(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する標識化ヌクレオチドであって：
【化１１】
0004961410.tif 000041
ここで：
Ｂは、示された糖部分にＮ９−位を介して結合された７−デアザプリンもしくはプリンヌクレオチド塩基であるか、または示された糖部分にＮ１−位を介して結合されたピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｗ１は、ＨまたはＯＨであり；
Ｗ２は、ＨまたはＯＨであり；
Ｗ３は、ＯＨ、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、またはホスホロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアニロチオエートおよびホスホロアミデートからなる群より選択されるリン酸アナログであり；
Ｄは、以下の式を有する蛍光色素部分であり：
【化１２】
0004961410.tif 000042
（ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、各々たがいに独立して水素、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、またはＲ１およびＲ６が一緒になってベンゾ基を形成するか、もしくはＲ４およびＲ５が一緒になってベンゾ基を形成し；
Ｙ１〜Ｙ４は、各々たがいに独立して水素、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、またはＹ１およびＲ２が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成しかつＹ２およびＲ１が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成するか、および／またはＹ３およびＲ３が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成しかつＹ４およびＲ４が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成し；そして
Ｘ１はカルボキシレートであり；
ＬはＢをＤに連結する連結基であり、Ｂがプリンである場合、該Ｌはプリンの８−位に結合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、該Ｌは７−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジンである場合、該Ｌはピリミジンの５−位に結合し、ここで、Ｌは、以下：
【化１３】
0004961410.tif 000043
からなる群より選択される、
標識化ヌクレオチド。
【請求項２】
Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群より選択される、請求項１に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項３】
Ｌは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項４】
Ｗ１およびＷ２は、各々Ｈであり、Ｗ３は、Ｐ３Ｏ１０である、請求項１に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項５】
Ｗ１がＨであり、Ｗ２がＯＨであり、Ｗ３がＰ３Ｏ１０である、請求項１に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項６】
以下の式を有するヌクレオチドを含む標識化ポリヌクレオチドであって：
【化１４】
0004961410.tif 000044
ここで：
Ｂは、示された糖部分にＮ９−位を介して結合された７−デアザプリンもしくはプリンヌクレオチド塩基であるか、または示された糖部分にＮ１−位を介して結合されたピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｚ１は、ＨまたはＯＨであり；
Ｚ２は、Ｈ、ＯＨまたはＮｕｃ１であり、Ｎｕｃ１は、示された糖部分に、５’−ホスホジエステル連結基、またはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデートおよびホスホルアミデートからなる群より選択されるそのアナログを介して結合されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｚ３はＯＨ、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、ホスホロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホロアニロチオエートおよびホスホルアミデートからなる群より選択されるリン酸アナログ、またはＮｕｃ２であり、Ｎｕｃ２は、示された糖部分に、３’−ホスホジエステル連結基、またはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデートおよびホスホルアミデートからなる群より選択されるそのアナログを介して結合されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり；
であり；
Ｄは、以下の式を有する蛍光色素部分であり：
【化１５】
0004961410.tif 000045
（ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、各々たがいに独立して水素、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、またはＲ１およびＲ６が一緒になってベンゾ基を形成するか、もしくはＲ４およびＲ５が一緒になってベンゾ基を形成し；
Ｙ１〜Ｙ４は、各々たがいに独立して水素、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、またはＹ１およびＲ２が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成しかつＹ２およびＲ１が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成するか、および／またはＹ３およびＲ３が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成しかつＹ４およびＲ４が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成し；そして
Ｘ１はカルボキシレートであり；
ＬはＢをＤに連結する連結基であり、Ｂがプリンである場合、該Ｌはプリンの８−位に結合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、該Ｌは７−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジンである場合、該Ｌはピリミジンの５−位に結合し、ここで、Ｌは、以下：
【化１６】
0004961410.tif 000046
からなる群より選択される、
標識化ポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群より選択される、請求項６に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｌは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である、請求項６に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項９】
以下の工程を包含するポリヌクレオチド配列決定の方法であって：
第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程であって、その結果：
該第１のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして第１の蛍光色素で標識され；
該第２のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシグアノシンまたは７−デアザジデオキシグアノシンを含み、そして第２の蛍光色素で標識され；
該第３のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシチミジンまたはジデオキシウラシルを含み、そして第３の蛍光色素で標識され；
該第４のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシアデノシンまたは７−デアザアデノシンを含み、そして第４の蛍光色素で標識され；
ここで、該第１、第２、第３、または第４の蛍光色素が互いからスペクトル分離可能であり、該第１、第２、第３、または第４の蛍光色素のうちの１つは、以下の式の４，７−ジクロロローダミン色素であり；
【化１０３】
0004961410.tif 000047
（ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、各々たがいに独立して水素、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、またはＲ１およびＲ６が一緒になってベンゾ基を形成するか、もしくはＲ４およびＲ５が一緒になってベンゾ基を形成し；
Ｙ１〜Ｙ４は、各々たがいに独立して水素、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、またはＹ１およびＲ２一緒になってが−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成しかつＹ２およびＲ１が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成するか、および／またはＹ３およびＲ３が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成しかつＹ４およびＲ４が一緒になって−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を形成し；
Ｘ１はカルボキシレートであり；そして
Ｌは４，７−ジクロロローダミン色素を該ポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基に連結する連結基であり、該ヌクレオチド塩基がプリンである場合、該Ｌはプリンの８−位に結合し、該ヌクレオチド塩基が７−デアザプリンである場合、該Ｌは７−デアザプリンの７−位に結合し、そして該ヌクレオチド塩基がピリミジンである場合、該Ｌはピリミジンの５−位に結合し、ここで、Ｌは、以下：
【化１０４】
0004961410.tif 000048
からなる群より選択される、
方法。
【請求項１０】
Ｒ２およびＲ３は各々が水素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；そして
Ｙ１〜Ｙ４が各々水素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｒ１およびＲ４は各々メチルであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４の一方はエチルであり、他方は水素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；Ｙ１〜Ｙ４が各々メチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｒ１とＹ２とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ２とＹ１とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ５およびＲ６は各々水素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１５】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４は各々水素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１６】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４は各々メチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２は各々メチルであり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２は各々水素であり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１９】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２が各々水素であり；
Ｙ３およびＹ４が各々メチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２１】
Ｒ２およびＲ３は各々が水素である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；そして
Ｙ１〜Ｙ４が各々水素である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
Ｒ１およびＲ４は各々メチルであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４の一方はエチルであり、他方は水素である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；Ｙ１〜Ｙ４が各々メチルである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
Ｒ１とＹ２とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ２とＹ１とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ５およびＲ６は各々水素である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４は各々水素である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４は各々メチルである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２は各々メチルであり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２は各々水素であり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２が各々水素であり；
Ｙ３およびＹ４が各々メチルである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の標識化ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
Ｒ２およびＲ３は各々が水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；そして
Ｙ１〜Ｙ４が各々水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ１およびＲ４は各々メチルであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４の一方はエチルであり、他方は水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；Ｙ１〜Ｙ４が各々メチルである、請求項９に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ１とＹ２とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ２とＹ１とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ５およびＲ６は各々水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４は各々水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；そして
Ｙ３およびＹ４は各々メチルである、請求項９に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２は各々メチルであり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２は各々水素であり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１はメチルであり；
Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は水素であり；
Ｒ３とＹ３とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し；そして
Ｒ４とＹ４とが一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ１〜Ｒ６は各々水素であり；
Ｙ１およびＹ２が各々水素であり；
Ｙ３およびＹ４が各々メチルである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分子プローブとして有用な蛍光色素化合物に関する。より
詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用な４，７−ジクロロローダミン色
素に関する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
0004961410.tif 000002
【０００４】
0004961410.tif 000003
【０００５】
生物学的分析物の非放射性検出は、現在の分析バイオテクノロジーにおいて、
重要な技術である。放射性標識の必要性をなくすことにより、安全性が高まり、
試薬廃棄物の環境上の影響が著しく低下し、その結果、分析コストが低減される
。このような非放射性検出方法を使用する方法の例には、ＤＮＡ配列決定、オリ
ゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、イムノアッセ
イなどが包含される。
【０００６】
多くの用途では、混合物中の複数の空間的に重複した分析物の独立した検出、
例えば、単一管の多重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮＡ配
列決定法などが必要である。複数座のＤＮＡプローブアッセイの場合には、多色
検出を提供することにより、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験
プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの製造が促進される。自動
化したＤＮＡ配列決定の場合には、多色標識化により、単一レーンの４個の塩基
全ての分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力が増え、レーン間
の電気泳動の可動性の変化に付随した不確実性がなくなる。
【０００７】
多重検出では、特に、電気泳動分離および酵素処理が必要な分析（例えば、Ｄ
ＮＡ配列決定）に対して、色素標識の選択について、非常に多くの厳しい制約が
課せられている。第１に、有機蛍光色素の典型的な発光バンドの半値幅は、約４
０〜８０ナノメーター（ｎｍ）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源
により制限されるので、その発光スペクトルが分光的に解析される一連の色素を
見つけるのは困難である。第２に、たとえ、非重複発光スペクトルを有する色素
を見出しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、そのセットは、依然として、適
当ではない。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合には、試料の充填を多くしても、低
い蛍光効率を補填できない（Ｐｒｉｎｇｌｅ）。第３に、数個の蛍光色素を同時
に使用するとき、これらの色素の吸収バンドが広範囲に分離するために、同時励
起が困難となる。第４に、これらの色素の電荷、分子サイズおよび立体配座は、
そのフラグメントの電気泳動可動性に悪影響を与えてはならない。最後に、これ
らの蛍光色素は、これらのフラグメントを製造するかまたは操作するのに使用す
る化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、
リガーゼ酵素など）と適合性でなければならない。
【０００８】
これらの厳しい制約のために、多色用途（特に、４色ＤＮＡ配列決定の領域）
で使用できる蛍光色素のセットは、少数発見されているにすぎない（Ｓｍｉｔｈ
１９９２，１９９５，  Ｐｒｏｂｅｒ；Ｃｏｎｎｅｌｌ）。
【０００９】
多色用途において特に有用な蛍光色素の１つのクラスはローダミン色素である
（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、
ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）など（Ｂｅｒｇｏｔ
）。（１）代表的に、ローダミンはフルオレセインよりも光安定であり、（２）
ローダミン標識されたジデオキシヌクレオチドは、熱安定性ポリメラーゼ酵素の
よりよい基質であり、そして（３）ローダミン色素の発光スペクトルは、フルオ
レセインの赤（より高波長）より顕著であるので、ローダミン色素はフルオレセ
イン色素に比べて特に魅力的である。
【００１０】
しかし、多重検出法の状況下で現在利用可能なローダミン色素の１つの重要な
欠点は、このような色素の比較的広い発光スペクトルである。この広い発光スペ
クトルは、スペクトルが隣接する色素間で低いスペクトル分解能を生じ、それに
よりこのような色素組み合わせの多成分分析を困難にする。図７Ａに示される蛍
光スペクトルは、この高程度のスペクトルの重複を実証する。現在利用可能なロ
ーダミン色素の２つ目の欠点は、それらの吸収スペクトルが、現在利用可能な固
体二重周波数緑ダイオードレーザー（例えば、ネオジム固体ＹＡＧレーザー、こ
れは約５３２ｎｍでの発光系列を有する）の波長と調和しないことである。これ
らのコンパクトなサイズ、長い寿命、および電力の効率的な使用のため、このよ
うなレーザーを使用することは非常に有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、分子プローブとして有用な４，７−ジクロロローダミン色素のクラ
スの発見に関する。
【００１２】
本発明の目的は、現在利用可能なローダミン色素より実質的に狭い発光スペク
トル領域を有するローダミン色素のクラスを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、現存のローダミン色素に比べて赤色側に約１５ｎｍまで
シフトした吸収スペクトルを有するローダミン色素のクラスを提供することにあ
る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１つの局面において、本発明は、以下の式を有する化合物であって：
【００１５】
【化８】
0004961410.tif 000004
【００１６】
ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低
級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコ
キシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択されるか、または、一緒
になった場合のＲ１およびＲ６がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合の
Ｒ４およびＲ５がベンゾであり；
Ｙ１〜Ｙ４は、別個に水素および低級アルキルからなる群から選択されるか、
または一緒になった場合のＹ１およびＲ２がプロパノでありかつＹ２およびＲ１
がプロパノであるか、もしくは一緒になった場合のＹ３およびＲ３がプロパノで
ありかつＹ４およびＲ４がプロパノであり；そして
Ｘ１〜Ｘ３は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート
、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、および連結基からなる群から選択される、
化合物。
【００１７】
好ましい実施態様において、Ｘ１は、カルボキシレートであり得る。
【００１８】
別の好ましい実施態様において、Ｘ２およびＸ３のうちの１つは、連結基であ
り得る。
【００１９】
別の好ましい実施態様において、Ｒ２およびＲ３は、別個に水素であり得る。
【００２０】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素、メチル、および
エチルからなる群から選択され得るか、または一緒になった場合のＲ１およびＲ
６がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ４およびＲ５がベンゾであ
り得；Ｙ１〜Ｙ４は、別個に水素、メチル、およびエチルからなる群から選択さ
れ得るか、または一緒になった場合のＹ１およびＲ２がプロパノでありかつＹ２
およびＲ１がプロパノであり得るか、もしくは一緒になった場合のＹ３およびＲ
３がプロパノでありかつＹ４およびＲ４がプロパノであり得；Ｘ１はカルボキシ
レートであり得；そしてＸ２およびＸ３は、別個に水素および連結基からなる群
から選択され得る。
【００２１】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素であり得；Ｙ１〜
Ｙ４は、別個に水素であり得；Ｘ１はカルボキシレートであり得；そしてＸ２お
よびＸ３のうちの１つは、連結基であり、他方は水素であり得る。
【００２２】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１およびＲ４は別個にメチルであり得；Ｒ
２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は水素であり得；Ｙ１およびＹ２のうち１つはエチ
ルであり、他は水素であり得；Ｙ３およびＹ４のうち１つはエチルであり、他は
水素であり得；Ｘ１はカルボキシレートであり得；そしてＸ２およびＸ３のうち
１つは連結基であり、他は水素であり得る。
【００２３】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１〜Ｒ６は別個に水素であり；Ｙ１〜Ｙ４
は別個にメチルであり；Ｘ１はカルボキシレートであり；そしてＸ２およびＸ３
のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。
【００２４】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１およびＹ２は一緒になってプロパノであ
り得；Ｒ２およびＹ１は一緒になってプロパノであり得；Ｒ３およびＹ３は一緒
になってプロパノであり得；Ｒ４およびＹ４は一緒になってプロパノであり得；
Ｒ５およびＲ６は水素であり得；Ｘ１はカルボキシレートであり得；そしてＸ２
およびＸ３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。
【００２５】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１はメチルであり得；Ｒ２〜Ｒ６は別個に
水素であり得；Ｙ１およびＹ２のうち１つはエチルであり、他は水素であり得；
Ｙ３およびＹ４は別個に水素であり得；Ｘ１はカルボキシレートであり得；そし
てＸ２およびＸ３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。
【００２６】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１はメチルであり得；Ｒ２〜Ｒ６は別個に
水素であり得；Ｙ１およびＹ２のうち１つはエチルであり、他は水素であり得；
Ｙ３およびＹ４は別個にメチルであり得；Ｘ１はカルボキシレートであり得；そ
してＸ２およびＸ３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。
【００２７】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は別個に水素
であり得；Ｙ１およびＹ２は別個にメチルであり得；Ｒ３およびＹ３は一緒にな
ってプロパノであり得；Ｒ４およびＹ４は一緒になってプロパノであり得；Ｘ１
はカルボキシレートであり得；そしてＸ２およびＸ３のうち１つは連結基であり
、他は水素であり得る。
【００２８】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６は別個に水素
であり得；Ｙ１およびＹ２は別個に水素であり得；Ｒ３およびＹ３は一緒になっ
てプロパノであり得；Ｒ４およびＹ４は一緒になってプロパノであり得；Ｘ１は
カルボキシレートであり得；そしてＸ２およびＸ３のうち１つは連結基であり、
他は水素であり得る。
【００２９】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１はメチルであり得；Ｒ２、Ｒ５およびＲ
６は別個に水素であり得；Ｙ１およびＹ２のうち１つはエチルであり、他は水素
であり得；Ｒ３およびＹ３は一緒になってプロパノであり得；Ｒ４およびＹ４は
一緒になってプロパノであり得；Ｘ１はカルボキシレートであり得；そしてＸ２
およびＸ３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。
【００３０】
別の好ましい実施態様において、Ｒ１〜Ｒ６は別個に水素であり得；Ｙ１およ
びＹ２は別個に水素であり得；Ｙ３およびＹ４は別個にメチルであり得；Ｘ１は
カルボキシレートであり得；そしてＸ２およびＸ３のうち１つは連結基であり、
他は水素であり得る。
【００３１】
別の局面において、本発明は、以下の式を有する標識化ヌクレオチドであって
：
【００３２】
【化９】
0004961410.tif 000005
【００３３】
ここで：
Ｄは、以下の式を有する色素化合物であり：
【００３４】
【化１０】
0004961410.tif 000006
【００３５】
（ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低
級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコ
キシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択されるか、または一緒に
なった場合のＲ１およびＲ６がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ
４およびＲ５がベンゾであり；
Ｙ１〜Ｙ４は、別個に水素および低級アルキルからなる群から選択されるか、
または一緒になった場合のＹ１およびＲ２がプロパノでありかつＹ２およびＲ１
がプロパノであるか、もしくは一緒になった場合のＹ３およびＲ３がプロパノで
ありかつＹ４およびＲ４がプロパノであり；そして
Ｘ１〜Ｘ３は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート
、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、および連結基からなる群から選択される）；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり
；
Ｗ１およびＷ２は別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｗ３はＯＨ、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０、およびそのアナログから
なる群から選択され；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまた
はデアザプリンのＮ９−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、
糖部分はピリミジンのＮ１−位に結合しており；
ここで、ＢとＤとを連結する連結は、Ｒ１−Ｒ６またはＸ１−Ｘ３のうちの１
つの位置でＤに結合し；および
ここで、Ｂがプリンである場合、連結はプリンの８−位に結合し、Ｂが７−デ
アザプリンである場合、連結は７−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢが
ピリミジンである場合、連結はピリミジンの５−位に結合する、
ヌクレオチドに関する。
【００３６】
好ましい実施態様において、Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、お
よびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００３７】
別の好ましい実施態様において、上記連結は、以下の式：
【００３８】
【化１１】
0004961410.tif 000007
【００３９】
であり得る。
【００４０】
別の好ましい実施態様において、Ｗ１およびＷ２は、両方ともＨであり得；お
よびＷ３は、−Ｐ３Ｏ１０であり得る。
【００４１】
別の好ましい実施態様において、Ｗ１は、Ｈであり得；Ｗ２は、ＯＨであり得
；およびＷ３が−Ｐ３Ｏ１０であり得る。
【００４２】
別の好ましい実施態様において、ＢとＤとを連結する上記連結は、Ｘ２または
Ｘ３のうちの１つの位置でＤに結合し得る。
【００４３】
さらに別の局面において、本発明は、以下の式を有するヌクレオチドを含有す
る標識化ポリヌクレオチドであって：
【００４４】
【化１２】
0004961410.tif 000008
【００４５】
ここで：
Ｄは以下の式を有する色素化合物であって：
【００４６】
【化１３】
0004961410.tif 000009
【００４７】
（ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、
低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択されるか、または、一
緒になった場合のＲ１およびＲ６はベンゾ、または、一緒になった場合のＲ４お
よびＲ５はベンゾであり；
Ｙ１〜Ｙ４は、別個に水素および低級アルキルからなる群から選択されるか
、または一緒になった場合のＹ１およびＲ２がプロパノでありかつＹ２およびＲ
１がプロパノであるか、もしくは一緒になった場合のＹ３およびＲ３がプロパノ
でありかつＹ４およびＲ４がプロパノであり；そして
Ｘ１〜Ｘ３は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレー
ト、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、および連結基からなる群から選択される、色素
化合物である）；
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり
；
Ｚ１は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｚ２はＨ、ＯＨ、−ＰＯ４、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここでＮ
ｕｃおよびヌクレオシドはホスホジエステル連結またはそのアナログによって結
合され、該連結はＮｕｃの５’−位に結合しており；
Ｚ３はＨ、−ＰＯ３またはホスフェートアナログ、およびＮｕｃからなる群か
ら選択され、ここでＮｕｃおよびヌクレオシドはホスホジエステル連結またはそ
のアナログによって結合され、該連結はＮｕｃの３’−位に結合しており；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまた
はデアザプリンのＮ９−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、
糖部分はピリミジンのＮ１−位に結合しており；
ここで、ＢとＤとを連結する連結は、Ｒ１〜Ｒ６またはＸ１〜Ｘ３のうちの１
つの位置でＤに結合し；および
ここで、Ｂがプリンである場合、該連結はプリンの８−位に結合し、Ｂが７−
デアザプリンである場合、該連結は７−デアザプリンの７−位に結合し、そして
Ｂがピリミジンである場合、該連結はピリミジンの５−位に結合する、
ポリヌクレオチドに関する。
【００４８】
１つの好ましい実施態様において、Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニ
ン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００４９】
別の好ましい実施態様において、上記連結は、以下の式：
【００５０】
【化１４】
0004961410.tif 000010
【００５１】
であり得る。
【００５２】
さらに別の局面において、本発明は、以下の工程を包含するポリヌクレオチド
配列決定の方法であって：
第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成す
る工程であって、その結果：
第１のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシアデノシンを含
み、そして第１の色素で標識され；
第２のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシシチジンを含み
、そして第２の色素で標識され；
第３のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシグアノシンを含
み、そして第３の色素で標識され；
第４のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシチミジンを含み
、そして第４の色素で標識され；
ここで、第１、第２、第３、または第４の色素のうちの１つは、４，７−ジ
クロロローダミン色素であり；
全ての色素が互いからスペクトル分離可能である、工程；
ポリヌクレオチドを電気泳動で分離し、それにより類似のサイズのポリヌクレ
オチドのバンドを形成する工程；
色素を蛍光放射させ得る照射ビームでバンドを照射する工程；および
色素の蛍光スペクトルによりバンド中のポリヌクレオチドのクラスを同定する
工程、
を包含し、ここで、４，７−ジクロロローダミン色素は、以下の式：
【００５３】
【化１５】
0004961410.tif 000011
【００５４】
（ここで：
Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低
級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコ
キシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択されるか、または一緒に
なった場合のＲ１およびＲ６がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ
４およびＲ５がベンゾであり；
Ｙ１〜Ｙ４は、別個に水素および低級アルキルからなる群から選択されるか、
または、一緒になった場合のＹ１およびＲ２がプロパノでありかつＹ２およびＲ
１がプロパノであるか、もしくは一緒になった場合のＹ３およびＲ３がプロパノ
でありかつＹ４およびＲ４がプロパノであり；そして
Ｘ１〜Ｘ３は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート
、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、および連結基からなる群から選択される）を有す
る、方法に関する。
【００５５】
第１の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、次式を有する化合物
により達成される：
【００５６】
【化１６】
0004961410.tif 000012
【００５７】
ここで可変置換基は以下のように定義される。Ｒ１〜Ｒ６は、別個に水素、フッ
素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホ
ン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基あるいはそれらの組合
せ、または、一緒になった場合のＲ１およびＲ６がベンゾであるか、または一緒
になった場合のＲ４およびＲ５がベンゾである。好ましくは、Ｒ１−Ｒ６は、水
素、メチルまたはエチルである。Ｙ１−Ｙ４は、別個に水素あるいは低級アルキ
ル、または一緒になった場合のＹ１およびＲ２がプロパノでありかつＹ２および
Ｒ１がプロパノであるか、もしくは一緒になった場合のＹ３およびＲ３がプロパ
ノでありかつＹ４およびＲ４がプロパノである。Ｘ１−Ｘ３は、別個に水素、塩
素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、お
よび連結基である。好ましくは、Ｘ１はカルボキシレートであり、かつＸ２およ
びＸ３は別個に水素または連結基である。
【００５８】
第２の局面では、本発明は、次式を有する標識化ヌクレオチドを包含する：
【００５９】
【化１７】
0004961410.tif 000013
【００６０】
ここで可変置換基および連結は以下のように定義される。Ｄは、本発明の４，７
−ジクロロローダミン色素化合物である。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、ま
たはピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくはウラシル、シトシン、デアザアデ
ニン、またはデアザグアノシンである。Ｗ１およびＷ２は別個に、ＨまたはＯＨ
である。Ｗ３はＯＨ、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０であり、そのアナロ
グを含む。１つの好ましい実施態様において、Ｗ１はＨ、Ｗ２はＯＨ、およびＷ
３は−Ｐ３Ｏ１０である。第２の好ましい実施態様において、Ｗ１およびＷ２は
Ｈであり、Ｗ３は−Ｐ３Ｏ１０である。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンであ
る場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ９−位に結合しており、そして
Ｂがピリミジンである場合、糖部分はピリミジンのＮ１−位に結合している。Ｂ
とＤとを連結する連結は、Ｒ１−Ｒ６またはＸ１−Ｘ３のうちの１つの位置でＤ
に結合する。好ましくは、ＢとＤとを連結する連結は、Ｘ２またはＸ３のうちの
１つの位置でＤに結合する。特に好ましい実施態様において、連結は以下のもの
である：
【００６１】
【化１８】
0004961410.tif 000014
【００６２】
Ｂがプリンである場合、この連結はプリンの８−位に結合し、Ｂが７−デアザプ
リンである場合、この連結は７−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢがピ
リミジンである場合、この連結はピリミジンの５−位に結合する。
【００６３】
第３の局面において、本発明は以下の式を有するヌクレオチドを含有する標識
化ポリヌクレオチドを含む：
【００６４】
【化１９】
0004961410.tif 000015
【００６５】
ここで可変の置換基および連結は以下のように定義される。Ｄは、本発明の４，
７−ジクロロローダミン色素化合物である。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、
またはピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくはウラシル、シトシン、デアザア
デニン、またはデアザグアノシンである。Ｚ１は、ＨまたはＯＨである。Ｚ２は
Ｈ、ＯＨ、−ＰＯ４、またはＮｕｃ、隣接ヌクレオチドであり、ここでＮｕｃお
よびヌクレオシドはホスホジエステル連結またはそのアナログによって結合され
、この連結はＮｕｃの５’−位に結合している。Ｚ３はＨ、−ＰＯ３（ホスフェ
ートアナログを含む）、またはＮｕｃであり、ここでＮｕｃおよびヌクレオシド
はホスホジエステル連結またはそのアナログによって結合され、この連結はＮｕ
ｃの３’−位に結合している。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、
糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ９−位に結合しており、そしてＢがピリ
ミジンである場合、糖部分はピリミジンのＮ１−位に結合している。ＢとＤとを
連結する連結は、Ｒ１−Ｒ６またはＸ１−Ｘ３のうちの１つの位置でＤに結合す
る。好ましくは、ＢとＤとを連結する連結は、Ｘ２またはＸ３のうちの１つの位
置でＤに結合する。特に好ましい実施態様において、連結は以下のものである：
【００６６】
【化２０】
0004961410.tif 000016
【００６７】
Ｂがプリンである場合、この連結はプリンの８−位に結合し、Ｂが７−デアザプ
リンである場合、この連結は７−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢがピ
リミジンである場合、この連結はピリミジンの５−位に結合する。
【００６８】
第４の局面において、本発明はポリヌクレオチド配列決定の方法を包含し、こ
のような方法は以下の工程を含む。第１、第２、第３、および第４のクラスのポ
リヌクレオチドの混合物を形成し、その結果、第１のクラスの各ポリヌクレオチ
ドは３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１の色素で標識され、第
２のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そし
て第２の色素で標識され、第３のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデ
オキシグアノシンを含み、そして第３の色素で標識され、第４のクラスの各ポリ
ヌクレオチドは３’−末端ジデオキシチミジンを含み、そして第４の色素で標識
される。色素は、第１、第２、第３、または第４の色素のうちの１つは、本発明
の４，７−ジクロロローダミン色素であり、他の色素は、互いからスペクトル分
離可能であるように選択される。ポリヌクレオチドを電気泳動で分離し、それに
より類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドを形成し、色素を蛍光放射させ得
る照射ビームでバンドを照射し、そして色素の蛍光スペクトルによりバンド中の
ポリヌクレオチドのクラスを同定する。
【００６９】
本発明のこれらおよび他の局面、目的、特徴、ならびに利点は、以下の説明、
図面、および添付の請求の範囲を参考にしてよりよく理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
本発明の好ましい実施態様を、ここで、詳細に言及する。その例は、添付の図
に示される。本発明は、その好ましい実施態様に関連して記述されているものの
、それらは、本発明をこれらの実施態様に限定する意図はないことが分かる。逆
に、本発明は、添付の請求の範囲で規定した本発明の範囲内に含まれ得る代替、
改良および等価物を含むことを意図している。
【００７１】
一般に、本発明は、蛍光色素として有用な新規なクラスの４，７−ジクロロロ
ーダミン化合物、このような色素を分子標識として使用する試薬、およびこのよ
うな色素および試薬を分析生物工学の領域で使用する方法を包含する。本発明の
化合物は、多色蛍光ＤＮＡ配列決定およびフラグメント解析の領域で、特に用途
が見出されている。
【００７２】
本発明は、一部は、４，７−ジクロロローダミンの蛍光特性、および関連色素
の発見をベースとする。それらの放射バンド幅は、４，７−ジクロロ誘導体を欠
くアナログよりも、通常、２０〜３０％狭く、それらの放射、および最大吸収は
、４，７−ジクロロ誘導体を欠くアナログよりも、通常、約１０〜３０ｎｍ高い
波長に存在する。
【００７３】
（Ｉ．定義）
他に述べない場合、本明細書で使用する以下の用語および言い回しは、以下の
意味を有することを意図する：
「連結基」（Ｌ）は、試薬に結合される「補足的官能基」と反応し得る（例え
ば、色素を試薬に連結する「結合」を形成する反応）官能基を言う。使用される
特定の連結基は、補足的官能基の性質、および所望の結合のタイプに依存する。
いくつかの場合、連結基は、補足的官能基との反応の前に、活性化されなければ
ならない（例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステルを形成するカ
ルボキシレート連結基の活性化）。好ましくは、補足官能基がアミンの場合常に
、本発明の連結基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ
ＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒドまたはグリオキサール、エポキシド
、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、酸無
水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、または他の活性カルボキシレート
である。好ましくは、補足官能基が、スルフヒドリルの場合常に、連結基は、ハ
ロアセチル、ハロゲン化アルキル、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、ア
クリロイル、アリール化剤（例えば、フルオロベンゼン、など）である。補足官
能基が、カルボキシレートの場合、連結基は、好ましくは、ジアゾアラン、ジア
ゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、およびカルボジイミド（Ｈｅｒｍａｎ
ｓｏｎ）である。特に好ましい実施態様では、連結基は、アミン補足官能基と反
応する活性化ＮＨＳエステルであり、活性化ＮＨＳエステルを形成する場合、カ
ルボキシレート連結基を含む本発明の色素が、ジシクロヘキシルカルボジイミド
およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応し、ＮＨＳエステルを形成する。以
下の表１は、代表的な連結基のサンプルを、互換性のある補足官能基および得ら
れる結合と共に示す。
【００７４】
【表２】
0004961410.tif 000017
【００７５】
用語「低級アルキル」は、１〜８の炭素原子を含む直鎖および分岐の炭化水素
部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル
、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、など）を
意味する。用語「プロパノ」は、特に、部分−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を意味する
。「低級置換アルキル」は、電子吸引性置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ
、スルホ、など）を含む低級アルキルを意味する。「低級ハロアルキル」は、１
つ以上のハロゲン原子置換基（通常、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード
）を有する低級置換アルキルを意味する。「低級アルケン」は、低級アルキルま
たは低級置換アルキル（ここで、１つ以上の炭素−炭素結合が、二重結合である
）を意味する。「低級アルキン」は、低級アルキル、または低級置換アルキル（
ここで、１つ以上の炭素−炭素結合が、三重結合である）を意味する。「スルホ
ネート」は、２つの酸素原子に二重結合し、そして１つの酸素原子に単結合した
硫黄原子を含む部分（それらの一塩基塩、二塩基塩を含む（例えば、ナトリウム
スルホホネート、カリウムスルホネート、ジナトリウムスルホネート、など））
を意味する。「スルホン」は、２つの酸素原子に二重結合した硫黄原子を含む部
分を意味する。「アミノ」は、２つの水素原子、低級アルキル部分、またはそれ
らの任意の組み合わせに結合した窒素原子を含む部分を意味する。「アミド」は
、酸素原子に二重結合し、そしてアミノ部分に単結合した炭素原子を含む部分を
意味する。「ニトリル」は、窒素原子に三重結合した炭素原子を含む部分を意味
する。「低級アルコキシ」は、酸素原子に単結合した低級アルキルを含む部分を
意味する。「アリール」は、単独の、または複数のフェニル、または置換フェニ
ル（例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、など）を意味
する。
【００７６】
用語「ヌクレオシド」は、１’位でペントースと結合したプリン、デアザプリ
ン、またはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシ
ン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン、など）からなる化
合物（２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型（Ｓｔｒｙｅｒ）を含む）
を意味する。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリ
ン酸エステル（例えば、トリリン酸エステル）を意味し、ここで、エステル化の
最も一般的な位置は、ペントースのＣ−５位に結合したヒドロキシル基である。
本発明の開示中の多くの場合、用語ヌクレオシドは、ヌクレオシドおよびヌクレ
オチドを含むことを意図する。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、修飾され
た塩基部分、修飾された糖部分、および／または修飾されたリン酸エステル部分
（例えば、（Ｓｃｈｅｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）に記載）を含む合成アナログを
含む。用語「標識化ヌクレオシド」は、式Ｉの色素化合物を共有結合したヌクレ
オシドを意味する。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオ
チド」は、２本および１本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、
それらのα−アノマー形、などを含む天然のヌクレオチドモノマーまたはそれら
のアナログの直線状ポリマーを意味する。通常、ヌクレオシドモノマーは、リン
酸ジエステル結合によって結合され、ここで、本明細書中で使用される場合、用
語「リン酸ジエステル結合」は、リン酸ジエステル結合、またはそれらのアナロ
グ（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホス
ホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホス
ホルアミデート、などを含む（対イオンが存在する場合、結合対イオン（例えば
、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）を含む））を意味する。ポリヌクレオチドは、代表的
には、大きさの種類においては、数モノマー単位から、例えば８〜４０、数千モ
ノマー単位までの範囲である。ポリヌクレオチドが、文字の配列（例えば、”Ａ
ＴＧＣＣＴＧ”）によって表される場合常に、ヌクレオチドは、５’〜＞３’順
序で、左から右へであり、他の方法で示され無ければ、「Ａ」はデオキシアデノ
シンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシ
ンを意味し、および「Ｔ」はチミジンを意味することが理解される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、色素のセットに関する用語「スペクトル分解」は
、色素の蛍光放射スペクトルが、十分に分かれ（すなわち、十分に重なっていな
い）、通常の光検出系（例えば、帯域通過フィルター（ｂａｎｄ  ｐａｓｓ  ｆ
ｉｌｔｅｒ）および光電子倍増管（ｐｈｏｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂ
ｅ）の系、分光器（ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ）と組み合わせた荷電結合素子、
など（（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ）に記載の系によって例示
される））を用いて、それぞれの色素に結合している試薬（例えば、ポリヌクレ
オチド）が、それぞれの色素によって生じる蛍光シグナルのベースによって区別
され得ることを意味する。
【００７９】
（ＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物）
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラ
スの４，７−ジクロロローダミン色素化合物を包含する。（本明細書中で提供し
た全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴
構造およびプロトン付加状態を含むことを意図していることに注意のこと）。
【００８０】
【化２１】
0004961410.tif 000018
【００８１】
式Ｉにおいて、Ｒ１からＲ６は、別々に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル
、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニ
トリル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組み合わせである。あるいは
、Ｒ１およびＲ６は、一緒になって、ベンゾであり、および／または、Ｒ４およ
びＲ５は、ベンゾである。好ましい実施態様では、Ｒ１からＲ６は、別々に、水
素、メチル、またはエチルである。より好ましくは、Ｒ１からＲ６は、別々に、
水素、またはメチルである。
【００８２】
Ｙ１からＹ４は、別々に、水素、および低級アルキルからなる群から選択され
る。あるいは、Ｙ１は、Ｒ２と一緒になってプロパノであり、およびＹ２は、Ｒ
１と一緒になって、プロパノであり、および／または、Ｙ３は、Ｒ３と一緒にな
ってプロパノであり、およびＹ４は、Ｒ４と一緒になって、プロパノである。好
ましくは、Ｙ１からＹ４は、別々に、水素、メチル、またはエチルである。
【００８３】
Ｘ１〜Ｘ３は、別々に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレー
ト、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、または連結基である。好ましくは、Ｘ１は、カ
ルボキシレートである。好ましい実施態様では、Ｘ２またはＸ３の１つは、連結
基である。
【００８４】
本発明の１つの特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＲ１１０として示す）
では、Ｒ１〜Ｒ６は、別々に、水素であり、Ｙ１〜Ｙ４は、別々に、水素であり
、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そしてＸ２およびＸ３の１つは、連結基（
Ｌ）であり、その他は、水素である。ＤＲ１１０の構造を以下に式ＩＩとして示
す。
【００８５】
【化２２】
0004961410.tif 000019
【００８６】
本発明の第２の特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＲ６Ｇとして示す）で
は、Ｒ１およびＲ４は、別々に、メチルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は
、水素であり、Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｙ
３およびＹ４の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｘ１は、カルボキシ
レートであり、そしてＸ２およびＸ３の一方は、連結基であり、他方は、水素で
ある。ＤＲ６Ｇの構造を以下に式ＩＩＩとして示す。
【００８７】
【化２３】
0004961410.tif 000020
【００８８】
本発明の第３の特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＴＭＲとして示す）で
は、Ｒ１〜Ｒ６は、別々に、水素であり、Ｙ１〜Ｙ４は、別々に、メチルであり
、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そしてＸ２およびＸ３の一方は、連結基で
あり、他方は、水素である。ＤＴＭＲの構造を以下に式ＩＶとして示す。
【００８９】
【化２４】
0004961410.tif 000021
【００９０】
本発明の第４の特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＲＯＸとして示す）で
は、Ｒ１およびＹ２は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ２およびＹ１は、一
緒になって、プロパノであり、Ｒ３およびＹ３は、一緒になって、プロパノであ
り、Ｒ４およびＹ４は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ５およびＲ６は、水
素であり、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そしてＸ２およびＸ３の一方は、
連結基であり、他方は、水素である。ＤＲＯＸの構造を以下に式Ｖとして示す。
【００９１】
【化２５】
0004961410.tif 000022
【００９２】
本発明の色素化合物のいくつかの追加の特に好ましい実施態様を、図１Ａおよ
び１Ｂに示す。化合物１ａにおいて、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２〜Ｒ６は、別
々に、水素であり、Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は、水素であり
、Ｙ３およびＹ４は、別々に、水素であり、Ｘ１は、カルボキシレートであり、
そしてＸ２およびＸ３の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１
ｂにおいて、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２〜Ｒ６は、別々に、水素であり、Ｙ１
およびＹ２の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｙ３およびＹ４は、別
々に、メチルであり、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そしてＸ２およびＸ３
の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｃにおいて、Ｒ１、Ｒ
２、Ｒ５およびＲ６は、別々に、水素であり、Ｙ１およびＹ２は、別々に、メチ
ルであり、Ｒ３およびＹ３は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ４およびＹ４
は、一緒になって、プロパノであり、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そして
Ｘ２およびＸ３の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｄにお
いて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、別々に、水素であり、Ｙ１およびＹ２は
、別々に、水素であり、Ｒ３およびＹ３は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ
４およびＹ４は、一緒になって、プロパノであり、Ｘ１は、カルボキシレートで
あり、そしてＸ２およびＸ３の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化
合物１ｅにおいて、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、別々に、
水素であり、Ｙ１およびＹ２の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｒ３
およびＹ３は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ４およびＹ４は、一緒になっ
て、プロパノであり、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そしてＸ２およびＸ３
の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｆにおいて、Ｒ１〜Ｒ
６は、別々に、水素であり、Ｙ１およびＹ２は、別々に、水素であり、Ｙ３およ
びＹ４は、別々に、メチルであり、Ｘ１は、カルボキシレートであり、そしてＸ
２およびＸ３の一方は、連結基であり、他方は、水素である。
【００９３】
図８Ａおよび８Ｂは、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素の調製のため
の好ましい一般化された合成スキームを示す。各図において示される変換可能な
置換基は、上記で定義されたものである。
【００９４】
図８Ａは、置換基Ｘ１がカルボキシレートより他のものであり得る一般化され
た合成スキームを示す。図において、Ｘ’は、Ｘ１の前駆体である部分を示す。
図８Ａの方法において、２当量の３−アミノフェノール誘導体８ａ／８ｂ（例え
ば、３−ジメチルアミノフェノール）が、１当量のジクロロベンゼン誘導体８ｃ
（例えば、４−カルボキシ−３，６，ジクロロ−２−スルホ安息香酸環式無水物
（すなわち、ここで、８ｃのＸ１’部分は、一緒になって以下である））と反応
する。
【００９５】
【化２６】
0004961410.tif 000023
【００９６】
次いで、反応物を、１２時間、強酸（例えば、ポリリン酸、または硫酸）中で、
１８０℃で加熱する。粗色素８ｄを、水の添加によって沈澱し、遠心分離によっ
て単離する。対称体の生成物を形成するために、反応物８ａおよび８ｂの置換基
は、同じであり、一方、非対称体の生成物を形成するために、置換基は、異なる
。
【００９７】
図８Ｂは、置換基Ｘ１がカルボキシレートである一般化された合成を示す。図
８Ｂの方法において、２当量の３−アミノフェノール誘導体８ａ／８ｂ（例えば
、３−ジメチルアミノフェノール）が、１当量のフタル酸無水物誘導体８ｅ（例
えば、３，６−ジクロロトリメリット酸無水物と反応する。次いで、反応物を、
１２時間、強酸（例えば、ポリリン酸、または硫酸）中で、１８０℃で加熱する
。粗色素８ｄを、水の添加によって沈澱し、遠心分離によって単離する。対称体
の生成物を形成するために、反応物８ａおよび８ｂの置換基は、同じであり、一
方、非対称体の生成物を形成するために、置換基は、異なる。
ＩＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物を利用する試薬
他の局面では、本発明は、式Ｉの４，７−ジクロロローダミン色素化合物で標
識した試薬を包含する。本発明の試薬は、事実上、本発明の色素が結合できるい
ずれのものでもよい。好ましくは、この色素は、この試薬に直接または結合を介
して共有結合される。試薬には、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、ヌクレオ
チド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機重
合体、およびそれらの組合せおよび集合（例えば、染色体、核、生存細胞（例え
ば、細菌、他の微生物、哺乳類細胞、組織糖タンパク）など）が挙げられる。
Ａ．ヌクレオチド試薬
本発明の好ましい種類の試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン色素を含有
するヌクレオチドおよびヌクレオシドを包含する。このようなヌクレオチド／ヌ
クレオシド試薬は、酵素合成により形成した標識ポリヌクレオチド（例えば、Ｐ
ＣＲ増幅、サンガー型ポリヌクレオチド配列決定およびニック翻訳反応の文脈で
使用されるヌクレオチド三リン酸）の文脈で、特に有用である。
【００９８】
本発明の好ましいヌクレオチド／ヌクレオシドは、式ＶＩで以下に示されてお
り、
【００９９】
【化２７】
0004961410.tif 000024
【０１００】
ここで、Ｂは、ヌクレオシド塩基（例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニ
ンおよびデアザグアノシン）である。Ｗ１およびＷ２は、別個に、Ｈ、ＯＨ、ま
たは−ＯＣＨ３である。Ｗ３は、ＯＨ、−ＰＯ４、−Ｐ２Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０ま
たはそれらのアナログ（例えば、リン酸チオエート、リン酸アニリデート、リン
酸アロニチオエート、リン酸アミジエートおよび他の類似のリン酸アナログ）で
あり、これには、もし存在するなら、会合対イオン（例えば、Ｈ、Ｎａ、ＮＨ４
など）が含まれる。Ｄは、式Ｉの色素化合物である。
【０１０１】
Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、プリンまたはデア
ザプリンのＮ９−位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、
ピリミジンのＮ１−位にて結合している。
【０１０２】
ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ６またはＸ１〜Ｘ３位の１つで、
Ｄに結合している。好ましくは、この結合は、Ｘ２またはＸ３の１つには結合し
ている。  好ましくは、Ｂがプリンのとき、ＢおよびＤを結合している結合は、
プリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、結合は、７−デ
アザプリンの７−位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、結合は、ピリミジ
ンの５−位にて結合している。
【０１０３】
１つの特に好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドは、以下に式ＶＩＩ
で示す構造を有するジデオキシヌクレオチドトリリン酸エステル（存在する場合
、会合した対イオンを含む）である。
【０１０４】
【化２８】
0004961410.tif 000025
【０１０５】
式ＶＩＩに示したもののような標識ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型Ｄ
ＮＡ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ）において、鎖停止剤すなわち「ターミネーター
」として、特定の用途が見出されている。
【０１０６】
第二の特に好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＶＩＩ
Ｉに示した構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するな
ら、会合対イオンを含めて）。
【０１０７】
【化２９】
0004961410.tif 000026
【０１０８】
式ＶＩＩＩに示したもののような標識デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリ
メラーゼ鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ）において、ポリメラーゼ伸長産物を標識する手
段として、特定の用途が見出されている。
【０１０９】
ヌクレオチド／ヌクレオシド標識化は、公知の結合、連結基および関連する相
補官能性を用いて、非常に多くの公知の連結基および関連する相補官能基を用い
た公知のヌクレオシド／ヌクレオチド標識化技術のいずれかを使用して、達成で
き、好ましい連結基の説明について上記参照。この色素およびヌクレオシドを結
合する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せ
ず、（ｉｉ）適切な酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と相溶性であ
り、そして（ｉｉｉ）この色素の蛍光を消失させてはならない。
【０１１０】
１つの好ましい実施態様では、本発明の色素は、ピリミジン塩基の５−炭素ま
たは７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合される。本発明で使用できる数
個の適当な塩基標識化操作が報告されている（Ｇｉｂｓｏｎ；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ
；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｌｉｓ；Ｎｅｌｓｏｎ  １９９２；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｎ
；Ｆｕｎｇ  １９９８；Ｗａｒｄ；Ｗｏｏ．）。
【０１１１】
好ましくは、この結合は、アセチレン性アミド結合またはアルケン性アミド結
合であり、この色素とヌクレオチド塩基との間の結合は、この色素の活性化Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと、ヌクレオチドのアルキニルア
ミノまたはアルケニルアミノ誘導体化塩基とを反応させることにより、形成され
る。より好ましくは、得られた結合は、３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピ
ニルまたは３−アミノ−１−プロピン−１−イルである（式ＩＸ．１）。本発明
の色素をヌクレオシド塩基に結合するための数個の好ましい結合は、式ＩＸ．１
、式ＩＸ．２および式ＩＸ．３にて、以下に示す。
【０１１２】
【化３０】
0004961410.tif 000027
【０１１３】
アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、（Ｈｏｂｂｓ  １９８９，
１９９２）によって記載され、要約すると、このアルキニルアミノ誘導体化ヌク
レオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常、５−ヨードピリミジン
および７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ
）をフラスコに入れ、アルゴンをフラッシュして空気を取り除き、無水ＤＭＦを
添加し、続いて、アルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（０）を添加
することにより、形成される。この反応混合物は、数時間、または薄層クロマト
グラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌し得る。未保
護のアルキニルアミンを使用するとき、このアルキニルアミノヌクレオシドは、
この反応混合物を濃縮し、そして水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用い
てシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、カップリング反応で生成したヒ
ドロハライドを中和することにより、単離できる。保護アルキニルアミンを使用
するとき、この反応混合物には、メタノール／塩化メチレンを添加し得、続いて
、重炭酸塩形態の強塩基性アニオン交換樹脂を添加し得る。次いで、このスラリ
ーは、約４５分間撹拌し得、濾過し得、樹脂は、追加のメタノール／塩化メチレ
ンで洗浄し得る。合わせた濾液は濃縮し得、そしてメタノール−塩化メチレン勾
配を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。ト
リホスフェートは、標準的な方法により得られる。
【０１１４】
（Ｂ．ポリヌクレオチド試薬）
本発明のさらに他の好ましい種類の試薬には、本発明の４，７−ジクロロロー
ダミン色素で標識したポリヌクレオチドが包含される。このような標識ポリヌク
レオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションプローブなどを含めた非常に多くの状況で、有用であ
る。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチドには、次式を有するヌクレオチドが挙げられる：
【０１１６】
【化３１】
0004961410.tif 000028
【０１１７】
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基で
ある。Ｚ１は、Ｈ、ＯＨ、−ＯＣＨ３である。Ｚ２は、ＯＨ、−ＰＯ４、−Ｐ２
Ｏ７、−Ｐ３Ｏ１０またはそれらのアナログ（例えば、リン酸チオエート、リン
酸アニリデート、リン酸アニロチオエート、リン酸アミデートおよび他の類似の
リン酸アナログ（存在するならば、結合対イオン、例えばＨ、Ｎａ、ＮＨ４など
）またはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチドを意味する。式ＸのヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホジエ
ステル結合またはそれらのアナログにより連結され、この結合は、好ましくは、
Ｎｕｃの５’−位に結合している。Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３またはそれらのアナロ
グまたはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエ
ステル結合またはそれらのアナログにより連結されており、この結合は、Ｎｕｃ
の３’−位に結合している。そしてＤは、式Ｉの色素化合物である。塩基Ｂは、
本発明のヌクレオチド試薬について記述のようにして、この糖部分および色素化
合物に結合される。ここで定義されるように、式Ｘの標識ヌクレオチドは、５’
−末端ヌクレオチド、３’−末端ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドのいず
れかの内部ヌクレオチドであり得る。
【０１１８】
好ましい１つの実施態様では、本発明の標識ポリヌクレオチドには、供与体色
素と受容体色素との間で、蛍光エネルギーの移動が起こるように配置した複数の
色素（本発明の色素化合物である少なくと１つ）が挙げられる。このような複数
色素ポリヌクレオチドは、分光調整可能なプローブまたはＤＮＡ配列決定プライ
マー（Ｊｕ；Ｌｅｅ）として用途が見出されている。
【０１１９】
標識ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼ（Ｓｔ
ｒｙｅｒ）を用いて、酵素的に合成するか、または例えば、ホスホルアミダイト
法、亜リン酸トリエステル法などによる化学合成によるか（Ｇａｉｔ）のいずれ
かにより、合成できる。標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使
用して、酵素合成中に導入してもよく、または合成に引き続いて導入してもよい
。
【０１２０】
一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵素合成により製造されるなら、以下
の操作が使用できる。テンプレートＤＮＡが変性され、このテンプレートＤＮＡ
に、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールされる。この反応系に、デオキシ
ヌクレオチド三リン酸および／またはジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄ
ｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰを含めて）が添加され、この場合、このデオキシヌク
レオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの１個の少なくとも断片は、上
記の本発明の色素化合物で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条
件下にて、ポリメラーゼ酵素が添加される。ポリメラーゼ鎖合成中に、この標識
デオキシヌクレオチドおよび／またはジオキシヌクレオチドの混入により、標識
ポリヌクレオチドが形成される。別の酵素的合成法では、１個のプライマーの代
わりに２個のプライマーが使用され、１個のプライマーは、この標的の＋（プラ
ス）鎖に相補的であり、他は、この標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、こ
のポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、その反応温度は、変性温度と
延長温度の間で反復され、それにより、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｉｎｎｉｓ）に
よって、標識成分が標的配列へと急激に合成される。
【０１２１】
合成に引き続いて、このポリヌクレオチドは、非常に多くの位置で標識でき
、これらの位置には、５’−末端（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ；  Ｏｒｇｅｌ；  Ｓｍｉ
ｔｈ）；ホスホジエステル骨格（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）；３’−末端（Ｎｅｌｓｏ
ｎ  １９９２ａ  ；  Ｎｅｌｓｏｎ  １９９２ｂ  ；  Ｎｅｌｓｏｎ  １９９５
）が含まれる。オリゴヌクレオチド標識化操作の総説については、（Ｓｔｅｉｎ
ｅｒ）を参照のこと。
【０１２２】
１つの好ましい合成後化学標識化法では、オリゴヌクレオチドは、以下のよう
にして標識化される。カルボキシ連結基を含む色素は、無水酢酸エチル中にて、
室温で３時間にわたり、およそ１当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ドおよびおよそ３当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより
、ＮＨＳエステルに転化される。この反応混合物は、５％  ＨＣｌで洗浄され、
硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、そして固形物になるまで濃縮され、こ
の固形物は、ＤＭＳＯに再懸濁される。このＤＭＳＯ色素ストックは、次いで、
過剰で（１０〜２０倍）、ｐＨ  ９．４にて、０．２５  Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩
衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加され、そして６時間
反応される（Ｆｕｎｇ  １９９８）。この色素標識したオリゴヌクレオチドは、
緩衝液（例えば、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸塩（ＴＥＡＡ））で溶出するサ
イズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、未反応色素から分離され
る。この粗標識オリゴヌクレオチドを含有する画分は、勾配溶離液を使用する逆
相ＨＰＬＣにより、さらに精製される。
【０１２３】
（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）
本発明の色素および試薬は、蛍光検出を使用するいずれかの方法（特に、複数
の空間的に重複した分析物の同時検出を必要とする方法）によく適合する。本発
明の色素および試薬は、生化学分離操作（例えば、電気泳動）を受けるポリヌク
レオチドの種類を同定するのに、特によく適合し、この場合、類似の物理化学的
特性（例えば、サイズ、コンホメーション、電荷、疎水性など）を有する標的物
質のバンドまたはスポットが、線状または平面状の配列において存在する。本明
細書中で使用する用語「バンド」は、類似のまたは同一の物理化学的な特性を基
準にして、いずれかの空間的な配置または集塊を含む。通常、バンドは、色素−
ポリヌクレオチド複合体の電気泳動による分離において、生じる。
【０１２４】
ポリヌクレオチドの分類は、種々の状況において生じ得る。「フラグメント解
析」法または「遺伝解析」法と称する好ましいカテゴリーの方法では、標識プラ
イマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート定方向酵素的合成（例えば、結
合またはポリメラーゼ定方向プライマー伸長による）により、標識ポリヌクレオ
チド断片が生じる。これらの断片は、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気
泳動またはクロマトグラフィー）に供される。分離した断片は、この分離に引き
続いて、例えば、レーザー誘発した蛍光により、検出される。特に好ましい実施
態様では、複数の種類のポリヌクレオチドが同時に分離され、異なる種類のもの
は、分光学的に分析可能な標識により、識別される。
【０１２５】
このようなフラグメント解析の１方法は、増幅断片長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ
）として知られているが、ＰＣＲにより増幅した増幅断片長の多型現象（すなわ
ち、制限断片長の多型現象）に基づいている（Ｖｏｓ）。種々のサイズのこれら
の増幅断片は、系統による次の突然変異遺伝子のための連鎖マーカーとして役立
つ。増幅断片が、染色体上の突然変異遺伝子に近づくほど、この結合の相関が高
くなる。多く遺伝的疾患に対する遺伝子は、同定されていないので、これらの結
合マーカーは、疾患のリスクまたは起源を評価するのに役立つ。このＡｍｐＦＬ
Ｐ方法では、このポリヌクレオチドは、標識ポリヌクレオチドＰＣＲプライマー
を用いることにより、またはＰＣＲ中の標識ヌクレオチド三リン酸を使用するこ
とにより、標識できる。
【０１２６】
他の代表的なフラグメント解析法は、可変数のタンデム繰り返し、すなわち、
ＶＮＴＲを基準にしている（Ｗｅｂｂｅｒ；Ｃａｓｋｅｙ）。ＶＮＴＲは、特定
の配列の隣接した複数コピーを含有する二本鎖ＤＮＡの領域であり、繰り返し単
位の数は、可変である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例には、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１
１８およびＡｐｏ  Ｂがある。ＶＮＴＲ法のサブセットには、微小サテライト繰
り返しまたは短タンデム繰り返し（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２個〜４個の塩
基）繰り返し配列により特徴付けられるＤＮＡのタンデム繰り返しの検出を基準
にしている。ヒトにて最も豊富に点在した繰り返しＤＮＡファミリーの１つには
、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリー（こ
れはまた、（ＣＡ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である
。ヒトのゲノムには、５０，０００個〜１００，０００個程度の（ＣＡ）ｎ繰り
返し領域があると考えられ、典型的には、１ブロックあたり、１５個〜３０個の
繰り返しを有する。これらの繰り返し領域の多くは、長さが多様であり、従って
、有用な遺伝子マーカーとして供され得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴ
Ｒ法では、色素標識ＰＣＲプライマーを用いることにより、ポリヌクレオチド断
片に標識が導入される。
【０１２７】
特に好ましいフラグメント解析法では、本発明に従って同定された種類のもの
は、４個の可能な末端塩基と分光学的に分析可能な色素のセットのメンバーとの
間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチドによって規定される（Ｆｕｎ
ｇ  １９８９）。このようなセットは、市販の分光光度計を用いて、発光および
吸収バンド幅を測定することにより、本発明の色素から容易に組み立てられる。
さらに好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖停止法の状況にて、階
級が生じ、最も好ましくは、この鎖停止法、すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決
定すなわちサンガー配列決定の状況において、階級が生じる。この方法は、配列
が決定されるべき一本鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートを用いた、インビボで
のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を包含する。合成は、このテンプレート
にオリゴヌクレオチドプライマーがアニールする１個の部位だけで、開始される
。この合成反応は、連続ＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチド類似物の含入によ
り、停止される。この鎖停止ヌクレオチド類似物には、２’，３’−ジデオキシ
ヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）があり、これは、３’から５’への
ＤＮＡ鎖の伸長に必要な３’−ＯＨ基がない。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デ
オキシヌクレオシド５’−三リン酸）および４個のｄｄＮＴＰの１個を使用する
と、酵素触媒した重合は、このｄｄＮＴＰが含入できる各部位で、鎖集団の断片
において、停止される。各反応に対して、標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰ
を使用するなら、この配列情報は、高分解能電気泳動による分離後、蛍光により
検出できる。
【０１２８】
上記の各々のフラグメント解析法において、標識ポリヌクレオチドは、好まし
くは、電気泳動操作により、分離される（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ；
Ｏｓｔｅｒｍａｎ）。好ましくは、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜２
０重量％の間の濃度（重量対容量）を有する架橋または非架橋ポリアクリルアミ
ドである。さらに好ましくは、このポリアクリルアミド濃度は、約４〜８％の間
である。好ましくは、ＤＮＡ配列決定の状況では、特に、この電気泳動マトリッ
クスは、鎖分離または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含有する。
このようなマトリックスを構築する詳細な手順は、（Ｍａｎｉａｔｉｓ  １９８
０；Ｍａｎｉａｔｉｓ  １９７５；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡ  
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ）に与えられる。特定の分離
において使用される最適なポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度などは、多
くの要因に依存し、これらには、分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩
基組成、それらが一本鎖か二本鎖か、およびその情報が電気泳動により追究され
る分類の性質が含まれる。従って、本発明の適用には、特定の分離のための条件
を最適化するためには標準予備試験が要求され得る。
【０１２９】
電気泳動分離に引き続いて、色素−ポリヌクレオチド複合体は、この色素標識
ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することにより検出される。このような
検出を行うために、この標識ポリヌクレオチドは、標準的な手段、例えば、高強
度水銀蒸気ランプ、レーザーなどにより照射される。好ましくは、この照射手段
は、４８８  ｎｍと５５０  ｎｍの間の波長の照射ビームを有するレーザーであ
る。さらに好ましくは、この色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザ
ー（特に、４８８  ｎｍおよび５１４  ｎｍの発光系列のアルゴンイオンレーザ
ー）、または５３２  ｎｍの発光系列のネオジム固相ＹＡＧレーザーにより発生
したレーザー光によって、照射される。いくつかのアルゴンイオンレーザーが市
販されており、これらは、これらの系列で、同時にレーザーとして使える（例え
ば、Ｃｙｏｎｉｃｓ、Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）のＭｏｄ
ｅｌ  ２００１など）。次いで、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電
結合素子など）により、その蛍光が検出される。
【実施例】
【０１３０】
（ＩＶ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確となるが、これら
の実施例は、単に、本発明の例示であることを意図し、いずれの点でも、本発明
の範囲を限定しない。
【０１３１】
他に指示がなければ、全ての試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃ
ｏ．  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。３，６−ジクロロトリメリ
ト酸無水物を（Ｋｈａｎｎａ）に記載のように調製した。
【０１３２】
（実施例１）
ＤＲ１１０（式ＩＩ）の調製
【０１３３】
【化３２】
0004961410.tif 000029
【０１３４】
３−アミノフェノール（０．２５ｇ、２．３ｍｍｏｌ）、３，６−ジクロロト
リメリト酸無水物（０．３３ｇ、１．３ｍｍｏｌ）および硫酸（１ｍＬ）の混合
物を配合して、そして１２時間１９０℃まで加熱した。水（１０ｍＬ）を反応液
に加え、そして、得られた黒固形物は濾過により分離した。次いで、固形物を、
アセトニトリル（１０ｍＬ）で抽出した。得られたオレンジ色の溶液は乾燥状態
に濃縮し、そして、残基は炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ  ９、１
０ｍＬ）に溶解した。溶液を、濃ＨＣｌで酸性化し、赤い沈澱物を遠心分離によ
って集め、そして減圧遠心分離器において乾燥した。赤い固形物を、得た（３２
ｍｇ、５％収率）。ＤＲ１１０生成物の溶液の吸光度極大は、４０％アセトニト
リル／トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中で、５１６ｎｍであった。
【０１３５】
（実施例２）
ＤＴＭＲ（式ＩＶ）の調製
【０１３６】
【化３３】
0004961410.tif 000030
【０１３７】
３−ジメチルアミノフェノール（３．６ｍｍｏｌ、０．５ｇ）（３，６−ジク
ロロメリト酸無水物（５００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、およびポリリン酸（ＰＰ
Ａ）（５ｇ）の混合物を配合し、１２時間１８０℃まで加熱した。水（２０ｍＬ
）を赤褐色の反応物に加え、混合物を濾過して、そして５％  ＨＣｌで洗浄した
。暗い固形物を、得た（７９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、８％収率）。ＤＴＭＲ生
成物の溶液の吸光度極大は、４０％アセトニトリル／トリエチルアンモニウムア
セテート緩衝液中で、５７０ｎｍであった。
【０１３８】
（実施例３）
ＤＲＯＸ（式Ｖ）の調製
【０１３９】
【化３４】
0004961410.tif 000031
【０１４０】
８−ヒドロキシユロリジン（１４０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、３，６−ジク
ロロトリメリト酸無水物（０．３８ｍｍｏｌ、ｌＯＯｍｇ）およびポリリン酸（
１ｇ）の混合物を配合して、そして１６時間１８０℃まで加熱した。水（１０ｍ
Ｌ）を添加し、そして溶液を濾過した。固形物を水性ＨＣＩで洗浄し、そして乾
燥させて８７ｍｇの紫の固形物（０．１４ｍｍｏｌ、３７％）を得た。
実施例４
ＤＲ６Ｇ（式ＩＩＩ）の調製
【０１４１】
【化３５】
0004961410.tif 000032
【０１４２】
３−アミノメチル−ｐ−クレゾール（０．６６ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）、３，
６−ジクロロトリメリト酸無水物（０．３８ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）およびポリ
リン酸（０．５ｇ）の混合物を配合して、１２時間、１８０℃まで加熱した。水
（１０ｍＬ）を赤褐色の反応物に添加し、そして混合物を濾過した。固形物を、
１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ  ９、２５ｍＬ）に入れ、そして濾過した。
濾液を、濃ＨＣｌで酸性化し、そして固形物を遠心分離によって収集し、そして
乾燥させた。固形物はアセトニトリル（１０ｍＬ）で抽出し、そして抽出物を粘
着性の固形物に濃縮した。固形物を、ジメチルホルムアミド（０．６ｍＬ）に溶
解した。収率を、アリコートを４０％アセトニトリル／トリエチルアンモニウム
アセテート緩衝液に希釈すること、およびＵＶ／可視光分光光度計で吸光度を測
定することにより推定した。５０，０００ｃｍ−１Ｍ−１の吸光係数を使用して
、吸光極大は５４０ｎｍであり、そして収率は９％であることが見い出された。
【０１４３】
（実施例５）
ＤＲ６ＧのＮＨＳエステルの調製
【０１４４】
【化３６】
0004961410.tif 000033
【０１４５】
ジメチルホルムアミド中のＤＲ６Ｇ（０．１ｍＬ中に６μｍｏｌ）の溶液を、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１２ｍｇ、０．
０６ｍｍｏｌ）と混合した。反応の進行を、ジクロロメタン、メタノールおよび
酢酸（６００：６０：１６）の混合物を溶離液として使用して、シリカゲル上の
薄層クロマトグラフィによって、モニターした。出発物質が消費された後、反応
物をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈して、５％ＨＣＩ（１０ｍＬ）で洗浄し
た。両方の相に不溶であった物質を捨てた。有機相を、２５０ｍＭ炭酸塩／重炭
酸塩（１０ｍＬ）および５％  ＨＣＩ（１０ｍＬ）で連続的に洗浄した。溶液を
乾燥し（ＭｇＳ０４）、そして暗色の油に濃縮した。残留物を、ジメチルホルム
アミド（０．２ｍＬ）中に入れて、そして−２０℃で保存した。
【０１４６】
−２０℃での３日間の後、金色の反射する結晶がジメチルホルムアミド溶液中
で形成した。上清をデカントし、そして捨てた。残留物を、メチルスルホキシド
（０．１ｍＬ）中に、溶解した。アリコートを、４０％アセトニトリル／トリエ
チルアンモニウムアセテート緩衝液に希釈した。５０．０００  ｃｍ−１Ｍ−１
の吸光係数を使用して、吸光度極大が５４８ｎｍであり、そして収率が７％であ
ることが見い出された。
【０１４７】
（実施例６）
ＤＲ６Ｇ標識したジデオキシアデノシン三リン酸の調製
【０１４８】
【化３７】
0004961410.tif 000034
【０１４９】
ｄｄＡＴＰ−ＮＨ２（５μＬ、２０ｍＭ、０．１μｍｏｌ）（Ｈｏｂｂｓ  １
９８９、１９９２）、ＤＲ６Ｇ−ＮＨＳ（０．１５μｍｏｌ）および２５０ｍＭ
炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９（５μＬ）の溶液を混合した。室温での１０分
間の後、溶液を陰イオン交換カラムを有するＨＰＬＣに供し、そして４０％アセ
トニトリル／６０％  ０．１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩から４０％アセ
トニトリル／６０％  １．５Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩への勾配で溶出
し遊離色素を除去した。色素標識ヌクレオチドおよび標識されていないヌクレオ
チドを含有する画分を減圧遠心分離器で濃縮し、そして逆相カラムを使用して第
２のＨＰＬＣに供した。標識されていないヌクレオチドおよび色素標識ヌクレオ
チドの各色素異性体を１５％アセトニトリル／８５％  ０．１Ｍトリエチルアン
モニウムアセテートから３５％アセトニトリル／６５％  ０．１Ｍトリエチルア
ンモニウムアセテートへの溶出勾配を使用して分離した。色素標識ヌクレオチド
の含有溶液を、減圧遠心分離器で濃縮し、そして１０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝
液（ｐＨ  ９）に再溶解し、そしてＵＶ／可視光分光光度計において溶液の吸光
度を測定することによって、定量した。収率は、およそ１％であった。
【０１５０】
（実施例７）
色素標識オリゴヌクレオチドの調製
５’−アミノヘキシル官能化オリゴヌクレオチドの色素標識オリゴヌクレオチ
ドの溶液、（１０μＬ、１ｍＭ）およびＤＲ６Ｇ−ＮＨＳ（ｌＯμＬ、メチルス
ルホキシド１２ｍＭ中）および炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（２μＬ、１Ｍ）を混合
した。アミノヘキシル誘導体化プライマーを、合成の最終サイクルにおいてＡｍ
ｉｎｏｌｉｎｋ−２を使用して自動化固相ＤＮＡ合成（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４００８０８）により調製した。室温での１０
分間の後、溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上のゲル濾過に供し遊離色素を分
離した。色素標識オリゴヌクレオチドおよび標識されていないオリゴヌクレオチ
ドを含有する画分を収集し、そして逆相カラム上のＨＰＬＣ精製に供した。標識
されていないオリゴヌクレオチドおよび色素標識したオリゴヌクレオチドの各色
素アイソマーを、１０％アセトニトリル／８５％  ０．１Ｍトリエチルアンモニ
ウムアセテートから３０％アセトニトリル／６５％  ０．１Ｍトリエチルアンモ
ニウムアセテートへの溶出勾配を使用して分離した。色素標識オリゴヌクレオチ
ド含有溶液を、減圧遠心機で濃縮し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ７．０（ＴＥ）含有緩衝液に再溶解した。
【０１５１】
（実施例８）
本発明の４，７−ジクロロローダミンジデオキシヌクレオチドターミネーターを
利用した単色配列決定反応
色素ターミネーター反応を、  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ  Ｍａｎｕ
ａｌ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０２１１６）
の基本プロトコルに従って、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
、ＦＳで行った。（ＦＳ酵素は、二つの点変異（Ｇ４６ＤおよびＦ６６７Ｙ）を
有する組換えｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼである
）。ｄＮＴＰ混合物および色素ターミネーター以外の全ての試薬は、ＡＢＩ  Ｐ
ＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／
ｎ  ４０２１１７）由来であった。反応成分のプレミックスは、以下のように調
製した。容積は、毎反応（ｐｅｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）ベースである：
５×緩衝液                                                    ４μＬ
ｄＮＴＰ混合物                                                １μＬ
テンプレート：ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋）、０．２μｇ／μＬ    
５μＬ
プライマー：−２１  Ｍ１３（正方向）、０．８ｐｍｏｌ／μＬ    ２μＬ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、ＦＳ                ０．５μＬ
水                                                          ２．５μＬ
。
【０１５２】
反応物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ４８０  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃ
ｙｃｌｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  Ｎ８０１
−ｌＯＯ）用の０．５ｍｌチューブに準備した。全反応容積は、１５μＬの上記
の反応プレミックス、適切な量の色素標識ターミネーター、および水を含む２０
μＬであった。単色色素ターミネーター反応を、ＡおよびＧターミネーターにつ
いては１ｐモルの色素ターミネーター、あるいはＣおよびＴターミネーターにつ
いては１５ｐモルで準備した。少数の場合において、ＣまたはＴについての色素
ターミネーターは濃度が低すぎたため、５μＬが１５ｐモル未満の色素ターミネ
ーターを生じた。これらの場合には、５μＬの色素ターミネーターを使用して、
水は反応物に添加しなかった。３０μＬのミネラルオイルを各反応物の容量の上
部に添加し、熱サイクルの間の蒸発を低減させた。
【０１５３】
反応は、以下のように熱サイクルさせた：
９６℃  ３０秒
５０℃  １５秒
６０℃    ４分  を２５サイクル
続いてサイクルを４℃に保った。
【０１５４】
全ての反応物をＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ａｄｅｌｐｈｉａ，  ＮＪ，  ｐ／ｎ  ＣＳ−９０１）
上でスピンカラム精製により精製した。カラム中のゲル材料を０．８ｍｌの脱イ
オン水で室温で少なくとも３０分間水和させた。カラムを水和し、そしてゲル材
料中に泡が混入されていないことが明らかになった後、上側のキャップ次いで下
側のキャップを除去した。カラムを重力により排水させた。次いで、カラムをＣ
ｅｎｔｉ−Ｓｅｐキットに提供される洗浄チューブ中に挿入し、そして可変速度
微小遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ  ５４１５）中で１３００×
ｇで２分間遠心分離した。カラムを洗浄チューブから取り出し、そしてサンプル
回収チューブへ挿入した。反応混合物を油の下からガラスピペットを使用して慎
重に取り出し、そしてＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラムの上に充填した。カラムを可
変速度微小遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ  ５４１５）中で１３
００×ｇで２分間遠心分離した。サンプルを減圧遠心分離器中で乾燥させた。
【０１５５】
乾燥させたサンプルを２５μＬのＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４
０１６７４）に再懸濁し、ボルテックスし、９５℃で２分間加熱し、氷上で冷却
し、再度ボルテックスし、そして遠心分離（１３，０００×ｇ）した。１０μＬ
の精製サンプルを、ＰＥ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  
Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  
３１０−００−１００／１２０）での使用に適したサンプルバイアル（ＰＥ  Ａ
ｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０１９５７）にアリコートし
た。Ｍｏｄｅｌ  ３１０上での電気泳動には、５０ｃｍの検出器に対する長さを
有する、長さ６１ｃｍ、５０μｍＩＤ非被膜融合シリカキャピラリー（ＰＥ  Ａ
ｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０２８４０）を使用した。キ
ャピラリーを直線状のジメチルポリアクリルアミド（ＤＭＡ）篩ポリマー（Ｍａ
ｄａｂｈｕｓｈｉ）、緩衝液、および核酸変性剤（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０２８３７）を含有する溶液で満たした。サンプ
ルを、２．５ｋＶで３０秒間、電気運動的に注入した。電気泳動をキャピラリー
温度を４２℃に維持しながら１２．２ｋＶで２時間実施した。
【０１５６】
図３Ａ〜３Ｈは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用
した単色Ｃ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ｃ末端ジデオキシヌクレオチ
ドターミネーターに付着した。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基１２〜８２を各電
気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の色素標識を、以下の表に
示す：
【０１５７】
【表３】
0004961410.tif 000035
【０１５８】
（「１」および「２」という名称は、使用する特定の色素アイソマーを示す。１
アイソマーおよび２アイソマーは、Ｃ−８カラムおよび１５％アセトニトリル／
８５％  ０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテートから３５％アセトニトリル
／６５％  ０．１Ｍ  トリエチルアンモニウムアセテートへの溶出勾配を利用す
る逆相分離系における遊離色素の溶出順序によって規定する。）
図４Ａ〜４Ｇは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用
する単色Ｔ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ｔ末端ジデオキシヌクレオチ
ドターミネーターに付着した。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基７〜８４を各電気
泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の標識を、以下の表に示す：
【０１５９】
【表４】
0004961410.tif 000036
【０１６０】
図５Ａ〜５Ｉは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用
する単色Ａ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ａ末端ジデオキシヌクレオチ
ドターミネーターに付着した。ＰＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基９４〜１６７を各
電気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の標識を、以下の表に示
す：
【０１６１】
【表５】
0004961410.tif 000037
【０１６２】
図６Ａ〜６Ｈは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用
した単色Ｇ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ｇ末端ジデオキシヌクレオチ
ドターミネーターに付着した。ＰＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基１８５〜２５２を
各電気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の標識を、以下の表に
示す：
【０１６３】
【表６】
0004961410.tif 000038
【０１６４】
以上のデータは、本発明の色素標識したジデオキシターミネーターが、蛍光に
基づくサンガー型のＤＮＡ配列決定における使用に適していることを示す。
【０１６５】
（実施例９）
本発明の４，７ジクロロローダミンジデオキシヌクレオチドターミネーターを利
用する４色配列決定反応
４色のＤＮＡ配列決定反応液を調製し、そして実質的に実施例８に記載のよう
に分析した。
【０１６６】
図２Ａは、４色の配列決定反応の電気泳動図を示す。ここでは、４つのジデオ
キシヌクレオチドターミネーターを以下のように標識した：ｄｄＧはＤＲ１１０
色素で、ｄｄＡはＤＲ６Ｇ−２色素で、ｄｄＣはＤＴＭＲ−１色素で、およびｄ
ｄＴはＤＲＯＸ−１色素で。図は、ＰＧＥＭ（登録商標）テンプレートの塩基１
９６〜２３８を示す。
【０１６７】
（実施例１０）
本発明の４，７ジクロロローダミンオリゴヌクレオチドプライマーを利用する４
色配列決定反応
色素プライマー反応を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭＤｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙ
ｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ  Ｍａｎｕａｌ（ＰＥ  Ａｐ
ｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ｐ／ｎ  ４０２１１４）に総括的に記載
されるようにＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを使用し
て実施した。プライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬は、ＡＢＩ  ＰＲ
ＩＳＭＴＭＤｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒ
ｅ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ｐ／ｎ  ４０２
１２５）由来であった。色素標識した−２１  Ｍ１３プライマーを、０．４ｐモ
ル／μＬの濃度で溶解した。プライマーを以下のように標識した：Ｃ反応はＤＲ
１１０で、Ａ反応はＤＲ６Ｇで、Ｇ反応はＤＴＭＲで、およびＴ反応はＤＲＯＸ
で。反応成分のプレミックスを以下のように４つの各塩基反応用に調製した：
【０１６８】
【表７】
0004961410.tif 000039
【０１６９】
Ｍ１３ｍｐ１８配列決定テンプレートを、０．０５μｇ／μＬの濃度で溶解し
た。
【０１７０】
配列決定反応を、以下のように、０．２ｍｌの薄壁Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ９６００
ＤＮＡサーマルサイクラーチューブ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，  ｐ／ｎ  Ｎ８０１−０５４０）中に準備した。
【０１７１】
【表８】
0004961410.tif 000040
【０１７２】
反応は、以下の温度プロフィールを使用してサイクルさせた：
９６℃  １０秒；
５５℃  ５秒
７０℃  １分間      を１５サイクル
続いて、
９６℃  １０秒
７０℃  １分間      を１５サイクル
に続いて４℃での保持サイクル。
【０１７３】
４つの反応液を８０μＬの９５％エタノール中で混合し、氷上で１０分間放置
し、そして微小遠心分離器中で最高速で１５分間遠心分離した。エタノール上清
を除去し、そしてペレットを減圧遠心分離器中で乾燥させた。
【０１７４】
ペレットを６μＬ充填緩衝液中に再懸濁し、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ 
Ｍｏｅｌ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ３７７−０１−２００／２０８）上で、標準フィル
ターセットＡまたは長波長セッティングを有する改変フィルターセットのいずれ
か使用して、分析した。図２Ｂは、塩基５０〜塩基９３までの得られたデータの
サンプリングを示す。
【０１７５】
（実施例１１）
伝統的なローダミンおよび本発明の４，７，−ジクロロローダミンの蛍光発光ス
ペクトルの比較
伝統的なローダミンで標識したオリゴヌクレオチドについての発光スペクトル
を本発明の４，７，−ジクロロローダミンで標識したオリゴヌクレオチドについ
ての蛍光発光スペクトルと比較した。各標識オリゴヌクレオチドの濃度は、ＴＥ
緩衝液中で０．４μＭであった。ローダミン色素の励起は、４８８ｎｍであり、
そして４，７−ジクロロローダミン色素の励起は５００ｎｍであった。スペクト
ルを、発光極大に対して標準化した。測定は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ
−５０機器を使用して行った。
【０１７６】
図７Ａは、４つの公知のローダミン色素５−Ｒ１１０、５−Ｒ６Ｇ、６−ＴＭ
Ｒ、および６−ＲＯＸ（Ｂｅｒｇｏｔ）の発光スペクトルを示す。図７Ｂは、本
発明の４つの好ましい４，７−ジクロロローダミン色素、ＤＲ１１０、ＤＲ６Ｇ
−２、ＤＴＭＲ−２、およびＤＲＯＸ−２の発光スペクトルを示す。４，７−ジ
クロロローダミン色素についてのこの減少した発光スペクトル幅は、多数の空間
的に重複する種が検出されるべきである場合に要求される多成分分析技術を実施
するための能力の増加をもたらす。
【０１７７】
全ての刊行物および特許出願は、本明細書中で、各個々の刊行物または特許出
願が、特異的かつ別々に参照として援用されるように示されているのと同程度に
参考として援用される。
【０１７８】
以上に少しの実施態様のみが詳細に記載されているが、有機化学の当業者は、
多くの改変が本発明の開示から逸脱することなく、好ましい実施態様において可
能であることを明白に理解する。全てのこのような改変は、以下の請求の範囲内
に包含されることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明は、分子プローブとして有用な４，７−ジクロロローダミン色素のクラ
スであって、現在利用可能なローダミン色素より実質的に狭い発光スペクトル領
域を有するローダミン色素のクラス、および現存のローダミン色素に比べて赤色
側に約１５ｎｍまでシフトした吸収スペクトルを有するローダミン色素のクラス
を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、本発明の数種の好ましい実施態様の色素化合物の構造を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の色素標識化ジデオキシターミネーター（２Ａ）および色素標識プライマー（２Ｂ）を用いた４色配列決定反応の電気泳動図を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ｃ終結反応の電気泳動図を示す。
【図３Ｂ】図３Ｅ〜３Ｈは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ｃ終結反応の電気泳動図を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ｔ終結反応の電気泳動図を示す。
【図４Ｂ】図４Ｅ〜４Ｇは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ｔ終結反応の電気泳動図を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ａ終結反応の電気泳動図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｆ〜５Ｉは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ａ終結反応の電気泳動図を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ｇ終結反応の電気泳動図を示す。
【図６Ｂ】図６Ｅ〜６Ｈは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色Ｇ終結反応の電気泳動図を示す。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、存在するローダミン化合物で標識されたオリゴヌクレオチド（７Ａ）と、本発明の数種の好ましい４，７−ジクロロローダミンオリゴヌクレオチド化合物（７Ｂ）との蛍光発光スペクトルを比較したものである。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、存在するローダミン化合物で標識されたオリゴヌクレオチド（７Ａ）と、本発明の数種の好ましい４，７−ジクロロローダミンオリゴヌクレオチド化合物（７Ｂ）との蛍光発光スペクトルを比較したものである。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の色素化合物の調製のための好ましい合成を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の色素化合物の調製のための好ましい合成を示す。
【図１】
0004961410.tif 000049
【図２】
0004961410.tif 000050
【図３Ａ】
0004961410.tif 000051
【図３Ｂ】
0004961410.tif 000052
【図４Ａ】
0004961410.tif 000053
【図４Ｂ】
0004961410.tif 000054
【図５Ａ】
0004961410.tif 000055
【図５Ｂ】
0004961410.tif 000056
【図６Ａ】
0004961410.tif 000057
【図６Ｂ】
0004961410.tif 000058
【図７Ａ】
0004961410.tif 000059
【図７Ｂ】
0004961410.tif 000060
【図８Ａ】
0004961410.tif 000061
【図８Ｂ】
0004961410.tif 000062