【手続補正書】
【提出日】平成29年12月27日(2017.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン産生細胞の集団の製造方法であって、
（ａ）成体ヒト組織を得るステップと、
（ｂ）前記成体ヒト組織を処理して、一次成体ヒト細胞を回収するステップと、
（ｃ）前記一次成体ヒト細胞を、既定数の細胞に増殖及び増幅させるステップと、
（ｄ）前記増幅した細胞を分化転換させるステップであって、前記分化転換は、
（１）前記増幅した細胞に、第１の期間において、少なくとも１つの発現ベクターを感染させることであって、
（ｉ）前記少なくとも１つの発現ベクターが、ＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、及び第２のヒト膵転写因子ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含み、前記アデノウイルスベクターの感染が同時に発生する、該感染させること、または
（ｉｉ）前記少なくとも１つの発現ベクターが、ヒトＰＤＸ−１ポリペプチド、及び第２の膵転写因子ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、該感染させること、及び
（２）（１）の前記増幅した細胞に、ＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを感染させることであって、前記感染は第２の期間に発生し、前記第２の期間は前記第１の期間の後である、該感染させることを含む、該ステップと、
（ｅ）前記分化転換した細胞を採取するステップと、を含み、
それにより、前記ヒトインスリン産生細胞の集団を製造し、
前記一次成体ヒト細胞は、胚性特徴を有するステージを経ることがなく、
前記ヒトインスリン産生細胞は、対照非分化一次成体ヒト細胞と比較して、感染後のＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１及びＭａｆＡ転写因子の短期の異所性発現、グルカゴンの発現及び産生、増加したインスリン含有量、増加したグルコース調節インスリン分泌、増加したＣ−ペプチド分泌、または増加した内因性Ｎｋｘ６．１転写因子、あるいはこれらの任意の組み合わせを含み、
前記インスリン産生細胞は、胚性特徴を発現しない、前記方法。
【請求項２】
前記増殖及び増幅が、バイオリアクターの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトインスリン産生細胞の集団の製造方法であって、
（ａ）ヒト組織を得るステップと、
（ｂ）前記ヒト組織を処理して、一次成体ヒト細胞の集団を回収するステップと、
（ｃ）前記一次成体ヒト細胞の集団を規定数の細胞に増殖及び増幅させ、前記増殖がバイオリアクターの使用を含むステップと、
（ｄ）前記増幅した細胞の集団を分化転換させるステップであって、前記分化転換は、
（１）前記増幅した細胞の集団に、第１の期間において、少なくとも１つの発現ベクターを感染させることであって、前記少なくとも1つの発現ベクターは、ＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、該感染させること、
（２）（１）の前記増幅した細胞の集団に、第２の期間において、少なくとも１つの更なる発現ベクターを感染させることであって、前記少なくとも１つの更なる発現ベクターは、第２の膵転写因子含むアデノウイルスベクターを含む、該感染させること、及び
（３）（２）の前記増幅した細胞の集団に、第３の期間において、少なくとも１つの更に別の発現ベクターを感染させることであって、前記少なくとも１つの更に別の発現ベクターは、ＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、該感染させることを含む、該ステップと、
（ｅ）前記分化転換した前記増幅した細胞の集団を採取するステップとを含み、
それにより、前記ヒトインスリン産生細胞の集団を製造し、
前記一次成体ヒト細胞は、胚性特徴を有するステージを経ることがなく、
前記ヒトインスリン産生細胞は、対照非分化一次成体ヒト細胞と比較して、感染後のＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ１及びＭａｆＡ転写因子の短期の異所性発現、グルカゴンの発現及び産生、増加したインスリン含有量、増加したグルコース調節インスリン分泌、増加したＣ−ペプチド分泌、または増加した内因性Ｎｋｘ６．１転写因子、あるいはこれらの任意の組み合わせを含み、
前記インスリン産生細胞は、胚性特徴を発現しない、前記方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において、前記ヒト組織が、
（ａ）膵臓障害、またはインスリン依存性糖尿病に羅患している対象から入手される組織、あるいは
（ｂ）肝組織、脂肪組織、骨髄、皮膚、胎盤、臍帯、ウォートンゼリーまたは臍帯血、あるいは
（ａ）及び（ｂ）の任意の組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記一次ヒト細胞が、内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞（liver cells）、骨髄細胞、筋細胞、脾臓細胞、腎細胞、血液細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、中心周囲肝細胞、非膵細胞、非膵β細胞、肝実質細胞(hepatocytes)、造血幹細胞、肝幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、胎盤幹細胞、神経幹細胞、または胎児肝細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）前記バイオリアクターシステムが、単一のバイオリアクターまたは複数のバイオリアクターを含む、あるいは
（ｂ）前記バイオリアクターが、単回使用バイオリアクター、複数回使用バイオリアクター、閉鎖系バイオリアクター、もしくは開放系バイオリアクター、またはそれらの任意の組み合わせを含む、あるいは
（ａ）及び（ｂ）の任意の組合せを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｄ）において、前記増幅した細胞の前記分化転換が、一連のバイオリアクターシステムを通じた分化転換を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の膵転写因子が、ＮｅｕｒｏＤ１及びＰａｘ４から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分化転換の素因がある細胞に関して、前記一次成体ヒト細胞を富化するステップをさらに含み、前記富化するステップが、前記分化転換に先行するか前記分化転換と同時に起きる、またはその両者である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記素因がある細胞が、
（ａ）活性Ｗｎｔシグナル伝達経路、
（ｂ）グルタミン合成酵素応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化する能力、
（ｃ）ＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、ＢＭＰＲ２、ＩＴＧＡ６、ＤＣＢＬＤ２、ＴＨＢＳ１、もしくはＶＡＭＰ４、またはこれらの細胞が肝細胞を含む場合に、これらの任意の組み合わせの増加した発現、
（ｄ）ＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、もしくはＰＲＮＰ、またはこれらの細胞が肝細胞を含む場合に、これらの任意の組み合わせの減少した発現、あるいは
これらの任意の組み合わせを含む細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一次成体ヒト細胞において、Ｗｎｔシグナルの活性化を増加させるステップを更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化の誘導が、前記一次成体ヒト細胞をリチウムでインキュベートすることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記規定数の細胞が、約１０億〜２０億個の細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅した細胞の集団の少なくとも９０％が、ステップ（ｄ）に先行して、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはＣＤ４４、あるいはこれらの任意の組み合わせを発現する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。