(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス化された生体組織のサイズを調整するための組成物であって、下記の式2によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩、及びアルカリ金属ハロゲン化物を含み、20〜60w/v%の尿素をさらに含む組成物。
【化１】
0006964674.tif 000007
【請求項２】
模擬体液をさらに含み、式2によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩の濃度が、30〜60w/v%であり、アルカリ金属ハロゲン化物の濃度が、1〜5w/v%である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
生体組織が、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓又は腸である、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
ガラス化された生体組織のサイズを調整する方法であって、ガラス化された生体組織を請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物と接触させることにより、当該生体組織のサイズを調整するステップを含む、方法。
【請求項５】
10℃〜50℃の温度範囲で行われる、請求項4に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、生体組織サイズを調整するための組成物、及び前記組成物を使用して生体組織のサイズを調整する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2.関連技術の説明
X線を使用した医療診断技法は、CT又はMRI等、二次元スキャニングから得られた画像の三次元観察から正確に疾患を診断することが可能な技術として開発された。光源の代わりに超音波が使用される場合も同様に、三次元画像を実現するための技法が診断に広く使用されてきた。しかし、現在までに開発された技法の大部分は、ミリメートル単位で画像を具体化するミリメートルレベルの分解能を有する。三次元において細胞レベルで解析され得るマイクロレベルを測定する技術は、相対的に不十分である。細胞レベル解析の大部分は、伝統的な二次元技法によって行われる。即ち、生検組織又は剖検組織等、生体組織試料が固定液で固定され、パラフィン又はポリマーに包埋され、次いで光又は電磁波が通過できるように、マイクロメートル又はナノメートルの厚さの切片が包埋組織から調製される。次に、光学又は電子顕微鏡を使用して透過画像を取得する技法を用いて、微細構造が解析される。
【０００３】
そのような精細イメージング技法を使用して試料の三次元画像を得るために、共焦点顕微鏡が使用される必要がある。この場合、数十マイクロメートルの厚さにおける情報を得ることができる。一般に、厚さは、光源が透過し得る深さによって限定される。しかし、大部分の生きている組織における重大な構造は、数百マイクロメートル以上のサイズを有するため、そのような方法では情報のごく一部しか取得できない。
【０００４】
したがって、より厚い組織画像を得るために、数十マイクロの厚さの連続切片の一連の小片が調製され、次いで顕微鏡により画像をイメージングし、再度それらを再構築することにより一連のプロセスが実行される。したがって、より厚い組織の内側の画像を得るために、数十マイクロメートルの厚さの連続切片の一連の小片が、先ず調製される必要があり、各切片のイメージングが、顕微鏡を使用することにより行われる必要があり、次いで再構築プロセスが必要とされる。特に、1個のニューロンは、その軸索を最大数メートルまで伸ばす場合があるため、脳組織におけるニューロン全体をイメージングする場合、組織のカット、接着及び再編成の一連のステップが要求され、その際に多くの望まれない問題のリスクがある。
【０００５】
他方では、組織透徹技法(tissue clearing technique)は、組織に損傷を与えることなく、組織における内部構造及びタンパク質分布の調査を容易にし、これにより、従来技法の限界が克服され、より深い組織構造を観察し、様々な系の複合的構造及び分子情報にアプローチすることが可能となる。したがって、様々なアプローチにより組織透徹技法が開発された。そのような組織透徹技術の進歩と併せて、ガラス化された(vitrified)組織を顕微鏡下でより明瞭に観察するための様々なマウント溶液も開発された。しかし、組織、特に、ガラス化された巨大組織のサイズを調整することができるマウント溶液に関する報告はない。加えて、現在商業利用されているマウント溶液の価格は高すぎる。例えば、焦点明瞭化溶液の場合、消費者価格は、5mL当たり税金を含めて500,000韓国ウォンである。
【０００６】
本発明者らは、生体組織を透徹するための組成物、及びこれを使用して生体組織を透徹する方法を開発した。特に、本発明者らは、高価な電気泳動装置及び高価な溶液を要求しないこと、脳、肝臓、肺、腎臓、腸、心臓、筋肉及び血管等、様々な生体組織へと、これらに損傷を与えることなく適用されること、気泡形成、変色及び黒色沈着物を伴わずに生体組織の透明度を改善すること、並びにガラス化された組織における抗体染色を可能にすることによって特徴付けられる、生体組織を透徹するための組成物のための特許出願を出願した(出願番号10-2017-0051443)。
【０００７】
その後、本発明者らは、タンパク質損傷及び組織変性等、組織にいかなる他の変化を引き起こすこともなく、顕微鏡の仕様及び研究者の必要に応じて、ガラス化された生体組織のサイズを調節することができるマウント溶液を開発し、本発明の完成に至った。
【０００８】
上述に関連して、米国特許出願公開第2016/0377514号は、トリクロロエタノールを含むマウント溶液について記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、生体組織サイズを調整するための組成物、及び上述の組成物を使用して生体組織のサイズを調整する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の目的を達成するために、本発明は、生体組織サイズを調整するための組成物であって、下記の式1によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩、及びアルカリ金属ハロゲン化物を含む組成物を提供する。
【００１１】
【化１】
0006964674.tif 000002
【００１２】
上記の式1において、
R1及びR2は独立して、C1〜10直鎖状又は分枝状アルキルであり、
p、q及びrは独立して、0〜10の整数である。
【００１３】
本発明はまた、生体組織のサイズを調整する方法であって、生体組織を前記組成物と接触させることにより、組織のサイズを調整するステップを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る生体組織のサイズを調整するための組成物は、顕微鏡の仕様及び研究者の必要に応じて、生体組織のサイズを調整することができ、マウント溶液として使用して、生体組織の画像を容易に取得することができる。したがって、本組成物を有用に使用して、様々な障害の原因を明らかにし、その治療方法を見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図１ｂ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図２ａ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図２ｂ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図３ａ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図３ｂ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図４ａ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図４ｂ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図５ａ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図５ｂ】本発明の実施例に従って、ガラス化された生体組織を調製するために行われた各ステップから得られた、生体組織を示す写真である。
【図６ａ】マウント溶液を使用することによりそのサイズが低下されている、本発明の実施例に従ってガラス化された生体組織を示す写真である。
【図６ｂ】マウント溶液を使用することによりそのサイズが低下されている、本発明の実施例に従ってガラス化された生体組織を示す写真である。
【図６ｃ】顕微鏡により得られたサイズ低下された生体組織の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、生体組織サイズを調整するための組成物であって、下記の式1によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩、及びアルカリ金属ハロゲン化物を含む組成物を提供する。
【００１７】
【化２】
0006964674.tif 000003
【００１８】
上記の式1において、
R1及びR2は独立して、C1〜10直鎖状又は分枝状アルキルであり、
p、q及びrは独立して、0〜10の整数である。
【００１９】
好ましくは、
R1及びR2は独立して、C1〜5直鎖状又は分枝状アルキルであり、
p、q及びrは独立して、0〜5の整数である。
【００２０】
より好ましくは、
R1及びR2は、メチルであり、
p、q及びrは、1の整数である。
【００２１】
最も好ましくは、式1によって表される化合物は、下記の式2によって表される化合物又はその水和物である。
【００２２】
【化３】
0006964674.tif 000004
【００２３】
下文に、本発明に係る生体組織サイズを調整するための組成物について詳細に記載する。
【００２４】
本発明に係る生体組織サイズを調整するための組成物は、各構成物の含有量及び濃度を制御することにより、生体組織のサイズを調整することができる。
【００２５】
本発明において、生体組織サイズを調整するための組成物は、顕微鏡下での生体組織の容易な観察のために調製され、当該生体組織は、ガラス化された生体組織となることができる。
【００２６】
ガラス化された生体組織を得るために使用される生体組織を透徹するための組成物は、一般的に使用される組成物であってよく、好ましくは、生体組織を透徹するための組成物は、式1によって表される化合物を含むことができる。その際、化合物の濃度は、2〜55w/v%(重量/容量%)、好ましくは、20〜50w/v%である。この濃度のための溶液は、本分野で一般に使用されている模擬体液であってよい。より具体的には、蒸留水、PBS(リン酸緩衝食塩水)又はTBS(トリス緩衝溶液)を使用することができるが、必ずしもそれらに限定される訳ではない。
【００２７】
上記の式1によって表される化合物の濃度が、2w/v%未満である場合、生体組織の透徹速度は遅くなるであろう。他方では、化合物の濃度が、55w/v%超である場合、上記の式1によって表されるCHAPSは、完全には溶解されないであろう。
【００２８】
更に、生体組織を透徹するための組成物は、浸透圧を制御することにより生体組織透徹の進行を加速することができる物質をさらに含むことができる。その際、生体組織透徹の進行を加速することができる物質は、尿素、CHAPSO(3-([3-コラミドプロピル]ジメチルアンモニオ)-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート)、スクロース、フルクトース、グリセロール、ジアトリゾ酸、トリトン(Triton)X-100、ツイーン(Tween)-20、2,2'-チオジエタノール、イオヘキソール、抱水クロラール又はそれらの組合せによって例証されるが、必ずしもそれらに限定される訳ではない。
【００２９】
その際、生体組織透徹を加速する物質は、5〜80w/v%、好ましくは、5〜75w/v%、より好ましくは、10〜70w/v%、5〜50w/v%、最も好ましくは、35〜60w/v%の濃度で含まれていてよい。その際、物質の濃度が、5w/v%未満である場合、組織透徹の速度は、遅くなるであろう。他方では、物質の濃度が、80w/v%超である場合、結晶が形成されるか、又は溶液中に溶解されないであろう。例として、生体組織透徹を加速する物質として尿素を使用する場合、尿素の濃度は、10〜70w/v%、より好ましくは、20〜60w/v%となることができる。加えて、生体組織透徹を加速する物質の濃度は、上記の式1によって表される化合物の好ましい濃度範囲へと適切に調整することができる。
【００３０】
生体組織が、生体組織を透徹するための組成物によってガラス化されると、生体組織のサイズは、本発明の生体組織サイズを調整するための組成物を使用することにより調整することができる。
【００３１】
本発明に係る生体組織サイズを調整するための組成物は、式1によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩、及びアルカリ金属ハロゲン化物を含むことができる。
【００３２】
その際、前記組成物は、尿素、CHAPSO(3-([3-コラミドプロピル]ジメチルアンモニオ)-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート)、スクロース、フルクトース、グリセロール、ジアトリゾ酸、トリトンX-100、ツイーン-20、2,2'-チオジエタノール、イオヘキソール、抱水クロラール又はそれらの組合せをさらに含むことができ、より好ましくは、尿素を含む。
【００３３】
生体組織サイズを調整するための組成物は、模擬体液をさらに含むことができる。生体組織サイズを調整するための組成物及び模擬体液の混合物において、上記の式1によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩の濃度は、30〜60w/v%とすることができ、アルカリ金属ハロゲン化物の濃度は、1〜5w/v%とすることができる。
【００３４】
アルカリ金属ハロゲン化物は、いずれかの形態の組み合わされたアルカリ金属及びハロゲン元素を含むことができ、これは好ましくは、塩化ナトリウムである。
【００３５】
上文に記載されている通り、本発明に係る生体組織サイズを調整するための組成物は、組織に損傷を与えることなく、ガラス化された生体組織のサイズを調整することができ、脳、肝臓、肺、腎臓、腸、心臓、筋肉及び血管等、様々な生体組織へと、これらに損傷を与えることなく適用することができ、組織が膨張、気泡形成、変色及び黒色沈着するのを防止することができ、高価ではなく、そのため、生体組織サイズを調整するための組成物として有効に使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、生体組織のサイズを調整する方法であって、生体組織を、前記生体組織サイズを調整するための組成物と接触させることにより、組織のサイズを調整するステップを含む方法を提供する。
【００３７】
下文に、本発明に係る生体組織サイズを調整する方法についてより詳細に記載する。
【００３８】
本発明に係る生体組織は、ガラス化された組織とすることができ、ガラス化された組織のサイズを調整する方法は、ガラス化された組織を上述の組成物と接触させることにより、組織のサイズを調整するステップを含む。
【００３９】
特に、本発明に係るガラス化された組織のサイズを調整する方法は、ガラス化された組織を式1によって表される化合物を含む組成物と接触させて、生体組織の生理化学的特徴に変化を誘導することによりサイズを調整することにより達成され、これにより、その画像を顕微鏡により容易に得ることができる。
【００４０】
本発明において、ガラス化された生体組織を調製するために、生体組織の固定が必要である。生体組織を固定する方法は、特にいかなる制約もなく使用することができる。
【００４１】
更に特に、生体組織を固定する方法は、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、ポリアクリルアミド又はそれらの組合せを使用した従来方法によって行うことができるが、必ずしもそれらに限定される訳ではない。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、組織サイズは、CHAPS、尿素及びアルカリ金属ハロゲン化物の混合物である生体組織サイズを調整するための組成物で組織を処理することにより調整することができる。
【００４３】
上述の濃度を調節するための溶液は、本分野で一般に使用されている模擬体液とすることができるか、又は蒸留水、PBS(リン酸緩衝食塩水)若しくはTBS(トリス緩衝溶液)とすることができるが、必ずしもそれらに限定される訳ではない。浸漬は、10℃〜50℃の温度範囲で、好ましくは、12℃〜48℃の温度範囲で、14℃〜46℃の温度範囲で、16℃〜44℃の温度範囲で、18℃〜42℃の温度範囲で、20℃〜40℃の温度範囲で、24℃〜39℃の温度範囲で、28℃〜38℃の温度範囲で、30℃〜37℃の温度範囲で、33℃〜34℃の温度範囲で行うことができる。
【００４４】
生体組織サイズを調整するための組成物が、模擬体液をさらに含む場合、生体組織サイズを調整するための組成物及び模擬体液を含む混合溶液におけるCHAPSの濃度は、30w/v%〜60w/v%とすることができ、アルカリ金属ハロゲン化物の濃度は、1w/v%〜5w/v%とすることができる。
【００４５】
その際、アルカリ金属ハロゲン化物は、いずれかの形態の組み合わされたアルカリ金属及びハロゲン元素を含むことができ、これは好ましくは、塩化ナトリウムである。
【００４６】
本発明に係る生体組織サイズを調整する方法は、様々な脊椎動物組織、特に、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、心臓等へと適用することができ、組成物は、一度に組織全体のサイズを調整することができる。
【００４７】
本発明の方法は、組織に損傷を与えることなく、ガラス化された組織のサイズの調節を容易にし、これにより、より良好な観察のための細胞及び分子の三次元分布のイメージングを可能にする。したがって、本発明の方法は、数百マイクロメートルのサイズで構造全体として複雑な構造を有する様々な生体組織の観察及び研究に、また、脳疾患を含む様々な疾患の原因を見出すのに有用であるとして、組織から有用な情報を得るのに有利である。
【実施例】
【００４８】
本発明の実用的且つ現在好まれる実施形態は、次の実施例に示す通り説明的である。
【００４９】
しかし、当業者であれば、本開示を考慮して、本発明の精神及び範囲内で修正及び改善を為すことができることが認められるであろう。
【００５０】
[実施例1]
実験例1:ガラス化された生体組織サイズの変化
次の実験を行って、本発明に係る組成物が、ガラス化された組織のサイズを変化させることができるか調査した。本明細書における動物試験法は全て、韓国毒性学研究所施設内動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee, Korea Institute of Toxicology)のガイドライン(承認番号RS17003)に従って行った。
【００５１】
1.ガラス化された生体組織の調製(ステップ1)
先ず、成体マウス(8週目)を吸入麻酔薬であるイソフルラン(1cc/分)で麻酔し、続いて段階的に50mLの冷1×PBS及び冷4%PFA(パラホルムアルデヒド)で灌流した。次いで、臓器を摘出し、4%PFA溶液に浸し、続いて4℃で24時間インキュベーションを行った。その際、上述の温度は、特異的な範囲に限定されなかったが、好ましくは0〜10℃であった。
【００５２】
次に、試料を、30%スクロースの存在下、0〜10℃で24時間インキュベートした。全体的脳サイズは、嗅球の部分を除いて1cm×1.3cm(幅×長さ)であった。結果を図1(a)及び図1(b)に示す。
【００５３】
組織試料を清澄化するために、25w/v%のCHAPS、50w/v%の尿素及び50mMアジ化ナトリウムを含む混合溶液と共に35℃で150rpmにて24時間振盪インキュベーションを行った。必要であれば、インキュベーション時間を延長又は短縮することができる。全体的脳サイズは、嗅球の部分を除いて1.2cm×1.3cm(幅×長さ)であった。結果を図2(a)及び図2(b)に示す。
【００５４】
次いで、PBS(リン酸緩衝食塩水、0.01%)を含有する50mLの滅菌蒸留水と共に0〜10℃で150rpmにて24時間インキュベーションを3回行った。全体的脳サイズは、嗅球の部分を除いて1.3cm×2cm(幅×長さ)であった。結果を図3(a)及び図3(b)に示す。
【００５５】
20w/v%のCHAPS、50w/v%の尿素及び50mMアジ化ナトリウムを含む混合溶液と共に35℃で150rpmにて24時間インキュベーションを再度行った。必要であれば、インキュベーション時間を延長又は短縮することができる。全体的脳サイズは、嗅球の部分を除いて1.2cm×1.3cm(幅×長さ)であった。結果を図4(a)及び図4(b)に示す。
【００５６】
次いで、40w/v%のCHAPS及び40w/v%の尿素を含む混合溶液と共に37℃で220rpmにて24時間インキュベーションを同様に行った。必要であれば、インキュベーション時間を延長又は短縮することができる。全体的脳サイズは、嗅球の部分を除いて1.2cm×1.3cm(幅×長さ)であった。結果を図5(a)及び図5(b)に示す。
【００５７】
徐々にCHAPSの濃度を高めつつ、上述の手順により試料をガラス化した。
【００５８】
2.ステップ1において調製された試料のサイズの低下(ステップ2)
ステップ1において調製されたガラス化された試料を、40w/v%のCHAPS、40w/v%の尿素及び50mM塩化ナトリウムを含む混合溶液において35℃で220rpmにて24時間インキュベートした。全体的脳サイズは、嗅球の部分を除いて0.8cm×1cm(幅×長さ)であった。結果を図6(a)及び図6(b)に示す。
【００５９】
結果として、ガラス化された組織のサイズが、本発明の組成物の処理によって低下されたことが確認された。
【００６０】
[実施例2]
実験例2:サイズが低下したガラス化された組織の顕微鏡画像を得ること
試料が、顕微鏡下での観察に適したサイズに変化されるように、ガラス化された組織のサイズは、本発明の組成物を使用することにより低下された。サイズが低下したガラス化された脳組織を、1×対物レンズを使用した顕微鏡下で観察し、そこから、マウス脳の緑色蛍光タンパク質(GFP)が確認された(図6(c))。
【００６１】
結果として、顕微鏡サイズに適合するようにガラス化された組織のサイズを低下させることにより、所望の画像を容易に得ることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係る生体組織サイズを調整するための組成物は、これを有効に使用して、生体組織画像を得て、様々な障害の原因を明らかにし、その治療方法を見出すことができるように、マウント溶液として使用することができる。
本発明の実施形態として例えば以下を挙げることができる。
［実施形態１］
生体組織サイズを調整するための組成物であって、下記の式1によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩、及びアルカリ金属ハロゲン化物を含む組成物
【化４】
0006964674.tif 000005
(上記の式1において、
R1及びR2は独立して、C1〜10直鎖状又は分枝状アルキルであり、
p、q及びrは独立して、0〜10の整数である)。
［実施形態２］
R1及びR2が独立して、C1〜5直鎖状又は分枝状アルキルであり、p、q及びrが独立して、0〜5の整数である、実施形態1に記載の生体組織サイズを調整するための組成物。
［実施形態３］
R1及びR2が独立して、メチルであり、p、q及びrが独立して、1の整数である、実施形態1に記載の生体組織サイズを調整するための組成物。
［実施形態４］
式1によって表される化合物が、下記の式2によって表される化合物又はその水和物である、実施形態1に記載の生体組織サイズを調整するための組成物。
【化５】
0006964674.tif 000006
［実施形態５］
尿素、CHAPSO(3-([3-コラミドプロピル]ジメチルアンモニオ)-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート)、スクロース、フルクトース、グリセロール、ジアトリゾ酸、トリトンX-100、ツイーン-20、2,2'-チオジエタノール、イオヘキソール及び抱水クロラールからなる群から選択される1種以上の化合物をさらに含む、実施形態1に記載の生体組織サイズを調整するための組成物。
［実施形態６］
模擬体液をさらに含み、式1によって表される化合物、その光学異性体、その水和物又はその塩の濃度が、30〜60w/v%であり、アルカリ金属ハロゲン化物の濃度が、1〜5w/v%である、実施形態1に記載の生体組織サイズを調整するための組成物。
［実施形態７］
生体組織が、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓又は腸である、実施形態1に記載の生体組織サイズを調整するための組成物。
［実施形態８］
生体組織のサイズを調整する方法であって、生体組織を実施形態1に記載の組成物と接触させることにより、組織のサイズを調整するステップを含む、方法。
［実施形態９］
10℃〜50℃の温度範囲で行われる、実施形態8に記載の生体組織のサイズを調整する方法。
【図１ａ】
0006964674.tif 000008
【図１ｂ】
0006964674.tif 000009
【図２ａ】
0006964674.tif 000010
【図２ｂ】
0006964674.tif 000011
【図３ａ】
0006964674.tif 000012
【図３ｂ】
0006964674.tif 000013
【図４ａ】
0006964674.tif 000014
【図４ｂ】
0006964674.tif 000015
【図５ａ】
0006964674.tif 000016
【図５ｂ】
0006964674.tif 000017
【図６ａ】
0006964674.tif 000018
【図６ｂ】
0006964674.tif 000019
【図６ｃ】
0006964674.tif 000020