【手続補正書】
【提出日】平成30年7月6日(2018.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性ヒトベータ−ヘモグロビン（Ｈｂｂ）遺伝子の配列番号２３または配列番号２４にまたはその付近にゲノム改変を含む、遺伝子改変された細胞であって、前記ゲノム改変が、挿入、欠失およびこれらの組合せからなる群から選択される、遺伝子改変された細胞。
【請求項２】
幹細胞である、請求項１に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３】
前記幹細胞が、造血幹細胞である、請求項２に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項３に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の幹細胞に由来する遺伝子改変された分化細胞。
【請求項６】
赤血球細胞（ＲＢＣ）である、請求項５に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項７】
前記遺伝子改変が、ヌクレアーゼを使用してなされる、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項７に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含み、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、認識ヘリックスを含む５または６個のジンクフィンガードメインを含み、さらに、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１の単一の行に示す順序で前記認識ヘリックス領域を含む、請求項８に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項１０】
前記挿入が、導入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組込みを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項１１】
前記ドナーポリヌクレオチドが、鎌状赤血球変異を補正する、請求項１０に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物。
【請求項１３】
認識ヘリックス領域を含む５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、表１の単一の行に示す順序で前記認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガータンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型または操作された開裂ハーフドメインとを含む融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の１種または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４に記載の１種もしくは複数の融合タンパク質または請求項１５に記載の１種もしくは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
【請求項１７】
赤血球細胞（ＲＢＣ）または前駆体細胞（例えば、ＣＤ４＋造血幹細胞）からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
ｉ）請求項１５に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはｉｉ）請求項１３もしくは請求項１４に記載のタンパク質のうち少なくとも１種を含むキット。
【請求項１９】
細胞におけるＨｂｂ発現を変更するインビトロの方法であって、
請求項１５に記載の１種または複数のポリヌクレオチドを、１種または複数のタンパク質が発現され、Ｈｂｂ遺伝子の発現が変更されるような条件下で、前記細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記Ｈｂｂ遺伝子の発現が増加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞のゲノムにドナー配列を組み込むステップをさらに含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、赤血球細胞（ＲＢＣ）前駆体細胞および造血幹細胞からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ドナー配列が、前記Ｈｂｂ遺伝子のｍＲＮＡプロセシングのためのスプライスドナー部位を変更する変異を補正するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
内在性Ｈｂｂ遺伝子内にゲノム改変を含む遺伝子改変された細胞を産生するインビトロの方法であって、
ａ）請求項１４に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと細胞を接触させるステップと、
ｂ）前記ポリヌクレオチドからの前記融合タンパク質の発現を促進する条件に前記細胞を供するステップと、
ｃ）前記遺伝子改変された細胞の産生に十分な発現された前記融合タンパク質により前記内在性Ｈｂｂ遺伝子を改変するステップと
を含む、方法。
【請求項２５】
少なくとも１種のサイトカインで前記細胞を刺激するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
β−サラセミアを有する患者を処置するための請求項１２に記載の医薬組成物であって、前記患者におけるＨｂｂ遺伝子発現を増加させるのに十分な量で投与されることを特徴とする、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
上述および他の態様は、開示を全体として踏まえることにより、当業者であれば容易に明らかとなるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
内在性ヒトベータ−ヘモグロビン（Ｈｂｂ）遺伝子の配列番号２３または配列番号２４にまたはその付近にゲノム改変を含む、遺伝子改変された細胞であって、前記ゲノム改変が、挿入、欠失およびこれらの組合せからなる群から選択される、遺伝子改変された細胞。
（項目２）
幹細胞である、項目１に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目３）
前記幹細胞が、造血幹細胞である、項目２に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目４）
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、項目３に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載の幹細胞に由来する遺伝子改変された分化細胞。
（項目６）
赤血球細胞（ＲＢＣ）である、項目５に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７）
前記遺伝子改変が、ヌクレアーゼを使用してなされる、項目１〜６のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、項目７に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含み、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、認識ヘリックスを含む５または６個のジンクフィンガードメインを含み、さらに、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１の単一の行に示す順序で前記認識ヘリックス領域を含む、項目８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１０）
前記挿入が、導入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組込みを含む、項目１〜９のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１）
前記ドナーポリヌクレオチドが、鎌状赤血球変異を補正する、項目１０に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物。
（項目１３）
認識ヘリックス領域を含む５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、表１の単一の行に示す順序で前記認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガータンパク質。
（項目１４）
項目１３に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型または操作された開裂ハーフドメインとを含む融合タンパク質。
（項目１５）
項目１３または項目１４に記載の１種または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目１６）
項目１４に記載の１種もしくは複数の融合タンパク質または項目１５に記載の１種もしくは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
（項目１７）
赤血球細胞（ＲＢＣ）または前駆体細胞（例えば、ＣＤ４＋造血幹細胞）からなる群から選択される、項目１６に記載の細胞。
（項目１８）
ｉ）項目１５に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはｉｉ）項目１３もしくは項目１４に記載のタンパク質のうち少なくとも１種を含むキット。
（項目１９）
細胞におけるＨｂｂ発現を変更する方法であって、
項目１５に記載の１種または複数のポリヌクレオチドを、１種または複数のタンパク質が発現され、Ｈｂｂ遺伝子の発現が変更されるような条件下で、前記細胞に導入するステップを含む、方法。
（項目２０）
前記Ｈｂｂ遺伝子の発現が増加される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞のゲノムにドナー配列を組み込むステップをさらに含む、項目１９または項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、赤血球細胞（ＲＢＣ）前駆体細胞および造血幹細胞からなる群から選択される、項目１９〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記ドナー配列が、前記Ｈｂｂ遺伝子のｍＲＮＡプロセシングのためのスプライスドナー部位を変更する変異を補正するオリゴヌクレオチドを含む、項目１９〜２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
内在性Ｈｂｂ遺伝子内にゲノム改変を含む遺伝子改変された細胞を産生する方法であって、
ａ）項目１４に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと細胞を接触させるステップと、
ｂ）前記ポリヌクレオチドからの前記融合タンパク質の発現を促進する条件に前記細胞を供するステップと、
ｃ）前記遺伝子改変された細胞の産生に十分な発現された前記融合タンパク質により前記内在性Ｈｂｂ遺伝子を改変するステップと
を含む、方法。
（項目２５）
少なくとも１種のサイトカインで前記細胞を刺激するステップをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
β−サラセミアを有する患者を処置する方法であって、前記患者におけるＨｂｂ遺伝子発現を増加させるのに十分な量の項目１２に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。