(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物におけるウイルス感染症の予防または治療のための抗ウイルス薬を製造するための、薬理学的に許容しうる、療法上有効な量のロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）薬の使用であって、前記ＬＴＢ4薬は、５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸およびその異性体、２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；１９−メチル−ＬＴＢ4、１９,１９−ジメチル−ＬＴＢ4、１９−フルオロ−ＬＴＢ4、１９,１９−ジフルオロ−ＬＴＢ4、１８，２０−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２０−フルオロ−ＬＴＢ4およびその異性体、３−チオ−ＬＴＢ4、３−メチル−ＬＴＢ4、３，３−ジメチル−ＬＴＢ4、３−フルオロ−ＬＴＢ4、３，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２,３−ジフルオロ−ＬＴＢ4；１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ3”）、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ5”）、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにその５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ、５−（Ｒ）−ヒドロペルオキシおよび５−デオキシ類似体；ＬＴＢ4  メチルエステル；５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸；２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；そのエーテル誘導体；ならびにロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］；ならびにこれらの任意の塩および任意の混合物、よりなる群から選択される前記使用。
【請求項２】
ウイルス感染症が、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルス科よりなる群から選択されるヒトウイルスまたは動物ウイルスの感染症である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ウイルスが、パルボウイルス科、パポーバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科およびヘパドナウイルス科よりなる群から選択されるＤＮＡウイルスである、請求項２記載の使用。
【請求項４】
ウイルスが、ＥＢＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７およびＨＨＶ−８よりなる群から選択されるヘルペスウイルス科である、請求項２記載の使用。
【請求項５】
ウイルスが、ピコルナウイルス科、トガウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、レオウイルス科およびフィロウイルス科よりなる群から選択されるＲＮＡウイルスである、請求項２記載の使用。
【請求項６】
ウイルスが、ウシ下痢ウイルス、ブタエンテロウイルス、パラミクソウイルス科のウイルス、またはウシＲＳウイルスである、請求項２記載の使用。
【請求項７】
ＬＴＢ4薬がロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］である、請求項１記載の使用。
【請求項８】
ヒトウイルスが、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２から選択されるレトロウイルス科のウイルスである、請求項２記載の使用。
【請求項９】
ＬＴＢ4薬を、異なる抗ウイルス薬１種類または数種類と一緒に投与する、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
異なる抗ウイルス薬が、インターフェロン−α、−β、−γ、腫瘍壊死因子α、ガンシクロビル、アシクロビル、ビダラビン、イドキシウリジン、ファムシクロビル、３ＴＣ、クリキシバン、ネバレピン、プロスタグランジン、プロスタグランジン類似体およびＡＺＴよりなる群から選択される、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ヒトまたは動物が、免疫抑制された患者もしくは動物、またはウイルス感染症の発生率を高めることが知られている薬物で処置された患者である、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
薬物がアザチオプリン、コルチコステロイド類、アドリアマイシン、シクロホスファミドおよびメトトレキセートよりなる群から選択される、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
腫瘍ウイルスにより誘発される癌の予防または治療のための抗ウイルス薬を製造するための、薬理学的に許容しうる、療法上有効な量のロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）薬の使用であって、前記ＬＴＢ4薬は、５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸およびその異性体、２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；１９−メチル−ＬＴＢ4、１９,１９−ジメチル−ＬＴＢ4、１９−フルオロ−ＬＴＢ4、１９,１９−ジフルオロ−ＬＴＢ4、１８，２０−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２０−フルオロ−ＬＴＢ4およびその異性体、３−チオ−ＬＴＢ4、３−メチル−ＬＴＢ4、３，３−ジメチル−ＬＴＢ4、３−フルオロ−ＬＴＢ4、３，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4；１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ3”）、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ5”）、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにその５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ、５−（Ｒ）−ヒドロペルオキシおよび５−デオキシ類似体；ＬＴＢ4  メチルエステル；５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸；２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；そのエーテル誘導体；ならびにロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］；ならびにこれらの任意の塩および任意の混合物、よりなる群から選択される前記使用。
【請求項１４】
ウイルス感染症がＥＢＶ感染症である、請求項１記載の使用。
【請求項１５】
ウイルス感染症がＨＳＶ−１感染症である、請求項１記載の使用。
【請求項１６】
ウイルス感染症がＨＩＶ−１感染症である、請求項１記載の使用。
【請求項１７】
ＬＴＢ4薬が以下のものよりなる群から選択される、請求項１記載の使用：ＬＴＢ4、１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにその５（Ｒ）−ヒドロキシ、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシおよび５−デオキシ類似体。
【請求項１８】
ＬＴＢ4薬が以下のものよりなる群から選択される、請求項１記載の使用：ＬＴＢ4の５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、および５−（Ｒ）−ヒドロペルオキシ−類似体、１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにこれらの類似体。
【請求項１９】
ＬＴＢ4薬が以下のものよりなる群から選択される、請求項１記載の使用：２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；１９−メチル−ＬＴＢ4、１９,１９−ジメチル−ＬＴＢ4、１９−フルオロ−ＬＴＢ4、１９,１９−ジフルオロ−ＬＴＢ4、１８，２０−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２０−フルオロ−ＬＴＢ4；３−チオ−ＬＴＢ4、３−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、およびその異性体。
【請求項２０】
ＬＴＢ4薬が以下のものよりなる群から選択される、請求項１記載の使用：３−メチル−ＬＴＢ4、３，３−ジメチル−ＬＴＢ4、３−フルオロ−ＬＴＢ4、３，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２,３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、およびその異性体。
【請求項２１】
ＬＴＢ4薬がその塩である、請求項１記載の使用。
【請求項２２】
ＬＴＢ4薬がそのエステルまたはそのラクトン誘導体である、請求項１記載の使用。
【請求項２３】
ＬＴＢ4薬がそのエーテル誘導体である、請求項１記載の使用。
【請求項２４】
ヒトおよび動物において腫瘍ウイルスにより誘発される癌の処置のための抗ウイルス薬を製造するための、薬理学的に許容しうる、療法上有効な量のＬＴＢ4薬の使用であって、前記ＬＴＢ4薬は、５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸およびその異性体、２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；１９−メチル−ＬＴＢ4、１９,１９−ジメチル−ＬＴＢ4、１９−フルオロ−ＬＴＢ4、１９,１９−ジフルオロ−ＬＴＢ4、１８，２０−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２０−フルオロ−ＬＴＢ4およびその異性体、３−チオ−ＬＴＢ4、３−メチル−ＬＴＢ4、３，３−ジメチル−ＬＴＢ4、３−フルオロ−ＬＴＢ4、３，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２,３−ジフルオロ−ＬＴＢ4；１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ3”）、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ5”）、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにその５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ、５−（Ｒ）−ヒドロペルオキシおよび５−デオキシ類似体；ＬＴＢ4  メチルエステル；５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸；２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；そのエーテル誘導体；ならびにロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］；ならびにこれらの任意の塩および任意の混合物、よりなる群から選択される前記使用。
【請求項２５】
ＬＴＢ4薬がロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｚ）−エイコサテトラエン酸］である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
薬理学的に許容しうる、療法上有効な量のＬＴＢ4薬を、薬剤学的に許容しうるキャリヤーと一緒に含む、抗ウイルス性薬剤組成物であって、前記ＬＴＢ4薬は、５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸およびその異性体、２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；１９−メチル−ＬＴＢ4、１９,１９−ジメチル−ＬＴＢ4、１９−フルオロ−ＬＴＢ4、１９,１９−ジフルオロ−ＬＴＢ4、１８，２０−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２０−フルオロ−ＬＴＢ4およびその異性体、３−チオ−ＬＴＢ4、３−メチル−ＬＴＢ4、３，３−ジメチル−ＬＴＢ4、３−フルオロ−ＬＴＢ4、３，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、２,３−ジフルオロ−ＬＴＢ4；１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ3”）、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4（“ＬＴＢ5”）、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにその５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ、５−（Ｒ）−ヒドロペルオキシおよび５−デオキシ類似体；ＬＴＢ4  メチルエステル；５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸；２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4；そのエーテル誘導体；ならびにロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］；ならびにこれらの任意の塩および任意の混合物、よりなる群から選択される前記組成物。
【請求項２７】
ＬＴＢ4薬がロイコトリエンＢ4［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］である、請求項２６記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
薬剤組成物が、エーロゾル剤の形で投与するために粉末、溶液、分散液、または懸濁液の状態である、請求項２６または２７記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（ａ）発明の分野
本発明は、ロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）の抗ウイルス活性、ならびにヒトウイルスおよび動物ウイルスにより起きるウイルス感染を処置するための療法薬としてのロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）の使用に関する。
（ｂ）先行技術の記述
人類を苦しめている多くの重大な感染性疾患がウイルスにより起きる。あるものは、それらが致命的となる頻度が高いので重大である。それらには、狂犬病、痘瘡、灰白髄炎、肝炎、黄熱病、免疫不全症、および種々の脳炎性疾患が含まれる。そのほか、インフルエンザ、麻疹、おたふくかぜおよび水痘、ならびに呼吸器−消化管障害などは、接触感染性が著しく高く、急性不快感を生じるので、同様に重大である。そのほか、風疹ウイルスおよびサイトメガロウイルスは先天性異常を起す可能性がある。最後に、ヒトや動物に腫瘍や癌を起す可能性のある腫瘍ウイルスとして知られるウイルスがある。
ウイルスのうちでは、ヘルペスウイルス科がきわめて重要である。ヘルペスウイルスはヒトに対し播種性が高く、かつ病原性が高い。たとえばエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）は、小児後期、青年期、すなわち青少年に感染性単核細胞症を起すことが知られている。急性感染性単核細胞症の特徴は、咽頭痛、発熱、頭痛、リンパ節症、扁桃肥大、および末梢血中における異型分裂リンパ球である。他の症状発現には、軽度の肝炎、巨脾腫症および脳炎が含まれる（総説についてはMiller G.,Vilology,B.N.Fields & D.M.Knipe編, ラバン・プレス, 1990,pp.1921-1958参照）。ＥＢＶは２形態の癌、すなわちバーキットリンパ腫（ＢＬ）および鼻咽頭癌（ＮＰＣ）にも関係する。赤道直下アフリカの一地方では、ＢＬは最も多い小児悪性疾患であり、小児癌の約８０％を占める。ＮＰＣは北米白色人種に中程度にみられるが、中国南部では最も多い癌のひとつであり、発症年齢の範囲は２６〜５５歳である。ＥＢＶは、サイトメガロウイルスと同様に移植後リンパ増殖性疾患にも関連がある。これは、実質性臓器や骨髄の移植に伴う、致命的となる可能性のある慢性免疫抑制性合併症である。
他のヘルペスウイルス、すなわち単純ヘルペスウイルス−タイプ１（ＨＳＶ−１）は、歯肉口内炎の発症因子であることが確認されている。発現症状は発熱、咽頭痛、ならびに口腔の潰瘍性および小胞性病変である。ＨＳＶにより起きる最も重症の臨床状態は、原発性生殖器ヘルペス感染症である。ＨＳＶ−１が生殖器ヘルペス感染症を起す可能性はあるが、ＨＳＶ−２がこの疾患に関連するおもなウイルスである。このＨＳＶ感染症は小胞、膿疱および潰瘍を伴い、生殖器部位の病変を起す。尿貯留症候群が起きることもある。８０％以上の人々がＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に対しセロポジティブであり、調査によれば６０％もの再発やウイルス再活性化の頻度を示した。そのほか、脈絡網膜炎および角結膜炎を含めた、皮膚および眼の感染症にもＨＳＶが関連する。米国では、眼のＨＳＶ感染症が年間約３００，０００例診断されている。
ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）は免疫系の細胞に顕著な向性をもつので、ＨＨＶ−６感染の結果、免疫反応が変化する可能性がある。現在ではＨＨＶ−６は、小児の原発性感染症として、突発性発疹の原因であることが明らかになっている。最近の研究は、移植前にセロポジティブであった臓器移植受容者の有意割合が、免疫抑制後に再活性化の血清学的証拠を示すことを暗示している。異染細胞（heterophil）陰性の単核症様疾病、および非−Ａ、非−Ｂ肝炎も、活性ＨＨＶ−６感染に関連する。ＨＨＶ−６は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症患者からしばしば分離されている。ＨＩＶおよびＨＨＶ−６が同じ標的細胞中に存在する可能性があるという事実から、ＨＨＶ−６感染はＨＩＶセロポジティブ患者が症候性エイズへと進行する際の補因子として作用するのかもしれないと推論される。最近の研究は、ヒトヘルペスウイルスがＨＩＶ疾患と密接な関連をもつことも示唆している。事実、ＨＩＶ感染者におもに起きる腫瘍であるカポージ肉腫（ＫＳ）には、感染性病因のあることが分かった。このウイルスはＫＳ関連ヘルペスウイルスと呼ばれるが、その正式な分類はＨＨＶ−８であると思われる。
１９８０年代初頭来、新しい疾患が確認され、後天性免疫不全症候群（エイズ）と命名された。レトロウイルス科に属するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がエイズの発症因子であることは知られている。ヒトのＨＩＶ感染は、単核症様症候群、持続性無症候性感染症およびエイズのような、多様な疾病状態をもたらす可能性がある。エイズ関連疾患には、カポージ肉腫、肺炎、慢性下痢症、髄膜炎、トキソプラズマ症、脳障害、肛門直腸癌およびＢ−リンパ球性リンパ腫が含まれる。急性感染症の顕著な症状には、リンパ節症、発熱、筋肉痛、関節痛、頭痛、疲労、下痢、咽頭痛および神経症状発現が含まれる。
現在では、ＨＩＶは３つの主経路で伝達されることが認められている：ａ）性的接触、ｂ）汚染血液、およびｃ）母から胎児へ。骨髄、リンパ節、血液、脳および皮膚を含めた、ヒトの多様な臓器や組織に、ウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ１２０と細胞表面受容体ＣＤ４の相互作用を介してＨＩＶが侵入する可能性がある。
１９９３年末で推定１４００万人がＨＩＶに感染しており、２０００年までにはこの数値は２４００万にもなるであろう。今日、医療処置は抗ウイルス薬（特に３′−アジド−３′−デオキシチミジン、ＡＺＴ）の使用と、多数の日和見感染症の処置に限られている。しかしこれらの処置は、ＨＩＶ感染症の抑制にまだ完全には有効でない。したがってＨＩＶ感染症の処置のための新規分子を作り出すことがきわめて重要である。
すべての感染性疾患において、療法の効果は宿主の免疫反応に依存することが多い。ヘルペスウイルスの場合、特にそうである。実際に、すべてのヘルペスウイルスが潜在性感染を樹立する能力をもつので、免疫無防備状態の患者における再活性化感染症の発症率がきわめて高くなる。腎移植片受容者では、４０〜７０％が潜在性ＨＳＶ感染症を再活性化し、８０〜１００％がＣＭＶ感染症を再活性化する。このようなウイルス再活性化はＨＩＶ陽性患者（エイズ）においてもみられる。
今日、ウイルス感染症の処置に用いられる療法薬の数は、依然として比較的限られている。ヘルペスウイルス感染症の処置に用いられるおもな化合物は、イドキシウリジン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビル、ならびにより最近ではファムシクロビルであり、これは体内でペンシクロビルに変換される。それらの有効性は限られており、かつそれらは多くの副作用を起す。眼のＨＳＶ感染症の処置にのみ用いられるイドキシウリジンで処置した患者の３５％に、アレルギー作用が報告されている。ビダラビンに最も多い副作用は、消化管障害である（患者の１５％）。アシクロビルのおもな副作用は、腎機能変調である。アシクロビルはウイルス細胞と宿主細胞両方のＤＮＡに取り込まれる可能性のあるヌクレオシド類似体であるので、宿主細胞の正常な分裂が影響を受ける可能性がある。ガンシクロビルの最も重大な副作用は、エイズ患者の約４０％に起きる好中球減少症および血小板減少症である。
したがって、副作用がより少ない、より有効な、ウイルス感染症処置のための療法薬の開発が緊急に求められている。
ロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）［５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４（Ｚ，Ｅ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸］は、既知の天然分子である。ＬＴＢ4は５−リポキシゲナーゼ経路に由来するアラキドン酸代謝産物である。ＬＴＢ、については多くの生物学的特性が報告されている。特に、ＬＴＢ4は有効な炎症前化合物であると考えられる。その最も重要な生物学的活性は、白血球に対するその走化作用およびケモキネシス作用である。実際にＬＴＢ4は、インビトロおよびインビボとも、ヒトの多形核白血球、単球およびマクロファージに対する有効な化学誘引物質であることが示された。ＬＴＢ4は、脱穎粒およびスーパーオキシドアニオン合成のような他の白血球機能も活性化する。これら炎症前作用のため、ＬＴＢ4は防御機序の推定成分であると考えられている。さらにＬＴＢ4は、多形核白血球、単球およびマクロファージのような炎症細胞により合成され、Ｂリンパ球によっても合成される。
ＬＴＢ4は免疫調節活性をもつことも示されている。実際に、ＬＴＢ4はヒト末梢血単核白血球培養物においてサプレッサー細胞活性を誘導することが認められた。この誘導されたサプレッサー細胞活性は、マイトジェンに対するヒトリンパ球の増殖反応を阻害した（Rola-Pleszczynski M.et al.,BioChem.Biophys. Res.Comm.,1982, 108:1531）。ＬＴＢ4が、Ｋ５６２赤白血病細胞に対する、また単純ヘルペスウイルスタイプ１に感染していない、または持続感染しているヒト前立腺アデノーマＭＡ−１６０細胞に対する、天然のヒト細胞毒性細胞活性を高めることも示された（Rola-Pleszczynski M.et al.,BioChem.Biophys.Res.Comm.,1983,113:531；Gagnon L.et al.,Cell Immunol.,1987,110:243）。他の研究で、ＬＴＢ4、ＬＴＡ4、ＬＴＤ4、５−ヒドロペルオキシ−エイコサテトラエン酸および１５−ヒドロペルオキシ−エイコサテトラエン酸も、ヒトナチュラルキラー細胞の細胞毒性を高めることが示された（Rola-Pleszczynski M.et al.,Prostaglandins Leukotrienes Med.,1984,13:113；Bray R.A.et al., J.Immunol.,1986,136:1783）。
ＬＴＢ4に構造的に関連する、プロスタグランジン（プロスタグランジンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｊ、ＥおよびＩ）と総称される一群の分子が、インビトロ系およびインビボ系とも抗ウイルスおよび抗癌活性をもつことは、たびたび証明されている。プロスタグランジンはＬＴＢ4と同様にアラキドン酸から誘導されるが、異なる生合成経路、すなわちシクロオキシゲナーゼ経路に由来する。
スギウラらの名で1987年8月25日に出願された米国特許第4,689,426号には、抗腫瘍活性および抗ウイルス活性をもつ、プロスタグランジンＡまたはＤに関連するシクロペンタノン誘導体が記載されている。
若干のプロスタグランジンは抗ウイルス活性をもつことが示されたが、それらは望ましくない副作用を生じ、比較的低い活性を示した。
より高い有効性をもち、かつ既知の抗ウイルス薬がもつ望ましくない副作用を示さない抗ウイルス薬を提供することが、きわめて望ましいであろう。
発明の概要
本発明の目的のひとつは、ウイルス感染症の予防および治療に、より有効であり、かつ既知の抗ウイルス薬がもつ望ましくない副作用を示さない抗ウイルス薬を提供すること、ならびにその使用である。
本発明の他の目的は、レトロウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスのような腫瘍ウイルスにより誘発される癌の予防または治療に用いる抗ウイルス薬を提供することである。
本発明の他の目的は、免疫抑制された患者および動物におけるウイルス感染症の予防または治療に用いる抗ウイルス薬を提供することである。
本発明の他の目的は、癌の治療に用いる抗腫瘍薬を提供することである。
本発明の１態様によれば、ヒトまたは動物におけるウイルス感染症の予防または治療のための、薬理学的に許容しうる、療法上有効な量のロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）薬の使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、薬理学的に許容しうる、療法上有効な量のＬＴＢ4薬、および薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む、抗ウイルス薬組成物が提供される。
したがって本発明によれば、たとえばＥＢＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７およびＨＨＶ−８よりなる群から選択されるヘルペスウイルスに対する抗ウイルス薬としてのロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）薬の使用が提供される。
本発明によれば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する、ならびに他のヒトウイルスおよび動物ウイルスに対する抗ウイルス薬としてのＬＴＢ4薬の使用が提供される。これらのウイルスには、ピコルナウイルス科に属するブタエンテロウイルス、またはトガウイルス科に属するウシ下痢ウイルス、パラミクソウイルス科に属するウシＲＳ（respiratory syncytial）ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、ヒトおよび動物のウイルス感染症の治療における抗ウイルス薬としての、他の抗ウイルス薬と併用した、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。この、他の抗ウイルス薬には、インターフェロン−α、−β、−γ、腫瘍壊死因子α、ガンシクロビル、アシクロビル、ビダラビン、イドキシウリジン、ファムシクロビル、３ＴＣ、クリキシバン、ネバレピン、およびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン類似体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、レトロウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスのような腫瘍ウイルスにより誘発される癌の予防および治療に用いる抗ウイルス薬としての、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。
本発明によれば、腫瘍ウイルスにより誘発される癌に対する抗ウイルス薬としての、他の抗腫瘍薬と併用した、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。この、他の抗腫瘍薬には、アドリアマイシン、シクロホスファミドおよびメトトレキセートが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、免疫抑制された患者および動物のウイルス感染症の予防および治療における抗ウイルス薬としての、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。
免疫抑制された患者には、臓器または組織移植を受け、かつ免疫抑制薬で処置された患者が含まれ、免疫抑制薬にはアザチオプリン、コルチコステロイド類、アドリアマイシン、シクロホスファミドおよびメトトレキセートが含まれるが、これらに限定されない。免疫抑制された患者には、いずれかの形態の癌または腫瘍性疾患を伴い、抗腫瘍薬で処置された、または処置されていない患者も含まれ、抗腫瘍薬には、アドリアマイシン、シクロホスファミドおよびメトトレキセートが含まれるが、これらに限定されない。免疫抑制された患者には、抗炎症薬で処置された、炎症性疾患を伴う患者も含まれ、抗炎症薬には、コルチコステロイド類、メトトレキセート、アザチオプリンおよびシクロホスファミドが含まれるが、これらに限定されない。免疫抑制された患者には、ショックもしくは重症の外傷（これには火傷による外傷が含まれるが、これに限定されない）を伴う患者、または長期血液透析を受けている患者も含まれる。
本発明によれば、免疫抑制された患者および動物のウイルス感染症に対する抗ウイルス薬としての、他の抗ウイルス薬と併用した、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。
本発明によれば、癌の治療に用いる抗腫瘍薬としてのＬＴＢ4薬の使用が提供される。
本発明によれば、癌の治療に用いる抗腫瘍薬としての、他の抗腫瘍薬と併用した、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。この、他の抗腫瘍薬には、アドリアマイシン、シクロホスファミドおよびメトトレキセートが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、細菌性グラム＋および−感染症または真菌感染症に対する療法薬としての、単独での、または他の抗菌薬もしくは抗真菌薬と併用した、ＬＴＢ4薬の使用が提供される。
本発明によれば、ヒトおよび動物のウイルス感染症の予防および治療における抗ウイルス薬としての、他の薬剤と併用した、ＬＴＢ4薬の使用も提供される。この、他の薬剤には、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロン、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−３およびインターロイキン−５など、白血球を刺激してＬＴＢ4または他のアラキドン酸代謝産物（数種類のＬＴＢ4を含む）の合成を開始させることが示され、かつＬＴＢ4薬の抗ウイルス活性を高めうるものが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、ヒトおよび動物のウイルス感染症の予防または治療における抗ウイルス薬としての、レチノイドと併用した、ＬＴＢ4薬の使用も提供される。レチノイドには、９−cis−レチノイン酸および類似体（１３−cis−レチノイン酸または全trans−レチノイン酸）など、レチノイド受容体のリガンドであり、かつＬＴＢ4薬の抗ウイルス活性を高めうるものが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、ヒトおよび動物のウイルス感染症の予防および治療のための抗ウイルス薬としての、非ステロイド系抗炎症薬と併用した、ＬＴＢ4薬の使用も提供される。この非ステロイド系抗炎症薬には、Ｎ−アセチルサリチル酸、インドメタシン、イブプロフェン、フルルビプロフェンおよびナプロキセンなど、タイプＩ（構成性）およびＩＩ（誘導性）シクロオキシゲナーゼの阻害薬であり、かつヒトおよび動物におけるＬＴＢ4薬投与の潜在的副作用を制限するのに有用となりうるものが含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＢＶにより誘導されるクランプ形成にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図２は、ＥＢＶにより誘導されるエプスタイン・バール核抗原（ＥＢＮＡ）タンパク質合成にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図３は、ＥＢＶ粒子の産生にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図４は、ＨＳＶ−１により誘導される細胞質抗原合成にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図５は、ＨＳＶ−１粒子の産生にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図６は、ＨＩＶ−１感染末梢血単核細胞の逆転写酵素活性にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図７は、細胞の生存率にＬＴＢ4が及ぼす影響を示す；
図８Ａおよび８Ｂは、ＥＢＶにより誘導されるＥＢＮＡタンパク質合成（Ａ）、およびＨＳＶ−１により誘導されるウイルスタンパク質合成（Ｂ）に、ＬＴＢ4およびアシクロビルが及ぼす影響を示す；
発明の詳細な記述
ｉ）ＬＴＢ4
本発明のロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4）薬は、ＬＴＢ4もしくは構造的に関連する特定の多不飽和脂肪酸、あるいは構造的に脂肪酸と関連のない物質であって、細胞によるＬＴＢ4もしくは他のＬＴＢ4薬の合成を刺激し、またはそれらの生物学的活性を模倣するものである。それらは天然物質、またはそのような天然物質の類似体である。これらのＬＴＢ4薬はすべて、文献に記載された方法による化学合成で得ることができ、大部分は市販されている。
ＬＴＢ4薬の例は、“CRC Handbook of Eicosanoids：Prostaglandins and Related Lipids”,Anthony L. Willis（CRCプレス社、米国フロリダ州、ボカ・レイトン）中にみられる。
本明細書中で用いる“ＬＴＢ4薬”という用語は、以下の多不飽和脂肪酸１種類またはそれ以上を意味する。これらはＬＴＢ4自身のほか、ＬＴＢ4の類似体、またはＬＴＢ4もしくはＬＴＢ4類似体の前駆物質もしくは代謝産物である：ＬＴＢ4、１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＢ4、１９−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、ならびにそれらの５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ、５（Ｒ）−ヒドロペルオキシおよび５−デオキシ類似体；ＬＴＡ4；１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＡ4、１７，１８−デヒドロ−ＬＴＡ4；５（Ｓ）−ヒドロキシ−６，８，１１，１４（Ｅ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸（“５−ＨＥＴＥ”）、１４，１５−ジヒドロ−５−ＨＥＴＥ、１７，１８−デヒドロ−５−ＨＥＴＥ、ならびにそれらの５（Ｒ）−ヒドロキシ、５−ケト、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ、５（Ｒ）−ヒドロペルオキシ類似体；１２（Ｒ）−ヒドロキシ−５，８，１０，１４（Ｚ，Ｚ，Ｅ，Ｚ）−エイコサテトラエン酸（“１２−ＨＥＴＥ”）、５，６−ジヒドロ−１２−ＨＥＴＥ、１４，１５−ジヒドロ−１２−ＨＥＴＥ、１７，１８−デヒドロ−１２−ＨＥＴＥ、ならびにそれらの１２（Ｓ）−ヒドロキシ、１２−ケト、１２（Ｓ）−ヒドロペルオキシおよび１２（Ｒ）−ヒドロペルオキシ類似体;ならびに１２−オキソ−５，８，１０（Ｚ，Ｚ，Ｅ）−ドデカトリエン酸、１５（Ｓ）−ヒドロキシ−５，８，１１，１３（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｅ）−エイコサテトラエン酸（“１５−ＨＥＴＥ”）、５，６−ジヒドロ−１５−ＨＥＴＥ、１７，１８−デヒドロ−１５−ＨＥＴＥ、ならびにそれらの１５（Ｒ）−ヒドロキシ、１５−ケト、１５（Ｓ）−ヒドロペルオキシおよび１５（Ｒ）−ヒドロペルオキシ類似体。
ＬＴＢ4という用語には、多不飽和脂肪酸の他の誘導体も含まれ；あるものはシクロオキシゲナーゼ経路、リポキシゲナーゼ経路（５−、１２−および１５−リポキシゲナーゼ）、またはシトクロムＰ４５０経路に由来し；他は天然に形成される化合物の類似体または誘導体である：１２（Ｓ）−ヒドロキシ−５，８，１０（Ｚ，Ｅ，Ｅ）−ヘプタデカトリエン酸；ロイコトリエンＣ4、Ｄ4およびＥ4、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；ロイコトリエンＣ4、Ｄ4およびＥ4のＮ−アシルまたはＮ−アルキル誘導体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；５，１２−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４,１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体;５，６−ジヒドロキシ−７，９，１１，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；５，１５−ジヒドロキシ−６，８，１１，１３−エイコサテトラエン酸のすべての異性体（５（Ｓ），１５（Ｓ）−ジヒドロキシ−６，８，１１，１３（Ｅ，Ｚ，Ｚ，Ｅ）−エイコサテトラエン酸を含む）、ならびにそれらの１７，１８−デヒドロ類似体；８−ヒドロキシ−１１（１２）−エポキシ−５，９，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体（ヘポキシリンＡ3を含む）、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１０−ヒドロキシ−１１（１２）−エポキシ−５，８，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体（ヘポキシリンＢ3を含む）、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；８，１１，１２−トリヒドロキシ−５，９，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体（トリオキシリンＡ3を含む）、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１０，１１，１２−トリヒドロキシ−５，８，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体（トリオキシリンＢ3を含む）、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１１（１２）−エポキシ−５，７，９，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１１，１２−ジヒドロキシ−５，７，９，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；８（９）−エポキシ−５，１０，１２，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；８，９−ジヒドロキシ−５，１０，１２，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；８，１５−ジヒドロキシ−５，９，１１，１３−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１４（１５）−エポキシ−５，８，１０，１２−エイコサテトラエン酸のすべ��の異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１４，１５−ジヒドロキシ−５，８，１０，１２−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；５−ヒドロキシ−１４（１５）−エポキシ−６，８，１０，１２−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１７，１８−デヒドロ類似体；５，１４，１５−トリヒドロキシ−６，８，１０，１２−エイコサテトラエン酸のすべての異性体（リポキシンＢ4を含む）、ならびにそれらの１７，１８−デヒドロ類似体；５，６，１５−トリヒドロキシ−７，９，１１，１３−エイコサテトラエン酸のすべての異性体（リポキシンＡ4を含む）、ならびにそれらの１７，１８−デヒドロ類似体；５（６）−エポキシ−１５−ヒドロキシ−７，９，１１，１３−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１７，１８−デヒドロ類似体；５−ヒドロキシ−６，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；８−ヒドロキシ−５，９，１１，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；９−ヒドロキシ−５，７，１１，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１１−ヒドロキシ−５，８，１２，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１２−ヒドロキシ−５，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１５−ヒドロキシ−５，８，１１，１３−エイコサテトラエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸のすべての異性体；１３−ヒドロキシ−９，１１−オクタデカジエン酸のすべての異性体；１２（Ｒ）−ヒドロキシ−５，８，１４（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−エイコサトリエン酸；５（６）オキシド−または５，６−ジヒドロキシ−８，１１，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；８（９）オキシド−または８，９−ジヒドロキシ−５，１１，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１１（１２）オキシド−または１１，１２−ジヒドロキシ−５，８，１４−エイコサトリエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１４，１５−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体；１４（１５）オキシド−または１４，１５−ジヒドロキシ−５，８，１１−エイコサトリエン酸のすべての異性体、ならびにそれらの５，６−ジヒドロまたは１７，１８−デヒドロ類似体。
ＬＴＢ4という用語には、ＬＴＢ4薬のナトリウム塩またはカリウム塩のような非共有結合修飾された脂肪酸である変異体も含まれる。
ＬＴＢ4という用語には、脂肪酸の標的官能基を、その選択した官能基と反応しうる（たとえばＬＴＢ4薬のエステルおよびエーテル誘導体を与える）、または分子内転位（たとえばヒドロキシル化脂肪酸とのラクトンの形成）を起しうる有機誘導体化剤と反応させることにより、その分子に修飾を導入した変異体も含まれる。得られた化合物は、変異した生物学的活性および／または生物学的利用能をもつ可能性がある。たとえば共有結合修飾された脂肪酸は、インビボ投与した際に徐々に、より活性な分子（誘導体化していないＬＴＢ4薬）に変換される、生物学的活性の低下したプロドラッグであってもよい。変異体は、化合物の処理が遅延するように（代謝および／または排出の低下）変化させた、代謝的に安定で、かつ生物学的に活性なＬＴＢ4薬類似体であってもよい。オメガ末端が修飾された変異体（たとえば２０，２０，２０−トリフルオロメチル−ＬＴＢ4）は、オメガ酸化（不飽和脂肪酸の異化プロセス）に対する抵抗性の増大を示す；炭素１３〜２０の位置においてオメガ末端修飾された他の変異体（たとえば１９−メチル−ＬＴＢ4もしくは１９，１９−ジメチル−ＬＴＢ4、または１９−フルオロ−ＬＴＢ4もしくは１９，１９−ジフルオロ−ＬＴＢ4、または１８，２０−ジフルオロ−ＬＴＢ4もしくは２０−フルオロ−ＬＴＢ4）はオメガ酸化に対する抵抗性の増大を示すであろう；カルボキシル末端の炭素１、２、３または４の位置が修飾された変異体（たとえば３−チオ−ＬＴＢ4、３−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、３−メチル−ＬＴＢ4もしくは３，３−ジメチル−ＬＴＢ4、または３−フルオロ−ＬＴＢ4もしくは３，３−ジフルオロ−ＬＴＢ4もしくは２,３−ジフルオロ−ＬＴＢ4、ＬＴＢ4メチルスルホニルアミド、ＬＴＢ4メチルアミド、１−テトラゾールＬＴＢ4）は、β−酸化および／または排出（たとえばプロベネシド感受性有機酸伝達物質による取込み）に対する代謝抵抗性の増大を示すであろう。炭素１２の位置が修飾された他の変異体、たとえば１２（Ｒ）−メチル−ＬＴＢ4は、１１，１２二重結合の還元（ＬＴＢ4の代謝経路）に対する抵抗性の増大を示すであろう。他の変異体は、たとえば以下の構造変化を伴うＬＴＢ4薬類似体である：鎖長の変化（鎖長が最高で炭素４個増加または減少）、二重結合（１またはそれ以上）の付加、二重結合（１またはそれ以上）の飽和、二重結合（１またはそれ以上）の幾何学的構造の変化（シスからトランスへ、またはその逆）、二重結合（１またはそれ以上）から三重結合（１またはそれ以上）への変化、１個または数個の官能基の立体配置の変化（ＲからＳへ、またはＳからＲへ）、あるいは１個または数個の官能基または置換基が除去され、付加し、または他の官能基もしくは置換基（ヒドロペルオキシ、カルボニル、スルフヒドリル、スルホキシド、スルホン、システイニル、グルタチオニル、システイニル−グリシン、メチル、イソプロピル、ベンジル、クロロ、フルオロ）に変化した場合、１個もしくは数個の官能基および／または１個もしくは数個の二重結合が、オメガ末端に対し炭素１、２、３個分移動した場合。ＬＴＢ4は、上記の構造修飾を１個または数個もつ変異体であってもよい。
ＬＴＢ4薬およびＬＴＢ4薬変異体はＬＴＢ4と構造的に関連し、種々の白血球（および他の細胞タイプ）上に存在する細胞表面ＬＴＢ4（または他の関連エイコサノイド；５−ＨＥＴＥ、ＬＴＤ4、リポキシンＡ4を含むが、これらに限定されない）結合部位に、またはＬＴＢ4の核結合部位である転写因子ＰＰＡＲα（ペルオキシソームプロリフェレーター活性化受容体α）（Devchand P.R., et al.,Nature 384:39,1996）に、または他の未知のＬＴＢ4結合部位に、異なる親和性で結合し、または結合する可能性があり、その結果、ＬＴＢ4およびＬＴＢ4薬の生物学的活性を発現する。ＬＴＢ4薬および変異体は、ＬＴＢ4のものと質的に類似する生物学的活性（ただしＬＴＢ4自身より活性が高いか、または低い）を示し、または示す可能性があり、したがってＬＴＢ4のものと類似の抗ウイルス活性を及ぼすと期待できる。ＬＴＢ4薬およびその変異体は、本発明の範囲に含まれる。
ＬＴＢ4薬という用語には、構造的にＬＴＢ4と関連がないものも含まれる。これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：走化性ペプチドであるホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）（および類似体、たとえばＮ−ホルミル−ｎｌｅ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、Ｎ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ−ベンジルアミド、Ｎ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ−メチルエステル、およびＮ−ホルミル−Ｎｌｅ−ｌｅｕ−ｐｈｅ−ｎｌｅ−ｔｙｒ−ｌｙｓ）、相補体フラグメントＣ５ａおよび類似体、ならびに生物学的活性リン脂質である血小板活性化因子、すなわち１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ならびに類似体、たとえば１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよび１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｎ−メチルカルバミル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）；これらは、細胞において不飽和脂肪酸（おもにアラキドン酸）の放出、結果的には１種類または数種類のＬＴＢ4薬の形成を、刺激し、または刺激する可能性があり、したがってＬＴＢ4のものと類似の抗ウイルス活性を示す可能性がある。したがって、構造的にＬＴＢ4と関連がない上記のＬＴＢ4薬は、本発明の範囲に含まれる。
ＬＴＢ4薬という用語には、２種類もしくは数種類のＬＴＢ4薬の混合物、または１種類のＬＴＢ4薬と、１種類または数種類の、同等もしくはより低い活性をもつＬＴＢ4薬異性体（位置、幾何、または光学異性体）との混合物を含有しうる配合物も含まれる。
ＬＴＢ4薬という用語には、ＬＴＢ4受容体に対する抗体、またはＬＴＢ4もしくは上記のＬＴＢ4類似体もしくは変異体のいずれかに対し形成された抗体に対する抗イディオタイプ抗体も含まれる。これらはＬＴＢ4様の生物学的反応、たとえば抗ウイルス作用を示すと期待できる。
ｉｉ）ウイルス感染症
本発明に従ってＬＴＢ4で処理できるウイルス感染症は、ヒトウイルスおよび／または動物ウイルスで起きる感染症である。
“ヒトウイルスおよび／または動物ウイルス”という表現は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルス全般ならびにレトロウイルス科を含むものとするが、これは限定ではない。ＤＮＡウイルスには、パルボウイルス科、パポーバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科およびヘパドナウイルス科が含まれる。ＲＮＡウイルスには、ピコルナウイルス科、トガウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、レオウイルス科、オンコルナウイルス科およびフィロウイルス科が含まれる。
２種類のヘルペスウイルス、ＥＢＶおよびＨＳＶ−１に対する、ならびにＨＩＶに対するＬＴＢ4の抗ウイルス活性を調べた。ヒト末梢血単核細胞を種々の濃度のＬＴＢ4の存在下または不在下で計数した。１０〜１２日の培養後、２パラメーターを評価した：クランプまたはロゼットの形成、これはＥＢＶ感染細胞の形態学的特徴である；およびエプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）、すなわちＥＢＶ感染細胞内で合成されるウイルス抗原の存在。得られた結果は、ＬＴＢ4がクランプ形成に顕著な影響を与えることを示す。同様に、ＥＢＮＡ陽性細胞の割合は、３０ｎＭ  ＬＴＢ4で５６％以上、１００ｎＭの濃度で７０％以上、著しく低下した。ＨＳＶ−１およびＨＩＶ−１についても同様な結果が得られた。事実、細胞培養物中にＬＴＢ4（１００ｎＭ）が存在すると、特異的ＨＳＶ−１抗原の合成が６０％以上、著しく阻害され、ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣにおいて逆転写酵素活性が７０％以上抑制された。興味深いことに、すべての細胞培養物において細胞の生存率は、同一期間培養した刺激していない細胞（対照）のものに匹敵した。これは、ＬＴＢ4が細胞に直接的細胞毒性を及ぼさないことを示す。さらに、ＬＴＢ4はＢ９５−８細胞において新たなＥＢＶ粒子の形成を阻害する（＞８０％）ことが見出された。この作用は、ＨＳＶ−１（７５％の阻害）およびＨＩＶ−１（＞５５％の阻害）についても、それぞれベロ細胞およびＪ１．１細胞を用いてみられた。インビボ実験モデル（ヌードマウス）において、ＨＳＶ−１接種により生じた皮膚病変は、ＬＴＢ4（１０μｇ、腹腔内）で処理した動物の方がより小さく、より速やかに消失した。これらの結果は、ＬＴＢ4がきわめて有効な抗ウイルス作用をこれら２種のヘルペスウイルスおよびＨＩＶ−１に及ぼし、かつインビボで、感染していない細胞に対する細胞毒性なしに、ＨＳＶ−１に対する防御作用を発揮することを明らかに示す。
若干のＬＴＢ4薬（ＬＴＢ4自身以外）を試験し、ＨＳＶ−１またはＥＢＶにインビトロで抗ウイルス作用を及ぼすことを見出した。細胞培地に添加した場合（インキュベーション期間７日目から１０日目まで、１００ｐｍｏｌ／ｍｌを連続４回添加）、ＬＴＢ4薬２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ4、１２（Ｒ）−ＨＥＴＥ、１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＢ4メチルエステル、およびＮ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅは、末梢血単核白血球のＨＳＶ−１感染（ＨＳＶ−１抗原の存在により評価）、またはベロ細胞におけるＨＳＶ−１粒子の産生を、４０％以上阻害した。同じ実験で、１０倍高い濃度で用いた抗ウイルス薬アシクロビルが同様な作用を示した。ＬＴＢ4薬である５（Ｓ），１５（Ｓ）−ジヒドロキシ−６，８，１１，１３−（Ｅ，Ｚ，Ｚ，Ｅ）−エイコサテトラエン酸（５，１５−ジＨＥＴＥ）、１４，１５−ジヒドロ−ＬＴＡ4メチルエステル、ＬＴＢ4メチルエステル、およびＮ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅは、末梢血単核白血球のＥＢＶ感染（ＥＢＶ抗原ＥＢＮＡの存在により評価）、またはＢ９５−８細胞におけるＥＢＶ粒子の産生を、４０％以上阻害した。ＬＴＢ4薬の抗ウイルス作用機序は分かっていないが、若干のＬＴＢ4薬、特に、ＬＴＢ4の細胞膜受容体の弱いアゴニストである５，１５−ジＨＥＴＥにつきみられた抗ウイルス活性は、ＬＴＢ4薬の作用部位が細胞表面のＬＴＢ4受容体ではなく、むしろＬＴＢ4の細胞内（核）結合部位である転写因子ペルオキシソームプロリフェレーター活性化受容体（ＰＰＡＲα）であることを示唆する。事実ＰＰＡＲαは、不飽和脂肪酸、血中脂質低下薬（hypolipidemic agent）（フィブレート類）、グルココルチコイド、プロスタサイクリン（ＰＧＩ2）の安定類似体イロプロスト（Iloprost）、および生体内異物を含めた、多様な親油性分子に関与することが知られており、これはＰＰＡＲα結合分子−リガンド相互作用の選択性が比較的低いことを示す。したがって、ＬＴＢ4の近縁構造類似体である５，１５−ジＨＥＴＥのような親油性化合物（両化合物ともアラキドン酸のジヒドロキシル化誘導体である）も、ＰＰＡＲαのリガンドであるらしいと思われる。事実、ＬＴＢ4に構造的に関連する広範な不飽和脂肪酸がＰＰＡＲαに結合しうると思われる。ＰＰＡＲ類は、脂質代謝（脂肪酸分解を含む）に関与する多数の酵素の発現を制御し、したがって脂質の恒常性を制御する、一群の転写因子を構成する。ウイルスの複製は脂質含有構造体（キャプシド、エンベロープ）の形成を意味するので、ＬＴＢ4薬によるＰＰＡＲαの活性化は、ウイルスの集合プロセスを妨害することにより抗ウイルス作用を発揮すると思われる。Steinhart W.L.,et al.（Vilorogy 70:241,1976）およびMehl J.K.,et al.（Antimicrob.Agents Ch.18:269,1980）が、ＨＳＶ−１に対するインビトロでのクロフィブレートおよびプロセトフェン（ＰＰＡＲαを活性化することが知られている２種類の血中脂質低下薬）の抗ウイルス活性を先に報告したのは興味深い。しかし、ＰＰＡＲαにＬＴＢ4薬が結合して活性化したことにより、まだ未知の細胞事象が開始され、その結果抗ウイルス活性を生じたという可能性があるのは、依然として明らかである。さらに、ＬＴＢ4薬が他の転写因子（１種類またはそれ以上）に結合して活性化���た可能性も除外されない。
ガンシクロビルがウイルス複製のインビトロアッセイで１および２．４μＭのＩＣ50値（それぞれＥＢＶおよびＨＳＶ）をもつことが示されたのは、注目すべきである（Matthews and Boehms,Rev.Inf.Dis.,1988,10,suppl.3:490）。予備的比較試験では、インビトロでＬＴＢ4はアシクロビルと比較して有効な抗ウイルス活性を発揮することが示される。さらに高い抗ウイルス活性をもつ分子または生物学的利用能が増大した分子（たとえば親油性の増大、またはインビボでの代謝に対する抵抗性の増大）を得るために、ＬＴＢ4の構造を修飾することが可能である。
したがってこれらの結果は、ＬＴＢ4がヒトおよび動物においてウイルス感染症の処置に有用であることを示す。これらのデータは、ＬＴＢ4が３種のウイルスに抗ウイルス活性を及ぼし、したがって単一タイプのウイルスに特異的ではないことを示すので、いかなるタイプのウイルスにより起きるウイルス感染症の処置にも有用であると期待される。
プロスタグランジン（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｊ、ＥおよびＩ）は、インビトロで試験した場合に、モル基準でＬＴＢ4より活性が低いことが認められた。
iii）用量範囲
療法上有効なＬＴＢ4薬投与量は、用いる個々のＬＴＢ4薬、投与の種類や様式、他の有効化合物の併用、宿主の年齢および体格、感染症のタイプ、程度および拡散度、個々の患者の反応などに応じて異なるであろう。ＬＴＢ4の場合、それはインビトロ実験（実施例Ｉ〜ＩＶ参照）で有効であると認められたＬＴＢ4濃度により示唆されるように、血漿中に約１〜１０００ｎＭ、通常は約２００ｎＭの有効ピーク濃度または定常状態濃度を得るのに十分な用量で投与されるであろう。したがってＬＴＢ4薬の有効用量は、医師が上記の基準すべてを考慮した後に決定する。ＬＴＢ4以外の異なる生物学的活性をもつＬＴＢ4薬の場合、必要なピーク濃度または定常状態濃度は、たとえば最高１０μＭ異なる可能性がある。希望する血中濃度を得るのに必要な薬剤投与量は、Marleau et al.,J.Immunol.150:206,1993およびMarleau et al.,Br.J.Pharmacol.112:654,1994に記載される薬物動態試験により判定できる。
ｉｖ）薬剤組成物
哺乳動物、特にヒトに、有効用量の本発明のＬＴＢ4薬を与えるためには、適した投与の種類や様式をいずれも採用できる。たとえば経口法、非経口法および局所法を採用できる。投与形態には、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、分散液剤、懸濁液剤、クリーム剤、軟膏剤およびエーロゾル剤が含まれる。
本発明の薬剤組成物は、有効成分としてのＬＴＢ4薬、および薬剤学的に許容しうるキャリヤー、ならびに所望により他の療法成分を含む。
ＬＴＢ4薬はインビボにおいて多様な様式で使用できることを認識すべきである。それは、薬剤学的に有用な組成物を調製する既知の方法のいずれかに従って配合して、薬剤組成物にすることができる。この様式では、上記脂肪酸を薬剤学的に許容しうるキャリヤーベヒクルと混和する。ヒトタンパク質、たとえばヒト血清アルブミンを含めた、適するベヒクルおよびそれらの配合物は、たとえばRemington’s Pharmaceutical Sciences（第16版、Osol,A.編、マック、ペンシルベニア州イーストン[1980]）に記載されている。有効な投与に適した薬剤学的に許容しうる組成物を調製するために、それらの組成物は療法上有効な量または抗ウイルス活性を生じる量のＬＴＢ4薬を、適した量のキャリヤーベヒクルと共に含有するであろう。抗ウイルス作用に要する量は、インビボ薬理学試験により判定できる。
ＬＴＢ4薬は、静脈内または動脈内投与に適した、療法用無菌薬剤組成物として配合できる。製品は、無溶剤形であって、使用するためには、適したキャリヤーまたは希釈剤の添加により再構成しうるものであってもよい。あるいはそれは水性または有機の液剤の形であってもよい。
本発明による無溶剤製品を再構成するためには、無菌希釈剤を使用することができ、これは生理学的条件に近似させるために一般に認められている物質を含有してもよい。この様式では、無菌希釈剤は生理学的に許容しうる張性およびｐＨを達成するための塩類および／または緩衝剤、たとえば塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ならびに／あるいは生理学的に許容しうる、および／または使用するのに安全な、他の物質を含有してもよい。
水溶液として用いる場合、薬剤組成物は大部分は無溶剤製品の再構成用として上記に述べたものと同じ物質の多くを含有するであろう。有機溶剤中の溶液として用いる場合、上記脂肪酸を含有する小容量の溶液が、無溶剤製品の再構成用として上記に述べたものと同じ物質の多くを含有する水溶液で希釈されるであろう。したがって、薬剤組成物は大部分が無溶剤製品の再構成用として上記に述べたものと同じ物質の多くを含有するであろう。
本発明方法に有用なＬＴＢ4薬は、たとえば注射用無菌液剤の形で使用でき、あるいはより緩慢な持続性放出のために、封入する（たとえばリポソーム内に）か、または包埋する（たとえば坐剤中に）ことができる。
ＬＴＢ4薬は、他の薬剤と併用できる。これには抗ウイルス薬、抗癌薬、免疫抑制薬、抗炎症薬、サイトカイン、レチノイド、およびＬＴＢ4薬の取込み、排出または代謝を低下させうる化合物、たとえばプロベネシドまたはクロフィブレートが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のＬＴＢ4薬を抗ウイルス薬として宿主に投与する場合、その薬剤をたとえば動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内に、注射、坐剤などにより投与できる。大部分のＬＴＢ4薬剤が高価であり、それらは安定であるので、投与量をより良く制御しうるためには、ＬＴＢ4の注射が本発明組成物を患者に投与するための最も有利な形態である。注射による投与方式には、連続注入および１回または多数回のボーラスも含まれる。若干のＬＴＢ4薬の循環における半減期が短いことを考えると（Marleau et al.,Br.J.Pharmacol.112:654,1994）、それらを１回または多数回のボーラスとして投与することは、薬剤類が同時に利用されること、あるいはＬＴＢ4薬の排出を遅延させ、および／またはその代謝を阻害するためには、循環における半減期が長いＬＴＢ4薬類似体を使用することを暗示する。有用な投与の種類や様式には、血管または種々の部位、たとえば腹腔もしくは皮下に連続注入するための埋込み式体内ポンプの使用も含まれる。そのような手法は肝癌の処置に関してCecil’s Text Book of Medicine（164章、第19版、1992）に示されている。ＬＴＢ4薬を含有するパッチによる経皮投与も、有用な投与様式であろう。
作用期間を制御するために、他の薬剤学的方法も採用できる。たとえば、高分子を利用して薬剤と複合体形成させ、または薬剤を吸収させることにより、制御放出製剤を得ることができる。制御送達は、適切な高分子（たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンまたは血清アルブミン）、適切な高分子濃度および取込み方法の選択により達成できる。この方法で、薬剤の放出を制御できる。
制御放出製剤により作用期間を制御するのに有用な他の可能な方法は、薬剤を高分子材料、たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレン−酢酸ビニルコポリマーの粒子に取り込ませるものである。
本発明の脂肪酸をポリマー粒子に取り込ませる代わりに、たとえばコアセルベーション法または界面重合法により調製したマイクロカプセル中（たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリメタクリル酸メチルのマイクロカプセル）、コロイド状の薬剤送達システム（たとえばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルション中に、これらの物質を封入することもできる。これらの方法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（第16版、Osol,A.編、マック、ペンシルベニア州イーストンロ[1980]）に記載されている。
組成物には、経口投与または非経口投与に適した組成物が含まれる。それらは単位用量剤形で提供するのが好都合であり、薬剤技術分野で周知のいずれかの方法により調製される。
実際に使用する際には、ＬＴＢ4薬を薬剤用キャリヤーとの密な混合物中の有効成分として、従来の薬剤配合技術に従って混和することができる。キャリヤーは、投与のために希望する剤形に応じて、多様な形態をとることができる。経口投与剤形の組成物を調製する際には、通常のいかなる薬剤用媒体も使用できる。たとえば経口液体製剤、たとえば懸濁液剤、エリキシル剤および液剤の場合は、水、グリコール、油、アルコール類、着香剤、保存剤、着色剤など；経口固体製剤、たとえば散剤、カプセル剤および錠剤の場合は、デンプン、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのキャリヤーが用いられる。所望により、錠剤を標準的な水性法または非水性法でコーティングしてもよい。
経口投与に適した本発明の薬剤組成物は、カプセル剤、カシェ剤または錠剤のようなそれぞれ予め定めた量のＬＴＢ4薬を含有する独立した単位として、散剤もしくは顆粒剤として、または水性液剤、非水性液剤、水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として提供できる。これらの組成物はいかなる調剤法でも調製できる。このような方法には、必要な成分１種類またはそれ以上を含有するキャリヤーとＬＴＢ4薬を混和する工程が含まれる。一般に組成物は、ＬＴＢ4薬を液体キャリヤーもしくは微細な固体キャリヤーまたは両方と均一かつ密に混合し、次いで必要ならば調製物を希望する形に造形することにより製造される。たとえば錠剤は、所望により１種類またはそれ以上の補助成分と共に圧縮または成形することにより製造できる。圧縮錠剤は、所望により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒のような流動性の形態の有効成分を、適した機械で圧縮することにより製造できる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末状化合物の混合物を、適した機械で成形することにより製造できる。
ＬＴＢ4薬を薬剤学的または生理学的に許容しうる量で投与すべきであることは理解されるであろう。これは、患者に有害でない量、または各患者に有害な副作用がある場合は有用性の方がまさる量であると理解すべきである。また、ＬＴＢ4薬を療法上有効な量で投与すべきである。これは、意図する療法目的に適合する量、およびＬＴＢ4薬の投与により得られる有用性を与える量であると解すべきである。
本発明は以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。実施例は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を説明するために提示される。
実施例Ｉ
末梢血単核細胞におけるＥＢＶ誘発性のクランプ形成およびＥＢＮＡ合成のアッセイ
クランプ形成
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナーから、Boyum A.（Scand.J.Immunol.,1976,5（5）:9）が先に記載したようにデキストラン沈降およびフィコール−パク（Ficoll-Paque、商標）密度勾配上で遠心分離した後に得られた。１０％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に、ウイルス力価１０7トランスフォーミング単位（ＴＦＵ）／ｍｌの感染性ＥＢＶ株Ｂ９５−８の存在下で、細胞を再懸濁した。指示した場合、ＥＢＶ感染ＰＢＭＣを、種々の濃度、すなわちそれぞれ０．３、３．０および３０ｎＭのＬＴＢ4で同時に処理した（１回添加）。９６ウェルのミクロプレートで、細胞（１０6個／ｍｌ、ウェル当たり２００μｌ）を１２日間培養し、ＥＢＶ感染細胞を特徴づけるクランプ形成を倒立顕微鏡（１００倍）で評価した（図１）。
細胞をミクロプレートで培養し、各ウェルのクランプを計数した。結果は、他の２実験を代表する１実験におけるウェル当たりの平均クランプ数＋標準偏差を示す。ＮＳ：刺激していない細胞。
エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）の検出
同様な実験で、ＰＢＭＣにＥＢＶを感染させ、ＬＴＢ4（カスケード・バイオケム（Cascade Biochem）社、英国バークシャー）の存在下（ＬＴＢ4を図２に示した濃度になるまで、培養０、３、６および９日目に添加した）または不在下で培養した。１０日間の培養後、ＥＢＶ感染の結果であるエプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）の存在を調べるために、細胞を収集した。細胞スミアの調製、固定、および抗−補体免疫蛍光（ＡＣＩＦ）試験によるＥＢＮＡ測定を、Reedman B.M. and Klein G.（Int.J.Cancer,1973,11:499）の記載に従って行った。スミアは、洗浄細胞の濃厚懸濁液（２×１０6個／ｍｌ）５０μｌを清浄なスライド上に広げ、風乾し、冷アセトン（−２０℃）中で１０分間固定することにより調製された。ＥＢＶセロポジティブドナーから得たヒト血清（５０μｌ）を補体源として用いた。スライドを室温で加湿チャンバー内において４５分間インキュベートした。次いでスライドをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、５０μｌのフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ、“異性体Ｉ”）−共役ヤギＩｇＧ画分抗ヒト補体Ｃ３（カッペル・リサーチ・プロダクツ（Cappel Research Products）、ノースカロライナ州ダーラム）により、室温で加湿チャンバー内において６０分間染色した。スライドをＰＢＳ中で洗浄し（３回）、ＰＢＳ：グリセリン  １：１中に封入し、検査した。陽性対照および陰性対照としては、それぞれＲａｊｉ細胞およびＵ９３７細胞を用いた。ＥＢＮＡ陽性細胞の割合は、３０ｎＭ  ＬＴＢ4で５５％以上、１００ｎＭ  ＬＴＢ4で７０％以上低下した（図２）。図２に示した結果は、他の６実験の代表である。ＥＢＶに暴露しなかった細胞は、検出可能なＥＢＮＡ抗原を示さなかった。
ＥＢＶ粒子の合成
ＬＴＢ4が新たに合成されるウイルス粒子の産生に及ぼす影響を評価するために、Ｂ９５−８細胞（その中でＥＢＶが複製する）をＬＴＢ4（図３に示した濃度になるまで、０、５および１０日目に）の存在下または不在下で、１４日間培養した。１０％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で細胞を増殖させた。細胞の生存率が２０％未満になった時点で、無細胞上清を収集し、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターでろ過し、ウイルス粒子をさらに超遠心分離により濃縮した（３８，０００×ｇ、１６０分、４℃）。ウイルス力価をＰＢＭＣ上でのＡＣＩＦ試験により測定し、１ｍｌ当たりのトランスフォーミング単位（ＴＦＵ／ｍｌ）で表した。次いでＰＢＭＣにこれら種々の濃度のＥＢＶ調製物を感染させ、免疫蛍光法（ＡＣＩＦ試験）によりＥＢＮＡの存在を評価した。ＥＢＮＡ抗原陽性細胞の低下（それぞれ７０％および８５％）により示されるように、ＥＢＶ粒子の産生は、３０ｎＭおよび１００ｎＭのＬＴＢ4で強く阻害された（図３）。図３に示した結果は、他の３実験の代表である。
実施例ＩＩ
末梢血単核細胞のＨＳＶ−１感染のアッセイ
特異的ＨＳＶ−１抗原の検出
ＰＢＭＣに、１０7／ｍｌのＴＣＩＤ50においてＨＳＶ−１（マッキンタイヤ（McInTyre）株）を感染させ、実施例Ｉの記載に従って、種々の濃度のＬＴＢ4で処理し（ＬＴＢ4を図４に示した濃度になるまで、０、２および４日目に添加）、または処理しなかった。５日間の培養後、モノクローナル抗体（Ｈ６２）（イムノコープ（ImmunoCorp）、カナダ、モントリオール）を用いて免疫蛍光法により、感染細胞の細胞質中で合成された特異的ＨＳＶ−１関連抗原の存在を評価した。ウイルス抗原の合成は、１００ｎＭ  ＬＴＢ4の存在下では６０％阻害された（図４）。図４に示した結果は、他の５実験の代表である。免疫蛍光アッセイにおいて、特異的抗血清（慢性感染ドナーからのもの）を用いて、同様な結果（阻害率７５％）を得た。
ＨＳＶ−１粒子の合成
ＬＴＢ4がＨＳＶ−１粒子の合成に及ぼす影響を評価するために、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣから入手）を用いて実験を行った。１０％の熱不活性化したＦＢＳを補充したＭ−１９９培地（ギブコ）中で細胞を増殖させた。細胞が８０％集密状態になった時点で、上清を捨て、２％の熱不活性化したＦＢＳを補充したＭ−１９９培地（ギブコ）中のＨＳＶ−１（１０7／ｍｌのＴＣＩＤ50）を、付着している細胞に感染させ、ＬＴＢ4で処理し（ＬＴＢ4を図５に示した濃度になるまで、０、１および３日目に添加）または処理しなかった。５日間の培養後、無細胞上清を収集し、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターでろ過し、ウイルス粒子をさらに超遠心分離により濃縮した（３８，０００×ｇ、１６０分、４℃）。濃縮ウイルス調製物をＭ−１９９培地に懸濁した。次いで新たに培養したＶｅｒｏ細胞にこれら種々のＨＳＶ−１調製物を感染させ、特異的抗血清またはＨ６２モノクローナル抗体を用いる免疫蛍光法により、感染細胞の割合を評価した。ＨＳＶ−１抗原陽性Ｖｅｒｏ細胞の低下（それぞれ６０％および７０％）により示されるように、ＨＳＶ−１粒子の合成は、培養物中３０ｎＭおよび１００ｎＭのＬＴＢ4の存在下で強く阻害された（図５）。図５に示した結果は、他の４実験の代表である。ＰＢＭＣに感染させることにより同様な結果が得られた。
インビボでのＨＳＶ−１感染のアッセイ
ＬＴＢ4の抗ウイルス作用をインビボの実験でも評価した。これらの試験では、実験モデル無毛マウス（ＳＫＨＩ系統、チャールズ・リバーズ（Charles Rivers）から入手、５〜６週齢の雌）を用いた。エタノール中のＬＴＢ4原液（カスケード・バイオケム社、英国バークシャー）を、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過した。０．０１％ＢＳＡを含有するＮａＣｌ  ０．９％＋グルコース５％（５０：５０，Ｖ／Ｖ）中に、１０μｇ／１００μｌの濃度のＬＴＢ4希釈液を調製した。
ウイルス接種のためにマウスを固定し、マウス背面の小領域を２７ゲージの針で網目模様に６回引掻いた。引掻いた皮膚領域に４０μｌのウイルス懸濁液（ＨＳＶ−１株Ｅ−３７７、１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌ）を付与し、このウイルス懸濁液をプラスチック片で皮膚に２０秒間こすりつけた。ウイルス接種により誘発された感染は、皮膚病変を生じた。これは接種部位には接種後３日目に既にみられ、幅４〜５ｍｍの帯状に、まずマウスの側面へ、次いで腹側へ進行した。病変は一般に接種後５〜６日目に完全に発現し、脊椎領域から腹中央部へ広がる連続した帯を形成した。ＨＳＶ−１感染マウスは後足炎症、痩せなどの症状も発現し、活動度の低下（し眠）も示した。このモデルでは、動物はＨＳＶ−１接種後脳炎により死亡する可能性がある。
ＬＴＢ4を、ウイルス接種の直前（０日目）、ならびに接種後１、３、５、７および９日目に腹腔内注射した（マウス１匹当たり１００μｌ、１ｍｌの注射器および２３ゲージの針を使用）。マウスを５匹の群で収容した。これらの群（各群５匹）は、１）接種していないマウス（これらの動物の背面の小領域を引掻き、４０μｌのＭＥＭ培地をこすりつけた）、２）ＨＳＶ−１を接種し、ＮａＣｌ：グルコース＋０．０１％ＢＳＡを腹腔内注射したマウス、および３）ＨＳＶ−１を接種し、ＮａＣｌ：グルコース＋０．０１％ＢＳＡに溶解したＬＴＢ4を腹腔内注射したマウスからなっていた。１日２回、マウスを皮膚病変の測定、他の症状および致死率の評価のために観察した。
得られた結果は、ＬＴＢ4がインビボでＨＳＶ−１感染に対し保護作用を及ぼすことを示す。表１に示したように、感染していない動物（１群）は正常な挙動を示し、１４日間生存し続けた；皮膚の引掻きにより起きた病変は３または４日以内に消失した。ＨＳＶ−１感染動物（２群）は病変（前記）を発現し、これは４日目から８日目が最大（長さ）であった；この同じ期間中、この群のマウスは後足炎症、痩せを示し、活動度がより低く、取り扱う際にほとんど動かなかった。ＨＳＶ−１感染およびＬＴＢ4処理した動物（３群）では、０日目から４日目までは同様に病変が発現したが、２群の動物にみられたものよりはるかに小さく（約８０％）、８日目から退行した。さらに、実験期間中、１群の動物と同様に、後足炎症および痩せはみられず、動物の一般状態に減退は認められず、ケージ内および取り扱う際に活発さを維持した。すべての動物が実験期間中、生存した；すべての動物を１４日目に屠殺した。
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実施例III
末梢血単核細胞のＨＩＶ−１感染のアッセイ
ＨＩＶ−１感染に対するＬＴＢ4の抗ウイルス性も評価した。
ＨＩＶ−１感染細胞の逆転写酵素活性
ＰＢＭＣを１０6個／ｍｌの密度で培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁し、３μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）および３０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２の存在下に、３７℃で２〜３日間、５％ＣＯ2雰囲気下で培養した。ＰＨＡ刺激したＰＢＭＣを１×１０6個／ｍｌに再懸濁し、ＬＴＢ4の不在下または漸増する濃度のＬＴＢ4（０、３０、１００および２００ｎＭ）の存在下でＨＩＶ−１IIIBを感染させた（種々多様な感染：感染性ウイルス粒子数／標的細胞）。培地を週２回交換し、培地交換ごとに適量のＬＴＢ4を添加した。無細胞培養上清を、アッセイするまで一定期間凍結した。ウイルスの複製を、逆転写酵素アッセイ法またはｐ２４アッセイ法により監視した。
短期間感染させた細胞からウイルス原液を調製した。要約すると、モルト（Molt）４、クローン８に、ＨＩＶ−１IIIBを感染させた。ウイルス産生が最大となった時点で、広範な細胞変性効果がみられる前に、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、ウイルスを含有する上清を２０００×ｇで３０分間澄明化し、０．４５μｍ酢酸セルロース膜でろ過して細胞片を除去した。次いでウイルスを含有する上清をアリコートずつ−８０℃で貯蔵した。高感受性ＭＴ−４細胞系を用いた終点希釈ミクロアッセイにより、感染性の測定を行った。
逆転写酵素アッセイ法
１０μｌの溶液Ａ（５ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％トリトン（Triton）Ｘ−１００）および４０μｌの溶液Ｂ（５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ  ＥＧＴＡ、０．０４ｍｇポリ（ｒＡ）−オリゴ（ｄＴ）12-18、３ｍＣｉ［３Ｈ］ＴＴＰ（４０〜７０Ｃｉ／ｍｍｏｌ））を添加した無細胞上清５０μｌを用いて、酵素活性を測定した。３７℃で１時間のインキュベーション後、０．１５％ピロホスフェートおよび１．６６％トリクロロ酢酸を含有する溶液１容量で試料を沈殿させ、次いで細胞収集システムを用いてガラス繊維フィルター上にろ過した。フィルターを乾燥させ、液体シンチレーション計数器（1205/1204  ＢＳベータプレート（Beta-plate）；ワラック・オイ（Wallac Oy）、フィンランド、ツルク）で放射能を測定した。アッセイは三重に行われた。
酵素ｐ２４アッセイ法
市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（オルガノン・テクニカ（Organon Teknika）、ノースカロライナ州ダーラム）を用いて、主ウイルスコアｐ２４タンパク質の定量測定を行った。
培地中にＬＴＢ4が存在すると、２週間の培養後に評価したＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１ウイルス活性は７０％以上低下していた（図６参照）。図６に示した結果は、他の３実験の代表である。上清中へのｐ２４放出を監視することによっても、同様な結果が得られた。
ＨＩＶ−１粒子の合成
この一組の実験は、Ｊ１．１細胞系、すなわち親細胞系ジャーカットＥ６．１に由来する潜在的感染細胞系を用いて行われた。Ｊ１．１細胞を１０6個／ｍｌの密度で培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁し、ＬＴＢ4の不在下または漸増する濃度のＬＴＢ4（０、３０、１００ｎＭ）の存在下に、ホルボールエステルＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。培養開始の２４時間後に、ＬＴＢ4を再び添加した（同濃度になるまで）。培養４８時間後に、無細胞培養上清を収集し、感染性ウイルス粒子の存在を終点測定法（end-point titration assay）により定量した。
終点測定法（ＴＣＩＤ50）
平行した４系列の無細胞上清１０倍希釈液を用いて、平底ミクロタイターウェル中で終点測定を行った。ＭＴ−４細胞と共に５〜７日間インキュベートした後、無細胞培養上清を収集し、市販の酵素アッセイにより、主ウイルスコアｐ２４タンパク質を検査した。ＴＣＩＤ50をReed and Munch法により計算した。
本発明者らの結果は、１００ｎＭのＬＴＢ4がＪ１．１細胞においてＨＩＶ−１粒子の合成を５５〜７９％阻害したことを明らかに証明する（表２）。
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実施例ＩＶ
ＬＴＢ4細胞毒性のアッセイ
実施例ＩおよびＩＩに記載した細胞培養物において、トリパンブルー色素排除試験により、最高３０ｎＭの濃度でＬＴＢ4の細胞毒性を評価した。ＬＴＢ4は細胞毒性を示さないことが認められた（図７）。細胞生存率をトリパンブルー排除試験により評価した；数値（３実験を代表する１実験からのもの）は細胞培養物（ｎ＝２４）中の平均細胞生存率を表す。
実施例Ｖ
ＬＴＢ4およびアシクロビルがＥＢＶ感染に及ぼす抗ウイルス作用
ＰＢＭＣ（１０6個／ｍｌ）をミクロプレート（９６ウェル）内においてウェル当たり２×１０5個で培養し、それぞれ実施例ＩおよびＩＩの記載に従って、ＥＢＶ（１０7ＴＦＵ／ｍｌ）またはＨＳＶ−１（１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌ）を感染させた。感染後１時間目に、細胞培養物をＬＴＢ4（１００ｎＭ）またはアシクロビル（アシクログアノシン）（１０００ｎＭ）で処理した。薬物は培養４８時間ごとに添加された。ＥＢＶおよびＨＳＶ−１の感染を、それぞれ７日目および６日目に、実施例ＩおよびＩＩの記載に従ってウイルス抗原の合成を評価することにより評価した（図８Ａおよび８Ｂ）。図８Ａおよび８Ｂに示した結果は、他の４実験を代表する１実験からのものである。アシクロビルは１μＭでのみ試験された。
ウイルス抗原の検出を、３６培養物につき免疫蛍光法により行った。
本発明をその特定の態様と関連づけて記載したが、さらに修正が可能であることは理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理に従った本発明のいかなる変更、利用または適合をも包含するものとし、本明細書の記載から当業者に既知の、または慣用される、ならびに以上の記載および以下の請求の範囲から容易になしうるものを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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