【手続補正書】
【提出日】平成30年3月29日(2018.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）に特異的に結合するヒト化またはヒトモノクローナル抗体であって、
アミノ酸ＧＹＳＦＴＡＹＷ（配列番号２３）またはその保存的変異型を有する重鎖ＣＤＲ１、
アミノ酸ＩＬＰＧＳＤＳＴ（配列番号２）またはその保存的変異型を有する重鎖ＣＤＲ２、および、
アミノ酸ＡＲＳＧＹＹＧＳＳＱＹ（配列番号３）またはその保存的変異型を有する重鎖ＣＤＲ３
を含む、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、アミノ酸ＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦ（配列番号４）またはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、アミノ酸ＬＴＳまたはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、アミノ酸ＱＱＮＡＥＤＰＲＴ（配列番号３３）またはその保存的変異型を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号１９または４８を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号２１または４９を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ＬＧＲ５（配列番号４７）のアミノ酸Ｔ１７５，Ｅ１７６，Ｑ１８０，Ｒ１８３，Ｓ１８６，Ａ１８７，Ｑ１８９，Ｄ２４７，Ｅ２４８，Ｔ２５１，Ｒ２５４，Ｓ２５７，Ｎ２５８，Ｋ２６０内のエピトープに結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ＬＧＲ５−ＲＳＰＯ結合を阻害しない、請求項１〜９のいずれか１項に記
載の抗体。
【請求項９】
配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体および薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
化学療法剤をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記化学療法剤が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、およびアブラキサンからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌の治療用である、請求項１０〜１２のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
静脈内投与用である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ＧＰＲ４９／ＨＧ３８／ＦＥＸとしても知られている、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）は、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）／糖タンパク質ホルモン受容体に構造的に類似している受容体タンパク質のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＲ）タンパク質ファミリーに属する。ＬＧＲは、３つのサブ群：（１）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体を含む糖タンパク質ホルモン受容体；（２）リラキシン受容体ＬＧＲ７およびＬＧＲ８；ならびに（３）ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、およびＬＧＲ６、に分けられている。ＬＧＲ５は、腸、骨格筋、胎盤、脳、および脊髄を含むいくつかの組織で発現される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本明細書に与えられる組成物、方法、およびキットについてのいくつかの実施形態は、上記抗体のいずれか１つを用いる治療の有効性を評価する方法であって、前記抗体で治療された腫瘍中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、該バイオマーカーは、核酸、または前記核酸がコードするポリペプチドであり、該バイオマーカーは、ＷＮＴ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、ＷＴ１１、ＮＦＡＴＣ１、ＦＺＤ５、ＦＺＤ２、ＦＲＺＢ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＤＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、ＩＴＧＡ２、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該抗体で治療されていない腫瘍中の該
バイマーカーのレベルと比べた該バイマーカーのレベルの減少は、有効な治療を示す。いくつかの実施形態において、該バイマーカーは、ＷＮＴ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、ＷＴ１１、ＮＦＡＴＣ１、ＦＺＤ５、ＦＺＤ２、ＦＲＺＢ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＤＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、およびＩＴＧＡ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該抗体で治療されていない腫瘍中の該バイマーカーのレベルと比べた該バイマーカーのレベルの増加は、有効な治療を示す。いくつかの実施形態において、該バイマーカーは、ＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２、ＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰ、およびＢＡＫ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍は、結腸癌腫瘍、結腸直腸癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、および肺癌腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該腫瘍は、ＡＰＣ変異を含む結腸癌腫瘍、ＫＲＡＳ変異を含む結腸癌腫瘍、転移性結腸直腸癌腫瘍、転移性膵臓癌腫瘍、トリプルネガティブ乳癌腫瘍、および小細胞肺癌腫瘍からなる群から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
詳細な説明
本出願のいくつかの実施形態は、ＬＧＲ５に特異的に結合するヒト化抗体、および該抗体を用いる癌幹細胞の成長を阻害する方法に関する。いくつかの実施形態において、該抗体は、特異的にＬＧＲ５に結合するが、Ｒ−ＳｐｏのＬＧＲ５への結合を阻害しない。他の実施形態は、ＬＧＲ５を介したＲ−Ｓｐｏシグナリングを阻害することなくＬＧＲ５に結合する抗体を含む。さらなる他の実施形態は、ＬＧＲ５に結合するが、ＬＧＲ５を介したＲ−Ｓｐｏ結合またはシグナリングのどちらも阻害しない抗体を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
いくつかの実施形態は、以下の実施例で生産され記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１と呼ばれる抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む、抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子に関する。いくつかの態様において、核酸分子は、以下の実施例で生産され記載される抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１などのヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
実施例１９−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療は癌幹細胞集団を低減する
フローサイトメトリー分析のために、５つの腫瘍各々からの細胞を、幹細胞に特異的なマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１６６に対する様々な抗体で染色した。腫瘍を解離し、マウス細胞を除去し、次に生細胞を数えた。解離した細胞を、フローサイトメトリーによる、細胞表面の幹細胞マーカーの発現分析に使用した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
実施例２８−ヒト化ＬＧＲ５抗体は、可溶性ＲＳＰＯとＬＧＲ５の結合を競争的に阻害はしない
ヒトＲ−スポンジン１／２／３／４タンパク質の存在下でのビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とｈＬＧＲ５−Ｆｃの相互作用を、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して調べた。９６ウェル高結合型ＥＬＩＳＡプレートに２μｇ／ｍＬでＬＧＲ５−Ｆｃを塗布し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングした。ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を結合バッファーで１μｇ／ｍＬに希釈した。ＬＧＲ５−Ｆｃとビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を事前に直接結合させたＥＬＩＳＡからＥＣ５０濃度より高いしっかりとしたシグナルを与える濃度を選択した。ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と同時に、競合タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに濃度を変えながら加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号８９０８０３）を１：１，０００に希釈して検出に使用した。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ）で顕色し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダーで４５０ｎｍでデータを収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６プログラムを使用してデータ分析を行った。ビオチン−モノクローナル抗体および競合剤の濃度に何らかの変更を施し、ＥＬＩＳＡを３回繰り返した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
タンパク質バッファー中のＬＧＲ５−Ｆｃまたは１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とプレインキュベートしたＬＧＲ５−ＦｃをＤ２Ｏバッファーと混合して最終濃度を５０％Ｄ２Ｏにすることにより、交換実験を開始した。混合物を０℃で１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００秒間インキュベートし、次に、氷冷したクエンチ溶液（０．９６％蟻酸，０〜０．８Ｍ塩酸グアニジン）を加えて交換反応をクエンチし、最終濃度が０．５８％ギ酸、０〜０．５Ｍ塩酸グアニンでｐＨが２．５のサンプルを得た。次に、サンプルを、直ちにドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。ＤＸＭＳ実験のデータ処理は、上記の専門ソフトウェア（ＤＸＭＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ，Ｓｉｅｒｒａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
実施例４４−進行性ＣＲＣ腫瘍におけるＬＧＲ５の発現
ＬＧＲ５特異的プローブを用いるＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を使用してＬＧＲ５転写産物の発現を調べた。ＬＧＲ５転写産物は、結腸、小腸、小脳、および膵臓を含む組織で検出可能であった。ＬＧＲ５転写産物は、ＣＴ１  ＣＲＣおよびＪＨ１０９膵臓腫瘍を含む患者由来異種移植片（ＰＤＸ）組織でも検出可能であった。早期（グレードI）対進行性（転移性）病変を含む腫瘍発生の異なるステージで単離したＣＲＣ患者サンプルでＬＧＲ５の発現を調べた。ＣＲＣのグレードI、II、およびIII病変でＬＧＲ５転写産物が発現されており、ＣＲＣ転移性病変で高く発現されていた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
実施例４５−転移性患者由来膵臓異種移植片におけるＬＧＲ５の発現
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を使用して転移性患者由来膵臓異種移植片におけるＬＧＲ５の発現を調べた。腫瘍組織のサンプルを、数時間４℃でインキュベーション後、急速凍結するか、またはＲＮＡｌａｔｅｒ(キアゲン（Qiagen），カリフォルニア州）を含む凍結保存バイアル（cryovial）に加え、−７０℃に移した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ抽出キット(キアゲン（Qiagen）、カリフォルニア州）を使用して全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIIIキット（ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カリフォルニア州）および製造業者提供のプロトコールを使用してｃＤＮＡを合成した。ヒト特異的ＬＧＲ５およびＧＡＰＤＨプライマーを使用し、ＳｔｅｐＯｎｅサーモサイクラー（ライフテクノロジーズ（Life Technologies），カリフォルニア州）で以下の温度条件：５０℃（２分）；９０℃（２分）および９０℃（１５秒）と６０℃（１分）を４０サイクル、および融解曲線評価（６５℃〜９５℃）、を使用して、ヒトＬＧＲ５転写産物量を測定した。ＬＧＲ５量を２＾δＣｔの式を使用して数量化した。