【手続補正書】
【提出日】平成30年6月26日(2018.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
【図１】ＶＤＲ発現は、ＡＭＬにおける分化及び生存に関連する。（Ａ〜Ｂ）ＶＤＲ発現は、ＡＭＬサンプル及び健常サンプルにおいて骨髄分化に関連する。（Ａ）正常核型ＡＭＬ患者のコホートにおけるＦＡＢサブタイプに従ってＶＤＲ発現を示すgenebankデータセット研究（ＧＳＥ１２４１７；ｎ＝１６３）の後向き分析。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｂ）健常サンプル（骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４＋細胞、ｎ＝８；Ｇ−ＣＳＦ動員ドナーから精製されたＣＤ３４＋細胞、ｎ＝８；骨髄有核細胞（ＢＭＭＣ）、ｎ＝１０；末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ｎ＝１０を含む）及びＦＡＢサブタイプに従って分類されたＡＭＬ患者由来の白血病性芽球（ＡＭＬ０〜２、ｎ＝８；ＡＭＬ４〜５  ｎ＝９）におけるＶＤＲ発現を示すgenebankデータセット研究（ＧＳＥ９４７６シリーズ）の後向き分析。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ〜Ｄ）ＶＤＲ欠損形質転換細胞における制限された骨髄分化。（Ｃ）ＶＤＲ−／−マウス及び野性型マウス（Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド）由来の骨髄造血前駆細胞に、ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＬＬ−ＡＦ９、又はＦＬＴ３−ＩＴＤをコードしているレトロウイルスを形質導入した。ＣＤ１１ｂ汎骨髄マーカー及びＦ４／８０単球マーカーを用いてフローサイトメトリーによって細胞分化を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧３マウス／群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）（Ｃ）において生成された細胞の細胞形態（May-GrunwaldGiemsa/MGG染色）。（Ｅ〜Ｇ）ＶＤＲ及びＶＤＲ標的遺伝子発現は、ＡＭＬの予後と相関する。（Ｅ）ＶＤＲ発現に従ったＧＳＥ１２４１７シリーズ由来の患者の全生存（ＡＭＬ４又はＡＭＬ５サブタイプの集計ｎ＝６２）。相対的ＶＤＲ発現（低ＶＤＲ発現（ｎ＝２１、Ａライン）；中ＶＤＲ発現（ｎ＝２０、Ｂライン）、及び高ＶＤＲ発現（ｎ＝２１、Ｃライン））に従った、異なる群の患者（三分位数で分離）を比較するログランク解析。（Ｆ〜Ｇ）ＣＡＭＰ発現に従った無症候生存（ＥＦＳ）（Ｆ）及び全生存（ＯＳ）（Ｇ）のログランク解析（四分位数で分離、患者コホートの高ｎ＝２３（Ａライン）ｎ＝２３  低（Ｃライン）ｎ＝９０、及び中央生存（Ｂライン）ｎ＝９０を示す）。データは、Castaigneらによる研究（Castaigne et al., 2012）から得た。
【図２】ＶＤＲ−／−の癌遺伝子形質転換は、造血前駆細胞の頻度増大及び幹細胞性の増大に関連する。（Ａ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞におけるＬＳＫ細胞の頻度増大。（Ａ）上−Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＫＩＴ＋の代表的なドットプロット（ＭＬＬ−ＡＦ９癌遺伝子による白血病形質転換後の野性型及びＶＤＲ−／−の骨髄細胞由来のＬＳＫ細胞）。（Ａ）下−ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＬＬ−ＡＦ９、又はＦＬＴ３−ＩＴＤをコードしているレトロウイルスを形質導入した野性型細胞及びＶＤＲ−／−細胞におけるＬＳＫ＋細胞の定量。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧３マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｂ）ＶＤＲ−／−細胞の癌遺伝子形質転換によって、化学療法に対する耐性が得られる。野性型細胞及びＶＤＲ−／−形質転換細胞を、７２時間、擬処理したか又はシタラビン（１μM）若しくはバルプロ酸（ＶＰＡ；１mM）で処理した。発光によってＡＴＰ含量を求めることにより細胞の生存を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧３マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞における幹細胞性関連遺伝子の発現増加。野性型細胞及びＶＤＲ−／−ＦＬＴ３−ＩＴＤ形質転換細胞を、ｑＰＣＲ分析によってＥＶＩ−１、ＨＯＸＡ−９、及びＭＥＩＳ−１の発現について分析した。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ≧３マウス）として提示する。（Ｄ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞のクローン形成能の増大。癌遺伝子で形質転換した野性型及びＶＤＲ−／−の一次造血前駆細胞を、サイトカイン（Ｍ−３４３４）を含有する半固体メチルセルロース培地にプレーティング（３０，０００細胞／条件）し、そして、７〜１０日間の培養後にスコア化した。再プレーティングアッセイについては、各条件につき３０，０００細胞をプレーティングした。ヒストグラムは、コロニーの数（３つの独立した実験の平均±ＳＥＭ）を表す。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧６マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３】ＶＤＲの不活化によって、単球分化に関与している骨髄前駆細胞が増加し、そして、ＬＳＫ細胞の寿命が延長された。（Ａ〜Ｃ）定常状態条件では、ＶＤＲ欠損マウスは、正常数の白血球（ＷＢＣ）、単球、及び顆粒球を示す。８〜１６週齢の野性型（ｎ＝１４）及びＶＤＲ−／−（ｎ＝１１）マウスにおけるＷＢＣ（Ａ）、顆粒球（Ｃ）、及び単球（Ｃ）の数。データは、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｄ〜Ｅ）定常状態条件では、ＶＤＲ欠損マウスは、骨髄及び脾臓において正常な細胞充実性を示す。２４週齢の野性型（ｎ＝６）及びＶＤＲ−／−（ｎ＝６）のマウスにおける骨髄（Ｄ）及び脾臓（Ｅ）の細胞充実性。データは、平均±ＳＥＭである。（Ｆ）ＶＤＲ−／−マウスにおける造血前駆細胞の数の増大。野性型及びＶＤＲ−／−の１２週齢マウス（ｎ＝５〜８／群）の骨髄における造血前駆細胞集団のマルチパラメトリックフローサイトメトリー定量。系列限定前駆細胞（ＬＲＰ）、共通の骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、単球−マクロファージ前駆細胞（ＭＭＰ）、共通のリンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）。（Ｇ）ＶＤＲ−／−マウスにおける単球前駆細胞の数の減少。野性型及びＶＤＲ−／−マウス由来の骨髄細胞のＣＦＣアッセイ。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎ≧４マウス／コホート；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｈ）ＶＤＲ−／−マウスにおけるＬＳＫ、長期（ＬＴ）、及び短期（ＳＴ）の造血幹細胞（ＨＳＣ）の数の増大。１２週齢の野性型及びＶＤＲ−／−マウス（ｎ＝５〜８動物／群）の骨髄における造血前駆細胞集団のマルチパラメトリックフローサイトメトリー定量。ＬＳＫ、ＬＫ、ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ、集団。合計生存骨髄細胞のうちの所与の集団の比率を示す。（Ｈ）ＶＤＲ欠損マウス由来の造血前駆細胞は、静止状態の増大を示した。野性型マウス及びＶＤＲ−／−マウス（ｎ＝６動物／群）由来の骨髄ＬＳＫ細胞からＫｉ６７及びＰＩ標識によって実施した細胞周期解析。左−代表的なヒストグラム；右−Ｇ０細胞の平均±ＳＥＭ百分率をプロットする。（Ｈ）ＶＤＲ欠損マウス由来の造血前駆細胞は、ＲＯＳレベルの低下を示した。野性型マウス及びＶＤＲ−／−マウス（ｎ＝４動物／群）由来の細胞からの骨髄ＬＳＫ細胞のＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ標識。左−代表的なヒストグラム；右−ＲＯＳ高細胞の平均±ＳＥＭ百分率をプロットする。
【図４】プロモータの過剰メチル化は、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲ発現を制限し、そして、ＶＤＲ欠損細胞は、低メチル化剤に対して耐性である。（Ａ）ＶＤＲプロモータの概略図。５’−ＣｐＧ−３’島は、破線によって表されるＶＤＲプロモータ（エクソン１ａの転写開始コドンに対して−１０３５〜−７５＋ｂｐの範囲の領域）に存在する。ＮＦ−κｂ、ＳＰ１、及びＡＰ−２の結合部位を示す。（Ｂ）ＶＤＲプロモータは、ＡＭＬにおいてメチル化によって調節される。（Ｂ〜Ｃ）低メチル化剤は、ＡＭＬ細胞におけるＶＤＲプロモータのメチル化を調節する。９６時間、５−アザシチジン（５−ＡＺＡ；１μM）で処理した又は処理していないＡＭＬ患者（ｎ＝３）由来の白血病細胞。ヒストグラムは、ＶＤＲプロモータ（開始コドンから−１０３５〜−７５ｂｐを含む領域）についてのメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を示す。（Ｃ）ＴＨＰ１細胞を９６時間５−ＡＺＡ（１μM）で処理したか又は処理せず、そして、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩によって変換した。ＶＤＲプロモータ（開始コドンから−１０３５〜−７５ｂｐを含む領域）についての高解像度融解ＰＣＲを実施した。未処理細胞（Ａライン）５−ＡＺＡ処理細胞（Ｂライン）。（Ｄ）ＶＤＲ−／−形質転換細胞は、５−ＡＺＡ処理に対して耐性である。ＭＬＬ−ＥＮＬで形質転換された野性型及びＶＤＲ−／−の細胞を、７２時間、漸増濃度の５−ＡＺＡで処理した又はしなかった。ＡＴＰアッセイによって細胞の生存を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する（ｎｓ有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｅ〜Ｆ）５−ＡＺＡ処理は、ＡＭＬ細胞株においてＶＤＲ及びＶＤＲ標的遺伝子の発現を誘導する。ＨＬ６０を、６時間擬処理したか又は５−ＡＺＡ（５μM）若しくはビタミンＤ（１０００μM；ポジティブコントロールとして）で処理した。（Ｅ）ＶＤＲ又はＶＤＲ標的遺伝子（ＣＡＭＰ及びＣＹＰ２４Ａ１）の発現をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｇ）５−ＡＺＡ処理は、ＡＭＬ患者由来の白血病細胞においてＶＤＲ標的遺伝子の発現を誘導する。初代細胞（ｎ＝３患者）を、６時間擬処理したか、あるいは５−ＡＺＡ（５μM）若しくはイネカルシトール（ＩＮＥＣ；１０μM）又は両方で処理した。ＶＤＲ又はＶＤＲ標的遺伝子（ＣＡＭＰ及びＣＹＰ２４Ａ１）の発現をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。
【図５】５−ＡＺＡ及びＶＤＲアナログは、相乗的に作用して、ＡＭＬ細胞の分化を促進し、そして、腫瘍成長を低減する。（Ａ）１−２５ジヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ）及びＶＤＲアゴニストイネカルシトールの構造式。http://www.chemblink.com/products/163217-09-2.htm.（Ｂ〜Ｄ）低メチル化剤は、ＶＤＲアゴニストと相乗的に作用して、骨髄分化及びＶＤＲ活性を促進する。（Ｂ）Ｕ９３７細胞を、７２時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ＩＮＥＣ（１０μM）、又は両方で処理した。ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の発現をフローサイトメトリーによって評価した。結果は、ビヒクルと比較した倍数増加で提示する。ヒストグラムは、平均±ＳＥＭである（ｎ≧１０；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＨＬ６０細胞を、１６時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ビタミンＤ（３００nM）、若しくはＩＮＥＣ（１０μM）で処理した。顆粒球分化遺伝子（ＰＲＴＮ３及びＮＥ）及び単球分化遺伝子（ＴＲＥＭＬ２及びＳＥＲＰＩＮＢ８）をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｄ）Ｕ９３７細胞を、１６時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ＩＮＥＣ（１０nM）、又は両方で処理した。ＶＤＲ活性化を、抗ホスホＶＤＲ特異的抗体を用いてイムノブロットによって評価した。ＶＤＲ抗体を用いて、タンパク質負荷を制御した。（Ｅ〜Ｇ）低メチル化剤／ＶＤＲアゴニストの併用療法は、腫瘍成長を障害する。（Ｅ）ＨＬ６０細胞を、１６時間擬処理したか、又は５−ＡＺＡ（５μM）、ＩＮＥＣ（１０nM）、又は両方で処理した。トプロ−３標識によって細胞周期解析を実施した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。Ｇ１、Ｓ、及びＧ２期の細胞の百分率をプロットする（ｎ≧３；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｆ）細胞周期制御因子遺伝子ｐ１５、ｐ２１、及びｐ２７の発現をｑＰＣＲによって評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｇ）Ｕ９３７細胞（各群ｎ＝８腫瘍）の皮下異種移植後、ビヒクル（ＰＢＳ）、５−アシチジン（５mg/kg、１週間に３回腹腔内、５回注射）、及び／又はＩＮＥＣ（２０μg／マウス、腹腔内、１週間に３回）で処理したマウスの生存のKaplan-Meierプロット。ｐ値は、ログランク検定を用いて決定した。
【図６】ＶＤＲアナログは、ＡＭＬ細胞の幹細胞性を低減する。（Ａ）イネカルシトールは、形質転換細胞のＦＬＴ３−ＩＴＤのクローン形成能を低下させる。ＦＬＴ３−ＩＴＤ形質転換骨髄造血前駆細胞を、サイトカイン（Ｍ−３４３４）を含有し、ＩＮＥＣ（１０nM）を含有するか又は含有しない半固体メチルセルロース培地にプレーティング（３０，０００細胞／条件）し、そして、７〜１０日間の培養後にスコア化した。再プレーティングアッセイについては、１０〜３０，０００細胞を、各条件につきＩＮＥＣ（１０nM）の存在下又は非存在下でプレーティングした（指定の通り）。ヒストグラムは、コロニーの数（３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ）を表す。結果は、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｂ）ＶＤＲアゴニストは、β−カテニン経路を阻害する。ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞を、４８時間擬処理したか、又は漸増濃度のＩＮＥＣ（１０、１００、又は１０００nM）で処理した。β−カテニンの発現をフローサイトメトリーによって評価した。