(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0006850396.tif 000063
［式中、
Ｘは、Ｈ、またはヒドロキシルで任意に置換されたＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｙは、Ｈ、ヒドロキシ、またはメチルであり、
Ｒは、エチル、ｎ−プロピル、シクロプロピル、または
【化２】
0006850396.tif 000064
であり、
Ａは、メチル、シクロプロピル、またはトリフルオロメチルである］
の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であって、
但し、ＸとＹが両方ともＨであり、Ｒがｎ−プロピルである場合、Ａはメチル以外である、上式の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｘはメチルである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
ＹはＨである、請求項１または請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｒはｎ−プロピルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ａはシクロプロピルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
前記化合物は遊離塩基形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物は、式：
【化３】
0006850396.tif 000065
の化合物である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
前記化合物は、式：
【化４】
0006850396.tif 000066
の化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物は、式：
【化５】
0006850396.tif 000067
の化合物である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記化合物は、式：
【化６】
0006850396.tif 000068
の化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
患者における慢性腎疾患を治療するための薬学的組成物であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
患者における糖尿病性腎疾患を治療する方法に用いるための薬学的組成物であって、
前記薬学的組成物が、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含み、
前記方法が、治療を必要とする患者に、前記薬学的組成物を投与することを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
治療において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
慢性腎疾患の治療において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
糖尿病性腎疾患の治療において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
薬学的組成物を調製するためのプロセスであって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のヒトＰＤＥ１阻害剤、該化合物を含む薬学的組成物、該化合物を使用して生理学的障害を治療する方法、ならびに該化合物の合成に有用な中間体およびプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰが加水分解される速度を制御することにより、これらの環状ヌクレオチドの細胞レベルを調節する酵素である。カルシウムおよびカルモジュリン依存性ＰＤＥであるＰＤＥ１は、少なくとも１１の既知のＰＤＥファミリーのうちの１つである。ＰＤＥ１は、脳、心臓、肺、腎臓、および平滑筋等の多くの組織で発現する。さらに、ＰＤＥ１は、３つの既知のアイソフォーム、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃのファミリーから構成される。
【０００３】
糖尿病に罹患する患者は、しばしば、糖尿病性腎疾患（または糖尿病性腎症）と称される慢性腎疾患の一形態を発症する。糖尿病性腎疾患は、４０パーセントもの糖尿病患者に影響を与え得ると推定されている。糖尿病性腎疾患の治療選択肢は限られており、血圧を下げる薬物の使用、血糖値、食事、および体重の管理、ならびに定期的な身体活動の実施を含む。したがって、慢性腎疾患、特に糖尿病性腎疾患に罹患する患者のためのさらなる治療選択肢が必要である。
【０００４】
米国特許第８，２９９，０８０号は、排尿障害および高血圧等の様々な障害の治療に有用なＰＤＥ９阻害活性を有する特定のキノキサリン誘導体を開示している。さらに、欧州特許第０  ０４０  ４０１号は、降圧作用を有する特定の置換トリアゾロキノキサリン−４−オンを開示している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ヒトＰＤＥ１の阻害剤である特定の新規化合物を提供する。さらに、本発明は、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、およびＰＤＥ６ＡＢ等の他のヒトＰＤＥと比較して、ヒトＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃの選択的阻害剤である特定の新規化合物を提供する。さらに、本発明は、降圧効果を有し得る、また腎血流を改善し得る、特定の新規化合物を提供する。さらに、本発明の特定の化合物は、腎線維症を軽減し得る。
【０００６】
したがって、本発明は、式Ｉ：
【０００７】
【化１】
0006850396.tif 000002
［式中、Ｘは、Ｈ、またはヒドロキシルで任意に置換されたＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｙは、Ｈ、ヒドロキシ、またはメチルであり、
Ｒは、エチル、ｎ−プロピル、シクロプロピル、または
【０００８】
【化２】
0006850396.tif 000003
であり、
Ａは、メチル、シクロプロピル、またはトリフルオロメチルである］
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩であって、
但し、ＸとＹが両方ともＨであり、Ｒがｎ−プロピルである場合、Ａはメチル以外である、化合物または塩を提供する。
【０００９】
本発明はまた、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、患者における糖尿病性腎疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、患者における高血圧を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、治療において使用するための式Ｉの化合物を提供する。本発明はさらに、慢性腎疾患の治療において使用するための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、糖尿病性腎疾患の治療において使用するための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、高血圧症の治療において使用するための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、慢性腎疾患の治療のための薬物を製造するために、式Ｉの化合物の使用を提供する。さらに、本発明は、糖尿病性腎疾患の治療のための薬物を製造するために、式Ｉの化合物の使用を提供する。本発明は、高血圧症の治療のための薬物を製造するために、式Ｉの化合物の使用をさらに提供する。
【００１３】
本発明はさらに、式Ｉの化合物を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに含む、薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、式Ｉの化合物を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、薬学的組成物を調製するための方法を提供する。本発明はまた、式Ｉの化合物の合成のための新規中間体およびプロセスも包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書で使用される場合、「治療すること」、「治療」、または「治療する」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を妨げること、抑制すること、遅延させること、阻止すること、または逆転させることを含む。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、イヌまたはヒト等の哺乳動物を指し、ヒトが好ましい。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者に単回または複数回投与されると、診断中または治療中の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または投与量を指す。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「Ｃ１−Ｃ３アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、およびイソプロピルを指す。
【００１８】
有効量は、既知の技法を使用して、および類似する状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定され得る。患者にとっての有効量を決定する際には、限定されないが、患者のサイズ、年齢、および一般的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度または関与もしくは重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物の生物学的利用能特性；選択された用法；併用薬の使用；ならびに他の関連する状況を含む、多数の要因が考慮される。
【００１９】
本発明の化合物は、約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内の１日当たりの投与量で有効である。ある場合には、前述の範囲の下限よりも低い投与量レベルが十分以上である場合があり、他の場合には、許容される副作用を伴って、さらに多い用量が用いられてもよく、したがって、前述の投与量範囲は、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２０】
本発明の化合物は、経口および経皮経路を含む、化合物を生体利用可能にする任意の経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。より好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。このような薬学的組成物およびこれを調製するためのプロセスは、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。
【００２１】
式Ｉの化合物は、本発明の治療方法において特に有用であるが、特定の基、置換基、および化合物が好ましい。以下の段落では、そのような好ましい基、置換基、および化合物について説明する。これらの選好は、本発明の治療方法および新規化合物の両方に適用可能であることを理解されたい。
【００２２】
ＹはＨであることが好ましい。
【００２３】
Ｘはメチルであることが好ましい。
【００２４】
Ｒはｎ−プロピルであることが好ましい。
【００２５】
Ａはシクロプロピルであることが好ましい。
【００２６】
式Ｉの化合物は遊離塩基形態であることが好ましい。
【００２７】
ＹがＨである場合、Ｘはメチルであることがさらに好ましい。
【００２８】
ＹがＨである場合、Ｒはｎ−プロピルであることがさらに好ましい。
【００２９】
ＹがＨである場合、Ａはシクロプロピルであることがさらに好ましい。
【００３０】
Ｘがメチルである場合、Ｒはｎ−プロピルであることがさらに好ましい。
【００３１】
Ｘがメチルである場合、Ａはシクロプロピルであることがさらに好ましい。
【００３２】
ＹがＨである場合、Ｘはメチルであり、Ａはシクロプロピルであることが特に好ましい。
【００３３】
ＹがＨである場合、Ｘはメチルであり、Ｒはｎ−プロピルであることが特に好ましい。
【００３４】
ＹがＨであり、Ｒがｎ−プロピルであり、Ａがシクロプロピルであることが特に好ましい。
【００３５】
以下の式の化合物
【００３６】
【化３】
0006850396.tif 000004
【００３７】
およびその薬学的に許容される塩が最も好ましく、すぐ上に記載する化合物の遊離塩基が最も特に好ましい。
【００３８】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当該技術分野で周知の標準的な条件下における、適切な溶媒中での本発明の化合物の適切な遊離塩基と適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。
【００３９】
個々の異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点において、当業者により分離または分割され得る（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１、およびＥ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．  Ｗｉｌｅｎ，”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照）。「異性体１」および「異性体２」という名称は、それぞれ、第１および第２の特定の条件下で、キラルクロマトグラフィーから溶出する化合物を指す。
【００４０】
特定の略語は以下のように定義される：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＡｃＯＨ」は氷酢酸を指し、「ＤＢＵ」は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンまたは塩化メチレンを指し、「ＤＩＰＥＡ」はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥＤＣＩ」は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを指し、「ＥＳ／ＭＳ」はエレクトロスプレー質量分析を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し、「ＨＭＤＳ」はヘキサメチルジシラザンを指し、「ＨＯＢＴ」はヒドロキシベンゾトリアゾールを指し、「ＩＰＡ」はイソプロパノールを指し、「ＨＡＴＵ」は１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＲＢＦ」は丸底フラスコを指し、「ＴＲ」は滞留時間を指し、「ｈｒ」は１時間または数時間を指し、「ＩＣ５０」は、その薬剤について可能な最大阻害反応の５０％をもたらす薬剤の濃度を指し、「μｍｏｌ」はマイクロモル（単数または複数）を指し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」はメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「ＮｉＮＴＡ」は、キレート剤としてニトリロ三酢酸で官能化されたアガロース固定相を用いたクロマトグラフィーを指し、「ＰＯＣｌ３」はオキシ塩化リンを指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＳＮＡｒ」は、求核芳香族置換を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「Ｔｒｉｓ」は２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールを指し、「Ｕ／ｍｌ」はミリリットル当たりの単位を指し、「ｗｔ」は重量を指し、「Ｐｄ−ＰＥＰＰＳＩ−ＩＨｅｐｔＣｌ」はジクロロ［１，３−ビス（２，６−ジ−４−ヘプチルフェニル）イミダゾール−２−イリデン］（３−クロロピリジル）パラジウム（ＩＩ）を指す。
【００４１】
本発明の化合物は、当業者に既知の様々な手順によって調製されてもよく、そのうちのいくつかを、以下のスキーム、調製物、および実施例において説明する。当業者は、本発明の化合物を調製するために、記載される経路のそれぞれに対する特定の合成ステップを異なる様式で組み合わせることができるか、または異なるスキームのステップと併せることができることを認識している。各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。以下のスキームにおいて、全ての置換基は、別途指示のない限り、すでに定義されたとおりである。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、以下のスキーム、調製物、および実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【実施例】
【００４２】
調製法１
３−Ｎ−ブチル−５−メチル−ピリジン−２，３−ジアミンの合成。
【００４３】
【化４】
0006850396.tif 000005
【００４４】
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の５−メチルピリジン−２，３−ジアミン（５．６４ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ブタナール（３．２８ｇ、４６ｍｍｏｌ）およびＡｃＯＨ（０．２６ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加える。懸濁液をＲＴで５０分間撹拌し、次いで１分間超音波処理する。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２９．１ｇ、１３７ｍｍｏｌ）を５回に分けて加え、反応混合物を室温で４５分間撹拌する。反応混合物を水（３００ｍＬ）でクエンチし、層を分離する。水溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＤＣＭで抽出する。合わせた有機物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、さらに無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗材料として表題化合物５．６４ｇを得る。ＮａＨＣＯ３水溶液と飽和水溶液ＮａＣｌ洗浄液を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で希釈し、３：１のＣＨＣｌ３／ＩＰＡ（４ｘ）およびＭＴＢＥで抽出する。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してさらに７８０ｍｇの材料を得る。材料を合わせて、粗表題化合物（６．４２ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８０（Ｍ＋Ｈ）。
【００４５】
５−メチルピリジン−２，３−ジアミンとプロパナール（調製物番号２の場合）、および５−ブロモ−６−メチル−ピリジン−２，３−ジアミンとブタナール（調製物番号３の場合）から、調製物１の方法と本質的に類似した様式で、表１に示す以下の化合物を調製する。
【００４６】
【表１】
0006850396.tif 000006
【００４７】
【化５】
0006850396.tif 000007
【００４８】
調製法４
６−メトキシ−Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミンの合成。
【００４９】
【化６】
0006850396.tif 000008
【００５０】
スキーム１、ステップＡ：ＡＣＮ（９０ｍＬ）中の２−クロロ−６−メトキシ−３−ニトロ−ピリジン（４．９９ｇ、２６．５１５ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で撹拌し、６５℃に加熱する。４−メトキシベンジルアミン（７．２５ｍＬ、５５．５ｍｍｏｌ）を加えると、固体沈殿物が形成される。反応物を６５℃で１時間撹拌する。反応混合物をＲＴに冷却し、珪藻土のパッドで濾過し、減圧下で濃縮し、次いで高真空下で一晩さらに乾燥させて、粗黄色固体の表題化合物（８．６３８ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５１】
調製法５
６−メトキシ−２−Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］ピリジン−２，３−ジアミンの合成
【００５２】
【化７】
0006850396.tif 000009
【００５３】
スキーム１、ステップＢ：６−メトキシ−Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン（５．００ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラート）ジボロン（１１．２ｇ、４３．２ｍｍｏｌ）およびカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．９３ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）をＩＰＡ（５５ｍＬ）中で合わせる。反応混合物を窒素ガス下で密封し、１１０℃で一晩撹拌する。反応物をＲＴに冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機層を水で洗浄し、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中３０〜５０％のＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮し、高真空下で一晩乾燥させて、粗青色残渣の表題化合物（４．８８ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５４】
【化８】
0006850396.tif 000010
【００５５】
調製法６
ｒａｃ−Ｎ−（２−メトキシブチル）−２−ニトロピリジン−３−アミンの合成。
【００５６】
【化９】
0006850396.tif 000011
【００５７】
スキーム２、ステップＡ：３−フルオロ−２−ニトロピリジン（１．５００ｇ、１０．２４ｍｍｏｌ）および（２−メトキシブチル）アミン塩酸塩（１．５９０ｇ、１０．８２ｍｍｏｌ）の懸濁液にＴＥＡ（４．３ｍＬ、３１ｍｍｏｌ）を加える。反応物をＲＴで２．５時間撹拌する。ＥｔＯＡｃを加え、材料を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過する。濾液を濃縮し、ＤＣＭ／ＭＴＢＥで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮し、表題化合物として黄橙色の液体（２．２２３ｇ、ラセミ体）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２６．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５８】
調製法７
ｒａｃ−３−Ｎ−［２−メトキシブチル］ピリジン−２，３−ジアミンの合成
【００５９】
【化１０】
0006850396.tif 000012
【００６０】
スキーム２、ステップＢ：ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）を、窒素下で５％Ｐｄ／Ｃ（０．４５２ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）を含むＰａｒｒ社製シェーカーに加え、次いでＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のＮ−（２−メトキシブチル）−２−ニトロ−ピリジン−３−アミン（２．２２ｇ、９．８６ｍｍｏｌ）の溶液を加える。Ｐａｒｒ社製シェーカーを密封し、窒素でパージし、水素でパージし、水素で加圧（６０ｐｓｉｇ）し、次いでＲＴで４時間撹拌する。材料を濾過し、濃縮して、表題化合物として暗色の粘度の高いゲル（１．７９４ｇ、ラセミ体）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９６．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００６１】
【化１１】
0006850396.tif 000013
【００６２】
調製法８
Ｎ−（２−アミノ−５−ブロモ−３−ピリジル）ブタンアミドの合成
【００６３】
【化１２】
0006850396.tif 000014
【００６４】
スキーム３、ステップＡ：５−ブロモピリジン−２，３−ジアミン（５ｇ、２７ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＰＥＡ（１４ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（９０ｍＬ）中の酪酸（２．７ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１５．０１ｇ、４０ｍｍｏｌ）の溶液に加える。反応物を窒素下で密封し、５０℃で一晩撹拌する。反応混合物をＲＴに冷却し、水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機相を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、５％塩化リチウム水溶液、および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中４０〜１００％のＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白褐色の固体を得る。その固体をＥｔＯＡｃ中で粉砕し、濾過し、真空下５０℃で１時間乾燥させて、表題化合物（３．６０７ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５８／２６０（Ｍ＋Ｈ）。
【００６５】
調製法９
５−ブロモ−３−Ｎ−ブチル−ピリジン−２，３−ジアミンの合成。
【００６６】
【化１３】
0006850396.tif 000015
【００６７】
スキーム３、ステップＢ：ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の水素化アルミニウムリチウム（３０ｍＬ、ＴＨＦ中１ｍｏｌ／Ｌ）の溶液を、オーブン乾燥した三つ口ＲＢＦ中で−７８℃に冷却する。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＮ−（２−アミノ−５−ブロモ−３−ピリジル）ブタンアミド（２．５０ｇ、９．６９ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下して加える。反応混合物を３時間かけて室温に加温し、次いでＲＴで一晩撹拌する。反応混合物を氷浴中で０℃に冷却する。水（３．０ｍＬ）、２ＮＮａＯＨ水溶液（３．７５ｍＬ）、および水（９．０ｍＬ）を連続的に滴下して加え、続いて無水ＭｇＳＯ４を滴下して加え、反応混合物を５分間撹拌する。溶液を珪藻土のパッドで濾過し、Ｅｔ２Ｏですすぐ。濾液をＥｔ２Ｏで希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗表題化合物（２．２８ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４４／２４６（Ｍ＋Ｈ）。
【００６８】
【化１４】
0006850396.tif 000016
【００６９】
調製法１０
１−ブチル−７−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンの合成
【００７０】
【化１５】
0006850396.tif 000017
【００７１】
スキーム４：過剰なシュウ酸ジエチル（３０ｍＬ、２２０．９ｍｍｏｌ）中の３−Ｎ−ブチル−５−メチル−ピリジン−２，３−ジアミン（５．６４ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）を２つのマイクロ波バイアルに均等に分割し、撹拌しながら１２０°で加熱し、窒素流下で１．７５時間大気に通気する。反応混合物をＲＴに冷却する。真空濾過により固体を回収し、濾過ケーキをＭＴＢＥ（２×５ｍＬ）ですすぐ。固体を３０分間風乾し、次いで高真空下５０℃で乾燥させて固体（２．１９８ｇ）を得る。濾液を濃縮し、ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮してさらなる固体を得る。固体を合わせて表題化合物（２．６７７ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２３４（Ｍ＋Ｈ）。
【００７２】
モル過剰のシュウ酸ジエチルを使用して、調製物１０の方法と本質的に類似した様式で、６−メトキシ−２−Ｎ−［（４−メトキシフェニル）メチル］ピリジン−２，３−ジアミン（調製物番号１１）、５−ブロモ−３−Ｎ−ブチル−ピリジン−２，３−ジアミン（調製物番号１２）、５−ブロモ−３−Ｎ−ブチル−６−メチル−ピリジン−２，３−ジアミン（調製物番号１３）、６−メチルピリジン−２，３−ジアミン（調製物番号１４）、５−メチル−３−Ｎ−プロピル−ピリジン−２，３−ジアミン（調製物番号１５）、ｒａｃ−３−Ｎ−［２−メトキシブチル］ピリジン−２，３−ジアミン（調製物番号１６）から、表２に示す以下の化合物を調製する。
【００７３】
【表２】
0006850396.tif 000018
【００７４】
調製物１７
１−（シクロプロピルメチル）−６−メトキシ−４−［（４−メトキシフェニル）メチル］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンの合成
【００７５】
【化１６】
0006850396.tif 000019
【００７６】
６−メトキシ−４−［（４−メトキシフェニル）メチル］−１Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（２．２４２ｇ、７．１５６ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（６．９９ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（１２３ｍｇ、０．７１８ｍｍｏｌ）およびブロモメチルシクロプロパン（１．８０ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５６ｍＬ）中で合わせる。混合物を窒素下８０℃で一晩撹拌する。反応物をＲＴに冷却し、前のロット（１５６ｍｇスケールの反応）と合わせる。反応物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中３０〜８０％のＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮し、高真空下で乾燥させて、桃色固体の粗表題化合物（１．９７ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６８（Ｍ＋Ｈ）。
【００７７】
調製物１８
１−（シクロプロピルメチル）−６−メトキシ−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンの合成。
【００７８】
【化１７】
0006850396.tif 000020
【００７９】
１−（シクロプロピルメチル）−６−メトキシ−４−［（４−メトキシフェニル）メチル］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（１．８０ｇ、４．９０ｍｍｏｌ）を、窒素下で密封されたマイクロ波バイアル中のＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解する。反応物を１２０℃で１時間撹拌する。反応物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭから１回濃縮する。得られた緑色の泡を高真空下で乾燥させて、粗表題化合物（５０質量％）（２．４ｇ、９９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４８（Ｍ＋Ｈ）。
【００８０】
【化１８】
0006850396.tif 000021
【００８１】
調製物１９
１−ブチル−３−クロロ−７−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンの合成
【００８２】
【化１９】
0006850396.tif 000022
【００８３】
スキーム５：過剰な塩化チオニル（１５ｍＬ、２０５．９ｍｍｏｌ）中の１−ブチル−７−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（２．１９８ｇ、８．９５１ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．０５ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を加熱還流する。１６時間後、反応混合物をＲＴに冷却し、ＤＣＭで希釈し、減圧下で濃縮する。粗材料をトルエンに懸濁し、超音波処理し、減圧下で濃縮する。粗材料を１０ｍＬの冷ＤＣＭに懸濁し、真空濾過により回収する。材料を１．５時間風乾して固体（１．６５５ｇ）を得る。濾液を減圧下で濃縮し、ＤＣＭに懸濁し、一晩氷浴に入れる。得られた懸濁液を微細なフリット漏斗で濾過し、１時間風乾して固体（２６７ｍｇ）を得る。材料を合わせて表題化合物（１．９２２ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５２（Ｍ＋Ｈ）。
【００８４】
モル過剰の塩化チオニルを使用して、調製物１９の方法と本質的に類似した様式で、１−（シクロプロピルメチル）−６−メトキシ−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンから（調製物２０）、７−ブロモ−１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンから（調製物番号２１）、１−プロピル−７−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンから（調製物番号２２）、および７−ブロモ−１−ブチル−６−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（調製物番号２３用）から、表３に示す以下の化合物を調製する。
【００８５】
【表３】
0006850396.tif 000023
【００８６】
【化２０】
0006850396.tif 000024
【００８７】
調製物２４
１−ブチル−３−ヒドラジノ−７−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンの合成。
【００８８】
【化２１】
0006850396.tif 000025
【００８９】
スキーム６：ＥｔＯＨ（７．０ｍＬ）中の１−ブチル−７−メチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（０．２６８ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の懸濁液を脱気する。ヒドラジン（０．６０ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１１０℃で一晩加熱する。反応物を濃縮し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮して、暗黄色固体として表題化合物（０．２２６ｇ、８０％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４８．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００９０】
モル過剰のヒドラジンを使用して、調製物２４の方法と本質的に類似した様式で、ｒａｃ−１−［２−メトキシブチル］−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンから（調製物番号２５）および６−メチル−１，４−ジヒドロピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンから（調製物番号２６）、表４に示す以下の化合物を調製する。
【００９１】
【表４】
0006850396.tif 000026
【００９２】
【化２２】
0006850396.tif 000027
【００９３】
調製物２７Ａ
１−シクロプロピルシクロプロパンカルボヒドラジド塩酸塩の合成
【００９４】
【化２３】
0006850396.tif 000028
【００９５】
ＤＭＦ（３００ｍＬ）中の１−シクロプロピルシクロプロパンカルボン酸（９．６３ｇ、７６．３ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（３２．３ｇ、８３．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（５．００ｇ、３７．８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＤＩＰＥＡ（１４．５ｍＬ、８３．１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で５日間撹拌する。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１．０Ｎ塩酸、飽和ＮａＨＣＯ３、および水で洗浄する。次いで、有機物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）を残渣に加え、１，４−ジオキサン（１００ｍＬ、４００ｍｍｏｌ）中の塩酸（４ｍｏｌ／Ｌ）を２０分かけて加え、反応物を室温で１時間撹拌する。溶液を濾過し、濾過ケーキをＭＴＢＥで洗浄し、減圧下で乾燥させて、表題化合物（８．０１ｇ、５８．７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１４１（Ｍ＋Ｈ）
【００９６】
調製物２７Ｂ
１−メチルシクロプロパンカルボヒドラジド塩酸塩の合成。
【００９７】
【化２４】
0006850396.tif 000029
【００９８】
ジクロロメタン（２００ｍＬ）中の１−メチルシクロプロパンカルボン酸（５．２５ｇ、５２．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（７．３ｍＬ、４２ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（１６．１ｇ、４１．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（５．００ｇ、３７．８ｍｍｏｌ）を加え、反応物をＲＴで一晩撹拌する。反応混合物を１．０Ｎ塩酸、飽和ＮａＨＣＯ３、および水で洗浄する。次いで、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣を０℃に冷却し、１，４−ジオキサン（７５ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）中の塩酸（４ｍｏｌ／Ｌ）に溶解する。５分後、反応混合物が白色スラリーになり、室温で１時間撹拌した。１，４−ジオキサン（７５ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）中のさらなる塩酸（４ｍｏｌ／Ｌ）を加え、反応物を一晩撹拌する。反応物をＭＴＢＥで希釈し、濾過し、濾過ケーキをＭＴＢＥで洗浄し、風乾して、粗表題化合物（６．４２ｇ）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １０．６４（ｓ，１Ｈ）、１０．２３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、１．２６（ｓ，３Ｈ）、１．０５−１．０２（ｍ，２Ｈ）、０．６９−０．６６（ｍ，２Ｈ）。
【００９９】
調製物２７Ｃ
Ｎ’−（１−ブチル−７−メチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジドの合成
【０１００】
【化２５】
0006850396.tif 000030
【０１０１】
スキーム７：４Å分子篩を含むオーブン乾燥したＲＢＦに、１−ブチル−３−クロロ−７−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（１．５０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）および１−シクロプロピルシクロプロパンカルボヒドラジド塩酸塩（１．０５ｇ、５．９４ｍｍｏｌ）を加える。容器を密封し、次いで排気し、窒素で埋め戻す（３回）。ＴＨＦ（４０ｍＬ）を加え、混合物を５０℃で撹拌する。１時間後、反応混合物を超音波処理し、５５℃で２時間撹拌する。反応混合物をＲＴに冷却し、得られた固体を真空濾過により回収し、５分間風乾し、次いで高真空下で１時間乾燥して、表題化合物（１．８６ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０２】
調製物２７Ｃの方法と本質的に類似した様式で、７−ブロモ−１−ブチル−３−クロロ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンから（調製物番号２８用）、３−クロロ−７−メチル−１−プロピル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンから（調製物番号２９）、７−ブロモ−１−ブチル−３−クロロ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンから、および１−メチルシクロプロパンカルボヒドラジド塩酸塩（調製物番号３０の場合）から、それぞれ、表５に示す以下の化合物を調製する。
【０１０３】
【表５】
0006850396.tif 000031
【０１０４】
【化２６】
0006850396.tif 000032
【０１０５】
調製物３１
Ｎ’−（１−ブチル−７−メチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボヒドラジドの合成。
【０１０６】
【化２７】
0006850396.tif 000033
【０１０７】
スキーム８：ＴＨＦ（９．１ｍＬ）中の１−ブチル−３−ヒドラジノ−７−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（０．２２４ｇ、０．９０６ｍｍｏｌ）、１−（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸（０．１５７ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（０．１９２ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ塩酸塩（０．２５８ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の混合物に、ＴＥＡ（０．４４ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を加え、ＲＴで一晩撹拌する。珪藻土のパッドで濾過する前に、ＤＣＭおよび水で希釈することにより溶液を得る。パッドをＤＣＭで洗浄し、廃棄する。濾液を濃縮し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮して、表題化合物（０．２８８ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４８．０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０８】
１−シクロプロピルシクロプロパンカルボン酸を使用して、調製物３１の方法と本質的に類似した様式で、ｒａｃ−３−ヒドラジノ−１−［２−メトキシブチル］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンから（調製物番号３２）および３−ヒドラジノ−６−メチル−１Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンから（調製物番号３３）、表６に示す以下の化合物を調製する。
【０１０９】
【表６】
0006850396.tif 000034
【０１１０】
【化２８】
0006850396.tif 000035
【０１１１】
調製物３４
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−（シクロプロピルメチル）−２−メトキシピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成。
【０１１２】
【化２９】
0006850396.tif 000036
【０１１３】
スキーム９：３−クロロ−１−（シクロプロピルメチル）−６−メトキシ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（１．０２５ｇ、２．３１５ｍｍｏｌ）および１−シクロプロピルシクロプロパンカルボヒドラジド塩酸塩（５２０ｍｇ、２．５０２３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解する。溶液を窒素下でマイクロ波バイアルに密封し、６０℃で一晩撹拌する。反応物をＲＴに冷却し、前のロット（１ｇスケールの反応）と合わせる。材料をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中５０〜１００％のＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で濃縮する。橙色の固体を高真空下で乾燥させて、粗表題化合物（１．０６８ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１４】
調製物３４の方法と本質的に類似した様式で、７−ブロモ−１−ブチル−３−クロロ−６−メチル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンから、表７に示す以下の化合物を調製する。
【０１１５】
【表７】
0006850396.tif 000037
【０１１６】
【化３０】
0006850396.tif 000038
【０１１７】
実施例１
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−ブチル−３−メチルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１１８】
【化３１】
0006850396.tif 000039
【０１１９】
スキーム１０：４Å分子篩を含むオーブン乾燥したマイクロ波バイアルに、Ｎ’−（１−ブチル−７−メチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジド（１．８３ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）を加える。バイアルを密封し、次いで排気し、窒素で埋め戻す（３×）。ＨＭＤＳ（１７ｍＬ、８１．２ｍｍｏｌ）を加え、続いてＤＢＵ（０．１６ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を加えて懸濁液を得、これを撹拌しながら１２５℃で加熱する。４時間後、メタノールを含むＲＢＦに反応溶液を移し、５０℃で１時間加熱する。粗混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をＤＣＭと水に分配する。層を分離し、水層をＤＣＭおよび３：１のＣＨＣｌ３／ＩＰＡで抽出する。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をＥｔＯＨ（１７ｍＬ）に溶解し、添加漏斗を介して３０分かけて水（１００ｍＬ）を加え、次いで氷浴中で１５分間冷却する。固体を真空濾過により単離し、水で洗浄し、１５分間風乾し、真空下５０℃で一晩乾燥させて、表題化合物（１．１４ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２０】
実施例１の方法と本質的に類似した様式で、Ｎ’−（１−ブチル−７−メチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−（トリフルオロメチル）シクロプロパンカルボヒドラジドから（実施例２）、Ｎ’−（７−ブロモ−１−ブチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−メチル−シクロプロパンカルボヒドラジドから（調製物番号３６）、Ｎ’−（１−プロピル−７−メチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−（シクロプロピル）シクロプロパンカルボヒドラジドから（実施例３）、Ｎ’−［（７−ブロモ−１−ブチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イリデン）アミノ］−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジドから（調製物番号３７）、１−シクロプロピル−Ｎ’−（６−メチル−２−オキソ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）シクロプロパンカルボヒドラジドから（調製物番号３８）、ｒａｃ−１−シクロプロピル−Ｎ’−［１−［２−メトキシブチル］−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル］シクロプロパンカルボヒドラジドから（実施例４）、表８に示す以下の化合物（調製物および実施例）を調製する。
【０１２１】
【表８−１】
0006850396.tif 000040
【０１２２】
【表８−２】
0006850396.tif 000041
【０１２３】
実施例４ａ
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−（２−メトキシブチル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（異性体１）の合成
【０１２４】
【化３２】
0006850396.tif 000042
【０１２５】
ｒａｃ−９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−（２−メトキシブチル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（０．１４８、０．４２ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２．０ｍＬ）、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を用いてキラル分離のために溶解し、次いでＤＣＭ（２．０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）ですすぐ。６ｍＬのフィード溶液を濾過し、全部で合計６回の注入のために１．０ｍＬずつ注入する。カラムは（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ−０１  １０ｕｍであり、流速８０ｍＬ／分、４０％ＭｅＯＨ／６０％ＣＯ２移動相で異性体１を表題化合物（５７ｍｇ、第１の溶出異性体）として得る。（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ−０１  １０ｕｍ、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２、５ｍＬ／ｍｉｎ、２２５ｎｍ：ＴＲ＝２．２２ｍｉｎ、＞９９％ｅｅ。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５４．２（Ｍ＋Ｈ）、［α］Ｄ２０−８．１°（ｃ  ０．２０、メタノール）。
【０１２６】
実施例４ｂ
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−（２−メトキシブチル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（異性体２）の合成
【０１２７】
【化３３】
0006850396.tif 000043
【０１２８】
実施例６の化合物を本質的に実施例５の方法により単離して、表題化合物として異性体２（６１ｍｇ、第２の溶出異性体）を得る。（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ−０１  １０ｕｍ、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２、５ｍＬ／ｍｉｎ、２２５ｎｍ：ＴＲ＝３．０８ｍｉｎ、＞９９％ｅｅ。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５４．２（Ｍ＋Ｈ）、［α］Ｄ２０＋７．１°（ｃ  ０．２０、メタノール）。
【０１２９】
実施例５
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−（シクロプロピルメチル）−２−ヒドロキシピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１３０】
【化３４】
0006850396.tif 000044
【０１３１】
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−（シクロプロピルメチル）−２−メトキシピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（４６０ｍｇ、１．３０９ｍｍｏｌ）、ナトリウムエタンチオラート（４８７ｍｇ、５．２１０ｍｍｏｌ）および１−メチル−２−ピロリジノン（５ｍＬ、５１．９０ｍｍｏｌ）を合わせて、窒素下でマイクロ波バイアルに密封する。反応物に２００℃で１２時間マイクロ波を照射する。反応混合物を前のロットの反応混合物（３０ｍｇスケールの反応）と合わせ、水で希釈する。水層を１ＮＨＣｌ水溶液でｐＨ約３に酸性化し、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣を水中１０〜１００％のＡＣＮ（１０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３および５％ＭｅＯＨ）で溶出して、Ｃ１８の逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋なクロマトグラフィー画分を合わせ、減圧下で水溶液に濃縮し、ＤＣＭで抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。乳白色の固体を真空下で乾燥させて、表題化合物（８４ｍｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３２】
実施例６
５−ブチル−３−メチル−９−（１−メチルシクロプロピル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１３３】
【化３５】
0006850396.tif 000045
【０１３４】
［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を、マイクロ波バイアル中でＴＨＦ（０．６ｍＬ、７ｍｍｏｌ）中の３−ブロモ−５−ブチル−９−（１−メチルシクロプロピル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（９０ｍｇ、０．２３９２ｍｍｏｌ）に加える。１０分間撹拌した後、メチル亜鉛クロリド（３５０μＬ、０．７ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中２ｍｏｌ／Ｌ）を加え、容器を排気し、窒素でパージする。反応混合物を８０℃で２時間撹拌し、ＲＴに冷却し、追加実験（３７ｍｇスケールの反応）と合わせ、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で希釈する。水層をＥｔＯＡｃで抽出し、有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。ヘキサン中０〜１００％のＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（７５ｍｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３５】
実施例７の方法と本質的に類似した様式で、９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−３−ブロモ−５−ブチル−２−メチルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンから、表９に示す以下の化合物を調製する。
【０１３６】
【表９】
0006850396.tif 000046
【０１３７】
実施例８
５−ブチル−３−エチル−９−（１−メチルシクロプロピル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１３８】
【化３６】
0006850396.tif 000047
【０１３９】
３−ブロモ−５−ブチル−９−（１−メチルシクロプロピル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（８９ｍｇ、０．２３６６ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン錯体（１１ｍｇ、０．０１３２ｍｍｏｌ）、および１，４−ジオキサン（１．０ｍＬ）をマイクロ波バイアル中で合わせる。バイアルを窒素下で密封し、ジエチル亜鉛（０．５０ｍＬ、０．５０ｍｍｏｌ、ヘキサン中１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、ＲＴで一晩撹拌する。反応混合物を飽和ＮａＣｌ水溶液でクエンチし、追加実験（２３ｍｇスケールの反応）と合わせる。混合物をＥｔＯＡｃおよび水で希釈し、層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出し、続いて３：１のＣＨＣｌ３／ＩＰＡで抽出する。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をＤＣＭ中０〜７％のＭｅＯＨで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して粗材料を得、それを水中１０〜１００％のＡＣＮ（１０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３および５％ＭｅＯＨ）中で溶出して、Ｃ１８の逆相フラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製し、表題化合物（６０ｍｇ、６０％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４０】
実施例９の方法と本質的に類似した様式で、９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−３−ブロモ−５−ブチルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンから、表１０に示す以下の化合物を調製する。
【０１４１】
【表１０】
0006850396.tif 000048
【０１４２】
実施例１０
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−ブチル−３−イソプロピルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１４３】
【化３７】
0006850396.tif 000049
【０１４４】
Ｐｄ−ＰＥＰＰＳＩ−ＩＨｅｐｔＣｌ（３ｍｇ、０．００３０７１ｍｍｏｌ）および９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−３−ブロモ−５−ブチルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（１００ｍｇ、０．２４８６ｍｍｏｌ）をＲＢＦに加え、パージし、窒素で埋め戻す。トルエン（２．５ｍＬ）を加え、溶液を０℃に冷却する。２−プロピル亜鉛ブロミド（６００μＬ、０．３ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中０．５ｍｏｌ／Ｌ）を加え、反応物をＲＴにする。さらなるＰｄ−ＰＥＰＰＳＩ−ＩＨｅｐｔＣｌ（３ｍｇ、０．００３０７１ｍｍｏｌ、１００質量％）を加え、容器を排気し、窒素でパージし、ＲＴで一晩撹拌する。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応をクエンチし、ＤＣＭで希釈する。相を分離し、水溶液をＤＣＭで抽出する。有機物を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中０〜１００％のＥｔＯＡｃ中で溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（３０ｍｇ、３３％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４５】
【化３８】
0006850396.tif 000050
【０１４６】
実施例１１
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−ブチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１４７】
【化３９】
0006850396.tif 000051
【０１４８】
スキーム１１、ステップＡ：９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−３−ブロモ−５−ブチルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（５９７ｍｇ、１．４８４ｍｍｏｌ）、カリウムトリフルオロ（２−トリメチルシリルエトキシメチル）ボラヌイド（４３０ｍｇ、１．８０５４ｍｍｏｌ）、メタンスルホナート（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジ−ｉ−プロポキシ−１，１’−ビフェニル）（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル−２−イル）パラジウム（ＩＩ）（１３３ｍｇ、０．１５４２４９ｍｍｏｌ）、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’６’−ジイソプロポキシ−１，１’−ビフェニル（７４ｍｇ、０．１５０６５１ｍｍｏｌ）、および炭酸セシウム（１．４８ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）をマイクロ波バイアル中で合わせる。バイアルを窒素下で密封し、１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）および水（０．５０ｍＬ）の溶液を加え、反応混合物を１００℃で一晩撹拌する。さらなる２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’６’−ジイソプロポキシ−１，１’−ビフェニル（３２ｍｇ）およびメタンスルホナート（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジ−ｉ−プロポキシ−１，１’−ビフェニル）（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル−２−イル）パラジウム（ＩＩ）（６５ｍｇ）を加え、反応物を１０５℃で２日間撹拌する。反応混合物を追加実験（１００ｍｇスケールの反応）と合わせ、混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄し、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、デカントし、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中４０〜６５％のＥｔＯＡｃ中で溶出して、シリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−ブチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（３７０ｍｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５４。
【０１４９】
スキーム１１、ステップＢ：９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−ブチル−３−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン（３７０ｍｇ、０．５７１０ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（３ｍＬ）をマイクロ波バイアル中で合わせる。バイアルを窒素下で密封し、氷浴中で０℃に冷却する。三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（０．３６ｍＬ、２．８ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合物を一晩ＲＴに加温する。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応を停止し、ＤＣＭで希釈する。有機物を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン中５０〜１００％のＥｔＯＡｃで溶出して、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、残渣を得る。残渣を水中１０〜１００％のＡＣＮ中で溶出して、Ｃ１８の逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（４９ｍｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５４（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５０】
実施例１２の方法と本質的に類似した様式で、３−ブロモ−５−ブチル−９−（１−メチルシクロプロピル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンから、表１１に示す以下の化合物を調製する。
【０１５１】
【表１１】
0006850396.tif 000052
【０１５２】
実施例１３
９−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−５−ブチル−２−メチルピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オンの合成
【０１５３】
【化４０】
0006850396.tif 000053
【０１５４】
リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（２．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ、ＭＴＢＥ中１ｍｏｌ／Ｌ）を、ＤＭＦ（７ｍＬ）中の１−（［１，１’−ビ（シクロプロパン）］−１−イル）−７−メチルピリド［２，３−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−４（５Ｈ）−オン（１９９ｍｇ、０．７０７４ｍｍｏｌ）に加え、反応物をＲＴで１時間撹拌する。１−ブロモブタン（３８０μＬ、３．５３９ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１２ｍｇ、０．０７２２９ｍｍｏｌ）を加え、反応物を５０℃で３日間撹拌する。反応物をＲＴに冷却し、２回の追加実験（各々が５０ｍｇのスケール）と合わせる。溶液を３：１のＣＨＣｌ３／ＩＰＡで抽出し、有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をＥｔＯＨに溶解し、水に加え、得られた沈殿物を濾過により回収する。回収した固体を水中１５〜１００％のＡＣＮ中で溶出して、Ｃ１８の逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（１４５ｍｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５５】
ＰＤＥタンパク質の生成
完全長ヒトＰＤＥ１Ａ（ＮＰ＿００１００３６８３．１）およびＰＤＥ１Ｃ（ＮＰ＿００５０１１．１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端ＨＩＳタグを有するｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。完全長ヒトＰＤＥ４Ｄ（ＮＰ＿００６１９４．２）およびＰＤＥ３Ａ（ＮＰ＿０００９１２．３）の触媒ドメイン（残基６４１−１１４１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。完全長ヒトＰＤＥ６Ａ（ＮＰ＿０００４３１．２）およびＰＤＥ６Ｂ（ＡＡＨ００２４９．１）をコードするヌクレオチド配列を、ＰＤＥ６Ａ／６Ｂ二量体を生成するために、それぞれ、Ｎ末端ＨＩＳタグおよびＮ末端Ｆｌａｇタグを有するｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って、Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルスの産生およびタンパク質発現を行う。完全長ヒトＰＤＥ１Ｂ（ＮＰ＿０００９１５．１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するｐＩＥＸ４（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、供給業者のプロトコル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に従ってＳｆ９細胞における両方のタンパク質の生成を行う。Ｈｉｓタグ付きＰＤＥタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、続いて保存バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）中のＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でサイズ排除クロマトグラフィーを行う。ＰＤＥ６Ａ／６Ｂを含むＦｌａｇタグ付きＰＤＥタンパク質を、ＮｉＮＴＡカラムクロマトグラフィーによる精製後に、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−アガロース（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製し、保存バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチド）中に溶出する。全ての精製されたタンパク質を、−８０℃で少量のアリコートで保存する。
【０１５６】
ホスホジエステラーゼ酵素アッセイ
全ての３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）酵素活性は、ＳＰＡ検出システムに基づく放射酵素アッセイ（シンチレーションプロキシミティアッセイ）で測定される。試験する化合物を、１０点濃度応答曲線を用いて純粋なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に希釈する。反応混合物の最大化合物濃度は、１０または１００μＭのいずれかである。基質の添加により反応が始まる前に、適切な濃度の化合物をＰＤＥ酵素のいずれかとともに３０分間プレインキュベートする。反応を室温で６０分間進行させる。次いで、ＳＰＡビーズの添加により反応を停止する。試料はＭＩＣＲＯＢＥＴＡ（商標）ＴＲＩＬＵＸ（登録商標）カウンターで１２時間後に読み込まれる。「ＩＣ５０」とは、その化合物で可能な最大阻害反応の５０％をもたらす化合物の濃度を指す。ＩＣ５０値は、正規化データ対ｌｏｇ［化合物］をプロットし、４パラメータロジスティック方程式を用いてデータを当てはめることによって算出される。
【０１５７】
Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性ＰＤＥ酵素アッセイ
ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ａ、およびＰＤＥ１Ｃは、標準的なタンパク質生成手順に従ってクローン化および精製される。アッセイ緩衝液は、水中（ｐＨ７．５）で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ウシ血清アルブミンおよび６Ｕ／ｍｌのカルモジュリンのアッセイにおける最終濃度を得るように調製する。最終酵素濃度は、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃについて、それぞれ０．２５、０．０７４および０．００１２ｎＭである。基質［３Ｈ］ｃＡＭＰの添加により反応を開始し、４７ｎＭの最終濃度を得る。
【０１５８】
【表１２】
0006850396.tif 000054
【０１５９】
表１２のデータは、実施例１〜１３の化合物がインビトロでヒトＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃ酵素活性を阻害することを示している。
【０１６０】
［３Ｈ］ｃＡＭＰを基質として使用するＰＤＥ酵素アッセイ
以下のホスホジエステラーゼ活性を、反応基質として［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いて測定する：ヒトＰＤＥ３Ａ（触媒ドメイン）およびヒトＰＤＥ４Ｄ。両方の酵素は、標準的な手順に従ってクローン化および精製される。アッセイ緩衝液は、ｐＨ７．５で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．７ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および０．１％のウシ血清アルブミンのアッセイにおける最終濃度を得るように調製する。最終酵素濃度は、ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ４Ｄについて、それぞれ０．００８および０．０２１ｎＭである。基質［３Ｈ］ｃＡＭＰの添加により反応を開始し、４７ｎＭの最終濃度を得る。
【０１６１】
【表１３】
0006850396.tif 000055
【０１６２】
［３Ｈ］ｃＧＭＰを基質として使用するＰＤＥ酵素アッセイ
以下のホスホジエステラーゼ活性を、反応基質として［３Ｈ］ｃＧＭＰを用いて測定する：ヒトＰＤＥ６Ａ／６Ｂ。ヒトＰＤＥ６の触媒活性型は、α（ヒトＰＤＥ６Ａ）およびβサブユニット（ヒトＰＤＥ６Ｂ）から構成される二量体である。ヒトＰＤＥ６Ａ／６Ｂの二量体は、２つの精製ステップ、すなわち、ＮｉＮＴＡおよび抗ＦＬＡＧセファロースクロマトグラフィーを使用して、共発現および精製ストラテジーにより生成される。アッセイ緩衝液は、ｐＨ７．５で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．７ｍＭの（ＥＤＴＡ）および０．１％のウシ血清アルブミンのアッセイにおける最終濃度を得るように調製する。最終酵素濃度は５ｎＭである。基質［３Ｈ］ｃＧＭＰの添加により反応を開始し、８０ｎＭの最終濃度を得る。
【０１６３】
【表１４】
0006850396.tif 000056
【０１６４】
表１２、１３、および１４のデータは、実施例１〜１３の化合物が、インビトロでヒトＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、およびＰＤＥ６ＡＢと比較して、ヒトＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃの選択的阻害剤であることを示している。
【０１６５】
本発明は以下の態様を含みうる。
［１］式：
【化４１−１】
0006850396.tif 000057
［式中、
Ｘは、Ｈ、またはヒドロキシルで任意に置換されたＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｙは、Ｈ、ヒドロキシ、またはメチルであり、
Ｒは、エチル、ｎ−プロピル、シクロプロピル、または
【化４１−２】
0006850396.tif 000058
であり、
Ａは、メチル、シクロプロピル、またはトリフルオロメチルである］
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩であって、
但し、ＸとＹが両方ともＨであり、Ｒがｎ−プロピルである場合、Ａはメチル以外である、化合物または塩。
［２］Ｘはメチルである、上記［１］に記載の化合物または塩。
［３］ＹはＨである、上記［１］または上記［２］に記載の化合物または塩。
［４］Ｒはｎ−プロピルである、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物または塩。
［５］Ａはシクロプロピルである、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物または塩。
［６］前記化合物は遊離塩基形態である、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の化合物。
［７］前記化合物は、式：
【化４１−３】
0006850396.tif 000059
の化合物である、上記［１］に記載の化合物または塩。
［８］前記化合物は、式：
【化４１−４】
0006850396.tif 000060
の化合物である、上記［１］に記載の化合物。
［９］前記化合物は、式：
【化４１−５】
0006850396.tif 000061
の化合物である、上記［１］に記載の化合物または塩。
［１０］前記化合物は、式：
【化４１−６】
0006850396.tif 000062
の化合物である、上記［１］に記載の化合物。
［１１］患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
［１２］患者における糖尿病性腎疾患を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
［１３］治療において使用するための、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
［１４］慢性腎疾患の治療において使用するための、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
［１５］糖尿病性腎疾患の治療において使用するための、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
［１６］上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに含む、薬学的組成物。
［１７］薬学的組成物を調製するためのプロセスであって、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、プロセス。