【手続補正書】
【提出日】平成30年3月9日(2018.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質であって、対応する野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質と比べて複数のアミノ酸突然変異を有し、前記複数の突然変異が、
（ａ）前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の触媒活性を低下又は消失させる少なくとも１つの第１の突然変異；及び
（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を与える少なくとも１つの第２の突然変異
を含む、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２】
前記第２の突然変異が、
（ｉ）Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高め；かつ／又は
（ｉｉ）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる
突然変異を含む、請求項１に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３】
前記対応する野生型タンパク質が、エリザベスキンギア・メニンゴセプチカム（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）、エリザベスキンギア・メニンゴセプチカムからのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（配列番号３）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号４）、及びエリザベスキンギア・ミリコラ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号５）からなる群から選択されるタンパク質を含み、好ましくは、前記対応する野生型タンパク質が、エリザベスキンギア・メニンゴセプチカムＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）を含む、請求項１又は２に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項４】
前記第１の突然変異が、エリザベスキンギア・メニンゴセプチカムＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸位置５９、６０、８２、１１８、２０６、２０７、２４８、若しくは２５１、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む；ならびに／又は
前記第２の突然変異が、エリザベスキンギア・メニンゴセプチカムＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸位置５７、５９、６０、６１、６２、８２、８５、１１８、１１９、１２０、１２３、１２５、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１９０、１９１、１９２、１９３、２０６、２０７、２４８、若しくは２５１、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項５】
（ａ）配列番号１のＤ５７位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む；
（ｂ）配列番号１のＤ６０位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む；
（ｃ）配列番号１のＹ６２位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にグリシン、トリプトファン、セリン、若しくはトレオニンでのアミノ酸置換を含む；
（ｄ）配列番号１のＥ１１８位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グルタミン、トレオニン、若しくはシステインでのアミノ酸置換を含む；
（ｅ）配列番号１のＴ１１９位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、若しくはバリンでのアミノ酸置換を含む；
（ｆ）配列番号１のＷ１２０位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む；
（ｇ）配列番号１のＫ１２３位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む；
（ｈ）配列番号１のＲ１２５位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む；
（ｉ）配列番号１のＫ１５３位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む；
（ｊ）配列番号１のＳ１５４位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む；
（ｋ）配列番号１のＳ１５５位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む；
（ｌ）配列番号１のＩ１５６位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、若しくはヒスチジンでのアミノ酸置換を含む；
（ｍ）配列番号１のＤ１５７位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む；
（ｎ）配列番号１のＧ１９２位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にイソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む；
（ｏ）配列番号１のＥ２０６位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にセリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、若しくはアルギニンでのアミノ酸置換を含む；ならびに／又は
（ｐ）配列番号１のＲ２４８位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、若しくはリジンでのアミノ酸置換を含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項６】
Ｄ５７位、Ｄ６０位、Ｉ１５６位、Ｇ１９２位、及びＥ２０６位に突然変異を含み、任意で、Ｗ５９位、Ｒ６１位、Ｙ６２位、Ｉ８２位、Ｙ８５位、Ｅ１１８位、Ｔ１１９位、Ｗ１２０位、Ｋ１２３位、Ｒ１２５位、Ｋ１５３位、Ｓ１５４位、Ｓ１５５位、Ｄ１５７位、Ｇ１９０位、Ｗ１９１位、Ｈ１９３位、Ｗ２０７位、Ｒ２４８位、若しくはＷ２５１位、又はこれらの任意の組合せの位置に突然変異をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項７】
（ａ）Ｄ５７Ｒ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｇ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｄ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｃ、及びＥ２０６Ｓ
（ｂ）Ｄ５７Ｃ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｗ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｑ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｔ、及びＥ２０６Ｒ
（ｃ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｄ）Ｄ５７Ｗ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｍ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｗ、及びＲ２４８Ｓ
（ｅ）Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｆ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ａ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｇ）Ｄ５７Ｌ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｈ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｅ１１８Ｑ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｉ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｊ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｋ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｋ１５３Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｌ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｍ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｎ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｏ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｐ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｑ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｄ１５７Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｒ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｓ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｔ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＥ２０６Ｓ
から選択される複数の突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項８】
クローンＤ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、Ｒ９１１３、又はＲ９１１Ｃ６０Ａによって発現される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項９】
Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ、又はＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ及びＯ結合型ＧａｌＮＡｃの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させる第２の突然変異を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１０】
Ｎ結合型グリカン、Ｎ結合型複合糖質、Ｎ結合型糖ペプチド、Ｎ結合型糖タンパク質、若しくは遊離Ｎ−グリカンに結合する；ならびに／又は
Ｏ結合型グリカン、Ｏ結合型複合糖質、Ｏ結合型糖ペプチド、Ｏ結合型糖タンパク質、若しくは遊離Ｏ−グリカンに結合する、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１１】
タンパク様の第２の成分又は非タンパク様の第２の成分に共有結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む第１の成分を含むコンジュゲートであって、任意で、前記第２の成分が治療薬又は診断薬である、前記コンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を含む、アフィニティーマトリックスであって、好ましくは、固形支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子からなる群から選択される、前記アフィニティーマトリックス。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載の融合タンパク質、又は請求項１３に記載のアフィニティーマトリックスと、使用説明書とを含む、キット。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくは発現ベクターである、前記ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは細菌細胞であり、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は酵母細胞である、前記宿主細胞。
【請求項１８】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を作製するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を、単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させるステップを含む、前記方法。
【請求項１９】
Ｎ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカン又はＯ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記Ｎ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンを検出するステップ
を含み、
好ましくは、前記検出されたＮ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含み、前記Ｎ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含み、好ましくは、前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、前記方法。
【請求項２０】
遊離Ｎ−グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｎ−グリカン又は遊離Ｏ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｎ−グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを検出するステップ
を含み、好ましくは、前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、前記方法。
【請求項２１】
Ｎ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、遊離Ｎ−グリカン、又は遊離Ｏ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカン又はＯ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＮ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、遊離Ｎ−グリカン、又は遊離Ｏ−グリカンを得るステップ
を含む、前記方法。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を含む、診断組成物又は治療組成物であって、好ましくは、前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、前記コンジュゲート、又は前記融合タンパク質が検出可能に標識され、好ましくは、前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む、前記診断組成物又は前記治療組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、請求項１１に記載のコンジュゲート、又は請求項１２に記載の融合タンパク質の、（ａ）治療薬としての使用；（ｂ）診断薬としての使用；（ｃ）標的薬物送達のための使用；（ｄ）生物学的若しくは実験室サンプル中のＮ結合型グリカン若しくは遊離Ｎ−グリカンの存在若しくは量の検出のための使用；又は（ｅ）生物学的若しくは実験室サンプル中のＯ結合型グリカン若しくは遊離Ｏ−グリカンの存在若しくは量の検出のための使用。
【請求項２４】
（ｅ）において、前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ若しくはＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含むか、又は前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ若しくはＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、請求項２３に記載の使用。