【手続補正書】
【提出日】平成30年4月3日(2018.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
市販のスペーサーの例としては、以下が挙げられる：アミノ-カルボン酸スペーサー、例えば、ペプチド(例：Z-Gly-Gly-Gly-Osu(N-α-ベンジルオキシカルボニル-(グリシン)3-N-スクシンイミジルエステル、SEQ ID NO: 1)もしくはZ-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Osu(N-α-ベンジルオキシカルボニル-(グリシン)6-N-スクシンイミジルエステル、SEQ ID NO: 2))、PEG(例：Fmoc-アミノPEG2000-NHSもしくはアミノ-PEG(12-24)-NHS)、またはアルカン酸鎖(例：Boc-ε-アミノカプロン酸-Osu)であるもの；化学反応対スペーサー、例えば、ペプチド部分(例:アジドホモアラニン-Gly-Gly-Gly-OSu(SEQ ID NO: 3)もしくはプロパルギルグリシン-Gly-Gly-Gly-OSu(SEQ ID NO: 4))、PEG(例：アジド-PEG-NHS)、またはアルカン酸鎖部分(例：5-アジドペンタン酸、(S)-2-(アジドメチル)-1-Boc-ピロリジン、4-アジドアニリン、もしくは4-アジド-ブタン-1-酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)と組み合わせた、本明細書に記載の化学反応性の対であるもの；チオール反応性スペーサー、例えば、PEG(例：SM(PEG)n NHS-PEG-マレイミド)、アルカン鎖(例：3-(ピリジン-2-イルジスルファニル)-プロピオン酸-Osuもしくはスルホスクシンイミジル6-(3'-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート))であるもの；およびオリゴヌクレオチド合成用のアミダイト、例えば、アミノ修飾剤(例：6-(トリフルオロアセチルアミノ)-ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホルアミダイト)、チオール修飾剤(例：S-トリチル-6-メルカプトヘキシル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト)、または化学反応性の対の修飾剤(例：6-ヘキシン-1-イル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホルアミダイト、3-ジメトキシトリチルオキシ-2-(3-(3-プロパルギルオキシプロパンアミド)プロパンアミド)プロピル-1-O-スクシノイル,長鎖アルキルアミノCPG、もしくは4-アジド-ブタン-1-酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル))。さらなるスペーサーは当技術分野で公知であり、ライブラリー合成中に使用できるスペーサーは、限定するものではないが、以下が挙げられる：5'-O-ジメトキシトリチル-1',2'-ジデオキシリボース-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト；9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト；3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト；および18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト。本明細書に記載のスペーサーはどれも、異なる所望の長さのスペーサーを生成するために、異なる組み合わせで相互に縦一列に付加することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
実施例1：化学的ライゲーションのための構成成分の調製(二本鎖ヘッドピースおよび二本鎖タグ)
5'末端が化学的にリン酸化されたヘッドピースHP006
2018501796.tif 000001
(ZはC6-アミノdT修飾を表す)は、Biosearch社から入手した。次に、以下の手順を用いて、Fmoc-NH-PEG4-CH2CH2COOH (Chem Pep社)を使用するDMT-MMアシル化により、HP006を修飾した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
オリゴヌクレオチドTagZA1+_deltaC_5OH：
2018501796.tif 000002
と、TagZB_CNIm_bot3OH：
2018501796.tif 000003
(5'末端が化学的にリン酸化されている)と、PrA_CNIm_bot5P：
2018501796.tif 000004
(5'末端が化学的にリン酸化されている)と、PrA_top_extraC_3P：
2018501796.tif 000005
(5'末端と3'末端の両方が化学的にリン酸化されている)をIDT DNAから入手した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
実施例6：代替隣接ヌクレオチドを用いた化学的ライゲーション
以下の化学的にリン酸化されたオリゴヌクレオチドをIDT DNAから入手した。
トップ鎖、ペア1：
PrA_top：
2018501796.tif 000006
Tag_ZA1+：
2018501796.tif 000007
トップ鎖、ペア2：
PrA_top_extraC_3P：
2018501796.tif 000008
tagZA1_deltaC_5OH：
2018501796.tif 000009
(太字はオーバーラップ配列)
ボトム鎖、ペアA：
PrA_CNIm_bot5P：
2018501796.tif 000010
TagZB_CNIm_bot3OH：
2018501796.tif 000011
ボトム鎖、ペアB：
PrA_CNIm_bot5OH：
2018501796.tif 000012
TagZB_CNIm_bot3P：
2018501796.tif 000013
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
[本発明1001]
コード化された化学物質(chemical entity)を作成する方法であって、
(a)第1官能基と第2官能基とを含むヘッドピースを準備する工程；
(b)該ヘッドピースの第1官能基を化学物質の構成成分に結合させる工程であって、該ヘッドピースが該構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースが二官能性スペーサーによって該構成成分に間接的に接続される、工程；および
(c)該ヘッドピースの第2官能基を第1オリゴヌクレオチドタグに化学的ライゲーションを介してライゲーションさせて、コード化された化学物質を形成する工程であって、該化学的ライゲーションがホスホジエステルリンケージ、ホスホネートリンケージまたはホスホロチオエートリンケージを生成する、工程
を含み、前記工程(b)および(c)は任意の順序で実施することができ、前記第1オリゴヌクレオチドタグは工程(b)の結合反応をコードしており、それによって、コード化された化学物質を作成する、方法。
[本発明1002]
前記化学的ライゲーションがホスホジエステルリンケージを生成する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ヘッドピースが二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはヘアピンオリゴヌクレオチドを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記ヘッドピースが二本鎖オリゴヌクレオチドまたはヘアピンオリゴヌクレオチドを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記ヘッドピースが第3官能基を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
(d)該ヘッドピースの第3官能基を第2オリゴヌクレオチドタグに化学的ライゲーションを介してライゲーションさせる工程であって、該化学的ライゲーションがホスホジエステルリンケージ、ホスホネートリンケージまたはホスホロチオエートリンケージを生成する、工程
をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
(d)該ヘッドピースの第3官能基を第2オリゴヌクレオチドタグにライゲーションさせる工程であって、該ライゲーションが、ホスホジエステルリンケージ、ホスホネートリンケージまたはホスホロチオエートリンケージを生成する化学的ライゲーションを介するものではない、工程
をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記ヘッドピースが5'末端および/または3'末端にリン酸を含む、本発明1002〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記化学的ライゲーションが、前記ヘッドピース上の5'-または3'-リン酸を5'-または3'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドにライゲーションすることを含む、本発明1002〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記化学的ライゲーションが、前記ヘッドピース上の5'-リン酸を3'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドに、および/または前記ヘッドピース上の3'-リン酸を5'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドにライゲーションすることを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記化学的ライゲーションが、前記ヘッドピース上の5'-リン酸を3'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドに、および前記ヘッドピース上の3'-リン酸を5'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドに、同時にライゲーションすることを含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記化学的ライゲーションがシアノイミダゾールの使用を含む、本発明1008〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記化学的ライゲーションが二価金属源の使用をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記二価金属源が可溶性Zn2+源である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記可溶性Zn2+源がZnCl2である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記ヘッドピースが二官能性スペーサーによって前記構成成分に間接的に接続される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記ヘッドピースが前記構成成分に直接接続される、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
本発明1001〜1017のいずれかの方法により作成された1つ以上の化学物質を含むライブラリー。
[本発明1019]
複数のヘッドピースを含む、本発明1018のライブラリー。
[本発明1020]
各化学物質が異なっている、本発明1018または1019のライブラリー。
[本発明1021]
複数の化学物質をスクリーニングする方法であって、
(a)標的を、本発明1001〜1016のいずれかの方法により調製されたコード化された化学物質および/または本発明1017〜1019のいずれかのライブラリーと接触させる工程；ならびに
(b)対照と比較して、該標的に対して所定の特性を有する1つ以上のコード化された化学物質を選択する工程
を含み、それによって、複数の該化学物質をスクリーニングする、方法。
[本発明1022]
前記所定の特性が、対照と比較した、前記標的への結合の増加を含む、本発明1021の方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018501796000001.app