【手続補正書】
【提出日】平成30年4月6日(2018.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックス（multiplexed）Ｔ細胞を製造する方法であって、
ｉ）遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
ii）前記遺伝子送達ポリヌクレオチドをＴ細胞に導入すること、
iii）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
iv）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
ｖ）第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、および
vi）選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離すること
を含み、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、ゲノムに挿入される核酸を含むこと、
ゲノムに挿入される前記核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列をさらに含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含み、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、配列番号２に示すＤＮＡ配列によってコードされ、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位を含み、
第７の配列が、第２の付着部位を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復配列を含む第２の配列の５’末端に隣接していること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択試薬が選択剤を含み、該選択剤がメトトレキサートである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであるか；前記第１の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭであるか；または前記第１の濃度域が少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記１回目の選択が、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記２回目の選択が、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法であって、
ｉ）遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
ii）前記遺伝子送達ポリヌクレオチドをＴ細胞に導入すること、
iii）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
iv）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
ｖ）第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、および
vi）選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離すること
を含み、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、ゲノムに挿入される核酸を含むこと、
ゲノムに挿入される前記核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列をさらに含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含み、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、配列番号２に示すＤＮＡ配列によってコードされ、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位を含み、
第７の配列が、第２の付着部位を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復配列を含む第２の配列の５’末端に隣接していること
を特徴とする方法。
【請求項８】
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーター領域が、ＥＦ１プロモーター配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第４の配列が、タンパク質をコードする１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの遺伝子を含むこと、前記第４の配列が、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列であること、および前記関連する複数のタンパク質が、同じエピトープに特異的な抗体結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第４の配列および／または前記第５の配列の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するように該配列のコドンが最適化されていること、ならびに／またはヒトにおける発現を目的として前記第４の配列および／または前記第５の配列のコドンが最適化されていること、ならびに前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列が、複数の関連配列において使用されている配列および／または核酸塩基の差異を比較することによって作製されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部がヒト化されていてもよい、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドがミニサークル（minicircle）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって製造される遺伝子改変Ｔ細胞であって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが持続的に発現されており、メトトレキサートを除去した後でも導入遺伝子が持続的に発現されることを特徴とする、遺伝子改変Ｔ細胞。