【手続補正書】
【提出日】平成30年7月17日(2018.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．各プローブが前記複数の特定核酸分子内の一特定核酸分子内のプローブ標的領域とハイブリダイズし、かつ各プローブがその５’末端において第１のアダプターを有する複数のプローブを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップと；
ｂ．第２のアダプターを、前記複数のプローブ伸長産物の二本鎖末端へと追加するステップと；
ｃ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記プローブ伸長産物の各々の配列データを生成するステップと；
ｄ．プローブ標的領域とハイブリダイズした各プローブの数を決定するステップであって、前記数が、前記プローブ標的領域を含む、前記特定核酸分子の各々の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
組成物中の複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．複数のプローブを、特定核酸分子内のプローブ標的領域とハイブリダイズさせるステップであって、各プローブが、その５’末端に、第１のアダプターを有する、ステップと；
ｂ．各プローブを伸長させて、前記第１のアダプター配列を含む複数のプローブ伸長産物を生成するステップと；
ｃ．第２のアダプター配列を、前記複数のプローブ伸長産物の二本鎖末端へと追加するステップと；
ｄ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記複数のプローブ伸長産物の各々の配列を生成するステップと；
ｅ．前記複数のプローブ伸長産物の各々の前記配列を、プローブデータベース内の所定の配列に対してアラインさせるステップであって、前記プローブデータベースが、複数の所定の配列を含み、各所定の配列が、プローブに特異的である、ステップと；
ｆ．各プローブ伸長産物の前記配列についての、前記シークエンシングデータベース内の所定の配列に対するアラインメントの数を決定するステップであって、前記アラインメントの数が、前記プローブがハイブリダイズする前記特定核酸分子の各々の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項３】
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列が、フォワードリード、インデックスリード、およびリバースリードのうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、ゲノムまたはトランスクリプトームの座標へとマッピングして、意図されるプローブのアニーリングおよび伸長を検証する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記フォワードリードおよび前記リバースリードの前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、前記複数の特定核酸についてマッピングする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記インデックスリードの前記複数のプローブ伸長産物の前記配列により、試料バーコード配列またはｎ−ランダム配列のうちの少なくとも１つを同定する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記アダプターの追加に続き、前記プローブ伸長産物を、任意選択で増幅する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のアダプターを付加する前に、前記プローブ伸長産物を、制限エンドヌクレアーゼで処理するか、またはこれに末端修復を施す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記末端修復が、平滑末端修復である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記制限エンドヌクレアーゼで処理されたプローブ伸長産物により、共通の末端を伴うフォワードリードをもたらす、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、ゲノムまたはトランスクリプトームの座標へとマッピングして、意図されるプローブのアニーリングおよび伸長を検証する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、プローブデータベースの基準コピーに対してアラインさせて、意図されるプローブのアニーリングを検証する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リバースリード配列を、それらが、どのプローブ配列を表すのかに従いビニングおよび計数し、各プローブが表される回数が、前記出発特定核酸分子が、元の試料中に存在する回数についての尺度である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
フォワードリード配列を、それらが、どのプローブ配列を表すのかに従いビニングおよび計数し、各プローブが表された回数が、前記出発特定核酸分子が、元の試料中に存在した回数についての尺度であった、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のアダプター配列が、インデックス配列のプライミング部位、インデックスヌクレオチド配列、ｎ−ランダムヌクレオチド配列、フォワードリードプライミング部位、リバースリードプライミング部位、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１から２および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のアダプター配列が、フォワードリードプライミング部位、リバースリードプライミング部位、およびリンカー配列、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１から２および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記５’の第１のアダプターが、各プローブ伸長産物に共通である、請求項１から２および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記インデックスヌクレオチド配列が、バーコード配列をさらに含む、請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の核酸が、組織、臓器、単一の細胞、腫瘍、患者から採取された有機流体の検体、遊離循環核酸、真菌、原核生物、およびウイルスからなる群より選択される試料に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
一部の実施形態では、本開示の方法、組成物、およびキットは、Ｌｉら、２０１２年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２８巻（１０号）：１３０７〜１３１３頁；Ｂｅｌｌｏｓら、２０１４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４２巻（２０号）：ｅ１５８頁；Ｊｉａｎｇら、２０１５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４３巻（６号）：ｅ３９頁；Ｘｉら、２０１１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１０８巻（４６号）：１１２８〜１１３６頁；ＦｒｏｍｅｒおよびＰｕｒｃｅｌｌ、２０１４年、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、８１巻：７．２１．１〜７．２３．２１節；Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉら、２０１１年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３１巻（１５号）：１〜８頁；Ｋｒｕｍｍら、２０１２年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２２巻（８号）：１５２５〜１５３２頁；Ｐｌａｇｎｏｌら、２０１２年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２８巻（２１号）：２７４７〜２７５４頁において開示されている、１種または複数の態様を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
組成物中の複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．複数のプローブ伸長産物を生成するステップであって、各プローブ伸長産物が、特定核酸分子内のプローブ標的領域と相補的なプローブ配列を含む、ステップと；
ｂ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記複数のプローブ伸長産物の各々の配列を生成するステップと；
ｃ．前記複数のプローブ伸長産物の各々の前記配列を、基準配列データベースに対してアラインさせるステップであって、前記基準配列データベースが、プローブ配列を含む、ステップと；
ｄ．前記基準配列データベース内の配列との、各プローブ伸長産物の前記配列についてのアラインメントの数を決定するステップであって、前記アラインメントの数が、前記プローブ伸長産物の前記プローブが相補的である前記特定核酸分子の各々の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．複数のプローブ伸長産物を生成するステップであって、各プローブ伸長産物が、（ｉ）第１のアダプターと、（ｉｉ）特定核酸分子内のプローブ標的領域と相補的なプローブ配列とを含む、ステップと；
ｂ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記複数のプローブ伸長産物の各々の配列を含む配列データを生成するステップと；
ｃ．前記配列データ内の、各プローブ伸長産物の前記プローブ配列の存在を同定するステップと；
ｄ．前記複数のプローブ伸長産物内の、前記プローブ配列の各々の数を決定するステップであって、前記プローブ配列の各々の数が、前記プローブ配列の各々が相補的である前記複数の特定核酸分子の各々の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
（項目３）
複数の核酸分子内の、複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．複数の核酸分子の各々の５’末端へと、第１のアダプター配列を追加するステップと；
ｂ．複数のプローブを、前記複数の特定核酸分子とハイブリダイズさせるステップであって、各プローブが、特定核酸分子内のプローブ標的領域と相補的である、ステップと；
ｃ．各プローブを、追加された前記第１のアダプター配列へと伸長させて、前記第１のアダプター配列および第２のアダプター配列を有する複数のプローブ伸長産物を生成して、複数のプローブ伸長産物を産生するステップと；
ｄ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記複数のプローブ伸長産物の各々についての配列データを生成するステップと；
ｅ．前記複数のプローブ伸長産物の各々の配列を、プローブデータベースの基準コピー内の所定の配列に対してアラインさせるステップであって、前記所定の配列が、各プローブに特異的である、ステップと；
ｆ．その所定の配列に対してアラインさせた各プローブ配列の数を決定するステップであって、前記数が、前記プローブが相補的である前記特定核酸分子の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
（項目４）
複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．各プローブが前記複数の特定核酸分子内の一特定核酸分子内のプローブ標的領域とハイブリダイズし、かつ各プローブがその５’末端において第１のアダプターを有する複数のプローブを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップと；
ｂ．第２のアダプターを、前記複数のプローブ伸長産物の二本鎖末端へと追加するステップと；
ｃ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記プローブ伸長産物の各々の配列データを生成するステップと；
ｄ．プローブ標的領域とハイブリダイズした各プローブの数を決定するステップであって、前記数が、前記プローブ標的領域を含む、前記特定核酸分子の各々の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
（項目５）
組成物中の複数の特定核酸分子を定量化するための方法であって、
ａ．複数のプローブを、特定核酸分子内のプローブ標的領域とハイブリダイズさせるステップであって、各プローブが、その５’末端に、第１のアダプターを有する、ステップと；
ｂ．各プローブを伸長させて、前記第１のアダプター配列を含む複数のプローブ伸長産物を生成するステップと；
ｃ．第２のアダプター配列を、前記複数のプローブ伸長産物の二本鎖末端へと追加するステップと；
ｄ．前記複数のプローブ伸長産物をシークエンシングして、前記複数のプローブ伸長産物の各々の配列を生成するステップと；
ｅ．前記複数のプローブ伸長産物の各々の前記配列を、プローブデータベース内の所定の配列に対してアラインさせるステップであって、前記プローブデータベースが、複数の所定の配列を含み、各所定の配列が、プローブに特異的である、ステップと；
ｆ．各プローブ伸長産物の前記配列についての、前記シークエンシングデータベース内の所定の配列に対するアラインメントの数を決定するステップであって、前記アラインメントの数が、前記プローブがハイブリダイズする前記特定核酸分子の各々の量を指し示す、ステップと
を含む、方法。
（項目６）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列が、フォワードリード、インデックスリード、およびリバースリードのうちの少なくとも１つを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
各プローブがそのそれぞれの特定核酸内のそのそれぞれのプローブ標的領域配列へとアニールした特異性を検証する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、ゲノムまたはトランスクリプトームの座標へとマッピングして、意図されるプローブのアニーリングおよび伸長を検証する、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、ゲノムまたはトランスクリプトームの座標へとマッピングする、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、プローブデータベースの基準コピーに対してアラインさせて、意図されるプローブのアニーリングおよび伸長を検証する、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記リバースリードが、前記プローブ標的領域を含む、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記フォワードリードが、前記プローブ標的領域を含む、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記フォワードリードおよび前記リバースリードの前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、前記複数の特定核酸についてマッピングする、項目８および９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記インデックスリードの前記複数のプローブ伸長産物の前記配列により、試料バーコード配列およびｎ−ランダム配列のうちの少なくとも１つを同定する、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記フォワードリードのマッピング座標と、前記インデックスリードのｎ−ランダム塩基との組み合わせにより、各プローブ伸長産物についてのＰＣＲ重複を決定する、項目８に記載の方法。
（項目１６）
同じフォワードリード座標および同じｎ−ランダム塩基配列を有する配列を、重複として同定し、単一の特定核酸分子として一括し、計数する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
フォワードリード座標は同じであるが、ｎ−ランダム塩基配列は異なる配列の各々を、別々の特定核酸分子として計数する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記フォワードリードのマッピング座標と、前記インデックスリードのｎ−ランダム塩基との組み合わせにより、特定核酸分子を同定する、項目９に記載の方法。
（項目１９）
同じフォワードリード座標および同じｎ−ランダム塩基配列を有する配列を、重複として同定し、単一の特定核酸分子として一括し、計数する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
フォワードリード座標は同じであるが、ｎ−ランダム塩基配列は異なる配列の各々を、別々の特定核酸分子として計数する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記フォワードリードと、対応するリバースリードとを、ペアエンドでアラインさせる、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
重複の一括に続き、各プローブ配列について計数されるリバースリードの数により、前記複数の特定核酸内の、各出発特定核酸分子についての分子の数を表す値を生成する、項目１６および１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
重複の一括に続き、各プローブ配列について計数されるフォワードリードの数により、前記複数の特定核酸内の、各出発特定核酸分子についての分子の数を表す値を生成する、項目１６および１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
各プローブ配列について計数されるリバースリードの数により、前記複数の特定核酸内の、各出発特定核酸分子についての分子の数を表す値を生成する、項目１７および１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ゲノムが、哺乳動物、細菌、ウイルス、リケッチア、または植物のゲノムまたはトランスクリプトームからなる群より選択される、項目８および９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１のアダプターを追加する前に、前記複数の特定核酸に末端修復を施す、項目２および３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記プローブを、ポリメラーゼにより伸長させる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素からなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記アダプターの追加に続き、前記プローブ伸長産物を、任意選択で増幅する、項目４から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第２のアダプターを付加する前に、前記プローブ伸長産物を、制限エンドヌクレアーゼで処理するか、またはこれに末端修復を施す、項目１および４から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記末端修復が、平滑末端修復である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記プローブ伸長産物の伸長が、第１のアダプターの付加をさらに含む、項目１および４から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記プローブ伸長産物の増幅が、前記増幅産物の各末端へのフローセル配列の付着をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記制限エンドヌクレアーゼで処理されたプローブ伸長産物により、共通の末端を伴うフォワードリードをもたらす、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、ゲノムまたはトランスクリプトームの座標へとマッピングして、意図されるプローブのアニーリングおよび伸長を検証する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、プローブデータベースの基準コピーに対してアラインさせて、意図されるプローブのアニーリングを検証する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記フォワードリードのマッピング座標と、前記インデックスリードのｎ−ランダム塩基との組み合わせにより、各プローブ伸長産物についてのＰＣＲ重複を決定する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
同じフォワードリード座標および同じｎ−ランダム塩基配列を有する配列を、重複として同定し、単一の特定核酸分子として一括し、計数する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記複数のプローブ伸長産物の前記配列を、プローブデータベースの基準コピーに対してアラインさせて、意図されるプローブのアニーリングを検証する、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
リバースリード配列を、それらが、どのプローブ配列を表すのかに従いビニングおよび計数し、各プローブが表される回数が、前記出発特定核酸分子が、元の試料中に存在する回数についての尺度である、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
フォワードリード配列を、それらが、どのプローブ配列を表すのかに従いビニングおよび計数し、各プローブが表された回数が、前記出発特定核酸分子が、元の試料中に存在した回数についての尺度であった、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記フォワードリードが、前記特定核酸配列の少なくとも一部を含む、項目６に記載の方法。
（項目４３）
前記フォワードリードが、前記特定核酸配列のうちの、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２５塩基を含む、項目６に記載の方法。
（項目４４）
前記第１のアダプター配列が、インデックス配列のプライミング部位、インデックスヌクレオチド配列、ｎ−ランダムヌクレオチド配列、フォワードリードプライミング部位、およびリバースリードプライミング部位、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目２、３、および３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記第２のアダプター配列が、フォワードリードプライミング部位、リバースリードプライミング部位、およびリンカー配列、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目２、３、および３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記第２のアダプター配列が、インデックス配列のプライミング部位、インデックスヌクレオチド配列、ｎ−ランダムヌクレオチド配列、フォワードリードプライミング部位、リバースリードプライミング部位、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目１、４から５、および３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１のアダプター配列が、フォワードリードプライミング部位、リバースリードプライミング部位、およびリンカー配列、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目４から５、および３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記５’の第１のアダプターが、各プローブ伸長産物に共通である、項目４から５、および３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記インデックスリードが、インデックスヌクレオチド配列およびｎ−ランダム塩基配列のうちの、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５塩基を含む、項目６に記載の方法。
（項目５０）
前記インデックスリードが、ｎ−ランダム塩基およびインデックスヌクレオチド配列のうちの、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０塩基を含む、項目６に記載の方法。
（項目５１）
前記インデックスリードが、前記ｎ−ランダム塩基および任意選択で前記インデックスヌクレオチド配列のうちの、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０塩基を含む、項目６に記載の方法。
（項目５２）
前記ｎ−ランダム塩基のヌクレオチド配列が、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチドを含む、項目４４および４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記インデックスヌクレオチド配列が、バーコード配列をさらに含む、項目４４および４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記リバースリードが、プローブ標的領域配列および前記特定核酸配列の一部、ならびにこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目６に記載の方法。
（項目５５）
前記リバースリードが、プローブ配列のうちの、少なくとも少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または少なくとも６０塩基を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記リバースリードが、前記プローブ配列に対して３’の特定核酸配列のうちの、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも２０塩基を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
項目２９に記載の方法により増幅されるプローブ伸長産物を含む組成物。
（項目５８）
項目１から５のいずれか一項に記載の方法により産生されるプローブ伸長産物を含む組成物。
（項目５９）
前記複数の核酸が、組織、臓器、単一の細胞、腫瘍、患者から採取された有機流体の検体、遊離循環核酸、真菌、原核生物、およびウイルスからなる群より選択される試料に由来する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記患者が、腫瘍を有することが知られているか、またはこれを有することが疑われる、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記有機流体が、少なくとも１つの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または播種性腫瘍細胞（ＣＴＤ）を含有する、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記患者が、ウイルス感染を有することが知られているか、またはこれを有することが疑われる、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
前記ウイルス感染が、伝染性感染または伝染性疾患である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記組成物が、複数の核酸分子をさらに含む、項目１から５に記載の方法。
（項目６５）
各プローブ伸長産物が、特定核酸分子内のプローブ標的領域と相補的なプローブの伸長産物である、項目１から５に記載の方法。