【手続補正書】
【提出日】平成30年7月17日(2018.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤の、少なくとも１つのジスルフィド結合及び少なくとも１つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法であって、
（ａ）単離されたタンパク質中の少なくとも１つのスルフィド結合を還元して、反応性スルフィド及び少なくとも１つのチオール基を含む還元されたタンパク質を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）前記組成物中の前記反応性スルフィドの含有量を減少させるステップと、
（ｃ）薬剤を前記還元されたタンパク質の前記少なくとも１つのチオール基にコンジュゲートして、タンパク質−薬剤コンジュゲートを形成するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記還元ステップが、前記単離されたタンパク質の還元剤との接触による前記少なくとも１つのスルフィド結合の少なくとも部分的な還元を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離されたタンパク質が少なくとも４つのジスルフィド結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単離されたタンパク質が少なくとも２つのトリスルフィド結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記還元ステップ前に、前記単離されたタンパク質中の前記スルフィド結合の約１％〜約２０％がトリスルフィド結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記還元ステップ前に、前記単離されたタンパク質中の前記スルフィド結合の約５％〜約７％がトリスルフィド結合である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記還元ステップが非変性条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システイン、Ｌ−システイン、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、及びＬ−ＧＳＨのうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記還元剤がＴＣＥＰである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＣＥＰが、前記単離されたタンパク質に対するＴＣＥＰの所定のモル比で前記単離されたタンパク質と混合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離されたタンパク質に対するＴＣＥＰの前記所定のモル比が、ＴＣＥＰのモル過剰を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記還元ステップが、前記単離されたタンパク質を約０．１〜約８ｍＭの濃度の化学的還元剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記還元ステップが、約ｐＨ７．０未満のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元ステップが、約４．５〜約６．５のｐＨで行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記還元ステップが、約５．５のｐＨで行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記還元ステップが、約６．５のｐＨで行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記還元ステップ前に、前記単離されたタンパク質のｐＨが、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０のｐＨに調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質中の前記トリスルフィド結合の約１００％が還元される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記還元ステップ後に、単離されたタンパク質１モル還元につき約４〜約８モルのチオール部分が、前記薬剤とのコンジュゲーションに利用可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記減少ステップが、前記組成物のｐＨを約５．０〜約６．０のｐＨに調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物のｐＨが約ｐＨ５．５に調整される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記減少ステップが、前記組成物から液体媒体を除去することと、前記液体媒体を代替液体媒体と置き換えることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記液体媒体が緩衝液を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記減少ステップが、
（ａ）前記組成物中の前記還元されたタンパク質を固体支持体と会合させることと、    （ｂ）前記組成物の少なくとも９０％を、前記反応性スルフィドを欠く代替溶液と置き換えることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体が、濾過膜、選択性透過膜、及びクロマトグラフィー樹脂のうちの少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記減少ステップが、前記組成物中の前記反応性スルフィドの含有量を低減するのに十分な速度で、前記還元ステップにおける前記組成物を混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記混合が、前記単離されたタンパク質中のスルフィド結合（複数可）の還元にとっての最適混合速度を超える増大した速度で前記組成物を撹拌することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
増大した速度での前記混合が、前記還元ステップの全反応時間未満の期間にわたって前記還元ステップにおける前記混合速度を増大させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記減少ステップが、前記溶液を窒素源と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記窒素源が窒素ガスを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触が、窒素ガスを前記組成物に通気させることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触が、前記組成物を、窒素ガス、空気、及びアルゴンガスのうちの少なくとも１つでスパージすることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記接触が、約１分間〜約２４０分間の期間行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記接触が、約１０立法センチメートル／分〜約６０立法センチメートル／分の速度で、前記組成物を窒素ガスでスパージすることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記接触が、前記還元ステップにとっての前記最適混合速度を少なくとも２００％超える速度で、窒素ガスの存在下で前記組成物を混合することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記接触が、約５．０〜約８．０のｐＨで行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記接触が、約４℃〜約４０℃の温度で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記接触が、約１５℃〜約４０℃の温度で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記接触が、約２０℃の温度で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記接触が、約３０℃〜の温度で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物の体積に対する表面積の比率が約２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記接触が、前記組成物を含有する反応容器の側面に対して窒素ガスをパイプ供給することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触が、前記組成物中にスパージストーンを浸すことを含み、前記スパージストーンが、約１ｃｍ〜約１メートルの直径を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記接触が、前記還元ステップ中に、前記還元ステップを行う時間未満の時間にわたって窒素ガスを前記組成物に導入することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記接触が閉鎖反応容器内で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触が開放反応容器内で行われ、反応性スルフィドが前記組成物から放出される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触が、前記組成物を含有する容器を、窒素ガス、アルゴン、及び空気のうちの少なくとも１つでスパージすることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触が、ｔｗｅｅｎ及び消泡剤のうちの少なくとも一方の存在下で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｔｗｅｅｎが、Ｔｗｅｅｎ−２０及びＴｗｅｅｎ−８０のうちの少なくとも一方である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記消泡剤が、Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｃ、及びポロキサマーのうちの少なくとも１つである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記単離されたタンパク質が抗体または抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体断片が抗原結合抗体断片である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ断片、またはｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体または前記抗体断片がＩｇＧ抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体または前記抗体断片がヒトモノクローナル抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体または前記抗体断片がヒト免疫グロブリン定常領域を含む、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５７】
前記抗体または前記抗体断片がヒトＩｇＧ定常領域を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩｇＧ定常領域のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＩｇＧ定常領域の前記アイソタイプがＩｇＧ１である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体または前記抗体断片中のスルフィド結合が、抗体重鎖と抗体軽鎖との間、または抗体重鎖間、または抗体重鎖と抗体軽鎖との間及び抗体重鎖間の両方に存在する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体または前記抗体断片が軽鎖定常ドメインを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記軽鎖定常ドメインがカッパ定常ドメインである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体が、重鎖を連結するヒンジ領域内に２つのスルフィド結合、ならびに軽鎖と重鎖との間に各々１つのスルフィド結合を含む４つの鎖間スルフィド結合を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記単離されたタンパク質が抗体であり、前記還元ステップが鎖間ジスルフィド結合のみの還元をもたらし、鎖内結合の還元はもたらさない、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記薬剤が、化学療法剤、核酸、サイトカイン、免疫抑制剤、放射性同位体、抗生物質、及び治療抗体から選択される少なくとも１つの治療薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療薬が化学療法剤である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記化学療法剤が、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、及びドラスタチンから選択される少なくとも１つの抗チューブリン剤である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記化学療法剤が、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、及びビンカアルカロイドのうちの少なくとも１つである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記化学療法剤がドラスタチンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ドラスタチンがオーリスタチンである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記オーリスタチンがＭＭＡＥまたはＭＭＡＦである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記薬剤が、前記還元されたタンパク質の前記少なくとも１つのチオール基を前記薬剤に連結するように適合されたリンカー部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７３】
前記リンカー部分が、切断可能なリンカーである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リンカー部分が、切断不可能なリンカーである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記リンカー部分が、細胞内条件下で切断されやすいリンカーである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記リンカー部分が、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞内プロテアーゼが、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記リンカー部分が、ジペプチドリンカーである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記ジペプチドリンカーが、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカーである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ジペプチドリンカーが、遊離チオールと反応して共有結合を形成するマレイミド官能基である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記タンパク質−薬剤コンジュゲートが、ａＣＤ２２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＣＤ２２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＬｙ６Ｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＬｙ６Ｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＣＤ７９ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＣＤ７９ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＮａＰｉ２ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＮａＰｉ２ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＭＵＣ１６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ＭＵＣ１６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ｓＳＴＥＡＰ１、及びａＥＴＢＲのうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項８２】
単離された抗体中のトリスルフィド結合のジスルフィド結合への変換方法であって、    （ａ）溶液中で、少なくとも１つのトリスルフィド結合を含む少なくとも１つの単離された抗体を、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８のｐＨのＴＣＥＰで還元するステップと、
（ｂ）前記溶液を窒素ガスと接触させるステップと、
（ｃ）オーリスタチンまたはその誘導体を前記還元された抗体にコンジュゲートして、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するステップと、を含む、前記方法。
【請求項８３】
前記還元ステップが、前記単離されたタンパク質を約０．５〜約８ｍＭの濃度の化学的還元剤と接触させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記単離されたタンパク質に対するＴＣＥＰのモル比が約３：１である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記接触が、窒素ガスを前記組成物に通気させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記接触が、少なくとも約３０分間行われる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記接触が、約５０立法センチメートル／分の速度で、前記組成物を窒素ガスでスパージすることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記接触が、前記還元ステップにとっての前記最適混合速度を約３００％超える速度で、前記組成物を窒素ガスの存在下で混合することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
前記接触が、約５．５〜約７．５のｐＨで行われる、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
前記接触が、約２０℃〜約３０℃の温度で行われる、請求項８２に記載の方法。
【請求項９１】
前記組成物の体積に対する表面積の比率が約２である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
前記接触が、前記組成物を含有する反応容器の側面に対して窒素ガスをパイプ供給することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９３】
前記接触が、前記組成物中にスパージストーンを浸すことを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９４】
前記接触が、窒素ガスを前記組成物に約３０分間導入することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９５】
前記接触が閉鎖反応容器内で行われる、請求項８２に記載の方法。
【請求項９６】
前記接触が開放反応容器内で行われ、硫化水素が前記組成物から放出される、請求項８２に記載の方法。
【請求項９７】
前記接触が、前記組成物を含有する容器を前記窒素ガスでスパージすることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９８】
前記接触が、ｔｗｅｅｎ及び消泡剤のうちの少なくとも一方の存在下で行われる、請求項８２に記載の方法。
【請求項９９】
前記ｔｗｅｅｎが、Ｔｗｅｅｎ−２０及びＴｗｅｅｎ−８０のうちの少なくとも一方である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記消泡剤が、Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｃ、及びポロキサマーのうちの少なくとも１つである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗体が抗体断片である、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗体断片が抗原結合抗体断片である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ断片、またはｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記抗体がヒト免疫グロブリン定常領域を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗体がヒトＩｇＧ定常領域を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＩｇＧ定常領域のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＩｇＧ定常領域の前記アイソタイプがＩｇＧ１である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗体中のスルフィド結合が、抗体重鎖と抗体軽鎖との間、または抗体重鎖間、または抗体重鎖と軽鎖抗体との間及び抗体重鎖間の両方に存在する、請求項８２に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体が軽鎖定常ドメインを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項１１２】
前記軽鎖定常ドメインがカッパ定常ドメインである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記抗体が、重鎖を連結するヒンジ領域内に２つのスルフィド結合、ならびに軽鎖と重鎖との間に各々１つのスルフィド結合を含む４つの鎖間スルフィド結合を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項８２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記還元ステップが鎖間ジスルフィド結合のみを還元し、鎖内結合は還元しない、請求項８２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記オーリスタチンがＭＭＡＥまたはＭＭＡＦである、請求項８２に記載の方法。
【請求項１１６】
前記治療薬が、前記抗体の前記少なくとも１つのチオール基を前記治療薬に連結するように適合されたリンカー部分を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項１１７】
前記リンカー部分が、切断可能なリンカーである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記リンカー部分が、切断不可能なリンカーである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記リンカー部分が、細胞内条件下で切断されやすいリンカーである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記リンカー部分が、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞内プロテアーゼが、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記リンカー部分が、ジペプチドリンカーである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ジペプチドリンカーが、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカーである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ジペプチドリンカーが、遊離チオールと反応して共有結合を形成するマレイミド官能基である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記オーリスタチンの二量体またはその誘導体が、前記コンジュゲートステップで形成され、前記方法が、前記ＡＤＣを前記二量体から分離して、精製されたＡＤＣを形成することをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗体−治療薬コンジュゲートが、ａＣＤ２２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＣＤ２２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＬｙ６Ｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＬｙ６Ｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＣＤ７９ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＣＤ７９ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＮａＰｉ２ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ａＮａＰｉ２ｂ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ａＭＵＣ１６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、ＭＵＣ１６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、ｓＳＴＥＡＰ１、及びａＥＴＢＲのうちの１つである、請求項８２に記載の方法。