【手続補正書】
【提出日】平成30年6月28日(2018.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最小必須培地、増殖因子、ホルモン、可溶性因子及び血清又は代用血清を含む、LSC、LSC様、SESC又はSESC様の短期又は長期インビトロ培養のためのフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項２】
短期インビトロ培養が、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞の第0〜約第4継代である、請求項1に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項３】
DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎仔血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素及び3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、前記ウシ胎仔血清は任意にヒト血清又は代用血清に代替され、EGF及びインスリンが、それぞれ、任意に組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであり、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCEC又は皮膚表皮細胞に分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的に等価の成分に置換される、請求項1に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項４】
DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに10〜20%の範囲のウシ胎仔血清又は10〜20%の範囲の血清の代用血清、10〜20ng/mlの範囲のEGF、5〜10μg/mlの範囲のインスリン、0.2〜0.8μg/mlの範囲のヒドロコルチゾン、5×10-11〜5×10-10Mの範囲のコレラ毒素及び10-9M〜4×10-9Mの範囲の3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、EGF及びインスリンが、それぞれ、任意に組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであり、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCEC又は皮膚表皮細胞に分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的に等価の成分に置換される、請求項1に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項５】
DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10%ウシ胎仔血清、10ng/ml EGF、5μg/mlインスリン、0.4μg/mlヒドロコルチゾン、10-10Mコレラ毒素及び2×10-9M 3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、ウシ胎仔血清は任意にヒト血清又は代用血清に代替され、EGF及びインスリンが、それぞれ、任意に組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであり、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCEC又は皮膚表皮細胞に分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的に等価の成分に置換される、請求項1に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項６】
rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む、請求項1に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項７】
長期インビトロ培養が、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞の17継代以上の継代である、請求項6に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項８】
DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎仔血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素及び3,3',5-トリヨード-L-チロニン、及びY-27632を含み、ウシ胎仔血清は任意にヒト血清又は代用血清に代替され、EGF及びインスリンが、それぞれ、任意に組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであり、Y-27632は任意に別のROCK阻害剤に置換され、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCEC又は皮膚表皮細胞に分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的に等価の成分に置換される、請求項6に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項９】
DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに10〜20%の範囲のウシ胎仔血清又は10〜20%の範囲の血清の代用血清、10〜20ng/mlの範囲のEGF、5〜10μg/mlの範囲のインスリン、0.2〜0.8μg/mlの範囲のヒドロコルチゾン、5×10-11〜5×10-10Mの範囲のコレラ毒素、10-9M〜4×10-9Mの範囲の3,3',5-トリヨード-L-チロニン及び1〜10μMの範囲のY-27632を含み、EGF及びインスリンが、それぞれ、任意に組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであり、Y-27632は任意に別のROCK阻害剤に置換され、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCEC又は皮膚表皮細胞に分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的等価物に置換される、請求項6に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１０】
DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10%ウシ胎仔血清、10ng/ml EGF、5μg/mlインスリン、0.4μg/mlヒドロコルチゾン、10-10Mコレラ毒素、2×10-9M 3,3',5-トリヨード-L-チロニン及び1μM Y-27632を含み、ウシ胎仔血清は任意にヒト血清又は代用血清に代替され、EGF及びインスリンが、それぞれ、任意に組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであり、Y-27632は任意に別のROCK阻害剤に置換され、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCEC又は皮膚表皮細胞に分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的等価物に置換される、請求項6に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１１】
白血病抑制因子(LIF)をさらに含む、請求項6に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１２】
長期インビトロ培養が、LSC又はLSC様細胞の17継代以上の継代である、請求項11に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１３】
DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎仔血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素及び3,3',5-トリヨード-L-チロニン、Y-27632及びLIFを含み、ウシ胎仔血清は任意にヒト血清又は代用血清に置換され、EGF、インスリン及びLIFが、それぞれ、任意に組換えEGF、組換えインスリン及び/又は組換えLIF、好ましくは組換えヒトEGF、組換えヒトインスリン及び組換えヒトLIFであり、Y-27632は任意に別のROCK阻害剤に置換され、ここでLSC又はLSC様細胞がCECに分化することなく増殖するしない限り、成分の各々が任意に機能的に等価の成分に置換される、請求項11に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１４】
DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに10〜20%の範囲のウシ胎仔血清又は10〜20%の範囲の血清の代用血清、10〜20ng/mlの範囲のEGF、5〜10μg/mlの範囲のインスリン、0.2〜0.8μg/mlの範囲のヒドロコルチゾン、5×10-11〜5×10-10Mの範囲のコレラ毒素、10-9M〜4×10-9Mの範囲の3,3',5-トリヨード-L-チロニン、1〜10μMの範囲のY-27632及び5〜20ng/ml LIFを含み、EGF、インスリン及びLIFが、それぞれ、任意に組換えEGF、組換えインスリン及び/又は組換えLIF、好ましくは組換えヒトEGF、組換えヒトインスリン及び組換えヒトLIFであり、Y-27632は任意に別のROCK阻害剤に置換され、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞がCECに分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的等価物に置換される、請求項11に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１５】
培地が、DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10%ウシ胎仔血清、10ng/ml EGF、5μg/mlインスリン、0.4μg/mlヒドロコルチゾン、10-10Mコレラ毒素、2×10-9M 3,3',5-トリヨード-L-チロニン、1μM Y-27632及び10ng/ml LIFを含み、ウシ胎仔血清は任意にヒト血清又は代用血清に置換され、EGF、インスリン及びLIFが、それぞれ、任意に組換えEGF、組換えインスリン及び/又は組換えLIF、好ましくは組換えヒトEGF、組換えヒトインスリン及び組換えヒトLIFであり、Y-27632は任意に別のROCK阻害剤に置換され、ここでLSC又はLSC様細胞がCECに分化することなく増殖する限り、成分の各々が任意に機能的等価物に置換される、請求項11に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１６】
ROCK阻害剤が、(R)-(+)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物(Y-27632、Sigma-Aldrich)、5-(1,4-ジアゼパン-1-イルスルホニル)イソキノリン(ファスジル又はHA1077、Cayman Chemical)、H-1152、H-1152P、(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]ホモピペラジン二塩酸塩、ジメチルファスジル(diMF、H-1152P)、N-(4-ピリジル)-N'-(2,4,6-トリクロロフェニル)尿素、Y-39983、Wf-536、SNJ-1656、及び(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン二塩酸塩、イミダゾール含有ベンゾジアゼピン、イミダゾピリジン誘導体、インダゾールコア、2-アミノピリジン/ピリミジンコア、9-デアザグアニン誘導体、ベンズアミド又はアミノフラザンを含む化合物、並びにこれらの誘導体及び類似体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項6又は11に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１７】
ウシ胎仔血清がヒト血清又は代用血清に置換される、請求項3、4、5、8、9、10、13、14又は15に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１８】
EGF、インスリン又はLIFが、それぞれ、組換えEGF、組換えインスリン又は組換えLIFである、請求項3、4、5、8、9、10、13、14又は15に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項１９】
EGFが、組換えヒトEGFである、請求項18に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項２０】
インスリンが、組換えヒトインスリンである、請求項18に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【請求項２１】
LIFが、組換えヒトLIFである、請求項18に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
本明細書を通して様々な出版物が参照されている。各出版物は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられることを意図している。
本発明の様々な態様を以下に示す。
１．染色体に組み込まれた、あるいは組み込まれていない染色体外遺伝物質のままのPAX6をコードする、化学合成、組換え、又は単離核酸を含む、単離された輪部幹若しくは前駆細胞(LSC)集団又はLSC様集団であって、単離されたLSC集団は非LSC細胞を実質的に含まず、又はLSC様集団は非LSC様細胞を実質的に含まず、又は単離されたLSC又はLSC様集団は非LSC細胞及び非LSC様細胞を実質的に含まない、単離されたLSC集団又はLSC様集団。
２．化学合成、組換え、又は単離核酸が、PAX6又はその断片を発現することができ、PAX6又はその断片が、LSC又はLSC様状態を維持することができ、又は幹細胞又は前駆細胞をLSC又はLSC様状態へと方向づけることができ、LSC又はLSC様状態が、結果として角膜上皮細胞(CEC)に至る分化経路に細胞集団を制限する、上記1に記載の単離されたLSC集団又はLSC様集団。
３．化学合成、組換え、又は単離核酸が、PAX6又はその断片を発現し、PAX6又はその断片が、LSC又はLSC様状態を維持し、又は幹細胞又は前駆細胞をLSC又はLSC様状態へと方向づけ、LSC又はLSC様状態が、結果として角膜上皮細胞に至る分化経路に細胞集団を制限する、上記2に記載の単離されたLSC集団又はLSC様集団。
４．染色体に組み込まれた、あるいは組み込まれていない染色体外遺伝物質のままのPAX6をコードする、化学合成、組換え、又は単離核酸を含む、単離された皮膚上皮幹細胞(SESC)集団又はSESC様集団であって、単離されたSESC集団は非SESC細胞を実質的に含まず、又はSESC様集団は非SESC様細胞を実質的に含まず、又は単離されたSESC又はSESC様集団は非SESC細胞及び非SESC様細胞を実質的に含まず、又は単離されたSESC又はSESC様集団は非SESC、非SESC様、非LSC及び非LSC様細胞を実質的に含まない、単離されたSESC集団又はSESC様集団。
５．化学合成、組換え、又は単離核酸が、PAX6又はその断片を発現することができ、PAX6又はその断片が、LSC又はLSC様状態を維持することができ、又は幹細胞又は前駆細胞をLSC又はLSC様状態へと方向づけることができ、LSC又はLSC様状態が、結果として角膜上皮細胞に至る分化経路に細胞集団を制限する、上記4に記載の単離されたSESC集団又はSESC様集団。
６．化学合成、組換え、又は単離核酸が、PAX6又はその断片を発現し、PAX6又はその断片が、SESC又はSESC様細胞をLSC又はLSC様状態へと方向づけ、LSC又はLSC様状態が、結果として角膜上皮細胞に至る分化経路に細胞集団を制限する、上記5に記載の単離されたSESC集団又はSESC様集団。
７．上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団及び適する担体を含む、医薬組成物。
８．上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団及び適する担体を含む、医薬組成物。
９．CECに分化することなく少なくとも17継代にわたって培養することができる、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
１０．第3継代でのPAX6及びp63を発現する細胞の割合が、第17継代での割合と同じである、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
１１．第3継代でK19及びKi67を発現する細胞の割合が、第17継代以降での割合よりわずかに大きい、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
１２．CECに分化することなく40〜60世代にわたって安定的に繁殖できる細胞を含む、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
１３．角膜上皮細胞集団に分化する、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
１４．皮膚表皮細胞又は角膜上皮細胞に分化することなく少なくとも17継代にわたって培養することができる、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
１５．皮膚表皮細胞又は角膜上皮細胞に分化することなく40〜60世代にわたって安定的に繁殖できる細胞を含む、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
１６．細胞運命がLSC又はLSC様細胞運命に切り替えられたSESC又はSESC様細胞を含む、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
１７．LSC又はLSC様細胞運命を採用したSESC集団又はSESC様集団であって、SESC又はSESC様細胞運命が存在しない、上記16に記載のSESC集団又はSESC様集団。
１８．角膜上皮細胞に分化する、上記4、16又は17に記載のSESC集団又はSESC様集団。
１９．実質的に皮膚表皮細胞を含まない、角膜上皮細胞に分化する、上記18に記載のSESC集団又はSESC様集団。
２０．LSC集団又はLSC様集団の90〜95%が、p63、PAX6、K19及びKi67を発現する、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
２１．LSC集団の5%未満が、K5及びK14を発現する、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
２２．LSC集団の95%より多くが、WNT7A及びFZD5を発現する、上記1に記載のLSC集団。
２３．LSC様集団の5%未満が、WNT7Aを発現する、上記1に記載のLSC様集団。
２４．細胞集団の90〜95%が、SESC又はSESC様細胞運命のままで、p63、K5及びKi67を発現する、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
２５．K3又はK12発現が、SESC又はSESC様細胞運命のままである細胞では検出されない、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
２６．WNT7Aが、SESC又はSESC様細胞運命のままである細胞において、LSC細胞におけるレベルより約4倍〜5倍低いレベルで発現される、上記4に記載のSESC集団。
２７．PAX6が、SESC又はSESC様細胞運命のままである細胞において発現されないか、又はLSC細胞におけるレベルの約8分の1未満のレベルで発現される、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
２８．WNT7Aが、SESC様運命のままである細胞の70%より多くで発現される、上記4に記載のSESC様集団。
２９．LSC又はLSC様細胞運命に切り替えられた集団内の細胞の90〜95%が、p63、PAX6、K19及びKi67を発現する、上記16に記載のSESC集団又はSESC様集団。
３０．角膜上皮細胞がPAX6並びに角膜上皮マーカー、K3及びK12を発現する、上記2又は18に記載のLSC集団又はLSC様集団。
３１．皮膚表皮細胞が、皮膚表皮分化マーカー、K1及びK10を発現する、上記19に記載のSESC集団又はSESC様集団。
３２．ヒトである、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
３３．ヒトである、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
３４．遺伝子改変されている、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
３５．遺伝子改変されている、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
３６．LSC又はLSC様細胞運命のままであるか、又はLSC又はLSC様細胞運命を維持する、上記1に記載のLSC集団又はLSC様集団。
３７．SESC又はSESC様細胞運命からLSC又はLSC様細胞運命に切り替えられる、上記4に記載のSESC集団又はSESC様集団。
３８．複数の上記1又は4に記載の細胞を含む被定義細胞集団。
３９．均一である、上記38に記載の被定義細胞集団。
４０．不均一である、上記38に記載の被定義細胞集団。
４１．クローン性であるか、又は単一細胞に由来する、上記38に記載の被定義細胞集団。
４２．角膜上皮細胞に発達するように決定された、上記38に記載の幹細胞の子孫細胞。
４３．上記38に記載の細胞を含む組織。
４４．対象において組織を形成する方法であって、対象中又は対象上に、上記42に記載の子孫細胞を、前記対象の角膜上皮細胞の形成に十分な量で導入することを含む方法。
４５．対象において組織を再生又は修復する方法であって、対象中又は対象上に、上記1又は4に記載の細胞を、組織の再生又は修復に十分な量で導入することを含む方法。
４６．再生又は修復される組織が、輪部幹又は前駆細胞(LSC)と角膜上皮細胞とを含む角膜上皮細胞系統の組織を含む、上記45に記載の方法。
４７．対象の皮膚上皮幹細胞(SESC)から輪部幹細胞又は前駆細胞(LSC)様細胞を得る方法であって、SESCをLSC様細胞に転換するのに十分なレベルにSESC中のPAX6タンパク質を増加させることによって対象のSESCからLSC様細胞を得るための、SESCへのPAX6遺伝子の導入又はSESCにおけるPAX6遺伝子発現のアップレギュレーションを含む方法。
４８．対象の皮膚上皮幹細胞(SESC)から輪部幹又は前駆細胞(LSC)様細胞を得るためのSESCへのPAX6遺伝子の導入又はSESCにおけるPAX6遺伝子発現のアップレギュレーションが、
(a)SESCを対象から得るステップ、
(b)SESCをインビトロ又はエクスビボでのフィーダーフリー細胞培養で培養するステップ、
(c)SESCに少なくとも1つのPAX6遺伝子を導入して又はSESCにおけるPAX6遺伝子発現をアップレギュレートさせて、SESCを輪部幹細胞又は前駆細胞(LSC)様細胞に転換するのに十分なレベルにSESC中のPAX6タンパク質を増加させ、それによって対象からの皮膚上皮幹細胞(SESC)から哺乳動物輪部幹細胞又は前駆細胞(LSC)様細胞を得るステップ
を含む、上記47に記載の方法。
４９．インビトロの方法であるか、エクスビボ方法であるか、又は生体内原位置（in situ）で若しくは直接対象に適用される、上記47に記載の方法。
５０．PAX6タンパク質をコードする核酸を導入するか、PAX6遺伝子発現をアップレギュレートするか、又はPAX6活性を増加させる薬剤で、対象が処置される、上記47に記載の方法。
５１．薬剤が、遺伝子治療ベクター、ウイルス粒子、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換え核酸、組換えタンパク質、PAX6タンパク質、PAX6発現の小分子レギュレーター、PAX6発現の負のレギュレーターの阻害剤、PAX活性の負のレギュレーターの小分子阻害剤、PAX6活性の小分子エンハンサー、又はこれらの組合せを含む、上記47に記載の方法。
５２．PAX6遺伝子が、PAX6a遺伝子、PAX6b遺伝子、操作されたPAX6a遺伝子、操作されたPAXb遺伝子、PAX6遺伝子ファミリーの任意のメンバー、PAX6aタンパク質のすべて又は一部をコードする核酸、PAX6bタンパク質のすべて又は一部をコードする核酸、及びPAX6又はPAX6様活性を有するタンパク質をコードする任意の核酸のセットから選択される、上記47又は48に記載の方法。
５３．PAX6タンパク質が、PAX6aタンパク質、PAX6bタンパク質、タンパク質のPAX6ファミリーの任意のメンバー、及びPAX6又はPAX6様活性を有する任意のタンパク質のセットから選択される、上記47又は48に記載の方法。
５４．PAX6又はPAX6様活性を有するタンパク質が、内因性K19の発現増加を生じさせることができる任意のタンパク質であり、K19がアップレギュレートされたSECSが、K3及びK12遺伝子発現増加並びにK1及びK10遺伝子発現減少を有する角膜上皮細胞(CEC)又はCEC様細胞に分化しうる、上記52又は53に記載の方法。
５５．上記48に記載のLSC様細胞から角膜上皮細胞(CEC)様細胞を得る方法であって、フィーダーフリーLSC分化培地で(c)の細胞を分化させてLSC様細胞をCEC様細胞に転換するステップをさらに含む方法。
５６．フィーダーフリーLSC分化培地が既知組成である、上記55に記載の方法。
５７．培地がゼノフリーであるか、又は培地に培養細胞と同じ種に由来する成分以外の成分を含まない、上記56に記載の方法。
５８．培地が無血清である、上記56に記載の方法。
５９．培地が、一切の動物又はヒト産物を有さない、上記56に記載の方法。
６０．皮膚上皮幹細胞(SESC)から輪部幹又は前駆細胞(LSC)様細胞を得る方法であって、
(a)SESCを対象から得るステップ、
(b)SESCをインビトロでのフィーダーフリー細胞培養で培養するステップ、
(c)SESCにおけるPAX6遺伝子発現をアップレギュレートさせる薬剤とSESCを接触させて、SESCを輪部幹細胞又は前駆細胞(LSC)様細胞に転換するの十分なレベルにSESC中のPAX6タンパク質を増加させ、それによって対象からの皮膚上皮幹細胞(SESC)から哺乳動物輪部幹細胞又は前駆細胞(LSC)様細胞を得るステップ
を含む、方法。
６１．薬剤が、PAX6遺伝子を含む核酸、遺伝子治療ベクター、ウイルス粒子、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換えタンパク質、PAX6タンパク質、PAX6発現の小分子レギュレーター、PAX6発現の負のレギュレーターの阻害剤、PAX活性の負のレギュレーターの小分子阻害剤、PAX6活性の小分子エンハンサー、及びこれらの組合せからなる群から選択される、上記60に記載の方法。
６２．PAX6遺伝子が、PAX6a遺伝子、PAX6b遺伝子、操作されたPAX6a遺伝子、操作されたPAXb遺伝子、PAX6遺伝子ファミリーの任意のメンバー、PAX6aタンパク質のすべて又は一部をコードする核酸、PAX6bタンパク質のすべて又は一部をコードする核酸、及びPAX6又はPAX6様活性を有するタンパク質をコードする任意の核酸のセットから選択される、上記61に記載の方法。
６３．PAX6タンパク質が、PAX6aタンパク質、PAX6bタンパク質、タンパク質のPAX6ファミリーの任意のメンバー、並びにPAX6又はPAX6様活性を有する任意のタンパク質及びその断片のセットから選択される、上記61に記載の方法。
６４．対象から哺乳動物LSCを得るためのインビトロの方法であって、
(a)対象の眼の輪部領域から組織のサンプルを採取するステップ、
(b)組織を解離させて単一細胞を得るステップ、及び
(c)LSCの増殖を可能にするようにフィーダーフリー細胞培養培地で(b)の単一細胞を培養するステップであって、ここで増殖したLSCは角膜上皮細胞(CEC)に分化する潜在力を有し、それによって対象からインビトロで哺乳動物LSCを得る、ステップ
を含む、方法。
６５．輪部領域が眼の角膜輪部を含む、上記64に記載の方法。
６６．(b)における組織の解離が、解離剤での処置を含み、解離剤が、組織をより小さい塊及び単一細胞に機械的に解離させるための機器若しくはツール、酵素、プロテアーゼ、化学薬品、金属キレート剤、レーザー又はこれらの組合せである、上記64に記載の方法。
６７．フィーダーフリー細胞培養培地が、rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤若しくは白血病抑制因子(LIF)又は両方をさらに含む、上記60又は64に記載の方法。
６８．ROCK阻害剤が、Y-27632(4-[(1R)-1-アミノエチル]-N-4-ピリジニル-トランス-シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩)である、上記67に記載の方法。
６９．LSC又はLSC様細胞を、マトリックス又は細胞外マトリックス上で培養することによって、CEC様細胞に転換するステップをさらに含む、上記60又は64に記載の方法。
７０．対象から哺乳動物輪部幹又は前駆細胞(LSC)を得てフィーダーフリーLSC培養培地においてインビトロで拡大させる方法であって、
(a)対象の眼の輪部領域から組織のサンプルを採取するステップ、
(b)組織を解離させて単一細胞を得るステップ、及び
(c)LSCの増殖を可能にするようにフィーダーフリー細胞培養培地で(b)の単一細胞を培養するステップであって、ここで増殖したLSCは角膜上皮細胞(CEC)に分化する潜在力を有し、それによって対象から哺乳動物輪部幹細胞を得てインビトロで拡大させる、ステップを含む、方法。
７１．(c)において、単一細胞がマトリックス又は細胞外マトリックス上で培養される、上記48又は70に記載の方法。
７２．マトリックス又は細胞外マトリックスが、Matrigel(登録商標)又はその等価物、増殖因子低減Matrigel(登録商標)又はその等価物、コラーゲン、コラーゲンIV、コラーゲンIVシート、哺乳動物羊膜、ヒト羊膜、フィブリノーゲン、トロンビン、パールカン、ラミニン、フィブロネクチン、組換えフィブロネクチン、プロテオグリカン、プロコラーゲン、ヒアルロン酸、エンタクチン、ヘパラン硫酸、テネイシン、ポリ-L-リシン、ゼラチン、ポリ-L-オルニチン、細胞外マトリックスタンパク質、トロンビンシート、フィブリノーゲンとトロンビンシート、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、上記71に記載の方法。
７３．増殖したLSC又はLSC様細胞を継代前に70〜90%の集密度及び継代後に15〜20%の集密度で継代するステップ(d)をさらに含む、上記70に記載の方法。
７４．増殖したLSC又はLSC様細胞をLSC又はLSC様細胞として安定的に継代することができる回数が、17継代以上である、上記73に記載の方法。
７５．LSCが、約16〜20時間の世代時間で増殖する、上記73に記載の方法。
７６．LSC又はLSC様細胞が、CECに分化することなく40〜60世代にわたって安定的に繁殖する、上記73に記載の方法。
７７．フィーダーフリーLSC培養培地が1日おきに交換される、上記70に記載の方法。
７８．輪部領域が、眼の角膜輪部、角膜と結膜の間の周縁部、角膜と強膜の境界、角強膜輪部、柵間乳頭間突起を含む領域、又はVogt柵を含む領域を含む、上記70に記載の方法。
７９．(b)における組織の解離が、解離剤での処置を含み、解離剤が、組織をより小さい塊及び単一細胞に機械的に解離させるための機器若しくはツール、酵素、プロテアーゼ、化学薬品、金属キレート剤、レーザー又はこれらの組合せである、上記70に記載の方法。
８０．プロテアーゼが、トリプシン、コラゲナーゼIV、又はこれらの組合せを含む、上記79に記載の方法。
８１．金属キレート剤が、EDTA、EGTA、又はこれらの組合せを含む、上記79に記載の方法。
８２．フィーダーフリー細胞培養培地が、最小必須培地、増殖因子、ホルモン及び可溶性因子を含む、上記70に記載の方法。
８３．フィーダーフリー細胞培養培地が、好ましくは、LSCを得て拡大させる種からの血清、又は代用血清をさらに含む、上記82に記載の方法。
８４．フィーダーフリー細胞培養培地が、rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤をさらに含む、上記82に記載の方法。
８５．ROCK阻害剤が、(R)-(+)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物(Y-27632)、5-(1,4-ジアゼパン-1-イルスルホニル)イソキノリン(ファスジル又はHA1077)、H-1152、H-1152P、(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]ホモピペラジン二塩酸塩、ジメチルファスジル(diMF、H-1152P)、N-(4-ピリジル)-N'-(2,4,6-トリクロロフェニル)尿素、Y-39983、Wf-536、SNJ-1656、及び(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン二塩酸塩(H-1152)、イミダゾール含有ベンゾジアゼピン、イミダゾピリジン誘導体、インダゾールコア、2-アミノピリジン/ピリミジンコア、9-デアザグアニン誘導体、ベンズアミド又はアミノフラザンを含む化合物、並びにこれらの誘導体及び類似体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、上記84に記載の方法。
８６．対象からのLSCの単離後、LSCの第4継代後にフィーダーフリー細胞培養培地にROCK阻害剤が添加される、上記84に記載の方法。
８７．フィーダーフリー細胞培養培地が、白血病抑制因子(LIF)をさらに含む、上記82に記載の方法。
８８．対象からのLSCの単離後、LSCの第4継代後にフィーダーフリー細胞培養培地にLIFが添加される、上記87に記載の方法。
８９．フィーダーフリー細胞培養培地が、DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素、3,3',5-トリヨード-L-チロニン、又はこれらの組合せを含み、血清が、ウシ胎仔血清、しかし好ましくは培養されるLSCと同じ種からの血清、又は代用血清でありうる、上記70に記載の方法。
９０．フィーダーフリー細胞培養培地が、DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素、及び3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、血清が、ウシ胎仔血清、しかし好ましくは培養されるLSCと同じ種からの血清、又は代用血清でありうる、上記70に記載の方法。
９１．フィーダーフリー細胞培養培地が、ROCK阻害剤、Y-27632をさらに含む、上記89又は90に記載の方法。
９２．ROCK阻害剤、Y-27632が、細胞第4継代後にフィーダーフリー細胞培養培地に添加される、上記91に記載の方法。
９３．フィーダーフリー細胞培養培地が、白血病抑制因子(LIF)をさらに含む、上記89又は90に記載の方法。
９４．対象からのLSCの単離後、LSCの第4継代後にフィーダーフリー細胞培養培地にLIFが添加される、上記93に記載の方法。
９５．LSCが、WNT7A、FZD5、PAX6、p63、ケラチン5(K5)、ケラチン14(K14)、ケラチン19(K19)及びKi67を含むマーカーのセットを発現する、上記70に記載の方法。
９６．LSCの90〜95%が、p63、PAX6、K19及びKi67を発現する、上記70に記載の方法。
９７．LSCの5%未満が、K5及びK14を発現する、上記70に記載の方法。
９８．LSCの95%より多くが、WNT7A及びFZD5を発現する、上記70に記載の方法。
９９．CECが、WNT7A、FZD5、PAX6、ケラチン3(K3)及びケラチン12(K12)を含むマーカーのセットを発現し、ここでK3及びK12発現はLSCと比較して統計的に有意に高く、K19発現はLSCと比較して統計的に有意に低い、上記70に記載の方法。
１００．CECが、p63を発現しないか、又はLSCより有意に低いレベルのp63を発現し、ケラチン1(K1)及びケラチン10(K10)を発現しないか、又は皮膚又は表皮細胞より有意に低いレベルのケラチン1(K1)及びケラチン10(K10)を発現する、上記70に記載の方法。
１０１．単離されたLSCをインビトロで角膜上皮細胞(CEC)に分化させる方法であって、
(a)元々対象に由来した、好ましくは単一細胞状態に解離されている、事前に培養されたLSCを得るステップ、
(b)単離されたLSCを、分化に適している3次元細胞培養物を形成する又は形成を可能にするように、マトリックス又は細胞外マトリックス中及び/又は上に配置するステップ、及び
(c)単離されたLSCのCECへのインビトロでの分化を可能にするようにLSC分化培地でLSCを培養することによって、単離されたLSCをインビトロで角膜上皮細胞に分化させるステップ
を含む方法。
１０２．マトリックス又は細胞外マトリックスが、Matrigel(登録商標)又はその等価物、増殖因子低減Matrigel(登録商標)又はその等価物、コラーゲン、コラーゲンIV、コラーゲンIVシート、哺乳動物羊膜、ヒト羊膜、フィブリノーゲン、トロンビン、パールカン、ラミニン、フィブロネクチン、組換えフィブロネクチン、プロテオグリカン、プロコラーゲン、ヒアルロン酸、エンタクチン、ヘパラン硫酸、テネイシン、ポリ-L-リシン、ゼラチン、ポリ-L-オルニチン、細胞外マトリックスタンパク質(Fischer又はLife Tech)、トロンビンシート(Fibrin Sealant、Reliseal(商標)、Reliance Life Sciences)、フィブリノーゲンとトロンビンのシート(Reliance Life)、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、上記101に記載の方法。
１０３．マトリックス又は細胞外マトリックスが、増殖因子低減Matrigel(登録商標)若しくはその等価物、又はコラーゲンを含む、上記101に記載の方法。
１０４．輪部幹細胞分化培地が、フィーダーフリー及び既知組成培地である、上記101に記載の方法。
１０５．フィーダーフリー及び既知組成培地が、CnT-30培地(Cellntec Advanced Cell Systems AG、Bern、Switzerland)、CnT-02(Cellntec)、CnT-02-3DP5(Cellntec)又は機能的等価物を含み、前記培地がLSCのCECへの分化を促進する、上記104に記載の方法。
１０６．CECが、WNT7A、FZD5、PAX6、ケラチン3(K3)及びケラチン12(K12)を含むマーカーのセットを発現し、ここでK3及びK12発現はLSCと比較して統計的に有意に高く、K19発現はLSCと比較して統計的に有意に低い、上記101に記載の方法。
１０７．CECが、p63を発現しないか、又はLSCより有意に低いレベルのp63を発現し、ケラチン1(K1)及びケラチン10(K10)を発現しないか、又は皮膚又は表皮細胞より有意に低いレベルのケラチン1(K1)及びケラチン10(K10)を発現する、上記106に記載の方法。
１０８．LSC分化培地が1日おきに交換される、上記101に記載の方法。
１０９．上記60又は64に記載の方法由来の単離された輪部幹細胞(LSC)又はLSC様細胞の集団。
１１０．LSCが、WNT7A、FZD5、PAX6、p63、ケラチン5(K5)、ケラチン14(K14)、ケラチン19(K19)、及びKi67を含むマーカーのセットを発現する、上記109に記載の細胞。
１１１．上記101に記載の方法由来の単離された角膜上皮細胞(CEC)の集団。
１１２．CECが、(i)WNT7A、FZD5、PAX6、ケラチン3(K3)及びケラチン12(K12)を含むマーカーのセットを発現し、ここでK3及びK12発現はLSCと比較して統計的に有意に高く、K19発現はLSCと比較して統計的に有意に低く、(ii)p63を発現しないか、又はLSCより有意に低いレベルのp63を発現し、ケラチン1(K1)及びケラチン10(K10)を発現しないか、又は皮膚又は表皮細胞より有意に低いレベルのケラチン1(K1)及びケラチン10(K10)を発現する、上記111に記載の細胞。
１１３．上記60、64又は101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様細胞若しくはCEC、又はこれらの細胞の組合せ、包装材料及び使用説明書を含む、角膜組織修復用キット。
１１４．医薬的に許容される担体をさらに含む、上記113に記載のキット。
１１５．医薬的に許容される担体が、ヒト又は動物の眼の湾曲部のような湾曲部での細胞付着又は増殖を支持するために使用されるコンタクトレンズ又はその等価物である、上記114に記載のキット。
１１６．ヒト羊膜又は動物羊膜をさらに含む、上記115に記載のキット。
１１７．輪部幹細胞又は角膜上皮細胞の機能不全に関連した疾患を有する対象を処置する方法であって、
a.上記1、6、7又は8に記載のLSC、LSC様、CEC又はCEC様細胞を対象の罹患した眼に移植するステップを含み、移植された細胞が対象の罹患した眼の角膜又は輪部に定着し、正常な角膜透明性及び透明度を回復させ、
それによって、輪部幹若しくは前駆細胞又は角膜上皮細胞の機能不全に関連した疾患を有する対象を処置する方法。
１１８．輪部幹細胞又は角膜上皮細胞の機能不全に関連した疾患を有する対象を処置する方法であって、
(a)上記47、48、55、60、64、70又は101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様、CEC又はCEC様細胞を対象の罹患した眼に移植するステップを含み、移植された細胞が対象の罹患した眼の角膜又は輪部に定着し、正常な角膜透明性及び透明度を回復させ、
それによって、輪部幹若しくは前駆細胞又は角膜上皮細胞の機能不全に関連した疾患を有する対象を処置する方法。
１１９．疾患又は状態が、輪部幹若しくは前駆細胞の欠損、角膜上皮細胞の欠損、角膜輪部の損傷、眼の角膜の損傷、輪部幹細胞の損傷、角膜上皮細胞の損傷、角膜の発生若しくは機能に影響を与える先天性欠損、角膜の発生若しくは機能に影響を与える後天性欠損、角膜が皮膚系統に切り替えられる細胞運命決定に影響を与える先天性欠損、角膜が皮膚系統に切り替えられる細胞運命決定に影響を与える後天性欠損、異常表皮分化、スティーブンス・ジョンソン症候群、無虹彩、再発性翼状片、角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷、化学熱傷、アルカリ熱傷、半盲目又は全盲を含む、上記117又は118に記載の方法。
１２０．疾患又は状態が、半盲目、全盲、角膜表面疾患、角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷又はアルカリ熱傷である、上記117又は118に記載の方法。
１２１．半盲目、全盲、角膜表面疾患、角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷又はアルカリ熱傷を有する対象の正常な角膜透明性及び透明度を回復させる方法であって、
(a)上記1、6、7又は8に記載のLSC、LSC様、CEC又はCEC様細胞を対象の罹患した眼に移植するステップを含み、移植された細胞が対象の罹患した眼の角膜又は輪部に定着し、正常な角膜透明性及び透明度を回復させ、
それによって、半盲目、全盲、角膜表面疾患、角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷又はアルカリ熱傷を有する対象の正常な角膜透明性及び透明度を回復させる方法。
１２２．半盲目、全盲、角膜表面疾患、角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷又はアルカリ熱傷を有する対象の正常な角膜透明性及び透明度を回復させる方法であって、
(a)上記47、48、55、60、64、70又は101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様、CEC又はCEC様細胞を対象の罹患した眼に移植するステップを含み、移植された細胞が対象の罹患した眼の角膜又は輪部に定着し、正常な角膜透明性及び透明度を回復させ、
それによって、半盲目、全盲、角膜表面疾患、角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷又はアルカリ熱傷を有する対象の正常な角膜透明性及び透明度を回復させる方法。
１２３．対象の角膜組織を再生又は修復する方法であって、上記1、6、7又は8に記載の単離されたLSC、LSC様、CEC又はCEC様細胞集団を角膜組織の再生又は修復に十分な量で対象に導入することを含む方法。
１２４．対象の角膜組織を再生又は修復する方法であって、上記47、48、55、60、64、70又は101に記載の方法によって生産された単離されたLSC、LSC様、CEC又はCEC様細胞集団を角膜組織の再生又は修復に十分な量で対象に導入することを含む方法。
１２５．細胞が、対象以外の個体からのものである、上記121、122、123又は124に記載の方法。
１２６．上記121、122、123又は124に記載の方法であって、細胞が、前記方法によって生産された細胞で処置される対象からのものである、方法。
１２７．対象が哺乳動物である、上記121、122、123又は124に記載の方法。
１２８．哺乳動物が、ヒト、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウサギ、ウシ、サル又はマウスである、上記127に記載の方法。
１２９．眼化生を有する患者がPAX6遺伝子又は遺伝子産物での処置の利益を受け得るかどうかを判定する方法であって、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の遺伝子発現又はタンパク質レベルを評価することを含み、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の非存在が、眼化生を有する患者が、PAX6遺伝子若しくは遺伝子産物又は上記1若しくは4に記載の細胞での処置の利益を受け得ることを示す方法。
１３０．眼化生を有する対象がWNT7A遺伝子又は遺伝子産物での処置の利益を受ける可能性があるかどうかを判定する方法であって、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の遺伝子発現又はタンパク質レベルを評価することを含み、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の非存在が、眼化生を有する患者が、WNT7A遺伝子又は遺伝子産物での処置の利益を受け得ることを示す方法。
１３１．眼化生を有する対象がWNT7A及びPAX6両方の遺伝子又は遺伝子産物での処置の利益を受け得るかどうかを判定する方法であって、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の遺伝子発現又はタンパク質レベルを評価することを含み、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の非存在が、眼化生を有する患者が、WNT7A及びPAX6両方の遺伝子又は遺伝子産物での処置の利益を受け得ることを示す方法。
１３２．眼化生を有する対象がPAX6遺伝子若しくは遺伝子産物又は上記47、48、55、60、64、70若しくは101に記載の方法によって生産された細胞での処置の利益を受け得るかどうかを判定する方法であって、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の遺伝子発現又はタンパク質レベルを評価することを含み、化生領域におけるWNT7A、PAX6、K3及び/又はK12の非存在が、眼化生を有する患者が、PAX6遺伝子若しくは遺伝子産物又は上記47、48、55、60、64、70若しくは101に記載の方法によって生産された細胞での処置の利益を受け得ることを示す方法。
１３３．対象の角膜組織を再生又は修復する方法であって、上記1、64又は70に記載の単離されたLSC集団を角膜組織の再生又は修復に十分な量で対象に導入することを含む方法。
１３４．対象が哺乳動物である、上記133に記載の方法。
１３５．哺乳動物が、ヒト、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウサギ、ウシ、サル又はマウスである、上記134に記載の方法。
１３６．上記47、48、55、60、64、70若しくは101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様、CEC若しくはCEC様細胞又はこれらの細胞の組合せの有効量及び適する医薬担体を含む、医薬組成物。
１３７．眼疾患を処置する方法であって、上記1に記載の単離されたLSC若しくはLSC様集団又は上記4に記載のSESC若しくはSESC様集団を、上記1又は4に記載の単離されたLSC又はLSC様集団が、CEC又はCEC様細胞への分化を可能にするLSC又はLSC様状態を生じさせる又は維持するのに十分な量のPAX6を生産又は過剰発現するのに十分な量で、対象に投与することによって、眼疾患を処置することを含む方法。
１３８．眼疾患が、ヒト角膜疾患、角膜上皮扁平上皮化生、炎症性角膜症、外傷及びアルカリ熱傷である、上記137に記載の方法。
１３９．眼疾患が、ヒト眼疾患である、上記137に記載の方法。
１４０．対象の角膜組織を再生又は修復する方法であって、対象の角膜組織、角膜組織の推定位置又は眼の前面を角膜組織の再生又は修復に十分な量のPAX6と接触させることを含む方法。
１４１．対象の角膜組織を再生又は修復する方法であって、上記47、48、55、60、64、70若しくは101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様、CEC若しくはCEC様細胞又はこれらの細胞の組合せを角膜組織の再生又は修復に十分な量で角膜又は眼の前面に投与することを含む方法。
１４２．対象の角膜組織を再生又は修復する方法であって、角膜組織、角膜組織の推定位置又は眼の前面に角膜組織の再生又は修復に十分な量のPAX6タンパク質を投与することを含む方法。
１４３．上記1又は6に記載のLSC又はLSC様集団を増殖及び維持するためのキットであって、LSC集団を維持するための細胞培養培地を含み、前記培地が本質的にフィーダーフリーである、キット。
１４４．上記4に記載のSESC又はSESC様集団のLSC又はLSC様集団を増殖及び維持するためのキットであって、LSC集団を維持するための細胞培養培地を含み、前記培地が本質的にフィーダーフリーである、キット。
１４５．培地が、本質的にゼノフリーである、上記143又は144に記載のキット。
１４６．LSC又はLSC様集団をCEC又はCEC様集団に分化させるためのLSC分化培地をさらに含む、上記143又は144に記載のキット。
１４７．培地が、本質的に無血清である、上記143又は144に記載のキット。
１４８．培地に本質的に動物産物を含まない、上記143又は144に記載のキット。
１４９．培地に本質的にヒト産物を含まない、上記143又は144に記載のキット。
１５０．培地が、既知組成である、上記143又は144に記載のキット。
１５１．上記47、48、55、60、64、70若しくは101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様、CEC若しくはCEC様細胞又はこれらの細胞の組合せ、包装材料及び使用説明書を含む、角膜組織修復用のキット。
１５２．医薬的に許容される担体をさらに含む、上記151に記載のキット。
１５３．医薬的に許容される担体が、ヒト又は動物の眼の湾曲部のような湾曲部での細胞付着又は増殖を支持するために使用されるコンタクトレンズ又はその等価物である、上記152に記載のキット。
１５４．ヒト羊膜又は動物羊膜をさらに含む、上記153に記載のキット。
１５５．対象の角膜又は角膜機能に影響を与える眼疾患を発症するリスクを評価する方法であって、(a)LSC又は角膜上皮細胞におけるWNTZ7A、FZD5及びPAX6又はこれらの組合せの活性を評価するステップを含み、WNTZ7A、FZD5及びPAX6又はこれらの組合せの活性がより低い又はないことが、対象の角膜又は角膜機能に影響を与える眼疾患を発症するリスクがより高いことを示し、それによって対象の角膜又は角膜機能に影響を与える眼疾患を発症するリスクを評価する方法。
１５６．上記47、48、55、60、64、70若しくは101に記載の方法によって生産されたLSC、LSC様、CEC若しくはCEC様細胞又はこれらの細胞の組合せでの細胞移植、あるいはPAX6タンパク質又はPAX6をコードする核酸での処置に適している患者集団であって、角膜の異常な皮膚表皮様細胞及び随伴角質化、並びにWNTZ7A、FZD5及びPAX6遺伝子又は遺伝子の組合せの発現喪失又は減少を有する患者集団を同定する方法。
１５７．輪部幹細胞が欠損している対象の輪部にLSC又はLSC様細胞を再定着させる方法であって、上記47、48、64又は70に記載の方法によって生産されたLSC又はLSC様細胞を対象の眼の前面に投与するステップ、及び前記細胞のLSCニッチへの遊走を可能にするステップであって、それによって対象の輪部にLSC又はLSC様細胞を再定着させる、ステップを含む、方法。
１５８．LSC又はLSC様細胞を投与するステップが、LSC又はLSC様細胞のシートを対象の眼表面にグラフトするステップ、あるいは、LSC又はLSC様細胞を含む細胞若しくは組織浮遊液を投与するステップを含む、上記157に記載の方法。
１５９．対象の眼へのLSC又はLSC様細胞の投与後、LSC又はLSC様細胞が羊膜、好ましくはヒト羊膜で覆われる、上記158に記載の方法。
１６０．輪部幹細胞が欠損している対象の輪部にLSC又はLSC様細胞を再定着させる方法であって、結膜、推定角膜位置、眼又は眼瞼の皮膚上皮幹細胞(SESC)をLSC又はLSC様細胞に転換するために、対象の結膜、推定角膜位置、眼又は眼瞼の領域にPAX6活性又は発現を増加させる薬剤を投与することを含み、輪部への移動時に、対象の輪部にLSC又はLSC様細胞を再定着させ、それによって対象の輪部にLSC又はLSC様細胞を再定着させる方法。
１６１．最小必須培地、増殖因子、ホルモン、可溶性因子及び血清又は代用血清を含む、LSC、LSC様、SESC又はSESC様の短期インビトロ培養のためのフィーダーフリー細胞培養培地。
１６２．短期インビトロ培養が、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞の第0〜約第4継代である、上記161に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１６３．DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎仔血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素及び3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、前記ウシ胎仔血清はヒト血清又は代用血清に代替されてもよく、EGF及びインスリンが、それぞれ、組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであってもよく、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCEC又は皮膚表皮細胞に分化しない限り、成分の各々が機能的に等価の成分に置換されてもよい、上記161に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１６４．DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに10〜20%の範囲のウシ胎仔血清又は10〜20%の範囲の血清の代用血清、10〜20ng/mlの範囲のEGF、5〜10μg/mlの範囲のインスリン、0.2〜0.8μg/mlの範囲のヒドロコルチゾン、5×10-11〜5×10-10Mの範囲のコレラ毒素及び10-9M〜4×10-9Mの範囲の3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、EGF及びインスリンが、それぞれ、組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであってもよく、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCEC又は皮膚表皮細胞に分化しない限り、成分の各々が機能的に等価の成分に置換されてもよい、上記161に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１６５．DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10%ウシ胎仔血清、10ng/ml EGF、5μg/mlインスリン、0.4μg/mlヒドロコルチゾン、10-10Mコレラ毒素及び2×10-9M 3,3',5-トリヨード-L-チロニンを含み、ウシ胎仔血清はヒト血清又は代用血清に代替されてもよく、EGF及びインスリンが、それぞれ、組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであってもよく、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCEC又は皮膚表皮細胞に分化しない限り、成分の各々が機能的に等価の成分に置換されてもよい、上記161に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１６６．最小必須培地、増殖因子、ホルモン、可溶性因子、血清又は代用血清、及びrho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞の長期インビトロ培養のためのフィーダーフリー細胞培養培地。
１６７．長期インビトロ培養が、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞の17継代以上の継代である、上記166に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１６８．DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎仔血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素及び3,3',5-トリヨード-L-チロニン、及びY-27632を含み、ウシ胎仔血清はヒト血清又は代用血清に代替されてもよく、EGF及びインスリンが、それぞれ、組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであってもよく、Y-27632は別のROCK阻害剤に置換されてもよく、LSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCEC又は皮膚表皮細胞に分化しない限り、成分の各々の代わりに機能的に等価の成分を代用してもよい、上記166に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１６９．DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに10〜20%の範囲のウシ胎仔血清又は10〜20%の範囲の血清の代用血清、10〜20ng/mlの範囲のEGF、5〜10μg/mlの範囲のインスリン、0.2〜0.8μg/mlの範囲のヒドロコルチゾン、5×10-11〜5×10-10Mの範囲のコレラ毒素、10-9M〜4×10-9Mの範囲の3,3',5-トリヨード-L-チロニン及び1〜10μMの範囲のY-27632を含み、EGF及びインスリンが、それぞれ、組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであってもよく、Y-27632は別のROCK阻害剤に置換されてもよく、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCEC又は皮膚表皮細胞に分化しない限り、成分の各々が機能的等価物に置換されてもよい、上記166に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７０．DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10%ウシ胎仔血清、10ng/ml EGF、5μg/mlインスリン、0.4μg/mlヒドロコルチゾン、10-10Mコレラ毒素、2×10-9M 3,3',5-トリヨード-L-チロニン及び1μM Y-27632を含み、ウシ胎仔血清はヒト血清又は代用血清に代替されてもよく、EGF及びインスリンが、それぞれ、組換えEGF及び/又は組換えインスリン、好ましくは組換えヒトEGF及び組換えヒトインスリンであってもよく、Y-27632は別のROCK阻害剤に置換されてもよく、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCEC又は皮膚表皮細胞に分化しない限り、成分の各々が機能的等価物に置換されてもよい、上記166に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７１．最小必須培地、増殖因子、ホルモン、可溶性因子、血清又は代用血清、rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤及び白血病抑制因子(LIF)を含む、LSC又はLSC様細胞の長期インビトロ培養のためのフィーダーフリー細胞培養培地。
１７２．長期インビトロ培養が、LSC又はLSC様細胞の17継代以上の継代である、上記171に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７３．DMEM/F12培地、DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎仔血清、EGF、インスリン、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素及び3,3',5-トリヨード-L-チロニン、Y-27632及びLIFを含み、ウシ胎仔血清はヒト血清又は代用血清に代替されてもよく、EGF、インスリン及びLIFが、それぞれ、組換えEGF、組換えインスリン及び/又は組換えLIF、好ましくは組換えヒトEGF、組換えヒトインスリン及び組換えヒトLIFであってもよく、Y-27632は別のROCK阻害剤に置換されてもよく、ここでLSC又はLSC様細胞が増殖してCECに分化しない限り、成分の各々の代わりに機能的に等価の成分を代用してもよい、上記171に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７４．DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに10〜20%の範囲のウシ胎仔血清又は10〜20%の範囲の血清の代用血清、10〜20ng/mlの範囲のEGF、5〜10μg/mlの範囲のインスリン、0.2〜0.8μg/mlの範囲のヒドロコルチゾン、5×10-11〜5×10-10Mの範囲のコレラ毒素、10-9M〜4×10-9Mの範囲の3,3',5-トリヨード-L-チロニン、1〜10μMの範囲のY-27632及び5〜20ng/ml LIFを含み、EGF、インスリン及びLIFが、それぞれ、組換えEGF、組換えインスリン及び/又は組換えLIF、好ましくは組換えヒトEGF、組換えヒトインスリン及び組換えヒトLIFであってもよく、Y-27632は別のROCK阻害剤に置換されてもよく、ここでLSC、LSC様、SESC又はSESC様細胞が増殖してCECに分化しない限り、成分の各々が機能的等価物に置換されてもよい、上記161に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７５．培地が、DMEM/F12及びDMEM(1:1)とともに100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10%ウシ胎仔血清、10ng/ml EGF、5μg/mlインスリン、0.4μg/mlヒドロコルチゾン、10-10Mコレラ毒素、2×10-9M 3,3',5-トリヨード-L-チロニン、1μM Y-27632及び10ng/ml LIFを含み、ウシ胎仔血清の代わりにヒト血清又は代用血清を使用してもよく、EGF、インスリン及びLIFが、それぞれ、組換えEGF、組換えインスリン及び/又は組換えLIF、好ましくは組換えヒトEGF、組換えヒトインスリン及び組換えヒトLIFであってもよく、Y-27632は別のROCK阻害剤に置換されてもよく、ここでLSC又はLSC様細胞が増殖してCECに分化しない限り、成分の各々が機能的等価物に置換されてもよい、上記161に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７６．ROCK阻害剤が、(R)-(+)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物(Y-27632、Sigma-Aldrich)、5-(1,4-ジアゼパン-1-イルスルホニル)イソキノリン(ファスジル又はHA1077、Cayman Chemical)、H-1152、H-1152P、(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]ホモピペラジン二塩酸塩、ジメチルファスジル(diMF、H-1152P)、N-(4-ピリジル)-N'-(2,4,6-トリクロロフェニル)尿素、Y-39983、Wf-536、SNJ-1656、及び(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン二塩酸塩、イミダゾール含有ベンゾジアゼピン、イミダゾピリジン誘導体、インダゾールコア、2-アミノピリジン/ピリミジンコア、9-デアザグアニン誘導体、ベンズアミド又はアミノフラザンを含む化合物、並びにこれらの誘導体及び類似体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、上記166又は171に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７７．ウシ胎仔血清がヒト血清又は代用血清に代替される、上記163、164、165、168、169、170、173、174又は175に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７８．EGF、インスリン又はLIFが、それぞれ、組換えEGF、組換えインスリン又は組換えLIFである、上記163、164、165、168、169、170、173、174又は175に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１７９．EGFが、組換えヒトEGFである、上記178に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１８０．インスリンが、組換えヒトインスリンである、上記178に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１８１．LIFが、組換えヒトLIFである、上記178に記載のフィーダーフリー細胞培養培地。
１８２．SESCを得てインビトロでフィーダーフリー細胞培養培地において拡大させる方法であって、単離されたSESC皮膚を上記161又は166に記載のフィーダーフリー細胞培養培地で培養することを含む方法。
１８３．SESCが、毛包間表皮から単離される、上記102に記載の方法。
１８４．SESCが、ヒト又は動物のSESCを有する任意のSESCニッチから単離される、上記102に記載の方法。
１８５．輪部幹細胞(LSC)から上皮幹細胞(SESC)又はSESC様細胞を得る方法であって、(a)細胞運命をLSCからSESC運命に変えるために十分にWNT7A又はPAX6遺伝子又はタンパク質の発現又は活性をノックダウンするステップを含み、それによってLSC細胞からSESC又はSESC様細胞を得る方法。
１８６．LSCを、WNT7A若しくはPAX6に指向されたshRNAと接触させて、あるいは、LSCが、WNT7A若しくはPAX6遺伝子に指向されたshRNA、RNAi若しくはアンチセンスRNAを生産する導入遺伝子を発現して、LSCをSESC又はSESC様細胞に転換するために十分にWNT7A又はPAX6の発現を低減させる、上記185に記載の方法。
１８７．対象から皮膚上皮幹細胞(SESC)を得て、フィーダーフリー細胞培養培地においてインビトロで拡大させる方法であって、
(a)対象の毛包間表皮から又は対象のSESCを有する任意のSESC幹細胞ニッチから組織サンプルを採取するステップ、
(b)組織を解離させて単一細胞を得るステップ、及び
(c)SESCの増殖を可能にするようにフィーダーフリー細胞培養培地で(b)の単一細胞を培養するステップであって、ここで増殖したSESCは皮膚表皮細胞に分化する潜在力を有し、それによって対象から皮膚上皮幹細胞を得てインビトロで拡大させる、ステップ
を含む、方法。
１８８．SESCが、上記161、163、164、165、166、168、169又は170に記載のフィーダーフリー細胞培養培地においてインビトロで培養される、上記185に記載の方法。
１８９．インビトロでSESC又はSESC様細胞から皮膚表皮細胞又は皮膚表皮様細胞を得る方法であって、SESC又はSESC様細胞の皮膚表皮細胞又は皮膚表皮様細胞への分化を支持する既知組成分化培地で単離されたSESC又はSESC様細胞を培養することによって、インビトロでSESC又はSESC様細胞から皮膚表皮細胞又は皮膚表皮様細胞を得ることを含む方法。
１９０．既知組成分化培地が、CnT-02(CellnTec)又は等価の培地である、上記189に記載の方法。
１９１．新たな皮膚を必要とする対象を処置する方法であって、上記185に記載の方法によって得た又は上記182、187若しくは189に記載の方法によって得て拡大させたSESC細胞、SESC様細胞、皮膚表皮細胞又は表皮上皮様細胞を対象に投与して、例えば、対象のSESC細胞集団又は皮膚表皮細胞集団を再定着させ、対象に新たな皮膚をもたらすことによって、新たな皮膚を必要とする対象を処置することを含む方法。
１９２．皮膚を必要とする対象が、皮膚ジストロフィー、皮膚疾患、皮膚感染症、熱傷傷害、皮膚潰瘍、擦過創、黒色腫、癌腫、創傷、加齢、皮膚の遺伝障害、皮膚生検、手術、美容上の欠陥、若しくは皮膚に影響を与える再建術を患う、又は皮膚を必要とする対象が、皮膚置換術を必要とする対象、又は皮膚に影響を与える美容整形若しくは再建術を受ける対象である、上記191に記載の方法。
１９３．輪部幹若しくは前駆細胞(LSC)及び/又はその子孫をSESC又はSESC様細胞に変化させる方法であって、LSC及び/又はその子孫をSESC又はSESC様細胞に変化させるために十分にLSCにおけるWNT7A又はPAX6遺伝子の発現をダウンレギュレートさせることによって、LSC及び/又はその子孫をSESC又はSESC様細胞に変化させることを含む方法。
１９４．LSC様細胞及び/又はその子孫をSESC又はSESC様細胞に変化させる方法であって、LSC様細胞及び/又はその子孫をSESC又はSESC様細胞に変化させるために十分にLSC様細胞におけるWNT7A又はPAX6遺伝子の発現をダウンレギュレートさせることによって、LSC様細胞及び/又はその子孫をSESC又はSESC様細胞に変化させることを含む方法。
１９５．皮膚上皮幹細胞(SESC)及び/又はその子孫をLSC又はLSC様細胞に変化させる方法であって、SESC細胞及び/又はその子孫をLSC又はLSC様細胞に変化させるために十分にSESCにおいてPAX6又はWNT7A遺伝子をアップレギュレート又は過剰発現させることによって、SESC及び/又はその子孫をLSC又はLSC様細胞に変化させることを含む方法。
１９６．SESC様細胞及び/又はその子孫をLSC又はLSC様細胞に変化させる方法であって、SESC様細胞及び/又はその子孫をLSC又はLSC様細胞に変化させるために十分にSESC様細胞においてPAX6又はWNT7A遺伝子をアップレギュレート又は過剰発現させることによって、SESC様及び/又はその子孫をLSC又はLSC様細胞に変化させることを含む方法。