(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
湖羊胚用の体外培養液であって、
従来の胚培養液、及び、ウシ血清アルブミン、ジンセノサイド、リシン、イソロイシン、バリン、ビタミンＣ、ペニシリン、ストレプトマイシンの成分を含み、
前記従来の胚培養液は、合成卵管液であることを特徴とする湖羊胚用の体外培養液。
【請求項２】
従来の胚培養液、及び、濃度６〜８．５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、５〜２０ｍＭのジンセノサイド、０．２〜０．５ｇ／Ｌのリシン、０．１〜０．５ｇ／Ｌのイソロイシン、０．１〜０．５ｇ／Ｌのバリン、１００〜１５０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の湖羊胚用の体外培養液。
【請求項３】
前記ジンセノサイドの濃度が１５ｍＭであることを特徴とする請求項２に記載の湖羊胚用の体外培養液。
【請求項４】
前記リシン、イソロイシン及びバリンの質量比が２：１：１であることを特徴とする請求項２に記載の湖羊胚用の体外培養液。
【請求項５】
湖羊胚体外培養方法であって、
受精後の湖羊胚を従来の胚培養液で洗浄した後、請求項１〜４のいずれか１項に記載の湖羊胚用の体外培養液を用いて３８〜３９℃、５％ＣＯ2の環境で培養するステップを含み、
前記従来の胚培養液は、合成卵管液であることを特徴とする湖羊胚体外培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚体外培養の技術分野に属し、具体的には、ジンセノサイド含有湖羊体外培養液に関する。
【背景技術】
【０００２】
湖羊は、太湖平野の重要な家畜の１つであり、中国国家一級保護地方家畜・家禽種である。湖羊は、中柄であり、オスとメスの両方に角がなく、頭部が長くて狭く、鼻梁が高く、ほとんどの耳が垂れ下がっていて、首が細長く、体が長くて狭く、腰部や背部が平らでまっすぐであり、腹部がわずかに垂れ下がっており、尾が平たくて丸く、尾の先端が反っており、四肢が比較的細くて長い。体全体にわたって白い毛が被覆され、腹毛が粗くて薄く短く、体が丈夫である。湖羊は、希少な白色子羊皮用の品種であり、成熟が早く、一年中発情期であり、１年に２回の出産が可能であり、１腹当たりの産子数が多く、泌乳能力が高く、成長発育の速度が速く、改良後、優れた肉産量を示し、耐高温や耐湿度などの優良な性状を有し、中国の太湖地域に分布しており、一年中舎飼いされている子羊皮用の中国ヒツジの品種であり、出生後１〜２日で屠殺されて剥がれる子湖羊の羊皮は、美しい模様を有し、世界的に有名である。
【０００３】
胚体外生産技術は、品種の育種と優良な個体群の繁殖速度を高めるための重要な手段になっている。胚体外生産技術によって生きた子孫が得られているが、体外受精又はクローニングによって得られた体外胚では、培養過程において、胚が特定の段階まで発達すると、発達を停止して退化する発達ブロックが発生する場合が多く、そのため、体外胚の胚盤胞の発育率が体内胚の発育率よりもはるかに低下する。胚体外培養は、通常、胚移植の成功のための事前工程であり、胚体外培養によって胚の発育を促進することができる。したがって、胚の初期培養系を改善し、胚盤胞の発育率を向上できる体外培養液を開発することは、胚体外生産技術の普及及び応用に対して重要な意義がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許出願公開第101555466号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第107201343号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第101880690号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上に鑑み、本発明の目的は、上記従来技術の不備な点を克服するために、ジンセノサイド及び３種類の必須アミノ酸を含み、湖羊胚体外の発育を効果的に促進して、体外培養胚の生存率及び胚盤胞率を向上できる湖羊胚用の体外培養液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成させるために、本発明が採用する技術案は、以下のとおりである。湖羊胚用の体外培養液であって、従来の胚培養液、及び、ウシ血清アルブミン、ジンセノサイド、リシン、イソロイシン、バリン、ビタミンＣ、ペニシリン、ストレプトマイシンの成分を含む。
【０００７】
好ましくは、前記湖羊胚用の体外培養液は、従来の胚培養液、及び、濃度６〜８．５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、５〜２０ｍＭのジンセノサイド、０．２〜０．５ｇ／Ｌのリシン、０．１〜０．５ｇ／Ｌのイソロイシン、０．１〜０．５ｇ／Ｌのバリン、１００〜１５０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
【０００８】
より好ましくは、前記湖羊胚用の体外培養液において、ジンセノサイドの濃度が１５ｍＭである。
【０００９】
より好ましくは、前記湖羊胚用の体外培養液において、リシン、イソロイシン及びプバリンの質量比が２：１：１である。
【００１０】
好ましくは、前記従来の胚培養液は、合成卵管液である。
【００１１】
本発明は、湖羊胚体外培養における前記湖羊胚用の体外培養液の用途をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、湖羊胚体外培養方法をさらに提供し、受精後の湖羊胚を従来の胚培養液で洗浄した後、前記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８〜３９℃、５％ＣＯ2の環境で培養するステップを含む。
【００１３】
好ましくは、前記従来の胚培養液は、合成卵管液である。
【００１４】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ウシ血清におけるグロブリンであり、６０７個のアミノ酸残基を含み、分子量が６６．４４６ＫＤａであり、成分には、主にタンパク質、ポリペプチド、ホルモン、アミノ酸、グルコース、ケト酸などが含まれる。その中でも、タンパク質は、ウシ血清の主成分であり、金属イオン、脂肪酸及び自体がホルモンであるタンパク質を含む以外、主にアルブミン、グロブリンがある。フィブロネクチン細胞は、細胞接着を促進し、α２マクログロブリンは、トリプシンの作用を阻害し、ウシ胎児血清は、細胞付着を促進するためのフェチュインを含み、トランスフェリンは、鉄イオンに結合してその毒性及び細胞による利用を減らす。血小板由来成長因子は、細胞分裂を促進することができ、ポリペプチドファミリーのメインメンバーの１つであり、主な細胞増殖促進因子であり、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、神経成長因子なども、細胞の成長に対して一定の作用を有する。それに含まれる成長促進ホルモンは、細胞増殖を促進する効果を有する。
【００１５】
ジンセノサイドは、高麗人参における活性成分であり、研究によれば、抗腫瘍、記憶力及び学習能力の向上、ＤＮＡ、ＲＮＡ合成の促進、体の免疫力の向上、抗菌、心臓・脳血管への血液供給不足の改善、中枢神経系の調節、耐疲労性、老化遅延など、多くの作用を有することが明らかなになる。
【００１６】
リシンは、人体の必須アミノ酸の１つであり、酵素タンパク質、生殖細胞、骨格筋及びヘモグロビンなどの形成に対して非常に重要な役割を果たし、また、一部のポリペプチドホルモンの構成成分の１つでもある。それは、人体の発達を促進し、脳の発達を促進し、免疫機能を高め、中枢神経組織の機能を向上させ、また脂肪代謝を促進し、松果腺、乳腺、黄体及び卵巣を調節して、細胞の退化を防ぐことができる。
【００１７】
イソロイシンは、「アイソリューシン」と英語読みで音訳され、人体の必須アミノ酸の１つであり、脂肪族中性アミノ酸の１つである。血糖を制御し、体の組織にエネルギーを供給できるとともに、成長ホルモンの産生量を増加させ、骨、皮膚や損傷した筋肉組織の治癒を促進できる。
【００１８】
バリンは、人体の必須アミノ酸の１つであり、分岐鎖アミノ酸であり、体の正常な成長を促進し、組織を修復し、血糖を調節し、且つ必要なエネルギーを提供することができる。黄体、乳腺及び卵巣に作用できる。
【００１９】
本発明者らは、研究した結果、従来の胚培養液に５〜２０ｍＭのジンセノサイド、０．２〜０．５ｇ／Ｌのリシン、０．１〜０．５ｇ／Ｌのイソロイシン及び０．１〜０．５ｇ／Ｌのバリンを添加することによって、胚の体外発育を効果的に促進して、体外培養胚の生存率及び胚盤胞率を向上させることができ、特にジンセノサイドの濃度が１５ｍＭであり、リシン、イソロイシン及びバリンの質量比が２：１：１である場合、効果が優れていることを見出した。
【００２０】
ビタミンＣは、Ｌ−アスコルビン酸とも呼ばれ、果物や野菜に豊富に含まれる水溶性ビタミンであり、鉄、カルシウムや葉酸の利用を改善できる。ビタミンＣは、ラジカルによる細胞の損傷に抵抗して細胞の変異を防ぐことができる強力な抗酸化作用を有する抗酸化物質である。
【発明の効果】
【００２１】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は、以下のとおりである。（１）本発明は、従来の胚培養液にジンセノサイド及び３種類の必須アミノ酸を添加することによって、湖羊胚の体外発育を効果的に促進し、体外培養胚の分裂率及び胚盤胞率を向上させることができ、湖羊胚体外培養において応用の将来性が期待できる。（２）発明者は、研究した結果、培養液におけるジンセノサイドの濃度が１５ｍＭであり、且つ、リシン、イソロイシン及びバリンの質量比が２：１：１である場合、より優れた胚体外培養効果が得られることを見出した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を理解しやすくするために、本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明は、さまざまな別の形態によって実施されてもよく、本明細書に記載の実施例に制限されない。むしろ、これら実施例を提供することは、本発明の開示内容をより徹底的かつ全面的に理解できるようにするためである。
【００２３】
実施例１
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度８ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１０ｍＭのジンセノサイド、０．５ｇ／Ｌのリシン、０．２５ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２５ｇ／Ｌのバリン、１４０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７５．８％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３８．５％であった。
【００２４】
実施例２
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度８．５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、６．５ｍＭのジンセノサイド、０．３ｇ／Ｌのリシン、０．２ｇ／Ｌのイソロイシン、０．５ｇ／Ｌのバリン、１００ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７４．２％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３６．９％であった。
【００２５】
実施例３
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度７．５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、２０ｍＭのジンセノサイド、０．２ｇ／Ｌのリシン、０．３ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２ｇ／Ｌのバリン、１５０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７６．０％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３８．９％であった。
【００２６】
実施例４
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度６ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１５ｍＭのジンセノサイド、０．４ｇ／Ｌのリシン、０．１ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２ｇ／Ｌのバリン、１３０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７５．１％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３７．８％であった。
【００２７】
実施例５
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度基７ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、５ｍＭのジンセノサイド、０．１ｇ／Ｌのリシン、０．５ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２ｇ／Ｌのバリン、１００ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７６．３％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３８．８％であった。
【００２８】
実施例６
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度８ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、２０ｍＭのジンセノサイド、０．３ｇ／Ｌのリシン、０．２ｇ／Ｌのイソロイシン、０．１ｇ／Ｌのバリン、１００ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７４．４％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３７．９％であった。
【００２９】
実施例７
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度８ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１５ｍＭのジンセノサイド、０．３ｇ／Ｌのリシン、０．１ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２ｇ／Ｌのバリン、１５０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７５．４％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３６．６％であった。
【００３０】
実施例８
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度７ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１０ｍＭのジンセノサイド、０．３ｇ／Ｌのリシン、０．１ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２ｇ／Ｌのバリン、１５０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７６．２％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３５．７％であった。
【００３１】
実施例９
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度８ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、８ｍＭのジンセノサイド、０．１ｇ／Ｌのリシン、０．２ｇ／Ｌのイソロイシン、０．４ｇ／Ｌのバリン、１２０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７５．９％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３６．２％であった。
【００３２】
実施例１０
本発明の湖羊胚用の体外培養液の一実施例では、前記湖羊胚用の体外培養液は、合成卵管液を基質とし、且つ、濃度８ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１５ｍＭのジンセノサイド、０．４ｇ／Ｌのリシン、０．２ｇ／Ｌのイソロイシン、０．２ｇ／Ｌのバリン、１２０ｍｇ／ＬのビタミンＣ、１０万ＩＵ／Ｌのペニシリン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンの成分を含む。
受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、上記湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。培養の２日目に、湖羊胚の初期胚の分裂率は、７９．６％であり、培養の７日目に、湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、４１．３％であった。
【００３３】
比較例１
実験目的：ジンセノサイドによる湖羊胚用の体外培養液の培養効果への影響を研究する。
実験設計：培養液の処方には、ジンセノサイドを含まない以外、残りは、実施例１０と同様であった。
実験方法：受精後の湖羊胚を人合成卵管液で繰り返して洗浄した後、それぞれ実施例１０及び本比較例の湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。
実験結果：培養の２日目に、実施例１０の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の分裂率は、７９．２％であり、本比較例の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の分裂率は、６６．３％であり、培養の７日目に、実施例１０前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、４０．７％であり、本比較例の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、２７．２％であった。
実験結論：本発明に係るジンセノサイド含有胚体外培養液は、湖羊胚の体外発育を効果的に促進し、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率を向上させ、ジンセノサイドを含まない培養液を用いて湖羊胚を体外培養する場合は、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率は有意的に低下した。
【００３４】
比較例２
実験目的：リシンによる湖羊胚用の体外培養液の培養効果への影響を研究する。
実験設計：培養液の処方には、リシンを含まない以外、残りは、実施例１０と同様であった。
実験方法：受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、それぞれ実施例１０及び本比較例の湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。
実験結果：培養の２日目に、実施例１０の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の分裂率は、７９．２％であり、本比較例の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の分裂率は、７１．３％であり、培養の７日目に、実施例１０の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、４０．７％であり、本比較例の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３３．５％であった。
実験結論：本発明に係るジンセノサイド、リシン、イソロイシン及びバリンを同時に含む胚体外培養液は、湖羊胚の体外発育を効果的に促進し、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率を向上させ、リシンを含まない培養液を用いて湖羊胚を体外培養する場合は、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率は有意的に低下した。
イソロイシン及びバリンを含まない培養液を用いて湖羊胚を体外培養する場合にも、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率は有意的に低下したが、具体的なデータは省略された。
【００３５】
比較例３
実験目的：培養液におけるアミノ酸の種類による湖羊胚用の体外培養液の培養効果への影響を研究する。
実験設計：培養液の処方には、リシンをトレオニンに変更する以外、残りは、実施例８と同様であった。
実験方法：受精後の湖羊胚を合成卵管液で繰り返して洗浄した後、それぞれ実施例１０及び本比較例の湖羊胚用の体外培養液を用いて３８℃、５％ＣＯ2の環境で培養した。
実験結果：培養の２日目に、実施例１０の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の分裂率は、７９．２％であり、本比較例の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の分裂率は、７０．１％であり、培養の７日目に、実施例１０の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、４０．７％であり、本比較例の前記培養液を用いて培養された湖羊胚の初期胚の胚盤胞率は、３１．９％であった。
実験結論：本発明に係るジンセノサイド、リシン、イソロイシン及びバリンを同時に含む胚体外培養液は、湖羊胚の体外発育を効果的に促進し、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率を向上させ、リシンをほかのアミノ酸に変更した培養液を用いて湖羊胚を体外培養する場合は、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率は有意的に低下した。
イソロイシン及びバリンをほかのアミノ酸に変更した培養液を用いて湖羊胚を体外培養する場合にも、体外培養された湖羊初期胚の分裂率及び胚盤胞率は有意的に低下したが、具体的なデータは省略された。
【００３６】
なお、以上の実施例は、本発明の技術案を説明するために過ぎず、本発明の特許範囲を制限するものではなく、好適実施例を参照しながら本発明を詳細に説明したが、当業者であれは、本発明の技術案の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明の技術案に対して修正又は同等置換を行えることが理解できる。