【手続補正書】
【提出日】平成30年9月10日(2018.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、真核細胞において非天然アミノ酸を所望のタンパク質に組み込むための方法。
ｉ）直交性ｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡのペア、前記所望のタンパク質をコードする所望の核酸配列、及びミュータントｅＲＦ１を発現する真核細胞を用意するステップであって、前記ミュータントｅＲＦ１が、他の終止コドンのリードスルーを実質的に増加させることなく、１個又は２個以上の終止コドンに応答した非天然アミノ酸の組み込みを増加させ、前記ミュータントｅＲＦ１が、配列番号４のヒト野生型ｅＲＦ１配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記ミュータントｅＲＦ１が、
（ｉ）Ｅ５５
（ii）Ｎ１２９、Ｋ１３０
（iii）Ｔ１２２、Ｓ１２３
（iv）Ｙ１２５
（ｖ）Ｔ５８、Ｓ６０、Ｓ６４、Ｙ１２５、Ｎ１２９
（vi）Ｓ１２３、Ｌ１２４、Ｙ１２５
（vii）Ｍ５１、Ｋ１３０
（viii）Ｓ７０、Ｇ７３
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含み、前記所望の核酸配列が、非天然アミノ酸の組み込みのための位置に前記ｔＲＮＡによって認識されるコドンを含む、ステップ；
ii）前記真核細胞を、前記所望の核酸配列によってコードされるタンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸の存在下でインキュベートするステップであって、前記非天然アミノ酸が、前記直交性ｔＲＮＡシンテターゼの基質である、ステップ；並びに
iii）前記真核細胞を、前記直交性ｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡのペアにより前記非天然アミノ酸を前記所望のタンパク質に組み込まれるように、インキュベートするステップ；
【請求項２】
真核細胞において、非天然アミノ酸を所望のタンパク質に組み込むためのミュータントｅＲＦ１の使用であって、前記ミュータントｅＲＦ１が、他の終止コドンのリードスルーを実質的に増加させることなく、１個又は２個以上の終止コドンに応答した非天然アミノ酸の組み込みを増加させ、前記ミュータントｅＲＦ１が、配列番号４のヒト野生型ｅＲＦ１配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記ミュータントｅＲＦ１が、
（ｉ）Ｅ５５
（ii）Ｎ１２９、Ｋ１３０
（iii）Ｔ１２２、Ｓ１２３
（iv）Ｙ１２５
（ｖ）Ｔ５８、Ｓ６０、Ｓ６４、Ｙ１２５、Ｎ１２９
（vi）Ｓ１２３、Ｌ１２４、Ｙ１２５
（vii）Ｍ５１、Ｋ１３０
（viii）Ｓ７０、Ｇ７３
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含む、前記使用。
【請求項３】
所望のポリペプチドをコードする核酸の翻訳による、前記所望のポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みの補助における使用のためのミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、又はそれをコードする核酸であって、前記ミュータントｅＲＦ１が、他の終止コドンのリードスルーを実質的に増加させることなく、１個又は２個以上の終止コドンに応答した非天然アミノ酸の組み込みを増加させ、前記ミュータントｅＲＦ１が、配列番号４のヒト野生型ｅＲＦ１配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記ミュータントｅＲＦ１が、
（ｉ）Ｅ５５
（ii）Ｎ１２９、Ｋ１３０
（iii）Ｔ１２２、Ｓ１２３
（iv）Ｙ１２５
（ｖ）Ｔ５８、Ｓ６０、Ｓ６４、Ｙ１２５、Ｎ１２９
（vi）Ｓ１２３、Ｌ１２４、Ｙ１２５
（vii）Ｍ５１、Ｋ１３０
（viii）Ｓ７０、Ｇ７３
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含み、前記核酸が、前記所望のポリペプチドへの前記非天然アミノ酸の組み込みを指示する直交性コドンを含む、前記ミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、又はそれをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド又は核酸を含む真核生物宿主細胞。
【請求項５】
（ｉ）直交性ｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡのペアと、
（ii）ミュータントｅＲＦ１とを含む、真核生物宿主細胞であって、
前記ミュータントｅＲＦ１が、他の終止コドンのリードスルーを実質的に増加させることなく、１個又は２個以上の終止コドンに応答した非天然アミノ酸の組み込みを増加させ、配列番号４のヒト野生型ｅＲＦ１配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
（ｉ）Ｅ５５
（ii）Ｎ１２９、Ｋ１３０
（iii）Ｔ１２２、Ｓ１２３
（iv）Ｙ１２５
（ｖ）Ｔ５８、Ｓ６０、Ｓ６４、Ｙ１２５、Ｎ１２９
（vi）Ｓ１２３、Ｌ１２４、Ｙ１２５
（vii）Ｍ５１、Ｋ１３０
（viii）Ｓ７０、Ｇ７３
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含み、かつ
前記真核生物宿主細胞が、任意で、
（iii）非天然アミノ酸の組み込みのための位置に前記ｔＲＮＡによって認識されるコドンを含む、所望のタンパク質をコードする所望の核酸配列
を含む、前記真核生物宿主細胞。
【請求項６】
（ｉ）直交性ｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡのペアをコードする核酸と、
（ii）ミュータントｅＲＦ１をコードする核酸とを含む組合せ又はキットであって、
前記ミュータントｅＲＦ１が、他の終止コドンのリードスルーを実質的に増加させることなく、１個又は２個以上の終止コドンに応答した非天然アミノ酸の組み込みを増加させ、配列番号４のヒト野生型ｅＲＦ１配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
（ｉ）Ｅ５５
（ii）Ｎ１２９、Ｋ１３０
（iii）Ｔ１２２、Ｓ１２３
（iv）Ｙ１２５
（ｖ）Ｔ５８、Ｓ６０、Ｓ６４、Ｙ１２５、Ｎ１２９
（vi）Ｓ１２３、Ｌ１２４、Ｙ１２５
（vii）Ｍ５１、Ｋ１３０
（viii）Ｓ７０、Ｇ７３
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含み、かつ
前記組合せ又はキットが、任意で、
（iii）非天然アミノ酸の組み込みのための位置に前記ｔＲＮＡによって認識されるコドンを含む、所望のタンパク質をコードする所望の核酸配列を含む核酸
を含む、前記組合せ又はキット。
【請求項７】
ＢｏｃＫ又はＣｙｐＫ又はＢＣＮＫなどの非天然アミノ酸をさらに含む、請求項５に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項８】
ミュータントｅＲＦ１が、野生型ｅＲＦ１対照と比較して、非天然アミノ酸の組み込みの効率の増加をもたらす、請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、若しくは７に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項９】
ミュータントｅＲＦ１が、
（ｉ）Ｅ５５Ｄ
（ii）Ｎ１２９Ｐ、Ｋ１３０Ｑ
（iii）Ｔ１２２Ｑ、Ｓ１２３Ｆ
（iv）Ｅ５５Ａ
（ｖ）Ｙ１２５Ｆ
（vi）Ｔ５８Ｋ、Ｓ６０Ｔ、Ｓ６４Ｄ、Ｙ１２５Ｆ、Ｎ１２９Ｓ
（vii）Ｓ１２３Ａ、Ｌ１２４Ｉ、Ｙ１２５Ｌ
（viii）Ｓ１２３Ｒ、Ｌ１２４Ｗ、Ｙ１２５Ｒ
（ix）Ｓ１２３Ｈ、Ｌ１２４Ａ、Ｙ１２５Ｇ
（ｘ）Ｍ５１Ａ、Ｋ１３０Ｍ
（xi）Ｓ１２３Ａ、Ｌ１２４Ｌ、Ｙ１２５Ｖ
（xii）Ｓ１２３Ｌ、Ｌ１２４Ｃ、Ｙ１２５Ｓ
（xiii）Ｓ１２３Ｌ、Ｌ１２４Ｓ、Ｙ１２５Ｓ
（xiv）Ｓ１２３Ｖ、Ｌ１２４Ｔ、Ｙ１２５Ｐ
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含む、請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、若しくは７に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項１０】
終止コドンがＴＡＧ（アンバー）であり、かつミュータントｅＲＦ１が、
（ｉ）Ｅ５５Ｄ
（ii）Ｎ１２９Ｐ、Ｋ１３０Ｑ
（iii）Ｅ５５Ａ
（iv）Ｙ１２５Ｆ
（ｖ）Ｔ５８Ｋ、Ｓ６０Ｔ、Ｓ６４Ｄ、Ｙ１２５Ｆ、Ｎ１２９Ｓ
（vi）Ｓ１２３Ａ、Ｌ１２４Ｉ、Ｙ１２５Ｌ
（vii）Ｓ１２３Ｒ、Ｌ１２４Ｗ、Ｙ１２５Ｒ
（viii）Ｓ１２３Ｈ、Ｌ１２４Ａ、Ｙ１２５Ｇ
（ix）Ｍ５１Ａ、Ｋ１３０Ｍ
（ｘ）Ｓ１２３Ａ、Ｌ１２４Ｌ、Ｙ１２５Ｖ
（xi）Ｓ１２３Ｌ、Ｌ１２４Ｃ、Ｙ１２５Ｓ
（xii）Ｓ１２３Ｌ、Ｌ１２４Ｓ、Ｙ１２５Ｓ
（xiii）Ｓ１２３Ｖ、Ｌ１２４Ｔ、Ｙ１２５Ｐ
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含む、請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、若しくは７に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項１１】
終止コドンがＴＧＡ（オパール）であり、かつミュータントｅＲＦ１が、
（ｉ）Ｔ１２２Ｑ、Ｓ１２３Ｆ
（ii）Ｓ７０Ａ、Ｇ７３Ｓ
からなる群から選択される、配列番号４に対する変異又は変異の組合せを含む、請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、若しくは７に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項１２】
真核細胞が哺乳類細胞又は昆虫細胞である、請求項１、８、９、１０、若しくは１１に記載の方法、請求項２、８、９、１０、若しくは１１に記載の使用、請求項３、８、９、１０、若しくは１１に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、７、８、９、１０、若しくは１１に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６、８、９、１０、若しくは１１に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項１３】
コドンが終止コドンであり、任意で前記終止コドンがＵＡＧである、請求項１、８、９、１０、若しくは１１に記載の方法、請求項２、８、９、１０、若しくは１１に記載の使用、請求項３、８、９、１０、若しくは１１に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、７、８、９、１０、若しくは１１に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６、８、９、１０、若しくは１１に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項１４】
直交性ｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡのペアが、ピロリシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｙｌＲＳ）／ＰｙｌＴ  ｔＲＮＡＣＵＡのペアを含む、請求項１、８、９、１０、若しくは１１に記載の方法、請求項２、８、９、１０、若しくは１１に記載の使用、請求項３、８、９、１０、若しくは１１に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、７、８、９、１０、若しくは１１に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６、８、９、１０、若しくは１１に記載の組合せ若しくはキット。
【請求項１５】
ｔＲＮＡが、
（ｉ）ＰｙｌＴのＵ２５Ｃバリアント、又は
（ii）ＰｙｌＴのＯｐｔバリアント、又は
（iii）ＰｙｌＴのＵ２５Ｃ−Ｏｐｔバリアント
である、請求項１、８、９、１０、若しくは１１に記載の方法、請求項２、８、９、１０、若しくは１１に記載の使用、請求項３、８、９、１０、若しくは１１に記載のミュータントｅＲＦ１ポリペプチド、請求項４、５、７、８、９、１０、若しくは１１に記載の真核生物宿主細胞、又は請求項６、８、９、１０、若しくは１１に記載の組合せ若しくはキット。