【手続補正書】
【提出日】平成30年2月20日(2018.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
実施例ＩＩＩ
遺伝子セレクションシステム
最良のアロステリックタンパク質設計を同定するための新規な遺伝子セレクションシステムを開発した。出願時において他の当業者に公知の一般的なセレクションシステムは、単一の所望の機能を最適化するものである。対照的に、本発明の実施形態は、１）アロステリックタンパク質に対する標的小分子の結合親和性、および２）アロステリックタンパク質のアロステリック性の保存、の２つの機能を最適化する。ある態様では、本発明のセレクションシステムには二重選択マーカーが使用され、これは場合により２段階に活性化される。最初のセレクションステップでは、アロステリックでない設計タンパク質がネガティブセレクションによって排除される。第２のセレクションステップでは、第１のセレクション段階で排除されなかった設計タンパク質が、ポジティブセレクションによって標的小分子への結合について評価される。本発明のセレクションシステムにより、ほぼ１０億個のタンパク質設計の評価が可能になる。両方のセレクション段階を通過したタンパク質設計は、活性について個別にアッセイされる。
本発明の態様は以下を含む。
付記１
立体構造変化を誘導するコンパニオンアロステリックエフェクターに結合する、アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を作製および単離する方法であって、
コンパニオンアロステリックエフェクターに対する結合ポケットを有する候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をインシリコで計算的に設計すること；
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を提供すること；
前記核酸配列を細菌宿主細胞に導入し、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現させること；
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して遺伝子の発現を阻害するかどうかをネガティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害している第１の複数の細菌宿主細胞を同定すること；および
前記第１の複数の細菌宿主細胞中の前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合するかどうかをポジティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合した第２の複数の細菌宿主細胞を同定すること
を含む方法。
付記２
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列が、基体に結合した核酸部分配列から作成される、付記１に記載の方法。
付記３
前記基体に由来する複数の部分配列が、連結されて前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記核酸配列を形成する、付記２に記載の方法。
付記４
前記ネガティブセレクションが、前記遺伝子を発現する細胞にとって有害である毒素に前記細菌宿主細胞を接触させることを含む、付記１に記載の方法。
付記５
前記ネガティブセレクションが、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害することがなかった細胞にとって有害である毒素に前記細菌宿主細胞を接触させることを含む、付記１に記載の方法。
付記６
前記ポジティブセレクションが、毒素および前記コンパニオンアロステリックエフェクターに前記第１の複数の細菌宿主細胞を接触させることを含み、前記毒素は、前記遺伝子が発現されない細胞にとって有害である、付記１に記載の方法。
付記７
前記ポジティブセレクションが、前記第１の複数の細菌宿主細胞を毒素およびアロステリックエフェクター標的に接触させることを含み、前記コンパニオンアロステリックエフェクターが前記ＤＮＡから前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を遊離させるような様式で前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質に結合しなかった細胞にとって、前記毒素が有害である、付記１に記載の方法。
付記８
前記ポジティブセレクションが、検出可能なマーカーを検出することを含み、該検出可能なマーカーは、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記ＤＮＡに結合して前記遺伝子が発現している場合に前記第１の複数の細菌細胞中で発現される、付記１に記載の方法。
付記９
前記検出可能なマーカーが蛍光タンパク質である、付記８に記載の方法。
付記１０
前記蛍光タンパク質が、蛍光活性化細胞選別によって検出される、付記９に記載の方法。
付記１１
前記ポジティブセレクションが、前記コンパニオンアロステリックエフェクターが前記ＤＮＡから前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を遊離させる様式で前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質に結合しなかった場合に前記第１の複数の細菌細胞中で発現される、検出可能なマーカーを検出することをさらに含む、付記７に記載の方法。
付記１２
前記ＤＮＡ結合タンパク質が化学センサーである、付記１に記載の方法。
付記１３
前記細菌宿主細胞が大腸菌または枯草菌である、付記１に記載の方法。
付記１４
立体構造変化を誘導するコンパニオンアロステリックエフェクターに結合するアロステリックＤＮＡ結合タンパク質を作製および単離する方法であって、
コンパニオンアロステリックエフェクターに対する結合ポケットを有する候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をインシリコで計算的に設計すること、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を提供すること、
前記核酸配列を出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）宿主細胞に導入し、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現させること、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して遺伝子の発現を阻害するかどうかをネガティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害している第１の複数の出芽酵母宿主細胞を同定すること、および
前記第１の複数の出芽酵母宿主細胞中の前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合するかどうかをポジティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合した第２の複数の出芽酵母宿主細胞を同定すること
を含む方法。
付記１５
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列が、基体に結合した核酸部分配列から作成され、且つ、連結されて前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記核酸配列を形成する、付記１４に記載の方法。
付記１６
前記ネガティブセレクションが、前記遺伝子を発現する細胞にとって有害である毒素に前記細菌宿主細胞を接触させることを含む、付記１４に記載の方法。
付記１７
前記ポジティブセレクションが、毒素および前記コンパニオンアロステリックエフェクターに前記第１の複数の細菌宿主細胞を接触させることを含み、前記毒素は、前記遺伝子が発現されない細胞にとって有害である、付記１４に記載の方法。
付記１８
立体構造変化を誘導するコンパニオンアロステリックエフェクターに結合するアロステリックＤＮＡ結合タンパク質を作製および単離する方法であって、
コンパニオンアロステリックエフェクターに対する結合ポケットを有する候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をインシリコで計算的に設計すること、
基体に結合した核酸部分配列から作成された、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を提供すること、
前記核酸配列を微生物に導入して前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現させること、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して遺伝子の発現を阻害するかどうかをネガティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害している第１の複数の微生物を同定すること、および
前記第１の複数の微生物中の前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合するかどうかをポジティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合した第２の複数の微生物を同定すること
を含む方法。
付記１９
前記基体がマイクロアレイである、付記１８に記載の方法。
付記２０
前記基体に由来する複数の部分配列が、前記マイクロアレイ上の配列から増幅され、且つ、連結されて前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記核酸配列を形成する、付記１９に記載の方法。
付記２１
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記核酸配列がランダムに作製される、付記１８に記載の方法。
付記２２
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がエラープローンＰＣＲまたはコンビナトリアルＰＣＲによって作製される、付記２１に記載の方法。
付記２３
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が、その機能のためにはタンパク質読み枠がインタクトなままである必要がある抗毒素遺伝子に融合している、付記１８に記載の方法。
付記２４
フレームのずれたまたは短縮された（truncated）候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が、毒素に対して特異的な抗毒素タンパク質を発現させない、付記２３に記載の方法。
付記２５
フレームのずれたまたは短縮された候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現する宿主細胞が、前記宿主細胞を前記毒素に晒すことにより排除される、付記２４に記載の方法。
付記２６
エフェクター分子に対する結合ポケットを有する計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質。
付記２７
エフェクター分子に対する結合ポケットを有する計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列。
付記２８
計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質の結合ポケットに選択的に結合する構造を有するエフェクター分子。
付記２９
計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質の結合ポケットに選択的に結合する構造を有するエフェクター分子をコードする核酸配列。
付記３０
エフェクター分子に対する結合ポケットを有する計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞。
付記３１
前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質によって制御される外来性遺伝子をさらに含む、付記３０に記載の細胞。
付記３２
計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質の結合ポケットに選択的に結合する構造を有するエフェクター分子をコードする核酸配列を含む細胞。
付記３３
エフェクター分子に対する結合ポケットを有する計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列、および
前記計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質の前記結合ポケットに選択的に結合する構造を有する前記エフェクター分子をコードする核酸配列
を含む細胞。
付記３４
前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質によって制御される外来性遺伝子をさらに含む、付記３３に記載の細胞。
付記３５
前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質と前記エフェクター分子とによって制御される外来性遺伝子をさらに含む、付記３３に記載の細胞。
付記３６
前記外来性遺伝子が、毒素に対する解毒剤をコードする、付記３３に記載の細胞。
付記３７
前記外来性遺伝子が、検出可能なタンパク質または検出可能なタンパク質タグをコードする、付記３３に記載の細胞。
付記３８
前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が、解毒剤遺伝子に融合しており、インタクトなタンパク質読み枠を有する、付記３３に記載の細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体構造変化を誘導するコンパニオンアロステリックエフェクターに結合する、アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を作製および単離する方法であって、
コンパニオンアロステリックエフェクターに対する結合ポケットを有する候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をインシリコで計算的に設計すること；
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を提供すること；
前記核酸配列を細菌宿主細胞に導入し、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現させること；
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して遺伝子の発現を阻害するかどうかをネガティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害している第１の複数の細菌宿主細胞を同定すること；および
前記第１の複数の細菌宿主細胞中の前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合するかどうかをポジティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合した第２の複数の細菌宿主細胞を同定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ネガティブセレクションが、
（ｉ）前記遺伝子を発現する細胞にとって有害である毒素に前記細菌宿主細胞を接触させること、または
（ｉｉ）前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害することがなかった細胞にとって有害である毒素に前記細菌宿主細胞を接触させることを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポジティブセレクションが、
（ｉ）前記第１の複数の細菌宿主細胞を毒素および前記コンパニオンアロステリックエフェクターに接触させること、ここで前記毒素は、前記遺伝子が発現されない細胞にとって有害であること、
（ｉｉ）前記第１の複数の細菌宿主細胞を毒素およびアロステリックエフェクター標的に接触させること、ここで前記コンパニオンアロステリックエフェクターが前記ＤＮＡから前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を遊離させるような様式で前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質に結合しなかった細胞にとって、前記毒素が有害であること、または
（ｉｉｉ）検出可能なマーカーを検出すること、ここで該検出可能なマーカーは、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記ＤＮＡに結合して前記遺伝子が発現している場合に前記第１の複数の細菌細胞中で発現されることを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出可能なマーカーが蛍光タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光タンパク質が、蛍光活性化細胞選別によって検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポジティブセレクションが、前記コンパニオンアロステリックエフェクターが前記ＤＮＡから前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を遊離させる様式で前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質に結合しなかった場合に前記第１の複数の細菌細胞中で発現される、検出可能なマーカーを検出することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が化学センサーである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌宿主細胞が大腸菌または枯草菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
立体構造変化を誘導するコンパニオンアロステリックエフェクターに結合するアロステリックＤＮＡ結合タンパク質を作製および単離する方法であって、
コンパニオンアロステリックエフェクターに対する結合ポケットを有する候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をインシリコで計算的に設計すること、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を提供すること、
前記核酸配列を出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）宿主細胞に導入し、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現させること、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して遺伝子の発現を阻害するかどうかをネガティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害している第１の複数の出芽酵母宿主細胞を同定すること、および
前記第１の複数の出芽酵母宿主細胞中の前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合するかどうかをポジティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合した第２の複数の出芽酵母宿主細胞を同定すること
を含む方法。
【請求項１０】
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列が、基体に結合した核酸部分配列から作成され、且つ、連結されて前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記核酸配列を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ネガティブセレクションが、前記遺伝子を発現する細胞にとって有害である毒素に前記出芽酵母宿主細胞を接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポジティブセレクションが、毒素および前記コンパニオンアロステリックエフェクターに前記第１の複数の出芽酵母宿主細胞を接触させることを含み、前記毒素は、前記遺伝子が発現されない細胞にとって有害である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
立体構造変化を誘導するコンパニオンアロステリックエフェクターに結合するアロステリックＤＮＡ結合タンパク質を作製および単離する方法であって、
コンパニオンアロステリックエフェクターに対する結合ポケットを有する候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をインシリコで計算的に設計すること、
基体に結合した核酸部分配列から作成された、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を提供すること、
前記核酸配列を微生物に導入して前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現させること、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して遺伝子の発現を阻害するかどうかをネガティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡに結合して前記遺伝子の発現を阻害している第１の複数の微生物を同定すること、および
前記第１の複数の微生物中の前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合するかどうかをポジティブセレクションを用いて決定して、前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が前記コンパニオンアロステリックエフェクターに結合した第２の複数の微生物を同定すること
を含む方法。
【請求項１４】
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記核酸配列がランダムに作製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質がエラープローンＰＣＲまたはコンビナトリアルＰＣＲによって作製され、
前記候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が、その機能のためにはタンパク質読み枠がインタクトなままである必要がある抗毒素遺伝子に融合しており、且つ
フレームのずれたまたは短縮された（truncated）候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が、毒素に対して特異的な抗毒素タンパク質を発現させない、
請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
フレームのずれたまたは短縮された候補アロステリックＤＮＡ結合タンパク質を発現する宿主細胞が、前記宿主細胞を前記毒素に晒すことにより排除される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質をコードする第１の核酸またはエフェクター分子をコードする第２の核酸を含むか、または
前記第１の核酸および前記第２の核酸を共に含む細胞であって、
前記計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質がエフェクター分子に対する結合ポケットを有し、
前記エフェクター分子が計算的にインシリコで設計されたアロステリックＤＮＡ結合タンパク質の結合ポケットに選択的に結合する構造を有する細胞。
【請求項１８】
前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質によって制御される外来性遺伝子または前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質と前記エフェクター分子とによって制御される外来性遺伝子をさらに含み、
前記外来性遺伝子が、毒素に対する解毒剤、検出可能なタンパク質、または検出可能なタンパク質タグをコードしている、
請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記アロステリックＤＮＡ結合タンパク質が、解毒剤遺伝子に融合しており、インタクトなタンパク質読み枠を有する、請求項１７または１８に記載の細胞。