(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化された、Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子によってコードされる、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
請求項1〜３のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ−アルギニンを生産する方法。
【請求項５】
前記培養する段階の後、前記微生物または培地からＬ−アルギニンを回収する段階をさらに含む、請求項４に記載のＬ−アルギニンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いてＬ−アルギニンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アルギニンは、植物の種子やニンニク中に遊離状態で含有されており、アミノ酸類強化剤としても用い、医薬品、食品などにも広く利用されている。医薬用としては、肝機能促進剤、脳機能促進剤、男性不妊治療剤、総合アミノ酸製剤などに使われており、食品用としては、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用に最近脚光を浴びている物質である。
【０００３】
コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）は、Ｌ−アミノ酸生産に多く利用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ−アルギニンの生産のためにコリネバクテリウム属菌株で、主にＬ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、またはＬ−アルギニンの生合成に不要な遺伝子を除去するような目的物質特異的なアプローチが主に用いられている（特許文献１）。しかし、それでも効率的かつ高収率でＬ−アルギニンを生産できる方法に対する研究の必要性が台頭している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国登録特許公報第１０−１１０２２６３号
【特許文献２】米国公開特許番号２００２−００４５２２３
【特許文献３】韓国特許登録番号０７９１６５９
【特許文献４】韓国特許登録番号第１０−０９２４０６５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142:9-108, 1996
【非特許文献２】Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)
【非特許文献３】Methods Enzymol., 183, 63, 1990
【非特許文献４】J Bacteriol. 2002Dec;184(23):6602-14
【非特許文献５】Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)
【非特許文献６】Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388
【非特許文献７】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、Ｌ−アルギニンを高効率で生産できる微生物を開発しようと鋭意研究した結果、コリネバクテリウム属微生物に機能が未知のタンパク質をコードする遺伝子が欠損した微生物の場合、Ｌ−アルギニンの生産収率が増加するという事実を確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化されたＬ−アルギニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【０００８】
本出願のもう一つの目的は、前記微生物を用いたＬ−アルギニンの生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本出願のＬ−アルギニンを生産する微生物は、Ｌ−アルギニンを高い効率で生産できる。また、製造されたＬ−アルギニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、人間の食品や食品添加剤、医薬品などの様々な製品に応用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本出願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【００１１】
前記のような目的を達成するために、本出願は一つの様態として、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化されたＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１２】
本出願において、用語、「Ｌ−アルギニン」（L-Arginine）は、すべての生物体に存在する条件付きの必須アミノ酸であり、Ｃ６Ｈ１４Ｎ４Ｏ２の化学式を有するＬ−アミノ酸を意味する。Ｌ−アルギニンは、微生物の中でも、主にコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物によって生産されると知られているが、これらは細胞内アルギニンによってフィードバック阻害（feedback inhibition）を受けると知られており（非特許文献１）、高収率のＬ−アルギニンを生産するには限界があると知られている。本発明者らは、驚くべきことに機能が知られていない配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を不活性化させる場合、Ｌ−アルギニン生産が増加することを確認し、新しいＬ−アルギニン生産用微生物を提供することになった。
【００１３】
本出願において、用語、「配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質」は、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するタンパク質や、機能が知られてない推定上のタンパク質（hypothetical protein）を意味する。その例として、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は配列番号１のアミノ酸配列に（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００１４】
また、本出願で「特定の配列番号で構成されるタンパク質」と記載されている場合でも、当該配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列前後の無意味な配列を追加または自然的に発生しうる突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（silent mutation）を除くものではなく、このような配列追加あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属することが自明である。
【００１５】
一つの具体例として、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、前記配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。前記配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質は、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上、具体的には、８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含んでもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００１６】
併せて、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされるものであってもよい。また、配列番号２のポリヌクレオチド配列で必須的に構成されるか、構成されている遺伝子によってコードされるものであってもよいが、これに制限されない。
【００１７】
また、本出願の前記タンパク質は、前記配列番号２に記載したポリヌクレオチド配列だけでなく、配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされてもよい。
【００１８】
具体的には、前記配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしうるポリヌクレオチド配列であれば、本出願のカテゴリに含まれるが、前記タンパク質は前記配列番号２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％以上、具体的には、８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされてもよい。また、遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因して、同一アミノ酸配列をコードする前記配列の変異体も、本出願に含まれてもよい。
【００１９】
本出願において、用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示されうる。本明細書で、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。
【００２０】
前記アミノ酸またはヌクレオチド配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ [参照：非特許文献２]やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献３）を用いて決定してもよい。これらのアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００２１】
本出願において、用語、「不活性化」は、前記タンパク質の発現が親菌株、野生型菌株、または変形前の菌株に比べて全く発現されてないか、または発現されてもその活性がないか、減少されたことを意味する。この時、前記減少は、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異、欠損などによってタンパク質の活性が本来の微生物が有しているタンパク質の活性に比べて減少した場合と、それをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などで細胞内で全体的なタンパク質の活性程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む概念である。
【００２２】
本出願では、前記タンパク質の不活性化がＬ−アルギニンの生産性と関連することを最初に究明した。
【００２３】
本出願において、前記不活性化は、当該分野でよく知られている様々な方法の適用で達成されうる。前記方法の例として、１）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；２）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列の変形；３）前記タンパク質の活性が除去または弱化されるようにタンパク質をコードする前記遺伝子配列の変形；４）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；５）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前段にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加して２次構造物を形成させ、リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法；６）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆方向に転写されるプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering、RTE）などがあり、これらの組み合わせでも達成されうるが、これに特に制限されるものではない。
【００２４】
具体的には、前記発現調節配列を変形する方法は、当該分野でよく知られている様々な方法の適用で達成されてもよい。前記方法の例として、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するポリヌクレオチド配列に交替することにより行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【００２５】
また、前記遺伝子配列を変形する方法は、前記酵素の活性をさらに弱化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列に交替することにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
また、前記タンパク質をコードする前記遺伝子の一部または全体を欠失させる方法は、微生物内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部のヌクレオチド配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することによって行われてもよい。これらのポリヌクレオチドの一部または全体を欠失させる方法の一例として、相同組換えによってポリヌクレオチドを欠失させる方法を用いてもよいが、これに限定されない。
【００２７】
また、前記遺伝子の一部または全体を欠損させる方法は、紫外線などの光や化学物質を用いて突然変異を誘発し、得られた突然変異体から目的遺伝子が欠損した菌株を選別して行うことができる。前記遺伝子欠損の方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。前記ＤＮＡ組換え技術には、例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（homologous recombination）が起こるようにしてなる。また、前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターには、優性選別マーカーを含みうる。
【００２８】
本出願において、用語、「Ｌ−アルギニンを生産する微生物」または「Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物」は、自然的にＬ−アルギニン生産能を有している微生物またはＬ−アルギニンの生産能のない親菌株にＬ−アルギニンの生産能が付与された微生物を意味する。例えば、前記Ｌ−アルギニンの生産能は配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を不活性化及び/またはＬ−アルギニン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を増進させて付与してもよい。
【００２９】
ここで、Ｌ−アルギニン生合成酵素の例は、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（ａｒｇＣ）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（ａｒｇＢ）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（ａｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ （ａｒｇＦ）、 アルギニノコハク酸シンテターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）、及びカルバモイルリン酸シンテターゼを含む。これらのアルギニン生合成酵素は、Ａｒｇオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ）上に存在して、ａｒｇＲによってコードされたアルギニンリプレッサーによって調節される（非特許文献４）。したがって、アルギニンリプレッサーの弱化（特許文献２）、または前記生合成関連遺伝子中の１つ以上の遺伝子を過発現させることにより、Ｌ−アルギニン生産能力を付与しうる。
【００３０】
本出願で、前記Ｌ−アルギニンを生産する微生物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化された微生物であって、本出願の目的上、前記微生物は配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化されてＬ−アルギニンを生産しうる微生物であればいずれも可能である。具体例としては、エシェリキア （Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、エルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。本出願の目的上、前記微生物はＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
【００３１】
前記「Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物」は、天然型または変異を介してＬ−アルギニン生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。コリネバクテリウム属微生物がＬ−アルギニンを生産できることは、すでに知られていたが、その生産能が著しく低く、生産メカニズムに作用する遺伝子やメカニズムの原理が明らかにされていない状態である。したがって、本出願のＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物は、天然型微生物自体または外部Ｌ−アルギニン生産メカニズムと関連する遺伝子の活性を強化したり、不活性させて向上されたＬ−アルギニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。
【００３２】
本出願において、「コリネバクテリウム属微生物」は、すべてのコリネバクテリウム属微生物を含んでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・マリス（Corynebacterium maris）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Corynebacterium lubricantis）、コリネバクテリウム・ドサネンス（Corynebacterium doosanense）、 コリネバクテリウム・ピロサム（Corynebacterium pilosum）、コリネバクテリウム・シスタイティディス（Corynebacterium cystitidis）、コリネバクテリウム・ウテレキー（Corynebacterium uterequi）、コリネバクテリウム・レナーレ（Corynebacterium renale）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacterium lactofermentum）であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。
【００３３】
本出願は、本出願に係る前記微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ−アルギニン生産方法を提供する。
本出願に係る前記微生物は、先に説明したとおりである。
本出願の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当業界で知られている任意の培養条件及び培養方法が用いられてもよい。
【００３４】
本出願において、用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願でコリネバクテリウム属微生物を用いてＬ−アルギニンを培養する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養してもよいが、これに制限されるものではない。
【００３５】
培養に用いられる培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知となっている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology、Washington D.C.、USA、1981）。
【００３６】
培地で用いられてもよい糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに限定されるものではない。
【００３７】
用いられてもよい窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに限定されるものではない。
【００３８】
用いられてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記された原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加されうる。
【００３９】
前記微生物の培養中の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃であってもよい。培養時間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで続けてもよいが、具体的には、１０〜１６０時間であってもよい。
【００４０】
本出願の方法において、培養はバッチ工程、注入バッチ及び反復注入バッチ工程のような連続式または回分式で行うことができる。これらの培養方法は、当業界によく知られており、当業者によって選択される任意の方法を用いてもよい。
【００４１】
培養物からのＬ−アルギニン分離は、当業界に知られている通常の方法によって分離してもよい。これらの分離方法には、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、及び結晶化などの方法が利用されうる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーを介して分離してもよいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本出願の方法において、前記培養する段階の後、前記微生物または培地からＬ−アルギニンを回収する段階をさらに含んでもよい。
前記回収段階は、精製工程を含んでもよい。
【実施例】
【００４３】
以下、本出願の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１：トランスポゾンを用いたランダム突然変異のライブラリ製作
Ｌ−アルギニン生産能が増加された菌株を得るために、下記の方法でベクターライブラリを製作した。
まず、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ/ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐトランスポソーム ＴＭ Ｋｉｔ（Epicentre）を用いて、得られたプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（特許文献３）を親菌株にして電気パルス法（非特許文献５）で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹して、約２０，０００個のコロニーを確保した。
<複合平板培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、牛肉抽出物５ｇ、酵母抽出物５ｇ、脳心臓浸出液（Brain Heart Infusion）１８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素２ｇ、ソルビトール９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）
【００４５】
実施例２：トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリのスクリーニング
前記実施例１で確保された約２０，０００個のコロニーをそれぞれ３００μｌの下記の選別培地に接種して、９６ディープウェルプレート（96-deep well plate）で３０℃、１０００ｒｐｍで約２４時間培養した。
<選別培地（ｐＨ ８．０）>
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）５．５ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．８ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １６．４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチン酸アミド２ｍｇ（ 蒸留水１Ｌ基準 ）
培養液で生産されたＬ−アルギニンの生産量を分析するために、ニンヒドリン方法を用いた（非特許文献６）。
培養が完了した後、培養上澄み液１０μｌとニンヒドリンの反応溶液１９０μｌとを６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで分光光度計（spectrophotometer）で吸光度を測定し、対照区であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株と比較して高い吸光度を示す変異菌株として約６０余種のコロニーを選別した。その他コロニーは、対照区として用いられたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株と類似または減少した吸光度を示すことが確認された。
前記選別された６０余種の菌株を前記と同様の方法で再培養した後にニンヒドリンの反応を繰り返し行い、結果的に親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐの菌株に比べてＬ−アルギニン生産能の向上された上位１０種の突然変異株を選別した。
【００４６】
実施例３：選別されたランダム突然変異株のＬ−アルギニン生産能の分析
前記実施例２で選抜した１０種の突然変異株を対象に、Ｌ−アルギニン生産能が再現性よく増加された菌株を最終選別するために、下記の培地を用いたフラスコ培養を行った。培養が完了した後、ＨＰＬＣを用いて培養液内のＬ−アルギニン濃度を分析し、各突然変異株のＬ−アルギニン生産濃度を表１に示した。
<生産培地（ｐＨ７．０）>
ブドウ糖６％、硫酸アンモニウム３％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．２％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ１％、酵母抽出物０．５％、ビオチン１００ｍｇ／ｌ、ＣａＣＯ３３％（ 蒸留水１Ｌ基準 ）。
【００４７】
【表１】
0006806895.tif 000002
【００４８】
選別した１０種の変異株の中でＬ−アルギニン生産能が有意に改善された菌株としてＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ−１０を最終選別した。
【００４９】
実施例４：最終選別株でのＬ−アルギニン生産能増加の原因究明
本実施例では、前記実施例３から最終選別された突然変異株を対象にトランスポゾンのランダムな挿入によって欠損された遺伝子を同定した。
ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ−１０のゲノムＤＮＡを抽出し切断した後に連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーの２０種を選別した後、未知の遺伝子の一部が含まれたプラスミドを獲得し、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ/ＫＡＮ−２＞ＴｎｐトランスポソームＴＭ Ｋｉｔのプライマー1（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いて塩基配列を分析した。その結果、前記欠失されて不活性化された遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列であることを確認した。
プライマー１（配列番号３）：ＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣ
プライマー２（配列番号４）：ＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣT
これにより、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の不活性化の際に、Ｌ−アルギニン生産能に影響があるかどうかを確認するために、前記遺伝子を欠損候補遺伝子として選別した。
【００５０】
実施例５：配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子欠損のための組換えベクター製作
本実施例では、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子の不活性化とＬ−アルギニン生産の影響を確認するために、前記実施例４で選別された前記遺伝子をコリネバクテリウムＬ−アルギニン生産菌株の染色体上で欠損させるための組換えプラスミドを製作した。
まず、コリネバクテリウム属微生物の染色体上で前記遺伝子を欠損させうる組換えベクターを製作するために、下記表２に示したようなプライマー３〜６を合成した。
【００５１】
【表２】
0006806895.tif 000003
【００５２】
具体的には、前記遺伝子のＯＲＦ部位（配列番号２）を欠損するために、５’末端と３’末端にＸｈｏＩ制限酵素部位を有するようにプライマー３（配列番号５）、プライマー４（配列番号６）、プライマー５（配列番号７）、プライマー６（配列番号８）を合成した。前記プライマー３、プライマー４、プライマー５、及びプライマー６を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。その結果、前記遺伝子がコードするタンパク質が、コードされる部分の前後に該当するＤＮＡ断片が、それぞれ５００ｂｐずつ増幅されることを確認した。このとき、ＰＣＲ条件は、変性９５℃で５分間変性させた後、９４℃／３０秒変性、５６℃／３０秒アニーリング、７２℃／１分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を通して行った。次に、コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献４）にＸｈｏＩ制限酵素の処理後、前記収得したＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行い、これを大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ＰＣＲを介して前記目的の遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをｐＤＺ−ΔＲＳ１と命名した。
【００５３】
実施例６：配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐの製作及びそのＬ−アルギニン生産能の評価
代表的なＬ−アルギニン生産コリネバクテリウム属菌株であるＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株を基に、前記配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株を製作して、そのＬ−アルギニン生産能を評価した。
具体的には、前記実施例５で製作した組換えプラスミドｐＤＺ−ΔＲＳ１を染色体上での相同組換えにより、Ｌ−アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐに形質転換させた（非特許文献７）。
以降、４％のスクロースを含む固体平板培地で２次組換えを行った。２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー３とプライマー６を用いてＰＣＲ法により前記遺伝子が欠損した菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム「ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ１」と命名した。
Ｌ−アルギニン生産能を分析するために、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株と前記製作したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ１菌株を下記の方法で培養した。
下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐと実施例６で製作した菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ１とを接種して、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間の間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチン酸アミド２ｍｇ（蒸留水1Ｌ基準）
<生産培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖６％、硫酸アンモニウム３％、第1リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．２％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ１％、酵母抽出物０．５％、ビオチン１００ ｍｇ／Ｌ（蒸留水1Ｌ基準 ）。
培養終了後、ＨＰＬＣによりＬ−アルギニンの生産量を測定し、分析したＬ−アルギニンの濃度を表３に示した。
【００５４】
【表３】
0006806895.tif 000004
【００５５】
前記結果のように、Ｌ−アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐから前記遺伝子を欠損させたＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ１の場合、親菌株に比べてＬ−アルギニン生産能が平均２５％増加することを確認した。
前記ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ１菌株をＣＡ０６−２８３０と命名し、２０１７年１２月１５日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korea Culture Center of Microorganisms、KCCM）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２１８７Ｐを与えられた。
したがって、コリネバクテリウム属微生物で配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることにより、Ｌ−アルギニン生産能を向上させうることを確認した。
【００５６】
実施例７：配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子の弱化のための組換えベクター製作
コリネバクテリウム属菌株の染色体上で配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を弱化させうる組換えベクターの製作のために、前記遺伝子の開始コドンをＧＴＧからＴＴＧに置換して弱化させるようにし、そのための断片を製作するために下記表４に示したようなプライマー３、及びプライマー７〜９を合成した。
【００５７】
【表４】
0006806895.tif 000005
【００５８】
前記遺伝子のＯＲＦ部位（配列番号２）を増幅するために、５’末端と３’末端にＸｈｏＩ制限酵素部位を有するようにプライマー３（配列番号５）、プライマー７（配列番号９）、プライマー８（配列番号１０）、プライマー９（配列番号１１）を合成した。プライマー３、プライマー７、プライマー８、及びプライマー９を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。このとき、ＰＣＲ条件は、変性９５℃で５分間変性後、９４℃／３０秒変性、５６℃／３０秒アニーリング、７２℃／1分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を通して行った。次に、コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献４）をＸｈｏＩ制限酵素処理した後、前記で得られたＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行い、これを大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ＰＣＲを介して前記目的の遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをｐＤＺ−ΔＲＳ２と命名した。
【００５９】
実施例８：配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が弱化されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐの製作及びそのＬ−アルギニン生産能の評価
前記実施例７で製作された組換えプラスミドｐＤＺ−ΔＲＳ２を染色体上の相同組換えによりＬ−アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐに形質転換させた（非特許文献７）。
以降、４％のスクロースを含む固体平板培地で２次組換えを行った。２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー３とプライマー９を用いて塩基配列を分析し配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子の開始コドンがＴＴＧで置換された菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ２と命名した。
Ｌ−アルギニン生産能を分析するために、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐと前記製作されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ−ＲＳ２菌株とを、前記実施例６と同様の方法で培養した後、ＨＰＬＣを用いてＬ−アルギニンの生産量を測定し、分析したＬ−アルギニンの濃度を下記表５に示した。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
前記の結果のように、Ｌ−アルギニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０７４１Ｐを対象に配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を弱化させた場合、Ｌ−アルギニン生産能が平均１２％増加することを確認した。
したがって、コリネバクテリウム属微生物で配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現を弱化させることにより、Ｌ−アルギニン生産能を向上させることを確認した。
前記結果を総合すると、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損または弱化された菌株は、Ｌ−アルギニン生産能が増加することが分かり、これは微生物で前記遺伝子がコードするタンパク質の活性を不活性化させて、Ｌ−アルギニンを大量生産できることを示唆する。
以上の説明から、本願が属する技術分野の当業者は、本願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００６２】
0006806895.tif 000007
【配列表】
0006806895000001.app