【手続補正書】
【提出日】平成30年3月30日(2018.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）DNAオリゴ、一本鎖DNAオリゴ、または100個もしくはそれ未満のヌクレオチドを有するDNAオリゴと（b）DNA消化剤、1つもしくは複数のRNA上にコードされたDNA消化剤、TALEN、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼ、部位特異的なヌクレアーゼ、または(i) ヌクレアーゼおよびCas9、もしくは(ii) 部位特異的なヌクレアーゼおよびガイドRNAを含む組成物とを含む組成物、または、非ウイルス性である前記組成物を、エレクトロポレーション、またはフローエレクトロポレーションデバイスを用いるフローエレクトロポレーションにより幹細胞にトランスフェクトする工程を含む、該幹細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法であって、
該DNAオリゴが、
（i）該標的ゲノムDNA領域に相同なDNA配列を含む相同領域と、
（ii）配列改変領域と
を含み、
該標的ゲノムDNA領域または1つもしくは複数の停止コドンにおいてゲノムDNA配列が特異的に改変され、
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が変化し、付加され、または欠失し、
任意に、前記配列改変について前記細胞をスクリーニングする工程、および／または
トランスフェクトされた細胞を凍結させる工程、および／または
以前に凍結させたトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程
をさらに含む、方法。
【請求項２】
前記DNAオリゴが10個超の核酸、10〜800個の核酸、10〜600個の核酸、10〜200個の核酸、10〜100個の核酸、または10〜50個の核酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が10μg/mLを上回る、約10μg/mL〜約500μg/mLである、約35μg/mL〜約300μg/mLである、または約35μg/mL〜約200μg/mLである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、哺乳動物末梢血リンパ球、増殖した哺乳動物T細胞、哺乳動物幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、または哺乳動物初代細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴが、核酸少なくとも10個の相同配列、核酸少なくとも20個の相同配列、または核酸少なくとも30個の相同配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記配列改変の効率が3%超、5%超、または10%超である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、(i)異なる相同配列を有する2つまたはそれ以上のDNAオリゴ、(ii)異なる相同配列を有する2つまたはそれ以上のDNAオリゴおよび2つまたはそれ以上のDNA消化剤、または、(iii)異なる相同配列を有する2つまたはそれ以上のDNAオリゴおよび異なるゲノム部位を標的にする2つまたはそれ以上のDNA消化剤を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、(i)患者から単離された細胞、(ii)前記細胞のトランスフェクションの1週間前以降の期間に前記患者から単離された細胞、(iii)前記細胞のトランスフェクションの1日前以降の期間に前記患者から単離された細胞、(iv)凍結されていない単離された細胞、(v)2つまたはそれ以上の異なる細胞型を含む単離された細胞、および／または(vi)多能性の異なる段階における2つまたはそれ以上の細胞型を含む単離された細胞である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記配列改変の効率が3%超、5%超、または10%超であり、および／または前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、(i)対象の骨髄から単離されている細胞、(ii)幹細胞を含む細胞、(iii)造血幹細胞を含む細胞、または(iv)細胞表面マーカーCD34+を含む造血幹細胞である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記DNA配列改変を有するクローン細胞を産生するために、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含み、前記クローン細胞は大規模製造のために増殖される、または1L超、または3Lもしくはそれ以上の容積で増殖される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が無血清培地中で培養される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（a）DNAオリゴと（b）消化剤とを含む組成物をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程であって、
ドナーDNAが、
（i）標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と、
（ii）配列改変領域と
を含む、工程；および
該標的ゲノムDNA領域におけるゲノムDNA配列改変について、トランスフェクトされた細胞をスクリーニングする工程；
クローン細胞を得るために、限界希釈によりスクリーニングしたトランスフェクトされた細胞を単離する工程；
該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程
を含む、該標的ゲノムDNA配列の該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するための方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法により産生された細胞株または請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法を使用して産生された、エレクトロポレーションされた細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
[本発明1001]
（a）100個またはそれ未満のヌクレオチドを有するDNAオリゴと（b）RNA上にコードされたDNA消化剤とを含む組成物をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程を含む、該細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法であって、
該DNAオリゴが、
（i）該標的ゲノムDNA領域に相同なDNA配列を含む相同領域と、
（ii）配列改変領域と
を含み、
該標的ゲノムDNA領域においてゲノムDNA配列が特異的に改変され、かつ該細胞が幹細胞またはそれらの子孫である、方法。
[本発明1002]
前記DNAオリゴが一本鎖でありかつ前記細胞が初代細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
（a）DNAオリゴと（b）DNA消化剤とを含む組成物をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程を含む、該細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法であって、
該DNAオリゴが、
（i）該標的ゲノムDNA領域に相同なDNA配列を含む相同領域と、
（ii）配列改変領域と
を含み、
該標的ゲノムDNA領域においてゲノムDNA配列が特異的に改変される、方法。
[本発明1004]
エレクトロポレーションが、フローエレクトロポレーションデバイスを用いるフローエレクトロポレーションである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記DNA消化剤が、TALEN、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、またはヌクレアーゼである、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記DNA消化剤が、1つまたは複数のRNA上にコードされている、本発明1003〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記DNA消化剤がヌクレアーゼである、本発明1003〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記組成物がCas9をさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ヌクレアーゼが、部位特異的なヌクレアーゼである、本発明1007および1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記部位組成物がガイドRNAをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記オリゴが一本鎖である、本発明1003〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記DNAオリゴが10個超の核酸である、本発明1003〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記DNAオリゴが10〜800個の核酸である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記DNAオリゴが10〜600個の核酸である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記DNAオリゴが10〜200個の核酸である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記DNAオリゴが10〜100個の核酸である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記DNAオリゴが10〜50個の核酸である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が10μg/mLを上回る、本発明1003〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約10μg/mL〜約500μg/mLである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約35μg/mL〜約300μg/mLである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記組成物中の前記DNAオリゴの濃度が約35μg/mL〜約200μg/mLである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記組成物が非ウイルス性である、本発明1003〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記細胞が哺乳動物細胞である、本発明1003〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記細胞が線維芽細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1026]
前記哺乳動物細胞が末梢血リンパ球である、本発明1023の方法。
[本発明1027]
前記哺乳動物細胞が、増殖したT細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1028]
前記哺乳動物細胞が幹細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1029]
前記幹細胞が造血幹細胞である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記細胞が間葉系幹細胞である、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記哺乳動物細胞が初代細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1032]
前記ゲノムDNA配列が疾患関連遺伝子を含む、本発明1003〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記ゲノムDNA配列がHBB遺伝子を含む、本発明1003〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記配列改変が前記ゲノムDNAの修正であり、該修正により前記HBB遺伝子の6番目のコドンがグルタミン酸コドンに改変される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記疾患が慢性肉芽腫性疾患である、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記ゲノムDNA配列がgp91phox遺伝子を含む、本発明1032または1035の方法。
[本発明1037]
前記オリゴが、核酸少なくとも10個の相同配列を含む、本発明1003〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記オリゴが、核酸少なくとも20個の相同配列を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記オリゴが、核酸少なくとも30個の相同配列を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記配列改変の効率が3%超である、本発明1003〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記配列改変の効率が5%超である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記配列改変の効率が10%超である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%である、本発明1003〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも40%である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも50%である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記DNA配列改変が、1つまたは複数の停止コドンである、本発明1003〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記組成物が、異なる相同配列を有する2つまたはそれ以上のDNAオリゴを含む、本発明1003〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記組成物が、2つまたはそれ以上のDNA消化剤を含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記組成物が、2つまたはそれ以上の部位特異的なDNA消化剤を含み、該DNA消化剤が、異なるゲノム部位を標的にする、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が変化する、本発明1003〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が付加される、本発明1003〜1049のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記配列改変により前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が欠失する、本発明1003〜1049のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記細胞が患者から単離された細胞である、本発明1003〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記細胞のトランスフェクションの1週間前以降の期間に該細胞が前記患者から単離された、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記細胞のトランスフェクションの1日前以降の期間に該細胞が前記患者から単離された、本発明1053の方法。
[本発明1056]
前記単離された細胞が凍結されていない、本発明1053〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記単離された細胞が、2つまたはそれ以上の異なる細胞型を含む、本発明1053〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記2つまたはそれ以上の異なる細胞型が、多能性の異なる段階における2つまたはそれ以上の細胞型を含む、本発明1053〜1056のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記配列改変の効率が3%超である、本発明1053〜1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記配列改変の効率が5%超である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記配列改変の効率が10%超である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも30%である、本発明1053〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも40%である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記エレクトロポレーション後の細胞生存率が少なくとも50%である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記細胞が対象の骨髄から単離されている、本発明1053〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記細胞が幹細胞を含む、本発明1053〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記幹細胞が造血幹細胞を含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記幹細胞が細胞表面マーカーCD34+を含む、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記DNA配列改変を有するクローン細胞を産生するために、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1003〜1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
細胞が大規模製造のために増殖される、本発明1069の方法。
[本発明1071]
細胞が1L超の容積で増殖される、本発明1069または1070の方法。
[本発明1072]
細胞が3Lまたはそれ以上の容積で増殖される、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記細胞が無血清培地中で培養される、本発明1003〜1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記配列改変について前記細胞をスクリーニングする工程をさらに含む、本発明1003〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
トランスフェクトされた細胞を凍結させる工程をさらに含む、本発明1003〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
以前に凍結させたトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1003〜1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
（a）DNAオリゴと（b）消化剤とを含む組成物をエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程であって、
ドナーDNAが、
（i）標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と、
（ii）配列改変領域と
を含む、工程；および
該標的ゲノムDNA領域におけるゲノムDNA配列改変について、トランスフェクトされた細胞をスクリーニングする工程；
クローン細胞を得るために、限界希釈によりスクリーニングしたトランスフェクトされた細胞を単離する工程；
該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程
を含む、該標的ゲノムDNA配列の該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を産生するための方法。
[本発明1078]
本発明1077の方法により産生された細胞株。
[本発明1079]
本発明1003〜1078のいずれかの方法を使用して産生された、エレクトロポレーションされた細胞。
[本発明1080]
本発明1079のエレクトロポレーションされた細胞または本発明1078の細胞株の有効量を投与する工程により、疾患もしくは状態を有するかまたは疾患もしくは状態を有することが疑われる対象を処置する方法。
[本発明1081]
本発明1079のエレクトロポレーションされた細胞または本発明1078の細胞株の有効量を投与する工程を含む、臨床研究方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本詳細な説明から本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が当業者には明らかになるため、詳細な説明および特定の実施例が、本発明の好ましい態様を示しているが、例示としてのみ提供されることを理解すべきである。