【手続補正書】
【提出日】平成30年5月9日(2018.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターであって、
該アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項２】
（i）アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、
（ii）サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターである、
（iii）2A DNAが、ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、かつ／または
（iv）プロモーター配列が構成性プロモーターである、
請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項３】
請求項1または2記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって生じたレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
【請求項４】
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、請求項2記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項５】
少なくとも5×107 pfu/mlまたは少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項1、2または4記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項６】
少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、請求項1、2、4または5記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項７】
少なくとも1つの異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項6記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項８】
感染性疾患が、
（i）エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ボルデテラ属(Bordetella)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ナイセリア属(Neisseria)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、放線菌(Actinomycete)、ストレプトミセス菌(Streptomycete)、ノカルジア属(Nocardia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルシニア属(Yersinia)、フランシセラ属(Fancisella )、パストレラ属(Pasturella )、モラクセラ属(Moraxella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ブランハメラ属(Branhamella)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、リステリア属(Listeria)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、トレポネーマ属(Treponema)、サルモネラ属(Salmonella)、クレブシエラ属(Kleibsiella )、ビブリオ属(Vibrio)、プロテウス属(Proteus)、エルウイニア属(Erwinia)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、スピリルム属(Spirillum)、カンピロバクター属(Campylobacter)、シゲラ属(Shigella)、レジオネラ属(Legionella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アエロモナス属(Aeromonas)、リケッチア属(Rickettsia)、クラジミア属(Chlamydia)、コクシエラ属(Coxiella)、ボレリア属およびマイコプラスマ属(Mycoplasma)からなる群より選択される原核生物、
（ii）ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)および特に高リスク発がん性ヒトパピローマウイルス型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)(ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8)としても公知)、単純ヘルペスウイルス(HSV)(任意のサブタイプ)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)を含むコロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、SIV、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス 、ならびに任意の新興ウイルス、特に、エボラウイルス、マーブルグウイルス、西ナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、およびブニヤウイルス科の他のメンバーからなる群より選択されるウイルス、または
（iii）アピコンプレクサ類およびトリパノソーマ類からなる群より選択される原生動物
に起因する、請求項7記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項９】
悪性疾患が、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性メラノーマ、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群および肝臓およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍、AIDS関連カポジ肉腫、腎細胞がん、大腸の腺がん、頭頸部扁平上皮がん、結腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、ならびに子宮内膜がんからなる群より選択されるがんである、請求項7記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１０】
自己免疫疾患が、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリトマトーデス、およびI型糖尿病からなる群より選択される、請求項7記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１１】
請求項1、2、および4〜10のいずれか一項記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む、組成物。
【請求項１２】
異種タンパク質に対する免疫性を対象に与えるための薬学的組成物であって、少なくとも107 pfu/mlの、請求項1、2、および4〜10のいずれか一項記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるVLVを含む組成物を含み、異種タンパク質の発現により該対象において免疫応答が誘導される、薬学的組成物。
【請求項１３】
治療的有効量の請求項11記載の組成物を含む、対象において疾患を処置および／または予防するための薬学的組成物。
【請求項１４】
疾患が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患である、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される量の請求項11記載の組成物を含む、対象において免疫応答を誘発するための薬学的組成物。
【請求項１６】
組成物が対象に予防的にまたは治療的に投与される、請求項15記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、請求項15または16記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項11記載の組成物を含む、対象において異種タンパク質に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせるための薬学的組成物であって、対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与され、第2のその後の時期に、該対象に、該異種タンパク質に対するTメモリー細胞を該対象において生じさせるのに有効な第2の量で投与される、薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項11記載の組成物を含む、対象において異種タンパク質に対する適応B細胞免疫応答を生じさせるための薬学的組成物であって、対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与され、第2のその後の時期に、該対象に、該異種タンパク質に対するBメモリー細胞を該対象において生じさせるのに有効な第2の量で投与される、薬学的組成物。
【請求項２１】
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターを含むタンパク質発現システムであって、
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G, G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
タンパク質発現システム。
【請求項２２】
（i）アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、
（ii）サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターに由来する、
（iii）2A DNAが、ゾセア・アシグナウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、かつ／または
（iv）プロモーター配列が構成性プロモーターである、
請求項21記載のタンパク質発現システム。
【請求項２３】
請求項21または22記載のタンパク質発現システムにより生じるレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
【請求項２４】
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、請求項22記載のタンパク質発現システム。
【請求項２５】
少なくとも5×107 pfu/mlまたは少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項21、22、または24記載のタンパク質発現システム。
【請求項２６】
少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、請求項21、22、24、または25記載のタンパク質発現システム。
【請求項２７】
VLVにおけるVSV Gタンパク質の発現を安定化する方法であって、VLV Gタンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを、VSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
VLVにおける異種タンパク質の発現を安定化する方法であって、異種タンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを異種タンパク質をコードするDNAに機能的に連結させ、次に、VSV Gタンパク質に機能的に連結させる工程を含む、方法。
【請求項２９】
以下の工程を含む、高力価 RNAウイルス様ベシクル(VLV)を選択する方法：
(i) アルファウイルス構造タンパク質を含まないウイルス構造タンパク質をコードするRNA配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養において継代することによって、VLVを生じさせる工程；および
(ii)生じたVLVを、細胞培養におけるVLVの大規模な継代およびVLVの定方向突然変異誘発からなる群より選択される少なくとも1つの手法を用いて、高力価VLVについてスクリーニングする工程。
【請求項３０】
（i）ハイブリッドウイルスベクターRNA配列がアルファウイルス非構造タンパク質をコードする、
（ii）ウイルス構造タンパク質がラブドウイルス糖タンパク質を含む、かつ／または
（iii）高力価VLVが少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)を産生する、
請求項29記載の方法。
【請求項３１】
（i）非構造タンパク質がセムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質である、かつ／または
（ii）糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質である、
請求項30記載の方法。
【請求項３２】
対象が哺乳動物またはヒトである、請求項12〜20のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV G タンパク質ヌクレオチド配列と、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含むSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有するRNAウイルス様ベシクル(VLV)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
さらなる局面において、発明には、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有するRNAウイルス様ベシクル(VLV)が含まれる。本発明のRNA VLVは、SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV Gタンパク質ヌクレオチド配列、およびG-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群から選択される変異のうち少なくとも2つを含むSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列を含む。
[本発明1001]
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターであって、
該アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1002]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1003]
サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターである、本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1004]
2A DNAが、ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1005]
本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって生じたレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
[本発明1006]
プロモーター配列が構成性プロモーターである、本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1007]
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、本発明1006の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1008]
少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1009]
少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、本発明1008の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1010]
少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1011]
少なくとも1つの異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、本発明1010の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1012]
感染性疾患が、エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ボルデテラ属(Bordetella)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ナイセリア属(Neisseria)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、放線菌(Actinomycete)、ストレプトミセス菌(Streptomycete)、ノカルジア属(Nocardia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルシニア属(Yersinia)、フランシセラ属(Fancisella )、パストレラ属(Pasturella )、モラクセラ属(Moraxella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ブランハメラ属(Branhamella)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、リステリア属(Listeria)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、トレポネーマ属(Treponema)、サルモネラ属(Salmonella)、クレブシエラ属(Kleibsiella )、ビブリオ属(Vibrio)、プロテウス属(Proteus)、エルウイニア属(Erwinia)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、スピリルム属(Spirillum)、カンピロバクター属(Campylobacter)、シゲラ属(Shigella)、レジオネラ属(Legionella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アエロモナス属(Aeromonas)、リケッチア属(Rickettsia)、クラジミア属(Chlamydia)、コクシエラ属(Coxiella)、ボレリア属およびマイコプラスマ属(Mycoplasma)からなる群より選択される原核生物に起因する、本発明1011の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1013]
感染性疾患が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)および特に高リスク発がん性ヒトパピローマウイルス型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)(ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8)としても公知)、単純ヘルペスウイルス(HSV)(任意のサブタイプ)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)を含むコロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、SIV、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス 、ならびに任意の新興ウイルス、特に、エボラウイルス、マーブルグウイルス、西ナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、およびブニヤウイルス科の他のメンバーからなる群より選択されるウイルスに起因する、本発明1011の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1014]
感染性疾患が、アピコンプレクサ類およびトリパノソーマ類からなる群より選択される原生動物に起因する、本発明1011の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1015]
悪性疾患が、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性メラノーマ、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群および肝臓およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍、AIDS関連カポジ肉腫、腎細胞がん、大腸の腺がん、頭頸部扁平上皮がん、結腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、ならびに子宮内膜がんからなる群より選択されるがんである、本発明1011の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1016]
自己免疫疾患が、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリトマトーデス、およびI型糖尿病からなる群より選択される、本発明1011の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
[本発明1017]
本発明1001の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む、組成物。
[本発明1018]
本発明1010の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む、組成物。
[本発明1019]
異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
異種タンパク質に対する免疫性を対象に与える方法であって、少なくとも107 pfu/mlの本発明1018のVLVを含む組成物を該対象に投与する工程を含み、異種タンパク質の発現が該対象において免疫応答を誘導する、方法。
[本発明1021]
異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
対象において疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量の本発明1016の組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1023]
疾患が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
対象にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される量の本発明1018の組成物を該対象に投与する工程を含み、該組成物の投与が該対象において免疫応答を誘発する、方法。
[本発明1025]
組成物が対象に予防的に投与される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
組成物が対象に治療的に投与される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、本発明1024の方法。
[本発明1028]
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
対象において異種タンパク質に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法であって、（a）本発明1018の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程；（b）第2のその後の時期に、第2の有効量の本発明1018の組成物を投与する工程を含み、該異種タンパク質に対するTメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
[本発明1030]
対象において異種タンパク質に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法であって、（a）本発明1018の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程；（b）第2のその後の時期に、第2の有効量の本発明1018の組成物を投与する工程を含み、該異種タンパク質に対するBメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
[本発明1031]
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターを含むタンパク質発現システムであって、
SFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G, G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、SFV構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
タンパク質発現システム。
[本発明1032]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、本発明1031のタンパク質発現システム。
[本発明1033]
サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターに由来する、本発明1031のタンパク質発現システム。
[本発明1034]
2A DNAが、ゾセア・アシグナウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、本発明1031のタンパク質発現システム。
[本発明1035]
本発明1031の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより生じるレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
[本発明1036]
プロモーター配列が構成性プロモーターである、本発明1031のタンパク質発現システム。
[本発明1037]
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、本発明1036のタンパク質発現システム。
[本発明1038]
少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、本発明1031のタンパク質発現システム。
[本発明1039]
少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、本発明1038のタンパク質発現システム。
[本発明1040]
少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、本発明1031のタンパク質発現システム。
[本発明1041]
VLVにおけるVSV Gタンパク質の発現を安定化する方法であって、VLV Gタンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを、VSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結させる工程を含む、方法。
[本発明1042]
VLVにおける異種タンパク質の発現を安定化する方法であって、異種タンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを異種タンパク質をコードするDNAに機能的に連結させ、次に、VSV Gタンパク質に機能的に連結させる工程を含む、方法。
[本発明1043]
以下の工程を含む、高力価 RNAウイルス様ベシクル(VLV)を選択する方法：
(i) アルファウイルス構造タンパク質を含まないウイルス構造タンパク質をコードするRNA配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養において継代することによって、VLVを生じさせる工程；および
(ii)生じたVLVを、細胞培養におけるVLVの大規模な継代およびVLVの定方向突然変異誘発からなる群より選択される少なくとも1つの手法を用いて、高力価VLVについてスクリーニングする工程。
[本発明1044]
ハイブリッドウイルスベクターRNA配列がアルファウイルス非構造タンパク質をコードする、本発明1043の方法。
[本発明1045]
非構造タンパク質がセムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ウイルス構造タンパク質がラブドウイルス糖タンパク質を含む、本発明1043の方法。
[本発明1047]
糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
高力価VLVが少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)を産生する、本発明1043の方法。
[本発明1049]
高力価VLVが、免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与される、本発明1043の方法。
[本発明1050]
対象が哺乳動物である、本発明1020、1022、1024、1029、1030および1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
哺乳動物がヒトである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV G タンパク質ヌクレオチド配列と、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含むSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有するRNAウイルス様ベシクル(VLV)。