(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
経皮透過用ナノ運搬体であって、
プルロニック高分子の両末端にキトサンが置換された、キトサン−プルロニック複合体、及びプルロニック高分子を含み、
前記プルロニック高分子が、下記化１で表され、
前記キトサン−プルロニック複合体とプルロニック高分子の重量比が、８：２である、
ナノ運搬体。
（化１）
（ＰＥＯ）ａ−（ＰＰＯ）ｂ−（ＰＥＯ）ａ
（前記ＰＥＯはポリエチレンオキシド、前記ＰＰＯはポリプロピレンオキシドであり、前記ａ及びｂはそれぞれ独立に１乃至３００の整数である。）
【請求項２】
前記キトサン−プルロニック複合体における、キトサンの分子量が３乃至７６０ｋＤａである、請求項１に記載のナノ運搬体。
【請求項３】
前記ナノ運搬体は、大きさが５００ｎｍ以下である、請求項１に記載のナノ運搬体。
【請求項４】
前記ナノ運搬体は、表面電荷が０乃至５０ｍＶである、請求項１に記載のナノ運搬体。
【請求項５】
前記ナノ運搬体は肌透過率の低い薬物又は活性成分を運搬する、請求項１に記載のナノ運搬体。
【請求項６】
前記ナノ運搬体は、肌透過率の低い薬物又は活性成分のローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）効率が９０％以上である、請求項５に記載のナノ運搬体。
【請求項７】
前記肌透過率の低い薬物又は活性成分は、化粧品、医薬品、医薬外品、又は美容用品に使用される機能性の物質である、請求項５に記載のナノ運搬体。
【請求項８】
前記ナノ運搬体は、化粧品、医薬品、医薬外品、又は美容用品に用いられる、請求項１に記載のナノ運搬体。
【請求項９】
前記ナノ運搬体は、肌透過率の低い薬品又は活性成分を含有する薬物複合体に用いられる
、請求項１に記載のナノ運搬体。
【請求項１０】
（ａ）プルロニック高分子とキトサンとを混合し、プルロニック高分子の末端にキトサン
が置換された複合体を製造する段階と、
（ｂ）前記複合体を溶媒としてのアセトンの存在下でプルロニック高分子と混合して混合物を製造する段階と、
（ｃ）前記混合物を蒸留水に滴下する段階と、
（ｄ）前記混合物が滴下した蒸留水を攪拌する段階と、を含み、
前記プルロニック高分子が、下記化１で表され、
前記キトサン−プルロニック複合体とプルロニック高分子の重量比が、８：２である、
請求項１に記載の経皮透過用ナノ運搬体の製造方法。
（化１）
（ＰＥＯ）ａ−（ＰＰＯ）ｂ−（ＰＥＯ）ａ
（前記ＰＥＯはポリエチレンオキシド、前記ＰＰＯはポリプロピレンオキシドであり、前記ａ及びｂはそれぞれ独立に１乃至３００の整数である。）
【請求項１１】
前記（ａ）段階で、３乃至７６０ｋＤａの分子量のキトサンを混合する、請求項１０に記
載のナノ運搬体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮透過用ナノ運搬体に関し、より詳細にはキトサンをベースとするナノスポンジ構造のナノ運搬体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肌を通過する薬物は、使用の便利性により、肌を通して特定器官に伝達する目的を有する。これと共に、アトピー治療剤、美白、シワ改善用化粧品等肌自体に伝達する場合も存在する。
【０００３】
肌はヒトの身体で表面積が最も大きな器官であって、適切な方法を使用する場合、効果的に薬物を伝達することができる経路になる。しかしながら、肌の一番外側で死んだ細胞から構成されている角質層により、外部物質の肌透過度は非常に低いため、分子量が大きく、親水性のある物質の伝達に困難がある。特に、角質層内の角質形成細胞とこれらの間の角質細胞間脂質である。殆どの肌で生理学的に活性を示す分子（以下、肌生理活性分子）は、肌角質層の抵抗性のため、経皮透過率が低くなる。
【０００４】
このような肌生理活性分子の経皮透過率を促進させることができる様々な方法が研究されてきたが、最近、細胞透過性ペプチドを用いた伝達システムに多くの関心が集中している。細胞透過性を有するペプチドの使用は種々の長所を有するが、これは主に常時ペプチド配列に行われ得る様々な変形に起因する。
【０００５】
しかしながら、ペプチドを用いた伝達システムは、従来、細胞透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の分析を通じて、特徴的なアミノ酸配列を選定、人工的に合成したものという点で、人体に適用するとき、免疫反応等の副作用を引き起こす素地があり、伝達しようとするタンパク質の構造及び機能に影響を与え得るため、細胞内へ伝達しようとする生物学的活性物質と連結する際に効率が低下するという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許公報第１０−２０１２−０１０４０３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、キトサンを含むナノ運搬体を提供することによって、化粧品及び医薬品分野に適用可能であり、生体適合性が高く、肌内薬物伝達に優れたナノ運搬体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、プルロニック高分子の両末端にキトサンが置換されたキトサン−プルロニック複合体を提供することを本発明の一側面とする。
【０００９】
前記プルロニック高分子は、下記化学式１で表すことができる。
【００１０】
（化１）
（ＰＥＯ）ａ−（ＰＰＯ）ｂ−（ＰＥＯ）ａ
【００１１】
（前記ＰＥＯはポリエチレンオキシド、前記ＰＰＯはポリプロピレンオキシドであり、前記ａ及びｂはそれぞれ独立に１乃至３００の整数である。）
【００１２】
前記キトサンの分子量は、３乃至７６０ｋＤａであり得る。
【００１３】
また、本発明は、前記のキトサン−プルロニック複合体を含むナノ運搬体を提供することを本発明の別の側面とする。
【００１４】
前記ナノ運搬体は、プルロニック高分子をさらに含むことができ、前記キトサン−プルロニック複合体と前記プルロニック高分子は総重量１００重量％に対して、前記キトサン−プルロニック複合体は１０重量％以上１００重量％以下であり、前記プルロニック高分子は、０重量％以上９０重量％以下の重量比で混合されたものであり得る。
【００１５】
前記キトサン−プルロニック複合体における、キトサンの分子量が３乃至７６０ｋＤａであってもよい。
【００１６】
前記ナノ運搬体は、大きさが５００ｎｍ以下であってもよく、好ましくは１４０ｎｍ以下であってもよい。
【００１７】
前記ナノ運搬体は、表面電荷が０乃至５０ｍＶであってもよく、好ましくは１１乃至１８ｍＶであってもよい。
【００１８】
前記ナノ運搬体は肌透過率の低い薬物又は活性成分を運搬するものであってもよく、肌透過率の低い薬物又は活性成分のローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）効率が９０％以上であってもよい。前記肌透過率の低い薬物又は活性成分は、疎水性の物質又は親水性の物質であってもよく、薬剤学的に許容される物質であってもよく、肌透過が難しいと判断される高分子量の物質を含んでもよい。
【００１９】
前記肌透過率の低い薬物又は活性成分は、化粧品、医薬品、医薬外品、又は美容用品に使用される機能性の物質であってもよい。
【００２０】
前記ナノ運搬体は、化粧品、医薬品、医薬外品、又は美容用品に用いられるものであってもよい。
【００２１】
前記ナノ運搬体は、経皮透過用、経口投与用、又は侵襲用であってもよい。
【００２２】
前記ナノ運搬体は、肌透過率の低い薬品又は活性成分を含有する薬物複合体に用いられることができる。
【００２３】
また、本発明は、（ａ）プルロニック高分子とキトサンとを混合し、プルロニック高分子の末端にキトサンが置換された複合体を製造する段階と、（ｂ）前記複合体を溶媒下でプルロニック高分子と混合して混合物を製造する段階と、（ｃ）前記混合物を蒸留水に滴下する段階と、（ｄ）前記混合物が滴下した蒸留水を攪拌する段階と、を含むナノ運搬体の製造方法を提供することを本発明のまた別の側面とする。
【００２４】
前記（ａ）段階で、３乃至７６０ｋＤａの分子量のキトサンを混合するものであってもよい。
【００２５】
前記（ｂ）段階で、前記複合体と前記プルロニック高分子は総重量１００重量％に対して、前記キトサン−プルロニック複合体は１０乃至１００重量％であり、前記プルロニック高分子は、０乃至９０重量％で混合することができる。
【発明の効果】
【００２６】
前記のような本発明によると、キトサンを含む複合体をベースとする肌透過率が改善されたナノ運搬体を提供することによって、薬物又は化粧品物質等を肌内に効率的に伝達できるという効果がある。
【００２７】
また、ナノ運搬体の凝集現象を最小化し、生体内の環境でも薬物又は化粧品物質等を安定的に伝達できるという効果がある。
【００２８】
また、細胞毒性を引き起こさないので、生体適合性に優れた経皮透過用ナノ運搬体を提供するという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施例に係るナノ運搬体の模式図である。
【図２】本発明の一実施例に係る反応器が導入されたプルロニック高分子の１Ｈ−ＮＭＲの分析結果である。
【図３】本発明の一実施例に係るキトサン−プルロニック複合体の１Ｈ−ＮＭＲの分析結果である。
【図４】本発明の一実施例に係るナノ運搬体の大きさ及び表面電荷の測定結果である。
【図５】本発明の一実施例に係るナノ運搬体の表面のキトサン量の測定結果である。
【図６】本発明の一実施例に係るナノ運搬体の安定性の測定結果である。
【図７】本発明の一実施例に係るナノ運搬体の薬物のローディング効率の分析結果である。
【図８】本発明の一実施例に係るナノ運搬体の細胞毒性の分析結果である。
【図９】本発明の一実施例に係るナノ運搬体を用いた薬物の肌透過率の測定結果である。
【図１０】本発明の一実施例に係るナノ運搬体を用いた薬物の肌透過分布イメージの測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３１】
実施例１．プルロニック高分子の両末端基に反応器導入
【００３２】
２ｇのプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、（ＰＥＯ）ａ−（ＰＰＯ）ｂ−（ＰＥＯ）ａ；前記ａ及びｂはそれぞれ独立に１乃至３００の整数である。）高分子の末端にアミンと反応性に優れた３２３ｍｇのｐ−ＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１０分子比）を３０ｍｌのＤＣＭ（ジクロロメタン）で反応を行った。触媒剤として１３０μＬのピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）（１０ｍｒ）を用いて、０℃で２４時間反応した。以降、反応しないｐ−ＮＰＣとピリジンを除去するために、冷エーテル（ｃｏｌｄ  ｅｔｈｅｒ）で精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を３回行った。
【００３３】
前記の過程は、下記反応式１に示した。
【反応式１】
【００３４】
0006918276.tif 000002
【００３５】
測定例１．ｐ−ＮＰＣ−プルロニックの１Ｈ−ＮＭＲ分析
【００３６】
前記実施例１で製造されたｐ−ＮＰＣ−プルロニック高分子を凍結乾燥（ｐｏｗｄｅｒｙ  ｓｔａｔｅ）した後、Ｄ２Ｏに溶かして１Ｈ−ＮＭＲを分析した。その結果を図２に示し、図２を参照すると、ピリジンが完璧に除去されたことが確認できる。（置換率＞９８％、純度１００％）
【００３７】
実施例２．キトサン−プルロニック（Ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）複合体の製造
【００３８】
（１）実施例２−１．３ｋＤａのキトサン−プルロニック複合体の製造
【００３９】
前記実施例１で製造したｐ−ＮＰＣ−プルロニックの両末端にキトサンを置換させるために、前記ｐ−ＮＰＣ−プルロニック３００ｍｇをＤＭＳＯに溶かした後、３ｋＤａのキトサン９００ｍｇを触媒剤であるトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；ＴＥＡ）と共に添加し、常温で１２時間反応させた。以降、純度を向上させるために、反応しないキトサンはアセトンに沈殿させて除去し、未反応のＴＥＡとｐ−ＮＰＣは冷エーテルから除去した。また、純度を向上させるために、キトサン−プルロニック複合体を３次蒸留水で透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）して不純物を除去し、その後に凍結乾燥（ｐｏｗｄｅｒｙ  ｓｔａｔｅ）した。前述した過程は下記の反応式２に示した。
【００４０】
（２）実施例２−２．１０ｋＤａのキトサン−プルロニック複合体の製造
【００４１】
前記実施例１−１と同じように実施するが、１０ｋＤａのキトサンを用いた。
【反応式２】
【００４２】
0006918276.tif 000003
【００４３】
測定例２．キトサン−プルロニック複合体の１Ｈ−ＮＭＲ分析
【００４４】
前記実施例２−１及び２−２で製造したキトサン−プルロニック複合体（ｐｏｗｄｅｒｙ  ｓｔａｔｅ）をＤ２Ｏに溶かして、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、その結果を図３に示した。図３（左側の結果：３ｋＤａのキトサン使用（実施例２−１）、右側の結果：１０ｋＤａのキトサン使用（実施例２−２））を参照すると、キトサンの分子量と関係なく、９８％以上の置換率を有するキトサン−プルロニック複合体を製造した。
【００４５】
実施例３．ナノ運搬体の製造
【００４６】
ナノ運搬体（３ｋＤａのキトサンが置換されたナノ運搬体：Ｃｈｉ３Ｋ−ＮＳ、１０ｋＤａのキトサンが置換されたナノ運搬体：Ｃｈｉ１０Ｋ−ＮＳ）は、前記実施例２で製造されたキトサン−プルロニック複合体とプルロニックの割合を調節し、ナノ沈殿法（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｔａｔｉｏｎ）を通じて製造した。より詳細には、前記実施例２で製造した３ｋＤａ又は１０ｋＤａのキトサンが置換されたキトサン−プルロニック複合体とプルロニックの割合を５：５、８：２、１０：０の重量比で１０ｍｇ／ｍｌのアセトン（９９％、ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）の濃度で溶かして混合溶液を製造した後、混合溶液１ｍｌを５００ｒｐｍで攪拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）している５ｍＬの３次蒸留水（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  Ｗａｔｅｒ）に０．１  ｍｌ／ｍｉｎの速度で徐々に投入した後、１２時間以上常温で反応させ、この過程でアセトン溶媒は自然的に蒸発されて除去された。前述した製造過程は、下記の反応式３に示した。
【反応式３】
【００４７】
0006918276.tif 000004
【００４８】
測定例３．ナノ運搬体の大きさ及び表面電荷の測定
【００４９】
前記実施例３で製造したナノ運搬体を０．２μｍのシリンジフィルタ（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ）でフィルタした後、ナノスポンジ（２ｍｇ／ｍＬ）の大きさ及び表面電荷をＤＬＳ（ＥＬＳ−８０００、Ｏｔｓｕｋａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）装備を用いて分析し、その結果を図４に示した。
【００５０】
図４を参照すると、製造されたナノ運搬体は均一な分布を示し、全てのグループで１４０ｎｍ以下の大きさを示し、配合割合及びキトサンの分子量による差は大きく表れなかった。
【００５１】
しかしながら、表面電荷を測定した結果、キトサン−プルロニックとプルロニックの配合割合によってキトサンの量が多く投入される剤形の場合、より高い正電荷（約＋１１ｍＶ→約＋１８ｍＶ）を示し、キトサンの分子量による差は観察されなかった。
【００５２】
測定例５．ナノ運搬体の表面のキトサン量の測定
【００５３】
前記実施例３で製造したナノ運搬体の表面のキトサンの量を定量分析するために、ニンヒドリン法を用いて測定した。ナノ運搬体の溶液とニンヒドリン試薬（Ｎｉｎ−ｈｙｄｒｉｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）（２％溶液）を１：１の体積比で混合した後、９０℃の条件で３０分間反応させた。以降、最終反応溶液（紫色）を５７０ｎｍのＵＶ吸光度を測定してキトサンの量を定量し、その結果を図５に示した。
【００５４】
図５を参照すると、配合割合によってキトサンの量が多く投入された剤形の場合、より多くの量のキトサンが存在した。
【００５５】
測定例６．ナノ運搬体の安定性評価
【００５６】
前記実施例３で製造したナノ運搬体の安定性を評価するために、生体内の環境と類似の条件（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、３７℃）で時間別にナノ運搬体の凝集現象が現れるかＤＬＳ装備で分析した。より具体的には、７日間３７℃及び１００ｒｐｍの条件下でキトサンの安定性が維持されるか観察をし、その結果を図６に示した。図６を参照すると、０乃至７日間凝集現象が現れずに均一な大きさがよく維持されることが観察されたことによって、生体内の環境で安定できることを確認できる。
【００５７】
測定例７．薬物のローディング効率及び薬物がローディングされたナノ運搬体の特性評価
【００５８】
モデル薬物として疎水性の特定を有し、赤色の蛍光を示せるナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）（ｅｘ．５３０ｎｍ／ｅｍ．６３５ｎｍ）を使用し、ナノ運搬体の製造時に共にローディングさせた後、ローディング効率を分析した結果、約９５％程度の高いローディング効率を示した。
【００５９】
薬物をローディングした後、ナノ運搬体の大きさ及び表面電荷の変化を観察した結果を図７に示し、図７を参照すると、全ての条件で薬物のローディング前後の大きさ及び表面電荷に微細な差は存在するが、統計学的には差がないことによって、薬物がナノスポンジの内側の疎水性高分子部分に安定的に捕集されたことを確認できる。
【００６０】
測定例８．ナノ運搬体の細胞毒性評価
【００６１】
Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＮＩＨ／３Ｔ３、ｐａｓｓａｇｅ  ＃１５、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｓｓ）を９６ウェルセルカルチャープレート（ｗｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）に塗布後、１２時間程度安定化させた。（細胞培地：ＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％、抗生物質１％を含む））
【００６２】
以降、モデル薬物であるナイルレッド（Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ）がローディングされたナノ運搬体を１０００μｇ／ｍＬまで製造後、細胞に添加した後に２４時間培養した後、それぞれのグループで細胞代謝作用に及ぼす影響に対してＷＳＴ−８評価法を使用して分析した後、結果を図８に示した。
【００６３】
図８を参照すると、全ての条件で１０００μｇ／ｍＬまで細胞毒性を引き起こさず、生体適合性に優れるということが確認できる。
【００６４】
測定例９．薬物の肌透過率評価
【００６５】
薬物の肌透過実験のために、フランツ型拡散セル（Ｆｒａｎｚ  ｔｙｐｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）のレセプターチャンバー（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）にリリースバッファー（ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）であるＰＢＳを５ｍｌ入れた後、レセプターチャンバーとドナーチャンバー（ｄｏｎｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）との間にヒト死体皮膚（ｈｕｍａｎ  ｃａｄａｖｅｒ  ｓｋｉｎ）を１．５×１．５ｃｍ２の大きさで覆った後、フランツセルのドナー部分に２ｍｇ／ｍＬの各サンプル（薬物（Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ）がローディングされたナノ運搬体）を入れた。
【００６６】
レセプターチャンバーの条件は３７℃、６００ｒｐｍに調節し、サンプル時間（ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）は０．５、１、２、４、８、１２、１８、２４時間で５００μＬずつ回収し、時間別に肌を通して透過して出た薬物の量を、蛍光を測定して分析し、その結果を図９に示した。
【００６７】
図９を参照すると、対照群（薬物自体）よりもナノ運搬体の剤形を使用した場合、薬物の肌透過率が４倍以上増加することが確認でき、特に３ｋＤａのキトサンに置換されたナノ運搬体８：２の配合割合を剤形（３ｋ−８：２）で最も高い薬物の肌透過率が観察された。（対照群に比べて約８倍向上した）
【００６８】
また、ナノ運搬体の剤形のうち、１０ｋＤａのキトサンに置換した場合よりも３ｋＤａのキトサンを使用した剤形の場合、薬物の肌透過率を向上させることによって、キトサンの分子量も薬物の肌透過率に影響を与え得るということが確認できる。
【００６９】
薬物の肌透過実験を完了した後、薬物が肌内にどのように分布されているか確認するために、肌を１０％中性ホルマリン溶液で１２時間以上固定させ、固定された肌をＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄと混合して液体窒素及び２０℃以下で凍らせた後、ｃｙｒｏ−ｓｅｃｔｉｏｎ機器（−２５℃）を通して２０μｍの厚さで肌を切った後、スライドガラスに付着させてサンプリングした。以降、３次蒸留水で洗浄した後、蛍光顕微鏡でモデル薬物（Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ）の肌内分布現況を観察し、その結果を図１０に示した。
【００７０】
図１０を参照すると、ナノ運搬体を使用しない対照群グループ（Ｄｒｕｇ（Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ）ａｌｏｎｅ）では、疎水性及び低分子の特性を有する薬物が角質層に集まっていることが観察され、それに対して、ナノ運搬体を使用したグループでは、薬物が角質層を透過し、表皮及び真皮層にむらなく広がっていることが観察された。
【００７１】
特に、最適の剤形条件である３ｋＤａのナノ運搬体８：２の配合割合（Ｃｈｉ３ｋ−ＮＳ）で高い蛍光が観察されたことによって、様々な難病の治療薬物を肌内に伝達するために、新規のプラットフォームに使用されることができることを確認した。
【００７２】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は単に好ましい実施態様であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１】
0006918276.tif 000005
【図２】
0006918276.tif 000006
【図３】
0006918276.tif 000007
【図４】
0006918276.tif 000008
【図５】
0006918276.tif 000009
【図６】
0006918276.tif 000010
【図７】
0006918276.tif 000011
【図８】
0006918276.tif 000012
【図９】
0006918276.tif 000013
【図１０】
0006918276.tif 000014