【手続補正書】
【提出日】平成30年2月15日(2018.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
政府支援
本出願は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号ＧＭ０４６０５９及びＧＭ１０１７６２の下で、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
配列表
本明細書に記載の配列番号は、ＡＳＣＩＩ形式の記録媒体で提出された配列表（整理番号ＭＴＶ−１４５．３０、サイズ１０４２１バイト）に記載の配列番号を参照する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【図１】本発明において有用な例示のリガンド（例えば、ｔＢｕＢｒｅｔｔＰｈｏｓ＝Ｌ１５；ＡｄＢｒｅｔｔＰｈｏｓ＝Ｌ１６；及びＲｏｃｋＰｈｏｓ＝Ｌ１７）を描写する。
【図２】本発明において有用な例示のリガンドを描写する。
【図３】システイン及びセレノシステインのアリール化のためのＰｄをベースとする試薬の代表的合成を描写する。
【図４（ａ）】非保護モデルペプチドにおける選択的システインＳ−アリール化を描写する。
【図４（ｂ）】非保護モデルペプチドのＳ−アリール化の生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図５】アリール化がないこと（例えば、スレオニンまたはリシンにおいて）を立証する、アリール化条件下のＡＫＬＴＧＦ−ＮＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｆ５）（配列番号１）についてのＬＣＭＳトレースである。
【図６】水性媒体中のＣｙｓ含有ペプチド（出現順に、それぞれ配列番号１９および２０）のアリール化からの生成物のＬＣＭＳトレースである。
【図７（ａ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｂ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｃ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｄ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｅ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｆ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図８（ａ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて得られたペプチド６のＳ−アリール化型の例示の種を描写する。
【図８（ｂ）】ペプチドへの生体共役反応に好適な例示の医薬品を描写する。
【図９】フルオレセイン含有Ｐｄ（ＩＩ）試薬（左）、及び標識化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（右）を用いるＤＡＲＰｉｎの代表的なアリール化を示す。（図中の“ＧＧＣＧＧ”は配列番号２１）
【図１０】Ｐｄをベースとする試薬を用いる抗体中のＣｙｓ側鎖のアリール化のための例示の戦略を描写する。
【図１１】ヒトＩｇＧ１抗体のフルオレセインアリール化についての実験的スキーム及びその結果を描写する。
【図１２（ａ）】環状またはステープルペプチドの形成のための多金属試薬（二官能性）の例示の合成を描写する。
【図１２（ｂ）】環状、多環、またはステープルペプチドの形成のための多金属試薬（三官能性）の例示の合成を描写する。
【図１３】本発明の方法を用いる、トラスツズマブのバンデタニブ（星印で表された）の抗体−薬物複合体についての代表的な手順の概略図を描写する。
【図１４】Ｐ２システイン抱合体の酸化条件下での安定性を示すグラフである。
【図１５】本発明のパラジウム試薬を用いるタンパク質修飾を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、パラジウム錯体１Ｄとの反応後の、タンパク質のａ）Ｎ末端（Ｐ４）、ｂ）ループ（Ｐ５）、及びｃ）Ｃ末端（Ｐ６）における、クマリンによるシステイン残基の定量的修飾を示す。
【図１６】パラジウム錯体１Ｄによるタンパク質標識化についての比較対照反応を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、得られたタンパク質Ｐ７〜Ｐ９が、システイン残基を含有しないことを示す。
【図１７】パラジウム錯体１Ｊを用いるタンパク質修飾を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、パラジウム錯体１Ｊとの反応後の、タンパク質のａ）Ｎ末端（Ｐ４）、ｂ）ループ（Ｐ５）、及びｃ）Ｃ末端（Ｐ６）における、薬物分子によるシステイン残基の定量的修飾を示す。
【図１８】パラジウム錯体１Ｊによるタンパク質標識化についての比較対照反応を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、得られたタンパク質Ｐ７〜Ｐ９が、システイン残基を含有しないことを示す。
【図１９】３つのパネル（上部、中間、及び下部）を有し、二重クロスカップリング反応の反応スキーム（上部）、ならびに１：１のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（中間）及び５：９５のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（下部）での様々な生成物を示すトレースを描写する。
【図２０】Ｐｄをベースとするハロアリール化試薬を用いる、ステープルペプチドの合成についての代表的手順の概略図を描写する（配列番号８）。
【図２１】空気中で安定するＰｈ−メシレートパラジウムプレ触媒及びハロゲン化アリールを用いるＣｙｓ残基のアリール化についての代表的手順の概略図を描写する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
実施例３−比較対照ペプチド
Ｃｙｓ残基またはＳｅｃ残基を欠如する比較対照ペプチドを、アリール条件に置いた。例えば、ＡＫＬＴＧＦ−ＮＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｆ５）（配列番号１）及びＶＴＬＰＳＴＦ＊ＧＡＳ（配列番号２）は、変換及び／または分解を示さず、アリール化がＣｙｓまたはＳｅｃ残基で限定的に起こることを示唆している。アリール条件下のＡＫＬＴＧＦ−ＮＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｆ５）（配列番号１）についてのＬＣＭＳトレースを図５に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
実施例４−反応条件の変化
本明細書に記載されるＣｙｓアリール化は、水を含有する溶媒混合物においても作動する。アリール化実験を、モデルペプチド４（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）（配列番号３）と試薬１ａとの間で、それぞれ、１：１  ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ及び２：１  Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ混合物中で行った。どちらの場合も、Ｓ−アリール化ペプチド５（γ−Ｇｌｕ−ＣｙｓＴｏｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）（配列番号４）を生成する選択的変換が、数分以内に起こり、非常に高速の反応速度を示唆した（図６）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
実施例５−官能基許容性
この変換の官能基許容性に対処するために、いくつかのＰｄ系トリフレート試薬と、ＯＨ（例えば、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）及びＮＨ／ＮＨ２（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）などの他の共通の求核性アミノ酸残基を特徴とする非保護ペプチド６（ＦＲＳＮＬＹＧＣＥＫＨＫＡＴ−ＮＨ２）（配列番号５）との間で試験を行った。アリール化反応は、特に明記しない限り、ｐＨ８．５の０．１Ｍトリスの存在下で、１：２  ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏの溶媒系で、５分間行った。試験された全てのアリール化試薬（６ａ〜ｆ）について、使用されたＰｄ（ＩＩ）の性質に関わりなく、選択的かつほぼ定量的なＳ−アリール化を観察した（図７）。更に、トリフレートの代わりに塩化物リガンドを含有するＰｄをベースとする種１ｂを用いた試験は、１ｍＭのペプチド濃度において、Ｓ−アリール化ペプチド６ａを５分以内に生成する同様な反応性を示した。アリール化戦略は、複雑な薬物分子を含有するＰｄ（ＩＩ）種による生体共役反応にも従順である（図８）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
実施例６−モデルタンパク質
次に、アリール化の化学作用を、単一のＣｙｓ残基を含有するモデルタンパク質を用いて評価した。Ｃｙｓ残基を配列鎖のＮ末端に組み込む単一点突然変異を有するＤＡＲＰｉｎタンパク質を、これらの試験のために設計し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた（最終的アミノ酸配列：ＧＧＣＧＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＹＤＤＮＧＶＴＰＬＨＬＡＡＦＬＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＡＤＳＷＧＴＴＰＬＨＬＡＡＴＷＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＡＦＤＩＳＩＤＮＧＮＥＤＬＡＥＩＬＱＫＬＮ）（配列番号６）。５０ｕＭのタンパク質と５当量の１ａとの間の反応は、出発物質の５分間以内の完全な消費をもたらした。得られた生成混合物を、ＬＣ−ＭＳによって分析し、タンパク質の定量的モノアリール化を確認した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
ペプチドＰ１（配列番号７）（上記の４μＬ、１５０μＭ）、Ｈ２Ｏ（４７μＬ）、有機溶媒（１μＬ）、及び緩衝液（６μＬ、１Ｍ）を、０．６ｍＬのプラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、ボルテクサーを用いて、得られた溶液を混合した。有機溶媒中のパラジウム錯体の原液（２μＬ、６００μＭ）を一度に添加し、反応チューブをボルテックスし、適切な試薬混合を確実にし、室温で５分間放置した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、０．０５μＬ／ｍＬの溶液）の添加によって、反応物を急冷させた。更に５分後に、ＬＣＭＳ溶液（６０μＬ）をエッペンチューブに添加し、反応混合物をＬＣＭＳにより分析した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
ペプチド（配列番号８）（４μＬ、１５０μＭ）、Ｈ２Ｏ（２３μＬ）、及びトリス緩衝液（３μＬ、１Ｍ、ｐＨ＝７．５）を、０．６ｍＬのプラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、ボルテクサーを用いて、得られた溶液を混合した。ＣＨ３ＣＮ中のパラジウム錯体の原液（３０μＬ、４０μＭ）を一度に添加し、反応チューブをボルテックスし、適切な試薬混合を確実にし、室温で１０分間放置した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、０．１μＬ／ｍＬの溶液）の添加によって、反応物を急冷させた。更に５分後に、ＬＣＭＳ溶液（６０μＬ）をエッペンチューブに添加し、反応混合物をＬＣＭＳにより分析した。（ステープルペプチド：配列番号９）
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
実施例１４−アリール化反応条件
例示されたシステイン抱合反応の多くは、ほぼ中性からわずかに塩基性のｐＨ値で動作する。パラジウム試薬を用いる反応条件の更なる評価は、様々な緩衝液中の共通の有機共溶媒（５％のＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ）を用いる、広範なｐＨ範囲内（５．５〜８．５）の出発ペプチドの対応するＳ−アリールシステイン抱合体への定量的変換を明らかにした。注目すべきことには、０．１％のＴＦＡ溶液（ｐＨ２．０）中であっても、反応は、７時間後に、５９％のＳ−アリール化生成物を得た。このプロセスは、マレイミド及びα−ハロアシル基と反応することによって、生体共役反応を妨害することが示されているタンパク質ジスルフィド還元剤のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とも互換性があった。
【化６０】
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【表１−１】
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【表１−２】
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【表２】
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【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
タンパク質標識付け
２０ｍＭのトリス及び１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の４７５μＬ中、タンパク質（５００ピコモル）の溶液に、ＤＭＦ中、パラジウム−クマリン錯体１Ｄまたはパラジウム−薬物錯体１Ｊ（２５μＬ、２００μＭ）を添加した。この溶液を、上下に２０回ピペッティングし、適切な試薬混合を確実にした。反応混合物を、室温で３０分間放置した。その後、２０ｍＭのトリス及び１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解した３−メルカプトプロピオン酸（２５μＬ、２ｍＭ）の添加によって、反応物を急冷させた。室温で更に５分間放置した後に、０．２％のＴＦＡを含有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）の５００μＬを添加し、得られた混合物を、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
【表４】
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