【手続補正書】
【提出日】平成29年12月18日(2017.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）のＰ５１、Ｓ６７、Ｅ６９、Ｔ１９７、Ｈ２０４、Ｅ３０２、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される各アミノ酸位置に変異を有する、単離された変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２】
以下の変異：Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、及びＬ６７１Ｐを含む、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３】
配列番号４を含む、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項４】
配列番号４からなる、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項５】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項において定義される変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物。
【請求項７】
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の界面活性剤、１つ以上のプライマー、１つ以上のホットスタート用成分、及び１つ以上の停止剤からなる群より選択される１つ以上の構成要素をさらに含み、任意で前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、請求項６に記載の前記組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項において定義される変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の使用を含む、核酸合成のための方法。
【請求項９】
１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法であって、
ａ．１つ以上の核酸鋳型を１つ以上の逆転写酵素とともに含む混合物を調製する工程であって、任意で前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子の集団である、工程と、
ｂ．前記１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記１つ以上の逆転写酵素が、請求項１〜５のいずれか一項において定義される、前記方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の第１の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに含み、任意で前記インキュベートする工程が約６０℃の温度で行われる、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
１つ以上の核酸分子を増幅させるための方法であって、
ａ．１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上の逆転写酵素及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程と、
ｂ．前記１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記１つ以上の逆転写酵素が、請求項１〜５のいずれか一項において定義される、前記方法。
【請求項１２】
前記インキュベートする工程が約６０℃の温度で行われる、請求項１１に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な前記増幅された核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む、請求項１１または１２に記載の前記方法。
【請求項１４】
１つ以上のパッケージ化格納容器に変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含むキットであって、前記変異型逆転写酵素が、請求項１〜５のいずれか一項において定義される、前記キット。
【請求項１５】
逆転写酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記ポリペプチドが、請求項１〜５のいずれか一項において定義されるアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記核酸を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１５に記載の前記核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記変異型逆転写酵素を含む、宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
[本発明1001]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）のＳ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を含む、単離された変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1002]
Ｓ67Ｒ、Ｓ67Ｎ、Ｓ67Ｋ、Ｔ197Ａ、Ｔ197Ｓ、Ｔ197Ｇ、Ｅ302Ｋ、Ｅ302Ｒ、及びＥ302Ｇからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1003]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）のＰ51、Ｅ69、Ｐ196、Ｄ200、Ｈ204、Ｍ289、Ｔ306、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｅ562、Ｄ583、Ｈ594、Ｌ603、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの変異をさらに含む、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1004]
Ｐ51Ｌ、Ｅ69Ｋ、Ｐ196Ｓ、Ｄ200Ｎ、Ｈ204Ｒ、Ｍ289Ｌ、Ｔ306Ｋ、Ｆ309Ｎ、Ｆ309Ｙ、Ｆ309Ｉ、Ｗ313Ｆ、Ｗ313Ｌ、Ｗ313Ｃ、Ｔ330Ｐ、Ｌ435Ｇ、Ｌ435Ｖ、Ｌ435Ｒ、Ｎ454Ｋ、Ｄ524Ｇ、Ｅ562Ｑ、Ｄ583Ｎ、Ｈ594Ｑ、Ｌ603Ｗ、Ｄ653Ｎ、Ｄ653Ｈ、及びＬ671Ｐからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、本発明1003の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1005]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）のＰ51、Ｓ67、Ｅ69、Ｔ197、Ｈ204、Ｅ302、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｄ583、Ｈ594、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択される各アミノ酸位置に変異を有する、本発明1003の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1006]
以下の変異：Ｐ51Ｌ、Ｓ67Ｒ、Ｅ69Ｋ、Ｔ197Ａ、Ｈ204Ｒ、Ｅ302Ｋ、Ｆ309Ｎ、Ｗ313Ｆ、Ｔ330Ｐ、Ｌ435Ｇ、Ｎ454Ｋ、Ｄ524Ｇ、Ｄ583Ｎ、Ｈ594Ｑ、Ｄ653Ｎ、及びＬ671Ｐを含む、本発明1005の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1007]
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1008]
以下の特性：
ａ．熱安定性、
ｂ．熱反応性、
ｃ．逆転写酵素阻害物質に対する向上した耐性、
ｄ．難しい鋳型を逆転写する向上した能力、
ｅ．向上した速度、
ｆ．向上した処理能力、
ｇ．向上した特異性、または
ｈ．向上した感受性
のうちの1つ以上を有する、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1009]
熱反応性である、本発明1008の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1010]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも50％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1011]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも75％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1012]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも100％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1013]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも200％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1014]
前記野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性と比較して向上した60℃の反応温度における逆転写酵素活性を示す、本発明1001の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1015]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも50％高い、本発明1014の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1016]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも75％高い、本発明1014の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1017]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも100％高い、本発明1014の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1018]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも200％高い、本発明1014の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1019]
野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号2）のＰ51、Ｅ69、Ｐ196、Ｄ200、Ｈ204、Ｍ289、Ｔ306、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｅ562、Ｄ583、Ｈ594、Ｌ603、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも6つの変異を含む、単離された変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1020]
Ｐ51Ｌ、Ｅ69Ｋ、Ｐ196Ｓ、Ｄ200Ｎ、Ｈ204Ｒ、Ｍ289Ｌ、Ｔ306Ｋ、Ｆ309Ｎ、Ｆ309Ｙ、Ｆ309Ｉ、Ｗ313Ｆ、Ｗ313Ｌ、Ｗ313Ｃ、Ｔ330Ｐ、Ｌ435Ｇ、Ｌ435Ｖ、Ｌ435Ｒ、Ｎ454Ｋ、Ｄ524Ｇ、Ｅ562Ｑ、Ｄ583Ｎ、Ｈ594Ｑ、Ｌ603Ｗ、Ｄ653Ｎ、Ｄ653Ｈ、及びＬ671Ｐからなる群より選択される少なくとも6つの変異を含む、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1021]
野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号2）のＳ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの変異をさらに含む、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1022]
前記逆転写酵素が、Ｓ67Ｒ、Ｓ67Ｎ、Ｓ67Ｋ、Ｔ197Ａ、Ｔ197Ｓ、Ｔ197Ｇ、Ｅ302Ｋ、Ｅ302Ｒ、及びＥ302Ｇからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、本発明1021の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1023]
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1024]
前記向上した逆転写酵素活性が、
ａ．向上した熱安定性、
ｂ．向上した熱反応性、
ｃ．逆転写酵素阻害物質に対する向上した耐性、
ｄ．難しい鋳型を逆転写する向上した能力、
ｅ．向上した速度、
ｆ．向上した処理能力、
ｇ．向上した特異性、及び
ｈ．向上した感受性、
のうちの1つ以上を含む、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1025]
熱反応性である、本発明1024の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1026]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも50％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1027]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも75％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1028]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも100％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1029]
野生型Ｍ−ＭＬＶによって37℃で5分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも200％多い逆転写酵素生成物を60℃で5分以内に合成する、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1030]
前記野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性と比較して向上した60℃の反応温度における逆転写酵素活性を示す、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1031]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも50％高い、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1032]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも75％高い、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1033]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも100％高い、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1034]
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも200％高い、本発明1019の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1035]
配列番号4に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する、単離された変異型逆転写酵素。
[本発明1036]
配列番号4を含む、本発明1035の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1037]
配列番号4からなる、本発明1035の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1038]
60℃で熱安定性である、本発明1035の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1039]
60℃で少なくとも5分間熱安定性である、本発明1035の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1040]
60℃で少なくとも5分間熱反応性である、本発明1035の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1041]
60℃で少なくとも15分間熱反応性である、本発明1040の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1042]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と比較して熱安定性を向上させるかまたは強化するように変異している、単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素であって、
ａ．Ｓ67Ｒ、
ｂ．Ｔ197Ａ、及び
ｃ．Ｅ302Ｋ
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、前記単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1043]
ａ．Ｐ51Ｌ、
ｂ．Ｅ69Ｋ、
ｃ．Ｈ204Ｒ、
ｄ．Ｆ309Ｎ、
ｅ．Ｗ313Ｆ、
ｆ．Ｔ330Ｐ、
ｇ．Ｌ435Ｇ、
ｈ．Ｎ454Ｋ、
ｉ．Ｄ524Ｇ、
ｊ．Ｄ583Ｎ、
ｋ．Ｈ594Ｑ、
ｌ．Ｄ653Ｎ、及び
ｍ．Ｌ671Ｐ
からなる群より選択される少なくとも1つの変異をさらに含む、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1044]
45℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1045]
50℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1046]
55℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1047]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1048]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも70％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1049]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも80％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1050]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも90％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1051]
50℃に5分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1052]
50℃に15分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1053]
50℃に60分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1042の前記逆転写酵素。
[本発明1054]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と比較して熱安定性を向上させるかまたは強化するように変異している、単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素であって、
ａ．Ｐ51Ｌ、
ｂ．Ｅ69Ｋ、
ｃ．Ｈ204Ｒ、
ｄ．Ｆ309Ｎ、
ｅ．Ｗ313Ｆ、
ｆ．Ｔ330Ｐ、
ｇ．Ｌ435Ｇ、
ｈ．Ｎ454Ｋ、
ｉ．Ｄ524Ｇ、
ｊ．Ｄ583Ｎ、
ｋ．Ｈ594Ｑ、
ｌ．Ｄ653Ｎ、及び
ｍ．Ｌ671Ｐ
からなる群より選択される少なくとも6つの変異を含む、前記単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素。
[本発明1055]
ａ．Ｓ67Ｒ、
ｂ．Ｔ197Ａ、及び
ｃ．Ｅ302Ｋ
からなる群より選択される少なくとも1つの変異をさらに含む、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1056]
45℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1057]
50℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1058]
55℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1059]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1060]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも70％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1061]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも80％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1062]
60℃に1分間加熱した後に少なくとも90％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1063]
50℃に5分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1064]
50℃に15分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1065]
50℃に60分間加熱した後に少なくとも50％の逆転写酵素活性を保持する、本発明1054の前記逆転写酵素。
[本発明1066]
60℃で5分以内に少なくとも7．5ｋｂのｃＤＮＡを生成することができる、単離された変異型逆転写酵素。
[本発明1067]
60℃で15分以内に少なくとも9．5ｋｂのｃＤＮＡを生成することができる、単離された変異型逆転写酵素。
[本発明1068]
60℃で少なくとも5分間熱安定性である、単離された変異型逆転写酵素。
[本発明1069]
60℃で少なくとも15分間熱安定性である、本発明1068の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1070]
60℃で少なくとも30分間熱安定性である、本発明1068の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1071]
60℃で少なくとも5分間熱反応性である、単離された変異型逆転写酵素。
[本発明1072]
60℃で少なくとも15分間熱反応性である、本発明1071の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1073]
60℃で少なくとも30分間熱反応性である、本発明1071の前記変異型逆転写酵素。
[本発明1074]
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、本発明1066〜1073のいずれかの前記変異型逆転写酵素。
[本発明1075]
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物であって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を含み、少なくとも1つの前記アミノ酸位置が、Ｓ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択される、前記組成物。
[本発明1076]
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、1つ以上の界面活性剤、1つ以上のプライマー、1つ以上のホットスタート用成分、及び1つ以上の停止剤からなる群より選択される1つ以上の構成要素をさらに含む、本発明1075の前記組成物。
[本発明1077]
前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、本発明1076の前記組成物。
[本発明1078]
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物であって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも6つの変異を含み、少なくとも6つの前記アミノ酸位置が、Ｐ51、Ｅ69、Ｈ204、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｄ583、Ｈ594、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択される、前記組成物。
[本発明1079]
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、1つ以上の界面活性剤、1つ以上のプライマー、1つ以上のホットスタート用成分、及び1つ以上の停止剤からなる群より選択される1つ以上の構成要素をさらに含む、本発明1078の前記組成物。
[本発明1080]
前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、本発明1079の前記組成物。
[本発明1081]
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物であって、前記変異型逆転写酵素が、配列番号4に少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する、前記組成物。
[本発明1082]
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、1つ以上の界面活性剤、1つ以上のプライマー、1つ以上のホットスタート用成分、及び1つ以上の停止剤からなる群より選択される1つ以上の構成要素をさらに含む、本発明1081の前記組成物。
[本発明1083]
前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、本発明1082の前記組成物。
[本発明1084]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を有する変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の使用を含む、核酸合成のための方法であって、少なくとも1つの前記アミノ酸位置が、Ｓ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択される、前記方法。
[本発明1085]
1つ以上の核酸分子の逆転写のための方法であって、
ａ．1つ以上の核酸鋳型を1つ以上の逆転写酵素とともに含む混合物を調製する工程と、
ｂ．前記1つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な1つ以上の第1の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記1つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を含み、少なくとも1つの前記アミノ酸位置が、Ｓ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択される、前記方法。
[本発明1086]
前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子の集団である、本発明1085の前記方法。
[本発明1087]
前記1つ以上の第1の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な1つ以上の第2の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記1つ以上の第1の核酸分子をインキュベートする工程をさらに含む、本発明1085の前記方法。
[本発明1088]
前記インキュベートする工程が約60℃の温度で行われる、本発明1085の前記方法。
[本発明1089]
1つ以上の核酸分子を増幅させるための方法であって、
ａ．1つ以上の核酸鋳型を、1つ以上の逆転写酵素及び1つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程と、
ｂ．前記1つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な1つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記1つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を含み、少なくとも1つの前記アミノ酸位置が、Ｓ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択される、前記方法。
[本発明1090]
前記インキュベートする工程が約60℃の温度で行われる、本発明1089の前記方法。
[本発明1091]
前記1つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な前記増幅された核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む、本発明1089の前記方法。
[本発明1092]
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を有する変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の使用を含む、核酸合成のための方法であって、少なくとも6つの前記アミノ酸位置が、Ｐ51、Ｅ69、Ｈ204、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｄ583、Ｈ594、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択される、前記方法。
[本発明1093]
1つ以上の核酸分子の逆転写のための方法であって、
ａ．1つ以上の核酸鋳型を1つ以上の逆転写酵素とともに含む混合物を調製する工程と、
ｂ．前記1つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な1つ以上の第1の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記1つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも6つの変異を含み、少なくとも6つの前記アミノ酸位置が、Ｐ51、Ｅ69、Ｈ204、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｄ583、Ｈ594、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択される、前記方法。
[本発明1094]
前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子の集団である、本発明1093の前記方法。
[本発明1095]
前記1つ以上の第1の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な1つ以上の第2の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記1つ以上の第1の核酸分子をインキュベートする工程をさらに含む、本発明1093の前記方法。
[本発明1096]
前記インキュベートする工程が約60℃の温度で行われる、本発明1093の前記方法。
[本発明1097]
1つ以上の核酸分子を増幅させるための方法であって、
ａ．1つ以上の核酸鋳型を、1つ以上の逆転写酵素及び1つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程と、
ｂ．前記1つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な1つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記1つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも6つの変異を含み、少なくとも6つの前記アミノ酸位置が、Ｐ51、Ｅ69、Ｈ204、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｄ583、Ｈ594、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択される、前記方法。
[本発明1098]
前記インキュベートする工程が約60℃の温度で行われる、本発明1097の前記方法。
[本発明1099]
前記1つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な前記増幅された核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む、本発明1097の前記方法。
[本発明1100]
1つ以上のパッケージ化格納容器に変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含むキットであって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つの変異を含み、少なくとも1つの前記アミノ酸位置が、Ｓ67、Ｔ197、及びＥ302からなる群より選択される、前記キット。
[本発明1101]
1つ以上のパッケージ化格納容器に変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含むキットであって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号2）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも6つの変異を含み、少なくとも6つの前記アミノ酸位置が、Ｐ51、Ｅ69、Ｈ204、Ｆ309、Ｗ313、Ｔ330、Ｌ435、Ｎ454、Ｄ524、Ｄ583、Ｈ594、Ｄ653、及びＬ671からなる群より選択される、前記キット。
[本発明1102]
逆転写酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号4に少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸。
[本発明1103]
本発明1102の前記核酸を含む、ベクター。
[本発明1104]
本発明1102の前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
[本発明1105]
本発明1102の前記核酸を含む、宿主細胞。
[本発明1106]
本発明1035の前記変異型逆転写酵素を含む、宿主細胞。
本発明の他の好ましい実施形態は、添付の図面及び本発明の説明、ならびに特許請求の範囲を踏まえると、当業者には明らかであろう。