【手続補正書】
【提出日】平成30年8月10日(2018.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部チャネルの部分が多孔性固体支持体で充填されている内部チャネルを含む、ハイブリダイゼーションカラムであって、該固体支持体が：
（ｉ）空隙およびチャネルの残りの間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、ならびに
（ｉｉ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブ
を含み、
該固体支持体の孔構造が、すべての次元で均一であり、該固体支持体がチャネルの全横断面を充填する
前記ハイブリダイゼーションカラム。
【請求項２】
空隙が、０．１〜１００μｍの平均孔サイズを有する、請求項１に記載のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項３】
固体支持体に占められるチャネルの部分が、０．１ｍｍ３〜１００ｍｍ３の範囲の体積を有する、請求項１または２に記載のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項４】
固体支持体内の空隙が、チャネル中の固体支持体によって占められる体積の約３０〜５０％を占める、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項５】
チャネルの一端が、多孔性フィルター、フリットまたは透過性膜を含み、チャネルの前記端に吸引を適用するか、またはチャネルの反対端に圧を適用した際、カラム中に固体支持体を保持する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラム、温度調節要素および温度センサーを含む微量流体デバイスであって、温度調節要素を用いて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内の温度を調節することが可能である、前記微量流体デバイス。
【請求項７】
各リザーバーが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端に連結された、１またはそれより多いリザーバーをさらに含み、各リザーバーが密封されそして加圧されることも可能である、請求項６に記載の微量流体デバイス。
【請求項８】
チュービングを通じて１またはそれより多いリザーバーに連結されている圧縮ガス供給源によって圧を供給する、請求項７に記載の微量流体デバイス。
【請求項９】
１またはそれより多い密封リザーバーに適用された圧が、固体支持体を通じて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内に流体を押し込む、請求項８に記載の微量流体デバイス。
【請求項１０】
圧縮ガス供給源を１またはそれより多いリザーバーにつなぐチュービング内にバルブをさらに含み、ここで１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節可能なコントローラーによって、バルブが開閉可能である、請求項８に記載の微量流体デバイス。
【請求項１１】
ポンプによって圧を供給し、ポンプが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節するようにプログラム可能である電子コントローラーに連結されている、請求項７に記載の微量流体デバイス。
【請求項１２】
１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの他方の端に付着された１またはそれより多い収集チュービングをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の微量流体デバイス。
【請求項１３】
１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端が吸引ポンプに連結され、ここで吸引ポンプがコントローラーに連結され、該コントローラーが、吸引が適用された際に、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節することが可能である、請求項８に記載の微量流体デバイス。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか一項のデバイスを産生するため、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカラムを受け入れるよう適応させた微量流体デバイス。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項のカラムを挿入することによって、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の微量流体デバイスを調製する方法。
【請求項１６】
核酸の複雑な混合物から核酸分子を濃縮するための方法であって：
（ｉ）
（ａ）空隙間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、および
（ｂ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブ
を含む多孔性固体支持体を提供し、
（ｉｉ）核酸混合物を、固体支持体を通じて駆動し、それによってハイブリダイゼーションプローブの核酸配列に相補的な核酸配列を含む核酸分子がプローブにハイブリダイズすることを可能にし、ハイブリダイゼーションが１０時間未満進行することが可能になり、
（ｉｉｉ）固体支持体を洗浄して、プローブにハイブリダイズしていない、いかなる核酸も取り除き、そして
（ｉｖ）固体支持体から、ハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸分子を溶出させる
工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
各相補核酸配列に対する個々のハイブリダイゼーションプローブが、固体支持体表面上にランダムに分布している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
混合物が、１〜１００μｌ／分の流速で、固体支持体を通じて駆動される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ハイブリダイゼーションが５５〜６５℃の温度で行われる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
洗浄工程が、ハイブリダイゼーションに用いた温度より５〜１０℃低い温度で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
溶出が、約９０〜１００℃の温度まで固体支持体を加熱することによって達成される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ハイブリダイゼーションプローブが同じ長さの５０〜２５０量体オリゴヌクレオチドであり、そして／または混合物中の核酸分子が１００〜３５０の長さを有する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
より大きい核酸分子を得て、これを核酸断片に断片化し、そして断片をアダプター分子に連結することによって混合物を調製する、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションカラムを調製する方法であって：
（ｉ）内部チャネルを含むカラムを提供し、そして
（ｉｉ）ほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズでチャネルの全横断面を充填し、ここでマイクロビーズが多孔性固体支持体を形成する；
工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
直径が０．５〜５００μｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）内部チャネルを含む１またはそれより多いカラム、および（ｉ）ほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズを含む容器を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションカラムを調製するためのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８９】
フリットタイプ２は、ホウケイ酸ガラス製であった。この材料は最高５１５℃の温度に耐えることも可能であり、そして水、酸およびアルカリ、塩、有機物質、塩素および臭素に化学的に適合した。このフリットタイプは、流速、マイクロビーズベッド特性およびビーズ保持能に関しては、フリットタイプ１と類似の特性を示した。この材料から調製したフリットは固形であり、カラム内に組み立てた際、形状を維持し、そしてカラム中に挿入した後、平坦な上部表面を有した。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］内部チャネルの部分が多孔性固体支持体で充填されている内部チャネルを含む、ハイブリダイゼーションカラムであって、該固体支持体が：
（ｉ）空隙およびチャネルの残りの間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、ならびに
（ｉｉ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブ
を含み、
該固体支持体の孔構造が、すべての次元で均一であり、該固体支持体がチャネルの全横断面を充填する
前記ハイブリダイゼーションカラム。
［態様２］空隙が、０．１〜１００μｍの平均孔サイズを有する、態様１のハイブリダイゼーションカラム。
［態様３］固体支持体に占められるチャネルの部分が、０．１ｍｍ３〜１００ｍｍ３の範囲の体積を有する、態様１または２のハイブリダイゼーションカラム。
［態様４］固体支持体内の空隙が、チャネル中の固体支持体によって占められる体積の約３０〜５０％を占める、先行する態様のいずれか一のハイブリダイゼーションカラム。
［態様５］チャネルの一端が、多孔性フィルター、フリットまたは透過性膜を含み、チャネルの前記端に吸引を適用するか、またはチャネルの反対端に圧を適用した際、カラム中に固体支持体を保持する、先行する態様のいずれか一のハイブリダイゼーションカラム。
［態様６］態様１〜５のいずれか一記載の１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラム、温度調節要素および温度センサーを含む微量流体デバイスであって、温度調節要素を用いて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内の温度を調節することが可能である、前記微量流体デバイス。
［態様７］各リザーバーが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端に連結された、１またはそれより多いリザーバーをさらに含み、各リザーバーが密封されそして加圧されることも可能である、態様６の微量流体デバイス。
［態様８］チュービングを通じて１またはそれより多いリザーバーに連結されている圧縮ガス供給源によって圧を供給する、態様７の微量流体デバイス。
［態様９］１またはそれより多い密封リザーバーに適用された圧が、固体支持体を通じて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内に流体を押し込む、態様８の微量流体デバイス。
［態様１０］圧縮ガス供給源を１またはそれより多いリザーバーにつなぐチュービング内にバルブをさらに含み、ここで１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節可能なコントローラーによって、バルブが開閉可能である、態様８の微量流体デバイス。
［態様１１］ポンプによって圧を供給し、ポンプが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節するようにプログラム可能である電子コントローラーに連結されている、態様７の微量流体デバイス。
［態様１２］１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの他方の端に付着された１またはそれより多い収集チュービングをさらに含む、態様７〜１１のいずれか一の微量流体デバイス。
［態様１３］１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端が吸引ポンプに連結され、ここで吸引ポンプがコントローラーに連結され、該コントローラーが、吸引が適用された際に、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節することが可能である、態様８の微量流体デバイス。
［態様１４］態様６〜１３のいずれか一のデバイスを産生するため、態様１〜５のいずれか一のカラムを受け入れるよう適応させた微量流体デバイス。
［態様１５］態様１〜５のいずれか一のカラムを挿入することによって、態様６〜１３のいずれか一の微量流体デバイスを調製する方法。
［態様１６］核酸の複雑な混合物から核酸分子を濃縮するための方法であって：
（ｉ）
（ａ）空隙間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、および
（ｂ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブ
を含む多孔性固体支持体を提供し、
（ｉｉ）核酸混合物を、固体支持体を通じて駆動し、それによってハイブリダイゼーションプローブの核酸配列に相補的な核酸配列を含む核酸分子がプローブにハイブリダイズすることを可能にし、ハイブリダイゼーションが１０時間未満進行することが可能になり、
（ｉｉｉ）固体支持体を洗浄して、プローブにハイブリダイズしていない、いかなる核酸も取り除き、そして
（ｉｖ）固体支持体から、ハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸分子を溶出させる
工程を含む、前記方法。
［態様１７］各相補核酸配列に対する個々のハイブリダイゼーションプローブが、固体支持体表面上にランダムに分布している、態様１６の方法。
［態様１８］混合物が、１〜１００μｌ／分の流速で、固体支持体を通じて駆動される、態様１６または１７の方法。
［態様１９］ハイブリダイゼーションが５５〜６５℃の温度で行われる、態様１６〜１８のいずれか一の方法。
［態様２０］洗浄工程が、ハイブリダイゼーションに用いた温度より５〜１０℃低い温度で行われる、態様１９の方法。
［態様２１］溶出が、約９０〜１００℃の温度まで固体支持体を加熱することによって達成される、態様１４〜１８のいずれか一の方法。
［態様２２］ハイブリダイゼーションプローブが同じ長さの５０〜２５０量体オリゴヌクレオチドであり、そして／または混合物中の核酸分子が１００〜３５０の長さを有する、態様１６〜２１のいずれか一の方法。
［態様２３］より大きい核酸分子を得て、これを核酸断片に断片化し、そして断片をアダプター分子に連結することによって混合物を調製する、態様１６〜２２のいずれか一の方法。
［態様２４］ハイスループット配列決定のための核酸分子混合物を含む試料を調製する方法であって：
（ｉ）核酸分子およびハイブリダイゼーションプローブの相補核酸配列が結合することを可能にする条件下で、１またはそれより多いハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体と、試料を接触させ；
（ｉｉ）未結合核酸分子を取り除き；
（ｉｉｉ）結合した核酸分子をアダプター分子と接触させ；
（ｉｖ）結合した核酸分子をアダプター分子に連結させて、アダプター末端を有する核酸分子を得て；そして
（ｖ）アダプター末端を有する核酸分子を固体支持体から放出させる；
工程を含む、前記方法。
［態様２５］ハイスループット配列決定のための核酸分子混合物を含む試料を調製する方法であって：
（ｉ）核酸分子およびハイブリダイゼーションプローブの相補核酸配列が結合することを可能にする条件下で、１またはそれより多いハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体と、試料を接触させ；
（ｉｉ）未結合核酸分子を取り除き；
（ｉｉｉ）結合した核酸分子を固体支持体から放出させ；
（ｉｖ）放出された核酸分子をアダプター分子と接触させ；そして
（ｖ）核酸分子をアダプター分子に連結させて、アダプター末端を有する核酸分子を得る；
工程を含む、前記方法。
［態様２６］アダプター分子が二重鎖ＤＮＡを含有する、態様２４または２５の方法。
［態様２７］アダプター分子がヘアピンを含有する、態様２４または２５の方法。
［態様２８］核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、先行する態様のいずれか一のデバイスまたは方法。
［態様２９］固体支持体が複数のマイクロビーズで構成される、先行する態様のいずれか一のデバイスまたは方法。
［態様３０］内部チャネル（２）および多孔性フリット（３）を含むカラム（１）であって、前記内部チャネル（２）が段階的にテーパリングされ、カラム（１）をトップセクション（４）、ネックセクション（５）およびボトムセクション（６）に分割し、ここでフリット（３）はカラム（１）のボトムセクション（６）に位置し、そして内部チャネル（２）の全横断面をふさぎ、内部チャネル（２）は、ネックセクション（５）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約３０％〜約５０％まで細くなり、そして内部チャネル（２）は、ボトムセクション（６）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約２０％〜約３０％まで細くなる、前記カラム。
［態様３１］ボトムセクション（６）が約１０μｌ〜約３０μｌの体積を有する、態様３０のカラム。
［態様３２］トップセクション（４）がカラム（１）の全長の約６０〜７５％を構成し、ネックセクション（５）がカラム（１）の全長の約５〜１０％を構成し、そしてボトムセクション（６）がカラム（１）の全長の約２０〜３０％を構成する、態様３０または３１のカラム。
［態様３３］態様１〜５のいずれか一のハイブリダイゼーションカラムを調製する方法であって：
（ｉ）内部チャネルを含むカラムを提供し、そして
（ｉｉ）ほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズでチャネルの全横断面を充填し、ここでマイクロビーズが多孔性固体支持体を形成する；
工程を含む、前記方法。
［態様３４］直径が０．５〜５００μｍである、態様３３の方法。
［態様３５］（ｉ）内部チャネルを含む１またはそれより多いカラム、および（ｉ）ほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズを含む容器を含む、態様１〜５のいずれか一のハイブリダイゼーションカラムを調製するためのキット。
［態様３６］カラムが態様３０〜３２のいずれか一記載のカラムである、態様３３または３４の方法あるいは態様３５のキット。
［態様３７］１セットより多いハイブリダイゼーションプローブを含むマイクロビーズであって、同じセット中の各ハイブリダイゼーションプローブが、生物ゲノムの同じ領域に結合し、そして各セットがゲノム中の異なる領域に結合する、前記マイクロビーズ。
［態様３８］異なる領域が、ゲノム内の異なるコードまたは非コード領域である、態様３７のマイクロビーズ。
［態様３９］異なる領域の少なくとも１つが、異なる染色体上に位置する、態様３７のマイクロビーズ。
［態様４０］異なる領域が同じ遺伝子内に位置する、態様３７のマイクロビーズ。
［態様４１］異なる領域が互いに重複している、態様３７のマイクロビーズ。
［態様４２］異なる領域が前記ゲノムのコード領域内に位置し、前記コード領域が疾患または障害と関連する、態様３７〜４１のいずれか一のマイクロビーズ。
［態様４３］疾患または障害が、新生物性疾患、神経学的疾患、自己免疫疾患、代謝疾患、遺伝子疾患または体質性障害より選択される、態様４２のマイクロビーズ。
［態様４４］異なる領域が１またはそれより多い出生前疾患または障害に関連する、態様３７〜４１のいずれか一のマイクロビーズ。
［態様４５］態様３７〜４４のいずれか一記載の複数のマイクロビーズを含むライブラリー。
［態様４６］１セットより多いハイブリダイゼーションプローブを含むマイクロビーズであって、同じセット中の各ハイブリダイゼーションプローブが、ゲノムの同じ領域に結合し、そして各ハイブリダイゼーションプローブの相補性領域が、同じセット内の少なくとも１つの他のハイブリダイゼーションプローブと重複し、そして各セットがゲノムの異なる領域に相当する、前記マイクロビーズ。
［態様４７］少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の異なるセットのハイブリダイゼーションプローブを含む、態様４６のマイクロビーズ。
［態様４８］重複が２ｘの最小タイリング深度を提供する、態様４６または４７のマイクロビーズ。
［態様４９］第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーであって、前記の第一のマイクロビーズが、生物ゲノム中の第一の相補性領域に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズがゲノム中の第二の相補性領域に結合し、前記の第一の領域および前記の第二の領域が、前記ゲノムの異なる領域に位置する、前記ライブラリー。
［態様５０］前記の第一の領域および前記の第二の領域が、ゲノムの異なるコードまたは非コード領域である、態様４９のライブラリー。
［態様５１］第一の領域および第二の領域が異なる染色体上に位置する、態様４９のライブラリー。
［態様５２］第一の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび第二の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブが、すべて、同じ配列を有する、態様４９〜５１のいずれか一のライブラリー。
［態様５３］第一の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび第二の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブが、すべて、異なる配列を有する、態様４９〜５１のいずれか一のライブラリー。
［態様５４］前記ゲノムの１０の異なる領域に結合する少なくとも１０の異なるマイクロビーズを含む、態様４９〜５１のいずれか一のライブラリー。
［態様５５］第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーであって、前記の第一のマイクロビーズが、生物ゲノム中の第一の癌遺伝子に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズが、ゲノム中の第二の癌遺伝子に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結される、前記ライブラリー。
［態様５６］１００を超えるマイクロビーズを含むライブラリーであって、各マイクロビーズが生物ゲノム中の異なる領域に結合するハイブリダイゼーションプローブを含む、前記ライブラリー。