【手続補正書】
【提出日】平成30年11月5日(2018.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む免疫動員性抗がんモノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）の生成方法であって、
（ａ）
成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに
生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相、を含む条件下で、培養培地において、前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲアルファ鎖及び前記ＴＣＲベータ鎖を発現させるように、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、前記ＴＣＲアルファ鎖及び前記ＴＣＲベータ鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを形成し、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、
（１）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲアルファ鎖をコードする、第１の翻訳単位、
（２）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲベータ鎖をコードする、第２の翻訳単位、ならびに
（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする、第３の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含み、
前記成長温度が、前記生成温度を２〜１０℃上回り、前記成長撹拌速度が、前記生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、前記培養することと、
（ｂ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞から前記生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを回収することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、
（１）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲアルファ鎖をコードする、第１の翻訳単位、
（２）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲベータ鎖をコードする、第２の翻訳単位、
（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする、第３の翻訳単位、
（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする、第４の翻訳単位、及び
（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする、第５の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含み、
前記第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記成長温度が、前記生成温度を２〜１０℃上回り、前記成長撹拌速度が、前記生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、前記培養すること、
を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、プロモータの３つのコピーを更に含み、第１のコピーが、前記第１の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第２のコピーが、前記第２の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第３のコピーが、前記第３の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、前記ＴＣＲアルファ鎖、前記ＴＣＲベータ鎖、及び前記シャペロンタンパク質の転写を駆動し、任意選択的に前記プロモータが、誘導プロモータであり、任意選択的に前記誘導プロモータが、ＩＰＴＧ誘導の不在下で、前記ＴＣＲアルファ鎖、前記ＴＣＲベータ鎖、及び前記シャペロンタンパク質の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導プロモータであり、かつ任意選択的に前記誘導プロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したとき、前記ＴＣＲアルファ鎖、前記ＴＣＲベータ鎖、及び前記シャペロンタンパク質の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、選択可能なマーカを更に含み、前記培養培地が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に前記ポリヌクレオチドを保持させるように、単一の抗生物質からなる選択剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の翻訳単位が、前記ＴＣＲアルファ鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第１の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、前記第２の翻訳単位が、前記ＴＣＲベータ鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第２の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、前記第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度が、約１．０〜約３．０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのシャペロンタンパク質、または前記第１のシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含み、任意選択的に前記ペプチジル−プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、かつ任意選択的に前記ＦｋｐＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦｋｐＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのシャペロンタンパク質が更に、または前記第２のシャペロンタンパク質及び前記第３のシャペロンタンパク質のうちの一方もしくは両方が、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼを含み、任意選択的に前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質及びＤｓｂＣタンパク質のうちの一方または両方であり、任意選択的に前記少なくとも１つのタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤｓｂＡ及びＥ．ｃｏｌｉ  ＤｓｂＣのうちの一方または両方である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ突然変異を有する株である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ２０９６  （Ｖａｌｒ）  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ  ｄｅｇｐＳ２１０Ａの遺伝子型を有する株である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＣＲアルファ鎖が、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲアルファ鎖定常ドメインを含み、前記ＴＣＲベータ鎖が、ＴＣＲベータ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖定常ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩｍｍＴＡＣの前記２つの鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩｍｍＴＡＣが、Ｔ細胞に結合し、Ｔ細胞応答を活性化する抗体断片を更に含み、任意選択的に前記抗体断片が、抗ＣＤ３単鎖抗体断片を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩｍｍＴＡＣが、操作されなかったＴＣＲの抗原に対する親和性と比較して、前記抗原に対する改善された親和性を保持するように操作されたＴＣＲを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩｍｍＴＡＣが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞のペリプラズムから回収される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記成長温度が、前記成長相中、約３０℃〜約３４℃の範囲内であり、前記生成温度が、前記生成相中、約２５℃〜約２９℃の範囲内である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記成長撹拌速度が、前記生成相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞におけるピーク酸素取り込み速度を０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分上回る、前記成長相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における酸素取り込み速度を達成するために十分である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記成長相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ピーク酸素取り込み速度が、３．５〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内であり、前記生成相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ピーク酸素取り込み速度が、１．０〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記成長撹拌速度が、前記生成撹拌速度よりも１０％〜４０％高い、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。