(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体サンプル中の少なくとも１つの目標分析物の存在および／または濃度を検出するための多使用バイオセンサであって、
センシング層を含む電極と、
前記電極のセンシング層の少なくとも一部の上に分配された改変された酵素であって、酵素上の少なくとも１つの官能基と反応物との反応によって、前記改変された酵素の溶解度が低下するように前記酵素は改変されており、前記改変された酵素は、前記生物学的流体サンプル中および前記多使用バイオセンサと共に用いられるキャリブレーション用試薬中で実質的に不溶性であり、かつ、前記生物学的流体サンプルおよび前記キャリブレーション用試薬よりも低いイオン強度を有する緩衝液に実質的に溶解し、前記改変された酵素は、前記目標分析物の検出のために前記目標分析物と相互作用する活性部位を含む、前記改変された酵素と、
前記改変された酵素の少なくとも一部の上に配置されて、前記電極上に前記改変された酵素を固定化し、検出される前記目標分析物に対して透過性であるが、前記改変された酵素に対しては実質的に不透過性である膜と、
を含む多使用バイオセンサ。
【請求項２】
前記多使用バイオセンサが、電位計測式分析物バイオセンサとして定められる、請求項１に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項３】
前記酵素上の少なくとも１つの官能基が、アルデヒド−、アミン−、カルボニル−、カルボキシル−、ヒドロキシル−、ケトン−、マレイミド−、スルフヒドリル−、およびチオール−反応性基を含む一群の中から選択される、請求項１または２に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項４】
前記反応物が長鎖ビオチンを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項５】
前記膜が、ポリウレタン、シリコーン、ポリ塩化ビニル、およびそれらの組み合わせを含む一群の中から選択される材料で形成される、請求項１から４のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項６】
前記酵素が、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラクケース、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む一群の中から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項７】
前記多使用バイオセンサは多使用血中尿素窒素（ＢＵＮ）バイオセンサとしてさらに定められ、かつ少なくとも１つの前記改変された酵素が改変されたウレアーゼである、請求項１から６のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項８】
前記多使用バイオセンサが少なくとも１４日間の使用寿命を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項９】
前記酵素に付着した前記反応物によって、改変されていない酵素の分子量および／または等電点と比較した場合に、前記改変された酵素の分子量の増加、および／または等電点の変化をもたらす、請求項１から８のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサ。
【請求項１０】
多使用バイオセンサ配列組立体であって、
基板と、
複数の多使用バイオセンサと、を含み、前記複数の多使用バイオセンサの各々が、前記基板の少なくとも１つの表面上に空間的に配置され、かつ前記複数の多使用バイオセンサのうちの少なくとも１つが、請求項１から９のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサである、多使用バイオセンサ配列組立体。
【請求項１１】
多使用バイオセンサを製造する方法であって、
（ａ）酵素上の少なくとも１つの官能基を反応物と反応させることによって、第１緩衝液中に存在する酵素を改変するステップであって、それにより、改変されていない酵素と比較して溶解度を低下させて、改変された酵素が、生物学的流体サンプル中および前記多使用バイオセンサと共に用いられるキャリブレーション用試薬中で実質的に不溶性であるようにし、かつ、前記改変された酵素が、目標分析物の検出のために前記目標分析物と相互作用する活性部位を含むようにする、ステップ、
（ｂ）前記改変された酵素の沈殿を形成するステップ、
（ｃ）前記改変された酵素の沈殿を第２緩衝液中に再溶解させて、前記改変された酵素の溶液を提供するステップであって、その際、前記第２緩衝液が前記第１緩衝液よりも低いイオン強度を有し、前記改変された酵素が前記第２緩衝液中に実質的に溶解するが、前記第１緩衝液中にはより可溶性が劣るかまたは実質的に不溶性であるようにする、ステップ、
（ｄ）電極のセンシング層の少なくとも一部の上に特定量の前記改変された酵素溶液を分配するステップ、
（ｅ）前記改変された酵素溶液を前記電極上で乾燥させるステップ、ならびに、
（ｆ）前記改変された酵素および前記電極の少なくとも一部の上に膜を配置するステップであって、前記膜は前記電極上に前記改変された酵素を固定化し、かつ、検出される目標分析物に対して透過性であるが、前記改変された酵素に対しては実質的に不透過性である、ステップ、
を含む方法。
【請求項１２】
前記多使用バイオセンサが、電位計測式分析物バイオセンサとして定められる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記酵素上の少なくとも１つの官能基は、アルデヒド−、アミン−、カルボニル−、カルボキシル−、ヒドロキシル−、ケトン−、マレイミド−、スルフヒドリル−、およびチオール−反応性基を含む一群の中から選択されること、
（ｉｉ）前記反応物は長鎖ビオチンを含むこと、
（ｉｖ）前記膜は、ポリウレタン、シリコーン、ポリ塩化ビニル、およびそれらの組合せを含む一群の中から選択される材料から形成されること、
（ｖ）前記酵素は、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラクケース、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼからなる一群の中から選択されること、ならびに、
（ｖｉ）前記酵素に付着した反応物によって、改変されていない酵素の分子量および／または等電点と比較した場合、前記改変された酵素の分子量の増加、および／または等電点の変化をもたらすこと、の少なくとも１つを満たす請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多使用バイオセンサが、多使用血中尿素窒素（ＢＵＮ）バイオセンサとしてさらに定められ、かつ少なくとも１つの前記改変された酵素が改変されたウレアーゼである、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多使用バイオセンサが、少なくとも１４日間の使用寿命を有するように生成される、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ａ）では、前記改変された酵素の溶解度を低下させて、前記改変された酵素が、前記生物学的流体サンプル中および前記多使用バイオセンサと共に用いられるキャリブレーション用試薬中で実質的に不溶性であるが、前記生物学的流体サンプルおよび前記キャリブレーション用試薬よりも低いイオン強度を有する緩衝液中では実質的に可溶性であるようにする、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｇ）前記ステップ（ａ）の前に、前記第１緩衝液中への緩衝液交換による添加物からの前記酵素の浄化と、
（ｈ）前記ステップ（ｄ）の前に、前記酵素の活性の測定、
とのうち少なくとも１つを含む、請求項１１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
多使用バイオセンサ配列組立体を製造する方法であって、
複数の多使用バイオセンサを、基板の少なくとも１つの表面上に形成するステップであって、この際、前記複数の多使用バイオセンサの各々が、基板の少なくとも１つの表面上に空間的に配置され、かつ前記複数の多使用バイオセンサのうちの少なくとも１つが、請求項１１から１７のいずれか１項に記載の方法によって形成される、ステップを含む方法。
【請求項１９】
生物学的流体サンプル中の目標分析物の存在および／または濃度を検出する方法であって、
（ａ）請求項１から９のいずれか１項に記載の多使用バイオセンサを有する、血液ガス機器、電解質機器、または代謝物機器の少なくとも１つに前記生物学的流体サンプルを挿入するステップ、ならびに、
（ｂ）前記多使用バイオセンサによって捕獲された前記目標分析物の存在および／または濃度を測定するステップ、
を含む方法。
【請求項２０】
生物学的流体サンプル中の複数の目標分析物の存在および／または濃度を検出する方法であって、
（ａ）前記生物学的流体サンプルを、請求項１０に記載の多使用バイオセンサ配列組立体を有する、血液ガス機器、電解質機器、または代謝物機器の少なくとも１つに挿入するステップ、ならびに、
（ｂ）前記多使用バイオセンサ配列組立体の個々の多使用バイオセンサによって捕獲された前記複数の目標分析物の各々の存在および／または濃度を測定するステップ、
を含む方法。
【請求項２１】
前記生物学的流体サンプルが、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、脳脊髄液、皮膚、腸液、腹腔内液、のう胞液、汗、間質液、細胞外液、涙液、粘液、膀胱洗浄液、精液、便、胸水、鼻咽頭液、の少なくとも１つ、または、それらの組み合わせのいずれかから選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「関連出願の相互参照」
本出願は、２０１７年５月４日に出願された米国仮出願第６２／５０１，３２２号に基づく優先権を主張するものであり、上記仮特許出願の開示を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
「連邦支援による資金提供を受けた研究開発の記載」
該当せず。
【背景技術】
【０００３】
センサまたは検出器は、物理量を測定して、それを観察者または器具により読取り可能な信号に変換する装置である。センサは、試料またはサンプル中の目的の分析物の特性を決定する化学的および生化学的検査に使用されている。生物医学およびバイオテクノロジーにおいて、細胞、タンパク質、または核酸などの生物学的成分を有する分析物を検出するセンサは、バイオセンサ（生体センサ）と呼ばれる。
【０００４】
複数のバイオセンサを１つのユニットに集める（グループ化する）バイオセンサ・アレイ（バイオセンサの配列）は、生物学的（生体）分析物の存在（有無）および／または濃度を決定するために、化学および医学において有用である。例えば、患者から採取した液体サンプルの分析によって、患者の診断および治療に関連する様々な種類の分析検査が行われることがある。一般的に検査される体液には、尿、血液、血漿、唾液、脳脊髄液、胸水などが含まれる。たとえば、血液サンプルを日常的に（ルーティン的に）分析して、ＣＯ２とＯ２の分圧（部分的な圧力）や、血液中の電解質と代謝産物の濃度を測定する。生物学的分析物の存在および濃度を決定するために、バイオセンサが一般的に使用されているが、これには、分析物を誘引し捕獲する固定化酵素が含まれる。具体的には、イオン選択性電極を利用することができる電位差（測定の）バイオセンサ、又は目的のイオンを選択的に拡散させるイオン透過性膜を有する電極を利用することができる電位差バイオセンサがしばしば用いられる。操作原理は、イオンが２つの相間で平衡化するときに生成される測定可能な電位差に基づいている。
【０００５】
硬質層状センサアセンブリおよび電気回路を利用してこのような測定を行うために、現在多くの様々な分析器が存在する。このようなセンサアセンブリは、一次臨床表示によって医療患者の状態を評価するために使用される。多くの患者にとって、検査回数のために、分析の実施用に小型のサンプルを使用可能にすることが望ましい。集中治療室の患者は、血液ガスおよび臨床化学測定のために１日に１５〜２０回のサンプリング回数を必要とすることがある。このような場合、比較的短期間に採取されるサンプルが比較的多くなるため、少量の血液サンプルを分析することが望ましい。また、実施される試験数を制限するためには、試験ごとにできるだけ多くの情報を収集することが望ましい。
【０００６】
現在、特許文献１、特許文献２及び特許文献３に開示されたセンサアレイのように、単回使用バイオセンサまたは多使用バイオセンサがセンサアレイに利用可能となっている。（これらの各内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。バイオセンサ測定に利用可能な分析（アッセイ）の１つの例は、血中尿素窒素（ＢＵＮ：Ｂｌｏｏｄ  Ｕｒｅａ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）分析である。ＢＵＮ分析では、老廃物である尿素からの血液中の窒素量を測定する。尿素は、タンパク質が分解されるときに腎臓でつくられる副産物である。尿素は肝臓で産生されるが、腎臓を通過するため、ＢＵＮを測定することにより、医師および臨床医が患者の腎機能を評価することが可能となっている。正常のＢＵＮ値よりも高い場合、患者の腎臓が適切に機能していないことを示している。単回使用ＢＵＮバイオセンサが現在入手可能であり、そのバイオセンサは、グルタルアルデヒド架橋などの一連のウレアーゼ固定化方法を使用する（例えば、ニュージャージー州プリンストン所在のアボット・ポイント・オブ・ケア社から入手可能な現在入手可能なｉＳＴＡＴ（登録商標）試験カートリッジを参照）。一般に、ウレアーゼは、電極上に堆積し、ポリマー中に捕捉するために不溶性の形態に架橋することによって「適所に保持」される。次に、一般的には、覆い（カバー）膜を適用して、酵素をさらに保持して、汚れ、干渉物質などから保護する。しかしながら、多使用ＢＵＮバイオセンサを製造するためにこの技術を適応する際に問題が生じている。一般的に、多使用ＢＵＮバイオセンサにとっては、使用寿命が劣ることが観察されている。使用寿命が劣ることの要因には様々があるが、例えば、バイオセンサに対する不十分な量の活性ウレアーゼの固定化、経時的なリーチング（ｌｅｅｃｈｉｎｇ）のためにウレアーゼの喪失による性能低下、および使用による酵素分解などがある（ただし、これらに限定されない）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／００８２８７４号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０２８６８８８号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／１５５６６５号
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明の技術思想に従って構成された多使用バイオセンサの透視図である。
【図２】図２は、本発明の技術思想に従って構成された多使用バイオセンサ配列組立体の構成である。
【図３】図３は、０、５、および２７ｍｇ／ｄＬのＢＵＮキャリブレーター溶液（１、２、および３）および反復血液サンプル（４）への露光時に、本発明の技術思想に従って構成された多使用バイオセンサの分析物の応答をグラフ表示する図である。
【図４】図４は、架橋ウレアーゼを含有する従来の多使用バイオセンサ（□）、ならびに非架橋ウレアーゼを含有する従来の多使用バイオセンサ（◇）と比較して、本開示の発明の技術思想に従って構成された多使用バイオセンサ（〇）の、３７℃での５および２７ｍｇ／ｄＬのＢＵＮキャリブレーター溶液（１日当たり１０個の血液サンプルと６２個のキャリブレーター）における３０日間にわたる電位差（測定の）ＢＵＮ（血液尿素窒素）センサ用量反応勾配（スロープ）をグラフ表示する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の技術思想に係る少なくとも１つの実施形態について、例示的な用語および結果を用いて説明する前に、本発明の技術思想は、以下の説明に記載される構成の詳細および構成要素の配置に限定されないことを理解されたい。本発明の技術思想は、他の実施形態によっても可能であり、また様々な方法で実施することも可能である。したがって、本明細書で使用される用語は、可能な限り広範な範囲および意味を与えることを意図したものである。また、実施形態は、例示的であり、網羅的ではないことを意図したものである。また、本明細書で使用される語句および用語は、説明の目的のため使われており、限定的ではないことを理解されたい。
【００１０】
本明細書で別途定義されない限り、本開示内容の発明の技術思想に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者に共通して理解される意味を有するものとする。さらに、別途記載される場合を除き、用語の単数は複数を含み、また複数は単数を含むものとする。前述の技術および手順は、一般的に、当技術分野で周知であり、本明細書中に引用され、論じられる種々の一般的および具体的な参考文献に記載の従来の方法に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、および医薬・薬学化学に関して利用される専門用語、ならびに実験の手順および技術は、当技術分野で公知であり、一般的に使用されるものである。化学合成や化学分析については標準的な手法が用いられる。
【００１１】
明細書に記載のすべての特許、公開された特許出願、および非特許公報は、現在、開示されている発明の技術思想と関連する当業者の技術レベルを示すものである。特許または公開された文献が、それぞれ参照により本明細書に援用されているのと同様に、本出願中に参照された全ての特許、公開された特許出願、及び非特許文献は、参照により本明細書に援用されている。
【００１２】
本明細書に開示された物品、組成物、および／または方法の全ては、本開示に照らして過度の実験を必要とすることなく作製および実施することができる。本発明の技術思想に係る物品、組成物、および方法は、特定の実施形態の観点から説明されているが、本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく、物品、組成物および方法、ならびに本方法のステップまたは順序に変更を加えることができることは、当業者には自明だろう。当業者に明らかな、同様の置換及び変更物は、添付された特許請求の範囲によって定義されている、本発明の技術思想または範囲内に含まれるとみなされる。
【００１３】
本開示内容で用いられる以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有する。
【００１４】
特許請求の範囲または明細書中において、用語「含む」と合わせて用いられる単数の表現（冠詞「ａ」または「ａｎ」に相当）は、「１つ」を意味するとともに、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは複数」の意味を有することができる。したがって、上記の単数の表現は、複数の意味を含むが、記載中で単数に限定されている場合は除かれる。従って、例えば、「化合物」とは、１つ以上の化合物、２つ以上の化合物、３つ以上の化合物、４つ以上の化合物、またはより多数の化合物を意味することができる。用語「複数」は、「２以上（２つまたは複数）」を意味する。
【００１５】
用語「少なくとも１つ」は、１つを含むとともに、１つよりも大きな任意の数を含むことができ、例えば、非限定的な例を示すと、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００などを含むことができる。用語「少なくとも１つ」は、それと関連する用語に応じて、１００または１０００以上にまで及ぶことがある。さらに、より高い数値も可能なため、１００／１０００の値は限定的ではないと考えられる。さらに、「Ｘ、Ｙ、Ｚのうちの少なくとも１つ」という用語は、Ｘ単独、Ｙ単独、およびＺ単独、ならびにＸ、Ｙ、およびＺの任意の組合せを含むと理解される。順序を表す数詞（すなわち、「第１」、「第２」、「第３」、「第４」など）は、２つ以上の項目を区別するに過ぎず、例えば、ある項目の他の項目または追加の順番に対する順序または順番または重要性を意味するものではない。
【００１６】
特許請求の範囲で用いられる用語「又は」は、包括的な「及び／又は」を意味し得る。ただし、二者択一に限ること、または選択が相互排他的であると明示的に記載されている場合は除かれる。例えば、条件「ＡまたはＢ」は、「Ａは真（または存在する）であり、Ｂは偽（または存在しない）である場合」、「Ａは偽（または存在しない）であり、Ｂは真（または存在する）である場合」、「ＡとＢは両方とも真（または存在する）である場合」のうち、いずれかでもよい。
【００１７】
本明細書で中、例えば、「実施形態」、「１つの実施形態」、「いくつかの実施形態」、「１例」、「例えば」または「例」が用いられる場合、実施形態に関連して記載される特定の要素、特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。明細書の種々の場所における「いくつかの実施形態において」または「１つの実施形態において」という語句は、必ずしもすべてが、例えば、同じ実施形態を参照していることを意味しない。さらに、１つまたは複数の実施形態または実施例についての全ての言及は、特許請求の範囲に限定されないことを理解されたい。
【００１８】
本願全体を通して、「約」という用語は、値が、組成／機器／装置（デバイス）のエラーの固有のばらつき、値を決定するために用いられる方法、または研究対象の中に存在するばらつきを含むことを示す。例えば、非限的な例を示すと、用語「約」が利用される場合、指定された値から、プラスマイナスで２０パーセント、または１５パーセント、または１２パーセント、または１１パーセント、または１０パーセント、または９パーセント、または８パーセント、または７パーセント、または６パーセント、または５パーセント、または４パーセント、または３パーセント、または２パーセント、または１パーセントだけ変化することができ、そのようなばらつきは、本開示の方法を実行するのに適切であって、当業者によって理解することができる。
【００１９】
本明細書および特許請求の範囲において使用可能な、用語「含む」（および「構成する」などの任意の形態を含む）、「有する」（および「含有する」などの任意の形態を含む）等は、包含的または開放的であり、追加の、列挙されていない要素または方法ステップを除外するものではない。
【００２０】
本明細書で使用される用語「又はそれらの組み合わせ」とは、用語の前に列挙された項目の全ての順列及び組み合わせを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことを意図し、特定の状況において順位が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことを意図する。この例に続いて、明示的に含まれる組合せは、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１つまたは複数の項目または用語の繰り返しを含む組合せである。当業者は、文脈から明らかでない限り、いずれの組合せにおいても、典型的には、項目または用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【００２１】
本明細書中で使用される「実質的に」という用語は、後に記載の事象または状況が完全に発生するか、または後に記載の事象または状況が大きな範囲にまたは程度で発生することを意味する。例えば、特定の事象または状況と関連する場合、「実質的に」という用語は、後に記載の事象または状況が、時間の少なくとも８０％、または時間の少なくとも８５％、または時間の少なくとも９０％、または時間の少なくとも９５％で生じることを意味する。「実質的に隣接している」という用語は、２つの項目が互いに１００％隣接していること、または２つの項目が互いに近接しているが１００％近接していない範囲内にあること、または２つの項目の１つの一部が他の項目に１００％隣接していないが、他の項目に近接している範囲内にあることを意味してもよい。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「関連する」および「結合する」という語句には、２つの部分の互いの直接的な会合／結合ならびに２つの部分の間接的な会合／結合の両方が含まれる。会合／カップリングの非限定的な例には、例えば、直接結合またはスペーサー基を介する、１つの部分の別の部分への共有結合、１つの部分の別の部分への直接または結合された特異的結合対メンバーのいずれかによる、１つの部分の別の部分への非共有結合、１つの部分の別の部分への溶解による、または合成によるなどの、１つの部分の別の部分への組み込み、および１つの部分の別の部分へのコーティングが含まれる。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「サンプル」は、本発明の概念に従って利用され得る任意のタイプの生物学的サンプル（試料）を含むと理解されるであろう。利用することができる生物学的流体サンプルの例としては、限定されるわけではないが、全血（血液）またはその任意の部分（すなわち、血漿または血清）、尿、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、皮膚、腸液、腹腔内液、のう胞液、汗、間質液、細胞外液、涙液、粘液、膀胱洗浄液、精液、便（糞便）、胸水、鼻咽頭液、これらの組み合わせなどが挙げられる。
【００２４】
用語「患者」には、ヒトおよび動物の被験者を含む。ある実施形態では、患者は哺乳動物である。特定の他の実施形態では、患者はヒトである。治療目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および家畜動物、非ヒト霊長類、および動物園、スポーツ、またはイヌ、馬、ネコ、ウシなどのペット動物を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。
【００２５】
ここで用いられる用語「浄化された」とは、出発物質または天然物質と比較して、少なくとも１桁の大きさの浄化（精製）が達成されることを意味するが、例えば、出発物質または天然物質の浄化の２、３、４、または５桁の大きさに限定されるものではない。従って、本明細書中で利用される用語「浄化された」は、材料が１００％浄化されていることを必ずしも意味せず、従って、そのような用語は、浄化組成物中に存在する他の物質の存在を除外しない。
【００２６】
ここで使用される用語「電極」は、本開示の発明の技術思想に従って機能できる任意の種類の導電体または媒体を指す。本発明の技術思想の範囲内に入る電極の非限定的な例は、複数の電極を含む電気化学セルを含む。例示的な電気化学セル構造体は、１つの指示電極および１つの参照電極を含む２電極セルと、１つのアノードおよび１つのカソードを含む２電極セルと、１つのアノード、１つのカソードおよび１つの参照電極を含む３電極セルと、２つの作用電極、１つの対電極および１つの参照電極を含む４電極セルとを含む。
【００２７】
現在、センサアレイに使用するために、多使用バイオセンサが利用可能である。しかしながら、これらのバイオセンサは、一般的に、バイオセンサ上に固定化された不十分な活性酵素、経時的な酵素リーチングの喪失によって引き起こされる劣化した性能、単に使用による酵素の劣化、および／または汚れおよび／またはインターフェレント（干渉物質）による不十分な酵素活性のために、短い使用寿命を有する。
【００２８】
従って、当技術分野では、従来技術の多使用バイオセンサの問題を解決するとともに、センサ配列組立体（アレイ・アセンブリ）にも使用できる新規で改良された多使用バイオセンサへの需要がある。特に、バイオセンサの完全性、応答、および精度を実質的に維持しながら、少なくとも１４日間の寿命（少なくとも２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、または３０日間の寿命など）および少なくとも１０００個のサンプル能力（少なくとも１５００、２０００、２５００、または３０００個のサンプル（サンプリング）能力など、ただしこれらに限定されない）を有する多使用バイオセンサ（ＢＵＮおよび他の酵素ベースのバイオセンサなど）の需要が当技術分野では存在する。
【００２９】
図面（特に図１）を参照すると、本発明の技術思想に係る特定の実施形態が示されているが、これは、生物学的流体サンプル中の少なくとも１つの目標分析物の存在および／または濃度を検出するための多使用（マルチユース）バイオセンサ１０に関する。多使用バイオセンサ１０は、電極１２と、少なくともその一部上に配置された改変酵素１４と、改変酵素１４の少なくとも一部上に配置された膜１６とを含む。膜１６（本明細書では「覆い膜またはカバー膜」とも呼ばれる）は、改変酵素１４を電極１２上に固定化するように機能する。酵素１４は、その少なくとも１つの官能基と反応体との反応を介して、その溶解度（可溶性）を低下させるように改変されているため、改変酵素１４は、生物学的流体サンプル中および多使用バイオセンサ１０と共に使用されるキャリブレーション（較正）用試薬中で実質的に不溶性である。例えば（非制限的だが）、改変酵素１４は、生物学的流体サンプルおよび多使用バイオセンサ１０と共に使用されるキャリブレーション用試薬中では実質的に不溶性であり得るが、一方、生物学的流体サンプルおよびキャリブレーション用試薬よりも低いイオン強度を有する緩衝液（バッファー液）中には実質的に可溶性であり得る。さらに、改変後、酵素１４は、少なくとも１つの目標分析物と相互作用することができる活性部位を保持する結果、少なくとも１つの目標分析物は、上記の相互作用を通して検出することができる（また改変酵素１４により捕捉される）。
【００３０】
特定の（しかし非限定的な）実施形態では、多使用バイオセンサ１０は、さらに多使用血中尿素窒素（ＢＵＮ：ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）バイオセンサとして定められる。この実施形態では、バイオセンサ１０中に存在する改変酵素１４は、改変ウレアーゼである。特定の（しかし非限定的な）例では、ウレアーゼは長鎖ビオチンとの相互作用によって改変されている。
【００３１】
本開示の発明の技術思想に係る多使用バイオセンサ１０は、酵素１４の溶解度を低下させてバイオセンサ１０からの酵素１４のリーチングを防止することによってバイオセンサ１０の完全性を維持して、従来技術の欠陥および欠点を克服するので、多使用バイオセンサ１０の使用寿命およびサンプル能力を増大させることができる。例えば（非限定的な例だが）、多使用バイオセンサ１０は、少なくとも約１４日間の使用寿命および少なくとも約３０００個のサンプルのサンプル能力について、その完全性を実質的に維持することができる。
【００３２】
現在、マルチ・バイオセンサ・アレイ（複数バイオセンサ配列）製品を製造するために２つの一般的な仕方がある。これらの仕方では、個々のセンサを別々に作製して、化学作用が各センサ上で行われた後にアレイ（配列）内でとじ合わせるか、あるいは、アレイ内に複数の電極を含む単一の基板を使用して、適切なカップリング（結合）化学作用（例えば、架橋による酵素付着）を各電極上で（典型的には、試薬を連続的に分配する）行う。この２番目の選択肢は、コストの減少およびサンプル量の減少という利点を有するものの、製造中に電極化学の１つに何らかの問題が生じた場合、アレイ全体が損傷を受けるという大きなリスクを有する。
【００３３】
従って、従来技術の標準的な架橋方法の欠点の１つは、結合化学作用が製造中に電極上で直接行われることである。この直接的な相互作用は、特に、複数の電極があって、「単一基板」のマルチ・センサ・アレイ製品中に１つ以上の結合化学作用が実施される場合に、製造のリスクおよび複雑性を増大させている。本開示の発明の技術思想は、最終アレイ製造工程の外で重要な酵素化学作用を行うことにより、この欠陥を克服し、それによって、製造工程に関するリスクを相当に低減させる。サンプルおよび試験マトリックス中の酵素の溶解度を相当に低下させることにより、自由に溶解できる別のマトリックスから酵素を分配することができる一方で、製造中に電極に付着する前に改変酵素を（活性、運動などについて）検証することができ、それによってアレイの場所で酵素を架橋する必要性を除くことができる。
【００３４】
多使用バイオセンサ１０の特定の構成要素に戻ると、酵素を含むバイオセンサ中に使用できる当技術分野で公知の任意の種類のセンサを、本発明の技術思想に従って利用することができる。例えば（非限定的だが）、バイオセンサ１４は、電位差測定、電流測定、インピーダンス測定、またはコンダクト測定センサであってもよい。さらに、上記種類のバイオセンサの１つと共に使用することができる当技術分野で公知の任意の電極を、本発明の技術思想に従う電極１２として使用することができる。使用可能な電極１２の非限定的な例には、イオン特有またはイオン選択性電極（ＩＳＥ：ｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を含む。選択される電極の特定の種類は、センサの種類（すなわち、電位差測定法、電流測定法、インピーダンス測定法、コンダクト測定法など）に基づく。非限定的な実施形態では、電極１２は、センシング層（検出層または検出層）１８を含むことができる。電極１２と共に利用可能で、当技術分野で公知な、または当業者が想定可能な検出層は、本開示の発明の技術思想に従って利用することができる。本発明の技術思想の範囲内の検出層１８の非限定的な例の１つは、ＮＨ４＋検出層である。
【００３５】
電極１２は、本開示の発明の技術思想に従って電極が機能できるようにする任意の形状を有する。例えば、非限定的な実施形態では、電極１２は平面状または円形状であってもよい。電極１２は、当技術分野で公知、または本明細書で想定される任意の方法によって作製することができる。本発明の技術思想に従って利用できる製造方法の例としては、スクリーンプリント法、金属スパッタリング法、フォトリソグラフィー法、または他の任意の標準的な電極製造法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
目標分析物は、生物学的流体サンプル中に存在する任意の分析物であってよく、当該技術分野で公知、または酵素含有バイオセンサによって検出可能であると本明細書で想定されている。本発明の技術思想に係る多使用バイオセンサによって検出可能な目標分析物の非限定的な例を挙げると、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、グルコース、グルタミン酸、乳酸塩、エタノール、アスコルビン酸、コリンアセチルコリン、クレアチニン、コレステロール、ピルビン酸、ビリルビンなどが含まれる。
【００３７】
生物学的流体サンプル中の目標分析物を検出するためにバイオセンサに使用可能な当技術分野で公知の任意の酵素として、本発明の技術思想の範囲に従う酵素１４を用いることができる。多使用バイオセンサ１０に使用可能な酵素の非限定的な例を挙げると、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラクケース、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、及びこれらの任意の組み合わせなどが含まれる。
【００３８】
酵素１４上に存在する少なくとも１つの改変される官能基は、反応体との反応を介して改変可能な当該技術分野で公知の任意の官能基であってもよい。官能基の例として、非限定的な例を挙げると、アルデヒド−、アミン−、カルボニル−、カルボキシル−、ヒドロキシル−、ケトン−、マレイミド−、スルフヒドリル−、およびチオール−反応性基が含まれる。
【００３９】
本明細書に記載の仕方で酵素上の官能基と相互作用することができる、当技術分野で公知または本明細書で想定される任意の反応物を、本発明の技術思想の範囲内で用いることができる。官能基と反応物との相互作用の非限定的な１例を挙げると、長鎖ビオチンを有する酵素上のアミン基間の相互作用を含む。官能基と反応物との相互作用の別の非限定的な例を挙げると、酵素上のＣＯＯＨ官能基と１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）との相互作用を含む。しかしながら、任意の官能基と反応物との相互作用（および複数の官能基と反応物との相互作用の任意の組合せ）を本発明の技術思想に従って利用することができるが、その相互作用によって酵素１４の溶解度に影響を及ぼすとともに酵素１４の活性部位および／または活性については実質的に影響を及ぼさないものとする。
【００４０】
酵素への改変は、当該技術分野において公知な方法または想定可能な任意の方法によって検出することができる。例えば（非限定的な例だが）、酵素に付着した反応物は、改変されていない酵素の分子量および／または等電点と比較して、改変酵素の分子量の増加および／または等電点の変化をもたらし得る。
【００４１】
改変酵素１４は、本開示の発明の技術思想に従ってバイオセンサ１０を実行可能にする表面積の任意のパーセンテージ（割合）で電極１２上に存在することができる。例えば（非限定的な例だが）、改変酵素１４は、バイオセンサ１０によって目標分析物の十分な捕獲を可能にするために、十分な大きさの表面積で電極１４上に存在する必要がある。特定の（非限定的の）実施形態では、改変酵素１４は、電極１２上に、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％、約１０１％、約１０２％、約１０３％、約１０４％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、さらにより多くの割合で存在し得る。別の方法として、改変酵素１４の表面積は、電極１２の表面積よりも小さくてもよく、等しくてもよく、または大きくてもよい。さらに、本発明の技術思想の範囲には、上記の２つの値の組合せから成る任意の範囲（例えば、約１０％から約１２０％までの範囲、約２０％から約１０５％までの範囲、約３０％から約１００％までの範囲、約４０％から約７５％までの範囲など）内に含まれる任意の表面積のパーセントで、電極１２上に存在する改変酵素１４の存在を含む。
【００４２】
非限定的な実施形態を挙げると、改変酵素１４と電極１２との間に物理的な付着（接続）はない。代わりに、改変酵素１４の上に覆い膜（カバー膜）１６を置き、改変酵素１４を電極１２上の所定の位置に保持する。覆い膜は、バイオセンサの構成要素として以前から使用されており、非限定的な例を挙げると、本開示の発明の技術思想に従う膜１６として利用できるものが、米国特許第７，９５９，７９１号（その全内容を参照により本明細書に援用する）に開示されている。従って、当業者は、本開示の発明の技術思想に従って利用することができる覆い膜を理解できるであろう。
【００４３】
ある実施形態では、覆い膜１６は、検出対象の目標分析物に対して透過性であるが、改変された酵素１４に対して実質的に不透過性である。例えば（非限定的な例を挙げると）、膜１６は、生物学的分析物を通過させる一方、センサ１０からの任意の副産物を除去することができるように、半透過性であり得る。さらに、膜１６は、本開示の発明の技術思想に従ってバイオセンサ１０が機能できるようにする、当技術分野で公知または本明細書で意図されている任意の材料で形成することができる。すなわち、膜１６は、検出対象の目標分析物に対して透過性である一方、改変された酵素１５に対して実質的に不透過性である物質で形成される必要がある。膜１６を形成することができる材料の非限定的な例を挙げると、ポリウレタン、シリコーン、ポリ塩化ビニル、それらの組み合わせなどが挙げられる。膜を構成することができる材料の特定の（しかし非限定的な）例を挙げると、ポリエステルベースのポリウレタンであるＨｙｄｒｏＭｅｄ（登録商標）Ｄ７（マサチューセッツ州ウィルミントン所在のアドバンスソース・バイオマテリアル社／ＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）がある。
【００４４】
膜１６は、副産物を除去するために、使用の間に、洗浄溶液で容易に洗浄することができる。本開示の発明の技術思想において、溶解度が低下した（かつ電極と架橋されていない）改変酵素を使用する前に、高密度架橋酵素層は、副産物を保持し、以前の生物学的サンプルからの持ち越し（キャリーオーバー）をもたらし得る。
【００４５】
溶解度を相当に低下させるための酵素の改変は、酵素をバイオセンサに対して直接的に共有結合（カップリング）する従来技術の方法に対して、驚くべき、予想外の改善を提供する。本開示の発明の技術思想に従った改変された酵素の使用によってもたらされる性能の長所には、（１）非架橋、改変されていない酵素の使用よりも優れていること、および（２）従来のその場での（オンボード）架橋酵素の使用と類似することがある（しかし、架橋の使用を必要としない）。例えば、これらの性能の長所によって、バイオセンサの応答（したがって、バイオセンサの精度も）を最大化しながら、バイオセンサのより長い使用寿命がもたらされる。また、官能基の反応を通じて酵素の溶解度を低下させるために、広く種々の公知の化学（作用）を利用することができ、これらの種々の化学は、任意のバイオセンサアレイの電極分配およびアセンブリに関連してオフラインで行うことができる。加えて、これらの化学の使用は、バイオセンサアレイの製造中に重要な酵素改変をオフラインで行うことを可能にするので、バイオセンサの使用寿命をより長くし、バイオセンサの応答および精度を最大化する。改変された酵素は、分配の開始前に準備されて、有効化できるため、「悪な」バイオセンサが作製されて、（すなわち、電極上に不十分な量の活性酵素を固定化する）バイオセンサ配列組立体全体の生産が損なわれる虞を減少させる。酵素の溶解度を低下させる適切な反応物を用いることによって、良好な酵素安定性も達成される。
【００４６】
本開示の発明の技術思想は、各使用後、または数回の使用後にバイオセンサを交換する必要性を排除する。むしろ、本開示の発明の技術思想に係るバイオセンサは、使用寿命を向上させており、かつ使用の間に洗浄溶液で簡単に洗浄することができる。さらに、本開示の発明の技術思想は、生物学的サンプル間の持ち越しを減少させる。何故なら、電極に対する酵素の架橋の欠如によって、架橋マトリックス中への捕捉を減少させて、生物学的サンプルの運用の間でのより良い洗浄を可能にするからである。よって、本開示の発明の技術思想は、（複数の試験を一度に行うことができるので）ターンアラウンド（折り返し）時間を減らして、血液ガス分析器のような器具に費やされるメンテナンス（維持）時間を減らすことによって、先行技術を改善する。
【００４７】
図２を参照すると、本開示の発明の技術思想の特定の実施形態は、基板５４と組み合わせた複数の多使用バイオセンサ（図２では、そのうちの２つを参照番号５２によって示している）を含む多使用バイオセンサ配列組立体（バイオセンサ・アレイ・アセンブリ）５０を対象とする。その際、多使用バイオセンサ５２のうちの少なくとも１つは、本明細書で上述のように、または本明細書で想定されるように、溶解度を低減された改変酵素１４を含むバイオセンサ１０のいずれかである。基板５４は、第１の表面５６と、第１の表面５６と対向する第２の表面５８とを有し、複数の多使用バイオセンサ５２の各々は、基板５４の第１の表面５６と第２の表面５８のうち少なくとも１つ上に空間的に配置される。
【００４８】
多使用バイオセンサ５２の少なくとも２つが、溶解度を低下させた改変酵素１４を含む多使用バイオセンサ１０である場合、２つの多使用バイオセンサ１０中に存在する酵素１４は、同一であってもよく、または互いに異なっていてもよい。所定の実施形態では、配列組立体５０中に存在するバイオセンサ５２の酵素の全てが異なっていてもよく、あるいは、多使用バイオセンサ配列組立体５０中に存在する複数の多使用バイオセンサ５２の各々の少なくとも２つの酵素が同一であってもよい。
【００４９】
本開示の発明の技術思想に係る多使用バイオセンサ１０は、当技術分野で公知の任意の方法によって、または当業者に想定可能な方法によって作製することができる。本発明の技術思想の追加の実施形態は、本明細書に記載、または本明細書で想定可能な多使用分析物バイオセンサの製造方法に関し、その際、バイオセンサは、安定かつ適切な製品を提供するために調製および製造可能である。本方法では、第一の緩衝液中に存在する酵素は、酵素上の少なくとも１つの官能基を反応物と反応させることによって改変させられ、それによって、改変されていない酵素と比較して溶解度を低下させた改変された酵素（改変酵素）を生成する。得られた改変酵素は、生物学的流体サンプル中および多使用バイオセンサと共に利用されるキャリブレーション用試薬中で、実質的に不溶性であり、かつ改変酵素は、目標分析物の検出のために目標分析物と相互作用することができる活性部位を依然として保持する。次いで改変酵素の沈殿が形成されて、改変酵素の沈殿を第２緩衝液中に再溶解させて、改変酵素溶液を提供する。第２緩衝液は、第１緩衝液と比較してイオン強度が低いため、改変酵素は、第２緩衝液中に実質的に可溶性であるが、一方第１緩衝液中には可溶性がより劣るか、実質的に不溶性である。改変酵素溶液の特定量を電極の少なくとも一部に分配し、その上で乾燥させる。次いで、改変された酵素および電極の少なくとも一部上に膜を配置して、その膜によって改変酵素を電極上に固定化する。
【００５０】
本方法はまた、（非限定的だが）、（ｉ）酵素の改変の前に、第１緩衝液中への緩衝液の交換による添加物から（離れるように）酵素を浄化する（精製する）ステップ、および／または（ｉｉ）電極上への付着の前および／または後に、酵素の活性を適格にするステップなど、１つ以上の任意のステップを含んでもよい。例えば、いったん酵素が改変されて、電極上に付着する前に、試験を実施して酵素活性を測定してもよい。次いで、その適格性を確認することで、所望の量の改変酵素を電極上に分配し、膜によってその上に固定化することができる。
【００５１】
本開示の発明の技術思想に係る多使用バイオセンサ配列組立体５０は、当技術分野で公知の任意の方法、または当業者によって想定可能な方法で作製することができる。本発明の技術思想に係るさらなる実施形態は、多使用バイオセンサ配列組立体の製造方法に関する。この方法では、複数の多使用バイオセンサが形成されて、基板の少なくとも１つの表面上に空間的に配置される。そのように形成された複数の多使用バイオセンサの少なくとも１つは、本明細書中で上述の、または本明細書中で想定された、溶解度を低下させた改変酵素を含む多使用バイオセンサのいずれかである。改変酵素を含む多使用バイオセンサは、本明細書中で上述の方法、または本明細書中で想定されている方法のいずれによっても形成することができる。
【００５２】
さらに、本発明の技術思想に係るさらなる実施形態は、生物学的流体サンプル中の目標分析物の存在および／または濃度を検出する方法に関する。この方法では、生物学的流体サンプルを、上述の多使用バイオセンサのいずれかを含む血液ガス、電解質、および／または代謝物機器（器具）に挿入する。次いで、この方法は、多使用バイオセンサによって捕獲された目標分析物の存在および／または濃度の測定、および機器によるその報告を含む。例えば（非限定的だが）、目標分析物イオンは、多使用バイオセンサを介して分散されて、多使用バイオセンサ上に存在する対応する酵素と結合される。その時点で、イオンレベルは、当技術分野で公知の、または本明細書で想定されている種々の方法によって測定することができる（膜の電位または電流測定の変化を含むが、これらに限定されない）。
【００５３】
さらに、本発明の技術思想に係る他の実施形態は、生物学的流体サンプル中の複数の目標分析物の存在および／または濃度を検出する方法に関する。その方法では、生物学的流体サンプルを、本明細書中で上述の多使用バイオセンサ配列組立体のいずれかを含む血液ガス、電解質、および／または代謝物機器に挿入する。次いで、この方法は、配列組立体の個々の多使用バイオセンサによって捕獲された複数の目標分析物の各々の存在および／または濃度の測定、および機器によるそれらの報告を含む。従って、本開示の発明の技術思想は、複数の多使用バイオセンサからの複数の分析物の測定を同時に得ることを想定している。
【００５４】
上記検出方法の各々において、生物学的流体サンプルは、全血またはその任意の部分（すなわち、血漿または血清）、尿、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ：ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、皮膚、腸液、腹腔内液、のう胞液、汗、間質液、細胞外液、涙液、粘液、膀胱洗浄液、精液、糞便、胸水、鼻咽頭液、およびこれらの組合せを含む一群の中から選択することができる。
【００５５】
実施例
以下に実施例を示す。しかしながら、本開示の発明の技術思想は、特定の実験、結果および臨床検査手順の適用に限定されないことを理解されたい。むしろ、実施例は、単に、様々な実施形態の１つとして提供されており、例示的であって、網羅的ではない。
以下の実施例は、溶解度の低下のために改変されたウレアーゼを用いて製造されたＢＵＮ多使用バイオセンサの製造および使用に関する。
【００５６】
１．ウレアーゼ（英国カーディフ所在のＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社、４７４ｍｇ）を１００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、０．９３６ｍｌ）に溶解して、７Ｋ  ＭＷＣＯ  ＺＥＢＡ（登録商標）Ｃｏｌｕｍｎ（カラム）（マサチューセッツ州ウォルサム所在のサーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて添加物を除去した。ウレアーゼ溶液の最終容量はＰＢＳを用いて１．２６ｍｌに調整した。
【００５７】
添加剤は反応の有効性を低下させるため、上記ステップのように添加剤からウレアーゼを浄化することは有用であることが証明された。しかしながら、このステップは必須ではない。代わりに、高濃度の反応物質を添加剤の存在下で用いることが可能である。
【００５８】
２．次いで、ウレアーゼを、２時間の穏やかな混合によって、少なくとも３０モル当量の硫黄−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（水中１２５ｍｇ／ｍｌの１６０μｌ；マサチューセッツ州ウォルサム所在のサーモフィッシャーサイエンティフィック社）と反応させた。
【００５９】
３．次いで、不溶性ビオチニル化ウレアーゼを含む沈殿物を、遠心分離機により形成して、集めた。
【００６０】
４．上清をデカンターに移して、次いで改変ウレアーゼを１０ｍＭのＰＢＳ（２ｍｌ）中に再溶解させた。このＰＢＳ緩衝液は、ステップ１の浄化反応で使用した１００ｍＭのＰＢＳよりも低いイオン強度を有する。
【００６１】
任意選択的に、２回目のＺＥＢＡ（登録商標）カラム緩衝液の交換（１０ｍＭのＰＢＳ）を用いて、余分な試薬を除去することができる。
【００６２】
特定の理論に拘束されることを想定していないが、このメカニズムは公知の「塩析」メカニズムを含む可能性が高い。この段階における重要な点は、改変酵素がより低いイオン強度の緩衝液／水中に可溶性である一方、キャリブレーター溶液および患者サンプル（典型的には１３０ｍＭより大きい）などの、より高い強度の緩衝液中には可溶性／不溶性が劣ることである。
【００６３】
５．改変酵素の活性は、標準の光学式ウレアーゼ・アッセイ（分析器）を用いて測定した。典型的には、この時点で、活性のいくらかの消失が観察されることが起こり得る。しかし、消失のレベルはごくわずかであり、依然としてバイオセンサ用の十分な酵素活性を提供する。
【００６４】
６．所望ならば、この時点で、長期保存用に酵素をガラス瓶内に凍結乾燥することができる。
【００６５】
７．ビオチニル化ウレアーゼ溶液を所望の活性／分配の濃度（例えば２６ＫＵ／ｍｌ）に調整して、非アクチン（ノンアクチン）ベースのＮＨ４＋検出層を含むスクリーン印刷されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極（１．５ｍｍ×０．５ｍｍ）上に分配して、乾燥させた（例えば、Ｂｕｔｔ  ａｎｄ  Ｃａｍｍａｎｎ（１９９２年）Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．、２５：１５９７参照）。このステップでは、０．０１秒用の２７ゲージ針、および１．４ｐｓｉ分配パラメータを利用した。この分配ステップはさらに２回繰り返され、各分配ステップの間は１５分間であった。
【００６６】
乾燥後、酵素の上にＨｙｄｒｏＭｅｄ（登録商標）Ｄ７ウレタン（ＴＨＦ／シクロヘキサノン（９：１）中に４％、０．０１ｓ、３．６ｐｓｉ；マサチューセッツ州ウィルミントン所在のアドバンソース  バイオマテリアル社）の層を分配することによって、覆い膜（カバー膜）を加えた。
【００６７】
ステップ（７）に続いて、センサ作製が完了した。
【００６８】
自由な標準の酵素と比較した、ＢＵＮセンサ（溶解度を低下させた改変ウレアーゼを含む）の改善された性能を図３および図４に示している。
図３および図４は、５ｍｇ／ｄＬおよび２７ｍｇ／ｄＬのＢＵＮキャリブレーター溶液、ならびに血液サンプルについての、センサのアッセイ応答および添加反応の勾配（スロープ）をそれぞれ例示している。センサは、典型的には、少なくとも２週間、最大で３０日まで、完全な安定性を維持した。
【００６９】
本発明の技術思想に係る非限定的な実施形態
特定の実施形態は、生物学的流体サンプル中の少なくとも１つの目標分析物の存在および／または濃度を検出するための多使用バイオセンサに関する。多使用バイオセンサは、電極、改変酵素、および膜を含む。改変酵素は、電極の少なくとも一部の上に分配される。改変酵素は、その上の少なくとも１つの官能基と反応体との反応を介して、酵素の溶解度を低下させるように改変されており、その結果、改変酵素は、生物学的流体サンプル中および多使用バイオセンサと共に用いられるキャリブレーション用試薬中で実質的に不溶性である。この際、改変酵素は、目標分析物の検出のために、目標分析物と相互作用する活性部位を含む。膜は、改変酵素の少なくとも一部の上に配置されて、その膜は、改変酵素を電極上に固定化する。
【００７０】
特定の実施形態において、多使用バイオセンサは、電位計測（電位差）式分析物バイオセンサとして定めることができる。
【００７１】
特定の実施形態において、改変酵素上の少なくとも１つの官能基は、アルデヒド−、アミン−、カルボニル−、カルボキシル−、ヒドロキシル−、ケトン−、マレイミド−、スルフヒドリル−、およびチオール−反応性基を含む一群の中から選択される。
【００７２】
特定の実施形態では、反応物は長鎖ビオチンを含む。
【００７３】
ある実施形態では、膜は、検出対象の目標分析物に対して透過性であるが、改変酵素に対しては実質的に不透過性である。
【００７４】
特定の実施形態では、膜は、ポリウレタン、シリコーン、ポリ塩化ビニル、およびそれらの組合せを含む一群の中から選択される材料から形成される。
【００７５】
特定の実施形態において、酵素は、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラクケース、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む一群の中から選択される。
【００７６】
特定の実施形態では、多使用バイオセンサは、多使用血中尿素窒素（ＢＵＮ）バイオセンサとして定められ、かつ少なくとも１つの改変酵素は改変ウレアーゼである。
【００７７】
特定の実施形態では、バイオセンサは、少なくとも１４日間の使用寿命を有する。
【００７８】
特定の実施形態では、改変酵素は、生物学的流体サンプルおよび多使用バイオセンサと共に用いられるキャリブレーション用試薬よりも低いイオン強度を有する緩衝液中に実質的に溶解できる。
【００７９】
特定の実施形態では、酵素に付着した反応物は、改変されていない酵素の分子量および／または等電点と比較した場合、改変酵素の分子量の増加、および／または等電点の変化をもたらす。
【００８０】
特定の実施形態は、基板および複数の多使用バイオセンサを含む、多使用バイオセンサ配列組立体に関する。複数の多使用バイオセンサの各々は、基板の少なくとも１つの表面上に空間的に配置され、かつ複数の多使用バイオセンサの少なくとも１つは、上述した多使用バイオセンサのいずれかである。
【００８１】
特定の実施形態は、多使用バイオセンサの製造方法に関し、その方法は以下のステップを含む。即ち、（ａ）酵素上の少なくとも１つの官能群を反応物と反応させることによって、第１緩衝液中に存在する酵素を改変し、それによって、改変されていない酵素と比較した場合に、改変酵素が、流体生体学的サンプル中および多使用バイオセンサと用いられるキャリブレーション用試薬中で実質的に不溶性となり、かつ改変酵素が、目標分析物の検出のために目標分析物と相互作用する活性部位を含むようにするステップと、（ｂ）改変酵素の沈殿を形成するステップと、（ｃ）改変酵素溶液を提供するために、改変酵素の沈殿を第２緩衝液中に再溶解させ、その際、第２緩衝液は、第１緩衝液よりも低いイオン強度を有するため、改変酵素は、第２緩衝液中で実質的に可溶性であるが、第１緩衝液中では可溶性がより劣るか、または実質的に不溶性にするステップと、（ｄ）電極の少なくとも一部上に、特定の量の改変酵素溶液を分配するステップと、（ｅ）電極上で改変酵素溶液を乾燥させるステップと、（ｆ）改変酵素および電極の少なくとも一部上に膜を配置して、その膜によって改変酵素を電極上に固定化するステップとを含む。
【００８２】
特定の実施形態では、さらに多使用分析物バイオセンサは、電位計測式分析物バイオセンサとして定められる。
【００８３】
特定の実施形態では、（ｉ）酵素上の少なくとも１つの官能基は、アルデヒド−、アミン−、カルボニル−、カルボキシル−、ヒドロキシ−、ケトン−、マレイミド−、スルフヒドリル−、およびチオール−反応性基を含む一群の中から選択される。（ｉｉ）反応物は、長鎖ビオチンを含む。（ｉｉｉ）膜は、検出対象の目標分析物に対しては透過性であるが、改変された酵素に対しては実質的に不透過性である。（ｉｖ）膜は、ポリウレタン、シリコーン、ポリ塩化ビニル及びそれらの組み合わせを含む一群の中から選択された材料を用いて形成される。（ｖ）酵素は、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ（ピルビン酸オキシダーゼ）、サルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノハイドロラーゼ（クレアチンアミジノヒドロラーゼ）、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む一群の中から選択される。および／または、（ｖｉ）酵素に結合した反応物は、改変されていない酵素の分子量および／または等電点と比較した場合、改変（された）酵素の分子量を増加させるか、および／または等電点を変化させる。
【００８４】
特定の実施形態では、多使用バイオセンサは、多使用血中尿素窒素（ＢＵＮ）バイオセンサとして定められ、かつ少なくとも１つの改変酵素はウレアーゼである。
【００８５】
特定の実施形態では、このように作製されたバイオセンサは、少なくとも１４日間の使用寿命を有する。
【００８６】
特定の実施形態において、上記方法のステップ（ａ）によって、改変酵素の溶解度を低下させて、改変酵素が生物学的流体サンプル中および多使用バイオセンサと共に用いられるキャリブレーション用試薬中で実質的に不溶性である一方、生物学的流体サンプルおよびキャリブレーション用試薬よりも低いイオン強度を有する緩衝液中では実質的に可溶性であるようにする。
【００８７】
特定の実施形態において、上述の方法は、さらに、（ｇ）ステップ（ａ）の前に緩衝液交換による第一緩衝液中への添加物から酵素を浄化するステップと、（ｈ）ステップ（ｄ）の前に酵素の活性を測定するステップのうちの少なくとも１つを含む。
【００８８】
特定の実施形態は、多使用バイオセンサ配列組立体を製造する方法に関する。本方法は、基板の少なくとも１つの表面上に複数の多使用バイオセンサを形成することを含む。複数の多使用バイオセンサの各々は、基板の少なくとも１つの表面上に空間的に配置される。複数の多使用バイオセンサの少なくとも１つは、上述の方法のいずれかによって形成される。
【００８９】
特定の実施形態は、生物学的流体サンプル中の目標分析物の存在および／または濃度を検出する方法に関する。本方法は、以下のステップを含む。即ち、（ａ）生物学的流体サンプルを、上述の多使用バイオセンサのいずれかを含む血液ガス、電解質、および／または代謝機器に挿入するステップと、（ｂ）多使用バイオセンサによって捕獲された目標分析物の存在および／または濃度を測定するステップとを含む。
【００９０】
特定の実施形態は、生物学的流体サンプル中の複数の目標分析物の存在および／または濃度を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）生物学的流体サンプルを、上述の多使用バイオセンサ配列組立体のいずれかを含む血液ガス、電解質、および／または代謝物機器に挿入するステップと、（ｂ）配列組立体の個々の多使用バイオセンサによって捕獲された複数の目標分析物の各々の存在および／または濃度を測定するステップとを含む。
【００９１】
特定の実施形態では、生物学的流体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ：ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、皮膚、腸液、腹腔内液、のう胞液、汗、間質液、細胞外液、涙液、粘液、膀胱洗浄液、精液、糞便、胸水、鼻咽頭液、およびこれらの組合せを含む一群の中から選択される。
【００９２】
したがって、本開示の発明の技術思想に従って、上述の目的および利点を十分に満足させる組成物および装置、ならびにそれらを製造および使用する方法が提供される。上述の特定の図面、実験、結果、および語彙を用いて本開示の発明の技術思想が説明されたが、多くの代替、修正および変形が当業者に明らかになるだろう。従って、本発明の技術思想および広範な範囲に収まる、そのような全ての代替、修正、および変形が本発明には含まれることを想定している。
【符号の説明】
【００９３】
１０  多使用バイオセンサ
１２  電極
１４  改変酵素
１６  膜
１８  検出層
５２  多使用バイオセンサ
５４  基板
５６  第１の表面
５８  第２の表面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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