【手続補正書】
【提出日】平成30年4月10日(2018.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）（ｉ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）RNA干渉分子をコードするヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列
を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
【請求項２】
プロモーターが、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである、請求項１に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項３】
少なくとも１のgRNAが、リボザイムをコードするヌクレオチド配列に隣接する、請求項１または２に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項４】
リボザイムが、シス作用性リボザイムである、請求項３に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項５】
リボザイムに隣接する少なくとも１のガイドRNA（gRNA）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸に作動的に連結したプロモーターを含む、操作されたコンストラクト。
【請求項６】
核酸がさらに、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、第２のヌクレオチド配列が、第１のヌクレオチド配列の上流にある、請求項５に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項７】
少なくとも１のマイクロRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５または６に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項８】
少なくとも１のマイクロRNAが、目的のタンパク質内にコードされる、請求項７に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項９】
核酸がさらに、三重らせん構造をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ここで、第３のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列との間にある、請求項６〜８のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１０】
プロモーターが、RNAポリメラーゼＩＩ依存的（RNA pol II）プロモーターである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１１】
RNA pol IIプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトユビキチンプロモーター、ヒトヒストンH2A1プロモーター、またはヒト炎症性ケモカインCXCL1プロモーターである、請求項１０に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１２】
第１のヌクレオチド配列が少なくとも２のgRNAをコードし、各々のgRNAがリボザイムに隣接する、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１３】
第１のヌクレオチド配列が、リボザイムに隣接する少なくとも２のgRNAをコードし、該gRNAは互いに異なる、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１４】
リボザイムが、シス作用性リボザイムである、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１５】
シス作用性リボザイムのうちの少なくとも１つが、ハンマーヘッド型リボザイムである、請求項１４に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１６】
ハンマーヘッド型リボザイムが、少なくとも１のgRNAの５’末端にある、請求項１５に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１７】
シス作用性リボザイムのうちの少なくとも１つが、デルタ型肝炎ウイルスリボザイムである、請求項１４に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１８】
デルタ型肝炎ウイルスリボザイムが、少なくとも１のgRNAの３’末端にある、請求項１７に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項１９】
三重らせん構造が、MALAT1遺伝子座の３’末端またはMENβ遺伝子座の３’末端からのヌクレオチド配列によりコードされる、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクト。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトを含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトを１つ以上または請求項２０に記載のベクターを１つ以上含む、細胞。
【請求項２２】
Casタンパク質を安定して発現するように改変されている、および／または、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む操作された核酸をさらに含む、請求項２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む、少なくとも１のさらなる操作された核酸をさらに含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
少なくとも１のさらなる操作された核酸の目的のタンパク質が、該細胞の任意の他の目的のタンパク質とは異なる、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
細菌細胞である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
ヒト細胞である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
核酸の発現を許容する条件下において請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む、方法。
【請求項３１】
細胞の遺伝子回路を生成、改変または再配線する方法であって、以下：
細胞において、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトから選択される第１の操作されたコンストラクトを発現させること；および
細胞において、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトから選択される第２の操作されたコンストラクトを発現させること、
ここで、第１の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも１のgRNAは、第２の操作されたコンストラクトのプロモーターの領域または内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する、
を含む、前記方法。
【請求項３２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトから選択される第３の操作されたコンストラクトを発現させることをさらに含む、請求項３１に記載の方法であって、第２の操作されたコンストラクトのうちの少なくとも１のgRNAは、第３の操作されたコンストラクトのプロモーターの領域または内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する、前記方法。
【請求項３３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作された核酸から選択される少なくとも１のさらなる操作された核酸を発現させることをさらに含む、請求項３２に記載の方法であって、少なくとも１のさらなる操作された核酸のうちの少なくとも１のgRNAは、細胞の操作された核酸のうちのいずれか１つのプロモーターの領域または少なくとも１の内在プロモーターの領域に対して相補的であり、これに結合する、前記方法。
【請求項３４】
細胞が、Casタンパク質を安定して発現するように改変されている、および／または、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモーターを含む操作された核酸をさらに含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
Casタンパク質がCasヌクレアーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
CasヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Casタンパク質が転写活性Casタンパク質である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ガイドリボ核酸（gRNA）のマルチプレックスな細胞発現の方法であって、細胞において、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作されたコンストラクトを発現させることを含む、前記方法。