(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール発酵性微生物を用いて好気的条件下エタノール発酵を行い、浸透気化膜を用いてエタノール発酵液からエタノールを分離濃縮するエタノールの製造方法であって、エタノール発酵性微生物が、好気的条件下で培養するとき、コハク酸を産生しないか、あるいはサッカロマイセス  セレビシエに比してコハク酸産生量が少ない微生物であることを特徴とする、エタノールの製造方法において、
当該微生物が、キャンディダ  クルセイ（Candida krusei）、キャンディダ  ランビカ（Candida lambica）、キャンディダ  サンタマリア(Candida santamariae)、キャンディダ  シェハーテ(Candida shehatae)、ピキア  ファーメンタンス(Pichia fermentans)、ピキア  ファリノス（Pichia farinose）のいずれかであることを特徴とする、エタノールの製造方法。
【請求項２】
キャンディダ  クルセイがキャンディダ  クルセイ（Candida krusei）IA-1株であることを特徴とする、請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノール発酵液の製造方法に関し、より詳細には、エタノール分離濃縮に用いる浸透気化膜の性能低下原因物質を産生しないかあるいは産生量の少ないエタノール発酵性微生物を用いてエタノール発酵を行い、該エタノール発酵液から、浸透気化膜を用いて、高濃度エタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母の発酵によるエタノールの製造技術は、古来より、各種発酵食品や発酵アルコール飲料の製造に利用されてきた。近年、酵母の発酵によるエタノールの製造技術は、工業的には大別すると、エタノール等の工業用アルコールの発酵による製造技術、及び、酒類のような発酵アルコール飲料の製造技術が挙げられ、このような分野の技術として進展してきた。エタノール等の工業用アルコールの発酵による製造の原料としては、主としてデンプン質原料及び糖質原料が用いられる。デンプン質原料としては、米、麦、トウモロコシ、甘藷、馬鈴薯、キャッサバ等が挙げられ、これらのデンプン質原料は麹や酵素等を用いて糖化してエタノール発酵に供されている。
【０００３】
糖質原料としては、製糖工場の副産物として産出される糖蜜が主要な糖質原料であり、砂糖の産地では、砂糖キビの搾汁（cane juice）も用いられている。また、最近では、未利用資源活用の一環として開発された、ミカンジュース製造後の残留物を加圧搾汁することにより回収したミカン果汁廃液も発酵エタノールの製造原料として使用されている。糖質原料は、デンプン質原料と異なり、原料の処理や糖化を要しないため、施設、製造技術、コスト、エネルギーバランスなど多くの面で有利な原料であり、エタノール製造原料として最も多く用いられている。近年は、廃棄バイオマスの再資源化という観点から、各種飲食品等の製造に際して産出されるデンプン質や糖質を含有する製造残渣等を用いて、エタノール発酵を行う方法も報告されている。
【０００４】
酵母の発酵によるエタノールの製造技術の、酒類のような発酵アルコール飲料の製造への利用は、清酒、ビール等の発酵麦芽飲料、ぶどう酒やリンゴ酒等の果実酒、ウイスキーや焼酎等の蒸留酒等、古来より多くの酒類の製造技術として利用されている。これらの発酵アルコール飲料の製造原料としては、米、麦、麦芽、そば、甘藷、サトウキビ、ぶどうやリンゴ等の果実、及び、蜂蜜のようなデンプン質や糖質を含む原料を、デンプン質の場合は麹や酵素により糖化して、用いられているが、これらの製造原料を用い、酵母によりエタノール発酵を行って各種の発酵アルコール飲料が製造されている。最近では、飲食品製造残渣の有効利用という観点から、柑橘類を搾汁して果汁を採取した残渣を原料として用い、エタノール発酵して、発酵アルコール飲料を製造する方法のようなものも開示されている（特許文献１）。
【０００５】
エタノール発酵性微生物としては、古来から、酒類やパンの製造に用いられてきたサッカロマイセス（Saccharomyces）属酵母の他に、クルベロマイセス(Kluveromyces)属酵母、シゾサッカロマイセス(Shcizosaccharomyces)属酵母、ピキア(Pichia)属酵母（特許文献２）、キャンディダ（Candida）属酵母（特許文献３）、あるいは、ザイモモナス属細菌、組換え大腸菌などの細菌類も知られている。
【０００６】
これらのエタノール等の工業用アルコールの発酵による製造技術、及び、酒類のような発酵アルコール飲料の製造技術によるは、発酵工程を経て得られた発酵液は、発酵により生成したエタノールを分離・精製する工程に供される。エタノールを分離する方法としては、蒸留、浸透気化膜等の公知の方法が知られているが、実プロセスとして用いられているエタノール精製方法は、多くの場合、蒸留法が用いられる。
【０００７】
一方、浸透気化膜を用いるエタノール精製方法は、エタノールを選択的に濃縮可能であるため、高濃度エタノールを製造可能である。また、多くの場合に用いられる蒸留法と比較して、浸透気化膜を用いるエタノール精製方法は、蒸留のための熱エネルギーを必要としないため、エタノール精製プロセスの省エネルギー化に貢献しうるエタノール精製方法でもある。
【０００８】
これらのエタノール等の工業用アルコールの発酵による製造技術、及び、酒類のような発酵アルコール飲料の製造技術は、いずれも、酵母の発酵によるエタノールの生成作用が基本となる。酵母の培養液中には、エタノールだけでなく、培地成分や代謝産物が混在したものであり、この中には浸透気化膜の性能を著しく低下させる阻害物質の存在が報告されている。特に、コハク酸は浸透気化膜の性能に重篤な悪影響を及ぼすことが分かっている（非特許文献１）。
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１５３２３１号公報。
【特許文献２】特開２００５−５２０２０号公報。
【特許文献３】特開２００４−３４４０８４号公報。
【非特許文献１】T. Ikegami, D. Kitamoto, H. Negishi, K. Haraya, H. Matsuda, Y. Nitanai, N. Koura, T. sano and H. Yanagishita: J. Chem. Technol. Biotechnol., 23, 885（1971）.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、上記従来技術の現状に鑑み、エタノール発酵後の培養液を、浸透気化膜を用いてエタノールを分離濃縮するに際して、浸透気化膜の性能を劣化させることなく、高濃度エタノールを効率的に製造する手段を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、好気的条件下、エタノール生産性が十分高く、エタノール分離濃縮に用いる浸透気化膜の性能低下原因物質、特にコハク酸を産生しないかあるいは産生量の少ないエタノール発酵性微生物を新たに取得し、該微生物を用いて好気的条件下で、エタノール発酵を行い、その結果得られた発酵液から浸透気化膜を用いてエタノールを分離濃縮することにより、高濃度エタノールを効率よく製造できることを見いだした。すなわち、当該発酵液を用いることにより、当該阻害物質含有量が少ないエタノール発酵液を製造可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明のエタノール発酵液製造方法において用いられる、エタノール発酵能を有する酵母株としては、Candida krusei IA-1株等を挙げることができる。従来、酵母によるエタノール発酵液は、エタノールだけでなく、培地成分や代謝産物が混在したものであり、この中には浸透気化膜の性能を著しく低下させる阻害物質も存在していた。本発明によるエタノール発酵液は、培養液中に含まれる、浸透気化膜の性能を著しく低下させる阻害物質の含有量が低いか含有しないため、浸透気化膜の性能を低下させないエタノール発酵液の製造が可能である。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１２】
（１）エタノール発酵性微生物を好気的条件下エタノール発酵を行い、浸透気化膜を用いて該発酵液からエタノールを分離濃縮するエタノールの製造方法であって、エタノール発酵性微生物が、好気的条件下で培養するとき、コハク酸を産生しないか、あるいはコハク酸産生量が少ない微生物であることを特徴とする、エタノールの製造方法。
（２）エタノール発酵性微生物が、キャンディダ（Candida）属、ピキア(Pichia)属に属する酵母であることを特徴とする上記（１）に記載のエタノールの製造方法。
（３）キャンディダ（Candida）属に属する微生物がキャンディダ  クルセイ  （Candida
krusei）、キャンディダ  ランビカ（Candida lambica）、キャンディダ サンタマリア（Candida santamariae)、キャンディダ シェハーテ (Candida shehatae)  であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のエタノールの製造方法。
（４）キャンディダ（Candida）属に属する微生物がキャンディダ  クルセイ  （Candida
krusei）IA-1株であることを特徴とする、上記（３）に記載のエタノールの製造方法。
（５）ピキア(Pichia)属に属する微生物がピキア ファーメンタンス(Pichia fermentans)、ピキア ファリノス（Pichia farinose）であることを特徴とする、上記（３）に記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のエタノール製造方法は、使用する微生物が、エタノール分離濃縮に用いる浸透気化膜の性能低下原因物質を産生しないか、あるいはその産生量が少ないものであり、該微生物の培地溶液から、浸透気化膜を用いてエタノールを極めて効率的に分離濃縮することが可能となる。したがって、本発明は、工業用アルコール、バイオ燃料等としてのエタノール生産、あるいはアルコール飲料の製造等において極めて有用な技術手段である。
特に、浸透気化膜を用いたエタノール製造技術の高効率化や連続プロセスの開発を可能とするものであり、浸透気化膜によるエタノール精製技術の実用化に貢献するものである。
【００１４】
化学品製造プロセスにおいては、初発の物質中の純度が、最終生成物の収率や純度に反映されるため、高純度エタノールを供給することが重要である。浸透気化膜を用いるエタノール精製方法を用いれば、高純度なエタノールを製造できるため、本発明のエタノールの製造方法によれば、高効率で、高純度エタノールを得ることが可能となり、化学品製造プロセスにおける基幹原料物質の提供手段としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、浸透気化膜法を使用して、発酵液からエタノールを、省エネルギーでかつ極めて効率的に分離濃縮する手段に関するものである。
浸透気化膜法を用いて、発酵液からエタノールを分離濃縮する手段は、それ自体公知であり、本発明は、特定の物質（ここでは、エタノール）に対して選択性を有する分離膜を介して、一方に液体混合物を供給し、反対（透過）側のみを減圧にすることによって、膜内を透過してきた液体の蒸気化を容易にして、その蒸気を冷却、液化して取り出す方法である。すなわち、膜分離の駆動力は蒸気圧差である。透過側を減圧にする代わりに、不活性ガスで透過側の膜面から蒸発する蒸気を掃引して冷却器へ導き、透過蒸気のみを液化することも可能である。この方法では、揮発性を有しない発酵原料、発酵性微生物細胞あるいは代謝産物などは、分離膜を透過することはない。
【００１６】
分離膜によってエタノールを選択的に除去するためには、膜は疎水性であることが要求される。これまで、発酵エタノールの膜分離・濃縮にはポリジメチルシロキサンが一般的に使用されてきた。しかしながら、ポリジメチルシロキサンのエタノール選択性は高いとは言えない。また、ポリ（1-トリメチルシリル-1-プロピン）など学術論文J Chem Technol Biotechnol 80:603-629 (2005) に記載のものを使用することができる。ゼオライトの一種であり、結晶構造にアルミナを含まないシリカライトは、非常に高い疎水性を有する多孔性物質であり、エタノールに対して親和性が高い。したがって、エタノール分離に使用される浸透気化膜としては、シリカライト膜、あるいはシリカライト膜をシリコンゴムデコーティングした膜を使用することが最も効果的である。
【００１７】
このような浸透気化膜は、エタノール発酵液中の阻害物質、特にコハク酸がシリカライト膜に吸着することによる、エタノールが透過するシリカライトの細孔の閉塞、ならびに疎水性シリカライト膜が親水性化することによって、分離性能が低下する。
すなわち、コハク酸等のエタノール発酵過程で副生する弱酸性の有機酸類は、それらを含有する水溶液のpHによって、各々の有機酸分子の解離度合いは大きく異なる。すなわち、各々の有機酸は、分子が解離した状態の有機酸イオン、および非解離状態の有機酸分子として存在する割合がpHに依存する（文献：J Membr Sci 222: 103-111 (2003)）。一方、上述したように、シリカライト膜は疎水性である。これらのことから、コハク酸のシリカライト膜への吸着量は、コハク酸含有水溶液のpHによって大きく支配されることになる。コハク酸含有水溶液のpHとシリカライト結晶へのコハク酸吸着量との関係、およびコハク酸含有エタノール水溶液を供給液とした場合の、そのpHとシリカライト膜の分離性能との関係は、既に報告している（文献：J Chem Technol Biotechnol 80: 381-387 (2005)）。pHの低下によって非解離状態のコハク酸分子の存在割合が増加することによって、シリカライト結晶へのその吸着量が増大し、その結果として、シリカライト膜の分離性能もまた低下することが明らかとなっている。
【００１８】
本発明の使用微生物は、好気的条件下において、エタノール生産能が十分高くかつ、浸透気化膜の性能低下原因物質、特にコハク酸を産生しないか、あるいはその産生が少なく、浸透気化膜法により発酵後の培養液からエタノール分離濃縮するに際して、浸透気化膜の性能低下を効果的に抑制乃至防止することができる。
【００１９】
本発明にいう、好気的条件下とは、使用微生物のエタノール発酵温度において、200 rpm 以上の回転速度で培地が攪拌・振とうされ、培養液中の溶存酸素量が飽和している状態をいう。また、コハク酸の産生能とは培地蓄積量をいい、その産生が少ないとは、培地１００ｍｌ当たり、０．０４ｇ（０，０４％）未満の蓄積量をいい、使用微生物のコハク酸蓄積量は、同０．０２ｇ（０．０２％）未満が好ましく、蓄積しないものがもっとも好ましい。
【００２０】
本発明におけるコハク酸蓄積量は、本発明におけるエタノール生産酵母を１０％以上のグルコースを含有する培地中で培養し、24時間培養後の培養液中のコハク酸含有量のことをいう。培養条件について、このほかは特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。
【００２１】
本発明の使用微生物としては、例えば、キャンディダ（Candida）属、ピキア(Pichia)属に属する酵母を挙げることができ、その中でも、キャンディダ  クルセイ  （Candida krusei）、キャンディダ  ランビカ（Candida lambica）、キャンディダ サンタマリア(（Candida santamariae)、ピキア ファーメンタンス(Pichia fermentans)、ピキア ファリノス（Pichia farinose）、キャンディダ シェハーテ (Candida shehatae)、またはピキア ファーメンタンス(Pichia fermentans)、ピキア ファリノス（Pichia farinose）に属する菌株が好ましい。
【００２２】
これら微生物は、好気的条件下での発酵においては、エタノール生産量が、代表的エタノール発酵菌であるサッカロミセス・セレビシェに匹敵するのに対し、コハク酸培地蓄積量はサッカロミセス属菌に比して少なく、また、サッカロミセス属菌が好気的条件下ではかえってコハク酸蓄積量が増大するのと比べ好対照である。
【００２３】
本発明のエタノールの製造方法は、液状発酵原料を用いた工業用アルコール等のエタノールの製造や各種発酵アルコール飲料の製造に用いることができ、本発明の微生物は、通常、液体培地を用いてエタノール発酵を行う。
エタノールの製造を行う際の発酵原料としては、使用微生物が酵母の場合、エタノールの製造を行う場合に用いられている酵母用の発酵原料を用いることができる。該発酵原料としては、デンプン質又は糖質発酵原料が用いられる。デンプン質原料としては、米、麦、トウモロコシ、甘藷、馬鈴薯、キャッサバ等が挙げられ、これらのデンプン質原料は麹や酵素等を用いて糖化してエタノール発酵に供されている。糖質原料としては、製糖工場の副産物として産出される糖蜜が主要な糖質原料であり、砂糖の産地で生産される、砂糖キビの搾汁（cane juice）も用いられる。また、未利用資源活用の一環として開発された、ミカンジュース製造後の残留物を加圧搾汁することにより回収したミカン果汁廃液等の果汁類も用いられ、その中に含まれるショ糖、グルコース及びフルクトース等が発酵に利用される。糖質原料は、デンプン質原料と異なり、原料の処理や糖化を要しないため、施設、製造技術、コスト、エネルギーバランスなど多くの面で有利な原料であり、エタノール製造原料として好適に用いることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、表３に示す酵母株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（１８０ｒｐｍ）培養した。主培地としては表２に示した液体培地Bを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、上記の種培養物を５％濃度で加え、回転振とう（１８０ｒｐｍ）し、３０℃で培養した。２４時間後に培養を終了した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により、菌体を除去した。得られた上澄液はフィルターろ過した後、高速液体クロマトグラフィーに供し、エタノール含有量を定量、比較した。その結果を表４に示した。表４に示したように、実験に用いた酵母株は全てエタノール生産性を示した。
【００２５】
表１
0005071935.tif 000002
【００２６】
表２
0005071935.tif 000003
【００２７】
表３
0005071935.tif 000004
【００２８】
表４
0005071935.tif 000005
【００２９】
実施例２
実施例１で示したエタノール発酵液中のコハク酸含有量は、有機酸分析システムにて定量して、生成量を求め、生産性を比較した。そのコハク酸生成量と生産性の結果を表５に示した。表５に示したように、実験に用いた酵母株の中でキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1 株の培養液中には、コハク酸は全く検出されなかった。この結果は、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1 株のエタノール発酵液が、一般的なエタノール発酵酵母であるサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ともの比べて、浸透気化膜を用いるアルコール分離濃縮に適していることを示している。
【００３０】
表５
0005071935.tif 000006
【００３１】
実施例３
表６に示すキャンディダ（Candida）属および、ピキア(Pichia)属酵母のエタノールおよびコハク酸生産量を、上記の方法で調べた。その結果を表７に示した。表７によると、実験に用いた全てのキャンディダ クルセイ（Candida krusei） およびキャンディダ シェハーテ (Candida shehatae)  の培地中には、コハク酸は全く検出されなかった。また、キャンディダ  ランビカ（Candida lambica）、キャンディダ サンタマリア(Candida santamariae)、ピキア ファーメンタンス(Pichia fermentans)、ピキア ファリノス（Pichia farinose）のエタノール発酵液中のコハク酸含有量は、一般的なエタノール発酵酵母であるサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ともの比べて、明らかに少ないことが分かる。
【００３２】
表６
0005071935.tif 000007
【００３３】
表７
0005071935.tif 000008
【００３４】
実施例４
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）NBRC 1953 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1 株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（１８０ｒｐｍ）培養した。主培地としては表２に示した液体培地Bを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、上記の種培養物を５％濃度で加え、回転振とう（１８０ｒｐｍ）（好気条件）あるいはスターリング（低速度の回転）（微好気条件）し、３０℃で培養した。２４時間後に培養を終了した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により、菌体を除去した。得られた上澄液はフィルターろ過した後、高速液体クロマトグラフィーに供し、エタノール含有量を定量、比較した。その結果を表８に示した。表８に示したように、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 1953 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株は好気条件で5.5%のエタノールを生産し、微好気条件では6.6%以上のエタノールを生産した。一方、コハク酸含量については、好気条件下でキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を培養した場合は検出されなかったが、微好気条件下では少量のコハク酸が検出された。サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 1953 株はいずれの条件においてもコハク酸を培地中に蓄積した。これらの結果は、好気条件下でキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を培養することで、コハク酸含有量の少ないエタノール発酵液の製造が可能であることが分かる。
【００３５】
表８
0005071935.tif 000009
【００３６】
実施例５
サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を、上記の方法で培養し、得られたエタノール発酵液を用いて、浸透気化膜によるエタノール精製を行い、浸透気化膜に対する影響を調べた。その結果を表９に示す。表９によれば、膜透過エタノール濃度の比較において、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の発酵液を用いた場合の膜性能は、コントロールの82.3%である。一方、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の発酵液を用いた場合、45.5%となっており、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の発酵液の方が、膜性能の低下の割合が明らかに低減されている。また、膜透過流束は、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の発酵液を用いた場合、9.9%である。一方、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の発酵液を用いた場合、2.5%となっており、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の発酵液の方が、膜透過流束の低下の割合もまた明らかに低減されている。以上の結果から、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の発酵液を用いることで、汎用されるエタノール生産酵母の一種であるサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の発酵液を用いる場合と比較して、浸透気化膜の性能を向上することができた。
【００３７】
表９
0005071935.tif 000010
【００３８】
実施例６
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（１８０ｒｐｍ）培養した。主培地としては表１０に示した各種液体培地を１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、上記の種培養物を５％濃度で加え、回転振とう（２００ｒｐｍ）し、３０℃で培養した。２４時間後に培養を終了した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により、菌体を除去した。得られた上澄液はフィルターろ過した後、高速液体クロマトグラフィーに供し、エタノールおよびコハク酸、グリセロール含有量を定量した。その結果を図１に示す。図１によると、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株は、ペプトンが0.3%でCorn steep liquor が0.3%の場合、明らかに残存グルコース量が高く、エタノール生産量も低く、生育が悪い。また、Corn steep liquor が0.3%の場合、ペプトンを1.0%含有する培地においてもわずかながらコハク酸の蓄積が認められる。15% グルコース、0.5% Corn steep liquor、1.0 % ペプトンを含有する培地を用い、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を培養すると、コハク酸は蓄積されず、高いエタノール生産性を示した。この結果から、上記の条件下でキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を培養することで、コハク酸含有量の少ないエタノール発酵液の製造が可能であることが分かる。
【００３９】
表１０
0005071935.tif 000011
【００４０】
実施例７
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（２００ｒｐｍ）培養した。主培地としては、表１１に示した各種液体培地を１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、上記の種培養物を５％濃度で加え、回転振とう（２００ｒｐｍ）し、３０℃で培養した。２４時間後に培養を終了した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により、菌体を除去した。得られた上澄液はフィルターろ過した後、高速液体クロマトグラフィーに供し、培地中のエタノールおよびコハク酸、グリセロール含有量を定量、比較した。その結果を図２に示す。図２によると、両酵母株の培地中エタノール含有量は、初発のグルコール含有量に依存して増加した。また、両酵母株の培地中エタノール含有量は、３０％のグルコースを添加した場合、２５％のグルコースを添加した場合と比べて、やや低い傾向が見られた。また、培養後の培地中コハク酸含有量は、いずれの場合も、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株が１ｇ/Ｌ以上であったのに対して、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株は全く検出されなかった。この結果から、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を培養することで、初発のグルコール含有量に依存することなく、コハク酸含有量の少ないエタノール発酵液の製造が可能であることが分かる。
【００４１】
表１１
0005071935.tif 000012
【００４２】
実施例８
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（２００ｒｐｍ）培養した。主培地（200g/L グルコース、5g/L Corn steep liquor、10g/L ペプトン）を１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、上記の種培養物を５％濃度で加え、回転振とう（２００ｒｐｍ）し、３０℃で培養した。培養３時間あるいは４時間毎に培養液を採取し、２４時間後に培養を終了した。培養終了後、採取した培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）することで、菌体を除去した。得られた上澄液はフィルターろ過した後、高速液体クロマトグラフィーに供し、培地中エタノールおよびコハク酸含有量を定量、比較した。菌体量はOD６６０を測定することで計測した。その結果を図３に示す。図３（a）によると、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1 株の増殖速度は同等である。図３（ｂ）によると、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株のエタノール生産速度も同等である。図３（ｃ）によると、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株のグルコース消費速度も同等である。図３（ｄ）によると、コハク酸の倍地中への蓄積量は、明らかにサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の方が高く、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株は培養期間中、培地中のコハク酸含有量は極めて低いレベルで維持されていることが分かる。したがって、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株を培養することで、安定して、コハク酸含有量の少ないエタノール発酵液の製造が可能であることが分かる。
【００４３】
実施例９
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（２００ｒｐｍ）培養した。コハク酸あるいはグルコースを炭素源とする寒天プレート培地（0.5, 1.0, 2.0% コハク酸あるいはグルコース、および Yeast extract (10 g/L) とPeptone (20 g/L) を含有する培地）を作成し、培養で得られた菌懸濁液を、ＯＤ６６０が1.0、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001になるように調整し、寒天プレート培地に５マイクロリットル滴下した。図４は、３０℃で２４時間インキュベートした後の様子をあらわす。図４によれば、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株は、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株と比べて、明らかにコハク酸資化能が高い。さらに、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株のコハク酸資化能は、グルコース資化能に匹敵することがわかる。
【００４４】
実施例１０
表１に示す液体培地Ａを１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。この種培地に、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株とキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の寒天プレート培地培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間回転振とう（２００ｒｐｍ）培養した。主培地（200g/L グルコース、5g/L Corn steep liquor、10g/L ペプトン）を１００ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌ分注し、上記の種培養物を５％濃度で加え、回転振とう（２００ｒｐｍ）し、３０℃で培養した。培養６時間で培養を終了した。培養終了後、培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）することで菌体を集め、４０ｍｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液（pH7.4）を用いて菌体を洗浄した。２ｍＭのプロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（pH7.4）中に再懸濁し、直径０．５ｍｍのガラスビーズを添加し、菌体破砕機（FastPrepTM FP100A、MPBiomedicals社）にて３分破砕処理を行った。さらに、遠心分離にて菌体残渣とガラスビーズを沈殿させ、上澄み液を粗酵素液として以後の実験に用いた。表１２は、測定したコハク酸代謝に関連する酵素群とその測定条件を示す。各酵素の測定結果は、表１３に示すとおりである。また、図５は、コハク酸代謝関連の各酵素が触媒する、クエン酸回路における反応段階を示す概略図である。数字は、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の各酵素活性を１とした場合のキャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株の各酵素活性の割合を示す。表１３および図５によると、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の約８倍にも達しており、スクシニルCoAシンターゼ活性は約０．３倍である。この結果から、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株のコハク酸は速やかにフマル酸へと変換されていることが考えられる。したがって、キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株において、生合成されたコハク酸は、ほとんど蓄積されることなく、菌体内で代謝されており、結果として、コハク酸量は培地中にほとんど蓄積されないと考えられる。
【００４５】
表１２
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【００４６】
表１３
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】キャンディダ クルセイ（Candidakrusei）IA-1株を培養してコハク酸含有量の少ないエタノール発酵液を製造するための培養条件検討の結果を示す棒グラフ。
【図２】キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株とサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株のエタノール生産量およびコハク酸生産量に対する初発グルコースの影響を示す棒グラフ。
【図３】キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株とサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株の菌体増殖、エタノール生産速度、グルコース消費速度およびコハク酸蓄積量を示す棒グラフである。
【図４】キャンディダ クルセイ（Candida krusei）IA-1株のコハク酸資化能がサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） NBRC 0216 株より高いことを表す写真。
【図５】コハク酸蓄積量に関連する代謝経路および代謝酵素の活性測定結果を表す概略図。
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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