【手続補正書】
【提出日】平成30年10月26日(2018.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１またはそれを超えるUNAモノマーを含み、かつ核酸モノマーを含むmUNA分子であって、該mUNA分子はポリペプチドまたはタンパク質を発現するために翻訳可能である該mUNA分子。
【請求項２】
分子が200〜12,000のモノマーを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
分子が200〜4,000のモノマーを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
分子が1〜8,000のUNAモノマーを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項５】
分子が1〜100のUNAモノマーを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項６】
分子が1〜20のUNAモノマーを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項７】
分子が１またはそれを超える修飾核酸ヌクレオチド、または１またはそれを超える化学−修飾核酸ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項８】
分子が5'キャップ、モノマーの5'非翻訳領域、モノマーのコード領域、モノマーの3'非翻訳領域、およびモノマーのテイル領域を含む、請求項１に記載の分子。
【請求項９】
分子が5'または3'非翻訳領域中に翻訳エンハンサーを含む、請求項８に記載の分子。
【請求項１０】
分子がイン・ビボ（in vivo）で翻訳可能である、請求項１に記載の分子。
【請求項１１】
分子がイン・ビトロ（in vitro）で翻訳可能である、請求項１に記載の分子。
【請求項１２】
分子が哺乳動物細胞において翻訳可能である、請求項１に記載の分子。
【請求項１３】
分子がイン・ビボ（in vivo）でヒトにおいて翻訳可能である、請求項１に記載の分子。
【請求項１４】
分子の翻訳生成物が活性なペプチドまたはタンパク質である、請求項１に記載の分子。
【請求項１５】
分子の翻訳生成物がヒトEPO、ヒト第IX因子、ヒトα−1−アンチトリプシン、ヒトCFTR、ヒトASL、ヒトPAH、ヒトNIS、またはヒトヘプシジンである、請求項１に記載の分子。
【請求項１６】
分子が、同一の翻訳生成物をコードするネイティブなmRNAと比較して、少なくとも2−倍の増大した翻訳の効率をイン・ビボ（in vivo）で示す、請求項１に記載の分子。
【請求項１７】
分子が、同一の翻訳生成物をコードするネイティブなmRNAと比較して、少なくとも3−倍の増大した翻訳の効率をイン・ビボ（in vivo）で示す、請求項１に記載の分子。
【請求項１８】
分子が、同一の翻訳生成物をコードするネイティブなmRNAと比較して、少なくとも5−倍の増大した翻訳の効率をイン・ビボ（in vivo）で示す、請求項１に記載の分子。
【請求項１９】
分子が、同一の翻訳生成物をコードするネイティブなmRNAと比較して、少なくとも10−倍の増大した翻訳の効率をイン・ビボ（in vivo）で示す、請求項１に記載の分子。
【請求項２０】
分子が、同一の翻訳生成物をコードする細胞のネイティブなmRNAよりも少なくとも2−倍大きい細胞における細胞質半減期を有する、請求項１に記載の分子。
【請求項２１】
分子が希少疾患、肝臓疾患、またはがんの治療剤である、請求項１に記載の分子。
【請求項２２】
分子が希少疾患、肝臓疾患、またはがんの免疫化剤またはワクチン成分である、請求項１に記載の分子。
【請求項２３】
分子が配列番号：1〜164から選択される配列を含む、請求項１に記載の分子。
【請求項２４】
請求項1〜２３のいずれか１項に記載のmUNA分子および医薬上許容し得る不活性成分を含む組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のmUNA分子を含むワクチンまたは免疫化組成物。
【請求項２６】
該不活性成分がナノ粒子またはリポソームである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項２４または２５に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患または症状を緩解する、予防するまたは処置する方法。
【請求項２８】
該疾患または症状が希少疾患、肝臓疾患、またはがんである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該疾患または症状が表１に記載したものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
イン・ビボ（in vivo）でポリペプチドまたはタンパク質を生成する方法であって、哺乳動物に請求項２４または２５に記載の組成物を投与することを含む該方法。
【請求項３１】
該ポリペプチドまたはタンパク質が表１に記載した疾患または症状において欠乏している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該タンパク質がヒトEPO、ヒト第IX因子、ヒトα−1−アンチトリプシン、ヒトCFTR、ヒトASL、ヒトPAH、ヒトNIS、またはヒトヘプシジンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
イン・ビトロ（in vitro）でポリペプチドまたはタンパク質を生成する方法であって、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のmUNA分子で細胞をトランスフェクトすることを含む該方法。
【請求項３４】
トランスフェクションをトランスフェクション試薬を用いて行う、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該ポリペプチドまたはタンパク質が表１に記載した疾患または症状において欠乏している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該タンパク質がヒトEPO、ヒト第IX因子、ヒトα−1−アンチトリプシン、ヒトCFTR、ヒトASL、ヒトPAH、ヒトNIS、またはヒトヘプシジンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ペプチドまたはタンパク質の欠乏と関連する対象における希少疾患または症状を緩解する、予防するまたは処置する方法であって、該ペプチドまたはタンパク質をコードするmUNA分子を対象に投与することを含む該方法。
【請求項３８】
該疾患または症状が表１に記載したものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
イン・ビボ（in vivo）でポリペプチドまたはタンパク質を生成する方法であって、該ポリペプチドまたはタンパク質をコードするmUNA分子を哺乳動物に投与することを含む該方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドまたはタンパク質がヒトEPO、ヒト第IX因子、ヒトα−1−アンチトリプシン、ヒトCFTR、ヒトASL、ヒトPAH、ヒトNIS、またはヒトヘプシジンである、請求項３９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【図１】図1は、第IX因子のネイティブなmRNAの発現と比較した、本発明の翻訳可能なmUNA分子を用いたイン・ビボ（in vivo）でのヒト第IX因子（F9）の発現の結果を示す。図1は、このmUNA分子の翻訳効率がF9のネイティブなmRNAと比較して2倍になったことを示す。本実施形態のmUNA分子は、C57BL/cマウスにおいて翻訳させてヒトF9を生成した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【図２】図2は、第IX因子のネイティブなmRNAの発現と比較した、本発明の翻訳可能なmUNA分子を用いたイン・ビトロ（in vitro）でのヒト第IX因子（F9）の発現の結果を示す。図2は、このmUNA分子の翻訳効率がF9のネイティブなmRNAと比較して48時間後に5−倍増大したことを示す。この実施形態のmUNA分子は、マウス幹細胞セルラインHepa1−6において翻訳させてヒトF9を生成した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【図３】図3は、ヒトEPOのネイティブなmRNAの発現と比較した、本発明の翻訳可能なmUNA分子を用いたイン・ビトロ（in vitro）でのヒトエリスロポイエチン（EPO）の発現の結果を示す。図3は、このmUNA分子の翻訳効率が、EPOのネイティブなmRNAと比較して、48時間後にほぼ3−倍増大することを示す。この実施形態のmUNA分子は、マウス肝細胞セルラインHepa1−6中で翻訳させてヒトEPOを生成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【図４】図4は、マウスEPOのネイティブなmRNAの発現と比較した、いくつかの翻訳可能な本発明のmUNA分子を用いたイン・ビトロ（in vitro）でのマウスエリスロポイエチン（EPO）の発現の結果を示す。図4は、mUNA分子（#2、3、4、5、6、7、8、9、10および11）の翻訳効率が、EPOのネイティブなmRNAと比較して、72時間後に10−倍まで増大することを示す。本実施形態のmUNA分子は、マウス肝細胞セルラインHepa1−6中で翻訳させてマウスEPOを生成した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
【図５】図5は、ヒトアルファ−1−アンチトリプシンのネイティブなmRNAの発現と比較した、本発明の翻訳可能なmUNA分子を用いたイン・ビボ（in vivo）でのヒトα−1−アンチトリプシンの発現の結果を示す。図5は、72時間におけるこのmUNA分子の翻訳の効率が、ヒトα−1−アンチトリプシンのネイティブなmRNAと比較して、3−倍を超えて増大したことを示す。この実施形態のmUNA分子は、C57BL/cマウスにおいて翻訳させてヒトα−1−アンチトリプシンを生成した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【図６】図6は、ヒトEPOのネイティブなmRNAの発現と比較した、本発明の翻訳可能なmUNA分子を用いたイン・ビボ（in vivo）でのヒトエリスロポイエチン（EPO）の発現の結果を示す。図6は、72時間におけるこのmUNA分子の翻訳の効率が、ヒトEPOのネイティブなmRNAと比較して、10−倍を超えて増大したことを示す。この実施形態のmUNA分子は、C57BL/cマウスにおいて翻訳させてヒトEPOを生成した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【図７】図7は、細胞質における機能的mRNA転写物の一次構造を示す。mRNAには、5'メチルグアノシンキャップ、非翻訳領域（UTR）によって挟まれたタンパク質コード配列、およびポリA結合タンパク質（PABP）によって結合されたポリアデノシン（ポリA）テイルが含まれる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【図８】図8は、タンパク質と協同的に相互作用する5'キャップおよびPABPが翻訳に関与してリボソームコンプレックスの補充および再生利用を促進することを示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
【図９】図9は、スプリント−媒介連結スキームを示し、ここに30−モノマーstubポリAテイル（A（30））を有するアクセプターRNAは30−モノマー供与体オリゴマーA（30）に連結されている。スプリント−媒介連結には、stubポリAテイルの3'UTR配列上流に相補的であるDNAオリゴマースプリントを用い、および60−モノマーオリゴ（dT）5'heel（T（60））を含めて連結を補助した。該スプリントのアンカー領域はUTR配列に相補的であって、アクセプターにハイブリダイゼーションした場合に5'dT30オーバーハングが提示されることを保証している。これにより、供与体オリゴマーがstubテイルの3'末端と横並びになり、連結のキネティクスを劇的に改善する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１０】図10は、供与体オリゴマーのアクセプターへのスプリント−媒介連結の実験結果を示す。図10は、T4 RNAリガーゼ2を用いて5'−リン酸化A30 RNA供与体オリゴマーに連結したA30 stubテイルを有する2μgの120−モノマーアクセプターを用いた連結の結果を示す。反応物は37℃にて一晩インキュベートした。連結および酵素を用いないで行った偽反応物を精製し、DNAse Iで1時間処理してスプリントオリゴマーを分解および切り離し、および30μLの体積で再精製した。連結効率はほぼ100%であった。偽反応調製物にサイズのシフトが存在しないことは、アクセプターおよび供与体が実際に連結しており、単純に非分解スプリントオリゴマーによって互いに保持されていないことを示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１１】図11は、30−モノマーstubポリAテイル（A（30））を有するアクセプターRNAを用いたスプリント−媒介連結の結果を示す。連結反応は、3の異なる供与体オリゴマー種：A（30）、A（60）およびA（120）を用いて行った。ゲルシフトに基づくと、連結はほぼ100%の効率を達成した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１２】図12は、nGFP−A30転写物に対して行った1時間のスプリント−媒介連結の結果を示す。得られた連結生成物を、非処理転写物およびネイティブなnGFP−A60 IVT生成物と比較した。ネイティブなnGFP−A60および連結生成物は非処理nGFP−A30転写物および偽−連結材料に対してゲル上で上方にシフト（up−shift）し、連結収率がほぼ100%であることを示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【図１３】図13は、nGFP−A60連結生成物に対する増大した寿命および翻訳活性を示す。図13において、核形成（nuclearized）転写物は繊維芽細胞にトランスフェクトし、および蛍光シグナルの比較をnGFP−A30、偽−連結nGFP−A30、およびnGFP−A60連結生成物に対して行った（図13、左から右）。nGFP−A60連結生成物について有意に高い蛍光シグナルが観察されたことは、それが顕著に増大した翻訳活性を有していることを示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１４】図14は、10μM濃度のポリAテイル30−モノマー供与体オリゴマーを用いてT4 RNAリガーゼ2（切頭型KQ突然変異体）で室温にて3時間処理した100−モノマーアクセプターRNAを用いて行った連結の結果を示す。この反応にはボリュームエクスクルーダー（volume excluder）として15% PEG 8000を含有させて、効率的な連結を促進した。連結反応は、サイズスタンダードとして含めた100−モノマーアクセプターRNAと180−モノマーRNA転写物との間のサイズを有する高分子量生成物が形成されたことを示した。これらの結果は、連結反応がアクセプターに対する供与体のほぼ100%の連結で高分子量を有する優勢な生成物を生成したことを示す。10μM、20μM、および40μMのポリAテイルの濃度を用いたさらなる実験は、約50%〜約100%のアクセプターRNAが連結したことを示した。