(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニンニク皮の水溶性溶媒抽出物（Ｎ−ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｏｙｌｏｃｔｏｐａｍｉｎｅの精製物を除く）を含有することを特徴とする脳機能改善用組成物。
【請求項２】
抗認知症用であることを特徴とする請求項１記載の脳機能改善用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症の改善などの脳機能改善効果を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における高齢化の進行に伴い、認知症患者の増加は大きな社会問題となり、認知症に効果のある医薬品や健康食品等の研究が盛んに行われている。
近年の研究においては、食物や食物由来成分が脳機能の維持、発達、改善に効果があることが明らかになりつつある。例えば、コーヒーやキャベツ等から抽出されるクロロゲン酸を含有する経口組成物が、脳機能改善に有効であることが明らかとなっている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１８−３９７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように認知症患者の増加が大きな社会問題となっている状況下、脳機能改善に効果のある新たな組成物が求められている。
本発明の課題は、優れた脳機能改善効果を有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
近年、腸管の活性化を介した脳機能制御機構が注目されているところ、この機構は、ヒト腸管上皮細胞において吸収された成分が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）産生を増強し、産生されたＢＤＮＦが血液脳関門（ＢＢＢ；Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ）を介して脳の神経細胞の活性化させ、神経成長因子（ＮＧＦ；Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）を増強させることにより、脳機能を制御（改善）するというものである。
【０００６】
本発明者らは、通常食されずに廃棄されているニンニクの皮に注目し、鋭意研究した結果、ニンニク皮が、ＢＤＮＦを介したＮＧＦの増強効果を有することを見いだした。さらに、ニンニクの皮は、ＮＧＦの直接的な増強効果をも有することを見いだした。
すなわち、本発明者らは、ニンニク皮が、脳機能改善に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］ニンニク皮又はその抽出物（Ｎ−ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｏｙｌｏｃｔｏｐａｍｉｎｅの精製物を除く）を含有することを特徴とする脳機能改善用組成物。
［２］ニンニク皮の水溶性溶媒抽出物を含有することを特徴とする上記［１］記載の脳機能改善用組成物。
［３］抗認知症用であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の脳機能改善用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、優れた脳機能改善効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物添加後のＣａｃｏ−２細胞におけるＢＤＮＦ遺伝子の発現変動を示すグラフである。
【図２】ニンニク皮水抽出物添加後の１３２１Ｎ１細胞におけるＮＧＦ遺伝子の発現変動を示すグラフである。
【図３】各種ニンニク皮水抽出物添加後のＣａｃｏ−２細胞におけるＢＤＮＦ遺伝子の発現変動を示すグラフである。
【図４】各種ニンニク皮水抽出物添加後の１３２１Ｎ１細胞におけるＮＧＦ遺伝子の発現変動を示すグラフである。
【図５】ニンニク皮含有サプリメントの摂取前後の精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）における場所の見当識及び計算の得点を示す図である（*：ｖｓサンプル摂取前 Ｐ＜０．１）。
【図６】ニンニク皮含有サプリメントの摂取前後の精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）における場所の見当識及び計算の得点差を示す図である。
【図７】ニンニク皮含有サプリメントの摂取前後の精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）における合計得点を示す図である（*：ｖｓサンプル摂取前 Ｐ＜０．１）。
【図８】ニンニク皮含有サプリメントの摂取前後の精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）における合計得点の差を示す図である。
【図９】ニンニク皮水抽出物添加によるＡＣＥ阻害活性率（％）を示すグラフである。
【図１０】ニンニク皮エタノール抽出物添加によるＡＣＥ阻害活性率（％）を示すグラフである。
【図１１】ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物におけるα‐グルコシダーゼ阻害活性（％）を示すグラフである。
【図１２】ニンニク皮水抽出物添加によるＲＡＷ２６４細胞の細胞生存率を示すグラフである。
【図１３】ニンニク皮水抽出物添加による１細胞あたりのＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図１４】ニンニク皮水抽出物添加によるＡＧＥｓ生成率（％）を示すグラフである。
【図１５】ニンニク皮エタノール抽出物添加によるＡＧＥｓ生成率（％）を示すグラフである。
【図１６】ニンニク皮水抽出物添加によるリパーゼ生成阻害率（％）を示すグラフである。
【図１７】ニンニク皮エタノール抽出物添加によるリパーゼ生成阻害率（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の脳機能改善用組成物は、ニンニク皮又はその抽出物を含有することを特徴し、ニンニク皮及びその抽出物の両者を含んでいてもよい。なお、本発明の脳機能改善用組成物には、Ｎ−ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｏｙｌｏｃｔｏｐａｍｉｎｅの精製物は含まない。
本発明における脳機能の改善とは、脳機能低下の予防（脳機能の維持向上）、脳機能低下の回復、脳機能低下の治療（治癒）を含む概念である。例えば、軽度認知障害等の記憶力の低下の改善や、認知症の改善（抗認知症）を挙げることができる。具体的に、認知症の改善としては、認知症の発症の予防、発症した認知症の緩和、発症した認知症の治療を挙げることができる。認知症としては、例えば、アルツハイマー型認知症を挙げることができる。
【００１１】
本発明の組成物は、腸管上皮細胞を活性化させ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を増強させる。このＢＤＮＦによる脳の神経細胞の活性化により、神経成長因子（ＮＧＦ）が増強し、優れた脳機能改善機能が発揮される。また、本発明の組成物は、脳の神経細胞に直接作用して、神経成長因子（ＮＧＦ）を増強し、優れた脳機能改善機能を発揮する。
【００１２】
本発明のニンニク皮の主体であるニンニク（Allium sativum）としては、その品種、産地等は特に限定されない。ニンニク皮としては、鱗茎（鱗球）全体を覆う皮、各鱗片（鱗片の一つ一つ）を覆う皮を用いることができ、少なくとも各鱗片を覆う皮を用いることが好ましい。本発明の組成物は、ニンニクの従来食されずに廃棄されていた部位のみを用いて構成可能であり、資源の有効活用の観点から優れている。
【００１３】
本発明のニンニク皮の形態としては、粉体、顆粒等の粉砕物を挙げることができる。また、ニンニク皮の抽出物としては、水抽出物、有機溶媒抽出物等を挙げることができ、水抽出物、エタノール抽出物、含水エタノール抽出物等の水溶性溶媒抽出物が好ましい。これらの中でも、優れた脳機能改善効果が得られることから、水抽出物、含水エタノール抽出物等の含水溶媒抽出物が好ましく、水抽出物がより好ましい。水抽出に用いる水は、冷水、常温水、温水、熱水、亜臨界水等を各種制限なく用いることができる。また、抽出物は、液状のままや、濃縮物として用いてもよいが、乾燥物（エキス末）として用いることが好ましい。乾燥方法としては特に制限されるものではなく、常温乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等を用いることができる。
【００１４】
本発明の組成物は、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品などの所定機関より効能の表示が認められた機能性食品等のいわゆる健康食品や、医薬品（医薬部外品を含む）として用いることができる。
【００１５】
例えば、本発明の組成物を健康食品として用いる場合、本発明の組成物は、ニンニク皮又はその抽出物を含有し、脳機能改善に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、本発明に係る製品の本体、包装、説明書、宣伝物のいずれかに、脳機能改善機能がある旨を表示したものが本発明の範囲に含まれる。また、脳機能改善に寄与する脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）や神経成長因子（ＮＧＦ）の増強等の効果がある旨を表示したものも本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
いわゆる健康食品においては、具体的には、「記憶力を維持」、「記憶力の低下を防ぐ」、「加齢による物忘れが気になる方へ」等を表示することができる。
【００１７】
本発明の組成物は、経口用であっても、注射、点滴、経皮吸収等の非経口用であってもよいが、手軽に摂取できる点から、経口用であることが好ましい。経口用の場合、その形態としては、例えば、錠状、カプセル状、粉末状、顆粒状、液状、粒状、棒状、板状、ブロック状、固体状、丸状、ペースト状、クリーム状、カプレット状、ゲル状、チュアブル状、スティック状等を挙げることができる。これらの中でも、錠状、カプセル状、粉末状、顆粒状、液状の形態が特に好ましい。
【００１８】
本発明の経口組成物におけるニンニク皮又はその抽出物の含有量としては、その効果の奏する範囲で適宜含有させればよい。その形態にもよるが、例えば、ニンニク皮又はその抽出物が、乾燥質量換算で本発明の組成物全体の１％以上であることが好ましく、５％以上であることがより好ましく、１０％以上であることがさらに好ましく、３０％以上であることが特に好ましい。本発明の効果をより有効に発揮させるためには、ニンニク皮又はその抽出物が乾燥質量換算で本発明の組成物全体の５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。
【００１９】
本発明の経口組成物の摂取量としては特に制限はないが、本発明の効果をより顕著に発揮させる観点から、ニンニク皮の抽出物としての摂取量が、成人の１日当たり、乾燥質量換算で、５０ｍｇ／日以上となるように摂取することが好ましく、１００ｍｇ／日以上となるように摂取することがより好ましく、１５０ｍｇ／日以上となるように摂取することがさらに好ましい。その上限は、例えば、１０００ｍｇ／日であり、好ましくは５００ｍｇ／日である。
【００２０】
本発明の経口組成物は、１日の摂取量が前記摂取量となるように、１つの容器に、又は例えば２〜３の複数の容器に分けて、１日分として収容することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、必要に応じて、本発明の成分以外の他の成分を添加して、公知の方法によって製造することができる。本発明の成分以外の他の成分としては、例えば、ビタミン、ミネラル、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、動物性油、植物性油を挙げることができる。
【００２２】
ニンニク皮又はその抽出物を含有する組成物は、上記のような脳機能改善効果の他、血圧上昇抑制効果（抗血圧上昇効果）、血糖値上昇抑制効果（抗血糖値上昇効果）、骨密度低減抑制効果（抗骨粗しょう症効果）、ＡＧＥｓ阻害効果（老化防止効果）、リパーゼ阻害効果（脂質吸収抑制効果、抗肥満効果）を有する。これらの脳機能改善以外の用途に用いる場合も、上記本発明の脳機能改善用組成物と同様の構成とすることができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例に基づき本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
＜サンプルの調製＞
（原料）
ニンニク皮としては、東北産の「福地ホワイト」の皮（主として各鱗片を覆う皮）を用いた。
【００２５】
（抽出操作）
ニンニク皮１ｇを秤量し、水又はエタノールで２４時間振盪抽出（２００ｒｐｍ）した。水抽出物は、遠心分離し、上澄みを凍結乾燥させて得た。エタノール抽出物は、抽出液を濾過し、ロータリーエバポレーターにて濃縮後、デシケータ内で乾固させて得た。
【００２６】
＜脳機能改善試験（抗認知症試験）＞
上述のように、近年では、食物や食物由来成分が脳機能の維持、発達および改善に効果があるということが明らかになりつつあり、その１つとして、ヒト腸管上皮細胞において吸収された成分が脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）産生を増強し、産生されたＢＤＮＦが神経細胞の活性化を促すという腸管の活性化を介した脳機能制御機構がある。
本試験では、腸管上皮細胞モデルとしてヒト結腸癌由来細胞（以下、「Ｃａｃｏ−２細胞」という。）を用い、神経細胞モデルとしてヒトアストロサイトーマ（以下、「１３２１Ｎ１細胞」という。）を用い、各サンプルが脳機能（認知症）に及ぼす影響を評価した。
【００２７】
（細胞培養）
Ｃａｃｏ−２細胞および１３２１Ｎ１細胞はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（高グルコース）（含１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を用いて、コンフルエントになるまでφ１０ｃｍディッシュにて前培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、培地に再懸濁後、２４穴プレートに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でオーバーナイト培養した。
【００２８】
（サンプル添加）
オーバーナイト培養後、サンプルを含む無血清ＤＭＥＭ培地（含１％ペニシリン−ストレプトマイシン）に交換し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。
【００２９】
（リアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１遺伝子の発現量の比較）
サンプル添加２４時間後のＣａｃｏ−２細胞および１３２１Ｎ１細胞を回収し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）にて、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型としてＡｒｉａＭＸ リアルタイムＰＣＲ装置（アジレント・テクノロジー）でリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応には、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＢＤＮＦ遺伝子用プライマーとして５’−ＧＴＣＡＡＧＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＧ−３’及び５’−ＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧ−３’を、ＮＧＦ遺伝子用プライマーとして５’−ＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＧＣＡＡ−３’及び５’−ＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡ−３’を、内部標準β−アクチン用プライマーとして５’−ＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧ−３’及び５’− ＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡＴＧＴＴＣＡＡＴ−３’を使用した。リアルタイムＰＣＲ反応条件として、９５℃、３分の初期変性後、９５℃、３秒での変性、６０℃、３０秒のアニーリング／伸長という２ステップのＰＣＲ反応を４０サイクル行った。
【００３０】
ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物添加による神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の遺伝子発現、及びニンニク皮水抽出物の神経成長因子（ＮＧＦ）の遺伝子発現を評価した。
その結果を図１及び２に示す。
【００３１】
図１に示すように、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＢＤＮＦ遺伝子発現は、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物において、コントロールと比較して約５〜７倍に上昇することが確認できた。したがって、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物には、神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を活性化する成分が含まれると考えられる。
【００３２】
また、図２に示すように、１３２１Ｎ１細胞におけるＮＧＦ遺伝子発現は、ニンニク皮水抽出物において、コントロールと比較して、濃度依存的に発現量が上昇することが確認できた。
【００３３】
以上の結果から、ニンニク皮抽出物は、ヒト腸管上皮細胞において吸収され、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）産生を増強し、産生されたＢＤＮＦが神経成長因子（ＮＧＦ）の活性化を促すという腸管の活性化を介した脳機能制御機構、及び／又はＮＧＦを直接活性化するＮＧＦ活性化機構により、認知症の予防、緩和、治療等の脳機能改善を図ることができると考えられる。
【００３４】
＜各種ニンニク皮水抽出物添加による脳機能改善試験（抗認知症試験）＞
Ｃａｃｏ−２細胞または１３２１Ｎ１細胞に、ニンニク皮の熱水抽出物、亜臨界水抽出物、温水・凍結乾燥物、温水・減圧乾燥物、水・凍結乾燥物を、終濃度１００μｇ／ｍＬ処理区添加、ＲＮＡを抽出後、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＢＤＮＦ遺伝子またはＮＧＦ遺伝子の発現量を調査するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
その結果を図３及び図４に示す。
【００３５】
図３に示すように、ニンニク皮熱水抽出物をＣａｃｏ−２細胞に添加した場合、コントロールと比較してＢＤＮＦ遺伝子の発現は約６倍に上昇していた。また、亜臨界水抽出物では、コントロールと比較してＢＤＮＦ遺伝子の発現は約４倍に上昇していた。その他、常温の水や温水によるニンニク皮抽出物は、コントロールと比較してＢＤＮＦ遺伝子の発現は約１．６〜２．３倍に上昇していた。
以上の結果から、熱水抽出物が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を最も増強できると考えられる。
【００３６】
図４に示すように、ニンニク皮熱水抽出物を１３２１Ｎ１細胞に添加した場合、コントロールと比較してＮＧＦ遺伝子の発現は約４．４倍に上昇していた。また、亜臨界水抽出物では、コントロールと比較してＮＧＦ遺伝子の発現は約２倍に上昇していた。その他、常温の水や温水によるニンニク皮抽出物は、コントロールと比較してＮＧＦ遺伝子の発現は約１．４〜３倍に上昇していた。
以上の結果から、熱水抽出物が、神経成長因子（ＮＧＦ）を最も活性化できると考えられる。
【００３７】
以上の図３及び図４の結果から、ニンニク皮熱水抽出物が、脳機能改善に対して最も効果を期待することができる。
【００３８】
＜ヒト脳機能改善試験＞
ニンニク皮含有サプリメントを摂取することによるヒトの認知機能の改善効果を検証した。
【００３９】
（試験方法）
満６５歳以上の健常な成人男女１６名を対象に、プラセボ対照二重盲検ランダム化並行群間比較試験（ＲＣＴ）を行った。被験者は、ブロックランダム化法を用いて、試験物群・プラセボ群の間に有意な偏りがないよう、性別と年齢を条件に各群を８名ずつに割り付けた。試験物群の平均年齢は７０．３±２．６０歳、プラセボ群の平均年齢は６６．６±０．９２歳であった。
【００４０】
ニンニク皮含有サプリメント（試験物）として、にんにく外皮末２００ｍｇ、菜種硬化油１０ｍｇ、ステアリン酸Ｃａ５ｍｇからなる錠剤を用いた。プラセボとして、コーンスターチ２００ｍｇ、菜種硬化油１０ｍｇ、ステアリン酸Ｃａ５ｍｇからなる錠剤を用いた。それぞれ１錠／１日、６週間摂取した。
【００４１】
試験物及びプラセボの摂取の前後に、口頭による精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）を行うことによって、認知機能（場所の見当識、記憶力、計算力、言語的能力、図形的能力）を評価した。
【００４２】
その結果を表１、及び図５〜図８に示す。結果は、試験前後で有意な差が示された項目を示す。
【００４３】
【表１】
0006948657.tif 000002
【００４４】
表１、及び図５〜図８に示すように、本発明の組成物群は、場所の見当識、計算及び合計の項目において、摂取後に上昇傾向を示した。また、上昇傾向が見られた各項目において、事前測定時からの得点の変化量は、プラセボ群と比較して、本発明の組成物群の方が大きかった。なお、本試験は、本発明の組成物の摂取期間が６週間という短期間であったため、効果の表れにくい状況での試験であったが、このような所望の効果が示された。
したがって、ニンニク皮含有サプリメントを摂取することにより、認知機能の向上が図られることが明らかとなった。
【００４５】
＜アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性試験＞
ＡＣＥは、血圧調節メカニズムの一つであるレニン−アンジオテンシン系において、アンジオテンシンＩから、昇圧作用を有するアンジオテンシンＩＩを生成する。また同時に、降圧ペプチドであるブラジキニンを分解するなど、血圧上昇に大きく関与する酵素である。
本試験では、各サンプルのＡＣＥに対する酵素阻害活性を評価することにより、各サンプルの降圧効果について検討した。
【００４６】
（ＡＣＥ阻害活性の測定）
ＡＣＥ活性試験は、ＡＣＥ ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学研究所）を用いた。同キットは、３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（３ＨＢＧＧＧ）より遊離した３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（３ＨＢ）を酵素法にて検出する方法である。
【００４７】
ニンニク皮水抽出物は、ＭｉｌｌｉＱ水に、エタノール抽出物はＤＭＳＯに溶解し、ＡＣＥ活性試験に使用した。サンプルの終濃度は、０．８７、２１．４、１０８．３、５４１．３、２７０６．７μｇ／ｍＬとした。ポジティブコントロールとして、ＭｉｌｌｉＱ水またはＤＭＳＯに溶解したＶａｌ−Ｔｙｒ（サーディンペプチド）を使用した。
【００４８】
測定には、９６穴プレートを用いた。各ウェルにサンプル溶液を２０μＬ、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ２０μＬ及び２０μＬのＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた。ＡＣＥ阻害なしのブランク（ｂｌａｎｋ１）として、ＭｉｌｌｉＱ水またはＤＭＳＯ ２０μＬ、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを２０μＬおよびＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ加えたウェルを作製した。また、試薬ブランク（ｂｌａｎｋ２）としてＭｉｌｌｉＱ水またはＤＭＳＯ ４０μＬ、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ加えたウェルを作製した。その後、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベート後、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ加え、室温で１０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定し、その値からＡＣＥ阻害活性率（％）を求め、さらに５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。
【００４９】
ＡＣＥ阻害活性率（％）
＝［（Ａｂｌａｎｋ１−Ａｓｍａｐｌｅ）／（Ａｂｌａｎｋ１−Ａｂｌａｎｋ２）］×１００
【００５０】
その結果を図９及び１０に示す。
【００５１】
図９に示すように、試験した最も高い濃度（２７０６．７μｇ／ｍＬ）におけるＡＣＥ阻害活性率は、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ポジティブコントロール）で９９．９％、ニンニク皮水抽出物では８２．２％であった。Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ポジティブコントロール）では、４５０ｎｍの吸光度値から算出したＡＣＥに対するＩＣ５０は３．０７μｇ／ｍＬであった。一方、ニンニク皮水抽出物のＡＣＥに対するＩＣ５０は１１６５．２４μｇ／ｍＬであった。
【００５２】
図１０に、ニンニク皮エタノール抽出物によるＡＣＥ阻害活性率（％）を示した。その結果、試験した最も高い濃度（２７０６．７μｇ／ｍＬ）におけるＡＣＥ阻害活性率は、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ポジティブコントロール）で１１２．１％、ニンニク皮エタノール抽出物では４７．７％であった。Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ポジティブコントロール）では、４５０ｎｍの吸光度値から算出したＡＣＥに対するＩＣ５０は１３．２７μｇ／ｍＬであった。一方、ニンニク皮エタノール抽出物のＡＣＥに対するＩＣ５０は３０９２．０９μｇ／ｍＬであった。
【００５３】
以上の結果から、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物には、降圧効果が期待できる。また、ニンニク皮水抽出物は、エタノール抽出物と比較して、より強いＡＣＥ阻害活性を示すことから、より優れた降圧効果を期待できる。
【００５４】
＜抗血糖値試験＞
糖尿病は糖代謝の異常により高血糖状態が継続する疾病であり、様々な病気を引き起こす原因ともなる。高血糖状態には生活習慣が大きく影響をしており、日常的な血糖値のコントロールが重要である。α−グルコシダーゼは小腸上皮細胞において糖のα−グルコシド結合を加水分解する酵素の複合体であり、二糖類の消化と吸収に関与する。
本試験では、サンプルの血糖値上昇抑制効果を評価するため、サンプルのα−グルコシダーゼ活性を測定した。
【００５５】
（α−グルコシダーゼ活性の測定）
評価サンプルとして、ニンニク皮水抽出を２２、２２２μｇ／ｍＬの終濃度、及びエタノール抽出物を２２２μｇ／ｍＬの終濃度で添加した。スクロース、α−グルコシダーゼおよびサンプルを各１００μＬずつ混合した。インキュベーター内で３７℃、３０分間反応させた。１００℃にセットしたブロックインキュベーターにて１０分間加熱し、反応停止した。加熱後、室温に戻るまで３分間静置した。サンプルを遠心し、上清中のグルコース濃度をバイオセンサで測定した。
【００５６】
その結果を図１１に示す。
【００５７】
図１１に示すように、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物において、強いα−グルコシダーゼ阻害活性が確認できた。
【００５８】
以上の結果から、ニンニク皮水抽出物およびエタノール抽出物にはα−グルコシダーゼ阻害活性が認められ、血糖値上昇抑制効果が期待できる。したがって、抗糖尿病に関する素材として利用できると考えられる。
【００５９】
＜抗骨粗しょう症試験＞
骨は、骨芽細胞による骨形成と、破骨細胞による骨吸収（骨破壊）のバランスによってコントロールされている。高齢になると骨粗しょう症になりやすいのは、破骨細胞が骨芽細胞よりも活性化されることで骨量が減少するためである。そのため、破骨細胞の増殖・分化を阻害することは骨粗しょう症の抑制に有効であると考えられる。
破骨細胞のマーカー酵素としては、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ：ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が知られている。骨髄細胞を分化誘導し、ＴＲＡＰ活性を測定することにより細胞の分化状態を評価可能である。
本実験では、サンプルが破骨細胞への分化を抑制する機能を有するか、ＴＲＡＰ活性を測定し評価した。
【００６０】
（細胞培養）
マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４）はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（高グルコース）（含１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を用いて、８０％コンフルエントになるまでφ１０ｃｍディッシュにて前培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、培地に再懸濁後、９６穴プレートに０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でオーバーナイト培養した。
【００６１】
（サンプル添加）
評価サンプルとして、ニンニク皮水抽出物を０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬの終濃度で添加した。オーバーナイト培養後、サンプルを含む破骨細胞分化誘導培地（ＯＳＣＭＭ、コスモバイオ）に交換し、ＣＯ２インキュベーターにて７２時間培養した。
【００６２】
（細胞生存率の測定）
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（同仁化学）を用いて測定した。サンプル添加７２時間後、サンプル含有ＯＳＣＭＭ培地を除去し、９６穴プレートの各ウェルにサンプルを含まない無血清ＤＭＥＭ培地（含１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を１００μＬ加えた。次いで、各ウェルにＣＣＫ−８液を１０μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターにて１時間静置培養した。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。
【００６３】
（ＴＲＡＰ活性の測定）
細胞生存率測定後、細胞上清を除去し、細胞固定液（アセトン：エタノール＝１：１）を各ウェル１００μＬずつ加え、１分間室温にて細胞を固定した。細胞固定液を除去し、３０分間ウェルを乾燥させた。各ウェルに基質パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ加え、３７℃で６０分間反応させる。その後、反応停止液１Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに５０μＬ加えた。マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＴＲＡＰ活性を算出した。
【００６４】
その結果を図１２及び図１３に示す。
【００６５】
図１２に示すように、コントロール（水）と比較して、細胞生存率の増加が認められた。また、図１３に示すように、コントロール（水）と比較して、１細胞あたりのＴＲＡＰ活性は８０％程度の抑制が確認できた。
【００６６】
以上のように、ニンニク皮水抽出物は、細胞生存率を促進すると共にＴＲＡＰ活性を低下させており、選択的に破骨細胞分化に関わる経路を阻害していると理解できる。すなわち、安全性の高い、骨粗しょう症治療改善薬・機能性食品に関する素材として期待できる。
【００６７】
＜ＡＧＥｓ（最終糖化産物）阻害活性試験＞
アミノ酸と還元糖を共存させると、架橋反応が生じタンパク質の構造が変化する。これはメイラード反応と呼ばれる非酵素的褐変化反応であり、パンやホットケーキなど、食品の加熱調理時に見られる茶色い焦げも、この反応によるものである。メイラード反応は、体内に存在するタンパク質と糖質との共存によっても進行する。血中の糖濃度が高い状態が続くと、タンパク質との架橋反応が生じ、後期生成物であるＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：最終糖化産物）が生成される。ＡＧＥｓが体内へ蓄積すると、老化や疾病のリスクが高まると考えられていることから、ＡＧＥｓ生成を阻害する素材の探索が求められている。
本試験では、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物がＡＧＥｓ形成に及ぼす影響について評価した。
【００６８】
（サンプル調製）
ニンニク皮水抽出物は超純水を溶媒としてサンプル濃度２．５ｍｇ／ｍｌになるよう調製した。終濃度は１ｍｇ／ｍｌである。ニンニク皮エタノール抽出物はＤＭＳＯを溶媒としてサンプル濃度２．５ｍｇ／ｍｌになるよう調製した。終濃度は１ｍｇ／ｍｌである。ポジティブコントロールとして、アミノグアニジンを２．２ｍｇ／ｍｌとなるよう、超純水を溶媒として調製した（終濃度：８８０μｇ／ｍｌ）。
【００６９】
（ＡＧＥ形成量の測定）
蛍光測定用黒色プレートに、グリセルアルデヒド溶液（４５ｍｇ／ｍｌｉｎＰＢＳ）１０μｌ、ＢＳＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）５０μｌ、サンプル溶液４０μｌを添加した。混合した直後（反応０時間）の蛍光強度（Ｅｘ：３７０ｎｍ、Ｅｍ：４４０ｎｍ）をＦｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ ３により測定した（ＡＧＥｓの構造は蛍光を発するものであり、蛍光強度によりＡＧＥｓの産生量を測定することが可能である）。また、サンプル自体の有する蛍光強度を測定するため、グリセルアルデヒド、ＢＳＡ溶液をＰＢＳに置き換えたプレートを陰性対照として用意し、この値を差し引くことで、反応０時間目の蛍光強度とした。このプレートを３７℃で２０時間反応させた。反応２０時間後の溶液の蛍光強度をＦｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ ３（水抽出物）およびｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＰＲＯ（エタノール抽出物）により測定した。陰性対照のプレートも同様に反応させて蛍光強度を測定し、陰性対照の値を差し引くことで、反応２０時間目の蛍光強度とした。反応前後の蛍光強度を差し引いてＡＧＥｓ生成量とし、コントロール（溶媒）のＡＧＥｓ生成量を１００％として、ニンニク皮のＡＧＥｓ生成量の相対値をＡＧＥｓ生成率（％）として表した。
【００７０】
その結果を図１４及び図１５に示す。
【００７１】
図１４に示すように、ニンニク皮水抽出物のＡＧＥｓ生成率（％）は、充分に反応が起こった反応２０時間後、ＡＧＥｓ生成の抑制効果が認められた。
【００７２】
また、図１５に示すように、ニンニク皮エタノール抽出物についても、ニンニク皮水抽出物と同様に、充分に反応が起こった反応２０時間後ＡＧＥｓ生成の抑制効果が認められた。
【００７３】
以上より、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物は、ＡＧＥｓ形成を阻害する効果を示した。したがって、ニンニク皮水抽出及びエタノール抽出物の成分には、体内のＡＧＥｓ蓄積による老化を軽減する作用があることが期待される。
【００７４】
＜リパーゼ阻害活性試験＞
リパーゼは脂肪を分解する酵素で、膵臓から十二指腸へ分泌されるリパーゼは脂肪の消化・吸収に大きく関与している。現在、肥満が原因となり、糖尿病に代表される代謝性疾患や血管疾患などの疾患を抱える人口が急増しており、肥満の解決は急務を有する事項の一つである。肥満の要因は環境、遺伝など数多くの要因があるが、肥満の原因自体は消費エネルギーよりも摂取エネルギーが過剰であることに尽きる。膵リパーゼは脂肪の吸収に関与しているため、リパーゼ活性が阻害されるような物質は、摂取エネルギーを低下させ、抗肥満効果を発揮する有効なアプローチの一つとして考えられている。
【００７５】
（実験方法）
ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物の抽出物溶液２５μＬを０．１ｍＭ ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｏｌｅａｔｅ（４−ＭＵＯ）（／１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２緩衝液）溶液５０μＬと混合し、１５０μｇ／ｍＬ膵臓由来リパーゼ２５μＬを上記と同様の緩衝液に溶かし、反応の開始とした。２５℃で３０分間インキュベートした。０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μＬを加えて反応を停止させた後、蛍光強度測定した（Ｅｘ：３６０、Ｅｍ：４６５ｎｍ）。４−ＭＵＯにリパーゼが作用して遊離した４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅの蛍光強度を測定することで、リパーゼ活性に与える影響を評価した。
【００７６】
その結果を図１６及び図１７に示す。
【００７７】
図１６に示すように、ニンニク皮水抽出物のリパーゼ生成阻害率（％）は、２５ｍｇ／ｍｌにおいて、ポジティブコントロールであるオルリスタット以上のリパーゼ生成阻害率が確認された。
【００７８】
また、図１７に示すように、ニンニク皮エタノール抽出物のリパーゼ生成阻害率（％）は、ニンニク皮水抽出物同様、２５ｍｇ／ｍｌにおいて、オルリスタットと同程度のリパーゼ生成阻害率（％）が確認された。
【００７９】
以上のとおり、ニンニク皮水抽出物及びエタノール抽出物において、抗リパーゼ活性の効果が認められた。したがって、脂質吸収抑制や抗肥満等の効果が期待される。
【００８０】
［配合実施例１］
以下に示す配合により、カプセル剤を製造した。
にんにく皮エキス末          ２００ｍｇ
菜種硬化油                    １０ｍｇ
ステアリン酸Ｃａ                ５ｍｇ
【００８１】
［配合実施例２］
以下に示す配合により、錠剤を製造した。
にんにく皮エキス末          ２００ｍｇ
結晶セルロース                ８８ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル            ９ｍｇ
微粒二酸化ケイ素                ３ｍｇ
【００８２】
［配合実施例３］
以下に示す配合により、カプセル剤を製造した。
にんにく皮エキス末          ２００ｍｇ
べに花油                    ２００ｍｇ
グリセリン脂肪酸エステル      ２５ｍｇ
【００８３】
［配合実施例４］
以下に示す配合により、顆粒剤を製造した。
にんにく皮エキス末            ６０ｇ
難消化性デキストリン          ２５ｇ
コーンスターチ                １５ｇ
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の脳機能改善用組成物は健康食品等として用いることができることから、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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