(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を塊に切削し、乾燥させ、粉砕し、篩で篩過してからアボカド粉末を得るＳ１と、
ステップＳ１に記載のアボカド粉末を取り、水を加えて超音波補助抽出し、冷却させ、遠心分離し、遠心分離後に得られた混合物を減圧濾過及び膜限外濾過を行い、前記膜限外濾過された濾液を収集するＳ２と、
酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、層分離させた後、下層液を取るＳ３と、
ステップＳ３に記載の下層液を真空凍結乾燥させ、固形物又は固体を得るＳ４とを含む、ことを特徴とするアボカド抽出物の調製方法。
【請求項２】
前記ステップＳ１の篩のメッシュ数は２８〜２００メッシュである、ことを特徴とする請求項１に記載のアボカド抽出物の調製方法。
【請求項３】
水の体積に対する前記アボカド粉末の質量の比は１〜２５ｇ：１００ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載のアボカド抽出物の調製方法。
【請求項４】
前記超音波補助抽出の温度は４５〜８０℃であり、前記超音波補助抽出の時間は３０〜１２０ｍｉｎであり、前記超音波補助抽出のパワーは１００〜４００Ｗである、ことを特徴とする請求項１に記載のアボカド抽出物の調製方法。
【請求項５】
前記減圧濾過の濾紙の孔径は１０〜２５μｍであり、前記膜限外濾過中の限外濾過膜の分画分子量は１ＫＤ〜５ＫＤである、ことを特徴とする請求項１に記載のアボカド抽出物の調製方法。
【請求項６】
真空凍結乾燥機で凍結された固形物又は固体を窒素密封乾燥ボックスに入れて３０〜６０分間乾燥させ、密封貯蔵するステップＳ５を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載のアボカド抽出物の調製方法。
【請求項７】
ステップＳ４の真空凍結乾燥条件は、真空圧力が５０〜１５０Ｐａであり、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−３５〜−２５℃に設定し、１〜２時間保持し、第２の段階の温度を−２０〜−１０℃に設定し、０．５〜２時間保持し、第３の段階の温度を−１０〜−５℃に設定し、３〜５時間保持し、解析乾燥段階の温度を３０〜６０℃に設定し、７〜１２時間保持することである、ことを特徴とする請求項１に記載のアボカド抽出物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然植物抽出技術の分野に関し、特にアボカド抽出物及びその調製方法並びに老化防止化粧品における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＭＮ）は、生物細胞内に存在する生化学物質であり、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ反応の生成物であり、ＮＡＤ＋の重要な前駆体の一つである。ニコチンアミドモノヌクレオチドは、ＮＡＤ＋の修復経路における中間体として、酸化防止、酸化ストレスの低減作用を有し、優れた老化防止、酸化防止作用を有し、エネルギー代謝を増強し、生体の生理的衰退を遅らせることができる。現在、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、網膜変性疾患、２型糖尿病の治療に主に適用されており、関連する化粧品／スキンケア製品の分野では適用されていない。ニコチンアミドモノヌクレオチドは人体の内生的な物質であり、安全性が高くて熱安定性が良好であることから、ニコチンアミドモノヌクレオチドを化粧品／スキンケア製品の分野で活性物質として適用することは幅広い見込みがある。
【０００３】
現在、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、微生物発酵、化学合成、又はインビトロ酵素触媒により調製して得られる。化学合成プロセスは、コストが高く、収率が低く、量産化が困難であるなどの欠点があり、微生物発酵とインビトロ酵素触媒は、溶媒の残留を回避可能であるものの、それぞれ、プロセスが複雑であることと酵素触媒が失活しやすいなどの欠点がある。上記の３種の調製方法と比較して、天然の果物と野菜から抽出されたニコチンアミドモノヌクレオチドは、コストが低く、収率が高く、生物活性が高いなどの利点がある。ニコチンアミドモノヌクレオチドは、アボカド、ブロッコリー、キャベツ、エダマメ、キュウリ、マッシュルーム、生牛肉及びエビなどの天然の食品に広く存在する。アボカドは、さまざまなビタミン、豊富な脂肪酸、微量元素などを含む栄養価の高い果物であるため、アボカドからニコチンアミドモノヌクレオチドを抽出して化粧品又はスキンケア製品技術の分野に適用することにより、従来の技術におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの合成が困難である問題を解決することができる。一般的には、抽出プロセスが異なると、抽出された最終的な生成物が異なり、抽出された抽出物の成分が複雑すぎると、化粧品又はスキンケア製品に適用した場合、肌のアレルギーなどの不良症状を引き起こす可能性がある。したがって、抽出プロセスを改善することにより、効率的で低感作性の酸化防止、老化防止抽出物を提供することは非常に必要である。
【発明の概要】
【０００４】
従来の技術に存在する上記の問題を克服するために、本発明の目的は、上記の欠点を解決するように高収率、低感作性のアボカド抽出物の調製方法を提供することにある。
【０００５】
本発明はアボカド抽出物の調製方法を提供しており、該調製方法は、
アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を塊に切削し、乾燥させ、粉砕し、篩で篩過してからアボカド粉末を得るＳ１と、
ステップＳ１に記載のアボカド粉末を取り、水を加えて超音波補助抽出し、冷却させ、遠心分離し、遠心分離後に得られた混合物を減圧濾過及び膜限外濾過を行い、前記膜限外濾過された濾液を収集するＳ２と、
酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、層分離させた後、下層液を取るＳ３と、
ステップＳ３に記載の下層液を真空凍結乾燥させ、固形物又は固体を得るＳ４とを含む。
【０００６】
さらに、前記ステップＳ１の篩のメッシュ数は２８〜２００メッシュである。
【０００７】
さらに、水の体積に対する前記アボカド粉末の質量の比は１〜２５ｇ：１００ｍＬである。
【０００８】
さらに、前記超音波補助抽出の温度は４５〜８０℃であり、前記超音波補助抽出の時間は３０〜１２０ｍｉｎであり、前記超音波補助抽出のパワーは１００〜４００Ｗである。
【０００９】
さらに、前記減圧濾過の濾紙の孔径は１０〜２５μｍであり、前記膜限外濾過中の限外濾過膜の分画分子量は１ＫＤ〜５ＫＤである。
【００１０】
さらに、真空凍結乾燥機で凍結された固形物又は固体を窒素密封乾燥ボックスに入れて３０〜６０分間乾燥させ、密封貯蔵するステップＳ５を更に含む。
【００１１】
さらに、前記ステップＳ４の真空凍結乾燥条件は、真空圧力が５０〜１５０Ｐａであり、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−３５〜−２５℃に設定し、１〜２時間保持し、第２の段階の温度を−２０〜−１０℃に設定し、０．５〜２時間保持し、第３の段階の温度を−１０〜−５℃に設定し、３〜５時間保持し、解析乾燥段階の温度を３０〜６０℃に設定し、７〜１２時間保持することである。
【００１２】
さらに、本発明は、上記調製方法調により調製されたアボカド抽出物を更に提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、上記調製方法により調製されたアボカド抽出物の老化防止美容・スキンケア製品における使用を更に提供しており、前記アボカド抽出物の用量は、重量パーセントで０．０５〜９９％である。
【００１４】
さらに、前記老化防止美容・スキンケア製品は、ローション剤、エッセンス、原液、乳液、クリーム、マスク、タブレット、ルージュのうちの１種又は複数種である。
【００１５】
アボカドは、天然食品としてその化学成分が極めて複雑である。本出願人は、実験の過程において、超音波補助抽出されたアボカド抽出物に、少量のγ−シトステロールが含まれ、γ−シトステロールは、肌のアレルギー性接触皮膚炎などのアレルギー反応を増加させる作用があることを発見した。
【００１６】
そのため、出願人は、抽出プロセスにおいて超音波補助抽出で得られた濾液を、酢酸エチルで抽出し、ニコチンアミドモノヌクレオチドが水に溶解しやすく、γ−シトステロールが水に難溶であるため、抽出操作によって濾液における少量のγ−シトステロールを除去することにより、後続きの真空凍結乾燥させたアボカド抽出物はγ−シトステロールを含まず、アボカド抽出物の化粧品又はスキンケア製品の分野に適用される安全性を保証した。
【００１７】
次に、出願人は、実験の過程において、真空乾燥の昇華乾燥段階に温度勾配制御乾燥により得られたアボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量がより高いことも発見し、これは、温度勾配制御により、濾液における関連する化学成分が環境の急激な変化により転化されないためである。また、真空乾燥後にアボカド抽出物を窒素密封乾燥ボックスにいれて一定時間乾燥させることにより、抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの安定性をより確実に確保でき、これは、出願人にとって予想外のものであり、その原因は、真空乾燥後の製品の表面積が増加し、さらに水分、微生物が吸着しやすくなり、さらに化学成分の転化及び変化につながる可能性がある。
【００１８】
したがって、本発明の調製方法は従来の技術に比べて、以下の有益な効果を有する。
【００１９】
（１）本発明は、超音波補助水抽出法を用いて、アボカドからニコチンアミドモノヌクレオチドを抽出し、これは、短時間で低コストであり、工場的な大規模生産を実現しながら、有機溶媒の残留がなく、溶媒として水を使用し、安全性が高く、調製方法において真空凍結乾燥を用いて下層生成物を処理し、真空乾燥の昇華乾燥段階において３段階の温度勾配制御乾燥を行うことにより、アボカド果肉における有効成分であるニコチンアミドモノヌクレオチドの活性の喪失をより良好に防止し、さらにアボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの収率を向上させることができる。
【００２０】
（２）本発明は、老化防止化粧品にアボカド抽出物を初めて適用し、ニコチンアミドモノヌクレオチドに加えて、抽出物にフラボン、多糖類、ポリペプチドなどの種々の活性成分を含み、これらの活性成分は、優れた老化防止効果を有し、肌荒れと老化を効果的に防止し、肌のしわの外観を減少させ、肌を新鮮で弾力性に保持することができる。
【００２１】
（３）本発明のアボカド抽出物の調製方法では、超音波補助抽出後に得られた濾液を酢酸エチルで抽出し、静置して層分離させた後、下層澄み液を取って真空乾燥させることにより、アボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの純度を向上させ、アボカド抽出物に含まれるγ−シトステロールを除去し、後続きに抽出物が化粧品に使用される過程における生体安全性を向上させ、アレルギー反応の発生を大幅に低減することができる。
【００２２】
（４）本発明のアボカド抽出物の製造方法では、真空凍結乾燥機で凍結させたアボカド抽出物を窒素密封乾燥ボックスに入れて一定時間乾燥させた後、密封貯蔵することにより、抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドをより長時間貯蔵し、一定時間内で活性が安定することをより良好に保証し、低温凍結乾燥によるアボカド抽出物の表面積の増大、吸湿性の増加、さらに抽出物の活性が不安定し、酸化腐敗しやすいことを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明に係るニコチンアミドモノヌクレオチドの検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、具体的な実施形態の説明を通じて本発明をさらに説明するが、これは本発明を限定するものではなく、当業者は、本発明の基本思想に基づいて様々な修正又は改良を行うことができ、本発明の基本思想から逸脱しない限り、すべて本発明の範囲内にある。
【００２５】
実施例１
実施例１のアボカド抽出物の調製方法は以下の通りである。
【００２６】
Ｓ１は、アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を１ｃｍ×１ｃｍの小塊に切削し、４５℃で一定の重量になるまで乾燥させ、粉砕し、２８メッシュの篩で篩過することである。
【００２７】
Ｓ２は、ステップＳ１に記載のアボカド粉末２．５ｋｇを精秤し、水１０Ｌを加え、温度４５℃、超音波パワー１００Ｗの条件で超音波補助抽出を１２０分間行い、室温で放置して自然冷却させた後、回転数４５００ｒｍｐで２０分間遠心分離し、孔径１０μｍの濾紙で減圧濾過してから、分画分子量１ＫＤの濾過膜で限外濾過して濾液を収集することである。
【００２８】
Ｓ３は、酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、静置して層分離させた後、下層液を取ることである。
【００２９】
Ｓ４は、前記下層液を真空凍結乾燥させ、真空圧力を１５０Ｐａに設定し、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−３５℃に設定し、１時間保持し、第２の段階の温度を−２０℃に設定し、２時間保持し、第３の段階の温度を−１０℃に設定し、３時間保持し、解析乾燥段階の温度を３０℃に設定し、恒温で１２時間保持し、固形物又は固体、即ち、アボカド抽出物を得ることである。
【００３０】
実施例２
実施例２のアボカド抽出物の調製方法は以下の通りである。
【００３１】
Ｓ１は、アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を０．５ｃｍ×０．５ｃｍの小塊に切削し、６０℃で一定の重量になるまで乾燥させ、粉砕し、２００メッシュの篩で篩過することである。
【００３２】
Ｓ２は、ステップＳ１に記載のアボカド粉末０．１ｋｇを精秤し、水１０Ｌを加え、温度８０℃、超音波パワー４００Ｗの条件で超音波補助抽出を３０分間行い、室温で放置して自然冷却させた後、回転数４５００ｒｍｐで２０分間遠心分離し、孔径２５μｍの濾紙で減圧濾過してから、分画分子量５ＫＤの濾過膜で限外濾過して濾液を収集することである。
【００３３】
Ｓ３は、酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、静置して層分離させた後、下層液を取ることである。
【００３４】
Ｓ４は、前記下層液を真空凍結乾燥させ、真空圧力を５０Ｐａに設定し、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−２５℃に設定し、２時間保持し、第２の段階の温度を−１０℃に設定し、０．５時間保持し、第３の段階の温度を−５℃に設定し、５時間保持し、解析乾燥段階の温度を６０℃に設定し、恒温で７時間保持し、固形物又は固体、即ち、アボカド抽出物を得ることである。
【００３５】
実施例３
実施例３のアボカド抽出物の調製方法は以下の通りである。
【００３６】
Ｓ１は、アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を１ｃｍ×１ｃｍの小塊に切削し、４５℃で一定の重量になるまで乾燥させ、粉砕し、２８メッシュの篩で篩過し、粒径が２５０μｍ未満のアボカド粉末を得ることである。
【００３７】
Ｓ２は、ステップＳ１に記載のアボカド粉末２．５ｋｇを精秤し、水１０Ｌを加え、温度４５℃、超音波パワー１００Ｗの条件で超音波補助抽出を１２０分間行い、室温で放置して自然冷却させた後、回転数４５００ｒｍｐで２０分間遠心分離し、孔径１０μｍの濾紙で減圧濾過してから、分画分子量１ＫＤの濾過膜で限外濾過して濾液を収集することである。
【００３８】
Ｓ３は、酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、静置して層分離させた後、下層液を取ることである。
【００３９】
Ｓ４は、前記下層液を真空凍結乾燥させ、真空圧力を１５０Ｐａに設定し、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−３５℃に設定し、１時間保持し、第２の段階の温度を−２０℃に設定し、２時間保持し、第３の段階の温度を−１０℃に設定し、３時間保持し、解析乾燥段階の温度を３０℃に設定し、恒温で１２時間保持し、固形物又は固体を得ることである。
【００４０】
Ｓ５は、真空凍結乾燥させた固形物又は固体を窒素密封乾燥ボックスに入れて３０分間乾燥させ、密封貯蔵し、アボカド抽出物を得ることである。
【００４１】
実施例４
実施例４のアボカド抽出物の調製方法は以下の通りである。
【００４２】
Ｓ１は、アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を０．５ｃｍ×０．５ｃｍの小塊に切削し、６０℃で一定の重量になるまで乾燥させ、粉砕し、２００メッシュの篩で篩過することである。
【００４３】
Ｓ２は、ステップＳ１に記載のアボカド粉末０．１ｋｇを精秤し、水１０Ｌを加え、温度８０℃、超音波パワー４００Ｗの条件で超音波補助抽出を３０分間行い、室温で放置して自然冷却させた後、回転数４５００ｒｍｐで２０分間遠心分離し、孔径２５μｍの濾紙で減圧濾過してから、分画分子量５ＫＤの濾過膜で限外濾過して濾液を収集することである。
【００４４】
Ｓ３は、酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、静置して層分離させた後、下層液を取ることである。
【００４５】
Ｓ４は、前記下層液を真空凍結乾燥させ、真空圧力を５０Ｐａに設定し、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−２５℃に設定し、２時間保持し、第２の段階の温度を−１０℃に設定し、０．５時間保持し、第３の段階の温度を−５℃に設定し、５時間保持し、解析乾燥段階の温度を６０℃に設定し、恒温で７時間保持し、固形物又は固体を得ることである。
【００４６】
Ｓ５は、真空凍結乾燥させた固形物又は固体を窒素密封乾燥ボックスに入れて６０分間乾燥させ、密封貯蔵し、アボカド抽出物を得ることである。
【００４７】
実施例５
実施例５のアボカド抽出物の調製方法は以下の通りである。
【００４８】
Ｓ１は、アボカドを取り、除核して剥皮し、果肉を０．５ｃｍ×０．５ｃｍの小塊に切削し、５０℃で一定の重量になるまで乾燥させ、粉砕し、１００メッシュの篩で篩過し、粒径が４００μｍ未満のアボカド粉末を得ることである。
【００４９】
Ｓ２は、ステップＳ１に記載のアボカド粉末１ｋｇを精秤し、水１０Ｌを加え、温度５５℃、超音波パワー２００Ｗの条件で超音波補助抽出を６０分間行い、室温で放置して自然冷却させた後、回転数４５００ｒｍｐで２０分間遠心分離し、孔径２０μｍの濾紙で減圧濾過してから、分画分子量３ＫＤの濾過膜で限外濾過して濾液を収集することである。
【００５０】
Ｓ３は、酢酸エチルでステップＳ２に記載の濾液を抽出し、静置して層分離させた後、下層液を取ることである。
【００５１】
Ｓ４は、前記下層液を真空凍結乾燥させ、真空圧力を１００Ｐａに設定し、昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御を行い、第１の段階の温度を−３０℃に設定し、１．５時間保持し、第２の段階の温度を−１５℃に設定し、１時間保持し、第３の段階の温度を−８℃に設定し、３時間保持し、解析乾燥段階の温度を４５℃に設定し、恒温で１０時間保持し、固形物又は固体を得ることである。
【００５２】
Ｓ５は、真空凍結乾燥させた固形物又は固体を窒素密封乾燥ボックスに入れて４５分間乾燥させ、密封貯蔵し、アボカド抽出物を得ることである。
【００５３】
比較例１
実施例５に比べて、ステップＳ２の超音波補助抽出温度を９０℃に設定し、他のステップ及びその操作条件は実施例５と一致する。
【００５４】
比較例２
実施例５に比べて、ステップＳ４の真空凍結乾燥における昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御乾燥を使用せず、温度を直接−８℃に設定し、５．５時間保持し、他のステップ及びその操作条件は実施例５と一致する。
【００５５】
比較例３
実施例５に比べて、酢酸エチルでの抽出操作を行わず、ステップＳ２で濾過された濾液を直接真空凍結乾燥させ、他のステップ及びその操作条件は実施例５と一致する。
【００５６】
試験例１、高速液体クロマトグラフィーによるニコチンアミドモノヌクレオチド及びγ−シトステロールの含有量の測定
実施例１〜５及び比較例１〜３で調製されたアボカド抽出物をそれぞれ取って試験を行った。
【００５７】
１．１ニコチンアミドモノヌクレオチド含有量の測定
１．１．１、サンプルの前処理
実施例１〜５及び比較例１〜３のアボカド抽出物のテスト用サンプルのそれぞれ約０．２ｇを１ｍｇまで正確に秤取し、１０ｍｌの純水を加えて溶解し、超音波洗浄器で２０分間超音波処理してから、純水で２０ｍＬにメスアップし、均一に混合した。溶液の一部を遠沈管に注入し、４５００ｒ／ｍｉｎで３０分間遠心分離し、上澄み液を取り、０．４５μｍの濾過膜で濾過して準備し、同一の実施例又は比較例の試験は２回の並行試験を行い、２回の並行試験の測定結果は相対偏差が５％以下であることが要求された。
【００５８】
１．１．２、クロマトグラフィー条件
クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；
サンプル注入量：２０μＬ；カラム温度：２５℃；測定波長：２６０ｎｍ。
移動相：アセトニトリル−ｐＨ６のリン酸塩緩衝液、グラジエント溶出条件は（体積比）以下の通りである。
【表１】
0006951525.tif 000002
【００５９】
１．１．３、ニコチンアミドモノヌクレオチド検量線の作成
１ｍｇ／ｍＬのニコチンアミドモノヌクレオチドのストック溶液を純水で調製し、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬの被測定液に純水で正確に希釈し、１．１．２のクロマトグラフィー条件に従って液体クロマトグラフィーに注入し、クロマトグラムから、ニコチンアミドモノヌクレオチドの保留時間は２．５３９ｍｉｎであることを取得し、ニコチンアミドモノヌクレオチドの濃度を横軸、ピーク面積を縦軸として、ニコチンアミドモノヌクレオチドの検量線を作成し、図１に示す。
【００６０】
１．１．４、サンプルテスト
アボカド抽出物のテスト用サンプルを１．１．２のクロマトグラフィー条件に従って液体クロマトグラフィーに注入し、２．５３９ｍｉｎでの各実施例／比較例の２つの並行なサンプルのクロマトグラフィーピークのピーク面積を記録し、ニコチンアミドモノヌクレオチドの検量線から、アボカドのテスト用サンプルにおけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量を算出し、２回のテスト結果の平均値を取って最終的なテスト結果とし、各サンプルにおけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量を表２に示す。
【００６１】
１．２γ−シトステロール含有量の測定
１．２．１、サンプルの前処理
実施例５及び比較例３のアボカド抽出物のテスト用サンプルのそれぞれ０．２ｇを１ｍｇまで正確に秤取し、１０ｍｌの９５％のエタノールを加えて溶解し、超音波洗浄器で２０分間超音波処理し、室温まで冷却してから９５％のエタノールで２０ｍＬにメスアップし、均一に混合した。溶液の一部を遠沈管に注入し、４５００ｒ／ｍｉｎで３０分間遠心分離し、上澄み液を取り、０．４５μｍの濾過膜で濾過して準備し、同一の実施例又は比較例の試験は２回の並行試験を行い、２回の並行試験の測定結果は相対偏差が５％以下であることが要求された。
【００６２】
１．２．２、クロマトグラフィー条件
クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；
サンプル注入量：２０μＬ；カラム温度：３０℃；測定波長：２１０ｎｍ。
移動相：アセトニトリル−イソプロパノール、体積比は７５：２５；アイソクラティック溶出を行った。
【００６３】
１．２．３、γ−シトステロール検量線の作成
１ｍｇ／ｍＬのγ−シトステロールのストック溶液を純水で調製し、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの被測定液に９５％のエタノールで正確に希釈し、１．２．２のクロマトグラフィー条件に従って液体クロマトグラフィーに注入し、γ−シトステロールの濃度を横軸、ピーク面積を縦軸として、γ−シトステロールの検量線を作成し、ただし、γ−シトステロールの保留時間は１６．１５７ｍｉｎである。
【００６４】
１．２．４、サンプルテスト
１．２．１のテスト用サンプルを１．２．２のクロマトグラフィー条件に従って液体クロマトグラフィーに注入し、１６．１５７ｍｉｎでの各実施例／比較例の２つの並行なサンプルのクロマトグラフィーピークのピーク面積を記録し、γ−シトステロールの検量線から、アボカドのテスト用サンプルにおけるγ−シトステロールの含有量を算出し、２回のテスト結果の平均値を取って最終的なテスト結果とした。
【００６５】
【表２】
0006951525.tif 000003
【００６６】
表２から分かるように、本発明の調製方法により得られたアボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量は、８．０２６〜８．８２８μｇ／ｍｇであり、そのうち、実施例５は本発明の最適な実施例である。
【００６７】
比較例１では、ステップＳ２の超音波補助抽出温度を９０℃に設定し、他のステップは実施例５と一致するが、そのアボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が大幅に減少し、実施例５と比較すると、ほぼ２７．８％が損失したことが明らかであり、これは、抽出温度がアボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量に明らかな影響を与えることを示している。
【００６８】
比較例２では、ステップＳ４の真空凍結乾燥の昇華乾燥段階で３段階の温度勾配制御乾燥を使用せず、温度を直接−８℃に設定し、５．５時間保持し、実施例５と比較すると、アボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量も減少し、即ち、３段階の温度勾配制御乾燥の操作により、アボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの生物活性の影響を受けることを防止し、さらに抽出過程における生成物の収率を向上させることができる。
【００６９】
比較例３は、実施例５と比較すると、そのニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が近いため、抽出操作がその含有量を減少させないことを示している。
【００７０】
試験例２、酸化防止及び老化防止の性能テスト
２．１、ＤＰＰＨ消去実験テスト
ＤＰＰＨは、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジルとも呼ばれ、窒素を中心とする非常に安定したフリーラジカルであり、その安定性は、主に共鳴安定化作用がある３つのベンゼン環の立体障害はそれらの間に挟まれた窒素原子上の不対電子が電子対形成に自身の役割を果たすことができないことに起因する。その無水エタノール溶液は紫色であり、５１７ｎｍの波長に極大吸収波長を有し、吸光度と濃度は線形関係にある。その中にラジカル消去剤を加えると、ＤＰＰＨと組み合わせ、あるいはＤＰＰＨに代わりに、ラジカルの数を減少させ、吸光度を小さくし、溶液の色を薄くすることができ、これによりラジカルの消去能力を評価できる。
【００７１】
０．２ｍｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨ無水エタノール溶液を調製し、２００ｍｇ／ｍＬの濃度の被測定サンプル溶液を調製し、ビタミンＣを陽性対照サンプルとした。
【００７２】
サンプル溶液２ｍＬとＤＰＰＨ溶液２ｍＬをそれぞれ栓付試験管に吸引して均一に混合し、光を避けて３０分間反応させ、５１７ｎｍ波長での吸光値Ａ１を測定し、サンプル溶液２ｍＬとメタノール２ｍＬをそれぞれ栓付試験管に吸引して均一に混合し、光を避けて３０分間反応させ、５１７ｎｍ波長での吸光値Ａ２を測定し、ＤＰＰＨ溶液２ｍＬとメタノール２ｍＬをそれぞれ栓付試験管に吸引して均一に混合し、光を避けて３０分間反応させ、５１７ｎｍ波長での吸光値Ａ０を測定し、各サンプルは３つの並行なサンプルを作製し、アボカド抽出物のＤＰＰＨ消去率を記録し、最終結果は３つの並行なサンプルの平均値を取った。
【数１】
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【００７３】
２．２、終末糖化産物除去実験テスト
非酵素的グリコシル化は、タンパク質とグルコースが体内で非酵素的反応が発生してシッフ塩基又はアマドリ産物などの早期グリコシル化産物を形成し、さらに酸化、再配列、架橋などの過程を経て、不可逆的な非酵素的グリコシル化最終産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＡＧＥｓ）を形成する一連の複雑な非酵素的反応である。該反応は生体内で広くてゆっくりと進行し、タンパク質の機能低下と老化を引き起こし、さらに有機体組織の老化と病変を引き起こす可能性があるため、ＡＧＥｓを効率的に除去できる物質は老化防止作用を有することを提示できる。
【００７４】
以下の試薬をそれぞれ調製した。（１）０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液；（２）０．０５ｍｏｌ／ＬのＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）；（３）１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液；（４）４５ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液；（５）０．２５ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸アミノグアニジン溶液；（６）２００ｍｇ／ｍＬのアボカド抽出物の被測定サンプル溶液。
０．０５ｍｏｌ／ＬのＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液及び４５ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液を恒温恒湿インキュベーターに入れてからアボカド抽出物の被測定サンプル溶液及び０．２５ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸アミノグアニジン溶液を加え、６０℃の条件で４０時間（３０℃の条件下で６０日培養することに相当する）培養した。４０時間後に各サンプルを取り出し、４０時間後、各サンプルを取り出してマイクロプレートリーダーで検出し、３７０／４４０ｎｍの蛍光励起／発光波長での蛍光吸収値を記録した。各サンプルは３つの並行なサンプルを作製し、アボカド抽出物のＡＥＧｓの抑制率を記録し、最終結果は３つの並行なサンプルの平均値を取った。ＡＥＧｓの抑制率は下記式に示し、ただし、Ａサンプルは、被験物とグルコース溶液を添加した場合の蛍光強度を示し、Ａサンプルブランクは、グルコース溶液を添加せず被験物を添加した場合の蛍光強度を示し、Ａ陰性対照は、被験物を含まずグルコース溶液を有する場合の蛍光強度を示し、Ａグルコース欠乏陰性対照は、被験物及びグルコース溶液を含まない場合の蛍光強度を示した。
【数２】
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【００７５】
【表３】
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【００７６】
表３の実施例１〜５に示すように、本発明の調製方法で調製されたアボカド抽出物のＤＰＰＨ消去率及びＡＥＧｓ抑制率はそれぞれ８６．５８％〜８８．９９％及び８５．３８％〜８９．８３％の範囲内にあり、それに対して、比較例１のＤＰＰＨ消去率及びＡＥＧｓ抑制率はそれぞれ７１．２６％及び６８．７９％であり、これにより、ＤＰＰＨ消去率及びＡＥＧｓ抑制率とニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量とは正の相関傾向があることを示した。表２の試験データは、本発明の調製方法により調製されたアボカド抽出物が優れた酸化防止及び老化防止効果を有することを提示した。
【００７７】
試験例３、異なる調製方法で得られたアボカド抽出物の安定性テスト
テスト方法：実施例１、２、５及び比較例３の調製方法で得られたアボカド抽出物を取って試験を行い、各テスト用サンプルをそれぞれ１４、２８、５６日密封貯蔵した後、抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量を液体クロマトグラフィーでテストし、クロマトグラフィー条件及びテスト方法は試験例１と一致する。具体的な試験結果は表４に示す。
【００７８】
【表４】
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【００７９】
表４に示すように、実施例１及び実施例２のアボカド抽出物は、１４〜５６日後にニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量がいずれも低減し、貯蔵時間の増加に伴ってニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量がますます低減し、それに対して実施例５及び比較例３のアボカド抽出物は、１４〜５６日後にニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量があまり変化せず、よって、真空凍結乾燥機で凍結させた製品を窒素密封乾燥ボックスに入れて乾燥させて密封貯蔵することにより、アボカド抽出物におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの安定性を向上させることができることを証明した。
【００８０】
当業者は、上記の実施例が本発明の原理及びその効果を例示的に示すものに過ぎず、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、上記の実施例を修正又は変更することができる。したがって、本発明に開示された精神及び技術的思想から逸脱することなく、当業者により行われたすべての同等の修正又は変更は、依然として本発明の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図１】
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