【手続補正書】
【提出日】平成30年1月22日(2018.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を標的ポリヌクレオチドに付着させる方法であって、
（ａ）負荷ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の負荷部分と結合している前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を用意するステップであって、前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が前記負荷ポリヌクレオチドに結合している、ステップと、
（ｂ）前記１つまたは複数の負荷部分を前記標的ポリヌクレオチドに付着させるステップであって、前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が前記負荷ポリヌクレオチドに結合したままである、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前に、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記１つまたは複数の負荷部分と結合させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が、１つまたは複数のポリヌクレオチドハンドリング酵素、例えば１つまたは複数のポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼまたはこれらの組み合わせであり、任意に、前記１つまたは複数のヘリカーゼ（ｉ）が、（Ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼもしくはＤｄａヘリカーゼ、（Ｂ）（ａ）におけるヘリカーゼのいずれかに由来するヘリカーゼ、例えば、少なくとも１つの立体構造で前記ポリヌクレオチドがそこを通って前記ヘリカーゼから解離することができるポリヌクレオチド結合ドメイン内の開口のサイズを低減させるように修飾されているヘリカーゼであり、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）におけるヘリカーゼのいずれかの組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２つ以上のポリヌクレオチド結合タンパク質を付着させることに関わる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記２つ以上のポリヌクレオチド結合タンパク質が、
（ｉ）前記１つまたは複数の負荷部分による以外に互いに付着していない、および／または
（ｉｉ）互いに異なる、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記１つまたは複数の負荷部分が合成のものである、
（ｉｉ）前記負荷ポリヌクレオチドが、一本鎖ポリヌクレオチドを含む、
（ｉｉｉ）前記負荷ポリヌクレオチドが、一本鎖ポリヌクレオチドであり、前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記１つまたは複数の負荷ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のスペーサーで停止されるヘリカーゼに由来する、
（ｉｖ）前記１つまたは複数の負荷部分が、膜とカップリングすることができる１つまたは複数のアンカーを含む、ならびに/または
（ｖ）ステップ（ｂ）が、リガーゼを使用して前記１つまたは複数の負荷部分を前記標的ポリヌクレオチドに付着させるステップを含み、任意に、（１）前記方法は方法条件から前記リガーゼを除去するステップ（ｃ）をさらに含み、および/または（２）ステップ（ｂ）が、ＡＴＰの不在下で行われるか、またはＡＴＰの代わりにγ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を使用して行われる、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数の負荷部分の少なくとも１つが、
（ｉ）Ｙアダプターであって、任意にポアを優先的に通り抜けるリーダー配列を含む、および/または
（ｉｉ）架橋部分であって、任意にヘアピンループを含み、ここで前記ヘアピンループのステムが、２００ヌクレオチド対未満の長さである、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的ポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた、１つまたは複数の付着しているポリヌクレオチド結合タンパク質を有する標的ポリヌクレオチドを、膜貫通ポアと、前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドの前記ポアに対する移動を制御するように接触させるステップと、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに、前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記標的ポリヌクレオチドを特性評価するステップであって、任意に、前記１つまたは複数の特性が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される、ステップと
を含む方法。
【請求項１０】
特性評価用の標的ポリヌクレオチドを調製する方法であって、
（ａ）１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が１つまたは複数のポリメラーゼを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた、前記標的ポリヌクレオチドに付着している前記１つまたは複数のポリメラーゼに、前記標的ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して１つまたは複数のポリヌクレオチドを形成させ、それによって特性評価用の前記標的ポリヌクレオチドを調製するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
標的ポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の方法を行うステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよび／またはステップ（ａ）で生成された１つもしくは複数のポリヌクレオチドを、膜貫通ポアと、前記標的ポリヌクレオチドおよび／またはステップ（ａ）で生成された前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように接触させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび／またはステップ（ａ）で生成された前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに、前記標的ポリヌクレオチドおよび／またはステップ（ａ）で生成された前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記標的ポリヌクレオチドを特性評価するステップであって、任意に、前記１つまたは複数の特性が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される、ステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたは固体ポアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリシン、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、ライセニン、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡに由来し、任意に、前記膜貫通タンパク質ポアが、
（ａ）配列番号２で示される８個の同一のサブユニットで形成されているＭｓｐＡ、もしくは（ｂ）前記８個のサブユニットの１個もしくは複数が、アミノ酸同一性に基づき配列全体にわたって配列番号２と少なくとも５０％の相同性を有し、かつポア活性を保持する、その変異体、または
（ｂ）配列番号４で示される７個の同一のサブユニットで形成されているα−ヘモリシン、もしくは（ｄ）前記７個のサブユニットの１個もしくは複数が、アミノ酸同一性に基づき配列全体にわたって配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有し、かつポア活性を保持する、その変異体
である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質で、または１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されている、ならびに／または
（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの前記１つまたは複数の特性が、電気的測定および／または光学的測定によって測定され、任意に、前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、
請求項９および１１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を標的ポリヌクレオチドに付着させるためのキットであって、（ａ）負荷ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の負荷部分と結合している前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質であって、前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記負荷ポリヌクレオチドに結合しているタンパク質、ならびに（ｂ）リガーゼを含み、
任意に、前記部分または１つもしくは複数の負荷部分が、請求項６または８において定義した通りであり、および／あるいは前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が、請求項３において定義した通りである、キット。