【手続補正書】
【提出日】平成30年9月26日(2018.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の認識可能なタグを含む発現可能なタンパク質をコードする核酸配列を、内因性ＤＮＡＫタンパク質またはＤＮＡＫタンパク質ホモログおよび第２の認識可能なタグを発現するように遺伝的に修飾されている染色体を有する細胞に、挿入すること（ただし、発現可能なタンパク質は内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログではなく、第１の認識可能なタグと第２の認識可能なタグとは同じではない）、
ｂ）核酸によりコードされる発現可能なタンパク質を発現させること、
ｃ）発現可能なタンパク質と内因性タンパク質を含む、細胞溶解物を抽出すること、
ｄ）第２の認識可能なタグを標的にすることによって細胞溶解物から内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログを除去することを含み、かつ、実質的に細胞溶解物から発現可能なタンパク質を除去しない、タンパク質精製手順に、細胞溶解物を適用することによって内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログを精製すること、および
ｅ）核酸によりコードされる発現可能なタンパク質を、第１の認識可能なタグを標的にすることによって精製すること
を含み、工程ｄおよびｅは、いずれの順で行われてもよく、前記細胞は細菌細胞である、タンパク質の単離方法。
【請求項２】
第２の認識可能なタグが、タンパク質タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質タグが、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨｉｓタグまたはＭｙｃタグである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質精製手順が、固相支持体または液相支持体単離を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログの精製工程が少なくとも１回繰り返されてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞溶解物内の他の混入物を標的にする追加の精製工程に用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログのタンパク質精製手順は、内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログに結合する別のタンパク質も単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝的に修飾された染色体は、染色体ＤＮＡＫ遺伝子の欠失を含み、かつ、内因性ＤＮＡＫタンパク質又はＤＮＡＫタンパク質ホモログおよび第２の認識可能なタグの核酸配列を含む形質転換されたベクターによって置換される、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ＤＮＡＫに結合することが公知の特定のタンパク質が、その特定のタンパク質が発現されＤＮＡＫタグ株から単離される際に単離され得る場合、タグ付きＤＮＡＫを使用してもよい。これは、診断および研究応用の両方に有用であり得る。
タグ付きＤＮＡＫアミノ酸配列はまた、プロテアーゼ感受性認識部位で修飾することができ、任意の微量のＤＮＡＫをさらに減少させるために、そのような認識部位をタグ付きＤＮＡＫと共に用いてよい。
本明細書は本発明の特定の実施形態を説明しているが、当業者は、本発明の概念を逸脱することなく本発明の変化形を考案することができる。
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本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ａ）ＤＮＡＫタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドおよび認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された遺伝子配列
を含む細菌であって、
ｂ）該遺伝子配列は天然に存在しない、細菌。
〔２〕認識可能なタグをコードする前記ヌクレオチド配列が、ＤＮＡＫのＮ末端またはＣ末端をコードするヌクレオチドの近くまたは内部の前記遺伝子配列上に位置する、前記〔１〕に記載の細菌。
〔３〕認識可能なタグがタンパク質タグであってよい、前記〔１〕に記載の細菌。
〔４〕ＤＮＡＫのヌクレオチド配列と認識可能なタグをコードするヌクレオチド配列との間にリンカー配列が挿入される、前記〔１〕に記載の細菌。
〔５〕ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列が欠失した、前記〔１〕に記載の細菌。
〔６〕ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列が修飾されており、該修飾が、ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列の発現を実質的に停止させた、前記〔１〕に記載の細菌。
〔７〕前記遺伝子配列が、細菌の染色体ＤＮＡと、認識可能なタグおよびＤＮＡＫの遺伝子配列の少なくともいくつかの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との相同組換えによって作製された、前記〔１〕に記載の細菌。
〔８〕前記〔７〕に記載の相同組換えであって、組換えの特異的部位が、ＤＮＡＫの天然に生じる遺伝子配列の少なくとも一部の置換を可能にし、認識可能なタグを導入するものである、相同組換え。
〔９〕前記〔７〕に記載の核酸であって、プラスミドＤＮＡの一部である、核酸。
〔１０〕ａ）ＤＮＡＫまたはＤＮＡＫホモログおよび認識可能なタグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細胞に、タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすること、
ｂ）核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
ｃ）細胞溶解物を抽出すること、および
ｄ）認識可能なタグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔１１〕前記細胞が細菌細胞である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記認識可能なタグがタンパク質タグである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕精製工程が固相支持体または液相支持体単離手順を利用する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕精製工程が少なくとも１回繰り返され得る、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１５〕細胞溶解物中の他の汚染物質を標的とする他の精製工程が用いられる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１６〕内因性タンパク質の精製工程が、内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１７〕ａ）ＤＮＡＫまたはＤＮＡＫホモログおよびタンパク質タグを含む内因性タンパク質を発現するように染色体が遺伝的に修飾されている細菌細胞に、タンパク質をコードする核酸を形質転換すること、
ｂ）核酸によりコードされるタンパク質を発現させること、
ｃ）細胞溶解物を抽出すること、および
ｄ）タンパク質タグに結合する方法により内因性タンパク質を除去することによって細胞溶解物を精製すること
を含む、タンパク質の単離方法。
〔１８〕タンパク質タグが、Ｎ末端またはＣ末端の近くに位置する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕精製工程が固相支持体または液相支持体単離手順を利用する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕内因性タンパク質の精製工程が、当該内因性タンパク質と関連し得る別のタンパク質も単離する、前記〔１７〕に記載の方法。