【手続補正書】
【提出日】平成30年6月5日(2018.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)TNFR:Fc融合タンパク質と少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含有する宿主細胞タンパク質(HCP)不純物とを含むタンパク質混合物を、採集細胞培養液から取得すること；
ｂ)タンパク質混合物をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｃ)TNFR:Fc融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出したTNFR:Fc融合タンパク質は、HCP不純物の含有量が減少した第２のタンパク質混合物中に存在すること；
ｄ)第２のタンパク質混合物を混合モードクロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｅ)TNFR:Fc融合タンパク質を混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出したTNFR:Fc融合タンパク質は、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含有するHCP不純物を実質的に含まないこと
を含んでなる、TNFR:Fc融合タンパク質とHCP不純物とを含むタンパク質混合物からTNFR:Fc融合タンパク質を精製する方法。
【請求項２】
ａ)TNFR:Fc融合タンパク質と少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含有する宿主細胞タンパク質(HCP)不純物とを含むタンパク質混合物を、採集細胞培養液から取得すること；
ｂ)タンパク質混合物をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｃ)TNFR:Fc融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出したTNFR:Fc融合タンパク質は、HCP不純物の含有量が減少した第２のタンパク質混合物中に存在すること；
ｄ)第２のタンパク質混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｅ)TNFR:Fc融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出した興味対象タンパク質は、HCP不純物の含有量が減少した第３のタンパク質混合物中に存在すること；
ｆ)第３のタンパク質混合物を混合モードクロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｇ)TNFR:Fc融合タンパク質を混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出した興味対象タンパク質は、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含有するHCP不純物を実質的に含まないこと
を含んでなる、TNFR:Fc融合タンパク質とタンパク質分解酵素を含有する少なくとも１つのHCP不純物とを含むタンパク質混合物からTNFR:Fc融合タンパク質を精製する方法。
【請求項３】
ａ)TNFR:Fc融合タンパク質と少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含有する宿主細胞タンパク質(HCP)不純物とを含むタンパク質混合物を、採集細胞培養液から取得すること；
ｂ)タンパク質混合物をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｃ)TNFR:Fc融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出したTNFR:Fc融合タンパク質は、HCP不純物の含有量が減少した第２のタンパク質混合物中に存在すること；
ｄ)第２のタンパク質混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｅ)TNFR:Fc融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出したTNFR:Fc融合タンパク質は、HCP不純物の含有量が減少した第３のタンパク質混合物中に存在すること；
ｆ)第３のタンパク質混合物をアニオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｇ)TNFR:Fc融合タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出した興味対象タンパク質は、HCP不純物の含有量が減少した第４のタンパク質混合物中に存在すること；
ｈ)第４のタンパク質混合物を混合モードクロマトグラフィーカラムに適用すること；
ｉ)TNFR:Fc融合タンパク質を混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出させることであって、溶出したTNFR:Fc融合タンパク質は、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含有するHCP不純物を実質的に含まないこと
を含んでなる、TNFR:Fc融合タンパク質とタンパク質分解酵素を含有する少なくとも１つのHCP不純物とを含むタンパク質混合物からTNFR:Fc融合タンパク質を精製する方法。
【請求項４】
混合モードクロマトグラフィーがフロースルーモードで行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質混合物が約pH６〜約pH6.8の範囲から選択される適切なpHでの混合モードクロマトグラフィーカラムに適用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質混合物が約30mS/cm〜約42mS/cmに調節された適切なタンパク質混合物導電率での混合モードクロマトグラフィーカラムに適用される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
TNFR:Fc融合タンパク質がエタネルセプトである請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項８】
工程(ｂ)が
ａ')結合したTNFR:Fc融合タンパク質を、pH約８〜pH約９から選択されるpH範囲及び約50mS/cm〜約75mS/cmより選択される導電率範囲を有する緩衝液で洗浄すること、及び/又は
ｂ')結合したTNFR:Fc融合タンパク質を、pH約４〜pH約５から選択されるpH範囲及び約10mS/cm〜約30mS/cmより選択される導電率範囲を有する緩衝液で洗浄すること
を更に含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ)及び工程ｂ)が、１回より多い洗浄をアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用しない方法による場合と比較して減少したHCP不純物の含有量を提供する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程(ａ')がTris塩基、Tris塩化物、HEPES、トリエタノールアミン、ボレート及びグリシン-NaOHから選択される緩衝液の使用を含んでなる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１、２若しくは３の工程(ｃ)において、TNFR:Fc融合タンパク質の溶出が線形グラジエント及びステップグラジエントの組合せである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
線形グラジエントがpH範囲約２〜約3.5より選択される溶出緩衝液及びpH範囲約４〜５より選択される洗浄緩衝液を適切な比で用いて達成される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質分解酵素が少なくとも90％除去される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．TNFR:Fc融合タンパク質と、ゼラチンザイモグラフィーにより決定されるタンパク質分解活性を有する少なくとも１つのHCPとを含む採集細胞培養液を取得すること；
ｂ．(ａ)の採集細胞培養液を、少なくとも１つのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程並びにイオン相互作用手段及び/又は疎水性相互作用手段を含む少なくとも１つの追加のクロマトグラフィー工程に供し、ゼラチンザイモグラフィーにより決定されるタンパク質分解活性を実質的に有さないTNFR:Fc融合タンパク質組成物を取得すること
を含んでなる、TNFR:Fc融合タンパク質組成物内のプロテアーゼ活性を低減する方法。
【請求項１５】
ａ．TNFR:Fc融合タンパク質と、適切なプロテアーゼ活性検出アッセイにより決定されるタンパク質分解活性を有する少なくとも１つのHCPとを含む採集細胞培養液を取得すること；
ｂ．(ａ)の採集細胞培養液を、少なくとも１つのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程に供して、TNFR:Fc融合タンパク質を含む第１のタンパク質組成物を取得すること
ｃ．第１のタンパク質組成物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程に供して、TNFR:Fc融合タンパク質を含む第２のタンパク質組成物を取得すること；
ｄ．第２のタンパク質組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー工程に供して、TNFR:Fc融合タンパク質を含む第３のタンパク質組成物を取得すること；
ｅ．第３のタンパク質組成物を、混合モードクロマトグラフィー工程に供して、TNFR:Fc融合タンパク質を含み、ゼラチンザイモグラフィーにより決定されるタンパク質分解活性を実質的に有さない最終タンパク質組成物を取得すること；
を順次含んでなる、TNFR:Fc融合タンパク質組成物内のプロテアーゼ活性を低減する方法。