【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を定量的に検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に含み、前記ＤＮＡ種が胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルが妊娠女性由来であり；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程であって、前記試薬が少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素を含む、工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）で前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で定量的に検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、１つ以上の前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示し、前記ＤＭＲが胎児ＤＮＡでは高度にメチル化され、母体ＤＮＡでは低メチル化されている、工程；および、
（ｃ）前記メチル化感受性制限酵素によって認識されるメチル化部位を含まない少なくとも一つの他の領域を用いて前記サンプル中に存在する全ＤＮＡ量を定量的に検出する工程；
工程（ｂ）の前記検出および工程（ｃ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ容器内で、そのＤＭＲおよび他の領域について実質的に同時に、（ｘ）前記ＤＭＲの各々について同一の検出可能な標識および（ｙ）前記他の領域について異なる検出可能な標識を用いて実施され；
（Ａ）前記検出工程（ｂ）および（ｃ）の一部として、前記ＤＭＲおよび前記他の領域を含む各ＤＮＡ領域が増幅され；
（Ｂ）工程（ｂ）および工程（ｃ）で使用される各検出可能な標識が、蛍光標識であり；
（Ｃ）工程（ｂ）の前記検出が、前記ＤＭＲの１つにそれぞれ特異的である少なくとも２つの標識プローブを用いるプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲを含み、；
（Ｄ）工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の１つに特異的である少なくとも１つの標識プローブを用いるプローブベースのリアルタイム定量ＰＣＲを含む方法。
【請求項２】
２つの前記ＤＭＲが異なる染色体に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記他の領域が、少なくとも１つの前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの間の上流または下流に、および／または、少なくとも１つの前記ＤＭＲと同じ遺伝子内に位置する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の少なくとも２つを使用することを含み、好ましくは前記他の領域の１つは、工程（ｂ）で使用されるＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置し、そして、別の前記他の領域はそれぞれ別の前記ＤＭＲの約２０ｂｐ〜約２０ｋｂの上流または下流に位置する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の前記検出が、前記他の領域の各々について同一の検出可能な標識を用いて実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）の前記検出および工程（ｂ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同一アリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、および、互いに実質的に同時に、そして、前記ＤＭＲおよび他の領域のそれぞれに特異的な少なくとも１つの標識プローブを使用するプローブベースの多重リアルタイム定量ＰＣＲによって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ種が循環無細胞ＤＮＡであり、前記サンプルが血漿または血清サンプルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（Ａ）少なくとも１つの前記ＤＭＲがＴＢＸ３の１，６６０ｂｐ〜２，４００ｂｐの位置の間に位置し；および／または
（Ｂ）前記他の領域がＴＢＸ３の１２，４００ｂｐ〜１３，０００ｂｐの位置の間に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記妊娠女性が、妊娠関連の疾患に感染しやすく、好ましくは前記妊娠関連の疾患が、子癇前症、早期陣痛、子宮内発育遅延およびバニシングツインからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが組織サンプルまたは全血、血液画分、尿、唾液、汗、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択される生物学的液体のサンプルであり；好ましくは、前記サンプルは血漿または血清サンプルである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が、ＡａｔＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＣｌａＩ、ＥａｇＩ、ＦａｕＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択されるメチル化感受性酵素を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出工程の各々が定量的検出を含み、また前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の全ＤＮＡに対する前記ＤＮＡ種の相対濃度として表される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
さらに下記工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法：
・工程（ｃ）で使用したものと同じ他の領域を使用して、既知量のＤＮＡの標準サンプル中の全ＤＮＡ量を検出する工程；および、
・前記ＤＮＡの標準サンプルから検出したシグナルを工程（ｃ）で検出したシグナルと比較する工程。
【請求項１４】
前記検出工程の各々が定量的検出を含み、前記ＤＮＡ種の前記検出量が、前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の絶対量として表される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに下記工程を含む、請求項１２または１４に記載の方法：
・検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程であって、（ｘ）前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、前記個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を示し；および／または、（ｙ）前記閾値を超える前記ＤＮＡ種の量または前記分布からの異常値が、前記サンプルで前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常の診断を実施できることを示す工程。
【請求項１６】
さらに下記工程を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法：
・前記サンプルで前記サンプル中に存在する前記ＤＮＡ種の異常について診断を行う工程；前記診断は出生前診断である。
【請求項１７】
前記ＤＭＲが、少なくとも１つ、または少なくとも２つの前記メチル化感受性制限酵素によって認識されるメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、配列番号１５〜１８７からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの前記ＤＭＲが、ヒト第１２染色体に位置する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの前記ＤＭＲが、配列番号１５〜５３および１４８〜１８７からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＭＲが、少なくとも１つ、または少なくとも２つの前記メチル化感受性制限酵素によって認識されるメチル化部位を含み、少なくとも１つの前記ＤＭＲが、配列番号１８８〜１９９からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＭＲの少なくとも１つが、
・第２１染色体、第１８染色体および第１３染色体からなるリストから選択されるヒト染色体に位置する；および／または、
・少なくとも１つ、または少なくとも２つの前記メチル化感受性制限酵素によって認識されるメチル化部位を含み、そして前記ＤＭＲが、マスピン、ＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２、ＣＧＩ００９、ＣＢＲ１、ＤＳＣＡＭ、Ｃ２１またはｆ２９およびＣＧＩ１３からなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する；請求項１〜７、１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＭＲの少なくとも１つが、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＴＢＸ３，ＺＦＹ，ＣＤＣ４２ＥＰ１，ＭＧＣ１５５２３，ＳＯＸ１４およびＳＰＮからなるリストから選択される領域および／または遺伝子に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプル中で２種のＤＮＡ種が検出される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
妊娠女性が宿す胎児の染色体異数性を検出する方法であって、下記工程を含む方法：
（Ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記妊娠女性から採取したサンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第１のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第１のＤＮＡ種が染色体異数性に関連する染色体上または染色体異数性に関連する染色体の部分内に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第１のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｂ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記サンプル中の胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する第２のＤＮＡ種の量を測定する工程であって、前記第２のＤＮＡ種が基準染色体上に位置し、胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来する前記第２のＤＮＡ種が、ＤＮＡのメチル化の違いによってサンプル中の母親由来のものと区別される工程；
（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の量の相対量、好ましくはその比を決定する工程；および、
（Ｄ）前記相対量または比を、量または比の閾値および／または基準分布と比較する工程であって、前記量または比の閾値および／または基準分布よりも高いまたは低い相対量または比が、胎児の染色体異数性の存在を示す工程。
【請求項２５】
個体の疾患の罹患または発症のリスク上昇を検出する方法であって、下記工程を含み：
（ｉ）請求項１２または１４に記載の方法を実施する工程；および、
（ｉｉ）検出された前記ＤＮＡ種の量を、量の閾値および／または量の基準分布と比較する工程；
前記ＤＮＡ種の量の増加または異常値が、個体の前記疾患の罹患または発症のリスク上昇を示す方法。
【請求項２６】
下記を含む組成物：
・（Ａ）２対のＰＣＲプライマーであって、それぞれの対が少なくとも１つ、または少なくとも２つのメチル化感受性制限酵素によって認識されるメチル化部位を含む２つの第一の領域の１つを増幅するために設計され、それぞれの第一の領域が、配列番号１５〜１８７からなるリストから独立して選択される領域および／または遺伝子に位置するか、または配列番号１８８〜１９９からなるリストから独立して選択される領域および／または遺伝子に位置する２対のＰＣＲプライマー；および
・２つの蛍光標識リアルタイム定量ＰＣＲプローブであって、（Ａ）の前記第一の領域の１つにそれぞれ特異的であり、同じ蛍光標識を有する２つの蛍光標識リアルタイム定量ＰＣＲプローブ。
【請求項２７】
さらに下記を含む、請求項２６に記載の組成物：
・（Ｃ）ヒトゲノム中の他の領域を増幅するために設計された１対のＰＣＲプライマーであって、前記他の領域が前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を含まず；好ましくは前記他の領域が、（Ａ）の前記第一領域の少なくとも１つの２０ｂｐ〜２０ｋｂの間の上流または下流に位置する１対のＰＣＲプライマー；および
・（Ｄ）前記他の領域に特異的であり、（Ａ）の前記第一の領域に特異的である蛍光標識プローブのものとは異なる蛍光標識を有する、１つの蛍光標識リアルタイム定量ＰＣＲプローブ。
【請求項２８】
下記を含むキット：
・請求項２６または２７に記載のプライマーおよびプローブ；および、
・場合により、（ｉ）前記プライマーおよびプローブの使用、請求項１〜１９および２５のいずれか一項に記載の方法の実施および／または請求項２６または２７に記載の組成物の製造もしくは使用のための指示を含む印刷されたマニュアルまたはコンピュータ読み取り可能なメモリ、および／または、（ｉｉ）請求項１〜１９および２５のいずれか一項に記載の方法の実施および／または請求項２６または２７に記載の組成物の製造もしくは使用に有用な１つ以上の他の品物、要素または試薬。
【請求項２９】
［（ｘ）疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇；および／または（ｙ）所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種における異常の診断を実施する場合、前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化ＤＮＡとの混合物中に所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種を含む個体由来の各々のサンプルにおいて（前記ＤＮＡ種は胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性由来である。）、メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを異なって修飾する試薬で処理される該サンプル中に存在するＤＮＡ］を診断するための動作を、実行および／または管理するコンピュータシステムを制御する複数の命令でコード化されたコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記試薬が少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素を含み、前記動作が下記工程を含むコンピュータプログラム製品：
・（ｉ）請求項１〜１９および２５のいずれか一項に記載の工程（ｂ）における２つ以上のＤＭＲのメチル化の実質的に同時の定量的検出を表すプローブベースのリアルタイム定量ＰＣＲからの１つのシグナル；および、（ｉｉ）請求項１〜１９および２５のいずれか一項に記載の工程（ｃ）における少なくとも１つの他の領域を用いた全ＤＮＡの実質的に同時の定量的検出を表すプローブベースのリアルタイム定量ＰＣＲからの１つのシグナルを受信する工程；
・（ｉ）および（ｉｉ）のシグナルからパラメータを決定する工程であって、前記パラメータが前記ＤＮＡ種の定量的な量を表す工程；
・前記パラメータを量の閾値及び／又は量の基準分布と比較する工程；および、
・その比較に基づいて、（ｘ）個体における疾患の罹患もしくは発症のリスク上昇が存在するか否か；および／または（ｙ）胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来するＤＮＡ種の異常が診断できるか否かの分類を決定する工程。
【請求項３０】
個体からのサンプル中の所定の細胞タイプに由来するＤＮＡ種の量を定量的に検出する方法であって、該サンプルは前記ＤＮＡ種を前記細胞タイプに由来しない異なるメチル化のＤＮＡとの混合物中に含み、前記ＤＮＡ種は胎児の細胞および／または胎児の胎盤に由来し、前記サンプルは妊娠女性由来であり；前記方法は下記工程を含み：
（ａ）メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを特異的に修飾する試薬を用いて、前記サンプル中に存在するＤＮＡを処理する工程であって、前記試薬が少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素を含む工程；および、
（ｂ）前記ＤＮＡ種と前記細胞タイプに由来しないＤＮＡとの間で異なるメチル化がされている２つ以上のＤＭＲで前記ＤＮＡ種におけるメチル化の存在を前記サンプル中で定量的に検出する工程であって、前記試薬によるそのＤＭＲのＤＮＡの修飾はＤＮＡのメチル化に感受性があり、前記１つ以上のＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの存在が前記サンプル中の前記ＤＮＡ種の量が存在することを示し、前記ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡの非存在が前記サンプル中に前記ＤＮＡ種が存在しないことを示し、前記ＤＭＲが胎児ＤＮＡでは高度にメチル化され、母体ＤＮＡでは低メチル化されている工程；
工程（ｂ）の前記検出が、前記サンプルのＤＮＡの同じアリコートを用いて、同じ反応／検出容器内で、それらのＤＭＲについて実質的に同時に、（ｘ）多重リアルタイム定量ＰＣＲ；および（ｙ）それぞれが前記ＤＭＲの１つに特異的であり、前記ＤＭＲの各々について同じ検出可能な標識で標識される少なくとも２つの標識プローブを用いて実施される、方法。