【手続補正書】
【提出日】平成30年10月9日(2018.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を作製するための方法であって、該方法は、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞の集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地でインビトロ培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項２】
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含み、任意選択的に、該高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インビトロ培養物中のヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を維持するための方法であって、該方法は、該ｈｉＰＳＣの集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項４】
前記ｈｉＰＳＣを、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とし、該酵素的に解離させた細胞を継代培養することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせであり、
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせであり、
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターを導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該挿入核酸を、ゲノム中に含む、遺伝子改変ｈｉＰＳＣを特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項７】
前記ターゲッティングベクターは、大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの総量は、少なくとも１０ｋｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的化された遺伝子改変は、
（ａ）内因性ヒト核酸配列の欠失、
（ｂ）任意選択的に、
（ｉ）該内因性ヒト核酸配列と相同な又はオーソロガスである核酸配列、
（ｉｉ）キメラ核酸配列、
（ｉｉｉ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子、及び
（ｉｖ）前記ｈｉＰＳＣ内で活性なプロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子
のうちの１つ又は２つ以上を含む、外因性核酸配列の挿入、又は、
（ｃ）該外因性核酸配列による該内因性ヒト核酸配列の置き換えを含み、
任意選択的に、該標的化された遺伝子改変は、二対立遺伝子改変である、
請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
導入ステップ（ａ）は、前記ターゲッティングベクターと前記ｈｉＰＳＣ内の前記標的ゲノム遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤を導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つのｈｉＰＳＣを特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼ剤は、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は、
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び、ゲノム標的配列を認識するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼ剤は、前記Ｃａｓタンパク質及び前記ガイドＲＮＡを含み、該Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）の前に、前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液にされ、かつ継代培養される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせであり、
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせであり、
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有し、
（ａ）ナイーブｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）任意選択的に、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導され該形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現し、任意選択的に、該形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記低オスモル濃度培地は、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２３５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせであり、
任意選択的に、前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記低オスモル濃度培地は、Ｆ−１２培地及びＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含み、前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｈｉＰＳＣは、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す、ナイーブ型ｈｉＰＳＣである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）任意選択的に、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法によって作製される、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団と、
（ｂ）基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地と、を含むインビトロ培養物であって、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、インビトロ培養物。
【請求項２７】
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有し、
（ａ）ナイーブ型ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）任意選択的に、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、
請求項２６に記載のインビトロ培養物。
【請求項２８】
前記ｈｉＰＳＣは、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す、ナイーブ型ｈｉＰＳＣである、請求項２７に記載のインビトロ培養物。
【請求項２９】
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導され、任意選択的に、該形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３０】
前記基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３１】
約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、前記低オスモル濃度培地は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２３５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、任意選択的に、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３２】
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせであり、
任意選択的に、前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３３】
前記低オスモル濃度培地は、Ｆ−１２培地及びＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地を含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３４】
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３５】
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含み、任意選択的に、前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３６】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【請求項３７】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、請求項３６に記載のインビトロ培養物。
【請求項３８】
前記ｈｉＰＳＣは、単個細胞浮遊液内にあり、任意選択的に、該単個細胞浮遊液内のｈｉＰＳＣは、正常核型を維持し、任意選択的に、該単個細胞浮遊液内のｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーの発現を維持するか、
（ｂ）ナイーブ状態を維持するか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、
請求項２６〜３７のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の特徴を発現するまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、約２か月の期間にわたって高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項１）
（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団と、
（ｂ）基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地と、を含むインビトロ培養物であって、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、インビトロ培養物。
（項２）
基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で作製又は維持されたヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団であって、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、集団。
（項３）
前記ｈｉＰＳＣは、
（ａ）ナイーブ型若しくはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、項１に記載のインビトロ培養物又は項２に記載の集団。
（項４）
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する、項１若しくは３に記載のインビトロ培養物又は項２若しくは３に記載の集団。
（項５）
前記多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、項３又は４に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項６）
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される、項１及び３〜５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜５のいずれか一項に記載の集団。
（項７）
前記形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、項６に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項８）
前記形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、項６又は７に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項９）
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む、項６〜８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項１０）
前記高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項９に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項１１）
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ型若しくはナイーブ様状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、項９又は１０に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項１２）
前記基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項１及び３〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１１のいずれか一項に記載の集団。
（項１３）
前記基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項１及び３〜１２のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１２のいずれか一項に記載の集団。
（項１４）
前記基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、項１及び３〜１３のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１３のいずれか一項に記載の集団。
（項１５）
前記低オスモル濃度培地は、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項１及び３〜１４のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１４のいずれか一項に記載の集団。
（項１６）
前記低オスモル濃度培地は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２３５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項１及び３〜１５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１５のいずれか一項に記載の集団。
（項１７）
前記低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項１及び３〜１６のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１６のいずれか一項に記載の集団。
（項１８）
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、項１及び３〜１７いずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１７のいずれか一項に記載の集団。
（項１９）
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、項１及び３〜１８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１８のいずれか一項に記載の集団。
（項２０）
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む、項１及び３〜１９のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜１９のいずれか一項に記載の集団。
（項２１）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、項１及び３〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜２０のいずれか一項に記載の集団。
（項２２）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、項１及び３〜２１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜２１のいずれか一項に記載の集団。
（項２３）
前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、項１及び３〜２２のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜２２のいずれか一項に記載の集団。
（項２４）
前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる、項１及び３〜２３のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項２〜２３のいずれか一項に記載の集団。
（項２５）
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項２４に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項２６）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）前記１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項２４又は２５に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項２７）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、項２４〜２６のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項２８）
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を作製するための方法であって、該方法は、多能性状態を発現するように形質転換された非多様性細胞の集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地でインビトロ培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項２９）
前記方法は、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣの集団を増加させる、項２８に記載の方法。
（項３０）
インビトロ培養物中のヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を維持するための方法であって、該方法は、該ｈｉＰＳＣの集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項３１）
前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる、項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項３２）
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項２９に記載の方法。
（項３３）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項３１又は３２に記載の方法。
（項３４）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項３５）
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターを導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該挿入核酸を、ゲノム中に含む、遺伝子改変ｈｉＰＳＣを特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項３６）
前記ターゲッティングベクターは、大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの総量は、少なくとも１０ｋｂである、項３５に記載の方法。
（項３７）
導入ステップ（ａ）は、前記ターゲッティングベクターと前記ｈｉＰＳＣ内の前記標的ゲノム遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む、項３５又は３６に記載の方法。
（項３８）
前記標的化された遺伝子改変は、
（ａ）内因性ヒト核酸配列の欠失、
（ｂ）外因性核酸配列の挿入、又は、
（ｃ）該外因性核酸配列による該内因性ヒト核酸配列の置き換えを含む、項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項３９）
前記外因性核酸配列は、
（ａ）前記内因性ヒト核酸配列と相同な又はオーソロガスである核酸配列、
（ｂ）キメラ核酸配列、
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子、及び
（ｄ）前記ｈｉＰＳＣ内で活性なプロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子のうちの１つ又は２つ以上を含む、項３８に記載の方法。
（項４０）
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導する１種又は２種以上のヌクレアーゼ剤を導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項４１）
ステップ（ａ）の前に、前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液にされ、かつ継代培養される、項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項４２）
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項４１に記載の方法。
（項４３）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項４１又は４２に記載の方法。
（項４４）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項４５）
前記ヌクレアーゼ剤は、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は、
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び、ゲノム標的配列を認識するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、を含む、項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項４６）
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、項４５に記載の方法。
（項４７）
前記標的化された遺伝子改変は、二対立遺伝子改変である、項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項４８）
前記ｈｉＰＳＣは、
（ａ）ナイーブ型若しくはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項４９）
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する、項２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項５０）
前記多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、項４８又は４９に記載の方法。
（項５１）
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される、項３０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項５２）
前記形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、項２８、２９、及び５１のいずれか一項に記載の方法。
（項５３）
前記形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、項２８、２９、５１、及び５２のいずれか一項に記載の方法。
（項５４）
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む、項２８、２９、及び５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項５５）
前記高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項５４に記載の方法。
（項５６）
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ型若しくはナイーブ様状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、項５４又は５５に記載の方法。
（項５７）
前記基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を示す、項２８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項５８）
前記基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項２８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項５９）
前記基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、項２８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項６０）
前記低オスモル濃度培地は、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項２８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項６１）
前記低オスモル濃度培地は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２３５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項２８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項６２）
前記低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項２８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項６３）
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、項２８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項６４）
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、項２８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項６５）
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む、項２８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項６６）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、項２８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項６７）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、項２８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項６８）
前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、項２８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項６９）
項２８、２９、３１〜３４、４８〜５０、及び５２〜６８のいずれか一項に記載の方法によって作製される、ｈｉＰＳＣ。
（項７０）
項３５〜６８のいずれか一項に記載の方法によって作製される、改変ｈｉＰＳＣ。