(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、前記検出方法。
（Ａ）ＰＣＲ反応用チューブに前記乾燥ろ紙血を添加する工程
（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブにＰＣＲ試薬を添加する工程であって、ＰＣＲ試薬は少なくとも以下の（１）のフォワードプライマー及び（２）のリバースプライマーからなる群から選ばれる１以上のプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びインターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む前記工程
（Ｃ）ＰＣＲ試薬と前記乾燥ろ紙血を添加したチューブ内でＰＣＲ反応を行う工程
（Ｄ）ＰＣＲ反応により増幅されたＳＭＮ１遺伝子中の標的核酸を経時的に光学的に検出する工程
（１）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列からなるフォワードプライマー
（２）配列番号１６〜２１のいずれかの塩基配列からなるリバースプライマー
【請求項２】
乾燥ろ紙血が、直径１．２ｍｍ〜２．０ｍｍの円形のパンチ片又は全血を全反応溶液量に対して０．９５ｖ/ｖ％〜６．６ｖ/ｖ％を含むパンチ片である、請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥ろ紙血から得られる一定サイズのパンチ片を用いて、直接リアルタイムＰＣＲによりパンチ片に含まれるＳＭＮ１遺伝子を特異的に検出及び定量するための方法及びその方法に使用するプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ；ＳＭＡ）は、脊髄の前角細胞の変性による筋委縮と進行性筋力低下を特徴とする下位運動ニューロン病で、難病指定されている。ＳＭＡでは、症状のあらわれる年齢やその程度によって、４つの型に分けられている。中でも生後６か月ごろまでに発症するI型は、新生児期ということもあり、診断が遅れやすくなるとともに、症状が重篤化に進展しやすく、I型ＳＭＡ患者の９０％以上が、２歳になる前に死亡するか、終身の人工呼吸器装着が必要となる。また、I型の有病率は、出生数２万人に１人程度と多く、治療開始が早いほど治療効果が期待されることがわかっており、原発性免疫不全に続き、新生児スクリーニング検査が要望されている。I型ＳＭＡ患者の９５％が、運動神経の働きを維持する役目のｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １（ＳＭＮ１）遺伝子のホモ欠失に起因していることがわかっていることから、スクリーニング対象の遺伝子はＳＭＮ１遺伝子となる。ところが、この遺伝子の代償的に働くＳＭＮ２遺伝子は、エクソン７の６番目の塩基がＳＭＮ１遺伝子のＣからＴに変更になっていることで、スプライシングの際にエクソン７のスキッピングが起こる要因配列となることから、この一塩基多型を特異的なターゲットとする方が好ましい。そこで、一塩基多型を特異的に測定する方法としては、しばしばアレル特異的なプライマーを設計することで、特異性を確保する試みが行われるが、対象とする一塩基多型周辺の塩基配列によっては、時として完全な特異性の確保は困難となることも少なくない。また、新生児スクリーニング用途でのＳＭＮ１遺伝子測定系開発においては、測定対象となる検体は、乾燥ろ紙血から切り出される紙片となることから、紙片からの血液の溶出性、妨害物質の溶出性などに対して様々な工夫が必要とされる。【０００３】
非特許文献１では、エクソン７ではなく、イントロン７に２箇所あるＳＭＮ２遺伝子の一塩基多型の内、１１０番目に対する蛍光標識ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）プローブを設計し、ＳＭＮ２遺伝子の増幅を特異的に阻害することで、ＳＭＮ１遺伝子の特異性を確保している。【０００４】
非特許文献２では、エクソン７の６番目の塩基を挟むように設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、増幅産物をＭｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｓｓａｙ方法を利用した測定方法が報告されている。この方法は、ＳＭＮ１遺伝子のみならず、ＳＭＮ２遺伝子の増幅産物も生じることから、Ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅが重なることで見にくくなり、スクリーニング検査としては適さない。【０００５】
非特許文献３では、エクソン７の６番目の塩基を挟むように設計されたプライマーを用いて第一のＰＣＲ反応をさせ、その反応液を一部とって、さらにＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子にそれぞれ相補的な塩基をプライマーの真ん中に配置した短いプライマーを用いて、第二のＰＣＲ反応を行い、その増幅産物を電気泳動にて確認する方法が報告されている。この方法は、第一反応でのプライマーの特異性が不十分である場合に用いられる方法、いわゆるＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ原理を用いる方法である。この方法の大きな欠点は、第一のＰＣＲ反応後に蓋を開けることによる、増幅産物の飛散による環境へのコンタミリスクの増大を招くことにある。さらに、増幅産物の検出が、電気泳動による増幅産物のバンドの確認であることから、測定効率の面からも、スクリーニング検査としては不向きである。【０００６】
非特許文献４では、エクソン７の６番目を挟むように設計されたプライマー及びエクソン７の６番目に相補な蛍光色素修飾プローブを用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、ＳＭＮ１遺伝子を定量する方法が報告されている。この方法では、ＳＭＮ２遺伝子由来の増幅産物も同時に生成される為、ＳＭＮ２遺伝子のＣＮＶ（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が高い場合、プローブの特異性が確保出来なくなる懸念がある。【０００７】
非特許文献５及び６では、本発明と類似のプライマーが設計され、使用されているが、何れも精製したＤＮＡを検体として用いているので、やはり測定効率の面からも、スクリーニング検査としては不向きである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Clinical Chemistry、61:2、412-419、2015
【非特許文献２】Clinical Chemistry、58:6、1033-1039、2012
【非特許文献３】Kobe J.Med.Sci.、63:2、E37-40、2017
【非特許文献４】Genet Med、8:7、428-437、2006
【非特許文献５】Neurogenetics 8、271-278、2007
【非特許文献６】Am.J.Hum.Genet. 70、358-368、2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＳＭＡの原因遺伝子であるＳＭＮ１遺伝子のホモ欠失を、乾燥ろ紙血を用いて検出及び定量する為のプライマー及びこれを用いたＳＭＮ１遺伝子の特異的な検出・定量に関する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＳＭＡに関しては、これまで不治の病とされてきたが、近年治療薬の開発が進み、臨床現場での治療が開始されており、ＱＯＬの向上が期待されている。特にI型に関しては、症状が重篤化しやすく、可能な限り早い段階での治療開始が望まれている。このような要望を踏まえ、新生児スクリーニングに応用可能なＳＭＮ１遺伝子に特異性が高く、かつ汎用で迅速な検出・定量系が望まれている。
本発明では、乾燥ろ紙血を用いて、直接リアルタイムＰＣＲによりＳＭＮ１遺伝子を検出する方法において、ＳＭＮ１遺伝子に特異性が高く、かつＳＭＮ２遺伝子に対する反応が、ＳＭＮ１遺伝子に対する反応より極めて低くなるようなプライマーを設計し、これを用いることによりＳＭＮ１遺伝子の欠失の有無を検定可能なＳＭＮ１遺伝子検出及び定量方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、前記検出方法。
（Ａ）ＰＣＲ反応用チューブに前記乾燥ろ紙血を添加する工程
（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブにＰＣＲ試薬を添加する工程であって、ＰＣＲ試薬は少なくともＳＭＮ２遺伝子への反応がＳＭＮ１遺伝子の１％未満となるように設計されたプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びインターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む工程
（Ｃ）ＰＣＲ試薬と前記乾燥ろ紙血を添加したチューブ内でＰＣＲ反応を行う工程
（Ｄ）ＰＣＲ反応により増幅されたＳＭＮ１遺伝子中の標的核酸を経時的に光学的に検出する工程
＜２＞
ＳＭＮ２遺伝子への反応が、ＳＭＮ１遺伝子の１％未満となるように設計されたプライマーが以下の（１）のフォワードプライマー及び（２）のリバースプライマーからなる群から選ばれる１以上のプライマーである＜１＞に記載の検出方法。
（１）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列からなるフォワードプライマー
（２）配列番号１６〜２１のいずれかの塩基配列からなるリバースプライマー
＜３＞
乾燥ろ紙血が、直径１．２ｍｍ〜２．０ｍｍの円形のパンチ片又は全血を全反応溶液量に対して０．９５ｖ/ｖ％〜６．６ｖ/ｖ％を含むパンチ片である、＜１＞又は＜２＞に記載の検出方法。
＜４＞
ＳＭＮ１遺伝子を特異的に検出するためのプライマーであって、以下の（１）のフォワードプライマー及び（２）のリバースプライマーからなる群から選ばれる１以上のプライマー。
（１）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列からなるフォワードプライマー
（２）配列番号１６〜２１のいずれかの塩基配列からなるリバースプライマー
＜５＞
乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法における、ＳＭＮ２遺伝子への反応性を弱める方法であって、以下の（１）のフォワードプライマー及び
（２）のリバースプライマーからなる群から選ばれる１以上のプライマーを用いる前記方法。
（１）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列からなるフォワードプライマー
（２）配列番号１６〜２１のいずれかの塩基配列からなるリバースプライマー
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、乾燥ろ紙血を用いたリアルタイムＰＣＲにおいて、ＳＭＮ１遺伝子の特定領域を増幅し、ＳＭＮ２遺伝子を増幅しにくい反応性の低いプライマーを提供することが可能となった。また、本プライマーを用いることで、乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより特異的に検出又は定量する方法を提供することが可能となった。
したがって、症状が重篤化しやすく早い段階での治療開始が望まれている新生児スクリーニングに応用可能なＳＭＮ１遺伝子の迅速な検出・定量系を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】検量線用のＳＭＮ１標準品を含有するＰＣＲ試薬の増幅反応曲線を示す。
【図２】ＳＭＮ２クロス試験用ＰＣＲ試薬の増幅反応曲線のうち２５〜４０サイクルの部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ＳＭＮ１遺伝子特異的プライマー）
本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的プライマーは、ＳＭＮ１遺伝子を特異的に増幅し、ＳＭＮ２遺伝子を増幅しにくいように設計されたプライマーである。すなわち、ＳＭＮ２遺伝子への反応性が、ＳＭＮ１遺伝子への反応性の１％未満となるように設計されたプライマーである。前記反応性は、次のように判定される。ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子の１反応当たりのコピー数が同じ場合のＣｑ値が同じであることを反応性１００％としたとき、ＳＭＮ１遺伝子に比較してＳＭＮ２遺伝子の１反応当たりのコピー数が１０倍多い場合のＣｑ値が同じ時の反応性は１０％となり、さらに１００倍多い場合のＣｑ値が同じ時の反応性は１％となる。この時、ＳＭＮ１遺伝子のＣｑ値の方が小さければ、反応性は１％未満と判定できる。なお、後述する実施例では、各プライマーと各増幅伸長温度との組み合わせ条件の中で、ＳＭＮ１遺伝子１００ｃｏｐｙ／反応のＣｑ値から、ＳＭＮ２遺伝子１０、０００ｃｏｐｙ／反応のＣｑ値を差し引いた場合のΔＣｑ値が−０．１未満の場合に、１％未満であると判定した。
さらに、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った場合、乾燥ろ紙血を検体として用いた場合にＳＭＮ２遺伝子への反応性がよりいっそう弱まることも見出した。
【００１４】
本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマーは、具体的には、配９のいずれかの塩基配列からなるプライマーを挙げることができる。これらのフォワードプライマーは、その３’末端が、ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７の６番目のＣを含むように設計されたものである。そして、当該６番目のＣより５’側に連続して２２〜３０塩基の鎖長を有する。連続する塩基は、ＳＭＮ１遺伝子の対応する塩基配列と完全に一致することが好ましいが、標的核酸の増幅に支障がない範囲で１又は数個の塩基がミスマッチであっても本発明のプライマーの範囲に含まれる。
【００１５】
本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーは、配列番号１６〜２１のいずれかの塩基配列からなるプライマーを挙げることができる。これらのリバースプライマーは、その３’末端が、ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７の６番目に相補的な配列をリバースプライマーの３’末端に含むように設計されたものであり、２０〜２５塩基の鎖長を有する。連続する塩基は、ＳＭＮ１遺伝子の対応する相補鎖と完全に一致することが好ましいが、標的核酸の増幅に支障がない範囲で１又は数個の塩基がミスマッチであっても本発明のプライマーの範囲に含まれる。
【００１６】
本発明のプライマーは、上記ＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマーとＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーのいずれか１つを用いればよく、セットに使用されるリバースプライマーおよびフォワードプライマーは、リアルタイムＰＣＲを行う場合は、蛍光標識プローブを両プライマーに挟まれた部分に設計する必要を考慮し、２０ｂｐ以上離れていることが望ましい。
上記本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマーとセットで用いられるリバースプライマーは、本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーでもよく、また、上記２０ｂｐ以上離れていることを条件にエキソン７やイントロン７の領域の一部と同一の塩基配列に相補的な配列を含むプライマーであってもよい。
【００１７】
また、上記本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーとセットで用いられるフォワードプライマーは、前述の本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマーでもよく、また、イントロン６の領域の一部と同一の塩基配列を含むプライマーであってもよい。
【００１８】
上記本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマー又はＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うと、ＳＭＮ１遺伝子のエキソン７の６番目のＣの配列を含む核酸は増幅される。一方、ＳＭＮ２遺伝子の対応する核酸であるエキソン７の６番目はＴであるため、本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマーもＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーもその３’末端が対応しておらず、ポリメラーゼによる増幅反応が起こりにくい。また、乾燥ろ紙血を検体として用いた場合に、さらにＳＭＮ２遺伝子の増幅反応が起きづらくなることで、ＳＭＮ１遺伝子の特異的な検出が可能となる。
このように、本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマー又はＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーの少なくとも１種を用いてＰＣＲを行う際に、乾燥ろ紙血を検体として用いることで効果をより奏することができる。すなわち、ＳＭＮ１遺伝子のエキソン７の該当領域を特異的に増幅することができ、ＳＭＮ２遺伝子の該当領域をほとんど増幅しないため、ＳＭＮ１遺伝子を特異的に検出又は定量することができる。増幅された核酸は、電気泳動やリアルタイムＰＣＲなどにより定性、定量することが可能である。
本発明のＳＭＮ１遺伝子特異的なフォワードプライマー又はＳＭＮ１遺伝子特異的なリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ＳＭＮ２遺伝子に対する反応性は、ＳＭＮ１遺伝子に対する反応性の１％未満であることが後述する実施例により実証されている。
【００１９】
（ＰＣＲ／リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲ法は、一般的に、ＰＣＲにおいて増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングする方法を意味する。本発明において、リアルタイムＰＣＲにより検出するとは、ＰＣＲ反応の後に増幅されたＳＭＮ１遺伝子の標的核酸（以下、単に増幅産物ともいう）を光学的手段により検出することを意味する。なお、増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応終了時または終了後に行ってもよいし、ＰＣＲ反応工程と並行して行ってもよい。並行して行う場合、増幅産物の検出は、例えば、経時的に行うことができる。経時的な検出（モニタリング）は、例えば、連続的であっても非連続的（断続的）であってもよい。
【００２０】
ＰＣＲ反応における各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。ＰＣＲ反応により生成した増幅産物は、例えば、前記増幅産物から発生する蛍光強度を検出することにより検出できる。蛍光検出としては、特に制限されないが、従来公知のインターカレーター法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法、ハイブリダイゼーション法、サイクリングプローブ法などがある。
【００２１】
蛍光強度の検出は、例えば、蛍光光度計で行うことができる。また、一般に、ＰＣＲ反応ユニット（例えば、サーマルサイクラー）と光学系ユニット（例えば、蛍光光度計）との両方を備える装置が使用される。具体例としては、市販のＳＭａｒｔＣｙｃｌｅｒ（商品名、タカラバイオ社製）、ライトサイクラー（商品名、ロシュ・ダイアグノスティック社製）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００（商品名、アプライド・バイオシステム社製）等があげられる。
【００２２】
（標的核酸の定量方法）
本発明のＳＭＮ１遺伝子の定量方法は、試料中のＳＭＮ１遺伝子の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させ、前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する方法である。前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、試料中に含まれる標的核酸を定量する方法ことができる。また、後述する実施例のように、標準品から算出されたＣｑ値の検量線から試料中の全血１μＬのコピー数を換算して定量することもできる。
【００２３】
（ＰＣＲ試薬）
本発明に用いられるＰＣＲ試薬は、少なくとも、プライマーのセット、ポリメラーゼ、dNTP（デオキシヌクレオシド三リン酸）各種、インターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む。また、典型的には当該試薬にはバッファーも含まれている。バッファーとしては、生物の体液中に存在する正電荷物質（ある種のタンパク質など）や負電荷物質（ある種の糖、色素など）などのＤＮＡ増幅反応を阻害する物質の作用を抑制する働きを持つバッファーであれば特に限定されない。市販されているものとして、例えば、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ ｐｌｕｓ（ともに（株）島津製作所製）等が挙げられる。本発明に用いられるＰＣＲ試薬の反応用チューブへの添加量は、２０〜５０μＬである。
【００２４】
（試料／乾燥ろ紙血）
本発明に用いられる試料は、乾燥ろ紙血とよばれる、ろ紙（フィルターペーパー）に血液を含ませた後に乾燥させたろ紙中の血液が好適である。乾燥ろ紙血は、穴あけパンチ工具によりパンチ穴形状の紙片（パンチ片）として取り出される。乾燥ろ紙血としては、例えば、新生児マス・スクリーニングなど新生児のかかとから採血したろ紙血、同時にオプショナルスクリーニングとして採血されたろ紙血などが用いられるがこれらに限定されない。乾燥ろ紙血から切り出されるパンチ片の大きさは、含まれる血液の量を適切な範囲とする必要があることから、一定サイズのパンチ片であることが望ましい。一定サイズのパンチ片としては直径は１．２〜２．０ｍｍの円形のパンチ片が望ましく、１．５ｍｍ〜１．８ｍｍの円形のパンチ片がよりいっそう望ましい。また、パンチ片に含まれる全血量としては、ＰＣＲ全反応溶液量に対して０．９５ｖ／ｖ％〜６．６ｖ／ｖ％が望ましく、１．４ｖ／ｖ％〜５．２ｖ／ｖ％がよりいっそう望ましい。なお、前記全血量は、直径１．２〜２．０ｍｍの円形のパンチ片、直径１．５ｍｍ〜１．８ｍｍのパンチ片を２０〜５０μＬのＰＣＲ反応溶液に添加して血液を溶解した場合の割合を、実測値（全血３０ｕＬをパンチ片を切り取る前の濾紙に添加して乾燥させた時にできた円形血液部分の直径は９．５ｍｍであった）をもとに算出した値として示している。
【００２５】
（ＰＣＲ反応用チューブ）
本発明に用いられるチューブは、ＰＣＲ反応用のチューブであり、ろ紙血のパンチ片がスムーズに挿入でき、キャップにより密閉できる構造であればよい。また、チューブ上部の開口部が円形（例えば、内径２．５ｍｍ〜１０ｍｍ程度）で底部が上部の開口部よりも狭くなっている形状が良く、逆円錐形などが好ましい。
上記チューブの容量は、ＰＣＲ反応試薬を添加し、ＰＣＲ反応による温度変化によっても反応溶液を十分に収容できる容量であればよく、０．１ｍＬ〜０．３ｍＬ容量が好ましく、さらに好ましくは０．１５ｍＬ〜０．２５ｍＬ容量、最も好ましくは０．２ｍＬ容量である。
本発明に用いるＰＣＲ反応用チューブは、チューブが９６個連続しているＰＣＲ反応用９６穴チューブ又は８個連続している８連チューブが好ましく、市販品としては、９６ウェルＰＣＲプレート、ＰＣＲ８連チューブなどの名称で販売されているものを用いることができる。市販品としては、LightCycler (登録商標) 480 Multiwell Plate 96（ロッシュ社）、96-Well PCR Plate, Flat Top, Low Profile, Natural, Polypropylene, UltraFlux（Scientific Specialties, Inc.社）、エッペンドルフPCR プレート 96、スカートレス, 150 μL,カラーレス（エッペンドルフ社）、PCRプレート96well シンプレート0.1ml  ナチュラル（BM機器社）、LightCycler 8-Tube Strips（ロッシュ社）などが挙げられる。
これらの反応用チューブの材質は、反応溶液のコンタミが少なく、また、ＰＣＲ反応の温度変化による内部圧力変動によっても形状が変化しない剛性を有することが望ましく、例えばポリプロピレン製が挙げられる。
【００２６】
（キット）
本発明のキットは、ＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより特異的に検出するためのキットであって、以下の（１）のフォワードプライマー及び（２）のリバースプライマーからなる群から選ばれる１以上のプライマーを含むものであればよい。
（１）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列からなるフォワードプライマー
（２）配列番号１６〜２１のいずれかの塩基配列からなるリバースプライマー
上記以外にそれぞれのプライマーとセットとして使用されるリバースプライマー又はフォワードプライマーを含むことができる。また、プローブ、その他のＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲに使用される試薬や容器を含むこともできる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本実施例は、設計したプライマーのＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子配列に対する反応性を比較した例である。【００２８】
〔実施例１〕ＳＭＮ１遺伝子特異的フォワードプライマーを用いたＳＭＮ１遺伝子定量系
（ａ）試験材料
（ａ−１）ＳＭＮ１遺伝子増幅用フォワードプライマー
ＳＭＮ１遺伝子増幅用のフォワードプライマー（表１；配列番号１〜９）及び共通リバースプライマー（表１；配列番号１０）をシグマ-アルドリッチ社に合成依頼したものを用いた。【００２９】
【表１】
0006850402.tif 000002
【００３０】
（ａ−２）プラスミド
ＰＣＲ反応の鋳型として、下記に示すＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子のエクソン７を含む部分配列をベクターに組み込んだプラスミドを、ユーロフィン社に合成依頼したものを用いた。下記配列番号１１の下線部は、ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７の配列（５４ｂｐ）を示し、その上流がイントロン６の部分配列であり、下流はイントロン7の部分配列を示す。配列番号１２の下線部は、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７の配列（５４ｂｐ）を示し、その上流がイントロン６の部分配列であり、下流はイントロン7の部分配列を示す。
ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７の６番目はＣであり、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７の６番目はＴである。【００３１】
エクソン７を含むＳＭＮ１遺伝子部分配列（配列番号１１）
CAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTC【００３２】
エクソン７を含むＳＭＮ２遺伝子部分配列（配列番号１２）
CAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATATCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTTAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAGAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTC【００３３】
（ｂ）ＰＣＲ試薬
ＰＣＲ試薬の組成を以下に示す。
１×（終濃度）ＰＣＲバッファー（Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓ；島津製作所社）    
０．２μＭ（終濃度）ＳＭＮ１遺伝子用フォワードプライマー（配列番号１〜９）  
０．２μＭ（終濃度）共通リバースプライマー（配列番号１０）    
０．０２５Ｕ/μＬ（終濃度）ＢＩＯＴＡＱ  ＨＳＤＮＡポリメラーゼ
０．５×（終濃度）  ＥｖａＧｒｅｅｎ【００３４】
（ｃ）プラスミド希釈系列
ＳＭＮ１遺伝子プラスミド  （終濃度）１００，０００ｃｏｐｙ／反応、１０，０００ｃｏｐｙ／反応、１，０００ｃｏｐｙ／反応、１００ｃｏｐｙ／反応
ＳＭＮ２遺伝子プラスミド  （終濃度）１００，０００ｃｏｐｙ／反応、１０，０００ｃｏｐｙ／反応【００３５】
（ｄ）ＰＣＲ反応の条件
(i）９５℃：１５分
(ii）９５℃：１５秒、６１〜６５℃：８０秒（４５サイクル）
(iii）３７℃：５分【００３６】
（ｅ）インターカレーターによるリアルタイムＰＣＲ測定
（ｅ−１）測定方法
以下の手順で測定した。
（i）ＰＣＲ試薬とプラスミドを、上記終濃度となるように混ぜ、その４０μＬを分注したＰＣＲチューブを用意した。
（ii）サーマルサイクラー装置（ＣＦＸ９６；バイオラッド社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ測定を行い、各プラスミド濃度のＣｑ値を算出した。
（ｅ−２）測定結果
結果を表２に示す。各プライマーと各増幅伸長温度との組み合わせ条件の中で、ＳＭＮ２遺伝子への反応が、ＳＭＮ１遺伝子の1%未満である組み合わせ、即ちＳＭＮ１遺伝子  １００ｃｏｐｙ／反応のＣｑ値から、ＳＭＮ２遺伝子  １０、０００ｃｏｐｙ／反応のＣｑ値を差し引いた場合のΔＣｑ値が−０．１未満を満たす組み合わせは、１１通りとなり、フォワードプライマーの配列番号１〜９では適用可能であった。【００３７】
【表２】
0006850402.tif 000003
【００３８】
〔実施例２〕ＳＭＮ１遺伝子特異的リバースプライマーを用いたＳＭＮ１遺伝子定量系
（ｆ）試験材料
（ｆ−１）ＳＭＮ１遺伝子増幅用リバースプライマー
ＳＭＮ１遺伝子増幅用のリバースプライマー（表３；配列番号１４〜２２）及び共通フォワードプライマー（表３；配列番号１３）をシグマ-アルドリッチ社に合成依頼したものを用いた。【００３９】
【表３】
0006850402.tif 000004
【００４０】
（ｆ−２）プラスミド
上記、（ａ−２）と同じプラスミドを用いた。【００４１】
（ｇ）ＰＣＲ試薬
ＰＣＲ試薬の組成を以下に示す。
１×（終濃度）ＰＣＲバッファー（ＡＭｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓ；島津製作所社）    
０．２μＭ（終濃度）共有フォワードプライマー（配列番号１３）    
０．２μＭ（終濃度）ＳＭＮ１遺伝子用リバースプライマー（配列番号１４〜２２）  
０．０２５Ｕ/μＬ（終濃度）ＢＩＯＴＡＱ  ＨＳＤＮＡポリメラーゼ
０．５×（終濃度）  ＥｖａＧｒｅｅｎ【００４２】
（ｈ）プラスミド希釈系列
上記、（ｃ）と同じプラスミド希釈系列を用いた。【００４３】
（ｉ）ＰＣＲ反応の条件
上記、（ｄ）と同じ条件で実施した。【００４４】
（ｊ）インターカレーターによるリアルタイムＰＣＲ測定
（ｊ−１）測定方法
以下の手順で測定した。
（i）ＰＣＲ試薬とプラスミドを、上記終濃度となるように混ぜ、その４０μＬを分注したＰＣＲチューブを用意した。
（ii）サーマルサイクラー装置（ＣＦＸ９６；バイオラッド社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ測定を行い、各プラスミド濃度のＣｑ値を算出した。
（ｊ−２）測定結果
結果を表４に示す。各プライマーと各増幅伸長温度との組み合わせ条件の中で、ＳＭＮ２遺伝子への反応が、ＳＭＮ１遺伝子の１％未満である組み合わせ、即ちＳＭＮ１遺伝子  １００ｃｏｐｙ／反応のＣｑ値から、ＳＭＮ２遺伝子  １０、０００ｃｏｐｙ／反応のＣｑ値を差し引いた場合のΔＣｑ値が−０．１未満を満たす組み合わせは、８通りとなり、リバースプライマーの配列番号１６〜２１では適用可能であった。【００４５】
【表４】
0006850402.tif 000005
【００４６】
〔実施例３〕乾燥ろ紙血パンチ片が共存したＳＭＮ１遺伝子定量系のＳＭＮ２クロス増幅反応の検証
（ａ）試験材料
（ａ−１）ＳＭＮ１遺伝子増幅用プライマー
ＳＭＮ１増幅用のプライマーとして、下記のプライマーをシグマ-アルドリッチ社に合成依頼したものを用いた。
ＳＭＮ１用特異的フォワードプライマー；  上記、表１の配列番号６
ＳＭＮ１用共通リバースプライマー；  上記、表１の配列番号１０【００４７】
（ａ−２）ＳＭＮ１検出プローブ
ＳＭＮ１のＰＣＲ増幅を確認するためのプローブとして、蛍光標識を施した下記の検出プローブを、プライムテック社に合成依頼して作成したものを用いた。
ＳＭＮ１用検出プローブ
５‘−(Ｑｕａｓａｒ６７０)−GGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGA−(ＢＨＱ３)−３’（塩基配列部分は配列番号２３）【００４８】
（ｂ）ＰＣＲ試薬
ＰＣＲ試薬の組成を以下に示す。
ＰＣＲバッファー（Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓ；島津製作所社）
０．２μＭ （終濃度）ＳＭＮ１用特異的フォワードプライマー  
０．２μＭ （終濃度）ＳＭＮ１用共通リバースプライマー    
０．１μＭ （終濃度）ＳＭＮ１用検出プローブ 
０．０２５Ｕ/μＬ  ＢＩＯＴＡＱ  ＨＳＤＮＡポリメラーゼ【００４９】
（ｃ）検量線用標準品含有ＰＣＲ試薬
上記（ｂ）のＰＣＲ試薬にＳＭＮ１部分配列（配列番号１１）が組み込まれたプラスミドを添加して、以下の標準品（希釈系列；ＳＴＤ１〜４）含有ＰＣＲ試薬を調製した。かっこ内は、それぞれの遺伝子のＰＣＲ１反応あたりのコピー数を示す。本試薬は、乾燥ろ紙血に含ませることなく、溶液状態で用いられた。
ＳＴＤ１（ＳＭＮ１ １００，０００ｃｏｐｙ／反応）、ＳＴＤ２（ＳＭＮ１ １０，０００ｃｏｐｙ／反応）、ＳＴＤ３（ＳＭＮ１１０００ｃｏｐｙ／反応）、ＳＴＤ４（ＳＭＮ１１００ｃｏｐｙ／反応）【００５０】
（ｄ）ＳＭＮ２クロス試験用ＰＣＲ試薬
上記（ｂ）のＰＣＲ試薬にＳＭＮ２の部分配列（配列番号１２）が組み込まれたプラスミドを、５０，０００ｃｏｐｙ／反応となるように添加して、ＳＭＮ２クロス試験用ＰＣＲ試薬を調製した。【００５１】
（ｅ）ＤＮＡ不含乾燥ろ紙血
白血球を除去したヒト赤血球画分とヒト血漿（ＥＤＴＡ）を、６：４の割合で混合した血液を、採血用ろ紙（アドバンテック社）に４０μＬ染み込ませ、そのまま乾燥させたものを、ＤＮＡ不含乾燥ろ紙血とした。すなわち、本乾燥ろ紙血にはＳＭＮ１とＳＭＮ２は含まれていない。【００５２】
（ｆ）ＰＣＲ反応の条件
(i）９５℃：１５分
(ii）９５℃：１５秒、６３℃：６０秒（４０サイクル）
(iii）３７℃：５分【００５３】
（ｇ）リアルタイムＰＣＲ測定
（ｇ−１）測定方法
以下の手順で測定した。
（i）ＤＮＡ不含乾燥ろ紙血から、パンチャーを用いて直径１．５ｍｍの円形のパンチ片を採取した。対象として、採血用ろ紙（アドバンテック社）から、同じ大きさのパンチ片（空のパンチ片）を採取した。
（ii）ＰＣＲ反応用のチューブ(ロッシュ社製：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ８−ＴｕｂｅＳｔｒｉｐｓ、ポリプロピレン製）に上記それぞれのパンチ片を投入した。
（iii）前記ＰＣＲ反応用のチューブに４０μＬのＳＭＮ２クロス試験用ＰＣＲ試薬をそれぞれ加えた後、キャップ（前記チューブとセットになっているもの）をして密閉した。
（iv）検量線用標準品含有ＰＣＲ試薬も、それぞれ４０μＬをチューブに分注したものを用意した（なおチューブにはパンチ片は含まれていない）。
（v）サーマルサイクラー装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６；ロッシュ社）を用いて、ＳＭＮ１のリアルタイムＰＣＲ測定並びにＳＭＮ２へのクロス反応の検証を行った。【００５４】
（ｆ−２）測定結果
(i)検量線用標準品含有ＰＣＲ試薬の増幅反応曲線を図１に示す。
ＳＭＮ１  １００ｃｏｐｙ／反応までは、良好に増幅することが確認された。
(ii) ＳＭＮ２クロス試験用ＰＣＲ試薬の増幅反応曲線の２５〜４０サイクルの部分を図２に示す。
ＤＮＡ不含乾燥ろ紙血のパンチ片を共存させると、興味深いことに、空のパンチ片（血液を含まないパンチ片）を共存させた場合（図中実線）と比較して、増幅の立ち上がりがＣｑ値として１程度遅れていることが確認された（図中点線）。この条件では、ＳＭＮ２に対するクロス反応が、コピー数に換算すると約５０％低下することになる。即ち、本発明においてＳＭＮ２遺伝子への反応性が、ＳＭＮ１遺伝子への反応性の１％未満となるように設計されたプライマーを、乾燥ろ紙血を検体として用いた場合に、ＳＭＮ２遺伝子への反応性が弱まることがわかった。すなわち、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った場合に、乾燥ろ紙血のパンチ片が当該反応系に存在することで、ＳＭＮ２遺伝子へのクロス反応が、より低下することを見出した。
したがって、本発明によれば新生児のスクリーニング検査において、ＳＭＮ１ホモ欠損であるＳＭＡ患者の見逃しのリスク（偽陰性）を低下させることにつながる。
なお、ＳＭＮ１についても上記同様に試験を行ったところ、乾燥ろ紙血による増幅阻害は認められなかった（結果図示せず）。したがって、上記の乾燥ろ紙血の共存による増幅の立ち上がりが遅れる現象は、ＳＭＮ２遺伝子の増幅反応における特有の現象であることがわかった。したがって、本願発明は、乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法において、特定プライマーを用いることによりＳＭＮ２遺伝子への反応性を弱める方法とも言える。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、本発明の特定のプライマーを用いることで乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより特異的に検出又は定量する方法を提供することが可能となった。したがって、症状が重篤化しやすく早い段階での治療開始が望まれている新生児スクリーニングに応用可能なＳＭＮ１遺伝子の迅速な検出・定量系を提供することができる。
【要約】
本発明は、ＳＭＡの原因遺伝子であるＳＭＮ１遺伝子のホモ欠失を、乾燥ろ紙血を用いて検出及び定量する為のプライマー及びこれを用いたＳＭＮ１遺伝子の特異的な検出・定量に関する方法を提供することを目的とする。
本発明は、乾燥ろ紙血中のＳＭＮ１遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、前記検出方法。
（Ａ）ＰＣＲ反応用チューブに前記乾燥ろ紙血を添加する工程
（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブにＰＣＲ試薬を添加する工程であって、ＰＣＲ試薬は少なくともＳＭＮ２遺伝子への反応がＳＭＮ１遺伝子の１％未満となるように設計されたプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びインターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む前記工程
（Ｃ）ＰＣＲ試薬と前記乾燥ろ紙血を添加したチューブ内でＰＣＲ反応を行う工程
（Ｄ）ＰＣＲ反応により増幅されたＳＭＮ１遺伝子中の標的核酸を経時的に光学的に検出する工程【図１】
0006850402.tif 000006
【図２】
0006850402.tif 000007
【配列表】
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