【手続補正書】
【提出日】平成30年10月17日(2018.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２４】
表１１に示すように、これらの結果は、ＭＰＧ、ｐＶＥＣ、ＴＬＭ、ゼブラおよびｐｅｐ１を含む５つのＣＰＰが、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門に属する嫌気性腸内細菌へ効率的に輸送し、それにより、ＣＰＰがこれらの細胞膜を横断することができることを示すことを示している。
【表１６】
2017532979.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２５】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、
前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつ
前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
２．前記ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、前記微生物細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合し、前記ＲＧＥＮは前記標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を前記標的
部位配列で切断することができる上記１に記載の組成物。
３．前記ＲＮＡ構成要素は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に機能可能なように結合したＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む上記２に記載の組成物。
４．前記ＲＧＥＮは、ＤＮＡ１本鎖または２本鎖を前記標的部位配列で切断することができる上記２に記載の組成物。
５．前記ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質−９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む上記１に記載の組成物。
６．前記ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合している上記１に記載の組成物。
７．ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは非共有結合的に結合している上記１に記載の組成物。
８．前記ＣＰＰはカチオン性または両親媒性である上記１に記載の組成物。
９．ＣＰＰは、
（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、
（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、
（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、または
（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ
を含む上記１に記載の組成物。
１０．前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は微生物細胞の細胞壁および細胞膜を横断することができる上記１に記載の組成物。
１１．上記１に記載の組成物を含む細胞。
１２．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を微生物細胞へ輸送する方法であって、
前記微生物細胞を、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の前記タンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程
を含み、
前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、
前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、前記細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより前記微生物細胞に侵入する方法。
１３．（ｉ）前記組成物は、さらに、少なくとも１つの、前記ＲＧＥＮの前記タンパク質構成要素と結合するＲＮＡ構成要素を含む、または
（ｉｉ）前記微生物細胞は、前記ＲＮＡ構成要素を含み、ここで、前記ＲＮＡ構成要素は、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が前記微生物細胞に侵入した後、前記ＲＧＥＮの前記タンパク質構成要素と結合し、
前記ＲＮＡ構成要素は、前記細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含み、前記ＲＧＥＮは前記標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を前記標的部位配列で切断することができる上記１２に記載の方法。
１４．前記ＲＧＥＮは、前記標的部位配列でＤＮＡ１本鎖または２本鎖を切断することができる上記１３に記載の方法。
１５．前記微生物細胞は、前記標的部位配列または前記標的部位配列近傍の配列と相同の少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含み、かつ前記ドナーポリヌクレオチドは相同組み換えによって前記標的部位配列または前記標的部位配列近傍でインテグレートされる上記１４に記載の方法。
１６．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含むＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、前記ヌクレオチド配列はプロモ
ータ配列に機能可能なように結合されるポリヌクレオチド配列。
１７．ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質の産生方法であって、
（ａ）上記１６に記載のポリヌクレオチド配列を供給する工程；
（ｂ）前記ポリヌクレオチド配列から前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を発現させて、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を産生する工程であって、前記発現は、場合により、細胞内で行われる工程；および
（ｃ）任意選択により、工程（ｂ）で産生された前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を単離する工程
を含む方法。
１８．ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素と、少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物であって、前記タンパク質組成物とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつ前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
１９．細胞のゲノムの標的部位を修飾する方法であって、ガイドポリヌクレオチド、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に供給する工程を含み、前記ガイドポリヌクレオチド、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣＰＰは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰの複合体を形成しており、かつ前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、
前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつ
前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含む細胞。
【請求項３】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を微生物細胞へ輸送する方法であって、
前記微生物細胞を、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の前記タンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程
を含み、
前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、
前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、前記細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより前記微生物細胞に侵入する方法。
【請求項４】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含むＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、前記ヌクレオチド配列はプロモータ配列に機能可能なように結合されるポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質の産生方法であって、
（ａ）請求項４に記載のポリヌクレオチド配列を供給する工程；
（ｂ）前記ポリヌクレオチド配列から前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を発現させて、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を産生する工程であって、前記発現は、場合により、細胞内で行われる工程；および
（ｃ）任意選択により、工程（ｂ）で産生された前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を単離する工程
を含む方法。
【請求項６】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素と、少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物であって、前記タンパク質組成物とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつ前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
【請求項７】
細胞のゲノムの標的部位を修飾する方法であって、ガイドポリヌクレオチド、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に供給する工程を含み、前記ガイドポリヌクレオチド、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣＰＰは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰの複合体を形成しており、かつ前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる方法。