【手続補正書】
【提出日】平成30年10月22日(2018.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法。
【請求項２】
試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないことがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチド分子が、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、又はアレナウイルスのポリヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチド分子が、試料を、試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができる薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤の１つ又は複数と接触させるステップによって得られ；および／または
アッセイの開始の７分後、１０分後、及び／又は１５分後に、標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能なシグナルが存在せず；および／または
ステップ（ａ）で使用されるプライマーが、ステップ（ｂ）で使用されるプライマーと同じ配列又は異なる配列を有し；および／または
ステップ（ａ）〜（ｃ）が単一の反応で実施され；および／または
ステップ（ａ）のｃＤＮＡが第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移され；および／または
逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが同じ又は異なる酵素であり；および／または
試料が体液、生体試料、又は環境試料である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検出の限界が１反応当たり１０又は２０コピーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間以内で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリメラーゼが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｃａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇａｎ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｂｏ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び／又はそれらの断片の５’−エキソ−誘導体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．ＢｓｔＳＥＩの１つ又は複数である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ、ＲＳＶ  ＲＴ、及び／又はそれらの変異体／誘導体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能なプローブが分子ビーコンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＢＯＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含み、
ＥＢＯＶの増幅が、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出され、
ＨＩＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含み、
ＨＩＶの増幅が、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出され、
デングウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含み、
デングウイルスの増幅が、以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出され、
Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含み、
Ｂ型インフルエンザウイルスの増幅が、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出され、
ＢＶＤＶ１の検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含み、
ＢＶＤＶ１の増幅が、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡウイルス配列に特異的に結合するプライマー、ＲＮＡウイルスアンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含む、ＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を検出するためのキット。
【請求項１３】
ＥＢＯＶの検出用に、
プライマーが、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含み、かつプローブが、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含み、
ＨＩＶの検出用に、
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含み、かつプローブが、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを含み、
デングウイルスの検出用に、
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含み、かつプローブが以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを含み、
Ｂ型インフルエンザウイルスの検出用に、
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含み、かつプローブが、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを含み、
ＢＶＤＶ１の検出用に、
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含み、かつプローブが、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを含む、
請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
フォワードプライマー又はリバースプライマーが、３’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）の１つ又は複数である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥された溶解試薬又はＲＮＡ安定化試薬を含むか又は含まないキャピラリーチューブ；（ｂ）逆転写酵素反応及び／又は増幅反応を実施することに適した緩衝液を含む１つ又は複数の器；および／または（ｃ）逆転写酵素、ニッキング酵素、及び凍結乾燥形態の鎖置換ポリメラーゼを含む器のうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１７】
ＲＮＡウイルスを有するヒト又は動物の対象を診断する方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、方法。
【請求項１８】
ＲＮＡウイルスが、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１７に記載の方法。