【手続補正書】
【提出日】平成30年4月16日(2018.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経学的状態に対する化合物の効果を決定するための方法であって、
化合物を、複数のニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該複数のニューロンのうちの少なくとも１つが、膜電位についての光レポーターを発現するステップと；
該化合物の提示の後で、該試料中の光依存性イオンチャネルの光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと；
該光シグナルに基づき、該化合物を、該神経学的状態を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
複数の試料を、複数の異なる化合物へと曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光依存性イオンチャネルが、前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも１つとシナプス連絡した第２のニューロンによって発現される藻類チャネルロドプシンを含み、膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンの野生型形態と比べて１〜１０の間のアミノ酸置換を有する該微生物型ロドプシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも１つがまた、細胞内カルシウムレベルについての遺伝子コード型インジケーターも発現し、
前記受け取られた光シグナルが、細胞内カルシウムレベルについての該遺伝子コード型インジケーターからのシグナルを含み、さらに、前記神経学的状態が、自閉症、てんかん、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、および結節性硬化症のうちの１つである、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のニューロンの各々に、膜電位についての前記光レポーターおよび前記光依存性イオンチャネルの両方を発現させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ニューロンを、膜電位についての前記光レポーターおよび前記光依存性イオンチャネルをコードする核酸を含むベクターで形質転換するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経学的状態が、コケイン症候群、ダウン症候群、ドラベ症候群、家族性自律神経障害、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、遺伝性痙性対麻痺、マシャド−ジョゼフ病、フェラン−マクダーミド症候群（ＰＭＤＳ）、ポリグルタミン（ポリＱ）コードＣＡＧリピート、脊髄性筋萎縮症、ティモシー症候群、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、多発性硬化症、パーキンソン病、球脊髄性筋萎縮症、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対照試料に対して前記ステップを実施するステップをさらに含み、前記試料中の前記ニューロンが、変異を除き該対照試料中の細胞と同系である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記光シグナルを受け取るステップが、細胞のクラスターを顕微鏡で観察すること、およびコンピュータを使用して、前記光レポーターにより発せられたシグナルを、細胞の該クラスターに由来する複数のシグナルの中から単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コンピュータで、独立成分分析を実施すること、および前記ニューロンによって生じたスパイク列を同定することにより、前記シグナルを単離する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記顕微鏡検査システムを使用して、細胞の複数のクラスターの画像を得るステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
シグナルを観察するために、細胞のクラスターを顕微鏡で観察することができ、コンピュータで、光レポーターにより発せられたシグナルを、異なる細胞に由来する複数のシグナルから単離することができる。一部の実施形態では、コンピュータで、独立成分分析を実施し、細胞と関連するスパイク列を同定することにより、シグナルを単離する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
状態を診断する方法であって、
該状態を有することが疑われる人間から入手可能な細胞を得るステップと；
前記細胞に、電気活動についての光レポーターを発現させるステップと；
該細胞の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられるシグネチャーを観察するステップと；
該観察されたシグネチャーを、予測されるシグネチャーと比較するステップと
を含み、該観察されたシグネチャーと該予測されるシグネチャーとの間の差異が、該状態についての陽性の診断に対応する方法。
（項目２）
前記細胞に、前記光学的刺激に応答して活動電位を惹起する光アクチュエーターを発現させるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞の前記刺激が、前記光アクチュエーターを照射することを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記細胞を得るステップが、体細胞を被験体から得ること、および該体細胞を電気的に活性な細胞型へと転換することを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記体細胞を、ニューロンへと転換する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記体細胞を、電気的に活性な細胞型へと転換することが、直接的な系列転換；およびｉＰＳの中間段階を介する転換からなるリストから選択される１つを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記状態を有さないと考えられる対照細胞を得ること、および該対照細胞における対照光レポーターにより発せられる対照シグナルを観察することにより、予測されるシグナルを得るステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記対照細胞を得ることが、該対照細胞と前記細胞とが変異を除き同系となるように、前記被験体に由来するゲノムを編集することを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記細胞に前記光レポーターを発現させるステップが、該細胞を、遺伝子コード型蛍光電位レポーターを保持するベクターで形質転換することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ベクターがまた、遺伝子コード型光電位アクチュエーターも含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記シグナルを観察することが、異なる細胞のクラスターを顕微鏡で観察することと、コンピュータを使用して、前記光レポーターにより発せられた前記シグナルを、該異なる細胞に由来する複数のシグナルから単離することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記コンピュータで、独立成分分析を実施すること、および前記細胞と関連するスパイク列を同定することにより、前記シグナルを単離する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記状態が、神経系の疾患を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記状態が、神経変性疾患を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記状態が、コケイン症候群、ダウン症候群、ドラベ症候群、家族性自律神経障害、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、遺伝性痙性対麻痺、マシャド−ジョゼフ病、フェラン−マクダーミド症候群（ＰＭＤＳ）、ポリグルタミン（ポリＱ）コードＣＡＧリピート、脊髄性筋萎縮症、ティモシー症候群、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、多発性硬化症、パーキンソン病、および球脊髄性筋萎縮症からなるリストから選択される１つを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記状態が、筋萎縮性側索硬化症を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記被験体が、ＳＯＤ１遺伝子における変異を有する、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記変異が、ＳＯＤ１Ａ４Ｖである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記観察されたシグナルと前記予測されるシグナルとの間の差異が、対照と比べた前記細胞の前記刺激に応答する電位スパイクの確率の変化を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記観察されたシグナルと前記予測されるシグナルとの間の差異が、対照と比べた前記細胞の前記刺激に応答する電位スパイクの確率の減少、および対照と比べた該細胞の、刺激がない時間において電位スパイクの確率の増大を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
神経学的状態に対する化合物の効果を決定するための方法であって、
化合物を、複数のニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該複数のニューロンのうちの少なくとも１つが、膜電位についての光レポーターを発現するステップと；
該化合物の提示の後で、該試料中の光依存性イオンチャネルの光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと；
該光シグナルに基づき、該化合物を、該神経学的状態を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
（項目２２）
複数の試料を、複数の異なる化合物へと曝露する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記光依存性イオンチャネルが、前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも１つとシナプス連絡した第２のニューロンによって発現される藻類チャネルロドプシンを含み、膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンの野生型形態と比べて１〜１０の間のアミノ酸置換を有する該微生物型ロドプシンを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも１つがまた、細胞内カルシウムレベルについての遺伝子コード型インジケーターも発現し、
前記受け取られた光シグナルが、細胞内カルシウムレベルについての該遺伝子コード型インジケーターからのシグナルを含み、さらに、前記神経学的状態が、自閉症、てんかん、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、および結節性硬化症のうちの１つである、
項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記複数のニューロンの各々に、膜電位についての前記光レポーターおよび前記光依存性イオンチャネルの両方を発現させる、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記ニューロンを、膜電位についての前記光レポーターおよび前記光依存性イオンチャネルをコードする核酸を含むベクターで形質転換するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記神経学的状態が、コケイン症候群、ダウン症候群、ドラベ症候群、家族性自律神経障害、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、遺伝性痙性対麻痺、マシャド−ジョゼフ病、フェラン−マクダーミド症候群（ＰＭＤＳ）、ポリグルタミン（ポリＱ）コードＣＡＧリピート、脊髄性筋萎縮症、ティモシー症候群、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、多発性硬化症、パーキンソン病、球脊髄性筋萎縮症、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２８）
対照試料に対して前記ステップを実施するステップをさらに含み、前記試料中の前記ニューロンが、変異を除き該対照試料中の細胞と同系である、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記光シグナルを受け取るステップが、細胞のクラスターを顕微鏡で観察すること、およびコンピュータを使用して、前記光レポーターにより発せられたシグナルを、細胞の該クラスターに由来する複数のシグナルの中から単離することを含む、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記コンピュータで、独立成分分析を実施すること、および前記ニューロンによって生じたスパイク列を同定することにより、前記シグナルを単離する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記顕微鏡検査システムを使用して、細胞の複数のクラスターの画像を得るステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。