【手続補正書】
【提出日】平成30年10月2日(2018.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（オリゴ）ペプチドを酵素的に合成するための方法であって、（ａ）（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと（ｂ）Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチド求核試薬をカップリングすることを含み、
ここで、前記カップリングが、水を含む流体中で実施され、
前記カップリングが、配列番号２又はその相同配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
−  位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、
−  Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインに対応する突然変異、
−  好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、
前記アミノ酸位置が、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の前記配列に従って定義される、方法。
【請求項２】
少なくとも１２個のアミノ酸の環状（オリゴ）ペプチドを酵素的に合成する方法であって、Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルを、環化ステップに付すことを含み、前記環化が水を含む流体中で実施され、
ここで、前記環化は、配列番号２又はその相同体配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
−  位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、
−  Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインに対応する突然変異、
−  好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、
前記アミノ酸位置は、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される、方法。
【請求項３】
前記Ｓ２２１に対応するアミノ酸での突然変異が、Ｓ２２１Ｃに対応する突然変異である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ及びＰ２２５Ｑに対応する突然変異の群から選択される、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置の突然変異を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８、Ｔ２５４又はＱ２７１に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記の１つ又は複数の突然変異が、群Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異の群から選択される、少なくとも４、好ましくは、少なくとも６、より好ましくは、少なくとも８、より好ましくは、少なくとも１２の前記突然変異を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＮ６２、Ｇ１００、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｇ１２７、Ｐ１２９、Ｎ１５５、Ｙ２１７、Ｎ２１８又はＭ２２２に対応するアミノ酸位置での突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＭ２２２に対応する位置に突然変異を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｍ２２２に対応する位置の前記突然変異が、Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｐ、Ｍ２２２Ｎ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｑ又はＭ２２２Ａに対応し、好ましくは、Ｍ２２２Ｇ又はＭ２２２Ｐに対応する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＹ２１７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、
前記突然変異が、Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｎ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｇ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｓ、Ｙ２１７Ａ又はＹ２１７Ｈに対応する、
請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素、特に、前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＹ１０４、Ｉ１０７、Ｌ１２６、Ｓ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１２７、Ｇ１２８、Ｌ１３５又はＰ１６８に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異が、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｉ１０７Ａ、Ｌ１３５Ｎ、Ｌ１３５Ｓ、Ｌ１３５Ｄ及びＬ１３５Ａに対応するアミノ酸位置での突然変異の群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記（オリゴ）ペプチドＣ末端エステルが、式ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−ＣＸ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−Ｒ１Ｒ２によって定義され、各Ｘは独立に、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子若しくはアルキル基、又はアミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの１つ若しくは複数において任意選択により保護された、Ｃ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２又はその相同体配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
−  位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、
−  Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインに対応する突然変異である突然変異、
−  Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンＢＰＮ変異体又はその相同体である酵素であって、
前記アミノ酸位置が、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される、酵素。
【請求項１７】
前記Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置の突然変異が、Ｓ２２１Ｃに対応する突然変異である、請求項１６に記載の酵素。
【請求項１８】
前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体が、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ及びＰ２２５Ｑの群から選択される、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む、請求項１６又は１７に記載の酵素。
【請求項１９】
配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項２０】
前記の１つ又は複数の突然変異が、群Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異から選択される、請求項１９に記載の酵素。
【請求項２１】
Ｎ２１８及びＭ５０に対応する位置のいずれにも突然変異を含み、前記突然変異が、好ましくは、Ｎ２１８Ｓ及びＭ５０Ｆに対応する突然変異である、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項２２】
Ｓ３Ｃ及びＱ２０６Ｃに対応するアミノ酸位置に突然変異を含む（ここで、位置３及び位置２０６に対応する位置のシステインが、二硫黄（disulphur）橋を形成する）、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項２３】
Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異の群から選択される、少なくとも６、好ましくは、少なくとも８、より好ましくは、少なくとも１２の前記突然変異を含む、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項２４】
配列番号２のＱ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異を含む、請求項２３に記載の酵素。
【請求項２５】
配列番号２のＭ２２２に対応する位置に突然変異を含み、
前記Ｍ２２２に対応する位置の前記突然変異が、Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｐ、Ｍ２２２Ｎ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｑ及びＭ２２２Ａに対応する突然変異の群から選択され、好ましくは、Ｍ２２２Ｇ又はＭ２２２Ｐに対応する突然変異である、
請求項１６から２４のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項２６】
配列番号２のＹ２１７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、
前記突然変異が、Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｎ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｇ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ａ、Ｙ２１７Ｓ及びＹ２１７Ｈに対応する突然変異の群から選択される、
請求項１６から２５のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項２７】
Ｙ２１７に対応するアミノ酸位置での突然変異が、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｇ又はＹ２１７Ｈに対応する突然変異である、請求項２６に記載の酵素。
【請求項２８】
Ｍ２２２及びＹ２１７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、前記突然変異が
−  Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｈに対応するか、
−  Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｇに対応するか、
−  Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆに対応するか、又は
−  Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｇに対応する、
請求項２７に記載の酵素。
【請求項２９】
配列番号２のＹ１０４、Ｉ１０７、Ｌ１２６、Ｓ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１２７、Ｇ１２８、Ｌ１３５及びＰ１６８に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１６から２８のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項３０】
前記突然変異が、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｉ１０７Ａ、Ｌ１３５Ｎ、Ｌ１３５Ｓ、Ｌ１３５Ｄ及びＬ１３５Ａに対応する突然変異の群から選択される、請求項２９に記載の酵素。