【手続補正書】
【提出日】平成30年6月13日(2018.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質または標的ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸のアミノ官能基において修飾する方法であって、
ａ．得られるタンパク質またはペプチドが、前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、前記標的タンパク質または標的ペプチドを修飾するステップと、
ｂ．前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドを、アシル化剤と６未満のｐＨで接触させて、修飾されたタンパク質またはペプチドを生成するステップと
を含み、
前記アシル化剤は、次式：
【化１】
2017525665.tif 000001
［式中、
Ｒは、ＨまたはＳＯ3Ｎａであり、
Ｌ1は、線状もしくは分枝状Ｃ1〜Ｃ30アルキルまたは式：
【化２】
2017525665.tif 000002
［式中、ｙは、０〜３４である］の分枝状でないオリゴエチレングリコール部分であり、
Ｒ1は、ビオチンまたは脂肪酸部分であり、
ｎは、０または１である］
のものであるか、
あるいは、前記アシル化剤は、式：
【化３】
2017525665.tif 000003
2017525665.tif 000004
のものであり、
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドの前記Ｎ末端にある２つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨ−［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘは、ＭおよびＡから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製されるか、または
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある３つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨＸ'−［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ'は、独立して、ＭおよびＡから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製されるか、または
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、式ＸＨの２つのアミノ酸配列または式ＸＨＸ'−の３つのアミノ酸配列［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ'は、ＭおよびＡから独立して選択される］を追加することにより調製されるか、または
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にヒスチジンタグを追加することにより調製される、方法。
【請求項２】
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、ＭＨＨＨＨＨＨ−またはＭＨＨＨＨＨＨＭ−から選択されるアミノ酸配列を追加することにより調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アシル化剤が、
【化４】
2017525665.tif 000005
［式中、Ｒ８は、線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルキル、線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルケニル、または線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルキニルであり、これらはそれぞれ、カルボキシおよびヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基で場合により置換されており、
ｓは、１〜３４である］
である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アシル化剤が
【化５】
2017525665.tif 000006
である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
以下の式：
【化６】
2017525665.tif 000007
［式中、ｙは、０〜３４であり、ＦＡは、以下の式：
【化７】
2017525665.tif 000008
のものである］
の生体相互作用薬または分析用薬剤を、前記アシル化剤中に存在する反応性基と反応させるステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的タンパク質または標的ペプチドが、ＡＰＪアゴニストペプチド、未変性Ｆｃ、またはＧＤＦ１５タンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨが４である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９１】
Ｈ2Ｏ中中間体１４ｃの５０ｍｇ／ｍＬの保存溶液を調製した。中間体１４ｃ（５３．７μＬ、１．５１５μｍｏｌ）を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中Ｆｃ−ＨＡ−ＢＣＮ（１．７３ｍｇ／ｍＬ、１．５６ｍｇ、０．０３μｍｏｌ）の保存溶液に加え、反応液を室温で１６時間混合した。５０ｋＤａ  ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、反応液を５回希釈および濃縮して２５０μＬの体積にすることによって、溶液を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に交換した。濃度は、Ａ２８０によって、３．３２ｍｇ／ｍＬ（８３０μｇ、５０％）であることが測定された。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿３５〜７０ｋＤａ＿３分、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ４．６×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＣＡＮ＋０．１％ギ酸、２分かけて１０〜８０％）Ｒt＝１．４３分、ＭＳ［Ｍ（グリコシル化）＋Ｈ］５４５２４．５。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
標的タンパク質または標的ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸のアミノ官能基において修飾する方法であって、
ａ．得られるタンパク質またはペプチドが、前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、前記標的タンパク質または標的ペプチドを修飾するステップと、
ｂ．前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドを、アシル化用化合物と６未満のｐＨで接触させて、修飾されたタンパク質またはペプチドを生成するステップと
を含む、方法。
［２］
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドの前記Ｎ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸を、ヒスチジンアミノ酸で置き換えることにより調製される、上記［１］に記載の方法。
［３］
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドの前記Ｎ末端にある２つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨ−［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘは、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製される、上記［１］に記載の方法。
［４］
前記アミノ酸配列ＸＨ−が、ＭＨ−またはＡＨ−である、上記［３］に記載の方法。
［５］
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある３つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨＸ'−［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ'は、独立して、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製される、上記［１］に記載の方法。
［６］
前記アミノ酸配列ＸＨＸ'−が、ＡＨＡ−およびＭＨＡから選択される、上記［５］に記載の方法。
［７］
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、式ＸＨの２つのアミノ酸配列または式ＸＨＸ'−の３つのアミノ酸配列［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ'は、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから独立して選択される］を追加することにより調製される、上記［１］に記載の方法。
［８］
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にヒスチジンタグを追加することにより調製される、上記［１］に記載の方法。
［９］
前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、ＭＨＨＨＨＨＨ−またはＭＨＨＨＨＨＨＭ−から選択されるアミノ酸配列を追加することにより調製される、上記［８］に記載の方法。
［１０］
前記アシル化剤が、活性化型の次式：
ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（Ｌ1）n−Ｒ1［式中、
Ｌ1は、リンカーであり、
Ｒ1は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分であるか、またはＲ1は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤であり、
ｎは、０または１である］
の酸である、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記アシル化剤が、次式：
【化６８】
2017525665.tif 000009
［Ｒは、ＨまたはＳＯ3Ｎａである］
のものである、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
ｎが１であり、Ｌ1が、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、および／もしくは１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／もしくは天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しているか、または前記生体相互作用薬／分析用薬剤および／もしくは前記標的タンパク質／ペプチドに、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している、上記［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］
前記リンカーが、線状もしくは分枝状アルキル、または分子量が１００ｋＤ〜５０００ｋＤの間であるポリエチレングリコールである、上記［１２］に記載の方法。
［１４］
Ｒ1が生体相互作用薬または分析用薬剤である、上記［１０］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
Ｒ１がビオチンである、実施形態１４に記載の方法。
［１６］
Ｒ１がアルブミン結合性部分である、実施形態１４に記載の方法。
［１７］
前記アシル化剤が、
【化６９】
2017525665.tif 000010
［Ｒ８は、線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルキル、線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルケニル、または線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルキニルであり、これらはそれぞれ、カルボキシおよびヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基で場合により置換されており、
ｓは、１〜３４である］
である、実施形態１から１４および１６のいずれか１つに記載の方法。
［１８］
Ｒ1が、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分である、上記［１０］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
前記反応性基が、アシル、エステルもしくは混合無水物、アルキン、テトラジン、マレイミド、イミデート、またはカルボキシから選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
前記反応性基がシクロオクチン部分である、上記［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］
前記アシル化剤が
【化７０】
2017525665.tif 000011
である、上記［１］から［１３］および［１８］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
生体相互作用薬または分析用薬剤を、前記アシル化剤中に存在する前記反応性基と反応させるステップをさらに含み、前記生体相互作用薬または分析用薬剤は、官能基を介して、場合によりリンカーＬ2を介して反応させる、上記［１８］から［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］
前記官能基が、アミノ基、アジド基、アルケン基、チオール基、およびヒドラジン、ヒドロキシルアミン基から選択される、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
前記官能基がアジドである、上記［２２］または［２３］に記載の方法。
［２５］
前記生体相互作用薬または分析用薬剤が、ビオチン、蛍光体、毒素、キレーター、アルブミン結合性部分または血漿タンパク質結合性部分、未変性Ｆｃ、Ｆｃ変異体、画像処理試薬、およびペプチドから選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
前記標的タンパク質または標的ペプチドが、ＡＰＪアゴニストペプチド、未変性Ｆｃ、Ｆｃ変異体、またはＧＤＦ１５タンパク質もしくはその変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
前記ｐＨが５未満である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
前記ｐＨが４である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
上記［１］から［２８］のいずれか一項に記載の方法によって調製されるコンジュゲート。
［３０］
上記［２９］に記載のコンジュゲートまたは上記［１］から［２８］のいずれか一項に記載の修飾タンパク質もしくは修飾ペプチドを含む、ワクチン。
［３１］
上記［１］から［２８］のいずれか一項に記載の修飾タンパク質または修飾ペプチドを含む、治療用タンパク質。
［３２］
上記［１］から［２８］のいずれか一項に記載の修飾タンパク質または修飾ペプチドを含む、画像処理剤。
［３３］
上記［１］から［２８］のいずれか一項に記載の修飾タンパク質または修飾ペプチドを含む、標識用ツール。