(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ胚に、ピルビン酸を添加することなく、10％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むKSOM溶液中において、4mM〜10mMのジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作して栄養膜細胞からのインターフェロン・タウの発現量を向上させたウシ胚を調製する工程、前記ウシ胚を移植する移植工程を備えた胚移植方法。
【請求項２】
インターフェロン・タウを発現するがウシ胎児とはならない性質を持つ補助細胞を調製する調製工程と、前記補助細胞とウシ胚とを共移植する共移植工程とを備えた胚移植方法において、。
前記調製工程が、（１）ウシ胚から動物胎児となる部分を分離した後に、ピルビン酸を添加することなく、10％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むKSOM溶液中において、4mM〜10mMのジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作して栄養膜細胞を調製する方法、及び（２）ウシの単為発生卵に、ピルビン酸を添加することなく、10％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むKSOM溶液中において、4mM〜10mMのジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作する方法からなる群から選択される少なくとも一種である胚移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反すう動物（特にウシ）胚におけるインターフェロン・タウの誘導方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国の資源の一つとして和牛がある。国内における肉用牛繁殖雌牛は、平成１９年〜平成３０年に渡って、概ね５８万頭〜６８万頭の間で推移している。しかしながら、その需要は多いために、子牛の供給価格は４０万円〜９０万円の間で高止まりしている。和牛子牛の供給を増加させるためには、人工的な胚移植の成功率を高めることが重要となる。このため、着床率が高いウシ胚の生産に関する技術が望まれている。
従来の研究によれば、ウシ・ヒツジ・ヤギなどを含む反すう動物では、妊娠の成立・維持に必要不可欠なホルモンとしてインターフェロン・タウ（IFNT）が同定されている。胚からIFNTが発現されることにより、子宮の免疫寛容及び母体の認識を促すことが知られている。この知見を利用して、２個の胚を移植することにより、IFNT分泌量を２倍とすることで着床率を向上させる方法（非特許文献１）や、ウシ胚と栄養膜細胞（ウシ胚のうち胎児となる細胞を切除し、胎盤となるIFNTを生産する細胞のみを残したもの）を移植する方法（非特許文献２）や、単為発生卵とウシ胚とを共移植する方法（非特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】原誠ら、Ｆ１雌牛飼育農場における黒毛和腫増産の取り組み、第30回  東日本家畜受精卵移植技術研究会大会、平成27年2月5日〜2月6日
【非特許文献２】Yutaka HASHIYADA et al, Transition of the Pregnancy Rate of Bisected Bovine Embryos after Co-transfer with Trophoblastic Vesicles Prepared from In Vivo-cultured In Vitro-fertilized Embryos, Journal of Reproduction and Development, p.749-756, Vol. 51, (6) 2005
【非特許文献３】櫻井貴博ら、単為発生卵が賛成する妊娠認識物質を利用した受胎率向上技術の確立、茨城畜セ研報46号、p.1-4、2012
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献１に開示された技術では、複数の仔牛が妊娠してしまい（多胎）、分娩時に事故が発生することが問題となっている。非特許文献２に開示された技術では、ウシ胚（直径が約200μm）を特殊な顕微鏡下で正確に分離する技術が必要となるため、一般的な方法とはなり難かった。また、非特許文献３に開示された技術では、単為発生卵３個を用いて胚移植した場合にのみ着床率の向上傾向が認められており生産性に乏しかった。
このため、（多胎妊娠する危険性が低い）１個のみの胚移植によって、高い着床率が得られる方法が求められていた。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりも高い着床率で反すう動物胚を移植（着床、受胎）させられる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
TCAサイクルの中間代謝産物であるアルファ・ケトグルタル酸は、そのままの状態では、細胞膜を容易に通過できないため、本発明者は、ジメチル化したジメチル・アルファ・ケトグルタル酸（下記化学式１。2-オキソグルタル酸ジメチル、2-オキソグルタル酸ジメチル、ジメチル2-ケトグルタラート、2-オキソペンタン二酸ジメチル、2-ケトグルタル酸ジメチル、α-ケトグルタル酸ジメチル、2-ケトグルタコン酸ジメチルともいう。以下、「α-KG」と略することがある。）がウシ胚からのIFNTの分泌を促すことを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００６】
【化１】
0006951718.tif 000002
【０００７】
こうして、本発明に係る反すう動物胚におけるインターフェロン・タウの誘導方法は、反すう動物胚とジメチル・アルファ・ケトグルタル酸とを接触させる工程を含むことを特徴とする。
反すう動物とは、反すう胃を備え、反すうを行う動物を意味している。反すうとは、食物を口で咀嚼し、反すう胃に送って部分的に消化した後、再び口に戻して咀嚼するという過程を繰り返す行為を意味する。反すう動物の胃は、４個の部屋を備えており、それぞれ第一胃（こぶ胃）、第二胃（蜂の巣胃）、第三胃（葉胃）及び第四胃（しわ胃：アボマスム、ギアラ）という。反すう動物には、ウシ・ヤギ・ヒツジ・キリン・バイソン・シカ・ヌー・アンテロープ・ラクダ・ラマが含まれる。反すう動物では、妊娠の成立と維持にインターフェロン・タウが必須の物質（ホルモン）として作用することが知られている。これらのうち、特にウシであることが好ましい。
【０００８】
反すう動物胚とは、反すう動物の受精卵が個体として発生する際における極めて初期段階の個体を意味する。受精卵が細胞分裂（卵割）して発生するときには、２細胞、４細胞等を経て、桑実胚、胚盤胞と呼ばれる状態に至った後に着床する。本発明において、反すう動物胚は、受精卵（１細胞）〜胚盤胞までの範囲の胚を含む。また、人工的な胚移植に用いられるものは、桑実胚（特に、後期桑実胚）または胚盤胞（特に、初期胚盤胞）であることが多い。
ジメチル・アルファ・ケトグルタル酸は、上記化１に示す構造を備えた有機化合物であり、C7H10O5の示唆式を有し、分子量は174.15である。
IFNTとは、反すう動物胚の着床期に胚から分泌され、妊娠認識および黄体機能の維持に重要な役割を果たす有機物質（ホルモン）であり、ウシでは、伸長した胚が子宮内膜に接着し、胎盤形成直前をピークとした一過性の分泌を示すことが知られている。初期胚が成長、分化し、胚盤胞を形成したときに、胚の外側に位置する胞状の膜を構成する細胞（栄養膜細胞）が認められる。栄養膜細胞は、初期胚の着床前にIFNTを分泌すると共に、胚の着床後には胎子側の胎盤を形成する。このため、胚のIFNTを合成する伝令RNA（mRNA）を多く発現させることができれば、IFNTがより多く分泌され胚移植時の着床率を向上させることができ得る。
【０００９】
「接触させる」とは、胚にα-KGを滴下・振り掛け・噴霧等の方法により直接に物理的に接させること、または胚の培養液中にα-KGを混合しておいて液中で接することなどを意味する。
上記発明によれば、反すう動物胚からインターフェロン・タウを誘導させられるので、胚移植時の着床率を向上させられる。
また、別の発明に係る反すう動物胚の凍結保存方法は、反すう動物胚にジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作する感作工程、感作した胚を凍結する凍結工程を備えることを特徴とする。
感作するとは、反すう動物胚とα-KGとを積極的に接触させることを意味する。初期の胚にα-KGを感作することで、胚がIFNTを多く誘導する状態となっているので、これを凍結保存しておくことにより、胚移植を行う際に着床率の高い胚として保存できることになる。
凍結保存とは、胚を凍結することで胚移植に使用するまで凍結して保存しておく技術を意味する。このとき、凍結しておく温度としては、当業者に公知のように、液体窒素を用いて-196℃を用いることができる。また、凍結保存時には、公知の技術を用いて、所定濃度の血清、エチレングリコール、グリセリン、プロパンジオール等の不凍液ならびにショ糖、トレハロース等の糖類を加えた溶液を用いることができる。
【００１０】
また、別の発明に係る胚移植方法は、反すう動物胚にジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作して栄養膜細胞からのインターフェロン・タウの発現量を向上させた動物胚を調製する工程、前記動物胚を移植する移植工程を備えることを特徴とする。
上記構成によれば、インターフェロン・タウの発現量を向上させた反すう動物胚を胚移植に利用するので、着床率を向上させられる。
また、別の発明に係る胚移植方法は、インターフェロン・タウを発現するが反すう動物胎児とはならない性質を持つ補助細胞を調製する調製工程と、前記補助細胞と反すう動物胚とを共移植する共移植工程とを備えることを特徴とする。
補助細胞とは、反すう動物胚を胚移植する際に、その着床率を向上させるために使用される。従来の方法と組み合わせることにより、IFNTの発現量を増加させられるので、更なる着床率の向上を図ることができる。
【００１１】
このとき、前記調製工程が、（１）反すう動物胚から動物胎児となる部分を分離した後にジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作して栄養膜細胞を調製する方法、及び（２）反すう動物の単為発生卵にジメチル・アルファ・ケトグルタル酸を感作する方法からなる群から選択される少なくとも一種の前記補助細胞の調製方法であることが好ましい。
単為発生卵とは、反すう動物の卵子を取り出し、所定の条件で培養した卵子をCa、電気パルス、エタノールなどの条件を与えた作成された卵を意味しており、IFNTを分泌すること（但し、仔牛とはならない）が知られている。単為発生卵と胚とを共移植することで、着床率を向上させられることが知られている（例えば、非特許文献３）。本発明によれば、単為発生卵にα-KGを感作することで、更にIFNTの分泌を増加させ、着床率を更に向上させられる。
また、別の発明に係るインターフェロン・タウ誘導用α-KGは、反すう動物胚からインターフェロン・タウを誘導するために使用されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来よりも高い着床率で反すう動物胚を移植させられる方法を提供できる。
また、本発明は下記の効果を奏する。
１．α-KGを添加し、ウシ胚を培養することで、胚のIFNTの分泌量を増加させ、ウシ胚の着床性を向上させることができる。
２．一般にウシ胚は受精後4〜5日目からIFNT分泌を開始するが、この時期のウシ胚にα-KGを接触させる処理を行えば、IFNTの分泌量を高く誘導し、着床率が高い胚とすることができる。
３．従来法では、ウシ胚を凍結保存すると栄養膜細胞に障害が生じ、IFNTの分泌量が低下してしまう。本発明によれば、凍結保存前のウシ胚とα-KGとを接触させる処理を行い、栄養膜細胞の機能性を向上させることで、凍結障害によるIFNT分泌量の低下を補うことができる。
４．従来法としての、単為発生卵とウシ胚との共移植の着床率を改善できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例１におけるIFNTの発現量を比較した棒グラフである。
【図２】Oct4の発現量を比較した棒グラフである。
【図３】Cdx2の発現量を比較した棒グラフである。
【図４】胚細胞数を比較した棒グラフである。
【図５】試験例２において、体外受精7日目〜14日目におけるウシ胚の生存性を比較した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく、様々な形態で実施できる。
＜試験例１＞α-KGがウシ胚の遺伝子発現に与える影響の確認試験
（１）試験方法
食肉処理されたウシ卵巣から卵子を回収し、TCM199（Gibco）、10%新生子ウシ血清、10 ng/ml硫酸ゲンタマイシン、0.02 AU/ml卵胞刺激ホルモン（アントリンR・10；共立製薬）、50 ng/ml EGFおよび50 μ0/ml dbcAMPを含有する溶液中で38.5℃、5%CO2、95%空気かつ飽和湿度条件下で21時間培養させ、体外成熟を実施した。成熟ウシ卵子は、媒精液（IVF100；機能性ペプチド研究所）を用い、常法により体外受精を行った。体外受精後の胚は、5％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むCR1aa溶液中で、38.5℃、5%CO2、5%O2、90%空気かつ飽和湿度条件下で7日間培養した。上記の条件にて得られた体外受精7日目の胚盤胞期のウシ胚を10％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むKSOM溶液にα-KGを添加し（0mMまたは4mM）、33.0℃または38.5℃、5%CO2、95%空気かつ飽和湿度条件下で3日間培養した。
培養開始から3日目にウシ胚中のmRNA遺伝子（IFNT、Oct4、Cdx2を含む）の発現量をβアクチンを内因性コントロール遺伝子としてリアルタイムPCRにて相対定量化（ΔΔCｔ法）し、比較した。また、培養開始から3日目の胚細胞数をヘキスト33342で核を染色し調べた。いずれも実験は3回繰り返した。
統計処理は、胚中のmRNA遺伝子の発現量を一次分散分析にて、胚細胞数をt検定にて行った。
【００１５】
（２）試験結果
図１〜図３には、ウシ胚中のIFNT、Oct4及びCdx2遺伝子の発現量を調べた結果を、図４には、胚の細胞数を比較した結果をそれぞれ示した。なお、図中の棒の長さは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。図中のアスタリスク（*）は、同じカテゴリー内での有意水準が5%以下であることを示す。
図１に示すように、ウシ体温下（38.5℃）または33℃にて4mMα-KGを添加して培養したウシ胚は、無処理（0mMα-KG）で培養したウシ胚と比べると、IFNT遺伝子の転写発現量が有意に（p<0.05）上昇した。一方、図２，３に示すように、ウシ胚の発生に重要な役割を果たす遺伝子であるOct4とCdx2については、α-KGの添加に係わらず、遺伝子の転写発現量に差異は認められなかった。
また、図４に示すように、ウシ体温下で培養した胚の細胞数は、α-KGの添加または無添加によって、差異は認められなかった。また、ウシ体温よりも低い33℃でウシ胚を培養すると胚細胞の増殖が極めて緩やかになるが、α-KGを添加して培養した場合には、38.5℃で培養した場合と同様にIFNT遺伝子の転写発現量が著しく上昇した（図１）。
このように、ウシ胚とα-KGとを接触させて培養した場合には、ウシ胚の栄養膜細胞を増殖させることなく、栄養膜細胞の機能に変化を与え、IFNT遺伝子の転写発現量を上昇させることが分かった。
【００１６】
＜試験例２＞α-KGがウシ胚の生存性に与える影響の確認試験
（１）試験方法
食肉処理されたウシ卵巣から卵子を回収し、TCM199（Gibco）、10％新生子ウシ血清、10 ng/ml硫酸ゲンタマイシン、0.02 AU/ml卵胞刺激ホルモン（アントリンR・10；共立製薬）、50 ng/ml EGFおよび50 μg/ml dbcAMPを含有する溶液中で38.5℃、5%CO2、95%空気かつ飽和湿度条件下で21時間培養させ、体外成熟を実施した。成熟ウシ卵子は、媒精液（IVF100；機能性ペプチド研究所）を用い、常法により体外受精を行った。体外受精後の胚は、5％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むCR1aa溶液中で、38.5℃、5%CO2、5%O2、90%空気かつ飽和湿度条件下で7日間培養した。上記の条件にて得られた体外受精7日目の胚盤胞期のウシ胚を10％新生子ウシ血清と10 ng/ml硫酸ゲンタマイシンを含むKSOM溶液にα-KGを添加し（0mMまたは6mM）、38.5℃、5%CO2、95%空気かつ飽和湿度条件下で７日間培養した。
体外受精7日目（試験開始時）〜14日目のそれぞれにおいて、ウシ胚の生存性を確認した。
統計処理は、フィッシャーの正確確率検定を用いて行った。
【００１７】
（２）試験結果
図５には、体外受精7日目〜14日目におけるウシ胚の生存性の割合を示した。生存性は、胚盤胞、脱出胚盤胞または変性胚の三種類で判断した（なお、変性胚は死滅した胚を示す）。図中の異符号（a-b, c-d）は、同じカテゴリー内での有意水準が5%以下であることを示す。
図に示すように、体外受精7日目〜14日目のウシ胚の生存性は、α-KGの添加または無添加によって、変化が認められないことが分かった。このことから、α-KGは、ウシ胚の生存性について影響を与えないことが分かった。なお、図には示さないが、α-KGの添加濃度を10mMとした試験を行ったところ、上記結果と同様に、ウシ胚の生存性について影響を与えないことが分かった。
【００１８】
＜試験例３＞ウシ胚の凍結保存方法
通常の方法によって採取されたウシ胚にα-KGを感作することにより、ウシ胚（の栄養膜細胞）からのIFNTの転写発現量を増加させられるので、その状態で凍結保存すれば、胚移植時の着床率を向上させられる。
そのような凍結保存方法の一例を下記に記載する。
従来法によって得られたウシ胚を、α-KG（4mM〜10mM）を添加した培養液中で38.5℃にて数日間に渡って培養する（感作工程）。こうして、IFNTの転写発現量を増加させた後に、通常の方法に従って凍結保存する（凍結工程）。
凍結した胚は、胚移植を行うまで凍結保存しておく。
【００１９】
＜試験例４＞ウシ胚の胚移植（１）
上記試験結果を利用して、着床率を向上させた胚移植方法を実施できる。そのような胚移植方法の一例を下記に記載する。
胚移植用のウシ胚にα-KG（4mM〜10mM）を添加（感作）した状態で数日間培養して、栄養膜細胞からのIFNTの転写発現量を向上させた状態としておく（IFNTの発現量を向上させた動物胚を調製する工程）。
次に、上記ウシ胚を通常の胚移植方法に従って移植する（移植工程）。
この胚移植方法によれば、栄養膜細胞からのIFNTの転写発現量を増加させた状態で胚移植が行われるので、従来の方法に比べると、着床率を向上させられる。
【００２０】
＜試験例５＞ウシ胚の胚移植（２）
胚移植用のウシ胚として、上記＜試験例３＞で凍結保存したものを用いることができる。すなわち、IFNTの転写発現量を増加させた状態で凍結保存したものを通常の胚移植に使用するウシ胚と同じ工程を用いて、胚移植させる。
上記胚移植方法によれば、ウシ胚からのIFNTの転写発現量が増加しているので、従来の胚移植に比べれば、着床率の高い胚移植となる。
【００２１】
＜試験例６＞ウシ胚の胚移植（３）
次に、補助細胞と反すう動物胚との共移植による胚移植について説明する。
（１）補助細胞の調製
IFNTを分泌するが、ウシ胎児とはならない性質を持つ補助細胞を次のようにして調製できる（調製工程）。
従来の方法によって採取されたウシ胚から動物胎児となる部分を分離した後に、α-KG（4mM〜10mM）を添加（感作）した状態で数日間培養して、栄養膜細胞からのIFNTの転写発現量を向上させた補助細胞とする（調製工程）。
（２）補助細胞とウシ胚の共移植
次に、上記で調製した補助細胞と胚移植用のウシ胚を共移植する（共移植工程）。
上記胚移植方法によれば、補助細胞からのIFNTの転写発現量が増加しているので、従来の胚移植に比べれば、着床率の高い胚移植となる。
【００２２】
＜試験例７＞ウシ胚の胚移植（４）
次に、単為発生卵を補助細胞として用いる胚移植について説明する。
（１）補助細胞の調製
従来の方法によって採取した単為発生卵にα-KG（4mM〜10mM）を添加（感作）した状態で数日間培養して、栄養膜細胞からのIFNTの転写発現量を向上させた補助細胞とする（調製工程）。
（２）補助細胞とウシ胚の共移植
次に、上記で調製した補助細胞と胚移植用のウシ胚を共移植する（共移植工程）。
上記胚移植方法によれば、補助細胞からのIFNTの転写発現量が増加しているので、従来の胚移植に比べれば、着床率の高い胚移植となる。
このように本実施形態によれば、従来よりも高い着床率でウシ胚を移植させられる方法を提供できた。
【図１】
0006951718.tif 000003
【図２】
0006951718.tif 000004
【図３】
0006951718.tif 000005
【図４】
0006951718.tif 000006
【図５】
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