【手続補正書】
【提出日】平成30年4月13日(2018.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学構造から成る合成レバウディオサイド。
2017519812.tif 000001
【請求項２】
レバウディオサイドD３の合成方法であって、下記工程、
レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジン二リン酸(UDP)-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
【請求項７】
SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
【請求項８】
前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、請求項６に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
【請求項９】
レバウディオサイドDの合成方法であって、下記工程：
レバウディオサイドAと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ EUGT11である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
レバウディオサイドEの合成方法であって、下記工程、
ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、
を含み、グルコースが、前記ステビオシドと共有結合してレバウディオサイドEを生成することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
甘くする量のレバウディオサイドD３を含む、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品。
【請求項１４】
約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、請求項１３に記載の経口消費できる製品。
【請求項１５】
甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品。
【請求項１６】
前記飲料製品が、炭酸飲料製品及び非炭酸飲料製品から成る群より選択される、請求項１５に記載の飲料製品。
【請求項１７】
前記飲料製品が、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、冷凍飲料；すぐに飲める飲料；冷凍したすぐに飲める飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、風味付けした水、改良水、果実ジュース、果実ジュースで風味付けしたドリンク、スポーツドリンク、及びエナジードリンクから成る群より選択される、請求項１５に記載の飲料製品。
【請求項１８】
製品の甘味を増強する方法であって、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される製品に添加する工程を含み、この添加されたレバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３を欠いている対応製品に比べて、前記製品の甘味を増強する、前記方法。
【請求項１９】
追加の甘味料を添加する工程を更に含む請求項１８に記載の方法であって、前記製品が、約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記方法。
【請求項２０】
甘くした製品の調製方法であって、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される製品を準備する工程、及び約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を前記製品に添加する工程を含む前記方法。
【請求項２１】
少なくとも1種の追加の甘味料を添加する工程を更に含み、前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Lアラニン、グリシン、ロハングオ、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも1種の添加物を前記製品に添加する工程を更に含み、前記少なくとも1種の添加物が、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記製品中の前記レバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３多形、非晶質レバウディオサイドD３及びレバウディオサイドD３立体異性体から成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
表1.  ステビオールグリコシド
2017519812.tif 000002
2017519812.tif 000003
2017519812.tif 000004
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ステビオールグリコシド−合成レバウディオサイドD３。一態様では、本開示は、下記化学構造から成る合成レバウディオサイド(レバウディオサイドD３)に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を生成する方法。別の態様では、本開示は、レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ(UDP-グリコシルトランスフェラーゼ)とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
ステビオシドからレバウディオサイドE及びレバウディオサイドD３を生成する方法。別の態様では、本開示は、ステビオシドからレバウディオサイドE及びレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。この方法は、ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ(UDP-グリコシルトランスフェラーゼ)とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースがレバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドE及びレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(「EUS」)。別の態様では、本開示はUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(本明細書では「EUS」と称する)に関する。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含む。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、1,2-βグリコシド結合及び1,6-βグリコシド結合酵素活性並びにスクロースシンターゼ活性を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品に関する。
別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品に関する。レバウディオサイドD３は、飲料製品中に約5ppm〜約100ppmの濃度で存在する。一部の実施形態では、例えば100ppm未満の低濃度のレバウディオサイドD３は、10,000〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。
別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む消費製品に関する。レバウディオサイドD３は、消費製品中に約5ppm〜約100ppmの濃度で存在する。一部の実施形態では、例えば100ppm未満の低濃度のレバウディオサイドD３は、10,000〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。
別の態様では、本開示は、下記化学構造から成る甘味料に関する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３が唯一の甘味料であり、かつ製品は約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、経口消費できる製品は更に追加の甘味料を含み、製品は約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が天然の高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、追加の甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシド(siamenoside)I、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン(hernandulcin)、フィロズルチン(phyllodulcin)、トリロブタイン(trilobtain)、及びその組み合わせから成る群より選択される1種以上の甘味料を含む。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、飲料製品及び消費製品は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される1種以上の添加物を更に含む。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３は、それを製品に添加する前に約50質量%〜約100質量%の純度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のレバウディオサイドD３はレバウディオサイドD３多形又は非晶質レバウディオサイドD３である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のレバウディオサイドD３はレバウディオサイドD３立体異性体である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本開示の他の態様は、精製レバウディオサイドD３を製品又は飲料製品及び消費製品を製造するための成分に含めることによって、レバウディオサイドD３が製品中に約5ppm〜約100ppmの濃度で存在する飲料製品及び消費製品を調製する方法に関する。本開示の他の態様は、約5ppm〜約100ppmの精製レバウディオサイドD３を飲料製品及び消費製品に添加し、この添加されたレバウディオサイドD３が、精製レバウディオサイドD３を欠いている対応飲料製品及び消費製品に比べて飲料製品及び消費製品の甘味を増強することによって、飲料製品及び消費製品の甘味を増強する方法に関する。
先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３が唯一の甘味料であり、製品が約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、本方法は、追加の甘味料を添加する工程を更に含み、製品は約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。
本開示の他の態様は、a)1種以上の甘味料を含有する飲料製品又は消費製品を準備する工程、及びb)約5ppm〜約100ppmの精製レバウディオサイドD３を飲料製品又は消費製品に添加する工程によって、甘くした飲料製品又は甘くした消費製品を調製する方法に関する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、本方法は、飲料製品又は消費製品に1種以上の添加物を添加する工程を更に含む。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、経口消費できる製品は、1種以上の添加物を更に含有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、1種以上の添加物は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから選択される。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が天然の高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、Lo Han Guo、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから選択される。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３は、それを製品に添加する前に約50質量%〜約100質量%の純度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のレバウディオサイドD３はレバウディオサイドD３多形又は非晶質レバウディオサイドD３である。
本開示の下記詳細な説明を考慮すると、本開示がよりよく理解され、上述したもの以外の特徴、態様及び利点が明らかになるであろう。該詳細な説明は以下の図面を参照する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
【図１Ａ】ステビオシドからのステビオールグリコシド生合成経路を示す模式図である。
【図１Ｂ】ステビオシドからのステビオールグリコシド生合成経路を示す模式図である。
【図１Ｃ】ステビオシドからのステビオールグリコシド生合成経路を示す模式図である。
【図２Ａ】実施例1で論じるように、精製組換えUDP-グリコシルトランスフェラーゼ酵素(EUGT11)のSDS-PAGE解析を示す。
【図２Ｂ】実施例1で論じるように、精製組換えUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)のSDS-PAGE解析を示す。
【図３】実施例2で論じるように、ステビオシド(「Ste」)、レバウディオサイドA(「Reb A」)及びレバウディオサイドD(「Reb D」)標準物質(図3A)；14時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3B)；14時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3C)；14時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3D)；24時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3E)；24時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3F)；及び24時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3G)のHPLC保持時間を示すグラフである。
【図４】実施例3で論じるように、ステビオシド(「Ste」)、レバウディオサイドA(「Reb A」)及びレバウディオサイドD(「Reb D」)標準物質(図4A)；14時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(「Reb D３」)(図4B)；14時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドE(「Reb E」)(図4C)；14時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図4D)；24時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(「Reb D３」)(図4E)；24時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドE(「Reb E」)(図4F)；及び24時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図4G)のHPLC保持時間を示すグラフである。
【図５】実施例4で論じるように、レバウディオサイドD(「Reb-D」)標準物質(図5A)；レバウディオサイドE(「Reb-E」)標準物質(図5B)；12時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(「Reb D３」)(図5C)；12時間でのUGT-SUS(EUGT11-SUSl)カップリング系(図5D)及び12時間でのEUS(図5E)；12時間でUGT76G1-AtSUSlカップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(「Reb D」)(図5F)；24時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図5G)；24時間でUGT-SUS(EUGT11-SUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図5H)；24時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図5I)；及び24時間でUGT76G1-AtSUSlカップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図5J)のHPLC保持時間を示すグラフである。
【図６Ａ】実施例5で論じるように、レバウディオサイドD３の化学構造を示す。
【図６Ｂ】実施例5で論じるように、レバウディオサイドEの化学構造を示す。
【図７】実施例5で論じるように、主要なTOCSYとHMBCの相関を示すレバウディオサイドD３の化学構造である。
【図８Ａ】実施例5で論じるように、レバウディオサイドD３の化学構造を示す。
【図８Ｂ】実施例5で論じるように、レバウディオサイドEの化学構造を示す。
【図８Ｃ】実施例5で論じるように、レバウディオサイドDの化学構造を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「立体異性体」は、個々の分子の空間におけるそれらの原子の配向のみが異なる全ての異性体の総称である。「立体異性体」には、エナンチオマー並びに互いに鏡像でない、1つより多くのキラル中心を有する化合物の異性体(ジアステレオマー)が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「非晶質レバウディオサイドD３」は、非結晶性固形のレバウディオサイドD３を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「甘味強度」は、個体、例えば、ヒトによって観察又は経験される甘い感覚の相対的強度、或いはテイスター、例えばBrixスケールで検出される甘味の程度又は量を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「甘味を増強する」は、本開示の飲料製品又は消費製品の1つ以上の甘味特性の知覚を、レバウディオサイドD３を含有しない対応する経口消費できる製品に比べて、その性質又は品質を変えずに増加、増大、強化、強調、拡大、及び／又は増強する際のレバウディオサイドD３の効果を指す。
本明細書で使用する場合、用語「オフテースト(off-taste)」は、本開示の飲料製品又は消費製品で特徴的又は普通に見られない味の量又は程度を意味する。例えば、オフテーストは、甘くした消費製品の消費者にとって望ましくない味、例えば、苦味、甘草様味、金属味、嫌悪味、渋味、甘味発生遅延、なかなか消えない甘い後味等である。
本明細書で使用する場合、用語「w/v-%」は、糖等の化合物の、該化合物を含有する本開示の液体の経口消費できる製品100ml毎の質量(グラムで)を表す。本明細書で使用する場合、用語「w/w-%」は、糖等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1グラム毎の質量(グラムで)を表す。
本明細書で使用する場合、用語「ppm」は、質量百万分率、例えば、レバウディオサイドD３等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1キログラム当たりの質量(ミリグラムで)(すなわち、mg/kg)又はレバウディオサイドD３等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1リットル当たりの質量(ミリグラムで)(すなわち、mg/L)を表し；或いは体積百万分率、例えば、レバウディオサイドD３等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1リットル当たりの体積(ミリリットルで)(すなわち、ml/L)を表す。
本開示により、ノンカロリー甘味料及びノンカロリー甘味料の合成方法を開示する。また、本開示によりノンカロリー甘味料を調製するための酵素及び該酵素の使用方法を開示する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
合成ノンカロリー甘味料：合成レバウディオサイドD３
一態様では、本開示は合成ノンカロリー甘味料に関する。合成ノンカロリー甘味料は、合成レバウディオサイド型ステビオールグリコシドであり、名称「レバウディオサイドD３」が与えられている。下記化学構造(I)に示すように、レバウディオサイドD３(「Reb D３」)は、ステビオールグリコシド、レバウディオサイドDの5つのグリコシド残基と同様の5つのグリコシド残基を有するステビオールグリコシドである。  
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
レバウディオサイドD３は、分子式C50H80O28及びIUPAC名、13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシル-6-D-グルコピラノシル)オキシ]ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステルを有する。
レバウディオサイドD３、レバウディオサイドE及びレバウディオサイドDの化学構造に示すように、レバウディオサイドD３及びレバウディオサイドDは、該構造中のアグリコンステビオールに結合した5つのβ-D-グリコシル単位を有するが、レバウディオサイドEは4つのD-グリコシド残基を含有する(例えば、表1及び図8参照)。合成レバウディオサイドD３は、ステビオールのC19位に2つのグリコシド残基及びC13位に3つのグリコシド残基を含む。
比較すると、レバウディオサイドDも5つのグリコシド残基を含み；アグリコンステビオールのC19位に2つのグリコシド残基及びC13位に3つのグリコシド残基を含む。レバウディオサイドD３の第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,6-β-グリコシド結合によってReb-EのC13-O-グルコースのC-6'に位置するが、レバウディオサイドDの第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,3-β-グリコシド結合によってReb-EのC13-O-グルコースのC-3'に位置している(図8参照)。しかしながら、レバウディオサイドEは、C19位に2つのグリコシド残基及びC13位に2つのグリコシド残基を含む。理論によって拘束されるものではないが、5つのグリコシド残基を有するステビオールグリコシド(レバウディオサイドD)及び4つのグリコシド残基を有するステビオールグリコシド(レバウディオサイドA及びレバウディオサイドE)は、グリコシド残基が少ないステビオールグリコシド(ステビオシド及びルブソサイド)より顕著に良い味質を有すると考えられる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
レバウディオサイドD３の製造方法
別の態様では、本開示は、レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。一実施形態では、本方法は、レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジン-ジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)から選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
特に適切なウリジンジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、EUGT11(WO 2013022989に記載どおり)であり得る。EUGT11は、1,2-19-O-グルコース及び1,2-13-O-グルコースグリコシル化活性を有するウリジン5'-二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ(「UGT」)である。EUGT11は、ステビオシドからレバウディオサイドEの生産及びレバウディオサイドAからレバウディオサイドDの生産を触媒することが知られている。しかしながら、驚くべきことにかつ予想外に、ウリジンジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼをインビトロで用いてレバウディオサイドEをレバウディオサイドD３に変換できることを発見した。
適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼは、例えばイネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11であり得る。特に適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
別の実施形態では、UDP-グリコシルトランスフェラーゼは、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(本明細書では「EUS」とも称する)であってよい。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素については更に詳細に後述する。
反応において、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、EUGT11及びEUS)は1,6-13-O-グルコースグリコシル化活性を有し、一実施形態では、グルコース分子をレバウディオサイドEに移してレバウディオサイドD３を形成することができる。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、EUGT11及びEUS)も1,2-19-O-グルコース及び1,2-13-O-グルコースグリコシル化活性を有する。別の実施形態では、UDP-グリコシルトランスフェラーゼがグルコース分子をステビオシドに移してレバウディオサイドEを形成することができ、グルコース分子をレバウディオサイドAに移してレバウディオサイドDを形成することもできる。更に、EUS融合酵素はスクロースシンターゼ活性を有するので、UDP及びスクロースからUDP-グルコースを再生することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
特に適切な実施形態は、UGT-SUSカップリング系を用いてレバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドEと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼと、スクロースシンターゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
この実施形態の方法で用いるのに適したUDPグリコシルトランスフェラーゼは上記と同一である。この実施形態の方法で用いるのに適したスクロースシンターゼは上記と同一である。
別の特に適切な実施形態は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を用いてレバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。
この方法は、レバウディオサイドEと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
特に適切なUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素については更に詳細に後述する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
別の態様では、本開示は、ステビオシドからレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。ステビオシドからレバウディオサイドD３を合成する方法は、ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが該レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
最初に、この実施形態の方法で用いるUDPグリコシルトランスフェラーゼは上記と同一である。上述したように、この方法は、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼを含有する反応混合物にスクロースシンターゼを添加してUGT-SUSカップリング系を生じさせる工程を更に含むことができる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
特に適切な実施形態は、UGT-SUSカップリング系を用いてステビオシドからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。この方法は、ステビオシドと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼと、スクロースシンターゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが該レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
この実施形態の方法で用いるのに適したUDPグリコシルトランスフェラーゼは、上記と同じである。この実施形態の方法で用いるのに適したスクロースシンターゼは、上記と同じである。
別の特に適切な実施形態は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を用いてステビオシドからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。この方法は、ステビオシドと、スクロースから成る群より選択される基質と、ウリジン二リン酸(UDP)と、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが該レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するの十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
特に適切なUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素について以下に更に詳細に述べる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素
別の態様では、本開示は、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(本明細書では「EUS」とも称する)に関する。特に、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含む。EUS融合酵素は、1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性を有する。驚くべきことにかつ予想外に、EUS融合酵素は、グルコース分子をレバウディオサイドEに移してレバウディオサイドD３を生成することができる1,6-13-O-グルコースグリコシル化活性をも有する。更に、EUS融合酵素はスクロースシンターゼ活性を有するので、UDP及びスクロースからUDP-グルコースを再生することができる。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえ同一のポリペプチド配列を有し得る。好適には、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:5と少なくとも80%の同一性を有する。更に好適には、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%さえのアミノ酸配列同一性を有する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
経口消費できる製品
一態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を有する、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品に関する。
経口消費できる製品は、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有し得る。
経口消費できる製品は、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を有することができる。
レバウジオシドD３は、経口消費できる製品中の唯一の甘味料であってよい。
経口消費できる製品は、少なくとも1種の追加の甘味料を有してもよい。少なくとも1種の追加甘味料は、例えば、天然の高甘味度甘味料であり得る。追加の甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソシド、モグロシド IV、シアメノシドI、モグロシド V、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから選択可能である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
経口消費できる製品は、少なくとも1種の添加物を有してもよい。添加物は、例えば、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、 糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、渋味化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせであってよい。
一態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品に関する。
飲料製品は、例えば、炭酸飲料製品及び非炭酸飲料製品であり得る。飲料製品は、例えば、ソフトドリンク、ファウンテン(fountain)飲料、冷凍飲料；すぐに飲める飲料；冷凍したすぐに飲める飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、風味付けした水、改良水、果実ジュース、果実ジュースで風味付けしたドリンク、スポーツドリンク、及びエナジードリンクであってもよい。
一部の実施形態では、本開示の飲料製品は、1種以上の飲料成分、例えば、酸味料、果実ジュース及び／又は野菜ジュース、果肉等、香味料、着色料、保存料、ビタミン、ミネラル、電解質、エリスリトール、タガトース、グリセリン、及び二酸化炭素を含むことができる。該飲料製品は、例えば飲料濃縮物及びすぐに飲める炭酸飲料等のいずれの適切な形態も提供可能である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
特定実施形態では、本開示の飲料製品は、多数の異なる特異的処方又は構成のいずれを有してもよい。本開示の飲料製品の処方は、該製品の意図した市場区分、その所望の栄養上の特性、風味プロファイル等の因子に応じて、ある程度まで変動し得る。例えば、ある特定の実施形態では、特定飲料製品の処方にさらなる成分を添加することは一般的にオプションである。例えば、追加の(すなわち、更に及び／又は他の)甘味料、香味料、電解質、ビタミン、果実ジュース又は他の果実製品、味覚剤(tastent)、マスキング剤等を添加することができ、風味向上剤、及び／又は炭酸化作用は、典型的にいずれの該処方に加えても、味覚、口当たり、栄養特性等を変えることができる。実施形態においては、飲料製品は、水と、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３と、酸味料と、香味料とを含有するコーラ飲料であり得る。典型的な香味料は、例えば、コーラ香味料、柑橘類香味料、及びスパイス香味料であり得る。一部の実施形態では、二酸化炭素の形態の炭酸化作用を泡立ちのために加えることができる。他の実施形態では、他の成分、生産技術、所望の貯蔵寿命等に応じて保存料を添加することができる。ある特定の実施形態では、カフェインを添加することができる。一部の実施形態では、飲料製品は、特徴的に炭酸水、甘味料、コーラナッツエキス及び／又は他の香味料、カラメル着色料、1種以上の酸、及び任意で他の成分を含有するコーラ風味の炭酸飲料であり得る。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
飲料製品中に存在するレバウディオサイドD３の適切な量は、例えば、約5ppm〜約100ppmであり得る。一部の実施形態では、低濃度、例えば、100ppm未満のレバウディオサイドD３は、10,000ppm〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。最終濃度は、約5ppm〜約100ppm、約5ppm〜約95ppm、約5ppm〜約90ppm、約5ppm〜約85ppm、約5ppm〜約80ppm、約5ppm〜約75ppm、約5ppm〜約70ppm、約5ppm〜約65ppm、約5ppm〜約60ppm、約5ppm〜約55ppm、約5ppm〜約50ppm、約5ppm〜約45ppm、約5ppm〜約40ppm、約5ppm〜約35ppm、約5ppm〜約30ppm、約5ppm〜約25ppm、約5ppm〜約20ppm、約5ppm〜約15ppm、又は約5ppm〜約10ppmの範囲である。或いは、レバウディオサイドD３は、本開示の飲料製品中に約5ppm〜約100ppm、約10ppm〜約100ppm、約15ppm〜約100ppm、約20ppm〜約100ppm、約25ppm〜約100ppm、約30ppm〜約100ppm、約35ppm〜約100ppm、約40ppm〜約100ppm、約45ppm〜約100ppm、約50ppm〜約100ppm、約55ppm〜約100ppm、約60ppm〜約100ppm、約65ppm〜約100ppm、約70ppm〜約100ppm、約75ppm〜約100ppm、約80ppm〜約100ppm、約85ppm〜約100ppm、約90ppm〜約100ppm、又は約95ppm〜約100ppmの範囲の最終濃度で存在してよい。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む消費製品に関する。消費製品は、例えば、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品及び卓上香味料であり得る。
本明細書で使用する場合、「健康補助食品(dietary supplement)」は、食事を補助し、食事に欠けているか又は食事で十分に消費できない可能性があるビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸等の栄養素を与えることを意図した化合物を指す。技術上周知のいずれの適切な健康補助食品も使用可能である。適切な健康補助食品の例は、例えば、栄養素、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、ハーブ、植物、アミノ酸、及び代謝物であり得る。
本明細書で使用する場合、「栄養補助食品(nutraceutical)」は、疾患若しくは障害(例えば、疲労、不眠症、老化作用、記憶喪失、気分障害、心血管疾患及び高レベルの血中コレステロール、糖尿病、骨粗しょう症、炎症、自己免疫障害等)の予防及び／又は治療を含めた医学上又は健康上の利益を与え得るいずれの食品又は食品の一部をも含む化合物を指す。技術上周知のいずれの適切な栄養補助食品をも使用可能である。一部の実施形態では、栄養補助食品を食品及び飲料のサプリメントとして並びにカプセル剤若しくは錠剤等の固形剤、又は溶液若しくは懸濁液等の液剤であってよい経腸又は非経口用途のための医薬製剤として使用することができる。
一部の実施形態では、健康補助食品及び栄養補助食品は、保護親水コロイド(例えばガム、タンパク質、加工デンプン)、結合剤、膜形成剤、被包剤／材、壁／殻材、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、表面活性剤、可溶化剤(油、脂肪、蝋、レシチン等)、吸着剤、担体、充填剤、共化合物(co-compound)、分散剤、湿潤剤、加工助剤(溶媒)、流動剤、味マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤(jellyfying agent)、ゲル形成剤、抗酸化剤及び抗菌剤を更に含有することができる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「ゲル化成分」は、液状媒体内にコロイド系を形成できるいずれの材料をも指す。適切なゲル化成分は、例えば、ゼラチン、アルギナート、カラギーナン、ガム、ペクチン、コンニャク、寒天、食用酸、レンネット、デンプン、デンプン誘導体、及びその組み合わせであり得る。食用ゲルミックス又は食用ゲル組成物に用いるゲル化成分の量は、例えば、使用する特定のゲル化成分、使用する特定の液体ベース、及びゲルの所望特性等のいくつかの因子に応じてかなり異なり得ることは当業者に周知である。
本開示のゲルミックス及びゲル組成物は、技術上周知のいずれの適切な方法によっても調製可能である。一部の実施形態では、本開示の食用ゲルミックス及び食用ゲル組成物は、レバウディオサイドD３とゲル化剤に加えて他の成分を用いて調製可能である。他の適切な成分の例は、例えば、食用酸、食用酸の塩、緩衝系、嵩高剤、捕捉剤、架橋剤、1種以上の香料、1種以上の着色料、及びその組み合わせであり得る。
技術上周知のいずれの適切な医薬組成物を使用してもよい。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３、及び1種以上の医薬的に許容できる賦形剤を含有することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物を用いて、生物学的効果を発揮する1種以上の活性薬を含有する医薬を処方することができる。従って、一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、生物学的効果を発揮する1種以上の活性薬を含有することができる。適切な活性薬は、技術上周知である(例えば、The Physician's Desk Reference)。該組成物は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USAに記載されているように、技術上周知の手順に従って調製可能である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
レバウディオサイドD３は、技術上周知のいずれの適切な歯科及び口腔衛生組成物と共に使用することもできる。適切な歯科及び口腔衛生組成物の例は、例えば、練り歯磨き、歯磨き粉、デンタルフロス、うがい薬、洗口液、歯磨き剤(dentrifice)、マウススプレー、マウスリフレッシャー、歯垢リンス、歯痛緩和薬等であり得る。
消費製品中に存在するレバウディオサイドD３の適量は、例えば、約5百万分率(ppm)〜約100百万分率(ppm)であり得る。一部の実施形態では、例えば、100ppm未満の低濃度のレバウディオサイドD３は、10,000ppm〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。最終濃度は、約5ppm〜約100ppm、約5ppm〜約95ppm、約5ppm〜約90ppm、約5ppm〜約85ppm、約5ppm〜約80ppm、約5ppm〜約75ppm、約5ppm〜約70ppm、約5ppm〜約65ppm、約5ppm〜約60ppm、約5ppm〜約55ppm、約5ppm〜約50ppm、約5ppm〜約45ppm、約5ppm〜約40ppm、約5ppm〜約35ppm、約5ppm〜約30ppm、約5ppm〜約25ppm、約5ppm〜約20ppm、約5ppm〜約15ppm、又は約5ppm〜約10ppmの範囲である。或いは、レバウディオサイドD３は、本開示の消費製品中に約5ppm〜約100ppm、約10ppm〜約100ppm、約15ppm〜約100ppm、約20ppm〜約100ppm、約25ppm〜約100ppm、約30ppm〜約100ppm、約35ppm〜約100ppm、約40ppm〜約100ppm、約45ppm〜約100ppm、約50ppm〜約100ppm、約55ppm〜約100ppm、約60ppm〜約100ppm、約65ppm〜約100ppm、約70ppm〜約100ppm、約75ppm〜約100ppm、約80ppm〜約100ppm、約85ppm〜約100ppm、約90ppm〜約100ppm、又は約95ppm〜約100ppmの範囲の最終濃度で存在し得る。
ある特定の実施形態では、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３が食品組成物中に存在する。本明細書で使用する場合、「食品組成物」は、栄養価を有し得るが、これが必要なわではなく、かつヒト及び動物による消費を意図し得るいずれの固体又は液体の摂取可能物質をも表す。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、レバウディオサイドD３が唯一の甘味料であり、製品は約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、消費製品及び飲料製品は、更に追加の甘味料を含むことができ、製品は約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、製品中のあらゆる甘くする成分が高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、製品中のあらゆる甘くする成分が天然の高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、追加の甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、Lo Han Guo、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから選択される1種以上の甘味料を含有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、消費製品及び飲料製品は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから選択される1種以上の添加物を更に含むことができる。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、レバウディオサイドD３は、それを製品に添加する前に約50質量%〜約100質量%の純度を有する。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
甘味料は、充填剤、嵩高剤及び固化防止剤の少なくとも1種を更に含むことができる。
適切な充填剤、嵩高剤及び固化防止剤は技術上周知である。
ある特定の実施形態では、消費製品及び飲料製品を甘くし及び／又はその甘さを増強するのに十分な最終濃度でレバウディオサイドD３甘味料を含めることができ及び／又は添加することができる。レバウディオサイドD３の「最終濃度」は、最終消費製品及び飲料製品中に存在する(すなわち、全ての成分及び／又は化合物を添加して消費製品及び飲料製品が生成された後の)レバウディオサイドD３の濃度を指す。従って、ある特定の実施形態では、レバウディオサイドD３は、消費製品及び飲料製品を調製するために用られる化合物又は成分に含められ及び／又は添加される。レバウディオサイドD３は、単一の化合物若しくは成分、又は複数の化合物及び成分に存在し得る。他の実施形態では、レバウディオサイドD３は、消費製品及び飲料製品に含められ及び／又は添加される。ある特定の実施形態では、レバウディオサイドD３は、約5ppm〜約100ppm、約5ppm〜約95ppm、約5ppm〜約90ppm、約5ppm〜約85ppm、約5ppm〜約80ppm、約5ppm〜約75ppm、約5ppm〜約70ppm、約5ppm〜約65ppm、約5ppm〜約60ppm、約5ppm〜約55ppm、約5ppm〜約50ppm、約5ppm〜約45ppm、約5ppm〜約40ppm、約5ppm〜約35ppm、約5ppm〜約30ppm、約5ppm〜約25ppm、約5ppm〜約20ppm、約5ppm〜約15ppm、又は約5ppm〜約10ppmの範囲の最終濃度で含められ及び／又は添加される。或いは、レバウディオサイドD３は、約5ppm〜約100ppm、約10ppm〜約100ppm、約15ppm〜約100ppm、約20ppm〜約100ppm、約25ppm〜約100ppm、約30ppm〜約100ppm、約35ppm〜約100ppm、約40ppm〜約100ppm、約45ppm〜約100ppm、約50ppm〜約100ppm、約55ppm〜約100ppm、約60ppm〜約100ppm、約65ppm〜約100ppm、約70ppm〜約100ppm、約75ppm〜約100ppm、約80ppm〜約100ppm、約85ppm〜約100ppm、約90ppm〜約100ppm、又は約95ppm〜約100ppmの範囲の最終濃度で含められ及び／又は添加される。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
例えば、レバウディオサイドD３は、約5ppm、約10ppm、約15ppm、約20ppm、約25ppm、約30ppm、約35ppm、約40ppm、約45ppm、約50ppm、約55ppm、約60ppm、約65ppm、約70ppm、約75ppm、約80ppm、約85ppm、約90ppm、約95ppm、又は約100ppm（これらの値間のいずれの範囲をも含めて）の最終濃度で含められ及び／又は添加され得る。
ある特定の実施形態では、レバウディオサイドD３は、消費製品及び飲料製品に含められ及び／又は添加される唯一の甘味料である。該実施形態では、消費製品及び飲料製品は、約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、約1%〜約3%(w/v-%)のスクロース溶液、又は約1%〜約2%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。或いは、消費製品及び飲料製品は、約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、約2%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、約3%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、又は約4%と同等の甘味強度を有する。例えば、消費製品及び飲料製品は、約1%、約2%、約3%、又は約4%(w/v-%)（これらの値間のいずれの範囲をも含めて）のスクロース溶液と同等の甘味強度を有し得る。
本開示の消費製品及び飲料製品は、レバウディオサイドD３と本開示の1種以上の甘味料との混合物を、所望の甘味強度、栄養特性、味覚プロファイル、口当たり、又は他の感覚受容因子を達成するのに十分な比率で含むことができる。
下記非限定例を考慮すると、本開示が更に完全に理解されるであろう。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例3
この実施例では、実施例2で述べたように14時間及び24時間のインキュベーション時間でステビオールグリコシド基質としてステビオシドを用いて、EUGT11及びEUSを1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性についてアッセイした。
上記実施例2に記載のEUGT11によるレバウディオサイドAのレバウディオサイドDへの変換に加えて、EUGT11はステビオシドをもレバウディオサイドEに変換した(図4中、標識「Reb E」)。驚くべきことに、約7.28分のHPLC保持時間を有する予想外の化合物、レバウディオサイドD３(図4中、標識「Reb D３」)が全ての反応でEUGT11とEUSの両者により生成された。AtSUSlをEUGT11反応混合物に添加してUGT-SUSカップリング系を生じさせたとき(図4D及び4G)、及びEUSを用いたとき(図4B及び4E)、更にレバウディオサイドD３が生成された。
レバウディオサイドD３生成の増加と共に、生成されたレバウディオサイドE(図4C及び4F中の標識「Reb E」)は、レバウディオサイドD３の生成中に消費された。これらの結果は、EUGT11が、レバウディオサイドEからレバウディオサイド(レバウディオサイドD３)を生成するための反応を触媒できることを示した。図4Aは、比較のためステビオシド(標識「Ste」)、レバウディオサイドA(標識「Reb A」)及びレバウディオサイドD(標識「Reb D」)のピークを示す。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
実施例4
この実施例では、レバウディオサイドEのレバウディオサイドD３への変換をインビトロで確認するため、実施例2で述べたようにステビオールグリコシド基質としてレバウディオサイドEを用いてEUGT11及びEUSをアッセイした。
比較のため、別のUGT(UGT76G1)の酵素活性をもアッセイした。ステビア由来のUGT76G1は、ステビオシドのC13-O-グルコースのC-3'に糖残基を移してレバウディオサイドAを形成する酵素として同定されている。図5F及び5Jに示すように、UGT-SUSカップリング系においてUGT76G1を使用すると、糖残基がレバウディオサイドEのC13-O-グルコースのC-3'に転移してレバウディオサイドDを形成する。図5A及び5Bは、比較のため精製レバウディオサイドD(「Reb D」)及びレバウディオサイドE(「Reb-E」)を示す。
上記実施例3で論じ、図5C及び5Gに示すように、EUGT11だけが1つのグルコース分子をレバウディオサイドEに移して、レバウディオサイドD及びEと異なる(それぞれ、図5A及び図5Bのピークを比較されたい)レバウディオサイド(本明細書では「レバウディオサイドD３」と称し、図5C及び5G中の標識「Reb D３」)を形成することができた。UGT-SUSカップリング系におけるEUGT11(図5D及び5H)並びにEUS(図5E及び5I)は、レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３への変換を増進した。
これらの結果は、EUGT11が、関連ステビオールグリコシドを生成するための1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性を有するUGTであることを実証した。EUGT11は、基質としてのステビオシドからReb-Eを生成し、基質としてのReb-AからReb-Dを生成するための反応を触媒することができる。驚くべきことに、化合物(Reb-D３)は、基質としてのステビオシドとのインビトロ反応で予想外に合成された。さらなる実験は、Reb-D３がReb-Eから直接合成されることを確証した。Reb-D３の構造によれば、インビトロ反応において、EUGT11がD-グルコースをReb-EのC13-O-グルコースのC-6'に移してl,6-β-グリコシド結合をもたらした。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
実施例5
この実施例では、拡大インビトロ反応からレバウディオサイド(レバウディオサイドD３)を精製し、液体クロマトグラフィー／質量分析(LC/MS)及び核磁気共鳴(NMR)分析用に調製した。
レバウディオサイド(レバウディオサイドD３)を拡大インビトロ反応から精製した。インビトロ反応をHPLC分析によりモニターした。所望の時点で、Reb-D３化合物をカラムで精製し、真空乾燥で濃縮した。精製Reb-D３は、95%純度の白色粉末であった。収集したReb-D３化合物を高分解能質量スペクトル(HRMS)解析に使用した。LTQ Orbitrap Discovery HRMS機器で、その分解能を30kに設定してHRMSデータを生成し、正イオンエレクトロスプレーモードで、m/z 150から1500までデータをスキャンした。ニードル電圧を4kVに設定し；他のソース条件は、シースガス＝25、補助ガス(aux gas)＝0、スイープガス＝5(全てのガス流量は任意単位)、キャピラリー電圧＝30V、キャピラリー温度＝300℃、及びチューブレンズ電圧＝75であった。サンプルを2:2:1のアセトニトリル:メタノール:水(注入溶出剤と同じ)で希釈し、50マイクロリットルのサンプルを注入した。Bruker Avance DRX 500 MHz機器又はVarian INOVA 600 MHz機器を用いて標準パルスシーケンスを利用して核磁気共鳴(NMR)スペクトルを取得した。1D(1H及び13C)及び2D(TOCSY、HMQC、及びHMBC)NMRスペクトル分析をピリジン-d5(C5D5Nとしても知られる)中で行なった。
Reb-D３の分子式を、m/zがそれぞれ1146.5169及び1151.4721で[M+NH4]+及び[M+Na]+に対応する付加イオンを示すその正の高分解能質量スペクトル(HRMS)に基づいてC50H80O28と推定した。この組成は13C NMRスペクトルデータにより支持された。Reb-D３の1H NMRスペクトルデータは、δ 1.10及び1.44に2つのメチルの一重線、δ 5.09及び5.72に環外二重結合の一重線として2つのオレフィン性プロトン、δ 0.74〜2.80の間に9つのsp3メチレン及び2つのsp3メチンプロトンの存在を示した。これは、ステビア属から単離されたent-カウランジテルペノイドの特徴である。
ent-カウランジテルペノイドの基本骨格はTOCSY研究により支持され、重要な相関性を示した：H-l/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12。Reb-D３の1H NMRスペクトルもδ 5.04、5.10、5.21、5.48及び6.30で共鳴するアノマープロトンを示し；その構造内の5つの糖単位を示唆している。Reb-D３の5%H2S04による酸加水分解はD-グルコースを与えた。これはTLCによって標品との直接比較により同定された。δ 5.04(d, J=7.5Hz)、5.10(d, J=7.4Hz)、5.21(d, J=7.9Hz)、5.48(d, J=7.9Hz)、及び6.30(d, J=7.9Hz)でグルコース成分の5つのアノマープロトンについて観察された大きいカップリング定数は、他のステビオールグリコシドについて報告されたようにそれらのβ-配向性を示唆している。Reb-D３についての1H及び13C NMRの値をTOCSY、HMQC及びHMBCデータに基づいて割り当て、表3に要約する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
表3.  Reb-D３及びReb-Eについての1H及び13C NMRの値
2017519812.tif 000005
2017519812.tif 000006
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
広範な1D(1H及び13C)、2D NMR(TOCSY、HMQC、及びHMBC)及び高分解能質量スペクトル(HRMS)データに基づいて、Reb-D３の構造を同定し、レバウディオサイドEの構造と比較した(図6参照)。
Reb-D３のNMRスペクトルデータ及び加水分解実験の結果に基づいて、アグリコンステビオールに結合したその構造中に5つのβ-D-グリコシル単位があると結論づけた。Reb-D３とレバウディオサイドEの1H及び13C NMRの値の厳密な比較(表2参照)により、エーテル結合の形でC13に2-O-β-D-グルコビオシル単位及びエステル結合の形でC19位に別の2-O-β-D-グルコビオシル単位を有し、さらなるβ-D-グルコシル単位の割当が残っているステビオールアグリコン成分の存在が示唆された。更に、糖部分の5つのオキシメチンカーボンの1つがδ 69.8の低磁場に現れることを示すReb-D３の13C NMRスペクトルデータにより、この位置にβ-D-グルコシル単位が更に配置されることが示唆された。Reb-D３及びReb-Eの2つの糖I及びIVについての同一のプロトン及びカーボンスペクトルデータにより、糖II又は糖IIIのどちらかの6位にβ-D-グルコシル単位が配置されることが示唆された。β-D-グルコシル成分の糖IIの6位における1H及び13Cの化学シフトが両方とも低磁場シフトしたことにより、さらなるβ-D-グルコシル単位がこの位置に付着していることが示唆された。この構造は、図7に示すように主要なTOCSYとHMBCの相関によって更に支持された。
NMR及び質量スペクトルデータ並びに加水分解研究の結果に基づいて、レバウディオサイドEの酵素的変換により生成されるReb-D３の構造を13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)オキシ]-ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステルと推定した。
13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)オキシ]-ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステル(Reb-D３)。白色粉末；1H-NMR(600MHz, C5D5N, δppm)及び13C-NMR (150MHz, C5D5N, δppm)分光学的データは表2参照；HRMS (M+NH4)+ m/z 1146.5169(C50H84O28Nに対する計算値：1146.5180)、(M+Na)+ m/z 1151.4721(C50H80O28Naに対する計算値：1151.4734)。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
MeOH(10ml)中のReb-D３(5mg)の溶液に3mlの5%H2SO4を加え、混合物を24時間還流させた。次に反応混合物を飽和炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル(EtOAc)(2×25ml)で抽出して、糖を含有する水性画分及びアグリコン部分を含有するEtOAc画分を得た。水相を濃縮し、TLC系EtOAc/n-ブタノール/水(2:7:1)及びCH2Cl2/MeOH/水(10:6:1)を用いて標準糖と比較し；この糖をD-グルコースと同定した。
広範な1D(1H及び13C)、及び2D NMR(TOCSY、HMQC、及びHMBC)、並びに高分解能質量スペクトルデータ及び加水分解研究に基づいてReb-D３の構造を13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシルβ-D-グルコピラノシル)オキシ]-ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシルβ-D-グルコピラノシル)エステルと推定した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
実施例6
この実施例では、レバウディオサイド(レバウディオサイドD３)の構造をReb-E及びReb-Dと比較した。
ステビオールグリコシドのデータベースによれば、Reb-Dだけがその構造中にアグリコンステビオールに結合した5つのβ-D-グリコシル単位、すなわちアグリコンステビオールのC19位に2つのグリコシド残基及びC13位に3つのグリコシド残基を含有する。スレビア由来のUGT76G1は、糖残基をReb-EのC13-O-グルコースのC-3'に移してレバウディオサイドDを形成する酵素と同定されている(図5F及び5J参照)。Reb-D３は、レバウディオサイドDと比較すると構造が異なるが、やはり5つのD-グリコシド残基を含有するステビオールグリコシドである(図8参照)。レバウディオサイドD３の第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,6-β-グリコシド結合によってReb-EのC-13-O-グルコースのC-6'に位置しているが、レバウディオサイドDの第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,3-β-グリコシド結合によってReb-EのC13-O-グルコースのC-3'に位置している(図8参照)。ここで述べたように、EUGT11及びEUGは両方ともインビトロで直接Reb-EをReb-D３に変換することができる。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
実施例7
この実施例では、Reb-D３について味覚検査を行なった。
コントロールとしてスクロースを用いてReb-D３の官能評価を行なった。スクロースサンプルはSigma-Aldrichから購入し、室温で容器入り飲料水(bottled water)中1.0%、3.0%、及び6.0%(w/v)の3つの異なる濃度のスクロースでコントロールサンプルを調製した。官能評価のための300、及び600ppmのステビオールグリコシドReb-D３は、1000mLの容器入り飲料水に対応質量を添加することによって調製した。混合物を室温で撹拌し、次にステビオールグリコシドサンプルを1.0%、3.0%、及び6.0%のいくつかのコントロールスクロースサンプルに対して9名の志願者団により評価した。
盲検結果は、2つの異なる濃度(300及び600ppm)のReb-D３で9名の志願者の過半数の間で一致した結果を示し；全体的な%甘味等価(sweetness equivalence)(SE)平均は、それぞれ約2.4及び5.4であった。この結果は、レバウディオサイドD３がスクロースの約80〜90倍甘いことを示している。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
実施例8
この実施例では、Reb-D３の溶解度をReb-Dと比較した。
Reb-D３及びReb-Dを水に添加して0.25mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、5mM及び10mMのReb-D３及びReb-D溶液を調製した。Reb-D３粉末は即座に水に完全に溶解したが、0.25mMのReb-Dだけが水に全体的に溶解した。更に、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、5mM及び10mMの濃度のReb-Dの溶液は、30℃で72時間加熱しても溶解しなかった。
これらの結果は、水中でReb-D３がReb-Dより高い溶解度を有することを実証している。
上記を考慮すると、本開示のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。本開示の範囲を逸脱することなく、上記方法及びシステムに種々の変更を加え得るので、上記説明に含まれ、添付図面に示される全ての事項は、例示として解釈すべきであり、限定的意味に解釈すべきでないことが意図される。
本開示又はその種々の異形、実施形態又は態様の要素を導入するときには、冠詞「a」、「an」、「the」及び「said」は、1つ以上の要素を意味するつもりである。用語「含む」、「含める」及び「有する」は、包括的であり、列挙した要素以外に更に要素があり得ることを意味するつもりである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕下記化学構造から成る合成レバウディオサイド。
2017519812.tif 000007
〔２〕レバウディオサイドD３の合成方法であって、下記工程、
レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジン二リン酸(UDP)-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔３〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔2〕に記載の方法。
〔４〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔2〕に記載の方法。
〔５〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔4〕に記載の方法。
〔６〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔4〕に記載の方法。
〔７〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔2〕に記載の方法。
〔８〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔7〕に記載の方法。
〔９〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11ドメインである、前記〔2〕の方法。
〔１０〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔2〕に記載の方法。
〔１１〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔2〕に記載の方法。
〔１２〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔2〕に記載の方法。
〔１３〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔2〕に記載の方法。
〔１４〕レバウディオサイドD３の合成方法であって、下記工程、
ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸及びウリジン二リン酸-グルコースから成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び  
前記反応混合物を、グルコースが前記ステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが前記レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔１５〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔14〕に記載の方法。
〔１６〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔15〕に記載の方法。
〔１７〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔16〕に記載の方法。
〔１８〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔16〕に記載の方法。
〔１９〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２０〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔19〕に記載の方法。
〔２１〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔14〕の方法。
〔２２〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２３〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔14〕に記載の方法。
〔２４〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２５〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２６〕スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔２７〕SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔26〕のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔２８〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔26〕のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔２９〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔26〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３０〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔26〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３１〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔30〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３２〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔26〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３３〕レバウディオサイドDの合成方法であって、下記工程：
レバウディオサイドAと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔３４〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ EUGT11である、前記〔33〕に記載の方法。
〔３５〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔34〕に記載の方法。
〔３６〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔35〕に記載の方法。
〔３７〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔35〕に記載の方法。
〔３８〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔33〕に記載の方法。
〔３９〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔38〕に記載の方法。
〔４０〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４１〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４２〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔33〕に記載の方法。
〔４３〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４４〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４５〕レバウディオサイドEの合成方法であって、下記工程、
ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、
を含み、グルコースが、前記ステビオシドと共有結合してレバウディオサイドEを生成することを特徴とする方法。
〔４６〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔45〕に記載の方法。
〔４７〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔46〕に記載の方法。
〔４８〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔47〕に記載の方法。
〔４９〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔47〕に記載の方法。
〔５０〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５１〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔50〕に記載の方法。
〔５２〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５３〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５４〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔45〕に記載の方法。
〔５５〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５６〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５７〕甘くする量のレバウディオサイドD３を含む、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品。
〔５８〕約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、前記〔57〕の経口消費できる製品。
〔５９〕レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料である、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６０〕前記経口消費できる製品が、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６１〕少なくとも1種の追加の甘味料を更に含む、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６２〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔61〕に記載の経口消費できる製品。
〔６３〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔61〕に記載の経口消費できる製品。
〔６４〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔61〕に記載の経口消費できる製品。
〔６５〕炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される少なくとも1種の添加物を更に含む、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６６〕前記消費製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品及び卓上香味料から成る群より選択される、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６７〕甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品。
〔６８〕前記飲料製品が、炭酸飲料製品及び非炭酸飲料製品から成る群より選択される、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔６９〕前記飲料製品が、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、冷凍飲料；すぐに飲める飲料；冷凍したすぐに飲める飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、風味付けした水、改良水、果実ジュース、果実ジュースで風味付けしたドリンク、スポーツドリンク、及びエナジードリンクから成る群より選択される、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７０〕約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７１〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料である、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７２〕前記飲料製品が、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７３〕少なくとも1種の追加の甘味料を更に含む前記〔67〕に記載の飲料製品であって、該飲料製品が約1%(w/v-%)〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する飲料製品。
〔７４〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔73〕に記載の飲料製品。
〔７５〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔73〕に記載の飲料製品。
〔７６〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔73〕に記載の飲料製品。
〔７７〕炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される少なくとも1種の添加物を更に含む、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７８〕甘くする量のレバウディオサイドD３を含む消費製品。
〔７９〕前記消費製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品及び卓上香味料から成る群より選択される、前記〔78〕に記載の消費製品。
〔８０〕約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８１〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料である、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８２〕前記飲料製品が、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８３〕少なくとも1種の追加の甘味料を更に含む前記〔78〕に記載の飲料製品であって、該飲料製品が約1%(w/v-%)〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する飲料製品。
〔８４〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔83〕に記載の飲料製品。
〔８５〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔83〕に記載の飲料製品。
〔８６〕前記追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、Lo Han Guo、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔83〕に記載の飲料製品。
〔８７〕炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される少なくとも1種の添加物を更に含む、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８８〕下記化学構造から成る甘味料。
2017519812.tif 000008
〔８９〕充填剤、嵩高剤及び固化防止剤の少なくとも1つを更に含む、前記〔88〕に記載の甘味料。
〔９０〕レバウディオサイドD３を含む製品の調製方法であって、レバウディオサイドD３を前記製品に添加する工程を含み、該製品が、飲料製品及び消費製品から成る群より選択され、かつ約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３が前記製品に添加される、前記方法。
〔９１〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料であり、かつ前記製品が約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔90〕に記載の方法。
〔９２〕少なくとも1種の追加の甘味料を添加する工程を更に含む前記〔90〕に記載の方法であって、前記製品が約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する前記方法。
〔９３〕製品の甘味を増強する方法であって、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される製品に添加する工程を含み、この添加されたレバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３を欠いている対応製品に比べて、前記製品の甘味を増強する、前記方法。
〔９４〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料であり、かつ前記製品が約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔93〕に記載の方法。
〔９５〕追加の甘味料を添加する工程を更に含む前記〔93〕に記載の方法であって、前記製品が、約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記方法。
〔９６〕甘くした製品の調製方法であって、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される製品を準備する工程、及び約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を前記製品に添加する工程を含む前記方法。
〔９７〕少なくとも1種の添加物を前記製品に添加する工程を更に含む、前記〔96〕に記載の方法。
〔９８〕前記少なくとも1種の添加物が、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔96〕に記載の方法。
〔９９〕少なくとも1種の追加の甘味料を添加する工程を更に含む、前記〔96〕に記載の方法。
〔１００〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔99〕に記載の方法。
〔１０１〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔100〕に記載の方法。
〔１０２〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Lアラニン、グリシン、ロハングオ、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔99〕に記載の方法。
〔１０３〕前記製品中の前記レバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３多形、非晶質レバウディオサイドD３及びレバウディオサイドD３立体異性体から成る群より選択される、前記〔96〕に記載の方法。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｂ】
2017519812.tif 000009
【手続補正４０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2017519812.tif 000010
【手続補正４１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2017519812.tif 000011
【手続補正４２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６Ａ】
2017519812.tif 000012
【手続補正４３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ａ】
2017519812.tif 000013