(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）に記載のDNA。
（ａ）配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
【請求項２】
アポトーシスを誘発させる活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）または（ｂ）に記載のDNA。
（ａ）配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１０アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のDNA、または請求項４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項３に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項９】
アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項３に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質と被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１０】
アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）配列番号：９または１０のいずれかに記載の塩基配列からなるｐ５３−結合配列とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するベクターを含む細胞、と被検試料とを接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）工程（ｂ）において測定したレポーター遺伝子の発現量を、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１１】
アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項３に記載のタンパク質、およびＢｃｌ−２タンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質とＢｃｌ−２タンパク質との結合活性を測定する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の結合活性を、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】
請求項８に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有するアポトーシス阻害剤。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のDNA、または該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有するアポトーシス促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ｐ５３依存性アポトーシスに関連する新規タンパク質、およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途、加えてアポトーシスを調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
ｐ５３癌抑制タンパク質は、熱ショック、低酸素、浸透圧ショック、およびＤＮＡ損傷等の種々の細胞ストレスによって安定化、および活性化し、細胞の成長停止・アポトーシスへと導くことが知られている（Ｋｏ  ａｎｄ  Ｐｒｉｖｅｓ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：１０５４−１０７２，１９９６；Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：３２３−３３１，１９９７；Ｏｒｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．５：２２１−２２７，１９９４）。しかし、ｐ５３がいかにして細胞の成長停止またはアポトーシス経路を選択するかについては、まだほとんど分かっていない。
また、アポトーシスおよび細胞周期の停止は、ｐ５３の主要な腫瘍抑制機能であることが知られている（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：３２３−３３１，１９９７）。従って、ｐ５３によって誘導されるアポトーシスのメカニズムを解明することができれば、癌の治療において、新たな機序を有する抗癌剤の開発が可能となる。外因性ｐ５３の発現により、全てではないもののいくつかのｐ５３変異癌細胞ではアポトーシスが引き起こされることが報告された（Ｇｏｍｅｚ−Ｍａｎｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：６９４−６９９；Ｋｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：８０８−８１５，１９９６）。従って、アポトーシスに関連したｐ５３の標的遺伝子を同定し、該遺伝子を癌細胞において発現させる、もしくは該遺伝子がコードするタンパク質を癌細胞に導入することによりアポトーシスを誘導することができれば、癌の有効な治療につながるものと考えられる。癌以外にもアポトーシスが関連した疾患には、例えば、動脈硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、移植片対宿主病、自己免疫性リンパ増殖症候群、ウイルス感染症等が挙げられる。従って、アポトーシスに関連したｐ５３の標的遺伝子の同定は、これらの疾患の原因究明、もしくは治療法の開発にとって、大いに期待される。
また、ミトコンドリア蛋白質Ｂｃｌ−２はアポトーシス過程を阻害し、細胞の生存性を高めることが知られている（Ｖａｕｘ，Ｄ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４４０−４４２，１９８８；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  Ｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：１３３１−１３３６，１９８９；Ｓｅｎｔｍａｎ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６７：８７９−８８８，１９９１；Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ａ．Ｃｅｌｌ，６７：８８９−８９９，１９９１）。Ｂｃｌ−２は当初、ヒト濾胞性リンパ腫で染色体転座によって活性化される癌遺伝子として単離された（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），２２６：１０９７−１０９９．１９８４；Ｂａｋｈｓｈｉ，Ａ．Ｃｅｌｌ，４１：８９９−９０６，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７４３９−７４４３，１９８５）。線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓではｃｅｄ−３およびｃｅｄ−４が発生時のアポトーシスに必須であり、ｃｅｄ−９はそれらの作用を妨げる（Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．Ｃｅｌｌ，４４：８１７−８２９，１９８６；Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，４：５８１−５８６，１９９４）。ｂｃｌ−２は機能および構造面でｃｅｄ−９のヒト相同体であるため（Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．Ｃｅｌｌ，７６：６６５−６７６，１９９４）、アポトーシスのこの機構は極めて良く保存されていると思われる。ｂｃｌ−２の主な作用機序は不明であるが、その遺伝子産物は直接的または間接的にミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を妨げると考えられる（Ｙａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），２７５：１１２９−１１３２，１９９７；Ｋｌｕｃｋ，ＲＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），２７５：１１３２−１１３６，１９９７；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．，ｅｔ，ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：４８３−４８７，１９９９）。Ｂｃｌ−２はＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３およびＢＨ４という４つの機能ドメインを含む（Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７：３２２５−３２３６，１９９８）。ｂｃｌ−２ファミリーの１７種を超えるメンバーが抗アポトーシス因子またはアポトーシス誘導因子であることが報告されており、それらはすべてこの４種のドメインのうち少なくとも１つを有する。
ｐ５３依存性アポトーシスはｐ５３による癌抑制の最も重要な特徴と考えられているが、その機序の大部分は解明されていない。Ｂａｘ（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．Ｃｅｌｌ，８０：２９３−２９９，１９９５）、ＰＩＧ３（Ｐｏｌｙａｋ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８９：３００−３０５，１９９７；Ｖｅｎｏｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：４６６８−４６７９，１９９８）、Ｋｉｌｌｅｒ／ＤＲ５（Ｗｕ，Ｇ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１７：１４１−１４３，１９９７）、Ｆａｓ（Ｏｗｅｎ−Ｓｃｈａｕｂ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５：３０３２−３０４０，１９９５；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：２０３３−２０４５，１９９８）、Ｎｏｘａ（Ｏｄａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），２８８：１０５３−１０５８，２０００）、ＰＥＲＰ（Ａｔｔａｒｄｉ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１４：７０４−７１８，２０００）およびＰＵＭＡ（Ｎａｋａｎｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｖｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，７：６８３−６９４，２００１；Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，７：６７３−６８２，２００１）をはじめ、いくつかの標的遺伝子がｐ５３依存性アポトーシスにかかわる候補タンパク質として単離されている。Ｂａｘ、ＮｏｘａおよびＰＵＭＡはミトコンドリア蛋白質であり、ＢＨ−３ドメインを含むことからｂｃｌ−２ファミリーに属する。ＰＩＧ３は、植物分裂組織の形成に必要なアポトーシス過程に関与する植物ＮＡＤＰＨ酸化還元酵素であるＴＥＤ２と相同である。ＫｉＩｌｅｒ／ＤＲ５およびＦａｓは外部の細胞死シグナルを伝達する受容体である。ＰＥＲＰは細胞の原形質膜蛋白質であり、その過剰産生によってアポトーシスが誘導される。これらの既知のそれぞれの標的は、ｐ５３依存性アポトーシスを司る候補タンパク質ではあるものの、実際にｐ５３がアポトーシスを誘導する機構を説明し得るものではない。
ｐ５３の有する癌抑制機構、とりわけｐ５３の介するアポトーシスのメカニズムを解明することによって得られる知見から、従来とは異なる作用機序を持った新たな薬剤、特にアポトーシスを介した癌の治療剤の開発が期待される。
発明の開示
上記のように、ｐ５３が介するアポトーシスのメカニズムについては、まだ不明な点が多い。そこで、本発明ではｐ５３によって誘導されるアポトーシスのメカニズムを解明することを第一の課題とし、さらにｐ５３によって転写誘導される新規アポトーシス関連タンパク質、および該タンパク質をコードする遺伝子の提供、さらにはアポトーシスのメカニズム解明によって得られる知見を基に、アポトーシスを調節する化合物の新規なスクリーニング方法、並びにアポトーシス調節剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために下記の如く鋭意研究を行った。まず、本発明者らは、ｐ５３によって発現が誘導される遺伝子、すなわちｐ５３の転写因子としての標的となる遺伝子の単離を試みた。ヒトゲノムＤＮＡのｐ５３結合配列の直接クローニングが可能な、酵母エンハンサー−トラップシステムにより行った（Ｔｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１５３７−１５４２，１９９４）。そしてこの方法により、ｐ５３によって転写が活性化されると思われる数多くのヒトゲノム配列を単離した。次いでこれらの配列の１つ（クローンＴＰ５３−４１）である１９０ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、実際にｐ５３結合配列と推定される配列（ＢＤＳ）を含んでいることを見出した。次に、ヒトコスミドライブラリーから、該配列を有するコスミドクローンを単離し、ショットガンシークエンシングによって、該コスミドクローンに含まれるゲノム配列全体の塩基配列を決定し、コンピュータープログラム（ＧＲＡＩＬ２）によるエキソンの予測を行った。予測したエキソン配列を基に作製したプローブを使用し、野生型ｐ５３を発現する複製能欠損アデノウィルス（Ａｄ−ｐ５３）を感染させた神経膠腫Ｕ３７３ＭＧ細胞（ＡＴＣＣより入手）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。２０の陽性クローンを取得し、これらｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定を行った。その結果、１２４、８６、および１０８のアミノ酸をコードするＯＲＦを含む、それぞれ８０６、７７７、２６５９ヌクレオチドからなる、α、β、γと名付けた３つの主な転写産物を同定した。これら３つの転写産物は、オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって１つの遺伝子から生成されることが分かった。該遺伝子は、既知の遺伝子との相同性は見られず、新規遺伝子であることが判明し、該遺伝子をｐ５３ＡＩＰ１（ｐ５３−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）と名付けた。このｐ５３ＡＩＰ１遺伝子は、８．２ｋｂの領域に及ぶ５つのエキソンから構成されており、またノーザンブロット解析によって、正常ヒト組織では、胸腺においてのみ発現していることが分かった。
次に本発明者らは、実際にｐ５３が上記ＢＤＳと結合し、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の発現を誘導するかどうかを検討した。その結果、ｐ５３はＢＤＳと結合し転写を活性化したことから、ｐ５３ＡＩＰ１はｐ５３の直接的な標的遺伝子であることが判明した。
アポトーシスは、ＤＮＡの損傷によって誘導されることが知られている。そこで本発明者らは、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子とアポトーシスとの関連性を検討するために、野生型のｐ５３を含む細胞へγ線照射、もしくはアドリアマイシンへの曝露を行い、内因性のｐ５３ＡＩＰ１が誘導されるかどうかを調べた。その結果、ｐ５３ＡＩＰ１の発現は、ＤＮＡ損傷に応答して誘導されることが分かった。
また本発明者らは、ｐ５３ＡＩＰ１α、βおよびγタンパク質自身が細胞の増殖抑制因子としての機能を有するかどうかを調べたところ、ｐ５３ＡＩＰ１αおよびβは細胞増殖を抑制する活性があることが分かった。さらに、ｐ５３ＡＩＰ１αタンパク質を細胞内で発現させることにより、アポトーシスが誘導されることが分かった。
つづいて本発明者らは、内因性ｐ５３ＡＩＰ１の阻害は、ｐ５３に依存するアポトーシスを抑制するかどうかを検討した。ｐ５３ＡＩＰ１発現を阻害するために、ｐ５３ＡＩＰ１  ｃＤＮＡ配列の一部に相当するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、細胞の核へ導入した。その結果、ｐ５３ＡＩＰ１発現の誘導およびｐ５３依存性アポトーシスの誘導を顕著に阻害した。以上からｐ５３ＡＩＰ１は、ｐ５３依存性アポトーシスに関連した重要な因子であることが判明した。
また本発明者らは、ｐ５３ＡＩＰ１が種々のアポトーシス経路に共通するメディエーターであるかどうかを明らかにするために、スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＵＶ照射およびミトコンドリア経路とは独立してアポトーシスを惹起するＴＮＦαという３つの異なるアポトーシス刺激因子に関して、ｐ５３ＡＩＰ１の機能の検討を行った。その結果、ＳＴＳまたはＵＶ照射によるアポトーシス誘導時には、ｐ５３ＡＩＰ１の発現が用量依存的に顕著に増加するが、ＴＮＦαに対する反応では増加しなかった。このことから、ｐ５３ＡＩＰ１がミトコンドリアを介するアポトーシス経路に関与していることが明らかとなった。さらに、ヒト細胞においてｐ５３ＡＩＰ１を異所性発現させることにより、ミトコンドリア膜電位の下方制御およびミトコンドリアからのシトクロムｃの放出が誘導されることが判明した。
また、本発明者らは免疫沈降実験および免疫染色実験から、ミトコンドリアにおいてｐ５３ＡＩＰ１とｂｃｌ−２蛋白質とが相互作用することが示された。さらに、この相互作用は、ミトコンドリア膜電位の制御を介して、ｐ５３ＡＩＰ１が関与するアポトーシスに影響を及ぼすことが明らかとなった。
以上のようにｐ５３の転写標的遺伝子のｐ５３ＡＩＰ１は、それ自身でアポトーシスを介した細胞増殖抑制活性、およびアポトーシスを誘導する機能を有することから、特に癌に対するアポトーシスを介した有効な治療剤の開発にとって有用である。また、アポトーシスが関連する疾患の標的分子として、該疾患の治療剤の開発にも有益である。
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたものであり、ｐ５３依存性アポトーシスに関連する新規遺伝子ｐ５３ＡＩＰ１、および該遺伝子によってコードされるタンパク質、並びにアポトーシスを調節する化合物の新規なスクリーニング方法、加えてアポトーシス調節剤を提供するものである。
より具体的には、
（１）  下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（２）  アポトーシスを誘発させる活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（３）  配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
（４）  （１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
（５）  （１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
（６）  （１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡ、または（５）に記載のベクターを保持する宿主細胞、
（７）  （６）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（４）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
（８）  （４）に記載のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、
（９）  配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（１０）  配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチド、
（１１）  アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）（４）に記載のタンパク質またはペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはペブチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質またはペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１２）  アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ｐ５３−結合配列とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するベクターを含む細胞、と被検試料とを接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）工程（ｂ）において測定したレポーター遺伝子の発現量を、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法、
（１３）  アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）（４）に記載のタンパク質またはペプチド、およびＢｃｌ−２タンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはペプチドとＢｃｌ−２タンパク質との結合活性を測定する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の結合活性を、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法、
（１４）  （１１）から（１３）のいずれかに記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含有するアポトーシス調節剤、
（１５）  （１０）に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含有するアポトーシス阻害剤、
（１６）  （１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含有するアポトーシス促進剤、を提供するものである。
本発明は、ｐ５３依存性アポトーシスに関連し、ｐ５３によって発現が誘導される新規なタンパク質「ｐ５３ＡＩＰ１α」、「ｐ５３ＡＩＰ１β」、および「ｐ５３ＡＩＰ１γ」に関する。これらのタンパク質をコードするＲＮＡ転写産物は、本発明の新規遺伝子「ｐ５３ＡＩＰ１」から、オルタナティブスプライシングを受けそれぞれ生成される。単離された本発明の「ｐ５３ＡＩＰ１α」、「ｐ５３ＡＩＰ１β」、および「ｐ５３ＡＩＰ１γ」のｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５に示す。該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質「ｐ５３ＡＩＰ１α」、「ｐ５３ＡＩＰ１β」、および「ｐ５３ＡＩＰ１γ」のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６に示す。また、本発明の遺伝子「ｐ５３ＡＩＰ１」のゲノムＤＮＡの塩基配列（９３０５  ｂｐ）を配列番号：７に示す。本発明のタンパク質「ｐ５３ＡＩＰ１α」、「ｐ５３ＡＩＰ１β」、および「ｐ５３ＡＩＰ１γ」を構成するエキソンの領域は次の通りである。
ｐ５３ＡＩＰα，β，γエキソン１：９１０−１０４３  ｂｐ
ｐ５３ＡＩＰα，βエキソン２：５９４１−６１５７  ｂｐ
ｐ５３ＡＩＰα，βエキソン３：７１８６−７２９７  ｂｐ
ｐ５３ＡＩＰαエキソン４：８１２３−８４６５  ｂｐ
ｐ５３ＡＩＰβエキソン４：８７９１−９１０４  ｂｐ
ｐ５３ＡＩＰγエキソン２：５９４１−６６６５  ｂｐ
本明細書において、特に断りがない限り、本発明のタンパク質「ｐ５３ＡＩＰ１α」、「ｐ５３ＡＩＰ１β」、および「ｐ５３ＡＩＰ１γ」をまとめて「ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質」と表記する。
「ｐ５３ＡＩＰ１」遺伝子によりコードされるタンパク質は、ｐ５３依存性アポトーシスに関連した機能を有することから、アポトーシス関連疾患の標的分子として、該疾患の予防剤および治療剤の開発に有益である。さらに「ｐ５３ＡＩＰ１α」タンパク質および「ｐ５３ＡＩＰ１β」タンパク質は、細胞増殖抑制活性を持ち、さらに細胞内で発現させることによりアポトーシスを誘導することから、それ自体が癌の治療のための医薬品としての応用が期待される。
本発明においては、細胞内で発現させることによりアポトーシスを誘発させる活性を有する限り、「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質と構造的に類似したタンパク質も含まれる。このような構造的に類似したタンパク質には、「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質の変異体や他の生物由来の「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質が含まれる。細胞がアポトーシスを誘発しているか否かは、例えば当業者により一般的に行われているＴＵＮＥＬ法、またはＬＭ−ＰＣＲ法等により、市販されている各種キットを用いて調べることができる。具体的には実施例６に示すように、Ａｐｏｔａｇ  Ｄｉｒｅｃｔ（ｏｎｃｏｒ）を使用して添付の指示書に従いＴＵＮＥＬを実施することができる。また、ＡｐｏＡｌｅｒｔ  ＬＭ−ＰＣＲラダーアッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．）を用いて、添付の指示書に従いＬＭ−ＰＣＲによって調べることもできる。
このようなタンパク質は、当業者であれば、例えば、公知の変異導入法を用いて調製することができる。当業者に公知のタンパク質中のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ作製による方法（Ｋｏｗａｌｓｋｉ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５，４４５７；ＭｃＣｕｔｃｈａｎ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２５，６２６−６２８）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２）、Ｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．−Ｊ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；広瀬進，１９９１，村松正実  ＆  岡山博人  編，実験医学別冊  遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ２４６−２５２）、ＰＣＲ法（村松正実  編，ラボマニュアル遺伝子工学  第３版，丸善株式会社，１９９６年発行，ｐｐ．２２７−２３０）、カセット変異法（岸本利光，１９９１，村松正実  ＆  岡山博人  編，実験医学別冊  遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ２５３−２６０）などのｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法などが挙げられる。例えば、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＃Ｋ１６００−１）を用いることができる。
タンパク質におけるアミノ酸の改変は、人為的に行うのであれば、通常、３０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このように細胞内で発現させることによりアポトーシスを誘発させる活性を有する限り、人為的なまたは自然界におけるアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入により天然型「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質（配列番号：２、４、または６）に対してアミノ酸配列が異なるタンパク質も、本発明に含まれる。
置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましいと考えられる。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質に対してアミノ酸が付加したタンパク質には、ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質が含まれる。
細胞内で発現させることによりアポトーシスを誘発させる活性を有するｐ５３ＡＩＰ１タンパク質と構造的に類似したタンパク質の調製は、公知のハイブリダイゼーション技術（細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール，１９９１，秀潤社，ｐｐ．１８８−１９３および７９−８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），８．４６−８．５２）やポリメラーゼ連鎖反応技術（細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール，１９９１，秀潤社，ｐｐ．１７１−１８６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），１４．１−１４．３５）を利用して行うことができる。即ち、当業者にとっては「ｐ５３ＡＩＰ１」ｃＤＮＡ配列（配列番号：１、３、または５）若しくはその一部をプローブとして、また「ｐ５３ＡＩＰ１」ｃＤＮＡ（配列番号：１、３、または５）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の生物から「ｐ５３ＡＩＰ１」ｃＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに単離したＤＮＡから「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質と構造的に類似したタンパク質を得ることが常套手段となっている。
本発明においては、細胞内で発現させることによりアポトーシスを誘発させる活性を有する限り、「ｐ５３ＡＩＰ１」ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質を包含する。このようなタンパク質を単離することが可能な生物としては、例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタなどが挙げられるが、これらに制限されない。このようなタンパク質をコードするＤＮＡを単離するには、例えば、これら生物の胸腺細胞が材料として適していると考えられる。
ヒト以外の生物に由来する「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質をコードするＤＮＡは、通常、「ｐ５３ＡＩＰ１」ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１、３、または５）と高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルで少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を指す。配列の相同性は、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｙａｔａ  １１１１，Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ  ４１１，Ｊａｐａｎ）の相同性検索プログラムにより決定することができる。
「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド（ストリンジェントな条件では、５０％ホルムアミド）、４ｘＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０ｘデンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、室温、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ストリンジェントな条件では、５０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄する。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度やホルムアミドの濃度、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である（細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール，１９９１，秀潤社，ｐｐ．７９−８７）。ハイブリダイゼーションに関するさらなる指針は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、およびＡｕｓｕｂａｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．））のユニット２．１０により、当技術分野において容易に入手可能である。
本発明のタンパク質は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質が発現していると考えられる組織（例えば胸腺細胞）の抽出液に対し、後述する「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、後述するように「ｐ５３ＡＩＰ１」タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養し、これらタンパク質を発現させ回収することにより調製することが可能である。
本発明はまた、本発明のタンパク質の部分ペブチドを包含する。本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のタンパク質のうち、Ｎ末端の１０アミノ酸からなる領域、および／またはＣ末端１０アミノ酸からなる領域を含む部分ペプチドが挙げられる。それぞれ、ミトコンドリア局在、および抗体作製のための免疫原として有用である。
本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列を有する部分ポリペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも９アミノ酸の鎖長を有する。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドは、下記の本発明のタンパク質を認識する抗体の作製において、免疫原として利用することができる。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、これらタンパク質をコードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、配列番号：１、３、または５に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、本発明のタンパク質が発現している組織（例えば骨髄や脾臓など）由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織（例えば胸腺など）由来のｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：１、３、または５に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる。
これらＤＮＡは、組換えタンパク質の生産に有用である。即ち、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、３、または５に記載のＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のタンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。本発明のタンパク質は分泌タンパク質であるため、例えば哺乳動物細胞で発現させ、細胞外に分泌させて調製することが可能である。
具体的には、例えば大腸菌で発現させるためのベクターとしては、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−２、ｐＪＬＡ５０２等が挙げられる。また、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。そのためのベクターとしては、例えば、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘなどが挙げられる。これらの融合タンパク質は、アフィニティーカラムを用いて容易に回収することができる。融合タンパク質の境界部にトロンビン切断部位やファクターＸａ切断部位を有するベクターを用いれば、目的のタンパク質のみを切り出すことができる。また、タンパク質をペリプラズムや菌体外に分泌させるためのベクターとしては、ｐＫＴ２８０やｐＲＩＴ５などが挙げられる（岡田雅人・宮崎香  編，無敵のバイオテクニカルシリーズ  タンパク質実験ノート  上  抽出と分離精製，羊土社，１９９６年発行，ｐｐ．１３９−１４９）。
また、バキュロウイルスを用いて、昆虫細胞や哺乳動物細胞でタンパク質を発現させることも可能である。哺乳動物細胞用のバキュロウイルスベクターとしては、例えばｐＡｃＣＡＧＭＣＳ１が挙げられる（村松正実  編，ラボマニュアル遺伝子工学  第３版，丸善株式会社，１９９６年発行，ｐｐ．２４２−２４６）。
宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で発現させた場合には、ニッケルカラムやグルタチオンセファロースカラム等により精製することができる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、また、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも可能である。遺伝子治療に用いるためのベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターや、カチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターが挙げられる（Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕ，Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ  ３５，Ｎｏ．１１，１３８５−１３９５，１９９８）。遺伝子の導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏやｅｘ  ｖｉｖｏなどが考えられる。また、他のサイトカイン遺伝子と共導入することも考えられる。
本発明はまた、配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５塩基（例えば、２０塩基以上、３０塩基以上、５０塩基以上）の鎖長を有するポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、上記した通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。このようなポリヌクレオチドには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的なＤＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えばリボザイム等）が含まれる。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡあるいはその配列の一部を含むオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子やｃＤＮＡのクローニング、あるいＰＣＲによる増幅に利用することができる。さらに、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）などの方法により、遺伝子あるいはｃＤＮＡの多型あるいは異常の検出（遺伝子診断など）に利用できる。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の発現を抑制することが期待でき、ｐ５３依存性アポトーシスに関連した疾患のメカニズムの解明のための試薬、および該疾患の治療のための薬剤の開発に有用である。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１、３、または５の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の発現を有効に阻害できるものであれば、配列番号：１、３、または５の塩基配列もしくはその部分配列に対し、完全に相補的でなくてもよいが、好ましくは配列番号：１、３、または５の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスポリヌクレオチドである。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドには、例えば、遺伝子治療への応用が考えられる。遺伝子治療の標的となる疾患としては、例えば、ｐ５３の異常を伴う癌や各種アポトーシス関連疾患が好適であると考えられる。これら分子を遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法などにより患者へ投与を行えばよい。
また、本発明は、本発明のタンパク質に結合する抗体に関する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、例えば文献「東京大学医科学研究所  制癌研究部  編，細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール，１９９３年発行，秀潤社，ｐｐ．２０２−２１７」に記載された方法に従って作製することができる。例えば、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に精製した本発明のタンパク質、その部分ペプチド、または本発明のタンパク質のアミノ酸配列を基に合成したペプチドを、耳の静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、そけい部、四肢指の爪の裏などに注射する。抗原タンパク質の投与は、フロイントの完全アジュバントや、フロイントの不完全アジュバントと共に行ってもよい。投与は通常、数週間ごとに行い、追加免疫により抗体価を上げることができる。定期的に採血を行い、ＥＬＩＳＡ等により抗体価の上昇を確認し、最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。抗血清は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により、ＩｇＧ分画を精製することができる。また、固定化抗原を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、さらに抗体を精製することもできる。
一方、モノクローナル抗体は、例えば文献「小池隆夫，谷口克，１９９１，村松正実  ＆  岡山博人  編，実験医学別冊  遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ７０−７４」に記載の方法に従って作製することができる。具体的には、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により、ＩｇＧ分画を精製することができる。また、固定化抗原を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、さらに抗体を精製することもできる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを免疫して得られる抗体は、本発明のタンパク質のアフィニティー精製のために用いられる他、例えば、本発明のタンパク質の発現異常や構造異常起因する疾患の検査や診断、本発明のタンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。具体的には、例えば組織、血液、または細胞などからタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等の方法による本発明のタンパク質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
ヒト型モノクローナル抗体は、例えば、文献「磯貝秀和，１９８８，実験医学Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，５５−６０」に従って行うことができる。また、文献「Ｔ．Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１６，２５３７−２５４４」に記載されたように、分子生物学的手法を用いて作製することもできる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のタンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
さらに本発明は、以下のアポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。
本発明のアポトーシス調節剤には、アポトーシス阻害剤およびアポトーシス促進剤が含まれる。
本発明のタンパク質と結合するタンパク質のスクリーニングは、例えば、本発明のタンパク質を固定したアフィニティーカラムに、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞の培養上清、もしくは細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングを実施することが可能である。
さらに、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される組織、もしくは細胞（例えば、胸腺細胞など）よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをアガロース上で発現させフィルターにタンパク質を固定後、標識した本発明のタンパク質を反応させ、結合するタンパク質を発現しているプラークを検出する「ウエストウエスタンブロッテイング法」や、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域およびＧＡＬ４転写活性化領域を、本発明のタンパク質および被検タンパク質との融合タンパク質として発現させ、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合タンパク質の結合配列を有するプロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子の発現を通して本発明のタンパク質と被検タンパク質との結合を検出する「ｔｗｏハイブリッドシステム」等に従い実施することも可能である。
また、固定化した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニングにより本発明のタンパク質に結合する化合物を単離する方法も当業者に周知の技術である。
スクリーニングに用いる被検試料としては、これらに制限されないが、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。スクリーニングに用いる被検試料は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
被検試料としては、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、タンパク質、天然または合成ペプチド、天然化合物、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明のタンパク質との結合活性を指標とした上記のスクリーニングにより単離された化合物を被検試料として用いることも可能である。スクリーニングに用いる本発明のタンパク質としては、精製したタンパク質であってもよく、また、本発明のタンパク質を分泌する形質転換体の培養上清であってもよい。
本発明のタンパク質「ｐ５３ＡＩＰ１」は、アポトーシスを誘導する機能を有することから、該タンパク質と結合する化合物は、該タンパク質のアポトーシス誘導を調節することが期待される。従って、本スクリーニングによって得られる化合物は、本発明のタンパク質「ｐ５３ＡＩＰ１」を介したアポトーシスの異常などに起因する疾患の予防剤または治療剤への応用、さらには癌細胞においてアポトーシスを誘導させることによる、癌の治療剤への応用が考えられる。
また本発明は、以下のアポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）ｐ５３−結合配列とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するベクター（以下、レポーターベクターと呼ぶ場合あり）を含む細胞、と被検試料とを接触させる工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において測定したレポーター遺伝子の発現量を、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む。
本発明の「ｐ５３−結合配列」（ＢＤＳ）とは、ｐ５３タンパク質の標的遺伝子であるｐ５３ＡＩＰ１の転写を誘導する際にｐ５３が結合する配列を指す。具体的には、５’−ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＣＧ−３’（配列番号：８）配列を示すことができる。
本発明のレポーター遺伝子としては、その発現を検出し得るものであれば特に制限はなく、当業者が一般的に各種アッセイ系に使用するレポーター遺伝子を使用することができる。好適なレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ（ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔａｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を挙げることができるが、これらに制限されない。
上記工程（ａ）においてｐ５３−結合配列とレポーター遺伝子とが「機能的に結合した」とは、ｐ５３−結合配列にｐ５３が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、該結合配列とレポーター配列とが結合していることをいう。好ましくは、レポーター遺伝子の上流に最小単位のプロモーター配列が位置し、さらに該プロモーター配列の上流にｐ５３−結合配列が位置する。
本発明のレポーターベクターは、アッセイに使用する宿主細胞に適した公知の発現ベクターを改変することによって構築することができる。例えば、実施例３に示すように、ｐＧＬ３プロモーターベクターのＳＶ４０プロモーターの上流のＢＤＳ（ＳＶ４０−ＢＤＳ）とルシフェラーゼ遺伝子を連結させることにより作製することができる。
上記レポーターベクターを導入する細胞は、特に制限はなく、例えばＨ１２９９細胞、ＳＷ４８０大腸癌細胞株、Ｓａｏｓ２骨肉腫細胞株等を用いることができる。
該レポーターベクターの細胞内への導入は、当業者に公知の種々の方法を利用して行うことができる。例えば前記のリン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法等を挙げることができる。
上記工程（ｂ）におけるレポーター遺伝子の発現量の測定は、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者によって一般的に行われる方法で実施することができる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、実施例３に示すように、市販のＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ活性の測定を行うことができる。
工程（ｂ）によるレポーター遺伝子の発現量測定の結果、被検試料を添加しないで同様の方法により行った場合の発現量と比較して、レポーター遺伝子の発現量を低下または増加させる化合物を選択する。ｐ５３は「ｐ５３−結合配列」に結合し、標的遺伝子の転写を活性化することにより、アポトーシスを誘導することが知られている。従って、本発明のレポーター遺伝子の発現量を低下させる化合物は、アポトーシス阻害剤の候補化合物となり、一方、レポーター遺伝子の発現量を増加させる化合物は、アポトーシス促進剤の候補化合物となる。
被検試料としては、上記したように細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物等を例示することができる。
また、本発明者らは、下記実施例に示すように、ミトコンドリアにおいて、本発明のｐ５３ＡＩＰ１とＢｃｌ−１タンパク質とが相互作用することを見出した。この相互作用は、ミトコンドリア膜電位の制御を介して、ｐ５３ＡＩＰ１が関与するアポトーシスに影響を及ぼすことが明らかとなった。つまり、ｐ５３ＡＩＰ１とＢｃｌ−１タンパク質との相互作用を亢進または阻害する化合物は、アポトーシスを制御する機能を有することが期待される。従って、本発明は、アポトーシス調節剤の候補化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）本発明のタンパク質またはペプチド、およびＢｃｌ−２タンパク質に被検試料を接触させる工程、（ｂ）該タンパク質またはペプチドとＢｃｌ−２タンパク質との結合活性を測定する工程、（ｃ）工程（ｂ）の結合活性を、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法を提供する。
本発明のＢｃｌ−２タンパク質をコードするＤＮＡ（ｂｃｌ−２遺伝子）の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等から入手することが可能である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１３９９４）。
本発明のスクリーニング方法には、上記に例示した被検試料を用いることができる。上記工程（ａ）の「接触」とは、通常、本発明のタンパク質またはペプチド、およびＢｃｌ−２タンパク質を含む溶液に、被検試料を添加することにより行うが、この方法に限定されない。本発明のタンパク質またはペプチド、およびＢｃｌ−２タンパク質を含む溶液は、例えば、該タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを、適当な細胞へトランスフェクションし、該細胞の抽出物から調製することができる。上記被検試料がタンパク質である場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、本発明のタンパク質およびＢｃｌ−２タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと共にトランスフェクションすることにより、上記の「接触」を行うことが可能である。
また、上記スクリーニング方法に利用する本発明のタンパク質およびＢｃｌ−２タンパク質は、相互作用に関与するアミノ酸領域を含む該タンパク質の部分ペプチドであってもよい。
上記工程（ｂ）の結合活性の測定は、当業者においては、免疫沈降法または免疫染色法等により実施することができる。例えば、下記の実施例９に示すように、本発明の抗体およびマウスモノクローナル抗Ｂｃｌ−２抗体を利用して免疫沈降法により行うことができる。具体的には、上記工程（ａ）の本発明のタンパク質またはペプチド、およびＢｃｌ−２タンパク質に被検試料を接触させた溶液から、本発明の抗体および抗Ｂｃｌ−２抗体を利用して免疫沈降を生じさせる。次いで、沈降した免疫複合体に本発明のタンパク質およびＢｃｌ−２タンパク質の両方が含まれるか否かをウェスタンブロットによって評価し、両方が含まれる場合、本発明のタンパク質とＢｃｌ−２タンパク質は結合活性を有するものと判定される。
その他、上記工程（ｂ）の結合活性は、酵母を用いたツーハイブリッド法、または大腸菌で合成したリコンビナントタンパク質あるいはインビトロ・トランスレーション（インビトロ翻訳系）を用いた試験管内のタンパク質合成系で合成したタンパク質を用いたインビトロ結合実験法や、免疫沈降法および免疫染色法等により測定することができる。
測定した結合活性が、被検試料の非存在下において測定した場合と比較して、低下した場合、該被検試料は、アポトーシス阻害剤の候補化合物となり、一方、増加した場合、該被検試料は、アポトーシス促進剤の候補化合物となる。
本発明のタンパク質、抗体、または本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を、薬剤として用いる場合には、該タンパク質、該抗体、または該化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ｐ５３によって誘導される新規転写ユニットの単離
酵母エンハンサートラップシステムを使用して、本発明者らは以前、ｐ５３依存的に転写を活性化すると思われる数多くのヒトゲノム配列を単離した（ｐ５３−標的部位；Ｔｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１５３７−１５４２，１９９４）。今回、それらの部位の１つ（Ｔｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１５３７−１５４２，１９９４におけるクローンＴＰ５３−４１）に相当する１９０−ｂｐのＤＮＡ断片の配列を決定し、ｐ５３−結合配列と推定される配列（ＢＤＳ）を含有していることを見出した（図１）。この断片を含むより大きいゲノム領域を単離するために、ｐ５３−標識部位を含有する１９０ｂｐのＤＮＡ断片を放射性標識し、１０６コロニーのヒトコスミドライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。スクリーニングによりＴＰ５３−ｃｏｓ３８と名付けたコスミドを単離し、ＦＩＳＨ分析を行った。ＦＩＳＨ分析は、文献（Ｉｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １７：１５３−１６２，１９９３）に記載の方法で、プローブとしてコスミドクローンＴＰ５３−ｃｏｓ３８を使用して行った。Ｇ−バンドパターンを変性するために、ヒト中期染色体をチミジン同調／ブロモデオキシウリジン−リリース法によって調製した。ハイブリダイゼーションの前に、中期細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で染色し、ＵＶ光線で照射した。ニックトランスレーションによってビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で標識し、変性した中期染色体にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションシグナルをＦＩＴＣ−アビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で検出した。ハイブリダイゼーションシグナルの正確な割り当ては、複製されたＧ−バンドの可視化によって求めた。
その結果、ＴＰ５３−ｃｏｓ３８は染色体１１ｑ２４にマッピングすることが判明した（データは示していない）。ｃｏｓ３８に含まれる４０−ｋｂのゲノム配列全体はショットガンシークエンシングによって求めた。ｃｏｓ−３８の４０ｋｂの配列は、２つのエクソン−予測コンピュータープログラム、Ｇｒａｉ１２（Ｓｏｌｏｖｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５１５６−５１６３，１９９４）およびＧＥＮＳＣＡＮ（Ｂｕｒｇｅ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：７８−９４，１９９７）を用いてエクソンと推定されるものについて検索した。ＧＲＡＩＬ２を用いた分析は、スコアが「ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ」または「ｇｏｏｄ」の１２の可能なエキソンを予測し、ＧＥＮＳＣＡＮも１２の可能なエキソンを予測した。それらのうち、４つは両プログラムによって候補エキソンと予測された。このように、合計２０の候補エクソンセグメントがｐ５３−結合配列と推定される配列の近傍に存在した。
次に候補エキソンに相当するオリゴヌクレオチドを合成し、胸腺ｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写させたｃＤＮＡを使用してエクソン−連結実験を実施した。その結果、２つの予測エキソンからなる４７４−ｂｐのｃＤＮＡ断片を作製した（データは示していない）。
［実施例２］  ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の単離
遺伝子の全長のｃＤＮＡを単離するために、野生型ｐ５３を発現する複製能欠損アデノウィルス（Ａｄ−ｐ５３）を、Ｕ３７３ＭＧ（神経膠腫）細胞に４８時間感染させ、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを細胞から単離した。プローブとして４７４−ｂｐ  ｃＤＮＡ断片を使用し、次のようにしてノーザンブロット分析を行った。
Ａｄ−ｐ５３を感染させたＵ３７３ＭＧ細胞から抽出した３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、１ｘＭＯＰＳおよび２％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移した。ブロットにランダム−プライム化３２Ｐ−標識ｐ５３ＡＩＰ１  ｃＤＮＡプローブ、およびβ−アクチンｃＤＮＡを、５ｘＳＳＰＥ／１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ／２％ＳＤＳ／５０％ホルムアミド中で５０℃においてハイブリダイゼーションし、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃において洗浄し、−８０℃においてオートラジオグラフィーに曝露した。
その結果、Ａｄ−ｐ５３を感染させることによってＵ３７３ＭＧ細胞に強く誘導された０．８−ｋｂ、および２．７−ｋｂの転写物を検出した（図２）。１６種の正常なヒト組織のｍＲＮＡを使用したノーザン−ブロット分析では、胸腺においてのみ遺伝子の発現が見られた（データは示していない）。
次に野生型ｐ５３を含有する組換えアデノウィルスベクター（Ａｄ−ｐ５３）を４８時間感染させたＵ３７３ＭＧ細胞から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（２μｇ）を使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。プローブとして、エクソン−連結ＰＣＲ産物の４７４−ｂｐのｐ５３ＡＩＰ１  ｃＤＮＡ断片を使用し、このライブラリーの１０６個の独立したコロニーをスクリーニングした。その結果、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の２０個の陽性クローンを得た。これらのｃＤＮＡクローンの配列決定により、それぞれ、１２４、８６および１０８のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを持つ８０６、７７７および２６５９ヌクレオチドからなる３つの主な転写物が同定され、それぞれα、βおよびγと名付けた（図３）。ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８，１９９０）およびＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）を使用したコンピュータ分析では、これら３つの産物と公開されているデータベースにおける任意の既知タンパク質との間の相同性は検出できなかった。ゲノムとｃＤＮＡ配列の比較により、以下に記載する機能的な特徴に基づいて、ｐ５３ＡＩＰ１と名付けたこの新規遺伝子のゲノム構造を決定した。遺伝子は８．２−ｋｂゲノム領域に及び、５つのエキソンから構成されていた（図１）。該遺伝子の塩基配列を配列表に示す（配列番号：７）。オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって３つの転写物が生じる。つまりｐ５３ＡＩＰ１γのエキソン２はｐ５３ＡＩＰ１αのイントロン２および３を含み、ｐ５３−結合部位と思われる部位を有する上記１９０−ｂｐのゲノム断片は、イントロン１の中に存在することが見出された。
［実施例３］  ｐ５３の新規な標的分子としてのｐ５３ＡＩＰ１
ｐ５３がｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のイントロン１のＢＤＳ配列に相当するオリゴヌクレオチドに結合することができるかどうかを試験するために、電気移動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ））を実施した。電子移動度シフトアッセイは次のようにして行った。まず、オリゴヌクレオチドを以下のように設計した。
0004936417.tif 000002
次にオリゴマー１Ｓおよび１Ａをアニーリングさせ、［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰで標識した。肺癌細胞株Ｈ１２９９（ＡＴＣＣから入手）にＡｄ−ｐ５３を感染させた。これらの細胞からの核抽出物を室温において、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ  ０．５μｇ、ＥＭＳＡ緩衝液（０．５×ＴＢＥ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセロール、０．１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプシン）、３２Ｐ−標識二本鎖オリゴマーと共に３０分間インキュベーションし、いくつかのケースでは、モノクローナル抗−ｐ５３抗体、ＰＡｂ４２１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＡｂ１８０１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベーションした。インキュベーション後、０．５×ＴＢＥを使用した未変性の４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。ゲルを乾燥し、−８０℃において３時間オートラジオグラフィーに曝露した。
その結果、図４に示すように、該ＢＤＳ配列は、Ａｄ−ｐ５３を感染させたＨ１２９９［肺癌］細胞の核抽出物中の分子と結合した。混合物に抗−ｐ５３抗体（ＰＡｂ４２１および／またはＰＡｂ１８０１）を添加すると、別のシフトバンドが観察された。非標識のオリゴヌクレオチド自身は、これらの相互作用を阻害したが、ランダムオリゴヌクレオチドは阻害しなかった。これらの結果から、ｐ５３タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実際にＢＤＳに結合することが示唆された。
次に、結合配列の転写亢進活性をさらに評価するために、ｐＧＬ３プロモーターベクターのＳＶ４０プロモーターの上流の１コピー（ｐ５３ＢＤＳ（１ｘ））、または２コピー（ｐ５３ＢＤＳ（２ｘ））のｐ５３ＢＤＳ（ＳＶ４０−ＢＤＳ）と連結したルシフェラーゼ遺伝子を用いてレポーターアッセイを実施した。レポーターアッセイは次のようにして行った。
ヒトＷＡＦ１−ルシフェラーゼプラスミドをＳ．Ｉｋａｗａ氏（Ｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：８３９−８４３，１９９８）より入手した。ｐ５３−ＡＩＰ１レポーター構築物は以下のように作製した。ｐ５３ＢＤＳプラスミドの構築のために、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：１１）、および５’−ＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：１２）を作製した。これらのオリゴマーをアニーリングさせ、ｐＧＬ３−プロモーターベクターのＫｐｎ１部位にサブクローニング（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）した。各トランスフェクションについては、０．３μｇのレポータープラスミドおよび５０ｎｇの野生型または変異型ｐ５３発現ベクターのいずれかを、０．３μｇのｐＲＬ−ＴＫベクターと組み合わせて、Ｈ１２９９細胞にコトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、細胞をＰＢＳですすぎ、５００μｌのｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶菌した。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定のために、デュアルルシフェラーゼシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。両ルシフェラーゼ活性の定量および相対比の算出は主にルミノメーターを用いて行った。各実験は少なくとも３回反復し、平均と標準偏差を算出した。
その結果、野生型ｐ５３を欠損する結腸癌細胞ＳＷ４８０（ＡＴＣＣより入手）へのｐ５３ＢＤＳ（１ｘ）、ｐ５３ＢＤＳ（２ｘ）またはコントロール（ｐ５３結合サイトのないＳＶ４０プロモーター）ベクターの転写は、ルシフェラーゼ活性を亢進しなかった。しかし、ｐ５３ＢＤＳ（１ｘ）またはｐ５３ＢＤＳ（２ｘ）と野生型ｐ５３発現するように設計された発現プラスミドとのコトランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性を顕著に増加させたが、変異型ｐ５３発現ベクターとのコトランスフェクションでは、ルシフェラーゼ活性の増加は見られなかった（図５）。
次に、ヘテロレポーターベクター（ｉｎｔｒｏｎ  １−ｗｔまたはｉｎｔｒｏｎ  １−ｍｔ）を次のようにして構築した。野生型（ｉｎｔｒｏｎ  １−ｗｔ）または変異型（ｉｎｔｒｏｎ  １−ｍｔ）のｐ５３ＢＤＳ配列を含むｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のイントロン１に相当する５００ｂｐセグメント、または変異５００ｂｐセグメントを、それぞれＳＶ４０最小プロモーターの上流へクローニングした。ｉｎｔｒｏｎ  １−ｗｔまたはｉｎｔｒｏｎ  １−ｍｔレポーターベクターの一方を、ｗｔ−ｐ５３またはｍｔ−ｐ５３発現ベクターのいずれかと共にＳＷ４８０へ、コトランスフェクションした。ｉｎｔｒｏｎ  １−ｗｔのルシフェラーゼ活性は、ｗｔ−ｐ５３発現ベクターとのコトランスフェクションによって上昇したが、ｉｎｔｒｏｎ  １−ｍｔでは上昇しなかった（図５）。さらに、ｍｔ−ｐ５３は、ｉｎｔｒｏｎ  １−ｗｔレポーターベクターのルシフェラーゼ活性を上昇させた（図５）。従って、結合部位はｐ５３−依存的に転写を活性化し、ｐ５３ＡＩＰ１は明らかにｐ５３タンパク質の直接的な標的遺伝子であることが分かった。
［実施例４］  ｐ５３ＡＩＰ１の細胞内局在化
ＰＳＯＲＴモチーフ予測プログラム（Ｎａｋａｉ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｈｉｒａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：８９７−９１１，１９９２）により、ｐ５３ＡＩＰ１αおよびｐ５３ＡＩＰ１βのＮ−末端にミトコンドリア標的配列と思われる配列が存在することが示された。このことは、ｐ５３ＡＩＰ１がミトコンドリアタンパク質である可能性があることを示唆する。そこで、ｐ５３ＡＩＰ１の細胞局在を調べるために以下の実験を行った。
まず、Ｃ−末端にＨＡ標識を有するｐ５３ＡＩＰ１αを発現するように設計したプラスミドクローンｐＣＡＧＧＳ／Ｃ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１αを構築した。一過的にｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１−αをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞をポリ−Ｄ−リジン−コートマルチ−ウェルチャンバースライド（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に移した。次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定し、４℃において３分間０．１％トリトンＸ−１００のＰＢＳ溶液を浸透させた。細胞を室温において６０分間ブロック溶液（３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）で覆った。次いで、細胞をラット抗−ＨＡ抗体、３Ｆ１０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、希釈はブロック液で１０００倍希釈）およびマウス抗−ヒトミトコンドリア抗体（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，希釈はブロック液で５００倍希釈）と共に室温において２時間インキュベーションした。これらの抗体、ラット抗−ＨＡ抗体およびマウス抗−ヒトミトコンドリア抗体は、ＦＩＴＣにヤギ抗−ラット二次抗体を複合体化したもの、およびローダミンにヤギ抗−マウス二次抗体を複合体化したものでそれぞれ染色し、ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で観察した。
その結果、図６に示すようにｐ５３ＡＩＰ１αは周辺核領域で強く染色され、細胞質内では点パターンとして出現した。抗ミトコンドリア抗体を使用してミトコンドリアを染色すると、ｐ５３ＡＩＰ１の緑色の信号はミトコンドリアの赤色の信号と正確に一致し、ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質がミトコンドリアに局在していることを確認した。
［実施例５］  ＤＮＡ損傷による内因性ｐ５３ＡＩＰ１の誘導
ｐ５３ＡＩＰ１は野生型ｐ５３によって誘導されることから、野生型ｐ５３を含有する新生児皮膚から誘導した正常ヒト線維芽細胞細胞株ＮＨＤＦ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）および野生型ｐ５３を含まないＳＷ４８０について、ｐ５３ＡＩＰ１の発現がγ線照射もしくはアドリアマイシンへの曝露によるＤＮＡ損傷処理よって誘導されるか否かを検討した。ＤＮＡ損傷処理は次のようにして行った。
細胞は処理の２４時間前に接種し、処理時には６０〜７０％の集密度とした。ＮＨＤＦおよびＳＷ４８０細胞を０．２μｇ／ｍｌの濃度のアドリアマイシン（ドキソルビシン）で連続的に処理する、もしくは約１Ｇｙ／ｍｉｎのγ線を照射した（１４Ｇｙ）。
その結果、遺伝毒性剤によるＤＮＡ損傷はＮＨＤＦ細胞ではｐ５３ＡＩＰ１の転写を強力に誘導したが、ＳＷ４８０細胞では誘導しなかった（図７）。ＮＨＤＦ細胞のｐ２１Ｗａｆｌ発現はアドリアマイシンまたは電離放射線のどちらかへの暴露の６時間後に最大に達したが、ｐ５３ＡＩＰ１の最大誘導は暴露の２４時間後だけ観察された。これらの結果から、ｐ５３ＡＩＰ１はＤＮＡ損傷に応答して誘導されるが、分子過程はｐ２１Ｗａｆｌ誘導の分子過程とは全く異なる可能性が示唆された。
［実施例６］  ｐ５３ＡＩＰ１のミトコンドリアΔΨｍの消失によるアポトーシスの誘導
ｐ５３ＡＩＰ１自身が増殖抑制因子として作用するかどうかを検討するために、コロニー形成アッセイを実施した。まず、各転写物の全コード配列を含有するほ乳類の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１α、βおよびγ）を次のようにして構築した。
ｃＤＮＡｓ（ｐ５３ＡＩＰ１−α、βおよびγ）の全コード配列を、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、以下のプライマーを用い、９４℃で２分の後、９４℃で３０秒／５６℃で３０秒／７２℃で３０秒を２５サイクル、つづいて７２℃で５分のＰＣＲ反応によって増幅した。
・ｐ５３ＡＩＰ１−α増幅用プライマー：
0004936417.tif 000003
・ｐ５３ＡＩＰ１−β増幅用プライマー：
0004936417.tif 000004
・ｐ５３ＡＩＰ１−γ増幅用プライマー：
0004936417.tif 000005
次に、ＰＣＲ増幅産物をＣＡＧ（サイトメガロウィルス即時型エンハンサーニワトリβ−アクチンハイブリッド）プロモーターを含有するｐＣＡＧＧＳほ乳類発現ベクターの唯一のＥｃｏＲＩ部位に挿入した（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−１９９，１９９１）。ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ標識を各発現ベクターのＮ−末端（ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１−α、βおよびγ）、またはＣ−末端（ｐＣＡＧＧＳ／Ｃ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１−α、βおよびγ）に配置した。構築物を塩基配列決定によって確認した。
次いで、ラット抗−ＨＡ標識モノクローナル抗体を使用して、該ベクターがほ乳類細胞中で発現されることを免疫ブロット法によって確認した（３Ｆ１０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；データは示していない）。ゲネチシン耐性を確認するために、２×１０５の細胞にネオマイシン（Ｇ４１８）に対する耐性遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ｐ５３ＡＩＰ１発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１−α，βおよびγ）、またはｐＣＡＧＧＳベクター単独のどちらか一方とを、野生型ｐ５３を欠損した神経膠腫細胞樹立株Ｔ９８Ｇ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂａｎｋ（日本）より入手）へコトランスフェクションした。トランスフェクションは製造業者の指示により実施した。トランスフェクションの２０時間後、細胞を４倍希釈し、６００μｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８）の存在下において２週間培養した。トランスフェクション実験は個別に３回行い、コロニー数をスコアリングした（Ｆｕｒｕｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：１９６５−１９７０，１９９６）。
その結果、図８で示すようにゲネチシン耐性コロニーの数が３倍〜４倍滅少し、ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはβの導入によって実質的に増殖抑制がみられた。ＨＡ標識をｐＣＡＧＧＳベクターのＣ−末端に挿入する場合にも、増殖抑制が観察された（ｐＣＡＧＧＳ／Ｃ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはβ；データは示していない）。また、ｐ５３ＡＩＰ１を過剰発現すると思われる安定な形質転換体を確立する試みをしたが、コロニー形成アッセイにおいて観察された細胞毒性のために成功しなかった。
上記のことからｐ５３による後期誘導、増殖抑制作用およびミトコンドリア局在化は、ｐ５３ＡＩＰ１はｐ５３−依存的アポトーシスにおいて重要な役割を果たしている可能性が推察された。そこで、内因性ｐ５３ＡＩＰ１の誘導が実際にアポトーシス細胞死を誘導することを検討するためにＴＵＮＥＬ（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）分析を実施した。まず、Ｔ９８Ｇ細胞にｐ５３ＡＩＰ１発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１−α）、またはｐ５３発現ベクター（野生型または変異型）をトランスフェクトし、４８時間後に細胞を採取した。ＴＵＮＥＬ法は、Ａｐｏｔａｇ  Ｄｉｒｅｃｔ（ＩＮＴＥＲＧＥＮ）を使用し、製造業者の指示に従い行った。次いで、ラット抗−ＨＡ抗体、３Ｆ１０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）またはｐ５３モノクローナル抗体、Ａｂ−６（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、免疫蛍光染色を実施した。抗体をローダミンに二次抗体を複合体化したもので染色し、ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で観察した。ＤＮＡ断片は、製造業者の指示どおりに、ＡｐｏＡｌｅｒｔ  ＬＭ−ＰＣＲラダーアッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して評価した。
ＴＵＮＥＬ分析の結果、ｐ５３ＡＩＰ１αを発現するＴ９８Ｇ細胞の半分より多くがアポトーシスを受けることが分かった。対照として野生型ｐ５３または変異型ｐ５３（ｐ５３−Ｒ２７３Ｈ）発現ベクターを、Ｔ９８Ｇ細胞にトランスフェクトした。外因性野生型ｐ５３の導入によってもアポトーシス細胞死を生じたが、ＴＵＮＥＬ−陽性細胞は、変異型ｐ５３を発現するように設計したプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした培養物中では、有意に少なかった（図９）。ｐＣＡＧＧＳベクター単独のトランスフェクションは、アポトーシス細胞死を誘導しなかった（データは示していない）。
ｐ５３ＡＩＰ１がアポトーシスを誘導する機序を検討するために、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、ミトコンドリア内部膜の電気化学的勾配の指標としてミトコンドリアΔΨｍを調べた。
ミトコンドリア膜電位を評価するために、細胞を、７０ｍＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する培地と共に３７℃において３０分間インキュベーションし、次に、より長い波長（５７９〜５９９ｎｍ）の蛍光発光で標識するために固定した。
その結果、ｐ５３ＡＩＰ１αを発現するほとんど全ての細胞において、トランスフェクション後２４時間でミトコンドリアΔΨｍが消失することが明らかになった（図１０）。
ｐ５３ＡＩＰ１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける影響を検討するために、ｐ５３ＡＩＰ１αおよびβを発現するアデノウィルスベクターを設計した後、本発明者らはＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１α、βまたはＡｄ−ＬａｃＺをＴ９８Ｇ細胞に感染させ、感染後７２時間経過時にＦＡＣＳおよびＴＵＮＥＬアッセイを実施した。アポトーシスはＦＡＣＳ、ＴＵＮＥＬアッセイおよびＬＭ−ＰＣＲによるＤＮＡのラダーアッセイによって検出した。ＦＡＣＳ分析については、ＤＮＡ損傷の３６時間後に、付着細胞および剥離細胞を合わせて、７５％エタノールのＰＢＳ溶液で４℃において終夜固定した。ＰＢＳで２回すすいだ後、細胞を１ｍｇの煮沸ＲＮａｓｅを含有する１ｍｌのＰＢＳと共に３７℃において３０分間インキュベーションした。次いで、細胞を、１０μｇのヨウ化プロピジウムを含有する１ｍｌのＰＢＳで染色した。次いで、合計２×１０４細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
その結果、Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αおよびβのＴ９８Ｇ細胞への導入によるアポトーシスの誘導はみられたが、ＡｄＬａｃＺは誘導を示さなかった（図１１）。さらに、アポトーシス細胞死は用量依存的にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αによって誘導された（図１２）。次に、内因性ｐ５３ＡＩＰ１の阻害は、Ａｄ−ｐ５３の感染によって誘導されるｐ５３−依存的アポトーシスをブロックするかどうかを検討した。内因性ｐ５３ＡＩＰ１の発現を阻害するために、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の配列により、ＨＰＬＣで精製したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ１：ＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＧＡ／配列番号：１８）、および対照としてセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥ１：ＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧ／配列番号：１９）を作製した。ＦＩＴＣ−標識ＡＳは、核導入効率を評価するために使用した。アンチセンス−オリゴヌクレオチド（１μＭ）はリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で４時間トランスフェクトし、次いで、細胞へＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺのいずれかを感染させた。感染の４８時間後に、アポトーシス細胞をＦＡＣＳ分析によって分析した。
その結果、リポフェクチンと共にトランスフェクトしたＦＩＴＣ−標識対照オリゴヌクレオチドは、トランスフェクションの４時間以内に９０％以上のＵ３７３ＭＧ細胞の核に導入された（データは示していない）。ＡＳ１によるＵ３７３ＭＧ細胞の前処理により、ｐ５３ＡＩＰ１発現の誘導（図１３）およびｐ５３−誘導アポトーシスの誘導を顕著に阻害した（図１４）が、ＳＥ１では阻害しなかった。これらの結果からｐ５３ＡＩＰ１は、ｐ５３−依存的アポトーシスに重要で不可欠な因子の１つである可能性が示唆された。
［実施例７］  ｐ５３ＡＩＰ１のミトコンドリア・アポトーシス経路における関与
ｐ５３ＡＩＰ１が種々のアポトーシス経路に共通するメディエーターであるかどうかを明らかにするために、本発明者らはスタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＴＮＦαおよびＵＶ照射という３つの異なるアポトーシス刺激因子に関して、その機能を検討した。ＴＮＦαはミトコンドリア経路とは独立して細胞死受容体経路を介してアポトーシスを惹起する（Ｌｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０１：３８９−３９９，２０００）。ＵＶおよびＳＴＳはミトコンドリア経路を通じてミトコンドリア膜電位を下方制御し、シトクロムｃの放出を誘発することによってアポトーシスを誘導する（Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２：３１８−３２５，２０００；Ｓｃａｒｌｅｔｔ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４７５：２６７−２７２，２０００；Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５２：２３７−２５０，２００１）。
アポトーシスの誘導処理２４時間前に播いた細胞の処理時点での集密度は、６０〜７０％であった。アポトーシス性ストレスに応じたｐ５３ＡＩＰ１の発現を検討するために、ＭＣＦ７（乳癌）細胞をスタウロスポリンまたはＴＮＦαとともに連続的にインキュベートするか、ＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて所定線量（Ｊ／ｍ２）の紫外線で処理した。浮遊細胞および付着細胞を採取し、ウェスタンブロット法、ＦＡＣＳ分析およびＲＴ−ＰＣＲを行った。ＦＡＣＳ分析に関しては、付着細胞および剥離細胞をまとめ、４℃の７５％エタノールで固定した。ＰＢＳで２回すすぎ洗いを行った後、煮沸ＲＮａｓｅを含む１ｍｌのＰＢＳとともに細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて細胞を１０μｇのヨウ化プロピジウムを含む１ｍｌのＰＢＳ中で染色した。細胞集団におけるｓｕｂ−Ｇ１核の比率を、２×１０４個以上の細胞を用いてフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。ｉｎ  ｓｉｔｕ末端転移酵素ｄＵＴＰニック断端標識（ＴＵＮＥＬ）は、Ａｐｏｐｔａｇ  Ｄｉｒｅｃｔ（Ｏｎｃｏｒ）を製造元の指示書通りに行った。
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＲＮｅａｓｙスピンカラムキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造元の指示に従って行った。まず、細胞から全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて５μｇの全ＲＮＡから合成した。同一反応物から生じたｃＤＮＡの半定量的比較が行えるように１５〜３０サイクルでＲＴ−ＰＣＲ指数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）を決定した。各ＰＣＲには、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９４℃の初期変性ステップを２分間行った後、９４℃３０秒間、５５〜５９℃３０秒間および７２℃１分間を、３３サイクル（ｐ５３ＡＩＰ１の場合）、２４サイクル（ＮｏｘａおよびＰＩＧ３の場合）、２５サイクル（ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５の場合）、２１サイクル（Ｂａｘの場合）または１８サイクル（β２ＭＧの場合）で行った。プライマー配列は、ｐ５３ＡＩＰ１の場合：Ｆ（ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＣ／配列番号：２０）およびＲ（ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣ／配列番号：２１）；ＰＩＧ３の場合：Ｆ（ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ／配列番号：２２）およびＨ（ＧＣＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＣＴＣ／配列番号：２３）；Ｎｏｘａの場合：Ｆ（ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ／配列番号：２４）およびＲ（ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＣＴＣ／配列番号：２５）；ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５の場合：Ｆ（ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＴＴＧ／配列番号：２６）およびＲ（ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＧＴＣ／配列番号：２７）；Ｂａｘの場合：Ｆ（ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＴＧ／配列番号：２８）およびＲ（ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＴＣ／配列番号：２９）とした。ＰＣＰ産物は２．５％アガロースゲル上での電気泳動によって分離した。
インキュベーション時間および線量は、ＲＴ−ＰＣＲではＳＴＳを２４時間、ＴＮＦαおよぴＵＶを４８時間、ウェスタンブロット法ではＳＴＳを３６時間、ＴＮＦαおよびＵＶを４８時間、ＦＡＣＳおよびＴＵＮＥＬアッセイではＳＴＳ（０．５μＭ）およぴＵＶ（５０Ｊ／ｍ２）を３６時間、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）を７２時間である。免疫細胞化学分析にはＳＴＳ（０．５μＭ）およびＵＶ（５０Ｊ／ｍ２を２４時間、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）を４８時間にて行った。
図１５に示す通り、ＳＴＳまたはＵＶ照射によるアポトーシス誘導時にはｐ５３ＡＩＰ１の発現が用量依存的に顕著に増加するが、ＴＮＦαに対する反応ではこれは生じなかった。ＢａｘおよびＰＩＧ３もＳＴＳおよびＵＶ性損傷によって誘導されたが、ｐ５３ＡＩＰ１の場合とは異なり、ＵＶ照射に応じたこれらの発現には用量依存性は認められなかった。Ｋｉｌｌｅｒ／ＤＲ５  ｍＲＮＡの発現はＳＴＳおよびＴＮＦαによるアポトーシス誘導時に上昇するが、ＮｏｘａはＵＶ照射によるアポトーシス誘発時のみに誘導された。これに対して、Ｈ１２９９（肺癌）細胞（ｐ５３−／−）を用いた場合には、この３つのアポトーシス刺激因子はいずれもｐ５３ＡＩＰ１の発現を誘導しなかった。以上の結果は、ｐ５３ＡＩＰ１がミトコンドリアのアポトーシス経路にｐ５３依存的な様式で特異的にかかわっている可能性を示唆するものである（図１６）。
次いで、種々のアポトーシス過程における内因性ｐ５３ＡＩＰ１の細胞内局在を検討した。どのアポトーシス刺激因子にも曝露していないＭＣＦ７（ヒト乳癌）細胞ではｐ５３ＡＩＰ１の発現は検出されなかったが、ＳＴＳで処理するかＵＶを照射するとミトコンドリアでｐ５３ＡＩＰ１の濃染が認められた。ＴＮＦα処理後にはｐ５３ＡＩＰ１の染色は認められなかった（図１７）。ｐ５３ＡＩＰ１がアポトーシス過程に関与することを確かめるために、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）を用いた実験を行った。  アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内因性ｐ５３ＡＩＰ１の発現を阻害するために、ＨＰＬＣで精製したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ２：ＴＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＣ／配列番号：３０）と、対照としてのセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥ２：ＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＧＡ／配列番号：３１）をｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の配列に従って調製した。ＡＳ２（１μＭ）によるトランスフェクションをリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて４時間行った後、細胞をＵＶ照射（５０Ｊ／ｍ２）で処理するか、０．５μＭ  ＳＴＳまたは１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαと共にインキュベートした。処理３６時間後にアポトーシス細胞をＦＡＣＳおよびＴＵＮＥＬアッセイによって分析した。
その結果、ＭＣＦ７細胞をＡＳで前処理した場合、ＵＶ照射後のｐ５３ＡＩＰ１の発現レベルはセンスオリゴヌクレオチドの場合と比べて約５０％低かった（図１７）。また、ＡＳによってＳＴＳ処理後のアポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）細胞集団は３７％から２８％に減り、ＵＶ照射後のものは３３％から１６％に減った。しかし、ＭＣＦ７細胞にＡＳ処理を行ってもＴＮＦαによって誘導される細胞死は阻害されなかった（図１８）。
［実施例８］  ｐ５３ＡＩＰ１によるミトコンドリアΔΨｍ、およびミトコンドリアからのシトクロムｃ放出の制御
Ｓｃｈｕｌｅｒら（Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：７３３７−７３４２，２０００）は、ｐ５３遺伝子の導入によってミトコンドリア膜電位の下方制御が誘導され、シトクロムｃの放出が促進されることを示した。Ｎｏｘａ、ＰＵＭＡおよびＢａｘなどのその他のｐ５３下流遺伝子もミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を亢進することが知られている（Ｏｄａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），２８８：１０５３−１０５８，２０００；Ｎａｋａｎｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｖｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，７：６８３−６９４，２００１；Ｊｕｒｇｅｎｓｍｅｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４９９７−５００２，１９９８）。ｐ５３ＡＩＰ１誘導性アポトーシスの分子機構を解明するために、本発明者らはこれらの現象に対するｐ５３ＡＩＰ１過剰発現の影響を検討した。
Ｈ１２９９（肺癌）およびＳａｏｓ−２（骨肉腫）細胞にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αを感染させた後、ローダミン１２３染色によってミトコンドリアΔΨｍの程度を評価した。Ｈ１２９９細胞ではＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αによってアポトーシスが誘導されたが、Ｓａｏｓ−２細胞はｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の導入に対して抵抗性であった。感染４８時間後にミトコンドリアΔΨｍの下方制御が認められたのはＨ１２９９細胞のみであった（図１９）。シトクロムｃの細胞内局在を調べるため、図２０に示す時点に細胞成分画分を採取し、サイトゾル画分およびミトコンドリア画分を抗シトクロムｃ抗体を用いるウェスタンブロット法にかけた。細胞成分画分の調製は、次のようにして行った。細胞をＰＢＳで２回洗い、各ペレットを０．８ｍｌのＲＳバッファー（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に懸濁した。細胞を２１ゲージ針に１０回通すことによってホモジネート化した。続いて各可溶化物に１１ｍｌの２．５×ＭＳバッファー（５２５ｍＭマンニトール、１７５ｎｍＭスクロース、１２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を添加した。ホモジネートを１３００ｇ、４℃で５分間×３回遠心し、核および細胞残渣を除去した。上清を１７０００ｇ、４℃で１５分間遠心し、ミトコンドリアを回収した。この結果得られた上清を１０００００ｇ、４℃で１時間遠心し、サイトゾル画分と称する最終的な上清を調製した。
その結果、Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１α感染から４８時間後に、シトクロムｃのミトコンドリアからサイトゾルへの顕著な移行が認められた。
［実施例９］  ｐ５３ＡＩＰ１のｂｃｌ−２との相互作用
ｂｃｌ−２の過剰発現により、ｐ５３依存的なミトコンドリアΔΨｍ損失およびアポトーシスを阻止することができる（Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：３４２７−３４３１，１９９３；Ｃｈｉｏｕ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４：２５５６−２５６３，１９９４）。ｐ５３ＡＩＰ１およびｂｃｌ−２はアポトーシスに関係するミトコンドリアの構成要素であるため、本発明者らはこの２つの蛋白質が相互作用によってアポトーシス過程に影響を及ぼすのではないかと推測した。ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはｂｃｌ−２のいずれかを含む発現ベクターによる、ＣＯＳ７細胞への同時トランスフェクションを行った。抗体は、ウサギにｐ５３ＡＩＰ１のＮ末端（Ａｂ−１）およびＣ末端（Ａｂ−２）ペプチドによる免疫処置を行い、後に抗原アフィニティーカラムで精製を行った。実験にはその他、ＨＡに対するウサギポリクローナル抗体（ＭＢＬ：５６１）、ｂｃｌ−２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ：ｓｃ−５０９）、ｐ２１ＷＡＦｌに対するマウスモノクローナル抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨ  ＥＭ：ＯＰ６４）、ｐ５３に対するマウスモノクローナル抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ：ＯＰ４３）およびシトクロムｃに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ：ｓｃ−７１５９）等を使用した。また、免疫沈降はウサギ抗ＨＡ抗体（ポリクローン）またはマウス抗ｂｃｌ−２抗体（モノクローン）に加えてプロテインＧセファロースを用いて行った。沈降物を可溶化緩衝液（０．５％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で４回洗い、レムリ試料用緩衝液（ＢＩＯ  ＲＡＤ）によって溶出させた。イムノブロット法は以前の記載の通りに行った（Ｏｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０２：８４９−８６２，２０００）。
その結果、ｐ５３ＡＩＰ１αまたはｂｃｌ−２を含む蛋白質複合体は、それぞれウサギポリクローナル抗ＨＡ抗体、またはマウスモノクローナル抗ｂｃｌ−２抗体によって細胞抽出物から免疫沈降を生じた。いずれの抗体によって沈降した免疫複合体にもｂｃｌ−２およびＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１α蛋白質の両方が含まれることがウェスタンブロットによって示された（図２１Ａ）。ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１βとｂｃｌ−２との間の特異的相互作用も同様に確かめられた。
本発明者らは続いて、ｐ５３ＡＩＰ１蛋白質およびｂｃｌ−２蛋白質の細胞内局在を調べた。発現ベクターをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトしてから２４時間後に、回収した細胞をマウスモノクローナル抗ｂｃｌ−２抗体およびウサギポリクローナル抗ＨＡ抗体で二重染色した。ｐ５３ＡＩＰ１は細胞質中に顆粒状パターン（緑色）として染色され、ｂｃｌ−２（赤色）も同様であった。この２つのシグナルは二重カラー画像でははつきりと重なり、黄色のシグナルとして認められた（図２１Ｂ、上方）。この２つの蛋白質はミトコンドリアに位置することが確認された。ＵＶ照射による損傷を受けたＭＣＦ７細胞において、ウサギポリクローナル抗ヒトｐ５３ＡＩＰ１抗体（Ａｂ−２）およびマウスモノクローナル抗ヒトｂｃｌ−２抗体による内因性ｐ５３ＡＩＰ１およびｂｃｌ−２の二重染色も行った。図２１Ｂの下方に示されている通り、損傷によって誘導された内因性ｐ５３ＡＩＰ１およびｂｃｌ−２蛋白質は異所性発現された蛋白質と同じ様式および位置に染色された。
［実施例１０］  ｐ５３ＡＩＰ１とｂｃｌ−２との機能的相互作用
図１９、２０に示されている通り、ｐ５３ＡＩＰ１がそれ自体でミトコンドリアΔΨｍを制御し、シトクロムｃの放出を誘発することが本発明者らの実験によって示された。Ｂｃｌ−２はミトコンドリアからのシトクロムｃの放出も遮断するミトコンドリアΔΨｍの重要な調節因子としてよく知られている。以上の事実に加えて、ｐ５３ＡＩＰ１およびｂｃｌ−２のミトコンドリアでの相互作用から、本発明者らはｐ５３ＡＩＰ１自体がｂｃｌ−２との相互作用によってミトコンドリアΔΨｍを制御し、シトクロムｃ放出を誘発しているのではないかと推測した。この仮説を検証するために、本発明者らはｂｃｌ−２がｐ５３ＡＩＰ１誘導性アポトーシスおよびミトコンドリアΔΨｍの変化を阻害しうるか否かについて検討した。ＨｅＬａ細胞に対してｐｃＤＮＡ３．１−ｂｃｌ−２およびｐＣＭＶ−ピューロマイシンを５：１の比でＦｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）とともに用いる同時トランスフェクションを行った。１．２５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む培地中に２０日間置いてトランスフェクト細胞を選択し、免疫細胞化学分析およびイムノブロット法によってｂｃｌ−２発現を評価した。ｂｃｌ−２を安定的に発現する細胞をＨｅＬａ−ｂｃｌ−２細胞と呼ぶ。このようにｂｃｌ−２発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすることにより、ｂｃｌ−２を発現する２つの独立した細胞株（ＨｅＬａ−ｂｃｌ２−１およびＨｅＬａ−ｂｃｌ２−２）を樹立した。
図２２Ａに示されている通り、ＨｅＬａ疑似親細胞（すなわち、対照ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみを組み入れたもの）にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはＡｄ−ｐ５３を感染させた場合には、アポトーシスを誘導可能であったが、Ａｄ−ＬａｃＺでは誘導できなかった。しかし、ｂｃｌ−２を過剰発現する２つのＨｅＬａ細胞株にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはＡｄ−ｐ５３を感染させた場合にはアポトーシス細胞の数が有意に減少し、このことからｐ５３ＡＩＰ１およびｐ５３が関与するアポトーシス経路をｂｃｌ−２が阻害しうる可能性が示唆された。
本発明者らは次にミトコンドリアΔΨｍそれ自体を検討した。ミトコンドリア膜電位の検出は次のようにして行った。細胞を５×１０５個／６ｃｍ培養皿の密度で播き、２４時間後にＡｄｐ５３ＡＩＰ１α、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺをＭＯＩ  １００ｐｆｕ／細胞で感染させた。感染６０時間後に付着細胞および浮遊細胞をトリプシン処理によって回収し、冷ＰＢＳで２回洗った。１０ｎＭローダミン１２３溶液（ＰＢＳ中）を添加し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、フローサイトメトリーによって蛍光を測定した。
その結果、外因性ｐ５３ＡＩＰ１α、およびｐ５３蛋白質の誘導によってＨｅＬａ疑似親細胞におけるミトコンドリアΔΨｍは下方制御されたが、外因性ＬａｃＺではこれは生じなかった。しかし、この現象はいずれのｂｃｌ−２過剰発現性ＨｅＬａ細胞株でもブロックされた（図２２Ｂ）。これらの結果から、ｂｃｌ−２がｐ５３ＡＩＰ１αまたはｐ５３によって誘導されるミトコンドリアΔΨｍの下方制御を阻害しうることが示され、ｂｃｌ−２とｐ５３ＡＩＰ１との相互作用が正の作用と負の作用のバランスをとることによってミトコンドリアΔΨｍを制御している可能性が裏づけられた。
［実施例１１］  種々の癌細胞株に対するｐ５３ＡＩＰ１のインビトロでの抗腫瘍効果
ｐ５３ＡＩＰ１は、Ａｄｐ５３ＡＩＰ１α感染後のＨ１２９９細胞のミトコンドリアにおいて時間依存的な様式で顕著に発現した（図２３Ａ、Ｂ）。種々の組織に由来する癌細胞に対するｐ５３ＡＩＰ１のアポトーシス誘導能を評価するために、ｐ５３がＥＩＡによって不活性化されたＨｅＬａ、Ｔ９８Ｇ（ｐ５３変異型）、Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル型）、ＳＷ４８０（ｐ５３変異型）、ＨＣＴ１１６（ｐ５３野生型）およびＭＣＦ７（ｐ５３野生型）という６種類の多様な癌細胞株にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αを感染させた。図２４に示されている通り、アポトーシスの程度は細胞株によって異なったものの、ｐ５３の状態とは関係なく、６種類のすべての細胞株でＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１α感染によってアポトーシスが明らかに誘導された。野生型ｐ５３蛋白質を含む癌細胞はｐ５３遺伝子治療に対する抵抗性が比較的高い（Ｇｏｍｅｚ−Ｍａｎｚａｎｏ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：６９４−６９９，１９９６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１２１−１３０，１９９６）。本発明者らはこのため、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のインビトロでの抗腫瘍効果を、野生型ｐ５３（ＷＴｐ５３）を有する９種の癌細胞株（ＨＣＴ１１６（結腸癌）、ＬＳ１７４Ｔ（結腸癌）、Ａ５４９（肺癌）、ＭＫＮ４５（胃癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＴＥＲＡ２（奇形種）、ＤＢＴＲＧＯ５ＭＧ（神経膠腫）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）およびＬｕ９９Ａ（肺癌））と比較した。この９種の細胞株はいずれもＡｄ−ＬａｃＺベクターに対して１００％の感染性を示した。アデノウィルスを介した遺伝子導入による外因性ｐ５３ＡＩＰ１の異所性発現により、ＷＴｐ５３癌細胞株のうち６種ではアポトーシスが効率的に引き起こされた（図２５）。事実、この６種の細胞株のうち４種はｐ５３よりもｐ５３ＡＩＰ１によって効率的に死滅した。
産業上の利用の可能性
本発明により、ｐ５３癌抑制タンパク質の新たな標的遺伝子「ｐ５３ＡＩＰ１」が提供された。該遺伝子は、ｐ５３が介するアポトーシスに密接に関連した機能を有する。Ｔ９８Ｇ細胞へのｐ５３ＡＩＰ１発現ベクターのトランスフェクション、またはｐ５３ＡＩＰ１を含むアデノウィルスベクターの感染により、大量のアポトーシス細胞死が誘発される。従って、本発明のｐ５３ＡＩＰ１遺伝子を発現ベクターもしくはアデノウィルスベクターによって癌細胞へ導入することにより、アポトーシスを介したヒト癌の治療の可能性が期待できる。また、本発明のｐ５３ＡＩＰ１遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質は、アポトーシスが関連する疾患の標的分子として、該疾患の治療剤の開発に有用である。
また、本発明者らにより、ｐ５３ＡＩＰ１はｐ５３感受性癌細胞株およびｐ５３抵抗性癌細胞株の双方においてアポトーシスを効果的に誘導することが分かった。このことから、ｐ５３ＡＩＰ１がミトコンドリアにおけるｐ５３依存的アポトーシス経路の直接的なメディエーターであることが示された。従って、本発明のｐ５３ＡＩＰ１遺伝子は、ｐ５３自体よりも癌の治療に広く応用できる可能性が考えられる。ｐ５３ＡＩＰ１を有するアデノウィルスベクターは、癌細胞、特に野生型ｐ５３を有するｐ５３抵抗性細胞の細胞死を目的とする遺伝子治療にも、有望な薬剤となるものと期待される。
また本発明は、アポトーシスの誘導を調節する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。これにより、癌およびアポトーシス関連疾患に対する該化合物を有効成分とする予防剤および治療剤の開発が大いに期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｐ５３ＡＩＰ１のゲノム構造を示す図である。エクソン−イントロンの組織図およびｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の転写物を示す。ｐ５３結合部位と思われる部位（ｐ５３−ＢＤＳ）をイントロン１内に同定した。ｐ５３結合部位と思われる部位の配列とコンセンサス配列を比較した。大文字のヌクレオチドはコンセンサスに対するゲノム配列の同一性を示すが、英小文字はコンセンサスとの不一致を表す。（Ｒ）＝プリン、（Ｙ）＝ピリミジン、（Ｗ）＝ＡまたはＴ。
図２は、ｐ５３によるｐ５３ＡＩＰ１の誘導を示す写真である。Ａｄ−ｐ５３を４８時間感染させたＵ３７３ＭＧ細胞から単離した３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用してノーザンブロットを行った。ｐ５３ＡＩＰ１およびβ−アクチンプローブを用いて実施したノーザンブロットのオートグラフを示す。
図３は、ｐ５３ＡＩＰ１α、βおよびγの予測されるアミノ酸配列を示す図である。白抜き文字はアミノ酸の同一性を示す。
図４は、ＥＭＳＡの結果を示す写真である。示したレーンにおいて、ｐ５３抗体ｐＡｂ４２１およびｐＡｂ１８０１が含まれている。ｐ５３およびＤＮＡ相互作用はｐ５３ＡＩＰ１遺伝子（自己）の結合部位に相当する非標識オリゴヌクレオチドによって阻害されたが、非特異的オリゴヌクレオチドによっては阻害されなかった（ＴＬ）。
図５は、ｐ５３ＢＤＳのｐ５３応答を示すグラフである。ｐ５３ＢＤＳ配列またはｐ５３ＢＤＳを含むイントロン１（ｉｎｔｒｏｎ  １−ｗｔまたはｉｎｔｒｏｎ  １−ｍｔ）の５００ｂｐゲノム配列の１コピー（ｐ５３ＢＤＳ（１ｘ））、または２コピー（ｐ５３ＢＤＳ（２ｘ））を含有するレポーターを構築した。ｐ５３ＢＤＳの４番目のＣからＴへの点変異を、５００ｂｐゲノム配列（ｉｎｔｒｏｎ  １−ｍｔ）へ導入した。活性は、コトランスフェクトしたｐＲＬ−ＴＫ（内部対照）からのホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケルシフェラーゼの発光の測定値の相対値として示されている。３回の実験結果の平均値を標準偏差の誤差棒と共に示す。
図６は、ＣＯＳ−７細胞におけるｐ５３ＡＩＰ１の局在化を示す写真である。ＣＯＳ−７細胞に、ＨＡ−標識ｐ５３ＡＩＰ１α（ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１α）を発現するように設計したプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。細胞を抗−ＨＡ抗体（ＦＩＴＣ）および抗−ヒトミトコンドリア抗体（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で二重染色した。
図７は、ヒト細胞におけるＤＮＡ損傷による内因性ｐ５３ＡＩＰ１  ｍＲＮＡの誘導を示す写真である。遺伝毒性ストレスによるＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を定量的対照として測定した。γ線照射（ＩＲ）およびアドリアマイシン処理（ＡＤＲ）によるｐ５３ＡＩＰ１およびｐ２１／ＷＡＦ１発現の誘導を示す。ＮＨＤＦは野生型ｐ５３遺伝子を有する正常なヒト皮膚線維芽細胞株、ＳＷ４８０は野生型ｐ５３遺伝子を含まない結腸腺癌細胞株である。
図８は、異所性ｐ５３ＡＩＰ１発現によるＴ９８Ｇの増殖抑制効果を示す写真である。ＨＡ−標識ｐ５３ＡＩＰ１α、β、γ（ｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１−α、β、γ）発現ベクター、およびモックベクター（ｐＣＡＧＧＳ）をＴ９８Ｇ細胞のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターでコトランスフェクトし、６００μｇ／ｍｌゲネチシンの存在下において２週間培養した。
図９は、ｐ５３ＡＩＰ１αの異所性発現によるアポトーシスの誘導を示す写真である。Ｔ９８Ｇ細胞にｐＣＡＧＧＳ／Ｎ−ＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１α、野生型ｐ５３および変異型（Ｒ２７３Ｈ）ｐ５３発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした。ｐ５３ＡＩＰ１αまたは野生型および変異型ｐ５３の発現は、それぞれ、抗−ＨＡ抗体または抗−ｐ５３抗体によって検出された。アポトーシスはＦＩＴＣ発光を用いたＴＵＮＥＬ方法によって検出した。
図１０は、ｐ５３ＡＩＰ１αのミトコンドリアΔΨｍの消失の誘導を示す写真である。（左上）ｐ５３ＡＩＰ１αの発現は抗−ＨＡ抗体（緑）によって検出された。（右上）ミトコンドリアΔΨｍはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（赤）によって染色された。（左下）異所性発現されたｐ５３ＡＩＰ１αタンパク質およびミトコンドリアΔΨｍの重なり像。（右下）ＤＡＰＩおよびミトコンドリアΔΨｍの重なり像。
図１１は、ｐ５３ＡＩＰ１のｐ５３−誘導アポトーシスに対する働きを示す図および写真である。Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αおよびβは、Ｔ９８細胞においてアポトーシスを誘導するが、Ａｄ−ＬａｃＺは誘導しない。Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１α、βまたはＡｄ−ＬａｃＺが感染したＴ９８細胞において、アポトーシス細胞は感染の７２時間後にＦＡＣＳおよびＴＵＮＥＬ分析によって評価された。
図１２は、ｐ５３ＡＩＰ１のｐ５３−誘導アポトーシスに対する働きを示す図である。Ｔ９８Ｇ細胞のアポトーシスは用量依存的にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αの感染によって誘導された。種々の用量のＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αが感染したＴ９８Ｇ細胞では、細胞は感染の７２時間後にＦＡＣＳ分析によって評価した。
図１３は、ｐ５３ＡＩＰ１のｐ５３−誘導アポトーシスに対する働きを示す写真である。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｐ５３ＡＩＰ１αｍＲＮＡ発現の阻害を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）またはセンス−オリゴヌクレオチド（ＳＥ）（１μＭ）をリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）と共にＵ３７３ＭＧ細胞に４時間トランスフェクトし、次いで、細胞にＡｄ−ｐ５３を感染させた。感染の４８時間後に、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡｓを合成し、ｐ５３ＡＩＰ１α発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した。
図１４は、ｐ５３ＡＩＰ１のｐ５３−誘導アポトーシスに対する働きを示す図である。ｐ５３ＡＩＰ１α発現の阻害はｐ５３−依存的アポトーシスを遮断した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）またはセンス−オリゴヌクレオチド（ＳＥ）（１μＭ）をリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）と共にＵ３７３ＭＧ細胞にトランスフェクトし、次いで細胞に種々の用量のＡｄ−ｐ５３を感染させた。感染の４８時間後に、アポトーシス細胞をＦＡＣＳ分析で評価した。
図１５は、ウェスタンブロット法（Ａ）または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）によって検討した、異なるアポトーシス経路を介したｐ５３ＡＩＰ１蛋白質の発現を示す写真である。ウェスタンブロット法に関してはＳＴＳ損傷の３６時間後、ＵＶまたはＴＮＦα損傷の４８時間後にＭＣＦ７細胞を採取し、ＲＴ−ＰＣＲに関してはＳＴＳ損傷から２４時間後、ＴＮＦαまたはＵＶ損傷から４８時間後に採取した。β−アクチンまたはβ２ＭＧの発現を対照として用いた。
図１６は、ＴＵＮＥＬアッセイにおけるアポトーシス細胞（緑色または黄色のシグナル）およびＦＡＣＳ分析におけるｓｕｂ−Ｇ１画分を示す写真および図である。０．５μＭ  ＳＴＳもしくは１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαとのそれぞれ３６時間および７２時間の連続インキュベーション後、または線量５０Ｊ／ｍ２のＵＶ照射から３６時間後に回収したＭＣＦ７細胞におけるアポトーシスを示す。
図１７は、ｐ５３ＡＩＰ１蛋白質のミトコンドリアでの発現、およびＵＶまたはＳＴＳによって誘導されるアポトーシスにおけるｐ５３ＡＩＰ１蛋白質の働きを示す写真である。（Ａ）は、ＵＶ照射（５０Ｊ／ｍ２）、０．５μＭ  ＳＴＳ、または１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαによる処理によって損傷を受けたＭＣＦ７細胞における、ｐ５３ＡＩＰ１蛋白質のミトコンドリアでの発現を示す。ＳＴＳおよびＵＶ損傷から２４時間後、ＴＮＦα損傷から４８時間後に、ｐ５３ＡＩＰ１蛋白質およびミトコンドリアをそれぞれＦＩＴＣ結合ウサギ抗ｐ５３ＡＩＰ１抗体およびＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（ＣＭＸＲｏｓ）で染色した。核はＤＡＰＩ染色によって可視化した。（Ｂ）は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）によるｐ５３ＡＩＰ１発現阻害を示す。リポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いてＡＳまたはセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥ）（各１μＭ）をＭＣＦ７細胞に４時間トランスフェクトした後、細胞にＵＶ（５０Ｊ／ｍ２）損傷を与えた。トランスフェクション３６時間後に、ｐ５３ＡＩＰ１の発現をウェスタンブロット法によって評価した。
図１８は、ＳＴＳ、ＴＮＦαおよびＵＶ依存性アポトーシスをＦＡＣＳｃａｎ（ｓｕｂ−Ｇ１画分）で測定した結果を示す図である。リポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いてＡＳまたはＳＥ（１μＭ）をＭＣＦ７細胞に４時間トランスフェクトした後、細胞をＵＶ、ＳＴＳまたはＴＮＦαで処理した。
図１９は、ｐ５３ＡＩＰ１によるアポトーシス誘導とミトコンドリアΔΨｍの制御を示す図である。Ｈ１２９９およびＳａｏｓ−２細胞にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはＡｄ−ＬａｃＺをＭＯＩ  １００ｐｆｕ／細胞で感染させた。ミトコンドリアΔΨｍ（感染４８時間後）およびアポトーシス細胞の集団（感染９６時間後）をそれぞれローダミン１２３染色およびＦＡＣＳ分析によって検討した。
図２０は、ｐ５３ＡＩＰ１によるシトクロムｃの放出を示す写真である。ｐ５３ＡＩＰ１の過剰発現によるミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を示す。ＨＣＴ１１６細胞にＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αまたはＡｄ−ＬａｃＺをＭＯＩ  １００で感染させ、表記した時点に回収した。サイトゾル画分およびミトコンドリア画分をそれぞれイムノブロットにかけた。
図２１は、ｐ５３ＡＩＰ１とｂｃｌ−２との物理的相互作用を示す写真である。（Ａ）ｂｃｌ−２およびＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１αの発現ベクターをＣＯＳ７細胞に同時トランスフェクトし、２４時間後に細胞抽出物を単離した。ｂｃｌ−２またはｐ５３ＡＩＰ１との蛋白質複合体を抗ｂｃｌ−２抗体または抗ＨＡ抗体によって免疫沈降させ（ＩＰ）、イムノブロットで分析した（ＩＢ）。ＷＣＬ：全細胞可溶化物。（Ｂ）ｂｃｌ−２およびｐ５３ＡＩＰ１の共存を示す。（上）ｂｃｌ−２およびＨＡ−ｐ５３ＡＩＰ１αの発現ベクターをＣＯＳ７細胞に同時トランスフェクトし、２４時間後に細胞をマウスモノクローナル抗ｂｃｌ−２抗体（緑）およびウサギポリクローナル抗ＨＡ抗体（赤）で二重染色した。二重カラー画像では２つのシグナルが重なって黄色のシグナルとして認められる。（下）ＵＶ照射（５０Ｊ／ｍ２）による損傷を受けたＭＣＦ７細胞。内因性ｐ５３ＡＩＰ１（緑）およびＢｃｌ−２（赤）蛋白質を、３６時間後にそれぞれウサギ抗ｐ５３ＡＩＰ１ポリクローナル抗体、およびマウス抗ｂｃｌ−２モノクローナル抗体によって免疫染色した。
図２２は、ｐ５３ＡＩＰ１とｂｃｌ−２との機能的相互作用を、ＦＡＣＳ分析によって評価した結果を示す図である。（Ａ）Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αによって誘導されるアポトーシスのｂｃｌ−２による阻害を示す。Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１α、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺをＨｅｌａ−ｐｃＤＮＡ、Ｈｅｌａ−ｂｃｌ−２（１）およびＨｅｌａ−ｂｃｌ−２（２）という３種の異なる細胞株に感染させ、感染７２時間後にアポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１画分）をＦＡＣＳ分析によって評価した。（Ｂ）Ａｄｐ５３ＡＩＰ１αおよびＡｄ−ｐ５３によるミトコンドリアΔΨｍの下方制御を示す。Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１α、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺをＨｅｌａ−ｐｃＤＮＡ、Ｈｅｌａ−ｂｃｌ−２（１）およびＨｅｌａ−ｂｃｌ−２（２）細胞株に感染させた。感染６０時間後に細胞をローダミン１２３によって染色し、ＦＡＣＳｃａｎによって蛍光を測定した。横軸の目盛りは、左端が「１００」、右端が「１０４」、中心が「１０２」を表す。
図２３は、アデノウィルスベクターを用いてＨ１２９９細胞へ導入した外来性ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質の発現を示す写真である。（Ａ）Ａｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αの感染による肺癌細胞における外因性ｐ５３ＡＩＰ１αの発現を示す写真である。Ｈ１２９９細胞を処理後の表記した時点で回収し、細胞可溶化物を抗ｐ５３ＡＩＰ１抗体を用いるイムノブロット法にかけた。（Ｂ）抗ｐ５３ＡＩＰ１抗体および抗ミトコンドリア抗体によって標識されたｐ５３ＡＩＰ１α（緑）、およびミトコンドリア（赤）を示す。この二重カラー画像は感染２４時間後にｐ５３ＡＩＰ１のシグナル（緑色）がミトコンドリアのものと対応することを示している。
図２４は、さまざまな癌細胞株に対するｐ５３ＡＩＰ１のインビトロでの抗腫瘍効果を示す図である。種々の用量（ＭＯＩ）のＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αの感染によって６種の癌細胞株で誘導されたアポトーシスを示す。アポトーシス細胞は感染９６時間後にＦＡＣＳｃａｎによって分析した。
図２５は、種々の用量（ＭＯＩ）のＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ５３ＡＩＰ１αの感染による、６種の癌細胞株（ｐ５３野生型）で誘導されたアポトーシスのＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。アポトーシス細胞は感染９６時間後にＦＡＣＳｃａｎによって分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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