【手続補正書】
【提出日】平成30年10月15日(2018.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた外因性核酸配列を含む単離された細胞であって、前記遺伝子座は、
（ａ）配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であり、
（ｂ）外因性核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を、ゲノム中へのランダム組込みによって典型的に観察される発現と比較して少なくとも１．５倍増強することが可能である
ヌクレオチド配列を含む、細胞。
【請求項２】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記外因性核酸配列が、１または複数の組換え認識配列を含み、
任意選択で、前記外因性核酸配列が、少なくとも２つの組換え認識配列と、前記２つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含み、
任意選択で、前記１または複数の組換え認識配列が、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、
請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記外因性核酸配列が第１の外因性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）および第１の外因性プロモーターを含み、前記第１の外因性ＧＯＩが前記第１の外因性プロモーターに作動可能に連結している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記外因性核酸配列が、
（ａ）第２の外因性ＧＯＩおよび第２の外因性プロモーターであって、前記第２の外因性ＧＯＩが前記第１のＧＯＩの３’側に位置し、前記第２の外因性プロモーターに作動可能に連結している、第２の外因性ＧＯＩおよび第２の外因性プロモーター、ならびに
（ｂ）前記第１の外因性ＧＯＩの５’側の第１の組換え認識配列、前記第１の外因性ＧＯＩの３’側の第２の組換え認識配列および前記第２の外因性ＧＯＩの３’側の第３のリコンビナーゼ認識配列
をさらに含み、任意選択で、前記第１および第２の組換え認識配列は異なり、かつＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、
請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記第１の外因性ＧＯＩが抗体の軽鎖またはその断片をコードし、前記第２の外因性ＧＯＩが抗体の重鎖またはその断片をコードする、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記外因性核酸配列が第３の外因性ＧＯＩをさらに含み、
任意選択で、前記第３の外因性ＧＯＩが前記第２の外因性ＧＯＩの３’側に位置し、
任意選択で、前記第１、第２および第３のＧＯＩが（ｉ）抗体の第１の軽鎖もしくはその抗原結合性断片、抗体の第２の軽鎖もしくはその抗原結合性断片および抗体の重鎖もしくはその抗原結合性断片、または（ｉｉ）抗体の軽鎖もしくはその抗原結合性断片、抗体の第１の重鎖もしくはその抗原結合性断片および抗体の第２の重鎖もしくはその抗原結合性断片からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、
請求項５または請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
ＣＨＯ細胞ゲノムを改変する方法であって、ＣＨＯ細胞中に外因性核酸を導入するステップを含み、前記外因性核酸は前記細胞のゲノムの遺伝子座に組み込まれ、前記遺伝子座は、
（ａ）配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であり、
（ｂ）外因性核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を、ゲノム中へのランダム組込みによって典型的に観察される発現と比較して少なくとも１．５倍増強することが可能である
ヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項９】
前記外因性核酸が、１または複数の組換え認識配列を含み、
任意選択で、前記外因性核酸が、少なくとも２つの組換え認識配列と、前記２つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含み、
任意選択で、前記１または複数の組換え認識配列が、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記外因性核酸が第１の外因性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含み、
任意選択で、前記外因性核酸は第２の外因性ＧＯＩをさらに含み、かつ、前記第１の外因性ＧＯＩの３’側に配置され、
任意選択で、前記第１の外因性ＧＯＩは抗体の軽鎖またはその抗原結合性断片をコードし、前記第２の外因性ＧＯＩは抗体の重鎖またはその抗原結合性断片をコードする、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記外因性核酸がベクターを含むビヒクルを使用して導入され、前記ベクターは、
ａ）配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な５’相同アーム、
ｂ）前記外因性核酸、および
ｃ）配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な３’相同アーム
を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記外因性核酸が、少なくともさらなるベクターまたはｍＲＮＡ分子を含むビヒクルを使用して導入され、
任意選択で、前記さらなるベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／もしくはトランスポザーゼ、インテグラーゼ基質ならびにプラスミドからなる群から選択され、ならびに／または前記さらなるベクターは部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮダイマー、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質およびはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼからなる群から任意選択で選択される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外因性核酸を導入するステップの前に、前記ＣＨＯ細胞は前記遺伝子座に組み込まれた１または複数の組換え認識配列を含み、前記外因性核酸は、前記遺伝子座の前記１または複数の組換え認識配列に導入され、
任意選択で、前記外因性核酸を導入するステップの前に、ＣＨＯ細胞は前記遺伝子座に組み込まれた少なくとも２つの組換え認識配列と、前記２つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含み、任意選択で、前記少なくとも２つの組換え認識配列は異なり、かつＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記外因性核酸は第１の外因性プロモーターに作動可能に連結した第１の外因性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）、前記第１の外因性プロモーターの５’において配置された第１の組換え認識配列、および前記第１の外因性ＧＯＩの３’において配置された第２の組換え認識配列を含み、前記第１および第２の組換え認識配列はそれぞれ、前記外因性核酸を導入するステップの前にゲノムの前記遺伝子座に存在する前記少なくとも２つの組換え認識配列と同一であり、
任意選択で、前記第１および第２の組換え認識配列は異なり、かつＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記外因性核酸は、第２の外因性プロモーターに作動可能に連結した第２の外因性ＧＯＩをさらに含み、前記第２の外因性ＧＯＩは前記第１の外因性ＧＯＩの３’側かつ前記第２の組換え認識配列の５’側に配置され、
任意選択で、前記第１の外因性ＧＯＩは抗体の軽鎖またはその抗原結合性断片をコードし、前記第２の外因性ＧＯＩは抗体の重鎖またはその抗原結合性断片をコードする、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞において目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現させる方法であって、
ａ）前記細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞を提供するステップであって、前記外因性核酸配列は第１のプロモーターに作動可能に連結した第１の外因性ＧＯＩを含み、前記遺伝子座は、（ｉ）配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であり、（ｉｉ）外因性核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を、ゲノム中へのランダム組込みによって典型的に観察される発現と比較して少なくとも１．５倍増強することが可能であるヌクレオチド配列を含み、前記第１の外因性ＧＯＩは第１の目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする、ステップ；
ｂ）（ａ）の前記細胞を、前記第１の外因性ＧＯＩの発現を可能にする条件下で培養するステップ；および
ｃ）前記第１のＰＯＩを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記外因性核酸が第２のプロモーターに作動可能に連結した第２の外因性ＧＯＩをさらに含み、前記条件は前記第１の外因性ＧＯＩおよび前記第２の外因性ＧＯＩの発現を可能にし、
任意選択で、前記第１の外因性ＧＯＩは抗体の軽鎖をコードし、前記第２の外因性ＧＯＩは抗体の重鎖をコードする、
請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＨＯ細胞ゲノムを改変して、（ｉ）目的のタンパク質を発現させるか、または（ｉｉ）認識配列を組み込むためのビヒクルであって、
ａ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な５’相同アーム、
ｂ．それぞれ、（ｉ）前記目的のタンパク質をコードするか、または（ｉｉ）前記認識配列を含む外因性核酸配列、および
ｃ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な３’相同アーム、
を含むベクターを含む、ビヒクル。
【請求項２０】
前記外因性核酸配列は、選択可能なマーカーに隣接する１つもしくは複数の組換え認識配列を含み、および／または第１の外因性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含み、
任意選択で、前記ビヒクルは少なくともさらなるベクターまたはｍＲＮＡ分子を含み、前記さらなるベクターは、任意選択で、前記認識配列を組み込みための部位特的ヌクレアーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的ヌクレアーゼは、任意選択で、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮダイマー、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質またはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、
請求項１９に記載のビヒクル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
本発明は、本明細書に記載される具体的実施形態によって範囲が限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、上述の説明および添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
遺伝子座内の特異的部位において組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞であって、前記遺伝子座は、配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、細胞。
（項目２）
第２の核酸配列内の特異的部位中に組み込まれた第１の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目３）
前記特異的部位が、配列番号１内の位置に位置するか、または配列番号１内の位置に隣接して位置し、前記位置が、配列番号１の１０〜４，０００；１００〜３，９００；２００〜３，８００；３００〜３，７００；４００〜３，６００；５００〜３，５００；６００〜３，４００；７００〜３，３００；８００〜３，２００；９００〜３，１００；１，０００〜３，０００；１，１００〜２，９００；１，２００〜２，８００；１，３００〜２，７００；１，２００〜２，６００；１，３００〜２，５００；１，４００〜２，４００；１，５００〜２，３００；１，６００〜２，２００；１，７００〜２１００；１，８００〜２０５０；１，９００〜２０４０；２，０００〜２，０２０、２００２〜２０２１、２，０１０〜２，０１５、２００１〜２００２、２００９〜２０１０および２０２１〜２０２２と番号付けされた位置に及ぶヌクレオチドから選択される、項目２に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）
配列番号１内の前記特異的部位または配列番号１内の位置に隣接する前記特異的部位が、配列番号１の１０〜５００；５００〜１，０００；５００〜２，１００；１，０００〜１，５００；１，０００〜２，１００；１，５００〜２，０００；１，５００〜２，５００；２，０００〜２，５００；２，５００〜３，０００；２，５００〜３，５００；３，０００〜３，５００；３，０００〜４，０００；および３，５００〜４，０００と番号付けされた位置に及ぶヌクレオチドからなる群から選択される、項目３に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）
改変されたゲノムを含む改変された細胞であって、前記ゲノムは、前記ゲノムの遺伝子座内での外因性核酸配列の挿入によって改変され、前記遺伝子座は、配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一である発現増強性ヌクレオチド配列を含む、細胞。
（項目６）
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目５に記載の改変された細胞。
（項目７）
前記外因性核酸配列が、１または複数の組換え認識配列を含む、項目５または６に記載の改変された細胞。
（項目８）
前記外因性核酸配列が、少なくとも２つの組換え認識配列と、前記２つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含む、項目７に記載の改変された細胞。
（項目９）
前記１または複数の組換え認識配列が、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、項目７に記載の改変された細胞。
（項目１０）
前記外因性核酸配列が、前記発現増強性ヌクレオチド配列に作動可能に連結した少なくとも１つの外因性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む、項目５または６に記載の改変された細胞。
（項目１１）
前記少なくとも１つの外因性ＧＯＩが、ヒト遺伝子であり、前記ヒト遺伝子が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、項目１０に記載の改変された細胞。
（項目１２）
第１のＧＯＩの３’側に第２のＧＯＩをさらに含み、前記第２のＧＯＩが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、項目１１に記載の改変された細胞。
（項目１３）
前記第１のＧＯＩが抗体の軽鎖をコードし、前記第２のＧＯＩが抗体の重鎖をコードする、項目１２に記載の改変された細胞。
（項目１４）
抗体の軽鎖をコードする前記遺伝子の５’側に第１のリコンビナーゼ部位と、抗体の重鎖をコードする前記遺伝子に直接隣接し、かつ３’側にある第２のリコンビナーゼ部位とをさらに含む、項目１３に記載の改変された細胞。
（項目１５）
前記第１のリコンビナーゼ認識部位と前記第２のリコンビナーゼ認識部位とが異なり、前記第１および第２のリコンビナーゼ認識部位が、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、項目１４に記載の改変された細胞。
（項目１６）
ＣＨＯ細胞ゲノムを改変する方法であって、前記ＣＨＯ細胞中に、外因性配列を含むビヒクルを導入するステップを含み、前記外因性配列は、配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む前記ゲノムの遺伝子座中に組み込まれる、方法。
（項目１７）
目的のタンパク質を発現するようにＣＨＯ細胞ゲノムを改変する方法であって、ＣＨＯ細胞中に、前記目的のタンパク質の発現のための配列を含む外因性核酸を前記ＣＨＯ細胞のゲノム中に導入するためのビヒクルを導入するステップを含み、前記ビヒクルはベクターを含み、前記ベクターは、
ａ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な５’相同アーム、
ｂ．前記目的のタンパク質をコードする核酸、および
ｃ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な３’相同アーム
を含む、方法。
（項目１８）
前記ビヒクルが、少なくともさらなるベクターまたはｍＲＮＡ分子を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記さらなるベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ、インテグラーゼ基質ならびにプラスミドからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記５’相同アームが、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記３’相同アームが、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
目的のタンパク質を発現するようにＣＨＯ細胞ゲノムを改変するためのビヒクルであって、
ａ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同である５’相同アーム、
ｂ．前記目的のタンパク質をコードする核酸、および
ｃ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な３’相同アーム
を含むベクターを含むビヒクル。
（項目２３）
少なくともさらなるベクターまたはｍＲＮＡ分子を含む、項目２２に記載のビヒクル。
（項目２４）
前記さらなるベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、項目２３に記載のビヒクル。
（項目２５）
前記５’相同アームが、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、項目２２に記載のビヒクル。
（項目２６）
前記３’相同アームが、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、項目２２に記載のビヒクル。
（項目２７）
目的のタンパク質を作製するための方法であって、
ａ．細胞中に目的の遺伝子（ＧＯＩ）を導入するステップであって、前記ＧＯＩは、配列番号１または配列番号４の発現増強性配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む特異的遺伝子座中に組み込まれる、ステップ；
ｂ．（ａ）の細胞を、前記ＧＯＩの発現を可能にする条件下で培養するステップ；および
ｃ．前記目的のタンパク質を回収するステップ
を含む方法。
（項目２８）
前記ＧＯＩが、前記発現増強性配列に作動可能に連結し、少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位が、前記ＧＯＩと直接隣接する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ＧＯＩが、免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片、および受容体またはそのリガンド結合性断片から選択されるタンパク質をコードする、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫グロブリンが、抗体軽鎖もしくはその抗原結合性断片、抗体重鎖もしくはその抗原結合性断片、Ｆｃ融合タンパク質、またはＦｃ−受容体融合タンパク質から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位が、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、Ｌｏｘ２２７２部位、Ｌｏｘ２３７２部位、Ｌｏｘ５１７１部位、Ｌｏｘｍ２部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｌｏｘ６６部位、ＬｏｘＦａｓ部位およびｆｒｔ部位からなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＧＯＩが前記リコンビナーゼ認識部位に直接隣接し、かつ５’側にあり、そして前記ＧＯＩに直接隣接し、かつ３’側にある第２のリコンビナーゼ認識部位をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第２のリコンビナーゼ認識部位に直接隣接し、かつ３’側にある第２のＧＯＩをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第２のＧＯＩに直接隣接し、かつ３’側にある第３のリコンビナーゼ認識部位をさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第２のリコンビナーゼ認識部位と前記第２のＧＯＩとの間に少なくとも１つのマーカー遺伝子をさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、薬物耐性遺伝子および発現レポーター遺伝子からなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第１のＧＯＩに作動可能に連結したプロモーターおよび前記第２のＧＯＩに作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第２および前記第３のリコンビナーゼ認識部位が、前記第１のリコンビナーゼ認識部位と反対の配向である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記第１、第２および第３のリコンビナーゼ認識部位が異なる、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
目的のタンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）ＣＨＯ細胞中に、配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む発現増強性配列と、目的のタンパク質をコードする外因性ＧＯＩとを含む核酸構築物を導入するステップであって、前記ＧＯＩは、前記発現増強性配列に作動可能に連結している、ステップ；
（ｂ）（ａ）のＣＨＯ細胞を、前記ＧＯＩの発現を可能にする条件下で培養するステップ；および
（ｃ）前記目的のタンパク質を回収するステップ
を含む方法。
（項目４１）
前記ＧＯＩが、プロモーターに作動可能に連結している、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＧＯＩが、免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片をコードする、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＧＯＩが、抗体、受容体もしくはそのリガンド結合性断片、Ｆｃ−受容体融合タンパク質またはＦｃ融合タンパク質をコードする、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
認識配列が組み込まれるようにＣＨＯ細胞ゲノムを改変する方法であって、ＣＨＯ細胞中に、認識配列を含む外因性核酸を前記ＣＨＯ細胞のゲノム中に導入するためのビヒクルを導入するステップを含み、前記ビヒクルはベクターを含み、前記ベクターは、
ａ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な５’相同アーム、
ｂ．認識配列を含む外因性核酸、および
ｃ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な３’相同アーム
を含み、前記認識配列が、配列番号１または配列番号４に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する前記ゲノムの遺伝子座内に組み込まれる、方法。
（項目４５）
前記外因性核酸配列が、少なくとも２つの組換え認識配列と、前記２つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ビヒクルが、少なくともさらなるベクターまたはｍＲＮＡ分子を含む、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
前記さらなるベクターが、前記認識配列を組み込むための部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮダイマー、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質またはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
認識配列が組み込まれるようにＣＨＯ細胞ゲノムを改変するためのビヒクルであって、
ａ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な５’相同アーム、
ｂ．前記認識配列を含む核酸、および
ｃ．配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な３’相同アーム
を含むベクターを含む、ビヒクル。
（項目５０）
前記核酸が、少なくとも２つの組換え認識配列と、前記２つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含む、項目４９に記載のビヒクル。
（項目５１）
少なくともさらなるベクターまたはｍＲＮＡ分子を含む、項目４９または５０に記載のビヒクル。
（項目５２）
前記さらなるベクターが、前記認識配列を組み込むための部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、項目５１に記載のビヒクル。
（項目５３）
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮダイマー、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質またはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目５２に記載のビヒクル。
（項目５４）
前記５’相同アームが、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記認識配列を含む前記核酸と連続している、項目４９に記載のビヒクル。
（項目５５）
前記３’相同アームが、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記認識配列を含む前記核酸と連続している、項目４９に記載のビヒクル。