【手続補正書】
【提出日】平成30年11月12日(2018.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のゲノム中のゲノム標的遺伝子座に両対立遺伝子改変を行うための方法であって、
（Ｉ）
（ａ）Ｃａｓタンパク質、
（ｂ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ、
（ｃ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ、及び
（ｄ）前記ゲノム標的遺伝子座内の５’標的配列にハイブリダイズする５’ホモロジーアームと、前記ゲノム標的遺伝子座内の３’標的配列にハイブリダイズする３’ホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクター、
を細胞の集団に導入することであって、
前記細胞が１細胞期胚である場合、前記ターゲティングベクターの長さは５ｋｂ以下であり、
前記ゲノムが、前記ゲノム標的遺伝子座を含む第１及び第２の相同染色体のペアを含み、任意選択で、前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が遺伝子のコード配列の全部又は一部に隣接し、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のそれぞれを切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも１つの二本鎖切断を生じ、任意選択で、前記第１および第２のガイドＲＮＡの両方を導入することが、前記第１のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡのいずれか単独を導入することと比較して増大した両対立遺伝子改変効率をもたらす、導入することと、
（ＩＩ）欠失及び／又は挿入を含む改変された標的遺伝子座を含む細胞を同定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記同定することが、定量的な対立遺伝子の改変アッセイ及びリテンションアッセイを行うことを含み、
前記対立遺伝子の改変アッセイが、
（ａ）前記細胞由来のゲノムＤＮＡサンプル中の核酸インサートＤＮＡ鋳型のコピーの数を決定するための対立遺伝子の獲得アッセイ、及び／又は
（ｂ）欠失のためにターゲティングされる前記ゲノム標的遺伝子座の領域内のＤＮＡ鋳型の前記ゲノムＤＮＡサンプル中のコピーの数を決定するための対立遺伝子の喪失アッセイ、
を含み、
前記リテンションアッセイが、改変される前記ゲノム標的遺伝子座中で保持するように意図される５’標的配列ＤＮＡ鋳型、及び／又は改変される前記ゲノム標的遺伝子座中で保持するように意図される３’標的配列ＤＮＡ鋳型の前記ゲノムＤＮＡサンプル中のコピーの数を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リテンションアッセイが、前記ゲノムＤＮＡサンプル中の前記５’標的配列ＤＮＡ鋳型及び前記ゲノムＤＮＡサンプル中の前記３’標的配列ＤＮＡ鋳型のコピーの数を決定し、任意選択で、対立遺伝子の改変アッセイが、前記対立遺伝子の喪失アッセイ及び前記対立遺伝子の獲得アッセイを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸インサートが、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含み
前記第１のホモロジーアームが前記５’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記５’標的配列であるか、又は前記第１のホモロジーアームが前記３’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記３’標的配列であり、
前記同定することが、
（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは、結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、
（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、
（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、
前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、
前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれの前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれに少なくとも２つの二本鎖切断を生ずるか、又は
（ｂ）前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（Ｉ）が、
（ｅ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び
（ｆ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡ、
を前記細胞の集団に導入することを更に含み、
任意選択で、前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の第１のペアを形成し、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の第２のペアを形成し、
任意選択で、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が前記第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列に隣接し、前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が前記第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列に隣接し、
任意選択で、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の前記第１のペアが前記ゲノム標的遺伝子座の５’末端の近傍に位置し、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の前記第２のペアが前記ゲノム標的遺伝子座の３’末端の近傍に位置する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れており、かつ／又は
（ｂ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れている、かつ／又は
（ｃ）前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の第１のペアであり、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の第２のペアであり、前記第１のペアと前記第２のペアとが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂだけ離れており、
任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じ、任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の両方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸インサートが前記５’標的配列と前記３’標的配列との間に挿入される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が二倍体であり、前記両対立遺伝子改変によって、前記ゲノム標的遺伝子座にホモ接合性、複合ヘテロ接合性、又はヘミ接合性が生じる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記両対立遺伝子改変が、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含み、
任意選択で、
（ａ）前記両対立遺伝子改変が、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失を含み、任意選択で、前記両対立遺伝子改変が、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を更に含むか、
（ｂ）前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第２の相同染色体ではなく、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入であるか、
（ｃ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第２の相同染色体の前記ゲノム標的遺伝子座の破壊であって、ここで、前記破壊が、前記少なくとも１つの二本鎖切断の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）媒介修復に由来するか、
（ｄ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入、及び前記第２の相同染色体の前記ゲノム標的遺伝子座の破壊であって、ここで、前記破壊が、前記少なくとも１つの二本鎖切断の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）媒介修復に由来するか、
（ｅ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列が、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスであるか、
（ｆ）前記欠失した核酸が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであるか、又は
（ｇ）前記欠失した核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、ｏｒ少なくとも５００ｋｂ、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、又は少なくとも２Ｍｂである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、若しくは少なくとも１００ｋｂに位置しているか、
（ｂ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しているか、又は、
（ｃ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、若しくは約５０ｋｂ〜約１００ｋｂに位置している、
（ｄ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れているか、
（ｅ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂだけ離れているか、
（ｆ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、若しくは約９００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れているか、又は、
（ｇ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、若しくは１０ｋｂ未満だけ離れている、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲティングベクターが直鎖状の形態である、かつ／または前記ターゲティングベクターが一本鎖又は二本鎖である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が真核細胞であり、任意選択で、前記真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚、又はマウス１細胞期胚である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が１細胞期胚であり、
（ａ）前記ターゲティングベクターの長さが約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂであるか、
（ｂ）前記ターゲティングベクターが一本鎖ＤＮＡであり、その長さが約６０〜約２００ヌクレオチドであるか、
（ｃ）前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ、及び前記第２のガイドＲＮＡが、それぞれ、マイクロインジェクションによって前記１細胞期胚に導入されるか、又は、
（ｄ）前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ、及び前記第２のガイドＲＮＡが、それぞれ、細胞質内にマイクロインジェクションによってＲＮＡの形態で前記１細胞期胚に導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が１細胞期胚ではなく、
（ａ）前記ターゲティングベクターが、少なくとも１０ｋｂのラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、任意選択で、前記ＬＴＶＥＣが、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、若しくは約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂであるか、又は
（ｂ）前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂであり、任意選択で、前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が１細胞期胚ではなく、
前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂであり、
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しており、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じ、
前記両対立遺伝子改変が、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列が、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである、請求項１〜１３および１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９であり、任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質が二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有するか、又は
任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質がニッカーゼであり、かつ前記方法が、
（ｅ）第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び
（ｆ）第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡ
を前記細胞に導入することを更に含み、
ここで、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖をニックし、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第３及び第４の  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖をニックし、前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のニックが、付着末端を有する第１の二本鎖切断を生成するオフセットしたニックであり、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のニックが、付着末端を有する第２の二本鎖切断を生成するオフセットしたニックである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）前記第１のガイドＲＮＡが互いに融合された第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第１のｔｒａｃｒＲＮＡを含む、かつ／又は前記第２のガイドＲＮＡが互いに融合された第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡを含むか、
（ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第１のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記第１のｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子である、かつ／又は前記第２のガイドＲＮＡが第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記第２のｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子であるか、
（ｃ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記Ｃａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、
（ｄ）前記第１のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のガイドＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、
（ｅ）前記第２のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のガイドＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、
（ｆ）前記Ｃａｓタンパク質及び前記第１のガイドＲＮＡが、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される、かつ／又は前記Ｃａｓタンパク質及び前記第２のガイドＲＮＡが、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入されるか、
（ｇ）前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ、及び前記第２のガイドＲＮＡが、それぞれ、ＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、又は
（ｈ）前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ、及び前記第２のガイドＲＮＡが、それぞれ、ＲＮＡの形態で前記細胞に導入される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されており、任意選択で、前記細胞が、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＡＲＰ１、及びリガーゼＩＶのうちの１つ以上の発現又は活性を低下させるように改変されており、任意選択で、前記発現又は活性の低下が、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、
（ａ）前記第１及び第２の相同染色体両方中の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の間の欠失、及び前記第１の相同染色体中であり、前記第２の相同染色体中ではない前記５’及び３’標的配列の間の前記核酸インサートの挿入を含む第１の細胞の亜集団、
（ｂ）前記第１及び第２の相同染色体両方中の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の間の欠失、及び前記５’及び３’標的配列の間の前記核酸インサートの挿入を含む第２の細胞の亜集団、
（ｃ）前記第１及び第２の相同染色体両方中の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の間の欠失を含むが、前記５’及び３’標的配列の間の前記核酸インサートの挿入を含まない第３の細胞の亜集団、
（ｄ）前記第１の相同染色体両方中の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の間の欠失、及び前記第２の相同染色体中の前記ゲノム標的遺伝子座の破壊を含み、前記破壊は少なくとも１つの二本鎖切断の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）媒介修復に由来する、第４の細胞の亜集団、又は
（ｅ）前記第１の相同染色体中の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の間の欠失、前記第１の相同染色体中の前記５’及び３’標的配列の間の前記核酸インサートの挿入、及び前記第２の相同染色体中の前記ゲノム標的遺伝子座の破壊を含み、前記破壊は少なくとも１つの二本鎖切断の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）媒介修復に由来する、第５の細胞の亜集団
を生成し、
任意選択で、前記方法が、前記第１の細胞の亜集団、前記第２の細胞の亜集団、前記第３の細胞の亜集団、前記第４の細胞の亜集団、及び前記第５の細胞の亜集団を生成する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がマウス又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞であり、前期方法が宿主胚に前記マウス又はラットＥＳ細胞を導入することを更に含む、請求項１〜１３及び１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第一の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、
（Ｉ）前記ゲノムを、
（ａ）Ｃａｓタンパク質、及び
（ｂ）第１の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ、
と接触させることであって、
前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が、第２の相同染色体上の前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側にあり、
前記Ｃａｓタンパク質及び前記第１のガイドＲＮＡは、天然に一緒に存在しておらず、
前記Ｃａｓタンパク質が前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して二本鎖切断を生成し、前記細胞が前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変される、接触させること、及び
（ＩＩ）前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である細胞を同定すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ゲノムを、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側の第２の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させることを更に含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して少なくとも１つの二本鎖切断を生し、
任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が、前記第２の相同染色体上に位置し、前記第１の相同染色体上には位置していない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ヘテロ接合性の喪失が前記二本鎖切断のテロメア側で生じる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識部位が、セントロメアから約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の対立遺伝子が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列から約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ヘテロ接合性の喪失によって置換される前記第２の相同染色体の領域が、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂである、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）前記第１の対立遺伝子が突然変異を有し、任意選択で、前記突然変異がターゲティングによる改変である、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であり、前記第２の相同染色体上の対応する遺伝子座が突然変異を有する、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
第一の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、
（Ｉ）前記ゲノムを、
（ａ）Ｃａｓタンパク質、
（ｂ）第２の対立遺伝子内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡであって、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記第２の対立遺伝子が、第２の相同染色体上の対応する遺伝子座にある、第１のガイドＲＮＡ、及び
（ｃ）第２の対立遺伝子内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ、
と接触させることであって、
前記Ｃａｓタンパク質及び前記第１のガイドＲＮＡは、天然に一緒に存在しておらず、
前記Ｃａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも１つを切断して二本鎖切断および組み換えを起こす末端配列を生成し、前記組み換えが、前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である改変されたゲノムを形成するように前記第１及び第２の対立遺伝子の間であり、
任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断する、接触させること、及び
（ＩＩ）前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である細胞を同定すること
を含む、方法。
【請求項３１】
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が前記第２の対立遺伝子内に位置し、前記第１の対立遺伝子内には位置していない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れているか、又は、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂだけ離れている、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間の配列の相違が、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂにわたるか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間の配列の相違が、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂにわたる、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）前記第１の対立遺伝子がターゲティングによる改変を有し、前記第２の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であるか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が疾患原因突然変異を有する、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組換えが、遺伝子変換又はヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が真核細胞であり、任意選択で、前記真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚である、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９であり、任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質が二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有するか、又は
任意選択で、前記Ｃａｓタンパク質がニッカーゼであり、かつ前記方法が、
（ｅ）第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び
（ｆ）第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡ
を前記細胞に導入することを更に含み、
ここで、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖をニックし、前記Ｃａｓタンパク質が、前記第３及び第４の  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖をニックし、前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のニックが、付着末端を有する第１の二本鎖切断を生成するオフセットしたニックであり、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のニックが、付着末端を有する第２の二本鎖切断を生成するオフセットしたニックである、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）前記第１のガイドＲＮＡが互いに融合された第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第１のｔｒａｃｒＲＮＡを含む、かつ／又は前記第２のガイドＲＮＡが互いに融合された第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡを含むか、
（ｂ）前記第１のガイドＲＮＡが第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第１のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記第１のｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子である、かつ／又は前記第２のガイドＲＮＡが第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと第２第１のｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子であるか、
（ｃ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記Ｃａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、
（ｄ）前記第１のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のガイドＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、
（ｅ）前記第２のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のガイドＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、
（ｆ）前記Ｃａｓタンパク質及び前記第１のガイドＲＮＡが、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される、かつ／又は前記Ｃａｓタンパク質及び前記第２のガイドＲＮＡが、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入されるか、
（ｇ）前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ、及び前記第２のガイドＲＮＡが、それぞれ、ＤＮＡの形態で前記細胞に導入されるか、又は
（ｈ）前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ、及び前記第２のガイドＲＮＡが、それぞれ、ＲＮＡの形態で前記細胞に導入される、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されており、任意選択で、前記細胞が、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＡＲＰ１、及びリガーゼＩＶのうちの１つ以上の発現又は活性を低下させるように改変されており、任意選択で、前記発現又は活性の低下が、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である、請求項２２〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
欠失および/または挿入を含む改変されたゲノム標的遺伝子座を含む細胞を同定するための方法であって、
前記細胞は、前記ゲノム標的遺伝子座内の５’標的配列にハイブリダイズする５’ホモロジーアームと、前記ゲノム標的遺伝子座内の３’標的配列にハイブリダイズする３’ホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクターでターゲティングされ、前記細胞が１細胞期胚である場合、前記ターゲティングベクターの長さは５ｋｂ以下であり、
前記方法が、前記細胞から得られたDNAに対して定量的な対立遺伝子の改変アッセイ及びリテンションアッセイを行うことを含み、
前記対立遺伝子の改変アッセイが、
（Ｉ）前記細胞由来のゲノムＤＮＡサンプル中の核酸インサートＤＮＡ鋳型のコピーの数を決定するための対立遺伝子の獲得アッセイ、及び／又は
（ＩＩ）欠失のためにターゲティングされる前記ゲノム標的遺伝子座の領域内のＤＮＡ鋳型の前記ゲノムＤＮＡサンプル中のコピーの数を決定するための対立遺伝子の喪失アッセイ、
を含み、
前記リテンションアッセイが、改変される前記ゲノム標的遺伝子座中で保持するように意図される５’標的配列ＤＮＡ鋳型、及び／又は改変される前記ゲノム標的遺伝子座中で保持するように意図される３’標的配列ＤＮＡ鋳型の前記ゲノムＤＮＡサンプル中のコピーの数を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記リテンションアッセイが、前記ゲノムＤＮＡサンプル中の前記５’標的配列ＤＮＡ鋳型及び前記ゲノムＤＮＡサンプル中の前記３’標的配列ＤＮＡ鋳型のコピーの数を決定し、任意選択で、対立遺伝子の改変アッセイが、前記対立遺伝子の喪失アッセイ及び前記対立遺伝子の獲得アッセイを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、二倍体細胞の前記ゲノム標的遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を同定するための方法であり、
前記核酸インサートが、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含み、任意選択で、前記選択カセットが薬剤耐性遺伝子を含み、
前記第１のホモロジーアームが前記５’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記５’標的配列であるか、又は前記第１のホモロジーアームが前記３’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記３’標的配列であり、
前記同定することが、
（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは、結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、
（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、
（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、
前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、
前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が１細胞期胚ではなく、前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記ＬＴＶＥＣが少なくとも１０ｋｂであるか、又は前記ＬＴＶＥＣの前記第１および第２のホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂであり、
任意選択で、前記核酸インサートが、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の標的配列プローブの結合からのシグナルを用いて前記第１の標的配列の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記参照遺伝子プローブの結合からのシグナルを用いて前記参照遺伝子の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記第１の標的配列のコピー数を決定し、
前記核酸インサートプローブの結合からのシグナルを用いて前記核酸インサートの閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記核酸インサートのコピー数を決定する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記プローブが前記第１の標的配列及び前記選択カセット内で結合する配列間の距離が、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、又は５ｋｂ以下である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含み、
任意選択で、
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記第２の標的配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記第２の標的配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第２の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸インサート内の１つ以上の更なる配列の前記コピー数を決定することを更に含み、
任意選択で、
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記核酸インサートに結合する１つ以上の更なるプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記１つ以上の更なるプローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを、前記１つ以上の更なる核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列のコピー数を決定することを更に含む、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列が、前記第２の標的配列に隣接した配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＬＴＶＥＣが、前記標的ゲノム遺伝子座から内因性配列を欠失させるように設計されているか、又は
前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、前記ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ、及び前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと更に接触させられている、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、前記ゲノム標的遺伝子座における前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含み、
任意選択で、
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記ゲノム標的遺伝子座における前記内因性配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記内因性配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記内因性配列プローブからのシグナルと比較して前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む、
請求項４９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
特定の方法では、前記ＬＴＶＥＣが前記標的ゲノム遺伝子座から内因性配列を欠失させるように設計されているか、又は前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、標的ゲノム遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと更に接触させられている。場合により、かかる方法は、標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む。場合により、前記工程（ｂ）は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記標的ゲノム遺伝子座の前記内因性配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、前記工程（ｃ）は、前記内因性配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、前記工程（ｄ）は、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記内因性配列プローブからのシグナルと比較して前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞内のゲノムに両対立遺伝子改変を行うための方法であって、前記ゲノムを、
（ａ）第１のＣａｓタンパク質、
（ｂ）ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、
（ｃ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、
（ｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び
（ｅ）前記細胞が１細胞期胚である場合にターゲティングベクターの長さは５ｋｂ以下であるものとして、５’標的配列にハイブリダイズする５’ホモロジーアームと３’標的配列にハイブリダイズする３’ホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクター、と接触させることを含み、
前記ゲノムが、前記ゲノム標的遺伝子座を含む第１及び第２の相同染色体のペアを含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、方法。
（項目２）
前記改変されたゲノムを有する細胞を同定することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸インサートが、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含み
前記第１のホモロジーアームが前記５’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記５’標的配列であるか、又は前記第１のホモロジーアームが前記３’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記３’標的配列であり、
前記同定することが、
（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは、結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、
（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、
（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、
前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、
前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれの前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれに少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ゲノムを、
（ｆ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び
（ｇ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと接触させることを更に含む、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れており、かつ／又は
（ｂ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の第１のペアであり、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の第２のペアであり、前記第１のペアと前記第２のペアとが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂだけ離れている、項目６又は７に記載の方法。
（項目９）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の両方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ゲノムを前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの両方と接触させることにより、前記ゲノムを前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ又は第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡのいずれか単独と接触させる場合と比較して両対立遺伝子改変の効率が高くなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記核酸インサートが前記５’標的配列と前記３’標的配列との間に挿入される、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記細胞が二倍体であり、前記両対立遺伝子改変によって、前記ゲノム標的遺伝子座にホモ接合性、複合ヘテロ接合性、又はヘミ接合性が生じる、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記両対立遺伝子改変が、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含む、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記両対立遺伝子改変が、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記両対立遺伝子改変が、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を更に含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記両対立遺伝子改変が、
（ａ）前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第２の相同染色体ではなく、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入、
（ｂ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第２の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の遺伝子座の破壊、
（ｃ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入、及び前記第２の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間の遺伝子座の破壊、又は、
（ｄ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列が、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
（ａ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、若しくは少なくとも１００ｋｂに位置しているか、
（ｂ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しているか、又は、
（ｃ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、若しくは約５０ｋｂ〜約１００ｋｂに位置している、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れているか、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂだけ離れているか、
（ｃ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、若しくは約９００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れているか、又は、
（ｄ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、若しくは１０ｋｂ未満だけ離れている、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
（ａ）前記欠失される核酸が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであるか、又は、
（ｂ）前記欠失される核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂであるか、又は、
（ｃ）前記欠失される核酸が、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、若しくは少なくとも２Ｍｂである、項目１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記５’及び３’標的配列が、前記ゲノム標的遺伝子座内にある、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記ターゲティングベクターが直鎖状の形態である、項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記ターゲティングベクターが一本鎖又は二本鎖である、項目１〜２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記細胞が真核細胞である、項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が１細胞期胚であり、
（ａ）前記ターゲティングベクターの長さが約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂであるか、又は、
（ｂ）前記ターゲティングベクターが一本鎖ＤＮＡであり、その長さが約６０〜約２００ヌクレオチドである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が１細胞期胚ではなく、
（ａ）前記ターゲティングベクターが、少なくとも１０ｋｂのラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であるか、又は、
（ｂ）前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
（ａ）前記ＬＴＶＥＣが、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、若しくは約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂであるか、又は、
（ｂ）前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が１細胞期胚ではなく、
前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂであり、
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しており、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じ、
前記両対立遺伝子改変が、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列が、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、前記ゲノムを、
（ａ）第１のＣａｓタンパク質、
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び
（ｃ）第１の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、と接触させることを含み、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側にあり、
前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断して二本鎖切断を生じ、前記細胞が前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変される、方法。
（項目３１）
前記ゲノムを、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側の第２の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ヘテロ接合性の喪失が前記二本鎖切断のテロメア側で生じる、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が、前記第２の相同染色体上に位置し、前記第１の相同染色体上には位置していない、項目３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識部位が、セントロメアから約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある、項目３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記第１の対立遺伝子が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列から約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある、項目３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ヘテロ接合性の喪失によって置換される前記第２の相同染色体の領域が、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂである、項目３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
（ａ）前記第１の対立遺伝子が突然変異を有するか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であり、前記第２の相同染色体上の対応する遺伝子座が突然変異を有する、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記第１の対立遺伝子が突然変異を有し、前記突然変異がターゲティングによる改変である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、前記ゲノムを、
（ａ）第１のＣａｓタンパク質、
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、
（ｃ）第２の対立遺伝子内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡであって、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記第２の対立遺伝子が第２の相同染色体上の対応する遺伝子座にある、第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び
（ｄ）前記第２の対立遺伝子内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、と接触させることを含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断することで、少なくとも１つの二本鎖切断及び組換えを起こす末端配列を生じ、前記組換えが前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間で起こることで、前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である改変されたゲノムを生じる、方法。
（項目４１）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列を切断する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列が前記第２の対立遺伝子内に位置し、前記第１の対立遺伝子内には位置していない、項目４０又は４１に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れているか、又は、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とが、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂだけ離れている、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
（ａ）前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間の配列の相違が、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂにわたるか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間の配列の相違が、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂにわたる、項目４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
（ａ）前記第１の対立遺伝子がターゲティングによる改変を有し、前記第２の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であるか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が疾患原因突然変異を有する、項目４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記組換えが、遺伝子変換又はヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む、項目４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である細胞を同定することを更に含む、項目３０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記Ｃａｓタンパク質と前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡとが天然に一緒に存在していない、項目３０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が真核細胞である、項目３０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記第１のＣａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目１〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記第１のＣａｓタンパク質が、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有する、項目１〜５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記第１のＣａｓタンパク質がニッカーゼである、項目１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記第１のＣａｓタンパク質がニッカーゼであり、前記方法が、前記ゲノムを、
（ｆ）ニッカーゼである第２のＣａｓタンパク質、
（ｇ）第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ、及び
（ｈ）第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ、と接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、前記第２のＣａｓタンパク質が、前記第３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内及び前記第４のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断する、項目１〜３９及び項目４１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として融合され、かつ／若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第２のｇＲＮＡとして融合されているか、又は、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子であり、かつ／若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子である、項目１〜２９及び項目３１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記接触させることが、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞に導入することを含む、項目１〜５５のいずれかに記載の方法。
（項目５７）
（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質が、タンパク質、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、
（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、かつ／又は
（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入され、かつ／又は前記第１のＣａｓタンパク質、前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードした前記ＤＮＡが、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡが、第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、
（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡが、第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は
（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードした前記ＤＮＡが、第４の発現コンストラクト内の第４のプロモーターと機能的に連結されており、
前記第１、第２、第３、及び第４のプロモーターが前記細胞内で活性である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記第１、第２、第３、及び／又は第４の発現コンストラクトが、１個の核酸分子の構成要素である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードした前記ＤＮＡが、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードした前記ＤＮＡとが、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は、
（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードした前記ＤＮＡとが、第２のｇＲＮＡをコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結されており、
前記第１、第２、及び第３のプロモーターが前記細胞内で活性である、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
前記第１、第２、及び／又は第３の発現コンストラクトが、１個の核酸分子の構成要素である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞が、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されている、項目１〜６２のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記細胞が、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＡＲＰ１、及びリガーゼＩＶのうちの１つ以上の発現又は活性を低下させるように改変されている、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記発現又は活性の低下が、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
Ｆ０世代の非ヒト動物を作成するための方法であって、
（ａ）項目１〜２５及び項目２７〜６５のいずれか一項に記載の方法によって作成された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、
（ｂ）前記非ヒト宿主胚を代理母に懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有する前記Ｆ０世代の非ヒト動物を作る、方法。
（項目６７）
Ｆ０世代の非ヒト動物を作成するための方法であって、項目１〜２６及び項目３０〜６５のいずれか一項に記載の方法によって作成された遺伝子改変された１細胞期胚を代理母に移植することを含み、
前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有する前記Ｆ０世代の非ヒト動物を作る、方法。
（項目６８）
前記非ヒト動物がマウス又はラットである、項目６６又は６７に記載の方法。
（項目６９）
１細胞期胚ではない二倍体細胞の標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を同定するための方法であって、
（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることであって、前記細胞が、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームと第２の標的配列にハイブリダイズする第２のホモロジーアームとを隣接させた前記核酸インサートを含むラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）と接触させられ、前記核酸インサートが、前記第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含むことと、
（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは、結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、
（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、
（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、
前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、
前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、方法。
（項目７０）
前記第１の標的配列プローブの結合からのシグナルを用いて前記第１の標的配列の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記参照遺伝子プローブの結合からのシグナルを用いて前記参照遺伝子の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記第１の標的配列のコピー数を決定し、
前記核酸インサートプローブの結合からのシグナルを用いて前記核酸インサートの閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記核酸インサートのコピー数を決定する、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記選択カセットが薬剤耐性遺伝子を含む、項目６９又は７０に記載の方法。
（項目７２）
前記核酸インサートが、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂである、項目６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記プローブが前記第１の標的配列及び前記選択カセット内で結合する配列間の距離が、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、又は５ｋｂ以下である、項目６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む、項目６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記第２の標的配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記第２の標的配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第２の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記核酸インサート内の１つ以上の更なる配列の前記コピー数を決定することを更に含む、項目６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記核酸インサートに結合する１つ以上の更なるプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記１つ以上の更なるプローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを、前記１つ以上の更なる核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列のコピー数を決定することを更に含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列が、前記第２の標的配列に隣接した配列を含む、項目７６又は７７に記載の方法。
（項目７９）
前記ＬＴＶＥＣが、前記標的ゲノム遺伝子座から内因性配列を欠失させるように設計されているか、又は
前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、標的ゲノム遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと更に接触させられている、項目６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記方法が、標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記内因性配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記内因性配列プローブからのシグナルと比較して前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む、項目８０に記載の方法。