(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝癌に罹患した被験者の予測生存転帰を生成するための方法であって、
上記被験者から採取した、肝細胞癌または胆管癌のうちの１つの組織試料を準備する工程と、
準備された上記試料における、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）および上皮細胞形質転換２（ＥＣＴ２）のトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を定量するために、少なくとも１つの、核酸に基づくアッセイおよび／またはプロテオミクスに基づくアッセイを行う工程と、
準備された上記試料上の特定の領域における、ＰＬＫ１またはＥＣＴ２の個々の発現レベルに基づき、またはＰＬＫ１およびＥＣＴ２の相対的発現を使用して、上記被験者の上記予測生存転帰を生成する工程であって；
（ａ）カットオフとして発現レベルの中央値を使用した場合、上記被験者のＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現レベルが低いグループである、および／または、
（ｂ）上記被験者のＰＬＫ１およびＥＣＴ２の相対的発現が、０．００１〜１の範囲内である所定の値未満である、
場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、
（ａ）カットオフとして発現レベルの中央値を使用した場合、上記被験者のＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現レベルが高いグループである、および／または、
（ｂ）上記被験者のＰＬＫ１およびＥＣＴ２の相対的発現が、０．００１〜１の範囲内である所定の値以上である、
場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第２の予測生存転帰とする工程とを含み、
上記第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、上記第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する方法。
【請求項２】
上記所定の期間は、１２〜３６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記核酸に基づくアッセイは、マイクロアレイに基づいた技術およびポリメラーゼ連鎖反応に基づいた技術のいずれか１つまたは組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記プロテオミクスに基づくアッセイは、組織マイクロアレイおよび／または免疫組織化学染色である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験者は、アジア系である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
肝癌に罹患した被験者の予測生存転帰を生成するための装置であって、
上記被験者の組織試料におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）および上皮細胞形質転換２（ＥＣＴ２）のトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を検出することができる第１のモジュールと、
準備された上記試料上の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率を導出し、導出された上記比率に基づき、上記被験者の上記予測生存転帰を生成するように構成された第２のモジュールとを備え、
上記第２のモジュールは、
（ａ）カットオフとして発現レベルの中央値を使用した場合、上記被験者のＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現レベルが低いグループである、および／または、
（ｂ）上記被験者のＰＬＫ１およびＥＣＴ２の相対的発現が、０．００１〜１の範囲内である所定の値未満である、
場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、または、
（ａ）カットオフとして発現レベルの中央値を使用した場合、上記被験者のＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現レベルが高いグループである、および／または、
（ｂ）上記被験者のＰＬＫ１およびＥＣＴ２の相対的発現が、０．００１〜１の範囲内である所定の値以上である、
場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第２の予測生存転帰とするように構成され、
上記第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、上記第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する装置。
【請求項７】
ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の発現されたトランスクリプトームまたはタンパク質と、上記第１のモジュールによって分離可能なシグナルを連続的または周期的に発するように形成されたシグナル伝達部分とを結合させるための、少なくとも１つの、核酸に基づくアッセイまたはプロテオミクスに基づくアッセイを行うことができる試験モジュールをさらに備える、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
上記所定の期間は、１２〜３６ヶ月である、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
上記核酸に基づくアッセイは、マイクロアレイに基づいた技術およびポリメラーゼ連鎖反応に基づいた技術のいずれか１つまたは組み合わせである、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
上記プロテオミクスに基づくアッセイは、組織マイクロアレイおよび／または免疫組織化学染色である、請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
上記被験者はアジア系である、請求項６に記載の装置。
【請求項１２】
上記被験者の上記組織試料は、癌腫であり、肝細胞癌または胆管癌のうちの１つである、請求項６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、肝癌に罹患している被験者の予測生存転帰を生成するための方法に関する。より詳細には、予測生存転帰は、被験者から得られた癌腫組織試料において示される、２つの遺伝子またはタンパク質（具体的に、ポロ様キナーゼ１（ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １；ＰＬＫ１）および上皮細胞形質転換２（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ２；ＥＣＴ２））の発現プロファイルに基づいて生成される。本開示はまた、開示された方法によって予測生存転帰を生成するために構成された装置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
原発性肝癌は、組織学的に異なる２つの主要なサブタイプ、すなわち、肝細胞癌（ＨＣＣ）および肝内胆管癌（ＣＣＡ）があり、それらの診断および治療は、それらのベースラインの臨床的特徴に基づいて独特に決定される。ＨＣＣまたはＣＣＡの広範な腫瘍の不均一性は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、寄生虫感染、および化学的発癌物質などの環境因子を含む複雑な多因子性病因の存在に起因する。他の危険因子として、性別および人種／民族の差異（肝癌は主に男性が罹患し、アジア人集団において罹患率が高い）（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｏｂｏｃａｎ．ｉａｒｃ．ｆｒ／）に加えて、喫煙、過度の飲酒および食事要因３などの不健康な生活習慣が挙げられる。ＨＢＶおよびＨＣＶはＨＣＣの主要な病因的因子であり、世界的に９０％までの肝癌の原因である。一方、ＣＣＡは、タイ北東部などの東南アジアを除いてまれであるが、例えば、タイ北東部では、肝吸虫（Ｏ．ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）による感染が風土病であり、肝臓癌の約６０％がＣＣＡ４である。これらのグローバルな差異は、異なる民族グループ間の異なる病因的因子の存在に起因する可能性がある。１つの仮説によれば、種々の原因因子が異なる分子メカニズムを誘発して、悪性形質転換を独立して開始し得、その結果、腫瘍間のゲノム不均一性が生じる。他の多くの固形癌と同様に、ここに記載のＨＣＣおよびＣＣＡのそれぞれの型における生物学的不均一性および遺伝的不均一性は、治療に対して高い耐性をこれらの癌にもたらし、世界で２番目に致死率の高い悪性腫瘍としている１，２。従って、癌の発達の駆動（ｄｒｉｖｉｎｇ）において発現する、基礎をなす遺伝子またはタンパク質を特定し、特定された癌ドライバー（ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｉｖｅｒ）に基づいて患者をより良好に層別化し、精密医療による治療を容易にするための努力がなされている。
【０００３】
例えば、Ｃｈｅｎら４５は、早期のＨＣＣ再発の促進において、ＥＣＴ２の発現がＲｈｏ／ＥＲＫシグナル軸（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｘｉｓ）の活性化と密接に関連していることを見出した。また、Ｓｕｎら４６は、ＰＬＫ１という別の遺伝子が、ＨＣＣサンプルにおいて有意に高く発現され、ＨＣＣについての独立した予後因子であり得、診断および治療に適用できることを実証した。Ｔａｋａｉら４７は、Ｓｕｎら４６の研究結果を裏付ける論文において、同様の結論を引き出した。さらに、肝癌とＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現との関連性が立証されたことを活かすいくつかの診断手段または予後手段が研究者によって考案されている。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３１１９２８０号は、ＰＬＫ１を含む複数の遺伝子マーカーをスキャンすることによるＨＣＣ診断のためのＤＮＡバイオチップを開示する。前述のアプローチのほとんどは、候補遺伝子または候補タンパク質間の相関に基づいて生成された詳細な情報に相関する癌予後ではなく、候補遺伝子または候補タンパク質の個々の発現に相関する癌予後を中心としたものであるが、複数の発現された候補遺伝子の相互関係に基づく診断結果の導出は、他の癌型に関するいくつかの出版物において提案されている。Ｓｏｍｍａらの米国特許公開第２０１２／０１９７５４０号は、乳癌患者の組織サンプルにおける、ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の両方を含む複数の遺伝子の発現レベルを測定することによって、乳癌患者の死亡リスクを予測する方法を提供する。この方法は続いて、測定された遺伝子発現レベルの各々を用いて、所定のアルゴリズムによって、被験者の死亡リスクを示す予後スコアを計算する。しかし、肝癌の予後または診断のために、共発現された遺伝子またはタンパク質の相互関係を利用する類似の方法またはプラットフォームは開示されていない。このような方法またはプラットフォームから得られる予後転帰は、治療結果または医療資源の割り当ての向上に適用可能であると考えられる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、被験者から得られた組織試料または組織サンプルにおけるＰＬＫ１およびＥＣＴ２の発現を測定または定量するための方法に関する。特に、本明細書に記載される発現は、試料におけるトランスクリプトーム発現またはタンパク質発現の少なくとも一方を指すことができる。好ましくは、組織サンプルはＨＣＣまたはＣＣＡに罹患したものである。
【０００５】
本開示の目的の一つは、組織試料における、測定または定量されたＰＬＫ１の発現およびＥＣＴ２の発現を用いて、ＨＣＣまたはＣＣＡに罹患した被験者についての予後結果または診断結果を生成するための方法を提供することである。予後結果または診断結果は一般に、被験者の予測生存転帰または死亡リスクに関連する。予後結果または診断結果は、精密医療を実施するために医師によって参照され得る。
【０００６】
本開示のさらなる目的は、好ましくは全自動的または半自動的に、ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の発現を定量し、その後、肝臓癌に罹患した被験者の病状に関する予後結果または診断結果を生成するように構成される装置を提供することである。
【０００７】
前述の目的のうちの少なくとも１つは本発明によって全体的または部分的に達成することができる。本発明の実施形態のうちの１つは肝癌に罹患した被験者の予測生存転帰を生成するための方法を含み、上記方法は、上記被験者から採取した、肝細胞癌もしくは胆管癌のうちの１つを含む組織試料、または肝細胞癌もしくは胆管癌のうちの１つである組織試料を準備する工程と、準備された上記試料における、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）および上皮細胞形質転換２（ＥＣＴ２）のトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を定量するために、少なくとも１つの、核酸に基づくアッセイおよび／またはプロテオミクに基づくアッセイを行う工程と、準備された上記試料の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率を導出する工程と、導出された上記比率に基づき、上記被験者の上記予測生存転帰を生成する工程であって、導出された上記比率が所定の値未満である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、導出された上記比率が上記所定の値以上である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第２の予測生存転帰とする工程とを含む。より具体的には、上記第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、上記第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する。典型的にはまたは好ましくは、上記所定の期間は１２ヶ月〜３６ヶ月であるが、これに限定されない。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記核酸に基づくアッセイは、マイクロアレイに基づいた技術およびポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲを含む）に基づいた技術のいずれか１つまたは組み合わせである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記プロテオミクスに基づくアッセイは、組織マイクロアレイのセットおよびヒト組織の免疫組織化学染色を含むか、または組織マイクロアレイのセットおよびヒト組織の免疫組織化学染色である。
【００１０】
本開示の別の態様において、肝癌に罹患した被験者の予測生存転帰を生成するための装置が開示される。この装置は、上記被験者の組織試料におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）および上皮細胞形質転換２（ＥＣＴ２）のトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を特定、検出、または決定することができる第１のモジュールと、準備された上記試料上の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率を導出し、導出された上記比率に基づき、上記被験者の上記予測生存転帰を生成するように構成された第２のモジュールとを備え、上記第２のモジュールは、導出された上記比率が所定の値未満である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、導出された上記比率が上記所定の値以上である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第２の予測生存転帰とするように構成される。より具体的には、上記第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％を超える全生存率に対応し、上記第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％以下の全生存率に対応する。典型的には、または好ましくは、上記核酸に基づくアッセイは、マイクロアレイに基づいた技術（マイクロアレイなど）およびポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲを含む）に基づいた技術のいずれか１つまたは組み合わせを指すことができる。また、上記プロテオミクスに基づくアッセイは、組織マイクロアレイおよびヒト組織の免疫組織化学染色であり得る。
【００１１】
複数の実施形態について、開示された装置は、ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の発現されたトランスクリプトームまたはタンパク質と、上記第１のモジュールによって分離可能なシグナルを連続的または周期的に発するように形成されたシグナル伝達部分とを結合させるための、少なくとも１つの、核酸に基づくアッセイまたはプロテオミクスに基づくアッセイを行うことができる試験モジュールをさらに備える。
【００１２】
いくつかの実施形態において、より高い精度の結果を得るために、上記被験者はアジア系であることが好ましい。また、上記被験者の上記組織試料は、肝細胞癌もしくは胆管癌のうちの１つの癌腫を含むか、または肝細胞癌もしくは胆管癌のうちの１つの癌腫であり、肝細胞癌腫または胆管癌腫のうちの１つである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】階層的（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）クラスタリングアルゴリズムを用いたコンセンサスクラスタリングの結果を示す。左パネル：クラスタ数（Ｋ）＝２〜８の範囲のコンセンサスマトリックスに対応する経験的累積分布（ＣＤＦ）プロット。中央パネル：ＣＤＦ下の面積の対応する変化。右パネル：２〜５の範囲のクラスタの数Ｋに対応するコンセンサスマトリックス。ＣＣＡサンプルについての結果を上側に示し、ＨＣＣサンプルについての結果を下側に示す。
【図２】（ａ）は、最も変動のある遺伝子のコンセンサスクラスタリングおよび階層的クラスタリングに基づくＣＣＡサブタイプのヒートマップである。ｘ軸は、ＣＣＡサブタイプのコンセンサスクラスタを表す。ＣＣＡサンプルは列で表され、樹状図によって４つの主要クラスタに分類される。遺伝子は行で表される。１１８９個の遺伝子（ｔ検定によってＣ１とＣ２との間で発現レベルが異なると特定される（ＦＤＲ＜０．０５、倍数変化＞２））の発現は、ｌｏｇ２で−３から３に示される。（ｂ）は、発現レベルの異なる１０２０個の遺伝子に基づくＨＣＣサブタイプのヒートマップ（ＦＤＲ＜０．０５、倍数変化＞２）であり、（ａ）と同様に示される。ｘ軸は、ＨＣＣサブタイプのコンセンサスクラスタを表す。（ｃ）は、ＣＣＡサブタイプおよびＨＣＣサブタイプのサブクラスマッピングである。クラスタ間の有意な関係がＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整したｐ値によって表される。
【図３】ＣＣＡおよびＨＣＣのＣ１サンプルまたはＣ２サンプル間で発現レベルが異なる、スチューデントのＴ検定（ＦＤＲ＜０．０５、倍数変化＞２）で定義される遺伝子の数を示すベン図を示す。左パネルはＣＣＡ（ｎ＝５７８）およびＨＣＣ（ｎ＝６５６）におけるＣ１において上方制御される遺伝子の数、および重複する遺伝子の数（ｎ＝２１８）（重複する遺伝子の確率が統計的に有意であるもの（ｐ＝３．２０ｘ１０−９７；超幾何学的検定））を示す。右パネルは、Ｃ２において上方制御される遺伝子の同様の結果を示す。
【図４】ＣＣＡサブタイプ（上パネル）またはＨＣＣサブタイプ（下パネル）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を示す。
【図５】ＧＳＥＡ分析によって特定された、ＨＣＣまたはＣＣＡのＣ１サブタイプまたはＣ２サブタイプの有意な経路を示す。２〜０のｌｏｇ１０ｐ値（０．０１〜１のｐ値）によって表される。
【図６】（ａ）タイ人（Ｔｈａｉ）ＣＣＡサブタイプと、公表されたシグネチャー（ｙ軸上に示される）との比較を示す。各列は腫瘍サンプルを表す。各シグネチャーの陽性は灰色のバーによって表され、陰性は黒色のバーによって表され、ＦＤＲ＞０．０５の場合は白色で示される。（ｂ）タイ人ＨＣＣサブタイプと、公表されたシグネチャー（ｙ軸上に示される）との間の比較を示す。
【図７】（ａ）ＨＣＣの染色体異常の頻度（上パネル）、または頻度＞３０％のＨＣＣの染色体異常の頻度（下パネル）を示し、（ｂ）ＣＣＡの同様の結果を示す。
【図８】（ａ）ＣＣＡのＣ１サブタイプ（上パネル）またはＣＣＡのＣ２サブタイプ（下パネル）の染色体異常の頻度を示す。コピー数の利得は薄い灰色で示され、コピー数の損失は黒色で示される。（ｂ）ＨＣＣのＣ１サブタイプ（上パネル）またはＨＣＣのＣ２サブタイプ（下パネル）の染色体異常の頻度を示す。
【図９】コピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＣＮＶ）を有するサンプルの頻度と共に、高い一致度の遺伝子と腫瘍サブタイプとの間の関係を示す。
【図１０】３７８例のＨＣＣ症例のすべてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。
【図１１】ＰＬＫ１（左パネル）またはＥＣＴ２（右パネル）についての免疫組織化学染色に基づく、倍率２００倍でのＣＣＡ症例およびＨＣＣ症例の代表的な画像を示す。
【図１２】（ａ）ＣＣＡ症例（上パネル）またはＨＣＣ症例（下パネル）における、ＰＬＫ１のアレイ発現とＴＭＡスコアの相関（左パネル）、またはＥＣＴ２のアレイ発現とＴＭＡスコアとの相関（右パネル）を明らかにし、（ｂ）ＣＣＡ症例またはＨＣＣ症例における、ＰＬＫ１のアレイ発現とＣＴ２のアレイ発現との相関、またはＰＬＫ１のＴＭＡスコアとＥＣＴ２のＴＭＡスコアとの相関を明らかにする。
【図１３】ＰＬＫまたはＥＣＴ２のカットオフ中央値に基づく、ＣＣＡ症例（左パネル）またはＨＣＣ症例（右パネル）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存解析の結果を示す。
【図１４】（ａ）タンパク質発現のレシオメトリックの組み合わせ（ＥＣＴ２／ＰＬＫ１）に基づく、すべてのＣＣＡ症例およびＨＣＣ症例のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を示す。低カットオフは、低（ｌｏｗ）については、ＥＣＴ２／ＰＬＫ１比率≦１によって低のカットオフが定義され、高（ｈｉｇｈ）については、ＥＣＴ２／ＰＬＫ１比率＞１によって高のカットオフが定義される。（ｂ）ＨＣＣ症例のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を（ａ）と同様に示す。
【図１５】（ａ）タイ人（Ｔｈａｉ）ＨＣＣサブタイプ対中国人ＨＣＣサブタイプについて、（ｂ）アジア系アメリカ人（ＡｓＡ）サブタイプについて、（ｃ）タイ人ＣＣＡサブタイプ対日本人（Ｊａｐａｎｅａｓｅ）ＣＣＡサブタイプについて、（ｄ）タイ人ＨＣＣサブタイプ対欧州系アメリカ人（ＥＡ）ＨＣＣサブタイプについて、サブクラスマッピングおよび関連するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を示す。（ｅ）タイ人ＣＣＡサブタイプ対白人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）ＣＣＡサブタイプのサブクラスマッピングを示す。クラスタ間の有意な関係は、０から１までのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整したｐ値、およびコホートにおけるサブタイプによって表される。タイ人コホートにおいて一致しないサブタイプはＸで示される。クラスタ間の有意な関連はｐ＜０．０５で薄い灰色で示される。
【図１６】タイ人ＨＣＣ症例、アジア系アメリカ人ＨＣＣ症例、およびタイ人ＣＣＡ症例のＣ１サブタイプおよびＣ２サブタイプにおけるＢＭＩのボックスプロットを示す。中央値および標準偏差も示されている。
【図１７】（ａ）ＣＣＡサンプルにおける、代謝産物存在量と遺伝子発現との相関を表すヒートマップ、および（ｂ）ＨＣＣサンプルにおける、代謝産物存在量と遺伝子発現とのグローバル相関を表すヒートマップを示す。−１〜１のピアソンＲ値に基づいて、正の相関を淡い灰色のバーで示し、負の相関を黒色のバーで示す。
【図１８】（ａ）８１の代謝産物の階層的クラスタリングが、ＨＣＣ−Ｃ１症例（薄い灰色のバー）とＣ２症例（黒色のバー）とを識別すること、および（ｂ）７７の代謝産物の階層的クラスタリングが、ＣＣＡ−Ｃ１症例（薄い灰色のバー）とＣ２症例（黒色のバー）とを識別することを示す。サンプルは列で表され、代謝産物は行で表され、代謝産物の存在量はｌｏｇ２で表される。
【図１９】（ａ）高度に一致する代謝産物／遺伝子ネットワークのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、および（ｂ）高度に一致する代謝産物／遺伝子ネットワークのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓを示す。Ｃ１サブタイプにおいて上方制御される代謝産物は薄い灰色で示され、Ｃ２サブタイプにおいて上方制御される代謝産物は濃い灰色で示される。
【図２０】（ａ）スチューデントのＴ検定ｐ値と共に、Ｃ１（ｎ＝１５）およびＣ２（ｎ＝１４）のＨＣＣサンプル中の、３つの代表的な胆汁酸関連の代謝産物の存在量のボックスプロット、および（ｂ）スチューデントのＴ検定ｐ値と共に、Ｃ１（ｎ＝３３）およびＣ２（ｎ＝１８）のＣＣＡサンプル中の、３つの代表的な胆汁酸関連の代謝産物の存在量のボックスプロットを示す。
【図２１】（ａ）ＨＣＣのＣ１サブタイプ対ＨＣＣのＣ２サブタイプのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析、および（ｂ）ＣＣＡのＣ１サブタイプ対ＣＣＡのＣ２サブタイプのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析を示す。細胞型間の高い関連性から低い関連性は、１から−１にスケーリングされている。円の大きさは関連性の有意性を示し、円が大きいほど有意性が高い。
【図２２】（ａ）標準偏差およびスチューデントのＴ検定ｐ値と共に、Ｃ１およびＣ２のＨＣＣサンプル中の３つの種類の白血球の存在量のボックスプロット、ならびに（ｂ）標準偏差およびスチューデントのＴ検定ｐ値と共に、Ｃ１およびＣ２のＣＣＡサンプル中の３つの種類の白血球の存在量のボックスプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を、本発明の代表的な実施形態または好ましい実施形態に基づいて、添付の説明および図面を参照して説明する。実施形態に対応する説明および図面は、本発明を明確にし、理解を助けるためのものであることを理解されたい。関連技術の当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を考案することができる。
【００１５】
本明細書で使用される用語「遺伝子」は、機能的な重要性のあるＤＮＡ配列を指し得る。遺伝子は、天然の核酸配列、または天然の供給源もしくは合成構築物に由来する組換え核酸配列であり得る。用語「遺伝子」はまた、例えば、ゲノムＤＮＡ配列によってコードされるｃＤＮＡおよび／もしくはｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡ配列に直接もしくは間接的に由来するｃＤＮＡおよび／もしくはｍＲＮＡを指し得るが、これに限定されない。
【００１６】
本明細書中で使用される用語「トランスクリプトーム」は、特定の組織において転写されたＲＮＡ転写産物（コードしているか否かにかかわらず）のコレクションを指し、好ましくは、組織において生成されたＲＮＡ転写産物の全てまたは実質的に全てを含む。これらの転写物には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、選択的スプライシングされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が含まれ、また、タンパク質に翻訳されない他の多くの転写物（例えば、（ｉ）核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、（ｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡなどのアンチセンス分子、ならびに（ｉｉｉ）機能が不明な他のＲＮＡ転写物）も含まれる。トランスクリプトームはまた、遺伝子転写の外延として、ＲＮＡ転写物から翻訳されたタンパク質を指し得る。
【００１７】
本開示の一態様は、肝癌に罹患した被験者の予測生存転帰を生成するための方法に関する。本質的に、該方法は、上記被験者から採取した、肝細胞癌または胆管癌のうちの１つに罹患した組織試料を準備する工程と、準備された上記試料における、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）および上皮細胞形質転換２（ＥＣＴ２）のトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を定量するために、少なくとも１つの、核酸に基づくアッセイおよび／またはプロテオミクスに基づくアッセイを行う工程と、準備された上記試料上の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率を導出する工程と、導出された上記比率に基づき、上記被験者の上記予測生存転帰を生成する工程であって、導出された上記比率が所定の値未満である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、導出された上記比率が上記所定の値以上である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第２の予測生存転帰とする工程とを含む。好ましくは、上記第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、上記第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する。本開示の発明者らは、肝細胞癌または胆管癌を有するか、またはそれに罹患した罹患組織における、腫瘍マーカーであるＰＬＫ１およびＥＣＴ２の相対的発現と、試験被験者の生存転帰または被験者に悪影響を及ぼす肝癌の急性とが相関することを見出した。得られた予測生存転帰は、戦略的治療の計画を容易にし、該治療に対応する医療資源を、試験被験者の医療ニーズに応じて用意することを容易にするための有効なツールとなり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、本開示における、肝細胞癌または胆管癌に罹患した組織試料は、本分野において公知である任意の手術または医療処置によって得ることができる。組織試料は、好ましくは肝生検によって採取される。肝生検は経皮的、ｔｒａｎｓｊａｎｇｕｌａｒ、または腹腔鏡下の生検であってもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、実施される肝生検の種類はＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２に関連するトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を定量するための、生検の後に行われるアッセイに依存する。例えば、免疫化学染色およびシグナル検出のために、試料において十分な領域を必要とする組織マイクロアレイ等のプロテオミクスに基づくアッセイには、腹腔鏡検査によって得られた組織試料がより適している。一方、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現に対応するｍＲＮＡまたはトランスクリプトームを試料から抽出し、比例的に増幅し、最終的に定量する、核酸に基づくアッセイには、経皮的生検から得られた被験者の組織試料が好ましい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、核酸に基づくアッセイは、マイクロアレイに基づいた技術、およびポリメラーゼ連鎖反応に基づいた技術（デジタルＰＣＲを含む）のいずれか１つまたは組み合わせである。核酸に基づくアッセイは一般に、所定の寸法の組織試料からｍＲＮＡまたはトランスクリプトームの全てを抽出し、その後、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現に関連するｍＲＮＡまたはトランスクリプトームを選択的に定量する（ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２のｍＲＮＡまたはトランスクリプトームの選択的増幅の有無にかかわらず）ことを含む。好ましくは、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２のトランスクリプトームがプラットフォーム上に固定された実質的に相補的なプローブ上でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのプロセスは、プラットフォームの近傍に、またはプラットフォーム内に位置する１つ以上のセンサによって検出可能なシグナル、好ましくは光シグナルを発するように構成される。プローブは、ハイブリダイゼーションおよび二本鎖核酸の形成の際に光シグナルを生成するように作られたシグナル伝達部分でタグ付けされる。発されるシグナルは、好ましくは、プラットフォームにおいて生じたハイブリダイゼーション反応の数に比例し、具体的には、予め確立された標準を参照することによる、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現の定量化をその後に可能にするハイブリダイゼーション反応の数に比例する。
【００２０】
同様に、複数の実施形態について、プロテオミクスに基づくアッセイはヒト組織の組織マイクロアレイおよび免疫組織化学染色であり、それによって、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現されたタンパク質またはペプチドが、１つ以上のシグナル伝達部分に選択的に結合し、その後、結合したシグナル伝達部分から発されたシグナルを検出することによって、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現を定量する。例えば、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）において、得られた組織サンプルを用いて、ホルマリンで固定しパラフィン包埋した組織サンプルのコア（０．５〜２．０ｍｍ）を作製する。作製した組織サンプルに対して、スライドの形態で１〜１０μｍのＴＭＡ断片において免疫組織化学処理を行う。さらに、組織試料の切り取られたセグメントを含むスライドを、キシレン中で脱パラフィンし、濃度勾配のあるアルコール中で再水和する。次いで、酸性緩衝液を用いて、抗原回収を加圧下で５〜６０分間行う。抗ＰＬＫ１（マウスモノクローナル）は、２％脱脂乳溶液で１：１０００に希釈した上で、処理された組織サンプルと、室温で１〜４時間接触させる。抗ＥＣＴ２（マウスモノクローナル）は、２％脱脂乳溶液で１：５００に希釈した上で、処理された組織サンプルと接触させる。開示される方法では、抗体を標的の腫瘍マーカーまたはタンパク質と接触させることによって、市販されるようなセンサまたはシステム（例えば、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と同時に使うＥｎｖｉｓｉｏｎ＋システム（Ｄａｋｏ））を用いて分離できる抗原抗体複合体が得られる結果となる。好ましくは、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、澄ませ、カバーガラスで覆う。タグ付けまたは染色されたＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の検出は、特定の領域におけるＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現の定量のために、２００倍以上の倍率で行うことができる。なお、定量化は、訓練された人員によって手動で行ってもよく、コンピューティングデバイスに接続されたシグナルセンサまたは画像アナライザを用いて行ってもよいことに留意されたい。好ましくは、処理された組織試料を、画像の種々のパラメータまたは特性（例えば、腫瘍細胞のパーセンテージ、および指示シグナルまたは染色の強度）についてスコア付けすることができる。肝細胞癌または胆管癌に罹患した被験者に関してより有用な検査結果を得るために、生成された異なる画像の特性のスコアをさらに処理することができる（例えば、互いに乗算するか、または１つ以上のアルゴリズムに入力する等）。いくつかの実施形態において、開示される方法におけるＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現レベルは、処理された試料から得られたスコアまたは処理された試料の画像から得られたスコアを乗算して得られる積に対応するか、または該積に定義される。ＰＬＫ１またはＥＣＴ２が発現された腫瘍細胞のパーセンテージのスコアに、発現されたＰＬＫ１またはＥＣＴ２のシグナルまたは染色の強度のスコアを乗じることによって発現レベルを定量することができ、これによって、各腫瘍マーカーの発現レベルを実質的に表す、計算されたスコアを得ることができる。このような実施形態では、検討中の腫瘍マーカーの発現レベルは���計算されたスコアに対応する。画像の各特性に対するスコアのスケールは、１〜１５、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜４の範囲であり得る。処理された試料の複数の領域は独立してスコア付けされる。いくつかの実施形態では、開示された方法において、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現をより良好に表すために、この独立したスコアを用いて平均を計算する。これによって、より高い精度の結果を得る可能性がある。
【００２１】
開示された方法では、核酸に基づくアッセイまたはタンパク質に基づくアッセイを経て、発現されたトランスクリプトームおよび／またはタンパク質を検出し定量した後に、準備された試料の特定の領域におけるＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率を導出する。例えば、ＰＬＫ１の発現レベルを１２と数値化し、算出されたＥＣＴ２の発現レベルが８である場合、導出される比率は１．５となる。いくつかの実施形態では、代わりに、ＥＣＴ２の発現レベルを分子とし、ＰＬＫ１の発現レベルを分母とする、というように、前述の比率の分子および分母を入れ替えることによって、比率を算出または計算することができる。前述の領域は、好ましくは長さ０．１〜１．０ｍｍ、０．１〜１．０ｍｍ、および厚さ１〜４ｕｍの寸法を有するが、これらに限定されない。開示された方法において、被験者の予測生存転帰を導出するプロセスを単純化するために、導出された比率が所定の値未満である場合、被験者の予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、導出された比率が上記所定の値以上である場合、被験者の予測生存転帰を第２の予測生存転帰とする。様々な実施形態において、上記所定の値を、使用されるスコアの０〜４のスケールに関連して、０〜１６の範囲内の任意の数とすることができるが、これに限定されない。所定の数は、関連する実施形態において適用されるスコアのスケールに応じて、０．００１〜１の範囲であってもよい。また、さらなる予測もしくは観察結果を得るために、またはより決定的な予測もしくは観察結果を得るために、導出された比率を分析することができ、あるいは導出された比率を、肝細胞癌または胆管癌に関連する他の遺伝子またはタンパク質の発現レベルとさらに数学的に関連付けることができる。
【００２２】
前述のように、いくつかの実施形態によれば、第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する。さらに、生成された生存率は、肝細胞癌または胆管癌に対する一般的な治療に対する、試験被験者の反応の可能性に関する経験的な情報を提供する指標と考えることができる。被験者が第２の予測生存転帰または比較的低い生存率に関連付けられたか、また第２の予測生存転帰または比較的低い生存率に割り当てられた場合、被験者は、従来の治療ではなく、代替治療を受けなければならない可能性がある。本開示の発明者らはまた、アジア系の遺伝的構成を有するか、またはアジア系である被験者について、開示された方法によって、より信頼性があるか、またはよりロバストな結果が得られることに気付いた。
【００２３】
いくつかの実施形態において、予測生存転帰は、所定の期間（好ましくは６〜４８ヶ月、より好ましくは１２〜３６ヶ月）における被験者の生存率を示すか、または該生存率のみを示す。
【００２４】
本開示の別の態様によれば、肝癌に罹患した被験者の予測生存転帰を生成するための装置が開示される。特に、開示された装置は、上記被験者の組織試料におけるＰＬＫ１およびＥＣＴ２のトランスクリプトーム発現および／またはタンパク質発現を特定または検出することができる第１のモジュールと、準備された上記試料上の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率を導出し、導出された上記比率に基づき、上記被験者の上記予測生存転帰を生成するように構成された第２のモジュールとを備え、上記第２のモジュールは、導出された上記比率が所定の値未満である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第１の予測生存転帰とし、導出された上記比率が上記所定の値以上である場合、上記被験者の上記予測生存転帰を第２の予測生存転帰とするように構成される。好ましくは、上記第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、上記第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する。
【００２５】
本開示に記載される第１のモジュールは、ＰＬＫ１の発現および／またはＥＣＴ２の発現を選択的に、人間または機械の読み取りによって検出可能にするために、遺伝学、プロテオミクス、免疫化学および／または組織化学の原理を用いて動作可能な、任意の公知のプラットフォームであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、開示された装置は、ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の発現されたトランスクリプトームまたはタンパク質と、上記第１のモジュールによって分離可能なシグナルを連続的または周期的に発するように形成されたシグナル伝達部分とを結合させるための、少なくとも１つの核酸に基づくアッセイまたはプロテオミクスに基づくアッセイを実施することができる試験モジュールをさらに備えてもよい。特に、第１のモジュールは、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２について発現されたトランスクリプトームおよび／またはタンパク質に、検出可能なシグナルを発することができるシグナル伝達部分を付着または結合させるように構成され、これによって、シグナル伝達部分と結合した、発現されたトランスクリプトームまたはタンパク質の存在を強調する。本開示の第１のモジュールは、最終的にＰＬＫ１の発現および／またはＥＣＴ２の発現の特定に導くために、組織試料の調製および処理のための連続プロセスを行うように配置された複数の作業ステーションから構成されてもよい。これらの複数の作業ステーションは、開示された実施形態の選択に応じて、相互接続されていてもよく、また、個別に動作することができる。好ましくは、さらなる実施形態において、第１のモジュールは、ＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現を強調するための第１のモジュールの照明装置と、照らされた試料のデジタル画像を生成するように設計された撮像装置とを備え、第１のモジュールは、分析および予測生存転帰の導出のために、撮影された画像を第２のモジュールにアップロードする。最も好ましくは、第１のモジュールは、接続されたデータベースに生成されたデジタル画像に記憶し、これによって、記憶された画像を呼び出し、さらに分析することが可能になる。例えば、第１のモジュールは、肝細胞癌または胆管癌に罹患した組織試料におけるＰＬＫ１および／またはＥＣＴ２の発現の検出および定量のための遺伝子発現マイクロアレイシステムまたは組織マイクロアレイシステムであり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、第２のモジュールは、準備された試料上の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率、またはＰＬＫ１の発現に対するＥＣＴ２の発現の比率を導出し、導出された比率に対応する、被験者の予測生存転帰を生成するようになっている。第２のモジュールは、撮影された画像を分析するための一連のコマンドがコンピューティングプログラムの形態でインストールされたコンピューティング手段であり得る。撮影された画像の特性は、行われた分析に応じて処理されてもよい。第２のモジュールは、好ましくは処理された組織試料を分析し、より好ましくは処理された組織試料の画像を分析し、画像の種々のパラメータまたは特性（たとえば、腫瘍細胞のパーセンテージ、および示された指示シグナルまたは染色の強度）についてのスコアを提供する。第２のモジュールは、肝細胞癌または胆管癌に罹患した被験者に関してより有用な検査結果を得るために、画像の種々の特性について生成されたスコアをさらに処理してもよい（例えば、スコアを互いに乗算するか、またはスコアを１つ以上のアルゴリズムに入力するなど）。さらなる実施形態において、第２のモジュールは、ＰＬＫ１またはＥＣＴ２の発現レベルを、処理された組織試料の撮像された画像の複数の特性にそれぞれ関連付けられた異なるスコアから得られた、計算されたスコアの数値として定義する。例えば、第２のモジュールは、検出されたＰＬＫ１またはＥＣＴ２を発現する腫瘍細胞のパーセンテージのスコアと、発現されたＰＬＫ１またはＥＣＴ２のシグナルまたは染色の強度のスコアとを乗算することによって発現レベルを定量し、これによって各標的腫瘍マーカーの発現レベルを実質的に表す計算されたスコアを得る。このような実施形態では、開示された装置は、注目する腫瘍マーカーの発現レベルが、計算されたスコアに対応すると見なす。各画像特性のスコアのスケールは、１〜１５、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜４の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、撮影された画像におけるＰＬＫ１の発現および／またはＥＣＴ２の発現をより良好に表現するために、第２のモジュールは、処理された試料の複数の領域のそれぞれについてスコアを生成し、これらの個別のスコアの平均を計算する。
【００２７】
さらに、第２のモジュールは、準備された試料の特定の領域における、ＥＣＴ２の発現に対するＰＬＫ１の発現の比率、またはＰＬＫ１の発現に対するＥＣＴ２の発現の比率を計算または導出する。該領域は、好ましくは、長さ０．１〜１．０ｍｍ、０．１〜１．０ｍｍ、および厚さ１〜４ｕｍの寸法を有する。被験者の予測生存転帰を導出するプロセスを単純化するために、開示された第２のモジュールは、導出された比率が所定の値未満である場合、被験者の予測生存転帰を第１の予測生存転帰としを第１の予測生存転帰とし、導出された比率が所定の値以上である場合、被験者の予測生存転帰を第２の予測生存転帰とするように構成される。所定の値は採用されるスコアのスケールに応じて、０〜１６の範囲内の任意の値とすることができるが、これに限定されない。上述のように、第１の予測生存転帰は、生存分析の所定の期間における、４０％〜６０％を超える全生存率に対応し、第２の予測生存転帰は、上記生存分析の上記所定の期間における、４０％〜６０％以下の全生存率に対応する。好ましくは、所定の期間は、好ましくは６〜４８ヶ月、より好ましくは１２〜３６ヶ月である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、核酸に基づくアッセイは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチド検出のための、マイクロアレイに基づいた技術、ならびにポリメラーゼ連鎖反応に基づいた技術（デジタルＰＣＲを含む）のいずれか１つまたは組み合わせである。
【００２９】
他の実施形態では、プロテオミクスに基づくアッセイは、組織マイクロアレイ組織マイクロアレイおよび／またはヒト組織の免疫組織化学染色である。
【００３０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明することを意図するものであり、該実施例に記載された具体的な実施形態によって本発明が限定されることを意図するものではない。
【００３１】
実施例１
コホートおよび臨床試料
ＴＩＧＥＲ−ＬＣコホートの１９９人の連続の患者（１３０人のＣＣＡ患者および６９人のＨＣＣ患者）に由来する、３９８の外科的対を成す、腫瘍試料および非腫瘍試料のセットを、本研究で使用した。腫瘍診断は病理学的評価により確定した。臨床的データ、人口統計学的データ、社会経済的データおよび罹患率のデータを、包括的なアンケートおよびカルテ記録から抽出した。この研究で評価された臨床変数のリストは、補足表Ｓ１において記載されている。ＴＣＧＡから得た、アジア人ＨＣＣ患者１５６例と白人ＨＣＣ患者１６３例の特徴（ＴＣＧＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ：  ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）も本研究において用いた。独立コホートにおける白人ＣＣＡ患者１０４例および日本人患者１８２例の特徴が近年報告された１４，２５。ＬＣＩからの中国人患者２４７例のＨＣＣコホートは、以前に報告されていた３５。インフォームド・コンセントは、本研究に含まれるすべての患者から得られ、それぞれの施設の施設内審査委員会によって承認された。
【００３２】
ＲＮＡ単離およびトランスクリプトミクス
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って凍結組織から抽出した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて良好なＲＮＡ品質を有すると確認されたＲＮＡサンプルのみをアレイ試験に含めた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０を用いて、対を成す腫瘍組織試料および非腫瘍組織試料における転写物を測定した。Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）方法およびｓｋｅｔｃｈ  ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化方法を用いて、生の遺伝子発現データを正規化した。複数のプローブセットを有する遺伝子について、平均の遺伝子発現を計算した。マイクロアレイプラットフォームおよびデータを、ＭＩＡＭＥガイドライン（ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＧＳＥ７６２９７）に従って、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）公開データベースに提出した。３つの独立したコホートの遺伝子発現データは、ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓ（ＧＳＥ１４５２０およびＧＳＥ２６５６６）、ＴＣＧＡ、およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｐｈｅｎｏｍｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＧＡ）データベース（ＥＧＡ００００１０００９５０）から入手可能である。全ての発現データをｌｏｇ２変換した。コンセンサスクラスタリング（ｃＣｌｕｓｔｅｒ；階層的（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）クラスタリング；ピアソン距離；完全連鎖（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）；１０００リサンプリング反復（ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ  ｉｔｅｒａｔｉｏｎ））を用いて、ＴＩＧＥＲ−ＬＣのＨＣＣコホートおよびＣＣＡコホートの両方に共通する２６１５の最も変動のある遺伝子セット（遺伝子フィルター：遺伝子中央値から１．５倍の変化、Ｌｏｇ強度変動ｐ値＞０．０１）を用いてＨＣＣまたはＣＣＡにおけるサブタイプを定義した。検証コホートのｃＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇは、個々のコホートと前述の２６１５の最も変動のある遺伝子とで共通する遺伝子を用いて実施した。階層的（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）クラスタリング（Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ  ６．６；ピアソン距離；完全連鎖（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ））を使用して、ｃＣｌｕｓｔｅｒによって定義された種々のサブグループ間の関係を決定し、視覚化した。教師なしサブクラスマッピング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ｍａｐｐｉｎｇ）方法（ＳｕｂＭａｐ）を使用して、ＳｕｂＭａｐモジュールに見られる初期設定を用いて、独立したコホート間の共通サブグループを特定した（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｐａｔｔｅｒｎ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）１１。
【００３３】
以前の研究では、トランスクリプトームプロファイリングによって決定される不均一性に関して、ＨＣＣおよびＣＣＡは腫瘍間で高い不均一性を有するが、腫瘍内の不均一性がそれに比べて遥かに低いことが示された５−７。タイ人のＣＣＡ患者およびＨＣＣ患者における分子的に均一な腫瘍サブグループを定義するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０を、１９９例の患者から得られた３９８の外科試料に対して行った。そのうち１５３の試料が品質管理試験に合格し、トランスクリプトーム分析に使用された。８前述のように、コンセンサスクラスタリング（ｃＣｌｕｓｔｅｒ）を用いて、ＨＣＣおよびＣＣＡのサブタイプを定義した。ｃＣｌｕｓｔｅｒでは、コンセンサス分布および対応するコンセンサスマトリックスに基づく、ＣＣＡの４つの主要サブグループおよびＨＣＣの３つの主要サブグループが明らかにされた（図１）。ｃＣｌｕｓｔｅｒによって定義される様々なサブグループ間の関係は、教師なし階層的（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）クラスタリングによって視覚化することができる（図２Ａ〜Ｂ）。この分析は、異なる遺伝子発現パターンを有するＨＣＣ症例またはＣＣＡ症例内の特有のサブグループを明らかにした。
【００３４】
いくつかの最近の研究は、ＣＣＡとＨＣＣとの間のトランスクリプトーム類似性を記載している９，１０。本発明は、サブクラスマッピング（Ｓｕｂｃｌａｓｓ  Ｍａｐｐｉｎｇ、ＳＭ）を用いて、ＣＣＡおよびＨＣＣの分子サブグループ間の関連性をより明確にした１１。この分析によって、ＣＣＡ−Ｃ１サブタイプおよびＨＣＣ−Ｃ１サブタイプが類似の遺伝子発現マトリックスを有する一方で、ＣＣＡ−Ｃ２サブタイプおよびＨＣＣ−Ｃ２／Ｃ３サブタイプが類似していることを明らかにした（図２Ｃ）。しかしながら、この関係は非腫瘍組織では観察されず、サブタイプ関連の遺伝子が腫瘍特異的であることを示唆している。Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプにおける遺伝子発現一致の分析によって、遺伝子クラスタ１（ＧＣ１）における上方制御された遺伝子がＣＣＡ−Ｃ１とＨＣＣ−Ｃ１との間で類似していることが明らかなった（図２Ａ〜Ｂおよび図３）。同様の結果が、ＧＣ２遺伝子クラスタにおいて観察された。興味深いことに、ＣＣＡ−Ｃ１およびＨＣＣ−Ｃ１と定義された症例は生存率が不良であったが、ＣＣＡ−Ｃ２およびＨＣＣ−Ｃ２の症例は図４に示されるように生存率がより高かった。サブタイプ特異的遺伝子シグネチャーのＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）は、図５に示されるように、ＣＣＡ−Ｃ１サブタイプおよびＨＣＣ−Ｃ１サブタイプの両方が有糸分裂チェックポイントシグナル伝達経路について濃縮されていることを明らかにした。このことは、このサブタイプが高い染色体不安定性を有することを示唆する。対照的に、ＣＣＡ−Ｃ２サブタイプおよびＨＣＣ−Ｃ２サブタイプは細胞免疫関連の経路について濃縮され、このことは、炎症反応がＣ２サブタイプに関連していることを示唆する。これらの結果は、ＣＣＡとＨＣＣとの間の明確な組織学的差異にもかかわらず、類似の遺伝子発現マトリックスおよび腫瘍の生態を有する共通のサブタイプが存在することを示す。
【００３５】
いくつかの遺伝子シグネチャーが、ＨＣＣ／ＣＣＡ予後サブタイプ、癌幹細胞の特徴および腫瘍転移に関連付けられている５，６，１２−１５。そこで、著者らは、タイ人のＨＣＣサブタイプと既知のシグネチャーとの間の関連性を、最も近いテンプレート予測アルゴリズムを用いて調べた１６。ＣＣＡ−Ｃ１サブタイプおよびＨＣＣ−Ｃ１サブタイプの両方が、Ｓ１−２に関連する遺伝的について濃縮されていること（Ｈｏｓｈｉｄａの研究に基づいて）６，１１，１６、幹細胞遺伝子について濃縮されていること（Ｌｅｅの研究に基づいて）１２，３４、およびＥｐＣＡＭ遺伝子について濃縮されていること（Ｙａｍａｓｈｉｔａの研究に基づいて）１３が分かった。同様に、ＣＣＡ−Ｃ１サブタイプは、Ｓ１−２遺伝子、幹細胞遺伝子およびＥｐＣＡＭ遺伝子について濃縮される（図６）。さらに、ＣＣＡ−Ｃ２およびＨＣＣ−Ｃ２の両方は前述のシグネチャーについて陰性である場合について濃縮され、一方、Ｃ３／４サブタイプは混合された場合を含む。対照的に、クラス２シグネチャー１４および増殖シグネチャー１５は、一般的なサブタイプを十分に分離しなかった。
【００３６】
肝癌の主要な特徴は、種々の病因的因子との関連性、ならびに臨床症状および基礎をなす腫瘍の生態における高い不均一性である。そのため、肝癌患者の多くは治療に不応であり、好ましくない転帰となる。肝癌患者の転帰を改善するために必要な必須要件の１つは、各々が特有の腫瘍の生態を示し、潜在的にドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）なドライバー遺伝子を示す、均一な分子サブタイプを正確に定義することができる診断ツールキットを、分子サブタイプに基づいて合理的な治療選択を実施するために提供することである。したがって、ＴＣＧＡやＩＣＧＣの取り組みのように、十分にアノテーションされた、癌患者のバイオバンクを開発することは、精密医療の目標をさらに発展させるための重要な資源である。現在、ＴＣＧＡおよびＩＣＧＣは、主に、北米、ヨーロッパおよび日本に由来するＨＣＣ試料を含む。ＨＣＣおよびＣＣＡがアジア人集団においてはるかに多いことを考慮して、本開示は、肝癌、特にＣＣＡが風土病であるタイにおいて症例対照研究を実施するためのＴＩＧＥＲ−ＬＣコンソーシアムを確立した。
【００３７】
肝癌の発生は複雑なプロセスであり、数十年にわたる様々な癌ドライバーの遺伝子変化およびエピジェネティックな変化の蓄積に起因する。異なる病因的因子による微小環境のストレスに、各腫瘍細胞が適応する必要があるため、腫瘍進化は、異なる腫瘍型の間で大きく異なることが予想される。その結果、肝臓癌は、特に遺伝的不均一性を示す傾向にある。全ゲノム／エキソームシークエンシングアプローチは潜在的な癌ドライバーを特定するのに強力であるが、ＨＣＣまたはＣＣＡ関連ドライバーの候補の突然変異は極めて不均一である。これは、各々の腫瘍が様々な組み合わせにおいて多数の低頻度突然変異遺伝子を有するためである２５，３１，３２。さらに、全エキソームシークエンシングによって特徴付けられるこれらの遺伝子異常のほとんどは、診断される腫瘍に機能的影響を及ぼさないパッセンジャー突然変異または組織学的突然変異のいずれかであると考えられてきた３３。候補ドライバーとして特徴付けられた、比較的高い変異頻度を有する遺伝子については、これらの候補ドライバーの種々の組み合わせを有する種々の腫瘍病変の間の膨大な腫瘍間の不均一性が明らかである３１，３２。異なる癌ドライバーの組み合わせが、異なるサブタイプに特有の、癌細胞生存のために繋ぎ変えられた、新しい収束適応経路として出現し得ることが考えられる。癌ドライバーは、体細胞突然変異によって得られ得るだけでなく、エピジェネティックな機構（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のＤＮＡメチル化）によっても得られ得ることに注意すべきである。このことは、腫瘍特性の一部のみを捕捉する全エキソームシークエンシングによって、特有の腫瘍の生態を有する安定な腫瘍サブタイプを発見することが、非常に困難であることを説明し得る。対照的に、トランスクリプトームに基づくアプローチによって様々な腫瘍サブタイプにおける主要なドライバー遺伝子を定義することは困難であったが、トランスクリプトームプロファイリングは、特有の腫瘍の生態を反映し得る安定なＨＣＣサブタイプを定義することに成功している６，１３，３４−３６。ゲノミクス、エピゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、およびメタボロミクスのデータを相関させる統合オミクスのアプローチは、腫瘍の不均一性および癌ドライバーに対処するための鍵となり得る。
【００３８】
実施例２
ＤＮＡ単離およびＳｏｍａｔｉｃ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ（ＳＣＮＡ）
全ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出プロトコルを用いて凍結組織から抽出した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて十分な量の二本鎖ＤＮＡを有することを確認したサンプルを、アレイ研究のために含めた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０を用いて、対を成す腫瘍組織試料および非腫瘍組織試料の間のＳｏｍａｔｉｃ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ（ＳＣＮＡ）を決定した。ＳＣＮＡの生データは、ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＧＳＥ７６２１３から入手可能である。Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ７．５を用いて、各患者の対を成す非腫瘍組織を参照として用いて、ＣＣＡおよびＨＣＣのＳＣＮＡを分析した。ＣＣＡおよびＨＣＣにおけるセグメント化領域は、Ｐａｒｔｅｋにおけるゲノムセグメンテーションアルゴリズムを用いて見出された。ＳＣＮＡによって一致して調節される遺伝子を特定するために、ピアソン相関値を、コピー数セグメント化領域と、ＣＣＡ組織またはＨＣＣ組織からのトランスクリプトームデータとで計算した。Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプに特異的な一致遺伝子を定義するために、正の相関値およびｐ値≦０．００５を有するセグメント化領域に位置する遺伝子を考慮した。ＣＣＡおよびＨＣＣにおけるＣ１サブタイプおよびＣ２サブタイプについてのコピー数一致遺伝子を定義するために、以下を用いた：(ｉ)スチューデントのｔ検定からのｐ値、および（ｉｉ）Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプのＣＣＡまたはＨＣＣの間のクラス予測に使用した最も変動のある遺伝子の中のｌｏｄ２変換発現値の倍数変化。ＣＣＡおよびＨＣＣにおけるＣ１サブタイプに特異的なコピー数一致遺伝子を特定するために、本開示の発明者らは、Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプを比較した場合において、スチューデントのｔ検定のｐ値が≦０．００５の遺伝子を選択した。
【００３９】
次に、本開示の発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０を用いて、タイ人の腫瘍試料、および対照としての対を成す非腫瘍組織の間のＳｏｍａｔｉｃ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ（ＳＣＮＡ）を決定した。以前に発表された研究１７と一致して、１ｑ、６ｐ、８ｑでの再発性の利得、および４ｑ、８ｐ、１３ｑ、１６、１７ｐでの再発性の損失を伴う典型的なＳＣＮＡプロファイルは図７Ａに示されるように、ＨＣＣ試料において明らかであった。ＨＣＣとＣＣＡとの間でＳＣＮＡプロファイルはかなり異なることが見出された（図７Ｂ）。しかしながら、本発明者らがＣ１サブタイプおよびＣ２サブタイプに基づいてＳＣＮＡプロファイルを分析したところ、ＣＣＡ−Ｃ２およびＨＣＣ−Ｃ２と比較して、ＣＣＡ−Ｃ１およびＨＣＣ−Ｃ１の両方において有意に高い程度の再発性の利得および損失が見られた（図８Ａ〜Ｂ）。この結果はトランスクリプトームおよびＧＳＥＡの分析と一致し、ＣＣＡ−Ｃ１およびＨＣＣ−Ｃ１が有糸分裂チェックポイント欠損を含み、その結果、異数性の程度が高くなる可能性があることを示唆する。
【００４０】
ドライバー遺伝子はＳＣＮＡと遺伝子発現との間で高度に一致した変化を有するべきであるという概念１７，１８に基づいて、潜在的なサブタイプ関連ドライバー遺伝子を決定するために、本開示の発明者らは最初に、ＳＣＮＡとトランスクリプトームとの間のピアソン相関を行った。この分析は、遺伝子のサブセット（Ｓｕｐｐｌ  Ｆｉｇ  Ｓ５Ａ−Ｂ）、すなわち、ＣＣＡ−Ｃ１については２３９個の遺伝子、ＨＣＣ−Ｃ１腫瘍試料については８９個の遺伝子の間に有意な正の相関があることを明らかにした。その中で、５１の遺伝子がＣＣＡ−Ｃ１とＨＣＣ−Ｃ１との間で重複し、このことは、ＨＣＣとＣＣＡにおける共通のサブタイプ特異的ドライバーの存在を示唆した。一貫して、図９に示すように、Ｃ１サブタイプはＣ２サブタイプよりも多いコピー数の増加および発現の上昇が関連している。前述の結果と一致して、これら５１の遺伝子のネットワーク解析により、ＰＬＫ１シグナル伝達に関連する有糸分裂チェックポイントシグナル伝達経路の濃縮が明らかになった。さらに、ＥＣＴ２は、Ｃ１サブタイプとＣ２サブタイプとの間で発現レベルの異なる遺伝子の最も上位ランキングであった。同様の結果が、図１０に示すＴＣＧＡ  ＨＣＣデータセットを用いて観察された。
【００４１】
実施例３
免疫組織化学
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、胆管癌および肝細胞癌について別個のＴＭＡとしてＳＨ  ４４によって検討された、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からの１．０ｍｍコアを用いて構築した。参照として、患者からの正常組織の対のＴＭＡを構築した。全てのＴＭＡは内部対照組織を含んでいた。５μｍのＴＭＡ断片について免疫組織化学を行った。まず、スライドをキシレン中で脱パラフィン化し、濃度勾配のあるアルコール中で再水和した。抗原回収を、ｐＨ６クエン酸緩衝液を用いて２０分間、圧力クッカー中で行った。２％脱脂乳溶液で１：１０００に希釈した抗ＰＬＫ１（マウスモノクローナル、クローンＣＮ０５−８４４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、室温で２時間、１：１０００希釈で接触させた。２％脱脂乳溶液で１：５００に希釈した抗ＥＣＴ２（マウスモノクローナル、“Ｅ−１”ｃａｔ  ＳＣ−５１４７６９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を接触させた。抗原抗体複合体を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋（Ｄａｋｏ）二次およびＤＡＢで検出した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、澄ませ、カバーガラスで覆った。陽性対照および陰性対照を行った。対の正常肝臓のＴＭＡを腫瘍ＴＭＡと同時に染色した。免疫組織化学染色の解釈は、２００倍の倍率で行った。腫瘍を、染色された腫瘍細胞のパーセンテージ（四分位数において０〜４）および染色の強度（０〜４）についてスコア付けした。２つの値を乗算した（０〜１６の範囲）。正常組織のＴＭＡは、腫瘍マーカーの染色を示さなかった。ＰＬＫ１またはＥＣＴ２の高レベルまたは低レベルを、中央値スコアを用いて決定した。生データからＥＣＴ２／ＰＬＫ１比率を計算し、カットポイントを、以前の２４と同様に、低レベルではＥＣＴ２／ＰＬＫ１比率≦１、高レベルでは＞１と決定し、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとしてプロットした。統計解析にはＣｏｘ−Ｍａｎｔｅｌ  ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いた。
【００４２】
経路分析は、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）バージョン１６およびＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）バージョン２４７１８９９９を用いて行った。患者生存を比較するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を行い、Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌ  ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定により統計的ｐ値を得た。全てのｐ値は二面性があり、統計的有意性は特に断らない限り、ｐ＜０．０５と定義した。以前に報告されたシグネチャーとタイ人のＣＣＡおよびＨＣＣコホートとの関係は、０．０５の予測信頼性の偽発見率（ＦＤＲ）カットオフに基づいて、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎで実施された最も近いテンプレート予測アルゴリズムを使用して決定された。ＣＣＡまたはＨＣＣの組織発現プロファイルからの免疫／炎症細胞サブセットの相対画分の推定を、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ  ３０を用いて行った。遺伝子発現データはｌｏｇ２スケール発現マトリックスのｑｕａｎｔｉｌｅ正規化によって変換し、ＣＣＡおよびＨＣＣのＣ１サブタイプおよびＣ２サブタイプにおける白血球の相対画分を、組み込みＬＭ２２シグネチャーマトリックス（ＬＭ２２）を使用した、実施した分析を用いてウェブサイト（ｃｉｂｅｒｓｏｒｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／）に従って定量した。ウェルチ２サンプルｔ検定（Ｗｅｌｃｈ  Ｔｏｗ  Ｓａｍｐｌｅ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて、２２個の相対白血球画分の各々を、Ｃ１サブタイプとＣ２サブタイプとの間で比較した。ピアソン相関分析を用いて、Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプにおける白血球とＢＭＩとの間の相関を決定した。
【００４３】
得られたデータから、ＥＣＴ２およびＰＬＫ１はＨＣＣおよびＣＣＡのサブタイプの検出に有効な、臨床的に重要な機能的バイオマーカーであることが示唆された。これは、両遺伝子は以前に腫瘍進行に関連付けられていたためである１９−２１。従って、本開示の発明者らは、１９９例のタイ人患者の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＥＣＴ２およびＰＬＫ１を評価した。ＣＣＡおよびＨＣＣのＴＭＡを構築した。ＰＬＫ１は細胞質で検出されるが、正常な肝細胞では発現されない（図１１）。ＥＣＴ２は核で発現されるが、正常な肝細胞においては存在しない。ＩＨＣによって検出された発現は、図１２Ａに示されるｍＲＮＡデータと相関した。さらなる分析（図１２Ｂ）は、ＲＮＡレベルおよびタンパク質発現レベルでのＰＬＫ１の発現とＥＣＴ２の発現との相関を実証した。ＰＬＫ１およびＥＣＴ２について個々に生存分析を行ったところ、ＰＬＫ１またはＥＣＴ２のＴＭＡスコアが高い患者は、不良転帰となる傾向にあることが示された（図１３）。ＰＬＫ１とＥＣＴ２との間の発現における実質的な相関、およびＰＬＫ１がインビトロでＥＣＴ２をリン酸化することが実証されていること２２を考慮して、本発明者らは、転帰を予測するためにこれら２つのバイオマーカーの組み合わせを評価した。関連バイオマーカーのレシオメトリックの組み合わせの以前の例２３，２４に基づいて、本開示はＴＭＡスコアからＰＬＫ１／ＥＣＴ２比率を生成し、図１４Ａ〜Ｂに示される生存分析を実施し、これは、ＰＬＫ１／ＥＣＴ２比率が転帰を識別するためにロバストであることを実証した（ＣＣＡ、ｐ＝０．０１、ＨＣＣ、ｐ＝０．０１２）。
【００４４】
実施された実験は、Ｃ１サブタイプが有糸分裂チェックポイント欠陥に関連すること、および、ＰＬＫ１およびＥＣＴ２がＣ１について臨床的に関連する重要な２つの遺伝子であることを明らかにした。ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の両方の発現が、Ｃ１サブタイプにおいて高度に発現され、ＩＨＣを使用した腫瘍サブタイプの定義においてロバストであることが見出された。これは、ＩＨＣが病理学的診断のための好ましい方法であるため、臨床的に有意義である。ＥＣＴ２遺伝子はまた、Ｃ１サブタイプにおいて優先的に増幅または変異され、これは、Ｃ１サブタイプのドライバー遺伝子であるという仮説と一致する。一貫して、ＰＬＫ１およびＥＣＴ２の両方は、癌に機能的に関連している。ＰＬＫ１は、有糸分裂セリン／トレオニンタンパク質キナーゼの１つであり、有糸分裂の開始、および紡錘体集合の調節に必要である。過剰反応性のＰＬＫ１シグナル伝達は、ヒト腫瘍（ＨＣＣを含む）において見出されており、また、癌形成ネットワーク（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ）におけるその重要な機能ノード１９のために、癌の治療のための潜在的な標的とし得ることが提案されている。多くのＰＬＫ１阻害剤は、現在、固形腫瘍において試験されている３７。ＥＣＴ２は、ＲａｓスーパーファミリーのＧＥＦおよびＧＡＰに属し２０、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換するその能力２１に基づいて１９９１年に最初に特定された古典的な癌遺伝子である。ＥＣＴ２がＨＣＣの早期再発の促進に関与することから、ＨＣＣを含む癌の治療の扱いやすい標的としてのＥＣＴ２の役割が提案されている２０，３８。得られた結果は、ＰＬＫ１の発現およびＥＣＴ２の発現が、アジア人のＨＣＣおよびＣＣＡのＣ１サブタイプについての患者層別化のためのバイオマーカーとして、および分子標的として役立ち得ることを示唆する。
【００４５】
実施例４
人種／民族関連の一般的な腫瘍サブタイプ
タイ人のサンプルで観察されたＣＣＡおよびＨＣＣの共通の分子サブタイプが普遍的であるかどうかを決定するために、本開示の発明者らは、アジア、欧州、および北米に居住した患者について入手可能なトランスクリプトームデータを有するいくつかの独立コホートを検討した。これらのコホートは、中国からの２４７例のＨＣＣ患者、米国からの３７８例のＨＣＣ患者（ＴＣＧＡデータ）、欧州からの１０４例のＣＣＡ患者、および日本からの１２８人のＣＣＡ患者を含む。トランスクリプトームによって特定された種々のサブタイプ間の類似性を、ＳＭを用いて決定した。著者らは、Ｃ１予後分子サブタイプまたはＣ２予後分子サブタイプが中国人ＨＣＣ患者、アジア系アメリカ人（ＡｓＡ）ＨＣＣ患者、および日本人ＣＣＡ患者で観察されたが、欧州系アメリカ人（ＥＡ）ＨＣＣ患者または欧州のＣＣＡ患者では観察されなかったことを見出した（図１５）。５１の共通のサブタイプ関連遺伝子と人種／民族関連予後との関連を示す同様の結果が米国のＨＣＣ患者でも観察された。総合すると、これらの結果は、ＣＣＡおよびＨＣＣの共通の予後分子サブタイプ人種／民族性にも関連していることを示唆している。
【００４６】
１２８の日本人ＣＣＡ腫瘍について遺伝子突然変異データが利用可能であったので、本開示は、本研究において特定された共通のサブタイプと、Ｎａｋａｍｕｒａら２５に記載された上位３２の突然変異遺伝子との間に何らかの関係が存在するかどうかを決定することを試みた。本開示は、突然変異データは共通のサブタイプを明確に識別せず、突然変異頻度は各サブタイプについて１〜４３％の範囲であることを見出したが、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、およびＧＮＡＳにおける突然変異（＞１０％突然変異）は予後不良のＣ１サブタイプにおいて濃縮を示す。また、ＢＡＰ１およびＩＤＨ１における突然変異は、Ｃ１／Ｃ２サブタイプと一致しなかったサブグループであるＸサブタイプにおいてより頻繁であったが、良好な予後と関連している。注目すべきことに、Ｘサブタイプの１５％はＩＤＨ１突然変異を有するが、Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプのいずれもＩＤＨ１突然変異を有しない。このことは、Ｃ１およびＣ２から独立したこの特有のＣＣＡサブタイプが、異なる遺伝子パターンを有し、より良好な予後となることを示唆している。興味深いことに、ＳＣＮＡおよびトランスクリプトーム（図９）に基づく、統計的に有意な数の遺伝子（５１個のドライバー遺伝子のうち３個、すなわちＮＲＡＳ、ＰＲＫＣＩおよびＥＣＴ２）が、これらの３２個の突然変異遺伝子と重複することが見出された（ｐ＝０．０００４；超幾何学的試験）。注目すべきことに、日本人のＣＣＡ−Ｃ１サブタイプの６％もＥＣＴ２に突然変異を示し、このことは、ＥＣＴ２が共通のＣ１サブタイプの機能的ドライバーであるという我々の発見と一致した。
【００４７】
実施例５
肥満、メタボロミクス、および腫瘍サブタイプ
病因学的／人口統計学的／臨床的特徴のいずれかが、特定された腫瘍サブタイプに関連するかどうかを決定するために、本開示は、入手可能な臨床変数（年齢、性別、タバコ消費およびアルコール消費、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）、および腫瘍特性を含む）に基づいて、Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプを比較した。タイ人のＨＣＣのＣ１サブタイプとＣ２サブタイプとの間では、年齢、ＢＭＩ状態および腫瘍サイズのみが異なるようであった。アルコール消費、ＨＢＶおよびＨＣＶの状態、肝硬変（Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のレベル、ＣＡ１９−９のレベル、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のレベル、および腫瘍の病期分類は、ＣＣＡとＨＣＣとの間で有意に異なっていたことに注意すべきである。興味深いことに、これらの病因的因子は共通の分子サブタイプと関連していないが、組織学的サブタイプと関連している。
【００４８】
ＭｅｔａｂｏｌｏｎのＤｉｓｃｏｖｅｒ  ＨＤ４  Ｐｌａｔｆｏｒｍを用いて、対を成す腫瘍組織試料および非腫瘍組織試料における小さな生化学種を測定した。正のモードおよび負のモード（ＬＣ＋／ＬＣ−）の液体クロマトグラフィー／質量分析、ならびにガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）の両方を用いた。合計７１８の代謝産物を測定した。欠損値は、各代謝産物の最小値を用いて補完（ｉｍｐｕｔｅ）した。ＨＣＣコホートおよびＣＣＡコホートの両方に共通する１７８の最も変動のある代謝産物を、各コホートにおいて選択した（フィルター：代謝産物の中央値から１．５倍の変化、対数強度変動ｐ値＞０．０１）。選択された代謝産物と最も変動のある遺伝子との間のピアソン相関値を、各コホートについて別々に計算した。同じサンプル内で有意に相関した代謝産物および遺伝子（Ｐ＜０．０５）のみをさらなる分析に含めた。さらに、遺伝子の少なくとも２０％と有意に関連する代謝産物を選択した。
【００４９】
さらに、利用可能なＢＭＩデータを有するタイ人、ＡｓＡおよびＥＡ患者におけるＢＭＩプロファイルを決定した。本開示は、ＥＡ患者が、アジアに住んでいるか米国に住んでいるかにかかわらず、アジア人患者よりも高いＢＭＩを有する傾向があることを見出した。Ｃ２サブタイプは、Ｃ１サブタイプよりも高いＢＭＩを有する傾向があり、その差は統計的に有意である（図１６）。ＢＭＩの差が腫瘍代謝の変化と関連しているかどうかを決定するために、著者らは、タイ人患者からの１９９のＨＣＣおよびＣＣＡの腫瘍試料と、対を成す非腫瘍組織との間で、標的化されていないメタボロームプロファイリングを実施した。代謝産物および遺伝子の発現プロファイルを組み込むことは、偽陽性を減少させ、機能的代謝産物を定義する可能性を高める強力な手法である２６。そのため、本開示は、代謝産物発現プロファイルと遺伝子発現プロファイルとの間のグローバルピアソン相関分析を行った。得られた結果は、図１７に示されている。全部で１７８の最も変動のある代謝産物から、ＣＣＡについては合計７７の代謝産物が、ＨＣＣについては合計８１の代謝産物が遺伝子発現との高い相関を示した（−０．５＜Ｒ＜０．５；Ｐ＜０．０５、遺伝子の少なくとも２０％と関連している）。ＣＣＡとＨＣＣとの間に統計的に有意な数の重複代謝産物（ｎ＝４６）が見出された（超幾何学的ｐ＝０．０００７）。さらに、遺伝子発現と高い一致度を示した代謝産物は図１８Ａ〜Ｂに例示されるように、Ｃ１サブタイプおよびＣ２サブタイプを識別した。ＨＣＣおよびＣＣＡからの最も重要な代謝産物のトップネットワークは、著しく類似していた（図１９Ａ〜Ｂ）。本開示は、胆汁酸関連の代謝産物（例えば、タウロケノデオキシコール酸およびｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏａｔｅ（ＴＵＤＣＡ））がＣ１サブタイプよりもＨＣＣ−Ｃ２およびＣＣＡ−Ｃ２の両方において有意に豊富であることを見出した（図２０Ａ〜Ｂ）。
【００５０】
Ｃ２サブタイプは高いＢＭＩに関連する。ＢＭＩは、代謝性疾病および細胞炎症に関連することが知られている２７，２８。さらに、Ｃ２サブタイプ関連の胆汁酸代謝産物は、炎症および免疫に関連することが知られている２９。そこで、本開示の発明者らは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ３０を用いて、タイ人のＨＣＣおよびＣＣＡにおける浸潤性免疫細胞を調べた。白血球浸潤物の活性は、Ｃ１サブタイプよりもＣ２サブタイプにおいてはるかに高いことが見出された。結果を図２１Ａ〜Ｂに示す。顕著なことに、ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞およびγδＴ細胞の上昇、ならびにＴｒｅｇ細胞の減少はＣ２サブタイプと関連している（図２２Ａ〜Ｂ）。総合すると、この結果は、Ｃ１サブタイプが変化したＰＬＫ１およびＥＣＴ２を伴う有糸分裂チェックポイント欠損を含むが、一方、Ｃ２サブタイプは上昇したＢＭＩ、免疫細胞異常、および異常な胆汁酸代謝を有することを示す。
【００５１】
本開示は、ＣＣＡおよびＨＣＣの両方が、その組織学における差異および関連する病因における差異にかかわらず、アジア人患者の間でのみ共有されるいくつかの共通の分子サブタイプからなることを見出した。興味深いことに、特有の遺伝子発現マトリックスを共有する共通のＣＣＡサブタイプおよびＨＣＣサブタイプは、類似の予後結果を有する。これは、従来の組織学的腫瘍サブタイプを超える共通の分子タイプの存在を示唆する。癌トランスクリプトーム、ＳＣＮＡ、およびメタボロームの系統的統合によって、攻撃的分子サブタイプに関連する、重要な発癌性駆動因子を明らかにした。具体的には、Ｃ１サブタイプは有糸分裂チェックポイント欠損を含み、一方、Ｃ２サブタイプは炎症、肥満および胆汁酸生合成に関連する。これらの結果は、治療の層別化が組織型に基づくべきではなく、むしろ分子型に基づくべきであることを示唆する。
【００５２】
代謝性肝疾患および肥満は、肝臓炎症および癌に関連している２７，２８，３９，４０。しかしながら、これらの関連の基礎をなす分子機構は不明である。著者らはＣ２サブタイプに関連する共通の臨床的特徴が高いＢＭＩであることを見出した。このことは、肝臓関連の代謝疾患との関連の可能性を示唆する。ＢＭＩは炎症反応および代謝障害に関連しているため、著者らはまた、分子的に定義されたサブタイプにおける腫瘍関連白血球を調べた。ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞およびγδＴ細胞などのリンパ系細胞は、Ｃ２サブタイプにおいて有意に上昇するが、骨髄系細胞はＣ２サブタイプにおいて有意に上昇しないことが見出された。これらの結果は、細胞免疫関連経路について濃縮されたＣ２サブタイプの遺伝子発現データと一致し、炎症応答がＣ２サブタイプに関連するという考えを再確認する。ＨＣＣおよびＣＣＡの両方において、いくつかの胆汁酸代謝産物（ＴＵＤＣＡ、タウロコール酸およびグリコケノデオキシコール酸など）が、Ｃ１サブタイプよりもＣ２サブタイプにおいて一貫してはるかに豊富であることも興味深い。胆汁酸は近年、コレステロール代謝、エネルギー恒常性、およびグルコース恒常性を調節するための汎用性のあるシグナル伝達分子として出現しており、これは、一般的な代謝疾患および肝疾患を治療するための新規な薬剤標的を開発するための基礎となる４１。これらの薬剤のいくつかは、肝癌のＣ２サブタイプを治療するために適用可能であり得ると考えられる。得られた結果はまた、肥満誘発の腸内微生物代謝産物であるデオキシコール酸が老化セクレトーム（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を通して肝臓発癌を促進すること、および、食餌がヒト腸内マイクロバイオームを変化させ、肥満のような食餌関連疾患を促進することを示す最近の研究２９，４２と一致する。さらに、食餌性脂肪誘発のタウロコール酸はＩＬ１欠損マウスにおいてパソビオント（ｐａｔｈｏｂｉｏｎｔ）の増殖および大腸炎を促進し、これは、遺伝的に感受性の宿主において、ある種の飽和脂肪を含む食餌が免疫介在性疾患を誘発することの、妥当な機構的な基礎を明らかにする４３。
【００５３】
得られた結果は、共通のＣ１〜Ｃ２サブタイプが主にアジア人患者と関連していることを示しているが、人種／民族との関連の理由は不明である。西洋型食餌はアジア人と白人の間で異なる腸内毒素症を誘発し得ること、また、腸内マイクロバイオームの人種／民族関連の相違が胆汁酸代謝と協同して、アジア人関連の共通のＣ２サブタイプで観察される特有の発癌過程を誘発し得ることが考えられる。Ｃ２サブタイプにおける浸潤性Ｔ細胞の増加はまた、これらの腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に感受性である場合があり得ることを示唆する。要約すると、本開示において採用される統合オミクスアプローチは、いくつかのアジア人集団にわたるＣＣＡおよびＨＣＣの共通の分子サブタイプを定義し、具体的なサブタイプに関連する潜在的なドライバー遺伝子および代謝プロセスを特定した。
【００５４】
本発明は、他の具体的な形態で実施されてもよく、上述した実施形態に限定されないことを理解されたい。しかしながら、開示された概念に対する、当業者が容易に想到し得るような変更などは、添付される特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００５５】
参照
１．Ｔｈｅｉｓｅ，  Ｎ．  Ｄ．  Ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１４）。
【００５６】
２．Ｗａｎｇ，  Ｘ．  Ｗ．  ＆  Ｔｈｏｒｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，  Ｓ．  Ｓ．  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １，  ５，  ｄｏｉ：１０．２２１７／ＨＥＰ．１４．１８  （２０１４）。
【００５７】
３．Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ，  Ｈ．  Ｂ．  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６５，  １１１８−１１２７，  ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｒａ１００１６８３  （２０１１）。
【００５８】
４．Ｓｒｉｐａ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｖｅｒ  ｆｌｕｋｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  ＰＬｏＳ．Ｍｅｄ．  ４，  ｅ２０１  （２００７）。
【００５９】
５．Ｙｅ，  Ｑ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ９，  ４１６−４２３  （２００３）。
【００６０】
６．Ｈｏｓｈｉｄａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９，  ７３８５−７３９２  （２００９）。
【００６１】
７．Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１，  ８８−９８，  ｄｏｉ：１０．７１５０／ｉｊｂｓ．１０５８３  （２０１５）。
【００６２】
８．Ｍｏｎｔｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｏｎｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｈｏｓｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ  １０５，  １８５１−１８６１，  ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００４−０７−２９４７  （２００５）。
【００６３】
９．Ｗｏｏ，  Ｈ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｉｔ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０，  ３０３４−３０４１  （２０１０）。
【００６４】
１０．Ｏｉｓｈｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｉＲ−２００ｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５６，  １７９２−１８０３  （２０１２）。
【００６５】
１１．Ｈｏｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｂｒｕｎｅｔ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｔａｍａｙｏ，  Ｐ．，  Ｇｏｌｕｂ，  Ｔ．  Ｒ．  ＆  Ｍｅｓｉｒｏｖ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｓｕｂｃｌａｓｓ  ｍａｐｐｉｎｇ：  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２，  ｅ１１９５，  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００１１９５  （２００７）。
【００６６】
１２．Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４０，  ６６７−６７６  （２００４）。
【００６７】
１３．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥｐＣＡＭ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８，  １４５１−１４６１  （２００８）。
【００６８】
１４．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｊ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４２，  １０２１−１０３１  ｅ１０１５，  ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１１．１２．００５  （２０１２）。
【００６９】
１５．Ｓｉａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ２  ｃｌａｓｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｈａｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４４，  ８２９−８４０，  ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１３．０１．００１  （２０１３）。
【００７０】
１６．Ｈｏｓｈｉｄａ，  Ｙ．  Ｎｅａｒｅｓｔ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓａｍｐｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｃｌａｓｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５，  ｅ１５５４３，  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１５５４３  （２０１０）。
【００７１】
１７．Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ８ｐ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４２，  ９５７−９６６  （２０１２）。
【００７２】
１８．Ｗｏｏ，  Ｈ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｉｖｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９，  ４０５９−４０６６  （２００９）。
【００７３】
１９．Ｓｔｒｅｂｈａｒｄｔ，  Ｋ．  Ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅｓ：  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ９，  ６４３−６６０，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ３１８４  （２０１０）。
【００７４】
２０．Ｖｉｇｉｌ，  Ｄ．，  Ｃｈｅｒｆｉｌｓ，  Ｊ．，  Ｒｏｓｓｍａｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ＆  Ｄｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｒａｓ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ＧＥＦｓ  ａｎｄ  ＧＡＰｓ：  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ？  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  １０，  ８４２−８５７，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ２９６０  （２０１０）。
【００７５】
２１．Ｃｏｏｋ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｒｏｓｓｍａｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ＆  Ｄｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｒｈｏ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒｓ：  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３３，  ４０２１−４０３５，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１３．３６２  （２０１４）。
【００７６】
２２．Ｎｉｉｙａ，  Ｆ．，  Ｔａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｓ．  ＆  Ｍｉｋｉ，  Ｔ．  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＥＣＴ２  ａｔ  Ｇ２／Ｍ  ｐｈａｓｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｋｉｎａｓｅ  Ｐｌｋ１  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＴＰ−ｂｏｕｎｄ  ＲｈｏＡ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，  ８２７−８３７，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｏｎｃ．１２０９１２４  （２００６）。
【００７７】
２３．Ｃｈｕｎｇ，  Ｊ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ，  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ，  ａｎｄ  ＰＴＥＮ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５，  ６６０−６６７，  ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−０８−１０８４  （２００９）。
【００７８】
２４．Ｋｉｔａｎｏ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ，  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ，  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ  ａｎｄ  ＥＧＦＲ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ６２，  ３３５−３４６，  ｄｏｉ：１０．１３６９／００２２１５５４１４５２３０２２  （２０１４）。
【００７９】
２５．Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４７，  １００３−１０１０，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．３３７５  （２０１５）。
【００８０】
２６．Ｂｕｄｈｕ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４４，  １０６６−１０７５  （２０１３）。
【００８１】
２７．Ｃａｌｌｅ，  Ｅ．  Ｅ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｃ．，  Ｗａｌｋｅｒ−Ｔｈｕｒｍｏｎｄ，  Ｋ．  ＆  Ｔｈｕｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ，  ｏｂｅｓｉｔｙ，  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．  ａｄｕｌｔｓ．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．  ３４８，  １６２５−１６３８  （２００３）。
【００８２】
２８．Ｐａｒｋ，  Ｅ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ＩＬ−６  ａｎｄ  ＴＮＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １４０，  １９７−２０８  （２０１０）。
【００８３】
２９．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，  ９７−１０１，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４７  （２０１３）。
【００８４】
３０．Ｎｅｗｍａｎ，  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，  ４５３−４５７，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３３３７  （２０１５）。
【００８５】
３１．Ｇｕｉｃｈａｒｄ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｏｃａｌ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｋｅｙ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ４４，  ６９４−６９８  （２０１２）。
【００８６】
３２．Ｔｏｔｏｋｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓ−ａｎｃｅｓｔｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４６，  １２６７−１２７３，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．３１２６  （２０１４）。
【００８７】
３３．Ｈｅｌｌｅｄａｙ，  Ｔ．，  Ｅｓｈｔａｄ，  Ｓ．  ＆  Ｎｉｋ−Ｚａｉｎａｌ，  Ｓ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １５，  ５８５−５９８，  ｄｏｉ：Ｄｏｉ  １０．１０３８／Ｎｒｇ３７２９  （２０１４）。
【００８８】
３４．Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  １２，  ４１０−４１６  （２００６）。
【００８９】
３５．Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０，  １０２０２−１０２１２  （２０１０）。
【００９０】
３６．Ｎａｕｌｔ，  Ｊ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ５−ｇｅｎｅ  ｓｃｏｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４５，  １７６−１８７，  ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１３．０３．０５１  （２０１３）。
【００９１】
３７．Ｙｉｍ，  Ｈ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２４，  ９９９−１００６，  ｄｏｉ：１０．１０９７／ＣＡＤ．０００００００００００００００７  （２０１３）。
【００９２】
３８．Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥＣＴ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｒｈｏ／ＥＲＫ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｘｉｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６２，  １２８７−１２９５，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２０１５．０１．０１４  （２０１５）。
【００９３】
３９．Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．  ＆  Ｈｏｂｂｓ，  Ｈ．  Ｈ．  Ｈｕｍａｎ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｏｌｄ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）  ３３２，  １５１９−１５２３，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０４２６５  （２０１１）。
【００９４】
４０．Ｗｅｌｚｅｌ，  Ｔ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：  ａ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＥＥＲ−Ｍｅｄｉｃａｒｅ  ｄａｔａｂａｓｅ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５４，  ４６３−４７１，  ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２４３９７  （２０１１）。
【００９５】
４１．Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．，  Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ，  Ｒ．，  Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ，  Ｍ．，  Ａｕｗｅｒｘ，  Ｊ．  ＆  Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，  Ｋ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｉｌｅ−ａｃｉｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，  ６７８−６９３，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ２６１９  （２００８）。
【００９６】
４２．Ｄａｖｉｄ，  Ｌ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｅｔ  ｒａｐｉｄｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｙ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５０５，  ５５９−５６３，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２８２０  （２０１４）。
【００９７】
４３．Ｄｅｖｋｏｔａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｅｔａｒｙ−ｆａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐａｔｈｏｂｉｏｎｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｉｌ１０−／−  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，  １０４−１０８，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１２２５  （２０１２）。
【００９８】
４４．Ｋｏｎｏｎｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，  ８４４−８４７  （１９９８）。
【００９９】
４５．Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥＣＴ２  ＲＥＧＵＬＡＴＥＳ  ＴＨＥ  Ｒｈｏ／ＥＲＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｘｉｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ６２（６）：  １２８７−９５  （２０１５）。
【０１００】
４６．Ｓｕｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｏ−Ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２０１４，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ３１２１３０。
【０１０１】
４７．Ｔａｋａｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅｓ  （ＰＬＫｓ）  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，  ２８７−２９１  （２００５）。
【図１】
0006951463.tif 000002
【図２Ａ】
0006951463.tif 000003
【図２Ｂ】
0006951463.tif 000004
【図２Ｃ】
0006951463.tif 000005
【図３】
0006951463.tif 000006
【図４】
0006951463.tif 000007
【図５】
0006951463.tif 000008
【図６Ａ】
0006951463.tif 000009
【図６Ｂ】
0006951463.tif 000010
【図７Ａ】
0006951463.tif 000011
【図７Ｂ】
0006951463.tif 000012
【図８Ａ】
0006951463.tif 000013
【図８Ｂ】
0006951463.tif 000014
【図９】
0006951463.tif 000015
【図１０】
0006951463.tif 000016
【図１１】
0006951463.tif 000017
【図１２Ａ】
0006951463.tif 000018
【図１２Ｂ】
0006951463.tif 000019
【図１３】
0006951463.tif 000020
【図１４Ａ】
0006951463.tif 000021
【図１４Ｂ】
0006951463.tif 000022
【図１５ＡＢ】
0006951463.tif 000023
【図１５ＣＤ】
0006951463.tif 000024
【図１５Ｅ】
0006951463.tif 000025
【図１６】
0006951463.tif 000026
【図１７Ａ】
0006951463.tif 000027
【図１７Ｂ】
0006951463.tif 000028
【図１８Ａ】
0006951463.tif 000029
【図１８Ｂ】
0006951463.tif 000030
【図１９Ａ】
0006951463.tif 000031
【図１９Ｂ】
0006951463.tif 000032
【図２０Ａ】
0006951463.tif 000033
【図２０Ｂ】
0006951463.tif 000034
【図２１Ａ】
0006951463.tif 000035
【図２１Ｂ】
0006951463.tif 000036
【図２２Ａ】
0006951463.tif 000037
【図２２Ｂ】
0006951463.tif 000038