【手続補正書】
【提出日】平成30年6月6日(2018.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物。
【請求項２】
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで２〜８の整数である、発現構築物。
【請求項３】
前記シグナル配列が、天然起源の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、請求項１または２に記載の発現構築物。
【請求項４】
前記シグナル配列が、酵母接合因子アルファシグナル配列または酵母キラートキシンＫ１、分泌酸性ホスファターゼ、インベルターゼ（スクラーゼ）、もしくはＰｓｔ１のシグナル配列である、請求項３に記載の発現構築物。
【請求項５】
前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母接合因子アルファプロ配列または酵母ＫＥＸ２、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｐｅｐ４、もしくはＰｒｂ１のプロ配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項７】
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、ＧＰＤ、ＡＤＨ、ＴＥＦ、ＣＹＣ１、ＭＲＰ７、ＭＥＴ２５、ＴＥＴ、ＶＰ１６、またはＶＰ１６−ＥＲである、請求項６に記載の発現構築物。
【請求項８】
（i）各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ３８、野生型Ａβ３９、野生型Ａβ４０、野生型Ａβ４１、野生型Ａβ４２、野生型Ａβ４３、野生型Ａβ４８、および野生型Ａβ４９からなる群から独立して選択される、または
（ii）各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３、Ａβ４８、およびＡβ４９からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｖ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ｅ１１Ｋ、Ｆ２０Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ｋ、Ｅ２２欠失、Ｄ２３Ｎ、Ｉ３１Ｅ、Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含み、任意で該ポリペプチドが少なくとも２つのアミロイドベータタンパク質もしくは少なくとも４つのアミロイドベータタンパク質を含み、任意で各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含むか、もしくは該ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項１０】
（i）前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１のアミノ酸配列を含む、かつ／または
（ii）エピソームプラスミドもしくは組込みプラスミドであり、任意で該組込みプラスミドが、ｐＡＧ３０３、ｐＡＧ３０４、ｐＡＧ３０５、ｐＡＧ３０６、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、もしくはこれらの誘導体である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項１１】
酵母細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発現構築物を含む酵母細胞。
【請求項１２】
（i）前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、
（ii）前記発現構築物が、エピソーム性であるか、もしくは前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、
（iii）酵母が、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ジオトリチュム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）菌種、もしくはジオトリチュム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、
（iv）薬剤排出もしくは細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が破壊されており、任意で該少なくとも１つの遺伝子が、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、もしくはＥＲＧ６である、かつ／または
（v）前記酵母細胞が、ガラクトース以外の炭素源でＧＡＬプロモーターからの発現を可能にし、任意で該酵母細胞が、転写活性化ドメインおよび調節ドメインに融合されているＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、任意で該融合タンパク質が、エストロゲンもしくはその類似体の存在下で転写を活性化し、好ましくは該酵母細胞がＧａｌ４−ＥＲ−ＶＰ１６融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、
請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
シグナル配列とヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
【請求項１４】
シグナル配列と式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで２〜８の整数であり、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
【請求項１５】
（i）前記シグナル配列がインスリンシグナル配列である、
（ii）前記シグナル配列がトリプシンシグナル配列であり、任意で該トリプシンシグナル配列がヒトトリプシンシグナル配列である、
（iii）前記ヒトアミロイドベータタンパク質が前記シグナル配列に直接融合されている、
（iv）各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ３８、野生型Ａβ３９、野生型Ａβ４０、野生型Ａβ４１、野生型Ａβ４２、野生型Ａβ４３、野生型Ａβ４８、および野生型Ａβ４９からなる群から独立して選択される、
（v）各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３、Ａβ４８、およびＡβ４９からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｖ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ｅ１１Ｋ、Ｆ２０Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ｋ、Ｅ２２欠失、Ｄ２３Ｎ、Ｉ３１Ｅ、Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、
（vi）前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を含む、
（vii）前記発現構築物がプラスミドもしくはウイルスベクターである、または
（viii）前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含み、任意で該ポリペプチドが少なくとも２つのアミロイドベータタンパク質もしくは少なくとも４つのアミロイドベータタンパク質を含み；任意で各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含むか、もしくは該ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのアミロイドベータタンパク質を含む、
請求項１３または１４に記載の発現構築物。
【請求項１６】
哺乳動物細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の発現構築物を含む哺乳動物細胞。
【請求項１７】
前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１８】
前記細胞が神経細胞である、請求項１６または１７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１９】
細胞中で毒性を誘導する方法であって、
請求項１１、１２、１６、または１７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
該細胞に対して毒性である前記核酸の発現レベルを該細胞中で誘導する工程と、を含む、方法。
【請求項２０】
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を特定する方法であって、
候補薬剤の存在下で、かつ、該候補薬剤の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下で、請求項１１、１２、１６、または１７のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇する場合に、前記候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される、方法。
【請求項２１】
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項１１、１２、１６、または１７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下において、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下のものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定される、方法。
【請求項２２】
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
細胞の内因性遺伝子が破壊されている、請求項１１、１２、１６、または１７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子の破壊の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下のものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定される、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
[本発明1001]
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物。
[本発明1002]
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで2〜8の整数である、発現構築物。
[本発明1003]
前記シグナル配列が、天然起源の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、本発明1001または1002の発現構築物。
[本発明1004]
前記シグナル配列が、酵母接合因子アルファシグナル配列である、本発明1003の発現構築物。
[本発明1005]
前記シグナル配列が、酵母キラートキシンＫ1、分泌酸性ホスファターゼ、インベルターゼ（スクラーゼ）、またはＰｓｔ1のシグナル配列である、本発明1003の発現構築物。
[本発明1006]
前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母接合因子アルファプロ配列である、本発明1001〜1005のいずれかの発現構築物。
[本発明1007]
前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母ＫＥＸ2、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｐｅｐ4、またはＰｒｂ1のプロ配列である、本発明1001〜1005のいずれかの発現構築物。
[本発明1008]
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、本発明1001〜1007のいずれかの発現構築物。
[本発明1009]
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ1−10、ＧＡＬ1、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、ＧＰＤ、ＡＤＨ、ＴＥＦ、ＣＹＣ1、ＭＲＰ7、ＭＥＴ25、ＴＥＴ、ＶＰ16、またはＶＰ16−ＥＲである、本発明1008の発現構築物。
[本発明1010]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ38、野生型Ａβ39、野生型Ａβ40、野生型Ａβ41、野生型Ａβ42、野生型Ａβ43、野生型Ａβ48、および野生型Ａβ49からなる群から独立して選択される、本発明1001〜1009のいずれかの発現構築物。
[本発明1011]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ38、Ａβ39、Ａβ40、Ａβ41、Ａβ42、Ａβ43、Ａβ48、およびＡβ49からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ2Ｔ、Ａ2Ｖ、Ｈ6Ｒ、Ｄ7Ｎ、Ｅ11Ｋ、Ｆ20Ｅ、Ａ21Ｇ、Ｅ22Ｇ、Ｅ22Ｑ、Ｅ22Ｋ、Ｅ22欠失、Ｄ23Ｎ、Ｉ31Ｅ、Ｅ22Ｇ／Ｉ31Ｅ、Ａ42Ｔ、およびＡ42Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、本発明1001〜1009のいずれかの発現構築物。
[本発明1012]
前記ヒトアミロイドベータタンパク質が野生型Ａβ42である、本発明1001〜1009のいずれかの発現構築物。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1001〜1012のいずれかの発現構築物。
[本発明1014]
前記ポリペプチドが少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1012の発現構築物。
[本発明1015]
前記ポリペプチドが少なくとも4つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1013または1014の発現構築物。
[本発明1016]
各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含む、本発明1013〜1015のいずれかの発現構築物。
[本発明1017]
前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1013〜1015のいずれかの発現構築物。
[本発明1018]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：51、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：53、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：55、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：57、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：59、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：61、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：63、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：65、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：67、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：69、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：71、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：73、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：75、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：77、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：79、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：81、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：83、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：101のアミノ酸配列を含む、本発明1001の発現構築物。
[本発明1019]
エピソームプラスミドまたは組込みプラスミドである、本発明1001〜1018のいずれかの発現構築物。
[本発明1020]
前記組込みプラスミドが、ｐＡＧ303、ｐＡＧ304、ｐＡＧ305、ｐＡＧ306、ｐＲＳ303、ｐＲＳ304、ｐＲＳ305、ｐＲＳ306、またはこれらの誘導体である、本発明1019の発現構築物。
[本発明1021]
酵母細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、本発明1001〜1020のいずれかの発現構築物を含む酵母細胞。
[本発明1022]
前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、本発明1021の酵母細胞。
[本発明1023]
前記発現構築物が、エピソーム性であるか、または前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1021または1022の酵母細胞。
[本発明1024]
酵母が、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ジオトリチュム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）菌種、またはジオトリチュム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、本発明1021〜1023のいずれかの酵母細胞。
[本発明1025]
薬剤排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が破壊されている、本発明1021〜1024のいずれかの酵母細胞。
[本発明1026]
前記少なくとも1つの遺伝子が、ＰＤＲ1、ＰＤＲ3、ＰＤＲ5、ＳＮＱ2、またはＥＲＧ6である、本発明1025の酵母細胞。
[本発明1027]
シグナル配列とヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
[本発明1028]
シグナル配列と式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで2〜8の整数であり、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
[本発明1029]
前記シグナル配列がインスリンシグナル配列である、本発明1027または1028の発現構築物。
[本発明1030]
前記インスリンシグナル配列がヒトインスリンシグナル配列である、本発明1029の発現構築物。
[本発明1031]
前記シグナル配列がトリプシンシグナル配列である、本発明1027または1028の発現構築物。
[本発明1032]
前記トリプシンシグナル配列がヒトトリプシンシグナル配列である、本発明1031の発現構築物。
[本発明1033]
前記ヒトアミロイドベータタンパク質が前記シグナル配列に直接融合されている、本発明1027または1029〜1032のいずれかの発現構築物。
[本発明1034]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ38、野生型Ａβ39、野生型Ａβ40、野生型Ａβ41、野生型Ａβ42、野生型Ａβ43、野生型Ａβ48、および野生型Ａβ49からなる群から独立して選択される、本発明1027〜1033のいずれかの発現構築物。
[本発明1035]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ38、Ａβ39、Ａβ40、Ａβ41、Ａβ42、Ａβ43、Ａβ48、およびＡβ49からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ2Ｔ、Ａ2Ｖ、Ｈ6Ｒ、Ｄ7Ｎ、Ｅ11Ｋ、Ｆ20Ｅ、Ａ21Ｇ、Ｅ22Ｇ、Ｅ22Ｑ、Ｅ22Ｋ、Ｅ22欠失、Ｄ23Ｎ、Ｉ31Ｅ、Ｅ22Ｇ／Ｉ31Ｅ、Ａ42Ｔ、およびＡ42Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、本発明1027〜1033のいずれかの発現構築物。
[本発明1036]
前記ヒトアミロイドベータタンパク質が野生型Ａβ42である、本発明1027〜1033のいずれかの発現構築物。
[本発明1037]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：93、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：95、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：103のアミノ酸配列を含む、本発明1027の発現構築物。
[本発明1038]
前記発現構築物がプラスミドまたはウイルスベクターである、本発明1027〜1037のいずれかの発現構築物。
[本発明1039]
前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1027〜1038のいずれかの発現構築物。
[本発明1040]
前記ポリペプチドが少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1039の発現構築物。
[本発明1041]
前記ポリペプチドが少なくとも4つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1039または1040の発現。
[本発明1042]
各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含む、本発明1039〜1041のいずれかの発現構築物。
[本発明1043]
前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1039〜1041のいずれかの発現構築物。
[本発明1044]
哺乳動物細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、本発明1027〜1043のいずれかの発現構築物を含む哺乳動物細胞。
[本発明1045]
前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、本発明1044の哺乳動物細胞。
[本発明1046]
前記細胞が神経細胞である、本発明1044または1045の哺乳動物細胞。
[本発明1047]
細胞中で毒性を誘導する方法であって、
本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を提供する工程と、
該細胞に対して毒性である前記核酸の発現レベルを該細胞中で誘導する工程と、を含む、方法。
[本発明1048]
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を特定する方法であって、
候補薬剤の存在下で、かつ、該候補薬剤の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下で、本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を培養する工程と、
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇する場合に、前記候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される、方法。
[本発明1049]
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を提供する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下において、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下のものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定される、方法。
[本発明1050]
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
細胞の内因性遺伝子が破壊されている、本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を提供する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子の破壊の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下のものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定される、方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。