【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のポリペプチドの組換え発現に適している単離された脊椎動物細胞であって、前記脊椎動物細胞は、マトリプターゼの効果を障害するように変更されており、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるので、前記マトリプターゼの効果が障害され、前記脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、前記脊椎動物細胞は、前記対象のポリペプチドを分泌する、単離された脊椎動物細胞。
【請求項２】
前記脊椎動物細胞のゲノムが、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害するように変更される、および／または前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つまたはすべてのコピーが、欠失するか、または機能的に不活性化される、請求項１に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項３】
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が、非機能的なもしくはあまり機能的でない発現産物を提供するように、前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に１つもしくは複数の変異を含む、および／または
ｂ）前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子のプロモーター中、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲおよび／もしくはその他の調節エレメント中に１つまたは複数の変異を含む
のうち１つまたは複数を有する、請求項２に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項４】
前記１つまたは複数の変異が、前記マトリプターゼ遺伝子のコーディング領域中に含まれ、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物をもたらし、任意選択で、前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼのエキソン２をコードするマトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれるか、または前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼの触媒ドメインの少なくとも一部をコードする、前記マトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれ、それによって非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物が得られる、請求項３に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項５】
変更されていない内因性マトリプターゼが、マトリプターゼ参照タンパク質として配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のうち１種または複数に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を共有し、前記マトリプターゼ参照タンパク質と同一のタンパク質分解性活性を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項６】
前記脊椎動物細胞が、以下の特徴：
ａ）前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、
ｂ）前記脊椎動物細胞がヒト細胞である、
ｃ）前記脊椎動物細胞がげっ歯類細胞である、
ｄ）前記脊椎動物細胞がハムスター細胞である、
ｅ）前記脊椎動物細胞がＣＨＯ細胞である、および／または
ｆ）前記脊椎動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される哺乳動物細胞である
のうち１つまたは複数を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項７】
前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエキソン２中に１つまたは複数のフレームシフト変異を含むＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項８】
前記対象のポリペプチドが、以下の特徴：
ａ）それが治療上活性のあるまたは診断用のポリペプチドである、
ｂ）それがプロテアーゼによるクリッピングに対して感受性である、
ｃ）それがマトリプターゼの少なくとも１つのクリッピング部位を含む、
ｄ）それがグリコポリペプチドである、および／または
ｅ）それが糖タンパク質、抗体、非ＩｇＧタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される
のうち１つまたは複数を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項９】
前記対象のポリペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれており、任意選択で、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中にさらに組み込まれている、請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されることによって脊椎動物細胞をマトリプターゼの効果を障害するように変更する段階と、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階とを含み、前記対象のポリペプチドが、前記脊椎動物細胞によって分泌される、方法。
【請求項１１】
対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）前記対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、請求項１から９のいずれか１項に記載の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）前記細胞培養培地から前記対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、前記単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、方法。
【請求項１２】
対象のポリペプチドを組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として請求項１から９のいずれか１項に記載の脊椎動物細胞を提供する段階と、
（ｂ）前記対象のポリペプチドを発現する１種または複数の宿主細胞を選択する段階と
を含み、
任意選択で、段階（ａ）が、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを用いて、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が障害されている脊椎動物細胞をトランスフェクトして、請求項１から９のいずれか１項に記載の脊椎動物宿主細胞を提供する段階を含む、方法。
【請求項１３】
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、
ｂ）段階（ａ）において提供される前記宿主細胞が、選択マーカーをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）が、前記選択マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む、
ｃ）ポリヌクレオチドが、１種もしくは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることによって前記脊椎動物細胞中に導入される、
ｄ）段階（ｂ）が、１つもしくは複数の選択ステップを含む、および／または
ｅ）段階（ｂ）が、フローサイトメトリーベースの選択を実施することを含む
のうち１つまたは複数を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞を選択するための方法であって、内因性プロテアーゼマトリプターゼが、前記脊椎動物細胞において機能的に発現されるか否かを分析する段階と、前記対象のポリペプチドの組換え製造のために、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されることによってこのような内因性マトリプターゼの効果が障害されている脊椎動物細胞を選択する段階を含む、方法。
【請求項１５】
脊椎動物細胞から分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のための前記脊椎動物細胞の使用であって、前記使用される細胞が、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更され、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるので、前記マトリプターゼの効果が障害され、任意選択で、前記脊椎動物細胞が、請求項２から９のいずれか１項に記載の１つまたは複数の特徴を有する、使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
製品品質を、ＳＥＣ、ＣＥＣおよびＣＥ−ＳＤＳによって純度について、ならびに独占所有権のある方法によってＮ−グリコシル化について分析的に評価した。結果は、すべてのＫＯクローンは、凝集および分解生成物、電荷変異体分布およびグリコシル化パターンの点で同等の製品品質に達することを示した。ＣＥ−ＳＤＳ還元結果は、すべてのＫＯサブクローンについてクリッピングされた種が０．７％の低レベルで存在することを示した。すべてのＫＯクローンは、参照野生型細胞株と比較して、同様または好ましい成長特徴を示すだけでなく、一貫して良好な品質のポリペプチドを製造した。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
対象のポリペプチドの組換え発現に適している単離された脊椎動物細胞であって、前記脊椎動物細胞は、マトリプターゼの効果を障害し、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含むように変更されており、前記脊椎動物細胞は、前記対象のポリペプチドを分泌する、単離された脊椎動物細胞。
［２］
前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるので、前記マトリプターゼの効果が障害される、上記［１］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［３］
前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって低減または排除される、上記［２］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［４］
前記脊椎動物細胞のゲノムが、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害するように変更される、上記［１］から［３］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［５］
前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つまたはすべてのコピーが、欠失するか、または機能的に不活性化される、上記［１］から［４］のうち１項または複数項に記載の単離された細胞。
［６］
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が、非機能的なもしくはあまり機能的でない発現産物を提供するように、前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に１つもしくは複数の変異を含む、および／または
ｂ）前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子のプロモーター中、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲおよび／もしくはその他の調節エレメント中に１つまたは複数の変異を含む
のうち１つまたは複数を有する、上記［４］または［５］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［７］
前記１つまたは複数の変異が、前記マトリプターゼ遺伝子のコーディング領域中に含まれ、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物をもたらす、上記［６］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［８］
前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼのエキソン２をコードするマトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれるか、または前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼの触媒ドメインの少なくとも一部をコードする、前記マトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれ、それによって非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物が得られる、上記［７］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［９］
変更されていない内因性マトリプターゼが、マトリプターゼ参照タンパク質として配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のうち１種または複数に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を共有し、前記マトリプターゼ参照タンパク質と同一のタンパク質分解性活性を有する、上記［１］から［８］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１０］
前記脊椎動物細胞が、哺乳動物細胞である、上記［１］から［９］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１１］
前記哺乳動物細胞が、以下の特徴：
ａ）前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、
ｂ）前記哺乳動物細胞がげっ歯類細胞である、
ｃ）前記哺乳動物細胞がハムスター細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞である、および／または
ｄ）前記哺乳動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される
のうち１つまたは複数を有する、上記［１０］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１２］
前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエキソン２中に１つまたは複数のフレームシフト変異を含むＣＨＯ細胞である、上記［１］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１３］
前記対象のポリペプチドが、以下の特徴：
ａ）それが治療上活性のあるまたは診断用のポリペプチドである、
ｂ）それがプロテアーゼによるクリッピングに対して感受性である、
ｃ）それがマトリプターゼの少なくとも１つのクリッピング部位を含む、
ｄ）それがグリコポリペプチドである、および／または
ｅ）それが糖タンパク質、抗体、非ＩｇＧタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される
のうち１つまたは複数を有する、上記［１］から［１２］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１４］
前記対象のポリペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれており、任意選択で、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中にさらに組み込まれている、上記［１］から［１３］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１５］
上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、脊椎動物細胞をマトリプターゼの効果を障害するように変更する段階と、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階とを含み、前記対象のポリペプチドが、前記脊椎動物細胞によって分泌される、方法。
［１６］
対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）前記対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）前記細胞培養培地から前記対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、前記単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、方法。
［１７］
対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物宿主細胞を培養する段階であって、前記細胞培養培地がマトリプターゼに対して選択的であるプロテアーゼ阻害剤を含む、段階と、
（ｂ）前記細胞培養培地から前記対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、前記単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、方法。
［１８］
対象のポリペプチドを組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物細胞を提供する段階と、
（ｂ）前記対象のポリペプチドを発現する１種または複数の宿主細胞を選択する段階と
を含む、方法。
［１９］
段階（ａ）が、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを用いて、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が障害されている脊椎動物細胞をトランスフェクトして、上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物宿主細胞を提供する段階を含む、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、
ｂ）段階（ａ）において提供される前記宿主細胞が、選択マーカーをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）が、前記選択マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む、
ｃ）ポリヌクレオチドが、１種もしくは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることによって前記脊椎動物細胞中に導入される、
ｄ）段階（ｂ）が、１つもしくは複数の選択ステップを含む、および／または
ｅ）段階（ｂ）が、フローサイトメトリーベースの選択を実施することを含む
のうち１つまたは複数を有する、上記［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］
脊椎動物細胞から分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のための前記脊椎動物細胞の使用であって、前記使用される細胞が、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更される、使用。
［２２］
前記脊椎動物細胞が、上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の１つまたは複数の特徴を有する、上記［２１］に記載の使用。
［２３］
対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞を選択するための方法であって、内因性プロテアーゼマトリプターゼが、前記脊椎動物細胞において機能的に発現されるか否かを分析する段階と、前記対象のポリペプチドの組換え製造のために、このような内因性マトリプターゼの効果が障害されている脊椎動物細胞を選択する段階を含む、方法。