【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年4月16日(2018.4.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）活性フラグメントアミノ酸配列とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列とを有し、前記タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列とが可撓性リンカーペプチドによって融合してなり、
前記タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列は配列番号６５乃至配列番号６８のうちから選択される１種であり、
前記リンカーペプチドのアミノ酸配列は配列番号６９乃至配列番号７３のうち選択される１種であり、
前記ＣＤ１３７Ｌタンパク質細胞外領域フラグメントアミノ酸配列は配列番号７７乃至配列番号７９に示すアミノ酸配列のうちから選択される一種である、タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ活性を有する二機能組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号２５乃至配列番号４８のうちの１つのアミノ酸配列を有する、請求項１記載の二機能組換えタンパク質。
【請求項３】
タムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子、リンカーペプチドをコードする遺伝子及びＣＤ１３７Ｌタンパク質細胞外領域フラグメントをコードする遺伝子から構成され、
前記タムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子は配列番号４９乃至配列番号５２のうち選択される一種であり、
前記リンカーペプチドをコードする遺伝子は配列番号５３乃至配列番号６０のうち選択される一種であり、
前記ＣＤ１３７Ｌタンパク質細胞外領域フラグメントをコードする遺伝子は配列番号６１乃至配列番号６４のうちから選択される一種である、請求項１記載の二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号１乃至配列番号２４のうちの１つのヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項３乃至４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列と比べて７０％以上の相同性を有する、タムスタチンとＣＤ１３７Ｌ活性を有する二機能組換えタンパク質の遺伝子。
【請求項６】
（１）請求項３乃至５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を設計して得るステップと、
（２）発現ベクターを構築し、且つ発現ベクターを宿主細胞にトランスファーすることを含む、請求項３乃至５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含有する発現系を構築し、請求項１記載のタムスタチン活性とＣＤ１３７Ｌ活性を有する組換えタンパク質を発現することができる組換え細胞を形成するステップと、
（３）ステップ（２）で形成された組換え細胞を培養するステップと、
（４）単離・精製して請求項１記載のタムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質を得るステップと、
を含む、請求項１記載のタムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の製造方法。
【請求項７】
前記発現系は原核発現系又は真核発現系であり、前記原核発現系は大腸菌発現系又はバチルス発現系から選択され、前記真核発現系は酵母発現系から選択される、請求項６に記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１記載のタムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の、腫瘍微小環境における血管再生の抑制、腫瘍関連の各種疾患の治療、生体免疫力の調節、Ｔ細胞増殖、並びに生物サイトカインの合成及び分泌のための薬物の製造における使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
本発明は、短い可撓性リンカーペプチドでタムスタチン抗血管新生活性フラグメントとＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質とを、Ｔ細胞免疫の強化と抗血管新生の二機能・二重標的を同時に有する分子に合成する。かつ本発明においてタムスタチンが異なる関連活性部位（タムスタチン１の第４５位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン２の第６０位乃至第１３２位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン３の第６０位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン７の第７４位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント）とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質アミノ酸配列（ＣＤ１３７Ｌ１の第４６位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ４の第５０位乃至第２４０位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ５の第８３位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ６の第４６位乃至第８５位のアミノ酸と第１６７位乃至第２５４位のアミノ酸の結合フラグメント、模式図は図２に示す）が選択され、リンカーペプチドで接続し、原核又は真核発現系によって調製され、この方法は調製が簡単であり、及び完全長タムスタチンと完全長ＣＤ１３７Ｌの副作用の問題を回避し、本発明は血管生成抑製剤、腫瘍関連の各種疾患（例えば、黒色腫、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎がん、膀胱がんなど）、網膜症、細胞増殖、生物サイトカイン合成及び分泌、生体免疫力の調製などの薬物の製造、及び経口或いは注射などの関連剤形薬物の調製においてよい適用の見通し及び市場価値を有する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明の技術方案は、具体的には以下の通りである。
タムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質であって、タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列とＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列を有し、前記ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列とタムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列とは可撓性リンカーペプチドで融合されてなり、前記タムスタチン活性フラグメントアミノ酸配列は、配列番号６５乃至配列番号６８に示すアミノ酸配列のうちから選択される１種であり、前記ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントアミノ酸配列は、配列番号７７乃至配列番号Ｎｏ．８０に示すアミノ酸配列のうちから選択される１種である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
前記リンカーペプチドアミノ酸配列は、本分野の通常の技術手段を採用して設計され、配列番号６９乃至配列番号Ｎｏ．７６のうちの１種が好ましい。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
本発明に関わる二機能組換えタンパク質アミノ酸配列は、配列番号２５乃至配列番号４８のうちの１種が好ましく、前記組換えタンパク質の構成模式図は図１に示される。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
本発明は、前記タムスタチンとＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質をコードする遺伝子を更に提供し、ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントをコードする遺伝子、リンカーペプチドをコードする遺伝子、及びタムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子を含む。尚、前記ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質フラグメントをコードする遺伝子は、配列番号６１〜配列番号６４のうちから選択される１種であり、前記タムスタチン活性フラグメントをコードする遺伝子は配列番号４９〜配列番号５２のうちから選択される１種である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
前記リンカーペプチドをコードする遺伝子は、配列番号５３〜配列番号６０のうちの１種が好ましい。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
前記組換えタンパク質の遺伝子は、配列番号１乃至配列番号２４のうちの１種のヌクレオチド配列を有することが好ましい。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
本発明は、前記タムスタチン及びＣＤ１３７Ｌを有する二機能組換えタンパク質の遺伝子の、腫瘍微小環境における血管再生及び腫瘍関連疾患（例えば、、黒色腫、直腸がん、肺がんなど）の抑制、生体免疫力の調節、Ｔ細胞増殖、並びに生物サイトカインの合成及び分泌のための薬物製造における使用を更に提供する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
【図１】本発明のタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ二機能を有する組換えタンパク質の構成模式図である。可撓性リンカーペプチドアミノ酸配列は配列番号６９〜配列番号７６のうちから選択される１種である。
【図２】ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号７７）、ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号７８）、ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号７９）及びＣＤ１３７Ｌ４（配列番号８０）のＣＤ１３７Ｌアミノ酸完全長配列にある領域模式図である。
【図３】アミノ酸配列、例えば、配列番号２５〜配列番号４８に示すような組換えタンパク質タムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌの大腸菌における発現である。レーン１〜２４が配列番号２５〜４８にそれぞれ対応する。
【図４】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質アミノ酸配列（配列番号２９〜配列番号３８）の枯草菌における発現である。レーン１〜８が配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８にそれぞれ対応する。
【図５】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質アミノ酸配列（配列番号２９〜配列番号３６）の酵母菌における発現である。レーン１〜１６がタンパク質アミノ酸配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２にそれぞれ対応する。
【図６】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質サンプルが希釈リフォールディングされた後に行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果図である。尚、第１レーンサンプルアミノ酸配列が配列番号２５である。第２レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号２６である。第３レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号２７である。第４レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号３７である。第５レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号３８である。第６レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４１である。第７と第１０レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４３である。第８と第１１レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４４である。第９と第１２レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４８である。第１３と第１５レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４５である。第１４と第１６レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４６である。第１７と第１８レーンのサンプルアミノ酸配列が配列番号４７である。
【図７】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質サンプルのヒト臍帯静脈内皮細胞増殖への影響である。
【図８】代表的なタムスタチン−リンカーペプチドＣＤ１３７Ｌタンパク質サンプルのマウスＴリンパ球増殖への影響である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
本発明は、合計でタムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する２４種の二機能組換えタンパク質を設計し、そのヌクレオチド配列は配列番号１乃至配列番号２４に示される配列であり、コードするアミノ酸配列は配列番号２５乃至配列番号４８に示される配列である。該組のタンパク質はタムスタチン１の第４５位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン２の第６０位乃至第１３２位のアミノ酸フラグメント、タムスタチン３の第６０位乃至第９８位のアミノ酸フラグメント、又はタムスタチン７の第７４位乃至第９８位のアミノ酸フラグメントと、ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質アミノ酸配列（ＣＤ１３７Ｌ１の第４６位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ５の第８３位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ６の第４６位乃至第８５位のアミノ酸と第１６７位乃至第２５４位のアミノ酸の結合フラグメント）のうちの１種と、を有し、両者が可撓性リンカーペプチドで接続・融合してなり、但し、リンカーペプチドアミノ酸配列は配列番号６９乃至配列番号７６に示されている。本発明は、前記タムスタチン活性フラグメント遺伝子及びリンカーペプチド遺伝子を接続したヌクレオチド配列（例えば、配列番号８１〜配列番号９４に示す）の５’端と３’にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化部位を設計し、上海捷瑞生体工程有限会社で完全合成され、かつ相応消化部位を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続され、組換えベクターが上海捷瑞生体工程有限会社で提供される。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
１．発現系の構築
合計でタムスタチン活性及びＣＤ１３７Ｌ活性を有する２４種の二機能組換えタンパク質を設計した。該タンパク質は、タムスタチン１／タムスタチン２／タムスタチン３／タムスタチン７と、ＣＤ１３７Ｌ１／ＣＤ１３７Ｌ４／ＣＤ１３７Ｌ５／ＣＤ１３７Ｌ６とを、リンカーペプチドで融合してなる（図１）。尚、ＣＤ１３７Ｌ１、ＣＤ１３７Ｌ４、ＣＤ１３７Ｌ５、ＣＤ１３７Ｌ６はそれぞれＣＤ１３７Ｌ完全長アミノ酸配列の４６−２５４位のアミノ酸、５０−２４０位のアミノ酸、８３−２５４位のアミノ酸、並びに４６−８５位のアミノ酸及び１６７−２５４位のアミノ酸から由来する（図２）。該タンパク質ヌクレオチド配列は配列番号１〜配列番号２４に示される配列であり、コードするアミノ酸配列が配列番号２５〜配列番号４８に示される配列であり、リンカーペプチドは配列番号６９〜配列番号７６に示される配列のうちから選択される１種である。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
ＣＤ１３７Ｌ細胞外領域タンパク質（ＣＤ１３７Ｌ１の第４６位乃至２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ４の第５０位乃至第２４０位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ５の第８３位乃至第２５４位のアミノ酸フラグメント、ＣＤ１３７Ｌ６の第４６位乃至第８５位のアミノ酸と第１６７位乃至第２５４位）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６１〜配列番号６４に示すようになっており、ＰＣＲ方法を採用して増幅することにより得られる。尚、ＣＤ１３７Ｌ完全長配列パターンは文献（Ｗａｎｇ  ｓｈｕｚｈｅｎ．Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２  Ｍａｒ；３９(３)：４７１−６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０２９５−０１１−１０４５−１．）に開示された方法を参照して調製することにより得られる。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６０】
前記文献で提示された方法によって、本願で使用したＣＤ１３７Ｌパターンを調製した。配列番号６１の上流プライマー（配列番号９５）と配列番号６１の下流プライマー（配列番号９６）をプライマーとし、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを触媒として増幅させて、ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号６１）遺伝子フラグメントを得て（この場合、該遺伝子の両端の消化部位はそれぞれ５’ＢａｍＨＩと３’ＮｏｔＩである）、該生成物をｐＭＤ１８−Ｔベクターに接続した。その後、消化接続などの通常の分子生物学的手段によって、ＣＤ１３７Ｌ１遺伝子フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターから切り出し、捷瑞会社で完全合成された、タムスタチンとリンカーペプチド（配列番号８７−配列番号９４）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続した。このステップまで、完全な融合タンパク質の遺伝子（配列番号５−配列番号１２）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに整合させた。その後、上流プライマー配列番号９７、下流プライマー配列番号９８を選択し、ＰＣＲの方法によって該融合タンパク質の遺伝子を増幅させ、生成物の５’消化部位がＮｈｅＩであり、生成物の３’消化部位がＮｄｅＩであり、最終に発現ベクターｐＥＴ１１ａに接続した。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
前記文献で提示された方法によって、本願で使用したＣＤ１３７Ｌパターンを調製した。配列番号６２の上流プライマー（配列番号９９）と配列番号６２の下流プライマー（配列番号Ｎｏ．１００）をプライマーとし、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを触媒として増幅させて、ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号６２）遺伝子フラグメントを得て（この場合、該遺伝子の両端の消化部位がそれぞれ５’ＢａｍＨＩ及び３’ＮｏｔＩである)、且つ該生成物をｐＭＤ１８−Ｔベクターに接続した。その後、消化接続などの通常の分子生物学手段によって、ＣＤ１３７Ｌ５遺伝子フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターから切り出して捷瑞会社で完全合成された、タムスタチンとリンカーペプチド（配列番号８１−配列番号８６）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続した。このステップまで、完全な融合タンパク質の遺伝子（配列番号１、配列番号３、配列番号１３−配列番号１６）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに整合させた。その後、配列番号１上流プライマー配列番号１０１、配列番号３上流プライマー配列番号１０２、配列番号１３−配列番号１４上流プライマー配列番号１０３、配列番号１５−配列番号１６上流プライマー１０４、配列番号１、配列番号３、配列番号１３−配列番号１６下流プライマー配列番号１０５を選択し、ＰＣＲの方法によって該融合タンパク質の遺伝子を増幅させ、生成物の５’消化部位がＮｈｅＩであり、生成物の３’消化部位がＮｄｅＩであり、最終に発現ベクターｐＥＴ１１ａに接続した。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
前記文献で提示された方法によって、本願で使用したＣＤ１３７Ｌパターンを調製した。配列番号６３の上流プライマー１（配列番号１０６）と配列番号６３の下流プライマー１（配列番号１０７）をプライマーとし、配列番号６３の上流プライマー２（配列番号１０８）と配列番号６３の下流プライマー２（配列番号１０９）をプライマーとし、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを触媒として増幅させて、ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号６３）の２つの遺伝子フラグメントを得て、アガロース電気泳動ゲル泳動により該２つのセクション遺伝子を回収した。その後、分子生物学ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ技術を使用して、回収された２つのセクションの遺伝子をパターンとし、ＣＤ１３７Ｌ６の上流プライマー１（配列番号１０７）とＣＤ１３７Ｌ６の下流プライマー２（配列番号１０９）をプライマーとし、最終的なＣＤ１３７Ｌ６（配列番号６３）フラグメント（両端の消化部位が５’ＢａｍＨＩと３’ＮｏｔＩ) を増幅させ、且つｐＭＤ１８−Ｔベクターに接続した。その後、ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号６３）遺伝子フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターから切り出し、上海捷瑞会社で合成された、タムスタチンとリンカーペプチド（配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続した。このステップで、完全的な融合タンパク質の遺伝子（配列番号２、配列番号４、配列番号１７−１８）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに整合させた。その後、それぞれ配列番号２、配列番号４上流プライマー配列番号１１０、配列番号１７上流プライマー配列番号１１１、配列番号１８上流プライマー配列番号１１２、配列番号２、配列番号４、配列番号１７、配列番号１８下流プライマー配列番号１１３を選択し、ＰＣＲの方法によって該融合タンパク質の遺伝子（配列番号２、配列番号４、配列番号１７、配列番号Ｎｏ．１８）を増幅し、且つ最終的な発現ベクターｐＥＴ１１ａに接続した。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
前記実験操作過程は関したプライマーは、以下の通りである。
配列番号６１の上流プライマー
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＣ−３’（下線を引いた部分がＢａｍＨＩ消化部位である。）
配列番号６１の下流プライマー
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴ−３’（下線を引いた部分がＮｏｔＩ消化部位である。）
融合タンパク質の遺伝子（配列番号５−配列番号１２)の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
融合タンパク質の遺伝子（配列番号５−配列番号１２）の下流プライマー
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴＣＣＧ−３’（下線を引いた部分がＮｄｅＩ消化部位である）
配列番号６２の上流プライマー
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧ−３’（下線を引いた部分がＢａｍＨＩ消化部位である）
配列番号６２の下流プライマー
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｏｔＩ消化部位）
配列番号１の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
配列番号３の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
配列番号１３−配列番号１４の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
配列番号１５−配列番号１６の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩダイジェスト部位である)
配列番号１、配列番号３、配列番号１３−配列番号１６の下流プライマー
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｄｅＩ消化部位である）
配列番号６３の上流プライマー１
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣ−３’（下線を引いた部分がＢａｍＨＩ消化部位である）
配列番号６３の下流プライマー１
５’−ＣＧＣＡＡＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧ−３’
配列番号６３の上流プライマー２
５’−ＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣ−３’
配列番号６３の下流プライマー２
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｏｔＩ消化部位である）
配列番号２、配列番号４の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
配列番号１７の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
配列番号１８の上流プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴ−３’（下線を引いた部分がＮｈｅＩ消化部位である）
配列番号２、配列番号４、配列番号１７、配列番号１８の下流プライマー
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’（下線を引いた部分がＮｄｅＩ消化部位である）
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７０】
１．発現系の構築
実施例１において構築された、完全な組換えタンパク質の遺伝子配列（配列番号１−２４）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターをパターンとし、異なるプライマー（５’ＰｓｔＩ、３’ＨｉｎｄＩＩＩ）を設計してＰＣＲを行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに接続された異なる融合タンパク質の遺伝子を増幅し、且つ完全なフラグメントを発現ベクターｐＰ４３に接続し（接続実験前にＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで該ベクターを二重消化する必要である）。ＰＣＲ及びダイジェスト接続などの操作ステップは、実施例１における融合タンパク質の遺伝子の構築部分と同じである。発現ベクターの構築が完了した後に、エレクトロポレーション操作を行い（具体的には、方法はＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーション装置の使用説明を参照する）、枯草菌発現系ＷＢ８００組換え菌株の構築を完了した。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７４】
１．発現系の構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターに取り込まれている異なる融合タンパク質の遺伝子（配列番号１〜２４）をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで二重消化し、且つｐＰＩＣ９Ｋに接続して、ベクターの構築作業を完了した。その後、エレクトロポレーション操作を行い（具体的な方法はＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーション装置の使用説明を参照する）、ピキア酵母ＧＳ１１５組換え菌株の構築を完了した。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
実験結果を図７に示す。図中、「ＴＰ−４７０」が陽性対照、「１１５」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号２５）、「１５５」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号２７）、「１１６」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号２６）、「２１５」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号３７）、「２５５」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号３８）、「２５６」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号４１）、「７１１」がタムスタチン７−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号２９）、「７２１」がタムスタチン７−リンカーペプチド２−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３０）、「７３１」がタムスタチン７−リンカーペプチド３−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３１）、「７４１」がタムスタチン７−リンカーペプチド４−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３２）、「７５１」がタムスタチン７−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３３）、「７６１」がタムスタチン７−リンカーペプチド６−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３４）、「７７１」がタムスタチン７−リンカーペプチド７−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３５）、「７８１」がタムスタチン７−リンカーペプチド８−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３６）、「１１４」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４３）、「２１４」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４４）、「３１４」がタムスタチン３−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４５）、「１５４」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４６）、「２５４」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４７）、「３５４」がタムスタチン３−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４８）である。前記結果により、選択された代表的なタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ機能を有する組換えタンパク質は、ヒト臍帯静脈内皮細胞に対して抑制効果を示し、なお、配列番号２６、配列番号３７、配列番号４1、配列番号３０、配列番号３１の抑制効果は、陽性対照より高いことが示される。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８２】
ステムセル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）社の「ＥａｓｙＳｅｐ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ」のキット説明書に従って操作した。マウス脾臓から分離することにより、精製されたＴ細胞集団を得た。ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を７．５ｇ／ｍＬで９６ウェルプレートを被覆し、４℃にて終夜し、第２日目に分離したマウス脾臓Ｔ細胞１００ｕｌ／孔（１０５個）を加え、合計で４個の実験組、即ち、１）何らかの抗体刺激を添加しないＴ細胞ブランク組（培地＋Ｔ細胞)、２）抗ＣＤ３（７．５μｇ／ｍＬ）と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍＬ）と結合する刺激組（ＣＤ３／ＣＤ２８）、３）抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体と抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体とが結合する刺激組（ＣＤ３／ＣＤ２８／ａｎｔｉ−ＣＤ１３７ｍＡｂ）、４）融合タンパク質サンプルがそれぞれ抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体に結合する刺激組（ＣＤ３／ＣＤ２８／タムスタチン１−ＣＤ１３７Ｌ）に分け、各組に３個の複数孔を設置した。９２時間培養した後、孔毎に「アラマーブルー」（ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ）１０μＬを加え、１２時間後に吸光度Ａ５７０値を測定し、Ａ６００を参照とした。実験結果を図８に示す。「１１５」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号２５）、「１５５」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号２７）、「１１６」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号２６）、「２１５」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号３７）、「２５５」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ５（配列番号３８）、「２５６」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ６（配列番号４１）、「７１１」がタムスタチン７−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号２９）、「７２１」がタムスタチン７−リンカーペプチド２−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３０）、「７３１」がタムスタチン７−リンカーペプチド３−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３１）、「７４１」がタムスタチン７−リンカーペプチド４−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３２）、「７５１」がタムスタチン７−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３３）、「７６１」がタムスタチン７−リンカーペプチド６−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３４）、「７７１」がタムスタチン７−リンカーペプチド７−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３５）、「７８１」がタムスタチン７−リンカーペプチド８−ＣＤ１３７Ｌ１（配列番号３６）、「１１４」がタムスタチン１−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４３）、「２１４」がタムスタチン２−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４４）、「３１４」がタムスタチン３−リンカーペプチド１−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４５）、「１５４」がタムスタチン１−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４６）、「２５４」がタムスタチン２−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４７）、「３５４」がタムスタチン３−リンカーペプチド５−ＣＤ１３７Ｌ４（配列番号４８）である。結果により、選択した代表的なタムス���チン及びＣＤ１３７Ｌ機能を有する組換えタンパク質は、終濃度が２μｇ／ｍＬである場合に、Ｔ細胞への増殖作用が「ＣＤ３＋ＣＤ２８」共刺激組より明らかに高く、ＣＤ１３７ＬとＣＤ２８とが協同効果を有することが証明される。それによって、本発明で獲得した代表的なタムスタチン及びＣＤ１３７Ｌ機能を有する組換えタンパク質は、Ｔ細胞増殖を共刺激する良好な生物学活性を有することが示される。