(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１−ａ）Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質及び転写因子のＤＮＡ結合領域（以下ＢＤという）を含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに
（１−ｂ）標的タンパク質候補及び転写因子の活性化領域（以下ＡＤという）を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子で、
（２）Ｆ−ｂｏｘタンパク質が欠失した変異細胞、Ｆ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞、及びプロテアソーム変異細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を低下させた細胞を形質転換し、
（３）該形質転換細胞内で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が相互作用又は
結合すればレポーター遺伝子の発現を活性化させることにより、ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
【請求項２】
前記ＢＤがＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、前記ＡＤがＧａｌ４の活性化領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＤが大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域であり、前記ＡＤが転写因子Ｂ４２の活性化領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項１記載の方法。
【請求項４】
（１−ａ）Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質及び転写因子の活性化領域（以下ＡＤという）を含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに
（１−ｂ）標的タンパク質候補及び転写因子のＤＮＡ結合領域（以下ＢＤという）を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子で、
（２）Ｆ−ｂｏｘタンパク質が欠失した変異細胞、又はＦ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞、及びプロテアソーム変異株細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を低下させた細胞を形質転換し、
（３）該形質転換細胞内で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が相互作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性化させることにより、ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
【請求項５】
前記ＡＤがＧａｌ４の活性化領域であり、前記ＢＤがＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＤが転写因子Ｂ４２の活性化領域であり、前記ＢＤが大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項４記載の方法。
【請求項７】
標的タンパク質候補を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子が遺伝子ライブラリーである請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Ｆ−ｂｏｘタンパク質がヒトのＦ−ｂｏｘタンパク質である請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
プロテアソーム変異株細胞がプロテアソームの温度感受性変異出芽酵母細胞である請求項第１〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
（１−ａ）Ｃ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質及び転写因子のＤＮＡ結合領域（以下ＢＤという）を含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに
（１−ｂ）標的タンパク質候補及び転写因子の活性化領域（以下ＡＤという）を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子で、
（２）Ｃ−ｂｏｘタンパク質が欠失した変異細胞、Ｃ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞、及びプロテアソーム変異細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を低下させた細胞を形質転換し、
（３）該形質転換細胞内で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が相互作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性化させることにより、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
【請求項１１】
前記ＢＤがＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、前記ＡＤがＧａｌ４の活性化領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢＤが大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域であり、前記ＡＤが転写因子Ｂ４２の活性化領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
（１−ａ）Ｃ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質及び転写因子の活性化領域（以下ＡＤという）を含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに
（１−ｂ）標的タンパク質候補及び転写因子のＤＮＡ結合領域（以下ＢＤという）を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子で、
（２）Ｃ−ｂｏｘタンパク質が欠失した変異細胞、Ｃ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞、及びプロテアソーム変異株細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を低下させた細胞を形質転換し、
（３）該形質転換細胞内で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が相互作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性化させることにより、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
【請求項１４】
前記ＡＤがＧａｌ４の活性化領域であり、前記ＢＤがＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＤが転写因子Ｂ４２の活性化領域であり、前記ＢＤが大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域であり、レポーター遺伝子がＬａｃＺである請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
標的タンパク質候補を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子が遺伝子ライブラリーである請求項１０〜１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ−ｂｏｘタンパク質がヒトのＣ−ｂｏｘタンパク質である請求項１０〜１６いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
プロテアソーム変異株細胞がプロテアソームの温度感受性変異出芽酵母細胞である請求項１０〜１７いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はユビキチンリガーゼのユビキチン化の標的タンパク質を同定するための新規のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  ユビキチン／プロテアソーム系は真核生物に普遍的に存在するタンパク質分解系である。この系では、まず、（１）分解すべきタンパク質をユビキチンリガーゼが認識し、ユビキチン化するステップと、（２）ユビキチン化されたタンパク質をプロテアソームが分解するステップからなっている。この二つのステップは連続して起きているので、ユビキチン化されたタンパク質は急速に分解される。
ユビキチン化に依存した制御タンパク質の分解は、細胞機能を正常に保つために必須であると考えられている。特に、ユビキチンリガーゼの一つであるＳＣＦユビキチンリガーゼ及びＡＰＣユビキチンリガーゼは、細胞周期、発生、分化、転写制御をはじめとした様々な細胞増殖の過程を制御しており、このユビキチン化の異常は癌をはじめとした様々な疾患を引き起こす。
ＳＣＦユビキチンリガーゼ及びＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼ（Ａｎａｐｈａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒ  ｃｙｃｌｏｓｏｍｅ）の細胞機能制御の全体像を把握するため、ひいては、ユビキチン化の異常に起因する病態の原因解明及び治療法を開発するためには、ユビキチン化の標的タンパク質を同定することが不可欠である。しかし、ＳＣＦユビキチンリガーゼはタンパク質分解系の一つであるために、その標的タンパク質の半減期が極めて短いため、標的タンパク質の同定は極めて困難である。
ＳＣＦユビキチンリガーゼは、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌ１（出芽酵母ではＣｄｃ５３）、Ｓｋｐ１との結合モチーフＦ−ｂｏｘを持つＦ−ｂｏｘタンパク質、及びＲｂｘ１から構成されるユビキチンリガーゼであり、Ｆ−ＢｏｘはＳｋｐ１との結合を介してＣｕｌ１のＮ末端側に結合し、Ｒｂｘ１が触媒部位であり、Ｒｂｘ１はＣｕｌ１のＣ末端側に結合している。この中で、ユビキチン化の標的タンパク質の認識（結合）を行う役割を果たすのが、Ｆ−ｂｏｘモチーフを持つＦ−ｂｏｘタンパク質である。
Ｆ−ｂｏｘタンパク質は、Ｆ−ｂｏｘモチーフでＳＣＦユビキチンリガーゼのコアと結合する。このＦ−ｂｏｘモチーフ以外に、標的タンパク質結合領域を持ち、ここで、標的タンパク質を結合する。ゲノム解析の結果、複数のＦ−ｂｏｘタンパク質が存在することが明らかになっている。また、それぞれのＦ−ｂｏｘタンパク質が、異なる標的タンパク質と結合することが遺伝的な解析から明らかになっている。
ところで、タンパク質間相互作用を検出する方法として、いくつか知られているが、好適には、酵母２−ハイブリッド（Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）システムという手法が一般的に用いられる。
Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムは、転写因子Ｇａｌ４の活性に、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）と転写活性化ドメイン（ＡＤ）の二つが必要であることを利用した系である（非特許文献１）。
あるタンパク質Ａとタンパク質Ｂとが相互作用をするかどうかを調べるために、まず、転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとタンパク質Ａの融合タンパク質（ＤＢ−Ａ）と、転写活性化ドメインとタンパク質Ｂの融合タンパク質（ＡＤ−Ｂ）を酵母内で発現させる。ＤＢ−Ａ及びＡＤ−Ｂはそれぞれ単独では転写因子としては機能できないが、もし、ＡとＢが結合すれば、転写活性に必要なＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインの二つ持つことになるので、転写因子として機能することができる。したがって、レポーター遺伝子の発現を調べることにより、ＡとＢが結合するのかを容易に調べることができる。
この時、Ｂとして遺伝子ライブラリーを用いれば、Ａと結合する未知のタンパク質をスクリーニングできる。
同様に、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼも複数のサブユニットから構成される複合体であり、標的タンパク質は、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的蛋白質結合サブユニットと結合する。標的蛋白質結合サブユニットとしては、Ｃｄｃ２０及びＨｃｔ１が知られている。
【特許文献１】米国特許第５２８３１７３号
【非特許文献１】Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ  Ｏ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６．
【非特許文献２】Ｇｙｕｒｉｓ  Ｊ，Ｇｏｌｅｍｉｓ  ＥＡ，Ｃｈｅｒｔｋｏｖ  Ｈ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ．Ｃｄｉ１，ａ  ｈｕｍａｎ  Ｇ１  ａｎｄ  Ｓ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｈａｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｄｋ２．Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３．
【発明の開示】
本願出願は、ＳＣＦユビキチンリガーゼ又はＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼによってユビキチン化されるタンパク質をスクリーニングする実験系を開発し、これを用いてユビキチン化の標的タンパク質を同定することを課題とする。
ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と結合するので、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と結合するタンパク質として標的タンパク質を同定できる可能性がある。このような場合に、タンパク質間相互作用を検出するＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムという手法が一般的に用いられる。
しかしながら、ユビキチン経路で分解されるようなタンパク質の場合には、従来の方法では、タンパク質間相互作用を検出することが困難であった。
ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質をＡとして、Ｆ−ｂｏｘタンパク質を用いてスクリーニングし、Ｂが標的タンパク質であるとすると、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムでは、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質Ｂが結合し、レポーター遺伝子の発現がおこることが期待される。
しかし、Ｆ−ｂｏｘタンパク質は標的タンパク質と結合すると、直ちに標的タンパク質Ｂをユビキチン化し分解へと導く。その結果、レポーター遺伝子の発現を誘導するより前に、標的タンパク質Ｂが分解されてしまうので、レポーター遺伝子の発現を活性化するには至らない。その結果、見かけ上、結合してないように見えることになる。したがって、標的タンパク質を同定するためには、結合の検出前に標的タンパク質が分解されるという問題点を克服する必要がある。
また、標的タンパク質が同定されたら、この実験系を、ユビキチン化を促進あるいは抑制する薬剤のスクリーニングにも応用することができる。
従来のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、Ｆ−ｂｏｘと結合するタンパク質として、ユビキチン化の標的タンパク質を同定することは困難であり、成功例は報告されていない。
しかし、以下の方法で、標的タンパク質を安定化することにより、ユビキチン化の標的タンパク質を同定することが可能となることを見いだした。
本願発明者は、酵母ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄスクリーニング系に、（１）完全長のＦ−ｂｏｘタンパク質ではなく、Ｓｋｐ１との結合領域であると考えられているＦ−ｂｏｘモチーフを、全体あるいはＳｋｐ１と結合できなくなる程度を欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質をｂａｉｔとして用い、更に（２）標的タンパク質の分解能が低下した変異株（例えば、温度感受性変異株あるいは欠失変異株）を用いることにより、標的タンパク質を安定化でき、結果としてスクリーニングできることを見出して、本願発明をなしたものである。
（１）Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質をｂａｉｔとして用いることにより、標的タンパク質と変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質が結合してもＳＣＦユビキチンリガーゼのコアにＳｋｐ１を介して結合することがないので、ユビキチン化されず、酵母内での分解が遅れることとなる。
（２）ただし、変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質を酵母に導入したのみでは、酵母内の野生型の−Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質が結合し分解されることとなる。そこで、酵母内の当該Ｆ−ｂｏｘタンパク質を欠失させる又は条件依存的、例えば温度依存的に不活化することにより、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の存在時間を延長できたものである。
これにより、標的タンパク質をスクリーニングするための実験系を、従来の手法である酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムを改良することにより開発できたものである。
この実験手法を用いて、出芽酵母ゲノムライブラリーを用いて、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｆ−ｂｏｘタンパク質Ｃｄｃ４）の新規の標的タンパク質を２種類同定することに成功した。
また、この手法を用いて、ヒトのＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質で、カルシウム制御因子として機能するタンパク質から、そのユビキチン化に必要なヒトＦ−ｂｏｘタンパク質を同定した。
また、本発明の方法により、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２７９２１６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質としてＣｄｃ４を用いた場合の従来のｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄシステムによる標的タンパク質の検出可能性を示す図である。
図２は、ＳＣＦユビキチンリガーゼ標的タンパク質の探索のための２−ハイブリッドシステムの改良を示す図である。
図３は、ＳＣＦユビキチンリガーゼ標的タンパク質の探索のため２−ハイブリッド系の改良（Ｃｄｃ４とＳｉｃ１）、温度感受性変異株あるいは欠失変異株を用いてＦ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質をｂａｉｔとして用いる標的タンパク質のスクリーニングの可能性の検証を示す図である。
図４は、Ｃｄｃ４の結合特性を利用した非特異的な相互作用を与えるクローンの除去を示す図である。
図５は、標的タンパク質の安定化を指標とした非特異的な相互作用を与えるクローンの除去を示す図である。
図６は、本実験系で同定されたタンパク質を示す図である。
スクリーニングの手順としては、安定化された状態でのスクリーニングをし、Ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅを、（１）結合特異性及び（２）安定化を指標とする２つの異なる特異性を利用して、除去する。次に（３）蛋白質の半減期を野生株とｃｄｃ４変異株とで比較することにより、標的タンパク質であることを確認する。
図７は、プロテアソームの温度感受性変異変異（ｐｒｅ１−１株）をスクリーニングのホストとして用いることができることを示す図である。なお、この場合には、Ｃｄｃ４−ｄＦおよびＣｄｃ４を用いることもできる。図７ではＣｄｃ４を用いた場合について示した。また、Ｃｄｃ４とは異なるＦ−ｂｏｘタンパク質Ｇｒｒ１とその標的タンパク質Ｃｌｎ２の結合も、この方法で検出することに成功した。言いかえれば、他のＦ−ｂｏｘにも適用できる。
図８は、ＡＰＣ／Ｃの標的タンパク質の同定のための方法論を示す図である。Ｃｌｂ２が安定化される条件ではＨｃｔ１とＣｌｂ２の結合を検出できることを示している。
なお、ＡＰＣ／Ｃとの結合領域であるＣ−ｂｏｘを除去したＨｃｔ１−ｄＣをｂａｉｔとして用いている
図９は、本実験系で同定されたタンパク質を示す図である。
図１０は、ＳＣＦおよびＡＰＣ／Ｃの模式図を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のユビキチンリガーゼ標的タンパク質スクリーニング方法は、例えば、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍであれば、種々のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍを基礎として、改良した系を利用することができる。Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍとしては、酵母、原核生物、哺乳細胞を用いる系が知られている。
本発明のユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法には、
（１）標的タンパク質の分解能が低下した細胞を、
（２−ａ）ユビキチンリガーゼを構成するサブユニットのうち標的タンパク質と結合するサブユニット又は変異型の該結合サブユニット及第１の領域を含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子、並びに
（２−ｂ）標的タンパク質候補及び第２の領域を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子、で形質転換して得られる
（３）第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が結合すれば第３の遺伝子の発現を活性又は抑制することができる形質転換細胞用いて、ユビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法が含まれる。
ここで、ユビキチンリガーゼとしては、ＳＣＦユビキチンリガーゼ及びＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼなどが挙げられる。
また、第１の融合タンパク質中の第１の領域及び第２の融合タンパク質中の第２の領域の組み合わせとしては、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が細胞内で結合するか否かを検出する既知の方法（以下既知のｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質相互作用検出方法という）において用いられる組み合わせを用いることができ、例えば、（イ）転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写因子の活性化領域、具体的には、（ロ）転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域及び転写因子Ｇａｌ４の活性化領域、（ハ）大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域と転写因子Ｂ４２の活性化領域（ニ）Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域及びＶ１６の活性化領域、が挙げられ、更に、（ホ）転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写因子の抑制化領域、（ヘ）Ｎ−ｉｎｔｅｉｎ及びＣ−ｉｎｔｅｉｎ、（ト）ＳＯＳタンパク質及びＭｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ、並びに（チ）カルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ２５フラグメント及びカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ１７フラグメント、が挙げられる。
より具体的には、本発明の方法は、例えば、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が細胞内で相互作用、言い換えれば結合又は会合することにより第３の遺伝子の発現を活性化又は抑制させ、該第３の遺伝子の活性化また抑制を検出することにより、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が細胞内で結合するか否かを検出する既知の方法において、（１−ａ）前記第１の融合タンパク質は、Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質Ａ及び転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（以下ＤＢと記載）を含む融合タンパク質であり、及び（１−ｂ）前記第２の融合タンパク質は、Ｆ−ｂｏｘの標的タンパク質Ｂと転写因子の活性化ドメイン（以下ＡＤと記載）との融合タンパク質であり、（ｃ）前記細胞は、標的タンパク質の分解が低下した細胞であって、該細胞内で、第１の融合タンパク質のＡ領域と第２の融合タンパク質のＢ領域が結合することにより第３の遺伝子の発現を活性又は抑制することができる細胞であり、該細胞を用いてＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質同定する方法を包含している。
Ｉ．上記の既知ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質相互作用検出方法としては、例えば以下の方法が含まれる。
（イ）転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域と活性化領域を用いるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法：第１の融合タンパク質遺伝子のＢＤ領域が転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、第２の融合タンパク質のＡＤ領域が転写因子Ｇａｌ４の活性化領域であり、第３の遺伝子がレポーター遺伝子であり、当該転写因子が欠損したＧＡＬ４（−）株出芽酵母酵母を用いる方法。具体的には、ＤＮＡ結合領域がＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、前記活性化領域がＧａｌ４の活性化領域であり、変異株細胞が、ＧＡＬ４（−）株出芽酵母である方法。（米国特許第５２８３１７３号、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ  Ｏ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６参照。）
（ロ）大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域と転写因子Ｂ４２の活性化領域を用いるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法：第１の融合タンパク質遺伝子のＢＤ領域が大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域であり、第２の融合タンパク質のＡＤ領域が転写因子Ｂ４２の活性化領域であり、第３の遺伝子がレポーター遺伝子であり、特に転写因子を欠損しない出芽酵母酵母を用いる方法。（ＯｒｉＧｅｎｅ社ＤｕｐＬＥＸ−Ａ  Ｙｅａｓｔ  ２−ハイブリッドシステムキット）
（ハ）哺乳類細胞ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法：第１の融合タンパク質遺伝子のＢＤ領域がＧａｌ４のＤＮＡ結合領域であり、第２の融合タンパク質のＡＤ領域がＶ１６の活性化領域、第３の遺伝子がレポーター遺伝子であり、哺乳動物細胞ＨｅＬａである方法。（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ哺乳類細胞２−ハイブリッドアッセイキット）
（ニ）転写因子抑制：第１の融合タンパク質遺伝子の第１の領域が転写因子のＤＮＡ結合領域であり、第２の融合タンパク質の第２の領域が転写因子の抑制化領域である方法。（米国特許第５８８５７７９号参照。）
（ホ）タンパク質トランスプライシングｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ法：第１の融合タンパク質遺伝子の第１の領域に相当する領域がＮ−ｉｎｔｅｉｎであり、第２の融合タンパク質の第２の領域がＣ−ｉｎｔｅｉｎである方法。（米国特許第６５６２５７６号参照。）
（ヘ）ＣｙｔｏＴｒａｐ（ＴＭ）法：前記第１の融合タンパク質遺伝子の第１の領域に相当する領域がＳＯＳタンパク質であり、第２の融合タンパク質の第２の領域がＭｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌで、変異株細胞が、ｃｄｃ２５Ｈ株である方法。
（ト）酵素分子の２領域を用いる方法：第１の融合タンパク質のＢＤ領域に相当する領域が酵素の第１の領域（又はフラグメント）あり、第２の融合タンパク質のＡＤ領域に相当する領域領域が酵素の第２の領域（フラグメント）である、具体的には、前記酵素の第１の領域がカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ２５フラグメントであり、前記酵素の第２の領域がカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ１７フラグメントであり、前記変異株がカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼ欠損株細菌である方法。（ＰＲＯＮＡＳ  ９５：５７５２−５７５６）
以下、ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的蛋白質同定法を中心に説明するが、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的蛋白質を同定する方法も、Ｆ−Ｂｏｘ蛋白質に代えて、Ｃ−Ｂｏｘ蛋白質（たとえば、Ｈｃｔ１，Ｃｄｃ２０）を用いて同様に行うことができる。（図１０参照。）Ｃ−ｂｏｘタンパク質は、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼと結合するのに必要なＣ−ｂｏｘモチーフを持つタンパク質で、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼによるユビキチン化において、標的タンパク質を結合するタンパク質である。
ＩＩ．第１の融合タンパク質をコードする遺伝子
第１の融合タンパク質は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質又は変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質及第１の領域を含んでいる。
ＩＩ−１．Ｆ−ｂｏｘタンパク質
Ｆ−ｂｏｘタンパク質としては、ＳＣＦユビキチンリガーゼを構成するＦ−ｂｏｘタンパク質であれば、いずれのタンパク質であっても本願発明に用いることができる。具体的には、酵母であれば、ＳＣＦユビキチンリガーゼのサブユニットとして機能することが知られているものは、Ｃｄｃ４、Ｍｅｔ３０、Ｇｒｒ１、ＹＪＬ２０４Ｃ、ＹＪＬ１４９Ｗ、ＹＬＲ０９７Ｃ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＹＬＲ３６８Ｗ、ＹＭＬ０８８Ｗ、ＹＤＲ１３１Ｃ、ＹＤＲ３０６Ｃ、ＹＮＬ３１１Ｃ、ＹＯＲ０８０Ｗ、Ｃｔｆ１３である。（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５４：４５５−４６７）。ヒトであれば、７０種以上知られている。
ＩＩ−２．Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質をコードする変異型Ｆ−ｂｏｘ遺伝子：
Ｆ−ｂｏｘモチーフとしては、例えば、アミノ酸１文字表記で表すと、（ＬＩ）ＸＸ（ＬＶ）ＰＸＥ（ＩＬＶ）ＬＸＸ（ＩＶ）ＬＸＸＬＤＸＸＤＬＬＤＬＤＤＶＣＫＲＷＸＸ（ＬＩＶ）ＩＸＸＸＸ（ＬＶ）ＸＸＸＬと言う配列で表されるＦ−ｂｏｘモチーフが挙げられる（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１４：２３６−２４３（１９９８）。Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質とは、上記Ｆ−Ｂｏｘタンパク質において、前記モチーフをすべて欠失させた変異、又はＳｋｐ１と結合できなくなる程度、前記Ｆ−ｂｏｘモチーフのアミノ酸配列において１以上アミノ酸が、好ましくは１ないし数個のアミノ酸が、欠失、付加又は置換から選ばれる少なくとも１以上の変異したさせた変異型Ｆ−Ｂｏｘタンパク質があげられる（以下Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質と記載する）。
なお、（  ）内はアミノ酸配列中の同じ位置を意味する。また、アミノ酸一文字表記では、Ｌはロイシン、Ｉはイソロイシン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｋはリジン、Ｒはアルギニン、Ｗはトリプトファンを意味する。Ｘは任意のアミノ酸を意味する。ただし、指定されたアミノ酸と必ずしも同一である必要はない。
なお、ここで必要な変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質については、Ｓｋｐ１と結合できないことが必要である。したがって、Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質だけでなく、Ｓｋｐ１と結合できなくなった変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質でも有効であることはいうまでもない。
ＩＩ−３．第１の融合タンパク質は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質又はＦ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質及び上記第１の領域から構成される。
ここで、第１の融合タンパク質はＦ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質を含むことが好ましいが、特に、スクリーニングに使用する細胞が、Ｆ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の変異株を用いる場合には、Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質を使用することが必須である。
また、第１の領域としては、上記したように、（イ）転写因子のＤＮＡ結合領域又は転写因子の活性化領域、具体的には、（ロ）転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域若しくは転写因子Ｇａｌ４の活性化領域、（ハ）大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域若しくは転写因子Ｂ４２の活性化領域、（ニ）Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域若しくはＶ１６の活性化領域、が挙げられ、更に、（ホ）転写因子のＤＮＡ結合領域若しくは転写因子の抑制化領域、（ヘ）Ｎ−ｉｎｔｅｉｎ若しくはＣ−ｉｎｔｅｉｎ、（ト）ＳＯＳタンパク質若しくはＭｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ、並びに（チ）カルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ２５フラグメント若しくはカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ１７フラグメント、が挙げられる。
ＩＩＩ．第２の融合タンパク質をコードする遺伝子
第２の融合タンパク質は、標的タンパク質候補及び第２の領域を含む。
ＩＩＩ−１．標的タンパク質及び標的タンパク質候補
あるＦ−ｂｏｘを構成成分とするＳＣＦユビキチンリガーゼによりユビキチン化される標的タンパク質としての候補がすでにある場合は、当該候補を用いることができる。
また、標的タンパク質候補をコードする遺伝子としては、ゲノムライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
ＩＩＩ−２．第２の融合タンパク質の第２の領域としては、上記した第２の領域が挙げられる。例えば、（イ）転写因子のＤＮＡ結合領域又は転写因子の活性化領域、具体的には、（ロ）転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域若しくは転写因子Ｇａｌ４の活性化領域、（ハ）大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域若しくは転写因子Ｂ４２の活性化領域、（ニ）Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域若しくはＶ１６の活性化領域、が挙げられ、更に、（ホ）転写因子のＤＮＡ結合領域若しくは転写因子の抑制化領域、（ヘ）Ｎ−ｉｎｔｅｉｎ若しくはＣ−ｉｎｔｅｉｎ、（ト）ＳＯＳタンパク質若しくはＭｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ、並びに（チ）カルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ２５フラグメント若しくはカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼのＴ１７フラグメント、で、それぞれの場合に第１の領域でないものが挙げられる。それぞれの場合に第１の領域とは異なるものとは、上記（イ）についていえば、第１の領域として「転写因子のＤＮＡ結合領域」を採用した場合には、第２の領域は「転写因子の活性化領域」となり、逆に、第１の領域として「転写因子の活性化領域」を採用した場合には、第２の領域は「転写因子のＤＮＡ結合領域」となる。（ロ）から（チ）についても同様である。
ＩＶ．標的タンパク質の分解が低下した細胞
標的タンパク質がＦ−ｂｏｘタンパク質と結合しても、（１）ユビキチン化されない又は（２）ユビキチン化されてもタンパク質分解を受けないように変異された細胞があげられる。
（１）細胞内の内在性のＦ−ｂｏｘタンパク質により標的タンパク質がユビキチン化されないようにする。
（イ）Ｆ−ｂｏｘタンパク質の中で必須遺伝子でなければ、細胞から欠失させることにより、若しくは必須の遺伝子であれば、Ｆ−ｂｏｘタンパク質の発現を温度感受性にする変異を起こさせることにより調製できる。
Ｆ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の中で必須遺伝子であるものはＣＤＣ４、ＭＥＴ３０、ＣＴＦ１３の３種類である。これらの必須遺伝子の温度感受性変異株は、分離した研究者より分与を受けるか、あるいは、Ｋａｎｅｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３（２９９３）７２０−７２４の方法で温度感受性株を作製することが可能である。
また、それ以外のＦ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の場合には、これらの遺伝子の欠失変異株を用いることができる。この欠失変異株は、例えば、Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ１４，９５３−９６１（１９９８）に記載される方法など、常法で調整することができる。あるいは、ＯＰＥＮ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ社、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから購入することが可能である。
（ロ）ＳＣＦユビキチンリガーゼを構成するＦ−ｂｏｘタンパク質遺伝子以外の遺伝子の温度感受性変異株（例えば、ｃｄｃ３４株、ｃｄｃ５３株、ｓｋｐ１株）を用いることも可能である。これらの変異株では標的タンパク質のユビキチン化活性が著しく低下する。これらの必須遺伝子の温度感受性変異株は、上記と同様に、分離した研究者より分与を受けるか、あるいは、Ｋａｎｅｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３（２９９３）７２０−７２４の方法で温度感受性株を作製することが可能である。
（２）ユビキチン化されても、タンパク質分解を受けないように、タンパク質分解能が低下した変異株、又はタンパク質分解阻害剤を与えられた細胞を用いることができる。具体的には、プロテアソームの変異株、あるいはタンパク質分解阻害剤ＭＧ１３２（ＳＩＧＭＡなどから購入可能）を用いる。
Ｖ．以下にＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法として、大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域と転写因子Ｂ４２の活性化領域を用いるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法に基づいてまず説明するが、本発明は、これに限られるものではない。
Ｖ−１．出芽酵母スクリーニング系による出芽酵母ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定
１−１．Ｆ−ｂｏｘ変異株酵母の調製
出芽酵母にはＦ−ｂｏｘタンパク質が１７種類存在する事が知られている。このうち、ＳＣＦユビキチンリガーゼのサブユニットとして機能することが知られているものは、Ｃｄｃ４、Ｍｅｔ３０、Ｇｒｒ１、ＹＪＬ２０４Ｃ、ＹＪＬ１４９Ｗ、ＹＬＲ０９７Ｃ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＬＲ３６８Ｗ、ＹＭＬ０８８Ｗ、ＹＤＲ１３１Ｃ、ＹＤＲ３０６Ｃ、ＹＮＬ３１１Ｃ、ＹＯＲ０８０Ｗ、Ｃｔｆ１３である。（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５４：４５５−４６７）。
まず、これらのＦ−Ｂｏｘの変異株については以下の方法で作製することが可能である。
上記Ｆ−ｂｏｘタンパク質の中で必須遺伝子であるものはＣｄｃ４、Ｍｅｔ３０、Ｃｔｆ１３の３種類である。これらの必須遺伝子の温度感受性変異株は、分離した研究者より分与を受けるか、あるいは、Ｋａｎｅｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３（２９９３）７２０−７２４の方法で温度感受性株を作製することが可能である。
また、それ以外のＦ−ｂｏｘ遺伝子の場合には、これらの遺伝子の欠失変異株を用いることができる。この欠失変異株は、例えば、Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ１４，９５３−９６１（１９９８）に記載される方法など、常法で調整することができる。あるいは、ＯＰＥＮ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ社、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから購入することが可能である。
１−２．Ｆ−ｂｏｘモチーフに変異を導入した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質をコードする遺伝子
Ｆ−ｂｏｘモチーフに変異を導入した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質に関しては、例えば、Ｆ−ｂｏｘモチーフに相当する部分の遺伝子領域内を、遺伝子組み換え技術により欠失させればよい。具体的には、Ｆ−ｂｏｘモチーフである「（ＬＩ）ＸＸ（ＬＶ）ＰＸＥ（ＩＬＶ）ＬＸＸ（ＩＶ）ＬＸＸＬＤＸＸＤＬＬＤＬＤＤＶＣＫＲＷＸＸ（ＬＩＶ）ＩＸＸＸＸ（ＬＶ）ＸＸＸＬ」の配列を欠失させた配列、具体的には、出芽酵母のＦ−ｂｏｘタンパク質の一つであるＣｄｃ４の場合では、配列番号１の配列において２８２アミノ酸残基から３２０アミノ酸残基までを欠失させた配列を用いることができる。あるいは、Ｓｋｐ１と結合できなくなった変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質が知られている場合にはこの変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質を用いることもできる。
（１−１）と（１−２）を組み合わせてスクリーニングを行えば、Ｃｄｃ４の標的タンパク質の場合と同様に、それぞれのＦ−ｂｏｘが結合する標的タンパク質を同定することが可能である。
１−３．酵母ライブラリーの調製
出芽酵母のゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＪＧ４−５等の発現ベクターにクローン化して調製することができる。
１−４．酵母ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄハイブリッド系の調製
１−４−１．第１の融合蛋白質・Ｂａｉｔの調製
ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインを組み込んだ発現ベクターに変異型Ｆ−ｂｏｘ遺伝子を組み替えＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインと変異型Ｆ−ｂｏｘを融合させたタンパク質を発現することができるベクターを調製する。発現ベクターとしては、例えば、ｐＧｉｌｄａなどを用いることができる。
１−４−２．第２の融合タンパク質・ライブラリーの調製
Ｂ４２の転写活性化ドメインを組み込んだ発現ベクターに酵母遺伝子ライブラリー中の遺伝子を組み替えＢ４２の転写活性化ドメインと種種の試験対象タンパク質を融合させたタンパク質を発現することができるベクターライブラリーを調製する。発現ベクターとしては、ｐＪＧ４−５などを用いることができる。
１−４−３．ｂａｉｔとベクターライブラリーの酵母変異株への導入
Ｆ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の変異株に、ｂａｉｔとベクターライブラリー及びレポーター遺伝子を導入する。周知の酵母へのベクター導入方法を利用することができるが、例えば、Ｇｉｅｔｚ  ＲＤ，ＳｃｈｉｅｓｔｌＲＨ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：２５５−２６９（１９９５）に記載の方法を用いることができる。
１−５．標的タンパク質の同定
陽性株のスクリーニング工程とｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅを排除する工程からなる。
１−５−１．スクリーニング
Ｆ−ｂｏｘ欠失変異株をバイトとライブラリーで形質転換し、得られた菌株をコロニー形成させる。Ｘ−ｇａｌの含まれる合成培地を用いてレポーター遺伝子ＬａｃＺを発現させ、その結果、青くなったコロニーをピックアップする。
１−５−２．選抜されたプラスミドの精製
常法に従って、プラスミドを分離し大腸菌ＫＣ８株を形質転換し、出てきたコロニーからプラスミドを抽出精製する。
１−５−３．再現性の確認
必要に応じ再現性を確認する。得られたクローンを再びｂａｉｔ、レポーター遺伝子とともにＦ−ｂｏｘ変異株に導入し、同様の要領でフィルターアッセイを行う。再現性のないものは排除する。
１−５−４．擬陽性の排除
更に必要に応じ、擬陽性を次のように排除することができる。
Ｆ−ｂｏｘタンパク質はＦ−ｂｏｘモチーフ以外にＷＤ（トリプトファンーアスパラギン酸）４０リピートあるいはＬＲＲ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ）などの、標的タンパク質を結合するモチーフを持っている。例えば、Ｃｄｃ４の場合にはＷＤ４０を持つ。また、別のＦ−ｂｏｘタンパク質Ｍｅｔ３０もＣｄｃ４と類似のＷＤ４０を持つが、Ｃｄｃ４とＭｅｔ３０は別の標的タンパク質の結合に関与する。そこで、Ｃｄｃ４のＷＤとＭｅｔ３０のＷＤを置き換えたキメラ分子Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０−ＷＤをｐＧｉｌｄａにクローン化する（ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０−ＷＤ）。Ｃｄｃ４の標的タンパク質をスクリーニングする場合では、ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦのかわりにｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０−ＷＤを導入した上記Ｆ−ｂｏｘ欠失変異株酵母に、（１）で分離したプラスミドを導入し、フィルターアッセイを行い、青くならないものを選択する。
Ｍｅｔ３０以外のＦ−ｂｏｘタンパク質の標的タンパク質結合領域を用いることが可能であることはいうまでもない。
Ｃｄｃ４以外のＦ−ｂｏｘタンパク質の場合には、該Ｆ−ｂｏｘタンパク質の標的タンパク質結合領域がＷＤ４０の場合には、該Ｆ−ｂｏｘタンパク質以外のＦ−ｂｏｘタンパク質で標的タンパク質結合領域がＷＤ４０であるＦ−ｂｏｘタンパク質のＷＤ４０を用いることができる。また、該Ｆ−ｂｏｘタンパク質の標的タンパク質結合領域がＬＲＲの場合には、該Ｆ−ｂｏｘタンパク質以外のＦ−ｂｏｘタンパク質で標的タンパク質結合領域がＬＲＲであるＦ−ｂｏｘタンパク質のＬＲＲを用いることができる。
１−５−５．標的タンパク質の塩基配列
ｐｏｓｉｔｉｖｅなシグナルを出すクローンを標的タンパク質をコードするクローンとして同定し、塩基配列を決定する。
１−６．ユビキチン化及びタンパク質分解の確認
同定された標的タンパク質が、実際にユビキチン化され、分解されているかどうかについても、必要に応じ検定することができる。
１−６−１．ユビキチン化による標的タンパク質の分解の確認（１）
決定された標的タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンから終止コドンの直前までをＰＣＲ法により増幅する。増幅したＤＮＡ断片とＬａｃＺ遺伝子とを融合する。できたプラスミドをＦ−ｂｏｘ変異株、及び野生株に導入する。もし該タンパク質が特定のＦ−ｂｏｘに依存してユビキチン化／分解されるのであれば、該タンパク質とＬａｃＺの融合タンパク質も、野生株では分解されるが、Ｆ−ｂｏｘ変異株では安定化される。そこで、コロニーをＸ−ｇａｌ含有合成培地でフィルターアッセイを行い、陽性（青色）クローンを残す。
１−６−２．ユビキチン化による標的タンパク質の分解の確認（２）
同定された標的タンパク質が本当にＳＣＦユビキチンリガーゼに依存して分解されるのかをタンパク質レベルで半減期を比較することにより調べることができる。
タンパク質量については、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行うことにより調べる。用いる抗体としては、すでに標的タンパク質の候補タンパク質の抗体がある場合には、その抗体を用いてタンパク質を検出する。もし、抗体がない場合には、組み換えＤＮＡの技術を用いて、短いアミノ酸配列（エピトープタグ）を標的タンパク質の候補タンパク質と融合し、エピトープ特異的抗体を用いて融合タンパク質を検出する。エピトープタグとしては、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来の９アミノ酸からなるペプチド（以下ＨＡと記載）、あるいは、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質由来の９Ｅ１０エピトープなどを用いる。ここでは、エピトープ特異的抗体を用いる場合を例にして説明する。
標的タンパク質とエピトープの融合タンパク質を、出芽酵母野生株及び出芽酵母Ｆ−ｂｏｘタンパク質遺伝子の変異株で発現させる。ここで、タンパク質合成阻害剤ｃｙｃｈｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡから購入）を終濃度５０μｇ／ｍｌ加えることにより、融合タンパク質の発現を停止させ、その直後から例えば１５分間隔で細胞を回収し、タンパク質抽出液を作製する。タンパク質抽出液の作製は、例えば、Ｙｅｏｎｇ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５０１−５１１（２０００）に記載の方法などを用いる。次に、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、エピトープ特異的抗体を用いて融合タンパク質の量を調べる。もし、調べているタンパク質が標的タンパク質ならば、野生株では不安定であり半減期が短いが、変異株では安定化され半減期が長くなるはずである。この条件を満たすものを標的タンパク質として再確認できる。
Ｖ−２．出芽酵母スクリーニング系によるヒトＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定
酵母の場合と同様に、ヒトなど哺乳類のＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定することができる。
今のところ、酵母のＦ−ｂｏｘタンパク質とヒトのＦ−ｂｏｘタンパク質とで、機能的な対応についてわかっていない。そこで、標的タンパク質の分解が低下した変異細胞として、ＳＣＦユビキチンリガーゼを構成するＦ−ｂｏｘタンパク質遺伝子以外の遺伝子の温度感受性変異株（例えば、ｃｄｃ３４株、ｃｄｃ５３株、ｓｋｐ１株）を用いることができる。あるいは、ユビキチン化されたタンパク質の分解を行うプロテアソームの変異株（温度感受性ｐｒｅ１−１変異株）を用いること、あるいは、タンパク質分解阻害剤であるプロテアソームインヒビター例えばＭＧ１３２（ＳＩＧＭＡから購入可能）などで処理した細胞を用いることができる。プロテアソームの阻害剤ＭＧ１３２（ＳＩＧＭＡ）を用いる場合には、さらに、ｅｒｇ６変異株（膜脂質合成酵素の変異株で、プロテアソームの阻害剤ＭＧ１３２を含む薬剤の膜透過活性があがった変異株）を用いることができる。
第１の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、ヒトＦ−ｂｏｘタンパク質あるいはＦ−ｂｏｘモチーフを欠失したヒトＦ−ｂｏｘタンパク質及び第１の領域からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
第２の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、ヒト標的タンパク質の候補及び第２の領域からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
Ｖ−３．出芽酵母スクリーニング系によるＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定
ＳＣＦユビキチンリガーゼの場合と同様に、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定することができる。
標的タンパク質の分解が低下した変異として、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼを構成するサブユニットの遺伝子の温度感受性変異株あるいは欠失変異株を用いることができる。あるいは、ユビキチン化されたタンパク質の分解を行うプロテアソームの変異株（例えば温度感受性ｐｒｅ１−１変異株など）を用いること、あるいは、プロテアソームインヒビター例えばＭＧ１３２（ＳＩＧＭＡから購入可能）などで処理した細胞を用いることができる。
プロテアソームの阻害剤ＭＧ１３２（ＳＩＧＭＡ）を用いる場合には、さらに、ｅｒｇ６変異株（膜脂質合成酵素の変異株で、プロテアソームの阻害剤ＭＧ１３２を含む薬剤の膜透過活性があがった変異株）を用いることができる。
第１の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、Ｃ−ＢｏｘとしてＣｄｃ２０又はＨｃｔ１（あるいはこれらのヒトホモログ）若しくはこれらの変異体及び第１の領域からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。上記変異体としては、Ｃ−Ｂｏｘモチーフを欠失した遺伝子、たとえば、Ｈｃｔ１のＣ−ｂｏｘモチーフを含む領域を欠損させた変異体を用いることができる。
Ｃ−ｂｏｘモチーフとしては、例えば、アミノ酸１文字表記で表すと、ＤＲ（Ｆ／Ｙ）ＩＰＸＲと言う配列で表されるＣ−ｂｏｘモチーフが挙げられる（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１８，ｐｐ．５１６５−５１７５）。Ｃ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質とは、上記Ｃ−Ｂｏｘタンパク質において、前記モチーフをすべて欠失させた変異、又はＡＰＣ／Ｃと結合できなくなる程度、前記Ｃ−ｂｏｘモチーフのアミノ酸配列において１以上アミノ酸が、好ましくは１ないし数個のアミノ酸が、欠失、付加又は置換から選ばれる少なくとも１以上の変異したさせた変異型Ｃ−Ｂｏｘタンパク質があげられる（以下Ｃ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質と記載する）。
なお、ここで必要な変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質については、ＡＰＣ／Ｃと結合できないことが必要である。したがって、Ｃ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質だけでなく、ＡＰＣ／Ｃと結合できなくなった変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質でも有効であることはいうまでもない。
第２の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、標的タンパク質候補及び第２の領域からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
ＶＩ．その他のスクリーニング系を利用したＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定方法
ＶＩ−１．ＳＯＳ／Ｒａｓシステム
ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムにおいて、ｂａｉｔ（餌）タンパク質はヒトＳＯＳタンパク質との融合タンパク質として、標的タンパク質はミリスチル化シグナルとの融合タンパク質としてｃｄｃ２５Ｈ変異株酵母内で発現させるシステムで、ｂａｉｔタンパク質と標的タンパク質が結合した場合に、ＳＯＳタンパク質が膜状にあるＲａｓを活性化し、３７度での生存ができるというものである。
本システムにおいても、ｃｄｃ２５Ｈ変異株酵母にさらに、常法によりＦ−ｂｏｘ変異させたＦ−ｂｏｘ／ｃｄｃ２５Ｈ変異株酵母を調製し、これに、Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失させたＦ−ｂｏｘタンパク質を融合したヒトＳＯＳタンパク質と、標的タンパク質を含むライブラリーと融合したミリスチル化シグナルとの融合タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することにより、標的タンパク質をスクリーニングすることができる。
ＶＩ−２．ほ乳類Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法を利用する方法
ほ乳類Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法を利用する。
ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムにおいて、ｂａｉｔ（餌）タンパク質は酵母Ｇａｌ４のＤＢとの融合タンパク質として、標的タンパク質はＶ１６のＡＤとの融合タンパク質としてＨｅＬａ細胞で発現させるシステムで、ｂａｉｔタンパク質と標的タンパク質が結合した場合に、レポーター遺伝子ＳＥＡＰの発現が観察されるというものである。
本システムにおいても、Ｇａｌ４のＤＢとＦ−ｂｏｘモチーフを欠失させたＦ−ｂｏｘタンパク質を融合したタンパク質と、標的タンパク質を含むライブラリーと融合したＶ１６のＡＤとの融合タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することにより、標的タンパク質をスクリーニングすることができる。この場合、ヒトなど哺乳類のＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定に用いることが可能である。
今のところ、酵母のＦ−ｂｏｘタンパク質とヒトのＦ−ｂｏｘタンパク質とで、機能的な対応についてわかっていない。そこで、細胞の、標的タンパク質の分解能を低下させる手段として、プロテアソームインヒビターを用いることができる。あるいは、ｓｉＲＮＡの手法を用いて、ＳＣＦユビキチンリガーゼあるいはプロテアソームの活性を低下させた細胞を用いることも可能である（例えばＷａｔａｎａｂｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：４４１９−４４２４（２００４））。
このほ乳類Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法を利用する方法は、例えばＶ−２の酵母を用いたヒト標的タンパク質スクリーニングにおいて明らかにした標的タンパク質と、当該ヒトＦ−ｂｏｘタンパク質の結合を、ヒトＨｅＬａ細胞で検証することにも用いることができる。
あるいは、ヒトＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることがわかっているが、それに対応するＦ−ｂｏｘタンパク質が明らかでない場合にも用いることができる。この場合、ヒトＦ−ｂｏｘタンパク質遺伝子のライブラリーとＧａｌ４のＤＢとの融合タンパク質遺伝子、及び標的タンパク質とＶ１６のＡＤとの融合タンパク質をコードする遺伝子でＨｅＬａ細胞を形質転換し、プロテアソームインヒビターの存在化でレポーター遺伝子ＳＥＡＰの発現を調べることができる。もちろん、ヒトＦ−ｂｏｘタンパク質遺伝子のライブラリーとＶ１６のＡＤとの融合タンパク質遺伝子、及び、標的タンパク質とＧａｌ４のＤＢとの融合タンパク質をコードする遺伝子を用いても同様に実験できることはいうまでもない。
ＳＣＦユビキチンリガーゼの場合と同様に、ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定することができる。
以下に実施例を用いて、より具体的に本願発明を説明するが、本願発明が実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。
【実施例】  以下の実施例、参考例で使用した出芽酵母菌株は次のとおりである。
野生株  Ｗ３０３株（ＡＴＣＣ２００９０３など）
ＴＫ−５０５（Ｍａｔ  ａ  ｃｄｃ４−１  ｓｉｃ１）
ｃｄｃ４−１株はＡＴＣＣ（２００６２５、２０８５４３、２０８５４４）から購入することが可能である。また必要に応じて野生株と掛け合わせて使用する。
ｓｉｃ１変異は、Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ１４，９５３−９６１（１９９８）の方法で導入した。
なお、このスクリーニングにおいては、ｓｉｃ１変異が導入されている必要は全くない。
ＴＫ−５４２（Ｍａｔ  ａ  ｈｃｔ１）
ｈｃｔ１変異は、Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ１４，９５３−９６１（１９９８）の方法でＷ３０３株に導入した。
以下の実施例、参考例で使用するプラスミドは次のとおりである。
ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４：市販されているｐＧｉｌｄａ（ＯｒｉＧｅｎｅ社）にＣＤＣ４全長をＰＣＲで増幅後にＢａｍＨＩＳａｌＩで切断後クローン化した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは、ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣとＣＧＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＣを用いた。
ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ：Ｆ−ｂｏｘモチーフ（ＣＤＣ４のアミノ酸残基２８１−３２０）を欠失したＣｄｃ４−ｄＦを、ｐＧｉｌｄａにクローン化した。具体的には、ＰＣＲでＣＤＣ４のアミノ酸残基１−２８１を増幅後、ＢａｍＨＩ  ＥｃｏＲＩで切断した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは、ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣとＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＣを用いた。また、ＣＤＣ４のアミノ酸残基３２１番からＣ末端までをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した後、ＥｃｏＲＩ  ＳａｌＩで切断した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは、ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＣＣとＣＧＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴを用いた。これら二つのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ  ＳａｌＩで切断したｐＧｉｌｄａにクローン化した。
ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０ＷＤ：Ｃｄｃ４の１−２８１番のアミノ酸残基までと、Ｍｅｔ３０の２２８番からＣ末端までを融合して作製したＣｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０ＷＤをｐＧｉｌｄａにクローン化した。Ｃｄｃ４の１−２８１番のアミノ酸残基までをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは、ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣとＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＣＣを用いた。また、Ｍｅｔ３０の２２８番からＣ末端までをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲで増幅した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは，ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＧＡＣＡＧとＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＣＡＴＴＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＴＧを用いた。
ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１：ＰＣＲで増幅した出芽酵母ＳＩＣ１全長をｐＪＧ４−５にＥｃｏＲＩ  ＮｏｔＩで切断後クローン化した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは，ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＡとＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＴＴを用いた。
出芽酵母ライブラリー：出芽酵母の全ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を含むライブラリー（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１１４３−１１４７（２００１））のライブラリー部分を制限酵素（ＡｓｃＩ  ＮｏｔＩ）で切断し、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１のＳＩＣ１部分と置き換えた。
ｐＳＨ１８−３４（レポーター遺伝子ＬａｃＺを持つプラスミド：ＯｒｉＧｅｎｅ社）
ｐＵＲＡ３−Ｇａｌ１ｐ−ＨＡ：ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＧＡＬ１ｐｒｏｍｏｔｅｒからＣＹＣ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒまでをＰＣＲで増幅（用いたプライマーは、ＡＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧとＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣである）し、ＹＣｐｌａｃ３３（Ｇｅｎｅ，７４（１９９８）５２７−５３４、なお、出芽酵母のプラスミドでＵＲＡ３をマーカーとして持つものであれば基本的に代用可能で、例えばＡＴＣＣから購入可能なｐＲＳ３０６等を用いることもできる。）のＰｖｕＩＩ部位にクローン化し（これをＹＣ３３Ｇとした）、次に、このＮｏｔＩ  ＳｐｈＩ部位に、ｐＦＡ５ａ−３ＨＡ−ｋａｎＭＸ（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ１４，９５３−９６１（１９９８））を鋳型としてＨＡエピトープを含む領域をＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をクローン化した（用いたプライマーは、ＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴとＡＡＧＣＡＴＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＧＣである）。なお、ＨＡエピトープとの融合タンパク質発現用の出芽酵母プラスミドであればどれでも代用可能である。
ｐＵＲＡ３−ＳＩＣ１−ＬａｃＺ：まず、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子をＰＣＲで増幅後（用いたプライマーは、ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧとＣＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧである）、ＮｏｔＩ  ＳｐｈＩでｐＵＲＡ３−Ｇａｌ１ｐ−ＨＡのＨＡをコードする領域と置き換えた。
ｐＧｉｌｄａ−ＨＣＴ１：市販されているｐＧｉｌｄａ（ＯｒｉＧｅｎｅ社）にＨＣＴ１全長をＰＣＲで増幅後にＢａｍＨＩＳａｌＩで切断後クローン化した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは、ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣとＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧを用いた。
ｐＧｉｌｄａ−Ｈｃｔ１−ｄＣ：Ｃ−ｂｏｘモチーフを含むＮ末端領域を欠失したＨｃｔ１−ｄＣを、ｐＧｉｌｄａにクローン化した。具体的には、ＰＣＲでＨＣＴ１のアミノ酸残基９９−５６６を増幅後、ＢａｍＨＩ  ＥｃｏＲＩで切断した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは、ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＣＴＴＡＴＡＡＴＡＣとＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧを用いた。
ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＣＬＢ２；ＰＣＲで増幅した出芽酵母ＣＬＢ２全長をｐＪＧ４−５にＡｓｃＩ  ＮｏｔＩで切断後クローン化した。鋳型として用いた出芽酵母染色体ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。プライマーは，ＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＴとＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡを用いた。
参考例１
Ｓｉｃ１はＦ−ｂｏｘとしてＣｄｃ４を持つＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることがわかっているタンパク質である。そこで、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムで、Ｆ−ｂｏｘタンパク質としてＣｄｃ４をもちいてｂａｉｔを調製し、ＳｉＣ１との結合を検出できるか検討した。Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム（ＯｒｉＧｅｎｅ社から購入したＤｕｐＬＥＸ−Ａ  Ｙｅａｓｔ２−ハイブリッドシステムキットを使用（Ｉ−（ロ）に記載）：（大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域と転写因子Ｂ４２の活性化領域を用いるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法）を、ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４及びｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１で常法により形質転換した。（図１）。このようにユビキチン化の標的タンパク質の同定を行う場合には、通常のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムでは不可能である。
実施例１
ＴＫ−５０５あるいは野生株を以下のプラスミドで形質転換し、得られたコロニーをメンブレン（ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ：直径８８ｍｍ）に移す。Ｘ−ｇａｌを含み、炭素源としてラフィノースとガラクトースを含む合成培地（寒天培地）の上にのせ、許容温度３０℃あるいは非許容温度３７℃で１２ｈｒ培養した（以下フィルターアッセイとする）。
レポーター遺伝子ＬａｃＺを発現させ、その結果、コロニーが青くなるか調べた。
（ｉ）野生株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４で形質転換し、許容温度３０℃で２４時間培養した。
（ｉｉ）野生株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦで形質転換し、許容温度３０℃で２４時間培養した。
（ｉｉｉ）ＴＫ−５０５をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦで形質転換し、許容温度で１２時間培養後、非許容温度３７度で１２時間培養した。
（ｉｖ）ＴＫ−５０５をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦで形質転換し、許容温度３０℃で２４時間培養した。
結果をそれぞれ、図３に示す。
（ｉｉｉ）のみ、ＰＯＳＩＴＩＶＥなシグナルが得られた。
したがって、上記標的タンパク質の分解が低下した変異株を用いてスクリーニングを行うこと（温度感受性変異株あるいは欠失変異株）、及び、完全長のＦ−ｂｏｘタンパク質ではなく、Ｆ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｆ−ｂｏｘタンパク質をｂａｉｔとして用いる（図２参照）ことという条件を同時に満たすことにより、標的タンパク質のスクリーニングが可能となることが判明した。
実施例２
ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリーニング
出芽酵母ライブラリーを用いてスクリーニングを行った。
具体的には、
（１）開発した実験系を用いたスクリーニングと、（２）非特異的な相互作用を与えるクローンの除去及び標的タンパク質であることの確認からなる。（２）は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質の結合特異性を利用した方法（２−１）と、標的タンパク質の安定化を利用する方法（２−２）とタンパク質の半減期を測定して、ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることを証明する（２−３）、という３段階を用いた。
（１）開発した実験系を用いたスクリーニング
予め、ＴＫ５０５株をｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦとｐＳＨ１８−３４の二つで形質転換しておく。得られた菌株（ＴＫ５０５／ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ＋ｐＳＨ１８−３４）に、出芽酵母ライブラリーを導入した（常法に従う）。
コロニーをメンブレン（ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ：直径８８ｍｍ）に移し、Ｘ−ｇａｌを含み炭素源としてラフィノースとガラクトースを含む合成培地（寒天培地）上にのせ、許容温度３０℃１２時間保温した後に、非許容温度３７℃１２時間保温（以下フィルターアッセイとする）した。
レポーター遺伝子ＬａｃＺを発現し、その結果、青くなったコロニーを培養し、常法に従って、プラスミドを分離し大腸菌ＫＣ８株（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより購入した）を形質転換し、出てきたコロニーからプラスミドを抽出精製した。
再現性を確認するために、得られたクローンを再びＴＫ５０５／ｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ＋ｐＳＨ１８−３４に導入し、同様の要領でフィルターアッセイを行った。結果、再現性のないものは廃棄した。
（２）非特異的な相互作用を与えるクローンの除去及び標的タンパク質であることの確認
（２−１）結合の特異性を利用する方法
Ｆ−ｂｏｘタンパク質はＦ−ｂｏｘモチーフ以外にＷＤ（トリプトファンーアスパラギン酸）４０リピートあるいはＬＲＲ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ）などの、標的タンパク質を結合するモチーフを持っている。Ｃｄｃ４の場合にはＷＤ４０を持つ。また、別のＦ−ｂｏｘタンパク質Ｍｅｔ３０もＣｄｃ４と類似のＷＤ４０を持つが、Ｃｄｃ４とＭｅｔ３０は別の標的タンパク質の結合に関与する。そこで、Ｃｄｃ４のＷＤとＭｅｔ３０のＷＤを置き換えたキメラ分子Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０−ＷＤをｐＧｉｌｄａにクローン化した（ｐＬｅｘＡ−Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０−ＷＤ：Ｃｄｃ４の１−２８１番のアミノ酸残基とＭｅｔ３０の２２８番から６４０番（Ｃ末端まで）を持つ）。
そこで、実施例１のｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦのかわりにｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４−ｄＦ−Ｍｅｔ３０−ＷＤを導入した株に、（１）で分離したプラスミドを導入し、フィルターアッセイを行い、青くならないものを選択した。ＳＩＣ１の場合の結果を図４に示す。ここまででｐｏｓｉｔｉｖｅなシグナルを与えるクローンの塩基配列を決定する。
（２−２）標的タンパク質の安定化を利用する標的タンパク質であることの確認方法
標的タンパク質の候補遺伝子の開始コドンから終止コドンの直前までをＰＣＲ法により増幅し、増幅されたＤＮＡ断片と、ｐＵｒａ３−ＳＩＣ１−ＬａｃＺのＳＩＣ１の部分とを置き換え、ＬａｃＺとの融合タンパク質遺伝子発現用のプラスミドを作製した。できたプラスミドをｃｄｃ４変異株、及び野生株に導入した。調べているタンパク質がＣｄｃ４に依存してユビキチン化／分解されるのであれば、ＬａｃＺと該タンパク質の融合タンパク質は、野生株では不安定である。一方、ｃｄｃ４変異株（ＴＫ５０５株）においては該タンパク質が安定化されるため融合タンパク質も安定化されるはずである。
そこで、コロニーをフィルターに移し、これをＸ−ｇａｌを含み炭素源としてラフィノースとガラクトースを含む合成培地（寒天培地）上におきフィルターアッセイを行う。ここで青くなるクローンを残す。図５にＳＩＣ１の場合の結果を示した。
（２−３）タンパク質の半減期を測定して、ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることの確認
これまでの過程で得たＯＲＦがコードするタンパク質が本当にＣｄｃ４に依存して分解されるのかをタンパク質レベルで半減期を比較することにより調べる。標的タンパク質の候補遺伝子の開始コドンから終止コドンの直前までをＰＣＲで増幅し、ｐＵＲＡ３−Ｇａｌ１ｐ−ＨＡにクローン化した。このプラスミドを用いて、出芽酵母野生株及びｃｄｃ４変異株（ＴＫ５０５株）を形質転換した。
形質転換体をラフィノースを炭素源とする培地で培養後、細胞数が１−２  Ｘ  １０７細胞程度まで培養した。ここで、ガラクトースを終濃度２％となるように加え、ＯＲＦ−ＨＡがコードする融合タンパク質を生産させた。ガラクトースを加えてから１時間後に、タンパク質合成阻害剤ｃｙｃｈｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡから購入）を終濃度５０μｇ／ｍｌ加え、融合タンパク質の発現を停止させた。その直後から１５分間隔で細胞を回収し、Ｙｅｏｎｇ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５０１−５１１（２０００）に記載の方法で、タンパク質抽出液を作製した。次に、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、ａｎｔｉ−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体（Ｒｏｃｈｅより購入）を用いて融合タンパク質の量を調べた。野生株では不安定であるが、変異株では安定化されたものを標的タンパク質とした。
本スクリーニングで同定した標的タンパク質の場合の一例を図６に示す。これまでに本実験で明らかにしたＳＣＦユビキチンリガーゼの新規標的タンパク質は細胞周期制御因子の転写因子であるＳｗｉ５と、カルシウムシグナリングの制御因子であるカルシニューリンの活性を調節するＲｃｎ１である。
実施例３
実施例２で明らかにした標的タンパク質の一つは、ヒトにホモログが存在する。そこで、このヒトホモログをユビキチン化するのに必要なＦ−ｂｏｘタンパク質をスクリーニングすることができる。これまでに完全長配列が知られているヒトＦ−ｂｏｘタンパク質のｃＤＮＡのうち、７種類（ＦＢＷ１，ＦＢＷ１Ｂ，ＦＢＷ２，ＦＢＷ３，ＦＢＷ５，ＦＢＷ７，ＳＫＰ２：Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ１０１：４４１９−４４２４（２００４）：これらの遺伝子はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入することが可能である）をＰＣＲで増幅し、ＡｓｃＩ  ＮｏｔＩで切断後に、ｐＧｉｌｄａにクローン化した。
次に、実施例２で明らかにした標的タンパク質のヒトホモログをＰＣＲで増幅後にｐＪＧ４−５にクローン化した。これとレポーター遺伝子ｐＳＨ１８−３４とで、ｐｒｅ１−１株を形質転換した。ｐｒｅ１−１株はプロテアソームを構成するプロテアーゼ遺伝子の変異株である（Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：５５５−５６２（１９９１）。
得られた形質転換体に、上記で作製したｐＧｉｌｄａにクローン化されたＦ−ｂｏｘタンパク質を導入した。
実施例１と同様なフィルターアッセイを行った。予め許容温度で１２時間培養後、３７℃（非許容温度）で２４時間培養した。その結果、青いシグナルを出すものが１種あった。これは出芽酵母Ｃｄｃ４とよく似た構造をしており、Ｃｄｃ４のヒトホモログと考えられているものであった。
実施例４
ｐｒｅ１−１株（プロテアソームの温度感受性変異株）あるいは野生株を以下のプラスミドで形質転換し、得られたコロニーをメンブレン（ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ：直径８８ｍｍ）に移す。Ｘ−ｇａｌを含み、炭素源としてラフィノースとガラクトースを含む合成培地（寒天培地）の上にのせ、許容温度３０℃あるいは非許容温度３７℃で１２ｈｒ培養した（以下フィルターアッセイとする）。
レポーター遺伝子ＬａｃＺを発現させ、その結果、コロニーが青くなるが調べた。
（ｉ）野生株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４で形質転換し、許容温度３０℃で２４時間培養した。
（ｉｉ）ｐｒｅ１−１株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４で形質転換し、許容温度で１２時間培養後、非許容温度３７度で１２時間培養した。
（ｉｉｉ）ｐｒｅ１−１株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＳＩＣ１、及びｐＧｉｌｄａ−Ｃｄｃ４で形質転換し、許容温度３０℃で２４時間培養した。
結果をそれぞれ、（図７）に示す。
（ｉｉ）のみ、ＰＯＳＩＴＩＶＥなシグナルが得られた。
したがって、プロテアソームの温度感受性変異株を用いた標的タンパク質のスクリーニングが可能であることが判明した。
なお、本実施例４では、Ｃｄｃ４に代えてＣｄｃ４−ｄＦを用いることもできる。
また、Ｃｄｃ４とは異なるＦ−ｂｏｘタンパク質Ｇｒｒ１とその標的タンパク質Ｃｌｎ２の結合も、この方法で検出することに成功したので、他のＦ−ｂｏｘにも（プロテアソームの温度感受性変異株）を利用する方法を適用できることが分かった。
参考例２
Ｃｌｂ２はＣ−ｂｏｘとしてＨｃｔ１を持つＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることがわかっているタンパク質である。そこで、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムで、Ｃ−ｂｏｘタンパク質としてＨｃｔ１をもちいてｂａｉｔを調製し、Ｃｌｂ２との結合を検出できるか検討した。Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム（ＯｒｉＧｅｎｅ社から購入したＤｕｐＬＥＸ−Ａ  Ｙｅａｓｔ２−ハイブリッドシステムキット（大腸菌転写因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域と転写因子Ｂ４２の活性化領域を用いるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法）を使用し、ｐＧｉｌｄａ−ＨＣＴ１及びｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＣＬＢ２で常法により形質転換した。結果、レポーターの発現は見られず、このようにユビキチン化の標的タンパク質の同定を行う場合には、通常のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムでは不可能であることが分かった。
実施例５
ＴＫ−５４２あるいは野生株を以下のプラスミドで形質転換し、得られたコロニーをメンブレン（ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ：直径８８ｍｍ）に移す。Ｘ−ｇａｌを含み、炭素源としてラフィノースとガラクトースを含む合成培地（寒天培地）の上にのせ、許容温度３０℃あるいは非許容温度３７℃で１２ｈｒ培養した（以下フィルターアッセイとする）。
レポーター遺伝子ＬａｃＺを発現させ、その結果、コロニーが青くなるか調べた。
（ｉ）野生株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＣＬＢ２、及びｐＧｉｌｄａ−ＨＣＴ１で形質転換し、３０℃で２４時間培養した。
（ｉｉ）野生株をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＣＬＢ２、及びｐＧｉｌｄａ−ＨＣＴ１−ｄＣで形質転換し、３０℃で２４時間培養した。
（ｉｉｉ）ＴＫ−５４２をｐＳＨ１８−３４、ｐＪＧ４−５−ＡＳＣ−ＣＬＢ２、及びｐＧｉｌｄａ−ＨＣＴ１−ｄＣで形質転換し、３０℃で２４時間培養した。
結果をそれぞれ、図８に示す。
（ｉｉｉ）のみ、ＰＯＳＩＴＩＶＥなシグナルが得られた。
したがって、上記標的タンパク質の分解が低下した変異株を用いてスクリーニングを行うこと（温度感受性変異株あるいは欠失変異株）、及び、完全長のＣ−ｂｏｘタンパク質ではなく、Ｃ−ｂｏｘモチーフを欠失した変異型Ｃ−ｂｏｘタンパク質をｂａｉｔとして用いる（図２参照）ことという条件を同時に満たすことにより、標的タンパク質のスクリーニングが可能となることが判明した。
実施例６
ＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリーニング出芽酵母ライブラリーを用いてスクリーニングを行った。
具体的には、
（１）ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリーニングと同様に、開発した実験系を用いたスクリーニングと、（２）非特異的な相互作用を与えるクローンの除去及び標的タンパク質であることの確認からなる。実際に行った結果、（１）で得たクローンが比較的少なかったので、ユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることを証明する手順のみ行った。
（１）開発した実験系を用いたスクリーニング
予め、ＴＫ５４２株をｐＧｉｌｄａ−Ｈｃｔ１−ｄＣとｐＳＨ１８−３４の二つで形質転換しておく。得られた菌株（ＴＫ５０５／ｐＧｉｌｄａ−Ｈｃｔ１−ｄＣ＋ｐＳＨ１８−３４）に、出芽酵母ライブラリーを導入した（常法に従う）。
コロニーをメンブレン（ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ：直径８８ｍｍ）に移し、Ｘ−ｇａｌを含み炭素源としてラフィノースとガラクトースを含む合成培地（寒天培地）上にのせ、３０℃２４時間保温（以下フィルターアッセイとする）した。
レポーター遺伝子ＬａｃＺを発現し、その結果、青くなったコロニーを培養し、常法に従って、プラスミドを分離し大腸菌ＫＣ８株（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより購入した）を形質転換し、出てきたコロニーからプラスミドを抽出精製した。
再現性を確認するために、得られたクローンを再びＴＫ５４２／ｐＧｉｌｄａ−Ｈｃｔ１−ｄＣ＋ｐＳＨ１８−３４に導入し、同様の要領でフィルターアッセイを行った。結果、再現性のないものは廃棄した。
（２）非特異的な相互作用を与えるクローンの除去及び標的タンパク質であることの確認
タンパク質の半減期を測定して、ＳＣＦユビキチンリガーゼの標的タンパク質であることの確認
野生株およびｈｃｔ１変異株にこれまでの過程で得た候補プラスミドを導入した。
形質転換体をラフィノースを炭素源とする培地で培養後、細胞数が１−２  Ｘ  １０７細胞程度まで培養した。ここで、ガラクトースを終濃度２％となるように加え、ＯＲＦ−ＨＡがコードする融合タンパク質を生産させた。ガラクトースを加えてから１時間後に、タンパク質合成阻害剤ｃｙｃｈｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡから購入）を終濃度５０μｇ／ｍｌ加え、融合タンパク質の発現を停止させた。その直後から１５分間隔で細胞を回収し、Ｙｅｏｎｇ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５０１−５１１（２０００）に記載の方法で、タンパク質抽出液を作製した。次に、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、ａｎｔｉ−ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体（Ｒｏｃｈｅより購入）を用いて融合タンパク質の量を調べた。野生株では不安定であるが、変異株では安定化されたものを標的タンパク質とした。同定された２種類の標的蛋白質の半減期を図９に示す。
これまでに本実験で明らかにしたＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質は細胞周期制御因子のＣｌｂ１およびＵＡＨ１である。
【産業上の利用可能性】  本発明の実験手法により、ユビキチン化の標的タンパク質を明らかにすることができる。こうした基礎生物学への貢献のみでなく、治療薬のスクリーニング及び評価に用いることが可能である。
ユビキチン化の標的タンパク質を明らかにする実験系として有用である。
開発した手法を用いて、ＳＣＦユビキチンリガーゼ及びＡＰＣ／Ｃユビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリーニングを行った。その結果、すでに明らかにされている標的タンパク質に加えて、新規の標的タンパク質を明らかにした。これらの中には細胞周期制御に関わる転写因子及びカルシウムシグナリングの制御因子を含む。
本発明は、治療薬のスクリーニング及び評価に有用である。本発明の方法は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を検出する系を包含する。この結合量をレポーター遺伝子の活性で定量することもできる。したがって、例えば、ある薬剤を作用したときに、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合が促進されるか、あるいは阻害されるかを、レポーター遺伝子の活性の増減を調べることにより、容易に判断できる。特定の標的タンパク質へのユビキチン化活性が亢進、あるいは阻害されると、癌をはじめとした様々な病態の原因となることが知られている。もし、ユビキチン化活性が亢進することによって病気が引き起こされるのであれば、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を阻害する薬剤及びＣ−Ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を阻害する薬剤は治療薬の候補になりうる。また、ユビキチン化活性が低下することによって病気が引き起こされるであれば、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を促進する薬剤及びＣ−Ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を阻害する薬剤は治療薬の候補になりうる。このように、Ｆ−ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を促進あるいは阻害する薬剤及びＣ−Ｂｏｘタンパク質と標的タンパク質の結合を促進あるいは阻害する薬剤のスクリーニング及び評価する実験系として用いる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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