【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年10月3日(2018.10.3)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＡＣ００９−Ｈ１）で表される化合物。
【化１】
2018507175.tif 000001
【請求項２】
式（ＡＣ０１２−Ｈ１）で表される化合物。
【化２】
2018507175.tif 000002
【請求項３】
癌の治療用の医薬組成物であって、該組成物は、治療に有効な量の化合物、塩類又はプロドラッグと、少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリアとを含み、
前記化合物は、以下の式で表されるAC011、AC009-H1及びAC012-H1からなる群から選択される少なくとも１種である癌の治療用の医薬組成物。
【化３】
2018507175.tif 000003
【請求項４】
前記キャリアは、賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性及び非油性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色素及び香料の少なくとも１種を含む請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物は、癌細胞の増殖を抑制することにより治療効果を有する請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は、静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の剤形を有する請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物は、溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含む剤形を有する請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記癌は、前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなる群から選択される少なくとも１種である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記癌は大腸癌又は肝癌である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体の製造方法であって、
該方法は、
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過し、
７０−３２０メッシュのシリカゲルを取り、菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで勾配溶出し、溶出物はF1、F2とF3という画分に分けられ、それぞれの勾配は１７−２２％の酢酸エチル、２３−２７％の酢酸エチル及び２８−３３％の酢酸エチルであり、F3を保持時間の順序に基づいて三つの画分F3-1〜F3-3に分け、
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトンを用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という画分を取り、更に順相MPLCでカラムを分取しｎ-ヘキサン／酢酸エチル（4：1）で分離、精製して化合物AC006を得、
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/アセトンを用いてに勾配分離し（100％：0％から70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの画分を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの画分に分離し、
F3-2-3を更に分離、精製し、移動相であるｎ-ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0%から0%:100%）、n-ヘキサン／アセトン=90/10から70/30までの画分を取って移動相であるn-ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続けて（100%:0%から0%:100%)、n-ヘキサン／酢酸エチル=60/40にAC007を得、
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/アセトンを用いて勾配溶出分離し（100％：0％から0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの画分を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの画分に分離し、
F-3-3-5（CH2Cl2/アセトン=73/27の画分）を更に分離、精製し、移動相であるn-ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5%から50%:50%）、85%:15%から70%:30%の画分を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの画分に分離し、
F3-3-5-1（n-ヘキサン／アセトン=90/10-80/20）を更に逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中1％の蟻酸／メタノール＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の画分を取って移動相であるn-ヘキサン／酢酸エチル=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-ヘキサン／酢酸エチル=75%:25%-65%:35%にAC012を得、
F3-3-5-3を更に逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中1％の蟻酸／メタノール＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする画分（保持時間は130‐170min）を取って更に精製し、移動相であるCH2Cl2/酢酸エチルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0%から0%:100%）、CH2Cl2/酢酸エチル=80%/20%- 60%/40%にAC009を得、
F3-3-5-4（n-ヘキサン／アセトンe=76/24)を取って逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中1％の蟻酸／メタノール＝25％:75％などまで勾配溶出し、生成物はAC011であり、
前記AC006、AC007、AC009、AC011、AC012は、生物活性を有する化合物である製造方法。
【請求項１１】
１モル当量のメタノールで前記生物活性を有する化合物を加水分解し、
加水分解反応が終わった後、アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過し、中間産物を得、
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチルを移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:1である時点に生成物を収集し、
該生成物を逆相HPLC及びC18によりカラム分取して精製し、メタノール／リン酸緩衝食塩水にて75:25で勾配溶出して、前記生物活性を有する化合物のC4が水酸基である誘導体を製造する請求項１０に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明は更に牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を製造する方法を提供し、それは以下のステップを含む。
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回還流抽出する。それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過する。
７０−３２０メッシュのシリカゲルを取り、菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-ヘキサン／酢酸エチルの勾配で溶出する。溶出物はF1、F2とF3に分画され、それぞれの勾配は１７−２２％の酢酸エチル、２３−２７％の酢酸エチル及び２８−３３％の酢酸エチルである。F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの画分F3-1〜F3-3に分ける。
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という画分を取り、更に順相MPLCでカラムを分取しｎ-ヘキサン／酢酸エチル（4：1）で分離、精製してから化合物AC006を得る。
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/アセトンを用いて勾配分離し（100％：0％から70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの画分を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの画分に分ける。
F3-2-3を更に分離、精製し、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0%から0%:100%）、ｎ−ヘキサン／アセトン=90/10から70/30までの画分を取って、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続け（100%:0%から0%:100%)、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル=60/40にAC007を得る。
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/アセトンを用いて勾配溶出分離し（100％：0％から 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの画分を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの画分に分ける。
F-3-3-5（CH2Cl2/アセトン=73/27の画分）を更に分離、精製し、移動相であるn-ヘキサン/アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5%から 50%:50%）、85%:15%から70%:30%の画分を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの画分に分ける。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
F3-3-5-1（n-ヘキサン/アセトン=90/10-80/20）を更に逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中の1％蟻酸／メタノール＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の画分を取って移動相であるn-ヘキサン／酢酸エチル=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-ヘキサン／酢酸エチル=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
F3-3-5-3を更に逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中の1％蟻酸／メタノール＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170分）を取って更に精製し、移動相であるCH2Cl2/酢酸エチルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0% から0%:100%）、CH2Cl2/酢酸エチル=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
F3-3-5-4（n-ヘキサン／アセトンe=76/24)を取って逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中の1％蟻酸／メタノール＝25％:75％などまで勾配溶出し、精製物はAC011である。
これらAC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
実施例１：牛樟芝化合物の製造
牛樟芝の液体発酵菌糸体をｎ−ヘキサン（n-hexane）で二回還流（reflux）させ、各回は１−３時間行う。排気し濾過した後、二回のn-ヘキサン抽出液を合わせる。７０−２３０ウェルのシリカゲル（７０‐２３０mesh）を取って菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、n-ヘキサン／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出する。溶出物を、F1、F2及びF3の三層に分ける（fraction）。勾配はそれぞれ17-22%の酢酸エチル、23-27%の酢酸エチル及び28-33%の酢酸エチルで、F3を保持時間（retention time）の順序によって三つの画分F3-1〜F3-3に分ける。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性が５０：１から２０：１まで勾配溶出する）、４０：１−１５：１の段階を取り、順相HPLC（Medium pressure liquid chromatography）でカラムを取分し、精製、n-ヘキサン／酢酸エチル（４：１）で分離、精製して化合物AC006を得る。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
F3-2を順相MPLC（Medium pressure liquid chromatography）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/アセトンで勾配分離し（100%:0%から70%: 30%）、95％：5％から85％：15％までの画分を取り三つの画分に分ける。
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0%から0%:100%）、n-ヘキサン／アセトン=90/10から70/30までの画分を取って移動相であるn-ヘキサン／酢酸エチルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0%から0%:100%）n-ヘキサン／酢酸エチル=60/40にAC007を得る。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、移動相であるCH2Cl2/アセトンで勾配分離し（100%:0%から0%: 100%）、90％：10％から70％：30％までの画分を取り五つの画分に分ける。
F-3-3-5(CH2Cl2/アセトン=73/27の画分)を更に分離、精製し、移動相であるn-ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（95％：5％から50％：50％）、85%:15%から70%:30%までの画分を取って五つの画分に分ける。
F3-3-5-1（n-ヘキサン／アセトン=90/10-80/20）を取り逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで更に分離、精製し、移動相である水中の１％蟻酸／メタノール水溶液=35％/65％から20％/80％を勾配として、28％/72％−22％/78％の画分を取って更に移動相である n-ヘキサン／酢酸エチル=80%:20%から50％/50％までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-ヘキサン／酢酸エチル=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
F3-3-5-3を取って逆相（reverse phase）MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である水中の１％蟻酸／メタノール=25/75を用いて１５ml/minの流速で勾配（isocratic）溶出し、AC009を主とする段階（保持時間は１３０−１７０min）を取って更に精製し、移動相であるCH2Cl2/酢酸エチル（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して勾配溶出し（90%:0%から0%:100%）、CH2Cl2/酢酸エチル=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
F3-1を取り逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である水中の１％蟻酸／メタノール=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、精製物はAC-05-01である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
F3-3-5-4（n-ヘキサン／アセトン=76/24）を取り逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、移動相である水中の１％蟻酸／メタノール=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、精製物はAC011である。
抽出物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012すなわち牛樟芝にある抗がん活性を有する化合物である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
該中間産物を、順相システムを利用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分析し、シリカゲルで樹脂を分離し、ヘキサン／酢酸エチルを流動相とする。溶出比例はヘキサン／酢酸エチル=4:1から1:1まで、溶出プロセスをTLCで監視測定し、AC012-H1とAC012-H2の混合物はヘキサン／酢酸エチル=1:1である時点に溶出され、それを収集して濃縮し、濃縮された産物を得る。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
濃縮された該産物を逆相HPLCで最後に純化し、C18でステンレス製カラムを分取し、移動相であるエタノール：0.1％のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）＝75：25を用いて単一比例で溶出する。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31分から25分までである。AC012-H2は39分から43分までである。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
実施例４：牛樟芝化合物が血管新生を抑制する効果
本発明はSR8試験及び血管形成試験（matrigel capillary tube formation assay）を使用し、牛樟芝から精製された化合物が血管新生を抑制することを確認する。
SRB試験はヒト内皮前駆細胞（EPC、endothelial progenitor cells）を5*103の細胞/培養皿ウェル（cell/well）の数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（serum free）の培地に置いて48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び異なる濃度のAC012に入れて48時間培養する。AC012の濃度はそれぞれ0.1、0.3、1、3、10と30マイクログラム/ミリリットル（μg/ml）である。処理薬物で培養した後の培地を取り出して、培養皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のスルホローダミンB (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5分放置する。次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTrisバッファ（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。