【手続補正書】
【提出日】平成30年6月6日(2018.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）又はその断片であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又はその断片に対して増大した熱安定性を有し、かつ該1つ以上の変異がTSHRの残基22〜260内にある、前記変異体TSHR又はその断片。
【請求項２】
前記TSHR又はその断片が、ヒトTSHR、該ヒトTSHRと86〜97.5％の配列同一性を有する種、並びにサル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ及びウマのTSHR（配列番号:47-56）から選択される哺乳動物種由来であるか、又はこれから誘導される、請求項1記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３】
前記TSHR又はその断片が、ヒトTSHR（配列番号47-56）由来であるか、又はこれから誘導される、請求項1又は2記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４】
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43、45及び46（タンパク質））から選択される1つ以上の変異を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５】
前記変異体が、I253R変異（配列番号45）であるか、またはこれを含む、請求項4記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６】
該変異体が、2つの点変異を含み、その一つがI253Rであり、その二番目がP28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43及び46（タンパク質））から選択される請求項4又は5記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項７】
前記変異体が、3つの点変異を含み、その一つがI253R（配列番号:27及び45）であり、その二番目がD143P（配列番号:18及び36）であり、並びにその三番目がP28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170W（配列番号:11-17、19-25及び28（DNA）、配列番号:29-35、37-43及び46（タンパク質））から選択される、請求項4又は5記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項８】
前記変異体が、4つの点変異を含み、その一つがI253R（配列番号:27及び45）であり、その二番目がD143P（配列番号:18及び36）であり、その三番目がR112P（配列番号:16及び34）であり、並びにその四番目が、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170W（配列番号:12、14、19、20、23及び24（DNA）、配列番号:30、32、37、38、41及び42（タンパク質））から選択される、請求項4又は5記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項９】
前記変異体が、5つの点変異を含み、その一つがI253R（配列番号:27及び45）であり、その二番目がD143P（配列番号:18及び36）であり、その三番目がR112P（配列番号:16及び34）であり、その四番目がD151E（配列番号:19及び37）又はH63C（配列番号:14及び32）であり、並びにその五番目が、L59F、H63C、D151E、S166T及びV169R（配列番号:12、14、19、20、23（DNA）、配列番号:30、32、37、38、41（タンパク質））から選択される、請求項4又は5記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１０】
前記変異体が、6つの変異を含み、そのひとつがI253Rであり、その二番目がD143P（配列番号:18及び36）であり、その三番目がR112P（配列番号:16及び34）であり、その四番目がD151E（配列番号:19及び37）であり、その五番目がH63C（配列番号:14及び32）であり、並びにその六番目がS166T（配列番号:20及び38）又はV169R（配列番号:23及び41）のいずれかである、請求項4又は5記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１１】
前記変異体が、下記からなる群から選択される変異のセット：
1） I253R（図5及び6；配列番号:27及び45）
2） D143P＋I253R（図5及び6；配列番号:18、27、36及び45）
3） R112P＋D143P＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45）
4） R112P＋D143P＋D151E＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45）
5） R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45）
6） H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45）
7） H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45）
8） H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45）：を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１２】
M22、K1-70、K1-18、及び患者血清自己抗体からなる群から選択される、TSHR自己抗体と結合する、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１３】
膜貫通ドメイン（TMD）内に1つ以上の変異をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１４】
E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A（配列番号:69-88（DNA）、配列番号:89-108（タンパク質））からなる群から選択される前記膜貫通ドメイン内の1つ以上の変異をさらに含む、請求項13記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１５】
前記膜貫通ドメイン（TMD）内の1つ以上の変異が、2つの点変異を含み、その一つがT477I（配列番号:77及び97）、V595I（配列番号:80及び100）又はI648L（配列番号:83及び103）であり、その二番目が：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、Q489H、K565L、C600R、Y601F、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A（配列番号:69-88（DNA）、配列番号:89-108（タンパク質））からなる群から選択された異なる変異であることをさらに含む、請求項13又は14記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメイン（TMD）内の1つ以上の変異が、3つの点変異を含み、その一つがV595L（配列番号:80及び100）であり、その二番目が、Y678L（配列番号:87及び107）又はK565L（配列番号:79及び99））であり、並びにその三番目が：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、Q489H、K565L、C600R、Y601F、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A（配列番号:69-88（DNA）、配列番号:89-108（タンパク質））からなる群から選択されることをさらに含む、請求項13又は14記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１７】
前記変異体が：酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識、色素、アルカリホスファターゼ（AP）標識、及びビオチン標識からなる群から選択される検出可能な標識をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１８】
前記変異体が、アルカリホスファターゼ（AP）標識をさらに含む、請求項17記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１９】
下記からなる群：
TSHR260-AP-I253R＝TSHR260-AP＋I253R（図5及び6；配列番号:27及び45）
TSHR260-AP-JMG22＝TSHR260-AP＋D143P＋I253R（図5及び6；配列番号:18、27、36及び45）
TSHR260-AP-JMG37＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45）
TSHR260-AP-JMG45＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋D151E＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45）
TSHR260-AP-JMG52＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45）
TSHR260-AP-JMG55＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45）
TSHR260-AP-JMG57＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45）
TSHR260-AP-JMG58＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45）
から選択される、請求項18記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２０】
i） 変異体TSHR又はその断片、及び任意に培養上清を含む組成物を精製することであって、
（a） 陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー；
（b） 抗体アフィニティクロマトグラフィー；及び
（c） 金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを用いるカラムクロマトグラフィーによるものである、前記精製すること；並びに
ii） 精製された変異体TSHR又はその断片を収集することを含む、請求項1〜19のいずれか1項記載の変異体TSHR又はその断片を精製する方法。
【請求項２１】
前記方法が：
i） 変異体又はその断片及び任意に培養上清を含む組成物を精製することであって：
（a） 陽イオン交換クロマトグラフィー；
（b） モノクローナル抗体がTSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープと結合し、かつ画分をそれぞれpH4.5±0.2又はpH5.0±0.2の緩衝液によって溶出し、プールし、かつ透析する、モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィー；及び
（c） ニッケルイオンアフィニティクロマトグラフィーを使用するカラムクロマトグラフィーによるものである、前記精製すること；並びに
ii） 精製した変異体TSHR又はその断片を収集することを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記変異体が、H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45；「TSHR260-JMG55」）を含み、精製された変異体TSHR又はその断片は、本質的にそれぞれTSHR260-JMG55-4.5又はTSHR260-JMG55-5.0からなる、請求項20又は21記載の方法。
【請求項２３】
精製された変異体TSHR又はその断片が、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法により入手可能な、請求項1〜19のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項２４】
前記変異体TSHR又はその断片が、脱グリコシル化されている、請求項1〜19及び23のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２５】
TSHRに対する被検自己抗体を検出するための診断方法であって、該方法が、被検自己抗体の試料を、請求項1〜19又は23、及び24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片と接触させることを含む、前記診断方法。
【請求項２６】
前記方法が：
a） 対象由来の体液試料を提供する工程；
b） TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程；
c） TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、変異体TSHR又はその断片であり、該変異体は：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43、45及び46（タンパク質））からなる群から選択される1つ以上の変異を含む、前記工程；
d） 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該体液試料と接触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程；
e） 工程（d）の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程（d）で形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程（d）の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体に固定される工程；
f） 工程（d）の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供し、これにより工程（d）で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程（d）の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程；並びに
g） 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程（e）に従い工程（d）において形成された複合体の存在を検出する工程：を含む、請求項25記載の診断方法。
【請求項２７】
前記工程（b）において提供されたTSHRの該第一の給源が、TSH受容体の1以上のエピトープ、又はTSH受容体の1以上のエピトープを含むポリペプチドを含む、完全長TSHRである、請求項25又は26記載の診断方法。
【請求項２８】
前記工程（b）において提供されたTSHRの該第一の給源が、変異体TSHR又はその断片であり、変異体が：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43、45及び46（タンパク質））からなる群から選択される1つ以上の変異を含む、請求項25〜27のいずれか1項記載の診断方法。
【請求項２９】
変異体TSHR又はその断片が： E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A（配列番号:69-88（DNA）、配列番号:89-108（タンパク質）） からなる群から任意に選択される前記膜貫通ドメイン（TMD）内の1つ以上の変異をさらに含む、請求項25〜28のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項３０】
前記標識手段が：酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識、色素、アルカリホスファターゼ（AP）標識、及びビオチン標識から選択される検出可能な標識を含む、請求項26〜29のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項３１】
前記変異体が、標識手段により、直接標識される、請求項26〜30のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項３２】
前記標識手段が、アルカリホスファターゼ（AP）標識を含む、請求項26〜31のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項３３】
前記TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定手段が、モノクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む、請求項26〜32のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項３４】
前記TSHRに対する被検自己抗体を検出するためのキットであって、該キットが：
a） TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源；
b） TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、変異体TSHR又はその断片であり、該変異体が：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43、45及び46（タンパク質））からなる群から選択される1つ以上の変異を含む、前記第二の給源；
c） 該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料と、同時に又は連続して接触させる手段であって、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する、前記手段；
d）（c）において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、（c）の前に、又は同時に、又は引き続き、固形支持体へ固定するための固定手段；
e） 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された（c）において形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な標識手段；並びに
f） 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、（c）において形成された複合体の存在を検出する手段：を含む、前記キット。
【請求項３５】
前記標識手段が：酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識、色素、アルカリホスファターゼ（AP）標識、及びビオチン標識からなる群から選択される検出可能な標識を含む、請求項34記載のキット。
【請求項３６】
前記（a）において提供された該TSHRの第一の給源が、変異体TSHR又はその断片であり、該変異体が：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43、45及び46（タンパク質））からなる群から選択される1つ以上の変異を含む、請求項34又は請求項35記載のキット。
【請求項３７】
前記変異体TSHR又はその断片が：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A（配列番号:69-88（DNA）、配列番号:89-108（タンパク質））からなる群から任意に選択される前記膜貫通ドメイン（TMD）内の1つ以上の変異をさらに含む、請求項34〜36のいずれか一項記載のキット。
【請求項３８】
変異体TSHR又はその断片がそれに直接又は間接に結合された固形支持体であって、該変異体が：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y（配列番号:11-25、27及び28（DNA）、配列番号:29-43、45及び46（タンパク質））からなる群から選択される1つ以上の変異を含む、前記固形支持体。
【請求項３９】
前記変異体が： 
1） I253R（図5及び6；配列番号:27及び45）
2） D143P＋I253R（図5及び6；配列番号:18、27、36及び45）
3） R112P＋D143P＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45）
4） R112P＋D143P＋D151E＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45）
5） R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45）
6） H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45）
7） H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45）
8） H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R（図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45）
からなる群から選択される変異のセットの一つを含む、請求項38記載の固形支持体。
【請求項４０】
前記変異体が、前記支持体に直接結合される、請求項38又は39記載の固形支持体。
【請求項４１】
支持体が、1個以上のウェルを含むELISAプレートである、請求項38〜40のいずれか一項記載の固形支持体。
【請求項４２】
前記変異体が請求項22に規定されたJMG55-4.5を含み、かつ該変異体が、M22、K1-10、及びK1-18からなる群から選択されるTSHR自己抗体と結合する、請求項38〜41のいずれか一項記載の固形支持体。
【請求項４３】
請求項38〜42のいずれか一項記載の固形支持体を含む、キット。
【請求項４４】
前記TSHRに対するモノクローナル自己抗体若しくはそれらの断片、TSHRに対する組換え抗体又は患者のTRAbを検出するための、請求項38〜42のいずれか一項記載の固形支持体、又は、請求項43記載のキットの使用。
【請求項４５】
医薬品中での使用のための、請求項1〜19、23、又は24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４６】
前記TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbの検出において使用するための、請求項1〜19、23又は24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４７】
循環している患者TRAbを吸収させるために治療的有効量で使用するための、請求項1〜19、23又は24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４８】
小型分子薬物の新規スカフォールドを同定するための小型-分子断片スクリーニングのための、請求項1〜19、23又は24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片の使用。
【請求項４９】
請求項1〜19、23又は24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片へ結合されている固相カラムを通して対象の血液の試料を通過させ、且つ該変異体TSHR又はその断片上に該血液中の循環TRAbを吸収させることを含む、対象におけるTSH受容体に対する免疫応答に関連した自己免疫疾患を治療するインビトロ方法。
【請求項５０】
a. 図6（配列番号:29-46）又は図30（配列番号:89-108）に示された変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、図5（配列番号:11-28）又は図29（配列番号:69-88）に示された、ヌクレオチド配列；
b. コードの縮重のために、コドン配列において（a）の任意の配列とは異なるヌクレオチド配列；
c.（a）の任意の配列の対立遺伝子変動を含むヌクレオチド配列；
d.（a-c）の任意の配列の断片を含むヌクレオチド配列；
e. ヌクレオチド塩基の変異、欠失又は置換のために、（a）の配列と異なり、且つ変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、ヌクレオチド配列：を含むポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項50記載のポリヌクレオチドを保有し、且つ宿主生物のゲノムへこのポリヌクレオチドを導入することが可能である、生物学的機能性ベクターシステム。
【請求項５２】
請求項50記載のポリヌクレオチドで形質転換される宿主細胞。
【請求項５３】
請求項1〜19、23、及び24のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片を同定する方法であって、（i） 変異体を得るためのPCRによる部位指定突然変異誘発、（ii） CHO-K1細胞の一過性トランスフェクションによるTSHR260変異体の発現、（iii） タンパク質の発現及び熱安定性の評価、及び（iv）（iii）において同定された最も安定した変異体の熱安定性曲線の分析、並びに任意に2つの最も熱安定性の単一変異を組合わせ、それにより二重、三重、四重、五重、又は六重変異体を生産するために同定されることを含む、前記方法。
【請求項５４】
前記変異体が、任意に全長TSHRに含まれるTSHR260の変異体であり、又はこれを含み、ここでTSHRの前記膜貫通ドメインが1つ以上の変異をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
TSHR又はその断片からのプロリン残基の除去、又はTSHR又はその断片へのプロリン残基の導入をさらに含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
表面残基の帯電残基への変異をさらに含む、請求項54記載の方法。