(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリヤーを介して、サンプル中に前記標的分子が存在するか否かを検出するための装置であって、
複数の測定分子と、
前記複数の測定分子を懸濁するためのゲル様物質と、
前記ゲル様物質の電気的特性を測定するための測定機器と
を含む測定プローブを含み、
前記標的分子が前記プローブの外側である前記バリヤーの一方の側に存在し、前記測定分子がプローブの内側であるバリヤーの他方の側に存在する場合、前記測定分子は、バリヤーを介して作用する親和力の結果として変化する空間的な配向を有し、前記測定分子の前記空間的な配向における変化は、前記ゲル様物質の電気的特性における変化を引き起こし、
前記電気的特性における変化は、前記標的分子が、前記測定分子に対して前記バリヤーの反対側に存在することを示す
装置。
【請求項２】
前記電気的特性の変化はゲルの固有抵抗の変化であり、前記ゲルの固有抵抗の変化を測定するために、該ゲルの近くに位置する電極を含んでなる装置。
【請求項３】
バリヤーを介して、サンプル中に前記標的分子が存在するか否かを検出するための方法であって、
複数の測定分子が懸濁されたゲル様物質を含むプローブを提供することと、
前記バリヤーの方に前記プローブを導き、前記ゲル様物質の電気的特性における変化を測定することと、
前記プローブを前記バリヤーの方に導いた場合に前記変化が測定された場合、前記標的分子が前記サンプル中に存在することを推測し、前記プローブを前記バリヤーの方に導いた場合に前記変化が測定されない場合、前記標的分子が前記サンプル中に存在しないことを推測することと
を含み、
前記ゲル様物質の電気的特性は、前記サンプル中に前記標的分子が存在する場合に、前記測定分子の配向における変化により影響され、
前記変化は、前記標的分子が前記プローブの外側である前記バリヤーの一方の側に存在し、前記測定分子がプローブの内側であるバリヤーの他方の側に存在する場合に、バリヤーを介して作用する親和力の結果として生じる
方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、2004年8月5日に提出された仮出願番号60/598,896の利益を主張する。
【発明の背景】
【０００２】
1．発明の分野
本発明は、特定された分子の存在を検出するための装置および方法に関し、特に、バリヤーを介して分子の存在および／または濃度を検出するための装置および方法に関する。本発明は、バリヤーの一方の側における標的分子の存在または濃度を推測するものであり、これは、標的分子に対する親和性（すなわち、標的分子に引き付けられるかまたは反発する）を有し、バリヤーの他方の側に位置する測定分子の分析に基づく。
【０００３】
本発明の説明は、「分子」について言及しているが、本発明は、分子それ自体の検出に限定されず、個々の原子を含む分子の構成物の存在および／または濃度の検出、ならびに分子または分子の群により作られた有機および無機の化学的実体の検出に広く適用される。さらに、標的実体の存在を検出するために用いられる測定薬剤には、個々の原子を含む分子の構成物、ならびに分子または分子の群により作られた有機および無機の化学的実体が含まれてよい。それ故、分子の検出は、本発明の特定の実施形態を表すが、本発明は、その最も広い形態において、一般的に化学物質、原子、および分子を含む標的実体を、一般的に化学物質、原子、および分子を含む相補的な測定薬剤により、バリヤーを介して検出および／または操作することに関する。
【０００４】
1つの例において、本発明は、外部のプローブにより血糖値を非侵襲的に測定することを可能にし、それは、前記プローブが患者の皮膚に近づいたときの、ゲルまたは他のゲル様の粘稠性マトリックス中に懸濁したグルコースオキシダーゼ分子の配向における変化に基づく。前記配向は、ゲルの抵抗のような電気的な性質における変化を測定することにより、または磁力もしくは光学的性質を含むゲルもしくはゲルの成分の他の配向に影響を与える性質を検出することにより決定されてよい。標的分子の存在は、「配向」以外の分子の親和-反応性の性質により影響を受けるゲルの性質を測定することにより推測されてもよく、例えば、適用される電場に応じた、ゲルを通しての測定分子の移行における変化である。
【０００５】
もう1つの例として、本発明は、C-反応性タンパク質(CRP)特異的抗体の存在を検出するために用いられてよく、これは、ゲル中に懸濁したCRP特異的モノクローナル抗体の配向に基づくものである。
【０００６】
2．関連分野の説明
現在、多くの生理学的状態は、インビトロ分析のために患者から血液または他の体液を採取することによってのみ検出することができる。血液の採取は、熟練した医師を必要とし、痛みがあり、不便であり、高価であり、且つ感染のリスクを有する。結果として、多くの病態はそれらが相対的に進行するまで見逃されるが、他のものはモニターするのが非常にやっかいである。
【０００７】
検査のために血液の頻繁な採取を必要とする疾患の例は、糖尿病である。グルコースレベルをモニターするための無痛の、非侵襲性の、外部の装置を発達させるために、多くの試みがなされてきた。種々のアプローチには、電気化学的な技術ならびに近赤外分光法およびラマン分光法のような分光学的な技術が含まれる。しかしながら、広い努力にもかかわらず、日常的に使うのに十分正確で、信頼でき、簡便で、且つ対費用効果の高いグルコースのインビトロ測定のための非侵襲的な装置または方法は、これらの中から得られなかった。
【０００８】
本発明は、血液またはグルコースのような組織成分のインビトロ測定のための異なるアプローチを提供する。成分濃度の直接的な測定を試みる代わりに、本発明は、ここにおいて「親和性」と呼ばれる化学的な相互作用および反応を引き起こす分子または原子間力を利用し、バリヤーの一方の側における原子または分子の挙動に基づいて、バリヤーの他方の側における相補的な原子および分子の存在および濃度を推定する。そのような親和力は、最近、原子間力鏡検を用いて研究され、強い化学結合を切断する能力が見出された。例えば、Grandbois et al., “Affinity Imaging of Red Blood Cells Using an Atomic Force Microscope,” Journal of Histochemistry and Cytochemistry, vol. 48, pp. 719-724 (May, 2000); Grubmuller et al., “Ligand Binding: Molecular Mechanics Calculation of the Streptavidin-Biotin Rupture Force," National Library of Medicine Science, 16:271(5251:954-5 (Fb. 1996); Moy et al., "Intermolecular Forces and Energies Between Ligands and Receptors," National Library of Medicine, Science, 266(5183):257-9 (October, 1994); and Moy et al. "Adhesion Forces Between Individual Ligand-Receptor Pairs," National Library of Medicine, Science, 264(5157):415-7 (April, 1994)を参照されたい。
【０００９】
相互に特異的に引きつけられる化学物質または原子および分子が含まれる化学的な成分は、互いに近づいた場合、引力を最大化する（または反発を最小化する）方向にそれら自身を配向させ、引きつけられるかまたは反発する分子対間を最低のエネルギー状態にするために、相互に結合するかまたは退け合うことによりそのような力を排除することを求めるであろう。天然において、そのような誘引性および反発性の親和力の多数の例が存在し、化合物の形成または解離および爆発または内破が含まれる。結果として分子間の「親和性」を生じる力は、静電気、磁力、核、またはそれらの組み合わせであってよいが、これら全ては、系に対する可能な最低のエネルギー状態を求める原理を共有する。
【００１０】
分子の引力は、典型的に、分子により化学的結合またはエピトープ部位において相互に及ぼされる相補的な電荷の結果である。そのような引力は、分子が存在する媒質がそのような配向を許容する限り、分子を特定の方向へ配向させ、相互に結合しようとしている相補的な分子対間の引力を最大にする。
【００１１】
この様式において、例えば、酵素−基質および抗原−抗体の対は、相互に「探し出し」、そのような相互作用的な分子の探索は、最終的に、分子対の分子結合となる。そのような結合に対して必須なことは、溶液中の分子の固有の空間的な分子配向である。そのような結合を形成する相互作用的な分子対は、結合の前にある一定の連続的な別のステップを介する必要があることが想像される。前記ステップは、以下の通りである：
1．   分子を、水のような液体媒質に溶解する。
【００１２】
2．   それらを、それらの相補的な分子対の近くに混合または他の方法により近づける。
【００１３】
3．   前記分子を、それらの活性部位を相互にさらすよう空間的に配向させる。
【００１４】
4．   その後、前記分子を相互に結合させ、結合および反応を介して、結果としてより低いエネルギー状態を得る。
【００１５】
図1は、最初の分子MMが第2の分子TMに結合する様式の概略図である。本発明は、引力または相互に高い特異性を有する誘引された分子対の配向を測定することができる場合、それらの分子が相互に結合または反応する前でさえ、それらの「相補的な分子」の存在を検出することができるという原理に基づく。互いに近い相補的な分子の濃度が高くなるほど、それらの間の引力の和も強くなるという原理にも基づいており、このような場合、分子の配向は、より簡単に且つ相補的な分子間の距離がより遠くても起こるであろう。現在まで、これらの原理は、バリヤーの向こう側の化学物質、分子、もしくは原子の存在および／または濃度を検出する方法として利用されてこなかった。
【発明の概要】
【００１６】
従って、本発明の目的は、離れた場所からおよび／またはバリヤーを介して、分子の存在の検出および濃度の測定をするための装置および方法を提供することであり、それは簡単に実行でき、放射線または複雑な計算技術を必要としない。
【００１７】
これらの目的は、化学的／静電気的な引力（以下「親和性」）、すなわち、化学的相互作用および反応を引き起こす荷電した分子間の親和性の原理を利用することにより、本発明の好ましい実施形態の原理に従って実行され、バリヤーの一方の側における原子または分子の挙動に基づいて、バリヤーの他方の側における対応する分子の存在および濃度が推定される。
【００１８】
それ故、本発明は、分子の親和性対のある特定の相補分子（「測定」分子）の分子配向に作用するか、または少なくともそれを結果として生じる力を測定することにより操作する方法および装置を提供し、これは、前記対の「他方の」分子（「標的」分子）の同一性および濃度を測定するためのものであり、前記他方の分子が引力に対して十分に近づいた場合、回転のような分子現象を引き起こす。
【００１９】
本発明は分子の検出に適用可能であると記載されているが、本発明の方法および装置は、分子または分子の群で作られている無機および有機の他の化学的実体の検出、ならびに個々の原子または原子の群のような分子の構成物にも適用され得ると解されるべきである。さらに、本発明は、バリヤーを介した分子の検出に適用可能であると記載されているが、本発明の方法および装置は、物理的なバリヤーが存在しない場合であっても、離れた分子の測定にも適用され得る。
【００２０】
上述の通り、分子間力のある一定の測定可能な発現は、特定の分子の空間的な配向であり、それは、測定分子および該分子が存在する物質または溶液の性質に依存した種々の方法で測定されてよい。権利請求する発明は、ある特定の配向の検出法に限定されることは意図していないが、前記分子が相互に十分近づき、分子の空間的な配向を変化させるのに十分な力を及ぼす場合、前記配向の検出が相補的に結合した分子対の存在および濃度を測定するために用いられる限り、そのような全ての方法を適用することを意図している。
【００２１】
以下の原理は、空間的な配向性の「測定」に適用されてよい：
1．   分子の再配向の速度および大きさは、相補分子の濃度、相補分子の相互の親和性、およびそれらの間の距離に関係する。
【００２２】
2．   配向の速度は、分子対間の距離の逆関数であり、それらの相互の親和性に直接関係する。
【００２３】
3．   そのような「親和力」の大きさまたは分子対の配向の速度および大きさの測定が、いくつかの方法で測定可能である場合、そのような大きさおよび速度は、分子対が相互に結合する前でさえ分子対の濃度に関係するべきである。
【００２４】
4．   十分高い親和性を有する分子を得られた場合、静電力は、前記分子対が互いに近くに導かれるが、膜および空気のようなバリヤーを介していることによりなお相互に有意な距離がある場合であっても、測定可能であってよい。バリヤーの性質も、分子対間の静電力のような親和性の大きさに有意な影響を及ぼすであろうことが予想される。
【００２５】
ここに記載される本発明の好ましい実施形態の全てが、生体の外部からの生体中の生物化学的な分析物の存在の検出を包含するが、本発明の原理は、「検出」以外の目的に対して親和力の効果を利用することにも拡大されてよく、すなわち、測定薬剤または分子の物理的または化学的性質における変化が、生物化学的な分析物の存在の単なる検出以外の予め決められた目的のために利用されてもよく、例えばバリヤーを介して、および離れて起こる作用または反応を引き起こす、メッセージを送信する等である。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００２６】
図2(a)は、本発明の好ましい実施形態の原理に従って構築されたゲル膜プローブを図示したものである。測定プローブには、以下が含まれる：
・ 濃度が測定されるべき標的分子に対する親和性を有する多数の測定分子；
・ 標的分子が近づくか、または退いた場合に、測定分子の配向を変化させることが可能な溶液；
・ 測定分子の配向を測定するための手段。
【００２７】
測定分子として使用される分子の型は、測定されるべき分子の型に依存する。例えば、標的分子が抗体である場合、測定分子は抗原であってよい。あるいは、酵素の濃度を測定するために、対応する「反応物質」または「反応生成物」が用いられてよい。本発明の好ましい実施形態は、原理的に、測定の間、離れた場所または測定分子および標的分子を隔てるバリヤーの向こう側に影響を及ぼすのに十分な力により、分子レベルにおいて相互に引きつけ合うかまたは退け合う2種類の分子に適用できる。
【００２８】
本発明の原理を適用することができる酵素-基質対の例は、グルコースオキシダーゼ-グルコース、グルコースデヒドロゲナーゼ-グルコース、またはグルコースムタロターゼ-グルコースのようなグルコース酵素-グルコース対である。グルコースは、糖尿病において通常モニターされ、しばしば血糖と称される。適切な抗体抗原対の例は、CRP特異的モノクローナル抗体-CRPであり、その血中における検出は、体内に存在する感染の存在および重症度を測定するために用いられる。あるいは、前記標的分子は抗原であってよく、前記測定分子は抗体であってよい。
【００２９】
本発明の機器が適用されてよい標的分子の他の例には、IgG、IgM、およびIgAのような免疫グロブリンならびにリポタンパク質が含まれる。加えて、前記機器は、アレルギー反応の非侵襲性の検出に対して用いられてよく、ウイルスもしくは細菌のような微生物により引き起こされる疾患または感染、他の型の感染、または化学的もしくは生物学的実体に対する免疫系反応を検出することは難しい。
【００３０】
測定分子が懸濁するかまたは位置する溶液は、測定分子の型に依存するであろう。例えば、図示した例において、前記溶液はゲルである。あるいは、標的分子の存在に反応して配向を変化させることが許容される限り、測定分子を含むために、液体、固体、または他の物質を用いることが可能である。加えて、測定分子が含まれる前記溶液は、引力または反発力を増大させるために必要な場合、補因子を含んでよい。
【００３１】
図2(a)および2(b)に図示した例において、電極は、適用された電流に対する溶液の抵抗を測定することを可能にするために、溶液の両側に位置する。ゲル層に負荷された一定の測定分子(MM)の抵抗ΔRにおける変化は、患者の皮膚のようなバリヤーをはさんで相補的な標的分子(TM)の近くに導いた場合、MM-TM対の親和性(a)または引力／反発力、標的分子の濃度CTM、および相補分子間の距離(d)の逆数の関数(f)である。これは、以下のような数式で表すことができる：
【数１】
0005096145.tif 000002
【００３２】
ここで、式中のΔR=RB-RMであり、RBは標的分子の近くへ導く前のゲル層の抵抗であり、RMはゲル層に近づけた後のゲル層の抵抗であり、(f)は任意の関数であり、線形または非線形であり、ΔRおよびaCTM/dの間の関係を表し、関数(f)および親和性変数(a)は共に親和対の性質に依存する。抵抗または導電率に加えて、この機構を用いて分子配向を測定することができるいくつかの方法があり、分子の核磁気共鳴(NMR)における変化、または電気的、磁気的、もしくは立体的な性質のような溶液の他の性質における変化の測定が含まれ、それは、分子の配向により影響されるか、または影響される原因となる。当業者は、測定分子は、標的分子における親和力を増強するために、例えば化学的に標識した補因子を提供すること等により修飾されてよいと認識するであろう。
【００３３】
さらに、当業者は、空間的な配向は、標的分子の存在に影響される分子の性質のみではないことも理解するであろう。例えば、親和力は電気泳動の現象に影響を与えることができ、分子は、適用される電場に応じてゲルを横切って移動する。当業者は、そのような移動における変化が、測定分子および標的分子間の親和性の存在を検出する方法として、配向の代わりに、または配向に加えて用いられ得ることを理解するであろう。
【００３４】
実施例
図2(a)および2(b)に図示されているプローブの実際の実施には、検出され得る標的分子誘発性の変化に対するベースラインを提供するために、測定分子の試料中において均一な分子回転を引き起こすことができるプローブが必要である。多くの適用においては、少なくとも98％の回転が必要とされるであろう。この測定分子の一方向性の回転は、蛍光分光学の技術により検証されてよい。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、必要な一方向性の回転を達成するために、均一な一方向性の電流を測定分子溶液に適用することができ、該溶液は測定フィルム上に均一に適用されるか、またはゲル様媒質中に均一に配置される。均一な電流および電流の検証は、一方向性の電流誘発および360°アレイにおける平面導電率の測定が可能な電気泳動装置により提供され、一般に、適用される電流に対して垂直モードであることが想定される。ローラ型の温度調節されたゲルコーティング装置を用いて、測定分子の均一な塗布を達成してよく、好ましくは、数オングストローム（測定分子の少なくとも1層を含み、障害のない分子回転を可能にする）から数ミリメートルまでの均一な厚さに塗布する。ゲル様媒質は例示であって、限定するものではないが、水に容易に溶解し、均一な測定分子の溶液を作ることができる無極性のゲル媒質であってよく、それは40〜60℃では液体であり、5〜40℃ではゲル様固体を形成する。
【００３６】
測定分子の均一な回転の達成において、本発明の実施は、好ましくは少なくとも±5％の回転精度で分子配向をモニターすることを必要とし、この場合にも蛍光標識した測定分子の蛍光分光法により検証してもよい。
【００３７】
均一に回転した分子の空間的な配置を「見る」ことが可能になったときには、均一に配置されたゲルコーティングフィルムを条件として、電流の変化、印加した電流の方向の変化、および電圧の変化を測定するために、商業的に入手可能な測定機器を用いることができる。次いで印加される電気泳動電流に対して異なる角度でのフィルムのコンダクタンスが、「オフ」モードにおいて、すなわち、電気泳動の電場電位の非存在下で測定されなければならない。商業的に入手可能な測定機器は、現在、電流方向に沿ったおよび電流方向に対して垂直の抵抗を、平面360°アレイにおいて10°±2°の間隔で、3次元モードで測定することが可能である。重要なことは、印加される電流の経路において分子回転により引き起こされる、電流インピーダンスによる抵抗における十分小さな変化を測定できることである。
【００３８】
前記ゲル媒質は、電気泳動伝導と、電気泳動の電場に対して垂直な伝導との間での指向性導電率において大きな差異を有するように、且つ一定の電位および電流における測定分子の完全な回転のために必要な時間が最小となるように選択されるべきである。広く使用されるゲル媒質には、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースゲルが含まれる。それぞれの候補のゲルに対して、それぞれのゲルにおける測定分子の特異的な電気泳動パラメーターは、濃度、温度、および溶媒組成物の関数としてある特定の装置に対して測定されるべきである。
【００３９】
上述したように、本発明のセンサーが標的分子の存在に反応した測定分子の回転を検出するために、ゲル溶液の導電率または抵抗における測定分子の回転の正確な効果を決定することが助けになる。これは、残留する電気泳動電流および電位がゼロの場合に、電気泳動電極を用いて導電率を測定することにより、および印加した電気泳動電流に対して、10度ずつ増加させて、垂直平面において測定することにより達成されてよい。前記センサーは、それ故、導電率または抵抗における測定可能な変化の間の関係を、(a)ゲル媒質に適用される電気泳動電流に対する測定電流の方向、(b)ゲルに溶解した測定分子の濃度、(c)測定分子の完全な一方向性の回転のために必要な電気泳動電場処理時間の関数として決定する。測定分子の回転は、蛍光旋光度測定装置によりモニターおよび検証されてよい。
【００４０】
一度、適用する電流および測定分子の回転の間の関係が確立すると、ゲル溶液のコンダクタンスまたは抵抗における標的溶液濃度の効果および標的分子の近接の効果は、異なる標的溶液に対するゲル溶液のコンダクタンスまたは抵抗を測定することにより確立することができる。測定分子の回転において測定可能な差異が検出された場合、標的距離および測定分子の回転の間の関係が、異なる分子対に対して確立され得る。標的分子の接近に応答した測定分子の回転は、蛍光光学分光法により再び検証され得る。
【００４１】
プローブプロトタイプ
測定分子の回転に応答した指向性コンダクタンスまたは抵抗の変化を検証するため、ゲル媒質の組成および厚さを確立するため、および目的の感度に必要な測定分子の選択および濃度を同定するために用いることができるプローブプロトタイプ1が、図3に図示されている。前記プローブプロトタイプは、修飾された電気泳動的なセルであり、円柱の周りを包むゲルコーティング膜5を横切って電気泳動電場を作るために、上部および下部にそれぞれ電極3および4を有する円柱体を含む。電気泳動電場は、ゲル中の測定分子を電場に対して配向させ、その時、電極に対する電流は止められるか、または電極の効果が無効にされるかもしくは除去され、ゲルコーティングフィルムに対する抵抗が、360°アレイに対して垂直且つ横切って測定される。上記で示したように、一度適切なゲルが見つかり、測定分子の回転およびゲルコーティングフィルムの抵抗の間の関係が確立されると、その後、測定は、標的分子の存在下で、例えば、コーティング膜を標的分子の溶液のビーカーと接触させることによりなされてもよい。
【００４２】
検証の次の局面において、前記プローブは、測定分子の±5％が回転する場合、固有抵抗において検出可能な変化を生じさせるのに十分な感受性を有するべきであり、標的の臨床的に正常な範囲の上限において、標的分子の標準溶液に対して±10％の変化率を達成するのに十分な正確性を有するべきであり、且つ、非特異的な同族体の等モル混合物を用いて純粋な標的溶液の検量線を±15％以内の変化率で再現するのに十分正確であるべきである。結局、実施バージョンのプローブは、標準的な参照方法に対する最低限の相関パラメータ値である0.9±0.1の回帰係数、0.9±0.15の勾配、および臨床的に正常な範囲の下限の±10％のY切片と共に、実際の患者の血清／血液試料を用いた場合に、少なくとも±2％の感度、±5％の精度、および正確さを必要とする。
【００４３】
このように、本発明の好ましい実施形態は、当業者が本発明を製造および使用できるように十分詳細に示したため、本発明の精神から逸脱することなく、図示した実施形態の多数の変形および修飾がなされてよいということが認識され、さらに、本発明は上記説明またはそれに伴う図に限定されるものではないことが意図されるが、付属の特許請求の範囲によりもっぱら定義される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図1は、本発明の好ましい実施形態により使用される分子の親和性の原理の概略図である。
【図２】図2(a)は、本発明の原理に従って構築された測定プローブの概略図である。図2(b)は、バリヤー膜の近くに導かれた後の図2(a)の測定プローブおよび膜の反対側にある標的分子を示す。
【図３】図3は、プローブプロトタイプを示した図である。
【図１】
0005096145.tif 000003
【図２】
0005096145.tif 000004
【図３】
0005096145.tif 000005