(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）ペプチドコンジュゲートであって、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチド、
ｉｉ）グリコシル部分、及び
ｉｉｉ）２０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
を含み、前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸位置１７３のトレオニンとグリコシル部分の第１の部位との共有結合によってグリコシル部分に結合され、前記グリコシル部分は、該グリコシル部分の第２の部位と２０ｋＤａのＰＥＧとの共有結合により、２０ｋＤａのＰＥＧに結合されている、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項２】
グリコシル部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基、ガラクトース（Ｇａｌ）残基、シアル酸（Ｓｉａ）残基、Ｓｉａ残基の５−アミン類似体、マンノース（Ｍａｎ）残基、マンノサミン、グルコース（Ｇｌｃ）残基、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基、フコース残基、キシロース残基、又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
グリコシル部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基、ガラクトース（Ｇａｌ）残基、シアル酸（Ｓｉａ）、又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
少なくとも１つのＳｉａ残基は、炭素数９のカルボキシル化された糖である、請求項３の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
少なくとも１つのＳｉａ残基は、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロピラノス−１−オン酸）（Ｎｅｕ５Ａｃ）、  Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、又は９−置換シアル酸である、請求項４の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
９−置換シアル酸は、９−０−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、又は９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃである、請求項５の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
グリコシル部分は、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−を含む、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
２０ｋＤａのＰＥＧ部分は、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むリンカーへの共有結合によって、グリコシル部分に結合されている、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
少なくとも１つのアミノ酸残基は、グリシン（Ｇｌｙ）である、請求項８の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含む、請求項１乃至９の何れかの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
構造
【化２３】
0006852939.tif 000042
を含み、式中、ｎは４５０〜４６０から選択される整数である、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
２０ｋＤａのＰＥＧは、直鎖ＰＥＧ又は分岐ＰＥＧである、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
２０ｋＤａのＰＥＧは、２０ｋＤａのメトキシ−ＰＥＧである、請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを生成する方法であって、
（１）発現宿主の中で変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを組換え的に産生するステップ、及び
（２）前記ステップ（１）の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに、２０ｋＤａを有するＰＥＧのグリコシル部分を酵素的に結合するステップ、を含み、これによって、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを生成する、方法。
【請求項１６】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含む疾患を有する被験体の血糖値を低下させる作用を有する、請求項１乃至１３の何れかに記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、経時的な血中グルコース値の持続的低下の指標であるＨｂＡ１Ｃ値を低下させる作用を有する、請求項１乃至１３の何れかに記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含む疾患を有する被験体を治療する作用を有する、請求項１乃至１３の何れかに記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項１９】
被験体は、ヒト被験体である、請求項１６又は１７又は１８に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート。
【請求項２０】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含む疾患を有する被験体の血糖値を低下させる作用を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、経時的な血中グルコース値の持続的低下の指標であるＨｂＡ１Ｃ値を低下させる作用を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含む疾患を有する被験体を治療する作用を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
被験体は、ヒト被験体である、請求項２０又は２１又は２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、１週間に１回又は２週間に１回投与される請求項２０又は２１又は２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
この出願は、２０１７年９月４日に出願された米国仮出願第６２／５５３，９７０号の優先権を主張し、その全体は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、グリコシル部分を介して変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに結合されたポリエチレングリコール(polyethylene glycol)（ＰＥＧ）部分を含む変異体線維芽細胞成長因子−２１(Mutant Fibroblast Growth Factor-21)（ＦＧＦ−２１）ペプチドコンジュゲート及びその治療的使用に関する。この明細書では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート及び前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物及び容器を製造する方法を包含する。
【背景技術】
【０００３】
＜発明の背景＞
ＦＧＦ−２１は内分泌ホルモンであり、単量体の非グリコシル化タンパク質として自然界に存在する。ＦＧＦ−２１は、ＦＧＦ−１９及びＦＧＦ−２３と共に、内分泌作用サブファミリーに属する。一方、１８の哺乳類ＦＧＦリガンドの残りは５つのパラクリン作用サブファミリーにグループ化される。内分泌作用ＦＧＦは、パラクリン作用ＦＧＦとは異なり、ヘパリン硫酸に対する親和性が低いため、血液循環に入ることができる。これにより、内分泌ＦＧＦは、胆汁酸の恒常性、肝臓のグルコースとタンパク質の代謝（ＦＧＦ−１９）、グルコースと脂質の代謝（ＦＧＦ−２１）、ビタミンＤとリン酸の恒常性（ＦＧＦ−２３）などの代謝プロセスを調節することができる。
【発明の概要】
【０００４】
＜発明の要旨＞
驚くべき特性を有する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートについて記載する。また、本明細書に記載する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの少なくとも１つを含む医薬組成物及び該医薬組成物を含む医薬用容器についても記載する。より詳細には、変異体線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）ペプチドコンジュゲートは、変位ＦＧＦ−２１ペプチドを含み、前記変位ＦＧＦ−２１ペプチドは、少なくとも１つのプロリン（Ｐ）残基のＣ末端側に隣接する少なくとも１つのトレオニン残基を含む。これにより、対応する天然(native)ＦＧＦ−２１に存在しない少なくとも１つのＯ結合型グリコシル化部位を形成する。前記天然ＦＧＦ−２１は、アミノ酸配列は、少なくとも９５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同一であり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は２０ｋＤａであって、２０ｋＤａのＰＥＧが、グリコシル部分を介して、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの少なくとも１つのトレオニン残基に共有結合されている。さらに、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを製造する方法を提供し、また、糖尿病及びその関連疾患（特に、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis)（ＮＡＳＨ）又はメタボリックシンドローム）の少なくとも１つの治療において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの使用を提供する。より詳細な実施形態では、２型糖尿病、ＮＡＳＨ、又はメタボリックシンドロームは、ヒト被験体において治療される。また、そのような治療を必要とする被験体の糖尿病及びその関連疾患を治療する方法、特に２型糖尿病、非アルコール性ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドローム、より詳細には、ヒト被験体における２型糖尿病、ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドロームを治療する方法を提供する。また、本明細書では、２型糖尿病、非アルコール性ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドローム、より詳細には、ヒト被験体における２型糖尿病、ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドロームを治療に使用される変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートが含まれる。別の態様では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２型糖尿病、非アルコール性ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドローム、より詳細には、ヒト被験体における２型糖尿病、ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドロームを治療するための薬剤の調製に使用される。
【０００５】
当技術分野での一般的な教示とは対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、Ｃ末端近くでのＰＥＧ化が許容されること、また、ＰＥＧ化合物を含むタンパク質コンジュゲートがインビトロ及びインビボで生物学的に活性であることを見出した。また、２０ｋＤａのＰＥＧ残基を変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに結合することによって生成された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、様々なインビトロ及びインビボのアッセイにおいて驚くべき治療特性を有することが実証された。そのような驚くべき特性には、ヒトで約８０時間と推定される半減期の向上、並びに、ＨｂＡｌｃ（血糖指数の安定型指標）、血清トリグリセリド値及び血清インスリン値の少なくとも１つを低下させる能力を含む。このような被験体(subjects)には、糖尿病及び／又はその関連疾患（例えば、２型糖尿病、ＮＡＳＨ、及び／又はメタボリックシンドローム）の疑いがある被験体、又は糖尿病及び／又はその関連疾患（例えば、２型糖尿病、ＮＡＳＨ、及び／又はメタボリックシンドローム）を有する被験体を挙げることができるが、これらに限定されない。２０ｋＤａのＰＥＧ残基を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートはまた、マウス及びラットで３８％、サルで５６％もの高い生物学的利用率を示す。
【０００６】
一態様において、本明細書に記載される変異体線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）ペプチドコンジュゲートは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチド、
ｉｉ）グリコシル部分、及び
ｉｉｉ）２０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を含み、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸位置１７３のトレオニンとグリコシル部分の第１の部位(site)との共有結合によってグリコシル部分に結合され、前記グリコシル部分は、該グリコシル部分の第２の部位と２０ｋＤａのＰＥＧとの共有結合により、２０ｋＤａのＰＥＧに結合されている。その特定の実施形態において、グリコシル部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基、ガラクトース（Ｇａｌ）残基、シアル酸（Ｓｉａ）残基、Ｓｉａ残基の５−アミン類似体(analogue)、マンノース（Ｍａｎ）残基、マンノサミン、グルコース（Ｇｌｃ）残基、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基、フコース残基、キシロース残基、又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む。別の特定の実施形態において、グリコシル部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基、ガラクトース（Ｇａｌ）残基、シアル酸（Ｓｉａ）、又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む。グリコシル部分のより詳細な実施形態において、少なくとも１つのＳｉａ残基は、カルボキシル化された炭素数９の糖である。さらにより詳細には、少なくとも１つのＳｉａ残基は、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロピラノス−１−オン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、  Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、又は９−置換シアル酸である。より詳細な実施形態では、９−置換シアル酸(9-substituted sialic acid)は９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、又は９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃである。さらに詳細な実施形態では、グリコシル部分は、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−を含む。
【０００７】
一態様において、本明細書に記載される２０ｋＤａのＰＥＧ部分を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むリンカーへの共有結合によって、グリコシル部分に結合される。例示されるアミノ酸には、極性を有するが中性のアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン）と、比較的単純な側鎖を持つ非極性のアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン）とが含まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基は少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）である。さらに詳細な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含む。
【０００８】
さらに詳細な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、次の構造を含み、式中、ｎは４５０〜４６０から選択される整数である。
【化１】
0006852939.tif 000002
【０００９】
本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２０ｋＤａのＰＥＧを含むことができ、前記ＰＥＧは、直鎖ＰＥＧ又は分岐ＰＥＧである。より詳細な実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。さらに詳細な実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧは２０ｋＤａのメトキシＰＥＧである。
【００１０】
別の態様において、本明細書に記載の少なくとも１つの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートのいずれか１つと、薬学的に許容される担体(carrier)と、を含む医薬組成物を提供する。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、医薬組成物中に０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在することができ、特に、１ｍｇ／ｍＬ〜４５ｍｇ／ｍＬの範囲、より詳細には１０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲、さらに詳細には２６±４ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、緩衝剤、特にトリス緩衝液をさらに含む。別の実施形態において、緩衝剤は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度、特に２ｍＭ〜７５ｍＭの濃度、より詳細には５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、さらに詳細には１０ｍＭ〜２５ｍＭの濃度、最も詳細には１６±２ｍＭの濃度で存在する。特に、ｐＨは６．０〜８．５の範囲、特に６．５〜８．０の範囲、より詳細には６．７５〜８．０の範囲、最も詳細には７．５±０．３の範囲である。別の特定の実施形態では、医薬組成物は、塩、特に無機塩、より詳細にはＮａＣｌをさらに含む。より詳細には、塩は、３０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度、特に４０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度、より詳細には５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度、最も詳細には５６±２ｍＭの濃度で存在する。医薬組成物は、張度調整剤(tonicity modifying egent)をさらに含むことができる。そのような張度調整剤には、グリセロール、アミノ酸、塩化ナトリウム、タンパク質、糖及び糖アルコールが含まれるがこれらに限定されない。特に、張度調整剤は糖であり、より詳細には張度調整剤はスクロースである。別の実施形態において、張度調整剤は、５０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で存在し、より詳細には１００ｍＭ〜１７５ｍＭの濃度で、さらに詳細には１３５ｍＭ〜１６０ｍＭの濃度で、最も詳細には１５０±２ｍＭの濃度で存在する。別の実施形態において、医薬組成物は、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤をさらに含む。界面活性剤又は非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートベースの非イオン性界面活性剤であって、特にポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり、より詳細にはポリソルベート２０である。特定の実施形態では、界面活性剤又は非イオン性界面活性剤は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、特に０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度、より詳細には０．２±０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００１１】
例示の実施形態では、医薬組成物は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、緩衝剤、特にトリス緩衝液を１ｍＭ〜１００ｍＭ、塩、特にＮａＣｌを３０ｍＭ〜２００ｍＭ、張度調整剤、特にスクロースを５０ｍＭ〜２００ｍＭ、及び、界面活性剤又は非イオン性界面活性剤、特にポリソルベート２０を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、ｐＨは６．０〜８．５である。
【００１２】
また、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート又は前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物のいずれか１つを含む医薬用容器をも提供される。医薬用容器として、例えば、シリンジ、バイアル、輸液用ボトル、アンプル、カープル、針保護システムを備えたシリンジ、又はペン型注射器内のカープルを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１３】
さらなる態様は、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを作製する方法であり、該方法は、
（１）発現宿主の中で変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを組換え的に産生するステップ、及び
（２）前記ステップ（１）の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに、ＰＥＧグリコシル部分（ＰＥＧは２０ｋＤａ）を酵素的に結合するステップ、を含み、これによって、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを形成する。特定の実施形態では、発現宿主は大腸菌である。この方法の別の特定の実施形態において、ステップ（２）は、ＧａｌＮＡｃを、ＧａｌＮＡｃ供与体からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のアミノ酸位置１７３のトレオニンに転移させるのに適した条件下で、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと接触させるステップ（２ａ）を含む。さらにより詳細な実施形態では、ＧａｌＮＡｃ供与体はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃである。さらに別の詳細な実施形態では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼはＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２である。本方法の別の詳細な実施形態では、ステップ（２）は、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａを、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体から、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のアミノ酸位置１７３のトレオニン残基に転移させるのに適した条件下で、又はステップ（２ａ）が存在する場合はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のアミノ酸位置１７３のトレニオン残基に転移させるのに適した条件下で、ステップ（１）の生成物を、又はステップ（２ａ）が存在する場合にはステップ（２ａ）の生成物を、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体及びシアリルトランスフェラーゼと接触させるステップ（２ｂ）をさらに含む。本方法のさらに詳細な実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ−ＣＭＰである。この方法のさらに詳細な実施形態では、シアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧａｌＮＡｃｌである。この方法のさらに詳細な実施形態において、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は、次の構造を含み、式中、ｎは４５０〜４６０から選択される整数である。
【化２】
0006852939.tif 000003
【００１４】
本発明の方法の別の特定の実施形態において、方法は、ステップ（１）の後、ステップ（２）の前に、組換え産生後、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを精製するステップ（３）をさらに含む。方法は、ステップ（２）の後、ステップ（２）で形成された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを精製するステップ（４）をさらに含むことができる。特定の実施形態において、ステップ（３）は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過及びそれらの組合せからなる群から選択される方法に適用することを含み、及び／又は、ステップ（４）は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過及びそれらの組合せからなる群から選択される方法に適用することを含む。精製するステップは、１又は複数工程のイオン交換クロマトグラフィーを含むことができ、特に２工程のイオン交換クロマトグラフィーを含むことができる。その特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーであり、特に強アニオン交換クロマトグラフィーである。その特定の実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックス、ポリスチレン／ジビニルベンゼンポリマーマトリックス、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＥＡＥ）、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）、アガロース、四級アンモニウム（Ｑ）強アニオン交換クロマトグラフィー及びその組合せである。他の特定の実施形態において、ステップ（３）は、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックスを使用する２工程のアニオン交換クロマトグラフィーを含む。他の特定の実施形態において、ステップ（４）は、２工程の第四級アンモニウム（Ｑ）強アニオン交換クロマトグラフィーを含む。特定の実施形態において、アルギニンは、ステップ（２）に添加され、及び／又は、ステップ（３）が存在する場合、ステップ（３）において、具体的には少なくとも４００ｍＭのアルギニンが添加される。他の特定の実施形態において、方法は、ステップ（３）の後、ステップ（２）の前に、エンドトキシンを除去するステップ（５）をさらに含み、ステップ（３）の生成物はエンドトキシン除去フィルターを使用して濾過される。
【００１５】
また、本明細書に記載の方法のいずれか１つにより得られる変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートが提供される。
【００１６】
別の態様において、糖尿病又は糖尿病関連疾患を治療する方法を提供するもので、該方法は、治療を必要とする被験体に対して、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、又は本発明に記載の方法によって得られる変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、又は前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物を所定量投与することを含む。糖尿病又は糖尿病関連疾患は、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含んでもよい。特定の実施形態では、被験体はヒト被験体である。より詳細な実施形態では、投与によりＨｂＡ１Ｃ値を低下させる。ＨｂＡ１Ｃ値の低下は、経時的な血中グルコース値の持続的低下の指標である。当該分野において様々な指標(indicator)が知られており、本明細書では、限定するものではないが、グルコース、インスリン、体重、血清脂質（総コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド）、肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）、肝臓重量、相対肝臓重量（％体重）、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、線維症スコア（例、肝線維症）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ１β、ＭＣＰ−１）、線維症バイオマーカー（αＳＭＡ、コラーゲン１アルファ）、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリド、及び肝臓脂肪酸の減少を示すものを含む。高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチン又はＨＤＬの少なくとも１つの増加についても、本明細書に記載の化合物及び組成物の臨床的有効性の指標である。
【００１７】
また、本明細書では、本明細書に記載した変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、又は前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含み糖尿病又は糖尿病関連疾患を治療する方法で使用するための医薬組成物のいずれか１つを含む。糖尿病又は糖尿病関連疾患は、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含むことができる。特定の実施形態において、糖尿病又は糖尿病関連疾患は、ヒト被験体を苦しめる。より詳細な実施形態において、使用は、ＨｂＡｌＣ値を低下させる。ＨｂＡｌＣ値の低下は、経時的な血中グルコース値の持続的低下の指標である。当該分野において様々な指標が知られており、本明細書では、限定するものではないが、グルコース、インスリン、体重、血清脂質（総コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド）、肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）、肝臓重量、相対肝臓重量（％体重）、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、線維症スコア（例、肝線維症）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ１β、ＭＣＰ−１）、線維症バイオマーカー（αＳＭＡ、コラーゲン１アルファ）、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリド、及び肝臓脂肪酸の減少を示すものを含む。高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチン又はＨＤＬの少なくとも１つの増加についても、本明細書に記載の化合物及び組成物の臨床的有効性の指標である。
【００１８】
別の態様では、糖尿病又は糖尿病関連疾患を治療する方法で使用するための医薬品の調製において、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの使用を提供する。糖尿病又は糖尿病関連疾患は、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はメタボリックシンドロームの少なくとも１つを含むことができる。特定の実施形態において、糖尿病又は糖尿病関連疾患は、ヒト被験体を苦しめる。より詳細な実施形態において、使用は、ＨｂＡｌＣ値を低下させる。ＨｂＡｌＣ値の低下は、経時的な血中グルコース値の持続的低下の指標である。当該分野において様々な指標が知られており、本明細書では、限定するものではないが、グルコース、インスリン、体重、血清脂質（総コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド）、肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）、肝臓重量、相対肝臓重量（％体重）、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、線維症スコア（例、肝線維症）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ１β、ＭＣＰ−１）、線維症バイオマーカー（αＳＭＡ、コラーゲン１アルファ）、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリド、及び肝臓脂肪酸の減少を示すものを含む。高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチン又はＨＤＬの少なくとも１つの増加についても、本明細書に記載の化合物及び組成物の臨床的有効性の指標である。
【００１９】
別の態様において、変異体線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）ペプチドコンジュゲートは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチド
ｉｉ）構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−を含むグリコシル部分、及び
ｉｉｉ）３０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を含み、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸位置１７３のトレオニンとグリコシル部分の第１の部位との共有結合によってグリコシル部分に結合され、前記グリコシル部分は、該グリコシル部分の第２の部位と３０ｋＤａのＰＥＧとの共有結合により、３０ｋＤａのＰＥＧに結合される。特定の実施形態では、３０ｋＤａのＰＥＧ部分は、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むリンカーへの共有結合によってグリコシル部分に結合される。例示されるアミノ酸には、極性であるが中性のアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン）と、比較的単純な側鎖を持つ非極性のアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン）とが含まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基は少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）である。さらに詳細な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（３０ｋＤａ）を含む。本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、３０ｋＤａのＰＥＧを含むことができ、前記ＰＥＧは、直鎖ＰＥＧ又は分岐ＰＥＧである。より詳細な実施形態では、３０ｋＤａのＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。さらに詳細な実施形態では、３０ｋＤａのＰＥＧは３０ｋＤａのメトキシＰＥＧである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の特定の実施形態、すなわちＦＧＦ−２１（Ｔｈｒ）−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧの例示的構造を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの構造であり、ｎは、ＰＥＧの所望の分子量を与えるために選択される。２０ｋＤａのＰＥＧに関しては、ｎは４５０〜４６０から選択される範囲内である。
【００２１】
【図２】図２は、例示として野生型／天然ＦＧＦ−２１及び発酵用振とうフラスコ１リットル当たりｍｇタンパク質ＦＧＦ−２１で示される変異体について、精製及び製剤化後の単離収量の全体量を示す。
【００２２】
【図３】図３は、細胞の増殖、産生、及び収穫の例示プロセスのフロー図である。
【００２３】
【図４】図４は、リフォールディング及び変異体ＦＧＦ−２１ペプチド精製の例示プロセスのフロー図である。
【００２４】
【図５】図５は、グリコＰＥＧ化(GlycoPEGylation)及び最終精製の例示プロセスのフロー図である。
【００２５】
【図６】図６は、（２−８）℃及び４０℃の温度で１週間保存された２０ｋＤａのＰＥＧ−ＦＧＦ−２１（Ｐ（１７２）ＴＱＧＡＳ）変異体コンジュゲート試料の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１：分子量マーカー。レーン２：（２−８）℃で保存されたｐＨ５試料。レーン３：４０℃で保存されたｐＨ５試料。レーン４：（２−８）℃で保存されたｐＨ６試料。レーン５：４０℃で保存されたｐＨ６試料。レーン６：（２−８）℃で保存されたｐＨ７試料。レーン７：４０℃で保存されたｐＨ７試料。試料の組成は次のとおりである。
【表Ａ】
0006852939.tif 000004
ゲル画像からわかるように、ｐＨ７の試料は、ｐＨ５又は６の試料と比べて、含まれる凝集体（高分子量でのバンド）、及び他の分解産物（低分子量のバンド）が最も少ない。
【００２６】
【図７】図７は、肉眼で見えない１０μｍ以上の粒子の濃度がポリソルベート２０濃度に依存することを示す。
【００２７】
【図８】図８は、２０ｋＤａの変異体ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１（Ｐ（１７２）ＴＱＧＡＳ）ペプチドコンジュゲートの糖尿病カニクイザルのＨｂＡ１ｃに対する効果を示す（実施例１２を参照）。
【００２８】
【図９】図９は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）に対する効果を示す（実施例１２を参照）。  データは、各処理の曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００２９】
【図１０】図１０は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの糖尿病カニクイザルにおける血清ＡＬＴ濃度に対する効果を示す。
【００３０】
【図１１】図１１は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで処理された糖尿病カニクイザルのトリグリセリド値を示す。
【００３１】
【図１２】図１２は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで処理された糖尿病カニクイザルのＨＤＬコレステロール値を示す。
【００３２】
【図１３】図１３は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで処理された糖尿病カニクイザルのアディポネクチン値を示す。
【００３３】
【図１４】図１４は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書では、ＴＥＶ−４７９４８と称す）で処理された後のＳＴＡＭモデルにおけるＮＡＦＬＤ活動性スコアを示す。ＮＡＳ＝ＮＡＦＬＤ活動性スコア。
【００３４】
【図１５】図１５Ａ−図１５Ｄは、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書ではＴＥＶ−４７９４８と称す）により、ＤＩＮ（食事誘発性ＮＡＳＨモデル）モデルにおけるＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）が有意に減少することを示しており、これは、脂肪症（Ａ）、炎症（Ｂ）及び線維症（Ｃ）における低減に反映されている。
【００３５】
【図１６】図１６Ａ−図１６Ｄは、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書ではＴＥＶ−４７９４８と称す）により、ＤＩＮモデルにおける炎症誘発性サイトカイン発現が有意に減少することを示しており、これは、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）（Ａ）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（Ｂ）、及びアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（Ｃ）、及びコラーゲン１α１（Ｄ）における低減に反映されている。
【００３６】
【図１７】図１７は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書ではＴＥＶ−４７９４８と称す）により、ＤＩＮモデルの体重が減少することを示す。
【００３７】
【図１８】図１８Ａ−図１８Ｃは、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書ではＴＥＶ−４７９４８と称す）により、ＤＩＮモデルにおけるグルコース値（Ａ）、血漿インスリン（Ｂ）、及びインスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）（Ｃ）が有意に低下することを示す。
【００３８】
【図１９】図１９Ａ−図１９Ｂは、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書ではＴＥＶ−４７９４８と称す）により、ＤＩＮモデルにおける総コレステロール値（Ａ）及び総トリグリセリド（Ｂ）が有意に低下することを示す。
【００３９】
【図２０】図２０Ａ−図２０Ｃは、変異型ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（本明細書ではＴＥＶ−４７９４８と称す）により、ＤＩＮモデルにおける肝臓コレステロール値（Ａ）、肝臓トリグリセリド（Ｂ）、及び肝脂肪酸（Ｃ）が有意に低下することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
開示される利益及び改善の中で、本発明の他の目的及び利点についても、添付の図面と共に以下の説明から明らかになるであろう。本発明の詳細な実施形態を本明細書に開示する。しかしながら、開示される実施形態は、様々な形態で具現化され得る本発明の単なる例示であることは理解されるべきである。さらに、本発明の様々な実施形態に関連して示される実施例は、各々が例示であり、限定するものでない。
【００４１】
＜定義＞
明確性及び可読性のために、以下の定義を提供する。これらの定義について記載される技術的特徴は、本発明の全ての実施形態及び各実施形態において理解されることができる。追加の定義及び説明は、これらの実施形態の説明の中で具体的に提供され得る。別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。概して、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、並びに核酸化学及びハイブリダイゼーションにおいて、本発明で用いられる専門用語及び実験手法は、当該技術分野で広く知られ、一般的に使用されているものである。核酸及びペプチドの合成には、標準的な技術が用いられる。前記技術及び前記手法は、当該技術分野における従来の方法及び様々な一般的参考文献(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY)に従って実施され、これらは本明細書を通じて提供される。
【００４２】
＜酵素＞
酵素は、触媒活性を有する生体分子であり、例えば、グリコシル部分又は修飾されたグリコシル部分が、それぞれのグリコシル供与体からＦＧＦ−２１のアミノ酸又はペプチドに結合された別のグリコシル部分へ転移する等の生化学反応を実行する。
【００４３】
＜タンパク質＞
タンパク質は、典型的には、１又は複数のペプチド又はポリペプチドを含む。タンパク質は、典型的には、タンパク質がその生物学的機能を発揮するために必要な三次元の形態に折り畳まれる。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的には、そのアミノ酸の配列の順序であると理解される。
【００４４】
＜組換えタンパク質(recombinant protein)＞
「組換えタンパク質」という用語は、異種系で産生されるタンパク質、すなわち、そのようなタンパク質又はそのようなタンパク質の変異体を自然に産生しない有機体の中で産生されるタンパク質のことを指す。すなわち、タンパク質又はペプチドは「組換えにより産生される」。典型的には、組換えタンパク質を産生するために当該技術分野で使用される異種系は、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、サッカロミセスセレビシェ）又は特定の哺乳動物細胞培養系統である。
【００４５】
＜発現宿主(expression host)＞
発現宿主とは、組換えタンパク質の産生に使用される有機体のことを言う。一般的な発現宿主は、大腸菌などの細菌、サッカロミセスセレビシエやピキアパストリスなどの酵母、又はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【００４６】
＜ＲＮＡ、ｍＲＮＡ＞
ＲＮＡはリボ核酸の一般的な略語である。それは核酸分子、すなわちヌクレオチドからなるポリマーである。これらのヌクレオチドは、通常、アデノシン−モノホスフェート、ウリジン−モノホスフェート、グアノシン−モノホスフェート、及びシチジン−モノホスフェートのモノマーであり、いわゆる骨格に沿って互いに結合されている。骨格は、第１の隣接するモノマーの糖、すなわちリボースと、第２の隣接するモノマーのリン酸塩部分と、の間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続したモノマーが、ＲＮＡ配列と呼ばれる。
【００４７】
＜ＤＮＡ＞
ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略語であり、核酸分子、すなわちヌクレオチドモノマーからなるポリマーである。これらのヌクレオチドは、通常、デオキシ−アデノシン−モノホスフェート、デオキシ−チミジン−モノホスフェート、デオキシ−グアノシン−モノホスフェート、及びデオキシ−シチジン−モノホスフェートのモノマーであり、それれ自体が、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸塩部分から構成され、特徴的な骨格構造によって重合される。骨格構造は、典型的には、第１の隣接するモノマーのヌクレオチド、すなわちデオキシリボースの糖部分と、第２の隣接するモノマーのリン酸塩部分と、の間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、つまり糖／リン酸塩−骨格に結合されたた塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは一本鎖でも二重鎖でもよい。二重鎖の形態では、例えば、Ａ／Ｔ−塩基−ペアリング及びＧ／Ｃ−塩基−ペアリングにより、第１鎖のヌクレオチドが第２鎖のヌクレオチドと雑種を生成する(hybridize)。  
【００４８】
＜核酸分子の配列／核酸配列＞
核酸分子の配列は、一般的には、特定かつ個別の順序、つまりそのヌクレオチドの連続であると理解されている。
【００４９】
＜アミノ酸分子の配列／アミノ酸配列＞
タンパク質又はペプチドの配列は、一般的には、その順序、つまりそのアミノ酸の連続であると理解されている。
【００５０】
＜配列同一性(sequence identity)＞
２以上の配列は、ヌクレオチド又はアミノ酸の長さと順序が同じであれば同一である。同一性の割合は、通常、２つの配列が同一である程度を表す。つまり、典型的には、天然又は野生型配列などの参照配列の同一のヌクレオチドに配列位置が一致するヌクレオチドの割合を表す。同一性の程度は、比較される配列が同じ長さ、すなわち比較される配列の最も長い配列の長さを示すことによって決定される。これは、８ヌクレオチド／アミノ酸からなる第１配列は、第１配列を含む１０ヌクレオチド／アミノ酸からなる第２配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において配列の同一性は、具体的には、同じ長さを有する２つ以上の配列において同じ位置を有する配列のヌクレオチド／アミノ酸の割合と関係する。ギャップは、通常、並べ方(alignment)における実際の位置とは関係なく、同一でない位置と見なされる。
【００５１】
＜新たに導入されるアミノ酸(newly introduced amino acids)＞
「新たに導入されるアミノ酸」とは、天然／野生型アミノ酸配列との比較において、アミノ酸配列の中に新たに導入されるアミノ酸を意味する。通常は、天然のアミノ酸配列が、突然変異により、アミノ酸配列内の所望の位置に特定のアミノ酸側鎖を有するように変更される。本発明では、特に、アミノ酸トレオニンが、プロリン残基に隣接するＣ末端側のアミノ酸配列に新たに導入される。
【００５２】
＜官能基＞
この用語は、当業者の一般的な理解に従って理解されるものであり、分子、特にペプチド、又はペプチドのアミノ酸又はペプチドに結合されたグリコシル残基に存在する化学的部分を意味し、他の化学的分子への共有結合又は非共有結合に関与することができ、グリコシル残基又はＰＥＧの結合を許容する。
【００５３】
＜天然アミノ酸配列(native amino acid sequence)＞
この用語は、当業者の一般的な理解に従って理解されるものであり、人による変異又はアミノ酸修正が一切無く、自然に発生する形態でのアミノ酸配列を意味する。それは、「野生型シーケンス」とも呼ばれる。「天然ＦＧＦ−２１」又は「野生型ＦＧＦ−２１」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるヒトＦＧＦ−２１の（変異していない）アミノ酸配列などのように、天然に存在するアミノ酸配列を有するＦＧＦ−２１を表す。使用される発現宿主に依存するＮ末端メチオニンの有無により、その自然又は天然／野生型配列を有すると考えられるタンパク質の状態は、通常は変化しない。
【００５４】
＜変異(mutated＞
この用語は、当業者の一般的な理解に従って理解されるべきである。アミノ酸配列は、その自然又は天然のアミノ酸配列との比較において、そのアミノ酸配列に少なくとも１つの追加、削除、又は交換されたアミノ酸を含む場合、すなわちアミノ酸変異を含む場合、「変異」と呼ばれる。変異タンパク質は変異体とも呼ばれる。本発明において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは具体的には、プロリン残基のＣ末端側のプロリン残基に隣接するアミノ酸交換を有するペプチドである。それにより、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドが新たに導入されたＯ結合型グリコシル化部位を含むように、Ｏ結合型グリコシル化のコンセンサス配列が、ＦＧＦ−２１に導入される。アミノ酸交換は、典型的には、Ｓ１７２Ｔとして示され、これは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列における１７２位置のアミノ酸セリンが、アミノ酸トレオニンによって交換されることを意味する。
【００５５】
＜薬学的有効量＞
本発明における薬学的有効量は、典型的には、医薬的効果を誘導するのに十分な量であると理解される。
【００５６】
＜治療／処理＞
「治療(therapy)」という用語は、疾患又は状態を「処理すること(treating)」又は疾患又は状態の「処理(treatment)」のことを言い、疾患を抑制し（その進行を遅延又は停止させる）、疾患の症状又は副作用を緩和し（苦痛緩和処理を含む）、及び疾患を軽減する（疾患の退行を生じさせる）。
【００５７】
＜治療有効量＞
疾患又は状態を処理し、疾患又は状態を抑制し、疾患の症状又は副作用を緩和し、及び／又は疾患又は状態の退行を生じさせるのに十分な化合物の量である。
【００５８】
＜半減期(half-life)＞
「半減期」という用語は、本明細書では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチド及び／又はそのコンジュゲートの投与において使用され、薬物、すなわち変異体ＦＧＦ−２１ペプチド及び／又はコンジュゲートの血漿濃度が、被験体の中で半分に減少するのに必要な時間として定義される。
【００５９】
＜Ｏ−結合グリコシル化(O-linked glycosylation)＞
「Ｏ−結合グリコシル化」は、セリン又はトレオニン残基で起こる(Tanner et al., Biochim. Biophys. Acta. 906:81-91(1987);及びHounsell et al, Glycoconj. J. 13: 19-26(1996))。本発明において、Ｏ結合グリコシル化部位は、ペプチドのアミノ酸配列の中で、グリコシルトランスフェラーゼによりグリコシル残基の結合点として認識されるアミノ酸モチーフであり、天然／野生型アミノ酸配列には存在しないアミノ酸モチーフのプロリン−トレオニン（ＰＴ）を含む。特に、トレオニン残基はプロリンに隣接して、プロリン残基のＣ末端側に新たに導入される。次に、グリコシル部分は、グリコシルトランスフェラーゼによりトレオニン残基の−ＯＨ基に結合される。
【００６０】
＜新しく導入されるＯ結合グリコシル化部位(newly introduced O-linked glycosylation side)＞
「新しく導入されるＯ結合グリコシル化部位」は、本明細書に記載されたプロリン残基のＣ末端側にトレオニンを導入する前は、天然又は野生型ＦＧＦ−２１に存在しなかったＯ結合グリコシル化部位を表す。
【００６１】
＜隣接(adjacent)＞
隣接とは、アミノ酸配列の中で別のアミノ酸のすぐ隣りにあるアミノ酸を意味し、それぞれのアミノ酸のＮ末端側又はＣ末端側のどちらかの末端側にある。本発明において、新しく導入されたトレオニン残基は、プロリン残基のＣ末端側のプロリン残基に隣接する。
【００６２】
＜グリコシル部分(glycosyl moiety)＞
グリコシル部分は、変異体ＦＧＦ-21ペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合する１又は複数の同一又は異なるグリコシル残基からなる部分であり、これによって、ペプチド、グリコシル部分及びＰＥＧを含むコンジュゲートを形成する。グリコシル部分は、モノ−、ジ−、トリ−、又はオリゴグリコシル部分であり得る。グリコシル部分は、１又は複数のシアル酸残基、１又は複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基、１又は複数のガラクトース（Ｇａｌ）残基及びその他を含み得る。グリコシル部分は、例えば、ＰＥＧ又はメトキシ−ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）、ＰＥＧのアルキル誘導体で修飾されることもできる。
【００６３】
＜グリココンジュゲーション(glycoconjugation)＞
本明細書で使用される「グリココンジュゲーション」という用語は、アミノ酸又は（ポリ）ペプチドのグリコシル残基、例えば本発明の変異体ＦＧＦ−２１に対して、ＰＥＧ修飾グリコシル部分が酵素を媒介として結合されたコンジュゲーションのことを指す。「グリココンジュゲーション」の分類上の亜属(subgenus)は、「グリコ−ＰＥＧ化」であり、修飾されたグリコシル部分の修飾基がＰＥＧ又はｍ−ＰＥＧである。ＰＥＧは、直鎖型又は分岐型のどちらでもよい。典型的には、分岐型ＰＥＧは、中央に分岐コア部分と、前記分岐コア部分に連結された複数の線状ポリマー鎖と、を有する。ＰＥＧは、一般に、分岐型で使用され、エチレンオキシドを、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトールなどの種々のポリオールに添加することによって調製されることができる。中央の分岐部分は、リジンなどのいくつかのアミノ酸から得られることもできる。分岐型ＰＥＧは、一般式Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＸ）ｍの形態で表すことができ、ここで、Ｒはグリセロール又はペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、Ｘはキャッピング基又は末端基を表し、ｍはアームの数を表す。「グリコシル−ＰＥＧ」と「グリコシル−ＰＥＧ」という用語は互いに交換可能に使用され、ＰＥＧ又はメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ又はｍ−ＰＥＧ）と、１又は複数のグリコシル残基（又はグリコシル部分）と、任意選択的に、ＰＥＧ／メトキシ−ＰＥＧとグリコシル部分との間のリンカー、例えばグリシンなどのアミノ酸と、からなる化学部分を表す。「グリコ−ＰＥＧ」及び「グリコシル−ＰＥＧ」と、グリコ−ＰＥＧ部分に対する同様な用語である「ＰＥＧ−シアル酸」及び「ＰＥＧ−Ｓｉａ」という用語は、ＰＥＧとグリコシル部分との間のリンカーを含んでも含まなくてもよいことに留意されるべきである。すなわち「ＰＥＧ−シアル酸」は、例えば、ＰＥＧ−シアル酸の他に、ＰＥＧ−Ｇｌｙ−シアル酸、ｍＰＥＧ−Ｇｌｙ−シアル酸をも包含する。
【００６４】
＜配列モチーフ(sequence motif)＞
配列モチーフは、ヒトＦＧＦ−２１のアミノ酸配列などの長鎖アミノ酸配列における任意の位置に存在する短鎖アミノ酸配列（例えば、含まれるアミノ酸が２つのみ）を意味する。例えば  Ｐ１７２Ｔと表される配列モチーフは、１７２位置のプロリンのＣ末端の直ぐ後がトレオニン残基であることを意味する。
【００６５】
＜シアル酸(sialic acid)＞
「シアル酸」又は「Ｓｉａ」という用語は、炭素数９のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロピラノス−１−オン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡと省略されることもある）。ファミリーの第２のメンバーはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）であり、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である(Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557)。また、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−０−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸も含まれる。このシアル酸ファミリーについては、例えば、文献(Varki, Glycobiology 2:25-40(1992)を参照することができる。
【００６６】
＜薬学的に許容される賦形剤＞
「薬学的に許容される」賦形剤(excipient)は、本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートと組み合わせたとき、コンジュゲートの活性を保持し、被験体の免疫系と非反応性のあらゆる材料を含む。例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、水、塩、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤などの標準的な医薬用賦形剤を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
＜医薬品容器＞
「医薬品容器」は、医薬組成物を運ぶのに適した容器であり、典型的には、不活性材料で作られ、滅菌されている。
【００６８】
＜投与＞：
「投与する」という用語は、被験体に対して、経口投与、吸入、座薬としての投与、局所接触、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病巣内投与、鼻腔内投与又は皮下投与、又は徐放装置、例えばミニ浸透圧ポンプの埋込みを意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣、直腸、又は経皮）を含む任意の経路によって行われる。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内及び頭蓋内の投与を含む。他の送達態様には、リポソーム製剤(liposomal formulations)の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
＜糖尿病及び糖尿病関連疾患＞
「糖尿病」は、しばしば真性糖尿病(diabetes mellitus)と称される疾患として広く知られ、特徴付けられている。この用語は、インスリン産生が不十分であるか、体の細胞がインスリンに対して適切に応答しないか、又はその両方のために、人のグルコース（血糖）値が高い一群の代謝疾患を表す。高血糖の患者は、一般的に、多尿症（頻尿）であり、喉の渇き（多飲症）、空腹（多食症）が増加する。「糖尿病関連疾患(diabetes related diseases)」とは、肥満、多尿、多飲、多食症などの同じ症状を特徴とする疾患である。
【００７０】
＜２型糖尿病＞
「２型糖尿病」は、糖尿病／真性糖尿病の最も一般的な形態である。２型糖尿病は最も一般的には、成人に発症し、肥満で、あまり身体を動かさない人に発生する可能性がより高い。現在予防できない１型糖尿病とは異なり、２型糖尿病の危険因子の多くは修飾されることができる。国際糖尿病連合(International Diabetes Foundation)は、糖尿病検査の必要性を示す４つの症状として、ａ）頻尿、ｂ）体重減少、ｃ）エネルギー不足、ｄ）過度の渇き、をリストアップしている。インスリン抵抗性は、通常、２型糖尿病の前兆であり、グルコースが細胞に入るために通常よりも多くのインスリンが必要とされる状態である。肝臓のインスリン抵抗性はより多くのグルコースを産生するのに対し、末梢組織の抵抗性はグルコースの取込みが損なわれることを意味する。
【００７１】
＜非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）＞
これは、肝臓に脂肪が蓄積し、その後、肝臓の損傷と炎症が起こる状態である。
【００７２】
＜代謝症候群(メタボリックシンドローム)＞
これは、２型糖尿病と心臓血管疾患の発症に関連する危険因子（生化学的及び生理学的変化）について定義されたクラスターである。
【００７３】
＜発明の詳細な説明＞
組換えＦＧＦ−２１が、血漿グルコース値及びインスリン値に影響を与えて、肝臓及び循環トリグリセリド値及びコレステロール値を低下させること、並びに、インスリン抵抗性動物モデルの範囲内で、インスリン感受性、エネルギー消費、脂肪肝及び肥満を改善することが示される。このため、ＦＧＦ−２１は、ヒト２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び関連のある代謝疾患の治療に対する標的として興味深い。
【００７４】
天然ＦＧＦ−２１はインビトロでの半減期が比較的短く、報告されている循環半減期は、げっ歯類及びヒト以外の霊長類で０．５〜４時間の範囲であり、臨床適用性が制限される。組換えヒトＦＧＦ−２１の半減期は１〜２時間である。ＦＧＦ−２１の薬物動態特性を改善するために、様々な半減期延長戦略が開発されてきた。
【００７５】
本明細書で使用される略語には、ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；ＮｅｕＡｃ、シアリル又はＮ−アセチルノイラミニル；Ｓｉａ、シアリル又はＮ−アセチルノイラミニル；及びそれらの誘導体及び類似体、がある。
【００７６】
＜ペグ化(PEGylation)＞
タンパク質の半減期を長くする１つの方法は、１又は複数のＰＥＧ部分をタンパク質に結合することであり、この結合によって、概して、タンパク質の生物物理学的溶解度及び安定性が向上する。この手法は、治療を必要とする被験体の治療に適した特性を有するタンパク質の治療的半減期を長くすることに関して特に有用であることが立証された。しかしながら、天然ＦＧＦ−２１は特定のタンパク質ＰＥＧ化部位を有しない。特定のタンパク質ＰＥＧ化部位を欠いた化学的ＰＥＧは、部位特異的(site-specific)ではなく、典型的には、不均質な製品集団が生成され、薬剤組成物として市場の承認を得るのに必須条件である均質で高純度の製品を達成するのに広範な精製を必要とする。それゆえ、向上した半減期と良好な生物学的活性を有する部位特異的ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１ペプチドを生成するために、ＦＧＦ−２１の部位特異的ＰＥＧ化が望ましい。
【００７７】
酵素ベースの合成は、位置選択性(regioselectivity)と立体選択性(stereoselectivity)という利点を有する。さらに、酵素合成は、保護されていない基質を用いて行うことができることである。ＰＥＧ残基をタンパク質に部位特異的に結合する１つの可能な方法は、グリコペグ化である。グリコペグ化では、ＰＥＧ部分が、グリコシルトランスフェラーゼを使用して、タンパク質又はペプチドのアミノ酸に結合したアミノ酸又はグリコシル残基に移される。一般的な最終構造は、タンパク質−グリコシル部分−任意選択的なリンカー−ＰＥＧである。より詳細な最終構造は、タンパク質−タンパク質の（Ｎ−、Ｃ−又は内部）アミノ酸−１又は複数のグリコシル残基−任意選択的なリンカー（例えば、アミノ酸リンカー）−様々な長さの直鎖又は分岐ＰＥＧ部分であり、グリコシル部分は、１又は複数のグリコシル残基を含み得る。構造の少なくとも一部を構成する１又は複数のグリコシル残基は、タンパク質をＰＥＧ部分に連結することができるあらゆるグリコシル残基であってよい。当該技術分野において、タンパク質をグリコＰＥＧ化するための多様な方法が知られており、以下に詳細に説明する。
【００７８】
タンパク質のＰＥＧ化では、コンジュゲートされたＰＥＧ部分が大きいほど、ＰＥＧがコンジュゲートされたタンパク質の予想半減期は長くなる。この理由は、コンジュゲートされたタンパク質を、血流中に存在するプロテアーゼから保護するためのＰＥＧ部分が大きくなると、相対的にその保護能力が向上することによる。ＰＥＧ部分が大きいと、ＰＥＧ部分が小さい場合よりも、ＰＥＧがコンジュゲートされたタンパク質に対する有効半径が大きくなる。また、大きなタンパク質は、小さなタンパク質と比べて、血流の中に分解されるのが遅く、また、除去されるのが遅い。これは、大きなタンパク質は、腎臓に入るのが遅いか、腎臓に入るのを完全に妨げられるためである。それゆえ、当業者であれば、ＰＥＧ化プロセスで、高分子量の長いＰＥＧ残基（例えば、３０ｋＤａ以上のＰＥＧ）、合計数の多いＰＥＧ残基、及び／又は、分岐の多いＰＥＧ残基をタンパク質に結合することにより、短い／小さいＰＥＧ部分にコンジュゲートされた同じタンパク質よりも優れた特性を有するＰＥＧ化タンパク質を作ることができるであろう。
【００７９】
しかしながら、ペグ化は、それに関連して、立体障害可能性という重大な不都合がある。これは、コンジュゲートされたＰＥＧ部分がタンパク質活性に重要又は必須であるタンパク質の活性部位を物理的にブロックする。例えば、ＰＥＧ部分は、その受容体のためのタンパク質の受容体結合部位を特異的にブロックする可能性があり、タンパク質活性に重大かつ有害な損失を引き起こす。ペグ化におけるそのような阻害効果を回避するために、当業者は、受容体結合に関与するアミノ酸の近くでＰＥＧを結合させないようにする。
【００８０】
ＦＧＦ−２１に関しては、Ｃ末端はβ−クロトー結合に重要であり、Ｎ末端はＦＧＦＲ活性化に重要である。さらに、他のＦＧＦ−２１ファミリータンパク質の結晶構造及びインビトロ効力アッセイに基づくＦＧＦ−２１のインシリコモデリングでは、推定受容体結合ドメインに位置するアミノ酸残基のＰＥＧ化は不活性であったが、遠位部位でのＰＥＧ化は最も活性な類似体を産生した。さらに、ＰＥＧ部分がＦＧＦ−２１の位置１８０に配置されたとき、細胞ベースの効力アッセイでは、効力の１００倍を超える損失が観察された。ＦＧＦ−２１について、抗体のＦｃ部分への融合を試験したところ、ＦＧＦ−２１のＣ末端での融合は、Ｎ末端での融合よりもはるかに弱い類似体を産生した。これに対して、Ｎ末端でＰＥＧ化されたＦＧＦ−２１は、生物学的に活性であることが示された。それゆえ、当業者であれば、当該分野の知識に基づき、タンパク質のこの領域が結合及びシグナル伝達において果たす役割に照らして、ＦＧＦ−２１のＣ末端近傍でＰＥＧ化を回避するであろう。
【００８１】
本発明者らは、この背景に反して、複数の変異体線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）ペプチドコンジュゲートを生成することを試みた。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、各々が、ｉ）変異体ＦＧＦ−２１ペプチドと、ｉｉ）２０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを含み、
前記ｉ）の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、少なくとも１つのプロリン（Ｐ）残基のＣ末端側にて、少なくとも１つのプロリン残基に隣接して少なくとも１つのトレオニン（Ｔ）残基を含み、これにより、対応する天然ＦＧＦ−２１に存在しない少なくとも１つのＯ結合型グリコシル化部位を形成し、前記天然ＦＧＦ−２１は、アミノ酸配列は、少なくとも９５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同一であり、
前記ｉｉ）の２０ｋＤａのＰＥＧは、少なくとも１つのトレオニン残基で、少なくとも１つのグリコシル部分を介して、前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに共有結合されている。
【００８２】
特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、アミノ酸配列ＰＴを含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを含む。その詳細な実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、Ｐ１７２Ｔ、Ｐ１５６Ｔ、Ｐ５Ｔ、Ｐ３Ｔ、Ｐ９Ｔ、Ｐ５０Ｔ、Ｐ６１Ｔ、Ｐ７９Ｔ、Ｐ９１Ｔ、Ｐ１１６Ｔ、Ｐ１２９Ｔ、Ｐ１３１Ｔ、Ｐ１３４Ｔ、Ｐ１３９Ｔ、Ｐ１４１Ｔ、Ｐ１４４Ｔ、Ｐ１４５Ｔ、Ｐ１４８Ｔ、Ｐ１５０Ｔ、Ｐ１５１Ｔ、Ｐ１５８Ｔ、Ｐ１５９Ｔ、Ｐ１６６Ｔ、Ｐ１７８Ｔ、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、前記プロリン及びトレオニンの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。より詳細な実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、Ｐ１７２Ｔ、Ｐ１５６Ｔ、Ｐ５Ｔ及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、特にＰ１７２Ｔ、Ｐ１５６Ｔ及びそれらの組合せからなり、プロリン及びトレオニンの位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。さらに詳細実施形態では、プロリン残基は、アミノ酸１４５と変異体ＦＧＦ−２１ペプチドのＣ末端との間に位置し、ここで、アミノ酸１４５の位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。
【００８３】
別の特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドはアミノ酸配列Ｐ１７２Ｔを含み、プロリン及びトレオニンの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。
【００８４】
別の特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは変異Ｓ１７３Ｔ及び変異Ｒ１７６Ａを含み、アミノ酸Ｓ及びＲの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいており、特に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８５】
別の特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは変異Ｑ１５７Ｔを含み、アミノ酸Ｑの位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいており、特に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８６】
別の特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは変異Ｄ６Ｔを含み、アミノ酸Ｄの位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいており、特に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８７】
他の特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列、より詳細には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、最も詳細には、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
他の特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）及び／又はシアル酸（Ｓｉａ）を含む少なくとも１つのグリコシル部分を含む。その特定の実施形態では、少なくとも１つのグリコシル部分は、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−を含む。
【００８９】
他の特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２０ｋＤａのＰＥＧ部分を含み、前記ＰＥＧ部分は、アミノ酸残基、特にグリシン（Ｇｌｙ）を介して少なくとも１つのグリコシル部分に結合されている。さらに特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含む。より詳細には、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、次の構造を含み、式中、ｎは４５０〜４６０から選択される整数である。
【化３】
0006852939.tif 000005
【００９０】
他の特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、２０ｋＤａのＰＥＧを含み、前記ＰＥＧは、直鎖ＰＥＧ又は分岐ＰＥＧである。より詳細な実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。さらに詳細な実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧは２０ｋＤａのメトキシ−ＰＥＧである。
【００９１】
また、本発明は、明細書に記載した少なくとも１つの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在し、特に、１ｍｇ／ｍＬ〜４５ｍｇ／ｍＬの範囲、より詳細には１０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲、最も詳細には２６±４ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。緩衝液は、トリス緩衝液であってよい。緩衝液は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度、特に２ｍＭ〜７５ｍＭの濃度、より詳細には５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、さらに詳細には１０ｍＭ〜２５ｍＭの濃度、最も詳細には１６±２ｍＭの濃度で存在してもよい。ｐＨは６．０〜８．５の範囲、特に６．５〜８．０の範囲、より詳細には６．７５〜８．０の範囲、最も詳細には７．５±０．３の範囲である。医薬組成物は、塩、特に無機塩、より詳細にはＮａＣｌをさらに含む。医薬組成物に含まれる塩は、３０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度、特に４０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度、より詳細には５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度、最も詳細には５６±２ｍＭの濃度で存在することができる。医薬組成物は、さらに張度調整剤を含むことができる。適当な張度調整剤には、グリセロール、アミノ酸、塩化ナトリウム、タンパク質、糖及び糖アルコールが含まれる。特に、張度調整剤は糖であり、より詳細には張度調整剤はスクロースである。張度調整剤は、５０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で存在し、より詳細には１００ｍＭ〜１７５ｍＭの濃度で、さらに詳細には１３５ｍＭ〜１６０ｍＭの濃度で、最も詳細には１５０±２ｍＭの濃度で存在する。医薬組成物は、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤又は非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートベースの非イオン性界面活性剤であって、特にポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり、より詳細にはポリソルベート２０である。界面活性剤又は非イオン性界面活性剤は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、特に０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度、より詳細には０．２±０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００９２】
特定の実施形態において、医薬組成物は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、緩衝剤、特にトリス緩衝液を１ｍＭ〜１００ｍＭ、塩、特にＮａＣｌを３０ｍＭ〜２００ｍＭ、張度調整剤、特にスクロースを５０ｍＭ〜２００ｍＭ、及び、界面活性剤又は非イオン性界面活性剤、特にポリソルベート２０を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、ｐＨは６．０〜８．５である。
【００９３】
本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、及び／又は、前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物を含む医薬品容器もまた、本発明に含まれる。適当な医薬品容器として、例えば、シリンジ、バイアル、輸液用ボトル、アンプル、カープル、針保護システムを備えたシリンジ、又はペン型注射器内のカープルを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９４】
また、本発明は、実施例１〜１７の何れかに記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを作製する方法を提供するもので、該方法は、
（１）発現宿主の中で変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを組換え的に産生するステップ、及び
（２）前記ステップ（１）の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに、２０ｋＤａのＰＥＧグリコシル部分を酵素的に結合するステップ、を含み、これによって、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを形成する。特定の実施形態では、発現宿主は大腸菌である。
より詳細な実施形態において、ステップ（２）は、ＧａｌＮＡｃを、ＧａｌＮＡｃ供与体から変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの少なくとも１つのトレニオン残基に転移させるのに適した条件下で、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと接触させるステップ（２ａ）を含む。さらにより詳細な実施形態では、ＧａｌＮＡｃ供与体はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃである。さらに別の詳細な実施形態では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼはＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２である。本方法の別の詳細な実施形態では、ステップ（２）は、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａを、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体から、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの少なくとも１つのトレオニン残基、又はステップ（２ａ）が存在する場合は変異体ＦＧＦ−２１ペプチドのＧａｌＮＡｃに転移させるのに適した条件下で、ステップ（１）の生成物、又はステップ（２ａ）が存在する場合にステップ（２ａ）の生成物を、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体及びシアリルトランスフェラーゼと接触させるステップ（２ｂ）をさらに含む。さらに詳細な実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ−ＣＭＰである。さらに詳細な実施形態では、シアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧａｌＮＡｃｌである。さらに詳細な実施形態において、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は、次の構造を含み、式中、ｎは４５０〜４６０から選択される整数である。
【化４】
0006852939.tif 000006
【００９５】
別の特定の実施形態において、方法は、ステップ（１）の後でステップ（２）の前に、組換え産生後、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを精製するステップ（３）をさらに含む。より詳細な実施形態において、方法は、ステップ（２）の後、ステップ（２）で形成された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを精製するステップ（４）をさらに含む。方法の他の特定の実施形態において、ステップ（３）は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過及びそれらの組合せからなる群から選択される方法に適用することを含み、及び／又は、ステップ（４）は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過及びそれらの組合せからなる群から選択される方法に適用することを含む。精製するステップは、１又は複数工程のイオン交換クロマトグラフィーを含み、特に２工程のイオン交換クロマトグラフィーを含む。他の特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーであり、より詳細には、強アニオン交換クロマトグラフィーである。より詳細には、アニオン交換クロマトグラフィーは、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックス、ポリスチレン／ジビニルベンゼンポリマーマトリックス、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＥＡＥ）、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）、アガロース、四級アンモニウム（Ｑ）強アニオン交換クロマトグラフィー及びその組合せである。他の特定の実施形態において、ステップ（３）は、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックスを使用する２工程のアニオン交換クロマトグラフィーを含む。他の特定の実施形態において、ステップ（４）は、２工程の第四級アンモニウム（Ｑ）強アニオン交換クロマトグラフィーを含む。特定の実施形態において、アルギニンは、ステップ（２）に添加され、及び／又は、ステップ（３）が存在する場合、ステップ（３）において、具体的には少なくとも４００ｍＭのアルギニンが添加される。他の特定の実施形態において、方法は、ステップ（３）の後でステップ（２）の前に、エンドトキシンを除去するステップ（５）をさらに含み、ステップ（３）の生成物はエンドトキシン除去フィルターを使用して濾過される。
【００９６】
本発明のさらなる態様において、上記記載の方法によって得られる変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートが含まれ、前記組成物は、薬学的に許容される賦形剤又は担体をさらに含む。
【００９７】
別の態様において、本発明は、糖尿病又は糖尿病関連疾患、特に、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又は代謝症候群を治療する方法を提供するもので、該方法は、本明細書に記載された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、又は本発明に記載された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを少なくとも１種含む医薬組成物を、治療を必要とする被験体に対して、治療上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、被験体は、ヒト被験体である。
【００９８】
＜ＦＧＦ−２１ペプチドのグリコシル化及びグリココンジュゲーション＞
ペプチド及びタンパク質の発現後のインビトロ修飾は、一般的に、グリコペプチド及びグリコタンパク質を生成するために使用される。サッカリド供与体部分を転移する酵素の多様な配列が利用可能であり、それにより、グリココンジュゲートは、カスタム設計されたグリコシル化パターン及びグリコシル構造とのインビトロ酵素合成が可能になる。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号、第６，０３０，８１５号、第５，７２８，５５４号、第５，９２２，５７７号、特許出願公開ＷＯ９８／３１８２６、ＷＯ０１／８８１１７、ＷＯ０３／０３１４６４、ＷＯ０３／０４６１５０、ＷＯ０３／０４５９８０、ＷＯ０３／０９３４４８、ＷＯ０４／００９８３８、ＷＯ０５／０８９１０２、ＷＯ０６／０５０２４７、ＷＯ１２／０１６９８４、ＵＳ２００２／１４２３７０、ＵＳ２００３／０４００３７、ＵＳ２００３／１８０８３５、ＵＳ２００４／０６３９１１、ＵＳ２００３／２０７４０６、及びＵＳ２００３／１２４６４５は、各々が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
ペプチドのグリコシル残基を追加及び／又は修飾するために利用可能な酵素及び方法の汎用性により、グリコシル連結基は実質的に任意の構造を有することができる。それゆえ、グリコシル連結基は、実質的にあらゆるモノサッカリド又はオリゴサッカリドを含むことができる。グリコシル連結基は、側鎖又はペプチド骨格のどちらかを通してアミノ酸に結合されることができる。或いは、グリコシル連結基は、サッカリル部分を介してペプチドに結合されることができ、前記サッカリル部分はペプチド上のＯ結合又はＮ結合グリカン構造の一部であり得る。
【０１００】
上記に従って、本発明者らは、グリコシル化変異体ＦＧＦ−２１のコンジュゲートを作製したもので、前記コンジュゲートには、対応する野生型ＦＧＦ−２１配列には存在しないグリコシル化部位を有する。そのようなコンジュゲートは、修飾された糖が、グリコシル化されたＦＧＦ−２１ペプチドに対して酵素的連に結合することによって形成された。修飾糖が、ペプチドと糖の修飾基の間に存在するとき、本明細書では「グリコシル連結基」と称されることがある。本発明者らは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼなどのような絶妙な酵素を選択することにより、１又は複数の特定の位置に所望の基を有する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを産生した。より具体的には、本発明者らは、グリコシルトランスフェラーゼを使用して、修飾糖類を、変異体ＦＧＦ−２１グリコペプチド上の炭水化物部分に連結した。
【０１０１】
＜ＦＧＦ−２１コンジュゲート＞
別の態様において、修飾糖と変異体ＦＧＦ−２１ペプチドのコンジュゲートを例示的に提供する。例えば、本明細書の以下の実施例１−７に示す。より具体的には、作製された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、変異体ＦＧＦペプチドと少なくとも１つの修飾糖類とを含み、前記少なくとも１つの修飾糖類の第１の修飾糖が、グリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸に連結されている。本明細書に記載されるように、グリコシル連結基が結合されたアミノ酸は、グリコシルトランスフェラーゼによって認識される部位を生成するために変異される。
【０１０２】
別の例示的な実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドと、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの変異アミノ酸残基に連結されたグリコシル基とを含むことができる。
【０１０３】
例示的な実施形態では、グリコシル基は無傷のグリコシル連結基である。別の例示的な実施形態では、グリコシル基は修飾基をさらに含む。別の例示的な実施形態では、修飾基は非グリコシド修飾基である。別の例示的な実施形態では、修飾基は天然に存在するサッカリド部分を含まない。
【０１０４】
＜修飾糖類(modified sugars)＞
例示的な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは修飾糖と反応し、ペプチドコンジュゲートを形成する。修飾糖は、「糖供与体部分(sugar donor moiety)」及び「糖転移部分(sugar transfer moiety)」を含む。糖供与体部分は、本明細書に記載のコンジュゲートとして、グリコシル部分又はアミノ酸部分のどちらかを介してペプチドに結合される修飾糖の任意の部分である。糖供与体部分は、修飾された糖から変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートのグリコシル連結基への転換中に化学的に変化される原子を含む。糖転移部分は、本明細書に記載のコンジュゲートとしてペプチドに結合されない修飾糖の任意の部分である。
【０１０５】
本明細書に記載の修飾された糖類について、サッカリル部分は、サッカリド、デオキシサッカリド、アミノサッカリド、又はＮ−アシルサッカリドであってよい。「サッカリド」及びその同等語である「サッカリルSaccharyl)」、「糖」、及び「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、及びポリマーのことを言う。糖部分も修飾基で官能化されている。修飾基は、典型的には、糖のアミン、スルフヒドリル又はヒドロキシル、例えば一級ヒドロキシルの部分とのコンジュゲーションを介してサッカリル部分にコンジュゲートされる。例示の実施形態において、修飾基は、糖のアミン部分を介して、結合される。例えば、アミンと修飾基の反応性誘導体との反応を介して形成されるアミド、ウレタン又は尿素を介して結合される。
【０１０６】
どんなサッカリル部分についても、修飾糖の糖供与体部分として利用されることができる。サッカリル部分は、マンノース、ガラクトース又はグルコースなどの既知の糖、又は既知の糖の立体化学(stereochemistry)を有する種であり得る。これらの修飾糖類の一般式は次の式に示される。
【化５】
0006852939.tif 000007
【０１０７】
本明細書に記載の方法に有用な他のサッカリル部分には、フコース及びシアル酸、並びに、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなどのアミノ糖、シアル酸等の５−アミン類似体などのアミノ糖が含まれるが、これらに限定されない。サッカリル部分は、天然に存在する構造であってもよいし、修飾基を結合するための部位を得るために修飾されることができる。例えば、一実施形態では、修飾糖は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置換されたシアル酸誘導体を提供する。アミンは、選択された修飾基の活性化された類似体で容易に誘導体化される。本明細書に記載の方法に有用な修飾糖類の例は、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／００２５２２に記載されており、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
さらなる例示的実施形態において、本発明は修飾糖類を利用するもので、前記修飾糖類は、６−ヒドロキシル位置が、対応するアミン部分に転換され、前記部分が、上記した修飾基等のリンカー修飾基カセットを有する。これら修飾糖のコアとして使用されることができるグリコシル基の例として、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが挙げられる。この実施形態による代表的な修飾糖は、次の構造を有し、式中、Ｒ１１−Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３から独立して選択されるメンバーであり、Ｒ１０は、例えば、他のグリコシル残基（−Ｏ−グリコシル）に連結され、Ｒ１４はＯＲ１、ＮＨＲ１又はＮＨ−Ｌ−Ｒ１であり、Ｒ１及びＮＨ−Ｌ−Ｒ１は本明細書に記載の通りである。
【化６】
0006852939.tif 000008
【０１０９】
さらに例示的実施形態において、６−ヒドロキシル位置が、対応するアミン部分に転換される修飾糖のコアとして使用されるグリコシル基は、Ｇａｌ及び／又はＧａｌＮＡｃを含む。
【０１１０】
＜グリコシル連結基(glycosyl linking groups＞
例示的な実施形態において、本明細書に記載の修飾糖及び変異体ＦＧＦペプチドを含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートが提供される。この実施形態では、修飾糖の糖供与体部分（サッカリル部分及び修飾基など）が「グリコシル連結基」になる。なお、「グリコシル連結基」は、ペプチドと修飾基の間に存在するグリコシル部分を指すこともある。
【０１１１】
以下の例示的な実施形態では、フラノース及びピラノースの選択された誘導体の使用を参照して本発明を説明する。当業者であれば、記載された構造及び組成物が、一般に、グリコシル連結基及び修飾糖類が含まれる属の全体に適用可能であることは理解し得るであろう。それゆえ、グリコシル連結基は、実質的にあらゆるモノサッカリド又はオリゴサッカリドを含むことができる。
【０１１２】
例示的な実施形態において、本明細書に記載の方法は、次の式を有するグリコシル連結基を利用することができ、式中、Ｊはグリコシル部分であり、Ｌは化学結合又はリンカーであり、Ｒ１は修飾基、例えばポリマー修飾基である。
【化７】
0006852939.tif 000009
化学結合は、例えば、グリコシル部分のＮＨ２部分と修飾基の相補的反応性の化学基との間に形成される。例えば、Ｒ１がカルボン酸部分を含む場合、この部分は活性化され、グリコシル残基のＮＨ２部分と結合され、構造ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１を有する結合が得られる。Ｊは、好ましくは、「無傷(intact)」であって、ピラノース又はフラノース構造を切断する条件、例えば、 酸化条件、例えば過ヨウ素酸ナトリウムの条件に曝露されても分解されなかったグリコシル部分である。
【０１１３】
リンカーの例として、アルキル部分及びヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーは、例えばアシルベースの連結基、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などの連結基を含む。連結基は、コンジュゲートの成分と成分との間、例えば、グリコシル部分とリンカー（Ｌ）との間、又はリンカーと修飾基との間（Ｒ１）に形成される結合である。  他の連結基の例は、エーテル、チオエーテル及びアミンである。例えば、一実施形態では、リンカーはグリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基のアミンとの反応により、対応するアミドに転換され、グリシンのアミンは、修飾基の活性化カルボン酸又は炭酸塩との反応により、対応するアミド又はウレタンに転換される。
【０１１４】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ１の典型的な種は、式：−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１を有し、指数(indices)ｓ及びｔは独立して０又は１である。指数ａ、ｂ及びｄは独立して０〜２０の整数であり、ｃは１〜２５００の整数である。他の同様なリンカーは、−ＮＨ部分が  他の化学基、例えば、−Ｓ、−Ｏ又は−ＣＨ２と置換される種に基づいている。当該技術分野で理解されているように、指数ｓ及びｔに対応する括弧部分の１又は複数の部分は、置換又は非置換アルキル又はヘテロアルキル部分で置き換えられることができる。
【０１１５】
より具体的には、本明細書に記載の化合物は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ’から構成され、ＮＨ−Ｌ−Ｒ’は、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、及びＮＨＲ１である。これらの式において、指数ａ、ｂ及びｄは、０〜２０、好ましくは１〜５の整数から独立して選択される。指数ｃは１〜約２５００の整数である。
【０１１６】
例示的な実施形態では、ｃの選択は、ＰＥＧ部分が約１ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤ、４５ｋＤ、５０ｋＤ、５５ｋＤ、６０ｋＤ又は６５ｋＤとなるように行われる。
【０１１７】
より詳細な実施形態では、ｃの選択は、ＰＥＧ部分が１５〜２５ｋＤ、１６〜２５ｋＤ、１７〜２５ｋＤ、１８〜２５ｋＤ、１９〜２５ｋＤ、２０〜２５ｋＤ、２１〜２５ｋＤ、２２〜２５ｋＤ、２３〜２５ｋＤ、２４〜２５ｋＤ、１５〜２０ｋＤ、１６〜２０ｋＤ、１７〜２０ｋＤ、１８〜２０ｋＤ、１９〜２０ｋＤ、２０〜３０ｋＤ、２１〜３０ｋＤ、２２〜３０ｋＤ、２３〜３０ｋＤ、２４〜３０ｋＤ、２５〜３０ｋＤ、２６〜３０ｋＤ、２７〜３０ｋＤ、２８〜３０ｋＤ、２９〜３０ｋＤの範囲となるように行われる。さらに詳細な実施形態では、ｃの選択は、ＰＥＧ部分が２０ｋＤ、２２ｋＤ、２３ｋＤ、２４ｋＤ、２５ｋＤ、２６ｋＤ、２７ｋＤ、２８ｋＤ、２９ｋＤ、又は３０ｋＤとなるように行われる。
【０１１８】
明確にするために記載すると、このセクションの残りのグリコシル連結基は、シアリル部分に基づいています。しかしながら、当業者であれば、シアリル部分に代えて、マンノシル、ガラクトシル、グルコシル、又はフコシルなどの他のグリコシル部分を使用できることは認識し得るであろう。
【０１１９】
例示的な実施形態において、グリコシル連結基は、無傷のグリコシル連結基であり、前記連結基を形成する１又は複数のグリコシル部分は、化学的プロセス（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウム）又は酵素的プロセス（例えば、オキシダーゼ）によって分解されない。本発明の選択されたコンジュゲートは、アミノサッカリドのアミン部分、例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などに結合される修飾基を含む。例示的な実施形態において、本発明は、次の式から選択される式を有する無傷のグリコシル結合基を含むペプチドコンジュゲートを提供する。
【化８】
0006852939.tif 000010
【０１２０】
式Ｉにおいて、Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７又はＯＲ７であり、ここでＲ７はＨ、置換若しくは非置換アルキル又は置換若しくは非置換ヘテロアルキルを表す。ＣＯＯＲ７がカルボン酸又はカルボン酸塩である場合、両方の形態は単一構造ＣＯＯ−又はＣＯＯＨの表示によって表される。式Ｉ及びＩＩにおいて、記号Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ６’は、独立して、Ｈ、置換又は非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９を表す。指数ｄは０又は１である。Ｒ８及びＲ９は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、シアル酸又はポリシアル酸から独立して選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ６’の少なくとも１つは修飾基を含む。この修飾基は、結合又は連結基を介して連結されるポリマー修飾部分、例えばＰＥＧであり得る。例示的な実施形態では、Ｒ６及びＲ６’は、それらが結合している炭素と共に、シアル酸のピルビル側鎖の成分である。さらなる例示的な実施形態において、ピルビル側鎖は、ポリマー修飾基で官能化される。別の例示的な実施形態では、Ｒ６及びＲ６’は、それらが結合している炭素と共に、シアル酸の側鎖の成分であり、ポリマー修飾基はＲ５の成分である。
【０１２１】
このモチーフによる修飾基−無傷グリコシル連結基カセットの例は、シアル酸構造に基づいており、例えば、次の式を有するカセットがある。
【化９】
0006852939.tif 000011
【０１２２】
上記式において、Ｒ１及びＬは上記のとおりである。例示的なＲ１基の構造に関するさらなる詳細については以下にて説明する。
【０１２３】
さらなる例示的な実施形態において、コンジュゲートは、ペプチドと修飾糖との間で形成され、修飾糖の６炭素位置で、修飾基がリンカーを介して結合されている。それゆえ、この実施形態による例示的なグリコシル連結基は、次の式を有する。
【化１０】
0006852939.tif 000012
なお、上記式において、ラジカルは既に説明したとおりである。グリコシル連結基には、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
一実施形態において、本発明は、次のグリコシル連結基を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを提供する：
【化１１】
0006852939.tif 000013
式中、Ｄは−ＯＨ及びＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーである。Ｇは、Ｈ及びＲ１−Ｌ−及び−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーである。Ｒ１は、直鎖又は分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分である。Ｌはリンカー、例えば化学結合（「ゼロ次(zero order)」）、置換若しくは非置換アルキル、及び置換若しくは非置換ヘテロアルキルである。  例示的な実施形態において、ＤがＯＨである場合、Ｇは○であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【０１２５】
本発明は、次の式を有するグリコシル連結基を含むペプチドコンジュゲートを提供する。
【化１２】
0006852939.tif 000014
【０１２６】
他の実施形態において、グリコシル連結基は次の式を有し、式中、指数ｔは０又は１である。
【化１３】
0006852939.tif 000015
【０１２７】
さらに他の実施形態において、グリコシル連結基は次の式を有し、式中、指数ｔは０又は１である。
【化１４】
0006852939.tif 000016
【０１２８】
さらに別の実施形態では、グリコシル連結基は次の式を有し、式中、ｐは１〜１０の整数を表し、ａは０又は１のいずれかである。
【化１５】
0006852939.tif 000017
【０１２９】
例示的な実施形態において、グリコＰＥＧ化ペプチドコンジュゲートは、次に記載の式から選択される。
【化１６】
0006852939.tif 000018
【０１３０】
上記式の中で、指数ｔは０〜１の整数であり、指数ｐは１〜１０の整数である。記号Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えば、Ｇａｌ−ＯＨ）、シアリル部分、シアリル連結基（すなわち、シアリル連結基−ポリマー修飾基（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）、又はポリマー修飾シアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）（“Ｓｉａ−Ｓｉａｐ”））が結合されたシアリル部分を表す。例示的なポリマー修飾糖部分は、式Ｉ及びＩＩによる構造を有する。本発明の例示的なペプチドコンジュゲートは、式Ｉ又はＩＩによる構造を含むＲ１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含む。式Ｉ及びＩＩの空原子価を有する酸素は、グリコシド結合を介してＧａｌ又はＧａｌＮＡｃ部分の炭素に結合されることが好ましい。さらなる例示的な実施形態では、酸素は、ガラクトース残基の３位置で炭素に結合される。例示的な実施形態において、修飾シアル酸は、ガラクトース残基とのα２，３−結合である。別の例示的な実施形態では、シアル酸は、ガラクトース残基とのα２，６−結合である。
【０１３１】
例示的な実施形態において、シアリル連結基は、ポリマーシアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）（“Ｓｉａ−Ｓｉａｐ”）が結合されたシアリル部分を表す。ここで、グリコシル連結基は、シアリル部分を介してガラクトシル部分に連結される。
【化１７】
0006852939.tif 000019
【０１３２】
このモチーフによる例示的な種は、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合、例えばＣＳＴ−１１、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ及びＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを形成する酵素を使用して、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１をグリカンの末端シアル酸にコンジュゲートすることによって調製される。
【０１３３】
別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートのグリカンは、次の群から選択される式及びそれらの組合せを有する。
【化１８】
0006852939.tif 000020
【０１３４】
上記の各式において、Ｒ１５’は既に説明したとおりである。さらに、本明細書に記載される例示的な変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、式Ｉ又はＩＩによる構造を有するＲ１５部分を有する少なくとも１つのグリカンを含む。
【０１３５】
別の例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、次の式を有する少なくとも１つのグリコシル連結基を含み、式中、Ｒ１５は前記シアリル結合基であり、指数ｐは１〜１０から選択される整数である。
【化１９】
0006852939.tif 000021
【０１３６】
例示的な実施形態では、グリコシル連結部分は、次の式を有し、式中、ｂは０〜１の整数であり、指数ｓは１〜１０の整数、指数ｆは１〜２５００の整数を表す。
【化２０】
0006852939.tif 000022
【０１３７】
例示的な実施形態において、ポリマー修飾基はＰＥＧである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は２０〜３０ｋＤａの分子量を有する。例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する。
別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は２０ｋＤａの分子量を有する。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は３０ｋＤａの分子量を有する。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約５ｋＤａの分子量を有する。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約１０ｋＤａの分子量を有する。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１３８】
例示的な実施形態では、グリコシル連結基は直鎖１０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシル連結基の１つ又は２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は直鎖２０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシル連結基の１つ又は２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は直鎖３０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシル連結基の１つ又は２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は直鎖５ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシル連結基の１つ、２つ又は３つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は直鎖４０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシル連結基の１つ又は２つはペプチドに共有結合されている。
【０１３９】
さらなる例示的な実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、本明細書に記載の方法に従ってペグ化される。特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、変異Ｓ１７２Ｔ及びＲ１７６Ａを含み、アミノ酸Ｓ及びＲの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。より具体的には、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。本明細書において詳細に説明したように、トレオニン残基に結合され、新たに導入されるトレオニン残基をＰＥＧ部分に連結する少なくとも１つのグリコシル部分は、実質的に、あらゆる可能なグリコシル部分であったよい。唯一の制限は、トレオニンに結合できるはずであることと、より具体的にはリンカー、例えばアミノ酸残基、特にグリシンを介して、ＰＥＧ又はｍ−ＰＥＧに結合されることができるはずであることである。特定の実施形態において、少なくとも１つのグリコシル部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）及び／又はシアル酸（Ｓｉａ）を含む。より詳細な実施形態において、少なくとも１つのグリコシル部分は、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−、すなわち、ＧａｌＮＡｃ及びＳｉａの２つのグリコシル部分を含み、ＰＥＧ残基は、ＧａｌＮＡｃ又はＳｉａ、特にＳｉａに結合されることができる。ＰＥＧ部分に結合されていないグリコシル部分は、新たに導入されるトレオニン残基に結合されることができる。
【０１４０】
別の特定の実施形態では、２０ｋＤａのＰＥＧ部分は、リンカー、例えば、アミノ酸残基、特にアラニン又はグリシンなどの小さなアミノ酸、より具体的にはグリシン（Ｇｌｙ）を介して、少なくとも１つのグリコシルリンカーに結合されている。それゆえ、ＰＥＧ又はｍ−ＰＥＧ部分はアミノ酸に結合され、アミノ酸はＳｉａなどのグリコシル部分に結合される。グリコシル部分は、アミノ酸リンカー（存在する場合）、及び変異体ＦＧＦ−２１アミノ酸配列に新しく導入されたトレオニン残基に結合される。アミノ酸残基は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０３１４６４に記載された方法を介して、ＰＥＧ及びグリコシル残基に結合される。
【０１４１】
特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）コンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含み、ここで、ＧａｌＮＡｃは、例えば、新たに導入されたトレオニン残基及びＳｉａに結合されている。Ｓｉａは、グリシン残基を介して、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、又は３３ｋＤａのＰＥＧにさらに結合される。
【０１４２】
より詳細な実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）コンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含み、ここで、ＧａｌＮＡｃは、例えば、新たに導入されたトレオニン残基及びＳｉａに結合されている。Ｓｉａは、グリシン残基を介して、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、又は３０ｋＤａのＰＥＧにさらに結合される。
【０１４３】
さらにより詳細な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）コンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含み、ここで、ＧａｌＮＡｃは、例えば、新たに導入されたトレオニン残基及びＳｉａに結合されている。Ｓｉａは、グリシン残基を介して、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、又は３０ｋＤａのＰＥＧにさらに結合される。
【０１４４】
さらにより詳細な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）コンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含み、ここで、ＧａｌＮＡｃは、例えば、新たに導入されたトレオニン残基及びＳｉａに結合されている。Ｓｉａは、グリシン残基を介して、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧにさらに結合される。
【０１４５】
さらにより詳細な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）コンジュゲートは、構造−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｉａ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含み、ここで、ＧａｌＮＡｃは、例えば、新たに導入されたトレオニン残基及びＳｉａに結合されている。Ｓｉａは、グリシン残基を介して、２０ｋＤａのＰＥＧにさらに結合される。
【０１４６】
特に具体的な実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは次の構造を含み、式中、ｎは、図１にも示されているように、４５０〜４６０から選択される整数である。
【化２１】
0006852939.tif 000023
【０１４７】
２０ｋＤａのＰＥＧは、直鎖又は分岐であってよく、より具体的には、２０ｋＤａのＰＥＧは、直鎖の２０ｋＤａＰＥＧである。さらに、２０ｋＤａのＰＥＧは、特に、２０ｋＤａのメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ）である。異なる分子量のＰＥＧ及びｍＰＥＧは、例えば、米国テキサス州プラノのＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ、又はドイツ国ウルムのＭｅｒｃｋｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃなどの様々なサプライヤーから入手することができる。ＰＥＧ２０ｋＤａは、ＰＥＧ残基のサイズが平均で２０ｋＤａであることを意味し、ＰＥＧ残基の大部分が２０ｋＤａのサイズであることは当該技術分野で理解されている。
【０１４８】
＜変異体ＦＧＦ−２１ペプチド及びそのコンジュゲート＞
本発明者らは、非常に長い半減期を有する変異体を含む驚くべき特性を有する線維芽細胞成長因子−２１（ＦＧＦ−２１）の変異体を作製した。この変異体は、
ｉ）少なくとも１つのプロリン（Ｐ）残基のＣ末端側に隣接する少なくとも１つのトレオニン（Ｔ）残基を含む変異体ＦＧＦ−２１ペプチドであって、アミノ酸配列の少なくとも９５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同一の対応する天然ＦＧＦ−２１には存在しない少なくとも１つのＯ結合型グリコシル化を形成することができる、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドと、
ｉｉ）少なくとも１つのグリコシル部分を介して、前記変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの少なくとも１つのトレオニン残基で共有結合された２０−３０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、を含む。
【０１４９】
２０−３０ｋＤａのＰＥＧ残基を結合するために、トレオニン残基が、天然ＦＧＦ−２１ＦＧＦのアミノ酸配列に既に存在するプロリン残基、すなわち天然プロリン残基のＣ末端側に隣接する位置にある天然ＦＧＦ−２１のアミノ酸配列に導入される。この目的のために、（ｉ）追加のトレオニンが天然プロリン残基のすぐ隣りに導入されるか、又は（ｉｉ）天然プロリン残基の末端側に隣接するＦＧＦ−２１の天然アミノ酸配列に存在する天然アミノ酸がトレオニン残基に転換される。本発明において、前記選択肢（ｉｉ）は例示的な実施形態である。本明細書に記載されるように、複数のトレオニン残基が、既に存在するプロリン残基のＣ末端に隣接する位置に導入され得る。したがって、本発明の変異体ＦＧＦ−２１は、追加に導入されたトレニオン残基と、天然アミノ酸の代わりに導入されたトレオニン残基の両方を含むことができる。
【０１５０】
プロリン残基のＣ末端側にてプロリン残基に隣接する新しいトレオニン残基を導入することにより、Ｏ−グリコシル化酵素のコンセンサス配列が形成される。プロリン残基は通常、タンパク質の表面（例えば、ターン、キンク、ループなどの中）に存在するため、プロリン残基に近接するＰＥＧ−グリコシル部分を使用してＯ−グリコシル化及びＰＥＧ化を要求する設計は、グリコシル又はグリコール−ＰＥＧ部分を転移するグリコシルトランスフェラーゼへの標的結合部位の相対的アクセス可能性がもたらす利点を有し、コンジュゲートされたグリコシル及び／又はＰＥＧ構造を、タンパク質構造を破壊することなく収容する能力を有する。
【０１５１】
トレオニン残基をＦＧＦ−２１の天然アミノ酸配列へ導入するために、組換え遺伝学の分野における通常の技術が用いられる。本発明において使用する一般的な方法を開示した基本的な文献として、文献（Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(3rd ed.2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及び Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology(1994)）がある。
【０１５２】
特定の実施形態において、天然ＦＧＦ−２１アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるヒトＦＧＦ−２１の天然アミノ酸配列に対応する。
【０１５３】
特定の実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、アミノ酸配列ＰＴ、すなわちプロリン残基にＣ末端で隣接するトレオニン残基を含む。前記配列ＰＴは、天然ＦＧＦ−２１アミノ酸配列には存在しない。
【０１５４】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、任意選択的に、Ｐ１７２Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は３）、Ｐ１５６Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、Ｐ５Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、Ｐ３Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、Ｐ９Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、Ｐ５０Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、Ｐ６１Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、Ｐ７９Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、Ｐ９１Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、Ｐ１１６Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、Ｐ１２０Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｐ１２５Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｐ１２９Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｐ１３１Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｐ１３４Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ１３９Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ１４１Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ１４４Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｐ１４５Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｐ１４８Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｐ１５０Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｐ１５１Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｐ１５８Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｐ１５９Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｐ１６６Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｐ１７８Ｔ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、プロリン及びトレニオンの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるＦＧＦ−２１の天然アミノ酸配列に基づいている。具体的には、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいて、Ｐ１７２Ｔ、Ｐ１５６Ｔ、Ｐ５Ｔ及びそれらの組合せからなる群、特に、Ｐ１７２Ｔ、Ｐ１５６Ｔ及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。さらに具体的には、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づく配列モチーフＰ１７２Ｔを含み、プロリン及びトレニオンの位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。
【０１５５】
特定の実施形態では、プロリン残基は、アミノ酸１４５と変異体ＦＧＦ−２１ペプチドのＣ末端との間に位置し、アミノ酸１４５の位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。本明細書に示される結果によって実証されるように、ＦＧＦ−２１のＣ末端は、驚くべきことに、ＰＥＧの結合、特にグリコシル−ＰＥＧ部分の結合を許容する。文献では、ＦＧＦ−２１のβ−クロトー結合には無傷のＣ末端を必要とすることが報告されているため、これは予期せぬことであった。
【０１５６】
特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、変異Ｓ１７２Ｔ及びＲ１７６Ａを含み、アミノ酸Ｓ及びＲの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。特に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。変異Ｒ１７６Ａは、トレニオン１７３のＯ結合型グリコシル化部位を導入した後、タンパク質の全体的な安定性に有益であることがわかった。この変異によって、比較的大きなアルギニン側鎖は除去され、アラニンの小さな側鎖に置換された。アラニンの小さい側鎖は、シンジケエ変異されたＦＧＦ−２１ペプチドに結合される多量のグリコシル−ＰＥＧ部分との干渉が少ないと考えられる。
【０１５７】
別の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは変異Ｑ１５７Ｔを含み、アミノ酸Ｑの位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。特に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すアミノ酸、すなわちＤ６Ｔを含み、アミノ酸Ｄの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいている。特に，変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、より具体的にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、さらに具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、最も具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
さらに本発明は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。担体は、水又は生理学的に適合性のある緩衝液などである。医薬組成物は、典型的には、活性剤として、治療上有効な量又は薬学的に活性な量の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は、様々な薬物送達システムでの使用に適している。本発明で使用するのに適した製剤(formulations)は、文献（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)）に記載されている。薬物送達の方法の簡単な説明については、文献（Langer、Science 249:1527-1533(1990)）を参照することができる。医薬組成物は、皮下注射、エアロゾル吸入、又は経皮吸着などにより、非経口投与、鼻腔内投与、局所投与、経口投与、又は局所投与することより、予防処置及び／又は治療のために用いられる。一般に、医薬組成物は、非経口的に、例えば皮下投与又は静脈内投与される。それゆえ、本発明は、非経口投与用の組成物を提供するもので、該組成物は、許容される担体、特に水性担体（例えば水、緩衝水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））などに溶解又は懸濁された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む。組成物はまた、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０などの洗剤；マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロースなどの安定剤；及びＥＤＴＡやｍ−クレゾールなどの防腐剤を含むことができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤、緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、洗剤などを含むことができる。
【０１６１】
本発明の医薬組成物は、従来の滅菌技術により滅菌されてもよく、又は滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージに入れてもよいし、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性担体と混合される。ＦＧＦペプチドコンジュゲートを含む組成物は、予防処置及び／又は治療のために、特に糖尿病又は糖尿病関連疾患の処置、特に２型糖尿病、ＮＡＳＨ及びメタボリックシンドロームの処置のために投与されることができる。治療用途では、組成物は、既に糖尿病又は糖尿病に関連する状態にある被験体に対して、疾患及びその合併症の症状を治癒又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量が投与される。これを達成するのに十分な量は「治療上有効な量」として定義され、通常は患者の健康状態と体重に依存する。ＮＡＳＨ及び２型糖尿病の様々な動物モデルで試験した場合、有効用量は０．１ｍｇ／ｋｇ乃至６ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１６２】
本発明は、疾患及び／又は該疾患の障害若しくは症状を治療する方法を提供するもので、治療上有効な量の化合物（本明細書に記載された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート）又は前記化合物を含む医薬組成物を、被験体（例えば、人間などの哺乳類）に投与することを含む。それゆえ、一実施形態は、糖尿病又は糖尿病関連疾患（例えば、２型糖尿病、ＮＡＳＨ又はメタボリックシンドローム）又はその症候を患っている被験体を治療する方法である。この方法は、疾患又は障害が治療される条件下で、本発明に記載された化合物又は該化合物を含む組成物を、疾患又は障害又はその症状を治療するのに十分な量を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１６３】
組成物の１回投与又は複数回投与は、治療医師によって選択される用量レベル及びパターンで行われることができる。いずれにしても、医薬組成物は、そのような治療を必要とする被験体を効果的に治療するのに十分な量の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを供給すべきである。
【０１６４】
医薬組成物において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、典型的には０．１  ｍｇ／ｍＬ乃至５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度、特に１ｍｇ／ｍＬ乃至４５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度、より詳細には１０ｍｇ／ｍＬ乃至４０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度、最も詳細には、２６±４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。より詳細な実施形態では、医薬組成物中の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの濃度は３３±７ｍｇ／ｍＬであるか、より詳細には２６±４ｍｇ／ｍＬである。
【０１６５】
医薬組成物の全ての成分及び該成分の特定の濃度は、非常に多くの異なる条件、化合物及びそれらの濃度を試験した後に慎重に選択された。それゆえ、本明細書に開示される医薬組成物は、化合物及び化合物濃度は任意に選択されたものでなく、本発明に係る変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート又は変異体ＦＧＦ−２１が含まれる水性医薬組成物が薬剤として最も最適であることが見出された条件を具体的かつ合理的に選択したものである。
【０１６６】
さらに、医薬組成物は、特に緩衝剤を含み、具体的にはリン酸塩又はトリス緩衝液、より具体的にはトリス緩衝液、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＨＡＭ）を含む。任意選択的に、緩衝剤は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度、特に２ｍＭ〜７５ｍＭの濃度、より具体的には５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、さらに具体的には１０ｍＭ〜２５ｍＭの濃度、最も具体的には１６±２の濃度で存在する。トリス緩衝液が選択されるのは、タンパク質の溶解性が他の緩衝系よりも優れていることがわかり、ｐＨをｐＨ７．５に維持するのに適しているためである。このｐＨは、ＰＥＧ化された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの長期保存に最適なものと考えられる。さらに、低温でのトリス結晶化の可能性は、リン酸塩ベースの緩衝剤の可能性よりも低い。
【０１６７】
本発明者は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは６．０未満のｐＨでは沈殿する可能性があることを見出した。任意選択的に、医薬組成物のｐＨは、６．０〜８．５の範囲、特に６．５〜８．０の範囲、より詳細には６．７５〜８．０の範囲、さらに詳細には７．０〜８．０の範囲であり、最も詳細には７．５±０．３である。ｐＨが７〜８の範囲にある場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの断片化が最も少なく、ＳＥＣの凝集が最も少ないことが観察されたためである。このｐＨは、粘度に関する選択の場合も同じであることが確認されている。溶液のｐＨは溶液の温度に依存する場合があるため、ｐＨは２５±２℃で測定されたものが適用されるべきである。ｐＨはＨＣｌで調整される。医薬組成物は、塩、特に無機塩、より具体的にはＮａＣｌをさらに含むことができる。任意選択的に、塩は、３０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度、特に４０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度、より詳細には５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度、最も詳細には５６±２ｍＭの濃度で存在する。塩、特にＮａＣｌの存在は、ＰＥＧ含有試料の中で増加する粘度を下げるのに有益である。同じ理由で、ソルビトール及び／又はグリシンを含めることも有利である。
【０１６８】
医薬組成物は、張度調整剤をさらに含むことができる。張度調整剤は、グリセロール、アミノ酸、塩化ナトリウム、タンパク質、糖及び糖アルコールからなる群から選択され得る。特定の実施形態では、張度調整剤は糖であり、より具体的には、張度調整剤はスクロースである。張度調整剤、特にスクロースは、活性剤、すなわち変異体ＦＧＦ−２１ペプチド（コンジュゲート）の凝集を低減するために、医薬組成物に有利な効果があることがわかった。
【０１６９】
張度調整剤、特にスクロースは、５０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度、より具体的には１００ｍＭ〜１７５ｍＭの濃度、さらに具体的には１３５ｍＭ〜１６０ｍＭの濃度、最も具体的には１５０±２ｍＭの濃度で存在することができる。
【０１７０】
医薬組成物は、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤又は非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートベースの非イオン性界面活性剤であって、特にポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり、より詳細にはポリソルベート２０である。界面活性材は、特にポリソルベート２０の場合、１０μｍより小さな肉眼では見えない粒子を低減し、医薬組成物に対して安定化効果を有すると思われる。
【０１７１】
界面活性剤又は非イオン性界面活性剤、特にポリソルベート２０又はポリソルベート８０、より詳細にはポリソルベート２０は、任意選択的に、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度、特に０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度、より詳細には０．２±０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。ポリソルベート２０又は８０、特にポリソルベート２０は、製剤を凝集に対して安定化させることがわかった。
【０１７２】
特定の実施形態において、医薬組成物は、０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ、特に３３±７ｍｇ／ｍＬの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートと、１ｍＭ〜１００ｍＭ、特に２０±２ｍＭの緩衝剤、特にトリス緩衝液と、３０ｍＭ〜２００ｍＭ、特に７０±２ｍＭの塩、特にＮａＣｌと、を含み、ｐＨは７．５±０．３（具体的には２５±２℃で測定されたｐＨ）である。
【０１７３】
より具体的には、医薬組成物は、０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ、特に２６±４ｍｇ／ｍＬの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートと、１ｍＭ〜１００ｍＭ、特に１６±２ｍＭの緩衝剤、特にトリス緩衝液と、３０ｍＭ〜２００ｍＭ、特に５６±２ｍＭの塩、特にＮａＣｌと、５０ｍＭ〜２００ｍＭの張度調整剤、特にスクロースと、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、特に０．２±０．０２ｍｇ／ｍＬの界面活性剤又は非イオン性界面活性剤、特にポリソルベート２０と、を含み、ｐＨは７．５±０．３（具体的には２５±２℃で測定されたｐＨ）である。
【０１７４】
また、本発明は、本明細書に記載された本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、又は本明細書に記載された本発明の医薬組成物を収容する医薬品容器を提供する。特定の実施形態では、医薬品容器は、シリンジ、バイアル、輸液ボトル(infusion bottle)、アンプル、カープル、針保護システムを備えたシリンジ、又はペン型注射器内のカープルである。
【０１７５】
本発明はさらに、本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを作製する方法を提供するもので、該方法は、
（１）発現宿主の中で変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを組換え的に産生するステップ、及び
（２）前記ステップ（１）の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドに、２０ｋＤａのＰＥＧ又は３０ｋＤａのＰＥＧのグリコシル部分を酵素的に結合するステップ、を含み、
前記ステップ（２）は、特にインビトロプロセスで無細胞であり、これによって、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１７６】
特定の実施形態において、方法は次のとおりである。最初の変異(mutation)は、プロリン残基のＣ末端側に隣接する位置にトレニオンを導入し、任意選択的に、１又は複数のさらなる変異体を導入することである。変異体は、天然又は変異体ＦＧＦ−２１、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１におけるヒトＦＧＦ−２１をコードする核酸配列に導入される。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドをコードする核酸配列は、発現宿主のタンパク質発現に適した発現ベクターに導入される。例えば、部位特異的変異誘発(site-directed mutagenesis)などのように変異体を核酸配列へ導入する方法、及び、変異した核酸配列を発現ベクターに組み込むことは、当業者に広く知られている（例えば “A Guide to Methods in the Biomedical Sciences" by R.B. Corley, Springer Science & Business Media, 2006 を参照）。
【０１７７】
タンパク質の発現、任意選択的な精製の後、ＰＥＧ残基は、少なくとも１つのグリコシル部分を介して、そして、任意選択的に、ＰＥＧとグリコシル残基との間に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を介して、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの新たに導入されたトレニオン残基に結合される。
【０１７８】
本発明の変異体ＦＧＦ−２１をコードする核酸を高い収率で発現させるために、典型的には、変異体線維芽細胞成長因子をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターにサブクローニング(subclone)することが行われ、前記発現ベクターには、転写を指令する強力なプロモータ、転写／翻訳ターミネータ、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位が含まれる。適当な細菌プロモータは、当該技術分野で広く知られており、例えば、上記の文献（Sambrook and Russell、及びAusubel et al）に記載されている。天然又は変異体ＦＧＦ−２１を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌(Escherichia coli (E. coli))、バチルス種(Bacillus sp.)、サルモネラ(Salmonella)、及びカウロバクター(Caulobacter)の中で利用可能である。そのような発現系キットは商業的に入手可能である。哺乳動物細胞、酵母、及び昆虫細胞用の真核生物発現システムは、当該技術分野で広く知られており、商業的にも入手可能である。一実施形態において、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター、又はレトロウイルスベクターである。特定の実施形態では、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、大腸菌細胞の中で組換え的に産生され、発現宿主は大腸菌である。
【０１７９】
産生の例示的な方法は、この段落に記載される。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、封入体(inclusion bodies)として大腸菌内で発現される。細胞は、遠心分離により、収穫物(harvest)から回収され、破壊される。封入体は、洗浄され、遠心分離により回収される。ＰＥＧ化されていない変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの精製は、封入体の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを可溶性にし、ペプチドをリフォールディングすることによって開始する。リフォールディングされた変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、濾過され、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｑクロマトグラフィー樹脂を用いた２つのアニオン交換クロマトグラフィーの結合溶出モードで精製される。精製された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、必要に応じて、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２（５ｋＤ  ＭＷＣＯ）メンブレンを使用した限外濾過(ultrafiltration)によって濃縮されることができる。精製された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、滅菌ＰＥＴＧボトルの中に入れられ、７０℃以下の温度で保存される。
【０１８０】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドのグリコＰＥＧ化は、２つの酵素反応により、連続又は同時に行われる。このステップの後、０．２μｍの濾過と２回のアニオンクロマトグラフィー工程が行われる。クロマトグラフィーは、どちらもＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー樹脂を使用し、結合溶出モードで行われる。最終の濃縮ステップは、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用し、限外濾過によって行われる。図３〜図５は、産生の例示的方法を示している。
【０１８１】
炭水化物の合成には、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）とグリコシダーゼとの２つの主要なクラス（類）の酵素が使用される。グリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼ（例えば、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）及びエンドグリコシダーゼ（例えば、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）としてさらに分類される。これらクラスの酵素は、各酵素が、炭水化物を調製するための合成用として使用されている。その一般的な説明は、文献（Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98- 111 (1998)）に記載されている。また、国際公開公報ＷＯ２００３／０３１４６４、ＷＯ２００５／０８９１０２、ＷＯ２００６／０５０２４７、ＷＯ２０１２／０１６９８４を参照することもできる。これらの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
特定の実施形態では、ステップ（２）は、ＧａｌＮＡｃを、ＧａｌＮＡｃ供与体から、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの少なくとも１つのトレニオン残基に転移させるのに適した条件下で、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと接触させるステップ（２ａ）を含む。この転移の条件については、実施例の項目で説明する。任意選択的に、ＧａｌＮＡｃ供与体はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、特に、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼはＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２である。
【０１８３】
特定の実施形態において、ステップ（２）は、ステップ（１）の生成物を、例えば、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａを２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体から変異ペプチドの少なくとも１つのトレニオン残基へ転移させるのに適した条件下で、又は、３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａを３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体から変異ペプチドの少なくとも１つのトレニオン残基へ転移させるのに適した条件下で、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体とシアリルトランスフェラーゼとに接触させるステップ（２ｂ）を含む。また、前記段落のステップ２（ａ）を含む実施形態において、ステップ（２）は、ステップ（２ａ）の生成物を、例えば、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａを２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体から変異ペプチドの少なくとも１つのトレニオン残基へ転移させるのに適した条件下で、又は、３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａを３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体から変異ペプチドの少なくとも１つのトレニオン残基へ転移させるのに適した条件下で、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体とシアリルトランスフェラーゼとに接触させるステップ（２ｂ）を含む。任意選択的に、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ−ＣＭＰであり、３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ−ＣＭＰであり、及び／又は、シアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。また、既に説明したように、「２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ」という用語は、「２０ｋＤａのＰＥＧ−リンカー−Ｓｉａ」及び「２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｓｉａ」を含み、「３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ」にとい用語は、「３０ｋＤａのＰＥＧ−リンカー−Ｓｉａ」及び「３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｇｌｙ−Ｓｉａ」を「含む。
【０１８４】
より詳細な実施形態において、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｓｉａ供与体は、次の構造を含み、式中、ｎは、２０ｋＤａの分子量となる整数であり、４５０〜４６０から選択される。
【化２２】
0006852939.tif 000024
この構造にはＧｌｙリンカーが含まれる。当業者であれば、その製造方法は国際公開ＷＯ２００３／０３１４６４に記載されていることは理解し得るものであり、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１８５】
発現後、グリコＰＥＧ化反応の前に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを精製することが望ましい。それゆえ、任意選択的に、 方法は、ステップ（１）の後、ステップ（２）の前に、組換え産生後、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを精製するステップ（３）をさらに含む。方法は、ステップ（２）の後、ステップ（２）で形成された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを精製するステップ（４）をさらに含むことができる。
【０１８６】
精製するステップ（３）及び／又はステップ（４）は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過及びそれらの組合せからなる群から選択される方法に供することを含むことができる。ステップ（３）及び／又はステップ（４）は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濾過又はそれらの組合せの１又は複数のステップを含むことができる。
【０１８７】
ステップ（３）及び／又はステップ（４）は、特に、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドを１又は複数のイオン交換クロマトグラフィー、より具体的には少なくとも２つのイオン交換クロマトグラフィー、さらに具体的にはアニオンクロマトグラフィーに供することを含む。
より詳細な実施形態において、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドは、２つのアニオンクロマトグラフィーステップ、より具体的には、ステップ（３）とステップ（４）において２つの強アニオンクロマトグラフィーステップに供される。
【０１８８】
アニオンクロマトグラフィーは、特に、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックス、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＥＡＥ）、アガロース、ポリスチレン／ジビニルベンゼンポリマーマトリックス、四級アンモニウム（Ｑ）強アニオンクロマトグラフィー及びそれらの組合せから成る群から選択されたメンバーを使用する。より具体的には、ステップ（３）において、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックスを用いる２つのカラムが使用される。さらに詳細には、ステップ（３）において、２つのＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）−Ｑカラムが使用される。Ｅｓｈｍｕｎｏ−Ｑ樹脂は、親水性ポリビニルエーテルベースマトリックスを有し、するＥｓｈｍｕｎｏR−Ｑ樹脂は、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂も本発明において有用である（GE Health Care Life Sciences, Chalfont St Giles, UK）。アフィニティークロマトグラフィーは、アニオン性アントラキノン色素アフィニティークロマトグラフィーであってよく、濾過は、改質された親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンを使用することができる。別の実施形態では、２つの弱アニオン交換クロマトグラフィーステップ、又は、１つが強アニオンで１つが弱アニオンの交換クロマトグラフィーステップが行われる。
【０１８９】
代替の実施形態において、ステップ（３）の精製は、以下のように、任意選択的に与えられた順序で実行される。
１．イオン交換クロマトグラフィー、特にアニオンクロマトグラフィー、
２．任意選択的に、アフィニティークロマトグラフィー
３．任意選択的に、イオン交換クロマトグラフィー、特にアニオンクロマトグラフィー、及び
３．濾過。
【０１９０】
例示的な精製は、実施例の項目で説明する。一般的に、クロマトグラフィー精製ステップは、製造元のプロトコルに基づいて実施される。さらなる情報については、例えば  文献（“Protein Purification Protocols”, Paul Cutler, Springer Science & Business Media, 2004）を参照することができる。
【０１９１】
任意選択的な実施形態において、方法は、ステップ（２）の後、具体的にはイオン交換クロマトグラフィーにより、より具体的には強アニオンクロマトグラフィーにより、さらに具体的には、四級アンモニウム（Ｑ）強アニオンクロマトグラフィーにより、ステップ（２）で形成された変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを、精製するステップ（４）をさらに含む。特定の実施形態において、２つのアニオンクロマトグラフィーステップは、ステップ（４）で行われる。Ｑ−セファロースは、ステップ（４）で本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを精製するのに適したより具体的なカラム材料である。Ｑセファロースは、例えば米国イリノイ州シカゴのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手することができる。
【０１９２】
特定の実施形態では、ステップ（２）及び（３）において、アルギニン、特に少なくとも４００ｍＭのアルギニンが添加される。アルギニンは、タンパク質を分解するプロテアーゼを阻害するために、任意選択的に添加される。アルギニンはタンパク質の損失を防ぐのに有用である。
【０１９３】
最後に、ステップ（３）の後、ステップ（２）の前に、任意選択的なステップ（５）において、発現宿主に由来するエンドトキシンが除去される。このステップでは、ステップ（３）の生成物が、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅ、０．２ミクロンフィルターなどのエンドトキシン除去フィルターを用いて濾過される。
【０１９４】
さらに、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、滅菌濾過されることができる。
【０１９５】
また、本発明は、本発明の方法により得られることができる変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを提供する。
【０１９６】
本発明はまた、医薬として使用するために、また、糖尿病及びその関連疾患、特に２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び／又はメタボリックシンドロームの治療に使用するために、本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート及び／又は本発明の医薬組成物を提供する。本発明はまた、糖尿病及びその関連疾患、特に２型糖尿病、ＮＡＳＨ及び／又はメタボリックシンドロームを治療するために、本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート及び／又は本発明の医薬組成物を使用することを提供する。
【０１９７】
さらに、糖尿病及びその関連疾患、特に２型糖尿病、ＮＡＳＨ、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び／又はメタボリックシンドロームを治療する方法を提供するものであって、本発明に係る変異ＦＧＤ−２１ペプチドコンジュゲート又は本発明に係る医薬組成物を、その治療を必要とする被験体に対して、ある量を投与することを含む。特定の実施形態では、被験体はヒトである。
【０１９８】
ＮＡＦＬＤは西洋諸国で一般的な慢性肝疾患であり、肝硬変に進行する可能性があり、一般に死亡リスクの増加、特に心血管疾患の死亡リスクの増加に関連する。ＮＡＦＬＤの現在の薬理学的治療の有効性は限られているため、この一般的で生命を脅かす疾患に対してより効果的で安全な薬剤を開発することが差し迫って要請されている。ファルネソイドＸ受容体の選択的アゴニストであるオベチコール酸（ＯＣＡ）は、ＮＡＦＬＤの管理のための治療薬として有望であると思われる。ＮＡＳＨ患者のＮＡＳＨ治療（ＦＬＩＮＴ）試験におけるファルネソイドＸ受容体リガンドオベチコール酸により、ＯＣＡ投与が、体重減少と血圧の低下だけでなく、肝臓組織の改善と関連していることが明らかになった。脂質プロファイル及びインスリン感受性に対して悪影響はあるが、ＯＣＡは、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを有する選択された患者、特に、グルコース値及び脂質値が適切に制御された患者には考慮される可能性がある。
【０１９９】
本明細書に記載の化合物及び組成物の臨床的有効性を示す指標(indicators)として、様々な指標が知られており、限定するものではないが、ＨｂＡ１ｃ、グルコース及びインスリン、体重、血清脂質（総コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド）、肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）、肝臓重量、肝臓の相対重量（％体重）、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）、線維症スコア（例えば、肝線維症）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ１β、ＭＣＰ−１）、線維化バイオマーカー（αＳＭＡ、コラーゲン１アルファ）、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリド、及び肝脂肪酸の低下が挙げられる。高分子量（ＨＭＷ）のアディポネクチン又はＨＤＬの少なくとも１つが増加することも、本明細書に記載の化合物及び組成物の臨床的有効性の指標である。例えば、図８〜２０及びその説明を参照することができる。それゆえ、前記指標の少なくとも１つの変化（上記したような）は、本明細書に記載の化合物又は組成物の臨床的有効性を反映する。
【０２００】
特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物又は組成物の治療効果は、血清トリグリセリド値又は血清インスリン値の少なくとも１つの低下に基づいて決定される。例えば、表５を参照することができる。
【０２０１】
ＨＯＭＡ−ＩＲは、例えば、被験体のインスリン抵抗性の存在と程度の指標である。これは、ベースライン（空腹時）血糖とそれに反応するインスリン値との間の動的で正確な指標です。それは、インスリン抵抗性計算機とも称される。人間の場合、健康範囲は１．０（０．５−１．４）である。１．０未満では、被験体がインスリン感受性であることを示し、これは理想的である。１．９を超えると、被験体は、初期のインスリン抵抗性を示していることを表し、２．９を超えると、被験体は有意のインスリン抵抗性を示していることを表す。ＨＯＭＡ−ＩＲ血液コードの計算は、インスリンｕＩＵ／ｍＬ（ｍＵ／Ｌ）Ｘグルコース（ｍｇ／ｄＬ）＝ＨＯＭＡ−ＩＲにより決定される。計算は米国標準単位を必要とする。国際ＳＩ単位から変換するために、インスリンでｐｍｏｌ／ＬからｕＩＵ／ｍＬに変換する場合、６で割り算（÷）し、グルコースの場合でｍｍｏｌ／Ｌからｍｇ／ｄＬ、二編案する場合、８を乗算（Ｘ）する。
【０２０２】
また、本発明は、治療レジメンについても提供する。このレジメンにより、治療上有効な量の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、及び、治療上有効な量の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物の投与が、１日２回、１日１回、２日間毎、週に３回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は月に１回、行われる。本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの長期有効性は、動物モデル系でこれらのコンジュゲートについて決定された驚くほど長い半減期によって証明される。例えば、実施例１１、１２、及び１３を参照することができる。次に、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの長期有効性により、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの投与頻度を少なくすることが可能になる。それゆえ、特定の実施形態では、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートを含む組成物は、投与を必要とする被験体に対して、週に１回又はそれ以上の頻度で投与されることができる。例えば、本明細書に記載の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートを含む組成物は、７日に１回、８日に１回、９日に１回、１０日に１回、１１日に１回、１２日に１回、１３日に１回、１４日に１回、１５日に１回、１６日に１回、１６日に１回、１７日に１回、１８日に１回、１９日に１回、２０日に１回、２１日に１回、２２日に１回、２２日に１回、２３日に１回、２４日に１回、２５日に１回、２６日に１回、２７日に１回、２８日に１回、２９日に１回、３０日に１回に１回、又は３１日に１回、投与されることができる。
【０２０３】
別の例示的な治療レジメンにおいて、本明細書に記載の化合物及びそれを含む組成物は、導入療法(induction therapy)を行い、次いで、維持療法(maintenance therapy)が行われる。導入療法の投与は、治療レジメンの開始時に週２回又は週１回のように頻度を多くし、維持療法の投与は、隔週又は月に１回の頻度で行われる。このようなレジメンは、初期治療が、被験体の状態を、疾患／状態の維持に許容され得る臨床状態を達成する上で、許容可能な管理可能なレベルまで改善するという点で効果的である。その後、維持療法は、健康レベルを維持レベルに保つために使用される。
【０２０４】
糖尿病及びその関連疾患、特に２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び／又はメタボリックシンドロームを治療するための化合物及び／又は組成物の治療効果は、当業者に知られている様々なパラメータ及びアッセイ、並びに本明細書に記載されたパラメータ及びアッセイを使用して評価されることができる。ＨｂＡ１Ｃの測定は、長期間にわたって被験体の血糖インデックスを測定するための標準的なアッセイと考えられる。それゆえ、これは、血糖インデックスの安定した指標であり、約３〜４か月間のグルコース値を反映する。したがって、糖尿病（例えば、２型糖尿病）を有する被験体は、適切なアッセイで決定されたＨｂＡ１Ｃの割合によって定義され得る。
【０２０５】
糖尿病のない健康な人の場合、ヘモグロビンＡ１ｃ値の正常範囲は４％〜５．６％である。ヘモグロビンＡ１ｃ値が５．７％〜６．４％のとき、糖尿病を発症する可能性が高いことを示す。６．５％以上の値の人は糖尿病であることを示す。
【０２０６】
特定の実施形態において、ＨｂＡ１Ｃは、ＨＰＬＣにより、糖化ヘモグロビン試験システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Hercules,CA,USA）を使用して測定される。血液試料（例えば、１回あたり１．０ｍＬ）が、橈側皮静脈又は伏在静脈からＢＤＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｋ２−ＥＤＴＡチューブの中に集められる。試料は直ちに４℃で保管されるか、又は濡れた氷の上で維持され、血液を採取したその日に分析される。血液中のＨｂＡ１ｃ値は、糖化ヘモグロビン試験システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Hercules,CA,USA）を使用し、ＨＰＬＣを用いて当業者により測定されることができる。
【０２０７】
ＮＡＳＨに関しては、この状態は現在、生検によってのみ診断されている。しかしながら、肝臓脂肪（ＭＲＩで決定）等のＮＡＳＨを予測可能と考えられる幾つかのセロゲートバイオマーカー(serogate biomarkers)、肝臓酵素（ＡＬＴ及びＡＬＴ／ＡＳＴ比）、及びｐｒｏ−Ｃ３などの線維症バイオマーカーがある。
【実施例】
【０２０８】
＜実施例１：ＦＧＦ−２１変異体の調製＞
［１．１］ＦＧＦ−２１の発現ベクターとｃＤＮＡ
このプロジェクトに使用される発現ベクターは、ｐＣＷＭ３を指定した。ベクターは、ＧＴ１０翻訳エンハンサーで発現を駆動するための強力なＴＡＣプロモータを有する。ｃＤＮＡを取り込むために選択された部位は、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩである。ヒトＦＧＦ２１遺伝子の完全長成熟形態をコードするｃＤＮＡは、大腸菌発現のためにコドン最適化され、公開された配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１９１１３）に基づいたＢｌｕｅＨｅｒｏｎによって合成した。遺伝子は、発現ベクターを構築するために所望の変異体及び制限部位を組み込オリゴヌクレオチドを２セット使用してＰＣＲ増幅された。
【０２０９】
［１．２］変異体ＦＧＦ−２１構造を生成するためのＰＣＲ反応のオーバーラッピング
制限部位を有するオリゴヌクレオチド配列は下記のとおり（夫々、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ）。
５’オリゴ５’ＧＡＧＧＴＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣ３’（第２段階ＰＣＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）。
３’オリゴ５’ＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＧＡＧＧＣＧＴＡＧ３’（第２段階ＰＣＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）。
【０２１０】
天然のヒトＦＧＦ−２１遺伝子（５μｇ）は、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎより、２００μＬの水に入れて供給を受けた（７５ｎｇ／μＬ）。
【０２１１】
【表Ｂ】
0006852939.tif 000025
【０２１２】
混合物は、滅菌エアロゾル耐性ピペットチップを使用して、滅菌０．２ｍＬの薄壁ＰＣＲ９６ウェルプレートの中に集めた。
【０２１３】
ＰＣＲ反応物（２０μＬ）を、アガロースゲルの装填前に、９６ウェルプレートの中で６Ｘローディングダイ(loading dye)５μＬと混合した。ＴＡＥ緩衝液を使用し、１．５％アガロースゲルを１００Ｖで電気泳動を行なった。インゲルＰＣＲ生成物のゲルスライスを分離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キットを使用して製造元の説明書に従って処理し、５０μＬのＨ２Ｏで溶出した。スペースを節約するために、完全長の変異体を生成するために第２段階のＰＣＲで使用されるプライマリーＰＣＲ生成物の対応する各ペアのバンドを、キットの抽出ウェルの中で混合した。単一段階のＰＣＲ反応生成物である変異体も、第一段階ＰＣＲ生成物に対して上記のとおり生成された。
【０２１４】
ＰＣＲ反応の第２のステップは、次のとおり実施した。
【表Ｃ】
0006852939.tif 000026
【０２１５】
ＰＣＲ生成物はＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで精製し、製造元の説明書に従って５０μＬの水で溶出した。精製されたＰＣＲ生成物とｐＣＷＭ３ベクターについて、以下のようにオートクレーブされた０．５ｍＬ遠心チューブの中で制限酵素消化を行なった。
【表Ｄ】
0006852939.tif 000027
【０２１６】
反応物を３７℃で２時間培養した。次に、１．５％アガロースゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎでローディングする前に、４μＬの６ｘ  ＤＮＡローディング緩衝液を添加し、ＴＡＥ緩衝液の中で１００Ｖで６０分間電気泳動を行なった。
【０２１７】
ゲルＰＣＲ生成物のスライスを分離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キットで製造元の説明書に従って処理し、５０μＬのＨ２Ｏで溶出した。
【０２１８】
［１．３］変異体ＦＧＦ２１遺伝子を発現ベクターｐｃＭＷ３に挿入するためのライゲーション反応
オートクレーブされた０．５ｍＬエッペンドルフチューブの中で、以下の試薬を混合して、ライゲーションを行なった。
０．２μＬｐＣＷＭ３（Ｎｄｅ１及びＸｈｏ１で消化し、アガロースゲルを分離）
１μＬＰＣＲ生成物（Ｎｄｅ１及びＸｈｏ１で消化し、アガロースゲルを分離）
１μＬ１０Ｘ  ＮＥＢリガーゼ緩衝液
０．５μＬ  ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
７．３μＬの水
室温で１時間培養する。
【０２１９】
［１．４］ライゲーション反応でコンピテントＴＯＰ１０大腸菌を形質転換(transform)
オートクレーブされた１．５μＬ微量遠心チューブ(microfuge tube)の中で、融解したＴｏｐ１０化学コンピテント細胞２５μＬに、各ライゲーション反応液１μＬを加えた。４２℃で１分間培養することにより、細胞に熱ショックを与えた。細胞を氷入りバケツに移動させ、２分間保持した。次に、１７５μＬの予熱されたＳＯＣを加え、２５０ｒｐｍに設定された回転プラットフォームで、前記管を３７℃で６０分間培養した。形質転換物の選択は、５０ｍｃｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンが入れられたＭａｒｔｏｎｅ寒天プレート上で形質転換反応を拡大することで行なった。プレートは３７℃で一晩培養した。各ＦＧＦ２１変異体の３コロニーを、２つのＭａｒｔｏｎｅ  ａｇａｒ−Ｋａｎ５０プレートに再びストリークし、１つはコロニーの増幅とシークエンシングのためにＧｅｎｅｗｉｚに送られた。４６個全ての変異体について正しい配列を同定した。
【０２２０】
＜実施例２：グリセロールストックのミニプレップＤＮＡ調製と生成＞
シーケンシングによって同定された正しいコロニーは、５０ｍｃｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンが補給された３ｍＬのＭａｒｔｏｎｅ  Ｌブロスの中で、一晩培養した。製造者の説明書に基づいて、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを使用して、１．５ｍＬの培養液からＤＮＡを分離した。ミニプレップＤＮＡは、−２０℃の１．５ｍＬエッペンドルフチューブの中で保存した。１２０μＬの培養液についても８０μｌの５０％グリセロール溶液で凍結し、最終濃度が２０％グリセロールを生成した。ストックは−８０℃の９６ウェルプレートの中で凍結した。
【０２２１】
化学的にコンピテントなＯｒｉｇａｍｉ２（２５μＬ）を、上記のように、１μＬのミニプレップＤＮＡで構築物から形質転換し、形質転換体の選択についても、上記のように、Ｍａｒｔｏｎｅ寒天Ｋａｎ５０プレート上で行なった。一晩培養物について、数個のコロニーを掻き取り、５０μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシンが補給されたＭａｒｔｏｎｅ  Ｌブロス２ｍＬの中で培養し、その後、２５０ｒｐｍに設定された振とう台(shaking platform)で３７℃にて一晩培養した。翌日、１２０μＬの培養液を８０μＬの５０％グリセロールと混合して、最終濃度２０％グリセロールを生成した。グリセロールストックは、９６ウェルプレートの中で−８０℃で凍結した。
【０２２２】
＜実施例３：ＦＧＦ−２１発現細胞株の生成＞
ＦＧ−２１（野生型、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び各ＦＧＦ−２１変異体をコードするプラスミドＤＮＡは、Ｔｅｖａ（Petach Tikva, Israel）から入手した。ｐＣＷＭ３ベクターを使用したプラスミドＤＮＡの調製は、実施例１に記載されている。全ての大腸菌細胞株は、以下の手順に従って調製した。化学的にコンピテントなＯｒｉｇａｍｉ−２細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を氷の上で溶かして、１０μＬの細胞懸濁液を、オートクレーブされた４℃（氷）の１．７ｍＬ微量遠心チューブの中に入れた。プラスミドＤＮＡ（１μＬ）を滅菌水で１：１０に希釈し、細胞に加えた後、チューブを軽くたたきながら穏やかに混合した。チューブを氷上で３０分間培養した。次いで、微量遠心チューブを４２℃に設定された水槽の中に入れ、４５秒間培養した。次に、チューブを氷の上で２分間冷却した。次に、３００マイクロリットルのＳＯＣ培地（TekNova, Hollister, CA, USA）をチューブに加え、チューブを３７℃で１時間培養した。次に、この反応混合物（１００μＬ）を、硫酸カナマイシン５０μｇ／ｍＬが入れられた予熱（３７℃）寒天プレートの上に広げた。これらの寒天プレートを上下逆さまにして３７℃のインキュベータの中に入れ、１６〜２４時間培養した。次に、プレートをパラフィルムで保護し、４℃で保存した。プレートは、この方法を使用して、数日間保管することができた。
【０２２３】
寒天プレートから３つの個々のコロニーをサイズと形状に基づいて選択し、２５μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンが含まれる２ｍＬのＬＢ−Ｂｒｏｔｈ（TekNova, Hollister, CA, USA）に接種（bacti-loops）した。接種されたチューブを、２５０ｒｐｍ攪拌と３７℃に設定されたシェーカーインキュベータの中で６〜８時間培養した。次に、培養液のアリコート（５０μＬ）を遠心分離（１０，０００ｘｇ、２分間）することにより、細胞を採取した。細胞ペレット（非誘導細胞ペレットと特定）を冷凍し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｎａｌｇｅｎｅクリオバイアルとラベリングされた滅菌バイアルの中で、２００  μＬの５０％グリセロール溶液と３００μＬの細胞培養液を混合することにより、層流フードの中でグリセロールストックを生成した。バイアルをボルテックスし、−８０℃で保存した。
【０２２４】
残りの培養物を、２０℃及び毎分２５０回転（ｒｐｍ）に設定されたシェーカーインキュベータに移し、３０分間培養した。ＩＰＴＧ（１Ｍ溶液）を培養液に加えて最終濃度を０．５ｍＭにし、培養液はシェーカーインキュベータ（２０℃及び２５０  ｒｐｍ）でさらに１２〜１６時間培養した。次に、５０μＬのアリコートを、発酵チューブから取り出して、遠心分離（１０，０００ｘｇで２分間）し、細胞ペレットは誘導細胞ペレットと特定した。製造業者（Thermo Scientific、Waltham、MA、USA）の説明書に従って、非誘導細胞ペレット及び誘導細胞ペレットは、ＤＮＡｓｅ及びリゾチームが添加されたＢ−ＰＥＲ細菌タンパク質抽出試薬５０μＬの中で、再懸濁した。細胞懸濁液は室温で１時間培養した。誘導培養物から細胞溶解物を２０，０００ｘｇで２分間遠心分離した。上澄みを新しいチューブに移し、誘導細胞溶解物と特定した（ゲル上にＳ）。残りのペレットは誘導細胞ペレットと特定した（ゲル上にＰ）。非誘導の全細胞溶解物は、ゲル上にＵＩと特定した。これらの試料は、下記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＦＧＦ−２１発現レベルを決定した。最高レベルの可溶性ＦＧＦ−２１（野生型及び／又は突然変異体）の発現を生じたコロニーを選択して、この研究で目的のタンパク質を産生した。
【０２２５】
＜実施例４：ＦＧＦ−２１（野生型）及びＦＧＦ−２１変異体の発現＞
ＦＧＦ−２１変異体発現の最高レベルをもたらすコロニーを、実施例３に記載の誘導２ミリリットル培養物からのＦＧＦ−２１バンドの染色強度に基づいて選択した。培地が入れられたチューブ（動物質を含まない大豆に２５μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシンが添加された３ｍＬのＬＢブロス）を、最高のプロデューサーに対応するグリセロールストックからの掻き取って接種した。培養物は３７℃、２５０ｒｐｍの条件で一晩（１２〜１６時間）成長した。これらのスタータ培養物（１ｍＬ）を使用して、２５μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシンを含むＬＢブロス１Ｌを接種した。発酵培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、フラスコを培養した（２５０ｒｐｍで３７℃）。この時点で、フラスコを、２０℃、２５０ｒｐｍに設定された別のシェーカーインキュベータに移し、４５〜６０分間培養した。次に、ＯＤ６００を測定し、５００μＬの１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を各フラスコに加え、２０℃、２５０ｒｐｍで１２〜１６時間発酵を続けた。収穫の直前、各フラスコのＯＤ６００を採取した。次に、フラスコを１Ｌの遠心ボトルに移し、４，６５７ｘｇで３０分間、４℃で回転することにより、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｂ−ＰＬＵＳで細胞をペレット化した。上澄みを注意深く漂白剤に移し、廃棄した。細胞を３０〜５０ｍＬの蒸留水の中で再懸濁し、事前に秤量した５０ｍＬ円錐形遠心チューブに移した。３２２０ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離して細胞をペレット化し、上澄みを除去（デカント）し、個々の湿細胞ペレットの重量を測定し、−８０℃で凍結した。
【０２２６】
全てのＦＧＦ−２１野生型及び変異体の発現により、精製及び製剤化後に計算された単離収率(isolated yields)に基づいて、発酵液１リットルあたり１１〜７０ｍｇの十分な収量が得られた（図２）。
【０２２７】
＜実施例５：ＦＧＦ−２１（野生型）及びＦＧＦ−２１変異体の溶解及び精製＞
ＦＧＦ−２１及びＦＧＦ−２１変異体は、ＩＥＸクロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ）、アフィニティークロマトグラフィー（Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、及びＭｕｓｔａｎｇ  Ｑメンブレンによる濾過の組合せを用いて精製した（プロセス１）。開発された代替精製戦略として、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑクロマトグラフィーを使用し、大腸プロテアーゼが除去されるまでＦＧＦ−２１変異体を再び精製した（プロセス２）。後者のプロセスを使用すると、通常、２つのＩＥＸ精製ステップにより残留プロテアーゼが全て除去された。しかしながら、必要に応じて、３つ又は４つのＩＥＸクロマトグラフィーステップを実行することもできる。
【０２２８】
両方のプロセスにおいて、残っているプロテアーゼが除去され、９８％を超える純度の製品が得られた。
【０２２９】
［５．１：プロセス１］
｛５．１．１：ＩＥＸクロマトグラフィー｝
実施例４の細胞ペレット（５グラム）を解凍し、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５）を加えた。ペレットは回転させることによって再懸濁した。次に、細胞懸濁液は、アベスチン乳化剤（Ottawa, ON, Canada）の中を２５，０００ｐｓｉの圧力で３回通過させて細胞を溶解し、懸濁液を２５分間遠心分離（１４，５０２ｘｇ）した。上澄みは別の容器に移すことによって除去し、０．２μｍフィルター（ＴＰＰ１５０ｍＬ  真空フィルタシステム）で濾過し、濾液（導電率≦５μＳ）を、緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と平衡化されたイオン交換カラム（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ；１．０ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ；２４ｍＬ）に投入した。カラムを３カラム容量のローディング緩衝液で洗浄し、２０カラム容量を超える緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０〜２００ｍＭ塩化ナトリウム）の直線勾配を２．０ｍＬ／分の流速で使用してＦＧＦ−２１を溶出した。溶出された生成物はタンパク質分解を防ぐために直ちに凍結して−８０℃で保存するか、又は、次のクロマトグラフィーステップで直ちに処理した。
【０２３０】
｛５．１．２：Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅクロマトグラフィー｝
ＦＧＦ−２１を含む留分を混合し、緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）で１０倍に希釈し、直ちにＴｏｓｏＧｅｌ  Ｂｌｕｅカラム（２ｃｍ  ｘ  １２ｃｍ；２５  ｍＬ）に投入した。次に、カラムを約１００ｍＬの緩衝液で（ベースラインが得られるまで）洗浄し、３．０ｍＬ／分の流速で未結合の物質を除去した。生成物の溶出は、３ｍＬ／分の流速で緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭアルギニン）による溶出ステップを使用して行なった。次に、適切なカラム留分を混合し、緩衝液を新しい緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に交換し、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑメンブレンフィルター（Pall, Port Washington, NY, USA）を通して濾過した。次いで、濾液を調合し、−８０℃で保存した。この工程ステップにより、大部分のＦＧＦ−２１タンパク質のプロテアーゼを除去した。
【０２３１】
［５．２：プロセス２］
｛５．２．１：ＩＥＸクロマトグラフィー−ステップ１｝
実施例４の細胞ペレット（５グラム）を解凍し、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５）を加えた。ペレットは回転させることによって再懸濁した。次に、細胞懸濁液は、アベスチン乳化剤（Ottawa, ON, Canada）の中を２５，０００ｐｓｉの圧力で３回通過させて細胞を溶解し、懸濁液を２５分間遠心分離（１４，５０２ｘｇ）した。上澄みは別の容器に移すことによって除去し、０．２μｍフィルター（ＴＰＰ１５０ｍＬ  真空フィルタシステム）で濾過し、濾液（導電率≦５μＳ）を、緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と平衡化されたイオン交換カラム（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ；１．０ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ；２４ｍＬ）に投入した。カラムを３カラム容量のローディング緩衝液で洗浄し、２０カラム容量を超える緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０〜２００ｍＭ塩化ナトリウム）の直線勾配を２．０ｍＬ／分の流速で使用してＦＧＦ−２１を溶出した。溶出された生成物はタンパク質分解を防ぐために直ちに凍結して−８０℃で保存するか、又は、次のクロマトグラフィーステップで直ちに処理した。
【０２３２】
｛５．２．２：ＩＥＸクロマトグラフ−ステップ２｝
ＦＧＦ−２１を含む留分を混合し、緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５）で４倍に希釈し、緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と平衡化されたＩＥＸカラム（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ；１．０ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ；２５ｍＬ）に直ちに投入した。カラムを３カラム容量のローディング緩衝液で洗浄し、２０カラム容量を超える緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０〜２００ｍＭ塩化ナトリウム）の直線勾配を２．０ｍＬ／分の流速で使用してＦＧＦ−２１を溶出した。溶出した生成物を含む留分がいくらかでも残存して場合には、タンパク質分解を防ぐために、直ちに凍結して−８０℃で保存する。次いで、各カラム留分の少量の試料を使用してプロテアーゼアッセイを行い、プロテアーゼがまだ残っているかどうかを決定する。プロテアーゼがまだ存在する場合、生成物は、上記したように、別のＩＥＸクロマトグラフィーステップ（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ）を使用して再度精製が行われる。次に、カラム留分を混合して配合する。
【０２３３】
［５．３：大規模生産］
図３、４及び５は、本発明の変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを大規模の生産及び精製を示している。図３は、封入体の発酵、細胞収穫、及び取得をまとめたものである。図４は、封入体の可溶化と、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの精製に有利に使用され得る精製ステップを示す。図示の精製方法は、２つのアニオン交換クロマトグラフィーステップを含み、例えば、ＤＡＥ樹脂及びＳＰセファロース樹脂を使用する他の多くの精製プロトコルの中で特定され、大規模発現から変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの最高の収率と最適な純度が得られた。図５は、グリコＰＥＧ化手順と、２つのアニオン交換クロマトグラフィーステップを含むその後の精製プロトコルを示しており、最高の収率と最適な純度を有する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートが得られた。
【０２３４】
＜実施例６：プロテアーゼの除去、ＰＥＧ化されていないＦＧＦ−２１の製剤化及び更なる特徴付け(characterization)＞
この大腸菌発現システムを使用して産生されたＦＧＦ−２１は全て、精製プロセスの緩衝液又は調合緩衝液(formulation buffer)を使用して４℃の温度で保存すると、内因性プロテアーゼにより急速に分解した。そのため、処理中、部分的に精製された試料の全てを直ちに処理するか、又は中間留分がさらなる処理が可能になるまで凍結保存した（−８０℃）。タンパク質の分解は、緩衝液に高濃度のアルギニン（≧４００ｍＭ）を添加することによって阻止されることもできる。
【０２３５】
精製された全てのＦＧＦ−２１は、３０℃で３日間培養することにより、プロテアーゼの除去（安定性）を試験した。プロテアーゼが初期精製後もまだ含まれているＦＧＦ−２１変異体については、第２、第３、又は第４のＩＥＸクロマトグラフィーステップ（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ）のいずれかのステップを使用して、残りのプロテアーゼを除去した。グリコＰＥＧ化反応では３０℃で一晩培養する必要があるため、全てのＦＧＦ−２１試料からプロテアーゼを完全に除去することが不可欠であった。塩濃度の高い（アルギニン、塩化ナトリウムなど）ものを使用すると、これらはグリコＰＥＧ化反応を阻害するため、グリコＰＥＧ化工程中のタンパク質分解を阻止することは不可能である。
【０２３６】
プロテアーゼが除去されたことの決定は、ＦＧＦ−２１及び潜在的なプロテアーゼが含まれる試料又はカラム留分（１０〜５０μＬ）を３０℃で１〜３日間培養することによって行なった。ＦＧＦ−２１のタンパク質分解が３日間で起こらなかった場合、プロテアーゼは完全に除去されたとみなした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、タンパク質分解の程度を決定した。ＩＥＸ留分の精製後、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅクロマトグラフィーを使用して、プロテアーゼが完全に除去されたことを観察した。
【０２３７】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析では、１２％又は４−１２％のどちらかの濃度のＢｉｓ−トリス  ＮｕＰＡＧＥが予め注入されたポリアクリルアミド勾配スラブゲルを使用した。試料は、特に明記しない限り、０．１Ｍ  ＤＴＴを含むＬＤＳ試料緩衝液と１：１で混合し、９５℃で３分間加熱した。ゲル(gels)は、ＭＥＳ緩衝液の中で４０分間、２００Ｖの定電圧で泳動した。タンパク質を可視化するために、電気泳動後、安全な菌株Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ（(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）溶液を使用し、製造業者の説明書に基づいて、必要に応じて室温で５０ｒｐｍで振とうしながら、タンパク質を２〜２４時間染色して可視化した。標準タンパク質には、１８８、９８、６２、４９、３８、２８、１７、１４、及び６ｋＤａ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA，ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ−２標準、カタログ番号ＬＣ５９２５）の質量、又は２２０、１５０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５及び１０ｋＤａ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA，Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ標準）の質量が含まれていた。ゲルを水で脱色した後、タンパク質バンドを可視化し、Ｌｉ−ＣｏｒＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線イメージャでスキャンし、記録した（LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA）。（図６）
【０２３８】
各ＦＧＦ−２１（野生型）及び変異体（ペグ化されていない）を、緩衝液（ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ、ｐＨ６．８；ＮａＣｌ、１００ｍＭ）の中で１ｍＬあたり約１ｍｇのタンパク質に調合し、凍結保存（−８０℃）した。エンドトキシン除去と滅菌濾過は、エンドトキシン除去フィルターディスクユニット（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅ、０．２ミクロンフィルター）を使用して行なった。バイアルを密封し、−８０℃で保管した。全ての試料を試験し、ＩＤ（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）、タンパク質濃度（ＢＣＡ）、凝集（ＳＥＣ）及びエンドトキシンを含む結果をリリースした。
【０２３９】
詳細には、ＩＥＸクロマトグラフィー後に収集されたＦＧＦ−２１をプールし、タンパク質濃度を測定（ＢＣＡ）し、スピンフィルター（Pall, NY, USA、Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；３Ｋ  ＭＷＣＯ、又はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３Ｋスピンフィルター）を使用して濃縮し、３２２０ｘｇで約４５分間、又は残留(retentate)タンパク質濃度が１〜２ｍｇ／ｍＬに達するまで遠心分離した。修飾されていないＦＧＦ−２１タンパク質の調合緩衝液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌであった。  次いで、調合緩衝液を残留液に加え、試料は残留タンパク質濃度が１〜２ｍｇ／ｍＬになるまで上記のように遠心分離した。このプロセスはさらに２回繰り返した。  次いで、調合緩衝液を残留液に加えて、タンパク質濃度を約１ｍｇ／ｍＬにした。
【０２４０】
全てのＦＧＦ−２１タンパク質の製剤化は、無菌環境を維持するＬａｂｃｏｎｃｏキャビネットの中で行われた。０．２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）−Ｅシリンジフィルター（PALL Corporation, NY, USA）の前処理を、製造者の説明書に従って、エンドトキシンを含まない１ｍＬの滅菌水を使用し、手操作で１〜４ｍＬ／分の流量に制御しながら濾過することによって行なった。その後、溶液の濾過を、シリンジを使用して、１〜４ｍＬ／分の流量でＭｕｓｔａｎｇＥカートリッジの中を通過させることによって行なった。濾液を静かに混合し、その後、発熱物質を含まない１．２ｍＬのクライオバイアルの中に分注して、所望の量にした。全ての生成物は、−８０℃で冷凍保存した。
【０２４１】
Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイ（Genscript, Piscataway, NJ, USA、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（登録商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット、カタログ番号Ｌ００３５０）を使用して、エンドトキシン汚染を測定した。ＬＡＬ反応は、修飾ＬＡＬ及び合成発色基質を使用して発色アッセイにおけるエンドトキシンを検出するインビトロの定量的エンドポイントアッセイである。試料中のエンドトキシンの濃度は、その吸光度(absorbance)を、既知の量の標準エンドトキシンを含む溶液の吸光度（４０５ｎｍ）と比較することによって算出した。
【０２４２】
タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ（登録商標）のタンパク質アッセイ試薬キット、部品番号２３２３５（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して決定した。ＢＳＡを使用して標準曲線を作成した。３７℃で３０分間培養した後、プレートは、マイクロプレートリーダの５６２ｎｍで読み取った。試料のタンパク質濃度は、ＢＳＡ標準曲線を参照して計算した。ＰＥＧ化タンパク質は、このアッセイに干渉しない。
【０２４３】
Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（東京、日本）カラム（ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ＸＬ、７．８ｍｍ  ｘ  ３０ｃｍ、カタログ番号７１６５−０６Ｒ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、タンパク質純度と凝集物の量を決定した。カラムを泳動緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）で平衡化し、２０〜５０μＬの試料（１５〜４０μｇのタンパク質）を注入した。この方法では、０．５ｍＬ／分の流量を使用し、Ａ２８０での吸光度を監視した。
【０２４４】
全てのＦＧＦ−２１タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質参照標準混合物（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、カタログ番号１５１−１９０１０）と比較した。Ｂｉｏ−Ｒａｄは、ウシサイログロブリン（６７０，０００）、ウシγ−グロブリン（１５８，０００）、オボアルブミン（４４，０００）、ウマミオグロビン（１７，０００）、ビタミンＢ１２（１，３５０）を含む。参照標準（約２５μＬ）を、希釈していない溶液(neat solution)又は泳動緩衝液で希釈した溶液として注入した。
【０２４５】
＜実施例７：変異体ＦＧＦ２１−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０／３０ｋＤａの産生＞
各変異体のグリコシル化については、ＭＡＬＤＩ質量分析で添加がモニターされたＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃで構成される酵素反応物を使用して評価した。
【０２４６】
変異体ＦＧＦ−２１のグリコＰＥＧ化は、ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０／３０ｋＤａ（２０ｋＤａのＰＥＧ又は３０ｋＤａのＰＥＧのいずれか）を使用して、単一ステップのワンポット反応で行われた。精製されたＦＧＦ−２１変異体は、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（Pall, NY, USA、Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、カタログ番号ＭＡＰ００３Ｃ３７、２０ｍＬ、３Ｋ  ＭＷＣＯ）を使用し、反応緩衝液（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−トリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．７）に緩衝液交換を行なった。緩衝液交換及び濃縮後、ＦＧＦ−２１変異体タンパク質濃度は３〜５ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）であった。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０／３０ｋＤａ（３ｍｏｌ当量）をＦＧＦ−２１変異体（１ｍｏｌ当量）の溶液に溶解した。ＭＢＰ−ＧａｌＮＡｃＴ２（１４−１５ｍＵ／ｍｇ  ＦＧＦ−２１）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（１．１ｍｏｌ当量）、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１（１００ｍＵ／ｍｇ  ＦＧＦ−２１）及びＭｎＣｌ２溶液（１０ｍＭ最終濃度）を反応管に直接添加し、静かに混合した。ＦＧＦ−２１の最終タンパク質濃度は、反応混合物の２〜４ｍｇ／ｍＬである必要がある。次に、反応混合物を３２℃で一晩（約１６時間）培養した。これらは、国際公開公報：ＷＯ２００３／０３１４６４；ＷＯ２００５／０８９１０２；ＷＯ２００６／０５０２４７；及びＷＯ２０１２／０１６９８４を参照することができ、各公報の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
ＦＧＦ−２１−変異体−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０／３０ｋＤａ生成物は、ＩＥＸクロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ；１ｃｍ  ｘ  ２４ｃｍカラム）を使用して精製し、生成物は、塩化ナトリウム勾配［５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、２０カラム容量を超える０〜１００ｍＭの塩化ナトリウム勾配］を用いて、２ｍＬ／分の流速で溶出した。留分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％）で分析し、プールし、濃縮し、製剤化した。全ての生成物について、内容（ＢＣＡ）、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、凝集（ＳＥＣ）、及びエンドトキシンを分析した。
【０２４８】
このプロセスの変換収率をＳＤＳ  ＰＡＧＥで測定し、変換収率は２５〜９０％であった。ペグ化反応混合物は、ＩＥＸクロマトグラフィーを使用して精製した（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ）。各ペグ化製品を製剤化し、リリース試験(release tests)を実施した。リリース試験には、ＩＤ（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）、タンパク質濃度（ＢＣＡ）、凝集（ＳＥＣ）及びエンドトキシンが含まれる。ＰＥＧ化生成物の各々は、９８％を超える純度であり、検出可能な凝集物は無かった。全体の単離収率は、スタート時のＦＧＦ２１タンパク質に基づいて１５〜４４％（モノＰＥＧ）であった。
【０２４９】
グリコＰＥＧ化されたＦＧＦ−２１変異体は全て、スピンフィルターを使用して試料を緩衝液で交換し、調合緩衝液の液量を調整して、所望される約１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得ることによって製剤化した。濃縮中、タンパク質の凝集を防止するために、タンパク質の濃度は５ｍｇ／ｍＬを超えてはならなかった。この研究で使用した調合緩衝液は、リン酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌであった。エンドトキシン除去フィルターディスクユニット（０．２ミクロンフィルター）を使用して、エンドトキシン除去（Ｍｕｓｔａｎ  Ｅ）及び滅菌濾過を行なった。バイアルを密封し、−８０℃で保管した。Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅフィルターは、ＦＧＦ２１を結合することにより、生成物の全体的な単離収率を大幅に低下させることが観察された。
【０２５０】
＜実施例８：肉眼で見えない粒子を分析するためのマイクロフローイメージング＞
４種類の賦形剤（スクロース、ポリソルベート２０、ＥＤＴＡ、及びＬ−メチオニン）が変異体ＦＧＦ−２１コンジュゲートの品質属性に及ぼす効果を評価するために、凍結融解と振動のストレスを繰り返し行なった後、コンジュゲート試料を、限外濾過（ＵＦ）により、約１．０ｍｇ／ｍＬから３６ｍｇ／ｍＬに濃縮し、２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。１１のＴＥＶ−４７９４８製剤を準備し（表１）、１．６ｍＬの充填量で２ｃｃのガラスバイアルに充填し、−２０℃で凍結した。全ての製剤に対して、ストレス（室温で解凍すること、室温で６時間５００ｒｐｍで振とうすること、−２０℃で凍結すること）を与えるステップを４サイクル行なった。解凍後、製剤は、２μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、及び２５μｍ以上の肉眼では見えない粒子をカウントするマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）による分析を行なった。１００μｍフローセルを備えたＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（San Jose, CA）のＭＦＩ５２００システムを使用して、肉眼で見えない粒子を測定した。０．９ｍＬの試料を９６ウェルプレートに加えて、オートサンプラーＢｏｔ１に移した。照明の最適化は、各試料の前に行なった。ＴＥＶ−４７９４８試料は、０．２ｍＬのパージ量、０．６ｍＬの撮像量、０．１７ｍｌ／分の流量、標準的な５倍の倍率で、２回分析した。分析の前に、試料は、ピペットチップで原子混合することによってウェル内で均質化した。ＭＦＩ  Ｖｉｅｗ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭＶＳＳ）に実装された画像フィルターを使用して、タンパク質粒子から気泡の画像を分離した。
【表１】
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表１は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート製剤の組成である。
【０２５１】
ＭＦＩの結果は、ポリソルベート２０を含まない製剤（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ８、Ｆ９）には肉眼で見えない粒子が実質的に多いことを示している。つまり、ポリソルベート２０は、肉眼で見えない粒子の濃度を低下させる（図７）。その結果、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート薬剤生成物について、ＭＦＩによる肉眼で見えない粒子を最小限に抑えるために、推奨される製剤組成は、２６ｍｇ／ｍＬの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート、１６ｍＭトリス、５６ｍＭのＮａＣｌ、０．１５Ｍスクロース、及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０であり、ｐＨ７．５である。
【０２５２】
＜実施例９：インビトロでのＦＧＦ−２１変異体及びグリコＰＥＧ化コンジュゲートの試験＞
ＦＧＦ−２１変異体及びグリコＰＥＧ化ＦＧＦ−２１コンジュゲートを、マウス脂肪細胞のグルコース取込みを測定する細胞ベースアッセイでスクリーニングした。グルコース輸送体発現の増加を通じて、マウス脂肪細胞の中に取り込まれるグルコース量の増加が、ＦＧＦ−２１の機能によることが報告されている（Kharitonenkov et al., 2005, Journal of Clin Invest, 115(6):1627-1635）。このアッセイでは、試験した化合物の効力はＥＣ５０値として表され、この値は、最大反応の半分をもたらす変異体又はコンジュゲートの濃度である。試験試料のＥＣ５０の値が低いほど活性である。
【０２５３】
この目的のために、マウス３Ｔ３−Ｌ１の前駆脂肪細胞を、文献（Kharitonenkov et al., 2005, Journal of Clin Invest, 115(6):1627-1635）の記載と同様な試験を行う準備として、９６ウェルプレートの中で２１日間分化させた(differentiated)。ＦＧＦ−２１変異体及びグリコＰＥＧ化コンジュゲートの連続希釈液を調製し、脂肪細胞に加えて、７２時間培養した。培養の最後の４時間は、細胞を、グルコース濃度が低下した培地に変更し、［３Ｈ］−２−デオキシグルコース（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）で１時間標識した。細胞を洗浄して取込みを停止し、取り込まれていないグルコースを除去した。脂肪細胞を０．１Ｎ  ＮａＯＨ及びシンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ（登録商標） Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）で溶解した。  ［３Ｈ］−２−デオキシグルコースの非特異的取込みは、５０μＭサイトカラシンの存在下で測定した。プレートの読取りは、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）ＬＳＣカウンター（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）で行なった。
【０２５４】
グリコＰＥＧ化されていないＦＧＦ−２１変異体の効力を表２にまとめており、変異体だけがＦＧＦ−２１活性に影響したかどうかを判定するために評価した。効力値は０．４〜４．３ｎＭの範囲であり、一方、野生型ＦＧＦ−２１の効力は２．０ｎＭであった。これらのデータは、グリコシル化コンセンサス部位を作るために特定位置でのＦＧＦ−２１配列を変異させることは十分許容されることを示している。約３０ｎＭ以上の値は、不活性(inactive)と見なされる。
【表２】
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表２は、マウス脂肪細胞におけるグルコース取込みによるＦＧＦ−２１変異体の効力評価である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるＦＧＦ−２１アミノ酸配列におけるプロリン残基の位置が括弧内に示されている。“１”は、単一アッセイでのスクリーニングである。
【０２５５】
グリコＰＥＧ化ＦＧＦ−２１変異体コンジュゲートの効力は、９ｎＭ〜２０ｎＭの範囲であった（表３）。最も強力なグリコＰＥＧ化類似体（ＥＣ５０約１０ｎＭ）は、野生型ＦＧＦ２１（２ｎＭ）よりも効力が低いことを示しており、バルクＰＥＧ部分の取込みに起因する何らかの障害を反映している可能性がある。一連の結合部位（Ｎ末端付近からプロリン１７２まで）は、グリコＰＥＧが分子のどちらかの末端への追加は十分に許容されたことを示唆している。このデータは、マウス脂肪細胞のグルコース取込みの増加によって証明されるように、Ｎ末端でのペグ化への代替手段が許容されることを示す報告（Huang et al., 2011, PLoS One, 6(6):e20669）と一致する。しかしながら、グリコＰＥＧ部分のＣ末端領域付近の残基への結合も許容されるという見解は予期されなかった。幾つかの報告には、ＦＧＦ−２１のＣ末端はβ−クロトーへの結合に必要であり、Ｃ末端のアミノ酸残基の削除(deletion)は結合及び効力に対して十分に許容されてないことを示すものがある（Yie et al., 2008, FEBS Letters, 583:19-24; Goetz et al., 2012, Molecular and Cellular Biol, 32(10):1944-54）。
【表３】
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表３は、マウス脂肪細胞にグルコースを取り込むことにより、３０ｋＤａのＰＥＧでＰＥＧ化されたグリコＰＥＧ化ＦＧＦ−２１コンジュゲートの効力評価を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるＦＧＦ−２１アミノ酸配列におけるプロリン残基の位置は括弧内に示されている。“１”のデータは、２〜５の独立したアッセイの平均を表す。
【０２５６】
最初は、３０ｋＤａのＰＥＧ化された変異体コンジュゲートのみを試験した。これらは、さらなる開発をする上で最も有望な候補であると考えられたためである。しかしながら、本明細書の中で説明されるように、２０ｋＤａのＰＥＧを有する変異体コンジュゲートが、利用可能な実験データに基づいて驚くべき特性を示した。
【０２５７】
＜実施例１０：マウスのグルコース取込みアッセイ及びヒト細胞の細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化アッセイにおけるグリコＰＥＧ化ＦＧＦ−２１変異体コンジュゲートについて、２０ｋＤａと３０ｋＤａとの比較試験＞
選択したＦＧＦ−２１変異体を２０ｋＤａＰＥＧ部分又は３０ｋＤａのＰＥＧ部分のどちらかのＰＥＧ部分で調製し、マウス及びヒトの細胞株での効力を試験した（表４）。  マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を使用して、実施例９に記載されているグルコース取込みアッセイで効力を評価した。
【０２５８】
ヒト細胞株における変異体コンジュゲート活性を評価するために、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞に、ＦＧＦ−２１の共受容体であるヒトβ−クロトーを一時的に導入した。受容体の活性化は、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を検出するアッセイを使用して評価した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩培養し、ＦＧＦ−２１変異体コンジュゲートの連続希釈液を２０分間適用した。細胞を溶解し、ホスホ−ＥＲＫのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹＣ１０１８Ｂ；R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA）で測定した。結果として生じる蛍光は、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USAＭ）で読み取った。
【０２５９】
驚くべきことに、２０ｋＤａのＰＥＧ部分を含むコンジュゲートは、３０ｋＤａのＰＥＧコンジュゲートよりも活性が高かった。
【０２６０】
さらに、使用された２つのアッセイは、修飾に対して特異的に敏感であることが観察された。Ｎ末端近くでグリコＰＥＧ化されたコンジュゲートＰ（５）ＴＳＳＰは、ヒトのリン酸化ＥＲＫアッセイでは許容可能な活性を示した。一方、マウスのグルコース取込みアッセイでは良好な活性を示した。しかしながら、Ｃ末端付近で修飾されたコンジュゲートは、ヒト及びマウスの両方の細胞株で非常に高い効力を維持した（表３のＰ（１５６）ＴＰ、及びＰ（１７２）ＴＱＧＡＳのデータを参照）。
【表４】
0006852939.tif 000031
表４は、２０ｋＤａＰＥＧ部分又は３０ｋＤａのＰＥＧ部分のどちらかのＰＥＧ部分を含むＦＧＦ−２１変異体コンジュゲートの比較である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による天然ＦＧＦ−２１配列によるＦＧＦ−２１アミノ酸配列におけるプロリン残基の位置は括弧内に示されている。“１”は、ＨＥＫ−２９３細胞によるＦＧＦ−２１に対するβ−クロトー共受容体の一時的な発現である。
【０２６１】
＜実施例１１：２０ｋＤａ及び３０ｋＤａのＰＥＧ部分を有する実施例１０のコンジュゲートのインビボ試験＞
実施例１０のコンジュゲートについて、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａのＰＥＧ部分を有する各コンジュゲートを、インビボでのより詳細な調査のために選択した（結果は表４に示されている）。選択されたコンジュゲートは、インビトロ細胞アッセイにおいて良好な活性を示し、インビボ試験に適当な量を発現した。
【０２６２】
正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおける薬物動態（ＰＫ）の半減期の延長及び暴露と、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルにおける有効性とを、最も強力なコンジュゲートを特定するための基準として使用した。
【０２６３】
Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットのＰＫ半減期延長を決定するために、ＦＧＦ−２１コンジュゲートを滅菌リン酸緩衝生理食塩水の中で希釈し、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（約０．３ｋｇ）ラットに０．２５ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。投与してから１、２、４、６、２４、３０、４８、５４、７２、７８、及び９６時間後に外側尾静脈から採血した。血液試料を室温で２０分間保持した後、遠心分離して血清を分離した。血清留分をクリーンチューブに移し、ドライアイスで凍結し、分析を行うまで−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡによる血清中のＦＧＦ−２１コンジュゲートの検出を、各コンジュゲートを用いて標準曲線を作成したことを除いて、製造者の説明書（BioVendor, Brno, Czech Republic, ヒトＦＧＦ−２１  ＥＬＩＳＡ、カタログ番号ＲＤ１９１１０８２００Ｒ）に基づいて行なった。複合薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン５．２、Pharsight Corporation, Palo Alto, CA, USA）を使用して、血清濃度対時間データの非コンパートメント分析により推定した。
【０２６４】
グリコＰＥＧ化コンジュゲートの循環半減期は、野生型ＦＧＦ−２１（２時間）と比べて長くなった（１５〜３０時間）。２０ｋＤａ及び３０ｋＤａのＰＥＧ化は、両方とも、コンジュゲートの半減期と暴露に同様の影響を及ぼし、ＦＧＦ−２１の半減期延長に対するＰＥＧ化の価値を示した。
【表５】
0006852939.tif 000032
表５は、インビボでのグリコＰＥＧ化されたＦＧＦ−２１コンジュゲートの有効性を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるＦＧＦ−２１アミノ酸配列におけるプロリン残基の位置は括弧内に示されている。ＰＫ＝薬物動態、ＷＴ＝野生型、ＡＵＣ＝曲線下面積である。“１”は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、０．２５ｍｇ／ｋｇの各コンジュゲート又は野生型ＦＧＦ−２１を皮下投与した。“２”は、各パラメータに対して有意な改善を示した投与量範囲である。コンジュゲートは１日目と４日目に投与され、データは６日目に収集した。“３”は、３ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ−２１を１４日間毎日投与した。“４”は、データに傾向性があるが、ＡＮＯＶＡによる有意レベルには達しなかった。
【０２６５】
ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスは、レプチン受容体に変異があり、高血糖と異脂肪血症を引き起こす遺伝子モデルである。ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける薬力学的効果の決定は、ＨＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Shanghai, China）で行なった。雄のｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−Ｄｏｃｋ７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ）及び同齢の同腹仔（非糖尿病対照）は、中国南京大学のモデル動物研究センターから購入した。動物は、到着後１週間、室温２１〜２３oＣ、相対湿度３０〜７０％、明暗サイクル１２時間：１２時間の標準条件下で順応させた。食事と水は自由に利用可能であった。全ての実験手順は、ＨＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたものである。コンジュゲートのスクリーニングのために、１日目と４日目に、０、０．１２５、０．２５、１、２．５ｍｇ／ｋｇをマウスに投与した。試験中は、血糖計を使用して血糖を測定した。６日目に動物を犠牲にし、血清トリグリセリド（ＥｎｚｙＣｈｒｏｍ（登録商標）アッセイ、カタログ番号ＥＴＧＡ−２００、Bioassay Systems, Hayward, CA, USA）及びインスリン値（Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｋｉｔ，MesoScale Discovery, Rockville, MD, USA）を評価した。
【０２６６】
グリコＰＥＧ化コンジュゲートについて、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖、血清トリグリセリド及びインスリン値に対する効果を調べた（表５）。これらのパラメータを大幅に改善した投与量を表５に示す。２０ｋＤａ及び３０ｋＤａのグリコＰＥＧ化コンジュゲートは両方とも、血糖値の低下には同様に有効であったが、２０ｋＤａのＰＥＧ化コンジュゲートは、トリグリセリドの改善が、一般に、少ない投与量でかつ、広い投与量範囲で得られた点において、３０ｋＤａのコンジュゲートよりも優れていた。
【０２６７】
次の表６は、各データセットを、その値が１００％とみなされるビヒクル(vehicle)対照グループと比較した場合、各変異体の２０ｋＤａコンジュゲートが、３０ｋＤａコンジュゲートよりもトリグリセリド値が大幅に低下したことを示している（結果の数値が低いほど、性能が良好である）。
【表６】
0006852939.tif 000033
表６は、トリグリセリドの減少（対照ビヒクルの％）を示す。１日目及び４日目に０．１２５ｍｇ／ｋｇを投与し、６日目にトリグリセリドを測定した。
【０２６８】
グリコペグ化ＦＧＦ−２１コンジュゲートの投与により、血清インスリン値が広範囲にわたって変化した（表７）。インスリン抵抗性がＦＧＦ−２１コンジュゲートによって改善されたので、血清高インスリン血症が解消されることが予想された。全てのｄｂ／ｄｂマウスは、糖尿病でない同腹児対照と比較して、顕著な高インスリン血症を示した。Ｐ（１７２）−２０の投与したときが、インスリンの減少は最大であり、２．５ｍｇ／ｋｇでは７３％減少した。さらに、Ｐ（１７２）−２０は、０．２５〜１．０ｍｇ／ｋｇの投与で血清インスリンが減少する傾向を示した。
【表７】
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表７は、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるグリコＰＥＧ化コンジュゲートの血清インスリン値の低下を示す。  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、一元配置分散分析(one-way ANOVA)により決定した。
【０２６９】
要するに、全ての変異体及び変異体コンジュゲートは適切な量で発現し、生物学的に活性である。２０ｋＤａ−ＰＥＧコンジュゲートは、インビトロでのグルコース取込み及びＥＲＫリン酸化アッセイ、並びにインビボでの実験において優れた性能を示した。また、半減期については、２０ｋＤａ−ＰＥＧ及び３０ｋＤａ−ＰＥＧの変異体コンジュゲート種において、同様に改善された。このように、突然変異体ＦＧＦ−２１に、小さな２０ｋＤａのＰＥＧ残基とは対照的に大きな３０ｋＤａのＰＥＧ残基を結合した場合、半減期のさらなる増加が達成されないことは明らかであるため、小さな２０ｋＤａのＰＥＧを結合することが有益である。その理由は、小さなＰＥＧ残留物は、受容体が、自然の生物学的相互作用に必要なＦＧＦ−２１変異体タンパク質の一部を結合又はシールドするのを妨げる可能性が低いと考えられるからである（生物学的活性の低下につながることが予想される）。さらに、２０ｋＤａのＰＥＧ化コンジュゲートは、一般に、トリグリセリドを少ない投与量で広い投与量範囲で改善するので、３０ｋＤａコンジュゲートよりも優れている。
【０２７０】
＜実施例１２：２０ｋＤａのＰＥＧ−ＦＧＦ−２１  Ｐ（１７２）ＴＱＧＡＳ（この実施例１２では「変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート」と称する）を糖尿病のカニクイザルに複数回投与したときの効果＞
カニクイザル（年齢６〜２８歳）を、実験の開始時、内在性ＦＧＦ２１レベルに基づいて、グループ（ｎ＝６）に無作為に選び分けた。ＦＧＦ−２１のグループ間の平均血清値は２２９±５８ｐｇ／ｍＬ乃至３１２±８８ｐｇ／ｍＬの範囲であった。順化段階及び２週間のベースライン収集段階の後、サルのグループに、ビヒクルと０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇの変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを、８週間にわたり、１週間に１回皮下投与した。サルは、試験のウォッシュアウト段階でさらに１０週間評価が行なった。試験のエンドポイント(endpoints)は、体重、摂食量、空腹時血糖、ＨｂＡ１ｃ値、ＡＬＴ、及び血清脂質を含む。
【０２７１】
［１２．１：変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの体重及び摂食量への影響］
糖尿病のカニクイザルは、全ての投与量レベルで食物摂取量の減少を示した（表８）。しかしながら、最も多く投与した変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲート（１．０ｍｇ／ｋｇ）で処理された動物のみが、体重で顕著な減少率を示し、処理段階の終わりに最大約１０％であった（表８）。処理が終了する前、効果はプラトーにはならず、動物の体重は最後の処理の約４週間後にベースライン値まで回復した（データは示していない）。
【表８】
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表８は、糖尿病カニクイザルにおける体重及び摂食量に対する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの効果を示す。“ａ”は、ｐ  ＜０．０５；ｋｇ＝キログラム；ＳＥＭ＝平均の標準誤差である。
【０２７２】
［１２．２：糖尿病のカニクイザルの血糖コントロールに対する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの効果］
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの有効性について、空腹時血糖、グリコシル化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、血清インスリン値、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）における耐性を含む血糖コントロールに関する幾つかのパラメータで評価した。これまでの報告では、ＦＧＦ−２１類似体は、ＮＨＰ又はヒトの血糖コントロールに影響を与えないことが示唆されてきた（Talakdar et al., 2016, Gaich et al., 2014）。短時間作用型ＦＧＦ−２１類似体ＬＹ２４０５３１９を、肥満２型糖尿病患者へ投与すると、体重、インスリン、及びトリグリセリドは減少したが、血糖値の有意な減少はなかった（Gaich et al., 2014）。同様に、長時間作用型ＦＧＦ−２１類似体ＰＦ−０５２３１０２３は、体重とトリグリセリドを減少させたが、肥満のカニクイザルにおけるグルコース耐性には影響を及ぼさなかった（Talakdar et al., 2016）。２型糖尿病患者の空腹時血糖値及びインスリン値に変化は観察されなかった（Talakdar et al., 2016）。研究者は、２型糖尿病患者１２０人を対象に、ＢＭＳ−９８６０３６（Bristol-Myers Squibb）を１２週間投与し、その有効性を評価した。ＢＭＳ−９８６０３６を投与された患者は、Ｎ末端ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチドの改善を示したが、ＨｂＡ１ｃ又は体重の改善は示さなかった（Charles ED, et al. Abstract 33. Presented at: The Liver Meeting; Nov. 11-15, 2016; Boston；Charles ED, et al. Abstract 1082. Presented at: The Liver Meeting; Nov. 11-15, 2016; Boston）。
【０２７３】
試験した変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを糖尿病サルに週１回投与すると、用量依存的に空腹時血糖値が改善された（表９）。インスリン値は、試験開始時にはグループ間で変動したが、最高投与量ではベースラインと比較して有意な減少が観察された（表９）。
【０２７４】
空腹時血糖値の変化と一致するのは、ＨｂＡ１ｃ値の改善である（図８）。これは、経時的な血中グルコース値を評価するための信頼できる指標である。注目すべきは、ＨｂＡ１ｃの改善が、これまで、当該技術分野の他のＦＧＦ−２１類似体又は変異体について報告されていないことである。特に、ＦＧＦ−２１に基づく製品候補、すなわちＢＭＳのＢＭＳ−９８６０３６又はＰｆｉｚｅｒのＰＦ−０５２３１０２３又はＬｉｌｌｙのＬＹ２４０５３１９では、ＨｂＡ１ｃの改善は報告されていない。
【表９】
0006852939.tif 000036
表９は、糖尿病カニクイザルの空腹時血糖に対する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの効果を示す。“ａ”はｐ＜０．０５、“ｂ”はｐ＜０．０１；ｋｇ＝キログラム；ｍＩＵ＝ミリ国際単位；ＳＥＭ＝平均の標準誤差。
【０２７５】
血液試料（１．０ｍＬ／回）を、示された時点で、頭静脈または伏在静脈からＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｋ２−ＥＤＴＡチューブに採取した。試料は、直ちに４℃の冷蔵庫又は濡れた氷の中に保存した。試料は、血液を採取し日と同じ日に分析した。
【０２７６】
ＨｂＡ１ｃは、糖化されたヘモグロビン試験システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Hercules, CA, USA）を使用してＨＰＬＣで測定した。
【０２７７】
ＯＧＴＴは、投与後、１１日目（ベースライン）、３１日目及び５２日目に実施した（図９）。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、３１日目と５２日目の両方で、試験した全ての用量で経口耐糖能を改善した。３１日目と５２日目の各処理グループ内の耐糖能の差が同様であったことから、耐糖能に対する変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの最大効果は、驚くべきことに、３１日目までに最も低い用量で到達したようである。ＮＨＰにおけるＯＧＴＴに対するＦＧＦ２１類似体の発散的な効果が観察され、この効果はＦＧＦ２１類似体の薬理学の変動を反映している可能性がある。ＯＧＴＴの改善は、肥満カニクイザルの長時間作用型ＦＧＦ２１では観察されなかった。ＯＧＴＴの改善は、肥満のカニクイザルにおける長時間作用型ＦＧＦ２１では観察されなかったが（Talakdarら、2016）、肥満アカゲザルにおける長時間作用型ＦＧＦ２１類似体では報告されている（Murielle M. Veniant, Renee Komorowski, Ping Chen, Shanaka Stanislaus,Katherine Winters, Todd Hager, Lei Zhou, Russell Wada, Randy Hecht, and Jing Xu (2012) Endocrinology 153:4192-4203）。
【０２７８】
グルコースの動物への投与は、真ん中にグルコースを埋め込んだバナナを動物の食事として置いておくことにより行なった。投与量は、グルコース１．０ｇ／ｋｇ＋バナナ１０ｇ／ｋｇである。グルコメータ（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）Performa, Roche）による血糖測定のために、血液採取は、尾静脈を穿刺することによって行なった。データは、各処理の曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である（図９）。
【０２７９】
［１２．３：変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで処理した糖尿病カニクイザルの血清ＡＬＴ値］
血清ＡＬＴ値は、試験中、毎週測定した。ＡＬＴ値は、０．３ｍｇ／ｋｇの投与グループは７日目に、１．０ｍｇ／ｋｇの投与グループは１４日目に減少した。ＡＬＴ値の低下傾向は、０．３ｍｇ／ｋｇ投与グループでは１４日目（ｐ＝０．０５６）に観察され、１．０ｍｇ／ｋｇ投与グループでは２８日目（ｐ＝０．０７３）に観察された。対照的に、ビヒクルグループのＡＬＴ濃度は、処理期間の終了までに僅かに上昇した（図１０）。
【０２８０】
血清化学パラメータ（ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＬＴ、グルコース）は、ＡＤＶＩＡ（登録商標）Ｒ２４００（ＳＩＥＭＥＮＳ）システムを使用して測定した。
【０２８１】
［１２．４：変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで処理した糖尿病カニクイザルの血清脂質濃度］
血清脂質値（トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、高密度コレステロール（ＨＤＬ）及び低密度コレステロール（ＬＤＬ）は、試験中、毎週測定した。動物を、ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで４日間処理すると、試験した全ての投与量で血清ＴＧ値が劇的に減少し、処理段階の期間中、安定したままであった。血清ＴＧ値はウォッシュアウト期間中、ベースライン値に回復した（図１１）。対照的に、ビヒクルで処理した動物では、ＴＧ値は、ほんの僅かな増加しか観察されなかった。
【０２８２】
ＴＧ値を、各個人のベースライン値に正規化した（図１１）。血清化学パラメータ（ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＬＴ、グルコース）を、ＡＤＶＩＡ（登録商標）Ｒ２４００（ＳＩＥＭＥＮＳ）システムを使用して測定した。
【０２８３】
総コレステロール値及びＬＤＬコレステロール値は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの最も多い投与量で、それぞれ２９パーセント及び３９パーセントのやや少ない低下を示した。ＨＤＬコレステロール値は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドの処理で有意に上昇し、ウォッシュアウトフェーズ中にベースラインに戻った（図１２）。
【０２８４】
血清化学パラメータ（ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ）は、ＡＤＶＩＡＲ４２００（登録商標）（ＳＩＥＭＥＮＳ）システムを使用して測定した。ＨＤＬコレステロール値は、各個人のベースライン値に正規化した。
【０２８５】
［１２．５：変異体ペプチドＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートで処理した糖尿病カニクイザルにおけるアディポネクチンバイオマーカーの評価］
高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチン値の上昇は、０．１ｍｇ／ｋｇグループ及び０．３ｍｇ／ｋｇグループで傾向があり、２１日目には１．０ｍｇ／ｋｇの投与で有意に上昇した（図１３）。
【０２８６】
サル血清中のアディポネクチンの検出は、ヒトＨＭＷアディポネクチン／Ａｃｒｐ３０イムノアッセイ用の市販キット、カタログ番号ＤＨＷＡＤ０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行なった。
【０２８７】
＜実施例１３：非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマウスモデルにおける２０ｋＤａのＰＥＧ−ＦＧＦ−２１  Ｐ（１７２）ＴＱＧＡＳ（この実施例１３では「ＴＥＶ−４７９４８」と称する）の投与の有効性＞
［１３．１：非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマウスモデルにおける有効性］
ステリック動物モデル（ＳＴＡＭ）マウスは、ＮＡＳＨ、線維症、最終的に肝細胞癌を発症する。このモデルは、人間の疾患と非常によく似た病理学的進行を示す。特に、ＳＴＡＭマウスは、８週でＮＡＳＨを発現し、１２週で線維症に進行し、最終的に肝細胞癌を発症する（Saito et al.,2015）。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートをＳＴＡＭマウスで評価し、体重、肝臓対体重比、肝臓脂肪症、炎症、線維症、及び複合ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）に対する影響を評価した。
【０２８８】
４０匹のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを対象に、生後２日後に２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Sigma-Aldrich, USA）を単回皮下注射し、４週齢後に高脂肪食（ＨＦＤ、５７  ｋｃａｌ％脂肪、カタログ番号：ＨＦＤ３２、ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ、Japan）を与えてＮＡＳＨを誘導した。６週齢時に８匹のマウスを５つのグループに無作為に割り付けた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をビヒクルとして使用した。通常の食事を与えてＳＴＺ処理を行わない８匹の雄マウスを正常グループとして使用した。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、６〜９週齢から、０．１、０．５、２．０及び６．０ｍｇ／ｋｇの用量で、７２時間毎に１回皮下投与した。
【０２８９】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、試験期間中、肝臓重量と、肝臓対体重比が有意に改善した（表１０）。変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの犠牲日における平均体重、肝臓重量、及び肝臓対体重比は、０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ及び６．０ｍｇ／ｋｇグループでは、ビヒクルグループに比べて有意に減少した。
【表１０】
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表１０は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを処理した後のＳＴＡＭモデルの体重と肝臓重量を示す。示されたデータは、試験終了時の各グループ（各グループｎ＝８匹）の平均±標準偏差である。ビヒクルグループと比較して１＝ｐ＜０．００１、ビヒクルグループと比較して２＝ｐ＜０．０５、ビヒクルグループと比較して３＝ｐ＜０．０１である。
【０２９０】
変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートは、ＳＴＡＭモデルの生化学パラメータを改善した（表１１）。７日目と１６日目の非空腹時血糖値は、ビヒクルグループでは、正常グループと比較して有意に上昇した。１６日目の非空腹時血糖値は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの６．０ｍｇ／ｋｇグループでは、ビヒクルグループと比較して有意に低下した。２２日目の空腹時血糖値は、ビヒクルグル−プと比較して、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの６．０ｍｇ／ｋｇグループでは有意に低下し、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの０．１ｍｇ／ｋｇ及び２．０ｍｇ／ｋｇグループでは、低下する傾向が認められた。４時間空腹時血糖値については、ビヒクルグループと変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの０．５ｍｇ／ｋｇグループとの間に有意差は認められなかった。
【０２９１】
血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）値は、肝障害のマーカーとなるものであり、ＳＴＡＭモデルでは、ビヒクルグループが、正常グループと比較して有意に上昇した。血清ＡＬＴ値は、ビヒクルグループと比較して、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの２．０ｍｇ／ｋｇ及び６．０ｍｇ／ｋｇグループでは有意に低下し、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの０．５ｍｇ／ｋｇグループでは低下する傾向にあった。血清ＡＬＴ値については、ビヒクルグループと変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートの０．１ｍｇ／ｋｇグループとの間で有意差は認められなかった。
【表１１】
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表１１は、変異体ＦＧＦ−２１ペプチドコンジュゲートを処理した後のＳＴＡＭモデルの生化学的パラメータを示す。示されたデータは、試験終了時の各グループ（各グループｎ＝８匹）の平均±標準偏差である。ＡＬＴ＝血清アラニントランスアミナーゼ。ＡＳＴ＝アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。ビヒクルグループと比較して１＝ｐ＜０．０５、ビヒクルグループと比較して２＝ｐ＜０．０１。
【０２９２】
ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）は、脂肪変性（オイルレッドＯ染色）、アポトーシス肝細胞のバルーニング（ＨＥ染色）、及び炎症（Ｆ４／８０免疫染色）の指標であり、治療試験中のＮＡＦＬＤの変化を測定するツールとして開発された。現在の研究におけるビヒクルグループの肝臓切片は、重度のミクロ及びマクロ小胞脂肪沈着、肝細胞バルーニング及び炎症性細胞浸潤を示した。これらの観察結果と一致するように、ビヒクルグループは、正常グループと比較して、ＮＡＳが大幅に増加した。ＴＥＶ−４７９４８グループは、全ての投与量において、脂肪変性、肝細胞バルーニング、炎症性細胞浸潤の顕著な改善が認められ、ビヒクルグループと比較してＮＡＳが大幅に減少した（図１４）。
【０２９３】
［１３．２：非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のＤＩＮ（食事誘発性NASH）の有効性］
代替の動物モデルでは、ＤＩＮモデルは、当該技術分野で理解され、以下に記載されるように、食事への変更を用いてＮＡＳＨを誘発する。ＤＩＮナッシュモデルは、ＩＩ型糖尿病の動物モデルとして認められている。従って、これは、ストレプトゾトシンの注射とそれに続く高脂肪食（ＳＴＡＭ  ＮＡＳＨ）によってマウスにＮＡＳＨを誘導した上記のＳＴＡＭ  ＮＡＳＨモデルとは異なる。ＳＴＡＭ  ＮＡＳＨは、Ｉ型糖尿病の動物として認められている。
【０２９４】
本実施例に記載のＤＩＮモデルでは、順応段階は、標準食（ＲＭ１（Ｅ）８０１４９２、ＳＤＳ）と通常の飲料水とで構成され、これらは自由摂取で提供された。次いで、マウスには、６０％高脂肪／２％コレステロールの食事（Research Diets Inc., NJ, USA）を与え、飲料水に１０％フルクトース（ＤＩＮダイエット）を添加した。食事の脂肪含有量は、脂肪から６０％ｋｃａｌである。％ｇベースでは、脂肪は３５％ｇに相当し、大豆油が３％ｇ、ラードは３２％ｇである。
【０２９５】
方法：
順応期間の後、マウスに２５週間ＤＩＮ食事を与えた。マウスの体重は、２５週間の食事期間の終了まで毎週測定した。食事期間６週間の時点で、マウスの体重を測定し、午前９時に、４時間絶食（１０％フルクトースを通常の水で置換）した。その後、午後１時に血液を採取して、血糖値、血漿インスリン値、血漿ＡＬＴ値、血漿ＡＳＴ値を測定した。血糖値と血漿インスリン値からＨＯＭＡ−ＩＲを計算した。ＨＯＭＡ−ＩＲ及びＡＬＴ／ＡＳＴ値が最も低い１５匹のマウスを除外した。マウスを、それらのＨＯＭＡ−ＩＲ、ＡＬＴ／ＡＳＴ、及び体重に応じて５つの同質グループに分け、３日ごとにビヒクル又は３種類の異なる用量のＴＥＶ−４７４９８を皮下注射して処理した。ＯＣＡは食事の中に与えた。
【０２９６】
処理の６、１０、１５、及び１９週目に、マウスを午前９時に４時間絶食（１０％フルクトースを通常の水に置換）させ、血液を採取して、血糖値、血漿インスリン、ＡＬＴ及びＡＳＴ、総コレステロール及びトリグリセリド値を測定した。処理の１９週目に、全てのマウスについて、分析を行うために、−８０℃で保存された血清をドライアイスで出荷する前に分離するために、最後の投与後の４つの異なる時点（０、６、２４、４８時間）で採血（血液約１００μＬ）した。１グループあたり５匹のマウスを投与後０時間と２４時間で採血し、他の５匹は投与後６時間と４８時間で採血した。最後の採血後、４％イソフルラン麻酔下で頸部脱臼によってマウスを犠牲にし、滅菌生理食塩水で放血した。
【０２９７】
結果：
この研究では、ＴＥ−４７９４８の効果を、上記のＤＩＮマウスモデルにおいて、以下に記載するようにして評価した。ＮＡＳＨを誘発する食事を６週間摂取した後、Ｃ５７Ｂｌ６マウスのサブグループに、３種類の異なる用量（２０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、及び５００μｇ／ｋｇ）のＴＥ−４７９４８を、３日ごとに皮下投与し、これを１９週間行なった。ＮＡＳＨ進行に対するＴＥ−４７９４８の効果を対照と比較するために、ＮＡＳＨを発症するように誘導されたＣ５７Ｂｌ６マウスのサブグループをビヒクル対照で処理し、ＮＡＳＨを発症するように誘導されたＣ５７Ｂｌ６マウスのサブグループをＦＸＲアゴニストであるオベチコール酸（ＯＣＡ）で処理し、食事の中に混ぜて（２５ｍｇ／ｋｇ）、これらのサブグループを並行して評価した。ＯＣＡは、その抗ＮＡＳＨ特性の参照として用いた。
【０２９８】
ＴＥＶ−４７９４８は、ＤＩＮマウスモデルで誘発された肝臓障害を用量依存的に有意に減少させた。この観察は、組織学的ＮＡＳスコアの有意な低下、並びに、肝トランスアミナーゼ、肝臓脂質、炎症マーカー及び線維症マーカーの強力な低下によって証明された。例えば、図１５及び１６を参照のこと。
【０２９９】
ＴＥ−４７９４８は、肝臓への有益な効果に加えて、重要な抗糖尿病及び抗肥満特性をも明らかにした。例えば、図１７−２０を参照のこと。これらの結果から、食事誘発性ＮＡＳＨの処理におけるＴＥ−４７９４８の有益な効果が確認された。
【０３００】
＜実施例１４：糖尿病カニクイザルへ２０ｋＤａ  ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１  Ｐ（１７２）ＴＱＧＡＳ（この実施例１４では「グリコール−ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１」と称する）を投与したときの有効性に対する異なる処理計画及びその効果＞
この実施例の目的は、異なる処理計画を用いて投与した場合のグリコ−ＰＥＧ−ＦＧＦ２１の薬理学的効果及びその全身曝露を、自発性糖尿病カニクイザルにおいて調べることである。より具体的には、実験は、１週間に１回又は２週間に１回皮下注射により投与した場合のグリコ−ＰＥＧ−ＦＧＦ２１の薬理学的効果を調べることを目的とする。
【０３０１】
実験計画：
［１４．１：動物ハウジング］
自発性糖尿病のサルは、ＡＡＡＬＡＣ（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care）が承認したガイドラインに沿って飼育、管理されている。動物の生活環境と光周期の目標条件は次のとおりである。
温度：２３±３°Ｃ
湿度：５０±２０％
光サイクル：明るい１２時間と暗い１２時間
【０３０２】
［１４．２：サルの食事］
全ての動物は水を自由に摂取することができ、１日に２回、季節の果物を使った栄養バランスのとれた食事を与えた。
食事構成（％）
炭水化物      約５１．８％
粗タンパク質  ≧１６．０
粗脂肪        ≧４．０
水分          ≦１０．０
灰分          ≦７．０
繊維          ≦４．０
カルシウム    ０．８〜１．２
リン          ０．６〜０．８
【０３０３】
［１４．３：化合物、製剤、及び供給物］
調合された化合物は、２０ｍＭトリスＨＣＬ、７０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５の中に２５ｍｇ／ｍＬグリコ−ＰＥＧ−ＦＧＦ２１を含む。
【０３０４】
［１４．４：グループ分け、実験手順及び処理］
｛１４．４．１：グループ分け｝
３０匹の自発性糖尿病カニクイザルをスクリーニングして、試験の包含基準に適合する２４匹の糖尿病サル被験体を選択する。少なくとも３０匹の動物から血清を採取し、グルコース、インスリン、脂質、肝臓酵素などの幾つかのパラメータを測定した。選択した動物（ｎ＝２４）を本試験に登録し、体重、グルコース、脂質、インスリン値に関して実験グループ間で均等に配分した。
【０３０５】
試験のために選択された糖尿病動物を、表１２に記載されているように、ビヒクル又は試験品のいずれかで処理する。
【表１２】
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表１２は、グループの設計、投与量、頻度、及び投与経路を示す。
【０３０６】
｛１４．４．２：グリコール−ＰＥＧ−ＦＧＦ−２１を用いた実験手順と処理計画｝
実施例１４の実験計画とデータ収集のフローチャートを以下に示す。
【表Ｅ】
0006852939.tif 000040
【０３０７】
本試験は、処理前段階と処理段階の２つの段階を含む。効果は、ビヒクル又はグリコ−ＰＥＧ−ＦＧＦ２１製剤化合物のいずれかの皮下投与後に観察される。観察、データ収集、及び処理の時間経過をフローチャート（上記）に示し、また、表１３にまとめている。
【０３０８】
前処理：
実験動物の全ては、順化に１週間を要し、その後、経口グルコース耐性試験（ＧＴＴ）、生化学（トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＬＴ、グルコース）体重（ＢＷ）、ＦＧＦ−２１及び食物摂取量のベースラインデータを収集するために２週間を要する。動物は、ＢＷ測定のために一晩絶食させ、脂質測定及び血糖測定のために血液試料を採取する。０日目をベースラインとして、経口グルコース−バナナＧＴＴ（１．０ｇ／ｋｇグルコース＋１０ｇ／ｋｇバナナ：バナナの真ん中にグルコースを埋め込んで動物に与える）（０、１５、３０、６０、１２０、１８０分）を実施する。
【０３０９】
処理：
動物は、表１２に従ってビヒクル（ＰＢＳ）又はグリコ−ＰＥＧ−ＦＧＦ２１の皮下投与により処理される。動物は、処理前に、一晩絶食される。１回目と最後の（２８日目）の皮下投与の後、一連の血液試料が、投与前、投与してから６、２４、４８、７２、１２０、及び１６８時間後に薬物動態（ＰＫ）のために収集される。１４日目に、全ての動物を次の投与前にＰＫのために採血される。ＰＫバイオ分析用の血液（２ｍｌ／１回）は、伏在静脈又は頭静脈から適切なチューブに引き込まれ、薬力学的（ＰＤ）アッセイのためにバタフライ針で挿入される。全ての試料は室温で簡単に凝固されることができ、その後、４℃、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。血清は、予めラベル付けされたポリプロピレン製スクリューキャップバイアルに移し、分析するまで直ちに−８０℃の冷凍庫に保存する。食物消費は毎週行ない、経口グルコースバナナＧＴＴは４週目に実施する。
【０３１０】
ウォッシュアウト：
２週間のＢＷウォッシュアウト期間中、食物摂取は毎週行われ、ウォッシュアウト期間終了時に生化学及びＰＫのための血液採取（４２、４３、４４日目）を行なった。６週目に経口グルコースバナナＧＴＴが実施される。
【０３１１】
試験期間中は、動物の活動、行動、食欲、下痢などの臨床的観察が行われる。異常な変化があれば全て記録され、報告される。
【０３１２】
［１４．５：血液採取と血清採取］
【表１３】
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表１３は、ＰＫ／ＰＤ試験のタイムポイントと血液量を示す。
【０３１３】
｛１４．５．１：ＰＫ及びアディポネクチンアッセイの試料｝
血液試料（２ｍＬ／１回）は、投与直前及び投与後の連続した時点（投与前、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、１２０時間後、及び１６８時間後）に、頭頂静脈又は伏在静脈からＢＤ血清分離器Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブに収集される。全ての試料は、室温で最低３０分間凝固させ、その後、冷蔵遠心分離機（４℃）で、３，５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。血清は、予めラベル付けされたポリプロピレン製スクリューキャップバイアルに移し、直ちに、上記のように分析されるまで、−８０℃の冷凍庫に保管される。
【０３１４】
この試料分析研究（Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａ）では、マウス抗ヒトＦＧＦ２１、ＩｇＧ１モノクローナル抗体（キャプチャー抗体）を９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。分析物（ＴＥＶ−４７９４８）は、標準物質、品質管理（ＱＣ）、及びプレート上のキャプチャー抗体に結合された試験動物の血清試験試料の中に存在する。ＴＥＶ−４７９４８は、さらに、発色性ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を触媒するワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたマウス抗ＰＥＧ、ＩｇＭモノクローナル抗体に結合され、青色を呈する。その後、硫酸を含む停止液を加えることで青色が黄色に変化し、４５０ｎｍで吸光度が最大になった。４５０ｎｍの吸光度から５６２ｎｍのバックグラウンド読取値を引いた値は、校正用標準試料、ＱＣ試料、及び試験試料中のＴＥＶ−４７９４８の量に比例していた。
【０３１５】
｛１４．５．２：ＰＤ及びアディポネクチンアッセイの試料｝
上記の表１３に従って、頭部又は伏在静脈から採取した血液試料（２．５ｍＬ／１回）をＢＤ血清分離器Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブに収集する。全ての試料は、室温で最低３０分間凝固させ、その後、冷蔵遠心分離機（４℃）で３，５００  ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。
【０３１６】
血清化学パラメータ（トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＬＴ、グルコース）は、ＡＤＶＩＡ（登録商標）Ｒ２４００（ＳＩＥＭＥＮＳ）システムを使用して測定される。血清インスリンは、ＡＤＶＩＡＣｅｎｔａｕｒ（登録商標）ＲＸＰイムノアッセイシステム（ＳＩＥＭＥＮＳ）を使用して、化学発光で測定される。
【０３１７】
アディポネクチンについては、各動物の適当な静脈から静脈血（１ｍＬ／回）を血清採取チューブに採取する。血液は、冷蔵条件下（＋４℃を維持するように設定）にて、２４００ｇで１０分間遠心分離する。得られた血清は２つのアリコート（第１のアリコートが２００μＬ；第２のアリコートが残りの約１００μＬ）に分けられ、個々のチューブに移されて−８０°Ｃで保存されるまで、濡れた氷の上に保持される。２つのアリコートは、発送まで（温度記録計を使用して）−８０℃で保持され、アッセイが行われる。
【０３１８】
この試料分析試験（Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａ）では、アッセイの校正標準、マトリックス品質管理（ｍＱＣ）試料、及び試験済みの動物血清試料におけるＨＭＷアディポネクチンは、マイクロプレート上のマウスモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）に結合され、固定化される。結合されていない全ての物質を洗い流した後、ＨＭＷアディポネクチンに特異的なワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートされたＭｏＡｂを、ＨＭＷアディポネクチンがさらに結合されたウェルに加えた。ＨＲＰがコンジュゲートされたＭｏＡｂは、発色性ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を触媒し、青色になった。停止溶液を加えると、ＨＲＰとＴＭＢの反応が停止し、色が青色から、４５０ｎｍで最大吸光度を有する黄色に変わった。４５０ｎｍでの吸光度から５６２ｎｍでのバックグラウンド読取り値を引いた値は、校正標準、ｍＱＣサンプル、及び試験試料におけるＨＭＷアディポネクチンの量に比例した。
【０３１９】
｛１４．５．２：ＨｂＡ１ｃアッセイの試料｝
血液試料（１．０ｍＬ／１回）は、上記の表１３に従って、頭静脈又は伏在静脈からＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｋ２−ＥＤＴＡチューブに集められる。採取した試料は、直ちに４℃の冷蔵庫に移すて保存されるか、又は。濡れた氷の上に置いてその日の分析に供される。ＨｂＡ１ｃは、例えばＢＩＯ−ＲＡＤから入手可能な糖化ヘモグロビン試験システムなどの標準的なアッセイを使用して、ＨＰＬＣで測定する。
【０３２０】
｛１４．５．３：経口グルコースバナナＧＴＴアッセイの試料｝
グルコメータによる血糖測定のために、尾静脈に穿刺して一滴の血液を採取する。
【０３２１】
｛１４．５．４：内因性ＦＧＦ２１の試料｝
内因性ＦＧＦ−２１の潜在的な分析のための試料を収集する。ＦＧＦ−２１を測定するためのアッセイは、例えば、ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  ＬＬＣ（NC, USA）によって販売されている抗ＦＧＦ−２１キット（カタログ番号：ＲＤ１９１１０８２００Ｒ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って実施することができる。
【０３２２】
本明細書に記載された全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前述の本発明は、明確さと理解を目的として詳細に記載してきたが、当業者であれば、本開示を読めば、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更が可能であることは、理解されるであろう。
【０３２３】
方法及びキットの具体的な例は、例示の目的で本明細書に記載されている。これらは例示に過ぎない。本明細書で提供される技術は、上記の例示的なシステム以外のシステムに適用可能である。本発明の実施形態内では、多くの変更、修正、追加、省略、及び置換が可能である。本発明は、記載された実施形態について、当業者にとって自明な変形を含むものとし、前記変形は、特徴、要素及び／又は行為を同等の特徴、要素及び／又は行為に置き換えること、異なる実施形態の特徴、要素、及び／又は行為を組み合わせること、本明細書で説明される実施形態の特徴、要素、及び／又は行為を、他の技術の特徴、要素、及び／又は行為と組み合わせること、及び／又は、記載された実施形態からの特徴、要素及び／又は動作の組合せを省略すること、を含む。
【０３２４】
上述した本発明の実施形態は、例示のみを目的としている。当業者であれば、これらの実施形態に様々な詳細な修正を加えることができ、その全てが本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006852939.tif 000058
【図１７】
0006852939.tif 000059
【図１８】
0006852939.tif 000060
【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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