【手続補正書】
【提出日】平成30年2月20日(2018.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを産生できる組換え細胞であって、
（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が前記核酸の発現および／または前記アセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されている、核酸；
（ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；および
（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸
を含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養がイソプレンの生産を提供する、組換え細胞。
【請求項２】
イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、
（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が前記核酸の発現および／または前記アセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されている、核酸；および
（ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸
を含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養が前記イソプレノイド前駆体の生産を提供する、組換え細胞。
【請求項３】
イソプレノイドを産生できる組換え細胞であって、
（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が前記核酸の発現および／または前記アセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されている、核酸；
（ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；および
（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸
を含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養が前記イソプレノイドの生産を提供する、組換え細胞。
【請求項４】
前記１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が、減衰、欠失、または増大するように調節される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５】
前記アセチル化タンパク質が、アセチルトランスフェラーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６】
前記アセチルトランスフェラーゼが、ＹｆｉＱペプチド、Ｐａｔペプチド、およびＡｃｕＡペプチドからなる群から選択される、請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
前記アセチル化タンパク質が、デアセチラーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８】
前記デアセチラーゼが、ＣｏｂＢペプチドおよびＳｒｔＮペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の組換え細胞。
【請求項９】
前記ＹｆｉＱポリペプチドの活性が、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子発現の低下、減衰、または欠失によって調節される、請求項６に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
前記ＣｏｂＢポリペプチドの活性が、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする遺伝子発現の増大によって調節される、請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
前記イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）交配種に由来するポリペプチドである、請求項１および４〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記組換え細胞が、
（ａ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸；
（ｂ）１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；
（ｃ）１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする核酸の発現および／またはペントースリン酸経路タンパク質の活性が調節されるように修飾されており、かつ前記ペントースリン酸経路タンパク質が、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、リボース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｉＡ）およびホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）からなる群から任意的に選択される、１つまたは複数の核酸；
（ｄ）１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が、酢酸循環タンパク質をコードする核酸の発現、および／または酢酸循環タンパク質の活性が調節されるように修飾されており、かつ前記酢酸循環タンパク質が、アセチル補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）からなる群から任意的に選択される、１つまたは複数の核酸；  および
（ｅ）ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｇｌｔａ、ａｃｓ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が核酸の発現および／またはタンパク質の活性が調節されるように修飾されている、１つまたは複数の核酸
のうちの１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または請求項１３（ｅ）に記載の１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、
（ａ）誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター下に置かれる；
（ｂ）１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローニングされる；または
（ｃ）前記細胞の染色体に組み込まれる、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
前記イソプレン生産が、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して増大される、請求項１および４〜１５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１７】
前記イソプレン生産の増大が、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）イソプレン対二酸化炭素比、（ｖ）比生産性、または（ｖｉ）細胞生産性指数の増大を含んでなる、イソプレン生産が少なくとも５％増大される、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項１８】
（ａ）請求項１および４〜１７のいずれか一項に記載の組換え細胞をイソプレンの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップと、任意的にさらに（ｃ）イソプレンを回収するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法。
【請求項１９】
前記イソプレノイド前駆体が、メバロン酸（ＭＶＡ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）からなる群から選択される、請求項２〜１０および１２〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記イソプレノイド前駆体の生産が、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して増大される、請求項２〜１０および１２〜１９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
前記イソプレノイド前駆体の生産の増大が、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）比生産性、または（ｖ）細胞生産性指数の増大を含んでなる、イソプレノイド前駆体の生産が少なくとも５％増大される、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
（ａ）請求項２〜１０および１２〜２１のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレノイド前駆体の生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップと、さらに任意的に（ｃ）イソプレノイド前駆体を回収するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法。
【請求項２３】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピネン、およびバレンセンからなる群から選択される、請求項３〜１０および１２〜２２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
前記イソプレノイドの生産が、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して増大される、請求項３〜１０および１２〜２３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記イソプレノイド生産の増大が、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）比生産性、または（ｖ）細胞生産性指数の増大を含んでなる、イソプレノイド生産が少なくとも５％増大される、請求項２４に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
（ａ）請求項３〜１０および１２〜２５のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレノイドの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップと、さらに任意的に（ｃ）イソプレノイドを回収するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法。