(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９５１）。
【請求項２】
配列番号１〜配列番号５に示されるゲノム塩基配列を有する、請求項１に記載のクロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株。
【請求項３】
配列番号６に示す１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を有する、請求項１に記載のクロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株。
【請求項４】
クロストリジウム・ベイジェリンキ基準株Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＢＲＣ  １０９３５９Ｔと比較して、３７℃で７２時間嫌気培養後の培養液中に含まれる酪酸の産生量が多く、乳酸及び酢酸の産生量が少ない、請求項１に記載のクロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株を用いる酪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酪酸産生能を有する菌株及びそれを用いた酪酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酪酸の有用性が注目されている。酪酸は大腸においてエネルギー源として利用され、腸内細菌叢を健康な状態に保ち免疫系の不調を改善する可能性があることが明らかになってきた。酪酸菌（酪酸産生菌）は、代謝により酪酸を産生する細菌の総称である。酪酸菌は、腸内細菌の一種であり、腸内で食物繊維を分解して酪酸を産生する。従来、整腸剤などの用途で用いられている代表的な酪酸菌としてクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）が知られているが、より効率的に酪酸を産生する酪酸菌が求められている。【０００３】
また、酪酸は、上述のような生体に対する用途のみならず、例えば香料の合成といった工業用途の原料としても有用である。このような用途においても、より効率的に酪酸を産生する酪酸菌が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酪酸を効率的に産生する菌株及びそれ用いた酪酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、大豆及び生薬といった様々な天然原料を発酵させて酪酸、プロピオン酸、乳酸などの短鎖脂肪酸を含む発酵液を製造する過程において、効率的に酪酸を産生するＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９５１）を見いだし、単離した。ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）種の菌株ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株として同定された。【０００６】
すなわち、本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９５１）を提供する。
また、本発明は、配列番号１〜配列番号５に示されるゲノム塩基配列を有するクロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株を提供する。
また、本発明は、配列番号６に示す１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を有するクロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株を提供する。
また、本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキ基準株Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＢＲＣ  １０９３５９Ｔと比較して、３７℃で７２時間嫌気培養後の培養液中に含まれる酪酸の産生量が多く、乳酸及び酢酸の産生量が少ない、クロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株を提供する。
さらに、本発明は、ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株を用いる酪酸の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、従来の代表的な酪酸産生菌であるクロストリジウム・ブチリカムと比べて効率的に酪酸を産生するとともに、クロストリジウム・ベイジェリンキの基準株との比較においてもより効率的に酪酸を産生する酪酸産生菌が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株のコロニー像を示す写真である。
【図２】ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株のグラム染色像を示す写真である。
【図３】ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株の分類学的性状を検討した。以下、本明細書中においてＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株をＢ１１株とも称する。なお以下の試験は、特段の断りのない限りすべて株式会社テクノスルガ・ラボにて行った。
【００１０】
（１）形態観察
培地としてＧＡＭ  Ｂｒｏｔｈ  “Ｎｉｓｓｕｉ”（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｊａｐａｎ）＋寒天を用い、３０℃で４８時間、Ｂ１１株の嫌気培養を行った。実体顕微鏡によるコロニー観察及びグラム染色を行い、検体のコロニー及び細胞形態を観察した。コロニー像を図１、グラム染色像を図２に示す。細胞形態は、桿菌〜卵円桿菌（１．０−１．５×３．０−５．０μｍ）であり、グラム染色性は陽性であり、芽胞形成が観察された。コロニーの色調はクリーム色であった。
【００１１】
（２）生理・生化学的性状
培地としてＧＡＭ  Ｂｒｏｔｈ（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｊａｐａｎ）＋寒天を用い、３０℃で４８時間、Ｂ１１株の嫌気培養を行った。嫌気性菌生化学同定キットであるＡＰＩ２０Ａ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，ＦＲＡ）を用いて試験を行った。試験項目及び結果を表１に示す。
【表１】
0006964854.tif 000002
さらに、下記項目の追加試験を行った。結果を下記表２に示す。
【表２】
0006964854.tif 000003
【００１２】
（３）１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列解析
１６Ｓ  ｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列（約１５００ｂｐ）（配列番号６）の解析結果から、検体の帰属を推定した。培地としてＢｒｏｔｈ  “Ｎｉｓｓｕｉ”（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｊａｐａｎ）＋寒天を用い、３０℃で７日間、Ｂ１１株の嫌気培養を行った。下記の条件を用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列解析を行った。
【００１３】
・ＤＮＡ抽出：アクロモペプチダーゼ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｊａｐａｎ）
・ＰＣＲ増幅：ＴＫｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，  Ｊａｐａｎ）
・サイクルシークエンス：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）
・使用プライマー：
ＰＣＲ増幅：９Ｆ、１５１０Ｒ
シークエンス：９Ｆ、５１５Ｆ、１０９９Ｆ、５３６Ｒ、９２６Ｒ，１５１０Ｒ
・シークエンス：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１３０  ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・塩基配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ  ２．１（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ，  ＡＵＳ）
・ＢＬＡＳＴ相同性検索：
解析ソフトウェア：ＥＮＫＩ（ＴｅｃｈｎｏＳｕｒｕｇａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｊａｐａｎ）
データベース：
ＤＢ−ＢＡ１４．１（ＴｅｃｈｎｏＳｕｒｕｇａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）
検索日：２０１９年２月２２日
・簡易分子系統樹解析：
系統樹の推定：近隣結合法
塩基置換モデル：Ｋｉｍｕｒａ−２−ｐａｒａｍｅｔｅｒ
樹形の信頼性評価：ブートストラップ法（１，０００反復）
【００１４】
結果を表３及び表４に示す。
【表３】
0006964854.tif 000004
注１）ＢＳＬ（バイオセーフティレベル）はレベル１*（日和見病原体）以上を表記し、空欄はレベル１を意味する。
注２）網掛けは、簡易分子系統解析に供した配列データを示す。
【００１５】
【表４】
0006964854.tif 000005
【００１６】
Ｂ１１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を図３に示す。図中、左上の線はスケールバーを示し、スケールバーの０．０１は、バーの長さが１％の相違塩基を意味する。系統枝の分岐に位置する数字は、樹形の信頼性を表す値であるブートストラップ値を示し、株名の末尾のＴはその種の基準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）を示し、ＢＳＬはバイオセーフティレベル（ＢＳＬ１*（日和見病原体）以上を表記）を示す。図３からわかるように、Ｂ１１株は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）及びクロストリジウム・ディオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）と近縁であると推定された。
【００１７】
（４）菌株の寄託
上記の結果から、ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株は、クロストリジウム属の菌株であることが判明した。ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株は、２０１９年５月１６日にブタペスト条約上の国際寄託機関（ＩＤＡ）の１つである独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９５１として国内寄託され、２０２０年４月２２日に同機関において国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９５１として国際寄託に移管された。
微生物の種類：細菌  細胞形状：桿菌  特徴：芽胞形成陽性（芽胞性）
分類学上の位置  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．（クロストリジウム属）
培養条件  ＧＡＭ  Ｂｒｏｔｈ“Ｎｉｓｓｕｉ”＋寒天
培養温度：３０℃  培養期間：４８時間
培養方法：嫌気性
【００１８】
（５）ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析
さらに、Ｂ１１株が新種であるかどうかを検討するため、Ｂ１１株との相同率が高かった上位３種のクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（相同率９９．７％）、クロストリジウム・ディオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）（相同率９９．７％）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）（相同率９９．０％）について、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ＡＮＩ）値を算出し、種の異同を決定した。ＡＮＩ解析は、対照株（検体）と比較株の完全長ゲノム配列やドラフトゲノム配列との類似度（ＡＮＩ：相同値）をコンピュータ上で計算し、種の異同を判断するものである。ＡＮＩ値の算定は公開プログラムＡＮＩ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｖｅ−ｏｍｉｃｓ．ｃｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ａｎｉ／ｉｎｄｅｘ）を用い、ＡＮＩ値が９５％以上であれば同種、９５％未満であれば別種（新種）と判定する。
【００１９】
ＡＮＩ解析に使用した比較対象種を下記表５に示す。
【表５】
0006964854.tif 000006
【００２０】
ＡＮＩ解析の結果を下記表６に示す。
【表６】
0006964854.tif 000007
【００２１】
ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１のクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）に対するＡＮＩ値は９５％以下であったことから、ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株とクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）とは別種であると判断する。ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）及びクロストリジウム・ディオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）に対してそれぞれ９５％以上のＡＮＩ値を示した。クロストリジウム・ベイジェリンキ及びクロストリジウム・ディオリスの組合せのＡＮＩ値も９５％以上を示した。よって上記３検体は同種と判断した。なお、２０２０年のＫｏｂａｙａｓｈｉらの報告（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０２０，  ７０：２４６３−２４６６）により、クロストリジウム・ディオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）はクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）と同種であることが示され、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）に学名が統合されている。以上のことからＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１をクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）と同定した。
【００２２】
（６）ゲノム解析
ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株のＤＮＡを抽出し、次世代シーケンス解析及びそのデータ解析を行った。
＜ＤＮＡの抽出及び精製＞
Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸＧ２０カラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ、ＤＥ）を用いてＢ１１株のＤＮＡの抽出及び精製を行い、抽出されたＤＮＡの純度測定を、超微量分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて行った。品質検査合格基準は、純度：Ａ２６０（波長２６０ｎｍでの吸光度、以下同様）／Ａ２８０≧１．８、Ａ２６０／Ａ２３０≧１．６であること、２０μｇ（濃度１５０ｎｇ／μＬ）以上であることとした。次いで抽出されたＤＮＡの断片化の確認をアガロース電気泳動により行った。設定条件は、０．５％アガロース、３０Ｖ、１時間とした。電気泳動の結果、抽出されたＤＮＡは、λＤＮＡ分子量マーカー（λ-Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ）と比較して、２３１３０ｂｐ付近にバンドが観察され、断片化が少ないことから、次世代シーケンスに使用できる品質であると判断した。
【００２３】
＜次世代シーケンス＞
次世代シーケンス解析及びそのデータ解析は、北海道システム・サイエンス株式会社に委託して行った。
抽出及び精製されたＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株のＤＮＡ試料に対して、次世代シーケンサーＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩを用いて次世代シーケンス解析を行い、ゲノム配列情報を得た。
クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）基準株（ＧＣＡ＿００２００６４４５．１）のゲノム配列情報をＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アメリカ国立生物工学情報センター）のＷＥＢサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＡ／００２／００６／４４５／ＧＣＡ＿００２００６４４５．１＿ＡＳＭ２００６４４ｖ１）より取得した。
ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１とクロストリジウム・ベイジェリンキ基準株のゲノム配列情報に対して、国立遺伝学研究所が提供する原核生物用の自動アノテーションプログラムである「ＤＦＡＳＴ」によるオートアノテーションを実施し、遺伝子領域予測及びアノテーション情報の付与を行った。
解析済みのＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１とクロストリジウム・ベイジェリンキ基準株のアノテーション情報をもとに、ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）機能分類情報を利用した２菌株間のドラフトゲノム配列比較を行った。ＣＯＧは、ＮＣＢＩが提供する微生物を中心とした遺伝子機能分類データベースである。
【００２４】
表７に使用したクロストリジウム・ベイジェリンキ基準株のゲノム情報概要を示し、表８にＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１のゲノム情報概要を示す。
【表７】
0006964854.tif 000008
表７に示すクロストリジウム・ベイジェリンキ基準株の２６４個のコンティグ配列をそれぞれ、配列番号７〜配列番号２７０とする。
【表８】
0006964854.tif 000009
表８中に示すＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１の５つのコンティグ配列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ１〜Ｓｅｑｕｅｎｃｅ５を、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５とする。
【００２５】
表９に、ＤＦＡＳＴを利用したアノテーション処理により検出された各菌株の予測遺伝子数（ＯＲＦ/ｒＲＮＡ/ｔＲＮＡ）を示す。
【表９】
0006964854.tif 000010
【００２６】
次に、ＤＦＡＳＴにより検出された全ＯＲＦ情報の中で、ＣＯＧアノテーションが付されたＯＲＦ情報に注目し、基準株及びＢ１１株がそれぞれ保有しているＣＯＧ機能分類が明らかとなった遺伝子の情報を比較し、いずれか一方の菌株にのみ特異的に検出されるＣＯＧアノテーション情報を抽出した。表１０に、クロストリジウム・ベイジェリンキ基準株とＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株で特異的に検出されたＣＯＧアノテーション情報をまとめて示す。
【表１０】
0006964854.tif 000011
【００２７】
上記の結果から、クロストリジウム・ベイジェリンキ基準株とＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株とでは、アノテーションの異なる配列を有することが分かる。このことからＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株は、クロストリジウム・ベイジェリンキ種の基準株とは異なる性質を有する菌株であると推定される。
【００２８】
上述のとおり、Ｂ１１株の分類学的性状を検討した結果、Ｂ１１株は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）種であると同定されたが、ゲノム解析の結果、基準株とはアノテーションが異なる配列を有することがわかった。そこで、Ｂ１１株がクロストリジウム・ベイジェリンキの基準株とは異なるの性質を有する菌株であることをさらに確認するために、Ｂ１１株と、代表的な酪酸産生菌であるクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の基準株と、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）の基準株とを用いて、有機酸産生能力を比較した。詳細を下記実施例１に示す。
【実施例】
【００２９】
実施例１：有機酸産生能力試験
培地としてＧＡＭ  Ｂｒｏｔｈ（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｊａｐａｎ）を用い、それぞれの菌株を３７℃で７２時間嫌気培養した。培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過し、試料溶液とした。試料溶液中に含まれる有機酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーにより測定した。本試験は２０２０年２月１３日に株式会社テクノスルガ・ラボにて行った。測定条件は下記の通りである。
・システム：島津有機酸分析システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  Ｊａｐａｎ）
・カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２（Ｈ）、３００ｍｍ×８ｍｍＩＤ、２本直列で使用
・ガードカラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２（Ｈ）、５０ｍｍ×６ｍｍＩＤ
・溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−トルエンスルホン酸
・反応液：５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−トルエンスルホン酸、１００μｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・オーブン温度：４５℃
・検出器：電気伝導度検出器  ＣＤＤ−１０Ａ
測定対象とした有機酸はコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｉｓｏ−酪酸、ｎ−酪酸、ｉｓｏ−吉草酸、ｎ−吉草酸の９種類である。結果を下記表１１に示す。
【表１１】
0006964854.tif 000012
表中、空欄は定量下限未満である。定量下限は、コハク酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸については５μｇ/ｍＬ、ギ酸、ｉｓｏ−酪酸、ｎ−酪酸、ｉｓｏ−吉草酸、ｎ−吉草酸については１０μｇ/ｍＬである。なおプロピオン酸については夾雑物を含む値である。【００３０】
酪酸菌として周知のクロストリジウム・ブチリカムと比較して、Ｂ１１株は２．７４倍多くのｎ−酪酸を産生していることがわかる。さらに、Ｂ１１は、培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれている有機酸量を差し引くと、ほぼ酪酸のみを産生することがわかる。これに対して、クロストリジウム・ブチリカムは酪酸の他に、乳酸、ギ酸、酢酸も産生している。このことからＢ１１株は、きわめて効率的かつ選択的に酪酸を産生する酪酸産生菌であるといえる。特に、Ｂ１１はギ酸をほとんど産生していない。ギ酸は、人体への悪影響があるとされている。Ｂ１１は、そのギ酸をほとんど産生していないことから、生体用途での応用が期待できる。【００３１】
さらに、Ｂ１１株とクロストリジウム・ベイジェリンキの基準株Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＢＲＣ  １０９３５９Ｔとを比較すると、産生する有機酸の種類及び量が異なることがわかる。Ｂ１１株は、基準株Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＢＲＣ  １０９３５９Ｔと比較して、乳酸の産生が定量限界以下であり、酢酸の産生量が少なく、酪酸の産生量が多い。したがって、Ｂ１１株はクロストリジウム・ベイジェリンキ種の基準株とは異なった性質を持った菌株であると判定された。【００３２】
［寄託生物材料への言及］
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室  電話番号０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９５１
（４）識別のための表示：ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１
（５）原寄託日：２０１９年５月１６日
【要約】
本発明は、酪酸を効率的に産生する菌株及びそれ用いた酪酸の製造方法を提供することを目的とする。本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキ基準株Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＢＲＣ  １０９３５９Ｔと比較して、３７℃で７２時間嫌気培養後の培養液中に含まれる酪酸の産生量が多く、乳酸及び酢酸の産生量が少ない、クロストリジウム・ベイジェリンキＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２９５１）を提供する。さらに、本発明は、ＳＩＩＤ２７４５１−Ｂ１１株を用いる酪酸の製造方法を提供する。【図１】
0006964854.tif 000013
【図２】
0006964854.tif 000014
【図３】
0006964854.tif 000015
【配列表】
0006964854000001.app