(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝プロパノエート、その立体異性体。
【化１】
0006948401.tif 000023
【請求項２】
式１．１のシクロブチル（Ｓ）−２−｛（Ｓ）−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝プロパノエート
または
式１．２のシクロブチル（Ｓ）−２−｛（Ｒ）−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝プロパノエート
である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
0006948401.tif 000024
【請求項３】
結晶形態または多結晶形態である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
結晶形態または多結晶形態である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤の特性を有する医療用薬物であり、それを必要とするヒトまたは温血動物におけるＣ型肝炎の処置を意図した請求項１に記載の化合物である、上記医薬用薬物。
【請求項６】
請求項１または２に記載の化合物の生産のための方法であって、式２のシクロブチル（Ｓ）−２−（ペンタフルオロフェニルオキシ−フェノキシ−ホスホリルアミノ）プロピオン酸塩、またはその立体異性体：式２．１のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−ペンタフルオロフェニルオキシ−フェノキシ−ホスホリルアミノ）プロピオン酸塩または式２．２のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−ペンタフルオロフェニルオキシ−フェノキシ−ホスホリルアミノ）プロピオン酸塩の使用を含む、上記方法。
【化３】
0006948401.tif 000025
【請求項７】
治療有効量の請求項１に記載の化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスの処置のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性およびがん疾患の処置のための化学療法剤およびその適用に関する。これらの化合物は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤のプロドラッグであり、哺乳動物におけるＣ型肝炎を処置することが意図される。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶによって引き起こされるＣ型肝炎は、世界で最も広く蔓延している肝疾患の１つである。世界保健機関（ＷＨＯ）の年報によれば、１億３０００万から１億５０００万を超える人がＨＣＶに感染しており、７０万を超える個体がＨＣＶのために死亡している［WHO. Hepatitis C.ＷＨＯファクトシート第１６４号、２０１６年７月アップデート、http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/］。ＨＣＶは、高い遺伝学的多様性を実証しており、（ｇＴ）ＨＣＶ遺伝子型が地域によって多様であることを特徴とする。遺伝子型１（ｇＴ１）は、世界中で最も一般的である（８３４０万の人、または全ＨＣＶ感染者の４６．２％；彼らの約３分の１は東アジア圏である）。遺伝子型３（ｇＴ３）は、２番目に一般的な遺伝子型である。世界的に、５４３０万の人（３０．１％）がｇＴ３に感染している。遺伝子型２、４、および６は、全ＨＣＶ感染者の２２．８％を占め、一方で遺伝子型５（ｇＴ５）は＜１％を占める。大部分の国々において、経済状態に関係なく遺伝子型１および３が優勢であるが、遺伝子型４および５は、低所得者層で最も多く出現する［Messina, J. P.ら、Global Distribution and Prevalence of Hepatitis C Virus Genotypes. Hepatology 2015、61（1）、77〜87］。
【０００３】
近年成し遂げられたＣ型肝炎の療法における顕著な進歩は、主として、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤のヌクレオシドプロドラッグであり、プロドラッグＰＳＩ−７８５１のＳｐ異性体であるソホスブビル（ソバルディ（Sovaldi）（登録商標）、ＰＳＩ−７９７７、ＧＳ−７９７７）の発見に関連する［Sofia, M.J.ら、Discovery of a β-D-20-Deoxy-20-rfluoro-20-β-C-methyluridine Sovaldi Nucleotide Prodrug (PSI-7977) for the Treatment of Hepatitis C Virus.J.Med.Chem. 2010、53、7202〜7218、Sofia, M.J.ら、Nucleoside phosphoramidate prodrugs.、米国特許第７９６４５８０号（２０１１）、米国特許第８３３４２７０号（２０１２）。ロシア国特許第２４７８１０４号（２０１３）］。
【０００４】
【化１】
0006948401.tif 000002
【０００５】
ソバルディ（登録商標）は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害剤などとのＣ型肝炎の併用療法において現在広く適用されている。ソバルディ（登録商標）は、様々なＨＣＶ遺伝子型（ｇＴ）に感染したＣ型肝炎患者の併用療法に関するＦＤＡおよびＥＣの規制機関によって承認された最初のヌクレオチドとなっている。臨床研究において、６種のＨＣＶ遺伝子型（ｇＴ１〜ｇＴ６）に対する高い効力が示されている［I.M.Jacobsonら、Sofosbuvir for hepatitis C genotype 2 or 3 in patients without treatment options. Engl.J.Med. 2013、368、1867〜1877、E.Lewirzら、Sofosbuvir for previously untreated chronic hepatitis C infection. Engl.J.Med. 2013、368、1878〜1887］。
【０００６】
ＰＳＩ−７８５１ならびにその立体異性体ＰＳＩ−７９７６およびＰＳＩ−７９７７は、三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９に代謝され、これは、実際には、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤である［E.Murakamiら、Mechanism of activation of PSI-7851 and its diastereoisomer PSI-7977. J.Biol.Chem. 2010、285（45）、34337〜34347］。
【０００７】
【化２】
0006948401.tif 000003
【０００８】
他にも公知のソバルディ（登録商標）類似体があり［米国特許第８３３４２７０号（２０１２）、M.J.Sofiaら、Discovery of a β-D-20-Deoxy-20-r-fluoro-20-β-C-methyluridine Nucleotide Prodrug (PSI-7977) for the Treatment of Hepatitis C Virus. J.Med. Chem. 2010、53、7202〜7218］、例えば、式Ａ１のシクロヘキシル（Ｓ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸塩、例えばＰＳＩ−７８５１ならびにそのリン含有立体異性体ＰＳＩ−７９７６およびＰＳＩ−７９７７（ソバルディ（登録商標））などであり、これらは、三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９に代謝される。
【０００９】
【化３】
0006948401.tif 000004
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７９６４５８０号
【特許文献２】米国特許第８３３４２７０号
【特許文献３】ロシア国特許第２４７８１０４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】WHO. Hepatitis C.ＷＨＯファクトシート第１６４号、２０１６年７月アップデート、http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/
【非特許文献２】Messina, J. P.ら、Global Distribution and Prevalence of Hepatitis C Virus Genotypes. Hepatology 2015、61（1）、77〜87
【非特許文献３】Sofia, M.J.ら、Discovery of a β-D-20-Deoxy-20-rfluoro-20-β-C-methyluridine Sovaldi Nucleotide Prodrug (PSI-7977) for the Treatment of Hepatitis C Virus. J.Med.Chem. 2010、53、7202〜7218
【非特許文献４】Sofia, M.J.ら、Nucleoside phosphoramidate prodrugs.
【非特許文献５】I.M.Jacobsonら、Sofosbuvir for hepatitis C genotype 2 or 3 in patients without treatment options. Engl.J.Med. 2013、368、1867〜1877
【非特許文献６】E.Lewirzら、Sofosbuvir for previously untreated chronic hepatitis C infection. Engl.J.Med. 2013、368、1878〜1887
【非特許文献７】E.Murakamiら、Mechanism of activation of PSI-7851 and its diastereoisomer PSI-7977. J.Biol.Chem. 2010、285（45）、34337〜34347
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、Ｃ型肝炎療法における近年の進歩にもかかわらず、改善された特徴を有する新規のＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤のプロドラッグの探求がいまだ主要な課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、驚くべきことに、これまでに未知の一般式１の化合物および式１．１（Ｓｐ立体異性体）または１．２（Ｒｐ立体異性体）のそのリン含有立体異性体が、とりわけＣ型肝炎の処置に使用され得るＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤の有力なプロドラッグおよび有望な抗ウイルス剤であることを見出した。
【００１４】
【化４】
0006948401.tif 000005
【００１５】
以下に、本発明を説明するのに使用される様々な用語の定義を列挙する。これらの定義は、特定の例において別段の限定がない限り、その用語が本明細書と特許請求の範囲にわたり使用されるときに、個々に、またはより大きい群の一部としてのいずれかでそれに適用される。
【００１６】
用語「結晶形態」は、結晶格子が形成されるように分子が配列されている物質構造を指す。
用語「多結晶形態」は、特定の結晶形態の複数の小さい単結晶または晶子からなる多結晶性の構造を指す。
【００１７】
用語「活性成分」（医薬物質）は、薬理活性を示す合成または他の（生物工学的な、植物性、動物性、細菌などの）起源の生理学的に活性な化合物を指し、医薬組成物の活性成分である。
【００１８】
用語「医療用薬物」は、ヒトおよび動物における生理学的機能の回復、改善または改変、ならびに疾患の処置および予防、診断、麻酔、避妊、美容術などを意図した、錠剤、カプセル剤、注射剤、軟膏剤、または他の完成した剤形の形態の化合物（または医薬組成物を形成する化合物の混合物）を指す。
【００１９】
用語「治療用カクテル」は、薬理学的作用の異なるメカニズムを示し、疾患の病因に関与する様々なバイオターゲットを標的化する、同時に投与される２種またはそれより多くの医療用薬物の組合せを指す。
【００２０】
用語「医薬組成物」は、式１の化合物と、医薬的に許容され、薬理学的に適合性を有する、増量剤、溶媒、希釈剤、担体、助剤、分散剤、および知覚剤、賦形剤、送達のための物質、例えば保存剤、安定剤、増量剤、崩壊薬、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、甘味料、矯味矯臭剤、芳香剤、抗菌剤、殺真菌剤、潤滑剤、および持続性の送達制御物質からなる群から選択される成分の少なくとも１つとを含む組成物を指し、これらの選択および比率は、投与の性質および経路ならびに投薬量によって決まる。好適な懸濁化剤の例は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン、ソルビトールおよびソルビトールエーテル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物である。微生物からの保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸などを使用して提供することができる。前記組成物はまた、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含んでいてもよい。組成物の持続的な作用は、活性成分の吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用して達成することができる。好適な担体、溶媒、希釈剤および送達のための物質の例としては、注射の場合、水、エタノール、多価アルコールおよびそれらの混合物、天然油（例えばオリーブ油）、ならびに有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が挙げられる。増量剤の例は、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなどである。崩壊薬および分散剤の例は、デンプン、アルギン酸およびその塩、ならびにケイ酸塩である。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、および高分子量のポリエチレングリコールである。活性成分の経口、舌下、経皮、筋肉内、静脈内、皮下、および局所または直腸内投与のための医薬組成物は、単独で、または別の活性化合物と組み合わせて、標準的な投与形態で、従来の医薬用担体との混合物として動物やヒトに投与することができる。好適な標準的な投与形態としては、経口の形態、例えば、錠剤、ゼラチンカプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、チューインガム、および経口溶液または懸濁液；舌下およびバッカル経由の投与形態；エアロゾル；インプラント；局所、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または眼球内の形態；ならびに直腸内投与形態が挙げられる。
【００２１】
用語「不活性増量剤」は、本明細書で使用される場合、医薬組成物を形成するために使用され、概して安全で非毒性であり、生物学的にもそれ以外の観点からも有害ではない化合物を指し、獣医学的な使用やヒトの医薬における使用にとって許容できる賦形剤を含む。本発明の化合物は、個別に投与することもできるが、一般的に、予期される薬物の投与経路および標準的な製薬上の実施に応じて選択された１つまたはそれより多くの医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体との混合物として投与される。
【００２２】
用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、対象におけるの疾患の症状を軽減するのに必要な物質、プロドラッグ、または薬物の量を指す。物質、プロドラッグ、または薬物の用量は、それぞれの特定のケースにおいて個々の要求を満たすものと予想される。前記用量は、処置しようとする疾患の重症度、患者の年齢および全体の状態、患者の処置に使用される他の医薬、投与の様式および経路、ならびに担当医師の経験のような多数の要因に応じて広範に変更することができる。経口投与の場合、１日用量は、単独療法および／または併用療法の両方において、その間の全ての値を含め約０．０１〜１０ｇである。好ましい１日用量は、約０．１〜７ｇである。一般的に、ウイルスを低減するかまたはなくすために、処置の開始時にはより多くの負荷用量を与え、続いて用量を、感染バーストを防ぐのに十分な程度のレベルに低減する。
【００２３】
用語「対象」は、これらに限定されないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、スイギュウ、ラマ、ダチョウ、イヌ、ネコ、およびヒトなどの哺乳動物を指し、最も好ましくは、ヒト対象である。対象の処置は、一般式１のいずれかのプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および結晶形態もしくは多結晶形態、またはそれらとＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害剤などの別の化合物との組合せの使用を含み得ることが想定される。
【００２４】
本発明の主題は、一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロパノエート、そのリン含有立体異性体（式１．１のＳｐ立体異性体または式１．２のＲｐ立体異性体）、それらの同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態である。
【００２５】
本発明の主題は、それを必要とするヒトまたは温血動物におけるＣ型肝炎の処置のための医薬用薬物としての、一般式１のＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤のプロドラッグ、そのリン含有立体異性体（式１．１のＳｐ立体異性体または式１．２のＲｐ立体異性体）、それらの同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態である。
【００２６】
好ましいプロドラッグは、シクロブチル（Ｓ）−２−｛（Ｓ）−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロパノエート（１．１）、その同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態である。
【００２７】
驚くべきことに、新規の一般式１のプロドラッグ、そのリン含有立体異性体、それらの同位体で濃縮された類似体、ならびに結晶形態および多結晶形態は、公知のＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤のプロドラッグより有効な、特定には、ソバルディ（Sovaldi）（登録商標）および式Ａ１のシクロヘキシルエステルより有効な、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤のプロドラッグのようであった。
【００２８】
実際に、ソバルディ（登録商標）は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ（ｇＴ１ｂ）に対して、ＥＣ５０＝０．０４５〜０．１７０μＭ［http://www.hcvdruginfo.ca/downloads/HCV_Sofosbuvir.pdf］およびＥＣ９０＝０．５９μＭを有するが、新規の式１．１のプロドラッグは、ＥＣ５０＝１５．０〜２７．０ｎＭおよびＥＣ９０＝１２８．０ｎＭ（表１а）を有し、これは、新規の式１．１のプロドラッグは、ソバルディ（登録商標）より３倍高活性であることを意味する。ヒト肝臓ミクロソームＳ９画分における式１．１のプロドラッグの半減期は、Ｔ１／２ｈＳ９＝０．０５時間であるが、ソバルディ（登録商標）は、Ｔ１／２ｈＳ９＝０．５４時間を有し（表２）、これは、ヒト肝臓ミクロソームＳ９画分における新規の式１．１のプロドラッグの代謝率は、ソバルディ（登録商標）の代謝率より１１倍速いことを意味する。加えて、式１．１のプロドラッグの代謝プロセスにより生じるラット肝臓における三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９の濃度およびＡＵＣ２４ｈは、それぞれＣｍａｘ＝３２２４．０ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝３０４８７．０ｎｇ・時間／ｇであるが、ソバルディの類似の代謝は、Ｃｍａｘ＝１９３４．０ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝１６７９６．０ｎｇ・時間／ｇをもたらす（表３）。これは、新規の式１．１のプロドラッグは、ほぼ２倍高い有効性で、肝臓で必要な三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９（薬物）に代謝されるという事実を証明する。
【００２９】
新規の式１．１のプロドラッグは、以下のパラメーター：ＥＣ９０＝２５０．０ｎＭ、Ｔ１／２ｈＳ９＝１．４時間、Ｃｍａｘ＝５５７ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝６４８４．０ｎｇ・時間／ｇを有することが公知であることから［M. J. Sofiaら、J.Med.Chem. 2010、53、7202〜7218］、前記プロドラッグは、公知の式Ａ１のシクロヘキシルエステルと比較して、よりいっそう大きい有効性を有する。
【００３０】
得られた結果（作用）は、式１．１のプロドラッグが、シクロブチルエステルであり、その類似体である式Ａ１のシクロヘキシルエステルほど有効ではないが、前述の驚くべき作用をよりよく例示するために発明者らによって特別に調製された別の類似体である式Ａ２のシクロプロピルエステルより高い活性を有することから（ＥＣ９０＝７３．０ｎＭ、ＥＣ９０＝４１０．０ｎＭ、表１ａを参照）驚くものである。
【００３１】
【化５】
0006948401.tif 000006
【００３２】
驚いたことに、一連のシクロアルキルエステルにおいて、最も有効なものは、中程度のサイズのシクロアルキルとの式１．１のシクロブチルエステルのようであったが、より大きいサイズのシクロアルキル（公知の式Ａ１のシクロヘキシルエステル）や、より小さいサイズのシクロアルキル（発明者らによって特別に調製された式Ａ．２のシクロプロピルエステル）とのエステルは、有効性がより低いようであった。
【００３３】
上記のデータは、本発明の新規性およびレベル（有効性）の説得力のある証拠である。
本発明の主題は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤の特性を有する医薬用薬物であった、それを必要とするヒトまたは温血動物におけるＣ型肝炎の処置を意図した治療有効量での、一般式１の化合物、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態である、上記医薬用薬物である。
【００３４】
本発明の主題は、一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態を、任意選択で医薬的に許容される増量剤、担体、添加剤、または希釈剤と組み合わせて含む、哺乳動物におけるＣ型肝炎ウイルスの処置のための治療有効量の医薬組成物である。
【００３５】
前記一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態は、様々な経口剤形および担体で調製することができる。経口投与は、錠剤、フィルムコーティング錠剤、ハードおよびソフトゼラチンカプセル、液剤、乳剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態で行うことができる。本発明の化合物は、坐剤の形態で投与すると効果的である。一般的に、最も便利な投与経路は、一般的な１日投薬レジメンを使用する経口経路であり、このようなレジメンは、疾患の重症度および患者の抗ウイルス薬または抗腫瘍薬反応に応じて調整することができる。
【００３６】
１種またはそれより多くの一般的な賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせた、一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態は、医薬組成物およびその単位剤形の形態であってもよい。医薬組成物および標準的な剤形は、追加の活性化合物および剤形を共に含むまたは含まない、通常の比率での通常の成分からなっていてもよい。医薬組成物は、処方された１日用量に応じてあらゆる適切な有効量の活性成分を含んでいてもよい。医薬組成物は、経口投与の場合、固形の物質、例えば錠剤もしくは充填済みのカプセルの形態；半固体の粉末剤、持続放出剤、もしくは液剤、例えば懸濁剤、乳剤、もしくは充填済みカプセルの形態；または直腸または膣内投与の場合、坐剤の形態で使用することができる。典型的な薬物療法は、およそ５ｗｔ％〜９５ｗｔ％の活性化合物または化合物を含むと予想される。用語「薬物療法」または「剤形」は、活性化合物の固体組成物と液体組成物の両方を包含することが意図され、したがって活性成分が、必要な用量および薬物動態パラメーターに応じて様々な薬物療法の形態で存在し得ることが当業者には明らかであると予想される。
【００３７】
固体剤形としては、粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、および分散性の顆粒剤が挙げられる。固形担体は、希釈剤、矯味矯臭薬剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、崩壊剤、または封入材料として作用し得る１種またはそれより多くの物質を指す。粉末担体は、一般的に、微粒状の活性成分と混合された微粒状の固体である。錠剤において、活性成分は通常、必要な結合能力を有する担体と適切な比率で混合され、望ましい形状およびサイズに圧縮される。好適な担体としては、これらに限定されないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどが挙げられる。固体製剤は、活性成分に加えて、色素、矯味矯臭剤、安定剤、緩衝液、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでいてもよい。
【００３８】
液体組成物も経口投与に好適である。液体剤形としては、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、および水性懸濁剤が挙げられる。これらは、使用直前に液状の薬物に変換されることになる固体薬物形態を含む。乳剤は、溶液中で、例えばプロピレングリコール水溶液中で調製してもよいし、またはこれらは、乳化剤、例えばレシチン、ソルビトールモノオレエート、またはアラビアゴムを含んでいてもよい。水性懸濁液は、延性材料、例えば天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の周知の懸濁化剤と共に、水中に微粒状の活性成分を分散させることによって調製することができる。
【００３９】
一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態は、坐剤の形態での投与のために調製することができる。低融点ワックス、例えば脂肪酸のグリセリドの混合物またはカカオバターをまず溶融させ、次いで活性成分を、例えば撹拌によって均一に分散させる。溶融した均一な混合物を好適なサイズの型に流し込み、そのまま冷却し、凝固させる。
【００４０】
一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態は、膣内投与のために調製することができる。活性成分に加えて当業界において周知の担体を含む、坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、発泡剤、またはスプレー剤を適用することが適切であると予想される。
【００４１】
本発明の主題は、Ｃ型肝炎ウイルスの処置のための医薬用薬物の生産における、一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態の適用である。本明細書に記載されるいずれかのウイルス性疾患の処置のための前記医薬用薬物の生産で使用される一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態は、以下から選択される一般式１の化合物：
シクロブチル（Ｓ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロパノエート（１）、
シクロブチル（Ｓ）−２−｛（Ｓ）−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロパノエート（１．１）、
およびシクロブチル（Ｓ）−２−｛（Ｒ）−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロパノエート（１．２）、
それらの同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態
のいずれかのそれぞれ、または本発明のいくつかの他の化合物と組み合わせたものであり得ると想定される。
【００４２】
本発明の主題は、それを必要とする対象におけるウイルス性およびがん疾患の併用処置および／または予防のための方法であって、治療有効量の一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、または結晶形態もしくは多結晶形態、および治療有効量のいくつかの他の抗ウイルス剤または抗がん剤を対象に投与することを含み、ここで薬剤は、同時または交互に投与される、上記方法である。連続した薬剤投与間の時間は、１〜２４時間の範囲のあらゆる期間であってもよいことが理解される。
【００４３】
「他の抗ウイルス剤」の例としては、これらに限定されないが、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤［ＵＳ２０１４０２９６１３６、ＵＳ８，９８７，１９５、ＵＳ７９７３０４０、ＵＳ２０１２２１４７８３］、ＨＣＶ  ＮＳ４阻害剤［ＥＰ１４９７２８２］、ＨＣＶ  ＮＳ３／ＮＳ４阻害剤［ＥＰ２３６４９８４］、およびＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害剤［C. Wangら、Hepatitis C virus RNA elimination and development of resistance in replicon cells treated with BMS-790052. Antimicrob. Agents Chemother. 2012、56、1350〜1358. https://en.wikipedia.org/wiki/Daclatasvir；A.V. Ivachtchenkoら、Discovery of Novel Highly Potent Hepatitis C Virus NS5A Inhibitor（AV4025）. J. Med. Chem. 2014、57、7716〜7730；米国特許出願第１４/８４５,３３３号）；Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＷＯ２０１５０２３９５８、ＷＯ２０１２０９７０１２）；および他の阻害剤（ＷＯ２０１４１０６０１９、ＷＯ２０１４０３３１７６、ＷＯ２０１４０３３１７０、ＷＯ２０１４０３３１６７、ＷＯ２０１３００６３９４、US ２００９０１６３５４５］が挙げられる。
【００４４】
より好ましくは、新規の一般式１のプロドラッグまたはその式１．１の立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態または多結晶形態と共に、抗ウイルス性または抗がん性医薬用薬物を治療有効量でさらに含む抗ウイルス性医薬組成物である。
【００４５】
より好ましくは、新規の一般式１のプロドラッグまたはその式１．１の立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態もしくは多結晶形態と共に、以下の群から選択される治療有効量のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害剤をさらに含む、抗ウイルス性医薬組成物である：
ダクラタスビル（ダクルインザ、BMS７９００５２）［Belema, M.ら、Discovery and Development of Hepatitis C Virus NS5A Replication Complex Inhibitors. J. Med. Chem. 2014、57、1643〜1672；Bachand, C.ら、Hepatitis C virus inhibitors．特許ＷＯ２００８／０２１９２７、２００８；Bachand, C.ら、Hepatitis c virus inhibitors．特許ＷＯ２００８／０２１９２８、２００８；Bachand, C.ら、Hepatitis C virus inhibitors．特許ＷＯ２００８／０２１９３６、２００８；http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Public_assessment report/human/003768/WC500172849.pdf.］
【００４６】
【化６】
0006948401.tif 000007
【００４７】
ヘパビビル（Hepavivir）（ＡＶ−４０２５）［Ivachtchenko, A. V.ら、Discovery of Novel Highly Potent Hepatitis C Virus NS5A Inhibitor（AV4025）. J. Med. Chem. 2014、57、7716〜7730；特許ＷＯ２０１２／０７４４３７、２０１２；米国特許第９４２８４９１号、２０１６］
【００４８】
【化７】
0006948401.tif 000008
【００４９】
ＡＶ−４０５６およびＡＶ−４０５８［ＵＳ９４２８４９１］
【００５０】
【化８】
0006948401.tif 000009
【００５１】
ＡＶ−４０６７およびＡＶ−４０８４［米国特許出願第１４／８４５，３３３号］
【００５２】
【化９】
0006948401.tif 000010
【００５３】
オムビタスビル（ＡＢＴ−２６７）［Gardelli, C.ら、Phosphoramidate Prodrugs of 20-C-Methylcytidine for Therapy of Hepatitis C Virus Infection. J. Med. Chem. 2014、57、2047〜2057；特許ＷＯ２０１０／１４４６４６、２０１０］
【００５４】
【化１０】
0006948401.tif 000011
【００５５】
エルバスビル（ＭＫ−８７４２）［Coburn, C. A.ら、ChemMedChem. 2013、8、1930〜1940；特許ＷＯ２０１２／０４０９２３、２０１２；特許ＷＯ２０１２／０４１０１４、２０１２］
【００５６】
【化１１】
0006948401.tif 000012
【００５７】
ベルパタスビル（ＶＥＬ、ＧＳ−５８１６）［特許ＷＯ２０１５／１１００４８、２０１５；http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfdadocs/nda/2016/208341Orig1s000PharmR.pdf；http://www.gilead.com/~/media/files/pdfs/medicines/liver-disease/epclusa/epclusa_pi.pdf］
【００５８】
【化１２】
0006948401.tif 000013
【００５９】
ナルラプレビル（ＳＣＨ９００５１８）、ＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）の阻害剤［Arasappan A.ら、Discovery of Narlaprevir （SCH 900518）:A Potent, Second Generation HCV NS3 Serine Protease Inhibitor. ACS Med. Chem. Lett.、2010、1（2）、64〜69］
【００６０】
【化１３】
0006948401.tif 000014
【００６１】
およびシメプレビル（オリシオ（Olysio））、ＨＣＶ非構造タンパク質NS３/NS４の阻害剤［https://www.tga.gov.au/sites/default/files/auspar-simeprevir-141027-pi.docx］。
【００６２】
【化１４】
0006948401.tif 000015
【００６３】
本発明の主題は、それを必要とする対象におけるウイルス性およびがん疾患の併用処置のための方法であって、治療有効量の一般式１のプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、結晶形態もしくは多結晶形態、またはいくつかの他の抗ウイルス剤もしくは抗がん剤の連続または同時投与を含む、上記方法である。連続した薬剤投与間の時間は、あらゆる期間であってもよいことが理解される。
【００６４】
他の抗ウイルス剤は、これらに限定されないが、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、ペグインターフェロンアルファ、リバビリン、レボビリン（levovirin）、ビラミジン（viramidine）、別のヌクレオシドＨＣＶポリメラーゼ阻害剤、非ヌクレオシドＨＣＶポリメラーゼ阻害剤、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤またはＨＣＶ融合阻害剤、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、およびＨＩＶ１逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤であると想定される。プロドラッグもしくは誘導体またはそれらの塩が別の抗ウイルス剤または抗がん剤と組み合わせて投与される場合、プロドラッグの元の活性より活性が増加する可能性がある。併用療法において、薬剤投与は、一般式１のプロドラッグと同時でもよいし、またはそれと連続していてもよい。したがって観念「同時の投与」は、本明細書で使用される場合、同時のまたは異なる時間での薬剤投与を意味する。２種またはそれより多くの薬剤の同時投与は、２種またはそれより多くの活性成分を含む１つの分取可能な形態を使用することによって、または１種の活性薬剤を含む剤形の２種またはそれより多くを実質的に同時に投与することによって実行することができる。本明細書で使用される全ての療法への言及は、予防も同様に網羅することが理解されるものとする。加えて、ウイルス感染「療法」という用語は、本明細書で使用される場合、媒介されたウイルスの感染またはその臨床症状に関連する疾患または状態の処置または予防を包含する。
【００６５】
本発明は、一般式１のプロドラッグおよびその立体異性体、同位体で濃縮された類似体、ならびに結晶形態および多結晶形態の生産のための方法であって、これまでに未知の式２のシクロブチル（Ｓ）−２−（ペンタフルオロフェニルオキシ−フェノキシ−ホスホリルアミノ）−プロピオン酸塩またはその立体異性体、式２．１のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−ペンタフルオロフェニルオキシ−フェノキシ−ホスホリルアミノ）−プロピオン酸塩、および式２．２のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−ペンタフルオロフェニルオキシ−フェノキシ−ホスホリルアミノ）−プロピオン酸塩の使用を含む、上記方法に関し、これらもまた本発明の主題である。
【００６６】
【化１５】
0006948401.tif 000016
【００６７】
本発明者らは、驚くべきことに、新規の一般式１のプロドラッグおよびそのリン含有立体異性体（式１．１のＳｐ−立体異性体および式１．２のＲｐ−立体異性体）は、例えば公知のソバルディ（登録商標）および式Ａ１のシクロヘキシルエステル、加えてこれまでに未知の式Ａ２のシクロプロピルエステル（比較例）より有効なＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤のプロドラッグであることを見出した。
【００６８】
したがって、ソバルディ（登録商標）は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ（ｇＴ１ｂ）に対して、ＥＣ５０＝０．０４５〜０．１７０μＭおよびＥＣ９０＝５９０ｎＭを有し、式Ａ１のシクロヘキシルエステルは、ＥＣ９０＝２５０．０ｎＭを有するが、式Ａ２のシクロプロピルエステルは、ＥＣ９０＝７３．０ｎＭおよびＥＣ９０＝４１０．０ｎＭを有する（表１）。新規の式１．１のプロドラッグは、ＥＣ５０＝１５．０〜２７．０ｎＭおよびＥＣ９０＝１２８．０ｎＭ（表１а）を有し、これは、新規の式１．１のプロドラッグは、ソバルディ（登録商標）より３倍高い活性を有し、式Ａ１の化合物の２倍の活性を有し、式Ａ２の化合物より３倍高い活性を有することを意味する。
【００６９】
ヒト肝臓ミクロソームＳ９画分における式１．１のプロドラッグの半減期は、Ｔ１／２ｈＳ９＝０．０５時間であるが、ソバルディ（登録商標）は、Ｔ１／２ｈＳ９＝０．５４時間を有し、式Ａ１のシクロヘキシルエステルは、Ｔ１／２ｈＳ９＝１．４時間を有し（表２）、これは、ヒト肝臓ミクロソームＳ９画分における新規の式１．１のプロドラッグの代謝率が、ソバルディ（登録商標）のより１１倍速く、式Ａ１のシクロヘキシルエステルのより２８倍速いことを意味する。加えて、式１．１のプロドラッグの代謝プロセスの結果生じるラット肝臓における三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９の濃度およびＡＵＣ２４ｈは、それぞれＣｍａｘ＝３２２４．０ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝３０４８７．０ｎｇ・時間／ｇであるが、ソバルディの類似の代謝は、Ｃｍａｘ＝１９３４．０ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝１６７９６．０ｎｇ・時間／ｇをもたらす（表３）。これは、新規の式１．１のプロドラッグは、ソバルディ（登録商標）のほぼ２倍高い有効性で、さらに、式Ａ１のシクロヘキシルエステルより４．７倍高い有効性で、肝臓で必要な三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９（薬物）に代謝されるという事実を証明する。
【００７０】
得られた結果（作用）は、式１．１のプロドラッグが、シクロブチルエステルであり、その類似体である式Ａ１のシクロヘキシルエステルほど有効ではないが、前述の驚くべき作用をよりよく例示するために発明者らによって特別に調製された別の類似体である式Ａ２のシクロプロピルエステルより高い活性を有することから（ＥＣ９０＝７３．０ｎＭ、ＥＣ９０＝４１０．０ｎＭ、表１ａを参照）、驚くものである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
最良の実施態様
ここで本発明を特定の実施態様に関して説明するが、それにより本発明の範囲を限定することは意図されない。それとは逆に、本発明は、特許請求の範囲内に含めることができる全ての代替物、改変、および均等物を網羅する。したがって、以下の具体的な実施態様を含む実施例は、本発明を限定することなく本発明を例示するものである。
【実施例】
【００７２】
実施例１．一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロパノエートのプロドラッグ、ならびにその立体異性体０１．１および１．２のための合成プロトコール（スキーム１）。
【００７３】
【化１６】
0006948401.tif 000017
【００７４】
ジクロロメタン（３００ｍｌ）中のＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン（４：１５．５ｇ、８１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（１６．９ｇ、８１．９ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、５分後、シクロブタノール（３：５．６ｇ、７８．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．０ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）で添加した。混合物をそのまま室温で一晩撹拌し、真空中で蒸発させ、残留物を酢酸エチル（３００ｍｌ）で処理した。残留物をろ過して分離し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液をクエン酸の５％溶液（２×１００ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３飽和溶液（２×１００ｍｌ）、およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で蒸発させ、１９．６ｇ（９８％）の（Ｓ）−シクロブチル２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノエート（５）を白色の粉末として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6)δ 7.22 (d, J=7.2 Hz, 0.85H), 6.87 (m, 0.15H), 4.89 (p, J=7.2 Hz, 1H), 3.94 (m, 1H), 2.26 (m, 2H), 1.98 (m, 2H), 1.74 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.38 (s, 7.5H), 1.34 (brs, 1.5H), 1.22 (d, J=7.2Hz, 3H)。
【００７５】
ジオキサン（５０ｍｌ）中の化合物５（１９．６ｇ、８０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中のＨＣｌ（２３０ｍｌ、３Ｍ）を添加し、混合物をそのまま一晩撹拌し、真空中で蒸発させた。残留物をエーテル（４００ｍｌ）で処理し、一晩撹拌した。残留物をろ過して分離し、エーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、１４．１ｇ（９７％）の（Ｓ）−シクロブチル２−アミノ−プロパノエート塩酸塩（６）を白色の粉末として得た。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ8.56 (brs, 3H), 5.00 (p, J=7.6 Hz, 1H), 4.02 (q, J=7.2 Hz, 1H), 2.31 (m, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.62 (m, 1H), 1.41 (d, J=7.2 Hz, 3H)。
【００７６】
ジクロロリン酸フェニル（１６．９ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２１４ｍｌ）中の化合物６（１４．４ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を−７５〜７０℃に冷却し、ジクロロメタン（１６ｍｌ）中のトリエチルアミン（１６．２ｇ、１６０．４ｍｍｏｌ）の溶液を、温度を−７５〜７０℃に維持しながら一滴ずつ添加した。混合物を−７０℃で３０分撹拌し、次いで−２０℃に加熱した。ジクロロメタン（１０５ｍｌ）中のペンタフルオロフェノール（１４．６ｇ、７９．４ｍｍｏｌ）の溶液を−２０〜１０℃で添加し、次いでジクロロメタン（８ｍｌ）中のトリエチルアミン（８．１ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）の溶液を一滴ずつ添加し、混合物をそのまま室温で一晩撹拌した。混合物を真空中で蒸発させ、酢酸エチル（５００ｍｌ）および水（５００ｍｌ）を添加し、有機層を分離し、５％ＮａＨＣＯ３溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で蒸発させた。ヘキサンおよび酢酸エチルの混合物（２００ｍｌ、６：１）を残留物に添加し、混合物をそのまま一晩撹拌させた。得られた残留物をろ過して分離し、６：１のヘキサン／酢酸エチル混合物（５０ｍｌ）で洗浄し、風乾させ、１６．７ｇのシクロブチル（Ｓ）−２−（（ペルフルオロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（２）を得た。
【００７７】
得られた生成物（２）をヘキサン／酢酸エチル（４：１）混合物（５００ｍｌ）から再結晶させて、１３．８ｇ（３７％）のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−（ペルフルオロフェノキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（２．１）を白色のばらばらの粉末として得た。1H NMR (300MHz, DMSO-d6)δ 7.42 (m, 2H), 7.24 (m, 3H), 6.87 (dd, J1=14.1 Hz, J2=10.2 Hz, 1H), 4.87 (p, J=7.5 Hz, 1H), 3.94 (m, 1H), 2.23 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.71 (m, 1H), 1.58 (m, 1H), 1.27 (d, J=7.2 Hz, 3H)。式２．１の化合物の再結晶中にヘキサン／酢酸エチルの混合物（６：１）で洗浄した後に残った全溶液を真空中で蒸発させ、ヘキサンから３回再結晶させて、シクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（ペルフルオロフェノキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（２．２）を白色のばらばらの粉末として得た。1H NMR(300MHz, DMSO-d6)δ7.42 (m, 2H), 7.26 (m, 3H), 6.85 (dd, J1=13.8 Hz, J2=10.2 Hz, 1H), 4.88 (p, J=7.5 Hz, 1H), 3.95 (m, 1H), 2.24 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 1.72 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.28 (d, J=6.9 Hz, 3H)。
【００７８】
ＴＨＦ（１６５ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−３−イル炭酸塩（７：５ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（３１．３ｍｌ、３１．３ｍｍｏｌ）中のｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロリドの１Ｍ溶液を、アルゴン下、０℃で添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の式２．１の化合物の溶液（７．８ｇ、１６／７ｍｍｏｌ）を、シリンジを使用して０〜５℃で添加し、混合物をアルゴン下で２４時間撹拌した。メタノール（１０ｍｌ）の添加のとき、混合物を真空中で蒸発させた。残留物を５００ｍｌの酢酸エチル中に溶解させ、クエン酸の５％溶液、ＮａＨＣＯ３の５％溶液で洗浄した、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で蒸発させた。残留物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（１：２）を使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーにかけて、５．８９ｇ（６６％）のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（８．１）を無色の凝固した発泡体のような外観で得た。LC-MS (ESI) 642 (M+H)+。
【００７９】
同様に、シクロブチル（Ｓ）−２−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（８）を、中間体７および２から開始して調製し（収量：５２%、LC-MS (ESI) 642 (M+H)+）、シクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（８．２）を、中間体７および２．２から開始して調製した（収量：５９％、LC-MS (ESI) 642 (M+H)+）。
【００８０】
ジクロロメタン（６０ｍｌ）中の式８．１の化合物（４．４５ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（６０ｍｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、真空中で蒸発させ、２５０ｍｌのＤＣＭ中に溶解させ、３００ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で蒸発させ、酢酸エチルおよびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１：１）の混合物から再結晶させ、２．７ｇ（７１％）のシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（１．１）を白色の結晶質として得た。LC-MS (ESI) 542 (M+H)+。1H NMR (400MHz, DMSO-d6 )δ 11.51 (brs, 1H), 7.56 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7.19 (m, 1H), 6.03 (m, 2H), 5.84 (d, J=6.8 Hz, 1H), 5.55 (dd, J1=8.0 Hz, J2=1.2 Hz, 1H), 4.85 (p, J=7.2 Hz, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.83 (m, 2H), 2.23 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.71 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.25 (d, J=22.8 Hz, 3H), 1.23 (d, J=6.8 Hz, 3H)。
【００８１】
様々な溶媒からの式１．１のプロドラッグの再結晶により、多結晶または結晶形態が生じる。したがって、酢酸エチルとメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルとの混合物（１：１）、エタノール、酢酸エチル、および酢酸と水との混合物からの再結晶により、ａ＝２８．１０５６（８）Ａ、ｂ＝１６．８９９８（４）Ａ、およびｃ＝５．２５３８０（１２）Ａの単位格子パラメーターを有する斜方晶相、ならびにａ＝１６．２７７０（６）Ａ、ｂ＝１６．９１１７（８）Ａ、ｃ＝５．２０４２９（１５）Ａ、およびβ＝１１７．８２２（２）°の単位格子パラメーターを有する単斜晶相を本質的に含む多結晶形態のプロドラッグ１．１を得た。
【００８２】
ジメチルスルホキシドと水との混合物からの式１．１のプロドラッグの再結晶により、ａ＝２８．１０５６（８）Ａ、ｂ＝１６．８９９８（４）Ａ、およびｃ＝５．２５３８０（１２）Ａの単位格子パラメーターを有する斜方晶相からなる白色の結晶質を得た。
【００８３】
結晶形態および多結晶形態は、ｐＨ２およびｐＨ７で、０．１８から０．２５ｍｇ／ｍｌに変化させた様々な溶媒からの再結晶の後に、類似の溶解性値を有する。例外は、ジメチルスルホキシドからの再結晶から得られた多結晶のサンプルであり、その溶解性は、よりわずかに高く、０．６３からの０．６７ｍｇ／ｍｌに変化している（表１）。
【００８４】
【表１】
0006948401.tif 000018
【００８５】
同様に、シクロブチル（Ｓ）−２−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（１）（収量：５８％；LC-MS (ESI) 542 (M+H)+、およびシクロブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（１．２）（収量：６４％；LC-MS (ESI) 542 (M+H)+。1H NMR (300MHz, DMSO-d6)δ 11.53 (brs, 1H), 7.56 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.19 (m, 3H), 6.08 (m, 2H), 5.91 (d, J=6.3 Hz, 1H), 5.57 (d, J=8.1 Hz, 1H), 4.85 (p, J=7.5 Hz, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.79 (m, 2H), 2.23 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.70 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.24 (d, J=23.4 Hz, 3H), 1.21 (d, J=6.0 Hz, 3H)を調製した。
【００８６】
実施例２．式Ａ２のシクロプロピル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエートのプロドラッグのための合成プロトコール（スキーム２）。
【００８７】
【化１７】
0006948401.tif 000019
【００８８】
シクロプロピルアミン（９：４．０６ｍｌ、５８．８ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−Ｌ−アラニン（２２．２ｇ、５８．８ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのクロロホルム中に溶解させ、亜硝酸イソアミル（７．９ｍｌ、５８．８ｍｍｏｌ）を氷で冷却しながら添加した。混合物を冷却しながら１６時間撹拌し、乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルでのクロマトグラフィー（１：８の酢酸エチル：ヘキサンで溶出）にかけて、７．６８ｇ（５７％）の式１０のシクロプロピルエステルと式１１のアリルエーテルとの比率１：４の混合物（１Ｈ  ＮＭＲデータに基づく）を得た。得られたエステル１０とエーテル１１との混合物を、１２０ｍｌのアセトニトリル中に溶解させ、その後すぐにトリフェニルホスフィン（４４６ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（９８４ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で添加した。溶液を氷で冷却し、アセトニトリル（３０ｍｌ）中のピロリジン（２．４９ｇ、３５ｍｍｏｌ）の溶液で希釈した。アルゴン下で混合物を０〜４℃で１６時間撹拌し、乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルでのクロマトグラフィー（１：８の酢酸エチル：ヘキサンで溶出）にかけて、１．３８ｇの（Ｓ）−シクロプロピル２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノエート（１５）を得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ 5.04 (br.s., 1H), 4.26 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 1.46 (с, 9H), 1.37 (d, J=7.2 Hz, 3H), 0.74 (m, 4H)。
【００８９】
１０ｍｌのジオキサン中の式１２の化合物（３．５ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）の溶液に、２０ｍｌのジオキサン中の３ＭのＨＣｌ溶液を添加した。混合物を室温で２時間撹拌し、乾燥するまで蒸発させて、２．５３ｇの（Ｓ）−シクロプロピル２−アミノ−プロパノエート塩酸塩（１３）を得た。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ 8,65 (br.s., 3H), 4,19 (m, 1H), 3,99 (к, J=6.9 Hz, 1H), 1.39 (d, J=6.9 Hz, 3H), 0.73 (m, 4H)。
【００９０】
−７０℃に冷却した５０ｍｌのジクロロメタン中の式１３の化合物（（２．５３ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸フェニル（３．２３ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）の溶液に、１０ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（４．２６ｍｌ、３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を一滴ずつ添加した。次いで反応混合物の温度を−１０℃に上昇させ、事前に調製した１５ｍｌのジクロロメタン中のペンタフルオロフェノール（２．８２ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．１３ｍｌ、１５．３ｍｍｏｌ）の混合物を一滴ずつ添加した。添加が完了したら、反応混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで蒸発させ、残留物を、５０ｍｌのベンゼンで処理した。残留物をろ過して分離し、１５ｍｌのベンゼンで洗浄した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。１：４の酢酸エチル：ヘキサンの混合物を物質１ｇ当たり８ｍｌの速度で残留物に添加し、得られた混合物を１６時間力強く撹拌した。残留物をろ過して分離し、１：４の酢酸エチル：ヘキサンの混合物から再結晶させ、１．０２ｇ（１４％）の（Ｓ）−シクロプロピル２−（（Ｓ）−（ペルフルオロフェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（１４）を得た。LC-MS (ESI) 452 (M+H)+。1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ 7.38 (m, 2H), 7.26 (m, 3H), 4.7 (m, 1H), 3.96 (m, 1H), 1.46 (d, J=7.2 Hz, 3H), 0.74 (m, 4H)。
【００９１】
２５ｍｌの氷で冷却した乾燥ＴＨＦ中のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−３−イル炭酸塩（８２０ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（４ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）中のｔ−ＢｕＭｇＣｌの１Ｍ溶液を一滴ずつ添加した。冷却を終わらせ、反応混合物を室温で０．５時間撹拌し、次いで氷で再度冷却し、ＴＨＦ中の式１４の化合物（１．０２ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の溶液を一滴ずつ添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで飽和塩化アンモニウム溶液で処理した。有機相を分離し、水相をジクロロメタンで抽出した。合わせた抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過して、約１．１６ｇの（Ｓ）−シクロプロピル２−（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（１５）を得て、これを次の段階にそのまま使用した。LC-MS (ESI) 628 (M+H)+。
【００９２】
２０ｍｌのジクロロメタン中の式１５の化合物（約１．１６ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（２０ｍｌ）を氷で冷却しながら添加した。反応混合物を３時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。残留物をジクロロメタン中に溶解させ、水で希釈し、炭酸水素ナトリウムで中和した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。残留物をシリカゲルでのクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）にかけ、酢酸エチル：ＭＴＢＥの混合物から再結晶させ、５０５ｍｇの式Ａ２の（Ｓ）−シクロプロピル２−（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−ヒドロキシ−４−メチル−４−フルオロ−テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）プロパノエート（５２％）を得た。LC-MS (ESI) 528 (M+H)+。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ 11.24 (b.s., 1H), 7.56 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.20 (m, 3H), 6.05 (m, 2H), 5.86 (m, 1H), 5.54 (d, J=8.1 Hz, 1H), 4.36 (m, 1H), 4.23 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 1.25 (d, J=22.2 Hz, 3H), 1.21 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.66 (m, 2H), 0.57 (m, 2H)。
【００９３】
実施例３．錠剤の形態の医薬組成物の調製
デンプン（５００ｍｇ）、すりつぶしたラクトース（８００ｍｇ）、タルク（２００ｍｇ）、および１５００ｍｇの式１．１のプロドラッグを一緒に混合し、棒状にプレスした。得られた棒状物を顆粒状に粉砕し、篩にかけて、１４〜１６メッシュの顆粒を収集した。このようにして得られた顆粒を、好適な形態を有するそれぞれ重さ４００または８００ｍｇの錠剤に成形した。
【００９４】
実施例４．カプセルの形態の医薬組成物の調製
式１．１のプロドラッグをラクトース粉末と１：１の比率で慎重に混合した。得られた粉末状の混合物を、好適なサイズを有するゼラチンカプセルに、各カプセル中に２００または４００ｍｇのいずれかで充填した。
【００９５】
実施例５．筋肉内、腹膜内、または皮下注射のための組成物の形態の医薬組成物の調製
式１．１のプロドラッグ（５００ｍｇ）を、クロロブタノール（３００ｍｌ）、プロピレングリコール（２ｍｌ）、および注射可能な水と混合した。得られた溶液をろ過し、５ｍｌアンプルに入れ、シールした。
【００９６】
実施例６．式１．１およびＡ２のプロドラッグならびにソバルディ（登録商標）に関する抗ＨＣＶ活性および細胞傷害性の評価
プロドラッグを含む試験された組成物の抗ウイルス活性を、ＨＣＶレプリコンで安定してトランスフェクトされたＨｕｈ７ヒト肝細胞癌細胞株を使用して評価した。完全培養培地（１×ＤＭＥＭ、セルグロ（Cellgro）；カタログ番号１０−０１３−ＣＶ）中の細胞懸濁液を、細胞７５００個／ウェルの最終密度で９６−ウェルプレート（５０μｌ／ウェル）に移した。試験したプロドラッグの連続希釈液を、完全培地中の２０ｎＭから開始して１１の濃度点と３倍の増加量での新しい２００倍の汎用のＤＭＳＯ溶液から調製し、２連で使用した。細胞をプレーティングしてから最短で４時間後、５０μｌのプロドラッグ連続希釈液を、各ウェルに添加した。最終的なプロドラッグ濃度は、１０ｎＭから０．１ｐＭまで変動し、ＤＭＳＯの濃度は０．５％であった。細胞を含むプレートを、加湿した５％ＣＯ２下で、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション完了後、プレートをさかさまにして培地を除去し、それを慎重に振盪した。１００μｌの１：１のアセトン：メタノール溶液を用いて１分間にわたり細胞を固定し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（１５０μｌ／ウェル）を使用して室温で１時間ブロックした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、アフィニティーバイオリージェント（Affinity BioReagents）（カタログ番号ＭＡ１−０８０）を使用して、抗ＮＳ５Ｂ  ＨＣＶ抗体（１００μｌ／ウェル）と共に３７℃で２時間インキュベートし、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳで全溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１：４０００の比率で希釈した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、各プレートにつきクエン酸／リン酸緩衝液（１２ｍｌ）中に溶解させた１つのＯＰＤタブレットを使用してＯＰＤ溶液（１００μｌ／ウェル）により展開し、そこに、暗所で、室温で３０分間、５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を添加した。２ＮのＨ２ＳＯ４（１００μｌ／ウェル）によって反応を止め、多機能リーダーＶｉｃｔｏｒ３Ｖ１４２０（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を使用してＯＤ４９０を測定した。試験したプロドラッグのＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを使用してプロットした活性曲線から測定した。新規の式１．１のプロドラッグは、１ｂ（ｇＴ１ｂ）ＨＣＶ遺伝子型に対して、ＥＣ５０＝１５．０〜２７．０ｎＭおよびＥＣ９０＝１２８．０ｎＭを有し；ソバルディ（登録商標）は、ＥＣ５０＝４５〜１７０ｎＭおよびＥＣ９０＝５９０ｎＭを有し；式Ａ１のシクロヘキシルエステルは、ＥＣ９０＝２５０．０ｎＭを有し；式Ａ２のシクロプロピルエステルは、ＥＣ９０＝７３．０ｎＭおよびＥＣ９０＝４１０．０ｎＭ（表１а）を有する。結果として、新規の式１．１のプロドラッグの活性は、ソバルディ（登録商標）の活性の３倍より高く、式Ａ１の化合物の活性の２倍であり、式Ａ２の化合物の活性より３倍高い。
【００９７】
【表１ａ】
0006948401.tif 000020
【００９８】
試験したプロドラッグを含む組成物の細胞傷害性を、同じ細胞株Ｈｕｈ７で、ＡＴＰＬｉｔｅキット（パーキンエルマー、米国ボストン）を製造元の説明書に従って使用して、同時に評価した。完全培養培地（１×ＤＭＥＭ、セルグロ）；カタログ番号１０−０１３−ＣＶ）中の細胞懸濁液を、細胞７５００個／ウェルの最終密度で、黒色の壁と透明な底を有する９６−ウェルプレートに移した（５０μｌ／ウェル）。細胞をプレーティングしてから１８時間後、薬物連続希釈液（５０μｌ／ウェル）を添加した。細胞を含むプレートを、加湿した５％ＣＯ２雰囲気中で、３７℃で４日インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄し、溶解緩衝液（５０μｌ／ウェル）を添加することによって溶解させた。全ての試薬をＡＴＰＬｉｔｅキットから採用した。振盪機で５分撹拌した後、基質を添加した（５０μｌ／ウェル）。追加の５分のインキュベーション後、プレートを暗所で１０分間維持し、多機能リーダーＶｉｃｔｏｒ３Ｖ１４２０（パーキンエルマー）を使用してウェル中の発光を測定した。試験したプロドラッグのＣＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを使用してプロットした細胞傷害性曲線から測定した。特定には、新規の式１．１のプロドラッグに関して、細胞傷害性はＣＣ５０＞１００μＭ（表１ａ）であり、治療域（治療指数ＴＩ＝ＥＣ５０／ＣＣ５０）は、ＴＩ＞６０００．０であることが見出された。
【００９９】
実施例７．化合物の動態学的溶解性の評価。
方法の原理。試験した化合物をＤＭＳＯ中に溶解させて、１０ｍＭ濃度にし、次いで水性溶媒（リン酸緩衝液、水、または異なるｐＨ値の万能緩衝液）中に注ぎ、濃度を２００μＭに下げた。得られた溶液を９６−ウェルフィルタープレート（ミリポア（Millipore）のマルチスクリーン溶解性フィルタープレート（MultiScreen Solubility Filter Plate））に入れ、振盪機で、室温で１時間インキュベートし、残留物を真空中でろ過して分離した。分光光度計で、化合物の吸収スペクトルを、２４０〜４００ｎｍの範囲で、１０ｎｍの増加量で記録した。溶解性の定量的な推測のために、４０％アセトニトリルを含む標準溶液（０〜２００μＭ）の検量線を使用した。推測された濃度の範囲は３〜２００μＭであった。試験手順を２連で実行した。
【０１００】
較正標準の調製。較正標準を、４０％アセトニトリルを含む緩衝液で希釈したＤＭＳＯ中の５０倍ストック溶液から調製し、これを添加して、較正サンプル中の試験した化合物の十分な溶解を確認した。０、３．１２５、１２．５、５０、１００、および２００μＭの濃度を有する６つの標準サンプルを、ＵＶ９６−ウェルプレートのウェル中で、４μｌの対応するＤＭＳＯ中の５０×ストック溶液を１９６μｌの４０％アセトニトリルを含む緩衝液に添加することによって調製した。全てのポイントにおけるＤＭＳＯの濃度は一定であり、２％（ｖ／ｖ）に等しかった。
【０１０１】
検量線をプロットするために、ＵＶプレートの光学スペクトルを、２５０〜４００ｎｍの波長範囲で、１０ｎｍの増加量で記録した。各化合物のスペクトルデータに基づいて、以下の基準を満たす波長を選択した：
−最小化合物濃度について、ＯＤ＞０．１（ＡＵ）；
−最大化合物濃度について、ＯＤ＜２．０。
【０１０２】
各化合物につき、選択された波長におけるＯＤで検量線を濃度の関数としてプロットした。
化合物の動態学的溶解性の評価。溶解性を、マルチスクリーン溶解性（ミリポア社）フィルタープレートで以下のように評価した：
・マルチスクリーン溶解性フィルタープレートの各ウェルに、１９６μｌの緩衝液（アセトニトリル非含有）および４μｌのＤＭＳＯ中の１０ｍＭ化合物または４μｌのＤＭＳＯ（ブランクマトリックスのため）を添加した。振盪機（４００ｒｐｍ）でプレートを室温で１時間インキュベートした。
【０１０３】
・得られた溶液を、真空（１０インチＨｇ）を用いてフィルタープレートでろ過して、Ｕ型の底を有するポリプロピレンプレートに分離した。
・Ｕ型の底を有するプレートから、ろ液（１２０μｌ／ウェル）を新しいＵＶプレートに移し、そこにアセトニトリル（８０μｌ／ウェル）を添加した。
【０１０４】
・各化合物につき、得られた溶液の予め選択された波長に対する光学密度を測定した。
計算。ろ液中の最終的な化合物濃度を以下の通りコンピューターで計算した：
Ｃｆｉｌｔｒａｔｅ＝（ろ液のＯＤλ−ブランクのＯＤλ）／傾き×１．６７。
【０１０５】
式中、
ろ液のＯＤλは、選択された波長でのろ液の光学密度であり；
ブランクのＯＤλは、ブランクマトリックスのＯＤであり；
傾きは、検量線の勾配であり；
１．６７は、アセトニトリルで希釈したろ液の希釈係数である。
【０１０６】
この発見は、表１に示される。
実施例８．プロドラッグサンプルのＸ線粉末相分析
全ての回折パターンを、ピーカブー式の設定で、銅陽極Ｘ線チューブ、およびＧｅ（１１１）モノクロメーター（ＣｕＫｏ＾）、およびＬｙｎｘＥｙｅ位置検出型検出器を備えた、ブルカーのＤ８アドバンス・バリオ（Advance Vario）回折計で記録した。ショット範囲は、サンプル５では３〜９０°２６であり、他のサンプルでは５．７〜９０°２６であり、増加量は０．０１°２６であった。ブルカーのＴｏｐａｓ５ソフトウェア［ブルカーＴＯＰＡＳ５使用者マニュアル−カールスルーエ、ドイツ：ブルカーＡＸＳ社（Bruker AXS GmbH）、2015］を使用して分析を行った。
【０１０７】
酢酸エチルとメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルとの混合物（１：１）、エタノール、酢酸エチル、および酢酸と水との混合物からの式１．１の化合物の再結晶により得られたサンプルは、多結晶形態を有していた。これらのサンプルのＸ線粉末相分析から、それらの定性的な相構造の類似性およびそれらの相関係における有意ではない差が解明された。サンプルは、以下の単位格子パラメーター：ａ＝２８．１０５６（８）Ａ、ｂ＝１６．８９９８（４）Ａ、およびｃ＝５．２５３８０（１２）Ａを有する斜方晶相を含んでいた。系統的な消滅分析から、Ｐ２１２１２１の空間群を仮定することが可能である。２４９５．４５（１１）Ａ３の単位格子体積は、特許請求された組成物およびＺ’＝１に対応する。またサンプルは、以下の単位格子パラメーター：ａ＝１６．２７７０（６）Ａ、ｂ＝１６．９１１７（８）Ａ、ｃ＝５．２０４２９（１５）Ａ、β＝１１７．８２２（２）°を有する単斜晶相も含む。系統的な消滅分析から、Ｐ２１の空間群を仮定することが可能である。１２６６．９８（９）Ａ３の単位格子体積は、特許請求された組成物およびＺ’＝１に対応する。積分ピーク強度の比較に基づく相関係の評価は、単斜晶相の含量が３０から５０％に変動していることを示唆する。
【０１０８】
ジメチルスルホキシドと水との混合物からの式１．１の化合物の再結晶により得られたサンプルは、結晶形態の白色物質である。Ｘ線粉末分析データによれば、前記形態のサンプルは、単一相であり、以下の単位格子パラメーター：ａ＝２８．１０５６（８）Ａ、ｂ＝１６．８９９８（４）Ａ、ｃ＝５．２５３８０（１２）Ａを有する斜方晶相からなる。系統的な消滅分析から、Ｐ２１２１２１の空間群を仮定することが可能である。２４９５．４５（１１）Ａ３の単位格子体積は、特許請求された組成物およびＺ’＝１に対応する。
【０１０９】
実施例９．式１．１のプロドラッグを含む組成物の生物学的なマトリックスにおける安定性の評価
式１．１のプロドラッグ（試験した化合物）を含む最初の組成物を、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの濃度で調製した。前記組成物から、１００倍の使用溶液を、１：１の体積比のアセトニトリル：水の混合物中１００μＭの濃度で調製した。
【０１１０】
ａ）Ｓ９画分における安定性。反応混合物を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４、BD Gentest）で２５０μｌの合計最終容量で調製し、１ｍＭのＮＡＤＰＨ四ナトリウム塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、７ｍＭのグルコース−６−リン酸ナトリウム塩（シグマ）、１．５Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ）、３．３ｍＭのＭｇＣｌ２（シグマ）、５ｍＭのウリジン−５−二リン酸塩−グルクロン酸三ナトリウム塩（ＵＤＰＧｌｕＡ、シグマ）、および１μＭの試験した化合物（これらは最終濃度である）を入れた。ヒト肝臓Ｓ９画分（BD Gentest）の懸濁液を添加することによって代謝反応を開始させたところ、タンパク質の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。Ｖｏｒｔｅｍｐ５６振盪機において４００ｒｐｍで撹拌しながら、反応混合物を３７℃でインキュベートした。特定のインターバル（０、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４時間）の後、３０μｌのサンプルを採取し、採取したサンプルに内部標準を含む冷たいアセトニトリル（１８０μｌ）を添加することによって反応を止めた。タンパク質を氷上に１５分置いた。次いでサンプルを３０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、分析のために上清（１５０μｌ）をサンプリングした。インキュベーションを２連で実行し、各サンプルを２回測定した。
【０１１１】
ｂ）人工胃および腸液中での安定性。最終濃度１μＭの式１．１のプロドラッグを含む試験した組成物を、人工胃液（０．７％ｖ／ｖのＨＣｌ中０．２％ＮａＣｌ）および人工腸液（０．０５ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．７５）中でインキュベートした。Ｖｏｒｔｅｍｐ５６振盪インキュベーター中、３７℃で、３００回転／分の速度で撹拌しながらインキュベーションを実行した。特定のインターバル（０、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４時間）の後、３０μｌのサンプルを採取し、採取したサンプルに内部標準を含む冷たいアセトニトリル（１８０μｌ）を添加することによって反応を止めた。次いでサンプルを３０００回転／分で１０分遠心分離し、分析のために上清（１５０μｌ）をサンプリングした。インキュベーションを２連で実行し、各サンプルを２回測定した。
【０１１２】
ｃ）血漿中の安定性。１μＭの最終濃度の試験した化合物をプールしたヒト血漿中でインキュベートした（イノベーティブリサーチ（Innovative Research））。Ｖｏｒｔｅｍｐ５６振盪インキュベーター中、３７℃で、３００回転／分の速度で撹拌しながらインキュベーションを実行した。特定のインターバル（０、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４時間）の後、３０μｌのサンプルを採取し、採取したサンプルに内部標準を含む冷たいアセトニトリル（１８０μｌ）を添加することによって反応を止めた。次いでサンプルを３０００回転／分で１０分遠心分離し、分析のために上清（１５０μｌ）をサンプリングした。インキュベーションを２連で実行し、各サンプルを２回測定した。
【０１１３】
サンプル分析。試験したプロドラッグそれぞれにつき開発したＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術を使用してサンプルを分析した。ここでクロマトグラフシステム１２９０インフィニティＩＩ（Infinity II）（アジレント・テクノロジーズ（Agilent Technologies））をタンデム質量分析計ＱＴＲＡＰ５５００（AB Sciex）と組み合わせた。質量分光分析検出のための条件を開発するとき、アセトニトリル−水の混合物（１：１）中の試験した化合物の溶液を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、シリンジポンプを使用して質量分析計に直接注入し、エレクトロスプレーイオン化をポジティブイオンモードで行った。総イオン電流モード（ＭＳ１）でのスキャニングは、各化合物につき分子状のイオンの同定を可能にし、ベースの生成物イオンをＭＳ２モードで記録した。次いで、最大感度を達成するために、ＭＳ／ＭＳ技術をＭＲＭモードで最適化した。定量的なクロマトグラム処理において、最も強いＭＲＭ移動を分析物および内部標準に使用した。水中０．１％ギ酸およびアセトニトリル中０．１％ギ酸からなる移動相中におけるＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８カラム（５０×２ｍｍ、１．９μｍ）での直線状勾配溶出クロマトグラフィーを用いて分離を行った。内部標準としてトルブタミド（フルカ（Fluka））を使用した。
【０１１４】
コンピューターによる計算。生物学的なマトリックス中でインキュベートする間の、抗ウイルス性組成物における試験したプロドラッグの消滅の速度論から、半減期（Ｔ１／２）を見出した。コンピューターによる計算は、内部標準シグナルに正規化した、試験サンプル中の化合物ごとのクロマトグラフピーク面積の値に基づいてなされた。ｌｏｇで正規化したクロマトグラフピーク面積の時間に対する直線的な依存関係から、消滅速度定数を計算した（ｋは、直線部分の傾きである）。次いで半減期が、Ｔ１／２＝０．６９３／ｋであることを見出した。式１．１のプロドラッグ、式Ａ１の化合物、およびソバルディ（登録商標）は、ヒト胃液中（Ｔ１／２ＳＧＦ＝１２．７〜１７時間）、ヒト腸液中（Ｔ１／２ＳＩＦ＞２０時間）、およびヒト血漿中（Ｔ１／２ＨＰＬ＞２４時間）で同等の安定性を有していたことが具体的に発見された（表２）。同時に、式１．１のプロドラッグは、より高活発でヒト肝臓ミクロソームＳ９画分によって代謝され、Ｔ１／２ＨＳ９＝０．０５時間の半減期を有するが、そのプロトタイプであるソバルディ（登録商標）は、Ｔ１／２ＨＳ９＝０．５７時間を有し、式Ａ１のシクロヘキシルエステルは、Ｔ１／２ＨＳ９＝１．４時間を有し（表２）、これは、式１．１のプロドラッグが、ソバルディ（登録商標）より１１倍速く、式Ａ１の化合物より２８倍速くヒト肝臓ミクロソームＳ９画分で代謝されることを意味する。
【０１１５】
【表２】
0006948401.tif 000021
【０１１６】
実施例１０．ラット肝臓における式１．１のプロドラッグおよびソバルディ（登録商標）を含む組成物の薬物動態（ＰＫ）研究
ラットへの投与のための式１．１のプロドラッグおよびソバルディ（登録商標）を含む組成物の調製
試験した組成物を５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。この目的を達成するために、組成物を、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の０．５％溶液中、式１．１のプロドラッグまたはソバルディ（登録商標）を５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製して、そこに以下のようにして５％エタノールを添加した。式１．１のプロドラッグまたはソバルディ（登録商標）の重さを量った部分に、適切な量のＨＰＭＣを添加し、混合物を乳鉢で乾式粉砕し、その後、適量の蒸留水中５％エタノールを一部ずつ徐々に添加し、混合物を慎重に撹拌して、胃内投与に好適な懸濁液を得た。
【０１１７】
式１．１のプロドラッグおよびソバルディ（登録商標）を含む組成物の動物への投与。血漿および肝臓サンプルの調製。スプラギー・ダーレー（Sprague Dawley）ラットで研究を行った。ラットを、選択されたタイムポイント（１、２、４、６、８、１０、１２、１６、および２４時間）に基づき６つのグループに分割した。ラットの体重を量り、所定体積の式１．１のプロドラッグまたはソバルディ（登録商標）を含む組成物を、フィーディングチューブを介して胃内投与した。特定のグループの動物への投与間のインターバル中に、肝臓および血液のサンプルを採取した。投与してから適切な期間がたった後、ラットをＣＯ２吸入によって安楽死させた。安楽死の直後、動物を迅速に切開し、その肝臓の上葉を切り取り、瞬間的に液体窒素中に入れた。次いで凍結した肝臓断片を、液体窒素で冷却したラベルを付けた試験管に移した。実験の最後までサンプルを液体窒素中で維持し、次いで−８０℃の超低温冷凍庫に入れた。
【０１１８】
サンプルの調製。重さ約１ｇの肝臓サンプルを、液体窒素で冷却しながら乳鉢で粉砕した。得られた粉末に、３倍体積のメタノールおよびＥＤＴＡを含む７０％メタノールを注ぎ、オムニビーズラプター２４（Omni Bead Ruptor）ホモジナイザーを使用して、６．３ｍ／秒の速度で、４５秒で２回（１０秒のインターバルを入れて）ホモジナイズした。このようにして得られたホモジネート３６０μｌに、ＰＳＩ−７４０９およびＨ０２７−４２６１（または実験サンプルのケースではメタノール）を含む１０倍標準溶液４０μｌおよび内部標準溶液（５−ブロモウリジン三リン酸塩）１００μｌを２５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。撹拌し遠心分離した後、４００μｌの上清を、メタノール−水の混合物（１：１）中１％ギ酸溶液４００μｌで希釈した。次いで、ウォーターズ（Waters）のオアシスワックス（Oasis WAX）カートリッジを使用して固相抽出を実行した。得られた生成物をメタノール中５％のアンモニア溶液８００μｌで溶出させ、溶出液を蒸発させ、メタノール２００μｌ中に再溶解させた。
【０１１９】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析条件。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術を使用してサンプルを分析した。ここでＨＰＬＣシステムであるアジレント１２９０インフィニティＩＩをＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴｒａｐ  ５５００質量分析計と組み合わせた。サーモハイパーカーボ（Thermo Hypercarb）カラム（５０×３ｍｍ、５μｍ）で分離を行った。０．５％アンモニウムを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を、移動相Ａ（ＭＰＡ）として使用し、０．５％アンモニウムを含む水−イソプロパノール−アセトニトリルの混合物（１：１：３）中の２５ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を、移動相Ｂ（ＭＰＢ）として使用した。勾配モード：５％ＭＰＢを０〜０．３分；５０％ＭＰＢを３〜３．４分；５％ＭＰＢを３．６〜４．５分で分離を実行した。ＰＳＩ−７４０９およびＨ０２７−４２６１をＭＲＭモードで記録したところ、イオン移動はそれぞれ４９９／１５９および４１０／１５０であった。
【０１２０】
薬物動態分析。「肝臓濃度−時間」データの薬物動態分析を、非コンパートメント技術によって、フェニックス（Phoenix）（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）６．３（ファーサイト社（Pharsight Corp.））およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを使用して実行した。以下の薬物動態パラメーター：肝臓中の最大濃度（Ｃｍａｘ）およびその達成時間（Ｔｍａｘ）、半減期（Ｔ１／２）、およびＰＫ曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−ｉｎｆ）をコンピューターで計算した。表３に結果を示す。表３からわかるように、ラット肝臓における式１．１のプロドラッグの代謝の結果生じる三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９の濃度およびＡＵＣ２４ｈは、それぞれＣｍａｘ＝３２２４．０ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝３０４８７．０ｎｇ・時間／ｇであるが、類似の代謝を示すソバルディ（登録商標）は、Ｃｍａｘ＝１９３４．０ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝１６７９６．０ｎｇ・時間／ｇを有し、式Ａ１のシクロヘキシルエステルは、Ｃｍａｘ＝５５７ｎｇ／ｇおよびＡＵＣ２４ｈ＝６４８４．０ｎｇ・時間／ｇを有する（表３）。これは、新規の式１．１のプロドラッグは、その望ましい三リン酸塩ＰＳＩ−７４０９（薬物）への肝臓代謝において、ソバルディ（登録商標）と比較してほぼ２倍、式Ａ１のシクロヘキシルエステルと比較して４．７倍、より有効であることを示唆する。
【０１２１】
【表３】
0006948401.tif 000022
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、医薬および獣医学において使用することができる。