(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含有する動物およびヒト細胞の遺伝子改変のための３１６５ｂｐの遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７。
【請求項２】
３１６５ｂｐの遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（配列番号１）を構築する方法であって、まず第一に、固有エンハンサーを伴うヒト伸張因子ＥＦ１Ａの１１８８ｂｐのプロモーター領域、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩに対する部位を備えた３５ｂｐのポリリンカー、ヒト増殖因子の４６６ｂｐのポリアデニル化配列及び転写ターミネーター、抗生物質を用いない正の選択を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の１３６ｂｐの調節要素ＲＮＡ−ＯＵＴ、ほとんどの大腸菌株の細胞においてベクター生産を増加させる一塩基置換を伴う自律的複製のための１２９９ｂｐの複製起点、１０１０ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含有する４１８２ｂｐのベクターを構築すること、次に、それがＳｐｅＩ制限部位で切断され、残りの断片がそれ自体に連結されることを含む、方法。
【請求項３】
抗生物質を用いない正の選択を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＩＮを含有する６４ｂｐの直鎖ＤＮＡ断片、産物がスクロース含有培地内での選択を保証する１４２２ｂｐのレバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ、相同組換えが生じるクローン株のピッキングに必要とされる７６３ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＲ、および遺伝子ｒｅｃＡの領域での遺伝子の不活化を伴った相同組み換えを保証する２つの相同配列３２９ｂｐと２３３ｂｐを構築すること、次いで、大腸菌細胞ＳＣＳ１１０をエレクトロポレーションにより形質転換させ、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する培地で生残しているクローンがピッキングされることにより得られた、抗生物質を用いない正の選択を可能とする遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（配列番号１）またはそれに基づく遺伝子治療ＤＮＡベクターを生産するための大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ。
【請求項４】
抗生物質を用いない正の選択を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＩＮを含有する６４ｂｐの直鎖ＤＮＡ断片、産物がスクロース含有培地内での選択を保証する１４２２ｂｐのレバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ、相同組換えが生じるクローン株のピッキングに必要とされる７６３ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＲ、および遺伝子ｒｅｃＡの領域での遺伝子の不活化を伴った相同組み換えを保証する２つの相同配列３２９ｂｐと２３３ｂｐを構築すること、次いで、大腸菌細胞をエレクトロポレーションにより形質転換させ、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する培地で生残しているクローンがピッキングされることを含む、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（配列番号１）またはそれに基づく遺伝子治療ＤＮＡベクターを生産するための大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦを得る方法。
【請求項５】
抗生物質を用いない選択を可能とするさらなる生産のための、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（配列番号１）を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号В−１２９９０、国際寄託当局Ｎｏ．ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）。
【請求項６】
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（配列番号１）を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号В−１２９９０、国際寄託当局Ｎｏ．ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）を得る方法であって、請求項３に記載の大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦのエレクトロコンピテントセルを作出すること、およびこれらの細胞に遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７でエレクトロポレーションを行うこと、および、その後、これらの細胞がイーストレル、ペプトン、６％スクロース、および１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する選択培地を含む寒天プレート（ペトリ皿）に注がれることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学に関し、バイオテクノロジー、医学および農業において遺伝子治療製品の製造のために使用することができる。すなわち、生産された、標的遺伝子を含有する遺伝子治療ＤＮＡベクターは、その遺伝子の発現が低下したまたは不十分なヒトおよび動物の細胞に送達され、従って、所望の治療効果を確保することができる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、突然変異遺伝子の機能を補償もしくは抑制するため、および／または遺伝性疾患を治療するために、患者の細胞への新規遺伝物質の送達という手段によって遺伝性および後天性疾患を治療することを目的とする医学における革新的アプローチである。
【０００３】
遺伝物質の輸送体（遺伝子治療ベクター）は、ウイルスベクターと非ウイルスベクターに分けられる。最も効率的なウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルスが含まれる（非特許文献１）。遺伝物質の非ウイルス送達は、主として、治療遺伝子を保持するプラスミドを、脂質、陽イオンポリマー、デンドリマー、ポリペプチド、およびナノ粒子などの様々な担体と組み合わせて含む（非特許文献２）。
【０００４】
ウイルスは本来、迅速性と効率の点で、組換えＤＮＡを細胞に送達するためのほぼ理想的な因子ではあるが、ウイルス送達系の使用にはいくつかの実用上の制限がある。これらには、製造の難しさ、選択性の欠如、免疫応答、潜在的発癌リスク、ならびに形質導入後の炎症がある。これらの問題のいくつかはまだ解決されていない。これが最近の遺伝子治療が非ウイルス遺伝子送達系の開発にますます傾注してきた理由である。
【０００５】
プラスミドは、自律的に複製する染色体外の環状ＤＮＡである。プラスミドは、抗生物質耐性、重金属イオン耐性の遺伝子、およびいくつかの有機化合物の異化作用を制御する遺伝子を含み得る（非特許文献３）。可動遺伝要素としてのプラスミドは、接合によってある細菌細胞から別の細胞へ伝達される能力があり、水平遺伝子導入を促す。
【０００６】
プラスミドには、ウイルスベクターに固有の制限はない。標的細胞では、プラスミドはゲノムに組み込まれずにエピソームとして存在し、しかも、それらの生産は極めて安価で、プラスミドの投与によって引き起こされる免疫応答も副作用もなく、このことによってプラスミドは遺伝子治療（治療遺伝子の移入）および遺伝病の予防（ＤＮＡワクチン接種）の便利なツールとなる（非特許文献４）。
【０００７】
遺伝子治療における送達の極めて有望な手段であること以外にも、プラスミドは、分子生物学および他のバイオテクノロジーに特化した研究室で長らく助けとなっており、分子クローニングおよび組換えタンパク質の生産に適用され好結果を得ている（非特許文献５）。
【０００８】
遺伝子治療の明らかな展望にもかかわらず、プラスミドの治療薬としての使用の重大な制限は、それらがｉ）保持株において構築物を生産するための抗生物質耐性遺伝子、ｉｉ）ウイルスゲノムの配列が呈する種々の調節要素を含むことである。もう一つの制限は、治療プラスミドのサイズであり、これは標的細胞へのベクター送達効率を左右する。
【０００９】
ここ数年で、世界中が病原体が抗菌薬に対する耐性をますます増加させているのを目の当たりにしていることは周知である。抗菌薬耐性の発生は、微生物の耐性株の選択、生残および増殖を促す選択圧を生じる、抗生物質に対する自然な生物学的反応である。抗生物質耐性は、社会的・経済的に極めて重要であり、国家安全保障に対する脅威であると考えられる（非特許文献６）。微生物集団内で抗生物質耐性遺伝子を含む遺伝子の水平移入を保証するものはプラスミドであり、このことはそれらに選択有利性を与える。従って、今日の抗生物質耐性ヒト病原体の増加は、水平遺伝子移入によるものである（非特許文献７）。
【００１０】
このため、欧州医薬品庁は、遺伝子治療のために新たに操作されるプラスミドに抗生物質耐性マーカー遺伝子を付加するのを控えることが必要であると考えている（非特許文献８）。
【００１１】
治療プラスミドベクターの使用に対するもう一つの重要な限界は、プラスミドベクターが標的遺伝子の発現を増強するための、様々なウイルスのゲノムのヌクレオチド配列が主として呈する調節要素（プロモーター、エンハンサー、翻訳後調節要素）を含むということである（非特許文献９）。
【００１２】
遺伝子治療のための既存のプラスミドベクターのもう一つの欠点は、それらのサイズ（長さ）である。プラスミドが長いほどそれが標的細胞に効果的に進入しにくくなることが知られている。既存のプラスミドは、それらの長さを実質的に増す不要な非機能的部位を持つ場合が多い（非特許文献１０）。
【００１３】
抗生物質を用いずに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株にプラスミドを蓄積する方法が知られている（非特許文献１１）。Ｌ−リシンの生合成に関与する酵素２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−ジカルボン酸−Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｄａｐＤがｌａｃプロモーターにより制御される大腸菌のＤＨ１ｌａｃｄａｐＤ株およびＤＨ１ｌａｃＰ２ｄａｐＤ株が構築された。インデューサーＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）の不在下では、これらの株は溶菌を受ける。しかしながら、ｌａｃオペロンを含有するマルチコピープラスミドｐＯＲＴを投与すると、遺伝子ｄａｐＤの発現が誘導され、従って、形質転換クローンをピッキングし、増殖させることができる。しかしながら、これらの株には、形質転換が低レベルで不安定であるという特徴がある。
【００１４】
さらに、抗生物質を用いない（又は、抗生物質フリーの）プラスミド選択系でプラスミドを生産するための大腸菌株を構築する方法も知られている（非特許文献１２）。選択された細菌株（例えば、ＤＧ５α、ＪＭ１０９、ＭＧ１６５５）は、プラスミド複製阻害剤ＲＮＡ  Ｉが、ＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成することによって、細菌活性に必須の遺伝子（例えば、細菌細胞壁ペプチドグリカンの生合成に関与する酵素ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン１−カルボキシビニル−トランスフェラーゼをコードするｍｕｒＡ）の翻訳を抑制することができるように改変されたものである。遺伝子ｍｕｒＡは、リプレッサータンパク質ｔｅｔＲによって制御され、構築されたＲＮＡ  Ｉ保持プラスミドの存在下でのみ発現させることができた。しかしながら、ＩＰＴＧの添加が標的プラスミドベクターを含まない大腸菌コロニーの生産をもたらすことが見出された。選択阻害の機序はなお未知である。
【００１５】
同様に、最小長のベクターを構築する方法も知られている。総ての原核生物ヌクレオチド配列を欠き、複製起点と抗生物質耐性遺伝子のみを含む小さなスーパーコイルＤＮＡ分子（いわゆる、「ミニサークル」）が操作されている。このベクターは、ファージφＣ３１を用いたインテグラーゼを媒介とする分子内組み込みによって作出された（非特許文献１３)。このようなプラスミドベクターの欠点として、それらの生産の複雑さ、および工業規模でのそれらの構築が不可能なことが含まれる。
【００１６】
ある発明が、抗生物質耐性を持たず、リプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物の作製を記載する特許文献１に報告されている。上記リプレッサータンパク質の発現は、大腸菌ゲノムの領域に組み込まれた有毒な遺伝子産物の発現を調節する。しかしながら、リプレッサータンパク質の使用に基づく他の選択方法と同様に、この方法は、不安定で非効率な形質転換を特徴とする。
【００１７】
特許文献２には、最小長のベクター（「ミニサークル」）を生産する方法が記載されている。このベクターは、原核生物を含まず、培養大腸菌株におけるｐａｒＡを媒介とする組換えにより生産される。最短ベクターを生産するというこの方法の欠点は、工業規模でのその使用が不可能なことである。
【００１８】
遺伝子治療のための組換えＤＮＡベクターの使用に関する本発明の原型は、遺伝的免疫誘導のための組換えベクターを生産する方法である（特許文献３）。プラスミドベクターは、クローニングされた遺伝子の発現のためにヒトおよび動物細胞で使用されるスーパーコイルプラスミドＤＮＡベクターである。このベクターは、複製起点、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサーを含む調節要素、およびヒトＴリンパ球向性ウイルス由来の調節配列を含有する。
【００１９】
このベクターは、バクテリオファージを用いて株に投与された遺伝子ｓａｃＢのアンチセンス補完を介して、抗生物質を用いずに、特殊な大腸菌株に蓄積される。遺伝子治療におけるこのＤＮＡベクターの使用は、ウイルスゲノムの調節配列の存在によって制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許出願第２０１１１５２３７７／１０号
【特許文献２】米国特許第９６４４２１１号
【特許文献３】米国特許第９５５０９９８号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｌｕｋａｓｈｅｖ  ＡＮ，  Ｚａｍｙａｔｎｉｎ  ＡＡ  Ｊｒ．  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）．  ２０１６．  ８１：７００−７０８
【非特許文献２】Ｍｉｎｔｚｅｒ  ＭＡ，  Ｓｉｍａｎｅｋ  ＥＥ．  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  ２００９．  １０９：２５９−３０２
【非特許文献３】Ｌｉｐｐｓ  Ｇ．  （編）．  （２００８）．  Ｐｌａｓｍｉｄｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ  ９７８−１−９０４４５５−３５−６
【非特許文献４】Ｌｉ  Ｌ，  Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  Ｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  ２０１６；１５（３）：３１３−２９
【非特許文献５】Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊｏｓｅｐｈ  （２００１），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
【非特許文献６】ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｄ．Ｗ．，  Ｇｕｓｈｕｌａｋ  Ｂ．Ｄ．，  Ｂａｉｎｅ  Ｗ．Ｂ．，  Ｂａｌａ  Ｓ．，  Ｇｕｂｂｉｎｓ  Ｐ．Ｏ．，  Ｈｏｌｔｏｍ  Ｐ．，  Ｓｅｇａｒｒａ−Ｎｅｗｎｈａｍ  Ｍ．  ２００９．  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ，  ｇｌｏｂａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １５：１７２７−１７３２
【非特許文献７】Ｒａｍｉｒｅｚ  ＭＳ，  Ｔｒａｇｌｉａ  ＧＭ，  Ｌｉｎ  ＤＬ，  Ｔｒａｎ  Ｔ，  Ｔｏｌｍａｓｋｙ  ＭＥ．  Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅｓ：  ｔｈｅ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｐａｒａｄｉｇｍ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．  ２０１４  （５）
【非特許文献８】Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ／  １４  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１  ＥＭＡ／ＣＡＴ／ＧＴＷＰ／４４２３６／２００９  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ
【非特許文献９】Ｄｒａｆｔ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ，  ｎｏｎ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｄｏｃｓ／ｅｎ＿ＧＢ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ＿ｌｉｂｒａｒｙ／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ／２０１５／０５／ＷＣ５００１８７０２０．ｐｄｆ
【非特許文献１０】Ｍａｉｒｈｏｆｅｒ  Ｊ，  Ｇｒａｂｈｅｒｒ  Ｒ．  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８．３９（２）：９７−１０４
【非特許文献１１】Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ  ＲＭ，  Ｈａｎａｋ  ＪＡ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＧ，  Ｓｈｅｒｒａｔｔ  ＤＪ．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｂｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００１．  ２９（５）：Ｅ２６
【非特許文献１２】Ｍａｉｒｈｏｆｅｒ  Ｊ，  Ｐｆａｆｆｅｎｚｅｌｌｅｒ  Ｉ，  Ｍｅｒｚ  Ｄ，  Ｇｒａｂｈｅｒｒ  Ｒ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．  ２００８．  ３（１）：８３−８９
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎ  ＺＹ，  Ｈｅ  ＣＹ，  Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ａ，  Ｋａｙ  ＭＡ．  Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００３．  ８（３）：４９５−５００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、ヒトおよび動物細胞の遺伝子改変のための遺伝子治療ＤＮＡベクターを構築することであり、このベクターは、以下を合理的に兼ね備えている：
Ｉ）遺伝子治療ＤＮＡベクターに抗生物質耐性遺伝子が存在しないためにヒトおよび動物の遺伝子治療に安全に使用できる可能性；
ＩＩ）標的細胞への効率的遺伝子送達を保証する長さ；
ＩＩＩ）標的遺伝子の効率的発現を保証し、しかもウイルスゲノムのヌクレオチド配列が呈するものでない調節要素（調節エレメント、制限エレメント／regulatory element）の存在；
ＩＶ）工業規模での生産可能性および構築可能性。
【００２３】
項目Ｉは重要であり、本明細書で、遺伝子治療薬に関する州規制の要件、具体的には、遺伝子治療のために新たに操作されるプラスミドに抗生物質耐性マーカー遺伝子を付加することを控えるという欧州医薬品庁の要件（開発中の遺伝子治療医薬品に関する設計変更に関するレフレクションペーパー（Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）／２０１１年１２月１４日ＥＭＡ／ＣＡＴ／ＧＴＷＰ／４４２３６／２００９  先進療法委員会）を遵守して提供される。
【００２４】
明示される目的は、第一に、配列番号１のヌクレオチド配列を含有する動物およびヒト細胞の遺伝子改変のための３１６５ｂｐの遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を構築することによって達成される。３１６５ｂｐの遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を構築する方法は、まず第一に、次工程で、固有エンハンサーを伴うヒト伸張因子ＥＦ１Ａの１１８８ｂｐのプロモーター領域、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩに対する部位を備えた３５ｂｐのポリリンカー、ヒト増殖因子の４６６ｂｐの転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列、抗生物質を用いない正の選択（ポジティブセレクション）を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の１３６ｂｐの調節要素ＲＮＡ−ＯＵＴ、ほとんどの大腸菌株の細胞においてベクター生産を増加させる一塩基置換を伴う自律的複製のための１２９９ｂｐの複製起点、１０１０ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含有する４１８２ｂｐのベクターを構築すること、次に、それがＳｐｅＩ制限部位で切断され、残りの断片がそれ自体に連結されることを含む。明示される目的は、抗生物質を用いない正の選択を可能とする遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７またはそれに基づく遺伝子治療ＤＮＡベクターを生産するための大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦを得ることによって達成される。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７またはそれに基づく遺伝子治療ＤＮＡベクターの生産のための大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦを得る方法であって、抗生物質を用いない正の選択を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＩＮを含有する６４ｂｐの直鎖ＤＮＡ断片、その産物がスクロース含有培地内での選択を保証する１４２２ｂｐのレバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ、相同組換えが生じるクローン株のピッキングに必要とされる７６３ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＲ、および遺伝子ｒｅｃＡの領域の相同組換えが遺伝子の不活化を伴うことを保証する２つの相同配列３２９ｂｐと２３３ｂｐを構築すること、次いで、大腸菌細胞をエレクトロポレーションにより形質転換させ、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する培地で生残しているクローンをピッキングすることを含む方法。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号Ｂ−１２９９０、国際寄託当局番号ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）はまた、抗生物質を用いない選択を可能とするさらなる生産のために構築される。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号Ｂ−１２９９０、国際寄託当局番号ＮＣＩＭＢ  ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）を得る方法は、大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦのエレクトロコンピテントセルを作出すること、およびこれらの細胞に遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７でエレクトロポレーションを行うことを含む。その後、これらの細胞は、イーストレル、ペプトン、６％スクロー��、および１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する選択培地を含む寒天プレート（ペトリ皿）に注がれる。
【００２５】
本発明の本質を図面で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、大腸菌細胞において自律的複製が可能な３１６５ｂｐ環状二本鎖ＤＮＡ分子である、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の構造を示す。  図１は、ベクターの下記の構造要素を示している。  （１）ＥＦ１ａ（１〜１１８８ｂｐ）−遺伝子の第１イントロンに含まれる固有エンハンサーを伴うヒト伸張因子ＥＦ１Ａのプロモーター領域。それはほとんどのヒト組織で組換え遺伝子の効率的転写を保証する。  （２）ＭＣＳ（１２０８〜１２４３ｂｐ）−制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＥｃｏＲＩの配列を含み、標的治療遺伝子のクローニングを可能とするポリリンカー（多重クローニング部位）。  （３）ｈＧＨ−ＴＡ（１２４４〜１７１０ｂｐ）−ヒト増殖因子遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列。  （４）ＲＮＡ−ｏｕｔ（１７１７〜１８５３ｂｐ）−大腸菌株ＳＣＳ１１０を使用する場合に抗生物質を用いない正の選択を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＯＵＴ。  （５）ｏｒｉ（１８６６〜３１６５ｂｐ）−ほとんどの大腸菌株の細胞でプラスミド生産を増加させるための一塩基置換を伴う自律的複製のための複製起点。
【図２】図２は、大腸菌株ＳＣＳ１１０を生産するための大腸菌の遺伝子ｒｅｃＡの領域における相同組換えのためのＤＮＡ断片の構造を示す。  直鎖断片は、抗生物質を用いない選択のためのトランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＩＮ（６４ｂｐ）、その産物がスクロース含有培地内での選択を保証するレバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ（１４２２ｂｐ）、相同組換えが生じるクローン株のピッキングに必要とされるクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＲ（７６３ｂｐ）を有するカセットからなる。このカセットには、遺伝子の不活化を伴う遺伝子ｒｅｃＡの領域での組換えプロセスを保証する２つの相同アームによって挟み込まれている（左アームおよび右アーム、それぞれ３２９ｂｐおよび２３３ｂｐ）。
【図３】図３は、プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞のトランスフェクション４８時間後のＨＥＫ−２９３細胞において、標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）産物の蓄積レベルを比較することを目的とした、プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞のトランスフェクション４８時間後のＨＥＫ−２９３細胞培養物の蛍光マイクロイメージング（А）、ならびにプラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞のトランスフェクション４８時間後のＨＥＫ−２９３細胞から抽出したタンパク質によって発せられた蛍光の図（Ｂ）を示す。
【図４】図４は、ヒトエラスチン遺伝子コード領域を保持するＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでの細胞のトランスフェクション前およびトランスフェクション４８時間後のケラチノサイト細胞ＨａＣａＴにおいて、標的遺伝子ｍＲＮＡ、例えば、エラスチン遺伝子のｍＲＮＡの蓄積の変化を分析することを目的とした、ヒトエラスチン遺伝子コード領域を保持するＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでのこれらの細胞のトランスフェクション前およびトランスフェクション４８時間後のケラチノサイト細胞ＨａＣａＴにおけるエラスチン遺伝子ｍＲＮＡの蓄積のパターンを示す。
【図５】図５は、標的遺伝子、例えば、ヒトエラスチン遺伝子を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７をヒト皮膚に投与した際のヒト皮膚におけるエラスチンタンパク質濃度の変化を分析することを目的とした、ヒトエラスチン遺伝子コード領域を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮを３名の患者の皮膚に注射した後のこれらの患者の皮膚生検サンプルにおけるエラスチンタンパク質濃度のプロットを示す。
【図６】図６は、ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７と緑色蛍光タンパク質コード領域を保持するＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞トランスフェクション４８時間後のウシ腎臓細胞ＭＤＢＫにおける標的遺伝子産物、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蓄積レベルを比較することを目的とした、ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７および緑色蛍光タンパク質コード領域を保持するＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞トランスフェクション４８時間後のウシ腎臓細胞ＭＤＢＫにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）濃度の変化のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の本質を下記の実施例で説明する。
【００２８】
実施例１
固有エンハンサーを伴うヒト伸張因子遺伝子ＥＦ１Ａのプロモーター、ポリリンカー、ヒト増殖因子のポリアデニル化配列及び転写ターミネーター、トランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＯＵＴ、ならびにプラスミド生産を増加させるための一塩基置換を伴う複製起点を含有する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の生産。
【００２９】
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７は、異なる供給源に由来するＤＮＡの６つの断片を統合することによって構築した：
（а）複製起点を、オリゴヌクレオチドＯｒｉ−Ｆ、Ｏｒｉ−Ｒ、Ｏｒｉ−Ｍ１、およびＯｒｉ−Ｍ２（配列表（１）〜（４））を用い、点突然変異を有する市販プラスミドｐＢＲ３２２の領域のＰＣＲ増幅によって生産し；
（ｂ）プロモーター領域ＥＦ１аを、オリゴヌクレオチドＥＦ１−ＦおよびＥＦ１−Ｒ（配列表（５）および（６））を用い、ヒトゲノムＤＮＡの部位のＰＣＲ増幅によって生産し；
（ｃ）転写ターミネーターｈＧＨ−ＴＡを、オリゴヌクレオチドｈＧＨ−ＦおよびｈＧＨ−Ｒ（配列表（７）および（８））を用い、ヒトゲノムＤＮＡの部位のＰＣＲ増幅によって生産し；
（ｄ）トランスポゾンＴｎ１０の調節部位ＲＮＡ−ＯＵＴを、オリゴヌクレオチドＲＯ−Ｆ、ＲＯ−Ｒ、ＲＯ−１、ＲＯ−２、およびＲＯ−３（配列表（９）〜（１３））から合成し；
（ｅ）カナマイシン耐性遺伝子を、オリゴヌクレオチドＫａｎ−ＦおよびＫａｎ−Ｒ（配列表（１４）および（１５））を用い、市販プラスミドｐＥＴ−２８の部位のＰＣＲ増幅によって生産し；
（ｆ）ポリリンカーを、２つの合成オリゴヌクレオチドＭＣＳ１およびＭＣＳ２（配列表（１５）および（１６））をアニーリングすることによって生産した。
【００３０】
ＰＣＲ増幅は、市販のキットＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、製造者の説明書に従って実施した。これらの断片は、続いてのＰＣＲ増幅でのそれらの統合を可能とする重複領域を有する。断片（ａ）および（ｂ）は、オリゴヌクレオチドＯｒｉ−ＦおよびＥＦ１−Ｒ（配列表（１）および（６））を用いて統合し、断片（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、オリゴヌクレオチドｈＧＨ−ＦおよびＫａｎ−Ｒ（配列表（７）および（１５））を用いて統合した。その後、生産された部位を、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ部位による制限処理とその後の連結により統合した。これにより、まだポリリンカーを欠くプラスミドが得られた。ポリリンカーを導入するために、プラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位で切断した後、断片（ｆ）と連結した。よって、ＳｐｅＩ制限部位によって挟み込まれたカナマイシン耐性遺伝子を保持する４１８２ｂｐベクターが構築された。次に、この部位はＳｐｅＩ制限部位で切断され、残りの断片はそれ自体に連結された。これにより、組換え体であり、抗生物質を用いない選択を可能とする３１６５ｂｐの遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７が得られた（配列番号１）。
【００３１】
実施例２
ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の効率を証明するために、標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、ポリリンカーにクローニングした。
【００３２】
標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子をコードする部位を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰの生産。緑色蛍光タンパク質遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドＭＶＧＦＰ−ＦおよびＭＶＧＦＰ−Ｒ（配列表（３０）および（３１））を用い、市販のプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰＣＲ増幅によって生産した。生産されたＰＣＲ断片を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより切断し、カナマイシン耐性遺伝子を保持し、同じ酵素で切断した４１８２ｂｐＤＮＡベクターと連結した。さらに、この生産されたベクターから、実施例１に記載したようにカナマイシン耐性遺伝子を除去した。これにより、抗生物質を用いない選択を可能とする３８７４ｂｐのＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰが得られた。
【００３３】
実施例３
ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の効率を証明するために、標的遺伝子、例えば、ヒトエラスチンコード遺伝子をポリリンカーにクローニングした。
【００３４】
標的遺伝子、例えば、ヒトエラスチンコード遺伝子をコードする領域を保持するＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮの生産。エラスチン遺伝子の２１７５ｂｐ長のコード領域（配列番号２）を、患者の皮膚生検サンプルから全ＲＮＡを抽出した後に逆転写およびＰＣＲ増幅を行うことによって生産した。材料は、皮膚生検デバイスＥｐｉｔｈｅａｓｙ  ３．５（Ｍｅｄａｘ  ＳＲＬ）を用い、前腕領域の健全な皮膚から採取した。患者の皮膚を無菌生理食塩水で予め洗い流し、リドカイン溶液で麻酔した。生検サンプルのサイズは約２×２×２ｍｍとし、重量は２０ｍｇまでとした。このサンプルを１ｍｌのトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に入れ、ホモジナイズし、６５℃で５分間加熱した。このサンプルを１４０００ｇで１０分間遠心分離し、再び６５℃で１０分間加熱した。次に、２００μｌのクロロホルムを加え、この混合物を穏やかに撹拌し、１４０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、水相を単離し、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、рН５．２および等容量のイソプロピルアルコールと混合した。このサンプルを−２０℃で１０分間インキュベートした後、１４０００ｇで１０分間遠心分離した。密集した細胞を１ｍｌの７０％エチルアルコールですすぎ、風乾し、１０μｌのＲＮアーゼ不含水に溶解させた。ヒトエラスチン遺伝子のｃＤＮＡの第一鎖を合成するために、Ｍｉｎｔ逆転写酵素（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）を使用した。４μｌのＭｉｎｔバッファー、２μｌのジチオトレイトール、２μｌのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、各２μｌのオリゴヌクレオチドＥＬＮ−ＦおよびＥＬＮ−Ｒ（配列表（３２）および（３３））、および２μｌのＭｉｎｔ逆転写酵素を６μｌの全ＲＮＡに加え、この混合物を４２℃で２時間インキュベートした。合成されたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＥＬＮ−ＦおよびＥＬＮ−Ｒ（配列表（３２）および（３３））を用いたＰＣＲ増幅でマトリックスとして使用し、ＰＣＲ増幅は、９４℃で３分；９４℃で２０秒、６０℃で２０秒および７２℃で６０秒の３０サイクル；最終伸張７２℃で５分間実施した。生産されたＰＣＲ断片を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を保持し、同じ酵素で切断された４１８２ｂｐのベクターと連結した。さらに、生産されたベクターから、実施例１に記載したようにカナマイシン耐性遺伝子を除去した。これにより、エラスチン遺伝子をコードする領域を保持し、抗生物質を用いない選択を可能とする５３２２ｂｐの遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮが得られた。
【００３５】
実施例４
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７およびそれに基づく遺伝子治療ベクターを生産するための大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦの操作。
【００３６】
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７およびそれに基づく遺伝子治療ベクターの操作のための大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦは、その染色体に、具体的には、遺伝子ｒｅｃＡの領域に、抗生物質を用いない正の選択を可能とするトランスポゾンＴｎ１０の調節要素ＲＮＡ−ＩＮ（６４ｂｐ）、産物がスクロース含有培地内での選択を保証するレバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ（１４２２ｂｐ）、相同組換えが起こったクローン株のピッキングに必要とされるクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＲ（７６３ｂｐ）、および遺伝子ｒｅｃＡの領域での遺伝子の不活化を伴った相同組み換えを保証する２つの相同配列（相同アーム）（左アームおよび右アーム、それぞれ３２９ｂｐおよび２３３ｂｐ）を含有する直鎖断片を与えることにより、相同組換えによって生産された。
【００３７】
左および右相同アームを合成するために、遺伝子ｒｅｃＡの断片に、大腸菌ＳＣＳ１１０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のゲノムＤＮＡをマトリックスとして用いてＰＣＲ増幅を行った。左相同アームを合成するためには、プライマーＬＨＡ−ＦおよびＬＨＡ−Ｒ（配列表（１８）および（１９））を使用し、右相同アームを合成するためには、プライマーＲＨＡ−ＦおよびＲＨＡ−Ｒ（配列表（２８）および（２９））を使用した。ＲＮＡ−ＩＮ断片は、合成オリゴヌクレオチドＩＮ−Ｆ、ＩＮ−１、ＩＮ−２、ＩＮ−Ｒ（配列表（２０）、（２１）、（２２）、（２３））末端を有する。遺伝子ｓａｃＢは、マトリックスとして枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ  １６８ＨＴおよびプライマーとしてＳａｃＢ−ＦとＳａｃＢ−Ｒ（配列表（２４）および（２５））を用い、ＰＣＲ増幅により生産した。遺伝子сａｔＲを合成するために、マトリックスとして大腸菌株ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳおよびプライマーとしてＣａｔＲ−ＦとＣａｔＲ−Ｒ（配列表（２６）および（２７））を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物ＬＨＡ（左相同アーム）、ＳａｃＢ、およびＲＨＡ（右相同アーム）を、９４℃で３分；９４℃で２０秒、６０℃で２０秒および７２℃で６０秒の３０サイクル；最終伸張７２℃で５分間増幅した。ＰＣＲ産物ＲＮＡ−ＩＮは、断片のアセンブリのためにオリゴヌクレオチドＩＮ−Ｆ、ＩＮ−１、ＩＮ−２、ＩＮ−Ｒ（配列表（２０）、（２１）、（２２）、（２３））を用い、９４℃で３分；９４℃で１０秒、６０℃で１０秒および７２℃で１０秒の３０サイクルで合成した。このために１０μＭのプライマーＩＮ−ＦとＩＮ−Ｒ、および５μＭのプライマーＩＮ−１とＩＮ−２を使用した。ＰＣＲ増幅は、市販キットＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造者の説明書に従って実施した。
【００３８】
相同組換えのための直鎖断片は、５種類のＰＣＲ産物を統合することによって合成した。これら５種類の産物は全て重複領域を持ち、続いて単一の断片へのアセンブリが可能である。全ての断片を５０μｌ容量中に１０ｎｇのアリコートとして混合した。ＰＣＲ産物は、プライマーを添加せずに９４℃で３分；９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で２分の１０サイクルで得た。次に、プライマーＬＨＡ−Ｆ、ＲＨＡ−Ｒ（配列表（１８）、（１９））を加え、さらに２５回のＰＣＲサイクルを行った：９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で２分、最終伸張７２℃で５分。これにより、下記の構造：ＬＨＡ−ＲＮＡ−ＩＮ−ＳａｃＢ−ＣａｔＲ−ＲＨＡを有する２８１１ｂｐ長のＰＣＲ断片を得た。この断片を、ＤＮＡ溶出キット（ＢｉｏＳｉｌｉｃａ、ロシア）を用い、製造者の説明書に従って、アガロースゲルから分取した。
【００３９】
大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦを合成するために、エレクトロコンピテントセルを作製した。このために、大腸菌株ＳＣＳ１１０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の単一コロニーを用いて１０ｍｌのＬＢ培地に感染させ、細胞をオービタルシェーカーにて１５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。翌日、１／２０を１００ｍｌのＬＢ培地に再播種し、オービタルシェーカーにて１５０ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００＝０．５となるまで培養した。必要な光学密度に達した際に、細胞を０℃に冷却し、４０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、培地を除去し、残留する培地を除去するために細胞を１００ｍｌの氷冷再蒸留水で２回すすぎ、次いで、２０ｍｌの１０％グリセリンですすいだ。その後、細胞を１ｍｌの１０％グリセリンに再懸濁させ、形質転換に使用した。
【００４０】
生産された直鎖断片による形質転換は、１ｍｍのキュベット内で、２ｋＶ、２００オーム、２５μＦにて、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いたエレクトロポレーションによって行った。パルス幅は４．９ｍｓ〜５．１ｍｓとした。その後、細胞をインキュベーターシェーカーにて３０℃で、ＳＯＣ培地で２．５時間培養した。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート（ペトリ皿）に注いだ。細胞を３０℃で４８時間培養した。ピッキングしたクローンを、イーストレル、ペプトン、６％スクロース、および１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する選択培地で生存するかどうか試験した。得られた株の遺伝子型は、ｒｅｃＡ  ｒｐｓＬ  （Ｓｔｒｒ）  ｔｈｒ  ｌｅｕ  ｅｎｄＡ  ｔｈｉ−１  ｌａｃＹ  ｇａｌＫ  ｇａｌＴ  ａｒａ  ｔｏｎＡ  ｔｓｘ  ｄａｍ  ｄｃｍ  ｓｕｐＥ４４  Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）［Ｆ’  ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑ  ＺΔＭ１５］ＣｈｍＲ  ｓａｃＢ＋であった。
【００４１】
実施例５
さらなる生産のための、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号Ｂ−１２９９０、国際寄託当局番号ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）の構築。
【００４２】
大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦのエレクトロコンピテントセルを作製するために、単一のコロニーを用いて１０ｍｌのＬＢ培地に感染させ、細胞をオービタルシェーカーにて１５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。翌日、１／２０を１００ｍｌのＬＢ培地に再播種し、オービタルシェーカーにて１５０ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００＝０．５となるまで培養した。必要な光学密度に達した際に、細胞を０℃に冷却し、４０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、培地を除去し、残留する培地を除去するために細胞を１００ｍｌの氷冷再蒸留水で２回すすぎ、次いで、２０ｍｌの１０％グリセリンですすいだ。その後、細胞を１ｍｌの１０％グリセリンに再懸濁させ、エレクトロポレーションによる形質転換に使用した。エレクトロポレーションは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用い、１ｍｍのキュベット内で、２ｋＶ、２００オーム、２５μＦにて行った。パルス幅は４．９ｍｓ〜５．１ｍｓとし、１〜１０ｎｇのベクターを使用した。その後、細胞をインキュベーターシェーカーにて３０℃で、ＳＯＣ培地で２．５時間培養した。次に、細胞を、イーストレル、ペプトン、６％スクロース、および１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する選択培地を含む寒天プレート（ペトリ皿）に注いだ。この手順により、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号Ｂ−１２９９０、国際寄託当局番号ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）が生産された。４８時間後に、単一のコロニーを用いて、イーストレル、ペプトン、６％スクロース、および１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する１０ｍｌの液体選択培地に感染させ、この培地をオービタルシェーカーにて１５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。翌日、細胞をペレットとし、ＤＮＡベクターを、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造者の説明書に従ってアルカリ溶解によって抽出した。
【００４３】
実施例６
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の効率を証明するために、標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード遺伝子をポリリンカーにクローニングした。
【００４４】
プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞トランスフェクション４８時間後のＨＥＫ−２９３細胞における、標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蓄積レベルの比較。
【００４５】
ＨＥＫ−２９３細胞（アデノウイルス５  ＤＮＡ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蓄積レベルを測定するために、プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞のトランスフェクションを行った。
【００４６】
細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）、４．５ｇ／ｌのグルコースおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中、５％СО２オーバーレイ、３７℃で増殖させた。９０％の集密度に到達させるために、トランスフェクション手順の２４時間前に細胞を２４ウェルプレートに４＊１０４細胞／ウェルの量で播種した。リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）をトランスフェクション試薬として使用した。試験管１に、プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１および遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰの溶液１μｌ（各５００ｎｇ／μｌ）および１μｌの試薬Р３０００を２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に加えた。この調製物を穏やかに振盪することにより混合した。試験管２において、１μｌのリポフェクタミン３０００溶液を２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に加えた。この調製物を穏やかに振盪することにより混合した。試験管１の内容物を試験管２の内容物に加え、この混合物を室温で５分間インキュベートした。得られた溶液を４０μｌ容量で細胞に滴下した。
【００４７】
結果は４８時間後に４８５／５３５ｎｍフィルターセットを備えたオリンパスｉｘ５３蛍光顕微鏡（日本）を用いて記録した（図３А）。これらの結果は、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでのＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクションは、プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）での同じ細胞のトランスフェクションに比べて、緑色蛍光タンパク質の蓄積に有意な増加を生じることを示す。
【００４８】
これらの結果は、トランスフェクトされた細胞株から抽出されたタンパク質の蛍光を測定することにより記録された。このために、細胞をピペット操作によってウェルからすすぎ取り、６０００ｒｐｍ、１０分間でペレットとし、２回すすぎ、その後、密集した細胞を１ｍｌのリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁させた。細胞を−７０℃での凍結／解凍サイクル３回で溶解させた。次に、溶解した細胞のホモジネートを１３０００ｇ、１５分間でペレットとした。上清を９６ウェル培養プレート（Ｇｒａｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）に各サンプルについて４反復で移した後、ＧＦＰの相対蛍光を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート蛍光計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した（吸収４５５ｎｍ／発光５３８ｎｍ）。得られた値を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって測定されたサンプル中の総タンパク質濃度に応じて正規化した。このために、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を色素として使用した。各反復試料を９６ウェルプレートのウェル中に水で１００倍希釈し（各サンプルにつき４反復）、次いで、色素を添加した。その後、全てのサンプルの光学密度を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて６２０ｎｍで測定した。得られた値を、ウシ血清アルブミン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に関して２０〜２．５μｇ／ｍｌの連続希釈系で作成した検量線と比較した。計算は下式を用いて行った。
Σタンパク質含量（μｇ）＝｛［ｘ］−σ｝÷ｋ＊Ｍ    
式中、［ｘ］は各サンプルに関する４反復のＯＤ６２０の平均値であり、σは平均偏差であり、ｋはＢＳＡの検量線の傾斜係数であり、Ｍはサンプルの希釈倍率である。
【００４９】
細胞から抽出されたタンパク質の総濃度の値に基づき、サンプルのＧＦＰ蛍光を、下式を用いて正規化した。
ＯＥｎ＝［ＯＥ］÷Σタンパク質含量（ｍｇ）    
式中、［ОЕ］は各サンプルに関する４反復の平均相対蛍光単位（ＲＦＵ）である。
【００５０】
結果を図３Ｂに示し、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでのＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクションは、プラスミドベクターｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）での同じ細胞のトランスフェクションに比べ、緑色蛍光タンパク質の蓄積レベルを２倍にすることを示す。
【００５１】
実施例７
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の効率を証明するために、標的遺伝子、例えば、エラスチンコード遺伝子をポリリンカーにクローニングした。
【００５２】
ヒトエラスチン遺伝子コード領域を保持するＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでのこれらの細胞のトランスフェクション４８時間後のケラチノサイト細胞ＨａＣａＴにおける、標的遺伝子、例えば、エラスチン遺伝子のｍＲＮＡの蓄積の変化の分析。
【００５３】
ＨａＣａＴ細胞（不死化ヒトケラチノサイト、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）、４．５ｇ／ｌのグルコースおよび２ｍＭのグルタミンを含有するＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中、５％СО２オーバーレイ、３７℃で増殖させた。９０％の集密度に到達させるために、トランスフェクション手順の２４時間前に細胞を２４ウェルプレートに５＊１０４細胞／ウェルの量で播種した。リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）をトランスフェクション試薬として使用した。ヒトエラスチン遺伝子を発現する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでの細胞のトランスフェクションは、実施例６に記載の手順に従って行った。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７でトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞を参照として使用した。トランスフェクト細胞からの全ＲＮＡの抽出および第一ｃＤＮＡ鎖の構築は、実施例３に記載の手順に従って行った。トランスフェクション後のエラスチン遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを測定するために、リアルタイムＰＣＲ（ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ）を使用した。ヒトエラスチンｃＤＮＡの増幅のために、オリゴヌクレオチドＥＬ１ＦおよびＥＬ１  Ｒを使用した（配列表（３４）、（３５）参照）。増幅産物の長さは２２７ｂｐである。β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を参照遺伝子として使用した。
【００５４】
ＰＣＲ増幅は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）または別のリアルタイムＰＣＲキットを用い、２５μｌのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、２．５ｍＭの塩化マグネシウム、各０．５μＭのプライマー、および５μｌの全ＲＮＡを含有する２０μｌの増幅混合物中で行った。増幅のため、ＣＦＸ９６反応モジュール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を下記の条件で使用した：４２℃で３０分の逆転写１サイクル、９８℃で１５分の変性、その後、９４℃で１５秒の変性、６０℃で３０秒のプライマーのアニーリングおよび７２℃で３０秒の伸張を含む４０サイクル。陽性対照は、遺伝子ＥＬＮおよびＢ２ＭのｃＤＮＡ配列を含有する既知濃度のプラスミドが表すマトリックスでのＰＣＲからのアンプリコンを含んだ。陰性対照は、脱イオン水を含んだ。ＰＣＲ産物、すなわち、増幅により得られるＥＬＮおよびＢ２Ｍ遺伝子ｃＤＮＡのリアルタイム定量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ２．１ソフトウエアを用いて行った。
【００５５】
エラスチン遺伝子をコードする領域を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでのこれらの細胞のトランスフェクション後のヒトケラチノサイト細胞におけるＥＬＮ遺伝子の発現の増強を証明するために、図３は、下記に対応するＰＣＲ産物の蓄積の図を示す。
１−遺伝子治療ベクターＶＴｖａｆ１７でのトランスフェクション後のＥＬＮ遺伝子のｃＤＮＡ；
２−エラスチン遺伝子コード領域を保持する遺伝子治療ベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでのトランスフェクション後のＥＬＮ遺伝子のｃＤＮＡ；
３−遺伝子治療ベクターＶＴｖａｆ１７でのトランスフェクション後のＢ２Ｍ遺伝子のｃＤＮＡ；
４−エラスチン遺伝子コード領域を保持する遺伝子治療ベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでのトランスフェクション後のＢ２Ｍ遺伝子のｃＤＮＡ。
【００５６】
この図から、標的遺伝子、例えば、ヒトエラスチン遺伝子を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮでのトランスフェクションは、ヒトエラスチン遺伝子特異的ｃＤＮＡのレベルを著しく上昇させるということになる。
【００５７】
実施例８
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の効率を証明するために、標的遺伝子、例えば、エラスチンコード遺伝子をポリリンカーにクローニングした。
【００５８】
標的遺伝子、例えば、ヒトエラスチン遺伝子を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７をヒト皮膚に注射した際の、ヒト皮膚におけるエラスチンタンパク質濃度の変化の測定を行った。
【００５９】
エラスチンタンパク質の濃度変化を分析するために、エラスチン遺伝子をコードする領域を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮを、目視的に年齢特有の変化を特徴とする３名の患者の前腕皮膚に注射し、同時にＥＬＮ遺伝子ｃＤＮＡを欠く遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７であるプラセボを導入した。患者１、女性、５６歳、小じわを特徴とする老化（Ｐ１）；患者２、女性、６７歳、変形または深いしわを特徴とする老化（Ｐ２）；患者３、男性、６０歳、変形を特徴とする老化（Ｐ３）。
【００６０】
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（プラセボ）およびエラスチン遺伝子をコードする領域を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮを、３０Ｇの針で深さ３ｍｍのトンネル法を用いて、各遺伝子構築体につき１ｍｇの量で注射した。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（プラセボ）およびエラスチン遺伝子をコードする領域を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮの注射溶液の容量は、各遺伝子構築体につき０．３ｍｌである。各遺伝子構築体の導入点は、５〜１０ｃｍ間隔で配置した。
【００６１】
生検サンプルは、遺伝子治療ＤＮＡベクターの導入２日目に採取した。生検サンプルは、エラスチン遺伝子をコードする領域を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ＥＬＮ（Ｉ）、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（プラセボ）（ＩＩ）の導入領域の患者の皮膚、および健全な皮膚（ＩＩＩ）から、皮膚生検デバイスＥｐｉｔｈｅａｓｙ  ３．５（Ｍｅｄａｘ  ＳＲＬ）を用いて採取した。患者の皮膚は無菌生理食塩水で予め洗い流し、リドカイン溶液で麻酔した。生検サンプルのサイズは約２×２×２ｍｍとし、重量は１０ｍｇまでとした。このサンプルを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、рН７．６、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含有するバッファー溶液中に入れ、ホモジナイズしてホモジナイズ懸濁液を得た。次に、この懸濁液を１４，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、標的タンパク質のアッセイに使用した。
【００６２】
患者の皮膚生検サンプル中のエラスチンタンパク質は、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  Ｆｏｒ  Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ）（ＳＥＢ３３７Ｈｕ、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）を用いた酵素結合免疫吸着アッセイにより定量した。
【００６３】
このキットから、マイクロプレートウェルに吸着されたエラスチンタンパク質に対して特異性の高い抗体を用いた。各１００μｌの希釈した参照サンプルおよび供試サンプルをウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。次に、１００μｌの試薬Аを加え、プレートを接着テープで覆い、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルを３５０μｌの洗浄バッファーで３回すすぎ、１００μｌの試薬Ｂを加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを３５０μｌの洗浄バッファーで５回洗浄し、９０μｌの基質溶液を加え、３７℃で２０〜２５分間インキュベートした。５０μｌの阻害剤除去バッファーを加えることで反応を終了させ、生化学・酵素結合アッセイＣｈｅｍＷｅｌｌ用完全自動分析装置（Ａｗａｒｅｎｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用い、４５０ｎｍで光学密度を測定した。濃度数値を測定するために、既知濃度のエラスチンタンパク質とともにキットの参照サンプルを用いて作成した検量線を使用した。結果の統計処理およびデータの可視化のためにＲ−３．０．２を使用した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。
【００６４】
３名の各患者の皮膚は、標的遺伝子、例えば、ヒトエラスチン遺伝子を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の導入領域では、ヒトエラスチン遺伝子をコードする領域を欠く遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７（プラセボ）の導入領域のエラスチンタンパク質濃度に比べて、エラスチンタンパク質濃度の増大を示す。患者Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の皮膚において得られたエラスチン濃度の値を図５に示す。
【００６５】
実施例９
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の効率を証明するために、ウシ腎臓細胞ＭＤＢＫにおいて標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード遺伝子をポリリンカーにクローニングした。
【００６６】
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでの細胞トランスフェクション４８時間後のウシ腎臓細胞ＭＤＢＫにおける標的遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蓄積レベルを比較した。
【００６７】
ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎臓細胞、ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−２２）における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蓄積レベルを定量するために、細胞を遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでトランスフェクトした。
【００６８】
細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）、１ｇ／ｌのグルコースおよび２ｍＭのグルタミンを含有するＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中、５％СО２オーバーレイ、３７℃で増殖させた。９０％の集密度に到達させるために、トランスフェクション手順の２４時間前に細胞を２４ウェルプレートに３＊１０４細胞／ウェルの量で播種した。リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）をトランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクションは実施例６に記載の手順に従って行った。緑色蛍光タンパク質遺伝子を欠く組換え遺伝子治療ベクターＶＴｖａｆ１７を参照として使用した。結果は、トランスフェクトされた細胞株から抽出したタンパク質の蛍光を、実施例６に記載するように測定することによって記録した。
【００６９】
結果を図６に示し、緑色蛍光タンパク質遺伝子を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７−ｅＧＦＰでのウシ腎臓細胞株ＭＤＢＫのトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質遺伝子を欠く遺伝子治療ベクターＶＴｖａｆ１７での同じ細胞のトランスフェクションに比べて、高いレベルの緑色蛍光タンパク質蓄積をもたらすことが結論付けられる。
【００７０】
実施例１０
工業規模での遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の生産可能性および構築可能性を証明するために、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号Ｂ−１２９９０、国際寄託当局番号ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）の大規模発酵を行った。
【００７１】
遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７の発酵は、１０−ｌのバイオリアクター／ファーメンターで行い、その後、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を抽出した。
【００７２】
大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７の発酵のために、１００ｇのトリプトン、５０ｇのイーストレル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（容量１０ｌ当たり）を含有する培地を調製した後、その培地を水で８８００ｍｌに希釈し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、次いで、１２００ｍｌの５０％（重量／容量）のスクロースを加えた。その後、大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７の種培養を培養フラスコに１００ｍｌの容量で播種した。この培養物をインキュベーターシェーカーにて３０℃で１６時間インキュベートした。種培養をＴｅｃｈｆｏｒｓ  Ｓバイオリアクター（Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ、スイス）に移し、静止期まで増殖させた。この過程は、培養物の光学密度を６００ｎｍで測定することにより制御した。細胞を５０００〜１００００ｇで３０分間ペレットとした。上清を除去し、細胞ペレットを１０％（容量）のリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。細胞を再び５０００〜１００００ｇで３０分間遠心分離した。上清を除去し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｇ／ｌのスクロース、рН８．０の溶液を１０００ｍｌの容量でこの細胞ペレットに加え、この混合物を十分に撹拌してホモジナイズ懸濁液を得た。次に、卵リゾチーム溶液を終濃度１００μｇ／ｍｌまで加えた。この混合物を穏やかに撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートした。次に、２５００ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｇ／ｌのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、この混合物を穏やかに撹拌しながら氷上で１０分間インキュベートし、次いで、３５００ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、２Ｍ酢酸、рН５〜５．５を加え、この混合物を穏やかに撹拌しながら氷上で１０分間インキュベートした。得られたサンプルを１５０００ｇ以上の値で２０〜３０分間遠心分離した。この溶液を慎重にデカントし、粗いフィルター（濾紙）に通すことによって残った沈澱を除去した。次に、ＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）を終濃度２０μｇ／ｍｌまで加え、この溶液を室温で１６時間、一晩インキュベートした。次に、この溶液を１５０００ｇで２０〜３０分間遠心分離し、０．４５μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。次に、１００ｋＤａのメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で限外濾過を行い、この混合物を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０のバッファー溶液で最初の容量まで希釈した。この操作を３〜４回行った。この溶液を、２５０ｍｌのＤＥＡＥセファロースＨＰ（ＧＥ、ＵＳＡ）を含むカラムに適用し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した。サンプルの適用後、カラムを３容量の同じ溶液で洗浄し、次いで、遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０の直線勾配を用いて溶出して、カラム容量の５倍の２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を得た。溶出過程は、流出溶液の光学密度を２６０ｎｍで測定することにより制御した。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を含有するクロマトグラフィー画分を一緒にし、スーパーデックス２００（ＧＥ、ＵＳＡ）を用いたゲル濾過を行った。カラムはリン酸緩衝生理食塩水で平衡化合物した。溶出過程は、流出溶液の光学密度を２６０ｎｍで測定することにより制御し、画分をアガロースゲル電気泳動により分析した。遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を含有するクロマトグラフィー画分を一緒にし、−２０℃で維持した。この収量は遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７の大規模工業生産に十分なものである。
【００７３】
従って、
Ｉ）遺伝子治療ＤＮＡベクターに抗生物質耐性遺伝子が存在しないためにヒトおよび動物の遺伝子治療に安全に使用できる可能性；
ＩＩ）標的細胞への効率的遺伝子送達を保証する長さ；
ＩＩＩ）標的遺伝子の効率的発現を保証し、しかもウイルスゲノムのヌクレオチド配列が呈するものでない調節要素の存在；および
ＩＶ）工業規模での生産可能性および構築可能性
を合理的に兼ね備えている本発明の目的、具体的には、ヒトおよび動物細胞の遺伝子改変のための遺伝子治療ＤＮＡベクターの構築が達成され、このことは以下の実施例：項目Ｉ−実施例１；項目ＩＩ−実施例１、６、７、８、９；項目ＩＩＩ−実施例１、６、７、８、９；項目ＩＶ−実施例５、１０により裏づけられる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
上記に挙げられた実施例は全て、提案される遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７およびその生産方法、ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７およびそれに基づく、標的遺伝子を保持する遺伝子治療ＤＮＡベクターの構築のための遺伝的に改変された大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ、ならびに大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦの生産方法、その構築のための遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する遺伝的に改変された大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７（番号В−１２９９０、国際寄託当局Ｎｏ．ＮＣＩＭＢ４２８０１としてロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムに登録）、および大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７の生産方法の産業上の利用可能性を裏づける。
【００７５】
オリゴヌクレオチド配列表
（１）  オリゴヌクレオチドＯＲＩ−Ｆ  ＡＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧ
（２）  オリゴヌクレオチドＯＲＩ−Ｒ  
ＡＧＣＣＴＣＡＣＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧ
（３）  オリゴヌクレオチドＯｒｉ−Ｍ１  
ＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧ  
（４）  オリゴヌクレオチドＯｒｉ−Ｍ２  
ＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧ
（５）  オリゴヌクレオチドＥＦ１−Ｆ  
ＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣ
（６）  オリゴヌクレオチドＥＦ１−Ｒ  
ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＴＡＧＧＧＧＴＡＧＴＴＴＴＣ
（７）  オリゴヌクレオチドｈＧＨ−Ｆ  
ＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧ
（８）  オリゴヌクレオチドｈＧＨ−Ｒ
ＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡ
（９）  オリゴヌクレオチドＲＯ−Ｆ  
ＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＡＣＧＣＧＴＡＧＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＴＣＧＴ
（１０）  オリゴヌクレオチドＲＯ−Ｒ
ＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＧ
（１１）  オリゴヌクレオチドＲＯ−１  
ＧＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＣＧＡＧＴＴＣＧＣＡＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧ
（１２）  オリゴヌクレオチドＲＯ−２  
ＧＡＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＣ
（１３）  オリゴヌクレオチドＲＯ−３  
ＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＡＡＧＧＴＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＧＴＣ
（１４）  オリゴヌクレオチドＫａｎ−Ｆ
ＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣ
（１５）  オリゴヌクレオチドＫａｎ−Ｒ
ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡ
（１６）  オリゴヌクレオチドＭＣＳ１  
ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧ
（１７）  オリゴヌクレオチドＭＣＳ２  
ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧ
（１８）  オリゴヌクレオチドＬＨＡ−Ｆ  ５’−  
ＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＣ
（１９）  オリゴヌクレオチドＬＨＡ−Ｒ  ５’−  
ＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＣＧＣＣＡＧ
（２０）  オリゴヌクレオチドＩＮ−Ｆ  ５’−  
ＣＴＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＧＧＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＧＴＣ
（２１）  オリゴヌクレオチドＩＮ−１  ５’−
ＡＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＴＧＴＣ
（２２）  オリゴヌクレオチドＩＮ−２  ５’−
ＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＡＴＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣ
（２３）  オリゴヌクレオチドＩＮ−Ｒ  ５’−
ＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧ
（２４）  オリゴヌクレオチドＳＡＣＢ−Ｆ  ５’−  
ＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧ
（２５）  オリゴヌクレオチドＳＡＣＢ−Ｒ  ５’−
ＣＴＴＡＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣ
（２６）  オリゴヌクレオチドＣＡＴＲ−Ｆ  ５’−
ＣＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＧＴＡＡＧＡＧＧ
（２７）  オリゴヌクレオチドＣＡＴＲ−Ｒ  ５’−
ＣＧＡＧＡＣＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＧＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣ
（２８）  オリゴヌクレオチドＲＨＡ−Ｆ  ５’−
ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＧＴＣＴＣＧＡ
（２９）  オリゴヌクレオチドＲＨＡ−Ｒ  ５’−
ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＣＡＣＧＴＡＣ
（３０）  オリゴヌクレオチドＭＶＧＦＰ−Ｆ  ５’−
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴ
（３１）  オリゴヌクレオチドＭＶＧＦＰ−Ｒ  ５’−  
ＧＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＧＡＧ
（３２）  オリゴヌクレオチドＥＬＮ−Ｆ  ５’−  
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＧ
（３３）  オリゴヌクレオチドＥＬＮ−Ｒ  ５’−  
ＧＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＣ
（３４）  オリゴヌクレオチドＥＬ１  Ｆ  ５’−  
ＧＡＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴ
（３５）  オリゴヌクレオチドＥＬ１  Ｒ  ５’−  
ＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＣＧＧＧＧＡＡＧＧＣＧ
【００７６】
略号の一覧
ＶＴｖａｆ１７  −  ウイルスゲノムおよび抗生物質耐性マーカーの配列を含まない遺伝子治療ベクター（ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ）
ＤＮＡ  −  デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  −  相補的デオキシリボ核酸
ＲＮＡ  −  リボ核酸
ｍＲＮＡ  −  メッセンジャーリボ核酸
ｂｐ  −  塩基対
ＰＣＲ  −  ポリメラーゼ連鎖反応
ｍｌ  −  ミリリットル、μｌ  −  マイクロリットル
ｌ  −  リットル
μｇ  −  マイクログラム
ｍｇ  −  ミリグラム
ｇ  −  グラム
μｍｏｌ  −  マイクロモル
ｍＭ  −  ミリモル
ｍｉｎ  −  分
ｓ  −  秒
ｒｐｍ  −  毎分回転数
ｎｍ  −  ナノモル
ｃｍ  −  センチメートル
ｍＷ  −  ミリワット
ＲＦＵ  −  相対蛍光単位
ＰＢＳ  −  リン酸緩衝生理食塩水
【図１】
0006918231.tif 000002
【図２】
0006918231.tif 000003
【図３】
0006918231.tif 000004
【図４】
0006918231.tif 000005
【図５】
0006918231.tif 000006
【図６】
0006918231.tif 000007