【手続補正書】
【提出日】平成30年4月24日(2018.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト脊椎動物の細胞または胚における複数の標的染色体ＤＮＡ部位でインビトロでの遺伝子編集を行う方法であって、
第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；および
第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型
を脊椎動物の細胞または胚に導入するステップを含み、
前記第１のＨＤＲ鋳型配列が前記第１の標的部位で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、かつ前記第２のＨＤＲ鋳型配列が前記第２の標的部位配列で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、
方法。
【請求項２】
第３、第４、第５、第６、および第７の標的染色体ＤＮＡ部位に各々特異的な第３、第４、第５、第６、および第７の標的化エンドヌクレアーゼ、ならびに
第３、第４、第５、第６、および第７の標的染色体ＤＮＡ部位に各々相同な第３、第４、第５、第６、および第７のＨＤＲ鋳型
の１つ以上を前記細胞または胚に導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的化エンドヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ９を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも第１の標的染色体ＤＮＡ部位が対立遺伝子における遺伝子座である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが前記鋳型に同族の前記ＤＮＡ標的部位のノックアウトをコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＤＲ鋳型の少なくとも１つが、外因性対立遺伝子における前記鋳型に同族の前記ＤＮＡ標的部位での対立遺伝子の置換をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞または胚が家畜の第一種または第一品種であり、また複数の前記編集が天然対立遺伝子と動物の第二種または第二品種に由来する外因性対立遺伝子との置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞または胚が前記標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集においてホモ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞または胚が前記標的ＤＮＡ部位での複数の遺伝子編集においてヘテロ接合性であり、前記編集が前記標的ＤＮＡ部位に同族のＨＤＲ鋳型によってコードされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞または胚が、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、接合体、幹細胞、成体幹細胞、多能性細胞、前駆細胞、および初代細胞からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚が、接合体、胚盤胞、桑実胚であるか、または１〜２００の数の細胞を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的化エンドヌクレアーゼがＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲの組み合わせである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的部位配列の１つ以上が、以下のリスト：ＩＬ２Ｒｇｙ／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇ−／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇｙ／−、ＲＡＧ２−／−、ＩＬ２Ｒｇ＋／−、ＲＡＧ２＋／−、ＩＬ２Ｒｇｙ／＋、ＲＡＧ２＋／−、ＩＬ２Ｒｇ＋／−、ＲＡＧ２＋／−、ＤＧＡＴ、ＡＢＣＧ２、ＡＣＡＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＬＧ、ＢＭＰ１Ｂ（ＦｅｃＢ）、ＤＡＺＬ、ＤＧＡＴ、Ｅｉｆ４ＧＩ、ＧＤＦ８、Ｈｏｒｎ−ｐｏｌｌ  ｌｏｃｕｓ、ＩＧＦ２、ＣＷＣ１５、ＫｉｓｓＲ／ＧＲＰ５４、ＯＦＤ１Ｙ、ｐ６５、ＰＲＬＲ、Ｐｒｍｄ１４、ＰＲＮＰ、Ｒｏｓａ、Ｓｏｃｓ２、ＳＲＹ、ＺＦＹ、β−ラクトグロブリン、ＣＬＰＧ、ＭＯＤＹ１（ＨＮＦ４α）、ＭＯＤＹ２（ＧＣＫ）、ＭＯＤＹ３（ＨＮＦ１α）、ＭＯＤＹ４（Ｐｄｘ１）、ＭＯＤＹ５（ＨＮＦ−１β）、ＭＯＤＹ６（神経原性分化１）、ＭＯＤＹ７（ＫＬＦ１１）、ＭＯＤＹ８（ＣＥＬ）、ＭＯＤＹ９（ＰＡＸ４）、ＭＯＤＹ１０（ＩＮＳ）、ＭＯＤＹ１１（ＢＬＫ）、ＡＰＣ、ＡｐｏＥ、ＤＭＤ、ＧＨＲＨＲ、ＨＲ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＬＤＬＲ、ＮＦ１、ＮＰＰＡ、ＮＲ３Ｃ２、ｐ５３、ＰＫＤ１、Ｒｂｍ２０、ＳＣＮＮ１Ｇ、ｔＰ５３、ＤＡＺＬ、ＦＡＨ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＭＩＷＩ、ＰＩＷＩ、ＤＣＡＦ１７、ＶＤＲ、ＰＮＰＬＡ１、ＨＲＡＳ、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｖｅｒｔ、ＤＳＰ、ＳＮＲＰＥ、ＲＰＬ２１、ＬＡＭＡ３、ＵＲＯＤ、ＥＤＡＲ、ＯＦＤ１、ＰＥＸ７、ＣＯＬ３Ａ１、ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＨＬＣＳ、ＮＩＰＡＬ４、ＣＥＲＳ３、ＡＮＴＸＲ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＤＳＧ４、ＵＢＲ１、ＣＴＣ１、ＭＢＴＰＳ２、ＵＲＯＳ、ＡＢＨＤ５、ＮＯＰ１０、ＡＬＭＳ１、ＬＡＭＢ３、ＥＯＧＴ、ＳＡＴ１、ＲＢＰＪ、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＡＣＶＲ１、ＩＫＢＫＧ、ＬＰＡＲ６、ＨＲ、ＡＴＲ、ＨＴＲＡ１、ＡＩＲＥ、ＢＣＳ１Ｌ、ＭＣＣＣ２、ＤＫＣ１、ＰＯＲＣＮ、ＥＢＰ、ＳＬＩＴＲＫ１、ＢＴＫ、ＤＯＣＫ６、ＡＰＣＤＤ１、ＺＩＰ４、ＣＡＳＲ、ＴＥＲＴ、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＰＶＲＬ１、ＭＧＰ、ＫＲＴ８５、ＲＡＧ２、ＲＡＧ−１、ＲＯＲ２、ＣＬＡＵＤＩＮ１、ＡＢＣＡ１２、ＳＬＡ−ＤＲＡ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＨＰ２、ＧＮＡ１１、ＷＮＴ５Ａ、ＵＳＢ１、ＬＭＮＡ、ＥＰＳ８Ｌ３、ＮＳＤＨＬ、ＴＲＰＶ３、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＦ２、ＴＧＭ１、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＫＰ１、ＷＲＡＰ５３、ＫＤＭ５Ｃ、ＥＣＭ１、ＴＰ６３、ＫＲＴ１４、ＲＩＰＫ４、ＰＲＫＤＣ、ＢＣＬ１１ａ、ＢＭＩ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＫＫ１、ＥＴＶ２、ＦＬＩ１、ＦＬＫ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、キット、ＬＭＸ１Ａ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＮＫＸ２−５、ＮＲ４Ａ２、ＰＡＸ３、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＨＲ、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５、ＥＴＶ２、ＰＤＸ１、ＴＢＸ４、ＩＤ２ＳＯＸ２、ＴＴＦ１／ＮＫＸ２−１、ＭＥＳＰ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＦＡＨ、ＰＲＫＤＣ、ＲＵＮＸ１、ＦＬＩ１、ＰＩＴＸ３、ＬＭＸ１Ａ、ＤＫＫ１、ＮＲ４Ａ２／ＮＵＲＲ１、ＦＬＫ１、ＨＨＥＸ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＲＡＧ２、ＲＡＧ１、ＩＬ２ＲＧ、ｃ−キッ��／ＳＣＦＲ、ＢＭＩ１、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ２、ＤＡＺＬ、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、それらのヘテロ接合体、それらのホモ接合体、およびそれらの組み合わせ、から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
非ヒト初代脊椎動物の細胞または胚において多重遺伝子編集を行う方法であって、異なる標的遺伝子に標的化された複数のＴＡＬＥＮを、前記異なる標的遺伝子に対する相同性を有するＨＤＲ鋳型の存在下で前記細胞または胚に導入するステップを含む、方法。
【請求項１６】
遺伝子編集宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである非ヒト脊椎動物胚であって、
異なる染色体ＤＮＡ部位で複数の宿主細胞の遺伝子編集を伴う宿主胚、および
前記キメラ胚を形成するため、前記宿主細胞に組み込まれたドナー細胞
を含む、脊椎動物胚。
【請求項１７】
前記ドナー細胞が、霊長類、齧歯類、または偶蹄目に由来する胚性幹細胞、多能性幹細胞、割球などである、請求項１６に記載の胚。
【請求項１８】
前記宿主またはキャリア細胞の遺伝子編集が、遺伝子のノックアウトまたは天然対立遺伝子と脊椎動物の別品種もしくは動物の別種の外因性対立遺伝子との置換を含む、請求項１６または１７に記載の胚。
【請求項１９】
前記宿主細胞の遺伝子編集の数が、２、３、４、５、６、もしくは７、または少なくとも２、３、４、５、６、もしくは７である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の胚。
【請求項２０】
天然対立遺伝子と脊椎動物の別品種もしくは動物の別種の外因性対立遺伝子との置換の数が、２、３、４、５、６、もしくは７、または少なくとも２、３、４、５、６、もしくは７である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の胚。
【請求項２１】
発現可能なレポーター遺伝子および／または合成遺伝子および／または外因性蛍光タンパク質を含まない、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の胚。
【請求項２２】
前記遺伝子編集のすべてが両アレルであるか、または前記編集の少なくとも２、３、４、もしくは５つが両アレルであるか、または前記遺伝子編集の少なくとも２、３、４、もしくは５つが単アレルであるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の胚。
【請求項２３】
前記宿主胚が高度虚弱（ＦＴＴ）表現型として運命づけられている、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の胚。
【請求項２４】
宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物であって、異なる染色体ＤＮＡ部位での複数の宿主細胞の遺伝子編集、および前記キメラ動物を形成するための前記宿主細胞に組み込まれたドナー細胞を含む、脊椎動物。
【請求項２５】
遺伝子編集宿主細胞およびドナー細胞におけるキメラである脊椎動物胚を作製する方法であって、
宿主の脊椎動物細胞に、
第１の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第１の標的化エンドヌクレアーゼおよび前記第１の標的部位配列に相同な第１の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；および
第２の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第２の標的化エンドヌクレアーゼおよび前記第２の標的部位配列に相同な第２のＨＤＲ鋳型
を導入するステップと、
宿主胚を発生させるため、前記細胞をクローン化するステップと、
ドナー細胞を前記宿主胚内に配置するステップと、
を含み、前記第１のＨＤＲ鋳型配列は前記第１の標的部位で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換し、また前記第２のＨＤＲ鋳型配列は前記第２の標的部位配列で前記天然染色体ＤＮＡ配列を置換する、方法。
【請求項２６】
前記細胞が初代細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
大型脊椎動物、家畜、サル、イヌ、ネコ、トリ、鳥類、魚類、ウサギ、ブタ、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ、および偶蹄目からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
第３、第４、第５、第６および／または第７の標的染色体ＤＮＡ部位に特異的な第３、第４、第５、第６および／または第７の標的化エンドヌクレアーゼならびに第３、第４、第５、第６および／または第７の標的部位配列に相同な第３、第４、第５、第６および／または第７の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型をさらに含む、請求項２５−２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子編集が遺伝子のノックアウトをもたらす、請求項１５に記載の方法。