(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含み、
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、組成物。
【化１】
0006906127.tif 000007
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ8又はＣＨ−Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１−１１である。
｝
【請求項２】
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、請求項１の組成物。
【化２】
0006906127.tif 000008
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１−１１である。
｝
【請求項３】
前記阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６である、請求項１の組成物。
【請求項４】
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を治療するための組成物である、請求項１〜３いずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を予防するための組成物である、請求項１〜３いずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ＦｏｘＯ１阻害剤を有効成分として含むコロナウィルス感染症の予防剤または治療剤であって、
前記ＦｏｘＯ１阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、予防剤または治療剤。
【化３】
0006906127.tif 000009
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ8又はＣＨ−Ｒ8 （Ｒ8：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１−１１である。
｝
【請求項７】
ＡＳ１８４２８５６を有効成分として含むコロナウィルス感染症の予防剤または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ，  ｓｅｒｉｎｅ  ２）の発現を抑制するための組成物、又は、コロナウィルス感染症の予防剤若しくは治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０１９年の終わりから人への感染が始まったとされる新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）による感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）は世界中で猛威を振るい、その治療薬並びにウイルスに対するワクチンの研究開発が各国で盛んに行われている。ＣＯＶＩＤ−１９は発症するとサイトカインストームと呼ばれる過剰な炎症反応が引き起こされ、当初は異常な肺炎症状を引き起こすことにより死に至らしめると考えられていた。その後、肺のみならず、血管、脳神経系、肝臓、腎臓など全身に症状が見られることが明らかになりつつある。これまでの研究成果から、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２は全ての細胞に感染するというより、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）を細胞表面に発現している細胞に特異的に感染することが示唆されている。さらに最近ではＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｓｅｒｉｎｅ２）というタンパク質分解酵素によって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２の表面にあるスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が切断されることでさらに感染力が高まる、などの報告も相次いでいる。非特許文献１では、これまでのＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に関する知見に関してまとめられている。  
【０００３】
ＡＣＥ２の遺伝子発現制御に関して、これまでにフォークヘッド型転写因子ＦｏｘＡファミリーが、ＡＣＥ２遺伝子のプロモーター領域に結合してｍＲＮＡの転写を促進するという文献報告（非特許文献２）はあった。そして、その文献で、ＦｏｘＡファミリーに近いファミリー分子であるＦｏｘＯ１に関しても検討しており、ＦｏｘＯ１はＡＣＥ２遺伝子のプロモーター領域に結合することはできるが、ＦｏｘＯ１の過剰発現でＡＣＥ２のｍＲＮＡの転写は有意に促進されない、という結果を報告している。しかし、この文献ではＦｏｘＯ１の過剰発現自体が成功しているかの検証はなされておらず、さらにＲＮＡ干渉法やノックアウト、阻害剤などでＦｏｘＡ２、ＦｏｘＯ１の必要性に関して検討もされておらず、ＦｏｘＡ２やＦｏｘＯ１がどこまでＡＣＥ２のｍＲＮＡ発現に影響するかについては依然不明のままであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】https://www.nature.com/articles/d41586-020-00502-w
【非特許文献２】J Endocr Soc. 2017 Apr 1;1(4):370-384.（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29082356/）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２の感染拡大に伴い、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に対する治療法及び予防法が全世界で期待されている。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２はＡＣＥ２を介して感染することは広く知られており、このＡＣＥ２に対する中和抗体の作成などが急ピッチで進められているものの、いまだ実用化に至ってはいない。そこで、本開示は、ＣＯＶＩＤ−１９の治療・予防にも関係する、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）を抑制するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者が鋭意検討したところ、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１の阻害剤を加えるだけで、ＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ量を減少させることが明らかになり、ＦｏｘＯ１がＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現の誘導に関連し、ＦｏｘＯ１を阻害することでＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することを明らかにした。  
【０００７】
さらに、上述のＡＣＥ２の発現量の減少が、新型コロナウィルスのスパイクタンパク質の細胞内の取り込みの減少につながることを見出した。  
【０００８】
本開示の発明は、上記知見に基づいて完成され、一側面において、以下の発明を包含する。
（発明１）
アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。
（発明２）
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、発明１の組成物。
【化１】
0006906127.tif 000002
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ８又はＣＨ−Ｒ８ （Ｒ８：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１−１１である。
｝
（発明３）
前記阻害剤が、以下の式で表される化合物又はその塩である、発明１の組成物。
【化２】
0006906127.tif 000003
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ８ （Ｒ８：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１−１１である。
｝
（発明４）
前記阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である、発明１の組成物。
（発明５）
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を治療するための組成物である、発明１〜４いずれか１つに記載の組成物。
（発明６）
新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を予防するための組成物である、発明１〜４いずれか１つに記載の組成物。
（発明７）
ＦｏｘＯ１阻害剤を有効成分として含むコロナウィルス感染症の予防剤または治療剤。
（発明８）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である発明７の予防剤または治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本開示の組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む。これによって、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６（濃度はグラフ下に示す）の添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。更には、ＦｏｘＯ１によるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現誘導メカニズムの模式図である。
【図２】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２表面タンパク質であるスパイクタンパク質中の、ＡＣＥ２結合領域（ＲＢＤ）の組換えタンパク質（ＲＢＤ−ｍＦｃ）の細胞内への取り込みアッセイの模式図である。Ｓ１及びＲＢＤにはマウスＩｇＧ由来のＦｃ配列（ｍＦｃ）が融合しており、マウスＩｇＧを認識する蛍光標識抗体を用いた免疫染色法により、細胞内に取り込まれたＲＢＤの量を定量化することが可能である。
【図３】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２表面タンパク質であるスパイクタンパク質の中の、ＡＣＥ２結合領域（ＲＢＤ）の組換えタンパク質（ＲＢＤ−ｍＦｃ）のＨｅｐＧ２細胞内への取り込みアッセイにおける、実際に取り込まれたＲＢＤタンパク質の典型的な顕微鏡画像である。
【図４】取り込まれたＲＢＤタンパク質を、フローサイトメトリーを用いて定量し、平均蛍光強度を相対化したグラフである。
【図５】フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６によるＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制と、スパイクタンパク質との結合・取り込み抑制の関係を表した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本開示の発明を実施するための具体的な実施形態について説明する。以下の説明は、発明の理解を促進するためのものである。即ち、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。  
【００１２】
１．  定義
本明細書で記載される用語「アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量を抑制するため」は、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２に関する特定の疾患を改善するという目的を包含する。更には、当該用語は、治療目的に限定されない。例えば、当該用語は、特定の疾患を有さないとしても、その疾患を発症することを予防する目的を包含する。
２．フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、こうした組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む。当該阻害剤により、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００１３】
また、本明細書で記載される「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、ＦｏｘＯ１の転写因子としての作用を抑制する阻害剤を意味する。従って、本明細書で記載される「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤を含むことができ、更には、ＦｏｘＯ１の上流のシグナル経路に作用してＦｏｘＯ１の転写因子としての作用を抑制する剤を含むことができる。好ましい「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤である。  
【００１４】
好ましい実施形態において、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の例として、以下の式で表される化合物又はその塩が挙げられる。
【化３】
0006906127.tif 000004
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ８又はＣＨ−Ｒ８ （Ｒ7：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2又はＣＨ3であり、
ｎは、１−１１である。
｝
【００１５】
更に、好ましい実施形態において、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の例として、以下の式で表される化合物又はその塩が挙げられる。
【化４】
0006906127.tif 000005
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨであり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ８ （Ｒ８：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｏであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2であり、
ｎは、１−１１である。
｝
【００１６】
上記式で表される化合物又はその塩の具体例として、ＡＳ１８４２８５６（ＣＡＳ  Ｎｏ．  ８３６６２０−４８−５）が挙げられる。
【化５】
0006906127.tif 000006
【００１７】
ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の更なる例として、上述したＡＳ１８４２８５６（ＣＡＳ  Ｎｏ．  ８３６６２０−４８−５）などのキノロン誘導体に加えて、ＫＩＳ−１５４、カルコン類、トリテルペン類、フラボン類、モノテルペノイド類、リグナン類、クマリン類、及びフィトケミカル類からなるＦＯＸＯ１活性阻害剤（再表2018/079715）などが挙げられる。  
【００１８】
また、ＦｏｘＯ１に直接結合して阻害する剤の具体例として、ＡＳ１７０８７２７等も利用可能である。  
【００１９】
好ましくは、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７である。  
【００２０】
ＦｏｘＯ１は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写を促す転写因子として作用する。従って、ＦｏｘＯ１の作用を阻害することで、これらの遺伝子の発現を抑制することができる。これによって、ウイルスがスパイクタンパク質を利用して細胞内に取り込まれることを低減することができる。  
【００２１】
３．用途
一実施形態において、本開示の組成物は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２が関与する疾患の治療及び／又は予防に利用することができる。具体的には、これらが関与する感染症の治療及び／又は予防に利用することができる。感染症の例としては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ又はＳＡＲＳ−ＣｏＶ２などのウイルスによる感染症が挙げられる。好ましくは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２による感染症（ＣＯＶＩＤ１９）である。これらのウイルスは、ヒト細胞のＡＣＥ２受容体に、自身のスパイクタンパク質を結合させ、これを足掛かりとして細胞内に侵入する。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２は、ヒト細胞の表面のＡＣＥ２と結合した後、ヒト細胞のＴＭＰＲＳＳ２の酵素処理によって、細胞内への侵入効率が増強される。従って、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することで、こうしたウイルスによる細胞の侵入を抑制することができる。これによって感染を抑制することができる。
【００２２】
こうしたアプローチのメリットは、ウイルス側の変異による影響を受けにくい点にある。一般にＳＡＲＳ−ＣＶ２をはじめとするＲＮＡ型ウイルスは、変異を起こしやすい。そして、ウイルス表面のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）は、ワクチンのターゲットとされるものの、このタンパク質に変異が起こることにより、ワクチンによる効果が回避されてしまう問題があった。しかし、このアプローチでは、変異による直接的な影響は受けにくいという点で、有利である。  
【００２３】
また、特筆すべきは、本開示の組成物は、感染の治療のみならず、感染の予防にも寄与することができる。例えば、感染の治療には、抗炎症作用などに基づいたアプローチがあるが、こうしたアプローチは、感染が起こった後での対処法となるため、予防には寄与できない。しかし、本開示の組成物は、いったん感染が起こってウイルスが増殖した後でも、他の細胞への更なる感染を防ぐという意味では、治療薬としても寄与できる。しかし、それだけではなく、感染する前の状態であっても、予め投与することで、ウイルスが感染する際の足掛かりとなる遺伝子の発現を抑制することで、細胞への感染を防ぐという意味で予防薬としても寄与できる。  
【００２４】
従って、一実施形態において、本開示の組成物は、投与形態に応じて、適切な追加成分を配合してもよい。例えば、本開示の組成物は、医薬品に一般的に含まれる成分を含んでもよい。当該成分の例として、保存料、防腐剤、香料、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、防カビ剤などが挙げられる。  
【００２５】
さらに、本開示の組成物ＡＳ１８４２８５６は、マウスを用いた動物実験において経口投与による効果が確認されている。従って、一実施形態において、本開示の組成物は、錠剤化、経口用カプセル封入、などの加工をしてもよい。
【実施例】
【００２６】
４．実施例
４−１．実施例１（ＨｅｐＧ２細胞の培養）
ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＨＢ−８０６５）から購入した。当該細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地を用いて継代・維持した。
４−２．実施例２（ＦｏｘＯ１阻害剤の効果）
ＨｅｐＧ２細胞を１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３６）の各ウェルに５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６〜２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を複数の濃度で添加（１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）し、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、１日（約２４時間）培養した。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｚ６０１２）を用いてＨｅｐＧ２細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；  Ｔａｋａｒａ，  ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ  Ｓｙｂｒ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ；  ＴＯＹＯＢＯ，  ＱＰＳ−２０１Ｘ５）を行った。
【００２７】
ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２  μｌ（最終濃度  １  ｘ）
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ                                          ５００  ｎｇ
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2０                            合計１０  μｌに調整
【００２８】
上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｅｒｉｔｉ  ９６  ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃  １５分
↓
８５℃  ５秒
↓
４℃  ∞
【００２９】
合成したｃＤＮＡ（１０  μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ＋  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。  
【００３０】
４−３．実施例３（ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子発現の解析）
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ              １０μｌ
５ｍＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
５ｍＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
Ｈ2０                                                               ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈）                                                １  μｌ
【００３１】
上記混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＣＦＸ−Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃  １分    （初期変性）
２．９５℃  １５秒  （変性）
３．６０℃  ３０秒  （伸長）
（２−３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５  ℃  〜  ９５  ℃まで０．５  ℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
【００３２】
上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。  
【００３３】
内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
【００３４】
全てのプライマーは株式会社ファスマックから購入した（逆相カラム精製グレード）。各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、ＦｏｘＯ１阻害剤で処理をしていないコントロール条件（ＤＭＳＯ処理）での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによって確認した。  
【００３５】
結果を図１に示す。コントロールのＤＭＳＯ処理と比較すると、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を加えると、その濃度依存的にＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現が減少することが観察された（多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法））。この結果は、ＦｏｘＯ１がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現に必要であることを示している。  
【００３６】
４−４．実施例４（スパイクタンパク質の細胞内への取り込みへの影響） 
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２の発現抑制が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２のスパイクタンパク質のＳ１の中でＡＣＥ２に結合するために必要十分な領域ＲＢＤ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ、Ｒ３１９〜Ｆ５４１）にマウスＩｇＧのＦｃ領域が融合されたリコンビナントタンパク質ＲＢＤ−ｍＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２−Ｖ０５Ｈ２）を準備した。実験の模式図を図２に示す。
【００３７】
ＨｅｐＧ２細胞を６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ；  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ３３３５）の各ウェルに１００，０００  個を播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６〜２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を１μＭの濃度で添加、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、３日間培養した（約７２時間）。培養後、最終濃度が１００ｎＭとなるようにＲＢＤ−ｍＦｃ、またはコントロールとして何も融合していないマウスＩｇＧ由来Ｆｃ領域（ｍＦｃ；Ａｂｃａｍ，ａｂ１７９９８２）を添加し、さらに３時間培養した。その後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄後、剥離し細胞を回収した。回収した細胞は４％  パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（富士フィルム和光純薬、  １６３−２０４１１５）で１５分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、マウスＩｇＧを認識する抗体にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光色素が共有結合した二次抗
体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７１５−５４５−１５０）で細胞表面や細胞内に取り込まれたｍＦｃを染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＦＣ５００）を用いて一細胞あたりのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の蛍光強度を測定し、定量した。解析にはＫａｌｕｚａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２．１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。典型的な細胞の写真は、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ、ＢＸ−７００）を用いて撮影した。  
【００３８】
結果を図３に示す。まず、Ｓ１及びＲＢＤがＨｅｐＧ２細胞に取り込まれ得るのか、免疫染色法及び蛍光顕微鏡を用いて観察した。コントロールのｍＦｃを添加した場合には、全くほとんど蛍光シグナルが検出されなかったのに対し、ＲＢＤ−ｍＦｃは５０％近くの細胞で観察された。これらの結果から、ＨｅｐＧ２細胞はＲＢＤを取り込むことが示唆された。  
【００３９】
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を用いて、あらかじめＡＣＥ２の発現を抑制した時、取り込まれるＲＢＤの量が抑制されるかフローサイトメトリーを用いて検討した。蛍光強度の違いを図４に示す。まず、ネガティブコントロールであるｍＦｃを添加した際の細胞の示す蛍光強度は、ＡＣＥ２を介さずにｍＦｃのみで取り込まれてしまったもの、二次抗体が非特異的に結合してしまったもの、及び細胞のもつ自家蛍光、の３つに由来し、これはバックグラウンドシグナルと考えられる。従って、ｍＦｃでの蛍光強度を引くことで、より正確に取り込まれたＲＢＤ由来のシグナルの差を正確に比較することが可能になる。すると、コントロールのＤＭＳＯを添加した際のＲＢＤの蛍光シグナルと比較すると、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６で予め処理することで、ＲＢＤ由来の蛍光シグナルの強度が有意に減少した（Ｔ検定；ｐ＜０．０００５）。すなわち、この結果はＦｏｘＯ１阻害剤によってＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みが抑制されたことを示しており、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２等のｍＲＮＡ発現量の抑制が、ＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みを抑制できるレベルまで抑えていることを示唆している。  
【００４０】
さらに、この結果はＦｏｘＯ１阻害剤によって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２がホスト細胞に結合し感染する（取り込まれる）ことが抑制されることを示唆している。  
【００４１】
また、こうした効果は、ＡＳ１８４２８５６の化学構造をある程度改変したとしても同様の効果が得られると考えられる。例えば、ＡＳ１８４２８５６のフルオロ基の部分は、他のハロゲン基に変えても同様の効果が得られると考えられる。また、ＡＳ１８４２８５６の水素部分は例えばメチル基に変えても同様の効果が得られると考えられる。ＡＳ１８４２８５６の（＝Ｏ）の部分は同族元素Ｓに変えても同様の効果が得られると考えられる。また、エチル基部分は、炭素数が１個増減したアルキル基でも同様の効果が得られると考えられる。アミノ基部分は、同程度のサイズであるメチル基に変えたとしても同様の効果が得られると考えられる。  
【００４２】
以上の実験結果から示される、一実施形態における本開示の作用機序を図５にまとめる。ＦｏｘＯ１阻害剤は、細胞に作用して、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の発現を抑制する。これによって、細胞表面のＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の量が減少する。そして、ウイルス表面に存在するスパイクタンパク質とＡＣＥ２との結合が阻害される。また、ＴＭＰＲＳＳ２によるウイルスの細胞内への侵入の促進効果も抑制される。  
【００４３】
以上、具体的な実施形態について説明してきた。上記実施形態は、具体例に過ぎず、本発明は上記実施形態に限定されない。例えば、上述の実施形態の１つに開示された技術的特徴は、他の実施形態に適用することができる。また、特記しない限り、特定の方法については、一部の工程を他の工程の順序と入れ替えることも可能であり、特定の２つの工程の間に更なる工程を追加してもよい。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。
【要約】      （修正有）【課題】アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物を提供すること。【解決手段】アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、前記組成物は、フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤を含む組成物。阻害剤が、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７であり、新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を治療およびまたは予防する組成物。【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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