(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を得る方法であって、
細胞はゲノムＤＮＡを含み、前記ゲノムＤＮＡは、複数のレトロトランスポゾンの塩基配列を含み、
方法は、
（ｉ）ゲノムＤＮＡ中の標的配列中に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列（すなわち、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列）を新たに導入し、標的配列中にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が組込まれたゲノムＤＮＡを含む細胞を選択すること、
を含み、
上記（ｉ）において、標的配列中への前記新たな導入が、塩基配列特異的な切断とその後に生じる相同組換えを利用してレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡの標的配列中に導入することを含む、
方法。
【請求項２】
上記（ｉ）において、標的配列中への前記新たな導入が、当該導入の際にゲノムＤＮＡに組込まれた人工的な配列の一部または全部を、ゲノムＤＮＡから除去し、組込まれた人工的な配列の一部または全部が除去された細胞を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記（ｉ）において新たに導入する塩基配列が、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと９０％以上の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記（ｉ）において新たに導入する塩基配列が、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと同一の塩基配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）ゲノムＤＮＡ中の別の標的配列（第２の標的配列）中に、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列（第２の塩基配列）を導入することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムＤＮＡを改変する方法および改変を検出する方法に関する。本発明は、例えば、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列を導入することを含む方法に関する。本発明はまた、レトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの、それぞれの周辺配列に対する挿入位置を変更することを含む方法に関する。本発明ではこのような方法により得られる改変真核細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞のゲノムをラベリングする技術は、細胞の由来をトラッキングする技術として有用であり、開発がなされている。例えば、特許文献１〜３では、細胞ゲノムＤＮＡに情報、コード配列、または暗号を導入する方法が開示されている。特許文献１〜３では、情報またはコード配列を導入するためにレトロトランスポゾンを利用することが開示されている。
【０００３】
農産物の品種識別、品質管理および流通管理の方法として、レトロトランスポゾンの塩基配列を利用する技術が開発されている。例えば、非特許文献１では、サツマイモのゲノムＤＮＡを分析して、内在するレトロトランスポゾンの塩基配列の挿入多型に基づくサツマイモ品種の識別方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＵＳ２０１０／０２８１５５５
【特許文献２】ＷＯ２０２０／２４７６８５Ａ
【特許文献３】ＷＯ２０００／０６８４３１Ａ
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｎｄｅｎ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２１（５）：  ４９１−４９８，  ２０１４
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、真核細胞中のゲノムＤＮＡを改変する方法および改変を検出する方法を提供する。本発明は、例えば、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列を導入することを含み得る。本発明はまた、レトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの、その周辺配列に対する挿入位置を変更することを含み得る。本発明はさらに、レトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの配列を改変することを含み得る。本発明ではこのような方法により得られる改変真核細胞が提供される。
【０００７】
真核細胞は、多数のレトロトランスポゾンの配列を含み、かつ、レトロトランスポゾンは、同生物種の細胞間や個体間で挿入位置が異なる多型（すなわち、挿入多型）を生じ得る。この挿入多型故に、上記改変を有する細胞において、その改変情報に基づけば、細胞の当該改変を特定できるが、その改変情報に基づかなければ当該改変を特定できないことを利用し、上記改変を細胞に対して改ざん不能なラベリングとして利用することができる。
【０００８】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）細胞を得る方法であって、
細胞はゲノムＤＮＡを含み、好ましくはクローン化された細胞であり、前記ゲノムＤＮＡは、複数のレトロトランスポゾン（好ましくは転移活性型レトロトランスポゾン）の塩基配列を含み、
方法は、
（ｉ）ゲノムＤＮＡ中の標的配列中に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列（すなわち、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列）を新たに導入し、標的配列中にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が組込まれたゲノムＤＮＡを含む細胞を選択すること、
（ｉｉ）ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの、それぞれの周辺配列に対する挿入位置を変更し、挿入位置が変更されたレトロトランスポゾンの塩基配列を有するゲノムＤＮＡを含む細胞を選択すること、および／または
（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡが有する１以上のトランスポゾンの塩基配列を改変（挿入、置換、欠失、付加、および削除から選択される塩基配列の改変）し、ゲノムＤＮＡの特定の位置のトランスポゾンの塩基配列が、天然の配列と異なる配列となっている細胞を選択すること、
を含む、方法。
（２）上記（ｉ）において、標的配列中への前記新たな導入が、塩基配列特異的な切断とその後に生じる相同組換えを利用してレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡの標的配列中に導入して、標的配列中にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が組込まれたゲノムＤＮＡを含む細胞を選択することを含む、
上記（１）に記載の方法。
（３）上記（ｉ）において、標的配列中への前記新たな導入が、当該導入の際にゲノムＤＮＡに組込まれた人工的な配列の一部または全部を、ゲノムＤＮＡから除去し、組込まれた人工的な配列の一部または全部が除去された細胞を選択することをさらに含む、上記（２）に記載の方法。
（４）上記（ｉ）において新たに導入する塩基配列が、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと９０％以上の配列同一性を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記（ｉ）において新たに導入する塩基配列が、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと同一の塩基配列である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（ｉ）ゲノムＤＮＡ中の別の標的配列（第２の標的配列）中に、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列（第２の塩基配列）を導入することをさらに含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ゲノムＤＮＡ中の標的配列中に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する追加の塩基配列を有する、細胞。
（７Ａ）（ｉｉ）上記レトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも２つの、それぞれの周辺配列に対する挿入位置を変更することを含む、上記（１）〜（６）のいずれか記載の方法。
（８）追加の塩基配列が、非天然の塩基配列である、上記（７）に記載の細胞。
（８Ａ）（８ａ）周辺配列に対する挿入位置が変更されたレトロトランスポゾンの塩基配列を有するゲノムＤＮＡを有する細胞、または（８ｂ）レトロトランスポゾンの塩基配列の一部に改変を有するゲノムＤＮＡを有する細胞。
（９）細胞、そのゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片の由来を分析する方法であって、
上記（７）または（８）に記載の細胞（起源細胞）に由来すると疑われる被検細胞のゲノムＤＮＡ、被検ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片の改変された領域の塩基配列を解読すること、または解読されたその塩基配列の情報を提供することと、
解読された塩基配列と改変された領域の情報とに基づいて、改変された領域に導入した塩基配列が存在しているか否かを決定または推定することと、
改変された領域に導入した配列が存在していると決定または推定された場合には、被検細胞は、上記（７）または（８）に記載の細胞（前記起源細胞）に由来する、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、被検細胞は、上記（７）または（８）に記載の前記細胞に記載の細胞（前記起源細胞）に由来しない、またはその可能性があると決定または推定すること
を含む、方法。
（１０）上記（７）または（８）に記載の細胞を含む、非ヒト生物。
（１１）上記（７）または（８）に記載の細胞をそれぞれ含む複数の容器を備える細胞管理システムであって、前記容器は、それぞれに対応する読み取り可能な情報を備え、当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域を含む対応表をさらに備える、細胞管理システム。
（１２）上記（７）または（８）に記載の細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器それぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域の情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、容器に付された読み取り可能な情報から、容器に含まれる細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片中の改変された領域の情報を特定すること、および／または、改変された領域の情報から、当該改変を有する細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片、またはそれを含む容器を特定することを含む、方法。
（１３）上記（７）または（８）に記載の細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器であって、それぞれ、読み取り可能な情報が付与された容器を用意することと、
当該容器を細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の保管または保存に適した条件下で保管または保存することと、
をさらに含む、上記（１２）に記載の方法。
（１４）上記（７）または（８）に記載の細胞を含む動植物（例えば、家畜）の個体または品種の情報と、当該情報に対応付けされた前記動植物（例えば、家畜）の個体または品種それぞれのゲノムＤＮＡの改変情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、動植物（例えば、家畜）の個体または品種の情報から、そのゲノムＤＮＡの改変情報を特定すること、および／または、ゲノムＤＮＡの改変情報から、当該当該改変を有する動植物（例えば、家畜）の個体または品種を特定することを含む、方法。
（１５）細胞またはそのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の情報の管理システムであって、
上記（７）または（８）に記載の細胞またはそのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体と、
上記読み取り可能な情報、および／または、改変情報を受領する受領部と、
プログラムを実行可能なプロセッサを含み、プログラムは、記憶媒体から読み出した対応表に基づいて、受領した読み取り可能な情報を有する容器に含まれる細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変情報を特定する、および／または、改変情報から細胞、それぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片、またはこれらを含む容器を特定するプログラムである、
情報の管理システム。
（１６）動植物（例えば、家畜）の個体または品種の管理システムであって、
上記（７）または（８）に記載の細胞をそれぞれ含む複数の動植物（例えば、家畜）の個体または品種それぞれの情報と当該情報のそれぞれに対応付けされた動植物（例えば、家畜）の個体または品種のゲノムＤＮＡの改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体と、
上記複数の動植物（例えば、家畜）の個体または品種の情報、および／または、ゲノムＤＮＡの改変情報を受領する受領部と、
プログラムを実行可能なプロセッサを含み、プログラムは、記憶媒体から読み出した対応表に基づいて、受領した動植物（例えば、家畜）の個体または品種の情報に対応する動植物（例えば、家畜）の個体または品種のゲノムＤＮＡの改変情報を特定する、および／または、ゲノムＤＮＡの改変情報に対応する改変を有する動植物（例えば、家畜）の個体または品種を特定するプログラムである、
情報の管理システム。
（１７）上記（７）または（８）に記載の細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器を含む保管庫（例えば、液体窒素を含む保管庫、冷凍庫、例えば、−８０℃〜−２０℃を有する冷凍庫）をさらに含む、上記（１５）に記載の細胞の管理システム。
（１８）レトロトランスポゾンが、転移活性型レトロトランスポゾンである、上記（１）〜（６）のいずれか記載の方法、上記（７）または（８）に記載の細胞、上記（９）に記載の方法、または、上記（１０）に記載の非ヒト生物。
（１９）（ｉ）を含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（２０）（ｉｉ）を含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（２１）（ｉｉｉ）を含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ゲノムＤＮＡへのレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入する方法の一例を示す。
【図２】図２は、ゲノムＤＮＡへのレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入する方法の一例を示す。
【図３】図３は、ゲノムＤＮＡへのレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入する方法の一例を示す。
【図４】図４は、ゲノムＤＮＡへのレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入する方法の一例を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本明細書では、「真核生物」とは、細胞核を有する細胞を有する生物である。真核生物は、特に限定されないが、動物、または植物であり得る。動物としては、哺乳動物（非ヒト哺乳動物）、特に、家畜、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラマ、およびラクダ、ニワトリなどの鳥類、および魚類などの魚介類などの農用動物、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、およびマウスなどの愛玩動物、並びに昆虫が挙げられる。植物としては、例えば、農作物、例えば、食用作物、例えば、イネ、トウモロコシ、イモ類、豆類、オオムギおよびコムギなどの麦類、園芸作物（野菜、果樹、および花卉）、例えば、葉菜類（キャベツ、アスパラガス等）、果菜類（ナス、トマト、キュウリ等）、根菜類（大根、人参等）、その他の野菜、果物（例えば、リンゴおよびナシなどの仁果類、ウメ、アンズ、スモモ、モモ、サクランボなどの核果類、アーモンド、クルミ、およびクリなどの殻果類、ミカン、およびレモンなどの柑橘類、トロピカルフルーツなどの熱帯果樹）、および、観葉植物、並びにこれらのいずれかの種子、苗、または球根が挙げられる。真核生物はまた、微細藻類であり得る。真核生物は、ヒトまたは非ヒトであり得る。
【００１１】
本明細書では、「細胞」とは、少なくともゲノムＤＮＡと細胞質と、これらを包む膜構造を有する生命の基本単位をいう。細胞としては、特に限定されないが、原核生物の細胞と真核生物の細胞とが挙げられる。ゲノムＤＮＡは、その細胞の内因性のＤＮＡを含むが、必ずしもその細胞の内因性の因子のみから構成されるものではない。本明細書では、真核生物の細胞または真核細胞は、真核生物の細胞である。真核細胞は、ヒト細胞であってもよい。細胞は、精製された細胞または単離された細胞であり得る。細胞は、培養された細胞であってもよい。細胞は、株化された細胞であってもよい。細胞は、例えば、体細胞であり得る。細胞は、例えば、多能性細胞または多能性幹細胞であり得る。細胞は、例えば、組織幹細胞であり得る。細胞は、例えば、組織前駆細胞であり得る。細胞は、例えば、生殖細胞であり得る。
【００１２】
細胞は、細胞のゲノムＤＮＡを含むが、外来の侵入者（例えば、病原体）のゲノムＤＮＡをさらに含む場合がある。本明細書では、ゲノムＤＮＡは、断りのない限り、細胞自体のゲノムＤＮＡ（すなわち、宿主ゲノムＤＮＡ）という。侵入者のゲノムＤＮＡは、宿主のゲノムＤＮＡとは別体として細胞内で存在し得るが、宿主のゲノムＤＮＡに組込まれていることもある。宿主ゲノムＤＮＡは、外来性の因子（例えば、ウイルス等のゲノムＤＮＡの全部または一部の挿入）を含んでいることがある。
【００１３】
本明細書では、「細胞集団」とは、複数の細胞を含む組成物を意味する。
【００１４】
本明細書では、「単離」とは、目的の細胞を少なくとも１つの他の構成要素から分離することを意味する。単離は、例えば、自然な存在状態の細胞を自然な存在状態において一緒に存在する他の構成要素から分離して取り出すことにより実施され得る。単離は、例えば、多細胞生物から一部の細胞を分離して取り出すことにより実施され得る。単離された細胞を扱う技術を本明細書では、インビトロの技術という。
【００１５】
本明細書では、「精製」とは、単離された目的の細胞を、一緒に存在する他の構成要素からさらに分離することを意味する。精製は、例えば、目的の細胞を、形態や表面マーカーに基づいて他の構成要素から分離することにより実施され得る。精製は、細胞の限外希釈および／またはクローニングにより実施され得る。精製は、目的の細胞の株化により実施され得る。精製は、目的の細胞が薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク質をコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を有する場合には、当該マーカー遺伝子の発現に基づいて実施することができる。本明細書では、「富化」（ｅｎｒｉｃｈ）とは、目的の細胞の存在密度を向上させることを意味する。
【００１６】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
【００１７】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、５’側から３’側に向かって記載する。「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
【００１８】
本明細書では、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
【００１９】
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載する。
【００２０】
本明細書では、「アレル」という用語は、染色体ゲノム上の同一座位に存在する塩基配列のセットを指す。ある態様では、２倍体の細胞では同一座位に２アレル存在し、３倍体の細胞では同一座位に３アレル存在する。また、ある態様では、染色体の異常なコピーまたは当該座位の異常な追加のコピーによって追加のアレルが形成されている場合がある。
【００２１】
本明細書では、「ゲノム改変」又は「ゲノム編集」という用語は、相互に互換的に用いられ、ゲノム上の所望の位置（標的領域）に変異を誘導することを指す。ゲノム改変は、標的領域ＤＮＡを切断するように設計された配列特異的核酸切断分子（例えば、配列特異的または配列依存的エンドヌクレアーゼ）の使用（特に、細胞への導入）を含み得る。好ましい実施形態において、ゲノム改変は、標的領域のＤＮＡを切断するように操作されたヌクレアーゼの使用、を含み得る。好ましい実施形態において、ゲノム改変は、標的領域中の特定の塩基配列を有する標的配列を切断するように操作されたヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥＮやジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））の使用を含み得る。特に好ましい実施形態において、ゲノム改変は、標的領域中の特定の塩基配列を有する標的配列を切断するように操作されたヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム）の使用を含み得る。好ましい実施形態において、ゲノム改変は、標的領域中の特定の塩基配列を有する標的配列を切断するように、メガヌクレアーゼなどのゲノムに１つしか切断部位を有しない制限酵素（例えば、１６ベースの配列特異性を有する制限酵素（理論上は４16塩基に１つの割合で存在する）、１７ベースの配列特異性を有する制限酵素（理論上は４17塩基に１つの割合で存在する）、および１８ベースの配列特異性を有する制限酵素（理論上は４18塩基に１つの割合で存在する））などの配列特異的エンドヌクレアーゼを用いることができる場合もある。典型的には、部位特異的ヌクレアーゼの使用により、標的領域のＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導され、その後、相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）及び非相同末端再結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｒｅｐａｉｒ：ＮＨＥＪ）のような、細胞の内因性プロセスによってゲノムが修復される。ＮＨＥＪは、ドナーＤＮＡを用いずに二本鎖切断された末端を連結する修復方法であり、修復の際に挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）が高頻度で誘導される。ＨＤＲは、ドナーＤＮＡを用いた修復機構であり、標的領域に所望の変異を導入することも可能である。ゲノム改変技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが好ましく例示される。メガヌクレアーゼとしては、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ���Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−Ｍｔｕｌ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、およびＰＩ−ＴｌｉＩＩ、並びにこれらの機能的な誘導体制限酵素からなる群から選択されるメガヌクレアーゼおよびその切断部位（または認識部位）、好ましくは、１８塩基以上の配列特異性を有する制限酵素であるメガヌクレアーゼおよびその切断部位（または認識部位）、特に細胞のゲノムを１箇所または複数箇所以上切断しないメガヌクレアーゼおよびその切断部位を用いることができる。
【００２２】
「標的領域」という用語は、ゲノム改変システムによりターゲティングされる領域をいう。本発明では、２箇所の標的領域（例えば、第１の標的領域および第２の標的領域）の間に位置するゲノム上のＤＮＡ領域を欠失させ得る。
【００２３】
「配列特異的核酸切断分子」という用語は、特定の核酸配列を認識し、前記特定の核酸配列で核酸を切断することができる分子を指す。配列特異的核酸切断分子は、配列特異的に核酸切断する活性（配列特異的核酸切断活性）を有する分子である。
【００２４】
「標的配列」という用語は、配列特異的核酸切断分子による切断の対象となるゲノム中のＤＮＡ配列を指す。配列特異的核酸切断分子がＣａｓタンパク質である場合、標的配列は、Ｃａｓタンパク質による切断の対象となるゲノム中のＤＮＡ配列を指す。Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９タンパク質を用いる場合、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する配列である必要がある。標的配列は、通常、ＰＡＭの５’側直前に隣接する１７〜３０塩基（好ましくは１８〜２５塩基、より好ましくは１９〜２２塩基、さらに好ましくは２０塩基）の配列が選択される。標的配列の設計には、ＣＲＩＳＰＲ  ＤＥＳＩＧＮ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）等の公知のデザインツールを利用することができる。
【００２５】
「Ｃａｓタンパク質」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質を指す。好ましい態様において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、エンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す。Ｃａｓタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、Ｃａｓ９タンパク質等が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと協働してエンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す限り、野生型Ｃａｓタンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。
好ましい態様において、Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものであり、より好ましくはＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものである。Ｃａｓタンパク質の好ましい例としては、Ｃａｓ９タンパク質が例示される。
【００２６】
「Ｃａｓ９タンパク質」という用語は、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡと協働して標的領域のＤＮＡを切断する活性を示す。Ｃａｓ９タンパク質は、前記の活性を有する限り、野生型Ｃａｓ９タンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインとしてＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するが、本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインのいずれか一方が不活性化されたものであってもよい。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインのいずれか一方が不活性化されたＣａｓ９は、二本鎖ＤＮＡに対して一本鎖切断（ニック）を導入する。そのため、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインのいずれか一方が不活性化されたＣａｓ９を二本鎖ＤＮＡの切断に用いる場合には、センス鎖とアンチセンス鎖それぞれに対してＣａｓ９の標的配列を設定し、センス鎖およびアンチセンス差のニックが十分に近い位置で生じ、それにより二本鎖切断が誘発されるように、改変システムを構成することができる。
Ｃａｓ９タンパク質が由来する生物種は特に限定されないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、又はトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属に属する細菌等が好ましく例示される。より具体的には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、又はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ等に由来するＣａｓ９タンパク質が好ましく例示される。好ましい態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質である。
【００２７】
「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、相互に互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的領域に誘導することができるＲＮＡを指す。好ましい態様において、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ゲノム上の標的領域への結合に関与し、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質との結合に関与する。好ましい態様において、ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列とリピート配列とを含み、スペーサー配列が標的領域において標的配列の相補鎖と結合する。好ましい態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、アンチリピート配列と３’テイル配列とを含む。アンチリピート配列はｃｒＲＮＡのリピート配列と相補的な配列を有し、リピート配列と塩基対を形成し、３’テイル配列は通常３つのステムループを形成する。
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端にｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を連結した単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを別々のＲＮＡ分子とし、リピート配列及びアンチリピート配列で塩基対を形成させたものであってもよい。好ましい態様において、ガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡである。
【００２８】
ｃｒＲＮＡのリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、Ｃａｓタンパク質の種類に応じて適宜選択することができ、Ｃａｓタンパク質と同じ細菌種に由来するものを用いることができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムとしては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡ）を用いることができる。ｓｇＲＮＡ設計のためのｃｒＲＮＡリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、種々提案されており、当業者は、公知技術に基づいてｓｇＲＮＡを設計することができる（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３７，  ８１６−２１；  Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３９：  ６１２１，  ８２３−６；  Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３９：  ６１２１，  ８１９−２３；  Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：  ３，  ２２７−９；  Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ｅＬｉｆｅ，  ２，  ｅ００４７１）。
【００２９】
ポリヌクレオチドに関して用いる「作動可能に連結」という用語は、プロモーターなどの制御配列が遺伝子配列に十分に近くに配置され、プロモーターなどの制御配列が遺伝子配列の発現に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結するとは、当該ポリヌクレオチドが、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
【００３０】
「発現可能な状態」という用語は、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを指す。
「発現ベクター」という用語は、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。例えば、「Ｃａｓタンパク質の発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、Ｃａｓタンパク質を発現可能なベクターを意味する。また、例えば、「ガイドＲＮＡの発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、ガイドＲＮＡを発現可能なベクターを意味する。
【００３１】
本明細明細書において、塩基配列どうし又はアミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、対応する塩基又はアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く、塩基配列全体又はアミノ酸配列全体に対する一致した塩基又はアミノ酸の割合として求められる。塩基配列又はアミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００３２】
本明細書では、「トランスポゾン」とは、ゲノムＤＮＡ中に存在する可動遺伝因子である。トランスポゾンは、真核細胞のゲノムＤＮＡ内に普遍的に存在する。レトロトランスポゾンは、ゲノムＤＮＡ中の自身のコピーをＲＮＡに転写し、その後、逆転写によって当該ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成し、ゲノムＤＮＡ中に当該ＤＮＡを挿入することによってゲノムＤＮＡ中に自己のＤＮＡを複製するタイプのトランスポゾンである。転移活性型レトロトランスポゾンは、転移活性を有するものを意味する。レトロトランスポゾンは、一度、ゲノムＤＮＡに挿入されるとその位置を変えることないという特徴を有し、そのうえで、そのコピーをゲノム上に増やす特徴を有することから、レトロトランスポゾンは、ｃｏｐｙ−ａｎｄ−ｐａｓｔ型のトランスポゾンに分類される。レトロトランスポゾンは、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンと非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンに大別される。非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、長鎖散在反復配列（ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するもの（ＬＩＮＥ）と、短鎖散在反復配列（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するもの（ＳＩＮＥ）に大別される。例えば、ヒトでは、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンはゲノムの約８％を占め、ＬＩＮＥはゲノムの約２１％を占め、ＳＩＮＥはゲノムの約１４％を占めると理解されている。ＳＩＮＥとしては、Ａｌｕ配列がヒトゲノムの約１０％を占めることで知られる。ヒトでは、Ａｌｕファミリーの配列またはＬ１（ＬＩＮＥ１）ファミリーの配列を好ましく用いることができる。その他、ＳＩＮＥファミリーの配列（例えば、ＳＶＡ配列）またはＬＴＲファミリーの配列（例えば、ＥＲＶ（Ｋ）配列、ヒトではＨＥＲＶ−Ｋ配列）もまた好ましく用いることができる。本発明のすべての態様においてレトロトランスポゾンは、好ましくは転移活性型レトロトランスポゾンである。転移活性型レトロトランスポゾンは、多型挿入を生じ得る。
【００３３】
＜細胞を得る方法＞
本発明によれば、細胞を得る方法が提供される。すべての実施形態において、細胞は、好ましくはレトロトランスポゾンを有する細胞であり得、真核細胞であり得る。すべての実施態様において、細胞は、好ましくは、クローン化した細胞であり得る。本発明の方法はまた、すべての実施態様において好ましくはインビトロの方法であり得る。したがって、本発明の方法では、単離された細胞が得られ得る。本発明で得られた単離された細胞は、標的配列中に挿入すべき塩基配列が挿入されている細胞であり得る。
【００３４】
本発明で得られた細胞は、その後、クローン化されても、クローン化されなくてもよい。ある好ましい態様では、本発明で得られた細胞は、クローン化され、クローン化された細胞として得られ得る。ゲノムを均一にすることによって、その後の遺伝子操作等がやりやすくなるメリットがある。ある好ましい態様では、本発明で得られた細胞は、クローン化されない。ゲノムが不均一であることにより、改変部位の存在がさらに分かりにくくなるというメリットがある。この観点では、本発明の改変対象となる細胞も、クローン化していない単離細胞であることが好ましい場合がある。このように得られた細胞のゲノムＤＮＡの均質性を確保するか否か、例えば、細胞をクローン化するかしないかは、目的に応じて好ましい態様を適宜選択することができる。
【００３５】
本発明では、複数のレトロトランスポゾンの塩基配列を含む細胞を改変する。すべての実施形態において、レトロトランスポゾンは、好ましくは転移活性を有し得る。具体的には、本発明は、複数のレトロトランスポゾンの塩基配列を含む細胞のゲノムＤＮＡの標的配列中に、新たにレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を新たに導入することを含む。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンのいずれか１つと配列同一性（例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％の配列同一性）を有し得る。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、非天然の塩基配列を有するものとしてもよい。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、当業者であれば適宜設計し、合成することができる。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、レトロトランスポゾンの塩基配列を改変することにより得ることができる。改変は、挿入、置換、欠失、付加、および削除から選択される塩基配列の改変であり得る。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、例えば、レトロトランスポゾンの塩基配列の±５０％以内、±４０％以内、±３０％以内、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±９％以内、±８％以内、±７％以内、±６％以内、±５％以内、±４％以内、±３％以内、±２％以内、±１％以内、±１０塩基以内、±９塩基以内、±８塩基以内、±７塩基以内、±６塩基以内、±５塩基以内、±４塩基以内、±３塩基以内、±２塩基以内、±１塩基以内の長さを有し得る。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、レトロトランスポゾンの塩基配列と同じ長さを有し得る。
【００３６】
細胞の中でも特に真核細胞は、ゲノムＤＮＡ内に複数の（大量の）レトロトランスポゾンの塩基配列を有する。通常は、ゲノムＤＮＡは大量のレトロトランスポゾンおよびレトロトランスポゾン様配列の挿入を有するが、その上、これらの配列は自発的にゲノムＤＮＡ中でコピーを大量かつランダムに増加させるために、これらの増加した配列と、人為的に挿入した配列とを、人為的な挿入の情報無しに区別することができない。しかし、人為的な挿入に関しては、その位置および配列の情報に基づけば容易に特定することができる。例えば、ランダムな挿入では正確な位置に特定の配列が挿入されることは確率的に無視できる。例えば、１塩基レベルの正確な位置に特定の配列が挿入される確率は無視できる程度であり、したがって、正確な挿入位置の情報に基づいてその情報の通りの挿入がある場合には、それは人為的に挿入された配列であると推定することができる。これに対して、挿入位置が不明な場合には、増加するトランスポゾンおよびトランスポゾン様配列のために、天然に生じた配列であるのか人為的に挿入された配列であるのかを決定することができない。このように、挿入情報に基づかなければ挿入の有無および挿入位置を特定することが容易ではないから、導入されたラベルの削除や変更などのラベルの改ざんが不能である。したがって、本発明は、上記改変を改ざん不能な細胞のラベリング技術として用いることができる。
【００３７】
本発明のある態様では、追加のトランスポゾンまたはトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡの標的配列中に（好ましくは、特定配列中に１塩基レベルの位置精度で正確に）導入し、既存の大量のレトロトランスポゾンに紛れ込ませることができる。導入は、ゲノム編集技術などのゲノム改変技術を用いることによって正確に行うことができる。例えば、ゲノム改変技術を用いることによって１塩基レベルで正確な位置に核酸配列を導入することができる。これに対して、当該塩基配列に導入配列が正確に導入されているかどうかを確認することは、当該領域の塩基配列の改変情報（例えば、改変された領域の情報、例えば、改変された領域の塩基配列の情報、塩基配列が導入された位置の情報、および導入された塩基配列の情報）に基づけば容易である。レトロトランスポゾンは、自己の複製をゲノムＤＮＡ中に導入するが、導入位置は基本的にはランダムである。改変した細胞のゲノムＤＮＡと同一の位置に偶然に１塩基の位置の相違もなく新しくトランスポゾンが自然に挿入される確率は無視できる程度に低いと考えられることから、追加で導入したトランスポゾンまたはトランスポゾン様配列は、その導入位置が１塩基レベルの位置精度で（すなわち、１塩基のズレもなく）導入した位置に存在する場合には、その配列は人為的に導入されたものであると決定または推定することができる。しかしながら、現実には、培養途上で、低い頻度で１塩基から数塩基程度の塩基配列の挿入、欠失および置換が生じ得る。本明細書では「数塩基」とは、４〜７塩基程度、好ましくは、４塩基または５塩基程度を意味する。したがって、１塩基から数塩基は、例えば、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、または７塩基であることを意味する。したがって、分析する際には、１塩基から数塩基程度のずれや相違があったとしても正しい位置に挿入されたものであったと推定してもよい。したがって、ある態様では、正しい位置に挿入されているか否かは、設計した位置からのずれや置換が１塩基から数塩基程度（好ましくは１〜２塩基、より好ましくは１塩基）である場合には、正しい位置に挿入されていると推定または決定することをさらに含む。ゲノムサイズを考慮すれば、数塩基の相違した箇所に偶然レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が自然に挿入される確率はほとんど無視できる程度に低いからである。ゲノムＤＮＡの異なる複数の箇所（例えば、２〜５箇所、例えば、２箇所、例えば、３箇所）に、同一のまたは異なるトランスポゾンまたはトランスポゾン様配列を追加で導入することも可能であり、それぞれの導入箇所において１塩基レベルの位置精度で塩基配列が導入されていれば、当該配列は人為的に導入されたものであるとさらに確度高く決定または推定することができる。これに対して、塩基配列の改変情報（例えば、改変された領域の情報、例えば、改変された領域の塩基配列の情報、塩基配列が導入された位置の情報、および導入された塩基配列の情報）無しでは、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の人為的な導入の有無さえも特定することは容易ではなく、当然、その位置を特定することは技術的に容易ではなく、したがって、導入位置の情報を有しない者は、人為的な配列の導入箇所の塩基配列を発見することも、発見してからこれを改ざんすることも容易にはできない。この原理故に、本発明により改変されたゲノムＤＮＡを有する細胞は、改変者および改変情報を有する者のみが、ゲノムＤＮＡに導入配列が正確に導入されているかどうかを確認することが容易にでき、したがって、導入位置の塩基配列情報を有する者のみが、被検細胞が改変細胞に由来する細胞であるかどうかを決定することができる。他方で、導入位置の情報を有しない者は改変を特定することができず、また改変を改ざんすることもできない。このようにして、本発明の方法は、細胞のラベリング技術として利用することができるが、当該ラベルの有無および位置は、改変者および改変情報を有するもののみが分析することができ、かつ改ざん不能なものとなり、ラベリング技術として有益である。なお、追加のトランスポゾンまたはトランスポゾン様配列の導入位置は、細胞の生存等の細胞機能に影響をもたらさない位置とすることができる。
【００３８】
上記は、トランスポゾンまたはトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡの標的領域に導入することを例示した。しかし、既存のトランスポゾン配列の１以上の塩基配列の改変（挿入、置換、欠失、付加、および削除から選択される塩基配列の改変）、および既存のトランスポゾン配列の周辺配列の改変、並びに既存のトランスポゾン配列の位置の変更（周辺配列に対する相対的位置の変更を含む）でも同様である。トランスポゾンの配列は、多様性を有しており、その周辺配列も多様である。その上、大量のトランスポゾンおよびトランスポゾン様配列の新規の自然増加のために、改変した配列の改変情報（例えば、導入位置の情報）なしにトランスポゾン内の配列やその周辺の配列を網羅的に解析して、改変の有無や改変の位置を特定することは容易ではない。トランスポゾン全体の繰り返し構造とその塩基配列の多様性、およびそのランダムな増加故に、増加した配列の中から人工的になされた改変を特定することは事実上不可能であるためである。一方で、改変した配列情報を有している場合には、当業者は技術常識に基づいて改変したトランスポゾン内配列やその周辺配列を特定することができる。
【００３９】
したがって、本発明は、例えば、
細胞を得る方法であって、
前記ゲノムＤＮＡは、複数のレトロトランスポゾンの塩基配列を含み、
方法は、
（ｉ）ゲノムＤＮＡ中（例えば、その標的配列中）に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列（すなわち、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列）を新たに導入すること、
（ｉｉ）ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの、それぞれの周辺配列に対する挿入位置を変更すること、および／または
（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡが有する１以上のトランスポゾンの塩基配列を改変（挿入、置換、欠失、付加、および削除から選択される塩基配列の改変）すること、
を含む、方法
が提供される。
【００４０】
ある好ましい態様では、本発明は、例えば、
細胞を得る方法であって、
前記ゲノムＤＮＡは、複数のレトロトランスポゾンの塩基配列を含み、
方法は、（ｉ）ゲノムＤＮＡ中（より好ましくは、その標的配列中）に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列（すなわち、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列）を新たに導入することを含む。
【００４１】
本発明はまた、
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上を含む、細胞をラベリングする方法、
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上を含む、ラベリングされた細胞を得る方法、および
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上を含む、細胞のゲノムＤＮＡを改変する方法
を提供し得る。
【００４２】
本発明によれば、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上による改変を含むゲノムＤＮＡを有する細胞が得られる。
【００４３】
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）において、新たに導入される塩基配列、または改変された塩基配列は、ゲノムＤＮＡ中のいずれかのレトロトランスポゾンの塩基配列と配列同一性（例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％の配列同一性）を有し得る。新たに導入される塩基配列、または改変された塩基配列は、ゲノムＤＮＡ中のいずれかのレトロトランスポゾンの塩基配列の±５０％以内、±４０％以内、±３０％以内、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±９％以内、±８％以内、±７％以内、±６％以内、±５％以内、±４％以内、±３％以内、±２％以内、±１％以内、±１０塩基以内、±９塩基以内、±８塩基以内、±７塩基以内、±６塩基以内、±５塩基以内、±４塩基以内、±３塩基以内、±２塩基以内、±１塩基以内の長さを有し得る。新たに導入される塩基配列、または改変された塩基配列は、ゲノムＤＮＡ中のいずれかのレトロトランスポゾンの塩基配列と配列同一性（例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％の配列同一性）を有し、かつ、当該レトロトランスポゾンの塩基配列の±５０％以内、±４０％以内、±３０％以内、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±９％以内、±８％以内、±７％以内、±６％以内、±５％以内、±４％以内、±３％以内、±２％以内、±１％以内、±１０塩基以内、±９塩基以内、±８塩基以内、±７塩基以内、±６塩基以内、±５塩基以内、±４塩基以内、±３塩基以内、±２塩基以内、±１塩基以内の長さを有し得る。このようにすることで、塩基配列を新たに導入したり、塩基配列の位置を変えたり、新たに改変を加えることにより得られる細胞は、天然の細胞と相違し得、かつ、改変の程度を小さく留めることで、改変の内容を知らない第三者により改変を特定されにくくなる。
【００４４】
ある好ましい態様では、導入はゲノムＤＮＡの標的配列中に行われ得る。ゲノムＤＮＡの標的領域への塩基配列の導入は、ゲノム編集技術等のゲノム改変システムを用いて行うことができる。具体的には、ゲノム編集技術等のゲノム改変システムを用いて標的領域に配列依存的様式で二本鎖切断を生じさせ、ドナーＤＮＡ存在下で、培養することにより細胞は二本鎖切断の修復の際にドナーＤＮＡ配列を取り込んで標的領域をドナーＤＮＡの塩基配列で置き換えることができる。この工程において、細胞にゲノム改変システムとドナーＤＮＡを導入することを含む。ゲノム改変システムは、それに必要な構成要素を導入すること、またはそれに必要な構成要素をコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドを導入することにより、細胞内で機能させることができる。ドナーＤＮＡは、前記標的領域中の切断部位の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域中の切断部位の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームとを有し、かつ、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列を含み得る。上流ホモロジーアームは、当該相同組換えする塩基配列と完全に同一の塩基配列を有していてもよいし、相違があってもよい。下流ホモロジーアームは、当該相同組換えする塩基配列と完全に同一の塩基配列を有していてもよいし、相違があってもよい。ある好ましい態様では、ドナーＤＮＡにおいて、上流ホモロジーアームは、当該相同組換えする塩基配列と完全に同一の塩基配列を有し、下流ホモロジーアームは、当該相同組換えする塩基配列と完全に同一の塩基配列を有し、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列を含んでいてもよい。
【００４５】
ある好ましい態様では、塩基配列特異的な切断と、その後に生じる相同組換えを利用してレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡに導入することができる。この態様では、前記配列が導入された細胞をその後選択することができる。ここで、導入された細胞の選択を効率化する目的で、相同組換えをした細胞を選択マーカー遺伝子を用いて選択することが好ましい。選択マーカー遺伝子をゲノムＤＮＡに導入した場合には、好ましくは、当該選択マーカー遺伝子を少なくとも含む人工的な塩基配列の一部または全部をゲノムＤＮＡから除去することができる。人工的な塩基配列をより多くゲノムＤＮＡから取り除くことにより、改変の有無や改変の位置を、改変情報を有しない第三者に特定される可能性を低下させることができるためである。選択マーカー遺伝子の除去は上述のようにネガティブ選択用マーカー遺伝子を用いて行うことができる。
【００４６】
ある好ましい態様におけるレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の導入の手順は、例えば、図１〜４に示される通りである。これらの手順では、ゲノムＤＮＡと選択マーカー用ドナーＤＮＡとの間で相同組換えを生じさせる。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、少なくとも、ポジティブ選択用マーカー遺伝子（ＰＭ）とネガティブ選択用マーカー遺伝子（ＮＭ）を含むか、またはポジティブ選択およびネガティブ選択兼用マーカー遺伝子（ＰＮＭ）を含む。図１および図２では、選択マーカー用ドナーＤＮＡが、レトロトランスポゾン配列またはレトロトランスポゾン様配列（Ｒｔ）を有し、上記段階においてゲノムの標的領域にＲｔを組込んでいる。ポジティブ選択用マーカー遺伝子を用いて組換えを起こした細胞を選択する。選択された細胞に対して、組換え用ドナーＤＮＡを作用させ、ゲノムＤＮＡと組換え用ドナーＤＮＡとの間で相同組換えを生じさせる。この際に、ゲノムＤＮＡに導入した人工的な配列（ＰＭおよびＮＭまたはＰＮＭ）等を除去する。組換えが成功した場合には、ネガティブ選択用マーカーを発現しなくなるので、そのような細胞を取得することができる。このようにして、レトロトランスポゾン配列またはレトロトランスポゾン様配列（Ｒｔ）のみが標的領域に正確に挿入されたゲノムＤＮＡを取得することができる。図３および４では、Ｒｔが、選択マーカー用ドナーＤＮＡではなく、組換え用ドナーＤＮＡに搭載されている例が示されているが、導入手順は基本的に図１および２と同様である。
【００４７】
ある好ましい態様では、ゲノムＤＮＡに対して、ポジティブ選択用マーカー遺伝子およびネガティブ選択用マーカー遺伝子（またはポジティブ選択およびネガティブ選択の兼用マーカー遺伝子）を導入し、その後、当該マーカー遺伝子をゲノムＤＮＡから除去することを含む。レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、マーカー遺伝子の隣接配列としてゲノムＤＮＡに導入してもよいし（例えば、図１および２）、マーカー遺伝子を除去するときに、ゲノムＤＮＡに導入してもよい（例えば、図３および４）。
【００４８】
ある好ましい態様では、例えば、新たな導入が、前記染色体ゲノムの標的領域を標的とし、当該標的領域を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システムにより、標的配列を切断することと、切断部位の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを含むドナーＤＮＡによる、ポジティブ選択用マーカー遺伝子とネガティブ選択用マーカー遺伝子｛ポジティブ選択用マーカー遺伝子とネガティブ選択用マーカー遺伝子は同一遺伝子であってもよく｝を導入することと、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入することと、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の導入と同時、またはその後に前記すべてのマーカー遺伝子を除去することとを含む。
【００４９】
例えば、新たな挿入は、塩基配列特異的な切断とその後に生じる相同組換えを利用してレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡの標的配列中に導入して、標的配列中にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が組込まれたゲノムＤＮＡを含む細胞を選択することを含み得る。
【００５０】
より具体的には、当該新たな挿入は、例えば、
（ｉ−１）ゲノムＤＮＡ中の標的配列に対して、標的配列の塩基配列特異的な切断によりＤＮＡ修復を誘発することと、当該切断により誘導される相同組換えを利用して、当該標的領域にポジティブ選択用マーカー遺伝子およびネガティブ選択用マーカー遺伝子またはポジティブ選択およびネガティブ選択の兼用マーカー遺伝子を導入して、当該マーカー遺伝子が導入された細胞を選択することと、
（ｉ−２）その後、標的配列の塩基配列特異的な切断によりＤＮＡ修復を誘発することと、当該切断により誘導される相同組換えを利用して、導入したマーカー遺伝子をゲノムＤＮＡから除去して、ゲノムＤＮＡから少なくとも導入したマーカー遺伝子を除去して、当該マーカー遺伝子を有しない細胞を選択することとを含み得るものであり、これにより、
レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、（ｉ−１）において当該マーカー遺伝子の隣接配列として当該マーカー遺伝子と一緒にゲノムＤＮＡに導入されるか、または（ｉ−２）においてマーカー遺伝子を除去するときの相同組換えを利用してゲノムＤＮＡに導入される。
【００５１】
また、別の好ましい態様では、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列は、挿入部位を狙い撃ちせず、ゲノムＤＮＡのどこか非特定の部位に挿入させることもできる。非特定の部位への挿入は、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列のプラスミドＤＮＡを細胞に導入することにより実施することができる。プラスミドＤＮＡは、例えば、そこからレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をＲＮＡに転写させ、例えば、当該ＲＮＡから翻訳されるタンパク質によって、転写されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成させることによって、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をゲノムＤＮＡ中に組込むことに用いることができる。したがって、プラスミドＤＮＡは、制御配列と作動配列に作動可能に連結したレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を有し得る。非特定の部位への挿入は、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列から転写された単離ＲＮＡを用いてもよいであろう。ゲノムＤＮＡの非特定の部位にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入した場合には、当該挿入の前の細胞と挿入後の細胞それぞれからゲノムＤＮＡを抽出して、挿入前の細胞のゲノムＤＮＡと比較することによって挿入後の細胞のゲノムＤＮＡにおけるレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の導入部位の一部または全部を決定して、改変された領域の情報を得ることができる。このようにして、この態様では、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が導入された細胞と、その細胞における改変された領域の情報を得ることができる。この方法では、導入部位の決定は、改変された領域の情報を入手した者のみが、挿入後のゲノムＤＮＡにおけるレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の挿入位置を決定することができ、改変された領域の情報を有しない者は、挿入部位を決定することが事実上不可能である。したがって、挿入直前の細胞は、挿入後の細胞とは別に保管して、挿入後の細胞のみを用いる、または流通させることができる。この態様では挿入部位を標的配列とみなすことができる。
【００５２】
ある態様では、選択マーカー用ドナーＤＮＡは、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間に、標的配列を含み、標的配列中にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を含む。この態様において標的配列は、上記（ｉ）においてレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を挿入する箇所の配列であり得る。標的配列中の特定塩基とその隣の塩基との間にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を含むよう設計されたドナーＤＮＡを用いて切断したゲノムＤＮＡと相同組換えを生じさせることによって設計した通りの配列がゲノムＤＮＡの標的配列の部位に組込まれることとなる。これにより上記（ｉ）を実施することができる。
【００５３】
ある態様では、選択マーカー用ドナーＤＮＡは、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間に、周辺配列に対する挿入位置が変更された少なくとも１つのレトロトランスポゾンの塩基配列を有する。このように設計されたドナーＤＮＡを用いて切断したゲノムＤＮＡと相同組換えを生じさせることによって設計した通りの配列がゲノムＤＮＡの標的配列の部位に組込まれることとなる。これにより、上記（ｉｉ）を実施することができる。挿入位置の変更は、例えば、１〜数塩基、またはそれ以上とすることができる。
【００５４】
ある態様では、選択マーカー用ドナーＤＮＡは、上記好ましい態様のドナーＤＮＡに対して、１塩基以上の塩基配列の改変（挿入、置換、欠失、付加、および削除から選択される塩基配列の改変）を含んでいてもよい。これにより（ｉｉｉ）を実施することができる。この方法において、（ｉｉｉ）により、ゲノムＤＮＡの特定の位置のトランスポゾンの塩基配列が、天然の配列と異なる配列となっている細胞を得ることができ、または、（ｉ）または（ｉｉ）により、ゲノムＤＮＡ中の新たな位置に上記レトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと同一の塩基配列を有するか、５０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するゲノムＤＮＡを含む細胞を得ることができる。
【００５５】
改変細胞取得の効率化のために、選択マーカー用ドナーＤＮＡは、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列の代わりに、または、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列に加えて、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子をさらに有していてもよい。ドナーＤＮＡが挿入されたときには、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入されるので、選択マーカー遺伝子の存在に基づいて改変細胞を選択することができる。選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合には、薬剤存在下で細胞を培養することで、非改変細胞を除去し、改変細胞を選択することができる。選択マーカー遺伝子が可視化マーカー遺伝子（例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子）である場合には、可視化されるマーカー遺伝子の発現に基づいて（例えば、フローサイトメトリーにより）細胞を選択することができる。選択マーカー用ドナーＤＮＡが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子を除去することをさらに実施し得る。選択マーカー遺伝子の除去は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え用ドナーＤＮＡで上記領域を置き換えるようにゲノム改変技術を適用することにより実施することができる。組換え用ドナーＤＮＡは、上流ホモロジーアームは、当該相同組換えする塩基配列と相同組換え可能な塩基配列（例えば、完全に同一の塩基配列）を有し、下流ホモロジーアームは、当該相同組換えする塩基配列と相同組換え可能な塩基配列（例えば、完全に同一の塩基配列）を有し、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様の塩基配列を含んでいる。例えば、上記において選択マーカー遺伝子が可視化遺伝子（例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子）である場合には、改変細胞の遺伝子改変位置を置き換えるようにゲノム改変をして標的領域に組換え用ドナーＤＮＡを組込み、可視化されるマーカー遺伝子の発現に基づいて（例えば、フローサイトメトリーにより）選択マーカーを有しない細胞を選択することによって目的の改変を有する細胞を取得することができる。選択マーカー遺伝子が、ポジティブ選択にしか用い得ない選択マーカーである場合には、ドナーＤＮＡは、ネガティブ選択用マーカー遺伝子をさらに有していてもよい。改変細胞の遺伝子改変位置を置き換えるようにゲノム改変をして組換え用ドナーＤＮＡを組込み、ネガティブ選択用マーカー遺伝子（例えば、自殺遺伝子）が発現しないことに基づいて目的の改変を有する細胞を選択することができる。選択マーカー遺伝子が、ポジティブ選択およびネガティブ選択兼用マーカー遺伝子（ＰＮＭ）、例えば、可視化遺伝子である場合には、可視化遺伝子の存在に基づいて選択マーカー用ドナーＤＮＡと相同組換えを起こした細胞を選択し、可視化遺伝子の喪失に基づいて組換え用ドナーＤＮＡと相同組換えを起こした細胞を選択することができる。
【００５６】
ある態様では、ゲノムＤＮＡの少なくとも１つのアレルに対してレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入する。ある好ましい態様では、ゲノムＤＮＡのすべてのアレルに同様にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入することができる。複数のアレルにレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列を導入する手法としては、当業者に周知の様々な方法を用いることができる。導入を効率化するために、例えば、国際公開第２０１４／０９３６６１号、Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １５：  １０４５−１０４７，  ２０１８、およびＳｕｐｈａｒａｔｔａｎｉｓｉｔｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ９：  １７４，  ２０１９に開示された方法などを用いてもよい。ある態様では、ゲノムＤＮＡのアレルの数だけ選択マーカー用ドナーＤＮＡを用意し、各選択マーカー用ドナーＤＮＡにはそれぞれ区別可能な固有の選択マーカー遺伝子を搭載することができる。選択マーカー用ドナーＤＮＡがすべてのアレルに組込まれた細胞は、組込まれたすべての選択マーカーが発現（または同時に発現）していることに基づいて取得することができる。
【００５７】
ゲノム改変システムは、所望の標的領域を改変することが可能な分子機構を意味する。ゲノム改変システムは、染色体ゲノムの標的領域を標的とする配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００５８】
配列特異的核酸切断分子は、配列特異的核酸切断活性を有する分子であれば、特に限定されず、合成有機化合物であってもよく、タンパク質等の生体高分子化合物であってもよい。配列特異的核酸切断活性を有する合成有機化合物としては、例えば、ピロール・イミダゾールポリアミド等が挙げられる。配列特異的部位切断活性を有するタンパク質としては、例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼが挙げられる。
【００５９】
配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で核酸を切断することができる酵素である。配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で、２本鎖ＤＮＡを切断することができる。配列特異的エンドヌクレアーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ））、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、Ｃａｓタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
ＺＦＮは、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼである。切断ドメインとしては、ＩＩ型制限酵素ＦｏｋＩの切断ドメインが挙げられる。標的配列を切断可能なジンクフィンガーヌクレアーゼの設計は、公知の方法で行うことができる。
【００６１】
ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼである。標的配列を切断可能なＴＡＬＥ構築物の設計は、公知の方法で行うことができる（例えば、Ｚｈａｎｇ，  Ｆｅｎｇ  ｅｔ．  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９  （２））。
【００６２】
配列特異的核酸切断分子として、Ｃａｓタンパク質を用いる場合、ゲノム改変システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。すなわち、ゲノム改変システムは、Ｃａｓタンパク質と、標的領域内の塩基配列に相同な塩基配列を有するガイドＲＮＡを含むことが好ましい。ガイドＲＮＡは、スペーサー配列として、標的領域内の配列（標的配列）と相同な配列を含んでいればよい。ガイドＲＮＡは、標的領域内のＤＮＡに結合できるものでればよく、標的配列と完全に同一の配列を有している必要はない。この結合は、細胞核内の生理的条件下で形成されればよい。ガイドＲＮＡは、例えば、標的配列に対して、例えば、０〜３塩基のミスマッチを含むことができる。前記ミスマッチの数は、０〜２塩基が好ましく、０〜１がより好ましく、ミスマッチを有しないことがさらに好ましい。ガイドＲＮＡの設計は、公知の方法に基づいて行うことができる。ゲノム改変システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであることが好ましく、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含むことが好ましい。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であることが好ましい。
【００６３】
配列特異的エンドヌクレアーゼは、タンパク質として細胞に導入してもよく、配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして細胞に導入してもよい。例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼのｍＲＮＡを導入してもよく、配列特異的エンドヌクレアーゼの発現ベクターを導入してもよい。発現ベクターにおいて、配列特異的エンドヌクレアーゼのコード配列（配列特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子）は、プロモーターに機能的に連結されている。プロモーターは、特に限定されず、例えば、ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターを各種使用することができる。ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、ＳＶ４０プロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター等が挙げられる。
【００６４】
プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、プロモーターを駆動する誘導因子の存在下でのみ、当該プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導することができるプロモーターである。誘導性プロモーターとしては、ヒートショックプロモーターなどの加熱により遺伝子発現を誘導するプロモーターが挙げられる。また、誘導性プロモーターには、プロモーターを駆動する誘導因子が薬剤であるプロモーターが挙げられる。このような薬剤誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列、λオペレーター配列（例えば、１２×λＯｐ）、テトラサイクリン系誘導性プロモーター等が挙げられる。テトラサイクリン系誘導性プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリンもしくはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）、またはリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）の存在下で遺伝子発現を駆動するプロモーターが挙げられる。テトラサイクリン系誘導性プロモーターとしては、例えば、ＴＲＥ３Ｇプロモーターが挙げられる。
【００６５】
発現ベクターは、公知のものを特に制限なく用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である場合、発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質のコード配列（Ｃａｓタンパク質遺伝子）に加えて、ガイドＲＮＡコード配列（ガイドＲＮＡ遺伝子）及びを含んでいてもよい。この場合、ガイドＲＮＡコード配列（ガイドＲＮＡ遺伝子）は、ｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターに機能的にされていることが好ましい。ｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、マウス及びヒトのＵ６−ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１−ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン−ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。
ドナーＤＮＡは、選択マーカーを標的領域にノックインするためのドナーＤＮＡである。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、標的領域の上流側に隣接する塩基配列と相同な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、標的領域の下流側に隣接する塩基配列と相同な塩基配列を有する下流ホモロジーアームとの間に、１以上の選択マーカー遺伝子の塩基配列を含む。
【００６６】
ドナーＤＮＡは、特に限定されないが、例えば、１ｋｂ以上、２ｋｂ以上、３ｋｂ以上、４ｋｂ以上、５ｋｂ以上、６ｋｂ以上、７ｋｂ以上、８ｋｂ以上、９ｋｂ以上、９．５ｋｂ以上、または１０ｋｂ以上の長さを有し得る。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、特に限定されないが、例えば、５０ｋｂ以下、４５ｋｂ以下、４０ｋｂ以下、３５ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、２５ｋｂ以下、２０ｋｂ以下、１５ｋｂ以下、１４ｋｂ以下、１３ｋｂ以下、１２ｋｂ以下、１１ｋｂ以下、１０ｋｂ以下、９ｋｂ以下、８ｋｂ以下、７ｋｂ以下、６ｋｂ以下、５ｋｂ以下、または４ｋｂ以下の長さを有し得る。
【００６７】
「選択マーカー」とは、その発現の有無に基づいて、細胞を選択することができるタンパク質を意味する。選択マーカー遺伝子は、選択マーカーをコードする遺伝子である。選択マーカー発現細胞及び非発現細胞が混在する細胞集団において、選択マーカー発現細胞を選択する場合、当該選択マーカーを「ポジティブ選択マーカー」または「ポジティブ選択用の選択マーカー」という。選択マーカー発現細胞及び非発現細胞が混在する細胞集団において、選択マーカー非発現細胞を選択する場合、当該選択マーカーを「ネガティブ選択マーカー」または「ネガティブ選択用の選択マーカー」という。選択マーカーが相互に異なるとは、相互に区別できること（例えば、区別可能に異なること）を意味し、例えば、選択マーカーが導入された細胞に付与する薬剤耐性の性質などの生理学的性質またはその他の物理化学的性質において少なくとも相互に区別できることを意味する。
【００６８】
ポジティブ選択マーカーは、それを発現する細胞を選択可能なものであれば、特に限定されない。ポジティブ選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。
【００６９】
ネガティブ選択マーカーは、それを発現しない細胞を選択可能なものであれば、特に限定されない。ネガティブ選択マーカー遺伝子としては、例えば、自殺遺伝子（チミジンカイネース等）、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。ネガティブ選択マーカー遺伝子が、細胞の生存に負の影響を与える遺伝子（例えば、自殺遺伝子）である場合、当該ネガティブ選択マーカー遺伝子は、誘導性プロモーターに機能的に連結され得る。誘導性プロモーターに機能的に連結することで、ネガティブ選択マーカー遺伝子を有する細胞を除去したいときにのみ、ネガティブ選択マーカー遺伝子を発現させることができる。ネガティブ選択マーカー遺伝子が、蛍光、発光、および発色等の光学的に検出可能なマーカー遺伝子（可視化マーカー遺伝子；ｖｉｓｉｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ）である場合など、細胞の生存に負の影響が少ない場合には、恒常的に発現させてもよい。
【００７０】
薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスティサイディン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
蛍光タンパク質遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
発光酵素遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
発色酵素遺伝子としては、例えば、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
自殺遺伝子としては、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
選択マーカー用ドナーＤＮＡが有する選択マーカー遺伝子は、ポジティブ選択マーカー遺伝子であることが好ましい。すなわち、選択マーカーを発現する細胞を、選択マーカー遺伝子がノックインされた細胞として、選択することができる。
【００７２】
上流ホモロジーアームは、改変対象のゲノムにおいて、標的領域中の切断部位の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有し、例えば、標的配列中の切断部位の上流側に隣接する塩基配列と相同な塩基配列を有する。下流ホモロジーアームは、改変対象のゲノムにおいて、標的領域中の切断部位の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有し、例えば、標的配列中の切断部位の下流側に隣接する塩基配列と相同な塩基配列を有する。上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームは、標的領域の周辺領域と相同組換可能であれば、その長さ及び配列は特に限定されない。上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームは、相同組換え可能な限り、標的領域の上流側配列若しくは下流側配列と必ずしも完全一致する必要はない。例えば、上流ホモロジーアームは、標的領域の上流側に隣接する塩基配列と９０％以上の配列同一性（相同性）を有する配列であることができ、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。例えば、下流ホモロジーアームは、標的領域の下流側に隣接する塩基配列と９０％以上の配列同一性（相同性）を有する配列であることができ、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。また、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとは、少なくともそのいずれかが標的領域中の切断箇所により近いとアレルの改変効率をより高め得る。ここで、「近い」とは、２つの配列の距離が１００ｂｐ以下、５０ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、３０ｂｐ以下、２０ｂｐ以下、または１０ｂｐ以下であることを意味し得る。
【００７３】
選択マーカー用ドナーＤＮＡにおいて、選択マーカー遺伝子は、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間に位置する。これにより、上記（ｉ）のゲノム改変システムと共に選択マーカー用ドナーＤＮＡを細胞に導入した場合に、ＨＤＲにより、選択マーカー遺伝子が標的領域に導入される（これにより遺伝子が破壊される場合、遺伝子ノックアウトといい、これにより所望の遺伝子が導入される場合、遺伝子ノックインという、遺伝子をノックアウトしつつ、別の遺伝子をノックインすることもできる）。
【００７４】
選択マーカー遺伝子は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように、プロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。プロモーターは、ドナーＤＮＡを導入する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の任意の制御配列等を有していてもよい。
【００７５】
選択マーカー用ドナーＤＮＡは、インスレーター配列を有していてもよい。「インスレーター」とは、隣接する染色体環境の影響を遮断または緩和し、その領域に挟まれたＤＮＡの転写調節の独立性を保証するまたは高める配列をいう。インスレーターは、エンハンサー遮断効果（エンハンサーとプロモーターの間に挿入することにより、エンハンサーによるプロモーター活性への影響を遮断する効果）、及び位置効果の抑制作用（導入遺伝子の両側をインスレーターで挟むことにより、導入遺伝子の発現を挿入されたゲノム上の位置に影響されないようにする作用）により定義される。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、上流アームと選択マーカー遺伝子との間（又は上流アームと選択マーカー遺伝子を制御するプロモーターとの間）に、インスレーター配列を有していてもよい。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、下流アームと選択マーカー遺伝子との間に、インスレーター配列を有していてもよい。
【００７６】
選択マーカー用ドナーＤＮＡは、直鎖状であってもよく、環状であってもよいが、環状であることが好ましい。好ましくは、選択マーカー用ドナーＤＮＡは、プラスミドである。選択マーカー用ドナーＤＮＡは、上記の配列に加えて、任意の配列を含み得る。例えば、上流ホモロジーアーム、インスレーター、選択マーカー遺伝子、及び下流ホモロジーアームの各配列間の全て又は一部に、スペーサー配列を含んでいてもよい。
【００７７】
ゲノム改変システム、選択マーカー用ドナーＤＮＡ、および組換え用ドナーＤＮＡを細胞に導入する方法は特に限定されず、公知の方法を特に制限なく用いることができる。ゲノム改変システム、ドナーＤＮＡ、および組換え用ドナーＤＮＡを細胞に導入する方法としては、例えば、ウイルス感染法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、カルシウムリン酸法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
選択マーカー用ドナーＤＮＡは、ある態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを有し、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームの間に、選択マーカー遺伝子を有し、好ましくは、メガヌクレアーゼの切断部位などのエンドヌクレアーゼ（塩基配列特異的核酸切断分子）の標的配列をさらに有し得る。この態様において、ある好ましい態様では、選択マーカーは、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子およびネガティブ選択用のマーカー遺伝子を含む。別の好ましい態様では、選択マーカーは、ポジティブ選択用の選択マーカーを含むが、これとは別にネガティブ選択マーカー遺伝子を含まなくてもよい。ある好ましい態様では、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、ネガティブ選択用にも用いられ得、そのようなマーカー遺伝子としては、可視化マーカー遺伝子が挙げられる。
【００７９】
改変されるゲノムＤＮＡの標的領域は、選択マーカー用ドナーＤＮＡおよび組換え用ドナーＤＮＡの配列に置き換わるので、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかとなるように置き換わる塩基配列を設計することによって上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの改変を実施することができる。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、いずれかのみを実施してもよいし、組み合わせて実施してもよい。すなわち、あるトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列について（ｉ）を実施し、かつ別のトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列についても（ｉ）を実施してもよい。また、あるトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列について（ｉｉ）を実施し、かつ別のトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列についても（ｉｉ）を実施してもよい。あるトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列について（ｉｉｉ）を実施し、かつ別のトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列についても（ｉｉｉ）を実施してもよい。また、あるトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列について（ｉ）を実施し、かつ別のトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列についても（ｉｉ）を実施してもよい。あるトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列について（ｉ）を実施し、かつ別のトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列についても（ｉｉｉ）を実施してもよい。あるトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列について（ｉｉ）を実施し、かつ別のトランスポゾン配列またはトランスポゾン様配列についても（ｉｉｉ）を実施してもよい。
【００８０】
ある好ましい態様では、レトロトランスポゾンは、ＬＩＮＥである。ある好ましい態様では、レトロトランスポゾンは、ＳＩＮＥである。ある好ましい態様では、レトロトランスポゾンは、Ａｌｕである。ある好ましい態様では、レトロトランスポゾンは、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンである。ある好ましい態様では、ヒトのレトロトランスポゾンとしては、Ａｌｕファミリーの配列またはＬ１（ＬＩＮＥ１）ファミリーの配列を好ましく用いることができる。その他、ＳＩＮＥファミリーの配列（例えば、ＳＶＡ配列）またはＬＴＲファミリーの配列（例えば、ＥＲＶ（Ｋ）配列、ヒトではＨＥＲＶ−Ｋ配列）もまた好ましく用いることができる。本発明のすべての態様においてレトロトランスポゾンは、好ましくは転移活性型レトロトランスポゾンである。これらのレトロトランスポゾンは、ゲノム上に非常に多くのコピーを有するため、改変部位の位置情報を知らない第三者による改変部位の特定の難易度が高くなり、好ましい。ある態様では、その生物種のゲノムで最も存在頻度の高いレトロトランスポゾン（または２番目、３番目、４番目、もしくは５番目、またはそれ以降に存在頻度の高い）を用いることができる。レトロトランスポゾンは、上記に限らず、生物種によって異なり、ゲノム中に多数のコピーを有するレトロトランスポゾンほど本発明で好ましく用いられ得る。
【００８１】
＜本発明の改変細胞（ｉ）＞
本発明によれば、
ゲノムＤＮＡ中の標的配列中に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する追加の塩基配列を有する、細胞
が提供される。ある態様では、追加の塩基配列は、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと配列同一性（例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％の配列同一性）を有し得る。ある態様では、追加の塩基配列は、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つの±５０％以内、±４０％以内、±３０％以内、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±９％以内、±８％以内、±７％以内、±６％以内、±５％以内、±４％以内、±３％以内、±２％以内、±１％以内、±１０塩基以内、±９塩基以内、±８塩基以内、±７塩基以内、±６塩基以内、±５塩基以内、±４塩基以内、±３塩基以内、±２塩基以内、±１塩基以内の長さを有する。
【００８２】
本発明によれば、上記細胞は、上記追加の塩基配列（第１の塩基配列）に加えて、ゲノムＤＮＡ中の第２の標的配列中に、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する第２の追加の塩基配列をさらに有していてもよい。ある態様では、第２の塩基配列は、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと配列同一性（例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％の配列同一性）を有し得る。ある態様では、第２の塩基配列は、前記ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つの±５０％以内、±４０％以内、±３０％以内、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±９％以内、±８％以内、±７％以内、±６％以内、±５％以内、±４％以内、±３％以内、±２％以内、±１％以内、±１０塩基以内、±９塩基以内、±８塩基以内、±７塩基以内、±６塩基以内、±５塩基以内、±４塩基以内、±３塩基以内、±２塩基以内、±１塩基以内の長さを有する。ある態様において、第１の塩基配列および第２の塩基配列は、同一である。ある態様において、第１の塩基配列と第２の塩基配列は、異なっている。
【００８３】
＜本発明の改変細胞（ｉｉ）＞
本発明によれば、
ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの周辺配列に対する挿入位置が変更された細胞
が提供される。本発明によればまた、
ゲノムＤＮＡにおいて、周辺配列に対する挿入位置が変更された少なくとも１つのレトロトランスポゾンの塩基配列を有する細胞
が提供される。
【００８４】
＜本発明の改変細胞（ｉｉｉ）＞
本発明によれば、
改変されたトランスポゾンの塩基配列を含む細胞
が提供される。改変は、挿入、置換、欠失、付加、および削除から選択される塩基配列の改変であり得る。改変は、トランスポゾンの塩基配列の内部に対して行われ得る。但し、付加および削除はそれぞれトランスポゾンの塩基配列の末端に対して付加および削除する。改変は、元の配列の他の配列への変更を生じ、例えば、他の配列は、人工的な配列（例えば、非天然の配列）であり得、または天然の他の配列であり得る。
【００８５】
本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、上記改変部位に選択マーカー遺伝子および部位特異的組換え配列（例えば、ｌｏｘＰなど）を有しない。
【００８６】
本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上を含む細胞集団が提供される。本発明によればまた、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上を含む組成物が提供される。組成物は、細胞の生存または保存に適した条件を有し得る。細胞、細胞集団、細胞を含む組成物は、凍結されていてもよい。凍結は、例えば、液体窒素中で行われ得る。凍結保存は、液体窒素中またはディープフリーザー（例えば、約−８０℃の温度を有する）中でなされ得る。本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）は単離された細胞であり得る。また、細胞集団は、単離された細胞の集団であり得る。本発明のある態様では、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかとその改変された領域の情報（例えば、改変された領域の塩基配列の情報、配列の挿入位置の情報、および挿入された塩基配列配列の情報からなる群から選択される１以上の情報）との組合せが提供される。当該組合せは、例えば、後述する細胞の管理方法および管理システム並びに細胞の分析方法で用いられ得る。
【００８７】
本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１以上のゲノムＤＮＡが提供される。ゲノムＤＮＡは、単離されたゲノムＤＮＡであり得る。単離されたゲノムＤＮＡは、水溶液中に溶解した形態、凍結された形態、または乾燥した形態であり得る。本発明のある態様では、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの単離したゲノムＤＮＡとその改変した領域の情報との組合せが提供される。当該組合せは、例えば、後述する細胞の管理方法および管理システム並びに細胞の分析方法で用いられ得る。
【００８８】
＜細胞の管理方法および管理システム＞
本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、改変の情報（特に、改変部位の位置情報、および／または改変後の配列情報）と紐付けられて培養、保管または管理され得る。本発明によれば、例えば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む容器が提供され、容器は、ラベルを含む。ラベルは、読み取り可能な情報、例えば、文字列、バーコード（二次元バーコードを含む）、およびＲＦＩＤから選択される読み取り可能な情報（例えば、印字）であり得、当該情報を読み取り、改変情報を保存した記録と照合することによって、当該容器に含まれる細胞がどのような改変がなされた細胞であるかを判別することができる。好ましい態様では、読み取り可能な情報は、容器毎に異なり、容器と一対一対応する。
【００８９】
本発明によれば、細胞の管理システムであって、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体（例えば、不揮発性メモリ）と、
上記読み取り可能な情報を受領する受領部（例えば、揮発性メモリ）と、
記憶媒体から読み出した対応表に基づいて、受領した読み取り可能な情報を有する容器に含まれる細胞の改変情報を特定するプログラムを実行するプロセッサと
を含む細胞の管理システムが提供される。
【００９０】
本発明によれば、細胞の管理システムであって、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体（例えば、不揮発性メモリ）と、
細胞の改変情報を受領する受領部と、
記憶媒体から読み出した対応表に基づいて、受領した細胞の改変情報に対応する読み取り可能な情報が付された容器を特定するプログラムを実行するプロセッサと
を含む細胞の管理システムが提供される。
【００９１】
本発明によれば、
本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）を管理する方法であって、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む容器であって、それぞれ、読み取り可能な情報が付与された容器を用意することと、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域の情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、容器に付された読み取り可能な情報から、容器に含まれる細胞の改変された領域の情報を特定すること、および／または、細胞の改変された領域の情報から、当該改変を有する細胞を含む容器を特定することを含む、方法が提供される。この態様において、本発明の方法は、本発明の上記細胞の管理システムを用いて実施され得る。
【００９２】
本発明によれば、細胞管理システムは、１以上の本発明の改変細胞を含む容器を備え、前記容器は、容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報を備え、細胞管理システムは、当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域の情報を含む対応表を備えていることができる。したがって、本発明によれば、１以上の本発明の改変細胞を含む容器を備え、前記容器は、容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報を備え、当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域の情報を含む対応表を備える、細胞管理システムが提供される。細胞管理システムにおいては、１以上の本発明の改変細胞の一部または全部は、凍結保存状態であってもよいし、１以上の本発明の改変細胞の一部または全部は、培養中であってもよい。本発明の改変細胞は、上記の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）であり得る。
【００９３】
本発明によれば、上記細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の管理システムが提供されうる。この管理システムは、上記細胞の管理システムにおいて、細胞の代わりに当該細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を用いる以外は、上記細胞の管理システムと同一である。したがって、上記の細胞管理システムにおいて、「細胞」を「細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片」と読み替えることができる。
【００９４】
すなわち、本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片またはその情報は、改変の情報（特に、改変部位の位置情報、および／または改変後の配列情報）と紐付けられて保管または管理され得る。本発明によれば、例えば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を含む容器が提供され、容器は、ラベルを含む。ラベルは、読み取り可能な情報、例えば、文字列、バーコード（二次元バーコードを含む）、およびＲＦＩＤから選択される読み取り可能な情報（例えば、印字）であり得、当該情報を読み取り、改変情報を保存した記録と照合することによって、当該容器に含まれるゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片がどのような改変がなされた細胞であるかを判別することができる。好ましい態様では、読み取り可能な情報は、容器毎に異なり、容器と一対一対応する。
【００９５】
本発明によれば、ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の管理システムであって、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を含む容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体（例えば、不揮発性メモリ）と、
上記読み取り可能な情報を受領する受領部（例えば、揮発性メモリ）と、
記憶媒体から読み出した対応表に基づいて、受領した読み取り可能な情報を有する容器に含まれるゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変情報を特定するプログラムを実行するプロセッサと
を含む管理システムが提供される。
【００９６】
本発明によれば、ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の管理システムであって、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を含む容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされたゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体（例えば、不揮発性メモリ）と、
ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変情報を受領する受領部と、
記憶媒体から読み出した対応表に基づいて、受領したゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変情報に対応する読み取り可能な情報が付された容器を特定するプログラムを実行するプロセッサと
を含む管理システムが提供される。
【００９７】
本発明によれば、
本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を管理する方法であって、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む容器であって、それぞれ、読み取り可能な情報が付与された容器を用意することと、
複数の本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされたゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変された領域の情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、容器に付された読み取り可能な情報から、容器に含まれるゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変された領域の情報を特定すること、および／または、ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変された領域の情報から、当該改変を有するゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片、またはそれを含む容器を特定することを含む、方法が提供される。この態様において、本発明の方法は、本発明の上記ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の管理システムを用いて実施され得る。
【００９８】
本発明によれば、ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の管理システムは、１以上の本発明の改変細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を含む容器を備え、前記容器は、容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報を備え、管理システムは、当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされたゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変された領域の情報を含む対応表を備えていることができる。したがって、本発明によれば、１以上の本発明の改変細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む容器を備え、前記容器は、容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報を備え、当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされたゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変された領域の情報を含む対応表を備える、管理システムが提供される。ゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の管理システムにおいては、１以上の本発明の改変細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の一部または全部は、凍結保存状態であってもよい。本発明の改変細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片は、上記の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片であり得る。
【００９９】
＜本発明による細胞の改変の分析方法＞
本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）に由来する細胞、または本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）である可能性を有する細胞は、当該細胞の改変された領域の塩基配列と改変された領域の情報（特に、改変部位の位置情報、および／または改変後の配列情報、特に改変部位の位置情報）に基づいて分析され得る。本発明によれば、改変された領域の情報、例えば改変部位の位置情報が把握されれば、当該部位の塩基配列を解読することによって細胞が、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）であるか否かを決定または推定することができる。本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）に由来する細胞とは、当該細胞を増殖させて得られる細胞や、当該細胞に別の遺伝子改変を加えて得られる細胞であり得る。改変部位が改ざんされない限りにおいて、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）に由来する細胞は、改変された領域に本発明の改変を含むため、本発明において改変した細胞であると決定または推定することに用いることができる。そして、改変を特定して改ざんすることは、上記の通り事実上不可能である。
【０１００】
例えば、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（または存在している）と決定または推定された場合には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞である、またはその可能性があると決定または推定することができる。したがって、本発明は、
（α）改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）と決定または推定された場合）には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞である、またはその可能性があると決定または推定すること
を含んでいてもよい。
また、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（または存在していない）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）と決定または推定された場合）には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞ではない、またはその可能性があると決定または推定することができる。複数の改変がなされている場合には、その一部または全部に関して、同様の分析を実施することができる。したがって、本発明は、
（β）改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（または存在していない）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（存在していない）と決定または推定された場合）には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞ではない、またはその可能性があると決定または推定すること
を含んでいてもよい。
本発明はまた、上記（α）および（β）のいずれか一方を含んでいてもよいし、上記（α）および（β）の両方を含んでいてもよい。具体的には、本発明は、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）と決定された場合）には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞である、またはその可能性があると決定または推定すること、および／または、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（または存在していない）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（存在していない）と決定または推定された場合）には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞ではない、またはその可能性があると決定または推定することを含んでいてもよい。複数の改変がいずれも改変の情報と合致する改変となっていると決定または推定される場合には、分析した細胞が、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）であることをより精度高く決定または推定されたことを意味する。ここで、「改変された領域」は、塩基配列または位置を変更した塩基配列が挿入された領域である。改変された領域は、挿入配列とその両サイドの各１塩基を含むか、挿入配列とその両サイドの各１塩基からなる。改変された領域は、挿入配列とその両サイドのそれぞれ１〜数塩基を含むか、挿入配列とその両サイドのそれぞれ１〜数塩基からなる場合がある。細胞が繰り返しの継代に供されるなど長期にわたり培養されたときには、後述するように、ゲノムに挿入や欠失などの変異が生じる場合があり、そのような場合には、改変領域を広めに考慮して、挿入位置のずれがあっても改変した細胞に由来すると決定または推定することがある。
【０１０１】
本発明によれば、上記細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を分析する方法が提供されうる。この方法は、上記細胞を分析する方法において、細胞の代わりに当該細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を用いる以外は、上記細胞を分析する方法と同一である。したがって、上記の細胞を分析する方法において、「細胞」を「細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片」と読み替えることができる。すなわち、本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）に由来する細胞、または本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）である可能性を有する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、当該ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片の改変された領域の塩基配列と改変された領域の情報（特に、改変部位の位置情報、および／または改変後の配列情報、特に改変部位の位置情報）に基づいて分析され得る。本発明によれば、改変された領域の情報、例えば改変部位の位置情報が把握されれば、当該部位の塩基配列を解読することによってゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片が、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片であるか否かを決定または推定することができる。本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）に由来する細胞とは、当該細胞を増殖させて得られる細胞や、当該細胞に別の遺伝子改変を加えて得られる細胞であり得る。改変部位が改ざんされない限りにおいて、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）に由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、改変された領域に本発明の改変を含むため、本発明において改変した細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片であると決定または推定することに用いることができる。そして、改変を特定して改ざんすることは、上記の通り事実上不可能である。
【０１０２】
例えば、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（または存在している）と決定または推定される場合には、当該ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定することができる。したがって、本発明は、
（α）改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）と決定または推定された場合）には、当該細胞は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定すること
を含んでいてもよい。
また、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（または存在していない）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）と決定または推定された場合）には、当該ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片ではない、またはその可能性があると決定または推定することができる。複数の改変がなされている場合には、その一部または全部に関して、同様の分析を実施することができる。したがって、本発明は、
（β）改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（または存在していない）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（存在していない）と決定または推定された場合）には、当該ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片ではない、またはその可能性があると決定または推定すること
を含んでいてもよい。
本発明はまた、上記（α）および（β）のいずれか一方を含んでいてもよいし、上記（α）および（β）の両方を含んでいてもよい。具体的には、本発明は、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されている（存在している）と決定または推定された場合）には、当該ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定すること、および／または、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（または存在していない）場合（特に、改変された領域にレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が挿入されていない（存在していない）と決定または推定された場合）には、当該ゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）またはそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片ではない、またはその可能性があると決定または推定することを含んでいてもよい。複数の改変がいずれも改変の情報と合致する改変となっていると決定または推定される場合には、分析したゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片が、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片であることをより精度高く決定できたことを意味する。
【０１０３】
本発明のある態様では、
細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域の情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、容器に付された読み取り可能な情報から、容器に含まれる細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片中の改変された領域の情報を特定すること、および／または、改変された領域の情報から、当該改変を有する細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を含む容器を特定することを含む、方法
が提供される。細胞のゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片は、本発明の改変を有する。この態様では、本発明の方法は、
細胞またはそのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器であって、それぞれ、読み取り可能な情報が付与された容器を用意することと、
当該容器を細胞またはそのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の保管または保存に適した条件下で保管または保存することと、
をさらに含んでいてもよい。
【０１０４】
本発明のある態様ではまた、
細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片をそれぞれ含む複数の容器のそれぞれに対応する読み取り可能な情報と当該読み取り可能な情報のそれぞれに対応付けされた細胞の改変された領域の情報を含む対応表を記憶媒体（例えば、不揮発性メモリ）に保存する（例えば、電子的に保存され得る）ことと、
前記対応表に基づいて、容器に付された読み取り可能な情報から、容器に含まれる細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片中の改変された領域の情報を特定すること、および／または、細胞の改変された領域の情報から、当該改変を有する細胞またはそれぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片を含む容器を特定するプログラムをプロセッサ（例えば、ＣＰＵ）に実行させることを含む、方法
が提供される。この態様では、本発明の方法は、電子計算機を用いて実行され得る。電子計算機は、インターネット等の電子回線によって接続されたサーバーであり得る。当該サーバーは、遠隔地に設置されていてもよい。電子計算機は、オフラインで当該方法を実行可能な電子計算機であってもよい。本発明の実行時に、対応表は、記憶媒体から読み出され得る。
【０１０５】
上記システムは、対応表に基づいて特定された細胞、それぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片またはこれらを含む容器の情報、および／または、細胞、それぞれのゲノムＤＮＡもしくは改変された領域を含むその断片の改変情報を出力する出力部をさらに備えていてもよい。出力部としては、上記システムに接続されたディスプレイ、上記システムに接続されたプリンタ、および他の端末への送信部（例えば、インターネット回線を介して他の端末に送信する送信部、無線を介して他の端末に送信する送信部）が挙げられる。
【０１０６】
＜動植物（例えば、家畜）の個体または品種の管理システムおよび管理方法＞
本発明のある態様では、動植物（例えば、家畜）の個体または品種の管理システムが提供されうる。
本発明によれば、動植物（例えば、家畜）の個体または品種の管理システムは、
本発明の改変を有する細胞をそれぞれ含む複数の動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種それぞれの情報と当該情報のそれぞれに対応付けされた動植物（例えば、家畜）のゲノムＤＮＡの改変情報を含む対応表を保存した記憶媒体と、
上記複数の動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の情報またはゲノムＤＮＡの改変情報を受領する受領部と、
プログラムを実行可能なプロセッサを含み、プログラムは、記憶媒体から読み出した対応表に基づいて受領した動植物（例えば、家畜）個体または動植物（例えば、家畜）品種の情報に対応する動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種のゲノムＤＮＡの改変情報を特定する、および／または、ゲノムＤＮＡの改変情報に対応する改変を有する動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種を特定するプログラムである、
情報の管理システム
であり得る。
【０１０７】
本発明によれば、
動植物（例えば、家畜）の個体それぞれまたは動植物（例えば、家畜）の品種の情報と、当該情報に対応付けされた前記動植物（例えば、家畜）の個体それぞれまたは動植物（例えば、家畜）の品種それぞれのゲノムＤＮＡの改変情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種の情報から、そのゲノムＤＮＡの改変情報を特定すること、および／または、ゲノムＤＮＡの改変情報から、当該改変を有する動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種を特定することを含む、方法
が提供される。
動植物（例えば、家畜）個体および動植物（例えば、家畜）品種を管理する場合に、動植物（例えば、家畜）に読み取り可能な情報を付さなくてもよい。基本的には、本発明は、動植物（例えば、家畜）個体や動植物（例えば、家畜）品種が管理外に流出した場合に、その動植物（例えば、家畜）個体や動植物（例えば、家畜）品種の由来を特定する技術を提供するものであり、特定するためにはゲノムＤＮＡの情報のみで十分であるから、動植物（例えば、家畜）個体や動植物（例えば、家畜）品種自体に読み取り可能な情報を付する必要がない。本発明では、単に、特定の動植物（例えば、家畜）個体や動植物（例えば、家畜）品種と対応付くようにゲノムＤＮＡの改変情報を記録媒体（不揮発性メモリ等）に記録しておくことができる。
【０１０８】
本発明によればまた、
動植物（例えば、家畜）の個体それぞれまたは動植物（例えば、家畜）の品種それぞれに対応する読み取り可能な情報と、当該読み取り可能な情報に対応付けされた前記動植物（例えば、家畜）の個体それぞれまたは動植物（例えば、家畜）の品種それぞれのゲノムＤＮＡの改変情報を含む対応表を用意することと、
前記対応表に基づいて、動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種に付された読み取り可能な情報から、そのゲノムＤＮＡの改変情報を特定すること、および／または、ゲノムＤＮＡの改変情報から、当該当該改変を有する動植物（例えば、家畜）の個体または動植物（例えば、家畜）の品種を特定することを含む、方法
が提供され得る。
【０１０９】
動植物（例えば、家畜）個体を管理する場合には、特に限定されないが例えば、各動植物（例えば、家畜）に読み取り可能な情報を付してもよい。読み取り可能な情報は、例えば、識別用集積回路に記録され得る。識別用集積回路は、体外に付することもできるが、体内に埋め込むことができる。識別用集積回路は、例えば、ＲＦＩＤ装置（例えば、パッシブ型ＲＦＩＤ装置）であり得る。識別用集積回路は、体内に埋め込むために、生体適合性の素材によって被覆されていてもよい。生体適合性の素材としては、特に限定されないが例えば、ソーダ石灰ガラス、およびホウケイ酸ガラスが挙げられる。
【０１１０】
上記システムは、対応表に基づいて特定された動植物（例えば、家畜）個体または動植物（例えば、家畜）品種の情報および／または動植物（例えば、家畜）個体または動植物（例えば、家畜）品種のゲノムＤＮＡの改変情報を出力する出力部をさらに備えていてもよい。出力部としては、上記システムに接続されたディスプレイ、上記システムに接続されたプリンタ、および他の端末への送信部（例えば、インターネット回線を介して他の端末に送信する送信部、無線を介して他の端末に送信する送信部）が挙げられる。
【０１１１】
改変の情報に基づけば、配列の解読は、当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、改変部位の周辺配列の情報に基づけば、周辺配列との位置関係を決定することができる。決定は、シークエンシングにより行うことができる。ある好ましい態様では、決定は、当該周辺配列を含めて遺伝子増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法）により遺伝子を増幅し、その後、増幅産物をシークエンシングすることにより行うことができる。遺伝子の増幅は、例えば、（ａ）レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列に対して外側の周辺配列に対するプライマーを用いて行うことができ、増幅により、周辺配列に挟まれたレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の配列が増幅され得る。このようにして、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列と周辺領域との境界部位の配列を決定することによって、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の挿入位置を決定すること、および／または、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の配列を決定することができる。遺伝子の増幅はまた、例えば、（ｂ）レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の内部に対するプライマーと外部の周辺配列に対するプライマーとを用いて行うことができ、増幅により、周辺配列とレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列との境界部位を含む配列が増幅され得る。このようにして、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列と周辺配列との境界部位の配列を決定することによって、レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列の挿入位置を決定することができる。ある好ましい態様では、決定は、ゲノムＤＮＡを制限酵素により切断し、その後、ライゲーションして環状ＤＮＡを作成し、環状ＤＮＡに対してレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列である挿入配列の内側から外側に向けてインバースＰＣＲをして増幅産物を得て、増幅産物の配列を決定することにより行うことができる。
【０１１２】
したがって、本発明によれば、
細胞の由来を分析する方法であって、
本発明の改変細胞に由来すると疑われる被検細胞のゲノムＤＮＡの標的領域の塩基配列を解読すること、または解読された塩基配列を提供することと、
解読された塩基配列に基づいて、改変された領域に導入した塩基配列が存在しているか否かを決定することと、
改変された領域に導入した塩基配列が存在していると決定または推定された場合には、被検細胞は、本発明の改変細胞に由来する、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、被検細胞は、本発明の改変細胞に由来しない、またはその可能性があると決定または推定することと
を含む、方法
が提供される。
【０１１３】
また、本発明によれば、
細胞の由来を分析する方法であって、
本発明の改変細胞に由来すると疑われる被検細胞のゲノムＤＮＡの標的領域の塩基配列を解読すること、または解読された塩基配列を提供することと、
解読された塩基配列に基づいて、改変された領域に導入した塩基配列が存在しているか否かを決定することと、
改変された領域に導入した塩基配列が存在していると決定または推定された場合には、被検細胞は、本発明の改変細胞に由来する、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、被検細胞は、本発明の改変細胞に由来しない、またはその可能性があると決定または推定することと
を含む、方法
が提供される。
【０１１４】
さらに、本発明によれば、
細胞の由来を分析する方法であって、
本発明の改変細胞（以下、「起源細胞」ともいう）に由来すると疑われる被検細胞のゲノムＤＮＡの標的領域の塩基配列を解読すること、または解読された塩基配列を提供することと、
解読された塩基配列に基づいて、改変された領域に改変した塩基配列が挿入されているか否かを決定してもよく、
改変された領域に導入した塩基配列が存在していると決定または推定された場合には、被検細胞は、本発明の改変細胞に由来する、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、被検細胞は、本発明の改変細胞に由来しない、またはその可能性があると決定または推定することと
を含む、方法
が提供される。ゲノムＤＮＡの標的配列の塩基配列は、改変された領域に基づいて解読することができる。すなわち、改変された領域に含まれる改変部位の情報に基づけば、当該部位を選択的に増幅し、または単離して、シークエンシングすることができる。
【０１１５】
同様にして、本発明によれば、本発明の改変を有するゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片の由来を分析する方法が提供される。本発明によれば、
ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片の由来を分析する方法であって、
本発明の改変細胞に由来すると疑われる細胞のゲノムＤＮＡまたは改変された領域を含むその断片の標的領域の塩基配列を解読すること、または解読された塩基配列を提供することと、
解読された塩基配列に基づいて、改変された領域に導入した塩基配列が存在しているか否かを決定することと、
改変された領域に導入した塩基配列が存在していると決定または推定された場合には、前記ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞に由来する細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、前記ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞に由来しない細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定することと
を含む、方法
が提供される。
【０１１６】
また、本発明によれば、
ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片の由来を分析する方法であって、
本発明の改変細胞に由来すると疑われる細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片の標的領域の塩基配列を解読すること、または解読された塩基配列を提供することと、
解読された塩基配列に基づいて、改変された領域に導入した塩基配列が存在しているか否かを決定することと、
改変された領域に導入した塩基配列が存在していると決定または推定された場合には、前記ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞に由来する細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、前記ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞に由来しない細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定することと
を含む、方法
が提供される。
【０１１７】
さらに、本発明によれば、
ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片の由来を分析する方法であって、
本発明の改変細胞（以下、「起源細胞」ともいう）に由来すると疑われる細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片の標的領域の塩基配列を解読すること、または解読された塩基配列を提供することと、
解読された塩基配列に基づいて、改変された領域に改変した塩基配列が挿入されているか否かを決定してもよく、
改変された領域に導入した塩基配列が存在していると決定または推定された場合には、前記ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞に由来する細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定し、および／または、上記以外の場合には、前記ゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片は、本発明の改変細胞に由来しない細胞のゲノムＤＮＡおよび改変された領域を含むその断片である、またはその可能性があると決定または推定することと
を含む、方法
が提供される。ゲノムＤＮＡの標的配列の塩基配列は、改変された領域に基づいて解読することができる。すなわち、改変された領域に含まれる改変部位の情報に基づけば、当該部位を選択的に増幅し、または単離して、シークエンシングすることができる。
【０１１８】
ある態様では、改変された領域に導入した塩基配列が存在しているか否かは、改変された領域の情報（例えば、改変情報）に基づいて評価することができる。改変された領域に導入した塩基配列が挿入されているか否かは、例えば、挿入されているべき位置（または設計した位置）に挿入されているか否かにより決定することができる。レトロトランスポゾンは、自然にも自己のコピーをゲノムＤＮＡ中に増やし続けている。したがって、単に新しい位置にレトロトランスポゾンの配列が存在することは人工的な改変を決定付けるものではない。しかしながら、一塩基のずれもなく、改変された領域（または設計した位置もしくは狙った位置）に挿入されている場合にはその配列は、人工的に挿入されたものである可能性が高い。例えば、ヒトのゲノムＤＮＡは、３０億塩基対の長さを有し、例えば、１塩基のずれもなく正しい位置にレトロトランスポゾンが挿入される確率は３０億分の１であるから確率論的に、１塩基のずれもなく正しい位置にレトロトランスポゾンが挿入されている場合にそれが自然に複製することによる偶発的な挿入である可能性を排除し得る。したがって、ある態様では、改変された領域に挿入されているか否かは、例えば、１塩基のずれ（挿入または欠失）もなく設計した位置または狙った位置に挿入されていることにより確認され得る。しかしながら、現実には、培養途上で、低い頻度で１塩基から数塩基程度の塩基配列の挿入、欠失および置換が生じ得る。したがって、分析する際には、１塩基から数塩基（例えば、１〜５塩基、好ましくは、１〜２塩基、より好ましくは、１塩基）程度のずれや相違があったとしても設計した位置または狙った位置に挿入されたものであったと推定してもよい。したがって、ある態様では、改変された領域に導入した塩基配列が挿入されているか否かは、設計した位置からのずれや置換が１塩基から数塩基程度（好ましくは１〜２塩基、より好ましくは１塩基）である場合には、設計した位置または狙った位置に挿入されたものであると推定または決定することをさらに含む。ゲノムサイズを考慮すれば、数塩基の相違した箇所に偶然レトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列が自然に挿入される確率はほとんど無視できる程度に低いからである。そして、第２のレトロトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン様配列をさらにゲノムＤＮＡに導入し、その配列が正しい位置に挿入されているかをさらに確認し、複数の挿入がいずれも正しい位置になされているならば、さらにそれらの挿入が自然に生じた可能性が強く排除できる。例えば、改変は２以上であり得、例えば、３以上であり得、例えば、４以上であり得る。また、レトロトランスポゾンの性質上、挿入された部位から消失することが基本的にはなく、挿入が永続的に保たれ得る。配列はその後の培養等により更なる変異に付される可能性があるが、導入位置は上記の通り基本的には一定に保たれる。したがって、本発明のある態様では、導入位置に基づいて、細胞が改変細胞に由来するか否かを決定または推定することができる。導入した塩基配列の情報に基づいて細胞が細胞が改変細胞に由来するか否かを決定または推定する場合には、1〜数塩基の相違がある場合でも、検査した��胞が改変細胞に由来すると決定または推定することができる。相違は小さいほど特異度が高いが、大きいほど感度が高くなり、特異度と感度とのトレードオフが生じる。当業者であれば、目的に応じて好ましい特異度と感度が得られるように、許容される相違の大きさを決定することができる。
【０１１９】
上記のようにして、重要な細胞資源が、管理外に流出したことを検知したり、流出した細胞を特定することができる。細胞のゲノムＤＮＡは、その後の培養、特に、増殖および分化（または脱分化）によっては変化しないと考えられる。したがって、増殖した細胞および分化（または脱分化）した細胞などの改変した細胞に由来する細胞も、改変した細胞と同じゲノムＤＮＡを有すると推定することができる。したがって、本発明によれば、細胞が、管理外に流出した重要な細胞資源に由来するものであるかを決定することができる。この方法は、細胞の流通管理（例えば、許諾した用途以外への細胞の利用を禁じる管理、許諾した者以外への細胞貸与や譲渡を禁じる管理）を行う場合において有効であり得る。例えば、細胞が管理外に流出した場合に、その細胞を入手して分析することによって、その細胞がどこから流出したのかを分析し、流出元を特定することに用いることができる。例えば、ある細胞を複数の受領者に貸与または譲渡するときに、受領者毎に異なる改変を有する細胞を貸与または譲渡することができる。そして、改変情報と受領者の対応関係を示す対応表を作成し、記録媒体に記録または保存することができる。細胞が管理外に流出した場合には、改変情報に基づいて流出したと疑われる細胞のゲノムＤＮＡを分析し、対応表に記載された改変情報のいずれかによる改変か否かを検査し、上記ゲノムＤＮＡが有する改変に対応する改変情報を発見した場合には、当該改変情報と対応する改変を有する細胞の受領者から当該流出した細胞が漏れたと決定または推定することができる。このような細胞の流通管理は、例えば、細胞の譲渡者や貸与者が実施することができる。
【０１２０】
ある好ましい態様では、細胞は、精子であり得る。例えば、精子（例えば、家畜の精子、例えば、和牛などのウシの精子、ブタの精子）、例えば、性選別精液などを本発明の方法により分析する、保管もしくは保存する、および／または管理することができる。改変したゲノムＤＮＡを有する精子は、本発明の方法により改変されたゲノムＤＮＡを有する細胞または個体から得られ得る。
【０１２１】
＜本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか少なくとも１つを含む真核生物＞
本発明によれば、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか少なくとも１つまたはそのゲノムＤＮＡを有する真核生物が提供される。真核生物は、特に限定されないが、動物、または植物であり得る。動物としては、哺乳動物（非ヒト哺乳動物）、特に、家畜、例えば、ウシ（例えば、和牛）、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラマ、およびラクダ、ニワトリなどの鳥類、および魚類などの魚介類などの農用動物、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、およびマウスなどの愛玩動物、並びに昆虫が挙げられる。植物としては、例えば、農作物、例えば、食用作物、例えば、イネ、トウモロコシ、イモ類、豆類、オオムギおよびコムギなどの麦類、園芸作物（野菜、果樹、および花卉）、例えば、葉菜類（キャベツ、アスパラガス等）、果菜類（ナス、トマト、キュウリ等）、根菜類（大根、人参等）、その他の野菜、果物（例えば、リンゴおよびナシなどの仁果類、ウメ、アンズ、スモモ、モモ、サクランボなどの核果類、アーモンド、クルミ、およびクリなどの殻果類、ミカン、およびレモンなどの柑橘類、オランダイチゴなどのイチゴ類、トロピカルフルーツなどの熱帯果樹）、および、観葉植物、並びにこれらのいずれかの種子、苗、または球根が挙げられる。真核生物は、非ヒトであり得る。このようにして、真核生物が、本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか少なくとも１つまたはそのゲノムＤＮＡを有するか否かを決定することができる。上記真核生物は、組換え動物の通常の作製方法（例えば、体細胞核移植や多能性細胞の編集等）に従って得ることができる。
【０１２２】
これにより、真核生物の管理または追跡が可能となり得る。このような追跡が可能となることによって、重要な農作物や家畜などの資源が、管理外に流出したことを検知したり、流出した資源を特定することが可能となる。本発明の方法は、動植物（例えば、家畜）、例えば、和牛やイチゴの農作物や家畜の品種にも適用され得る。一例として、本発明の方法によるゲノムＤＮＡの改変情報を登録する登録機関または認証機関、例えば、国際的な登録機関または認証機関を設ける。本発明の改変細胞（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか少なくとも１つの作製者は、本発明の方法によるゲノムＤＮＡの改変情報を当該登録機関または認証機関に登録することができる。当該登録機関または認証機関には、合わせて作製した細胞またはそのゲノムＤＮＡを寄託してもよいであろう。当該登録機関または認証機関では、例えば、ゲノムＤＮＡの改変情報を秘匿化して管理する。誰かが当該登録機関または認証機関に細胞と改変情報とを送付して分析を依頼すると、登録機関または認証機関は、検査する真核生物やその細胞が、依頼者が送付した改変情報に基づいて作製された細胞に由来する細胞であるか否かを判定し、その結果を依頼者に返すことができる。
【要約】
本発明は、真核細胞中のゲノムＤＮＡをインビトロで改変する方法および改変を検出する方法を提供する。本発明は、例えば、ゲノムＤＮＡが有するレトロトランスポゾンの塩基配列のいずれか１つと５０％以上の配列同一性を有する塩基配列を導入することを含み得る。本発明はまた、レトロトランスポゾンの塩基配列の少なくとも１つの、それぞれの周辺配列に対する挿入位置を変更することを含み得る。本発明ではこのような方法により得られる改変真核細胞が提供される。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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