【手続補正書】
【提出日】平成30年11月5日(2018.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核宿主細胞における２つの鎖を含むポリペプチドの生産方法であって、
（ａ）成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、成長温度からより低い生産温度への温度シフト、及び成長撹拌速度からより低い生産撹拌速度への速度シフト、並びに生産温度及び生産撹拌速度を含む生産相、を含む条件下で、培養培地において、ポリペプチドの２つの鎖を発現させるように、宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞が、
（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする、第１の翻訳単位、
（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする、第２の翻訳単位、ならびに
（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする、第３の翻訳単位、
を含む、ポリヌクレオチドを含み；
成長温度が、成長相の間約３０℃から約３４℃の範囲であり、生産温度が、生産相の間約２５℃から約２９℃の範囲であり、かつ成長撹拌速度が、生産撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、培養することと、
（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のポリペプチドを回収することと、を含み；
任意選択的に、成長撹拌速度が、生産撹拌速度より約１０％から約４０％高い、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、宿主細胞が、
（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする、第４の翻訳単位、及び
（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする、第５の翻訳単位、
を含むポリヌクレオチドをさらに含み、
第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、
方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、プロモータの３つのコピーを更に含み、第１のコピーが、第１の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第２のコピーが、第２の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第３のコピーが、第３の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プロモータが、誘導プロモータである、請求項３に記載の方法であって、任意選択的に誘導プロモータが、ＩＰＴＧ誘導の不在下で、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導プロモータである、または培養培地中のリン酸塩が枯渇したとき、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動する、Ｐｈｏプロモータである、方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、選択可能なマーカを更に含み、培養培地が、宿主細胞にポリヌクレオチドを保持させるように、単一の抗生物質からなる選択剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１の翻訳単位が、第１の鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第１の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第２の翻訳単位が、第２の鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第２の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度が、約１．０〜約３．０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含み；任意選択的にペプチジル−プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質、またはおよび任意選択的に大腸菌ＦｋｐＡタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのシャペロンタンパク質が更に、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼを含み、任意選択的にタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質及びＤｓｂＣタンパク質のうちの一方または両方、および任意選択的に大腸菌ＤｓｂＡ及び大腸菌ＤｓｂＣのうちの一方または両方である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
原核宿主細胞が、グラム陰性細菌であり；任意選択的にグラム陰性細菌が、大腸菌であり；任意選択的に大腸菌が、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ突然変異を有する株であり；かつ任意選択的に大腸菌が、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ２０９６（Ｖａｌｒ）  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ  ｄｅｇｐＳ２１０Ａの遺伝子型を有する株である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドの２つの鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結され；
任意選択的にポリペプチドが、第１の鎖及び第２の鎖が免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む一価抗体であり、一価抗体が、抗原に特異的に結合することが可能であり；かつ
任意選択的にポリペプチドが、宿主細胞のペリプラズムから回収される分泌タンパク質である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
成長撹拌速度が、生産相中の宿主細胞におけるピーク酸素取り込み速度を０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分上回る、成長相中の宿主細胞における酸素取り込み速度を達成するために十分であり；または
成長相中の宿主細胞のピーク酸素取り込み速度が、３．５〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内であり、生産相中の宿主細胞の酸素取り込み速度が、１．０〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、２つの鎖を含むポリペプチドが、重鎖及び軽鎖を含む半抗体であり、発現時に、重鎖及び軽鎖が組み立てられて、宿主細胞において半抗体を形成し；かつ任意選択的に半抗体が、少なくとも１つのホール形成突然変異または少なくとも１つのノブ形成突然変異を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、２つの鎖を含むポリペプチドが、重鎖及び軽鎖を含む抗ＩＬ１３半抗体であり、重鎖が、配列番号９のＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含み；軽鎖が、配列番号１２のＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１３のＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１４のＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインを含み、発現時に、重鎖及び軽鎖が組み立てられて、宿主細胞において抗ＩＬ１３半抗体を形成し；
任意選択的に抗ＩＬ１３半抗体が、少なくとも１つのホール形成突然変異または少なくとも１つのノブ形成突然変異を含み；
任意選択的に抗ＩＬ１３半抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含み、抗ＩＬ１３半抗体の軽鎖可変ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含み；
任意選択的に抗ＩＬ１３半抗体の重鎖が、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含み；かつ
任意選択的に抗ＩＬ１３半抗体の軽鎖が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
２つの鎖を含むポリペプチドが、重鎖及び軽鎖を含む半抗体であり；重鎖が、配列番号２０のＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２１のＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号２２のＨＶＲ−Ｈ３を含む第２の重鎖可変ドメインを含み、かつ軽鎖が、配列番号２３のＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２４のＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号２５のＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメインを含み、発現時に、重鎖及び軽鎖が組み立てられて、宿主細胞において抗ＩＬ１７半抗体を形成し；
任意選択的に抗ＩＬ１７半抗体が、少なくとも１つのホール形成突然変異または少なくとも１つのノブ形成突然変異を含み；
抗ＩＬ１７半抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、かつ抗ＩＬ１７半抗体の軽鎖可変ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
抗ＩＬ１７半抗体の重鎖が、配列番号２６または配列番号２７のアミノ酸配列を含み；並びに
抗ＩＬ１７半抗体の軽鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、
方法。
【請求項１５】
第１の抗原に結合することが可能な第１の半抗体、及び第２の抗原に結合することが可能な第２の半抗体を含む、二重特異性抗体の生産方法であって、第１の半抗体と第２の半抗体が相違し、かつ還元条件において、第１の半抗体を第２の半抗体と組み合わせて二重特異性抗体を生産することを含み、
第１の半抗体が、少なくとも１つのノブ形成突然変異を含み、かつ第２の半抗体が、少なくとも１つのホール形成突然変異を含み、並びに
第１の半抗体及び第２の半抗体の両方が、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法によって生産され；
任意選択的に第１の半抗体が、ＩＬ−１３に結合することが可能であり、かつ／又は、第２の半抗体が、ＩＬ−１７に結合することが可能であり；並びに
任意選択的に還元条件を達成するように、還元剤を添加するステップを更に含み、還元剤が、任意選択的にグルタチオンである、
方法。
【請求項１６】
ＩＬ１３に結合することが可能な第１の半抗体、及びＩＬ１７に結合することが可能な第２の半抗体を含む、二重特異性抗体の生産方法であって、
（ａ）第１の半抗体の第１の重鎖及び第１の軽鎖を発現させるように、第１の原核宿主細胞を培養することであって、（ｉ）第１の重鎖が、配列番号９のＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ３を含む第１の重鎖可変ドメインを含み、かつ（ｉｉ）第１の軽鎖が、配列番号１２のＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１３のＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１４のＨＶＲ−Ｌ３を含む、第１の軽鎖可変ドメインを含み、それによって、発現時に、第１の重鎖及び第１の軽鎖が組み立てられて、宿主細胞において第１の半抗体を形成する、培養することと、
（ａ’）第２の半抗体の第２の重鎖及び第２の軽鎖を発現させるように、第２の原核宿主細胞を培養することであって、（ｉ）第２の重鎖が、配列番号２０のＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２１のＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号２２のＨＶＲ−Ｈ３を含む第２の重鎖可変ドメインを含み、かつ（ｉｉ）第２の軽鎖が、配列番号２３のＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２４のＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号２５のＨＶＲ−Ｌ３を含む第２の軽鎖可変ドメインを含み、それによって、発現時に、第２の重鎖及び第２の軽鎖が組み立てられて、宿主細胞において第２の半抗体を形成し、
第１の宿主細胞が、
（１）第１の重鎖をコードする第１の翻訳単位、
（２）第１の軽鎖をコードする第２の翻訳単位、を含む、第１のポリヌクレオチドを含み、
第２の宿主細胞が、
（１’）第２の重鎖をコードする第３の翻訳単位、
（２’）第２の軽鎖をコードする第４の翻訳単位、を含む、第２のポリヌクレオチドを含み、
第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの両方が、
（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする第５の翻訳単位、
（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする第６の翻訳単位、及び
（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする第７の翻訳単位を更に含み、
第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
第１の宿主細胞及び第２の宿主細胞の両方が、
成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに
生産温度及び生産撹拌速度を含む生産相を含む、条件下で、培養培地において、別個に培養され、
成長温度が、生産温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度が、生産撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、培養することと、
（ｂ）第１の宿主細胞から第１の半抗体を回収することと、
（ｂ’）第２の宿主細胞から第２の半抗体を回収することと、
（ｃ）還元条件において、第１の半抗体を第２の半抗体と組み合わせて、ＩＬ−１３及びＩＬ−１７の両方に結合することが可能な二重特異性抗体を生産することと、を含み；
任意選択的に第１の半抗体が、少なくとも１つのノブ形成突然変異を含み、第２の半抗体が、少なくとも１つのホール形成突然変異を含み；並びに
任意選択的に還元条件を達成するように、還元剤を添加するステップを更に含み、還元剤が、任意選択的にグルタチオンである、
方法。
【請求項１７】
請求項１６または１７に記載の二重特異性抗体を含む組成物。