【手続補正書】
【提出日】平成30年9月7日(2018.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞であって、前記細胞における前記核酸の発現及び前記ポリペプチドの産生が、前記細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす、前記酵母細胞。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記核酸の発現及び前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、請求項１または請求項２に記載の酵母細胞。
【請求項４】
前記発現構築物が、前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５】
前記発現構築物が、組込み型プラスミドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
前記組込み型プラスミドが、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、またはそれらの誘導体である、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項７】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項８】
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、またはＧＡＬＳである、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項９】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・スピーシーズ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ゲオトリクム・スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、またはゲオトリクム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
薬物排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が破壊されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、またはＥＲＧ６である、請求項１０に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記シグナル配列が、天然の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
前記シグナル配列が、酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列と同一である、請求項１２に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
前記発現構築物を少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、または少なくとも４コピー含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥタンパク質と検出可能なマーカーとを含むポリペプチドをコードする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥタンパク質と蛍光タンパク質とを含むポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の酵母細胞。
【請求項１８】
（ｉ）前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、
（ｉｉ）前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列に融合しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、または
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
前記酵母細胞が、シグナル配列と、野生型アミロイドβ１−３８、野生型アミロイドβ１−３９、野生型アミロイドβ１−４０、野生型アミロイドβ１−４１、野生型アミロイドβ１−４２、及び野生型アミロイドβ１−４３からなる群より選択されるヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含み、任意で、前記アミロイドβタンパク質が、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ｋ、Ｄ２３Ｎ、Ａ４２Ｔ、及びＡ４２Ｖからなる群より選択される突然変異を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、（ｉ）組込み型プラスミドであるか、（ｉｉ）前記酵母細胞のゲノムに組み込まれているか、（ｉｉｉ）誘導性プロモーターを含むか、（ｉｖ）ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、及びＧＡＬＳから選択される誘導性プロモーターを含むか、（ｖ）前記細胞において少なくとも１、２、もしくは３コピー存在するか、（ｖｉ）酵母シグナル配列を含むか、（ｖｉｉ）酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列を含むか、または（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の任意の組み合わせである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２２】
前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２３】
（ｉ）前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ２タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ２媒介性毒性を抑制もしくは増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現もしくは活性が上昇もしくは低下している、
（ｉｉ）前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ３タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ３媒介性毒性を抑制もしくは増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現もしくは活性が上昇もしくは低下している、または
（ｉｉｉ）前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ４媒介性毒性を抑制もしくは増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現もしくは活性が上昇もしくは低下している、
請求項２２に記載の酵母細胞。
【請求項２４】
以下の工程を含む、酵母細胞において毒性を誘導する方法：
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程；及び
前記酵母細胞に対して毒性であるレベルの、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する工程。
【請求項２５】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防もしくは抑制する化合物、またはＡｐｏＥ関連疾患を治療するかもしくはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防もしくは抑制する化合物として同定される、またはＡｐｏＥ関連疾患を治療するかもしくはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される、前記方法。
【請求項２６】
ＡｐｏＥを発現する哺乳動物細胞と候補化合物を接触させる工程、及び前記候補化合物が前記哺乳動物細胞における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ４タンパク質でありかつ前記表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＡｐｏＥ関連疾患のモデルとして機能する非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、及び前記候補化合物が前記動物における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連疾患表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥ関連疾患表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡｐｏＥ関連疾患が、ＡｐｏＥ４関連神経変性疾患、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法であって、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程であって、前記酵母細胞が、遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、提供する工程；
前記遺伝子の過剰発現の不在下で前記酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下にて、前記酵母細胞を培養する工程；
前記遺伝子の過剰発現の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子として同定される、前記方法。
【請求項３０】
前記遺伝子が酵母遺伝子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードする、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法であって、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程であって、前記酵母細胞のある内因性遺伝子が破壊されている、提供する工程；
前記内因性遺伝子が破壊されていない場合に前記酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含む前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、前記酵母細胞を培養する工程；
前記内因性遺伝子が破壊されている場合の細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記内因性遺伝子が破壊されている場合に測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合の細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、前記方法。
【請求項３３】
（ａ）前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ２タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖もしくは生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖もしくは生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、
（ｂ）前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ３タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖もしくは生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ３媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖もしくは生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、
（ｃ）前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ４タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖もしくは生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖もしくは生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する方法であって、毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項３５】
（ｉ）毒性誘導量のＡｐｏＥ２を発現する細胞を、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、
（ｉｉ）毒性誘導量のＡｐｏＥ３を発現する細胞を、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、
（ｉｉｉ）毒性誘導量のＡｐｏＥ４を発現する細胞を、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、
（ｉｖ）毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を阻害する有効量の化合物と接触させる工程を含む方法によって、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する工程を含む、
（ｖ）毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を阻害する有効量の化合物、あるいは表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を増強する有効量の化合物と接触させる工程を含む方法によって、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する工程を含む、
請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥを発現する細胞を提供する工程、ならびに（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって、前記薬剤がＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、前記方法。
【請求項３７】
（ｉ）前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ２を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ２媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、
（ｉｉ）前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ３を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ３媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、または
（ｉｉｉ）前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ４を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体の発現もしくは活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ４媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、
請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬剤が、合成化合物、小分子、核酸、タンパク質、抗体、またはペプチド模倣物である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する治療量または予防量の化合物を含む、ＡｐｏＥ４媒介性疾患を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項４１】
前記化合物が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強するか、あるいはＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
ＡｐｏＥ媒介性疾患の存在またはその発症し易さについて個体を評価する方法であって、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子のヒト相同体によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現または活性について、対象から得られた生体試料を分析する工程；ならびに前記試料中の前記１つ以上のタンパク質の発現または活性を、好適な対照値と比較する工程を含み、前記比較の結果によって、前記対象が前記ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であるかどうかが示される、前記方法。
【請求項４３】
前記試料が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子のヒト相同体によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現または活性について分析され、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有しないかまたはそれを発症するリスクがない個体間での前記１つ以上のタンパク質の発現または活性を表す対照値と比較したときの、前記対象からの前記試料において上昇した前記１つ以上のタンパク質の発現または活性によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であることが示されるか、あるいは、前記試料が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現または活性について分析され、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有しないかまたはそれを発症するリスクがない個体間での前記１つ以上のタンパク質の発現または活性を表す対照値と比較したときの、前記対象からの前記試料において低下した前記１つ以上のタンパク質の発現または活性によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であることが示される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＡｐｏＥ媒介性疾患の存在またはその発症し易さについて個体を評価する方法であって、前記対象におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子及び増強遺伝子のヒト相同体からなる群より選択される遺伝子の少なくとも一部分の配列を、好適な対照配列と比較する工程を含み、前記比較の結果によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であるかどうかが示され、任意で、前記抑制遺伝子または増強遺伝子が、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている、前記方法。
【請求項４５】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする第１の核酸に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現構築物を含む細胞であって、（ａ）前記細胞が、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）前記細胞において、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、前記細胞。
【請求項４６】
（ｉ）前記第１の発現構築物、前記第２の発現構築物、もしくはその両方が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、
（ｉｉ）前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、もしくはその両方が、誘導性プロモーターである、
（ｉｉｉ）ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子内に突然変異を有する、
（ｉｖ）ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子内に遺伝子操作された突然変異を有する、
（ｖ）前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ２タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸が、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、
（ｖｉ）前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ２タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が低減もしくは欠如している、
（ｖｉｉ）前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ３タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸が、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、
（ｖｉｉｉ）前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ３タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が低減もしくは欠如している、
（ｉｘ）前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸が、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、
（ｘ）前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が低減もしくは欠如している、
（ｘｉ）前記細胞が、アミロイドβタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに含み、任意で、前記ポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドであり、さらに任意で、前記プロモーターが誘導性プロモーターである、または
（ｘｉｉ）前記第１の核酸が、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする、
請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする配列に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の核酸を含む細胞であって、（ａ）前記細胞が、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸をさらに含み、前記第１の核酸、前記第２の核酸、またはその両方が、異種核酸であるか、あるいは（ｂ）前記細胞において、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如しており、（ｉ）前記第１の核酸が異種核酸であるか、（ｉｉ）前記細胞が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされる前記タンパク質の発現または活性が低減するように遺伝子操作されているか、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との両方である、前記細胞。
【請求項４８】
（ｉ）前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ２タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体である、
（ｉｉ）前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ３タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体である、
（ｉｉｉ）前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ４タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子もしくはそのヒト相同体である、
請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む、請求項４７または請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
シグナル配列とアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５１】
酵母細胞またはヒト細胞であり、任意で、前記ヒト細胞が、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞もしくはｉＰＳ細胞から生成された細胞である、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５２】
前記細胞が神経細胞であり、任意で、前記神経細胞がインビトロで生成される、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５３】
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルで前記第１の核酸を発現するか、またはそれを発現するように誘導され得る、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５４】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防もしくは抑制する化合物、またはＡｐｏＥ関連疾患を治療するかもしくはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記第１の核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防もしくは抑制する化合物として同定される、またはＡｐｏＥ関連疾患を治療するかもしくはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される、前記方法。
【請求項５５】
ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドを発現する哺乳動物細胞と候補化合物を接触させる工程、及び前記候補化合物が前記哺乳動物細胞における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ４タンパク質でありかつ前記表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＡｐｏＥ関連疾患のモデルとして機能する非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、及び前記候補化合物が前記動物における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連疾患表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥ関連疾患表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡｐｏＥ関連疾患が、ＡｐｏＥ４関連神経変性疾患、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物の分子標的または前記化合物が関与する生物学的経路もしくはプロセスを同定する工程をさらに含む、請求項２５〜２８、３６〜３９、または５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ヒト相同体が、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されている、または前記ヒト相同体が、表３に列記されている酵母遺伝子のヒト相同体である、請求項３４〜５８のいずれか一項に記載の細胞、薬学的組成物、または方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
[本発明1001]
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞であって、前記細胞における前記核酸の発現及び前記ポリペプチドの産生が、前記細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす、前記酵母細胞。
[本発明1002]
前記ポリペプチドが、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む、本発明1001の酵母細胞。
[本発明1003]
前記核酸の発現及び前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、本発明1001または本発明1002の酵母細胞。
[本発明1004]
前記発現構築物が、前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1001〜1003のいずれかの酵母細胞。
[本発明1005]
前記発現構築物が、組込み型プラスミドである、本発明1001〜1004のいずれかの酵母細胞。
[本発明1006]
前記組込み型プラスミドが、ｐＲＳ303、ｐＲＳ304、ｐＲＳ305、ｐＲＳ306、またはそれらの誘導体である、本発明1005の酵母細胞。
[本発明1007]
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、本発明1001〜1006のいずれかの酵母細胞。
[本発明1008]
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ1−10、ＧＡＬ1、ＧＡＬＬ、またはＧＡＬＳである、本発明1007の酵母細胞。
[本発明1009]
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・スピーシーズ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ゲオトリクム・スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、またはゲオトリクム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、本発明1001〜1008のいずれかの酵母細胞。
[本発明1010]
薬物排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が破壊されている、本発明1001〜1009のいずれかの酵母細胞。
[本発明1011]
前記少なくとも1つの遺伝子が、ＰＤＲ1、ＰＤＲ3、ＰＤＲ5、ＳＮＱ2、またはＥＲＧ6である、本発明1010の酵母細胞。
[本発明1012]
前記シグナル配列が、天然の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、本発明1001〜1011のいずれかの酵母細胞。
[本発明1013]
前記シグナル配列が、酵母Ｋａｒ2ｐシグナル配列と同一である、本発明1012の酵母細胞。
[本発明1014]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ2である、本発明1001〜1013のいずれかの酵母細胞。
[本発明1015]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ3である、本発明1001〜1013のいずれかの酵母細胞。
[本発明1016]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ4である、本発明1001〜1013のいずれかの酵母細胞。
[本発明1017]
前記発現構築物を少なくとも2コピー含む、本発明1001〜1016のいずれかの酵母細胞。
[本発明1018]
前記発現構築物を少なくとも3コピー含む、本発明1001〜1016のいずれかの酵母細胞。
[本発明1019]
前記発現構築物を少なくとも4コピー含む、本発明1001〜1016のいずれかの酵母細胞。
[本発明1020]
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥタンパク質と検出可能なマーカーとを含むポリペプチドをコードする、本発明1001〜1019のいずれかの酵母細胞。
[本発明1021]
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥタンパク質と蛍光タンパク質とを含むポリペプチドをコードする、本発明1020の酵母細胞。
[本発明1022]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1021のいずれかの酵母細胞。
[本発明1023]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3の配列に融合しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1021のいずれかの酵母細胞。
[本発明1024]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1021のいずれかの酵母細胞。
[本発明1025]
シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの酵母細胞。
[本発明1026]
前記酵母細胞が、シグナル配列と、野生型アミロイドβ1−38、野生型アミロイドβ1−39、野生型アミロイドβ1−40、野生型アミロイドβ1−41、野生型アミロイドβ1−42、及び野生型アミロイドβ1−43からなる群より選択されるヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含み、任意で、前記アミロイドβタンパク質が、Ａ2Ｔ、Ｈ6Ｒ、Ｄ7Ｎ、Ａ21Ｇ、Ｅ22Ｇ、Ｅ22Ｑ、Ｅ22Ｋ、Ｄ23Ｎ、Ａ42Ｔ、及びＡ42Ｖからなる群より選択される突然変異を含む、本発明1001〜1025のいずれかの酵母細胞。
[本発明1027]
シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、（ｉ）組込み型プラスミドであるか、（ｉｉ）前記酵母細胞のゲノムに組み込まれているか、（ｉｉｉ）誘導性プロモーターを含むか、（ｉｖ）ＧＡＬ1−10、ＧＡＬ1、ＧＡＬＬ、及びＧＡＬＳから選択される誘導性プロモーターを含むか、（ｖ）前記細胞において少なくとも1、2、もしくは3コピー存在するか、（ｖｉ）酵母シグナル配列を含むか、（ｖｉｉ）酵母Ｋａｒ2ｐシグナル配列を含むか、または（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の任意の組み合わせである、本発明1024〜1026のいずれかの酵母細胞。
[本発明1028]
前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、本発明1001〜1027のいずれかの酵母細胞。
[本発明1029]
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ2タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ2媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、本発明1028の酵母細胞。
[本発明1030]
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ3タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ3媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、本発明1028の酵母細胞。
[本発明1031]
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ4タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ4媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、本発明1028の酵母細胞。
[本発明1032]
以下の工程を含む、酵母細胞において毒性を誘導する方法：
本発明1001〜1031のいずれかの細胞を提供する工程；及び
前記酵母細胞に対して毒性であるレベルの、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する工程。
[本発明1033]
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、本発明1001〜1031のいずれかの細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物として同定される、前記方法。
[本発明1034]
ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、本発明1001〜1031のいずれかの細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される、前記方法。
[本発明1035]
ＡｐｏＥを発現する哺乳動物細胞と候補化合物を接触させる工程、及び前記候補化合物が前記哺乳動物細胞における少なくとも1つのＡｐｏＥ関連表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ4タンパク質でありかつ前記表現型がＡｐｏＥ4関連表現型である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
ＡｐｏＥ関連疾患のモデルとして機能する非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、及び前記候補化合物が前記動物における少なくとも1つのＡｐｏＥ関連疾患表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥ関連疾患表現型がＡｐｏＥ4関連表現型である、本発明1034または本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記ＡｐｏＥ関連疾患がＡｐｏＥ4関連神経変性疾患である、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記ＡｐｏＥ4関連疾患が、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1039]
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法であって、
本発明1001〜1031のいずれかの酵母細胞を提供する工程であって、前記酵母細胞が、遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、提供する工程；
前記遺伝子の過剰発現の不在下で前記酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下にて、前記酵母細胞を培養する工程；
前記遺伝子の過剰発現の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子として同定される、前記方法。
[本発明1040]
前記遺伝子が酵母遺伝子である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ4タンパク質を含むポリペプチドをコードする、本発明1039または本発明1040の方法。
[本発明1042]
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法であって、
本発明1001〜1031のいずれかの酵母細胞を提供する工程であって、前記酵母細胞のある内因性遺伝子が破壊されている、提供する工程；
前記内因性遺伝子が破壊されていない場合に前記酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含む前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、前記酵母細胞を培養する工程；
前記内因性遺伝子が破壊されている場合の細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記内因性遺伝子が破壊されている場合に測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合の細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、前記方法。
[本発明1043]
前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ2タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ4媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ2媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ3タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ3媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ3媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ4タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ4媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ4媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、本発明1042の方法。
[本発明1046]
ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する方法であって、毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、前記方法。
[本発明1047]
毒性誘導量のＡｐｏＥ2を発現する細胞を、ＡｐｏＥ2媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
毒性誘導量のＡｐｏＥ3を発現する細胞を、ＡｐｏＥ3媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1049]
毒性誘導量のＡｐｏＥ4を発現する細胞を、ＡｐｏＥ4媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1050]
毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する有効量の化合物と接触させる工程を含む方法によって、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1051]
毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する有効量の化合物、あるいは表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強する有効量の化合物と接触させる工程を含む方法によって、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥを発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって、前記薬剤がＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、前記方法。
[本発明1053]
前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ2を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ2媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ2媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ3を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ3媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ3媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、本発明1052の方法。
[本発明1055]
前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ4を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ4媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ4媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、本発明1052の方法。
[本発明1056]
前記薬剤が合成化合物である、本発明1046〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記薬剤が、小分子、核酸、タンパク質、抗体、またはペプチド模倣物である、本発明1046〜1055のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記細胞が酵母細胞である、本発明1046〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記細胞が哺乳動物細胞である、本発明1046〜1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
ＡｐｏＥ4媒介性疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する治療量または予防量の化合物を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1061]
前記化合物が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強するか、あるいはＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する、本発明1060の方法。
[本発明1062]
ＡｐｏＥ媒介性疾患の存在またはその発症し易さについて個体を評価する方法であって、対象から生体試料を得る工程；表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子のヒト相同体によってコードされる1つ以上のタンパク質の発現または活性について、前記試料を分析する工程；ならびに前記対象からの前記試料中の前記1つ以上のタンパク質の発現または活性を、好適な対照値と比較する工程を含み、前記比較の結果によって、前記対象が前記ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であるかどうかが示される、前記方法。
[本発明1063]
前記試料が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子のヒト相同体によってコードされる1つ以上のタンパク質の発現または活性について分析され、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有しないかまたはそれを発症するリスクがない個体間での前記1つ以上のタンパク質の発現または活性を表す対照値と比較したときの、前記対象からの前記試料において上昇した前記1つ以上のタンパク質の発現または活性によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であることが示されるか、あるいは、前記試料が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子によってコードされる1つ以上のタンパク質の発現または活性について分析され、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有しないかまたはそれを発症するリスクがない個体間での前記1つ以上のタンパク質の発現または活性を表す対照値と比較したときの、前記対象からの前記試料において低下した前記1つ以上のタンパク質の発現または活性によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であることが示される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
ＡｐｏＥ媒介性疾患の存在またはその発症し易さについて個体を評価する方法であって、前記対象におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子及び増強遺伝子のヒト相同体からなる群より選択される遺伝子の少なくとも一部分の配列を得る工程；及び前記対象からの前記配列を好適な対照配列と比較する工程を含み、前記比較の結果によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であるかどうかが示され、任意で、前記抑制遺伝子または増強遺伝子が、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されている、前記方法。
[本発明1065]
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする第1の核酸に機能的に連結された第1のプロモーターを含む第1の発現構築物を含む細胞であって、（ａ）前記細胞が、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、及び2Ｃのいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第2の核酸に機能的に連結された第2のプロモーターを含む第2の発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）前記細胞において、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、前記細胞。
[本発明1066]
前記第1の発現構築物、前記第2の発現構築物、またはその両方が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1065の細胞。
[本発明1067]
前記第1のプロモーター、前記第2のプロモーター、またはその両方が、誘導性プロモーターである、本発明1065または本発明1066の細胞。
[本発明1068]
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子内に突然変異を有する、本発明1065の細胞。
[本発明1069]
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子内に遺伝子操作された突然変異を有する、本発明1065の細胞。
[本発明1070]
前記第1の核酸が、ヒトＡｐｏＥ2タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第2の核酸が、ＡｐｏＥ2媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、本発明1065〜1069のいずれかの細胞。
[本発明1071]
前記第1の核酸が、ヒトＡｐｏＥ2タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ2媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、本発明1065〜1069のいずれかの細胞。
[本発明1072]
前記第1の核酸が、ヒトＡｐｏＥ3タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第2の核酸が、ＡｐｏＥ3媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、本発明1065〜1069のいずれかの細胞。
[本発明1073]
前記第1の核酸が、ヒトＡｐｏＥ3タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ3媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、本発明1065〜1069のいずれかの細胞。
[本発明1074]
前記第1の核酸が、ヒトＡｐｏＥ4タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第2の核酸が、ＡｐｏＥ4媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、本発明1065〜1069のいずれかの細胞。
[本発明1075]
前記第1の核酸が、ヒトＡｐｏＥ4タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ4媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、本発明1065〜1069のいずれかの細胞。
[本発明1076]
前記細胞が、アミロイドβタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに含み、任意で、前記ポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドであり、さらに任意で、前記プロモーターが誘導性プロモーターである、本発明1065〜1075のいずれかの細胞。
[本発明1077]
前記第1の核酸が、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする、本発明1065〜1076のいずれかの細胞。
[本発明1078]
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする配列に機能的に連結された第1のプロモーターを含む第1の核酸を含む細胞であって、（ａ）前記細胞が、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第2の核酸に機能的に連結された第2のプロモーターを含む第2の核酸をさらに含み、前記第1の核酸、前記第2の核酸、またはその両方が、異種核酸であるか、あるいは（ｂ）前記細胞において、表1Ａ、1Ｂ、2Ａ、2Ｂ、2Ｃ、及び3のいずれか1つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如しており、（ｉ）前記第1の核酸が異種核酸であるか、（ｉｉ）前記細胞が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされる前記タンパク質の発現または活性が低減するように遺伝子操作されているか、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との両方である、前記細胞。
[本発明1079]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ2タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ2媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体である、本発明1078の細胞。
[本発明1080]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ3タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ3媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体である、本発明1078の細胞。
[本発明1081]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ4タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ4媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体である、本発明1078の細胞。
[本発明1082]
前記ポリペプチドが、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む、本発明1078〜1081のいずれかの細胞。
[本発明1083]
シグナル配列とアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1078〜1082のいずれかの細胞。
[本発明1084]
酵母細胞である、本発明1078〜1083のいずれかの細胞。
[本発明1085]
前記細胞がヒト細胞であり、任意で、前記ヒト細胞が、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞またはｉＰＳ細胞から生成された細胞である、本発明1078〜1083のいずれかの細胞。
[本発明1086]
前記細胞が神経細胞であり、任意で、前記神経細胞がインビトロで生成される、本発明1078〜1083のいずれかの細胞。
[本発明1087]
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルで前記第1の核酸を発現するか、またはそれを発現するように誘導され得る、本発明1078〜1086のいずれかの細胞。
[本発明1088]
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記第1の核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、本発明1065〜1087のいずれかの細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物として同定される、前記方法。
[本発明1089]
ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記第1の核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、本発明1065〜1087のいずれかの細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される、前記方法。
[本発明1090]
ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドを発現する哺乳動物細胞と候補化合物を接触させる工程、及び前記候補化合物が前記哺乳動物細胞における少なくとも1つのＡｐｏＥ関連表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ4タンパク質でありかつ前記表現型がＡｐｏＥ4関連表現型である、本発明1088または本発明1089の方法。
[本発明1091]
ＡｐｏＥ関連疾患のモデルとして機能する非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、及び前記候補化合物が前記動物における少なくとも1つのＡｐｏＥ関連疾患表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥ関連疾患表現型がＡｐｏＥ4関連表現型である、本発明1088または本発明1089の方法。
[本発明1092]
前記ＡｐｏＥ関連疾患がＡｐｏＥ4関連神経変性疾患である、本発明1089〜1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
前記ＡｐｏＥ4関連疾患が、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、本発明1089〜1091のいずれかの方法。
[本発明1094]
前記化合物の分子標的または前記化合物が関与する生物学的経路もしくはプロセスを同定する工程をさらに含む、本発明1033〜1038、1052〜1059、または1085〜1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
前記ヒト相同体が、表1Ｃ、1Ｄ、2Ａ、2Ｂ、及び2Ｃのいずれか1つ以上に列記されている、本発明1046〜1094のいずれかの細胞または方法。
[本発明1096]
前記ヒト相同体が、表3に列記されている酵母遺伝子のヒト相同体である、本発明1046〜1094のいずれかの方法または細胞。
[本発明1097]
以下の工程を含む、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法：
本発明1001〜1031または1065〜1087のいずれかの細胞を提供する工程；
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程；及び
前記ポリペプチドに結合する内因性ポリペプチドまたは内因性脂質を同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程。
[本発明1098]
以下の工程を含む、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法：
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞を提供する工程；
前記核酸の発現を可能にする条件下にて前記酵母細胞を培養する工程；及び
前記ポリペプチドに結合する内因性酵母ポリペプチドを同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程。
[本発明1099]
以下の工程を含む、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法：
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を、前記核酸の発現を可能にする条件下にて酵母細胞において発現させる工程；ならびに
前記ポリペプチドに結合する内因性脂質または内因性ポリペプチドを同定する工程であって、
（ｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体を単離すること、及び
（ｉｉ）前記ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質または内因性ポリペプチドを質量分析によって同定することであって、それによって前記内因性脂質または前記内因性ポリペプチドが前記ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーとして同定されることを含む、同定する工程。
[本発明1100]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ2、ＡｐｏＥ3、及びＡｐｏＥ4から選択される、本発明1097〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
ヒトＡｐｏＥ結合タンパク質を含む前記ポリペプチドが、検出可能なマーカーを含む、本発明1097〜1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
前記検出可能なマーカーが、蛍光タンパク質またはエピトープタグである、本発明1101の方法。
[本発明1103]
前記エピトープタグが、タンデムアフィニティー精製タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、Ｖ5タグ、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ、カルモジュリンタグ、Ｅタグ、ＳＰＢタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＶＳＶタグ、Ｆｃ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグからなる群より選択される、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記細胞を溶解する工程をさらに含み、それによって抽出物が生成される、本発明1097〜1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
前記抽出物から前記ヒトＡｐｏＥタンパク質を単離する工程をさらに含み、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質複合体が形成される、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質を単離する工程が、共免疫沈降、同時精製、アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはイオン交換クロマトグラフィを含む、本発明1105の方法。
[本発明1107]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程をさらに含む、本発明1105の方法。
[本発明1108]
前記ＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程が、質量分析またはエドマン分解を含む、本発明1107の方法。
[本発明1109]
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質を同定する工程を含む、本発明1106の方法。
[本発明1110]
内因性脂質を同定する工程が、質量分析を含む、本発明1109の方法。
[本発明1111]
前記結合パートナーが、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補である、本発明1096〜1109のいずれかの方法。
[本発明1112]
前記ＡｐｏＥ関連疾患が、ＡｐｏＥ4関連神経変性疾患である、本発明1111の方法。
[本発明1113]
前記ＡｐｏＥ4関連疾患が、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、本発明1112の方法。
[本発明1114]
ＡｐｏＥ媒介性毒性に関与する生物学的プロセスまたは生物学的経路を、前記方法の前記工程によって同定された結合パートナーの同一性に基づいて同定する工程をさらに含む、本発明1096〜1113のいずれかの方法。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。