【手続補正書】
【提出日】平成30年9月4日(2018.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）、または（Ｂ）で定義される要素を含む、Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーシステムであって、
（Ａ）
（ａ）共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含む、（ｉ）第１のバイオセンサー、
（ｉ）で定義される前記第１及び第２の成分；及び
組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含む、（ｉｉ）第２のバイオセンサー、または
（Ｂ）
（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している
を含む、（ｉ）バイオセンサー
を含む、前記バイオセンサーシステム。
【請求項２】
前記Ｇγタンパク質が、前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第２の断片に融合している、請求項１に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項３】
前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第２の断片が、前記ＧβまたはＧγタンパク質のＮ末端で融合している、請求項１または２に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項４】
前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片が、前記βγＩＰのＣ末端で融合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項５】
前記βγＩＰが、前記ＲＥＴアクセプター及び前記Ｇβタンパク質に融合しており、Ｇγタンパク質またはＧＰＣＲが、前記ＲＥＴドナーに融合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項６】
前記ＲＥＴドナーが、生物発光タンパク質であり、そして、前記ＲＥＴアクセプターが、蛍光タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項７】
前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、請求項６に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、請求項６または７に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項９】
前記第１の成分が、前記βγＩＰまたは前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片に融合した原形質膜（ＰＭ）標的化部分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１０】
前記ＰＭ標的化部分が、プレニル化モチーフを含む、請求項９に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１１】
前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号３７）を含む、請求項１０に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１２】
（ｉ）前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片と（ｉｉ）前記ＰＭ標的化部分の間にフレキシブルリンカーをさらに含む、請求項７に記載のバイオセンサーシステムであって、前記フレキシブルリンカーが、約５０〜約５００アミノ酸に対応する長さを有する、バイオセンサーシステム。
【請求項１３】
前記組換えＧαタンパク質が、ヒトＧαq、Ｇαs、Ｇαi1、Ｇαi2、Ｇαi3、Ｇαt-cone、Ｇαt-rod、Ｇαt-gust、Ｇαz、ＧαoA、ＧαoB、Ｇαolf、Ｇα11、Ｇα12、Ｇα13、Ｇα14、及びＧα15／Ｇα16タンパク質、またはそれらの無差別または非選択的Ｇα変異体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１４】
前記βγＩＰが、ＧＲＫ２またはＧＲＫ３である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１５】
（ｉ）前記第２の成分が融合Ｇβタンパク質を含む場合、前記第１及び第２のバイオセンサーは、組換えＧγタンパク質をさらに含み、または（ｉｉ）前記第２の成分が融合Ｇγタンパク質を含む場合、前記第１及び第２のバイオセンサーは、組換えＧβタンパク質をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１６】
（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）をさらに含むか、あるいは、（Ｂ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、組換えＧβタンパク質及び／または組換えＧγタンパク質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１７】
（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、複数の第２のバイオセンサーを含み、前記第２のバイオセンサーの各々が、異なる組換えＧαタンパク質を含み、そして、前記異なる組換えＧαタンパク質が、以下のＧαタンパク質：Ｇαq、Ｇαs、Ｇαi1、Ｇαi2、Ｇαi3、Ｇαt-cone、Ｇαt-rod、Ｇαt-gust、Ｇαz、ＧαoA、ＧαoB、Ｇαolf、Ｇα11、Ｇα12、Ｇα13、Ｇα14、及びＧα15／Ｇα16の少なくとも２つである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のバイオセンサーを含む宿主細胞。
【請求項１９】
Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーであって、
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含み、
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、前記バイオセンサー。
【請求項２０】
試験薬剤がＧＰＣＲの活性を調節するかどうかの決定方法であって、
（１）（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）で定義される要素を含むバイオセンサーを提供すること：
（Ａ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び
（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；
（Ｂ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合した前記ＧＰＣＲを含む第２の成分；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；または
（Ｃ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び
（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；及び
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；
前記薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を増加させることを示し、前記薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を阻害することを示す
を含む、前記方法。
【請求項２１】
Ｇαタンパク質がＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかの決定方法であって、
（ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステムの前記第１及び第２のバイオセンサー中で前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること、及び
（ｂ）前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルに基づいて、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかを同定すること；
前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す；または
（ａ１）以下の（ｉ）、及び（ｉｉ）を含む第１のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること：
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
（ｉｉ）融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｂ１）以下の（ｉ）、及び（ｉｉ）を含む第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること：
（ｉ）（ａ１）で定義される前記第１及び第２の成分；及び
（ｉｉ）前記Ｇαタンパク質の組換え形態を含む第３の成分；
（Ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（Ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（Ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す
を含む、前記方法。
【請求項２２】
試験薬剤が目的Ｇαタンパク質のインヒビターまたは活性化因子であるかどうかの決定方法であって、
（１）
（ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー、または
（ｂ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー
をＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニストと接触させること、前記組換えＧαタンパク質は、前記目的Ｇαタンパク質に対応する；
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；及び
（ｃ）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターまたは活性化因子であるかどうかを決定すること
（ｉ）前記ＧＰＣＲアゴニストとの接触後に前記試験薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質のインヒビターであることを示し、前記ＧＰＣＲアゴニストとの接触後に前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質のインヒビターではないことを示す；または（ｉｉ）前記ＧＰＣＲアンタゴニストとの接触後に前記試験薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質活性化因子であることを示し、前記ＧＰＣＲアンタゴニストとの接触後に前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質活性化因子ではないことを示す
を含む、前記方法。