【手続補正書】
【提出日】平成29年12月18日(2017.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全発酵ブロスからバイオ燃料の生産に適した脂質を抽出する方法であって：
（ａ）油産生微生物を含有する前記ブロスを、約９０℃〜約１５０℃、または約１００℃〜約１５０℃、または約１１０℃〜約１５０℃、または約１２０℃〜約１５０℃、または約１３０℃〜約１５０℃の温度に加熱することによって、前記全発酵ブロスをプレ処理することと；
場合により、
（ｉ）前記全発酵ブロスを、約３０分間〜約１８時間、または３時間超〜約１８時間、または３時間超〜約８時間にわたり加熱すること；
（ｉｉ）前記油産生微生物を含有する前記全発酵ブロスによって４５℃〜８０℃で費やされる時間を、前記油産生微生物を含有する前記全発酵ブロスを４５℃から８０℃に６０分未満で加熱することによって、最小限にすること；および
（ｉｉｉ）前記全発酵ブロスを、毎分摂氏約０．１〜約８０度の平均速度で加熱すること
のうちの少なくとも１つと、
（ｂ）その後産物を前記油産生微生物から抽出することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記全発酵ブロスのｐＨを、酸または塩基のいずれかを加えることによって調整することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらなる等温プロセシングを可能にするために、前記全発酵ブロスを、約６０℃超、または約７０℃超、または約８０℃超、または約８５℃超、または約９０℃超に冷却すること、および、場合により、前記全発酵ブロスを、毎分摂氏約０．２〜約８０度の平均速度で冷却すること、をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記さらなる等温プロセシングは、機械的破壊を適用することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記加熱の後、前記全発酵ブロスを乾燥させること；
（ｂ）前記全発酵ブロスを、毎秒約１０ｃｍ〜毎秒約２４０ｃｍのインペラ先端速度で撹拌すること；および
（ｃ）前記プレ処理中、前記全発酵ブロスを含有する系において、圧力を、約１０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉ、または約２０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉ、または約３０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉ、または約５０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉに維持すること
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プレ処理中、前記全発酵ブロスを含有する系に塩が存在して、前記系中で約０．０１Ｍ〜約２Ｍのイオン強度がもたらされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記油産生微生物を溶解に曝して、小滴および破片の粒子サイズ分布をもたらすことをさらに含み、放出された産物油小滴および破片の少なくとも８０容量％、好ましくは９５容量％は、直径において０．１μｍよりも大きいサイズを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１２０ｃｍ／秒を超えるインペラ先端速度での混合によって、前記油および細胞破片小滴を連続相として回収することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プレ処理を経た前記発酵ブロスは、前記発酵ブロスを付加的に３０分間〜約８時間にわたり９０℃超で加熱することによって、８時間未満以内に合体され得る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出プロセスは、前記全発酵ブロス中の金属を、油と比較して少なくとも２の比率で濃縮する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
粗糖に前記方法を実行することと、粗油を回収するために全乾燥バイオマスおよび／または溶媒を利用する抽出技術と比較して、金属および無機元素がより少ない粗油を回収することとを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記全発酵ブロスは、＞０．０５ｇ／Ｌの濃度で塩およびイオンを伴う粗糖源を含み、
好ましくは、前記塩およびイオンは、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、クロリド、サルフェート、ホスフェート、ニトレート、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
より好ましくは、前記塩およびイオンは、カリウム、カルシウム、またはそれらの組合せを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩およびイオンは蓄積して、０．５〜４０ｇ／Ｌの濃度となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩およびイオンは、
（ａ）ナトリウムよりも高い濃度のカリウム；
（ｂ）１ｇ／Ｌを超える濃度のカルシウム；および
（ｃ）２．５ｇ／Ｌを超える濃度のカリウム
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩およびイオンは、前記産物が前記油産生微生物から放出される場合に、合体による油相の回収に役立つ、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵ブロスは、前記合体の間、０．５〜４０ｇ／Ｌの濃度の塩およびイオンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記合体は、合体脂質の粒子サイズ分布をもたらし、合体脂質の少なくとも８０容量％、好ましくは９５容量％は、直径において４０μｍよりも大きいサイズを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記加熱の後に、前記発酵ブロスを減圧することと、さらなるプロセシング前に前記ブロス中で固体を濃縮するために前記全発酵ブロスを冷却することとをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
混合物を形成するために、前記加熱の後に、溶媒を乾燥細胞または溶解発酵ブロスに加えることをさらに含み、
好ましくは、前記溶媒は、ヘキサン、ドデカン、デカン、ディーゼル、アルコール、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）接触させて油を前記油産生微生物から抽出するために、前記溶解発酵ブロスおよび前記溶媒の前記混合物を撹拌すること；
（ｂ）前記溶媒および前記油を前記溶解発酵ブロスから分離すること；および
（ｃ）前記溶媒および前記油を前記溶解発酵ブロスから分離するために遠心分離機を用いること
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記油の少なくとも一部を燃料成分に変換するために、前記溶媒および前記油を反応させることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶媒および残りの前記油を、バイオ燃料を含む燃料に変換することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記消費されたブロスを、作物の肥料、動物の飼料、酵母抽出物、酵母加水分解物、または炭素／栄養源として用いることをさらに含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記油産生微生物を含有する前記全発酵ブロスは、糖フィードストックを含み、
好ましくは、前記油産生微生物および前記糖フィードストックを含有する前記全発酵ブロスは、発酵槽ブロスのリットルあたり約５０〜約２５０グラムの脂質、発酵槽ブロスのリットルあたり約０〜約５０グラムの糖、発酵槽ブロスのリットルあたり約０〜約４０グラムの塩、および発酵槽ブロスのリットルあたり約１０〜約１００グラムの脂質フリー乾燥バイオマスを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記油産生微生物は、少なくとも４０重量％の脂肪を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記油産生微生物を含有する全発酵ブロスを低温殺菌することをさらに含み、
好ましくは、前記全発酵ブロスを約４０℃〜約８０℃に約１分間〜約３時間にわたり加熱することによって、前記全発酵ブロスを低温殺菌することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記全発酵ブロスを、約９０℃〜約１５０℃、または約１００℃〜約１５０℃、または約１１０℃〜約１５０℃、または約１２０℃〜約１５０℃、または約１３０℃〜約１５０℃の温度にて、約３０分間〜約１８時間、または３時間超〜約１８時間、または３時間超〜約８時間にわたり保持することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）前記全発酵ブロスを、加熱インターバル中に撹拌すること；
（ｂ）酸を前記全発酵ブロスに加えること；および
（ｃ）塩基を前記全発酵ブロスに加えること
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ビーズミル、ホモジナイザー、オリフィスプレート、高剪断ミキサー、プレス、押出機、圧力破壊、湿式ミリング、乾式ミリング、または他の剪断もしくは機械破壊装置に少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、前記全発酵ブロスを通過させることをさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶解発酵ブロスを、ベッセル内で約７０℃〜約１００℃にて約１〜約６０時間にわたり撹拌することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
塩を前記ベッセル内の前記溶解発酵ブロスに加えることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
最大約２重量％の前記塩を加えることを含み、
好ましくは、前記塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４であるか、またはＨ２ＳＯ４をプラスした少なくとも１つのＮａＯＨおよびＫＯＨの組合せに由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベッセル内の前記溶解発酵ブロスのｐＨを約３〜約１１に調整するために、塩基を加えることをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
２０％未満の遊離脂肪酸である油を、遠心分離により、前記全発酵ブロスから分離することをさらに含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記油産生微生物は、油産生酵母細胞である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記油産生微生物の油産生細胞壁を破壊するために、アミラーゼ、１−４マンノシダーゼ、および１−３マンノシダーゼを含む酵素の組合せを用いることをさらに含み、
好ましくは、酵素の前記組合せはさらに、スルファターゼ、プロテアーゼ、およびキチナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの補助酵素を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記アミラーゼは、α１−４結合グルコースに特異的である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
酵素の前記組合せは、約５重量％〜約３０重量％のアミラーゼを含む、請求項３６または３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
酵素の前記組合せは、約５重量％〜約４５重量％の１−４マンノシダーゼを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
酵素の前記組合せは、約５重量％〜約４５重量％の１−３マンノシダーゼを含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記油産生細胞壁を破壊した後に前記油産生細胞壁から細胞内代謝物質を収穫することをさらに含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞内代謝物質は、脂質を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞内代謝物質をバイオ燃料に変換することをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞内代謝物質を収穫した後に残る水抽出廃水をリサイクルすることをさらに含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記リサイクルされた抽出水を、糖を抽出するためにプロセスフィードストックを洗浄する吸収水として用いることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
微生物細胞壁の分解のための酵素の組合せであって：
アミラーゼと；
１−４マンノシダーゼと；
１−３マンノシダーゼと
を含み、
好ましくは、前記アミラーゼは、α１−４結合グルコースに特異的である、酵素の組合せ。
【請求項４７】
スルファターゼ、プロテアーゼ、およびキチナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの補助酵素をさらに含む、請求項４６に記載の酵素の組合せ。
【請求項４８】
前記組合せは、スポリジオボルス・パラロセウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）ＭＫ２９４０４に用いられる、請求項４６または４７に記載の酵素の組合せ。
【請求項４９】
約５重量％〜約３０重量％のアミラーゼを含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の酵素の組合せ。
【請求項５０】
約５重量％〜約４５重量％の１−４マンノシダーゼを含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の酵素の組合せ。
【請求項５１】
約５重量％〜約４５重量％の１−３マンノシダーゼを含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の酵素の組合せ。
【請求項５２】
全発酵ブロスからバイオ燃料の生産に適した脂質を抽出する方法であって：
油産生微生物を含有する前記全発酵ブロスに、前記油産生微生物の細胞壁を破壊するために、アミラーゼ、１−４マンノシダーゼ、および１−３マンノシダーゼを含む酵素の組合せを適用することと；
その後産物を前記油産生微生物から抽出することと
を含む、方法。
【請求項５３】
酵素の前記組合せはさらに、スルファターゼ、プロテアーゼ、およびキチナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの補助酵素を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アミラーゼは、α１−４結合グルコースに特異的である、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
酵素の前記組合せは、約５重量％〜約３０重量％のアミラーゼを含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
酵素の前記組合せは、約５重量％〜約４５重量％の１−４マンノシダーゼを含む、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
酵素の前記組合せは、約５重量％〜約４５重量％の１−３マンノシダーゼを含む、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞壁を破壊した後に前記油産生細胞壁から細胞内代謝物質を収穫することをさらに含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞内代謝物質は、脂質を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞内代謝物質をバイオ燃料に変換することをさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞内代謝物質を収穫した後に残る水抽出廃水をリサイクルすることをさらに含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記リサイクルされた抽出水を、糖を抽出するためにプロセスフィードストックを洗浄する吸収水として用いることをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ブロスを、約９０℃〜約１５０℃、または約１００℃〜約１５０℃、または約１１０℃〜約１５０℃、または約１２０℃〜約１５０℃、または約１３０℃〜約１５０℃の温度に加熱することによって、前記全発酵ブロスをプレ処理することをさらに含み、
さらに、
（ａ）混合物を形成するために、溶媒、好ましくは、ヘキサン、ドデカン、デカン、ディーゼル、アルコール、およびそれらの組合せからなる群から選択される溶媒を、乾燥細胞または溶解発酵ブロスに加えること；
（ｂ）接触させて油を前記油産生酵母細胞から抽出するために、前記ブロスおよび前記溶媒の前記混合物を撹拌すること；および
（ｃ）前記溶媒および前記油を前記ブロスから分離すること
のうちの少なくとも１つを含む、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記溶媒および前記油を前記ブロスから分離するために遠心分離機を用いることを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記油の少なくとも一部を燃料成分に変換するために、前記溶媒および前記油を反応させることをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記溶媒および残りの前記油を、バイオ燃料を含む燃料に変換することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記消費されたブロスを、作物の肥料、動物の飼料、酵母抽出物、酵母加水分解物、または炭素／栄養源として用いることをさらに含む、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
水性発酵ブロスからバイオ燃料の生産に適した脂質を抽出する方法であって：
脂質を、油産生微生物を含有する前記水性発酵ブロスから、バイオマス固体および残りのブロス水を残して抽出することと；
前記残りのブロス水を、糖を抽出するためのプロセスフィードストックを洗浄する吸収水として用いることと
を含む、方法。
【請求項６９】
前記水性発酵ブロスを低温殺菌することをさらに含み、
好ましくは、前記水性発酵ブロスを約４０℃〜約８０℃に約１分間〜最長約３時間にわたり加熱することによって、前記水性発酵ブロスを低温殺菌することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記水性発酵ブロスを、約３０分間〜約１８時間、または３時間超〜約１８時間、または３時間超〜約８時間にわたり加熱することを含む、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）前記水性発酵ブロスを、約９０℃〜約１５０℃、または約１００℃〜約１５０℃、または約１１０℃〜約１５０℃、または約１２０℃〜約１５０℃、または約１３０℃〜約１５０℃の温度にて、約３０分間〜約１８時間、または３時間超〜約１８時間、または３時間超〜約８時間にわたり保持すること；
（ｂ）前記水性発酵ブロスを、加熱インターバル中に撹拌すること；
（ｃ）酸を前記水性発酵ブロスに加えること；
（ｄ）塩基を前記水性発酵ブロスに加えること；および
（ｅ）ビーズミル、ホモジナイザー、オリフィスプレート、高剪断ミキサー、プレス、押出機、圧力破壊、湿式ミリング、乾式ミリング、または他の剪断もしくは機械破壊装置に少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、前記水性発酵ブロスを通過させること
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
溶解発酵ブロスを、ベッセル内で約７０℃〜約１００℃にて約１〜約６０時間にわたり撹拌することをさらに含む、請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
塩を前記ベッセル内の前記溶解発酵ブロスに加えることをさらに含み、
好ましくは、前記塩は、ＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
最大約２重量％の前記塩を、前記ベッセル内の前記溶解発酵ブロスに加えることを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ベッセル内の前記溶解発酵ブロスのｐＨを約３〜約１１に調整するために、塩基を加えることをさらに含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記脂質を、遠心分離により、前記溶解発酵ブロスから分離することをさらに含む、請求項６８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記水性発酵ブロスは、サトウキビ抽出物を含む、請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記残りのブロス水と共に前記バイオマス固体をリサイクルすることをさらに含む、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。