(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子マトリクス中に主剤が均一に分散されたマイクロスフェアーであって、
前記マイクロスフェアーの平均体積粒子径が１μｍ以上１５０μｍ以下であり、
前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の主剤を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、４つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアー。
【請求項２】
前記主剤が親油性物質である、請求項１に記載のマイクロスフェアー。
【請求項３】
分散された前記主剤の平均体積基準粒子径が５ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１又は２に記載のマイクロスフェアー。
【請求項４】
前記マイクロスフェアー中の前記主剤の含有量が前記マイクロスフェアー全量に対して０．１０〜５０質量％である、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロスフェアー。
【請求項５】
前記高分子が生分解性ポリマーである、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロスフェアー。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のマイクロスフェアーを含有する徐放性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主剤が均一に分散されたマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤に関する。本発明は、特に、生分解性を有する高分子マトリクス中に主剤が均一に分散されたマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
主剤を含有する医薬品等の徐放性製剤等として、近年、マイクロスフェアー又はナノスフェアーが注目されている。マイクロスフェアーとは、通常、粒子径が１μｍから１５０μｍ程度の製剤をいい、それよりも小さい１μｍ未満の製剤はナノスフェアーと呼ばれる。これらは、例えば、主剤を生分解性の合成高分子又は天然高分子に内包させて、局所で主剤を持続的に放出することができ、又は組織への主剤のターゲッティング等を行うことができる。【０００３】
主剤を一定の速度で徐々に放出する徐放性マイクロスフェアー製剤には、例えば、生分解性高分子、主剤、添加剤、溶媒等が適切に制御された製剤が必要である。徐放性マイクロスフェアー製剤が生体内で一定期間、有効に薬理学的効果を示すためには、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度を適切に制御して、主剤を生体内で一定期間、継続して放出することが必要である。しかしながら、従来のマイクロスフェアーの場合には、投与後１０〜３０％が初期バーストするため、インスリン、抗がん剤のような血中・組織中濃度の制御が必要な薬物では使えなかった。逆にこの初期バーストを解決した場合には、長期除法性マイクロスフェアーの利用価値はもっと高まると考えられている（非特許文献１）。【０００４】
主剤の初期放出量異常（初期バースト）を抑え、放出期間中の放出速度を一定に制御するためには、マイクロスフェアーの粒子径とマイクロスフェアー中の主剤の分散状態が関係する。マイクロスフェアーの粒子径は、歩留まりの問題があるが、ろ過などの操作で目的とする粒子径に合わせこむことができる。しかしながら、マイクロスフェアー中の主剤の分散状態は、ただ一様とされており確認されていない。【０００５】
長期徐放型マイクロカプセルとして、黄体形成ホルモン放出ホルモン誘導体であるリュープロレリン酢酸塩を皮下注射することで約１ヶ月から数ヶ月にわたって放出する製剤が特許文献1に開示されている。同製剤には粒子径の粒度分布が１μｍから４００μｍと非常に広いことの問題がある。そこで、この問題を解決する方法として、特許文献２に二重乳化法により担体用高分子内に主剤が封入されたマイクロスフェアーを製造する方法が提案されている。しかし、実施例１〜５で得られたリュープロレイン酢酸塩含有マイクロスフェアーは、粒子中の薬物の分散状態については、記載されていない。【０００６】
特許文献３には、少なくとも２８日間（６７２時間）、慢性の痛みを軽減するマイクロスフェアーが開示されている。同マイクロスフェアーは、生分解性ポリマー及び局所麻酔剤（主剤）を含み、局所麻酔剤の約７５％が約７２時間までに放出され、局所麻酔剤の約８０〜９０％が約１２０時間までに放出される。このことから、マイクロスフェアー中の局所麻酔剤の分布はマイクロスフェアー中に均一ではなく外側に偏っていることが示唆される。図２に記載されたマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像からは、局所麻酔剤の分散状態は、確認できない。【０００７】
特許文献４では、コアが固体状のアリピプラゾールを含有し、生分解性ポリマーを含むシェルがコアの表面を被覆したコアシェル構造のマイクロスフェアーが開示されている。このように、特許文献４のマイクロスフェアーは、マイクロスフェアー中に主剤が均一に分散されたものではない。また、図５に記載された実施例で得られたマイクロスフェアーを切断した断面の電子顕微鏡写真では、シェル中には、アリピプラゾールの分散状態が、確認できない。【０００８】
特許文献５では、水溶性高分子を主成分とする水溶性賦形剤からなる高分子マトリクス中に親油性物質の主剤を含有する油性成分を多分散させている。ここでは、水溶性高分子マトリクスを溶解し、主剤の粒度分布を測定して粒子径は確認されているが、実際に水溶性高分子マトリクス中の主剤の分散状態について確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許２６５３２５５号公報
【特許文献２】特開２０１４−２２４１１４号公報
【特許文献３】特開２０１６−０６９３７８号公報
【特許文献４】特表２０１０−５３１３０３号公報
【特許文献５】国際公開２００８／０５３９２０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，２０１４年２９巻１号，ｐ．５１〜６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
平均体積基準粒子径が１μｍ以上１５０μｍ以下である生分解性高分子マイクロスフェアーは、マイクロスフェアー中の主剤（薬物と表記する場合もある）の分布が制御されていなければ、放出期間を設計通りに実現することができない。例えば、マイクロスフェアーの表面近くに主剤が偏っていれば、投与後初期にマイクロスフェアーから多量の主剤が放出され、初期バーストの問題が発生する。逆に、マイクロスフェアーの中心部に主剤が偏っていれば、又はコアシェルの様な状態であれば、初期から持続的に放出することができない。故に、微粒子の主剤が均一に分散された状態が望ましい。大きな塊の主剤が点在するような分散状態では、初期から持続的に放出することはできない。同様に、空孔の制御がなされていなければ、主剤の放出において同様な問題が発生する。【００１２】
実際にラット等の小動物を用いて薬物動態を調べた際、放出速度や放出プロファイルにバラつきが多く発生することがあり、その原因としてラット等の個体差であると結論付けることが多い。しかし、マイクロスフェアー中の主剤の分散状態が均一であれば、バラつきの多くがより改善され、高分子の種類や分子量で分解速度を制御したマイクロスフェアーからの主剤の放出も設計通りに実現できる。【００１３】
マイクロスフェアー中に主剤が均一に分散されていることが、主剤を生体内で一定期間継続して放出するための絶対条件である。しかし、現状ではマイクロスフェアー内の主剤の均一な分散状態について探索がなされていない。マイクロスフェアーの粒子径は、ナノ粒子と違って大きいため、一般に均一化が難しい。そこで、マイクロスフェアー中の主剤の分散状態を確認する必要がある。そのためには、マイクロスフェアーの粒子を切断した断面観察試料を作成し、マイクロスフェアー中の主剤を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、その分散状態を確認することが、容易に実施することができ、確実である。【００１４】
図１は、特許文献１に記載されるＬＨ−ＲＨ誘導体の長期徐放型マイクロカプセルに相当する、マイクロカプセル型徐放性製剤リュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇ（武田薬品工業株式会社製）の電子顕微鏡写真である。
本製剤には、大きな粒子から小さな粒子までいろいろ含まれているが、その代表的な粒子である約６μｍの粒子を選択して、その粒子の断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像を図２に示す。図２中の矢印で示す大きな分散体は、空孔であることが、画像でのエッジ効果の確認によって、またＳＥＭ−ＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光器）によって分かる。図３は、図２のＳＥＭ断面画像を画像上で４分割（領域１〜領域４）し、市販の画像処理解析ソフトｉＴＥＭ（ＴＥＭカメラ制御、画像解析ソフトウェア、ＥＭＳＩＳ社製）を用いてピクセル範囲３×３で平均化処理後に、エッジ部分を強調する処理を行い、コントラストの最適化を行った。その後、２値化処理を行い、画像処理でノイズ除去及びコントラストの低い粒子の強調処理を行った後に、再度ピクセル範囲３×３で平均化処理後にエッジ部分を強調する処理を行った画像である。図３に基づいて、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）の変動係数を求めたところ、１.１１４であった。この様に実施することで、粒子断面から主剤の分散状態を確認することができる。この変動係数が０．３５を超えており、マイクロスフェアー粒子中に分散された主剤が均一でない分散状態であるために、本製剤では放出期間中の放出速度を適切に制御することができない。【００１５】
そこで、本発明の課題は、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を生体内で一定期間、継続して放出することができるマイクロスフェアーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、マイクロスフェアーの断面の電子顕微鏡観察を行い、断面観察した像の４分割した領域における主剤の面積比率の変動係数が０．３５以下であるマイクロスフェアーであることによって、主剤がマイクロスフェアー中に均一に分散され、不均一な空孔がなく、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を生体内で一定期間、継続して放出することができることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。【００１７】
［１］本発明の第１の態様は、高分子マトリクス中に主剤が均一に分散されたマイクロスフェアーであって、
前記マイクロスフェアーの平均体積粒子径が１μｍ〜１５０μｍ以下であり、
前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の主剤を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、４つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアーである。【００１８】
［２］本発明の第２の態様は、前記主剤が親油性物質である、［１］に記載のマイクロスフェアーである。
［３］本発明の第３の態様は、分散された前記主剤の平均体積基準粒子径が５ｎｍ〜５００ｎｍである、［１］又は［２］に記載のマイクロスフェアーである。
［４］本発明の第４の態様は、前記マイクロスフェアー中の前記主剤の含有量が前記マイクロスフェアー全量に対して０．１０〜５０質量％である、［１］〜［３］のいずれかに記載のマイクロスフェアーである。
［５］本発明の第５の態様は、前記高分子が生分解性ポリマーである、［１］〜［４］のいずれかに記載のマイクロスフェアーである。
［６］本発明の第６の態様は、［１］〜［５］のいずれかに記載のマイクロスフェアーを含有する徐放性製剤である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のマイクロスフェアーによって、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を一定期間、継続して放出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】リュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇ（武田薬品工業株式会社製）のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像である。
【図２】リュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇ（武田薬品工業株式会社製）の代表的な粒子の断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像である。
【図３】図２の断面画像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。
【図４】参考例１の主剤を含まないマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図５】マイクロスフェアーの分割方法の例を示す。（Ａ）は同心円上に４分割したものである。（Ｂ）は縦方向に４分割したものである。（Ｃ）は円周方向に４分割したものである。
【図６−１】実施例１のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図６−２】図６−１の断面画像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。
【図７−１】実施例３のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図７−２】図７−１の断面画像を拡大し、２値化処理した画像である。
【図８−１】実施例４のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図８−２】図８−１の断面画像を２値化処理した画像である。
【図９】実施例７のマイクロスフェアーの断面を拡大したＳＥＭ画像である。
【図１０】実施例８のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。
【図１１】比較例１のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図１２】比較例２のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図１３】比較例３のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【図１４】比較例４のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．マイクロスフェアー
本発明のマイクロスフェアーは、高分子マトリクス中に主剤が均一に分散されたマイクロスフェアーであって、前記マイクロスフェアーの平均体積粒子径が１μｍ〜１５０μｍ以下であり、前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の主剤を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、４つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアーである。
【００２２】
表層又は中心部に主剤が偏析するか、あるいは粗大粒子や凝集体又は大きな空孔等があれば、上記比率の変動係数が大きくなる。上記比率の変動係数が０．３５以下であれば主剤が均一に分散している状態である。本発明に係るマイクロスフェアーは、上記マイクロスフェアーの断面を４分割した各領域内において、各領域面積に対する主剤が占める面積比率の変動係数が０.３５以下であり、好ましくは０．２５以下、より好ましくは０．２０以下である。
本発明のマイクロスフェアーによって、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を生体内で一定期間、継続して放出することができる。
【００２３】
＜マイクロスフェアーの断面の観察＞
マイクロスフェアー中の主剤の分散状態の確認方法について以下に述べる。
分散された主剤の微粒子を明確に確認できる倍率で、マイクロスフェアーの断面を電子顕微鏡で観察することで実施することができる。電子顕微鏡は、透過電子を情報源にした透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）と二次電子（反射電子）を検出する走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等がある。観察する試料に合わせて選択するが、ナノスフェアーなどは、透過型電子顕微鏡の方が微細構造を観察できる。また、位相差顕微鏡などを用いて、マイクロスフェアー内に５００ｎｍ以上の空孔及び又は主剤等の偏りの有無を確認することが出来る。空孔や含有物に偏りがあると屈折率が変化するため、マイクロスフェアー粒子内のコントラストに差が生じる。光の波長以上の大きさで変化がある場合には簡便で有用である。
【００２４】
断面観察の方法について特に限定されるものではないが、具体的には次の手順で確認することができる。先ず金や白金、白金パラジウム合金等の薄膜をマイクロスフェアーにコートする。実施例では、オスミウムを用いてコートしている。次にマイクロスフェアーを液体窒素によって凍結させる。凍結後、ＦＩＢ（集束イオンビーム：Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ）により断面を作成する。すなわち、ＦＩＢ装置を用いて、集束したイオンビームを試料に照射し、試料内部の所望位置の構造を切り出すことで、マイクロスフェアーの断面観察試料を作製した。高分子マトリクス中に分散された主剤の微粒子の好ましい粒子径は数１０ｎｍ〜数１００ｎｍであるが、数μｍの場合もある。この大きさの分散微粒子を確認できる電子顕微鏡の観察倍率でマイクロスフェアーの断面全体を観察する。通常、電子顕微鏡の観察倍率は２５００倍から数十万倍程度である。また、マイクロスフェアー全体を観察できない高い倍率を用いた場合、観察された部分を繋ぎ合わして全体を観察してもよい。
【００２５】
断面画像を４分割にする際、例えば、図５のＡ〜Ｃに示すように、同心円状に４分割してもよく、縦方向又は横方向に４分割してもよく、中心を通る円周方向に４分割しても構わない。主剤の偏析状態を顕著に示す分割方法を取ることが好ましい。例えば、同心円状に４分割する場合（図５Ａ）は、マイクロスフェアーの断面の最大直径の中心点から半径を４等分して同心円状に分割が必須である。縦方向又は横方向に分割する場合（図５Ｂ）は、等間隔に４分割が必須である。上記の最大直径と平行に又は垂直、いずれかの方向に４分割が必須である。中心を通る円周方向に４分割する場合（図５Ｃ）は、上記の最大直径の中心点を中心にして９０度ごとに４分割が必須である。主剤の構成元素にもよるが、マイクロスフェアーの断面をＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光器）を用いて元素分析を行うことができ、空孔かそうでないかも確認できる。空孔の場合は主剤の面積に積算してはならない。ＥＤＳ検出元素が入っていない場合、断面観察試料を四酸化ルテニウムや四酸化オスミウム、リンタングステン酸、酢酸ウラニル、酢酸サマリウム、ヨウ素などを用いて染色することもできる。また、主剤が入っていないマイクロスフェアーとの比較により、主剤を特定することもできる。電子顕微鏡断面観察画像にコントラストが得にくい場合、染色法が有効である。上述は一例であり試料を樹脂で包埋したり、マイクロスフェアーの断面作成にミクロトームを用いたりしても構わない。
また、断面積の算出は、特に方法は問わないが、市販の画像処理解析ソフトを用いることが好ましい。市販の画像処理解析ソフトとしては、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製)やｉＴＥＭ（ＴＥＭカメラ制御、画像解析ソフトウェア、ＥＭＳＩＳ社製）等、多種類のものを用いることができる。
【００２６】
＜高分子＞
本発明のマイクロスフェアーに用いられる高分子は、ポリラクチド類（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ，Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＰＬＡ）、ポリ（Ｄ−ラクチド）類、ポリ（Ｌ−ラクチド）類、ポリ（ＤＬ−ラクチド）類、ポリグリコリド類（Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ，ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）類（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ−ラクチド−コ−グリコリド）類、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）類、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）類、ポリカプロラクトン類（Ｐｏｌｙ−Ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ）、ポリカーボネート類、ポリエステルアミド類、ポリアンヒドリド類、ポリオルトエステル類、ポリエーテルエステル類、ポリ（ジオキサノン）類、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、ポリブチレンサクシネート等のポリエステル又はこれらのコポリマー；酢酸セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ aｃｅｔａｔｅ、ＣＡ）、エチルセルロース（Ｅｔｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース等のセルロース類又はセルロース誘導体；アミロース、アミロペクチン、ペクチン、でんぷん、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ガラギナン等の多糖類又はその誘導体；ポリアセタール類、ポリアミノ酸、ポリシアノアクリレート類、ポリアルキレンアルキレート類、生分解性ポリウレタン混合物、又はこれらのコポリマー、ポリ酢酸ビニル、メタクリル酸コポリマー類、コラーゲン、ゼラチンなどの高分子を利用することができる。本明細書に記載したものは一例として記載したものであり、記載されたものに制限されるものではない。また、高分子種は、薬物種や放出速度などにより適宜選択することができ、１種単独で使用してもよいし、複数種を併用して使用しても良い。
【００２７】
主剤の徐放効果を生体内で長期間持続させることが必要なときは、非生分解性ポリマーを用いてもよく、短時間で薬物を放出させることが必要なときは生分解性ポリマーを用いれば良い。また、例えばポリ（カプロラクトン）、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）は、この順序で生分解速度は速くなるので、マイクロスフェアーを形成する高分子の選択によって薬物の徐放速度を制御することもできる。
【００２８】
高分子の構成についてモル比等に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することが出来る。例えば、ＰＬＧＡは乳酸に由来する構成単位（Ｌ）とグリコール酸に由来する構成単位（Ｇ）とのモル比（Ｌ：Ｇ）は特に制限はなく、目的に応じて選択できる。１：９９〜９９：１が好ましく、２５：７５〜９９：１がより好ましく、３０：７０〜９０：１０が更に好ましく、５０：５０〜８５：１５が特に好ましい。また、ＰＬＡやＰＧＡ単独でも使用できる。その他の共重合体についても同様に構成物質のモル比を調整することができ、分子量の選択についても、主剤の均一な分散状態の実現ならびに徐放性の制御には重要となる。
【００２９】
本発明のマイクロスフェアーは、高分子マトリクス中に主剤が含まれるが、必要に応じて、分散剤やその他の成分を含有させても良い。また、高分子マトリクスの状態は特に規定されるものではないが、アモルファスの状態であることが好ましい。
【００３０】
［主剤］
本発明のマイクロスフェアーに含まれる主剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬化合物、機能性食品化合物、機能性化粧品化合物、動物投与化合物、農薬等が挙げられる。医薬化合物を含むマイクロスフェアーは、例えば、徐放性医薬製剤として好適に用いることができる。主剤には、親油性物質及び親水性物質のいずれもが含まれる。好ましい主剤として親油性物質が挙げられる。親油性物質は、例えば、水／オクタノール分配係数のｌｏｇＰ値が３以上である物質を意味し、親油性物質に含まれない主剤は、親水性物質に分類される。水／オクタノール分配係数は、ＪＩＳＺ７２６０−１０７（２０００）フラスコ振とう法に準拠して測定することができる。主剤は、徐放性製剤が望まれるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。主剤には、塩、水和物等のいずれの形態も包含される。
【００３１】
本発明のマイクロスフェアー中に主剤が均一に分散している。その構成を取ることで、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を一定期間、継続して放出することができる。マイクロスフェアー中に主剤が均一に分散していることは、マイクロスフェアー全量に対する主剤の含有量で制御することができる。主剤の好ましい含有量としては、主剤によっても変化するが、マイクロスフェアー全量に対して、例えば、０．１〜５０質量％が挙げられ、好ましくは０．３〜３０質量％が挙げられ、より好ましくは０．３５〜１５質量％が挙げられ、更により好ましくは０．５〜１０質量％が挙げられる。
分散された主剤の微粒子の平均体積基準粒子径は、５ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜４００ｎｍが挙げられ、更に好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍが挙げられる。
【００３２】
［分散剤］
主剤を分散させるために、分散剤を用いることができる。分散剤としては、低分子量の分散剤であってもよく、高分子量の分散剤ポリマーであってもよい。低分子量の分散剤とは、重量平均分子量が１５，０００未満の化合物を意味し、高分子量の分散剤ポリマーとは、１つ以上のモノマーの間に繰り返しの共有結合を含み、重量平均分子量が１５，０００以上の化合物を意味する。
【００３３】
低分子量の分散剤としては、医薬化合物、機能性食品化合物、機能性化粧品化合物、動物投与化合物、農薬等に許容されるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、脂質類、糖類、アミノ酸類、有機酸類、その他の成分等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
脂質類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、中鎖又は長鎖のモノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリド、リン脂質、植物油（例えば、大豆油、アボカド油、スクアレン油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ナタネ油、サフラワー油、ヒマワリ油等）、魚油、調味油、水不溶性ビタミン、脂肪酸、及びこれらの混合物を含み、これらの誘導体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３５】
糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、フコース、リボース、キシロース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、ツラノース、ラフィノース、マルトトリオース、アカルボース、水溶性セルロース、合成セルロース、糖アルコール、グリセリン、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、若しくはポリオール、又はこれらの誘導体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３６】
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、医薬、食品、化粧品等に使用できるものが好ましい。
【００３７】
＜平均体積基準粒子径＞
本発明のマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は、１μｍ以上１５０μｍ以下であり、１０μｍ以上１００μｍ以下が好ましく、２０μｍ以上７５μｍ以下がより好ましい。平均体積基準粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定することができる。本発明においては、平均体積基準粒子径が、１５０μｍを超えると、マイクロスフェアー粒子内の主剤の分散不均一性によって初期バーストの問題が発生し、凝集や沈降し易くなり、後工程の処理も難しくなる。１μｍより小さくなると著しく初期バーストの問題が発生する。
【００３８】
本発明のマイクロスフェアーによって、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を生体内で一定期間、継続して放出することができる。
【００３９】
２．徐放性製剤
本発明のマイクロスフェアーを用いて、マイクロスフェアーを含有する徐放性製剤を調製することができる。本発明の徐放性製剤によって、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を一定期間、継続して放出し、有効に薬理学的効果を示すことができる。
【００４０】
本発明の徐放性製剤は、そのまま筋肉内、皮下、血管、臓器、関節腔、腫瘍などの病巣等に容易に注射剤及び埋め込み剤として、又は経皮剤として投与することができる。その他、経口剤、塗布剤、点鼻製剤等の種々な製剤形態で投与することもできる。例えば、本発明の徐放性製剤を注射剤とするには、分散剤（Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＣＯ−６０、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等）、保存剤（メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）などと共に水性懸濁剤とするか、大豆油、ゴマ油、コーン油などの植物油と共に分散して油性懸濁剤として、徐放性注射剤とするなどの形態で投与することができる。
【００４１】
３．マイクロスフェアーの製造方法
＜マイクロスフェアーの製造工程＞
本発明のマイクロスフェアーの製造方法は、粒子形成工程を少なくとも含み、更に必要に応じて、ろ過滅菌工程、良溶媒除去工程、その他の工程等を含んでもよい。
また、溶媒を用いてのエマルション液中乾燥法に関して詳細に記載するが、溶媒フリー製造法、混合液直接噴霧乾燥法などを用いてもかまわない。
【００４２】
［粒子形成工程］
粒子形成工程は特に限定されるものではないが、特開２００９−１３２８７１号公報又は特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の接近離反可能な対向して配設された、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する複数の処理用面の間で粒子化処理がなされる粒子化処理装置を用いることが好ましい。粒子形成工程は、例えば、前記の粒子化処理装置を用いて、高分子の良溶媒に高分子及び主剤を溶解又は分散させて得られる主剤を含む高分子溶液と、高分子の貧溶媒を含む溶液とを連続投入して、乳化粒子を作製し、作製された粒子から良溶媒を除去することによって、本発明のマイクロスフェアーを析出させることで実施される。ここで、「分散」とは、主剤を固体のまま、高分子の良溶媒に分散させること、主剤を高分子の良溶媒に乳化させること、親水性主剤の水性溶液と高分子の良溶媒を含むｗ／ｏエマルションを形成させること等を含む。
基本的には粒子形成工程で主剤を含む高分子溶液を乳化し、脱溶媒などの工程を行うが、特に限定されるものではない。スプレードライなどを用い、粒子形成工程と溶媒除去を同時に行っても良い。
【００４３】
主剤を含む高分子溶液としては、高分子の良溶媒に高分子及び主剤が溶解又は分散している溶液であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。良溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、脂肪族ハロゲン化炭化水素類（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、１，４−ジオキサン等）、脂肪族炭化水素類（例えば、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン等）、芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等）、有機酸類（例えば、酢酸、プロピオン酸等）、エステル類（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル等）、アミド類（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等）などが挙げられる。水溶性の高分子を用いる場合は水を使用してもよい。これらの中でも、溶解性の面から脂肪族ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、ケトン類又はこれらの混合溶媒が好ましく、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒がより好ましい。これらは、１種類単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。溶媒種や混合量を変化させることにより粒子径の制御や薬物含有量を制御することができる。
【００４４】
良溶媒とは、高分子の溶解度が大きい溶媒を意味し、貧溶媒とは、高分子の溶解度が小さい又は溶解しない溶媒を意味する。良溶媒及び貧溶媒は、それぞれマイクロスフェアー中の主剤が偏析したり、粗大粒子や凝集体を発生させないものを選択する。また、良溶媒及び貧溶媒は、例えば、２５℃における溶媒１００ｇに溶解し得る高分子の質量で規定することができる。本発明において、良溶媒は、高分子を０．１ｇ以上溶解する溶媒であることが好ましく、より好ましくは０．２ｇ以上が挙げられ、更に好ましくは０．５ｇ以上が挙げられる。貧溶媒は、高分子を０．０５ｇ以下しか溶解しない溶媒であることが好ましく、より好ましくは０．０２ｇ以下が挙げられ、更に好ましくは０．０１ｇ以下が挙げられる。貧溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水が好ましい。
【００４５】
高分子及び主剤の溶液中の高分子の含有量は、良溶媒に応じて、目的とするマイクロスフェアーの粒子径に応じて、またマイクロスフェアー中に主剤が均一に分散するように、変化させることができる。高分子の含有量は、例えば、１〜３０質量％が挙げられ、好ましくは３〜２０質量％が挙げられ、より好ましくは５〜１５質量％が挙げられる。高分子溶液中の主剤の含有量は、目的、薬理効果等に応じて、またマイクロスフェアー中の主剤が均一に分散されているように、適宜変化させることができる。
【００４６】
作製したマイクロスフェアーの安定性を更に確保するため、貧溶媒に安定剤を加えてもよい。安定剤としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、レシチン、ポリソルベート８０等が挙げられ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましい。また、添加する安定剤の濃度は好ましくは０．０１〜２０質量％が挙げられ、５質量％以下であることがより好ましい。好ましい貧溶媒としては、例えば、ＰＶＡ水溶液などが挙げられる。
【００４７】
高分子及び主剤の溶液並びに貧溶媒を含む溶液は、棒状、板状、プロペラ状等の種々の形状の撹拌子を槽内で回転させるものや、撹拌子に対して相対的に回転するスクリーンを備えたものなど、流体にせん断力を加えるなどして、均質な混合を実現する回転式分散機などの調製装置を用いて調製されることが望ましい。回転式分散機の好ましい例としては、特許第５１４７０９１号に開示されている撹拌機を適用することができる。マイクロスフェアー中の主剤が均一に分散するためには、高分子溶液と貧溶媒を完全混合する必要がある。完全混合のために、少なくとも分子レベルでの均一化を目指す必要があり、混合が不十分であることが不均一な分散状態の原因になる。
【００４８】
回転式分散機はバッチ式で行うものであっても、連続式で行うものであってもよい。連続式で行う場合には、撹拌槽に対する流体の供給と排出とを連続的に行うものであってもよく、撹拌槽を用いずに連続式のミキサーを用いて行うものであってもよく、公知の撹拌機や撹拌手段を用い、適宜撹拌エネルギーを制御することができる。なお、撹拌エネルギーに関しては、本出願人による特開平０４−１１４７２５号公報に詳述されている。本発明における撹拌の方法は特に限定されないが、各種せん断式、摩擦式、高圧ジェット式、超音波式などの撹拌機や溶解機、乳化機、分散機、ホジナイザーなどを用いて実施することができる。一例としては、ウルトラタラックス（ＩＫＡ製）、ポリトロン（キネマティカ製）、ＴＫホモミキサー（プライミクス製）、エバラマイルダー（荏原製作所製）、ＴＫホモミックラインフロー（プライミクス製）、コロイドミル（神鋼環境ソリューション製）、スラッシャー（日本コークス工業製）、トリゴナル湿式微粉砕機（三井三池化工機製）、キャビトロン（ユーロテック製）、ファインフローミル（太平洋機工製）などの連続式乳化機、クレアミックス（エム・テクニック製）、クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）などのバッチ式又は連続両用乳化機が挙げられる。また、撹拌処理は、高速回転する撹拌翼を備えたものであって、撹拌翼の外側にスクリーンを備え、スクリーンの開口から流体がジェット流となって吐出する撹拌機、特に上記のクレアミックス（エム・テクニック製）やクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いることが望ましい。
【００４９】
前記の粒子化処理装置において、回転する処理用面の停止時の接面圧を調整することにより、高分子マトリクスの粒子径及び粒子径分布の制御が可能である。本発明者による実験の結果、接面圧は、好ましくは２０ｇ／ｃｍ２〜２５０ｇ／ｃｍ２である。接面圧が２０ｇ／ｃｍ２より低い場合には薄膜が安定せず、粒子径分布が広くなる。接面圧が２５０ｇ／ｃｍ２より高いと目的としている粒子径の調整が難しくなることが判明した。より好ましくは５０ｇ／ｃｍ２〜２００ｇ／ｃｍ２が挙げられ、さらに好ましくは８０ｇ／ｃｍ２〜１５０ｇ／ｃｍ２が挙げられる。
【００５０】
高分子及び主剤の溶液と貧溶媒を含む溶液とが接することで形成されるマイクロスフェアーのそれぞれが合着することを防ぐことが好ましい。その合着を防ぐ方法としては、溶液吐出液回収タンクに予め貧溶媒を含む溶液を入れておき、緩やかに撹拌しておくことが好ましい。撹拌を行うことにより、マイクロスフェアーの合着がより抑制できる。撹拌については、回転式分散機が好ましく、クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）が望ましい。全体を緩やかに流動させることができるものであれば特に限定するものではない。撹拌が強いと、高分子の乳化粒子が壊れ、分布幅が広くなり、高分子マトリクス中の主剤の分散状態が崩れる可能性がある。
【００５１】
主剤が親油性物質である場合、上記の説明に従って、粒子形成工程を好適に実施することができ、マイクロスフェアーを製造することができる。主剤が親水性物質である場合、親水性物質を例えば分散剤を用いて、高分子を良溶媒に分散させることで、同様に粒子形成工程を実施して、マイクロスフェアーを製造することができる。
【００５２】
また、主剤が親水性物質である場合、親水性物質を、必要に応じて安定剤と共に水等の水性溶媒に溶解させて、高分子の良溶媒に溶解させた高分子溶液と共に混合することで調製されるｗ／ｏエマルションを、高分子及び主剤の溶液として用い、前記の粒子化処理装置を用いて、前記の粒子形成工程を実施することもできる。ｗ／ｏエマルションの調製には、断続振とう法、プロペラ型撹拌機、タービン型撹拌機を用いるミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法を用いることができる。前記の粒子化処理装置を用いて、このｗ／ｏエマルションである主剤を含む高分子溶液と、高分子の貧溶媒を含む溶液とを連続投入して、ｗ／ｏ／ｗエマルションとして乳化粒子を作製し、作製された粒子から良溶媒を除去することによって、本発明のマイクロスフェアーを析出させることで実施される。このマイクロスフェアーをそのまま用いることもできるが、さらに賦形剤（マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖等）を加えて、再分散した後、凍結乾燥又は噴霧乾燥して固形化することもできる。この固形化したマイクロスフェアーは、使用時に、注射用蒸留水又は適当な分散媒を加えることで、より安定した徐放性注射剤が得ることができる。
【００５３】
［ろ過滅菌工程］
必要に応じて、粒子形成工程の前に、調製された高分子及び主剤の溶液並びに貧溶媒を含む溶液の無菌ろ過を行うことも好ましい。ろ過に用いるフィルターの孔径は０．１μｍ〜０．４５μｍが好ましく、０．２μｍがより好ましい。
【００５４】
前記のろ過滅菌フィルターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）やポリエーテルサルフォン等の親水性フィルターやポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などの疎水性フィルター等が挙げられる。ここに記載している材質に限定されるものではなく、使用する溶媒種や高分子種、主剤、添加剤の吸着により適宜選定を行う必要がある。
【００５５】
［良溶媒除去工程］
良溶媒除去工程において、高分子及び主剤を含む前記乳化粒子から良溶媒を除去する。良溶媒除去工程は、マイクロスフェアー中の主剤が均一に分散した状態で、前記乳化粒子を含有する液から前記良溶媒を除去することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、撹拌しながら前記液を加熱すること、前記液の液面に窒素などのガスをフローすること、及び前記液を減圧させることの少なくともいずれかにより、前記良溶媒を蒸発させて前記液から除去する方法などが挙げられ、好ましくは前記液の液面に窒素などのガスをフローすることが挙げられる。マイクロスフェアー中の主剤が均一に分散した状態を維持するようにするためには、良溶媒を早く除去することが好ましいことが多いが、ゆっくりと除去した方が良い場合もある。良溶媒を除去する時間としては、例えば、３０分間〜１２時間が挙げられ、好ましくは１〜１０時間が挙げられ、より好ましくは１〜５時間が挙げられる。
また、良溶媒除去時の温度は、良溶媒の種類による。良溶媒の沸点付近の高温から低温まで、マイクロスフェアーの断面観察をし、適正な温度で実施する必要がある。また、マイクロスフェアー中の良溶媒を除去する目的で貧溶媒で希釈しても良い。貧溶媒で希釈することによりマイクロスフェアーの表面が固化し、粒子径の変化を抑制することが出来る。
【００５６】
［その他の工程］
その他の工程としては、例えば、溶媒組成調製、分級工程、粒子洗浄工程などが挙げられる。通常、分級工程において粗粉カットや微粉カットが行われるが、本発明において製造した粒子は、実質的に分級工程を行う必要はなくなる。但し、念のため分級工程を含んでおいても構わない。
【００５７】
上記の製造方法によって、マイクロスフェアーの粒子径が１μｍ〜１５０μｍ以下となり、マイクロスフェアー中の主剤が均一な分散状態であるマイクロスフェアーを製造することができる。すなわち、マイクロスフェアーの粒子を切断した断面観察試料を作成し、マイクロスフェアー中の主剤を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、断面画像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）として、４分割した領域内における主剤の占める面積比率の変動係数が０．３５以下であるマイクロスフェアーを製造することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００５９】
（参考例１）
参考例１で、主剤を含まないマイクロスフェアー（ＰＬＧＡ微粒子）を作製した。参考例１のマイクロスフェアーを指標に用いて、実施例及び比較例のマイクロスフェアーの断面をＳＥＭ画像で観察することで、実施例及び比較例のマイクロスフェアー中の主剤の分散状態を、以下で確認した。【００６０】
＜ＰＬＧＡ溶液とＰＶＡ水溶液の調製＞
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４，エボニック製）が１３質量％なるようにジクロロメタン（関東化学製）を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ溶液を得た。その後、０．２μｍのベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ，ＥＧ−４０Ｐ，日本合成化学工業製）が１．５質量％となるようにイオン交換水を加え、高速回転式分散機クレアミックス（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＶＡ水溶液を得た。その後、親水性ＰＶＤＦメンブレンフィルター（φ４７ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＬＧＡ乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００６１】
＜マイクロスフェアー（ＰＬＧＡ微粒子）の調製＞
粒子形成工程として、調製したＰＬＧＡ溶液とＰＶＡ水溶液とを特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。ここで特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置とは、同公報の図２５に記載の装置であって、第２導入口ｄ２０がリング状ディスクである処理用面２の中央の開口を取り巻く同心円状の円環形状であるものであり、ディスク直径は７５ｍｍである。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０２ＭＰａＧ、６５ｍＬ／分、３０℃で導入し、処理用部１０を２０００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＬＧＡ溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．６５ＭＰａＧ、２０ｍＬ／分、３０℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＬＧＡ溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間においてジクロロメタンを含むＰＬＧＡ乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＬＧＡ乳化粒子を含む流体（以下、ＰＬＧＡ乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＬＧＡ乳化粒子分散液を、回収タンクに回収した。【００６２】
次に脱溶媒工程として、前記吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、アルゴンガスを液面に吹き付けるようフローして３．５時間かけてジクロロメタンを除去し、ＰＬＧＡ微粒子を含む懸濁液（ＰＬＧＡ微粒子懸濁液）を得た。得られたＰＬＧＡ微粒子の平均体積基準粒子径は３４．０μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図４）を観察した。【００６３】
図４の通り、上記のＦＩＢ断面に粒子状の塊及び空孔がないことが確認された。また、参考例１のマイクロスフェアーの断面が、実施例及び比較例のマイクロスフェアーの断面の観察における指標として用いることができることが解った。【００６４】
（実施例１）
＜ＰＬＧＡ及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液の調製＞
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ７５２Ｈ，エボニック製）が１０質量％に、主剤としてクルクミン（富士フイルム和光純薬製，和光特級）が０．５質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）６４．５質量％とアセトン（関東化学製）２５質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００６５】
＜マイクロスフェアーの調製＞
粒子形成工程として、参考例１と同様にして、調製されたＰＬＧＡ及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液とを、特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０１ＭＰａＧ、５０ｍＬ／分、２５℃で導入し、処理用部１０を５０００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＬＧＡ及び主剤の溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．３ＭＰａＧ、１６ｍＬ／分、２５℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＬＧＡ及び主剤の溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間においてジクロロメタンを含むＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を含む流体（以下、ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子分散液を、０．０３ＭＰａＧで圧力保持した回収タンクに回収した。【００６６】
次に脱溶媒工程として、前記吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、アルゴンガスを液面に吹き付けるようフローして３．５時間かけてジクロロメタンとアセトンを除去し、マイクロスフェアーを含む懸濁液（マイクロスフェアー懸濁液）を得た。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は７．５μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図６−１）を観察した。得られたＳＥＭ画像の粒子断面をｉＴＥＭ（ＴＥＭカメラ制御、画像解析ソフトウェア、ＥＭＳＩＳ社製）を用いてピクセル範囲３×３で平均化処理後に、エッジ部分を強調する処理を行い、コントラストの最適化を行った。その後、２値化処理を行い、画像処理でノイズ除去及びコントラストの低い粒子の強調処理を行った後に、再度ピクセル範囲３×３で平均化処理後にエッジ部分を強調する処理を行った。画像上で粒子断面を最大直径の中心点を中心にして９０度ごとに４分割（領域１〜領域４）した画像を図６−２に示す。【００６７】
図６−２のクルクミン粒子のＦＩＢ断面における分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．１６２であった。【００６８】
（実施例２）
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４，エボニック製）の代わりにポリ乳酸（Ｒｅｓｏｍｅｒ  Ｒ２０２Ｈ）を用いた以外は、実施例1と同様にして、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は７．３μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。【００６９】
観察したＳＥＭ画像を実施例１と同じ方法で画像解析を行ったところ、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．２１５であった。【００７０】
（実施例３）
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４，エボニック製）が１３質量％に、主剤としてプロゲステロン（シグマアルドリッチ製）が１．０質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００７１】
＜マイクロスフェアーの調製＞
粒子形成工程として、参考例１と同様にして、調製されたＰＬＧＡ及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液とを、特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０１ＭＰａＧ、５０ｍＬ／分、３０℃で導入し、処理用部１０を１７００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＬＧＡ及び主剤の溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．３５ＭＰａＧ、１６ｍＬ／分、３０℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＬＧＡ及び主剤の溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間においてジクロロメタンを含むＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を含む流体（以下、ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子分散液を、０．０２ＭＰａＧで圧力保持した回収タンクに回収した。【００７２】
実施例１及び２と同じ方法で脱溶媒工程を行い、得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は３４．８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図７−１）を観察した。【００７３】
観察したＳＥＭ画像を実施例１及び２と同じ方法で画像解析を行った。拡大して２値化処理後のＳＥＭ断面を図７−２に示す。最大直径の中心点を中心にして９０度ごとに４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．０５４であった。【００７４】
（実施例４）
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４，エボニック製）が１３質量％に、主剤としてプロブコール（富士フイルム和光純薬製、生化学用）が１.０質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００７５】
実施例１〜３と同じ方法で脱溶媒工程を行い、得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は３２．５μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図８−１）を観察した。【００７６】
観察したＳＥＭ画像を実施例１〜３と同じ方法で画像解析を行った。２値化処理後のＳＥＭ断面を図８−２に示す。最大直径の中心点を中心にして９０度ごとに４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．２４４であった。【００７７】
（実施例５）
＜ＰＣＬ及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液の調製＞
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ，Ｒｅｓｏｍｅｒ  Ｃ２０９，エボニック製）が３．６質量％に、主剤としてイベルメクチン（シグマアルドリッチ製）が０．４質量％になるように酢酸エチル（関東化学製）９６．０質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＣＬ及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＣＬ及び主剤の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００７８】
＜マイクロスフェアーの調製＞
粒子形成工程として、参考例１と同様にして、調製されたＰＣＬ及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液とを、特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０５ＭＰａＧ、５０ｍＬ／分、２５℃で導入し、処理用部１０を３０００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＣＬ及び主剤の溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．１ＭＰａＧ、１６ｍＬ／分、２５℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＣＬ及び主剤の溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間において酢酸エチルを含むＰＣＬ及び主剤の乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＣＬ及び主剤の乳化粒子を含む流体（以下、ＰＣＬ及び主剤の乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＣＬ及び主剤の乳化粒子分散液を、０．０３ＭＰａＧで圧力保持した回収タンクに回収した。【００７９】
実施例１〜４と同じ方法で５時間、脱溶媒工程を行い、得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は１２．９μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。【００８０】
観察したＳＥＭ画像を実施例１と同じ方法で画像解析を行ったところ、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．０６７であった。【００８１】
（実施例６）
イベルメクチンの代わりにオルビフロキサシン（富士フイルム和光純薬製）、酢酸エチルの代わりにジクロロメタン（関東化学製）を用いた以外は、実施例５と同様にして、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は１３．５μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。【００８２】
観察したＳＥＭ画像を実施例１と同じ方法で画像解析を行ったところ、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．０７０であった。【００８３】
（実施例７）
＜エチルセルロース及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液の調製＞
エチルセルロース（富士フイルム和光純薬製）が１質量％に、主剤としてラズベリーケトン（富士フイルム和光純薬製）が０．３３質量％になるように酢酸メチル（関東化学製）９８．６７質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、エチルセルロース及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ，ＥＧ−４０Ｐ，日本合成化学工業製）が１．５質量％にとなるようにイオン交換水を加え、高速回転式分散機クレアミックス（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＶＡ水溶液を得た。酢酸メチルが２３．５質量％となるようにＰＶＡ水溶液を加え、高速回転式分散機クレアミックス（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＶＡ水−酢酸メチル混合溶液を得た。その後、親水性ＰＶＤＦメンブレンフィルター（φ４７ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。【００８４】
＜マイクロスフェアーの調製＞
粒子形成工程として、参考例１と同様にして、調製されたエチルセルロース及び主剤の溶液とＰＶＡ水溶液とを、特開２０１１−１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に０．１ＭＰａＧ以下で、５０ｍＬ／分、２５℃で導入し、処理用部１０を５００ｒｐｍで回転させながら、調製されたエチルセルロース及び主剤の溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．１ＭＰａＧ、１６ｍＬ／分、２５℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とエチルセルロース及び主剤の溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間において酢酸メチルを含むエチルセルロース及び主剤の乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるエチルセルロース及び主剤の乳化粒子を含む流体（以下、エチルセルロース及び主剤の乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたエチルセルロース及び主剤の乳化粒子分散液を、回収タンクに回収した。【００８５】
次に脱溶媒工程として、前記吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、イオン交換水を１ｍＬ／ｍｉｎの速度で吐出液の１．５倍量を投入し、粒子の表面を固化させた後、ロータリーエバポレーターを用いて、−０．０８ＭＰａＧの減圧下で酢酸メチルを留去し、マイクロスフェアーを含む懸濁液（マイクロスフェアー懸濁液）を得た。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は１０．７μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。ＳＥＭ断面の拡大写真を図９に示す。【００８６】
観察したＳＥＭ画像を実施例１〜６と同じ方法で画像解析を行った。最大直径の中心点を中心にして９０度ごとに４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．２４５であった。【００８７】
（実施例８）
エチルセルロースの代わりに酢酸セルロース（関東化学製）を用いた以外は、実施例７と同様にして、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は１１．２μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。【００８８】
観察したＳＥＭ画像を実施例１と同じ方法で画像解析を行った。２値化処理後のＳＥＭ断面を図１０に示す。最大直径の中心点を中心にして９０度ごとに４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．３１７であった。【００８９】
（比較例１）
実施例４と同様にして、粒子形成工程として、ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子分散液を調製した。次に脱溶媒工程として、回収した吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて、周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、大気中で４２時間かけてジクロロメタンを除去し、マイクロスフェアーを含む懸濁液（マイクロスフェアー懸濁液）を得た。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は３１．８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。【００９０】
観察したＳＥＭ画像（図１１）を実施例１〜３と同じ方法で画像解析を行った。２値化処理後のＳＥＭ断面を最大直径の中心点から半径を４等分して同心円状に４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．４８２であった。【００９１】
（比較例２）
実施例４と同じ処方で、ＰＬＧＡと薬物の溶解をプロペラ式の撹拌機（スリーワンモーター製）で１０分撹拌することに変更して、実施例４と同じ条件で粒子形成工程と脱溶媒工程を行って、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は２９.８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図１２）を観察した。【００９２】
観察したＳＥＭ画像を実施例１〜４と同じ方法で画像解析を行い、縦方向に４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．４５２であった。【００９３】
（比較例３）
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４，エボニック製）が５.０質量％に、主剤としてクルクミン（富士フイルム和光純薬製，和光特級）が０．２５質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）６９．７５質量％とアセトン（関東化学製）２５質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００９４】
実施例１と同じ条件で粒子形成工程と脱溶媒工程を行って、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は６．８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図１３）を観察した。【００９５】
観察したＳＥＭ画像を実施例１〜４と同じ方法で画像解析を行い、縦方向に４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）は、における変動係数は０．４２２であった。【００９６】
（比較例４）
乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４，エボニック製）が５.０質量％に、主剤としてプロゲステロン（シグマアルドリッチ製）が０．３質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）６９．５質量％とアセトン（関東化学製）２５質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び主剤の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２ｍｍ，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び主剤の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。【００９７】
実施例３と同じ条件で粒子形成工程と脱溶媒工程を行って、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は２１.６μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図１４）を観察した。【００９８】
観察したＳＥＭ画像を実施例１〜４と同じ方法で画像解析を行い、縦方向に４分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）は、における変動係数は１.０４９であった。【００９９】
（比較例５）
ＰＣＬ及び主剤の溶液としてイベルメクチンの添加量を０．４質量％から、４質量％に変更した以外は、実施例５と同様にして、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は１１.８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。【０１００】
観察したＳＥＭ画像を実施例１と同じ方法で画像解析を行ったところ、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．３６１であった。【０１０１】
表１及び表２に実施例１〜８、比較例１〜５及び参考例１（ＰＬＧＡのみ）の条件の一部を示す。【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
表３に実施例１〜８及び比較例１〜５とリュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇの代表的な粒子径のマイクロスフェアー各領域における面積比率％、標準偏差、平均値及び変動係数（ＣＶ値）を示す。【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
表１〜表３から分かる通り、いずれの高分子を用いても粒子内の各領域の主剤の占める面積比率の変動係数は０．３５以下となり、粒子内の主剤の分布は均一であった。比較例３では、粒子形成工程と脱溶媒工程は実施例１と同条件にも関わらず、ＰＬＧＡ濃度を低下させると粒子内の均一性が低下し、各領域の主剤の占める面積比率の変動係数が０．４２２と大きくなった。
実施例４と比較例１では、乾燥条件及び乾燥時間の違いにより、主剤の微粒子の粒子径が変化し、乾燥時間が長いものではマイクロスフェアーの粒子内に分布する主剤の均一性が低下し、各領域の主剤の占める面積比率の変動係数が０．４８２と大きくなった。実施例に比較してＰＬＧＡと薬物の濃度を下げた比較例３と４では、乾燥時の収縮率が大きくなり、粒子内の主剤に偏りが生じ、各領域の主剤の占める面積比率の変動係数が０．３５を上回った。比較例５では実施例５よりも主剤の濃度を上昇させるとマイクロスフェアー内の主剤の均一性が低下し、各領域の主剤の占める面積比率の変動係数が０．３６１と大きくなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によって、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を生体内で一定期間、継続して放出することができるマイクロスフェアーを提供することができる。
【要約】
高分子マトリクス中に主剤が均一に分散されたマイクロスフェアーであって、前記マイクロスフェアーの平均体積基準粒子径が１μｍ以上１５０μｍ以下であり、前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の主剤を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を４分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記主剤の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、４つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアーが提供される。本発明のマイクロスフェアーは、主剤の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、主剤を一定期間、継続して放出することができる。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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