【手続補正書】
【提出日】平成30年6月27日(2018.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【図１】図１は、例示的なベーシックブレッドボードプロセスの概略図を提供する。図１のＡは、１，４ブタンジオールを産生するための生体分子の「事象検出」および経路を含む、設計・実行された回路のタイプを示す。図１のＢは、ブレッドボード主成分がＴＸ−ＴＬ抽出システムであることを示す。また、詳細なモデリングツールボックスが回路および経路のシミュレーションおよび分析のために使用可能である。図１のＣ〜Ｄは、液滴に基づくミクロ流体システムおよび連続的なフローリアクター（EPFLとともに開発）の使用を示す。回路は、大腸菌に形質転換され得る（図１のＥ）。
【図２】図２は、ＴＸ−ＴＬ無細胞システムを用いた転写および翻訳プロセスを示す。
【図３】図３の（ａ）は、遺伝学的トグルスイッチ遺伝子回路レイアウトを示す。ＴｅｔＲはＰＬｔｅｔＯ−１を抑制するが、ＴｅｔＲ’の働きは、インデューサーａＴｃにより阻害され、ＬａｃＩはＰｔｒｃ−２の働きを抑制するが、ＬａｃＩの働きは、インデューサーＩＰＴＧにより阻害される。図３の（ｂ）は、抑制遺伝子回路レイアウトを示す。ＴｅｔＲはλcIの発現を抑制し、同様にＬａｃＩ発現を抑制する。最後に、ＬａｃＩはＴｅｔＲの発現を抑制し、抑制サイクルが完成する。
【図４】図４は、８つのタイプのフィードフォワードループ（ＦＦＬ）を示す。転写調節因子Ｘは、転写調節因子Ｙを調節し、両方が共にＺを調節する。普通の矢印は、２つのノード間の相互作用が活性化していることを示す。頭の部分がフラットな矢印は、２つのノード間の相互作用が抑制されていることを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、例示的な非干渉性フィードフォワードループを示す。Ａ、Ｂ、Ｃとラベルされたボックスは、遺伝学的分子成分であり、それぞれが翻訳または転写ユニットを表す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５のＡの非干渉性フィードフォワードループから生じたパルス状の波形を示す。
【図６】図６は、例示的な生体分子回路のプロトタイピングおよびデバッグの基本的な「ワークフロー」を描く概略図を示す。全体のワークフローは、「設計、構築、試験」（ＤＢＴサイクル）として言及され、それは、モデル、無細胞発現システム、インビボ回路の組み合わせを用いるＤＢＴサイクルを実行する方法を含む。
【図７】図７は、フローチャートとして示される、例示的な生体分子回路のプロトタイピングおよびデバッグの基本的な「ワークフロー」を描く概略図を示す。インビトロおよびインビボでの実験の結果は、モデルにより予測された結果と比較される。これらのステップは、エレメントがマッチしない場合には、繰り返される。
【図８】図８は、インビボで採取された一実施形態において、ＯＤにより正規化されたレポータータンパク質ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡにより示される、ＧＦＰシグナルの時間発展をプロットする。各プロットされた種は、プラスミド３６０およびｐＬａｓ変異体レポータープラスミドの組み合わせである。
【図９Ａ】図９のＡは、例示的なオープンループバージョンの例示的なフィードフォワードループを示し、２つのノード、ｐＬａｃＯ１−ＵＴＲ１−ｌａｓＲおよびｐＬａｓ−変異体−ＵＴＲ１−ｄｅＧＦＰを含む。各ｌａｓＲプロモーター変異体は、３ＯＣ１２ＨＳＬを変更することによるＴＸ−ＴＬで試験される。各プロットで示されるのは、独立した３つの実験の平均である。図９のＢからＦは、各ｐＬａｓ変異体のｐＬａｓ変異体（５つのプロモーター：Ｐ＿ｏｒｉｇ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４）についての時間の関数として、各パネルのｄｅＧＦＰ量を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂでは、文献からのこれまでのレポーターである、ｐＲｓａＬ（Ｐ０、またはＰ＿ｏｒｉｇ）が試験された。
【図９Ｃ】図９Ｃでは、−１０領域（Ｐ１）で変異を有するｐＬａｓＩが試験される。
【図９Ｄ】図９Ｄでは、ｐＬａｓＩ野生型（Ｐ２）が試験された。
【図９Ｅ】図９Ｅでは、ｐＬａｓＢ野生型（Ｐ３）が試験された。
【図９Ｆ】図９Ｆでは、拡張された領域を有するｐＲｓａＬ（Ｐ４）が試験された。
【図９Ｇ】図９Ｇは、関連するプロモーターの特徴についての最も適合される値を示す。データは、３ＯＣ１２ＨＳＬを変化されるために、ＴＸ−ＴＬｐｅｒプロモーター時間＝３００分でのエンドポイントの値から得て、各実験は、新たに調製されたＤＮＡ源で３回行われる。
【図９Ｈ】図９Ｈは、一実施形態における各ｐＬａｓ変異体についての３ＯＣ１２ＨＳＬ濃度の関数として、ｄｅＧＦＰ量をプロットする。本実施形態で試験される回路は、変化したｄｅＧＦＰを産生するｌａｓＲ−活性化プロモーターとともに、１ｎＭｐＬａｃ−ｌａｓＲプラスミドおよび１ｎＭプラスミドで構成される。３つの独立した実験からｔ＝３００分からのエンドポイントが図９Ｈに示される。
【図９Ｉ】図９Ｉは、各プロモーターについての最小のシグナルに対して最大のシグナルを比較し、各プロモーターについてのフォールドチェンジダイナミックレンジを決定する。
【図１０】図１０は、インビトロ（左）およびインビボ（右）についてのヒートマップを示す。インビトロのセクションについては、各横列はｐＬａｓ変異体(つまりプロモーター）に対応し、各縦列は異なる抽出（Ａ〜Ｋ）に対応する。ｔ＝１８０分でのプロモーターＶｍａｘの値は、ことなる抽出にわたって使用される。抽出は、図９、１２、１４、１５、１６、３８、３９、４１、４３、４４、５４について使用される主要な抽出である。抽出ＡおよびＤは、ＥｘｐｒｅｓｓＩＱの種であり、Ｂ〜ＣおよびＥ〜Ｉは、ＢＬ２１Ｒｏｓｅｔｔａ２であり、ＪはＭＧＺ１種であり、およびＫはＪＳ００６種である。インビボのセクションについては、データの一次導関数、例えば、ｄＧＦＰ／ｄＯＤは、図８から取られ、それぞれの最大値はヒートマップ上にプロットされる。濃いグレーは相対的な発現が１であり、白は相対的な発現が０である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、３つの遺伝学的分子成分を有する例示的な非干渉性フィードフォワードループのモチーフ（ＩＦＦＬ）を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、一実施形態における、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時の正規化されたＧＦＰシグナルを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時のＧＦＰシグナルを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時のＯＤシグナルを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＵＴＲ１  ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ（横列）およびＵＴＲ１  ＴｅｔＲ（縦列）の場合についてトレースされたサンプルデータを示す。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ（横列）およびＢ００３４  ＴｅｔＲ（縦列）の場合についてトレースされたサンプルデータを示す。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＢＣＤ２４  ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ（横列）およびＵＴＲ１  ＴｅｔＲ（縦列）の場合についてトレースされたサンプルデータを示す。
【図１２Ａ】図１２のＡおよびＢは、インビトロおよびインビボでの例示的なフィードフォワードループの例示的な翻訳の変化を示し、リプレッサー成分およびレポーター成分は、ＲＢＳにより変化する。インビトロでは、ｌａｓＲ、ＴｅｔＲ、およびｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡは、２：１：８の割合で発現される。インビトロでは、それらはｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１＊、およびｃｏｌＥ１プラスミドの上に置かれ、２：１：８の割合でみられる。点線は、［１］で開発された予測バイシストロニックアレンジメントを用いてＲＢＳのアウトラインを描く。
【図１２Ｂ】インビボについてのデータは、ピークパルス（またはオープンループについて１６時間後のエンドポイントの発現）としてとられ、インビトロについてのデータは、６時間後のエンドポイントの発現として取られた。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、インビトロ（左）およびインビボ（右）からのＴｅｔＲ発現（Ｂ００３４）の１つの縦列を示す。各縦列は、ＲＢＳ配列を変化させた１６のｄｅＧＦＰ変異体を含む。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、インビトロ（上）およびインビボ（下）からのｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ（ＵＴＲ１）の１つの横列を示す。各横列は、ＲＢＳ配列を変化させた１６のＴｅｔＲ変異体を含む。
【図１３】図１３は、２つの種からのインビボでの相対的なコピー数を定量するための定量的ＰＣＲを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、１つのインビトロでの実施形態における、ａＴｃ１０ｕＭレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時の正規化されたＧＦＰシグナルを示す。各サブパネルは、異なる種を表し、Ｙ軸は相対的な蛍光ユニット（ｒｆｕ）、Ｘ軸は分での時間を示す。ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡプラスミドに対応するＲＢＳは、各横列の左側に示され、ＴｅｔＲプラスミドに対応するＲＢＳは、各縦列の上に示される。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、１０ｕＭのａＴｃで、ＵＴＲ１  ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡおよびＵＴＲ１  ＴｅｔＲの場合についてのサンプルデータのトレースを示す。
【図１５】図１５は、一実施形態において、インビトロでの（左）およびインビボ（右）でのａＴｃの変化を示す。インビトロのプロットは、ａＴｃ量（Ｘ軸）の関数として、ｄｅＧＦＰの発現（Ｙ軸）を示す。インビボのプロットは、ａＴｃ量を変化させた１６ｘ１６ＧＦＰ格子データを示す（左から右に：１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ）。濃いグレーはパルスなし、明るいグレーはパルスを示す。
【図１６】図１６は、一実施形態におけるインビトロ（左下）およびインビボ（右）でのｌａｓＲ変化の効果を示す。左は、ｌａｓＲ  ＤＮＡ濃度（Ｘ軸）を変化させた場合のエンドポイントのｄｅＧＦＰ発現（Ｙ軸）を示し、図面におけるインサートは、異なる量のｌａｓＲ  ＤＮＡ濃度についての時間（Ｙ軸）とｄｅＧＦＰシグナル（Ｘ軸）を示す。右側は、ｌａｓＲを発現する高発現のＲＢＳの１つ（ＢＣＤ２、左）と、ｌａｓＲを発現する中程度に発現するＲＢＳの１つ（ＢＣＤ２０、右）と、ｌａｓＲを発現する低発現のＲＢＳの１つ（ＢＣＤ２２、下）との３セットの種からのインビボの結果を示す。図の一部となっている種の各グラフでは、ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡを発現するプラスミドについてのＲＢＳが横列で配置され、ＴｅｔＲを発現するプラスミドについてのＲＢＳが縦列で配置され、各グラフは時間（Ｘ軸）およびＧＦＰ／ＯＤ（ｒｆｕ）（Ｙ軸）を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、プラスミド３６０（ＰｌａｃＯ１＿ＢＣＤ２２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００）（配列番号１）についての配列表を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、利用プロモーター「ＰＯｒｉｇ＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４２８（ＰＲｓａＬ−ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号２）についての配列表を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、利用プロモーター「Ｐ１＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド３４７（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿−１０−ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号３）についての配列表を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、利用プロモーター「Ｐ２＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４２９（ＰＬａｓＩ−ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号４）についての配列表を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、利用プロモーター「Ｐ３＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４３０（ＰＬａｓＢ−ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号５）についての配列表を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、利用プロモーター「Ｐ４＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４３１（ＰＲａｓＬ  ｌｏｎｇ（ｌａｓ）−ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号６）についての配列表を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、利用プロモーター「Ｐｏｒｉｇ」のプラスミド１６５  （ＰＲｓａＬ＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号７）についての配列表を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、利用プロモーター「Ｐ１」のプラスミド１９６（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿−１０＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号８）についての配列表を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、利用プロモーター「Ｐ２」のプラスミド１９７（ＰＬａｓＩ−＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号９）についての配列表を示す。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、利用プロモーター「Ｐ３」のプラスミド１９８（ＰＬａｓＢ−＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号１０）についての配列表を示す。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、利用プロモーター「Ｐ４」のプラスミド１９９（ＰＲａｓＬ  ｌｏｎｇ（ｌａｓ）−＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号１１）についての配列表を示す。
【図１８Ｆ】図１８Ｆは、プラスミド１６３（ｐＬａｃＯ１−ＵＴＲ１−ｌａｓＲ）（配列番号１２）についての配列表を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡをコードする遺伝子（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿−１０＿ｔｅｔＯ１（Ｐ１＿ｔｅｔＯ１）−（ｂｌａｎｋ）−ｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡ−Ｂ１００２）（配列番号１３）を運ぶ、プラスミドの共有骨格配列の配列表を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、図１９Ａおよび図１９Ｂで示されるプラスミド骨格配列に装入される１６の変異体ＲＢＳ配列（配列番号１４〜２９）の一覧である。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＴｅｔＲ（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿−１０（Ｐ１）−（ｂｌａｎｋ）−ＴｅｔＲ−Ｔ５００）（配列番号３０）を運ぶ、プラスミドの共有骨格配列の配列表を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、プラスミド３７３：Ｐｌａｃ＿ＢＣＤ２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００（配列番号３１）についての配列表を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、プラスミド３７４：Ｐｌａｃ＿ＢＣＤ２２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００（配列番号３２）についての配列表を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、実施例３３〜４０で使用される直鎖ＤＮＡ構成物を表に要約する。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、実施例３３〜４０で使用されるプラスミドを表に要約する。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、実施例３３〜４０で使用されるプラスミドを表に要約する。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、実施例３３〜４０で使用される種を表に要約する。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、実施例３３〜４０で使用されるＤＮＡ濃度の一覧である。
【図２１Ｆ】図２１Ｆは、実施例３３〜４０で使用されるＤＮＡ濃度の一覧である。
【図２２】図２２は、無細胞リプレッシレーターの特徴づけを説明する。図２２のＡは、ＣＩリプレッサーの結合部位の１つに位置するＣＩプロモーター(ＯＲ２＊)での点変異を有する変更されたバージョンおよびオリジナルのリプレッシレーターを特徴づける無細胞システムの実施形態を示す。図２２のＢは、希釈時間を異ならせて、リプレッシレーターおよびＯＲ２＊バージョンの３つのプロモーターからの発現を示す。図２２のＣは、希釈時間の関数として、リプレッシレーターのオシレーション期間を示す。ＯＲ２＊バージョンでは、オリジナルのリプレッシレーターネットワークと比較して、狭い範囲の希釈時間で持続したオシレーションが維持される。図２２のＤは、異なる初期ＴｅｔＲおよびＣＩリプレッサー濃度から開始するリプレッシレーターオシレーションの位相ポートレートを示す。
【図２３】図２３は、ネガティブフィードバック回路の特徴づけおよび無細胞プロトタイピングを説明する。図２３のＡは、リプレッシレーターリプレッサー‐プロモーターのペア（上）およびＴｅｔＲ相同体（下）の伝達関数を示す。ＴｅｔＲリプレッサーは、２つの異なるプロモーター：リプレッシレーターで使用されるプロモーター（上のパネル）およびＪ２３１１９−ＴｅｔＲプロモータ［２］（下のパネル）に対して試験される。ラインはヒル機能適合である。図２３のＢは、プラスミドＤＮＡで構成された新規な３−ノードリングオシレータ（３ｎ１）のオシレーションを示す。図２３のＣは、直鎖ＤＮＡ上の２つのバージョンの第２のノードリングオシレータ（３ｎ２）が、オシレータ機能でのＣｌｐＸＰ分解の効果を実験するために使用されたことを示す。１つのバージョンは、全てのリプレッサー遺伝子でｓｓｒＡがタグされたものであり、他のバージョンは、リプレッサーで分解タグが運ばれなかった。中程度の強さの分解タグを有する同じレポーターが両方のバージョンで使用された。図２３のＤは、直鎖ＤＮＡ上の４−ノードサイクリックネガティブフィードバックネットワーク初期条件に依存する２つの安定した定常の状態を有することを示す。ＩＰＴＧは、ｐＰｈｌＦがオンであり、ｐＴｅｔＲがオフである状態へとネットワークを切り替えた。ａＴｃの初期パルスは、安定した定常の状態とは逆の状態をもたらした。図２３のＥは、直鎖ＤＮＡで構成される２つの新規な５−ノードリングオシレータ（５ｎ１、５ｎ２）を示す。図２３のＦは、シミュレーションにより予測され、実験データに示されるように、５−ノードリングオシレータが３−ノードリングオシレータよりも長い期間振動することを示す。
【図２４】図２４は、例示的な無細胞フレームワークを用いる５−ノードネガティブフィードバックオシレータのエンジニアリングの例示的な実施形態を示す。コンピュータを用いて意図された挙動を示す新規なネットワーク構造は、インビトロで特徴づけられた部分を用いて直鎖ＤＮＡでまずは組み立てられる。直鎖ＤＮＡで試験する初期回路は、i）数時間で直鎖ＤＮＡを合成することができ、ii)複数の回路変異体の迅速な試験を可能にし、iii）それらの相対的濃度を変化させることにより、ネットワーク成分の発現強度を容易に調整することができるため有利である。機能回路は、所望の挙動を維持するパラメータの範囲を特定するために、仮説を実験的に試験するために、さらにその後特徴づけられる。インビボでの実行が意図される場合、インビボでの実行前に、クローンプラスミドのインビトロでの正しい機能が評価される。
【図２５Ａ】図２５Ａは、一実施形態における、希釈時間および合成率に関して、３−ノードリプレッシレーターネットワークについてのオシレーションパラメータの状態を示す。転写（ＴＸ）および翻訳（ＴＬ）率は、３−ノードリプレッシレーターネットワークについての異なる希釈時間でオシレーションを維持する。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、希釈時間に関し、３−ノードリプレッシレーターネットワークについてのオシレーションの存在および期間を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、希釈時間およびリプレッサー結合親和性に関する３−ノードリプレッシレーターネットワークについてのオシレーションパラメータ状態を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、一実施形態における、リプレッサーの伝達関数の測定を示す。プロモーターのペアは、無細胞フレームワークを用いて測定される。示されるのは、例としてＬａｃＩ‐pＬａｃＩ(r)を用いる分析および実験結果である。伝達関数は、総Ｃｅｒｕｌｅａｎ濃度に対して、最も高いリプレッサー濃度から最も低いリプレッサー濃度まで（グレーにシェーディングされたエリア）のＣｉｔｒｉｎｅ合成率をプロットすることにより得られ、ナノリアクターアレンジメントでセットされた異なる希釈時間については同じであった。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、一実施形態におけるインビトロおよびインビボでの相対的なプロモーター強度の比較を示す。相対的プロモーター強度（Ｖｍａｘ）の比較をインビトロおよびインビボで測定した。ｐＣＩ（ｒ）、ｐＴｅｔＲ（ｒ）、およびｐＬａｃＩ（ｒ）は［３］由来であり、ｐＴｅｔＲは［２］由来であり、ｐＬａｃＩは［４］由来である。エラーバーは、３つの複製の標準偏差を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、一実施形態における、インビトロおよびインビボでの抑制のために必要とされる最大半量のリプレッサー濃度の比較を示す。ＫＭ値とともに本研究においてインビトロで測定されたＫＭ値の比較がＳｔａｎｔｏｎらの［２］によりインビボで測定された。ＫＭ値は、ＴｅｔＲのＫＭに対して正規化された。
【図２７】図２７のＡ〜Ｆは、一実施形態における、細胞での新規な３−ノードおよび５−ノードリングオシレータを示す。図２７のＡは、大腸菌（マザーマシン）で動いている３−ノードリングオシレータの時系列のトレースを示す。強いｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーターおよびオシレーションの「オン」および「オフ」からの代表的な画像を用いて、インビボで３６時間、３ｎ１および３ｎ２のシングルトラップのトレースを観察した。スケールバーは５μｍである。図２７のＢは、大腸菌（マザーマシン）において動く５−ノードリングオシレータの時系列のトレースを示す。弱ｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡ  レポーターを用いてインビボで７２時間、５ｎ１および５ｎ２のシングルトラップのトレースを観察した。図２７のＣは、インビボで、母集団が広いオシレーションパルスを示す（ＣｅｌｌＡＳＩＣ）。１６０分ごとの強３ｎ１のｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡ  レポーターの時系列の顕微鏡写真であり、挿入図は、初期のミクロコロニーの個々の細胞を示す。スケールバーは１０μｍおよび５μｍ（挿入図）。図２７のＤは、インビボでの期間と分裂時間との関係を示す。左は、インビボでの強いｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーター下での３ｎ１である。インビトロでのデータは比較のために示される。ＣｅｌｌＡＳＩＣの実験からの期間および分裂時間に対応するインビボデータでの各ポイントは、異なる媒体タイプおよび流量下で動く。右は、弱いｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーター下での５ｎ２である。インビボの期間は、マザーマシン実験での２９℃および２１℃の増殖温度で測定された。ボックスは、メジアンで内側４分位の範囲を示す。図２７Ｅは、ＣｌｐＸＰ分解について競うことによる、オシレーション期間でのレポーター濃度の影響を示す。左は、一定量のＣｌｐＸＰで、レポーター濃度がリプレッサー分解、つまりオシレーション期間に影響を及ぼす。マザーマシンでランした３ｎ１および５ｎ２の両方について、弱いおよび強いｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーターが観察される期間のヒストグラム。点線はメジアンを示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、一実施形態における、インビボでの３−ノードおよび５−ノードオシレータの強いオシレーションを示す。３−ノード(上)および５−ノードネットワーク(下)は、インビボで、ネットワークサイズに応じた期間で振動する。示されるのは、点線で示されるメジアンと観察される期間の長さの分布である。３−ノードおよび５−ノードネットワークの両方が、３−ノードネットワークについての全ての増殖細胞のオシレーションおよび５−ノードネットワークについての９５％以上の増殖細胞のオシレーションを伴う強いオシレーションを示した（トレースあたり少なくとも２つの別個のオシレーションピークで定義される）。３−ノードネットワークはともに、ｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーターを用いて分析され、２つの５−ノードネットワークは、弱いｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーターを用いて分析された。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、一実施形態における、インビボでの、母集団レベルの３ｎ２オシレータを示す。３ｎ２オシレータは、ＣｅｌｌＡＳＩＣミクロ流体アレンジメントにおいて、強いｐＰｈｌＦ  ｓｆＧＦＰ−ｓｓｒＡレポーターのもとで、３ｎ２が動かされる。スケールバーは１０μｍである。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、一実施形態における、インビボでの３ｎ２オシレータの母集団レベルのオシレーションおよび３カラーのオシレーションを示す。３ｎ２は、同時に３つのレポーターを観察する位相同調性を示す。レポーターは、強いｐＰｈｌＦ  Ｃｉｔｒｉｎｅ−ｓｓｒＡ、ｐＴｅｔＲ  ｍＣｈｅｒｒｙ−ｓｓｒＡ、およびｐＳｒｐＲ  Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ｓｓｒＡである。示されるのは、１つのオシレーションサイクルである。スケールバーは１０μｍである。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、オリジナルのリプレッシレーターを示し、ＯＲ２＊変異リプレッシレーターは母集団レベルのオシレーションを示さない。オリジナルのリプレッシレーターとＯＲ２＊変異リプレッシレーターとは、位相同調性を示さない。これらはＭ９最少培地で、ｐＴｅｔＲ（ｒ）−ｅＧＦＰ（ＡＳＶ）下で動く。オシレーションは、ＬＢでは維持されない。スケールバーは１０μｍである。
【図２９】図２９のａ）およびｂ）は、一実施形態における、遺伝子回路の迅速なプロトタイピング手順の概要を説明する。図２９のａ）は、回路の従来の試験を示し、パーツは単一のプラスミドまたは相補的なプラスミドのセットでクローニングされ、インビボで試験され、構成へとサイクルで戻る。図２９のｂ）は、迅速なプロトタイピング手順を示し、回路は直鎖ＤＮＡ上の構成間でサイクルされ、ＴＸ−ＴＬで試験する。最終的な回路のプロトタイプが完成すると、プラスミドＤＮＡ構成およびインビボでの回路の実行の１つのサイクルのみが生じる。
【図３０】図３０のａ）〜ｄ）は、一実施形態における、直鎖ＤＮＡを保護することにおけるｇａｍＳの活性を示す。図３０のａ）は、プラスミドＤＮＡ、ｇａｍＳ保護のない直鎖ＤＮＡ、ｇａｍＳ保護のある直鎖ＤＮＡについてのｄｅＧＦＰの時系列の蛍光の比較を示す。使用されるプラスミドＤＮＡはｐＢＥＳＴ−ＯＲ２−ＯＲ１−Ｐｒ−ＵＴＲ１−ｄｅＧＦＰ−Ｔ５００であり、直鎖ＤＮＡは立体保護の末端がない８１０ｂｐのＰＣＲ産物であり、それぞれは１６ｎＭで供給される。図３０のｂ）は、天然のまま抽出したタンパクの前もってのインキュベーションを行わず、ｇａｍＳの作用濃度を異ならせるために、シグナルに対してプロットされた２ｎＭの直鎖ＤＮＡの８時間後のエンドポイントＧＦＰ発現を示す。図３０のｃ）は、ＤＮＡ濃度を増加させて、ｇａｍＳタンパクありまたはなしでプラスミドおよび直鎖ＤＮＡからのエンドポイントｄｅＧＦＰ発現を示す。プラスミドＤＮＡの０．９８の相関性は０ｎＭ〜４ｎＭの値のみについてであり、直鎖ＤＮＡの０．９９の相関性は０ｎＭ〜１６ｎＭについてである。図３０のｄ）は、テンプレートの末端で非コードＤＮＡの異なる量を用いる２ｎＭの直鎖ＤＮＡの保護を示す。
【図３１】図３１のａ）〜ｃ）は、一実施形態における、迅速な組み立て概念の方法およびＰＣＲにより作成したもの対迅速に作成した直鎖ＤＮＡを比較する結果を説明する。図３１のａ）は、迅速な組み立ての概要およびプロトタイピング手順を示し、ＤＮＡパーツはプラスミドを作成するゴールデンジーンアッセンブリ（ＧＧＡ）を用いて組み立て、ＴＸ−ＴＬに適する高濃度で直鎖ＤＮＡを作成するために、その後、ＰＣＲテンプレートとして直接使用される。同時に、組み立て産物が、クローンプラスミドのより多くのコピーを産生するために、インビボで増殖させることもできる。図３１のｂ）は、５つのスタンダードなピースである６６ｂｐ、１０３ｂｐ、１１０ｂｐ、７０７ｂｐ、および２３７６ｂｐから組み立てられた遺伝子のアガロースゲルからの結果を示す。示されるのは、５０ｎｇのそれぞれの開始フラグメント（６６ｂｐを除く）、エキソヌクレアーゼ消化前後の組み立て後のフラグメント（「ｅｘｏ」）、およびクローン後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）と比較される迅速な組み立てＰＣＲ産物（「ＲＡＰ」）である。矢印は、８９２ｂｐと予測されるサイズを示す。図３１のｃ）は、０．５ｍＭのＩＰＴＧインデューサーありまたはなしで、４ｎＭの迅速な組み立てまたはクローン後産物の機能的な試験を示す。実験は、２ｎＭのＰｌ−ｔｅｔＯ１−ＬａｃＩ直鎖ＤＮＡの存在下で行った。直鎖ＤＮＡは、ｇａｍＳおよび３１ｂｐの立体保護で保護される。エラーバーは、３つの独立した実験からの１標準偏差を示す。
【図３２】図３２のａ）は、一実施形態における、標準的なピースから組み立てられた、４つのピースのネガティブフィードバック遺伝子を示す。図３２のｂ）は、アイソサーマルアッセンブリ（「ＲＡＰ−ｉｓｏ」）により作成された迅速な組み立て産物、ゴールデンジーンアッセンブリ（「ＲＡＰ−ＧＧＡ」）により作成される迅速な組み立て産物、およびクローン後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）のアガロースゲル電気泳動による比較を示す。矢印は、期待されるバンドを示す。直鎖ＤＮＡは、ｇａｍＳで、および２５０ｂｐの立体保護で保護される。図３２のｃ）は、１０μＭのａＴｃありまたはなしでクローン後のＰＣＲ産物と比較される６ｎＭの迅速な組み立て産物の機能的な試験を示す。
【図３３】図３３のａ）〜ｂ）は、一実施形態における、迅速な組み立て方法についての具体的なピースを示す。図３３のａ）は、プロモーター、５’ＵＴＲ、コード配列、ターミネーター（転写終結コドン）、およびこれまでに使用されたｐＢＥＳＴ骨格に基づくベクターに特異的なライゲーション末端を有する５つのピースの標準を示す。図３３のｂ）は、各部位でのライゲーションについての配列の図を示す。
【図３４】図３４のａ）は、一実施形態における、４つのピースの遺伝学的スイッチを示す。図３４のｂ）は、重複プライマーを用いて、４つの直鎖のピースを形成するために、クローン後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）に対する、迅速な組み立て産物（「ＲＡＰ」）の比較を示す。図３４のｃ）は、「オン」または「オフ」の状態の遺伝学的スイッチのためのクローン後のＰＣＲ産物対ＲＡＰ産物の機能的なアッセイを示す。２ｎＭのレポーターおよび１ｎＭのリプレッサーが試験され、「＋ＩＰＴＧ」は０．５ｍＭのＩＰＴＧ、０μＭのａＴｃの状態を示し、「−ＩＰＴＧ」は０ｍＭのＩＰＴＧ、１０μＭのａＴｃの状態を示す。直鎖ＤＮＡは、ｇａｍＳおよび３１ｂｐの立体保護で保護される。エラーバーは、３つの独立した実験からの１標準偏差を示す。
【図３５】図３５は、一実施形態における、テンプレートの濃度および重複プライマーの機能としての迅速な組み立て産物の純度を示す。標準的な５ピースの組み立てのために、迅速な組み立て産物（「ＲＡＰ」）は、５０μＬのＰＣＲ反応における１μＬ、２μＬ、または５μＬのいずれかを増幅した。また、クローン後のＰＣＲ産物(「ｐｏｓ」)が産生される。非重複プライマーは結合部位を指し、結合部位は、ベクターとプロモーターおよびベクターとターミネーター間の組み立て接合部と交差せず、重複プライマーがこの接合部と交差する。白い実線の矢印はテンプレートＤＮＡ、グレーの矢印は重複プライマーにより除去される非特異的な産物、点線の白い矢印は、重複プライマーにより保持される非特異的な産物である。赤い矢印は、サイズから、セルフライゲーションしたベクターであることが推定される。
【図３６Ａ】図３６Ａ〜Ｄは、一実施形態における、非干渉性フィードフォワードループにおけるパルスを生成するプロセスを示す。図３６Ａは、パルスが生成され始め、上のノードが、中間のノードおよび下のノード（下のノードはレポーターである）を活性化するためのタンパクを発現している。
【図３６Ｂ】図３６Ｂでは、下のノードは完全に発現し、時間の経過によりシグナルに反映される。同時に、中間のノードもまた発現を開始するが、中間のノードの産物（この場合ＴｅｔＲ）はフリーａＴｃに結合される。
【図３６Ｃ】図３６Ｃでは、フリーａＴｃが低下し、中間のノードの産物が、下のノードプロモーターを抑制するために、下のノードに作用し始める。
【図３６Ｄ】図３６Ｄでは、下のノードが完全に抑制され、レポーターの分解（レポーターが−ｓｓｒＡタグされている場合）および／または細胞もしくは無細胞システムの希釈からのシグナルが低下する。
【図３７】図３７は、プロモーターＰｏｒｉｇおよびＰ１‐Ｐ４（配列番号３３〜３７）についての配列表を示す。
【図３８】図３８のＡは、ｌａｓＲタンパクが除かれている非干渉性フィードフォワードループのオープンループを示す。図３８のＢは、ｌａｓＲあり（ダークグレイ）およびなし（白）である場合の各プロモーター変異体（Ｐ＿ｏｒｉおよびＰ１‐Ｐ４）について検出されたｄｅＧＦＰシグナルを示す。
【図３９】図３９のＡは、野生型と比較される、ｔｅｔＯオペレーター部位、変異体１、および変異体２の２つの配置の合理的な設計を示す（配列番号３８〜４０）。図３９Ｂは、抑制を試験するために使用される回路の概略図を示し、ａＴｃがＴｅｔＲ産生構成物の存在で変化する。図３９のＣは、野生型およびａＴｃを変化させた２つの変異体について、ｔ＝300分で検出されたエンドポイント蛍光を示す。図３９のＤは、Ｘ軸の時間と、野生型プロモーター対２つの操作されたプロモーターの産生率（Ｙ軸）を示す一次導関数を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａは、プラスミド２１２の配列表（配列番号４１）を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、プラスミド２１３の配列表（配列番号４２）を示す。
【図４１】図４１は、図４３および図４４に示される結果を有する、インビトロでの各感受性分析試験について使用される成分およびそれらの濃度を示す。
【図４２】図４２は、プラスミド２２０の配列表（配列番号４３）を示す。
【図４３】図４３は、図４１での実験セットアップに対応する各プロットを有する、非干渉性フィードフォワードループのインビトロでおよびインシリコ感受性分析の結果を示す。図４３のＡでは、Ｉ−ＦＦＬについて、５つの各パラメータが個々に変更され、一方、他のパラメータは、１ｕＭの３ＯＣ１２ＨＳＬ、１０ｕＭのａＴｃ、１ｎＭのｐＬａｃ−ｌａｓＲ、０．１ｎＭのｐＬａｓ−ＴｅｔＲ、および１ｎＭｐＬａｓ−ｔｅｔＯ−ｄｅＧＦＰで一定に維持される。全ての反応は、残りのＬａｃＩを除くために１ｍＭのＩＰＴＧを含み、新たなＤＮＡ源を用いて３重で行う。図４３のＢでは、ｐＬａｓ−ｔｅｔＯ−ｄｅＧＦＰプラスミドが変更され、ｔ＝３００分でアウトプットｄｅＧＦＰが測定される。実験データはブラックおよびブルーである。インレットは時系列のデータを示す。図４３のＣでは、３ＯＣ１２を変化させ、アウトプットｄｅＧＦＰをｔ＝３００分で測定した。図４３のＤでは、ｐＬａｃ−ｌａｓＲプラスミドを変化させ、アウトプットｄｅＧＦＰをｔ＝３００分で測定した。図４３のＥでは、ａＴｃを変化させ、抑制までの時間を示す。抑制までの時間は、産生率が最大半量に到達する時間として測定される。図４３のＦでは、ｐＬａｓ−ＴｅｔＲプラスミドを変化させる。ＴｅｔＲの直接的な効果を調査するために、本実験に対してａＴｃは添加しなかった。
【図４４】図４４は、図４３から得られるインビトロの結果の上に、生体分子ブレッドボード（点線）のインシリコ部分から得られるモデリングデータ重ねたものを示す。
【図４５】図４５は、最初に特徴づける部分により回路の挙動を予測するためのインシリコモデリングの実行を示すフロー図を提供する。
【図４６】図４６は、一実施形態における、インシリコモデリングのために使用されるツールボックスのインプットおよびアウトプットのセットを提供する。
【図４７】図４７は、一実施形態における、インシリコツールボックスにおけるＧＦＰレポーター部分およびＴｅｔＲ−ｐＴｅｔ−ａＴｃからの回路を構築ために使用されるコマンドのセットを提供する。
【図４８】図４８は、インシリコモデリングツールボックスにおけるｔｘｔｌプロットコマンドのアウトプットを示す。図４８のＡは、シミュレーションにおける時間の関数として、タンパク濃度についての曲線を提供する。図４８のＢは、時間の関数として、シミュレーションでのＲＮＡ（Ｙ軸）の濃度をプロットする。図４８Ｃは、それらの最初（最大）の値に対して正規化された、ＡＧＴＰ（ＡＴＰとＧＴＰの濃度の合計）、ＣＵＴＰ（ＣＴＰとＵＴＰの濃度の合計）、アミノ酸、リボソーム、およびＲＮＡＰの量をプロットする。
【図４９】図４９は、インシリコモデリングツールボックスにおけるユーザレベル機能間の情報の流れを図示するフロー図を提供し、ユーザが見ることができる機能間の依存性を示す。
【図５０】図５０は、インシリコモデルに適合させるためのインビトロでのデータを提供するために行われる特徴づけの実験を提供する。実験１は、ｐＴｅｔ−ＧＦＰの量を変化させて（４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０ｎＭ）、ｐＴｅｔプロモーターの制御下でのＧＦＰの恒常的な発現である。実験２は、ｐＬａｃ−ＧＦＰのＤＮＡを変化させ（２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０．０６２５ｎＭ、０ｎＭ）、ｐＬａｃプロモーターの制御下でのＧＦＰの恒常的な発現である。実験３は、ｐＬａｃ−ＴｅｔＲ遺伝子の量を変化させることにより（２ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．０００２ｎＭ、０．００００２ｎＭ、０ｎＭ）、産生されるＴｅｔＲの量を変化させることによるｐＴｅｔ−ＧＦＰ遺伝子（１ｎＭで）の発現の抑制である。実験４は、システムに対して、変化させた量のａＴｃを添加することによる（１０ｕＭ、１ｕＭ、０．１ｕＭ、０．０１ｕＭ、０．００１ｕＭ、０．０００１ｕＭ、０．００００１ｕＭ）、抑制されたｐＴｅｔ−ＧＦＰ遺伝子の導入（deprepression：抑制解除）である。ここで、ｐＬａｃ−ＴｅｔＲのＤＮＡは０．１ｎＭであり、ｐＴｅｔ−ＧＦＰのＤＮＡは１ｎＭである。実験５は、活性化したｐＬａｓ−ＧＦＰ発現の導入である。ｐＬａｃ−ｌａｓＲおよびｐＬａｓ−ＧＦＰのＤＮＡは１ｎＭであり、インデューサー３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させる（１０ｕＭ、１ｕＭ、０．１ｕＭ、０．０１ｕＭ、０．００１ｕＭ、０．０００１ｕＭ、０．００００１ｕＭ）。
【図５１Ａ】図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。パラメータ予測の手順は、図５２および５３に詳細が記載される。図５１Ａは実験１に対応し、ｐＴｅｔ恒常的な発現強度はｐＴｅｔプロモーター下でＧＦＰ発現を測定することにより観察される。ｐＴｅｔプロモーター（ＴＸＴＬ＿ＰＴＥＴ＿ＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｆ  ａｎｄ  ＴＸＴＬ＿ＰＴＥＴ＿ＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｒ）を含むＤＮＡに、（シグマ７０ファクターボンド）ＲＮＡポリメラーゼの結合と関連するパラメータが予測される。特徴づけ工程の残りについて固定するいくつかのコアパラメータもまた決定される。
【図５１Ｂ】図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。図５１Ｂは、実験２と関連するコード、反応、種を示し、ｐＬａｃの制御下でＧＦＰの恒常的な発現である。予測されるパラメータは、実験１がそのまま固定されたことに起因する特徴づけにおいて決定されるコアパラメータによる、ｐＬａｃのＤＮＡに結合するシグマ７０ボンドＲＮＡポリメラーゼについてのフォワードおよびリバース反応である。
【図５１Ｃ】図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。図５１Ｃは、ｐＴｅｔ−ＴｅｔＲ−ａＴｃ抑制−導入システムについて作成されたモデルを示す。予測されるパラメータは、ＴｅｔＲ二量体化のフォワードおよびバックワード率、ＴｅｔＲ抑制強度を特徴づけるｐＴｅｔ隔離（ＴｅｔＲ二量体による）結合および非結合割合（実験３）、ａＴｃ−ＴｅｔＲ二量体の結合非結合割合（実験４）であった。また、本図面は、これまでの２つの実験／特徴づけ（図５１Ａおよび５１Ｂ）由来である本シミュレーションについて固定されたパラメータの値を示す。
【図５１Ｄ】図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。図５１Ｄは、ｐＬａｓ−ｌａｓＲ−３ＯＣ１２ＨＳＬ活性化システムについて作成されたモデルを示し、実験５からのデータと合わせて使用される。ここで、非活性化（ＴＸＴＬ＿ＰＬＡＳ＿ＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｆ／Ｒ）および活性化（ＴＸＴＬ＿ＰＬＡＳ＿ＴＦＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｆ／Ｒ）プロモーター部分に結合する（シグマ７０ボンド）ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーター部位（ＴＸＴＬ＿ＰＬＡＳ＿ＴＦＢＩＮＤ＿Ｆ／Ｒ）に結合する転写因子、アクチベータータンパクに結合するインデューサー（ＴＸＴＬ＿ＩＮＤＵＣＥＲ＿ＬＵＸＲ＿ＡＨＬ＿Ｆ／Ｒ）についてのパラメータが、実験５からのデータに対するモデル挙動を適合させることにより決定される。
【図５２】図５２は、一実施形態における、パラメータ予測手順の全体を示すフローチャートを提供する。
【図５３】図５３は、一実施形態における、パーツの特徴付け手順を示すフローチャートである。
【図５４】図５４は、図５１Ａ〜Ｄにおけるモデルに対し、図５０における実験１〜５からの実験データを適合させるためのパラメータを予測することによるパーツの特徴づけの手順の結果を示す。各図のＹ軸はその実験についてのＧＦＰのエンドポイント濃度であり、一方Ｘ軸は変化させた種の濃度である。プロットには３つのラインがあり、実験データからの平均および標準偏差が、エラーバーとともに明るい実線で示される。点線は、図５２に記載されるパラメータ予測の前処理のステージ後のシミュレーション結果である。暗い実線は、図５２に記載される完全なパラメータ予測の結果である。左上：実験１によりｐＴｅｔ−ＧＦＰのＤＮＡを変化させている。右上：実験２によりｐＬａｃ−ＧＦＰＤＮＡを変化させている。中央の左：実験３によりＴｅｔＲのＤＮＡを変化させている。中央の右：実験４によりａＴｃを変化させている。下：実験５により３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させている。
【図５５】図５５は、パーツが特徴づけられた後に、コンピュータを用いて完全なIFFLを生成するために使用されるツールボックスを提供し、予測されたパラメータ値は、パーツのコンフィグレーションファイルをアップデートするために使用されている。
【図５６】図５６のＡおよびＢは、蛍光タグ−ｓｓｒＡｄｅＧＦＰ（図５６のＡ）および非−ｓｓｒＡタグｄｅＧＦＰ（図５６のＢ）についての、時間の経過によるｄｅＧＦＰ分解をプロットする。
【図５７】図５７は、もともとは［５］由来であり、酵素ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥを用いてヴィオラセイン（violacein）へとトリプトファンを代謝するための代謝経路を示す。文字「Ｘ」は未知の中間体を表す。
【図５８】図５８は、もとは［５］に示される研究由来であり、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥを発現するための直鎖ＤＮＡのピースを作り上げることが可能な成分を説明する。Ｊ２３１５１は恒常的なプロモーターであり、ＢＣＤ５はＲＢＳであり、Ｔ１４は［６］由来のターミネーターである。
【図５９】図５９は、［５］由来であり、経路で所定の遺伝子を排除して得られる、異なる色の代謝生成物を説明する。具体的には、完全な経路な暗い紫色の反応物を作成し、一方、ＶｉｏＥ、ＶｉｏＣ、およびＶｉｏＤの排除は無色の反応物を作成し、ＶｉｏＣおよびＶｉｏＤの排除はピンクの反応物を作成し、ＶｉｏＣの排除はオレンジ色の反応物を作成し、ＶｉｏＤの排除は明るい紫色の反応を作成する。
【図６０】図６０は、［５］由来であり、完全な経路（左）対ＴＸ−ＴＬ欠如ＶｉｏＣ（右）を用いたＴＸ−ＴＬの結果のナノドロップ２０００での読み取りを説明する。これは異なる波長での測定吸光度であり、垂直な線は、ヴィオラセイン（左）およびデオキシビオラセイン（右）についての公表されたピークを示す。
【図６１】図６１は、［５］由来であり、完全な経路を含むＴＸ−ＴＬでのＬＣ−ＭＳによる、ヴィオラセイン（図６１のａ））、デオキシビオラセイン（図６１のｂ））、プロデオキシビオラセイン（図６１のｃ））の検出を説明する。
【図６２】図６２は、［５］由来であり、ヴィオラセイン検出量に対して正規化された、図６１におけるヴィオラセイン、デオキシビオラセイン、およびプロデオキシビオラセインのピーク検出を説明する。
【図６３】図６３は、［５］由来であり、後に示されるスタンダード（第１カラム）完全な経路（第２カラムおよび第３カラム）またはｖｉｏＢのみ反応（第４カラム）のいずれかからのｖｉｏＡ、ｖｉｏＥ、およびｖｉｏＢの図６３のａ）におけるウェスタンブロットを説明する。ウェスタンブロットにおける各タンパクの定量は、図６３のｂ）に示され、各カラムにおける左手のバー（ダークグレイ）はモデル予測量であり、各カラムにおける右手のバー（ライトグレイ）はウェスタンブロット定量である。
【図６４】図６４は、［５］由来であり、標準コントロールのヴィオラセイン、６．５ｎＭで含まれるｖｉｏＣおよびｖｉｏＤを除いて４ｎＭで全ての成分を有するＴＸ−ＴＬ反応物、４ｎＭでの全ての成分を有するＴＸ−ＴＬ反応物の薄層クロマトグラフィーを説明する。
【図６５】図６５は、［５］由来であり、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥについてコードする異なる量の直鎖ＤＮＡで異なる反応物の５７２ｎｍの吸光度により測定される天然のままのヴィオラセインの産生物を説明する。
【図６６】図６６は、［５］由来であり、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥをコードする直鎖ＤＮＡの異なる量での異なる反応のＬＣ‐ＭＳにより測定されるヴィオラセイン、デオキシビオラセイン、およびプロデオキシビオラセインの産生を説明する。「Ｍ」、「ＳＴＤ」、「ＣＨＤＨ」、「ＥＬ」、「ＢＨＣＨＤＨＥＬ」、および「ＢＨＣＨＥＬ」のそれぞれについての棒グラフ（上）では、左の棒はヴィオラセインを測定しており、中央のバーはデオキシビオラセインを測定しており、右側のバーはプロデオキシビオラセインを測定している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
いくつかの実施形態では、目標環境の条件は、異なる効率を有するリボソームと結合する異なるＲＢＳにより提供されることとしてもよい。大腸菌において、例えば、TTTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG（配列番号４４）の配列を有するのは、高いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列であり、それは、この配列に直接続くあらゆる遺伝子（直接３’−この配列まで）がより高い割合で翻訳されることを意味する。したがって、オリジナルの発現レベルで、オリジナルの環境で発現されるタンパクにより形成される分子成分では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝産物のセットで作用される回路の一部を形成することは、回路が動かされる別の環境でタンパク成分を試験するために提供されることとしてもよい。例えば、実施例６〜１１では、１６の異なるＲＢＳユニットが、フィードフォワードループ回路におけるＴｅｔＲおよびｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡの発現の内容物で試験され、これらのＲＢＳのそれぞれは、ＴｅｔＲおよびｄｅＧＦＰ−ｓｓｒＡタンパクの異なる発現レベルをもたらし、したがって、実施例１１および図１２Ａにみられるようにインビトロでのまたはインビトロでの回路の異なる挙動をもたらす。よって、所望される遺伝子回路の最終的な機能的挙動を（フィードフォワードループにおける、特定の期間のパルス）調整するために、強ＲＢＳ、中ＲＢＳ、弱ＲＢＳ、またはその変化は、翻訳効率に影響を及ぼすために選択することができる。結合効率を変化させるＲＢＳの例は、実施例のセクションにおいて使用されるＢＣＤおよびＭＣＤを含む。通常使用されるＲＢＳ配列の１つのファミリーは、http://partsregistry.org.からのB0030のATTAAAGAGGAGAAA（配列番号４５）またはB0034のAAAGAGGAGAAA（配列番号４６）のような、合成モノシストロニック設計（ＭＣＤ）を含む。他のＭＣＤは、B0031、B0032、およびB0033を含む。これらのＲＢＳ配列は、強、中、および弱のＲＢＳ配列に分けることができ、各エレメントの最終的な翻訳の強度は広く予測できるが、広範囲な実験を行うことなく前測定することはできない。ＲＢＳ配列の追加のファミリーは、とりわけ、BCD2のGGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCTAAGGAGGTTTTCT（配列番号２２）、またはBCD22のGGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCGGTGGAGGGTTTCT（配列番号１９）のような合成バイシストロニック設計（ＢＣＤ）を含む。［１］で開発されたこれらのＢＣＤユニットは、１対１の相関性ではないにもかかわらず、ｍＲＮＡからの二次構造の制約を除くことにより、各エレメントの最終的な翻訳強度のより大きな予測性を提供することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
下のノードでは、プロモーターはｔｅｔＯ１プログラムされた演算子要素を有するｌａｓ応答性プロモーターである。ｔｅｔＯ１エレメントをｌａｓ応答性プロモーターにプログラムするためには、配列「ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ」（配列番号４７）を有するｔｅｔＯ１  ＤＮＡオペレーター片を含める必要がある。［４］下のノードのＲＢＳはＵＴＲ１であり、コード配列はｄｅＧＦＰをコードする。ｄｅＧＦＰは、一般的なプレートリーダー中の吸光度４８５エミッタンス５１５で視覚化することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
【表１】
2018512044.tif 000001