【手続補正書】
【提出日】平成30年2月13日(2018.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の標的領域におけるゲノム編集を有する細胞のライブラリーを生成する方法であって、該方法は、
（ａ）細胞を複数の合成されたオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドが、標的領域を標的化する配列をコードする核酸、該標的配列に対する配列の変化、および選択可能なマーカーを含む、ステップ；ならびに
（ｂ）該オリゴヌクレオチドに適合可能なヌクレアーゼを使用して該ゲノム編集を作製し、それによって、ゲノム編集を有する細胞のライブラリーを生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがバーコードをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ライブラリーの１つまたは複数の細胞の前記バーコードを配列決定し、それによって該１つまたは複数の細胞の前記ゲノム編集を特定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択可能なマーカーがＰＡＭ変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的領域を標的化する配列がガイドＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的領域を標的化する配列がキメラガイドＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的領域を標的化する配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が原核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ゲノム編集を有する細胞のライブラリーを生成する方法であって、該方法は、
（ａ）オリゴヌクレオチドのライブラリーを得るステップであって、該オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）標的領域を標的化する配列をコードする核酸、
（ｉｉ）該標的領域に対する配列の変化、および
（ｉｉｉ）選択可能なマーカー
を含む、ステップ；
（ｂ）該オリゴヌクレオチドのライブラリーを形質転換により細胞に導入するステップ；
（ｃ）該標的領域を標的化する配列をコードする核酸に適合するヌクレアーゼを使用して、形質転換された細胞を濃縮するステップ；ならびに
（ｄ）該濃縮した形質転換細胞を増殖させ、それによって、該ライブラリーを生成するステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
前記標的領域が非コード領域にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列の変化が、前記標的領域の少なくとも１つのコドンにある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択可能なマーカーが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が原核生物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が真核細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ライブラリーの細胞が、少なくとも２つの異なる標的領域において、配列の変化を有する細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ゲノム編集を有する細胞のライブラリーを生成する方法であって、該方法は、
（ａ）細胞を合成されたオリゴヌクレオチドのライブラリーと接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドが
（ｉ）核酸の標的領域および該標的領域に対する配列変異と相同である領域、
（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
（ｉｉｉ）バーコード、および
（ｉｖ）該標的領域を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的領域特異的標的化部分を少なくともコードする核酸
を含む、ステップ；
（ｂ）該標的領域に対する配列の変化、ＰＡＭ変異、および該バーコードを含む細胞について濃縮するステップ；ならびに
（ｃ）該細胞のライブラリーの１つまたは複数の細胞の該バーコードを配列決定して、それによって、該ライブラリーの細胞内の該配列の変化を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項１８】
前記細胞のライブラリーが、少なくとも１つの目的の遺伝子におけるゲノム編集を有する細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞のライブラリーが、少なくとも１つの目的の非コード領域におけるゲノム編集を有する細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記濃縮するステップが、前記ガイドＲＮＡに適合可能なヌクレアーゼを使用することを含む、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
記載される全ての実施形態において、変異は、１つもしくは複数の挿入、欠失、置換、または前述の２つもしくは３つの任意の組合せ（例えば、挿入および欠失；挿入および置換；欠失および置換；置換および挿入；挿入、欠失、および置換）などの任意の所望のタイプのものであり得る。挿入、欠失、および置換は、任意の数のヌクレオチドのものであり得る。それらは、コドン（コード領域）および／または非コード領域にあり得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、ベクターを含む細胞を生成するステップ、
（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で前記ベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または前記細胞のゲノム上にコードされ、前記ベクターを含み前記ＰＡＭ変異を含まない細胞ならびに前記ベクターおよび前記ＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、
（ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
（ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
を含む、ゲノムエンジニアリングの方法。
（項目２）
（ａ）（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
をコードするベクターを細胞の第１の集団に導入して、これにより、ベクターを含む細胞の第２の集団を生成するステップ、
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼが発現される条件下で細胞の前記第２の集団を維持するステップであって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター、第２のベクター、または細胞の前記第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、前記ＰＡＭ変異を含まない細胞におけるＤＮＡ切断およびかかる細胞の死をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
（ｄ）細胞の前記第２の集団の少なくとも１つの細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定することにより、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
を含む、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリングの方法。
（項目３）
編集オリゴヌクレオチドの集団を合成するおよび／または得るステップをさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
編集オリゴヌクレオチドの前記集団を増幅するステップをさらに含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ベクターが、スペーサーおよび／または少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記編集カセットが、前記ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内の少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
（ａ）（ｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する遺伝子（隣接遺伝子）における少なくとも１つのコドンの変異を有する第１の単一のＰＡＭの欠失と結合する、合理的に設計されたオリゴヌクレオチドなどの、１つまたは複数の編集オリゴヌクレオチド、および（ｂ）染色体のオープンリーディングフレームの５’にあるヌクレオチド配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、第１の細胞の集団に導入すること（それらにより第１の細胞の集団を共形質転換すること）により、プラスミド中に組換え染色体または組換えＤＮＡなどの組換えＤＮＡを含む、ドナーライブラリーを構築し、これにより、標的化されたコドン変異を有する組換え染色体を含む第１の細胞の集団を含むドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）前記編集オリゴ由来の合成特性を使用し、前記遺伝子の３’末端の第２のＰＡＭ欠失（最終ＰＡＭ欠失）を同時に取り込む組換えＤＮＡ（組換え染色体など）の増幅（ＰＣＲ増幅など）により、（ａ）において構築された前記ドナーライブラリーを回収し、これにより、標的化されたコドン変異を前記最終ＰＡＭ欠失に直接共有結合させ、前記最終ＰＡＭ欠失および標的化されたコドン変異を有する回収されたドナーライブラリーを生成するステップ、ならびに
（ｃ）前記最終ＰＡＭ欠失および標的化されたコドン変異を有する前記回収されたドナーライブラリー、ならびに最終ｇＲＮＡプラスミドを、ナイーブ細胞の集団に共形質転換し、これにより、標的化されたコドン変異を含む最終ライブラリーを生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（コンビナトリアルゲノムエンジニアリング）の方法。
（項目８）
タンパク質が生成される条件下で前記最終ライブラリーを維持するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
細胞の前記第１の集団が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１０）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞に存在する標的核酸に相補的である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記編集オリゴヌクレオチドの核酸配列が、前記標的核酸に対する１つまたは複数の置換、欠失、挿入を含む、項目７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記編集オリゴヌクレオチドが合理的に設計される、項目７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記編集オリゴヌクレオチドが、縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される、項目７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記編集オリゴヌクレオチドが、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する、項目７に記載の方法。
（項目１７）
前記ｇＲＮＡがプラスミド上にコードされる、項目７に記載の方法。
（項目１８）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、形質転換により前記第１の細胞に導入される、項目７に記載の方法。
（項目１９）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に順次導入される、項目７に記載の方法。
（項目２０）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に同時に導入される、項目７に記載の方法。
（項目２１）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、（ａ）前記編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）前記編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目２２）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、前記回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目２３）
前記最終細胞／ナイーブ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目７に記載の方法。
（項目２４）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）（ｉ）編集オリゴヌクレオチドを含む合成ｄｓＤＮＡ編集カセット、および（ｉｉ）目的の遺伝子のすぐ上流のゲノム配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターを、第１の細胞の集団に、前記編集オリゴヌクレオチドのｇＲＮＡによる多重リコンビニアリングおよび選択的濃縮が生じる条件下で導入し（共形質転換し）、これにより、ドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）目的の前記遺伝子の３’末端に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（最終ＰＡＭ）を欠失する、オリゴヌクレオチドを有する前記ドナーライブラリーを増幅し、これにより、３’ＰＡＭ欠失を有するｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、およびＰ１部位を含む増幅されたドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｃ）前記増幅されたドナーライブラリーを、ＢｓａＩで処理して、前記Ｐ１部位を取り除くステップ、ならびに
（ｄ）（ｃ）において生成された前記増幅されたドナーライブラリーおよび最終ｇＲＮＡで、ナイーブ細胞の集団を共形質転換し、これにより、３’ＰＡＭ欠失を有するｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、および最終ｇＲＮＡを含む、共形質転換された細胞の集団を生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリングの方法。
（項目２６）
（ｄ）において生成された共形質転換された細胞の前記集団を、タンパク質発現が生じる条件下で維持するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞に存在する標的核酸に相補的である、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記編集オリゴヌクレオチドの核酸配列が、前記標的核酸に対する１つまたは複数の置換、欠失、挿入を含む、項目２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記編集オリゴヌクレオチドが合理的に設計される、項目２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記編集オリゴヌクレオチドが、縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される、項目２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記編集オリゴヌクレオチドが、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する、項目２５に記載の方法。
（項目３５）
前記ｇＲＮＡがプラスミド上にコードされる、項目２５に記載の方法。
（項目３６）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、形質転換により前記第１の細胞に導入される、項目２５に記載の方法。
（項目３７）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、第１の細胞の前記集団に順次導入される、項目２５に記載の方法。
（項目３８）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に同時に導入される、項目２５に記載の方法。
（項目３９）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、（ａ）前記編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）前記編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目４０）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、前記回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目４１）
前記最終細胞／ナイーブ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目２５に記載の方法。
（項目４２）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同である領域を含み、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む編集カセット、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ベクター。
（項目４４）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同である領域を含み、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む編集カセット、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ベクター。
（項目４５）
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ベクター。
（項目４６）
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ベクター。
（項目４７）
スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む、項目４３〜４６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４８）
前記編集カセットが、前記ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内に少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む、項目４４、４６、または４７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４９）
項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞の集団を含む、ライブラリー。
（項目５０）
項目４３〜４８のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞の集団を含む、ライブラリー。
（項目５１）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含む、細胞の集団。
（項目５２）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含む、細胞の集団。
（項目５３）
（ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、前記ベクターを含む細胞を生成するステップ、
（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で前記ベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または前記細胞のゲノム上にコードされ、前記ベクターを含み前記ＰＡＭ変異を含まない細胞ならびに前記ベクターおよび前記ＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、
（ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
（ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
を含む、ゲノムエンジニアリングの方法。