【手続補正書】
【提出日】平成29年12月27日(2017.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一ポリヌクレオチドであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲッティング領域と；
ＤＮＡを含む前記ターゲッティング領域に隣接した活性化領域と；
を含み、
ここで、前記活性化領域は、ステムループ構造を含み、そして、Ｃｐｆ１と結合することが可能である、
前記単一ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系であって、
（ｉ）（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲッティング領域；および、（ｂ）ＤＮＡを含む前記ターゲッティング領域に隣接した活性化領域；を含む単一ポリヌクレオチドであって；  ここで前記活性化領域はステムループ構造を含み、そして、Ｃｐｆ１と結合することが可能である；前記単一ポリヌクレオチドと；
（ｉｉ）Ｃｐｆ１と
を実質的に含む、前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項５】
前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項４に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項６】
前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項４に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項７】
前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項４に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項８】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項９】
単一ポリヌクレオチドであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲッティング領域と；
ＤＮＡを含む前記ターゲッティング領域に隣接した活性化領域と；
を含み、
ここで、前記活性化領域は、ステムおよびバルジを含みを含み、そして、前記活性化領域は、Ｃａｓ９と結合することが可能である、
前記単一ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、そして活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系であって、
（ｉ）（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むターゲッティング領域；および、（ｂ）ＤＮＡを含む前記ターゲッティング領域に隣接した活性化領域；を含む単一ポリヌクレオチドであって；  ここで前記活性化領域はステムおよびバルジを含み、そして、Ｃａｓ９と結合することが可能である；前記単一ポリヌクレオチドと；
（ｉｉ）Ｃａｓ９と
を実質的に含む、前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１４】
前記活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンを含む、請求項１３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１５】
前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１６】
前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１３に記載のクラス２
ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１７】
前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、そして活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリ
エステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項１３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１８】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１３に記載のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系。
【請求項１９】
標的核酸分子を修飾する方法であって：
標的配列を有する前記標的核酸分子を、
（ｉ）（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、前記標的配列にハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域；および
（ｂ）前記ターゲティング領域に隣接し、ＤＮＡを含む活性化領域であって、ここで前記活性化領域はステムループ構造を含む、前記活性化領域；
を含む単一ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）Ｃｐｆ１であって、ここでＣｐｆ１は単一ポリヌクレオチドの活性化領域と結合し、前記標的核酸分子と前記単一ポリヌクレオチドおよび前記Ｃｐｆ１との、（Ａ）インビトロ、（Ｂ）非ヒト細胞、または（Ｃ）分離された細胞での接触が起き、そして前記標的核酸分子が切断される、前記Ｃｐｆ１；
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、インビトロで起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、非ヒト細胞内で起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、分離された細胞内で起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する方法であって：
標的配列を有する前記標的核酸分子を、
（ｉ）（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、前記標的配列にハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域であって、ここで前記標的配列は、前記少なくとも１つの遺伝子のオープンリーディングフレーム配列内または、前記少なくとも１つの遺伝子のプロモーター配列内にある、前記ターゲティング領域；および
（ｂ）前記ターゲティング領域に隣接し、ＤＮＡを含む活性化領域であって、ここで前記活性化領域はステムループ構造を含む、前記活性化領域；
を含む単一ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）Ｃｐｆ１であって、ここで、Ｃｐｆ１はヌクレアーゼ活性を有せず、Ｃｐｆ１は単一ポリヌクレオチドの活性化領域と結合し、単一ポリヌクレオチドのターゲティング領域は標的配列にハイブリダイズし、前記標的核酸分子と前記単一ポリヌクレオチドおよび前記Ｃｐｆ1との、（Ａ）インビトロ、（Ｂ）非ヒト細胞、または（Ｃ）分離された細胞での接触が起き、そして前記標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写が調節される、前記Ｃｐｆ1；
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３２】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、インビトロで起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、非ヒト細胞内で起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
標的核酸分子と、単一ポリヌクレオチドおよびＣｐｆ１との接触が、分離された細胞内で起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
非ヒト生物、分離された細胞、またはインビトロでの標的核酸分子を修飾する方法であって、前記方法は：
細胞に、
（ｉ）（ａ）前記標的核酸内の標的配列にハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域、および
（ｂ）前記ターゲティング領域に隣接し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む活性化領域であって、ここで前記活性化領域はステムおよびバルジを含む、前記活性化領域；を含む単一ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）Ｃａｓ９であって、ここでＣａｓ９は単一ポリヌクレオチドの活性化領域と結
合し、前記単一ポリヌクレオチドの活性化領域は、前記標的配列とハイブリダイズし、そして前記標的核酸分子が切断される、前記Ｃａｓ９；
を導入することを含む、前記方法。
【請求項４０】
Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
単一ポリヌクレオチドおよびＣａｓ９は、細胞内に導入する前に複合体を形成する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｃａｓ９は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
単一ポリヌクレオチドおよびＣａｓ９は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
ターゲティング領域は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
ドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入する工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
非ヒト生物、分離された細胞、またはインビトロでの標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法は：
細胞に、
（ｉ）（ａ）前記少なくとも１つの遺伝子のオープンリーディングフレーム内の標的配列、または前記少なくとも１つの遺伝子のプロモーター配列内の標的配列にハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域、および
（ｂ）前記ターゲティング領域に隣接し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む活性化領域であって、ここで前記活性化領域はステムおよびバルジを含む、前記活性化領域；を含む単一ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）Ｃａｓ９であって、ここでＣａｓ９は単一ポリヌクレオチドの活性化領域と結合し、前記単一ポリヌクレオチドの活性化領域は、前記標的配列とハイブリダイズし、そして前記標的核酸分子内の少なくとも１つの遺伝子の転写が調節される、前記Ｃａｓ９；を導入することを含む、前記方法。
【請求項５０】
Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のコーデイング配列を含む発現ベクターによりコードされる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
単一ポリヌクレオチドおよびＣａｓ９は、細胞内に導入する前に複合体を形成する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
Ｃａｓ９は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
単一ポリヌクレオチドおよびＣａｓ９は、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、またはそれらの組み合わせにより細胞内に導入される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
活性化領域は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸アルキル、ホスホン酸５’−アルキレン、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェート、およびボラノホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
ターゲティング領域は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項４９に記載の方法。