【手続補正書】
【提出日】平成30年3月19日(2018.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおける細胞集団であって、該細胞集団が哺乳類の神経細胞を含み、該神経細胞のうちの少なくとも約８０％がリム（ＬＩＭ）ホメオボックス転写因子１（Ｌｍｘ１）とフォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）両方の発現に関して陽性である、細胞集団。
【請求項２】
少なくとも５００，０００個の細胞を含んでいる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
少なくとも１００万個の細胞を含んでいる、請求項２に記載の集団。
【請求項４】
神経細胞のうちの少なくとも約１０％がチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の発現に関して陽性な、請求項１に記載の集団。
【請求項５】
神経細胞のうちの少なくとも約５０％がＴＨの発現に関して陽性な、請求項４に記載の集団。
【請求項６】
該細胞がトランスジェニック細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項７】
該トランスジェニック細胞が、パンニューラルプロモーターの制御下にスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーを含んでいる、請求項６に記載の集団。
【請求項８】
該パンニューラルプロモーターが、ＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘ、シナプシン（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）２、グリア線維酸性タンパク質、またはチューブリンアルファ−１Ａ鎖プロモーターである、請求項７に記載の集団。
【請求項９】
該パンニューラルプロモーターがＭａｐ−２プロモーターである、請求項８に記載の集団。
【請求項１０】
該細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項１１】
限定培地に入っている請求項１に記載の細胞集団を含む、組織培養システム。
【請求項１２】
薬学的に許容可能な培地に入っている請求項１に記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ヒト疾患を治療するための治療法としての使用と、容器に入っているヒトドーパミン作動性ニューロンの用量が表示された容器であって、ここで、該ヒトドーパミン作動性ニューロンを構成しているニューロンのうちの８０％超がＦｏｘＡ２とＬｍｘ１の発現に関して陽性であり、該容器は、ヒト疾患の治療における該ニューロンの使用用途を記載した表示とともに供給される、上記の容器。
【請求項１４】
請求項１〜１０の細胞集団を、該細胞がインビボで生着可能な条件において対象に移植することを含む、該対象の治療方法。
【請求項１５】
該対象がパーキンソン病だと診断されているか、またはパーキンソン病の症状を呈している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
候補薬物のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞の集団を準備すること；
ｂ）該集団と該候補薬物を接触させること；および
ｃ）該候補薬物が該細胞集団に及ぼす影響を決定すること
を含む方法。
【請求項１７】
濃縮された中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの集団を準備するための方法であって：
神経細胞系列の細胞集団を準備するために、多能性細胞の細胞集団を分化させること；
中脳ニューロンを含んでいる細胞集団を生成するために該神経細胞系列の細胞集団の細胞をさらに分化させること；および
濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を得るために、パンニューラルプロモーターによって発現しているマーカーを利用して前記細胞集団から細胞を精製すること、
を含んでいる方法。
【請求項１８】
マーカーを利用して該細胞を精製することが、パンニューラルプロモーターの制御下でスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーを発現する細胞を選抜することを含んでいる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該スクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーが該細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該パンニューラルプロモーターがＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘ、シナプシン、エノラーゼ２、グリア線維酸性タンパク質、またはチューブリンアルファ−１Ａ鎖プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
該パンニューラルプロモーターがＭａｐ−２プロモーターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該細胞を精製することが、パンニューラルプロモーターの制御下で選択可能なマーカーを発現する細胞を選抜することを含んでおり、ここで該選択可能なマーカーが薬物耐性マーカーであり、かつ、該選抜することが、薬物耐性マーカーを発現している細胞を、薬物を使って選抜することである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
マーカーを利用して該細胞を精製することが、パンニューラルプロモーターによって発現された表面マーカーを含んでいる細胞のアフィニティ精製を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を神経細胞系列の細胞集団に分化させることが、多能性細胞の集団を、ＢＭＰシグナル阻害剤；ＴＧＦβシグナル阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地中で培養することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
多能性細胞の集団を、さらにＭＥＫ阻害剤および／またはＦＧＦ８を含んでいる培地中で培養することを含む、請求項２４に記載の方法、
【請求項２６】
さらに、
（ａ）多能性細胞の集団を得ること；
（ｂ）該細胞の集団を、ＢＭＰシグナル阻害剤；ＴＧＦβシグナル阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地中で培養すること；
（ｃ）該細胞集団を、ＢＭＰシグナル阻害剤；ＳＨＨシグナル活性化剤；およびＷｎｔシグナル活性化剤を含んでいる培地における浮遊培養に移し、それによって、細胞凝集体を形成させること；
（ｄ）細胞凝集体を解離させ、そして該解離細胞をマトリクス培養に播種して、神経細胞系列の細胞集団を準備すること；
（ｅ）該神経細胞系列の細胞集団を、神経成熟因子を含んでいる成熟培地中でさらに分化させて、中脳ニューロンを含む細胞集団を生成すること；ならびに
（ｆ）パンニューラルプロモーターによって発現されたマーカーを利用して該細胞を精製し、濃縮された中脳ニューロンの集団を準備すること、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
濃縮された中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの集団を準備するための方法であって、
多能性細胞の集団を得ること；
該細胞を、ＭＥＫ阻害剤を含むが外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まない培地中で、神経細胞系列の細胞集団に分化させること；および
該神経細胞系列の細胞集団をさらに分化させて、濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を準備すること
を含む方法。
【請求項２８】
該細胞を神経細胞系列の細胞集団に分化させることが、多能性細胞の集団を、外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まないが、ＢＭＰシグナル阻害剤；ＴＧＦβシグナル阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤およびＭＥＫ阻害剤を含む培地中で培養することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、
（ａ）多能性細胞の集団を得ること；
（ｂ）該細胞の集団を、ＢＭＰシグナル阻害剤；ＴＧＦβシグナル阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤を含むが、外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まない培地中で培養すること；
（ｃ）該細胞集団を、外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まないがＢＭＰシグナル阻害剤；ＳＨＨシグナル活性化剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤；ＭＥＫ阻害剤を含み；かつ、外因的に加えられたＦＧＦ８ｂを含まない培地における浮遊培養に移し、それによって細胞凝集体を形成させること；
（ｄ）細胞凝集体を解離させ、該解離細胞をマトリクス培養に播種すること；および
（ｅ）該細胞をさらに分化させて、濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団を生成すること、
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
該細胞がヒト細胞である、請求項１７または２７に記載の方法。
【請求項３１】
該細胞が、パーキンソン病の症状を呈している患者に由来するものである、請求項１７または２７に記載の方法。
【請求項３２】
該方法が、ＤＡ特異的マーカーを利用した細胞の精製を含まない、請求項１７または２７に記載の方法。
【請求項３３】
濃縮された中脳ＤＡニューロンの集団が、少なくとも１×１０2、１×１０3、１×１０4、１×１０5、または１×１０6個の中脳ＤＡニューロン細胞を含んでいる、請求項１７または２７に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法によって生産された、中脳ＤＡニューロンの集団。
【請求項３５】
ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン細胞または多能性幹細胞を含んでいる、インビトロにおける精製した細胞の集団であって、前記細胞が、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子を含んでいる第一の発現カセットを含んでいる、インビトロにおける精製した細胞の集団。
【請求項３６】
中脳ＤＡニューロン細胞を含んでいる、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
該多能性細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３８】
対象の治療方法であって、請求項３６に記載の中脳ＤＡニューロンの集団または請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法によって生産された中脳ＤＡニューロンの集団を、該細胞がインビボ生着可能な条件で該対象に移植することを含む、治療方法。
【請求項３９】
候補薬物のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項３６に記載の中脳ＤＡニューロンの集団または請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法によって生産された中脳ＤＡニューロンの集団を準備すること；
ｂ）該中脳ＤＡニューロンの集団を該候補薬物と接触させること；および
ｃ）該候補薬物が該細胞集団に及ぼす影響を決定すること、
を含む方法。
【請求項４０】
少なくとも５０％の中脳ニューロンと５０％のＤＡニューロンから構成される、中脳ＤＡニューロンを含んでいる細胞の集団。
【請求項４１】
該集団が、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子をコードしている第一の発現カセットを含んでいる中脳ＤＡニューロン細胞を含む、請求項４０に記載の集団。
【請求項４２】
安定な凍結溶液に入った中脳ＤＡニューロンを含んでいる細胞の集団であって、１回凍結融解した後に、少なくとも５０％の生きている中脳ニューロンと５０％のＤＡニューロンから構成される、細胞の集団。
【請求項４３】
該集団が、パンニューラルプロモーターの制御下にある第一のマーカー遺伝子をコードしている第一の発現カセットを含んでいる中脳ＤＡニューロン細胞を含む、請求項４２に記載の集団。