【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える単離された宿主細胞を、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＴＳに断裂を作製することができるヌクレアーゼ（Ｎ）；および
（ｉｉｉ）該宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、２つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項１に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、該環状の染色体外核酸の該形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＥＳがＴＳにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、
（ａ）該回収する工程が、前記宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としないか；または
（ｂ）該回収する工程が、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に少なくとも約１回の頻度で行われる、方法。
【請求項５】
複数（ｎ個）の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込まれ、ここで、ｎは、少なくとも２であり、工程（ａ）は、前記単離された宿主細胞を
（ｉ）該複数の外来性核酸であって、ここで、
ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ
と接触させる工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、：
（ａ）単一のヌクレアーゼが、（ＴＳ）ｘの各々を切断することができるか；または
（ｂ）ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０である、方法。
【請求項６】
ＥＳが、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含み、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して、それぞれ第３の相同性領域（ＨＲ３）および第４の相同性領域（ＨＲ４）と組み換わることができ、ＨＲ３およびＨＲ４は各々、ＴＳに存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、
（ａ）Ｎが、ＴＳに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができるか；または、
（ｂ）ＥＳが、直鎖状である、方法。
【請求項７】
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、方法。
【請求項９】
前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、請求項８に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、該ｃｒＲＮＡ活性および該ｔｒａｃｒＲＮＡ活性が、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される、方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、必要に応じて、さらに、
（ａ）該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質であり、該タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、該ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含むか；あるいは、
（ｂ）該エンドヌクレアーゼが、
（ｉ）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼであるか；
（ｉｉ）Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるか；または
（ｉｉｉ）内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合せず、該エンドヌクレアーゼは（ｉ）または（ｉｉ）の野生型エンドヌクレアーゼに由来する、方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、
（ａ）原核細胞であるか；
（ｂ）真核細胞であるか；
（ｃ）真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択されるか；
（ｄ）げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞であるか；あるいは
（ｅ）必要に応じてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである酵母細胞である、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞であって、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）；および
（ｉｉｉ）直鎖状核酸として該宿主細胞に導入される核酸であって、該宿主細胞内の１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、核酸
を含む、宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、該環状の染色体外核酸の該形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、
（ｉ）複数の外来性核酸であって、ここで、
ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ
を含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＥＳが、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含み、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して、それぞれ第３の相同性領域（ＨＲ３）および第４の相同性領域（ＨＲ４）と組み換わることができ、ＨＲ３およびＨＲ４は各々、ＴＳに存在し、必要に応じて、さらに、
（ａ）Ｎが、ＴＳに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができるか；または
（ｂ）ＥＳが、直鎖状である、宿主細胞。
【請求項１５】
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、宿主細胞。
【請求項１６】
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、宿主細胞。
【請求項１７】
前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、請求項１６に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該ｃｒＲＮＡ活性および該ｔｒａｃｒＲＮＡ活性が、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される、宿主細胞。
【請求項１８】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、
（ａ）該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質であり、該タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、該ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含むか；あるいは
（ｂ）該エンドヌクレアーゼが、
（ｉ）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼであるか；
（ｉｉ）Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるか；または
（ｉｉｉ）内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合せず、該エンドヌクレアーゼは（ｉ）または（ｉｉ）の野生型エンドヌクレアーゼに由来する、宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸；ならびに
（ｂ）第１の直鎖状核酸および１つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸であって、ここで、該第１および第２の直鎖状核酸は、宿主細胞への導入の後に互いとの相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、第１の直鎖状核酸および１つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
を含む、組成物。
【請求項２０】
細胞培養培地ならびに請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養組成物。
【請求項２１】
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える単離された宿主細胞を、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの該標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；および
（ｉｉ）該宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。