(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの候補腫瘍形成性スプライスバリアントを識別するためのシステムであって、
メモリと、
少なくとも１つのプロセッサと、
命令を含有している少なくとも１つの非一時的コンピュータ可読媒体とを備え、前記命令が、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行されると、前記少なくとも１つのプロセッサに、
前記患者から取得された単一のホルマリンで固定されてパラフィンに埋め込まれた（ＦＦＰＥ）腫瘍試料からの複数のＲＮＡ配列リードから１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を判定するステップと、
前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料と同一の生物学的対象から取得されていない複数の健康なＲＮＡ試料から判定された１組のベースラインスプライス接合部位を検索するステップと、
前記１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を前記１組のベースラインスプライス接合部位と比較するステップと、
１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位を識別するステップであって、前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位は、前記１組のベースラインスプライス接合部位とオーバラップしない試料のスプライス接合部位である、ステップと、
識別された前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位の１つまたは複数を候補腫瘍形成性イベントであると判定するステップとを含む動作を遂行させる、システム。
【請求項２】
候補腫瘍形成性イベントのリストを出力するステップをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、地理的領域、年齢、性別、人種群、組織タイプ、または試料保存特性のうち１つまたは複数から選択される範囲にわたるドナーから得られた健康なＲＮＡ試料を含む、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、肺、副腎、膀胱、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、皮膚、および脾臓からなる群から選択された１つまたは複数の組織タイプからの試料を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、ある範囲の年齢にわたるドナーからの試料を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料からの試料接合部位を判定する前記ステップの前に、前記複数の健康なＲＮＡ試料からの前記ベースラインスプライス接合部位が判定される、請求項１から５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記ベースライン接合部位が、前記試料接合部位と同一のゲノム領域に由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
前記複数の健康なＲＮＡ試料が非腫瘍組織に由来する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記試料のスプライス接合部位と前記ベースラインスプライス接合部位が両方とも共通のアッセイを使用して判定される、請求項１から８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の試料接合部位を判定するステップが、
前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料からの前記複数のＲＮＡ配列リードを判定するステップと、
前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料からのＲＮＡ配列リードとアラインしたＤＮＡ参照配列を検索するステップと、
前記ＲＮＡリードにおいて、前記ＤＮＡ参照と比較して失われた連続位置として１つまたは複数の試料接合部位を判定するステップとを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位が、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフから判定された非癌性スプライスバリアントとオーバラップしない、請求項１から１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ベースラインスプライス接合部位の組が、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフを判定せずに判定される、請求項１から１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
コンピュータで実施される方法であって、
少なくとも１つのプロセッサを使用して、患者から取得された単一のホルマリンで固定されてパラフィンに埋め込まれた（ＦＦＰＥ）腫瘍試料からの複数のＲＮＡ配列リードから１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を判定するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、メモリから、前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料と同一の生物学的対象から取得されていない複数の健康なＲＮＡ試料から判定された１組のベースラインスプライス接合部位を検索するステップと、
前記１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を前記１組のベースラインスプライス接合部位と比較するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位を識別するステップであって、前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位は、前記ベースラインスプライス接合部位とオーバラップしない試料のスプライス接合部位である、ステップと、
識別された前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位の１つまたは複数を候補腫瘍形成性イベントであると判定するステップとを含む方法。
【請求項１４】
候補腫瘍形成性イベントのリストを出力するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料からのＲＮＡリードを判定するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記メモリから、前記単一のＦＦＰＥ腫瘍試料からの前記ＲＮＡリードとアラインしたＤＮＡ参照を検索するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記ＲＮＡリードにおいて、前記ＤＮＡ参照と比較して失われた連続位置として前記試料接合部位を判定するステップとをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、地理的領域、年齢、性別、人種群、組織タイプ、または試料保存特性のうち１つまたは複数から選択される範囲にわたるドナーから得られた健康なＲＮＡ試料を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィルター処理された試料接合部位が、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフから判定された非癌性スプライスバリアントとオーバラップしない、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願への参照による援用
本願は、２０１７年１月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／４４７,３８２号に基づく優先権の利益を主張しており、この仮出願は、本明細書によって参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
スプライスバリアントは遺伝子転写物の１つのバリエーションである。多くの遺伝子が細胞の環境または機能に依拠して複数の可能なスプライスバリアントを有することにより、単一の遺伝子が、複数の可能なタンパク質をコードすることが可能になる。タンパク質に翻訳される前に、ｍＲＮＡ転写物は、タンパク質配列におけるコードされないｍＲＮＡ転写物の部分を除去するようにスプライスされる。図１に示されるように、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）１０２およびカルシトニン１０４は同一の起源遺伝子の転写物によって生成され、前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）１０６として発現されて、遺伝子転写物がどこで発現されるかに依拠して異なってスプライスされる。非限定的な例として、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ１０６は、神経細胞にあるときにはＣＧＲＰ１０２としてスプライスされてよく、甲状腺細胞にあるときにはカルシトニン１０４としてスプライスされてよい。
【０００３】
従来、腫瘍形成性スプライスバリアントは、患者から１組の非腫瘍試料および１組の腫瘍試料を取得することによって判定され得る。次いで、試料の各々が配列決定され、参照（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）に対してマッピングされる。続いて、全体のスプライス転写物が新たに識別され、スプライス転写物に基づき、正常な（非腫瘍）試料と異常な（腫瘍）試料の間の発現差分が評価される。
【０００４】
腫瘍形成性スプライスバリアントを判定する伝統的方法は、多数の試料を必要とするので理想的ではない。また、一人の患者のために多数の試料を試験すると、試薬のコストと配列決定のコストの両方が大幅に増加する。例えば、腫瘍試料／非腫瘍試料の対が必要な場合には、コストは少なくとも２倍になるはずである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
【０００６】
発明の要旨は、以下の、発明を実施するための形態においてさらに説明される概念の選択を簡単に導入するために提供されるものである。発明の要旨は、特許請求される主題の主な特長または重要な特徴を識別するように意図されたものではなく、特許請求される主題の範囲を限定するように使用されることを意図したものでもない。
【０００７】
本開示の一態様は、スプライスバリアントを識別するための様々な方法およびシステムを提供するものである。一実装形態では、方法は、単一の生物学的試料からの複数のＲＮＡ配列リードから１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を判定するステップと、複数の健康なＲＮＡ試料から判定された１組のベースラインスプライス接合部位を検索するステップと、１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を１組のベースラインスプライス接合部位と比較するステップと、ベースラインスプライス接合部位とオーバラップしない試料のスプライス接合部位を含む１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位を識別するステップであって、１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位は候補腫瘍形成性イベントである、ステップとを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態は、候補腫瘍形成性イベントのリストを出力するステップをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、複数の健康なＲＮＡ試料は、地理的領域、年齢、性別、人種群、組織タイプ、または試料保存特性タイプのうち１つまたは複数の断面から得られた健康なＲＮＡ試料を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、複数の健康なＲＮＡ試料は、肺、副腎、膀胱、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、皮膚、および脾臓からなるグループから選択された１つまたは複数の組織タイプからの試料を含む。いくつかの実施形態では、複数の健康なＲＮＡ試料は、ある範囲の年齢にわたるドナーからの試料を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、単一の試料からの試料接合部位を判定するステップの前に、複数の健康なＲＮＡ試料からのベースラインスプライス接合部位が判定される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ベースラインスプライス接合部位のための複数の健康なＲＮＡ試料は、単一の生物学的試料と同一の生物学的対象からは取得されない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ベースライン接合部位は試料接合部位と同一のゲノム領域に由来する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、単一の生物学的試料は腫瘍試料に由来する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、試料のスプライス接合部位とベースラインスプライス接合部位は両方とも共通のアッセイを使用して判定される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の試料接合部位を判定するステップは、単一の生物学的試料からの複数のＲＮＡ配列リードを判定するステップと、単一の生物学的試料からのＲＮＡ配列リードとアラインしたＤＮＡ参照配列を検索するステップと、ＲＮＡリードにおいて、ＤＮＡ参照と比較して失われた連続位置として１つまたは複数の試料接合部位を判定するステップとを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、フィルター処理された試料のスプライス接合部位はサードパーティ接合部位とオーバラップせず、サードパーティ接合部位は、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフから判定される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ベースラインスプライス接合部位の組は、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフを判定せずに判定される。
【００１９】
いくつかの実施形態は、スプライスバリアントを識別するためのシステムを提供する。このシステムは、メモリと、少なくとも１つのプロセッサと、命令を含有している少なくとも１つの非一時的コンピュータ可読媒体とを含み、命令が、少なくとも１つのプロセッサによって実行されると、少なくとも１つのプロセッサに、単一の生物学的試料からの複数のＲＮＡ配列リードから１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を判定するステップと、複数の健康なＲＮＡ試料から判定された１組のベースラインスプライス接合部位を検索するステップと、１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を１組のベースラインスプライス接合部位と比較するステップと、１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位を識別するステップであって、フィルター処理された試料のスプライス接合部位が、ベースラインスプライス接合部位の組とオーバラップしない試料のスプライス接合部位を含み、フィルター処理された試料のスプライス接合部位は候補腫瘍形成性イベントである、ステップとを含む動作を遂行させる。
【００２０】
本明細書で説明されるように、様々な他の特徴および利点は、これらの技術の中へ要求通りに組み込まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、スプライスバリアントの例示的特徴を示す概念図である。
【００２２】
【図２】図２は、スプライスバリアントの判定を含む動作環境の一実施形態を示すブロック図である。
【００２３】
【図３】図３は、図２の動作環境によって利用されるスプライスバリアント判定サービスの例示の構成要素の一実施形態を示すブロック図である。
【００２４】
【図４】図４は、接合部位分析の一実施形態を示す流れ図である。
【００２５】
【図５】図５は、可能性のある腫瘍形成性接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００２６】
【図６】図６は、試料接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００２７】
【図７】図７は、ベースライン接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００２８】
【図８】図８は、フィルター処理された試料接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００２９】
【図９】図９は、フィルター処理された試料接合部位を検証するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００３０】
【図１０】図１０は、可能性のある腫瘍形成性接合部位を判定するステップの一実施形態の概念図を伴う流れ図である。
【００３１】
【図１１】図１１は、図１０の実施形態からの実験結果を示す表である。
【００３２】
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、フィルター処理された試料接合部位を検証するステップの特徴を示す概念図である。
【図１２Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
全般的に説明すると、本開示は、ベースライン分析によって腫瘍形成性スプライスバリアントを判定するための方法およびシステムに対応するものである。
【００３４】
癌細胞ではスプライシングが破壊されることが多い。その全体が参照によって本明細書に組み込まれているDvinge,  H.、およびBradley,  R.  K.（２０１５年）、「Widespread  intron  retention  diversifies  most  cancer  transcriptomes」Genome  Medicine、７巻（１号）、４５頁に説明されているように、スプライシング変化の原因となる破壊は多くの癌において識別されている。加えて、製薬会社は、これらのバリアントの製品を薬物治療の可能な標的として識別している。影響を受けたバリアントを持つ患者を識別する能力は、癌治療薬の効能の検討において重要であり得る。
【００３５】
癌の異常なスプライシング（スプライスバリアント）をもたらす可能性がある、ＤＮＡレベルにおける複数の突然変異がある。非限定的な例は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれているJung,  H.、Lee,  D.、Lee,  J.、Park,  D.、Kim,  Y.  J.、Park,  W.-Y.、...  Lee,  E.（２０１５年）、「Intron  retention  is  a  widespread  mechanism  of  tumor-suppressor  inactivation」、Nature  Genetics、４７巻（１１号）、１２４２〜１２４８頁に見られる。
【００３６】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（米国のメリーランド州ロックヴィルに本社を置くＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、および米国のメリーランド州ベテスダに本社を置くＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって管理されている）は、少なくとも（１）スプライス位置の直接的な突然変異と、（２）エクソンの最後の塩基の３０の塩基対（ｂｐ）の内部で生じる突然変異と、（３）影響を受けたエクソンの近くでは生じないが、スプライシングが起こるところで生じる、転写物に対する変化と、（４）スプライシングに直接関係のない腫瘍形成性の変化（それだけではないがＭｙｃ突然変異など）とを含む、突然変異（スプライスバリアント）の複数の仕組みを識別した。
【００３７】
したがって、破壊されたスプライシングをもたらし得る多種多様な仕組みに少なくとも部分的に起因する関連する変化に関するＤＮＡではなくＲＮＡを直接試験することによってスプライスバリアントを識別するのが有利であり得る。
【００３８】
その上、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定のために本明細書で説明される様々な実施形態によるシステムおよび方法は、可能な腫瘍形成性スプライスバリアントを従来の技法の短所なしで簡単に判定するものである。上記で説明されたように、スプライスバリアント判定の従来の技法は、より侵襲性であり、患者からの複数の生検すなわち試料を採用することに少なくとも部分的に起因して計算負荷が重く、高くつくものである。むしろ、以下でさらに説明されるように、腫瘍の単一の試料が患者から得られ、健康な試料のベースライン参照と比較されてよい。対応する正常かつ健康な試料なしで単一の腫瘍試料を使用するこのタイプのバリアント識別により、分析の複雑さが低減され、正常かつ健康な試料では発現しない検証可能で異常なイベントに的が絞られる。
【００３９】
それゆえに、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定は、以下でさらに説明されるようなスプライス接合部位判定などのスプライスバリアント判定のための関連要因に的を絞って、初めからゲノム発現を判定する複雑な（計算負荷が重い）プロセスを回避するものである。別の言い方をすれば、単一構造重複（またはすべて）において捕捉する全体の転写物のスプライスグラフを構築するのではなく、所定の遺伝子のエクソンが集められ得る代替のやり方で、スプライスバリアントが接合部位レベルで評価され得る。
【００４０】
スプライス接合部位（接合部位とも名付けられる）は、ＤＮＡ参照とアラインしたとき、ＲＮＡ配列において出現しないＤＮＡ参照における座標としてスプライスバリアントを規定する。接合部位はアッセイによって判定されてよく、これは、特定の内容物（ＲＮＡアッセイのＲＮＡなど）に対する試験である。接合部位は、少なくとも図４に関連して以下でさらに論じられる。非限定的な例として、肺癌における突然変異をスキップするＭＥＴエクソン１４については、１３と１５の間の接合部位がスプライスバリアントであると判定され得る。
【００４１】
上記で導入されたように、ベースライン参照は、健康な非腫瘍試料からの接合部位の断面のコレクションである。健康な非腫瘍組織の様々な断面において観測される接合部位（またはスプライスバリアント）のこのベースライン参照は、調査中の腫瘍試料を配列決定するのに使用されるのと同じＲＮＡアッセイによって配列決定されてよい。ベースライン参照は、通常の生理学において捕捉するスプライシングイベントに使用されてよく、またはアッセイアーチファクトによってもたらされ得る。ベースライン参照を使用することにより、文献における転写アイソフォームのキュレーションの制限が補完され、ホルマリンで固定されてパラフィンに埋め込まれた（ＦＦＰＥ）保存状態または他の系統誤差におけるアーチファクトが低減する。ベースライン分析、またはベースライン参照のベースライン接合部位によるフィルター処理は、癌と関連する可能性が高い新規のスプライス接合部位を捕捉する。ベースライン参照のベースライン接合部位を、少なくとも図７に関連して以下でさらに論じる。
【００４２】
しかしながら、計算資源におけるこれらの節約は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれているBen-Hur,  V.、Denichenko,  P.、Siegfried,  Z.、Maimon,  A.,、Krainer,  A.、Davidson,  B.、およびKarni,  R.（２０１３年）、「S6K1  Alternative  Splicing  Modulates  Its  Oncogenic  Activity  and  Regulates  mTORC1」、Cell  Reports、３巻（１号）、１０３〜１１５頁に説明されているように、本質的に正常組織において発現される、それだけではないがＲＰＳ６ＫＢ１の特定のバリアントなど、癌に関連したスプライスバリアントを判定する際の困難さとバランスをとられてよいことが注目され得る。それにもかかわらず、上記で導入されたように、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定は、これらの難点よりも重要な、従来のツールに対する複数の利点を特徴とするものである。
例示の実施形態の概要
【００４３】
図２は、例示のスプライスバリアント判定サービス２０２の状況において本明細書で説明された特徴を実施することができるスプライスバリアント判定環境２００の一実施形態を示すものである。いくつかの実施形態では、スプライスバリアント判定環境２００は、スプライスバリアント判定サービス２０２、スプライスバリアント判定データメモリ２０４、ネットワーク２０６、ローカルデータプロバイダ２０８Ａ、リモートデータプロバイダ２０８Ｂ、参照プロバイダ２１０、ローカルデータコンシューマ２１２Ａ、およびリモートデータコンシューマ２１２Ｂを含む。いくつかの実施形態では、スプライスバリアント判定環境２００の様々な構成要素が、ネットワーク２０６を通じて互いに通信可能に相互接続される。スプライスバリアント判定環境２００は、多数または少数の異なる構成要素を含み得て、異なって構築され得る。例えば、スプライスバリアント判定サービス２０２に関連して、複数のデータメモリまたは他のコンピュータデバイスがあり得る。別の例として、スプライスバリアント判定環境２００の構成要素は、ネットワーク２０６を用いて、またはネットワークなしで、互いに通信してよい。
【００４４】
スプライスバリアント判定サービス２０２は、本明細書で説明されたプロセスを遂行することができる任意のシステムに対応し得るものである。スプライスバリアント判定サービス２０２は、１つまたは複数のコンピュータデバイスによって実施されてよい。例えば、スプライスバリアント判定サービス２０２は、メモリに記憶された１つまたは複数の命令を実行するための１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータデバイスと、ネットワーク２０６を通じてデータを送受信するための通信デバイスとによって実施され得る。いくつかの実施形態では、スプライスバリアント判定サービスは、ネットワークにわたる通信が可能な１つまたは複数のバックエンドサーバ上で実施される。他の実施形態では、スプライスバリアント判定サービス２０２は、ホスティングされたコンピュータ環境（例えば「クラウドコンピュータ環境」）において１つまたは複数の仮想マシンによって実施される。ホスティングされたコンピュータ環境に含まれ得る、１つまたは複数の、セットアップして公開されたコンピュータ資源は、コンピュータデバイス、ネットワークデバイス、および／または記憶デバイスを含み得る。
【００４５】
一態様では、スプライスバリアント判定サービス２０２が実施し得る１つまたは複数のアプリケーションが、個々に、または組合せで、試料接合部位を判定するステップ、ベースライン接合部位を判定するステップ、ベースライン参照を判定するステップ、フィルター処理された試料接合部位を検証するステップ、組織からＲＮＡリードを判定するステップ、接合部位のオーバラップを除去するステップ、フィルター処理された試料接合部位を検証するステップ、十分なオーバラップ数を判定するステップなどを含む、本明細書で説明されたスプライスバリアント判定機能を遂行する。これらのスプライスバリアント判定機能は、（それだけではないが）スプライスバリアント判定サービスが、試料のフィルター処理された接合部位または試料接合部位を判定するのと同時にベースライン参照のベースライン接合部位を判定するのではなく、最初に（ベースライン参照として収集された）ベースライン接合部位を判定して記憶し、次いで、試料のフィルター処理された接合部位を判定するとき、記憶されたベースライン接合部位を検索する場合など、異なる時間において、スプライスバリアント判定サービスの異なる態様によって遂行されてよい。別の態様では、スプライスバリアント判定サービス２０２は、試料接合部位、ベースライン接合部位を、スプライスバリアント判定データメモリ２０４において記憶するかまたは更新するように構成されてよい。いくつかの実施形態では、スプライスバリアント判定サービスは、ネットワークまたはネットワークベースのサービスプロバイダまたはサービスベンダに関連づけられてよい。
【００４６】
示された実施形態では、スプライスバリアント判定サービス２０２は、スプライスバリアント判定データメモリ２０４に対して通信可能に接続され得る。スプライスバリアント判定データメモリ２０４は、一般的には任意のリポジトリ、データベース、またはスプライスデータおよび関連するメタデータを記憶することができる情報記憶システムを含むことができる。スプライスバリアント判定データメモリ２０４に記憶されるスプライスデータは、（健康な試料の断面から判定された接合部位を含む）ベースライン参照のベースライン接合部位、単一の腫瘍試料からの腫瘍試料のデータ、健康な試料または非腫瘍試料の断面からの健康な試料のデータ、単一の腫瘍試料からの試料接合部位、および／またはベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアント判定によって処理された、フィルター処理された試料接合部位であり得る。スプライスデータは、リスト、ベクトル、アレイ、マトリクスなどの様々な形式またはデータ構造で記憶され得る。メタデータは、個々の試料もしくは接合部位、または接合部位の試料の集合の、フォーマット、セマンティクス、特徴、状態、起源、生成のデータ、入力の日付、注釈の日付、処理の日付、関連する断面（例えば地理的領域、年齢、性別、道徳上の群、ＦＦＰＥアーチファクト、ＦＦＰＥ品質、同族体アーチファクト、ポリメラーゼ通読アーチファクト、非腫瘍性代替スプライシング、組織タイプ）などを指示するために、それらに関連づけられ得る。例えば、メタデータは、共通のアッセイによって判定された単一の腫瘍試料からの試料接合部位を、共通のアッセイによって判定されたベースライン接合部位にリンクすることができる。その代わりに、またはそれに加えて、メタデータは、カテゴリまたは接合部位の集合（それだけではないが、ベースライン参照、ベースライン接合部位の集合、フィルター処理された試料接合部位の集合、または試料接合部位の集合など）における接合部位に関連した分類における位置を指示し得る。
【００４７】
ネットワーク２０６は、スプライスバリアント判定環境２００の内部の通信を確立するのに必要なネットワークのハードウェアとプロトコールの任意の適切な組合せを含み得る。例えば、ネットワーク２０６は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）などの私的ネットワークまたは広域ネットワーク（ＷＡＮ）、ならびに公開または非公開の有線または無線のネットワーク、衛星ネットワーク、ケーブルネットワーク、セルラーネットワーク、またはインターネットを含み得る。そのような一実施形態では、ネットワーク２０６は、ハードウェア（例えばモデム、ルータ、スイッチ、負荷分散装置、プロキシサーバなど）と、スプライスバリアント判定環境２００の内部でネットワークのリンクを確立するハードウェアによって実施されるソフトウェア（例えばプロトコールスタック、アカウントソフトウェア、ファイアウォール／セキュリティソフトウェアなど）とを含み得る。加えて、ネットワーク２０６は、スプライスバリアント判定環境２００の構成要素の間でデータを伝送するための様々な通信プロトコールのうち１つを実施してよい。
【００４８】
データプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂは、ローカルデータプロバイダ２０８Ａのサイト（それだけではないが、スプライスバリアント判定サービス２０２が、計器上のＲＮＡ配列決定からのデータも判定する装置上にあるとき、またはＲＮＡ配列決定からのそのようなデータを記憶するデバイス上にあるときなど）、またはネットワークもしくは他のリモートデータプロバイダ２０８Ｂのサイト（それだけではないが、ＲＮＡ配列決定からのデータを判定する装置またはＲＮＡ配列決定からのそのようなデータを記憶するデバイスがスプライスバリアント判定サービス２０２から遠く離れているときなど）などのホストに対応し得る。それゆえに、データプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂは、ネットワーク２０６を介して、またはネットワーク２０６の代わりに、スプライスバリアント判定サービス２０２との通信を助長することができる任意のコンピュータデバイス（複数可）に関連づけられ得る。そのようなコンピュータデバイスは、一般に、少し例を挙げると、配列決定装置、無線モバイルデバイス（例えばスマートフォン、ＰＤＡ、タブレット、着用可能コンピュータデバイスなど）、サーバ、デスクトップコンピュータ、ノートパソコン、およびコンピュータ化された装置を含むことができる。さらに、そのようなコンピュータデバイスは、上記で説明された通信を助長することができる任意のタイプのソフトウェア（ブラウザまたはモバイルアプリケーションなど）を実施することができる。
【００４９】
データコンシューマ２１２Ａ、２１２Ｂは、ローカルデータコンシューマ２０８Ａのサイト（それだけではないが、スプライスバリアント判定サービス２０２が他のサービスまたはプロセスが依拠する計器上にあるときなど）またはネットワークもしくは他のリモートデータプロバイダ２０８Ｂのサイト（それだけではないが、スプライスバリアント判定サービス２０２が、サービスまたはプロセスが依存する遠く離れた計器上にあるときなど）などのホストに対応し得る。データコンシューマ２１２Ａ、２１２Ｂは、臨床または研究のネットワークサイトのビジター、科学者、医者、生物情報科学者、技術者などに対応し得、ネットワーク２０６を介して、またはネットワーク２０６の代わりに、スプライスバリアント判定サービス２０２との通信を助長することができる任意のコンピュータデバイス（複数可）に関連づけられ得る。そのようなコンピュータデバイスは、一般に、少し例を挙げると、無線モバイルデバイス（例えばスマートフォン、ＰＤＡ、タブレット、着用可能コンピュータデバイスなど）、サーバ、デスクトップコンピュータ、ノートパソコン、測定器、およびコンピュータ化された装置を含むことができる。さらに、そのようなコンピュータデバイスは、上記で説明された通信を助長することができる任意のタイプのソフトウェア（ブラウザまたはモバイルアプリケーションなど）を実施することができる。
【００５０】
参照プロバイダ２１０は、それだけではないが、参照ゲノム、ＤＮＡ参照、ＲＮＡ参照、ＲＮＡ転写物のスプライスグラフ、およびサードパーティ接合部位など、スプライスバリアント判定サービス２０２に関係のある参照データを提供する、任意のエンティティに対応し得るものである。特定の実施形態では、参照プロバイダ２１０がスプライスバリアント判定サービス２０２に参照データを提供し、スプライスバリアント判定サービス２０２は、参照データを、スプライスバリアント判定データメモリ２０４に局所的に記憶する。参照プロバイダ２１０は、参照データベースネットワークサイトなどに対応してよく、ネットワーク２０６を介してスプライスバリアント判定サービス２０２との通信を助長することができる任意のコンピュータデバイスに関連づけられてよい。そのようなコンピュータデバイスは、一般に、少し例を挙げると、無線モバイルデバイス（例えばスマートフォン、ＰＤＡ、タブレット、着用可能コンピュータデバイスなど）、サーバ、デスクトップコンピュータ、ノートパソコン、測定器、およびコンピュータ化された装置を含むことができる。さらに、そのようなコンピュータデバイスは、上記で説明された通信を助長することができる任意のタイプのソフトウェア（ブラウザまたはモバイルアプリケーションなど）を実施することができる。
【００５１】
当業者なら、図２に与えられた構成要素および構成は本来例証であることを理解するであろう。それゆえに、本明細書で開示された機能を助長するための追加の構成要素、システム、およびサブシステムを含む、追加もしくは代替の構成要素および／または構成が利用され得る。
【００５２】
図３は図２の動作環境によって利用されるバリアントコールサービスの例示の構成要素の一実施形態を示すブロック図である。例示のコンピュータシステム３００は、本開示の態様を実施するために使用され得るコンピュータハードウェアおよびソフトウェアコンポーネントの機構を含む。当業者なら、コンピュータシステム３００が、図３に表されたものよりも多数（または少数）の構成要素を含み得ることを理解するであろう。しかしながら、可能にする開示を提供するために、これらの全般的に従来の構成要素のすべてを示す必要はない。
【００５３】
示された実施形態では、コンピュータシステム３００は、処理ユニット３０２、ネットワークインターフェース３０４、非一時的コンピュータ可読媒体ドライブ３０６、および入出力デバイスインターフェース３０８を含み、それらのすべてが通信バスによって互いに通信してよい。ネットワークインターフェース３０４は、１つまたは複数のネットワークあるいはコンピュータシステムに対する接続性を用いて、スプライスバリアント判定サービス２０２（図２を参照されたい）を提供し得る。したがって、処理ユニット３０２は、ネットワークを介して、他のコンピュータデバイス、システム、またはサービスから情報および命令を受け取り得る。処理ユニット３０２はまた、メモリ３１０と通信してよく、入出力デバイスインターフェース３０８を介して出力情報を提供してよい。入出力デバイスインターフェース３０８はまた、キーボード、マウス、デジタルペン、タッチスクリーンなどの様々な入力デバイスから入力を受け入れてよい。
【００５４】
メモリ３１０は、処理ユニット３０２が本開示の１つまたは複数の実施形態を実施するために実行し得るコンピュータプログラム命令を含有してよい。メモリ３１０は、一般に、ＲＡＭ、ＲＯＭおよび／または他の持続的すなわち非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含む。メモリ３１０は、スプライスバリアント判定サービス３０２の全般的な管理および動作において処理ユニット３０２が使用するコンピュータプログラム命令を供給するオペレーティングシステム３１４を記憶してよい。メモリ３１０は、本開示の態様を実施するための他の情報をさらに含み得る。
【００５５】
一実施形態では、メモリ３１０はインターフェースモジュール３１２を含む。インターフェースモジュール３１２は、１つまたは複数のユーザインターフェースの生成を助長するように構成され得、互換性のあるコンピュータデバイスを利用するデータプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂ、参照プロバイダ２１０、またはデータコンシューマ２１２Ａ、２１２Ｂは、ユーザインターフェースを通じて、スプライスバリアント判定サービス２０２との間で、スプライスデータ、参照データ、命令データ、メタデータなどを送信するかもしくは受信してよく、またはそうでなければスプライスバリアント判定サービス２０２と通信してよい。具体的には、インターフェースモジュール３１２は、スプライスデータの取得、スプライスデータの処理、スプライスデータの記憶、スプライスデータの送信、スプライスデータの注釈などを含む、本明細書で説明された処理機能を助長するように構成され得る。例えば、データプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂ、またはデータコンシューマ２１２Ａ、２１２Ｂは、特定のアッセイによって判定された接合部位を記憶するか、注釈するか、または検索してよく、その結果、ベースライン分析によるスプライスバリアントの判定が、一貫したアッセイの下で遂行されたものとして追跡され得る。これは、１つまたは複数の生成されたユーザインターフェースを介して行われ得る。ユーザインターフェースは、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）、ネットワークベースのユーザインターフェース、コンピュータプログラム、スマートフォンもしくは表プログラム、またはアプリケーション、タッチスクリーン、着用可能コンピュータデバイスインターフェース、コマンドラインインターフェース、ジェスチャ、音声、テキストインターフェースなど、あるいはそれらの任意の組合せとして実施され得る。その上、ユーザインターフェースは、試料が処理されるとき、候補腫瘍形成性イベントであるフィルター処理された試料接合部位を判定するため指示器などを含み得る。
【００５６】
加えて、メモリ３１０は、処理ユニット３０２によって実行され得るデータ処理モジュール３１６を含み得る。一実施形態では、データ処理モジュール３１６は本開示の態様を実施する。非限定的な例として、データ処理モジュール３１６は、スプライスデータ、命令、参照データ、またはメタデータを処理するように構成され得る。具体的には、データ処理モジュール３１６は、試料接合部位の判定、ベースライン接合部位の判定、フィルター処理された試料接合部位の判定、組織からのＲＮＡリードの判定、接合部位オーバラップの除去、フィルター処理された試料接合部位の検証、十分なオーバラップカウントの判定などを含む、本明細書で説明された機能を遂行するように構成され得る。
【００５７】
スプライスバリアント判定サービス２０２は、図３に関して本明細書で論じられたようなコンピュータシステム３００に存在する構成要素のうちいくつかまたはすべてによって実施され得ることに留意されたい。加えて、コンピュータシステム３００は、図３にない追加部品を含み得る。上記で説明されたモジュールまたは構成要素は、追加モジュールも含み得、または図２もしくは図３に表されていなくてよいコンピュータデバイスによって実施され得る。例えば、インターフェースモジュール３１２およびデータ処理モジュール３１６は図３では単一モジュールとして識別されているが、当業者なら、これらのモジュールが２つまたはそれよりも多いモジュールによって分散したやり方で実施され得ることを理解するであろう。また、スプライスバリアント判定サービス２０２およびスプライスバリアント判定データメモリ２０４は、図２では単一の構成要素として識別されているが、２つまたはそれよりも多い構成要素によって分散したやり方で実施され得ることを当業者なら理解するであろう。別の例として、コンピュータシステム３００およびその構成要素は、ネットワーク２０６を介して、またはネットワーク２０６の代わりに、データプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂまたはデータコンシューマ２１２Ａ、２１２Ｂとの間のデータ伝送を助長するように構成されたネットワークサーバ、アプリケーションサーバ、データベースサーバ、これらの組合せなどによって実施され得る。それゆえに、モジュールおよび構成要素の記述は本来例証である。
接合部位
【００５８】
上記で導入されたように、接合部位は特定のスプライスバリアントを識別するやり方の１つである。接合部位は、読取りアライナの上流で識別され、ＤＮＡゲノム上の座標によって識別される。正常な組織では、接合部位は、イントロン（切り出されたＤＮＡ配列の一部分）ではなく、エクソン間の境界において（スプライシングの後に保持されるＤＮＡ配列の一部分として）生じる。
【００５９】
図４は、（図２の）スプライスバリアント判定サービス２０２によって実施される接合部位分析の一実施形態を示す流れ図である。図４について付け加えると、ブロック４０２において接合部位分析４００のプロセスが始まり、ここで、スプライスバリアント判定サービスがＲＮＡリードを検索する。ＲＮＡリードは、シーケンサを使用するＲＮＡ試料の処理から判定されたヌクレオチド配列である。図２を参照して、ＲＮＡリードは、スプライスバリアント判定データメモリ２０４またはデータプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂから検索され得る。ＲＮＡリードは、組織試料から、具体的には（図７に関連してさらに論じられるように）健康な組織試料から、または（図６に関連してさらに論じられるように）腫瘍組織試料から判定されてよい。ＲＮＡリードは、以下でさらに論じられる配列決定方法によってシーケンサから判定されてよい。
【００６０】
図４について付け加えると、ブロック４０４においてＲＮＡリードがアラインされ得る。ＲＮＡリードは、ＲＮＡリードを検索して、ＲＮＡリードをＤＮＡ参照にアラインさせることによってアラインされてよい。アラインは、ＤＮＡ参照に対するＲＮＡリードの位置を判定する。図２を参照して、ＤＮＡ参照は参照プロバイダ２１０によってもたらされ得るが、アクセスの容易さのために、スプライスバリアント判定データメモリ２０４において局所的に記憶され（かつ検索され）てよい。図４に戻って、参照ＤＮＡ配列は、人間の１組の遺伝子の代表的な例としてのデジタル核酸シーケンスデータベースの参照ゲノムの一部分でよく、一般的には複数のドナーからの異なるＤＮＡ配列の半数のモザイクである。ＲＮＡリードおよびＤＮＡ配列は、それだけではないが、米国メリーランド州ボルティモアのジョンホプキンズ大学によって維持されているBowtie配列アライナ（全体が参照によって本明細書に組み込まれているLangmead  B、Trapnell  C、Pop  M、Salzberg  SL、「Ultrafast  and  memory-efficient  alignment  of  short  DNA  sequences  to  the  human  genome」、Genome  Biol  10:  R25.に関連してさらに説明される）、米国メリーランド州ボルティモアのジョンホプキンズ大学によって維持されているTop  Hat配列アライナ（全体が参照によって本明細書に組み込まれているTrapnell  C、Pachter  L、  Salzberg  SL.、「TopHat:  discovering  splice  junctions  with  RNA-Seq」、Bioinformatics  doi:10.1093/bioinformatics/btp120.に関連してさらに説明される）またはGitHub上に維持されているSTAR配列アライナ（全体が参照によって本明細書に組み込まれているDobin、Davis  CA、Schlesinger  F、Drenkow  J、Zaleski  C、Jha  S、Batut  P、Chaisson  M、Gingeras  TR.、「STAR:  ultrafast  universal  RNA-seq  aligner」、Bioinformatics.、２０１３年１月１日、２９巻（１号）：１５〜２１頁、doi:  10.1093/bioinformatics/bts635.  Epub、２０１２年１０月２５日に関連してさらに説明される）などのアライナを使用してアラインされてよい。ＤＮＡ配列にアラインされたＲＮＡリードにおけるギャップはスプライシングイベントを示しており、処理するべき接合部位のリストを作成するのに使用される。現在の実装形態では、アライナは下流の処理の前にスプライス接合部位を識別する。
【００６１】
ブロック４０６において、スプライスバリアント判定サービス２０２は、アラインされたＤＮＡ配列との比較に基づいて、ＲＮＡリードにおいて失われた連続位置があるかどうかを判定する。この判定は、上記で説明されたアライナを使用して遂行されてよい。また、上記で導入されたように、ＲＮＡリードからのこれらの失われた連続位置は、アラインされたＲＮＡ配列において除去されたＤＮＡ配列上の座標である。また、これらはエクソンとイントロンの間の境界において生じ得るものである。
【００６２】
ＲＮＡリードにおいて失われた連続領域があると判定された場合には、接合部位分析４００のプロセスはブロック４０８へ進み、ここで、ＲＮＡリードにおいて失われた連続領域は接合部位とされる。
【００６３】
ブロック４２０において、この接合部位はスプライスバリアント判定データメモリ２０４に記憶され得る。この接合部位は、染色体の注釈およびＲＮＡリードにおいて失われたＤＮＡ配列における位置とともに記憶されてよい。非限定的な例として、接合部位は、ＲＮＡリードにおいて失われた連続領域が位置１２と１５の間の染色体２１において生じるとの注釈として記憶され得る。
【００６４】
ＲＮＡリードにおいて失われた連続領域が検知されなければ、接合部位を判定するプロセスはブロック４１０へ進み、ＲＮＡリードから評価される部分は接合部位とされない。
【００６５】
ブロック４１６はブロック４０６、４０８、および４１０を包含し、総体として接合部位を判定するプロセスと名付けられてよく、後に、少なくとも図６および図７に関連して参照される。
腫瘍形成性接合部位の判定
【００６６】
図５は、（図２の）スプライスバリアント判定サービス２０２によって実施される、可能性のある腫瘍形成性接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。図５は、その前の図やその後の図においてより詳細に論じられるベースライン分析プロセスによる腫瘍形成性スプライスバリアントの判定の概要を示すものである。
【００６７】
可能性のある腫瘍形成性接合部位を判定するプロセス５００はブロック５０２において始まり、ここで試料接合部位が判定される。試料接合部位の判定は、図６に関連して、より詳細に論じられる。
【００６８】
図５に戻って、ブロック５０４において、ベースライン参照のベースライン接合部位が判定される。ベースライン接合部位の判定は、図７に関連して、より詳細に論じられる。
【００６９】
ブロック５０６において、フィルター処理された試料接合部位が判定される。フィルター処理された試料接合部位の判定は、図８に関連して、より詳細に論じられる。
試料の接合部位
【００７０】
上記で導入されたように、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定は患者からの単一の腫瘍試料を使用するものであり、有利には、患者からの複数の試料（腫瘍試料および健康な非腫瘍試料）を使用する従来のスプライスバリアント判定よりも簡単である。
【００７１】
図６は、スプライスバリアント判定サービス２０２によって実施される、試料接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００７２】
図６に示された試料接合部位５０２の判定は、ブロック６１２において始まり、ここで、患者からの単一の腫瘍試料を反映する腫瘍試料リードが検索される。単一の腫瘍試料は、異常なスプライスバリアントを表す異常な接合部位を識別するために、腫瘍組織から収集されてよい。特定の実施形態では、腫瘍試料リードは、配列決定方法に関連して以下でさらに論じられるように、単一の腫瘍試料の配列決定から従来のやり方で判定されてよい。特定の実施形態では、腫瘍試料リードは、データプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂから検索されてよく（図２に関連してさらに論じる）、データプロバイダは、それ自体が（それだけではないが、以下でさらに論じられる配列決定方法などによって）腫瘍試料リードを生成するものであるか、または腫瘍試料リードのリポジトリであって、ここからスプライスバリアント判定サービスが腫瘍試料リードを検索する。
【００７３】
図６について付け加えると、ブロック６１４において腫瘍試料のＲＮＡリードがＤＮＡ参照にアラインされる。腫瘍試料のＲＮＡリードはアライナによって判定されてよく、図４に関連して上記でさらに論じられている。
【００７４】
図６について付け加えると、ブロック６１６において、ブロック６１４の腫瘍試料のＲＮＡリードから試料接合部位が判定される。試料接合部位はアライナによって判定されてよく、図４に関連して上記でさらに論じられている。例証となる非限定的な例として、図４を参照すると、試料接合部位は、図４に関連して示されたような接合部位分析４００のプロセスのブロック４１６の接合部位判定と同じように判定されてよく、ブロック４０２において検索されたＲＮＡリードは、ブロック６１４において単一の試料から判定されたＲＮＡリードであり、ブロック４０８において接合部位とされたのはブロック６１６から判定された試料接合部位である。
【００７５】
図６について付け加えると、ブロック６１８において、試料接合部位は、スプライスバリアント判定サービス２０２によるさらなる検索および処理のために、図２に関連してさらに論じられたスプライスバリアント判定データメモリ２０４に記憶されてよい。
【００７６】
特定の実施形態では、試料接合部位の判定は、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定のセッション中に、スプライスバリアント判定サービス２０２によって遂行される他のプロセス（それだけではないが、フィルター処理された試料接合部位の判定および／またはベースライン接合部位の判定など）と一緒に生じ得る。他の実施形態では、試料接合部位の判定は、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定のセッション中に、スプライスバリアント判定サービス２０２によって遂行される他のプロセス（それだけではないが、フィルター処理された試料接合部位の判定および／またはベースライン接合部位の判定など）の後で、またはそれよりも早く、独立して遂行されてよい。
ベースライン接合部位
【００７７】
上記で導入されたように、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定が対象とするのは、主として腫瘍形成性イベントを要求する接合部位であり、新たなスプライスバリアントコールではない。新たなスプライスバリアントコールによってスプライスバリアント判定を遂行すると、複数の誤差が導入される可能性がある。これらの誤差には、腫瘍形成性イベントを要求するスプライスバリアントの精度の妨げになり得るアルゴリズムまたはアッセイの問題が含まれ得る。非限定的な例として、検討されている腫瘍試料がＦＦＰＥであるので、新たなスプライスバリアントコールにはアッセイまたは試料の準備で導入されたアーチファクトがあり得る。また、新たなスプライスバリアントコールが、ＲＮＡアライナを使用するリードアラインに頼るので、アラインアーチファクトがあり得る。
【００７８】
しかしながら、本質的に、トランスクリプトームが包括的に注釈されていないという問題があり、腫瘍進行と無関係なイベントが報告されることになる。これらは、特徴付けられていない正常かつ健康な細胞における実際の構成的イベントである可能性がある。アルゴリズムまたはアッセイの問題は、アッセイおよびアルゴリズムから誤差を除去することによって仮説的に扱うことができる可能性がある。しかしながら、トランスクリプトームのどれが正常かつ健康な組織のものであるのか実際に特徴付ける試行をせず、包括的に注釈しないので、誤差を除去するのは困難であろう。
【００７９】
その上、前述のように、一般的には、新たなスプライスバリアントコールは、一人の患者から少なくとも２つの試料（腫瘍組織から少なくとも１つの試料と健康な組織から少なくとも１つの試料）を必要とする。追加の試料を処理しなくてはならないことは、侵襲性で、臨床的に望ましくない。また、一人の患者のために多数の試料を試験すると、試薬のコストと配列決定のコストの両方が大幅に増加する。
【００８０】
それゆえに、ベースライン分析によって腫瘍形成性スプライスバリアントの判定を遂行すると、従来の新たなスプライスバリアントコールの、少なくともこれらの短所が克服され得る。ベースライン分析は、患者からの単一の試料を評価するとき参照として使用される、正常かつ健康な非腫瘍組織試料からのベースライン接合部位の多様な断面のベースライン参照を使用する分析を指す。これらの断面は、それだけではないが、地理的領域、年齢、性別、倫理学上の群、ＦＦＰＥアーチファクト、ＦＦＰＥ品質、同族体アーチファクト、ポリメラーゼ通読アーチファクト、非腫瘍代替スプライシング、組織タイプなど、任意数の範疇にわたり得る。断面は、特定の範疇の内部の変動であり得る。例えば、年齢の断面は、（それだけではないが）１歳、５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳、１０５歳、１１０歳など、異なる年齢にわたる様々なドナーからの試料を含み得る。さらなる例として、組織タイプの断面は、（それだけではないが）肺、副腎、膀胱、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、皮膚、脾臓などの様々な位置からの組織を含めて、異なる身体部分からの組織を含み得る。さらなる例として、ＦＦＰＥアーチファクトの断面は、（それだけではないが）脱アミノ、フラグメンテーション、塩基修飾、脱塩基部位などの異なる値を含み得る。さらなる例として、ＦＦＰＥ品質の断面は、（それだけではないが）異なるサイズのＲＮＡの断片を伴う異なる試料を含み得る。
【００８１】
その上、ベースライン参照は、様々な組織タイプの構成的スプライシングを捕捉するのに十分包括的であり得る。ベースライン参照における試料が、完全にオーバラップするスプライスバリアント発現を有し得ない多くの異なる組織タイプからのものであっても、図１０および図１１に関連して言及されるように、ベースライン分析が有効であるために、組織にわたって見いだされるスプライスバリアントのタイプにおいて意義深く十分なオーバラップがあるはずである。より包括的なベースライン参照を用いて、腫瘍形成性イベントとして誤識別されてしまう偽のスプライス接合部位または通常の生理的スプライス接合部位を減少するのはより効果的であり得る。
【００８２】
ベースライン分析によるスプライスバリアント判定は、アッセイ誤差または位置合わせ誤差を伴ってオーバラップする実際の腫瘍形成性スプライシングイベントも濾過されることになるので、感度が犠牲になる可能性がある。しかしながら、アラインおよび試料の処理が改善するにつれて、ベースライン参照も、正常かつ健康な（非腫瘍）試料からの正常な構成的接合部位を捕捉する一方で、改善された方法を反映するように更新され得る。
【００８３】
図７は、スプライスバリアント判定サービス２０２によって実施されるベースライン参照のベースライン接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。
【００８４】
図７に示されるベースライン接合部位５０４の判定は、ブロック７１２において始まり、ここで、健康な（非腫瘍組織）試料の断面から健康な試料のリードが検索される。前述のように、断面は、患者からの単一の試料を評価するとき参照として使用される健康な（非腫瘍組織）試料からの接合部位の任意の断面でよい。これらの断面は、それだけではないが、地理的領域、年齢、性別、倫理学上の群、ＦＦＰＥアーチファクト、ＦＦＰＥ品質、同族体アーチファクト、ポリメラーゼ通読アーチファクト、非腫瘍代替スプライシング、組織タイプなど、任意数の範疇にわたり得るものである。
【００８５】
特定の実施形態では、健康な試料のリードは、個々の健康な組織試料の配列決定から、従来のやり方で判定され得る。配列決定方法は以下でさらに論じられる。特定の実施形態では、健康な試料のリードは、データプロバイダ２０８Ａ、２０８Ｂから検索されてよく（図２に関連してさらに論じる）、データプロバイダは、それ自体が（それだけではないが、以下でさらに論じられる配列決定などによって）健康な試料のデータを生成するものであるか、または健康な試料のリードのリポジトリであって、ここからスプライスバリアント判定サービスが健康な試料のリードを検索する。
【００８６】
図７について付け加えると、ブロック７１４において健康な試料のリードが参照配列にアラインされる。健康な試料のリードはアライナによってアラインされてよく、図４に関連して上記でさらに論じられている。
【００８７】
ブロック７１６において、ベースライン接合部位は、ブロック７１４の健康な試料のＲＮＡリードから判定される。ベースライン接合部位はアライナによって判定されてよく、図４に関連して上記でさらに論じられている。例証となる非限定的な例として、図４を参照すると、ベースライン接合部位は、図４に関連して示されたような接合部位分析４００のブロック４１６の接合部位判定と同じように判定されてよく、ブロック４０２において検索されたＲＮＡリードは、ブロック７１２において健康な試料から判定された健康な試料のリードであり、ブロック４０８において接合部位とされたのはブロック７１６から判定されたベースライン接合部位である。
【００８８】
図７について付け加えると、ブロック７１８において、ベースライン接合部位の集合は、スプライスバリアント判定サービス２０２によるさらなる検索および処理のために、ベースライン参照として、図２に関連してさらに論じられたスプライスバリアント判定のデータメモリ２０４に記憶されてよい。
【００８９】
特定の実施形態では、ベースライン接合部位またはベースライン参照の判定はフィルター処理された試料接合部位の判定および／または試料接合部位の判定に先立って遂行されてよい。それゆえに、コンピュータ資源における節約が実現されるのは、ベースライン参照がスプライスバリアント判定データメモリ２０４から必要に応じて検索されるときであり得、ベースライン分析によって、進行中に判定されるとき、またはスプライスバリアント判定の各セッションで臨時に判定されるときではない。
【００９０】
その上、特定の実施形態では、ベースライン接合部位の判定は、スプライスバリアント判定データメモリ２０４から、記憶されたベースライン参照を検索することを含み得る。さらなる実施形態では、ベースライン参照の判定およびベースライン接合部位の構成は、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアント判定のセッション中に一緒に生じ得る。
フィルター処理された試料接合部位
【００９１】
ベースライン分析によるスプライスバリアント判定は、フィルター処理された試料接合部位を生成する。これらのフィルター処理された試料接合部位は、可能性のある腫瘍形成性スプライスバリアントとして試料接合部位を指示し得るものである。フィルター処理された試料接合部位は、試料接合部位とベースライン接合部位が同一のアッセイを使用して判定されるとき、ベースライン接合部位とオーバラップしない試料接合部位でよい。また、接合部位が健康な非腫瘍形成性組織に由来するものであると知られていないために、フィルター処理された試料接合部位は、新規のものとして、したがって場合により腫瘍形成性として識別され得、または癌に関連づけられる可能性がある。これらのフィルター処理された試料接合部位は、スプライスバリアントおよび薬物治療の可能性のある標的として識別される可能性がある。
【００９２】
特定の実施形態では、フィルター処理された試料接合部位は、フィルター処理された試料接合部位が誤っていないことを確証する証拠によって付加的に検証されてよい。このタイプのフィルター処理された試料接合部位は、図９に関連してさらに論じられる検証済みのフィルター処理された試料接合部位であり得る。
【００９３】
追加の実施形態では、フィルター処理された試料接合部位は、上記で論じられたようにベースライン接合部位とオーバラップしないことに加えて、サードパーティ接合部位とオーバラップしない試料接合部位として判定されてよい。このタイプのフィルター処理された試料接合部位は、ベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位と名付けられ得、図１０に関連してさらに論じられる。また、図１０に関連してさらに論じられるように、このタイプのフィルター処理された試料接合部位は付加的に検証されてよく、検証されたベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位と名付けられ得る。
【００９４】
図８は、スプライスバリアント判定サービス２０２によって実施される、フィルター処理された試料接合部位を判定するステップの一実施形態を示す流れ図である。図７に示された、フィルター処理された試料接合部位５０６の判定は、ブロック８１２で始まり、ここで試料接合部位が検索される。試料接合部位の判定は、図６に関連してさらに論じられている。また、図２および図６に関連してさらに論じられたように、試料接合部位はスプライスバリアント判定データメモリ２０４から検索されてよい。
【００９５】
図８に戻って、ブロック８１４では、（ブロック８１２の試料接合部位と共通のアッセイを使用して判定された）ベースライン接合部位のベースライン参照が検索される。ベースライン参照の判定は、図７に関連してさらに論じられる。また、図２および図７に関連してさらに論じられたように、ベースライン参照はスプライスバリアント判定データメモリ２０４から検索されてよい。
【００９６】
ブロック８１６において、スプライスバリアント判定サービス２０２は、試料接合部位がベースライン接合部位とオーバラップするかどうかを判定する。特定の実施形態では、この判定は、各試料接合部位の値をベースライン参照のベースライン接合部位の各々と比較して、それらがオーバラップするかどうかを判定することに基づくものでよい。オーバラップは、比較されている接合部位の間に同一の値または座標があるかどうかを判定することを指す。非限定的な例として、これは、第２の試料接合部位がベースライン接合部位の各々と比較される前に第１の試料接合部位がベースライン接合部位の各々と比較される場合に行われてよい。
【００９７】
ブロック８１６について付け加えると、特定の実施形態では、ベースライン参照のすべてのベースライン接合部位は、ブロック８１６で試料接合部位とのオーバラップがあるかどうかを判定するために個々に参照されてよい。しかしながら、さらなる実施形態では、参照されるベースライン接合部位は、ブロック８１２において検索された試料接合部位の座標に依拠するものでよい。具体的には、ブロック８１２において検索された試料接合部位とオーバラップする可能性があるベースライン接合部位が参照され、ブロック８１２において判定された試料接合部位とオーバラップする可能性がないベースライン接合部位は参照されない。非限定的な例として、特定の染色体の試料接合部位が、その染色体のベースライン接合部位と比較されてよい。有利には、試料接合部位の座標に依拠する参照されたベースライン接合部位があると、試料接合部位の座標とは無関係にベースライン参照のすべてのベースライン接合部位を検索するかまたは処理するのと比較して、計算上の効率が改善され得る。
【００９８】
試料接合部位がベースライン参照のベースライン接合部位とオーバラップすると判定された場合には、プロセスはブロック８２２へ進み、ここで、オーバラップしている試料接合部位は、フィルター処理された試料接合部位ではなくオーバラップする試料接合部位として収集される。
【００９９】
試料接合部位がベースライン参照のベースライン接合部位のいずれともオーバラップしないと判定された場合には、プロセスはブロック８１８へ進み、ここで、ベースライン接合部位のいずれともオーバラップしない試料接合部位は、フィルター処理された試料接合部位として収集される。
【０１００】
ブロック８２４は、ベースライン接合部位とオーバラップする試料接合部位を除去することによってフィルター処理された試料接合部位を収集する総体のステップを指すものであり、ブロック８１６、ブロック８１８、およびブロック８２２の総体としての言い換えである。ブロック８２２は、後に、図１０に関連して参照され得る。
【０１０１】
ブロック８２０において、フィルター処理された試料接合部位が検証される。フィルター処理された試料接合部位の検証は、図９に関連してさらに論じられる。特定の実施形態では、フィルター処理された試料接合部位の検証は（ブロック８２０の点線によって示されるように）任意選択でよく、フィルター処理された試料接合部位は、図９に関連して説明されるように検証なしで使用され得る。あるいは、検証は、それだけではないが、接合部位が判定された後の任意の時点など、ベースライン分析によってスプライスバリアントを判定するプロセスの他の部分で行われてよい。
【０１０２】
図８について付け加えると、ブロック８３０において、フィルター処理された試料接合部位は、スプライスバリアント判定サービス２０２によるさらなる検索および処理のため、またはデータコンシューマ２０８Ａ、２０８Ｂによるさらなる検索および処理のために、図２に関連してさらに論じられたスプライスバリアント判定データメモリ２０４に記憶されてよい。
検証
【０１０３】
接合部位検証は、いかなるベースライン接合部位ともオーバラップしないフィルター処理された試料接合部位が誤りであるかどうかを判定するために遂行され得る。多くの実施形態では、接合部位検証は、図８のブロック８２４によって判定された、フィルター処理された試料接合部位に対して遂行されてよく、ここで、ベースライン接合部位とオーバラップしない試料接合部位は、フィルター処理された試料接合部位として収集される。そうすると、試料接合部位が検証される場合には、フィルター処理された試料接合部位の数が試料接合部位の数よりも少ない可能性があるので有利であり得る。しかしながら、さらなる実施形態は、試料接合部位および濾過されていない試料接合部位の検証、ならびに／あるいは試料接合部位とフィルター処理された試料接合部位の両方の検証も企図するものである。
【０１０４】
前述のように、接合部位は、単一の試料からの少なくとも１つのＲＮＡリードによって判定され得る。配列決定方法に関連して以下でさらに説明されるように、試料からのＲＮＡは、配列決定中に増幅されるかまたは転写されてよい。増幅されたＲＮＡは、配列決定中に、信号対雑音比を向上するように利用され得る。加えて、増幅されたＲＮＡからのリードはＲＮＡからの特定のリードを確認するため、または支持するために利用され得る。同様に、増幅されたＲＮＡからのリードは、ＲＮＡリードから判定された特定の接合部位の精度を確認するかまたは支持する、支持接合部位リードでよい。これらの支持接合部位リードは、ＲＮＡリードから判定された特定の接合部位を伴う冗長な追加のリードからの接合部位を含むリードでよい。それゆえに、特定の接合部位の検証は、支持接合部位リードの閾値数が、検証されている特定の接合部位に関して判定されるとき、判定されてよい。
【０１０５】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、フィルター処理された試料接合部位を検証するステップの特徴を示す概念図である。図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、支持接合部位リード１２０２は分割されたリードでよく、アラインメントは、検証されている接合部位の開始１２０４において終了し、検証されている接合部位の他の端部１２０６から再び開始する。これは、１２１０で、検証されている接合部位にアラインメントが及ぶかどうかを評価し、１２１２で、検証されている接合部位の一端においてアラインメントが終了するかどうかを評価し、かつ／または１２１４で、検証されている接合部位の他端からアラインメントが開始するかどうかを評価することによって判定されてよい。
【０１０６】
それゆえに、図１２Ａに示されるように、接合部位の範囲内にリードのいずれかのアラインされた領域があれば、リードは、支持する接合部位リードとしてカウントされないわけではない。また、別の言い方をすれば、図１２Ｂに示されるように、エクソン１２２０は、検証されている接合部位の中央においてアラインしない、検証されている接合部位の終端に対して、アラインしなければならない。
【０１０７】
特定の実施形態では、接合部位は、スコアが、検証されている接合部位に起因すると考えることによって検証されてよい。式
スコア＝（ｍｉｎ（ｕ，Ｍ）−Ｎ）×１／（Ｍ−Ｎ）
で表現されるように、スコアは０〜１でよく、各支持接合部位のリードに０．１点が加算され、ここで、Ｍ＝検証されている接合部位に及ぶリードの最大数（デフォルトは１０）、Ｎ＝検証されている接合部位に及ぶリードの最小数（デフォルトは０）、ｕ＝支持接合部位リードの数である。この式に採用されているように、検証されている接合部位に関して少なくとも１０の支持接合部位リードが判定されたとき、検証が達成される。
【０１０８】
図９は、スプライスバリアント判定サービス２０２によって実施される、接合部位を検証するステップの一実施形態を示す流れ図である。図９に示された接合部位９００を検証するプロセスは、ブロック９０２において始まり、ここで、試料からの第１のＲＮＡリードから接合部位が判定される。特定の実施形態では、試料は、図６に関連してさらに上記で論じられた単一の試料でよく、接合部位は、ブロック６１２、６１４、および６１６に関連して論じられたように単一の試料から判定されてよい。また、検証分析されている接合部位は、第１のＲＮＡリードから判定された接合部位でよい。また、接合部位を判定するプロセスは、図４に関連してさらに論じられている。
【０１０９】
図９について付け加えると、ブロック９０４において、試料から、ＲＮＡリードからの追加の接合部位が判定されてよい。上記で論じられたように、単一の試料が複数のＲＮＡリードを有し得る。これらのＲＮＡリードは、第１のリードに対して冗長な接合部位を含む支持接合部位リードとして利用されてよい。また、試料は、図６に関連してさらに上記で論じられた単一の試料でよく、接合部位は、ブロック６１２、６１４、および６１６に関連して論じられたように単一の試料から判定されてよい。その上、接合部位を判定するプロセスは、図４に関連してさらに論じられている。
【０１１０】
図９について付け加えると、ブロック９０６において、スプライスバリアント判定サービス２０２は、追加のＲＮＡリードからの追加の接合部位から、十分なオーバラップカウントがあるかどうかを判定する。十分なオーバラップカウントは、オーバラップする支持接合部位リードの（それだけではないが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のオーバラップする支持接合部位リードなどの）閾値カウントでよく、これから検証が行われ得る。
【０１１１】
十分なオーバラップカウントがあると判定された場合には、プロセスはブロック９０８へ進み、ここで、ブロック９０２において参照された接合部位は、検証されたもの（すなわち検証済みのフィルター処理された試料接合部位）とされる。
【０１１２】
十分なオーバラップカウントがないと判定された場合には、プロセスはブロック９０４へ戻り、ここで、試料から、ＲＮＡリードからの追加の接合部位が判定されてよい。
例示的実施形態
【０１１３】
図１０は、可能性のある腫瘍形成性接合部位を判定するステップの一実施形態の概念図を伴う流れ図である。図１０の流れ図は、ベースライン分析によって、非癌性スプライスバリアントを表すサードパーティ接合部位が、スプライスバリアント判定の一部として利用される一実施形態を示すものである。非癌性スプライスバリアントを表すこれらのサードパーティ接合部位は、健康な試料の断面（非腫瘍組織）試料から判定されるベースライン接合部位と対照的に、新たなスプライスバリアントコールから判定されてよい。
【０１１４】
流れ図１０００には、流れ図１０００のブロックの各々を表す図解１０５０が並置されている。
【０１１５】
図１０に示された腫瘍形成性スプライスバリアントの判定のプロセス１０００は、ブロック６１４において始まり、ここで、図６に関連して上記で論じられたように、単一の腫瘍試料からのＲＮＡリードがアラインされる。
【０１１６】
図６に関連して上記でさらに論じられたように、ブロック６１６において、ブロック６１４のＲＮＡリードから試料接合部位が判定される。
【０１１７】
ブロック１００２において、サードパーティ接合部位とオーバラップする試料接合部位が除去される。上記で論じられたように、非癌性スプライスバリアントを表すこれらのサードパーティ接合部位は、健康な試料の断面（非腫瘍組織）試料から判定されるベースライン接合部位のベースライン参照と対照的に、新たなスプライスバリアントコールから判定されてよい。ブロック１００２による、サードパーティ接合部位とオーバラップする試料接合部位の除去は、図８に関連して論じられたような、試料接合部位とベースライン接合部位のオーバラップを除去するプロセス８２４に似たやり方で遂行されてよいが、ここでは、（図８の）ベースライン接合部位はサードパーティ接合部位であり、（図８の）フィルター処理された試料接合部位は、サードパーティ接合部位とオーバラップする試料接合部位の除去の後に残存するサードパーティのフィルター処理された試料接合部位である。
【０１１８】
図１０について付け加えると、ブロック１００４において、ベースライン接合部位とオーバラップするサードパーティのフィルター処理された試料接合部位を除去することにより、ベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位が収集される。ブロック１００４による、ベースライン接合部位とオーバラップするサードパーティのフィルター処理された試料接合部位の除去は、図８に関連して論じられたような、試料接合部位とベースライン接合部位のオーバラップを除去するプロセス８２４に似たやり方で遂行されてよいが、ここでは、（図８の）試料接合部位はサードパーティのフィルター処理された試料接合部位であり、（図８の）フィルター処理された試料接合部位は、ベースライン接合部位とオーバラップするサードパーティのフィルター処理された試料接合部位の除去の後に残存するベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位である。
【０１１９】
図１０について付け加えると、ブロック１００６において、ベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位が検証される。ブロック１００６による、ベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位の検証は、図９に関連して論じられたような、接合部位を検証するプロセス９００に似たやり方で遂行されてよいが、ここでは、（図９の）第１のＲＮＡリードからの接合部位はベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位であり、ブロック９０８において検証済みとされた接合部位は、検証済みのベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位である。
【０１２０】
ブロック１００８において、検証されたベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位が記憶され得る。検証されたベースラインサードパーティの記憶は、図８のブロック８３０に関連して論じられた、フィルター処理された試料接合部位の記憶と似たやり方で遂行されてよいが、ここでは、記憶されるのは、フィルター処理された試料接合部位ではなく、検証済みのベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位である。検証済みのベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位は、それだけではないが、示された実施形態におけるバリアントコールフォーマット（ＶＣＦ）ファイルなどの任意のデータ構造で記憶されてよい。ＶＣＦファイルは、少なくともメタ情報ライン、ヘッダライン、およびデータラインを含有しており、それぞれが、少なくとも１つの検証済みのフィルター処理された試料接合部位に関連した座標を含有している。
【０１２１】
前述のように、フィルター処理された試料接合部位（上記で論じられたような、検証済みのベースラインサードパーティのフィルター処理された試料接合部位など）は、上記で論じられたように、サードパーティ接合部位とオーバラップせずベースライン接合部位ともオーバラップしない試料接合部位として判定されてよい。ブロック１００２、ブロック１００４、およびブロック１００６は、図１０の流れ図１０００の中で特定の順序で生じているが、フィルター処理された試料接合部位を判定するステップの任意のポイントにおいて、それに応じて調節された従属性を伴って生じ得るものである。
【０１２２】
図１１は、図１０の実施形態からの実験結果を示す表である。図１１に示されるように、スプライスバリアント（接合部位）は、組織タイプ（肺、副腎、膀胱、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、皮膚、および脾臓）の断面にわたる７１の異なる相互検証された正常かつ健康な（非腫瘍）試料に対してプロットされている。試験すべき１０の試料からなる７つの異なる相互検証の組を生成し、残りの６１からベースライン参照を生成した。最初にサードパーティ接合部位のオーバラップを除去し、次いでベースライン接合部位のオーバラップを除去することによって濾過した。図１１に示されるように、ベースライン接合部位のオーバラップを除去した後のスプライスバリアントの数は、サードパーティ接合部位のオーバラップを除去した後のものよりも少ない。これは、新規の接合部位（フィルター処理された試料接合部位、または候補腫瘍形成性イベント）の減少が、サードパーティ接合部位とオーバラップする試料接合部位の除去と比較して、より顕著であることを指示している。実際、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアントの判定を受けた後にフィルター処理された試料接合部位として残った新規の接合部位はほとんどなかった。
検知の性能／限界
【０１２３】
ＲＮＡにおけるバリアントの検知限界は、発現した特定のスプライスバリアントに加えて、影響を受けた転写物がどれだけ発現したかということの関数であり得る。ＲＮＡの１ナノグラム当たりの融合コピー数における有効な検知限界は、特定のＦＦＰＥ試料においてスプライスバリアント転写物がどれだけ発現するかを推定するためにデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して検知され得る。
【０１２４】
ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアント判定の性能を実証するために、３つのスプライスバリアント（ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＡＲｖ７、およびＭＥＴエクソンの１４スキッピング）がＦＦＰＥ腫瘍試料において識別され、次いでｄｄＰＣＲを使用して測定された。スプライスバリアントの発現レベルが十分に大きい場合には、これらの試料はＲＮＡの１ナノグラム当たり２つのコピーまで滴定された。このデータから、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアント判定は、ＲＮＡの１ナノグラム当たりわずか０．１３のコピーで少なくとも１つのスプライスバリアント（ＥＧＦＲｖｉｉｉ）をコールした。ＲＮＡの１ナノグラム当たり５つのコピーでは、ベースライン分析による腫瘍形成性スプライスバリアント判定によって、３つのスプライスバリアントのすべてが正確に識別される。
配列決定方法
【０１２５】
本明細書で説明された方法は、様々な核酸の配列決定技術とともに使用され得るものである。特に適用可能な技術は、核酸が、アレイにおいて、相対位置が変化しないように固定配置で付加され、アレイが繰り返し撮像されるものである。１つのヌクレオチド塩基タイプを別のものから区別するために使用される、例えば異なる標識と符合する異なる色チャネルにおいて画像が取得される実施形態には、特に適用可能である。いくつかの実施形態では、目標の核酸のヌクレオチド配列を判定するプロセスは自動プロセスであり得る。望ましい実施形態は合成による配列決定（「ＳＢＳ」）技術を含む。
【０１２６】
ＳＢＳ技術は、一般に、鋳型鎖に対してヌクレオチドを繰り返し付加することによる発生期の核酸鎖の酵素伸長を包含している。ＳＢＳの従来の方法では、各デリバリにポリメラーゼがある状態では、単一のヌクレオチドモノマーが標的ヌクレオチドに与えられ得る。しかしながら、本明細書で説明された方法では、デリバリにポリメラーゼがある状態で、複数のタイプのヌクレオチドモノマーが標的核酸に与えられ得る。
【０１２７】
ＳＢＳは、ターミネータ部分を有するヌクレオチドモノマーまたはターミネータ部分がないヌクレオチドモノマーを利用することができる。ターミネータがないヌクレオチドモノマーを利用する方法は、例えば、以下でより詳細に説明されるように、ピロ配列決定法と、ガンマ−リン酸塩で標識されたヌクレオチドを使用する配列決定法とを含む。ターミネータがないヌクレオチドモノマーを使用する方法では、各サイクルにおいて付加されるヌクレオチドの数は一般に可変であり、鋳型配列およびヌクレオチドデリバリのモードに依拠するものである。ターミネータ部分を有するヌクレオチドモノマーを利用するＳＢＳ技術向けには、ターミネータは、ジデオキシヌクレオチドを利用する従来のＳａｎｇｅｒ配列決定法で使用されるような配列決定の条件下では効果的に不可逆であり得、またはＳｏｌｅｘａ（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によって開発された配列決定法の場合のように可逆的であり得る。
【０１２８】
ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチドモノマーまたは標識部分がないヌクレオチドモノマーを利用することができる。それゆえに、取り込みイベントは、標識の蛍光などの標識の特性、分子量または分子電荷などのヌクレオチドモノマーの特性、ピロリン酸塩の放出などヌクレオチドの取り込みの副産物、などに基づいて検知され得る。配列決定試薬の中に２つまたはそれよりも多い異なるヌクレオチドが存在する実施形態では、異なるヌクレオチドは互いに識別可能であり得、あるいは、使用されている検知技術の下で２つまたはそれよりも多い異なる標識が識別不可能なこともある。例えば、配列決定試薬の中にある異なるヌクレオチドは、異なる標識を有し得、Ｓｏｌｅｘａ（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によって開発された配列決定法によって例示されているような適切な光学部品を使用して識別され得る。
【０１２９】
望ましい実施形態はピロ配列決定技術を含む。特定のヌクレオチドが発生期の鎖に組み込まれるので、ピロ配列決定法によって無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出が検知される（Ronaghi,  M.、Karamohamed,  S.、Pettersson,  B.、Uhlen,  M.およびNyren,  P.（１９９６年）「Real-time  DNA  sequencing  using  detection  of  pyrophosphate  release.」  Analytical  Biochemistry２４２巻（１号）、８４〜９頁、Ronaghi,  M.（２００１年）「Pyrosequencing  sheds  light  on  DNA  sequencing.」  Genome  Res.  １１巻（１号）、３〜１１頁、Ronaghi,  M.、Uhlen,  M.およびNyren,  P.（１９９８年）「A  sequencing  method  based  on  real-time  pyrophosphate.」Science２８１巻（５３７５号）、３６３頁、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号および米国特許第６，２７４，３２０号、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。ピロ配列決定法では、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによって直ちにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換されることによって検知され得、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ生成の光子によって検知される。配列決定される核酸はアレイの特徴に付加され得、アレイは、ヌクレオチドをアレイの特徴に組み込むことによって生成される化学発光（chemiluminscent）信号を捕捉するために撮像され得る。アレイが特定のヌクレオチドタイプ（例えばＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）を用いて処置された後に画像が取得され得る。それぞれのヌクレオチドタイプを付加した後に得られる画像は、アレイにおいて検知される特徴によって異なることになる。画像におけるこれらの相違は、アレイ上の特徴の異なる配列内容を反映するものである。しかしながら、各特徴の相対的位置は画像の中で変わらないはずである。画像は、本明細書で説明された方法を使用して、記憶され、処理され、かつ分析され得る。例えば、それぞれの異なるヌクレオチドタイプを用いてアレイを処置した後に得られる画像は、可逆性ターミネータに基づく配列決定法用の異なる検出チャネルから取得された画像に関して本明細書で例示されたのと同一のやり方で扱われ得る。
【０１３０】
ＳＢＳの別の例示的タイプでは、サイクル配列決定法は、例えばＷＯ０４／０１８４９７および米国特許第７，０５７，０２６号において説明されているような例えば開裂性または光退色性の染料標識を含有している可逆性のターミネータヌクレオチドを段階的に追加することによって達成され、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。この手法はＳｏｌｅｘａ（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）によって商品化され、ＷＯ９１／０６６７８およびＷＯ０７／１２３，７４４において説明されており、これらの各々が参照によって本明細書に組み込まれる。終止の反転と蛍光性標識の開裂の両方が可能な、蛍光性に標識されたターミネータの可用性により、効率的で周期的な可逆性終止（ＣＲＴ）の配列決定が助長される。ポリメラーゼはまた、これらの修正されたヌクレオチドを効率的に組み込み、かつそこから伸長するために、共操作され得る。
【０１３１】
好ましくは、可逆性ターミネータに基づく配列決定の実施形態では、標識は、実質的にＳＢＳ反応状態での伸長を阻止しない。しかしながら、検知標識は、例えば開裂または劣化によって除去可能であり得る。画像は、アレイの核酸特徴に標識を組み込んだ後に取り込まれ得る。特定の実施形態では、各サイクルが、アレイに対して４つの異なるヌクレオチドタイプを同時にデリバリすることを包含しており、それぞれのヌクレオチドタイプがスペクトル的に別個の標識を有する。次いで、それぞれが４つの異なる標識のうち１つ向けの選択的検知チャネルを使用して、４つの画像が取得され得る。あるいは、異なるヌクレオチドタイプが順次に追加され得、各追加ステップの間にアレイの画像が取得され得る。そのような実施形態では、各画像は、特定のタイプのヌクレオチドを組み込んだ核酸特徴を示すはずである。異なる画像には、各特徴の異なる配列内容による異なる特徴が、存在するかまたは存在しないことになる。しかしながら、特徴の相対位置は画像の中で変わらないはずである。そのような可逆性のターミネータ−ＳＢＳ方法から取得された画像は、本明細書で説明されたように記憶され、処理されて、分析され得る。画像取込みステップに続いて標識が除去され得、後続のヌクレオチド追加および検知のサイクルのために、可逆性のターミネータ部分が除去され得る。標識が、特定のサイクルにおいて検知された後に、後続のサイクルに先立って除去されると、サイクル間のバックグラウンド信号およびクロストークが低減するという利点がもたらされ得る。有効な標識および除去方法の例が以下で説明される。
【０１３２】
特定の実施形態では、ヌクレオチドモノマーのうちいくつかまたはすべてが可逆性のターミネータを含み得る。そのような実施形態では、可逆性ターミネータ／開裂性蛍光体は、３’エステル結合（Metzker,  Genome  Res.  １５巻、１７６７〜１７７６頁（２００５年）、参照によって本明細書に組み込まれる）によってリボース部分に連結された蛍光体を含み得る。他の手法は、蛍光標識の開裂からターミネータの化学的性質を分離している（Ruparelら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０２巻、５９３２〜７頁（２００５年）、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。Ruparelらは、ブロック伸長に小さい３’アリル基を使用するがパラジウム触媒を用いる短い処置によって容易に非ブロック化され得る、可逆性ターミネータの開発を説明した。フルオロフォアが、長波長ＵＶ光に３０秒露光することによって容易に開裂され得る光開裂性リンカによって塩基に付加された。したがって、二硫化物還元または光切断のいずれかが開裂性リンカとして使用され得る。可逆性ターミネーションの別の手法には、ｄＮＴＰ上に大きな染料を配置した後に結果として起きる自然なターミネーションを使用するものがある。ｄＮＴＰ上の帯電した大きな染料の存在が、立体障害および／または静電気障害による有効なターミネータとして働き得る。染料が除去されなければ、１つの取り込みイベントの存在が、さらなる取り込みを防止する。染料の開裂が蛍光体を除去し、ターミネーションを効果的に反転する。修正されたヌクレオチドの例は、米国特許第７，４２７，６７３号および米国特許第７，０５７，０２６号にも説明されており、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
本明細書で説明された方法およびシステムとともに利用され得る追加の例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、米国特許出願公開第２００６／０１８８９０１号、米国特許第７，０５７，０２６号、米国特許出願公開第２００６／０２４０４３９号、米国特許出願公開第２００６／０２８１１０９号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０６５８１４、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０６４１９９、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０７／０１０，２５１、米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５号および米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７２号に説明されており、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態は、４つ未満の異なる標識を使用する、４つの異なるヌクレオチドの検知を利用することができる。例えば、ＳＢＳは、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号の組み込まれた資料の中で説明されている方法およびシステムを利用して遂行され得る。第１の例として、１対のヌクレオチドタイプは、同一の波長において検知され得るが、対の一方の要素の強度の他方の強度との比較における相違に基づいて、または、対の他方の要素に関して検知された信号と比較して、（例えば化学的修飾、光化学的修飾または物理的修飾による）信号の明白な出現もしくは消滅をもたらす対の一方の要素の変化に基づいて、識別され得る。第２の例として、４つの異なるヌクレオチドタイプのうち３つが特定の条件下で検知され得るが、第４のヌクレオチドタイプは、それらの条件下で検知可能な標識がないか、または（例えばバックグラウンド蛍光などによって）それらの条件下での検知が最小限になる。最初の３つのヌクレオチドタイプの核酸への取り込みは、それぞれの信号の存在に基づいて判定され得、第４のヌクレオチドタイプの核酸への取り込みは、何らかの信号の不在または最小限の検知に基づいて判定され得る。第３の例として、１つのヌクレオチドタイプが２つの異なるチャネルで検知される標識（複数可）を含み得、他のヌクレオチドタイプはチャネルのうちの１つ以下で検知される。前述の３つの例示的構成は、相互排除とは見なされず、様々な組合せにおいて使用され得るものである。すべての３つの例を組み合わせる例示的実施形態は、第１のチャネルで検知される第１のヌクレオチドタイプ（例えば第１の励起波長で励起されたとき第１のチャネルで検知される標識を有するｄＡＴＰ）と、第２のチャネルで検知される第２のヌクレオチドタイプ（例えば第２の励起波長で励起されたとき第２のチャネルで検知される標識を有するｄＣＴＰ）と、第１のチャネルと第２のチャネルの両方で検知される第３のヌクレオチドタイプ（例えば第１の励起波長および／または第２の励起波長によって励起されたとき両方のチャネルで検知される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ）と、いずれのチャネルにも検知されない、または検知が最小限になる、標識がない第４のヌクレオチドタイプ（例えば標識がないｄＧＴＰ）とを使用する蛍光ベースのＳＢＳ法である。
【０１３５】
さらに、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号の組み込まれた資料の中で説明されているように、配列決定データは単独チャネルを使用して取得され得る。そのような、いわゆる、１つの染料の配列決定手法では、第１のヌクレオチドタイプが標識されるが、第１の画像が生成された後に標識が除去され、第１の画像が生成された後でなければ第２のヌクレオチドタイプは標識されない。第３のヌクレオチドタイプは第１の画像と第２の画像の両方でその標識を保持し、第４のヌクレオチドタイプはどちらの画像でも標識のないままである。
【０１３６】
いくつかの実施形態は、ライゲーション技術による配列決定法を利用することができる。そのような技術は、オリゴヌクレオチドを組み込んでそのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを識別するためにＤＮＡリガーゼを利用する。オリゴヌクレオチドは、一般的にはオリゴヌクレオチドが交雑する配列において特定のヌクレオチドのアイデンティティに関連づけられた異なる標識を有する。他のＳＢＳ方法と同様に、画像は、標識された配列決定試薬を用いて核酸特徴のアレイを処置した後に取得され得る。各画像は、特定のタイプの標識を組み込んだ核酸特徴を示すはずである。各特徴の配列内容が異なるので、異なる画像には異なる特徴が存在するかまたは存在しないことになるが、画像における各特徴の相対位置は変わらないはずである。ライゲーションに基づく配列決定方法から取得された画像は、本明細書で説明されたように記憶され、処理されて、分析され得る。本明細書で説明された方法およびシステムとともに利用され得る例示的ＳＢＳのシステムおよび方法は、米国特許第６，９６９，４８８号、米国特許第６，１７２，２１８号、および米国特許第６，３０６，５９７号に説明されており、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
いくつかの実施形態はナノ細孔配列決定法を利用することができる（Deamer,  D.  W.およびAkeson,  M.「Nanopores  and  nucleic  acids:  prospects  for  ultrarapid  sequencing.」Trends  Biotechnol.  １８巻、１４７〜１５１頁（２０００年）、Deamer,  D.およびD.  Branton、「Characterization  of  nucleic  acids  by  nanopore  analysis」  Acc.  Chem.  Res.  ３５巻、８１７〜８２５頁（２００２年）、Li,  J.,  M.  Gershow、D.  Stein、E.  Brandin、およびJ.  A.  Golovchenko、「DNA  molecules  and  configurations  in  a  solid-state  nanopore  microscope」Nat.  Mater.  ２巻、６１１〜６１５頁（２００３年）、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。そのような実施形態では、標的核酸はナノ細孔を通過する。ナノ細孔は、合成細孔またはアルファ−溶血素などの生体膜タンパク質であり得る。標的核酸がナノ細孔を通過するので、各塩基対は、細孔の電気的伝導度における変化を測定することによって識別され得る（米国特許第７，００１，７９２号、Soni,  G.  V.およびMeller、「A.  Progress  toward  ultrafast  DNA  sequencing  using  solid-state  nanopores.」Clin.  Chem.  ５３巻、１９９６〜２００１頁（２００７年）、Healy,  K.「Nanopore-based  single-molecule  DNA  analysis.」Nanomed.  ２巻、４５９〜４８１頁（２００７年）、Cockroft,  S.  L.,  Chu,  J.,  Amorin,  M.およびGhadiri,  M.  R.「A  single-molecule  nanopore  device  detects  DNA  polymerase  activity  with  single-nucleotide  resolution.」J.  Am.  Chem.  Soc.  １３０巻、８１８〜８２０頁（２００８年）、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。ナノ細孔配列決定法から取得されたデータは、本明細書で説明されたように記憶され、処理され、かつ分析され得る。具体的には、データは、本明細書で説明された、光学画像および他の画像の例示的処置によって、画像として処置され得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイム監視を包含する方法を利用することができる。ヌクレオチドの取り込みは、例えば米国特許第７，３２９，４９２号および米国特許第７，２１１，４１４号（各々が参照によって本明細書で組み込まれる）において説明されているように、フルオロフォア担持ポリメラーゼとガンマ−リン酸塩で標識されたヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）相互作用によって検知され得、あるいは、例えば米国特許第７，３１５，０１９号（参照によって本明細書に組み込まれる）において説明されているゼロモード導波路を用い、例えば米国特許第７，４０５，２８１号および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号（各々が参照によって本明細書に組み込まれる）において説明されているように、蛍光性ヌクレオチド類似体および操作されたポリメラーゼを使用して、検知され得る。蛍光性に標識されたヌクレオチドの取り込みが低バックグラウンド状態で観測され得るように、照明は、表面拘束されたポリメラーゼのまわりのゼプトリットルスケールボリュームに制限され得る（Levene,  M.  J.  ら「Zero-mode  waveguides  for  single-molecule  analysis  at  high  concentrations.」Science  ２９９巻、６８２〜６８６頁（２００３年）、Lundquist,  P.  M.ら「Parallel  confocal  detection  of  single  molecules  in  real  time.」  Opt.  Lett.  ３３巻、１０２６〜１０２８頁（２００８年）、Korlach,  J.ら「Selective  aluminum  passivation  for  targeted  immobilization  of  single  DNA  polymerase  molecules  in  zero-mode  waveguide  nano  structures.」Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０５巻、１１７６〜１１８１頁（２００８年）、これらの開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。そのような方法から取得された画像は、本明細書で説明されたように記憶され、処理され、かつ分析され得る。
【０１３９】
いくつかのＳＢＳの実施形態は、伸長生成物にヌクレオチドを組み込むとき放出されるプロトンの検知を含む。例えば、放出されたプロトンの検知に基づく配列決定法は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気的検知器および関連する技術、あるいは米国特許出願公開第２００９／００２６０８２  Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３  Ａ１号、または米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７  Ａ１号に説明されている配列決定方法およびシステムを使用することができ、これらの各々が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書で説明された、動的除外を使用して標的核酸を増幅するための方法は、プロトンを検知するために使用される基体に対して容易に適用され得るものである。より具体的には、本明細書で説明された方法は、プロトンを検知するために使用される単位複製配列のクローン群を生成するのに使用され得る。
【０１４０】
上記のＳＢＳ方法は、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるように、有利には多重フォーマットで実行され得る。特定の実施形態では、異なる標的核酸が、共通の反応槽の中で、または特定の基体の面上で処置され得る。これによって、配列決定試薬の便利なデリバリ、未反応の試薬の除去および取り込みイベントの検知が、多重化されたやり方で可能になる。表面結合の標的核酸を使用する実施形態では、標的核酸はアレイフォーマットであり得る。アレイフォーマットでは、標的核酸は、一般的には空間的に識別可能なやり方で表面に結合され得る。標的核酸は、直接的な共有結合の取付け、ビードもしくは他の粒子への取付け、または表面に取り付けられているポリメラーゼもしくは他の分子に結合することによって結合され得る。アレイは、各サイト（特徴とも称される）における標的核酸の単一のコピーを含み得、または各サイトすなわち特徴において同一の配列を有する多重コピーが存在し得る。多重コピーは、以下でより詳細に説明されるようなブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲなどの増幅方法によって生成され得る。
【０１４１】
本明細書で説明された方法は、例えば、少なくとも約１０特徴／ｃｍ２、１００特徴／ｃｍ２、５００特徴／ｃｍ２、１，０００特徴／ｃｍ２、５，０００特徴／ｃｍ２、１０，０００特徴／ｃｍ２、５０，０００特徴／ｃｍ２、１００，０００特徴／ｃｍ２、１，０００，０００特徴／ｃｍ２、５，０００，０００特徴／ｃｍ２、またはより高い密度を含む様々な密度のうち任意の密度の特徴を有するアレイを使用することができる。
【０１４２】
本明細書で説明された方法には、複数の標的核酸を、並行して迅速かつ効率的に検知するという利点がある。それゆえに、本開示は、上記で例示されたものなど当技術において公知の技術を使用して、核酸を準備して検知することができる、統合システムを提供するものである。したがって、本開示の統合システムは、１つまたは複数の固定されたＤＮＡ断片に対して増幅試薬および／または配列決定試薬をデリバリすることができる流体成分を含み得、ポンプ、弁、貯槽、流体ラインなどの構成要素を備える。フローセルは、統合システムにおいて、標的核酸を検知するように構成され、かつ／または使用され得る。例示的フローセルは、例えば米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８  Ａ１号および米国特許仮出願第１３／２７３，６６６号に説明されており、これらの各々が参照によって本明細書に組み込まれる。フローセルに関して例示されるように、統合システムの流体成分のうち１つまたは複数が増幅方法および検知方法に使用され得る。一例として核酸の配列決定の実施形態を挙げれば、統合システムの流体成分のうち１つまたは複数は、本明細書で説明された増幅方法用、および上記で例示されたものなどの配列決定方法における配列決定試薬のデリバリ用に使用され得る。あるいは、統合システムは、増幅方法を実行するための流体系と検知方法を実行するための流体系とを個別に含み得る。増幅された核酸を生成することができ、核酸の配列を判定することもできる統合型配列決定システムの例は、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および米国特許仮出願第１３／２７３，６６６号において説明されているデバイスを制限なく含み、この仮出願は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
上記で導入されたように、上記の配列決定方法などの方法によって試料から検知されるヌクレオチドは、試料からのリードと名付けられ得る。
代替形態
【０１４４】
本明細書で説明されたアルゴリズムのうち任意のものの特定の行為、イベント、または関数は、実施形態に依拠して、異なる順序で遂行され得、付加され得、合併され得、またはすべて除外され得る（例えば、アルゴリズムを実行するのに、説明された行為またはイベントのすべてが必要とされるとは限らない）。その上に、特定の実施形態では、行為またはイベントは、順次に遂行するのではなく、例えばマルチスレッド処理、割込み処理、または複数のプロセッサもしくはプロセッサコアによって、あるいは他の並列アーキテクチャ上で、同時に遂行され得る。
【０１４５】
本明細書で開示された実施形態に関連して説明された様々な例証となる論理ブロック、モジュールおよびアルゴリズムのステップは、電子的ハードウェア、コンピュータソフトウェアまたは両方の組合せとして実施され得るものである。ハードウェアおよびソフトウェア、様々な例証となる構成要素、ブロック、モジュールおよびステップは、この互換性を明瞭に示すために、それらの機能性の観点から全般的に上記で説明されている。そのような機能性がハードウェアで実施されるのかそれともソフトウェアで実施されるのかということは、特定の用途および全体的なシステムに課された設計制約条件に依拠する。説明された機能性は、それぞれの特定用途向けの様々なやり方で実施され得るが、そのような実装形態の決定が本開示の範囲からの逸脱をもたらすと解釈されるべきではない。
【０１４６】
本明細書で開示された実施形態に関連して説明された様々な例証となる論理ブロックおよびモジュールは、本明細書で説明された機能を遂行するように設計された、汎用プロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）もしくは他のプログラマブル論理デバイス、離散ゲート論理もしくはトランジスタ論理、離散ハードウェア構成要素、またはそれらの任意の組合せなどのマシンによって実施され得、または遂行され得る。汎用プロセッサはマイクロプロセッサであり得るが、代替形態では、コントローラ、マイクロコントローラ、またはステートマシン、それらの組合せなどであり得る。プロセッサは、例えばＤＳＰとマイクロプロセッサの組合せ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアに関連する１つまたは複数のマイクロプロセッサ、他のそのような構成といったコンピュータデバイスの組合せとしても実施され得る。
【０１４７】
本明細書で開示された実施形態に関連して説明された方法、プロセス、またはアルゴリズムの要素は、ハードウェア、プロセッサによって実行されるソフトウェアモジュール、またはこれら２つの組合せで、直接具現され得る。ソフトウェアモジュールは、ＲＡＭメモリ、フラッシュメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、レジスタ、ハードディスク、取外し可能ディスク、ＣＤ−ＲＯＭまたは当技術において公知のコンピュータ可読記憶媒体の任意の他の形態の中に存在し得る。記憶媒体は、プロセッサが記憶媒体との間で情報の読取りおよび書込みをすることができるように、プロセッサに結合され得る。代替形態では、記憶媒体はプロセッサに内蔵され得る。プロセッサおよび記憶媒体はＡＳＩＣ内に存在し得る。ＡＳＩＣはユーザ端末内に存在し得る。代替形態では、プロセッサおよび記憶媒体はユーザ端末の個別部品として存在し得る。
【０１４８】
本明細書で使用された、「可能性がある」、「恐れがある」、「あり得る」、「例えば」などの条件付き言語は、特に別記されない限り、または文脈の中で使用されたのと違った風に理解されるのでなければ、一般に、特定の特徴、要素および／または状態が、特定の実施形態には含まれ、他の実施形態には含まれないことを伝えるように意図されている。したがって、そのような条件付き言語は、一般に、特徴、要素および／または状態が１つまたは複数の実施形態に多少なりとも必要なものであること、あるいは、任意の特定の実施形態において、著者の入力または促しの有無にかかわらず、これらの特徴、要素および／または状態を含むべきかどうか、または遂行するべきかどうかを判断するための論理を、１つまたは複数の実施形態が必然的に含むこと、を意味するようには意図されていない。「備える」、「含む」、「有する」、および「包含する」などの用語は同意語であり、包括的に、拡張可能なやり方で使用され、追加の要素、特徴、行為、動作などを除外しない。同様に、「または」という用語は、その（排他的な意味ではなく）包括的な意味で使用されており、例えば要素のリストを接続するように使用されたときには、リストにおける要素のうち１つ、いくつかまたはすべてを意味する。
【０１４９】
慣用句「Ｘ、ＹまたはＺのうち少なくとも１つ」などの分離性の言語は、特に別記しない限り、一般に、項目、事項などが、Ｘ、ＹもしくはＺのいずれか、またはそれらの任意の組合せ（例えばＸ、Ｙおよび／またはＺ）でよいことを提示するように使用されるような文脈で理解される。したがって、そのような分離性の言語は、一般に、特定の実施形態のそれぞれが、Ｘのうち少なくとも１つ、Ｙのうち少なくとも１つ、またはＺのうち少なくとも１つの存在を必要とすることを意味するようには意図されておらず、意味するべきではない。
【０１５０】
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」などの冠詞は、明示的に別記されない限り、一般に、１つまたは複数の説明された項目を含むように解釈されるべきである。それゆえに、「〜ように構成されたデバイス」などの慣用句は、１つまたは複数の記載されたデバイスを含むように意図されている。そのような１つまたは複数の記載されたデバイスはまた、明示された記載を実行するように総体として構成され得る。例えば、「記載Ａ、ＢおよびＣを実行するように構成されたプロセッサ」は、記載ＢおよびＣを実行するように構成された第２のプロセッサと連動する、記載Ａを実行するように構成された第１のプロセッサを含み得る。
【０１５１】
上記の詳細な説明は、新規の特徴を示し、説明して、様々な実施形態に適用されるものと指摘してきたが、本開示の精神から逸脱することなく、示されたデバイスまたはアルゴリズムの形態および詳細における様々な省略、置換および変更が可能であることが理解されよう。認識されるように、本明細書で説明された特定の実施形態は、本明細書で説明された特徴および利点のうちすべてを用意するわけではない形態の範囲内で具現され得、いくつかの特徴は、他のものから分かれて使用され得、または実施され得る。特許請求の範囲の等価の意味および範囲の範囲内に入るすべての変更形態は、それらの範囲内に包含される。
【０１５２】
いずれかの例からの技術は、他の例のうち任意の１つまたは複数で説明されている技術と組み合わされ得る。開示された技術の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すれば、示された実施形態が開示された技術の例であり、開示された技術の範囲における制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。むしろ、開示された技術の範囲は、以下の特許請求の範囲によって対象として含まれるものを含む。したがって、特許請求の範囲の範囲および精神の中に入るものは特許請求される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）  
スプライスバリアントを識別するためのシステムであって、
メモリと、
少なくとも１つのプロセッサと、
命令を含有している少なくとも１つの非一時的コンピュータ可読媒体とを備え、前記命令が、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行されると、前記少なくとも１つのプロセッサに、
単一の生物学的試料からの複数のＲＮＡ配列リードから１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を判定するステップと、
複数の健康なＲＮＡ試料から判定された１組のベースラインスプライス接合部位を検索するステップと、
前記１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を前記１組のベースラインスプライス接合部位と比較するステップと、
前記１組のベースラインスプライス接合部位とオーバラップしない試料のスプライス接合部位を含む１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位を識別するステップであって、前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位が候補腫瘍形成性イベントである、ステップとを含む動作を遂行させる、システム。
（項目２）  
候補腫瘍形成性イベントのリストを出力するステップをさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目３）  
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、地理的領域、年齢、性別、人種群、組織タイプ、または試料保存特性のうち１つまたは複数の断面から得られた健康なＲＮＡ試料を含む、項目１または２に記載のシステム。
（項目４）  
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、肺、副腎、膀胱、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、皮膚、および脾臓からなる群から選択された１つまたは複数の組織タイプからの試料を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５）  
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、ある範囲の年齢にわたるドナーからの試料を含む、項目１から４のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６）  
前記単一の試料からの試料接合部位を判定する前記ステップの前に、前記複数の健康なＲＮＡ試料からの前記ベースラインスプライス接合部位が判定される、項目１から５のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７）  
前記ベースラインスプライス接合部位のための前記複数の健康なＲＮＡ試料が、前記単一の生物学的試料と同一の生物学的対象からは取得されない、項目１から６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目８）  
前記ベースライン接合部位が、前記試料接合部位と同一のゲノム領域に由来する、項目１から７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目９）  
前記単一の生物学的試料が腫瘍試料に由来する、項目１から８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１０）  
前記複数の健康なＲＮＡ試料が非腫瘍組織に由来する、項目９に記載のシステム。
（項目１１）  
前記試料のスプライス接合部位と前記ベースラインスプライス接合部位が両方とも共通のアッセイを使用して判定される、項目１から１０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１２）  
前記１つまたは複数の試料接合部位を判定するステップが、
前記単一の生物学的試料からの前記複数のＲＮＡ配列リードを判定するステップと、
前記単一の生物学的試料からのＲＮＡ配列リードとアラインしたＤＮＡ参照配列を検索するステップと、
前記ＲＮＡリードにおいて、前記ＤＮＡ参照と比較して失われた連続位置として１つまたは複数の試料接合部位を判定するステップとを含む、項目１から１１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１３）  
前記フィルター処理された試料のスプライス接合部位がサードパーティ接合部位とオーバラップせず、前記サードパーティ接合部位が、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフから判定される、項目１から１２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１４）  
前記ベースラインスプライス接合部位の組が、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフを判定せずに判定される、項目１から１３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１５）  
コンピュータで実施される方法であって、
少なくとも１つのプロセッサを使用して、単一の生物学的試料からの複数のＲＮＡ配列リードから１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を判定するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、メモリから、複数の健康なＲＮＡ試料から判定された１組のベースラインスプライス接合部位を検索するステップと、
前記１つまたは複数の試料のスプライス接合部位を前記１組のベースラインスプライス接合部位と比較するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記ベースラインスプライス接合部位とオーバラップしない試料のスプライス接合部位を含む１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位を識別するステップであって、前記１つまたは複数のフィルター処理された試料のスプライス接合部位が候補腫瘍形成性イベントである、ステップとを含む方法。
（項目１６）  
候補腫瘍形成性イベントのリストを出力するステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）  
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記単一の試料からのＲＮＡリードを判定するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記メモリから、前記単一の試料からの前記ＲＮＡリードとアラインしたＤＮＡ参照を検索するステップと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記ＲＮＡリードにおいて、前記ＤＮＡ参照と比較して失われた連続位置として前記試料接合部位を判定するステップとをさらに含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）  
前記複数の健康なＲＮＡ試料が、地理的領域、年齢、性別、人種群、組織タイプ、または試料保存特性のうち１つまたは複数の断面から得られた健康なＲＮＡ試料を含む、項目１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）  
前記ベースラインスプライス接合部位のための前記複数の健康なＲＮＡ試料が、前記単一の生物学的試料と同一の生物学的対象からは取得されない、項目１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）  
前記フィルター処理された試料接合部位がサードパーティ接合部位とオーバラップせず、前記サードパーティ接合部位が、所定の遺伝子のエクソンの複数の交互の組合せを捕捉するスプライスグラフから判定される、項目１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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