【手続補正書】
【提出日】平成30年8月20日(2018.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを合成するための無細胞製法であって、開始濃度のヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、反応混合物を形成することを含み、ＤＮＡテンプレートの等温増幅が鎖置換での複製を介して起こり、ポリメラーゼによるＤＮＡの連続的な合成のためにさらなるヌクレオチドの供給が必要であり、反応混合物に供給されるさらなるヌクレオチドの量は制御される、上記製法。
【請求項２】
前記反応混合物が、１種またはそれより多くのプライマーをさらに含む、請求項１に記載の製法。
【請求項３】
ＤＮＡを合成するための無細胞製法であって、開始濃度のヌクレオチドおよび少なくとも１つのプライマーの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、反応混合物を形成することを含み、ＤＮＡテンプレートの等温増幅が鎖置換での複製を介して起こり、ポリメラーゼによるＤＮＡの連続的な合成のためにさらなるヌクレオチドの供給が必要であり、反応混合物に供給されるさらなるヌクレオチドの量は制御される、上記製法。
【請求項４】
反応混合物が、１種またはそれより多くの金属カチオンをさらに含み、さらなる金属カチオンの反応混合物への供給は、任意にさらなるヌクレオチドの供給とは独立して、制御される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを合成するための無細胞製法。
【請求項５】
反応混合物からのＤＮＡの最終的な収量がラージスケールであり、０．２〜１０ｇ/ｌであってもよい、請求項１〜４のいずれか一項に記載の無細胞製法。
【請求項６】
反応混合物中のヌクレオチドの開始濃度は、最終的な収量を達成するのに十分ではない、請求項５に記載の無細胞製法。
【請求項７】
さらなるヌクレオチドが、ポリメラーゼによる要求に応じて供給される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の無細胞製法。
【請求項８】
ポリメラーゼについての酵素反応速度論の理論上の計算に基づいて、反応混合物に対し、さらなるヌクレオチドの供給が制御される、請求項７に記載の無細胞製法。
【請求項９】
反応混合物の測定可能なパラメーターに基づいて、反応混合物に対し、さらなるヌクレオチドの供給が制御される、請求項７に記載の無細胞製法。
【請求項１０】
反応混合物の測定可能なパラメーターが、ＤＮＡ合成の速度、合成されたＤＮＡの濃度、反応混合物の粘度または反応混合物の体積を含む、請求項９に記載の無細胞製法。
【請求項１１】
合成されたＤＮＡの濃度がモニターされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の無細胞製法。
【請求項１２】
反応混合物中のＤＮＡの濃度は、反応混合物またはその一部または局部の圧力における差を測定することによりモニターされる、請求項１０または請求項１１に記載の無細胞製法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡテンプレートが、環状であり、前記ＤＮＡテンプレートの増幅が、ローリングサークル増幅による、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡテンプレートが、閉じた直鎖状ＤＮＡであり、好ましくは、前記ＤＮＡテンプレートが、変性条件下でインキュベートされて、閉じた環状一本鎖ＤＮＡを形成する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡテンプレートが、少なくとも１つのプロセシング酵素の標的配列、好ましくはリコンビナーゼ標的配列またはプロテロメラーゼ標的配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製法。
【請求項１６】
プロセシング酵素が反応混合物に供給され、前記供給は制御される、請求項１５に記載の製法。
【請求項１７】
前記さらなるヌクレオチドが、複数のアリコートで反応混合物に供給され、好ましくは、前記さらなるヌクレオチドが、製法の持続時間中にわたり一定間隔で、任意に少なくとも３０分毎に、アリコートとして供給される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製法。
【請求項１８】
前記さらなる金属イオンが、製法の持続時間中にわたり一定間隔で、任意に少なくとも３０分毎に、アリコートとして供給される、請求項４に記載の製法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドが、生物学的に不活性なヌクレオチドを含み、好ましくは活性化を介して前記反応混合物に供給される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製法。
【請求項２０】
前記製法が、合成装置中で実行される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の製法であって、前記装置が：
少なくとも第１のポートおよび第２のポートを有する反応容器；
反応容器の温度を制御するための温度制御デバイス；
任意に前記さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンを含む、反応要素を保持するための複数の貯蔵容器；
複数のコンジットであって、それぞれが反応容器の第１のポートを複数の貯蔵容器の１つのそれぞれに接続する、コンジット；
反応容器の第１のポートまたは第２のポートの近傍に配置された少なくとも１つの圧力センサー；
反応容器に、貯蔵容器中に保持された制御された量の反応要素を選択的に供給するための供給手段；
反応容器から、それらの第２のポートを介して所定量の内容物を選択的に引き出し、反応容器に、それらの第２のポートを介して反応容器の内容物を選択的に戻すための撹拌手段；および
供給手段と撹拌手段とを制御するための制御手段
を含み、
ここで圧力センサーは、反応容器の外部からＤＮＡの濃度に関する圧力の変化を検出し、シグナルを制御手段に送り、制御手段は、観察された圧力の変化に応答して供給手段および／または撹拌手段を制御する、製法。
【請求項２１】
前記シグナルがＤＮＡの濃度を示し、圧力センサーで、反応混合物の一部を取り出したり戻したりする往復ポンプによって生じた圧力差を測定することによって生成される、請求項２０に記載の製法。
【請求項２２】
前記金属カチオンが、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、マンガン（Ｍｎ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、ベリリウム（Ｂｅ２＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）およびストロンチウム（Ｓｒ２＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）またはカリウム（Ｋ＋）からなるリストから選択される１種以上の金属、好ましくはＭｇ２＋を含む、請求項４または２０に記載の製法。
【請求項２３】
前記金属カチオンが、２価カチオンであり、前記２価の金属カチオンとヌクレオチドとの比率は、反応混合物中で約３：１に維持される、請求項４、または請求項２２に記載の製法。
【請求項２４】
前記反応混合物中のヌクレオチドの濃度が、０．００１ｍＭから６ｍＭの間、任意に約３ｍＭに維持される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の製法。
【請求項２５】
前記ヌクレオチドおよび／またはさらなるヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、またはそれらの誘導体もしくは改変型であり、好ましくは、前記ヌクレオチドおよび／またはさらなるヌクレオチドは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびそれらの誘導体の１種またはそれ以上である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチドが、遊離酸、それらの塩またはそれらのキレートの１種以上として提供され、前記塩またはキレートに含まれるものは、任意に以下の金属イオンの１種以上：Ｍｇ２＋、Ｂｅ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｎ２＋またはＺｎ２＋であってよい、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の製法。