(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0004875612.tif 000015
（式中、Ｒ１は、式（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかで表されるアミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、
【化２】
0004875612.tif 000016
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、ｎは、２〜４の整数である。）
で表されるカチオン性アミノ酸型脂質。
【請求項２】
Ａ１及びＡ２が、いずれも、−ＣＯＯ−である、請求項１に記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
【請求項３】
Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソプレノイド基、ビニル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、及びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、主鎖の炭素数が１２〜３０の鎖状炭化水素基である、請求項１または２に記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
【請求項４】
Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２２のアルキル鎖である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
【請求項５】
ｎが２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
【請求項６】
式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、または（Ｉ）−３のいずれかで表されるカチオン性アミノ酸型脂質。
【化３】
0004875612.tif 000017
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のカチオン性アミノ酸型脂質を含む分子集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工の二分子膜からなる小胞体、リポソームに有用物質を内包させる技術は、医薬品、香粧品、食品、染料などの分野で盛んに研究されている。
リポソームの膜構成脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びコレステロールなどの膜構成脂質と、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリンなどの負電荷リン脂質の混合脂質が広く用いられている。
しかし、生体に投与できるリポソーム製剤において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物分解抑制及び体内動態制御は比較的容易に達成可能であるが、細胞内移行性の向上に対する工夫をも達成できる製剤の構築は極めて難しい。これは、リポソーム製剤が内包する薬物の体内動態を制御することによって、標的とする組織または細胞近傍での薬物濃度を上昇させることを目的としており、細胞への移入は薬物自身のリポソーム二分子膜と細胞膜の透過性に依存しているからである。ただし、マクロファージ及び単球細胞などの貪食細胞を標的とした場合には、これらの細胞がリポソーム等の微粒子を取り込み易い性質を有するため、細胞内移行性が高まる例がある。
近年では、カチオン性脂質単独またはそれを含むリポソームを用いて、遺伝子と複合体を形成することにより、細胞内に遺伝子を導入する研究が行われている。しかしながら、この細胞内移行性を有する担体の使用には、１）カチオン脂質の合成が困難である、２）製剤が高価である、３）細胞毒性が強い、という問題があった。
ところで、カチオン性脂質としては、ジアルキルアスパラギン酸にリシンを結合させたアミノ酸型脂質が報告されている（Ｈｏｎｇ  Ｓｕｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｉａｍｉｎｏ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｖａｒｉｅｄ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｃｈａｎｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００４，１５，１０９５）。しかしながら、この脂質は小胞体構造をとり難く、分散状態が不安定であるという問題があった。
上記実情に鑑み、１）容易に合成可能であり、２）安価に提供可能であり、３）生体適合性が高い、すなわち低毒性のカチオン性脂質の開発が望まれている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、上記実情に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質の合成に成功した。
すなわち、本発明は、以下に示したとおりのカチオン性アミノ酸型脂質を提供するものである。
（１）一般式（Ｉ）
0004875612.tif 000002
（式中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、ｎは、２〜４の整数である。）
で表されるカチオン性アミノ酸型脂質。
（２）カチオン性官能基が、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基、及びこれらの誘導体からなる群から選択されるものである、上記（１）に記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
（３）Ｒ１が、式（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかで表されるものである、上記（１）または（２）のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
0004875612.tif 000003
（４）Ａ１及びＡ２が、いずれも、−ＣＯＯ−である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
（５）Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソプレノイド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、及びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、主鎖の炭素数が１２〜３０の鎖状炭化水素基である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
（６）Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２２のアルキル鎖である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
（７）ｎが２である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
（８）式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、または（Ｉ）−３のいずれかで表されるカチオン性アミノ酸型脂質。
0004875612.tif 000004
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質を含む分子集合体。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、原料の調達及び合成が容易であるため、安価かつ大量に合成が可能である。本発明の好ましい態様によれば、本発明のカチオン性脂質は、ミセル、リピッドマイクロスフェア、リポソーム等の製剤の構成成分に用いることにより、製剤の細胞に対する親和性を高め、極めて細胞内移行性の高い製剤を形成することができる。また、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、小胞体形成能が高いため、有用物質を安定に内包させることができる。さらに、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、生分解性が高く、分解物もアミノ酸またはその誘導体、あるいは長鎖アルコールなどであるので低毒性である。従って、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、医薬品、試薬、化粧品等において、薬効を有する物質の安定、安全かつ機能的な担体の成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、カチオン性アミノ酸型脂質（２）水和物をエクストルージョン処理した後の分子集合体の透過型電子顕微鏡写真である。
図２は、カチオン性アミノ酸型脂質（３）水和物をエクストルージョン処理した後の分子集合体の透過型電子顕微鏡写真である。
図３は、カチオン性アミノ酸型脂質（４）水和物をエクストルージョン処理した後の分子集合体の透過型電子顕微鏡写真である。
図４は、水和物をエクストルージョン処理した後のカチオン性アミノ酸型脂質（２）からなる分子集合体の透過型電子顕微鏡写真と、Ｌｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）からなる分子集合体の透過型電子顕微鏡写真とを比較した図である。
図５は、Ｌｙｓ−Ａｓｐ２１６（５）からなる分子集合体の３７℃における偏光顕微鏡写真（ａ）と、室温における偏光顕微鏡写真（ｂ）とを比較した図である。
図６は、カチオン性アミノ酸型脂質（２）とリポフェトアミンとの細胞毒性をＣＯＳ−７の細胞生存率（ａ）及びＣＣＤ−３２ＳＫの細胞生存率（ｂ）により比較したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質及びそれを含む分子集合体について詳細に説明する。
Ａ．カチオン性アミノ酸型脂質
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、一般式（Ｉ）
0004875612.tif 000005
（式中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、ｎは、２〜４の整数である。）
で表されることを特徴としている。
式（Ｉ）中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基である。ここで「カチオン性官能基」とは、水溶液中でカチオン性を示す基をいい、このような性質を有するものであれば特に限定されない。例えば、カチオン性官能基としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基、及びこれらの誘導体が挙げられる。「誘導体」としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基に含まれる水素原子が、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル等）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）や対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が挙げられる。
Ｒ１は、カチオン性官能基を少なくとも一つ有していればよいが、カチオン性官能基を二つ以上有していることが好ましい。特に、カチオン性官能基を二つ以上有している化合物は、ポリアニオンであるＤＮＡやＲＮＡなどの核酸と安定な複合体を形成できる、あるいは細胞表面の負電荷が密集している部分に安定に結合し細胞内移行性が高まる点で好ましい。カチオン性置換基を二つ以上有している場合は、カチオン性置換基の組み合わせは特に限定されない。
これらの中でも、Ｒ１としては、次式（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかで表される基であることが好ましい。
0004875612.tif 000006
次に、式（Ｉ）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基である。「鎖状炭化水素基」は、結合基Ａ１またはＡ２に共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に限定されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよいが、直鎖が好ましい。鎖状炭化水素基の主鎖の炭素数は、１２〜３０が好ましく、１２〜２２がより好ましい。このような鎖状炭化水素基に二重結合または三重結合などの不飽和結合がある場合、その数は１〜４であることが好ましい。鎖状炭化水素基の主鎖としては、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖が好ましく、アルキル鎖がより好ましい。
また、鎖状炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソプレノイド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、及びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。ここで、アルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。アルケニル基としては、炭素数１〜６のアルケニル基が好ましく、例えば、ビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２−ブテニル等が挙げられる。アルキニル基としては、炭素数１〜６のアルキニル基が好ましく、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
これらの鎖状炭化水素基の中でも、Ｒ２及びＲ３としては、置換基を有していてもよい、炭素数１２〜２２のアルキル鎖が好ましい。
また、式（Ｉ）中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基である。Ａ１及びＡ２の組み合わせは特に限定されるものではないが、Ａ１及びＡ２が、いずれも、−ＣＯＯ−であることが好ましい。
式（Ｉ）中、ｎは、２〜４の整数である。ｎが２〜４であると、二分子膜中で式（Ｉ）の化合物の鎖状炭化水素基を膜平面に対して略垂直に配向させることができる点で好ましい。また、ｎが２〜４であると、水溶液中でカチオン性アミノ酸型脂質が集合して形成する二分子膜の親−疎水界面が安定であり小胞体構造を形成しやすいため、分子集合体の構成脂質成分として用いることにより、小胞体構造ならびに分散状態を安定化させる効果が期待できる。特に、ｎが２であると、上述の効果に加えて、グルタミン酸やその誘導体を原料にできるため、低価格や低毒性の点でより好ましい。
具体的には、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、下記式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、または（Ｉ）−３で表される化合物であることが好ましい。
0004875612.tif 000007
（製造方法）
このような本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、公知の反応を組み合わせることによって極めて簡便に製造することができる。例えば、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、次式
0004875612.tif 000008
（式中、Ａ１１及びＡ１２は、それぞれ独立して、カルボキシル基、水酸基、またはアミノ基であり、ｎは、２〜４の整数である。）
を有する三官能性コア化合物に、鎖状炭化水素基の供給源及びカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源を順次反応させることによって製造することができる。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質を製造するための代表的な合成経路を示すと以下のとおりである。
まず、三官能性コア化合物のＡ１１やＡ１２部に、鎖状炭化水素基の供給源を反応させる。この際、必要に応じて、カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源と反応させる官能基を、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の保護基で保護しておくことが好ましい。
次いで、得られた化合物のアミノ基にカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源を反応させる。カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源は、予めアミノ基をｔｅｒｔ−ブトキシ基などにより保護し、スクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。
上記反応はいずれも、室温で行うことができる。また、反応は、加圧、減圧または大気圧いずれの圧力下でも行うことができるが、操作が簡便であることから、大気圧雰囲気下で行うことが望ましい。
反応終了後は、トリフルオロ酢酸などの酸で処理して脱保護し、常法により精製してカチオン性アミノ酸型脂質を得ることができる。なお、反応の終点は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、核磁気共鳴スペクトル、及び赤外吸収スペクトル等によって確認できる。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の製造方法は、上記方法に限定されるものではない。例えば、三官能性コア化合物のアミノ基にカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源と先に反応させ、次いで、Ａ１１やＡ１２部に鎖状炭化水素基の供給源と反応させることもできる。
以下、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の合成に用いることができる原料化合物を例示する。
鎖状炭化水素基の供給源としては、三官能性コア化合物と共有結合しうる、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などの反応性官能基を有するものであれば特に限定されない。
カルボキシル基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、脂肪酸が挙げられる。例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等であり、それぞれ分岐鎖体も含まれる。また、それらの酸無水物、または酸クロライドも含まれる。
アミノ基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一アミンとして、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ヘプタデシルアミン、オクタデシルアミン、ドコシルアミン、オレイルアミン等が挙げられ、それらの分岐鎖体も含まれる。さらに分岐状のイソプレノイド等のアミンも使用できる。また、アミノ基を有する脂肪族炭化水素基の供給源には、Ｎ−メチル−ドデシルアミン、Ｎ−メチル−テトラデシルアミン、Ｎ−メチル−ヘキサデシルアミン、Ｎ−エチル−ドデシルアミン、Ｎ−エチル−テトラデシルアミン、Ｎ−エチル−ヘキサデシルアミン、Ｎ−プロピル−ドデシルアミン、Ｎ−プロピル−テトラデシルアミン、Ｎ−プロピル−ヘキサデシルアミン、ジオレイルアミン等の第二アミンも含まれ、それらの分岐鎖体も用いられる。
水酸基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一飽和アルコールとしてラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等が挙げられる。その他、１，１−ドデセノール、１−オレイアルコール、リノレニルアルコール等の直鎖第一飽和アルコール、分岐第一飽和アルコール、分岐第一不飽和アルコール、第二飽和アルコールあるいは第二不飽和アルコールが挙げられる。また、これらアルコール類をグリセリンの１，３−位あるいは１，２−位に結合したジアルキルグリセロール、第一飽和アルコール及び第一不飽和アルコールで構成されたジアルキルグリセロールが挙げられる。
その他、鎖状炭化水素基の供給源としては、ステロール類が挙げられる。例えば、コレステロール、コレスタノール、シトステロール及びエルゴステロール等である。
カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源としては、アミノ酸またはその誘導体を使用できる。中でも、リシン、アルギニン、ヒスチジンまたはこれらの誘導体が好ましく、リシン、アルギニン、ヒスチジンがより好ましい。ここで、アミノ酸の誘導体には、アミノ酸に含まれる水素原子が、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル等）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）や対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が含まれる。
Ｂ．分子集合体
次に、本発明の分子集合体について説明する。本発明の分子集合体は、構成脂質として、上述した本発明のカチオン性アミノ酸型脂質を含むものであれば特に限定されない。そのような分子集合体としては、例えば、高分子集合体、高分子ミセル、エマルジョン、リピドマイクロスフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、ヘキサゴナル構造を有する集合体およびその他のチューブ状集合体などが挙げられるが、本発明においては、有用物質を内包させるためにリポソームなどの小胞体構造やチューブ状構造を有するものであることが好ましい。本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、２０〜１００モル％であることが好ましく、５０〜１００モル％であることがより好ましい。
本発明の分子集合体に含まれるその他の構成脂質は、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質と分子集合体を形成することができ、分子集合体の構成脂質として一般に使用されるものであれば特に限定されない。例えば、リン脂質、脂肪酸、ステロール類、多種の糖脂質などが挙げられる。
リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。これらのリン脂質は、エン（二重結合）、イン（三重結合）、ジエン、ジイン、トリエンなどの不飽和部を含有しても良いし、ビニル基などの重合性基、例えばスチリル基を含有しても良い。リン脂質の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０〜７０モル％であることが好ましく、０〜５０モル％であることがより好ましい。
リン脂質のアシル鎖を構成する脂肪酸としては、炭素数１２〜２２の飽和または不飽和脂肪酸が用いられる。例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、オクタデカ−２，４−ジエン酸などがある。更には、グリセロール骨格ではなく、３官能性アミノ酸、例えばグルタミン酸やリジン骨格を持つ両イオン性などのアミノ酸型脂質も使用することができる。脂肪酸の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、１〜７０モル％であることが好ましく、５〜３０モル％であることがより好ましい。
また、分子集合体には、脂質小胞体の膜成分としてステロール類を安定化剤として添加してもよい。そのようなステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレン骨格を有する全てのステロイドが挙げられるが、好ましくはコレステロールである。ステロール類の含有量に特に制限はないが、小胞体膜の安定性を考慮すれば、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、５〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０モル％である。
分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、一般に公知の方法を用いることができる。例えば、リポソー厶の製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などで製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールやエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。
このような分子集合体に有用物質を内包させる方法は、有用物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。有用性物質が水溶性薬剤の場合には、例えば、リポソーム製造時に薬剤を水相に溶解させて調製することができる。あるいは、リポソームを製造した後に外水相に水溶性薬剤を添加し、リポソーム膜の透過性を利用して、内水相に薬剤を導入させることができる。内包されなかった水溶性薬剤はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。脂溶性薬剤の場合には、例えば、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で薬剤を混合して、上述した方法でリポソームを形成させることにより、二分子膜の疎水部に薬物を導入することができる。あるいは、あらかじめリポソームを製造した後、水と混じり合う有機溶媒に薬剤を溶解させ、これを外水相に添加して薬剤を二分子膜の疎水部に導入させることができる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
〔実施例１〕
カチオン性アミノ酸型脂質の合成
（Ａ）ｐ−トルエンスルホン酸−水和物（４．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１００ｍＬ）を８５℃にて沸点還流し、ジンスタークを用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸（２．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）とヘキサデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、１０時間生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し透明に変化した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃にて再結晶し、ジアルキルグルタミン酸誘導体（１）（収率８３％）を白色粉末で得た。
0004875612.tif 000009
ジアルキルグルタミン酸誘導体（１）の分析結果は以下のとおりであった。
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６２（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．８４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．０８（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．４５（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕ  γ−ＣＨ２）；３．４５（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ）；４．０６，４．１０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：５９５．９；Ｆｏｕｎｄ：５９７．３（ＭＨ）＋．
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたジアルキルグルタミン酸誘導体１（１．０ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（２０２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、アミノ基をｔ−ブトキシ基で保護し、スクシンイミドにより活性化されたリシン（６１７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ヒスチジン（６３３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、又はアルギニン（５９３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して、アミノ基を保護したリジン、ヒスチジン、アルギニン誘導体をそれぞれ得た。
得られた誘導体にフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え、４℃で、２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で４回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、ろ過し、乾燥して、カチオン性アミノ酸型脂質（２）（８０％）、（３）（５３％）、（４）（４３％）を白色粉末として得た。
0004875612.tif 000010
カチオン性アミノ酸型脂質（２）及び（３）及び（４）の分析結果は以下のとおりであった。
（２）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６３（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）；１６７３（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５−１．２９（ｂｒ，４４Ｈ，−ＣＨ２−）；４．５１（ｄ，１Ｈ，−ＣＯ−Ｎ−ＣＨ−）；７．８，８．２（ｂｒ，２Ｈ，−Ｃ−ＮＨ２）
（３）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６８（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）；１６７３（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５−１．２９（ｂｒ，４４Ｈ，−ＣＨ２−）；４．５１（ｄ，１Ｈ，−ＣＯ−Ｎ−ＣＨ−）；７．８，８．２（ｂｒ，２Ｈ，−Ｃ−ＮＨ２）
（４）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６２（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３２１（νＮ＝Ｈ，ｅｓｔｅｒ）；１７０８（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５−１．２９（ｂｒ，４４Ｈ，−ＣＨ２−）；４．５１（ｄ，１Ｈ，−ＣＯ−Ｎ−ＣＨ−）；７．８，８．２（ｂｒ，２Ｈ，−Ｃ−ＮＨ２）
〔実施例２〕
（Ａ）カチオン性アミノ酸型脂質の相転移温度
得られた各カチオン性アミノ酸型脂質を６０℃で純水に単純分散させたものを測定試料とし、試料溶液（脂質濃度１ｗｔ％）６０μＬを銀製パン（密閉型）に封入し、示差走査熱量計にて相転移温度Ｔｃを昇温速度：２℃／ｍｉｎ、測定温度：２０−８０℃で測定した。測定結果を表１に示す。
【表１】
0004875612.tif 000011
（Ｂ）カチオン性アミノ酸型脂質単独分子集合体のゼータ電位
エクストルージョン法にて調製した各カチオン性アミノ酸型脂質（２），（３），（４）の単独分子集合体（１ｍｇ／ｍＬ）のゼータ電位をゼータ電位測定装置（Ｎａｎｏ−ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて、リン酸緩衝液３０ｍＭ  ｐＨ７．４の条件にてゼータ電位測定を行った。測定結果を表２に示す。カチオン性アミノ酸型脂質（２）は＋３７ｍＶであり、カチオン性アミノ酸型脂質（３）は＋４５ｍＶ、カチオン性アミノ酸型脂質（４）では他より低く＋１８ｍＶであった。以上より、生理条件では、カチオン性アミノ酸型脂質から成る分子集合体のゼータ電位値から、集合体表面が正電荷を帯びていることが明らかとなった。
【表２】
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〔実施例３〕
（Ａ）カチオン性アミノ酸型脂質単独分子集合体の観察
各カチオン性アミノ酸型脂質（２），（３），（４）１０ｍｇを純水２ｍＬに水和させ、室温にて６時間撹拌後、水和物をメンブランフィルター（最終孔径０．２２μｍ）に加圧透過させた（エクストルージョン法）。室温でのエクストルージョンでは０．２２μｍのメンブランフィルター透過性が悪かったため、脂質分散液を約６０℃に加温してからフィルターを透過させた。透過後、超遠心（３３，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）し、純水で再分散し、カチオン性アミノ酸型脂質集合体を得た。調製したそれぞれのカチオン性アミノ酸型脂質の分子集合体を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、加速電圧１００ｋＶ）により観察した。
（Ｂ）カチオン性アミノ酸型脂質（２）単独の分子集合体
カチオン性アミノ酸型脂質（２）の水和分散液をエクストルージョンして電子顕微鏡観察したところ、図１のような１枚膜の小胞体が多数観察された。この小胞体の粒子径は、動的光散乱法で測定した粒径（１８１±８３ｎｍ）とほぼ同じであった。よってエクストルージョン法で調製されたカチオン性アミノ酸型脂質（２）は安定な１枚膜小胞体を形成することが明らかとなった。
（Ｃ）カチオン性アミノ酸型脂質（３）単独の分子集合体
カチオン性アミノ酸型脂質（３）の水和分散体をエクストルージョンしたところ、動的光散乱法で測定した粒子径は２４１±９６ｎｍであったが、電子顕微鏡では管径２０ｎｍ程度のチューブ状の分子集合体が観測された。チューブ状の分子集合体の枝分かれ箇所は、図２のように空洞になってつながっていた。またチューブの先端は開いていた。チューブの壁の厚さは５ｎｍ程度であり、カチオン性アミノ酸型脂質（３）の二分子膜厚に相当していた。
（Ｄ）カチオン性アミノ酸型脂質（４）単独の分子集合体
カチオン性アミノ酸型脂質（４）の水和分散体をエクストルージョンしたところ、透過型電子顕微鏡では６００ｎｍから１μｍの１枚膜小胞体構造が観察された（図３）。動的光散乱法で測定された粒子径も１μｍを超えていた（１６４７±７３３ｎｍ）。孔径０．２２μｍのフィルターを透過させた後にこのような大きな一枚膜小胞体が観測されたことから、小さな一枚膜小胞体が直ちに凝集融合して成長し大きな一枚膜小胞体となったと思われる。
（Ｅ）カチオン性アミノ酸型脂質（２）とＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）の検討
本発明では一般式（１）のｎを２〜４と定義し、特にｎが２のグルタミン酸を用いており、ｎが１のアスパラギン酸を排除している。他方、前述のとおり、Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍらによってジアルキルアスパラギン酸にリシンを結合させたＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）が報告されている（Ｈｏｎｇ  Ｓｕｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｉａｍｉｎｏ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｖａｒｉｅｄ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｃｈａｎｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００４，１５，１０９５）。そこでカチオン性アミノ酸型脂質（２）とＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）の相違を明らかとした。
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Ｌｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）を１０ｍｇ／ｍＬの脂質濃度で水和しエクストルージョン法により最終孔径０．２２μｍのメンブランフィルターを透過させた後、集合体の相転移温度や粒径を測定した。その結果、動的光散乱法により測定したＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）の分子集合体の粒子径は３７４±１７８ｎｍであり、相転移温度は３０℃であった。カチオン性アミノ酸型脂質（２）よりもＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）の方が分子充填状態が悪いことと凝集しやすいことが判明した。
【表３】
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透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）での観察では、カチオン性アミノ酸型脂質（２）は二分子膜小胞体構造であったのに対し、Ｌｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）ではリボン状の分子集合体が観察された（図４）。リボンの厚さは二分子膜厚の５ｎｍ程度であると思われる。リボンの幅が約１００ｎｍで長さが約１μｍ以上もあった。以上のことから、疎水部骨格がグルタミン酸とアスパラギン酸とでは、水和時の分子集合体が異なることが明らかとされた。
またＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）の相転移温度が３０℃付近であることから、３７℃におけるＬｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）の分子集合形態を偏光顕微鏡にて観察したが、同様にリボン状の繊維形態が観測され、相転移温度上下で大きな形態の変化は観測されなかった（図５）。また３７℃では偏光が観測されなかったことから、このリボンは液晶状態になっており、室温では偏光が観測されゲル状態になっていると思われた。
結論として、Ｌｙｓ−Ａｓｐ２Ｃ１６（５）は形態が不安定であり、０．２２μｍのメンブランフィルターを透過後、形態がリボン状に変化し、長さは１μｍ程度になることが明らかとなった。また、他のリン脂質との混合においても、得られた小胞体の構造ならびに分散状態を不安定化することが懸念される。
〔実施例３〕
カチオン性アミノ酸型脂質（２）の細胞毒性試験
カチオン性アミノ酸型脂質（２）の細胞への添加量を変化させ細胞毒性評価を行った。具体的には、サル腎臓由来細胞ＣＯＳ−７またはヒト繊維芽細胞ＣＣＤ−３２ＳＫをディッシュに１ｘ１０４個播種し、インキュベーター内にて２４時間培養した。培養細胞に、培地にて希釈したカチオン性リポソームを０．１、１、５、１０μｇ／ｄｉｓｈになる様に添加して、さらに２４時間培養した。その後培地で洗浄し、ＷＳＴａｓｓａｙにて細胞生存率を算出し、この結果を元に毒性評価を行った（ｎ＝２）。比較として、現在遺伝子導入試薬として汎用されているリポフェクトアミンについても同様に試験を行った。結果を図６に示す。図中、（ａ）はＣＯＳ−７を用いた例であり、（ｂ）はＣＣＤ−３２ＳＫを用いた例である。リポフェクトアミンでは、ＣＯＳ−７に１０μｇ添加後２４時間の細胞生存率は２０％であった。
カチオン性アミノ酸型脂質（２）単独集合体では、細胞生存率の低下は１０μｇの添加では全く見られなかったことから、カチオン性アミノ酸型脂質（２）はリポフェクトアミンと比較して極めて低毒性であることが明らかとなった。ＣＣＤ−３２ＳＫにおいても、リポフェクトアミンの場合には１０μｇの添加では生存率は２０％以下となったのに対して、カチオン性アミノ酸型脂質（２）では同条件での生存率が８０％程度であり、１００μｇ添加でも生存率の低下は認められなかった。以上より、カチオン性アミノ酸型脂質（２）はリポフェクトアミンよりも細胞毒性がかなり低いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、例えば、細胞やタンパク質に対して特異的な認識能を有するリポソームやマイクロスフェア、分離用充填剤、各種センサー、細胞培養基板等の表面改質剤として、更には、医薬品、食品、化粧品、染料等の乳化剤、安定剤、分散剤、可溶化剤、混和剤、浸透剤、粘度調整剤などに応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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