【手続補正書】
【提出日】平成30年7月4日(2018.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの個々の標的鋳型核酸分子の配列を生成する方法であって、
(a)少なくとも2つの標的鋳型核酸分子を含む核酸分子の少なくとも1つのサンプルを提供するステップ;
(b)該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子のそれぞれの一端に第1の分子タグを導入し、該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子のそれぞれの他端に第2の分子タグを導入して、少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子を提供するステップであって、それぞれのタグ化鋳型核酸分子は、固有の第1の分子タグ及び固有の第2の分子タグでタグ化される、ステップ;
(c)該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子を増幅して、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーを提供するステップ;
(d)該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含む該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の領域を配列決定するステップ; 及び
(e)該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子の少なくとも1つについてコンセンサス配列を再構築するステップ
を含み、ステップ(e)は、
(i)互いに相同である第1の分子タグ配列及び互いに相同である第2の分子タグ配列を含む配列を同じクラスターに割り当てることによって、同じ標的鋳型核酸分子に対応する可能性のある該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列のクラスターを同定するステップ;
(ii)配列の少なくとも1つのクラスターを選択するステップであって、該選択されたクラスター内の配列は、異なる第1の分子タグ又は第2の分子タグとよりも互いによりよく関連している第1の分子タグ及び第2の分子タグを含む、ステップ;
(iii)ステップ(ii)で選択されたクラスターにおける少なくとも2つの鋳型核酸分子の配列を整列させ、これらの配列からコンセンサス配列を定義することによって、第1の標的鋳型核酸分子のコンセンサス配列を再構築するステップ; 及び
(iv)第2の及び/又はさらなる鋳型核酸分子に関してステップ(ii)〜(iii)を実施するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
サイズが1Kbpを超える少なくとも1つの個々の標的鋳型核酸分子の配列を生成する方法であって、
(a)サイズが1Kbpを超える少なくとも2つの標的鋳型核酸分子を含む核酸分子の少なくとも1つのサンプルを提供するステップ;
(b)該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子のそれぞれの一端に第1の分子タグを導入し、該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子のそれぞれの他端に第2の分子タグを導入して、少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子を提供するステップであって、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子のそれぞれは、固有の第1の分子タグ及び固有の第2の分子タグでタグ化される、ステップ;
(c)該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子を増幅して、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーを提供するステップ;
(d)該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの一部を単離し、該一部における該タグ化鋳型核酸分子を断片化して、複数の断片化鋳型核酸分子を提供するステップ;  (e)該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含む該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域を配列決定するステップ;
(f)該複数の断片化鋳型核酸分子を配列決定するステップ; 及び
(g)ステップ(f)において生成された配列の少なくともサブセットを含む配列から、該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子の少なくとも1つについてのコンセンサス配列を再構築するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
(A)前記複数の断片化鋳型分子を富化し、前記第1の分子タグ又は前記第2の分子タグを含む前記複数の断片化鋳型核酸分子の割合を増加させるステップをさらに含み、このステップは、ステップ(f)の前にあり、及び／又は
(B)ステップ(g)が、以下:
(i)互いに相同である第1の分子タグ配列及び互いに相同である第2の分子タグ配列を含む配列を同じクラスターに割り当てることによって、同じ個々の標的鋳型核酸分子に対応する可能性のある前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列のクラスターを同定するステップ;
(ii)前記複数の断片化鋳型核酸分子の配列を分析して、第1のクラスターの配列の第1の分子タグに相同である第1の分子タグ又は第1のクラスターの配列の第2の分子タグに相同である第2の分子タグを含む、複数の断片化鋳型核酸分子の配列を同定するステップ;
(iii)ステップ(ii)で同定された複数の断片化鋳型核酸分子の配列の少なくともサブセットを含む配列を整列させ、これらの配列からコンセンサス配列を定義することによって、第1の鋳型核酸分子の配列を再構築するステップ; 及び
(iv)第2の及び/又はさらなる鋳型核酸分子に関してステップ(i)〜(iii)を実施するステップであって、場合により、ステップ(i)が、第1のクラスターの第1の分子タグ配列についてのコンセンサス配列及び第2の分子タグ配列についてのコンセンサス配列を決定することをさらに含み、ステップ(ii)が、該第1のクラスターの該第1の分子タグについての該コンセンサス配列又は該第2の分子タグについての該コンセンサス配列に相同である第1の分子タグ又は第2の分子タグを含む、複数の断片化鋳型核酸分子の配列を同定することを含む、ステップ;
を含み、及び／又は
(C)ステップ(g)が、コンピュータによって実行される方法ステップであり、及び／又は  (D)ステップ(e)及び/又は(f)が、ブリッジPCRのステップを含む配列決定技術を用いて実施され、場合により、ブリッジPCRのステップが15秒を超える伸長時間を用いて実施される、及び／又は
(E)ステップ(e)及び(f)が、異なる配列決定ランで実施される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1つの個々の標的鋳型核酸分子の配列を決定するための、コンピューターによって実行される方法であって、以下のステップ:
(a)少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列を含むデータを得るステップであって、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子のそれぞれは一端に第1の分子タグ及び他端に第2の分子タグを含み、それぞれの標的鋳型核酸分子は、固有の第1の分子タグ及び固有の第2の分子タグでタグ化され、該領域は、該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含む、ステップ;
(b)該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含む該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の領域の配列を含むデータを分析して、互いに相同である第1の分子タグ及び互いに相同である第2の分子タグを含む配列を同じクラスターに割り当てることによって、同じ個々の標的鋳型核酸分子に対応する可能性のある配列のクラスターを同定するステップ;
(c)該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列を含むデータを得るステップであって、該断片のそれぞれは、該第1の分子タグ又は該第2の分子タグのいずれかを含む、ステップ;
(d)該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列を分析して、第1のクラスターの配列の第1の分子タグに相同である第1の分子タグ又は第1のクラスターの配列の第2の分子タグに相同である第2の分子タグを含む、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列を同定するステップ;
(e)ステップ(d)で同定された該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列の少なくともサブセットを含む配列を整列させ、これらの配列からコンセンサス配列を定義することによって、第1の標的鋳型核酸分子の配列を再構築するステップ; 及び
(f)第2の及び/又はさらなる標的鋳型核酸分子に関してステップ(c)〜(e)を実施するステップであって、場合により、ステップ(b)が、第1のクラスターの第1の分子タグ配列についてのコンセンサス配列及び第2の分子タグ配列についてのコンセンサス配列を決定することをさらに含み、ステップ(d)が、該第1のクラスターの該第1の分子タグについての該コンセンサス配列又は該第2の分子タグについての該コンセンサス配列に相同である第1の分子タグ又は第2の分子タグを含む、複数の断片化鋳型核酸分子の配列を同定することを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項５】
少なくとも1つの標的鋳型核酸分子の配列を決定するための、コンピューターによって実行される方法であって、以下のステップ:
(a)配列のクラスターを含むデータを得るステップ、ここで:
(i)それぞれのクラスターは、少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列を含み、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子のそれぞれは、一端に第1の分子タグ及び他端に第2の分子タグを含み、それぞれの標的鋳型核酸は、固有の第1の分子タグ及び固有の第2の分子タグでタグ化され、該領域は、該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含み;
(ii)それぞれのクラスターは、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列を含み、該断片のそれぞれは、該第1の分子タグ又は該第2の分子タグのいずれかを含み;
(iii)それぞれのクラスターにおける少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列は、互いに相同である第1の分子タグ及び第2の分子タグを含み;
(iv)該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列は、そのクラスターにおける少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列の第1の分子タグに相同である第1の分子タグ、又はそのクラスターにおける該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列の第2の分子タグに相同である第2の分子タグを含む;
(b)第1のクラスターにおける該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数断片の配列の少なくともサブセットを含む配列を整列させ、これらの配列からコンセンサス配列を定義することによって、第1の標的鋳型核酸分子の配列を再構築するステップ; 及び
(c)第2の及び/又はさらなる鋳型核酸分子に関してステップ(b)を実施するステップ
を含む、方法。
【請求項６】
以下のステップ:
(v)互いに相同である第1の分子タグ配列及び互いに相同である第2の分子タグ配列を含む配列を同じクラスターに割り当てることによって、同じ鋳型核酸分子に対応する可能性のある前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列のクラスターを同定するステップ;
(vi)配列の少なくとも1つのクラスターを選択するステップであって、選択されたクラスター内の配列は、異なる第1の分子タグ又は第2の分子タグとよりも互いによりよく関連している第1の分子タグ及び第2の分子タグを含むステップ、
をさらに含み、前記第1の標的鋳型核酸分子の配列は、ステップ(vi)で選択されたクラスターにおける配列から再構築され、
場合により、ステップ(vi)が、前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の配列のクラスターの群を同定するステップであって、それぞれの群のクラスター内の配列は、互いに相同である第1の分子タグを有する、ステップ、及び/又は前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の配列のクラスターの群を同定するステップであって、それぞれの群のクラスター内の配列は、互いに相同である第2の分子タグを有する、ステップ、及び配列のクラスターの群からクラスターを選択するステップであって、選択されたクラスターは、最も大きい数の配列を含有する、ステップからなる、
請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
(A)ステップe)が、コンピュータによって実行される方法ステップであり、及び／又は  (B)ステップd)が、ブリッジPCRのステップを含む配列決定技術を用いて実施され、場合により、ブリッジPCRのステップが15秒を超える伸長時間を用いて実施される、
請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つの個々の標的鋳型核酸分子の配列を決定するための、コンピュータによって実行される方法であって、以下のステップ:
(a)少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列を含むデータを得るステップであって、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子のそれぞれは一端に第1の分子タグ及び他端に第2の分子タグを含み、それぞれの標的鋳型核酸分子は、固有の第1の分子タグ及び固有の第2の分子タグでタグ化され、該領域は、該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含む、ステップ;
(b)該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含む該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の領域の配列を含むデータを分析して、互いに相同である第1の分子タグ及び互いに相同である第2の分子タグを含む配列を同じクラスターに割り当てることによって、同じ鋳型核酸分子に対応する可能性のある配列のクラスターを同定するステップ;
(c)配列の少なくとも1つのクラスターを選択するステップであって、選択されたクラスター内の配列は、異なる第1の分子タグ又は第2の分子タグとよりも互いによりよく関連している第1の分子タグ及び第2の分子タグを含む、ステップ;
(d)ステップ(c)で選択されたクラスターにおける分子の配列の少なくともサブセットを整列させ、これらの配列からコンセンサス配列を定義することによって、第1の標的鋳型核酸分子のコンセンサス配列を再構築するステップ; 及び
(e)第2の及び/又はさらなる標的鋳型核酸分子に関してステップ(c)〜(d)を実施するステップ
を含む、方法。
【請求項９】
前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の配列のクラスターの群を同定するステップであって、それぞれの群のクラスター内の配列は、互いに相同である5'分子タグを有する、ステップ、及び/又は前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の配列のクラスターの群を同定するステップであって、それぞれの群のクラスター内の配列は、互いに相同である3'分子タグを有する、ステップ、及び配列のクラスターの群からクラスターを選択するステップであって、選択されたクラスターは、最も大きい数の配列を含有する、ステップからなる、請求項１(iv)の方法ステップ、又は請求項８(c)の方法ステップ。
【請求項１０】
少なくとも1つの標的鋳型核酸分子の配列を決定するための、コンピュータによって実行される方法であって、
(a)配列のクラスターを含むデータを得るステップ;
(b)選択されたクラスターにおける配列の少なくともサブセットの配列を整列させることによって、第1の鋳型核酸分子のコンセンサス配列を再構築するステップ;
を含み、選択されたクラスターにおける配列は、少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の複数コピーの領域の配列を含み、該少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子のそれぞれは、一端に第1の分子タグ及び他端に第2の分子タグを含み、該少なくとも2つの標的鋳型核酸分子のそれぞれは、固有の第1の分子タグ及び固有の第2の分子タグでタグ化され、該領域は、該第1の分子タグ及び該第2の分子タグを含み、
選択されたクラスターにおけるそれぞれの配列は、
(i)そのクラスターにおける他の配列の第1の分子タグに相同である第1の分子タグ、及びそのクラスターにおける他の配列の第2の分子タグに相同である第2の分子タグを含み;  (ii)異なる第1の分子タグ又は第2の分子タグとよりも互いによりよく関連している第1の分子タグ及び第2の分子タグを含む、方法。
【請求項１１】
(A)同じクラスターの配列の第1の分子タグが、互いに少なくとも90％の配列同一性を有する、及び／又は
(B)同じクラスターの配列の第2の分子タグが、互いに少なくとも90％の配列同一性を有する、
請求項３(B)〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コンピュータによって実行される方法である、請求項３(B)、６又は７に記載の方法。
【請求項１３】
(A)前記領域が、前記第1の分子タグ又は前記第2の分子タグを含む25個を超える塩基対を含む、及び／又は
(B)前記領域が、配列決定される前記少なくとも2つのタグ化鋳型核酸分子の全長を含む、及び／又は
(C)前記第1の分子タグ及び前記第2の分子タグが、PCR、タグメンテーション(tagmentation)、及び前記少なくとも1つの鋳型核酸分子の物理的せん断若しくは制限消化とその後の5'分子タグ若しくは3'分子タグを含む核酸のライゲーションからなる群より選択される方法を用いて、前記少なくとも2つの鋳型核酸分子に導入され、場合により、前記第1の分子タグ及び前記第2の分子タグが、前記第1の分子タグ又は前記第2の分子タグを含む部分と、前記少なくとも2つの鋳型核酸分子にハイブリダイズすることができる配列を有する部分とを含むプライマーを用いたPCRによって、前記少なくとも2つの鋳型核酸分子に導入され、及び／又は
(D)前記少なくとも2つの鋳型核酸分子が、微生物リボソーム16Sをコードする、及び／又は
(E)前記少なくとも2つの鋳型核酸分子の少なくとも1つが、10Kbp未満のサイズである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項４、５、８、若しくは１０に記載の方法、請求項２の方法ステップ(g)、又は請求項１の方法ステップ(e)を実施するために適合されたコンピュータプログラムであって、電子デバイス上で実行される、コンピュータプログラム。
【請求項１５】
請求項１４に記載のコンピュータプログラムを記憶している、コンピュータ可読媒体。