(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
（ｉ）生薬試料を、アセトニトリルと水の容量比が７：３〜１９：１であるアセトニトリル水溶液で抽出する工程、
（ii）抽出後のアセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水の容量比を９：１１〜３：２に調整する工程、及び
（iii）前記工程（ii）によりアセトニトリルと水の容量比が調整された溶液をカラムクロマトグラフィーに付す工程
を含む生薬試料中の残留農薬の精製方法。
【請求項２】
工程（ｉ）で用いるアセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水の容量比が７：３〜９：１であり、工程（ii）において抽出後のアセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水の容量比を９：１１〜１１：９に調整する請求項１記載の方法。
【請求項３】
生薬試料が生薬又は漢方製剤である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
生薬試料がソヨウ、センナ、ビワヨウ、カンキョウ、サイシン、サンショウ、キョウカツ、ゼンコ、チョウジ、モッコウ、リョウキョウ及びワキョウカツから選ばれる請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
残留農薬がピレスロイド系農薬である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生薬試料中の残留農薬を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、農産物の生産性を高めるために種々の農薬が使用されてきた。近年、農産物中の残留物質への関心が高まり、残留物質の測定が重視されてきている。これに対応する形で、厚生労働省でも、農産物中に残存する残留物質に関する基準を設定しようとしている（非特許文献１）。
【０００３】
非特許文献１には、一斉試験法として「ＧＣ／ＭＳによる農薬等の一斉試験法（農産物）」が記載されており、果実、野菜、ハーブ、茶及びホップの場合の試験溶液の調製の抽出工程について、以下のように記載されている。
【０００４】
「果実、野菜及びハーブの場合は、試料２０．０ｇを量り採る。茶及びホップの場合は、試料５．００ｇに水２０ｍＬを加え、１５分間放置する。
これにアセトニトリル５０ｍＬを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル２０ｍＬ加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトニトリルを加えて正確に１００ｍＬとする。
抽出液２０ｍＬを採り、塩化ナトリウム１０ｇ及び０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬを加え、振とうする。静置した後、分離した水層を捨てる。アセトニトリル層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を４０℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にアセトニトリル及びトルエン（３：１）混液２ｍＬを加えて溶かす。」
【０００５】
本発明者らがカラムクロマトグラフィーに付すアセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水の割合を検討したところ、農薬の添加回収率だけを考えると容量比で２：３が最適であったが、生薬によっては容量比２：３では夾雑物が多く分析が困難となることがあった。
【非特許文献１】食安発第０１２４００１号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知、別添「食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生薬試料において農薬の添加回収率を維持しつつ、夾雑物の除去率を高めることができる生薬試料中の残留農薬の精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次の工程：
（ｉ）生薬試料を、アセトニトリルと水の容量比が１：１〜１９：１であるアセトニトリル水溶液で抽出する工程、
（ii）抽出後のアセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水の容量比を２：３〜３：２に調整する工程、及び
（iii）前記工程（ii）によりアセトニトリルと水の容量比が調整された溶液をカラムクロマトグラフィーに付す工程
を含む生薬試料中の残留農薬の精製方法。
（２）生薬試料が生薬又は漢方製剤である前記（１）に記載の方法。
（３）生薬試料がソヨウ、センナ、ビワヨウ、カンキョウ、サイシン、サンショウ、キョウカツ、ゼンコ、チョウジ、モッコウ、リョウキョウ及びワキョウカツから選ばれる前記（１）に記載の方法。
（４）残留農薬がピレスロイド系農薬である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、農薬の添加回収率を維持しつつ、夾雑物の除去率を高めることができ、通常の精製法でみられる夾雑物の混入を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の対象となる生薬としては、例えばソヨウ、センナ、ビワヨウ、カンキョウ、サイシン、サンショウ、キョウカツ、ゼンコ、チョウジ、モッコウ、リョウキョウ、ワキョウカツ、アキョウ、イレイセン、インチンコウ、ウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウゴン、オウバク、オウレン、オンジ、ガイヨウ、カシュウ、カッコン、カッセキ、カロコン、カロニン、カンゾウ、キキョウ、キクカ、キジツ、キッソウコン、キョウニン、クジン、ケイガイ、ケイヒ、コウカ、コウジン、コウブシ、コウベイ、コウボク、ゴシツ、ゴシュユ、ゴボウシ、ゴマ、ゴミシ、サイコ、サンザシ、サンシシ、サンシュユ、サンソウニン、サンヤク、カンジオウ、ジコッピ、シコン、シツリシ、シャクヤク、シャゼンシ、ジュクジオウ、シュクシャ、ショウキョウ、ショウバク、ショウマ、シンイ、セッコウ、センキュウ、センコツ、センタイ、ソウジュツ、ソウハクヒ、ソボク、ダイオウ、タイソウ、タクシャ、チクジョ、チクセツニンジン、チモ、チャヨウ、チョウトウコウ、チョレイ、チンピ、テンナンショウ、テンマ、テンモンドウ、トウガシ、トウキ、トウニン、トウヒ、トコン、トチュウ、ドッカツ、ニンジン、ニンドウ、バイモ、バクガ、バクモンドウ、ハッカ、ハマボウフウ、ハンゲ、ビャクゴウ、ビャクシ、ビャクジュツ、ビンロウジ、ブクリョウ、ブシ、フンマツアメ、ボウイ、ボウフウ、ボクソク、ボタンピ、ボレイ、マオウ、マシニン、モクツウ、ヨクイニン、リュウガンニク、リュウコツ、リュウタン、レンギョウ、レンニク、好ましくはソヨウ、センナ、ビワヨウ、カンキョウ、サイシン、サンショウ、キョウカツ、ゼンコ、チョウジ、モッコウ、リョウキョウ、ワキョウカツが挙げられる。
【００１０】
本発明において精製対象となる農薬としては、特に制限はなく、例えば、テフルトリン、シネリンＩ、シネリンII、シハロトリン、シペルメトリン、ジャスモリンＩ、ジャスモリンII、ピレトリンＩ、ピレトリンII、フルシトリネート、フルバリネート、デルタメトリン、アクリナトリン、ペルメトリンＩ、ペルメトリンII、シフルトリン、シラフルオフェン、フェンバレレート、エスフェンバレレート、フィプロニル、ビフェントリン、フェンプロパトリン、トラロメトリン等のピレスロイド系農薬；ジクロラン、ブロモブチド、クロメトキシニル、スウェップ、ジクロフルアニド、クロルフェンソン、ビフェノックス、シフルトリン、フルバリネート、テフルトリン、プロピザミド、ジコホール、ビナパクリル、クロルベンジレート、キントゼン、エンドスファン、プロシミドン、クロルプロピレート、ブロモプロピレート、テトラジホン、ハルフェンプロックス、フルオロイミド、クロロフェネトール、ホルペット、エンドリン等の有機塩素系農薬；メトラクロール、トリアジメノール、キノメチオネート、パクロブトラゾール、プレチラクロル、フルシラゾール、プロピコナゾール、レナシル、テニルクロール、アセタミプリド、フルトラニル、メフェナセット、フェナリモル、ビテルタノール、ピリダベン、ピリミジフェン、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、ペンジメタリン、ミクロブタニル、トリシクラゾール、シプロコナゾール、メプロニル、テブコナゾール、イプロジオン、テブフェンピラド、ピリプロキシフェン、ジフェノコナゾール、イミベンコナゾール、トリフルラリン、メトリブジン、トリクラミド、ヘキサコナゾール、エトキサゾール、シハロホップブチル、カフェンストロール等の含窒素系農薬；ピペロニル・ブトキシド等のメチレンジオキシ系農薬；アラクロール等のアセトアニリド系農薬；ブチレート、イソプロカルブ、ジエトフェンカルブ、メチオカルブ、クロロプロファム、ピリミカーブ、チオベンカルブ、ピリブチカルブ、ベンダイオカルブ、エチオフェンカルブ、フェノブカルブ、カルバリル等のカーバメート系農薬；ジメチピン、ベンフレセート等の有機硫黄系農薬が挙げられる。
【００１１】
本発明における抽出工程においては、生薬の特性（水分含量が１０％以下である）の点から、抽出溶媒としてアセトニトリルと水の容量比が１：１〜１９：１であるアセトニトリル水溶液を用いる。アセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水との割合は、容量比で、好ましくは７：３〜９：１、更に好ましくは４：１である。アセトニトリル水溶液の使用量は、試料１ｇ当たり、通常８〜１２ｍＬ、好ましくは９〜１１ｍＬである。抽出に際して、試料及び溶媒の混合順序には制限はなく、予めアセトニトリル水溶液を調製した後、試料と混合してもよく、また試料と、アセトニトリル及び水の一方を混合した後、他方の溶媒を加えてもよい。
試料の使用量は、特に制限はないが、通常１〜４ｇである。
【００１２】
次いで、試料と溶媒との混合物を十分に振盪する。その後、前記混合物を遠心分離し、上清をとる。好ましくは、残留物に前記アセトニトリル水溶液を添加し（残留物１ｇ当たり、通常１０〜３０ｍＬ、好ましくは１５〜２５ｍＬ）、振盪後、遠心分離して上清をとる操作を１回以上繰り返し、得られた上清を合わせる。
【００１３】
本発明においては、抽出後のアセトニトリル水溶液（前記上清）に水を加えて、当該溶液におけるアセトニトリルと水の容量比を２：３〜３：２に調整する。この処理を行うことにより、夾雑物の混入を防ぐことができる。ここで加える水の添加量は、試料１ｇ当たり、通常６〜２０ｍＬ、好ましくは９〜１５ｍＬである。
【００１４】
本発明においては、農薬の回収率を向上させる点から、前記のようにして得られた抽出液のｐＨを３．５〜４．５に調整することが好ましい。前記ｐＨは、更に好ましくは３．８〜４．２、最も好ましくは４．０である。ｐＨ調整するために用いる溶液としては特に制限はないが、通常リン酸水溶液、酢酸水溶液、ギ酸水溶液、パラトルエンスルホン酸水溶液等の酸性水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ性水溶液等を単独で又は組み合わせて用いる。ｐＨ調整後のアセトニトリル水溶液におけるアセトニトリルと水の容量比は、好ましくは２：３〜３：２、更に好ましくは９：１１〜１１：９である。
【００１５】
本発明においては、前記のようにしてｐＨ調整された溶液をカラムクロマトグラフィーに付す。
【００１６】
本工程で用いるカラムクロマトグラフィーとしては、特に制限はなく、例えばＣ１８カラムクロマトグラフィー、ＰＳＡカラムクロマトグラフィー、グラファイトカーボンブラック（ＧＣＢ）カラムクロマトグラフィー、ＳＡＸ／ＰＳＡカラムクロマトグラフィー、フロリジルカラムクロマトグラフィー等を単独で又は組み合わせて行うことができる。
【００１７】
本発明に従えば、通常の精製法では夾雑物の混入が多く分析が困難である生薬試料においても農薬の添加回収率を維持しつつ、夾雑物の除去率を高めることができるので、本発明方法により前処理された試料を、例えばＧＣ／ＭＳＤ（質量分析計付きガスクロマトグラフ装置）により分析することにより、生薬中の残留農薬を高精度で分析することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１及び比較例１）
１．試料秤量
５０ｍＬのスリ栓付き遠沈管にソヨウ粉末２．０ｇ（１．９５〜２．０４ｇ）を精密に量り取った。
【００２０】
２．抽出
２−１．遠沈管にアセトニトリル／水混液（容量比４：１）２０ｍＬを加えた。
２−２．遠沈管に栓をして、下記条件にて振盪した。
振盪時間：１０分、振盪速度：２００回／分
２−３．振盪後、下記条件にて遠心分離した。
回転速度：３０００ｒｐｍ、遠心時間：５分
２−４．綿栓をした漏斗を１００ｍＬ三角フラスコの上に載せ、アセトニトリル／水混液（容量比４：１）約２ｍＬで洗浄した。
２−５．綿栓をした漏斗を２００ｍＬ三角フラスコの上に載せ、遠沈管を傾け、上清を漏斗に移した。
２−６．遠沈管中の試料についてもう一度２−１〜３の操作を行った。２−５の漏斗に移し、先の抽出液と合わせた。
【００２１】
３．抽出液のｐＨ調整
３−１．２−６の漏斗を水１０ｍＬで洗い込む。漏斗をはずした後、抽出液に水１５ｍＬ（実施例１）又は３０ｍＬ（比較例１）を加え、よく混和した。
３−２．ｐＨ試験紙を用いて、３−１の抽出液のｐＨを測定したところ、ｐＨは約５．７であった。
前記抽出液に、１０％リン酸水溶液、又は飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、ｐＨを４に調整した。
【００２２】
４．Ｃ１８（５ｇ）−ＰＳＡ−ＧＣＢカラム処理
（Ｃ１８カートリッジ下準備）
４−１．Ｃ１８（５ｇ）カートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にアセトニトリル２０ｍＬを加えた。カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、水２０ｍＬ、水／アセトニトリル混液（容量比３：２）２０ｍＬを順次加えた。
【００２３】
（農薬の吸着）
４−２．３−２の調整液をＣ１８（５ｇ）カートリッジに加えた。アダプターをつけたリザーバーカートリッジをＣ１８（５ｇ）カートリッジに取り付け、リザーバーカートリッジに３−２の調整液約６５ｍＬ（実施例１）又は約８０ｍＬ（比較例１）を加えた。Ｃ１８（５ｇ）カートリッジ上部の調整液がなくなったら、アダプターをつけたリザーバーカートリッジを外し、シリンジを用いてＣ１８（５ｇ）カートリッジ内の溶媒を押し出した。通導した液は廃棄した。
４−３．ＰＳＡカートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にアセトニトリル１０ｍＬを加えた。通導した液は廃棄した。
【００２４】
（ＧＣＢカートリッジ下準備）
４−４．ＧＣＢカートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にヘキサン１０ｍＬ、アセトン１０ｍＬ、アセトニトリル１０ｍＬを順次加えた。通導した液は廃棄した。
４−５．１００ｍＬ三角フラスコに無水硫酸ナトリウム大さじ３杯を加えた。
【００２５】
（吸着させた農薬の溶出）
４−６．４−２のＣ１８（５ｇ）カートリッジにアダプターをつけたリザーバーカートリッジを取り付けた。Ｃ１８（５ｇ）カートリッジの下に４−３のＰＳＡカートリッジを、ＰＳＡカートリッジの下に４−４のＧＣＢカートリッジを置いた。ＧＣＢカートリッジの下に４−５の１００ｍＬ三角フラスコを置いた。
４−７．アセトニトリル５０ｍＬを量り取り、Ｃ１８（５ｇ）カートリッジ上部のリザーバーカートリッジに加えた。
４−８．Ｃ１８（５ｇ）カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、アダプターをつけたリザーバーカートリッジを外し、シリンジを用いてＣ１８（５ｇ）カートリッジ内の溶媒を押し出した。
４−９．ＰＳＡカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出し、カートリッジを取り外した。
【００２６】
５．脱水剤分離
５−１．ひだ折り濾紙を載せた漏斗を１００ｍＬ三角フラスコの上に載せ、アセトニトリル約５ｍＬで洗浄した。
５−２．ひだ折り濾紙を載せた漏斗を２００ｍＬナス型フラスコの上に載せた。
５−３．４−９の溶出液をひだ折り濾紙を載せた漏斗に移した。４−９の１００ｍＬ三角フラスコにアセトニトリル約５ｍＬを加え洗浄した。同操作を更に２回行った。
【００２７】
６．溶出液濃縮
６−１．５−３の溶出液を、ロータリーエバポレーターを用い乾固まで減圧濃縮した。
６−２．６−１の濃縮液にヘキサン５ｍＬを加え、２ｍＬまで減圧濃縮した。
【００２８】
７．ＳＡＸ／ＰＳＡ−フロリジル（１ｇ）カラム処理
（フロリジルカートリッジ下準備）
７−１．ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にヘキサン１０ｍＬを加えた。カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、酢酸エチル１０ｍＬ、ヘキサン１０ｍＬを順次加えた。通導した液は廃棄した。
７−２．フロリジル（１ｇ）カートリッジに注射針を取り付け、組立式漏斗台に載せ、下部にビーカーを置いた。カートリッジ上部にヘキサン１０ｍＬを加えた。カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、酢酸エチル１０ｍＬ、ヘキサン１０ｍＬを順次加えた。通導した液は廃棄した。
【００２９】
（ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ下準備）
７−３．７−１のＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジの下に７−２のフロリジル（１ｇ）カートリッジを、フロリジル（１ｇ）カートリッジの下にビーカーを置いた。
７−４．６−２の濃縮液にヘキサン２ｍＬを加え、超音波洗浄器を用いて均一に分散させた。パスツールピペットを用いてＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ上部に加えた。
７−５．７−４の２００ｍＬナス型フラスコにヘキサン４ｍＬを加えた。超音波洗浄器を用いて均一に分散させ、ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ上部に加えた。同操作をもう一度行った。通導した液は廃棄した。
７−６．フロリジル（１ｇ）カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、フロリジル（１ｇ）カートリッジ下部に１００ｍＬナス型フラスコを置いた。ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ上部にヘキサン／酢酸エチル混液（３：１）３０ｍＬを加えた。
７−７．ＳＡＸ／ＰＳＡカートリッジ上部の溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出し、カートリッジを取り外した。
７−８．フロリジル（１ｇ）カートリッジ上部の溶媒がなくなったら、シリンジを用いてカートリッジ内の溶媒を押し出した。
【００３０】
８．溶出液濃縮
８−１．７−８の溶出液を、ロータリーエバポレーターを用い４０℃以下で約２ｍＬまで減圧濃縮した。
８−２．８−１の濃縮液にアセトン５ｍＬを加え、約１ｍＬまで減圧濃縮した。同操作をもう一度行った。
【００３１】
９．分析試料調製
９−１．８−２の濃縮液を２ｍＬメスフラスコに移し、０．０１％ポリエチレングリコールアセトンを用いて２ｍＬに定容した。
９−２．パスツールピペットを用い、メスフラスコ内をよく撹拌した。
９−３．バイアル瓶に試料溶液を約１ｍＬ入れ、キャップをセットした。
９−４．クリンパーを用いて、キャップを閉じた。
【００３２】
１０．ＧＣ／ＭＳＤ測定
以下の条件にしたがって、ＧＣ／ＭＳＤによる分析を行った。
検出器：ＭＳＤ
カラム：ＤＢ−１ＭＳ  長さ１５ｍ，内径０．２５ｍｍ，膜厚０．２５μｍ
カラム温度：100℃(2min hold) - (20℃/min) - 194℃ - (5℃/min) -220℃- (15℃/min) - 300℃(5.77min hold)
注入口温度：２５０℃
インターフェース：３００℃
注入量：２．０μＬ
注入方法：パルスドスプリットレス
パルス圧：２０．０ｐｓｉ
パルス時間：１．００ｍｉｎ
キャリアガス：ヘリウム
平均線速度：６３ｃｍ／ｓｅｃ
【００３３】
１１．選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）の設定と対象農薬のイオン設定
対象農薬の溶出順序から定量用イオンとフラグメントイオン（クォリファイアイオン１及び２）を選定した。
ＳＩＭの設定と対象農薬のイオン設定を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004998151.tif 000002
【００３５】
分析結果を表２に示す。シペルメトリンは異性体の混合物であり検出法あるいは使用機器等の測定条件により確認されるピーク数が異なり、今回の測定条件においては４種のピークが検出される。そのため、それぞれをシペルメトリンＩ、シペルメトリンＩＩ、シペルメトリンＩＩＩ、シペルメトリンＩＶとしている。また、フェンバレレートについても同様に異性体の混合物であり、今回の測定条件では２種のピークが検出されるため、フェンバレレートＩ、フェンバレレートＩＩとしている。
【００３６】
【表２】
0004998151.tif 000003
【００３７】
（判定基準）
（ａ）回収率が７０〜１２０％を示すものを適用可能と判断した。
前記範囲外の回収率には取り消し線を付した。
（ｂ）クォリファイアイオン判定：
ターゲットイオン（定量分析を行うときに検量線を作成し、定量するイオン；定量用イオン）、クォリファイアイオン（Qualifier ion；定量分析を行うときに本当にその物質であるかどうかを確認するためターゲットイオンとの比率を計算するためのイオン）１（確認用イオン１）及びクォリファイアイオン２（確認用イオン２）が確認できる場合を「○」、ターゲットイオンと、クォリファイアイオン１又はクォリファイアイオン２が確認できる場合を「△」として表２に示した。また、ターゲットイオンが確認できない場合及びターゲットイオンは確認できたがクォリファイアイオン１及びクォリファイアイオン２ともに確認できなかった場合を「×」として示した。
【００３８】
表２から、実施例１及び比較例１は、添加回収率においていずれも良好な結果が得られたが、ブランクのクォリファイアイオン判定において、実施例１の方が「△」が少なく、夾雑物の混入が少ないことがわかる。シペルメトリンＩＩについては、生薬由来の夾雑物のピークが同じ位置で検出されるため実施例のＢｌａｎｋクォリファイアが○となっている。