【手続補正書】
【提出日】平成30年11月13日(2018.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペイロードを細胞内に送達するためのマイクロ流体システムであって、
管腔を画定するとともに、緩衝液中に懸濁した細胞が前記管腔を通過できるように構成されたマイクロ流体チャネルであって、細胞変形狭窄部を有し、前記狭窄部の直径が前記細胞の直径の関数であり、前記ペイロードが通過するのに十分なほど大きい細胞膜の一時的な摂動を誘発するように選択される、前記マイクロ流体チャネルと、
（ａ）エネルギー場、または、
（ｂ）前記狭窄部の下流、上流、もしくは上流及び下流に位置するエネルギー場のソースまたはエミッタと
を備える、前記マイクロ流体システム。
【請求項２】
（ａ）前記エネルギー場が電場を含み、前記ソースもしくはエミッタが電極を含む；または
（ｂ）前記エネルギー場が磁場を含み、前記ソースもしくはエミッタが磁石または電磁石を含む；または
（ｃ）前記エネルギー場が音場を含み、及び前記ソースもしくはエミッタがスピーカを含む；または
（ｄ）前記エネルギー場が光場を含み、及び前記ソースもしくはエミッタが、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー、もしくは白熱電球を含む、請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
前記エネルギー場が電場を含み、前記ソースまたはエミッタが電極を含み、かつ、前記マイクロ流体システムが電極対ごとに電極サイズが様々に異なる複数の電極対をさらに含む、請求項２に記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
（ａ）前記細胞が、前記狭窄部を通って連続流で前記場に進行し、前記狭窄部を通過した後、前記細胞が前記一時的な摂動を介して前記ペイロードを輸送するのに十分な強度を有する前記場の部分に接触するかもしくはそこを通過し；または、
（ｂ）前記狭窄部を通過した後、前記細胞が、前記狭窄部の下流に位置する前記装置のゾーン内に進入して留まり、前記ゾーン内の細胞が前記場と接触する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項５】
前記マイクロ流体チャネルが、前記マイクロ流体システム内の複数の平行なマイクロ流体チャネルのうちの１つであり、前記複数の平行なマイクロ流体チャネルの各マイクロ流体チャネルが、管腔を画定するとともに、緩衝液中に懸濁した細胞が前記管腔を通過できるように構成され、各マイクロ流体チャネルが細胞変形狭窄部を有し、狭窄部の直径が前記細胞の直径の関数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項６】
前記複数の平行なマイクロ流体チャネルが、少なくとも約２、５、１０、２０、２５、３０、４０、４５、５０、７５、１００、５００、または１，０００個のマイクロ流体チャネルを備える、請求項５に記載のマイクロ流体システム。
【請求項７】
前記エネルギー場が電場を含み、かつ
（ａ）前記電極が、前記緩衝液中に懸濁した前記細胞内に前記ペイロードを輸送するための前記電場を生成する２つの電極を有する；及び／または
（ｂ）前記マイクロ流体システムが、
（ｉ）少なくとも第一及び第二電極アレイに構成される複数の電極であって、前記第一電極アレイが前記第二電極アレイからずらして配置される、前記複数の電極、または
（ii）少なくとも第一及び第二電極対アレイに構成される複数の電極対であって、前記第一電極対アレイが前記第二電極対アレイからずらして配置される、前記複数の電極対；を備え、及び／または
（ｃ）前記マイクロ流体システムが、
（ｉ）前記細胞変形狭窄部に前記細胞を接触させた後に、前記緩衝液に懸濁した前記細胞内に前記ペイロードを輸送するために、前記少なくとも１つの電極に連結し、前記少なくとも１つの電極を輸送して電場を生成する発振器；または、
（ii）前記細胞変形狭窄部に前記細胞を接触させた後に、前記緩衝液に懸濁した前記細胞内に前記ペイロードを輸送するために、誘導によって前記少なくとも１つの電極を輸送して電場を生成する発振器
をさらに備える、
請求項２〜６のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項８】
前記エネルギー場が電場を含み、
前記マイクロ流体システムが、
（ｉ）少なくとも第一及び第二電極アレイに構成される複数の電極であって、前記第一電極アレイが前記第二電極アレイからずらして配置される、前記複数の電極、または
（ii）少なくとも第一及び第二電極対アレイに構成される複数の電極対であって、前記第一電極対アレイが前記第二電極対アレイからずらして配置される、前記複数の電極対
を備え、
水平、垂直、または対角方向の平面において、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４５、または１〜９０°の角度で、前記第一アレイが前記第二アレイからずらして配置される、
請求項７に記載のマイクロ流体システム。
【請求項９】
前記マイクロ流体システムが、
（ｉ）前記細胞変形狭窄部に前記細胞を接触させた後に、前記緩衝液に懸濁した前記細胞内に前記ペイロードを輸送するために、前記少なくとも１つの電極に連結し、前記少なくとも１つの電極を輸送して電場を生成する発振器；または、
（ii）前記細胞変形狭窄部に前記細胞を接触させた後に、前記緩衝液に懸濁した前記細胞内に前記ペイロードを輸送するために、誘導によって前記少なくとも１つの電極を輸送して電場を生成する発振器
をさらに備え、
前記発振器が、前記少なくとも１つの電極を輸送して、約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１．５、０．１〜２、０．１〜２．５、０．１〜３ｋＶ／ｃｍ、１〜３ｋＶ／ｃｍ、０．１〜１０ｋＶ／ｃｍ、１０〜２００ｋＶ／ｍ、または１０〜２０００ｋＶ／ｍの強度を有する電場を生成するように構成される、
請求項７に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１０】
電場が、
（ａ）前記ペイロードを前記細胞内の第一位置から前記細胞内部の第二位置に移送する；または
（ｂ）前記ペイロードを前記細胞内に輸送する、
請求項７〜９のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１１】
前記狭窄部の直径が、そこを通過する前記細胞の直径の約２０％〜９９％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１２】
前記狭窄部の直径が、約４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、４μｍ〜１０μｍ、または１０μｍ〜２０μｍであり、かつ／または、前記狭窄部の長さが、約１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２４μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、１０μｍ〜４０μｍ、１０μｍ〜５０μｍ、または１０μｍ〜６０μｍである、請求項１１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１３】
前記マイクロ流体チャネルが、単一の細胞変形狭窄部、または複数の細胞変形狭窄部を並列及び／または直列で有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１４】
化合物または組成物の細胞内への送達方法であって：
ペイロードを含有する細胞懸濁液に細胞を提供すること；
細胞変形狭窄部を有するマイクロ流体チャネルに前記細胞懸濁液を通すこと；
前記細胞を前記狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記ペイロードが前記細胞膜を通過して前記細胞の細胞質ゾルに到達するのに十分なほど大きい前記細胞膜の摂動を引き起こすこと；及び
前記細胞を、電場、磁場、音場、または光学場に接触させ、
（ａ）前記細胞内の第一位置から前記細胞内部の第二位置に前記ペイロードを移送する；または
（ｂ）前記ペイロードを前記細胞内に輸送する
ことを含む、前記送達方法。
【請求項１５】
（ａ）前記細胞を電場に接触させ、前記電場が１つ以上の電極によって生成する；または
（ｂ）前記細胞を磁場に接触させ、前記磁場が少なくとも１つの電磁石によって生成する；かつ／または
(i)前記細胞を、第一装置内のマイクロ流体チャネルに通し、次いで前記第一装置から除去し、第二装置内の電場、磁場、または音場と接触させる；または
（ii）前記マイクロ流体チャネル、ならびに前記電場、前記磁場、及び前記音場が、１つの装置内にある、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マイクロ流体チャネル及び前記電場、前記磁場、または前記音場が、１つの装置内にあり、前記細胞が、前記狭窄部を通って連続流で前記場に進入し、
（ａ）前記狭窄部を通過する前または通過した後、前記細胞は、一時的な摂動を介してペイロードを輸送するのに十分な強度の場の部分に接触するか、またはそれを通過する；または
（ｂ）前記狭窄部を通過した後、前記細胞は、前記装置のゾーン内に流入して留まり、そこで前記細胞が前記場と接触する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞を電場と接触させ、前記狭窄部の直径が、前記ペイロードが通過するのに十分なほど大きい前記細胞膜の一時的な摂動を誘発するように選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペイロードが、
（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）；
（ｂ）リボ核酸（ＲＮＡ）；
（ｃ）インビボもしくはインビトロでＤＮＡもしくはＲＮＡの安定性もしくは半減期を増加させる１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む前記ＤＮＡもしくはＲＮＡ；
（ｄ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）；
（ｅ）メチル化ＤＮＡ；
（ｆ）天然に存在する染色体もしくはその一部；
（ｇ）発現ベクター；
（ｈ）タンパク質；
（ｉ）小分子；
（ｊ）糖；
（ｋ）生物学的、合成的、有機的、もしくは無機的分子のポリマー；
（ｌ）荷電分子もしくは荷電分子を含む組成物；または、
（ｍ）非荷電分子、
の１つ以上を含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペイロードが、局在化シグナルを含むポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を電場に接触させ、前記ペイロードを、（ａ）前記細胞の核内；
（ｂ）前記細胞のミトコンドリア内；または、
（ｃ）前記細胞の核もしくは前記細胞のミトコンドリア以外の前記細胞の小器官内、
の１つ以上に輸送する、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞を電場に接触させ、
前記電場が
（ａ）２つの電極によって生成され、前記緩衝液に懸濁した前記細胞内に前記ペイロードを輸送する、かつ／または
（ｂ）電極対ごとに電極サイズが様々に異なる複数の電極対によって生成される、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの電極を、前記電極に連結する発振器によって輸送させ、前記電極を輸送する前記発振器が、前記細胞を前記細胞変形狭窄部に接触させた後に、前記細胞内に前記ペイロードを輸送するために、前記発振器が、前記電極を輸送して前記電場を生成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）前記狭窄部の直径が、そこを通過する前記細胞の直径の約２０〜９９％であり；
（ｂ）前記狭窄部の直径が、約４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、４μｍ〜１０μｍ、または１０μｍ〜２０μｍであり；
（ｃ）前記狭窄部の長さが、約１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２４μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、１０μｍ〜４０μｍ、１０μｍ〜５０μｍ、１０μｍ〜６０μｍであり；
（ｄ）前記細胞が、前記細胞変形狭窄部を出てから約０．０００１秒、０．００１秒、０．００２秒、０．００３秒、０．００４秒、０．００５秒、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、０．００１秒〜０．００５秒、または０．０００１秒〜１０秒後に、または前記細胞変形狭窄部を出てから約０．０００１秒、０．００１秒、０．００２秒、０．００３秒、０．００４秒、０．００５秒、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、０．００１秒〜０．００５秒、または０．０００１秒〜１０秒以内に前記電場と接触し；
（ｅ）前記電場に対する前記細胞の曝露時間は約１０〜５０ｍｓ、５０〜１００ｍｓまたは１０〜１００ｍｓであり；
（ｆ）前記電場が一定であり；
（ｇ）前記電場が定電流または直流パルス電流であり；
（ｈ）前記電場をパルスし；
（ｉ）前記電場を約５０μｓ〜２００μｓでパルスし；
（ｊ）前記電場の強度またはパルス強度が約１ｋＶ／ｃｍ〜３ｋＶ／ｃｍ、０．１ｋＶ／ｃｍ〜１０ｋＶ／ｃｍ、または０．１ｋＶ／ｃｍ〜０．５ｋＶ／ｃｍ、０．１ｋＶ／ｃｍ〜１ｋＶ／ｃｍ、０．１ｋＶ／ｃｍ〜１．５ｋＶ／ｃｍ、０．１ｋＶ／ｃｍ〜２ｋＶ／ｃｍ、０．１ｋＶ／ｃｍ〜２．５ｋＶ／ｃｍ、もしくは０．１〜３ｋＶ／ｃｍであり；
（ｋ）前記電場の強度またはパルス強度が、電気穿孔のみの特定の細胞型に対する所与のペイロードに対して同等レベルの送達を達成するのに必要な強度よりも低く；
（ｌ）前記電場の強度またはパルス強度が、前記細胞を電気穿孔するのに必要な強度よりも約５０％、１〜５０％、５０〜９９％、または１〜９９％低く；
（ｍ）約１０ｐｓｉ〜１００ｐｓｉの圧力を用いて前記細胞懸濁液を前記マイクロ流体チャネルに通し；
（ｎ）前記細胞を、約３００ｍｍ／ｓ、１００ｍｍ／ｓ〜３００ｍｍ／ｓ、２００ｍｍ／ｓ〜７００ｍｍ／ｓ、２５０ｍｍ／ｓ〜４００ｍｍ／ｓ、１００ｍｍ／ｓ〜１０００ｍｍ／ｓ、または１ｍｍ／ｓ〜１０００ｍｍ／ｓの速度で前記マイクロ流体チャネルに通し；
（ｏ）前記マイクロ流体チャネルが、複数の細胞変形狭窄部を並列及び／または直列で有し；
（ｐ）前記マイクロ流体チャネルが、単一の細胞変形狭窄部を有し；
（ｑ）前記細胞が複数の細胞であり、前記電場に通した後に、前記細胞の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９０〜９５、または８０〜１００％が生存可能であり；
（ｒ）前記電場の強度またはパルス強度が、約１０ｋＶ／ｍ〜２０００ｋＶ／ｍ、または１００ｋＶ／ｍ未満であり；
（ｓ）前記電場を、約０．１ｍｓ、０．１〜２ｍｓ、または０．１ｍｓ〜２０００ｍｓの持続時間、１ｍｓ〜２０ｍｓ、０．１ｍｓ〜２０００ｍｓ、または１ｍｓ〜２００ｍｓの周期でパルスし；
（ｔ）前記細胞を、約１００ｍｍ／ｓ、１７０ｍｍ／ｓ、３００ｍｍ／ｓ、１００ｍｍ／ｓ〜３００ｍｍ／ｓ、２００ｍｍ／ｓ〜７００ｍｍ／ｓ、２５０ｍｍ／ｓ〜４００ｍｍ／ｓ、１００ｍｍ／ｓ〜１０００ｍｍ／ｓ、または１ｍｍ／ｓ〜１０００ｍｍ／ｓの速度で電場に通し；
（ｕ）前記細胞膜の前記摂動が、約１ｎｍ〜２０ｎｍ、１ｎｍ〜６００ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ、１６ｎｍ、１８ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、または６００ｎｍの最大直径を有し；かつ／または、
（ｖ）約１ｎｍ〜２０ｎｍ、１ｎｍ〜６００ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ、１６ｎｍ、１８ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、または６００ｎｍの最大直径を有する前記細胞膜の前記摂動が、前記細胞膜上において、少なくとも約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、または１〜１０分間持続する、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
導入遺伝子をコードする発現ベクターの細胞への送達方法であって：
前記細胞及び前記発現ベクターを含有する細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記発現ベクターが通過するのに十分なほど大きい前記細胞膜の摂動を引き起こすこと；
前記発現ベクターを前記細胞内に輸送するために、少なくとも１つの電極によって生成された電場に前記細胞懸濁液を通すことを含み、
（ａ）前記細胞中に前記導入遺伝子が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞、または前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞における前記導入遺伝子の発現に比べて、より速い速度で発現する、及び／または
（ｂ）前記細胞中の前記導入遺伝子の最大発現を、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞、または前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞中の前記発現に比べて、より速い速度で達成する、及び／または
（ｃ）前記細胞中に前記導入遺伝子が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞、または前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞中の前記導入遺伝子の発現に比べて、より広範囲に発現する、及び／または
（ｄ）前記細胞懸濁液が細胞集団を含み、前記集団中の前記導入遺伝子を発現する細胞の割合が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞集団中、または前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の前記導入遺伝子を発現する細胞の割合よりも大きい、及び／または
（ｅ）前記細胞懸濁液が細胞集団を含み、前記集団中の前記導入遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞集団中、または前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の前記導入遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合よりも大きい、及び／または
（ｆ）前記細胞内で前記導入遺伝子が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞、または前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞中の前記導入遺伝子の発現よりも、より速く発現する、
前記送達方法。