【手続補正書】
【提出日】平成30年3月23日(2018.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）生成物の生合成のための少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、
２）１つ以上の代謝経路を介してフラックスを制御可能に低減または排除するための少なくとも１つの合成代謝弁とを備え、
前記合成代謝弁は、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレンシングおよび（ｉｉ）少なくとも１つのタンパク質の制御されたプロテオリシス性不活性化のための、少なくとも１つの遺伝子のプロモータの抑制を介した、１つ以上の遺伝子を含み、
前記少なくとも１つのタンパク質の制御されたタンパク質分解的不活性化は、プロテアーゼまたはタンパク質分解酵素増強因子の制御された誘導によって媒介され、
前記少なくとも１つのタンパク質は、少なくとも１つの遺伝子によってエンコードされる、
遺伝子修飾された微生物。
【請求項２】
前記遺伝子発現の制御されたサイレンシングは、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲ干渉または転写抑制によって達成される、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項３】
前記制御されたプロテオリシス性不活性化は、プロテアーゼによるタンパク質切断または特定のペプチドタグによる標的分解によって達成される、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項４】
遺伝子修飾された微生物を利用した生成物の生産のための多段階発酵バイオプロセスであって、
１）生成物の生合成のための少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、
２）複数の代謝経路を介してフラックスを制御可能に低減または排除するための複数の合成代謝弁の組み合わせを含み、
前記複数の合成代謝弁の少なくとも１つは、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレンシングおよび（ｉｉ）少なくとも１つのタンパク質の制御されたプロテオリシス性不活性化のための、１つ以上の遺伝子を含み、
前記バイオプロセスは、
成長相に前記微生物を増殖させること、及び
産生相の細胞内で前記生成物の生合成を開始させることを含み、
前記生成物の前記生合成の速度は、栄養素の枯渇時における前記産生相に増加し、
前記栄養素の枯渇は、複数の合成代謝弁を誘導する、
多段階発酵バイオプロセス。
【請求項５】
前記産生相と前記産生相との間の移行は、化学誘導剤の添加によって制御される、
請求項４に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項６】
前記産生相と前記産生相との間の移行は、前記栄養素の制限によって制御される、
請求項４に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項７】
前記栄養素は、リン酸塩、窒素、硫黄、マグネシウム、またはそれらの組み合わせである、
請求項６に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項８】
前記遺伝子発現の制御されたサイレンシングは、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲ干渉または転写抑制によって達成される、
請求項４に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項９】
前記合成代謝弁は、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレンシングおよび（ｉｉ）少なくとも１つのタンパク質の制御されたプロテオリシス性不活性化のための、１つ以上の遺伝子を含む、
請求項４に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項１０】
前記遺伝子発現の制御されたサイレンシングのための１つ以上の遺伝子は、小さなガイドＲＮＡをエンコードする遺伝子を含み、
前記小さなガイドＲＮＡをエンコードする遺伝子は、構成的に発現される、
請求項１に記載の微生物または請求項４に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項１１】
前記遺伝子発現の制御されたサイレンシングのための１つ以上の遺伝子は、（ｉ）ｄＣａｓ９をエンコードする遺伝子、および（ｉｉ）プロテオリシス性酵素増強因子をエンコードする遺伝子を含み、
前記ｄＣａｓ９をエンコードする遺伝子および前記プロテオリシス性酵素増強因子をエンコードする遺伝子は、条件的に発現される、
請求項１０に記載の微生物または請求項１０に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項１２】
前記プロテオリシス性酵素増強因子は、ｓｓｐＢである、
請求項１０に記載の微生物または請求項１０に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項１３】
少なくとも1つの遺伝子のプロモータは、内因性プロモータである、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項１４】
１）生成物の生合成のための少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、
２）複数の代謝経路を介してフラックスを制御可能に低減または排除するための複数の合成代謝弁の組み合わせを含み、
前記複数の合成代謝弁の各々は、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレンシングおよび（ｉｉ）少なくとも１つのタンパク質の制御されたプロテオリシス性不活性化のための、１つ以上の遺伝子を含み、
前記生成物の前記生合成の速度は、栄養素の枯渇時における生産的な固定相に増加し、
前記栄養素の枯渇は、複数の合成代謝弁を誘導する、
遺伝子修飾された微生物。
【請求項１５】
前記遺伝子発現の制御されたサイレンシングは、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲ干渉または転写抑制によって達成される、
請求項１４に記載の微生物。
【請求項１６】
前記制御されたプロテオリシス性不活性化は、特定のプロテアーゼまたは特定のペプチドタグによる標的分解による、タンパク質切断によって達成される、
請求項１４に記載の微生物。
【請求項１７】
前記栄養素は、リン酸塩、窒素、硫黄、マグネシウム、またはそれらの組み合わせである、
請求項１４に記載の微生物。
【請求項１８】
１）ピルビン酸、アセト乳酸、アセチル-ＣｏＡ、アセトアセチル-ＣｏＡまたはマロニル-ＣｏＡである代謝物の１つからの生成物の生合成のための少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、
２）複数の合成代謝弁の組み合わせであって、前記複数の合成代謝弁の各々は、ｆａｂｌ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ又はｕｄｈＡ遺伝子の１つであって、（ｉ）前記ｆａｂｌ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ又はｕｄｈＡ遺伝子の１つに対応するものの遺伝子発現の制御されたサイレンシング、または（ｉｉ）前記ｆａｂｌ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ又はｕｄｈＡ遺伝子の１つに対応するものによってエンコードされる制御されたプロテオリシス性不活性化のための、遺伝子を含み、
前記生成物の前記生合成の速度は、栄養素の枯渇時における生産的な固定相に増加し、
前記栄養素の枯渇は、複数の合成代謝弁を誘導する、
遺伝子修飾された大腸菌。
【請求項１９】
前記生成物は、アラニンまたはその誘導体である、
請求項１８に記載の遺伝子修飾された大腸菌。
【請求項２０】
前記生成物は、メバロン酸またはその誘導体である、
請求項１８に記載の遺伝子修飾された大腸菌。
【請求項２１】
前記生成物は、マロン酸またはその誘導体である、
請求項１８に記載の遺伝子修飾された大腸菌。
【請求項２２】
前記栄養素は、リン酸塩、窒素、硫黄、マグネシウム、またはそれらの組み合わせである、
請求項１８に記載の遺伝子修飾された大腸菌。
【請求項２３】
１）ピルビン酸からアラニンを生産するための生産経路と、
２）複数の合成代謝弁の組み合わせであって、前記複数の合成代謝弁の各々は、ｆａｂｌ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ又はｕｄｈＡ遺伝子の１つであって、（ｉ）前記ｆａｂｌ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ又はｕｄｈＡ遺伝子の１つに対応するものの遺伝子発現の制御されたサイレンシング、または（ｉｉ）前記ｆａｂｌ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ又はｕｄｈＡ遺伝子の１つに対応するものによってエンコードされる制御されたプロテオリシス性不活性化のための、遺伝子を含み、
前記アラニンの生合成の速度は、栄養素の枯渇時における生産的な固定相に増加し、
前記栄養素の枯渇は、複数の合成代謝弁を誘導する、
遺伝子修飾された大腸菌。

【請求項２４】
前記栄養素は、リン酸塩、窒素、硫黄、マグネシウム、またはそれらの組み合わせである、
請求項２３に記載の遺伝子修飾された大腸菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
グルコースの定量
ＹＳＩ生化学分析器モデル２９５０Ｍ（ＹＳＩインコーポレイテッド（ＹＳＩ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）社、米国オハイオ州イエロースプリングス）を用いて、グルコース濃度及びエタノールを慣用の方法で測定した。上記機器は、製造元の説明書に従って使用され、全ての試薬はＹＳＩから供給されたものを用いた。
〔付記１〕
代謝フラックスに関与する少なくとも１つのタンパク質の制御下プロテオリシス性不活性化によって、代謝フラックスが制御可能な様式で再分配される、遺伝子修飾された微生物。
〔付記２〕
ａ）代謝フラックスに関与する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の制御下サイレンシング；及び
ｂ）代謝フラックスに関与する少なくとも１つのタンパク質の制御下プロテオリシス性不活性化
の組み合わせによって、代謝フラックスが制御可能な様式で再分配される、遺伝子修飾された微生物。
〔付記３〕
前記代謝フラックスに関与する遺伝子は、成長に必須の酵素をエンコードし、
前記代謝フラックスに関与するタンパク質は、成長に必須の酵素である、付記１又は２に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記４〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、少なくとも１つのサイレンシングＲＮＡの制御下発現を含む、付記２又は３に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記５〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、転写サイレンシングを含み、
前記転写サイレンシングは、転写の少なくとも１つのリプレッサの発現を含む、付記２又は３に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記６〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、転写サイレンシングを含み、
前記転写サイレンシングは、ＣＲＩＳＰＲ干渉、少なくとも１つのターゲッティング小型ガイドＲＮＡの発現、及びカスケードタンパク質又はカスケードタンパク質複合体の発現を含む、付記２又は３に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記７〕
前記プロテオリシス性不活性化は：
ｉ）前記代謝フラックスに関与するタンパク質に対するペプチド配列の付加；及び
ｉｉ）前記ペプチド配列を認識する少なくとも１つのプロテアーゼの制御下発現
を含む、付記１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記８〕
前記プロテオリシス性不活性化は：
ｉ）前記代謝フラックスに関与するタンパク質に対するペプチド配列の付加；及び
ｉｉ）前記ペプチド配列に結合する少なくとも１つのタンパク質の制御下発現
を含み、
前記ペプチド配列への前記タンパク質の前記結合は、少なくとも１つのプロテアーゼによる、前記代謝フラックスに関与するタンパク質の分解を引き起こす、付記１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記９〕
前記プロテアーゼの制御下発現は、前記ペプチド配列の切断を引き起こし、
前記ペプチド配列に結合する前記タンパク質は、切断された前記ペプチド配列に結合して、少なくとも１つのプロテアーゼによる、前記代謝フラックスに関与するタンパク質の分解を引き起こす、付記８に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記１０〕
前記制御下遺伝子サイレンシング及び／又は前記制御下タンパク質分解は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超及び１００％超からなる群から選択される量の、代謝フラックス分配の変化を引き起こす、付記１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記１１〕
前記代謝フラックスの分配の変化は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超及び１００％超からなる群から選択される量の、所望の産物の産生速度の変化に対応する、付記１０に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記１２〕
付記１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物の使用を含む、バイオプロセスであって、
遺伝子発現の制御下サイレンシング及び／又は制御下プロテオリシス性不活性化は、化学誘導物質の添加を含む、バイオプロセス。
〔付記１３〕
付記１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物の使用を含む、バイオプロセスであって、
遺伝子発現の制御下サイレンシング及び／又は制御下プロテオリシス性不活性化は、栄養素の制限を含む、バイオプロセス。
〔付記１４〕
前記栄養素の制限は、無機リン酸塩の制限を含む、付記１３に記載のバイオプロセス。