(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸもしくはＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；
ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）もしくはＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）のアミノ酸配列；または、
ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列
を含む、１０個〜４５個のアミノ酸からなるペプチド。
【請求項２】
ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸまたはＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個〜２５個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個〜２５個のアミノ酸からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱ（配列番号５）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号６）、ＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号７）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号８）、ＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号２２）、ＬＮＭＦＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号２３）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴＩ（配列番号２４）およびＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴＩＫＱＬＹ（配列番号２５）のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱ（配列番号２８）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳ（配列番号２９）、ＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱ（配列番号３０）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３１）、ＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３２）、ＬＮＭＦＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３３）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴＩ（配列番号３４）およびＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴＩＫＱＬＹ（配列番号３５）のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項７】
ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）、ＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号２０）、または、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）、ＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号２０）、または、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号２１）のアミノ酸配列からなる、請求項１または７に記載のペプチド。
【請求項９】
ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含み、１９個〜２５個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなる、請求項１または９に記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド、請求項１１に記載の核酸、請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する抗原提示細胞、または、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１に記載の核酸を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクターを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤をさらに含むか、または、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤と併用される、請求項１２〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
がんの治療または予防のための、請求項１２〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
がんワクチンである、請求項１２〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
がんの処置または予防のための医薬を製造するための、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド、請求項１１に記載の核酸、請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する抗原提示細胞、または、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１８−０２４９７２号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、新規がん抗原ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、正常細胞ががん化する際に発現される免疫原性の高いがん抗原タンパク質を認識し、がん細胞を排除する機構を備えている。近年、抗ＰＤ−１抗体等に代表される免疫チェックポイント阻害剤による目覚しい処置効果によって、がんの増殖を制御するには免疫系を有効に活性化することがきわめて重要であるということが示され、がん免疫ワクチン療法に注目が集まっている。【０００３】
従来のがん免疫ワクチン療法では、標的として選択された抗原分子のほとんどは、正常組織ではほとんど発現されていないか、もしくはある程度発現されているが、「成長した」がん組織にのみ高発現している分子であった。一方、がん細胞は免疫系から逃れるために様々な免疫逃避機構を備えており、正常細胞ががん化する際には、免疫系からの標的になりやすい分子の発現を低下させながら、「成長していく」ことが知られている（非特許文献１）。つまり、「成長した」がん組織において発現が維持されている抗原は免疫系の標的にはなりにくく、がん組織が「成長していく」過程において、その発現量を低下させる必要がなかった抗原であることが示唆される。これを考慮すると、従来のがんワクチンにおいて選択されてきた標的抗原は、免疫系を活性化するには不十分な抗原であった可能性がある。【０００４】
がん細胞が「がん細胞にとって不都合な」抗原の発現量を低下させるメカニズムの１つとして、免疫原性の高いがん抗原遺伝子のプロモーター領域のメチル化による遺伝子発現の抑制が報告された（非特許文献２）。これは、免疫監視機構を逃れてがん組織を形成したがん細胞が、「がん細胞にとって不都合な」免疫原性の高いがん抗原タンパク質を、そのプロモーター領域をメチル化することによって隠していることを示唆する。【０００５】
より有効ながんワクチン療法を確立するため、がん組織が成長する過程で発現量を低下させた、「がん細胞にとって不都合な」免疫原性の高いがん抗原分子、即ち、ステルスがん抗原の同定が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Schreiber RD et al. Science 2011, Mar 25;331(6024):1565-70
【非特許文献２】DuPage et al. Nature 2012 Feb 8;482(7385):405-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願は、新規がん抗原ペプチドおよびその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤を用いてステルスがん抗原を特定し、その部分ペプチドであって、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを同定した。【０００９】
従って、ある態様では、本願は、
ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；
ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列；または、
ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列
を含む、１０個〜４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
前記のいずれかのペプチドにおいて１個〜３個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを提供する。【００１０】
ある態様では、本願は、前記ペプチドをコードする核酸を提供する。
ある態様では、本願は、前記核酸を含む発現ベクターを提供する。
ある態様では、本願は、前記ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマーを提供する。
ある態様では、本願は、前記ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞を提供する。
ある態様では、本願は、前記ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識する、ヘルパーＴ細胞を提供する。
ある態様では、本願は、前記ペプチド、前記核酸、前記発現ベクター、前記抗原提示細胞、または、前記ヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物を提供する。
ある態様では、本願は、前記ペプチド、前記核酸、前記発現ベクター、または、前記抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本願に開示されるペプチドは、ステルスがん抗原特異的なヘルパーＴ細胞を活性化し得、従って、当該ステルスがん抗原を発現し得るがんの処置または予防に有用であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５−ＡＺＡ処理した癌細胞株ＥＢＣ１およびＬｕ６５におけるＳＹＣＰ３の遺伝子発現量を示す。
【図２】５−ＡＺＡ処理した癌細胞株ＨＴ−２９およびＳＡＳにおけるＳＹＣＰ３の遺伝子発現量を示す。
【図３】５−ＡＺＡ処理した癌細胞株ＳＷ８３９、５６３７、ＬＣ２／ＡｄおよびＥＢＣ１におけるＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現量を示す。
【図４】５−ＡＺＡ処理した癌細胞株ＨＴ−２９、Ｌｕ６５およびＳＡＳにおけるＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現量を示す。
【図５】５−ＡＺＡ処理した癌細胞株ＷＥＨＩ−３におけるＤＡＺＬ１の遺伝子発現量を示す。
【図６】大腸癌細胞株を接種し、５−ＡＺＡを投与した免疫不全マウスから回収した腫瘍組織における、ＳＹＣＰ３の遺伝子発現量を示す。
【図７】肺癌細胞株を接種し、５−ＡＺＡを投与した免疫不全マウスから回収した腫瘍組織における、ＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現量を示す。
【図８】ＳＹＣＰ３−Ａ断片ペプチドに対するＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応性を示す。
【図９】ＤＡＺＬ−１ＣペプチドのマウスにおけるヘルパーＴ細胞活性化能を示す。
【図１０】ＳＹＣＰ３−Ａ刺激に対するＳＹＣＰ３−Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。
【図１１】ＳＹＣＰ３−Ａ断片ペプチドに対するＳＹＣＰ３−Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。
【図１２】ＳＹＣＰ３−Ａ断片ペプチドに対するＳＹＣＰ３−Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。
【図１３】ＳＰＥＳＰ１−Ｂ刺激に対するＳＰＥＳＰ１−Ｂ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。
【図１４】ＤＡＺＬ１断片ペプチドに対するＤＡＺＬ１特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。
【図１５】５−ＡＺＡ処理されたＤＲ５３陽性癌細胞株に対するＳＹＣＰ３−Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。
【図１６】５−ＡＺＡおよびＳＹＣＰ３−Ａ特異的Ｔｈ細胞の併用による腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図１７】ヒトＳＹＣＰ３（配列番号１）、ヒトＳＰＥＳＰ１（配列番号２）およびヒトＤＡＺＬ１（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１４】
本明細書において、がん細胞の免疫逃避機構により、その遺伝子のプロモーター領域がメチル化されることにより発現が抑制されているタンパク質を「ステルスがん抗原」と称する。ステルスがん抗原としては、ＳＹＣＰ３（synaptonemal complex protein 3）、ＳＰＥＳＰ１（Sperm Equatorial Segment Protein 1）またはＤＡＺＬ１（deleted in azoospermia-like 1）が例示される。ＳＹＣＰ３は、減数分裂における染色体の対合、組換えおよび分離に関与するシナプトネマ複合体の重要な構成成分である。ＳＹＣＰ３の変異は、無精子症および不妊症に関連する。ヒトのＳＹＣＰ３は、配列番号１のアミノ酸配列を有し得る。ＳＰＥＳＰ１は、精子と卵子の結合および融合に関与するヒト同種抗原である。ヒトのＳＰＥＳＰ１は、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。ＤＡＺＬ１はＤＡＺファミリーの一員であり、出生前および出生後の雌雄の生殖細胞において発現されるＲＮＡ結合タンパク質である。ヒトのＤＡＺＬ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を有し得る。
【００１５】
本明細書において、がん抗原タンパク質に由来する、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを、「ヘルパーペプチド」と称する。
【００１６】
ＳＹＣＰ３由来のヘルパーペプチドの例として、アミノ酸配列ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号３）またはＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号４）を含むペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱ（配列番号５）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号６）、ＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号７）およびＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号８）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、特に、配列番号５または６のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１７】
配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドの例として、ＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号２２）、ＬＮＭＦＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号２３）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴＩ（配列番号２４）またはＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴＩＫＱＬＹ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号２２〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００１８】
ＳＹＣＰ３由来のヘルパーペプチドの別の例として、アミノ酸配列ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱ（配列番号２６）またはＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳ（配列番号２７）を含むペプチド、または、配列番号２６または２７のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱ（配列番号２８）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳ（配列番号２９）、ＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱ（配列番号３０）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３１）、ＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３２）、ＬＮＭＦＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３３）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴＩ（配列番号３４）およびＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴＩＫＱＬＹ（配列番号３５）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号２８〜３５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１９】
本明細書において、配列番号３および４のアミノ酸配列をまとめて、配列（Ｉ）：ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸと表す場合があり、ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである。本明細書において、配列番号２６および２７のアミノ酸配列をまとめて、配列（Ｉ’）：ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＸと表す場合があり、ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである。
【００２０】
ＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドの例として、アミノ酸配列ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）を含むペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００２１】
ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドの例として、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含むペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する２０個以上のアミノ酸の配列を含むペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する１０個以上または２０個以上のアミノ酸の配列を含み、配列番号１５のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号１６、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）、ＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号２０）、および、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号２１）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号１６〜２１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００２２】
ヘルパーペプチドの長さは、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合が可能なものであればよく、例えば、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０または１０〜２５アミノ酸である。例えば、１０〜１８、１０〜１９、１０〜２０、１１〜１８、１１〜１９、１１〜２０、１２〜１８、１２〜１９または１２〜２０アミノ酸のヘルパーペプチドを使用し得る。一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示される抗原ペプチドは、約９個のアミノ酸残基からなるＭＨＣクラスＩＩ分子結合モチーフがＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝に結合し、ペプチドの両端は溝の両端からはみ出すことができるために、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるペプチドの長さには原則的に制限はないと考えられている。例えば、１０〜４５、１５〜４０または２０〜３８アミノ酸のヘルパーペプチドも使用し得る。しかし多くの場合、長いペプチドはペプチダーゼで切られ、１３〜１７個のアミノ酸の長さになっている（Immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)）。
【００２３】
ヘルパーペプチドは、前記いずれかのヘルパーペプチドのアミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。置換、欠失または付加されるアミノ酸残基の数および位置は、ヘルパーＴ細胞活性化能が維持される限り、任意である。例えば、前記いずれかのヘルパーペプチドのアミノ酸配列において、１〜９個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、例えば１個のアミノ酸が、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。アミノ酸の置換、付加または欠失は、ペプチド中のＮ末端またはＣ末端で行われても、配列内部で行われてもよい。上記のヘルパーペプチドの性質から、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されるアミノ酸の数に制限はなく、例えば、１〜２０個、１〜１５個または１〜１０個であり得る。
【００２４】
ペプチド中のアミノ酸の置換はいずれの種類のアミノ酸との間で行われてもよく、保存的なアミノ酸置換が好ましい。「保存的なアミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することを意味する。アミノ酸残基はその側鎖によって、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、アミド側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン）、含硫側鎖（例えば、システイン、メチオニン）のように、いくつかのファミリーに分類できる。保存的なアミノ酸置換は、好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。保存的なアミノ酸置換の例としては、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、フェニルアラニン残基をチロシン残基に、ロイシン残基をイソロイシン残基に、イソロイシン残基をバリン残基に、アラニン残基をセリン残基に、ヒスチジン残基をアルギニン残基に置換することなどが挙げられる。
【００２５】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）がある。ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝に沿ってはまり込み、固定される。ペプチド収容溝にペプチド上のアミノ酸残基の側鎖が結合することと、すべてのＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝によく保存されているアミノ酸残基の側鎖とペプチド主鎖とが結合することにより、ペプチドがペプチド収容溝の中に固定される。ペプチド収容溝にある大小のポケットを構成するアミノ酸残基には多型性があり、異なる対立遺伝子由来のＭＨＣクラスＩＩ分子のそれぞれについて、結合するペプチドに共通するアミノ酸残基のパターンを解析することにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝のポケット部分に結合するアミノ酸残基のモチーフを推定できる。従って、所望のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合性を有するペプチドに共通するモチーフを維持するように、アミノ酸を置換してもよい。
【００２６】
ある実施態様において、ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ、特にはＨＬＡ−ＤＲ５３に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ、特にはＨＬＡ−ＤＲ４、８、９、１５または５３に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ４、９または５３に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１５に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ８に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。
【００２７】
ペプチドのアミノ酸残基は、公知の方法で修飾されていてもよい。例えば、アミノ酸残基の側鎖中の官能基、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に、エステル化、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、ハロゲン化、リン酸化などを施し得る。ある実施態様では、ヘルパーペプチドのＮ末端はアセチル化されている。また、ヘルパーペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。例えば、ヒスチジンタグを付加してもよく、チオレドキシン等のタンパク質とともに融合タンパク質となっていてもよい。あるいは、ヘルパーペプチドに検出可能な標識を結合させてもよい。ヘルパーペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的にヘルパーペプチドを生じるものであってもよい。これらの物質は、ヘルパーペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的にヘルパーペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、ヘルパーＴ細胞を活性化する他のペプチドであってもよい。
【００２８】
ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。ペプチドはまた、当該ペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。これらの手法は、文献に記載される方法などに準じて行うことができる（例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS (1985)）。
【００２９】
一般的に、ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ・ＣＤ３複合体が抗原提示細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して抗原ペプチドを認識し、Ｔ細胞表面のインテグリンが抗原提示細胞表面のインテグリンリガンドで刺激されることにより、活性化される。本明細書において、ヘルパーＴ細胞の活性化には、ヘルパーＴ細胞の誘導または増殖促進、およびヘルパーＴ細胞からのサイトカイン産生の誘導が含まれる。
【００３０】
ペプチドがヘルパーＴ細胞活性化能を有することは、当該変異体の候補ペプチドを合成し、それがヘルパーＴ細胞を活性化できるか否かを試験することにより、決定し得る。試験には、例えば、Hassane M. Zarour et al., Cancer Research 62, 213-218, January 1, 2002 に記載の方法、実施例記載の方法、または、下記の方法を用い得る。
【００３１】
まず、ヒトから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を回収し、浮遊細胞を除去することにより樹状細胞（付着細胞）を調製する。また別途、同一のヒトから Ficoll-Paque の密度勾配遠心法または磁気細胞分離システム等によりヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）を調製する。次に、前記樹状細胞に候補ペプチドを添加して培養した後、この樹状細胞と前記ヘルパーＴ細胞とを混合培養する。その後ヘルパーＴ細胞を回収し、候補ペプチドと培養した樹状細胞で同様に何回か刺激する。ペプチド刺激に反応してヘルパーＴ細胞が活性化（誘導）されたことは、例えば（１）当該ヘルパーＴ細胞の増殖活性や、（２）ヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生活性を測定することにより、調べることができる。ここで（１）の増殖活性は、例えば、ヘルパーＴ細胞内に取り込まれる［３Ｈ］−チミジン量を測定することにより調べることができる。また（２）のサイトカイン産生活性は、例えば、活性化ヘルパーＴ細胞が産生するＩＦＮ−γなどのサイトカインの量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等により測定することによって調べることができる。
【００３２】
ある態様では、本願は、前記ヘルパーペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのいかなる核酸の形態であっても良い。これらのポリヌクレオチドは、ペプチドのアミノ酸配列情報およびそれをコードするＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
【００３３】
ヘルパーペプチドをコードするポリヌクレオチドには、当該ポリヌクレオチドの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。ここに、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。
【００３４】
前記で作製されたポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、ヘルパーペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。ここで用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３.１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００３５】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質をもたらす配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３.１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００３６】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
【００３７】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００３８】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより、ヘルパーペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。またヘルパーペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
【００３９】
ある態様では、前記ヘルパーペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。これらは、周知の製造方法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons.、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。ポリクローナル抗体は、ペプチドを免疫原として用い、ウサギ等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることができる。一方、モノクローナル抗体は、ペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めてもよい。
【００４０】
これらの抗体は、前記ヘルパーペプチドを認識し、さらにはその活性を中和し得る。従って、これらの抗体を、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等に使用し得る。免疫学的診断は、例えば、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より実施し得る。このような免疫学的診断は、ＤＮＡメチル化の阻害によりＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１またはＤＡＺＬ１を発現するがん、例えば、白血病を含む血液疾患、悪性黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、泌尿器系腫瘍、食道癌、肝臓癌、肺癌または大腸癌等の診断において有効である。
【００４１】
ある態様では、本願は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマーを提供する。本明細書において、ＨＬＡマルチマーとは、ＨＬＡタンパク質をペプチドと会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）を、公知の手法を用いて２つまたはそれ以上結合させることにより多量体化したものをいう。ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ５３であり得るが、これに限定されない。ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ４、８、９、１５または５３であり得るが、これに限定されない。マルチマーは、結合したヘルパーＴ細胞を、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により容易に選別または検出できるように、蛍光標識されていてもよい。ＨＬＡマルチマーは、テトラマー、ペンタマー、デンドリマーなどであり得、例えば、ＨＬＡモノマーをビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したＨＬＡテトラマーであり得る。ＨＬＡテトラマーとして、種々の抗原ペプチドを含有するものが市販されており、ヘルパーペプチドを含むＨＬＡテトラマーを容易に作製することができる（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)）。
【００４２】
ある態様では、本願は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞を提供する。ある実施形態において、ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ５３であり得るが、これに限定されない。ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ４、８、９、１５または５３であり得るが、これに限定されない。抗原提示細胞は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体をヘルパーＴ細胞に提示することができる細胞であって、例えば、樹状細胞、末梢血単核球に由来し得る。
【００４３】
当該抗原提示細胞は、当業者に周知の手法で抗原提示能を有する細胞にペプチドを添加することにより、調製され得る。ペプチドの細胞への添加は、当該ペプチドを用いて直接的に、あるいは前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクターまたは前記形質転換細胞を用いて間接的に、行われ得る。具体的には、ペプチドの細胞への添加は、ペプチドと抗原提示能を有する細胞とを接触させることにより、または前記ポリヌクレオチドもしくは前記発現ベクターを細胞に導入することにより、行うことができる（Cancer Immunol. Immunother. 46:82, 1998、J. Immunol., 158: p1796,1997、Cancer Res., 59: p1184, 1999 Cancer Res., 56: p5672, 1996、J.Immunol., 161: p5607, 1998、J. Exp. Med., 184: p465, 1996）。本明細書において、抗原提示能を有する細胞とは、ＨＬＡクラスＩＩ分子を細胞表面に発現する細胞であり、例えば、末梢血単核球または樹状細胞である。抗原提示細胞による抗原提示は、例えば、実施例に記載の通り、ヘルパーＴ細胞の活性により確認することができる。ヘルパーＴ細胞の活性は、例えば、インターフェロンγなどのサイトカインの産生により確認し得る。当該抗原提示細胞は、例えば、細胞療法（例えば、樹状細胞療法）において有効成分として用いられ得る。
【００４４】
さらなる態様では、抗原提示細胞を調製するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、またはこれらのいずれかを含む細胞が提供される。さらなる態様では、抗原提示細胞を調製するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、またはこれらのいずれかを含む細胞の使用が提供される。
【００４５】
前記抗原提示細胞は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞を活性化し得る。従って、本願は、ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤を提供する。
【００４６】
活性化されたヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導・増殖・活性化を促進することにより免疫系を活性化する機能を有する。従って、前記ヘルパーＴ細胞の活性化剤または活性化されたヘルパーＴ細胞を、Ｂ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の誘導・増殖・活性化を促進するために、または、それにより免疫系を活性化するために、用いることができる。
【００４７】
当該活性化剤は、前記有効成分以外に、例えば、適当な担体、賦形剤、添加剤などを含んでいてもよい。当該活性化剤は、インビトロでもインビボでも使用でき、インビボでは、後述する医薬組成物に準じて使用し得る。当該活性化剤の適用方法は、所望のヘルパーＴ細胞の活性化の程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができ、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などにより対象に投与すること、あるいは細胞培養液に添加することなどが挙げられるが、これらに限定されない。当該活性化剤に含まれる有効成分の量、組成物の形態、適用回数などは、所望のヘルパーＴ細胞の活性化の程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
ある態様では、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞が提供される。ある態様では、ヘルパーＴ細胞の活性化剤を製造するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞の使用が提供される。ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞を対象に投与することを含む、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法が提供される。ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞をインビトロでヘルパーＴ細胞に添加することを含む、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法が提供される。
【００４９】
ある態様では、前記ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞が提供される。ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ５３であり得るが、これに限定されない。ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ４、８、９、１５または５３であり得るが、これに限定されない。当該ヘルパーＴ細胞は、当該技術分野における公知の手法を用いて当業者が容易に調製することができる（Iwata, M. et al., Eur. J. Immunol, 26, 2081(1996)）。
【００５０】
本願は、別の態様において、１つまたはそれ以上の前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、がんを処置または予防するために、あるいは、それを補助するために、用いることができる。ある実施態様では、当該医薬組成物はがんワクチンである。
【００５１】
当該医薬組成物により、ＤＮＡメチル化の阻害によりＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１またはＤＡＺＬ１を発現するがんを処置または予防し得る。ＤＮＡメチル化の阻害によりＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１またはＤＡＺＬ１を発現するがんは、固形腫瘍または血液腫瘍であり得、例えば、白血病を含む血液疾患、悪性黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、泌尿器系腫瘍、食道癌、肝臓癌、肺癌または大腸癌である。また、ある実施態様では、ヘルパーペプチドがＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来である場合、当該医薬組成物は、ＨＬＡ−ＤＲ５３を有する対象に投与し得るが、これに限定されない。ある実施態様では、ヘルパーペプチドがＤＡＺＬ１由来である場合、当該医薬組成物は、ＨＬＡ−ＤＲ４、８、９、１５または５３を有する対象に投与し得るが、これに限定されない。
【００５２】
当該医薬組成物は、有効成分以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。前記医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。投与方法として、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限定されない。当該医薬組成物に含まれる前記有効成分の量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
当該医薬組成物は、１種またはそれ以上のさらなる有効成分を含有してもよく、それと併用してもよい。さらなる有効成分としては、例えば、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管作用薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的治療薬、がんワクチン、免疫調節薬、免疫チェックポイント阻害薬、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤などの化学療法剤、または、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞の活性化剤、増殖剤もしくは誘導剤などが挙げられる。さらなる有効成分およびその治療上有効量は、通常の臨床医の技術および判断の範囲内で決定され得る。当該医薬組成物は、化学療法、放射線療法、免疫療法、造血幹細胞移植および外科手術等の他の療法と並行して、または、それらの前または後に、使用してもよい。
【００５４】
ある実施態様では、さらなる有効成分は、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤である。ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤の例としては、例えば、J. Med. Chem. 2015, 58, 2569-2583に記載される薬剤であり、その一例としては、デシタビン、グアデシタビン、アザシチジン、ゼブラリン、テトラヒドロウリジン、テトラヒドロウリジンおよびその誘導体であって、特にデシタビンやアザシチジンが挙げられる。
【００５５】
成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与形の使用および各成分を別個に含有する投与形の組合せ（キット）の使用のみならず、それらが同一の疾患の処置に使用される限り、各成分を同時もしくは連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。
【００５６】
ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、がんを処置または予防するための方法が提供される。
ある態様では、医薬、例えばがんの処置または予防のための医薬として使用するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞が提供される。
ある態様では、医薬、例えばがんの処置または予防のための医薬を製造するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞の使用が提供される。
【００５７】
本願は、なお別の態様において、対象におけるステルスがん抗原特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）前記対象から取得した試料をヘルパーペプチドで刺激する工程、および、
（ｂ）ヘルパーＴ細胞またはそれにより産生されるサイトカインの量を調べる工程、
を含み、ヘルパーＴ細胞またはそれにより産生されるサイトカインの量の増加がステルスがん抗原特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を示すものである方法を提供する。試料は、抗原提示細胞を含むものであればいかなるものであってもよく、例えば、末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、またはリンパ節細胞などが挙げられる。試料は、健常人由来であっても、がん患者由来であってもよい。健常人由来の試料を用いることにより、例えば、がんに罹患しているかどうか、あるいはその素因を有するかどうかを診断することなどが可能になる。がん患者由来の試料を用いることにより、例えば、当該がん患者においてステルスがん抗原を用いる免疫療法が効果を有するかどうかを予測することなどが可能になる。ある実施形態において、ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１に由来するヘルパーペプチド特異的ヘルパーＴ細胞の量を決定される対象は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、特にはＨＬＡ−ＤＲ５３陽性であるが、これに限定されない。ある実施形態において、ＤＡＺＬ１に由来するヘルパーペプチド特異的ヘルパーＴ細胞の量を決定される対象は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、特にはＨＬＡ−ＤＲ４、８、９、１５または５３陽性であるが、これに限定されない。取得した試料は、ヘルパーペプチドによる刺激の前後に培養されてもよく、前記培養条件は当業者が適宜決定することができる。ヘルパーペプチドを用いたこれらの細胞の刺激は、公知の手法を用いて行うことができ、インビトロまたはインビボのいずれにおいて行われてもよい。ヘルパーＴ細胞またはそれにより産生されるサイトカインの量は、公知の方法により調べることができる。
【００５８】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）またはＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、１０個〜２５個のアミノ酸からなるペプチド。
［２］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含む、第１項に記載のペプチド。
［３］配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなる、第１項または第２項に記載のペプチド。
［４］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号３）、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号４）、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱ（配列番号５）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号６）またはＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号７）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［５］配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１項〜第４項のいずれかに記載のペプチド。
［６］配列番号３または４のアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［７］配列番号３または４のアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第６項のいずれかに記載のペプチド。
［８］配列番号３のアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［９］配列番号３のアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第８項のいずれかに記載のペプチド。
［１０］配列番号４のアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１１］配列番号４のアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第１０項のいずれかに記載のペプチド。
【００５９】
［１２］配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１３］配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第１２項のいずれかに記載のペプチド。
［１４］配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１５］配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第１４項のいずれかに記載のペプチド。
［１６］配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１７］配列番号５または６のアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第１６項のいずれかに記載のペプチド。
［１８］配列番号５のアミノ酸配列を含む、第１項〜第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１９］配列番号５のアミノ酸配列からなる、第１項〜第３項および第１８項のいずれかに記載のペプチド。
【００６０】
［２０］ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、第１項に記載のペプチド。
［２１］配列番号２のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなる、第１項または第２０項に記載のペプチド。
［２２］配列番号９のアミノ酸配列からなる、第１項、第２０項または第２１項に記載のペプチド。
［２３］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）またはＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、１０個〜２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
前記ペプチドのアミノ酸配列において１個〜３個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド。
【００６１】
［２４］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
［２５］第２４項に記載の核酸を含む発現ベクター。
［２６］第２５項に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞。
［２７］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
［２８］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー。
［２９］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞。
［３０］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識する、ヘルパーＴ細胞。
［３１］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチド、第２４項に記載の核酸、第２５項に記載の発現ベクター、第２８項に記載のＨＬＡマルチマー、第２９項に記載の抗原提示細胞、または、第３０項に記載のヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物。
［３２］がんの治療または予防のための、第３１項に記載の医薬組成物。
［３３］がんワクチンである、第３１項または第３２項に記載の医薬組成物。
［３４］がんが肺癌または大腸癌である、第３２項または第３３項に記載の医薬組成物。
［３５］第１項〜第２３項のいずれかに記載のペプチド、第２４項に記載の核酸、第２５項に記載の発現ベクター、第２８項に記載のＨＬＡマルチマー、または、第２９項に記載の抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤。
【００６２】
本願は、例えば、さらに下記の実施態様を提供する。
［１］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；
ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列；または、
ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列
を含む、１０個〜４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
前記のいずれかのペプチドにおいて１個〜３個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド。
【００６３】
［２］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個〜２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
である、第１項に記載のペプチド。
［３］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）またはＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個〜２５個のアミノ酸からなる、第２項に記載のペプチド。
［４］配列番号５〜７および２８〜３０のいずれかのアミノ酸配列を含む、第２項または第３項に記載のペプチド。
［５］配列番号３〜８および２２〜３５のいずれかのアミノ酸配列からなる、第２項または第３項に記載のペプチド。
［６］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個〜２５個のアミノ酸からなる、第２項に記載のペプチド。
［７］配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、第６項に記載のペプチド。
［８］配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列を含む、第６項または第７項に記載のペプチド。
［９］配列番号３〜８および２２〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなる、第６項または第７項に記載のペプチド。
［１０］配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列からなる、第６項、第７項または第９項に記載のペプチド。
【００６４】
［１１］配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含み、１０個〜４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
である、第１項に記載のペプチド。
［１２］配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含み、１０個〜４５個のアミノ酸からなる、第１１項に記載のペプチド。
［１３］配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する２０個以上のアミノ酸の配列を含み、２０個〜３８個のアミノ酸からなる、第１１項または第１２項に記載のペプチド。
［１４］配列番号１５のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、第１１項〜第１３項のいずれかに記載のペプチド。
［１５］配列番号１６〜２１のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１１項〜第１４項のいずれかに記載のペプチド。
［１６］配列番号１６〜２１のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１１項〜第１５項のいずれかに記載のペプチド。
【００６５】
［１７］配列番号９のアミノ酸配列を含み、１０個〜２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
である、第１項に記載のペプチド。
［１８］配列番号９のアミノ酸配列を含み、１９個〜２５個のアミノ酸からなる、第１７項に記載のペプチド。
［１９］配列番号２のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、第１７項または第１８項に記載のペプチド。
［２０］配列番号９のアミノ酸配列からなる、第１７項〜第１９項のいずれかに記載のペプチド。
【００６６】
［２１］第１項〜第２０項のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
［２２］第２１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
［２３］第１項〜第２０項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー。
［２４］第１項〜第２０項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞。
［２５］第１項〜第２０項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識する、ヘルパーＴ細胞。
［２６］第１項〜第２０項のいずれかに記載のペプチド、第２１項に記載の核酸、第２２項に記載の発現ベクター、第２３項に記載のＨＬＡマルチマー、第２４項に記載の抗原提示細胞、または、第２５項に記載のヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物。
［２７］ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤をさらに含むか、または、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤と併用される、第２６項に記載の医薬組成物。
［２８］ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤が、デシタビン、グアデシタビン、アザシチジン、ゼブラリン、テトラヒドロウリジン、テトラヒドロウリジンおよびその誘導体からなる群から選択される、第２７項に記載の医薬組成物。
［２９］ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤が、デシタビンおよびアザシチジンからなる群から選択される、第２７項または第２９項に記載の医薬組成物。［３０］がんの治療または予防のための、第２６項〜第２９項のいずれかに記載の医薬組成物。
［３１］がんワクチンである、第２６項〜第３０項のいずれかに記載の医薬組成物。
［３２］がんが、血液がん、悪性黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、泌尿器系腫瘍、食道癌、肝臓癌、肺癌または大腸癌である、第３０項または第３１項に記載の医薬組成物。
［３３］がんが肺癌または大腸癌である、第３０項〜第３２項のいずれかに記載の医薬組成物。
［３４］第１項〜第２０項のいずれかに記載のペプチド、第２１項に記載の核酸、第２２項に記載の発現ベクター、第２３項に記載のＨＬＡマルチマー、または、第２４項に記載の抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤。
【００６７】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例】
【００６８】
試験１：候補分子の探索
ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤（５−アザ−２'−デオキシシチジン（デシタビン）；５−ＡＺＡ）によって遺伝子発現が再上昇する分子を同定するために、肺癌細胞株Ａ５４９を５−ＡＺＡ（１０μＭ）にて３日間処理後にＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイにて未処理の癌細胞株において発現量が０に近く、かつ５−ＡＺＡ処理癌細胞株における発現量が３０倍以上増加している分子を探索した。その結果、ＳＹＣＰ３（未処理：３.０、５−ＡＺＡ処理後：３４０.９、発現上昇率：１１２.３）、ＳＰＥＳＰ１（未処理：１.７、５−ＡＺＡ処理後：６５.３、発現上昇率：３８.８）およびＤＡＺＬ１（未処理２.８、５−ＡＺＡ処理後：３４１.３、発現上昇率：１２３.６）を含む候補分子を同定した。【００６９】
試験２：５−ＡＺＡ処理によるＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１およびＤＡＺＬ１の遺伝子発現上昇の検討
各種の癌細胞株（肺癌細胞株ＥＢＣ１、肺癌細胞株Ｌｕ６５、大腸癌細胞株ＨＴ−２９、口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ）を、５−ＡＺＡ（１０μＭ）を含む完全培地（１００Ｕ／ｍＬペニシリン（明治製菓）、１００μｇ／Ｌストレプトマイシン（明治製菓）加ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク 30264-56）に５６℃、３０分非働化した牛胎児血清（biosera FB-1365/500）を１０％添加したもの）を用いて２ｘ１０５／ウェルの条件で６穴培養プレート（Falcon 353046）にて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度９５％に設定したインキュベーター（SANYO）内で３日間培養した（以下、全ての細胞培養はこのインキュベーターを用いた）。２ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、関東化学株式会社 73111）で洗浄後、それぞれからRNeasy Mini Kit（Qiagen 74106）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript 1st strand cDNA Syntesis Kit（タカラバイオ 6110A）を用いてｃＤＮＡを合成し、LightCycler480（Roche）を用いてリアルタイムＰＣＲ法にてＧＡＰＤＨ（Applied Biosystems Hs02786624_g1）およびＳＹＣＰ３（Applied Biosystems Hs00538146_m1）の遺伝子発現量を解析した。各手順はそれぞれの試薬に付属する取扱説明書に従って行った。結果を図１および図２に示す。試験した全ての細胞株において、５−ＡＺＡ処理によるＳＹＣＰ３の発現上昇が確認された。【００７０】
同様に、腎癌細胞株ＳＷ８３９、膀胱癌細胞株５６３７、肺腺癌細胞株ＬＣ２／Ａｄ、肺癌細胞株ＥＢＣ１、大腸癌細胞株ＨＴ−２９、肺癌細胞株Ｌｕ６５および口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳを５−ＡＺＡ存在下で培養し、ＧＡＰＤＨおよびＳＰＥＳＰ１（Applied Biosystems Hs00377364_m1）の遺伝子発現量を解析した。結果を図３および図４に示す。試験した全ての細胞株において、５−ＡＺＡ処理によるＳＰＥＳＰ１の発現上昇が確認された。【００７１】
同様に、マウス白血病細胞株ＷＥＨＩ−３（Ｂａｌｂ／ｃ）を５−ＡＺＡ存在下で培養し、マウスＧＡＰＤＨ（Applied Biosystems Mm99999915_g1）およびマウスＤＡＺＬ１（Applied Biosystems Mm01273546_m1）の遺伝子発現量を解析した。結果を図５に示す。ＷＥＨＩ−３において、５−ＡＺＡ処理によるＤＡＺＬ１の発現上昇が確認された。【００７２】
また、同様に５−ＡＺＡ処理したＥＢＣ１およびＬｕ６５におけるＳＹＣＰ３のタンパク質量をウェスタンブロッティングにより解析した。一次抗体として、２００倍希釈した抗ＳＹＣＰ３抗体（Mouse anti-SCP3、BD Bioscience 611230）を用いた。５−ＡＺＡ処理によるＳＹＣＰ３の発現上昇がタンパク質レベルにおいても確認された。【００７３】
マウス癌細胞株（Ｅ０７７１：Ｃ５７ＢＬ／６マウス乳がん細胞株およびＣ１４９８：Ｃ５７ＢＬ／６マウス急性骨髄性白血病細胞株）を５−ＡＺＡ（１０μＭ）で処理し、ＤＡＺＬ１のタンパク質量をウェスタンブロッティングにより解析した。両細胞株において、５−ＡＺＡによるＤＡＺＬ１の発現上昇が確認された。【００７４】
一方、癌細胞株ＥＢＣ１、Ｌｕ６５およびＨＴ−２９を、ＤＮＡ合成阻害剤であるゲムシタビンの存在下で培養し、ＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１およびＤＡＺＬ１の遺伝子発現量を解析すると、コントロールと同等の発現しか確認されなかった。従って、試験２で見られた各遺伝子の発現上昇は、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤に特有の効果であることが示唆される。【００７５】
試験３：免疫不全マウスを用いた５−ＡＺＡによるＳＹＣＰ３およびＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現上昇の確認
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１０〜１４週齢、日本チャールズリバー）に大腸癌細胞株であるＨＴ−２９（５ｘ１０５個）またはＷｉＤｒ（５ｘ１０５個）をマイジェクター（TERUMO SS_05M2913）にて皮内接種し、接種後５、１０、１５、および２０日目に５−ＡＺＡ（１.６μｇ／マウス体重ｇ）を含むＰＢＳ溶液をマイジェクターにて２００μＬ腹腔内投与した。コントロールには２００μＬのＰＢＳを腹腔内投与した。２５日目に５００μｇ／ｍＬのペントバルビタール（ナカライテスク 02095-04）を２００μＬ腹腔内投与することによってマウスを安楽死させ、腫瘍組織を解剖用ハサミ（野中理化器製作所  11301）にて切除しバイオマッシャーＩＩ（（株）ニッピ  320103）を用いて腫瘍組織を破砕後、試験２と同様にリアルタイムＰＣＲ法にてＳＹＣＰ３およびＧＡＰＤＨの遺伝子発現量を解析した。結果を図６に示す。ＰＢＳのみを投与したマウスに比べて、５−ＡＺＡを投与したマウスから回収した腫瘍組織においてＳＹＣＰ３遺伝子の発現上昇が確認された。【００７６】
同様に、ヌードマウスに肺癌細胞株であるＥＢＣ１（５ｘ１０５個）またはＬｕ６５（５ｘ１０５個）を皮内接種し、５−ＡＺＡまたはＰＢＳ（コントロール）を腹腔内投与した。２５日目に回収した腫瘍組織からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法にてＳＰＥＳＰ１およびＧＡＰＤＨの遺伝子発現量を解析した。結果を図７に示す。ＰＢＳのみを投与したマウスに比べて、５−ＡＺＡを投与したマウスから回収した腫瘍組織においてＳＰＥＳＰ１遺伝子の発現上昇が確認された。【００７７】
試験４：候補分子におけるＨＬＡ結合性アミノ酸配列領域の探索
試験１で選別されたタンパク質においてＨＬＡに対する結合能の高いアミノ酸配列を同定するために、コンピューターアルゴリズムを用いて、日本人および欧米人において発現頻度の高いHLA-DRB1*01:01（約１０％）、HLA-DRB1*04:05（約２５％）、HLA-DRB1*09:01（約２６％）、HLA-DRB1*15:01（約１５％）、HLA-DR53（６０％以上）の５種類に対する結合可能性について解析し、ＳＹＣＰ３−Ａ（配列番号８）、ＳＰＥＳＰ１−Ｂ（配列番号９）およびＤＡＺＬ−１Ｃ（配列番号２０）を含むアミノ酸配列を選別した。【００７８】
試験５：ＨＬＡ遺伝子組換えマウスを用いた候補アミノ酸配列の免疫活性化能の検討
HLA-A*02:01/DRB1*01:01遺伝子組み換えマウス（Ａ２.ＤＲ１−Ｔｇマウス、１０〜１６週齢；フランスパスツール研究所）にＳＹＣＰ３−Ａペプチド（Genscript社にて合成）を０日目と１０日目に１００μｇをＰＢＳ１００μＬに溶解させてマイジェクターを用いて皮内投与した。１５日目に５００μｇ／ｍＬのペントバルビタールを２００μＬ腹腔内投与することによってＡ２.ＤＲ１−Ｔｇマウスを安楽死させた後、開腹して所属リンパ節（ｄＬＮ）および脾臓を採取し、それぞれからリンパ球および脾臓細胞を分離した。【００７９】
３ｘ１０５個のリンパ球と５ｘ１０５個の脾臓細胞をELISPOTプレート（EMD Millipore、MAHAS4510）に加え、コントロールペプチド（ＳＹＣＰ３に含まれない配列を有する１５アミノ酸残基のペプチド）もしくは試験４で選別したＳＹＣＰ３−Ａペプチド存在下（３μｇ／ｍＬ）のもと、完全培地中、１５０μＬ／ウェルにて２４時間共培養した。ＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生細胞を検出するために、mouse IFN-γ ELISpot BASIC (ALP) キット（MABTECH 3321-2A）を用いてELISPOT法を行った。手順は付属の取扱説明書に従い、発色基質はBCIP-NBT-plus substrate for ELISpot（MABTECH 3650-10）を、各段階における洗浄はＰＢＳ−Ｔを用いた。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応であることを確認するために、一部の培養系には抗マウスＣＤ４抗体（BioLegend 100435）および抗マウスＣＤ８抗体（BioLegend 100735）を終濃度５μｇ／ｍＬとなるように加えた。【００８０】
結果を下表に示す。ＳＹＣＰ３−Ａペプチド刺激による特異的Ｔ細胞応答が確認された。この反応はＣＤ４に対する抗体によって阻害されたことから、ＣＤ４陽性Ｔ細胞による反応であることが確認された。
【表１】
0006857930.tif 000002
【００８１】
さらに、ＳＹＣＰ３−ＡペプチドにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応領域を同定するために、ＳＹＣＰ３−Ａペプチド配列内において１アミノ酸ずつずらした１２アミノ酸長の断片ペプチドを、Sigma-aldrichのPepscreenで合成した（下表）。
【表２】
0006857930.tif 000003
【００８２】
上記と同様、これらの断片ペプチドをワクチンしたＡ２.ＤＲ１−Ｔｇマウス由来のｄＬＮと脾臓から回収したリンパ球および脾臓細胞を２４時間刺激し、各断片ペプチド（３μｇ／ｍＬ）に対するＴ細胞応答をELISPOT法によって評価した。結果を図８に示す。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は断片ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４に対して反応することが確認された。このことから、ＳＹＣＰ３−Ａペプチド内のＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応領域は、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４に共通するアミノ酸配列ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱであることが示唆される。【００８３】
試験６：マウスを用いたＤＡＺＬ１候補アミノ酸ペプチドの免疫活性化能の検討
２匹のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、１０から１６週齢；Charles river）に、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ 関東化学株式会社 73111）に溶解したＤＡＺＬ−１Ｃペプチド（ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号２０）：Genscript社にて合成）を、０日目と１０日目にマイジェクター（TERUMO SS_05M2913）を用いて１００μｇ／５０μＬで皮内投与した。１２日目に５００μｇ／ｍＬのペントバルビタール（ナカライテスク 02095-04）を２００μＬ腹腔内投与することによってマウスを安楽死させた後、開腹して所属リンパ節（ｄＬＮ）および脾臓を採取し、それぞれからリンパ球および脾臓細胞を分離した。【００８４】
３ｘ１０５個のリンパ球と５ｘ１０５個の脾臓細胞を９６穴平底培養プレート（Falcon 353072）に加え、コントロールペプチドもしくはＤＡＺＬ１−Ｃペプチド存在下（２．５μｇ／ｍＬ）のもと、完全培地中、２００μＬ／ウェルにて２４時間共培養した。ＤＡＺＬ１−Ｃペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生を検出するために、２４時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡセット（BD Biosciences 551866）を用いて付属の取扱説明書に従って測定した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応であることを確認するために、一部の培養系には抗マウスＣＤ４抗体（aCD4; BioLegend 100435）および抗マウスＣＤ８抗体（aCD8; BioLegend 100735）を終濃度５μｇ／ｍＬで加えた。【００８５】
結果を図９に示す。ＤＡＺＬ−１Ｃペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生が抗ＣＤ４抗体によって阻害されたことから、ＤＡＺＬ−１ＣペプチドはマウスにおいてヘルパーＴ細胞活性化能を有することが明らかになった。【００８６】
試験７：健常人末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＳＹＣＰ３−ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチド特異的ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の誘導
健常人の末梢血からリンホプレップ（Alere Technologies AS  1114547）を用いた密度勾配分離法によってＰＢＭＣを回収した。ＰＢＭＣから磁気細胞分離システム（Miltenyi 130-050-201）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離し、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（peprotech AF-300-03）および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（peprotech AF-200-04）存在下で３ｍＬのヒト細胞用培地を用いて６穴培養プレート（Falcon 353046）にて７日間培養することによって樹状細胞（Dendritic Cells;ＤＣｓ）に分化させた。ヒト細胞用培地には、ＡＩＭ−Ｖ培地（ThermoFisher SCIENTIFIC 0870112DK）に５６℃、３０分非働化したヒトＡＢ型血清（Innovative RESEARCH IPLA-SERAB）を３％添加したものを用いた。また、ＰＢＭＣから同様にしてＣＤ４陽性Ｔ細胞（Miltenyi 130-045-101）を分離し、１ｘ１０５個のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＳＹＣＰ３−ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下で５ｘ１０４個のＤＣｓと９６穴平底培養プレート（Falcon 353072）にて２００μＬにて共培養を始めた。７日後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をペプチド刺激するために、１００μＬの培養上清を取り除いた後、ＳＹＣＰ３−ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチド（３μｇ／ｍＬ）とガンマ線照射（４０Ｇｙ）した不活化ＰＢＭＣ（２ｘ１０５個）を１００μＬにて培養プレートに追加した。その２日後に５０μＬの培養上清を取り除き、５０μＬのＩＬ−２（塩野義製薬 イムネース注35）を最終濃度が１０Ｕ／ｍＬになるように添加した。以後、活性化したＣＤ４陽性Ｔ細胞を持続的に増殖させるために、１週間おきにＳＹＣＰ３−ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチドと不活化ＰＢＭＣ（１ｘ１０６個）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞（１ｘ１０６個）を刺激し、以降に述べる各種実験を行った。【００８７】
試験８：ＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的ヘルパーＴ細胞株のＨＬＡ拘束性の検討
増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＳＹＣＰ３−Ａペプチドに対する特異的反応性を調べるために、ＳＹＣＰ３−Ａペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下で５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞と１ｘ１０５個のＰＢＭＣを２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ拘束性を調べるために、一部の培養系には抗ＤＲ抗体（BioLegend 307612）を、もしくは対照群として抗HLA-class I抗体（BioLegend 311412）を終濃度５μｇ／ｍＬになるように添加した。２４〜４８時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences  555142）を用いて付属の取扱説明書に従って測定した。【００８８】
結果を図１０に示す。試験した３名の健常人から複数のＳＹＣＰ３−Ａ特異的Ｔｈ細胞クローンが樹立された。これらのクローンにおいて、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ａＤＲ）を用いた場合にペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生が抑制されたことから、ＳＹＣＰ３−ＡペプチドはＨＬＡ−ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが確認された。【００８９】
さらに、拘束されるＨＬＡ型を調べるために、ＳＹＣＰ３−Ａペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下で５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞とＨＬＡ−ＤＲ４、ＤＲ８、ＤＲ９もしくはＤＲ５３の遺伝子が導入された３ｘ１０４個のマウス由来線維芽細胞株（Ｌ−ＤＲ４、Ｌ−ＤＲ８、Ｌ−ＤＲ９およびＬ−ＤＲ５３）を２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養し、上記と同様に２４〜４８時間後の培養上清のＩＦＮ−γ濃度を測定した。【００９０】
その結果、試験したすべてのＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的Ｔｈ細胞が特にＬ−ＤＲ５３細胞に強いペプチド特異的反応（ＩＮＦ−γの高い発現）を示すことが確認された。一方、ＳＹＣＰ３−Ａペプチドは、ＤＲ５３アレルを持たない検体でもある程度の反応性を示した。従って、ＤＲ５３以外のアレルにも効果があることが示唆される。【００９１】
さらに、ＳＹＣＰ３−Ａペプチドに対する最小認識配列を調べるために、３μｇ／ｍＬのＳＹＣＰ３−Ａペプチドの断片ペプチドＴ１〜Ｔ８（試験５参照）存在下で５ｘ１０４個のＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的Ｔｈ細胞（Healthy donor ３の細胞株ＩＤ番号＃１４）と、同一のドナーに由来する１ｘ１０５個のＰＢＭＣを２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。結果を図１１に示す。Ｔ３およびＴ４ペプチドに対して高いＩＦＮ−γ産生が確認された。このことから、このＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的Ｔｈ細胞の最小認識配列は、Ｔ３およびＴ４ペプチドに共通するＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳであると考えられる。【００９２】
同様の試験を、下表のペプチドを用いて行った。
【表３】
0006857930.tif 000004
【００９３】
結果を図１２に示す。いずれのペプチドでも高いＩＦＮ−γ産生が確認された。この結果は、最小認識配列のペプチドのＮ末端、Ｃ末端のどちらにアミノ酸が付加されていても、反応性が維持されることを示す。また、アセチル基の付加は反応性に影響を与えず、ペプチドが修飾されていてもよいことが示唆される。両クローンに反応性の差異は見られなかった。【００９４】
さらに、ＳＹＣＰ３−Ａの１１番目のＩをＶに置換したペプチド（配列番号３１）を用いて同様の実験を行ったところ、反応性に低下が認められなかった。ＳＹＣＰ３−Ａペプチド内のＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応領域に、ある程度のアミノ酸の変異が許容されることが示唆される。【００９５】
試験９：ＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチド特異的ヘルパーＴ細胞株のＨＬＡ拘束性の検討
試験８と同様に、但し、ＳＹＣＰ３−Ａペプチドの代わりにＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチドを用いて、培養上清のＩＦＮ−γ濃度を測定した。結果を図１３に示す。試験した１名の健常人から２種類のＳＰＥＳＰ１−Ｂ特異的Ｔｈ細胞クローン（ＨＫ１５、ＨＫ１８）が樹立された。これらのクローンにおいて、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ａＤＲ）を用いた場合にペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生が抑制されたことから、ＳＰＥＳＰ１−ＢペプチドはＨＬＡ−ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが確認された。また、試験８と同様にＬ−ＤＲ５３を用いた実験により、ＳＰＥＳＰ１−ＢはＨＬＡ−ＤＲ５３に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが確認された。【００９６】
また、これらのＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチド特異的Ｔｈ細胞のペプチドに対する反応性を調べるために、ＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチドの濃度を０.０００３〜３０μｇ／ｍＬに段階希釈してＴｈ細胞を刺激した。その結果、低濃度（０.０００３μｇ／ｍＬ）から十分なＩＦＮ−γ産生が示されることが確認された。【００９７】
試験１０：ＤＡＺＬ−１ペプチド特異的Ｔｈ細胞の誘導およびそのＨＬＡ拘束性の検討
試験７と同様に、但し、ＳＹＣＰ３−ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１−Ｂペプチドの代わりにＤＡＺＬ−１断片ペプチドｐ１１、ｐ１２またはｐ１３（表４）を用いて、ＤＡＺＬ−１ペプチド特異的Ｔｈ細胞を誘導した。
【表４】
0006857930.tif 000005
【００９８】
試験８と同様に、但し、ＳＹＣＰ３−Ａペプチドの代わりに、ＤＡＺＬ−１断片ペプチドｐ１１、ｐ１２またはｐ１３を用いて、培養上清のＩＦＮ−γ濃度を測定した。ＨＬＡ拘束性を調べるために、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体（SPV-L3：Abcam ab85614）および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（BRAFB6：Santa Cluz sc-33719）を用いた。結果を図１４に示す。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いた場合にペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生が抑制されたことから、これらのＤＡＺＬ−１断片ペプチドはＨＬＡ−ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが確認された。ｐ１３によるＩＦＮ−γ産生は抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体によっても抑制されたので、ＤＡＺＬ−１に由来するペプチドは幅広いＨＬＡに対して有効であると考えられる。【００９９】
また、試験８と同様に、Ｌ−ＤＲ４、Ｌ−ＤＲ８、Ｌ−ＤＲ９、Ｌ−ＤＲ１５およびＬ−ＤＲ５３を用いた実験により、ｐ１１はＨＬＡ−ＤＲ４／９／５３に結合し、ｐ１２はＨＬＡ−ＤＲ１５に結合し、ｐ１３はＨＬＡ−ＤＲ８に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが確認された。【０１００】
試験１１：ＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の癌細胞株に対する反応性の検討
ＳＹＣＰ３−Ａペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の癌細胞株に対する反応性を調べるために、ＤＲ５３陽性（ＷｉＤｒ、Ｌｕ６５、Ｃａｌｕ１）癌細胞株を選別した。各癌細胞株を、１０μＭの５−ＡＺＡとともに、癌細胞株の細胞表面上にＨＬＡクラスＩＩを発現させるための５００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ（塩野義製薬 イムノマックス−γ注５０）を含む２ｍＬの完全培地を用いて、６穴培養プレートにて３日間培養した。各癌細胞株の培養プレートをＰＢＳでよく洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸 ナカライテスク 14347-21）を１ｍＬ用いて各細胞株を遊離させ、各癌細胞株を回収した。試験８と同様に、１ｘ１０４個の各細胞株と５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞を２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。また、ＨＬＡ−ＤＲ依存的な反応性であることを調べるために培養系に抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を添加した。２４時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。【０１０１】
結果を図１５に示す。その結果、５−ＡＺＡ処理することによってＩＦＮ−γ産生の増強が認められた。このことから、ＳＹＣＰ３−Ａペプチドを用いて活性化されたＴｈ細胞は５−ＡＺＡ処理されたＤＲ５３陽性癌細胞株に対して効率的に反応することが確認された。【０１０２】
試験１２：免疫不全マウスにおけるＤＮＡメチル化阻害剤とＳＹＣＰ３特異的Ｔｈ細胞の腫瘍増殖抑制効果の検討
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１０〜１４週齢、日本チャールズリバー）に肺癌細胞株であるＬｕ６５（３ｘ１０６個）をマイジェクターにて皮内接種し、接種後７、１２、１７、および２２日目に５−ＡＺＡ（１５０ｎｍｏｌ／マウス体重ｇ）を含むＰＢＳ溶液をマイジェクターにて２００μＬ腹腔内投与した。コントロールには２００μＬのＰＢＳを腹腔内投与した。一方、接種後１３、２０、２７日目にＳＹＣＰ３特異的ヒトＴｈ細胞（３〜５ｘ１０６個）を２００μＬで尾静脈投与し、コントロールには２００μＬのＰＢＳを尾静脈投与した。腫瘍の表面積を継時的に測定した。結果を図１６に示す。５−ＡＺＡの単剤投与では効果は認められなかったが、ＳＹＣＰ３特異的ヒトＴｈ細胞との併用投与によって腫瘍増殖抑制効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本願で開示されるペプチドは、がん抗原特異的なヘルパーＴ細胞を活性化するので、がんワクチンとしての使用が期待される。当該ペプチドは、非常に高頻度に共有されているＨＬＡ−ＤＲ５３を含むＨＬＡに結合し、多くのがん患者に有用であると期待される。
【図１】
0006857930.tif 000006
【図２】
0006857930.tif 000007
【図３】
0006857930.tif 000008
【図４】
0006857930.tif 000009
【図５】
0006857930.tif 000010
【図６】
0006857930.tif 000011
【図７】
0006857930.tif 000012
【図８】
0006857930.tif 000013
【図９】
0006857930.tif 000014
【図１０】
0006857930.tif 000015
【図１１】
0006857930.tif 000016
【図１２】
0006857930.tif 000017
【図１３】
0006857930.tif 000018
【図１４】
0006857930.tif 000019
【図１５】
0006857930.tif 000020
【図１６】
0006857930.tif 000021
【図１７】
0006857930.tif 000022
【配列表】
0006857930000001.app