【手続補正書】
【提出日】平成29年12月4日(2017.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７〜１００アミノ酸長を有し、以下の配列番号１３の配列を含む、ペプチド配列：
Ｘ１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＸ４Ｘ５ＮＸ２
式中、
Ｘ１はＲ及びＣから選択され；
Ｘ４はＳ及びＬから選択され；
Ｘ５はＧ及びＲから選択され；
Ｘ２はＫ及びＴから選択され；並びに
Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ２の少なくとも１つは、それぞれＣ、Ｌ、Ｒ、又はＴである。
【請求項２】
１７〜１００アミノ酸長を有し、以下の配列番号１の配列を含む、請求項１に記載のペプチド配列：
Ｘ１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＸ２
式中、
Ｘ１はＲ及びＣから選択され；
Ｘ２はＫ及びＴから選択され；並びに
Ｘ１がＣである場合、Ｘ２は、Ｋ及びＴから独立して選択され、Ｘ１がＲである場合、Ｘ２はＴである。
【請求項３】
前記ペプチドが、更に以下の配列番号４の配列を含む、請求項１又は２に記載のペプチド：
ＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＧＫＴＫＩＩＸ３
式中、
Ｘ３はＳ及びＲから選択される。
【請求項４】
以下の配列番号５の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド配列：
Ｘ１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＸ２ＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＧＫＴＫＩＩＸ３
式中、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は請求項１及び２と同じ意味であり、
Ｘ１がＣである場合、Ｘ２はＫ及びＴから独立して選択され、Ｘ１がＲである場合、Ｘ２はＴである。
【請求項５】
以下の配列番号１４の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド配列：
Ｘ１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＸ４Ｘ５ＮＸ２ＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＧＫＴＫＩＩＸ３
式中、
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３、Ｘ４及びＸ５は請求項１、２及び３と同じ意味であり、
Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ２の少なくとも１つは、それぞれＣ、Ｌ、Ｒ、又はＴである。  
【請求項６】
配列番号１又は配列番号１３をコードする配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号４を更にコードする、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５又は配列番号１４をコードする配列を含む、請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号６（ＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴ）及び配列番号７（ＴＴＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴ）からなるプライマーセット。
【請求項１０】
請求項９に記載のプライマーセット及び／又は請求項６〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１１】
更に、ＫＲＡＳ及び／又はＰＩＫ３ＣＡ、及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の変異、及び／又はＥＧＦＲ遺伝子内の追加の変異を検出するための試薬を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体を含む治療レジメンに対する対象の応答性の予測に使用するための、請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記治療レジメンがセツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む、請求項１２に記載の使用のためのキット。
【請求項１４】
インビトロで、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性を予測する方法であって、
（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料において、配列番号２のヒトＥＧＦＲのコンセンサス野生型アミノ酸配列のアミノ酸４５０からアミノ酸４７０の断片である、配列番号１２で定義される断片中に変異が存在するか存在しないかを決定し、
（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意の変異の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、又は工程（ｉ）における変異の非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む、方法。
【請求項１５】
工程（ｉ）において、配列番号１２中に以下の変異の少なくとも１つが存在するか存在しないかを決定する、請求項１４に記載のインビトロでの方法：
配列番号２の４５１位におけるアルギニンのシステインへの変化；
配列番号２の４６４位におけるセリンのロイシンへの変異；
配列番号２の４６５位におけるグリシンのアルギニンへの変異；及び
配列番号２の４６７位におけるリシンのスレオニンへの変異。
【請求項１６】
工程（ｉ）を、請求項９に記載のプライマーセット又は請求項１０若しくは１１に記載のキットを用いて実施する、請求項１４又は１５に記載のインビトロでの方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）が配列番号２に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在又は非存在を決定することを更に含み、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）において同定されたアルギニンの更なる存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付ける、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のインビトロでの方法。
【請求項１８】
対象から得た試料中、配列番号２に対応するアミノ酸配列の４５１位におけるシステインの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６４位におけるロイシンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定するインビトロでの方法であって、配列番号２の少なくとも４５０位から４７０位の配列を決定することを含む、方法。
【請求項１９】
対象から得た試料中、配列番号２に対応するアミノ酸配列の４５１位におけるシステインの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６４位におけるロイシンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定するインビトロでの方法であって、
遺伝子型法及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段により、４５１位及び／又に４６４位及び／又に４６５位及び／又に４６７位におけるアミノ酸を決定することを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
【図１】従来のサンガー配列決定（プロットＡ）、及び４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）における、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって得られた配列決定の結果の２つの表示のプロット（ｐｌｏｔ  Ｂ）である。図１は、２つの試料においてセツキシマブで治療した後のＥＧＦＲ外部ドメインにおける突然変異の獲得を示す。（Ａ）患者＃３１では、治療後の腫瘍試料において、治療前生検では存在しなかったＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４００でＡ→Ｃ置換が得られ、アミノ酸４６７でリシンのスレオニンへの置換が起こった（Ｋ４６７Ｔ）。（Ｂ）患者＃３５では、治療後の腫瘍試料において、ＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３５１でＣ→Ｔ置換が検出され、アミノ酸４５１でアルギニンのシステインへの置換が起こった（Ｒ４５１Ｃ）。
【図２】一次抗体としてセツキシマブ（図２Ａ）又はパニツムマブ（図２Ｂ）と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリンと結合した二次抗体を使用した、トリプシン処理されたＮＩＨ３Ｔ３過剰発現野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）及びＫ４６７Ｔ  ＥＧＦＲ変異体のフローサイトメトリー結合分析である。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大シグナル強度を示し、Ｅは陰性対照を意味する。
【図３】一次抗体としてセツキシマブ（図３Ａ）又はパニツムマブ（図３Ｂ）と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリンと結合した二次抗体を使用した、トリプシン処理されたＮＩＨ３Ｔ３過剰発現野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）及びＳ４６４Ｌ  ＥＧＦＲ変異体のフローサイトメトリー結合分析である。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大シグナル強度を示し、Ｅは陰性対照を意味する。
【図４】一次抗体としてセツキシマブ（図４Ａ）又はパニツムマブ（図４Ｂ）と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリンと結合した二次抗体を使用した、トリプシン処理されたＮＩＨ３Ｔ３過剰発現野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）及びＧ４６５Ｒ  ＥＧＦＲ変異体のフローサイトメトリー結合分析を示す。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大シグナル強度を示し、Ｅは陰性対照を意味する。