(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単鎖VH抗体であって、VHドメインからなる抗原結合部位と、免疫グロブリン定常ドメインCL及びCH1とを、N末端からC末端の順に含む：VH-L1-CL-L2-CH1
ここで、L1及びL2は、それぞれ独立してペプチドリンカーであり；及び、
ここで、CLは、βシート接触によりCH1と対になり、それによりCL/CH1ダイマーとなる
ことを特徴とする単鎖VH抗体(scVHAb)。
【請求項２】
CLが、Cκ又はCλのいずれかであり、好ましくはCλが、Cλ1、Cλ2及びCλ3からなる群より選択される、請求項１に記載のscVHAb。
【請求項３】
L1が、3〜40アミノ酸長のアミノ酸配列であり、好ましくは
ａ）任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列；又は
ｂ）VHフレームワーク配列からなり、
及び／又は
L2が、25〜50アミノ酸長のアミノ酸配列であり、好ましくは、任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列からなる
請求項１又は２に記載のscVHAb。
【請求項４】
抗原結合部分のC末端が、ヒンジ領域に融合され、さらに、N末端からC末端の順に少なくともCH2-CH3を含む免疫グロブリン定常ドメインに融合される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のscVHAb。
【請求項５】
請求項４に記載のscVHAbを２つ含む重鎖抗体であって、第１のscVHAbのCH2-CH3ドメインが、第２のscVHAbのCH2-CH3ドメインと対になり、それによってFc領域となる、重鎖抗体(HCAb)。
【請求項６】
医療用である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAb、又は請求項５に記載のHCAb。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAbをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載のHCAbをコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAb、又は請求項５に記載のHCAbを含む抗体のレパートリーであって、多様な抗体(各々が異なる抗原結合部位を特徴とする)を含み、B細胞から抗体をコードする遺伝子をクローニングすることによって、又は種々の哺乳動物形質細胞によって抗体を分泌することによって得ることができる、抗体のレパートリー。
【請求項１０】
形質細胞がげっ歯類起源である、請求項９に記載のレパートリー。
【請求項１１】
形質細胞がマウス起源である、請求項１０に記載のレパートリー。
【請求項１２】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムに、
ａ）VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々を１つ以上含む可変重鎖領域、
ｂ）CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
ｃ）連結領域
を含み、
ａ）、ｂ）及びｃ）の領域が、請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAb又は請求項５に記載のHCAbを発現するように操作及び配置されている、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
前記定常重鎖領域が、さらにCH2及びCH3ドメインをコードするエクソンを含む、請求項１２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
マウス、ラット、ウサギ又はニワトリである、請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
内因性軽鎖遺伝子座カッパもしくはラムダのいずれか、又はその両方の中の特定の遺伝子座もしくは遺伝子を不活性化するか、又は内因性軽鎖遺伝子座カッパもしくはラムダのいずれか、又はその両方を欠失させる機能喪失変異を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、
ａ）非ヒト動物細胞を提供すること；
ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAb、又は請求項５に記載のHCAbをコードするエクソンを含む１つ以上のベクターを提供すること；
ｃ）前記１つ以上のベクターを前記非ヒト動物細胞に導入すること；
ｄ）前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込み、前記エクソンが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある標的部位(前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における第一CH1エクソンの5'側)において、前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること；
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること；
を含む、トランスジェニック非ヒト動物の作製方法。
【請求項１７】
非ヒト動物細胞が、胚性幹細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体を製造する方法であって、
ａ）非ヒト動物において異種免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現すること、この遺伝子座は、
ｉ）VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々を１つ以上含む可変重鎖領域、
ii）CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
iii）連結領域
を含むものであり、
これらの領域は、請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAb、または請求項５に記載のHCAbを発現するように操作及び配置されており、
ここで、前記非ヒト動物は、内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座を発現しない；及び
ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のscVHAb、又は請求項5に記載のHCAbである抗体、又は少なくとも前記scVHAb又は前記HCAbのVHドメインを含む抗体を産生すること
を含む、抗体の製造方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用であって
ａ）scVHAb又はHCAb抗体、又はVHドメインを含むそのフラグメントを産生するため；又は
ｂ）scVHAb又はHCAb抗体、又はVHドメインを含むそのフラグメントのナイーブライブラリー、又は前記ナイーブライブラリーをコード又は発現する核酸配列のライブラリーを作るため
の使用。
【請求項２０】
前記scVHAb又はHCAb抗体に含まれる前記VHドメイン、又はそのフラグメントを含む抗体を産生することをさらに含む、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単鎖VH抗体(scVHAb)構築物、そのような構築物を含む重鎖のみの抗体、及びインビトロ及びインビボでのその産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、（ｉ）多様な分子形態の抗原を標的とすることができる優れた結合特性を示すこと、（ii）治療されたヒト及び動物においてそれらを十分に耐容性とする望ましい薬物動態を有する生理学的分子であること、及び（iii）感染性物質を自然に防御する強力な免疫学的特性に関連することから、重要な生物学的医薬品として現れた。さらに、実験動物から抗体を迅速に単離するための確立された技術が存在し、これは、体内に天然に存在しない実質的な異物に対する特異的抗体応答を速やかに開始可能にする。
【０００３】
それらの最も基本的な形態において、抗体は、各々が同一の軽(L)鎖と対になっている２つの同一の重(H)鎖から構成される。H鎖及びL鎖の両方のN末端は、可変ドメイン(それぞれ、VH及びVL)からなり、これは一緒になって固有の抗原結合特異性を有する一対のH-L鎖を提供する。抗体VH及びVLドメインをコードするエクソンは、生殖系列DNAには存在しない。その代わりに、各VHエクソンは、H鎖遺伝子座(Igh)に存在する無作為に選択されたV、D、及びJ遺伝子セグメントの組換えによって生成される；同様に、個々のVLエクソンは、軽鎖遺伝子座(Igl)における無作為に選択されたV及びJ遺伝子セグメントの染色体再配列によって生成される(図１のマウスIgh遺伝子座、Iglκ遺伝子座(Igk又はIgκ)及びIgλ遺伝子座(Igl又はIgλ)の概略を参照のこと)(Tonegawa, Nature, 302:575, 1983； Bassing, et al., Cell, 109 Suppl:S45, 2002)。マウスゲノムは、H鎖を発現することができる２つの対立遺伝子(各親からの１つの対立遺伝子)、カッパ(κ)L鎖を発現することができる２つの対立遺伝子、及びラムダ(λ)L鎖を発現することができる２つの対立遺伝子を含む。H鎖遺伝子座には複数のV、D、及びJ遺伝子セグメントが存在し、両方のL鎖遺伝子座には複数のV及びJ遺伝子が存在する。各免疫グロブリン(Ig)遺伝子座におけるJ遺伝子の下流には、抗体の定常領域(C)をコードする１つ以上のエクソンが存在する。重鎖遺伝子座には、異なる抗体クラス(アイソタイプ)の発現のためのエクソンも存在する。マウスにおいて、コードされるアイソタイプはIgM、IgD、IgG1、IgG2a/c、IgG2b、IgG3、IgE、及びIgAであり；ヒトにおいて、それらはIgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1、及びIgA2である。
【０００４】
B細胞発生の間、遺伝子再構成は、H鎖V、D、及びJ遺伝子セグメントを含む２つの相同染色体のうちの１つで最初に起こる。次いで、プレB細胞において、得られたVHエクソンを、RNAレベルで、μH鎖の定常領域をコードするエクソンにスプライシングする。プレB細胞によって合成されたμH鎖の大部分は、小胞体(ER)で保持され、μH鎖の部分的にアンフォールドのCH1ドメインと、常在性ERシャペロンBiPとの間の非共有結合性相互作用のために最終的に分解される(Haas and Wabl, Nature, 306:387-9, 1983; Bole, et al., J Cell Biol. 102:1558, 1986)。しかし、μ鎖の小フラクションは、不変λ5及びVpreBタンパク質から構成される代替軽鎖複合体と会合し、BiPを置換し、μH鎖/λ5/VpreB複合体が、Igα/βシグナル伝達分子と共に、プレB細胞受容体(preBCR)としてERを出ること、分泌経路を通って原形質膜に輸送されることを可能にする(Ubelhart, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393:3, 2016)。
【０００５】
その後、VJ再配列は、機能的L鎖が産生されるまで、一度に１つのL鎖対立遺伝子上で起こり、その後、L鎖ポリペプチドはBiPを完全に置換し、μH鎖と会合して、抗原に対する完全に機能的なB細胞受容体(BCR)を形成することができる。
【０００６】
細胞表面発現又は不完全にアセンブルされたIg分子の分泌を妨げるER品質制御機構は、非常にストリンジェントであり、したがって、HL、HHL、又はHHなどの分子は、通常、ER中に保持され、完全なH2L2構造への組立によって救済されない場合、分解される。(前記システムは、主に、IgH鎖の保持に特化している；ゆえに遊離L鎖がしばしば分泌されうる)。しかし、遊離モノクローナルH鎖は重鎖疾患(HCD)と呼ばれる稀なB細胞増殖性障害において分泌され得ることが数十年にわたって知られている(Franklin, et al., Am. J. Med., 37:332, 1964)。HCDにおいて H鎖は切断され、その後の構造研究は、CH1ドメインがほとんど常に欠失していることを示した(Corcos, et al., Blood, 117:6991, 2011)。機械的には、CH1欠失が、H鎖をBiPとのその拘束性相互作用から解放し、したがって、その分泌を可能にし、また、L鎖とのジスルフィド結合媒介共有結合性会合を妨げ、そのため、HCDタンパク質はHH二量体である。重鎖のみのAb(HCAb)もまた、非疾患の状況において見出され得る。ｉ）正常なラクダにおける血清IgGの約75%は、HCAbからなり、これはCH1ドメインを欠き、VLドメインとの有効な会合を妨げる構造的に改変されたVHドメインも有する(de los Rios, et al., Cur. Opin. Struct. Biol., 33:27, 2015)。ii）κ及びλL鎖遺伝子座の両方が不活性化されているマウスは、依然として血清IgGを産生するが、この抗体の産生は、B細胞DNAにおいてCH1ドメインをコードするエクソンの欠失をもたらすクラススイッチ組換え(CSR)におけるエラーを必要とする(Zou, et al., J. Exp. Med., 204:3271, 2007)。
【０００７】
HCAbは安定性が高く、従来の免疫グロブリンよりも小さいため、治療薬として魅力的である。分子のVH抗原結合部分は、VL抗原結合部分によって妨害されず、酵素活性部位及びウイルス上のエピトープを含む、タンパク質構造のポケット内のエピトープ、及びG共役タンパク質受容体を認識することができる(さもなければ、従来のAbに接近不可能である)。例えば、内因性VH遺伝子がラクダVH遺伝子によって置換され、CH1をコードするエクソンが欠失しているマウスに由来するラクダ系HCAbは、このような抗体の潜在的な供給源である。しかし、これらは、ラクダVHドメインが、治療薬として使用され得るヒト及び他の動物において免疫原性であるという欠点を有する。内因性VH遺伝子が人間の対応物によって置き換えられたマウスが存在し、κ及びλL鎖遺伝子座の不活性化と組み合わせることで、HCAbのソースとなりうる。しかし、このような抗体の産生は、免疫応答の間のCSRにおける比較的まれなエラーに依存し、したがって、効率的ではない。
【０００８】
WO 2014/141192 A2は、重鎖のみの抗体の生成、及びそれを産生するトランスジェニック非ヒト動物を開示する。このような抗体は、CHドメインを欠く。
US 8754287 B2は、CH1ドメインを欠く重鎖抗体を産生するマウス、及びCH1ドメインをコードする核酸を欠失させる生殖系列修飾を含むトランスジェニックマウスを開示する。
VJCLノックアウトニワトリにおける関連軽鎖を有さない重鎖のみの抗体の発現が、Schusserらによって記載される(Eur. J. Immunol., 46:2137, 2016)。
Kleinら(Biochemistry,18:1473,1979)は、軽鎖の単離された可変ドメイン及び定常ドメインと、免疫グロブリンGのFd'フラグメントとの相互作用を記載する。
【０００９】
診断的及び治療的使用のためのHCAb抗体を産生するための効率的かつコスト効率の良い方法が必要とされている。より詳細には、抗原特異的HCAbを産生することができる、小さく、迅速に繁殖する動物が必要とされている。このような動物は、H鎖のみのモノクローナル抗体の大規模な産生が可能なハイブリドーマを作製するために有用である。
前述の目的に従って、HCAbを産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【発明の概要】
【００１０】
この発明の概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される概念の選択を簡略化された形態で紹介するために提供される。この発明の概要は、特許請求される主題の重要な又は本質的な特徴を識別することを意図するものではなく、特許請求される主題の範囲を限定するために使用されることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に示され、添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１１】
本発明の目的は、トランスジェニック動物又はインビトロ細胞培養物のいずれかにおいて容易に産生できる抗体構築物を提供することである。
この目的は、本特許請求の範囲の主題によって解決され、及び本明細書にさらに記載されるようにして解決される。
【００１２】
本発明によれば、VHドメインからなる抗原結合部分、及び免疫グロブリン定常ドメインCL及びCH1を、N末端からC末端の順に含む単鎖VH抗体(scVHAb)が提供される：VH-L1-CL-L2-CH1(ここで、L1及びL2はそれぞれ独立して、ペプチドリンカーであり；ここで、CLはβシート接触を介してCH1と対になり、それによって、CL/CH1ダイマーが得られる)。
【００１３】
具体的には、CLはCκ又はCλのいずれかであり、好ましくはCλは、Cλ1、Cλ2及びCλ3からなる群より選択され、特に、図１６に示されるようなヒト配列を含む。さらなる特定の実施形態によれば、CλはCλ6及びCλ7からなる群より選択され、特に、図１６に示されるようなヒト配列を含む。
【００１４】
マウスにおいて抗体を産生する場合、H鎖及びL鎖の定常領域は、マウス免疫系とより良好に相互作用するために、典型的にはマウス起源である(例えば、CH1、及びCλ1、Cλ2又はCλ3配列のいずれか１つを含む)。それぞれのマウス抗体の単離後、C領域は容易に、例えば、ヒトCH1、及び/又は、ヒトCλ1、Cλ2、Cλ3、Cλ6又はCλ7配列のいずれか１つを含むように、ヒト化することができる。
【００１５】
具体的には、CL/CH1ダイマーは、一対のドメインを形成するような抗体ドメインの会合によって形成される。
【００１６】
具体的には、CLドメインのCH1ドメインへの会合は、共有結合を介する(例えば、リンカーL2を使用して、CLドメインのC末端をC-N結合を介してCH1ドメインのN末端に連結することによる)。具体的には、CL/CH1ダイマーのコンフォメーションが、アミノ酸の側鎖の相互作用によって、例えば、βシートのβストランド間の連結界面を介してさらに安定化され、任意で、１つ又は複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。
【００１７】
具体的には、CL/CH1ダイマーは、少なくとも１つのドメイン間ジスルフィド結合を含む。具体的には、少なくとも１つのドメイン間ジスルフィド結合は、CL及びCH1ドメインそれぞれの最もC末端寄りのシステインを還元して、ジスルフィド結合の形成を可能にすることによって形成される。
【００１８】
具体的には、VHドメインのC末端が、C-N結合を介してCLドメインのN末端に共有結合され、任意でリンカーL1を使用して、この領域に追加の柔軟性を提供する。
【００１９】
具体的には、CL/CH1ドメインのペアは、少なくとも１つのドメイン間ジスルフィド結合によって、好ましくは、Cκ中のCys107(UniProtKB-P01837)、又はCλ1中のCys105(UniProtKB-A0A0G2JE99)、又はCλ2中のCys103(UniProtKB-P01844)、又はCλ3中のCys103(UniProtKB-P01845)を、関連CH1中のCys102(UniProtKB-P01868)に連結するジスルフィド架橋によって、さらに安定化される。scVHAb中のCL/CH1のペアを安定化する任意のこのようなドメイン間ジスルフィド架橋は、本明細書において、ドメイン間、鎖内ジスルフィド架橋として理解される。新しいCys残基又は任意の他のチオール形成アミノ酸又はアミノ酸類似体を、ある位置に導入し、酸化反応によりそれらから追加のS-S架橋を形成することによって、追加のジスルフィド架橋を設計してもよい。
【００２０】
scVHAbは、Fab断片に類似して(VHがCH1ドメインの代わりにCLドメインに連結され、CH1及びCLドメインがさらに単鎖リンカーによって連結されていることを除いて)配置されたVH、CL及びCH1抗体ドメインの配置によって特に特徴付けられる。それにより、CLドメインは抗体重鎖の一部である。scVHAbは、軽鎖を欠如していること、とりわけVLドメインがないことを特に特徴とする。
例示的なscVHAbの構造を図２Ａに示す。
【００２１】
リンカーは、酸性リンカー、塩基性リンカー、及び構造モチーフ、又はそれらの組み合わせを含み得る。
特定の態様によれば、L1及びL2のいずれか１つ又は両方は、人工ペプチド、好ましくはグリシン及び/又はセリンリッチリンカーである。
【００２２】
さらなる特定の態様によれば、L1及びL2のいずれか１つ又は両方は、天然抗体配列、特に抗体ドメインのアミノ末端配列又はカルボキシ末端配列、又はヒンジ領域の一部を含むか、又はそれらからなる。
【００２３】
具体的には、L1は3〜40アミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーであり、好ましくは
a）任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列；又は
b）VHフレームワーク配列からなる。
【００２４】
特定の実施形態によれば、scVHAbはリンカーL1を含まない。このようなscVHAbは、CLドメインに直接連結又は共有結合しているVHドメインを含む(すなわち、VH-CL-L2-CH1)。
具体的には、L1は複数のグリシン及びセリン残基を含むか、又は3、4、5、6、7、8、9、10、40までの連続アミノ酸の少なくともいずれか、又は代替アミノ酸を含む同じ長さのペプチドからなる。
【００２５】
具体的には、L2は、CL/CH1ドメインのペアを連結するためのテザー(tether)として使用されるペプチドリンカーである。例示的なL2リンカーは、20〜250、好ましくは40〜225、又は60〜225アミノ酸長のアミノ酸配列からなり、好ましくは任意の組合せのグリシン及び/又はセリン及び/又はアルギニンの配列からなる。例示的なL2リンカーは、(GGAGGAGGGGGGTCC[配列番号１１])n(ここで、n＝4〜16)のような配列の反復を特徴とする。
【００２６】
特定の場合において、L2は15〜90、具体的には20〜80、より具体的には25〜50又は25〜40アミノ酸長のアミノ酸配列であり、好ましくは、任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列からなる。具体的には、L2は、複数のグリシン及びセリン残基を含むか、又は20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、80までの連続アミノ酸の少なくともいずれか、又は代替アミノ酸を含む同じ長さのペプチドからなる。
【００２７】
具体的には本明細書に記載されるペプチドリンカーは、セリン及びグリシンに富むアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、好ましくはアミノ酸のそれぞれがセリン又はグリシンであり、より好ましくはペプチドリンカーは、セリン及びグリシン残基の反復からなり、例えば、(GlyGlyGlyGlySer[配列番号３５])n(n＝2〜16)である。典型的には、ドメインのβシート領域における接触表面を支持するように対になったCL/CH1ドメインの構造を安定化するために、6〜10回の反復が使用される。
【００２８】
例えば、以下の配列のいずれかが、ペプチドリンカーL1として適切に使用される：(GlyGlyGlyGlySer[配列番号３５])n(n＝1〜8)。
例えば、以下の配列のいずれかが、ペプチドリンカーL2として適切に使用される:(GlyGlyGlyGlySer[配列番号３５])n(n＝4〜16)。
具体的には、VHは、VH-CDR配列の親和性成熟抗原結合部位又はナイーブコンフォメーションを含む。
【００２９】
抗原結合部分は、特に、VHドメインの３つのCDRループ、すなわち、VH-CDR1、VH-CDR2、及びVH-CDR3を含むか、又はそれらからなる。抗原結合部分は、１つ以上のCDRループの変異によって親和性成熟されることができ、それによって、標的抗原との結合の親和性を最適化又は増加させる。このような変異は、親和性成熟抗原結合部位を得るために、CDR配列のいずれか又は各々における１つ以上の点変異、例えば、1、2、3又はそれ以上の点変異によって、例えば、インビボ処理によって、又はインビトロ突然変異誘発技術によって得ることができる。
【００３０】
トランスジェニック非ヒト動物によって産生される抗体は、自然又は天然の抗体として一般に理解される。このような天然抗体は、ナイーブレパートリーに由来してもよく、又はインビボでの親和性成熟を経て、特定の標的抗原に結合する高親和性抗体となってもよい(例えば、10-7M未満のKDを有する、例えば、10-7と10-10Mの間）。
【００３１】
ランダム突然変異誘発及び/又はライブラリー技術を使用するような、インビトロ突然変異誘発法によって産生される親和性成熟抗体は、さらに高い親和性をもたらすことができる(例えば、10-8M未満のKDを有する、例えば、10-11M未満）。
【００３２】
自然抗体は、VH-CDR配列の天然コンフォメーションによって特徴づけられる。このような天然コンフォメーションは、抗原結合部位の天然に存在する一次構造、及び/又は全長VHドメインの天然に存在する一次構造によって特徴付けられる。
【００３３】
VHドメインの天然のコンフォメーションは、例えば、親VHドメインのCDR配列を変異させることにより、又は親VHドメインの変異体を産生することによって、人工抗体ディスプレイシステム、及び人工抗体配列を含む個別のライブラリー(適切な抗体を産生するために選択することができる)を使用して、インビボで産生することができる。
【００３４】
特定の態様によれば、scVHAbの抗原結合部分のC末端は、ヒンジ領域の有無にかかわらず、さらなる免疫グロブリン定常ドメインに融合される。
【００３５】
具体的には、さらなる免疫グロブリンドメインは、N末端からC末端の順に、少なくともCH2-CH3を含む。
【００３６】
具体的には、単鎖構築物は、N末端からC末端の順に、VH-L1-CL-L2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3からなる伸長scVHAbを含む。
【００３７】
本発明はさらに、２つの伸長scVHAbを含む重鎖抗体(HCAb)を提供し、ここで、第１の伸長scVHAbのCH2-CH3ドメインは、第２の伸長scVHAbのCH2-CH3ドメインと対になり、それによってFc領域を得る。
【００３８】
本明細書中に記載されるFc領域は特に、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含む。したがって、「Fc領域」は、IgA、IgD、及びIgGの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインに対する柔軟なヒンジN末端、ならびにIgE及びIgMの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指す。IgGでは、Fcは、免疫グロブリンドメインCH2及びCH3(Cγ2及びCγ3)を含み、ならびにCH1(Cγ1)とCH2(Cγ2)との間のヒンジを含む。Fc領域はまた、それぞれの天然に存在する抗体ドメインの人工変異体(例えば、前記天然に存在する抗体ドメインに対して少なくとも90％の配列同一性を有する)の形態のCH2又はCH3ドメインを含んでもよい。
【００３９】
特に、本明細書に記載されるFc領域は、抗体重鎖(HC)の一部であるCH2及びCH3ドメインのダイマーを含むか、又はそれらからなり、ここで、第１HCのCH2ドメインは、第２HCのCH2と対になり、第１HCのCH3ドメインは、第２HCのCH3と対になる。このようなダイマーは、ホモダイマー(すなわち、同じアミノ酸配列の２つのCH2-CH3ドメイン鎖から構成される)であってもよく、又はヘテロダイマー(すなわち、２つのCH2-CH3ドメイン鎖から構成され、ここで、各々は異なるアミノ酸配列を有する、例えば、Fcを安定化するための異なるCH3アミノ酸配列を有する)であってもよい。
【００４０】
具体的には、ヒンジ領域は、CH1ドメインのC末端をCH2ドメインのN末端に連結する抗体重鎖ヒンジ領域に由来する。あるいは、ほぼ同じ長さの任意の他の天然又は人工リンカーを使用することができる。適切なヒンジ領域は、天然のIgG又はIgA重鎖ヒンジ領域(配列番号２２〜３３)、又は同じ長さ＋/−1又は2アミノ酸のその機能的変異体であり、これらは、任意に、１つ以上５つ以下の点変異を含む。
【００４１】
例えば、マウス抗体に由来するヒンジ領域を使用してもよい。例えば、IgG1(配列番号２８)、IgG2a(配列番号２９)、IgG2b(配列番号３０)、IgG2c(配列番号３１)、IgG3(配列番号３２)、又はIgA(配列番号３３)。
【００４２】
あるいは、ヒトのヒンジ領域が適切に使用される。例えば、IgG1(配列番号２２)、IgG2(配列番号２３)、IgG3(配列番号２４)、IgG4(配列番号２５)、IgA1(配列番号２６)、又はIgA2(配列番号２７)。
【００４３】
ヒンジ領域は、典型的にはHCAb中にジスルフィド架橋を生成するための１つ以上のシステイン残基を含む。具体的には、IgG1のマウス重鎖ヒンジ領域が使用される場合、HCAbは、Cys104、Cys107及びCys109にて、２つのヒンジ領域間の鎖間ジスルフィド架橋を含む(UniProtKB-P01868)。
【００４４】
具体的には、第１及び第２の伸長scVHAbは、以下の抗体ドメイン及び連結配列: VH-L1-CL-L2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3(N末端からC末端の順に)からなる単鎖構築物である。
例示的なHCAbの構造を、図２Bに示す。
【００４５】
HCAb中の第１及び第２の伸長scVHAbは、同一又は異なるアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、第１の伸長scVHAbは第１のVHを含み、第２の伸長scVHAbは第２のVHを含む。第１及び第２のVHは、同じ又は異なる抗原結合部位(例えば、２つの異なる標的抗原を特異的に認識する)を含んでもよい。従って、HCAbは、単一特異性かつ二価、又は二重特異性かつ一価であり得る。
【００４６】
scVHAb又はHCAbを産生する場合、選択されたドメイン及び/又はヒンジ領域は、ヒト又は非ヒト動物起源である。例えば、トランスジェニックマウスにおいて、scVHAb又はHCAbは、好ましくは以下の１つ以上を使用して産生される：
scVHAbの場合はVH-CL-L2-CH1、HCAbの場合はVH-CL-L2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3。これらの場合におけるVHエクソンは、プレB細胞における重鎖遺伝子座でのVDJ再構成の間に形成され、そして個々のB細胞において異なる。例えば、他のエレメントのヌクレオチド配列は、以下の通りである：CL[Cκ(配列番号１０)、Cλ1(配列番号３６)、Cλ2(配列番号３７)、又はCλ3(配列番号３８)]、L2(配列番号１１として同定される配列の4〜16反復配列)、CH1(配列番号１２)、ヒンジ(配列番号１４)、CH2(配列番号１５)、及びCH3(配列番号１６)。
【００４７】
CL、CH1、CH2、又はCH3抗体ドメインをコードする核酸配列は、それぞれマウス起源のものである。本明細書に記載される抗体は、他の種のそれぞれの配列の１つ以上を用いて調製できることが十分に理解される。前記配列は、例えば、非マウス動物又はヒト起源のもの、又はそれらの任意の組合せを含み、例えば、それぞれのヒト抗体ドメインをコードするヒト核酸配列、例えば、以下のようなアミノ酸配列を含む抗体ドメインを含む：CL[例えば、配列番号３９を有するCκ、配列番号４０を有するCλ1、配列番号４１を有するCλ2、配列番号４２を有するCλ3、配列番号４３を有するCλ6、又は配列番号４４を有するCλ7]、配列番号４５を有するIGHG1 CH1、配列番号４６を有するIGHG1 CH2、及び配列番号４７を有するIGHG1 CH3。
【００４８】
ヒト抗体ドメインの配列のいずれも例示にすぎないことが十分に理解される。あるいは、それぞれの異なる対立遺伝子のヒト抗体ドメインの配列を使用することができる。
【００４９】
抗体ドメインをコードする動物又はヒト起源のヌクレオチド配列、又は動物あるいはヒトアミノ酸配列の代わりに、改変(人工)ヌクレオチド配列及びそれぞれのアミノ酸配列、例えば、少なくとも80％又は少なくとも90％の配列同一性を有するそれぞれの配列を使用することができるが、ただし、それぞれの抗体ドメインは、機能的であり、本明細書に記載されるように、それぞれの抗体構造内で対をなし且つ連結される。
【００５０】
特定の態様によれば、本明細書に記載のscVHAb又は本明細書に記載のHCAbは、可溶性の形態、例えば、医薬調製物に適切に使用される濃度の水溶性形態で提供される。特に、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるscVHAb又は本明細書中に記載されるHCAbを単離された形態(例えば、これを産生する動物の血清又は血液画分から単離されるか、又は細胞培養画分から単離される)で含む可溶性調製物である。
【００５１】
特定の態様によれば、本発明は、医学的使用のための、本明細書に記載のscVHAb又は本明細書に記載のHCAbを提供する。医学的使用は、ヒトの治療又は獣医学的使用を包含する。
【００５２】
したがって、本発明は、疾患の予防又は治療のために、被験体、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物を治療する方法であって、有効量の前記scVHAb又はHCAbを前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００５３】
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載のscVHAbをコードする核酸分子を提供する。
別の特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載のHCAbをコードする核酸分子を提供する。
【００５４】
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載されるscVHAb又は本明細書に記載されるHCAbを含む抗体のレパートリーを提供し、このレパートリーは、それぞれが同じ標的抗原を特異的に認識する多様な抗体を含む。このようなレパートリーは、同じ抗体タイプ又は構造の抗体ライブラリーとして理解され、ここで、抗体はそれらの抗原結合部位において異なる(例えば、同じエピトープを認識する親抗体の抗体変異体、例えば親和性成熟又は他の方法で最適化された抗体変異体など；又は標的抗原を特異的に認識するが、そのような標的抗原の異なるエピトープを認識する抗体を産生する)。
【００５５】
このようなレパートリーは、適切にスクリーニング可能であり、そして個々のライブラリーメンバーは、抗体産物を産生するために、所望の構造的又は機能的特性に従って選択されることができる。
【００５６】
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載のscVHAb又は本明細書に記載のHCAbを含む抗体のレパートリーを提供し、このレパートリーは、異なる標的抗原を認識する多様な抗体を含む。このようなレパートリーは、多くの異なる標的抗原(各々が複数のエピトープを有する)を有するウイルス又は細菌のような複合多成分抗原による免疫化によって得られる。
【００５７】
特定の実施形態によれば、前記レパートリーは、プレ免疫レパートリーとも呼ばれる抗体のナイーブなライブラリーとして理解され、これは、それらの生成部位である骨髄から最近出てきた、成熟しているが抗原未経験のB細胞によって発現される。
【００５８】
本明細書に記載の抗体のレパートリーは、少なくとも102の抗体、好ましくは少なくとも105、106、又は107のいずれかの抗体(それぞれが異なる抗原結合部位を特徴とする)を包含する多様性によって、特に特徴付けられる。
【００５９】
特定の態様によれば、本明細書に記載されるレパートリーが提供され、ここで、
ａ）該抗体をコードする遺伝子は、非免疫又は免疫化マウスのB細胞に由来するか、又は
ｂ）該抗体は、哺乳動物形質細胞、好ましくはげっ歯類起源、特にマウス起源のものによって分泌される。
【００６０】
具体的には、前記レパートリーは、それをコードする遺伝子をB細胞からクローニングすることによって、又は種々の哺乳動物形質細胞によって抗体を分泌することによって得ることができる。具体的には、哺乳動物形質細胞によって分泌される抗体は、哺乳動物形質細胞起源の種に特徴的な糖鎖付加パターンによって特徴付けられる。ほとんどの生理学的抗体アイソタイプは、H2L2の二量体として分泌されるが、IgAは高次の二量体又は三量体である(H2L2)2及び(H2L2)3として分泌され、IgMは五量体(H2L2)5又は六量体(H2L2)6として分泌される。しかしながら、注目すべきことに、本明細書中に記載されるHCAbはL鎖を含まない。
【００６１】
したがって、本発明はさらに、本明細書に記載される抗体を産生する方法、特に、そのような抗体を発現及び分泌する哺乳動物形質細胞を操作することによって、本明細書に記載される抗体のレパートリーを産生する方法を提供する。
【００６２】
具体的には、哺乳動物形質細胞は、非ヒト動物起源、例えば、哺乳動物、脊椎動物起源、特に、げっ歯類(例えば、マウス又はラット)；又はウサギ、又は鳥類起源(例えば、ニワトリ)である。具体的には、哺乳動物形質細胞はげっ歯類、好ましくはマウスに由来する。
【００６３】
特定の局面によれば、本発明は、以下のものを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する：
ａ）VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々の１つ以上を含む可変重鎖領域、
ｂ）CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
ｃ）連結領域
これらの領域は、本明細書中に記載されるscVHAb又は本明細書中に記載されるHCAbを発現するように操作される。
【００６４】
具体的には、前記領域は、L1-CL部分及びL2をコードするエクソンが、CH1ドメインをコードするエクソンの5'に挿入されるように、前記遺伝子座内に位置する。
具体的には、定常重鎖領域は、CH2及びCH3ドメインをコードするエクソンをさらに含む。
具体的には、前記遺伝子座は、動物に由来する組換え遺伝子座であり、少なくとも１つの外因性エレメント、例えば、前記遺伝子座の調節エレメントと天然には関連しない１つ以上の外因性重鎖領域をさらに含む。
【００６５】
具体的には、発現ベクターが使用され、宿主細胞のトランスフェクション時に宿主細胞ゲノムとの組換え、そして生産的VDJ再構成に続いて、コードされた抗体が発現され、そして原形質膜に挿入され、及び/又は、宿主細胞によって分泌される。具体的にはベクターは、抗体コード配列に作動可能に連結されたプロモーターのような、１つ以上の外因性又は異種の調節エレメントを含み、この調節エレメントは前記抗体コード配列と天然には関連しない。
【００６６】
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の遺伝子座を含む組換え宿主細胞を提供する。
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の遺伝子座でトランスフェクトされた宿主細胞、又は本明細書に記載のベクターを提供する。
【００６７】
具体的には、宿主細胞は、非機能性内因性κ軽鎖遺伝子座、及び非機能性内因性λ軽鎖遺伝子座を含む。軽鎖遺伝子座は非機能的遺伝子座であり、例えば、機能喪失のために改変されるか、又は完全に欠失される。
【００６８】
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。具体的には、トランスジェニック非ヒト動物は、哺乳動物、例えば脊椎動物、特にげっ歯類、例えばマウス又はラット；又はウサギ、又は鳥類、例えばニワトリである。
好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、げっ歯類、好ましくはマウスである。
【００６９】
具体的には、トランスジェニック非ヒト動物は鳥類であり、この動物は原始生殖細胞を用いて産生される。従って、本明細書に記載される方法は、導入された抗体コード領域を含む原始生殖細胞を単離すること、及び前記生殖細胞を使用して、置換された免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することをさらに含むことができる。
【００７０】
具体的には、本明細書に記載されるトランスジェニック非ヒト動物は、内因性軽鎖遺伝子座、κもしくはλ、又はその両方のいずれかの中に、機能喪失突然変異(例えば、サイレンシング突然変異、又は特定の遺伝子座もしくは遺伝子を不活性化する突然変異を含む)を含むか、又はその欠失を含む。
【００７１】
具体的には、トランスジェニック非ヒト動物は、改変免疫グロブリン対立遺伝子又は他の導入遺伝子をそれらのゲノム中に保有する。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリン領域をさらに含む。例えば、内因性マウス免疫グロブリン領域をヒト免疫グロブリン配列で置換して、薬物発見目的のための部分的又は完全ヒト抗体を作製するための多くの方法が開発されている。そのようなマウスの例としては、例えば、以下に記載されているものが挙げられる。米国特許第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号；及び第5,591,669号。
【００７３】
特に好ましい態様において、本発明のトランスジェニック動物は、WablとKilleenによる米国特許出願公開第2013/0219535号に記載されるようなキメラ免疫グロブリンセグメントを含む。このようなトランスジェニック動物は、導入された部分ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、導入された領域は、ヒト可変領域コード配列、及び非ヒト脊椎動物の内因性ゲノムに基づく非コード調節配列を含む。好ましくは、本発明のトランスジェニック細胞及び動物は、内因性免疫グロブリン領域の一部又は全部が除去されたゲノムを有する。
【００７４】
別の好ましい態様において、動物のゲノム内容物は、WO 2017/035252 A1に記載されるように、それらのB細胞が、細胞あたり２つ以上の機能的VHドメインを発現し得るように改変される(すなわち、細胞は、二重特異性抗体を産生する)。
【００７５】
特定の態様によれば、本発明は、以下を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法を提供する:
ａ）非ヒト動物細胞を提供すること；
ｂ）本明細書に記載のscVHAb又はHCAbをコードするエクソンを含む１つ以上のベクターを提供すること；
ｃ）前記非ヒト動物細胞へ前記１つ以上のベクターを導入すること；
ｄ）前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込むこと、及び、前記エクソンが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある標的部位(前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における第一CHエクソンの5'側)で、前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること；及び
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること。
【００７６】
具体的には、トランスジェニック非ヒト動物は、本明細書に記載のscVHAb又はHCAbを発現する。具体的には、トランスジェニック非ヒト動物は、重鎖抗体のみを発現し、及び/又はVLドメインを含む抗体構築物を発現しない。
【００７７】
具体的には、マーカーは、細胞ゲノムへの前記エクソンの成功した組み込みを示すために使用される。具体的には、マーカーは、宿主において発現することができる選択マーカーであり、導入された核酸又はベクターを含む宿主の選択を容易にする。
【００７８】
選択マーカーの例としては、例えば、抗菌剤(例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール)に対する耐性を付与するタンパク質、宿主細胞に栄養的利点などの代謝的利点を付与するタンパク質、ならびに細胞に機能的又は表現型的利点(例えば、細胞分裂)を付与するタンパク質が挙げられる。
【００７９】
具体的には、ベクターは、真核細胞に核酸配列を取り込むことができる手段によって、コード核酸配列が細胞に挿入されるように導入され、ここで、前記核酸配列は細胞中に一過性に存在してもよく、又は細胞のゲノム(特に染色体)中に取り込まれてもよく、又は安定に組み込まれてもよい。
【００８０】
具体的には、前記エクソンは、標的組換えの任意の方法によって、例えば、相同組換えによって、又は部位特異的組換え技術によって、標的部位で前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれる。具体的には、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを標的組換えに使用することができる(He, et al., Nuc. Acids Res., 44:e85, 2016)。
【００８１】
具体的には、前記非ヒト動物細胞は、前記非ヒト動物の胚幹(ES)細胞である。１つの態様において、内因性免疫グロブリン遺伝子の置換のために利用される宿主細胞はES細胞であり、これは、次いで、トランスジェニック哺乳動物を作製するために利用される。従って、本明細書中に記載される特定の方法は、導入された抗体コード領域を含むES細胞を単離すること、及び該ES細胞を使用して、改変された又は置換された免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を作製することをさらに含み得る。
【００８２】
特定の実施形態によれば、以下を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法が提供される:
ａ）非ヒト動物細胞を提供し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一CHエクソンの5'側の位置に、部位特異的リコンビナーゼの認識配列が隣接するリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)標的部位を組み込むこと；
ｂ）本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbをコードするエクソンを含む１つ以上のベクターを提供すること、このエクソンは、部位特異的リコンビナーゼのさらなる認識部位と、細胞ゲノムへのベクターの標的化組み込みを選択するための１つ以上のマーカーとに隣接し、ここで、前記さらなる認識部位は、前記RMCE標的部位と組換え可能である；
ｃ）前記１つ以上のベクターと、前記RMCE標的部位及びさらなる認識部位を認識する部位特異的リコンビナーゼとを、前記非ヒト動物細胞へ導入すること；
ｄ）前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込み、前記RMCE標的部位で前記エクソンが前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること；及び
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること。
【００８３】
具体的には、部位特異的リコンビナーゼの前記認識部位のいずれかは、リコンビナーゼ認識部位(例えば、Cre/lox、Flp-FRTなど)であり、ここで、前記リコンビナーゼは、その認識部位の２つの間のDNA配列を切り出すことができる。
【００８４】
別の特定の実施形態によれば、トランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法が提供され、この方法は、以下を含む；
ａ）内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一CHエクソンの5'側標的部位を含む非ヒト動物細胞を提供すること；
ｂ）本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbをコードするエクソン(このエクソンは、前記標的部位に相同なDNA配列に隣接する)、及び、細胞ゲノムへのベクターの標的化相同組換えを選択するための１つ以上のマーカーを含む１つ以上のベクターを提供すること；
ｃ）前記非ヒト動物細胞へ前記１つ以上のベクターを導入すること；
ｄ）前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込み、前記標的部位で前記エクソンが前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること；及び
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること。
【００８５】
具体的には、相同性ターゲティングベクター又は「ターゲティングベクター」を使用することができ、これはターゲティング配列をコードする核酸、部位特異的組換え部位、及び場合により選択マーカー遺伝子を含むベクターであり、宿主細胞において相同性媒介組換えを使用して内因性免疫グロブリン領域を改変するために使用される。例えば、相同性ターゲティングベクターは、本発明において、宿主細胞ゲノムの特定の領域に、部位特異的組換え部位を導入するために使用できる。
【００８６】
特定の態様によれば、本発明は、抗体を産生するための方法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ）非ヒト動物において異種免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現すること、この遺伝子座は
ｉ）VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々を１つ以上含む可変重鎖領域、
ii）CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
iii）連結領域
を含み、これらの領域は本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbを発現するように操作及び配置され、ここで、この非ヒト動物は、内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座を発現しない
ｂ）前記scVHAb及び前記HCAbそれぞれである抗体を産生するか、又は前記scVHAb又は前記HCAbの少なくともVHドメインをそれぞれ含む抗体を産生すること。
【００８７】
具体的には、前記非ヒト動物は、本発明の遺伝子座を含み、本明細書にさらに記載される。
具体的には、前記非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼ技術、又はCRISPR/Cas9技術を用いて、適切な遺伝子標的化技術(例えば、指向性相同組換え)によって、遺伝子座を取り込むように処置される。
【００８８】
具体的には、前記非ヒト動物は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物であり、本明細書にさらに記載される。
具体的には、前記非ヒト動物は、内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座を発現しないが、これは前記内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座が、欠失又はサイレンシングされているか、さもなければ機能喪失のために変異されているからである。
【００８９】
特定の実施形態によれば、この方法は、非ヒト動物を抗原で免疫化して、その抗原に対する免疫応答を誘発し、親和性成熟特異的モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の産生を生じる工程をさらに含む。
【００９０】
抗原は、アジュバントの有無にかかわらず、任意の便利な様式で非ヒト動物に投与することができ、所定のスケジュールに従って投与することができる。
【００９１】
免疫化後、免疫化された動物の血清又は乳は、抗原に特異的な医薬グレードのポリクローナル抗体を精製するために分画され得る。トランスジェニックバードの場合、卵黄を分画することによって抗体を作製することもできる。濃縮精製免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー(親和性、イオン交換、ゲル濾過など)、選択的沈殿(硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、又はポリエチレングリコールなどのポリマーを用いる)によって得ることができる。
【００９２】
モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞(例えば、脾臓及び/又はリンパ節細胞)が、免疫化されたトランスジェニック動物から単離されてもよく、そしてハイブリドーマ産生のための形質転換細胞株との細胞融合において使用されてもよく、又は、抗体をコードするcDNAが標準的な分子生物学技術によってクローニングされ、そしてトランスフェクトされた細胞において発現されてもよい。モノクローナル抗体を作製するための手順は、当該分野で十分に確立されている。
【００９３】
具体的には、前記方法は、ハイブリドーマを調製する工程、ならびに抗体産生細胞、特に標的抗原を特異的に認識するものを、産生及びスクリーニングする工程をさらに含む。
【００９４】
具体的には、この方法はさらに、細胞培養において、特異的抗体又はそのフラグメント、特に抗原結合フラグメントを産生するために、免疫化された非ヒト動物から核酸配列を単離する工程を含む。このような抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書において、高度免疫抗体として理解される。
【００９５】
特定の実施形態によれば、本明細書中に記載される抗体は、適切な産生宿主細胞株を使用する細胞培養において産生される。具体的には、この産生は、細菌、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物細胞培養物を使用する。具体的には、前記宿主細胞は、本明細書中に記載される抗体をコードするそれぞれの核酸分子との組換えの際に使用される。特に、次の哺乳動物宿主細胞のいずれかが有利に使用される：BHK、CHO、HeLa、HEK293、MDCK、NIH3T3、NS0、PER.C6、SP2/0又はVERO細胞。
【００９６】
特定の態様によれば、本発明は、scVHAb又はHCAb抗体、又はそのフラグメント(VHドメインを含むもの)を産生するための、及び任意で前記VHドメインを含む抗体をさらに産生するための、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用を提供する。
【００９７】
特定の態様によれば、本発明は、scVHAbもしくはHCAb抗体、又はVHドメインを含むそのフラグメントのライブラリー、特に、ナイーブライブラリー、又は前記ナイーブライブラリーをコード又は発現する核酸配列のライブラリーを作製するための、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用を提供する。
【００９８】
本明細書中に記載されるトランスジェニック細胞は、例えば、B細胞から抗体をコードする遺伝子をクローニングすることによって、又は、形質細胞膜上に抗体を発現する改変マウスにおいて規定された特異性を有する形質細胞を選択することによって(例えば、US 2017/0226162 A1に記載されるように)、目的の抗体を同定するための発現ライブラリーを産生するために使用されてもよい。従って、本発明はまた、形質細胞によって発現される抗原特異的抗体の同定のための、細胞技術を使用して産生される抗体ライブラリーを含む。
【００９９】
本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbを産生する際に、VHドメイン又はその抗原結合部位は、任意タイプの抗体(例えば、全長抗体もしくはその抗原結合フラグメント、又はさらには単一VHドメイン抗体及びこのような単一VHドメイン抗体を含む抗体構築物)を操作するための適切な技術によって特徴付けられてもよい。例えば、VHドメイン又はその抗原結合部位のアミノ酸配列又はコードヌクレオチド配列を決定し、抗体構築物のさらなる配列と組換えることができ、あるいは、そのようなVHドメイン又はその抗原結合部位を取り込んだ他の結合分子としてもよい。
【０１００】
いくつかの例示的な実施形態は、ヒト免疫グロブリン領域をさらに含む本発明のトランスジェニック動物を提供する。例えば、内因性マウス免疫グロブリン領域をヒト免疫グロブリン配列で置換して、薬物発見目的のための部分-又は完全-ヒト抗体を作製するための多くの方法が開発されている。このようなマウスの例には、例えば、以下の米国特許に記載されているものが含まれる。US特許第7,145,056号：第7,064,244号：第7,041,871号：第6,673,986号：第6,596,541号：第6,570,061号：第6,162,963号：第6,130,364号：第6,091,001号：第6,023,010号：第5,593,598号：第5,877,397号：第5,874,299号：第5,814,318号：第5,789,650号：第5,661,016号：第5,612,205号；及び第5,591,669号。
【０１０１】
いくつかのさらなる例示的な実施形態は、米国特許出願公開第2013/0219535号(Wabl及びKilleenによる)に記載されるような、キメラ免疫グロブリンセグメントをさらに含む本発明のトランスジェニック動物を提供する。このようなトランスジェニック動物は、導入された部分ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、導入された領域は、ヒト可変領域コード配列及び非ヒト脊椎動物の内因性ゲノムに基づく非コード可変配列を含む。好ましくは、本発明のトランスジェニック細胞及び動物は、内因性免疫グロブリン領域の一部又は全部が除去されたゲノムを有する。
【０１０２】
いくつかのさらなる例示的な実施形態は、免疫グロブリン重鎖遺伝子に対する変化をさらに含む本発明のトランスジェニック動物を提供し、二重特異性抗体の産生を可能にする(例えば、WO 2017/035252 A1、US 2017/058052 A1に記載されるような)。
【０１０３】
他の実施形態は、初代B細胞、不死化B細胞、又は遺伝子改変動物に由来するハイブリドーマを提供する。
他の実施形態は、遺伝子改変動物の操作された部分に由来する免疫グロブリン重鎖遺伝子から転写された免疫グロブリンタンパク質の一部又は全部；及び遺伝子改変動物の細胞に由来する操作された免疫グロブリンタンパク質の一部又は全部を含む。
本発明のこれら及び他の態様、目的及び特徴は、以下により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
［図１］マウスIgh遺伝子座(上部) [V(IghV)、D(IghD)、J(IghJ)、及びC(IghC)遺伝子セグメントを含む；異なるIgH鎖アイソタイプをコードするための複数のIghCエクソンが存在する]、Igκ遺伝子座(Igk、中央)[V(IgkV)、J(IgkJ)、及びC(IgkC)遺伝子セグメントを含む]及びIgλ遺伝子座(下部)[V(IglV)、J(IglJ)、及びC(IglC)遺伝子セグメントを含む]を描写する。また、（１）VDJ再構成における末端VH遺伝子セグメントの利用を確実にするためにIghループ形成に重要なシス調節配列であるPAIRエレメント、（２）Adam6a雄性受精可能化遺伝子、（３）Igh遺伝子座の秩序化された系列特異的再編成を調節する部位を含む遺伝子間制御領域1(IGCR1)、（４）Eμ、iEκ及びEλ2-4、重鎖、κ及びλ軽鎖イントロンエンハンサー、（５）3'Eκ、Eλ及びEλ3-1、κ及びλ軽鎖3'エンハンサー、（６）Sμ、μスイッチ領域、ならびに（７）アイソタイプスイッチングを制御するシス作用エレメントである3'調節領域(3'RR)も示される。
【０１０５】
［図２］ （Ａ）scVHAbの膜貫通型(TM)及び分泌型。TM型は、抗原受容体(BCR)としてB細胞によって発現される。成熟タンパク質は、構造VH-L1(任意)-CL-L2-CH1-TM； VH(重鎖可変領域)、L1(リンカー1)、CL(κ又はλ軽鎖定常領域)、L2(リンカー2)、CH1(重鎖CH1)ドメインを有する。TM scVHAbは、Igα/βと会合する(CD79a/CD79b、図示せず)。scVHAbの分泌形態は、形質芽細胞及び形質細胞によって産生され、71アミノ酸長のTM領域が単一のリジン残基によって置換され、分子がIgα/βと会合していないことを除いて、本質的に同じ構造を有する。（Ｂ）TM及び分泌型のHCAb。TM型は、B細胞によってBCRとして発現される。成熟タンパク質は、構造VH-L1(任意)-CL-L2-CH1-H-CH2-CH3-TM；H(重鎖ヒンジ領域)、CH2(重鎖CH2ドメイン)、CH3(重鎖CH3ドメイン)を有する。TM HCAbはまた、Igα/βと会合する(CD79a/CD79b、図示せず)。HCAbの分泌形態は、形質芽細胞及び形質細胞によって産生され、71アミノ酸長のTM領域が単一のリジン残基によって置換され、分子がIgα/βと会合していないことを除いて、本質的に同じ構造を有する。
【０１０６】
［図３］抗体Fab結晶構造に基づくリンカー2(L2)長の設計における考察。L2はCLをCH1に接続する。図に示すFab構造及びその構成領域は、IgG1κ mAb(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank ID: 2XKN)である。CκのCOOH末端とCH1のNH2末端とを連結するために架橋されるべき間隔は、破線によって示されるように40.9Åであるが、CκとCH1との相対位置に起因して、リンカーはCOOH末端とNH2末端とを連結するために、より長いことが好ましい。(GGGGS[配列番号３５])4リンカーの理論的長さは76Åであり、これは、２つの末端間の距離のカバレージの2倍(81.8Å)未満である。それゆえ、例示されるリンカー長は(GGGGS[配列番号３５])4-16である。
【０１０７】
［図４］インビトロでの細胞表面発現について試験するために作製した重鎖抗体(HCAb)構築物。（１）陽性対照、従来のH2L2 IgG。（２及び３）LCなしで細胞表面に表現されることが知られている陽性対照（２）CH1を欠くラクダ様HCAb、（３）VHに直接連結されたVLを有し、CH1を欠く単鎖Fv(scFV)。（４）タンパク質ドメイン構造NH-VH-Cκ-L2-CH1-CH2-CH3-TM-COOHを有する、本明細書に記載のHCAb。（５）CL及びCH1の順序が逆であることを除いて、構築物４と同じである、VH-CH1-L2-Cκ-CH2-CH3-TM-COOH。（６）陰性対照、LCを含まない従来のIgG(H2L0)。ここに示された構築物は、原形質膜への挿入のための膜貫通領域を含む、マウスHC(例えば、マウスIgG1)をコードする。分泌形態をコードする構築物もまた、HCAb分泌を試験するために作製した。構築物をHEK 293T細胞にトランスフェクトした。
【０１０８】
［図５］図４に示すHCAb構築物の細胞表面発現。トランスフェクション対照としてmycタグ化ヒトCD4(hCD4)をコードするベクターと共にLipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して、図４に示す構築物を、HEK 293T細胞に一過性にトランスフェクトした。さらに、すべてのHEK 293T細胞を、B細胞抗原受容体(HCAbの膜結合型を含む)の表面発現に必要な共受容体であるマウスCD79a及びCD79b(Igα/Igβ)の両方を発現する構築物と同時トランスフェクトした(Wienands and Engles, Int. Rev. Immunol., 20:679, 2001)。20〜24時間後、細胞を、細胞表面hCD4、マウスIgG1(mIgG1)及びマウスκ軽鎖(mIgκ)について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図の上部の数字は、図４の構築物番号に対応する。各フロープロットの上部の数字は、陰性(左)及び陽性(右)細胞の出現頻度を示す。
【０１０９】
［図６］細胞内hCD4、mIgG1及びmIgκについてのトランスフェクト細胞の染色。図５に示すトランスフェクションからの細胞のサンプルを固定し、透過処理し、hCD4、mIgG1及びmIgκの細胞内発現について染色した。フローサイトメトリーを用いて、全ての構築物が発現されていることを確認した。
【０１１０】
［図７］（Ａ）インビトロでの細胞表面発現の効率についてCκ、Cλ1及びCλ2を比較するために作製した重鎖抗体(HCAb)構築物。（１）陽性対照、CH1を欠くラクダ様HCAb。（２）本明細書に記載の、構造VH-Cκ-L2-CH1-CH2-CH3-TMを有するHCAb。（３）本明細書に記載の、構造VH-Cλ1-L2-CH1-CH2-CH3-TMを有するHCAb [配列番号４７、ヌクレオチド配列；配列番号４８、アミノ酸配列]（４）本明細書に記載の、構造VH-Cλ2-L2-CH1-CH2-CH3-TMを有するHCAb。ここに示された構築物は、原形質膜への挿入のための膜貫通領域をコードする。分泌形態をコードする構築物もまた、HCAb分泌を試験するために作製した。（Ｂ）5'から3'への構築物３融合遺伝子の模式図。SPはシグナルペプチド； VH3-11、D2-21、JH4は、重鎖VDJ再構成に使用されるVH、DH及びJH遺伝子セグメント；Cλ1は軽鎖定常領域； L2はリンカー2；CH1は、IgG1のCH1ドメインをコードするエクソン；Hは、IgG1ヒンジ領域エクソン； CH2は、IgG1のCH2ドメインをコードするエクソン；CH3-Sは、IgG1のCH3ドメイン及び分泌テール(secretory tail)をコードするエクソン； M1+M2は、IgG1膜貫通領域をコードするエクソン。
【０１１１】
［図８］図７Ａに示すHCAb構築物の細胞表面発現。トランスフェクション対照としてmycタグ化ヒトCD4(hCD4)をコードするベクターと共にLipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して、図７Ａに示す構築物を、HEK 293T細胞に一過性にトランスフェクトした。さらに、すべてのHEK 293T細胞を、抗原受容体(HCAbの膜結合型を含む)の表面発現に必要な共受容体であるマウスCD79a及びCD79b(Igα/Igβ)の両方を発現する構築物と同時トランスフェクトした(Wienands and Engles, Int. Rev. Immunol., 20:679, 2001)。20〜24時間後、細胞を、細胞表面hCD4(上の列)又はマウスmIgG1(中央の列)について染色するか、又は固定し、透過処理し、細胞内マウスmIgG1(下の列)について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。左のカラム(HC無し)は、hCD4構築物のみでトランスフェクトした細胞。カラム１〜４は、hCD4に加えて図７Ａに番号を付した構築物をトランスフェクトした細胞。各フロープロットの上部の数字は、陰性(左)及び陽性(右)細胞の出現頻度を示す。
【０１１２】
［図９］種々のHCAb構築物の分泌及び細胞内発現のウェスタンブロット分析。示された構築物でトランスフェクトされた細胞を40〜48時間培養し、次いで遠心分離した。上清を回収してHCAb分泌(左)を検出し、細胞ペレットをNP-40に溶解して、HCAbの細胞内発現(右)を検出した。試料を非還元条件下でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、PVDF膜にブロットし、次いでHRP標識抗マウスIgG Fc抗体でプローブした。mIgG1；ベクターのCH1及び/又はFc領域が、mIgG1をコードする。mIgG2a；ベクターのCH1及び/又はFc領域が、mIgG2aをコードする。これらの構築物はまた、図に示されるように、L2の長さ(6又は10)及びCL(Cκ、Cλ1、又はCλ2)によって異なる。空ベクター(Empty vector)は、挿入物を含まない発現ベクターである。レーン１のVH-Fcは、ラクダ様HCAb。分子量マーカー(kDa0)は、ゲルの左側及び右側に可視化されている。
図９は、配列GGGGS(配列番号３５)の反復に言及する。
【０１１３】
［図１０］種々のHCAb構築物の分泌及び細胞内発現のウェスタンブロット分析。ゲルを還元条件下で泳動したことを除いて、図９と同一である。図１０は、配列GGGGS(配列番号３５)の反復に言及する。
【０１１４】
［図１１］図９及び図１０に示すブロットのトランスフェクション及びローディング対照。ブロットを剥がし、抗myc又は抗GAPDH mAbで再プローブした。hCD4構築物は、トランスフェクション対照として働くmycタグを含む。GAPDHは、ローディング対照として使用されるハウスキーピング遺伝子である。図１１は、配列GGGGS(配列番号３５)の反復に言及する。
【０１１５】
［図１２］ELISAによるHCAb分泌の定量。図９に示すトランスフェクタントの上清中の分泌IgG1(左)及びIgG2a(右)HCAbの量を、ELISAによって決定した。
【０１１６】
［図１３］マウスCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを、HCAbの産生のための相同組換えによって、Ighmの上流の内因性マウスIgh遺伝子座に導入するためのストラテジー。この図及び図１４及び１５において、「内因性マウスIgh遺伝子座」は、米国特許出願公開第2013/219535 A1(Wabl及びKilleenによる)に記載されている部分ヒトIgh遺伝子座を含むES細胞におけるものである。（Ａ、Ｂ）ターゲティングベクターの構造。Ａ及びＢとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、ターゲティングベクター中で近接している。（Ｃ）標的とする内因性マウスIgh遺伝子座の領域。（Ｄ、Ｅ）得られた標的マウスIgh遺伝子座。Ｄ及びＥとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、インビボで近接している。（Ｆ、Ｇ）Flpリコンビナーゼによる選択マーカー除去後の最終標的化遺伝子座。Ｆ及びＧとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、インビボで近接している。この図及び後続の図におけるIgCLは、Cκ又はCλ(マウスの場合、Cλ1、Cλ2又はCλ3)のいずれかの軽鎖定常領域を示す。
【０１１７】
［図１４及び１５］HCAb産生のためのリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)による、Ighmの上流の内因性マウスIgh遺伝子座へのマウスCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの導入のためのストラテジー。
図１４：ステップ１  ジェネレーション又はRMCEアクセプター対立遺伝子。（Ａ）RMCEターゲティングベクターの構造。（Ｂ）標的とする内因性マウスIgh遺伝子座の領域。（Ｃ）得られた標的化マウスIgh遺伝子座。
図１５：ステップ２  CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMベクターを用いて、RMCE改変アクセプター対立遺伝子を標的とする。（Ａ）RMCEターゲティングベクターの構造。（Ｂ）RMCE改変Igh遺伝子座。（Ｃ、Ｄ）得られた標的化Igh遺伝子座。Ｃ及びＤとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、in vivoで近接している。
【０１１８】
［図１６］本明細書中で言及される配列
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
別段の指示又は定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、当業者には明らかな、当技術分野で通常の意味を有する。例えば、Sambrookらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(第２版)、Vols. 1-3、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin、「Genes IV」、Oxford University Press、New York(1990)、及び、Janewayらの「Immunobiology」(第５版、又はより最近の版)、Garland Science、New York、2001などの標準ハンドブックを参照されたい。
【０１２０】
本明細書中で言及される抗体中のアミノ酸残基の位置は、IMGTナンバリングに対応する位置として理解される(IMGT(登録商標)、国際ImMunoGeneTics情報システム(登録商標))。IMGTナンバリングは、天然に存在する抗体のナンバリングを指す。IMGTデータベース及びナンバリングスキームの説明は、Giudicelli et al., Nuc. Acids Res., 34:D781, 2006に見出すことができる。
【０１２１】
本明細書においてscVHAb及びHCAbと呼ばれる抗体構築物は、天然に存在しない人工構築物である。例えば、単離された核酸配列、アミノ酸配列、発現構築物、形質転換された宿主細胞、トランスジェニック動物及び組換え抗体に特に言及する、本発明の材料、方法及び使用は、「人工」又は合成であり、したがって、「自然法則」の結果と見なされないことが十分に理解される。
【０１２２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、種々の組み合わせ又は構築物における抗体ドメインからなるか、又は当該抗体ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質を指すものであり、リンカー配列の有無にかかわらず、免疫グロブリンの重鎖及び/又は軽鎖の定常ドメイン及び/又は可変ドメインとして理解される。ポリペプチドは、ループ配列によって連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのβストランドからなるβバレル構造を含む場合、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは天然構造のものであってもよく、あるいは突然変異誘発もしくは誘導体化によって改変されてもよく、例えば、抗原結合特性又は任意の他の特性、例えば、Fcレセプター、Fcμ、Fcα/μ、Fcα、Fcε、及び/又はFcγレセプター(例えば、マウスにおけるFcRn、FcγRI、FcγRIIB、FcγRIII、もしくはFcγRIV)への結合、又はポリマーIgレセプター(pIgR)への結合などの安定性もしくは機能特性を改変してもよい。
【０１２３】
本明細書において、用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、互換的に使用される。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特に、１つ又は複数の連結配列又はヒンジ領域を有する定常抗体ドメインとの組み合わせで、単一可変抗体ドメインとしてVHを含む抗体構築物(例えば、重鎖抗体)を指すものとし、１つ又は２つの単鎖から構成され、各単鎖は、定常領域に連結された可変重鎖領域(又はVH)を含むか、又はそれからなる。例示的な抗体は、本明細書にさらに記載されるscVHAb又はHCAbのいずれかを含むか、又はそれらからなる。本明細書中に記載される抗体は、IgG型(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、又はIgM型、又はそれらのマウス対応物、IgG1、IgG2a/c、IgG2b、IgG3、IgA、IgD、IgE、又はIgMである抗体ドメインを含んでもよく、又はそれらからなってもよい。
【０１２４】
それによれば、抗体は、典型的には免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質(又はタンパク質複合体)として理解される。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖(LC)は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖(HC)は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、順に、免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEをそれぞれ規定する。
【０１２５】
典型的なIgG抗体構造において、HC又はLCはそれぞれ、互いに接続された少なくとも２つのドメインを含み、１対の結合部位領域を生成する。特定の場合において、重鎖はLC定常ドメインを組み込み得るが、それでもなおHCと考えることができ、例えば、軽鎖可変ドメイン又は領域を欠く。
【０１２６】
抗体のHCは、抗体の１つ又は２つの抗原結合アームをFc部分に接続するヒンジ領域を含み得る。特に、本明細書中に記載されるscVHAbは、C末端伸長としてヒンジ領域(例えば、scVHAbを、ペプチド/ポリペプチド配列を含むさらなるエレメントに連結するための)を適切に含み得る。例示的な抗体構築物は、ヒンジ領域を介して連結されたFcのような抗体定常ドメインを含み得る。
【０１２７】
ヒンジ領域は、免疫グロブリンの(例えば、IgG1又はIgG3の)天然に存在する重鎖ヒンジ領域であってもよく、又は天然に存在するものとほぼ同じ長さ(±20％、又は±10％)の多数の連続アミノ酸を含むか又はそれからなる人工ヒンジ領域であってもよい。好ましいヒンジ領域は、１つ以上、例えば、２、３、又は４つのシステイン残基を含み、システイン残基は、別のヒンジ領域となるジスルフィド架橋を形成することができ、それによって二量体構築物が得られる。
【０１２８】
本明細書中に記載される抗体は、短縮又は伸長される(例えば、連結配列又はリンカーを使用して)１つ以上の抗体ドメインを含んでもよい。このような連結は、特に、組換え融合又は化学結合による。特定の連結は、１つのドメインのC末端を別のドメインのN末端に連結することによるものであってもよく、例えば、この際、末端領域中の１つ以上のアミノ酸残基を欠失させてドメインサイズを短くするか、又は伸長させてドメインの柔軟性を増大させる。
【０１２９】
具体的には、短縮されたドメイン配列は、C末端及び/又はN末端領域の欠失を含み、例えば、少なくとも1、2、3、4、又は5個、最大で6、7、8、9、又は10個までのアミノ酸を欠失する。
【０１３０】
リンカーによるドメイン伸長は、ドメイン間の天然の接合部を含むように、ドメインに隣接して天然に位置する免疫グロブリンドメインのN末端領域又はC末端領域に由来するアミノ酸配列を介するものであってもよい。あるいは、リンカーは、ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、リンカーは人工配列(例えば、複数のGly及びSerアミノ酸に富むか、又はそれらからなる)であってもよい。
【０１３１】
「抗原結合部位」又は「結合部位」という用語は、抗原結合に関与する抗体の部分を指す。天然抗体の抗原結合部位は、重(H)鎖及び/又は軽(L)鎖のN末端可変(V)領域、又はその可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖(及び任意で軽鎖)のV領域内の３つの高度に可変なストレッチは、より保存された隣接ストレッチ(フレームワーク領域として知られる)の間に介在する。抗原結合部位は、結合されるエピトープ又は抗原の三次元表面に相補的な表面を提供し、超可変領域は「相補性決定領域」又は「CDR」と呼ばれる。CDRに含まれる結合部位は、本明細書では「CDR結合部位」とも呼ばれる。
【０１３２】
用語「CDR領域」又はそれぞれの配列は、可変抗体ドメイン(例えば、VH又はVHHドメイン)の可変抗原結合領域であり、これは、抗原との相互作用で結合し得る種々の構造を含む。CDR領域を有する抗体ドメインは、そのままで使用され得るか、又はより大きなタンパク質性構築物内に組み込まれることができ、それによって、結合機能を有するそのような構築物の特異的領域を形成する。様々な構造は、免疫グロブリンなどの結合タンパク質の天然レパートリーに、特に抗体又は免疫グロブリン様分子に由来し得る。様々な構造は、ランダム化技術でも、特に本明細書に記載されているものによっても生成することができる。これらには、抗体可変ドメインの変異誘発CDRループ領域、特に免疫グロブリンのCDRループが含まれる。
【０１３３】
典型的には、特異的CDR構造を持つ抗原結合部位を有する抗体が、標的抗原に特異的に結合することができ、すなわち、一対のVH/VLドメインのCDRループを介してこのような標的抗原を特異的に認識することができる。
【０１３４】
HC抗体では、抗原結合部位は、VH-CDR1、VH-CDR2、及びVH-CDR3ループのみからなる特異的CDR構造によって特徴付けられる。このような抗原結合部位は、動物(例えば、本明細書中に記載されるようなトランスジェニック非ヒト動物)によって産生される場合、天然であるか、又は天然の構造及び/又はコンフォメーションであると理解される。新しい構造を合成する組換え技術によって操作されるので、抗原結合部位は人工的に産生され得るが、トランスジェニック非ヒト動物への、それぞれの抗体をコードするそれぞれの遺伝子の組み込みは、天然のコンフォメーションを有する新しい合成抗体の産生をもたらす。
【０１３５】
このような天然のコンフォメーションは、親和性成熟の任意のインビボ又はインビトロ技術によってさらに親和性成熟されてもよく、それによって、ポリクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体(天然のコンフォメーションを特徴とし、さらにその標的抗原に特異的に結合する高い親和性を特徴とする人工抗原結合部位を含む)を産生する。
【０１３６】
用語「抗体」は、哺乳動物(ヒト、マウス、ウサギ、及びラットを含む)、又は鳥類(ニワトリなど)等の動物起源の抗体に適用されるものとし、この用語は、動物起源の配列(例えば、マウス配列)に基づく組換え抗体を特に含むものとする。
用語「抗体」はさらに、完全ヒト抗体にも適用される。
【０１３７】
免疫グロブリンに関して使用される用語「完全ヒト」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むと理解される。ヒト抗体は、例えばCDR中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異)を含んでもよい。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリン又は抗体ライブラリーから単離された、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入された動物から単離された抗体が含まれる。
【０１３８】
ヒト免疫グロブリンは、好ましくは、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及びIgMからなる群より選択又は誘導される。
マウス免疫グロブリンは、好ましくはIgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3及びIgMからなる群より選択又は誘導される。
【０１３９】
用語「抗体」は、さらに、マウス及びヒト起源の配列などの異なる種に由来する混合配列を有するキメラ抗体に適用される。
具体的には、用語「抗体」は、ヒト抗原結合領域及び非ヒト(例えば、マウス)定常領域又はフレームワーク配列を含む、トランスジェニック非ヒト動物(例えば、マウス)によって産生される抗体に適用される。
【０１４０】
免疫グロブリン又は抗体に関して使用される「キメラ」という用語は、抗体鎖の一部が特定の種に由来するか又は特定のクラスに属する免疫グロブリン中の対応する配列に相同であるが、鎖の残りのセグメントは、別の種又はクラス中の対応する配列に相同である分子を指す。典型的には、可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する免疫グロブリンの可変領域を模倣する一方、定常部分は別の種に由来する免疫グロブリンの配列と相同である。一例において、可変領域は、ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なB細胞を使用して、現在公知の供給源から得ることができ、例えば、非ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせられる。
【０１４１】
用語「抗体」は、モノクローナル抗体、特に組換え抗体にさらに適用され、この用語は、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、又は単離される全てのタイプの抗体及び抗体構造を含み、例えば、異なる起源由来の遺伝子又は配列を含む、動物(例えば、ヒトを含む哺乳動物)由来の抗体を含み、例えば、キメラ、ヒト化抗体、又はハイブリドーマ由来抗体を含む。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、又は抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、又は抗体遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製され、発現され、作製され、もしくは単離された抗体に関する。
【０１４２】
用語「抗体」は、新規又は既存の(本明細書では「親」と呼ばれる)分子、例えば天然に存在する免疫グロブリンの機能的に活性な変異体を含むと理解される。さらに、この用語は抗体変異体を含み、このような分子の誘導体も同様に含むことが理解される。誘導体は、１つ以上の抗体及び/又は融合タンパク質の任意の組合せであり、この際、抗体の任意のドメイン(例えば、VHドメインの抗原結合部位を含む抗体ドメイン、又はVHドメイン)は、任意の位置で、１つ以上の他のタンパク質、例えば、他の抗体(例えば、CDRループ、レセプターポリペプチドを含む結合構造)だけでなく、他のリガンド、酵素、毒素などに融合されてもよい。本明細書中に記載される抗体は、特に、単離されたポリペプチドとして、又は組合せ分子として(例えば、他のペプチド又はポリペプチドとの組換え、融合又はコンジュゲーション技術を介して得られる組合せ分子)、使用され得る。
【０１４３】
抗体の誘導体はまた、共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合等の様々な化学技術によって、他の物質と会合又は結合することによって得ることもできる。抗体に結合した他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機及び無機分子、又はそれらの任意の組合せ(例えば、PEG、プロドラッグ又は薬物)であってもよい。誘導体はまた、同じアミノ酸配列を有するが、非天然又は化学的に修飾されたアミノ酸から完全に又は部分的に作製された抗体を含んでもよい。特定の実施形態では、抗体は、生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にする追加のタグを含む誘導体である。本発明において使用可能なタグに関して特定の制限はない(免疫グロブリンのその標的への結合に全く影響を及ぼさない又は負の影響を及ぼすが許容できる範囲である限り)。適切なタグの例には、Hisタグ、Mycタグ、FLAGタグ、Strepタグ、Calmodulinタグ、GSTタグ、MBPタグ、及びSタグが含まれる。別の特定の実施形態において、抗体は、標識を含む誘導体である。本明細書で使用される「標識」という用語は、「標識された」抗体を生成するために、抗体に直接又は間接的に結合される検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体で検出可能であってもよく、例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識であってもよく、あるいは酵素標識の場合、検出可能な基質化合物の化学変化を触媒してもよい。
【０１４４】
抗体の誘導体は、例えば、親抗体又は親抗体配列に、例えば、親抗原結合(例えば、CDR)配列又はフレームワーク(FR)配列に由来し、例えば、in silico又は組換え工学によって、あるいは化学的誘導体化又は合成によって得られる突然変異体又は変異体(改変体)である。
【０１４５】
用語「変異体」は、特に機能的に活性な変異体を包含するものとする。本明細書に記載の抗体の機能的変異体は、抗原結合の特異性に関して特に機能的である。
【０１４６】
用語「変異体」は特に、抗体、例えば、突然変異誘発法によって得られる、突然変異抗体又は抗体フラグメントなどを指し、特に、特定の抗体アミノ酸配列又は領域に欠失、交換、挿入もしくは欠失を導入するか、又は化学的にアミノ酸配列を誘導体化して、例えば、定常ドメインにおいて、改善された抗体安定性、増強されたエフェクター機能もしくは半減期を操作し、又は可変ドメインにおいて、例えば、当該分野で利用可能な親和性成熟技術によって、抗原結合特性を調節したものを指す。任意の公知の突然変異誘発法を使用することができ、これには、所望の位置での点変異(例えば、ランダム化技術によって得られる)、又はドメイン欠失(scVHAbもしくはHCAbエンジニアリングのために使用される)が含まれる。いくつかの場合において、位置は、例えば、可能なアミノ酸のいずれか、又は抗体配列をランダム化するための好ましいアミノ酸の選択のいずれかを用いて、ランダムに選択される。「突然変異誘発」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を改変するための、当技術分野で認識されている任意の技術を指す。好ましいタイプの突然変異誘発には、エラープローンPCR突然変異誘発、飽和突然変異誘発、又は他の部位特異的突然変異誘発が含まれる。
【０１４７】
抗原結合に関する抗体の機能的活性は、抗原が細胞表面又は細胞内で発現される場合、典型的にはELISAアッセイ、BIAcoreアッセイ、Octet BLIアッセイ、又はフローサイトメトリーに基づくアッセイにおいて決定される。
【０１４８】
機能的に活性な変異体は、例えば、親抗体(例えば、IgG1構造などの免疫グロブリンの特定天然構造を有するモノクローナル抗体)の配列を変化させて、標的抗原を認識する際に同じ特異性を有するが、親構造とは異なる構造を有する変異体を得ることによって(例えば、任意の抗体ドメインを改変して、特定の変異を導入するか、又は親分子のフラグメントを産生することによって)得ることができる。
【０１４９】
特定の機能的に活性な変異体は、親抗体の１つ以上の機能的に活性なCDR変異体を含み、その各々は親CDR配列中に少なくとも１つの点変異を含み、親CDR配列と少なくとも60％の配列同一性、好ましくは少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１５０】
特定の変異体は例えば、親抗体の機能的に活性な変異体であり、ここで、親CDR配列はヒトフレームワーク配列に組み込まれ、任意で親CDR配列の各々の1、2、3、又は4アミノ酸残基は、親又はヒト化抗体の安定性、特異性、及び親和性を改善するために点変異を導入することによってさらに突然変異させることができる。
【０１５１】
具体的には、前記抗体は、親抗体のCDR配列のいずれかの機能的に活性なCDR変異体を含むことができ、前記機能的に活性なCDR変異体は、以下の少なくとも１つを含む
ａ）親CDR配列における1個、2個又は3個の点変異、好ましくは、各CDR配列における点変異の数は、0、1、2、又は3のいずれかである；及び/又は
ｂ）親CDR配列の、4つのC末端アミノ酸又は4つのN末端アミノ酸、又は4つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける1個又は2個の点変異；及び/又は
ｃ）親CDR配列との少なくとも60％の配列同一性；
ここで、好ましくは、前記機能的に活性な変異抗体は、本明細書中に記載されるような機能的に活性なCDR変異体の少なくとも１つを含む。具体的には、１つ以上の機能的に活性なCDR変異体を含む前記機能的に活性な変異抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する。
【０１５２】
特定の態様によれば、点変異は、１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入のいずれかである。
【０１５３】
抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(％)」は、配列を整列させ、必要であれば、当技術分野で周知の方法、例えば、CLUSTALW(Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31:3497, 2003)によって、最大パーセントの配列同一性を達成するために間隙を導入した後であって、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１５４】
抗体変異体は、特に、特定の糖鎖付加パターンを有するホモログ、アナログ、フラグメント、改変体又は変異体を含むと理解され、例えば糖鎖工学によって産生され、これらは、機能的であり、及び機能的等価物として役立ちうる(例えば、特定の標的へ結合し、且つ異なる機能的特性を有する)。抗体はグリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい。例えば、本明細書中に記載される組換え抗体は、適切な哺乳動物細胞において発現されてもよく(これは抗体を発現する宿主細胞によって決定される分子の特異的グリコシル化を可能にする)、又はグリコシル化機構を欠く原核細胞において発現されてもよい(これは非グリコシル化タンパク質を生じる)。
【０１５５】
抗体ドメイン、特に定常抗体ドメインの「βシート」又は「βストランド」という用語は、本明細書では以下のように理解される。抗体ドメインは、典型的には少なくとも２つ又は３つの骨格水素結合によって横方向に連結された少なくとも２つのβストランドからなり、一般にねじれたプリーツシートを形成する。βストランドは、このような延長コンフォメーションを採用するアミノ酸の単一の連続したストレッチ(典型的には3〜10アミノ酸長)であり、そして少なくとも１つの他のストランドへの骨格水素結合に関与し、その結果、それらはβシートを形成する。βシートでは、βストランドの大部分が他のストランドに隣接して配置され、それらの近隣ストランドと広範な水素結合ネットワークを形成し、この中で、１つのストランド骨格中のN-H基は、隣接ストランド骨格中のC＝O基と水素結合を確立する。
【０１５６】
CL(Cκ、Cλ1)、CH1、CH2又はCH3ドメインなどの抗体定常領域の構造は、可変領域の構造と類似しており、ループによって連結されたβストランドからなり、そのいくつかは短いαヘリックスストレッチを含む。様々なFc結晶構造のX線結晶学的Bファクターから分かるように、フレームワークはほぼ柔軟性に欠けており、ループは比較的柔軟である。抗体定常ドメインは、典型的にはβシート(A-B-C-D-E-F-G)を形成する７つのβストランドを有し、βストランドはループを介して連結され、３つのループはドメイン(A-B、C-D、E-F)のN末端チップに位置し、さらに３つのループはドメイン(B-C、D-E、F-G)のN末端チップに位置する。ドメインの「ループ領域」は、βストランドの領域に位置するタンパク質の部分を指す(例えば、各CH3ドメインは、N-末端からC-末端に配向した７つのβシート、A〜Gを含む)。
【０１５７】
具体的には、定常抗体ドメインなどの抗体ドメインの対(ペア)、例えば、本明細書に記載のscVHAb又はHCAbに含まれるCL/CH1ドメイン対、又はFcの任意の抗体ドメイン対は、A、B及びE鎖を含む結合表面を接続することによって産生され、本明細書において第１抗体ドメインのβシート領域とも呼ばれ、これは第２ドメインのβシート領域と接触されて(すなわち、対にされて)二量体を産生する。
【０１５８】
特定の実施形態では、抗体ドメインは、動物(ヒトを含む)に由来するような野生型アミノ酸配列を含んでもよく、又は突然変異を含む人工アミノ酸配列を含んでもよく、例えば、異種配列で置換された１つ以上のβストランドの少なくとも一部を有してもよい(例えば、別のドメインとの対合を容易にする、例えば、２つの抗体ドメインのβシート領域を連結するようなドメイン間ジスルフィド架橋を容易にする突然変異、ノブ及び/又はホール突然変異、又は鎖交換を含む)。
【０１５９】
特定のドメイン変異は、
ａ）追加のドメイン内ジスルフィド結合により抗体ドメインを安定化するために、及び/又は
ｂ）CLドメインとCH1ドメインとの間のドメイン間ジスルフィド架橋によってドメイン対(例えば、本明細書中にさらに記載される抗体構築物中の)を安定化するために、及び/又は
ｃ）追加の鎖間ジスルフィド架橋によって抗体ドメインの２つの鎖を安定化するために、
追加のドメイン間又は鎖間ジスルフィド架橋を形成することができる、新しい(追加の)アミノ酸残基(例えば、Cys残基)の組み込みを含んでもよい。
【０１６０】
ジスルフィド結合は通常、２つのシステイン又は他のチオール形成アミノ酸のチオール基の酸化から、又はアミノ酸類似体のチオール基の酸化から形成され、アミノ酸側鎖のS原子を連結することによる人工ジスルフィド架橋を形成する。具体的には、システインは、追加のシステイン修飾を是認する一対のドメイン間に(追加のアミノ酸又はアミノ酸置換として)挿入され、それによってジスルフィド結合形成によって安定化ドメイン対を生成することができる。
【０１６１】
抗体ドメインの「対(ペア)」は、特定の配置における２つの抗体ドメインのセットとして理解され、ここで、一方は、その表面上又はキャビティ内に領域を有し、この領域は他方の領域に特異的に結合し、それゆえ他方の領域に相補的である。抗体ドメインは、βシート領域の接触を介して会合し、一対の領域を形成することができる。このようなドメイン対はまた、(ヘテロ-又はホモ-)ダイマーとも呼ばれ、これは、例えば、静電相互作用、組換え融合又は共有結合によって会合され、２つのドメインを直接物理的に関連させる。特に、本明細書に記載されるのは、CLドメイン及びCH1ドメインの同族対であるscVHAbのCL/CH1ダイマーである。安定性の理由のために、このようなCL/CH1対は、特に、ペプチドリンカーL2を介してさらに連結され、それによって、この対は単一の共有結合ポリペプチド鎖となる。さらに、CLドメインとCH1ドメインとの間の共有結合ジスルフィド架橋を導入して、ドメイン対の相互作用を安定化させることができる。
【０１６２】
関連するドメイン対又はドメインダイマーに関する用語「同族」は、その各々が各ドメイン上にドメイン間接触表面を作製するための相互に相補的な結合界面を有しているドメインと理解される。互いに接触すると、これらの接触表面の会合によって一対のドメインが形成される。
【０１６３】
抗体は、抗体ライブラリーの各結合部位においてCDR配列を折り畳んで形成される抗原結合部位を最初にスクリーニングし、特定のバインダーを選択することによって産生できる。次の工程として、選択されたライブラリーメンバーは、任意の種類の抗体構築物(例えば、全長免疫グロブリン又はその抗原結合フラグメント)を操作するために使用され得るCDR配列(又は親CDR配列、これは、抗原結合及び表現型特性さえも調節するためにさらに改変され得る)のソースとして役立ち得る。
【０１６４】
抗体のライブラリー(例えば、同じ標的抗原を認識する特異的抗体構築物のレパートリーを含むもの、又は特定の動物もしくは品種、例えば、本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物によって産生される抗体のナイーブライブラリーであって、このライブラリーは異なる標的抗原を認識する抗体のレパートリーを含む)は、抗体(例えば、本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAb)のセット又はコレクションを指し、各抗体は、選択されたディスプレイシステム又はコンテインメント(containment)において適切に提示される。
【０１６５】
特定のディスプレイシステムは、所定のタンパク質、本明細書中の抗体、例えば、本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbを、そのコード核酸、例えば、そのコードmRNA、cDNA又は遺伝子と対にする。従って、ライブラリーの各メンバーは、その上に提示された、その抗体をコードする核酸を含む。ディスプレイシステムは、細胞、ウイルス(例えば、ファージ)、リボソーム、真核細胞(例えば、酵母)、DNA(プラスミドを含む)、及びmRNAを包含するが、これらに限定されない。
【０１６６】
例えば、多数の個々のライブラリーメンバーを含む任意の抗体遺伝子多様性ライブラリーをこのような目的のために使用して、多様な抗体配列を作製してもよく、又は、例えば、安定化されたライブラリーメンバーもしくは機能的に活性なライブラリーメンバーに富む、予め選択されたライブラリーを使用してもよい。例えば、ディスプレイシステムは、特定の標的に結合するライブラリーメンバーに富む。
【０１６７】
ライブラリーは、例えば、鎖シャッフリング法を含む周知の技術によって構築できる。重鎖シャッフリングのために、抗体を、例えば、ヒトVH遺伝子レパートリーを含むベクターにクローニングして、ファージ抗体ライブラリー形質転換体を作製する。さらなる方法は、抗体のCDRの部位特異的突然変異誘発、CDRランダム化を含み、CDRランダム化では、NNKコドン含有突然変異誘発オリゴヌクレオチドの適用による標的残基の全ランダム化、又は簡素な突然変異誘発を使用する標的残基の部分ランダム化(標的アミノ酸残基をコードする位置のオリゴヌクレオチドが、オリジナルのヌクレオチド塩基に偏っている混合物を含む)のいずれかを使用して、部分的又は全CDRがランダム化される。あるいは、エラープローンPCRを使用して、ライブラリーを構築することができ、これは、PCR反応における、dNTPアナログ、エラープローンポリメラーゼの適用、又はMn2+イオンの添加を伴う。
【０１６８】
ヒト抗体ライブラリー構築物の設計をコードする遺伝子の製造のために、種々の技術が利用可能である。合成オリゴヌクレオチドとして後に調製される重複フラグメントに配列を分割する完全合成アプローチによって、DNAを製造することが可能である。これらのオリゴヌクレオチドを一緒に混合し、最初に約100℃に加熱し、次いで周囲温度にゆっくりと冷却することによって互いにアニーリングする。このアニーリング工程の後、合成的に組み立てられた遺伝子は、直接クローニングされ得るか、又はクローニングの前にPCRによって増幅され得るかのいずれかである。これは、大型のシングルポットヒトライブラリーが望まれており、構築プロセスに膨大な資源が利用可能である場合に、特に望ましい。
【０１６９】
特定の方法は、直接バインダー選択及び内在化ファージ抗体選択のために、ファージ、ファージミド及び/又は酵母ライブラリーを使用する。Kunkel法(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 82:488, 1985)又はDpnI法[Weiner, et al., Gene 151:119, 1994]のような、部位特異的突然変異誘発のためのさらなる方法を、ライブラリー挿入物の生成に用いることができる。
【０１７０】
「ナイーブライブラリー」とは、特定の抗原に対して特異性を有する抗体の存在について調べられていないポリヌクレオチド(又はそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド)のライブラリーを指す。「ナイーブライブラリー」とは、抗原の任意の群に対して、又は特定の抗原に対して特異性を有する抗体配列に限定されないか、又はそれらに偏っているか、もしくはそれらに富んでいるライブラリーも指す。したがって、ナイーブライブラリーは「成熟ライブラリー」(例えば、「親和性成熟ライブラリー」)とは異なる。
【０１７１】
ナイーブライブラリーはまた、「免疫前」ライブラリーを含んでもよく、これは、天然に存在する抗体配列に類似する配列多様性を有するライブラリーを指す(このような天然に存在する配列が抗原選択を受ける前)。このような免疫前ライブラリーは、免疫前レパートリーを反映又は模倣するように設計及び調製されてもよく、及び/又は、V、D、及びJ遺伝子の収集、ならびに重鎖配列の他の大きなデータベース(例えば、公知の生殖系列配列)によって情報提供される合理的な設計に基づいて設計及び調製されてもよい。本発明の特定の実施形態において、ヒト又は非ヒトレパートリーにおいて見出される可能なV、D、及びJ多様性、ならびに接合部多様性(すなわち、N1及びN2)を表すカセットは、単鎖又は二本鎖DNAオリゴヌクレオチドとして新たに合成される。
【０１７２】
「成熟ライブラリー」は、抗原に対して特異性を有する抗体配列の存在について、ライブラリー(例えば、ナイーブライブラリー又は免疫前ライブラリー)を照合する際に特定される、抗体配列の少なくとも１つの特徴を増強又は改善するように設計されたライブラリーを指す。このような成熟ライブラリーは、初期(親)抗体に対して導入された多様性を有するライブラリーを生成するために、１つ以上のCDR；１つ以上の抗原結合領域；１つ以上のVH領域；及び/又は１つ以上の重鎖；に対応する核酸配列(ナイーブライブラリーから得られるか、ナイーブライブラリーの照合において同定される)を、インビトロ又はインビボでさらに突然変異誘発するように設計されたライブラリーへ取り込むことによって生成されてもよい。
【０１７３】
アレイ技術の異なる例として、B細胞クローニングが使用でき、本明細書中に記載される抗体構築物をコードする遺伝子を、B細胞のアレイにおいて手動で又はコンピューターアドレス可能な位置で生じさせる。ロボット又は手動の方法を使用して、このアレイを操作して、特定の型の抗体を発現する細胞及び/又は特定の標的を特異的に認識する細胞のみを再アレイすることが可能である。
【０１７４】
特定の実施形態において、B細胞クローニング(例えば、抗体を産生するために遺伝子操作された、本明細書中に記載されるような、適切に免疫化された非ヒトトランスジェニック動物からの)、又は哺乳動物細胞発現ライブラリーが使用されるか、あるいは安定に形質転換された哺乳動物細胞の大きな集団が、抗体及びタンパク質工学の標準的な方法及びロボットツールによって生成される。個々のクローンを、適切なインキュベーター中及び/又は長期保存条件下(例えば、液体窒素中で細胞懸濁液を-135℃で保存しながら凍結することを含み得る)で、又は保存された細胞株の回収を可能にする他の許容可能な条件下で、プレート上に配列されたアドレス可能なウェル中で生存可能に保つ。
【０１７５】
本明細書で使用する「レパートリー」という用語は、変異体(標的エピトープ又は抗原特異性の多様性を特徴とする変異体など)の集合体を指すものとする。典型的には抗体の構造(「骨格」とも呼ばれる)はそのようなレパートリー内で同じであるが、様々な異なるCDR配列を有する。
【０１７６】
当技術分野で周知のように、特定の結合特性及び親和性を有するタンパク質の同定及び単離のために使用することができる様々なディスプレイ及び選択技術があり、例えば、細胞性及び非細胞性方法、特に動態化ディスプレイシステム(mobilized display system)などのディスプレイ技術が挙げられる。細胞性システムの中で、ファージディスプレイ、ウイルスディスプレイ、酵母又は他の真核細胞ディスプレイ(例えば、哺乳動物又は昆虫セルラーディスプレイ)が使用され得る。動態化システムは、可溶性フォーマットにおけるディスプレイシステム(例えば、インビトロ・ディスプレイシステム)に関し、その中でも、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ又は核酸ディスプレイに関する。
【０１７７】
標的に結合することができる抗原結合構造を示すライブラリーメンバーのために、ライブラリーをスクリーニングすることは、任意の適切な方法によって行うことができる。スクリーニング工程は、１又は複数ラウンドの選択を含んでもよい。
【０１７８】
標的抗原に結合することができる抗体を同定するのに適した任意のスクリーニング方法を使用することができる。特に、選択のラウンドは、前記抗原又はそのエピトープに結合する抗体を選択するために、前記標的の存在下でライブラリーをインキュベートすることを含んでもよい。
【０１７９】
一旦、所望の構造を有する抗体が同定されると、このような抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術又は組換えDNA技術を含む、当該分野で周知の方法によって産生することができる。
【０１８０】
ハイブリドーマ法では、げっ歯類又はマウスなどの適切な非ヒト宿主動物を免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するリンパ球、又は産生することができるリンパ球を活性化する。別法として、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球を、適切な融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用して形質細胞腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【０１８１】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、前記抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、フローサイトメトリー、免疫沈降、又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などのインビトロ結合アッセイによって決定される。
【０１８２】
別の特定の例によれば、組換えモノクローナル抗体は、必要な抗体鎖をコードするDNAを単離して、発現のためのコード配列で組換え宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生できる(周知の組換え発現ベクター、例えば、抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド又は発現カセットを使用して)。組換え宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞であり得る。
【０１８３】
特定の態様によれば、コードヌクレオチド配列は、抗体をヒト化するため、又は抗体の親和性もしくは他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用され得る。例えば、定常領域は、ヒト定常領域に類似するように改変されてもよい。標的抗原に対するより大きな親和性を得るために、抗体配列を遺伝的に操作することが望ましい場合がある。１つ以上のポリヌクレオチド変化を抗体に作成することができ、そしてなお標的(エピトープ又は抗原)に対するその結合能力を維持できることは、当業者に明らかである。
【０１８４】
種々の手段による抗体分子の産生は、一般に十分に理解されている。抗体の産生に関連する種々の技術は、例えば、Harlowらの「Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2014)」に示されている。
【０１８５】
モノクローナル抗体は、例えば、培地中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生できる。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Kohlerら(Nature 256:495, 1975)のハイブリドーマ法、及びヒトB細胞ハイブリドーマ法[Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984；and Brodeur, et al., 1987, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, LB Schook, ed., (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63]が挙げられる。
【０１８６】
本明細書で使用される「標的」という用語は、エピトープ又は抗原を指すものとする。
【０１８７】
本明細書中で使用される用語「抗原」は特に、動物の免疫系又は抗体のライブラリーへの抗原の曝露の結果として、抗体の結合部位(少なくとも１つのパラトープ)によって認識されることが示されている全ての抗原及び標的分子を含む。具体的には、本明細書に記載される抗体によって標的とされる好ましい抗原は、免疫学的又は治療的に関連することが既に証明されているか、又は関連する能力がある分子、特に臨床効力が試験されている分子である。
【０１８８】
「抗原」という用語は、標的分子全体又はそのような分子のフラグメント、特に標的のポリペプチド又は炭水化物構造などの部分構造を記述するために使用される。そのような部分構造は、しばしば「エピトープ」(例えばB細胞エピトープ、T細胞エピトープ)と呼ばれ、免疫学的に関連し得る(すなわち、天然又はモノクローナル抗体によって認識されてもよい。
【０１８９】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は特に、抗原と特異的抗体との間の界面に存在する分子構造を指すものとし、エピトープと相互作用する抗体表面は「パラトープ」と呼ばれる。化学的には、エピトープは、炭水化物配列又は構造、不連続エピトープ中のペプチド配列又は配列セット、脂肪酸又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドから構成され得る。抗原分子が有機、生化学又は無機物質である場合、それは「ハプテン」と呼ばれる。エピトープ又はハプテンは、上記物質の誘導体又は任意の組合せからなり得る。エピトープがポリペプチドである場合、エピトープは、通常、ペプチド中に少なくとも3個のアミノ酸、好ましくは8〜50個のアミノ酸、より好ましくは約10〜20個のアミノ酸を含む。エピトープは、線状又は不連続エピトープのいずれかであり得る。線状エピトープは、ポリペプチド又は炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントから構成される。線状エピトープは、連続していても、重複していてもよい。不連続エピトープは、ポリペプチドを折り畳んで三次構造を形成することによって一緒にされたアミノ酸又は炭水化物から構成され、アミノ酸は必ずしも線状配列において互いに隣接していない。具体的には、エピトープは、診断に関連する分子の少なくとも一部であり、すなわち、サンプル中のエピトープの不在又は存在は、疾患に又は患者の健康状態に、又は製造におけるプロセス状態に、又は環境及び食物状態のいずれかに、定性的又は定量的に相関する。エピトープはまた、治療的に関連する分子(すなわち、特異的結合ドメインによって標的とされることができる分子であって、疾患の経過で変化する分子)の少なくとも一部であってもよい。
【０１９０】
本明細書中で使用される場合、用語「特異性」又は「特異的結合」は、分子の異種性の集団において目的の同族リガンドを決定する結合反応を指す。従って、指定された条件(例えば、イムノアッセイ条件)下で、抗体はその特定の標的に結合し、そしてサンプル中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。結合する特異的結合手段は、標的同一性、高、中又は低結合親和性又は結合活性に関して選択的である。選択的結合は、通常、結合定数又は結合動力学が、サンプル中の競合標的と少なくとも10倍異なる場合、好ましくは差が少なくとも100倍、より好ましくは少なくとも1000倍である場合に達成される。
【０１９１】
特異的結合は、類似の抗原、又は異なる種(アナログ)の同じ抗原との特定の交差反応性を排除しない。例えば、結合実体はまた、好ましくは、前臨床動物研究を容易にするために、ヒト標的に類似するげっ歯類又は霊長類標的と交差反応し得る。
【０１９２】
本明細書で使用される「遺伝子座」という用語は、発現産物をコードするDNAコード配列又はDNAのセグメントを指す(すなわち、ゲノム配列、例えば宿主生物のゲノムの一部、又は、ベクターの一部、例えば、限定された制限部位又は相同領域などの標的部位に組み込まれたもの)。
【０１９３】
制限部位は、適切なリーディングフレームに発現カセットを確実に挿入するように設計され得る。典型的には、外来(本明細書では外因性とも呼ばれる)DNAを、ベクターDNAの１つ以上の制限部位に挿入し、次いでベクターによって伝達性ベクターDNAと共に宿主細胞に運ぶ。
【０１９４】
典型的には、遺伝子座は少なくとも１つの遺伝子を包含する。「遺伝子座」という用語は、遺伝子が活発に転写されるか、又は無傷であることを意味しない。不活性化された遺伝子が包含されてもよい。
【０１９５】
本明細書に記載の特定の実施形態では、トランスジェニック動物の内因性カッパ及びラムダ軽鎖遺伝子座は、機能喪失突然変異、又は内因性κ及び/もしくはλ軽鎖遺伝子座の欠失、又はその一部の欠失などの１つ以上の改変によって非機能的である。
【０１９６】
例示的な適切な改変は、以下のように理解される。カッパ鎖遺伝子座、Vκ2-137の間の3.2Mbゲノム領域全体、Cκ最遠位のVκ遺伝子セグメント、及びJκ5を不活性化するために、Cκ最近位のJκが、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)戦略によって欠失される。これは、Vκ2-137の上流及びJκ5の下流に適切なターゲティング配列を挿入し、続いて介在ゲノム領域のインビトロCre媒介欠失によって行われる。同様のストラテジーを用いて、ラムダ鎖遺伝子座を不活性化する。マウスラムダV遺伝子セグメント(IglV)を含む194Kb領域全体をRMCEによって欠失させる。この場合、適切なターゲティング配列をIglV2の上流及びIglV1の下流に挿入し、続いて介在ゲノム領域のインビトロCre媒介欠失を行う。
【０１９７】
遺伝子座は本明細書中にさらに記載されるように、抗体をコードするエクソンを発現するように操作されてもよい。
【０１９８】
組換え遺伝子座は、部位特異的編集及び/又は組換えのための種々の従来の技術を使用して作製できる。好ましくは、改変された遺伝子座は、例えばCL-L2-CH1をコードする遺伝子セグメントを含むDNAの断片(ここでは「ドナーDNA」と称する)を、宿主生物の重鎖遺伝子座(ここでは「アクセプター対立遺伝子」と称する)のような非ヒト動物免疫グロブリン遺伝子座の改変版に挿入することによって生成される。アクセプター対立遺伝子は、Creリコンビナーゼのような部位特異的DNAリコンビナーゼの認識部位を含み得る(loxP部位、及びloxP部位の変異バージョン)。ドナーDNAは、同じCreリコンビナーゼ認識部位に隣接し得る(5'末端及び3'末端の両方において、例えば、一方の側にloxP部位が存在し、他方の側にloxP部位の変異バージョンが存在する)。Creリコンビナーゼは、アクセプター対立遺伝子へのドナーDNAの挿入を触媒するために使用され得る。
【０１９９】
代替の実施形態において、遺伝子セグメントは、排他的ではないにしても、主に相同組換えによって免疫グロブリン遺伝子座に導入される。そのような実施形態では、抗体をコードする遺伝子セグメントを含む核酸配列に隣接するゲノムターゲティング相同性アーム(すなわち、標的配列と相同であり、標的配列とハイブリダイズすることができる、5'末端及び3'末端の両方のヌクレオチド配列)からなる、ターゲティング配列又はターゲティングベクターが使用される。これらのゲノム相同性アームは、免疫グロブリン遺伝子座への、抗体をコードするDNA(免疫グロブリン重鎖をコードするDNAなど)の挿入を容易にする。
【０２００】
用語「ターゲティング配列」は、改変されるべき免疫グロブリン遺伝子座の領域に隣接しているか、又は近接して生じる、細胞のゲノム中のDNA配列に相同である配列を指す。フランキング配列又は隣接配列は、宿主細胞のゲノム中のコード配列の遺伝子座自体の中、又は上流もしくは下流にあってもよい。ターゲティング配列は、細胞ゲノムに挿入されるべき配列(組換え部位の配列など)が、ベクターのターゲティング配列によって隣接されるように、細胞トランスフェクションにおいて使用するための組換えDNAベクターに挿入される。
【０２０１】
挿入又は欠失等のゲノムにおける遺伝的変化を達成するために相同組換えが使用される多くの場合において、さらなる改変は、所望の結果を達成できる可能性を増加させるために、遺伝子操作された部位特異的エンドヌクレアーゼの使用を含む。このようなエンドヌクレアーゼは、標的ゲノム中のユニークな配列に高度に特異的であるように遺伝子操作することができるため、且つ、認識する部位で二本鎖DNA切断を引き起こすため、価値がある。二本鎖切断は、切断のすぐ近くのDNAと標的化相同性を保有するターゲティングベクターとの相同組換えを促進する。従って、ターゲティングベクターと、ベクターによって標的化される領域内又はその近くのDNAを切断する部位特異的エンドヌクレアーゼとの組合せは、典型的にはターゲティングベクター単独の使用よりもはるかに高い相同組換え効率を生じる。さらに、１つ以上の部位特異的エンドヌクレアーゼ、及び２つの標的化相同性アームを含むターゲティングベクター(一方のアームが欠失されるべき領域の一方の側を標的とし、他方のアームが他方の側を標的とする)の使用を介して、ゲノム欠失の作製を容易にすることが可能である。
【０２０２】
部位特異的組換えは、リコンビナーゼ認識に必要な短い特異的DNA配列が、組換えが起こる唯一の部位であるという点で、一般的な相同組換えとは異なる。部位特異的組換えは、部位を認識し、これらの部位で組換えを触媒するために、特殊なリコンビナーゼを必要とする。多数のバクテリオファージ由来及び酵母由来の部位特異的組換えシステム(各々がリコンビナーゼ及び特異的同族標的部位を含む)が、DNA組み込みの目的のために真核細胞において作用することが示されており、したがって、本明細書に記載されるような使用に適用可能である。これらには、バクテリオファージP1 Cre/lox、酵母FLP-FRT系、及び部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのDre系が含まれる。このようなシステム及び使用方法は、従来技術に十分に記載されている。リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)手順は、野生型及び変異型loxP(又はFRTなど)部位の組み合わせを、適切なリコンビナーゼ(例えば、Cre又はFlp)、ならび負及び/又は正の選択とともに使用することによって促進される。RMCEは、使用される部位が互いに同一である場合、及び/又は選択の非存在下で生じ得るが、挿入反応よりもむしろ切除が有利であり、そして(正の選択を組み込まなければ)適切に変異した細胞についての濃縮がないため、プロセスの効率が低下する。
【０２０３】
チロシンファミリーの他のシステム、例えばバクテリオファージλIntインテグラーゼ、HK2022インテグラーゼ等、及びさらに別のセリンファミリーのリコンビナーゼに属するシステム、例えばバクテリオファージphiC31、R4Tp901インテグラーゼ等は、それらのそれぞれの組換え部位を使用して哺乳動物細胞において作用することが知られており、本明細書に記載の使用にも適用可能である。
【０２０４】
本明細書に記載の方法は特に、同じリコンビナーゼを利用するが、部位間の組換えを促進しない部位特異的組換え部位を利用する。例えば、loxP部位及び変異loxP部位は、宿主のゲノムに組み込まれ得るが、宿主へのCreの導入は、２つの部位に組換えを起こさせず；むしろ、loxP部位は別のloxP部位と組換えられ、そして変異部位は別の同様に変異されたloxP部位とのみ組換えられる。
【０２０５】
リコンビナーゼ媒介カセット交換を促進するために、２クラスの変種リコンビナーゼ部位が利用可能である。一方は、部位の8bpスペーサー領域内に突然変異を有し、他方は13bp逆方向反復に突然変異を有する。
【０２０６】
スペーサー変異体、例えばlox511(Hoess, et al., Nucleic Acids Res., 14:2287, 1986)、lox5171及びlox2272(Lee and Saito, Gene, 216:55, 1998)、m2、m3、m7、及びmil(Langer, et al., Nucleic Acids Res., 30:3067, 2002)等は、それら自体と容易に組み変わるが、野生型部位との組換え速度は著しく低下している。リコンビナーゼ媒介カセット交換によるDNA挿入のためのこの種の変異部位の使用の例は、「Baer and Bode, Curr. Opin. Biotechnol., 12:473, 2001」に見出すことができる。
【０２０７】
逆方向反復変異体は、変種リコンビナーゼ部位の第２クラスを表す。例えば、loxP部位は、変更された塩基を、左逆方向反復(LE変異体)又は右逆方向反復(RE変異体)で含むことができる。LE変異体であるlox71は、左逆方向反復の5'末端に、野生型配列からTACCGに変化した5bpを有する(Araki, Nucleic Acids Res., 25:868, 1997)。同様に、RE変異体であるlox66は、CGGTAに変化した５つの3'末端塩基を有する。逆方向反復変異体は、プラスミド挿入物を染色体DNAに組み込むために使用することができる。例えば、LE変異体は、「ドナー」RE変異体が組み換わる「標的」染色体loxP部位として使用することができる。組換え後、RE部位を含んだDNAのドナー片が、一方の側に二重変異部位(LE及びRE逆方向反復変異の両方を含む)が隣接し、他方の側に野生型部位が隣接するゲノムに挿入されているのが見いだされる(Lee and Sadowski, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 80:1, 2005)。二重変異体は、野生型部位とは十分に異なるため、Creリコンビナーゼによって認識されず、挿入されたセグメントは、２つの部位間のCre媒介性組換えによって切り出すことができない。
【０２０８】
特定の態様において、部位特異的組換え部位は、コード核酸領域又は制御配列とは対照的に、イントロン又は遺伝子間領域に導入可能である。これは、動物細胞のゲノムへの部位特異的組換え部位の挿入の際に、適切な遺伝子発現に必要な任意の制御配列又はコード領域を不注意に破壊することを回避し得る。
【０２０９】
部位特異的組換え部位の導入は、従来の相同組換え技術によって達成されてもよい。このような技術は以下の参照文献に記載されている。例えば、「Sambrook and Russell (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, 3d ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)」及び「Nagy, (2003) Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3d ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)」等。
【０２１０】
ゲノムへの特異的組換えは、当該分野で公知のように、正又は負の選択のために設計されたベクターを使用して促進できる。置換反応を受けた細胞の同定を容易にするために、適切な遺伝子マーカーシステムを使用してもよく、細胞を、例えば、選択培地の使用によって選択する。しかしながら、置換区間の２つの終点にある又はそれに隣接する外来核酸配列をゲノム配列が実質的に含まないことを確実にするために、望ましくは、マーカーシステム/遺伝子は、置き換えられた核酸を含む細胞の選択後に除去される。
【０２１１】
リコンビナーゼは、精製タンパク質として提供されてもよく、又はリコンビナーゼ活性を提供するために、細胞内で一過性に発現される構築物から発現されてもよい。あるいは、マーカー遺伝子及び関連する組換え部位を欠く子孫を産生するために、その細胞を使用してトランスジェニック動物を作製してもよく、このトランスジェニック動物を、前記リコンビナーゼを発現する動物と交配してもよい。
【０２１２】
本明細書において、遺伝子に関する「内因性」という用語は、その遺伝子が細胞に対して天然であること、すなわち、その遺伝子が、非改変細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に存在することを示す。内因性遺伝子は、(天然に見出されるような)野生型細胞中のその遺伝子座に存在する野生型遺伝子であってもよい。内因性遺伝子は、ゲノム中で野生型遺伝子と同じ遺伝子座に存在する場合、改変された内因性遺伝子であってもよい。このような改変された内因性遺伝子の例は、その中に外来核酸が挿入される遺伝子である。内因性遺伝子は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノムなどに存在し得る。
【０２１３】
代替的な実施形態において、遺伝子セグメントは、この系で典型的に使用される相同性指向修復によるよりむしろ、非相同末端結合アプローチを使用するCRISPR/Cas9技術によって、免疫グロブリン遺伝子座に導入される(例えば、He, et al., Nuc. Acids Res., 44:e85, 2016)。
【０２１４】
本明細書中で使用される「ベクター」は、クローン化組換えヌクレオチド配列の(すなわち組換え遺伝子の)転写、及び適切な宿主生物におけるそれらのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列として定義される。ベクターは、プラスミド及びウイルス、ならびに任意のDNA又はRNA分子を含み、自己複製性であるか否かにかかわらず、細胞を形質転換、形質導入、又はトランスフェクトするために使用できる。ベクターは、自己複製ヌクレオチド配列、ならびにゲノム組み込みヌクレオチド配列を含んでもよい。発現ベクターは宿主細胞又はゲノム組み込み部位における自己複製のための起点、１つ以上の選択マーカー(例えば、アミノ酸合成遺伝子又は抗生物質(例えば、ピューロマイシン、ゼオシン(商標)、カナマイシン、G418又はハイグロマイシン)に対する耐性を付与する遺伝子)、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写ターミネーターをさらに含んでもよく、これらの構成要素は、共に作動可能に連結される。
【０２１５】
一般的な種類のベクターは「プラスミド」であり、これは一般に二本鎖DNAの自己完結型分子であり、容易に追加の(外来)DNAを受け入れることができ、適切な宿主細胞に容易に導入されることができる。プラスミドはしばしば、コードDNA及びプロモーターDNAを含み、外来DNAを挿入するのに適した１つ以上の制限酵素認識部位を有する。具体的には、用語「プラスミド」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)を促進するために、DNA又はRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入することができる媒体を指す。
【０２１６】
本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載の抗体などの特定の組換えタンパク質、及びその任意の子孫を産生するように形質転換された一次対象細胞を指すものとする。すべての子孫が親細胞と正確に同一であるわけではないことを理解すべきであるが(意図的又は不注意な突然変異又は環境の相違点のため)、最初に形質転換された細胞と同じ機能性を子孫が保持する限り、このような変化した子孫はこれらの用語に含まれる。「宿主細胞株」という用語は、組換えポリペプチド(組換え抗体等)を産生するために、組換え遺伝子を発現するのに使用される宿主細胞の細胞株を指す。本明細書で使用する「細胞株」という用語は、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。このような宿主細胞又は宿主細胞株は、細胞培養液中で維持されてもよく、及び/又は培養されて、組換えポリペプチドを産生してもよい。
【０２１７】
「単離された」又は「単離」という用語は、核酸、抗体、又は他の化合物に関して本明細書で使用される場合、「実質的に純粋である」形態で存在するように、それが天然に関連する環境から十分に分離された化合物を指すものとする。「単離された」とは、必ずしも、他の化合物又は材料との人工又は合成混合物の排除、又は基本的活性を妨害しない不純物、及び、例えば不完全な精製のために存在し得る不純物の存在の排除を意味するものではない。特に、本明細書中に記載される単離された核酸分子は、化学的に合成されたものを含むことも意味する。
【０２１８】
本明細書に記載される核酸に関して、「単離された核酸」という用語が時に使用される。この用語は、DNAに適用される場合、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接している配列から分離されたDNA分子を意味する。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド又はウイルスベクターのようなベクターに挿入されたDNA分子、又は原核細胞又は真核細胞又は宿主生物のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含んでもよい。RNAに適用される場合、「単離された核酸」という用語は、主として、上記で定義されるような単離されたDNA分子によってコードされるRNA分子を意味する。あるいは、この用語は、天然の状態(すなわち、細胞又は組織中)でそれと会合する他の核酸から十分に分離されたRNA分子を意味することができる。「単離された核酸」(DNA又はRNAのいずれか)は、生物学的又は合成手段によって直接産生され、その産生中に存在する他の成分から分離された分子も表すことができる。
【０２１９】
単離された抗体等のポリペプチド又はタンパク質に関して、用語「単離された」は、特に、それらが天然に関連する物質(例えば、それらが天然環境においてともに、またはそれらが調製される環境、例えば細胞培養においてともに見出される他の化合物等)を含まないか、又は実質的に含まない化合物を指すものとし、その場合、そのような調製は、インビトロ又はインビボで実施される組換えDNA技術による。単離された化合物は、希釈剤又はアジュバントと共に処方されることができ、そしてなお実用的な目的のために単離されてもよい−例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、診断又は治療において使用される場合、薬学的に受容可能なキャリア又は賦形剤と混合されてもよい。
【０２２０】
本明細書中に記載される抗体は、特に、単離された形態で提供され、これは異なる標的抗原に対する他の抗体、及び/又は抗体ドメインの異なる構造配置を含んでいる他の抗体を実質的に含まない。さらに、単離された抗体は組合せ調製物中に含まれてもよく、これは、単離された抗体と、例えば、少なくとも１つの他の抗体(異なる特異性を有するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント等)との組合せを含む。
【０２２１】
具体的には、本明細書に記載の抗体は、実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で使用される「実質的に純粋である」又は「精製された」という用語は、核酸分子又は抗体などの化合物を少なくとも50％(w/w)、好ましくは少なくとも60％、70％、80％、90％、又は95％含む調製物を指すものとする。純度は、その化合物に適切な方法(例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC分析など)によって測定される。
【０２２２】
本明細書中に記載される抗体は、医薬組成物において特に使用され得る。したがって、本明細書に記載の抗体、及び薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物は、本発明に従って、ボーラス注射又は注入として、又は連続注入によって投与することができる。このような投与手段を促進するのに適した医薬キャリアは、当技術分野で周知である。
【０２２３】
薬学的に受容可能なキャリアは一般に、本発明によって提供される免疫グロブリンと生理学的に適合性である、任意の及び全ての適切な溶媒、分散媒、コーティング、等張性及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に受容可能なキャリアのさらなる例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの任意の組合せが含まれる。
【０２２４】
さらなる薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において既知であり、例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences (Gennaro, AR, ed., Mack Printing Co)」に記載されている。液体製剤は、溶液、エマルジョン又は懸濁液であってよく、懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤、防腐剤、及びキレート剤などの賦形剤(添加剤)を含むことができる。
【０２２５】
非経口投与に使用される例示的な製剤には、例えば、溶液、エマルジョン又は懸濁液として、皮下、筋肉内又は静脈内注射に適した製剤が含まれる。
【０２２６】
化合物(例えば、本明細書中に記載されるような抗体)の投与に関して本明細書中で使用される用語「治療的有効量」は、被験体に投与された際、有益な又は所望の結果(臨床結果を含む)を達成するために十分な量又は活性である。したがって、有効量又はその同義の量は、それが適用されている状況に依存する。
【０２２７】
有効量は、疾患又は障害を治療、予防又は阻害するのに十分な化合物の量を意味することが意図される。疾患との関連で、本明細書中に記載される抗体の治療的有効量は、抗体とその標的抗原との相互作用の恩恵を受ける疾患又は状態を、治療、調節、減弱、元に戻す又は影響を及ぼすために特に使用される。
【０２２８】
そのような有効量に対応する化合物の量は、様々な因子(例えば、投与する薬物又は化合物、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害のタイプ、治療される被験体又は宿主の同一性等)に応じて変化するが、それにもかかわらず当業者によってルーチン的に決定することができる。
【０２２９】
「組換え体」という用語は、宿主細胞に天然には存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。組換え分子は、天然に存在しない方法で互いに連結された２つ以上の天然配列を含むことができる。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む。細胞が組換え核酸を受け取る場合、核酸は細胞に対して「外因性」である。
【０２３０】
用語「組換え」は、特に「遺伝子工学によって調製される」又は「遺伝子工学の結果である」ことを意味する。代替的に「操作(改変)される」という用語が使用される。例えば、抗体又は抗体ドメインは、それぞれの親配列を操作して、改変された抗体又はドメインを産生することによって、変異体を生じるように改変されてもよい。組換え宿主は、発現ベクター又はクローニングベクターを特異的に含むか、又は組換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている(特に、宿主に対して外来性であるヌクレオチド配列を使用する)。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主中で発現させることによって産生される。本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、免疫グロブリンを含み、特に、以下のような組換え手段によって、調製され、発現され、作製され、または単離された抗体である：
ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入又は染色体導入した動物(例えば、マウスなどの非ヒト動物)又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、
ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体(例えば、トランスフェクトーマから)、
ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び
ｄ）任意の他の手段(例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む)によって、調製され、発現され、作製され、または単離された抗体。
このような組換え抗体は、例えば、抗体成熟の間に生じる再構成及び変異を含むように操作された抗体を含む。
【０２３１】
「部位特異的組換え」とは、以下の３つの事象のいずれかを含む、２つの適合性組換え部位間での組換え処理を指す：
ａ）組換え部位に隣接する予め選択された核酸の欠失；
ｂ）組換え部位に隣接する予め選択された核酸のヌクレオチド配列の逆位、及び
ｃ）異なる核酸分子上に位置する組換え部位に近接する核酸領域の相互交換。核酸セグメントのこの相互交換は、核酸分子の一方又は両方が円形である場合、組み込み事象を生じることが理解されるべきである。
【０２３２】
「導入遺伝子」という用語は、本明細書において、細胞、特に宿主動物の細胞のゲノムに人工的に挿入されたか、又は人工的に挿入されようとしている遺伝子材料を記述するために使用される。「導入遺伝子」という用語は本明細書で使用される場合、核酸分子、例えば、発現構築物及び/又はターゲティングベクターの形態の核酸を指す。
【０２３３】
「トランスジェニック動物」は非ヒト動物、通常は哺乳動物又は鳥類、例えばげっ歯類、特にマウス又はラットを意味する。他の哺乳動物は、その細胞の一部に染色体又は染色体外エレメントとして存在するか、又はその生殖系列DNA(すなわち、その細胞の大部分又はすべてのゲノム配列において)に安定に組み込まれた外因性核酸配列を有することが想定される。
【０２３４】
実施形態の特定の態様において、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリン領域をさらに含む。例えば、内因性マウス免疫グロブリン領域をヒト免疫グロブリン配列で置換して、薬物発見目的のための部分的又は完全ヒト抗体を作製するための多くの方法が開発されている。このようなマウスの例には、例えば、以下の米国特許に記載されているものが含まれる。米国特許第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号；及び第5,591,669号。
【０２３５】
特に好ましい態様において、本発明のトランスジェニック動物は、米国特許出願公開第2013/0219535号(Wabl及びKilleenによる)に記載されるようなキメラ免疫グロブリンセグメントを含む。このようなトランスジェニック動物は、導入された部分ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、導入された領域は、ヒト可変領域コード配列、及び非ヒト脊椎動物の内因性ゲノムに基づく非コード可変配列を含む。好ましくは、本発明のトランスジェニック細胞及び動物は、内因性免疫グロブリン領域の一部又は全部が除去されたゲノムを有する。
【０２３６】
別の好ましい態様において、動物のゲノム内容は、それらのB細胞が１つの細胞あたり２つ以上の機能的VHドメインを発現できるように改変される(すなわち、WO 2017/035252 A1に記載されるように、細胞は二重特異性抗体を産生する)。
【０２３７】
前述の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしながら、このような実施例は、本発明の１つ以上の実施形態を実施する方法を単に代表するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２３８】
実施例１：IgG Fabフラグメントの結晶構造に基づく最小リンカー２の長さの推定
リンカー２(L2、図2)は、CL(Cκ又はCλ)をCH1に接続する。図３に示すFab構造[PDB 2XKN、EGFR(上皮増殖因子受容体)抗体7A7、IgG1κ mAbのFabフラグメントの結晶構造]に基づくと、CκのCOOH末端とCH1のNH2末端とを連結するために架橋される間隔は、40.9Åである(図3に破線で示す)。Cκ及びCH1の相対位置に起因して、リンカーはC末端及びN末端を連結するために、より長くなければならない。(GGGGS[配列番号３５])4リンカーの理論長さは76Åであり、これは、２つの末端間の距離のカバレージの２倍(81.8Å)未満である。したがって、このケースで示唆される最小リンカー長は、(GGGGS[配列番号３５])4であり、最大は(GGGGS[配列番号３５])16である。
【０２３９】
実施例２：HCAbをコードする発現ベクターのインビトロ検査
scVHAb又はHCAbを発現するトランスジェニックマウスを作製する前に、膜貫通型及び分泌型のHCAbをコードする種々の発現ベクターを構築し、インビトロでの発現について試験した。これらの種々の構築物は、いくつかの点で異なる−L2の長さ、CLの組成(Cκ、Cλ1又はCλ2)、CHの組成(IgG1又はIgG2a)、ならびにコードされたHCAbタンパク質におけるCL及びCH1ドメインの順序(NH-VH-Cκ-L2-CH1-CH2-CH3-TM-COOH これに対して NH-VH-CH1-L2-Cκ-CH2-CH3-TM-COOH)。いくつかの陽性及び陰性対照ベクターも構築し、試験した：細胞表面上で発現することが知られている陽性対照−従来のH2L2 IgG抗体、CH1ドメイン及びいかなるLCも欠くラクダ様IgG、連結されたVκ及びVHを有するがCL又はCH1を有さないscFV IgG抗体。細胞表面上で発現されない陰性対照−従来のIgG抗体であるが、LCを有さない (H2L0)。
【０２４０】
発現ベクターを、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いてHEK 293T細胞にトランスフェクトした。mycタグを有するヒトCD4をコードする発現ベクターを、同時トランスフェクトし、hCD4発現をトランスフェクション効率の対照として使用した。さらに、すべてのHEK 293T細胞を、HCAbの膜結合型を含む抗原受容体の表面発現に必要な共受容体であるマウスCD79a及びCD79b(Igα/Igβ)の両方を発現する構築物と同時トランスフェクトした(Wienands and Engles, Int. Rev. Immunol., 20:679, 2001)。20〜24時間後、細胞を、細胞表面hCD4、マウスIgG1(mIgG1)及びマウスκ軽鎖(mIgκ)について染色し、細胞表面及び細胞内HCAb及びhCD4タンパク質発現を検出するために、フローサイトメトリーで分析した。細胞会合myc、GAPDH及びHCAbならびに分泌されたHCAbのウェスタンブロット(WB)検出のために、細胞を溶解し、トランスフェクションの40〜48時間後に上清を収集した。同じ上清を、分泌されたHCAbをELISAによって定量するためにも使用した。
【０２４１】
Cκを含むHCAbは、細胞表面上に発現される。
図４は、実験の第１ラウンドで使用した発現ベクターを示す。
陽性対照：１．従来のH2L2 IgG抗体、２．CH1ドメイン及びLCを欠くラクダ様IgG、３．連結されたVκ及びVHを有するがCL又はCH1を有さないscFV IgG抗体。
本明細書に記載のHCAb：４．NH-VH-Cκ-L2-CH1-CH2-CH3-TM-COOH
Cκ及びCH1ドメインの順序がHCAbにおいて逆であることを除いて、本明細書中に記載のHCAb：５．NH-VH-CH1-L2-Cκ-CH2-CH3-TM-COOH
陰性対照：LCを含まない従来のIgG抗体(H2L0)。
【０２４２】
図５は、フローサイトメトリーによる、目的のタンパク質の細胞表面発現の分析を示す。hCD4を発現する細胞の頻度は、全てのトランスフェクトされた細胞株において同様であり(61〜64％の範囲)、全ての場合において同様のトランスフェクション効率を示した(上の列)。予想されたように(中央の列)、陽性対照である、従来のmIgG1（１）、ラクダ様Ab（２）及びscFv（３）は、全て細胞表面上で発現された。本明細書に記載のHCAb（４）は同様に発現した；しかしながら、HCAb中のCκ及びCH1ドメインの順序が逆転した場合（５）、もはや細胞表面発現はなかった。発現レベルと相関する、細胞表面mIgG1染色の平均蛍光強度(MFI)は、異なる構築物によって変化した(表１)。
軽鎖を有さない従来のIgG1である陰性対照（６）は、細胞表面上で発現されなかった。予想通り、表面mIgκの発現は、構築物１及び４でのみ観察された(それらがCκを有する表面発現HCAbであるため)。細胞表面mIgG1発現の欠如が、タンパク質が細胞内で分解されているためではないことを確実にするために、トランスフェクタントを固定し、透過処理し、同じ抗体パネルを用いて細胞内タンパク質について染色した(図６、これらのサンプルについての細胞内mIgG1染色のMFIを、表２に示す)。構築物５及び６でトランスフェクトされた細胞は、豊富な細胞内mIgG1重鎖を含有したが、それは細胞表面上で発現されなかった。したがって、いくつかの活性メカニズムが、これらの分子を細胞の内部に保持しているはずである。構築物６によってコードされるH2L0 HCAbについて、この保持は部分的に折り畳まれていないCH1ドメインとERシャペロンBiPとの会合によって引き起こされることが知られている(Haas and Wabl, Nature, 306:387, 1983；Bole, et al., J Cell Biol. 102:1558, 1986)。
【０２４３】
【表１】
0006951545.tif 000002
【０２４４】
【表２】
0006951545.tif 000003
【０２４５】
Cλ1又はCλ2を含むHCAbも細胞表面上に発現される。
HCAb中のCLドメインを変更する影響についても、図７Ａに描写される構築物を使用して試験した。陽性対照構築物１は、ラクダ様IgG1をコードし、構築物２〜４はそれぞれCκ、Cλ1及びCλ2を有する本明細書に記載のHCAbをコードする。MFIは変化したが(表３)、全てのHCAbは細胞表面上で発現した(図８、中央の列)。Cλ3はここでは試験されなかったが、Cλ2及びCλ3のアミノ酸配列はほぼ同一である(99％アミノ酸同一性)ので、結果はCλ2と同じであると予想される。構築物３をコードする融合遺伝子の概略を、図７Ｂに示す。この構築物中のVHエクソンは、VH3-11、DH2-21及びJH4によってコードされ、CLエクソンは、Cλ1によってコードされ、CH及びヒンジ(H)エクソンは、IgG1由来である。当業者は、任意のVH、DH、JH、CL又はCH遺伝子を挿入して、ここに示されている構築物のそれぞれの構成要素と置き換えることができることを認識するであろう。
【０２４６】
【表３】
0006951545.tif 000004
【０２４７】
HCAbの分泌
HEK 293T細胞はまた、WB(図９及び図１０)及び酵素結合免疫測定法(ELISA、図１２)によってHCAb分泌を試験するために、図７に描写される構築物の分泌形態でトランスフェクトされた。L2長さを6から10反復に変更し、CHドメインをIgG1からIgG2aに変更する影響もこれらの実験で調べた。トランスフェクション効率のためのWBコントロール(抗Myc抗体)及びローディングコントロール(抗GAPDH抗体)を図１１に示す。
【０２４８】
ラクダ様Abは、WBによって評価されるように最良の分泌を示した(図９左、レーン１、非還元条件；図１０左、レーン１、還元条件)。試験したHCAb構築物のうち、Cλ1及びGGGGS(配列番号３５)10反復のリンカーを有するmIgG1をコードするものは、最良の分泌を示した(図９左、レーン４、非還元条件；図１０左、レーン４、還元条件)。リンカー長を６反復から１０反復に増加させることは、おそらくハイブリッドHCAb分子のフォールディング及びERシャペロンからのそのリリースを改善することによって、VH-Cκ HCAbの分泌も改善した(図９の左パネル、レーン２及び３を比較)。HCAb分泌は、リンカー長をさらに増加させることによって、さらに改善され得る。ラクダ様Abと比較して比較的低いレベルのHCAb分泌は、HCAbの細胞内タンパク質複合体の形成に起因し得る。これらの高分子量バンドは、ラクダ様の溶解物(ライセート)よりも、mIgG1 HCAb発現トランスフェクタントの細胞溶解物においてより豊富であることが分かる(図９、右パネルにおいてレーン１をレーン２〜５と比較)。これらはジスルフィド結合複合体であり、還元条件下で消失するので非特異的凝集体ではない(図１０、右パネル)。
【０２４９】
ELISAアッセイを使用して、WBによって分析した同じ上清中のHCAbを定量した(図１２)。WBデータと一致して、Cλ1及びGGGGS(配列番号３５)10反復リンカーを有するmIgG1が、HCAbの中で最良の分泌(〜840ng/ml)を示し、これはラクダ様抗体よりも〜3.8倍少ないだけであった。
【０２５０】
実施例３：HCAbの産生のために、マウスCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを、Ighmの上流の内因性マウスIgh遺伝子座に導入するための相同組換えの使用
HCAbの生成のためにCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを導入するための例示的な方法を、図１３に示す。
【０２５１】
ターゲティングベクターが、図１３Ａ、Ｂに示される(Ａ及びＢと表記され、この図において破線でつながっているセグメントは、ターゲティングベクター中で連続している)。カセットのCL構成要素は、CκもしくはCλ(Cλ1、Cλ2、又はCλ3)のどちらかをコード化することができる。(リンカー１含有カセットである、L1-CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMも本明細書に記載され、同一の様式で導入できることに留意)
【０２５２】
相同組換えターゲティングベクターの２つの必須構成要素は、短い相同アーム(SHA)及び長い相同アーム(LHA)であり、これらは、改変される内因性遺伝子座の領域に隣接する相同DNAセグメントとの配列同一性をシェアする(図１３Ｃ)。この場合、SHAは、対応するマウスJh非コード配列に隣接するヒトJH2-JH6遺伝子セグメントからなる(配列番号２)。LHAは、5'イントロンで始まり、3' UTRで終結するIghm遺伝子全体からなる(配列番号２１)。5'末端から始まるターゲティングベクターの他の注目すべき特徴には、以下のものが含まれる：１）Pgk_TK_pA(配列番号１)、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(Pgk)によって駆動され、ポリA部位(pA)を含む、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子。このエレメントは、ターゲティングベクターを組み込んだものの、相同組換えによってではない細胞に対して、ガンシクロビルを用いた負の選択のために使用される。そのような細胞は、HSV-TK遺伝子を保持し、死滅されることになる。２）T3バクテリオファージRNAポリメラーゼのためのT3プロモーター(配列番号３)。このDNA依存性RNAポリメラーゼは、T3ファージプロモーターに非常に特異的である。99KDの酵素はインビトロRNA合成を触媒し、これは、少数のB細胞又はハイブリドーマからのVDJ再構成の迅速なクローニングを可能にする。３）CAG_PuroR_pA、強力なCAGプロモーターによって駆動され、ポリA部位を含むピューロマイシン耐性遺伝子(配列番号５)。このエレメントは、ピューロマイシン耐性に基づくターゲティングベクターを組み込んだ細胞の陽性選択のために使用される。４）ターゲティングベクターをそれらのゲノムに安定に組み込んだ細胞は、ガンシクロビル及びピューロマイシンの両方に対して耐性であることに留意。５）CAG_ PuroR_pAエレメントは、適切に標的化されたES細胞クローンの同定後に、Flpリコンビナーゼを供給することによってインビトロ又はインビボでこのエレメントを除去するために使用され得るFRT部位(配列番号４及び配列番号６)に隣接することに留意。Eμエンハンサー(配列番号７)は、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの上流に含まれ、遺伝子座の転写を促進する。これは、ターゲティングベクターにおいて、Ighm LHA(配列番号２１)によって追跡される。ターゲティングベクターは、内因性Igh遺伝子座に存在するμスイッチ(S)領域を欠いており、その結果、標的とされた遺伝子座もS領域を欠くことになり、したがって、アイソタイプスイッチングを受けることができない。ターゲティングベクターは、エレクトロポレーションによってES細胞に導入される。細胞を、ガンシクロビル及びピューロマイシンを補充した培地中で増殖させる。次いで、新たに導入されたCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの5'及び3'内に位置するプライマーを用いて、広く実施されている遺伝子ターゲティング戦略を使用するゲノムPCRによって、生存している単離されたES細胞クローンを、遺伝子ターゲティングの成功についてモニターする。ターゲティングカセットの適切な組み込みは、さらに、SHAの5'側に隣接するDNA配列にマッピングするプローブ、LHAの3'側に隣接するDNA配列にマッピングする第２のプローブ、及び、ベクターにおいてゲノム同一性の２つのアーム間の新規DNA内にマッピングする第３のプローブを使用するゲノムサザンブロットによって検証される。(適切に標的化された遺伝子座の構造が、図１３ＤとＥに示される。Ｄ及びＥとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、ES細胞のIgh遺伝子座において近接していることに留意)
【０２５３】
PCR及びサザンブロットで検証されたES細胞クローンの核型は、最も一般的に起こりうる染色体異常(マウスES細胞で生じる)を見分けるために設計されたin situ蛍光ハイブリダイゼーション法を用いて分析される。このような異常を有するクローンは、さらなる使用から除外される。PCR及びサザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断され、核型分析に基づいて検出可能な染色体異常も有さないES細胞クローンを、さらなる使用のために選択する。
【０２５４】
マウス重鎖遺伝子座に適切に標的化されたCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを有するES細胞クローンを、株DBA/2由来のマウス胚盤胞にマイクロインジェクションして、標準的な手順に従って部分的にES細胞由来のキメラマウスを作製する。それらのコート(coat)への最高レベルのES細胞由来の寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。ここで選択される雌マウスは、生殖系列においてFlpリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を保有するC57B1/6NTac株のものである。これらの交配からの子孫を、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの存在について、及びFRT隣接ピューロマイシン耐性遺伝子の喪失について分析する。(図１３のＦ，Ｇ：Ｆ及びＧとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、インビボでIgh遺伝子座において近接していることに留意) 正しく標的化されたマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。
【０２５５】
実施例４：scVHAbの産生のために、マウスCL-L2-CH1_S-TM遺伝子カセットを、Ighmの上流の内因性マウスIgh遺伝子座に導入するための相同組換えの使用
この実施例は、遺伝的に改変されたマウスが、HCAbの代わりにscVHAbを産生することを除いて、実施例３と全ての点において同一である。これは、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMの代わりにCL-L2-CH1_S-TMの構造を有するように遺伝子カセット(ターゲティングベクター)を改変することによって達成される。ターゲティングベクターの構造及び配列は、その他の点では実施例３と同じであり、同様に、ベクターをES細胞に導入し、正しい相同組換えについて選択及び分析し、マウスのコロニーを確立するための方法が使用される。(リンカー１を含むカセット、本明細書にも記載の、L1-CL-L2-CH1_S-TMが、同じ方法で導入できることに留意されたい)
【０２５６】
実施例５：リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を用いて、HCAb産生のために、Ighmの上流にある内因性マウスlgh遺伝子座に、マウスCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを導入する
【０２５７】
実施例５Ａ：RMCEアクセプター対立遺伝子の作製
ここでの目的は、Eμの下流及びIghmの上流の内因性Igh遺伝子座の領域に、上流に変異FRT部位及び変異LoxP部位が隣接し、下流にWT FRT部位及びWT LoxP部位が隣接するpuro_TK融合遺伝子を導入することである(図１４Ｂ)。この配置において、変異及びWTのFRT又はLoxP部位は、Flp又はCreリコンビナーゼの存在下で組み換わることはできないが、対応する変異及びWT部位をそれぞれその5'及び3'末端に有するドナーDNAの断片を組み込むことができる(図１４Ａ)。puro_TK融合遺伝子は、図１３と同じSHA及びLHAを用いた相同組換えによって導入される。ターゲティングベクターのさらなる特徴は、SHAの5'末端上流にジフテリア毒素Ａ(DTA)遺伝子(配列番号３４)が存在することである。このエレメントは、ターゲティングベクターを組み込んだが相同組換えによるものではない細胞に対する負の選択のために使用され；このような細胞は、DTA遺伝子を保持し、毒素が発現されると死滅する。
【０２５８】
ターゲティングベクターをエレクトロポレーションによってES細胞に導入し、そして細胞を、ピューロマイシンを補充した培地中で増殖させる。次いで、生存している単離されたES細胞クローンを、新たに導入されたpuro_TK融合遺伝子カセットの5'及び3'内に位置するプライマーを用いて、広く実施されている遺伝子ターゲティング戦略を使用するゲノムPCRによって、遺伝子ターゲティングの成功についてモニターする。標的とされた遺伝子座の構造はさらに、SHAの5'側に隣接するDNA配列にマッピングするプローブ、LHAの3'側に隣接するDNA配列にマッピングする第２のプローブ、及び、ベクターにおいてゲノム同一性の２つのアーム間の新規DNA内にマッピングする第３のプローブを使用するゲノムサザンブロットによって検証される。(適切に標的化された遺伝子座の構造を図１４Ｃに示す)
【０２５９】
ES細胞のPCR及びサザンブロット陽性クローンの核型を、最も一般的に発生する染色体異常(マウスES細胞において生じる)を識別するように設計されたin situ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して分析する。このような異常を有するクローンは、さらなる使用から除外される。PCR及びサザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断され、核型分析に基づいて検出可能な染色体異常も有さないES細胞クローンを、以下に記載するさらなる使用のために選択する。
【０２６０】
実施例５Ｂ：リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)によるCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの導入
RMCEターゲティングベクター(図１５Ａ)は、ベクターが5'末端で変異FRT及び変異LoxP部位によって隣接し、3'末端でWT FRT及びWT LoxP部位に隣接することを除いて、図１３Ａ，Ｂに示す相同領域と配列が同一である。(本明細書中に記載されるL1-CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMカセットもまた、同一の様式で導入できることに留意)
【０２６１】
ベクターを、CRE又はFlpリコンビナーゼの一過性発現のためのベクターと共に実施例５Ａで作製したRMCE-改変ES細胞(図１５Ｂ)に導入し、ターゲティングベクターを組み込み、その結果、図１５Ｃ，Ｄに示すゲノム構造が得られる(Ｃ及びＤとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、インビボでIgh遺伝子座において近接していることに留意)。RMCEによってターゲティングベクターを正しく組み込んでいないES細胞は、Puro_TK遺伝子を保持し、増殖培地にガンシクロビルを添加することによって死滅する。
【０２６２】
次いで、新たに導入されたCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの5'及び3'内に位置するプライマーを用いて、広く実施されている遺伝子ターゲティング戦略を使用するゲノムPCRによって、生存する単離されたES細胞クローンを、遺伝子ターゲティングの成功についてモニターする。標的にされた遺伝子座の構造を、5'側、3'側に隣接する、及び新規DNA内にあるDNA配列をマップするプローブを用いて、ゲノムサザンブロットによってさらに検証する。
【０２６３】
ES細胞のPCR及びサザンブロット陽性クローンの核型を、最も一般的に発生する染色体異常(マウスES細胞において生じる)を識別するように設計されたin situ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して分析する。このような異常を有するクローンは、さらなる使用から除外される。PCR及びサザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断され、核型分析に基づいて検出可能な染色体異常も有さないES細胞クローンを、さらなる使用のために選択する。
【０２６４】
マウス重鎖遺伝子座に適切に標的化されたCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを有するES細胞クローンを、DBA/2株由来のマウス胚盤胞にマイクロインジェクションして、標準的な手順に従って、部分的にES細胞に由来するキメラマウスを作製する。それらのコート(coat)への最高レベルのES細胞由来の寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。これらの交配からの子孫を、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットの存在について分析する。正しく標的化されたマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。
【０２６５】
実施例６：scVHAbの産生のために、Ighmの上流の内因性マウスIgh遺伝子座にマウスCL-L2-CH1_S-TM遺伝子カセットを導入するためのリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)の使用
この実施例は、遺伝的に改変されたマウスが、HCAbの代わりにscVHAbを産生することを除いて、実施例５と全ての面において同一である。これは、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMの代わりにCL-L2-CH1_S-TMの構造を有するようにターゲティングベクターを改変することによって達成される。ターゲティングベクターの構造及び配列は、他の点では実施例５と同じであり、ベクターをES細胞に導入し、正しい相同組換えについて選択及び分析を行い、マウスのコロニーを確立するために使用される方法による。(本明細書に記載されるL1-CL-L2-CH1_S-TMカセットもまた、同一の様式で導入できることに留意)
【図１】
0006951545.tif 000005
【図２Ａ】
0006951545.tif 000006
【図２Ｂ】
0006951545.tif 000007
【図３】
0006951545.tif 000008
【図４】
0006951545.tif 000009
【図５】
0006951545.tif 000010
【図６】
0006951545.tif 000011
【図７Ａ】
0006951545.tif 000012
【図７Ｂ】
0006951545.tif 000013
【図８】
0006951545.tif 000014
【図９】
0006951545.tif 000015
【図１０】
0006951545.tif 000016
【図１１】
0006951545.tif 000017
【図１２】
0006951545.tif 000018
【図１３−１】
0006951545.tif 000019
【図１３−２】
0006951545.tif 000020
【図１３−３】
0006951545.tif 000021
【図１３−４】
0006951545.tif 000022
【図１４Ａ】
0006951545.tif 000023
【図１４Ｂ】
0006951545.tif 000024
【図１４Ｃ】
0006951545.tif 000025
【図１５−１】
0006951545.tif 000026
【図１５−２】
0006951545.tif 000027
【図１５−３】
0006951545.tif 000028
【図１６−１】
0006951545.tif 000029
【図１６−２】
0006951545.tif 000030
【図１６−３】
0006951545.tif 000031
【図１６−４】
0006951545.tif 000032
【図１６−５】
0006951545.tif 000033
【図１６−６】
0006951545.tif 000034
【図１６−７】
0006951545.tif 000035
【図１６−８】
0006951545.tif 000036
【図１６−９】
0006951545.tif 000037
【図１６−１０】
0006951545.tif 000038
【図１６−１１】
0006951545.tif 000039
【配列表】
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