【手続補正書】
【提出日】平成29年12月6日(2017.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）多能性細胞を第１のＳＭＡＤ阻害剤および第２のＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＢＭＰ経路活性化剤の存在下ならびに第１および第２のＳＭＡＤ阻害剤の非存在下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を再播種するステップと
を含む、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、細胞を単層としてあるいは懸濁培養で培養する、ステップ（ｂ）において、細胞を単層としてあるいは懸濁培養で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性細胞が胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のＳＭＡＤ阻害剤が、ＢＭＰ１型受容体ＡＬＫ２および／またはＡＬＫ３の阻害剤、ドルソモルフィン誘導体、ノギン、コーディンおよび４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）、またはその塩もしくは水和物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が０．５ｎＭ〜１０μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第２のＳＭＡＤ阻害剤が、
ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７の阻害剤、
４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド、
２−メチル−５−（６−（ｍ−トリル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］イミダゾール−５−イル）−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール、
２−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）キナゾリン−４−アミン、
２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、
４−（２−（６−メチルピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル）フェノール、
２−（４−メチル−１−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）チエノ［３，２−ｃ］ピリジン、
４−（５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ベンズアミド、
２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）プテリジン−４−アミン、
６−メチル−２−フェニルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン、
３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ  ８３−０１）；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン（ＳＢ−５０５１２４）、
７−（２−モルホリノエトキシ）−４−（２−（ピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル）キノリン（ＬＹ２１０９７６１）、
４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４９４７）および
４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（ＳＢ−４３１５４２）
またはその塩もしくは水和物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が０．５ｎＭ〜１００μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において、多能性細胞を少なくとも１、３、４、５、６、７、８、９または１０日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の初期密度あるいは１０００００〜５０００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＢＭＰ経路活性化剤がＢＭＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）において、前記細胞を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）において、前記細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）において、前記細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤の濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下で培養する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）は、細胞をＢＭＰ経路活性化剤の存在下で培養した後、細胞を少なくとも１０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養することをさらに含み、
ステップ（ｃ）は、敷石状の形態を有するステップ（ｂ）の細胞を再播種することを含み、前記方法は、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
以下の追加のステップ：
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも１０日間培養する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＰＥ細胞を回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＰＥ細胞を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によってＲＰＥ細胞を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
−ＲＰＥ細胞を再播種することと、
−再播種したＲＰＥ細胞を培養することと
を含む方法によってＲＰＥ細胞を拡大する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
細胞を細胞１０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、または少なくとも４２日間培養する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）ＲＰＥ細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で播種するステップと、
（ｂ）前記ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤、ｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を拡大する方法。
【請求項２９】
ＲＰＥ細胞であって、
（ａ）多能性細胞を第１のＳＭＡＤ阻害剤および第２のＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＢＭＰ経路活性化剤の存在下ならびに第１および第２のＳＭＡＤ阻害剤の非存在下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を再播種するステップと
を含む、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法によって得られた、前記ＲＰＥ細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載のＲＰＥ細胞を含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載のＲＰＥ細胞または当該ＲＰＥ細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象において網膜疾患を処置する方法。
【請求項３２】
ａ）ＲＰＥ細胞および非ＲＰＥ細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
ｂ）細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮することによって、細胞集団中のＲＰＥ細胞のパーセンテージを増加させるステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を精製する方法。
【請求項３３】
ステップｂ）が、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
非ＲＰＥ細胞が多能性細胞またはＲＰＥ前駆体である、請求項３３に記載の方法。