(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と、架橋剤と、水と、を含み、架橋反応に供する前の貯蔵弾性率Ｇ’（周波数１Ｈｚ）が１５０００Ｐａ以上である混合物を、酸又はアルカリ条件下で攪拌混合することを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物中のヒアルロン酸高分子鎖を物理的に切断することなく攪拌混合することを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、自転−公転式混合装置により該混合物を攪拌混合することを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、パン生地練り装置又はもちつき装置により該混合物を攪拌混合することを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項５】
請求項２に記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、ヒトの手で揉むことにより該混合物を攪拌混合することを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物中の架橋剤濃度が０．０２〜１Ｗ／Ｖ％であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物中の架橋剤濃度がヒアルロン酸構成単位に対して０．０２〜２Ｗ／Ｗ％であることを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、架橋剤が、ジビニルスルホン、１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、及びエチレングリコール・ジグリシジルエーテルからなる群から選択されることを特徴とする架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００４年１１月１５日付け出願の出願番号６０／６２７８８６号の米国仮出願の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法、特に低い架橋率で且つ優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルをより簡易に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸を架橋した架橋ヒアルロン酸ゲルは、生体適合性に優れるとともに、生体内において経時的に分解が進み、最終的には消滅するという生分解性も兼ね備えている。従来、架橋ヒアルロン酸ゲルのこのような性質を利用して、癒着防止剤、骨修復剤、薬物徐放性組成物、及び組織増大物質等への応用に関する研究・開発が盛んに行なわれている。これらのうち、組織増大物質への代表的な応用例として、美容形成の分野における皺伸ばし注入剤が知られている。【０００４】
架橋ヒアルロン酸ゲルは、一般的に、ヒアルロン酸と架橋剤とを水溶液中で攪拌混合し、ヒアルロン酸高分子鎖間を架橋剤により化学的に結合させることによって調製されている。ここで、このような架橋ヒアルロン酸ゲルを生体内に投与する場合には、生体内でゲルが分解された後、残存する架橋剤成分が生体にとって異物として認識されてしまい、炎症反応を引き起こしてしまう等の悪影響を及ぼすことが懸念される。このため、生体適合性の維持を目的とした場合には、可能な限り低い架橋率で架橋ヒアルロン酸ゲルを調製することが望まれる。【０００５】
しかしながら、従来の一般的な架橋方法では、架橋剤の添加量を少なくすると、得られる架橋ヒアルロン酸ゲルの粘弾性が低下して柔らかくなってしまい、例えば、皺伸ばし注入剤として用いた場合に、注入部位において一定の体積を確保することができない。また、薬物徐放製剤として架橋ヒアルロン酸ゲルを用いる場合においても、薬剤の適正な効果を一定期間維持するためには生体内に長期間滞留させる必要があり、より濃密な高粘弾性の架橋ゲルが要求されるが、架橋剤量を減らした場合にこのような高粘弾性の架橋ゲルを得ることは難しい。このように、低い架橋率と優れた粘弾性との両者を兼ね備えた架橋ヒアルロン酸ゲルを調製することは、非常に困難な課題であった。【０００６】
このような問題点に対して、特許第３０９４０７４号には、比較的低い架橋率で且つ優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法が報告されている。しかしながら、この製造方法は、具体的には、ヒアルロン酸と架橋剤とを水溶液中で混合して架橋反応を開始させ、ゲル化が起こる前に水を加えて混合溶液を希釈することにより一旦架橋反応の進行を妨げ、さらにこの混合溶液から水を揮発させて再度架橋反応を進行させる、といったように２段階の架橋反応工程を経るものであるため、操作が非常に煩雑であり、反応の制御が難しく、大量生産には不向きであるという問題点があった。
【特許文献１】特許第３０９４０７４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前述のような従来技術の課題に鑑みて行われたものであり、その目的は、架橋率が低く且つ優れた粘弾性を示す架橋ヒアルロン酸ゲルを簡易に製造することのできる新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために本発明者等が鋭意研究を行なった結果、架橋反応に供する混合物中のヒアルロン酸を１０Ｗ／Ｖ％以上の高濃度条件とすることにより、架橋剤の添加量を減少した場合にも、優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルが得られることが明らかとなった。なお、一般的なヒアルロン酸を用いた場合、１０Ｗ／Ｖ％以上といった高濃度のヒアルロン酸水溶液は、溶液状とは到底呼ぶことのできないような固体粉末状あるいは非常に高粘度のゲル状を呈している。すなわち、本発明者らは、通常、当業者が用いることのないような極めて高い濃度条件でヒアルロン酸を反応させることによって、架橋率が低いにもかかわらず優れた粘弾性を示す架橋ヒアルロン酸ゲルを簡易に製造することができることを見出し、本発明を完成するに至ったのである。【０００９】
本発明にかかる架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法は、ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と、架橋剤と、水とを含み、架橋反応に供する前の貯蔵弾性率Ｇ’（周波数１Ｈｚ）が１５０００Ｐａ以上である混合物を、酸又はアルカリ条件下で攪拌混合することを特徴とするものである。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、架橋反応に供する前の該混合物の貯蔵弾性率Ｇ’（周波数１Ｈｚ）が１５０００Ｐａ以上であることが好適である。
【００１０】
また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物中のヒアルロン酸高分子鎖を物理的に切断することなく攪拌混合することが好適である。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物を自転−公転式混合装置により攪拌混合することが好適である。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、パン生地練り装置又はもちつき装置により該混合物を攪拌混合することが好適である。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、ヒトの手で揉むことにより該混合物を攪拌混合することが好適である。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物中の架橋剤濃度が０．０２〜１Ｗ／Ｖ％であることが好適である。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、該混合物中の架橋剤濃度がヒアルロン酸構成単位に対して０．０２〜２Ｗ／Ｗ％であることが好適である。また、前記架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法において、架橋剤がジビニルスルホン、１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、及びエチレングリコール・ジグリシジルエーテルからなる群から選択されることが好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施例において用いられる自転−公転式混合装置の全体図である。
【図２】本発明の一実施例において用いられるパン生地練り装置の全体図である。
【図３】本発明の実施例１−１により得られた架橋ヒアルロン酸ゲル（ヒアルロン酸４１Ｗ／Ｖ％，ヒアルロン酸構成単位当たりジビニルスルホン架橋率０．８％）の粘弾性測定結果である。
【図４】市販架橋ヒアルロン酸ゲル（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ：Ｑ−ＭＥＤ社製）の粘弾性測定結果である。
【図５】本発明の実施例１−２により得られた架橋ヒアルロン酸ゲル（ヒアルロン酸３３Ｗ／Ｖ％，ヒアルロン酸構成単位に対して１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル架橋率１％）の粘弾性測定結果である。
【図６】本発明の実施例１−３により得られた架橋ヒアルロン酸ゲル（ヒアルロン酸２６Ｗ／Ｖ％，ヒアルロン酸構成単位に対してジビニルスルホン架橋率０．８％）の粘弾性測定結果である。
【図７】本発明の実施例１−４により得られた架橋ヒアルロン酸ゲル（ヒアルロン酸２６Ｗ／Ｖ％，ヒアルロン酸構成単位に対して１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル架橋率１％）の粘弾性測定結果である。
【図８】本発明の実施例１−５により得られた架橋ヒアルロン酸ゲル（ヒアルロン酸１３Ｗ／Ｖ％，ヒアルロン酸構成単位に対して１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル架橋率２．８％）の粘弾性測定結果である。
【図９】本発明の製造方法により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリー及び１．２％ヒアルロン酸水溶液に酵素溶液を添加した試験品（及び対照品）の酵素反応後のサンプル重量を、理論残存サンプル百分率（％）としてまとめた図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、本発明にかかる架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法は、ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と、架橋剤と、水とを含み、架橋反応に供する前の貯蔵弾性率Ｇ’（周波数１Ｈｚ）が１５０００Ｐａ以上である混合物を、酸又はアルカリ条件下で攪拌混合することを特徴とするものであり、これによって、架橋率が低いにもかかわらず優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルを簡易に製造することができるというものである。
【００１３】
本発明において「架橋率」とは、ヒアルロン酸構成単位当たりの架橋剤の数を表す。例えば、架橋率１００％では、１個のヒアルロン酸構成単位に対して１個の架橋剤が結合していることを示す。
本発明に用いるヒアルロン酸は、下記一般式に示されるようにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基と、Ｄ−グルクロン酸残基が交互に結合した直鎖状高分子であり、このようなものであれば特に限定することなく用いることができる。
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【００１４】
ヒアルロン酸は、例えば、鶏冠や他の動物組織からの単離抽出、あるいはストレプト・コッカス属などの微生物を用いた発酵法により得ることができる。また、本発明においては、例えば、ヒアルロン酸の誘導体として、ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアルロン酸カリウム塩等のヒアルロン酸金属塩や、ヒアルロン酸のヒドロキシル基、カルボキシル基等をエーテル化、エステル化、アミド化、アセタール化、ケタール化させて得られるヒアルロン酸誘導体等を用いても構わない。【００１５】
また、本発明のヒアルロン酸としては、市販品を用いることもできる。市販のヒアルロン酸としては、例えば、バイオヒアロ１２（資生堂社製）、ヒアルロン酸（紀文社製）等が挙げられる。【００１６】
本発明においては、架橋反応に供する混合物中、前記ヒアルロン酸を１０Ｗ／Ｖ％以上含んでいることが必要とされる。このようにヒアルロン酸を高濃度で含有する混合物中では、ヒアルロン酸分子鎖が非常に複雑に絡み合った状態で存在しているため、ヒアルロン酸鎖同士が部分的に架橋されることで、分子鎖同士が立体的に束縛し合うこととなり、ネットワーク構造を強固に安定化することができる。そして、このため、ヒアルロン酸を１０Ｗ／Ｖ％以上含む混合物を架橋反応に用いることにより、架橋率が低いにもかかわらず優れた粘弾性を示す架橋ヒアルロン酸ゲルを調製することができるものと考えられる。一方で、ヒアルロン酸濃度１０Ｗ／Ｖ％未満の場合では、架橋率が低いとヒアルロン酸分子鎖の自由度が高く、この結果、架橋ゲルが柔らかくなってしまい、優れた粘弾性が得られない。また、本発明においては、架橋反応に供する混合物中、前記ヒアルロン酸を１０〜２０Ｗ／Ｖ％含んでいることがより好適である。【００１７】
なお、通常、一般的に用いられている分子量１０万以上のヒアルロン酸を使用して、前述のような１０Ｗ／Ｖ％以上の高濃度ヒアルロン酸水溶液とした場合には、固体粉末状あるいは非常に高粘度のゲル状を呈しており、周波数１Ｈｚにおける貯蔵弾性率Ｇ’が１５０００Ｐａ以上となる。本発明においては、架橋反応に供する混合物がこのような固体粉末状あるいは高粘度ゲル状を呈する状態で反応を行なうことが好ましい。すなわち、本発明においては、前記ヒアルロン酸分子が非常に複雑に絡み合った状態で架橋反応を行なう必要があり、ヒアルロン酸濃度が１０Ｗ／Ｖ％以上であったとしても、ヒアルロン酸が水中に分散した所謂溶液状で反応を行なうと、所望の粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルを得られない場合がある。このため、本発明においては、架橋反応に供する前の混合物の貯蔵弾性率Ｇ’（周波数１Ｈｚ）が１５０００Ｐａ以上である。
【００１８】
本発明に用いるヒアルロン酸の分子量は特に限定されるものではないが、分子量１０万以上、さらには分子量が５０万〜３００万程度であることが好適である。通常、一般的に用いられるヒアルロン酸はそのほとんどが分子量１０万以上であるものの、特別に低分子化した分子量１万程度のヒアルロン酸も存在する。本発明において、このような分子量１万程度の低分子化ヒアルロン酸を用いると、ヒアルロン酸濃度を１０Ｗ／Ｖ％以上としても、ヒアルロン酸が水中に均一に分散した溶液状となってしまうことがあり、架橋率を低くした場合に柔らかくなってしまい、所望の粘弾性を得ることができない場合があるため、好ましくない。【００１９】
本発明に用いる架橋剤は、前記ヒアルロン酸の高分子鎖間を化学結合によって架橋し得るものであれば、どのようなものを用いても構わない。ヒアルロン酸の架橋剤としては、ヒアルロン酸分子の持つカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基といった反応性官能基と反応して共有結合を形成し得る官能基を２以上有する多官能性化合物を用いることができる。本発明に用いる架橋剤としては、具体的には、１，３−ブタジエンジエポキシド、１，２，７，８−ジエポキシオクタン、１，５−ヘキサジエンジエポキシド等のアルキルジエポキシ体、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル等のジグリシジルエーテル体、ジビニルスルホン、エピクロルヒドリン等が挙げられる。これらの中でも、特にジビニルスルホン、１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、及びエチレングリコール・ジグリシジルエーテルを好適に用いることができる。また、本発明においては、２種以上の架橋剤を適宜組み合わせて用いても構わない。【００２０】
本発明においては、架橋反応に供する混合物中、前記架橋剤の配合量は特に限定されるものではないが、得られる架橋ヒアルロン酸ゲルの生体適合性の観点から、可能な限り少量の架橋剤により架橋反応を行なうことが好ましい。具体的には、架橋反応に供する混合物中、前記架橋剤濃度が０．０２〜１Ｗ／Ｖ％であることが好適であり、また、より好適には０．０５〜０．５Ｗ／Ｖ％である。あるいは、混合物中の架橋剤濃度がヒアルロン酸構成単位に対して０．０２〜２Ｗ／Ｗ％であることが好適である。本発明によれば、架橋剤濃度を混合物中１Ｗ／Ｖ％以下とした場合であっても、優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルを製造することができる。なお、本発明において、一般的な低分子の架橋剤を用い、架橋剤濃度を０．０６６Ｗ／Ｖ％、ヒアルロン酸濃度を１４Ｗ／Ｖ％として架橋反応を行なった場合、架橋剤の全量がヒアルロン酸の反応性基と反応したものと仮定すると、得られる架橋ヒアルロン酸ゲルの架橋率は、通常、ヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり約１．６７％以下となる。言い換えれば、６４個のヒアルロン酸構成単位当たり１個の架橋剤が結合していることになる。【００２１】
本発明にかかる架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法においては、前記ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と、前記架橋剤と、水とを含む混合物を、酸又はアルカリ条件下で攪拌混合し、前記ヒアルロン酸の有する反応性官能基と前記架橋剤とを反応させることによって、ヒアルロン酸高分子鎖間を化学結合により架橋し、架橋ヒアルロン酸ゲルを生成する。【００２２】
なお、本発明においては、架橋反応時のヒアルロン酸の反応性を高める目的で、塩酸、硫酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基、あるいはリン酸塩、４級アンモニウム塩等の適当な緩衝液により混合物のｐＨを適宜調整し、酸又はアルカリ条件下で攪拌混合を行なう。具体的には、例えば、酸条件下においてはｐＨ１〜５、アルカリ条件下においてはｐＨ１０〜１４となるように混合物のｐＨを調整することが好適である。【００２３】
また、本発明においては、架橋反応に供する混合物中、前記必須成分の他にも、予め、通常、医薬品、化粧料等に用いられる成分を、本発明の目的及び効果に影響が出ない範囲で配合しても構わない。配合可能な成分としては、例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、グリセリン等の保湿剤、レチノール及びその誘導体、サリチル酸等の抗炎症剤等が挙げられる。【００２４】
本発明において、前記混合物を攪拌混合する方法は、特に限定されるものではないが、混合物中のヒアルロン酸高分子鎖を物理的に切断することなく攪拌混合することが好適である。ヒアルロン酸は極めて高い水膨潤性を有しており、例えば、約１０Ｗ／Ｖ％程度のヒアルロン酸水溶液では極めて高粘度のゲル状を呈している。このため、例えば、一般的に広く用いられているプロペラミキサーやディスパー等の回転型の攪拌混合装置では、攪拌羽根や装置壁等に付着してしまい、系全体を均一に攪拌混合することが難しい。加えて、このような攪拌混合装置を用いて、無理に攪拌羽根を回転させて攪拌混合した場合には、鋭利な攪拌羽根によってヒアルロン酸高分子の分子鎖を物理的に切断してしまうこととなり、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲル（３次元ネットワーク状構造を有する架橋ゲル）は得られない。このように、通常の攪拌混合装置を用いて、高濃度条件のヒアルロン酸水溶液において均一な架橋反応を行なうことは非常に困難であったため、従来、架橋ヒアルロン酸ゲルの製造に際しては、一般的に０．１〜３Ｗ／Ｖ％程度の低粘度のヒアルロン酸水溶液中で架橋反応が行なわれてきた。【００２５】
これに対して、本発明の架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法においては、例えば、自転−公転式混合装置を用いた攪拌混合、パン生地練り装置（あるいはもちつき装置）を用いた攪拌混合、あるいはヒトの手揉みによる攪拌混合といったように、混合物中のヒアルロン酸高分子鎖を物理的に切断することなく攪拌混合することによって、１０Ｗ／Ｖ％以上という極めて高いヒアルロン酸濃度条件においても、容易に均一な架橋構造を形成させることが可能となる。すなわち、これらの攪拌混合方法によれば、ヒアルロン酸高濃度条件下においても、ヒアルロン酸高分子の分子鎖を物理的に切断することなく、系全体を均一に攪拌混合することができ、均一に架橋された架橋ヒアルロン酸ゲルを調製することが可能となる。【００２６】
以下、本発明にかかる架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法について、攪拌混合方法の具体例を挙げて、本発明について更に詳しく説明を行なう。
１．自転−公転式混合装置による攪拌混合
本発明における前記混合物を攪拌混合する方法としては、自転−公転式混合装置による攪拌混合を用いることができる。【００２７】
本発明に用いる自転−公転式混合装置は、当業者において公知であり、例えば、特開昭６１−２９０９４６号公報、実公平５−３２１１０号公報、特開平１０−４３５６８号公報、特開平１１−２２６３７６号公報、及び特開２０００−２７１４６５号公報等に記載されている混合装置を本発明に用いることができる
図１に、本発明の一実施例にかかる自転−公転式混合装置を示す。
本発明の一実施例にかかる自転−公転式混合装置１０は、試料を収容する容器本体１４及びその容器蓋１２と、容器本体１４を固定保持する容器ホルダ１６と、容器ホルダ１６を自転軸１８に沿って回転させる自転機構２０と、自転機構２０を支持する支持部２２と、支持部２２を公転軸２４に沿って回転させる公転機構２６とを備えている。【００２８】
（製造例１）
１）自転−公転式混合装置１０の容器本体１４に、ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と架橋剤と水とを含む混合物３０を収容し、容器蓋１２を嵌め、容器ホルダ１６に装着する。
２）自転−公転式混合装置１０を運転し、自転機構２０及び公転機構２６を回転させる。
なお、上記混合物３０は、ヒアルロン酸を１０Ｗ／Ｖ％以上という極めて高い濃度で含んでおり、固体粉末状あるいは非常に高粘度のゲル状を呈しているものである。【００２９】
上記製造例において、容器ホルダ１６は自転機構２０によって自転軸１８に沿って回転させられ、さらに自転機構２０を支持する支持部２２は公転機構２６によって公転軸２４に沿って回転させられる。そして、容器ホルダ１６に収容される混合物３０は、自転軸１８に沿って自転すると同時に、公転軸２４に沿って公転することになる。
以上のようにして、ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と架橋剤と水とを含む混合物３０を、自転機構２０及び公転機構２６を有する自転−公転式混合装置１０に供し、自転させながら公転させて攪拌混合を行なうことにより、混合物３０は固体粉末状あるいは非常に高粘度のゲル状であるにもかかわらず、ヒアルロン酸高分子の分子鎖を物理的に切断することなく、系全体が均一に攪拌混合されるため、容易にヒアルロン酸分子間に均一な架橋構造を形成させることが可能となる。【００３０】
なお、容器ホルダ１６は自転機構２０及び公転機構２６により、自転と公転とを同時に行なうことができ、その回転速度は自由に設定することができる。容器ホルダ１６の回転速度は、調製される架橋ヒアルロン酸ゲルの性質や容量、さらには容器ホルダ１６や自転−公転式混合装置１０の規模によって異なるが、通常の場合、自転速度は６０〜１０００回転／分、公転速度は３００〜３０００回転／分程度である。また、自転−公転式混合装置１０によって混合物３０を攪拌混合する時間も、前述の回転速度の場合と同様に、調製される架橋ヒアルロン酸ゲルの性質や容量及び装置の規模等の諸条件によって異なるが、通常の場合、１０秒〜３０分程度である。【００３１】
２．パン生地練り装置による攪拌混合
本発明における前記混合物を攪拌混合する方法としては、パン生地練り装置による攪拌混合を用いることができる。
本発明に用いるパン生地練り装置は、当業者において公知であり、各種市販の装置を本発明に用いることができる。
図２に、本発明の一実施例にかかるパン生地練り装置を示す。【００３２】
本発明の一実施例にかかるパン生地練り装置４０は、試料を収容する容器本体４４、その容器蓋４２及び容器本体４４中のパン生地練り用羽根４６と、容器本体４４を回転軸４８に沿って回転させる回転機構５０とを備えている。ここで、パン生地練り用羽根４６は、通常のミキサーあるいはフードプロセッサ用の鋭利な攪拌羽根とは異なり、パン生地を練る目的に応じて設計されているものである。なお、通常のパン生地は、練ることによってグルテンの架橋構造を形成し、独特の粘弾性を得るものであり、本発明とほぼ同様に、グルテンの分子鎖を物理的に切断することなく攪拌混合する必要がある（アミロペクチンの絡み合いにより粘弾性を得るもちつきの場合においても同様である）。【００３３】
（製造例２）
１）パン生地練り装置４０の容器本体４４にパン生地練り用羽根４６を装着し、この容器本体４４中にヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と架橋剤と水とを含む混合物６０を収容し、容器蓋４２を嵌める。
２）パン生地練り装置４０を運転し、回転機構５０を回転させる。
上記製造例において、容器本体４４中のパン生地練り用羽根４６は、回転機構５０によって回転軸４８に沿って回転させられる。そして、パン生地練り用羽根４６の回転によって、容器本体４４に収容される混合物６０が攪拌混合される。ここで、パン生地練り用羽根４６は、本来、パン生地中のグルテンの分子鎖を物理的に切断することなく攪拌混合を行なうことができるように設計されているものである。このため、上記製造例においても、混合物６０中のヒアルロン酸高分子の分子鎖を物理的に切断することなく、系全体が均一に攪拌混合される。【００３４】
以上のように、ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と架橋剤と水とを含む混合物６０を、パン生地練り装置４０に供し、パン生地練り羽根４６の回転によって攪拌混合を行なうことにより、混合物６０は固体粉末状あるいは非常に高粘度のゲル状であるにもかかわらず、ヒアルロン酸高分子の分子鎖を物理的に切断することなく、系全体が均一に攪拌混合されるため、容易にヒアルロン酸分子間に均一な架橋構造を形成させることが可能となる。【００３５】
なお、パン生地練り用羽根４６の回転速度は自由に設定することができ、調製される架橋ヒアルロン酸ゲルの性質や容量、パン生地練り用羽根４６の形状、さらには容器本体４４やパン生地練り装置４０の規模によっても異なるが、通常の場合、回転速度は１０００〜２０００回転／分程度である。また、パン生地練り装置４０によって混合物６０を攪拌混合する時間も、前述の回転速度の場合と同様に、調製される架橋ヒアルロン酸ゲルの性質や容量、羽根の形状及び装置の規模等の諸条件によって異なるが、通常の場合、２〜６分程度である。【００３６】
また、本発明における前記混合物を攪拌混合する方法としては、上記パン生地練り装置と同様にして、もちつき装置による攪拌混合を用いることもできる。
本発明に用いるもちつき装置は、当業者において公知であり、各種市販の装置を本発明に用いることができる。【００３７】
３．ヒトの手揉みによる攪拌混合
本発明において、前記混合物を攪拌混合する方法としては、ヒトの手揉みによる攪拌混合を用いることができる。
（製造例３）
１）ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と架橋剤と水とを含む混合物を、密閉可能なプラスチック製の袋に入れ、封をする。
２）両手の指２本により、前記袋の中の混合物を揉むようにしてよく混ぜ合わせる。
以上のように、ヒアルロン酸１０Ｗ／Ｖ％以上と架橋剤と水とを含む混合物について、ヒトの手揉みによって攪拌混合を行なうことにより、混合物が固体粉末状あるいは非常に高粘度のゲル状であるにもかかわらず、ヒアルロン酸高分子の分子鎖を物理的に切断することなく、系全体が均一に攪拌混合されるため、ヒアルロン酸分子間に均一な架橋構造を形成させることが可能となる。【００３８】
なお、ヒトの手揉みによって前記混合物を混ぜ合わせる時間は、調製される架橋ヒアルロン酸ゲルの性質や容量、及び袋の大きさ等の諸条件によっても異なるが、通常の場合、５〜１０分程度である。
以上説明した本発明にかかる架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法によれば、具体的には、架橋率がヒアルロン酸構成単位1ユニット当たり２％以下の低い架橋率であるにもかかわらず、例えば、生理食塩水中で膨潤平衡に達した該架橋ヒアルロン酸ゲルの周波数１Ｈｚにおける貯蔵弾性率Ｇ’が１００Ｐａ以上、より好ましくは１０００Ｐａ以上の非常に優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルを簡易に製造することが可能となる。【００３９】
本発明の製造方法により得られる架橋ヒアルロン酸ゲルは、そのままで、あるいは適当な処方中に配合することにより、医薬品、化粧料等に用いることが可能である。特に本発明の製造方法によれば、架橋率が低いにもかかわらず優れた粘弾性を示す架橋ヒアルロン酸ゲルを簡易に製造することができるため、生体中に適用する物質への応用、例えば、皺伸ばし注入剤等の組織増大物質、薬物徐放性組成物、癒着防止剤、骨修復剤等に好適に応用することが可能である。【００４０】
また、本発明の製造方法により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルは、酵素消化耐性（ヒアルロニダーゼ耐性）が高く、生体内で長期間ゲル構造を維持することができるため、例えば、関節注入剤、眼内硝子体置換剤、眼科用手術補助剤として特に好適に応用することが期待される。【００４１】
現在、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、慢性関節リウマチにおける膝関節痛等の症状を改善する目的で、ヒアルロン酸が関節注入剤として用いられている。本発明により得られる架橋ヒアルロン酸ゲルは、酵素消化耐性が高いため、関節注入剤として用いることにより、従来品よりも症状改善の効果を長期間持続することが期待できる。また、剥離した網膜を復位させるための眼内硝子体置換物として、現在ではシリコーンオイルが広く用いられている。このような眼内硝子体置換物としては、生体内成分であるヒアルロン酸が適しているものと考えられるものの、ヒアルロン酸は眼内で酵素により分解されやすいため、現在のところ、硝子体置換物としてのヒアルロン酸は市販されていない。本発明により得られる架橋ヒアルロン酸ゲルは、酵素消化耐性が高いため、硝子体置換物として用いることにより、長期間にわたって眼内に留まり、網膜を脈絡膜に付着させ、網膜を復位させる効果が期待できる。また、近年、眼科手術補助剤としてヒアルロン酸を用いることにより、白内障の手術が安全かつ容易に行なわれるようになった。そして、本発明により得られる架橋ヒアルロン酸ゲルは、架橋ゲルであるものの、非常に小さい微粒子となっており、高粘弾性ヒアルロン酸溶液を同等の粘弾性を示す。このため、市販のヒアルロン酸眼科手術補助剤と同様に眼科手術時の補助剤等として用いることが期待できる。さらに、市販品のヒアルロン酸製剤はすべてろ過滅菌であるが、本発明により得られる架橋ヒアルロン酸ゲルは、高圧蒸気滅菌を行なうことができるため、最終製品の微生物汚染の危険性を最小限にすることが可能である。【００４２】
以下、本発明の実施例を示して、本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
ヒアルロン酸高濃度条件による架橋ヒアルロン酸ゲルの調製（自転−公転式混合装置）
本発明者らは、まず最初に、自転−公転式混合装置を用いて、５０Ｗ／Ｖ％という極めて高いヒアルロン酸濃度条件で、少量の架橋剤による架橋反応を試み、得られた架橋ヒアルロン酸ゲルについて粘弾性を測定し、市販の架橋ヒアルロン酸ゲルの粘弾性との比較を行った。なお、本発明においては、ヒアルロン酸水溶液の容積を測定し、Ｗ／Ｖ％の計算を行なった。【００４３】
実施例１−１：ヒアルロン酸４１Ｗ/Ｖ％,ジビニルスルホン架橋率０．８％
精製水１８００μＬに、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液２００μＬ、及びジビニルスルホン２μＬを加え、さらにヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）１．０ｇを添加した。この混合物（周波数１Ｈｚでの貯蔵弾性率Ｇ’：３０００００Ｐａ）を、自転−公転式混合装置（ＡＲ−２５０：ＴＨＩＮＫＹ社製）により、室温で５分間攪拌混合した。生成物を生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置し、膨潤した架橋ヒアルロン酸ゲルをサンプルミル（ＳＫ−Ｍ２型：共立理工社製）にて破砕し、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーについて、レオメーター（Ｒｈｅｏｌｙｓｔ ＡＲ１０００−Ｎ：ＴＡインスツルメント社製）を用いて、２５℃、周波数０．１〜１０Ｈｚの条件で、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の測定を行なった。なお、添加した架橋剤の全量がヒアルロン酸の反応性基と反応したものと仮定すると、得られた架橋ヒアルロンゲルの架橋率はヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり０．８％である。測定結果を図３に示す。【００４４】
比較例１−１：市販架橋ヒアルロン酸ゲル(Restylane:Q-MED社製)架橋率１％
本発明との比較の目的で、従来、皺伸ばし注入剤として広く用いられている市販の架橋ヒアルロン酸ゲル（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ：Ｑ−ＭＥＤ社製）について、上記実施例１−１と同様にして、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の測定を行なった。なお、この市販架橋ヒアルロン酸ゲルは、特許第３０９４０７４号公報に記載される方法により製造されたものであり、架橋率はヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり１％であると推測される。測定結果を図４に示す。【００４５】
図３に示されるように、上記実施例１−１により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーは、架橋率が０．８％と低いにもかかわらず、生理食塩水で膨潤平衡に達した場合に、周波数０．１〜１０Ｈｚの範囲で貯蔵弾性率Ｇ’が約２００００Ｐａ、損失弾性率Ｇ’’が約５０００Ｐａと優れた粘弾性を示すことが明らかとなった。これは架橋反応に供する混合物中のヒアルロン酸濃度が４１Ｗ／Ｖ％と著しく高いために、少量の架橋剤により架橋されるだけで、ヒアルロン酸分子鎖同士が立体的に束縛し合い、ネットワーク構造が強固に安定化されているためと考えられる。一方で、図４に示されるように、従来、皺伸ばし注入剤として広く用いられている比較例１−１の市販架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーでは、架橋率１％程度で、生理食塩水で膨潤平衡に達した際の貯蔵弾性率Ｇ’が約１０００Ｐａ、損失弾性率Ｇ’’が約２００Ｐａであることがわかった。このことから、上記実施例１−１により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーは、架橋率が低いにもかかわらず、皺伸ばし注入剤としての実使用に十分な程度の優れた粘弾性を有していることがわかる。【００４６】
なお、上記比較例１−１として用いた市販の架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーは、架橋率は低いものの、その製造方法は、特許第３０９４０７４号公報に記載されているように、ヒアルロン酸と架橋剤とを水溶液中で混合して架橋反応を開始させ、ゲル化が起こる前に水を加えて混合溶液を希釈することにより一旦架橋反応の進行を妨げ、さらにこの混合溶液から水を揮発させて再度架橋反応を進行させる、といったように２段階の架橋反応工程を経るものであり、非常に煩雑な操作が必要とされる。これに対して、上記実施例１−１の製造方法によれば、４１Ｗ／Ｖ％という極めて高いヒアルロン酸濃度条件により架橋反応を行なうことによって、低い架橋率で且つ優れた粘弾性を示す架橋ヒアルロン酸ゲルを、より簡易に製造することができることがわかった。
つづいて、本発明者らは、架橋剤の種類と架橋反応に供するヒアルロン酸濃度条件を適宜変化させて上記実施例１−１と同様の試験を試み、得られる架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーの粘弾性との関係について検討を行なった。【００４７】
実施例１−２：３３Ｗ/Ｖ％ヒアルロン酸,１，４-ブタンジオール・ジグリシジルエーテル架橋率１％
精製水２２５０μＬに、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液２５０μＬ、及び１，４−ブタンジオール・グリシジルエーテル５μＬを加え、さらにヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）１．０ｇを添加した。この混合物（周波数１Ｈｚでの貯蔵弾性率Ｇ’：１０００００Ｐａ）を、自転−公転式混合装置（ＡＲ−２５０：ＴＨＩＮＫＹ社製）により、室温で５分間攪拌混合した後、室温で２４時間静置した。得られたゲルを生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置し、膨潤した架橋ヒアルロン酸ゲルをサンプルミル（ＳＫ−Ｍ２型：共立理工社製）にて破砕し、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーについて、上記実施例１−１と同様にして貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の測定を行なった。なお、添加した架橋剤の全量がヒアルロン酸の反応性基と反応したものと仮定すると、得られた架橋ヒアルロンゲルの架橋率はヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり１％である。測定結果を図５に示す。【００４８】
図５に示されるように、架橋剤として１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテルを用い、ヒアルロン酸濃度３３Ｗ／Ｖ％の条件で得られた実施例１−２の架橋ヒアルロン酸ゲルは、架橋率が１％と低いにもかかわらず、生理食塩水で膨潤平衡に達した場合に、周波数０．１〜１０Ｈｚの範囲で貯蔵弾性率Ｇ’が約１５００Ｐａ、損失弾性率Ｇ’’が約３００〜４００Ｐａであった。このことから、上記実施例１−１とは異なる架橋剤を用いた場合でも、ヒアルロン酸高濃度条件で架橋反応を行なうことによって、低架橋率で且つ優れた粘弾性を示す架橋ヒアルロン酸ゲルが得られることがわかった。【００４９】
実施例１−３：２６Ｗ/Ｖ％ヒアルロン酸,ジビニルスルホン架橋率０．８％
精製水３０００μＬに、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液３３３μＬ、及びジビニルスルホン２μＬを加え、さらにヒアルロン酸（バイオヒアロ９：資生堂社製）１．０ｇを添加した。この混合物（周波数１Ｈｚでの貯蔵弾性率Ｇ’：６００００Ｐａ）を、自転−公転式混合装置（ＡＲ−２５０：ＴＨＩＮＫＹ社製）により、室温で５分間攪拌混合した。生成物を生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置し、膨潤した架橋ヒアルロン酸ゲルをサンプルミル（ＳＫ−Ｍ２型：共立理工社製）にて破砕し、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーについて、上記実施例１−１と同様にして貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の測定を行なった。なお、添加した架橋剤の全量がヒアルロン酸の反応性基と反応したものと仮定すると、得られた架橋ヒアルロンゲルの架橋率はヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり０．８％である。測定結果を図６に示す。【００５０】
実施例１−４：２６Ｗ/Ｖ％ヒアルロン酸,１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル架橋率１％
精製水３０００μＬに、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液３３３μＬ、及び１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル５μＬを加え、さらにヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）１．０ｇを添加した。この混合物（周波数１Ｈｚでの貯蔵弾性率Ｇ’：６００００Ｐａ）を、自転−公転式混合装置（ＡＲ−２５０：ＴＨＩＮＫＹ社製）により、室温で５分間攪拌混合した後、室温で２４時間静置した。得られたゲルを生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置し、膨潤した架橋ヒアルロン酸ゲルをサンプルミル（ＳＫ−Ｍ２型：共立理工社製）にて破砕し、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーについて、上記実施例１−１と同様にして貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の測定を行なった。なお、添加した架橋剤の全量がヒアルロン酸の反応性基と反応したものと仮定すると、得られた架橋ヒアルロンゲルの架橋率はヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり１％程度である。測定結果を図７に示す。【００５１】
実施例１−５：１３Ｗ／Ｖ％ヒアルロン酸,１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル架橋率２．８％
精製水２２５０μＬに、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液２５０μＬ、及び１，４−ブタンジオール・グリシジルエーテル５μＬを加え、さらにヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）０．３７５ｇを添加した。この混合物（周波数１Ｈｚでの貯蔵弾性率Ｇ’：２００００Ｐａ）を、自転−公転式混合装置（ＡＲ−２５０：ＴＨＩＮＫＹ社製）により、室温で５分間攪拌混合した後、室温で２４時間静置した。得られたゲルを生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置し、膨潤した架橋ヒアルロン酸ゲルをサンプルミル（ＳＫ−Ｍ２型：共立理工社製）にて破砕し、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーについて、上記実施例１−１と同様にして貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の測定を行なった。なお、添加した架橋剤の全量がヒアルロン酸の反応性基と反応したものと仮定すると、得られた架橋ヒアルロンゲルの架橋率はヒアルロン酸構成単位１ユニット当たり２．８％である。測定結果を図８に示す。【００５２】
図６に示されるように、ヒアルロン酸濃度２６Ｗ／Ｖ％の条件において、架橋剤としてジビニルスルホン用いた実施例１−３の場合には、架橋率０．８％程度で、生理食塩水で膨潤平衡に達した際の前記貯蔵弾性率Ｇ’が約３００〜７００Ｐａ、損失弾性率Ｇ’’が約１００〜２００Ｐａであった。また、図７に示されるように、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを用いた実施例１−４の場合では、架橋率１％程度で、生理食塩水で膨潤平衡に達した際の貯蔵弾性率Ｇ’が約２００Ｐａ、損失弾性率Ｇ’’が約３０〜５０Ｐａであった。さらに、図８に示されるように、架橋剤として１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテルを用い、ヒアルロン酸濃度１３Ｗ／Ｖ％の条件で得られた実施例１−５の架橋ヒアルロン酸ゲルは、架橋率２．８％程度で、生理食塩水で膨潤平衡に達した際の貯蔵弾性率Ｇ’が約１５０Ｐａ、損失弾性率Ｇ’’が約２０Ｐａであった。
これらの結果から、ヒアルロン酸高濃度条件下で架橋反応を行なうことによって、０．８〜２．８％程度の低い架橋率であるにもかかわらず優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルが得られることが明らかとなった。【００５３】
ヒアルロン酸濃度条件の検討
つづいて、本発明者らは、架橋反応に供するヒアルロン酸の濃度条件について、より詳細に検討するため、ヒアルロン酸濃度条件を各種変化させて上記実施例１−１と同様の試験を試み、架橋ヒアルロン酸ゲルの粘弾性との関係について検討を行なった。【００５４】
実施例２−１，２−２，比較例２−１〜２−５
精製水４．７ｍＬに、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液０．２５ｍＬ、及びジメチルスルホキシドにて１３．３倍に希釈したジビニルスルホン５０μＬ（ジビニルスルホンとして３μＬ）を加え、さらに各種濃度のヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）を添加した（実施例２−１：１ｇ（１８．２Ｗ／Ｖ％），実施例２−２：０．７５ｇ（１３．９Ｗ／Ｖ％），比較例２−１：０．５ｇ（９．４Ｗ／Ｖ％），比較例２−２：０．２５ｇ（５．０Ｗ／Ｖ％），比較例２−３：０．１５ｇ（３．０Ｗ／Ｖ％），比較例２−４：０．１ｇ（２．０Ｗ／Ｖ％），比較例２−５：０．０５ｇ（１．０Ｗ／Ｖ％））。この混合物を、自転−公転式混合装置（ＡＲ−２５０：ＴＨＩＮＫＹ社製）により、室温で５分間攪拌混合した。生成物を生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置し、膨潤した架橋ヒアルロン酸ゲルをサンプルミル（ＳＫ−Ｍ２型：共立理工社製）にて破砕し、目的とする架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーについて、レオメーター（Ｒｈｅｏｌｙｓｔ ＡＲ１０００−Ｎ：ＴＡインスツルメント社製）を用いて、２５℃、周波数１Ｈｚの条件で、貯蔵弾性率Ｇ’の測定を行なった。結果を下記表１に示す。【００５５】
［表１］
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表１に示されるように、混合物中のヒアルロン酸濃度が１３．９〜１８．２％である実施例２−１，２−２においては、生理食塩水で膨潤平衡に達した際の貯蔵弾性率Ｇ’が、それぞれ６２７．７Ｐａ、２０４．１Ｐａであり、優れた粘弾性を有する架橋ヒアルロン酸ゲルが得られることが明らかとなった。これに対して、混合物中のヒアルロン酸濃度が９．４Ｗ／Ｖ％である比較例２−１においては、貯蔵弾性率Ｇ’が０．１７Ｐａであり、極めて低い粘弾性を示していた。さらに、混合物中ヒアルロン酸濃度が５．０Ｗ／Ｖ％以下である比較例２−２〜２−５においては、部分的に架橋ゲルの形成は見られたものの、大部分が高濃度ヒアルロン酸溶液であり、粘弾性を示すゲルは得られなかった。【００５６】
パン生地練り装置による架橋ヒアルロン酸ゲルの調製
つづいて、本発明者らは、市販のパン生地練り装置を用いて、高濃度のヒアルロン酸と少量の架橋剤による架橋反応を試み、得られた架橋ヒアルロン酸ゲルについて粘弾性を測定した。【００５７】
実施例３−１
精製水１９０ｍＬに、ジメチルスルホキシドにて１６．７倍に希釈したジビニルスルホン溶液２ｍＬ（ジビニルスルホンとして１２０μＬ）を加えて軽く攪拌し、さらにヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）２８．０ｇを添加した（ヒアルロン酸濃度１３．０Ｗ／Ｖ％）。この混合物を、市販のパン生地練り装置（ナショナルフードプロセッサＭＫ−Ｋ５８：松下電器社製，別売のパンの羽根（ＡＵＦ８４−１３７）を装着）により、室温で２分間攪拌混合した後、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液１０ｍＬを添加して、さらに５分間攪拌混合した。生成物を密封可能なポリエチレン袋に封入し、室温で１８時間静置し、２００ｇの架橋ヒアルロン酸ゲルを得た。この架橋ヒアルロン酸ゲル約７．２ｇを生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置して膨潤ゲルを得た。さらに、この膨潤ゲルをミルで破砕してスラリー化し、これを小型の注射筒に約１ｍＬ充填して、高圧蒸気滅菌を行なった。この高圧蒸気滅菌の後に、レオメーター（Ｒｈｅｏｌｙｓｔ ＡＲ１０００−Ｎ：ＴＡインスツルメント社製）を用いて、２５℃、周波数１Ｈｚの条件で、貯蔵弾性率Ｇ’の測定を行なったところ、５７７Ｐａであった。【００５８】
手揉みによる架橋ヒアルロン酸ゲルの調製
つづいて、本発明者らは、ヒトの手揉みによる攪拌混合により、高濃度のヒアルロン酸と少量の架橋剤による架橋反応を試み、得られた架橋ヒアルロン酸ゲルについて粘弾性を測定した。【００５９】
実施例４−１，４−２，比較例４−１
予めエタノールにて消毒したポリエチレン袋（長さ１００ｍｍ，幅７０ｍｍ）に、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液４．９５ｍＬ、及びジメチルスルホキシドにて１３．３倍に希釈したジビニルスルホン溶液５０μＬ（ジビニルスルホンとして３μＬ）を加えてよく攪拌し、さらに各種濃度のヒアルロン酸（バイオヒアロ１２：資生堂社製）を添加した（実施例４−１：０．７ｇ（１３Ｗ／Ｖ％），実施例４−２：０．６ｇ（１１Ｗ／Ｖ％），比較例４−１：０．５ｇ（９．４Ｗ／Ｖ％））。ヒアルロン酸添加後、すばやく袋のシールをしめ、両手の指２本で袋の中の混合物を揉むようにしてよく混ぜ合わせた。約５分間混ぜ合わせた後、袋を振り回してゲル状の混合物を袋の底に集め、これを棒状に成型した。袋をクリーンベンチ内に４時間静置した後、袋を破って生成物を取り出し、架橋ヒアルロン酸ゲルを得た。この架橋ヒアルロン酸ゲルを生理食塩水中で１週間膨潤平衡に達するまで静置して膨潤ゲルを得た。さらに、この膨潤ゲルをミルで破砕してスラリー化し、これを小型の注射筒に約１ｍＬ充填して、高圧蒸気滅菌を行なった。この高圧蒸気滅菌の後に、レオメーター（Ｒｈｅｏｌｙｓｔ ＡＲ１０００−Ｎ：ＴＡインスツルメント社製）を用いて、２５℃、周波数１Ｈｚの条件で、貯蔵弾性率Ｇ’の測定を行なったところ、それぞれ１８１Ｐａ（実施例４−１），６１．５Ｐａ（実施例４−２），１０．５Ｐａ（比較例４−１）であった。【００６０】
なお、以上の各実施例により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルのスラリーを指上で擦ってみたところ、機械（自転−公転式混合装置又はパン生地練り装置）による攪拌混合にて調製したヒアルロン酸ゲルスラリーにおいては、ごく少量の硬いゲル微粒子の存在が確認されたものの、ヒトの手揉みによる攪拌混合にて調製したヒアルロン酸ゲルスラリーにおいては、このような硬い微粒子の存在は確認されなかった。このことから、本発明にかかる架橋ヒアルロンゲルの製造方法においては、ヒトの手揉みに攪拌混合がより適しているものと考えられる。【００６１】
架橋ヒアルロン酸ゲルの酵素消化耐性
つづいて、本発明者らは、例えば、皺伸ばし注入剤のように生体内に注入して用いる架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーの応用を考慮し、本発明により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーの酵素消化耐性についての検討を行なった。【００６２】
酵素消化耐性試験
本発明の製造方法により得られた架橋ヒアルロン酸ゲルスラリー１〜５及び１．２％ヒアルロン酸水溶液のそれぞれ１ｇを無菌エッペンドルフチューブ(２ｍＬ)に入れ、チューブ内のメニスカスを水平にするため、それぞれのチューブをスウィングバケツの遠心機に入れて遠心した（８３００ ｘ ｇ，２０００ｒｐｍ，１０分間）。その後、それぞれのチューブ内のヒアルロン酸表面に０．１１２ｍＬのヒアルロニダーゼ溶液（牛睾丸抽出ヒアルロニダーゼ，２０００ｕｎｉｔ／ｍＬ，０．１ｍｏｌ／Ｌ，リン酸緩衝液ｐＨ７．４）を静かに入れたものを試験品とした。また、ヒアルロニダーゼを含まないほかは同様の条件としたものを対照品とした。それぞれのチューブを３７℃の恒温槽に入れ、１６時間酵素反応を行なった。酵素溶液添加後の試験品の最終酵素活性は２０１ｕｎｉｔ／ｍＬとなった。反応後、それぞれのチューブを倒立させて、液状化したサンプルをペーパータオルで吸収し、チューブの底部に残存したサンプル重量を測定した。各試料における試験品及び対照品のサンプル重量の測定結果を、理論残存サンプル百分率（％）としてまとめたものを図９に示す。なお、理論残存サンプル百分率（％）は、液化したサンプル重量を理論初期サンプル重量（１ｇ）から差し引いたものを残存サンプル重量とし、残存サンプル重量を理論初期量（１g）との百分率で表したものである。【００６３】
図９に示されるように、酵素を含有していない添加液（０．１１２ｍＬ）を加えた対照品においては、添加液分の重量が増加しているものの、１．２％ヒアルロン酸水溶液あるいは架橋ヒアルロン酸ゲルの液化は全く見られなかった。他方、酵素を添加した試験品のうち、１．２％ヒアルロン酸水溶液においては、約８０％が液状化していることがわかった。これに対して、本発明の製造方法により得られた架橋ヒアルロン酸ゲル１〜５においては、ゲルの液化が３５％〜２５％にとどまっていた。このことから、本発明により得られる架橋ヒアルロン酸ゲルスラリーは、酵素消化耐性（ヒアルロニダーゼ耐性）が高く、生体内においても長期間ゲル構造を維持することができるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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