【手続補正書】
【提出日】平成30年5月28日(2018.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の水溶性変異体を選択する手順を実行するためのコンピュータ実装方法であって、
（１）  分析のために前記ＧＰＣＲの配列を入力する工程と、
（２）  前記ＧＰＣＲの膜貫通（ＴＭ）ドメインαヘリックスセグメント（「ＴＭ領域」）内の複数の疎水性アミノ酸が置換されている前記ＧＰＣＲの変異体を得る工程であって、
（ａ）前記疎水性アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、
（ｂ）前記ロイシン（Ｌ）はそれぞれ独立して、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）で置換されており、
（ｃ）前記イソロイシン（Ｉ）および前記バリン（Ｖ）はそれぞれ独立してトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）で置換されており、かつ
（ｄ）前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン（Ｙ）で置換されている
ことを特徴とする工程と、その後に
（３）  前記変異体のためにαヘリックス二次構造結果を得て、前記変異体内のαヘリックス二次構造の維持を確認する工程であって、任意で、工程（４）の前、それと同時またはその後に行う工程と、
（４）  前記変異体のために膜貫通領域結果を得て前記変異体の水溶性を確認する工程と
を含み、
任意で、ランク付け関数を用いて前記変異体をランク付けする工程をさらに含み、
前記ランク付け関数は二次構造成分および水溶性成分を任意で含み、
前記ランク付け関数は、前記二次構造成分および／または前記水溶性成分の重み付け値を任意で含み、
任意で、データプロセッサを用いて前記方法を行う工程をさらに含み、
前記データプロセッサは、メモリに任意で接続されている、
それにより前記ＧＰＣＲの水溶性変異体を選択することを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（２）において、前記ＧＰＣＲの１つの同じＴＭ領域内の前記複数の疎水性アミノ酸の１つのサブセットを置換して変異体候補ライブラリーの１種のメンバーを作製し、かつ前記複数の疎水性アミノ酸の１つ以上の異なるサブセットを置換して前記ライブラリーのさらなるメンバーを作製し、
任意で、前記ライブラリー全てのメンバーを組み合わせスコアに基づいてランク付けする工程であって、前記組み合わせスコアは、前記αヘリックス二次構造予測結果および前記膜貫通領域予測結果の重み付けされた組み合わせである工程をさらに含み、
最も高い組み合わせスコアを有するＮ種のメンバーを選択して前記ＴＭ領域のための変異体候補の第１のライブラリーを形成する工程であって、Ｎは所定の整数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である工程をさらに含み、
前記ＧＰＣＲの１、２、３、４、５または６つ全ての他のＴＭ領域のための変異体候補の１つのライブラリーを作製する工程を任意でさらに含み、
前記ＧＰＣＲの２つ以上のＴＭ領域を前記変異体候補ライブラリー内の対応するＴＭ領域で置換して組み合わせ変異体ライブラリーを作製する工程をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、
任意で、前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、
任意で、前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、
任意で、前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換される、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上（例えば、１、２または３つ）の前記ロイシンは置換されておらず、
任意で、１つ以上（例えば、１、２または３つ）の前記イソロイシンは置換されておらず、
任意で、１つ以上（例えば、１、２または３つ）の前記バリンは置換されておらず、
任意で、１つ以上（例えば、１、２または３つ）の前記フェニルアラニンは置換されていない、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）工程（２）において、ＴＭ領域内の前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、ＴＭ領域内の前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、ＴＭ領域内の前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、ＴＭ領域内の前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換されるか、または
（ｂ）前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換される、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組み合わせ変異体を産生／発現させる工程をさらに含み、
任意で、前記組み合わせ変異体をリガンド結合について（例えば、酵母ツーハイブリッド法で）試験する工程であって、ＧＰＣＲと比較して実質的に同じリガンド結合を有するものを選択する工程をさらに含み、
任意で、前記組み合わせ変異体を前記ＧＰＣＲの生物学的機能について試験する工程であって、前記ＧＰＣＲと比較して実質的に同じ生物学的機能を有するものを選択する工程をさらに含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組み合わせ変異体ライブラリーは約２百万未満のメンバーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＰＣＲの前記配列は前記ＧＰＣＲのＴＭ領域に関する情報を含み、
任意で、前記ＧＰＣＲの前記配列はタンパク質構造データベース（例えば、ＰＤＢ、ＵｎｉＰｒｏｔ）から得られ、
任意で、前記ＧＰＣＲのＴＭ領域を前記ＧＰＣＲの前記配列に基づいて、任意でピーク探索のために動的ベースラインを利用するＴＭＨＭＭ２．０（隠れマルコフモデルを用いる膜貫通予測）ソフトウェアモジュールを任意で用いて予測する、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＰＣＲの各変異体のポリヌクレオチド配列を提供する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド配列は、宿主（例えば、大腸菌などの細菌、出芽酵母または分裂酵母などの酵母、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、非ヒト哺乳類細胞またはヒト細胞）における発現のために最適化されたコドンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、ＶＢＡスクリプトを含むスクリプト化手順であり、
任意で、前記スクリプト化手順は、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）システム（例えば、Ubuntu 12.04 LTS）、Ｕｎｉｘ（登録商標）システム、Microsoft Windowsオペレーティングシステム、ＡｎｄｒｏｉｄオペレーティングシステムまたはApple iOSオペレーティングシステムにより動作可能である、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の水溶性変異体であって、
（１） ＧＰＣＲの膜貫通（ＴＭ）ドメインαヘリックスセグメント（「ＴＭ領域」）内の複数の疎水性アミノ酸が置換され、
（ａ）前記疎水性アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、
（ｂ）前記ロイシン（Ｌ）はそれぞれ独立して、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）で置換され、
（ｃ）前記イソロイシン（Ｉ）および前記バリン（Ｖ）はそれぞれ独立してトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）で置換され、かつ
（ｄ）前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン（Ｙ）で置換され、その後に
（２）  前記変異体の７つ全てのＴＭ領域によりαヘリックスの二次構造が維持されており、かつ
（３）  予測される膜貫通領域が存在しない
ことを特徴とする水溶性変異体。
【請求項１３】
（ａ）工程（２）において、ＴＭ領域内の前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、ＴＭ領域内の前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、ＴＭ領域内の前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、ＴＭ領域内の前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換されるか、または
（ｂ）前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換される、
請求項１２に記載の水溶性変異体。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法を行うための一連の命令が記憶された非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１５】
膜タンパク質の水溶性変異体を選択するための手順を実行するためのコンピュータ実装方法であって、
（１）  データ処理を行って分析のために膜タンパク質の配列を同定する工程と、
（２）  前記膜タンパク質の前記膜貫通（ＴＭ）ドメインαヘリックスセグメント（「ＴＭ領域」）の複数の疎水性アミノ酸が置換されている前記膜タンパク質の変異体を得る工程と
を含み、
当該データプロセッサは、
（３）  前記変異体のαヘリックスの二次構造結果を決定して前記変異体におけるαヘリックスの二次構造の維持を確認し、
（３）  前記変異体の膜貫通領域結果を決定して前記変異体の水溶性を確認し、かつ
（５）  前記膜タンパク質の水溶性変異体を選択する
ことを特徴とし、
前記置換は、
（ａ）疎水性アミノ酸をロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択すること、
（ｂ）ロイシン（Ｌ）をそれぞれ独立してグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）で置換すること、
（ｃ）イソロイシン（Ｉ）および前記バリン（Ｖ）をそれぞれ独立してトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）で置換すること、および
（ｄ）前記フェニルアラニンをそれぞれチロシン（Ｙ）で置換すること
を含み、
前記変異体は、変異体のライブラリーのメンバーであり、
前記方法は、前記ライブラリー全てのメンバーを組み合わせスコアに基づいてランク付けする工程であって、前記組み合わせスコアは、前記αヘリックス二次構造予測結果および前記膜貫通領域予測結果の重み付けされた組み合わせである工程をさらに含み、
任意で、最も高い組み合わせスコアを有するＮ種のメンバーを選択して前記ＴＭ領域のための変異体候補の第１のライブラリーを形成する工程であって、Ｎは所定の整数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である工程をさらに含み、
ＧＰＣＲの１、２、３、４、５または６つ全ての他のＴＭ領域のために変異体候補の１つのライブラリーを作製する工程をさらに含み、
前記ＧＰＣＲの２つ以上のＴＭ領域を前記変異体候補ライブラリー内の対応するＴＭ領域で置換して組み合わせ変異体ライブラリーを作製する工程をさらに含み、
任意で、ランク付け関数を用いて前記変異体をランク付けする工程をさらに含み、
前記ランク付け関数は二次構造成分および水溶性成分を任意で含み、
前記ランク付け関数は前記二次構造成分および／または前記水溶性成分の重み付け値を任意で含み、
任意で、前記データプロセッサに接続されたメモリをさらに備える、
方法。
【請求項１６】
ＧＰＣＲの１つの同じＴＭ領域の前記複数の疎水性アミノ酸の１つのサブセットを置換して変異体候補ライブラリーの１種のメンバーを作製し、かつ前記複数の疎水性アミノ酸の１つ以上の異なるサブセットを置換して前記ライブラリーのさらなるメンバーを作製する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）工程（２）において、ＴＭ領域内の前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、ＴＭ領域内の前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、ＴＭ領域内の前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、ＴＭ領域内の前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換されるか、または
（ｂ）前記ロイシンの実質的に全て（例えば全て）はグルタミンで置換され、前記イソロイシンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、前記バリンの実質的に全て（例えば全て）はトレオニンで置換され、前記フェニルアラニンの実質的に全て（例えば全て）はチロシンで置換される、
請求項１５に記載の方法。