【手続補正書】
【提出日】平成30年5月2日(2018.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞であって、
（ｉ）機能的ニコチンＮ−デメチラーゼをコードし、かつ配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それから構成される、またはそれから実質的に構成されるポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、    （ｉｉｉ）ニコチンＮ−デメチラーゼをコードし、かつ配列番号３との少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む、それから構成される、またはそれから実質的に構成されるポリペプチド、または
（ｉｖ）（ｉ）に記載した前記単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを含み、
かつ前記ニコチンデメチラーゼの前記発現または活性が、前記ニコチンデメチラーゼの前記発現または活性が低減されなかった対照のたばこ植物細胞と比較して低減される、たばこ植物細胞。
【請求項２】
前記たばこ植物細胞が前記ニコチンＮ−デメチラーゼの前記発現または活性を減少させる１つ以上の突然変異を含む、請求項１に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞であって、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異を含み、ここで前記突然変異は結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼの発現または機能の低減をもたらすが、好ましくは、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼが、配列番号１２〜１６またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択され、好ましくは、前記突然変異が結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼの変性をもたらし、かつ配列番号５のアミノ酸残基３２９、３６４、３７６、３８２、および４５８またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択される位置で発生し、好ましくは、前記突然変異が、ａ）配列番号５の位置３２９にあるトリプトファン残基のための終止コドン置換、ｂ）配列番号５の位置３６４にあるリジン残基のためのアスパラギン置換、ｃ）配列番号５の位置３７６にあるバリン残基のためのメチオニン置換、ｄ）配列番号５の位置３８２にあるプロリン残基のためのセリン置換、ｄ）配列番号５の位置４５８にあるプロリン残基のためのセリン置換、およびｅ）それらのうちの二つ以上の任意の組み合わせから成る群から選択される、たばこ植物細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞であって、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異を含むが、ここで前記突然変異は結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼの発現または機能の低減をもたらし、好ましくは、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼが配列番号２４または２５またはその組み合わせから選択され、好ましくは、前記突然変異が結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼの変性をもたらし、かつ配列番号１７のアミノ酸残基４２２または４４９またはその組み合わせで発生し、好ましくは前記突然変異は、ａ）配列番号１７の位置４２２にあるトリプトファン残基のための終止コドン置換、ｂ）配列番号１７の位置４４９にあるプロリン残基のためのロイシン置換、およびｃ）その組み合わせから成る群から選択される、たばこ植物細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞であって、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異を含むが、ここで前記突然変異は結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼの発現または機能の低減をもたらし、好ましくは前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼが、配列番号３２〜３５またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択され、好ましくは、前記突然変異が結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼの変性をもたらし、かつ配列番号２６のアミノ酸残基７９、１０７、３８２、４１９またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択される位置で発生し、好ましくは、前記突然変異は、ａ）配列番号２６の位置７９にあるグリシン残基のためのセリン置換、ｂ）配列番号２６の位置１０７にあるプロリン残基のためのセリン置換、ｃ）配列番号２６の位置３８２にあるプロリン残基のためのセリン置換、ｄ）配列番号２６の位置４１９にあるプロリン残基のためのセリン置換、およびｅ）その任意の組み合わせから成る群から選択される、たばこ植物細胞。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞であって、
（ｉ）ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記突然変異は結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼの発現または機能の低減をもたらすが、好ましくは、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼが、配列番号１２〜１６またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択され、好ましくは、前記突然変異が結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼの変性をもたらし、かつ配列番号５のアミノ酸残基３２９、３６４、３７６、３８２、および４５８またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択される位置で発生し、好ましくは、前記突然変異が、ａ）配列番号５の位置３２９にあるトリプトファン残基のための終止コドン置換、ｂ）配列番号５の位置３６４にあるリジン残基のためのアスパラギン置換、ｃ）配列番号５の位置３７６にあるバリン残基のためのメチオニン置換、ｄ）配列番号５の位置３８２にあるプロリン残基のためのセリン置換、ｄ）配列番号５の位置４５８にあるプロリン残基のためのセリン置換、およびｅ）それらのうちの二つ以上の任意の組み合わせから成る群から選択される）；及び
（ｉｉ）ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記突然変異は結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼの発現または機能の低減をもたらし、好ましくは、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼが配列番号２４または２５またはその組み合わせから選択され、好ましくは、前記突然変異が結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼの変性をもたらし、かつ配列番号１７のアミノ酸残基４２２または４４９またはその組み合わせで発生し、好ましくは前記突然変異は、ａ）配列番号１７の位置４２２にあるトリプトファン残基のための終止コドン置換、ｂ）配列番号１７の位置４４９にあるプロリン残基のためのロイシン置換、およびｃ）その組み合わせから成る群から選択される）；及び
（ｉｉｉ）ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記突然変異は結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼの発現または機能の低減をもたらし、好ましくは前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼが、配列番号３２〜３５またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択され、好ましくは、前記突然変異が結果的に前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼの変性をもたらし、かつ配列番号２６のアミノ酸残基７９、１０７、３８２、４１９またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせから成る群から選択される位置で発生し、好ましくは、前記突然変異は、ａ）配列番号２６の位置７９にあるグリシン残基のためのセリン置換、ｂ）配列番号２６の位置１０７にあるプロリン残基のためのセリン置換、ｃ）配列番号２６の位置３８２にあるプロリン残基のためのセリン置換、ｄ）配列番号２６の位置４１９にあるプロリン残基のためのセリン置換、およびｅ）その任意の組み合わせから成る群から選択される）
をさらに含む、たばこ植物細胞。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞であって、
（ｉ）ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異およびＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼが配列番号１３（Ｗ３２９Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼが配列番号２４（Ｗ４２２Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼが配列番号３３（Ｇ７９Ｓ）に規定された配列を含む）；または
（ｉｉ）ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異およびＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼが配列番号１３（Ｗ３２９Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼが配列番号２４（Ｗ４２２Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼが配列番号３４（Ｐ１０７Ｓ）に規定された配列を含む）；または
（ｉｉｉ）ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異およびＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼが配列番号１３（Ｗ３２９Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼが配列番号２４（Ｗ４２２Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼが配列番号３５（Ｐ３８２Ｓ）に規定された配列を含む）；または
（ｉｖ）ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異およびＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子における１つ以上の突然変異（ここで、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチンデメチラーゼが配列番号１３（Ｗ３２９Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチンデメチラーゼが配列番号２４（Ｗ４２２Ｓｔｏｐ）に規定された配列を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチンデメチラーゼが配列番号３２（Ｐ４１９Ｓ）に規定された配列を含む）
をさらに含む、たばこ植物細胞。
【請求項８】
前記突然変異がヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の、突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞。
【請求項９】
前記植物細胞が１％未満のニコチンからノルニコチンへの変換を持つ、請求項１〜８のいずれか１項に記載の突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えのたばこ植物細胞。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物細胞を含む、突然変異の、非天然の、または遺伝子組み換えの植物またはその構成要素またはその部分。
【請求項１１】
請求項１０に記載の植物に由来するバイオマス、種子、幹、花または葉を含む、植物材料。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物細胞、請求項１０の植物の少なくとも一部、または請求項１１に記載の植物材料を含む、たばこ製品。
【請求項１３】
ノルニコチンおよび／またはＮＮＮのレベルが低減されたたばこ植物を調製するための方法であって、前記方法が、
（ａ）（ｉ）機能的ニコチンＮ−デメチラーゼをコードし、かつ配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それから構成される、またはそれから実質的に構成されるポリヌクレオチドを含む植物を用意する工程と、
（ｂ）１つ以上の突然変異を前記たばこ植物の前記ポリヌクレオチドに挿入して突然変異のたばこ植物を生成する工程と、
（ｃ）随意に前記たばこ植物材料を乾燥処理する工程と、
（ｄ）前記突然変異のたばこ植物中のノルニコチンおよび／またはＮＮＮの前記レベルを測定する工程とを含み、対照たばこ植物と比較した前記突然変異のたばこ植物中のノルニコチンおよび／またはＮＮＮの前記レベルの低下が、前記突然変異のたばこ植物における前記ノルニコチンおよび／またはＮＮＮのレベルが低減されたことを示すものである、方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）における前記たばこ植物が、突然変異のたばこ植物であり、好ましくは、前記突然変異のたばこ植物が１つ以上のさらなるニコチンＮ−デメチラーゼ遺伝子における１つ以上の突然変異を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記突然変異のたばこ植物が、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５またはＣＹＰ８２Ｅ１０またはそれらのうちの二つ以上の組み合わせの群から構成される前記遺伝子における１つ以上のさらなる突然変異を持つ、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
たばこ植物における、たばこ植物材料における、又は、前記たばこ植物若しくはたばこ植物材料に由来するたばこの煙における低いレベルのノルニコチンおよび／またはＮＮＮと関連する、たばこ植物の１つ以上の突然変異を同定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）対照たばこ植物と比較して低いレベルのノルニコチンおよび／またはＮＮＮを有するたばこ植物を同定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で同定された前記たばこ植物に由来する核酸試料を用意する工程と、
（ｃ）前記対照植物中には存在しない配列番号１の配列における１つ以上の突然変異の存在について、工程（ｂ）での前記核酸試料をスクリーニングする工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で同定された前記１つ以上の突然変異を、たばこ植物中のノルニコチンおよび／またはＮＮＮの前記レベルを低減させる既知の突然変異と随意に比較する工程と、
（ｅ）低いレベルのノルニコチンおよび／またはＮＮＮと関連した１つ以上の突然変異を同定する工程とを含む、方法。
【請求項１７】
対照植物材料と比較して低いレベルのノルニコチンを持つか、または対照植物材料と比較して低いレベルの少なくともＮＮＮを持つか、またはその組み合わせを持つ乾燥処理済み植物材料、好ましくは、乾燥処理済みの葉、または花を製作する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の植物または請求項１１に記載の前記植物材料を用意する工程と、
（ｂ）随意に、前記植物材料をそこから収穫する工程と、
（ｃ）少なくともノルニコチンまたはＮＮＮの前記レベルが対照の乾燥処理済み植物材料よりも低くなるような期間だけ前記植物材料を乾燥処理する工程とを含む、方法。