【手続補正書】
【提出日】平成30年7月11日(2018.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
【請求項２】
第2の配列領域(ii)の逆相補体である配列の一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
エンドリボヌクレアーゼがRNase HIIである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
RNase HIIが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
切断可能なプローブが、第2の配列領域と、第2の配列領域の逆相補体である配列との間に、(v)1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ループ配列が4〜20ヌクレオチドの長さであり、第2の配列領域が6〜20ヌクレオチドの長さであり、かつ、第1の配列領域が4〜20ヌクレオチドの長さである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ループ配列が、少なくとも3〜5個連続したAヌクレオチドを含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
切断可能なプローブが、ループ配列中に伸長ブロッキング修飾を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
シグナルを等温的に増幅するために切断可能なプローブを使用することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
第1の切断可能なプローブを含む組成物であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、組成物。
【請求項１５】
第2の切断可能なプローブをさらに含み、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
第1および第2のプローブが、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、請求項14記載の組成物。
【請求項１７】
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)フルオロフォアであるレポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされたプローブを形成させる段階；
(c)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、トランケートされたヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)フルオロフォアおよびクエンチャーが物理的に分離されるように、トランケートされたヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに
(e)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
【請求項１８】
レポーター-クエンチャー対の一方のメンバーが、切断可能なプローブの5'末端にある、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを少なくとも第2の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対を含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の(またはさらなる)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)ヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに
(e)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
第1の切断可能なプローブと第2の切断可能なプローブが、(i)同じレポーターを有し、かつ(2)第1および第2の切断可能なプローブの切断と伸長の後に異なる融解温度(Tm)を有する、請求項19記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
[本発明1001]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1002]
第2の配列領域(ii)の逆相補体である配列の一部は、標的核酸の第1鎖上の第1領域に対して相補的である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
エンドリボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
RNase HがRNase HIIである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
エンドリボヌクレアーゼが熱安定性RNase HII酵素である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
エンドリボヌクレアーゼが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
切断可能なプローブが、第2の配列領域と、第2の配列領域の逆相補体である配列との間に、(v)1個以上のヌクレオチドのループ配列をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
ループ配列が4〜20、6〜15または10〜15ヌクレオチドの長さである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
ループ配列が、少なくとも3〜5個連続したAヌクレオチドを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
切断可能なプローブが、ループ配列中に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1007の方法。
[本発明1012]
第2の配列領域が6〜20ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
第1の配列領域が4〜20ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1014]
標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列が10〜50ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
切断可能なプローブの1個以上のリボヌクレオチド塩基が、第2の配列領域の逆相補体である配列のちょうど3'側に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1016]
切断可能なプローブの1個以上のリボヌクレオチド塩基が、標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列の3'末端から少なくとも4塩基に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1017]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1〜5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3〜5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドが、切断可能なプローブの5'末端に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
切断可能なプローブが3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
切断可能なプローブの第2の配列領域が、少なくとも50％のG/C含量を含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
切断可能なプローブの第2の配列領域が6〜15ヌクレオチドの長さである、本発明1001の方法。
[本発明1023]
切断可能なプローブの第2の配列領域が1個以上の非天然塩基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
エンドリボヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブおよび標的核酸は、標的核酸への切断可能プローブのアニーリング温度より低い融解点を有する、本発明1001の方法。
[本発明1025]
エンドリボヌクレアーゼ切断の後、トランケートされた切断可能プローブおよび標的核酸は、55℃未満の融解点を有する、本発明1001の方法。
[本発明1026]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーがレポーターである、本発明1001の方法。
[本発明1027]
レポーターがフルオロフォアである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
シグナルの変化が蛍光シグナルの減少である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1030]
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
切断可能なプローブが固相支持体に結合されている、本発明1001の方法。
[本発明1032]
少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドがisoGであり、他方がisoCである、本発明1001の方法。
[本発明1033]
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを第2の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1001の方法。
[本発明1034]
さらに、以下の段階：
(a)前記サンプルを第3、第4、第5または第6の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができるレポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(e)切断可能なプローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1033の方法。
[本発明1035]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、本質的に同時に実施される、本発明1033の方法。
[本発明1036]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、連続して実施される、本発明1033の方法。
[本発明1037]
第1および第2のプローブが、識別可能なレポーターを含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
第1および第2のプローブが、同じレポーターを含む、本発明1033の方法。
[本発明1039]
第1および第2のプローブによって形成されたヘアピンプローブが、識別可能な融解点を有する、本発明1038の方法。
[本発明1040]
第1、第2、第3、第4、第5および第6のプローブによって形成されたヘアピンプローブがそれぞれ、識別可能な標識または識別可能な融解点を有する、本発明1034の方法。
[本発明1041]
第1、第2、第3、第4、第5および第6の切断可能プローブがそれぞれ、同じ第1の配列領域、第2の配列領域および/または第2の配列領域と第2の配列領域の逆相補体である配列との間の同じループ配列を含む、本発明1034の方法。
[本発明1042]
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1043]
シグナルを等温的に増幅するために切断可能なプローブを使用することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1044]
複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1045]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前と実施した後に、該シグナルを検出することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1049]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することが、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
第1の切断可能なプローブを含む組成物であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、組成物。
[本発明1051]
第2の切断可能なプローブをさらに含み、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、本発明1050の組成物。
[本発明1052]
第1および第2のプローブが、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
少なくとも4つのプローブを含む、本発明1051の組成物。
[本発明1054]
レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含む、本発明1050の組成物。
[本発明1055]
ポリメラーゼ、エンドリボヌクレアーゼ酵素、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含む、本発明1050の組成物。
[本発明1056]
(a)第1の切断可能なプローブであって、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含むプローブ；ならびに
(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素；
を含んでなるキット。
[本発明1057]
少なくとも4つのプローブを含む、本発明1056のキット。
[本発明1058]
前記プローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1057のキット。
[本発明1059]
ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプルまたはキットの使用説明書をさらに含む、本発明1056のキット。
[本発明1060]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに
(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1061]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1〜5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
エンドリボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1060の方法。
[本発明1063]
RNase HがRNase HIIである、本発明1062の方法。
[本発明1064]
エンドリボヌクレアーゼが熱安定性RNase HII酵素である、本発明1060の方法。
[本発明1065]
エンドリボヌクレアーゼが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、本発明1060の方法。
[本発明1066]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3〜5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1061の方法。
[本発明1067]
切断可能なプローブ上の捕捉配列が1個以上の非天然塩基を含む、本発明1060の方法。
[本発明1068]
エンドリボヌクレアーゼ切断の前に、切断可能なプローブおよび捕捉プローブが55℃未満の融解点を有する、本発明1060の方法。
[本発明1069]
切断可能なプローブが、3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1060の方法。
[本発明1070]
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1060の方法。
[本発明1071]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーがレポーターである、本発明1060の方法。
[本発明1072]
レポーターがフルオロフォアである、本発明1071の方法。
[本発明1073]
シグナルの変化が蛍光シグナルの減少である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1060の方法。
[本発明1075]
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1074の方法。
[本発明1076]
捕捉プローブが固相支持体に結合されている、本発明1060の方法。
[本発明1077]
少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドがisoGであり、他方がisoCである、本発明1060の方法。
[本発明1078]
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを第2のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって第2の標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに
(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1060の方法。
[本発明1079]
さらに、以下の段階：
(a)サンプルを第3、第4、第5または第6のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一であり、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって第3、第4、第5または第6の標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)捕捉プローブ中の少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、クエンチャー標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長された切断可能プローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；ならびに
(f)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1078の方法。
[本発明1080]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、本質的に同時に実施される、本発明1078の方法。
[本発明1081]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、連続して実施される、本発明1078の方法。
[本発明1082]
第1および第2のセットのプローブが識別可能なレポーターを含む、本発明1078の方法。
[本発明1083]
第1および第2のセットのプローブが同じレポーターを含む、本発明1078の方法。
[本発明1084]
第1および第2のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブが識別可能な融解点を有する、本発明1083の方法。
[本発明1085]
第1、第2、第3、第4、第5および第6のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブが、それぞれ、識別可能なレポーターまたは識別可能な融解点を有する、本発明1079の方法。
[本発明1086]
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1087]
複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1088]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前と実施した後に、該シグナルを検出することを含む、本発明1087の方法。
[本発明1089]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む、本発明1087の方法。
[本発明1090]
検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含む、本発明1089の方法。
[本発明1091]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含む、本発明1087の方法。
[本発明1092]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することが、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
第1のセットのプローブを含む組成物であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、組成物。
[本発明1094]
第2のセットのプローブをさらに含み、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、本発明1093の組成物。
[本発明1095]
第1および第2のセットのプローブが、識別可能なレポーターを含むか、または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1094の組成物。
[本発明1096]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1094の組成物。
[本発明1097]
レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含む、本発明1093の組成物。
[本発明1098]
ポリメラーゼ、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含む、本発明1093の組成物。
[本発明1099]
(a)第1のセットのプローブであって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域と同一である配列領域であって、かつ切断可能なプローブからの少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと同一である少なくとも1個の未標識の非天然ヌクレオチドを含む、配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、第1のセットのプローブ；ならびに
(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素；
を含んでなるキット。
[本発明1100]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1099のキット。
[本発明1101]
前記セットのプローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1100のキット。
[本発明1102]
ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプルまたはキットの使用説明書をさらに含む、本発明1099のキット。
[本発明1103]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(f)切断可能なプローブの5'側で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに
(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1104]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な1〜5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1103の方法。
[本発明1105]
エンドリボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1103の方法。
[本発明1106]
RNase HがRNase HIIである、本発明1105の方法。
[本発明1107]
エンドリボヌクレアーゼが熱安定性RNase HII酵素である、本発明1103の方法。
[本発明1108]
エンドリボヌクレアーゼが好熱性ホットスタートRNase HII酵素である、本発明1103の方法。
[本発明1109]
切断可能なプローブが、標的核酸配列の第1鎖上の第1領域に相補的な3〜5個のリボヌクレオチド塩基を含む配列を含む、本発明1104の方法。
[本発明1110]
切断可能なプローブ上の捕捉配列が1個以上の非天然塩基を含む、本発明1103の方法。
[本発明1111]
エンドリボヌクレアーゼ切断の前に、切断可能なプローブと捕捉プローブが55℃未満の融解点を有する、本発明1103の方法。
[本発明1112]
切断可能なプローブが、その3'末端に伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1103の方法。
[本発明1113]
切断可能なプローブが、リボヌクレオチド塩基の3'側に位置する伸長ブロッキング修飾を含む、本発明1103の方法。
[本発明1114]
レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーがレポーターである、本発明1103の方法。
[本発明1115]
レポーターがフルオロフォアである、本発明1114の方法。
[本発明1116]
シグナルの変化が蛍光シグナルの減少である、本発明1115の方法。
[本発明1117]
標識からのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度を変化させたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1103の方法。
[本発明1118]
レポーターからのシグナルの変化を検出することが、サンプルの温度をヘアピンプローブの融解点より高く上げたときの、レポーターからのシグナルの変化を検出することを含む、本発明1117の方法。
[本発明1119]
捕捉プローブが固相支持体に結合されている、本発明1103の方法。
[本発明1120]
少なくとも1個の非天然ヌクレオチドまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドがisoGであり、他方がisoCである、本発明1103の方法。
[本発明1121]
さらに、以下の段階：
(a)前記サンプルを第2のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(f)切断可能なプローブの5'側で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに
(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1103の方法。
[本発明1122]
さらに、以下の段階：
(a)前記サンプルを第3、第4、第5または第6のセットのプローブと接触させる段階であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第3、第4、第5または第6の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブを捕捉プローブとハイブリダイズさせる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブを伸長させて、伸長されたプローブを形成させる段階；
(e)伸長された切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(f)切断可能なプローブの5'側で少なくとも1個の標識された非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブをさらに伸長させる段階；ならびに
(g)切断可能プローブおよびヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって、第3、第4、第5または第6の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1121の方法。
[本発明1123]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、本質的に同時に実施される、本発明1121の方法。
[本発明1124]
第1および第2の標的核酸の存在を検出することが、連続して実施される、本発明1121の方法。
[本発明1125]
第1および第2のセットのプローブが識別可能なレポーターを含む、本発明1121の方法。
[本発明1126]
第1および第2のセットのプローブが同じレポーターを含む、本発明1121の方法。
[本発明1127]
第1および第2のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブが、識別可能な融解点を有する、本発明1126の方法。
[本発明1128]
第1、第2、第3、第4、第5および第6のセットのプローブによって形成されたヘアピンプローブがそれぞれ、識別可能なレポーターおよび/または識別可能な融解点を有する、本発明1122の方法。
[本発明1129]
等温増幅を用いて標的核酸を増幅することをさらに含む、本発明1103の方法。
[本発明1130]
複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施することをさらに含む、本発明1103の方法。
[本発明1131]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する前と実施した後に、該シグナルを検出することを含む、本発明1130の方法。
[本発明1132]
標識からのシグナルの変化を検出することが、複数のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施した後にのみ、該シグナルを検出することを含む、本発明1130の方法。
[本発明1133]
検出された標識からのシグナルを、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識からの参照シグナルに対する該標識のシグナルの所定比率と比較することをさらに含む、本発明1132の方法。
[本発明1134]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することをさらに含む、本発明1130の方法。
[本発明1135]
サンプル中の標的核酸の量を定量化することが、標準曲線を使用すること；核酸標的の相対量を決定すること；エンドポイント定量を使用すること；またはシグナルがバックグラウンドに対して検出可能であるPCRサイクル数を、存在する標的の量に関連付けることによって、核酸標的の量を決定すること；を含む、本発明1134の方法。
[本発明1136]
第1のセットのプローブを含む組成物であって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、組成物。
[本発明1137]
第2のセットのプローブをさらに含み、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)第2の標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、本発明1136の組成物。
[本発明1138]
第1および第2のセットのプローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1137の組成物。
[本発明1139]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1137の組成物。
[本発明1140]
レポーター標識されたまたはクエンチャー標識された非天然ヌクレオチドをさらに含む、本発明1136の組成物。
[本発明1141]
ポリメラーゼ、参照プローブまたは遊離ヌクレオチドをさらに含む、本発明1136の組成物。
[本発明1142]
(a)第1のセットのプローブであって、該プローブのセットが切断可能なプローブと捕捉プローブとを含み、該切断可能なプローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む配列領域；(ii)捕捉配列；および(iii)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列；を含み、該捕捉プローブが、5'から3'の方向に、(i)切断可能なプローブからの該配列領域の一部と同一の配列領域；および(ii)切断可能なプローブの捕捉配列に相補的な配列；を含む、第1のセットのプローブ；ならびに
(b)レポーター標識された非天然ヌクレオチド；クエンチャー標識された非天然ヌクレオチド；またはエンドリボヌクレアーゼ酵素；
を含んでなるキット。
[本発明1143]
少なくとも4セットのプローブを含む、本発明1142のキット。
[本発明1144]
前記セットのプローブが、識別可能なレポーターを含み、かつ/または識別可能な融解点を有するヘアピンプローブを形成する、本発明1143のキット。
[本発明1145]
ポリメラーゼ、参照プローブ、遊離ヌクレオチド、参照サンプルまたはキットの使用説明書をさらに含む、本発明1142のキット。
[本発明1146]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしている切断可能プローブを切断して、トランケートされたプローブを形成させる段階；
(c)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、トランケートされたヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)フルオロフォアおよびクエンチャーが物理的に分離されるように、トランケートされたヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに
(f)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1147]
レポーター-クエンチャー対の一方のメンバーが、切断可能なプローブの5'末端にある、本発明1146の方法。
[本発明1148]
さらに、以下の段階：
(a)該サンプルを少なくとも第2の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対を含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)第2の(またはさらなる)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な1個以上のリボヌクレオチド塩基を含む配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブをエンドリボヌクレアーゼと接触させ、それによって標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(c)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(d)ヘアピンプローブを第1の配列領域上に伸長させる段階；ならびに
(e)該レポーターからのシグナルの変化を検出することによって第2の標的核酸を検出する段階；
を含んでなる、本発明1146の方法。
[本発明1149]
第1の切断可能なプローブと第2の切断可能なプローブが、(i)同じレポーターを有し、かつ(2)第1および第2の切断可能なプローブの切断と伸長の後に異なる融解温度(Tm)を有する、本発明1148の方法。
[本発明1150]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対の第1のメンバーで標識された少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含む第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブおよび上流プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；
(c)該核酸配列を、切断可能なヘアピンプローブに接触するまで、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで伸長させ、それにより標的核酸とハイブリダイズしているプローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(d)トランケートされた切断可能プローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、ヘアピンプローブを形成させる段階；
(e)第1の配列領域の少なくとも1個の非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、レポーター-クエンチャー対の第2のメンバーで標識された非天然ヌクレオチドの存在下で、該ヘアピンプローブを伸長させる段階；ならびに
(f)該ヘアピンプローブ上の標識からのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
[本発明1151]
ヘアピンプローブに対して融解分析を実施することをさらに含む、本発明1150の方法。
[本発明1152]
標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の段階：
(a)サンプルを第1の切断可能なプローブと接触させる段階であって、該プローブが、5'から3'の方向に、(i)レポーター-クエンチャー対で標識された第1の配列領域；(ii)第2の配列領域；(iii)第2の配列領域の逆相補体である配列；および(iv)標的核酸の第1鎖上の第1領域に相補的な配列、を含む、段階；
(b)該切断可能なプローブおよび上流プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて伸長反応を実施する段階；
(c)該核酸配列を、切断可能なヘアピンプローブに接触するまで、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで伸長させ、それにより標的核酸とハイブリダイズしている該プローブを切断して、トランケートされた切断可能プローブを形成させる段階；
(d)トランケートされたプローブをそれ自体にハイブリダイズさせて、切断されたヘアピンプローブを形成させる段階；
(e)フルオロフォアとクエンチャーが物理的に分離されるように、切断されたヘアピンプローブをそれ自体に伸長させる段階；ならびに
(f)伸長されたヘアピンプローブからのシグナルの変化を検出することによって標的核酸を検出する段階；
を含んでなる方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい態様を示すものの、単なる例示として提供されることを理解すべきである。というのは、本発明の精神および範囲内のさまざまな変更および修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。