(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の培地に１μＭのアトルバスタチンを加え、２４時間前処理した後、細胞の培地を無エクソソームの完全培地に変更して引き続き培養し、４８時間後に馴化培地を収集し、アトルバスタチンで前処理した間葉系幹細胞から分泌されたエクソソームを超遠心により分離して得ることを含み、前記アトルバスタチンで前処理した間葉系幹細胞から得られるエクソソームは、球状又はディスク状であり、３０〜１５０ｎｍの範囲の粒径分布を有し、かつ、アトルバスタチンで前処理していない間葉系幹細胞から得られるエクソソームよりも１０倍以上のｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９を高発現している、間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法。
【請求項２】
前記超遠心は、
馴化培地を収集し、３００ｇで１０分遠心することにより、細胞を除去する工程と、
２０００ｇで２０分遠心することにより、細胞破片を除去する工程と、
１６５００ｇで３０分高速遠心することにより、大型小胞を除去する工程と、
１２００００ｇで７０分超遠心することにより沈殿を回収し、再懸濁後に、再度１２００００ｇで７０分超遠心し、エクソソームを得る工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞又は脂肪間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤前処理による間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法に関し、具体的には、スタチン系薬剤前処理による間葉系幹細胞由来エクソソームの効率的な調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ）の統計データにより、心血管疾患は、世界中で２０１６年の死因の１位となり（凡そ１７６０万人、３２．２％を占める）、そのうちの９４８万人は、虚血性心疾患（１７．３％を占める）で死亡した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ  ＧＭ．  Ｇｌｏｂａｌ，  ｒｅｇｉｏｎａｌ，  ａｎｄ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｕｎｄｅｒ−５  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，  ａｄｕｌｔ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，  ａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，  ａｎｄ  ｌｉｆｅ  ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ，  １９７０−２０１６：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ２０１６．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１７；３９０（１０１００）：１０８４−１１５０；  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ  ＧＣＯＤ．  Ｇｌｏｂａｌ，  ｒｅｇｉｏｎａｌ，  ａｎｄ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ−ｓｅｘ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ２６４  ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ，  １９８０−２０１６：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ２０１６．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１７；３９０（１０１００）：１１５１−１２１０）。急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ、ＡＭＩ）では、多数の心筋が虚血によって壊死し、そして瘢痕組織に代替され、心不全、さらには死亡を誘発する。従来の治療手段では、心筋の再生及び修復に非効果的である。近年、ＡＭＩの治療には、幹細胞移植療法、特に例えば骨髄間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭ−ＭＳＣｓ）のような間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ、ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）の移植療法が強く期待されてきた（Ｏｒｌｉｃ  Ｄ，  Ｋａｊｓｔｕｒａ  Ｊ，  Ｃｈｉｍｅｎｔｉ  Ｓ，  Ｊａｋｏｎｉｕｋ  Ｉ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＭ，  Ｌｉ  Ｂ，  Ｐｉｃｋｅｌ  Ｊ，  ＭｃＫａｙ  Ｒ，  Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ  Ｂ，  Ｂｏｄｉｎｅ  ＤＭ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ．  Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；４１０（６８２９）：７０１−７０５；  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＡ，  Ｄｏｒｅｅ  Ｃ，  Ｍａｔｈｕｒ  Ａ，  Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｅｎｄｏｎ  Ｅ．  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１５；１１６（８）：１３６１−１３７７；  Ａｆｚａｌ  ＭＲ，  Ｓａｍａｎｔａ  Ａ，  Ｓｈａｈ  ＺＩ，  Ｊｅｅｖａｎａｎｔｈａｍ  Ｖ，  Ａｂｄｅｌ−Ｌａｔｉｆ  Ａ，  Ｚｕｂａ−Ｓｕｒｍａ  ＥＫ，  Ｄａｗｎ  Ｂ．  Ａｄｕｌｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ    Ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌｓ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２０１５；１１７（６）：５５８−５７５）。しかしなが��、臨床研究によれば、間葉系幹細胞はパラ分泌による保護効果に基づき梗塞後の心機能をある程度に改善するものの、その効果が著明ではない。更に研究した結果、間葉系幹細胞は、パラ分泌により保護効果を発生するマカニズムは主に細胞外小胞構造体であるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の分泌により達成されることが明らかとなった（Ｍａｋｒｉｄａｋｉｓ  Ｍ，  Ｒｏｕｂｅｌａｋｉｓ  ＭＧ，  Ｖｌａｈｏｕ  Ａ．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２０１３；１８３４（１１）：２３８０−２３８４；Ｈｕａｎｇ  Ｐ，  Ｔｉａｎ  Ｘ，  Ｌｉ  Ｑ，  Ｙａｎｇ  Ｙ．  Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｖ  ２０１６；２１（６）：７３７−７５２；Ｌａｉ  ＲＣ，  Ａｒｓｌａｎ  Ｆ，  Ｌｅｅ  ＭＭ，  Ｓｚｅ  ＮＳ，  Ｃｈｏｏ  Ａ，  Ｃｈｅｎ  ＴＳ，  Ｓａｌｔｏ−Ｔｅｌｌｅｚ  Ｍ，  Ｔｉｍｍｅｒｓ  Ｌ，  Ｌｅｅ  ＣＮ，  Ｅｌ  ＯＲ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ．  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ＭＳＣ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２０１０；４（３）：２１４−２２２）。エクソソームは、供給源の豊富さ、安定、免疫原性なしなどの利点を有し、またＢＭ−ＭＳＣｓ由来のエクソソーム  （ＭＳＣ−Ｅｘｏ）は、心筋梗塞微小環境を改善することができるため、新世代の心筋修復製品として期待されている（Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ  ＴＮ，  Ｓｏｋｉｃ  Ｓ，  Ｓｃｈａｒｄｔ  ＪＳ，  Ｒａｉｋｅｒ  ＲＳ，  Ｌｉｎ  ＪＷ，  Ｊａｙ  ＳＭ．  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ：  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１５；２１（１）：４５−５４）。
【０００３】
発明内容
本発明は、効率的な間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
本発明により、スタチン系薬剤、例えばアトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ、  ＡＴＶ）で間葉系幹細胞を前処理することにより、間葉系幹細胞の抗アポトーシス能及びホーミング促進能を有意に向上させ、著明な心筋梗塞微小環境改善作用及び効率的な心筋修復能力を有する幹細胞由来エクソソームを調製することができることを発見した。
【０００５】
一方、本発明は、スタチン系薬剤で間葉系幹細胞を前処理し、分泌のエクソソームを収集するように処理された間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法を提供する。
【０００６】
本発明の具体的実施態様によれば、本発明にかかる間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法は、
間葉系幹細胞の培地にスタチン系薬剤を加え、１２〜２４時間前処理した後、細胞の培地を無エクソソームの完全培地に変更して引き続き培養し、４８時間後に馴化培地を収集し、スタチン系薬剤で前処理した間葉系幹細胞から分泌されたエクソソームを超遠心により分離して得ることを含む。
【０００７】
本発明の具体的実施態様によれば、本発明にかかる間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法において、前記超遠心は、
馴化培地を収集した後、遠心により細胞を除去する工程と、遠心により細胞破片を除去する工程と、高速遠心により大型小胞を除去する工程と、そして超遠心により沈殿を回収し、再懸濁後に再度超遠心し、エクソソームを得る工程とをこの順で含む。
【０００８】
本発明の一つの好ましい具体的実施態様において、馴化培地を収集した後、３００ｇで１０分遠心することにより、細胞を除去する。２０００ｇで２０分遠心することにより、細胞破片を除去する。１６５００ｇで３０分高速遠心することにより、大型小胞を除去する。１２００００ｇで７０分超遠心することにより沈殿を回収し、再懸濁後に、再度１２００００ｇで７０分超遠心し、エクソソームを得る。
【０００９】
本発明の具体的実施態様によれば、本発明にかかる間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法において、前記スタチン系薬剤は、アトルバスタチンを含む。
【００１０】
本発明の具体的実施態様によれば、本発明にかかる間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法において、前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞又は脂肪間葉系幹細胞を含む。
【００１１】
一方、本発明は、また、本発明に記載の方法により調製したエクソソームを提供する。
【００１２】
もう一方、本発明は、また、間葉系幹細胞の抗アポトーシス能及び／又はホーミング促進能を向上させる製剤の調製のためのスタチン系薬剤の使用を提供する。
【００１３】
もう一方、本発明は、また、間葉系幹細胞の心筋梗塞微小環境改善作用及び／又は心筋修復能力を有するエクソソームの分泌を促進する製剤の調製のためのスタチン系薬剤の使用を提供する。
【００１４】
本発明の具体的実施態様によれば、本発明において、前記スタチン系薬剤は、アトルバスタチンを含み、好ましくは、スタチン系薬剤１μＭで間葉系幹細胞を２４時間前処理する。
【００１５】
本発明の具体的実施態様によれば、本発明において、前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞又は脂肪間葉系幹細胞を含む。
【００１６】
本発明の一つの具体的実施態様において、ＡＴＶ  １μＭでＢＭ−ＭＳＣを２４時間前処理することにより、効率的な心筋修復及び内皮保護機能を有するエクソソームを取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、本発明実施例における間葉系幹細胞由来エクソソームの同定結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、本発明実施例における間葉系幹細胞由来エクソソームの同定結果を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、本発明実施例における間葉系幹細胞由来エクソソームの同定結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｄは、濃度の異なるＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームの内皮細胞への作用差を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｄは、濃度の異なるＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームの内皮細胞への作用差を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｄは、濃度の異なるＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームの内皮細胞への作用差を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｄは、濃度の異なるＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームの内皮細胞への作用差を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｇ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図３Ｈ】図３Ａ〜図３Ｈは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが血管内皮細胞の管形成、遊走及び生存の促進についての測定結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが有意なラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小という測定結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが有意なラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小という測定結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが有意なラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小という測定結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが有意なラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小という測定結果を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが有意なラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小という測定結果を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームが有意なラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小という測定結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｅ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｆ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｇ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｈ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｉ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｊ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【図５Ｋ】図５Ａ〜図５Ｋは、ＡＴＶで前処理した間葉系幹細胞由来エクソソームによる保護作用とｌｎｃＲＮＡＨ１９の発現上昇との関係を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、具体的な実施例により本発明の特徴及び奏する技術効果についてさらに詳細に説明するが、本発明はそれらによって何ら限定されるものではない。実施例では、各々の出発試薬は、何れも市販されるものであり、具体的条件が記載されていない実験方法について、当分野で周知の一般的方法及び通常の条件、又は機器メーカーの推奨条件に従う。
【実施例】
【００１９】
実施例１
間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法
差次接着により初代ラット（ＳＤラット、６０〜８０ｇ）ＢＭ−ＭＳＣｓを単離し、３〜４代目に拡大継代して使用に備えた。ＢＭ−ＭＳＣｓ完全培地（ＩＭＤＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ）にＡＴＶを加え、２４時間前処理した後、細胞の培地を無エクソソームの完全培地（１８時間の超遠心により得られた１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）に変更して引き続き培養した。４８時間後、馴化培地を回収し、超遠心によりＡＴＶで前処理したＢＭ−ＭＳＣｓに分泌されたエクソソーム（ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏ）を分離して得た。具体的な超遠心工程は、馴化培地を回収した後、３００ｇで１０分遠心することにより、細胞を除去する工程と、２０００ｇで２０分遠心することにより、細胞破片を除去する工程と、１６５００ｇで３０分高速遠心することにより、大型小胞を除去する工程と、１２００００ｇで７０分超遠心することにより沈殿を回収し、再懸濁後に、再度１２００００ｇで７０分超遠心し、エクソソームを得る工程とを含む。
【００２０】
調製したＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏの同定
電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｈ−６００ＩＶ、日本）で、形態構造を解析観察すること、ＮＴＡ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ、イギリス）で、エクソソームの粒径分布を分析すること、及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔでエクソソーム蛋白質マーカーを検出することを含む。
【００２１】
濃度の異なるＡＴＶでの前処理がＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏの機能への影響を比較して、最適なＡＴＶ前処理濃度を選定した。この最適なＡＴＶ濃度で前処理したＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏを利用して、血管内皮細胞の管形成、遊走及び抗アポトーシス作用への影響、心筋内注射によるラット心筋梗塞後心機能改善、梗塞面積減小効果を含む機能学的評価を行った。最後に、ＭＳＣＡＴＶ−ＥｘｏにおけるｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９発現レベルを測定する分子生物学的評価を行った。
【００２２】
評価指標（調査結果）
超遠心により分離して得たＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、電子顕微鏡下で球状若しくはディスク状を示し、１００ｎｍ程度の大きさを有する。ＮＴＡ分析により、その粒径分布は３０〜１５０ｎｍの範囲にあり、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔアッセイにより、ＭＳＣＡＴＶ−ＥｘｏはＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＣＤ６３、ＣＤ８１などのエクソソーム蛋白質マーカーを高発現していることが明らかとなる。ＡＴＶで前処理されたＢＭ−ＭＳＣと前処理されていないＢＭ−ＭＳＣは、それぞれの分泌されたエクソソームが、形態、粒径分布及び蛋白質マーカーに有意な差が認められていない。具体的な結果として、図１Ａ〜図１Ｃに示した。なお、図１Ａは、間葉系幹細胞由来エクソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）の形態構造が電子顕微鏡下で観察されたものであり、球状若しくはディスク状を示し、大きさが１００ｎｍ程度であり、スタチン系前処理した後、形態が変化しなっかた。図１Ｂでは、ＭＳＣ−Ｅｘｏの粒径分布がＮＴＡにより分析され、スタチン系前処理されたと処理されていないＭＳＣ−Ｅｘｏの粒径分布は、ともに３０〜１５０ｎｍの範囲にある。図１Ｃでは、エクソソームの蛋白質マーカー同定を示し、スタチン系処理したＭＳＣ−Ｅｘｏは、ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＣＤ６３、ＣＤ８１などのエクソソーム蛋白質マーカーを高発現している。
【００２３】
濃度の異なるＡＴＶ（０．０１、０．１、１、１０μＭ）で前処理されたＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏについて機能学的に分析した結果として、ＡＴＶ  １μＭで前処理されたＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、最も強い内皮細胞の管形成及び遊走を促進する作用を示すことを発見した。具体的な結果を、図２Ａ〜図２Ｄに示した。なお、図２Ａ〜図２Ｂでは、濃度の異なるＡＴＶ（０．０１、０．１、１、１０μＭ）で前処理された間葉系幹細胞から抽出したエクソソームによる内皮細胞管形成への作用差を比較し、ＡＴＶ  １μＭでの前処理した方が最適効果を示した（図２Ｂ）。図２Ｃ〜図２Ｄでは、濃度の異なるＡＴＶで前処理された間葉系幹細胞から後抽出したエクソソームによる内皮細胞遊走への作用差を比較し、ＡＴＶ  １μＭでの前処理した方が最適効果を示した（図２Ｄ）。
【００２４】
ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、ＡＴＶで前処理されていないＭＳＣ−Ｅｘｏよりも血管内皮細胞の管形成及び遊走を有意に促進するとともに、低酸素・無血清条件下での内皮細胞の生存及び抗アポトーシス作用を促進することができる。具体的には、図３Ａ〜図３Ｈに示した。なお、図３Ａ  〜図３Ｂでは管形成試験により、ＡＴＶで前処理された間葉系幹細胞由来エクソソーム（ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏ）は、コントロール群より血管内皮細胞管形成を有意に促進することが明らかとなった。図３Ｃ〜図３Ｄではスクラッチアッセイ（創傷治癒アッセイ）により、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、コントロール群よりも血管内皮細胞遊走を有意に促進することが明らかとなった。図３Ｅ〜図３Ｆではフローサイトメトリーアッセイにより、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、コントロール群より血管内皮細胞の低酸素・無血清条件下での生存を有意に促進することが明らかとなった。図３Ｇ〜図３ＨではＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色により、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏが、コントロール群より血管内皮細胞の低酸素・無血清条件下でのアポトーシスを有意に低減することが明らかとなった。
【００２５】
ＡＴＶで前処理されていないＭＳＣ−Ｅｘｏと比べ、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、心筋内注射された後にラット心筋梗塞後心機能を有意に改善し、梗塞面積を減小させることができる。具体的には、図４Ａ〜図４Ｆに示した。なお、図４Ａ〜図４Ｂでは、心筋梗塞ラットの心機能がＡＴＶで前処理された間葉系幹細胞由来エクソソーム（ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏ）の移植によって有意に改善されることが明らかとなった。図４Ｃ〜図４Ｄでは、Ｍａｓｓｏｎ染色により、ラット心筋梗塞面積がＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏ移植によって有意に減少されることが明らかとなった。図４Ｅ〜図４Ｆでは、シリウスレッド染色により、ラット心筋梗塞局所へのコラーゲン沈着がＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏ移植によって有意に減少されることが明らかとなった。
【００２６】
ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏは、ＭＳＣ−Ｅｘｏよりも１０倍以上のｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９を高発現している。ＡＴＶで前処理されたＭＳＣにおいて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）によりｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９発現レベルをノックダウンし、それにより分泌されたエクソソーム（ＭＳＣＡＴＶ（Ｓｉ）−Ｅｘｏ）を抽出すると、上記保護作用がなくなることから、ｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９は、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏによる効率的な内皮細胞保護作用、心機能改善及び梗塞面積縮小作用に関与していることが明らかとなった。具体的には、図５Ａ〜図５Ｋに示した。なお、図５Ａ〜図５Ｂでは、ＡＴＶで前処理された間葉系幹細胞由来エクソソーム（ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏ）は、ｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９を高発現しており、ｓｉＲＮＡによりノックダウンされたエクソソーム（ＭＳＣＡＴＶ（Ｓｉ）−Ｅｘｏ）において、ｌｎｃＲＮＡ  Ｈ１９発現レベルは有意に低下することが明らかとなった。図５Ｃ〜図５Ｈでは、ＭＳＣＡＴＶ（Ｓｉ）−Ｅｘｏによる内皮保護作用は、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏよりも減少することが明らかとなった。図５Ｉ〜図５Ｋでは、ＭＳＣＡＴＶ（Ｓｉ）−Ｅｘｏによる梗塞後心機能改善作用、心筋修復作用は、ＭＳＣＡＴＶ−Ｅｘｏよりも減弱することが明らかとなった。
【００２７】
結論：ＡＴＶ  １μＭでＢＭ−ＭＳＣ  を２４時間前処理することにより、効率的な内皮保護及び心筋修復機能を有するエクソソームを取得することができ、そのマカニズムとしては、エクソソームにおけるｌｎｃＲＮＡＨ１９発現レベルの上昇と関係する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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