【手続補正書】
【提出日】平成30年6月25日(2018.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、
（ａ）１つまたは複数の細胞表面特徴結合基を有する細胞を、前記１つまたは複数の細胞表面特徴結合基からの１つの細胞表面特徴結合基を前記細胞と結合させるのに十分な条件下でインキュベートすることであって、前記１つまたは複数の細胞表面特徴結合基のうちの各細胞表面特徴結合基が、レポーターオリゴヌクレオチド配列を含むレポーターオリゴヌクレオチドと結合する、ことと、
（ｂ）前記細胞を各々がバーコード配列を含む配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む区分に区分することと、
（ｃ）前記バーコード配列および前記レポーターオリゴヌクレオチドを使用して、（ｉ）前記バーコード配列またはその相補体、および（ｉｉ）前記レポーターオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子を生成することと
と含む、方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数の細胞表面特徴結合基が、１つまたは複数の抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の細胞表面特徴結合基が、１つまたは複数の抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子を配列決定して、前記細胞を特徴づけることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のオリゴヌクレオチドがビーズに結合され、前記区分が前記ビーズをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のオリゴヌクレオチドが、各々が前記バーコード配列を含む少なくとも１００万のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記区分が液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記区分がウェルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ｃ）が前記区分中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記液滴から前記核酸分子を放出することまたは除去することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子を、前記液滴から前記核酸分子を放出することまたは除去することの後の１つまたは複数の反応に供することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の反応は、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の反応は、シーケンサーのフローセルへの付着を可能にするように構成された１つまたは複数の機能配列の添加を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズはゲルビーズである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子を配列決定して、前記バーコード配列またはその相補体および前記レポーターオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を識別することであって、前記オリゴヌクレオチド配列またはその相補体が、前記細胞表面特徴結合基が特異的である細胞表面特徴を識別し、前記バーコード配列またはその相補体が前記細胞を識別する、ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞表面特徴が、細胞表面タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のオリゴヌクレオチドの各々が識別子配列を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドの各々オリゴヌクレオチドの前記識別子配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドの他のオリゴヌクレオチドの識別子配列と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のオリゴヌクレオチドの各々が、前記レポーターオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーターオリゴヌクレオチドの配列に相補的な前記配列は、ポリチミン（ポリＴ）配列であり、前記レポーターオリゴヌクレオチドがポリアデニン（ポリＡ）配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）の生成することが、核酸伸長反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（ｃ）の生成することが、核酸増幅反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（ｃ）の生成することが、逆転写反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｃ）の生成することが、テンプレートスイッチング反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも（ａ）において、前記細胞表面特徴結合基は、前記レポーターオリゴヌクレオチドに共有結合性に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも（ａ）において、前記細胞表面特徴結合基は、前記レポーターオリゴヌクレオチドに非共有結合性に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも（ａ）において、前記レポーターオリゴヌクレオチドは、前記細胞表面特徴結合基が共有結合性に付着するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記バーコード配列を含む前記配列は、前記ビーズから放出可能である、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
前記バーコード配列を含む前記配列は、ジスルフィド結合を介して前記ビーズに付着する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記バーコード配列を含む前記配列は、化学刺激への暴露に際して、前記ビーズから放出可能である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
（ｃ）の前に、前記ビーズから、前記バーコード配列を含む前記配列を放出することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面（本明細書の「Ｆｉｇｕｒｅ（図面）」及び「ＦＩＧ．」）を参照することによって、本発明の特徴及び利点がより良く理解されることになる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞から核酸を分析する方法であって、
（ａ）個々の細胞に由来する核酸を離散区分に提供することと、
（ｂ）前記離散区分内の前記核酸に由来する１つまたは複数の第１の核酸配列であって、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを結合させている前記１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することと、
（ｃ）前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第１の核酸配列に由来する１つもしくは複数の第２の核酸配列であって、共通のバーコード配列を含む前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の特徴付けを行うことと、
（ｄ）（ｃ）で行われた前記特徴付けにおける前記共通の核酸バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記個々の細胞に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を識別することと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記離散区分が離散液滴である、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドが、前記個々の細胞に由来する前記核酸と前記離散区分に共に区分される、項目１に記載の方法。
（項目４）
（ａ）において、少なくとも１０，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目３に記載の方法。
（項目５）
（ａ）において、少なくとも１００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目４に記載の方法。
（項目６）
（ａ）において、少なくとも５００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドがビーズに付着されて提供され、ビーズ上の各オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、前記ビーズが前記離散区分に前記個々の細胞と共に区分される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチドが前記ビーズに放出可能に付着している、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ビーズが分解性ビーズを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
（ｂ）の前または最中に、前記ビーズの分解を介して前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを放出することをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
（ｃ）の前に、前記離散区分から前記１つまたは複数の第１の核酸配列を放出することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
（ｃ）が、前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列を配列決定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列から、前記個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の連続核酸配列をアセンブルすることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記個々の細胞が、前記個々の細胞の前記ゲノムの少なくとも一部の前記核酸配列に基づいて特徴付けされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸が、前記離散区分内の前記個々の細胞から放出される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
（b）が、前記1つまたは複数の第1の核酸配列をもたらす条件下で前記核酸を逆転写させることをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記逆転写が前記離散区分で生じる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に提供され、かつポリＴ配列をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記逆転写が、前記ポリＴ配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記ポリＴ配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記オリゴヌクレオチドが、前記ポリＴ配列のハイブリダイゼーションを促進するアンカー配列をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記オリゴヌクレオチドが、ランダムプライミング配列をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ランダムプライミング配列がランダム六量体である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記逆転写が、前記ランダムプライミング配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記ランダムプライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記1つまたは複数の第１の核酸配列のうちの所与の１つが、前記核酸の所与の１つの少なくとも一部に対する配列相補性を有する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記離散区分が、複数の細胞の中で、最大でも前記個々の細胞のみを含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記オリゴヌクレオチドが、固有の分子配列セグメントをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記固有の分子配列セグメントの存在に少なくとも部分的に基づいて、前記核酸の所与の核酸に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列、または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の個々の核酸配列を識別することをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記固有の分子配列セグメントの存在に基づいて前記所与の核酸の量を決定することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の配列を生成するために、１つまたは複数の追加配列を前記１つまたは複数の第１の配列に追加することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
スイッチオリゴヌクレオチドを用いて、第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核酸配列に追加することをさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記スイッチオリゴヌクレオチドが、前記１つまたは複数の第１の核酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズさせ、前記第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させるためにテンプレート指向様式で伸長する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の追加核酸配列に結合する前記より多くの第１の核酸配列のうちの１つを増幅させることをさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記増幅が前記離散区分で生じる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記増幅が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列を前記離散区分から放出した後に生じる、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記増幅後に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記第１の追加配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは複数の第２の追加核酸配列を追加することをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記１つまたは複数の第２の追加配列の追加が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数の第１の核酸配列に前記１つまたは複数の第２の追加核酸配列を結合させることと、を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記除去が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列の剪断によって完了する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記結合が連結によって完了する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＲＮＡ断片を生成するために、前記１つまたは複数の第１の核酸配列を転写させることをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目４２）
前記転写が、離散区分からの前記1つまたは複数の第１の核酸配列の放出後に生じる、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記オリゴヌクレオチドが、Ｔ７プロモーター配列をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列に追加配列を結合させることと、をさらに含む、項目
４３に記載の方法。
（項目４５）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記追加配列に結合する前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＤＮＡ配列を生成するために、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列に１つまたは複数の追加配列を結合させることと、をさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記核酸が、前記個々の細胞からのＲＮＡの逆転写から生成された相補的（ｃＤＮＡ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目５１）
前記オリゴヌクレオチドがプライミング配列をさらに含む、離散区分に提供される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記プライミング配列が、ランダムＮ量体を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
（ｂ）が、前記ライミング配列を前記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせることと、前記プライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記離散区分が、前記オリゴヌクレオチドの相補配列を含むスイッチオリゴヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）
（ｂ）が、前記スイッチオリゴヌクレオチドを前記核酸由来の核酸断片の少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記スイッチオリゴヌクレオチドをテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記１つまたは複数の第１の核酸配列が前記核酸由来の核酸断片である、項目１に記載の方法。
（項目５８）
前記（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に結合させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５９）
前記結合させることが連結させることを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
複数の区分が離散区分を含む、項目１に記載の方法。
（項目６１）
前記複数の区分が、１つの区分あたり平均１つ未満の細胞を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記複数の区分の２５％未満の区分が細胞を含まない、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記複数の区分が、それぞれ少なくとも１つの区分された細胞を有する離散区分を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記離散区分の２５％未満が複数の細胞を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも離散区分のサブセットがビーズを含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記離散区分の少なくとも７５％が、少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記離散区分が、区分された核酸バーコード配列をさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６８）
前記離散区分が、少なくとも１，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記離散区分が、少なくとも１０，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記離散区分が、少なくとも１００，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記複数の区分が、少なくとも１，０００の区分を含む、項目６０に記載の方法。
（項目７２）
前記複数の区分が少なくとも１０，０００の区分を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記複数の区分が、少なくとも１００，０００の区分を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
複数の異なる細胞タイプの集団における細胞を特徴付ける方法であって、
（ａ）前記集団内の個々の細胞からの核酸を離散区分へ提供することと、
（ｂ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記離散区分であって、複数の異なる区分が異なる共通の核酸バーコード配列を含む、前記離散区分内の個々の細胞からの前記核酸の１つまたは複数の断片に結合させることと、
（ｃ）前記複数の離散区分からの前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けて、共通バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記１つまたは複数の断片を個々の細胞に帰属させることと、
（ｄ）前記複数の離散区分における前記１つまたは複数の断片の前記特徴付けに基づいて、前記集団内の複数の個々の細胞を特徴付けることと、を含む、前記方法。
（項目７５）
前記核酸を断片化することをさらに含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記離散区分が液滴である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けることが、前記個々の細胞からのリボソームデオキシリボ核酸を配列決定することを含み、前記個々の細胞を特徴付けることが、細胞の属、種、株または変異体を識別することを含む、項目７４に記載の方法。
（項目７８）
前記個々の細胞がマイクロバイオームサンプルに由来する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記個々の細胞がヒト組織サンプルに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８０）
前記個々の細胞が哺乳類の循環細胞に由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８１）
前記個々の細胞が法医学的サンプルに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８２）
前記核酸が、前記離散区分の前記個々の細胞から放出される、項目７４に記載の方法。
（項目８３）
個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプであって、各異なる細胞表面結合基タイプは異なる細胞表面特徴に結合することができ、かつ存在する場合は、１つまたは複数の細胞表面特徴結合基とその細胞表面特徴それぞれとの間の結合を可能にする条件下で、それに結合したレポーターオリゴヌクレオチドを含む、前記複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプを有する細胞をインキュベートすることと、
（ｂ）前記細胞を、バーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む区分に区分することと、
（ｃ）前記バーコード配列を前記区分に存在するオリゴヌクレオチドレポーター基に結合させることと、
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドレポーター基及び結合したバーコードを配列決定することと、
（ｅ）配列決定されたレポーターオリゴヌクレオチドに基づいて前記細胞上に存在する細胞表面特徴を特徴付けることと、を含む方法。
（項目８４）
複数の区分を含む組成物であって、前記複数の区分のそれぞれが、（ｉ）個々の細胞、及び（ｉｉ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物。
（項目８５）
前記複数の区分がエマルジョン中の液滴を含む、項目８４に記載の組成物。
（項目８６）
前記複数の区分のそれぞれの中の前記オリゴヌクレオチドの集団が、前記複数の区分のそれぞれの中に配置されたビーズに結合される、項目８４に記載の組成物。
（項目８７）
前記個々の細胞には、それらのそれぞれの細胞表面特徴に関連する複数の異なる細胞表面特徴結合基が結合しており、各異なるタイプの細胞表面特徴結合基は、異なるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドレポーター基を含む、項目８４に記載の組成物。
（項目８８）
前記複数の異なる細胞表面特徴結合基が、複数の異なる細胞表面特徴に対して結合親和性を有する複数の異なる抗体または抗体断片を含む、項目８７に記載の組成物。