(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含み、前記リン酸カルシウム系化合物の主成分がハイドロキシアパタイト又はハイドロキシアパタイトの水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたフッ素アパタイトである吸着剤が、帯電物質の分離に適した本来の分離能を有するようにするための処理方法であって、前記処理方法は、
吸着剤の吸着能を変化させる物質又は不純物の存在により本来の分離能から変化した分離能を有する可能性がある吸着剤を準備する工程と、
５ｍＭ〜２０ｍＭであるリン酸緩衝剤溶液中に前記吸着剤を０．５時間以上２４時間以下に亘って静置する静置工程を含み、
前記静置工程で用いられるリン酸緩衝剤溶液のｐＨ値が６〜６．５である、処理方法。
【請求項２】
前記静置工程において用いられるリン酸緩衝剤溶液がさらにアルコールを含む、請求項１に記載の処理方法。
【請求項３】
少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含み、前記リン酸カルシウム系化合物の主成分がハイドロキシアパタイト又はハイドロキシアパタイトの水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたフッ素アパタイトであるである吸着剤が、帯電物質の分離に適した本来の分離能を有するようにするための処理方法であって、前記処理方法は、
吸着剤の吸着能を変化させる物質又は不純物の存在により本来の分離能から変化した分離能を有する可能性がある吸着剤を準備する工程と、
ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液又はＭＥＳ緩衝剤溶液中に前記吸着剤を１日以上に亘って静置する静置工程を含み、
前記静置工程で用いられるＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液又はＭＥＳ緩衝剤溶液は、アルコールを含み、
前記ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液のｐＨが７．５〜８．０であり、
前記ＭＥＳ緩衝剤溶液のｐＨが６．５〜７．０である、
吸着剤の処理方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の静置工程の後に、フレッシュなリン酸緩衝剤溶液をカラムに通液させて該カラムを平衡化する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の処理方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の処理方法を行うことによって、帯電物質の分離に適した分離能を有する吸着剤を得る、吸着剤の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤（充填剤）の生産方法に関する。より詳しくは、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤の生産方法であって、得られる吸着剤が有する分解能が変動するのを抑制又は防止した生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】ハイドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウム系化合物は、生体親和性に優れることから、従来から、試料液中に含まれるタンパク質等の帯電物質を吸着・分離する液体クロマトグラフィー用カラム（吸着装置）に使用する吸着剤として広く利用されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】この液体クロマトグラフィー用カラムでは、試料液中に含まれる帯電物質を、リン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤に吸着させた後に、吸着剤から離脱させることにより分離させ、この吸着・分離を繰り返して実施することにより、試料液中に含まれる帯電物質の分離を複数回に亘って行うことができる。【０００４】ところで、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤を用いた帯電物質の分離は、期間を空けることなく繰り返して実施されることもあるし、又は、分離の実施から７日間以上のような一定期間（保存期間）を空けた後に実施されることもある。帯電物質の分離を行うまでの一定期間においては、吸着剤は、高濃度の水酸化ナトリウム溶液（例えば、約１．０Ｍ）又はリン酸緩衝液（例えば、約０．４Ｍ）等の保存液中に保存されることがある。【０００５】本発明者は、このような一定期間に亘る保存液中での保存の後に、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤を用いて帯電物質の分離を実施すると、リン酸サイトに結合する塩基性タンパク質のような正帯電物質は、吸着剤から分離する正帯電物質の分離位置（溶出時間）が変化しないが、カルシウムサイトに結合する酸性タンパク質のような負帯電物質は、吸着剤から分離する分離位置（溶出時間）が変化することを発見した。【０００６】液体クロマトグラフィー用カラムから流出する流出液を、所定量ずつ分画することによって、分画された各画分の流出液中に、負帯電物質を分離しようとする際には、負帯電物質が分離される画分が、保存期間の前後において変化してしまう。従って、所望の負帯電物質を回収するためには、保存期間の前後で、回収すべき画分を再設定する必要が生じるため、時間と手間とを要するという問題が生じる。本発明者は、そのような問題があることを発見した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５３４２５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】本発明の目的は、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤の生産において、得られる吸着剤が有する分解能が変動するのを抑制又は防止することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】本発明は好ましい一実施態様において下記のいずれかの態様を有する。
（Ａ１）少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含み、分離能を有する吸着剤を得るための吸着剤の生産方法であって、前記生産方法は、
吸着剤を準備する工程と、
第１の溶媒と第１の添加物とを含む第１の溶液中に前記吸着剤を浸漬する第１の工程と、
第２の溶媒と第２の添加物とを含む第２の溶液に前記吸着剤を接触させる第２の工程と、
を含み、
前記第１の添加物は、前記第１の溶媒に加えられた際に、前記吸着剤を構成するカルシウム元素の、被吸着剤に対する吸着力に影響を与える能力を有し、
前記第２の溶液中の前記第２の添加物のモル濃度は、前記第１の溶液中の前記第１の添加物のモル濃度よりも低く、
前記第２の工程は、前記第１の工程よりも後に行われる、生産方法。
（Ａ２）
前記第２の溶液が、ｐＨ緩衝剤を含む、Ａ１に記載の生産方法。
（Ａ３）
前記第１の添加物が、塩基、塩およびアルコールからなる群より選択される１つ以上を含む、Ａ１又はＡ２記載の生産方法。
（Ａ４）
前記帯電物質が、負に帯電した部分を有する、Ａ１〜Ａ３のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ５）
前記第１の添加物の濃度が、約０．０１Ｍ以上約２．０Ｍ以下である、Ａ１〜Ａ４のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ６）
前記第２の添加物の濃度をＡ［Ｍ］とし、前記第１の添加物の濃度をＢ［Ｍ］としたとき、Ａ／Ｂが、約０．００１以上約０．１以下である、Ａ１〜Ａ５のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ７）
前記第２の工程は、前記第２の溶液中に前記吸着剤を静置させる静置工程を含み、
前記静置工程は、約０．１時間以上約２４時間以下である、Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ８）
前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とする、Ａ１〜Ａ７のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ９）
前記第１の添加物が、水酸化ナトリウムを含み、
前記第２の添加物が、リン酸緩衝剤を含む、Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ１０）
前記第１の添加物および前記第２の添加物が、リン酸緩衝剤を含む、Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ１１）
前記第１の添加物が、水酸基含有化合物とｐＨ緩衝剤との組み合わせを含む、Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ１２）
前記第１の添加物が、水酸基含有化合物とスルホ基を有する緩衝剤との組み合わせを含む、Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の生産方法。
（Ａ１３）
少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含み、分離能を有する吸着剤を得るための吸着剤の生産方法に用いるための溶液セットであって、
前記溶液セットは、第１の溶媒と第１の添加物とを含む第１の溶液と、第２の溶媒と第２の添加物とを含む第２の溶液とを含み、
前記第１の添加物は、前記第１の溶媒に加えられた際に、前記吸着剤を構成するカルシウム元素の、被吸着剤に対する吸着力に影響を与える能力を有し、
前記第２の溶液中の前記第２の添加物のモル濃度は、前記第１の溶液中の前記第１の添加物のモル濃度よりも低く、
前記生産方法が、Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の生産方法である、溶液セット。
（Ａ１４）
少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含み、分離能を有する吸着剤を得るための吸着剤の生産方法における溶液セットの使用であって、
前記溶液セットは、第１の溶媒と第１の添加物とを含む第１の溶液と、第２の溶媒と第２の添加物とを含む第２の溶液とを含み、
前記第１の添加物は、前記第１の溶媒に加えられた際に、前記吸着剤を構成するカルシウム元素の、被吸着剤に対する吸着力に影響を与える能力を有し、
前記第２の溶液中の前記第２の添加物のモル濃度は、前記第１の溶液中の前記第１の添加物のモル濃度よりも低く、
前記生産方法が、Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の生産方法である、使用。
（Ａ１５）
Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の生産方法によって生産された吸着剤。
（Ａ１６）
Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の生産方法によって生産された吸着剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラム。【００１０】本発明の生産方法の技術は、吸着剤の吸着能の変化を抑制又は防止して安定化させることができるので、安定化方法としても使用することができる。本発明の安定化方法は、好ましくは下記の態様を有する。以下の安定化方法の記載は、本発明の生産方法にも適用可能である。
（１）  水と、塩基、塩およびアルコールのうちの少なくとも１種の添加物とを含む保存液中に保存された、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤の分離能を安定させる安定化方法であって、
前記吸着剤は、前記保存液中に保存することで、前記吸着剤に吸着した負帯電物質の溶出時間が、保存前の前記負帯電物質の溶出時間よりも短くなっており、
前記保存液中における前記添加物の含有量よりも低い含有量となっている前記添加物を含む処理液に前記吸着剤を接触させる処理工程を有することを特徴とする安定化方法。【００１１】これにより、吸着剤の分離能の安定化が図られ、吸着剤から負帯電物質が分離する溶出時間が長くなり、結果として、保存液により保存する前とほぼ同一の溶出時間に復帰させることができる。そのため、保存液中における保存の前後において、正帯電物質と同様に、負帯電物質についても、分離位置（溶出時間）に変化が生じるのを的確に抑制または防止することができる。【００１２】したがって、吸着剤が充填された吸着装置から流出する流出液を、所定量ずつ分画することで、分画された各画分の流出液中に、負帯電物質を分離する際に、負帯電物質が分離される画分に、保存液による保存の前後において、ズレが生じるのを的確に抑制または防止することができる。よって、負帯電物質を回収すべき画分を再設定する必要がなくなることから、時間と手間とを要することなく、試料液中からの負帯電物質の分離（精製）を行うことができる。【００１３】（２）  前記保存液において、前記添加物は前記塩基であり、前記塩基は、水酸化ナトリウムである上記（１）に記載の安定化方法。【００１４】これにより、吸着剤に残存する夾雑タンパク質のような他の物質のさらなる溶出を図ることができる他、さらに、吸着剤における保存時のバクテリア等の発生を的確に抑制または防止することができる。【００１５】（３）  前記保存液における、前記添加物の濃度は約０．０１Ｍ以上約２．０Ｍ以下である上記（１）または（２）に記載の安定化方法。【００１６】これにより、吸着剤に残存する夾雑タンパク質のような他の物質のさらなる溶出を図ることができる。【００１７】（４）  前記処理液における前記添加物の濃度をＡ［Ｍ］とし、前記保存液における前記添加物の濃度をＢ［Ｍ］としたとき、Ａ／Ｂは、約０．００１以上約０．１以下である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の安定化方法。【００１８】これにより、吸着剤による負帯電物質の溶出時間を、保存液により保存する前とほぼ同一の時間により確実に復帰させることができる。【００１９】（５）  前記処理工程において、前記処理液中に前記吸着剤を静置させ、前記処理剤を静置する時間は、約０．１時間以上約２４時間以下である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の安定化方法。【００２０】これにより、吸着剤による負帯電物質の溶出時間を、保存液により保存する前とほぼ同一の時間により確実に復帰させることができる。【００２１】（６）  前記処理液において、前記添加物は前記塩であり、前記処理液は、リン酸緩衝液である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の安定化方法。【００２２】これにより、吸着剤による負帯電物質の溶出時間を、保存液により保存する前とほぼ同一の時間により確実に復帰させることができる。【００２３】（７）  前記リン酸緩衝液は、そのｐＨが約６．０以上約７．５以下である上記（６）に記載の安定化方法。【００２４】これにより、吸着剤による負帯電物質の溶出時間を、保存液により保存する前とほぼ同一の時間により確実に復帰させることができる。【００２５】（８）  前���負帯電物質は、酸性タンパク質である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の安定化方法。【００２６】これにより、吸着剤による酸性タンパク質の溶出時間を、保存液により保存する前とほぼ同一の時間により確実に復帰させることができる。【００２７】（９）  前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の安定化方法。【００２８】  ハイドロキシアパタイトは、生体を構成する成分に近いため、帯電物質として特にタンパク質を吸着・分離する際に、かかるタンパク質が変質（変性）するのを好適に防止することができる。
【発明の効果】
【００２９】本発明の生産方法は、リン酸カルシウム系化合物を含むで構成される吸着剤の生産において、得られる吸着剤が有する分解能が変動するのを抑制又は防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の安定化方法を適用し得る吸着剤を備える吸着装置の一例を示す縦断面図である。
【図２】実施例１における、保存液による保存前後での溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２における、保存液による保存前後での溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図４】実施例３における、保存液による保存前後での溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図５】比較例１における、保存液による保存前後での溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図６】比較例２における、保存液による保存前後での溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図７】実施例４において、それぞれ異なる濃度のリン酸緩衝液を、それぞれ保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を示すグラフである。
【図８】それぞれ異なるｐＨのリン酸緩衝液を、それぞれ保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を示すグラフである。
【図９】比較例３において、２０％エタノールを保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間との差を示すグラフである。
【図１０】実施例６において、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．５）を保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間との差を示すグラフである。
【図１１】実施例７において、２０％エタノールを含み、それぞれ濃度が異なるリン酸緩衝液を、それぞれ保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を示すグラフである。
【図１２】実施例８において、２０％エタノールを含み、それぞれ異なるｐＨのリン酸緩衝液を、それぞれ保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を示すグラフである。
【図１３】実施例９において、２０％エタノールを含み、それぞれｐＨ値が異なるリン酸緩衝液を、それぞれ保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を示すグラフである。
【図１４】本発明の生産方法の各工程を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】  以下、本発明の生産方法及び安定化方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。まず、本発明の生産方法及び安定化方法について説明するのに先立って、本発明の生産方法及び安定化方法を適用し得る吸着剤を備える吸着装置の一例について説明する。
【００３２】  なお、以下では、吸着装置を用いて分離する帯電物質がタンパク質である場合、すなわち、負帯電物質が酸性タンパク質であり、正帯電物質が塩基性タンパク質である場合を一例として説明する。
【００３３】  ＜吸着装置＞
図１は、本発明の生産方法及び安定化方法を適用し得る吸着剤を備える吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００３４】  ここで、流入側とは、目的とするタンパク質を分離（精製）する際に、例えば、試料液（試料を含む液体）、溶出液であるリン酸系緩衝液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が吸着装置内から流出する側のことを言う。
【００３５】  タンパク質を試料液から分離（精製）する、図１に示す吸着装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００３６】  カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００３７】  カラム本体２１は、例えば、円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料は、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、若しくは、各種セラミックス材料等であってもよいし、又は、これらの任意の組み合わせであってもよい。
【００３８】  カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００３９】  このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００４０】  吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、約０．１ｍＬ以上約１００ｍＬ以下が好ましく、約１ｍＬ以上約５０ｍＬ以下がより好ましい。
【００４１】  また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００４２】  各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、前記液体が供給される。また、吸着剤３に供給された液体は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、試料液（試料）に含まれる分離すべきタンパク質（以下、単に「タンパク質」と言うこともある）と、分離すべきタンパク質以外の物質（分離すべきタンパク質以外の夾雑タンパク質（以下、単に「夾雑タンパク質」と言うこともある）が含まれていてもよい）とは、吸着剤３に対する吸着性の差異およびリン酸系緩衝液に対する親和性の差異に基づいて分離される。
【００４３】  各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００４４】  吸着剤３は、少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含む。吸着剤３は、より好ましくは、その少なくとも表面が、リン酸カルシウム系化合物で構成されている。かかる吸着剤３には、分離すべきタンパク質が、このタンパク質固有の吸着（担持）力で特異的に吸着し、この吸着力の差に応じて、分離すべきタンパク質以外の他の物質（夾雑タンパク質を含む）と分離・精製される。
【００４５】  リン酸カルシウム系化合物は、例えば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、ＴＣＰ（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＤＣＰＤ（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、若しくは、これらの一部が他の原子または原子団で置換されたもの等であってもよいし、又は、これらのうちの１種または２種以上の組み合わせであってもよい。
【００４６】  ここで、タンパク質は、一般的に、その構成アミノ酸として酸性アミノ酸を比較的多く含み負に帯電する酸性タンパク質と、塩基性アミノ酸を比較的多く含み正に帯電する塩基性タンパク質とに分類される。
【００４７】  リン酸カルシウム系化合物は、その結晶構造中に、正に帯電するＣａサイトと、負に帯電するリン酸サイトとを有している。
【００４８】  したがって、酸性タンパク質は、リン酸カルシウム系化合物が有するＣａサイトと、該酸性タンパク質の酸性アミノ酸残基との間でイオン結合が形成されることにより、リン酸カルシウム系化合物に吸着される。塩基性タンパク質は、リン酸カルシウム系化合物が有するリン酸サイトと、塩基性アミノ酸残基との間でイオン結合が形成されることにより、リン酸カルシウム系化合物に吸着される。タンパク質のリン酸カルシウム系化合物に対する結合（吸着）の強度は、各タンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）の帯電量に応じて異なる。
【００４９】  このため、その少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤３を用いれば、タンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）と、他の物質（例えば、夾雑タンパク質等）とを、これらの吸着剤３に対する吸着力の差を利用して分離することが可能となる。
【００５０】  リン酸カルシウム系化合物は、上述したものの中でも、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものが好ましい。特に、ハイドロキシアパタイトは、生体を構成する成分に近いため、タンパク質を吸着・分離する際に、かかるタンパク質が変質（変性）するのを好適に防止することができる。また、溶出液として、リン酸系緩衝液の塩濃度を変えて用いることで、タンパク質を、吸着剤３から特異的に取り外すことができるという利点も有する。
【００５１】  ここで、リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトを「主成分とする」とは、リン酸カルシウム系化合物の全質量を１００質量％としたとき、ハイドロキシアパタイトの質量が約５０％以上であることを意味する。この質量は、より好ましくは約６０％以上であり、さらに好ましくは約７０％以上であり、さらにより好ましくは約８０％以上であり、最も好ましくは約９０％以上である。
【００５２】  さらに、ハイドロキシアパタイトは、それが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたものであってもよい。フッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイト（以下、「フッ素アパタイト」と言う）は、その結晶構造中にフッ素原子（フッ素イオン）が存在することにより、カルシウム原子（カルシウムイオン）のフッ素アパタイトからの離脱をより確実に防止することができる。
【００５３】  なお、以下では、ハイドロキシアパタイトおよびフッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイトを、総称して「アパタイト」と言うこともある。
【００５４】  上記吸着剤３は、図１に示すように、粒状（顆粒状）の形態（形状）を有することが好ましい。上記吸着剤３の形態は、例えば、ペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等であってもよい。吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、タンパク質の分離特性の向上を図ることができる。
【００５５】  粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、約０．５μｍ〜約１５０μｍであるのが好ましく、約１０μｍ〜約８０μｍであるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００５６】  吸着剤３は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであってもよく、又は、担体（基体）の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したものであってもよい。これらの中でも、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであるのが好ましい。これにより、吸着剤３の強度をさらに向上することができる。また、多量のタンパク質を分離する際の使用に適したカラム２を得ることができる。
【００５７】  その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤３は、例えば、湿式合成法や乾式合成法を用いて、リン酸カルシウム系化合物粒子（一次粒子）を得、かかるリン酸カルシウム系化合物粒子を含有するスラリーを、乾燥や造粒することにより、乾燥粒子を得、さらに、この乾燥粒子を焼成する等して得ることができる。
【００５８】  一方、担体の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆した吸着剤３は、例えば、樹脂等で構成される担体に、前記乾燥粒子を衝突（ハイブリダイズ）させる方法等により得ることができる。
【００５９】  本実施形態のように、吸着剤３を吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填する場合には、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成を有していることが好ましい。これにより、吸着装置１は、タンパク質の分離（精製）能が特に優れたものとなる。
【００６０】  なお、吸着剤充填空間２０の一部（例えば流入管２４側の一部）に吸着剤３を充填し、その他の部分には他の吸着剤を充填してもよい。
【００６１】  ＜分離方法＞
次に、このような吸着装置１を用いたタンパク質の分離方法について説明する。
【００６２】  ［１Ａ］  調製工程
まず、分離（精製）すべきタンパク質と、分離すべきタンパク質以外の物質（混合物）とを含有する試料液を用意する。
【００６３】  タンパク質が遺伝子組み換えタンパク質（モノクローナル抗体等）である場合、試料液は、タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸を導入したヒツジ、ウサギ、ニワトリ等の哺乳動物、カイコ等の昆虫のような動物、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞のような動物細胞、大腸菌のような微生物等からの分泌物、それらの細胞質成分等、又は、それらの任意の組み合わせであってもよい。
【００６４】  タンパク質が天然のタンパク質である場合、試料液は、例えば、各種動物由来の血液（血漿）、リンパ液、唾液、鼻汁のような体液等であってもよい。
【００６５】  タンパク質のうち酸性タンパク質は、例えば、ＢＳＡ、ＨＳＡ、フィブリノゲン、ペプシノーゲン、α−グロブリン、β−グロブリン、又は、γ−グロブリン等であってもよい。また、塩基性タンパク質は、例えば、リゾチーム、ソーマチン、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシン、ヒストン、プロタミン、ポリリジン、又は、モネリン等であってもよい。
【００６６】  なお、これらのタンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）は、そのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられた改変体であってもよい。
【００６７】  試料液としては、前記微生物等からの分泌物や、動物由来の体液をそのまま用いてもよい。あるいは、試料液は、これらを水や生理食塩水のような中性緩衝液中で希釈したもの、およびフィルタ等の濾過膜で濾過したものであってもよい。また、試料液には、複数種のタンパク質が含まれていてもよい。
【００６８】  ［２Ａ］  供給工程
次に、得られた試料液を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２（吸着装置１）内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
【００６９】  これにより、吸着剤３に対して吸着能が高いタンパク質や、分離（精製）すべきタンパク質以外の混入物（夾雑タンパク質等）の中でも吸着剤３に対して比較的吸着能の高いもの（タンパク質）は、カラム２内に保持される。そして、吸着剤３に対して吸着能の低い混入物は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。
【００７０】  ［３Ａ］  分画工程
次に、流入管２４からカラム２内に、タンパク質を溶出させるための溶出液として例えばリン酸系緩衝液を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。これにより、吸着剤３に吸着しているタンパク質および混入物は、それぞれが有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて異なるタイミングでそれぞれ流出し、それぞれが、各分画内に溶解した状態で回収（分離・精製）される。
【００７１】  すなわち、吸着剤３には、タンパク質および混入物が、それぞれに固有の吸着（担持）力で特異的に吸着している。つまり、それらには、吸着剤３に対する吸着力に差がある。この吸着力の差に応じて、タンパク質と混入物とが分離、精製される。分離（精製）すべきタンパク質が溶解している分画を選択的に回収することによって、精製されたタンパク質を得ることができる。
【００７２】  溶出液において用いられる緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ等のＧｏｏｄバッファ、硫酸塩、又は、リン酸塩であることが好ましい。これらの中でも、スルホ基を有する緩衝剤及びリン酸塩がより好ましい。スルホ基を有する緩衝剤は、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳであることが好ましい。リン酸塩は、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、又は、リン酸アンモニウム等であってもよい。これらの中でも、リン酸ナトリウムが最も好ましい。
【００７３】  上記Ｇｏｏｄバッファを含む溶出液のｐＨは、各ＧｏｏｄバッファのｐＨ緩衝機能を発揮し得る範囲であればよいが、下記表に記載の「Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｐＨ」であることがより好ましい。
0006951051.tif 000002
【００７４】  リン酸系緩衝液（リン酸塩を溶解させた溶液）のｐＨは、好ましくは約５．５〜８．５、より好ましくは約６．５〜７．５に設定される。これにより、タンパク質を確実に溶出させることができ、その精製率の向上を図ることができる。
【００７５】  緩衝液（溶出液）の温度は、好ましくは約１０〜５０℃であり、より好ましくは約２０〜３５℃である。これにより、分離するタンパク質の変質（変成）を防止することができる。
【００７６】  したがって、かかるｐＨ範囲および温度範囲の緩衝液を用いることにより、目的とするタンパク質の回収率を向上できる。
【００７７】  緩衝液の塩濃度は、５００ｍＭ以下であるのが好ましく、４００ｍＭ以下であるのがより好ましい。このような塩濃度の緩衝液を用いて、タンパク質の分離を行うことにより、リ衝液中の金属イオンによるタンパク質への悪影響を防止することができる。
【００７８】  塩濃度が約１〜４００ｍＭの緩衝液がさらに好ましく用いられる。また、緩衝液の塩濃度は、タンパク質の分離操作の際に、連続的または段階的に変化させるのが好ましい。これにより、タンパク質の分離操作を効率化できる。
【００７９】  緩衝液の流速は、０．１〜１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、タンパク質の分離を行うことにより、分離操作に長時間を要することなく、目的とするタンパク質を確実に分離すること、すなわち、高純度なタンパク質を得ることができる。
【００８０】  以上のような操作により、所定の画分に、タンパク質が回収される。これにより、分離すべき精製されたタンパク質が、所定の画分中に得られる。
【００８１】  上記溶出液は、上記緩衝剤に加えてアルコールをさらに含んでいてもよい。上記溶出液が緩衝剤に加えてアルコールを含む場合、アルコールは、例えば、メタノール、エタノール、又は、イソプロパノールであってもよい。これらの中でも、エタノールが特に好ましい。
【００８２】  上記溶出液中のアルコールの濃度は、例えば、溶出液の全質量を１００％としたとき、１％以上であってもよい。より好ましくは２％〜５０％であり、さらに好ましくは５％〜４０％であり、さらにより好ましくは１０％〜３０％であり、最も好ましくは１５％〜２５％である。上記溶出液中のアルコールの濃度が上記範囲であることにより、他の物質のさらなる溶出および／またはバクテリア等の発生の抑制という効果がより顕著に発揮されると共に、吸着剤の吸着能への悪影響を最小限にできる。
【００８３】  次いで、上記工程１Ａ〜３Ａを行ったカラムには、以下で述べるように、本発明の安定化方法が適用される。従って、上記工程１Ａ〜３Ａは、本発明の安定化方法を適用するためのカラムを用意する工程であると理解することができる。また、本発明を生産方法においては、上記工程１Ａ〜３Ａは、本発明の生産方法の材料となるカラムを用意する工程であると理解することができる。本発明の生産方法の「材料となるカラム」は、すでに使用されることにより、吸着剤の吸着能を変化させる物質が含まれている（可能性がある）カラム、又は、未使用であっても、不純物の存在等の何らかの理由により、吸着能が変化した吸着剤を有するカラムである。この工程は、図１４におけるＳ１０１に該当する。
【００８４】  ＜安定化方法＞［４Ａ］  保存工程
ここで、この吸着装置１を用いたタンパク質の分離方法では、一般的に、上述したタンパク質の分離（精製）の後に、期間を空けることなく、高濃度の緩衝液（リン酸系緩衝液等）を用いて、吸着剤３に吸着する他の物質（夾雑タンパク質等）を溶出させて洗浄し、その後、再度、タンパク質の分離に吸着装置１を供することで、タンパク質の分離が繰り返して実施される。
【００８５】  あるいは、吸着剤３は、１〜７日間程度のような一定期間（保存期間）を空けた後に、吸着装置１においてタンパク質の分離に用いられることもある。この場合、帯電物質の分離までの一定期間において、他の物質のさらなる溶出および／またはバクテリア等の発生の抑制を目的に、通常、高濃度の水酸化ナトリウム溶液（例えば、１．０Ｍ程度）やリン酸緩衝液（例えば０．４Ｍ程度）、さらにはエタノール水溶液（例えば２０％（０．３Ｍ）程度）等の保存液中に吸着剤３が保存される。すなわち、吸着剤３は、一定期間において、水と、塩基、塩およびアルコールのうちの少なくとも１種の添加物（本明細書において「第１の添加物」ともいう）とを含む保存液（本明細書において「第１の溶液」ともいう）中に保存される。保存工程（４Ａ工程）は、吸着剤を保存液に浸漬する工程であり、図１４におけるＳ１０２に該当する。
【００８６】  しかしながら、このような一定期間をおいた後に、吸着装置１を用いたタンパク質の分離を実施すると、タンパク質のうち、リン酸サイトに結合する塩基性タンパク質は、塩基性タンパク質の分離位置（溶出時間）に変化がしないが、カルシウムサイトに結合する酸性タンパク質は、吸着剤３から分離する分離位置（溶出時間）が変化することがある。より具体的には、吸着剤３から酸性タンパク質が分離する溶出時間が、保存液中における保存前の溶出時間よりも短くなる。
【００８７】  前記保存液中の添加物（第１の溶液中の第１の添加物）の濃度は、好ましくは約０．０１Ｍ以上約２．０Ｍ以下、より好ましくは約０．１Ｍ以上約１．０Ｍ以下である。例えば、添加物が塩基としての水酸化ナトリウムである場合、水酸化ナトリウムの濃度は、約０．１Ｍ以上約１．０Ｍ以下であってもよい。また、保存液が添加物として塩基を含むリン酸緩衝液である場合、塩基の濃度は、約０．１Ｍ以上約０．５Ｍ以下であってもよい。さらに、添加物がアルコールである場合、アルコールの濃度は、約０．２Ｍ以上約０．６Ｍ以下であってもよい。水酸化ナトリウムの濃度をかかる濃度範囲に設定することで、他の物質（夾雑タンパク質）のさらなる溶出およびバクテリア等の発生の抑制の双方をより高めることができる。また、リン酸緩衝液の濃度をかかる濃度範囲に設定することで、他の物質をさらに溶出させることができる。さらに、アルコールの濃度をかかる濃度範囲に設定することで、バクテリア等の発生をより抑制できる。
【００８８】  保存液中含まれる添加物は、塩基、塩、又は、アルコールであってもよい。これらのうちでも塩基であることが好ましい。塩基であるため、水酸化ナトリウムであることが特に好ましい。これにより、他の物質（夾雑タンパク質）のさらなる溶出を図ることができる。さらに、吸着剤３におけるバクテリア等の発生をより強く抑制することができる。
【００８９】  本発明の安定化方法は、以上のような一定期間をおいた後の吸着剤３において、この吸着剤３が備えるカルシウムサイトに吸着する酸性タンパク質の吸着能（分離能）の変化を抑制又は防止する。これにより、吸着剤３から酸性タンパク質が分離する溶出時間が短くなるのを抑制または防止する。本発明の安定化方法は、下記［１Ｂ］に示す処理工程を有する。
【００９０】  ［１Ｂ］  処理工程
処理工程は、第２の添加物を含む第２の溶液（本明細書において「処理液」ともいう）中に吸着剤３を接触させる（好ましくは、該第２の溶液中に静置する）工程である。前記第２の溶液中の第２の添加物のモル濃度は、前記第１の溶液中の第１の添加物のモル濃度よりも低い。工程１Ｂ（処理工程）は、図１４におけるＳ１０３に該当する。
【００９１】  より具体的には、カラム２内において、保存液中に保存されている吸着剤３に対して、流入管２４からカラム２内に、処理液を供給する。そして、流出管２５から保存液が流出し、カラム２内の全体が、保存液から処理液に置換された時点で、流入管２４からの処理液の供給を停止する。このようにカラム２内への処理液の供給が停止されることで、処理液中に吸着剤３が静置される。
【００９２】  前述の通り、本工程［１Ｂ］による処理の以前では、保存液中における保存により吸着剤３から酸性タンパク質が分離する溶出時間が短くなっているが、本工程［１Ｂ］において、吸着剤３を処理液中に静置することで、その作用機序は明らかではないが、吸着剤３の分離能の安定化が図られ、吸着剤３から酸性タンパク質が分離する溶出時間が長くなる。この結果として、該溶出時間を、保存液により保存する前とほぼ同一の溶出時間に復帰させることができる。すなわち、酸性タンパク質の分離位置（溶出時間）が、保存液中における保存の前後において変化するのを抑制または防止することができる。
【００９３】  したがって、保存期間の前後において、酸性タンパクの溶出のタイミングにズレが生じるのを抑制または防止することができる。よって、酸性タンパク質を回収すべき画分を再設定する必要がなくなることから、時間と手間とを要することなく、試料液中からの酸性タンパク質の分離（精製）を行うことができる。
【００９４】  本明細書中において、処理液中における吸着剤３の静置とは、吸着剤３を処理液中に浸漬した状態で、流入管２４からの処理液の供給、および流出管２５からの処理液の排出が停止されている状態のことをいう。静置は、例えば、超音波による振動や、シェーカーを用いた揺動が付与されていてもよい。
【００９５】  処理液は、保存液中における添加物のモル濃度よりも、添加物のモル濃度が低いことが好ましい。保存液中に含まれる添加物（第１の添加物）の種類と、処理液中に含まれる添加物（第２の添加物）の種類は同一であっても異なっていてもよい。第１の添加物及び第２の添加物は、塩基、塩およびアルコールのうちの少なくとも１種を含むものであれば、１種類又はそれらのいかなる組み合わせのものであってもよい。第１の添加物及び第２の添加物は、添加物として塩を含むリン酸緩衝液であることが好ましい。これにより、保存液により保存する前とほぼ同一の溶出時間により近く復帰させることができる。また、後述する次工程［２Ｂ］における、吸着剤３の緩衝液による置換を省略することができるため、工程の簡略化を図ることができる。なお、リン酸緩衝液としては、前記工程［３Ａ］と、同様のものを用いることができる。
【００９６】  処理液としてリン酸緩衝液を用いる場合、リン酸緩衝液のｐＨは、約６．０以上約７．５以下であることが好ましく、約６．５であることがより好ましい。これにより、保存液により保存する前とほぼ同一の溶出時間により復帰させることができる。
【００９７】  処理液における添加物の濃度をＡ［Ｍ］とし、保存液における添加物の濃度をＢ［Ｍ］としたとき、Ａ／Ｂは、約０．００１以上約０．１以下であることが好ましく、約０．０１以上約０．０５以下であることがより好ましい。
【００９８】  処理液中に吸着剤３を静置する時間は、約０．１時間以上約２４時間以下であることが好ましく、約０．５時間以上約２時間以下であることがより好ましい。
【００９９】  処理液における添加物の濃度および処理液中に吸着剤３を静置する時間を、それぞれ、前述した範囲内に設定することにより、保存液により保存する前の溶出時間により近く復帰させることができる。
【０１００】  上記説明では、本工程［１Ｂ］において、処理液中に吸着剤３を静置する場合について説明したが、本工程［１Ｂ］では、処理液に吸着剤３が接触していればよい。流入管２４からカラム２内に対する処理液の供給を継続して、吸着剤３に処理液が通液された状態を維持することによっても、吸着剤３を処理することができる。ただし、処理液中に吸着剤３を静置する方法を選択することで、無駄となる処理液を減少させることができる。また、吸着剤３に処理液を通液する方法を選択した場合、処理液の流速は、好ましくは約０．１ｍＬ／分以上約１０ｍＬ／分以下であり、より好ましくは約１ｍＬ／分以上約５ｍＬ／分以下である。さらに、処理液を通液する時間は、好ましくは約０．１時間以上約２４時間以下であり、より好ましくは約０．５時間以上約２時間以下である。
【０１０１】  ［２Ｂ］  置換工程
次に、流入管２４からカラム２内に、緩衝液を供給することで、カラム２内をこの緩衝液に置換する。
【０１０２】  これにより、吸着剤３を緩衝液で浸漬された状態とされ、再度、吸着装置１を、前述した分離方法に供することが可能なものとして準備することができる。使用不能になった吸着剤３を分離方法に再び供することができるようにするという観点では、これらの処理は、吸着剤３の生産方法である。これらの処理の後に、吸着剤３を再び分離方法に供する工程は、図１４のＳ１０４に該当する。
【０１０３】  この緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液であってもよい。このリン酸緩衝液としては、例えば、前記工程［３Ａ］と同様のものを用いることができる。
【０１０４】  前記処理工程［１Ｂ］において処理液としてリン酸緩衝液を用いた場合には、本工程［２Ｂ］を省略することもできる。
【０１０５】  以上のような操作により、吸着剤３が備えるカルシウムサイトに結合する酸性タンパク質の分離能の変化が抑制又は防止される。、これにより、吸着剤３は、上述した分離（精製）に供することができる。
【０１０６】  以上の説明では、タンパク質を帯電物質の一例としたが、負帯電物質は、酸性タンパク質の他、酸性アミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、負電荷リポソーム等であってもよい。正帯電物質は、塩基性タンパク質の他、塩基性アミノ酸、正電荷コレステロール、又は、正電荷リポソーム等であってもよい。
【０１０７】  以上、本発明の安定化方法及び生産方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１０８】  本発明の安定化方法及び生産方法においては、任意の目的で、１以上の工程が追加されてもよい。
【実施例】
【０１０９】  次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．吸着装置の製造
吸着剤（充填剤）としてハイドロキシアパタイト（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ＣＨＴ  ４０μｍ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）を、ステンレスカラム（内径４．０ｍｍ×長さ１００ｍｍ）の充填空間にほぼ満量となるように充填することにより、吸着装置を製造した。【０１１０】  ２．吸着装置によるタンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）の分離
（実施例１）
２−１．保存液による保存前の吸着装置によるタンパク質の分離
＜１Ａ＞  まず、酸性タンパク質としてのＢＳＡ（牛血清アルブミン）の含有量が１０ｍｇ／ｍＬ、塩基性タンパク質としてのα−キモトリプシノーゲンＡの含有量が５ｍｇ／ｍＬとなるように、ＢＳＡおよびα−キモトリプシノーゲンＡを、それぞれ、１．０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解させて混合液を得た。その後、混合液を０．２２μｍのフィルタで濾過することで試料液を得た。【０１１１】  ＜２Ａ＞  次に、吸着装置を、クロマト装置に装着した。その後、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、温度２５℃）を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着装置を平衡化した。【０１１２】  ＜３Ａ＞  次に、試料液５０μＬを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、吸着装置内に供給した後、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を１５分で１０ｍＭ〜４００ｍＭ（７５％）となるようにグラジエントをかけ、吸着装置内から流出する流出液（溶出液）の吸光度（２８０ｎｍ）を、測定した。【０１１３】  ２−２．保存液による保存後の吸着装置によるタンパク質の分離
＜１Ｂ＞  まず、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液（温度２５℃）の保存液を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着装置に充填された吸着剤を水酸化ナトリウム水溶液（保存液）中に浸漬させた。そして、この状態で、充填剤を７日間保存した。【０１１４】  ＜２Ｂ＞  次に、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（温度２５℃）の処理液を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着装置に充填された吸着剤をリン酸ナトリウム緩衝液（処理液）中に浸漬させた。そして、この状態で、充填剤を１時間保存（静置）した。【０１１５】  ＜３Ｂ＞  次に、吸着装置を、クロマト装置に装着した。その後、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、温度２５℃）を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着装置を平衡化した。【０１１６】  ＜４Ｂ＞  次に、前記工程＜１Ａ＞で調製したのと同様の試料液５０μＬを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、吸着装置内に供給した後、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を１５分で１０ｍＭ〜４００ｍＭ（７５％）となるようにグラジエントをかけ、吸着装置内から流出する流出液（溶出液）の吸光度（２８０ｎｍ）を、測定した。【０１１７】（実施例２）
保存液による保存後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−２．）の検討において、前記工程＜１Ｂ＞で、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液（温度２５℃）に代えて、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（温度２５℃）中に吸着剤を浸漬させたこと以外は、前記実施例１と同様にして、保存液による保存前後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−１．および前記２−２．）の検討を行った。【０１１８】（実施例３）
保存液による保存後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−２．）の検討において、前記工程＜１Ｂ＞の後、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（温度２５℃）で置換してｐＨを６．５にした後、さらに、前記工程＜２Ｂ＞で、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（温度２５℃；処理液）による吸着装置の充填の後、この処理液の通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎでの供給を１時間継続することで、充填材に処理液を接触させたこと以外は、前記実施例１と同様にして、保存液による保存前後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−１．および前記２−２．）の検討を行った。【０１１９】（比較例１）
保存液による保存後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−２．）の検討において、前記工程＜２Ｂ＞を省略したこと以外は、前記実施例１と同様にして、保存液による保存前後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−１．および前記２−２．）の検討を行った。【０１２０】（比較例２）
保存液による保存後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−２．）の検討において、前記工程＜１Ｂ＞で、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液（温度２５℃）に代えて、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（温度２５℃）中に吸着剤を浸漬させ、さらに、前記工程＜２Ｂ＞を省略したこと以外は、前記実施例１と同様にして、保存液による保存前後の吸着装置によるタンパク質の分離（前記２−１．および前記２−２．）の検討を行った。【０１２１】（実施例４）
前記工程＜１Ｂ＞の後に、前記＜２Ｂ＞工程において、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭとそれぞれ異なる濃度のリン酸緩衝液（処理液）中に浸漬させた。そして、この状態で、充填剤を１時間保存（静置）した以外は、実施例１と同様に試験を行った。これらの保存液を用いた後の溶出時間と、該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を測定した。結果を図７に示す。【０１２２】（実施例５）
前記工程＜１Ｂ＞の後に、前記＜２Ｂ＞工程において、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５とそれぞれ異なるｐＨ値を有する１０ｍＭリン酸緩衝液（処理液）中に浸漬させた。そして、この状態で、充填剤を１時間保存（静置）した以外は、実施例１と同様に試験を行った。これらの保存液を用いた後の溶出時間と、該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を測定した。結果を図８に示す。【０１２３】（比較例３）
前記工程＜１Ｂ＞において、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液に代えて、２０％エタノールを保存液として用いた以外は、実施例１と同様に試験を行った。２０％エタノールを保存液として用いた後の溶出時間と該保存液を用いる前の溶出時間との差を測定した。結果を図９に示す。「Ｒｕｎ−１」と実線で示されているのが保存前の溶出時間である。「Ｒｕｎ−２」と破線で示されているのが保存後の溶出時間である。【０１２４】（実施例６）
前記工程＜１Ｂ＞において、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液に代えて、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  ＮａＰ溶液（ｐＨ６．５）を保存液として用い、７日間保存した以外は、実施例１と同様に試験を行った。この保存液を用いた後の溶出時間と、該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を測定した。結果を図１０に示す。「Ｒｕｎ−１」と実線で示されているのが保存前の溶出時間である。「Ｒｕｎ−２」と破線で示されているのが保存後の溶出時間である。【０１２５】（実施例７）
前記工程＜１Ｂ＞において、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液に代えて、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭのそれぞれ異なる濃度のリン酸緩衝液を、それぞれ保存液として用いた以外は、実施例１と同様に試験を行った。これらの保存液を用いた後の溶出時間と、該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を測定した。結果を図１１に示す。【０１２６】（実施例８）
前記工程＜１Ｂ＞において、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液に代えて、２０％エタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液であって、、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、のそれぞれ異なるｐＨ値を有するものを、それぞれ保存液として用いた以外は、実施例１と同様に試験を行った。これらの保存液を用いた後の溶出時間と、該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を測定した。結果を図１２に示す。【０１２７】（実施例９）
前記工程＜１Ｂ＞において、１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液に代えて、２０％エタノールを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５およびｐＨ８．０）、並びに、２０％エタノールを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）を、それぞれ保存液として用いた以外は、実施例１と同様に試験を行った。これらの保存液を用いた後の溶出時間と、該保存液を用いる前の溶出時間とのそれぞれの差を測定した。結果を図１３に示す。【０１２８】３．評価
実施例１、２、３および比較例１、２において、保存液による保存の前後で測定した溶出液の吸光度について、それぞれ、溶出液の溶出時間と前記吸光度との関係を示すグラフを作成し、これらのグラフを図２、３、４および図５、６に示した。【０１２９】  図２、３から明らかなように、実施例１、２では、保存液による吸着剤の保存の後に、処理液による吸着剤の保存（静置）を実施することで、保存液による保存の前後において、塩基性タンパク質としてのα−キモトリプシノーゲンＡの溶出時間、および、酸性タンパク質としてのＢＳＡの溶出時間がともにほぼ一致していた。従って、塩基性タンパク質および酸性タンパク質の吸着剤の分離能が変化していないことが判った。【０１３０】  また、図４から明らかなように、処理液による吸着剤に対する接触を、吸着剤に対する処理液の通液に代えた実施例３においても、吸着剤を処理液中に保存（静置）した実施例１、２と同様の結果が得られた。【０１３１】  これに対して、比較例１、２では、保存液による吸着剤の保存の後において、処理液による吸着剤の保存（静置）が省略された。図５、６から明らかなように、保存液による保存の前後において、塩基性タンパク質としてのα−キモトリプシノーゲンＡの溶出時間がほぼ一致しているものの、酸性タンパク質であるＢＳＡの溶出時間が保存後において短くなっていた。つまり、比較例１、２では、酸性タンパク質の吸着剤の分離能が、吸着剤の保存の後に変化していた。【０１３２】  図７に示されている実施例４においては、リン酸緩衝液が１０ｍＭの濃度であるときに、吸着剤の吸着能の変化が最も小さかった。図８に示されている実施例５においては、１０ｍＭリン酸緩衝液がｐＨ６．０又は６．５であるときに、吸着剤の吸着能の変化が最も小さかった。図９に示されている比較例３においては、２０％エタノールに７日間保存された後の吸着剤は、酸性タンパク質であるＢＳＡの溶出時間が保存後に短くなっていた。【０１３３】  図１０に示されている実施例６においては、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  ＮａＰ溶液（ｐＨ６．５）中に７日間保存された後の吸着剤は、酸性タンパク質であるＢＳＡの溶出時間が保存後にもほとんど変化していなかった。図１１に示されている実施例７においては、０〜１５ｍＭのそれぞれ異なる濃度のリン酸緩衝液中に保存された後の吸着剤は、１０ｍＭの濃度のときにＢＳＡの溶出時間の変化が最も小さかった。【０１３４】  図１２に示されている実施例８において、２０％エタノールを含み、それぞれ異なるｐＨ値を有する１０ｍＭリン酸緩衝液中に保存された後の吸着剤は、ｐＨが６．５のときにＢＳＡの溶出時間の変化が最も小さかった。図１３に示されている実施例９において、２０％エタノールを含み、それぞれ異なるｐＨ値を有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に保存された後の吸着剤は、ｐＨが７．５又は８．０のときに、ＢＳＡの溶出時間の変化が最も小さかった。【０１３５】  本発明の生産方法安及び定化方法によれば、例えば、高濃度の水酸化ナトリウム溶液（例えば、１．０Ｍ程度）やリン酸緩衝液（リン酸系緩衝液、（例えば０．４Ｍ程度））等の保存液中に保存した後のリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤につい��、このリン酸カルシウム系化合物（吸着剤）が備えるカルシウムサイトに結合する負帯電物質の分離能の安定化が図られることとなる。【０１３６】  そのため、吸着剤から分離する分離位置（溶出時間）を、前記保存液による保存の前後において、ほぼ一定に保つことができる。したがって、吸着剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムから流出する流出液を、所定量ずつ分画することで、分画された各画分の流出液中に、負帯電物質を分離する際に、負帯電物質が分離される画分に、前記保存液による保存の前後において、ズレが生じるのを的確に抑制または防止することができる。よって、回収すべき画分を再設定する必要がなくなることから、時間と手間とを要することなく、試料液中からの負帯電物質の分離を行うことができる。【０１３７】  本明細書において、「約」が付された数値は、矛盾が生じない範囲内で当該数値が異なっていてもよいことを示している。「約」が付された数値は、例えば、プラスマイナス１０％の誤差を含む範囲であってもよい。この範囲は、より好ましくはプラスマイナス５％の範囲であり、さらに好ましくはプラスマイナス１％の範囲であり、最も好ましくは誤差がないこと（当該数値そのもの）の範囲である。
【符号の説明】
【０１３８】  １                吸着装置
２                カラム
３                吸着剤
４                フィルタ部材
５                フィルタ部材
２０              吸着剤充填空間
２１              カラム本体
２２              キャップ
２３              キャップ
２４              流入管
２５              流出管【０１３９】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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