【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年1月11日(2018.1.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の名称
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の名称】オフターゲットを防ぐために変形したＲＮＡ干渉誘導核酸およびその用途
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸およびその用途に関し、より詳細には、ＲＮＡ干渉誘導核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端と３’末端領域にスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）に置換する変形を含ませたＲＮＡ干渉を誘導する核酸に関する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
これにより、本発明者は、従来技術の問題点を解決するために、ターゲット遺伝子の抑制効率は高めながらも、オフターゲット効果は完全に遮断できるように変形させたＲＮＡ干渉誘導核酸を開発することによって本発明を完成した。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
本発明に係るＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、ターゲット遺伝子の発現を抑制しながらオフターゲット効果も防ぎ、標的選別性および特異性を備えた新たな変形形態でＲＮＡ干渉誘導核酸を提供することにより、従来のＲＮＡ干渉誘導遺伝子の問題点であるオフターゲットによる不正確性および副作用を解消し、遺伝子発現抑制技法として研究および遺伝子治療に安心して使用することができるという特徴がある。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
【図１】デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に変形された核酸の遺伝子発現オンターゲット阻害効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果抑制を図式化して示した図である。
【図２】デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。
【図３】リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）に置換変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。
【図４】デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に挿入変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。
【図５】リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）に挿入変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。
【図６】５’末端基準の６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換変形された形態（６ｐｉ）のｓｉＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子調節機能に及ぼす影響および従来の５’末端の２番目部分の２’ＯＭｅ変形されたｓｉＲＮＡ分子と効果を比較して示した図である。
【図７】細胞内でｓｉＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）のオフターゲット効果および本発明によって６ｐｉ変形後のオフターゲット効果を評価した結果を示した図である。
【図８】生体内でｓｉＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）のオフターゲット効果および本発明によって６ｐｉ変形後のオフターゲット効果を評価した結果を示した図である。
【図９】従来のミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ）および２’ＯＭｅ変形が５’末端の６番目部分に適用されたｓｉＲＮＡ形態と、５’末端の２番目部分の２’ＯＭｅ変形、６番目部分のＵＮＡ変形、ｓｉＲＮＡ二重体に２番目の位置にバルジが導入された形態のｓｉＲＮＡ分子に対し、その遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を本発明と比較した結果を示した図である。
【図１０】ＲＮＡ干渉誘導核酸の一本鎖において、５’末端の６番目が少なくとも炭素数３つを有するアルキル基である炭化水素鎖からなるスペーサに変形されたとき、遺伝子発現オンターゲット阻害効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果抑制を図式化して示した図である。
【図１１】５’末端の６番目の位置がアルキル基からなるスペーサ（Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ）に置換されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を評価した結果を示した図である。
【図１２】３’末端の１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲットのうち３’末端補償結合に対する効果を評価した結果を示した図である。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
上述により、本発明は、ターゲット遺伝子の発現を抑制する、ＲＮＡ干渉誘導核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目の位置のヌクレオチドがスペーサに置換されて５番目と７番目のヌクレオチドが前記スペーサと共有結合していたり、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドが非塩基性ヌクレオチドまたはスペーサに置換されたりすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を提供する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
本発明者は、図１の図式化された例のように、アルゴノートタンパク質に結合するすべてのＲＮＡ干渉誘導核酸の５’シード部分を塩基配列ができないスペーサに変形させた場合、ターゲット遺伝子抑制効率（オンターゲット効果）が高いながらも、オフターゲット効果は完全に遮断することができることを予測し、マイクロＲＮＡ認識メカニズムに対するモデルである転移核型性モデル（Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２Ｆｅｂ１２；１９（３）：３２１−７）に基づき、５’シードのうち特に軸（ｐｉｖｏｔ）と呼ばれる５’末端の６番目の塩基配列に注目して本ＲＮＡ干渉誘導核酸を発明した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０４】
５’末端から６番目の位置に塩基（ｂａｓｅ）がない形態で、５番目と７番目のヌクレオチドがＣ３共有結合に置換されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
前記実施例８で観察されたように、５’末端から６番目のヌクレオチドをｄＳｐａｃｅｒに置換した（６ｐｉ）ｓｉＲＮＡは完全にオフターゲット効果を取り除くという点において、これは６番目に塩基がなくなり、これ以上この部分を通じてオフターゲットと塩基配列ができなくなるためであると予想することができる。したがって、理論的には、５’末端から６番目のヌクレオチドに塩基が存在しなければ、そのバックボーンがヌクレオチドではない他の変形であっても、その変形が単一ヌクレオチドと置換される同じ大きさのスペーサ変形であれば、同じオフターゲット除去効果を示すようになるであろう。これにより、本発明者は、図１０に示した図式化した例のように、図１の５’末端から６番目の位置をｄＳｐａｃｅｒ置換で確張し、５’末端から６番目の位置に塩基（ｂａｓｅ）がない形態で骨格を維持する最小のスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）として５番目と７番目のヌクレオチドが共有結合するように設計した。すなわち、６番目の位置に、ヌクレオチドが占める空間を維持することのできるスペーサの最小の大きさでリン酸基と炭素原子３個（Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ）からなる変形を設計した。ヌクレオチドなくＣ３変形を最小基準とし、塩基のないあらゆる形態の共有結合変形であっても５’末端から６番目の位置に適用されるようになれば、非塩基性ヌクレオチド置換と同じように、オンターゲット抑制効率を維持しながらも、オフターゲット効果は完全に取り除くことができるという効果を現すものと予想しながら、新たなＲＮＡ干渉誘導核酸を発明した。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
従来のｓｉＲＮＡは、３’末端から１番目と２番目にジオキシヌクレオチドチアミン（ｄＴ）を一般的に備えるが、これは主にｓｉＲＮＡ二重重合体から突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）構造として現われる。ｄＴの場合にも、ＲＮＡのアデノシン（Ａ）と塩基配列が可能であるため、これが３’末端補償結合に参加することによってマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果として現われるようになる。これにより、このような３’末端補償結合によるオフターゲット効果を防ぐためには、図１２ａに示すように、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドに塩基配列ができないスペーサ置換変形を適用してもよい。すなわち、本発明者は、３’末端の１番目と２番目のヌクレオチドが塩基のないスペーサ形態としてｄＳｐａｃｅｒまたはＣ３  ｓｐａｃｅｒ変形を適用する場合、既存のｓｉＲＮＡ二重構造は維持することから、オンターゲット抑制効率は高いながらも、３’末端補償結合によるオフターゲット効果は取り除くことができるという点に注目し、本ＲＮＡ干渉誘導核酸を発明した。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
このような結果により、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドが塩基のない共有結合形態の変形であるスペーサに置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸は、ターゲット遺伝子に対する発現抑制効果は維持しながらも、３’末端補償結合によるオフターゲット効果を回避する効果も現すことができることが分かった。