【手続補正書】
【提出日】平成30年8月1日(2018.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的を認識する結合体の多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの産生方法であって、
前記結合体をコードするドナーＤＮＡ分子、及び真核細胞の提供であって、前記結合体が抗体、蛋白質又はペプチドである、提供と、
前記細胞への前記ドナーＤＮＡの導入、及び前記細胞内での部位特異的なヌクレアーゼの提供であって、前記ヌクレアーゼが細胞ＤＮＡの認識配列を切断することで、前記ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡへと組込まれる組込み部位が創出され、組込みが、前記細胞に対して内在性であるＤＮＡ修復機構を介して生じ、それによって前記細胞ＤＮＡに組込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を創出する前記導入及び提供と、
クローン産生のための前記組換え細胞の培養と、
それによる、前記結合体のレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの提供と、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記結合体が、抗体分子、Ｔ細胞受容体であり、及び／又は、前記結合体が、少なくとも第１サブユニット及び第２サブユニットを含む多量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体分子が、全長免疫グロブリン、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、またはｓｃＦｖである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的を認識する多量体である結合体の多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの産生方法であって、それぞれの結合体が、第１サブユニット及び第２サブユニットを含み、前記方法が、
前記第１サブユニットをコードするＤＮＡを含む真核細胞の提供、及び前記第２結合体サブユニットをコードするドナーＤＮＡ分子の提供であって、前記結合体が抗体、蛋白質又はペプチドである、提供と、
前記細胞への前記ドナーＤＮＡの導入、及び前記細胞内での部位特異的ヌクレアーゼの提供であって、前記ヌクレアーゼが細胞ＤＮＡの認識配列を切断することで、前記ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡへと組込まれる組込み部位が創出され、組込みが、前記細胞に対して内在性であるＤＮＡ修復機構を介して生じ、それによって、前記細胞ＤＮＡに組込まれたドナーＤＮＡを含む組換え細胞を創出する前記導入及び提供と、
前記多量体である結合体の前記第１サブユニット及び前記第２サブユニットをコードするＤＮＡを含むクローンを産生するための前記組換え細胞の培養と、
それによる、前記多量体である結合体のレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの提供と、
を含む前記方法。
【請求項５】
標的を認識する多量体である結合体の多様なレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの産生方法であって、それぞれの結合体が、少なくとも第１サブユニット及び第２サブユニットを含み、前記結合体が抗体、蛋白質又はペプチドであり、前記方法が、
前記第１サブユニットをコードする第１ドナーＤＮＡ分子の提供、及び真核細胞の提供と、
前記細胞への前記第１ドナーＤＮＡの導入、及び前記細胞内での部位特異的ヌクレアーゼの提供であって、前記ヌクレアーゼが細胞ＤＮＡの認識配列を切断することで、前記ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡへと組込まれる組込み部位が創出され、組込みが、前記細胞に対して内在性であるＤＮＡ修復機構を介して生じ、それによって、前記細胞ＤＮＡに組込まれた第１ドナーＤＮＡを含む、第１セットの組換え細胞を創出する前記導入及び提供と、
前記第１サブユニットをコードするＤＮＡを含む、第１セットのクローンを産生するための前記第１セットの組換え細胞の培養と、
前記第１セットのクローンの細胞への、前記第２サブユニットをコードする第２ドナーＤＮＡ分子を導入であって、前記第１セットのクローンの細胞ＤＮＡへと前記第２ドナーＤＮＡを組込み、それによって、前記細胞ＤＮＡへと組込まれた第１ドナーＤＮＡ及び第２ドナーＤＮＡを含む、第２セットの組換え細胞を創出する前記導入と、
第２セットのクローンを産生するための、第２セットの組換え細胞の培養であって、こうしたクローンが、前記多量体である結合体の前記第１サブユニット及び前記第２サブユニットをコードするＤＮＡを含む前記培養と、
それによる、前記多量体である結合体のレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリーの提供と、
を含む前記方法。
【請求項６】
前記細胞内での部位特異的ヌクレアーゼの提供であって、前記ヌクレアーゼが細胞ＤＮＡの認識配列を切断することで、前記ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡへと組込まれる組込み部位が創出され、組込みが、前記細胞に対して内在性であるＤＮＡ修復機構を介して生じる前記提供を含む方法によって、前記第２ドナーＤＮＡ分子が組込まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多量体である結合体が、別々のサブユニットとして、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む抗体分子である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記多量体である結合体が、全免疫グロブリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、２×１０７塩基対を超えるサイズのゲノムを有する高等真核細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、哺乳類のものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｔリンパ球系譜細胞もしくはＢリンパ球系譜細胞、または「Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」もしくは「ＣＯＳＭＩＣ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ」に記載の細胞株のいずれかである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記認識配列が、前記細胞のゲノムＤＮＡに存在する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記部位特異的ヌクレアーゼに向けた前記認識配列が、前記細胞ＤＮＡにおいて１回または２回のみ生じる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、細胞ＤＮＡを切断し、組込み部位として働く二本鎖切断を創出する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、もしくはＴＡＬＥヌクレアーゼであり、またはＤＮＡ切断が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって指示される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ドナーＤＮＡが、前記ドナーＤＮＡが組込まれた細胞の選択に向けた遺伝子要素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞ＤＮＡへの前記ドナーＤＮＡの組込みが、前記細胞ＤＮＡ内に存在するプロモーター制御下での、前記結合体の発現及び／または遺伝子選択要素の発現を引き起こす、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライブラリーが、少なくとも、１００、１０３、１０４、１０５、または１０６個のクローンを含み、それぞれのクローンが、ドナーＤＮＡの組込みによって産生した個々の組換え細胞から得られる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライブラリーが、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、または１０６個の異なる結合体をコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
それぞれのクローンが、前記結合体レパートリーの１つまたは２つのメンバーのみをコードする組込みドナーＤＮＡを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記真核細胞が、二倍体であり、前記細胞ＤＮＡにおける二重の固定遺伝子座に、前記部位特異的ヌクレアーゼに向けた認識配列を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
それぞれのクローンが、前記結合体レパートリーの単一メンバーをコードする組込みドナーＤＮＡを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ドナーＤＮＡ分子のそれぞれが、単一の結合体または結合体サブユニットをコードする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合体が、前記細胞表面にディスプレイされる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合体が、前記細胞から分泌される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ドナーＤＮＡが、ラウンドのファージディスプレイによる選択に由来する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合体を発現させるための、前記ライブラリーの培養と、
関心結合体を発現する１つまたは複数のクローンの回収と、
前記１つまたは複数の回収クローンからの派生ライブラリーの生成であって、前記派生ライブラリーが、第２の結合体レパートリーをコードするＤＮＡを含む前記生成と、
をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記派生ライブラリーの生成が、前記１つまたは複数の回収クローンからのドナーＤＮＡの単離と、第２の結合体レパートリーをコードするドナーＤＮＡ分子の派生集団を提供するための、前記ＤＮＡへの変異導入と、前記第２の結合体レパートリーをコードするＤＮＡを含む細胞の派生ライブラリーを創出するための、細胞へのドナーＤＮＡ分子の前記派生集団の導入と、を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記派生ライブラリーの生成が、前記クローン内の前記ＤＮＡの変異導入による、前記１つまたは複数の回収クローンの前記ドナーＤＮＡへの変異導入を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
結合体の多様なレパートリーの産生方法であって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によるライブラリー産生と、前記結合体を発現させるための、前記ライブラリー細胞の培養と、を含む前記産生方法。
【請求項３１】
標的を認識する結合体の選別方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によるライブラリーの産生と、
前記結合体を発現させるための、前記ライブラリーの細胞の培養と、
前記標的に対する前記結合体の曝露であって、存在するのであれば、１つまたは複数の同種結合体による前記標的の認識が可能になる前記曝露と、
前記標的が同種結合体によって認識されたかどうかの検出と、
を含む、前記選別方法。
【請求項３２】
前記結合体が、抗体分子であり、前記標的が、抗原である、または
前記結合体が、ＴＣＲであり、前記標的が、ＭＨＣ：ペプチド複合体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
同種結合体による標的認識の検出と、前記同種結合体をコードするＤＮＡを含むクローン細胞の回収と、をさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記回収クローンからの、前記結合体をコードするＤＮＡの単離と、それによる前記標的を認識する結合体をコードするＤＮＡの取得と、をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
変異導入または前記ＤＮＡの、再構造化された結合体をコードする修飾ＤＮＡへの変換を含む、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合体が、ｓｃＦｖであり、前記方法が、前記ｓｃＦｖをコードするＤＮＡの、Ｉｇまたはその断片をコードするＤＮＡへの変換であって、可変ＶＨ鎖及び可変ＶＬ鎖の元のペアが維持される前記変換を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞への、前記ＤＮＡの導入をさらに含み、
任意選択により、前記細胞の培養と、細胞ペレットまたは濃縮細胞懸濁液の提供のための、前記細胞の濃縮と、をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記結合体の発現のための前記細胞の培養と、前記結合体の精製と、をさらに含む、請求項３３または３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法による、結合体のレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核細胞のライブラリー構築における、細胞ＤＮＡの標的切断に向けた部位特異的ヌクレアーゼの使用であって、ヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ切断が、内在性の細胞ＤＮＡ修復機構を介する結合体遺伝子の部位特異的組込みを増進する前記使用。