【手続補正書】
【提出日】平成30年5月18日(2018.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の標的遺伝子座の連続的修飾方法であって、
（ａ）前記標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記標的遺伝子座が、（１）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸、および（２）第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を含む第１選択カセットを含み、前記第１ヌクレアーゼ認識部位は、前記第１選択マーカーのコード領域又は前記第１選択マーカーのいずれかの非タンパク質コード領域に位置する、工程と、
（ｂ）前記細胞に、
（ｉ）前記第１ヌクレアーゼ剤であって、前記第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、第１ヌクレアーゼ剤と、
（ｉｉ）前記標的遺伝子座に位置する第１標的部位に対応する第１ホモロジーアームおよび前記標的遺伝子座に位置する第２標的部位に対応する第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターであって、前記第１挿入ポリヌクレオチドは、（１）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする核酸であって、前記第１選択マーカーと前記第２選択マーカーが異なる、核酸、および（２）第２ヌクレアーゼ剤のための第２ヌクレアーゼ認識部位を含む第２選択カセットを含み、前記第２ヌクレアーゼ認識部位は、前記第２選択マーカーのコード領域又は前記第２選択マーカーのいずれかの非タンパク質コード領域に位置する、第１ターゲッティングベクターと、
を導入する工程と、
（ｃ）前記第１標的遺伝子座に前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第２選択マーカーの活性を有するが、前記第１選択マーカーの活性を有しない、工程と、
（ｄ）前記修飾された細胞に、
（ｉ）前記第２ヌクレアーゼ剤であって、前記第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、第２ヌクレアーゼ剤と、
（ｉｉ）前記標的遺伝子座に位置する第３標的部位に対応する第３ホモロジーアームおよび前記標的遺伝子座に位置する第４標的部位に対応する第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターであって、前記第２挿入ポリヌクレオチドは、（１）第３選択マーカーをコードする核酸であって、前記第１選択マーカーと前記第３選択マーカーが同一である、核酸、および（２）第３ヌクレアーゼ剤のための第３ヌクレアーゼ認識部位を含む第３選択カセットを含み、前記第３ヌクレアーゼ認識部位は、前記第１ヌクレアーゼ認識部位と同一である、第２ターゲッティングベクターと、
を導入する工程と、
（ｅ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
（Ｉ）前記同定する工程（ｃ）が、
（ｉ）前記第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
（ｉｉ）前記第１及び第２標的部位に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定すること、を含む、かつ／又は
（ＩＩ）前記同定する工程（ｅ）が、
（ｉ）前記第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
（ｉｉ）前記第３及び第４標的部位に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定すること、を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定する工程（ｃ）が対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを経て実施される、かつ／又は前記同定する工程（ｅ）がＭＯＡアッセイを経て実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）の前記修飾された細胞における前記選択カセットが、前記第３標的部位及び前記第４標的部位に隣接している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、抗生物質耐性を付与し、
任意選択で、前記抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含み、
任意選択で、前記第１および前記第３選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、かつ前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与するか、又は前記第１および前記第３選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、かつ前記第２選択マーカーがネオグロマイシン耐性を付与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対して毒性であり、
任意選択で、前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１ヌクレアーゼ剤と前記第１ターゲッティングベクターとの併用により、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらし、
任意選択で、前記第１ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１ヌクレアーゼ剤、前記第２ヌクレアーゼ剤又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸配列が、前記細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されているか、又は前記第１ヌクレアーゼ剤、前記第２ヌクレアーゼ剤又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１ヌクレアーゼ剤、前記第２ヌクレアーゼ剤又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は
（ｄ）クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１ヌクレアーゼ剤、前記第２ヌクレアーゼ剤又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、前記第１ヌクレアーゼ認識部位、前記第２ヌクレアーゼ認識部位又は前記第３ヌクレアーゼ認識部位が、配列番号９〜１２のいずれか１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１ヌクレアーゼ剤、前記第２ヌクレアーゼ剤又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質及び前記ガイドＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している前記第１、前記第２又は前記第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含み、
任意選択で、前記標的遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｇＲＮＡが、配列番号１３〜２０のいずれか１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｇＲＮＡが、配列番号２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１つを含み、
任意選択で、前記ガイドＲＮＡが、配列番号３又は７を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１ヌクレアーゼ認識部位が、前記第１選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置しており、前記第２ヌクレアーゼ認識部位が、前記第２選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１ヌクレアーゼ剤が、前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第１ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼであり、かつ前記第１ヌクレアーゼ認識部位が配列番号９又は１０を含み、前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、前記第２ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼであり、かつ前記第２ヌクレアーゼ認識部位が配列番号１１又は１２を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第１ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質および配列番号１３〜１６のいずれか１つを含むガイドＲＮＡであり、前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、前記第２ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質および配列番号１７〜２０のいずれか１つを含むガイドＲＮＡであり、
任意選択で、前記第１選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第１ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓ９タンパク質および配列番号１３を含む前記ガイドＲＮＡであり、前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、前記第２ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓ９タンパク質および配列番号１７を含む前記ガイドＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１ヌクレアーゼ認識部位及び前記第３ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第１ヌクレアーゼ剤及び前記第３ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第１ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼであり、かつ前記第１ヌクレアーゼ認識部位が配列番号９又は１０を含み、前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、前記第２ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼであり、かつ前記第２ヌクレアーゼ認識部位が配列番号１１又は１２を含み、前記第３選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第３ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼであり、かつ前記第３ヌクレアーゼ認識部位が配列番号９又は１０を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第１ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質および配列番号１３〜１６のいずれか１つを含むガイドＲＮＡであり、前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、前記第２ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質および配列番号１７〜２０のいずれか１つを含むガイドＲＮＡであり、前記第３選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第３ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質および配列番号１３〜１６のいずれか１つを含むガイドＲＮＡであり、
任意選択で、前記第１選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第１ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓ９タンパク質および配列番号１３を含む前記ガイドＲＮＡであり、前記第２選択マーカーがハイグロマイシン耐性を付与し、前記第２ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓ９タンパク質および配列番号１７を含む前記ガイドＲＮＡであり、前記第３選択マーカーがネオマイシン耐性を付与し、前記第３ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓ９タンパク質および配列番号１３を含む前記ガイドＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１ヌクレアーゼ認識部位に直接隣接している、
（ｂ）前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１ヌクレアーゼ認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置しているか、
（ｃ）前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２ヌクレアーゼ認識部位に直接隣接しているか、又は
（ｄ）前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２ヌクレアーゼ認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）前記第１ホモロジーアームと前記第２ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂであり、かつ／又は前記第３ホモロジーアームと前記第４ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、かつ／又は
（ｂ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲であり、かつ／又は前記第２挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１挿入ポリヌクレオチドが目的の第１ポリヌクレオチドを更に含む、かつ／又は前記第２挿入ポリヌクレオチドが目的の第２ポリヌクレオチドを含み、
任意選択で、前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体の領域をコードするポリヌクレオチドを含み、
任意選択で、前記Ｔ細胞受容体がＴ細胞受容体αであり、
任意選択で、前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含み、
任意選択で、前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含み、
任意選択で、前記ゲノム核酸配列が、再構成されていないヒトλ及び／又はκ軽鎖可変領域の核酸配列を含むか、又は前記ゲノム核酸配列が、再構成されたヒトλ及び／又はκ軽鎖可変領域の核酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的の第１ポリヌクレオチド及び／又は前記目的の第２ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの疾患対立遺伝子を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
（Ｉ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、
（ｉ）前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的の第１ポリヌクレオチド、又は
（ｉｉ）外来の核酸配列を含む目的の第１ポリヌクレオチド、を含む、かつ／又は
（ＩＩ）前記第２挿入ポリヌクレオチドが、
（ｉ）前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな目的の第２ポリヌクレオチド、又は
（ｉｉ）外来の核酸配列を含む目的の第２ポリヌクレオチド、を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
（Ｉ）前記第１挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらし、かつ／又は
（ＩＩ）前記第２挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらす、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的遺伝子座が、前記細胞のゲノム中に存在しているか、又は前記細胞内のベクターに位置している、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的遺伝子座が、免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的ゲノム遺伝子座が、Ｔ細胞受容体遺伝子座を含み、
任意選択で、前記Ｔ細胞受容体遺伝子座がＴ細胞受容体α遺伝子座である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が真核生物細胞であり、任意選択で、前記細胞が哺乳動物細胞であり、任意選択で、前記細胞が、
（ａ）非ヒト哺乳動物細胞、
（ｂ）多能性細胞、
（ｃ）ヒト人工多能性幹細胞、
（ｄ）ヒト線維芽細胞、
（ｅ）非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、
（ｆ）マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞、
（ｇ）造血幹細胞、又は
（ｈ）神経幹細胞、
（ｉ）齧歯動物細胞である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、前記マウスＥＳ細胞又は前記ラットＥＳ細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ｆ）前桑実胚期の非ヒト動物の宿主胚に工程（ｃ）で作製された細胞を導入して、修飾された宿主胚を作製する工程、及び
（ｇ）前記修飾された宿主胚を仮親に移植して、工程（ｅ）で作製された細胞に由来するＦ０世代を作製する工程、を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
他の非限定的な実施形態には、以下のものが含まれる。
１．細胞内の目的の標的遺伝子座の修飾方法であって、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸を含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）Ｃａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、各々が、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され、Ｃａｓタンパク質が第１核酸中の第１  ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２核酸を含む第１挿入核酸を含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞は、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
２．第１  ｇＲＮＡが、第１挿入核酸とハイブリダイズしない、実施形態１に記載の方法。
３．目的の標的遺伝子座が、細胞のゲノム中に位置している、実施形態１に記載の方法。
４．目的の標的遺伝子座が、細胞内のベクターに位置している、実施形態１に記載の方法。
５．同定する工程（ｃ）が、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さない、修飾された細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態１に記載の方法。
６．（ｄ）第１標的遺伝子座で第１挿入核酸を含む修飾された細胞に、（ｉ）Ｃａｓタンパク質及び第２  ｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、各々が修飾された細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結し、Ｃａｓタンパク質が、第２核酸を含む第１挿入核酸内の第２  ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の核酸と、（ｉｉ）第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３核酸を含む第２挿入核酸を含む第２ターゲッティングベクターであって、第２挿入核酸が、第２標的遺伝子座に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接している、第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｅ）第２標的遺伝子座内に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞を同定する工程であって、第２の修飾された細胞が、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さず、第２及び第３選択マーカーが異なる工程と、を更に含む、実施形態１に記載の方法。
７．第１及び第２標的遺伝子座が、各々に隣接して位置している、実施形態６に記載の方法。
８．第１又は第２標的遺伝子座が、第１又は第２  ｇＲＮＡ標的部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、実施形態６に記載の方法。
９．第２  ｇＲＮＡが、第２挿入核酸とハイブリダイズしない、実施形態８に記載の方法。
１０．同定する工程（ｅ）が、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さない第２の修飾された細胞の同定を可能にする条件下で、修飾された細胞を培養することを含む、実施形態６に記載の方法。
１１．（ｆ）第２標的遺伝子座に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞に、（ｉ）第２の修飾された細胞内で活性なプロモーターと各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第３  ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第３核酸を含む第２挿入核酸で第３  ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第３選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第４プロモーターに作動可能に連結された第４選択マーカーをコードする第４核酸を含む第３挿入核酸を含む第３ターゲッティングベクターであって、第３挿入核酸が、第３標的遺伝子座に位置する第５及び第６標的部位に対応する第５及び第６ホモロジーアームに隣接している、第３ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｇ）第３標的遺伝子座に第３挿入核酸を含む第３の修飾された細胞を同定する工程であって、第３の修飾された細胞が第４選択マーカーの活性を有するが、第３選択マーカーの活性を有さず、第３及び第４選択マーカーが異なる、工程と、を含む。
１２．第２及び第３標的遺伝子座が、各々直接隣接して位置している、実施形態１１に記載の方法。
１３．第２又は第３標的遺伝子座が、第１又は第２  ｇＲＮＡ標的部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、実施形態１１に記載の方法。
１４．第１、第２、第３又は第４マーカーが、抗生物質耐性を付与する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．第１、第２、第３又は第４選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１７．第１、第２又は第３  ｇＲＮＡが、（ｉ）第１、第２又は第３  ｇＲＮＡ標的部位とハイブリダイズするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
１８．第１、第２又は第３標的遺伝子座が、第１、第２又は第３  ｇＲＮＡ標的部位の近傍に位置し、ｇＲＮＡ標的部位のニック又は二本鎖切断が、標的遺伝子座でのターゲッティングベクターの相同組換えを促進する、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
１９．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
２０．第１、第２又は第３  ｇＲＮＡ標的部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している、実施形態１９に記載の方法。
２１．細胞が、原核細胞である、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
２２．細胞が、真核生物細胞である、実施形態１、６及び１１のいずれか１つに記載の方法。
２３．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２４．哺乳動物細胞が、線維芽細胞である、実施形態２３に記載の方法。
２５．哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、実施形態２３に記載の方法。
２６．哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、実施形態２３に記載の方法。
２７．齧歯動物が、ラット、マウス又はハムスターである、実施形態２６に記載の方法。
２８．真核生物細胞が、多能性細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２９．多能性細胞が、造血幹細胞又は神経幹細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３０．多能性細胞が、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３１．多能性細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３２．第１、第２又は第３  ｇＲＮＡ標的部位が、第１、第２又は第３選択マーカーをコードする第１、第２又は第３核酸のイントロン、エキソン、プロモーター又はプロモーター調節領域に位置している、実施形態１、６及び１１のいずれか１つに記載の方法。
３３．第１、第２又は第３ターゲッティングベクターが、少なくとも約１０ｋｂである、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
３４．第１、第２又は第３挿入核酸が、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲である、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
３５．第１、第２又は第３挿入核酸が、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座のゲノム領域を含む、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
３６．ゲノム領域が、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む、請求項３５に記載の方法。
３７．第１及び第３選択マーカーが同じである、実施形態６に記載の方法。
３８．第１及び第３選択マーカーが同じであり、第２及び第４選択マーカーが同じである、実施形態１１に記載の方法。
３９．第１及び第３  ｇＲＮＡが同じである、実施形態３８に記載の方法。
４０．ｇＲＮＡがハイグロマイシン又はネオマイシン抵抗性遺伝子に特有である実施形態１、６、３７、３８又は３９に記載の方法。
４１．ネオマイシン抵抗性遺伝子に特異的なｇＲＮＡが、配列番号１３、１４、１５又は１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態４０に記載の方法。
４２．ハイグロマイシン抵抗性遺伝子に特異的なｇＲＮＡが、配列番号１７、１８、１９又は２０に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態４０に記載の方法。
４３．ａ）第１  ｇＲＮＡが、配列番号１３、１４、１５又は１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、第２  ｇＲＮＡが、配列番号１７、１８、１９又は２０に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるか、又はｂ）第１  ｇＲＮＡが、配列番号１７、１８、１９又は２０に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、第２  ｇＲＮＡが、配列番号１３、１４、１５又は１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコード化される、実施形態６、３７、３８又は３９に記載の方法。