【手続補正書】
【提出日】平成30年10月30日(2018.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、遺伝子構築物：
第１ＤＮＡ要素であって、
ＣＲＩＳＰＲガイド配列、および
足場配列
を含む、前記第１ＤＮＡ要素；
第１ＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることができる、前記適合末端要素；
バーコード要素；
バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることができるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および
第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する分離部位であって、ここで、前記ＤＮＡ要素、第１適合末端要素、および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、バーコード要素、第３適合末端要素、および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【請求項２】
第１ＤＮＡ要素の上流にプロモーター要素をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項４】
以下を含む、遺伝子構築物：
複数のＤＮＡ要素であって、ここで該複数のＤＮＡ要素の各ＤＮＡ要素は、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列を含む、前記複数のＤＮＡ要素；
複数のＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることができる、前記適合末端要素；
複数のバーコード要素；
複数のバーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることができるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および
複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する、分離部位。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子構築物、および
ＣＲＩＳＰＲガイド配列の各々の上流に位置するプロモーター配列、
を含む、ベクター。
【請求項６】
コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法：
（ａ）以下を含む第１遺伝子構築物を含有するベクターを提供すること：
ＣＲＩＳＰＲガイド配列；
ＣＲＩＳＰＲガイド配列に隣接する第２適合末端要素および第１制限酵素のための第１認識部位；
バーコード要素；および
バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第２制限酵素のための第２認識部位；
（ｂ）第１遺伝子構築物を第１認識部位で切断して、第５適合末端要素を生じ、ベクターを第２認識部位で切断して、第６適合末端要素を生じること；
（ｃ）以下を含む足場要素を提供すること：
足場配列；
第１適合末端要素および第４適合末端要素を含む、分離部位；および
足場要素に隣接する第７適合末端要素および第８適合末端要素、ここで第７適合末端要素は、第５適合末端要素にアニーリングすることができ、第８適合末端要素は、第６適合末端要素にアニーリングすることができる；
（ｄ）足場要素を、切断された第１遺伝子構築物にアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることができる、ベクターおよび足場要素内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、足場要素はＣＲＩＳＰＲガイド配列とバーコード要素の間に組み込まれ、分離部位は、足場配列とバーコード要素の間に位置し、こうしてコンビナトリアルベクターが作製される；
任意に、ここで、第１認識部位と第２認識部位は、同一の認識部位配列を有し、第１制限酵素と第２制限酵素が、同一の制限酵素である。
【請求項７】
以下をさらに含む、請求項６に記載の方法：
（ａ）ベクターを、足場要素内の分離部位で切断して、第１適合末端要素および第４適合末端要素を生じること；
（ｂ）以下を含む第２遺伝子構築物を提供すること：
ＣＲＩＳＰＲガイド配列；
足場配列；
バーコード要素；および
第２遺伝子構築物に隣接する第２適合末端要素および第３適合末端要素、ここで第２遺伝子構築物の第２適合末端要素は、ベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第２遺伝子構築物の第３適合末端要素は、ベクターの第４適合末端要素にアニーリングすることができる；
（ｃ）第２遺伝子構築物を切断ベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることができる、第２遺伝子構築物およびベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後に、第２遺伝子構築物はベクター内に組み込まれて、こうして、連結されたバーコード要素および連結されたＣＲＩＳＰＲガイドと足場配列を含むコンビナトリアルベクターが作製される；
任意に、ここで、方法は反復的である。
【請求項８】
コンビナトリアルベクターが、ＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流にプロモーター要素をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下を含む、遺伝子構築物：
少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲガイド配列；
バーコード要素；および
各ＣＲＩＳＰＲガイド配列の間、およびバーコード要素と該バーコード要素に最も近いＣＲＩＳＰＲガイド配列との間に位置する、制限認識部位。
【請求項１０】
以下を含む、遺伝子構築物：
複数のＤＮＡ要素であって、各々が
ＣＲＩＳＰＲガイド配列；および
足場配列；
を含む、前記複数のＤＮＡ要素；
バーコード要素；および
前記複数のＤＮＡ要素の各ＤＮＡ要素の上流に位置するプロモーター配列。
【請求項１１】
バーコード要素が、遺伝子構築物の５’末端に位置する、または、バーコード要素が、遺伝子構築物の３’末端に位置する、請求項９または１０に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子構築物のいずれかを含む、ベクター。
【請求項１３】
コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法：
（ａ）以下を含むベクターを提供すること：
複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列；
バーコード要素、ここでバーコード要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の下流に位置する；
任意に、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列；および
複数の制限酵素のための複数の認識部位、ここで複数の認識部位の各々は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの下流に位置する；
（ｂ）ベクターを、複数の認識部位の少なくとも１つにおいて、複数の制限酵素の少なくとも１つで切断して、第１適合末端要素および第２適合末端要素を生じること；
（ｃ）以下を含む第１足場要素を提供すること：
足場配列、
任意にプロモーター配列、および
第１足場要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素、ここで第３適合末端要素は、切断されたベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第４適合末端要素は、切断されたベクターの第２適合末端要素にアニーリングすることができる；
（ｄ）第１足場要素を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、第１足場要素および切断されたベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、第１足場要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの下流に組み込まれ、こうしてコンビナトリアルベクターが生成される；
任意に、ここで、方法は反復的である。
【請求項１４】
コンビナトリアルベクターを生成するための、以下を含む方法：
（ａ）以下を含むベクターを提供すること：
複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列、
バーコード要素、ここでバーコード要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の上流に位置する、
任意に、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の少なくとも１つの上流に位置する、プロモーター配列、および
複数の制限酵素のための複数の認識部位、ここで複数の認識部位の各々は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの上流に位置する；
（ｂ）ベクターを、複数の認識部位の少なくとも１つにおいて、複数の制限酵素の少なくとも１つで切断して、第１適合末端要素および第２適合末端要素を生じること；
（ｃ）以下を含む第１足場要素を提供すること：
任意に足場配列、
プロモーター配列、および
第１足場要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素、ここで第３適合末端要素は、切断されたベクターの第１適合末端要素にアニーリングすることができ、第４適合末端要素は、切断されたベクターの第２適合末端要素にアニーリングすることができる；
（ｄ）第１足場要素を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、第１足場要素および切断されたベクター内の適合末端要素で起こり、アニーリング後、第１足場要素は、複数のＣＲＩＳＰＲガイド配列の１つの上流に組み込まれ、こうしてコンビナトリアルベクターが生成される；
任意に、ここで、方法は反復的である。
【請求項１５】
表２に記載のエピジェネティック遺伝子の組合わせから選択される２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の阻害剤を含む、組成物。
【請求項１６】
細胞の増殖を低減する方法であって、細胞を、表２に記載のエピジェネティック遺伝子の組合わせから選択される２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の阻害剤の組合わせと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１７】
細胞が癌細胞であり、任意に、癌細胞が卵巣癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象における癌を処置する方法であって、対象に、表２に記載のエピジェネティック遺伝子の組合わせから選択される２または３以上のエピジェネティック遺伝子を標的とする２または３以上の阻害剤の組合わせを投与することを含み、ここで２または３以上の阻害剤の各々は、有効量で投与される、前記方法。
【請求項１９】
阻害剤の各々が、ＣＲＩＳＰＲガイド配列、ｓｈＲＮＡ、および小分子からなる群から選択され、任意に、２または３以上の阻害剤の各々が、エピジェネティック遺伝子の発現を低減もしくは防止するか、またはエピジェネティック遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減もしくは防止する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
組合わせで投与される２または３以上の阻害剤の各々の有効量が、組合わせで投与されない場合の阻害剤の有効量より少ない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
阻害剤の各々が、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列；ｓｈＲＮＡ；および小分子からなる群から選択され、任意に、阻害剤の少なくとも１つが、ＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列であり；組成物がさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含むかまたはコードする、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ＣＲＩＳＰＲガイド配列またはｓｈＲＮＡが、組換え発現ベクターから発現される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
エピジェネティック遺伝子の組合わせが、BRD4とKDM4CまたはBRD4とKDM6Bを含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
BRD4の阻害剤が、JQ1（（６Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル）である；および／または
KDM4Cの阻害剤が、SD70（Ｎ−（フラン−２−イル（８−ヒドロキシキノリン−７−イル）メチル）イソブチルアミド）である；および／または
KDM6Bの阻害剤が、GSK-J4（エチル３−（（６−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］アゼピン−３（２Ｈ）−イル）−２−（ピリジン−２−イル）ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパノアート、一塩酸塩）である、
請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
細胞の増殖を低減するエピジェネティック遺伝子の阻害剤の組合わせを同定するための方法であって、
第１細胞集団および第２細胞集団を、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼの複数の組合わせと接触させること；
第１細胞集団および第２細胞集団を、第２細胞集団が第１細胞集団より長い期間培養されるように、培養すること；
第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせ、および第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを同定すること；
第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量を、第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量と比較すること；および
第２細胞集団においては不在であるかまたは低減された存在量であるが、第１細胞集団においては存在するかまたは増加した存在量である、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを、細胞増殖を低減するＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせとして同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２６】
細胞の増殖を低減するために阻害すべき遺伝子の組合わせを同定する方法であって、
第１細胞集団および第２細胞集団を、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列および足場配列およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼの複数の組合わせと接触させること；
第１細胞集団および第２細胞集団を、第２細胞集団が第１細胞集団より長い期間培養されるように、培養すること；
第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせ、および第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを同定すること；
第１細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量を、第２細胞集団における、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の各組合わせの存在量と比較すること；および
第２細胞集団においては不在であるかまたは低減された存在量であるが、第１細胞集団においては存在するかまたは増加した存在量である、２または３以上のＣＲＩＳＰＲガイド配列と足場配列の組合わせを、増殖を低減するために阻害すべき遺伝子として同定すること；
を含む、前記方法。