【手続補正書】
【提出日】平成30年8月30日(2018.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫低下状態の対象を処置するための医薬組成物であって、第１の治療用ペプチドまたは第１の治療用ペプチドの複数コピーを含む第１の多価構造化ポリペプチドを含み、第１の治療用ペプチドは、以下からなる群から選択される、５から８個のアミノ酸の配列からなり：
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰまたはＫであるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬまたはＳであるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳまたはＬであるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）；
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加させるのに十分な量である、前記医薬組成物。
【請求項２】
がんおよび／またはウイルス感染に罹患している対象を処置するための医薬組成物であって、第１の治療用ペプチドまたは第１の治療用ペプチドの複数コピーを含む第１の多価構造化ポリペプチドを含み、第１の治療用ペプチドは、以下からなる群から選択される、５から８個のアミノ酸からなり：
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰまたはＫであるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬまたはＳであるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳまたはＬであるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）；
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加させることによってがんおよび／またはウイルスを処置するのに十分な量である、前記医薬組成物。
【請求項３】
第１の治療用ペプチドが、ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）、ＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）およびＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
対象ががんに罹患している、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
第１の治療用ペプチドが、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該医薬組成物が第１の多価構造化ポリペプチドを含み、第１の多価構造化ポリペプチドが分岐状である、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象が持続性ウイルス感染に罹患している、請求項１から４および６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
持続性ウイルス感染がＨＩＶ／エイズ感染、ＣＭＶ感染、ＨＢＶ感染、およびＨＣＶ感染からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
対象がＨＢＶ感染に罹患している、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該医薬組成物が、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫細胞の増殖を刺激し、Ｔ細胞が、ナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該医薬組成物を投与する前および該医薬組成物を投与した後に、対象における免疫細胞のレベルが決定される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
対象における免疫細胞のレベルがフローサイトメトリーにより決定される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該医薬組成物を投与した後の対象における免疫細胞のレベルの比が、該医薬組成物を投与する前の対象における免疫細胞のレベルの少なくとも１．５倍である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抑制性シグレック受容体に結合することによって免疫細胞を活性化する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＮＫＧ２ＤおよびＣＬＥＣ１０ａからなる群から選択される少なくとも１つの活性化受容体に結合することによって免疫細胞を活性化する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
第２の治療用ペプチドまたは第２の治療用ペプチドの複数コピーを含む第２の多価構造化ポリペプチドをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
第２の治療用ペプチドが、以下からなる群から選択される、５から８個のアミノ酸の配列からなる、請求項１６に記載の医薬組成物：
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）；および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、ＨおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）。
【請求項１８】
第２の治療用ペプチドがＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該医薬組成物が第２の多価構造化ポリペプチドを含み、第２の多価構造化ポリペプチドが分岐状である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
第２の治療用ペプチドが、複合型グリカン上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを機能的に模倣し、末端配列が、α（２，３）結合しているか、α（２，６）結合しているか、または末端糖である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
末端糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトースからなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
担体をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
抗炎症剤、Ｂ細胞増殖剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤およびＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
対象において抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物、または対象における受動免疫防御を増強するのに十分な量でそれらと共に混合される免疫グロブリンをさらに含む、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
対象における受動免疫防御を増強するのに十分な量でそれらと共に混合される免疫グロブリンをさらに含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【図１】一価の治療用ペプチドのモデルを示す図である。図１は、受容体シグレック−５（受託番号２ＺＧ１）のグリカン結合部位においてドッキングされた一価ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３、空間充填構造）のモデルを示し、予測される結合エネルギーはΔＧ’＝−４７ｋＪ／ｍｏｌである。予測される結合エネルギーは、受容体との強い相互作用を示唆し、ＫＤ＝〜１×１０−８Ｍである。
【図２】図２は、受容体ＮＫＧ２Ｄ（受託番号１ＭＰＵ）のリガンド結合部位においてドッキングされた一価ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３、空間充填構造）のモデルを示す。ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）に対する予測される結合エネルギーは、ΔＧ’＝−４０ｋＪ／ｍｏｌであった。これはＫＤ＝〜１×１０−７Ｍに相当する。
【図３】図３は、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して高度に特異的なＣＬＥＣ１０ａに相同なタンパク質である受容体アシアロ糖タンパク質受容体−１（ＡＳＧＰＲ−１）（受託番号１ＤＶ８）のリガンド結合部位においてドッキングされた一価ＳＶ６Ｄ（配列番号５、空間充填構造）のモデルを示す。予測される結合エネルギーは、ΔＧ’＝−４０ｋＪ／ｍｏｌであった。これはＫＤ＝〜１×１０−７Ｍに相当する。
【図４】ペプチドの最終設計のモデルを示す図である。４つの同一の活性配列（例えば、アーム１およびアーム２）をリンカー配列（３）によって、トリリシンアミドからなる中心コア（４）から伸長させた。
【図５】ＳＶＨ１Ｃ（［ＮＰＳＨＰＬＳＧＧＧＧＳ］４Ｋ３−ＮＨ２）の多価構造を示す。Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｓ、セリン；Ｈ、ヒスチジン；Ｌ、ロイシン；Ｇ、グリシン；Ｋ、リシン。ペプチドの分子量は４，５９３．９である。リンカー配列（ＧＧＧＳ）は、トリリシンコアから活性配列を伸長する。
【図６】ＳＶ６Ｄ（［ＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ］４Ｋ３−ＮＨ２）の多価構造を示す。Ｎ、アスパラギン；Ｑ、グルタミン；Ｈ、ヒスチジン；Ｔ、スレオニン；Ｐ、プロリン；Ｒ、アルギニン、Ｇ、グリシン；Ｓ、セリン；Ｋ、リシン。分子量は４，３６９．１である。リンカー配列（ＧＧＧＳ）は、トリリシンコアから活性配列を伸長する。
【図７】固相アッセイにおけるレクチン型受容体シグレック（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン受容体）および他のレクチン型受容体へのＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）の結合を示す図である。これらのアッセイにおける緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳであった。図は、受容体に結合したＳＶＨ１Ｃに結合したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を示す。受容体はＦｃ−キメラであり、プロテインＡ／Ｇ−コーティングしたマイクロタイターウェルでアッセイした。シグレック−１およびＣＬＥＣ１０ａはＣ末端Ｈｉｓタグを含有しており、Ｎｉコーティングしたウェルとは別の実験でアッセイした。ＳＥＭは、二連で実施した４つの独立した実験から決定した。フェツインによる阻害は、各受容体群において糖タンパク質を１０μＭで添加（２番目の黒色の棒）、または３０μＭで添加（３番目の薄灰色の棒）した２つのアッセイの平均によって示す。結合は、ペルオキシダーゼの比色アッセイによって測定した。
【図８】固相アッセイにおけるＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）の受容体ＮＫＧ２Ｄへの結合を示す図である。Ａでは、受容体に結合したＳＶＨ１Ｃに結合したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで十分洗浄した後に測定した。フェツイン（５μＭ、黒色の棒；１０μＭ、薄灰色の棒；３０μＭ、灰色の棒）およびシアリルラクトース（１２μＭ、黒色の棒；２０μＭ、薄灰色の棒；４０μＭ、灰色の棒）が阻害剤として含まれていた。結合は、ペルオキシダーゼの比色アッセイによって測定した。このアッセイは、３回実施した。Ｂでは、フェツイン（丸）またはシアリルラクトース（正方形）によるＳＶＨ１ＣのＮＫＧ２Ｄへの結合の阻害をグラフ表示した。
【図９】５分間、１００ｎＭのＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）でヒトＰＢＭＣを処置した後の細胞表面免疫受容体のリン酸化の変化を示す図である。細胞溶解産物を捕捉抗体のアレイ上に広げ、リン酸化形態をホスホチロシン抗体（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｒｒａｙ、  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）によって検出した。ＣＤ２２９、ＦｃγＲＩＩＡ、ＬＡＩＲ−１、シグレック−２、−３、−５、−７、−９および−１０のリン酸化形態は減少したが、ＢＬＡＭＥ（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）は増加した。ＦｃＲＨ４、ＳＨＰ−１およびＮＫｐ４６は有意には変化しなかった。この実験は、本ペプチドがヒト細胞に対して劇的な効果を有することを示した。
【図１０】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）を隔日で皮下注射すると、腹腔内の免疫細胞群に比較的大きな増加が生じたことを示す図である。次第に濃くなる棒は、１日、３日および５日間の処置での、すなわち、０日目、２日目および４日目にそれぞれ注射した２４時間後の特定の細胞型群を示す。腹膜細胞を３匹の動物から採取し、プールし、フローサイトメトリーによって分析した。細胞型を同定するために使用したマーカーは、図の上部に記載している。各細胞型の総数をプロットし、スケールを各細胞型の上部に示した。細胞は、図下部の横方向の通常表示によって識別される。星印は、ＣＤ６９を発現する活性化群を示す。
【図１１】ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）およびＳＶ６Ｂ（配列番号２）の抗ウイルス活性を、抗ＨＩＶ抗体を含まないＰＢＭＣ培養物においてＨＩＶ−１複製を阻害することにより示す図である。
【図１２】固相アッセイにおけるレクチン型受容体ＣＬＥＣ１０ａ、ランゲリン、ＡＳＧＰＲ−１、デクチン−１および他のレクチン型受容体へのＳＶ６Ｄ（配列番号５）の結合を示す図である。これらのアッセイにおける緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳであった。図は、受容体に結合したＳＶ６Ｄに結合したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を示す。受容体はＦｃ−キメラであり、プロテインＡ／Ｇコーティングしたマイクロタイターウェルにおいてアッセイした。このアッセイは、図７で記載したものと同様であった。
【図１３Ａ】５分、１０分または１５分間、１００ｎＭのＳＶ６Ｄで処置した培養物中のヒトＰＢＭＣにおけるシグナル伝達キナーゼのリン酸化の変化を示す図である。細胞溶解産物を捕捉抗体アレイ上に広げ、リン酸化形態はヒトホスホキナーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）により検出した。
【図１３Ｂ】５分、１０分または１５分間、１００ｎＭのＳＶ６Ｄで処置した培養物中のヒトＰＢＭＣにおけるシグナル伝達キナーゼのリン酸化の変化を示す図である。細胞溶解産物を捕捉抗体アレイ上に広げ、リン酸化形態はヒトホスホキナーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）により検出した。
【図１４】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＳＶ６Ｄ（配列番号５）を隔日で皮下注射すると、腹腔内の免疫細胞群に比較的大きな増加が生じたことを示す図である。次第に濃くなる棒は、１日、３日および５日間の処置での、すなわち、０日目、２日目および４日目にそれぞれ注射した２４時間後の特定の細胞型群を示す。腹膜細胞を３匹の動物から採取し、プールし、フローサイトメトリーによって分析した。細胞型を同定するために使用したマーカーは、図の上部に記載している。各細胞型の総数をプロットし、スケールを各細胞型の上部に示した。細胞は、図下部の横方向の通常表示によって識別される。星印は、ＣＤ６９を発現する活性化群を示す。
【図１５】卵巣がん細胞株を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスの処置効果を示す図である。１日おきに皮下注射したＳＶ６Ｄ（配列番号５）の１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量または０．１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量で処置する間、個々のマウスの体重を測定した。腹水形成は処置の開始時に明らかであり、示した体重は処置後２週間のものである。０．１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量の有効性は、現在使用の化学療法薬パクリタキセルの有効性と類似していた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
ペプチドのレクチンへの直接結合
ＭＡＡおよびＳＮＡ１などのレクチンへのＳＶＨ１Ｃの結合［１９］は、ペプチドが複合型グリカンの末端上のＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ配列を模倣することを示唆している。この配列は、ＮＫ細胞およびδγＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞上の受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドである［１８］。また、１４種のレクチン型受容体のファミリー、シグレック（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）は、Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−配列に結合する（文献１３において概説されている）。シグレックは、細胞間相互作用を促進し、グリカン認識を介して自然免疫系および適応免疫系における細胞の機能を制御すると考えられる。これらの受容体は、分子モデリングによって予測されるように、ペプチドの可能性のある標的である（図１〜３）。ＮＫＧ２ＤはＮｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ結合に特異的であるが、シグレックファミリーのメンバーは、α（２，３）結合またはα（２，６）結合に対して特異性を示す。したがって、ペプチドは、これらの受容体の全部に結合する適応性を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018514558.tif 000009
【図１０】
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【図１１】
2018514558.tif 000011
【図１２】
2018514558.tif 000012
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2018514558.tif 000014
【図１４】
2018514558.tif 000015
【図１５】
2018514558.tif 000016