【手続補正書】
【提出日】平成30年1月30日(2018.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質の構築における使用のための結合領域のアミノ酸配列を同定するための方法であって、
前記１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質が、
ｉ）ポリペプチドを含み、かつリボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、ii）ポリペプチドを含み、かつ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と
を含み、
前記方法が、
ａ）複数のキメラタンパク質を用意するステップであって、
各タンパク質が、
ｉ）修飾リボ毒素領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、対応する非修飾リボ毒素領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加を含む前記修飾リボ毒性領域と
ii）ポリペプチドを含み、かつ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と
を含む、ステップと；
ｂ）前記複数のキメラタンパク質をスクリーニングして、少なくとも１つのアッセイスクリーニング可能な特徴であり、標的生体分子への結合アフィニティー、標的生体分子への結合選択性、標的細胞への結合アフィニティー、標的細胞への結合選択性、標的細胞への内部化、及び発現量から選択される特徴を伴うキメラタンパク質を同定するステップと；
ｃ）前記同定されたキメラタンパク質内に存在する前記修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた、前記同定されたキメラタンパク質内の結合領域のアミノ酸配列を含む１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質を構築するために、ステップｂ）で同定された前記キメラタンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するステップ、或いはステップｂ）で同定された前記キメラタンパク質の前記結合領域の前記アミノ酸配列を同定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
ｄ）同定されたキメラタンパク質内に存在する修飾リボ毒性領域のうちの、リボ毒性のより強い形態と会合させた、前記同定されたキメラタンパク質の結合領域のアミノ酸配列を含む１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質を産生するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法であって、
前記産生するステップが、
（ｉ）前記同定されたキメラタンパク質の前記結合領域の前記アミノ酸配列を含む、１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用意することと、
（ii）宿主細胞又は無細胞翻訳系を使用して、前記ポリヌクレオチドを発現させることとを含む、前記方法。
【請求項３】
１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質が、結合領域と融合させたリボ毒素領域を含む融合ポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
複数のキメラタンパク質が、複数の融合ポリペプチドであり、各融合ポリペプチドが、結合領域と融合させた修飾リボ毒素領域を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の前に、
ａ’）複数の融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドから構築された、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップと；
ｂ’）複数の融合ポリペプチドのそれぞれが、
i)対応する非修飾リボ毒素領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加；及び
ii) ポリペプチドを含み、かつ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域、を含む
複数の融合ポリペプチドが産生されるように、多様な核酸の前記発現ライブラリーを発現させるステップと;
c’)発現した複数の融合ポリペプチドを、複数のキメラタンパク質としてステップa)のために用意するステップと
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ’）の前に、
ａ’’）複数の結合領域をコードする複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも２つのサブセットが、それぞれ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な異なる結合領域を伴うポリペプチドをコードする、ステップと；
ｂ’’）前記ライブラリーの前記ポリヌクレオチドを、毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数の融合ポリペプチドをコードする多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、前記毒素鋳型ポリヌクレオチドが、対応する非修飾リボ毒素領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加を有する修飾リボ毒素領域をコードし、各融合ポリペプチドが、修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含む、ステップと；
ｃ’’）任意で、接合されたポリヌクレオチドの前記ライブラリーの前記ポリヌクレオチドを、発現ポリヌクレオチド鋳型へと組み換えて、複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含む、ステップと； 
ｄ’’）前記発現ライブラリーを、複数の融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドから構築された多様な核酸の前記発現ライブラリーとして、ステップa’)のために用意するステップと
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
修飾リボ毒性領域が、
アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ（Amaranthus）属抗ウイルス性タンパク質／ＲＩＰ、アンギオジェニン、Ａ．パテンス（A. patens）ＲＩＰ、アーティクラチンＤ、アスパリン、アスペルギリン、Ａｓｐｆ１、バルサミン、トウガン（B.hispida）ＲＩＰ、ブーガニン、ブーゲンビレア（Bougainvillea x buttiana）抗ウイルス性タンパク質１、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキ（B. rubra）ＲＩＰ、ブリオジン、イカダカズラ（B. spectabilis）ＲＩＰ、ビート（B. vulgaris）ＲＩＰ、シロザ（C. album）ＲＩＰ、カンホリン、トゲエビス（C. aculeatum）全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲ（C. cristata）ＲＩＰ、ククミス・フィガレイ（C. figarei）ＲＩＰ、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャ（C. moschata）ＲＩＰ、コチニンＢ、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ（Dianthus）属種ＲＩＰ、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属種ジフテリア毒素、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウ（E. hyemalis）ＲＩＰ、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキ（H. crepitans）ＲＩＰ、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンＡ、ヒヤシンス（H. orientalis）ＲＩＰ、オオムギ（H. vulgare）ＲＩＰ、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリス（I. hollandica）ＲＩＰ、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマ（L. cylindrical）ＲＩＰ、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマ（L. usitatissimum）ＲＩＰ、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシ（M. charantia）レクチン、アイスプラント（M. crystallinum）ＲＩＰ、メロニン、メキシン、オシロイバナ（Mirabilis）属種ＲＩＰ、ミトギリン、モデクシン、ＭＯＲ、ツルレイシ（Mormordica）属種ＲＩＰ、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコ（N. tabacum）ＲＩＰ、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピー（P. californicum）レクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ（Phytolacca）属種ＲＩＰ、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナ（A. thaliana）ペクチンメチルトランスフェラーゼ、ソロモンズシール（P. multiforum）ＲＩＰ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ポレクチン、エロモナス菌（Aeromonas）属種シュードモナス（Pseudomonas）属毒素（エロモナス・ハイドロフィラ（A. hydrophila）シュードモナス様毒素）、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマ（R. communis）アグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギ（S. cereale）ＲＩＰ、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンｂ、セイヨウニワトコ（S. nigra）ＲＩＰ、ツルコザクラ（S. ocymoides）ＲＩＰ、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）タンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ（Trichosanthes）属種ＲＩＰ、コムギ（Triticum）属種ＲＩＰ、ヤドリギ（V. album）ＲＩＰ、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウ（V. hispanica）ＲＩＰ、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケ（V. volvacea）ＲＩＰ、ボルバリン、ユッカ葉タ���パク質、Ｚ．ジプロペレンニス（Z. diploperennis）ＲＩＰ、トウモロコシ（Z. mays）ＲＩＰ、及び前出のいずれかの任意のリボ毒性断片
からなる群から選択される毒素に由来する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
結合領域が、
相補性決定領域３断片、拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合性断片、Ｆｄ断片、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、操作抗体模倣体、及び結合機能性を保持する前出のいずれかの任意の遺伝子操作対応物
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発現ライブラリーが、
バクテリオファージディスプレイ、ＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、微生物ディスプレイ、及び哺乳動物細胞ディスプレイ
からなる群から選択されるタンパク質ディスプレイ法を使用して作動可能である、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの結合領域が、少なくとも１つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される標的生体分子に結合することが可能である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの結合領域の標的生体分子が、
ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスＹ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイスＹ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、線維芽細胞増殖因子受容体、ＣＤ３３９、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ会合抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ＣＤ１１ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１２０、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のいずれかの任意の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多様な核酸の発現ライブラリーの少なくとも１つの結合領域のアミノ酸配列が、抗原又は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸により免疫化された脊索動物に由来する、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
脊索動物が、
鳥類、ウシ科動物、ラクダ科動物、軟骨魚類、ウマ科動物、ウサギ目動物、霊長動物、齧歯動物、及びイノシシ亜目動物
からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗原又は抗原性ペプチドが、
ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスＹ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイスＹ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、線維芽細胞増殖因子受容体、ＣＤ３３９、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ会合抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ＣＤ１１ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１２０、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のいずれかの任意の抗原性断片
からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
修飾リボ毒性領域が、配列番号１〜３９のいずれか、又はその任意のリボ毒性断片のアミノ酸配列に由来する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
修飾リボ毒性領域が、志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーのＡサブユニットのアミノ酸配列に由来する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
修飾リボ毒性領域が、
Ｎ７５、Ｙ７７、Ｙ１１４、Ｅ１６７、Ｒ１７０、Ｒ１７２、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｒ１８８、Ｖ１９１、Ｗ２０３、及びＬ２３３
を含む群から選択される、志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーの志賀毒素Ａサブユニットの、天然で配置されたアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）を、リボ毒性領域の阻害剤の存在下で実施する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
キメラ細胞毒性タンパク質をコードする核酸を産生するための方法であって、
前記キメラ細胞毒性タンパク質が、少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と融合させた、リボソームを不活性化することが可能なリボ毒素領域を含み、前記方法が、
ａ）請求項１〜１８のいずれかに記載の方法を使用して、キメラタンパク質の結合領域のアミノ酸配列を同定するステップと、
ｂ）キメラ細胞毒性タンパク質をコードする核酸を創出するステップであって、
前記結合領域が、ａ）で同定された前記結合領域の前記アミノ酸配列に由来するか、それを含むか、又はそれからなり、前記リボ毒性領域のリボ毒性が、前記同定されたキメラタンパク質の修飾リボ毒性領域より強い、ステップと
を含む、前記方法。
【請求項２０】
キメラ細胞毒性タンパク質の構築における使用のための、結合領域のアミノ酸配列を同定するための核酸ライブラリーを産生するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な複数の結合領域をコードする、複数のポリヌクレオチドを用意するステップと、
ｂ）前記複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、修飾リボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも１つのアミノ酸変異により、リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域をコードする複数の毒素鋳型ポリヌクレオチドへと接合させるステップと
を含み、
前記接合させた複数のポリヌクレオチドが、各々、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含む融合ポリペプチドをコードする、
前記方法。
【請求項２１】
キメラ細胞毒性タンパク質の構築における使用のための、結合領域のアミノ酸配列を同定するための発現ライブラリーを産生するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な複数の結合領域をコードする、複数のポリヌクレオチドを用意するステップと；
ｂ）前記複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、修飾リボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも１つのアミノ酸変異により、リボ毒性領域から修飾した、修飾リボ毒性領域をコードする複数の毒素鋳型ポリヌクレオチドへと接合させるステップであって、
前記接合させた複数のポリヌクレオチドが、各々、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含む融合ポリペプチドをコードする、ステップと；
ｃ）前記接合させた複数のポリヌクレオチドを、作動可能な組合せで、発現ベクターへと接合させて、複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な発現ライブラリーを形成するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記修飾リボ毒性領域と融合させた結合領域を含む、ステップと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
キメラ細胞毒性タンパク質の構築における使用のための、結合領域のアミノ酸配列を同定するための発現ライブラリーを産生するための方法であって、
ａ）複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な複数の核酸を含む発現ライブラリーを用意するステップであって、各融合ポリペプチドが、リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と融合させた、少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域を含む、ステップと；
ｂ）修飾リボ毒性領域のリボ毒性を低減するか又は消失させるように、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加により、前記リボ毒性領域を修飾するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２３】
複数の融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む分子ライブラリーであって、各融合ポリペプチドが、リボ毒性を、対応する非修飾リボ毒素領域と比較して低減するか又は消失させるように、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加を含む修飾リボ毒素領域と融合させた、少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域を含む、前記分子ライブラリー。
【請求項２４】
各ポリヌクレオチドを、宿主細胞内又は無細胞系内で、コードされる融合ポリペプチドを発現させることが可能な発現ベクターと作動可能に組み合わせる、請求項２３に記載の分子ライブラリー。
【請求項２５】
修飾リボ毒性領域が、
アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ属抗ウイルス性タンパク質／ＲＩＰ、アンギオジェニン、Ａ．パテンスＲＩＰ、アーティクラチンＤ、アスパリン、アスペルギリン、Ａｓｐｆ１、バルサミン、トウガンＲＩＰ、ブーガニン、ブーゲンビレア抗ウイルス性タンパク質１、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキＲＩＰ、ブリオジン、イカダカズラＲＩＰ、ビートＲＩＰ、シロザＲＩＰ、カンホリン、トゲエビス全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲＲＩＰ、ククミス・フィガレイＲＩＰ、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャＲＩＰ、コチニンＢ、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種ＲＩＰ、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウＲＩＰ、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキＲＩＰ、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンＡ、ヒヤシンスＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスＲＩＰ、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマＲＩＰ、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマＲＩＰ、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントＲＩＰ、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種ＲＩＰ、ミトギリン、モデクシン、ＭＯＲ、ツルレイシ属種ＲＩＰ、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコＲＩＰ、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種ＲＩＰ、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ、ソロモンズシールＲＩＰ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素（エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素）、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギＲＩＰ、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンｂ、セイヨウニワトコＲＩＰ、ツルコザクラＲＩＰ、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種ＲＩＰ、コムギ属種ＲＩＰ、ヤドリギＲＩＰ、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウＲＩＰ、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケＲＩＰ、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Ｚ．ジプロペレンニスＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ、及び前出のいずれかの任意のリボ毒性断片
からなる群から選択される毒素のアミノ酸配列に由来する、請求項２３又は２４に記載の分子ライブラリー。
【請求項２６】
結合領域が、
相補性決定領域３断片、拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合性断片、Ｆｄ断片、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、操作抗体模倣体、及び結合機能性を保持する前出のいずれかの任意の遺伝子操作対応物
からなる群から選択される、請求項２３〜２５のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項２７】
ライブラリーが、
バクテリオファージディスプレイ、ＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、微生物ディスプレイ、及び哺乳動物細胞ディスプレイ
からなる群から選択される、タンパク質ディスプレイ法を使用して作動可能である、請求項２３〜２６のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項２８】
少なくとも１つの結合領域が、少なくとも１つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される標的生体分子に結合することが可能である、請求項２３〜２７のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項２９】
少なくとも１つの結合領域の標的生体分子が、
ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスＹ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイスＹ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、線維芽細胞増殖因子受容体、ＣＤ３３９、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ会合抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ＣＤ１１ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１２０、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のいずれかの任意の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項２８に記載の分子ライブラリー。
【請求項３０】
少なくとも１つの結合領域のアミノ酸配列が、抗原又は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸により免疫化された脊索動物に由来する、請求項２３〜２９のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項３１】
脊索動物が、
鳥類、ウシ科動物、ラクダ科動物、軟骨魚類、ウマ科動物、ウサギ目動物、霊長動物、齧歯動物、及びイノシシ亜目動物
からなる群から選択される、請求項３０に記載の分子ライブラリー。
【請求項３２】
抗原又は抗原性ペプチドが、
ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスＹ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイスＹ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、線維芽細胞増殖因子受容体、ＣＤ３３９、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ会合抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ＣＤ１１ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１２０、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のいずれかの任意の抗原性断片
からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する、請求項３０又は３１に記載の分子ライブラリー。
【請求項３３】
修飾リボ毒性領域が、配列番号１〜３９のいずれか、又はその任意のリボ毒性断片のアミノ酸配列に由来する、請求項２３〜３２のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項３４】
修飾リボ毒性領域が、志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーのＡサブユニットのアミノ酸配列に由来する、請求項２３〜３２のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項３５】
修飾リボ毒性領域が、
Ｎ７５、Ｙ７７、Ｙ１１４、Ｅ１６７、Ｒ１７０、Ｒ１７２、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｒ１８８、Ｖ１９１、Ｗ２０３、及びＬ２３３
を含む群から選択される、志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーのＡサブユニットの、天然で配置されたアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基位置において、少なくとも１つの変異を含む、請求項３４に記載の分子ライブラリー。
【請求項３６】
複数のポリヌクレオチドが、配列番号４０〜６４のいずれかの配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項２３〜３５のいずれかに記載の分子ライブラリー。
【請求項３７】
１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質の構築における使用のための、結合領域のアミノ酸配列を同定するための方法であって、
前記１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質が、
ｉ）ポリペプチドを含み、かつリボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、ii）ポリペプチドを含み、かつ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と
を含み、
前記方法が、
ａ）複数のキメラ細胞毒性タンパク質を用意するステップであって、
各タンパク質が、
ｉ）ポリペプチドを含み、かつリボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と
ii）ポリペプチドを含み、かつ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と
を含む、ステップと；
ｂ）前記リボ毒性領域の阻害剤の存在下で、前記複数のキメラ細胞毒性タンパク質をスクリーニングして、少なくとも１つのアッセイスクリーニング可能な特徴を伴うタンパク質を同定するステップであって、前記少なくとも１つの特徴が、標的生体分子への結合アフィニティー、標的生体分子への結合選択性、標的細胞への結合アフィニティー、標的細胞への結合選択性、標的細胞への内部化、及び発現量から選択される、ステップと；
ｃ）ステップｂ）で同定されたキメラ細胞毒性タンパク質のポリペプチド領域のアミノ酸配列を同定するか、ステップｂ）で同定された前記キメラ細胞毒性タンパク質の前記結合領域の前記アミノ酸配列を同定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３８】
ｄ）同定されたキメラ細胞毒性タンパク質の結合領域のアミノ酸配列に由来するか又はこれを含む、１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質を産生するステップ
をさらに含み、
前記産生するステップが、
ｉ）前記同定されたキメラ細胞毒性タンパク質の前記結合領域の前記アミノ酸配列に由来するか又はこれを含む、１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用意するステップと、
ii）宿主細胞又は無細胞翻訳系を使用して、前記ポリヌクレオチドを発現させることとを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１又は２以上のキメラ細胞毒性タンパク質が、結合領域と融合させたリボ毒素領域を含む融合ポリペプチドである、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
複数のキメラ細胞毒性タンパク質が、複数の融合ポリペプチドであり、各融合ポリペプチドが、結合領域と融合させたリボ毒素領域を含む、請求項３７〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ステップａ）の前に、
ａ’）複数の融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドから構築された、多様な核酸の発現ライブラリーを用意するステップであって、各融合ポリペプチドが、
ｉ）リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域と、
ii）少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と
を含む、ステップと；
ｂ’）複数の融合ポリペプチドが産生されるように、多様な核酸の前記発現ライブラリーを発現させるステップと；
ｃ’）前記発現した複数の融合ポリペプチドを、前記複数のキメラ細胞毒性タンパク質としてステップa）のために用意するステップと
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップａ’）の前に、
ａ’’）複数の結合領域をコードする複数の多様なポリヌクレオチドを含むライブラリーを用意するステップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも２つのサブセットが、それぞれ少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な異なる結合領域を伴うポリペプチドをコードする、ステップと；
ｂ’’）前記ライブラリーの前記ポリヌクレオチドを、リボ毒性領域をコードする毒素鋳型ポリヌクレオチドへと、作動可能な組合せで接合させて、複数の融合ポリペプチドをコードする多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記リボ毒性領域及び前記結合領域のうちの１つを含む、ステップと；
ｃ’’）任意で、前記ポリヌクレオチドライブラリーの前記ポリヌクレオチドを、発現ポリヌクレオチド鋳型へと組み換えて、複数の融合ポリペプチドを発現させることが可能な、多様な核酸の発現ライブラリーを構築するステップであって、各融合ポリペプチドが、前記リボ毒性領域及び前記結合領域のうちの１つを含む、ステップと； 
ｄ’’）前記発現ライブラリーを、複数の融合ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドから構築された多様な核酸の発現ライブラリーとして、ステップa’)のために用意するステップと
をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
リボ毒性領域が、
アブリン、アグロスチン、アマランジン、アマランチン、ヒユ属抗ウイルス性タンパク質／ＲＩＰ、アンギオジェニン、Ａ．パテンスＲＩＰ、アーティクラチンＤ、アスパリン、アスペルギリン、Ａｓｐｆ１、バルサミン、トウガンＲＩＰ、ブーガニン、ブーゲンビレア抗ウイルス性タンパク質１、ベニンカシン、ブーガニン、シンツルムラサキＲＩＰ、ブリオジン、イカダカズラＲＩＰ、ビートＲＩＰ、シロザＲＩＰ、カンホリン、トゲエビス全身抵抗性誘導タンパク質、ゾウクラゲＲＩＰ、ククミス・フィガレイＲＩＰ、チャランチン、カリブジン、シナモミン、クラビン、トウヨウカボチャＲＩＰ、コチニンＢ、コロシン、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種ＲＩＰ、コリネバクテリウム属種ジフテリア毒素、ドデカンドリン、エブリン、エブリチン、キバナセツブンソウＲＩＰ、ユーセランチン、ユーチルカリン、フラミン、フラムリン、フェチジシミン、ゲロニン、ジガンチン、グリソフィリン、スナバコノキＲＩＰ、ヘテロテパリン、ヒスピン、ヒスルテリンＡ、ヒヤシンスＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、ヒプシン、インズラリン、ダッチアイリスＲＩＰ、ランゲニン、ラムジャピン、ランセオリン、ヘチマＲＩＰ、ルファシリン、ルファクリン、ルファグリン、ルフィン、アマＲＩＰ、リクニン、リオフィリン、マヌチン、マルモリン、マパルミン、ツルレイシレクチン、アイスプラントＲＩＰ、メロニン、メキシン、オシロイバナ属種ＲＩＰ、ミトギリン、モデクシン、ＭＯＲ、ツルレイシ属種ＲＩＰ、モモルスグロビン、モスカチン、ムサルミン、タバコＲＩＰ、ニグリン、ニグリチン、オシモイジン、パキエロシン、カリフォルニアポピーレクチン、ペポシン、ペトログラウシン、ペトログランジン、ヤマゴボウ属種ＲＩＰ、ピサビン、プレウツレジン、プルツレジン、シロイヌナズナペクチンメチルトランスフェラーゼ、ソロモンズシールＲＩＰ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ポレクチン、エロモナス菌属種シュードモナス属毒素（エロモナス・ハイドロフィラシュードモナス様毒素）、プルケリン、キンケギンシン、トウゴマアグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン、サポリン、サルシン、サチビン、ライムギＲＩＰ、セキウミン、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジンｂ、セイヨウニワトコＲＩＰ、ツルコザクラＲＩＰ、ホウレンソウタンパク質、ステラリン、ステノダクチリン、テキサニン、トリコリン、カラスウリ属種ＲＩＰ、コムギ属種ＲＩＰ、ヤドリギＲＩＰ、ベリン、ベルチン、ベロ毒素、ドウカンソウＲＩＰ、ビルクミン、ボルケンシン、フクロタケＲＩＰ、ボルバリン、ユッカ葉タンパク質、Ｚ．ジプロペレンニスＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ、及び前出のいずれかの任意のリボ毒性断片
からなる群から選択される毒素に由来する、請求項３７〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
結合領域が、
相補性決定領域３断片、拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合性断片、Ｆｄ断片、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、操作抗体模倣体、及び結合機能性を保持する前出のいずれかの任意の遺伝子操作対応物
からなる群から選択される、請求項３７〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
発現ライブラリーが、
バクテリオファージディスプレイ、ＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、ビーズ表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、微生物ディスプレイ、及び哺乳動物細胞ディスプレイ
からなる群から選択される、タンパク質ディスプレイ法を使用して作動可能である、請求項４１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの結合領域が、少なくとも１つの種類の悪性細胞と物理的に会合して見出される標的生体分子に結合することが可能である、請求項３７〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つの結合領域の標的生体分子が、
ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスＹ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイスＹ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、線維芽細胞増殖因子受容体、ＣＤ３３９、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ会合抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ＣＤ１１ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１２０、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のいずれかの任意の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
多様な核酸の発現ライブラリーの少なくとも１つの結合領域のアミノ酸配列が、抗原又は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸により免疫化された脊索動物に由来する、請求項４１〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
脊索動物が、
鳥類、ウシ科動物、ラクダ科動物、軟骨魚類、ウマ科動物、ウサギ目動物、霊長動物、齧歯動物、及びイノシシ亜目動物
からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
抗原又は抗原性ペプチドが、
ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイスＹ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合性タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイスＹ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、線維芽細胞増殖因子受容体、ＣＤ３３９、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパラチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ会合抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ＣＤ１１ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１２０、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、及び腫瘍壊死因子アルファ、並びに前出のいずれかの任意の抗原性断片
からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列に由来する、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
リボ毒性領域が、配列番号１〜１４のいずれかに示されるポリペプチド配列又はその任意のリボ毒性断片に由来する、請求項３７〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
リボ毒性領域が、志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーのＡサブユニットのアミノ酸配列に由来する、請求項３７〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
キメラ細胞毒性タンパク質をコードする核酸を産生するための方法であって、
ａ）請求項３７〜５２のいずれかに記載の方法を使用して、キメラ細胞毒性タンパク質の結合領域のアミノ酸配列を同定するステップと、
ｂ）キメラ細胞毒性タンパク質をコードする核酸を創出するステップであって、前記コードされるキメラ細胞毒性タンパク質が、
（i）a）において同定された前記結合領域の前記アミノ酸配列に由来するか、それを含むか、又はそれからなる結合領域であって、前記結合領域が、少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域を含み、
(ii)リボソームを不活性化することが可能なリボ毒性領域
に融合されるステップと
を含む、前記方法。
【請求項５４】
リボ毒性を低減するか又は消失させる、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、又は付加を含む修飾リボ毒素領域を含むキメラタンパク質であって、前記修飾リボ毒素領域が、配列番号１〜３９のいずれかのアミノ酸配列に由来し、前記修飾リボ毒素領域が、少なくとも１つの標的生体分子に結合することが可能な結合領域と融合している、前記キメラタンパク質。
【請求項５５】
修飾リボ毒素領域が、配列番号４０〜６４のいずれかによるポリヌクレオチド配列に由来するか、又はこれを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項５４に記載のキメラタンパク質。
【請求項５６】
請求項５４又は５５に記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
【請求項５７】
修飾リボ毒素領域が、配列番号４０〜６４のいずれかのポリヌクレオチド配列に由来するか又はこれを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項５６に記載の核酸。