【手続補正書】
【提出日】平成29年12月5日(2017.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系細胞を製造する方法であって、
（ａ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（ｂ）細胞集団の肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導して、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞などの肝細胞系細胞を含む集団を得るステップであって、成熟を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が、胚葉体（ＥＢ）において内胚葉細胞を誘導するステップによって、又は単層中にある内胚葉細胞を誘導するステップによって得られ、ここで誘導された内胚葉集団が、ｎｏｄａｌアゴニスト、例えばアクチビンの存在下で長期間培養されて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が製造され、及び／又は
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖が、１つ又は複数のさらなるステップを含んでいてもよく、任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞及び／又は凝集体を含む細胞集団が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）及び／又はオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片の存在下で培養される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
Ａ．
ａ）単層として培養された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）請求項１に記載のステップａ）に従って、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化するステップと、
ｄ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｅ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項４】
多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
ａ）任意選択で、多能性幹細胞を、ＢＭＰ４アゴニストと接触させることによって、多能性幹細胞の胚葉体（ＥＢ）を形成するステップと、
ｂ）ＥＢを、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと
ｃ）誘導された内胚葉細胞集団を解離して、解離された誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｄ）解離された誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｅ）請求項１に記載のステップａ）に従って、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化するステップと、
ｆ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｇ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の増殖された肝芽細胞集団及び／又は肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項５】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％のＣＸＣＲ４＋及びｃＫＩＴ＋陽性細胞、並びに／又は少なくとも７０％、７５％、８０％のＳＯＸ１７＋細胞を含み；
特定化するステップが、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され（例えば、アクチビン処理され）誘導された内胚葉集団を、ＦＧＦ及びＢＭＰ４を含む特定化培地と接触させるステップを含み、任意選択で、ＦＧＦが、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２又はＦＧＦ４又はそれらの組合せであり；
凝集体が、少なくとも７０％、８０％、８５％又は９０％のアルブミン陽性細胞を含む細胞集団から作製され；そして／又は
成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、凝集体の細胞内のｃＡＭＰ経路を活性化して、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導するステップをさらに含み、任意選択で、ｃＡＭＰ経路を活性化するステップが、凝集体を８−ブロモアデノシン−３’５”−環状一リン酸などのｃＡＭＰ類似体と接触させるステップを含む、
請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から、肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
Ａ．
ａ）単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、請求項１に記載のステップａ）に従って特定化するステップと、
ｄ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸを含む成熟培地を用いて培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）凝集細胞成熟培地中で凝集細胞を培養するサブステップと、
（ｉｖ）任意選択で、凝集の約１〜約１０日内に、例えば、凝集の６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に凝集細胞においてｃＡＭＰ経路を任意選択で活性化するサブステップと
を含む、ステップ；
或いは
Ｂ．
ａ）単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と、任意選択で、約４〜約８日間接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、約１、２、３又は約４日間接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）請求項１に記載のステップａ）に従って、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を任意選択で、約４〜約１０日間特定化し、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）肝細胞又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、Ｄｅｘ及び／又はＯＳＭを含む成熟培地を用いて、任意選択で、約１０〜１４日間培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）Ｄｅｘを含む成熟培地中で約１〜１０日間凝集体を培養するサブステップと、
（ｉｖ）ａ）Ｄｅｘ及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニスト、任意選択で、ｃＡＭＰ類似体を含む肝細胞成熟培地中で約６日〜約１０日凝集体を培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に、ｃＡＭＰアゴニストを添加するサブステップ、又は
ｂ）凝集体を、ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ＯＰ−９細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニスト、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦｂ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＥＧＦ、ＴＧＦｂ１及びＨＧＦを含む胆管細胞成熟／特定化培地中で、約５日〜約９０日間培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２０〜４０日培養した後に、ｎｏｔｃｈアゴニストを添加するステップ並びに／又はｎｏｔｃｈアゴニストがｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞である場合には、凝集体を共培養するサブステップと
を含む、ステップ；
とを含む方法。
【請求項７】
凝集細胞成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で、
ａ．任意選択で、アルブミン＋／ＨＮＦ４＋前駆体集団の増殖を促進するＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＣＩＨＲ９９０２１などのｗｎｔアゴニスト、又は
ｂ．ｃＡＭＰ活性化ステップの間に添加され、ＣＹＰ酵素の発現を増強し、肝細胞前駆体の成熟を促進する、ＸＡＶ９３９及び／又はＭｅｋ／Ｅｒｋアンタゴニスト、例えば、ＰＤ０３２５９０１などのＷｎｔアンタゴニスト；好ましくはここで凝集細胞はＷｎｔアンタゴニスト及び任意選択でＴＧＦβアンタゴニスト（ＳＢ４３１５４２など）で約６日から約１２日、好ましくは約８日から約１０日、任意選択で約９日間処理される；
を含む、選択Ａを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
凝集細胞成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で、
ａ．胆管細胞系統特定化を促進するＮｏｔｃｈアゴニスト、
ｂ．肝細胞系統特定化を促進するγ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ６９５，４５８などのＮｏｔｃｈアンタゴニスト
を含む、選択Ａを含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
成熟培地及び／又は凝集体特定化培地が、ｎｏｔｃｈアゴニストを含み、ｃＡＭＰ活性化が除かれている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凝集細胞成熟培地が、ｎｏｔｃｈアゴニストを含み、そして製造された肝細胞が、機能的肝細胞であり；
好ましくは、機能的肝細胞が、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、
ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の発現及び／又は活性；及び／又は
ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現
が増大している、ことを含む；
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
機能的肝細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％が、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップ中に、ｎｏｔｃｈアゴニストを用いて細胞集団の凝集体を処理することによって、胆管細胞の運命が特定化され；
好ましくはｎｏｔｃｈアゴニストが、細胞、プラスチック、ＥＣＭ又はビーズなどの表面と結合しているｎｏｔｃｈリガンドを含み；
より好ましくはｎｏｔｃｈアゴニストが、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーを含む；
請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
ｎｏｔｃｈアゴニストが、ｎｏｔｃｈリガンドδ、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｊａｇｇｅｄ１ペプチド、又はＰｒｅｆ−１／ＤＬＫ−１／ＦＡ１から選択されるｎｏｔｃｈリガンドを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１４】
胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ｎｏｔｃｈアゴニストと、少なくとも５日間又は約５〜約１４日間接触させて、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞、任意選択で、機能的胆管細胞へのさらなる系統特定化及び／又は成熟を誘導するステップを含む、請求項８、９、１２又は１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
製造された胆管細胞の集団が、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、及び／又はｎｏｔｃｈアゴニストで処理されていない凝集体から製造された集団細胞と比較して、
Ｓｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される少なくとも１種、少なくとも２若しくは３種のタンパク質の発現が増大している、及び／又は
Ｓｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される少なくとも１種、少なくとも２若しくは３種の遺伝子の発現が増大している
機能的胆管細胞を含み、
任意選択で、胆管細胞の集団の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％が、ＣＫ１９＋胆管細胞及び／若しくはＣＦＴＲ＋胆管細胞である、請求項８、９、１２、１３又は１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦとの存在下で、少なくとも５、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間、ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーが、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞を含み、少なくとも１種の肝前駆細胞の、機能的胆管細胞への成熟を誘導する；
請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団が、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導され、多能性幹細胞が、任意選択で、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の移植用医薬としての使用のための、
機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を含む細胞集団を作製する方法であって、
ａ．肝芽細胞、任意選択で、２５日目段階の肝芽細胞；肝細胞及び／又は胆管細胞を含む細胞の集団を、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法に従って製造するステップと、
ｂ．ｉ．細胞の集団、任意選択で肝芽細胞を含む細胞の集団を、
１．任意選択で、キメラ凝集体で培養された、内皮細胞、任意選択で、ＣＤ３４＋内皮細胞、任意選択で、胚性ＣＤ３４＋内皮細胞と共培養し、任意選択で、凝集体はゲル／マトリックス中に包埋され、機能的肝細胞を含む細胞の集団を製造するステップ又は
２．任意選択で、キメラ凝集体の、ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞、任意選択で、ＯＰ９細胞、ＯＰ９−Ｊａｇｇｅｄ１細胞及び／又はＯＰ９δ１細胞と共培養し、任意選択で、凝集体は、ゲル／マトリックス中に包埋され、ＥＧＦ、ＴＧＦｂ１、ＥＧＦ及びＨＧＦ又はＥＧＦ、ＴＧＦｂ１及びＨＧＦとともに培養されて、機能的胆管細胞を含む細胞の集団を製造するステップ、及び／又は
ｉｉ．ａ）又はｂｉ）から得た細胞の集団又はそれから機能的肝細胞及び／若しくは胆管細胞が濃縮若しくは単離された集団を、対象に導入するステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
細胞の集団が、ｉ）内皮細胞と、少なくとも４日間、６日間、８日間、１０日間、１２日間、１５日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間若しくは９０日間共培養されるか、又はｉｉ）ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ＯＰ９細胞、ＯＰ９−Ｊａｇｇｅｄ１細胞及び／又はＯＰ９δ１細胞と、少なくとも４日間、６日間、８日間、１０日間、１２日間、９０日間又は６０日間共培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
凝集体がゲル／マトリックス中に包埋され、３次元培養される、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞を濃縮又は単離するステップをさらに含み、
好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大約９５％の肝細胞及び／又は胆管細胞、
任意選択で、機能的肝細胞を含む、
請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法で製造された細胞の集団。
【請求項２３】
創薬、薬物代謝分析、バイオ人工肝臓装置の開発のための、並びに／又は肝臓及び／若しくは胆管疾患の治療のための細胞置換療法としての、請求項２２に記載の細胞の集団の使用。
【請求項２４】
請求項１から２３までに記載の、細胞を増殖させるためのアゴニスト、アンタゴニスト、成熟因子、１種又は複数の培地及び容器の１種又は複数を含む、
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞を増殖及び／若しくは製造するための使用のためのキットであって、
任意選択で長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞を増殖及び／若しくは製造するための使用のための使用説明書を含む、キット。