【手続補正書】
【提出日】平成30年5月23日(2018.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞クローンに由来する細胞集団を含むＢＲＡＦ陽性癌に罹患している対象が、ＢＲＡＦ阻害剤に対する非レスポンダーであるか否か、及び／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対するレスポンダーであるかを同定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）該対象のサンプル中の少なくともＮＲＡＳ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異の存在又は不存在を特定し；そして
（ｂ）ＮＲＡＳ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異が特定された場合、該対象がＢＲＡＦ阻害剤に対する非レスポンダー及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対するレスポンダーであると同定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記方法が、ＢＲＡＦ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異の存在又は不存在を特定し、それによって、前述の少なくとも１つの突然変異の存在が、対象がＢＲＡＦ阻害剤に対する非レスポンダーであり、且つ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対するレスポンダーであると更に同定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＲＡＦ陽性癌が黒色腫癌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記単一細胞クローンに由来する細胞集団の細胞が、ＢＲＡＦ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異及びＮＲＡＳ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異をそれらのゲノム内に含んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＲＡＦ阻害剤がＢＲＡＦ活性の小分子阻害剤であり、好ましくは、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４０３２、及び／又はＧＳＫ２１１８４３６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤がＭＥＫ又はＥＲＫ活性の小分子阻害剤であり、そして好ましくは、ＧＳＫ１１２０２１２、ＭＥＫ１６２であり、そして前記ＥＲＫ活性の阻害剤がＳＣＨ７７２９８４である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＲＡＳ遺伝子の突然変異が、ヒトＮＲＡＳタンパク質のエクソン２のアミノ酸６１に相当する位置におけるアミノ酸置換をもたらす、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸置換が、グルタミンからリジンへの置換（Ｑ６１Ｋ）、グルタミンからアルギニンへの置換（Ｑ６１Ｒ）、又はグルタミンからロイシンへの置換（Ｑ６１Ｌ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＲＡＦ遺伝子の突然変異が、ヒトＢＲＡＦタンパク質のエクソン１５のアミノ酸６００に相当する位置におけるアミノ酸置換をもたらす、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸置換が、バリンからグルタマートへの置換（Ｖ６００Ｅ）、バリンからリジンへの置換（Ｖ６００Ｋ）、バリンからアルギニンへの置換（Ｖ６００Ｒ）、又はバリンからアスパラギン酸への置換（Ｖ６００Ｄ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＲＡＳ核酸の触媒サブユニットのエクソン２内の少なくとも１つの突然変異の存在を、以下のステップ：
ａ）対象からのサンプル中の核酸を、以下の：
ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴ（配列番号７）；
ＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号８）；
ＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡ（配列番号９）；及び
ＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１０）；
から成る群から選択される遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドの１以上と接触させ；
ｂ）ＮＲＡＳ核酸内のその標的配列へのオリゴヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下でサンプルをインキュベートし；
ｃ）前記ハイブリダイゼーションを検出し；そして
ｄ）ステップｃ）で検出された前記ハイブリダイゼーションに基づいて少なくとも１つの突然変異を特定すること、
によって特定する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップｂ）が、次のオリゴヌクレオチドプライマー：配列番号１１を有するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２を有するリバースオリゴヌクレオチドプライマー、のうちの一方又はその両方を用いてサンプル中のＮＲＡＳ核酸を増幅することによって、ＮＲＡＳ核酸内の標的配列を含む増幅産物を作り出すステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＢＲＡＦ核酸の触媒サブユニットのエクソン１５内の少なくとも１つの突然変異の存在を、以下のステップ：
ａ）対象からのサンプルの核酸を、以下の：
ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧ（配列番号１）；
ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧ（配列番号２）；
ＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡ（配列番号３）；及び
ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴ（配列番号４）；
から成る群から選択される遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドの１以上と接触させ；
ｂ）ＢＲＡＦ核酸内のその標的配列へのオリゴヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下でサンプルをインキュベートし；
ｃ）前記ハイブリダイゼーションを検出し；そして
ｄ）ステップｃ）で検出された前記ハイブリダイゼーションに基づいて少なくとも１つの突然変異を特定すること、
によって特定する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップｂ）が、次のオリゴヌクレオチドプライマー：配列番号５を有するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６を有するリバースオリゴヌクレオチドプライマー、の一方又はその両方を用いてサンプル中のＮＲＡＳ核酸を増幅することによって、ＢＲＡＦ核酸内の標的配列を含む増幅産物を作り出すステップを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、対象がＢＲＡＦ阻害剤に対する非レスポンダーであるして、且つ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対するレスポンダーであるとして同定された場合に、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤の投与を対象に推奨することを更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
単一細胞クローンに由来する細胞集団を含むＢＲＡＦ陽性癌に罹患している対象を処置するのに使用するＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤であって、それによって、前述の癌が、（ｉ）ＮＲＡＳ遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を少なくとも有するか、又は（ｉｉ）ＮＲＡＳ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異及びＢＲＡＦ遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を少なくとも有することがわかっているＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤。
【請求項１７】
単一細胞クローンに由来する癌に罹患していることが疑われた対象のサンプルにおいて癌を診断する方法であって、以下のステップ：
ａ）２つの以下のプライマーオリゴヌクレオチド：
ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧ（配列番号１）；
ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧ（配列番号２）；
ＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡ（配列番号３）；及び／又は
ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴ（配列番号４）、
並びに２つの以下のプライマーオリゴヌクレオチド：
ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴ（配列番号７）；
ＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号８）；
ＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡ（配列番号９）；及び／又は
ＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１０）；
を用いてサンプル中の核酸を増幅することによって、ＢＲＡＦ核酸及びＮＲＡＳ核酸内の標的配列を含む１若しくは複数の増幅産物を作り出し：
ｂ）以下の突然変異特異的ＢＲＡＦオリゴヌクレオチド：
ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧ（配列番号１）；
ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧ（配列番号２）；
ＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡ（配列番号３）；及び／又は
ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴ（配列番号４）；
の１以上、並びに以下の位置特異的ＮＲＡＳオリゴヌクレオチド：
ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴ（配列番号７）；
ＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号８）；
ＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡ（配列番号９）；及び／又は
ＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１０）；
の１以上と、核酸サンプルを接触させ；
ｃ）ＢＲＡＦ核酸及びＮＲＡＳ核酸内のそれらのそれぞれの標的配列へのオリゴヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下でサンプルをインキュベートし；
ｄ）前記ハイブリダイゼーションを検出し、それによって、癌が診断されること、
を含む方法。
【請求項１８】
単一細胞クローンに由来する癌を診断するためのキットの使用であって、前記キットが、
次のオリゴヌクレオチド：
ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧ（配列番号１）；
ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧ（配列番号２）；
ＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡ（配列番号３）；
ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴ（配列番号４）；
ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴ（配列番号７）；
ＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号８）；
ＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡ（配列番号９）；及び
ＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１０）；
を含む、使用。
【請求項１９】
単一細胞クローンに由来する癌に罹患していることが疑われる対象のサンプルにおいて癌を診断するため、及び／又は単一細胞クローンに由来する細胞集団を含むＢＲＡＦ陽性癌に罹患している対象が、ＢＲＡＦ阻害剤に対する非レスポンダーであるか否か、及び／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対するレスポンダーであるかどうか同定するためのデバイスの使用であって、前記デバイスが、以下の：
（ｉ）以下の突然変異特異的ＢＲＡＦオリゴヌクレオチド：
ＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧ（配列番号１）；
ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧ（配列番号２）；
ＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡ（配列番号３）；及び／又は
ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴ（配列番号４）、
のうちの１以上、並びに以下の位置特異的ＮＲＡＳオリゴヌクレオチド：
ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴ（配列番号７）；
ＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号８）；
ＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡ（配列番号９）；及び／又は
ＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１０）、
のうちの１以上を含む分析ユニット；及び
（ｉｉ）ＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ核酸の前記オリゴヌクレオチドへの特異的なハイブリダイゼーションを検出することができる検出装置、
を含む、使用。
【請求項２０】
対象において標的療法に対して応答性を評価する方法であって、以下ステップ：
ａ）対象から単一細胞クローンに由来するサンプルを調製し；
ｂ）ＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ遺伝子内の突然変異の存在についてサンプルを試験し、ここで、該試験は、選択的増幅、プローブハイブリダイゼーション又は核酸シークエンシングから成る群から選択される方法のうちの１つによって実施され；
ｃ）ＮＲＡＳ及びＢＲＡＦ遺伝子内に突然変異が検出された場合、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対して応答性及びＢＲＡＦ阻害剤に対して非応答性を特定すること、
を含む方法。
【請求項２１】
対象において癌を評価する方法であって、以下のステップ：
ａ）核酸を含んでいる対象からの単一細胞クローンに由来するサンプルを調製し；
ｂ）サンプル中の核酸を、ＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ遺伝子内の突然変異に特異的な核酸プローブと接触させ；
ｃ）ＮＲＡＳ及びＢＲＡＦ遺伝子内に突然変異が検出された場合、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤に対して応答性であり、且つ、ＢＲＡＦ阻害剤に対して非応答性であるとして癌を評価すること、
を含む方法。