(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固定相（Stationary phase）にキレートリガンドを固定させる段階と、
（ｂ）前記キレートリガンドが固定された固定相に金属を添加し、前記キレートリガンド上に前記金属を固定する段階と、
（ｃ）前記キレートリガンド上に固定されていない金属残余物を洗浄する段階と、
（ｄ）前記洗浄した固定相に細胞外小胞が含まれる試料を注入し、前記細胞外小胞を、前記キレートリガンド上に固定された前記金属に結合させる段階と、
（ｅ）前記固定相で前記金属と結合していない試料の残余物を洗浄する段階と、
（ｆ）前記固定相で前記金属と結合された前記細胞外小胞を溶出させる段階と、
を含む、細胞外小胞の分離方法であって、
前記細胞外小胞は、その膜表面にヒスチジンタグ融合タンパク質を有しない、
前記細胞外小胞の分離方法。
【請求項２】
前記固定相（Stationary phase）は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、マグネチックビーズ、金ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項３】
前記キレートリガンドは、イミノ二酢酸（ＩＤＡ：iminodiacetic acid）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：nitrilotriacetic acid）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ：tris-(carboxymethyl)ethylenediamine）、エチレンジアミン（ethylenediamine）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ：ethylendiamine tetraacetate）、アルキレンジアミン三酢酸（alkylenediamine triacetic acid）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ：diethylenetriaminepentaacetic acid）、エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ：ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid）、ホスホセリン（phosphoserine）及び１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ：1,4,7-triazocyclononane）からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項４】
前記金属は、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、チタニウム（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ハフニウム（Ｈｆ）、ラザホージウム（Ｒｆ）、バナジウム（Ｖ）、ニオビウム（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、ドブニウム（Ｄｂ）、クロム（Ｃｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、シーボーギウム（Ｓｇ）、マンガン（Ｍｎ）、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、ボーリウム（Ｂｈ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、ハッシウム（Ｈｓ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、コペルニシウム（Ｃｎ）、アルミニウム（Ａｌ）及びガリウム（Ｇａ）からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項５】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血しょう、唾液、涙、汗、尿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ：cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、粉塵、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項６】
前記固定相（Stationary phase）に前記試料を添加する前に、前記試料の前処理段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項７】
前記試料の前処理段階は、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿及び有機溶媒沈殿からなる群から選択される１つ以上の方法を利用することを特徴とする請求項６に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項８】
前記金属と結合された前記細胞外小胞を溶出させる段階の後に、溶出物の後処理段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項９】
前記溶出物の後処理段階は、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿及び有機溶媒沈殿からなる群から選択される１つ以上の方法を利用することを特徴とする請求項８に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１０】
（ａ）固定相（Stationary phase）にキレートリガンドを固定させる段階と、
（ｂ）細胞外小胞が含まれる試料に金属を混合して、前記細胞外小胞と前記金属とを結合させる段階と、
（ｃ）前記キレートリガンドが固定された前記固定相に前記金属及び前記試料の混合物を添加し、前記キレートリガンド上に前記金属と結合された前記細胞外小胞を固定する段階と、
（ｄ）前記固定相に結合されていない残余物を洗浄する段階と、
（ｅ）前記固定相で前記金属と結合された前記細胞外小胞を溶出させる段階と、
を含む、細胞外小胞の分離方法であって、
前記細胞外小胞は、その膜表面にヒスチジンタグ融合タンパク質を有しない、
前記細胞外小胞の分離方法。
【請求項１１】
前記固定相（Stationary phase）は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、マグネチックビーズ、金ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１２】
前記キレートリガンドは、イミノ二酢酸（ＩＤＡ：iminodiacetic acid）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：nitrilotriacetic acid）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ：tris-(carboxymethyl)ethylenediamine）、エチレンジアミン（ethylenediamine）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ：ethylendiamine tetraacetate）、アルキレンジアミン三酢酸（alkylenediamine triacetic acid）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ：diethylenetriaminepentaacetic acid）、エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ：ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid）、ホスホセリン（phosphoserine）及び１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ：1,4,7-triazocyclononane）からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１３】
前記金属は、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、チタニウム（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ハフニウム（Ｈｆ）、ラザホージウム（Ｒｆ）、バナジウム（Ｖ）、ニオビウム（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、ドブニウム（Ｄｂ）、クロム（Ｃｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、シーボーギウム（Ｓｇ）、マンガン（Ｍｎ）、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、ボーリウム（Ｂｈ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、ハッシウム（Ｈｓ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、コペルニシウム（Ｃｎ）、アルミニウム（Ａｌ）及びガリウム（Ｇａ）からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１４】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血しょう、唾液、涙、汗、尿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ：cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、粉塵、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１５】
前記固定相（Stationary phase）に前記試料を添加する前に、前記試料の前処理段階をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１６】
前記試料の前処理段階は、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿及び有機溶媒沈殿からなる群から選択される１つ以上の方法を利用することを特徴とする請求項１５に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１７】
前記金属と結合された前記細胞外小胞を溶出させる段階の後に、溶出物の後処理段階をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１８】
前記溶出物の後処理段階は、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿及び有機溶媒沈殿からなる群から選択される１つ以上の方法を利用することを特徴とする請求項１７に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項１９】
（ａ）固定相（Stationary phase）にキレートリガンドを固定させる段階と、
（ｂ）前記キレートリガンドが固定された固定相に細胞外小胞が含まれる試料と金属とを添加する段階と、
（ｃ）前記キレートリガンド上に前記金属を固定し、前記細胞外小胞を前記金属に結合させる段階と、
（ｄ）前記固定相に結合されていない残余物を洗浄する段階と、
（ｅ）前記固定相で前記金属と結合された前記細胞外小胞を溶出させる段階と、
を含む、細胞外小胞の分離方法であって、
前記細胞外小胞は、その膜表面にヒスチジンタグ融合タンパク質を有しない、
前記細胞外小胞の分離方法。
【請求項２０】
前記固定相（Stationary phase）は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、マグネチックビーズ、金ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１９に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２１】
前記キレートリガンドは、イミノ二酢酸（ＩＤＡ：iminodiacetic acid）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：nitrilotriacetic acid）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ：tris-(carboxymethyl)ethylenediamine）、エチレンジアミン（ethylenediamine）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ：ethylendiamine tetraacetate）、アルキレンジアミン三酢酸（alkylenediamine triacetic acid）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ：diethylenetriaminepentaacetic acid）、エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ：ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid）、ホスホセリン（phosphoserine）及び１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ：1,4,7-triazocyclononane）からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１９に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２２】
前記金属は、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、チタニウム（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ハフニウム（Ｈｆ）、ラザホージウム（Ｒｆ）、バナジウム（Ｖ）、ニオビウム（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、ドブニウム（Ｄｂ）、クロム（Ｃｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、シーボーギウム（Ｓｇ）、マンガン（Ｍｎ）、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、ボーリウム（Ｂｈ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、ハッシウム（Ｈｓ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、コペルニシウム（Ｃｎ）、アルミニウム（Ａｌ）及びガリウム（Ｇａ）からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１９に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２３】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血しょう、唾液、涙、汗、尿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ：cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、粉塵、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１９に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２４】
前記固定相（Stationary phase）に前記試料を添加する前に、前記試料の前処理段階をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２５】
前記試料の前処理段階は、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿及び有機溶媒沈殿からなる群から選択される１つ以上の方法を利用することを特徴とする請求項２４に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２６】
前記金属と結合された前記細胞外小胞を溶出させる段階の後に、溶出物の後処理段階をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の細胞外小胞の分離方法。
【請求項２７】
前記溶出物の後処理段階は、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿及び有機溶媒沈殿からなる群から選択される１つ以上の方法を利用することを特徴とする請求項２６に記載の細胞外小胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属を用いた細胞外小胞の分離方法に関し、より詳細には、本発明は、金属親和性を利用して、様々な試料から細胞外小胞を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞（extracellular vesicles）は、一般的な細胞メカニズムにおいては、ヒトからバクテリアに至るまで全ての生命体又は細胞から自然に分泌されるナノサイズの小胞である。真核細胞に由来した細胞外小胞の場合、赤血球の分化、免疫反応の調節等に関与しており、特に癌細胞の微細環境では、癌の進行、転移、血管形成等の重要な機能が明らかにされることによって、癌を含む様々な病気の診断マーカーとしての活用において高い関心を集めている。
【０００３】
原核細胞から分泌される細胞外小胞は、真核細胞の細胞外小胞と同様に原核細胞の構成物質を含有しており、人体では、全身の炎症をはじめとして、流入経路によって急性肺炎症疾患を誘導し、皮膚の場合には、局所皮膚組織の炎症反応を慢性的に誘導して、現代人の代表的な病気の１つであるアトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）の原因となる可能性があることが報告された。また、人体でバクテリア由来の細胞外小胞と癌発症との関連性が台頭するにつれて、原核細胞由来の細胞外小胞も高い関心を集めている。
【０００４】
細胞外小胞の機能として最も大きいのは、これらが細胞間の情報交換メカニズムの重要な要素であるという点である。したがって、細胞外小胞の構成成分も、基礎及び医学分野において高い関心を集めている。
【０００５】
細胞外小胞は、生体内又は試験管内の複数の種類の細胞から分泌される生体ナノ粒子であって、血液、尿、唾、涙等の体液に存在し、細胞に由来する脂質二重層を含み、２０〜１０，０００ｎｍの範囲の様々なサイズを有する膜構造の小胞である。
【０００６】
細胞外小胞は、他の細胞及び組織に結合して膜の構成要素、タンパク質、ＲＮＡ等の細胞内物質を伝達する運送体の役割をするため、細胞外小胞を分泌した元の細胞（母細胞）のタンパク質、脂質、アミノ酸、ＲＮＡ等をそのまま含んでおり、母細胞の生理的・病理的特性を知ることができる重要な根拠となる。また、細胞外小胞に含まれている核酸、成長ホルモン、タンパク質等は、細胞膜形態のリン脂質により保護されており、可溶性形態の成長因子及びサイトカインより安定した機能を実行することができるという点が知られ、細胞外小胞の重要性が益々増大しており、細胞外小胞に含まれる物質を分析して、病気の診断、治療を含む様々な用途への活用の可能性が期待されている。
【０００７】
細胞外小胞は、サイズがナノメートルレベルと小さく、体液内及び細胞培養液等には細胞外小胞以外に数多くの物質が存在するので、細胞外小胞の分析のためには、体液内及び細胞培養液等の試料から細胞外小胞を分離することが重要であり、細胞外小胞を利用するあらゆる分野において最も重要な技術である。
【０００８】
従来の細胞外小胞の分離技術としては、超遠心分離（ultra-centrifugation）、サイズ排除法（size exclusion）、免疫親和性分離（immunoaffinity isolation）、マイクロ流体チップ（microfluidic chip）又はポリマーを利用した方法等があり、これらのうち超遠心分離法が最も広く使用されている。しかし、超遠心分離を用いて細胞外小胞を分離する場合には、手順が複雑で、労働力と時間を多く必要とし、巨大な装置を必要とするだけでなく、作業に必要な試料の量が多いという限界があるので、少量の試料のみを利用して、迅速に結果を得なければならない臨床診断及び多量の細胞外小胞が必要な治療方法で適用するのには適していない。
【０００９】
サイズ排除法の場合、主に超遠心分離法と共に使用され、細胞外小胞の純度を高めることができるという利点があるが、細胞外小胞がフィルタに付着して分離後の収率が低いという限界がある。
【００１０】
免疫親和性分離法は、抗体を細胞外小胞に付着して分離する方法であって、選別性（specificity）が非常に高いという利点があるが、抗体を生成するのに多くの過程がかかり、多くの費用がかかるので、実用的な診断及び治療に適用するのには適していないという問題がある。
【００１１】
したがって、細胞外小胞の構造及び機能をそのまま維持しながら、流用可能な量だけ効率的に分離、精製する技術が急がれるのが現状である。
【００１２】
親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）は、受容体−リガンドのような特異的相互作用関係に基づいて、生物学的混合物から所望の物質を分離する方法である。特に、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ：immobilized metal affinity chromatography）は、金属イオンとタンパク質との相互作用を利用して水溶液からタンパク質を分離する方法であって、主にヒスチジン又はシステインが金属イオンと結合する性質を利用して、ヒスチジンを含む組み換えタンパク質又はペプチドを分離精製する用途に使用されている。しかしながら、金属イオンと細胞外小胞との親和性を利用してこれらを分離する方法については、未だ報告されていない。
【００１３】
最近、非侵襲的液体生検（liquid biopsy）を病気の診断に利用する案が多角的に展開されている。これと共に、生体組織又は体液内の細胞外小胞を利用して新しい病気の診断マーカーを発掘し、これを利用して診断する努力が試みられている。このような努力の根源的な問題点は、生体組織又は体液から細胞外小胞を分離することにあるが、比較的制限された量及び高い複雑性を示す体液から細胞外小胞を通常の方法で精製することは殆ど不可能である。したがって、通常の細胞外小胞の分離法と差別される新たな分離法が急がれているのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、（ａ）固定相（Stationary phase）にキレートリガンドを固定させる段階と、（ｂ）前記キレートリガンドが固定された固定相に金属を添加する段階と、（ｃ）前記固定相に固定されていない金属残余物を洗浄する段階と、（ｄ）前記洗浄した固定相に細胞外小胞が含まれている試料を注入する段階と、（ｅ）前記固定相で金属と結合されていない試料残余物を洗浄する段階と、（ｆ）前記固定相で金属と結合された細胞外小胞を溶出させる段階と、を含む細胞外小胞の分離方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、（ａ）固定相にキレートリガンドを固定させる段階と、（ｂ）細胞外小胞が含まれる試料に金属を混合して、細胞外小胞と金属とを結合させる段階と、（ｃ）前記キレートリガンドが固定された固定相に前記金属及び試料の混合物を添加する段階と、（ｄ）前記固定相に結合されていない残余物を洗浄する段階と、（ｅ）前記固定相で金属と結合された細胞外小胞を溶出させる段階と、を含む細胞外小胞の分離方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、（ａ）固定相にキレートリガンドを固定させる段階と、（ｂ）前記キレートリガンドが固定された固定相に細胞外小胞が含まれる試料と金属とを添加する段階と、（ｃ）前記固定相に結合されていない残余物を洗浄する段階と、（ｄ）前記固定相で金属と結合された細胞外小胞を溶出させる段階と、を含む細胞外小胞の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、上述した問題点を解決するためのものであって、従来のタンパク質分離方法に主に使用されている固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）方法を用いて、金属と細胞外小胞との親和性を利用して細胞外小胞を分離する方法を提供する。
【００１８】
本発明において「固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）」とは、金属に対する細胞外小胞の親和性を利用して、細胞外小胞を精製するクロマトグラフィー技術を意味する。すなわち、分析対象のサンプルをクロマトグラフィーカラムに流すと、カラム上に固定されている金属イオンに対して親和性を有する物質のみがカラムに吸着され、残りの成分が吸着しないままカラムを通過して出る。次に、吸着された物質をｐＨ又はイミダゾール（imidazole）、ヒスチジン（histidine）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ：ethylendiamine tetraacetate）、塩濃度等の環境条件を変化させることによって溶出させて精製することである。
【００１９】
本発明では、細胞外小胞を含む様々な試料を金属親和性クロマトグラフィーカラムに通過させると、カラム上に固定された金属イオンと細胞外小胞との親和性によって、試料内の細胞外小胞がカラムに吸着され、吸着されない残りの試料がカラムの外に抜け出すことになる。これにより、様々な試料から物理化学的変形することなく迅速且つ容易に細胞外小胞を分離することができ、このように分離された細胞外小胞を、診断、治療、マルチオミックス（multi-omics）の研究、細胞外小胞の特性研究等に活用することが容易になる。
【００２０】
本発明の「細胞外小胞」という用語は、古細菌（Archaea）、原核生物（Prokarya）又は真核生物（Eukarya）の細胞に由来した生体ナノ粒子を総称するものであり、細胞外小胞（exosome）、アルゴソーム（argosomes）、デキソソーム（dexosomes）、エクトソーム（ectosomes）、エキソベシクル（exovesicle）、オンコソーム（oncosome）、プロミノソーム（prominosome）、プロスタソーム（prostasome）、トレロソーム（tolerosome）、微細粒子（microparticle）、微細小胞（microvesicle）、ナノ小胞（nanovesicle）、水泡性小胞（blebbing vesicle）、出芽性小胞（budding vesicle）、細胞外小胞状の小胞（exosome-like vesicle）、マトリックス小胞（matrix vesicle）、膜小胞（membrane vesicle）、脱皮性小胞（shedding vesicle）、膜粒子（membrane particle）、脱皮性微細小胞（shedding microvesicle）、膜水泡（membrane bleb）、エピジジモソーム（epididimosome）、プロミニノソーム（promininosome）、テクソソーム（texosome）又はアーケオソーム（archeosome）を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、（ａ）固定相（stationary phase）にキレートリガンドを固定させる段階と、（ｂ）前記キレートリガンドが固定された固定相に金属を添加する段階と、（ｃ）前記固定相に固定されていない金属残余物を洗浄する段階と、（ｄ）前記洗浄した固定相に細胞外小胞が含まれる試料を注入する段階と、（ｅ）前記固定相で金属と結合されない試料残余物を洗浄する段階と、（ｆ）前記固定相で金属と結合された細胞外小胞を溶出させる段階と、を含む細胞外小胞の分離方法を提供する。
【００２２】
本発明による前記細胞外小胞の分離方法を図１ａに模式的に示す。
【００２３】
また、本発明は、（ａ）固定相にキレートリガンドを固定させる段階と、（ｂ）細胞外小胞が含まれる試料に金属を混合して、細胞外小胞と金属とを結合させる段階と、（ｃ）前記キレートリガンドが固定された固定相に前記金属及び試料の混合物を添加する段階と、（ｄ）前記固定相に結合されていない残余物を洗浄する段階と、（ｅ）前記固定相で金属と結合された細胞外小胞を溶出させる段階と、を含む細胞外小胞の分離方法を提供する。
【００２４】
本発明による前記細胞外小胞の分離方法を図１ｂに模式的に示す。
【００２５】
また、本発明は、（ａ）固定相にキレートリガンドを固定させる段階と、（ｂ）前記キレートリガンドが固定された固定相に細胞外小胞が含まれる試料と金属とを添加する段階と、（ｃ）前記固定相に結合されていない残余物を洗浄する段階と、（ｄ）前記固定相で金属と結合された細胞外小胞を溶出させる段階と、を含む細胞外小胞の分離方法を提供する。
【００２６】
本発明による前記細胞外小胞の分離方法を図１ｃに模式的に示す。
【００２７】
本発明の「固定相（stationary phase）」という用語は、親和性クロマトグラフィーで生物学的に高い特異的親和性を示す２種類の物質のうち何れかの物質を固定するための基質を意味する。具体的には、本発明における固定相は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、マグネチックビーズ、金ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン、紙、プラスチック、ガラス、金属センサーチップからなる群のうち１つ以上を選択することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の「キレートリガンド（chelate ligands）」という用語は、金属と共にキレート錯体を形成するための２つ以上の可能な配位原子を含む原子団を意味し、配位原子の数に応じて三座リガンド（tridentate ligand）、四座リガンド（tetradentate ligand）、五座リガンド（pentadentate ligand）、六座リガンド（hexadentate ligand）等のように呼ばれる。本発明のキレートリガンドは、イミノ二酢酸（ＩＤＡ：iminodiacetic acid）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：nitrilotriacetic acid）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ：tris-(carboxymethyl)ethylenediamine）、エチレンジアミン（ethylenediamine）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ：ethylendiamine tetraacetate）、アルキレンジアミン三酢酸（alkylenediamine triacetic acid）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ：diethylenetriaminepentaacetic acid）、エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ：ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid）、ホスホセリン（phosphoserine）及び１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ：1,4,7-triazocyclononane）からなる群のうち１つ以上を選択することができるが、本発明で使用される金属を固定相に固定させることができるものであれば、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の「金属」という用語は、細胞外小胞と特異的親和性を持って試料内の細胞外小胞と結合することができるものであり、好ましくは金属イオンであり、より好ましくは遷移金属イオンであってもよい。本発明の金属は、遷移金属以外にもアルミニウム（Ａｌ）、ガリウム（Ｇａ）等のように、通常の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に使用される金属を使用することができ、分離しようとする細胞外小胞と特異的親和性を有する金属であれば、これらに限定されない。
【００３０】
遷移金属（transition metal）は、化学周期律表の４〜７周期、３〜１２族元素を含むものであって、非金属と共にイオン結合化合物を形成して錯イオン形態で存在する特徴がある。具体的には、本発明の遷移金属は、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、チタニウム（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ハフニウム（Ｈｆ）、ラザホージウム（Ｒｆ）、バナジウム（Ｖ）、ニオビウム（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、ドブニウム（Ｄｂ）、クロム（Ｃｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、シーボーギウム（Ｓｇ）、マンガン（Ｍｎ）、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、ボーリウム（Ｂｈ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、ハッシウム（Ｈｓ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）及びコペルニシウム（Ｃｎ）からなる群のうち１つ以上を選択することができる。
【００３１】
本発明の「試料」という用語は、細胞外小胞を含む生体試料又は細胞培養液、組織試料等を含むものであって、具体的には、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血しょう、唾液、涙、汗、尿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ：cerebrospinal fluid）、腹水（ascites）、羊水（amniotic fluid）、精液、乳（milk）、粉塵、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群のうち１つ以上を選択することができるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の細胞外小胞の分離方法は、分離しようとする細胞外小胞が金属と特異的に結合する性質を利用して、金属と結合した細胞外小胞を試料から分離する方法に関する。本発明の分離方法では、先ず、キレートリガンドを固定させた固定相を製造する。前記固定相に金属と細胞外小胞試料をと添加してリガンド−金属のキレート化合物を形成し、金属−細胞外小胞の結合を形成することにより、細胞外小胞を試料から分離することができる。
【００３３】
本発明は、前記キレートリガンドが固定された固定相に金属と試料とを添加する段階において、３つの方法を提供する。
【００３４】
第１に、本発明は、前記キレートリガンドが固定された固定相に金属を添加し、非結合金属を洗浄して、金属キレート化合物を先に形成する。次に、金属キレート化合物が形成された固定相に細胞外小胞が含まれる試料を添加して、金属と細胞外小胞とを結合させ、固定相に金属と結合されて残っている細胞外小胞を溶出させることによって、目的とする細胞外小胞を試料から分離することができる。
【００３５】
本発明において、前記固定相にキレートリガンド、金属又は試料をローディングする方法は、重力式、ポンプ式（液体クロマトグラフィーシステム）、注射式、回転式又は真空式の中から選択することができるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明では、前記固定相にキレートリガンド、金属又は試料を結合させたり、非結合物質を洗浄するためには、本技術が属する分野における当業者が理解することができる様々な条件を適用することができる。具体的には、緩衝液のｐＨ、ＮａＣｌの濃度、イミダゾール（imidazole）等の濃度を調節することができる。好ましくは、本発明の結合及び洗浄条件は、ｐＨ３〜１２の緩衝液、０〜２ＭのＮａＣｌ、０〜１００ｍＭのイミダゾール、又は、上記条件の組み合わせを適用することができる。
【００３７】
本発明において、前記固定相に結合された細胞外小胞を溶出させるためには、本技術が属する分野における当業者が理解することができる様々な条件を適用することができる。具体的には、緩衝液のｐＨ、ＮａＣｌの濃度、イミダゾール（imidazole）の濃度、キレート剤の濃度、他のキレート剤の適用を調節することによって溶出させることができるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の溶出条件は、ｐＨ１０以下の緩衝液、０〜２ＭのＮａＣｌ、０〜２Ｍのイミダゾール、０〜２Ｍの金属キレート剤、又は、上記条件の組み合わせを適用することができる。
【００３８】
本発明の第２の方法は、キレートリガンドが固定された固定相にローディングする前に、少量の金属を試料に混合して金属と細胞外小胞とを結合させた後、前記結合物が含まれる試料を固定相に添加することである。前記細胞外小胞と結合した金属が、固定相に存在するキレートリガンドに結合することによって、目的とする細胞外小胞を試料から分離することができる。
【００３９】
本発明の第３の方法は、キレートリガンドが固定された固定相に金属と試料とを同時にローディングして、キレートリガンド−金属−細胞外小胞の結合物を同時に形成させることである。固定相に結合されていない物質を洗浄して除去することによって、細胞外小胞を試料から分離することができる。
【００４０】
本発明の細胞外小胞の分離方法は、前記固定相にローディングする前に、試料を前処理する段階をさらに含むことができる。
【００４１】
また、本発明の細胞外小胞の分離方法によって分離された細胞外小胞を後処理する段階をさらに含むことができる。
【００４２】
本発明の前記前処理段階は、非精製試料の部分精製段階として、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿又は有機溶媒沈殿のうち１つ以上の方法を選択することができるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の前記後処理段階は、分離された細胞外小胞の精製段階として、遠心分離、超遠心分離、濾過、限外濾過、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーベースの沈殿又は有機溶媒沈殿のうち１つ以上の方法を選択することができるが、これらに限定されない。
【００４４】
また、本発明は、前記分離方法によって分離された細胞外小胞を提供する。
【発明の効果】
【００４５】
本発明による細胞外小胞の分離方法は、遠心分離機のような高価な機器を必要とせず、分離過程で試料が極限の環境にさらされていないため、細胞外小胞の形態や性質を維持しながら効率的に分離することができるという利点がある。また、本発明の方法は、従来の細胞外小胞の分離方法と組み合わせて適用することができ、従来の方法の実行前段階又は後段階に適用することによって、分離効率を最大化することができる。
【００４６】
また、本発明の細胞外小胞の分離方法は、試料量の制限なしに迅速且つ効果的に細胞外小胞を分離することができるので、細胞外小胞の大量生産に重要な要素として活用することができると共に、少量の体液試料の前処理及び後処理段階に適用することによって、臨床診断に活用することができる。
【００４７】
さらに、本発明の細胞外小胞の分離方法は、細胞外小胞の種類に応じて、特定の金属に対する親和性が異なる性質を利用して、様々な金属で細胞外小胞のサブセット（subset）を分画することができる。分画された細胞外小胞のサブセットは、多次元的な病気の診断に活用することができ、既存の開発された多様な病気の診断マーカーを本発明に適用することによって、従来の診断マーカーの問題を解決し、様々な活用を可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】本発明による細胞外小胞の分離方法の模式図である。
【図１ｂ】本発明による細胞外小胞の分離方法の模式図である。
【図１ｃ】本発明による細胞外小胞の分離方法の模式図である。
【図２】本発明の一実施例による大腸癌細胞株ＳＷ４８０から標本細胞外小胞を分離する方法の概念図である。
【図３】本発明の一実施例によって分離された標本細胞外小胞を分子サイズ別クロマトグラフィー（ａ）及び透過電子顕微鏡（ｂ）で確認した結果を示す図である。
【図４】本発明による標本細胞外小胞の純度分析のためのクロマトグラムの結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例による標本細胞外小胞のナノ粒子分析結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例による標本細胞外小胞のサンドイッチＥＬＩＳＡ分析結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例による、金属がない場合の標本細胞外小胞の固定相結合面を分析したクロマトグラムである。
【図８】本発明の一実施例による、金属がない場合の標本細胞外小胞の固定相結合面を分析した結果を示す図である。
【図９】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＣｕ（ＩＩ）に対する親和性を分析したクロマトグラムである。
【図１０】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＣｕ（ＩＩ）に対する親和性分析結果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＣｕ（Ｉ）に対する親和性を分析したクロマトグラムである。
【図１２】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＣｕ（Ｉ）に対する親和性分析結果を示す図である。
【図１３】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＺｎ（ＩＩ）に対する親和性を分析したクロマトグラムである。
【図１４】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＺｎ（ＩＩ）に対する親和性分析結果を示す図である。
【図１５】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＮｉ（ＩＩ）に対する親和性を分析したクロマトグラムである。
【図１６】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＮｉ（ＩＩ）に対する親和性分析結果を示す図である。
【図１７】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＣｏ（ＩＩ）に対する親和性を分析したクロマトグラムである。
【図１８】本発明の一実施例による、標本細胞外小胞のＣｏ（ＩＩ）に対する親和性分析結果を示す図である。
【図１９】本発明の一実施例による、細胞培養液からの細胞外小胞の分離結果をクロマトグラム（ａ）及びウェスタンブロット（ｂ）で確認した結果を示す図である。
【図２０】本発明の一実施例による、前処理した細胞培養液からの細胞外小胞の分離結果をクロマトグラム（ａ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ｂ）及びナノ粒子分析（ｃ）で確認した結果を示す図である。
【図２１】本発明の一実施例による、前処理した細胞培養液から注射式で分離した細胞外小胞の分画を確認した結果を示す図である。
【図２２】本発明の一実施例による、前処理した細胞培養液から遠心分離法での細胞外小胞の分離結果をウェスタンブロットで確認した結果を示す図である。
【図２３】本発明の一実施例による、前処理した組織抽出液から遠心分離法での細胞外小胞の分離結果をナノ粒子分析（ａ）及び化学発光信号分析（ｂ）で確認した結果を示す図である。
【図２４】本発明の一実施例による、前処理した癌組織抽出液から遠心分離法での細胞外小胞の分離結果をナノ粒子分析（ａ）及び化学発光信号分析（ｂ）で確認した結果を示す図である。
【図２５】本発明の一実施例による、前処理した尿からの細胞外小胞の分離結果をクロマトグラム（ａ）、ナノ粒子分析（ｂ）及びＥＬＩＳＡ（ｃ）で確認した結果を示す図である。
【図２６】本発明の一実施例による、前処理した大腸菌培養液からの細胞外小胞の分離結果をＥＬＩＳＡで確認した結果を示す図である。
【図２７】本発明の一実施例による、前処理したビールからの細胞外小胞の分離結果をＥＬＩＳＡで確認した結果を示す図である。
【図２８】本発明の一実施例による図１ｂの方法を使用して前処理した細胞培養液から細胞外小胞を分離した結果をウェスタンブロット及びナノ粒子分析で確認した結果を示す図である。
【図２９】本発明の一実施例による図１ｃの方法を使用して前処理した細胞培養液から細胞外小胞を分離した結果をウェスタンブロット及びナノ粒子分析で確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を単に例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００５０】
（実施例１．標本細胞外小胞の精製及び分析）
（１−１．標本細胞外小胞の分離及び精製）
新鮮な得られた大腸癌細胞株ＳＷ４８０培養液を５００ｘｇで１０分間遠心分離（計２回反復）して、残存する細胞及び沈殿物を除去した。上記上澄み液を再度２，０００ｘｇで２０分間遠心分離（計２回反復）して、沈殿物を除去した。
【００５１】
上記上澄み液に存在する細胞外小胞を１次精製及び沈殿するために、細胞外小胞沈殿誘導液（８．４％Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ６０００、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を添加し、１６時間冷蔵保管した後、１２，０００ｘｇで３０分間遠心分離して沈殿した細胞外小胞を取得し、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶かし出した。
【００５２】
密度及び浮力を利用して細胞外小胞を２次精製するために、上記試料をオプティプレップと混合（最終濃度３０％）して超遠心分離容器の最下層に位置させた後、２０％オプティプレップ、５％オプティプレップの順に積層した。２００，０００ｘｇで２時間、オプティプレップ浮力密度勾配超遠心分離（３０％、２０％、５％オプティプレップの三重層）を行い、超遠心分離後の細胞外小胞と相当密度（１．０８〜１．１２ｇ／ｍｌ）地域とを取得した。
【００５３】
上記精製された細胞外小胞を３次精製するために、ＨＰＬＣ装備を利用して、セファクリル（Sephacryl）Ｓ５００で充填されたカラム（１０×１００ｍｍ）にローディングした後、分子サイズ別クロマトグラフィーを介して最終精製された細胞外小胞分画を取得し、この標本細胞外小胞の分離過程を図２に示した。
【００５４】
上記方法により大腸癌細胞株ＳＷ４８０から最終精製された細胞外小胞を分子サイズ別クロマトグラフィー及び電子顕微鏡を介して確認した。その結果、図３（ａ）に示すように、分子サイズ別クロマトグラフィーでは、精製した大腸癌細胞株由来の細胞外小胞の高い純度を確認することができ、図３（ｂ）に示すように、透過電子顕微鏡を用いて大腸癌細胞株由来の細胞外小胞のサイズが約５０〜２００ｎｍであることを確認することができた。
【００５５】
（１−２．標本細胞外小胞の純度分析）
上記大腸癌細胞株ＳＷ４８０から精製された標本細胞外小胞の純度を検証するために、ＨＰＬＣシステムを用いた。ＨＰＬＣ用ＴＳＫｇｅｌ６０００カラム（７．５×６００ｍｍ）に上記方法により精製した標本細胞外小胞をローディングした後、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を流動相として０．５ｍｌ／ｍｉｎで流しながら、２８０ｎｍ吸光度を追跡して精製した試料の純度を検証した。図４に示すように、約１６分で溶出された標本細胞外小胞（赤色）は、非常に高い純度（＞９０％）を示した。これは、対照群として使用されたアルブミン（ＢＳＡ）（黒色；約５０ｋＤａ）とＩｇＧ抗体（青色；約１５０ｋＤａ）よりも早く溶出され、そのサイズが非常に大きいことが分かった。
【００５６】
（１−３．標本細胞外小胞分画のナノ粒子分析）
ナノ粒子の確認及び定量のために、上記ＨＰＬＣ装置を利用して、標本細胞外小胞の分子サイズ別クロマトグラフィー分画に対してナノ粒子分析（Nanoparticle Tracking Analysis）を行った。ナノ粒子分析においてＮａｎｏｓｉｇｈｔ  ＬＭ１０装置が使用され、カメラレベル１０、検出限界５の条件で６０秒間追跡記録し、その結果を図５に示した。
【００５７】
図５に示すように、分子サイズ別クロマトグラフィー分画のうち１６分に溶出された分画において、高い濃度のナノ粒子が存在することを確認することができた。
【００５８】
（１−４．標本細胞外小胞分画のサンドイッチＥＬＩＳＡ分析）
上記標本細胞外小胞の分子サイズ別クロマトグラフィー分画をヒト大腸癌細胞株由来の細胞外小胞に特異的な複数のクローン抗体（rabbit polyclonal anti-SW480 EVs）でコーティングされたマイクロプレート（microplate）に反応させた後、上記結合された細胞外小胞を単一クローン抗−ＣＤ９抗体又はビオチン（biotin）が結合された複数のクローン抗−大腸癌細胞株由来の細胞外小胞抗体と共に培養して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）が結合された抗−マウス抗体又は西洋ワサビペルオキシダーゼが結合されたストレプトアビジン（streptavidin）と培養させた後、化学発光を測定することによって、細胞外小胞の量を測定した。
【００５９】
その結果、図６に示すように、分子サイズ別クロマトグラフィー分画のうち１６分に溶出された分画において、多重クローン抗−大腸癌細胞株由来の細胞外小胞抗体と共に単一クローン抗−ＣＤ９抗体に対して高い反応性を示すことが分かった。
【００６０】
（実施例２．金属がない場合の標本細胞外小胞の固定相結合面）
ＨＰＬＣシステムを利用して、標本細胞外小胞（４×１０１０パーティクル）を、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に５分間、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を使用してローディングした後、さらに５分間、同一の緩衝溶液で洗浄した。次に、２０カラム体積の間ｐＨ７．２で０〜５００ｍＭイミダゾール（imidazole）／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で濃度勾配を行い、結合及び洗浄過程を含む全ての過程の溶出液を１ｍｌずつ分画した。
【００６１】
分画された溶出液に対して、上記のような方法でクロマトグラム分析（２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ吸光度測定）と、ナノ粒子分析と、サンドイッチＥＬＩＳＡと、を行って、細胞外小胞の固定相結合面を分析し、その結果を図７及び図８に示した。その結果、固定相に金属がない場合、全ての標本細胞外小胞は、固定相に結合せず、ローディングと同時に溶出されることが分かった。
【００６２】
（実施例３．Ｃｕ（ＩＩ）に対する標本細胞外小胞の親和性分析）
ＨＰＬＣシステムを利用して、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンを結合させた後、２０カラム体積のＨＥＰＥＳ緩衝溶液で結合していない残余物を洗浄した。
【００６３】
上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相カラムに標本細胞外小胞（４×１０１０パーティクル）を、５分間、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を使用してローディングした後、さらに５分間、同一の緩衝溶液で洗浄し、２０カラム体積の間ｐＨ７．２で０〜５００ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で濃度勾配を行いながら、結合及び洗浄過程を含む全ての過程の溶出液を１ｍｌずつ分画した。分画された溶出液に対して上述した方法でクロマトグラム分析（２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ吸光度測定）と、ナノ粒子分析と、サンドイッチＥＬＩＳＡとを行い、細胞外小胞の固定相結合面を分析し、その結果を図９及び図１０に示した。その結果、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相には、全ての標本細胞外小胞が結合し、イミダゾール濃度の増加に応じて溶出されるのを確認することができた。
【００６４】
（実施例４．Ｃｕ（Ｉ）に対する標本細胞外小胞の親和性分析）
固定相（IDA-Sepharose）に添加する金属としてＣｕ（Ｉ）イオンを使用したことを除いて、上記実施例３と同様の方法で標本細胞外小胞の親和性を分析した。
【００６５】
その結果、図１１及び図１２に示すように、Ｃｕ（Ｉ）イオンが結合された固定相には、全ての標本細胞外小胞が結合し、イミダゾール濃度の増加に応じて溶出されるのを確認することができた。
【００６６】
（実施例５．Ｚｎ（ＩＩ）に対する標本細胞外小胞の親和性分析）
ＨＰＬＣシステムを利用して、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｚｎ（ＩＩ）イオンを結合させた後、２０カラム体積のＨＥＰＥＳ緩衝溶液で結合していない残余物を洗浄した。
【００６７】
上記Ｚｎ（ＩＩ）イオンが結合された固定相カラムに標本細胞外小胞（２×１０１０パーティクル）を、５分間、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を使用してローディングした後、さらに５分間、同一の緩衝溶液で洗浄し、２０カラム体積の間０〜５００ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で濃度勾配を行いながら、結合及び洗浄過程を含む全ての過程の溶出液を１ｍｌずつ分画した。分画された溶出液に対して上述した方法でクロマトグラム分析（２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ吸光度測定）と、ナノ粒子分析と、サンドイッチＥＬＩＳＡとを行い、細胞外小胞の固定相結合面を分析し、その結果を図１３及び図１４に示した。
【００６８】
その結果、Ｚｎ（ＩＩ）イオンが結合された固定相には、約８０％の標本細胞外小胞が結合し、イミダゾール濃度の増加に応じて溶出されるのを確認することができた。残りの約２０％の標本細胞外小胞は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合せず、ローディングと同時に溶出された。これは、約２０％の細胞外小胞は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンに結合しないサブセット（subset）であって、Ｚｎ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合した細胞外小胞とは異なる特性を有することを意味する。
【００６９】
（実施例６．Ｎｉ（ＩＩ）に対する標本細胞外小胞の親和性分析）
固定相（IDA-Sepharose）に添加する金属としてＮｉ（ＩＩ）イオンを使用したことを除いて、上記実施例３と同様の方法で標本細胞外小胞の親和性を分析した。
【００７０】
その結果、図１５及び図１６に示すように、Ｎｉ（ＩＩ）イオンが結合された固定相には、約２５％の標本細胞外小胞が結合し、イミダゾール濃度の増加に応じて溶出されるのを確認することができた。残りの約７５％の標本細胞外小胞は、Ｎｉ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合せず、ローディングと同時に溶出された。これは、約２５％の細胞外小胞サブセット（subset）が、Ｎｉ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合する特性を有することを意味する。
【００７１】
（実施例７．Ｃｏ（ＩＩ）に対する標本細胞外小胞の親和性分析）
固定相（IDA-Sepharose）に添加する金属としてＣｏ（ＩＩ）イオンを使用したことを除いて、上記実施例３と同様の方法で標本細胞外小胞の親和性を分析した。
【００７２】
その結果、図１７及び図１８に示すように、Ｃｏ（ＩＩ）イオンが結合された固定相には、約１０％の標本細胞外小胞が結合し、イミダゾール濃度の増加に応じて溶出されるのを確認することができた。残りの約９０％の標本細胞外小胞は、Ｃｏ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合せず、ローディングと同時に溶出された。これは、約１０％の細胞外小胞サブセット（subset）が、Ｃｏ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合する特性を有することを意味する。
【００７３】
（実施例８．幹細胞培養液（crude sample）からの細胞外小胞の分離−ポンプ式）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、幹細胞の培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、ＨＰＬＣシステムを利用して、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンを結合させた後、２０カラム体積のＨＥＰＥＳ緩衝溶液で結合していない残余物を洗浄した。
【００７４】
上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に前処理していないヒト間葉系幹細胞（hMSC serum-free）培養液（conditioned medium）５ｍｌを、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を使用してローディングし、同じ緩衝溶液で５カラム体積で洗浄した後、２０カラム体積の間ｐＨ７．２で０〜５００ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で濃度勾配を行いながら、結合及び洗浄過程を含む全ての過程の溶出液を１ｍｌずつ分画した。
【００７５】
分画された溶出液で上述した方法でクロマトグラム分析（２８０ｎｍ吸光度測定）を行い、同じ体積の溶出液をトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）で沈殿した後に、ＳＤＳ−電気泳動を行った後、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ９の信号を分析した。
【００７６】
その結果、図１９（ａ）に示すように、クロマトグラムの結果、溶出時間が１６分である場合に細胞外小胞信号を確認し、図１９（ｂ）に示すように、ウェスタンブロット分析結果においても、クロマトグラム結果と同じ溶出時間の分画物において強いＣＤ９信号を検出することによって、ヒト間葉系幹細胞培養液の細胞外小胞が、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合して、イミダゾール濃度勾配によって溶出及び分離されたことを確認した。
【００７７】
（実施例９．前処理した大腸癌細胞株培養液からの細胞外小胞の分離−ポンプ式）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、大腸癌細胞株培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、ＨＰＬＣシステムを利用して、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンを結合させた後、２０カラム体積のＨＥＰＥＳ緩衝溶液で結合していない残余物を洗浄した。
【００７８】
大腸癌細胞株ＳＷ４８０の培養液（１０％細胞外小胞が除外されたＦＢＳを含む）を細胞外小胞沈殿誘導溶液（８．４％  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ６０００、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞（４×１０１０パーティクル）を、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相カラムにＨＥＰＥＳ緩衝溶液を使用してローディングし、同じ緩衝溶液で１０カラム体積で洗浄した後に、２０カラム体積の間０〜５００ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で濃度勾配を行いながら、結合及び洗浄過程を含む全ての過程の溶出液を１ｍｌずつ分画した。ＨＰＬＣ過程で溶出された全ての溶液は、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長で吸光度を追跡して、各波長のクロマトグラムを確保した。
【００７９】
同じ体積の上記溶出液をサンドイッチＥＬＩＳＡに適用して、大腸癌細胞株由来の細胞外小胞特異的信号及びＣＤ９抗体の信号を分析し、ナノ粒子分析を介して細胞外小胞の濃度を測定した。
【００８０】
その結果、図２０（ａ）に示すクロマトグラム上の１１分のバンドと同じ溶出時間に大腸癌細胞由来の細胞外小胞の信号及びＣＤ９抗体の強力な信号を検出し（図２０（ｂ））、分画された溶出液のナノ粒子分析を介してクロマトグラム上の１１分のバンドと同じ溶出時間にナノ粒子信号（図２０（ｃ））が検出されることを確認した。したがって、細胞外小胞の沈殿誘導を介して得られた細胞外小胞溶液が、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合して、イミダゾール濃度勾配によって溶出及び分離されたことを確認することができた。
【００８１】
（実施例１０．前処理した大腸癌細胞株培養液からの細胞外小胞の分離−注射式）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、大腸癌細胞株培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、注射式（syringe）システムを利用して、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンを結合させた後、２０カラム体積のＨＥＰＥＳ緩衝溶液で結合していない残余物を洗浄した。
【００８２】
大腸癌細胞株ＳＷ４８０の培養液（１０％細胞外小胞が除外されたＦＢＳを含む）を細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞を、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相カラムに注射を利用してローディングし、同じ緩衝溶液で１１カラム体積で洗浄した後、５０ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で各１ｍｌ、計５回の注射を利用して溶出した。
【００８３】
ローディング段階での非結合溶出液、洗浄段階での溶出液、及び、イミダゾール段階での溶出液で通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ９のウェスタンブロット分析を行い、収率を確認するために、同量の前処理した試料とイミダゾール段階の溶出液とに対してＣＤ９信号強度を分析した。その結果、図２１に示すように、試料に存在する殆どのＣＤ９信号が、注射式によって、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合し、５０ｍＭイミダゾール溶液で溶出されるのを確認した。また、試料内に存在するＣＤ９信号と溶出液に存在するＣＤ９信号とで強度が非常に類似している点に基づいて、本技術を介して高い収率の細胞外小胞を分離することができることを確認した。
【００８４】
（実施例１１．前処理した細胞培養液からの細胞外小胞の分離−遠心分離法）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、大腸癌細胞株培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、遠心分離（７００ｘｇ、１分）を利用して、固定相（IDA-Sepharose）を空きのカラムに充填し、０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンをローディングして結合させた後、金属イオンをローディングしたカラムにＨＥＰＥＳ緩衝溶液（１ｍｌずつ）を入れ、３回に亘る遠心分離を介して、結合していない残余物を洗浄した。
【００８５】
大腸癌細胞の培養液（１０％細胞外小胞が除外されたＦＢＳを含む）を細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞を、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相が充填されたスパンカラムにローディングし、同じ緩衝溶液で計３回、各１ｍｌずつの遠心分離を介して洗浄した後、計５回、各０．５ｍｌ  ２０ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で固定相に結合した細胞外小胞を溶出した。残存する細胞外小胞を確認するために、１００ｍＭイミダゾールで最終洗浄した。
【００８６】
溶出された各分画及び最終洗浄液に対してＳＤＳ−電気泳動を行い、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ８１の信号を分析した。その結果、図２２に示すように、２番目の２０ｍＭイミダゾール溶出分画で強いＣＤ８１信号を検出することによって、大腸癌細胞由来の細胞外小胞が、遠心分離を介して、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合し、２０ｍＭイミダゾール溶出条件で分離されたことを確認した。
【００８７】
（実施例１２．前処理した組織抽出液からの細胞外小胞の分離−遠心分離法）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、マウスの肝組織から細胞外小胞を分離した。具体的には、遠心分離（７００ｘｇ、１分）を利用して、固定相（IDA-Sepharose）を空きのカラムに充填し、０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンをローディングして結合させた後、金属イオンをローディングしたカラムにＨＥＰＥＳ緩衝溶液を入れ、計３回、各１ｍｌずつの遠心分離を介して、結合していない残余物を洗浄した。
【００８８】
肝組織内の細胞外小胞を分離するために、麻酔したマウスで灌流を介して血液が除去された肝組織を摘出し、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で洗浄した後、組織を５ｍｍ×５ｍｍサイズに切って、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で洗浄した。洗浄されたマウス肝組織をコラゲナーゼ（Collagenase）とディーエヌアーゼ（DNase）とを混合したＲＰＭＩ培養液と共に３７℃で３０分間培養した後、遠心分離（５００ｘｇ、１０分）を介して肝組織を除去し、残った肝組織抽出液をさらに遠心分離（２，０００ｘｇ、１０分、計２回）して浮遊物を除去した。
【００８９】
浮遊物が除去された肝組織抽出液を細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して非精製細胞外小胞を取得した。取得した非精製細胞外小胞溶液から、セファクリルＳ５００分子サイズ別クロマトグラフィーを利用して、細胞外小胞を含む分子量が５００ｋＤａ以上の分画を取得し、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンと結合した固定相が充填されたスパンカラムにローディングした後、遠心分離を介して非結合溶出液を取得した。上記カラムをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で計３回、各０．５ｍｌずつ遠心分離を介して洗浄した。次に、結合された細胞外小胞を固定相から分離するために、各０．５ｍｌずつ計３回、５０ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を洗浄されたカラムにローディングし、遠心分離を介して溶出液を取得した。
【００９０】
結果分析のために、上記カラムにローディングした試料、非結合溶出液及びＥＤＴＡ溶出液に対してナノ粒子分析を行い、マイクロプレートに吸着させた後、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ９と反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗−レット抗体に対する抗体を反応させて、化学発光の信号を分析した。その結果、図２３に示すように、非結合溶出液及び洗浄過程でナノ粒子信号が検出されておらず、ＥＤＴＡ溶出液で高いナノ粒子信号が検出された（図２３（ａ））。また、試料内の殆どのＣＤ９陽性反応を示す物質が固定相に結合し、ＥＤＴＡによって溶出されたが、非結合溶出液には、ＣＤ９信号が非常に低く（図２３（ｂ））、本方式を介して肝組織抽出液から細胞外小胞を高効率で分離することができることを確認した。
【００９１】
（実施例１３．前処理した癌組織抽出液からの細胞外小胞の分離−遠心分離法）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、マウスの癌組織から細胞外小胞を分離した。具体的には、遠心分離（７００ｘｇ、１分）を利用して、固定相（IDA-Sepharose）を空きのカラムに充填し、０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンをローディングして結合させた後、金属イオンをローディングしたカラムにＨＥＰＥＳ緩衝溶液を入れ、計３回、各１ｍｌずつ遠心分離を介して、結合していない残余物を洗浄した。
【００９２】
マウスにＣＴ２６癌細胞を皮下注射して１０日間癌組織を培養した後、麻酔したマウスの癌組織を摘出し、これをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で洗浄した後、組織を５ｍｍ×５ｍｍサイズに切って、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で洗浄した。洗浄された癌組織をコラゲナーゼ（Collagenase）とディーエヌアーゼ（DNase）とを混合したＲＰＭＩ培養液と共に３７℃で３０分間培養した後、遠心分離（５００ｘｇ、１０分）を介して癌組織を除去し、残った癌組織抽出液をさらに遠心分離（２，０００ｘｇ、１０分、計２回）して浮遊物を除去した。
【００９３】
浮遊物が除去された癌組織抽出液を細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して非精製細胞外小胞を取得した。取得した非精製細胞外小胞溶液から、セファクリルＳ５００分子サイズ別クロマトグラフィーを利用して、細胞外小胞を含む分子量が５００ｋＤａ以上の分画を取得し、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンと結合した固定相が充填されたスパンカラムにローディングした後、遠心分離を介して非結合溶出液を取得した。上記カラムをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で計３回、各０．５ｍｌずつ遠心分離を介して洗浄した。次に、結合された細胞外小胞を固定相から分離するために、各０．５ｍｌずつ計３回、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を洗浄されたカラムにローディングし、遠心分離を介して溶出液を取得した。
【００９４】
上記カラムにローディングした試料、非結合溶出液及びＥＤＴＡ溶出液に対してナノ粒子分析を行い、マイクロプレートに吸着させた後、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ９と反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗−レット抗体に対する抗体を反応させて、化学発光の信号を分析した。その結果、図２４に示すように、非結合溶出液及び洗浄過程でナノ粒子信号が検出されず、ＥＤＴＡ溶出液から高いナノ粒子信号が検出された（図２４（ａ））。また、試料内の殆どのＣＤ９陽性反応を示す物質が固定相に結合し、メタルキレートであるＥＤＴＡによって溶出されたが、非結合溶出液では、ＣＤ９信号が検出されなかった（図２４（ｂ））。したがって、本方式を介して癌組織抽出液から細胞外小胞を分離することができることを確認した。
【００９５】
（実施例１４．前処理した尿からの細胞外小胞の分離−ポンプ式）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、ヒトの尿試料から細胞外小胞を分離した。具体的には、ＨＰＬＣシステムを利用して、固定相（IDA-Sepharose）が充填されたカラム（１ｍｌ）に０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンを結合させた後、２０カラム体積のＨＥＰＥＳ緩衝溶液で結合していない残余物を洗浄した。
【００９６】
ヒトの尿を採取して０．４５ｍｍフィルタで濾過した後、細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させた。遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞から、セファクリルＳ５００分子サイズ別クロマトグラフィーを利用して、細胞外小胞を含む分子量が５００ｋＤａ以上の分画を取得し、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンと結合した固定相が充填されたカラムにローディングした。同じ緩衝溶液で５カラム体積で洗浄した後、２０カラム体積の間０〜５００ｍＭイミダゾール／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で濃度勾配を行いながら、ローディング及び洗浄過程を含む全ての過程の溶出液を１ｍｌずつ分画し、ＨＰＬＣ過程で溶出された全ての溶液が、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長で吸光度を追跡して、各波長のクロマトグラムを確保した。同じ体積の溶出された分画に対してナノ粒子分析を行い、マイクロプレートに吸着させた後、通常の細胞外小胞マーカーＣＤ９に対して単一クローン抗−ＣＤ９抗体を反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗−マウス抗体に対する抗体をさらに培養して、化学発光を測定した。
【００９７】
その結果、図２５に示すクロマトグラム（図２５（ａ））上の１１分のバンドと同じ溶出時間に高濃度のナノ粒子信号（図２５（ｂ））が検出され、また、ＣＤ９抗体に対するウェスタンブロット分析を介して、クロマトグラム上の１１分のバンドと同じ溶出時間に強いＣＤ９信号（図２５（ｃ））が検出されることを確認した。したがって、尿中の細胞外小胞を、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相を利用して結合させ、イミダゾールを利用して溶出及び分離することができることを確認した。
【００９８】
（実施例１５．前処理した大腸菌培養液からの細菌由来の細胞外小胞の分離−遠心分離法）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、大腸菌培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、遠心分離（７００ｘｇ、１分）を利用して、固定相（IDA-Sepharose）を空きのカラムに充填し、０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンをローディングして結合させた後、金属イオンをローディングしたカラムにＨＥＰＥＳ緩衝溶液を入れ、計３回、各１ｍｌずつ遠心分離を介して、結合していない残余物を洗浄した。
【００９９】
大腸菌培養液（E.coli C4 culture medium）を０．４５ｍｍフィルタで濾過した後、細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して、大腸菌由来の細胞外小胞を沈殿させた。遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞から、セファクリルＳ５００分子サイズ別クロマトグラフィーを利用して、細胞外小胞を含む分子量が５００ｋＤａ以上の分画を取得し、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンと結合した固定相が充填されたスパンカラムにローディングした。
【０１００】
遠心分離を介して非結合溶出液を取得し、上記カラムをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で計３回、各０．５ｍｌずつ遠心分離を介して洗浄した。次に、結合された大腸菌由来の細胞外小胞を固定相から分離するために、各０．５ｍｌずつ計３回、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を洗浄されたカラムにローディングした後、遠心分離を介して溶出液を取得した。
【０１０１】
上記カラムにローディングした試料、非結合溶出液及びＥＤＴＡ溶出液をマイクロプレートに吸着させた後、複数のクローン抗−大腸菌由来の細胞外小胞抗体を添加して反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗−ウサギ抗体に対する抗体をさらに培養して、化学発光を測定した。
【０１０２】
その結果、図２６に示すように、試料内の複数のクローン抗−大腸菌由来の細胞外小胞抗体に反応する物質の殆どが、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合し、メタルキレートであるＥＤＴＡによって溶出されたが、非結合溶出液には、複数のクローン抗−大腸菌由来の細胞外小胞抗体の信号が検出されなかった。したがって、本発明の方法を利用して、大腸菌由来の細胞外小胞を高い収率で分離することができることを確認した。
【０１０３】
（実施例１６．前処理したビールからの酵母由来の細胞外小胞の分離−遠心分離法）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第１の方法（図１ａ参照）を利用して、ビールから細胞外小胞を分離した。具体的には、遠心分離（７００ｘｇ、１分）を利用して、固定相（IDA-Sepharose）を空きのカラムに充填し、０．５ｍｌ  ５００ｍＭ  Ｃｕ（ＩＩ）イオンをローディングして結合させた後、金属イオンをローディングしたカラムにＨＥＰＥＳ緩衝溶液で計３回、各１ｍｌずつ遠心分離を介して、結合していない残余物を洗浄した。
【０１０４】
ビールを０．４５ｍｍフィルタで濾過した後、細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させた。遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞から、セファクリルＳ５００分子サイズ別クロマトグラフィーを利用して、細胞外小胞を含む分子量が５００ｋＤａ以上の分画を取得し、上記Ｃｕ（ＩＩ）イオンと結合した固定相が充填されたスパンカラムにローディングした。
【０１０５】
遠心分離を介して非結合溶出液を取得し、上記カラムをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で計３回、各０．５ｍｌずつ遠心分離を介して洗浄した。次に、結合された細胞外小胞を固定相から分離するために、各０．５ｍｌずつ計３回、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を洗浄されたカラムにローディングした後、遠心分離を介して溶出液を取得した。
【０１０６】
上記カラムにローディングした試料、非結合溶出液及びＥＤＴＡ溶出液をマイクロプレートに吸着させた後、複数のクローン抗−酵母由来の細胞外小胞抗体を添加して反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗−ウサギ抗体に対する抗体をさらに培養して、化学発光を測定した。
【０１０７】
その結果、図２７に示すように、試料内の複数のクローン抗−酵母由来の細胞外小胞抗体に反応する物質の殆どが、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが結合された固定相に結合し、メタルキレートであるＥＤＴＡによって溶出されたが、非結合溶出液には、複数のクローン抗−酵母由来の細胞外小胞抗体の信号が検出されなかった。したがって、本発明の方法を利用して、ビールから酵母由来の細胞外小胞を高い収率で分離することができることを確認した。
【０１０８】
（実施例１７．前処理した細胞培養液からの細胞外小胞の分離）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第２の方法（図１ｂ参照）を利用して、大腸癌細胞の培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、大腸癌細胞の培養液を細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して取得した非精製細胞外小胞溶液にＣｕ（ＩＩ）イオンを最終的に５ｍＭになるように添加した。１ｍｌの固定相（IDA-Sepharose）をスパンカラムに充填した後、水で計３回、各１ｍｌずつ遠心分離（７００ｘｇ、１分）を介して洗浄した。洗浄された固定相にＣｕ（ＩＩ）イオンが添加された試料をローディングし、遠心分離を介して非結合溶液を取得した後、上記カラムをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で計３回、各１ｍｌずつ遠心分離で洗浄した。
【０１０９】
固定相に結合された細胞外小胞を溶出するために、洗浄されたカラムに１ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を添加し、上記と同様の条件で遠心分離して細胞外小胞を溶出した。上記カラムにローディングした試料、非結合溶出液及びＥＤＴＡ溶出液に対してナノ粒子分析を行い、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤに対するウェスタンブロット分析を行った。その結果、図２８に示すように、９０％以上のナノ粒子信号が固定相に結合して、メタルキレートであるＥＤＴＡによって溶出された。また、非結合溶出液には、ナノ粒子信号がなく、本発明の方法を利用して細胞外小胞が高い収率で分離されることを確認した。そして、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ９のウェスタンブロット分析においても、ナノ粒子分析と同じ面に試料内の９０％以上のＣＤ９信号が固定相に結合した後、ＥＤＴＡによって溶出されることを確認することができた。
【０１１０】
（実施例１８．前処理した細胞培養液からの細胞外小胞の分離）
本発明の細胞外小胞の分離方法のうち第３の方法（図１ｃ参照）を利用して、大腸癌細胞の培養液から細胞外小胞を分離した。具体的には、大腸癌細胞の培養液を細胞外小胞沈殿誘導溶液と混合して細胞外小胞を沈殿させ、遠心分離を介して非精製細胞外小胞を取得した。取得した非精製細胞外小胞溶液と５ｍＭのＣｕ（ＩＩ）イオン、そして水で洗浄された１ｍｌの固定相（IDA-Sepharose）を含む懸濁液を２５℃で３０分間培養した。上記懸濁液をスパンカラムにローディングし、遠心分離（７００ｘｇ、１分）を介して非結合溶液を取得した後、上記カラムをＨＥＰＥＳ緩衝溶液で各１ｍｌずつ計３回、遠心分離で洗浄した。
【０１１１】
固定相に結合された細胞外小胞を溶出するために、洗浄されたカラムに１ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を添加し、上記と同様の条件で遠心分離して細胞外小胞を溶出した。上記カラムにローディングした試料、非結合溶出液及びＥＤＴＡ溶出液に対してナノ粒子分析を行い、通常の細胞外小胞マーカーであるＣＤ９に対するウェスタンブロット分析を行った。その結果、図２９に示すように、殆どのナノ粒子信号及び試料内のＣＤ９陽性反応を示す物質が固定相に結合し、メタルキレートであるＥＤＴＡによって溶出されたが、非結合溶出液には、ナノ粒子信号及びＣＤ９信号がなく、本発明の方法を介して試料内の細胞外小胞を高い収率で分離することができることを確認した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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