(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組み合わせ物であって、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化５】
0006906626.tif 000025
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化６】
0006906626.tif 000026
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組み合わせ物。
【請求項２】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組み合わせ物であって、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化７】
0006906626.tif 000027
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化８】
0006906626.tif 000028
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組み合わせ物。
【請求項３】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組み合わせ物であって、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化９】
0006906626.tif 000029
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１０】
0006906626.tif 000030
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組み合わせ物。
【請求項４】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組み合わせ物であって、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１１】
0006906626.tif 000031
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化１２】
0006906626.tif 000032
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組み合わせ物。
【請求項５】
前記ＡＣＣ阻害剤および前記ＦＸＲアゴニストが一緒に投与されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
前記ＡＣＣ阻害剤および前記ＦＸＲアゴニストが別々に投与されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
前記肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１３】
0006906626.tif 000033
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１４】
0006906626.tif 000034
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
【請求項９】
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１５】
0006906626.tif 000035
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化１６】
0006906626.tif 000036
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
【請求項１０】
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１７】
0006906626.tif 000037
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１８】
0006906626.tif 000038
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
【請求項１１】
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１９】
0006906626.tif 000039
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化２０】
0006906626.tif 000040
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
【請求項１２】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＡＣＣ阻害剤を含み、前記組成物はＦＸＲアゴニストを組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化５】
0006906626.tif 000041
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化６】
0006906626.tif 000042
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１３】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＦＸＲアゴニストを含み、前記組成物はＡＣＣ阻害剤を組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化６】
0006906626.tif 000043
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化５】
0006906626.tif 000044
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１４】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＡＣＣ阻害剤を含み、前記組成物はＦＸＲアゴニストを組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化７】
0006906626.tif 000045
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化８】
0006906626.tif 000046
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１５】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＦＸＲアゴニストを含み、前記組成物はＡＣＣ阻害剤を組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化８】
0006906626.tif 000047
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化７】
0006906626.tif 000048
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１６】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＡＣＣ阻害剤を含み、前記組成物はＦＸＲアゴニストを組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化９】
0006906626.tif 000049
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１０】
0006906626.tif 000050
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１７】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＦＸＲアゴニストを含み、前記組成物はＡＣＣ阻害剤を組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１０】
0006906626.tif 000051
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化９】
0006906626.tif 000052
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１８】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＡＣＣ阻害剤を含み、前記組成物はＦＸＲアゴニストを組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１１】
0006906626.tif 000053
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化１２】
0006906626.tif 000054
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【請求項１９】
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防するための組成物であって、ＦＸＲアゴニストを含み、前記組成物はＡＣＣ阻害剤を組み合わせて投与されることを特徴とし、前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化１２】
0006906626.tif 000055
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１１】
0006906626.tif 000056
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、肝疾患を予防および／または処置する方法に関する。
【０００２】
配列表
本出願と関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、ここに参照により明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、１２１２Ｐ３Ｃ＿２０１８−０３−２６＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。２０１８年３月２６日に作製されたテキストファイルは、サイズが２．３２ＫＢであり、ＥＦＳ−ウェブを通して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
肝疾患は、疾患の期間に基づいて急性または慢性と一般的に分類される。肝疾患は、感染、傷害、薬物または毒性の化合物、アルコール、食物中の不純物への曝露、および血液中の正常な物質の異常な蓄積、自己免疫過程、遺伝子欠損（ヘモクロマトーシスなど）または未知の原因（複数可）により引き起こされ得る。
【０００４】
肝疾患は、世界中で主要な死因である。詳細には、脂肪含有量の多い食事が、肝炎と驚くほど類似している方法で肝臓に損傷を与えることが知られている。米国肝臓協会は、人口の２０パーセントより多くが非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有すると推定する。肥満、不健康な食事および坐位のライフスタイルがＮＡＦＬＤの高い有病率に寄与することができることが示唆される。無処置のままだと、ＮＡＦＬＤは、重篤な有害作用を引き起こす非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に進行し得る。ＮＡＳＨが発生すると、それは時間とともに肝臓を膨潤および瘢痕化させる（すなわち、肝硬変）。
【０００５】
予備的報告はプラスのライフスタイル変化が肝損傷を予防または逆転させるかもしれないことを示唆するが、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの有効な医療処置はない。したがって、肝疾患を処置するための新しい有効な薬剤を提供する必要性がまだある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
それを必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤を治療的有効量のファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストと組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で開示される。肝疾患は、慢性および／または代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を限定されずに含む、任意の肝疾患であってよい。
【０００７】
ある特定の実施形態では、それを必要とする患者において非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
【０００８】
本明細書で提供される方法では、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、同時投与されてもよい。そのような実施形態では、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、単一の医薬組成物として一緒に投与されてもよいか、または複数の医薬組成物で別々に投与されてもよい。したがって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤および治療的有効量のＦＸＲアゴニストを含む医薬組成物も本明細書で提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化５】
0006906626.tif 000002
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化６】
0006906626.tif 000003
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目２)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化７】
0006906626.tif 000004
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化８】
0006906626.tif 000005
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目３)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化９】
0006906626.tif 000006
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１０】
0006906626.tif 000007
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目４)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１１】
0006906626.tif 000008
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化１２】
0006906626.tif 000009
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目５)
前記ＡＣＣ阻害剤および前記ＦＸＲアゴニストが一緒に投与される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記ＡＣＣ阻害剤および前記ＦＸＲアゴニストが別々に投与される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１３】
0006906626.tif 000010
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１４】
0006906626.tif 000011
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目９)
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１５】
0006906626.tif 000012
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化１６】
0006906626.tif 000013
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目１０)
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１７】
0006906626.tif 000014
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化１８】
0006906626.tif 000015
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目１１)
治療的有効量のＡＣＣ阻害剤、治療的有効量のＦＸＲアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって；前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）：
【化１９】
0006906626.tif 000016
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）：
【化２０】
0006906626.tif 000017
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、マウスＦＦＤモデルにおける肝臓トリグリセリドをμｍｏｌ／ｇで示す。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１０】
【図２】図２は、マウスＦＦＤモデルにおけるＡＬＴ  ＩＵ／Ｌを示す。（＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１１】
【図３】図３は、マウスＦＦＤモデルにおいて定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定された肝臓線維化遺伝子Ｃｏｌ１ａ１の肝臓発現を示す。（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１２】
【図４】図４は、マウスＦＦＤモデルにおいて定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定された肝臓線維化遺伝子Ｔｉｍｐ１の肝臓発現を示す。（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１３】
【図５】図５は、ラットＣＤＨＦＤモデルにおける定量的画像分析によるＰＳＲ陽性面積のパーセントを示す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定によりビヒクルと有意に異なる；＆ｐ＜０．００１、ｔ検定により処置開始から有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１４】
【図６】図６は、ラットＣＤＨＦＤモデルにおける定量的画像分析によるα−ＳＭＡ陽性面積のパーセントを示す。（＊＊ｐ＜０．０１、ｔ検定によりビヒクルと有意に異なる；＆ｐ＜０．００１、ｔ検定により処置開始から有意に異なる；＃ｐ＜０．０５、ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１５】
【図７】図７は、ラットＣＤＨＦＤモデルにおいてＥＬＩＳＡによって測定された血漿中のＴｉｍｐ１タンパク質を示す。（＊ｐ＜０．０５、ｔ検定によりビヒクルと有意に異なる；＆ｐ＜０．００１、ｔ検定により処置開始から有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１６】
【図８】図８は、ラットＣＤＨＦＤモデルにおいてＥＬＩＳＡによって測定された血漿中のヒアルロン酸（ＨＡ）を示す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定によりビヒクルと有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００１７】
【図９】図９は、ラットＣＤＨＦＤモデルにおいてＥＬＩＳＡによって測定された血漿中のＩＩＩ型コラーゲン（ＰＩＩＩＮＰ）のＮ末端プロペプチドを示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定によりビヒクルと有意に異なる；＆ｐ＜０．００１、ｔ検定により処置開始から有意に異なる；＃ｐ＜０．０５、ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義および一般パラメーター
本明細書で用いるように、以下の用語および語句は、それらが使用される文脈が別途示す場合を除き、一般的に下記のような意味を有するものである。
【００１９】
本明細書で用いるように、定量的測定との関連で使用される用語「約」は、指示量の±１０％、あるいは指示量の±５％もしくは±１％を意味する。
【００２０】
用語「薬学的に許容される塩」は、基礎となる化合物の生物学的効果および特性を保持し、生物学的にも他の点でも望ましくなくはない、本明細書で開示される化合物の塩を指す。酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）および塩基付加塩（ｂａｓｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）がある。薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機の酸で調製することができる。
【００２１】
薬学的に許容される塩（それぞれ、酸付加または塩基付加塩）を形成するための基礎となる化合物との反応に有益な酸および塩基は、当業者に公知である。同様に、基礎となる化合物（開示後）から薬学的に許容される塩を調製する方法は当業者に公知であり、例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７年１月、６６巻、１号、および他の出典で開示される。
【００２２】
本明細書で用いるように、「薬学的に許容される担体」には、賦形剤または作用物質、例えば、溶媒、希釈剤、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、ならびに開示される化合物にもその使用にも有害でないようなものなどが含まれる。薬学的に活性な物質の組成物を調製するためのそのような担体および作用物質の使用は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ  第１７版（１９８５年）；およびＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  第３版（Ｇ．Ｓ．  ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．  Ｒｈｏｄｅｓ編）を参照）。
【００２３】
用語「治療的有効量」および「有効量」は互換的に使用され、そのような処置を必要とする患者（例えば、ヒト）に１用量または複数用量で投与されるとき、下で規定される処置の実行に十分である化合物の量を指す。治療的有効量は、患者、処置される疾患、患者の体重および／もしくは年齢、疾患の重症度、または資格のある処方者もしくは介護者によって決定される投与様式によって異なる。
【００２４】
用語「処置」または「処置すること」は、以下の目的で化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを意味する：（ｉ）疾患の開始を遅延させること、すなわち、疾患の臨床症状を起こさせないことまたはその発生を遅延させること；（ｉｉ）疾患を抑制すること、すなわち、臨床症状の発生を阻止すること；および／または（ｉｉｉ）疾患を軽減すること、すなわち、臨床症状またはその重症度の退行を引き起こすこと。
【００２５】
肝疾患
肝疾患は、疾患の期間に基づく、肝臓への急性または慢性の損傷である。肝損傷は、感染、傷害、薬物または毒性化合物、例えばアルコールまたは食物中の不純物への曝露、血液中の正常な物質の異常な蓄積、自己免疫過程、遺伝子欠損（ヘモクロマトーシスなど）または他の未知の原因により引き起こされ得る。例示的な肝疾患には、限定されずに、肝硬変、肝臓線維症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪肝炎（ＡＳＨ）、肝臓虚血再かん流傷害、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）ならびにウイルス性およびアルコール性の肝炎を含む肝炎が含まれる。
【００２６】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールによって引き起こされない、肝臓細胞における余分な脂肪の蓄積である。ＮＡＦＬＤは、肝臓を膨潤させる（すなわち、脂肪肝炎）ことができ、それは次に時間とともに瘢痕化（すなわち、肝硬変）を引き起こすことができ、肝がんまたは肝不全に導くことができる。ＮＡＦＬＤは肝細胞における脂肪の蓄積によって特徴付けられ、メタボリックシンドロームの一部の態様（例えば、２型真性糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧）にしばしば関連している。この疾患の頻度は、炭水化物に富むおよび高脂肪の食事の消費のためにますます一般的になっている。ＮＡＦＬＤ患者のサブセット（約２０％）は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を起こす。
【００２７】
脂肪肝疾患のサブタイプであるＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤのより重度の形態である。それは、大滴性脂肪変性（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝細胞のバルーン変性（ｂａｌｌｏｏｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および／または肝臓の瘢痕化（すなわち、線維症）に最終的につながる炎症によって特徴付けられる。ＮＡＳＨと診断された患者は、進行したステージの肝臓線維症および最終的に肝硬変に進行する。末期疾患の肝硬変ＮＡＳＨ患者のための現在の処置は、肝移植である。
【００２８】
別の一般的な肝疾患は、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）である。それは、肝臓の内外の胆管に徐々に損傷を与える、慢性または長期の肝疾患である。ＰＳＣ患者では、ブロックされた胆管により胆汁が肝臓に蓄積し、そこでそれは徐々に肝臓細胞に損傷を与え、肝硬変または肝臓の瘢痕化を引き起こす。現在では、ＰＳＣを治癒させる有効な処置がない。ＰＳＣを有する多くの患者は、疾患を診断されてから一般的に約１０年後に、肝不全のために肝移植を最終的に必要とする。ＰＳＣは、胆管がんにつながることもある。
【００２９】
肝臓線維症は、ほとんどのタイプの慢性肝疾患において起こる、コラーゲンを含む細胞外マトリクスタンパク質の過剰な蓄積である。進行した肝臓線維症は肝硬変、肝不全および門脈圧亢進をもたらし、肝移植をしばしば必要とする。
【００３０】
方法
それを必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で開示される。活動的な肝疾患の存在は、血液中の高い酵素レベルの存在によって検出することができる。具体的には、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の臨床的に容認された正常範囲より上の血中レベルは、進行中の肝損傷を示すことが知られている。医療処置の間の肝疾患の進行を測定するために、ＡＬＴおよびＡＳＴの血中レベルのための肝疾患患者の慣用的なモニタリングが臨床で使用される。高いＡＬＴおよびＡＳＴの容認された正常範囲内へ低減は、患者の進行中の肝損傷の重症度の低減を反映する臨床エビデンスとしてとられる。
【００３１】
ある特定の実施形態では、肝疾患は慢性肝疾患である。慢性肝疾患は肝実質の進行性の破壊および再生を含み、線維症および肝硬変につながる。一般に、慢性肝疾患は、ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）など）、有毒な薬剤または薬物（アルコール、メトトレキセートまたはニトロフラントインなど）、代謝疾患（非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、ヘモクロマトーシスまたはウイルソン病など）、自己免疫性疾患（例えば、自己免疫性慢性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（以前には原発性胆汁性肝硬変として知られる）または原発性硬化性胆管炎、または他の原因（右心不全など）により引き起こされ得る。
【００３２】
一実施形態では、肝硬変のレベルを低減させる方法が本明細書で提供される。一実施形態では、肝硬変は、線維症および結節性再生を伴う、正常な顕微鏡的小葉構造の喪失によって病理学的に特徴付けられる。肝硬変の程度を測定する方法は、当技術分野で周知である。一実施形態では、肝硬変のレベルは、約５％から約１００％低減される。一実施形態では、肝硬変のレベルは、被験体において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、肝疾患は、代謝性肝疾患である。一実施形態では、肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドローム（肥満、複合高脂血症、真性糖尿病（ＩＩ型）および高血圧）と関連する。ＮＡＦＬＤは、一連の疾患活動を包含すると考えられ、肝臓における脂肪蓄積（肝臓脂肪症）として始まる。
【００３４】
肥満およびインスリン抵抗性が、おそらくＮＡＦＬＤの疾患過程において強力な役割を演ずることが示されている。劣った食事に加えて、ＮＡＦＬＤはいくつかの他の公知の原因を有する。例えば、ＮＡＦＬＤは、ある特定の医薬品、例えばアミオダロン、抗ウイルス薬（例えば、ヌクレオシド類似体）、アスピリン（稀に小児におけるライエ症候群の部分として）、コルチコステロイド、メトトレキセート、タモキシフェンまたはテトラサイクリンにより引き起こされ得る。腹部における脂肪の堆積の増加を引き起こすことができる高フルクトースコーンシロップの存在を通して、ＮＡＦＬＤはソフトドリンクの消費にも関連づけられているが、スクロースの消費は（おそらくフルクトースへのその分解のために）類似の作用を示す。この感受性に関する２つの遺伝子変異が同定されているので、遺伝的特質も一役を担うことが知られている。
【００３５】
無処置のままだと、ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に発達することができ、それは、脂肪症が炎症および線維症と合併した状態である、ＮＡＦＬＤの最も極度の形態である。ＮＡＳＨは、肝臓の肝硬変の主因と考えられている。したがって、それを必要とする患者において非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
【００３６】
それを必要とする患者において肝臓線維症を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて患者に投与することを含む方法も本明細書で提供される。肝臓線維症は、ほとんどのタイプの慢性肝疾患において起こる、コラーゲンを含む細胞外マトリクスタンパク質の過剰な蓄積である。ある特定の実施形態では、進行した肝臓線維症は、肝硬変および肝不全をもたらす。肝臓組織学、例えば線維症の程度の変化、小葉の肝炎および門脈周囲の架橋状壊死を測定するための方法は、当技術分野で周知である。
【００３７】
一実施形態では、線維組織の形成、フィブロイドまたは線維の変性である肝臓線維症のレベルは、約９０％より多く低減される。一実施形態では、線維組織の形成、フィブロイドまたは線維の変性である線維症のレベルは、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％または少なくとも約２％低減される。
【００３８】
一実施形態では、本明細書で提供される化合物は、肝臓における線維形成のレベルを低減する。肝臓の線維形成は、線維症として知られる、肝臓における過剰の細胞外マトリクス構成成分の堆積につながる過程である。それは、いくつかの状態、例えば、慢性のウイルス性Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、アルコール性肝疾患、薬物性肝疾患、ヘモクロマトーシス、自己免疫肝炎、ウイルソン病、原発性胆汁性胆管炎（以前は原発性胆汁性肝硬変として知られる）、硬化性胆管炎、肝臓住血吸虫病および他の状態で観察される。一実施形態では、線維形成のレベルは、約９０％より多く低減される。一実施形態では、線維形成のレベルは、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％または少なくとも２％低減される。
【００３９】
さらに他の実施形態では、それを必要とする患者において原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を治療的有効量のＦＸＲアゴニストと組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
【００４０】
ＮＡＳＨを有する患者は健康な患者より平均して約２．８歳高齢であることが後成的試験で観察されている。したがって、一実施形態では、ＮＡＳＨの処置のために有用な化合物は、ＮＡＳＨによる後成的年齢または加齢の影響を減速する、改善する、または逆転させるために有用だろう。別の実施形態では、ＮＡＳＨの処置のための併用療法、例えば、本明細書に開示されるＡＣＣ阻害剤のＦＸＲアゴニストとの組み合わせは、ＮＡＳＨによる加齢の影響の改善または逆転のために有用である可能性がある。
【００４１】
一実施形態では、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、組み合わせ製剤において一緒に、または別個の医薬組成物で投与することができ、ここで各阻害剤を任意の適する剤形で製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＡＣＣ阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物ならびにＦＸＲアゴニストおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を別々に投与することを含む。本開示による組み合わせ製剤は、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤および必要に応じて他の治療剤と一緒に含む。有効成分を含有する組み合わせ製剤は、意図された投与方法に適するいかなる形態であってもよい。
【００４２】
ＡＣＣ阻害剤
本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）の構造を有する化合物：
【化１】
0006906626.tif 000018
または薬学的に許容されるその塩である。
【００４３】
本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）の構造を有する化合物：
【化２】
0006906626.tif 000019
または薬学的に許容されるその塩である。
【００４４】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物は、当業者に公知である方法、例えば、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２０１３／０７１１６９に記載されるものを使用して合成することおよび特徴付けることができる。一実施形態では、ＡＣＣ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩である。一実施形態では、ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物または薬学的に許容されるその塩である。
【００４５】
ＦＸＲアゴニスト
本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＩＩ）の構造を有する化合物：
【化３】
0006906626.tif 000020
または薬学的に許容されるその塩である。
【００４６】
本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＦＸＲアゴニストは、式（ＩＶ）の構造を有する化合物：
【化４】
0006906626.tif 000021
または薬学的に許容されるその塩である。
【００４７】
式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）の化合物は、当業者に公知である方法、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２２１６５９号に記載されるものを使用して合成することおよび特徴付けることができる。
【００４８】
投薬および投与
有効成分は単独で投与することが可能であるが、下記のように医薬製剤または医薬組成物としてそれらを提供することが好ましいかもしれない。獣医学およびヒトでの使用のための本開示の製剤は、有効成分の少なくとも１つを、そのための１つまたは複数の許容される担体、および必要に応じて他の治療成分と一緒に含む。担体（複数可）は、製剤の他の成分に適合するという意味、およびそのレシピエントにとって生理的に無害であるという意味において「許容」されなければならない。
【００４９】
有効成分の各々は従来の担体および賦形剤で製剤化することができ、それらは通常の実施に従って選択される。錠剤は、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、充填剤、結合剤などを含有することができる。水性製剤は無菌形態で調製され、経口投与以外による送達が意図される場合には、一般的に等張性である。全ての製剤は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９８６年）に示されるものなどの賦形剤を必要に応じて含有する。賦形剤には、アスコルビン酸および他の抗酸化剤、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、炭水化物、例えばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、ステアリン酸などが含まれる。製剤のｐＨは、約３から約１１の範囲内であるが、通常は約７から１０である。
【００５０】
有効成分の治療的有効量は、従来の用量漸増研究を使用して、熟練した臨床医が容易に決定することができる。一般的に、各有効成分は、０．０１ミリグラムから１グラムまでの用量で投与される。一実施形態では、投薬量は、約１０ミリグラムから４５０ミリグラムまでである。別の実施形態では、投薬量は、約２５から約２５０ミリグラムまでである。別の実施形態では、投薬量は、約５０または１００ミリグラムである。一実施形態では、投薬量は、約１００ミリグラムである。一実施形態では、２０ｍｇのＡＣＣ阻害剤が投与される。具体的な実施形態では、２０ｍｇの式（ＩＩ）の化合物が投与される。一実施形態では、３０ｍｇのＦＸＲアゴニストが投与される。具体的な実施形態では、３０ｍｇの式（ＩＩＩ）の化合物が投与される。有効成分は、１日につき１回、２回または３回投与することができることが意図される。さらに、有効成分は、週１回もしくは２回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回または６週に１回投与することができる。
【００５１】
有効成分のための医薬組成物には、上述の投与経路に適するものを含めることができる。製剤は単位剤形で都合よく提供することができ、薬学分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。技術および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に一般的に見出される。そのような方法は、有効成分を１つまたは複数の副成分を構成する担体と合わせるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体または微粉固体担体または両方と均一および緊密に合わせ、次に、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００５２】
経口投与に適する製剤は、有効成分の所定量を各々含有するカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤などの個別の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物として；または、水中油型の液体乳剤もしくは油中水型の液体乳剤として提供することができる。有効成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。ある特定の実施形態では、有効成分は、皮下注射として投与されてもよい。
【００５３】
錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の副成分と一緒に、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤または界面活性剤と必要に応じて混合した、粉末または顆粒などの易流動性の形態の有効成分を適する機械の中で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿らせた粉末化有効成分の混合物を適する機械の中で成形することによって作製することができる。錠剤は、必要に応じてコーティングすることまたは刻みを付けることができ、必要に応じてそこからの有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化される。
【００５４】
有効成分は、状態に適当な任意の経路によって投与することができる。適する経路には、経口、直腸、経鼻、局所（口内および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）などが含まれる。好ましい経路は、例えばレシピエントの状態によって異なってもよいことが理解される。ある特定の実施形態では、有効成分は経口で生体利用可能であり、したがって、経口的に投薬することができる。一実施形態では、患者はヒトである。
【００５５】
本明細書で開示される方法において組み合わせで使用されるとき、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、単一の医薬組成物、例えば固定された用量の組み合わせで一緒に、または複数の医薬組成物で別々に（同時または逐次的に）投与することができる。ある特定の実施形態では、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、一緒に投与される。他の実施形態では、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、別々に投与される。一部の態様では、ＡＣＣ阻害剤は、ＦＸＲアゴニストの前に投与される。一部の態様では、ＦＸＲアゴニストは、ＡＣＣ阻害剤の前に投与される。別々に投与されるとき、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストは、同じまたは異なる送達経路によって患者に投与することができる。
【００５６】
医薬組成物
本開示の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される有効量のＡＣＣ阻害剤、ならびに式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＶ）の化合物または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される有効量のＦＸＲアゴニストを含む。
【００５７】
例えば経口使用のために使用されるとき、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁物、分散性の粉末もしくは顆粒、乳剤、ハードもしくはソフトカプセル、シロップ剤またはエリキシル剤を調製することができる。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができ、そのような組成物は、口に合う調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤を含む、１つまたは複数の作用物質を含有することができる。錠剤の製造のために適する無毒の薬学的に許容される賦形剤と混合された有効成分を含有する錠剤が、許容される。これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤、例えば、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、ラクトース一水和物、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒化および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えば、セルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；ならびに、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってよい。錠剤はコーティングされなくてもよく、または、胃腸管で崩壊および吸着を遅延させ、それによってより長い期間の持続作用を提供するために、マイクロカプセル化を含む公知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、時間遅延材料（ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独で、またはワックスと一緒に用いることができる。
【００５８】
経口使用のための製剤は、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えばリン酸カルシウムもしくはカオリンと混合されるハードゼラチンカプセルとして、または、有効成分が水もしくは油媒体、例えば落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合されるソフトゼラチンカプセルとして提供することもできる。
【００５９】
本開示の水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適する賦形剤と混合させた活性材料を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、ならびに、分散または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。水性懸濁物は、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つまたは複数の保存剤、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の矯味矯臭剤、および例えばスクロースまたはサッカリンなどの１つまたは複数の甘味剤を含むこともできる。
【００６０】
植物油、例えば落花生油、オリーブ油、胡麻油もしくはヤシ油に、または例えば流動パラフィンなどの鉱油に有効成分を懸濁することによって、油性懸濁物を製剤化することができる。油性懸濁物は、例えば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。口に合う経口調製物を提供するために、例えば上に示すものなどの甘味剤、および矯味矯臭剤を添加することができる。これらの組成物は、例えばアスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存することができる。
【００６１】
水の添加による水性懸濁物の調製に適する本開示の分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の保存剤と混合させた有効成分を提供する。適する分散剤または湿潤剤、および懸濁剤は、上で開示されるものによって例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤が存在してもよい。
【００６２】
本開示の医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、例えばオリーブ油または落花生油などの植物油、例えば流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの混合物であってよい。適する乳化剤には、天然に存在するゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズレシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびにエチレンオキシドとのこれらの部分エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが含まれる。乳剤は、甘味剤および矯味矯臭剤を含有することもできる。シロップ剤およびエリキシル剤は、例えばグリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤で製剤化することができる。そのような製剤は、粘滑薬、保存剤、矯味矯臭剤または着色剤を含有することもできる。
【００６３】
本開示の医薬組成物は、例えば無菌の注射可能な水性または油性の懸濁物などの、無菌の注射可能な調製物の形態であってよい。この懸濁物は、上で言及されている適する分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の技術によって製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液などの無毒の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注射可能な溶液もしくは懸濁物であってもよいか、または凍結乾燥粉末として調製されてもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒または懸濁媒体として、無菌の不揮発性油を従来通り用いることができる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。さらに、注射剤の調製において、例えばオレイン酸などの脂肪酸を同様に使用することができる。
【００６４】
単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置する宿主および特定の投与様式、例えば経口投与または皮下注射によって異なる。例えば、ヒトへの経口投与のために意図される時限放出製剤は、概ね１から１０００ｍｇの活性材料を、全組成物の約５から約９５％（重量：重量）まで変動してよい適当な、および好都合な量の担体材料と混合されて含有することができる。投与のために容易に測定可能な量を提供するように、医薬組成物を調製することができる。例えば、約３０ｍＬ／時間の速度での適する体積の注入ができるように、静脈内注入のために意図される水溶液は、溶液１ミリリットルにつき約３から５００μｇの有効成分を含有することができる。皮下投与のために製剤化されるとき、製剤は、一般的に約２から約４カ月の期間にわたって１カ月につき約２回投与される。
【００６５】
非経口投与のために適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる、水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。
【００６６】
製剤は、単位用量または多回用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液および懸濁物は、前記の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単位投薬製剤は、本明細書で上に挙げたような、有効成分の１日用量または単位１日部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適当な部分を含有するものである。
【実施例】
【００６７】
（実施例１  ＮＡＳＨのマウスモデルにおける有効性）
以下の研究は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）のマウスモデルにおいて、モデルにおける単独の個々の薬剤の有効性と比較した、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストの組み合わせの有効性を評価するために実行した。ＮＡＳＨは、合計６カ月間の飽和脂肪、コレステロールおよび糖分の高い「ファーストフード」食（ＦＦＤ）の慢性投与によって雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導し、痩せ型（ｌｅａｎ）対照動物は、通常の固形飼料食で維持した。ＮＡＳＨ表現型は６カ月後に対照マウスと比較してＦＦＤマウスにおいて確立され、大滴性脂肪変性、高いＡＬＴおよびＡＳＴ、ならびに肝臓星細胞の活性化に関連した転写物の増加したレベルによって特徴付けられた。Ｃｈａｒｌｔｏｎ  Ｍら、「Ｆａｓｔ  ｆｏｏｄ  ｄｉｅｔ  ｍｏｕｓｅ：  ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＮＡＳＨ  ｗｉｔｈ  ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ，  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ」。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ。Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２０１１年；３０１巻（５号）：Ｇ８２５〜３４頁を参照。
【００６８】
５カ月後、ＦＦＤマウスをプラセボ（ビヒクル）、ＡＣＣ阻害剤（式（Ｉ））、ＦＸＲアゴニスト（式（ＩＩＩ））または式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の組み合わせによってその後１カ月間処置した。対照マウスは、６カ月の全試験期間の間、通常の固形飼料食のままであった。エンドポイント分析は、肝臓トリグリセリド、血漿中ＡＬＴの生化学的定量化、ならびに肝臓における線維症促進転写物Ｔｉｍｐ１およびＣｏｌ１Ａ１の測定を含んだ。
【００６９】
方法
動物
この研究では、雄Ｃ５７ＣＬ／６マウス（試験開始時１２週齢）を使用した。動物を試験するために使用した全ての手順は、米国農務省のＡｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ（９ＣＦＲパート１、２および３）；Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）；およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅに従った。
【００７０】
ＦＦＤマウスモデルのための生存中の実験プロトコール
実験設計を、表１に示す。試験動物に、標準の固形飼料食（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔｓ  ２０１４、ＴＤ２０１４）または市販されている高脂肪、高コレステロール食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ、ＤＢ１２０７９Ｂ）（ＦＦＤ）を投与した。ＦＦＤを受けた動物は、以下の通りに配合された飲料水中のフルクトース／グルコースを投与された：２３．１ｇフルクトース（Ｓｉｇｍａ、Ｆ２５４３）および１７．２ｇのグルコース（Ｓｉｇｍａ、４９１５８）を、１０００ｍＬの飲料水に混合した。
【００７１】
研究の最終月の間（５カ月目〜６カ月目）、式（Ｉ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物を単独で、または式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせを投与した。式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、逆浸透水中の０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（中間粘度）、１ｗ／ｗ％エタノール、９８．５ｗ／ｗ％の５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８、に製剤化した。式（Ｉ）の化合物は０．１または０．２ｍｇ／ｍＬで製剤化し、表１に提供した用量で与え、式（ＩＩＩ）の化合物は２ｍｇ／ｍＬで製剤化し、表１に提供した用量で与えた。
【００７２】
ＰＯ投薬の７日前に開始して、群１〜６の動物は、１日２回ビヒクルを偽投薬した。偽投薬は、動物を経口胃管栄養用量投与に順応させるように設計されていた。試験の１日目に開始して、全ての用量群の動物は、１日に３回投薬した；化合物を含有しない製剤（群１、ビヒクル）または下で（表１）概説される適当な化合物を含有する同じ体積の製剤を、ＡＭ（７：００＋／−１時間）に２回逐次的に、および夕方（１９：００＋／−１時間）に１回、２８日間（２９日目の投薬まで）。各群を２つに分け、２９日目に半分は用量の２時間後に屠殺し、半分は用量の８時間後に屠殺した。
【表１】
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【００７３】
マウスの肝臓からのトリグリセリドの定量化
【００７４】
組織抽出：マウス肝臓組織試料（２５±１０ｍｇ、凍結状態で正確に秤量する）をホモジナイズし、トリアシルグリセリド分画ならびに遊離のおよびエステル化されたコレステロール分画を有機相に抽出する水不混和性の有機溶媒混合物で抽出した。遠心分離の後、トリアシルグリセリド、コレステロールおよびコレステロールエステルを含有する有機上層のアリコートを、エタノールで１０倍または２５倍に希釈した。この希釈物の２つの別個のアリコートをとった。１つのアリコートはトリアシルグリセリドについて分析し、第２のアリコートは全コレステロール決定のために使用した。
【００７５】
トリアシルグリセリド決定：トリアシルグリセリド決定のために、２５倍希釈物（または、低トリアシルグリセリド含有量を有する試料の場合は希釈なし）の１つのアリコートは、窒素ストリームの下で蒸発させた。乾燥抽出物は、超音波処理の下でのＰＢＳ溶液中の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで、続いてトリアシルグリセリド決定試薬（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）トリグリセリド液体安定試薬、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品データシート、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）、トリグリセリド液体安定試薬）との混合によって段階的に再構成した。
【００７６】
この試薬溶液は、いくつかの酵素、補因子および発色試薬４−アミノアンチピリンを含有した。この試薬によるトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）の決定は、以下の通り、Ｗａｋｏ、製品データシート、トリアシルグリセリド−ＧコードＮｏ．９９７−６９８０１、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、の方法、ならびにＭｃＧｏｗａｎら（ＭｃＧｏｗａｎ，  ＭＷら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ１９８３年：２９巻：５３８頁）およびＦｏｓｓａｔｉら（Ｆｏｓｓｅｔｉ，  Ｐ．  Ｐｒｅｎｃｉｐｌｅ  Ｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９８２年：２８巻：２０７７〜８０頁）による改変に基づいた：
１．トリグリセリドは、リパーゼによって遊離脂肪酸およびグリセロールに酵素的に加水分解される。
２．グリセロールは、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）を用いてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によってリン酸化され、グリセロール−３−リン酸およびアデノシン二リン酸を生成する。
３．グリセロール−３−リン酸はグリセロールリン酸オキシダーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡＰ）によって酸化され、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する。
４．ペルオキシダーゼによって触媒されるＴｒｉｎｄｅｒ５タイプの呈色反応では、Ｈ２Ｏ２は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）および３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート（ＤＨＢＳ）と反応して、赤色色素を生成する。この色素の吸光度は、試料中に存在するトリグリセリドの濃度に比例する。
【００７７】
３７℃で３０分間のトリアシルグリセリド決定試薬とのインキュベーションの後、試料をマイクロタイタープレートに移し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で吸光度を５４０ｎｍで測定する。定量化は、トリアシルグリセリド参照標準としてグリセリルトリオレエート（トリオレイン）を使用した、強化された較正標準から生成された線形最小二乗回帰分析を使用して実行した。較正標準試料は、組織試料と同じ抽出およびインキュベーションステップを通してとった。重量補正および濃度計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２０１３を使用して実行した。最終組織含有量は、肝臓組織１ｇあたりのμｍｏｌトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）で与えられた。
【００７８】
ＡＬＴ
末期の剖検で血清を全てのマウスから収集した。血清ＡＬＴは、ピリドキサール−５’−リン酸によってピルビン酸塩によって測定し、Ｃｏｂａｓ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ６０００  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓで分析した。
【００７９】
遺伝子発現
溶解およびＲＮＡ抽出のために、凍結左側葉の概ね１００ｍｇのかたまりを、ＤＣ３  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣに送った。ＲＮＡ転写物を測定するために、ｎＣｏｕｎｔｅｒマスターキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）に含まれる全試薬および消耗品でＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイを製造業者の指示に従って実行した。簡潔には、１１０個の肝臓線維症関連遺伝子および６つの対照ハウスキーピング遺伝子（表２）を標的にするカラーコードリポータープローブを、予熱した６５℃サーモサイクラーの中でハイブリダイゼーション緩衝液および捕捉プローブを含む反応において１００ｎｇのＲＮＡ試料と１６から２２時間、一晩ハイブリダイズさせた。インキュベーションの後、試料をプレップステーションに置き、そこでは、過剰なプローブを除去し、プローブ−転写物複合体をストレプトアビジンでコーティングされたカートリッジの上に固定化した。最後に、カートリッジをｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）で画像化した。全ての転写物は、ｎＳｏｖｅｒ  ３．０ソフトウェアによって６つのハウスキーピング遺伝子（Ｂ２ｍ、Ｈｐｒｔ、Ｐｇｋ１、Ｒｐｌ１３ａ、Ｒｐｎ１およびＳｆｒｓ４）の幾何平均に正規化した。
【表２】
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【００８０】
結果
実施例１は、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを組み合わせた処置が、ＮＡＳＨのマウスモデルにおいて単独で投与されるいずれの薬剤より大きな有効性をもたらすことを実証する。詳細には、図１は、個々の薬剤と比較して式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせによる肝臓トリグリセリドの有意な低減を示し、図２は、個々の薬剤と比較して式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせによる血清ＡＬＴの有意な低減を示し、図３および図４は、個々の薬剤と比較して式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせによるＣｏｌ１ａ１およびＴｉｍｐ１の肝臓発現の有意な低減をそれぞれ示す。
【００８１】
（実施例２  ＮＡＳＨのラットモデルにおける有効性）
以下の研究は、線維症を伴う非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）のげっ歯動物モデルにおいて、モデルにおける単独の個々の薬剤の有効性と比較した、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストの組み合わせの有効性を評価するために実行した。このモデルでは、線維症を伴うＮＡＳＨは、コリン欠乏高脂肪食（ＣＤＨＦＤ）の投与によって雄ウィスターラットにおいて誘導した。
【００８２】
動物
雄ウィスター（Ｃｒｌ：Ｗｉ（Ｈａｎ））ラット（到着時８〜９週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから得て、現在の研究で使用した。この研究は、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ規則（連邦行政命令集、タイトル９）の最終規則の全ての適用可能なセクション、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  ＷｅｌｆａｒｅからのＰｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｕｎｃｉｌからのＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従った。
【００８３】
ビヒクル調製
脱イオン水の中のビヒクル、ｗ／ｖ５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８を使用前に調製し、２〜８℃を維持するように設定した冷蔵庫に保存した。１Ｌを調製するために、８００ｍＬの熱水（約８０℃）を適当な容器に加え、激しい渦が形成されるまで激しく撹拌した。５．０グラムのメチルセルロースナトリウムをボルテックスで撹拌しながらカルボキシメチルセルロースナトリウムに徐々に加えた。全てのカルボキシメチルセルロースが溶解するまで撹拌を継続し、溶液を周囲温度まで冷却した。５．１２ｇのトリスＨＣｌを、容器に加えた。２．１２ｇのトリス塩基を、容器に加えた。１０ｇのエタノールを、容器に加えた。構成成分を概ね１５分間撹拌して、全ての固体を確実に溶解した。弱く混合しながら、ＱＳ水を１Ｌまで加えた。
【００８４】
試験設計
食事は自由摂食とし、表３に概説したように、標準食（５ＣＲ４）を受けた群１、対照固形飼料群を除いて、試験の１日目に全ての試験動物はコリン欠乏、高脂肪、高コレステロール食（ＣＤＨＦＤ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ａ１６０９２００３）を与えられた。屠殺の日、肝臓を採取してパラフィン包埋し、血漿を収集して冷凍した。屠殺日に、動物は投薬されなかった。
【表３】
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【００８５】
組織はＲｅｎｏ、ＮｅｖａｄａのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒによって収集され、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡのＨｉｓｔｏ−ｔｅｃにおいて処理およびパラフィン包埋され、その後Ｆｏｓｔｅｒ  ＣｉｔｙのＧｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに送付された。試料は５μｍの切片にし、以降の染色のために切片をガラススライドの上にマウントした。
【００８６】
ピクロシリウスレッド染色：切片は０．２％リンモリブデン酸（ＥＭＳ、Ｃａｔ＃２６３５７−０１）で前処理し、次に室温で１時間、飽和ピクリン酸溶液（ＥＭＳ、Ｃａｔ＃２６３５７−０２）の中の０．１％（ｗ／ｖ）Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  ８８−８９−１にその後インキュベートした。これの後に、０．０１Ｎ  ＨＣｌ（ＥＭＳ、Ｃａｔ＃２６３５７）の中での分染および段階的なアルコールでの脱水が続いた。
【００８７】
ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色スライドの全スライド画像を、ライカＡＴ２スキャナを４０×倍率で使用して捕捉した。デジタルスライド画像をスキャン品質についてチェックし、注釈を付け、ライカデジタル画像ハブアーカイブの中の適当なネットワークフォルダにエクスポートした。ＰＳＲの程度および強度を決定するために、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像分析ソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して全スライド画像の上で定量的画像分析を実行した。ＰＳＲで染色された全面積を測定し、染色された肝臓全面積の百分率で表した。結果を、図７に示す。
【００８８】
α−ＳＭＡ：各々５分間のキシレンの３回の交換で切片を脱パラフィンし、その後、各々３分間の１００％ＥｔＯＨの３回の交換、９５％ＥｔＯＨの１回の交換、８０％ＥｔＯＨの１回の交換；続いて蒸留水での逐次的な２回のリンスで再湿潤化させた。切片は、次にＰｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ  １（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＰＸ９６８）内因性ペルオキシダーゼブロッカーの中で５分間インキュベートし、蒸留水でリンスした。Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＮｘＧｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＤＣ２０１２）でＲｅｖｅａｌ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＲＶ１０００Ｍ）を使用して９５℃で４０分間熱誘導エピトープ回復を次に実行し、続いて、回復緩衝液の蒸留水との交換によって徐々に冷却し、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）の中に置いた。以下のステップにより、Ｉｎｔｅｌｌｉｐａｔｈ  ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＩＰＳ０００１）を使用して調製スライドの上で免疫組織化学を実行した：
１．  ３００μＬのＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｐｕｎｉｓｈｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＩＰ９７４Ｇ２０）をスライドに適用して１０分間インキュベートし；ＴＢＳ洗浄がそれに続く。
２．  Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｇｒｅｅｎ希釈剤（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＰＤ９００Ｌ）に１：５０に希釈した、マウスモノクローナルＳＭＡ、クローン１Ａ４の一次抗体（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＣＭ００１）３００μＬを適用する。室温で３０分間インキュベートし；ＴＢＳ洗浄がそれに続く。
３．  Ｍｏｕｓｅ  ｏｎ  Ｒａｔ  ＨＲＰポリマー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＭＲＴ６２１Ｈ）３００μＬを適用し、３０分間インキュベートし；ＴＢＳ洗浄がそれに続く。
４．  ＤＳＢの調製：１滴のＤＳＢ色素原／１ｍｌの基質緩衝液（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、それぞれＣａｔ＃ＢＲＩ４０１４Ｃ／ＢＲＩ４０１３）。３００μＬのＤｅｅｐ  Ｓｐａｃｅ  Ｂｌａｃｋ（ＤＳＢ）色素原を５分間適用し；蒸留水洗浄がそれに続く。
５．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃａｔ＃ＳＴＮＦＲＬＴ）で１分間対比染色し；蒸留水洗浄がそれに続く。
【００８９】
スライドを機器から取り出し、組織学グレードの段階的アルコールからキシレンまでの系列を通して脱水し、カバーガラスを載せた。
【００９０】
α−ＳＭＡ染色スライドの全スライド画像を、ライカＡＴ２スキャナを４０×倍率で使用して捕捉した。デジタルスライド画像をスキャン品質についてチェックし、注釈を付け、ライカデジタル画像ハブアーカイブの中の適当なネットワークフォルダにエクスポートした。α−ＳＭＡの程度および強度を決定するために、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像分析ソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して全スライド画像の上で定量的画像分析を実行した。α−ＳＭＡで染色された全面積を測定し、染色された肝臓全面積の百分率で表した。
【００９１】
血漿ＴＩＭＰ−１  ＥＬＩＳＡ：血漿ＴＩＭＰ−１の濃度は、市販のラットＴＩＭＰ−１特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、Ｃａｔ＃ＲＴＭ１００）を使用して二連で決定した。わずかに改変した製造業者の仕様書により、ＴＩＭＰ−１を血漿でアッセイした。マウス抗ＴＩＭＰ−１で予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートウェルに、緩衝液ＲＤ１−２１（５０μｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡの前に、ラットＴＩＭＰ−１の７点標準曲線（ＮＳ０発現組換えＴＩＭＰ−１：２４００〜３７．５ｐｇ／ｍＬ）を作成し、血漿試料を緩衝液ＲＤ５−１７で１：２０に希釈した。ＲＤ１−２１を含有するウェルに試料および標準（各々５０μｌ）を二連で加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上で２時間インキュベートした（室温）。抗原捕捉の後、自動プレート洗浄機を使用してプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した（３５０μＬ／ウェル／洗浄）。洗浄の後、各ウェルにラットＴＩＭＰ−１コンジュゲート（１００μｌ）を加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上でプレートを２時間インキュベートした（室温）。プレートを次に５回洗浄し、基質溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。遮光下で３０分間、プレートを室温でインキュベートした。最後に、停止溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）の上で、光学密度（Ｏ．Ｄ．）吸光度を４５０ｎｍで直ちに決定した。各標準および試料のための相対Ｏ．Ｄ．をブランク試料に対してバックグラウンド補正し、ＴＩＭＰ−１濃度へのＯ．Ｄ．の変換のための標準曲線を、４パラメーター曲線あてはめ方法を使用して作成した。未知試料のＴＩＭＰ−１濃度は、２０の希釈係数を使用したＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ５ソフトウェアを使用して決定した。結果を、図７に示す。
【００９２】
血漿ＰＩＩＩＮＰ：血漿ＰＩＩＩＮＰ濃度は、市販のラットプロコラーゲンＩＩＩ  Ｎ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｍａｔｉｋ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、Ｃａｔ＃ＥＫＵ０６７８８）を使用して、二連で決定した。わずかに改変した製造業者の仕様書により、ＰＢＳに５０倍希釈した血漿でＰＩＩＩＮＰをアッセイした。標準の希釈剤で再構成した標準ストックから、７つの標準（２，０００ｐｇ／ｍＬ、１，０００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、２５０ｐｇ／ｍＬ、１２５ｐｇ／ｍＬ、６２．５ｐｇ／ｍＬ、３１．２ｐｇ／ｍＬ）を調製した。各１００μＬの標準、ブランクおよび試料を適当なウェルに加えた。プレートをプレートシーラーで覆い、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルから液体を取り出した後、検出試薬Ａ作業用溶液の１００μＬを各ウェルに加え、プレートシーラーで覆い、次に３７℃で１時間インキュベートした。１×洗浄液の３５０μＬでウェルを洗浄して、１〜２分の間静置することを３回行った。最後の洗浄の後、デカントし、吸収紙で吸い取ることによって、残りのいかなる洗浄緩衝液も除去した。検出試薬Ｂ作業用溶液の１００μＬを次に各ウェルに加え、プレートシーラーでプレートを覆い、３７℃で３０分間インキュベートした。吸引／洗浄工程は、合計５回繰り返した。基質溶液の９０μＬを各ウェルに加え、新しいプレートシーラーでプレートを覆い、遮光下の３７℃で１０〜２０分間インキュベートした。基質溶液の添加によって液体は青色になった。最後に、５０μＬの停止溶液を各ウェルに加えた。液体は、次に黄色に変化した。プレートの側面を軽くたたくことによって、液体を混合する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）の上で、光学密度（Ｏ．Ｄ．）吸光度を４５０ｎｍで直ちに決定した。各標準および試料のための相対Ｏ．Ｄ．をブランク試料に対してバックグラウンド補正し、ＰＩＩＩＮＰ濃度へのＯ．Ｄ．の変換のための標準曲線を、４パラメーター曲線あてはめ方法を使用して作成した。未知試料のＰＩＩＩＮＰ濃度は、５０の希釈係数を使用したＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ５ソフトウェアを使用して決定した。結果を、図９に示す。
【００９３】
血漿ヒアルロン酸（ＨＡ）アッセイ：血漿ＨＡ濃度は、市販のＨＡ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（Ｃｏｒｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ、ＣＯ、Ｃａｔ＃０２９−００１）を使用して、二連で決定した。わずかに改変した製造業者の仕様書により、ＨＡを血漿でアッセイした。アッセイの前に、ＨＡ参照溶液（８００〜１２．５ｎｇ／ｍＬ）の７点標準曲線を作成し、各参照試料および血漿試料を、１０部の反応緩衝液に対して１部で希釈した（３００μｌ反応緩衝液に対して３０μｌの参照／試料）。ＨＡ結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）で予めコーティングしたマイクロプレートウェルに試料および標準（１００μｌ）を二連で加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上で６０分間インキュベートした（室温）。抗原捕捉の後、自動プレート洗浄機を使用してプレートをＰＢＳで４回洗浄した（３５０μＬ／ウェル／洗浄）。洗浄の後、各ウェルにＨＲＰコンジュゲートＨＡＢＰ（１００μｌ）を加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上でプレートを３０分間インキュベートした（室温）。プレートを次に４回洗浄し、１成分基質溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。遮光下で３０分間、プレートを室温でインキュベートした。最後に、停止溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）の上で、光学密度（Ｏ．Ｄ．）吸光度を４５０ｎｍで直ちに決定した。各標準および試料のための相対Ｏ．Ｄ．をブランク試料に対してバックグラウンド補正し、ＨＡ濃度へのＯ．Ｄ．の変換のための標準曲線を、４パラメーター曲線あてはめ方法を使用して作成した。希釈していない未知試料のＨＡ濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ５ソフトウェアを使用して決定した。結果を、図８に示す。
【００９４】
結果
実施例２は、ＡＣＣ阻害剤およびＦＸＲアゴニストを組み合わせた処置が、ＮＡＳＨのラットモデルにおいて単独で投与されるいずれの薬剤より大きな有効性をもたらすことを実証する。詳細には、図５〜９は、ビヒクルと比較して式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせによる、ピクロシリウス陽性面積のパーセント、α−ＳＭＡ陽性面積のパーセントを含む線維症のマーカー、ならびに線維症に関連した３つの血漿マーカー、ＴＩＭＰ１、ＨＡおよびＰＩＩＩＮＰの有意な低減を示す。図６および図９は、個々の薬剤と比較して式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせによる、α−ＳＭＡおよびＰＩＩＩＮＰの有意な低減をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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