【手続補正書】
【提出日】平成30年6月20日(2018.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を含むヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される心前駆体マーカーと反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
心前駆体マーカー反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ヒト細胞の前記培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とさらに接触させ；心前駆体マーカー反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心前駆体マーカーと反応性の薬剤が抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記心前駆体マーカーと反応性の薬剤が、可溶性リガンド融合タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記心前駆体マーカー反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別によって前記非反応性細胞から分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト心室前駆体細胞が、ＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養および分化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を生成する条件下でヒト多能性幹細胞を培養して、細胞の培養物を取得するステップ；
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される心前駆体マーカーと反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
心前駆体マーカー反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項８】
前記細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とさらに接触させ；心前駆体マーカー反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記心前駆体マーカーと反応性の薬剤が抗体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記心前駆体マーカーと反応性の薬剤が、可溶性リガンド融合タンパク質である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記心前駆体マーカー反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別によって前記非反応性細胞から分離される、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト心室前駆体細胞が、ＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養および分化される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するための方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される心前駆体マーカーについて陽性である単一のヒト心室前駆体細胞を単離するステップ；および
前記細胞が少なくとも１×１０９細胞まで拡大増殖されるような条件下で、前記単一の心前駆体マーカー陽性ヒト心室前駆体細胞を培養することによって、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
前記単一のヒト心室前駆体細胞が、初期培養の時点においてＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単一のヒト心室前駆体細胞が、蛍光活性化細胞選別によって単離される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記単一のヒト心室前駆体細胞が、前記心前駆体マーカーと反応性の１つまたは複数の試薬を使用して単離される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記心前駆体マーカーと反応性の試薬が、抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一のヒト心室前駆体細胞が、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地中で培養される、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記単一のヒト心室前駆体細胞が、前記細胞が心室分化に偏向するような条件下で培養される、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記単一のヒト心室前駆体細胞が、少なくとも１０×１０９細胞まで拡大増殖される、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１３から２０のいずれか一項に記載の方法によって取得される、少なくとも１×１０９のヒト心室前駆体細胞のクローン性集団。
【請求項２２】
請求項１３から２０のいずれか一項に記載の方法によって取得される、少なくとも１０×１０９のヒト心室前駆体細胞のクローン性集団。
【請求項２３】
対象において心機能を増強するための、請求項２１に記載のクローン性集団を含む医薬組成物。
【請求項２４】
前記対象の心臓中に直接投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記対象が、心筋梗塞に罹患している、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記対象が、先天性心臓障害を有する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記対象の心臓の心室領域中に直接投与されることを特徴とする、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記医薬組成物が、二次元または三次元マトリックス上に製剤化された前記クローン性集団を含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ヒト心室組織を生成するための方法であって、
ヒト心室前駆体細胞を非ヒト動物の臓器中に移植するステップであって、前記ヒト心室前駆体細胞が、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される心前駆体マーカーについて陽性である、ステップ；および
ヒト心室組織が生成されるように、前記前駆体細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで成長させるステップ
を含む、方法。
【請求項３０】
前記非ヒト動物が免疫不全マウスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記臓器が、腎臓または心臓である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
以下の細胞マーカーパターン：（ｉ）心中胚葉形成のピーク後；（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク時；（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピーク前；（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１発現のピーク前；ならびに（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前のうち１、２、３、４または５つが存在するときに、前記細胞が移植される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目から７日目の間（５日目および７日目を含む）で移植される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の６日目に移植される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
試験化合物の心毒性についてスクリーニングする方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される心前駆体マーカーについて陽性であるヒト心室前駆体細胞を提供するステップ；
前記細胞を前記試験化合物と接触させるステップ；および
前記細胞に対する前記試験化合物の毒性を測定するステップ
を含み、前記細胞に対する前記試験化合物の毒性が、前記試験化合物の心毒性を示す、方法。
【請求項３６】
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を生成する方法であって、
心中胚葉マーカーを発現する細胞が生成されるように、ＣＨＩＲ９８０１４を含む培地中でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養するステップ、および
ＨＶＰが生成されるように、Ｗｎｔ−Ｃ５９を含む培地中で、前記心中胚葉マーカーを発現する細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を含むヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法。
（項目２）
ヒト細胞の前記培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とさらに接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞またはＪａｇｇｅｄ１反応性／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する、項目１に記載の方法。
（項目３）
ヒト細胞の前記培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤ならびに前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と、同時に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目４）
ヒト細胞の前記培養物を、前記Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる前に、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる、項目２に記載の方法。
（項目５）
ヒト細胞の前記培養物を、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、前記Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤が抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体であり、かつ／または前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体である、上述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンド融合タンパク質または可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド融合タンパク質である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記Ｊａｇｇｅｄ１リガンドがＮｏｔｃｈ−１である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別によって前記非反応性細胞から分離される、上述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ヒト心室前駆体細胞が、ＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養および分化される、上述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を生成する条件下でヒト多能性幹細胞を培養して、細胞の培養物を取得するステップ；
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法。
（項目１２）
前記細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とさらに接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞またはＪａｇｇｅｄ１反応性／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤ならびに前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と同時に接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる前に、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞の培養物を、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤が抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体であり、かつ／または前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体である、項目１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンド融合タンパク質または可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド融合タンパク質である、項目１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｊａｇｇｅｄ１リガンドがＮｏｔｃｈ−１である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別によって前記非反応性細胞から分離される、項目１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ヒト心室前駆体細胞が、ＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養および分化される、項目１１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するための方法であって、
単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ；および
前記細胞が少なくとも１×１０９細胞まで拡大増殖されるような条件下で、前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を培養することによって、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するステップ
を含む、方法。
（項目２２）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、初期培養の時点においてＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、蛍光活性化細胞選別によって単離される、項目２１または項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の試薬を使用して単離される、項目２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の試薬が、抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地中で培養される、項目２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、前記細胞が心室分化に偏向するような条件下で培養される、項目２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、少なくとも１０×１０９細胞まで拡大増殖される、項目２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
項目２１から２８のいずれか一項に記載の方法によって取得される、少なくとも１×１０９のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団。
（項目３０）
項目２１から２８のいずれか一項に記載の方法によって取得される、少なくとも１０×１０９のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団。
（項目３１）
対象において心機能を増強する方法であって、項目２９に記載のクローン性集団を含む医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目３２）
前記クローン性集団が、前記対象の心臓中に直接投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記対象が、心筋梗塞に罹患している、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
前記対象が、先天性心臓障害を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記クローン性集団が、前記対象の心臓の心室領域中に直接投与される、項目３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記医薬組成物が、二次元または三次元マトリックス上に製剤化された前記クローン性集団を含む、項目３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ヒト心室組織を生成するための方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を、非ヒト動物の臓器中に移植するステップ；および
ヒト心室組織が生成されるように、前記前駆体細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで成長させるステップ
を含む、方法。
（項目３８）
前記非ヒト動物が免疫不全マウスである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記臓器が、腎臓または心臓である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
以下の細胞マーカーパターン：（ｉ）心中胚葉形成のピーク後；（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク時；（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピーク前；（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１発現のピーク前；ならびに（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前のうち１、２、３、４または５つが存在するときに、前記細胞が移植される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞が、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目から７日目の間（５日目および７日目を含む）で移植される、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞が、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の６日目に移植される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
試験化合物の心毒性についてスクリーニングする方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を提供するステップ；
前記細胞を前記試験化合物と接触させるステップ；および
前記細胞に対する前記試験化合物の毒性を測定するステップ
を含み、前記細胞に対する前記試験化合物の毒性が、前記試験化合物の心毒性を示す、方法。
（項目４４）
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を生成する方法であって、
心中胚葉マーカーを発現する細胞が生成されるように、ＣＨＩＲ９８０１４を含む培地中でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養するステップ、および
ＨＶＰが生成されるように、Ｗｎｔ−Ｃ５９を含む培地中で、前記心中胚葉マーカーを発現する細胞を培養するステップ
を含む、方法。