【手続補正書】
【提出日】平成30年6月22日(2018.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖標的核酸からシーケンシングライブラリを調製する方法であって、
（ａ）複数のトランスポソームを提供するステップであって、各トランスポソームモノマーはトランスポザーゼとトランスポゾン核酸とを含み、前記トランスポソームは前記二本鎖標的核酸の一方の鎖にのみニックを入れるように構成されている、提供ステップと、
（ｂ）前記標的核酸をトランスポソームに接触させて、その結果、前記標的核酸の複数の部位で前記標的核酸にニックを入れ、少なくとも１つの前記ニック入り標的核酸の少なくとも１つに単一トランスポゾン核酸を付加して転移核酸を生成することによりシーケンシング用の修飾核酸ライブラリを得る接触ステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記方法は、バーコードを有するシーケンシングライブラリを調製する方法であって、
前記提供ステップでは、（ａ）各トランスポソームはトランスポザーゼと、認識配列を含むトランスポゾン核酸とを含み、
前記接触ステップは、（ｂ）前記トランスポゾン核酸を前記標的核酸の鎖に挿入するステップであって、
（ｉ）前記標的核酸を前記トランスポソームに接触させ、その結果、複数の部位で前記標的核酸にニックを入れ、前記ニック入り鎖のニック部位の一方の側に単一トランスポゾン核酸を付加して転移核酸を生成し、
（ｉｉ）前記ニック入り鎖のニック部位のもう一方の側に付加した前記単一トランスポゾン核酸をライゲーションすることによりシーケンシング用の修飾核酸ライブラリを得るステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的ＤＮＡの近接情報を得るための方法であって、
（ａ）複数のトランスポソームを提供するステップであって、各トランスポソームモノマーはトランスポザーゼとトランスポゾン核酸とを含み、前記トランスポソームは二本鎖標的核酸の一方の鎖にのみニックを入れるように構成されている、ステップと、
（ｂ）前記標的ＤＮＡを前記トランスポソームに接触させて、その結果、前記標的核酸の複数の部位で前記標的ＤＮＡにニックを入れるステップと、
（ｃ）前記標的ＤＮＡ配列に１つまたは複数の認識配列を追加または挿入して処置済み標的ＤＮＡを生成するステップと、
（ｄ）前記処置済み標的ＤＮＡをシーケンシングするステップと、
（ｅ）共通の特性を有する、前記標的ＤＮＡ配列または認識配列を特定することにより近接情報を得るステップと、を含む方法。
【請求項４】
標的ＤＮＡの近接情報を取得するための方法であって、
（ａ）複数のトランスポソームを提供するステップであって、各トランスポソームモノマーはトランスポザーゼと、認識配列を含むトランスポゾン核酸とを含み、前記トランスポソームは二本鎖標的核酸の一方の鎖にのみニックを入れるように構成されている、ステップと、
（ｂ）前記トランスポゾン核酸を前記標的核酸の鎖に挿入するステップであって、
（ｉ）前記標的核酸を前記トランスポソームに接触させ、その結果、複数の部位で前記標的核酸にニックを入れ、前記ニック入り鎖のニック部位の一方の側に単一トランスポゾン核酸を付加し、
（ｉｉ）前記ニック入り鎖のニック部位のもう一方の側に前記付加した単一トランスポゾン核酸をライゲーションすることにより修飾核酸を得るステップと、
（ｃ）前記修飾核酸を増幅することにより、挿入した認識配列を含む複数の核酸を得るステップと、
（ｄ）処置済み前記標的ＤＮＡをシーケンシングするステップと、
（ｅ）共通の特性を有する、前記標的ＤＮＡ配列または認識配列を特定することにより近接情報を取得するステップと、を含む方法。
【請求項５】
前記認識配列はバーコードであり、少なくとも１つのトランスポゾン核酸の前記バーコードは異なり、
任意に前記認識配列はバーコードであり前記トランスポゾン核酸の前記バーコードは同じではない、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
修飾核酸を表面上に捕捉するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記表面は複数の捕捉プローブを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉プローブは核酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾核酸を前記捕捉プローブにハイブリダイズするステップを含み、
任意に前記修飾核酸および前記捕捉プローブはそれぞれ親和性部を含み、
任意に前記親和性部はビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記表面は、mm2あたり少なくともおよそ100,000の捕捉核酸を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において標的核酸に接触させたトランスポソームを表面に付加することにより前記修飾核酸を前記表面上に捕捉する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
表面上の捕捉核酸をシーケンシングするステップを更に含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸配列の線形表現において２つの捕捉核酸から得た配列情報の近接度は、前記表面上の捕捉核酸の近接度を示す、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面上で互いの近接度がより高い捕捉核酸は、近接度のより低い捕捉核酸と比較し、前記標的核酸配列の表現における近接度がより高い配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸配列の表現はハプロタイプ表現を含む、請求項１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記トランスポソームは、片側トランスポザーゼ活性を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記トランスポソームはトランスポザーゼ活性を欠くモノマーサブユニットを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスポソームは、共有結合的に連結したモノマーサブユニットを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスポザーゼの四次構造はモノマー状である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記トランスポザーゼはダイマーを形成する機能を欠く、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスポザーゼは、Ｍｕ、Ｍｕ Ｅ３９２Ｑ、Ｔｎ５、高活性Ｔｎ５、Ｔｎ５多様体、Ｖｉｂｈａｒ、ＲＡＧ、およびＴｎ５５２からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記1つまたは複数のトランスポゾン核酸は非機能的である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記非機能的トランスポゾン核酸の3'末端は、ジデオキシ基、スペーサ基、アミン基、アルキル基、アリール基、ホスフェート基、チオール基、逆ヌクレオチド、アジド基、硫酸基、およびビオチン基からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のトランスポソームは、前記トランスポザーゼを、機能的トランスポゾン核酸と非機能的トランスポゾン核酸とに接触させることにより調製する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
非機能的トランスポゾン核酸を含むトランスポゾン核酸の、機能的トランスポゾン核酸に対する比率は１：１以上、例えば１０：１以上である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）前記ニック入り標的核酸にＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、
（ｉｉ）前記捕捉鎖を鋳型として用いて前記標的核酸の3’を伸長させるステップと、
（ｉｉｉ）任意に前記伸長した核酸を増幅するステップと、をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２７】
前記伸長した核酸を増幅するステップは、アンカー部位、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、バーコード、およびレポータータグからなる群から選択される配列を含むテイル化増幅プライマーを用いる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
捕捉核酸を増幅するステップを含み、
任意に前記捕捉核酸を増幅するステップはブリッジ増幅を有する、請求項６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
表面は複数の捕捉プローブを含み、
任意に前記捕捉プローブは核酸を含む、請求項６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記トランスポゾン核酸は、アンカー部位、バーコード、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、およびレポータータグからなる群から選択される配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つのトランスポソームが２つのトランスポゾン核酸を含み、
任意に前記２つのトランスポゾン核酸は異なる配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数のトランスポソームは、少なくとも２つの異なるトランスポゾン核酸を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数のトランスポソームは、トランスポソームを形成する機能は有するが転移する機能は欠く、少なくとも１つのトランスポザーゼを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、およびｃＤＮＡからなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記トランスポゾンは第１バーコードセットを含み、
前記第１バーコードセットを転移中に前記標的核酸に導入して、第１バーコードセットを含む転移標的核酸を生成し、
前記転移標的核酸をプールして、転移標的核酸の第１プールを生成し、
第２バーコードセットを前記転移標的核酸の第１プールに導入して、第１および第２のバーコードセットを含む標的核酸を生成し、
第１および第２のバーコードセットを含む標的核酸をプールして転移標的核酸の第２プールを生成し、
任意に追加バーコードを導入するステップと、プールしてバーコード化標的核酸ライブラリを生成するステップを繰り返す、
組み合わせバーコーディングをさらに含む請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法により調製されるシーケンシングライブラリ。