(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌およびその前段階に対して個体を免疫するのに適した量のｐ１６タンパク質および／または該ｐ１６タンパク質をコードする発現可能な核酸と、通常の助剤とを含有してなる、癌およびその前段階に対して個体を免疫するための医薬組成物であって、該癌が上気道の癌または肛門性器の癌であり、該癌の細胞が、ｐ１６を発現するＨＬＡ陽性細胞である、医薬組成物。
【請求項２】
ｐ１６タンパク質の野生型形態を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｐ１６タンパク質が、１以上の断片の形態で利用可能である請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該断片が、細胞傷害性Ｔ細胞により検出されかつ細胞傷害性免疫応答を誘発しうるエピトープを含んでなる、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
該１以上の断片が、ＶＭＭＭＧＳＡＲＶ、ＶＬＨＲＡＧＡＲＬ、ＴＬＴＲＰＶＨＤＡ、ＬＬＨＧＡＥＰＮＣ、ＳＭＥＰＳＡＤＭＬ、ＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬ、ＬＬＬＨＧＡＥＰＮＣ、およびＧＶＭＭＭＧＳＡＲＶからなる群より選択される、請求項３または４記載の医薬組成物。
【請求項６】
肛門性器の癌が頸部癌である請求項１〜５いずれか記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌およびその前段階に対して個体を免疫するための医薬組成物の製造における、ｐ１６タンパク質および／または該ｐ１６タンパク質をコードする発現可能な核酸の使用であって、該癌が上気道の癌および／または肛門性器の癌であり、該癌の細胞が、ｐ１６を発現するＨＬＡ陽性細胞である、使用。
【請求項８】
ｐ１６タンパク質が、１以上の断片の形態で利用可能である請求項７記載の使用。
【請求項９】
該断片が、細胞傷害性Ｔ細胞により検出されかつ細胞傷害性免疫応答を誘発しうるエピトープを含んでなる、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
肛門性器の癌が頸部癌である請求項７〜９いずれか記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞周期調節タンパク質を含有してなる医薬組成物、ならびに癌およびその前段階に対して個体を免疫するための該医薬組成物の使用に関する。
【０００２】
毎年、世界中で数百万人の人々が癌に罹患し、死亡する。治療法の研究が盛んに行なわれているにもかかわらず、これらの死亡率は何年も変わらないままである。これまでのところ、癌患者は、しばしば癌の除去手術または化学療法もしくは放射線治療を受けなければならない。しかしながら、これはかなり重症な副作用を伴い、そのことが癌患者の死亡率の一因となっている。
【０００３】
したがって、本発明の目的は、癌に対する治療手段および予防手段を取り得る産物を提供することであり、上記の副作用が回避される。
【０００４】
本発明によれば、このことは、特許請求の範囲に規定された主題により達成される。
【０００５】
本発明は、癌またはその前段階において細胞周期調節タンパク質が修正された形態または量で利用可能である、という本出願人の知見に基づく。例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビターの過剰発現が癌において認められる（本出願人の独国特許１９８  ２９  ４７３号を参照のこと）。本出願人はまた、癌およびその前段階に対して治療手段および予防手段が取れるように、形態または量に関して修正された細胞周期調節タンパク質に対して個体を免疫しうることを見出した。本出願人は、これをインビトロおよびインビボ実験（以下の実施例を参照のこと）により示した。
【０００６】
したがって、本発明は、癌およびその前段階に対して個体を免疫するのに適した量の細胞周期調節タンパク質または該細胞周期調節タンパク質をコードする発現可能な核酸と、通常の助剤とを含有してなる医薬組成物に関する。
【０００７】
用いる「細胞周期調節タンパク質」という用語は、任意の種類および起源の細胞周期調節タンパク質を包含する。例えば、これらはサイクリンでありうる。特に、これらは、サイクリンを調節するｃｄｋ４およびｃｄｋ６などのサイクリン依存性キナーゼでありうる。より特別には、これらはサイクリン依存性キナーゼインヒビターであり得、これがサイクリン依存性キナーゼを調節し得る。サイクリン依存性キナーゼインヒビターの例は、タンパク質ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８、ｐ１９であり、ｐ１６が好ましい。細胞周期調節タンパク質は、野生型または修飾された形態で利用可能である。後者の形態には、１つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換および／または逆位などのアミノ酸配列の修飾が含まれる。細胞周期調節タンパク質の断片そのもの、または担体との組み合わせもまた存在し得、該断片は、野生型または修飾されたアミノ酸配列を有しうる。個体における担体は免疫原性でないことが好都合である。かかる担体は、個体自身のタンパク質であってもよく、外来タンパク質またはその断片であってもよい。血清アルブミン、フィブリノーゲンもしくはトランスフェリンまたはそれらの断片などの担体が好ましい。細胞周期調節タンパク質の断片は、細胞傷害性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８+ Ｔ細胞により認識されて細胞傷害性免疫応答を誘導しうるエピトープを含有することが特に好都合である。細胞周期調節タンパク質のかかるエピトープは、当業者によく知られた方法、特にＮＩＨソフトウェアシステム（ＮＩＨバイオインフォメーションサービスhttp:/bimas.dcrt.nih.gov.cgi-bin/molbio/ken ＿parker＿comboform ）を用いることにより決定することができる。また、様々な細胞周期調節タンパク質またはその断片（これらに対して上述の説明が相応じて当てはまる）が同時に存在することが有利でありうる。上述の細胞周期調節タンパク質の作製に関し、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) に記載がなされている。
【０００８】
用いる「細胞周期調節タンパク質をコードする発現可能な核酸」という用語は、個体において発現可能であり、かつ細胞周期調節タンパク質（これらに対して上述の説明が相応じて当てはまる）をコードする任意の核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡを包含する。該核酸は、そのままで、すなわちその発現のために好適なエレメントとともに存在しうるか、またはベクターとの組み合せで存在しうる。かかるエレメントの例は、ＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−メタロチオネインＩ型およびポリヘドリン(Polyhedrin)プロモーターまたはＣＭＶエンハンサーおよびＳＶ４０エンハンサーなどのプロモーターおよびエンハンサーである。発現に好適なさらなる配列は、Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に開示されている。さらに、哺乳動物細胞における発現に好適な任意のベクターをベクターとして使用しうる。これらは、例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＸ、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４、ならびにｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターである。組換えウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノ随伴ウイルスもまた、ベクターとして使用しうる。上述の核酸、特にかかる核酸を含有するベクターの作製に関し、例えばSambrookら（上記）に記載がなされている。
【０００９】
用いる「癌およびその前段階」という用語は、任意の種類および起源の癌およびその前段階を包含する。例えば、これらは、上気道の癌または肛門性器の癌であり得、特に、頸部上皮内癌（ＣＩＮ  Ｉ〜ＩＩＩ）、上皮内癌（ＣＩＳ）などの頸部癌またはその前段階でありうる。同様に、乳頭腫、腺腫、過形成または上皮増殖、間葉増殖もしくは造血性増殖のような類似の増殖などの良性変化もまた包含される。
【００１０】
用いる「個体」という用語は、細胞周期調節タンパク質を有し、癌および／またはその前段階に罹患しうる任意の種類および起源の個体を包含する。かかる個体の例はヒトおよび動物ならびにそれらの細胞である。
【００１１】
用いる「個体を免疫するのに適した量」という用語は、細胞周期調節タンパク質（これらに対して上述の説明が相応じて当てはまる）または該細胞周期調節タンパク質（これらに対して上述の説明が相応じて当てはまる）をコードする発現可能な核酸の任意の量を包含し、該量により個体が免疫されうる。該量は、細胞周期調節タンパク質を使用するか、細胞周調節タンパク質をコードする発現可能な核酸を使用するかに依存する。該量はまた、個体の免疫が、修飾された細胞周期調節タンパク質に対する抗体の産生を目的とするのか、または修飾された細胞周期調節タンパク質に指向される細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ８+ Ｔ細胞の刺激を目的とするのかに依存する。免疫の両方の可能性が本発明により達成される。さらにまた、該量は、免疫が予防処置を意図するのか、または治療処置を意図するのかに依存する。また、個体の年齢、性別および体重は、量の決定にある役割を果たす。細胞周期調節タンパク質１００μｇ〜１ｇまたは細胞周期調節タンパク質をコードする発現可能な核酸を含有する組換えウイルス１０6 〜１０12ＭＯＩを、注射により個体に与えることが好都合である。注射は、個体の種々の部位に、筋肉内、皮下、皮内または任意の他の適用形態で行い得る。また、ほぼ等量の「ブースター注射」を１回以上行なうことが好都合であり得る。この場合、個体への注射のために、それぞれの細胞周期調節タンパク質の異なる断片を使用することが特に好ましくあり得る。
【００１２】
用いる「通常の助剤」という用語は、個体を免疫するための医薬組成物に好適な任意の助剤を包含する。かかる助剤は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはフロイントアジュバントなどの免疫アジュバント、通常の緩衝塩溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、湿潤剤、滅菌溶液などである。
【００１３】
本発明により、修飾された細胞周期調節タンパク質に対して個体、特にヒトおよび動物を免疫することが可能である。免疫は、修飾された細胞周期調節タンパク質に対して指向される、抗体の誘導とＣＤ８+ Ｔ細胞の刺激の両方により起こる。したがって、癌およびその前段階に対して予防手段および治療手段を取ることが可能である。
【００１４】
本発明を以下の実施例により説明する。
【００１５】
実施例：サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６に対するＣＤ８+ Ｔ細胞の刺激およびｐ１６過剰発現性癌細胞の溶解
（Ａ）  ｐ１６に対するＣＤ８+ Ｔ細胞の刺激
末梢単核細胞を健常ドナーから採取し、ＥＬＩＳＰＯＴ解析と称するものに供する。この実験の趣旨は、培養容器内のリンパ球を特異的抗原で刺激することである。リンパ球が抗原を認識して活性化されると、活性化されたリンパ球はサイトカインを放出し、次にこのサイトカインが、培養容器の底面上に固定化された特異的抗体と結合する。リンパ球を洗い流した後、結合したサイトカインを培養容器内において、続く呈色反応において可視化される第２抗体により検出することができる。
【００１６】
ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性健常発端者由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（登録商標）グラジエントにより密度勾配遠心分離によって精製する。抗体結合磁気ビーズ（ＣＤ１１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６およびＣＤ５６）（Ｐａｎｔ  Ｔ細胞単離キット（登録商標）、Milteny, Bergisch Gladbach, Germany ）を用いてＢリンパ球または単球を分離することによりＴリンパ球を得る。３０ｍｌの血液から約２×１０7 個のＴ細胞が得られる。
【００１７】
ｐ１６のＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドを、ＮＩＨソフトウェアシステム（ＮＩＨバイオインフォメーションサービス[http:/bimas.dcrt.nih.gov.cgi-bin/molbio/ken＿parker＿comboform ）により同定する。これらは以下のペプチドである。
【００１８】
９量体ペプチド：                      １０量体ペプチド：
スコア１：ＶＭＭＭＧＳＡＲＶ          スコア１：ＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬ
スコア２：ＶＬＨＲＡＧＡＲＬ          スコア２：ＬＬＬＨＧＡＥＰＮＣ
スコア３：ＴＬＴＲＰＶＨＤＡ          スコア３：ＧＶＭＭＭＧＳＡＲＶ
スコア４：ＬＬＨＧＡＥＰＮＣ
スコア５：ＳＭＥＰＳＡＤＭＬ
【００１９】
単離したＴ細胞を、（ａ）上記９量体ペプチド（１０μｇ／ペプチド）の混合物および（ｂ）上記１０量体ペプチド（１０μｇ／ペプチド）の混合物を負荷したＴ２細胞とともにインキュベートする。Ｔ細胞を１週間に１回、６週間再刺激する。それぞれ１０7 個のＴ細胞を、２×１０6 個のペプチド負荷Ｔ２細胞とともに２４ウェルプレート内で共存培養する。
【００２０】
ペプチド負荷Ｔ２細胞に対する反応性を、実験の第０日から始めて１週間に１回、ＩＦＮ−γエリスポット解析を行なうことにより測定する。第２８日目に、（ａ）の混合物による反応性が観察される（１００万個の細胞あたり４００個の特異的細胞）。この場合の主な反応性は、ペプチドＶＭＭＭＧＳＡＲＶに対するものである（１０００個の特異的細胞／１００万個の細胞）（図１）。より強度の低い活性が（ｂ）の混合物に対して観察される（１５０個の特異的細胞／１００万個の細胞）。ここで、ペプチドＭＭＧＳＡＲＶＡＥＬは、最大反応性を示す（６００個の特異的細胞／１００万個の細胞）。
【００２１】
したがって、ｐ１６に対して活性化されたＣＤ８+ Ｔ細胞を刺激することが可能であることは明白である。
【００２２】
（Ｂ）  ｐ１６過剰発現性癌細胞の溶解
別の再刺激の後、活性化ＣＤ８+ Ｔ細胞を、ｐ１６を過剰発現するＨＬＡ  Ａ０２０１+ 頸部癌細胞Ｃａｓｋｉとともにインキュベートする。ｐ１６を過剰発現しない大腸癌細胞ＳＷ４８０を対照として使用する。１０6 個のＣａｓｋｉ細胞を52Ｃｒ（１００μＣｉ）により３７℃で１時間標識し、活性化ＣＤ８+ Ｔ細胞の数を増大させながら３時間共存培養する。上清み中に放出された放射能の量によりＣａｓｋｉ細胞の特異的溶解を測定する。
【００２３】
Ｃａｓｋｉ細胞は、活性化ＣＤ８+ Ｔ細胞により溶解されるが、対照細胞ＳＷ４８０によっては溶解されないことがわかる（図２）。