【手続補正書】
【提出日】平成30年3月19日(2018.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ付けされたヌクレオチドであって、末端リン酸を有するポリリン酸基、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって、前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
【請求項２】
前記タグは、１，２−ジアジン又はトリアゾールによって前記末端リン酸に共有結合されており、
好ましくは、前記トリアゾールは、構造：
【化１】
2017515887.tif 000001
を有し、
Ｒ１は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み、或いは、
Ｒ１は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含むか、又は
前記トリアゾールは、構造：
【化２】
2017515887.tif 000002
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し、及び
結合したＲ１及びＲ３は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み、或いは、
結合したＲ１及びＲ３は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
請求項１に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリリン酸基は、前記ヌクレオチドの５’位にあり、
好ましくは、前記ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸、又は４つから６つまでのリン酸を含むか、又は
前記タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はそれらの何れかの組み合わせを含む請求項１に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
【請求項４】
前記タグは、オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは前記オリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドを含み、
より好ましくは、前記非天然のヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチド、２’，５’結合、α−Ｄ−ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非天然塩基、非天然糖基、及びそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される基を含み、
より好ましくは、前記非天然のヌクレオチドは、二トロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、ベンゼン及びベンゼン誘導体からなる群から選択される非天然塩基を含み、或いは、前記非天然のヌクレオチドは、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボロノリン酸、ホスホロアミド酸及びモルホリノ基からなる群から選択される非天然ヌクレオチド間結合を含む請求項３に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端は、ポリリン酸基の前記末端リン酸と共有結合しているおり、前記オリゴヌクレオチドは、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する、その３’末端の化学修飾を含み、
好ましくは、前記化学修飾は、リン酸化、及び末端ヒドロキシル基を有するＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択されるか、又は
前記オリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリリン酸基の前記末端リン酸に共有結合しており、前記オリゴヌクレオチドは、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する、その５’末端の化学修飾を含み、
好ましくは、前記５’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される請求項４に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、シアニン色素基、又はＣｙ３基であるシアニン色素基を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、スペーサーを含み、
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の炭素〜約１２個の炭素のアルキル基を含むスペーサー、無塩基の単位を含むスペーサー、又はｉｄＳｐ、ｉＳｐ９、ｉＳｐ１８、ｉＳｐＣ３、ｉＳｐＣ６及びｉＳｐＣ１２からなる群から選択されるスペーサーを含む請求項４又は５に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
【請求項７】
前記タグは、
表５に掲げられたタグからなる群から選択されるか、
表６に掲げられた化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含むか、
配列番号１７、１８、２２〜３３、４２〜７２、７４〜８２、８６〜８８、９０又は９４〜１０２で表されるか、
ＤＢＣＯ−Ｃｙ３であるか、又は配列番号５〜１６、１９〜２１又は３４〜４１で表されるか、
配列番号８９、９１〜９３又は１０３〜１０５で表されるか、
配列番号７３、８３〜８５又は１０６で表されるか、
dG6P-(T4-Npy2)6-C3、dG6P-(T4-Neb2)6-C3、dT6P-dT6-C7NH6-dT18-C3、dT6P-dT6-Pyrd6-dT18-C3、dA6P-dT6-dTNH6-dT18-C3、dG6P-dT4-sperm-dT22-C3、dT6P-dT4-sperm-dSp3-dT19-C3、dC6P-dT4-sperm-iFlrT-dT21-C3、dG6P-sperm-dT30-C3、dT6P-Cy3.5-dT30-C3、dT6P-Cy3-Cy3-dT30-C3、dT6P-dT6-Cy3-dT23-C3、dT6P-dT10-Cy3-dT19-C3、dT6P-Hairpin Block、dA6P-Cy3 T2-Sp18-T22-C3、dT6P-Cy3-dT4-dSp8-T18-C3、dT6P-Hex-dT6-dTC2NH6-dT18-C3、dA6P-Cy3-dT4-Sp9-T23-C3、dC6P-Cy3-T-dSp3-T26-C3、dC6P-Cy3-T4-dSp3-T23-C3、dC6P-Cy3-T7-dSp3-T20-C3、dC6P-Cy3-T10-dSp3-T17-C3、dC6P-Cy3 T4-iFluorT3-T23-C3、dC6P-Cy3 T4-iFluorT-T-iFluorT-T23-C3、Bio-Spermine-dT30-C3、dT6P-dT30-Cy3-C3、dG6P-dT8-Spermine-dT20-C3、dA6P-Cy3- T4-iFluorT-T-iFluorT-T23-C3、dT6P-CY3-dT4-Aptamer-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT4-12Hairpin-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT5-dSp3-dT22-C3、dT6P-Cy3-dT6-dSp3-dT21-C3、dT6P-Cy3-dT4-dSp4-dT22-C3、dT6P-Cy3-dT4-dSp5-dT21-C3、dC6P-Cy3-dT5-SpC12-dT23-C3、dC6P-Cy3-dT4-SpC6-SpC6-dT24-C3、dC6P-Cy3-dT4-(SpC3)3-dT23-C3、dG6P-Cy3-dT30-C3、dT6P-Cy3-dT2-dSp8-dT20-C3、dC6P-Cy3-T30-(C3)4-PO4、dC6P-Cy3-T30-PO4、dC6P-Cy3-T30-C3-NH2、dG6PaS-Cy3-dT2-dSp8-dT20-C3、Rev-P-T30-Cy3-dG6P、Rev-P-T24-dSp3-T3-Cy3-dC6P、dT6P-Cy3-dT4-HP6-dT25-C3、dA6P-Cy3-dT4-dI6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-NitrIndole6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-dC6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-5IU6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-PyrndU6-dT20-C3、dT6P-Cy3-dT4-(idSP-T)4-dT18-C3、dT6P-Cy3-dT5-(idSP-T)4-dT17-C3、dT6P-Cy3-dT4-Propyl6-dT20-C3、dT6P-Cy3-LdT30-C3、dT6P-Cy3-dT4-L111-dT26-C3、dT6P-Cy3-dT4-L121-dT26-C3、dT6P-Cy3-dT4-SpC12-SpC12-dT24-C3、dT6P-Cy3-dT4-(SpC6)4-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT4-Spermine-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT2-Spermine-dT27-C3、dT6P-Cy3-dT2-Spermine-Spermine-dT26-C3、dT6P-Cy3-dT4-Pyrn-dU-TT-Pyrn-dU-dT22-C3、dT6P-Cy3-dT4-Tmp6-dT20-C3、dT6P-Cy3-dT4-Pyrrolidine6-dT20-C3、dT6P-Pyrrolidine-dT30-C3、dT6P-Pyrrolidine-Pyrrolidine-dT30-C3及びdT6P-Pyrrolidine3-dT30-C3からなる群から選択されるか、
dT6P-Cy3、dA6P-Cy3、dT6P-Cy3-T25、dA6P-T*30_ODD、dG6P-T30、dT6P-T6-dSp8-T16、dC6P-T6-T*10-T14、dC6P-T4-dSp3-T23、dC6P-T7-dSp3-T20、dC6P-T10-dSp3-T17、dC6P-T13-dSp3-T14、dG6P-T30-C6、dG6P-Cy3-T30-C6、dT6P-T4-dSp10-T16-C6、dA6P-T4-Sp18-T22-C3、dA6P-T4-Sp182-T19-C3、dA6P-T4-Sp92-T22-C3、dC6P-Cy3、dG6P-Cy3、dT6P-T6-dSp8-T16-C3、dA6P-Cy3-T30-C6、dT6P-Cy3-T30-C6、dC6P-Cy3-T30-C6、dA6P-Cy3-dT*30_ODD、dA6P-T*30、dA6P-Cy3-T*30、dG6P-Cy3-T30-C3、dG6P-Cy3-T15-C3、dG6P-Cy3-T20-C3、及びdG6P-Cy3-T25-C3からなる群から選択されるか、
dT6P-Cy3-dT3-(SpC12)3-dT24-C3、dT6P-Cy3-dT4-(SpC6)5-dT23-C3、dT6P-Cy3-dT5-(SpC6)4-dT24-C3、dT6P-Cy3-dT2-(SpC6)5-dT25-C3、dT6P-SpC3-Cy3-dT30-C3、dT6P-SpC3-SpC3-Cy3-dT30-C3、及びdT6P-SpC6-Cy3-dT30-C3からなる群から選択されるか、或いは、
dT6P-Cy3-dC30-C3、dT6P-Cy3-LdT4-dSp3-LdT23-C3、dT6P-Cy3-LdT4-dSp8-LdT18-C3、dT6P-Cy3-LdT4-dI6-LdT20-C3、及びdT6P-Cy3-dT4(alpha-dT)3-dT23-C3からなる群から選択される請求項１〜７の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
【請求項８】
前記各タグ付けされたヌクレオチドは、前記タグを前記ヌクレオチドに連結しているリンカー内のシアニン色素基を含み、かつ前記タグ付けされたヌクレオチドは、シアニン色素基を含まないタグ付けされたヌクレオチドと比較して、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼと少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼに前記プライマーへの前記タグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、核酸伸長生成物を形成させるために、接触させること、
ただし、前記少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドの各々は、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩基、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、ただし、（ｉ）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされた前記ヌクレオチドの各々中の塩基の種類と異なっており、及び（ｉｉ）各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、前記他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、かつ各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、前記他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、前記タグが結合したリン酸の解離をもたらし、
（ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及び前記ナノポアに入っていく、前記ナノポア中に位置するようになる、及び／又は前記ナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成した、前記タグが結合した前記ポリリン酸に起因する、前記ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、前記工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、どのタグ付けされたヌクレオチドが前記プライマーに組み込まれたかを決定すること、ただし、前記電子的変化は、前記ポリリン酸基中のリン酸の各異なる数、若しくは前記タグの各異なる種類のうち、適切な方について異なり、それによって前記組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な前記一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定し、
（ｃ）シークエンシングされている前記一本鎖核酸の各核酸残基について、前記工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、前記工程（ａ）の各反復において、前記タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する前記核酸伸長生成物中に組み込まれ、
それによって、前記一本鎖核酸の配列を決定すること
を含む方法。
【請求項１０】
一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼとタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼに前記プライマーへのタグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、ＤＮＡ伸長生成物を形成させるために、接触させること、ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドは、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、
ただし、タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、結合しているタグを有するポリリン酸の解離をもたらし、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれない場合、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれるまで、異なるタグ付けされたヌクレオチドを接触させることを反復して繰り返し、ただし、（１）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々の塩基の種類と異なっており、及び（２）各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
（ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及び前記ナノポアに入っていく、前記ナノポア中に位置するようになる、及び／又は前記ナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成された、前記タグが結合した前記ポリリン酸に起因する、前記ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、前記工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、タグ付けされたヌクレオチドがプライマーに組み込まれたかどうかを決定すること、ただし、前記電子的変化は、ｎの各値、又はタグの各異なる種類のうちの適切な方について異なり、それによって前記組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な前記一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定すること;
（ｃ）シークエンシングされている前記一本鎖核酸の各核酸残基について、工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、前記工程（ａ）の各反復において、前記タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する前記核酸伸長生成物中に組み込まれ、
それによって、前記一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定すること
を含む方法。
【請求項１１】
前記タグ付けされたヌクレオチドの各々の前記ポリリン酸基におけるリン酸の数は、同じであり、前記タグ付けされたヌクレオチドの各々の種類は、他の３種類のタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類と異なり、
好ましくは、各ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸を含み、
より好ましくは、各ポリリン酸基は、４つから６つまでのリン酸を含む
前記各タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はそれらの何れかの組み合わせを含む請求項９又は１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記各タグは、１，２−ジアジン、又はトリアゾールによって前記末端リン酸に共有結合しており、
好ましくは、トリアゾールによってであり、前記各トリアゾールは、アジドとアルキンとの間の反応によって形成され、
前記各トリアゾールは、構造：
【化３】
2017515887.tif 000003
を有し、
Ｒ１は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み；又は、
Ｒ１は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含むか、或いは、
前記各トリアゾールは、構造：
【化４】
2017515887.tif 000004
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し；及び
結合したＲ１及びＲ３は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み；又は、
結合したＲ１及びＲ３は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
請求項９又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記各タグは、表５に掲げられているか、或いは配列番号１７、１８、２２〜３３、４２〜７２、７４〜８２、８６〜８８、９０又は９４〜１０２で表されるか、
DBCO-Cy3であるか、又は前記タグは、配列番号５〜１６、１９〜２１、又は３４〜４１で表されるか、
配列番号８９、９１〜９３、又は１０３〜１０５で表されるか、或いは
配列番号７３、８３〜８５、又は１０６で表される
タグの群から選択されるか、或いは、前記各タグは、表６に掲げられている化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含むか、或いは、前記各タグ付けされたヌクレオチドは、dG6P-(T4-Npy2)6-C3、dG6P-(T4-Neb2)6-C3、dT6P-dT6-C7NH6-dT18-C3、dT6P-dT6-Pyrd6-dT18-C3、dA6P-dT6-dTNH6-dT18-C3、dG6P-dT4-sperm-dT22-C3、dT6P-dT4-sperm-dSp3-dT19-C3、dC6P-dT4-sperm-iFlrT-dT21-C3、dG6P-sperm-dT30-C3、dT6P-Cy3.5-dT30-C3、dT6P-Cy3-Cy3-dT30-C3、dT6P-dT6-Cy3-dT23-C3、dT6P-dT10-Cy3-dT19-C3、dT6P-Hairpin Block、dA6P-Cy3 T2-Sp18-T22-C3、dT6P-Cy3-dT4-dSp8-T18-C3、dT6P-Hex-dT6-dTC2NH6-dT18-C3、dA6P-Cy3-dT4-Sp9-T23-C3、dC6P-Cy3-T-dSp3-T26-C3、dC6P-Cy3-T4-dSp3-T23-C3、dC6P-Cy3-T7-dSp3-T20-C3、dC6P-Cy3-T10-dSp3-T17-C3、dC6P-Cy3 T4-iFluorT3-T23-C3、dC6P-Cy3 T4-iFluorT-T-iFluorT-T23-C3、Bio-Spermine-dT30-C3、dT6P-dT30-Cy3-C3、dG6P-dT8-Spermine-dT20-C3、dA6P-Cy3- T4-iFluorT-T-iFluorT-T23-C3、dT6P-CY3-dT4-Aptamer-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT4-12Hairpin-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT5-dSp3-dT22-C3、dT6P-Cy3-dT6-dSp3-dT21-C3、dT6P-Cy3-dT4-dSp4-dT22-C3、dT6P-Cy3-dT4-dSp5-dT21-C3、dC6P-Cy3-dT5-SpC12-dT23-C3、dC6P-Cy3-dT4-SpC6-SpC6-dT24-C3、dC6P-Cy3-dT4-(SpC3)3-dT23-C3、dG6P-Cy3-dT30-C3、dT6P-Cy3-dT2-dSp8-dT20-C3、dC6P-Cy3-T30-(C3)4-PO4、dC6P-Cy3-T30-PO4、dC6P-Cy3-T30-C3-NH2、dG6PaS-Cy3-dT2-dSp8-dT20-C3、Rev-P-T30-Cy3-dG6P、Rev-P-T24-dSp3-T3-Cy3-dC6P、dT6P-Cy3-dT4-HP6-dT25-C3、dA6P-Cy3-dT4-dI6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-NitrIndole6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-dC6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-5IU6-dT20-C3、dA6P-Cy3-dT4-PyrndU6-dT20-C3、dT6P-Cy3-dT4-(idSP-T)4-dT18-C3、dT6P-Cy3-dT5-(idSP-T)4-dT17-C3、dT6P-Cy3-dT4-Propyl6-dT20-C3、dT6P-Cy3-LdT30-C3、dT6P-Cy3-dT4-L111-dT26-C3、dT6P-Cy3-dT4-L121-dT26-C3、dT6P-Cy3-dT4-SpC12-SpC12-dT24-C3、dT6P-Cy3-dT4-(SpC6)4-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT4-Spermine-dT25-C3、dT6P-Cy3-dT2-Spermine-dT27-C3、dT6P-Cy3-dT2-Spermine-Spermine-dT26-C3、dT6P-Cy3-dT4-Pyrn-dU-TT-Pyrn-dU-dT22-C3、dT6P-Cy3-dT4-Tmp6-dT20-C3、dT6P-Cy3-dT4-Pyrrolidine6-dT20-C3、dT6P-Pyrrolidine-dT30-C3、dT6P-Pyrrolidine-Pyrrolidine-dT30-C3、及びdT6P-Pyrrolidine3-dT30-C3からなる群から選択されるか、
dT6P-Cy3、dA6P-Cy3、dT6P-Cy3-T25、dA6P-T*30_ODD、dG6P-T30、dT6P-T6-dSp8-T16、dC6P-T6-T*10-T14、dC6P-T4-dSp3-T23、dC6P-T7-dSp3-T20、dC6P-T10-dSp3-T17、dC6P-T13-dSp3-T14、dG6P-T30-C6、dG6P-Cy3-T30-C6、dT6P-T4-dSp10-T16-C6、dA6P-T4-Sp18-T22-C3、dA6P-T4-Sp182-T19-C3、dA6P-T4-Sp92-T22-C3、dC6P-Cy3、dG6P-Cy3、dT6P-T6-dSp8-T16-C3、dA6P-Cy3-T30-C6、dT6P-Cy3-T30-C6、dC6P-Cy3-T30-C6、dA6P-Cy3-dT*30_ODD、dA6P-T*30、dA6P-Cy3-T*30、dG6P-Cy3-T30-C3、dG6P-Cy3-T15-C3、dG6P-Cy3-T20-C3、及びdG6P-Cy3-T25-C3からなる群から選択されるか、
dT6P-Cy3-dT3-(SpC12)3-dT24-C3、dT6P-Cy3-dT4-(SpC6)5-dT23-C3、 dT6P-Cy3-dT5-(SpC6)4-dT24-C3、dT6P-Cy3-dT2-(SpC6)5-dT25-C3、dT6P-SpC3-Cy3-dT30-C3、dT6P-SpC3-SpC3-Cy3-dT30-C3、及びdT6P-SpC6-Cy3-dT30-C3からなる群から選択されるか、或いは
dT6P-Cy3-dC30-C3、dT6P-Cy3-LdT4-dSp3-LdT23-C3、dT6P-Cy3-LdT4-dSp8-LdT18-C3、dT6P-Cy3-LdT4-dI6-LdT20-C3、及びdT6P-Cy3-dT4(alpha-dT)3-dT23-C3からなる群から選択される
請求項９〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記各タグ付けされたヌクレオチドは、前記タグを前記ヌクレオチドに連結しているリンカー内のシアニン色素基を含み、かつ前記タグ付けされたヌクレオチドは、シアニン色素基を含まないタグ付けされたヌクレオチドと比較して、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する請求項９〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記４つのタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３である請求項９〜１４の何れか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
この出願は、「１５０８０５_０５７５_８５６２５_ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ_ＪＡＫ.ｔｘｔ」と称するファイル中に示されるヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を参照により援用し、そのファイルは５２キロバイトのサイズであり、２０１５年８月５日にＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）と互換性のあるオペレーティングシステムを有するＩＢＭ−ＰＣ機械フォーマットにおいて作成され、この出願の一部として２０１５年８月５日に出願されたテキストファイルに含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
アジド修飾化合物とシクロオクチン修飾化合物（例えば、ジベンジルシクロオクチン「ＤＢＣＯ」で修飾）との間の、共有トリアゾール結合を含む両化合物の生成物複合体を得るための環化付加を用いる銅無しクリック反応も開発されてきている。例えば、ジェウェット（Ｊｅｗｅｔｔ）及びベルトッツィ（Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）（２０１０）を参照のこと。トリアゾールによって２つの化合物Ａ及びＢを結合させるための銅無しのアジド−シクロオクチンクリック反応の使用のための一般的なスキームは、図２１のスキーム（Ｂ）に記載されている。幾つかの実施形態において、この銅無しクリック反応は、本開示の方法に従ってヌクレオチドにタグを結合するために使用することができ、タグとヌクレオチドとの間の共有結合中にトリアゾールを含むタグ付けされたヌクレオチドを提供し得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
本開示のタグ付けされたヌクレオチドを提供するために有用な他のクリックケミストリー反応は、逆電子要請型ディールス−アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応である。例えば、レイナー（Ｒｅｉｎｅｒ）ら（２０１４）並びに米国特許出願公開第２０１３／０２６６５１２Ａ１号及び第２０１３／００８５２７１Ａ１号を参照のこと。ＩＥＤＤＡクリック反応は、テトラジン修飾化合物とトランス−シクロオクテン修飾化合物との間の高速不可逆反応を用いて共有１，２−ジアジン結合、より具体的には、１，２−ジアジンの互変異性同等物のジヒドピリダジンを含む複合体生成物を提供する。１，２−ジアジン（ジヒドロピリダジン互変異性体）基で２つの化合物Ａ及びＢを結合するためのテトラジンとトランス−シクロオクテンとの間のＩＥＤＤＡクリック反応の使用のための一般的なスキームは、図２１のスキーム（Ｃ）に示されている。従って、幾つかの実施形態において、このＩＥＤＤＡクリック反応は、本開示の方法に従ってヌクレオチドにタグを結合するためにも使用することができ、タグとヌクレオチドとの間の共有結合内に１，２−ジアジン（ジヒドロピリダジン互変異性体）を含むタグ付けされたヌクレオチドを提供し得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
幾つかの実施形態において、タグは、「クリックケミストリー」として知られるアジド−アルキンヒュスゲン環化付加を用いてヌクレオチドへ結合されている。例えば、図６は、クリックケミストリーを用いて、６つの炭素スペーサー及び反応性アルキン基を有するタグ（右）と反応する、６個の炭素スペーサー及び反応性アジド基を末端リン酸に結合した６個のリン酸を有するヌクレオチド（左）を示す。本明細書の他の箇所に記載されるように、図２１のスキーム（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、２つの化合物（Ａ及びＢ）を結合するための３つの例示的なクリックケミストリー反応を示す。これらの３つの例示的なクリック反応は、ヌクレオチドへのタグの結合における使用のために適用することが可能であり、それによって本開示のタグ付けされたヌクレオチドが製造される。このようなクリック反応の使用の詳細な記載は、例において提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
例６  タグ付けされたヌクレオチドの例
表４は、合成され、ポリメラーゼの基質として働き得ることが見いだされたタグ付けされたヌクレオチドの例を示す。表４に示される例示的なタグ付けされたヌクレオチドは、５’−アジド−六リン酸−ヌクレオチド（「ｄＮ６Ｐ−Ｎ３」）及びアルキン−タグから、アジド−アルキン又はアジド−シクロオクチン「クリック」反応（例えば、図２１を参照のこと）の何れかを用いて合成され得る。アジド−アルキン又はアジド−シクロオクチンクリック反応合成のための更なる試薬及び条件の更なる説明を以下の例７〜例１１に提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
表４は、天然又は非天然オリゴヌクレオチドを含む多くのタグ構造を含む。それらのオリゴヌクレオチドタグは、５’から３’の順列で示され、ホスホラミダイト合成によって調整され、インテクレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（コーラルビル、アイオワ州、ＵＳＡ）又はトリリンクバイオテクノロジーズ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）又はグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（スターリング、バージニア州、ＵＳＡ）のようなカスタムオリゴヌクレオチドの販売業者から我々の設計に基づいて購入可能である。公開され、カスタムオリゴヌクレオチドの販売業者から購入することができ、タグとして有用なカスタム合成されたオリゴヌクレオチドに簡単に組み込むことができる何百もの非標準的なホスホアミダイトモノマー単位「ビルディングユニット」が存在する。それらの非標準的なホスホアミダイトモノマー単位の多くがスペーサー(例えば、「ｉＳｐ」)、色素（例えば、「ｉＣｙ３」）、及びリンカー（例えば、「ヘキシニル」）として分類される。表４の全てのオリゴヌクレオチドタグ構造は、非標準的なモノマー単位を示すために、周知のオリゴヌクレオチド合成の用語を用いて説明される。（例えば、慣習的に使用されるオリゴヌクレオチドの用語の更なる詳細については、ｗｗｗ.ｉｄｔＤＮＡ.ｃｏｍにあるインテクレーテッドＤＮＡテクノロジーズのウェブサイトを参照のこと。）例えば、非標準的なモノマー単位は、ユニット間のスラッシュ「／」及びアスタリスク「＊」で囲まれており、それはチオリン酸ジエステル結合を示す。それゆえ、「／５ヘキシニル／／ｉＳｐＣ３／／ｉＣｙ３／Ｔ」は、５’−ヘキシン−リン酸−ジヒドロキシプロパン−リン酸−シアニン３（色素）−リン酸−チミジン-３’（ＯＨ）を示す。更に選択した略語の説明は、表４に含まれている。
【表４−１】
2017515887.tif 000005
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
【表４−４】
2017515887.tif 000006
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
【表４−５】
2017515887.tif 000007
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応は、これら四つのオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３でタグ付けされたヌクレオチド、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡＰ、及び「シンプルベル（ＳｉｍｐｌｅＢｅｌｌ）」プライマーループ鋳型ＤＮＡ（５‘−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧ−３’）（配列番号１０７）を用いて行った。それぞれの反応は１．５μＭ鋳型ループプライマー、１Ｘ等温増幅緩衝液［２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、２５℃でｐＨ８．８］、４単位のＢｓｔ２．０ＤＮＡＰ、２．２５μＭの天然のｄＮＴＰ又は３．７５μＭのオリゴヌクレオチドでタグ付けされたヌクレオチド、１ｍＭのＭｎＳＯ４を含んでも含まなくてもよい、からなる２０μＬの反応物中で３０分間６５℃で行った。ＤＮＡ伸長生成物を、５分間９５℃で変性した後、急激に４℃に冷却した。変性した伸長生成物は、２５分間、２５０ｍＶの下で１５％ＴＢＥ尿素プレキャストゲル（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）で分離した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
材料及び方法。以下の表５に示すような５’−ビオチン及び種々の３’化学修飾を有するｄＴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて調製した。
【表５】
2017515887.tif 000008
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
この例に記載の実験を実施するために、七量体のα溶血素ポア中の７つのモノマーのそれぞれのＣ末端付近に提示された単一のビオチン基を有するナノポアを調製した。次いで、ストレプトアビジン（ビオチン結合部位を４つ有する）及びビオチン化ヘアピンバイオシングルベル（ＢｉｏＳｉｎｇｌｅＢｅｌｌ）Ｃプライマー／鋳型ＤＮＡ（５’−ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＴ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＴ ＣＡＣ−３’）（配列番号１１５）を添加した。ストレプトアビジンの存在によって、ポアに隣接して結合した１つ以上のヘアピンプライマー／鋳型分子を有する強い結合複合体の形成が可能となった。このナノポア複合体を精製して過剰のバイオシングルベルＣＤＮＡプライマー／鋳型を除去し、次いでＤＮＡポリメラーゼを加え、プライマー／鋳型に少なくとも室温で３０分間結合することが可能とした。得られたＤＮＡポリメラーゼ／ナノポア／ＤＮＡ複合体をゲニア（Ｇｅｎｉａ）チップ上の脂質二重膜に露出し、ポアを形成させた。結合したヘアピンＤＮＡ分子は、それらの露出した３’末端が二本鎖であり、ポアに入ることができないため、ポアを通って流れるイオン電流に干渉しない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
シンプルベルＤＮＡ鋳型は、配列５’−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＸＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧ−３’（配列番号１１６）を有する８３量体の自己プライミング一本鎖であり、ここで、Ｘは鋳型上の最初の開放位置であり、４つの塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴの何れか１つであり得る。これらのナノポアの実験で使用される４つのシンプルベルＤＮＡ鋳型は、相補的なヌクレオチドへの結合及びポリメラーゼによる組み込みのための鋳型上の最初の利用可能な位置のみが異なっている。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】
ナノポアアレイチップの調製。例１６に記載されているように、脂質二重膜を２６４ウェルＣＭＯＳチップアレイ上に調製し、６：１α−ＨＬ−Ｐｈｉ２９複合体を、１５０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＳｒＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、２５℃）の緩衝溶液中のＤＮＡ鋳型とともに二重膜中に挿入した。２つの異なるＤＮＡ鋳型を本例に記載のシークエンシング反応に用いた。最初の２つの反応（図３６の（Ａ）及び（Ｂ）を参照のこと）において、鋳型は、例１６で使用された８３量体自己プライミング一本鎖シンプルベルＤＮＡ鋳型であり、Ｘ位置で選択されたＡヌクレオチドは、自己プライミング領域：５’−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧ−３’（配列番号１１６）の始まりの開始を示す。第３のシークエンシング反応（図３７参照）において、ホモポリマー領域を有する自己プライミング一本鎖ＤＮＡ鋳型：５’−ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＴＧＧ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＡＧ ＧＧＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＴＴ−３’（配列番号１１７）を使用した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
結果
図３６に示すように、オープン状態の電流値よりも低い４つの異なる電流値が一時的に観察され、４つの異なるヌクレオチドのそれぞれに関する、４つの異なるタグのナノポアによる捕捉を示している。存在する４つのタグ付けされたヌクレオチドの全てによるこのシークエンシング実験中に観察された相対的電流値の変化は、単一のタグ及び非触媒Ｓｒ２＋二価金属イオンのみ存在するナノポアアレイ測定の間に観察されたものと一致した（例えば例１６参照のこと）。予想されたように、４つの異なるタグ付けされたヌクレオチドについて観察された最低から最高への残留電流（Ｉ／Ｉ０）のランク付けは、例１６のナノポアアレイチップを用いたこれらのタグ付けされたヌクレオチドについて観察された相対的残留電流と一致した：ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３(〜０．１５)、＜ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６（〜０．２５）、＜ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３（〜０．４２）、＜ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３（〜０．５０）。更に、電流値変化のトレースは、図３６の上部に示される「伸長プライマー」配列、５’―――ＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴ―――３'（配列番号１１８）である自己プライミングシンプルベルＤＮＡ鋳型の相補的な配列に基づく正確なヌクレオチド配列の組み込みに対応するタグ捕捉事象を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
図３７に示すように、ナノポアアレイチップを用いてタグ付けされたヌクレオチドの署名電流値の変化を検出することにより、ホモポリマー鋳型領域、５’―――ＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＴＴ―――３’（配列番号１１９）をシークエンシングすることができた。電流の急激な減少は、ポア内へのタグ捕捉、マークされた４つのタグの異なる構造のたわみ特性の深さを示すものであり、非常に小さな（＜２ｍｓ）バックグラウンドのたわみは無視した。図３７の電流トレースは、後の処理又はノイズ減少のない生のデータ出力である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１０】
２０１３年４月８日に出願されたジュらのＰＣＴ国際出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３５号。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
タグ付けされたヌクレオチドであって、末端リン酸を有するポリリン酸基、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって、前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
［２］
前記タグは、トリアゾールによって前記末端リン酸に共有結合されている［１］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［３］
前記トリアゾールは、構造：
【化１５】
2017515887.tif 000009
を有し、
Ｒ１は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み、或いは、
Ｒ１は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
［２］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［４］
前記トリアゾールは、構造：
【化１６】
2017515887.tif 000010
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し、及び
結合したＲ１及びＲ３は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み、或いは、
結合したＲ１及びＲ３は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
［２］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［５］
前記タグは、１，２−ジアジンによって前記末端リン酸に共有結合されている［１］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［６］
前記ポリリン酸基は、前記ヌクレオチドの５’位にある［１］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［７］
前記ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸、又は４つから６つまでのリン酸を含む［１］〜［６］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［８］
前記タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、又はそれらの何れかの組み合わせを含む［１］〜［７］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［９］
前記タグは、オリゴヌクレオチドを含む［８］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１０］
前記タグの前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも７個のモノマー単位、又は少なくとも３０個のモノマー単位を含む［９］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１１］
前記オリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドを含む［９］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１２］
前記非天然のヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチド、２’，５’結合、α−Ｄ−ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非天然塩基、非天然糖基、及びそれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される基を含み、或いは、前記非天然のヌクレオチドは、二トロピロール、ニトロインドール、ネブラリン、ゼブラリン、ベンゼン及びベンゼン誘導体からなる群から選択される非天然塩基を含み、或いは、前記非天然のヌクレオチドは、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボロノリン酸、ホスホロアミド酸及びモルホリノ基からなる群から選択される非天然ヌクレオチド間結合を含む［１１］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１３］
前記オリゴヌクレオチドの５’末端は、ポリリン酸基の前記末端リン酸と共有結合している［９］〜［１２］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１４］
前記オリゴヌクレオチドは、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する、その３’末端の化学修飾を含む［１３］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１５］
前記３’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される［１４］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１６］
前記オリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリリン酸基の前記末端リン酸に共有結合している［９］〜［１２］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１７］
前記オリゴヌクレオチドは、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護する、その５’末端の化学修飾を含む［１６］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［１８］
前記５’末端の化学修飾は、リン酸化、及びＣ３アルキルからＣ１２アルキルまでのスペーサーとの共有結合から選択される［１４のタグ付けされたヌクレオチド。
［１９］
前記オリゴヌクレオチドは、シアニン色素基、又はＣｙ３基であるシアニン色素基を含むリンカーを含む［９］〜［１８］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［２０］
前記オリゴヌクレオチド及び／又は前記リンカーは、少なくとも２個の炭素から約１２個の炭素までのアルキル基を含むスペーサー基を含む［９］〜［１９］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［２１］
［１］〜［２０］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチドを含む、核酸をシークエンシングするためのキット。
［２２］
タグ付けされたヌクレオチドを作製するためのプロセスであって、
（ａ）（ｉ）末端リン酸を有するポリリン酸基を含むヌクレオチド、ここで、前記末端リン酸は第１の反応性官能基を含むリンカーと結合しており、及び（ｉｉ）第２の反応性官能基を含むタグを提供すること、
ただし、
（１）前記第１の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択され、或いは、
（２）前記第１の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、及び
（ｂ）前記タグに前記ヌクレオチドを結合させるために、前記第１の反応性官能基を前記第２の反応性官能基と反応させること
を含むプロセス。
［２３］
前記第１の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択される［２２］に記載のプロセス。
［２４］
前記第１の反応性官能基は、アルキンであり、前記第２の反応性官能基は、アジドであるか、又は前記第１の反応性官能基は、アジドであり、前記第２の反応性官能基は、アルキンである［２２］に記載のプロセス。
［２５］
前記アルキンは、シクロオクチンである［２４］に記載のプロセス。
［２６］
前記第１の反応性官能基は、マレイミド、ハロアセトアミド、アルデヒド、イソチオシアネート、イソシアネート、ビニルスルホン、アジド及びテトラジンからなる群から選択され、前記第２の反応性官能基は、チオール、イミダゾール、アミン、アルキン及びジエンからなる群から選択される［２２］に記載のプロセス。
［２７］
前記工程（ｂ）は、銅、ルテニウム、銀、又はそれらの何れかの組合せを含む不均一触媒によって促進される［２２］〜［２６］の何れか１項に記載のプロセス。
［２８］
前記工程（ｂ）は、不均一触媒によって促進されない［２２］〜［２６］の何れか１項に記載のプロセス。
［２９］
前記タグは、表４に掲げられたタグからなる群から選択される［１］〜［７］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は［２２］〜［２８］の何れか１項に記載のプロセス。
［３０］
前記タグ付けされたヌクレオチドは、表４に掲げられたタグ付けされたヌクレオチドからなる群から選択される［１］〜［７］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は［２２］〜［２８］の何れか１項に記載のプロセス。
［３１］
前記タグは、表５に掲げられたタグからなる群から選択される［１］〜［７］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は［２２］〜［２８］の何れか１項に記載のプロセス。
［３２］
前記タグは、表６に掲げられた化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含む［１］〜［７］の何れか１項に記載のタグ付けされたヌクレオチド又は［２２］〜［２８］の何れか１項に記載のプロセス。
［３３］
前記タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する［１９］に記載のタグ付けされたヌクレオチド。
［３４］
一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼと少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼに前記プライマーへの前記タグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、核酸伸長生成物を形成させるために、接触させること、
ただし、前記少なくとも４つのタグ付けされたヌクレオチドの各々は、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩基、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、ただし、（ｉ）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされた前記ヌクレオチドの各々中の塩基の種類と異なっており、及び（ｉｉ）各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、前記他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、かつ各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、前記他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、前記タグが結合したリン酸の解離をもたらし、
（ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及び前記ナノポアに入っていく、前記ナノポア中に位置するようになる、及び／又は前記ナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成した、前記タグが結合した前記ポリリン酸に起因する、前記ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、前記工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、どのタグ付けされたヌクレオチドが前記プライマーに組み込まれたかを決定すること、ただし、前記電子的変化は、前記ポリリン酸基中のリン酸の各異なる数、若しくは前記タグの各異なる種類のうち、適切な方について異なり、それによって前記組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な前記一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定し、
（ｃ）シークエンシングされている前記一本鎖核酸の各核酸残基について、前記工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、前記工程（ａ）の各反復において、前記タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する前記核酸伸長生成物中に組み込まれ、
それによって、前記一本鎖核酸の配列を決定すること
を含む方法。
［３５］
一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜中のナノポアと接触している電解質溶液中にあり、かつ一部にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖核酸を、核酸ポリメラーゼとタグ付けされたヌクレオチドとに、それが、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記核酸ポリメラーゼに前記プライマーへのタグ付けされたヌクレオチドの一つの組み込みを触媒させることを許容する条件のもとで、ＤＮＡ伸長生成物を形成させるために、接触させること、ただし、前記タグ付けされたヌクレオチドは、末端リン酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン若しくはウラシルである塩、又はそれらそれぞれの誘導体、及びトリアゾール、１，２−ジアジン、ジスルフィド、第２級アミン、ヒドラゾン、チオアセトアミド、又はマレイミド−チオ付加体によって前記ヌクレオチドの前記末端リン酸に共有結合したタグを有するポリリン酸基を含み、
ただし、タグ付けされたヌクレオチドの組み込みは、結合しているタグを有するポリリン酸の解離をもたらし、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれない場合、タグ付けされたヌクレオチドが組み込まれるまで、異なるタグ付けされたヌクレオチドを接触させることを反復して繰り返し、ただし、（１）各タグ付けされたヌクレオチド中の塩基の種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々の塩基の種類と異なっており、及び（２）各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数と異なっているか、或いは、各タグ付けされたヌクレオチドの前記ポリリン酸基中のリン酸の数は、同じであり、各タグ付けされたヌクレオチド上のタグの種類は、他の３つのタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類とは異なっており、
（ｂ）前記膜を通して電圧を印加し、及び前記ナノポアに入っていく、前記ナノポア中に位置するようになる、及び／又は前記ナノポアを通り抜けて転座する、工程（ａ）において生成された、前記タグが結合した前記ポリリン酸に起因する、前記ナノポアを通した電子的変化を測定することによって、前記工程（ａ）における核酸伸長生成物を形成するために、タグ付けされたヌクレオチドがプライマーに組み込まれたかどうかを決定すること、ただし、前記電子的変化は、ｎの各値、又はタグの各異なる種類のうちの適切な方について異なり、それによって前記組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドに相補的な前記一本鎖核酸中のヌクレオチド残基を特定すること;
（ｃ）シークエンシングされている前記一本鎖核酸の各核酸残基について、工程（ａ）及び（ｂ）を反復して繰り返すこと、ただし、前記工程（ａ）の各反復において、前記タグ付けされたヌクレオチドは、それが、前記核酸伸長生成物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に対し直近の５’である前記一本鎖核酸のヌクレオチド残基に相補的である場合、前記工程（ａ）の先行の反復に起因する前記核酸伸長生成物中に組み込まれ、
それによって、前記一本鎖核酸のヌクレオチド配列を決定すること
を含む方法。
［３６］
前記核酸は、ＤＮＡであり、前記核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであるか、又は前記核酸は、ＲＮＡであり、前記核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素である［３４］又は［３５］に記載の方法。
［３７］
前記タグ付けされたヌクレオチドの各々の前記ポリリン酸基におけるリン酸の数は、同じであり、前記タグ付けされたヌクレオチドの各々の種類は、他の３種類のタグ付けされたヌクレオチドの各々のタグの種類と異なる［３４］又は［３５］に記載の方法。
［３８］
前記各タグは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ糖、炭水化物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビニルポリマー、他の水溶性ポリマー、又はそれらの何れかの組み合わせを含む［３４］〜［３７］の何れか１項に記載の方法。
［３９］
前記各タグは、チアゾール、又は１，２−ジアジンによって前記末端リン酸に共有結合している［３４］〜［３８］の何れか１項に記載の方法。
［４０］
各ポリリン酸基は、少なくとも３つのリン酸を含む［３４］〜［３９］の何れか１項に記載の方法。
［４１］
前記各ポリリン酸基は、４つから６つまでのリン酸を含む［３４］〜［３９］の何れか１項に記載の方法。
［４２］
前記各タグは、前記トリアゾールによって前記末端リン酸に共有結合されており、前記各トリアゾールは、アジドとアルキンとの間の反応によって形成される［３９］に記載の方法。
［４３］
前記各トリアゾールは、構造：
【化１７】
2017515887.tif 000011
を有し、
Ｒ１は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み；又は、
Ｒ１は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
［３９］又は［４２］に記載の方法。
［４４］
前記各トリアゾールは、構造：
【化１８】
2017515887.tif 000012
を有し、
Ｒ１及びＲ３は、結合して環状部を形成し；及び
結合したＲ１及びＲ３は、前記タグを含み、Ｒ２は、前記ヌクレオチドを含み；或いは、
結合したＲ１及びＲ３は、前記ヌクレオチドを含み、Ｒ２は、前記タグを含む
［３９］又は［４２］に記載の方法。
［４５］
前記各タグは、表４又は５に掲げられているタグの群から選択されるか、或いは、前記各タグは、表６に掲げられている化学修飾からなる群から選択される化学修飾を含むか、或いは、前記各タグ付けされたヌクレオチドは、表４に掲げられているタグ付けされたヌクレオチドの群から選択される［３４］〜［４４］の何れか１項に記載の方法。
［４６］
前記各タグ付けされたヌクレオチドは、前記タグを前記ヌクレオチドに連結しているリンカー内のシアニン色素基を含み、かつ前記タグ付けされたヌクレオチドは、シアニン色素基を含まないタグ付けされたヌクレオチドと比較して、ポリメラーゼによる改善された補足速度を有する［３４］〜［４４］の何れか１項に記載の方法。
［４７］
前記４つのタグ付けされたヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ＦｌｄＴ−Ｔ−ＦｌｄＴ−Ｔ２３−Ｃ３、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ２−ｄＳｐ８−Ｔ２０−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ６、及びｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−ｄＳｐ３−Ｔ２３−Ｃ３である［３４］又は［３５］に記載の方法。