(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２；配列番号３；配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも１つのペプチドの有効量；及び
ｂ）少なくとも１つの式１の化合物の有効量
【化１】
0006944551.tif 000008
式１
（式中、環Ａは
【化２】
0006944551.tif 000009
0006944551.tif 000010
又は
0006944551.tif 000011
である、
を含む寄生性線虫を防除するための組成物であって、
前記ペプチド０．８ｍｇ／ｍｌ及び式１の化合物１０−４〜１０−５Ｍの濃度で１００％の相乗的な抗線虫効果を有する、組成物。
【請求項２】
１５アミノ酸の長さを有する配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドから構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１６アミノ酸の長さを有する配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドから構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
１２アミノ酸の長さを有する配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドから構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの増量剤、乳化剤及び／又は界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの農薬活性を有する化合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
農薬活性を有する化合物が、植物に処理可能な物質、殺真菌剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、軟体動物防除剤、セーフナー、植物成長調節物質、植物栄養剤及び／又は生物学的防除剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000012
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000013
である。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000014
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000015
である。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000016
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000017
である。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000018
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000019
である。
【請求項１２】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000020
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000021
である。
【請求項１３】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000022
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000023
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000024
である。
【請求項１４】
配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000025
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000026
である。
【請求項１５】
配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000027
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000028
である。
【請求項１６】
配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、及び式１の化合物を含む請求項１に記載の組成物、
0006944551.tif 000029
式１
式中、環Ａは
0006944551.tif 000030
である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物寄生虫、具体的には線虫を死滅させるために農業分野で使用される組成物である殺線虫剤に関する。より具体的には、本発明は、ＣＥＤ−４タンパク質由来の殺線虫ペプチド及びカルコンから構成される殺線虫剤の相乗的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、収量に大きな損害をもたらし、それにより経済に甚大な影響が及ぶため、農産業にとって大きな脅威である。線虫は、昆虫に次いで、トマト及び他の野菜、柑橘類、ジャガイモ、コメ、ココナツ、コムギ及び他の穀類、観賞植物などの作物に深刻な損害を与えるものであることが知られている。線虫は、単独又は他の土壌微生物との組み合わせで、根、茎、葉、果実及び種子を含む植物の殆ど全ての部分を攻撃することが分かっている。これらにより、世界中で推定で１２．３％（＄１５７０億ドル）の収量損失が引き起こされる。このうち、＄４０３０万がインドから報告されている（Ｓｉｎｇｈら、２０１５）。
【０００３】
メロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｇｅｎｕｓ）に属する根瘤線虫は、園芸作物及び農作物において植物寄生線虫のうち３つの最も経済的に損害を与える属の１つである。これらは、いくつかの植物の根の偏性寄生生物であり；メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）はとりわけ世界の主要害虫である。
【０００４】
殺線虫剤は、これらの植物寄生虫、線虫を死滅させるために使用される組成物である。使用される殺線虫剤のうち殆どは、ヒトにとって非常に毒性が高い化学組成物であり、有用な土壌細菌にも有害である。一部の殺線虫剤は、地下水に混入し、オゾン層の枯渇を引き起こすことも示されている。周知の殺線虫剤の１つである臭化メチルは、米国及びインドを含む一部の国で禁止されている。農作物で広く使用される非常に毒性が高い別の殺線虫剤はカルボフランであり；１粒のカルボフランによって数分以内に鳥が死亡し得る。ホレートなどの殺線虫剤は容易に土壌を通って地下水に達し、それに混入し得る。
【０００５】
化学殺線虫剤に付随する重大な欠点は、線虫を防除するための新規技術の開発を必要とする。あるこのような方法は、線虫に対する耐性に対するトランスジェニック遺伝子を発現するトランスジェニック植物ラインを作製することである。しかし、これは、大規模な事前調査活動を必要とする、時間がかかり、高価な方法である。インドを含む多くの国において、いくつかの道徳的、倫理的及び見えない環境問題に基づき、トランスジェニックラインの導入に対する激しい異論がある。
【０００６】
ある有効な方法は、環境面で安全で無毒性であり、作製及び使用が容易な殺線虫剤の組成物の作製を含む。
【０００７】
米国特許第９１２５４１３Ｂ１号明細書は、強力な殺線虫活性を示す、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ．ｅｌｅｇａｎｃｅ）ＣＥＤ−４タンパク質由来のペプチドを記載する。配列番号１のアミノ酸からなるＣＥＤ−４タンパク質はアポトーシスタンパク質のファミリーに属する。配列番号１は、
ＭＬＣＥＩＥＣＲＡＬＳＴＡＨＴＲＬＩＨＤＦＥＰＲＤＡＬＴＹＬＥＧＫＮＩＦＴＥＤＨＳＥＬＩＳＫＭＳＴＲＬＥＲＩＡＮＦＬＲＩＹＲＲＱＡＳＥＬＧＰＬＩＤＦＦＮＹＮＮＱＳＨＬＡＤＦＬＥＤＹＩＤＦＡＩＮＥＰＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣＹＩＲＥＹＨＶＤＲＶＩＫＫＬＤＥＭＣＤＬＤＳＦＦＬＦＬＨＧＲＡＧＳＧＫＳＶＩＡＳＱＡＬＳＫＳＤＱＬＩＧＩＮＹＤＳＩＶＷＬＫＤＳＧＴＡＰＫＳＴＦＤＬＦＴＤＩＬＬＭＬＫＳＥＤＤＬＬＮＦＰＳＶＥＨＶＴＳＶＶＬＫＲＭＩＣＮＡＬＩＤＲＰＮＴＬＦＶＦＤＤＶＶＱＥＥＴＩＲＷＡＱＥＬＲＬＲＣＬＶＴＴＲＤＶＥＩＳＮＡＡＳＱＴＣＥＦＩＥＶＴＳＬＥＩＤＥＣＹＤＦＬＥＡＹＧＭＰＭＰＶＧＥＫＥＥＤＶＬＮＫＴＩＥＬＳＳＧＮＰＡＴＬＭＭＦＦＫＳＣＥＰＫＴＦＥＫＭＡＱＬＮＮＫＬＥＳＲＧＬＶＧＶＥＣＩＴＰＹＳＹＫＳＬＡＭＡＬＱＲＣＶＥＶＬＳＤＥＤＲＳＡＬＡＦＡＶＶＭＰＰＧＶＤＩＰＶＫＬＷＳＣＶＩＰＶＤＩＣＳＮＥＥＥＱＬＤＤＥＶＡＤＲＬＫＲＬＳＫＲＧＡＬＬＳＧＫＲＭＰＶＬＴＦＫＩＤＨＩＩＨＭＦＬＫＨＶＶＤＡＱＴＩＡＮＧＩＳＩＬＥＱＲＬＬＥＩＧＮＮＮＶＳＶＰＥＲＨＩＰＳＨＦＱＫＦＲＲＳＳＡＳＥＭＹＰＫＴＴＥＥＴＶＩＲＰＥＤＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹＤＳＬＫＮＦＡＣＣを含む。
【０００８】
配列番号１由来の３つのペプチドは、約１ｍｇ／ｍｌの有効濃度で殺線虫活性を有することが示され、このペプチドは次の配列：
１）１５アミノ酸ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（９９〜１１３アミノ酸区間、配列番号２）からなるペプチド２、
２）１９アミノ酸ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（１１２〜１３０アミノ酸区間、配列番号３）からなるペプチド３及び
３）１２アミノ酸ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（５２９〜５４０アミノ酸区間、配列番号４）からなるペプチド１２
から構成された。
【０００９】
本発明は、先行技術の欠点を考慮し、無毒性で環境面で安全である抗寄生虫ペプチド及び化合物群、カルコンを使用して線虫を防除するための方法を提供する。
【００１０】
発明の目的
したがって、本発明の主な目的は、環境面で安全で作製及び使用し易い殺線虫剤の組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、
１．ＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも１つのペプチド、ペプチド２、ペプチド３又はペプチド１２
ａ．ペプチド２、配列ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（配列番号２）から構成される１５アミノ酸長ペプチド
ｂ．ペプチド３、配列ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（配列番号３）から構成される１９アミノ酸長及び
ｃ．ペプチド１２、配列ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（配列番号４）から構成される１２アミノ酸長；及び
２．化合物、カルコンの群に属する少なくとも１つのカルコンであって、カルコン１７、カルコン２５又はカルコン３０の何れかである、化合物
を含む相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のまた別の目的は、殺線虫活性を示す相乗的殺線虫組成物を提供することであり、本ペプチドの濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、カルコンの濃度は１０−４〜１０−５Ｍの範囲である。
【００１３】
本発明のまた別の目的は、カルコンを溶解させ、殺線虫剤としての使用のための水などの水性溶媒中のカルコン作業溶液を提供するための方法を提供することである。
【００１４】
本発明のまた別の目的は、ヒトに対して無毒性である相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のまた別の目的は、広域スペクトル活性がなく、土壌微生物にとって有害ではない相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のまた別の目的は、合成し易く、トランスジェニック植物の作製の必要がなく、経済性に優れた相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、植物寄生虫、具体的には線虫を死滅させるために農業の目的で使用される殺線虫剤の組成物に関する。より具体的には、本発明は、殺線虫性ペプチド及びカルコンから構成される殺線虫剤の相乗的組成物に関する。
【００１８】
本発明の主な実施形態において、本発明は、
１．ＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも１つのペプチド、ペプチド２、ペプチド３又はペプチド１２
ａ．ペプチド２、配列ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（配列番号２）から構成される１５アミノ酸長ペプチド
ｂ．ペプチド３、配列ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（配列番号３）から構成される１９アミノ酸長及び
ｃ．ペプチド１２、配列ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（配列番号４）から構成される１２アミノ酸長；及び
２．化合物、カルコン１７｛（２Ｅ）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−３−フェニル−２−プロペン−１−オン｝、カルコン２５｛（２Ｅ）−１−（４−エトキシフェニル）−３−フェニル−２−プロペン−１−オン又はカルコン３０｛（２Ｅ）−３−フェニル−１−（２−チエニル）−２−プロペン−１−オン｝の何れかである、カルコン又はカルコノイドの群に属する少なくとも１つのカルコン
を含む殺線虫剤の組成物を提供する。
【００１９】
ペプチド、ペプチド２、ペプチド３及びペプチド１２は、個々に、１ｍｇ／ｍｌという低い濃度で１００％殺線虫活性を示す。しかし、カルコン、カルコン１７、カルコン２５又はカルコン３０との本ペプチドの何れかの組み合わせは、相乗的に作用し、１００％殺線虫活性に対するペプチド濃度が０．８ｍｇ／ｍｌに低下し、カルコン濃度は１０−４〜１０−５Ｍと低い。活性に必要とされるペプチド量の顕著な減少によって生産コストが大きく削減され、それによりユニークな組成物が非常に経済的なものとなる。
【００２０】
カルコンは、水などの水性溶媒中で容易に溶解しない複雑な有機化合物である。カルコンを溶解させるためにジメチルスルホキシド及びエタノールなどの有機溶媒が一般的に使用される。しかし、これらの溶媒は、ヒト及び動物に対して毒性であり、環境面で有害でもある。
【００２１】
したがって、本発明の別の実施形態において、本発明は、いくつかの希釈方法により水中の濃縮カルコン保存液を溶解させるための方法を提供し、このカルコン保存液は、ＤＭＳＯ中で調製し、次いでエタノール中で連続希釈し、続いて殺線虫剤としての作業溶液を調製するために水で希釈する。カルコンの作業溶液は１０−４〜１０−５Ｍの範囲であり、ＤＭＳＯ及びエタノールの最終濃度はそれぞれ０．０１〜０．１％及び０．５〜５％の範囲であり、これは、環境面で安全であり、ヒト及び動物に対して無毒性である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、９６ウェルプレート実験における、線虫に対する、カルコン１７又はカルコン２５と組み合わせたペプチド２の効果のグラフ表示を示す。
【図２】図２は、９６ウェルプレート実験における、線虫に対する、カルコン３０と組み合わせたペプチド２の効果のグラフ表示を示す。
【図３】図３は、９６ウェルプレート実験における、線虫に対する、カルコン１７又はカルコン２５と組み合わせたペプチド３の効果のグラフ表示を示す。
【図４】図４は、９６ウェルプレート実験における、線虫に対する、カルコン３０と組み合わせたペプチド３の効果のグラフ表示を示す。
【図５】図５は、９６ウェルプレート実験における、線虫に対する、カルコン１７又はカルコン２５と組み合わせたペプチド１２の効果のグラフ表示を示す。
【図６】図６は、９６ウェルプレート実験における、線虫に対する、カルコン３０と組み合わせたペプチド１２の効果のグラフ表示を示す。
【図７】図７は、９６ウェルプレート実験における、線虫卵の孵化に対する、ペプチド２単独又はカルコンと組み合わせたペプチド２のグラフ表示を示す。
【図８】図８は、９６ウェルプレート実験における、線虫卵の孵化に対する、ペプチド３単独又はカルコンと組み合わせたペプチド３のグラフ表示を示す。
【図９】図９は、９６ウェルプレート実験における、線虫卵の孵化に対する、ペプチド１２単独又はカルコンと組み合わせたペプチド１２のグラフ表示を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ここで、本明細書中で以下、本発明をより詳細に記載する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書中で示される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、実施形態は、この開示が完全なものであり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供される。
【００２４】
カルコン又はカルコノイドは、芳香族ケトン及びエノンから構成される中心コアを有する化合物の群である。ベンジリデンアセトフェノンは、カルコンシリーズの親メンバーである。カルコン及びそれらの誘導体は、抗レトロウイルス、抗炎症、抗寄生虫、抗マラリア、抗酸化、抗真菌、抗原生生物、抗菌、抗ステロイド、心保護的、抗腫瘍、抗癌など、広い生物学的活性スペクトルを有する分子である。カルコンのいくつかのタイプは、様々な双子葉植物において、及び一部の単子葉植物、シダ植物及び裸子植物において天然に存在することが知られている。
【００２５】
カルコン、（２Ｅ）−１，３−ジフェニルプロプ−２−エン−１−オンは、化学式Ｃ１５Ｈ１２Ｏを有し、他のカルコンは、一般的には、式Ｘの構造を有するこの親化合物の誘導体である：
【化１】
0006944551.tif 000002
カルコン構造は、２個の芳香族環、環Ａ及び環Ｂから構成され、これらは３個の炭素α，β−不飽和カルボニル系により連結される。環Ａ又はＢに結合される化学基のいくつかのタイプとともに、少なくとも３０種類の天然のカルコンが知られている。
【００２６】
表１は、３０数種のタイプのカルコン、カルコン１〜カルコン３０、の構造を提供し、その基本構造は式Ｘで提供されるものである。
【表１】
0006944551.tif 000003
【００２７】
Ａｔｔａｒらは、カルコンが殺線虫活性を有することが知られていることを示しているが、しかし、個々のカルコンの有効性は、様々な濃度で、５％という低いものから１００％殺線虫活性という高いものまで多岐にわたる。さらに、カルコンの効果は、非寄生性モデル線虫カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）でのみ試験された。個々のカルコンの活性は、１０−２Ｍより高い濃度で見られた。最小阻害効果のためにより高濃度の化合物を使用することは、毒性、土壌混入、地下水への漏出及び他の関連問題ゆえに非常に限定的なものとなっている。
【００２８】
カルコンの群は、構造式１としてまとめて示し得る：
【化２】
0006944551.tif 000004
カルコン１７は、化学名（２Ｅ）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−３−フェニル−２−プロペン−１−オン及び式２で示されるような式を有し：
【化３】
0006944551.tif 000005
カルコン２５は、化学名（２Ｅ）−１−（４−エトキシフェニル）−３−フェニル−２−プロペン−１−オン及び式３で示されるような式を有し：
【化４】
0006944551.tif 000006
カルコン３０は、化学名（２Ｅ）−３−フェニル−１−（２−チエニル）−２−プロペン−１−オン及び式４で示されるような式を有する：
【化５】
0006944551.tif 000007
カルコン及びカルコン様の構造は、多くの植物において天然に存在し、そのため環境に優しく；いくつかの生物学的活性とのそれらの組み合わせにより、農業でのそれらの使用の可能性が大きく上昇する。しかし、カルコンの大きな制約はそれらの溶解度である。カルコンは、水などの水性溶媒中で容易に溶解されず、そのため、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒中で溶解させなければならない。ＤＭＳＯは、ヒト及び動物にとって毒性があると考えられ、急性経口毒性（ＬＤ５０）は７９２０ｍｇ／ｋｇ［マウス］であり、急性皮膚毒性（ＬＤ５０）は４００００ｍｇ／ｋｇ［ラット］である。ゆえに、ＤＭＳＯ中で溶解されたカルコンは、それに接触する使用者及び動物に対して有害であるため、土壌への直接散布に適切ではない。同様に、別の溶媒エタノールは、急性経口毒性（ＬＤ５０）が７０６０ｍｇ／ｋｇ［ラット］であり、これは使用者に対しても安全ではない。したがって、環境面で安全な溶液中でカルコンを使用するための方法が必要とされる。
【００２９】
本発明は、植物寄生虫、具体的には線虫を死滅させる能力を有する相乗的組成物に関する。より具体的には、本発明は、殺線虫ペプチド及びカルコンから構成される殺線虫剤の相乗的組成物に関し、本ペプチドはＣＥＤ−４タンパク質配列由来である。殺線虫ペプチド及びカルコンの組み合わせは他にないものであり、トランスジェニックラインの作製などの線虫防除のための他の既存の方法と比較して経済的である。本ペプチドは個々に殺線虫活性を示すものの、カルコンとの組み合わせによって効率が上昇し、相乗的効果がもたらされ、また活性に必要とされるペプチド量も減少するので、本組成物の生産コストが低下する。
【００３０】
本発明の主な実施形態において、本発明は、
１．ＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも１つのペプチド、ペプチド２、ペプチド３又はペプチド１２、
ａ．ペプチド２、配列ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（配列番号２）の１５アミノ酸長ペプチド、
ｂ．ペプチド３、配列ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（配列番号３）から構成される１９アミノ酸長及び
ｃ．ペプチド１２、配列ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（配列番号４）から構成される１２アミノ酸長；
及び
２．化合物、カルコン１７｛（２Ｅ）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−３−フェニル−２−プロペン−１−オン｝又はカルコン２５｛（２Ｅ）−１−（４−エトキシフェニル）−３−フェニル−２−プロペン−１−オンの何れかである、カルコン又はカルコノイドの群に属する少なくとも１つのカルコン
を含む殺線虫剤の相乗的組成物を提供する。
【００３１】
本ペプチドは、式２〜４の少なくとも１つのカルコンと組み合わせたとき、０．８ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度で１００％殺線虫活性を示す。本カルコンはまた、ペプチド配列番号２〜４と組み合わせて１０−４〜１０−５Ｍという低い濃度で１００％殺線虫活性を示した。殺線虫ペプチド配列番号２〜４と式２〜４のカルコンとの組み合わせによって相乗的効果がもたらされ、この組み合わせは、ペプチド単独と比較してより低い濃度で作用する。
【００３２】
カルコンは、水又は他の水性溶液中で容易に溶解せず、これにより、それらの有用性が大きく制限される。カルコンを非水性溶液中で溶解させることにより、環境面での負担が大きくなる。一般に、カルコンは、ヒト及び動物にとって毒性が高いＤＭＳＯ及びエタノールなどの有機溶媒中で溶解される。
【００３３】
したがって、本発明の別の実施形態において、本発明は、最小限のＤＭＳＯ及びエタノール濃度で環境面で安全な溶液中でカルコンを使用するための方法を提供する。カルコンの作業溶液は、
１．例えば、１０００μｌのＤＭＳＯ中で１３．８ｍｇのカルコン１７又は１２．６５ｍｇのカルコン２５を添加することによって、１０−１Ｍ濃度でＤＭＳＯ中でカルコンの保存溶液を作製すること；
２．１００％エタノール中でカルコン保存溶液を希釈して、１０−２Ｍ濃度でカルコン溶液を調製する、例えば、９００μｌの１００％エタノールに段階１からの１００μｌのカルコン保存溶液を添加すること；
３．水溶液中５０％エタノール中で段階２からのカルコン溶液を希釈して、１０−３Ｍ濃度のカルコン溶液を得る、例えば段階２からの１００μｌのカルコン溶液を９００μｌの水溶液中５０％エタノールに添加すること；及び
４．作業溶液として、通常の蒸留水中で段階３からのカルコン溶液を希釈して、１０−４Ｍ濃度のカルコン水溶液を得て、例えば段階２からの１ｍＬのカルコン溶液を９００ｍＬの水溶液中５０％エタノールに添加して、続いて１０−５Ｍ以下などのより低濃度のカルコン溶液を得るために蒸留水中で溶液をさらに希釈すること
から構成される段階において水などの水性溶媒中で作製され、
それぞれ０．０１〜０．１％及び０．５〜５％であるカルコンの作業溶液中のＤＭＳＯ及びエタノールの最終濃度はその溶媒の致死濃度よりも顕著に低い。この方法は、１０−４Ｍ未満の濃度で、水性溶液中でカルコンを溶解させるための希釈方法を提供する。
【００３４】
例１
Ａ）Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）増殖
トマト植物にＭ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）幼虫を接種し、栽培箱中で維持した。少なくとも２か月後、Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）卵を実験のために根から抽出した。Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）卵を抽出するために従った手順を以下で説明する。
【００３５】
手術用メス及び時計皿を使用して根の組織を手作業により細切するか、又はフードプロセッサを使用して細切した。次に、細切した組織をボトルに入れ、漂白剤の１０％希釈液で洗浄した。次いで、滅菌条件下で、ふるい（上に６０カウントシーブ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｅｖｅ）、下に５００カウントシーブ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｅｖｅ））に根の溶液を注いだ。粗製卵回収物（ｃｒｕｄｅ  ｅｇｇ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を５００カウントシーブ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｅｖｅ）の下部から回収して、１５ｍＬファルコンチューブ中で各５ｍＬの漂白剤及び卵の混合物になるようにした。次に、５ｍＬの７０％スクロース溶液を各ファルコンチューブに入れた。次に、二重蒸留滅菌水の１ｍＬ層を各ファルコンチューブ中のスクロース混合物の上部に静かに置いた。次いで、１２００ｒｐｍで５分間試料を遠心分離した。各ファルコンチューブから新しい１５ｍＬファルコンチューブに全部で３ｍＬ（溶液の３ｍＬの上層）、スクロース溶液と１ｍＬ水層との間に浮遊した胚を回収した。１０ｍＬの５％漂白剤溶液を添加し、卵を１０分間ボルテックス処理した。次に、ファルコンチューブを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、上清を除去し、１０ｍＬの滅菌二重蒸留水中で卵をすすぎ、２０００ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。この工程をさらに２回反復した。最後の洗浄後、５ｍＬの上清を除去し、一方で残った５ｍＬの水を卵と混合し、５ｍＬのペトリ皿に入れた。次に、卵を２５〜２７℃のインキュベーターに入れ、約１０日後に幼虫（Ｊ２期）が孵化した。この虫を保管のために２５〜２７℃のインキュベーター中で維持した。
【００３６】
Ｂ）試験溶液の調製及び線虫の配置
試験しようとするカルコンを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、１０−１Ｍ溶液を作製した。滅菌二重蒸留水中でのさらなる希釈のためにこの保存液を使用した（１０−４Ｍ〜１０−５Ｍ）。例えば、ＤＭＳＯ溶液中の１０μＬの１０−１Ｍカルコンを９９９０μＬの滅菌二重蒸留水に添加して、線虫でのアッセイ用の１０−４Ｍ溶液を作製した。水中の１００μＬの希釈液をピペットで９６ウェルプレートの３０ウェルに添加し、抽出したＪ２  Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）の保存物から各ウェルに１匹を移した。陰性対照に対して、ＤＭＳＯの濃度が線虫を死滅させるものではなかったことを確認するために、各実験に対して１００μＬの滅菌二重蒸留水中１％ＤＭＳＯ中に３０匹の寄生虫を入れた（過去の研究から、このＤＭＳＯ濃度でＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ．エレガンス）寄生虫が生存し得ることが明らかになっている（Ａｔｔａｒら、２０１１）。
【００３７】
Ｃ）線虫の監視
この寄生虫を死滅させるためのペプチド及びカルコンの能力を試験するためにバイオアッセイを設計する（％死亡率）。各ウェル（全部で３０ウェル）中線虫１匹を使用して９６ウェルプレート中で各試験を行った。５日間にわたり処理溶液中で線虫を温置した。プローブでの撹乱後、運動性についてそれぞれを調べることによって、手術用顕微鏡下で線虫の生存能を試験した。
【００３８】
Ｄ）卵孵化実験：
ペプチド及びカルコンの混合物の卵孵化防止能（％未孵化卵）を試験するために、バイオアッセイを設計する。ウェルあたり１０個の卵を使用して９６ウェルプレート中で各試験を行った。１６日間にわたり各処理において卵を温置した。顕微鏡画像によって孵化対未孵化卵を調べた。
【００３９】
例２
ペプチド及びカルコンから構成される殺線虫組成物の有効性
以前に記載のように、５日間にわたり９６ウェルプレートにて様々な処理溶液中で等しい数の線虫を温置し、第５日に死亡したか又は生存している線虫数を数えることによって、殺線虫剤の様々な組み合わせの効力を試験した。同様に、線虫卵孵化に対する殺線虫剤組成物の様々な組み合わせの効果も数えた。
【００４０】
図１〜６で示されるように、水又は１％ＤＭＳＯ中でのＪ２期幼若線虫の温置によって、第５日に１０〜１５％の線虫が死亡し、これらの処理を陰性対照とした。一方で、クロルピリホス及びイミダクロプリド（１：１比）から構成される化学混合物中での幼若線虫の温置の結果、第５日で５０％前後が死亡し、これを陽性対照とした。１０−４〜１０−５Ｍの濃度のカルコン１７、カルコン２５又はカルコン３０のみでの線虫の処理によって、幼若線虫の７０〜８５％が死亡した。
【００４１】
同様に、図７、図８及び図９で示されるように、水中での卵の温置の結果、陰性対照として使用した卵の７０％が孵化した。１０−４〜１０−５Ｍの濃度のカルコン１７又はカルコン２５の何れかでの線虫卵の処理によって、第１６日までに孵化した卵は僅か５０％前後となった。
【００４２】
図１及び２で示されるように、０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチド２のみとの幼若線虫の温置の結果、第５日に６０〜８０％前後が死亡した。しかし、ペプチド２とカルコン１７、カルコン２５又はカルコン３０の何れかとの組み合わせの結果、第５日に幼若線虫のほぼ１００％が死亡し、このときペプチド濃度は０．８ｍｇ／ｍｌであり、カルコン濃度は１０−４〜１０−５Ｍという低濃度であった。さらに、図２で示されるように、ペプチド２（０．８ｍｇ／ｍｌ）及び１０−４〜１０−５Ｍ濃度の１：１の比でのカルコン１７及びカルコン３０の組み合わせは非常に有効であった。
【００４３】
同様に、図３及び４は、ペプチド３単独が、カルコンと組み合わせたものと比較したとき、幼若線虫の死滅において効果が低いことを示す。ペプチド３の場合、カルコン２５又はカルコン３０との組み合わせは、カルコン１７との組み合わせよりも有効である。さらに、図４で示されるように、ペプチド３（０．８ｍｇ／ｍｌ）及び１０−４〜１０−５Ｍの濃度の１：１の比でのカルコン１７及びカルコン３０の組み合わせは非常に有効であった。
【００４４】
図５及び６は、幼若線虫の死滅において０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチド１２単独は非常に有効であり、やはり、少なくとも１つのカルコンとのペプチドの組み合わせは殺線虫剤組成物の効力を顕著に促進することを示す。
【００４５】
図７で示されるように、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のペプチド２での線虫卵の処理によって、第１６日までに３０％前後の卵が孵化し、一方でペプチド２（０．８ｍｇ／ｍｌ）及びカルコン（１０−４〜１０−５Ｍ）の組み合わせの結果、第１６日までに卵の１０〜２５％が孵化した。
【００４６】
図８で示されるように、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のペプチド３での線虫卵の処理によって、第１６日までに卵の１０％前後が孵化し、一方でペプチド３（０．８ｍｇ／ｍｌ）及びカルコン（１０−４〜１０−５Ｍ）の組み合わせの結果、第１６日までに卵の１０〜２０％が孵化した。
【００４７】
図９で示されるように、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のペプチド１２での線虫卵の処理によって、第１６日までに卵の２０％前後が孵化し、一方で、ペプチド１２（０．８ｍｇ／ｍｌ）及びカルコン（１０−４〜１０−５Ｍ）の組み合わせの結果、第１６日までに卵の１０〜１５％が孵化した。
【００４８】
これらの結果から、ＣＥＤ−４タンパク質由来のペプチド、ペプチド２又はペプチド３又はペプチド１２及びカルコンが効率的な殺線虫活性を有し、線虫を死滅させる能力を有し、またそれらの卵を破壊することがさらに示唆される。
【００４９】
しかし、これらのペプチドとカルコン、具体的にはカルコン３０との組み合わせは、線虫の死滅に対して激しい相乗的効果を示した。
【００５０】
これらの結果から、０．８ｍｇ／ｍｌの濃度の殺線虫ペプチド、ペプチド２又はペプチド３又はペプチド１２と、１０−４〜１０−５Ｍという低濃度のカルコン、カルコン１７、カルコン２５又はカルコン３０の何れかとの組み合わせが、線虫の死滅に対して相乗的効果を有し、殺線虫組成物として非常に強力であることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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