(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒメジョオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ  ａｎｎｕｕｓ）の花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボツリヌス毒素を併せて含み、
前記ボツリヌス毒素は、神経細胞膜のｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質及びシナプス小胞膜のｖ−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を分解する役割を果たし、
前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボツリヌス毒素により分解されたｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の再生を抑制する役割を果たす、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成阻害剤。
【請求項２】
前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボツリヌス毒素の効果維持期間を１．５〜１０倍延ばすことを特徴とする、請求項１に記載のＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成阻害剤。
【請求項３】
筋緊張、筋痙攣、片側顔面痙攣、成人発病痙性斜頸（ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、裂肛（ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ）、眼瞼痙攣、顔面筋痙攣、脳性麻痺、頭痛、片頭痛、筋肉痛、斜視、側頭下顎関節障害（ｔｅｍｐｅｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経痛、過活動膀胱、切迫性尿失禁、鼻炎、副鼻腔炎、にきび、毛穴拡張症、筋緊張異常症、筋緊張異常性収縮、多汗症、声帯障害及び心筋障害からなる群から選択される経筋肉関連疾患の予防又は治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成阻害剤。
【請求項４】
微細ライン（ｆｉｎｅ  ｌｉｎｅ）の外形（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）減少、シワの外形減少、目の拡張（ｗｉｄｅｎｉｎｇ）、口角リフティング（ｌｉｆｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｔｈ）、筋肉量の減少及び上唇から展開するラインの平坦化からなる群から選択される美容効果を得るために用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成阻害剤。
【請求項５】
ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）を有効成分として含み、
前記ボツリヌス毒素は、神経細胞膜のｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質及びシナプス小胞膜のｖ−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を分解する役割を果たし、
前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボツリヌス毒素により分解されたｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の再生を抑制する役割を果たす、ボツリヌス毒素効能延長剤。
【請求項６】
筋緊張、筋痙攣、片側顔面痙攣、成人発病痙性斜頸（ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、裂肛（ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ）、眼瞼痙攣、顔面筋痙攣、脳性麻痺、頭痛、片頭痛、筋肉痛、斜視、側頭下顎関節障害（ｔｅｍｐｅｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経痛、過活動膀胱、切迫性尿失禁、鼻炎、副鼻腔炎、にきび、毛穴拡張症、筋緊張異常症、筋緊張異常性収縮、多汗症、声帯障害及び心筋障害からなる群から選択される神経筋肉関連疾患の予防または治療用であることを特徴とする、請求項５に記載のボツリヌス毒素効能延長剤。
【請求項７】
微細ライン（ｆｉｎｅ  ｌｉｎｅ）の外形（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）減少、シワの外形減少、目の拡張（ｗｉｄｅｎｉｎｇ）、口角リフティング（ｌｉｆｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｔｈ）、筋肉量の減少及び上唇から展開するラインの平坦化からなる群から選択される美容効果を得るために用いられることを特徴とする、請求項５に記載のボツリヌス毒素効能延長剤。
【請求項８】
ボツリヌス毒素投与と同時に投与されることを特徴とする、請求項５に記載のボツリヌス毒素効能延長剤。
【請求項９】
ボツリヌス毒素投与の１〜６週後に投与されることを特徴とする、請求項５に記載のボツリヌス毒素効能延長剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒメジョオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ  ａｎｎｕｕｓ）の花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む神経筋肉関連疾患の予防または治療用薬学的組成物及び美容薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経伝達物質の排出時に神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）を含んでいるシナプス小胞（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）は、シナプス前膜（ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と融合されてはじめて二つの境界間の通路が形成され得る。このとき、膜融合の根源的な力を提供するタンパク質は、ＳＮＡＲＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれる３種のタンパク質複合体である。
【０００３】
シナプス小胞とシナプス前膜間の膜融合により神経伝達物質排出通路が開くようになるが、標的膜（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に付着しているｔ−ＳＮＡＲＥ複合体と小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）に付着しているｖ−ＳＮＡＲＥが関与する。ｔ−ＳＮＡＲＥは、シンタキシン（Ｓｙｎｔａｘｉｎ）１ａタンパク質とＳＮＡＰ−２５（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２５）タンパク質等の複合体であり、ｖ−ＳＮＡＲＥは、ＶＡＭＰ−２（ｖｅｓｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）等のタンパク質で構成されている。これらのＳＮＡＲＥタンパク質は、スクリューのように撚られてＳＮＡＲＥ複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。前記膜融合時には、当分野に広く公知になっている脂質二重層（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）の再配列が起こるようになる。生体膜は、互いに強く押し出しているので、これらの膜は、自発的に融合されず、外部から強い力が与えられて膜間の反発力を克服しなければならないが、このとき、膜間の反発力を克服する程の強い力を作り出すものがＳＮＡＲＥタンパク質にほかならない。即ち、ＳＮＡＲＥ複合体の形成は、膜間反発力を克服する力を提供し、神経伝達物質の分泌（ｒｅｌｅａｓｅ）を含む細胞外排出作用（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）に媒介するようになる。
【０００４】
ＳＮＡＲＥタンパク質の破壊または発現抑制によるＳＮＡＲＥ複合体形成の減少は、神経細胞末端と小胞体膜融合の阻害を誘導するようになり、神経伝達物質分泌を減少させるようになる。神経伝達物質の分泌により筋肉の収縮／弛緩運動が調節されているが、これらの分泌減少は、筋肉収縮運動を減少させて筋肉収縮によるシワ生成を抑制し、生成されたシワを改善でき、神経伝達物質の過多排出によって発生する多汗症等を改善できる。また、神経調節により縮小または拡大される毛穴の場合、選択的に副交感神経を抑制すると、補償作用で交感神経が作用して毛に付いている筋肉を収縮させて毛穴を縮小させることができる。さらに、生体内で肥満細胞（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ）特異的なＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成を抑制する場合、肥満細胞脱顆粒を抑制することでアレルギー性疾患及び自己免疫性疾患を治療及び予防できる。
【０００５】
前記ＳＮＡＲＥを標的とする代表的な物質であるボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ）は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ及びＣ．ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｅの嫌気性バクテリアから分泌される毒素で７種類があり、このうちボツリヌス毒素Ａ型とＢ型が精製されて医学的に使用される。この毒素は、神経伝達物質排出に核心的に関与するＳＮＡＲＥタンパク質を切断するプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であり、「ボトックス（ｂｏｔｏｘ）」として知られた薬物の主成分でもある。
【０００６】
前記ボトックスは、通常、筋痙攣または収縮を誘発する信号を本質的に遮断して、麻痺をもたらす効果を有し、このような筋肉−麻痺効果は、治療的効果のために利用されている。例えば、筋緊張、筋痙攣、片側顔面痙攣、成人発病痙性斜頸（ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、裂肛（ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ）、眼瞼痙攣、顔面筋痙攣、脳性麻痺、頭痛、片頭痛、筋肉痛、斜視、側頭下顎関節障害（ｔｅｍｐｅｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経痛、過活動膀胱、切迫性尿失禁、鼻炎、副鼻腔炎、にきび、筋緊張異常症、筋緊張異常性収縮、多汗症、声帯障害、心筋障害等、多くの神経伝達物質の分泌と関連した疾患および／または筋肉関連疾患の治療に使用されており、シワ、微細ライン（ｆｉｎｅ  ｌｉｎｅ）、フラウンライン（ｆｒｏｗｎ  ｌｉｎｅｓ）等の除去と目の拡張、口角リフティング、筋肉量の減少、上唇から展開するラインの平坦化等、美容目的の施術にも主に使用される。具体的に、ボトックスは、その主成分である神経毒素が神経細胞に存在するＳＮＡＲＥに特異的に作用してＳＮＡＲＥタンパク質を切断することで複合体形成を阻害して膜融合を抑制することを通して神経伝達物質の分泌を遮断するので、筋肉の動きや交感または副交感神経系を抑制することで前記のような疾患の治療効果を奏するものと知られている。ただし、ボトックスの成分は、毒性物質であるので、副作用を起こすことがあり、毒素複合体は、患者の免疫系が中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を形成するように誘導できるため、同じ効果を達成するために、後続投与でより多くの量の毒素が要求されるので、投与量や適用部位を決定するにあたって高度の注意を払う必要がある。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ボトックスの神経伝達物質分泌抑制効果を増加させ、細胞毒性減少及び安定性を向上させることのできる薬物を開発するための研究を遂行した結果、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルがボトックスにより分解されたＳＮＡＲＥタンパク質の再生成を抑制することで神経伝達物質分泌を抑制し、ボトックスの効果維持期間を延ばすことができることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む神経筋肉関連疾患の予防または治療用薬学的組成物及び美容薬学的組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む美容薬学的組成物を提供することである。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）を有効成分として含むボトックス（ｂｏｔｏｘ）補助剤を提供することである。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、ヒメジョオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ  ａｎｎｕｕｓ）の花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む薬学的組成物を神経筋肉関連疾患の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする治療方法を提供することである。
【００１２】
また、本発明の他の目的は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む美容薬学的組成物を美容施術を必要とする対象に投与することを特徴とする美容施術方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、
本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む神経筋肉関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む美容薬学的組成物を提供する。
さらに、本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）を有効成分として含むボトックス（ｂｏｔｏｘ）補助剤を提供する。
また、本発明は、ヒメジョオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ  ａｎｎｕｕｓ）の花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む薬学的組成物を神経筋肉関連疾患の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする治療方法を提供する。
さらに、本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む美容薬学的組成物を美容施術を必要とする対象に投与することを特徴とする美容施術方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、神経細胞であるｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の発現を抑制してＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成を抑制し、ボトックスにより分解されたｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の再生を抑制することで神経伝達物質分泌を抑制する効果を有し、これによってボトックスの効果維持期間を延ばすことができるので、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルをボトックス補助剤としてボトックスと併用して神経筋肉関連疾患の予防、治療または美容のための用途に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）から筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）への神経伝達物質分泌メカニズムを示した模式図である；（Ａ）正常な神経伝達物質分泌機序、（Ｂ）ボトックス（Ｂｏｔｏｘ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）によるｔ−ＳＮＡＲＥ及びｖ−ＳＮＡＲＥ分解を通した神経伝達物質分泌抑制機序、（Ｃ）本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ、Ａｂ；アブソリュート）によるｔ−ＳＮＡＲＥ及びｖ−ＳＮＡＲＥ生成抑制を通した神経伝達物質分泌抑制機序。
【図２】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度による神経細胞であるＰＣ１２細胞の細胞生存率（％）を測定した結果を示したグラフである。
【図３】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度によるＰＣ１２細胞での神経伝達物質放出関連ＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ２５、Ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ、ＶＡＭＰ２及びＳｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ−１のタンパク質発現を確認した分析結果である。
【図４】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理によるＰＣ１２細胞でのＳＮＡＰ２５タンパク質発現抑制によるＳＮＡＰ−２５とＳｙｎｔａｘｉｎ  １ａタンパク質の複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）形成抑制効果を確認した分析結果である。
【図５】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理によるＰＣ１２細胞でのアセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定結果を示したグラフである。
【図６】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理によるＰＣ１２細胞でのノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）分泌量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定結果を示したグラフである。
【図７】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理によるＰＣ１２細胞でのドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎ）分泌量（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の測定結果を示したグラフである。
【図８】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度による筋肉細胞であるＬ６細胞の細胞生存率（％）を測定した結果を示したグラフである。
【図９】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度による血管平滑筋細胞（Ｒａｔ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ、ＲＡＳＭＣ）の細胞生存率（％）を測定した結果を示したグラフである。
【図１０】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度によるＬ６細胞でのＳＮＡＰ２５、Ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ及びＶＡＭＰ２のタンパク質発現を確認した分析結果である。
【図１１】本発明のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度によるＲＡＳＭＣでのＳＮＡＰ２５、Ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ及びＶＡＭＰ２のタンパク質発現を確認した分析結果である。
【図１２】対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ボトックス処理群（Ｂｏｔｏｘ）、及びボトックス＋ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）のラット（Ｒａｔ）の時間経過（１〜２０週）による大腿部筋肉麻痺程度を分析した結果を示したグラフである。
【図１３】対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ボトックス処理群（Ｂｏｔｏｘ）、及びボトックス＋ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）のラット（Ｒａｔ）の時間経過（１、１０及び２０週）による足（脚）筋肉の変化を撮影したイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
神経筋肉関連疾患の予防または治療用薬学的組成物及び美容薬学的組成物
本発明は、ヒメジョオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ  ａｎｎｕｕｓ）の花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む神経筋肉関連疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【００１８】
本発明に係る薬学的組成物において、前記ボトックスは、神経細胞膜のｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質及びシナプス小胞膜のｖ−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を分解する役割を果たし、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボトックスにより分解されたｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の再生を抑制する役割を果たすものであってよい。
【００１９】
本発明に係る薬学的組成物において、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、揮発性溶剤を利用して有機溶媒抽出法により抽出されたものであってよく、好ましくは、有機溶媒抽出法により抽出されたコンクリート（ｃｏｎｃｒｅｔｅ）をアルコールで抽出して不溶性ワックス（ｗａｘ）を除去したアブソリュート（ａｂｓｏｌｕｔｅ、Ａｂ）であってよい。
【００２０】
具体的に、前記アブソリュートは、ヒメジョオンの花を揮発性溶剤を利用した有機溶媒抽出法で抽出してコンクリート（ｃｏｎｃｒｅｔｅ）を得るステップ；及び、前記得たコンクリートをアルコールで抽出して不溶性ワックス（ｗａｘ）を除去し、アブソリュート（ａｂｓｏｌｕｔｅ）を得るステップにより抽出され得る。前記有機溶媒抽出法と抽出物からアブソリュートを分離する方法は、この技術の分野における通常の知識を有する者が変形できる全ての方法を含むことが可能である。
【００２１】
一般に、神経細胞（ニューロン、ｎｅｕｒｏｎ）から筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）への正常な神経伝達物質分泌メカニズム（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を検討すると、神経細胞には、標的膜（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）である神経細胞膜（シナプス前膜、ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に付着しているｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と、神経細胞内にアセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等の神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）を含んでいるシナプス小胞（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の膜表面に付着しているｖ−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のＳＮＡＲＥタンパク質が存在し、前記ｔ−ＳＮＡＲＥ及びｖ−ＳＮＡＲＥの結合過程によりＳＮＡＲＥタンパク質複合体（ＳＮＡＲＥ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成されながらシナプス小胞とシナプス前膜との間の膜融合が起こって二つの境界間の通路が形成される機序を通して神経伝達物質が筋肉細胞に分泌（ｒｅｌｅａｓｅ）される（図１Ａ参照）。
【００２２】
このような過程でボトックス（Ｂｏｔｏｘ）、即ち、ボツリヌス神経毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）成分を神経細胞に投与するようになると、ボトックス分子により神経細胞膜のｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質とシナプス小胞のｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質が切断（ｃｌｅａｖｅ）及び分解（ｄｅｇｒａｄｅ）され、このような過程によってＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成が抑制され、神経細胞膜とシナプス小胞が結合され得ないことで神経伝達物質分泌が抑制される（図１Ｂ参照）。
【００２３】
ボトックスによりｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質が分解された神経細胞に本発明に係るヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルを投与するようになると、神経細胞膜及びシナプス小胞でのｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）することで前記二つのＳＮＡＲＥタンパク質が再生されることを抑制でき、これによって神経細胞膜とシナプス小胞の結合が抑制されることで神経伝達物質の分泌を抑制できるようになる（図１Ｃ参照）。
【００２４】
従って、ボトックスと共にヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルを併せて利用する場合、このようなメカニズムを通してボトックス単独で使用する場合よりボトックスの長期的効果（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）をもたらすことができる。
【００２５】
本発明に係る薬学的組成物において、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボトックスの効果維持期間を１．５〜１０倍延ばすものであってよく、好ましくは１．５〜７倍延ばすものであってよく、さらに好ましくは１．５〜５倍延ばすものであってよい。
【００２６】
本発明に係る薬学的組成物において、前記神経筋肉関連疾患は、筋緊張、筋痙攣、片側顔面痙攣、成人発病痙性斜頸（ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、裂肛（ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ）、眼瞼痙攣、顔面筋痙攣、脳性麻痺、頭痛、片頭痛、筋肉痛、斜視、側頭下顎関節障害（ｔｅｍｐｅｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経痛、過活動膀胱、切迫性尿失禁、鼻炎、副鼻腔炎、にきび、毛穴拡張症、筋緊張異常症、筋緊張異常性収縮、多汗症、声帯障害及び心筋障害からなる群から選択される疾患のものであってよく、その他、免疫反応の軽減または強化、神経伝達物質分泌調節と関連した多様な筋肉疾患を含むものであってよい。
【００２７】
また、本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む美容薬学的組成物に関する。
【００２８】
本発明において、前記美容薬学的組成物の美容効果は、微細ライン（ｆｉｎｅ  ｌｉｎｅ）の外形（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）減少、シワの外形減少、目の拡張（ｗｉｄｅｎｉｎｇ）、口角リフティング（ｌｉｆｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｔｈ）、筋肉量の減少及び上唇から展開するラインの平坦化からなる群から選択されるものであってよい。
【００２９】
ボトックス補助剤
本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）を有効成分として含むボトックス（ｂｏｔｏｘ）補助剤に関する。
【００３０】
本発明に係る前記ボトックス補助剤において、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、前記ボトックスによって分解された神経細胞膜のｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質及びシナプス小胞膜のｖ−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質がまた生成されることを抑制することで、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成阻害効果、神経伝達物質伝達効果、筋肉麻痺効果等、ボトックスの効果を維持できる期間を延ばす役割を果たすものであってよい。
【００３１】
本発明の一実施例においては、ボトックスにより誘発されたラット（ｒａｔ）の大腿部筋肉麻痺がボトックス単独処理群（Ｂｏｔｏｘ）よりボトックス及びヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）で２倍以上の期間の間さらに長く持続されることを確認して、ボトックスの神経伝達物質分泌抑制効果維持期間が延びる長期的効果（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）があることを確認した（実験例４、図１２及び図１３参照）。
【００３２】
本発明において、前記ボトックス補助剤は、神経筋肉関連疾患の予防または治療用のものであってよい。前記神経筋肉関連疾患は、筋緊張、筋痙攣、片側顔面痙攣、成人発病痙性斜頸（ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、裂肛（ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ）、眼瞼痙攣、顔面筋痙攣、脳性麻痺、頭痛、片頭痛、筋肉痛、斜視、側頭下顎関節障害（ｔｅｍｐｅｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経痛、過活動膀胱、切迫性尿失禁、鼻炎、副鼻腔炎、にきび、毛穴拡張症、筋緊張異常症、筋緊張異常性収縮、多汗症、声帯障害及び心筋障害からなる群から選択される疾患のものであってよく、その他、免疫反応の軽減または強化、神経伝達物質分泌調節と関連した多様な筋肉疾患を含むものであってよい。
【００３３】
本発明において、前記ボトックス補助剤は、美容のためのものであってよい。前記美容のための効果は、微細ライン（ｆｉｎｅ  ｌｉｎｅ）の外形（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）減少、シワの外形減少、目の拡張（ｗｉｄｅｎｉｎｇ）、口角リフティング（ｌｉｆｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｔｈ）、筋肉量の減少及び上唇から展開するラインの平坦化からなる群から選択されるものであってよい。
【００３４】
本発明に係る前記ボトックス補助剤は、ボトックス投与と同時に投与するものであってよい。または、ボトックス投与の１〜６週後に投与されるものであってよく、好ましくは１〜４週後に投与されるものであってよい。
【００３５】
神経筋肉関連疾患の治療方法
本発明は、ヒメジョオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ  ａｎｎｕｕｓ）の花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む薬学的組成物を神経筋肉関連疾患の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする治療方法を提供する。
【００３６】
本発明に係る治療方法において、前記ボトックスは、神経細胞膜のｔ−ＳＮＡＲＥ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質及びシナプス小胞膜のｖ−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を分解する役割を果たし、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボトックスにより分解されたｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質の再生を抑制する役割を果たすものであってよい。
【００３７】
本発明に係る治療方法において、前記神経筋肉関連疾患は、筋緊張、筋痙攣、片側顔面痙攣、成人発病痙性斜頸（ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、裂肛（ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ）、眼瞼痙攣、顔面筋痙攣、脳性麻痺、頭痛、片頭痛、筋肉痛、斜視、側頭下顎関節障害（ｔｅｍｐｅｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経痛、過活動膀胱、切迫性尿失禁、鼻炎、副鼻腔炎、にきび、毛穴拡張症、筋緊張異常症、筋緊張異常性収縮、多汗症、声帯障害及び心筋障害からなる群から選択される疾患のものであってよく、その他、免疫反応の軽減または強化、神経伝達物質分泌調節と関連した多様な筋肉疾患を含むものであってよい。
【００３８】
本発明に係る治療方法において、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、揮発性溶剤を利用して有機溶媒抽出法により抽出されたものであってよく、好ましくは、有機溶媒抽出法により抽出されたコンクリート（ｃｏｎｃｒｅｔｅ）をアルコールで抽出して不溶性ワックス（ｗａｘ）を除去したアブソリュート（ａｂｓｏｌｕｔｅ、Ａｂ）であってよい。
【００３９】
具体的に、前記アブソリュートは、ヒメジョオンの花を揮発性溶剤を利用した有機溶媒抽出法で抽出してコンクリート（ｃｏｎｃｒｅｔｅ）を得るステップ；及び、前記得たコンクリートをアルコールで抽出して不溶性ワックス（ｗａｘ）を除去し、アブソリュート（ａｂｓｏｌｕｔｅ）を得るステップにより抽出され得る。前記有機溶媒抽出法と、抽出物からアブソリュートを分離する方法は、この技術の分野における通常の知識を有する者が変形できる全ての方法を含むことが可能である。
【００４０】
本発明に係る治療方法において、前記ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ボトックスの効果維持期間を１．５〜１０倍延ばすものであってよく、好ましくは１．５〜７倍延ばすものであってよく、さらに好ましくは１．５〜５倍延ばすものであってよい。
【００４１】
美容施術方法
本発明は、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ）及びボトックス（Ｂｏｔｏｘ）を併せて含む美容薬学的組成物を美容施術を必要とする対象に投与することを特徴とする美容施術方法を提供する。
【００４２】
本発明の美容施術方法において、前記美容薬学的組成物の美容効果は、微細ライン（ｆｉｎｅ  ｌｉｎｅ）の外形（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）減少、シワの外形減少、目の拡張（ｗｉｄｅｎｉｎｇ）、口角リフティング（ｌｉｆｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｔｈ）、筋肉量の減少及び上唇から展開するラインの平坦化からなる群から選択されるものであってよい。
【００４３】
下記の実施例を通して本発明をより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであるだけで、これにより本発明が限定されるものではない。
【００４４】
＜実施例１＞ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（アブソリュート）の製造
ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、ヒメジョオンの花から収得して使用した。具体的に、前記ヒメジョオンの花は、大韓民国忠清南道牙山市にあるヒメジョオン群落地で自生
されたヒメジョオンの花を採取して使用した。開花された状態のヒメジョオンの花を採取して洗浄後、有機溶媒抽出法を利用して抽出した。
即ち、乾燥していないヒメジョオンの花をヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）に沈殿させた後、抽出し、抽出物を回転式蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｅｒ）を活用してヘキサンを蒸発させて濃縮させることで固形のコンクリート（ｃｏｎｃｒｅｔｅ）を獲得した。その後、前記コンクリートをエチルアルコール（ｅｔｈｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）に溶解させ、−２０℃で保管した後、真空冷却フィルタ（ｖａｃｕｕｍ  ｃｏｏｌｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を介して不溶性ワックス（ｗａｘ）を除去し、さらに回転式蒸発器を活用してエタノールを蒸発させて分離／精製することでヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ、Ａｂ；アブソリュート）を製造した。その後、前記製造したヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルは、４℃の低温庫で保管して使用した。
【００４５】
＜実験例１＞ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルの処理による神経細胞でのＳＮＡＲＥタンパク質発現分析
【００４６】
１−１．神経細胞（ＰＣ１２）に対する細胞毒性分析
神経細胞ＰＣ１２に対してヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が有する毒性を確認するために、ＸＴＴ（２，３−ｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏ−５−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ）分析方法を通してヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度によるＰＣ１２細胞の生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した。
【００４７】
具体的には、ＰＣ１２細胞を９６  ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅに各ｗｅｌｌ当たりに細胞数１．５×１０4ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌになるように分注して３７℃、５％、ＣＯ2培養器で付着させた。２４時間の間培養した後、実施例１のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０及び５０μｇ／ｍＬの濃度で希釈して、各ｗｅｌｌに１００μＬずつ処理し、３６時間培養した。Ｅｚ−ｃｙｔｏｘとＲＰＭＩ１６４０を１:１で混合して各ｗｅｌｌ当たりに２０μＬずつ処理した後、培養器で３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｅ２、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定後、百分率に換算してヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の細胞毒性に対する結果を確保した。
【００４８】
その結果、図２に示されたように、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の５０μｇ／ｍＬ濃度まで細胞毒性が現れないことを確認した。
【００４９】
１−２．ＳＮＡＲＥタンパク質発現分析
実施例１のように製造したヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が神経細胞（ＰＣ１２）内のＳＮＡＲＥタンパク質の発現に及ぼす影響を確認するために、下記のように分析を実施した。
【００５０】
具体的には、ＰＣ１２細胞を１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を利用して培養して使用した。ＰＣ１２細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈに各ｄｉｓｈ当たりに細胞数８×１０5ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ  ｄｉｓｈになるように注入して３７℃、５％、ＣＯ2培養器で付着させた。ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）は、０〜５０μｇ／ｍＬ濃度で各ｄｉｓｈに処理して３６時間の間培養させた。細胞ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを利用して細胞を溶解させた後、ａｎｔｉ−ＳＮＡＰ２５、ａｎｔｉ−ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ、ａｎｔｉ−ＶＡＭＰ２またはａｎｔｉ−Ｓｙｔ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙと免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｌｏｔ）法を活用して結果を確保した。
【００５１】
その結果、図３に示されたように、神経伝達物質放出と関連したＳＮＡＲＥタンパク質であるＳＮＡＰ２５、Ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ、ＶＡＭＰ２及びＳｙｔ−１タンパク質はいずれもヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）濃度依存的に発現が抑制された。
【００５２】
１−３．ＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成分析
実施例１のように製造したヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が神経細胞（ＰＣ１２）内のＳＮＡＲＥタンパク質複合体形成に及ぼす影響を確認するために、下記のように分析を実施した。
【００５３】
ＰＣ１２細胞を１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を利用して培養して使用した。ＰＣ１２細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈに各ｄｉｓｈ当たりに細胞数８×１０5ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ  ｄｉｓｈになるように注入して３７℃、５％、ＣＯ2培養器で付着させた。ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）は、５０μｇ／ｍＬ濃度でｄｉｓｈに処理して３６時間の間培養させた。培養が終了したＰＣ１２細胞にＳＮＡＲＥ複合体誘導物質であるＫ＋溶液を処理してＳＮＡＲＥ複合体の形成を誘導した。細胞ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを利用して細胞を溶解させた後、ＳＮＡＰ２５  ａｎｔｉｂｏｄｙを免疫沈降反応（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）した。その後、ａｎｔｉ−ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａまたはａｎｔｉ−ＳＮＡＰ２５  ａｎｔｉｂｏｄｙと免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｌｏｔ）法を活用して結果を確保した。
【００５４】
その結果、図４に示されたように、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理により、ＳＮＡＰ２５とｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａの複合体形成が抑制されることを確認した。
【００５５】
＜実験例２＞ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルの処理による神経細胞での神経伝達物質分泌抑制効果分析
【００５６】
２−１．アセチルコリン分泌量分析
ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）に対する神経細胞（ＰＣ１２）での神経伝達物質分泌阻害効果を確認するために、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）を利用して分化された神経細胞（ＰＣ１２）を使用して神経伝達物質であるアセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）の分泌量を測定した。
【００５７】
具体的には、ＰＣ１２細胞を１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を利用して培養して使用した。ＰＣ１２細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈに各ｄｉｓｈ当たりに細胞数８×１０5ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ  ｄｉｓｈになるように注入して３７℃、５％、ＣＯ2培養器で付着させた。ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）は、２５及び５０μｇ／ｍＬ濃度でｄｉｓｈに処理して３６時間の間培養させた。培養が終了したＰＣ１２細胞にＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）５０ｎｇ／ｍＬを添加して７２時間の間３７℃、５％、ＣＯ2培養器で分化した。分化が終了した後、ＳＮＡＲＥ複合体誘導物質であるＫ＋溶液を処理してＳＮＡＲＥ複合体の形成及びアセチルコリン放出を誘導した。その後、細胞培養液であるｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍをｔｕｂｅに集めてアセチルコリン分析Ｋｉｔ（Ａｍｐｌｉｔｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を活用して結果を確保した。
【００５８】
その結果、図５に示されたように、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）２５及び５０μｇ／ｍＬ処理群はいずれも有意性のあるようにアセチルコリンの分泌が抑制された。
【００５９】
２−２．ノルエピネフリン分泌量分析
ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）に対する神経細胞（ＰＣ１２）での神経伝達物質分泌阻害効果を確認するために、前記実験例２−１と同様の方法でサンプルを処理し、神経伝達物質のノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）の分泌量は、ノルエピネフリン分析Ｋｉｔ（ＩＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【００６０】
その結果、図６に示されたように、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理群で濃度依存的に有意性のあるようにノルエピネフリンの分泌が抑制されることを確認した。
【００６１】
２−３．ドーパミン分泌量分析
ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）に対する神経細胞（ＰＣ１２）での神経伝達物質分泌阻害効果を確認するために、前記実験例２−１と同様の方法でサンプルを処理し、神経伝達物質のドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）の分泌量は、ドーパミン分析Ｋｉｔ（Ｄｅｍｅｄｉｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【００６２】
その結果、図７に示されたように、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理群で濃度依存的に有意性のあるようにドーパミン分泌量が減少するものと示された。
【００６３】
従って、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が神経伝達物質であるアセチルコリン、ノルエピネフリン及びドーパミンの分泌を抑制できることを確認した。
【００６４】
＜実験例３＞ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルの処理による筋肉細胞及び血管平滑筋細胞でのＳＮＡＲＥタンパク質発現分析
【００６５】
３−１．筋肉細胞（Ｌ６）及び血管平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）に対する細胞毒性分析
筋肉細胞（Ｌ６）及び血管平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）に対してヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が有する毒性を確認するために、ＸＴＴ（２，３−ｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏ−５−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ）実験方法を通してヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の処理濃度による筋肉細胞（Ｌ６）及び血管平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）の生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した。
【００６６】
具体的には、Ｌ６またはＲＡＳＭＣ細胞を９６  ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅに各ｗｅｌｌ当たりに細胞数５×１０3ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌになるように分注して３７℃、５％、ＣＯ2培養器で付着させた。培養した後、実施例１のヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）をそれぞれ０、０．１、１、１０、５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で希釈して、各ｗｅｌｌに１００μＬずつ処理し、２４時間培養した。Ｅｚ−ｃｙｔｏｘとＤＭＥＭを１:１で混合して各ｗｅｌｌ当たりに２０μＬずつ処理した後、培養器で３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｅ２、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定後、百分率に換算してヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）の細胞毒性に対する結果を確保した。
【００６７】
その結果、図８及び図９に示されたように、Ｌ６細胞及びＲＡＳＭＣはいずれも５０μｇ／ｍＬ濃度まで細胞毒性が現れないことを確認した。
【００６８】
３−２．ＳＮＡＲＥタンパク質発現分析
実施例１のように製造したヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が筋肉細胞（Ｌ６）及び血管平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）内のＳＮＡＲＥタンパク質の発現に及ぼす影響を確認するために、下記のように分析を実施した。
【００６９】
具体的には、Ｌ６またはＲＡＳＭＣを１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＤＭＥＭ培地を利用して培養して使用した。Ｌ６またはＲＡＳＭＣを６０ｍｍ  ｄｉｓｈに各ｄｉｓｈ当たりに細胞数２×１０5ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ  ｄｉｓｈになるように注入して３７℃、５％、ＣＯ2培養器で付着させた。ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）は、０〜５０μｇ／ｍＬ濃度で各ｄｉｓｈに処理して３６時間の間培養させた。細胞ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを利用して細胞を溶解させた後、ａｎｔｉ−ＳＮＡＰ２５、ａｎｔｉ−ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａまたはａｎｔｉ−ＶＡＭＰ２  ａｎｔｉｂｏｄｙと免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｌｏｔ）法を活用して結果を確保した。
【００７０】
その結果、図１０及び図１１に示されたように、前記実験例１−２のＰＣ１２細胞での結果とは異なり、Ｌ６及びＲＡＳＭＣでは神経伝達物質放出と関連したＳＮＡＲＥタンパク質であるＳＮＡＰ２５、Ｓｙｎｔａｘｉｎ  １ａ及びＶＡＭＰ２タンパク質発現の変化が現れなかった。
【００７１】
従って、前記のような結果から、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）が筋肉細胞及び血管平滑筋細胞ではＳＮＡＲＥタンパク質発現に影響を及ぼさず、神経細胞で特異的にＳＮＡＲＥタンパク質の生成を抑制する効果を有することを確認した。また、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）は、既存のボトックス効果のように既に生成されたｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質またはｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質を分解及び除去することで一時的な神経伝達物質分泌を抑制する効果を有するものではなく、神経細胞のｔ−ＳＮＡＲＥ及びｖ−ＳＮＡＲＥの生成を抑制することで神経細胞の膜とシナプス小胞（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）が結合できないようにして神経伝達物質のアセチルコリン、ノルエピネフリン及びドーパミンの分泌を抑制する効果を奏するものであることを確認した。
【００７２】
＜実験例４＞ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイルの処理によるボトックス効能延長期間分析
【００７３】
４−１．動物モデルの準備
具体的には、８週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（（株）オリエントバイオ）を動物実験に使用し、実験に使用されたボトックスは、凍結乾燥状態であるボトックス（Ｘｅｏｍｉｎ、ＭＥＲＺ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を０．９％生理食塩水に２５Ｕ／ｍＬの濃度で溶かして使用した。ラットをそれぞれ対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ボトックス処理群（Ｂｏｔｏｘ）、及びボトックスとヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）に分類した。
【００７４】
先ず、実験動物の左側大腿部筋肉に対照群、ボトックス、ボトックスとヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）を投与し、１週間おきに全ての処理群にサンプルを新たに投与した。対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、０．９％生理食塩水を投与し、ボトックス処理群（Ｂｏｔｏｘ）は、ボトックスタイプＡを５ユニット投与してラットの左脚を麻痺させた後、１週間おきにヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）を溶かした溶媒を投与した。ボトックスとヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）は、ボトックスタイプＡを５ユニット投与してラットの左脚部分を麻痺させた後、１週間おきにヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）５０μｇ／ｍＬを投与した。
【００７５】
４−２．ボトックス効能延長期間分析
ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）がボトックス効能維持期間に及ぼす影響を確認するために、前記実験例４−１の各処理群に対してラット（ｒａｔ）の大腿部筋肉麻痺の持続時間を目視観察分析を通して比較した。
【００７６】
具体的には、各処理群を投与したラットを３日おきに体重と飼料摂取量を測定し、観察者３名が１週間おきにラットの左足を観察して筋肉麻痺程度を測定した。筋肉麻痺分析は、０〜１０点に分けて測定し、筋肉麻痺の状態によって麻痺が多く進行すると１０点に近い点数を記録し、麻痺が回復すると０点に近い点数を記録して出た平均値をデータに使用してグラフを作成した。
【００７７】
その結果、図１２及び図１３に示されたように、ボトックス処理群（Ｂｏｔｏｘ）の場合、ボトックスにより誘発された大腿部筋肉麻痺がボトックス処理５週後から減少し始めて１０週が過ぎたら筋肉麻痺程度が最初に対比して半分に減少し、２０週後には筋肉麻痺がほとんど残っていないものと示された。これに対して、ボトックス及びヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）の場合、１２週まで筋肉麻痺が最初と類似した水準に維持され、２０週が過ぎた後にも半分以上筋肉麻痺が持続された。
【００７８】
即ち、ボトックス処理群（Ｂｏｔｏｘ）に比してボトックス及びヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル併用処理群（Ｂｏｔｏｘ＋ヒメジョオンの花のＡｂ）でラットの大腿部筋肉麻痺期間が２倍以上に顕著に長くなったことを確認した。
【００７９】
前記のような結果は、ｔ−ＳＮＡＲＥ及びｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質がボトックスにより分解され、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）により前記ＳＮＡＲＥタンパク質の生成が阻害されることで、ボトックスの神経伝達物質分泌抑制効果維持期間が延びることを意味する。これは、ヒメジョオンの花のエッセンシャルオイル（ヒメジョオンの花のＡｂ）及びボツリヌス毒素−含有組成物の治療的用途に対して重要な影響を有し、特に、本発明に係る組成物を利用することにより、ボツリヌス毒素により誘発された特定の美容または治療効果を維持するために要求される後続ボトックス投与の頻度を相当減少させることができる。結果として、減少したボトックス適用頻度は、個体がボツリヌス毒素に対する抗体を生成する傾向を減少させるため、より優れた長期的効果（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）をもたらすことができる。
【００８０】
今まで、本発明について、その好ましい実施例を中心に検討した。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を外れない範囲で変形された形態で具現され得ることを理解できるだろう。それゆえ、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されるべきである。本発明の範囲は、前述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にある全ての相違点は、本発明に含まれたものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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