【手続補正書】
【提出日】平成29年12月19日(2017.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｎ−１培養容器で目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養して、少なくとも２５×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度を達成すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた細胞を、少なくとも８．５×１０６生細胞／ｍｌの播種密度でＮ培養容器に接種すること；及び
（ｃ）目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で前記細胞を前記Ｎ培養容器で培養すること
を含み、ここで、工程（ａ）における培養に、生細胞密度に基づいて決定されたレベルで栄養分を補充し、そして工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が約５０ｍＭ〜約２Ｍであることを特徴とする、目的のタンパク質の生産方法。
【請求項２】
工程（ａ）の間に、前記培養の生細胞密度を定期的に測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記栄養分が、アミノ酸、亜鉛、鉄、及び銅を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、及びＣＯＳ細胞から成る群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
廃棄物を、工程（ａ）の間に除去する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記廃棄物の除去を、ろ過、遠心分離、傾斜細胞沈澱器、交互接線流、または接線流によって行う請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも３５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも４０×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも５０×１０６生細胞／ｍｌ、または少なくとも６０×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における培養の生細胞密度を、１秒当たり１〜１０回測定する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約１．８μＭ〜約１ｍＭ、約５μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、または約５０μＭ〜約０．５ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、
（ｉ）鉄キレート剤の存在下で約０．１μＭ〜約１０ｍＭ、約０．１μＭ〜約５ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約５ｍＭ、または約５００μＭ〜約１ｍＭ；あるいは
（ｉｉ）鉄キレート剤の非存在下で約２μＭ〜約１０ｍＭ、約２μＭ〜約５ｍＭ、約５μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約５ｍＭ、または約１００μＭ〜約１ｍＭ
である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．００８μＭ〜約１ｍＭ、約０．０５μＭ〜約１ｍＭ、約０．０５μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、または約１００μＭ〜約０．２ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）のＮ−１培養容器における培養を灌流する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記灌流量が、約０．０１ｎＬ／細胞／日〜約０．２ｎＬ／細胞／日である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎ培養容器における細胞によって生産される目的のタンパク質を捕集する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）の培養をフェドバッチモードで行う請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）のＮ培養容器における培養を灌流する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
目的のタンパク質生産物が抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
目的のタンパク質生産物が、抗体、融合タンパク質、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＲＴ、Ｌｉｎｇｏ、ａＢＤＣＡ２、抗ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＸ−１００、Ｔｗｅａｋ、ダクリズマブ、ペグ化インターフェロン、インターフェロン、エタナーセプト、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｉｔｕｘａｎ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、またはＣＤ２０に結合するあらゆるものである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｎ培養容器が少なくとも８．５×１０６生細胞／ｍｌ、少なくとも１０×１０６生細胞／ｍｌ、１５×１０６生細胞／ｍｌ、２０×１０６生細胞／ｍｌ、２５×１０６生細胞／ｍｌ、または３０×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）の培養を約３日〜約８日間維持する請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）の培養を約８日〜約２３日間維持する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｎ−１培養容器の体積が約５０リットル〜約２０，０００リットル、約５０リットル〜約１０，０００リットル、約１００リットル〜約１０，０００リットル、約１００リットル〜約４，０００リットル、約２００リットル〜約２０，０００リットル、約２００リットル〜約１０，０００リットル、約１０００リットル〜約１０，０００リットル、または約１０００リットル〜約５，０００リットルである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が、約７５ｍＭ〜約１Ｍ、または約７５ｍＭ〜約５００ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
廃棄物を灌流培養における工程（ａ）の間に除去し、ここで工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が約７５ｍＭ〜約５００ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．１ｍＭ未満に維持する請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）の培養のｐＨを約６．８〜約７．４または約６．９〜約７．３に維持する請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
また、本発明は、本発明の方法によって生産されるバイオプロダクトにも関する。いくつかの実施形態では、そのバイオプロダクトは抗体または抗体様ポリペプチドである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）Ｎ−１培養容器で目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養して、少なくとも２５×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度を達成すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた細胞を、少なくとも８．５×１０６生細胞／ｍｌの播種密度でＮ培養容器に接種すること；及び
（ｃ）目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で前記細胞を前記Ｎ培養容器で培養すること
を含み、ここで、工程（ａ）における培養に、生細胞密度に基づいて決定されたレベルで栄養分を補充し、そして工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が約５０ｍＭ〜約２Ｍであることを特徴とする、目的のタンパク質の生産方法。
（項目２）
工程（ａ）の間に、前記培養の生細胞密度を定期的に測定する項目１に記載の方法。
（項目３）
前記栄養分が、アミノ酸、亜鉛、鉄、及び銅を含む項目２に記載の方法。
（項目４）
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、及びＣＯＳ細胞から成る群より選択される項目１〜３のいずれか一つに記載の方法。
（項目５）
廃棄物を、工程（ａ）の間に除去する項目１〜４のいずれか一つに記載の方法。
（項目６）
前記廃棄物の除去を、ろ過、遠心分離、傾斜細胞沈澱器、交互接線流、または接線流によって行う項目１〜５のいずれか一つに記載の方法。
（項目７）
少なくとも３０×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜６のいずれか一つに記載の方法。
（項目８）
少なくとも３５×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜７のいずれか一つに記載の方法。
（項目９）
少なくとも４０×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜８のいずれか一つに記載の方法。
（項目１０）
少なくとも５０×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜９のいずれか一つに記載の方法。
（項目１１）
少なくとも６０×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
（項目１２）
工程（ａ）における培養の生細胞密度を、１秒当たり１回測定する項目２〜１１のいずれか一つに記載の方法。
（項目１３）
工程（ａ）における培養の生細胞密度を、１秒当たり１０回測定する項目２〜１１のいずれか一つに記載の方法。
（項目１４）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約１．８μＭ〜約１ｍＭである項目１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
（項目１５）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約５μＭ〜約１ｍＭである項目１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
（項目１６）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約１０μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
（項目１７）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約５０μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜１６のいずれか一つに記載の方法。
（項目１８）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約０．１μＭ〜約１０ｍＭまたは鉄キレート剤の非存在下で約２μＭ〜約１０ｍＭである項目１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
（項目１９）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約０．１μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
（項目２０）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約１μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
（項目２１）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約１０μＭ〜約５ｍＭである項目１〜２０のいずれか一つに記載の方法。
（項目２２）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約５００μＭ〜約１ｍＭである項目１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
（項目２３）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約２μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
（項目２４）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約５μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１９及び項目２３のいずれか一つに記載の方法。
（項目２５）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約１０μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１９、項目２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
（項目２６）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約１００μＭ〜約１ｍＭである項目１〜１９及び項目２３〜２５のいずれか一つに記載の方法。
（項目２７）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．００８μＭ〜約１ｍＭである項目１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
（項目２８）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．０５μＭ〜約１ｍＭである項目１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
（項目２９）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．０５μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
（項目３０）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約１０μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
（項目３１）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約１００μＭ〜約０．２ｍＭである項目１〜３０のいずれか一つに記載の方法。
（項目３２）
工程（ａ）のＮ−１培養容器における培養を灌流する項目１〜３１のいずれか一つに記載の方法。
（項目３３）
前記灌流量が、約０．１ｎＬ／細胞／日である項目１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
（項目３４）
前記灌流量が、約０．０５ｎＬ／細胞／日である項目１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
（項目３５）
灌流が交互接線流である項目１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
（項目３６）
灌流が接線流である項目１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
（項目３７）
前記Ｎ培養容器における細胞によって生産される目的のタンパク質を捕集する工程を更に含む項目１〜３６のいずれか一つに記載の方法。
（項目３８）
工程（ｃ）の培養をフェドバッチモードで行う項目１〜３７のいずれか一つに記載の方法。
（項目３９）
工程（ｃ）のＮ培養容器における培養を灌流する項目１〜３７のいずれか一つに記載の方法。
（項目４０）
目的のタンパク質生産物が抗体である項目１〜３９のいずれか一つに記載の方法。
（項目４１）
目的のタンパク質生産物が、抗体、融合タンパク質、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＲＴ、Ｌｉｎｇｏ、ａＢＤＣＡ２、抗ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＸ−１００、Ｔｗｅａｋ、ダクリズマブ、ペグ化インターフェロン、インターフェロン、エタナーセプト、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｉｔｕｘａｎ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ（またはＣＤ２０に結合するあらゆるもの）である項目１〜４０のいずれか一つに記載の方法。
（項目４２）
前記Ｎ培養容器が約８．５×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４３）
前記Ｎ培養容器が約１０×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４４）
前記Ｎ培養容器が約１５×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４５）
前記Ｎ培養容器が約２０×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４６）
前記Ｎ培養容器が約２５×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４７）
前記Ｎ培養容器が約３０×１０６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４８）
工程（ａ）の培養を約３日〜約８日間維持する項目１〜４７のいずれか一つに記載の方法。
（項目４９）
工程（ｃ）の培養を約８日〜約２３日間維持する項目１〜４８のいずれか一つに記載の方法。
（項目５０）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約５０リットル〜約２０，０００リットルである項目１〜４９のいずれか一つに記載の方法。
（項目５１）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約５０リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５０のいずれか一つに記載の方法。
（項目５２）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約１００リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５１のいずれか一つに記載の方法。
（項目５３）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約１００リットル〜約４，０００リットルである項目１〜５２のいずれか一つに記載の方法。
（項目５４）
前記Ｎ培養容器の体積が約２００リットル〜約２０，０００リットルである項目１〜５３のいずれか一つに記載の方法。
（項目５５）
前記Ｎ培養容器の体積が約２００リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５４のいずれか一つに記載の方法。
（項目５６）
前記Ｎ培養容器の体積が約１０００リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５５のいずれか一つに記載の方法。
（項目５７）
前記Ｎ培養容器の体積が約１０００リットル〜約５，０００リットルである項目１〜５６のいずれか一つに記載の方法。
（項目５８）
工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が、約７５ｍＭ〜約１Ｍである項目１〜５７のいずれか一つに記載の方法。
（項目５９）
工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭである項目１〜５８のいずれか一つに記載の方法。
（項目６０）
廃棄物を灌流培養における工程（ａ）の間に除去し、ここで工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が約７５ｍＭ〜約５００ｍＭである項目１〜５７のいずれか一つに記載の方法。
（項目６１）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１５ｍＭ未満に維持する項目１〜６０のいずれか一つに記載の方法。
（項目６２）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１０ｍＭ未満に維持する項目１〜６１のいずれか一つに記載の方法。
（項目６３）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１ｍＭ未満に維持する項目１〜６２のいずれか一つに記載の方法。
（項目６４）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において０．１ｍＭ未満に維持する項目１〜６３のいずれか一つに記載の方法。
（項目６５）
工程（ａ）の培養のｐＨを約６．８〜約７．４に維持する項目１〜６４のいずれか一つに記載の方法。
（項目６６）
工程（ａ）の培養のｐＨを約６．９〜約７．３に維持する項目１〜６５のいずれか一つに記載の方法。