【手続補正書】
【提出日】平成30年11月12日(2018.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【図１−１】骨及び軟骨はクローン性系統限定前駆細胞に由来することを示す。（Ａ）出生後３日目にタモキシフェンによる誘導後の６週齢のレインボーアクチン−Ｃｒｅ−ＥＲＴマウスの大腿骨の組織顕微鏡写真である。左側：大腿骨の成長板において存在するクローンを示す、パネルの中央に白い正方形で表された高倍率の斜めに角度を付けた長方形で表示される挿入図を備える蛍光顕微鏡法である。中央：大腿骨の成長板を示す、パネルの中央に白い正方形で表された高倍率の斜めに角度を付けた長方形の挿入図を備えるペンタクロム染色されたマウスの大腿骨の明視野像である。右側：マウス大腿骨の冠状断面の写真である。特に、黄色の破線は、大腿骨成長板を表し、紫色の破線は、骨マトリックスを表し、緑色の破線は骨髄を表す。全ての図のスケールバーは、５００μＭに相当する。（Ｂ）大腿骨成長板（最上部横型パネル）、剥離骨（中央パネル）及び骨（底部横型パネル）から機械的及び酵素消化によって単離された懸濁細胞の分布を示すＦＡＣＳプロットである。大腿骨の３種の異なる部分のうちで、［アルファＶ＋］集団は、成長板中で最も多く見られた（中央の最上部の横型パネル）。ＤＮは二重陰性であり、すなわち、Ｔｈｙ及び６Ｃ３染色に対して陰性である；［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−］。（Ｃ）実験のスキームである：アクチン−Ｃｒｅ−ＥＲＴ遺伝子導入マウスを、レインボーリポーター遺伝子マウスと交配させた。子孫のＣｒｅ組換えを、胚性１５日目（Ｅ１５）、出生後３日目（Ｐ３）及び出生後６週目にトモキシフェン注射で誘導した。（Ｄ）骨及び軟骨にわたって異なる数のクローンが存在することを示す結果のグラフ表現である。６週間の追跡期間後に、クローン領域は、単色の均一に標識付けされた領域として決定することができた（ｘ軸上に「カラー１−７」によって示されたように、７個の特有に着色されたクローンが観察された）。我々は、造血、脂肪または筋肉組織とは全く区別できる骨、軟骨及び間質細胞を捕捉するクローン領域を観察しなかったために、これらはグラフでは表現されていない。
【図１−２】骨及び軟骨はクローン性系統限定前駆細胞に由来することを示す。（Ｅ）４つのさらなる細胞表面マーカー；Ｔｈｙ、６Ｃ３、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００の差次的発現に基づく、出生後３日目の野生型Ｃ５７ＢＩ６マウスの長骨、肋骨及び胸骨から取得された［アルファＶ＋］サブセットから得られた８種の明確に区別される骨格組織サブ集団の単離のためのＦＡＣＳのゲーティング手法（ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）である。ＦＡＣＳプロットで示される細胞集団（ａ〜ｈ）は、［アルファＶ＋］サブセットから得られた８種の明確に区別される骨格組織サブ集団に相当する：ａ＝ＢＣＳＰ、ｂ＝ＢＬＳＰ、ｃ＝６Ｃ３、ｄ＝ＨＥＣ、ｅ＝ｍＳＳＣ、ｆ＝ｐｒｅ−ＢＣＳＰ、ｇ＝ＣＣＰ、ｈ＝Ｔｈｙ。（Ｆ）（上部）モバットの（Ｍｏｖａｔ’ｓ）ペンタクロムで染色されたＰ３のマウス大腿骨の組織学的分析であり、これは、骨（黄色に染色）、軟骨（青色／緑色に染色）及び骨髄（赤色に染色）を含有する。スケールバーは２００μＭに相当する。（底部）腎被膜下の細胞サブ集団移植後に、組織切片をペンタクロムで染色し：Ｐ３での骨格組織の８種のサブ集団からの２０，０００個の高度に精製された細胞を、免疫抑制状態にあるマウスの腎被膜の下に注入し、移植から３０日後に採取した（パネル「ａ」〜「ｈ」は、図１ＥのＦＡＣＳプロットに示した［アルファＶ＋］サブセット内の８種の細胞サブ集団を表す）。各移植片のペンタクロム染色された横断面は、各前駆細胞サブ集団の骨、軟骨、及び骨髄間質に限定された細胞の運命を立証している。集団ｅ［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）、ｆ［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋ＣＤ１０５−Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ２００−］、（プレ−ＢＣＳＰ）及びａ［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５＋］、（ＢＣＳＰ）は、骨、軟骨及び機能的骨髄腔からなる骨環境全体を再構築することができる。集団ｂ（ＢＬＳＰ）、ｃ（６Ｃ３）、ｄ（ＨＥＣ）、及びｈ（Ｔｈｙ）は、骨のみを形成した。集団ｇ（ＣＣＰ）は、少量の骨に加えて、軟骨を形成した。スケールバーは２００μＭに相当する。（Ｇ）外植移植片のそれぞれの組織組成比率を示すグラフである（「ａ」〜「ｈ」は、図１ＥのＦＡＣＳプロット及び図１Ｆの移植組織に相当する［アルファＶ＋］サブセット内の８種の細胞サブ集団を表す）：積み上げ縦棒グラフ内で、骨の比率は、黄色で表され、骨髄の比率は赤色で表され、また軟骨の比率は青色で表される。（Ｈ）実験のスキームである：機械的及び酵素的解離後に、［アルファＶ＋］サブセット内の８種の細胞サブ集団の２０，０００個の細胞を、Ｐ３でのＧＦＰ標識マウスの長骨から単離した。細胞をその後、上で詳説したように、ＦＡＣＳによって８種の細胞サブ集団に分画した。精製ＧＦＰ＋細胞を、次いで受容マウスの腎被膜の下に移植した。移植から１ヶ月後に、移植片を分析用に外植した。
【図２−１】ｍＳＳＣ（マウス骨格幹細胞）の特定である。（Ａ）実験のスキームである：［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（概略的にＣＤ２００＋ＴＮ、すなわちＣＤ２００＋三重陰性で示される）細胞を、機械的及び酵素的解離、抗体染色ならびにＦＡＣＳ分画後に、Ｐ３のＧＦＰ＋マウスの大腿骨から単離した。（ｉ）精製［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞を、１０％のウシ胎児血清を有するＭＥＭα培地を含有する培養プレートに播種した。培養の０日目、１１日目及び２５日目に、培養した細胞をＦＡＣＳ分析用に採取し、選別して培養増殖後の［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞サブ集団の構成細胞を決定した。ＦＡＣＳによる細胞の再分画後２５日目に、各サブセット（ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ、６Ｃ３）の２０，０００個の細胞を、受容マウスの腎被膜下に移植した。移植から１ヶ月後に、分析用に外植した。（ｉｉ）精製ＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞をまた、受容マウスの腎臓被膜下に直接移植した（先行する培養中の増殖無しに）。移植から１か月後に、移植片を、ＦＡＣＳによる分析または組織学的分析のいずれかのために外植した。（Ｂ）培養の０、１１及び２５日目の培養された［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）のＦＡＣＳ分析である（ｉ、ｉｉ）。２５日目に、インビトロ培養物をＦＡＣＳ選別し、４種のサブ集団（ｍＳＳＣ［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００+]、ＢＣＳＰ［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５＋］、Ｔｈｙ＋［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ＋６Ｃ３−ＣＤ１０５−］、及びＣ３＋［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３＋ＣＤ１０５＋］）を、腎被膜下に移植して、これらの固有の潜在能力を決定した。（ｉｉｉ）ｍＳＳＣは、骨、軟骨、及び骨髄腔（赤色ボックス）を形成した。ＢＣＳＰ（緑色ボックス）、Ｔｈｙ細胞（青色ボックス）及び６Ｃ３細胞（橙色ボックス）は、骨髄腔のない、骨のみを形成した。スケールバー（ｉｉｉ、上部パネル）は５００μｍに相当し、（ｉｉｉ、下部パネル）は、２００μｍに相当する。（Ｃ）高度に精製されたＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞が、腎被膜下に移植された移植から１ヶ月後の外殖された腎被膜移植片のＦＡＣＳ分析である。（ｉ）、（ｉｉ）外植された移植片のＦＡＣＳ分析は、外植された移植片が、７種の下流側サブ集団（青色、赤色及び橙色のボックス）からなることを明らかにした。ペンタクロム染色された外植片の明視野顕微鏡写真（（ｉｉｉ）左端、下部パネル）は、［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−Ｃ���１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）サブ集団が、骨、軟骨、及び骨髄を生成することができることを立証している。下部パネルの左端にあるペンタクロム染色されたパネルのより高倍率の蛍光画像が、図の右側に延びる紫色のボックス内に示されている。紫色のボックス内のパネルは、免疫組織化学法で観察されるように、ｍＳＳＣがＴｈｙ及び６Ｃ３を発現する細胞を生成することができることを示している（（ｉｉｉ）中央パネル；ここではＴｈｙ＝赤色、６Ｃ３＝白色で示す）。統合パネルは、底部右端にある（ｉｉｉ、底部右側パネル）。ＧＦＰ＋移植片の蛍光画像は、低倍率像（ｉｉｉ）の最上部左側パネルに示されている。スケールバーは、（ｉｉｉ、上部パネル）では５００μｍに相当し、（ｉｉｉ、下部パネル）では１００μｍに相当し、（ｉｉｉ、免疫蛍光画像）では５０μｍに相当する。
【図２−２】ｍＳＳＣ（マウス骨格幹細胞）の特定である。（Ｄ）実験のスキームである：機械的及び酵素的解離後に、ＲＦＰ＋のＰ３マウスの長骨からの細胞を単離した。これらの細胞は、ＦＡＣＳによって分画せず、フィーダー細胞として機能した。機械的及び酵素的解離後に、Ｐ３のＧＦＰ＋マウスの長骨からの細胞を単離し、ＦＡＣＳ後に［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞を得た。（ｉ）単一ＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞を５，０００個のＲＦＰ（＋）フィーダー細胞と、免疫不全マウスの腎被膜下に同時移植した。（ｉｉ）単一の精製ＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）を、９６ウェルの培養皿のウェル毎に播種した。培養の１４日後に、形成されたコロニーを計数し、採取し、ＦＡＣＳを用いて再選別して、単一の精製ＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）を、９６ウェルの培養皿のウェル毎に再度播種し、アッセイを繰り返した。（Ｅ）インビトロで、単一の［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞を９６ウェル培養皿の各ウェルに播種することによって、コロニー形成アッセイを行った。（ｉ）播種後１４日目の一次コロニーの代表的位相顕微鏡像を示す。（ｉｉ）一次コロニーの継代培養は、一次コロニーと同様な形態を有する二次コロニーの形成をもたらした（位相顕微鏡法）。（ｉｉｉ）一次コロニーは、免疫蛍光染色法後に、抗コラーゲン２型（紫色）、抗オステオカルシン（緑色）、及びＤＡＰＩ（青色）に対して陽染された（蛍光顕微鏡法）。（ｉｖ）最も右側の縦型パネルは、単離された元々の［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞（上部）、その後の一次コロニー（中央）、及び二次コロニー細胞（底部）のＦＡＣＳ分析を示す。スケールバーは、（ｉ、ｉｉ）では５００μｍに相当し、（ｉｉｉ）では１００μｍに相当する。（Ｆ）腎被膜下からの外植された（図２Ｄ（ｉ）のように）移植片の顕微鏡法である。ＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞からのインビボでのコロニー形成の範囲を、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）では黄色の破線で輪郭を描かれ、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）では黒色の破線で輪郭を描かれている。クローン的に増殖された、ＧＦＰ標識［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−６Ｃ３−ＣＤ１０５−ＣＤ２００＋］（ｍＳＳＣ）細胞は、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）においては、蛍光顕微鏡法を用いて緑色の細胞として明らかである。対応する明視野顕微鏡写真を、パネル（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）に示す。移植片の横断面の蛍光撮影画像をパネル（ｉｉｉ）及び（ｖ）に示す。ペンタクロム染色された細胞辺の対応する明視野顕��鏡写真は、クローン増殖した細胞が、骨（黄色）及び軟骨（青色）に運命付けられていることを立証している（ｉｖ及びｖｉ）。（ｖｉｉ）のグラフは、骨または軟骨形成に対するＧＦＰまたはＲＦＰ細胞による代表的な寄与（移植された細胞毎の）である。スケールバーは、（ｉ〜ｖｉ）では２００μｍに相当する。
【図２−３】ｍＳＳＣ（マウス骨格幹細胞）の特定である。（Ｇ）骨格幹細胞系統樹の概略的表現である。ｍＳＳＣは、この階層ツリーの頂点を占有し、多能性であり、自己再生可能であり、より系統に限定された前駆細胞（プレ−ＢＣＳＰ及びＢＣＳＰ）に分化することが可能である。ｍＳＳＣ、プレ−ＢＣＳＰ及びＢＣＳＰは、骨、軟骨、及び造血支援間質を生じさせることが可能である。各細胞の免疫表現型を、細胞に隣接して表示している。我々が、ＶＥＧＦ拮抗作用性が、軟骨性の運命の促進をもたらし（赤色で表示）、一方Ｗｎｔ作動性が、骨性の運命を促進し得る（緑色で表示）を観察することに留意されたい。
【図３−１】ｍＳＳＣニッチェは、他の骨格系統細胞から構成されることを示す。（Ａ）実験のスキームである：Ｐ３マウスの長骨を採取し、機械的及び酵素的解離によって細胞を単離した。細胞懸濁液をＦＡＣＳによって選別し、ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ（＋）（これはＣＣＰを包含する）、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブセット、ならびに６Ｃ３（＋）（これは６Ｃ３及びＨＥＣを包含する）を得た。次いで、細胞サブ集団をシングルセルＲＮＡシークエンシング及び後続の分析用に調製した。（Ｂ）４種の骨格幹細胞／前駆細胞サブ集団からのシングルセルＲＮＡシークエンシングデータの階層クラスタリングは、ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ（＋）及び６Ｃ３（＋）間の細胞転写発現の４種の分子的に特徴的なパターンを立証する。
【図３−２】ｍＳＳＣニッチェは、他の骨格系統細胞から構成されることを示す。（Ｃ）次の集団：（左から右までの細胞の順序）ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ（＋）、６Ｃ３（＋）のシングルセルＲＮＡシークエンシングに関するモルフォゲン、受容体または両者の転写発現の比率である。各列：ＢＭＰ２／ＢＭＰＲ１ａ、ＷＮＴ／ＦＲＺ、ＴＧＦβ３／ＴＧＦβＲ２の上から下までモルフォゲン及び同族受容体の順序で示す。ベン図は、モルフォゲンの発現率（各ベン図の左側の円）及び同族受容体の発現率（各ベン図の右側の円）を示す。モルフォゲン及びリガンドの共発現は、ベン図の重なった中央部分に示されている。これらの比率が、関連遺伝子配列を発現するアッセイされた各サブセット（ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ（＋）、６Ｃ３（＋））内の細胞の比率を示すことに留意されたい。表示されたパターンは、自己分泌シグナル伝達（左下の概略図）及びパラ分泌シグナル伝達（右下の概略図）の可能性を示す。
【図３−３】ｍＳＳＣニッチェは、他の骨格系統細胞から構成されることを示す。（Ｄ）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｍｏｎｓ（ＧＥＸＣ）解析プラットフォームを用いて決定された骨格集団中のＷｎｔ関連遺伝子の遺伝子発現レベルである（上から下まで次の順序：ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ、６Ｃ３、ＢＬＳＰ及びＨＥＣで示される）。これらの実験は、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われ、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示す。ＧＥＸＣを用いて算出された転写発現の範囲を、図の一番右よりに描写された色の変化によって示されている（すなわち、濃い紫色は非常に高い発現と相関関係付けされ、一方濃い青色は最小の発現に相関関係付けされる）。このヒートマップは、Ｗｎｔ関連リガンド（Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ）及び受容体（Ｆｚｄ５−９）の両方の高い発現を示し、Ｗｎｔシグナル伝達経路が、骨格前駆細胞機能に能動的に関与し得ることを立証している。我々はまた、細胞集団全体を通してＳＦＲＰ−２（分泌Ｆｚｄ関連タンパク質２）の高発現も確認している。Ｆｚｄはフリッツルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）受容体である。（Ｅ）リガンド−受容体相互作用マップである。骨格間質サブセットのマイクロアレイデータの遺伝子発現解析（上から下まで次の順序で示される：ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ、６Ｃ３、ＢＬＳＰ及びＨＥＣ）は、リガンドを左列に、同族受容体を右列に図示する。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示す。２つの最上部のリガンド−受容体相互作用マップは、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７が、重要な骨格形成遺伝子であり、これらの同族受容体が、骨格間質集団中で高度に発現されることを立証している。下の３つのリガンド−受容体相互作用マップは、ＴＧＦβ３、ＧＤＦ５及びＶＣＡＭ−１並びに対応する受容体の遺伝子発現を詳説する。これらのリガンド−受容体相互作用マップは、骨格間質細胞が、それら自体のニッチェとして作用し、互いにシグナル伝達して、骨格形成を促進することを立証している。連結する矢印は、可能なリガンド−受容体相互作用経路を示す。注釈：ＧＤＦは増殖及び分化因子であり、ＶＣＡＭ−１は、血管細胞接着分子−１である。（Ｆ）骨格幹細胞／前駆細胞の活性に影響を及ぼす可能性のあるシグナル伝達経路を示す図である。我々は、自己分泌及びパラ分泌シグナル伝達が、骨格幹細胞ニッチェ中で生じ、細胞活性及び維持を調節すると提議する。（Ｇ）５，０００個の新たに単離されたｍＳＳＣ（ＧＦＰ標識マウスから取得）を、様々なモルフォゲン（ＢＭＰ２、ＴＧＦβ、ＴＮＦα）と共培養した。右側の蛍光顕微鏡写真は、モルフォルゲン補充による培養後のコロニー形態を示し、��側のグラフは、異なる条件下（対照またはＢＭＰ２／ＴＧＦβ／ＴＮＦαの補充）の１４日間の培養後に存在するｍＳＳＣの数を示す。ここで、我々は、ｒｈＢＭＰ−２の補充によるｍＳＳＣの培養が、対照、すなわち、非補充の培地（蛍光顕微鏡写真の上部左側パネル）と比べて、インビトロでｍＳＳＣ集団の有意な増幅と関連付けられたことを確認している（ｐ＜０．０１、分散分析（ＡＮＯＶＡ））。ＴＧＦβまたはＴＮＦαの補充は、コロニー形態の変化をもたらした（蛍光顕微鏡写真の右側の上部及び下部パネル）。これらの結果は、ニッチェシグナル伝達が、ｍＳＳＣ増殖に影響を与え得ることを示している。スケールバーは２００μｍに相当する。
【図３−４】ｍＳＳＣニッチェは、他の骨格系統細胞から構成されることを示す。（Ｈ）図の左側のグラフは、組換え増殖因子ＢＭＰ２の滴定値の培養中のｍＳＳＣ増殖に及ぼす効果を示す。ここでは、我々は、最大増殖効果が、５０ｎｇ／ｍＬの濃度で見られることを確認している。ＢＭＰ−２の効果は、次の濃度：５０ｎｇ／ｍＬ（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）、５００ｎｇ／ｍＬ（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）のそれぞれにおいて対照よりも有意に大きかった。右側の位相画像は、ｍＳＳＣに由来する細胞のコロニーを示す（対照、５０ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬでは矢sirusi尻で表示され、５０ｎｇ／ｍＬ及び５００ｎｇ／ｍＬでは破線で表示）。スケールバーは５００μＭに相当する。（Ｉ）Ｆｏｘａ２の遺伝子発現ヒートマップが、ＦＯＸａ２遺伝子がｍＳＳＣ中でアップレギュレートされることを示している。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示す。（Ｊ）抗Ｆｏｘａ２抗体（赤色）について染色された近位大腿骨成長板の蛍光顕微鏡写真は、成長板でのｍＳＳＣの位置を可視化し、これは白色の破線によって境界が画定されている。ＤＡＰＩは青色である。スケールバーは５００μＭに相当する。（Ｋ）Ｆｏｘａ２を示す細胞内ＦＡＣＳシグナルは、ｍＳＳＣ中にタンパク質レベルで存在する。黒色ピークはｍＳＳＣシグナルであり、赤色ピークは、アイソタイプシグナルである。
【図３−５】ｍＳＳＣニッチェは、他の骨格系統細胞から構成されることを示す。（Ｌ）（左側）ｍＳＳＣの存在を示す、抗Ｆｏｘａ２抗体（赤色）について染色されたＰ３マウス近位大腿骨の蛍光顕微鏡写真である。抗６Ｃ３抗体（白色）及び抗ＴＨｙ１抗体（緑色）は、それぞれ６Ｃ３及びＴｈｙ細胞の存在を示し、ＤＡＰＩ（青色）は、ｍＳＳＣニッチェを示す。右側の統合された図は、ｍＳＳＣを取り囲むニッチェ細胞、６Ｃ３細胞（白色）及びＴｈｙ細胞（緑色）で明らかであるように、ｍＳＳＣが、大部分が成長板に存在することを示す。スケールバーは、（左端）は２００μｍに相当し、（左端）は５００μｍに相当する。
【図４】軟骨細胞系統は、骨形成を受けるために骨芽細胞によって誘導され得ることを示す。（Ａ）実験のスキームである：機械的及び酵素的解離、その後ＦＡＣＳによる分画後に、ＢＣＳＰを、Ｐ３でのＧＦＰ＋マウスの大腿骨から単離し、ＣＣＰ（委託軟骨前駆細胞）細胞を、ＲＦＰ＋成体マウスの耳／胸骨から単離し、その後ＦＡＣＳによって分画化した。精製したＧＦＰ＋ＢＣＳＰ及びＲＦＰ＋ＣＣＰを、免疫抑制状態にある受容マウスの腎被膜の下に、分泌フリッツルド受容体２、ＳＦＲＰ−２を伴いまたこれを伴わずに同時移植した。ＲＦＰ＋ＣＣＰ単独の移植は、対照として機能した。移植から１ヶ月後に、全ての移植片を分析用に取り出した。（Ｂ）ＣＣＰ前駆細胞サブ集団の２０，０００個のＲＦＰ標識細胞が腎被膜中に移植され、１ヶ月後に外植された（図４Ａに詳説されたように）外植移植片の顕微鏡法である。白色の点線は、形成された移植片の範囲の輪郭を描いている。外植移植片の蛍光顕微鏡写真は、ＲＦＰ＋移植片の存在を立証している（上部左側）。対応する明視野顕微鏡写真が、上部右側パネルに示されている。モバットペンタクロム（骨を黄色で染色し、軟骨を青色で染色し、骨髄を赤色で染色する）で染色された横断面は、青色の染色で示されるように、ＲＦＰ標識ＣＣＰ細胞が軟骨を形成することを立証している。（蛍光顕微鏡写真：底部左側、明視野顕微鏡写真：底部右側）。スケールバーは、（上部パネル）では５００μｍに相当し、（下部パネル）では２００μｍに相当する。（Ｃ）２０，０００個のＲＦＰ標識ＣＣＰ細胞が２０，０００個のＧＦＰ標識ＢＣＳＰ細胞と腎被膜下に同時移植され、１ヶ月後に外植された（図４Ａに詳説されたように）、外植移植片の顕微鏡法である。その後形成された移植片は、白色点線（移植片のＲＦＰ＋部分を示す）及び黄色実線（移植片のＧＦＰ＋部分を示す）によって輪郭が描かれている（上部左側）。対応する明視野顕微鏡写真は、上部右側パネルに示されている。モバットペンタクロムで染色された横断面は、黄色の染色で示されるように、ＲＦＰ標識ＣＣＰ細胞及びＧＦＰ標識ＢＣＳＰの両方が軟骨を形成することを立証している。（蛍光顕微鏡写真：底部左側、明視野顕微鏡写真：底部右側）。スケールバーは、（上部パネル）は５００μｍに相当し、（下部パネル）は２００μｍに相当する。（Ｄ）１０８／１０９単位の可溶性フリッツルド関連タンパク質２（ＳＦＲＰ−２）をコードするアデノウイルスベクターで前処理された、２０，０００個のＲＦＰ標識ＣＣＰ細胞が、２０，０００個のＧＦＰ標識ＢＣＳＰ細胞と腎被膜下に同時移植された（図４Ａに詳説されたように）、外植移植片の顕微鏡法である。１ヶ月後に採取された得られた移植片が示されている。蛍光顕微鏡写真（上部左側）は、ＧＦＰ＋集団（黄色実線の範囲内）及びＲＦＰ＋集団（白色点線の範囲内）を輪郭で描いている。対応する明視野顕微鏡写真は、（上部右側パネル）に示されている。横断面の顕微鏡写真は、底部パネルに示されている。移植片の横断面の蛍光顕微鏡写真が示され（底部左側）及びもバットペンタクロムによる個の断面の染色を示す明視野顕微鏡写真（底部右側）は、青色の染色で示されるように、ＲＦＰ標識ＣＣＰ細胞は軟骨を形���したが、ＧＦＰ標識ＢＣＳＰは、黄色の染色で示されるように、骨を形成することを立証している。スケールバーは、（上部パネル）では５００μｍに相当し、（下部パネル）では２００μｍに相当する。
【図５−１】ｍＳＳＣにおける軟骨の運命は、微小環境におけるＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の不在下で促進されることを示す。（Ａ）実験のスキームである：機械的及び酵素的解離、その後ＦＡＣＳによる分画後に、ｍＳＳＣをＰ３マウスから単離した。次いで、Ｅ１４．５マウスから単離した無傷の前骨形成大腿骨または２０，０００個のｍＳＳＣのいずれかを、ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の全身的阻害を伴いまたそれを伴わず、免疫不全受容マウスの腎被膜の下に移植した。ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の阻害を試験するために、可溶性ＶＥＧＦＲ１細胞外ドメインをコードするアデノウイルスベクター（Ａｄ  ｓＶＥＧＦＲ１）を、腎被膜移植の２４時間前に、指定された受容マウスに静脈内送達し、このＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の強力な拮抗作用物質の循環系における全身放出をもたらした。陰性対照については、免疫グロブリンＦｃ断片をコードするＡｄ  Ｆｃを用いた。（Ｂ）ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の全身阻害は、無傷の前骨形成胎児骨またはｍＳＳＣのインビボでの軟骨形成分化をもたらす。無傷の胎児骨またはｍＳＳＣを、Ａｄ  ｓＶＥＧＦＲ１で前処理された免疫抑制状態にあるマウスの腎被膜の下に移植した。移植片を１ヶ月後に外植した。外植移植片の明視野顕微鏡写真が、上部パネルから第１及び第３列に示されている（対照、Ａｄ  Ｆｃを左側パネルに、処理されたＡｄ  ｓＶＥＧＦＲ１を右側パネルに示す）もバットペンタクロム染色で染色された代表的断面が、上部パネルから第２及び第４列目に示されている（上２列：無傷の胎児骨、下２列：ｍＳＳＣ）。ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の阻害は、軟骨の形成（青色）（右側）をもたらし、同時にＡｄ  Ｆｃ群が骨を形成した（黄色）（左側）。スケールバーは、（無傷胎児骨、上部パネル）では５００μｍに相当し、（無傷胎児骨、底部パネル）では１００μｍに相当し、（ｍＳＳＣ、上部パネル）では５００μｍに相当し、（ｍＳＳＣ、下部パネル）では２００μｍに相当する。（Ｃ）（Ｃ）Ａｄ  ｓＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦシグナル伝達の拮抗作用）またはＡｄ  Ｆｃ対照の存在下でのｍＳＳＣ／胎児骨移植の運命のグラフ表現である。ここでは、我々は、全身的ＶＥＧＦ拮抗作用の存在下での軟骨の運命の促進を確認している。（Ｄ）ＧＥＸＣを用いて、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を、６種の骨格前駆細胞サブ集団で決定した（ｍＳＳＣ、ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ、６Ｃ３、ＢＬＳＰ及びＨＥＣが上から下に列記される）。ｍＳＳＣ及びその下流の子孫の遺伝子発現解析は、Ｆｌｔ１、Ｋｄｒ、及びＦｌｔ４などの従来のＶＥＧＦ受容体をほとんど発現しないが、これとは対照的に、ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦ受容体ホモログのＮｒｐ１及びＮｒｐ２の高発現を明らかにしている。骨格幹細胞／前駆細胞は、ＶＥＧＦＡまたはＶＥＧＦＢを発現しないが、ＶＥＧＦＣ及びＰＩＧＦを発現する。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。
【図５−２】ｍＳＳＣにおける軟骨の運命は、微小環境におけるＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の不在下で促進されることを示す。（Ｅ）実験のスキームである：ｍＳＳＣを、Ｐ３のＣ５７ＢＬ６野生型マウスの長骨から単離した。これらの細胞を、組換えタンパク質の存在下で培養した。４つの実験群と１つの対照が存在した。実験群は、次の可溶性組換えタンパク質：（Ｉ）ＮＲＰ１、（ＩＩ）ＰＩＧＦ、（ＩＩＩ）ＶＥＧＦ及び（ＩＶ）ＶＥＧＦＲ１で１週間にわたって処理され、その後、鼠径部脂肪体の皮下脂肪に移植された。移植片をその後、組織学的分析用に３週間にわたって外植した。（Ｆ）移植から３週間後に、図５Ｅの説明文に記載されているように、組織学的分析用に外植した。試料は、対照（処理なし）、ＰＩＧＦ、ｓＮＲＰ１、ＶＥＧＦＡ、ｓＶＥＧＦＲ１の順序で左から右に列記される。移植片のそれぞれの肉眼で見える外観の写真が上部パネルで示されており、これらの移植片のそれぞれは、赤味を帯びた外観を有することに留意されたい（同様に、試料は、対照、ＰＩＧＦ、ｓＮＲＰ１、ＶＥＧＦＡ、ｓＶＥＧＦＲ１の順序で左から右に列記される）。モバットペンタクロムで染色された外植した移植片の明視野画像である（同様に、試料は、対照、ＰＩＧＦ、ｓＮＲＰ１、ＶＥＧＦＡ、ｓＶＥＧＦＲ１の順序で左から右に列記される）。ここで、我々は、移植片の全てが、優勢に骨及び骨髄を生じさせることを確認している。ＰＩＧＦ、ｓＮＲＰ１、ＶＥＧＦ、ｓＶＥＧＦＲ１で処理されたｍＳＳＣは、少量の軟骨と共に、骨及び骨髄を生じさせる。スケールバーは、（上部パネル）では１ｍｍに相当し、（底部パネル）では２００μｍに相当する。
【図６−１】ＢＭＰ経路の巧みな操作が、骨外性領域におけるｍＳＳＣのデノボ（新規）形成を誘導し得ることを示す。（Ａ）３μｇの凍結乾燥組換えＢＭＰ２を含有するコラーゲンスポンジを、Ｃ５７ＢＬ６野生型マウスの骨外性部位に、腎被膜の下または鼠径部脂肪体の皮下のいずれかに配置した。１ヶ月後に、移植片を分析用に外植した（左側パネル）。腎被膜移植を上部に示し、皮下移植を下部に示した外植片の明視野画像である（右側パネル）。モバットペンタクロムで染色された横断面は、誘導された骨質類骨が骨髄腔内に充満したこと（赤色染色によって示されるように）を立証した。スケールバーは、（左側パネル）では５００μｍに相当し、（右側パネル）では２００μｍに相当する。（Ｂ）骨外性部位におけるＢＭＰ２誘導によって形成された類骨内の存在する細胞のＦＡＣＳ分析は、マウスの「正常な」成体大腿骨におけるＨＳＣ生着の通常の頻度（右端のＦＡＣＳプロット上の緑色集団によって表示）と同様な、循環ＳｌａｍＦ１陽性ＨＳＣによる高レベルの生着（右端のＦＡＣＳプロット上の緑色集団によって表示）を明らかにしている（上部横型パネル）。（Ｃ）（左側パネル）骨外性部位への配置後１０日目でのＢＭＰ２添加コラーゲンスポンジの外植の後に、移植片中に存在する構成細胞集団のＦＡＣＳ分析は、ｍＳＳＣ（ＦＡＣＳプロット上の赤色ボックスによって表示）及びＢＣＳＰ（ＦＡＣＳプロット上の緑色ボックスで表示）が、ＢＭＰ２処理外植片中で容易に検出可能であることを明らかにしている。（右側パネル）これとは対照的に、ＢＭＰ２不在下での脂肪組織のＦＡＣＳ分析は、ｍＳＳＣ（ＦＡＣＳプロット上の赤色ボックスによって表示）またはＢＣＳＰ（ＦＡＣＳプロット上の緑色ボックスで表示）のいずれも検出しない。スケールバーは、５００μｍに相当する。
【図６−２】ＢＭＰ経路の巧みな操作が、骨外性領域におけるｍＳＳＣのデノボ（新規）形成を誘導し得ることを示す。（Ｄ）異所性骨格前駆細胞がＢＭＰ２誘導骨格委託によって元の場所で形成されるかどうか、またはＢＭＰ２が骨組織によって動員された循環骨格前駆細胞の移動を促進するかどうかを決定するために、我々は、並列結合体（ｐａｒａｂｉｏｎｔ）モデルを実施し、ＢＭＰ２移植片中の骨格前駆細胞の起源を決定した。ＧＦＰ標識マウスを非蛍光の野生型マウスとペアリングし、その後外科的に融合させた。手術後２週間目に、野生型マウスの循環血液中に存在するＧＦＰ標識抹消血液細胞の一部を測定することによって、生理学的キメラ性を確認した。３μｇの凍結乾燥組み換えＢＭＰ２を含有するコラーゲンスポンジを野生型マウスの鼠径部脂肪体に移植し、異所性骨形成を誘導した。移植から１０日後に、我々は、組織を外植し、機械的及び化学的解離を実行して、異所性骨組織の構成細胞集団を単離した。次いで、我々は、ＦＡＣＳ分析を描写する横型上部パネル（すなわち、ＧＦＰ＋＝循環細胞、及び非蛍光＝局所細胞）に示されるように、ＦＡＣ分析によって、ＧＦＰ標識細胞の非ＧＦＰマウスにおける異所性骨形成への寄与をアッセイした。我々は、採取時に移植編中に豊富なＧＦＰ標識細胞を検出したが、移植片に寄与するＧＦＰ標識細胞は、ＣＤ４５（＋）造血細胞のみであって（上部及び下部の左端パネル）、骨格前駆細胞集団と一致しなかった（横型パネル、ｍＳＳＣ集団は、右端の赤色ボックスで示される）。採取時に外植された組織中に存在する骨格前駆細胞集団は、完全にＧＦＰ陰性であって、これは、循環骨格前駆細胞が、ＢＭＰ２誘導異所性骨に寄与しなかったことを示唆している[右端のＦＡＣＳプロット中に存在する緑色細胞は、ＧＦＰ標識細胞を代表しない]。
【図６−３】ＢＭＰ経路の巧みな操作が、骨外性領域におけるｍＳＳＣのデノボ（新規）形成を誘導し得ることを示す。（Ｅ）（左側パネル）リポーター遺伝子のマウスモデルの図は、Ｔｉｅ２発現が、ＧＦＰ発現をもたらすことを示している。その結果、Ｔｉｅ２＋細胞は緑色に変わるが、Ｔｉｅ２−細胞は赤色のままである。（右側パネル）実験のスキームである：ｍＳＳＣへのＢＭＰ−２仲介初期化を受けることができる細胞型を決定するために、我々は、Ｔｉｅ２Ｃｒｅ×ＭＴＭＧリポーターマウスを実施し、３μｇの凍結乾燥組み換えＢＭＰ２を含有するコラーゲンスポンジを鼠径部脂肪体の皮下脂肪中に配置した。１ヶ月後に、分析用に小骨を外植した。（Ｆ）組織切片の蛍光顕微鏡写真は、ＢＭＰ−２誘導小骨（黄色の破線で表示）が、目に見える細管を有するＧＦＰ＋Ｔｉｅ２＋誘導骨細胞及びＴｉｅ２陰性ＲＦＰ標識骨細胞の両方を明確に組み込むことを示し、したがって、Ｔｉｅ２陽性及びＴｉｅ２陰性系統が両方ともにＢＭＰ２誘導骨格初期化を受けることができたことを示唆している。白線で表示されるＡｒｅは、右端のボックス内に高倍率で示され、これは、（ＲＦＰ＋）Ｔｉｅ２−細胞の存在下での（ＧＦＰ＋）Ｔｉｅ２＋細管の存在を示している。スケールバーは、（左パネル）では５００μｍに相当し、（右パネル）では５０μｍに相当する。
【図７−１】ＢＭＰ２及びＶＥＧＦ阻害物質の同時送達が、脂肪組織中の軟骨のデノボ形成を誘導するために十分であることを示す。（Ａ）実験のスキームである：ＢＭＰ２及び可溶性ＶＥＧＦＲ１をその場で脂肪細胞に同時送達する。ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦシグナル伝達の阻害を加えたＢＭＰ２は、脂肪組織の軟骨形成分化をもたらす。ＢＭＰ２単独（すなわち、ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦの阻害を含まない）は、骨形成分化をもたらす。（Ｂ）ＶＥＧＦＲ遮断がない（左側パネル）またはＶＥＧＦ遮断を備えた（右側パネル）ＢＭＰ２を含有する皮下コラーゲンスポンジは、移植片の運命を示す。全身的／局所的ＶＧＦＲ遮断を含む／含まない３μｇの凍結乾燥組み換えＢＭＰ２を含有するコラーゲンスポンジの配置後１ヶ月目に、移植片を分析用に外植した。移植片の明視野画像(左側）は、モバットペンタクロムで染色された代表的切片（右側）と並んで示されている。ＢＭＰ２及びＶＥＧＦＲの同時送達は、青色に染色される軟骨の形成をもたらした（上部及び下部の右端パネル）。ＶＥＧＦ遮断後の結果は、右側の上部連続図に示され、一方局所的ＶＥＧＦ遮断は、右側の底部連続図で示されている。スケールバーは、（パネルが右から左に移動して）、（右端）１ｍｍ、（右内側）２００μｍ、（左内側）１ｍｍ、（左端）２００μｍに相当する。
【図７−２】ＢＭＰ２及びＶＥＧＦ阻害物質の同時送達が、脂肪組織中の軟骨のデノボ形成を誘導するために十分であることを示す。（Ｃ）誘導された軟骨（上部横型パネル）（図７Ａに示した実験スキーム）の構成細胞のＦＡＣＳプロット分析の年齢適合ＦＡＣＳプロット分析したマウスの耳軟骨から新たに単離された細胞のＦＡＣＳプロット分析（底部横型パネル）は、誘導された軟骨組織及び天然の軟骨組織の両方の大部分が、ＣＣＰ（委託軟骨前駆細胞）サブ集団の範囲内にあることを立証している。（Ｄ）脂肪生成集団におけるＢＭＰ２及びＶＥＧＦ／ＰＩＧＥシグナル伝達経路に関連するリガンド及び受容体についての遺伝子発現である（上部：リガンド、下部：受容体）。（Ｔ＋Ｐ＋：ＣＤ４５（−）Ｔｉｅ２（＋）ＰＤＧＦＲ<（＋）、Ｔ−Ｐ＋：ＣＤ４５（−）Ｔｉｅ２（−）ＰＤＧＦＲ<（＋））。（Ｅ）脂肪生成集団におけるＳｏｘ９（骨形成タンパク質−２誘導軟骨形成の転写因子）、Ｒｕｎｘ２（破骨細胞形成のための重要な転写因子）、Ｓｐ７（骨芽細胞分化及び骨形成に必要とされる骨特異的転写因子）、及びＦｏｘａ２遺伝子についての遺伝子発現である（右側）。（Ｔ＋Ｐ＋：ＣＤ４５（−）Ｔｉｅ２（＋）ＰＤＧＦＲ<（＋）、Ｔ−Ｐ＋：ＣＤ４５（−）Ｔｉｅ２（−）ＰＤＧＦＲ<（＋））。
【図８−１】出生後のクローン増殖が、骨、軟骨及び乾漆の運命に制限されることを示す。（Ａ）レインボー定量化スキームである：示された蛍光画像は、Ｐ３マウスの大腿骨成長板のものである。クローン（＞／＝５個の単色の一致する細胞）が、白色破線で示されている。画像中で１〜５の番号付けされた５色の組み合わせが示されている。クローンの定義は、下部右側に示される。スケールバーは１００μｍに相当する。（Ｂ）実験のスキームである：アクチン−Ｃｒｅ−ＥＲＴ遺伝子導入マウスをレインボーリポーター遺伝子マウスと交配した。子孫のＣｒｅ組み換えを、胚性１５日目（Ｅ１５）、出生後３日目（Ｐ３）及び出生後６週目にトモキシフェン注射で誘導させた。大腿骨組織を誘導後６週間で採取した。
【図８−２】出生後のクローン増殖が、骨、軟骨及び乾漆の運命に制限されることを示す。（Ｃ）誘導後異なる時点での大腿骨成長板の顕微鏡写真である（左側の縦型パネル（ｉ）、（ｉｉ）：Ｅ１５での誘導；中央パネル（ｉｉｉ）、（ｉＶ）：Ｐ３での誘導；右側の縦型パネル（ｖ）、（ｖｉ）：６週目での誘導）。矢尻は、クローンが存在することを立証している。クローン領域における緩やかな減少が誘導から６週後にあったことに留意されたい。白色の破線の長方形によって示された領域の高倍率の挿入図は、示された対応する図：（ｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｉｖ）の挿入図で示されている。スケールバーは、５００μｍに相当する。
【図８−３】出生後のクローン増殖が、骨、軟骨及び乾漆の運命に制限されることを示す。（Ｄ）６週齢のアクチン−Ｃｒｅ／レインボーマウスを、出生後３日目（Ｐ３）においてタモキシフェンによって誘導し、６週目に殺処分した。（ｉ）（ａ）成長板、（ｂ）骨髄、（ｃ）脂肪及び（ｄ）血管系に対応する領域を有する、大腿骨の近位セグメントの低電力図である。代表的な高倍率パネルは、大腿骨成長板（ｉｉ）、（ｉｉｉ）；骨髄（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）；脂肪（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）；及び血管（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｉ）を表示する。蛍光顕微鏡写真は、各クローンが同色の細胞の積層として出現する状態で、ただ１つの部位−すなわち成長板（ｉｉ）における細胞のクローン領域を立証している。骨髄間質（ｉｖ）、脂肪（ｖｉｉ）、及び血管系（ｘ）で示される顕著なクローン領域（同色の細胞の積層として描かれるであろう）は存在しない。パネル（ｖｉ）、（ｘｉｉ）及び（ｉｘ）で示すように、組織切片中のＨＳＣ、血管及び脂肪を、それぞれ抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３１、及び抗ペリリピンＡで免疫染色した。注釈：画像（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、及び（ｘ）：蛍光顕微鏡法；画像（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、（ｘｉ）：ペンタクロム染色後の明視野顕微鏡法。スケールバーは、（ｉ）５００μｍに相当し、（ｉｉ〜ｉｘ）５０μｍ、（ｘ、ｘｉ、ｘｉｉ）２００μｍに相当する。
【図８−４】出生後のクローン増殖が、骨、軟骨及び乾漆の運命に制限されることを示す。（Ｅ）アクチンＣｒｅ／レインボーマウスをＰ３で誘導し、６週間後に採取した。（ｉ）胸骨の明視野画像である。（ｉｉ）蛍光顕微鏡写真は、同色の細胞の積層によって再度示されたクローンを有する胸骨を示す。（ｉｉｉ）白色ボックスによって表示された指の骨の高倍率挿入図である。スケールバーは、（ｉ、ｉｉ）では５００μｍに相当し、（ｉｉｉ−ｖ）では２００μｍに相当する。
【図８−５】出生後のクローン増殖が、骨、軟骨及び乾漆の運命に制限されることを示す。（Ｆ）アクチンＣｒｅ／レインボーマウスをＰ３で誘導し、６週間後に採取した。（ｉ）肋骨の明視野画像である。（ｉｉ）蛍光顕微鏡写真は、同色の細胞の積層によって再度示されたクローンを有する肋骨を示す。（ｉｉｉ）白色ボックスによって表示された指の骨の高倍率挿入図である。スケールバーは、（ｉ、ｉｉ）では５００μｍに相当し、（ｉｉｉ）では５０μｍに相当する。
【図８−６】出生後のクローン増殖が、骨、軟骨及び乾漆の運命に制限されることを示す。（Ｇ）アクチンＣｒｅ／レインボーマウスをＰ３で誘導し、６週間後に採取した。（ｉ）足全体の明視野画像である。（ｉｉ）蛍光顕微鏡写真は、同色の細胞の積層によって再度示されたクローンを有する足を示す。（ｉｉｉ）白色ボックスによって表示された指の骨の高倍率挿入図である。スケールバーは、（ｉ、ｉｉ）では１ｍｍに相当し、（ｉｉｉ）では２００μｍに相当する。
【図９−１】損傷によって誘導された局所的ｍＳＳＣ増殖を示す。（Ａ）実験のスキームである：８週齢の野生型マウスの下肢において安定化大腿骨横中骨幹部骨折を作り出した。その後、大腿骨カルスを３日目／１週目／３週目に採取し、機械的及び酵素的解離によって構成細胞を単離した。次いで、細胞を染色し、ＦＡＣＳによって分画化した。左側大腿骨は損傷されておらず、その代わりに非骨折対照として作用した。非損傷大腿骨及び損傷した大腿骨からのｍＳＳＣを、次いで免疫不全マウスの腎被膜下に移植し、１ヶ月後に、組織学的分析用に外植した。（Ｂ）非損傷の無傷の大腿骨及び大腿骨カルス中に存在するｍＳＳＣの異なる時点での数を示す棒グラフである。これは、１週目にｍＳＳＣの数の著しい増加、その後の骨折治癒の後期（３週目）における骨折カルス中のベースラインのｍＳＳＣの数の復帰を示している。この観察は、骨損傷に応答して生じるｍＳＳＣの積極的な増殖を支援する（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。各試料の分析された１００，０００個の細胞当たりのｍＳＳＣの数が、ｘ軸の下に表示されている。（Ｃ）（左側パネル）２０，０００個のｍＳＳＣを、骨折後１週目にカルスから（上部）及び非損傷の大腿骨から（底部）新たに単離した。細胞を骨形成分化培地の存在下で２週間培養し、次いでアリザリンレッド染色に曝した。ここで、我々は、非損傷の大腿骨から単離したものに比べて、骨折微小環境から得たｍＳＳＣの有意に強いアリザリンレッド染色を認め、これは、損傷後のｍＳＳＣの増強された骨形成能力を示唆している（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。（右側パネル）増殖した移植片の明視野画像であり、（上部）骨折細胞から単離したｍＳＳＣの移植から得られた組織であり、（底部）非損傷大腿骨から単離したｍＳＳＣの移植から得た組織である。スケールバーは、（左側パネル、インビトロ）では５００μｍに相当し、（右側パネル、インビボ）では１ｍｍに相当する。
【図９−２】損傷によって誘導された局所的ｍＳＳＣ増殖を示す。（Ｄ）次の試料：（ｉ）骨折後１週目の非商社の大腿骨、（ｉｉ）骨折後１週目の照射された大腿骨、（ｉｉｉ）非照射の非損傷大腿骨、（ｉｖ）照射された非損傷大腿骨中に存在するｍＳＳＣの数を示す棒グラフである。これは、非照射の対照と比べて、照射後に骨折された後１週目で見られたｍＳＳＣの数の有意な減少を示している（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。これはまた、非照射の対照と比べて、照射後に非損傷の大腿骨中のｍＳＳＣの数の有意な減少も示している（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。これは、照射がｍＳＳＣの増殖を低減することを示している。
【図１０】ｍＳＳＣ子孫が、全身的シグナルを親ｍＳＳＣに変換することを示す。（Ａ）ｍＳＳＣの下流の前駆細胞サブ集団で、具体的にはＴｈｙ及びＢＬＳＰサブ集団で発現されることが見出されているＢＭＰ拮抗作用物質のグレムリン−２及びノギン（それぞれ、右側上部及び底部）の遺伝子発現レベルを示すリガンド−受容体相互作用マップである。我々は、ＢＭＰ２経路の拮抗作用物質を発現することが見出されている、前駆細胞の下流の同じサブ集団、Ｔｈｙ及びＢＬＳＰ（左側上部及び底部パネル）上で全身的ホルモンのレプチン及びチロイド刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する受容体の遺伝子発現の増加が存在することにも注目する。左側及び右側パネルをそろって見ると、リガンド−同族受容体相互作用のグラフは、全身的ホルモンのレプチン及びＴＳＨ受容体を通してのシグナル伝達が、ＢＭＰ２拮抗作用による（グレムリン２、ノギンを介しての）ｍＳＳＣ増殖及び後続の骨格間質集団中の骨形成に対するシグナルの阻害を生じ得ることを立証している。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（Ｂ）１０，０００個のｍＳＳＣを、多種多様な条件下で培養した：通常の培地（対照）、組換えレプチンタンパク質で処理された、または処理されていないＴｈｙサブ集団からの調整培地（ＣＭ）（Ｔｈｙ  ＣＭ＋レプチン／Ｔｈｙ  ＣＭ−レプチン）及び組換えレプチンタンパク質で処理された、または処理されていないＢＬＳＰ集団からのＣＭ（ＢＬＳＰ  ＣＭ＋レプチン／ＢＬＳＰ  ＣＭ−レプチン）。ここで、我々は、レプチンなしで培養されたＴｈｙ及びＢＬＳＰの両方からのＣＭが、対照と比較してｍＳＳＣの増殖を低減することに注目している。しかしながら、レプチンを含んで培養されたＴｈｙ及びＢＬＳＰの両方からのＣＭは、対照またはレプチンで処理されない細胞からのＴｈｙ／ＢＬＳＰサブ集団ＣＭと比較して、ｍＳＳＣの増殖をさらに低減する。したがって、レプチンシグナル伝達は、インビボでのｍＳＳＣの増殖能力を低減する。（Ｃ）骨格間質集団中のレプチン（左側）及びその受容体（右側）遺伝子発現レベルである。リガンドの発現陰性、しかしその受容体の高発現は、レプチンが本質的に備わっていることを暗示する。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（Ｄ）１０，０００個の新たに単離したＴｈｙ細胞を、インビトロで、組換えレプチン（１μｇ／ｍL）で補充したまた補充していない無血清培地中で培養し、その後、播種後１４日目にｑＲＴＰＣＲ用に採取した。組換えレプチンで処理したまたは処理していないＴｈｙサブセット中のノ���ン、グレムリン２及びレプチン受容体についての相対的遺伝子発現レベルをグラフに示す。このグラフは、レプチンの存在下で培養されたＴｈｙサブセットが、ノギン、グレムリン２及びレプチン受容体の転写発現のアップレギュレーションをもたらすことを立証しており、したがって、全身循環と骨格前駆細胞サブ集団との間に関連が存在し得るという我々の仮説を強固なものにする。（ｉｉ）レプチンの補充なしで培養されたＴｈｙ細胞の免疫組織化学法である。赤色染色は、グレムリン２の発現を示す。（ｉｉｉ）レプチンを補充されて培養されたＴｈｙ細胞の免疫組織化学法である。赤色染色は、グレムリン２の発現を示す。ここで、我々は、培地のレプチン（１μｇ／ｍＬ）による補充後のグレムリン２の発現の増加を確認することができている。スケールバーは１００μｍに相当する。（Ｅ）ｍＳＳＣ機能に影響を及ぼす提案された経路の概略である。レプチンは、循環する全身的因子であり、Ｔｈｙ及びＢＬＳＰ細胞上に存在するレプチン受容体を活性化し、これが、Ｔｈｙ及びＢＬＳＰ細胞によるグレムリン２及びノギンの発現をもたらし（図３Ｄを参照）、これが、ＢＭＰ−２シグナル伝達及びその後のＢＭＰ２誘導ｍＳＳＣ増殖を拮抗作用する。これとは対照的に、ｍＳＳＣ増殖は、ＢＭＰ−２を通して促進される。
【図１１】ｍＳＳＣにおけるＴｇｆβ拮抗作用促進軟骨形成を示す。（Ａ）実験のスキームである：ｍＳＳＣをＰ３のＣ５７ＢＬ６野生型マウスの長骨から単離した。これらの細胞を、組み換えタンパク質の存在下で培養した。２つの実験群及び１つの対照がある。実験群は、鼠径部脂肪体の皮下脂肪への移植前１週間にわたって以下の可溶性組換えタンパク質で処理された：（ｉ）ＴＧＦβ、（ｉｉ）ＴＧＦβＲ。その後、移植片を、組織学的分析用に３週目に外植した。（Ｂ）（左側パネル）ＴＧＦβで前処理されたｍＳＳＣである。上部に、外植での移植片の写真を見ることができる。下部では、ペンタクロム染色された組織学的標本を見ることができ、これは全体の骨または軟骨形成を示していない。（右側パネル）ＴＧＦβＲで前処理されたｍＳＳＣである。上部に、外植での移植片の写真を見ることができる。下部では、ペンタクロムで染色された外植組織の明視野画像を見ることができ、これは、わずかな骨形成を伴い、大部分が軟骨（青色）と一致する外植移植片を示す。スケールバーは（上部パネル）では１ｍｍに相当し、（下部パネル）では２００μｍに相当する。
【図１２】骨格サブセット上の遺伝子発現のヒートマップである。（Ａ）造血を支援するために必須であるＣ−Ｋｉｔ、ＩＬ−３及びＩＬ−９リガンドを骨格間質サブセット上で発現させる。グラフは、骨格間質と造血細胞との間のリガンド−同族受容体相互作用を立証している。（注釈：ＭＥＰ＝巨核球・赤血球前駆細胞、ＧＭＰ＝顆粒球マクロファージ前駆細胞、ＣＬＰ＝リンパ球系共通前駆細胞）。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（Ｂ）骨格ニッチェと造血ニッチェとの間の提案された相互作用の図は、骨格間質細胞が調節分子及びサイトカインを、それぞれ局部ニッチェ及び造血ニッチェに分泌することを示している。これらのシグナル伝達分子は、ｍＳＳＣ及びＨＣＳの両方の増殖及び分化に関与する。
【図１３】Ｍｘ１のＣｒｅ標識細胞がｍＳＳＣ集団を包含することを示す。（Ａ）実験のスキームである：Ｍｘ１−Ｃｒｅ−ＥＲＴマウスをＥ１５において誘導させた。Ｐ３において、大腿骨を採取し、機械的及び酵素的解離、その後のＦＡＣＳ分画化後に、細胞を単離した。（Ｂ）ＦＡＣＳゲーティング戦略は、ｍＳＳＣが、Ｍｘ１−Ｃｒｅ発現細胞中に存在することを示している。これは、Ｍｘ１標識細胞が、間葉系前駆細胞に対する非特異的マーカーであることを立証している。Ｍｘ１発現細胞（ＧＦＰ＋）は、ＣＤ４５＋、Ｔｉｅ２＋、及び[アルファＶ＋]サブセット内で特定される。［ＣＤ４５（−）Ｔｅｒ１１９（−）Ｔｉｅ２（−）アルファＶ（＋）Ｔｈｙ（−）６Ｃ３（−）］集団（ｍＳＳＣを含む）の細胞の１２．６％がＭｘ１−Ｃｒｅ陽性であって、これは、図の右端からの第２のＦＡＣＳプロットでの底部パネルで立証される。
【図１４−１】ｍＳＳＣ異種性が、骨格構造における差を反映することを示す。（Ａ）マウス骨格構造の図は、骨の異なる形状及び寸法を例示する。番号付けされた骨を採取し、機械的及び酵素的に解離し、ＦＡＣＳ分析用に染色し、各骨サブセットから単離された１００万個の細胞中に存在するｍＳＳＣの数を特定した。（Ｂ）棒グラフは、各々の単離された骨からの１００万個の細胞中に存在するｍＳＳＣの数を立証する。ｍＳＳＣの相対的数は、全ての骨サブタイプにわたって均一ではなく、附属肢骨格の遠位構成要素で増加する傾向性が高い。（Ｃ）表は、異なるマウスの骨から単離されたｍＳＳＣのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数を示す。各骨サブセットから５００個の二重選別されたｍＳＳＣを、１０％のＦＢＳを補充されたＭＥＭα培地を含む１０ｃｍの組織培養皿に播種し、ＣＦＵを１４日後に計数した。ここで、我々は、異なる骨サブタイプにわたるコロニー形成に対する異種性収容能力を再度確認している。
【図１４−２】ｍＳＳＣ異種性が、骨格構造における差を反映することを示す。（Ｄ）培養後１４日目に４０×で示す形成されたコロニーの位相顕微鏡画像である。異なる骨によって形成されたコロニーの携帯において全体的異種性の証拠がある。スケールバーは２００μｍに相当する。（Ｅ）播種後１４日目にＣＦＵを計数した後に、細胞を染色し、ＦＡＣＳによって分析し、構成細胞がコロニー中に存在することを決定した。各骨サブセットから形成されたコロニーの分析は、それが単離された骨のタイプに応じて、ｍＳＳＣについての差異的潜在能力における異種性を立証している。（Ｆ）２つの時点における各骨サブセットからの４種のサブ集団（アルファＶ＋、Ｔｈｙ、６Ｃ３及び二重陰性（ＤＮ）＝Ｔｈｙ−６Ｃ３−）の細胞計数は、各サブ集団の増殖速度もまた、細胞の起源に応じて変化することを暗示している。
【図１５−１】提案されたシグナル伝達経路がｍＳＳＣ及び子孫に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）３種の異なる実験条件下（通常の培地のＢＭＰ２（０．１μｇ／ｍＬ）／ノギン（１μｇ／ｍＬ）／グレムリン２（１μｇ／ｍＬ）の補充）の培養後１週間目のｍＳＳＣ（ＦＡＣＳ後に初期播種された１０，０００個のｍＳＳＣ）または対照（通常の培地：＜ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン）の位相顕微鏡画像である。これらの条件下で、我々は以下を認識している：培養基のノギン及びグレムリン２の補充が、対照またはＢＭＰ２補充（肥大軟骨細胞領域の増殖）と比べて、インビトロでの未処理ｍＳＳＣ培養に特有である肥大軟骨細胞の増殖の減少をもたらす。スケールバーは、５００μｍに相当する。
【図１５−２】提案されたシグナル伝達経路がｍＳＳＣ及び子孫に影響を及ぼすことを示す。（Ｂ）（ｉ）１０，０００個のｍＳＳＣを新たに選別し、通常の培地中（ＦＡＣＳプロットの上部列）またはＷｎｔ３ａを補充した（２μｇ／ｍＬ）通常の培地中（ＦＡＣＳプロットの下部列）で培養した。１週間後に、細胞を再単離し、抗体で染色し、ＦＡＣＳ分画化を実施した。ここで、我々は、プロ骨形成である、Ｔｈｙサブ集団（赤色ボックスで表示）の増加を認識している。（ｉｉ）１ヶ月間にわたって腎被膜に移植されたｗｎｔ未処理のＳＳＣに対比するｗｎｔで処理されたＳＳＣの５０００個の細胞から形成された小骨のペンタクロム染色切片を示す。Ｗｎｔによる処理は、Ｗｎｔ処理資料における骨髄腔の形成の減少でも分かるように、ＳＳＣによる軟骨内骨化を阻害するように見える。スケールバーは２００μｍに相当する。（Ｃ）ｍＳＳＣ及び下流の前駆細胞（ＢＣＳＰ、Ｔｈｙ、６Ｃ３、ＢＬＳＰ、ＣＣＰ）によるアキシン１発現の遺伝子発現データである。ここで、我々は、他の幹細胞／前駆細胞と比べて、ＣＣＰによるアキシン１の発現の減少を認識している。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。
【図１５−３】提案されたシグナル伝達経路がｍＳＳＣ及び子孫に影響を及ぼすことを示す。（Ｄ）[ＣＤ４５＋Ｔｅｒ１１９＋]または[Ｔｉｅ２＋]サブ集団が、高頻度の骨格形成細胞のサブ集団を含有しなかったことを確かなものにするために、我々は、Ｐ３のＧＦＰ標識マウスから長骨[ＣＤ４５＋Ｔｅｒ  １１９＋]及び[Ｔｉｅ２＋]細胞集団（我々は、ＦＡＣＳ分画化の際に前に除外したもの）を、機械的及び酵素的解離、その後のＦＡＣＳ分画化によって単離した。次いで、これらの固有の骨格形成潜在能力を評価するために、サブセットのそれぞれの２０，０００個の細胞を免疫不全ＲＡＧ−２／ガンマ（ｃ）ＫＯマウスの腎被膜下に移植した。[アルファＶ＋]の８種のサブ集団とは異なり、ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９＋及びＴｉｅ２＋サブセットは、移植から４週後に、骨、軟骨または間質を形成することが見出されなかった。移植から４週後に存在する組織の明視野顕微鏡写真が、左側のパネルに示され、これとともに蛍光画像が右側に示されている。移植された集団は、両方の列で以下の順序で（上から下に向かって）示されている：上部[ＣＤ４５＋Ｔｅｒ１１９＋アルファＶ−]、中間[Ｔｉｅ２−アルファＶ＋]、底部[Ｔｉｅ２＋アルファＶ−]。黄色の破線は、自己蛍光スポンジスキャフォールドを表し、緑色の破線は、真のＧＦＰ＋組織を表す。[ＣＤ４５＋Ｔｅｒ１１９＋アルファＶ−]移植細胞の移植後に、真の緑色の蛍光は存在せず、したがって、真の組織移植はないが、スポンジ中に存在する自己蛍光（黄色の破線）はある。[Ｔｉｅ２−アルファＶ＋]集団の移植後に（赤色ボックス）、我々は、緑色の破線で表される骨組織の形成があることを確認している。Ｔｉｅ２＋アルファＶ−集団の移植後には、いくつかの緑色蛍光組織が存在するが、これは、骨組織とは一致せず、線維組織の形成（高倍率挿入図）の代わりに、管状構造（おそらくは、高倍率挿入図において白色の矢印によって描写された血管を表す）が存在する。左右のパネル：スケールバーは１ｍｍに相当する。
【図１５−４】提案されたシグナル伝達経路がｍＳＳＣ及び子孫に影響を及ぼすことを示す。（Ｅ）（ｉ）骨格間質集団中のレプチン（左側）及びその受容体（右側）の遺伝子発現レベルである。Ｔｈｙサブセット中のリガンドが陰性発現、しかしながら受容体の高発現は、レプチンが外来的に提供されることに起因する。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。ＦＰＫＭは、マップされた百万個の読み取り当たりの転写物の１キロベース当たりの断片である。（Ｅ）（ｉｉ）以下の細胞群のシングルセルＲＮＡシークエンシングである：６Ｃ３（＋）（６Ｃ３及びＨＥＣサブ集団を包含する）、Ｔｈｙ（＋）（ＣＣＰ、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブ集団を包含する）、ｍＳＳＣならびにＢＣＳＰ。グラフは、ｍＳＳＣ及び下流側の子孫によるレプチン受容体の発現を示す。これは、下流側子孫（６Ｃ３−紫色、Ｔｈｙ−赤色）に比べて、ｍＳＳＣ（緑色）及びＢＣＳＰ（ターコイズ）集団によるレプチン受容体の発現がないことを示している。（Ｆ）（ｉ）骨格間質集団におけるＦｏｘＡ２の遺伝子発現レベルである。ここで、我々は、下流側の子孫に比べてｍＳＳＣ中のＦｏｘＡ２の顕著な発現を確認している。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（ｉｉ）以下の細胞集団のシングルセルＲＮＡシークエンシングである：６Ｃ３（＋）（６Ｃ３及びＨＥＣサブ集団を包含する）、Ｔｈｙ（＋）（ＣＣＰ、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブ集団を包含する）、ｍＳＳＣならびにＢＣＳＰ。グラフは、単一細胞レベルでのＦｏｘＡ２の発現を示す。（ｉ）と一致して、我々は、Ｆｏｘａ２が、ＣＳＰ中よりの非常に低いレベルでｍＳＳＣにおいて著しくアップレギュレートされ、また下流側の子孫ではほとんど存在しないことを観察した。
【図１５−５】提案されたシグナル伝達経路がｍＳＳＣ及び子孫に影響を及ぼすことを示す。Ｇ（ｉ）骨格間質集団におけるＲｕｎｘ２の遺伝子発現レベルである。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（ｉｉ）以下の細胞集団のシングルセルＲＮＡシークエンシングである：６Ｃ３（＋）（６Ｃ３及びＨＥＣサブ集団を包含する）、Ｔｈｙ（＋）（ＣＣＰ、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブ集団を包含する）、ｍＳＳＣならびにＢＣＳＰ。グラフはＲｕｎｘ２の発現を示す。Ｈ（ｉ）骨格間質集団におけるコラーゲン２Ａの遺伝子発現レベルである。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（ｉｉ）以下の細胞集団のシングルセルＲＮＡシークエンシングである：６Ｃ３（＋）（６Ｃ３及びＨＥＣサブ集団を包含する）、Ｔｈｙ（＋）（ＣＣＰ、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブ集団を包含する）、ｍＳＳＣならびにＢＣＳＰ。グラフは、コラーゲン２Ａの発現を示す。
【図１５−６】提案されたシグナル伝達経路がｍＳＳＣ及び子孫に影響を及ぼすことを示す。Ｉ（ｉ）骨格間質集団におけるコラーゲン１０Ａの遺伝子発現レベルである。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（ｉｉ）以下の細胞集団のシングルセルＲＮＡシークエンシングである：６Ｃ３（＋）（６Ｃ３及びＨＥＣサブ集団を包含する）、Ｔｈｙ（＋）（ＣＣＰ、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブ集団を包含する）、ｍＳＳＣならびにＢＣＳＰ。グラフは、コラーゲン１０Ａの発現を示す。Ｊ（ｉ）骨格間質集団におけるＳｏｘ９の遺伝子発現レベルである。これらの実験が、ＣＤ２００によるさらなる精製に先立って行われたために、試験された＊ｍＳＳＣ集団は、三重陰性細胞集団［ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−Ｔｉｅ２−アルファＶ＋Ｔｈｙ−ＣＤ１０５−６Ｃ３−］を表し、これはＣＤ２００＋／−細胞集団の両方を含み、したがって、ｍＳＳＣ／プレ−ＢＣＳＰの転写発現データを示すことに留意されたい。（ｉｉ）以下の細胞集団のシングルセルＲＮＡシークエンシングである：６Ｃ３（＋）（６Ｃ３及びＨＥＣサブ集団を包含する）、Ｔｈｙ（＋）（ＣＣＰ、ＴＨＹ及びＢＬＳＰサブ集団を包含する）、ｍＳＳＣならびにＢＣＳＰ。グラフは、Ｓｏｘ９の発現を示す。
【図１６】（Ａ）軟骨（青色）、及び骨（黄色）領域を示す、モバットペンタクロムで染色された１７週齢のヒト胎児大腿骨の断面である。挿入図は、成長板領域を示し、ここでは我々は、高ＳＳＣ頻度を見出している。（Ｂ）インビボでのヒト骨格幹細胞／前駆細胞の予測単離及び二次表現型特性化についての実験スキームである。（Ｃ）１７週齢のヒト胎児大腿骨からのヒト骨格幹細胞／前駆細胞サブセットＦＡＣＳゲーティング戦略であり、軟骨、軟骨を備える骨、または骨髄を備える骨を生じさせる画定された集団を示す。色のついた矢印は、腎臓中の外植されたヒト前駆細胞由来の組織のペンタクロム染色された切片を示す（青色＝軟骨；緑色＝骨＋軟骨；黄色＝骨）。（Ｄ）ヒト骨格幹細胞／前駆細胞サブセットが単離され得る大腿骨骨頭領域を示す図及び成体大腿骨骨頭領域の写真である。（Ｅ）成体大腿骨骨頭組織から単離されたヒト骨格幹細胞／前駆細胞サブセットのＦＡＣＳゲーティング戦略である。
【図１７】（Ａ）ｈＳＳＣ及びヒト骨格前駆細胞サブセットによる系統進行のインビトロ分析についてのスキームである。（Ｂ）（上部及び中間パネル）ＦＡＣＳによってアッセイされた培養ｈＳＳＣの系統限定されたサブセットへの分化である。（下部パネル）アリザリンレッド染色によって決定される個々のヒト骨格前駆細胞の分化骨形成能力である（ｈＳＳＣ＝ヒト骨格幹細胞；ＢＣＳＰ＝骨、軟骨及び間質前駆細胞；ｈＣＰ＝ヒト軟骨形成前駆細胞；ｈＯＰ＝ヒト骨形成前駆細胞）。最も強いアリザリンレッドは、ｈＯＰで示されている。（Ｃ）ＲＧＢウイルス標識付け及びレンチウイルス標識付けヒト骨格幹細胞（ｈＳＳＣ）のインビボクローン発現の実験スキームである。（Ｄ）レンチウイルス標識付けＥＧＦＰ及びＲＦＰ  ｈＳＳＣのクローンは、ｈＳＳＣ由来腎臓移植片のペンタクロム染色切片で示されるように、骨（黄色）及び軟骨（青色）に分化する。（Ｅ）（上部パネル）ｈＳＳＣ、ＢＣＳＰ、ｈＯＰ、及びｈＣＰの培養物のそれぞれに由来するコロニーの顕微鏡写真である。（下部パネル）４種のヒト骨格幹細胞／前駆細胞サブセットのＦＡＣＳプロットである。
【図１８】ｈＳＳＣ（左側）のｍＳＳＣ（右側）と対比する系統マップである。（プレ）ＢＣＳＰ＝（プレ）骨、軟骨及び間質前駆細胞；ｈＣＰ＝ヒト軟骨形成前駆細胞；ｈＯＰ＝ヒト骨形成前駆細胞。
【図１９】（Ａ）（左側パネル）骨格ニッチェ因子の範囲を描写する図と一緒に、骨の発生におけるヒト骨格前駆細胞サブセットの局在化を示す図である（ｈＳＳＣ＝ヒト骨格幹細胞；ＢＣＳＰ＝骨、軟骨及び間質前駆細胞；ｈＣＰ＝ヒト軟骨及び間質前駆細胞；ｈＯＰ＝ヒト骨形成前駆細胞）。（Ｂ）ｈＳＳＣニッチェ相互作用の図である。（Ｃ）代表的ｍＳＳＣニッチェ因子による処理からのｈＳＳＣの増殖である。（Ｄ）ＧＥＸＣアルゴリズムによるヒト骨格集団の間のニッチェ因子／同族受容体相互作用の予測である。（Ｅ）ヒト骨格前駆体細胞サブセット中の代表的ＳＳＣニッチェ因子ＢＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ３の正規化された発現である。（Ｆ）（左側パネル）単一細胞ｍＲＮＡ配列決定からの４種のヒト骨格前駆体細胞のヒートマップである。（右側パネル）ＢＭＰ２またはＷＮＴリガンド及び受容体の共発現を単一細胞レベルで示すベン図である。
【図２０】（Ａ）（上部ＦＡＣＳプロット）ｈＡＳＣは、ＢＭＰシグナル伝達に対する応答性を示唆するＢＭＰＲ１Ｂの発現を示す。（下部ＦＡＣＳプロット）ＢＭＰ２によるｈＡＳＣからのｈＳＳＣ形成の誘導である。（Ｂ）ｈＡＳＣの初期化ＢＭＰ２との同時送達についてのスキームである。（Ｃ）（左側パネル）ｈＡＳＣとＢＭＰ２との同時送達に由来するその後誘導された小骨の顕微鏡写真である。下のパネルは上のパネルの長方形を３倍に拡大したものである。モバットクロムで染色した、導入された小骨の顕微鏡写真（骨＝黄色；軟骨＝青緑色）。（Ｄ）ＢＭＰ２及び可溶性ＶＥＧＦ受容体の組み合わせを用いる、マウス脂肪組織からのその場での骨の誘導、または軟骨形成の図である。（Ｅ）ＶＥＧＦシグナル伝達は、ＢＭＰ２誘導ｍＳＳＣを骨（左側）または軟骨の運命（右側）に向けて切り替えることができる。
【図２１】次世代の幹細胞系骨格再生医薬品である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
【表１】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
【表２】
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