(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記抗体-薬物複合体は抗体と前記抗体に結合した薬物とを含み、前記抗体は1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域を含み、
ここで、前記重鎖可変領域は、
CDR1：GFTFSSYE、
CDR2：ISSSGSTI、および
CDR3：AREMQFGWELLGAFDI、
という3つの相補性決定領域を含み、
前記軽鎖可変領域は、
CDR1’： QSVSSSY、
CDR2’： GAS、および
CDR3’： QQYGSS、
という3つの相補性決定領域を含む、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号7で示され、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号8で示され、
前記抗体-薬物複合体はZV0508、ZV0512、ZV0513、ZV0503からなる群から選ばれることを特徴とする抗体-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩。
（ここで、複合体ZV0508の構造は以下の通りである。
【化５２】
0006944526.tif 000041
複合体ZV0512の構造は以下の通りである。
【化５３】
0006944526.tif 000042
複合体ZV0513の構造は以下の通りである。
【化５４】
0006944526.tif 000043
複合体ZV0503の構造は以下の通りである。
【化５５】
0006944526.tif 000044
）
【請求項２】
前記抗体は配列番号9で示される重鎖を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗体-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記抗体は配列番号10で示される軽鎖を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗体-薬
物複合体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
前記抗体-薬物複合体はZV0508からなる群から選ばれること
を特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩。
（ここで、複合体ZV0508の構造は以下の通りである。
【化５２】
0006944526.tif 000045
）
【請求項５】
前記抗体-薬物複合体はZV0512からなる群から選ばれること
を特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩。
（ここで、複合体ZV0512の構造は以下の通りである。
【化５３】
0006944526.tif 000046
）
【請求項６】
前記抗体-薬物複合体はZV0513からなる群から選ばれること
を特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩。
（ここで、複合体ZV0513の構造は以下の通りである。
【化５４】
0006944526.tif 000047
）
【請求項７】
請求項1に記載の抗体-薬物複合体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする薬物組成物。 
【請求項８】
抗腫瘍の薬物の製造における、請求項1に記載の抗体-薬物複合体の使用。
【請求項９】
前記腫瘍は5T4陽性腫瘍で、好ましくは乳癌、胃癌、卵巣癌、肺癌などを含むことを特徴とする請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
請求項1に記載の抗体-薬物複合体を製造する方法であって、
前記抗体および遊離のリンカーを含む薬物分子を含む反応系を調製した後、結合反応を行うことによって、前記抗体-薬物複合体を得、
ここで、前記薬物分子はリンカーである工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に関し、具体的に、抗5T4抗体-薬物複合体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト5T4癌胎児性抗原は、TPBG遺伝子（栄養膜糖タンパク質遺伝子）によってコードされる、分子量が約72kDaの高度にグルコシル化された、膜貫通糖タンパク質である。5T4は、最初に胚の発育に発見され、胎盤栄養膜細胞で高度発現され、正常組織に基本的に存在せず、一部の特殊な上皮、たとえば基底層の重層扁平上皮、腺体および導管上皮、ならびに網膜二次ニューロンおよび嗅球に存在する。その後、卵巣癌、結腸・直腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌を含む、多くの癌の種類に5T4の発現が相次いで発見され、そして5T4の腫瘍における過剰発現はすでに疾患の進展に関連づけされ、その発揮しうる作用は腫瘍細胞の間の連結に影響し、細胞の形態、運動および付着力に影響があり、よって遠隔転移が促進されるが、具体的な調節機序はまだ完全に解明されていない。しかし、明らかに、5T4は癌標的治療の非常に魅力のある標的である。ネズミ化またはヒト化モノクローナル抗体を含む、いくつかの抗5T4抗体はすでに記載されている。
【０００３】
5T4はすでに標的治療薬の設計標的として取り上げられ、たとえば、抗5T4抗体のFab断片をスーパー抗原と融合させ、スーパー抗原でT細胞が活性化されて免疫反応が生じる。たとえば、一本鎖抗5T4抗体scFv-Fcをヒト膵臓リボヌクレアーゼと融合させ、ヒト膵臓リボヌクレアーゼによってRNAが分解され、腫瘍細胞は翻訳過程が遮断されて先に死亡する。たとえば、CAR-T療法では、5T4を標的とするキメラ抗原受容体をコードするベクターを患者のT細胞に導入し、修飾さるT細胞は腫瘍細胞における5T4抗原を認識して結合し、よって腫瘍細胞が殺滅され、キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合領域は抗5T4モノクローナルのscFvでもよい。また、組み換え5T4ワクチンも癌を治療する試みもされている。
【０００４】
癌標的治療の発展過程において、もう一つ成功した対策は抗体を媒体とし、毒性小分子を癌細胞に導入した後、解離した小分子で癌細胞を殺滅するものである。現在、アドセトリス（Adcetris）とカドサイラ（Kadcyla）という、2つの抗体薬物複合体（Antibody-drug conjugate、ADC）はすでに癌標的治療に使用されている。5T4を標的とする抗体薬物複合体はすでに記載され、たとえば、huA1-mcMMAF（US2012251558）は従来の抗体のジスルフィド結合を還元させることによってチューブリン阻害剤であるMMAFをヒト化された抗5T4モノクローナル抗体A1に連結した抗体薬物複合体で（一つの抗体分子に2-8個の異なる数のMMAFが連結しており、平均DARは4である）、I期臨床では良い安全性が示された（2015 ASCO）。抗体薬物複合体はすでに腫瘍に対する顕著な治療効果を示し、これに基づき、当業者は新規でより有効な抗体薬物複合体の開発に取り組んでいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新規な抗5T4抗体薬物複合体および治療におけるその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の側面では、抗体薬物複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記抗体薬物複合体は抗体と前記抗体に結合した薬物とを含み、前記抗体は1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域を含み、
ここで、前記重鎖可変領域は、
CDR1：GFTFSSYE、
CDR2：ISSSGSTI、および
CDR3：AREMQFGWELLGAFDI、
という3つの相補性決定領域を含み、
前記軽鎖可変領域は、
CDR1’： QSVSSSY、
CDR2’： GAS、および
CDR3’： QQYGSS、
という3つの相補性決定領域を含むものを提供する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号7で示される。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号8で示される。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列番号9で示される重鎖を含む。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列番号10で示される軽鎖を含む。
もう一つの好適な例において、前記薬物は、デュオスタチン（Duostatin）5、MMAF、デュオスタチン（Duostatin）14、デュオマイシン（Duomycin）2、デュオマイシン（Duomycin）4、カリケアミシン（Calicheamicin）、アマニチン（Amanitine）からなる群から選ばれる小分子薬物を含む。
【０００７】
もう一つの好適な例において、前記薬物はデュオスタチン5である。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記抗体薬物複合体の構造は式Iで表される。
Ab−（L-D）n        I
（ここで、Abは前記抗体である。
Lはなしか、前記抗体と前記薬物を連結するリンカーである。
Dは腫瘍細胞を抑制する小分子薬物である。
nは前記抗体に結合した前記薬物の数である。
「−」は結合またはリンカーである。)
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記抗体-薬物複合体の軽鎖定常領域に少なくとも1つの薬物分子（好ましくは各軽鎖定常領域に1つの薬物分子）が結合し、かつ前記薬物分子が前記軽鎖定常領域のリシン部位に連結している。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記抗体の軽鎖定常領域がEKHモチーフを含み、かつ前記薬物分子が前記モチーフのリシン(K)部位に連結している。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記抗体の軽鎖定常領域がYEKHKモチーフを含み、かつ前記薬物分子が前記モチーフの1番目のリシン(K)部位に連結している。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記抗体の軽鎖定常領域がADYEKHKモチーフを含み、かつ前記薬物分子が前記モチーフの1番目のリシン(K)部位に連結している。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記薬物分子は腫瘍細胞を抑制する小分子薬物である。
【００１４】
もう一つの好適な例において、nは前記抗体-薬物複合体における薬物の平均結合数で、好適に1〜4、好ましくは1.5〜3.5、より好ましくは1.8〜2である。
【００１５】
もう一つの好適な例において、Dは、デュオスタチン5、MMAF、デュオスタチン14、デュオマイシン2、デュオマイシン4、カリケアミシン、アマニチンからなる群から選ばれる。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記抗体-薬物複合体の構造は式IIIで表される。
【化１】
0006944526.tif 000002
（式IIIにおいて、前記L1-L2の構造はL-1、L-2、およびL-3からなる群から選ばれる。
【化２】
0006944526.tif 000003
ここで、L21、L22、L23は独立に-(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-、Val-Cit、Ala-Ala-Asn、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるリンカーである。
Ab、D、nは前記の通りである。
波線は抗体との連結部位を表す。）
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記抗体-薬物複合体は、以下の群から選ばれる。
ZV0508、ZV0512、ZV0513、ZV0501、ZV0503、ZV0504、ZV0517、ZV0518、ZV0505、ZV0516、ZV0515、ZV0519。
ここで、複合体ZV0508の構造は以下の通りである。
【化３】
0006944526.tif 000004
複合体ZV0512の構造は以下の通りである。
【化４】
0006944526.tif 000005
複合体ZV0513の構造は以下の通りである。
【化５】
0006944526.tif 000006
複合体ZV0501の構造は以下の通りである。
【化６】
0006944526.tif 000007
複合体ZV0503の構造は以下の通りである。
【化７】
0006944526.tif 000008
複合体ZV0504の構造は以下の通りである。
【化８】
0006944526.tif 000009
複合体ZV0517の構造は以下の通りである。
【化９】
0006944526.tif 000010
複合体ZV0518の構造は以下の通りである。
【化１０】
0006944526.tif 000011
複合体ZV0505の構造は以下の通りである。
【化１１】
0006944526.tif 000012
複合体ZV0516の構造は以下の通りである。
【化１２】
0006944526.tif 000013
複合体ZV0515の構造は以下の通りである。
【化１３】
0006944526.tif 000014
複合体ZV0519の構造は以下の通りである。
【化１４】
0006944526.tif 000015
【００１８】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗体-薬物複合体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。 
【００１９】
本発明の第三の側面では、抗腫瘍の薬物の製造における、本発明の第一の側面に記載の抗体-薬物複合体の使用を提供する。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は5T4陽性腫瘍で、好ましくは乳癌、胃癌、卵巣癌、肺癌などを含む。
【００２１】
本発明の第四の側面では、腫瘍を治療または予防する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載の抗体-薬物複合体、
または本発明の第二の側面に記載の組成物を施用する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記対象は哺乳動物で、ヒトを含む。
【００２３】
本発明の第五の側面では、本発明の第一に記載の抗体-薬物複合体を製造する方法であって、
抗体および遊離のリンカーを含む薬物分子を含む反応系を調製した後、結合反応を行うことによって、前記抗体-薬物複合体を得、
ここで、前記薬物分子はリンカーである工程を含む方法を提供する。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記反応系のpHは、6.5〜8.0、好ましくは6.8〜7.8、より好ましくは7.0〜7.5、たとえば7.1、7.2、7.3、7.4である。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記薬物分子が前記抗体の軽鎖定常領域のリシン部位に連結している。
【００２６】
もう一つの好適な例において、反応時間は3 h〜16 hである。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記抗体と薬物分子のモル比は、1〜2：3〜20、好ましくは、1：6〜10である。
【００２８】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、抗体薬物複合体ZV0508のHIC-HPLC分析結果を示す。
【図２】図2は、抗体薬物複合体ZV0508の親和性が影響されなかったことを示す。
【図３】図3は、抗体（ZV05）およびADC（ZV0508）が細胞において強い取り込み性を有することを示す。
【図４】図4は、抗体薬物複合体ZV0508が細胞周期がG2/M期に留まるようにさせたことを示す。
【図５】図5は、ADCでマウス体内におけるMDA-MB-468乳癌移植腫瘍（+++）を治療する場合の治療効果を示す。
【図６】図6は、ADCでマウス体内におけるBxPC-3膵臓癌移植腫瘍（++）を治療する場合の治療効果を示す。
【図７】図7は、ADCでマウス体内におけるH1975肺癌移植腫瘍（+++）を治療する場合の治療効果を示す。
【図８】図8は、ADCでマウス体内におけるDU-145前立腺癌移植腫瘍（+++）を治療する場合の治療効果を示す。
【図９】図9はADCでマウス体内におけるPA-1卵巣癌移植腫瘍（+）を治療する場合の治療効果を示す。
【図１０】図10は、ADCでマウス体内におけるLovo結腸癌移植腫瘍（+）を治療する場合の治療効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明者は幅広く深く研究することによって、5T4を標的とする抗体薬物複合体を設計したが、前記抗体-薬物複合体は顕著な抗腫瘍効果を有する。また、本発明は薬物の製造における前記抗5T4抗体-薬物複合体の使用、および腫瘍の抑制または予防におけるその作用を提供する。
【００３１】
本発明の一つの好適な実施形態において、使用されるのは、ヒト化された抗5T4モノクローナル抗体(たとえばZV05抗体)で、当該抗体は5T4抗原および5T4抗原を発現する腫瘍細胞のいずれにおいても高い親和力を表し、かつ5T4抗原を発現する腫瘍細胞において強い取り込み性を有する。また、非ヒトモノクローナル抗体と比べ、免疫原性が低く、HAMA応答が避けられ、治療応答を実現させる高投与量および繰り返し投与の実施が許容される。
【００３２】
本分野の通常の結合技術、たとえばSeaGen連結法によって抗体と小分子薬物を結合させることができる。
【００３３】
好ましくは本発明における方法によって抗体と小分子薬物を結合させ、本発明の方法を使用して簡単な化学的工程および精製工程によって抗体と薬物の所定部位で所定量の結合を実現させることができ、複合体の均一性がより高い。本発明によって提供される一連の抗体薬物複合体のうち、ZV0508はより幅広く、より優れた体内抗腫瘍活性を表す。
【００３４】
本発明は、リンカー（L）部分によって、抗体の定常領域の特定のリシンの部位、またはジスルフィド結合の還元によるシステインに結合させ、さらに疎水性精製（HIC）によって所定部位に所定量で結合した抗体薬物複合体を得る。
【００３５】
抗体（Ab）はジスルフィド結合の還元によるシステインまたは定常領域の1つの活性化リシンによってリンカー（L、L1またはL2を含む）を介して薬物モジュール（D）に結合することによって抗体-薬物複合体：Ab-（L-D）n（ここで、nは1〜4である）を形成する。本発明は、抗体薬物複合体の結合方法および治療における使用を公開する。
【００３６】
本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
【００３７】
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。本明細書で用いられるように、具体的に例示される数値で使用される場合、用語「約」とは当該値が例示される数値から1％以内で変わってもよい。たとえば、本明細書で用いられるように、「約100」という記述は99と101およびその間の全部の値（たとえば、99.1、99.2、99.3、99.4など）を含む。
【００３８】
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
本発明は2種類の結合方法を提供し、毒素小分子を特定のリンカーを介して抗体に結合させ、抗体の親和性を変えずに大幅に腫瘍細胞に対する殺傷力を向上させる。
【００３９】
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約150000ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、2つの同じ軽鎖（L）と2つの同じ重鎖（H）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に1つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、1つの末端に可変領域（VH）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（VL）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
【００４０】
本明細書で用いられるように、用語の「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域 (CDR)または超可変領域と呼ばれる3つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域 (FR) FRと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する3つのCDRで連結され、場合によって部分βシート構造となる4つのFR領域が含まれる。各鎖におけるCDRは、FR領域で密接し、かつ他方の鎖のCDRと一緒に抗体の抗原結合部位(Kabatら、NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669頁(1991)を参照する)を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【００４１】
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、明らかに異なる二種類（κとλと呼ばれる）のいずれかに分類することができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、主として5つのクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、そのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2に分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンの重鎖の定常領域に応じて、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は本分野の技術者熟知である。
【００４２】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変領域に位置する3つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（CDR）と呼ばれ、4つのフレームワーク領域(FR)に分かれ、4つのFRのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのCDRは環状構造を形成し、その中のFRで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるCDRおよび相応の軽鎖におけるCDRが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がFRあるいはCDR領域を構成するか確認することができる。
【００４３】
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【００４４】
本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、基本的に本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをいう。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似体は、（i）1個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、あるいは（ii）1個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、あるいは（iii）成熟のポリペプチドと別の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールのようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、あるいは（iv）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列または蛋白質前駆体配列、あるいは6Hisタグと形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。
【００４５】
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、10個以下、好ましくは8個以下、より好ましくは5個以下、最も好ましくは3個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Aのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【表Ａ】
0006944526.tif 000016
【００４６】
本発明の抗体またはその断片のDNA分子の配列は、通常の技術で、たとえば、PCR増幅  あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
【００４７】
関連の配列を獲得すれば、組換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
【００４８】
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
【００４９】
現在、前記の本発明の抗体（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で得ることがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【００５０】
さらに、本発明は、上記の適当なDNA配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００５１】
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。
たとえば、本発明の抗体は以下の方法によって製造することができる。
【００５２】
まず、本発明の抗体をコードするヌクレチオド配列およびその配列と作用可能に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する。
【００５３】
ここで用いられる用語の「発現調節配列」とは、通常、ヌクレチオド配列の発現を制御する配列のことを指す。発現調節配列は、目的ヌクレチオド配列と作用可能に連結したポロモーターおよび終結シグナルを含む。通常、さらに、ヌクレチオド配列の適当な翻訳に必要な配列を含む。「作用可能に連結した」とは、直鎖状DNA配列のある部分が同直鎖状DNA配列のほかの部分の活性に影響できることをいう。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、コード配列とは作用可能に連結した。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体をコードするDNA配列は、本分野の技術者に熟知の通常の手段で得られる。たとえば、本発明に公開された配列に基づき、人工合成またはPCR法による増幅でそのモノクローナル抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードするヌクレチオド配列を得ることができる。その後、本分野で熟知の各種の方法で、好適な制限酵素切断部位の選択によって、それぞれ発現ベクターが有する重鎖定常領域のコード配列と軽鎖定常領域のコード配列の前に位置し、且つ同一のリーディングフレームにあるように、これらのヌクレチオド配列を好適な発現ベクターに挿入する。本発明で用いられる発現ベクターは、本分野の技術者に既知の各種の市販の発現ベクター、たとえばpPIC9Kである。
【００５５】
そして、上記で得られた発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換する。「宿主細胞」は、一般的に原核細胞と真核細胞とを含む。常用の原核宿主細胞の例として、大腸菌、枯草菌などを含む。常用の真核宿主細胞として、酵母細胞、昆虫細胞や、哺乳動物細胞を含む。本発明において、哺乳動物細胞が好ましい。通常、哺乳動物細胞系が真核細胞由来のポリペプチドを発現する宿主細胞として用いられる。哺乳動物細胞の培養物における増殖は、本分野で熟知である。「組織培養」，Academic Press, Kruse及びPatterson編(1973)を参照し、ここに参考として取り入れる。好ましい哺乳動物細胞は、多くの入手可能な無限増殖性細胞系である。これらの無限増殖性細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Vero細胞、Hela細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝臓癌細胞(たとえばHep G2)やほかの多くの細胞系を含むが、これらに限定されない。これらの細胞は、タンパク質分子に正確な折り畳み、正確なジスルフィド結合の形成および正確な部位のグリコシル化を含む翻訳後の修飾を提供する。下記の実施例において、本発明では、CHO細胞を宿主細胞とする例だけが挙げられたが、当業者は本発明の詳細および具体的な実施例を読めば、本発明に上記のこれらの細胞系も使用できることがわかる。
【００５６】
発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法はたくさんあるが、用いられる形質転換のプロトコールが形質転換しようとする宿主にもよる。異質ポリヌクレチオドを哺乳動物細胞に導入する方法は、本分野で知られているが、デキストランによるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プリブレン(1,5-ジメチル-1,5-ジアザウンデカメチレンポリメトブロミド)によるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポフェクション及びDNAの細胞核への直接のマイクロインジェクションを含む。本発明において、好ましい方法は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法等である。例えば、Invitrogen社のリポフェクション法キットでCHO細胞などの宿主細胞へのトランスフェクションを行うことができる。
【００５７】
その後、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインA-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明の抗体を得る。
【００５８】
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験（たとえば放射免疫測定（RIA）または酵素結合免疫吸着測定（ELISA））で測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えばMunson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析で測定することができる。
【００５９】
本発明の抗体は、細胞内又は細胞膜において発現し、或いは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の分離方法で組換えタンパク質を分離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）及びほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗5T4抗体の重鎖可変領域は、3つの相補性決定領域を含む：
CDR1：GFTFSSYE (配列番号1)、
CDR2：ISSSGSTI (配列番号2)、および
CDR3：AREMQFGWELLGAFDI(配列番号3)。
本発明のもう一つの好適な実施形態において、前記抗5T4抗体の前記軽鎖可変領域は、3つの相補性決定領域を含む：
CDR1’： QSVSSSY (配列番号4)、
CDR2’： GAS (配列番号5)、および
CDR3’： QQYGSS(配列番号6)。
【００６１】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYE MNWVRQAPGKGLEWVSY ISSSGSTI YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC AREMQFGWELLGAFDI WGQGTMVTVSS (配列番号7)。  
【００６２】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSFGQGTKLEIK (配列番号8)。
【００６３】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖は以下の通りである：
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYE MNWVRQAPGKGLEWVSY ISSSGSTI YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC AREMQFGWELLGAFDI WGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  (配列番号9)。
【００６４】
もう一つの好適な例において、前記抗体の軽鎖は以下の通りである：
MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号10)。
【００６５】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、前記抗体-薬物複合体の構造は式IIで表される。
Ab-（L-D）n      II
（ここで、Abは抗体である。
Dは腫瘍細胞を抑制する小分子薬物である。
Lは前記抗体と前記薬物を連結するリンカーである。）
もう一つの好適な例において、nは1〜8で、好ましくは整数である。
もう一つの好適な例において、Dは以下の群から選ばれる。
デュオスタチン（Duostatin）5：
【化１５】
0006944526.tif 000017
MMAF：
【化１６】
0006944526.tif 000018
デュオスタチン（Duostatin）14：
【化１７】
0006944526.tif 000019
デュオマイシン（Duomycin）2：
【化１８】
0006944526.tif 000020
デュオマイシン（Duomycin）4：
【化１９】
0006944526.tif 000021
カリケアミシン（Calicheamicin）γ１：
【化２０】
0006944526.tif 000022
α-アマニチン（Amanitine）：
【化２１】
0006944526.tif 000023
【００６６】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、前記抗体-薬物複合体の構造は式IVで表される（すなわち、LはL1-L2を含む）。
【化２２】
0006944526.tif 000024
（式IVにおいて、前記L1-L2の構造は、からなる群から選ばれる。
【化２３】
0006944526.tif 000025
ここで、L2は-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-、Val-Cit、Ala-Ala-Asn、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるリンカーである。
Ab、D、nは前記の通りである。
波線は抗体との連結部位を表す。）
【００６７】
もう一つの好適な例において、前記抗体-薬物複合体は、以下の群から選ばれる：
ZV0508、ZV0512、ZV0513、ZV0501、ZV0503、ZV0504、ZV0517、ZV0518、ZV0505、ZV0516、ZV0515、ZV0519。
【００６８】
ここで、複合体ZV0508の構造は以下の通りである。
【化２４】
0006944526.tif 000026
複合体ZV0512の構造は以下の通りである。
【化２５】
0006944526.tif 000027
複合体ZV0513の構造は以下の通りである。
【化２６】
0006944526.tif 000028
複合体ZV0501の構造は以下の通りである。
【化２７】
0006944526.tif 000029
複合体ZV0503の構造は以下の通りである。
【化２８】
0006944526.tif 000030
複合体ZV0504の構造は以下の通りである。
【化２９】
0006944526.tif 000031
複合体ZV0517の構造は以下の通りである。
【化３０】
0006944526.tif 000032
複合体ZV0518の構造は以下の通りである。
【化３１】
0006944526.tif 000033
複合体ZV0505の構造は以下の通りである。
【化３２】
0006944526.tif 000034
複合体ZV0516の構造は以下の通りである。
【化３３】
0006944526.tif 000035
複合体ZV0515の構造は以下の通りである。
【化３４】
0006944526.tif 000036
複合体ZV0519の構造は以下の通りである。
【化３５】
0006944526.tif 000037
【００６９】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体-薬物複合体を製造する結合形態は、K-LockとC-Lockの2種類の結合形態がある。K-Lock結合形態では、薬物分子が抗体の配列におけるリシン（K）残基に結合し、C-Lock結合形態では、薬物分子が抗体の配列におけるシステイン残基（C）に結合する。以下、本発明の抗体-薬物複合体の結合方法を概述する。
【００７０】
K-Lock方法：抗体は穏和な溶液系において直接L1-Dと連結してもよい。たとえば、室温で6〜10倍の過剰量のL1-Dを抗体と3〜16 h反応させ、限外ろ過で過剰量の小分子L1-Dを除去する。抗体-薬物複合体を疎水性クロマトグラフィーカラム（HIC）にかけ、精製して結合数が2の抗5T4抗体-薬物複合体を得る。
【００７１】
C-Lock方法：抗体はTCEPで還元させた後、穏和な溶液系において直接L2-Dと連結してもよい。たとえば、抗体を室温で5〜10倍の過剰量のTCEPで還元させ、限外ろ過で過剰量のTCEPを除去する。5〜10倍のL2-Dを還元後の抗体溶液に入れて反応させ、限外ろ過で過剰量の小分子L2-Dを除去する。抗体-薬物複合体を疎水性クロマトグラフィーカラム（HIC）にかけ、精製して結合数が4の抗5T4抗体-薬物複合体を得る。
【００７２】
また、本発明は抗腫瘍薬物の製造における前記抗体-薬物複合体の使用を提供する。
【００７３】
前記抗腫瘍薬物は、有効量の本発明による抗体-薬物複合体と、少なくとも一つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。調製の際、通常、活性成分を賦形剤と混合するか、または賦形剤で希釈するか、またはカプセルかマイクロスフェアに含まれる形態で担体に存在する。賦形剤が希釈剤として作用する場合、固体、半固体または液体の材料を賦形剤、担体または活性成分の媒体として使用してもよい。そのため、組成物は錠剤、丸剤、粉剤、溶液材、シロップ材、滅菌注射溶液などでもよい。
【００７４】
適切な賦形剤は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水などを含み、製剤はさらに湿潤剤、乳化剤、防腐剤（たとえば安息香酸メチルや安息香酸プロピル）、甘味料を含んでもよい。前記抗腫瘍薬物は単一または多重剤形にしてもよく、各剤形は所期の治療効果が生じるように算出した所定量の前記抗5T4抗体-アプリシアトキシン結合体、および適切な薬剤学的賦形剤を含む。
【００７５】
前記抗腫瘍薬物は通常の経路で給与することができ、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、皮内、局部給与などが含まれるが、これらに限られない。
【００７６】
当該薬物を使用する際、安全有効量の前記抗体-薬物複合体をヒトに施用するが、ここで、当該安全有効量の範囲は0.5〜50mg/kg体重が好ましく、1〜10mg/kg体重がより好ましい。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【００７７】
また、本発明の複合体はほかの治療薬と併用してもよく、中には、様々なサイトカイン、たとえばTNF、IFN、IL-2など、様々な腫瘍の化学療法の薬物、たとえば5-FU、メトトレキサートなどの核酸の生物合成に影響する薬物、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミドなどのアルキル化剤系薬物、アドリアマイシン、アクチノマイシンDなどの転写過程を干渉してRNA合成を阻止する薬物、ビンクリスチン、カンプトテシン系などのタンパク質合成に影響する薬物や一部のホルモン系薬物などが含まれるが、これらに限られない。
【００７８】
既存技術と比べ、本発明の有益な効果は以下の通りである。
（1）  本発明の5T4を標的とする抗体薬物複合体は、顕著な抗腫瘍効果を有する。
（2）  本発明の抗体-薬物複合体によれば、5T4抗原および5T4抗原を発現する腫瘍細胞のいずれにおいても高い親和力を表し、かつ5T4抗原を発現する腫瘍細胞において強い取り込み性を有する。
【００７９】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を詳述する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で詳細な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。以下、実施例で使用された実験材料および試薬は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【００８０】
共通の合成工程  カルボキシ基を持つ化合物からその活性エステルを合成する方法（たとえばNHS） 
カルボキシ化合物をジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミドに溶解させ、1.5当量のN-ヒドロキシスクシンイミド、1.5当量のEDCIを入れた。カルボキシ化合物が完全に消耗されるまで、反応液を室温で1時間撹拌した。RP-HPLCで反応過程をモニタリングした。ジクロロメタンで反応液を希釈し、そしてクエン酸（10％溶液）と飽和食塩水で有機相を洗浄した。 有機相を分離して乾燥し、HPLCまたは中圧順相クロマトグラフィーによって精製し、相応する活性エステルを得た。
【００８１】
実施例で使用された対照抗体（ヒト化されたA1抗体）の重鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNFGMNWVRQAPGKGLEWVAWINTNTGEPRYAEEFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWDGAYFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号11) 。
【００８２】
軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYFATNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号12)。
【実施例１】
【００８３】
実施例１  小分子薬物の合成
カリケアミシン小分子の合成経路：
【化３６】
0006944526.tif 000038
(9H-フルオレン-9-イル)メチル(2-クロロ-2-オキソエチル)カルバメート(256 mg, 0.81 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA, 173 μL, 1 mmol)をカリケアミシンγ1(1，880 mg, 0.54 mmol，25 mLのDMFに溶解させたもの)に入れた。当該混合物を2時間撹拌した後、溶液を移し、HPLCによって精製して化合物2(300 mg)を得た。MS m/z 1647.3 (M+H).
化合物8の製造:
化合物2 (100 mg, 0.06 mmol)を4 mLのアセトニトリルと0.3 mLのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解させた後、それに化合物3(75 mg, 0.24 mmol)を入れた。 反応は撹拌しながら16時間続けた後、120 μLのピペリジンを入れた。30分間後、HPLCによって精製して化合物4(60 mg)を得た。MS m/z 1654.4 (M+H)。
化合物4(20 mg, 12 μmol，2 mLのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解させたもの)に化合物5(11 mg, 14 μmol)、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt, 2 mg)および5μLジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を入れた。反応混合物を1時間撹拌した後、40 μLのピペリジンを入れた。10分間後、当該混合物をHPLCによって精製して化合物6(21 mg)を得た。MS m/z 2059.6 (M+H)。
化合物6(21 mg, 10 μmol，2 mLのジクロロメタン（DCM）に溶解させたもの)に化合物7(13 mg, 13 μmol)および3μLジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を入れた。当該反応混合物を20撹拌した後、溶媒を除去してHPLCによって精製して化合物8(11 mg)を得た。MS m/z 2558.6 (M+H).
デュオスタチン5小分子の合成経路：
【化３７】
0006944526.tif 000039
化合物25の製造:
化合物19のTFA塩(1 mmol)、化合物24(1 eq.)、HOAt (3 eq.)、ジクロロメタン（DCM）(20 mL)、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA6 eq.)およびDIC (2 eq.)を丸底フラスコに置いた。16時間撹拌した後、反応液を20mLのジクロロメタンで希釈し、そして20mLの水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧で溶媒を除去し、得られたガラス状固体をそのまま次の工程の反応に使用した。得られた固体を10 mLのジクロロメタン（DCM）、10 mLのトリフルオロ酢酸（TFA）および1mLのトリイソプロピルシランに溶解させて1時間撹拌した。 真空で溶媒を除去した後、HPLCによって精製して化合物6を得た。MS m/z 1351.5 (M+H)。  
【００８４】
化合物26の製造:
化合物25(0.5 mmol)、アセトニトリル20 mL、水5 mLおよび飽和炭酸水素ナトリウム10 mL水溶液をを丸底フラスコに置いた後、チオ硫酸ナトリウム（Na2S2O4）(4 eq.)を入れて20 分間撹拌した。 HPLCによって精製して化合物7を得た。MS m/z 1321.7 (M+H)。
【００８５】
化合物27の製造:
化合物26(0.4 mmol)を10 mLのアセトニトリルに溶解させた後、1,4-ジブロモブタン-2,3-ジオン(3 eq.)を入れた。20撹拌した後、HPLCによって精製して化合物27を得た。MS m/z 1527.6 (M+H)。
【実施例２】
【００８６】
実施例２  抗体の製造
化学合成によって抗体（抗5T4抗体および対照抗体A1）の重鎖と軽鎖の可変領域の遺伝子配列を得、得られた抗体（抗5T4抗体および対照抗体A1）の重鎖と軽鎖の定常領域の遺伝子配列に対してPCR増幅を行った。酵素切断と連結によって、重鎖の可変領域および定常領域を発現ベクターに組み込み、類似する方法によって軽鎖の可変領域および定常領域をもう一つの発現ベクターに組み込み、さらに酵素切断と連結によって、重鎖の可変領域および定常領域の発現ベクターおよび軽鎖の可変領域および定常領域の発現ベクターを一体化させ、すなわち、抗体の組み換え発現ベクターを得た。抗体の発現ベクターで形質転換されたCHO細胞を発現させた。
【００８７】
発現上清を収集し、プロテインAによって精製して高純度の抗体を得、限外ろ過または脱塩カラムによって抗体を結合に適切な緩衝液系に置換した。
5T4-抗体を37℃で15×モル当量のTCEP（水で調製されたもの）でC-Lock緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、4mM EDTA，pH7.0）において3時間還元させたか、または室温で一晩還元させた。
PD-10ゲルろ過カラムまたはAmicon回転濃縮器によって緩衝液を置換し、完全に還元された抗体を精製してTCEPを除去した。
分光光度計によって412nm吸光度および280nm吸光度を測定することによって、抗体の遊離チオールを定量した。3つのジスルフィド結合から約6つの遊離チオールができるはずである。TCEPを除去した後、分光光度計によって280nm吸光度を測定することによって、抗体の濃度を定量した。 
【実施例３】
【００８８】
実施例３  抗体-薬物複合体の製造
K-Lock法またはC-Lock法などの結合方法によって、相応する薬物を抗体と結合させ、表1に挙げられたADCを形成した。
【００８９】
K-Lock法は、ZV0512を例として、抗体（たとえば配列番号10で示される軽鎖と配列番号9で示される重鎖）は穏和な溶液系において直接薬物分子と連結してもよい。
室温25℃（範囲は4〜37℃でもよい）で、10mg/mlの抗体（リン酸緩衝液PBSに濃度範囲5〜30mg/mlで溶解させたもの）に抗体の6〜10倍のモル量の薬物分子（DMAに体積がPBSの10％を超えないように溶解させたもの）を入れて3〜16h反応させ、限外ろ過で過剰量の薬物分子を除去した。抗体-薬物複合体を疎水性クロマトグラフィーカラム（HIC）にかけ、0.75〜1 Mの硫酸アンモニウム溶液で平衡化した後、さらに25 mMの硫酸アンモニウム溶液で溶離させ、結合数が2の溶離液を合併してPBSで置換し、結合数が2の抗5T4抗体-薬物複合体を得た。
【００９０】
本発明者は、抗体と薬物を結合する過程において、pHが結合反応に顕著に影響することを見出したが、好適な結合pHは6.5〜8.0で、好ましくは6.8〜7.8で、より好ましくは7.0〜7.5、たとえば7.1、7.2、7.3、7.4である。
【００９１】
実験結果から、pH6以下では、抗体がほんとんど薬物分子と結合反応が生じず、pH7.8の場合、元の抗体が一部残留し、DAR数が1のものが大きな比率を占めたが、pHが約7.0の場合、ほとんどDAR2のものであったため、pHが約7.0の場合の反応効率が好適であることが示された。
【００９２】
C-Lock法はZV0508を例とした。
A．結合
結合される薬物(デュオスタチン5)(実施例1における化合物27)を60％アセトニトリル/水に溶解させて10mMストック溶液を調製した。
4.5×の最終薬物当量まで、5分間おきに0.5×モル当量の薬物を還元された5T4抗体に入れた。反応系を室温で回転器で混合した。
HIC-HPLCで反応させてフィッティング曲線を分析した。未結合の抗体は0％で、DAR 4ピーク≧70％になるはずである。
【００９３】
B．精製
ADC産物はDAR 2-4を含有する異質混合物を残す場合、Amicon回転濃縮器の緩衝液で置換することによって遊離薬物を除去した。緩衝液は50mMリン酸ナトリウム+30％プロピレングリコールであった。
均一相のDAR 3ピークが必要な場合、産物を疎水作用カラムで精製することによって必要ではないDARを除去した。
抗体-薬物複合体を疎水性クロマトグラフィーカラム（HIC）にかけ、精製して結合数が4の抗5T4抗体-薬物複合体を得た。
【００９４】
本実施例で製造された抗体-薬物複合体の構造は下記表に示す。
【表１】
0006944526.tif 000040
【００９５】
代表的な一つの抗体-薬物複合体を取ってHIC-HPLC分析を行ったが、操作手順は以下の通りである。
TSKゲルブチルNPRカラム(4.6 mmIDx3.5 cm, 2.5 mm, Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA)を使用し、移動相はそれぞれ1.5M 硫酸アンモニウムと0.025Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7）および75％ 0.025Mリン酸ナトリウム緩衝液と25％イソプロパノール（pH7.0）で、勾配溶離は10％ B〜70％ B、10分、70％ B〜100％ B、5分、100％ B〜10％ B, 2分であった。
図1は、本発明の抗体-薬物複合体ZV0508よるHIC分析結果を示すが、結果から示された。
【実施例４】
【００９６】
実施例４  親和性検出
親和性検出の実験手順は以下の通りである。
ZV05およびZV0508を3.3μg/mlに希釈した後、3倍の勾配で希釈し、濃度はそれぞれ10、3.3、1.1、0.33μg/mlで、それぞれ3.0×105個のMDA-MB-468細胞を含有するエッペンドルフ管に入れ、4℃の条件において30分間インキュベートした。沈殿細胞を遠心し、PBSを入れて1回洗浄した。さらに、600μlのFITCで標識された二次抗体希釈液を入れ、4℃の条件において光を避けて30 分間インキュベートした。沈殿細胞を遠心し、PBSで2回洗浄し、最後に500μlのPBSを入れて細胞を均一に懸濁させ、フローサイトメーターによって平均蛍光強度値を検出した。
検出結果は以下の通りである。
【００９７】
本発明で製造された抗5T4抗体複合体の結合前後の親和性を比較すると、代表的な抗体薬物複合体ZV0508の親和性検出の結果は図2に示すように、図から結合前後の抗体親和性はほぼ変わらなかったことがわかる。
【実施例５】
【００９８】
実施例５  細胞取り込み性の検出
細胞取り込み性の実験手順は以下の通りである。
ZV05およびZV0508を10μg/mlに希釈し、それぞれ3.0×105個のMDA-MB-468細胞を含有するエッペンドルフ管に入れ、4℃の条件において30分間インキュベートした。沈殿細胞を遠心し、PBSを入れて1回洗浄した。各EP管における細胞を等量の二つにわけ、その一つは4℃で2hインキュベートし、もう一つは37℃で2hインキュベートした。遠心で細胞を沈殿させ、PBSを入れて1回洗浄した。さらに、各EP管に600μlのFITCで標識された二次抗体希釈液を入れ、4℃の条件において光を避けて30 分間インキュベートした。沈殿細胞を遠心し、PBSで2回洗浄し、最後に500μlのPBSを入れて細胞を均一に懸濁させ、フローサイトメーターによって平均蛍光強度値を検出した。取り込み率の計算式：取り込み率（％）=（MFI4℃-MFI37℃）/MFI4℃。検出結果は以下の通りである。
【００９９】
代表的な抗体薬物複合体ZV0508の取り込み性の検出結果は図3に示すように、図から抗体（ZV05）およびADC（ZV0508）が細胞において強い取り込み性を有することがわかる。
【実施例６】
【０１００】
実施例６  腫瘍細胞の細胞周期阻害実験
本実施例において、本発明の抗体-薬物複合体の5T4陽性細胞の細胞周期に対する阻害効果を検出した。本実施例における腫瘍細胞株はいずれも米国ATCCから購入された。
実験の手順は以下の通りである。
【０１０１】
MDA-MB-468細胞を5.0×104個/ウェルで6ウェルプレートに接種し、37℃の細胞インキュベーターで培養し、細胞が壁に付着したら、ZV05およびZV0508を5μg/mlに希釈し、それぞれ6ウェルプレートに入れ、続いて48h〜72h培養した後、碧雲天の細胞周期検出キットを使用し、説明書の操作手順に従い、フローサイトメーターによってDNA含有量を測定し、細胞周期を分析した。
実験結果から、薬物の作用で抗体薬物複合体ZV0508が細胞周期がG2/M期に留まるようにさせたことが示され、結果は図4に示すように、図4ではZV05は薬物が結合していない抗体対照である。
【実施例７】
【０１０２】
実施例７  体内抗腫瘍活性
抗5T4抗体-薬物複合体の体内抗腫瘍活性の検出手順は以下の通りである。
腫瘍細胞をヌードマウスまたはSCIDマウスの腋下に接種し、腫瘍体積が100〜300mm3に生長したら尾静脈に投与し、OE19は3回に分けて、3日に1回で投与し、ほかのモデルはしずれも単回で投与し、投与後一定の時間で腫瘍の大きさ、腫瘍塊の長径（a）、短径（b）を測量し、腫瘍体積（tumor volume，TV）の計算式はTV = 1/2×a×b2である。
【０１０３】
実験結果から、本発明の抗5T4抗体（ZV05）-薬物複合体は、体内における腫瘍に対して顕著な抑制作用を有し、体内腫瘍抑制活性は顕著に対照抗体（ヒト化されたA1抗体）よりも優れたことが示された。
図5は、ADCでマウス体内におけるMDA-MB-468乳癌移植腫瘍（+++）を治療する場合の治療効果を示す。
図6は、ADCでマウス体内におけるBxPC-3膵臓癌移植腫瘍（++）を治療する場合の治療効果を示す。
図7は、ADCでマウス体内におけるH1975肺癌移植腫瘍（+++）を治療する場合の治療効果を示す。
図8は、ADCでマウス体内におけるDU-145前立腺癌移植腫瘍（+++）を治療する場合の治療効果を示す。
図9はADCでマウス体内におけるPA-1卵巣癌移植腫瘍（+）を治療する場合の治療効果を示す。
図10は、ADCでマウス体内におけるLovo結腸癌移植腫瘍（+）を治療する場合の治療効果を示す。ここで、対照としての抗体薬物複合体(A1-MMAF)の腫瘍阻害効果は顕著に本発明の抗体薬物複合体よりも低かった。
【０１０４】
各図において、測定されたADCは以下のものを含む：
ZV05-MMAF（0501）、すなわちZV0501；
ZV05-0115（0508）、すなわちZV0508；
ZV05-0154（0505）、すなわちZV0505；
ZV05-0155（0504）、すなわちZV0504；
ZV05-0174（0503）、すなわちZV0503；
ZV05-0472（0516）、すなわちZV0516；
ZV05-0481（0517）、すなわちZV0517；
ZV05-0482（0518）、すなわちZV0518；
ZV05-0441（0512）、すなわちZV0512；
ZV05-0443（0513）、すなわちZV0513；
ZV05-0454（0515）、すなわちZV0515；
ZV05-0428（0519）、すなわちZV0519。
A1-MMAFはUS2012251558に記載の方法によって製造された、従来の抗体のジスルフィド結合を還元させることによってチューブリン阻害剤であるMMAFをヒト化された抗5T4モノクローナル抗体A1に連結した抗体薬物複合体で、ここで、DARは約4である。
【０１０５】
測定結果（図5-10）から、本発明の抗体薬物複合体(ZV0508、ZV0512、ZV0513、ZV0503などを含む)は腫瘍阻害効果が顕著に対照としての抗体薬物複合体(A1-MMAF)よりも優れて、ZV0508、ZV0512、ZV0513およびZV0503の阻害効果が最も優れたことが示された。
【０１０６】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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