【手続補正書】
【提出日】平成30年8月25日(2018.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
【図１】ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、ＮＩ−３０１．３７Ｆ１、ＮＩ−３０１．２Ｆ５、ＮＩ−３０１．２８Ｂ３、ＮＩ−３０１．１１９Ｃ１２、ＮＩ−３０１．５Ｄ８、ＮＩ−３０１．９Ｄ５、ＮＩ−３０１．１０４Ｆ５、ＮＩ−３０１．２１Ｆ１０、ＮＩ−３０１．９Ｇ１２、ＮＩ−３０１．１２Ｄ３、ＮＩ−３０１．３７Ｆ１−ＰＩＭＣ、ＮＩ−３０１．４４Ｅ４、ＮＩ−３０１．１８Ｃ４、ＮＩ−３０１．１１Ａ１０、ＮＩ−３０１．３Ｃ９、ＮＩ−３０１．１４Ｄ８、ＮＩ−３０１．９Ｘ４およびＮＩ−３０１．１４Ｃ３の各ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。
【図２】直接的ＥＬＩＳＡによる、凝集した野生型ＴＴＲおよび変異型ＴＴＲに対する結合。Ａ、Ｂ、Ｃ：ＥＬＩＳＡプレートを、凝集したヒト野生型ＴＴＲ（●）、凝集した組換えＶ３０Ｍ−ＴＴＲ（▼）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（■）により１０μｇ／ｍｌで被覆し、４ｐＭ〜４００ｎＭの濃度範囲での下記のヒトモノクローナル抗体とインキュベーションした：Ａ）ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、Ｂ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｃ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１。ＥＣ５０値を、データ点を最小二乗法により当てはめることによって推定した。ＮＩ−３０１．５９Ｆ１：凝集ｗｔ−ＴＴＲのＥＣ５０＝３．０ｎＭ、凝集Ｖ３０Ｍ−ＴＴＲのＥＣ５０＝１５．５ｎＭＮＩ−３０１．３５Ｇ１１：凝集ｗｔ−ＴＴＲのＥＣ５０＝３．９ｎＭ、凝集Ｖ３０Ｍ−ＴＴＲのＥＣ５０＝５．０ｎＭＮＩ−３０１．３７Ｆ１：凝集ｗｔ−ＴＴＲのＥＣ５０＝０．３５ｎＭ、凝集Ｖ３０Ｍ−ＴＴＲのＥＣ５０＝０．１５ｎＭ
【図３】ドットブロットでの凝集したＴＴＲについての特異性。ネイティブ立体配座（１）または凝集した立体配座（２）でのヒト野生型ＴＴＲタンパク質、および凝集した組換えＶ３０Ｍ−ＴＴＲタンパク質（３）をニトロセルロースメンブランに置き、下記の抗体とインキュベーションした：Ａ）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２；１５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ）ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、Ｃ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｄ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１（Ｂ、ＣおよびＤ：ヒトモノクローナル抗体、５０ｎＭ）。
【図４】ウエスタンブロットでの凝集したＴＴＲについての特異性。ネイティブ立体配座（１）または凝集した立体配座（２）でのヒト野生型ＴＴＲタンパク質（３００ｎｇ）、および、野生型マウスの肝臓抽出物（１０μｇの総タンパク質）（３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、下記の抗体を用いたウエスタンブロットのための処理した：Ａ）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２；１５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ）ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、Ｃ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｄ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１（Ｂ、ＣおよびＤ：ヒトモノクローナル抗体、５０ｎＭ）。高分子量凝集物の解離を防止するために、凝集したＴＴＲのサンプルを、ゲルに載せる前にグルタルアルデヒドにより架橋した（１％、５分）。
【図５】ウエスタンブロットでのヒト血漿中ＴＴＲに対する結合の非存在。コントロール（ｎ＝５）、無症候性変異保因者（ｎ＝５）およびＦＡＰ患者（ｎ＝４）からの血漿サンプル（０．５μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、下記の抗体を用いたウエスタンブロットのための処理した：Ａ）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２；１５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ）二次抗体のみ（抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ、１／１００００の希釈）、Ｃ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｄ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１（ＣおよびＤ：ヒトモノクローナル抗体、５０ｎＭ）。
【図６】ドットブロットでのヒト血漿中ＴＴＲに対する結合の非存在。ネイティブ立体配座および凝集した立体配座での純粋な野生型ＴＴＲタンパク質および変異型ＴＴＲタンパク質、ならびに、コントロール、無症候性変異保因者およびＦＡＰ患者からの血漿サンプルをニトロセルロースメンブランに置き、下記の抗体とインキュベーションした：Ａ）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２；１５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ）二次抗体のみ（抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ、１／１００００の希釈）、および、Ｃ）マウスキメラ抗体ＮＩ−３０１．ｍｕｒ３５Ｇ１１（１０ｎＭ）。サンプル１〜６：１５０ｎｇの１）凝集ｗｔ−ＴＴＲ、２）ネイティブｗｔ−ＴＴＲ、３）ＢＳＡ、４）ネイティブＶ３０Ｍ−ＴＴＲ、５）ネイティブＬ５５Ｐ−ＴＴＲ、および、６）ネイティブＹ７８Ｆ−ＴＴＲ。サンプル７〜１８：２μｌの採取された血漿、７〜１０）コントロール（ｎ＝４）、１１〜１４）無症候性変異保因者（ｎ＝４）、および、１５〜１８）ＦＡＰ患者（ｎ＝４）。
【図７】溶液中の凝集したＴＴＲに対する特異的結合。ネイティブ立体配座および凝集した立体配座でのヒト野生型ＴＴＲタンパク質および組換えＴＴＲタンパク質、ならびに、３つの異なる希釈度でのヒト血漿サンプルを、下記の抗体を使用するＴＴＲ免疫沈殿（ＩＰ）のために使用した：Ａ）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２）、Ｂ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｃ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１。免疫沈殿させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、Ｄａｋｏ−Ａ０００２抗体（１５０ｎｇ／ｍｌ）を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）によって検出した。レーン１〜２：ＷＢ負荷コントロール：３００ｎｇの１）ヒトｗｔ−ＴＴＲ、２）組換えｗｔ−ＴＴＲレーン３〜６：純粋なＴＴＲタンパク質に対するＩＰ：３）ヒトネイティブｗｔ−ＴＴＲ、４）ヒト凝集ｗｔ−ＴＴＲ、５）組換えネイティブｗｔ−ＴＴＲ、および、６）組換え凝集ｗｔ−ＴＴＲレーン７〜１０：ＰＢＳ希釈のヒト血漿に対するＩＰ、７）１０倍、８）１００倍、９）１０００倍、および、１０）ＰＢＳのみ
【図８】ＦＡＰマウス組織におけるＴＴＲに対する特異的結合。ヒトＶ３０Ｍ−ＴＴＲ対立遺伝子をＴＴＲノックアウト（ＫＯ）バックグラウンドで発現するトランスジェニックマウスは、様々な組織における無定型ＴＴＲ沈着物およびアミロイドＴＴＲ沈着物を含めて、ＦＡＰの組織病理学的特徴を再現する。Ａ）ＦＡＰマウスおよびＢ）ＴＴＲ−ＫＯマウスから集められた肝臓組織切片および腸組織切片を、下記の抗体を使用する免疫組織化学のために処理した：１）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２；１／１０００の希釈）、２）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、３）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１（２および３：ヒトモノクローナル抗体、５０ｎＭ）。
【図９】ヒト組織における、ネイティブＴＴＲではなく、ミスフォールドしたＴＴＲ沈着物に対する特異的結合。様々な抗体を、ＦＡＰ患者皮膚生検および健康なコントロール膵臓からの切片におけるＴＴＲと結合するそれらの能力について特徴づけた：ＦＡＰについて特徴的であるミスフォールドしたＴＴＲの蓄積が患者皮膚生検において存在し、これに対して、膵臓アルファ細胞はＴＴＲの内因性発現を示す。切片を、下記の抗体を使用する免疫組織化学のために処理した：１Ａ）ＴＴＲに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ−Ａ０００２；１／１０００の希釈）、１Ｂ）ＨＲＰ結合の抗ウサギＩｇＧ抗体（１／１２５の希釈）、２Ａ）マウスキメラ抗体ＮＩ−３０１．ｍｕｒ３５Ｇ１１（５０ｎＭ）、２Ｂ）ＨＲＰ結合の抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（１／１２５の希釈）、３Ａ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１（５０ｎＭ）、および、３Ｂ）ＨＲＰ結合の抗ヒトＩｇＧ（１／１２５の希釈）。
【図１０】ペップスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）分析によって評価されるＴＴＲ結合エピトープ。ＴＴＲに対する抗体結合エピトープを、ペプチドスキャン法を使用して決定した。完全なヒト野生型ＴＴＲ配列を覆うペプチド（スポット１〜２９）に加えて、選択されたＴＴＲ変異もまたメンブラン上に示された（スポット３０〜４４）。ペプチドスキャン用メンブランを５０ｎＭでの下記の抗体とインキュベーションした：Ａ）ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、Ｂ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｃ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１。表Ｄ）にまとめられるように：ＮＩ−３０１．５９Ｆ１はＥＥＥＦＶＥＧＩＹ（ＴＴＲ６１−６９）と結合する；ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１はＧＥＬＨＧＬＴＴＥＥＥ（ＴＴＲ５３−６３）と結合する；Ｌ５５Ｐ変異は抗体結合を妨げる；ＮＩ−３０１．３７Ｆ１はＷＥＰＦＡ（ＴＴＲ４１−４５）と結合する；Ｅ４２Ｇ変異は抗体結合を妨げる。述べられたエピトープの配列要件を決定するために、ＴＴＲに対する抗体結合エピトープをさらに、アラニンスキャン法を使用して特定した。ヒト野生型ＴＴＲタンパク質の全配列が、ＴＴＲタンパク質のどのアミノ酸からでも始まる長さが１５アミノ酸の１５１個の連続するペプチドの一組としてメンブラン上に示された。それぞれのペプチドについて、１０位のアミノ酸をアラニンによって、あるいは、最初のアミノ酸がアラニンであるときにはグリシンまたはプロリンによって置換した。ペプチドスキャン用メンブランを２０ｎＭでの下記の抗体とインキュベーションした：Ｅ）ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、Ｆ）ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１、および、Ｇ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１。表Ｈ）にまとめられるように：ＮＩ−３０１．５９Ｆ１はＥＥＦＸＥＧＩＹ（ＴＴＲ６２−６９）と結合する。ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１はＥＬＸＧＬＴＸＥ（ＴＴＲ５４−６１）と結合する。ＮＩ−３０１．３７Ｆ１はＷＥＰＦＡ（ＴＴＲ４１−４５）と結合し、ただし、Ｘはアミノ酸を表す；Ｅ４２のアラニンによる置換は結合を妨害せず、しかし、グアニンによる置換は、Ｃで報告されるように抗体結合を妨げた。
【図１１】表面プラズモン共鳴によって評価される溶液中のＴＴＲタンパク質に対する抗体結合速度論。ＴＴＲタンパク質に対する抗体ＮＩ−３０１．３７Ｆ１の結合速度論を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。抗体ＮＩ−３０１．３７Ｆ１を抗ヒトＩｇＧ抗体によってセンサー上に捕捉し、ＴＴＲタンパク質溶液を、３．２ｎＭから３１６ｎＭにまで及ぶ濃度でセンサー表面を覆って流した。単純な１：１の結合モデルを使用して、データを当てはめ、それぞれの会合定数（ｋａ）および解離定数（ｋｄ）ならびに親和性（ＫＤ）を導いた。結合特性を、Ａ）ネイティブ立体配座でのヒト野生型ＴＴＲタンパク質、Ｂ）変性させたヒト野生型ＴＴＲタンパク質（ミスフォールドした立体配座）、および、Ｃ）組換え変異型ＴＴＲ−Ｌ５５Ｐタンパク質について求めた。ネイティブ野生型ＴＴＲ：ｋａ＝未決定、ｋｄ＝未決定、ＫＤ＞３１６ｎＭ変性させた野生型ＴＴＲ：ｋａ＝２．１  １０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｄ＝２．６  １０−５ｓ−１、ＫＤ＝１．２ｎＭ組換えＴＴＲ−Ｌ５５Ｐ：ｋａ＝３．３  １０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｄ＝４．６  １０−５ｓ−１、ＫＤ＝１．４ｎＭ
【図１２】抗ＴＴＲ抗体による長期処置は病理学的ＴＴＲ沈着をＦＡＰマウスモデルにおいて低下させる。ＦＡＰマウス（Ｔｇ（６．０ｈＭｅｔ３０）×ｍｕＴＴＲ−ＫＯ）に、マウスキメラＮＩ−３０１．３７Ｆ１抗体またはアイソタイプコントロール抗体の１２週間にわたる３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）での毎週の投与を与えた。処置期間を終了したとき、組織を集め、ＴＴＲ沈着の程度を免疫蛍光によって定量化した。Ａ）７月齢マウスにおける処置の影響（ｎ＝１４匹〜１５匹のマウス／群）；Ｂ）１７月齢マウスにおける処置の影響（ｎ＝１０匹のマウス／群）。両側非対ｔ検定による群比較。
【図１３】インビボにおける病理学的ＴＴＲ沈着物に対する抗体結合。標的関与を、３０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）での抗体ＮＩ−３０１．３７Ｆ１の単回用量またはＰＢＳを投与した４８時間後に成体ＦＡＰマウス（７月）において特徴づけた。病理学的ＴＴＲ沈着物と注入抗体の局在化とを免疫蛍光によって同時に検出した。Ａ、Ｄ）（Ａ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１または（Ｄ）ＰＢＳが注入されたマウスの腎臓における病理学的ＴＴＲ沈着物。Ｂ、Ｅ）（Ｂ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１または（Ｅ）ＰＢＳが注入されたマウスにおけるヒト抗体の検出。Ｃ、Ｆ）ＴＴＲおよびＮＩ−３０１．３７Ｆ１を示す重ね合わされた画像、（Ｃ）共局在化および（Ｆ）非特異的染色の非存在。
【図１４】組織を使用しない、インビボにおけるミスフォールドしたＴＴＲの検出。成体ＦＡＰマウスに、３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）でのＮＩ−３０１．３７Ｆ１抗体またはアイソタイプコントロール抗体の単回投与を与えた。血液サンプルを抗体注入前（ｔ＝０）および抗体注入後４８時間（ｔ＝４８ｈ）において集めた。血漿サンプルを抗ヒトＩｇＧ抗体との免疫沈殿によって処理し、検出のために、Ａ）立体配座非依存的な抗ＴＴＲポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ  Ａ０００２、１５０ｎｇ／ｍｌ）、および、Ｂ）ＮＩ−３０１．３７Ｆ１（２０ｎＭ）を使用するウエスタンブロットによって分析した。並行して、注入を受けていないＦＡＰマウスから得られる血漿サンプルを処理前にインビトロにおいて抗体ＮＩ−３０１．３７Ｆ１とインキュベーションした。
【図１５】ＥＬＩＳＡによって凝集性タンパク質に対して評価される抗体特異性。ＴＴＲタンパク質についての抗体特異性を、選択された凝集性タンパク質に対する結合を直接的ＥＬＩＳＡにより測定することによって評価した。抗体結合を４ｎＭおよび２０ｎＭにおいて評価し、シグナル強度を、抗ＴＴＲ抗体の非存在下でそれぞれのアッセイについて測定されるバックグランドレベルに対する変化倍数で表した。Ａ〜Ｂ）２０ｎＭ（Ａ）および４ｎＭ（Ｂ）でアッセイされるＮＩ−３０１．３７Ｆ１結合Ｃ〜Ｄ）２０ｎＭ（Ｃ）および４ｎＭ（Ｄ）でアッセイされるＮＩ−３０１．４４Ｅ４結合
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
これに関連して、１５アミノ酸の長さおよび１４アミノ酸の重なりを有する１５１個の連続するペプチド（この場合、それぞれのペプチドについて、１０位のアミノ酸が、アラニン以外のアミノ酸についてはアラニンによって置換され、これに対して、アラニンがグリシンまたはプロリンによって置換された）からなるパネルを使用する、本発明に従って行われ、実施例９に記載される拡大されたエピトープマッピングでは、抗体ＮＩ−３０１．５９Ｆ１はエピトープＥＥＦＸＥＧＩＹ（ＴＴＲａａ６２−６９）と結合し、抗体ＮＩ−３０１．３５Ｇ１１はＥＬＸＧＬＴＸＥ（ＴＴＲａａ５４−６１）と結合し、一方、さらなる配列要件が抗体ＮＩ−３０１．３７Ｆ１のエピトープについては決定されなかったことが明らかにされた。したがって、別の実施形態において、所与の抗体が、ＮＩ−３０１．５９Ｆ１、ＮＩ３０１．３５Ｇ１１およびＮＩ−３０１．３７Ｆ１の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを明らかにすることが、実施例９および図１０Ｅ〜図１０Ｈに従って行われる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１８】
抗体ＮＩ−３０１．５９Ｆ１はスポット７７およびスポット８３のみを認識し、このことは、Ｅ６１およびＶ６５が、５９Ｆ１が結合するために要求されず、これに対して、Ｅ６２、Ｅ６３、Ｆ６４、Ｅ６６、Ｇ６７、Ｉ６８およびＹ６９が抗体結合のために要求されることを示している。Ｋ７０のまさにその寄与は解釈の問題である：図１０Ａに示されるペプチド４４に対する強い抗体結合は、Ｃ末端位置におけるＫ７０の非存在が抗体結合を妨げないことを明瞭に示している；しかしながら、図１０Ｅに示されるその後の実験では、このペプチドにおける１０位でのＫ７０Ａ置換は抗体結合を妨げた。これらの一見して逆の結果は、ＮＩ−３０１．５９Ｆ１がアミノ酸配列６２−ＥＥＦＸＥＧＩＹ−６９（配列番号５８；式中、Ｘはどのようなアミノ酸でも可能である）の特定の立体配座に結合することを示唆している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
抗体ＮＩ−３０１．３７Ｆ１は、アラニンスキャン用メンブランにおけるスポット５０、スポット５２、スポット５５、スポット５６およびスポット５８〜スポット６２に結合し、スポット５１、スポット５３、スポット５４およびスポット５７には全く結合しない。このことは、Ｗ４１、Ｐ４３、Ｆ４４およびＡ４５が抗体結合のために要求されることを示している。変異Ｅ４２Ｇが抗体結合を乱すという以前の所見（図１０Ｃ）と組み合わされると、これらの結果は、ＮＩ−３０１．３７Ｆ１が配列４１−ＷＥＰＦＡ−４５（配列番号６０）に結合することを示している（図１０Ｇを参照のこと）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2017506501.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−２】
2017506501.tif 000002
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−３】
2017506501.tif 000003
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−４】
2017506501.tif 000004
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−５】
2017506501.tif 000005
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−６】
2017506501.tif 000006
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−７】
2017506501.tif 000007
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０−２】
2017506501.tif 000008
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2017506501000001.app