【手続補正書】
【提出日】平成30年8月7日(2018.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはその機能的断片に対して少なくとも９０％の同一性を含む、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｃｅｌ３Ａ酵素は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、請求項２に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む核酸配列によりコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは１つ以上のグリコシル化部位の近位、またはその部位に変異を含み、前記変異は前記１つ以上のグリコシル化部位でのグリコシル化を防止する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項６】
前記アグリコシル化されたポリペプチドは、
（ａ）野生型Ｔ．リーセイ由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて、増加したセロビアーゼ活性を有する、
（ｂ）野生型Ｔ．リーセイ由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて、増加した基質認識、より活性な基質認識部位、または低減された立体障害を有する、および／または
（ｃ）セロビオースなどの炭水化物を１つ以上の単糖、例えば、グルコースに加水分解する、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項７】
前記セロビアーゼ活性はセロビオースのβ１，４グリコシド結合の加水分解を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７に記載のポリペプチドをコードする核酸配列であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対して少なくとも９０％同一性を含む、核酸配列。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸配列を含む、核酸分子であって、前記核酸配列が、
（ａ）プロモーター、例えば、原核細胞発現、例えば、細菌細胞発現、例えば、大腸菌における発現のためのプロモーターであって、プロモーター配列が、構成的プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、または抑制プロモーター配列、例えばＴ７プロモーターである、プロモーター；
（ｂ）タグ、例えば、検出および／または精製のための、および／または別の分子への連結のためのタグ、例えば、Ｈｉｓタグ；および／または
（ｃ）１つ以上のシグナル配列、例えば、分泌シグナル配列
をさらに含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
さらに、選択マーカー、例えば、カナマイシンまたはアンピシリンマーカーをコードする核酸配列を含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１３】
細菌細胞である、請求項１２に記載の細胞であって、必要に応じて、
（ａ）前記細菌細胞は、グリコシル化に障害がある；および／または
（ｂ）前記細菌細胞は、大腸菌細胞（例えばｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞）である、
細胞。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞を、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養するステップであって、前記細胞は前記ポリペプチドをグリコシル化しない、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、例えば、ｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である、ステップ；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドを脱グリコシル化酵素で処理するステップであって、必要に応じて前記脱グリコシル化酵素はＰＧＮａｓｅおよびＥｎｄｏＨから選択される、ステップ；または
（ｃ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞を培養するステップであって、前記核酸配列は、コードされる前記ポリペプチドのグリコシル化を防止する１つ以上の変異を有する、ステップ；
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを発現する細胞を、グリコシル化阻害剤、例えば、ツニカマイシンの存在下で培養するための方法。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むグリコシル化されたポリペプチドとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアグリコシル化されたポリペプチドとを含む酵素混合物であって、前記グリコシル化されたポリペプチドおよび前記アグリコシル化されたペプチドはどちらもセロビアーゼ活性を有する、酵素混合物。
【請求項１７】
前記アグリコシル化されたポリペプチドは請求項１〜７のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドである、請求項１６に記載の酵素混合物であって、必要に応じて
（ａ）前記グリコシル化されたポリペプチドおよび前記アグリコシル化されたポリペプチドはどちらも野生型Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素を含む；
（ｂ）前記混合物が、１種以上のリグニナーゼ、１種以上のエンドグルカナーゼ、１種以上のセロビオヒドロラーゼ、および／または１種以上のキシラナーゼをさらに含む；
（ｃ）前記アグリコシル化されたポリペプチド対残りの酵素の間の比は少なくとも１：３２、例えば、１：３２〜１：３００である；および／または
（ｅ）前記アグリコシル化されたポリペプチド対グリコシル化されたポリペプチドの比は少なくとも１：３２、例えば、１：３２〜１：３００である、
酵素混合物。
【請求項１８】
バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール、など）を生成させる方法であって、バイオマスを、例えば、電子ビームによる処理により、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドおよび１つ以上のバイオマス分解酵素またはバイオマス分解酵素を含む酵素混合物を生成させる微生物と、前記生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含み、
（ａ）前記生成物は、糖生成物（例えばグルコースおよび／またはキシロース）である；および／または
（ｂ）前記方法は、前記糖生成物を単離することをさらに含み、必要に応じて、前記糖生成物の単離は、沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、または抽出を含む、
方法。
【請求項１９】
前記酵素混合物は、Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、およびスウォレニンからなる群より選択される酵素の少なくとも２つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物の１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み；ここで：
ａ）農産物または農業廃棄物は、サトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み；
ｂ）紙製品または紙屑は紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み；
ｃ）林産物はアスペン材、パーティクルボード，木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み；ならびに
ｄ）一般廃棄物は堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バイオマス分解酵素を生成する前記微生物は、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムおよびトリコデルマから選択される属の種に由来する、請求項１８に記載の方法。