【手続補正書】
【提出日】平成29年12月11日(2017.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが５’末端および３’末端を有する複数のポリヌクレオチドを含む核酸試料における配列変異体を同定する方法であって、
（ａ）前記複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが前記５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップと、
（ｃ）増幅されたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列決定リードを生成するステップと、
（ｄ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、
（ｅ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記複数のポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
環状化が、前記複数のポリヌクレオチドをライゲーション反応に供することによってなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個々の環状ポリヌクレオチドが、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記配列変異体が、一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記参照配列が、前記配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
環状化が、アダプターポリヌクレオチドを前記複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方と接合するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅されたポリヌクレオチドを、富化を伴わずに前記配列決定ステップに供する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列決定の前に、富化ステップを実施することによって、前記増幅されたポリヌクレオチドの中で１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを富化するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記富化ステップが、増幅されたポリヌクレオチドを、基質に付着させた複数のプローブにハイブリダイズさせることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記富化ステップが、
（ａ）前記増幅されたポリヌクレオチド；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を増幅することを含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、対象由来の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、尿、便、血液、唾液、組織、または体液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、腫瘍細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記配列変異体が、がんの種類または病期に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のポリヌクレオチドが、無細胞ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記無細胞ポリヌクレオチドが、循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）の前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップが、複数のコンカテマーを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記配列変異体が、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満の頻度で生じる稀な配列変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸試料が、５０ｎｇ未満、４５ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３５ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１５ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、４ｎｇ未満、３ｎｇ未満、２ｎｇ未満、または１ｎｇ未満のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本明細書に開示されている種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、方法、組成物、およびシステムは、例えば、患者試料の特徴付けおよび場合によって対象の状態の診断においてなど、治療に適用される。一部の実施形態では、試料は、尿、便、血液、唾液、組織、または体液などの対象由来の試料である。一部の実施形態では、試料は、対象由来の腫瘍組織の試料中のものなどの腫瘍細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。一部の実施形態では、方法は、コールするステップに基づいて対象を診断するステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列変異体は、原因遺伝子変異体である。一部の実施形態では、配列変異体は、がんの種類または病期に関連するものである。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡまたは循環腫瘍ＤＮＡなどの無細胞ポリヌクレオチドを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
それぞれが５’末端および３’末端を有する複数のポリヌクレオチドを含む核酸試料における配列変異体を同定する方法であって、
（ａ）前記複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが前記５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップと、
（ｃ）増幅されたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列決定リードを生成するステップと、
（ｄ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、
（ｅ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップと
を含む方法。
（項目２）
配列変異体を同定する方法であって、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップとを含み、
（ａ）前記配列決定リードが、前記少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドの増幅産物に対応し、
（ｂ）前記少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドのそれぞれが、各々のポリヌクレオチドの５’末端と３’末端をライゲーションすることによって形成された異なる接合部を含む、
方法。
（項目３）
前記複数のポリヌクレオチドが一本鎖である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
環状化が、前記複数のポリヌクレオチドをライゲーション反応に供することによってなされる、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
個々の環状ポリヌクレオチドが、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記配列変異体が、一塩基多型である、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
前記参照配列が、前記配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
前記参照配列が、既知の参照配列である、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
環状化が、アダプターポリヌクレオチドを前記複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方と接合するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、それぞれが異なる標的配列と配列相補性によって特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記増幅されたポリヌクレオチドを、富化を伴わずに前記配列決定ステップに供する、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
配列決定の前に、富化ステップを実施することによって、前記増幅されたポリヌクレオチドの中で１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを富化するステップをさらに含む、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１５）
前記富化ステップが、増幅されたポリヌクレオチドを、基質に付着させた複数のプローブにハイブリダイズさせることを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記富化ステップが、
（ａ）前記増幅されたポリヌクレオチド；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を増幅することを含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記コールするステップに基づいて微生物性汚染物質を同定する、項目１または２に記載の方法。
（項目１８）
それぞれが５’末端および３’末端を有するポリヌクレオチド５０ｎｇ未満を含む核酸試料において配列変異体を同定する方法であって、
（ａ）リガーゼを用いて前記試料中の個々のポリヌクレオチドを環状化して複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（ｂ）前記リガーゼを前記環状ポリヌクレオチドから分離したら、前記環状ポリヌクレオチドを増幅してコンカテマーを形成するステップと、
（ｃ）前記コンカテマーを配列決定して複数の配列決定リードを生成するステップと、
（ｄ）複数の配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、
（ｅ）前記５０ｎｇ未満のポリヌクレオチドの核酸試料からの前記複数のリードにおいて０．０５％またはそれ超の頻度で生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップと
を含む方法。
（項目１９）
前記試料の前記ポリヌクレオチドが一本鎖である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
個々の環状ポリヌクレオチドが、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記配列変異体が、一塩基多型である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記参照配列が、前記配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記参照配列が、既知の参照配列である、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、それぞれが異なる標的配列と配列相補性によって特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅する方法であって、前記反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、前記反応混合物が、
（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数のコンカテマー；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、方法。
（項目２８）
反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を含む複数の異なる環状ポリヌクレオチドを増幅する方法であって、前記反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、前記反応混合物が、
（ａ）複数の環状ポリヌクレオチドであって、前記複数の個々の環状ポリヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数の環状ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含み、
配列Ａおよび配列Ｂが内因性配列であり、前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、方法。
（項目２９）
前記第１のプライマーが配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、前記第２のプライマーが配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも前記複数のコンカテマーとハイブリダイズしない、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
増幅が、第１の相および第２の相を含み、前記第１の相が、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に前記第１および第２のプライマーが前記コンカテマーとハイブリダイズし、前記第２の相が前記第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、前記第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第２の温度におけるハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を５サイクル行った後、前記反応混合物中の増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも５％が前記標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１のプライマーが配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、前記第２のプライマーが配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも前記複数の環状ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
増幅が、第１の相および第２の相を含み、前記第１の相が、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に前記第１および第２のプライマーが前記環状ポリヌクレオチドまたはその増幅産物とハイブリダイズし、前記第２の相が、前記第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、前記第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅するための反応混合物であって、
（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数のコンカテマー；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、反応混合物。
（項目３５）
前記第１のプライマーが配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、前記第２のプライマーが配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、増幅反応の第１の増幅ステップの間、配列Ｃも配列Ｄも前記２つまたはそれ超のコンカテマーとハイブリダイズしない、項目３４に記載の反応混合物。
（項目３６）
一本鎖であり、リガーゼを実質的に含まない複数の環状化されたポリヌクレオチドを含む組成物。
（項目３７）
複数のコンカテマーを含む組成物であって、前記複数のコンカテマーが、１００００またはそれ未満の標的ポリヌクレオチドの群に対応し、さらに、前記複数の個々のコンカテマーが、
（ａ）配列反復の２つまたはそれ超のコピーを含み、前記コピーの全てが同じ標的ポリヌクレオチドに対応し、
（ｂ）前記組成物における１つの個々のコンカテマーの前記配列反復の前記２つまたはそれ超のコピー間の接合部が別の個々のコンカテマーのものとは異なる
ことを特徴とする、組成物。
（項目３８）
配列変異体を検出するためのシステムであって、
（ａ）試料に対する検出反応を実施するための使用者要求を受信するように構成されたコンピュータ；
（ｂ）前記使用者要求に応答して前記試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施する増幅システムであって、前記増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含む増幅システム；
（ｃ）前記増幅システムによって増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成し、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定し、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするシークエンシングシステム；および
（ｄ）受信者に報告を送信する報告作成プログラムであって、前記報告が、前記配列変異体の検出の結果を含有する報告作成プログラム
を含むシステム。
（項目３９）
前記受信者が使用者である、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
１つまたは複数のプロセッサにより実行されると、配列変異体を検出する方法を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体であって、該方法は、
（ａ）試料に対する検出反応を実施するための顧客要求を受信するステップと、
（ｂ）前記顧客要求に応答して前記試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施するステップであって、前記増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含むステップと、
（ｃ）（ｉ）前記増幅反応において増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成するステップと、（ｉｉ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｉｉｉ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップとを含む配列決定解析を実施するステップと、
（ｄ）前記配列変異体の検出の結果を含有する報告を作成するステップと
を含む、コンピュータ可読媒体。
（項目４１）
前記試料が、対象由来の試料である、項目１または２に記載の方法。
（項目４２）
前記試料が、尿、便、血液、唾液、組織、または体液である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記試料が、腫瘍細胞を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記コールするステップに基づいて前記対象を診断するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記配列変異体が原因遺伝子変異体である、項目１または２に記載の方法。
（項目４７）
前記配列変異体が、がんの種類または病期に関連する、項目１または２に記載の方法。
（項目４８）
前記複数のポリヌクレオチドが、無細胞ポリヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４９）
前記無細胞ポリヌクレオチドが、循環腫瘍ＤＮＡを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記試料の前記ポリヌクレオチドが、無細胞ポリヌクレオチドを含む、項目１８に記載の方法。
（項目５１）
前記配列変異体が原因遺伝子変異体である、項目１８に記載の方法。
（項目５２）
前記ポリヌクレオチドが無細胞ＤＮＡである、項目３６に記載の組成物。