(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CLEC4Aタンパク質の細胞外領域に結合するCLEC4A機能阻害抗体を含む、免疫チェックポイント阻害剤。
【請求項２】
CLEC4A機能阻害抗体が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列又はその部分配列からなる領域に結合する、請求項１に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
【請求項３】
CLEC4AがヒトCLEC4Aである、請求項１又は２に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫チェックポイント阻害剤を含む、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん抗原の発見以来、がん免疫療法開発に向けて様々な研究が進行している。従来のがん免疫療法では、様々なアジュバント、がん抗原タンパク質やがん抗原ペプチドが、抗腫瘍免疫応答の誘導のために使用されている。しかし、がん抗原の多くが正常自己抗原であるため免疫原性が弱く、加えて自己抗原に対する免疫応答（自己免疫）を抑制する免疫制御機構が、がん抗原に対する免疫応答をも抑制していることが明らかになりつつある。このような免疫制御機構は「免疫チェックポイント分子」と呼ばれる分子により担われている。免疫チェックポイント分子は、抗腫瘍免疫応答及び自己免疫応答を負に制御しており、例としてT細胞に発現するCTLA-4やPD-1が挙げられる（非特許文献１）。これら「免疫チェックポイント分子」に対する阻害抗体を用いた免疫治療法が試みられている（非特許文献１）。しかしながら、そのような免疫治療法では一定の臨床効果が認められてはいるものの、多くのがん種では依然として不応答性であることが指摘されており、未だ満足すべき結果が得られているとはいえない。さらにT細胞に発現する免疫チェックポイント分子「CTLA-4・PD-1系」の阻害では、がんのみならず自己に対する免疫応答の活性化により発生する、自己免疫様病態等の有害事象が生じる可能性がある。このように免疫チェックポイント阻害剤では、がん不応答性の克服、及び自己免疫寛容の破綻に起因する免疫関連有害事象（immune-related adverse events: irAEs）の軽減も求められている。【０００３】
樹状細胞（dendritic cells; DCs）は樹状突起を有する、系統マーカー陰性、かつ主要組織適合遺伝子複合体クラスII陽性の抗原提示細胞であり、通常型樹状細胞（conventional DCs; cDCs）と形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DCs; pDCs）に大別される亜集団から構成される。樹状細胞は炎症状態では自然免疫と適応免疫を繋ぐ最も強力な抗原提示細胞として抗原特異的エフェクターT細胞の誘導を介して免疫系を賦活し、定常状態では抗原特異的クローンの除去、不応答性の誘導や免疫抑制能を有する制御性T（regulatory T; Treg）細胞の生成・増幅を介した免疫寛容を誘導する制御細胞として、免疫学的恒常性の維持に重要な役割を果たしている。一方、がん環境下での樹状細胞の機能阻害によるがん免疫応答の低下が推察されているが、その作用機序には不明な点が多く残されている。【０００４】
本発明者らは、ヒトとマウスにおいて特定の培養条件で炎症状態においても顕著なT細胞制御機能を有する免疫抑制性樹状細胞の作製に成功している（非特許文献２、３）。【０００５】
また本発明者らは、Cタイプレクチンレセプターファミリーに属する「Clec4A4 (DCIR2)」を同定し、Clec4A4が細胞内シグナル伝達を介して樹状細胞の機能を制御し、炎症及びT細胞免疫を減弱することを示した（非特許文献４）。Clec4A4欠損マウスでは自己反応性T細胞の過剰な増幅・活性化により自己免疫疾患の発症が早まり、自己免疫病態が増悪することも見出された（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Topalian S.L., et al., Cancer Cell. (2015) 27:450-461
【非特許文献２】Sato K., et al., Immunity. (2003) 18:367-379
【非特許文献３】Sato K., et al., Blood. (2003) 101:3581-3589
【非特許文献４】Uto T., et al., Nat. Commun., (2016) 7:11273
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新たな機序に基づく免疫チェックポイント阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、CLEC4Aタンパク質が樹状細胞等の抗原提示細胞上で発現して免疫チェックポイント分子として機能すること、また、CLEC4A機能阻害物質が、抗原提示細胞に対して免疫チェックポイント阻害をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] CLEC4A機能阻害物質を含む、免疫チェックポイント阻害剤。
[2] CLEC4A機能阻害物質が、CLEC4A機能阻害抗体、又はCLEC4A遺伝子発現抑制核酸である、上記[1]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[3] CLEC4A機能阻害抗体が、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域に結合する抗体である、上記[2]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[4] CLEC4A機能阻害抗体が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列又はその部分配列からなる領域に結合する、上記[2]又は[3]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[5] CLEC4A遺伝子発現抑制核酸が、CLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAである、上記[2]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[6] CLEC4AがヒトCLEC4Aである、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[7] 上記[1]〜[6]のいずれかに記載の免疫チェックポイント阻害剤を含む、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化のための医薬組成物。
[8] CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を測定し、被験物質で処理していない抗原提示細胞からのサイトカイン産生量と比較して、炎症性サイトカイン産生量の増加が示された場合にその被験物質は免疫チェックポイント阻害作用を有するものと判断することを含む、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法。【００１０】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-095752号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、樹状細胞などの抗原提示細胞に対し、免疫チェックポイント阻害を引き起こし、免疫チェックポイント分子CLEC4Aの働きにより低下した抗腫瘍免疫応答を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（非担がん及び担がんマウス）における、OVA特異的T細胞（CD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞）の誘導についての、フローサイトメトリー法による解析結果を示す。ＡはY軸にCD44、X軸にOVA-MHCクラスIペンタマーを表示したドットプロット、ＢはCD8+ T細胞中のCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞のパーセンテージ（％）を示す。*P <0.01（WTマウスと比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。
【図２】図２は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（非担がん及び担がんマウス）における、OVA特異的T細胞（OVA特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞）の誘導についての、フローサイトメトリー法による解析結果を示す。ＡはY軸にCD8α、X軸にIFN-γを表示したドットプロット、ＢはCD8+ T細胞中のOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞のパーセンテージ（％）を示す。*P <0.01（WTマウスと比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。
【図３】図３は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種の担がん状態のWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおけるがん進展の評価結果を示す。Ａはがん細胞移植後18日目の担がんマウスの写真と腫瘍体積値（mm3）を示す。Ｂは、がん細胞移植後23日間の腫瘍体積値の変化を示す。Ｃはがん細胞移植後23日目の腫瘍体積値を示す。*P <0.01（WTマウスのワクチン接種群又はワクチン非接種群との比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。
【図４】図４は、Clec4A4の免疫細胞動態に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓（Ａ）とがん組織（Ｂ）における免疫細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。脾臓細胞中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した（Ａ）。腫瘍浸潤白血球中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した（Ｂ）。各細胞表面分子の発現をドットプロットで示す。Ａ、Ｂにおいて、最左列はCD11c（X軸）及びSiglecH（Y軸）、左から２番目の列はB220（X軸）及びGr-1（Y軸）、中央列はF4/80（X軸）及びCD11b（Y軸）、右から２番目の列はNK1.1（X軸）及びCD3（Y軸）、最右列はCD8（X軸）及びCD4（Y軸）の発現を示している。
【図５】図５は、Clec4A4のリンパ組織T細胞活性化に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓におけるT細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。脾臓CD4+ T細胞（Ａ）と脾臓CD8+ T細胞（Ｂ）の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａ、Ｂにおいて、左列はCD44、右列はCD62Lの発現を示している。
【図６】図６は、Clec4A4の腫瘍浸潤T細胞活性化に対する制御機能を示す。担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）のがん組織におけるT細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。腫瘍浸潤CD4+ T細胞（Ａ）と腫瘍浸潤CD8+ T細胞（Ｂ）の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａ、Ｂにおいて、左列はCD44、右列はCD62Lの発現を示している。
【図７】図７は、Clec4A4の脾臓樹状細胞活性化に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓における樹状細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。脾臓樹状細胞の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａにおいて、最左列はMHC-I、左から２番目の列はMHC-II、中央列はCD40、右から２番目の列はCD80、最右列はCD86の発現を示している。Ｂにおいて、最左列はCD11c、左から２番目の列はClec4A4、中央列はB7-H1、右から２番目の列はB7-H2、最右列はB7-DCの発現を示している。
【図８】図８は、Clec4A4の腫瘍浸潤樹状細胞活性化に対する制御機能を示す。担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）のがん組織における樹状細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。腫瘍浸潤樹状細胞の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａにおいて、最左列はMHC-I、左から２番目の列はMHC-II、中央列はCD40、右から２番目の列はCD80、最右列はCD86の発現を示している。Ｂにおいて、最左列はCD11c、左から２番目の列はClec4A4、中央列はB7-H1、右から２番目の列はB7-H2、最右列はB7-DCの発現を示している。
【図９】図９は、健常人末梢血由来免疫細胞でのCLEC4Aの発現状態を示す図である。Ａは、末梢血単核球画分中のCD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD11c+樹状細胞、CD14+単球、CD56+ NK細胞における細胞表面分子CLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｂは、末梢血単核球画分における細胞表面分子CD141、CD1c、CD303、CD11c、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｃは、末梢血単球、末梢血単球由来樹状細胞、及び末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞における細胞表面分子CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。
【図１０】図１０は、トランスジェニック細胞株におけるGFP及びCLEC4Aの発現を示すドットプロットである。Ａは、マウス樹状細胞株DC2.4（図中、DC2.4）、対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）、及びCLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）における、GFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現を示す。Ｂは、マウス樹状細胞株DC2.4、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）、CRD欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM（Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif）配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を示す。
【図１１】図１１は、トランスジェニック細胞株におけるサイトカイン産生能を示す。Ａは、LPS刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のIL-6産生量を示す。Ｂは、LPS刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のTNF-α産生量を示す。Ｃは、CpG-B ODN 1668刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のIL-6産生量を示す。Ｄは、CpG-B ODN 1668刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のTNF-α産生量を示す。*P <0.01（対照レトロウイルス感染細胞株と比較、又はCLEC4A発現細胞株と糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株間の比較）。
【図１２】図１２は、ハイブリドーマクローンの培養上清の、CLEC4A発現細胞株に対する反応性を示す。Ａは、対照マウスIgG抗体又は抗CLEC4A抗体（クローン9E8）との反応性を示した細胞におけるGFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現の例をドットプロットで示す。Ｂは、作製したハイブリドーマクローンの培養上清との反応性を示した細胞におけるGFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現をドットプロットで示す。なおクローンA-2、A-77、B-23、B-54、C-47、C-90、D-4、D-87、E-11、及びE-88は、旧クローン名suna2、suna77、sunb23、sunb54、sunc47、sunc90、sund4、sund87、sune11、及びsune88に対応する。
【図１３】図１３は、CLEC4A機能阻害抗体のCLEC4A機能に対する制御機能を示す。Ａは、末梢血単球由来樹状細胞を対照マウスIgG抗体（cont. Ig）若しくは抗CLEC4A抗体の存在下又は非存在下にてLPSで刺激後、IL-6の産生をELISA法により測定した結果を示す。図中の「無刺激（None）」は、対照マウスIgG抗体及び抗CLEC4A抗体の非存在下かつLPSで刺激していない試料を示す。図中の「LPS」は、対照マウスIgG抗体及び抗CLEC4A抗体の非存在下でLPSで刺激した試料を示す。図中の「cont. Ig」は、対照マウスIgG抗体の存在下でLPSで刺激した試料を示す。抗CLEC4A抗体の存在下ではLPS刺激が実施された。図中の黒の水平線は対照マウスIgG抗体（cont. Ig）存在下でLPSで刺激した場合のIL-6産生値を示す。Ｂは、CLEC4A発現樹状細胞株DC2.4を、対照マウスIgG抗体若しくはマウス抗CLEC4A抗体の存在下又は非存在下にて可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子と反応させた後、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する結合を指標にフローサイトメトリー法により結合阻害率を解析した結果を示す。図中の黒の水平線は80％結合阻害を示す。
【図１４】図１４は、CLEC4A機能阻害抗体のCLEC4A介在性シグナル伝達に対する制御機能を示す。Ａは、対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下の、2B4株由来のNFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（対照T細胞株）及びCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株におけるCLEC4AとGFPの発現をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。CLEC4A（Y軸）及びGFP（X軸）の発現をドットプロットで示す。Ｂは、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（GFP発現陽性率23.8%）を抗CLEC4A抗体若しくは対照マウスIgG抗体の存在下又は非存在下にて培養後、CLEC4AとGFPの発現をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。CLEC4A（Y軸）及びGFP（X軸）の発現をドットプロットで示す。
【図１５】図１５は、CLEC4A機能阻害抗体のがん進展に対する制御機能を示す。ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性）を対照マウスIgG抗体（cont. Ig）若しくは抗CLEC4A抗体（クローンB-71）の存在下又は非存在下にてMART-1ペプチドと培養した後、MART-1特異的CTL（MART-1-MHCクラスIテトラマー結合CD8+ T細胞）の誘導をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。CD8+ T細胞中のMART-1特異的CTLの誘導をドットプロットで示す（X軸: MART-1-MHCクラスIテトラマー、Y軸: CD8α）。
【図１６】図１６は、CLEC4A機能阻害抗体のがん進展に対する制御機能を示す。ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性）と、対照マウスIgG抗体（cont. Ig）又は抗CLEC4A抗体（クローンB-71）とを、ヒト悪性黒色腫細胞株（MEL-624, HLA-A2陽性）とともに移植したNOJマウスにおいて、がん進展をがん細胞移植後30日間評価した。Ａは、がん細胞移植後30日間の腫瘍体積（mm3）の経日変化を示す。Ｂは、がん細胞移植後30日目のがん細胞を移植したNOJマウスの移植部位の外観写真を示す。*P < 0.01; 対照マウスIgG処理群と比較。
【図１７】図１７は、ヒト末梢血単核球と、対照マウスIgG抗体（cont.Ig）又は抗CLEC4A抗体（クローンB-71）とを、ヒト悪性黒色腫細胞株（MEL-624, HLA-A2陽性）とともに移植したNOJマウスにおける、がん移植後30日目の体重を示す。「未処置」は非担がんNOJマウスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能に基づくものである。より具体的には、本発明は、CLEC4A機能阻害物質を含む、免疫チェックポイント阻害剤に関する。本発明はまた、そのような免疫チェックポイント阻害剤を含む、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化のための医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明において、CLEC4Aとは、Cタイプ（カルシウム依存性）レクチンドメインファミリー4メンバーA（C-type Lectin Domain Family 4 Member A）と称されるタンパク質である。CLEC4Aは樹状細胞などの抗原提示細胞で発現する免疫チェックポイント分子であり、抗原提示細胞の機能を制御する。
【００１６】
本発明において、「CLEC4A機能阻害物質」とは、CLEC4Aタンパク質又はCLEC4A遺伝子の機能を阻害する作用（アンタゴニスト作用）を有する任意の物質である。CLEC4A機能阻害物質は、例えば、CLEC4A機能阻害抗体、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸などであり得るが、これらに限定されない。本発明において、「CLEC4A機能阻害抗体」とは、CLEC4Aタンパク質の機能を阻害する作用（アンタゴニスト作用）を有する抗CLEC4A抗体を指す。「CLEC4A遺伝子発現抑制核酸」は、CLEC4A遺伝子に対する発現抑制配列を含み、CLEC4A遺伝子の発現を抑制することができる核酸を指す。
【００１７】
CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能を阻害する。一実施形態では、CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4Aタンパク質、又はCLEC4A核酸（ゲノム上のCLEC4A遺伝子、CLEC4A遺伝子のmRNAなど）に結合、好ましくは特異的に結合してその機能を阻害する。CLEC4A機能阻害物質は、それが投与される対象生物の内因性CLEC4Aタンパク質に結合し、その機能を阻害することができる。別の実施形態では、CLEC4A機能阻害物質は、それが投与される対象生物の内因性CLEC4A遺伝子のmRNAに結合し、その発現を阻害することができる。好ましい実施形態では、CLEC4A機能阻害物質、例えばCLEC4A機能阻害抗体は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）などの抗原提示細胞の細胞表面上に発現したCLEC4Aタンパク質に結合し、そのCLEC4Aタンパク質の免疫チェックポイント分子としての機能を阻害することができる。好ましい別の実施形態では、CLEC4A機能阻害物質、例えば、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）などの抗原提示細胞又はその前駆細胞中で、ゲノム上のCLEC4A遺伝子又はCLEC4A遺伝子のmRNAに結合し、CLEC4A遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１８】
CLEC4A機能阻害物質の標的となるCLEC4Aは、哺乳動物由来であることが好ましく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳動物由来であってよい。CLEC4A機能阻害物質の標的となるCLEC4AはヒトCLEC4A、又はそのマウスホモログ（例えば、オルソログであるClec4A4）等のホモログ（例えば、オルソログ）であってよい。特に好ましい実施形態では、CLEC4A機能阻害物質の標的となるCLEC4Aは、ヒトCLEC4Aである。
【００１９】
一実施形態では、CLEC4A機能阻害物質（例えば、CLEC4A機能阻害抗体）は、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合するものであってよい。一実施形態では、CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain; CRD）を含む配列（例えば、6アミノ酸長以上、典型的には6〜20アミノ酸長、6〜9アミノ酸長、又は7〜10アミノ酸長、例えば6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長の配列）に結合するものであってよい。
【００２０】
ヒトCLEC4Aタンパク質の全長アミノ酸配列の例を配列番号２に、それをコードする塩基配列の例を配列番号１に示す。CLEC4Aタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLEC4Aタンパク質、その機能的変異体、又はそのホモログ（好ましくはオルソログ）であってよい。CLEC4Aタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、例えば90％以上、93％以上、95％以上、98％以上、99％以上、若しくは99.5％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってよく、免疫チェックポイント機能（樹状細胞などの抗原提示細胞上での免疫チェックポイント分子としての機能）を保持することが好ましい。
【００２１】
CLEC4Aタンパク質の細胞外領域は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69位から237位までの領域（配列番号１２）、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4Aタンパク質において、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（細胞外領域）又はその部分配列、例えば６アミノ酸長以上の部分配列からなる領域に結合するものであってよい。一実施形態では、CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4Aタンパク質中、配列番号１２の1〜10位、11〜20位、21〜30位、31〜40位、41〜50位、42〜50位、51〜60位、61〜70位、71〜80位、81〜90位、91〜100位、101〜110位、111〜120位、121〜130位、131〜140位、141〜150位、151〜160位、若しくは161〜169位のアミノ酸配列、又は６アミノ酸長以上若しくは７アミノ酸長以上、例えば6〜20、6〜9、若しくは7〜10アミノ酸長であるその部分配列を含む領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域に結合するものであってよい。他のCLEC4A機能阻害物質も、CLEC4Aタンパク質中のこのような領域に結合するものであってよい。
【００２２】
CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメイン（CRD）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ヒトCLEC4A）の195位から197位までの領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。CLEC4Aタンパク質の細胞内領域内のITIM配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の5位から10位までの領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。
【００２３】
CLEC4A機能阻害抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD、又はIgYであってよく、さらに任意のサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等であってよい。
【００２４】
CLEC4A機能阻害抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。CLEC4A機能阻害抗体は、任意の抗体形態であってよく、例えば、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ等であってよい。CLEC4A機能阻害抗体はまた、全抗体であっても、抗体の抗原結合性フラグメント、例えばFab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv、sdFv等であってもよい。
【００２５】
CLEC4A機能阻害物質、例えばCLEC4A機能阻害抗体は、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（PEG）化等の任意の修飾がされていてもよい。
【００２６】
CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、CLEC4A遺伝子に対する発現抑制配列を含む任意の形態の核酸であってよく、一本鎖核酸分子であっても二本鎖核酸分子であってもよい。CLEC4A遺伝子に対する発現抑制配列は、典型的には、CLEC4A遺伝子の標的領域（例えば、CLEC4A遺伝子のmRNA中の標的領域）のアンチセンス配列、又はアンチセンス配列及びセンス配列である。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、RNA、DNA、ペプチド核酸（PNA; Peptide Nucleic Acid）、ロックド核酸（LNA; Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等であってもよい。一実施形態では、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、hpRNA（hairpin RNA）、又はそれを含むより長い核酸であってもよい。一実施形態では、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、CLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAである。あるいは、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、体内でCLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAを生成する前駆体核酸であってもよい。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、修飾塩基を有していてもよい。その修飾としては、蛍光色素標識、メチル化、ハロゲン化、脱アミノ化、チオ化、ジヒドロ化、アミノ化、シュードウリジン化などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるCLEC4A遺伝子発現抑制核酸によるCLEC4A遺伝子の発現抑制は、RNA干渉によるものであってよいが、それに限定されない。RNA干渉は、典型的には、二本鎖RNA（dsRNA）が、細胞内のDicerにより、3'末端にオーバーハングを有する典型的には21〜23塩基対（bp）程度の短い二本鎖RNA（siRNA）に切断され、一方の一本鎖RNAが標的mRNAに結合して標的mRNAの分解を引き起こすことにより標的mRNAの翻訳を抑制し、それにより標的mRNAが由来する標的遺伝子の発現を抑制する現象である。一実施形態では、発現抑制配列は、19〜30塩基長であり、例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30塩基長であってよい。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ21〜34塩基長、21〜25塩基長、又は21〜23塩基長、例えば21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、又は34塩基長であるsiRNAであってもよい。siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さであっても異なる長さであってもよい。siRNAは通常、3'末端に1〜5塩基程度（典型的には、2塩基）のオーバーハングを有する。
【００２７】
CLEC4A機能阻害物質は、常法により作製することができる。CLEC4A機能阻害抗体は、公知の抗体作製法に基づいて作製することができる。例えば、まず、抗体の結合対象の配列（CLEC4A中の標的配列）を含む抗原若しくはその配列からなる抗原（例えば、CLEC4Aの標的配列を含む部分配列と、免疫グロブリンFc分子のような他のタンパク質との、融合タンパク質）、又はその抗原を細胞表面に発現する細胞等を、動物の皮下、足蹠、腹腔内等に投与して免疫する。抗原は、任意のアジュバントと共に投与することが好ましい。抗原の投与は１回でもよいが、複数回（例えば、２回〜５回）行うことが好ましい。免疫後、免疫細胞（例えば、リンパ節細胞、又は脾臓細胞）を通常の細胞融合法によって公知の親細胞（例えば、ミエローマ細胞）と融合させ、融合細胞を得る。融合相手の親細胞は、免疫細胞と同じ生物種に由来することが好ましい。融合相手の親細胞として用いられるマウス由来のミエローマ細胞としては、P3U1（P3-X63Ag8U1）、P3（P3x63Ag8.653）、P3x63Ag8U.1、NS-1、MPC-11等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
免疫細胞と親細胞との細胞融合は、例えば、ケーラーとミルステインの方法（Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981)73, 3-46）等に準じて行うことができる。具体的には、そのような細胞融合は、細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で実施される。細胞融合促進剤としては、例えば平均分子量1000〜6000程度のポリエチレングリコール（PEG）（例えば、PEG4000）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤をさらに使用することもできる。免疫細胞と親細胞（ミエローマ細胞等）との使用割合は任意に設定することができる。
【００２９】
得られた融合細胞を、目的の抗体の産生能についてスクリーニングし、クローン化することにより、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得することができる。そのハイブリドーマを培養して得られる培養上清から抗体を回収することによってCLEC4A機能阻害抗体を作製することができる。
【００３０】
CLEC4A機能阻害抗体がポリクローナル抗体の場合には、上記のとおり免疫した動物から血清を採取することにより取得することができる。この場合、免疫する動物として、ヒト抗体産生動物を用いることができる。
【００３１】
CLEC4A機能阻害抗体は、さらに、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させることにより、組換え抗体としても製造することができる。具体的には、抗体の可変領域（V領域）のcDNAを抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、発現ベクターの発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御下へ組み込み、その発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、宿主細胞により抗体を産生させることにより、CLEC4A機能阻害抗体を組換え抗体として作製することができる。
【００３２】
一方、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、公知の核酸合成法に基づいて作製することができる。例えば、ホスホロアミダイト法により、自動核酸合成機を使用して設計した配列の3'側から5'側に向かって核酸合成を行うことができる。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸はまた、短い複数の核酸断片に分けて合成し、それをアニーリングやライゲーション等により連結することによって作製してもよい。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、CLEC4A遺伝子を鋳型としたPCR法を用いて合成してもよい。
【００３３】
以上のようにして得られた抗体や核酸等は、公知の精製法により単離精製し、回収することができる。精製法としては、アフィニティ精製法、逆相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ゲル濾過、カラム精製、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）等、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
上記のCLEC4A機能阻害物質は、免疫チェックポイント阻害を引き起こすことができる。CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4A機能阻害により、抗原提示細胞において免疫チェックポイント阻害を引き起こし、免疫チェックポイント分子が寄与する抗腫瘍免疫応答（がん免疫応答）抑制を解除し、抗腫瘍免疫応答を活性化し、有効な抗腫瘍免疫応答（がん免疫応答）を増強することができる。ここで免疫チェックポイント阻害が引き起こされる抗原提示細胞は、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現している抗原提示細胞であり、そのような抗原提示細胞としては、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお抗原提示細胞は、抗原を細胞表面上に提示してT細胞を活性化する細胞である。したがって本発明に係るCLEC4A機能阻害物質は、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害剤として用いることができる。
【００３５】
本発明において免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化の標的となるがんは、任意のタイプのがんであってよい。
【００３６】
本発明に係る免疫チェックポイント阻害剤は、CLEC4A機能阻害物質を有効成分として含むものであってよい。本発明に係る免疫チェックポイント阻害剤は、CLEC4A機能阻害物質を治療上有効量で含むことができる。
【００３７】
本発明におけるCLEC4A機能阻害物質の免疫チェックポイント阻害作用（免疫チェックポイント阻害活性）や抗腫瘍免疫応答の活性化能は、CLEC4A機能阻害物質で処理した抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、当該CLEC4A機能阻害物質で処理しない場合と比較して、炎症性サイトカイン（例えば、IL-6、TNF-α、IL-12p40等）の産生量が増加する（好ましくは統計学的に有意に増加する）ことを指標として、評価することができる。より具体的には、CLEC4A機能阻害物質の免疫チェックポイント阻害作用や抗腫瘍免疫応答の活性化能の評価は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を、TLR4リガンドやTLR9リガンド等のTLRリガンド、例えば、LPS又はCpG-B ODN 1668等の存在下で、CLEC4A機能阻害物質を添加して培養し、培養液中のサイトカイン量を測定し、当該CLEC4A機能阻害物質で処理しない対照と比較することによって行うことができる。
【００３８】
本発明はまた、CLEC4A機能阻害物質又はそれを含む免疫チェックポイント阻害剤を含有する、医薬組成物も提供する。本発明は、CLEC4A機能阻害物質又はそれを含む免疫チェックポイント阻害剤を含有する、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化（又は抗腫瘍免疫応答の誘導）のための医薬組成物（又は医薬）を提供する。本発明はまた、CLEC4A機能阻害物質又はそれを含む免疫チェックポイント阻害剤を含有する、がんの治療又は予防（例えば、がんの再発予防）のための医薬組成物（又は医薬）を提供する。これらの医薬組成物（又は医薬）は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害に基づくがんの治療又は予防のために有用である。
【００３９】
本発明で治療又は予防の対象になるがん又は腫瘍としては、以下に限定されないが、悪性黒色腫、肺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、膀胱がん、膵がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、胆道がん、大腸がん、尿路上皮がん、膠芽腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、乳がん、悪性胸膜中皮腫、軟部肉腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、精巣原発リンパ腫等）、ウイルス陽性又は陰性固形がん、メルケル細胞がん等が挙げられる。
【００４０】
本発明に係る免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物（又は医薬）は、製薬上許容される添加剤を含んでもよい。そのような添加剤としては、以下に限定されないが、担体、懸濁剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、pH調整剤等が挙げられる。添加剤は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、製剤の剤形に応じて適宜用いることができる。
【００４１】
本発明に係るCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、非経口又は経口投与などの任意の投与経路で投与することができるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、経鼻、経肺、又は腫瘍内に投与することができる。本発明に係るCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、全身投与又は局所投与してもよい。
【００４２】
本発明は、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物を対象（患者）に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害方法も提供する。本発明はまた、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物を対象（患者）に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害に基づく、抗腫瘍免疫応答の活性化方法（又は抗腫瘍免疫応答の誘導方法）も提供する。本発明はまた、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害に基づくがんの治療又は予防方法も提供する。がんの予防方法は、がんの再発予防方法であってもよい。これらの方法において、免疫チェックポイント阻害は、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現している抗原提示細胞に対するものであることが好ましく、例えば、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等に対するものであることが好ましい。
【００４３】
投与の対象は、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳動物由来であってよい。対象は、免疫チェックポイント分子による免疫抑制が生じているか又は生じている疑いのある対象であってよい。対象は、典型的には、がんを有するか又はがんを有する疑いのある対象であってよい。対象は、がん免疫治療法に不応性となっているか又はがん免疫治療法への応答性が低下している対象であってよい。そのようながん免疫治療法への不応性又は応答性の低下は、免疫チェックポイント、特に、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等の抗原提示細胞における免疫チェックポイントによって引き起こされるものであり得る。対象はまた、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子（CTLA-4、PD-1、PD-L1等）に対する阻害剤に対する不応性又は耐性を有するがんに罹患した患者であってもよい。
【００４４】
投与方法は、対象（患者）の年齢、体重、性別、症状などにより、当業者が適宜選択することができる。CLEC4A機能阻害物質の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mg〜1000mgの範囲で、及び／又は対象当たり0.001mg〜100000mgの範囲で、投与量を設定することができるが、これらの範囲に限定されない。
【００４５】
上記CLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物の対象への投与により、抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、炎症性サイトカインの産生が増強され、それがT細胞や他の免疫細胞の機能を活性化／増強し、抗腫瘍免疫応答を活性化（惹起）し、結果的に対象におけるがんの進展抑制や退縮がもたらされる。好ましい実施形態では、本発明のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、（i）リンパ組織及び／又はがん組織における、骨髄由来抑制細胞の誘導及び／又は集積の抑制、（ii）エフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、及び活性化樹状細胞の誘導及び／又は集積の促進、（iii）がん微小環境での免疫寛容の抑制、並びに（iv）抗腫瘍免疫応答の活性化の少なくとも１つをもたらすことができる。本発明のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、免疫関連有害事象（例えば、自己免疫疾患又は障害などの自己免疫病態、体重減少等）、特に、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子の阻害に起因する免疫関連有害事象を生じるリスクを低減しながら高い抗腫瘍効果をもたらすことができる。
【００４６】
本発明では、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物の投与を含む、抗腫瘍免疫応答の活性化方法、又はがんの治療若しくは予防方法を、がんワクチン療法と併用してもよい。併用するがんワクチン療法の例としては、がん抗原（例えば、卵白アルブミン）とアゴニストTLRリガンドの組み合わせ、又はがん抗原（例えば、卵白アルブミン）とアゴニストTLRリガンドとアゴニスト抗CD40抗体との組み合わせを患者に投与する方法が挙げられる。アゴニストTLRリガンド（アゴニスト作用性TLRリガンド又はTLRアゴニストとも呼ばれる）としては、TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、及び／又は13等のアゴニストリガンド、例えば、CpG ODN 2006やCpG-B ODN 1668等の非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフ含有オリゴヌクレオチドであるアゴニストTLR9リガンドなどが挙げられる。ヒト対象への投与に好適なアゴニストTLRリガンドは、ヒトTLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10に対するアゴニストリガンドであり得る。
【００４７】
さらに本発明は、上記のCLEC4A機能阻害物質、又は免疫チェックポイント阻害剤を、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+単球）等の抗原提示細胞を含む免疫細胞とがん細胞とを含む組織又は細胞集団に適用することを含む、in vitroでの免疫チェックポイントの阻害方法も提供する。
【００４８】
本発明はまた、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能を利用した、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。本発明は、例えば、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を評価することを含む免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。具体的には、本発明は、例えば、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を測定し、被験物質で処理していない抗原提示細胞（被験物質で処理したものと同じ種類の、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞；対照）からのサイトカイン産生量と比較することを含み、好ましくは、炎症性サイトカイン産生量の増加が示された場合にその被験物質は免疫チェックポイント阻害作用を有するものと判断することを含む、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、基本的には、上述のCLEC4A機能阻害物質の免疫チェックポイント阻害作用の評価方法と同様に行うことができる。一実施形態では、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞、例えば、樹状細胞（例えば、末梢血単球由来樹状細胞、及び樹状細胞株DC2.4）、B細胞（例えば、CD19+B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等を、TLR4リガンドやTLR9リガンド等のTLRリガンド、例えば、LPS又はCpG-B ODN 1668等の存在下で、被験物質を添加して培養し、培養液中のサイトカイン（好ましくは、炎症性サイトカイン）量を測定し、その被験物質で処理していないこと以外は同様に培養した対照の抗原提示細胞について測定した培養液（例えば、培養上清）中のサイトカイン量と比較すればよい。炎症性サイトカインとしてはIL-6、TNF-α、IL-12p40等が挙げられる。サイトカイン量の測定は、常法により行うことができ、例えば、ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法、CBA（Cytometric Bead Array）法等を用いて行うことができる。対照と比較した炎症性サイトカイン産生量の増加は、好ましくは、統計学的に有意な増加である。このスクリーニング方法に供する被験物質は、任意の物質であってよく、例えば、タンパク質（抗体など）、核酸（siRNAなど）等であってよい。被験物質は、CLEC4Aタンパク質又はCLEC4A遺伝子を標的とするものであってもよい。「CLEC4Aタンパク質又はCLEC4A遺伝子を標的とする」とは、CLEC4Aタンパク質に結合するか、又はゲノム上のCLEC4A遺伝子若しくはCLEC4A遺伝子のmRNAに結合する、あるいは結合することが予測されることを意味する。スクリーニングに利用する抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球画分由来の抗原提示細胞（樹状細胞、B細胞、単球等）であってよい。樹状細胞の例としてマウスDC2.4株が挙げられる。CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞は、CLEC4A遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって作製されるトランスジェニック細胞であってもよい。CLEC4A遺伝子の抗原提示細胞への導入は、常法により行うことができ、例えば、CLEC4A遺伝子を発現する組換え発現ベクター（例えば、レトロウイルスベクター等のウイルスベクター）を用いて行うことができる。本スクリー���ング方法における細胞培養は、抗原提示細胞の公知の培養方法を用いて実施することができる。本スクリーニング方法で選抜された被験物質は、抗原提示細胞に対して免疫チェックポイント阻害を引き起こすために用いる候補薬剤であってよく、好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤に利用することができる。
【００４９】
一実施形態では、サイトカイン産生量を指標とする上記のスクリーニング方法は、抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニングの工程を、さらに含んでもよい。そのような、抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニングにおいては、例えば、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を、被験物質（例えば、抗体）によりin vitroで処理し、続いて、当該抗原提示細胞（具体的には、当該抗原提示細胞上のCLEC4Aタンパク質）と被験物質との結合性（反応性）を検出してもよい。検出された結合性に基づき、CLEC4Aタンパク質に結合する被験物質（例えば、抗体）を、スクリーニングすることができる。この抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニング方法においては、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現させた抗原提示細胞（例えば、CLEC4A遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって作製されるトランスジェニック細胞）と、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現していない抗原提示細胞（例えば、上記トランスジェニック細胞の親株である抗原提示細胞）との混合細胞（典型的には、1.1:1〜1:1.1、例えば、約1:1の細胞数の混合比で調製した混合細胞系）を、被験物質で処理してもよく、それによりスクリーニング反応系を１つにまとめることができ、スクリーニング工程を効率化することができる。抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニングによって選抜された被験物質は、CLEC4Aタンパク質を標的とするものであり、免疫チェックポイント阻害作用を有する可能性が高いと判断することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、下記実施例ではフローサイトメトリー法を以下のとおり実施した。【００５１】
＜フローサイトメトリー法＞
フローサイトメトリー解析における細胞の染色には、以下の蛍光標識モノクローナル抗体を用いた。
抗マウスCD3ε抗体（クローン145-2C11; BD Biosciences）、抗マウスCD4抗体（クローンRM4-5; BD Biosciences）、抗マウスCD8α抗体（クローン53.6.7; BD Biosciences）、抗マウスCD11b抗体（クローンM1/70; Biolegend）、抗マウスCD11c抗体（クローンHL3; BD Biosciences）、抗マウスCD40抗体（クローン3/23; BD Biosciences）、抗マウスCD44抗体（クローンIM7; BD Biosciences)、抗マウスCD80抗体（クローン16-10A1; BD Biosciences）、抗マウスCD86抗体（クローンGL1; BD Biosciences）、抗マウスCD62L抗体（クローンMEL-14; Biolegend）、抗マウスB220（抗体クローンRA3-6B2; BD Biosciences）、抗マウスF4/80抗体（クローンBM8; Biolegend）、抗マウスNK1.1抗体（クローンPK136; BD Biosciences）、抗マウスMHCクラスI抗体（クローンAF6-88.5; BD Biosciences）、抗マウスMHCクラスII抗体（クローンM5/114.15.2; BD Biosciences）、抗マウスB7-H1抗体（クローンMIH5; eBioscience）、抗マウスB7-DC抗体（クローンTY25; eBioscience）、抗マウスB7-H2抗体（クローンHK5.3; eBioscience）、抗マウスSiglecH抗体（クローン551; Biolegend）、抗マウスGr-1抗体（クローンRB6-8C5; Biolegend）、抗マウスClec4A4抗体(クローン33D1; Biolegend)、抗マウスIFN-γ抗体（クローンXMG1.2; BD Biosciences）、又は対照ラットIgG抗体（BD Biosciences）。【００５２】
抗ヒトCD3抗体（クローンUCHT1; TOMBO）、CD8α（クローンSK1; BD Biosciences）、抗ヒトCD11c抗体（クローン3.9; TOMBO）、抗ヒトCD14抗体（クローン61D3; TOMBO）、抗ヒトCD19抗体（クローンHIB19; TOMBO）、抗ヒトCD56抗体（クローンMY31; TOMBO）、抗ヒトCD1c抗体（クローンL161; Biolegend）、抗ヒトCD40抗体（クローン5C3; BD Biosciences）、抗ヒトCD80抗体（クローンL307.4; BD Biosciences）、抗ヒトCD86抗体（クローンIT2.2; BD Biosciences）、抗ヒトCD141抗体（クローンM80; Biolegend）、抗ヒトCD303抗体（クローン201A; Biolegend）、抗ヒトHLA-DR抗体（クローンL243; Biolegend）、抗ヒトCLEC4A抗体（クローン9E8; Biolegend）、又は対照マウスIgG抗体（BD Biosciences）。【００５３】
細胞表面分子の染色は、細胞（1〜5 x 105個）を、蛍光標識モノクローナル抗体と共に4℃で30分インキュベートすることにより染色した。【００５４】
なお一部のフローサイトメトリー解析では、細胞の染色に、蛍光標識モノクローナル抗体の代わりに、以下の蛍光標識したMHC-ペプチド複合体を用いた：マウスH-2Kb OVAペプチドペンタマー、及びヒトHLA-A*02:01 Mart-1ペプチドテトラマー（MBL）。【００５５】
細胞内染色は、上述の細胞表面分子の染色後、OVA257-264ペプチド（アミノ酸配列SIINFEKL（配列番号１４）; 10μM）とタンパク質輸送インヒビターGolgiPlugTM（BD Biosciences）を添加して37℃で２時間刺激し、固定透過化液（Fixation-Permeabilization solution）（BD Cytofix/Cytoperm kit; BD Biosciences）を用いて4℃で20分間、固定及び透過処理した後、蛍光標識モノクローナル抗体を添加して4℃で30分インキュベートすることにより染色した。【００５６】
蛍光染色解析はFACSVerseTMフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowJoソフトウェア（Tree star）を用いて行った。【００５７】
また、下記実施例で得られたデータについて、統計学的解析は以下のとおり行った。
＜統計学的解析＞
データの統計学的有意差の解析は分散分析（analysis of variance: ANOVA）を用いた。P値が0.01未満のものを有意とした。図中のデータは平均値（±標準偏差）で示した。【００５８】
［実施例１］
１）マウス
本実施例では、野生型（WT）マウスとして、C57BL/6マウス（Japan Clea）を用いた。非特許文献４の記載に従い、C57BL/6マウスを用いて、Clec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-マウス）を作製した。Clec4A4欠損マウス（系統名B6.Cg-Clec4a4<tm1.1Ksat>）は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター（RIKEN BRC; 日本）にアクセッション番号RBRC09657の下で寄託され、入手可能である。なおClec4A4は、CLEC4Aのマウスオルソログである。【００５９】
２）非担がんマウスモデルのがんワクチン接種後の免疫応答
WTマウス、及びClec4A4欠損マウスに、がんワクチンとして卵白アルブミン（OVA）（500 μg/1匹; Sigma-Aldrich）、Toll様受容体（Toll-like receptor; TLR）9リガンドであるCpG-B ODN 1668（50 μg/1匹; Hokkaido System Science）、及びアゴニスト抗CD40抗体（10 μg/匹; クローン1C10; Biolegend）を腹腔内投与して免疫した。免疫後6日目に、脾臓におけるOVA特異的細胞傷害性T細胞（CTL）（CD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞）及びOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。対照として、ワクチン接種していないWTマウス及びClec4A4欠損マウスの脾臓についても同様の細胞解析を行った。【００６０】
WTマウスでは、ワクチン非接種群と比較して、がんワクチン（OVA、CpG-B ODN 1668、アゴニスト抗CD40抗体）免疫群において抗原特異的CTLであるCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞（図１Ａ及びＢ）と抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞（図２Ａ及びＢ）の誘導が増強されていることが示された。一方、Clec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、抗原特異的CTLと抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞が誘導されただけでなく、WTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、抗原特異的CTLと抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞の誘導が著しく増強された（図１、図２）。【００６１】
３）担がんマウスモデルのがん進展評価及びがんワクチン接種後の免疫応答
WTマウス、及びClec4A4欠損マウスの背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞/1匹）することにより、担がんマウスを作製した。がんの進展は、担がんマウスの腫瘍体積をがん移植後23日目まで毎日、デジタルキャリパー（Digimatic Caliper, Mitutoyo）を用いて測定し、それを指標として評価した。【００６２】
担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスに対し、がん細胞移植後7日目に、がんワクチンを腹腔内投与して免疫した。がん細胞移植後13日目に、OVA特異的CTLであるCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞、及びOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。【００６３】
担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスでは、非担がん状態のWTマウス及びClec4A4欠損マウスと比較して、がんワクチン免疫群での抗原特異的CTL及び抗原特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導が増強された（図１、図２）。さらに、担がんClec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、抗原特異的CTL及び抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞の誘導が著しく増強された（図１、図２）。【００６４】
がん細胞移植後15日目以降、担がんWTマウス（ワクチン非接種）と比較して、担がんClec4A4欠損マウス（ワクチン非接種）では、免疫関連有害事象の発生を示さずに、がん進展が著しく抑制された（図３Ａ〜Ｃ）。一方、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群では、がん細胞移植後15日目以降、がん退縮が明らかに認められた。さらに、担がんClec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、がん細胞移植後23日目にはがんワクチンのがん進展抑制効果の亢進が認められた（図３）。【００６５】
以上の結果から、マウスClec4A4は樹状細胞上に発現する、免疫チェックポイント分子であり、抗腫瘍免疫応答にブレーキをかける働きをしていることが示された。また【００６６】
４）担がんマウスモデルにおける免疫応答
WTマウス、及びClec4A4欠損マウスの背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞/1匹）することにより、担がんマウスを作製した。がん細胞移植後20日目に、担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスの脾臓及びがん組織における各種免疫細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。なお、非担がんマウス及び担がんマウスの脾臓単核球は脾臓細胞を赤血球溶解バッファー（Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxTM; Sigma-Aldrich）を用いて調製した（非特許文献４）。担がんマウスの脾臓単核球及びがん組織の調製はがん細胞移植後20日目に行った。対照として、非担がんWTマウス及び非担がんClec4A4欠損マウスにおいても同様にフローサイトメトリー法による解析を行った。解析の結果を図４〜８に示す。【００６７】
担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、脾臓（図４Ａ）とがん組織（図４Ｂ）におけるGr1-1+CD11b+F4/80+骨髄由来抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells; MDSCs）の増加の抑制が認められた。【００６８】
また担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、がん組織におけるCD11c+Siglec-H-cDCs（通常型樹状細胞）とCD11clowSiglec-H+pDCs（形質細胞様樹状細胞）の集積亢進が認められた（図４Ｂ）。【００６９】
さらに、担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、がん組織における腫瘍浸潤CD4+/CD8+リンパ球（T細胞）（tumor-infiltrating lymphocytes; TILs）や、NK1.1+NK細胞の集積亢進が認められた（図４Ｂ）。【００７０】
担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のGr1-1+CD11b+F4/80+MDSCsの増加が認められるとともに（図４Ａ）、がん組織での顕著な集積が認められた（図４Ｂ）。【００７１】
担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のCD44+CD62L-エフェクターCD4+T細胞の増加が認められた（図５Ａ）が、CD8+ T細胞のその増加は認められなかった（図５Ｂ）。一方、担がんClec4A4欠損マウスでは、担がんWTマウスと比較して、脾臓（図５）とがん組織（図６）におけるCD44+CD62L-エフェクターCD4+T細胞/CD8+ T細胞の増加が認められた（Ａ: CD4+ T細胞、Ｂ: CD8+ T細胞）。【００７２】
担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のcDCsにおけるMHC I、CD40、CD80、B7-H1、及びB7-H2の発現低下が認められた（図７）。一方、担がんClec4A4欠損マウスでは、非担がんClec4A4欠損マウスと比較して、脾臓中のcDCsにおけるMHC I、CD80、CD86、B7-H1、及びB7-H2の発現増強が認められた（図７）。【００７３】
さらに、担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは脾臓cDCsにおけるMHCクラスI（MHC I）、CD80、CD86、B7-H1、及びB7-H2の発現増強が認められた（図７）。【００７４】
また担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは腫瘍浸潤cDCsにおけるMHC I、MHCクラスII（MHC II）、CD80、CD86、及びB7-H1の発現増強と、B7-H2及びB7-DCの発現低下が認められた（図８）。【００７５】
担がんClec4A4欠損マウスでは、担がんWTマウスと比較して、がん組織におけるcDCsのMHC I、MHC II、CD80、CD86、及びB7-H1の発現増強と、B7-H2及びB7-DCの発現低下が認められた（図８）。【００７６】
以上の解析結果から、Clec4A4による樹状細胞機能阻害は、リンパ組織とがん組織における、骨髄由来抑制細胞の誘導と集積の促進、並びにエフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、及び活性化樹状細胞の誘導と集積の抑制に基づいてがん微小環境での免疫寛容原性を誘発し、抗腫瘍免疫応答を抑制することにより、がん進展を促進することが示された（図４〜図８）。上記解析結果は、Clec4A4機能の阻害が、抗腫瘍免疫応答の活性化、及びがん抑制につながることを示している。【００７７】
さらに、マウスにおいてClec4A4欠損によりがん免疫応答が増強し、がん進展が抑制されることから、Clec4A4は樹状細胞に発現し、がん免疫（自己免疫）応答を制御する「免疫チェックポイント分子」であることが証明された。【００７８】
［実施例２］
ヒト末梢血（健常人末梢血）から、末梢血単核球を、Ficoll-PaqueTM PLUS（GE Healthcare Life Sciences）を用いた比重遠心法により分離した。分離した末梢血単核球画分から、末梢血単球を、単球単離キットII（Monocyte Isolation Kit II; Miltenyi Biotec）及び細胞分離装置autoMACS(R) Pro Separator（Miltenyi Biotec）を用いて精製した。【００７９】
非特許文献３に記載の方法に従い、取得したヒト末梢血単球をヒト組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（50 ng/ml、Wako）とヒト組換えIL-4（100 ng/ml、Wako）の存在下で1週間培養することにより、ヒト末梢血単球由来樹状細胞を作製した。また、非特許文献３に記載の方法に従い、取得したヒト末梢血単球をヒト組換えGM-CSF（50 ng/ml、Wako）、ヒト組換えIL-4（100 ng/ml、Wako）、ヒト組換えIL-10（50 ng/ml、Wako）、及びヒト組換えTGF-β1（50 ng/ml、Wako）の存在下で1週間培養することにより、ヒト末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞を作製した。末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞はがん環境で生成することが知られている。【００８０】
健常人から得られた末梢血単核球画分中の、CD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD14+単球、CD11c+樹状細胞、CD56+ナチュラルキラー（NK）細胞におけるCLEC4Aの発現を上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞における細胞表面分子（CLEC4A）の発現を図９Ａにヒストグラムで示す。【００８１】
末梢血単核球画分においてCLEC4Aの発現はCD3+ T細胞やCD56+ NK細胞では認められず、CD19+B細胞、CD14+単球、CD11c+樹状細胞では認められた（図９Ａ）。さらに、CD14+単球とCD11c+樹状細胞は、CD19+ B細胞と比較してCLEC4Aについてより高い発現を示した（図９Ａ）。【００８２】
健常人から得られた末梢血単核球画分中の、CD141+cDC1細胞、CD1c+cDC2細胞、CD303+pDC細胞におけるCD11c、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現を上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子（CD141、CD1c、CD303、CD11c、HLA-DR、及びCLEC4A）の発現を図９Ｂにヒストグラムで示す。【００８３】
健常人由来の末梢血単核球画分中の末梢血樹状細胞亜集団において、CD1c+CD11c+HLA-DR+cDC2細胞は、CD141+CD11c+HLA-DR+cDC1細胞、及びCD303+CD11c-HLA-DR+pDC細胞と比較して、CLEC4Aについてより高い発現を示した（図９Ｂ）。なお、フローサイトメトリー解析で得られた、CD1c+末梢血単核球をcDC2、CD141+末梢血単核球をcDC1、CD303+末梢血単核球をpDCとした。【００８４】
さらに、健常人から得られた末梢血単球、作製された末梢血単球由来樹状細胞（図中、単球由来DC）、及び末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞（図中、単球由来DCreq）におけるCD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現を図９Ｃにヒストグラムで示す。【００８５】
末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞は、末梢血単球由来樹状細胞と比較して、CD11c、CD86、HLA-DRについてより低い発現を示したが、CLEC4Aについては同等に高い発現を示した（図９Ｃ）。【００８６】
マウスにおいてClec4A4の発現はCD1c+末梢血単核球（cDC2）にのみ限定されるが（非特許文献４）、ヒトにおいてはcDC2がCD141+末梢血単核球（cDC1）やCD303+末梢血単核球（pDC）よりも高いCLEC4A発現を示すとともに、単球やB細胞でもCLEC4A発現が認められた。また、がん環境で生成される免疫抑制性樹状細胞（非特許文献３、及びNagayama H., et al., Melanoma Res., (2003) 13, pp.521-530）においてもCLEC4Aの発現が認められた。これらの結果からヒトにおいてCLEC4Aは抗原提示細胞に発現する機能制御分子であると考えられた。【００８７】
［実施例３］
CLEC4Aタンパク質の全長（配列番号２; NCBIアクセッション番号NP_057268.1; M1-L237; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１）の5'末端にBamHI認識配列（5'-ggatcc-3'）、3'末端にXhoI認識配列（5'-ctcgag-3'）を付加したcDNA（配列番号１１）を、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。【００８８】
同様に、CLEC4AのITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif））配列欠損変異体（配列番号４; ΔI5-V10; 231アミノ酸長）、CLEC4Aの細胞外領域欠損変異体（配列番号６; ΔF69-L237; 68アミノ酸長）、CLEC4Aの糖鎖認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain; CRD）欠損変異体（配列番号８; ΔE195-S197; 234アミノ酸長）、及びCLEC4Aの糖鎖修飾部位置換変異体（配列番号１０; N185Q; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（それぞれ、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９）の5'末端にBamHI認識配列、3'末端にXhoI認識配列を上記と同様に付加したcDNAを、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。【００８９】
次にこれらcDNAを、制限酵素BamHI及びXhoIで処理して、pMX-IRES-GFPレトロウイルスベクターのマルチクローニングサイト中のBamHI-XhoI部位に導入し、CLEC4A又は変異体発現レトロウイルスベクターを作製した。さらに、これらのレトロウイルスベクター、又は対照レトロウイルスベクター（CLEC4A又は変異体コード配列を含まない）を、レトロウイルスパッケージング細胞（Phoenix）にLipofectAMINE Plus Reagent（Life Technologies）を用いて感染させ、24時間後に培養上清からレトロウイルスを採取し、遠心法（8,000 g、16時間、4℃）により濃縮した。【００９０】
得られたレトロウイルスを、マウス樹状細胞株DC2.4（Shen Z, et al., J. Immunol., (1997) 158:p.2723-2730）に対し、DOTAPリポソーム性トランスフェクション試薬（DOTAP Liposomal Transfection Reagent; Roche）の2日間処理により感染させた。得られた細胞から、GFP発現を指標として、FACSAriaTMIIセルソーター（BD Biosciences）を用いてトランスジェニック細胞株を精製分離した。【００９１】
分離したトランスジェニック細胞株（CLEC4A発現細胞株又はCLEC4A変異体発現細胞株、対照レトロウイルス感染細胞株）、及びマウス樹状細胞株DC2.4における、GFP及びCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。【００９２】
マウス樹状細胞株DC2.4（図中、DC2.4）、対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）、及びCLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を、図１０Ａにドットプロットで示す。【００９３】
糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）、CRD欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を、図１０Ｂにドットプロットで示す。【００９４】
マウス樹状細胞株DC2.4、対照レトロウイルス感染細胞株、CLEC4A発現細胞株、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株、CRD欠損変異体発現細胞株、細胞外領域欠損変異体発現細胞株、及びITIM配列欠損変異体発現細胞株を、48ウェル培養プレート（BD Bioscience）にそれぞれ播種し、TLR4リガンドであるリポ多糖（LPS; 0.1 μg/ml; Sigma-Aldrich）又はTLR9リガンドであるCpG-B ODN 1668（0.1 μM）を刺激のために添加して16時間培養した後、培養上清中のIL-6（インターフェロン-6; eBioscience）とTNF-α（腫瘍壊死因子-α; eBioscience）の量をELISA法により測定した。対照として、同じ細胞株を、リポ多糖もCpG-B ODN 1668も添加せず無刺激で16時間培養後、同様に培養上清中のIL-6及びTNF-αの量をELISA法により測定した。その結果を図１１に示す。【００９５】
対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）と比較して、CLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）では、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生が著しく減弱した（図１１）。【００９６】
CLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）と比較して、CRD欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）では、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生が著しく亢進し、これらの産生量は対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）とほぼ同等であった（図１１）。これらの細胞株に導入されたCLEC4A変異体はCLEC4A活性を保持しないことが示された。【００９７】
一方、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）では、CLEC4A発現細胞株と比較して、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生の部分的な増強が認められた（図１１）。この糖鎖修飾部位置換変異体は、CLEC4A活性を部分的に保持していると考えられた。樹状細胞機能の抑制をもたらすClec4A4の自己分子（内/間）結合には、CRD内の185位（N-186）におけるN-結合型糖鎖が必要とされている。【００９８】
以上の結果から、CLEC4Aは抗原提示細胞の機能制御分子であり、樹状細胞などの抗原提示細胞におけるCLEC4Aの機能制御の分子基盤には、その細胞外領域の糖鎖認識ドメイン（CRD）と修飾糖鎖との会合を介した自己分子（内/間）結合に基づくITIM依存性抑制性シグナル経路が関与しており、当該経路の誘導によりサイトカイン産生能及びT細胞活性化能が抑制されることが示された。すなわちCLEC4Aの機能制御活性には、細胞外領域、CRD、及びITIM配列が重要であることが示された。【００９９】
［実施例４］
１）可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子の作製
CLEC4A細胞外領域（配列番号１２; F69-L237; 169アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１の205〜711位の塩基配列に相当）の5'末端にBamHI認識配列（5'-ggatcc-3'）、3'末端にEcoRV認識配列（5'-gatatc-3'）を付加したcDNAを、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。次に、得られたcDNAを、制限酵素BamHI及びXhoIで処理して、マウスIgFcキメラ分子発現ベクター（pFUSEN-mG2A-Fcベクター; InvivoGen）のマルチクローニングサイト中のBamHI-EcoRV部位に導入し、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子発現ベクターを作製した。可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子発現ベクターを、293fectinTMトランスフェクション試薬（293fectinTM Transfection Reagent; Life Technologies）を用いてFreeStyleTM 293-F細胞（Life Technologies）に遺伝子導入した。続いて遺伝子導入細胞を培養し、培養上清より、HiTrapTMProtein G HP（GE Healthcare Life Sciences）を用いて可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子を精製した。【０１００】
２）抗CLEC4A抗体の作製
上記で作製した可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（12.5 μg/１匹）及びTiterMax(R) Gold Adjuvant（27.5 μl/1匹; Sigma-Aldrich）を用いて、マウスの足蹠に対し2週間隔で2回免疫した。さらに、初回免疫後31日目にマウスの尾静脈内へ可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（25 μg/１匹）を投与した。初回免疫後34日目にマウスのリンパ節を採取し、得られたリンパ節細胞と、P3U1ミエローマ細胞株を、ポリエチレングリコール4000（Wako）を用いて融合し、ハイブリドーマを作製した。480クローンのハイブリドーマを得た。【０１０１】
３）抗体のスクリーニング
作製したハイブリドーマの培養上清について、CLEC4A発現細胞株に対する反応性を指標とし、二次抗体であるR-フィコエリスリン標識F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、上記フローサイトメトリー法により、抗体クローンのスクリーニングを行った。【０１０２】
具体的には、作製したハイブリドーマの培養上清を、マウス樹状細胞株DC2.4と実施例３で作製したCLEC4A発現細胞株（CLEC4A-GFP）の混合細胞（混合比１：１）に添加し、抗体と細胞の反応性を上記フローサイトメトリー法により調べた。なお混合細胞系を使用することにより、マウス樹状細胞株DC2.4（親株）とCLEC4A発現細胞株のそれぞれに対する反応性を一度に解析することが可能になる。図１２Ｂに、CLEC4A発現細胞株に対する抗体クローンの反応性の例を、GFP及びCLEC4Aの発現量のドットプロットで示す。【０１０３】
同様に、対照マウスIgG抗体又は抗CLEC4A抗体（クローン9E8）を、マウス樹状細胞株DC2.4と実施例３で作製したCLEC4A発現細胞株（CLEC4A-GFP）の混合細胞（混合比１：１）に添加し、抗体と細胞の反応性を上記フローサイトメトリー法により調べた。図１２Ａに、GFP及びCLEC4Aの発現量のドットプロットで示す。【０１０４】
このようにして、CLEC4A発現細胞株に特異的な反応を高レベルで示した４０個のクローンを樹立した。高反応性クローンとして選択されたハイブリドーマの培養上清から、HiTrapTM Protein G HPを用いて、マウス抗CLEC4A抗体を精製した。得られた抗CLEC4A抗体を、CLEC4A機能阻害作用、及び樹状細胞に対する免疫チェックポイント阻害作用について試験した。【０１０５】
［実施例５］
本実施例ではCLEC4A機能阻害抗体のCLEC4A機能制御活性及びCLEC4A結合阻害活性を試験した。【０１０６】
実施例２で得られた末梢血単球由来樹状細胞（1x105細胞）を、96ウェル培養プレートに播種し、対照マウスIgG抗体（cont. Ig）（10 μg/ml; Sigma-Aldrich）若しくはマウス抗ヒトCLEC4A抗体（10 μg/ml）の存在下又は非存在下にてLPS（0.1 ng/ml）で刺激して16時間培養した後、培養上清中のIL-6量をELISA法により測定した。結果の例を図１３Ａに示す。図中の黒の水平線は対照マウスIgG抗体（cont. Ig）の存在下でLPSで刺激した場合のIL-6産生値を示す。【０１０７】
図１３Ａに示されるように、末梢血単球由来樹状細胞のLPSの刺激による炎症性サイトカインIL-6の産生は、抗CLEC4A抗体の非存在下（図中、LPS）及び対照マウスIgG抗体（図中、cont. Ig）の存在下と比較して、抗CLEC4A抗体（クローンB-71、A-77、及びB-23）の存在下では約1.5倍の増強が認められた。抗CLEC4A抗体B-71、A-77、及びB-23がCLEC4A機能阻害抗体として作用し、樹状細胞におけるCLEC4Aのサイトカイン産生誘導機能を制御（阻害）したと考えられた。なお抗体B-71、A-77、及びB-23はいずれも、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する。【０１０８】
また、ヒトCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4（4x105細胞）を、対照マウスIgG抗体（100 μg/ml）若しくはマウス抗ヒトCLEC4A抗体（100 μg/ml）の存在下又は非存在下にて60分間培養した後、可溶型ヒトCLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（10 μg/ml）を添加して反応させた。その後、可溶型ヒトCLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する反応性（結合）を指標に、二次抗体であるR-フィコエリスリン標識F(ab')2断片ヤギ抗マウスIgG(H+L)を用いたフローサイトメトリー法により結合阻害率を解析した。結果の例を図１３Ｂに示す。図中の黒の水平線は80％結合阻害を示す。【０１０９】
図１３Ｂに示されるとおり、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する結合が抗CLEC4A抗体（クローンB-71、A-77、及びB-23）により80％以上阻害された。それらの抗CLEC4A抗体は、樹状細胞株DC2.4の細胞表面上に発現したCLEC4Aと可溶型CLEC4Aとの結合阻害を引き起こしたと考えられ、CLEC4A機能阻害抗体として作用したことが示された。なお抗体B-71、A-77、及びB-23はいずれも、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する。【０１１０】
以上の結果から、上記CLEC4A機能阻害抗体によるCLEC4Aの認識はその分子（内/間）結合を阻害することによりITIM依存性抑制性シグナル経路を抑制し、すなわちCLEC4Aの免疫チェックポイント機能を制御することにより、樹状細胞の活性化機能変換を誘導することが証明された。【０１１１】
［実施例６］
融合タンパク質CLEC4A-CD3ζ（配列番号１６）をコードするDNA配列の5'末端にEcoRI認識配列、3'末端にXhoI認識配列を付加したcDNA（配列番号１５）はGeneArt(R)（Thermo Fisher Scientific）により合成した。CLEC4A-CD3ζをコードするDNA配列は、マウスCD3ζ細胞内領域（NCBI: NP_001106862.1; R52-R164; 113アミノ酸長）をコードするDNA配列に開始コドン（ATG）を付加し、かつ終止コドン（TAA）を削除した配列（M1-R114; 114アミノ酸長）の5'末端側に、ヒトCLEC4Aの細胞外領域と細胞膜貫通領域（L46-L237; 192アミノ酸長）をコードするDNA配列を連結したものである。【０１１２】
合成したcDNAをpMX-IRES-CD8αレトロウイルスベクター（非特許文献４）のマルチクローニングサイト中のEcoRI-XhoIサイトに導入し、CLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスベクターを作製した。このCLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスベクター又は対照レトロウイルスベクター（pMX-IRES-CD8α）をレトロウイルスパッケージング細胞Phoenix（Kitamura T., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA,(1995) Vol.92, pp. 9146-9150、及び非特許文献４）へLipofectAMINE PlusTM Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて感染させ、24時間後に培養上清からCLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスを回収し、遠心法（8,000 g、16時間、4℃）により濃縮した。【０１１３】
マウスT細胞株2B4にNFAT-GFPコンストラクトを導入することにより作製されたNFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（Ohtsuka M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., (2004) 101:8126-8131）に、得られたCLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスをDOTAP Liposomal Transfection Reagent（Roche）を用いて2日間感染させた。上記のNFAT-GFPコンストラクトは、３つのタンデムNFAT（nuclear factor of activated T cells; 活性化T細胞核因子）結合部位を含むDNA配列を、増強GFP（緑色蛍光タンパク質）コードcDNAの5'側に融合させることにより作製したものである。感染後、CLEC4A発現を指標にCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株をFACSAriaTM IIセルソーター（BD Biosciences）を用いて精製分離した（非特許文献４）。【０１１４】
得られたCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（1x105細胞）又は上記のNFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（対照T細胞株）を、対照マウスIgG抗体（10 μg/ml）若しくはマウス抗ヒトCLEC4A抗体（10 μg/ml）の存在下又は非存在下にて24時間培養した後、GFPの発現とCLEC4Aの細胞表面上の発現を、GFP蛍光又はマウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローン9E8; Biolegend）を用いたフローサイトメトリー法により解析した。【０１１５】
その結果を図１４に示す。対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下で、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株では、GFPの恒常的な発現が認められたが、対照T細胞株ではGFPの発現は認められなかった（図１４Ａ）。NFATは、セリンスレオニンホスファターゼであるカルシニューリンの基質であり、カルシニューリンにより脱リン酸化（活性化）された後、核内に移行して遺伝子を活性化する転写因子である。NFATは、サイトカインの産生を誘導し、リンパ球を活性化することから、リンパ球活性化の指標として用いられている。CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株では、細胞表面上のCLEC4Aが結合相手と結合すると、CD3ζ介在性下流シグナルが惹起されることにより最終的にシグナル標的であるNFATが活性化され、活性化NFATがGFPの発現を誘導すると考えられる。図１４Ａに示されるように、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株では、対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下でも恒常的なGFPの発現が認められたことから、CLEC4Aは恒常的な自己分子（内/間）結合によりITIM依存性抑制性シグナル経路を惹起することが証明された（図１４Ａ）。【０１１６】
一方、図１４Ｂに示されるように、対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下（無処理）（GFP発現陽性率23.8％）又は対照マウスIgG抗体の存在下（図中、cont. Ig; GFP発現陽性率24.0％）のCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株と比較して、マウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71、A-77、及びB-23; いずれもヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する）の存在下のCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターT細胞株では恒常的なGFPの発現が低減した。したがって抗ヒトCLEC4A抗体B-71、A-77、及びB-23は、CLEC4A機能阻害抗体として作用し、CLEC4A介在性のITIM依存性抑制性シグナル経路を抑制することが示された。なお、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターT細胞株における抗体9E8を用いたフローサイトメトリーによるCLEC4Aの検出量が抗体A-77、及びB-23の存在下で低減したことから、これらの抗体が認識するエピトープ配列は同一又は近似していることが示された（図１４Ｂ）。【０１１７】
CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターT細胞株は、免疫チェックポイント阻害剤のin vitro評価系として有用であることも示された（図１４）。【０１１８】
［実施例７］
１）MART-1特異的CTL誘導
ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性; 107細胞）を、対照マウスIgG抗体（cont. Ig; 10 μg/ml）又はマウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71、10μg/ml）の存在下又は非存在下にてLPS（0.1μg/ml）、MART-1ペプチド（ELAGIGILTV（配列番号１７）; 10 μg/ml, MBL）、IL-2（50 U/ml; WAKO）、及びIL-7（10 ng/ml; WAKO）を添加し、35 mmディッシュ（Ultimate low cell binding surface, Thermo Scientific）上で1週間培養した。培養後、ヒト末梢血単核球中のMART-1特異的CTL（MART-1-MHCクラスIテトラマー結合CD8+ T細胞）の誘導を、フローサイトメトリー法により解析した。なおB-71抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する。【０１１９】
MART-1ペプチドを添加したヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性）の培養では、対照抗体（cont. Ig）の処理と比較して、マウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71）の処理ではMART-1特異的CTL誘導の増強が認められた（図１５）。上記の抗CLEC4A抗体は、CLEC4A機能阻害抗体として作用し、がん抗原MART-1特異的CTLの誘導を増強することが示された。【０１２０】
２）担がん免疫系ヒト化マウスを用いたがん進展評価
高度免疫不全ヒト化マウスであるNOJ（NOD/Scid/Jak3null）マウス（Okada S,, et al., Int. J. Hematol., (2008) 88, pp.476-482）へ、ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性; 107細胞）を対照マウスIgG抗体（cont. Ig; 100 μg）又はマウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71、100 μg）とともに静脈内移植した。【０１２１】
さらに、移植と同日に、ヒト悪性黒色腫細胞株（MEL-624, HLA-A2陽性及びMART-1陽性; Kawakami Y., et al., J. Immunol., (1992) 148, pp.638-643）をマウスの背部に皮下移植した（1x106細胞/1匹）。この担がん免疫系ヒト化マウスにおけるがん進展の評価は、がん移植後30日目まで経日的に腫瘍体積をデジタルキャリパーを用いて測定することにより行った。また、免疫関連有害事象の指標として、担がん免疫系ヒト化マウスの体重変化、飲水摂餌不良の有無、及び外見上変化（不動化、立毛等）をがん移植後30日目まで観察した。【０１２２】
その結果、担がん免疫系ヒト化マウスにおいて、対照抗体（cont. Ig）と比較して、マウス抗ヒトCLEC4A抗体を投与した場合に顕著な腫瘍退縮効果が認められた（図１６Ａ及びＢ）。さらに、マウス抗ヒトCLEC4A抗体投与群では体重減少、飲水摂餌不良、及び外見上変化（不動化、立毛等）のような免疫関連有害事象の発生を認めなかった（図１６Ｂ、図１７）。抗CLEC4A抗体の投与により、免疫関連有害事象を誘発することなく、がん抗原特異的CTLの誘導を増強し、がん進展を抑制することが示された。したがって、CLEC4A機能阻害抗体は免疫関連有害事象を伴わない免疫チェックポイント阻害剤として有用であることが証明された。【０１２３】
上述の実施例で示したとおり、CTLA-4欠損マウスやPD-1欠損マウスとは異なり、Clec4A4欠損マウスでは自己免疫様病態を自然発症しないこと、及び担がん免疫系ヒト化マウスにおいてCLEC4A機能阻害抗体は免疫関連有害事象を誘発しないことから、T細胞発現免疫チェックポイント分子に対する機能阻害で発生する免疫関連有害事象が、樹状細胞発現免疫チェックポイント分子CLEC4Aに対する機能阻害では著しく軽減されることが示された。したがってCLEC4A機能阻害物質は、投与する上で、安全性がより高いという利点を有する。【０１２４】
以上の実施例の結果から、CLEC4Aは樹状細胞等の抗原提示細胞の機能を阻害することによりがん特異的T細胞応答を抑制し、がん進展を促進すると考えられた。また、CLEC4Aは樹状細胞等の抗原提示細胞に発現し、がん免疫（自己免疫）応答を負に制御する「免疫チェックポイント分子」であることが明らかになった。CLEC4A4の機能阻害は、免疫関連有害事象の発生を伴わずにがん特異的T細胞応答を増強するとともに、リンパ組織やがん組織での骨髄由来抑制細胞の誘導抑制とエフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、活性化樹状細胞の集積促進等に基づいてがん微小環境での免疫寛容の誘導を抑制し、有効ながん免疫応答を成立させることによりがん進展を抑制することが示された。したがって、CLEC4A機能阻害抗体等のCLEC4A機能阻害物質は、がん免疫療法に有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、免疫チェックポイント分子であるCLEC4Aの機能阻害を介して樹状細胞等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害を効果的に誘導し、抗腫瘍免疫応答を活性化することができる新たながん治療手段として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号１：全長CLEC4Aコード配列
配列番号２：全長CLEC4Aタンパク質
配列番号３：ITIM(I5-V10)欠損変異体コード配列
配列番号４：ITIM(I5-V10)欠損変異体
配列番号５：細胞外領域(F69-L237)欠損変異体コード配列
配列番号６：細胞外領域(F69-L237)欠損変異体
配列番号７：CRD(E195-S197)欠損変異体コード配列
配列番号８：CRD(E195-S197)欠損変異体
配列番号９：N185Q変異体コード配列
配列番号１０：N185Q変異体
配列番号１１：BamHI及びXhoI部位付加断片
配列番号１２：CLEC4A細胞外領域(F69-L237)
配列番号１３：CLEC4A ITIM配列(I5-V10)
配列番号１４：OVA257-264ペプチド
配列番号１５：CLEC4A-CD3ζコード配列
配列番号１６：CLEC4A-CD3ζ
配列番号１７：MART-1ペプチド【０１２７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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