【手続補正書】
【提出日】平成30年6月22日(2018.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを同定する方法であって、
（ａ）前記原発腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで継代することであって、前記原発腫瘍の細胞および前記原発腫瘍の継代された細胞は、免疫単離を受けていない、および
（ｂ）少なくとも１つの抗原について、前記原発腫瘍の継代された腫瘍細胞の第１の集団におけるレベルと、前記原発腫瘍の腫瘍細胞の第２の集団におけるレベルとを比較することであって、腫瘍細胞の前記第２の集団が、
（ｉ）前記ヒト原発腫瘍の非継代細胞である、または
（ｉｉ）前記ヒト原発腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞であって、前記腫瘍細胞の前記第２の集団が、継代された腫瘍細胞の前記第１の集団よりも少なくとも１回少ない回数にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代されたものである、
ことを含み、
腫瘍細胞の前記第１の集団中のがん幹細胞の頻度と、腫瘍細胞の前記第２の集団中のがん幹細胞の頻度との比が５：１より大きい条件下で前記比較を実施し、
腫瘍細胞の前記第２の集団中の前記抗原の量に対する、腫瘍細胞の前記第１の集団中の前記抗原の量の増加を、前記ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーの指標とする、方法。
【請求項２】
ヒト由来の原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを同定する方法であって、
（ａ）前記原発腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで継代することであって、前記原発腫瘍の細胞および前記原発腫瘍の継代された細胞は、免疫単離を受けていない；および
（ｂ）少なくとも１つの抗原について、前記原発腫瘍の継代された腫瘍細胞の第１の集団におけるレベルと、前記原発腫瘍の腫瘍細胞の第２の集団におけるレベルとを比較することであって、継代された細胞の前記第１の集団中のがん幹細胞と、非がん幹細胞との比が１：１０００より大きくなるように、継代された細胞の前記第１の集団の継代回数が選択され、腫瘍細胞の前記第２の集団が、
（ｉ）前記ヒト原発腫瘍の非継代細胞である、または
（ｉｉ）前記ヒト原発腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞であって、前記腫瘍細胞の前記第２の集団が、継代された腫瘍細胞の前記第１の集団よりも少なくとも１回少ない回数にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代されたものである、
ことを含み、
腫瘍細胞の前記第２の集団中の前記抗原の量に対する、腫瘍細胞の前記第１の集団中の前記抗原の量の増加を、前記ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーの指標とする、方法。
【請求項３】
ヒト由来の原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーを同定する方法であって、
（ａ）前記原発腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで継代することであって、前記原発腫瘍の細胞および前記原発腫瘍の継代された細胞は、免疫単離を受けていない；および
（ｂ）少なくとも１つの抗原について、前記原発腫瘍の継代された腫瘍細胞の第１の集団におけるレベルと、前記原発腫瘍の腫瘍細胞の第２の集団におけるレベルとを比較することであって、継代された細胞の前記第１の集団のｉｎ  ｖｉｖｏにおける継代の回数が１０回以上であり、腫瘍細胞の前記第２の集団が、
（ｉ）前記ヒト原発腫瘍の非継代細胞である、または
（ｉｉ）前記ヒト原発腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞であって、前記腫瘍細胞の前記第２の集団が、継代された腫瘍細胞の前記第１の集団よりも少なくとも１回少ない回数にわたってｉｎ  ｖｉｖｏで継代されたものである、
ことを含み、
腫瘍細胞の前記第２の集団中の前記抗原の量に対する、腫瘍細胞の前記第１の集団中の前記抗原の量の増加を、前記ヒト原発腫瘍中のがん幹細胞マーカーの指標とする、方法。
【請求項４】
継代された細胞の前記第１の集団の継代回数は、少なくとも２回の連続する継代にわたって顕在性の腫瘍侵攻性表現型が有意に増加しないように選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の集団の継代回数は、継代された細胞の前記第１の集団の細胞５０００個を使用した際に、後世代の異種移植を開始する頻度が、前記ヒト原発腫瘍の非継代細胞と比較して、少なくとも５倍に増加するように選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原がポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドの量の増加が、細胞あたりの前記ポリペプチドの発現レベルの増加である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドの量の増加が、前記ポリペプチドを発現する細胞数の増加である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの量の増加が、細胞あたりの前記ポリペプチドの発現レベルの増加および前記ポリペプチドを発現する細胞数の増加である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記原発腫瘍が小児腫瘍である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記原発腫瘍が、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、ユーイング肉腫、血管筋脂肪腫、胸膜肺芽腫およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞の前記第２の集団は、連続的な５回以上のｉｎ  ｖｉｖｏの継代を経ている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
継代された腫瘍細胞の前記第１の集団は、少なくとも５回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代に付される、請求項１、２、および５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
継代された腫瘍細胞の前記第１の集団は、少なくとも１０回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代に付される、請求項１、２、および５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
継代された腫瘍細胞の前記第１の集団は、少なくとも１０〜３０回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代に付される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
継代された腫瘍細胞の前記第１の集団は、少なくとも１０〜２０回のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代に付される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記継代がマウスにおいて行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記継代が、前記原発腫瘍の異種移植の組織試料の非解離細胞を動物中に埋め込むことによって行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記継代が、前記原発腫瘍の異種移植の単一細胞懸濁液を動物中に埋め込むことによって行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の抗原の前記発現の決定をｍＲＮＡレベルで行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の抗原の前記発現の決定をタンパク質レベルで行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記がん細胞侵攻性表現型が、がん細胞マーカーのレベル、遺伝子発現プロファイル、異種移植にかかる時間、異種移植の生成に必要な細胞数、細胞の移動能、非がん性組織に侵襲する能力および増殖のレベルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
がん診断用のキットであって、対象の腫瘍中の抗原レベルを分析するための薬剤を含み、前記腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の前記抗原の量と、前記腫瘍の原発細胞中の前記抗原の量との比が所定のレベルよりも上であるときに、前記抗原の存在ががんの指標となる、キット。
【請求項２４】
がん処置のモニタリング用のキットであって、前記がん処置の投与後に対象の原発腫瘍中の抗原のレベルを分析するための薬剤を含み、前記対象の前記腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の前記抗原の量と、前記対象の前記腫瘍の原発細胞中の前記抗原の量との比が所定のレベルよりも上であるときに、前記がん処置の投与前の前記抗原のレベルに対する前記抗原の量の減少が治療的処置の指標となる、キット。
【請求項２５】
対象におけるがんの処置のための薬剤を選択する方法であって、
（ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法にしたがって前記対象由来の原発腫瘍中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定すること；ならびに
（ｂ）前記がん幹細胞マーカーの発現を下方調節する、および／またはその活性を阻害する薬剤を選択することによって、がんの処置のための薬剤を選択すること
を含む方法。
【請求項２６】
対象におけるがん処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法にしたがって前記対象由来の原発腫瘍中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定すること、ならびに
（ｂ）前記がん処置後に前記対象由来の前記腫瘍中の前記がん幹細胞マーカーの量を分析すること
を含み、前記処置の前の前記がん幹細胞マーカーの量に対する前記腫瘍中の前記がん幹細胞マーカーの量の減少が有効ながん処置の指標となる、方法。
【請求項２７】
がんの診断用キットであって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法にしたがって対象由来の生物試料中の少なくとも１つのがん幹細胞マーカーを同定することを含み、前記がん幹細胞マーカーの存在が前記がんの指標となる、キット。
【請求項２８】
前記がん幹細胞マーカーが、セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）からなる群から選択されるものであり、前記がんがＡＴＲＴである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
抗原の発現を下方調節する、および／またはその活性を阻害する薬剤であって、腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏで継代された細胞中の前記抗原の量と、前記腫瘍の原発細胞中の前記抗原の量との比が所定のレベルよりも上である、がん処置用の薬剤。
【請求項３０】
前記抗原が、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法にしたがって同定されたがん幹細胞マーカーである、請求項２９に記載のがん処置用の薬剤。
【請求項３１】
非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）を処置するのに使用するための、セマホリン３Ｃ（ＳＥＭＡ３Ｃ）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、糖タンパク質Ｍ６Ａ（ＧＰＭ６Ａ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）からなる群から選択されるポリペプチドに結合する、および／またはその発現を下方調節する薬剤。
【請求項３２】
前記ポリペプチドがリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）である、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記薬剤がβ−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）である、請求項３１に記載の薬剤。