【手続補正書】
【提出日】平成30年4月13日(2018.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、宿主細胞表面でタンパク質をディスプレイする方法：
（a）宿主細胞に、前記宿主細胞の表面でディスプレイされるべき標的のタンパク質をコードする少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドを導入する工程であって、前記標的のタンパク質が少なくとも1つのFcドメインホモダイマーを含む、前記工程；
（b）前記宿主細胞の表面を第一の標識と接触させる工程であって、前記第一の標識がビオチン、ビオチン誘導体又はビオチンアナログであり、前記宿主細胞の表面と共有結合により結合している、前記工程；
（c）（b）の前記宿主細胞の表面を第二の標識と接触させ、それによって第二の標識が、特異的かつ非共有結合的に前記第一の標識及び前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる前記標的のタンパク質と結合する工程；
（d）前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドを、当該少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる前記標的のタンパク質の分泌に十分な条件下で、前記宿主細胞で発現させる工程；
（e）工程（d）の前記宿主細胞を、前記第二の標識が非共有結合により結合した前記標的のタンパク質を特異的に検出する手段と接触させ、その表面で標的のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を検出する工程。
【請求項２】
前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコーダされるタンパク質がモノマー又はマルチマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質がシグナルペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の標識がさらに別のタンパク質又はさらに別のポリペプチドである、請求項１−３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記第二の標識が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、又はその配列変種と融合された、タンパク質A、タンパク質L、タンパク質G、タンパク質A−G融合物、タンパク質AのドメインE、D、A、Bの1つである、又はそれらの1つを含む、マルチマータンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が哺乳動物、酵母又は昆虫細胞から選択される、請求項１−５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的のタンパク質を特異的に検出する手段が、抗体若しくは抗体フラグメント、量子ドット、酵素、発蛍光団、又はインターカレート染料及びガングリオシドを含む群から選択される、請求項１−６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的のタンパク質を特異的に検出する手段が、さらなる標識を含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、scFv-Fc、scFv、(Fab’)2、Fab、ミニボディ、ジアボディ、又はVHH抗体の1つである、請求項１−７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
さらに宿主細胞を選別する工程を含み、前記選別された宿主細胞が改変された表現型の標的のタンパク質をディスプレイする、請求項１−８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変された表現型が、表面発現レベル、タンパク質安定性、タンパク質の折り畳み又は親和性の1つである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変された表現型が、工程（e）の前記宿主細胞を参照サンプルと比較することによって決定される、請求項１−１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも1つのFcドメインホモダイマーが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、若しくはネズミIgG3又は前記の配列変種の1つである、請求項１−１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Fcドメイン含有タンパク質がN-末端Fcドメイン融合タンパク質、C-末端Fcドメイン融合タンパク質又は抗体である、請求項１−１２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、ネズミモノクローナル抗体、マウス-ヒトキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はヒトモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の標識が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、又はネズミIgG3のFcドメインと特異的に結合する、請求項１−１５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の標識が配列番号:1のアミノ酸配列及び/又は配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項１−１６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二の標識が配列番号:3のアミノ酸配列を含む、請求項１−１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（e）の検出がさらに以下の工程を含む、請求項１−１８のいずれか1項に記載の方法：
（i）前記宿主細胞を、検出できるように標識された抗体又は抗体フラグメントと接触させる工程であって、前記抗体又は抗体フラグメントが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、若しくはネズミIgG3のFcドメイン又はその変種配列と特異的に結合するか、或いはヒト若しくはネズミのIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、又はネズミIgG3のカッパ若しくはラムダ軽鎖、又は前記の配列変種と特異的に結合する、前記工程；
（ii）前記宿主細胞を、第二の標識を結合させた抗体と特異的に結合する抗原及び/又はエピトープと接触させる工程であって、前記抗原及び/又はエピトープが（i）で用いられた標識とは別個のさらに別の検出可能な標識と結合される、前記工程；
（iii）前記宿主細胞で（i）及び/又は（ii）の標識を検出する工程；
（iv）参照サンプルと比較して、（i）で用いられた標識、及び/又は（ii）で用いられた標識の改変量をディスプレイするか、及び/又は両標識の改変量をディスプレイする宿主細胞を選別する工程。
【請求項２０】
（i）及び（ii）の標識及び/又は選別工程（iv）が、フローサイトメトリー及び/又はFACS及び/又はミクロ流体技術を含み、工程（a）−（e）が繰り返される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が酵母細胞であり、工程（a）がさらに少なくとも第一及び第二の酵母細胞の接合を含み、前記第一及び第二の宿主細胞が異なるポリヌクレオチドを含み、その少なくとも1つがFcドメイン含有融合タンパク質をコードし、かつ前記第一及び第二の宿主細胞の前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つの選別可能な別個のマーカーを含む、請求項１−２０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の酵母細胞が免疫グロブリン軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、及び/又は前記第二の酵母細胞が免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一の酵母細胞が、免疫グロブリン軽鎖ライブラリーをコードするポリヌクレオチドを含み、前記第二の酵母細胞が、標的のタンパク質に対して予め決定された親和性の免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１−２３のいずれか1項に記載の方法における、配列番号:3のアミノ酸配列を含むタンパク質の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
表1：本発明の方法によってBJ5464細胞でディスプレイされる抗体の抗原特異性及びKD値
2017533704.tif 000001
次に、本発明の態様を示す。
１.  以下の工程を含む、宿主細胞表面でタンパク質をディスプレイする方法：
（a）宿主細胞に、前記宿主細胞の表面でディスプレイされるべき標的のタンパク質をコードする少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドを導入する工程；
（b）前記宿主細胞の表面を第一の標識と接触させる工程；
（c）（b）の前記宿主細胞の表面を第二の標識と接触させ、それによって第二の標識が、特異的かつ非共有結合的に前記第一の標識及び前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる前記標的のタンパク質と結合する工程；
（d）前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドを、当該少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる前記標的のタンパク質の分泌に十分な条件下で、前記宿主細胞で発現させる工程；
（e）工程（d）の前記宿主細胞を、前記第二の標識が非共有結合により結合した前記標的のタンパク質を特異的に検出する手段と接触させ、その表面で標的のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を検出する工程。
２.  前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコーダされるタンパク質がモノマー又はマルチマーである、上記１に記載の方法。
３.  前記少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質がシグナルペプチドを含む、上記１又は２に記載の方法。
４.  前記第一の標識が前記宿主細胞の表面と共有結合により結合する、上記１−３のいずれか1項に記載の方法。
５.  前記第一の標識がビオチン又はビオチン誘導体である、上記１−４のいずれか1項に記載の方法。
６.  前記第二の標識がさらに別のタンパク質又はさらに別のポリペプチドである、上記１−５のいずれか1項に記載の方法。
７.  前記第二の標識のさらに別のタンパク質がマルチマータンパク質である、上記６に記載の方法。
８.  前記第二の標識が、タンパク質A、タンパク質L、タンパク質G、タンパク質A−G融合物、タンパク質AのドメインE、D、A、Bの1つであるか、又は前記を含み、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、又はその配列変種と融合される、上記１−７のいずれか1項に記載の方法。
９.  前記宿主細胞が哺乳動物、酵母又は昆虫細胞から選択される、上記１−８のいずれか1項に記載の方法。
１０.  酵母宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、クルイベロミセスラクチス（Kluyveromyceslactis）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含む群から選択される、上記１−８のいずれか1項に記載の方法。
１１.  哺乳動物宿主細胞が、HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK 293F、NS0、per.C6、MCF-7、HeLa、Cos-1、Cos-7、PC-12、3T3、Vero、vero-76、PC3、U87、SAOS-2、LNCAP、DU145、A431、A549、B35、H1299、HUVEC、Jurkat、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、Caco-2、CHO、CHO-K1、CHO-B11、CHO-DG44、BHK、AGE1.HN、Namalwa、WI-38、MRC-5、HepG2、L-929、RAB-9、SIRC、RK13、11B11、1D3、2.4G2、A-10、B-35、C-6、F4/80、IEC-18、L2、MH1C1、NRK、NRK-49F、NRK-52E、RMC、CV-1、BT、MDBK、CPAE、MDCK.1、MDCK.2、及びD-17を含む群から選択される、上記１−９のいずれか1項に記載の方法。
１２.  昆虫細胞が、Hi5、Sf9、Sf21、S2及びBTI-TN-5B1-4を含む群から選択される、上記１−９のいずれか1項に記載の方法。
１３.  前記標的のタンパク質を特異的に検出する手段が、抗体若しくは抗体フラグメント、量子ドット、酵素、発蛍光団、又はインターカレート染料及びガングリオシドを含む群から選択される、上記１−１２のいずれか1項に記載の方法。
１４.  前記タンパク質を特異的に検出する手段が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、scFv-Fc、scFv、(Fab’)2、Fab、ミニボディ、ジアボディ、又はVHH抗体の1つであり、場合によってさらに別の標識と結合される、上記１−１３のいずれか1項に記載の方法。
１５.  さらに宿主細胞を選別する工程を含む、上記１−１４のいずれか1項に記載の方法。
１６.  前記選別された宿主細胞が改変された表現型の標的のタンパク質をディスプレイする、上記１５のいずれか1項に記載の方法。
１７.  前記改変表現型が、表面発現レベル、タンパク質安定性、タンパク質の折り畳み又は親和性の1つである、上記１６に記載の方法。
１８.  前記改変された表現型が、工程（e）の前記宿主細胞を参照サンプルと比較することによって決定される、上記１−１７のいずれか1項に記載の方法。
１９.  工程（a）の少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる標的のタンパク質が少なくとも1つのFcドメインホモダイマーを含む、上記１−１８のいずれか1項に記載の方法。
２０.  前記少なくとも1つのFcドメインホモダイマーが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、若しくはネズミIgG3又は前記の配列変種の1つである、上記１９に記載の方法。
２１.  前記Fcドメイン含有タンパク質がN-末端Fcドメイン融合タンパク質、C-末端Fcドメイン融合タンパク質又は抗体である、上記１９又は上記２０に記載の方法。
２２.  前記抗体がモノクローナル抗体である、上記２１に記載の方法。
２３.  前記モノクローナル抗体が、ネズミモノクローナル抗体、マウス-ヒトキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はヒトモノクローナル抗体である、上記２２に記載の方法。
２４.  前記第二の標識が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、又はネズミIgG3のFcドメインと特異的に結合する、上記１−２３のいずれか1項に記載の方法。
２５.  前記第二の標識の抗体結合の親和性が、少なくともKd＝10-8M、2.5ｘ10-8M、5ｘ10-8M、7.5ｘ10-8M、10-9M、5ｘ10-9M、7.5ｘ10-9M、10-10M、2.5ｘ10-10M、5ｘ10-10M、7.5ｘ10-10M、10-11M、2.5ｘ10-11M、5ｘ10-11M、7.5ｘ10-11M、又は10-12Mである、上記１−２４のいずれか1項に記載の方法。
２６.  前記第二の標識が配列番号:1のアミノ酸配列及び/又は配列番号:2のアミノ酸配列を含む、上記１−２５のいずれか1項に記載の方法。
２７.  前記第二の標識が配列番号:3のアミノ酸配列を含む、上記１−２６のいずれか1項に記載の方法。
２８.  工程（e）がさらに以下の工程を含む、上記１−２７のいずれか1項に記載の方法：
（i）前記宿主細胞を、検出できるように標識された抗体又は抗体フラグメントと接触させる工程であって、前記抗体又は抗体フラグメントが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、若しくはネズミIgG3のFcドメイン又はその変種配列と特異的に結合する、前記工程；
（ii）前記宿主細胞を、第二の標識を結合させた抗体と特異的に結合する抗原及び/又はエピトープと接触させる工程であって、前記抗原及び/又はエピトープが（i）で用いられた標識とは別個のさらに別の検出可能な標識と結合される、前記工程；
（iii）前記宿主細胞で（i）及び/又は（ii）の標識を検出する工程；
（iv）参照サンプルと比較して、（i）で用いられた標識、及び/又は（ii）で用いられた標識の改変量をディスプレイするか、及び/又は両標識の改変量をディスプレイする宿主細胞を選別する工程。
２９.  工程（e）の検出できるように標識された抗体又は抗体フラグメントが、ヒト若しくはネズミのIgG1、ヒトIgG2、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、又はネズミIgG3のカッパ若しくはラムダ軽鎖、又は前記の配列変種と特異的に結合する、上記２８に記載の方法。
３０.  （i）及び（ii）の標識及び/又は選別工程（iv）が、フローサイトメトリー及び/又はFACS及び/又はミクロ流体技術を含む、上記２８又は上記２９に記載の方法。
３１.  工程（a）−（e）が繰り返される、上記１−３０のいずれか1項に記載の方法。
３２.  宿主細胞が酵母細胞であり、工程（a）がさらに少なくとも第一及び第二の酵母細胞の接合を含み、前記第一及び第二の宿主細胞が異なるポリヌクレオチドを含み、その少なくとも1つがFcドメイン含有融合タンパク質をコードし、かつ前記第一及び第二の宿主細胞の前記ポリヌクレオチドが少なくとも1つの選別可能な別個のマーカーを含む、上記１−３１のいずれか1項に記載の方法。
３３.  前記第一の酵母細胞が免疫グロブリン軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、及び/又は前記第二の酵母細胞が免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、上記３２に記載の方法。
３４.  前記第一の酵母細胞が、免疫グロブリン軽鎖ライブラリーをコードするポリヌクレオチドを含み、前記第二の酵母細胞が、標的のタンパク質に対して予め決定された親和性の免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、上記３３に記載の方法。
３５.  配列番号:5のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
３６.  配列番号:5の核酸配列によってコードされる単離タンパク質であって、配列番号:4のアミノ酸が除去されている、前記単離タンパク質。
３７.  上記３５に記載の少なくとも1つの核酸分子を含む、宿主細胞。
３８.  以下の工程を含む、タンパク質を生成するプロセス：
−上記３７に記載の宿主細胞をタンパク質発現に十分な条件下でin vitro培養する工程；
−上記３５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現させる工程；
−前記タンパク質を単離及び精製する工程。
３９.  前記単離タンパク質が配列番号:3のアミノ酸配列を含む、上記３８に記載のプロセス。
４０.  前記単離及び精製されたタンパク質がマルチマーである、上記３８又は上記３９に記載のプロセス。
４１.  上記１−３４のいずれか1項に記載の方法における、上記３８−４０のいずれか1項に記載のプロセスにしたがって入手できるタンパク質の使用。
４２.  以下を含む、複数の部分のキット：
−上記１−３４のいずれか1項に記載の第一の標識；
−上記３６に記載の単離タンパク質、及び/又は上記３８−４０のいずれか1項に記載のプロセスで使用される配列番号:5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
−上記１−３４のいずれか1項に記載のタンパク質ディスプレイの方法で使用される宿主細胞。
４３.  前記宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ、ハンセヌラ・ポリモルファ、シゾサッカロミセス・ポンベ、シュワンニオミセス・オクシデンタリス、クルイベロミセスラクチス、ヤロウイア・リポリチカ、ピキア・パストリス、HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK 293F、NS0、per.C6、MCF-7、HeLa、Cos-1、Cos-7、PC-12、3T3、Vero、vero-76、PC3、U87、SAOS-2、LNCAP、DU145、A431、A549、B35、H1299、HUVEC、Jurkat、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、Caco-2、CHO、CHO-K1、CHO-B11、CHO-DG44、BHK、AGE1.HN、Namalwa、WI-38、MRC-5、HepG2、L-929、RAB-9、SIRC、RK13、11B11、1D3、2.4G2、A-10、B-35、C-6、F4/80、IEC-18、L2、MH1C1、NRK、NRK-49F、NRK-52E、RMC、CV-1、BT、MDBK、CPAE、MDCK.1、MDCK.2、D-17、Hi5、Sf9、Sf21、S2又はBTI-TN-5B1-4の1つである、上記４２に記載の複数の部分のキット。
４４.  上記３６に記載の単離タンパク質及び/又は配列番号:5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが凍結乾燥されている、上記４２又は上記４３に記載の複数の部分のキット。