【手続補正書】
【提出日】平成30年9月10日(2018.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体液を含む試料において可溶性ミスフォールディングα−シヌクレイン（αＳ）タンパク質の存在を判定するための方法であって、
前記試料を、前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質に対応するモノマーフォールディングαＳタンパク質と接触させてインキュベーション混合物を形成させるステップであって、前記インキュベーション混合物は、１００ｎＭ〜２０μＭの濃度範囲でモノマーフォールディングαＳタンパク質を含む、ステップ；
前記インキュベーション混合物に緩衝液を与えるステップであって、前記緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳのうちの１つを含む、ステップ；
ミスフォールディングαＳタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施するステップであって、各インキュベーションサイクルが、
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在下で、前記モノマーフォールディングαＳタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるように前記インキュベーション混合物をインキュベートすることと；
存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるように前記インキュベーション混合物を物理的に破壊することと、
を含む、ステップ；ならびに
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の少なくとも一部を検出することによって前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在を判定するステップ、
を含み、
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質が、可溶性ミスフォールディングαＳモノマーおよび可溶性ミスフォールディングαＳ凝集物のうちの１つ以上を含み；
前記ミスフォールディングαＳタンパク質の増幅部分が、前記可溶性ミスフォールディングαＳモノマーの増幅部分、前記可溶性ミスフォールディングαＳ凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディングαＳ凝集物のうちの１つ以上を含む、
方法。
【請求項２】
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の指示薬を前記インキュベーション混合物に接触させるステップをさらに含み、前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の前記指示薬が、前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在下での指示状態、および前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の非存在下での非指示状態を特徴とし；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在を判定するステップが、前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の前記指示薬の前記指示状態を検出することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の前記指示薬が、チオフラビンＴ、コンゴーレッド、ｍ−Ｉ−スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ−２２７、Ｘ−３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ−Ｘ−０４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ−４、発光コンジュゲートポリチオフェン、蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体のうちの１種または複数を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在を判定するステップが、
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を測定すること；
少なくとも８０％の感度で前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を検出すること；
１００ｎｍｏｌより少ない前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を検出すること；
前記試料によって含まれるモノマーフォールディングαＳタンパク質に対するモル比で、前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を検出することであって、前記モル比が１：１００より小さい、検出すること；
少なくとも８０％の特異度で前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を検出すること；および
対照試料と比較した前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を測定すること、
のうちの１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１μＭ〜１０μＭ；７μＭ；および２μＭのうちの１つの濃度の前記モノマーフォールディングタンパク質を含む前記インキュベーション混合物を調製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１μｍ〜５００ｍＭの総濃度の塩組成物を含む前記インキュベーション混合物を調製することを含み、前記塩組成物が、ＮａＣｌおよびＫＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベートすることが、前記インキュベーション混合物を、４℃〜６０℃、８℃〜５０℃、１２℃〜４５℃、１２℃〜４０℃、１８℃〜３０℃、１８℃〜２６℃；および２２℃のうちの１つでインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を検出することが、ウェスタンブロットアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、チオフラビンＴ結合アッセイ、コンゴーレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡測定、原子間力顕微鏡測定、表面プラズモン共鳴、および分光法のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標識された形態のモノマーフォールディングαＳタンパク質を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、
標識された形態のモノマーフォールディングαＳタンパク質が、共有結合により取り込まれた放射性アミノ酸、共有結合により取り込まれた同位体標識アミノ酸、および共有結合により取り込まれたフルオロフォアのうちの１つまたは複数を含み、
前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を検出することが、ミスフォールディングαＳタンパク質の前記増幅部分に取り込まれた、標識された形態のモノマーフォールディングαＳタンパク質を検出することを含む、
方法。
【請求項１０】
前記試料が対象から採取されたものである、請求項１に記載の方法であって、
対照群の対象から採取された対照試料と比較した前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在；
所定の閾値量と比較した前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量であって、前記検出することが、前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を検出することを含む、量；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在であって、前記対象が認知テストによる認知症の臨床徴候を示さない、存在；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在であって、前記対象が認知テストによる認知症の１つ以上の臨床徴候を示す、存在；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の存在であって、前記対象が認知テストによる認知症の臨床徴候を示さない、存在；および
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量を、前記試料とは異なる時間に前記対象から採取された比較試料中の前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質の量と比較すること；
のうちの１つ以上に従って前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を判定することをさらに含む、方法。
【請求項１１】
前記生体液が、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ；乳；粘液；粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙液；および尿のうちの１種または複数を含み、
前記対象が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、シカ、ヘラジカ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および非ヒト霊長類のうちの１つである、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料および前記インキュベーション混合物のうちの１つ以上において前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を選択的に濃縮することをさらに含み、前記選択的に濃縮することが、
前記インキュベーション混合物を形成させる前に前記試料を前処置すること；
前記インキュベーション混合物をインキュベートする前に前記インキュベーション混合物を前処置すること；
１種または複数の可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質特異的抗体を前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質に接触させて、捕捉された可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を形成させることであって、前記１種または複数の可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質特異的抗体が、前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質のアミノ酸配列に特異的な抗体、および前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つ以上を含む、形成させること；
のうちの１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料にはαＳフィブリルおよびタウフィブリルが含まれないことを条件とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記モノマーフォールディングαＳタンパク質および／または前記可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質が、αＳ−１４０タンパク質のタンパク質分解切断を介して形成された１つまたは複数のペプチド、αＳ−１４０、αＳ−１２６およびαＳ−１１２のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生体液を含む試料において可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するための方法であって、
前記試料から可溶性ミスフォールディングタンパク質を捕捉して、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を形成させるステップ；
前記捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を、モル過剰の、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質に対応する前記モノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させるステップであって、前記モル過剰が、前記捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの量よりも大きい、ステップ；
ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施するステップであって、各インキュベーションサイクルが、
前記捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、前記モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるように前記インキュベーション混合物をインキュベートすることと；
存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるように前記インキュベーション混合物を物理的に破壊することと、
を含むステップ；ならびに
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するステップ、
を含み、
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質が、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つ以上を含み；
前記捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質が、捕捉された可溶性ミスフォールディングモノマーおよび捕捉された可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つ以上を含み、
前記ミスフォールディングタンパク質の増幅部分が、前記可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、前記可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つ以上を含むが、
ただし、前記モノマーフォールディングタンパク質および前記可溶性ミスフォールディングタンパク質にはプリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが含まれないことを条件とする、方法。
【請求項１６】
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬を前記インキュベーション混合物に接触させるステップをさらに含み、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の前記指示薬が、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下での指示状態、および前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の非存在下での非指示状態を特徴とし；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するステップが、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の前記指示薬の前記指示状態を検出することを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の前記指示薬が、チオフラビンＴ、コンゴーレッド、ｍ−Ｉ−スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ−２２７、Ｘ−３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ−Ｘ−０４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ−４、発光コンジュゲートポリチオフェン、それらの誘導体のうちの１種または複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するステップが、
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を測定すること；
少なくとも８０％の感度で前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を検出すること；
１００ｎｍｏｌより少ない前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を検出すること；
前記試料によって含まれるモノマーフォールディングタンパク質に対するモル比で前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を検出することであって、前記モル比が１：１００より小さい、検出すること；
少なくとも８０％の特異度で前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出すること；および
対照試料と比較した前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を測定すること、
のうちの１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
１ｎＭ〜２ｍＭ；１０ｎＭ〜２００μＭ；１００ｎＭ〜２０μＭ；１μＭ〜１０μＭ；および２μＭのうちの１つの濃度の前記モノマーフォールディングタンパク質を含む前記インキュベーション混合物を調製することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳのうちの１つまたは複数を含む緩衝組成物を含む前記インキュベーション混合物を調製することを含み、前記インキュベーション混合物が、１μｍ〜１Ｍの総濃度の前記緩衝組成物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
１μｍ〜５００ｍＭの総濃度の塩組成物を含む前記インキュベーション混合物を調製することを含み、前記塩組成物が、ＮａＣｌおよびＫＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記インキュベートすることが、前記インキュベーション混合物を、４℃〜６０℃、８℃〜５０℃、１２℃〜４５℃、１２℃〜４０℃、１８℃〜３０℃、１８℃〜２６℃；および２２℃のうちの１つでインキュベートすることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することが、ウェスタンブロットアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、チオフラビンＴ結合アッセイ、コンゴーレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡測定、原子間力顕微鏡測定、表面プラズモン共鳴、および分光法のうちの１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
標識された形態の前記モノマーフォールディングタンパク質を提供することをさらに含む、請求項１５に記載の方法であって、
標識された形態の前記モノマーフォールディングタンパク質が、共有結合により取り込まれた放射性アミノ酸、共有結合により取り込まれた同位体標識アミノ酸、および共有結合により取り込まれたフルオロフォアのうちの１つまたは複数を含み、
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することが、ミスフォールディングタンパク質の前記増幅部分に取り込まれた、標識された形態の前記モノマーフォールディングタンパク質を検出することを含む、
方法。
【請求項２５】
前記試料が対象から採取されたものである、請求項１５に記載の方法であって、
対照群の対象から採取された対照試料と比較した前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在；
所定の閾値量に対する前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量であって、前記検出することが、前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を検出することを含む、量；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在であって、前記対象が認知テストによる認知症の臨床徴候を示さない、存在；
前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在であって、前記対象が認知テストによる認知症の１つ以上の臨床徴候を示す、存在；
前記試料とは異なる時間に前記対象から採取された比較試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の量と比較した、前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質；
のうちの１つに従って前記可溶性ミスフォールディングタンパク質を判定することをさらに含む、方法。
【請求項２６】
前記生体液が、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ；乳；粘液；粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙液；および尿のうちの１種または複数を含み、
前記対象が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、シカ、ヘラジカ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および非ヒト霊長類のうちの１つである、
請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料から可溶性ミスフォールディングタンパク質を捕捉して、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を形成させることが、１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質特異的抗体を用いて実施され、前記１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質特異的抗体が、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質のアミノ酸配列に特異的な抗体、および前記可溶性ミスフォールディングタンパク質のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つ以上を含み、任意選択で前記１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質特異的抗体が固相に連結されていてもよい、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料をモル過剰の前記モノマーフォールディングタンパク質と接触させて、前記インキュベーション混合物を形成させることを含み、前記モル過剰が、前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの総モル量よりも大きい、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料にはαＳフィブリルおよびタウフィブリルが含まれないことを条件とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
試料において可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するためのキットであって、
既知量の、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質に対応するモノマーフォールディングタンパク質、および既知量の、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬のうちの１つ以上と；
取扱説明書と、
を含み、前記取扱説明書で、
前記試料を、前記既知量のモノマーフォールディングタンパク質および前記既知量の、前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬のうちの１つ以上と接触させて、インキュベーション混合物を形成させること；
ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することであって、各インキュベーションサイクルが、
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、前記モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるように前記インキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の前記増幅部分を形成させることと；
存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるように前記インキュベーション混合物を物理的に破壊することと、
を含む、実施すること；ならびに
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することによって前記試料中の前記可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定すること、
がユーザに指導され、
前記可溶性ミスフォールディングタンパク質が、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つ以上を含み；
前記ミスフォールディングタンパク質の増幅部分が、前記可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、前記可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つ以上を含むが、
ただし、前記モノマーフォールディングタンパク質および前記可溶性ミスフォールディングタンパク質にはプリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが含まれないことを条件とする、キット。