【手続補正書】
【提出日】平成30年11月14日(2018.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程であって、前記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる、工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを導入する工程；並びに
前記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程
を含み、
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である、方法。
【請求項２】
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の前記標的特異的プライマーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで前記非特異的増幅産物を切断する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の前に、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の後に、前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リゾルバーゼで前記非特異的増幅産物を切断する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、約０．２Ｕ〜１０００Ｕのリゾルバーゼに対して、０．５分〜６０分、１６℃〜３７℃で曝露する工程を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは：
ポリメラーゼ；
複数の標的特異的プライマー対；
増幅緩衝液；リゾルバーゼ緩衝液；
異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；及び
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記リゾルバーゼを使用した増幅後に、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットを使用するための説明書
を含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２２】
本明細書に含まれる実施例及び図は、限定ではなく例示として、本主題を実施できる特定の実施形態を示している。上記のように、他の実施形態を例示した実施形態から利用及び導き出すことができ、その結果、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的及び論理的な置換及び変更を行うことができる。本主題のそのような実施形態は、本明細書において、単に便宜上、用語「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」によって個別的及び／又は集合的に呼称され得るが、これは、２以上の発明が実際に開示されている場合に、本出願の範囲をいずれか１つの発明又は創造的な発想に自発的に限定することを意図するものではない。従って、特定の実施形態について本明細書中で説明及び記載してきたが、同じ目的を達成する為に算出される任意の構成で、示されている特定の実施形態を置換してもよい。本開示は、様々な実施形態のありとあらゆる応用形態又は変形形態を網羅することを意図している。上記説明を検討すれば、上記実施形態及び本明細書で詳細には説明されていない他の実施形態の組み合せが、当業者には明らかであろう。
〔付記１〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程であって、前記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる、工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを導入する工程；並びに
前記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程
を含み、
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である、方法。
〔付記２〕
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記３〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記４〕
前記分析工程は、次世代シーケンシング反応を含む、付記３に記載の方法。
〔付記５〕
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、付記１に記載の方法。
〔付記６〕
前記標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、付記１に記載の方法。
〔付記７〕
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである、付記１に記載の方法。
〔付記８〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記９〕
前記標的特異的プライマーは、１０対〜１０００対の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記１０〕
前記標的特異的プライマーは、１，０００〜約１００，０００対の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記１１〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記１２〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、付記１に記載の方法。
〔付記１３〕
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、付記１に記載の方法。
〔付記１４〕
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１５〕
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含み、
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する前記工程は、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで前記非特異的増幅産物を切断する工程を含む、付記１に記載の方法。
〔付記１６〕
前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１７〕
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の前に、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１８〕
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の後に、前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１９〕
前記アダプターは、少なくとも３個の連続するホスホロチオエートを含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２０〕
前記リゾルバーゼで前記非特異的増幅産物を切断する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、約０．２Ｕ〜１０００Ｕのリゾルバーゼに対して、０．５分〜６０分、１６℃〜３７℃で曝露する工程を含む、付記１に記載の方法。
〔付記２１〕
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を含む、付記１に記載の方法。
〔付記２２〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを前記混合物に導入し、前記複数の非特異的増幅産物を前記リゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程であって、前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちのである、工程；並びに
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程
を含む、方法。
〔付記２３〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを前記混合物に導入する工程であって、前記Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩは、前記非特異的増幅産物上の異常なＤＮＡ構造を認識する、工程；
前記複数の非特異的増幅産物を前記Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程；並びに
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程
を含む、方法。
〔付記２４〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを前記混合物に導入し、前記複数の非特異的増幅産物を前記リゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程であって、前記リゾルバーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である、工程；
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程；並びに；
前記標的特異的増幅産物を再増幅する工程
を含む、方法。
〔付記２５〕
前記標的特異的増幅産物上のニックをＤＮＡリガーゼで修復する工程を更に含む、付記２４に記載の方法。
〔付記２６〕
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは：
ポリメラーゼ；
複数の標的特異的プライマー対；
増幅緩衝液；リゾルバーゼ緩衝液；
異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；及び
前記リゾルバーゼを使用した増幅後に、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットの使用についての説明書
を含む、キット。
〔付記２７〕
少なくとも１つの核酸アダプターを更に含む、付記２６に記載のキット。
〔付記２８〕
少なくとも１つの核酸アダプターを更に含み、
前記少なくとも１つの核酸アダプターは、少なくとも３個のホスホロチオエートを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記２９〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３０〕
前記標的特異的プライマーは、約１，０００〜約１００，０００の前記標的特異的プライマーを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３１〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３２〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、付記２６に記載のキット。
〔付記３３〕
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、付記２６に記載のキット。
〔付記３４〕
前記非特異的増幅産物を切断するためのエキソヌクレアーゼを更に含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３５〕
前記非特異的増幅産物を切断するためのエキソヌクレアーゼを更に含み、
前記エキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３６〕
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは：
ポリメラーゼ；
複数の標的特異的プライマー対；
増幅緩衝液；
リゾルバーゼ緩衝液；
異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；
前記標的特異的アンプリコンを再増幅するための再増幅ＰＣＲプライマー対；及び
リゾルバーゼを使用した増幅後に増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットの使用についての説明書
を含む、キット。
〔付記３７〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含む、付記３６に記載のキット。
〔付記３８〕
前記標的特異的プライマーは、約１，０００〜約１００，０００の前記標的特異的プライマーを含む、付記３６に記載のキット。
〔付記３９〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記３６に記載のキット。
〔付記４０〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、付記３６に記載のキット。
〔付記４１〕
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、付記３６に記載のキット。
〔付記４２〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、前記非特異的増幅産物を除去する為に異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して前記混合物を導入する工程であって、前記異常なＤＮＡ構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、工程
を含む、方法。
〔付記４３〕
前記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する前記タンパク質は、ＭｕｔＳである、付記４２に記載の方法。
〔付記４４〕
前記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する前記タンパク質は、基体に連結される、付記４２に記載の方法。
〔付記４５〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４６〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含み、
前記分析工程は、次世代シーケンシング反応を含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４７〕
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４８〕
前記標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４９〕
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである、付記４２に記載の方法。
〔付記５０〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の前記標的特異的プライマーを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５１〕
前記標的特異的プライマーは、約１，０００〜約１００，０００の前記標的特異的プライマーを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５２〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５３〕
前記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して、前記混合物を導入する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、０．５分〜２０分、２０℃〜４０℃で、インキュベートする工程を含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５４〕
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を含む、付記４２に記載の方法。