【手続補正書】
【提出日】平成29年12月12日(2017.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと、
（ｉｉ）核酸編集ドメインと
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記核酸編集ドメインがＤＮＡ編集ドメインまたはデアミナーゼドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
デアミナーゼドメインが、
（ｉ）シチジンデアミナーゼ、
（ｉｉ）アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリのデアミナーゼ、
（ｉｉｉ）ＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼ、
（ｉｖ）活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、
（ｖ）ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、
（ｖｉ）アデノシンデアミナーゼ、または
（ｖｉｉ）ＡＤＡＴファミリのデアミナーゼ
である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記核酸編集ドメインが前記Ｃａｓ９ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記Ｃａｓ９ドメインおよび前記核酸編集ドメインがリンカーを介して融合しており、
任意に、前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎが独立して１〜３０の整数である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９６％同一であるか、少なくとも９７％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、少なくとも９９．５％同一であるか、または少なくとも９９．９％同一であるようなアミノ酸配列を含み、任意に、前記ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが配列番号４の１０位に対応する位置にアラニンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記デアミナーゼドメインが、配列番号６〜２８のいずれかのアミノ酸配列を含み、任意に、前記デアミナーゼドメインが、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を含むＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＤＮＡ編集の方法であって、ＤＮＡ分子と、
（ａ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインおよび核酸編集ドメインを含む融合タンパク質、および
（ｂ）前記（ａ）の融合タンパク質の標的を前記ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列に定めるｓｇＲＮＡ
とを接触させることを含み、
前記ＤＮＡ分子が、前記ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基の脱アミノ化に有効な量で、および前記脱アミノ化に適した条件下で前記融合タンパク質および前記ｓｇＲＮＡと接触させられ、
任意に、前記核酸編集ドメインがデアミナーゼドメインである、
前記方法（ヒト個体での実施を除く）。
【請求項９】
前記デアミナーゼドメインが、
（ｉ）シチジンデアミナーゼ、
（ｉｉ）アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリのデアミナーゼ、
（ｉｉｉ）ＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼ、
（ｉｖ）活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、
（ｖ）ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、
（ｖｉ）アデノシンデアミナーゼ、または
（ｖｉｉ）ＡＤＡＴファミリのデアミナーゼ
である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸編集ドメインが前記Ｃａｓ９ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合している、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９ドメインおよび前記核酸編集ドメインがリンカーを介して融合しており、
任意に、前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎが独立して１〜３０の整数である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９６％同一であるか、少なくとも９７％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、少なくとも９９．５％同一であるか、または少なくとも９９．９％同一であるようなアミノ酸配列を含み、任意に、前記ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが配列番号４の１０位に対応する位置にアラニンを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記デアミナーゼドメインが、配列番号６〜２８のいずれかのアミノ酸配列を含み、任意に、前記デアミナーゼドメインが、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を含むＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的ＤＮＡ配列が疾患または障害に関連する配列を含み、前記ヌクレオチド塩基の前記脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が生じ、
任意に、前記標的ＤＮＡ配列が疾患または障害に関連する点変異を含み、前記脱アミノ化により前記点変異が修正される、
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的ＤＮＡ配列が、疾患または障害に関連するＴ→ＣまたはＡ→Ｇ点変異を含み、変異ＣまたはＧ塩基の脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が生じる、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患または障害に関連する前記配列がタンパク質をコードし、前記脱アミノ化により、前記疾患または障害に関連する前記配列に終止コドンが導入され、その結果、前記コードされたタンパク質が短縮される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患または障害が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角化症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽細胞腫（ＮＢ）、フォン・ウィルブランド病（ｖＷＤ）、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ水腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連心筋症（ＤＲＭ）または変異ＰＩ３ＫＣＡタンパク質に関連する腫瘍性疾患である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ＤＮＡ配列が、
（ｉ）野生型ＰＩ３Ｋタンパク質と比較してＰＩ３ＫＣＡタンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化され、
任意に、前記点変異が、Ｈ１０４７Ｒ置換が生じるＡ３１４０Ｇ変異であり；
（ｉｉ）野生型ＰＳＥＮ１タンパク質と比較してＰＳＥＮ１タンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化され、
任意に、前記ＰＳＥＮ１タンパク質がＰＳＥＮ１遺伝子のコドン１４３におけるＡ→Ｇ点変異に起因するＩ１４３Ｖ置換を含み、
任意に、前記ＰＳＥＮ１点変異がアルツハイマー病に関連し、
任意に、前記接触させることにより、前記ＰＳＥＮ１遺伝子のコドン１４３における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ａ→Ｇ点変異が修正され；
（ｉｉｉ）野生型α−抗トリプシンタンパク質と比較してα−抗トリプシンタンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化され、
任意に、前記α−抗トリプシンタンパク質がα−抗トリプシン遺伝子のコドン５５におけるＴ→Ｃ点変異に起因するＬ５５Ｐ置換を含み、
任意に、前記α−抗トリプシン点変異が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連し、
任意に、前記接触させることにより、前記α−抗トリプシン遺伝子のコドン５５における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ｔ→Ｃ点変異が修正され；
（ｉｖ）野生型ｖＷＦタンパク質と比較してｖＷＦタンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化され、
任意に、前記ｖＷＦタンパク質がｖＷＦ遺伝子のコドン５０９におけるＴ→Ｃ点変異に起因するＣ５０９Ａ置換を含み、
任意に、前記ｖＷＦ点変異がフォン・ウィルブランド病に関連し、
任意に、前記接触させることにより、前記ｖＷＦ遺伝子のコドン５０９における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ｔ→Ｃ点変異が補正され；または
（ｖ）野生型カスパーゼ−９タンパク質と比較してカスパーゼ−９タンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化され、
任意に、前記カスパーゼ−９タンパク質がカスパーゼ−９遺伝子のコドン１９７におけるＴ→Ｃ点変異に起因するＬ１９７Ｐ置換を含み、
任意に、前記カスパーゼ−９点変異が神経芽細胞腫に関連し、
任意に、前記接触させることにより、前記カスパーゼ−９遺伝子のコドン１９７における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ｔ→Ｃ点変異が修正される；
請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド塩基の前記脱アミノ化を検出することを更に含み、任意に、前記検出することがＰＣＲによる、請求項１５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸構築物であって、
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９配列をコードする配列、
前記Ｃａｓ９をコードする配列と核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインをコードする配列とのインフレームでのクローニングを可能にするように位置するクローニング部位を含む配列、
任意に、前記Ｃａｓ９をコードする配列と前記クローニング部位との間に位置するリンカーをコードする配列
を含む、前記核酸構築物と、
Ｃａｓ９核酸編集融合タンパク質を生成するための、核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインをコードする配列の前記核酸構築物中へのインフレームでのクローニングに好適な試薬、緩衝液および／または使用説明書と
を含むキットであって、
任意に、前記クローニング部位を含む前記配列が前記Ｃａｓ９配列のＮ末端またはＣ末端であり、
任意に、前記コードされたリンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎが独立して１〜３０の整数である、
前記キット。