【手続補正書】
【提出日】平成29年11月22日(2017.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
減少ゲノム大腸菌宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法であって、前記組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するｏｍｐＡ、ｏｍｐＦまたはｙｔｆＱシグナル配列に融合された、前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、天然−２フレームシフト突然変異を含むＫ−１２株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、次の修飾：（ｉ）大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５の欠失、（ｉｉ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生の回復のための、ｉｌｖＧ遺伝子における天然−２フレームシフト突然変異の補正、ならびに（ｉｖ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の全てまたは一部の欠失を含む、方法。
【請求項２】
前記天然の親大腸菌株が、Ｋ−１２株  ＭＧ１６５５である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１リットル当たり少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナル配列が、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル配列が、ＹｔｆＱである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２をさらに欠失している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ４２株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ６９株である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記減少ゲノム大腸菌が、ｒｅｌＡ遺伝子であって、前記ｒｅｌＡ遺伝子のコード配列の５４７または５４８位に少なくとも１つの点突然変異を有するｒｅｌＡ遺伝子を含み、前記突然変異が、５４７位でのＧ→Ａ突然変異、５４７位でのＧ→Ｔ突然変異、５４８位でのＣ→Ｇ突然変異、または５４８位でのＣ→Ｔ突然変異のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｐｏｌＢ（ｂ００６０）、機能ｄｉｎＢ（ｂ０２３１）、及び機能ｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３−ｂ１１８４）遺伝子の１つ以上を欠く、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
（ｂ）ＣＲＭ１９７の発現を誘導することと、を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、発酵装置内で実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下のうちの１つ以上：（１）工程（ａ）が、前記減少ゲノム大腸菌を３７℃で最大１９時間成長させ、続いて工程（ｂ）の前及び後で、約２０〜３０℃で成長させることを含む、（２）工程（ａ）及び（ｂ）が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、（３）工程（ａ）において、ｐＨが、６．５〜７．５の範囲である、ならびに／あるいは（４）ｐＨが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
発現が、工程（ｂ）において、好適な量のＩＰＴＧを添加することによって誘導される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
発現が、２００〜２７５のＯＤ６００で誘導される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記発酵装置が、０．５〜５０，０００リットルの培養物を含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｃ）洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＲＭ１９７が、１つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を欠く、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するｏｍｐＡ、ｏｍｐＦまたはｙｔｆＱシグナル配列に融合された、前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、天然−２フレームシフト突然変異を含むＫ−１２株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、次の修飾：（ｉ）大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５の欠失、（ｉｉ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生の回復のための、ｉｌｖＧ遺伝子における天然−２フレームシフト突然変異の補正、ならびに（ｉｖ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の全てまたは一部の欠失を含む、減少ゲノム大腸菌宿主。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明のこれら及び他の実施形態は、本明細書において以下により詳細に記載される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
減少ゲノム大腸菌宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法であって、前記組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するシグナル配列に融合された、前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、前記天然の親大腸菌株が、Ｋ１２株、好ましくはＫ１２  ＭＧ１６５５である、前記方法。
（項目２）
１リットル当たり少なくとも２グラム、１リットル当たり少なくとも３グラム、１リットル当たり少なくとも４グラム、または１リットル当たり少なくとも５グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、項目１に記載の前記方法。
（項目３）
前記シグナル配列が、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＭｇｌＢ、ＭａｌＥ、ＯｐｐＡ、ＲｂｓＢ、Ａｇｐ、ＦｋｐＡ、ＹｔｆＱ、ＨｄｅＡ、ＨｄｅＢ、ＯｍｐＣ、及びＧｌｎＨシグナル配列からなる群から選択される、項目２に記載の前記方法。
（項目４）
前記シグナル配列が、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱである、項目３に記載の前記方法。
（項目５）
前記シグナル配列が、ＹｔｆＱである、項目４に記載の前記方法。
（項目６）
前記減少ゲノム大腸菌が、大腸菌株ＭＧ１６５５より約２％〜約４０％小さい、好ましくは約５％〜約３０％小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７）
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、−ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５を欠失している、項目６に記載の前記方法。
（項目８）
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３
、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２をさらに欠失している、項目７に記載の前記方法。
（項目９）
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ４２株である、項目７に記載の前記方法。
（項目１０）
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ６９株である、項目８に記載の前記方法。
（項目１１）
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２）
前記減少ゲノム大腸菌が、ｒｅｌＡ遺伝子であって、前記ｒｅｌＡ遺伝子のコード配列の５４７または５４８位に少なくとも１つの点突然変異を有するｒｅｌＡ遺伝子を含み、前記突然変異が、５４７位でのＧ→Ａ突然変異、５４７位でのＧ→Ｔ突然変異、５４８位でのＣ→Ｇ突然変異、または５４８位でのＣ→Ｔ突然変異のうちの１つ以上から選択される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１３）
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｐｏｌＢ（ｂ００６０）、ｄｉｎＢ（ｂ０２３１）、及び任意にｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３−ｂ１１８４）遺伝子を欠く、項目１〜１２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１４）
前記減少ゲノム大腸菌が、以下の修飾：（ｉ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するための、ｉｌｖＧ遺伝子における天然−２フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の欠失を含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１５）
前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、項目１〜１４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１６）
前記ＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１７）
（ａ）前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
（ｂ）ＣＲＭ１９７の発現を誘導することと、を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１８）
前記方法が、発酵装置内で実行される、項目１７に記載の前記方法。
（項目１９）
工程（ａ）が、前記減少ゲノム大腸菌を３７℃で最大１９時間成長させ、続いて工程（ｂ）の前及び後で、約２０〜３０℃、好ましくは約２５℃で成長させることを含む、項目１７または１８に記載の前記方法。
（項目２０）
工程（ａ）及び（ｂ）が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、項目１７〜１９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２１）
工程（ａ）において、ｐＨが、６．５〜７．５の範囲である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２２）
前記ｐＨが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、項目１７〜２１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２３）
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、項目２２に記載の前記方法。
（項目２４）
発現が、工程（ｂ）において、好適な量のＩＰＴＧを添加することによって誘導される、項目１７〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２５）
発現が、１００〜４００、好ましくは２００〜２７５、より好ましくは２３０〜２５０のＯＤ６００で誘導される、項目１８〜２４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２６）
前記発酵装置が、０．５〜５０，０００リットルの培養物を含む、項目１８〜２５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２７）
（ｃ）洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、項目１７〜２６のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２８）
前記機械的破砕が、超音波処理または微細流動化を含む、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
ＣＲＭ１９７が、１つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、項目２７または２８に記載の前記方法。
（項目３０）
前記１つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目２９に記載の前記方法。
（項目３１）
前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目３０に記載の前記方法。
（項目３２）
ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合されず、それにより、１リットル当たり約２グラム〜１リットル当たり約２０グラムの不溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、項目１に記載の前記方法。
（項目３３）
前記不溶性ＣＲＭ１９７が、１つ以上の可溶化工程に供される、項目３２に記載の前記方法。
（項目３４）
ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ｏｍｐＦまたはｙｔｆＱシグナル配列に融合され、前記減少ゲノム大腸菌宿主が、次の修飾：（ｉ）前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５の欠失、（ｉｉ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するための、ｉｌｖＧ遺伝子における天然−２フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに（ｉｖ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の欠失を含み、
それにより、１リットル当たり少なくとも１グラム、好ましくは１リットル当たり少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、項目１に記載の前記方法。
（項目３５）
前記減少ゲノム大腸菌宿主が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２をさらに欠失している、項目３４に記載の前記方法。
（項目３６）
発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記発現ベクターが、前記大腸菌周辺質へのＣＲＭ１９７の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする５’シグナル配列部分と、その天然のシグナル配列を欠く前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする３’ＣＲＭ１９７部分と、を含む核酸配列を含む、前記減少ゲノム大腸菌宿主。