトの使用により誘発される骨生成妨害作用を補償し、そして服用方法の難易性と食道副作用等の問題点等による、低下したコンプライアンスを向上させることができ、それによって骨粗鬆症の発生を効果的に防ぐことができる効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  卵巣摘出後、2ヶ月間アレンドロネイトとカルシトリオールを単独投与または複合投与した後、脛骨の骨小柱状態を顕微鏡(×40)を使って観察した結果を示したものである。
【図２】  イメージ測定器を使って骨小柱面積を測定した結果を示したグラフである。
【図３】  カルシウムの濃度をテクニコン自動測定器(Technicon autoanalyzer)を使って測定した結果を示したグラフである。
【図４】  尿へのカルシウム/クレアチニンの濃度をカルシウムキット(YeongDong製薬製品)を利用して測定した結果を示したグラフである。
【図５】  オステオカルシンの濃度をRIA方法を利用したキットで測定し、その結果を示したグラフである。
【図６】  アルカラインポスタパゼ活性度をテクニコン自動測定器で測定した結果を示したグラフである。
【図７】  骨吸収の速度の指標で、尿中のコラゲン1型テロペプチド(NTx)の濃度を測定してその結果を示したグラフである。
【図８】  カルシトリオールとアレンドロネイトを経口投与した鼠の体重を2週間測定してその結果を示したグラフである。
【図９】  カルシトリオールとアレンドロネイトを経口投与した鼠の摂取量を2週間 測定してその結果を示したグラフである。
【図１０】  カルシトリオール(100μg/kg) ＋ アレンドロネイト(1000μg/kg)を経口投与した鼠の脾臓を組織所見した結果を示した顕微鏡写真(H & E×100)を示したものである。
【図１１】  カルシトリオールとアレンドロネイトを経口投与した鼠の体重を7週間測定した結果を示したグラフである。
【図１２】  カルシトリオールとアレンドロネイトを経口投与した鼠の摂取量を7週間測定してその結果を示したグラフである。
【符号の説明】
（図1〜7に対する符号の説明）
(A) : 無処理
(B) : 賦形剤処理
(C) : カルシトリオール(0.1μg/kg)
(D) : アレンドロネイト(1.0mg/kg)
(E) : 複合投与群1(カルシトリオール(0.1μg/kg) ＋ アレンドロネイト(0.5mg/kg)
(F) : 複合投与群2(カルシトリオール(0.1μg/kg) ＋ アレンドロネイト(1.0mg/kg)
(G) : 複合投与群3(カルシトリオール(0.1μg/kg) ＋ アレンドロネイト(2.0mg/kg)
（図8〜9に対する符号の説明）
1 : カルシトリオール(125μg/kg) ＋ アレンドロネイト(1250mg/kg)
2 : カルシトリオール(100μg/kg) ＋ アレンドロネイト(1000mg/kg)
3 : カルシトリオール(75μg/kg) ＋ アレンドロネイト(70mg/kg)
4 : カルシトリオール(50μg/kg) ＋ アレンドロネイト(500mg/kg)
5 : カルシトリオール(25μg/kg) ＋ アレンドロネイト(250mg/kg)
6 : カルシトリオール(5μg/kg) ＋ アレンドロネイト(50mg/kg)
7 : カルシトリオール(1μg/kg) ＋ アレンドロネイト(10mg/kg)
8 : カルシトリオール(0.2μg/kg) ＋ アレンドロネイト(2.0mg/kg)
（図11〜12に対する符号の説明）
1 : カルシトリオール(25μg/kg) ＋ アレンドロネイト(250mg/kg)
2 : カルシトリオール(5μg/kg) ＋ アレンドロネイト(50mg/kg)
3 : カルシトリオール(1μg/kg) ＋ アレンドロネイト(10mg/kg)
4 : カルシトリオール(0.2μg/kg) ＋ アレンドロネイト(2mg/kg)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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