【手続補正書】
【提出日】平成30年9月26日(2018.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォークヘッド関連（ＦＨＡ）ドメインを有するタンパク質であって、
ＦＨＡドメインが、
ａ）少なくとも１つの足場配列および少なくとも１つのループドメイン、
ｂ）変異させた少なくとも１つのループドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列における部分的なランダム変異は、ＦＨＡドメインの構造的足場を破壊しない）、
ｃ）少なくとも１つのループドメイン間の少なくとも１つの足場配列中の変異させた少なくとも１つのアミノ酸配列、および
ｄ）天然に生じる、又はインビボＦＨＡドメイン認識部位に基づく、リン酸部分との相互作用を含まない標的分子に対する特異的親和性を有するタンパク質をもたらす、少なくとも１つのループドメイン内の前記少なくとも１つの変異させたアミノ酸配列、
を含む、タンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸配列の変異が、最低でも前記アミノ配列内の少なくとも２つのアミノ酸残基であり、アミノ酸の変異は、ＦＨＡドメインの構造的足場を破壊せず、かつ、変異アミノ酸配列は天然には存在しない、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
少なくとも１つのアミノ酸配列の変異が、アミノ酸残基の翻訳後修飾を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
少なくとも１つのアミノ酸配列の変異が、アミノ酸残基の欠失、置換、又は付加を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸の配列。
【請求項７】
宿主細胞にトランスフェクトされる、請求項６に記載の単離された核酸の配列。
【請求項８】
単離された核酸の配列の発現が、選択されたバリアントタンパク質を宿主細胞から発現させて前記標的分子に結合させることを可能にする、請求項７に記載の単離された核酸の配列。
【請求項９】
第２の標的分子に対する特異的結合親和性を有する第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列と組み合わされており、組み合わされた核酸配列の発現は、同時に複数の標的分子に結合することができるオリゴマータンパク質を作製する、請求項６に記載の単離された核酸の配列。
【請求項１０】
シグナルペプチド又はタグをコードする他のタンパク質配列、又は、ＡＬＰと隣接タンパク質との間に位置する介在配列に連結される、請求項６に記載の単離された核酸の配列。
【請求項１１】
前記介在配列が、リンカー配列又はプロテアーゼ認識部位を含む、請求項１０に記載の単離された核酸の配列。
【請求項１２】
さらに少なくとも１つの追加ＦＨＡドメイン及び少なくとも１つのリンカー配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記ＦＨＡドメインが、他の機能的ドメイン内に位置する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
標的分子に対する前記特異的結合親和性は、活性を阻害する、又は、活性化する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記ＦＨＡドメインが配列番号９由来である、請求項１に記載のタンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本明細書は本発明の特定の実施形態を説明しているが、当業者は、本発明の概念を逸脱することなく本発明の変化形を考案することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕バリアントタンパク質のライブラリーをコードする単離された核酸のライブラリーであって、各バリアントタンパク質は、
ａ）ＦＨＡドメインを含み、
ｂ）各バリアントタンパク質は、ＦＨＡドメインのアミノ酸配列における部分的なランダム改変によって互いに異なっており、ランダム改変がＦＨＡドメインの構造的足場を実質的に破壊せず、
ｃ）ランダム改変は、野生型ＦＨＡドメインを含む起源のタンパク質をコードする起源の核酸配列の単離された核酸のランダム改変に起因しており、
ｄ）ランダムに改変されたヌクレオチド配列は、最小２ヌクレオチド長で互いに隣接しており、ランダムに改変されたヌクレオチド配列は、ＦＨＡドメインの構造的足場を破壊しないアミノ酸をコードする、
単離された核酸のライブラリー。
〔２〕前記ランダム改変が、部位特異的変異誘発、制限エンドヌクレアーゼに基づくＤＮＡ組換え、または相同組換えを含む方法によって行われる、前記〔１〕に記載の単離された核酸のライブラリー。
〔３〕前記〔２〕に記載の方法であって、前記部位特異的変異誘発が、配列番号３〜８に示されるヌクレオチド配列の群からなるプライマーを利用する、方法。
〔４〕前記ランダムに改変されたヌクレオチド配列が、ＦＨＡドメインのループドメインに向けられている、前記〔１〕に記載の単離された核酸のライブラリー。
〔５〕コードされたバリアントタンパク質が、標的分子と結合する能力について選択される、前記〔１〕に記載の単離された核酸のライブラリー。
〔６〕前記〔５〕に記載の標的分子に結合するバリアントタンパク質を選択するために使用される方法であって、前記標的分子が選択のためのリガンドとして使用され、リガンドは単離のために使用される固相または液相支持体のいずれかに結合する、方法。
〔７〕前記〔５〕に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質であって、前記バリアントタンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、選択されたバリアントタンパク質。
〔８〕前記〔５〕に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質であって、単離された核酸の配列が、宿主細胞にトランスフェクトされる選択されたバリアントタンパク質の１つをコードする、選択されたバリアントタンパク質。
〔９〕前記〔８〕に記載の単離された核酸の配列であって、単離された核酸の配列の発現が、選択されたバリアントタンパク質の発現および前記標的分子への結合を可能にする、核酸の配列。
〔１０〕前記〔５〕に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質であって、選択されたバリアントタンパク質の１つをコードする単離された核酸の配列が、第２の標的分子に対する特異的結合親和性を有する少なくとも第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列と組み合わされ、組み合わされた核酸配列の発現は、同時に複数の標的分子に結合することができるオリゴマータンパク質をもたらす、選択されたバリアントタンパク質。
〔１１〕単離された核酸の各々が、タンパク質タグをコードするヌクレオチド配列を含む、前記〔１〕に記載の単離された核酸のライブラリー。
〔１２〕前記〔１〕に記載のバリアントタンパク質の１つの前記単離された核酸の配列の１つを含むベクター。
〔１３〕前記バリアントタンパク質の１つの前記単離された核酸の配列の１つが、発現コンピテント宿主細胞において前記タンパク質の発現を可能にする発現制御配列と動作可能に結合している、前記〔１２〕に記載のベクター。
〔１４〕宿主細胞中で複製可能なＤＮＡを含む、前記〔１３〕に記載のベクター。
〔１５〕宿主細胞にトランスフェクトされる、前記〔１４〕に記載のベクター。
〔１６〕前記〔１５〕に記載の宿主細胞であって、細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
〔１７〕ファージ形質導入が可能であり、前記ベクターが、子孫ファージ粒子内へのパッケージングが可能なＤＮＡを含む、前記〔１６〕に記載の宿主細胞。
〔１８〕ファージ形質導入が可能な細胞であり、前記バリアントタンパク質の１つが子孫ファージ粒子にパッケージングされており、前記ベクターが、子孫ファージ粒子への前記バリアントタンパク質のパッケージングが可能なＤＮＡを含む、前記〔１７〕に記載の宿主細胞。
〔１９〕各単離された核酸が、ファージ粒子中にパッケージングされ、ファージ粒子のコレクションの全体が、ファージライブラリーまたはファージミドライブラリーとして使用され得る、前記〔１〕に記載の単離された核酸のライブラリー。
〔２０〕前記バリアントタンパク質が、それぞれ少なくとも２つ以上のＦＨＡドメインを含み、各ＦＨＡドメインが、前記ランダム改変を含む、前記〔１〕に記載の単離された核酸のライブラリー。
〔２１〕標的分子に結合するバリアントタンパク質について選択され得る、前記〔２０〕に記載のバリアントタンパク質。
〔２２〕前記バリアントタンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、前記〔２１〕に記載の選択されたバリアントタンパク質。
〔２３〕前記バリアントタンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、前記〔２２〕に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質。
〔２４〕ＦＨＡドメインに基づくタンパク質ライブラリーの調製方法であって、ＦＨＡ足場構造のアミノ酸配列およびＦＨＡループドメインのアミノ酸配列を有するＦＨＡドメインを含む、足場構造の配列を破壊しない残基を含むアミノ酸配列を提供すること、それによりタンパク質ライブラリーの一部である前記残基内に少なくとも１つのランダムに変異したアミノ酸の人工変異体アミノ酸配列を産生することを含む、方法。
〔２５〕人工変異体アミノ酸配列が、前記残基の置換または欠失を含み、少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、天然に存在しないアミノ酸配列を提供するように設計されている、前記〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕アミノ酸残基への人工変異の導入が、ＦＨＡドメインの天然に存在する遺伝子に対してプライマーを用いてＰＣＲを実施することを含む、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕ＦＨＡドメインに基づくタンパク質の天然に存在する遺伝子が、ＫＩＦ１Ｃ遺伝子である、前記〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕プライマーが、配列番号３〜８からなる群から選択される、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕ＦＨＡドメインに基づく標的特異的タンパク質バリアントの産生方法であって、
ａ）前記〔２４〕に記載の方法を実施することによって、ＦＨＡドメインに基づくタンパク質ライブラリーを調製すること、
ｂ）タンパク質ライブラリーをスクリーニングして、標的分子に対する特異的親和性を有するアミノ酸配列を同定すること、および
ｃ）同定されたアミノ酸配列を、ＦＨＡドメインに基づく標的特異的タンパク質バリアントとして単離すること
を含む、方法。
〔３０〕標的分子が、脂質、核酸、糖、またはタンパク質の少なくとも一部を含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーの調製方法であって、
ａ）前記〔２８〕または〔２９〕に記載の方法を実施することによって、２つ以上のアミノ酸配列を提供すること、
ｂ）ここで２つ以上のアミノ酸配列は、単一の標的分子に対する特異的結合親和性を有し、および
ｃ）リンカーを使用して２つ以上のアミノ酸配列を組み合わせて、単一の標的分子に結合可能なオリゴマーを提供すること
を含む、方法。
〔３２〕ａ）前記〔２８〕または〔２９〕に記載の方法を実施することによって、２つ以上のアミノ酸配列を提供すること、
ｂ）ここで２つ以上のアミノ酸配列は、２つ以上の異なる標的分子に対する特異的結合親和性を有する配列を含み、
ｃ）ここで２つ以上のアミノ酸配列は、単一の標的分子に対する特異的結合親和性を有し、および
ｄ）リンカーを使用して２つ以上のアミノ酸配列を組み合わせて、複数の標的分子に同時に結合可能なオリゴマーを提供すること
を含む、多価アミノ酸配列または多特異的アミノ酸配列の調製方法。
〔３３〕ＦＨＡドメインを有するタンパク質であって、
ａ）ＦＨＡドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸配列が変異し、アミノ酸配列の変異は、ＦＨＡドメインの構造的足場を実質的に破壊しないこと、
ｂ）アミノ酸配列の変異は、最低でも前記アミノ配列内の少なくとも２つのアミノ酸残基であり、アミノ酸の変異は、ＦＨＡドメインの構造的足場を破壊しないこと、
ｃ）少なくとも１つの変異アミノ酸配列は、野生型標的分子とは異なる標的分子に対する特異的結合親和性を有するタンパク質をもたらすこと、および
ｄ）変異アミノ酸配列は天然には存在しないこと
を含む、タンパク質。
〔３４〕少なくとも１つの変異アミノ酸配列の変異が、タンパク質をコードする単離された核酸の配列を変異させることによって作製される、前記〔３３〕に記載のタンパク質。
〔３５〕前記〔３４〕に記載の少なくとも１つの変異アミノ酸配列の変異であって、部位特異的変異誘発、制限エンドヌクレアーゼに基づくＤＮＡ組換え、または相同組換えを含む方法によって行われる、変異。
〔３６〕前記〔３５〕に記載の方法であって、前記部位特異的変異誘発が、配列番号３〜８に示されるヌクレオチド配列の群からなるプライマーを利用する、方法。
〔３７〕少なくとも１つのアミノ酸配列の変異が、アミノ酸残基の翻訳後修飾を含む、前記〔３３〕に記載のタンパク質。
〔３８〕少なくとも１つのアミノ酸配列の変異が、アミノ酸残基の欠失を含む、前記〔３３〕に記載のタンパク質。
〔３９〕少なくとも１つのアミノ酸配列に対する変異が、前記タンパク質のバリアントからなるタンパク質ライブラリー由来の前記標的分子の結合選択によって決定され、バリアントは、ＦＨＡドメインを有する前記少なくとも１つのアミノ酸配列に対するランダムに変異したバリエーションからなる、前記〔３３〕に記載のタンパク質。
〔４０〕前記タンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、前記〔３３〕に記載のタンパク質。
〔４１〕前記〔３３〕に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸の配列。
〔４２〕前記タンパク質をコードしており、宿主細胞にトランスフェクトされる、前記〔４１〕に記載の単離された核酸の配列。
〔４３〕単離された核酸の配列の発現が、選択されたバリアントタンパク質を宿主細胞から発現させて前記標的分子に結合させることを可能にする、前記〔４２〕に記載の単離された核酸の配列。
〔４４〕第２の標的分子に対する特異的結合親和性を有する第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列と組み合わされており、組み合わされた核酸配列の発現は、同時に複数の標的分子に結合することができるオリゴマータンパク質を作製する、前記〔４１〕に記載の単離された核酸の配列。