【手続補正書】
【提出日】平成30年7月20日(2018.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物においてステビオールグリコシドを産生することが可能な組み換え宿主細胞であって、
組み換え宿主細胞が、トランスポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子、および／または、少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子の発現を制御する転写因子ポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性転写因子遺伝子の改変された発現を有し、および／または、少なくとも１種の非相同トランスポーター遺伝子を発現する；
ステビオールグリコシドの少なくとも一部が、組み換え宿主細胞から細胞培養物中へ輸送される、
前記組み換え宿主細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え宿主細胞であって、トランスポーターポリペプチドが、ＡＴＰ−結合カセット（ABC）トランスポーター、主要ファシリテータースーパーファミリー（MFS）トランスポーター、アミノ酸／オーキシンパーミアーゼ（AAAP）ファミリートランスポーター、ＡＴＰアーゼトランスポーター、硫酸パーミアーゼ（SulP）ファミリートランスポーター、リソソームシステイントランスポーター（LCT）ファミリートランスポーター、Ｃａ２＋：カチオンアンチポーター（CaCA）ファミリートランスポーター、アミノ酸−ポリアミン−有機カチオン（APC）スーパーファミリートランスポーター、多剤／オリゴ糖−脂質／多糖（MOP）トランスポーター、ＺＲＴ／ＩＲＴ様タンパク質（ZIP）金属トランスポーターファミリートランスポーター、ミトコンドリアタンパク質トランスロカーゼ（MPT）ファミリートランスポーター、電位依存性イオンチャネル（VIC）ファミリートランスポーター、一価カチオン：プロトンアンチポーター２（CPA2）ファミリートランスポーター、推定膜透過アミノ酸排出（putative transmembrane amino acid efflux）トランスポーターのThrEファミリー、オリゴペプチドトランスポーター（OPT）ファミリートランスポーター、Ｋ＋トランスポーター（Trk）ファミリートランスポーター、胆汁酸：Ｎａシンポーター（BASS）ファミリートランスポーター、薬物／代謝物トランスポーター（DMT）スーパーファミリートランスポーター、ミトコンドリアキャリア（MC）ファミリートランスポーター、オーキシン排出キャリア（AEC）ファミリートランスポーター、アンモニアチャネルトランスポーター（Amt）ファミリートランスポーター、金属イオン（Ｍｎ２＋−鉄）トランスポーター（Nramp）ファミリートランスポーター、一過性受容器電位Ｃａ２＋チャネル（TRP-CC）ファミリートランスポーター、ヒ素耐性３（ACR3）ファミリートランスポーター、核酸塩基：カチオンシンポーター１（NCS1）ファミリートランスポーター、無機リン酸トランスポーター（PiT）ファミリートランスポーター、亜ヒ酸−アンチモナイト（ArsAB）排出ファミリートランスポーター、IISPファミリーのトランスポーター（IISP family of transporter）、グリセロール取り込み（GUP）ファミリートランスポーター、金属イオン輸送（MIT）ファミリートランスポーター、銅輸送（Ctr）ファミリートランスポーター、またはカチオン拡散ファシリテーター（CDF）ファミリートランスポーターを含む、前記組み換え宿主細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組み換え宿主細胞であって、改変された発現が、
（ａ）トランスポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子および／または転写因子ポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性転写因子遺伝子の過剰発現；
（ｂ）トランスポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子および／または転写因子ポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性遺伝子の欠失；または
（ｃ）トランスポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子および／または少なくとも１種のトランスポーター遺伝子の発現を制御する転写因子ポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性転写因子遺伝子の発現または活性の増加または減少、または、当該少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子および当該少なくとも１種の内在性転写因子遺伝子の両方の発現または活性の、対応する未改変の組み換え宿主細胞において観察される発現または活性のレベルよりも少なくとも５％以上の増加または少なくとも５％以下の減少
を含む、前記組み換え宿主細胞。
【請求項４】
内在性トランスポーターポリペプチドが、配列番号１３〜３４および３６〜１４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、および、内在性転写因子ポリペプチドが、配列番号３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
改変された発現が、配列番号２２、２６、３０、３８、４２、４４、４８、５６、６８、６９、７９、８２、８８、９４、９５、１０２、１１２、１２１、１２６、１２７、１２９、１３２、１４６、または１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するトランスポーターポリペプチドをコードするトランスポーター遺伝子の過剰発現を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞であって、
（ａ）スクローストランスポーター（ＳＵＣ１）ポリペプチドおよびスクロース合成酵素（ＳＵＳ１）ポリペプチドをコードする１種以上の遺伝子；
（ｂ）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１４９に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｃ）ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５０に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｄ）ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｅ）ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｆ）ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで当該ポリペプチドは、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｇ）シトクロームＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性または配列番号１５５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｈ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５６に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｉ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｊ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで当該ポリペプチドは、配列番号１５７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；および／または
（ｋ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号１５９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性または配列番号１４８に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
をさらに含み、
ここで、項目（ａ）〜（ｋ）の少なくとも１種の遺伝子が組み換え遺伝子であり；および
ここで、ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＭ、またはその異性体である、
前記組み換え宿主細胞。
【請求項７】
項目（ａ）〜（ｋ）の少なくとも１種の遺伝子が、組み換え宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項９】
ヤロウイア・リポティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を、１種以上の遺伝子が発現される条件下で培養培地において培養することを含む、細胞培養物においてステビオールグリコシドを産生する方法であって、
少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子、少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子の発現を制御する少なくとも１種の内在性転写因子遺伝子、または両方が発現される；
培養することが、１種以上の遺伝子の発現を誘導すること、または、１種以上の遺伝子を恒常的に発現することを含む；
ステビオールグリコシドが組み換え宿主細胞によって産生される；および
ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＭ、またはその異性体である、
前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
（ａ）レバウジオシドＡが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される；
（ｂ）レバウジオシドＢが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される；
（ｃ）レバウジオシドＤが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される；および／または
（ｄ）レバウジオシドＭが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される、
前記方法。
【請求項１２】
ステビオールグリコシドが、少なくとも５００ｍｇ／Ｌの細胞培養物の濃度で産生される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステビオールグリコシドの産生またはステビオールグリコシドの細胞培養培地中への輸送を増加させる方法であって、トランスポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子、少なくとも１種の内在性トランスポーター遺伝子の発現を制御する転写因子ポリペプチドをコードする少なくとも１種の内在性転写因子遺伝子、または両方が発現される条件下で、培養培地において請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含み、ここで、ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＭ、またはその異性体である、前記方法。
【請求項１４】
レバウジオシドＭを、単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに、細胞培養物から単離することをさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、単離するステップが、
細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに含む上清を得ること、および
（ａ）上清を１種以上の吸着樹脂に接触させて、レバウジオシドＭの少なくとも一部を単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに得ること；または
（ｂ）上清を１種以上のイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラムに接触させて、レバウジオシドＭの少なくとも一部を単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに得ること；または
（ｃ）レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに結晶化または抽出すること；
これによって、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに単離すること
を含む、前記方法。
【請求項１６】
レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１種の他のステビオールグリコシドとともに含むステビオールグリコシド組成物を細胞培養物から回収することをさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
回収されたステビオールグリコシド組成物が、ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対して、レバウジオシドＭを豊富に含み、および、植物由来のステビア抽出物から得られるステビオールグリコシド組成物に対して、ステビア植物由来成分の低減されたレベルを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組み換え宿主細胞が、ある時間ある温度で発酵槽において培養され、当該温度および時間が、ステビオールグリコシド組成物の産生を促進する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を含む細胞培養物であって、
（ａ）組み換え宿主細胞によって産生されたステビオールグリコシド；
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素；
をさらに含み、ここで、ステビオールグリコシドが、少なくとも１ｍｇ／リットルの細胞培養物の濃度で存在する、前記細胞培養物。
【請求項２０】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法によって産生されたステビオールグリコシド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のステビオールグリコシドを含む、甘味料組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の甘味料組成物を含む、食品。
【請求項２３】
請求項２１に記載の甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。
【請求項２４】
レバウジオシドＡが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
レバウジオシドＤが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
レバウジオシドＭが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞において産生される、請求項１０に記載の方法。