【手続補正書】
【提出日】平成30年8月31日(2018.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
ａ．前記標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、前記標的分析物が前記ポアに対して移動するように接触させるステップ、および、
ｂ．前記分析物が前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、それによって前記分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドであり、ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させることをさらに含み、任意で、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質がヘリカーゼである、またはヘリカーゼに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー。
【請求項４】
標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異体と（ｂ）膜の成分とを含むキット。
【請求項５】
前記ＣｓｇＧ変異体が、
（ｉ）配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、前記バリアントが、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つまたは複数に変異を含む、変異体ＣｓｇＧモノマー、または
（ｉｉ）９つのモノマーであって、該モノマーの少なくとも１つが配列番号３９０のバリアントであり、前記バリアントが、（ａ）位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３のうちの１つもしくは複数における変異、ならびに／または（ｂ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のうちの１つもしくは複数の欠失を含む、９つのモノマー
を含む、請求項１もしくは２に記載の方法、請求項３に記載のセンサーまたは請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記バリアントが、（ｉ）位置Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２における１つまたは複数の変異、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のうちの１つまたは複数の欠失のうちの１つまたは複数を含み、任意で、
（ａ）前記バリアントが、（ｉ）において、置換Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎのうちの１つもしくは複数を含む、
（ｂ）前記バリアントが、（ｉｉ）において、
【化１−１】
2017527284.tif 000001
【化１−２】
2017527284.tif 000002
【化１−３】
2017527284.tif 000003
を含む、ならびに／または
（ｃ）前記バリアントが、（ｘｉ）において、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失および単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換、Ｙ５１Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む、
請求項５（ｉｉ）に記載の方法、センサーまたはキット。
【請求項７】
前記バリアントが、
【化２−１】
2017527284.tif 000004
【化２−２】
2017527284.tif 000005
を含む、請求項６に記載の方法、センサーまたはキット。
【請求項８】
前記バリアントが、Ｔ１５０に変異を含む、請求項６に記載の方法、センサーまたはキット。
【請求項９】
前記バリアントが、置換（ｉ）Ｆ５６Ｎ，Ｆ５６Ｑ，Ｆ５６Ｒ，Ｆ５６Ｓ，Ｆ５６Ｇ，Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ，Ｆ５６Ｐ，Ｆ５６Ｒ，Ｆ５６Ｈ，Ｆ５６Ｓ，Ｆ５６Ｑ，Ｆ５６Ｉ，Ｆ５６Ｌ，Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｉｉ）Ｎ５５Ｑ，Ｎ５５Ｒ，Ｎ５５Ｋ，Ｎ５５Ｓ，Ｎ５５Ｇ，Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｉｉｉ）Ｙ５１Ｌ，Ｙ５１Ｖ，Ｙ５１Ａ，Ｙ５１Ｎ，Ｙ５１Ｑ，Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｉｖ）Ｔ１５０Ｉ、（ｖ）Ｓ５４Ｐ、および（ｖｉ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、請求項５（ｉｉ）に記載の方法、センサーまたはキット。
【請求項１０】
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
（ａ）前記バリアントが、（ｉ）Ｙ５１、（ｉｉ）Ｎ５５、（ｉｉｉ）Ｆ５６、（ｉｖ）Ｙ５１／Ｎ５５、（ｖ）Ｙ５１／Ｆ５６、（ｖｉ）Ｎ５５／Ｆ５６または（ｖｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含み、（ｉ）における前記変異は、ＡでＹ５１を置換することである、または、
（ｂ）前記バリアントが、請求項６または７に定義されたものである、
変異体ＣｓｇＧモノマー。
【請求項１１】
２つ以上の共有結合ＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、前記モノマーの少なくとも１つが、請求項１０に記載の変異体モノマーである、構築物。
【請求項１２】
少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧポアであって、前記モノマーが、配列番号３９０で示される配列の３８〜６３位の間での修飾を含む、修飾ＣｓｇＧポア。
【請求項１３】
（ａ）前記ポアが、請求項１０（ａ）に記載のモノマーを含む、または、
（ｂ）前記モノマーが、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド配列を有する、
請求項１２に記載の修飾ＣｓｇＧポア。
【請求項１４】
請求項１０に記載の同一の変異体モノマーまたは請求項１１に記載の同一の構築物を含む、ホモオリゴマー修飾ＣｓｇＧポア。
【請求項１５】
請求項１０に記載の変異体ＣｓｇＧモノマーをコードするポリヌクレオチド配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９０】
本発明は、以下の態様も包含する。
［１］
位置Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６のうちの１つまたは複数に修飾を含む、
少なくとも１つの修飾ＣｓｇＧモノマー。
［２］
［１］に記載の少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾生体ポア。
［３］
少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧ生体ポアであって、０．５ｎｍ
〜１．５ｎｍの範囲の直径を有するチャネル狭窄を１つしか有さない修飾ＣｓｇＧ生体ポ
ア。
［４］
前記修飾が、前記ＣｓｇＧモノマーのポリペプチド配列の３８〜６３位にある、［
３］に記載の修飾ポア。
［５］
前記修飾が、Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６から選択される位置にある、［
４］に記載の修飾ポア。
［６］
前記修飾が、位置Ｔｙｒ５１に、または位置Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の両方にある
、［５］に記載の修飾ポア。
［７］
前記ＣｓｇＧモノマーに対する修飾が、天然に存在するアミノ酸の置換、天然に存在す
るアミノ酸の欠失、および天然に存在するアミノ酸側鎖の修飾からなる群から選択される
、［３］から［６］のいずれかに記載の修飾ポア。
［８］
前記修飾が、未修飾アミノ酸の立体障害を低減または除去する、［３］から［７］に記載
の修飾ポア。
［９］
前記修飾ポアの前記少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による
３８〜６３位のポリペプチド配列を有する、［３］から［８］のいずれかに記載の修飾ポア
。
［１０］
［３］から［９］のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアの少なくとも１つのＣｓｇＧ
モノマーをコードする単離されたポリペプチド。
［１１］
［１０］に記載の単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸。
［１２］
ａ）絶縁層と、
ｂ）前記絶縁層内のＣｓｇＧ生体ポアと、
ｃ）前記生体ポアを通る電流を測定するための装置と
を含むバイオセンサー。
［１３］
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、［３］から［９］のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアで
ある、［１２］に記載のバイオセンサー。
［１４］
分析物検出または核酸シークエンシングである生体センシング用途のための、ＣｓｇＧ
生体ポアの使用。
［１５］
前記核酸シークエンシングが、ＤＮＡシークエンシングまたはＲＮＡシークエンシング
である、［１４］に記載の使用。
［１６］
分子センシングのための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
けるステップ、
ｂ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と相互作用させるステップ、および
ｃ）前記相互作用中に１回または複数回の測定を行うステップ
を含む方法。
［１７］
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
けるステップ、
ｂ）前記絶縁層を介して電気的電位を印加し、それによって前記生体ポアを通る電流の
流れを確立するステップ、
ｃ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と接触させるステップ、および
ｄ）前記生体ポアを通る電流の流れを測定するステップ
を含む、［１６］に記載の方法。
［１８］
前記絶縁層が膜である、［１６］または［１７］に記載の方法。
［１９］
前記膜が、脂質二重層である、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記ポアを通る電流が、前記絶縁層の第１の側面から前記絶縁層の第２の側面への可溶
性イオンの流れによって搬送される、［１７］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
前記分子センシングが、分析物検出である、［１６］から［２０］に記載の方法。
［２２］
ステップ（ｄ）の後に、前記試験基質が不在である場合の前記生体ポアを通る電流と比
較して前記生体ポアを通る電流が低減することによって前記試験基質の存在を判定するさ
らなるステップを含む、［１７］から［２１］に記載の方法。
［２３］
前記分子センシングが、核酸シークエンシングである、［１６］から［２２］に記載の方
法。
［２４］
前記方法によってシークエンシングされる核酸のタイプがＤＮＡまたはＲＮＡである、
［２３］に記載の方法。
［２５］
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、さらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合され
る、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２６］
前記さらなるアクセサリータンパク質が、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラ
ーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびヘ
リカーゼからなる群から選択される核酸プロセシング酵素である、［２５］に記載の方
法。
［２７］
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、修飾ＣｓｇＧポアであり、前記修飾ＣｓｇＧポアが、前記Ｃ
ｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーの少なくとも１つにおいてモノマー野生型大
腸菌（E-coli）ＣｓｇＧポリペプチド配列に少なくとも１つの修飾を有する、［１６］
から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］
同じ修飾が、前記ＣｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーすべてに施される、［
２７］に記載の方法。
［２９］
前記修飾ＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド
配列を有する、［２７］または［２８］に記載の方法。
［３０］
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
前記バリアントが、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つまたは複数に変異を含
む、変異体ＣｓｇＧモノマー。
［３１］
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
前記バリアントが、（ｉ）位置Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９
７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２における１つま
たは複数の変異、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５
１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９
Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ
、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、
（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１
ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ
）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およ
びＳ５７のうちの１つまたは複数の欠失のうちの１つまたは複数を含む、変異体ＣｓｇＧ
モノマー。
［３２］
（ａ）前記バリアントが、（ｉ）において、置換Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４
３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５
７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、
Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４
Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１
４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎのうちの１つもしくは複
数を含む、
（ｂ）前記バリアントが、（ｉｉ）において、
【化７−１】
2017527284.tif 000006
【化７−２】
2017527284.tif 000007
【化７−３】
2017527284.tif 000008
を含む、ならびに／または
（ｃ）前記バリアントが、（ｘｉ）において、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２
／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失
、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失お
よび単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６
の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５５
／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一
のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１
Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠
失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置
換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５
５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および
単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換／Ｙ５
１Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む、
［３１］に記載の変異体モノマー。
［３３］
前記バリアントが、
【化８−１】
2017527284.tif 000009
【化８−２】
2017527284.tif 000010
を含む、［３１］または［３２］に記載の変異体。
［３４］
前記バリアントが、Ｔ１５０に変異を含む、［３１］に記載の変異体モノマー。
［３５］
２つ以上の共有結合ＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、前記モノマーの少なくと
も１つが、前記のいずれか一項に記載の変異体モノマーである、構築物。
［３６］
前記２つ以上の変異体モノマーが同じである、または異なる、［３５］に記載の構築
物。
［３７］
前記２つ以上の変異体モノマーが、遺伝子的に融合されている、［３５］または［３６
］に記載の構築物。
［３８］
前記２つ以上の変異体モノマーが、１つまたは複数のリンカーによって結合されている
、［３５］から［３７］のいずれか一項に記載の構築物。
［３９］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の２つの変異体モノマーを含む、［３５］
から［３８］のいずれか一項に記載の構築物。
［４０］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは［３７］に記載の
構築物をコードするポリヌクレオチド。
［４１］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の同一の変異体モノマーまたは［３５］か
ら［３９］のいずれか一項に記載の同一の構築物を含む、ＣｓｇＧに由来するホモオリゴマー
ポア。
［４２］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の９つの同一の変異体モノマーを含む、［
４１］に記載のホモオリゴマーポア。
［４３］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは［
３５］から［３９］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの構築物を含む、ＣｓｇＧに由
来するヘテロオリゴマーポア。
［４４］
（ａ）［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の９つの変異体モノマーを含み、それ
らの少なくとも１つが他と異なる、または（ｂ）［３１］から［３４］のいずれか一項に記
載の１つもしくは複数の変異体モノマーと配列番号３９０を含む十分なさらなるモノマー
とを含む、［４３］に記載のヘテロオリゴマーポア。
［４５］
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
ａ．前記標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、前記標的分析物が前記ポアに
対して移動するように接触させるステップ、および
ｂ．前記分析物が前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い
、それによって前記分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステッ
プ
を含む方法。
［４６］
前記ＣｓｇＧ変異体が９つのモノマーを含み、前記モノマーの少なくとも１つが配列番
号３９０のバリアントであり、前記バリアントが、（ａ）位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、
Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０
２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９
５、Ｅ２０１およびＥ２０３のうちの１つもしくは複数における変異、ならびに／または
（ｂ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６
およびＳ５７のうちの１つもしくは複数の欠失を含む、［４５］に記載の方法。
［４７］
前記バリアントが、置換（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、
Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ
５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ
５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ
５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５
４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、［４６］に記載の方法。
［４８］
前記バリアントが、［３１］から［３４］に記載の変異／置換の組合せのいずれかを含む
、［４６］または［４７］に記載の方法。
［４９］
前記ポアが、［３１］から［３４］のいずれか一項に記載のポアである、［４８］に記
載の方法。
［５０］
前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチ
ド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤
、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である、［
４５］から［４９］のいずれか一項に記載の方法。
［５１］
前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、［５０］に記載の方法。
［５２］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアと、前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移
動するように接触させるステップ、および
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の
測定を行い、前記測定が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによ
って前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、［５１］に記載の方法。
［５３］
前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリ
ヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌク
レオチドの二次構造、および（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選
択される、［５２］に記載の方法。
［５４］
前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測
定によって測定される、［５２］または［５３］に記載の方法。
［５５］
前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定または電界効果
トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、［５４］に記載の方法。
［５６］
ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タ
ンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させること
をさらに含む、［５２］から［５５］のいずれか一項に記載の方法。
［５７］
ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアおよび前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と、
前記タンパク質が前記ポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触さ
せるステップ、ならびに
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに前記ポアを通過する
電流を測定し、前記電流が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それに
よって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、［５６］に記載の方法。
［５８］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質がヘリカーゼである、またはヘリカーゼに由来す
る、［５６］または［５７］に記載の方法。
［５９］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体およびエキソヌクレアーゼ
と、前記エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレ
オチドを消化し、前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように接触させる
ステップ、ならびに
ｂ）前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回
の測定を行い、前記測定が前記個々のヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それ
によって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、［５１］に記載の方法。
［６０］
前記ポアが、膜内にある、［４５］から［４９］のいずれか一項に記載の方法。
［６１］
前記膜が、両親媒性層である、または固体層を含む、［６０］に記載の方法。
［６２］
前記標的分析物を、前記ポアと接触させる前に前記膜とカップリングさせる、［６
０］または［６１］に記載の方法。
［６３］
前記標的分析物を、前記分析物を前記膜の方に送達する微粒子に結合させる、［６
０］から［６２］のいずれか一項に記載の方法。
［６４］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法であって、ＣｓｇＧ
ポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それによ
って前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成するステップを含む方
法。
［６５］
前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポアを前記ポリヌクレ
オチド結合タンパク質と接触させること、および（ａ）前記ポアを介して電位を印加する
ことによって形成される、［６４］に記載の方法。
［６６］
前記電位が、電圧電位または化学的電位である、［６５］に記載の方法。
［６７］
前記複合体が、前記ポアを前記タンパク質に共有結合させることによって形成される、
［６４］に記載の方法。
［６８］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはその
変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー。
［６９］
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するための、ＣｓｇＧポ
アまたはその変異体の使用。
［７０］
標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異体
と（ｂ）膜の成分とを含むキット。
［７１］
試料中の標的分析物を特徴づけるための装置であって、（ａ）複数のＣｓｇＧポアまた
はそれらの変異体と（ｂ）複数の膜とを含む装置。
［７２］
前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポア
および膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
前記特徴づけを行うための材料を送達するための少なくとも１つのポートと
を含む、［７１］に記載の装置。
［７３］
前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポア
および膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
前記特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと
を含む、［７２］に記載の装置。
［７４］
材料を前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに制御可能に供給す
るように構成されている流体工学システムと、
それぞれの試料を受けるための複数の容器と
をさらに含み、前記流体工学システムが、前記試料を前記容器から前記センサーデバイス
に選択的に供給するように構成されている、［７２］または［７３］に記載の装置。
［７５］
標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、ポリメラーゼおよび標識
ヌクレオチドと、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有するリン酸標識分子種が前記ポリ
メラーゼによって前記標的ポリヌクレオチドに逐次的に付加されるように接触させるステ
ップ、ならびに
ｂ）前記ポアを使用して前記リン酸標識分子種を検出し、それによって前記ポリヌクレ
オチドを特徴づけるステップ
を含む方法。
［７６］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは［３７］に記載の
構築物を産生する方法であって、好適な宿主細胞において［４０］に記載のポリヌクレ
オチドを発現させ、それによって［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは［３７］に記載の構築物を産生するステップを含む方法。
参考文献