【手続補正書】
【提出日】平成30年10月5日(2018.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内の前記ヌクレオチド配列とは異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素を提供する段階；
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
前記サンプル、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な前記１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中で前記二次伸長生成物を検出及び区別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項２】
サンプルにおいて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素を提供する段階；
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
前記サンプル、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な前記１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの１つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’部分、前記標的特異的部分、前記３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記５’部分をその相補的３’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づき、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項３】
前記混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前、またはそれと同時に、前記サンプルを少なくとも第１のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階
を更に含み、
前記第１のメチル化感受性酵素が、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中で核酸分子を切断し、これにより、前記検出する段階が、前記標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の検出を含み、前記核酸分子が元々１つ以上のメチル化残基を含有している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記１つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記１つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前に、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下において、前記制限酵素反応混合物を亜硫酸水素塩処理に供す段階
を更に含み、
前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記１つ以上のメチル化され切断されていない制限酵素切断部位を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された前記伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
メチル化感受性酵素認識配列内に非メチル化残基を含有する核酸分子を切断する１つ以上の第２のメチル化感受性酵素を提供する段階；及び
前記少なくとも１つの第２のメチル化感受性酵素を、前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物と混和して第２の制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記第２のメチル化感受性酵素が、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中に潜在的に存在する核酸分子を切断する、前記段階
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む３’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離３’ＯＨ末端を遊離させる段階
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する５’部分
を含むが、前記亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列内で、対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする１つ以上のヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非メチル化残基を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列の領域にハイブリダイゼーション可能な１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する段階；及び
前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記供す段階の前に、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、亜硫酸水素塩で処理した相補的な標的核酸配列にハイブリダイゼーションし、前記伸長処理の間に一次オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を妨害する、前記接触させる段階
を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む３’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離３’ＯＨ末端を遊離させる段階
を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、ｕｎｉｔａｑ検出部分を更に含むことにより、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記ｕｎｉｔａｑ検出部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
以下の段階：
１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ｕｎｉｔａｑ検出プローブが相補性ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイゼーションし、かつ前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；及び
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供している間に、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上の相補性ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理間に前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、ライゲーション産物の接合部部分またはその相補鎖にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；並びに
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供している間に、前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上で相補性検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理の間に前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ライゲーションの前または後に、固体支持体上で各一次伸長生成物の少なくとも１つの鎖を固定化する段階であって、前記ライゲーション産物配列が前記固定化した一次伸長生成物にハイブリダイゼーションする、前記固定化する段階；並びに
前記ライゲーションの後で、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブ及び非標的特異的ライゲーション産物を前記サンプルから取り除く段階；並びに
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記固定化した一次伸長生成物から前記ライゲーション産物配列を変性させる段階
を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分が、前記３’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含み、
以下の段階：
前記プローブが、前記一次伸長生成物の相補性標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする際に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’ＯＨを遊離させる段階
を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、その５’末端に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端とオーバーラップする同一のヌクレオチドを有し、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置における、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによる接合部の形成の際に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブとの前記接合部にてフラップを形成し、
以下の段階：
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドを、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’末端におけるリン酸基を遊離させる段階
を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第３のオリゴヌクレオチドプローブを更に含み、プローブセットの前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブが、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し、これらの間の接合部とハイブリダイゼーションするように構成されており、前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブの間でのライゲーションにより、プローブセットの前記第１、第２、及び第３のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成することを可能にする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明は、ヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼ反応を用いて、標的核酸分子における変異、発現、スプライス変異体、転座、コピー数、及び／またはメチル化変化を検出するための多数のアプローチについて記載する。本発明は、キャリーオーバー防止の問題を解決し、同様に空間的多重化を可能にして、デジタルＰＣＲに類似した相対的定量化を提供する。かかる技術は、癌の非侵襲的早期発見のため、癌の非侵襲的予測のため、及び、血漿または血清サンプルから癌の再発を監視するために利用され得る。 
[本発明1001]
サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び／または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び／または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内の前記ヌクレオチド配列とは異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素を提供する段階；
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
前記サンプル、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な前記1種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）5’プライマー特異的部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｂ）5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中で前記二次伸長生成物を検出及び区別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び／または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1002]
サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び／または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び／または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素を提供する段階；
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
前記サンプル、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な前記1種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分をその相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づき、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び／または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1003]
前記混和することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前、またはそれと同時に、前記サンプルを少なくとも第1のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階
を更に含み、
前記第1のメチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中で核酸分子を切断し、これにより、前記検出する段階が、前記標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の検出を含み、前記核酸分子が元々1つ以上のメチル化残基を含有している、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記混和することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前に、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下において、前記制限酵素反応混合物を亜硫酸水素塩処理に供す段階
を更に含み、
前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化され切断されていない制限酵素切断部位を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された前記伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
メチル化感受性酵素認識配列内に非メチル化残基を含有する核酸分子を切断する1つ以上の第2のメチル化感受性酵素を提供する段階；及び
前記少なくとも1つの第2のメチル化感受性酵素を、前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物と混和して第2の制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記第2のメチル化感受性酵素が、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中に潜在的に存在する核酸分子を切断する、前記段階
を更に含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離3’ＯＨ末端を遊離させる段階
を更に含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する5’部分
を含むが、前記亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列内で、対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする1つ以上のヌクレオチド配列を有する、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ＤＮＡポリメラーゼが、5’ヌクレアーゼ活性、3’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を欠く、本発明1008の方法。
[本発明1010]
非メチル化残基を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列の領域にハイブリダイゼーション可能な1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する段階；及び
前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記供す段階の前に前記1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、前記1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、亜硫酸水素塩で処理した相補的な標的核酸配列にハイブリダイゼーションし、前記伸長処理の間に一次オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を妨害する、前記接触させる段階
を更に含む、本発明1004の方法。
[本発明1011]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離3’ＯＨ末端を遊離させる段階
を更に含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1012]
前記切断可能なヌクレオチドが、1つ以上のＲＮＡ塩基を含む、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする野生型核酸分子内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する5’部分
を含むが、前記標的核酸分子内の対応するヌクレオチド配列部分に対してミスマッチする1つ以上のヌクレオチド配列を有する、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記1つ以上の配列ミスマッチが、前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーの5’末端から2つのヌクレオチド塩基、及び／または前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記5’末端から3つのヌクレオチド塩基に位置する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記ＤＮＡポリメラーゼが、5’ヌクレアーゼ活性、3’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を欠く、本発明1013の方法。
[本発明1016]
ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：、
他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、各プライマーが前記1つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
前記接触したサンプル、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成する段階；
前記逆転写混合物中で相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成する段階であって、各ｃＤＮＡ分子が、標的リボ核酸分子に相補的でありかつｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む、前記生成する段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記ｃＤＮＡの前記標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ｃＤＮＡ分子を含有する前記逆転写混合物、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼを混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより1種以上の異なる一次伸長生成物を形成する段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、
（ａ）5’プライマー特異的部分及び3’標的配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的配列特異的部分及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記提供する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成する段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2プローブが互いにライゲーションされ、前記リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により前記サンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1017]
ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、各プライマーが前記1つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
前記接触したサンプル、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成する段階；
前記逆転写混合物中で相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成する段階であって、各ｃＤＮＡ分子が、標的リボ核酸分子に相補的でありかつｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む、前記生成する段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記ｃＤＮＡの前記標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ｃＤＮＡ分子を含有する前記逆転写混合物、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼを混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより1種以上の異なる一次伸長生成物を形成する段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、
（ａ）5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記提供する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成する段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2プローブが互いにライゲーションされ、前記リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記形成する段階；
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分をその相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づいて、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中で、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により前記サンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1018]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が潜在的に異なる1つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）5’ステムループ部分、ブロック基、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列部分、及び5’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、
（ｄ）前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第4のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記接触したサンプル、プライマーセットの前記1つ以上の第1のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記サンプル中に存在する場合、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、前記逆転写酵素が、前記ハイブリダイゼーションした第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記3’末端を伸長して、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する、前記段階；
プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む前記伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記領域にハイブリダイゼーションし、伸長して前記5’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、前記逆転写反応混合物を、前記プライマーセットの前記第2、第3、及び第4のオリゴヌクレオチドプライマーと混和し、ポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより複数の一次伸長生成物を形成する段階；
前記複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）5’プライマー特異的部分及び3’標的配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する段階。
[本発明1019]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が潜在的に異なる1つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）5’ステムループ部分、ブロック基、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列部分、及び5’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、
（ｄ）前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第4のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記接触したサンプル、プライマーセットの前記1つ以上の第1のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記サンプル中に存在する場合、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、前記逆転写酵素は前記ハイブリダイゼーションした第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記3’末端を伸長して、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する、前記段階；
プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む前記伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記領域にハイブリダイゼーションし、伸長して前記5’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、前記逆転写反応混合物を、前記プライマーセットの前記第2、第3、及び第4のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより複数の一次伸長生成物を形成する段階；
前記複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分を、その相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づいて前記サンプル中で前記ライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する段階。
[本発明1020]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他のｍｉＲＮＡ分子とは配列の1つ以上の塩基の違いが潜在的に異なる1つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
前記接触したサンプルを、リガーゼと、並びに5’リン酸基、5’ステムループ部分、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する段階；
前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を、その3’末端にて、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’リン酸基にライゲーションして、前記サンプル中に存在する場合、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブに付加した前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成する段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列、及び5’プライマー特異的部分を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに
（ｃ）前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記キメラ核酸分子、前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記サンプル中に存在する場合、プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記キメラ核酸分子の前記内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その3’末端を伸長して前記キメラ核酸分子の相補鎖を生成する、前記段階；
前記逆転写反応混合物をプライマーセットの前記第1及び第3のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）5’プライマー特異的部分及び3’標的配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ライゲーション産物配列及び前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する段階。
[本発明1021]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他のｍｉＲＮＡ分子とは配列の1つ以上の塩基の違いが潜在的に異なる1つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
前記接触したサンプルを、リガーゼと、並びに5’リン酸基、5’ステムループ部分、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する段階；
前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を、その3’末端にて、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’リン酸基にライゲーションして、前記サンプル中に存在する場合、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブに付加した前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成する段階；
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列、及び5’プライマー特異的部分を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに
（ｃ）前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記キメラ核酸分子、前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記サンプル中に存在する場合、プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記キメラ核酸分子の前記内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その3’末端を伸長して前記キメラ核酸分子の相補鎖を生成する、前記段階；
前記逆転写反応混合物をプライマーセットの前記第1及び第3のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分を、その相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づいて前記サンプル中で前記ライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する段階。
[本発明1022]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、ｕｎｉｔａｑ検出部分を更に含むことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記ｕｎｉｔａｑ検出部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
以下の段階：
1つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ｕｎｉｔａｑ検出プローブが相補性ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイゼーションし、かつ前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記1つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；及び
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に前記供している間に、前記1つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上の相補性ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理間に前記1つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブから切断され、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、本発明1001、1016、1018、または1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、ライゲーション産物の接合部部分またはその相補鎖にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；並びに
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に前記供している間に、前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上で相補性検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理の間に前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、本発明1001、1016、1018、または1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記ライゲーションの前または後に、固体支持体上で各一次伸長生成物の少なくとも1つの鎖を固定化する段階であって、前記ライゲーション産物配列が前記固定化した一次伸長生成物にハイブリダイゼーションする、前記固定化する段階；並びに
前記ライゲーションの後で、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブ及び非標的特異的ライゲーション産物を前記サンプルから取り除く段階；並びに
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記固定化した一次伸長生成物から前記ライゲーション産物配列を変性させる段階
を更に含む、本発明1002、1017、1019、または1021のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分が、前記3’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含み、
以下の段階：
前記プローブが、前記一次伸長生成物の相補性標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする際に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記ライゲーションの前に前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの3’ＯＨを遊離させる段階
を更に含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、その5’末端に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’末端とオーバーラップする同一のヌクレオチドを有し、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置における、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによる接合部の形成の際に、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブとの前記接合部にてフラップを形成し、
以下の段階：
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドを、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’末端におけるリン酸基を遊離させる段階
を更に含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブを更に含み、プローブセットの前記第2及び第3のオリゴヌクレオチドプローブが、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し、これらの間の接合部とハイブリダイゼーションするように構成されており、前記第2及び第3のオリゴヌクレオチドプローブの間でのライゲーションにより、プローブセットの前記第1、第2、及び第3のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成することを可能にする、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
サンプルにおいて、前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは1つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは1つ以上のメチル化残基が異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階；
前記サンプルを1種以上のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記1つ以上の前記メチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中の核酸分子を切断する、前記形成する段階；
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記1つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記1つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記制限酵素反応混合物を、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、前記一次伸長生成物にハイブリダイゼーション可能な第1及び第2のｎｅｓｔｅｄオリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記提供する段階；
前記一次伸長生成物、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別して、前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは1つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1029]
1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、前記一次伸長生成物またはその相補鎖内の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；並びに
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記供している間に、前記一次伸長生成物の相補部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び検出可能な標識が、前記二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物の前記1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルの前記伸長処理の間に、前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
以下の段階：
前記一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物の前記1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルの前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの遊離3’ＯＨ端を遊離させる段階
を更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記一次オリゴヌクレオチドプライマーが、長さが約6〜20塩基の、同一または実質的に同一な5’ヌクレオチド配列部分を含む、本発明1028の方法。
[本発明1032]
前記サンプルが、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞血中循環核酸、無細胞血中循環腫瘍核酸、妊娠した女性の無細胞血中循環胎児核酸、血中循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検、及びエクソソームからなる群から選択される、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記1つ以上の標的ヌクレオチド配列は、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での、1つ以上のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を含む少量の核酸分子である、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1034]
1つ以上のヌクレオチド塩基の、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を有する前記少量の核酸分子を、前記少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、前記1つ以上のヌクレオチド塩基の、ゲノムレベル及び／もしくはメチル化ヌクレオチド塩基での変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を有しない、前記サンプル中の多量の核酸分子から識別して区別する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
1つ以上の少量の標的ヌクレオチド配列のコピー数を、前記サンプル中の前記多量の核酸分子のコピー数と比較して定量化する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記1つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化または計算する、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1037]
同一の後の工程を受ける、前記サンプルまたは他のサンプル中の他のヌクレオチド配列と比較して、前記1つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化または計算する、本発明1036の方法。
[本発明1038]
1つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対的なコピー数を定量化または計算する、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記識別する段階に基づいて、病状を診断または予測する段階
を更に含む、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記識別する段階に基づいて、遺伝子型または病気の素因を区別する段階
を更に含む、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1041]
マイクロタイタープレートと組み合わせて使用し、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった2つ以上のウェルに液体を同時に加えるためのデバイスであって、前記マイクロタイタープレートが、対向した上部表面及び底部表面を有し、前記上部表面が前記ウェルの中に至る開口部を有し、前記底部表面が前記ウェルの閉鎖端を画定し、
前記デバイスが、
第1及び第2の境界により画定される第1層であって、計量チャンバが前記第1層の前記第1及び第2の境界の間に延在して互いに流体連通し、前記第1層は作動可能な位置で、前記マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、前記第1層の前記第1の境界は、前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に最も近く、前記計量チャンバのそれぞれは、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通しており、前記第1層は、1つ以上の前記計量チャンバと流体連通した充填チャンバを更に含む、前記第1層、並びに
第1及び第2の境界により画定される第2層であって、充填ポートが前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第2層は作動可能な位置で、前記第1層に隣接して適合するように構成され、前記第2層の前記第1の境界は前記第1層の前記第2の境界に最も近く、前記充填ポートは前記充填チャンバと連動している、前記第2層
を含み、前記第1層、前記第2層、及び前記マイクロタイタープレートが、互いに作動可能な位置で配置される場合、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった2つ以上のウェルに入る、前記デバイス。
[本発明1042]
前記第2層が、
前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在する通気道であって、前記計量チャンバと連動している、前記通気道
を含む、本発明1041のデバイス。
[本発明1043]
第1及び第2の境界により画定される中間層であって、中間層流路が前記中間層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記中間層は、前記マイクロタイタープレートと前記第1層の間の作動可能な位置で適合するように構成され、前記中間層の前記第1の境界は前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に隣接し、前記中間層の前記第2の境界は前記第1の層の前記第1の境界に隣接し、前記中間層流路の1つは、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと連動している、前記中間層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過して前記マイクロタイタープレートのウェルに入る、本発明1041のデバイス。
[本発明1044]
前記中間層流路が疎水性壁を含む、本発明1043のデバイス。
[本発明1045]
前記中間層流路がバーストバルブ（ｂｕｒｓｔ  ｖａｌｖｅ）である、本発明1043のデバイス。
[本発明1046]
前記第1層が、前記充填チャンバと流体連通しているオーバーフローチャンバを更に含む、本発明1041のデバイス。
[本発明1047]
前記中間層が、前記オーバーフローチャンバを前記充填チャンバと接続するオーバーフロー流路を更に含む、本発明1046のデバイス。
[本発明1048]
前記第2層が、
前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在するオーバーフロー通気道であって、前記オーバーフローチャンバと連動している、前記オーバーフロー通気道
を有する、本発明1046のデバイス。
[本発明1049]
第1及び第2の境界を有する第3層であって、充填ポートコネクタが前記第3層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第3層は、前記第1及び第2層の間で作動可能な位置で適合するように構成され、前記第3層の前記第1の境界は前記第1層の前記第2の境界に隣接し、前記充填ポートコネクタは前記充填ポートと連動している、前記第3層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記第3層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で互いに配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填ポートコネクタ、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過し、前記マイクロタイタープレートの前記ウェルに入る、本発明1043のデバイス。
[本発明1050]
毛管現象により前記計量チャンバが満たされることを可能にするよう構成された、本発明1041のデバイス。
[本発明1051]
機械的な力により前記計量チャンバが満たされることを可能にするよう構成された、本発明1041のデバイス。
[本発明1052]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの1つと流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの半分に液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの他の半分に液体を提供する、本発明1041のデバイス。
[本発明1053]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの一方と流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記一対の離間した充填ポートの1つが、前記一対の充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの全てに液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの全てに液体を提供する、本発明1041のデバイス。
[本発明1054]
前記マイクロタイタープレートの2つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成される、本発明1041のデバイス。
[本発明1055]
前記第1層が、
2つ以上の横列に前記計量チャンバを有する第1領域、並びに、
2つ以上の縦列に前記計量チャンバを有する第2領域であって、前記第1及び第2領域が互いに離間している、前記第2領域
を有する、本発明1041のデバイス。
[本発明1056]
前記層が一体的であり前記デバイスをモノリシック構造とする、本発明1041〜1055のいずれかのデバイス。
[本発明1057]
対向した上部表面及び底部表面を有するマイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった2つ以上のウェルであって、前記上部表面は前記ウェルの中に至る開口部を有し、前記底部表面は前記ウェルの閉鎖端を画定する、前記ウェル
に液体を加える方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
第1及び第2の境界を有する第1層であって、計量チャンバが前記第1層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、互いに流体連通しており、前記第1層は作動可能な位置で、前記マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、前記第1層の前記第1の境界は、前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に最も隣接し、前記計量チャンバの1つは、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通しており、前記第1層は、1つ以上の前記計量チャンバと流体連通した充填チャンバを更に含む、前記第1層
第1及び第2の境界を有する第2層であって、充填ポートが前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第2層は作動可能な位置で、前記第1層に隣接して適合するように構成され、前記第2層の前記第1の境界は、前記第1層の前記第2の境界に最も近く、前記充填ポートは前記充填チャンバと連動している、前記第2層
を含むデバイスを提供する段階であって、
前記第1層、前記第2層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった2つ以上のウェルに入る、前記段階；
前記デバイスを液体で満たす段階；並びに
前記デバイス内の液体を、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった2つ以上のウェルへ放出する段階。
[本発明1058]
前記デバイスが、
第1及び第2の境界を有する中間層であって、中間層流路が前記中間層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記中間層は、作動可能な位置で前記マイクロタイタープレートと前記第1層の間に適合するように構成され、前記中間層の前記第1の境界は前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に隣接し、前記中間層の前記第2の境界は前記第1の層の前記第1の境界に隣接し、前記中間層流路の1つは、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと連動している、前記中間層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過して前記マイクロタイタープレートに入る、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記中間層流路が疎水性壁を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記中間層流路がバーストバルブ（ｂｕｒｓｔ  ｖａｌｖｅ）である、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記デバイスが、
第1及び第2の境界を有する第3層であって、充填ポートコネクタが前記第3層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第3層は、前記第1及び第2層の間で作動可能な位置で適合するように構成され、前記第3層の前記第1の境界は前記第2層の前記第2の境界に隣接し、前記充填ポートコネクタは前記充填ポートと連動する、前記第3層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記第3層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置され、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填ポートコネクタ、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過し、前記マイクロタイタープレートの前記ウェルに入る、本発明1058の方法。
[本発明1062]
前記満たす段階が毛管現象により行われる、本発明1057の方法。
[本発明1063]
前記放出する段階が機械的な力により行われる、本発明1057の方法。
[本発明1064]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対側に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの1つと流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記満たす段階の間に、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの半分に液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の離間した充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの他の半分に液体を提供する、本発明1057の方法。
[本発明1065]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの一方と流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記満たす段階の間に、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方、及び前記計量チャンバの全てに液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の離間した充填チャンバのもう一方、及び前記計量チャンバの全てに液体を提供する、本発明1057の方法。
[本発明1066]
前記デバイスが、前記満たす段階の間に、前記マイクロタイタープレートの2つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成される、本発明1057の方法。
[本発明1067]
前記第1層が、
2つ以上の横列に前記計量チャンバを有する第1領域、並びに、
2つ以上の縦列に前記計量チャンバを有する第2領域であって、前記第1及び第2領域が互いに離間している、前記第2領域
を有する、本発明1057の方法。
[本発明1068]
前記層が一体的であり前記デバイスをモノリシック構造とする、本発明1057〜1067のいずれかの方法。