【手続補正書】
【提出日】平成30年5月21日(2018.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座を含む前記細胞を提供することであって、前記標的ゲノム遺伝子座がヌクレアーゼ剤のための認識部位を含み、前記細胞が、ＤＭＥＭ基本培地を含む培養物中に存在する、提供することと、
（ｂ）前記細胞中に、
（ｉ）前記認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤；ならびに
（ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座中に位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む、大きな標的化ベクターであって、前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも１０ｋｂであり、前記標的化ベクターは前記標的ゲノム遺伝子座との相同組み換えを受ける、大きな標的化ベクター
を導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を特定することであって、前記挿入ポリヌクレオチドの組み込みは、前記標的ゲノム遺伝子座における内因性核酸配列の欠失及び外因性核酸配列との置き換えを含む遺伝子修飾を導入する、特定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計が、１５０ｋｂ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳類細胞であり、必要に応じて、前記哺乳類細胞がげっ歯類由来であり、必要に応じて、前記げっ歯類がラット、又はマウスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が多能性細胞であり、必要に応じて、前記多能性細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞又は非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞であり、必要に応じて、前記非ヒトＥＳ細胞がげっ歯類ＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、又はマウスＥＳ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞がマウスＥＳ細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は
（ｅ）ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質及び前記ｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）前記認識部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、ｃｒＲＮＡと、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記挿入ポリヌクレオチドが約５ｋｂ〜約４００ｋｂの長さである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記挿入ポリヌクレオチドが、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸、又はプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子が、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ビーナス、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、セルリアン、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータンパク質をコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾が、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、制御配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記欠失する内因性核酸配列が、約５ｋｂ〜約３Ｍｂに及ぶ、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記欠失する内因性核酸配列が少なくとも５００ｋｂである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾が、内因性核酸配列の、相同又はオーソロガス核酸配列との置き換えを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座が、Ｓｒｙ遺伝子、Ｕｔｙ遺伝子、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ遺伝子、Ｄｄｘ３ｙ遺伝子、Ｕｂｅ１ｙ遺伝子、Ｔｓｐｙ遺伝子、Ｕｓｐ９ｙ遺伝子、Ｚｆｙ１遺伝子、Ｚｆｙ２遺伝子、又は前記Ｋｄｍ５ｄ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｔｓｐｙ、Ｕｔｙ、Ｄｄｘ３ｙ、及びＵｓｐ９ｙ遺伝子を包含する領域である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座が、Ｓｒｙ遺伝子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹマウスを生み出すことが可能なマウスＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞株を作製するための方法であって、
（ａ）マウスＸＹ  ＥＳ細胞を、内因性Ｓｒｙ遺伝子を不活性化する欠失を含む遺伝子修飾を含むように改変することであって、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６系統由来のＹ染色体を含む、ことと、
（ｂ）改変された前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞を、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト哺乳動物を生み出すことができるマウスＸＹ  ＥＳ細胞株を生み出す条件下で培養することとを含む、方法。
【請求項１７】
前記遺伝子修飾を、前記Ｙ染色体上の認識部位において、ニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤を、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞中に導入することによって生じさせる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、あるいは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡは、
（ａ）前記認識部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記認識部位にはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、ｃｒＲＮＡと、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、
必要に応じて、前記ｇＲＮＡは、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２を含む配列を標的化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼ剤がＴＡＬＥＮであり、
必要に応じて、前記ＴＡＬＥＮが、配列番号７２を含む配列及び配列番号７３を含む配列を標的化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子修飾が、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞に、前記Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターを導入することによって生じ、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、前記標的ゲノム遺伝子座において前記挿入ポリヌクレオチドを含むように改変される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のホモロジーアームは、約４００〜１０００塩基対であり、前記第２のホモロジーアームは、約４００〜１０００塩基対である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子修飾が、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞に：
（ｉ）Ｙ染色体上の前記認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する前記ヌクレアーゼ剤と；
（ｉｉ）Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターとを導入することによって生じ、
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、前記標的ゲノム遺伝子座において前記挿入ポリヌクレオチドを含むように改変される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、雌化培地中で培養されない、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養する工程が、前記改変されたマウスＸＹ  ＥＳ細胞を、（１）約３ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する基本培地と；（２）前記改変されたマウスＥＳ細胞を培養物中で維持する補充物とを含む培地中で培養することを含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
宿主胚内への前記改変されたマウスＸＹ  ＥＳ細胞の導入、及び続くＦ０マウスを生み出すための宿主胚の懐胎後に、前記Ｆ０マウスの少なくとも６０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌である、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹマウスを作製するための方法であって、
（ａ）マウスＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞を宿主胚に導入することであって、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６系統由来のＹ染色体と、内因性マウスＳｒｙ遺伝子を不活性化する欠失を含む遺伝子修飾とを含み、必要に応じて、前記宿主胚は、前桑実胚である、導入することと；
（ｂ）前記宿主胚を懐胎させることと；
（ｃ）前記宿主胚の懐胎に続いてＦ０マウスを得ることであって、前記Ｆ０マウスの少なくとも６０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌である、得ることとを含む、方法。
【請求項２９】
前記Ｆ０  ＸＹ雌マウスが、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持ち、必要に応じて、前記野生型マウスはＣ５７ＢＬ／６マウスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、１２９Ｓ６系統及びＣ５７ＢＬ／６系統の間の交配であるマウスから単離される、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスに交配することによって生み出されたハイブリッド胚から単離される、請求項３０に記載の方法
【請求項３２】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの置換、又はこれらの組み合わせをさらに含み、必要に応じて、
（Ｉ）前記遺伝子修飾が、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の、相同、異種、若しくはオーソロガス核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせをさらに含むか；
（ＩＩ）前記遺伝子修飾が、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカーをコードする核酸及び／又はレポーター遺伝子をコードする核酸の挿入をさらに含むか；
（ＩＩＩ）前記遺伝子修飾が、内因性Ｓｒｙプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子をコードする核酸の挿入をさらに含む、請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＸＹ  ＥＳ細胞を、少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドのさらなる標的化遺伝子修飾を含むように改変することをさらに含む、請求項１６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主胚内への前記改変されたマウスＸＹ  ＥＳ細胞の導入、及び続く前記宿主胚の懐胎後に、前記Ｆ０マウスの少なくとも８０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌であり、前記Ｆ０マウスの少なくとも９０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌であり、必要に応じて、前記Ｆ０マウスの少なくとも９５％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌である、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。