(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入された、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体であって、前記ナノリポソームは、毛乳頭真皮細胞で発現するｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ３４、ｋｅｒａｔｉｎ１８及びＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６）よりなる群から１種以上選ばれるタンパク質を認識することができる単クローン性または多クローン性抗体が結合した、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体。
【請求項２】
前記ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡは、配列番号１、２、３、４または５の塩基配列を含む、請求項１に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体。
【請求項３】
前記ナノリポソームは、レシチン、コレステロール、カチオン性リン脂質及び金属キレート脂質を含む、請求項１に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体。
【請求項４】
前記マイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質を含む、請求項１に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を含有する、脱毛改善または治療用組成物。
【請求項６】
Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体を製造し、
レシチン、コレステロール、カチオン性リン脂質及び金属キレート脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第１ステップと、
前記脂質フィルム組成物に、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体を入れて超音波処理する第２ステップと、
前記超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し融解した後、再び超音波処理する第３ステップと、
前記第３ステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を遠心分離し、沈殿物状態のナノリポソームを回収する第４ステップと、
前記第４ステップで得た沈殿物状態のナノリポソームに架橋剤を介して抗体を結合する第５ステップと、を含んで製造されたナノリポソームと、
両性リン脂質、コレステロール、アニオン性脂質、アミン基を有する脂質、及びジスルフィド基を有する脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第Ａステップと、
前記第Ａステップにグルコース溶液を入れて超音波処理する第Ｂステップと、
前記第Ｂステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し融解した後、再び超音波処理する第Ｃステップと、
前記第Ｃステップで超音波処理された脂質フィルム組成物に疎水性気体を注入してマイクロバブルを製造する第Ｄステップとを含んで製造されたマイクロバブルとを混合して、ナノリポソーム−マイクロバルブ結合体を形成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体、並びにこれを含有する脱毛改善または治療用組成物
に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソームに、疎水性気体を含むマイクロバブルが化学的に安定な状態で結合されているナノリポソーム−マイクロバブル結合体、及びこれを含有した脱毛改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物の適応免疫から始まった遺伝子編集技術は、バクテリオファージの感染によってバクテリオファージの断片をＤＮＡに記憶しており、２次感染されたときに遺伝子はさみの役割を果たすヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ９：ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）で当該ＤＮＡを切断してなくす免疫システムから開始した。これは、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）が特定の塩基配列を認識すると、Ｃａｓ９タンパク質が当該部位を切断して校正することができる遺伝子校正集技術へと発展した(Ran FA et al., 2013, Woo JW et al., 2015)。
【０００４】
これは、不治の病とされる、遺伝子異常により誘導された疾患で病気の根本的な原因を治療することができる方法として脚光を浴びている。しかし、遺伝子編集システムの効率的な体内送達や、目標遺伝子ではなく他の遺伝子を切断するオフターゲット作用（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）などの解決すべき問題点を持っている。特に、初期方式であるＣａｓ９プラスミドを用いた遺伝子編集システムは、体内送達時の抗生剤抵抗性、様々な免疫反応などの安全性に対する検証が必要であった。最近では、タンパク質からなる遺伝子はさみ（Ｃａｓ９）とガイドＲＮＡを実験管内で作って送達するシステムがその代案として適用されているが、これも細胞内の効率的送達とタンパク質及びＲＮＡの安定性についての問題が提起されている(Ramakrishna S et al., 2014)。
【０００５】
脱毛は、一般に、頭皮の太くて黒い髪の毛が抜けることを意味する。脱毛の原因はさまざまであるが、遺伝的な原因と男性ホルモンであるアンドロゲン（ａｎｄｒｏｇｅｎ）が重要な因子として考えられている。その中でも６０〜７０％程度と大きな割合を占めている男性型脱毛症（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ａｌｏｐｅｃｉａ）は、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）が５−α還元酵素（５−ａｌｐｈａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＳＲＤ５Ａ）によってジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）に転換され、過剰に生成されたジヒドロテストステロンが毛乳頭真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＤＰＣ）の男性ホルモン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＲ）に結合してアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発し、毛髪の小型化により脱毛が進行するのである。５−α還元酵素のうち、毛包の毛乳頭と外側毛根鞘に主に分布する２型５−α還元酵素（５−ａｌｐｈａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２、ＳＲＤ５Ａ２）自体が多く発現している男性や、２型５−α還元酵素の活性度が高いヒトは、ジヒドロテストステロンの量が一般な男性よりも相対的に多いため、脱毛の発生可能性が大きくなる。よって、男性型脱毛症の治療核心は、２型５−α還元酵素の量又は活性度を低下させてテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を防ぐことにある。
【０００６】
現在、脱毛治療剤としてプロペシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）などの薬物が開発されている。プロペシアは、２型５−α還元酵素を直接抑制し、デュタステリドは、１型、２型５−α還元酵素を抑制してテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を抑制して脱毛の進行を緩和させる。しかし、服用患者に性欲減退や勃起不全などの副作用が発生し、服用中止時に脱毛が再び進行するという欠点を持つ。特に、米国ＦＤＡでは、不妊又は精子数の少ない男性の場合、薬物の服用を中止することを勧告しており、妊娠可能年齢の女性の場合、胎児の男性器形成障害を発生させることができるので、服用を禁止している(Myscore  V  et  al.,2012)。
【０００７】
ＳＲＤ５Ａ２遺伝子は、脱毛に関連する遺伝子の一つであり、特にアポトーシスを誘導するジヒドロテストステロンに関連付けられているので、この遺伝子を改善させることが重要にされている。
【０００８】
一方、細胞内薬物送達システムで要求される重要な二つの性質は、効率性と細胞毒性（安全性）であって、コレステロールや脂質などで構成されたナノリポソーム送達体技術が幅広く使用されている(Zuris  JA  et  al.,2015)。しかし、このようなナノリポソーム技術のみでは、皮膚バリアの役割を果たす角質層の下に存在する真皮内への薬物送達が容易ではない(Nemes  Z  et  al.,1999)。
【０００９】
マイクロバブルは、ＦＤＡに承認された診断超音波造影剤であって、疎水性気体で充填されたマイクロサイズの気泡形状を持っている。超音波にさらされたマイクロバブルは、空洞現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）が生じて周辺細胞の細胞膜が一時的に気孔を形成し、この気孔を介して細胞内へ物質が透過する超音波穿孔法（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）でナノリポソームが細胞内へ送達されることにより、他の細胞送達法よりもさらに効果的に送達することができる。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するナノリポソームを真皮層まで効率的に送達するために、このようなマイクロバブル技術を前記ナノリポソームに適用し、好ましくは、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体をナノリポソームに封入し、これをマイクロバブルと結合させた組成物を製造した。したがって、このような技術を用いて真皮内へ薬物送達効率の良い送達体を製造し、これを脱毛の改善または治療用組成物として用いることにより、本発明を完成することができた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１７１００２６号（発明の名称：Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの混成体を含有するナノリポソーム送達体組成物、出願人：株式会社ムジンメディ、登録日：２０１７年２月２０日）
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１６８３４６３号（発明の名称：マイクロバブル−リポソーム−メラニンナノ粒子複合体及びこれを含む造影剤、出願人：ソウル大学産学協力団、登録日：２０１６年１２月１日）
【特許文献３】韓国公開特許第１０−２０１６−００８９５２６号（発明の名称：粒子送達成分を用いた標的障害及び病気に対するＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステム及び組成物の送達、利用及び治療適用、出願人：ソウル大学産学協力団、公開日：２０１６年７月２７日）
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ran  RA  et  al.,Genome  engineering  using  the  CRISPR-Cas9  system,Nat  Protoc,2013,8(11),2281-2308.
【非特許文献２】Woo  JW  et  al.,DNA-free  genome  editing  in  plants  with  preassembled  CRISPR-Cas9  ribonucleoproteins,  Nat  Biotechnol,2015,33(11),1162-1164.
【非特許文献３】Ramakrishna  S  et  al.,Gene  disruption  by  cell-penetrating  peptide-mediated  delivery  of  Cas9  protein  and  guide  RNA,Genome  Res,2014,24(6),1020-1027.
【非特許文献４】Myscore  V  et  al.,Finasteride  and  sexual  side  effects,Indian  Dermatol  Online  J,2012,3(1),62-65.
【非特許文献５】Zuris  JA  et  al.,Cationic  lipid-mediated  delivery  of  proteins  enables  efficient  protein-based  genome  editing  in  vitro  and  in  vivo,Nat  Biotechnol,2015,33(1),73-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体、並びにこれを含有する脱毛改善または治療用組成物を提供することにある。
【００１４】
より具体的には、本発明の目的は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソームに、疎水性気体を含むマイクロバブルが化学的に安定的に結合されているナノリポソーム−マイクロバブル結合体、並びにこれを含有してＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制する効能のある脱毛改善または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体に関する。
【００１６】
前記ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡは、配列番号１、２、３、４または５の塩基配列を含むことができる。
【００１７】
前記ナノリポソームは、レシチン、コレステロール、カチオン性リン脂質及び金属キレート脂質を含むことができる。
【００１８】
前記ナノリポソームには、毛乳頭真皮細胞で発現するｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ３４、ｋｅｒａｔｉｎ１８及びＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６）よりなる群から１種以上選ばれるタンパク質を認識することができる単クローン性または多クローン性抗体が結合できる。
【００１９】
前記マイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質を含むことができる。
【００２０】
前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体は、８００〜１５００ｎｍの粒子サイズを有することができる。
【００２１】
本発明は、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を含有する脱毛改善または治療用組成物を提供することができる。
【００２２】
また、本発明は、下記の毛乳頭真皮細胞を選択的に認識することができるナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製造方法を提供する。より好ましくは、ナノリポソームとマイクロバブルをそれぞれ製造した後、これを混合してナノリポソーム−マイクロバブル結合体を製造することができる。
【００２３】
前記ナノリポソームは、下記の方法で製造することができる。
【００２４】
好ましくは、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体を製造し、
レシチン、コレステロール、カチオン性リン脂質及び金属キレート脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第１ステップと、
前記脂質フィルム組成物に、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体を入れて超音波処理する第２ステップと、
前記超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し、融解した後、再び超音波処理する第３ステップと、
前記第３ステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を遠心分離し、沈殿物状態のナノリポソームを回収する第４ステップと、
前記第４ステップで得た沈殿物状態のナノリポソームに架橋剤を介して抗体を結合する第５ステップとを含んで前記ナノリポソームを製造することができる。
【００２５】
また、前記マイクロバブルは、下記の方法で製造することができる。
【００２６】
両性リン脂質、コレステロール、アニオン性脂質、アミン基を有する脂質、及びジスルフィドを有する脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第Ａステップと、
前記第Ａステップにグルコース溶液を入れて超音波処理する第Ｂステップと、
前記第Ｂステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し、融解した後、再び超音波処理する第Ｃステップと、
前記第Ｃステップで超音波処理された脂質フィルム組成物に疎水性気体を注入してマイクロバブルを製造する第Ｄステップと、を含んで、前記マイクロバブルを製造することができる。
【００２７】
このように製造されたマイクロバブルにナノリポソームを混合してナノリポソーム−マイクロバブル結合体を形成することができる。
【００２８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２９】
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体に関する。
【００３０】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、ｐＥＴ２８ａ／Ｃａｓ９−Ｃｙｓプラスミド（ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにＣａｓ９−Ｃｙｓが挿入されたもの）が形質転換された細胞または菌株から取得することができる。好ましくは、ｐＥＴ２８ａ／Ｃａｓ９−Ｃｙｓプラスミドを大腸菌に形質転換してＣａｓ９タンパク質を過発現して得ることができる。
【００３１】
本発明で適用することができるガイドＲＮＡは、下記の配列番号１乃至５の塩基配列から選択されるガイドＲＮＡであり、このようなガイドＲＮＡが含まれているナノリポソーム送達体組成物は、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制して脱毛を改善または治療することができる機能をする。
【００３２】
前記配列番号１のガイドＲＮＡは、下記配列番号６のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＳＲＤ５Ａ２の一部ＤＮＡ塩基配列に由来するものであり、下記配列番号１１のＳＲＤ５Ａ２の一部ＤＮＡ塩基配列をターゲットにし（配列番号６と配列番号１１は相補的な塩基配列を有する）、配列番号２〜５と対比して配列番号７〜１０、配列番号１２〜１５も同様に対応する。
【００３３】
【表１】
0006944061.tif 000002
一方、本発明では、研究開発中には、臨床適用が難しいヒトに代える動物実験用ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を提供し、この動物実験用ナノリポソーム−マイクロバブル結合体は、下記配列番号１６〜２０から選択されるガイドＲＮＡを含む。前記動物としては、好ましくはマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を使用する。各配列の対応関係は、表１と同様の方法で表２に示した。
【００３４】
【表２】
0006944061.tif 000003
前記配列番号１乃至５、または、配列番号１６乃至２０から選択されるガイドＲＮＡの塩基配列の後には、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成するためにスキャフォールド塩基配列（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が含まれ得る。このとき、スキャフォールド塩基配列の種類は大きく制限されず、ガイドＲＮＡの製造に用いられる通常の塩基配列であればいずれでも使用できる。
【００３５】
したがって、本発明のナノリポソームに適用されるガイドＲＮＡは、下記スキャフォールド塩基配列に結合されたガイドＲＮＡが適用されてナノリポソームの製造に使用できる。
【００３６】
【表３】
0006944061.tif 000004
0006944061.tif 000005
前記配列番号１乃至５のガイドＲＮＡの塩基配列がターゲットとする配列番号１１乃至１５のＤＮＡ塩基配列は、ＳＲＤ５Ａ２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１７、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００００２．１２）に存在する塩基配列であり、配列番号１乃至５のガイドＲＮＡを介して前記ＤＮＡが切断される。
【００３７】
前記配列番号１６乃至２０のガイドＲＮＡの塩基配列がターゲットとする配列番号２６乃至３０のＤＮＡ塩基配列は、ＳＲＤ５Ａ２（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１７、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００００８３．６）に存在する塩基配列であり、配列番号１６乃至２０のガイドＲＮＡを介して前記ＤＮＡが切断される。
【００３８】
前記配列番号３１乃至４０のガイドＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いた試験管内転写反応過程（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を介して合成することができる。
【００３９】
前記カチオン性ポリマーとして、好ましくは、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアミドアミン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］、キトサン、ポリ−Ｌ−オルニチン、シクロデキストリン、ヒストン、コラーゲン、デキストラン、及びポリエチレンイミンから選択される１種以上が使用でき、最も好ましくはポリエチレンイミンが使用できる。
【００４０】
前記ナノリポソームは、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ、α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎ）、カチオン性リン脂質、コレステロール、及び金属キレート脂質を含むことができ、これにより、前記レシチン、カチオン性リン脂質、コレステロール及び金属キレート脂質がナノリポソームを形成する膜を成すことができる。
【００４１】
レシチンは、動／植物界に広く分布しており、生体適合性に優れるうえ、その安定性においても既に検証されて食品や製薬の送達体技術に広く活用されている。また、ナノリポソームのサイズ調節及び変形を容易にする材料として使用できる。
【００４２】
前記カチオン性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）よりなる群から１種以上選択できる。好ましくは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を使用するのが良い。
【００４３】
金属キレート脂質としては、好ましくは、ＤＯＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉ脂質、ＤＭＰＥ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ脂質、ＤＭＰＥ−ＤＴＰＡ−Ｃｕ脂質よりなる群から選択される１種以上を使用することができる。前記ＤＯＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉ脂質は、下記（化学式１）の化学構造を有する脂質であって、
【００４４】
【化１】
0006944061.tif 000006
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）という。
＊1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic  acid)succinyl](nikel  salt)
ＤＭＰＥ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ脂質は、下記（化学式２）の化学構造を有する脂質であって、
【００４５】
【化２】
0006944061.tif 000007
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ガドリニウム塩）という。
【００４６】
＊1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-
Diethylenetriaminepentaacetic  acid(gadolinium  salt)
ＤＭＰＥ−ＤＴＰＡ−Ｃｕ脂質は、下記（化学式３）の化学構造を有する脂質であって、
【００４７】
【化３】
0006944061.tif 000008
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（銅塩）という。
＊1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic  acid(copper  salt)
前記ＤＯＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉ脂質は、タンパク質精製方法で使用されるＨｉｓ−Ｔａｇ（６Ｘ  ｈｉｓｔｉｄｉｎ）とＮｉ２＋親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を活用してＣａｓ９タンパク質（Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むもの）が効果的にナノリポソームの内部に封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）されるようにする役割を果たすことができる。さらに詳しくは、前記ＤＯＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉは、１８個の炭素に二重結合が１つある構造であって、レシチンと一緒に脂質（ｌｉｐｉｄ）を形成することができ、端にＮｉ２＋が結合されており、Ｃａｓ９タンパク質に付いている２つのＨｉｓ−ｔａｇと一つのＮｉ２＋とが結合してＣａｓ９タンパク質がより効率よくナノリポソーム内に封入されるようにする。ＤＭＰＥ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ脂質とＤＭＰＥ−ＤＴＰＡ−Ｃｕ脂質も、これと同じ役割を果たし、Ｃａｓ９タンパク質が含まれている複合体のナノリポソーム内への封入を効果的に誘導する。
【００４８】
本発明のナノリポソーム内には、単一種類のガイドＲＮＡに結合されたＣａｓ９タンパク質が含まれてもよく、前記それぞれのガイドＲＮＡに結合されたＣａｓ９タンパク質が混在して存在してもよい（例えば、「配列番号１のガイドＲＮＡ−Ｃａｓ９タンパク質」、「配列番号２のガイドＲＮＡ−Ｃａｓ９タンパク質」など）。
【００４９】
前記ナノリポソームには、毛乳頭真皮細胞で発現するｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ３４、ｋｅｒａｔｉｎ１８及びＩＬ−６よりなる群から選択されるタンパク質を認識することができる単クローン性または多クローン性抗体が結合できる。
【００５０】
前記抗体を生成することは、当業分野における公知の技術を用いて容易に行うことができる。前記多クローン性抗体は、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ３４、ｋｅｒａｔｉｎ１８及びＩＬ−６よりなる群から選択される抗原タンパク質を動物に注射した後に採血した血清から得ることができる。前記動物としては、ヤギ、ウサギ、ブタなどの任意の動物宿主を用いることができる。前記単クローン性抗体は、本発明の属する技術分野に広く知られているように、ハイブリドーマ方法（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．）、またはファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．）技術を用いて製造することができる。前記ハイブリドーマ方法を行うためには、マウスなどの免疫学的に適した宿主動物の細胞と、がんまたは骨髄腫細胞株を用いることができる。その後、ポリエチレングリコールなどを用いる方法、すなわち、本発明の属する技術分野における公知の方法で、これらの二種類の細胞を融合させた後、抗体産生細胞を標準的な組織培養方法で増殖させることができる。そして、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によるサブクローニングによって均一な細胞集団を得た後、前記抗原タンパク質に対して特異的な抗体を生産することができるハイブリドーマを標準技術に基づいて試験管内または生体内で大量培養することができる。
【００５１】
前記ファージ抗体ライブラリー方法は、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ３４、ｋｅｒａｔｉｎ１８及びＩＬ−６よりなる群から選択される抗原タンパク質に対する抗体遺伝子を取得し、これをファージ（ｐｈａｇｅ）の表面に融合タンパク質の形で発現して抗体ライブラリーを試験管内で製作し、前記ライブラリーから前記抗原タンパク質と結合する単クローン性抗体を分離及び製作して行うことができる。これらの方法によって製造された抗体は、電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィーなどの方法で分離することができる。
【００５２】
前記抗体は、２つの全長の軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）及び２つの全長の重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含むことができる。抗体分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖなどがある。
【００５３】
本発明において、前記抗体は、１，４−ビス−マレイミドブタン、１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］］及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、スクシミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−ロピオナミド］ヘキサノエート］及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＰ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、及びスクシミジル［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート］及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）よりなる群から選択された１種以上の架橋剤がリンカーとして用いられて結合できる。
【００５４】
前記リンカーは、ナノリポソームのカチオン性リン脂質と抗体とを連結することを特徴とする。
【００５５】
本発明のナノリポソームは、中性の水、細胞培養液、血液などで数時間以上安定的に分散できる。
【００５６】
本発明のマイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質を含むことができ、これらの混合物からなる脂質フィルム組成物に投入された疎水性気体を介してバブルを形成する膜をなすことにより、マイクロバブルが製造される。
【００５７】
前記両性リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、１−ミリストイル−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＭＰＰＣ）、及び１−ミリストイル−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＭＳＰＣ）よりなる群の中から選択できる。好ましくは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）を使用するのが良い。
【００５８】
前記アニオン性リン脂質は、ジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＣＰ）、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＥＰＡ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＬＰＡ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＭＰＡ）、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＯＰＡ）よりなる群から１種以上選択できる。好ましくは、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）を使用するのが良い。
【００５９】
前記カチオン性リン脂質としては、ナノリポソームの製造時に使用するものを同一に使用することができ、より詳しくは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）よりなる群から１種以上選択できる。好ましくは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を使用するのが良い。
【００６０】
前記ジスルフィド基を有する脂質としては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰとも呼ばれる１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ポリ（エチレングリコール）−２０００−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを使用するのが良い。
【００６１】
＊ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ：1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-
N-poly(ethyleneglycol)-2000-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ脂質は、下記（化学式４）の化学構造を有する脂質である。
【００６２】
【化４】
0006944061.tif 000009
マイクロバブルの製造のための両性リン脂質：アニオン性リン脂質：コレステロール：カチオン性リン脂質：ジスルフィド基を有する脂質の混合割合は、１〜３ｍＭ：０．１〜０．３ｍＭ：０．５〜２ｍＭ：０．１〜０．３ｍＭ：０．１〜０．３ｍＭであり得る。このとき、両性リン脂質：アニオン性リン脂質：コレステロール：カチオン性リン脂質：ジスルフィド基を有する脂質として、ＤＰＰＣ：ＤＣＰ：コレステロール：ＤＰＰＥ：ｓＰＤＰが使用でき、好ましくはＤＰＰＣ：ＤＣＰ：コレステロール：ＤＰＰＥ：ｓＰＤＰが２．０ｍＭ：０．１８ｍＭ：０．９ｍＭ：０．１７ｍＭ：０．１７ｍＭで混合できる。
【００６３】
マイクロバブル内の前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ脂質は、ナノリポソームと結合するときに架橋剤になり、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体に結合できる。
【００６４】
前記マイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質の混合物のバブリングにより誘導されたものであり得る。また、前記マイクロバブルの内部は、ＳＦ６、ＣＯ２、ＣＦ４及びＣ３Ｆ８から選択される疎水性気体が内包されたものであり得る。前記疎水性気体は、好ましくはＳＦ６であることがさらに良い。
【００６５】
前記ナノリポソームは、１００〜２００ｎｍの粒子サイズを有することができる。ナノリポソームのサイズが１００ｎｍ未満である場合には、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が前記ナノリポソームに封入され難く、体内に注入される場合に安定性が低くなることがあって好ましくない。また、２００ｎｍを超える場合にも、前記ナノリポソームの含まれた組成物が体内に注入される場合に安定性が低くなることがあって好ましくない。また、前記マイクロバブルは、８００〜１５００ｎｍの粒子サイズを有することができる。このため、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体は、約８００〜１５００ｎｍの粒子サイズを有することができる。
【００６６】
本発明は、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体組成物を含有する脱毛改善または治療用組成物を提供することができる。前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体組成物は、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子治療を行って脱毛の治療に効果的である。
【００６７】
本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体組成物の製造方法において、ナノリポソームを製造し、マイクロバブルを製造してこれを混合することにより、前記結合体を製造することができる。
【００６８】
ナノリポソームの製造において、前記第１ステップの複合体の製造の際に、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーは、１：１〜３：３０〜７０のモル比で混合できる。この際の混合比から外れると、複合体の製造がうまくできない。前記第１ステップのレシチン、金属キレート脂質、コレステロール及びカチオン性リン脂質は、２：０．１〜５：０．０１〜０．５：０．０１〜０．５のモル比で混合できる。同様に、このときの混合比から外れると、ナノリポソームを構成する脂質の製造がうまくできない。この際、前記第３ステップで凍結し融解する過程は、１〜１２回繰り返し行うことができる。脂質フィルム組成物を凍結し融解するステップを繰り返すことにより、より均一なサイズのナノリポソーム分散液が形成でき、ナノリポソームの薬物封入効率を高めることができる。ただし、１２回を超過する場合には、ナノリポソームの封入効率がむしろ減ることができるため、１２回以内が好ましい。前記第５ステップでナノリポソームに架橋剤を１〜５時間混合した後、抗体を添加して１〜５時間混合することを特徴とする。前記第５ステップでナノリポソーム、架橋剤及び抗体は１０〜３０：１〜５：１の重量比で結合できる。
【００６９】
前記第５ステップを経て製造されたナノリポソームには、マイクロバブルとの結合のためにカチオン性リン脂質にチオール基（ｔｈｉｏｌ  ｇｒｏｕｐ）を導入することができる。好ましくは、２−イミノチオランヒドロクロリド（２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を添加することができ、チオール基が導入されると、ナノリポソームのみを回収し、これをグルコース水溶液、特に１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するグルコース水溶液に分散させ、以後のマイクロバブルとの混合に用いることができる。
【００７０】
ナノリポソームとマイクロバブルとの結合のために、本発明でマイクロバブルを製造するとき、第Ｂステップで、マイクロバブルはグルコース溶液、グリセロール及びプロピレングリコールのうちの１種以上の溶液を用いて安定化した後、ナノリポソームと混合することができる。好ましくは、グルコース溶液を使用するのが良い。このとき、グルコース溶液は、１〜２０％（ｗ／ｖ）になることができる。グルコースの濃度が２０％（ｗ／ｖ）を超える場合には、粘性が生じてマイクロバブルの合成ができないことがある。
【００７１】
本発明のナノリポソームの製造時に、金属キレート脂質は、負電荷（−）を帯びるので、Ｃａｓ９タンパク質とＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡの混成体の負電荷（−）に反応して、ナノリポソームのカプセル化がうまくできないことがある。したがって、これを克服するために、正電荷（＋）を有するカチオン性高分子を結合させた複合体を製造することにより、ナノリポソームのカプセル化を強化することができる。
【００７２】
また、本発明は、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を含有する医薬組成物を提供することができるが、前記医薬組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形で製剤化して使用できる。前記医薬組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、本発明の組成物に少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜることにより調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００７３】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、治療する特定の疾患または病理状態、疾患または病理状態の重症度、投与経路、及び処方者の判断によって異なる。これらの因子に基づいた投与量の決定は当業者のレベル内にあり、一般に、投与量は０．０１ｍｇ／ｋ／日乃至約２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。さらに好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日乃至５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、１日１回行ってもよく、１日数回に分けて行ってもよい。前記投与量は、いかなる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与できる。
【発明の効果】
【００７５】
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体、並びにこれを含有する脱毛改善または治療用組成物に関する。現在、脱毛治療剤として使用されている薬剤は、性欲減退や勃起不全などの深刻な副作用がもたらされ、薬物治療を中止する場合には、再び脱毛が進行するという欠点を持っている。ところが、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を用いる場合、脱毛を誘導させるＳＲＤ５Ａ２を根本的に抑制することができ、男性型脱毛の治療を非常に効果的に行うことができる。
【００７６】
韓国登録特許第１０−１７１００２６号には、糖尿発現遺伝子をターゲットとするＣａｓ９タンパク質、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の発現を抑制するガイドＲＮＡ及びカチオン性ポリマーの複合体が封入されたナノリポソームが開示されており、韓国登録特許第１０−１６８３４６３号には、マイクロバブル−リポソーム−メラニンナノ粒子複合体が開示されているが、本発明のように脱毛の原因となる遺伝子またはこれを発現する毛乳頭真皮細胞への送達効率を高めるために抗体結合ナノリポソームとマイクロバブルとを結合させた結合体技術は確認されていない。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】毛乳頭真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＤＰＣ）にナノリポソーム−マイクロバブル結合体を送達して超音波を加えたとき、細胞膜に穿孔が生じ、マイクロバブルが崩壊しながらナノリポソームが細胞内に入ることを示す模式図である。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｅｄ  ｓｇＲＮＡｓと精製したＣａｓ９タンパク質とを実験室内で結合させて混成体に製造した後（Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ混成体、Ｃａｓ９−ＲＮＰ）、この混成体を用いて、ＳＲＤ５Ａ２遺伝子が実際切断されるかを確認した結果を示す。
【図３】比較例１のナノリポソーム、比較例２のマイクロバブル及び実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体のサイズ及び分散度をＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いて確認した結果を示す。
【図４】実施例２のナノリポソームとマイクロバブルとの結合を確認するために、ナノリポソームにはＲＩＴＣ、マイクロバブルにはＦＩＴＣを導入してナノリポソーム−マイクロバブル結合体を製造した後、これを共焦点蛍光顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で撮影した写真を示す。
【図５】比較例１のナノリポソーム、比較例２のマイクロバブル及び実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体内で疎水性気体が維持されるかを確認するためにエコー輝度（ｅｃｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を確認した結果である。
【図６】本発明の一本鎖状態のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１〜５、順番に配列番号１〜５）の効率をプラスミドシステム（ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）に導入した後、毛乳頭細胞におけるＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現を介して確認した結果を示す。
【図７】本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が毛乳頭真皮細胞に流入するかを確認するために、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に処理し、Ｃａｓ９に対する抗体で免疫染色した後、共焦点蛍光顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で撮った写真を示す。
【図８】図８のＡは本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブルを毛乳頭真皮細胞に処理してＳＲＤ５Ａ２遺伝子においてＰＡＭ構造の後ろにある１つの塩基配列が切断されることを図式化して示し、図８のＢは本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブルを細胞に処理して超音波を加えた後、ＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現抑制効果を確認した結果を示す。
【図９】本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に処理してＳＲＤ５Ａ２タンパク質の発現程度を確認した結果である。
【図１０】本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に前処理した後、テストステロンを処理したときの毛乳頭真皮細胞の生存状態を共焦点蛍光顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で撮った写真を示す。
【図１１】本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に前処理した後、テストステロンを処理したときの細胞の生存と増殖状態をＷＳＴ−１アッセイ方法で示す。
【図１２】本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に前処理した後、毛乳頭真皮細胞にテストステロンを処理したときに現れるジヒドロテストステロンへの転換程度を確認したウェスタンブロッティング結果を示す。
【図１３】実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に前処理した後、テストステロンを処理したときに現れるアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を確認するためにカスパーゼ−３活性（ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した結果を示す。
【図１４】マウス真皮組織から抽出したＤＮＡにＣａｓ９タンパク質と一緒に一本鎖状態のマウスガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡｍ１〜５：順番に配列番号３６〜４０）を混合してＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとの混成体の活性を確認した結果を示す。
【図１５】マウスに脱毛を誘導した後、本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブルをマウスに１回（実験群１）、３回（実験群２）及び５回（実験群３）繰り返し処理した後、発毛効果が現れるかを写真で確認した結果である。
【図１６】本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブルをマウスに処理した後、マウス真皮組織に現れるＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現程度を確認した結果である。
【図１７】ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃａｓ  ｇｕｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒの構造を示す。
【図１８】ｐＥＴ２８ａ／Ｃａｓ９−Ｃｙｓ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ＃５３２６１）の構造を示す。
【図１９】［Ｗｕ  Ｓ  ｅｔ ａｌ］から抜粋したｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙを製造する過程を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、本発明の好適な実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態で具体化されることも可能である。むしろ、ここで紹介される内容が徹底かつ完全となるように、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するのである。
【００７９】
＜実施例１．ガイドＲＮＡの製造及びＣａｓ９タンパク質の精製＞
実施例１−１．ＳＲＤ５Ａ２を目標遺伝子とするガイドＲＮＡの製造
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を活用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ方法を用いて、ＫＲＡＳを目標遺伝子とするガイドＲＮＡを製造した。このため、表４のＴ７プロモーター塩基配列とＳＲＤ５Ａ２遺伝子の２０ｂ．ｐ．塩基配列である配列番号６：ＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＡＡＴＣＧ、配列番号７：ＡＧＧＧＧＣＣＧＡＡＣＧＣＴＴＧＴＡＡＴ、配列番号８：ＡＣＴＡＴＡＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣ、配列番号９：ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＡＣＧＧＴＴＴＡＧＣＴ、配列番号１０：ＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧ、配列番号２１：ＡＣＡＧＡＣＡＴＧＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＴ、配列番号２２：ＣＧＣＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＴ、配列番号２３：ＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＣＴＣＧＣＣＣ、配列番号２４：ＴＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＡ、配列番号２５：ＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＴＡＣを含む「６９  ｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ」、ガイドＲＮＡに接続されるスキャフォールド塩基配列を含む「２０  ｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ」、ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃａｓ  ｇｕｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ（ｏｒｉｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ法で１４０ｂ．ｐ．のＤＮＡ鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を製造した。このＤＮＡ鋳型、ｒＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含んで３７℃で２時間転写反応を介してガイドＲＮＡを製作し、ＲＮＡ精製過程を経てＲＮＡ純度を高めた。
【００８０】
＊Ｔ７プロモーター塩基配列は、下記表４の下線部分に該当する。
【００８１】
＊表１の太字の塩基配列はＳＲＤ５Ａ２遺伝子を認識する部位であり、スキャフォールドの塩基配列の鋳型（ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃａｓ  ｇｕｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ）を認識してガイドＲＮＡの合成が行われ、最終製造されたガイドＲＮＡの配列とこの塩基配列とが同じ（Ｔの代わりにＵで置換された）塩基配列構造を持つ。
【００８２】
＊Ｆプライマーの後ろのＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡは、スキャフォールド塩基配列の一部分である。
【００８３】
＊ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃａｓ  ｇｕｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒにスキャフォールド塩基配列の鋳型が含まれている。
【００８４】
＊この実験に使用されたｐｌａｓｍｉｄ  Ｃａｓ  ｇｕｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒの構造は、図１７のとおりである。
【００８５】
出典：http://www.origene.com/CRISPR-CAS9/Detail.aspx?sku=GE100001
【００８６】
【表５】
0006944061.tif 000010
前記実験によって、下記表５の塩基配列を有するガイドＲＮＡを製造した。
【００８７】
【表６】
0006944061.tif 000011
0006944061.tif 000012
最終製造された前記ガイドＲＮＡは、ヒトＳＲＤ５Ａ２遺伝子の配列番号１１乃至１５の塩基配列をターゲットとして認識し、マウスＳＲＤ５Ａ２遺伝子の配列番号２６乃至３０の塩基配列をターゲットとして認識する。
【００８８】
実施例１−２．Ｃａｓ９タンパク質の精製
ｐＥＴ２８ａ／Ｃａｓ９−Ｃｙｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＃５３２６１）を大腸菌（ＢＬ２１）に形質転換して０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）と２８℃の条件でＣａｓ９タンパク質を過発現し、Ｃａｓ９タンパク質が過発現された大腸菌を溶解バッファ（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ａｔ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム）と共に超音波処理した。超音波処理して得た粉砕物を遠心分離してタンパク質の含まれている液状を得た。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ抽出法（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ａｔ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）で、前記液状に含まれているＣａｓ９タンパク質を分離した。以後、分離物をストレージバッファ（ｓｔｏｒａｇｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ａｔ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０％グリセロール）に混合した状態で透析して（ｃｕｔ  ｏｆｆ  １０Ｋ）イミダゾールを除去した後、タンパク質濃度を定量した（ＢＣＡ法を用いる）。
【００８９】
＊＊ｐＥＴ２８ａ／Ｃａｓ９−Ｃｙｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ＃５３２６１）の構造：図１８参照、出典：Ａｄｄｇｅｎｅ(http://www.addgene.org/)
＜実施例２．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製作＞
実施例２−１．ナノリポソームの製作
実施例１で製造したＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及びポリエチレンイミンを１：２：５０のモル比（ｍｏｌｅ  ｒａｔｉｏ）で混合して複合体を製造した。このとき、ガイドＲＮＡとしては、スキャフォールド塩基配列の含まれているヒト配列番号３１、３２、３３、３４または３５（配列番号１、２、３、４または５を含む）及びマウス配列番号３６、３７、３８、３９または４０（配列番号１６、１７、１８、１９または２０を含む）を使用した。
【００９０】
次に、レシチン（Ｌｅｃｉｔｈｉｎ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ＤＯＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉ脂質（Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）及びＤＰＰＥ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）を２：１：０．１：０．０５のモル比でクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）で混ぜた後、回転濃縮器を用いて脂質フィルム（ｌｉｐｉｄ  ｆｉｌｍ）化した。
【００９１】
ここにＣａｓ９タンパク質／ガイドＲＮＡ／ポリエチレンイミンの複合体を入れ、超音波を加えて混合した。液体窒素を活用して凍結し融解する過程（ｆｒｅｅｚｅ  ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅ）を５回繰り返し行い、その後、超音波（プローブ方式）処理して、より小さいサイズの均一な状態のナノリポソーム組成物を作製した。
【００９２】
その後、遠心分離方法で沈殿したナノリポソーム組成物（脂質の総量２０．４３ｍｇ、Ｃａｓ９とｇＲＮＡの総量０．１ｍｇ）を回収して、抗体結合のためのリンカーとして使用されるＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＰｒｏｔｅｏＣｈｅｍ）２．５ｍｇをＰＢＳで２時間２５℃の常温で混合した。
【００９３】
次には、ナノリポソームに結合するための精製抗体を準備したが、前記ナノリポソームに結合する抗体は、毛乳頭真皮細胞で過発現することが知られているｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＣＤ３４、ｋｅｒａｔｉｎ１８及びＩＬ−６などを認識することができる単クローン性または多クローン性抗体を選択した。特に、この中でも、ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体（Ａｎｔｉ−ｅｎｄｏｇｌｉｎ）を選択して、２−メルカプトエチルアミン（Ｔｈｅｒｍｏ）及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡで２時間、３７℃で混合した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＰＤ−１０  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体と２−メルカプトエチルアミンは１ｍｇ：０．６ｍｇで混合）。このとき、抗体の精製過程は図１９で説明することができる（Ｙ字型を持つ同じ２つの鎖からなっている抗体に２−メルカプトエチルアミンを添加してハーフ抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を製造して再び精製した後、これをナノリポソームに結合させる）。
＊図１９出典：Wu  S  et  al.,Highly  sensitive  nanomechanical  immunosensor  using  half  antibody  fragments,Anal  Chem,2014,86(9),4271-4277.
図１９に示すように、ハーフ抗体（ｈａｌｆ  ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ）を製造すると、−ＳＨが生成される。ナノリポソームを構成するＤＰＰＥ脂質に−ＮＨ２が存在するため、ここにｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（リンカー）が反応し、こうして作られたナノリポソームのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣとハーフ抗体の−ＳＨ部分とが結合する。このようにハーフ抗体の製造によって、ナノリポソームの毛乳頭真皮細胞に対する認識能力を倍増させることができる。
【００９４】
このように精製された抗体（ａｎｔｉ−ｅｎｄｏｇｌｉｎ）１ｍｇを、リンカーが結合されているナノリポソーム組成物と４℃で１２時間混合し、その後、遠心分離方法で沈殿したものだけを回収して毛乳頭真皮細胞を選択的に認識することができる抗体が結合されたナノリポソームを得た。
【００９５】
精製された抗体を、リンカーが結合されているナノリポソームの脂質構造体中のＤＰＰＥ（カチオン性リン脂質）にチオール基を導入してマイクロバブルと結合させるために、２−イミノチオランヒドロクロリド（ｐＨ８．２）（粉末状態、ナノリポソーム２０．５３ｍｇ／ｍＬ当たり０．５ｍｇを添加）を添加して２５℃で２時間混合し、その後、遠心分離方法で沈殿されたものだけを回収して５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液に分散させた。
【００９６】
実施例２−２．マイクロバブルの製作
ＤＰＰＣ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）１５．４ｍｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）３．４８ｍｇ、ＤＣＰ（ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）１ｍｇ、ＤＰＰＥ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｒｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）１．２ｍｇ、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ＰＤＰ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）］、Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ）５ｍｇをクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）１ｍＬで混合した後、回転濃縮器を用いてマイクロバブルの合成のための脂質フィルム（ｌｉｐｉｄｆｉｌｍ）化した。
【００９７】
その後、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液１ｍｌを入れて超音波を加えて混合した。液体窒素を用いて凍結し融解する過程（ｆｒｅｅｚｅ  ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅ）を３回繰り返し行い、その後、超音波（プローブ方式）処理した後、ＳＦ６ガスを充填して分散状態のマイクロバブル組成物を製造した。
【００９８】
実施例２−３．ナノリポソーム−マイクロバブルの製作
実施例２−１で製造されたナノリポソーム（２０．５３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬと実施例２−２のマイクロバブル（２６．０８ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを混合（２：１の体積比）して、ナノリポソームとマイクロバブルがグルコース水溶液に分散した状態となるようにした。
【００９９】
その後、装備（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｉｒｉｓ）を用いて１５秒間強い振動効果［Ｍｉｘｉｎｇ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：４５００ｔｒ／ｍｎ（ｃｐｍ；分あたりｍ３送り量の単位）］を与え、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を形成させた後、５％グルコース水溶液に分散した状態で冷蔵保管した。
【０１００】
このように最終製造されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体を以下「実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体」という。
【０１０１】
＜比較例１．抗体結合ナノリポソーム＞
実施例２−１に記載された方法でナノリポソームを製造するが、抗体結合までのみを行い、チオール基の導入は行っていないナノリポソーム（マイクロバブル未結合）を比較例１の組成物として使用した。
【０１０２】
＜比較例２．マイクロバブル＞
実施例２−２の方法で製造したマイクロバブルをそのまま比較例２の組成物（ナノリポソーム未結合）として使用した。
【０１０３】
＜比較例３．ナノリポソーム＞
実施例２−１に記載された方法でナノリポソームを製造するが、抗体結合前のナノリポソームを比較例３の組成物として使用した（抗体未結合のナノリポソーム）。
【０１０４】
＜比較例４．ｓｃｒａｍｂｌｅガイドＲＮＡが含まれている抗体結合ナノリポソームとマイクロバブルの結合体＞
本発明のナノリポソームの製造方法を用いるが、ガイドＲＮＡとしてｓｃｒａｍｂｌｅガイドＲＮＡ配列（配列番号４１：ＧＣＡＣＵＡＣＣＡＧＡＧＣＵＡＡＣＵＣＡ）の含まれているナノリポソームを製造した。ｓｃｒａｍｂｌｅガイドＲＮＡ配列は、ＤＮＡのいずれの部位とも結合していない配列であって、比較例として使用されるために製造されたものである。このようなｓｃｒａｍｂｌｅガイドＲＮＡの含まれているナノリポソームにチオール基を導入し（実施例２−２を参照）、マイクロバブルと結合（実施例２−３参照）させてｓｃｒａｍｂｌｅガイドＲＮＡの含まれている抗体結合ナノリポソームとマイクロバブルとの結合体を製造した。
【０１０５】
一方、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体で抗体がないものはターゲッティングに著しく劣るので、本発明において敢えて比較例として製造していない。
【０１０６】
＜実験例１．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製造過程におけるガイドＲＮＡの活性及び機能の確認＞
実験例１−１．ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の活性確認
この実験に使用した毛乳頭真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＤＰＣ）は、ＨＦＤＰＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌｓ）であって、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社から購入した。この細胞をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ製のＦｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＭｅｄｉｕｍとＦｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ製品を混ぜて製造した培養培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間以上培養したものを実験に使用した。
【０１０７】
ガイドＲＮＡの製造とＣａｓ９タンパク質の精製がうまく行われたかを確認するために、毛乳頭真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＤＰＣ）細胞を収集してＤＮＡを抽出し、フォワードプライマー（Ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＴＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣ、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＧＴＡＴＴＧＣを用いてＰＣＲ法によってテンプレートフラグメント（５００ｂｐ）を作った。次に、フラグメントに精製されたＣａｓ９タンパク質のみ、精製されたＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ３（配列番号３３、図２）とを混合して入れた。
【０１０８】
図２を参照すると、精製されたＣａｓ９タンパク質のみ入れた実験群では、ガイドＲＮＡが存在しないため、Ｃａｓ９タンパク質がフラグメントを切断せず、精製されたＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ３（配列番号３３）とを混合した実験群では、Ｃａｓ９タンパク質がフラグメントを切断したことを示す結果が確認される。
【０１０９】
実験例１−２．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体のサイズの確認
本発明で製造したナノリポソーム、マイクロバブル及びナノリポソーム−マイクロバブル結合体のサイズと表面電荷をＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）で測定した。配列番号３３のガイドＲＮＡが含まれているものを代表として、その結果を表６及び図３に示した。
【０１１０】
【表８】
0006944061.tif 000013
毛乳頭真皮細胞内にガイドＲＮＡの含まれているナノリポソームを送達するためには、（−）電荷を帯びる表面電荷値が正電荷であることが良いが、表６及び図３を参照すると、実施例２のナノリポソームは、表面電荷値が正電荷に属する。また、比較例１のナノリポソームと比較例２のマイクロバブルは、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体と比較してサイズと表面電荷が大きく変わっていないことが分かる。
【０１１１】
一方、実施例２の組成物がナノリポソームとマイクロバブルの混合状態ではなく、完全な結合状態を維持するナノリポソーム−マイクロバブル結合体であることを確認するために、共焦点蛍光顕微鏡でイメージ化した。このため、実施例２−１ステップでのナノリポソームの製造時にＲＩＴＣ（ｒｅｄ）蛍光色素（ｄｙｅ）を導入し、実施例２−２のマイクロバブルの合成時にＦＩＴＣ（ｇｒｅｅｎ）蛍光色素を導入した。このようにして実施例２−３でナノリポソーム−マイクロバブル結合体に最終製造された実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体に対する電子顕微鏡及び蛍光写真の結果を図４に示した。ナノリポソームがマイクロバブルによく結合された状態であることを確認することができる。
【０１１２】
実験例１−３．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体のエコー輝度の確認
次には、ナノリポソームとマイクロバブルとを結合した後にもマイクロバブル内の気体が維持されることを確認するために、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体のエコー輝度（Ｅｃｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を臨床超音波装備（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて確認した。エコー輝度とは、超音波の透過される程度に応じて、超音波検査のイメージが白く又は黒く見える現象をいう。ナノリポソーム内には気体がない状態であるため、超音波を加えた場合にエコー輝度が示されないが、マイクロバブルは中に気体があるので、エコー輝度が確認される。超音波は、空気中では殆ど伝達されず、液体や固体などではうまく伝達されるので、マイクロバブル内の疎水性気体により超音波がよく伝播される現象を利用する実験である。このため、対象物にプローブを当てて超音波を発生させながら、反射された超音波を受信して画像を確認した。
【０１１３】
エコー輝度の測定のための臨床超音波装備のＭＩ（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｄｅｘ）は０．０７であり、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を入れることができる２％アガロースゲルを作って５〜１２ＭＨｚの四角形超音波プローブで測定した。
【０１１４】
これに対する結果は図５に示したが、比較例２のマイクロバブルと実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体とを比較したとき、エコー輝度が変わらないことを確認することができるので、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が「ナノリポソームと完全な形のＳＦ６ガスが内包されたマイクロバブルとがよく結合された状態」であることが分かる。
【０１１５】
＜実験例２．ＳＲＤ５Ａ２発現及び活性の測定＞
実験例２−１．ガイドＲＮＡのＳＲＤ５Ａ２発現効率の比較
毛乳頭真皮細胞ＤＰＣにおけるｓｇＲＮＡ１、２、３、４及び５（配列番号１、２、３、４及び５）の効率を比較するために、ｐＣａｓプラスミド（実施例１−１にあるｐＣａｓ−Ｇｕｉｄｅプラスミドに配列番号６、７、８、９及び１０）を入れ、毛乳頭真皮細胞に処理した。
【０１１６】
処理した細胞を収集してＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｐｒｅｍｉｘ  ２ｘ（ＧｅＮｅｔＢｉｏ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１１７】
ＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現を確認するための実時間ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ２ｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）とＡＢ  ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製造）を用いて測定した。このとき、検出に使用したプライマーの塩基配列は、次のとおりである。
【０１１８】
ＳＲＤ５Ａ２  ｓｅｎｓｅ：ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＡＧＡＴＴＡ
ＳＲＤ５Ａ２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＣＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＧＴＡＴＧ
ＧＡＰＤＨ  ｓｅｎｓｅ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡ
ＧＡＰＤＨ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡ
上記の結果は図６に示した。ＤＰＣ細胞におけるｓｇＲＮＡの効率比較を行った結果、ｓｇＲＮＡ３（配列番号３）は最も効率よくＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現が減少したので、以後の実験はいずれも、配列番号３のガイドＲＮＡが含まれたものを使用した。
【０１１９】
実験例２−２．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の毛乳頭真皮細胞への流入確認
実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の毛乳頭真皮細胞への流入を確認するために、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体をＤＰＣ細胞に２時間Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ（２４．７μｇ：８．６μｇ−総培養液内にＣａｓ９
２４．７μｇ及びｇＲＮＡ８．６μｇ）の濃度で処理した後、Ｃａｓ９に対する抗体で免疫染色して、図７に共焦点蛍光顕微鏡写真を示す。免疫染色のためにＣａｓ９の１次抗体（ウサギ）を使用した後、２次抗体ＣＦＬ−４８８を用いて細胞内のＣａｓ９タンパク質を標識し、共焦点蛍光顕微鏡でイメージ化した。上記の結果は、配列番号３３のガイドＲＮＡが含まれているものを代表として図７に示した。
【０１２０】
図７におけるＤＡＰＩはＤＮＡ染色写真、Ｃａｓ９はＣａｓ９タンパク質のＣＦＬ−４８８染色写真、Ｍｅｒｇｅはこれらの全てを組み合わせたイメージ写真を示す。図６を参照すると、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理により毛乳頭真皮細胞の核内にＣａｓ９タンパク質がよく注入されていることが分かる。
【０１２１】
一方、配列番号３のガイドＲＮＡが認識するヒトゲノムＤＮＡの位置を図８のＡに示したが（緑下線）、これを参照すると、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を介して、ガイドＲＮＡが２０個の塩基配列を認識し、Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）（ＡＧＧ配列）部位を切断することにより、切断されたＤＮＡが自然に回復（ｒｅｐａｉｒ）される過程中に１つのＤＮＡ塩基配列が切断されたことが確認された（実施例２のナノリポソーム−マイクロバブルが処理された細胞からゲノムＤＮＡを直接抽出し、これを（株）バイオニアにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅを要求し、図８のＡに示された切断された配列の位置を確認した）。
【０１２２】
実験例２−３．ＳＲＤ５Ａ２発現の測定−ｍＲＮＡ発現量の確認
毛乳頭真皮細胞に、本発明で製造した各ナノリポソーム−マイクロバブルを２時間Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ（２４．７μｇ：８．６μｇ）の濃度で処理した後、収集した細胞にＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｐｒｅｍｉｘ  ２ｘ（ＧｅＮｅｔＢｉｏ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１２３】
ＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現を確認するための実時間ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ２ｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）とＡＢ  ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を活用して測定した。このとき、検出に使用したプライマーの塩基配列は、次のとおりである。
【０１２４】
ＳＲＤ５Ａ２  ｓｅｎｓｅ：ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＡＧＡＴＴＡ
ＳＲＤ５Ａ２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＣＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＧＴＡＴＧ
ＧＡＰＤＨ  ｓｅｎｓｅ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡ
ＧＡＰＤＨ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡ
上記の結果は図８のＢに示した。実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理により毛乳頭真皮細胞におけるＳＲＤ５Ａ２  ｍＲＮＡの発現が顕著に減少する結果を確認することができる。
【０１２５】
実験例２−４．ＳＲＤ５Ａ２発現の測定−タンパク質発現量の確認
ｍＲＮＡ発現確認実験と同じ条件で実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を処理するが、毎日１回ずつ１〜５回の処理でナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理回数を異ならせた。毛乳頭真皮細胞（ＤＰＣ）処理群をそれぞれ収集し、前記細胞にＲＩＰＡバッファ（Ｓｉｇｍａ製）を処理してタンパク質を抽出した後、ＳＲＤ５Ａ２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ａｎｔｉｂｏｄｉｅ−ｏｎｌｉｎｅ）でＳＲＤ５Ａ２タンパク質の発現を確認した。このとき、比較例１〜４の組成物に対しても同様の実験を行った。
【０１２６】
その結果、本発明の実施例２の組成物のみは、処理回数が増加するほどナノリポソーム−マイクロバブル結合体無処理群（対照群）と比較してＳＲＤ５Ａ２タンパク質の発現量が減少して５日以上維持されることを、表７及び図９から確認することができる。
【０１２７】
【表９】
0006944061.tif 000014
＜実験例３．細胞生存率及び増加率の確認＞
実験例３−１．生細胞／死滅細胞の確認
実施例２で最終的に得られたナノリポソーム−マイクロバブル結合体を毛乳頭真皮細胞に２時間Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ（２４．７μｇ：８．６μｇ−総培養液内にＣａｓ９  ２４．７μｇ及びｇＲＮＡ８．６μｇ）の濃度で毎日１回ずつ、合計５日まで繰り返し処理した（処理基準１日１回ずつ、実験例２−４と同一の条件）。その後、脱毛の原因となる毛乳頭真皮細胞の死滅条件を誘導するために、実験に使用された毛乳頭真皮細胞に培地を変えてＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ  ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）２μＭ、ＥｔｈＤ−１（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）４μＭを２５℃で３０分間処理した。
【０１２８】
細胞の生存及び死滅は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ製）で細胞を蛍光染色して共焦点蛍光顕微鏡でイメージ化した。生きている細胞は、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭが細胞内のエストラーゼ（ｅｓｔｅｒａｓｅ）の活性を認知して緑色蛍光を帯び、ＥｔｈＤ−１（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）は、死滅する細胞の損傷した細胞膜に浸透して細胞内に入り込み、核酸に結合して赤色蛍光を帯びる。
【０１２９】
上記の結果は図１０に示した。実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理回数に依存的に生きている細胞の比率が高いことを確認することができる。
【０１３０】
実験例３−２．細胞生存率の確認
細胞生存率の確認は、ＷＳＴ−１アッセイ（ＥＺ−ｃｙｔｏｘ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）によって行った。毛乳頭真皮細胞（ＤＰＣ）を９６ウェルプレートに１×１０４／ｗｅｌｌの密度で２４時間培養した。その後、実施例３、比較例３、４、５及び６のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理後、テストステロンが濃度別（２００μＭ、４００μＭ）で処理された培地と交換し、さらに２４時間後、そのままＷＳＴ−１試薬を添加した。ＷＳＴ−１試薬を培養液の１０％仕込み、１時間後に４６０ｎｍで吸光度を測定して細胞の生存及び増殖を対照群（非処理群）と比較した。細胞の生存評価は、ナノリポソームの処理後５日間、２４時間を周期として測定した。
【０１３１】
このとき、図１１のＡはナノリポソーム−マイクロバブル結合体のみを処理した細胞実験群に対する結果であって、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の毒性なしに細胞がよく育つことを示し、図１１のＢ及び図１１のＣは本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を処理した後、テストステロンを２００〜３００μＭ処理した細胞実験群に対する結果であって、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理回数依存的に細胞の生存及び増殖が著しく増加することが確認される。このような結果は、本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が細胞におけるテストステロンによるアポトーシスを効果的に抑制することができることを意味する。
【０１３２】
＜実験例４．テストステロンがジヒドロテストステロンに転換された量の測定＞
本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が細胞においてＳＲＤ５Ａ２遺伝子を編集した後、実際、テストステロンがジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に転換されるかを確認した。ナノリポソーム−マイクロバブル結合体が細胞処理条件を実験例３−２と同様にし、その後、テストステロン（０〜４００μＭ）の含まれた培地で交換し、２４時間処理した。
【０１３３】
上記の結果は図１２に示した。対照群（非処理群）では、テストステロンの処理濃度と比例してジヒドロテストステロンの発現量が増加するが、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体処理群では、テストステロンの処理濃度が高くても、ジヒドロテストステロンタンパク質の発現が相対的に増加しないため、本発明の組成物が脱毛の進行を抑制する組成物であることを確認することができる。
【０１３４】
＜実験例５．カスパーゼ−３活性の測定＞
カスパーゼ−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）活性をＣａｓｐａｓｅ−３  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて確認した。以前の実験のように実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を１〜５日間毛乳頭真皮細胞に処理した後、テストステロン（２００μＭ、４００μＭ）の含まれた培地で交換し、２４時間処理した。その後、各細胞からタンパク質を抽出し、抽出されたタンパク質の１ｘアッセイバッファＡと基質溶液Ｂ（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ）を２００μｌ入れて混合し、３７℃で３０分間反応した。反応後、励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）３８０ｎｍとエミッション（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）４４０ｎｍで蛍光値を測定してカスパーゼ−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）活性を測定した。
【０１３５】
上記の結果は図１３に示した。ＳＲＤ５Ａ２遺伝子の編集後、テストステロンの処理時に、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理回数依存的にカスパーゼ−３活性が著しく減少したことを確認することができる。
【０１３６】
＜実験例６．マウスモデルにおけるナノリポソーム−マイクロバブル結合体の脱毛抑制効果の確認＞
実験例６−１．マウス真皮組織ＤＮＡにおけるガイドＲＮＡの活性の確認
マウスから毛乳頭真皮組織内の細胞でのｓｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４及びｍ５（配列番号１６、１７、１８、１９及び２０）の効率を比較するために、マウス真皮組織を得てＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、ｓｇＲＮＡ  ｍ１及びｍ２はフォワードプライマー（Ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＴＴ、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴ、ｓｇＲＮＡ  ｍ３及びｍ４はフォワードプライマー（Ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＴ、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＡＡＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴ、ｓｇＲＮＡ  ｍ５はフォワードプライマー（Ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＡＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＣＣ、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）：ＧＧＧＴＣＡＴＡＧＡＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧを用いて、ＰＣＲ法によって各テンプレートフラグメント（５００ｂｐ）を作った。次に、精製されたＣａｓ９タンパク質、または、精製されたＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４及びｍ５（配列番号３６、３７、３８、３９及び４０）を混合して入れた。
【０１３７】
図１４を参照すると、精製されたＣａｓ９タンパク質のみを入れた実験群では、ガイドＲＮＡが存在しないため、Ｃａｓ９タンパク質がフラグメントを切断しておらず、精製されたＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４及びｍ５（配列番号３６、３７、３８、３９及び４０）とを混合した実験群では、Ｃａｓ９タンパク質がフラグメントを切断したことを示す結果が確認される。その中でも、ｓｇＲＮＡ  ｍ１（配列番号３６）の効率が最も良いことが確認され、以後のマウス実験はいずれも、配列番号３６のガイドＲＮＡが含まれているものを使用した。
【０１３８】
実験例６−２．マウスにおける脱毛改善及び治療剤としての効率の確認
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を動物用除毛器（ｐｈｉｌｉｐｓ製）と除毛クリーム（Ｖｅｅｔ製）を用いてマウスの背中の毛を除毛した後、対照群２、実験群１、２及び３には、プロピレングリコールとエタノールとの混合溶液（３：７（ｖ：ｖ））に溶かしたテストステロン（３０μｇ／ｍｌ）を毎日塗布してヒトの脱毛と同様の環境に作った。対照群１は、除毛後、何らの処理もしていない。実験群１、２及び３は、本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体（２００μｌ、ナノリポソーム−マイクロバブル２：１の割合で結合されて分散したもの）を、マウスの除毛された背中全体にプラスチックスパチュラで２００μｌずつ塗布し、３分後、医療用超音波機器を用いて超音波にさらした。実験群１は実施例２を１回処理、実験群２は実施例２を３回処理、実験群３は実施例２を５回処理したことをそれぞれ示す。
【０１３９】
上記の結果は図１５に示した。対照群２では、テストステロンの影響により２１日以後に毛がほとんど育っていないが、実施例２を３回及び５回処理した（実験群２及び３）実験群で対照群２に比べて相対的に毛が育つことを確認することができた。
【０１４０】
実験例６−３．マウスにおけるＳＲＤ５Ａ２発現の特徴−ｍＲＮＡ発現量の確認
マウスに本発明で製造した実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ（７４μｇ：２６μｇ））を処理した後、２４時間後にマウスの皮膚を得てＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｐｒｅｍｉｘ  ２ｘ（ＧｅＮｅｔＢｉｏ製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１４１】
ＳＲＤ５Ａ２のｍＲＮＡ発現を確認するための実時間ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ２ｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）とＡＢ  ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて測定した。このとき、検出に使用したプライマーの塩基配列は、次のとおりである。
【０１４２】
ＳＲＤ５Ａ２  ｓｅｎｓｅ：ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＡＧＡＴＴＡ
ＳＲＤ５Ａ２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＣＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＧＴＡＴＧ
ＧＡＰＤＨ  ｓｅｎｓｅ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡ
ＧＡＰＤＨ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡ
上記の結果は図１６に示した。実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の処理により毛乳頭真皮細胞におけるＳＲＤ５Ａ２  ｍＲＮＡの発現が著しく減少する結果を確認することができる。
【０１４３】
以上の結果から、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が脱毛を誘導するＳＲＤ５Ａ２を根本的に抑制することができることが確認される。これは、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体が男性型脱毛の治療に非常に効果的であることを提示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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