【手続補正書】
【提出日】平成30年1月9日(2018.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【表２５−２】
2017511685.tif 000001
本発明の態様は以下を含む。
付記１
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること。
付記２
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる、付記１に記載の方法。
付記３
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがＣａｓ９である、付記１に記載の方法。
付記４
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが一本鎖切断を生じさせる、付記１に記載の方法。
付記５
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがＣａｓ９ニッカーゼである、付記１に記載の方法。
付記６
少なくとも１つの標的位置が必須遺伝子内に存在し、前記外来核酸配列が前記必須遺伝子に隣接して挿入されて、前記必須遺伝子の一部を置換する、付記１に記載の方法。
付記７
前記第１の外来核酸が相同組換えにより挿入される、付記１に記載の方法。
付記８
前記生殖系列細胞が、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、付記１に記載の方法。
付記９
前記ＲＮＡが約１０〜約２５０ヌクレオチドを含む、付記１に記載の方法。
付記１０
前記ＲＮＡが約２０〜約１００ヌクレオチドを含む、付記１に記載の方法。
付記１１
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、関連するガイドＲＮＡと共に複数の関連する標的位置に共局在して、前記第１の染色体または前記第２の染色体のいずれかを複数の切断部位で切断する、付記１に記載の方法。
付記１２
前記複数の切断部位での切断により、ＤＮＡ配列が除去されるとともに相同組換えによって前記第１の外来核酸配列で置換される、付記１１に記載の方法。
付記１３
前記生殖系列細胞を生物へと成長させるステップをさらに含む、付記１に記載の方法。
付記１４
前記生物を同じ生物種の野生型生物と交配させて前記第１の外来核酸配列を有する染色体対の第１の染色体を含む子生殖系列細胞を産生させるステップをさらに含む、付記１３に記載の方法。
付記１５
前記第１の外来核酸配列が前記子生殖系列細胞によって発現されて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡが産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記染色体対の第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、
前記第１の外来核酸配列を前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して前記子生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にする、
付記１４に記載の方法。
付記１６
前記生殖系列細胞を生物へと成長させるステップおよび前記生物を同じ生物種の野生型生物と交配させるステップを繰り返して、前記第１の外来核酸配列についてホモ接合型である同じ生物種の生物集団を作り出す、付記１５に記載の方法。
付記１７
前記第１の外来核酸配列が１種類または複数種類の選択された遺伝子配列を含む、付記１に記載の方法。
付記１８
前記第１の外来核酸配列が１種類または複数種類の選択された遺伝子配列を含み、前記１種類または複数種類の選択された遺伝子配列が、前記生物集団内の生物のゲノム内に存在する、付記１６に記載の方法。
付記１９
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列をそのゲノム内に含む改変生物を、前記生物集団に導入し、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、前記第１の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、前記第２の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記改変生物が、前記生物集団のメンバーと交配して、前記第２の外来核酸配列および前記第１の外来核酸配列を含む子生殖系列細胞を産生し、
前記子生殖系列細胞が、前記第２の外来核酸配列を発現して前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１の外来核酸配列を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、
前記第２の外来核酸配列が前記生殖系列細胞のゲノム中に前記切断部位で挿入されて前記子生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にする、
付記１６に記載の方法。
付記２０
改変野生型生物が、前記第１の外来核酸配列が前記改変野生型生物のゲノムに侵入しないよう、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的位置に非相補的となり、且つ前記１つまたは複数の標的位置と結合できないように、ゲノムＤＮＡ上の前記１つまたは複数の標的位置が改変された前記集団に導入される、付記１６に記載の方法。
付記２１
前記改変野生型生物が、前記第１の外来核酸配列に共局在して前記第１の外来核酸配列を切断部位特異的に切断して再コード化アレルを生じさせる、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする第２の外来核酸配列の発現によって改変される、付記２０に記載の方法。
付記２２
さらに以下を含む、付記１に記載の方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記１つまたは複数の標的位置に相補的である、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記２３
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、付記２２に記載の方法。
付記２４
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された染色体の野生型配列を含む、付記２３に記載の方法。
付記２５
少なくとも１つの標的位置が必須タンパク質コード遺伝子内に存在し、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるように前記外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入されるが、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的位置に非相補的になるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変される、付記１に記載の方法。
付記２６
以下を含む、真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質および関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で前記外来核酸配列を挿入すること；
前記挿入された外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡを前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で前記外来核酸配列を挿入して前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること。
付記２７
以下を含む、ある生物種の２つの集団を、生存可能な子孫を産生できないようにする方法。
前記生物種の第１の集団を、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類の第１のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を含むように改変すること；
ここで、前記１種類または複数種類の第１のガイドＲＮＡが、必須遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、且つ前記必須遺伝子のヌクレオチド配列が、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的配列に非相補的であるがコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列が保存されるように改変されている、
前記生物種の第２の集団を、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類の第２のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を含むように改変すること；
ここで、前記１種類または複数種類の第２のガイドＲＮＡが、前記１種類または複数種類の第１のガイドＲＮＡの前記標的位置とは異なる前記必須遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、且つ前記必須遺伝子のヌクレオチド配列が、前記１種類または複数種類の第２のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的位置に非相補的であるがコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列が保存されるように改変されている、
前記第１の集団を前記第２の集団と交配させて生殖系列細胞を産生させること；
ここで、前記第１の外来核酸配列が発現されて、第２の親から与えられた前記必須遺伝子を切断し、前記第２の外来核酸配列が発現されて、前記第１の親から与えられた前記必須遺伝子を切断する。
付記２８
以下を含む、標的核酸配列中に変異を有する真核生殖系列細胞中のアレルを置換する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、アレル上の変異に隣接する染色体のゲノムＤＮＡ上の複数の標的位置に相補的であり、前記変異により、対応するガイドＲＮＡが前記ゲノムＤＮＡに結合することが妨げられ、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記複数の標的位置で切断部位特異的に切断して、前記変異を含む前記ゲノムＤＮＡの一部を除去する、および
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記２９
全ての標的位置を除去する欠失が起こると非常に有害であり自然選択により前記集団から除かれることになるように、前記標的位置の少なくとも１つが必須遺伝子などの前記生物の適応度に重要な遺伝子内に存在する、付記２８に記載の方法。
付記３０
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を複数の遺伝子において改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記複数の遺伝子に対応する１種類または複数種類の更なる外来核酸配列と共に前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体のゲノムＤＮＡ中の複数の遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的な１種類または複数種類の遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含み、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置のうちの１つの第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の同じ標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記１種類または複数種類の核酸配列の各々が、残りの標的位置の第１の部分および第２の部分に対応する第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を複数の遺伝子において切断部位特異的に切断する、および
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記３１
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記複数の標的位置に相補的である、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記関連する標的位置で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること
をさらに含む、付記３０に記載の方法。
付記３２
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、付記３１に記載の方法。
付記３３
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記染色体の野生型配列を含む、付記３２に記載の方法。
付記３４
以下を含む、２つの集団を、互いの間で子を産生できないようにする方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび第１セットのガイドＲＮＡ群をコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、第１の生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、染色体のゲノムＤＮＡ上の第１セットの標的位置群に相補的であり、
前記第１セットの標的位置群が必須タンパク質コード遺伝子内に存在し、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるが、前記第１セットのガイドＲＮＡ群が前記１つまたは複数の標的位置に非相補的であるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変されるように、前記第１の外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入され、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および前記第１セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列、および前記必須タンパク質のアミノ酸配列を保存する前記第１の外来核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１セットのガイドＲＮＡ群を産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する第１セットの標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記第１セットの標的位置群で切断部位特異的に切断して前記必須遺伝子内の前記ゲノムＤＮＡの一部を除去する、および
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること；および
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび第２セットのガイドＲＮＡ群をコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む、第２の外来核酸配列を、第２の生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、染色体のゲノムＤＮＡ上の第２セットの標的位置群に相補的であり、
前記第２セットの標的位置群が、前記第１セットの標的位置群と同じ必須タンパク質コード遺伝子内に存在するが、前記第１セットの標的位置群のいずれとも同じでなく、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるが、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が前記第２セットの標的位置群に非相補的になるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変されるように、前記第２の外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入され、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および前記第２セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列、および前記必須タンパク質のアミノ酸配列を保存する前記第２の外来核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第２セットのガイドＲＮＡ群を産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連する第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第２セットの関連する標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記第２セットの標的位置群で切断部位特異的に切断して前記必須内の前記ゲノムＤＮＡの一部を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること；
ここで、前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼに前記第２の外来核酸配列内の前記第１セットの標的位置群を切断させ、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼに前記第１の外来核酸配列内の前記第２セットの標的位置群を切断させる場合に、前記第１の生殖系列細胞および前記第２の生殖系列細胞から生じる生物の相互間の子孫が生存可能できない。
付記３５
以下を含む、精母細胞からＹ染色体精子のみを産生する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記精母細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記精母細胞のＸ染色体上の１つまたは複数の標的位置および前記精母細胞のＹ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記Ｙ染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記Ｙ染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと、前記精母細胞の前記Ｘ染色体上の１つまたは複数の標的位置と前記精母細胞の前記Ｙ染色体上の１つまたは複数の標的位置とに相補的な前記１種類または複数種類のＲＮＡとを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｙ染色体上の標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｙ染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｙ染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記Ｙ染色体中に前記切断部位で挿入すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｘ染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｘ染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｘ染色体を作働不能（inoperable）にする。
付記３６
精母細胞からＹ染色体精子のみを産生させる方法であって、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡを、対応するプロモーター配列を用いて前記Ｙ染色体上に位置する配列から発現させることを含み、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記精母細胞のＸ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的配列に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｘ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｘ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｘ染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記３７
精母細胞からＸ染色体精子のみを産生させる方法であって、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡを、対応するプロモーター配列を用いて前記Ｘ染色体上に位置する配列から発現させることを含み、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記精母細胞のＹ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｙ染色体上の１種類または複数種類の標的配列に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｙ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｙ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｙ染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記３８
精母細胞からＹ染色体含有精子のみを産生させる方法であって、
第１の外来核酸配列および第２の外来核酸配列をコードするようにＹ染色体を改変することを含み、
ここで、前記第１の外来核酸配列が、第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、第１セットのガイドＲＮＡ群、および対応するプロモーター配列をコードし、
前記第２の外来核酸配列が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、第２セットのガイドＲＮＡ群、対応するプロモーター配列、ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列をコードし、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする前記第２の核酸配列および前記第２セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第２セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、
前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、性染色体ではない染色体のゲノムＤＮＡ上の複数の標的位置に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列が減数分裂前に前記生殖系列中で発現されて前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１セットのＲＮＡ群が産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第１セットの関連する標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、細胞修復機構により前記第２の外来核酸配列が前記Ｙ染色体から前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上にコピーされるように、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記第１セットの標的位置群で切断部位特異的に切断し、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上に位置する前記第２の外来核酸配列の前記コピーが、減数分裂より前または減数分裂中に発現されて前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質および前記第２セットのガイドＲＮＡ群が産生され、
前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的な前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記Ｘ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｘ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｘ染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記３９
精母細胞からＸ染色体含有精子のみを産生する方法であって、
第１の外来核酸配列および第２の外来核酸配列をコードするようにＸ染色体を改変することを含み、
ここで、前記第１の外来核酸配列が、第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および第１セットのガイドＲＮＡ群、および対応するプロモーター配列をコードし、
前記第２の外来核酸配列が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および第２セットのガイドＲＮＡ群、および対応するプロモーター配列、ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列をコードし、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする前記第２の核酸配列および前記第２セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第２セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、
前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、性染色体ではない染色体のゲノムＤＮＡ上の複数の標的位置に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列が減数分裂の前に前記生殖系列中で発現されて前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１セットのＲＮＡ群が産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第１セットの関連する標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、細胞修復機構により前記第２の外来核酸配列が前記Ｘ染色体から前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上にコピーされるように、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記第１セットの標的位置群で切断部位特異的に切断し、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上に位置する前記第２の外来核酸配列の前記コピーが減数分裂の前または減数分裂中に発現されて、前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質および前記第２セットのガイドＲＮＡ群が産生され、
前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｙ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的な前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記Ｙ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｙ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｙ染色体を作働不能にする。
付記４０
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと、精子のＹ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡと、精子のＸ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡと、第１の隣接配列と、第２の隣接配列とをコードする第１の外来核酸配列を有する改変Ｘ染色体を有する、雄子孫を排除するための雌子孫を産生する方法であって、
前記第１の外来核酸配列を卵母細胞中で発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記Ｙ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列と前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列とに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させ、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記Ｘ染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記Ｘ染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列を発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記Ｙ染色上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列と前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列とに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させ、
Ｙ染色体を有する野生型精子と前記改変Ｘ染色体を含む卵母細胞が結合すると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと前記Ｙ染色体を標的とする前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡとが前記Ｙ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｙ染色体を切断して前記卵母細胞の雄生物へのその後の発生を作働不能にし、
Ｘ染色体を有する野生型精子と前記改変Ｘ染色体を含む卵母細胞が結合すると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｘ染色体を切断し、そこで前記第１の外来核酸配列が前記Ｘ染色体中に挿入される、
前記方法。
付記４１
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと、発生に必須の遺伝子内に位置する前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡとをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を有する改変Ｙ染色体を有する、雌子孫を排除するための雄子孫を産生する方法であって、
前記第１の隣接配列が、前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、前記改変Ｙ染色体が、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡによって認識される前記１つまたは複数の標的位置が１種類または複数種類の前記ガイドＲＮＡによって認識される前記配列と非相補的になるように改変された前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子をコードする第２の核酸配列をさらに含み、その結果、野生型Ｘ染色体を有する卵母細胞が前記改変Ｙ染色体を有する精子と結合した場合に前記第１の外来核酸配列が発現されてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡが産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、そこで前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｘ染色体を切断して前記必須遺伝子を除去してそこに前記第１の核酸配列を挿入し、前記Ｙ染色体上の前記必須遺伝子の前記の追加のコピーのために生存可能なままである改変Ｘ染色体が作られ、
野生型Ｘ染色体を有する卵母細胞と前記改変Ｘ染色体を有する精子が結合すると、前記第１の外来核酸配列が発現されて、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡが産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、そこで前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｘ染色体を切断して前記必須遺伝子を除去し、前記第１の外来核酸配列を前記Ｘ染色体中に挿入し、その結果、前記接合体が前記必須Ｘ染色体遺伝子を欠くことになる、
前記方法。
付記４２
生殖可能な雄および生殖不能の雌を作製する方法であって、付記４１に記載の方法が、その遺伝子を欠いた生物が生殖不能となるように、前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子が生殖能にのみ必須である点で改変されている、方法。
付記４３
前記第１の核酸配列が、第３の隣接配列および第４の隣接配列をさらに含み、
前記第３の隣接配列が、生殖能に必須の遺伝子の第１の部分と同じ配列である第３の配列を含み、
前記第４の隣接配列が、生殖能に必須の遺伝子の第２の部分と同じ配列である第４の配列を含み、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第３の隣接配列と前記第４の隣接配列との間に位置し、前記第１の核酸配列が、前記生殖能に必須の遺伝子内に位置する１種類または複数種類の標的配列に相補的な第２セットのガイドＲＮＡ群をさらに含み、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第２セットのガイドＲＮＡ群が発現し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記生殖能に必須の遺伝子内の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記生殖能に必須の遺伝子を切断してそこに前記第１の核酸配列を挿入する、付記４１に記載の方法。
付記４４
制御された集団抑制の方法であって、付記４３に記載のＹ染色体を抑制対象の集団中に放出し、付記４３に記載のＹ染色体に利用される前記ガイドＲＮＡに非相補的となるが前記遺伝子によりコードされるタンパク質が同じアミノ酸配列を保持するように、付記４３に記載のＹ染色体によって標的とされた前記生殖能に必須の遺伝子内に位置する前記１種類または複数種類の標的配列を改変する付記３０に記載のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを、前記Ｙ染色体が、前記抑制対象の集団中で息子のみを産生し、保護対象の集団中に放出された前記ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブにより改変された雌と交配した場合には生殖可能な息子および生殖不能な娘を産出するように、前記保護対象の集団中に放出する、方法。
付記４５
抑制または根絶する対象の集団中に付記４４に記載のＹ染色体を放出することを含む、標的集団抑制または標的集団絶滅のための方法。
付記４６
標的集団中に性別にバイアスをかける染色体を放出することを含む、標的集団抑制または標的集団絶滅のための方法。
付記４７
以下を含む、改変生物から同じ生物種の野生型生物への遺伝子流動を阻止する方法。
最初に、前記生物が生存可能であるためには２つの機能的なコピーとして存在しなければならない遺伝子（以後、必須遺伝子と呼ぶ）の中央部の配列に対応する配列が、前記遺伝子の野生型コピーの遠位に存在する染色体の別の領域中に挿入されるように、前記野生型生物のゲノムを改変すること；および次に、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列、第１の隣接配列、第２の隣接配列、第３の隣接配列、第４の隣接配列、および前記必須遺伝子と同じタンパク質をコードするが同じ核酸配列を使用しない配列（以後、再コード化必須遺伝子と呼ぶ）を含む第１の外来核酸配列を、前記改変生物の生殖系列に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記染色体の前記遠位領域中に挿入された前記１つまたは複数の標的位置および前記必須遺伝子内の配列に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列と、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、前記第３の隣接配列、前記第４の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列とが、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記染色体の遠位領域中の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記染色体の遠位領域中の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第３の隣接配列が、前記必須遺伝子の第３の部分と同じ配列である第３の配列を含み、
前記第４の隣接配列が、前記必須遺伝子の第４の部分と同じ配列である第４の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記染色体の前記遠位領域中の１つまたは複数の標的位置と前記必須遺伝子内の前記１種類または複数種類の標的配列とに相補的な前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記染色体の前記遠位領域中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記染色体の前記遠位領域中に挿入すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記野生型必須遺伝子中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記野生型必須遺伝子を切断部位特異的に切断する、
前記第３の隣接領域と前記第４の隣接領域との間の配列を前記必須遺伝子の野生型コピー中に挿入することによりその機能を破壊して、
その結果、前記改変生物が、前記染色体の遠位領域中に前記必須遺伝子の２つの再コード化コピーを有し、前記野生型必須遺伝子の機能的コピーを有さず、改変生物が野生型生物と交雑すると、前記染色体の前記遠位領域中に前記再コード化必須遺伝子の追加のコピーを挿入することなく前記必須遺伝子の野生型コピーが破壊されること。
付記４８
前記必須遺伝子が、前記Ｘ染色体上に位置し、生存能に２コピーが必要であり；前記遠位領域も前記Ｘ染色体上に存在し；雄の生殖能または生存能に必要な遺伝子（以後、雄必須遺伝子と呼ぶ）が、コードされている雄必須タンパク質のアミノ酸配列を保存するようその核酸配列中に再コード化されるように、前記生物の前記第１の改変により前記Ｙ染色体がさらに改変され；非機能的である前記雄必須遺伝子の更なるコピーが前記雄必須遺伝子の前記再コード化コピーの隣に挿入され；前記第１の核酸配列が、前記雄必須遺伝子の第５の部分と同じ配列である第５の配列を含む第５の隣接配列も含み；前記第１の核酸配列が、前記雄必須遺伝子の第６の部分と同じ配列である第６の配列を含む第６の隣接配列も含み；前記第１の核酸配列が、前記遺伝子を非機能的にするように再コード化された前記野生型雄必須遺伝子内の配列に対応する第２セットのガイドＲＮＡ群も含み；前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列ならびに前記ガイドＲＮＡ、前記第３の隣接配列、前記第４の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在する前記第５の隣接配列と前記第６の隣接配列との間に存在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼは前記再コード化遺伝子または前記非機能的雄必須遺伝子を切断せず、前記改変Ｙ染色体は前記改変Ｘ染色体上の前記必須遺伝子を切断しないので、改変Ｙ染色体を有する雄と交配した２つの改変Ｘ染色体を有する雌が、生存可能な雄の子を生じ；野生型Ｙ染色体を有する精子と受精した、２つの改変Ｘ染色体を有する雌に由来する卵母細胞の場合は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記野生型雄必須遺伝子を切断してその場所に前記第５の隣接配列と前記第６の隣接配列との間の配列をコピーして、生殖不能または生存不能な雄が生じ；改変Ｙ染色体を有する精子と受精した、野生型雌に由来する卵母細胞の場合は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記必須遺伝子を切断して、生存不能な雄の子孫が生じ；改変Ｘ染色体および野生型Ｘ染色体を共に含む精子と卵が結合すると、前記再コード化必須遺伝子をコピーすることなく前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記野生型必須遺伝子を切断して、１つの改変Ｘ染色体および１つの破壊されたＸ染色体を有するハイブリッド雌子孫が生じ；野生型雄と交配させたこれらのハイブリッド雌が、生存不能もしくは生殖不能な雄またはハイブリッド雌を産生し；ハイブリッド雌と改変Ｙ染色体を有する雄との雄子孫の半数が生存可能である、付記４７に記載の方法。
付記４９
以下を含む、固有の遺伝的多型を有する亜集団から野生型集団の残りへの遺伝子流動を阻止する方法。
前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間の標的位置中に固有の多型を有する集団中でのみ拡散でき、さらに前記染色体の遠位領域中に前記標的部位を挿入する、付記３０に記載のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを放出すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが、前記固有多型領域中に前記ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを挿入するための前記第１および第２の隣接配列をコードし、且つ前記遠位領域中に前記標的部位を挿入するための第３および第４の隣接配列をコードする、および次に、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、第２セットのガイドＲＮＡ群、および第３セットのガイドＲＮＡ群をコードし、且つ対応するプロモーター配列、第５の隣接配列、第６の隣接配列、第７の隣接配列、第８の隣接配列、第９の隣接配列、第１０の隣接配列、および前記必須遺伝子と同じタンパク質をコードするが同じ核酸配列を使用しない配列（以後、再コード化必須遺伝子と呼ぶ）を含む、第２の外来核酸配列を最初に上記のように改変された生物の生殖系列に導入することによって二次的に改変した生物を放出すること；
ここで、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記染色体の前記遠位領域に挿入された前記第１セットの標的位置群およびさらに前記必須遺伝子内の配列に相補的であり、
前記第３セットのガイドＲＮＡ群が、前記第１セットの核酸配列内に固有に存在する標的配列群に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列ならびに前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、前記第７の隣接配列、前記第８の隣接配列、前記第９の隣接配列、前記第１０の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列が、前記第５の隣接配列と前記第６の隣接配列との間に存在し、
前記第５の隣接配列が、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的位置の第５の部分と同じ配列である第５の配列を含み、
前記第６の隣接配列が、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的位置の第６の部分と同じ配列である第６の配列を含み、
前記第７の隣接配列が、前記必須遺伝子の第７の部分と同じ配列である第７の配列を含み、
前記第８の隣接配列が、前記必須遺伝子の第８の部分と同じ配列である第８の配列を含み、
前記第９の隣接配列が、前記第１の隣接配列の第９の部分と同じ配列である第９の配列を含み、
前記第１０の隣接配列が、前記第２の隣接配列の第１０の部分と同じ配列である第１０の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記染色体の前記遠位領域中の前記第２セットの標的位置群と前記必須遺伝子内の前記第２セットの標的配列群とに相補的な前記第２セットのＲＮＡ群を産生させること；、
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記染色体の前記遠位領域中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記染色体の前記遠位領域中の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記染色体の前記遠位領域に挿入すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、野生型必須遺伝子中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記野生型必須遺伝子を切断部位特異的に切断する、
前記第７の隣接領域と前記第８の隣接領域との間の配列を前記必須遺伝子の前記野生型コピー中に挿入することによりその機能を破壊すること；
前記第１の核酸配列内に固有に位置する配列に相補的な前記第３セットのガイドＲＮＡ群を発現させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１の核酸配列内の配列に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記第１の核酸配列内の標的配列に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１の核酸配列内の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第１の核酸配列を、前記第９の隣接領域と前記第１０の隣接領域との間の配列で置換し、
その結果、前記改変生物が、前記第１の核酸配列のコピーを有さず、２つの前記必須遺伝子の再コード化コピーを前記染色体の遠位領域中に有し、前記野生型必須遺伝子の機能的コピーを有さず、改変生物が野生型生物と交雑すると、前記染色体の前記遠位領域中に前記再コード化必須遺伝子の追加のコピーを挿入することなく前記必須遺伝子の前記野生型コピーが破壊されること。
付記５１
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む外来核酸配列を含む生殖系列細胞であって、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記生殖系列細胞。
付記５２
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である感作核酸（sensitizing nucleic acid）を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記感作核酸を発現させること。
付記５３
前記感作核酸の発現により、前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する、付記５２に記載の方法。
付記５４
前記生殖系列細胞を生物へと成長させ、前記感作核酸を子孫に移行させて、前記感作核酸を含む生物の集団を作り出し、前記感作核酸が前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる、付記５２に記載の方法。
付記５５
前記生物が雑草または有害生物である、付記５２に記載の方法。
付記５６
前記感作核酸が、現存遺伝子を置換する感作遺伝子である、付記５２に記載の方法。
付記５７
前記感作遺伝子が、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンであり、前記現在の変異バージョンが前記祖先形態で置換される、付記５６に記載の方法。
付記５８
前記現存遺伝子が、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している、付記５６に記載の方法。
付記５９
前記化学物質または化合物が、農薬、除草剤、または殺真菌剤である、付記５２に記載の方法。
付記６０
前記農薬、除草剤、または殺真菌剤が、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＦ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、ｍＣｒｙ３Ａ、もしくはＶＩＰによって産生されるＢｔ毒素、２，４−Ｄ、またはグリホサートのいずれかである、付記５９に記載の方法。
付記６１
前記感作遺伝子が、前記生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子を置換する、付記５６に記載の方法。
付記６２
前記化学物質がプロドラッグであり、前記感作遺伝子が対応するプロドラッグ変換酵素をコードする、付記５２に記載の方法。
付記６３
前記酵素と化学物質の組み合わせが、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン、またはニトロレダクターゼとＣＢ１９５４である、付記６２に記載の方法。
付記６４
感受性遺伝子ドライブが、特定の化学物質、化合物、または条件の存在する場合に、雑草または有害生物集団を毒性に対して脆弱にする、感受性遺伝子ドライブを雑草または有害生物の集団のゲノム中に含む、前記雑草または有害生物の集団を制御する方法であって、
前記雑草もしくは有害生物を死滅させる、前記雑草もしくは有害生物の増殖を低減する、または前記雑草もしくは有害生物を生殖不能にして増殖を阻害するのに有効な量の前記化学物質、化合物、または条件と前記雑草または有害生物集団を接触させることを含む、前記方法。
付記６５
前記化学物質または化合物が、除草剤、農薬、または殺真菌剤である、付記６４に記載の方法。
付記６６
以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第２の外来核酸配列の前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して、前記第１の外来核酸配列が除去される、
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第２の感作核酸配列を発現させること。
付記６７
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第２の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、付記６６に記載の方法。
付記６８
前記生物が雑草または有害生物である、付記６６に記載の方法。
付記６９
以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第２の外来核酸配列の前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第２の感作核酸配列を発現させること。
付記７０
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第２の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、付記６９に記載の方法。
付記７１
前記生物が雑草または有害生物である、付記６９に記載の方法。
付記７２
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記外来核酸配列によって切断および置換される前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に位置する配列の少なくとも１個のコピーが、前記生物が生存するためまたは生存可能な子を産生するために必要である、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に位置し、前記外来核酸配列によって切断および置換されて遺伝的荷重を生じる配列が、その生物が生存または生殖可能な子を産生するためにもはや必要ない発生段階で、前記発現および挿入ステップを行うこと。
付記７３
ＲＮＡ誘導型遺伝的荷重ドライブを標的集団中に放出することを含む、付記１〜７２のいずれか一項記載の標的集団の抑制または絶滅のための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記１つまたは複数の標的位置に相補的である、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
【請求項２】
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが二本鎖切断又は一本鎖切断を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがＣａｓ９ニッカーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの標的位置が必須遺伝子内に存在し、前記第１の外来核酸配列が前記必須遺伝子に隣接して挿入されて、前記必須遺伝子の一部を置換する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の外来核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生殖系列細胞が、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが１０〜２５０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、関連するガイドＲＮＡと共に複数の関連する標的位置に共局在して、前記第１の染色体または前記第２の染色体のいずれかを複数の切断部位で切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の切断部位での切断により、ＤＮＡ配列が除去されるとともに相同組換えによって前記第１の外来核酸配列で置換される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された染色体の野生型配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を複数の遺伝子において改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記複数の遺伝子に対応する１種類または複数種類の更なる外来核酸配列と共に前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体のゲノムＤＮＡ中の複数の遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的な１種類または複数種類の遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含み、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置のうちの１つの第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の同じ標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記１種類または複数種類の核酸配列の各々が、残りの標的位置の第１の部分および第２の部分に対応する第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を複数の遺伝子において切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること；
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記複数の標的位置に相補的である、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記関連する標的位置で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
【請求項１４】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記染色体の野生型配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である感作核酸（sensitizing nucleic acid）を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記感作核酸を発現させること。
【請求項１７】
前記感作核酸の発現により、前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生殖系列細胞を生物へと成長させ、前記感作核酸を子孫に移行させて、前記感作核酸を含む生物の集団を作り出し、前記感作核酸が前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物が雑草または有害生物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記感作核酸が、現存遺伝子を置換する感作遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記感作遺伝子が、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンであり、前記現在の変異バージョンが前記祖先形態で置換される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記現存遺伝子が、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学物質または化合物が、農薬、除草剤、または殺真菌剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記農薬、除草剤、または殺真菌剤が、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＦ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、ｍＣｒｙ３Ａ、もしくはＶＩＰによって産生されるＢｔ毒素、２，４−Ｄ、またはグリホサートのいずれかである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記感作遺伝子が、前記生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子を置換する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学物質がプロドラッグであり、前記感作核酸が対応するプロドラッグ変換酵素をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロドラッグ変換酵素と化学物質の組み合わせが、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン、またはニトロレダクターゼとＣＢ１９５４である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第２の外来核酸配列の前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第２の感作核酸配列を発現させること。
【請求項２９】
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第２の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物が雑草または有害生物である、請求項２８に記載の方法。