【手続補正書】
【提出日】平成30年9月14日(2018.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物のインビボのディスポジションを予測するために、インビトロの培養物及び／又は懸濁液中でこの候補化合物のディスポジションを評価する方法であって、
(a) 細胞の培養物及び／又は懸濁液を提供する段階、
(b) 候補化合物をこの培養物及び／又は懸濁液に曝露する段階、
(c) この培養物及び／又は懸濁液を、インビボの関連する細胞外環境を提供する培地であって、該培地に含まれる成分の濃度が生理学的濃度又は生理的濃度と同様の特性を有する濃度である培地に曝露する段階、
及び
(d) この培養物及び／又は懸濁液に取り込まれた候補化合物の量を決定し、それにより、この候補化合物のディスポジションを評価して、この候補化合物のインビボのディスポジションを予測する段階
から成る方法。
【請求項２】
前記培養物及び／又は懸濁液が、細胞を擬態するように適合した人工膜システムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記「この培養物及び／又は懸濁液に取り込まれた候補化合物の量を決定し、それにより、ディスポジションを評価する段階」が、
(a) 該候補化合物の細胞内濃度を決定する段階、
(b) 肝臓蓄積を決定する段階、
(c) 胆汁排出を決定する段階、及び／又は
(d) 胆汁クリアランスを決定する段階、
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
候補化合物の胆汁排出感受性を検査する方法であって、
(a) 細胞を擬態するように適合した人工膜システム及び少なくとも一つの毛細胆管を含む細胞の培養物及び／又は懸濁液を提供する段階、
(b) 候補化合物をこの細胞の培養物及び／又は懸濁液に曝露する段階、
(c) この細胞の培養物及び／又は懸濁液を、インビボの関連する細胞外環境を提供する培地であって、該培地に含まれる成分の濃度が生理学的濃度又は生理的濃度と同様の特性を有する濃度である培地に曝露する段階、及び
(d) 該少なくとも一つの毛細胆管中の候補化合物の量を決定し、それにより、候補化合物の胆汁排出感受性を検査する段階
から成る方法。
【請求項５】
前記(d)少なくとも一つの毛細胆管中の候補化合物の量を決定する段階が、
(a) 候補化合物と輸送タンパク質のための標識された予め選択された量の基質とを同時に、取り込みを可能にする十分な時間、細胞培養物及び／又は懸濁液に曝露する段階、
(b) 該細胞培養物及び／又は懸濁液を洗浄する段階、及び
(c) 該少なくとも1つの毛細胆管内に存在する標識された基質の量を検出し、該輸送タンパク質による胆汁排出についての候補化合物と標識された基質との間の競合を評価する段階であって、該標識された基質の予め選択された量と比べた該少なくとも一つの毛細胆管中の該標識された基質の減少量の存在が、輸送タンパク質による胆汁中排出に対する候補化合物の感受性を示す、段階
から成る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識された基質が、蛍光発生的化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、比色化合物、放射性標識化合物及びこれらの組み合わせから成る群から選択される化合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの毛細胆管中の候補化合物の量が、前記培養物及び／又は懸濁液の胆汁クリアランス値を計算することによって決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
候補化合物の胆汁排出感受性を検査する方法であって、
(a) 第１及び第２の細胞培養物及び／又は懸濁液を確立する段階であって、該第１及び第２の培養物及び／又は懸濁液がそれぞれ細胞を擬態するように適合された人工膜システム及び少なくとも一つの毛細胆管を含み、該第１の培養物及び／又は懸濁液が無傷の毛細胆管を有し、該第２の培養物及び／又は懸濁液が崩壊した毛細胆管を有する段階、
(b) 候補化合物を、候補化合物の取り込みを可能にする十分な時間、該第１の培養物及び／又は懸濁液並びに該第２の培養物及び／又は懸濁液に曝露する段階、
(c) この第１及び第２の培養物及び／又は懸濁液を、インビボの関連する細胞外環境を提供する培地であって、該培地に含まれる成分の濃度が生理学的濃度又は生理的濃度と同様の特性を有する濃度である培地に曝露する段階、
(d) 該第１及び第２の培養物及び／又は懸濁液を洗浄し、溶解する段階、及び
(e) 段階(d)のそれぞれの培養物及び／又は懸濁液から得られた溶解物中に存在する候補化合物の量を決定し、各培養物及び／又は懸濁液中のこの候補化合物の量を用いて、候補化合物の胆汁排出感受性を評価する段階、
から成る方法。
【請求項９】
下記を含む請求項８に記載の方法。
(i) 候補化合物を、候補化合物の取り込みを可能にする十分な時間（Ｔ）、該第１及び該第２の培養物及び／又は懸濁液に曝露する段階、
(ii) この第１及び第２の培養物及び／又は懸濁液を、インビボの関連する細胞外環境を提供する培地に曝露する段階、
(iii) 該第１及び第２の培養物及び／又は懸濁液の各第１及び第２の画分を洗浄し、溶解する段階、
(iv) 段階(iii)の各第１及び第２の培養物及び／又は懸濁液から得られた溶解物中に存在する候補化合物の量を決定する段階、
(v) 毛細胆管中の量を、無傷の毛細胆管を有する第１の培養物及び／又は懸濁液と、崩壊した毛細胆管を有する第２の培養物及び／又は懸濁液とから得られた２つの溶解物中に存在する候補化合物の量の差として計算する段階、及び
(vi) 段階(iv)で計算された量を用いて、候補化合物の胆汁排出感受性を評価する段階
【請求項１０】
候補化合物のインビボでの効果を予測するためにインビトロの培養物及び／又は懸濁液中の候補化合物の効果を評価する方法であって、
(a) 細胞の培養物及び／又は懸濁液を提供する段階、
(b) 少なくとも一度この培養物及び／又は懸濁液を少なくとも一つの候補化合物に曝露する段階、
(c) この培養物及び／又は懸濁液を、インビボの関連する細胞外環境を提供する培地であって、該培地に含まれる成分の濃度が生理学的濃度又は生理的濃度と同様の特性を有する濃度である培地に曝露する段階、及び
(d) この培養物及び／又は懸濁液を少なくとも一つの候補化合物に曝露した効果を評価して、候補化合物のインビボでの効果を予測する段階
から成る方法。
【請求項１１】
細胞を擬態するように適合した人工膜システム及び少なくとも一つの毛細胆管を含む培養物及び／又は懸濁液を提供する段階、を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記人工膜システムが、支持細胞と共培養液中の細胞を擬態し、該支持細胞が線維芽細胞及び／又はクッパー細胞からなる、請求項８又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記人工膜システムにより擬態される細胞が、小胞、肝細胞、肝臓由来細胞、腎細胞、胃腸細胞、膵臓細胞、心臓細胞、神経細胞、筋細胞、脂肪細胞及び肺細胞から成る群から選択される請求項２、８又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記人工膜システムにより擬態される細胞がひとつの細胞株から成り、任意に、この細胞株が、HepaRG（登録商標）細胞株、Caco-2、Opti-Target（登録商標）細胞株、及びMDCから成る群から選択される、請求項２、８又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記効果が、伝達及び他のタイプの研究（代謝、誘導及び毒性）；代謝物同定及び代謝安定性（親寿命）を含む代謝研究；遺伝子調節（誘導/抑制）；P450及びトランスポーター薬物相互作用；細胞内蓄積及び遊離又は全ての（結合＋遊離）細胞内濃度（例えば、核、ミトコンドリア）；並びに毒物学的効果から成る群から選択される請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養物及び／又は懸濁液が複数の候補化合物に曝露される、又は前記培養物及び／又は懸濁液が一つ又はそれ以上の候補化合物に繰り返し曝露される請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、サル、類人猿、ネコ、イヌ、子ブタ、食用ブタ、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、鶏、魚、アヒル及びガチョウから成る群から選択される供給源から単離される請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養物及び／又は懸濁液が、さらに長期の培養物及び／又は懸濁液を含む請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養物及び／又は懸濁液が、毛細胆管ネットワークを含む請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養物及び／又は懸濁液が、クラスター、凝集体、細胞の少なくとも一つの層、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される構成を有することを特徴とする請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がマトリックス中に埋め込まれている請求項２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養物及び／又は懸濁液が、更にサンドイッチ培養物及び／又は懸濁液を含み、該サンドイッチ培養物及び／又は懸濁液が、細胞の少なくとも１つの層を含み、かつ任意に該細胞の少なくとも１つの層内に少なくとも１種の毛細胆管を含む請求項２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンドイッチ培養物及び／又は懸濁液が、さらに長期のサンドイッチ培養物及び／又は懸濁液を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞の少なくとも１つの層が、マトリックスの２つの層の間に挟まれている請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記マトリックスが、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、支持細胞型の共培養液、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的マトリックス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記成分が、アルブミン；β-リポタンパク質；α-1-酸性糖タンパク質；マウス、ラット、ウサギ、ヒト、サル、類人猿、ネコ、イヌ、子ブタ、食用ブタ、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、鶏、魚、アヒル若しくはガチョウに由来する血漿又は血清；胆汁酸又は胆汁酸の混合物；ビリルビン；及びこれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１、４、８又は１０に記載の方法。
【請求項２８】
マルチウェルプレート中の少なくとも１つのウェル中で行われる請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、同時に複数の候補化合物をスクリーニングする段階を含む請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
生理的濃度のタンパク質を含む培地が、候補化合物の特性を調節する他の化合物を含む請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。