【手続補正書】
【提出日】平成30年9月12日(2018.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること；
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解すること、ここで１つまたは複数の微生物細胞の溶解は、複数の微生物遺伝物質を放出させる；
複数の微生物遺伝物質を単離すること；
複数の微生物遺伝物質を増幅すること；
増幅された微生物遺伝物質を複数のＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）と接触させること、ここで複数のＤＩＡＮＡは、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を含む；および
微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出すること、ここで結合の検出は、試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す
を含む方法。
【請求項２】
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることが、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液が約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤、約０．２％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含み、約６〜９のｐＨを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
複数の微生物遺伝物質を単離することが、微生物遺伝物質を陰イオン性−交換微小粒子に結合させ、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することが、１つまたは複数の微生物細胞を、ＤＮＡインターカレーティング色素を含む溶解緩衝液と接触させることを含み、ＤＮＡインターカレーティング色素が、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、またはその組合せから選択されてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することが、単離された複数の微生物遺伝物質を、約３〜７．５のｐＨ、少なくとも１つの一価の塩であって、一価の塩濃度が約０．７５Ｍ〜２．７５Ｍである一価の塩、少なくとも１つの非イオン性洗浄剤であって、非イオン性洗浄剤濃度が約０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）である非イオン性洗浄剤、および少なくとも１つの両性イオン性洗浄剤であって、両性イオン性洗浄剤濃度が約０．１×〜４００×ＣＭＣである両性イオン性洗浄剤を含む洗浄緩衝液と接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
複数の微生物遺伝物質を増幅することが約４００〜２０００ｂｐのアンプリコンを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＤＩＡＮＡが１つまたは複数のリンカーを含み、リンカーが、長さが約４０〜２００原子であってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＤＩＡＮＡが１つまたは複数の結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
多方向の流れを可能にする複数の相互接続されたチャンバーを含むカートリッジであって：
第１のチャンバーが反応チャンバーであり、第１のチャンバーが約１０μｌ〜１０ｍｌの試料を受け取るように構成されており；
第２のチャンバーが溶解用溶液貯蔵チャンバーであり；
第３のチャンバーが溶解終結溶液貯蔵チャンバーであり；
第４のチャンバーが陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーであり；
第５のチャンバーがアウトプットチャンバーである、カートリッジ；および
複数の流れチャネルを含む流体デバイスであって、
第１の流れチャネルが第１のチャンバーを第２のチャンバーに連結し、
第２の流れチャネルが第１のチャンバーを第３のチャンバーに連結し、
第３の流れチャネルが第１のチャンバーを第４のチャンバーに連結し、
第４の流れチャネルが第１のチャンバーを第５のチャンバーに連結する、流体デバイス
を含むデバイス。
【請求項１１】
１つまたは複数のＤＩＡＮＡを含む組成物であって、ＤＩＡＮＡが、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を有する、組成物。
【請求項１２】
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させるための方法であって、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、請求項１０に記載のデバイスを使用して、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、方法。
【請求項１３】
対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、試料から真核生物ＤＮＡを真核細胞の選択的溶解によって枯渇させること；
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解すること、ここで１つまたは複数の微生物細胞の溶解は、複数の長さが２ｋｂ〜２９０ｋｂである微生物遺伝物質を放出させる；
陰イオン交換樹脂を用いて複数の微生物遺伝物質を精製すること；
複数の微生物遺伝物質を増幅して長さが４００〜４０００ｂｐであるアンプリコンを生成すること；
増幅された微生物遺伝物質を少なくとも１つのＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）と接触させること、ここで複数のＤＩＡＮＡは、配列番号１〜３７からなる群から選択される；および
微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への少なくとも１つのＤＩＡＮＡの結合を検出すること、ここで結合の検出は、試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
他の実施形態が以下の特許請求の範囲において記載される。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１．  対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること；
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解すること、ここで１つまたは複数の微生物細胞の溶解は、複数の微生物遺伝物質を放出させる；
複数の微生物遺伝物質を単離すること；
複数の微生物遺伝物質を増幅すること；
増幅された微生物遺伝物質を複数のＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）と接触させること、ここで複数のＤＩＡＮＡは、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を含む；および
微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出すること、ここで結合の検出は、試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す
を含む方法。
２．  単離された複数のゲノム物質が精製される、上記１に記載の方法。
３．  試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることが、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、上記１から２の１項に記載の方法。
４．  試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液が約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤、約０．２％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含み、約６〜９のｐＨを有する、上記３に記載の方法。
５．  遊離の真核生物ＤＮＡが、約０．１Ｍ〜０．８５Ｍの一価の塩濃度を有する約６〜９のｐＨの条件下で陰イオン性−交換微小粒子を使用して血液反応から除去される、上記３に記載の方法。
６．  試料が血液または痰である、上記１に記載の方法。
７．  対象が哺乳動物である、上記１に記載の方法。
８．  哺乳動物がヒトである、上記７に記載の方法。
９．  複数の微生物遺伝物質を単離することが、微生物遺伝物質を陰イオン性−交換微小粒子に結合させ、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することを含む、上記１に記載の方法。
１０．  単離された微生物遺伝物質がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せである、上記１に記載の方法。
１１．  ＤＮＡが一本鎖または二本鎖である、上記１０に記載の方法。
１２．  試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することが、１つまたは複数の微生物細胞を、ＤＮＡインターカレーティング色素を含む溶解緩衝液と接触させることを含む、上記１に記載の方法。
１３．  ＤＮＡインターカレーティング色素が、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、またはその組合せから選択される、上記１２に記載の方法。
１４．  微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することが、単離され
た複数の微生物遺伝物質を、約３〜７．５のｐＨ、少なくとも１つの一価の塩であって、
一価の塩濃度が約０．７５Ｍ〜２．７５Ｍである一価の塩、少なくとも１つの非イオン性
洗浄剤であって、非イオン性洗浄剤濃度が約０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）である非イ
オン性洗浄剤、および少なくとも１つの両性イオン性洗浄剤であって、両性イオン性洗浄
剤濃度が約０．１×〜４００×ＣＭＣである両性イオン性洗浄剤を含む洗浄緩衝液と接触
させることを含む、上記９に記載の方法。
１５．  複数の微生物遺伝物質を増幅することが約４００〜２０００ｂｐのアンプリコンを得る
ことを含む、上記１に記載の方法。
１６．  ＤＩＡＮＡが１つまたは複数のリンカーを含む、上記１に記載の方法。
１７．  リンカーが、長さが約４０〜２００原子である、上記１６に記載の方法。
１８．  ＤＩＡＮＡが１つまたは複数の結合部分を含む、上記１に記載の方法。
１９．  多方向の流れを可能にする複数の相互接続されたチャンバーを含むカートリッジであっ
て：
第１のチャンバーが反応チャンバーであり、第１のチャンバーが約１０μｌ〜１０ｍｌの
試料を受け取るように構成されており；
第２のチャンバーが溶解用溶液貯蔵チャンバーであり；
第３のチャンバーが溶解終結溶液貯蔵チャンバーであり；
第４のチャンバーが陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーであり；
第５のチャンバーがアウトプットチャンバーである、カートリッジ；および
複数の流れチャネルを含む流体デバイスであって、
第１の流れチャネルが第１のチャンバーを第２のチャンバーに連結し、
第２の流れチャネルが第１のチャンバーを第３のチャンバーに連結し、
第３の流れチャネルが第１のチャンバーを第４のチャンバーに連結し、
第４の流れチャネルが第１のチャンバーを第５のチャンバーに連結する、流体デバイス
を含むデバイス。
２０．  流体デバイスが流れゲートをさらに含み、流れゲートが２つ以上のチャンバーを連結す
る流れチャネル間に配置されている、上記１９に記載のデバイス。
２１．  流体デバイスが１つまたは複数のニューマチックインターフェースをさらに含み、ニュ
ーマチックインターフェースが少なくとも１つのチャンバーに流体連結されている、請求
項１９に記載のデバイス。
２２．  陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーが陰イオン交換樹脂を含む、上記１９に記載のデバ
イス。
２３．  陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーが、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換
樹脂を含む、上記１９に記載のデバイス。
２４．  溶解用溶液貯蔵チャンバーが真核生物溶解用溶液を含み、試料と組み合わせられた真核
生物溶解用溶液が約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤および約０．２
％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含む、上記１９に記載
のデバイス。
２５．  Ｔｗｅｅｎ界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、およびＴｗｅｅｎ−８０からなる群から選択される、上記２４に記載のデバイス。
２６．  ＴｒｉｔｏｎがＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４である、上記２４に記載のデバイス。
２７．  ＩＧＥＰＡＬが、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−６３０、およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−７２０からなる群から選択される、上記２４に記載のデバイス。
２８．  流体撹拌がチャンバーの１つまたは複数中への無菌気体の流れによって作製される、上記１９に記載のデバイス。
２９．  独立型デバイスである、上記１９に記載のデバイス。
３０．  デバイスが第２のデバイス中のモジュールであり、第２のデバイスがモジュールの上流および／または下流処理を行う、上記１９に記載のデバイス。
３１．  １つまたは複数のＤＩＡＮＡを含む組成物であって、ＤＩＡＮＡが、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を有する、組成物。
３２．  １つまたは複数のＤＩＡＮＡが固体支持体に結合している、上記３１に記載の組成物。
３３．  １つまたは複数のＤＩＡＮＡが検出可能なマーカーを含む、上記３１に記載の組成物。
３４．  試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させるための方法であって、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、上記１９に記載のデバイスを使用して、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、方法。