(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２０抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)であって、前記抗原結合ドメインは
（ｉ）配列番号７で示される重鎖可変領域（ＶＨ）、および
（ｉｉ）配列番号１１で示される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ＶＨは、ＶＬのＮ末端に位置し、
前記キメラ抗原受容体は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
請求項1に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクター又は請求項２に記載の核酸分子を含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項５】
薬学的に許容される担体と、請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、あるいは請求項４に記載の細胞とを含有することを特徴とする薬物組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、または請求項４に記載の細胞の使用であって、癌を治療する薬物または製剤の製造における使用。
【請求項７】
請求項1に記載のキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ-Ｔ細胞（ＣＡＲ修飾Ｔ細胞）を製造する方法であって、
前記方法は、請求項２に記載の核酸分子または請求項３に記載のベクターをＴ細胞内に形質導入することによって、前記ＣＡＲ-Ｔ細胞を得る工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CD20抗原を標的とするキメラ抗原受容体の配列成分、およびその修飾T細胞（CART20）の製造方法および活性同定を提供する。本発明は、CD20陽性のB細胞性リンパ腫を治療するキメラ抗原受容体の構造を同定する。
【背景技術】
【０００２】
血液系の悪性腫瘍は人類の悪性腫瘍の約10％を占め、95％の血液系の悪性腫瘍はBリンパ球由来のものである。従来の化学治療および放射線治療は血液系の悪性腫瘍の治療に重要な作用を果たし、一部の患者には治療効果が顕著であるが、大半は治癒が難しい。新規で有効な治療方法はずっとこの分野における探索の焦点になっている。
【０００３】
養子T細胞治療は悪性腫瘍に対する臨床治療においてすでに強い治療効果および明るい未来を示している。中では、いくつかの機構によって独立に展開されたキメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor、CAR）によって修飾されたT細胞はCD19を発現する再発・ 難治性B細胞悪性腫瘍において未曾有の成功を収めた。特にペンシルベニア大学医学部によって行われたCART19によって再発・ 難治性急性B細胞リンパ腫（R/R B-ALL）を治療する臨床試験において94％もの患者が完全に緩和された。この臨床試験の初期反応率が高かったが、40％近くの患者が治療1か月で完全に緩和された後、また再発し、そして再発した患者のうち、60％もの患者はCD19陰性腫瘍細胞の免疫逃避が現れた。そのため、悪性リンパ腫の患者を治療するために、CD19以外のB細胞リンパ腫に関連する抗原を標的とするCARTの構造のスクリーニングが切望されている。
【０００４】
CD20はグリコシル化タンパク質で、初めて同定されたB細胞の膜マーカーで、B1と呼ばれ、MS4A遺伝子によってコードされる。CD20分子は4つの膜貫通疎水性領域を有し、そのN末端とC末端のいずれも細胞質の一方の側に位置することで、細胞外で2つのループになり、それぞれ大ループと小ループと呼ばれる。CD20は特異的に95％以上の正常と癌化のB細胞で発現され、これらの細胞は前B細胞およびその後の発育段階にあり、形質細胞に分化するまでCD20がずっと発現される。そのため、CD20は理想のB細胞悪性腫瘍の免疫治療の標的である。
【０００５】
リツキシマブ（Rituximab）（MabTheraR、RituxanR）は初めて米国FDAおよび欧州EMAによって許可された緩慢性リンパ腫を治療するための第一世代のCD20を標的とするキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブはCD20細胞外領域の大ループ構造を認識して結合し、ADCCによる殺傷作用によって腫瘍細胞を殺傷する。しかしながら、リツキシマブの単独で使用する場合の活性が限られてかつ反応の持続時間が短いが、化学治療との併用によって化学治療の効果が顕著に増強する。リツキシマブはリンパ腫の治療に使用され、半数の患者は完全（CR）または部分（PR）の反応がある。
【０００６】
オファツムマブ（Ofatumumab）(ArzerraR)は初めての全ヒト由来のCD20治療性抗体である。リツキシマブと異なり、オファツムマブによって認識されるエピトープはCD20の大ループおよび小ループのそれぞれの一部を含む。同時に、オファツムマブの腫瘍殺傷手段は主に補体に依存する経路によるもので、その次はADCCに依存する腫瘍殺傷作用である。
【０００７】
オビヌツズマブ（Obinutuzumab）(GazyvaroR、GazyvaR)はヒト化された、フコシル化レベルの低下によってFcγRIIIaの親和力が最適化されたII型抗CD20抗体である。オビヌツズマブはCD20細胞外分子の大ループ部分を認識して結合し、主にADCC作用によって腫瘍の殺傷作用を仲介し、同時に、オビヌツズマブとCD20分子の結合は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する作用もある。オビヌツズマブはリツキシマブによる治療で効果のないNHLに対して窒素マスタード類薬物であるベンダムスチン（bendamustine）と併用するIII期臨床試験においてオビヌツズマブとベンダムスチンの併用はベンダムスチンの単独使用よりも無増悪生存期間が1倍長かった（前者は29か月で、後者は14か月であった）。オビヌツズマブはCLLを治療する場合、総奏効率（ORRで、CRとPRを含む）が77.3％に達し、リツキシマブは65.7％であった。
【０００８】
治療性抗体と比べると、細胞免疫治療は顕著な治療効果を有する、新しい腫瘍治療手段で、自己免疫による抗癌の新規な治療方法である。生物技術および生物製剤で患者の体内から採集された免疫細胞を体外で培養および増幅した後、患者の体内に戻す方法で、生体の自己免疫機能を活性化、増強することによって、腫瘍を治療する目的を果たす。当業者は新たな細胞免疫療法の開発に取り込み、細胞免疫療法の効果を向上させ、そしてその副作用を低下させる。近年、上記のような多くの治療性抗体が開発されてきたが、その臨床治療の効果はいずれもCART19と同等のレベルの治療効果に達していない。そのため、CD20を標的とするCART療法の開発は巨大な市場価値および社会的意義がある。
【発明の概要】
【０００９】
CD20を標的とする治療性抗体は親和力、殺傷機序において異なることで、私達は異なる抗体の抗原結合領域のDNA配列を利用してCD20を標的とする一連のキメラ抗原受容体を構築し、これらのキメラ抗原受容体の遺伝子改変T細胞の体外抗腫瘍活性の同定および相違の比較を行い、臨床におけるCAR-TによるCD20陽性の白血病およびリンパ腫の治療に有効で新しい方法および製剤を提供する。
本発明の目的は、CD20を標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用を提供することである。
【００１０】
本発明は、CD20抗原を標的とするキメラ抗原受容体の構造の構築、CD20抗原を標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変T細胞の製造方法およびその活性同定に関する。
【００１１】
本発明の第一の側面では、キメラ抗原受容体(CAR)(配列)であって、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメイン(すなわち、scFv)は配列番号7または9または33で示される抗体の重鎖可変領域、および配列番号11または13または35で示される抗体の軽鎖可変領域を含む受容体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、以下の式で表される。
VH−VL
（ただし、VHは抗体の重鎖可変領域で、VLは抗体の軽鎖可変領域で、「−」は連結ペプチドまたはペプチド結合である。）
もう一つの好適な例において、前記連結ペプチドのアミノ酸配列は配列番号15で示される。
もう一つの好適な例において、VHのアミノ酸配列は配列番号7で示され、かつVLのアミノ酸配列は配列番号11で示される。
もう一つの好適な例において、VHのアミノ酸配列は配列番号9で示され、かつVLのアミノ酸配列は配列番号13で示される。
もう一つの好適な例において、VHのアミノ酸配列は配列番号33で示され、かつVLのアミノ酸配列は配列番号35で示される。
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗原受容体の構造は、以下の式で表される。
L−VH−VL−H−TM−CS−CD3ζ
（ただし、
Lは任意のリーダー配列（Leader sequence、すなわちシグナルペプチド配列）である。
Hはヒンジ領域である。
TMは膜貫通ドメインである。
CSは4-1BBおよび/またはCD28由来の共刺激分子である。
CD3ζはCD3ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
VH、VLおよび「−」はそれぞれ上記の通りである。）
もう一つの好適な例において、Lの配列は配列番号27で示される。
もう一つの好適な例において、Hの配列は配列番号17または19で示される。
もう一つの好適な例において、TMの配列はCD8aの膜貫通領域またはCD28の膜貫通領域を含み、好ましくはTM配列は配列番号21または37で示される。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記CS構造は、CD28-4-1BBで、ここで、CD28はCD28由来の共刺激分子で、4-1BBは4-1BB由来の共刺激分子である。
もう一つの好適な例において、4-1BB由来の共刺激分子の配列は配列番号23で示される。
もう一つの好適な例において、CD28由来の共刺激分子の配列は配列番号39で示される。
もう一つの好適な例において、CD3ζの配列は配列番号25で示される。
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗原受容体の配列は配列番号1、3、5、29、31で示される。
【００１３】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸分子を提供する。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる前記ヒンジ領域をコードする核酸配列を含む：
(a) 配列番号17または19で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b） 配列が配列番号18または20で示されるポリヌクレオチド；
（c） ヌクレオチド配列の配列番号18または20で示される配列との相同性が≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ配列番号17または19で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（d） （a）〜（c）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる前記CD8aの膜貫通領域をコードする核酸配列を含む：
(a) 配列番号21で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b） 配列が配列番号22で示されるポリヌクレオチド；
（c） ヌクレオチド配列の配列番号22で示される配列との相同性が≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ配列番号21で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（d） （a）〜（c）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる前記4-1BB(CD137)の細胞内シグナルドメインをコードする核酸配列を含む：
(a) 配列番号23で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b） 配列が配列番号24で示されるポリヌクレオチド；
（c） ヌクレオチド配列の配列番号24で示される配列との相同性が≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ配列番号23で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（d） （a）〜（c）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる前記CD28の細胞内シグナルドメインをコードする核酸配列を含む：
(a) 配列番号39で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b） 配列が配列番号40で示されるポリヌクレオチド；
（c） ヌクレオチド配列の配列番号40で示される配列との相同性が≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ配列番号39で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（d） （a）〜（c）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる前記CD3ζの細胞内シグナルドメインをコードする核酸配列を含む：
(a) 配列番号25で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b） 配列が配列番号26で示されるポリヌクレオチド；
（c） ヌクレオチド配列の配列番号26で示される配列との相同性が≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ配列番号25で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（d） （a）〜（c）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる核酸配列を含む：
(a) 配列番号1、35、29または31で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b） 配列が配列番号2、4、6、30または32で示されるポリヌクレオチド；
（c） ヌクレオチド配列の配列番号2、4、6、30または32で示される配列との相同性が≧95％（好ましくは≧98％）で、かつ配列番号1、35、29または31で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（d） （a）〜（c）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は単離されたものである。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、さらに、リーダー配列（リーダーシークエンス、シグナル配列）をコードするポリヌクレオチドを含み、前記リーダー配列のアミノ酸配列は配列番号27で示され、好ましくは前記リーダー配列（シグナル配列）をコードするポリヌクレオチドは配列番号28で示される。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子の配列は配列番号2、46、30または32で示される。
【００２０】
本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のベクターを含有するか、あるいは染色体に外来の本発明の第二の側面に記載の核酸分子が組み込まれた宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記細胞は単離された細胞で、および/または前記細胞は遺伝子改変された細胞である。
もう一つの好適な例において、前記細胞は哺乳動物の細胞である。
もう一つの好適な例において、前記細胞はT細胞である。
【００２１】
本発明の第五の側面では、薬学的に許容される担体と、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の細胞とを含有する薬物組成物を提供する。
【００２２】
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の細胞の使用であって、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬物または製剤の製造における使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の自己免疫疾患はB細胞の過剰発現による自己免疫疾患（たとえばエリテマトーデス）である。
もう一つの好適な例において、前記の腫瘍はCD20陽性腫瘍である。
【００２３】
本発明の第七の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に適量の本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の細胞、または本発明の第五の側面に記載の薬物組成物を施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記疾患は腫瘍である。
【００２４】
本発明の第八の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体を発現するCAR-T細胞（CAR修飾T細胞）を製造する方法であって、方法を提供する。
【００２５】
本発明の第二の側面に記載の核酸分子または本発明の第三の側面に記載のベクターをT細胞内に形質導入することによって、前記CAR-T細胞を得る工程を含む、
【００２６】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
図面の説明
【図１】図1は、CD20を標的とするキメラ抗原受容体の構造図である。設計されたCAR構造の各エレメントは図に示すように、示されたエレメントは、リーダー配列、抗原認識配列（オファツムマブ、オビヌツズマブ、リツキシマブ）、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域およびCD3ζシグナル伝達領域を含む。ここで、CAR-T20.14、CAR-T20.13およびCAR-T20.16はそれぞれオファツムマブ、オビヌツズマブおよびリツキシマブ抗体の可変領域に基づいて構築されたCAR構造で、CAR-T20.19およびCAR-20.20はCAR-T20.14のIgG4Hinge-CH2-CH3連結領域におけるL235E-N297Q突然変異の形態で、CAR-T20.20はまた同時にCD28および4-1BBの共刺激シグナル分子コード配列を持つ第三世代のキメラ抗原受容体の構造である。
【図２】図2は、CD20を標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変T細胞への形質導入効率の検出である。プロテインL法によって、7日目（A）および11日目（B）まで培養したCAR-T20s細胞におけるCAR遺伝子によってコードされるタンパク質のT細胞の膜表面における発現レベルを同定した。
【図３】図3は、順に6日目まで培養したNT、CART-20.13、CART-20.14およびCAR-T20.16細胞を1×105個取り、それぞれCD20陽性のRAJIおよびRAMOS腫瘍細胞系、ならびにCD20陰性のMOLT-4腫瘍細胞系と、200μlのGT-551培地において1:1の比率で18h共培養した後、T細胞の膜表面おけるCD137の発現レベル（A）および共培養上清におけるIFNγの分泌レベル(B)を検出した。
【図４】図4は、CART-20による腫瘍細胞のアポトーシスの誘導のレベルの検出である。それぞれCFSEで標識されたCD20陰性（MOLT-4）またはCD20陽性（RAJI，RAMOS）の腫瘍細胞系を1×104個取り、200μlのGT-551培地において図に示す比率でそれぞれ11日目まで培養したNT、CART-20.13、CART-20.14およびCAR-T20.16細胞と4h共培養した後、遠心して細胞の沈殿を収集し、細胞をPBSで2回洗浄した後、Annexin V-APC染色試薬で1:50の比率で100μlの染色液において30min染色し、PBSで1回洗浄した後、フローサイトメトリーによってCFSE陽性細胞におけるAnnexin V陽性細胞の比率を分析した。図に示される結果は、Annexin V陽性細胞の相応する共培養サンプルにおける統計分析結果を示す。
【図５】図5は、オファツムマブ抗体の配列に基づいて構築されたヒンジ領域突然変異のキメラ抗原受容体および第三世代のキメラ抗原受容体の体外活性化能力の同定である。プロテインL法によって、7日目まで培養したCAR-T20.14、CAR-T20.19およびCAR-T20.20におけるCAR遺伝子によってコードされるタンパク質のT細胞の膜表面の発現レベル（A）を検出し、順に7日目まで培養したNT、CART-20.14、CART-20.14およびCAR-T20.16細胞を1×105個取り、それぞれK562、CD19単陽性、CD20単陽性、CD19とCD20双陽性のK562安定導入株細胞、およびRAJI標的細胞と1:1の比率で、200μlのGT-551培地において18h共培養した後、T細胞の膜表面おけるCD137の発現レベル（B）および培養上清におけるIFNγの分泌レベル(C)を検出した。
【図６】図6は、CAR-T20細胞の体内におけるCD20陽性細胞を排除する能力の検出結果を示し、結果から、CAR-T20.19が有効にCD20陽性細胞の体内における増殖を抑制することができることが示された。
【００２８】
具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究することによって、CD20を標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用を得たが、前記キメラ抗原受容体の細胞外抗原結合ドメインは配列番号1で示される抗体の重鎖可変領域および配列番号2で示される抗体の軽鎖可変領域を含む。実験結果から、本発明によって提供されるキメラ抗原受容体が非常に高い腫瘍細胞に対する殺傷能力を示したことがわかる。
【００２９】
CD20を標的とする治療性抗体は親和性力、殺傷機序などにおいて異なり、そして異なる膜貫通ドメイン、細胞内ドメインがキメラ抗原受容体の活性に顕著に影響するため、本発明において、複数の抗CD20抗体の可変領域のアミノ酸配列を使用して異なる膜貫通および細胞内の部分と結合させ、CD20を標的とする一連のキメラ抗原受容体を構築し、そしてこのようなキメラ抗原受容体の初代T細胞における発現を実現し、受容体の発現強度の検出方法を確立し、これらのCAR-T細胞の体外、体内のCD20抗原を認識する能力、およびその体外の殺傷および体内のCD20抗原を持つ悪性腫瘍の排除の活性の違いを同定し、臨床におけるCAR-TによるCD20陽性の白血病およびリンパ腫の治療に有効で新しい方法および製剤を提供する。
【００３０】
キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を提供する。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部を含む。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する有効な応答に必要な細胞表面分子で、抗原受容体またはそのリガンドではない。
【００３１】
CARの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはCARの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、リンカーを導入してもよい。本明細書で用いられるように、用語「リンカー」とは、通常、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインに連結させる作用を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドをいう。リンカーは、0〜300個のアミノ酸、好ましくは2〜100個のアミノ酸、最も好ましくは3〜50個のアミノ酸を含んでもよい。
【００３２】
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明によって提供されるCARの細胞外ドメインはCD20を標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明のCARがT細胞において発現される場合、抗原結合の特異性に基づいて抗原を認識することができる。それが関連抗原に結合すると、腫瘍細胞に影響し、腫瘍細胞が成長せず、死亡するように、またはほかの形で影響され、そして患者の腫瘍負荷が軽減または解消する。抗原結合ドメインは、共刺激分子およびζ鎖から由来する一つまたは複数の細胞内ドメインと融合することが好ましい。好ましくは、抗原結合ドメインは4-1BBシグナル伝達ドメインおよび/またはCD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメインと組み合わせた細胞内ドメインと融合する。
【００３３】
一つの実施形態において、本発明のCD20を標的とするCARは、本発明の特定のシグナル伝達ドメイン(CD8の膜貫通領域、CD137およびCD3ζの細胞内シグナルドメインが直列で繋がったもの)を含む。ほかの形態のCD20を標的とするCARと比較すると、本発明のシグナル伝達ドメインは抗腫瘍活性およびCAR-T細胞の体内持続性を向上させる。
【００３４】
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明によって提供されるキメラ抗原受容体（CAR）のアミノ酸配列は以下の通りである。
CAR-T20.13 (配列番号29)
MALPVTALLL PLALLLHAAR PQVQLVQSGA EVKKPGSSVK VSCKASGYAF SYSWINWVRQ  60
APGQGLEWMG RIFPGDGDTD YNGKFKGRVT ITADKSTSTA YMELSSLRSE DTAVYYCARN  120
VFDGYWLVYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIVMT QTPLSLPVTP GEPASISCRS  180
SKSLLHSNGI TYLYWYLQKP GQSPQLLIYQ MSNLVSGVPD RFSGSGSGTD FTLKISRVEA  240
EDVGVYYCAQ NLELPYTFGG GTKVEIKRTV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK  300
DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV  360
LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL  420
VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM  480
HEALHNHYTQ KSLSLSLGKI YIWAPLAGTC GVLLLSLVIT LYCKRGRKKL LYIFKQPFMR  540
PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCELRVKFS RSADAPAYKQ GQNQLYNELN LGRREEYDVL  600
DKRRGRDPEM GGKPRRKNPQ EGLYNELQKD KMAEAYSEIG MKGERRRGKG HDGLYQGLST  660
ATKDTYDALH MQALPPR  677
【００３５】
CAR-T20.13をコードするDNA配列(配列番号30)は以下の通りである。
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg  60
ccgcaggtgc aattggtgca gtctggcgct gaagttaaga agcctgggag ttcagtgaag  120
gtctcctgca aggcttccgg atacgccttc agctattctt ggatcaattg ggtgcggcag  180
gcgcctggac aagggctcga gtggatggga cggatctttc ccggcgatgg ggatactgac  240
tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg acaaatccac tagcacagcc  300
tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcaagaaat  360
gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca  420
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgatat cgtgatgacc  480
cagactccac tctccctgcc cgtcacccct ggagagcccg ccagcattag ctgcaggtct  540
agcaagagcc tcttgcacag caatggcatc acttatttgt attggtacct gcaaaagcca  600
gggcagtctc cacagctcct gatttatcaa atgtccaacc ttgtctctgg cgtccctgac  660
cggttctccg gctccgggtc aggcactgat ttcacactga aaatcagcag ggtggaggct  720
gaggatgttg gagtttatta ctgcgctcag aatctagaac ttccttacac cttcggcgga  780
gggaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct  840
tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag  900
gacaccctga tgatcagccg gacccccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag  960
gaagatcccg aggtccagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag  1020
accaagccca gagaggaaca gttcaacagc acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg  1080
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagaa tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg  1140
cccagcagca tcgaaaagac catcagcaag gccaagggcc agcctcgcga gccccaggtg  1200
tacaccctgc ctccctccca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg  1260
gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag  1320
aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc  1380
cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg  1440
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgtccct gggcaagatc  1500
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc  1560
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga  1620
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa  1680
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag  1740
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg  1800
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag  1860
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg  1920
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca  1980
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctag  2034
【００３６】
CAR-T20.14 (配列番号1)
MALPVTALLL PLALLLHAAR PEVQLVESGG GLVQPGRSLR LSCAASGFTF NDYAMHWVRQ  60
APGKGLEWVS TISWNSGSIG YADSVKGRFT ISRDNAKKSL YLQMNSLRAE DTALYYCAKD  120
IQYGNYYYGM DVWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSEI VLTQSPATLS LSPGERATLS  180
CRASQSVSSY LAWYQQKPGQ APRLLIYDAS NRATGIPARF SGSGSGTDFT LTISSLEPED  240
FAVYYCQQRS NWPITFGQGT RLEIKESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI  300
SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW  360
LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY  420
PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH  480
NHYTQKSLSL SLGKIYIWAP LAGTCGVLLL SLVITLYCKR GRKKLLYIFK QPFMRPVQTT  540
QEEDGCSCRF PEEEEGGCEL RVKFSRSADA PAYKQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG  600
RDPEMGGKPR RKNPQEGLYN ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT  660
YDALHMQALP PR  672  
【００３７】
CAR-T20.14をコードするDNA配列(配列番号2)は以下の通りである。
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg  60
ccggaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga  120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt aatgattatg ccatgcactg ggtccggcaa  180
gctccaggga agggcctgga gtgggtctca actattagtt ggaatagtgg ttccataggc  240
tatgcggact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaagtccctg  300
tatctgcaaa tgaacagtct gagagctgag gacacggcct tgtattactg tgcaaaagat  360
atacagtacg gcaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc  420
gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaaatt  480
gtgttgacac agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc  540
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccag  600
gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcatccc agccaggttc  660
agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat  720
tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggccga tcaccttcgg ccaagggaca  780
cgactggaga ttaaagagag caagtacgga ccgccctgcc ccccttgccc tgcccccgag  840
ttcctgggcg gacccagcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc  900
agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga tcccgaggtc  960
cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag  1020
gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg  1080
ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcccag cagcatcgaa  1140
aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct cgcgagcccc aggtgtacac cctgcctccc  1200
tcccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac  1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc  1320
acccctcccg tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac  1380
aagagccggt ggcaggaagg caacgtcttt agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac  1440
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tccctgggca agatctacat ctgggcgccc  1500
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg  1560
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact  1620
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg  1680
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc  1740
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc  1800
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat  1860
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc  1920
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc  1980
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctag  2019  
【００３８】
CAR-T20.16 (配列番号3)
MALPVTALLL PLALLLHAAR PQVQLQQPGA ELVKPGASVK MSCKASGYTF TSYNMHWVKQ  60
TPGRGLEWIG AIYPGNGDTS YNQKFKGKAT LTADKSSSTA YMQLSSLTSE DSAVYYCARS  120
TYYGGDWYFN VWGAGTTVTV SAGGGGSGGG GSGGGGSQIV LSQSPAILSA SPGEKVTMTC  180
RASSSVSYIH WFQQKPGSSP KPWIYATSNL ASGVPVRFSG SGSGTSYSLT ISRVEAEDAA  240
TYYCQQWTSN PPTFGGGTKL EIKESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR  300
TPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN  360
GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS  420
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH  480
YTQKSLSLSL GKIYIWAPLA GTCGVLLLSL VITLYCKRGR KKLLYIFKQP FMRPVQTTQE  540
EDGCSCRFPE EEEGGCELRV KFSRSADAPA YKQGQNQLYN ELNLGRREEY DVLDKRRGRD  600
PEMGGKPRRK NPQEGLYNEL QKDKMAEAYS EIGMKGERRR GKGHDGLYQG LSTATKDTYD  660
ALHMQALPPR   670
【００３９】
CAR-T20.16をコードするDNA配列(配列番号4)は以下の通りである。
ATGGCCTTAC CAGTGACCGC CTTGCTCCTG CCGCTGGCCT TGCTGCTCCA CGCCGCCAGG  60
CCGCAGGTGC AGTTGCAACA GCCTGGAGCT GAGTTGGTGA AGCCTGGTGC TTCTGTGAAG  120
ATGTCTTGTA AGGCTTCTGG ATACACATTC ACTTCTTACA ACATGCACTG GGTGAAGCAG  180
ACTCCTGGTA GGGGTTTGGA GTGGATCGGA GCTATCTACC CAGGAAACGG AGACACATCT  240
TACAACCAGA AGTTCAAGGG TAAGGCTACA TTGACTGCTG ACAAGTCTTC ATCTACTGCT  300
TACATGCAAT TGTCTTCTTT GACATCTGAG GACTCTGCAG TTTACTACTG CGCTAGGTCT  360
ACATACTACG GAGGTGACTG GTACTTCAAC GTGTGGGGAG CAGGTACCAC GGTCACTGTC  420
TCTGCAGGTG GAGGTGGATC TGGAGGAGGA GGATCTGGTG GAGGAGGTTC TCAAATTGTT  480
CTCTCCCAGT CTCCAGCAAT CCTGTCAGCT TCTCCTGGAG AGAAGGTGAC TATGACTTGC  540
AGGGCTTCTT CATCTGTTTC TTACATCCAC TGGTTCCAGC AGAAGCCTGG TTCTTCACCT  600
AAGCCTTGGA TCTACGCTAC ATCTAACTTG GCATCTGGAG TGCCTGTGAG GTTCTCTGGT  660
TCTGGTTCAG GTACTTCTTA CTCTTTGACA ATCTCTAGGG TGGAGGCTGA GGACGCTGCT  720
ACTTACTACT GCCAGCAGTG GACATCTAAC CCTCCAACAT TCGGAGGTGG TACTAAGTTG  780
GAGATCAAGG AGAGCAAGTA CGGACCGCCC TGCCCCCCTT GCCCTGCCCC CGAGTTCCTG  840
GGCGGACCCA GCGTGTTCCT GTTCCCCCCC AAGCCCAAGG ACACCCTGAT GATCAGCCGG  900
ACCCCCGAGG TGACCTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG AAGATCCCGA GGTCCAGTTC  960
AATTGGTACG TGGACGGCGT GGAAGTGCAC AACGCCAAGA CCAAGCCCAG AGAGGAACAG  1020
TTCAACAGCA CCTACCGGGT GGTGTCTGTG CTGACCGTGC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC  1080
GGCAAAGAAT ACAAGTGCAA GGTGTCCAAC AAGGGCCTGC CCAGCAGCAT CGAAAAGACC  1140
ATCAGCAAGG CCAAGGGCCA GCCTCGCGAG CCCCAGGTGT ACACCCTGCC TCCCTCCCAG  1200
GAAGAGATGA CCAAGAACCA GGTGTCCCTG ACCTGCCTGG TGAAGGGCTT CTACCCCAGC  1260
GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAACGGC CAGCCTGAGA ACAACTACAA GACCACCCCT  1320
CCCGTGCTGG ACAGCGACGG CAGCTTCTTC CTGTACAGCC GGCTGACCGT GGACAAGAGC  1380
CGGTGGCAGG AAGGCAACGT CTTTAGCTGC AGCGTGATGC ACGAGGCCCT GCACAACCAC  1440
TACACCCAGA AGAGCCTGAG CCTGTCCCTG GGCAAGATCT ACATCTGGGC GCCCTTGGCC  1500
GGGACTTGTG GGGTCCTTCT CCTGTCACTG GTTATCACCC TTTACTGCAA ACGGGGCAGA  1560
AAGAAACTCC TGTATATATT CAAACAACCA TTTATGAGAC CAGTACAAAC TACTCAAGAG  1620
GAAGATGGCT GTAGCTGCCG ATTTCCAGAA GAAGAAGAAG GAGGATGTGA ACTGAGAGTG  1680
AAGTTCAGCA GGAGCGCAGA CGCCCCCGCG TACAAGCAGG GCCAGAACCA GCTCTATAAC  1740
GAGCTCAATC TAGGACGAAG AGAGGAGTAC GATGTTTTGG ACAAGAGACG TGGCCGGGAC  1800
CCTGAGATGG GGGGAAAGCC GAGAAGGAAG AACCCTCAGG AAGGCCTGTA CAATGAACTG  1860
CAGAAAGATA AGATGGCGGA GGCCTACAGT GAGATTGGGA TGAAAGGCGA GCGCCGGAGG  1920
GGCAAGGGGC ACGATGGCCT TTACCAGGGT CTCAGTACAG CCACCAAGGA CACCTACGAC  1980
GCCCTTCACA TGCAGGCCCT GCCCCCTCGC TAG  2013
【００４０】
本発明のもう一つのさらに好適な実施形態において、本発明によって提供されるキメラ抗原受容体（CAR）のアミノ酸配列は以下の通りである。
CAR-T20.19 (配列番号5) 
MALPVTALLL PLALLLHAAR PEVQLVESGG GLVQPGRSLR LSCAASGFTF NDYAMHWVRQ  60
APGKGLEWVS TISWNSGSIG YADSVKGRFT ISRDNAKKSL YLQMNSLRAE DTALYYCAKD  120
IQYGNYYYGM DVWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSEI VLTQSPATLS LSPGERATLS  180
CRASQSVSSY LAWYQQKPGQ APRLLIYDAS NRATGIPARF SGSGSGTDFT LTISSLEPED  240
FAVYYCQQRS NWPITFGQGT RLEIKESKYG PPCPPCPAPE FEGGPSVFLF PPKPKDTLMI  300
SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFQSTYRVV SVLTVLHQDW  360
LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY  420
PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH  480
NHYTQKSLSL SLGKIYIWAP LAGTCGVLLL SLVITLYCKR GRKKLLYIFK QPFMRPVQTT  540
QEEDGCSCRF PEEEEGGCEL RVKFSRSADA PAYKQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG  600
RDPEMGGKPR RKNPQEGLYN ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT  660
YDALHMQALP PR  672
【００４１】
CAR-T20.19をコードするDNA配列(配列番号6)は以下の通りである。
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg  60
ccggaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga  120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt aatgattatg ccatgcactg ggtccggcaa  180
gctccaggga agggcctgga gtgggtctca actattagtt ggaatagtgg ttccataggc  240
tatgcggact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaagtccctg  300
tatctgcaaa tgaacagtct gagagctgag gacacggcct tgtattactg tgcaaaagat  360
atacagtacg gcaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc  420
gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaaatt  480
gtgttgacac agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc  540
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccag  600
gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcatccc agccaggttc  660
agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat  720
tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggccga tcaccttcgg ccaagggaca  780
cgactggaga ttaaagagag caagtacgga ccgccctgcc ccccttgccc tgcccccgag  840
ttcgagggcg gacccagcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc  900
agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga tcccgaggtc  960
cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag  1020
gaacagttcc aaagcaccta ccgggtggtg tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg  1080
ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcccag cagcatcgaa  1140
aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct cgcgagcccc aggtgtacac cctgcctccc  1200
tcccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac  1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc  1320
acccctcccg tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac  1380
aagagccggt ggcaggaagg caacgtcttt agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac  1440
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tccctgggca agatctacat ctgggcgccc  1500
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg  1560
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact  1620
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg  1680
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc  1740
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc  1800
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat  1860
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc  1920
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc  1980
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctag  2019
【００４２】
本発明のもう一つの最も好適な実施形態において、本発明によって提供されるキメラ抗原受容体（CAR）のアミノ酸配列は以下の通りである。
CAR-T20.20 (配列番号31) 
MALPVTALLL PLALLLHAAR PEVQLVESGG GLVQPGRSLR LSCAASGFTF NDYAMHWVRQ  60
APGKGLEWVS TISWNSGSIG YADSVKGRFT ISRDNAKKSL YLQMNSLRAE DTALYYCAKD  120
IQYGNYYYGM DVWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSEI VLTQSPATLS LSPGERATLS  180
CRASQSVSSY LAWYQQKPGQ APRLLIYDAS NRATGIPARF SGSGSGTDFT LTISSLEPED  240
FAVYYCQQRS NWPITFGQGT RLEIKESKYG PPCPPCPAPE FEGGPSVFLF PPKPKDTLMI  300
SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFQSTYRVV SVLTVLHQDW  360
LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY  420
PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH  480
NHYTQKSLSL SLGKFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR  540
PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSKRGRKKLL YIFKQPFMRP VQTTQEEDGC SCRFPEEEEG  600
GCELRVKFSR SADAPAYKQG QNQLYNELNL GRREEYDVLD KRRGRDPEMG GKPRRKNPQE  660
GLYNELQKDK MAEAYSEIGM KGERRRGKGH DGLYQGLSTA TKDTYDALHM QALPPR  716
【００４３】
CAR-T20.20をコードするDNA配列(配列番号32)は以下の通りである。
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg  60
ccggaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga  120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt aatgattatg ccatgcactg ggtccggcaa  180
gctccaggga agggcctgga gtgggtctca actattagtt ggaatagtgg ttccataggc  240
tatgcggact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaagtccctg  300
tatctgcaaa tgaacagtct gagagctgag gacacggcct tgtattactg tgcaaaagat  360
atacagtacg gcaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc  420
gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaaatt  480
gtgttgacac agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc  540
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccag  600
gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcatccc agccaggttc  660
agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat  720
tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggccga tcaccttcgg ccaagggaca  780
cgactggaga ttaaagagag caagtacgga ccgccctgcc ccccttgccc tgcccccgag  840
ttcgagggcg gacccagcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc  900
agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga tcccgaggtc  960
cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag  1020
gaacagttcc aaagcaccta ccgggtggtg tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg  1080
ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcccag cagcatcgaa  1140
aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct cgcgagcccc aggtgtacac cctgcctccc  1200
tcccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac  1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc  1320
acccctcccg tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac  1380
aagagccggt ggcaggaagg caacgtcttt agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac  1440
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tccctgggca agttttgggt gctggtggtg  1500
gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg  1560
gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc  1620
cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat  1680
cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca  1740
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga  1800
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc  1860
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac  1920
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa  1980
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg  2040
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc  2100
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a  2151
【００４４】
抗原結合ドメイン
一つの実施形態において、本発明のCARは抗原結合ドメインと呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。本発明のCARの抗原結合ドメインはCDを標的とする特異的結合エレメントである。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗原結合ドメインは抗CD抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記オファツムマブ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFN DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGSIGY  60
ADSVKGRFTI SRDNAKKSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV  120
SS  122  (配列番号7)
オファツムマブ抗体の重鎖可変領域をコードするDNA配列は以下の通りである。
GAAGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGCAGGTC CCTGAGACTC  60
TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTTAAT GATTATGCCA TGCACTGGGT CCGGCAAGCT  120
CCAGGGAAGG GCCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTAGTTGGA ATAGTGGTTC CATAGGCTAT  180
GCGGACTCTG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA GTCCCTGTAT  240
CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCCTTGT ATTACTGTGC AAAAGATATA  300
CAGTACGGCA ACTACTACTA CGGTATGGAC GTCTGGGGCC AAGGGACCAC GGTCACCGTC  360
TCCTCA  366  (配列番号8)
あるいは、
前記リツキシマブ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA IYPGNGDTSY  60
NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARST YYGGDWYFNV WGAGTTVTVS  120
A  121  (配列番号9)
リツキシマブ抗体の重鎖可変領域をコードするDNA配列は以下の通りである。
CAGGTGCAGT TGCAACAGCC TGGAGCTGAG TTGGTGAAGC CTGGTGCTTC TGTGAAGATG  60
TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT TCTTACAACA TGCACTGGGT GAAGCAGACT  120
CCTGGTAGGG GTTTGGAGTG GATCGGAGCT ATCTACCCAG GAAACGGAGA CACATCTTAC  180
AACCAGAAGT TCAAGGGTAA GGCTACATTG ACTGCTGACA AGTCTTCATC TACTGCTTAC  240
ATGCAATTGT CTTCTTTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTTT ACTACTGCGC TAGGTCTACA  300
TACTACGGAG GTGACTGGTA CTTCAACGTG TGGGGAGCAG GTACCACGGT CACTGTCTCT  360
GCA  363  (配列番号10)
【００４５】
また、本発明で使用されるオビヌツズマブ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGR IFPGDGDTDY  60
NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV FDGYWLVYWG QGTLVTVSS  119 (配列番号33)
オビヌツズマブ抗体の重鎖可変領域をコードするDNA配列は以下の通りである。
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc  60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg  120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac  180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat  240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc  300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca  357
(配列番号34)
【００４６】
もう一つの好適な例において、前記オファツムマブ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA  60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIK  107  (SEQ ID NO.11)
オファツムマブ抗体をコードするDNA配列は以下の通りである。
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC  60
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT  120
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC  180
AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT  240
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGATCAC CTTCGGCCAA  300
GGGACACGAC TGGAGATTAA A  321  (配列番号12)
あるいは、  前記リツキシマブ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG SSPKPWIYAT SNLASGVPVR  60
FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW TSNPPTFGGG TKLEIK  106 (配列番号13)
リツキシマブ抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（VL）をコードするDNA配列は以下の通りである。
CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCAGCTT CTCCTGGAGA GAAGGTGACT  60
ATGACTTGCA GGGCTTCTTC ATCTGTTTCT TACATCCACT GGTTCCAGCA GAAGCCTGGT  120
TCTTCACCTA AGCCTTGGAT CTACGCTACA TCTAACTTGG CATCTGGAGT GCCTGTGAGG  180
TTCTCTGGTT CTGGTTCAGG TACTTCTTAC TCTTTGACAA TCTCTAGGGT GGAGGCTGAG  240
GACGCTGCTA CTTACTACTG CCAGCAGTGG ACATCTAACC CTCCAACATT CGGAGGTGGT  300
ACTAAGTTGG AGATCAAG  318  (配列番号14)
【００４７】
また、本発明で使用されるオビヌツズマブ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSNGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLV  60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP YTFGGGTKVE IKRTV  115 (配列番号35)
オビヌツズマブ抗体の重鎖可変領域をコードするDNA配列は以下の通りである。
gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc  60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg  120
tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc  180
tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggctcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc  240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct  300
tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtg  345 (配列番号36)
本発明の一つの好適な実施の形態において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間のアミノ酸連結配列は以下の通りである。
GGGGSGGGGS GGGGS  15  (配列番号15)
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
GGTGGCGGTG GCTCGGGCGG TGGTGGGTCG GGTGGCGGCG GATCT  45  (配列番号16)
【００４８】
ヒンジ領域と膜貫通領域
ヒンジ領域と膜貫通領域（膜貫通ドメイン）について、CARはCARの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むように設計してもよい。一つの実施形態において、天然のCARにおけるドメインの一つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の例において、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換で修飾することによって、このようなドメインが同様または相異の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けることで、受容体複合体のほかのメンバーとの相互作用を最小限にする。
本発明の一つの好適な実施形態において、ヒンジ領域は以下のアミノ酸配列（IgG4 Hinge-CH2-CH3ヒンジ領域）を含む。
ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY  60
VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK  120
AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL  180
DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK  229 (配列番号17)
【００４９】
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
GAGAGCAAGT ACGGACCGCC CTGCCCCCCT TGCCCTGCCC CCGAGTTCCT GGGCGGACCC  60
AGCGTGTTCC TGTTCCCCCC CAAGCCCAAG GACACCCTGA TGATCAGCCG GACCCCCGAG  120
GTGACCTGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGATCCCG AGGTCCAGTT CAATTGGTAC  180
GTGGACGGCG TGGAAGTGCA CAACGCCAAG ACCAAGCCCA GAGAGGAACA GTTCAACAGC  240
ACCTACCGGG TGGTGTCTGT GCTGACCGTG CTGCACCAGG ACTGGCTGAA CGGCAAAGAA  300
TACAAGTGCA AGGTGTCCAA CAAGGGCCTG CCCAGCAGCA TCGAAAAGAC CATCAGCAAG  360
GCCAAGGGCC AGCCTCGCGA GCCCCAGGTG TACACCCTGC CTCCCTCCCA GGAAGAGATG  420
ACCAAGAACC AGGTGTCCCT GACCTGCCTG GTGAAGGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC  480
GTGGAGTGGG AGAGCAACGG CCAGCCTGAG AACAACTACA AGACCACCCC TCCCGTGCTG  540
GACAGCGACG GCAGCTTCTT CCTGTACAGC CGGCTGACCG TGGACAAGAG CCGGTGGCAG  600
GAAGGCAACG TCTTTAGCTG CAGCGTGATG CACGAGGCCC TGCACAACCA CTACACCCAG  660
AAGAGCCTGA GCCTGTCCCT GGGCAAG  687 (配列番号18)
あるいは、前記ヒンジ領域は以下のアミノ酸配列（IgG4 Hinge-CH2-CH3(L235E，N297Q)）を含む。
ESKYGPPCPP CPAPEFEGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY  60
VDGVEVHNAK TKPREEQFQS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK  120
AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL  180
DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK  229  (配列番号19)
【００５０】
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
GAGAGCAAGT ACGGACCGCC CTGCCCCCCT TGCCCTGCCC CCGAGTTCGA GGGCGGACCC  60
AGCGTGTTCC TGTTCCCCCC CAAGCCCAAG GACACCCTGA TGATCAGCCG GACCCCCGAG  120
GTGACCTGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGATCCCG AGGTCCAGTT CAATTGGTAC  180
GTGGACGGCG TGGAAGTGCA CAACGCCAAG ACCAAGCCCA GAGAGGAACA GTTCCAAAGC  240
ACCTACCGGG TGGTGTCTGT GCTGACCGTG CTGCACCAGG ACTGGCTGAA CGGCAAAGAA  300
TACAAGTGCA AGGTGTCCAA CAAGGGCCTG CCCAGCAGCA TCGAAAAGAC CATCAGCAAG  360
GCCAAGGGCC AGCCTCGCGA GCCCCAGGTG TACACCCTGC CTCCCTCCCA GGAAGAGATG  420
ACCAAGAACC AGGTGTCCCT GACCTGCCTG GTGAAGGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC  480
GTGGAGTGGG AGAGCAACGG CCAGCCTGAG AACAACTACA AGACCACCCC TCCCGTGCTG  540
GACAGCGACG GCAGCTTCTT CCTGTACAGC CGGCTGACCG TGGACAAGAG CCGGTGGCAG  600
GAAGGCAACG TCTTTAGCTG CAGCGTGATG CACGAGGCCC TGCACAACCA CTACACCCAG  660
AAGAGCCTGA GCCTGTCCCT GGGCAAG  687   (配列番号20)。
【００５１】
本発明の一つの好適な実施形態において、CD8由来の膜貫通領域（CD8TM）のアミノ酸配列は以下の通りである。
IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYC  24  (配列番号21)
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
ATCTACATCT GGGCGCCCTT GGCCGGGACT TGTGGGGTCC TTCTCCTGTC ACTGGTTATC  60
ACCCTTTACT GC  72   (配列番号22)
本発明の一つの好適な実施形態において、CD28由来の膜貫通領域（CD28TM）のアミノ酸配列は以下の通りである。
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV  27 (配列番号37)
CD28由来の膜貫通領域（CD28TM）をコードするDNA配列は以下の通りである。
TTTTGGGTGC TGGTGGTGGT TGGTGGAGTC CTGGCTTGCT ATAGCTTGCT AGTAACAGTG  60
GCCTTTATTA TTTTCTGGGT G  81 (配列番号38)
【００５２】
細胞内ドメイン
本発明のCARにおける細胞内ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含む。
好ましくは、4-1BBのシグナル伝達ドメインは以下のアミノ酸配列を含む。
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL  42  (配列番号23)
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
AAACGGGGCA GAAAGAAACT CCTGTATATA TTCAAACAAC CATTTATGAG ACCAGTACAA  60
ACTACTCAAG AGGAAGATGG CTGTAGCTGC CGATTTCCAG AAGAAGAAGA AGGAGGATGT  120
GAACTG  126   (配列番号24)
好ましくは、CD28由来の細胞内シグナル伝達ドメインは以下のアミノ酸配列を含む。
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S  41 (配列番号39)
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
AGGAGTAAGA GGAGCAGGCT CCTGCACAGT GACTACATGA ACATGACTCC CCGCCGCCCC  60
GGGCCCACCC GCAAGCATTA CCAGCCCTAT GCCCCACCAC GCGACTTCGC AGCCTATCGC  120
TCC  123  (配列番号40)
【００５３】
好ましくは、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインは以下のアミノ酸配列を含む。
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPQ RRKNPQEGLY  60
NELQKDKMAE AYSEIGMKGE RRRGKGHDGL YQGLSTATKD TYDALHMQAL PPR  113  (配列番号25)
それをコードするDNA配列は以下の通りである。
AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGACGCC CCCGCGTACA AGCAGGGCCA GAACCAGCTC  60
TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC  120
CGGGACCCTG AGATGGGGGG AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT  180
GAACTGCAGA AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC  240
CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC CAAGGACACC  300
TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGC  336  (配列番号26)
【００５４】
ベクター
また、本発明は、本発明のCAR配列をコードするDNA構築体を提供する。
所期の分子をコードする核酸配列は本分野で既知の組み換え方法、たとえば遺伝子を発現する細胞においてライブラリーをスクリーニングすること、既知の当該遺伝子を含むベクターから当該ベクターを得ること、あるいは標準の技術で当該遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによって得ることができる。必要により、興味のある遺伝子は合成によって生産することもできる。
【００５５】
また、本発明は本発明のDNA構築体が挿入されたベクターを提供する。レトロウイルス、たとえばレンチウイルス由来のベクターは、導入された遺伝子の長期間で、安定した組み込みおよびその子細胞における増殖を可能にするため、長期間の遺伝子の移動を実現させる適切な道具である。レンチウイルスは、増殖しない細胞、たとえば肝細胞に導入することができるため、発癌性レトロウイルス、たとえばマウス白血病ウイルスのベクターを超える利点を持つ。また、低免疫原性という利点もある。
【００５６】
つまり、通常、操作可能にCARポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに連結し、そして構築体を発現ベクターに組み込むことによって、CARをコードする天然または合成の核酸の発現を実現する。当該ベクターは、真核細胞の複製および組み込みに適する。典型的なクローニングベクターは、所期の核酸配列の発現を調節するのに使用できる転写と翻訳のターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
【００５７】
本発明の発現構築体は標準の遺伝子送達プロトコールによって、核酸免疫および遺伝子療法に使用することもできる。遺伝子送達の方法は、本分野では既知である。たとえば、米国特許番号5,399,346、5,580,859、5,589,466を参照し、ここで引用によって全文を取り込む。もう一つの実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
【００５８】
当該核酸は様々な種類のベクターにクローニンすることができる。たとえば、当該核酸がクローニングできるベクターは、プラスミド、ファージ、ファージ誘導体、動物ウイルスやコスミドを含むが、これらに限定されない。特定の興味のあるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
【００５９】
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態によって細胞に提供することができる。ウイルスベクターの技術は本分野公知のもので、そしてたとえばSambrookら(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)およびほかのウイルス学と分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして使用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスやレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。通常、適切なベクターは少なくとも1種類の有機体において作用する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素切断部位および1つまたは複数の選択できるマーカーを含む(たとえば、WO01/96584、WO01/29058および米国特許番号6,326,193)。
【００６０】
すでに多くのウイルスに基づいたシステムが開発され、哺乳動物細胞への遺伝子の導入に使用されている。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットホームを提供する。本分野で既知の技術によって選択された遺伝子をベクターに挿入してレトロウイルス顆粒にパッケージングすることができる。当該組み換えウイルスは、さらに分離されて体内または体外の対象細胞に送達される。多くのレトロウイルスシステムは本分野では既知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターは本分野では既知である。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
【００６１】
付加のプロモーターエレメント、たとえばエンハンサーは転写が開始する頻度を調節することができる。通常、これらは開始点の上流の30〜110 bpの領域に位置するが、最近、多くのプロモーターは開始点の下流の機能エレメントも含むことが明らかになった。プロモーターエレメントの間の間隔は、エレメントが別のエレメントに対して逆さまになったか、移動した場合、プロモーターの機能が維持できるように、可動性のものが多い。チミジンキナーゼ（tk）プロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が低下することなく、50 bpまで増加することができる。プロモーターによって、単一のエレメントは共同にまたは独立に作用し、転写を開始させる。
【００６２】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列である。当該プロモーター配列は操作可能にそれに連結した任意のポリヌクレオチド配列を高レベルで発現させることができる強力な構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターのもう一例は、伸長因子1α（EF-1α）である。しかし、ほかの構成型プロモーター配列を使用してもよく、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）長鎖末端反復（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されず、ヒト遺伝子プロモーターは、たとえばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーターやクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は構成型プロモーターの使用に限定されない。誘導型プロモーターも本発明の一部として考えられる。誘導型プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、それによって、そのような発現が必要な場合、操作可能に誘導型プロモーターに連結したポリヌクレオチド配列の発現を開始させ、あるいは発現が必要ではない場合、発現を終止させることができる。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターやテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
CARポリペプチドまたはその一部の発現を評価するため、細胞に導入された発現ベクターは選択できるマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のうちの任意の一方または両方を含むようにすることによって、ウイルスベクターで形質導入または感染された細胞群から発現細胞を同定および選択することもできる。また、選択できるマーカーは単独のDNA断片に載せて共形質移入のプロセスに使用することができる。選択できるマーカー遺伝子およびレポーター遺伝子の両者の隣接する領域には、いずれも適切な調節配列を有することによって、宿主細胞において発現できるようにしてもよい。有用な選択できるマーカーは、たとえば抗生物質耐性遺伝子、たとえばneoなどを含む。
【００６４】
レポーター遺伝子は形質導入された可能性のある細胞の同定および調節配列の機能性の評価に使用される。通常、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織に存在しないか、レシピエントの有機体または組織によって発現され、そしてその発現が容易に検出できる性質、たとえば酵素活性によって明確に示すことができるポリペプチドをコードする遺伝子である。DNAがすでにレシピエントの細胞に導入されると、レポーター遺伝子の発現は適切な時間で測定される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素、分泌型アルカリホスファターゼや緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む（たとえば、Ui-Teiら，2000FEBS Letters479:79-82）。適切な発現系は公知で、かつ既知の技術によって製造するか、市販品として入手することができる。通常、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、少なくとも5つのフランキング領域を有する構築体はプロモーターと同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、かつ試薬のプロモーターを調節して転写を活性化させる能力の評価に使用することができる。
【００６５】
遺伝子を細胞に導入する方法および細胞において遺伝子を発現させる方法は、本分野では既知である。発現ベクターの内容において、ベクターは本分野における任意の方法によって宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母や昆虫の細胞に容易に導入することができる。たとえば、発現ベクターは物理、化学または生物学の手段によって宿主細胞に導入することができる。
【００６６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび/または外来核酸を含む細胞を生産する方法は本分野では公知である。たとえば、Sambrookら(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)を参照する。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好適な方法は、リン酸カルシウム形質導入である。
【００６７】
興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、DNAおよびRNAベクターを使用する方法を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、すでに最も幅広く使用される、遺伝子を哺乳動物、たとえばヒト細胞に挿入する方法になっている。ほかのウイルスベクターはレンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスなどからのものでもよい。例えば、米国特許番号5,350,674および5,585,362を参照する。
【００６８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、コロイド分散系、たとえば大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、やリポソームを含む脂質に基づいた系を含む。体外および体内の送達担体（delivery vehicle）として使用される例示的なコロイド系はリポソーム（たとえば、人工膜小胞）である。
【００６９】
非ウイルス送達系を使用する場合、例示的な送達担体はリポソームである。脂質製剤を使用し、核酸を宿主細胞に導入することが考えられる（体外、エクスビボ（ex vivo）または体内）。また、当該核酸は脂質と関連してもよい。脂質と関連した核酸は、リポソームの水性の内部に封入し、リポソームの脂質二重層に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者に連結する連結分子を介してリポソームに接着し、リポソームに取り込まれ、リポソームと複合体化し、脂質を含む溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と配合し、懸濁液として脂質に含まれ、ミセルに含まれるか、ミセルと複合体化し、あるいはほかの形態で脂質と結合することができる。組成物と関連する脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクターは溶液における具体的な構造のいずれにも限定されない。たとえば、二重層の構造において、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。簡単に溶液に分散し、大きさや形状が異なる集合体を形成してもよい。脂質は脂肪物質で、天然の脂質でも合成の脂質でもよい。たとえば、脂質は細胞質で自然に発生する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、たとえば脂肪酸、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類やアルデヒド類のような化合物を含む。
非ウイルス送達系を使用する場合、たとえば遺伝子編集技術、たとえばCRISPR-Cas9、ZFNやTALENによって本発明を完成させる。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００７０】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記DNA構築体は、さらに、シグナルペプチドをコードする配列を含む。好ましくは、前記シグナルペプチド配列は前記抗原結合ドメインの核酸配列の上流に連結している。好ましくは、前記シグナルペプチドはヒト由来CD8aシグナルペプチドである。
好ましくは、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
CD8リーダー配列（CD8 Leader sequence）のアミノ酸配列：
MALPVTALLL PLALLLHAAR P  21  (配列番号27)
CD8リーダー配列（CD8 Leader sequence）をコードするDNA配列：
ATGGCCTTAC CAGTGACCGC CTTGCTCCTG CCGCTGGCCT TGCTGCTCCA CGCCGCCAGG  60
CCG  63 （配列番号28）
【００７１】
治療的使用
本発明は、本発明のCARをコードするレンチウイルスベクター（LV）で形質導入された細胞（たとえば、T細胞）を含む。形質導入されたT細胞はCARによるT細胞の応答を引き起こすことができる。
【００７２】
そのため、本発明は、哺乳動物の標的細胞群または組織に対するT細胞による免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に本発明のCARを発現するT細胞を施用する工程を含む方法も提供する。
【００７３】
一つの実施形態において、本発明は、T細胞が本発明のCARを発現するように遺伝子修飾され、かつCAR-T細胞がそれが必要なレシピエントに注入される、細胞療法を含む。注入される細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺滅することができる。抗体療法と異なり、CAR-T細胞は体内で複製可能で、持続的に腫瘍を抑える長期間の持久性が生じる。
【００７４】
一つの実施形態において、本発明のCAR-T細胞は安定した体内におけるT細胞の増殖を経て延長した時間で持続することができる。また、CARによる免疫応答は養子免疫療法の工程の一部でもよく、ここで、CAR修飾T細胞はCARにおける高原結合ドメインに特異的な免疫応答を誘導する。たとえば、抗CD20のCAR-T細胞はCD20を発現する細胞に抵抗する特異的な免疫応答を引き起こす。
【００７５】
本明細書で公開されたデータは、具体的に抗CD20scFv、ヒンジおよび膜貫通領域、および4-1BBとCD3ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを公開したが、本発明は構築体の各構成部分の任意の数の変化を含むと解釈されるべきである。
【００７６】
治療できる適応症は、CD20陽性腫瘍および過剰なB細胞による疾患（たとえば自己免疫疾患、たとえばエリテマトーデス）を含む。CD20陽性腫瘍は、CD20陽性の非固形腫瘍（たとえば血液腫瘍、たとえば白血病やリンパ腫）または固形腫瘍を含む。本発明のCARで治療する腫瘍または癌の種類は、癌、胚細胞腫瘍や肉腫、および一部の白血病やリンパ性悪性腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、および悪性腫瘍、たとえば肉腫、癌やメラノーマを含むが、これらに限定されない。成人腫瘍/癌および児童腫瘍/癌も含む。
【００７７】
血液癌は血液または骨髄の癌である。血液(または血液原性)癌の例は、白血病を含み、それに急性白血病(たとえば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球型、単核球性や赤白血病)、慢性白血病(たとえば慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髓性白血病や慢性リンパ性白血病)、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫(無痛および重症の場合)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、H鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病や脊髄形成異常が含まれる。
【００７８】
固形腫瘍は、通常、嚢腫や液体領域の組織の腫瘤を含まない。固形腫瘍は良性でも悪性でもよい。異なる種類の固形腫瘍はこれらを形成する細胞の種類によって命名される（たとえば肉腫、癌やリンパ腫）。固形腫瘍は、たとえば肉腫および癌の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、卵巣癌を含む。
本発明のCAR修飾T細胞は哺乳動物に対する体外免疫および/または体内療法のワクチンとしても有用である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７９】
体外免疫について、i)細胞の増殖、ii)CARをコードする核酸の細胞への導入、および/またはiii)細胞の凍結保存のうちの少なくとも一つが細胞を哺乳動物に施用する前に体外で行われる。
【００８０】
体外プロトコールは本分野では公知で、そして後記でより完全に検討される。簡単に言えば、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離して本明細書で公開されるCARを発現するベクターで遺伝子修飾を行う（すなわち、体外形質転換または形質導入）。CAR修飾細胞は哺乳動物のレシピエントに施用し、治療の有益な効果を提供することができる。哺乳動物のレシピエントはヒトでもよく、そしてCAR修飾細胞はレシピエント自身の細胞でもよい。必要により、細胞はレシピエントに対して同種異系、同系（syngeneic）または異種でもよい。
体外免疫について細胞に基づいたワクチン以外、本発明は、体内免疫によって患者における抗原に対する免疫応答を引き起こす組成物および方法も提供する。
【００８１】
通常、本明細書に記載のように活性化および増殖した細胞は免疫応答のない個体に生じる疾患を治療および予防するために使用することができる。特に、本発明のCAR修飾T細胞はCCLを治療するために使用することができる。一部の実施形態において、本発明の細胞はCCLが発症する恐れがある患者を治療するために使用される。そのため、本発明は、CCLを治療または予防する方法であって、それが必要な対象に治療有効量の本発明のCAR修飾T細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
【００８２】
本発明のCAR修飾T細胞は単独で、または薬物組成物として希釈剤および/またはほかの成分、たとえばIL-2、IL-17やほかのサイトカインまたは細胞群と合わせて施用することができる。簡単に言えば、本発明の薬物組成物は、生合成薬、たとえばモノクローナル抗体、小分子薬物を含み、一つまたは複数の薬学または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせてもよい。このような組成物は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばEDTAやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。
【００８３】
本発明の薬物組成物は、治療（または予防）が必要な疾患に適する形態によって施用することができる。施用の数量および頻度は、患者の病床、および患者の疾患の種類と重篤度のような要素によって決まるが、適切な投与量は臨床試験によって決定する。
【００８４】
「免疫学的な有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」と記載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、医師によって決められる。通常、本明細書に記載のT細胞を含む薬物組成物は、104〜109個細胞/kg体重の投与量、好ましくは105〜106個細胞/kg体重の投与量（これらの範囲内におけるすべての整数値を含む）で施用することができる。T細胞の組成物はこれらの投与量で数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術(たとえばRosenbergら，NewEng.J. of Med.319:1676，1988)によって施用することができる。具体的な患者対する最適な投与量および治療プランは、患者の疾患の所見をモニタリングしてそれに基づいて調整して治療することができ、医学分野の技術者によって容易に決めることができる。
【００８５】
対象への組成物の施用は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内、静脈内（i.v.）注射または腹膜内で患者に施用されてもよい。一つの実施形態において、本発明のT細胞の組成物は皮内または皮下注射によって患者に施用される。もう一つの実施形態において、本発明のT細胞の組成物はi.v.注射によって施用することが好ましい。T細胞の組成物は直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入してもよい。
【００８６】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかのT細胞を治療的レベルに増殖させる方法によって活性化および増殖した細胞を使用し、任意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン-2、アザシチジン（ARA-Cとして知られる）のような試薬で治療するもの、あるいはMS患者に対するナタリズマブによる治療または乾癬患者に対するエファリズマブによる治療またはPML患者に対するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のT細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンA、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルやFK506、抗体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（XRT）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増殖した細胞は外科手術前または外科手術後に施用される。
【００８７】
患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピエントによって変わる。ヒトへ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって実施することができる。通常、1回の治療または1回の治療クールに、1×106個〜1×1010個の本発明の修飾されたT細胞（たとえば、CAR-T20細胞）を、たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。
【００８８】
本発明の利点は以下の通りである。
(1)本発明のキメラ抗原受容体は、細胞外抗原結合ドメインが特定の抗CD20 scFvで、当該特定の抗CD20 scFvは特定のヒンジ領域および細胞内ドメインと結合してなるCARは非常に強力な腫瘍細胞に対する殺傷能力を示し、しかも細胞毒性が小さく、副作用が低い。
(2)本発明にによって提供されるキメラ抗原受容体はCAR遺伝子を担持するレンチウイルスでT細胞を感染させた後、CARタンパク質の安定した発現および膜局在化を実現することができる。
(3)本発明のCAR修飾T細胞は体内で生存期間が長く、かつ抗腫瘍効果が強く、IgG4 Hinge-CH2-CH3連結領域を最適化したCARは、Fc受容体の結合およびその後のADCC作用（抗体依存性細胞傷害作用）を避けることができる。
【００８９】
実施例1  レンチウイルス発現ベクターの構築
コードプラスミドは、上海博益生物科技有限公司に全長DNAの合成およびクローンの構築を依頼した。各コードプラスミドにおいて、それぞれ異なる抗CD20 scFvコード配列を使用し、クローニングベクターはpWPTレンチウイルスベクターを使用し、クローニング部位はBamH IおよびSal I部位である。具体的な配列の構造は図1に示す。各エレメントのアミノ酸およびヌクレオチドの配列は上記の通りである。
以下の実施例において、効果が比較的に良いCAR-T20.13、CAR-T20.14、CAR-T20.16、CAR-T20.19、CAR-T20.20を例として説明する。
【００９０】
実施例2  CAR-T細胞の製造
（1）健常者の静脉血を採取し、密度勾配遠心法によって単核球を単離した（PBMC）。
（2）0日目に、PBMCを2％ヒト血清アルブミン含有GT-T551細胞培地で培養し、細胞の最終濃度が2×106 細胞/mLになるように調整した。細胞を事前に最終濃度が5μg/mLのCD3モノクローナル抗体（OKT3）および最終濃度が10μg/mLのRetronectin（TAKARA社から購入）でコーティングした細胞培養瓶に接種した。培地に最終濃度が1000 U/mLの組み換えヒトインターロイキン-2（IL-2）を入れ、37℃、飽和湿度、5％ CO2のインキュベーターで培養した。
（3）2日目に、新鮮な培養液、濃縮・精製されたCAR20sレンチウイルス液、プロタミン硫酸塩（12ug/ml）、および最終濃度が1000U/mLのIL-2を入れた。37℃、5％ CO2のインキュベーターで12時間感染させた後、培養液を捨て、新鮮な培地を入れ、37℃、5％ CO2のインキュベーターで培養を続けた。
（4）6日目から、CART20s細胞を取って相応する活性検出試験を行うができた。
本発明において、CD20抗原を標的とするCAR構造で修飾されたT細胞の製造プロセスを改良し、2％ヒト血清アルブミンを添加したGT-551無血清培地で体外でリンパ球を培養した。
【００９１】
実施例3  CAR遺伝子のT細胞ゲノムにおける組み込み率およびそれによってコードされるタンパク質の膜表面における発現レベルの検出
それぞれ0.5×106の実施例2で7日目（図2Aおよび図5A）および11日目(図2B)まで培養したCART-20s細胞のサンプルを取り、プロテインLで染色してフローサイトメーターによってCAR20タンパク質のT細胞の膜表面における発現レベルを分析した。結果から、本研究で設計されたCAR構造は、CAR-T20.13を除いて、いずれもプロテインLを使用してキメラ抗原受容体の相応する修飾されたT細胞の膜表面における局在化が検出されたことが示された。
【００９２】
実施例4  CAR-T20sの体外活性化能力の検出
実施例2で6日目まで培養したCART-20s細胞を使用して標的細胞と共培養した後、CD137の上方調節レベルおよび培養上清におけるIFNγの分泌レベルを検出した。順に6日目まで培養したCART-20細胞を1×105個取り、それぞれCD20陽性のRAJIおよびRAMOS腫瘍細胞系、ならびにCD20陰性のMOLT-4腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍細胞を添加せずに、200μlのGT-551培地において1:1の比率で18h共培養した後、フローサイトメーターによってT細胞の膜表面おけるCD137の発現レベルを（図3A）、ELISA法によって培養上清におけるIFNγの分泌レベルを(図3B)検出した。
図3の結果から、オビヌツズマブに基づいたCARも相応する修飾細胞の発現および膜表面の局在化が実現したが、オファツムマブ配列に基づいたCAR構造はオビヌツズマブおよびリツキシマブを元に構築されたCARよりも優れた体外活性化能力および標的抗原特異性を示したという結論が得られた。 
【００９３】
実施例5  CAR-T20s細胞による腫瘍細胞の早期アポトーシスの誘導活性の検出
実施例2で11日目まで培養したCART-20.13、CART-20.14およびCAR-T20.16細胞を使用し、図4に示す比率でそれぞれ1×104個のCFSEで標識されたCD20陰性（MOLT-4）またはCD20陽性（RAJI，RAMOS）の腫瘍細胞系と、200μlのGT-551培地におい4h共培養し、遠心して細胞の沈殿を収集し、細胞をPBSで2回洗浄した後、Annexin V-APC染色試薬で1:50の比率で100μlの染色液において30min染色し、PBSで1回洗浄した後、フローサイトメトリーによってCFSE陽性細胞におけるAnnexin V陽性細胞の比率を分析した。
図4の結果から、オファツムマブ配列に基づいたCAR構造はオビヌツズマブおよびリツキシマブを元に構築されたCARよりも優れた体外でCD20標的細胞の早期アポトーシスを誘導する能力を示したことがわかる。
【００９４】
実施例6  ヒンジ領域突然変異のキメラ抗原受容体および第三世代のキメラ抗原受容体の体外活性化能力の同定
（1）実施例2における方法によって製造された、7日目まで培養したCAR-T20s細胞を使用し、形質導入率がほぼ同等の条件において（図5A）、それぞれ1×105個の細胞を取ってK562、CD19単陽性、CD20単陽性、CD19とCD20双陽性のK562安定導入株細胞、およびRAJI標的細胞と1:1の比率で、200μlのGT-551培地において18h共培養した後、CD137の上方調節レベル（図5B）および培養上清におけるIFNγの分泌レベル(図5C)を検出した。
（2）図5に示された結果から、感染効率がほぼ同等の場合、ヒンジ領域突然変異のキメラ抗原受容体CAR-T20.19はCAR-T20.14の体外活性化能力（CD137およびIFNg）とほぼ同等であったが、第三世代のCAR構造のCAR-T20.20は第二世代のCAR-T20.14およびCAR-T20.19よりも優れた体外活性化能力を示した（CD137およびIFNg）ことがわかる。
【００９５】
実施例7  CAR-T20細胞の体内におけるCD20陽性細胞を排除する能力の検出
（1）ルシフェラーゼを発現するRaji-Luc 細胞を尾静脉からNCGマウスに注射した(5×105/匹)。接種から1週間後、インビボイメージングによって腫瘍細胞の体内における増殖の状況を観察し、Day 0と記載した。NTおよびCAR-T20.19細胞を尾静脉からDay 0のマウスに注射した(5×106/匹) 。 Day0、Day7、Day14、Day21で、インビボイメージングによってマウス体内における腫瘍細胞の増殖の状況を観察し、蛍光強度の変化およびマウスの体重の変化から分析した。
（2）図6に示される結果から、CAR-T20.19が有効にCD20陽性細胞の体内における増殖を抑制することができることがわかる。
【００９６】
以上、本発明の好適な実施形態を詳しく記述したが、本発明は上記実施形態における具体的な詳細に限定されず、本発明の技術の趣旨の範囲内で、本発明の技術方案に対して様々な簡単な変更ができ、これらの簡単な変更はいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【００９７】
なお、上記具体的な実施形態で記載された各具体的な技術特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な形態で組み合わせることができ、無駄な重複を避けるために、本発明は様々な可能な組み合わせ方を別途で説明しない。
また、本発明の異なる各実施形態の間でも任意に組み合わせることができ、本発明の趣旨に反しない限り、同様に本発明で公開される内容とみなす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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