【手続補正書】
【提出日】平成30年10月26日(2018.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
【図１Ａ】ナノポアデバイス１５と併用して使用されるマイクロ流体デバイス１０を描写する。
【図１Ｂ】ナノポアデバイス１５と併用して使用されるマイクロ流体デバイス１０を描写する。
【図２Ａ】チャンネル４０経由でナノポアモジュール３０とマイクロ流体モジュール２０を組み合わせた可逆的集積デバイスの概略図を描写する。
【図２Ｂ】チャンネル４０経由でナノポアモジュール３０とマイクロ流体モジュール２０を組み合わせた可逆的集積デバイスの概略図を描写する。
【図２Ｃ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｄ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｅ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｆ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｇ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｈ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｉ−１】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｉ−２】例示的な集積デバイスの、モジュール間のインターフェースでの横断面の正面図を描写する。
【図２Ｊ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｋ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。
【図２Ｌ】例示的な集積デバイスの概略図を描写し、そこではマイクロ流体モジュールはナノポアモジュールへ流体的に接続される。ナノポアモジュールは、２つのマイクロ流体チャンネルが交差する場所で２つのマイクロ流体チャンネルを物理的に分離する層中でナノポアを含む。
【図３】マイクロ流体モジュール３００およびナノポアモジュール３２５を含む、例示的な集積デバイスを図示する。
【図４】集積デバイス４００を提供し、そこではデジタルマイクロ流体モジュールは内蔵のナノポアモジュールを含む。
【図５Ａ】集積デバイスの上面図を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの集積デバイスの側面図を示す。
【図６】本開示の例示的なデバイスおよび方法を描写する。
【図７】本開示の例示的なデバイスおよび方法を描写する。
【図７Ｂ】本開示の例示的なデバイスおよび方法を描写する。
【図８】本開示の例示的な集積デバイスの側面図を描写する。
【図９】本開示の例示的なシステムを描写する。
【図１０】低コストのＤＭＦチップの製作過程の概略図を描写する。
【図１１】図１０中の概略図に従って製作された単一の可撓性ＤＭＦチップを描写する。
【図１２】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦチップ中の小滴のアクチュエーションを描写する。
【図１３Ａ】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦチップにおける免疫アッセイの遂行を描写する。
【図１３Ｂ】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦチップにおける免疫アッセイの遂行を描写する。
【図１３Ｃ】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦチップにおける免疫アッセイの遂行を描写する。
【図１３Ｄ】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦチップにおける免疫アッセイの遂行を描写する。
【図１３Ｅ】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦチップにおける免疫アッセイの遂行を描写する。
【図１４Ａ】本開示の実施形態に記載の、ナノポアモジュールの製作およびデザインを描写する。
【図１４Ｂ】本開示の実施形態に記載の、ナノポアモジュールの製作およびデザインを描写する。
【図１４Ｃ】本開示の実施形態に記載の、ナノポアモジュールの製作およびデザインを描写する。
【図１５Ａ】リアルタイムで測定された漏洩電流のプロットを示す。
【図１５Ｂ】ナノポアについての電流−電圧（Ｉ−Ｖ）カーブを描写する。
【図１６Ａ】本開示の実施形態に記載の、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスにおけるキャピラリーチャンネルの充填を示す。
【図１６Ｂ】本開示の実施形態に記載の、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスにおけるキャピラリーチャンネルの充填を示す。
【図１６Ｃ】本開示の実施形態に記載の、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスにおけるキャピラリーチャンネルの充填を示す。
【図１７】本開示の実施形態に記載の、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスにおけるモジュール間の小滴転送のための概略図を示す。
【図１８】本開示の実施形態に記載の、ナノポアモジュールのデザインの概略図を示す。
【図１９】本開示の実施形態に記載の、受動輸送によるモジュール間の小滴転送を実行するのに適合した集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスの概略図を示す。
【図２０】本開示の実施形態に記載の、受動輸送によるモジュール間の小滴転送を実行するのに適合した集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスの概略図を示す。
【図２１】本開示の実施形態に記載の、受動輸送による液滴の受動的な動きを可能にする、シリコンマイクロチャンネルを含有するシリコンマイクロ流体デバイスの概略図である。
【図２２】本開示の実施形態に記載の、受動輸送による液滴の受動的な動きを可能にする、シリコンマイクロ流体デバイスのシリコンマイクロチャンネルの像である。
【図２３Ａ】本開示の実施形態に記載の、集積ナノポアセンサーについての製作方法の概略図を示す。
【図２３Ｂ】本開示の実施形態に記載の、集積ナノポアセンサーについての製作方法の概略図を示す。
【図２４Ａ】通常の二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）からなる、ナノポアを介して示される移動事象を使用して得られるプロットについてのスキャッタープロット（レベルの継続時間ｖｓ遮断のレベル）を提示する。
【図２４Ｂ】ＤＢＣＯ修飾ｄｓＤＮＡからなる、ナノポアを介して示される移動事象を使用して得られるプロットについてのスキャッタープロット（レベルの継続時間ｖｓ遮断のレベル）を提示する。
【図２４Ｃ】ｄｓＤＮＡスターからなる、ナノポアを介して示される移動事象を使用して得られるプロットについてのスキャッタープロット（レベルの継続時間ｖｓ遮断のレベル）を提示する。
【図２５】チオール媒介性化学切断の概略図を示す。
【図２６Ａ】磁性マイクロ粒子上で実行される光切断実験の概略図を示す。示される配列はいずれも配列番号：６〜７である。
【図２６Ｂ】磁性マイクロ粒子上で実行される光切断実験の概略図を示す。示される配列は、上から順に、配列番号：６、配列番号：６〜７、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：６〜７である。
【図２７】ＤＭＦチップ上の試薬設置の概略図を示す。
【図２８】秒-1での、サンプルｖｓナノポア流動（ＤＭＦ切断）の棒グラフを提示する。
【図２９】デジタルシグナルのカウントについての閾値が決定される手段を提示する。
【図３０Ａ】９４ｎＭのスタンダードについての異なる時間的な期間にわたる電流遮断を示す。
【図３０Ｂ】１８２ｎＭのスタンダードについての異なる時間的な期間にわたる電流遮断を示す。
【図３０Ｃ】２６６ｎＭのスタンダードについての異なる時間的な期間にわたる電流遮断を示す。
【図３１】固定された量の時間（５分間）にわたる事象の数の用量−応答カーブを示す。
【図３２】事象の固定された数に要求される時間の用量−応答カーブを示す。
【図３３】単位時間あたりの事象の用量−応答カーブを示す。
【図３４】Ｓｅｑ３１−ＳＳ−ビオチンを使用する、単位時間あたりの事象の用量−応答カーブを示す。
【図３５】本開示の実施形態に記載の、シリコンナノポアモジュールにおけるナノポアチャンバーのデザインの概略図を示す。
【図３６】本開示の実施形態に記載の、シリコンナノポアモジュールのナノポアチャンバーにおけるＣＯＭＳＯＬ電界シミュレーションのために使用される物理的パラメーターを表のリストに示す。
【図３７】本開示の実施形態に記載の、シリコンナノポアモジュール中のナノポアの近くのカウンターイオン濃度勾配についてのシミュレーション結果を示す像のコレクションである。
【図３８】本開示の実施形態に記載の、ナノポアを介する電気浸透流に対する、ナノポアを備えたナノポア膜にわたって作製されたＳｉＯ2ビアの直径の効果を示すグラフである。
【図３９】本開示の実施形態に記載の、ナノポアを介するコンダクタンスに対する、ナノポアを備えたナノポア膜にわたって作製されたＳｉＯ2ビアの直径の効果を示すグラフである。
【図４０】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦモジュールの１つの側面上に位置するナノポアモジュールを備えた、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスの概略図を示す。
【図４１】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦモジュール基板中のＤＭＦモジュールから孔を介する液体の毛細管力による動きを示す像のコレクションである。
【図４２】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦモジュールの１つの側面上に位置するナノポアモジュールおよびナノポア製作のために構成された電極を備えた、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスを示す像のコレクションである。
【図４３】本開示の実施形態に記載の、ＤＭＦモジュールの１つの側面上に位置するナノポアモジュールを備えた、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスの概略図である。
【図４４】本開示の実施形態に記載の、２つのＤＭＦモジュールの間に位置するナノポアモジュールを備えた、集積ＤＭＦナノポアモジュールデバイスの概略図である。
【図４５】本開示の実施形態に記載の、ナノポア膜を横切って電圧を適用することによって、および誘電破壊によって証明されるように、ナノポア膜（透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）ウィンドウ）におけるナノポアの製作を示すグラフである。
【図４６Ａ】本開示の実施形態に記載の、条件付けプロセスの前の膜において形成されたナノポアの電流−電圧（Ｉ−Ｖ）カーブを示すグラフのコレクションである。
【図４６Ｂ】本開示の実施形態に記載の、条件付けプロセスの後の膜において形成されたナノポアの電流−電圧（Ｉ−Ｖ）カーブを示すグラフのコレクションである。
【図４７】ＳＮＲ（シグナル対ノイズ比）に対する、カウントされる標識の平均直径とナノポアサイズとの間でプロットされた比の平均のスキャッタープロットを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
第２の結合メンバー中に取り込まれたタグの数（すなわちタグ／第２の結合メンバーのコンジュゲート中のタグの数）は、検体により定義されたストイキオメトリーを提供する。ある特定の実施形態において、タグは、各々の第２の結合メンバーへ添付された一貫した数のタグ（複数可）を産する手順を使用して、第２の結合メンバーへ添付され得る。タグの数はカウントのスピードに基づいて最適化され得る。より速いリード速度は、カウント速度が濃度に依存するので結合メンバー上に多くのタグを含むことによって得ることができる。タグの数は、タグ取り込みのストイキオメトリー（例えば１：１または１：４の取り込み率）に基づいて最適化することができる。いくつかの実施形態において、１：５の取り込み率がある。例えば、１つの第２の結合メンバーは、それへ添付された１つのタグ分子、２つのタグ分子、３つのタグ分子、４つのタグ分子、または１０までのタグ分子を有し得る。いくつかの実施形態において、１つの第２の結合メンバーは、それへ添付された５つのタグ分子を有し得る。第２の結合メンバー（例えばペプチド、ポリペプチド、核酸）へタグをコンジュゲートするための多くのコンジュゲーション法は公知であり、そのうちの任意のものを使用して、本方法およびデバイスにおける使用のためのタグ付けされた第２の結合メンバーを調製することができる。例えば、検体特異的抗体へのタグの部位特異的コンジュゲーションは、チオール−マレイミド化学、アミン−スクシンイミジル化学、ＴＨＩＯＢＲＩＤＧＥ（商標）技術を使用して、Ｃ末端またはＮ末端のヘキサヒスチジンタグ（配列番号：１２）を備えた抗体、アルデヒドタグを備えた抗体、銅不含有クリック反応、および同種のものを使用して、実行され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３６】
（実施例１６）
切断可能なＤＮＡ−ビオチンコンストラクトの合成
非ビオチン化二本鎖ＤＮＡ（ＮＰ１）の合成
２つの一本鎖の５０ｍｅｒを標準的なホスホロアミダイトケミストリー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して合成した。オリゴＮＰ１−１Ｓは、Ｃ−１２炭素スペーサーによってＤＮＡから分離された５’末端上にアミノ基を含有する５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列（配列番号：１）（１、ＭＷ＝１５，５２２．３ｇ／モル、ε＝５０２，１００Ｍ-1ｃｍ-1）からなっていた。オリゴＮＰ１−２ＡＳは、ＮＰ１−１Ｓに相補的な５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列（配列番号：２）（２、ＭＷ＝１５，５０７．１ｇ／モル、ε＝４８７，９００Ｍ-1ｃｍ-1）からなっていた。両方のオリゴヌクレオチドを後続の操作の前に定量および凍結乾燥した。示される配列は、上から順に、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１〜２である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３８】
非ビオチン化二本鎖５０ｂｐのＤＮＡコンストラクトの合成：ＮＰ１−２ＡＳ（１．４４ｍｇ、９３．４ナノモル）を０．５ｍＬの蒸留水中で再構成して、１８７μＭの溶液を得た。ＮＰ１−１Ｓ（１．３２ｍｇ、８５．３ナノモル）を、０．５ｍＬの５０ｍＭのリン酸塩、７５ｍＭの塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で再構成して、１７１μＭの溶液を得た。二本鎖コンストラクト（３）（配列番号：１、フォワードストランド（上部）；  配列番号：２、リバースストランド（下部））を、４０μＬのＮＰ１−２ＡＳ溶液（７．４７μモル）と６０μＬのＮＰ１−１Ｓ溶液（１０．２μモル）をアニールすることによって作製した。混合物を８５℃で３０分間加熱ブロック中に設置し、続いて、２時間にわたって室温へ徐冷した。１０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）により平衡化されたＴｏｓｏＨ  Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）に全アニーリング体積（１００μＬ）を注入することによって、二本鎖材料を精製した。カラム溶出液を２６０および２８０ｎｍでモニターした。二本鎖材料（３）は７．９分で溶出された（およそ２０分間）。ＤＮＡを、０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎフィルター濃縮器（ＭＷカットオフ１０，０００Ｄａ）を使用して、１５０μＬへ濃縮した。最終的なＤＮＡ濃度は、Ａ260の吸光度によって決定されるように、４０．５μＭであると計算された。示される配列は、上から順に、配列番号：１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１〜２である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４３】
（実施例１７）
切断可能なＤＮＡ−ビオチンコンストラクトの代替合成
相補的ＤＮＡ配列（ＮＰ−３１ａおよびＮＰ−３１ｂ）：２つの一本鎖の６０ｍｅｒを標準的なホスホロアミダイトケミストリー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して合成した。オリゴＮＰ−３１ａは、Ｃ−６炭素スペーサーによってＤＮＡから分離された５’末端上にアミノ基を含有する６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列（配列番号：３）（１、ＭＷ＝１８，８４１．２ｇ／モル、１．７μＭ／ＯＤ）からなっていた。オリゴＮＰ−３１ｂは、ＮＰ−３１ａに相補的な６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列（配列番号：４）（２、ＭＷ＝１８２９２．８ｇ／モル、１．８μＭ／ＯＤ）からなっていた。両方のオリゴヌクレオチドを後続の操作の前に定量および凍結乾燥した。示される配列は、上から順に、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：３〜４である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４４】
【化１８】
2018511805.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４５】
一本鎖の５’アミノオリゴＮＰ−３１ａのビオチン化
１０ｍＭのＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−ｄＰＥＧ４−ビオチン（４、ＭＷ＝７５１．９４ｇ／モル、Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ）の溶液を、２．０ｍＬのジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中での１５．０４ｍｇの粉末の溶解によって調製した。溶液をボルテックスで撹拌し、５’アミノ−ＤＮＡのビオチン化のために直ちに使用した。およそ１００μＬの１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中のｓｓＤＮＡ（１、１００μＭ、０．０１μモル、０．１８８ｍｇ）（配列番号：３）溶液を、１０μＬのＤＭＦ中の１０ｍＭのビオチン化試薬（０．１μモル、ｓｓＤＮＡに対して１０倍のモルの過剰量）と混合した。混合物を混合し、室温で２時間反応させた。２つの０．５ｍＬのＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷカットオフ７，０００Ｄａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で平衡化した。粗製のビオチン化ｓｓＤＮＡ溶液を１つのＺｅｂａカラムへ添加し、２分間４，６００ｒｐｍで溶出させた。記載されるように、溶出液を第２のＺｅｂａカラムへ移し溶出させた。精製されたＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチン（５）（配列番号：３）の濃度を、Ａ260の吸光度の測定によって決定した（１．４５ｍｇ／ｍｌ、７７μＭ）。示される配列は、上から順に、配列番号：３、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：３〜４である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４８】
（実施例１８）
切断可能なＤＮＡ−ビオチン（チオール媒介性切断コンストラクト）の合成
ストレプトアビジンコーティング磁性マイクロ粒子（ＳＡ−ＭＰ）へのｓｓＮＰ−３１−ＳＳビオチンの結合および化学切断（ＴＣＥＰまたはＤＴＴ）
化学切断実験を以下の方法によって磁性マイクロ粒子上で実行した（図２５を参照）。１００μＬの７７μＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で修飾オリゴヌクレオチドｓｓＮＰ−３１−ＳＳビオチン溶液を、１μＬの０．１％のストレプトアビジン常磁性マイクロ粒子と共に室温で３０分間インキュベーションした。磁石へ粒子を誘引することおよびＰＢＳＴバッファー（ｐＨ７．４）により１０回洗浄することによって、過剰なオリゴを除去した。オリゴ結合粒子を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の変動濃度のＤＴＴまたはＴＣＥＰのいずれかにより１５分間インキュベーションした。マイクロ粒子をＰＢＳＴバッファー（ｐＨ７．４）により１０回洗浄して、任意の切断されたオリゴヌクレオチドを除去した。フルオロフォアを含有する相補的配列ＮＰ−３１ｃ（配列番号：５）（７、ＭＷ＝７４９４．６ｇ／モル、５．２μＭ／ＯＤ）を、マイクロ粒子と共にＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３０分間インキュベーションして、粒子上でインタクトなままの任意の未切断のｓｓＮＰ−３１−ＳＳビオチンと結合させた。マイクロ粒子を磁石へ誘引し、ＰＢＳＴバッファー（ｐＨ７．４）により１０回洗浄して、任意の過剰なＮＰ−３１ｃセグメントを除去した。上記のように調製されたコーティングマイクロ粒子を洗浄したが、化学切断を行わず、対照として供した。粒子上の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡法によって測定した。表１中に示されるように、最大切断効率はＤＴＴおよびＴＣＥＰについてそれぞれ７９％および９３％と測定された。以下に示される配列は配列番号：５である。