【手続補正書】
【提出日】平成30年3月16日(2018.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、標的基質のマルチプレックスＰＣＲベース濃縮の方法。
（ｉ）複数のポリメラーゼ鎖反応成分を、核酸基質を含む試料に導入し、ＰＣＲ反応混合物を提供するステップであって、
前記複数のポリメラーゼ鎖反応成分が、前記核酸基質の複数の異なる遺伝子座を増幅させるための複数の異なる標的特異的プライマー対、ユニバーサルプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを含み、
前記複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれが、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーが、前記核酸基質の第１の配列及び前記核酸基質の第２の配列にそれぞれ相補的である３’相補性配列を含み、
前記第１の配列及び第２の配列が、前記複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれに対して異なり、
前記複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれの前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーが、前記核酸基質に相補的でない５’末端配列をさらに含み、前記５’末端配列が、ユニバーサルアダプター配列を含み、
前記ユニバーサルプライマーが、修飾ユニバーサルアダプター配列を含み、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列が、修飾塩基を保有し、
前記修飾塩基が、エンドヌクレアーゼによる前記ユニバーサルプライマーの切断を標的化し、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列及び前記ユニバーサルアダプター配列が、共通の配列に相補的であり、かつ
前記ユニバーサルプライマーの最終濃度が、前記ＰＣＲ反応混合物中で、前記複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれの最終濃度を超える、ステップ；
（ii）前記ＰＣＲ反応混合物を、第１のアニーリング時間のための第１のアニーリング温度を含む少なくとも２つの初期のＰＣＲサイクルに露出して、複数の異なる標的特異的アンプリコンを産出するステップであって、
前記複数の異なる標的特異的アンプリコンのそれぞれが、その５’末端領域に前記５’末端配列を含む、ステップ；
（iii）前記ＰＣＲ反応混合物を適切な数の追加のＰＣＲサイクルに露出し、前記複数の異なる標的特異的アンプリコンをさらに増幅するステップであって、
前記追加のＰＣＲサイクルが、第２のアニーリング時間のための第１のアニーリング温度を含み、前記第１のアニーリング時間が、前記第２のアニーリング時間より長い、ステップ；
【請求項２】
複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか、又は両方が、その５’末端配列に縮重配列をさらに含み、前記縮重配列が、３’相補配列とユニバーサルアダプター配列との間に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾塩基が、デオキシウリジン、ＲＮＡ、デオキシイノシン、又はイノシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼが、修飾塩基に忍容性がある高忠実度ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ユニバーサルプライマーが、その３’末端にヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレアーゼ耐性修飾が、ホスホロチオエート連結である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、その３’末端にヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれの、ユニバーサルプライマーに対するモル比が、少なくとも１：１００である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数の異なる標的特異的アンプリコンが、第１の標的特異的アンプリコン及び第２の標的特異的アンプリコンを含み、前記第１の標的特異的アンプリコンが、前記第２の標的特異的アンプリコンと重複する領域と、前記第２の標的特異的アンプリコンと重複しない領域とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数の異なる標的特異的アンプリコンの少なくとも１つが、他の２つの前記複数の異なる標的特異的アンプリコンと重複する２つの領域と、前記複数の異なる標的特異的アンプリコンのいずれとも重複しない領域とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１のアニーリング時間が、５分以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第２のアニーリング時間が、１分以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ii）が、２つのＰＣＲサイクルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ii）が、少なくとも４つのＰＣＲサイクルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（iii）が、１〜４０のＰＣＲサイクルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（iv）ＰＣＲ混合物から、複数の異なる標的特異的アンプリコンを精製し、精製された標的特異的アンプリコン試料を産出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
以下のステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
（ｖ）リガーゼ、５’アダプター、３’アダプター、５’flapエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、及びエンドヌクレアーゼを、精製された標的特異的アンプリコン試料に適用するステップであって、前記５’アダプターが、ユニバーサルアダプター配列の３’部分と同一である３’配列を含み、前記５’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない５’部分をさらに含み、前記３’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列の５’部分と同一である配列を含み、かつ前記３’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない３’部分をさらに含む、ステップ；及び
（vi）以下の（ａ）〜（ｃ）が可能となるように十分な条件下で、ステップ（iv）における精製された標的特異的アンプリコン試料をインキュベートするステップ；
（ａ）前記複数の異なる標的特異的アンプリコンに存在する修飾塩基を含む前記ユニバーサルプライマーの切断；
（ｂ）前記５’アダプター及び３’アダプターの、前記複数の異なる標的特異的アンプリコンそれぞれへのアニーリング；及び
（ｃ）エンドヌクレアーゼの消化の結果、前記ユニバーサルプライマーの残存する塩基がもたらされた場合にflapエンドヌクレアーゼ切断後に、前記５’アダプター及び３’アダプターの前記複数の異なる標的特異的アンプリコンそれぞれへのライゲーション；
【請求項１８】
十分な条件が、３７度で少なくとも１０分を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
エンドヌクレアーゼが、ＵＤＧプラスエンドヌクレアーゼVIII、ＲＮアーゼ  ＨＩ、ＲＮアーゼ  Ｈ２、及びエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップを含む、シークエンシングライブラリを作製する方法。
(ｉ)複数のポリメラーゼ鎖反応成分を、核酸基質を含む試料に導入し、ＰＣＲ反応混合物を提供するステップであって、
前記複数のポリメラーゼ鎖反応成分が、標的特異的プライマー対、ユニバーサルプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを含み、
前記標的特異的プライマー対のフォワードプライマー及びリバースプライマーが、前記核酸基質の第１の配列及び前記核酸基質の第２の配列にそれぞれ相補的な３’相補性配列を含み、
前記標的特異的プライマー対のそれぞれのプライマーが、前記核酸基質に相補的でない５’末端配列を含み、
前記５’末端配列が、ユニバーサルアダプター配列を含み、
前記ユニバーサルプライマーが、修飾ユニバーサルアダプター配列を含み、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列が、修飾塩基を保有し、
前記修飾塩基が、エンドヌクレアーゼによる前記ユニバーサルプライマーの切断を標的化し、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列及び前記ユニバーサルアダプター配列が、共通の配列に相補的であり、
前記ユニバーサルプライマーの最終濃度が、前記ＰＣＲ反応混合物中で、前記標的特異的プライマー対の最終濃度を超える、ステップ；
（ii）前記ＰＣＲ反応混合物を、第１のアニーリング時間のための第１のアニーリング温度を含む少なくとも２つの最初のＰＣＲサイクルに露出して、その５’末端領域に５’末端配列を含む、標的特異的アンプリコンのセットを産出するステップ；
（iii）前記ＰＣＲ反応混合物を、前記標的特異的アンプリコンのセットをさらに増幅するのに十分な適切な数の追加のＰＣＲサイクルに露出するステップであって、前記追加のＰＣＲサイクルが、第２のアニーリング時間のための第１のアニーリング温度を含み、
前記第１のアニーリング時間が、前記２のアニーリング時間より長い、ステップ；
（iv）リガーゼ、５’アダプター、３’アダプター、５’flapエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素及びエンドヌクレアーゼを、ステップ（iii）の後、前記ＰＣＲ反応混合物から精製された前記標的特異的アンプリコンのセットを含む第２の試料に適用するステップであって、
前記５’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列の３’部分と同一の３’配列を含み、
前記５’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない５’部分をさらに含み、
前記３’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列の５’部分と同一の配列を含み、及び
前記３’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない３’部分をさらに含む、ステップ；及び
（ｖ）以下の（ａ）〜（ｃ）が可能となるように十分な条件下で、ステップ（iv）における第２の試料をインキュベートするステップ；
（ａ）前記標的特異的アンプリコンのセットに存在する修飾塩基を含む前記ユニバーサルプライマーの切断；
（ｂ）前記５’アダプター及び３’アダプターの、前記標的特異的アンプリコンのセットのそれぞれへのアニーリング；及び
（ｃ）前記エンドヌクレアーゼの消化の結果、前記ユニバーサルプライマーの残存する塩基がもたらされた場合、flapエンドヌクレアーゼ切断後に前記５’アダプター及び３’アダプターの前記標的特異的アンプリコンのセットのそれぞれへのライゲーション；
【請求項２１】
フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む標的特異的プライマー対であって、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ核酸基質の第１の配列及び第２の配列それぞれに相補的な３’相補性配列、及び前記核酸基質に相補的でない５’末端配列を含み、前記５’末端配列がユニバーサルアダプター配列を含む、前記標的特異的プライマー対；と、
ユニバーサルプライマーであって、前記ユニバーサルプライマーが、修飾ユニバーサルアダプター配列を含み、前記修飾ユニバーサルアダプター配列が、修飾塩基を保有し、前記修飾塩基が、エンドヌクレアーゼによる前記ユニバーサルプライマーの切断を標的化し、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列及び前記ユニバーサルアダプター配列が、共通の配列に相補的である、前記ユニバーサルプライマー；と、
ｄＮＴＰ；と、
前記核酸基質を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼ；と、
前記修飾塩基を含む前記ユニバーサルプライマーを切断するためのエンドヌクレアーゼ；と、
第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、及び二本鎖部分を含む３’アダプターポリヌクレオチドであって、前記二本鎖部分が、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記３’アダプターポリヌクレオチドが、前記ユニバーサルアダプター配列の５’部分と同一の配列を含み、及び前記３’アダプターポリヌクレオチドが前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない３’部分をさらに含む、前記３’アダプターポリヌクレオチド；と、
前記ユニバーサルアダプター配列の３’部分と同一である３’配列を含む５’アダプターポリヌクレオチドであって、前記５’アダプターポリヌクレオチドが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない５’部分をさらに含む、前記５’アダプターポリヌクレオチド；と、
前記ユニバーサルプライマーの残存する塩基を切断するための５’flapエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素；と、
前記３’アダプターポリヌクレオチドを標的特異的アンプリコンの３’末端にライゲーションし、前記５’アダプターポリヌクレオチドを前記標的特異的アンプリコンの５’末端にライゲーションするための、リガーゼ；と
を含む、シークエンシングライブラリを作製するためのポリメラーゼ鎖反応系。
【請求項２２】
以下のステップを含む、標的基質のＰＣＲベース濃縮の方法。
（ｉ）複数のポリメラーゼ鎖反応成分を、核酸基質を含む試料に導入し、ＰＣＲ反応混合物を提供するステップであって、
前記複数のポリメラーゼ鎖反応成分が、前記核酸基質を増幅するための標的特異的プライマー対、ユニバーサルプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを含み、前記標的特異的プライマー対が、フォワードプライマーとリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーが、前記核酸基質の第１の配列と前記核酸基質の第２の配列にそれぞれ相補的な３’相補性配列を含み、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーが、それぞれ前記核酸基質に相補的でない５’末端配列をさらに含み、
前記５’末端配列が、ユニバーサルアダプター配列を含み、
前記ユニバーサルプライマーが、修飾ユニバーサルアダプター配列を含み、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列が、修飾塩基を保有し、
前記修飾塩基が、エンドヌクレアーゼによる前記ユニバーサルプライマーの切断を標的化し、
前記修飾ユニバーサルアダプター配列及び前記ユニバーサルアダプター配列が、共通の配列に相補的である、ステップ；
（ii）前記ＰＣＲ反応混合物を、第１のアニーリング時間のための第１のアニーリング温度を含む少なくとも２つの最初のＰＣＲサイクルに露出させ、その５’末端領域に５’末端配列を含む、標的特異的アンプリコンのセットを作製するステップ；
（iii）前記ＰＣＲ反応混合物を、前記標的特異的アンプリコンをさらに増幅するのに適切な数の追加のＰＣＲサイクルに露出するステップ；
【請求項２３】
ユニバーサルプライマーの最終濃度が、ＰＣＲ反応混合物中で、複数の異なる標的特異的プライマー対のそれぞれの最終濃度を超える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
追加のＰＣＲサイクルが、第２のアニーリング時間のための第１のアニーリング温度を含み、第１のアニーリング時間が、前記第２のアニーリング時間より長い、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
修飾塩基が、デオキシウリジン、ＲＮＡ、デオキシイノシン、又はイノシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
（iv）標的特異的アンプリコンをＰＣＲ混合物から精製し、精製された標的特異的アンプリコン試料を産出するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
以下のステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
（ｖ）リガーゼ、５’アダプター、３’アダプター、５’flapエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、及びエンドヌクレアーゼを、精製された標的特異的アンプリコン試料に適用するステップであって、
前記５’アダプターが、ユニバーサルアダプター配列の３’部分と同一である３’配列を含み、前記５’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない５’部分をさらに含み、前記３’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列の５’部分と同一である配列を含み、かつ前記３’アダプターが、前記ユニバーサルアダプター配列に存在しない３’部分をさらに含むステップ；及び
（vi）以下の（ａ）〜（ｃ）が可能となるのに十分な条件下で、ステップ（iv）における精製された標的特異的アンプリコン試料をインキュベートするステップ；
（ａ）前記複数の異なる標的特異的アンプリコンに存在する修飾塩基を含む前記ユニバーサルプライマーの切断；
（ｂ）前記５’アダプター及び３’アダプターの、前記複数の異なる標的特異的アンプリコンそれぞれへのアニーリング；及び
（ｃ）エンドヌクレアーゼの消化の結果、前記ユニバーサルプライマーの残存する塩基がもたらされた場合、flapエンドヌクレアーゼ切断後に前記５’アダプター及び３’アダプターの前記複数の異なる標的特異的アンプリコンそれぞれへのライゲーション；
【請求項２８】
第２の標的特異的アンプリコンが、安定な第２の構造を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項２９】
以下のステップを含む、標的核酸基質のマルチプレックスＰＣＲ増幅の方法。
（ｉ）複数の標的特異的プライマーを、前記標的核酸基質と組み合わせて、単一のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）反応混合物を産出するステップであって、
前記複数の標的特異的プライマーが、第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、前記第１及び第２のフォワード及びリバースプライマーのそれぞれが、前記標的核酸基質に相補的な３’相補性配列、及び前記核酸基質に相補的でない５’非相補性配列を含み、前記第１及び第２のフォワード及びリバースプライマーのそれぞれの前記３’相補性配列が異なる、ステップ；
（ii）前記ＰＣＲ反応混合物をマルチプレックスポリメラーゼ鎖反応に供し、それにより少なくとも３つのアンプリコンを作製するステップであって、前記少なくとも３つのアンプリコンが、前記第１のフォワードプライマー及び前記第１のリバースプライマーによって産生された第１のアンプリコン、前記第２のフォワードプライマー及び前記第２のリバースプライマーによって産生された第２のアンプリコン、前記第２のフォワードプライマー及び前記第１のリバースプライマーによって産生された第３のアンプリコンを含み、前記第３のアンプリコンが、前記第１及び第２のアンプリコンと重複する配列を保有し、前記第１のアンプリコンが、前記第２のアンプリコンと重複する配列を保有し、前記第３のアンプリコンが、前記マルチプレックスポリメラーゼ鎖反応のプライマーアニーリングステップ中に安定である第２の構造を形成する、ステップ；
【請求項３０】
少なくとも３つのアンプリコンが、第１のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーによって産生される第４のアンプリコンをさらに含み、前記第４のアンプリコンが、第１、第２、及び第３のアンプリコンと重複する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第３のアンプリコンの３’末端及び５’末端が相補的であり、それにより第２の構造を形成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
以下のステップを含む、標的核酸基質のマルチプレックスＰＣＲ増幅のためのＰＣＲ反応混合物を調製する方法。
複数の標的特異的プライマーを、標的核酸基質と組み合わせて、単一ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）反応混合物を産出するステップであって、
前記複数の標的特異的プライマーが、第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、前記第１及び第２のフォワード及びリバースプライマーのそれぞれが、前記標的核酸基質に相補的な３’相補性配列、及び前記標的核酸基質に相補的でない５’非相補性配列を含み、
前記第１及び第２のフォワード及びリバースプライマーのそれぞれの３’相補性配列が異なり、
前記標的特異的プライマーが、前記核酸基質の少なくとも３つのアンプリコンを産生することが可能なように設計され、
前記少なくとも３つのアンプリコンが、前記第１のフォワードプライマー及び前記第１のリバースプライマーによって産生された第１のアンプリコン、前記第２のフォワードプライマー及び前記第２のリバースプライマーによって産生された第２のアンプリコン、及び前記第２のフォワードプライマー及び前記第１のリバースプライマーによって生産された第３のアンプリコンを含み、
前記第３のアンプリコンが、前記第１及び第２のアンプリコンと重複する配列を保有し、
前記第１のアンプリコンが、前記第２のアンプリコンと重複する配列を保有し、
前記第３のアンプリコンが、マルチプレックスポリメラーゼ鎖反応のプライマーアニーリングステップ中に安定である第２の構造を形成する、ステップ；
【請求項３３】
少なくとも３つのアンプリコンが、第１のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーによって産生された第４のアンプリコンをさらに含み、前記第４のアンプリコンが、第１、第２、及び第３のアンプリコンと重複する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第３のアンプリコンの３’末端及び５’末端が相補的であり、それによって第２の構造を形成する、請求項３２に記載の方法。