【手続補正書】
【提出日】平成30年4月17日(2018.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ付き核酸配列を形成する方法であって、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することにより、固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｉｉ）前記固定化標的ポリヌクレオチドに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み標的ポリヌクレオチドを含む、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成するステップと；
を含む、方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｉ）の固定化は、
（ａ）固体支持体にＲＮＡ分子を捕捉することにより捕捉ＲＮＡを形成するステップと；
（ｂ）前記捕捉ＲＮＡを逆転写することにより、前記固体支持体に固定された標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドは一本鎖ｃＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体はビーズ構造を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アダプター核酸配列は第１増幅核酸配列相補体を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第１増幅核酸配列相補体を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で前記第１増幅核酸配列にハイブリダイズすることにより、前記タグ付き核酸配列を増幅するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｉｖ）のライゲーションの後、前記タグ付き核酸配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で第１増幅核酸配列に接触させるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する方法であって、
（ｉ）複数の不均一な標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することにより、複数の不均一な固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｉｉ）前記不均一な固定化標的ポリヌクレオチドに複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、複数の認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、複数の切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記複数の切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成するステップと；
を含む、方法。
【請求項９】
タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成する方法であって、
（ｉ）標的ｃＤＮＡを固体支持体に固定することにより、固定化標的ｃＤＮＡを形成するステップと；
（ｉｉ）前記固定化標的ｃＤＮＡに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸をライゲーションすることにより、タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成するステップと；
を含む、方法。
【請求項１０】
タグ付き核酸配列を形成する方法であって、
（ｉ）標的リボ核酸を固体支持体に固定することにより、固定化標的リボ核酸（ＲＮＡ）を形成するステップと；
（ｉｉ）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することにより、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ｃＤＮＡ切断剤で切断して切断済みＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを生成するステップであって、該ｃＤＮＡはライゲーション可能な末端を含む、ステップと；
（ｉｖ）前記ライゲーション可能な末端にアダプターオリゴヌクレオチドをライゲーションするステップと；
（ｖ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、タグ付き核酸配列を形成するステップと；
を含む、方法。
【請求項１１】
複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成する方法であって、
（ｉ）複数の不均一な標的リボ核酸配列を固体支持体に固定することにより、複数の不均一な固定化標的リボ核酸配列を形成するステップと；
（ｉｉ）前記不均一な固定化標的リボ核酸配列を逆転写することにより、複数の不均一なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記複数の不均一なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、複数の切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記複数の切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにアダプター核酸配列をライゲーションするステップと；
（ｖ）前記リボ核酸配列を前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成するステップと；
を含む、方法。
【請求項１２】
複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを含む認識オリゴヌクレオチドのライブラリであって、該不均一な認識オリゴヌクレオチドはそれぞれ、縮重核酸配列が隣接する制限酵素認識配列を含む、ライブラリ。
【請求項１３】
ｃＤＮＡ配列を増幅する方法であって、
（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成するステップと；
（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、固定化ｃＤＮＡ配列を形成するステップと；
（ｉｖ）前記固定化ｃＤＮＡ配列に認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｖ）前記認識オリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド：切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｖｉ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付きｃＤＮＡ配列を形成するステップと；
（ｖｉｉ）前記タグ付きｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で増幅核酸配列にハイブリダイズすることにより、ｃＤＮＡ配列を増幅するステップと；
を含む、方法。
【請求項１４】
ｃＤＮＡ配列を増幅する方法であって、
（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成するステップと；
（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにアダプター核酸配列をライゲーションするステップと；
（ｖ）前記リボ核酸を前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、タグ付きｃＤＮＡ配列を形成するステップと；
（ｖｉ）前記タグ付きｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で増幅核酸配列に接触させることにより、前記ｃＤＮＡ配列を増幅するステップと；
を含む、方法。