(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＲ（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子及びｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）遺伝子の発現を同時に抑制する二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ｓｉＲＮＡ分子であって、
（i）配列番号１が配列番号２と部分的に相補的結合をなし、配列番号３が配列番号４と部分的に相補的結合をなし、配列番号５が配列番号６と部分的に相補的結合をなし、配列番号７が配列番号８と部分的に相補的結合をなし、配列番号９が配列番号１０と部分的に相補的結合をなし、配列番号１１が配列番号１２と部分的に相補的結合をなし、配列番号１３が配列番号１４と部分的に相補的結合をなし、配列番号１５が配列番号１６と部分的に相補的結合をなし、配列番号１７が配列番号１８と部分的に相補的結合をなし、配列番号１９が配列番号２０と部分的に相補的結合をなし、配列番号２１が配列番号２２と部分的に相補的結合をなし、配列番号２３が配列番号２４と部分的に相補的結合をなし、又は、配列番号２５が配列番号２６と部分的に相補的結合をなしている二重鎖ｓｉＲＮＡ分子、又は、
（ii）前記（i）の二重鎖ｓｉＲＮＡ分子の各鎖と９０％以上の配列相同性を有するｓｉＲＮＡ分子。
【請求項２】
ＡＲ（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子及びｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）遺伝子の発現を同時に抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であって、
（iii）配列番号１が配列番号２と部分的に相補的結合をなし、配列番号３が配列番号４と部分的に相補的結合をなし、配列番号５が配列番号６と部分的に相補的結合をなし、配列番号７が配列番号８と部分的に相補的結合をなし、配列番号９が配列番号１０と部分的に相補的結合をなし、配列番号１１が配列番号１２と部分的に相補的結合をなし、配列番号１３が配列番号１４と部分的に相補的結合をなし、配列番号１５が配列番号１６と部分的に相補的結合をなし、配列番号１７が配列番号１８と部分的に相補的結合をなし、配列番号１９が配列番号２０と部分的に相補的結合をなし、配列番号２１が配列番号２２と部分的に相補的結合をなし、配列番号２３が配列番号２４と部分的に相補的結合をなし、又は、配列番号２５が配列番号２６と部分的に相補的結合をなして、ヘアピン構造をなすｓｈＲＮＡ分子、又は
（iv）前記（iii）の各配列番号の配列と９０％以上の配列相同性を有するｓｈＲＮＡ分子。
【請求項３】
請求項２に記載のｓｈＲＮＡのＤＮＡ変換配列からなる、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号２９または配列番号３０の塩基配列と９０％以上の配列相同性を有する、請求項２に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換された細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ分子を有効成分として含む、抗がん用薬学的組成物。
【請求項８】
さらなる抗がん剤を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抗がん用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子と、それを含む抗がん用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、全世界的に最も多くの死者を出す疾病の一つであり、革新的ながん治療剤の開発は、これに対する治療時に発生する医療費を節減できると同時に高付加価値を生み出し得る。また、２００８年の統計によれば、既存の抗がん剤耐性を克服できる分子治療剤は、主要７カ国（ＵＳ、Ｊａｐａｎ、Ｆｒａｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｉｔａｌｙ、Ｓｐａｉｎ、ＵＫ）で＄１７．５ｂｉｌｌｉｏｎを占めており、２０１８年の場合、約＄４５ｂｉｌｌｉｏｎ程度のｍａｒｋｅｔ  ｓｉｚｅを占めて、２００８年に対比して９．５％の成長率を示すものと予測されている。がんの治療は、手術、放射線治療、化学療法、生物学的治療に区別されるが、このうち、化学療法は、化学物質でもってがん細胞の増殖を抑制するか消す治療法であり、抗がん剤によって現れる毒性は相当部分正常細胞でも現れるため、一定程度の毒性を示し、抗がん剤が効果を奏しても一定期間の使用後には効果がなくなる耐性が発生するため、がん細胞に選択的に作用し、耐性が生じることのない抗がん剤の開発が切実である（がん征服の現状  Ｂｉｏｗａｖｅ  ２００４．６（１９））。近年、がんに対する分子遺伝情報の確保を通してがんの分子的特性を標的とした新たな抗がん剤の開発が進行しており、がん細胞だけが持っている特徴的な分子的標的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ）を狙う抗がん剤は、薬剤耐性が生じないという報告もある。
【０００３】
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病治療のための治療剤の開発及び標的検証で重要な道具である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」という）は、その役割が見出された以後、様々な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）で配列特異的ｍＲＮＡに作用するという事実が明らかになった（Ｓｉｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ（２００５）８３：７６４７７３）。ＲＮＡｉは、２１−２５個のヌクレオチドの大きさの二重らせん構造を有する小さな干渉リボ核酸短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下「ｓｉＲＮＡ」という）が相補的な配列を有する転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に特異的に結合して該当転写体を分解することで特定タンパク質の発現を抑制する現象である。細胞内では、ＲＮＡ二重鎖がＤｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によりプロセシングされて２１〜２３個の二重鎖（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ、ｂｐ）のｓｉＲＮＡに変換され、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合してガイド（アンチセンス）鎖がターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程を通してターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（ＮＵＣＬＥＩＣ−ＡＣＩＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＣＥＮＴ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２．１，５０３−５１４）。バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究チームによれば、同じターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡがアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＡＳＯ）に比べて生体内／外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れ、該当効果が長く持続される効果を含むものと明らかになった（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２．２９６：１０００−１００４）。ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ技術基盤の治療剤市場は、今後、世界市場規模が２０２０年頃に計１２兆ウォン以上を形成するものと分析され、該当技術を適用できる対象が画期的に拡大されて既存の抗体、化合物基盤の医薬品で治療し難い疾病を治療できる次世代遺伝子治療技術と評価されている。また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的にターゲット遺伝子の発現を調節するため、既存の抗体基盤の医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）が特定のタンパク質標的に最適化されるまで長い間の開発期間及び開発コストが必要とされるのに比べて、適用できる対象が画期的に拡大され得、開発期間が短縮され、かつ医薬化が不可能な標的物質を含むあらゆるタンパク質標的に対して最適化されたリード化合物を開発できるという長所を有する（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６  １３（４）：６６４−６７０）。そこで、近年、このリボ核酸媒介干渉現象が既存の化学合成医薬開発で発生する問題の解決策を提示し、転写体の水準で特定タンパク質の発現を選択的に抑制して各種の疾病治療剤、特に腫瘍治療剤の開発に利用しようとする研究が進行している。また、ｓｉＲＮＡ治療剤は、既存の抗がん剤とは異なり、標的が明確で副作用が予測可能であるという長所があるが、このような標的特異性は、様々な遺伝子の問題により発生する疾病である腫瘍の場合、むしろこのような標的特異性は治療効果が高くない原因となることもある。
【０００４】
アンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＲ）は、アンドロゲンホルモン、テストステロンまたはジヒドロテストステロンのいずれか一つを細胞質に結合させた後、核に転位させることで活性化される核受容体の一種であり（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＬＸＶ．Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ、ｍｉｎｅｒａｌｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ、ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ、ａｎｄ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．５８（４）：７８２−９７．）、主な機能は、遺伝子発現を調節するＤＮＡ結合転写因子である（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．８（１）：１−２８．）。アンドロゲン受容体は、アセチル化を通した翻訳後変形により変形され、これは、ＡＲ媒介転写活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及び前立腺がん細胞の非付着発育（ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ）を直接的に促進すると知られており（Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２３（２３）：８５６３−７５）、前立腺がんの治療標的に重要であると見なされ、タンパク質のＮ末端ドメインを標的とする抑制剤が開発中である。
【０００５】
一方、ｍＴＯＲ（哺乳動物のラパマイシン標的；ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、サイトカイン−刺激細胞増殖、細胞周期のＧ１位相を調節するいくつかの重要タンパク質のためのｍＲＮＡの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）誘導転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を含む、様々な信号転換経路において重要な酵素である。ｍＴＯＲの抑制は、細胞周期のＧ１からＳまでの進行の抑制を引き起こす。ｍＴＯＲ抑制剤は、免疫抑制、抗増殖及び抗がん活性を示すので、このような疾患の治療のためにｍＴＯＲが標的とされている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ、１６：３１７−３２３、２００５）。また、ｍＴＯＲは、自食（ａｕｔｏｐｈａｇｅ）調節に重要な因子であって、自食経路を調節するｍＴＯＲを標的として様々な疾患、例えば、がん、神経変性疾患、心臓疾患、老化、免疫疾患、感染疾患及びクローン病等を治療できる（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：７６７−７７７；Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１０６９−１０７５，２００８）。
【０００６】
現在、細胞質に存在するので既存に多く使用される抗体治療剤では接近が不可であり、また薬物で伝達するにはシステミックな副作用が問題となり得、本発明者らは、局所伝達が可能であり、選択性に優れるので、ＡＲとｍＴＯＲにより展開される癌腫に効果的なｓｉＲＮＡを構成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明においては、ｓｉＲＮＡの標的特異性による治療効果が高くない短所を克服するために、ＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを作製し、その抗がん活性及び抗がん剤とのシナジー的抗がん活性を確認することで、それをがん予防及び治療効果的に利用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的の達成のために、本発明は、ＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子を提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記組換え発現ベクターが導入された形質転換された細胞を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記核酸分子を有効成分として含む、抗がん用薬学的組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記核酸分子を個体に投与するステップを含むがんの予防及び治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子に関し、本願発明の二重鎖ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、がんと関連したＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制するように設計した。本願発明の二重鎖ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、がん細胞の死滅を促進し、抗がん剤との併用処理でがん細胞死滅をシナジー的に向上させる効果があるので、様々な癌腫を効果的に予防及び治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１を含むｓｈＲＮＡを細胞内で発現するためのベクターのマップを示した図である。
【図２ａ】ｈ４６０細胞株で本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１によるＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制効果を確認した図である（ＮＣは対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉＡＲはＡＲに対するｓｉＲＮＡ、ｓｉｍＴＯＲはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＡＴ１は本発明のＡＲ及びｍＴＯＲ二重標的ｓｉＲＮＡセット１）。
【図２ｂ】ｐｃ３細胞株で本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１によるＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制効果を確認した図である（ＮＣは対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉＡＲはＡＲに対するｓｉＲＮＡ、ｓｉｍＴＯＲはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＡＴ１は本発明のＡＲ及びｍＴＯＲ二重標的ｓｉＲＮＡセット１）。
【図３】本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット２−１３によるＡ５４９細胞株でのＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制効果を確認した図である（ＮＣは対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＡＴ２〜ｓｉ−ＡＴ１３は本発明のｓｉＲＮＡセット２〜１３である）。
【図４ａ】ＤＵ１４５細胞株で二重標的ｓｉＲＮＡセット１の抗がん剤の併用処理によるがん細胞死滅効果を確認した図である（ＮＣは対照群ｓｉＲＮＡ、ｎｏ  ｔｒｅａｔは抗がん剤を処理していない群、ｓｉ−ＡＴ１は本発明のＡＲ及びｍＴＯＲ二重標的ｓｉＲＮＡセット１である）。
【図４ｂ】Ｈ４６０細胞株で二重標的ｓｉＲＮＡセット１の抗がん剤の併用処理によるがん細胞死滅効果を確認した図である（ＮＣは対照群ｓｉＲＮＡ、ｎｏ  ｔｒｅａｔは抗がん剤を処理していない群、ｓｉ−ＡＴ１は本発明のＡＲ及びｍＴＯＲ二重標的ｓｉＲＮＡセット１である）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の具現例で本発明を詳細に説明する。ただし、下記具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであり、これによって本発明が制限されることはなく、本発明は、後述の特許請求の範囲の記載及びそれより解釈される均等範疇内で様々な変形及び応用が可能である。
【００１６】
一側面において、本発明は、ＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子に関するものである。
【００１７】
一具現例において、前記核酸分子は、前記核酸分子は、配列番号１及び２；配列番号３及び４；配列番号５及び６；配列番号７及び８；配列番号９及び１０；配列番号１１及び１２；配列番号１３及び１４；配列番号１５及び１６；配列番号１７及び１８；配列番号１９及び２０；配列番号２１及び２２；配列番号２３及び２４；並びに配列番号２５及び２６からなる群から選択された１種以上の塩基配列と８０％以上の配列相同性を有する配列であることを特徴とする核酸分子であってよい。
【００１８】
前記配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【００１９】
一具現例において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５で表示される塩基配列を含む核酸分子は、ＲＮＡ干渉によりＡＲ遺伝子発現を抑制できる。また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６で表示される塩基配列を含む核酸分子は、ＲＮＡ干渉によりｍＴＯＲ遺伝子の発現を抑制でき、本願発明の核酸分子は、ＡＲ遺伝子とｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制できる。
【００２０】
一具現例において、前記核酸分子は、配列番号１は配列番号２と、配列番号３は配列番号４と、配列番号５は配列番号６と、配列番号７は配列番号８と、配列番号９は配列番号１０と、配列番号１１は配列番号１２と、配列番号１３は配列番号１４と、配列番号１５は配列番号１６と、配列番号１７は配列番号１８と、配列番号１９は配列番号２０と、配列番号２１は配列番号２２と、配列番号２３は配列番号２４と、配列番号２５は配列番号２６と、部分的に相補的結合をなしている二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ｓｉＲＮＡであってよい。
【００２１】
本発明の一実施例において、二重標的のｓｉＲＮＡセット１−１３を作製した。具体的に、前記配列番号１及び２からなる２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１は１８ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号３及び４からなる１９ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット２は１７ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号５及び６からなる１８ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット３は１６ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号７及び８からなる１７ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット４は１５ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号９及び１０からなる１９ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット５は１５ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号１１及び１２からなる１８ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット６は１４ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号１３及び１４からなる１７ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット７は１３ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号１５及び１６からなる２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット８は１９ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号１７及び１８からなる２２ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット９は１８ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号１９及び２０からなる２２ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１０は１８ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号２１及び２２からなる２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１１は１７ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号２３及び２４からなる２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１２は１６ｍｅｒが互いに相補的であり、配列番号２５及び２６からなる２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１３は１７ｍｅｒが互いに相補的に作製した。
【００２２】
前記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５のｓｉＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＡＲ）がＡＲのｍＲＮＡに相補的に結合できる。また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のｓｉＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍＴＯＲ）がｍＴＯＲのｍＲＮＡに相補的に結合できる。従って、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１−１３は、ＡＲ及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に減少させることができる。
【００２３】
一具現例において、前記核酸分子は、配列番号１の塩基配列及び配列番号２の塩基配列を含むｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であってよく、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号２９または配列番号３０の塩基配列と８０％以上の配列相同性を有する配列であってよい。
【００２４】
前記配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【００２５】
一具現例において、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列が部分的に相補的結合し、ループ領域により回文的に連結されてヘアピン構造を形成することができ、本願発明の一実施例においては、ヘアピン構造のループ部分塩基配列によってＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧ  ｌｏｏｐ  ｓｈＲＮＡ（配列番号２９）またはＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡ  ｌｏｏｐ  ｓｈＲＮＡ（配列番号３０）と記載した。
【００２６】
本発明において、ＡＲ及びｍＴＯＲを標的とするｓｉＲＮＡは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のＡＲ遺伝子またはｍＴＯＲ遺伝子の一部と相補的な配列を有して、ＡＲ遺伝子またはｍＴＯＲ遺伝子のｍＲＮＡを分解するか、翻訳を抑制できる。
【００２７】
本発明において使用される用語、「発現抑制」とは、標的遺伝子の（ｍＲＮＡへの）発現または（タンパク質への）翻訳低下を引き起こすことを意味し、好ましくは、これにより標的遺伝子発現が探知不可能となるか、無意味な水準で存在するようになることを意味する。
【００２８】
本発明において使用される用語、「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」とは、特定ｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を通してＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象を誘導できる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。一般的に、ｓｉＲＮＡは、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相同である配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、それと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とで構成されるが、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（ＡＲ遺伝子に対するアンチセンス鎖）であり、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（ｍＴＯＲ遺伝子に対するアンチセンス鎖）であるので、二重標的ｓｉＲＮＡセット１−１３がそれぞれ同時にＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を抑制できるため、効率的な遺伝子ノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）方法として、または、遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）の方法として提供される。
【００２９】
前記塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の核酸分子は、それを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、ＡＲ遺伝子及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子の一部の塩基配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により変形されたが、前記核酸分子と機能的に同じ作用ができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。具体的に、前記遺伝子は、配列番号の塩基配列とそれぞれ７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に並んだ配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域でのポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適な並びに対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（即ち、ギャップ）を含むことができる。
【００３０】
一側面において、本発明は、本願発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターに関するものである。
【００３１】
本明細書において用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；ファージミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクター等が含まれ、好ましくはアデノウイルスベクターであるが、これに制限されない。
【００３２】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築され得る。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築され得る。本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合は、転写を進行させることのできる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーター等）、解毒の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解毒終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５α等）が利用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．（１９８４），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４）そしてファージの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５）が調節部位として利用され得る。
【００３３】
一方、本発明に利用され得るベクターは、当業界でたびたび使用されるプラスミド（例：ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９等）、ファージミド（例：ｐＣｏｍｂ３Ｘ）、ファージ（Ｍ１３等）またはウイルス（例：ＳＶ４０等）を操作して作製され得る。
【００３４】
一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞の遺伝体から由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びＨＳＶのＴＫプロモーター）が利用され得、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００３５】
本発明のベクターは、アミノ酸のタンパク質精製を容易にするために、必要に応じて他の配列と融合されてもよく、融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）等が利用され得るが、これに制限されることはない。また、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含むことができ、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００３６】
一具現例において、本発明の組換え発現ベクターは、配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ及び配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡを含むことができ、配列番号２９の塩基配列を含むｓｈＲＮＡまたは配列番号３０の塩基配列の塩基配列を含むｓｈＲＮＡを含むことができる。
【００３７】
本発明の組換えベクターは、当該分野に公知になった組換えＤＮＡ方法により製造され得、一実施例においては、ｐＥ３．１ベクターを利用した。
【００３８】
本発明においてＡＲ及びｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡを伝達するに有用な非ウイルスベクターとしては、通常遺伝子療法に使用される全てのベクターを含み、例えば、真核細胞で発現可能な様々なプラスミド及びリポソーム等がある。
【００３９】
本発明においてＡＲ及びｍＴＯＲを標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡが伝達された細胞で適切に転写されるようにするためには、それを含むｓｈＲＮＡ、特に、配列番号２９の塩基配列または配列番号３０の塩基配列からなるｓｈＲＮＡを少なくともプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。前記プロモーターは、真核細胞で機能し得るプロモーターであればいずれであっても構わないが、配列番号３１に記載したＵ７プロモーターがより好ましい。ＡＲ及びｍＴＯＲを標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの効率的な転写のために、必要に応じてリーダー配列、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサー、上流活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子をはじめとする調節配列をさらに含むこともできる。
【００４０】
本発明においてＡＲ及びｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを伝達するに有用なウイルスまたはウイルスベクターとしては、バキュロビリジアエ（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄｉａｅ）、パルボビリジアエ（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄｉａｅ）、ピコルノビリジアエ（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ）、ヘルペスビリジアエ（ｈｅｒｅｐｅｓｖｉｒｉｄｉａｅ）、ポックスビリジアエ（ｐｏｘｖｉｒｉｄｉａｅ）、アデノビリジアエ（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ）等があるが、これに制限されるものではない。
【００４１】
一側面において、本発明は、本願発明の核酸分子を有効成分として含む、抗がん用薬学的組成物に関するものである。
【００４２】
一具現例において、本発明の抗がん用薬学的組成物は、抗がん剤をさらに含むことができ、前記抗がん剤は、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロナイシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アムプリゲン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシネート、アサリー、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、バチルス・カルメット−グエリン（ＢＣＧ）、ベイカーズアンチホル、β−２−ジオキシチオグアノシン、ビサントレンＨＣｌ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ  ７７３Ｕ８２、ＢＷ  ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ  ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、クロロキノキサリン−スルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウム・パルブム、ＣＰＴ−１１、クリスナトル、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレエート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、デアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンハイドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ジデムニンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エキノマイシン、エダトレキセート、エデルホシン、エフロルニチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エタニダゾール、エチオホス、エトポシド、ファドラゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステライド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５’−フルオロウラシル、Ｆｌｕｏｓｏｌ、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセタミド、ホモハリントニン、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣｌ、イフォスファミド、４−イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミソール、リポソームダウノルビシン、リポソーム捕集ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６−メルカプトプリン、メスナ、バチルス・カルメット−グエリンのメタノール抽出物、メトトレキセート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、ミトマイシン−Ｃ、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、単球／マクロファージコロニー−刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルジノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サル���ラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジン注射、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、塩酸トリフルオペラジン、トリフルリジン、トリメトレキセート、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ  ８６４、ゾルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン及びタキソールからなる群から選択された１種以上であり、好ましくは、タキソール（Ｔａｘｏｌ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）またはエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）であるが、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセットと併用して効果的にシナジー効果が奏され得る目的を達成するためであれば、これに制限されない。
【００４３】
一具現例において、前記がんは、大腸がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部癌腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、胃がん、肺がん、膵臓がん、非小細胞性肺がん、肝がん、食道がん、小腸がん、肛門付近がん、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、膀胱がん、腎がん、輸尿管がん、腎細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、骨がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ；ＣＮＳ）腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、多形性膠芽腫及び脳下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つであってよく、前立腺がんまたは肺がんであることがさらに好ましいが、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセットを利用できるがんの種類であれば、これに制限されない。
【００４４】
本発明において使用された用語「治療」とは、本願発明の核酸を含む組成物の投与でがん細胞の死滅またはがんの症状を好転させるか有益に変更する全ての行為を意味する。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会等で提示された資料を参照して、本願の組成物が効果のある疾患の正確な基準が分かり、改善、向上及び治療された程度を判断できるだろう。
【００４５】
一具現例において、前記薬学的組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液及び噴霧剤を含む群から選択される一つ以上の剤形であってよい。
【００４６】
本発明の組成物の治療的に有効な量は、様々な要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態等によって変わり得る。従って、人体に使用時の投与量は、安全性及び効率性を共に考慮して適量に決定されなければならない。動物実験を通して決定した有効量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．（２００１），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及びＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記述されている。
【００４７】
本発明の組成物はまた生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、組成物を生体内伝達に適したものであれば特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して利用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等、他の通常の添加剤を添加できる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液等のような主利用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらには、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０）に開示されている方法を利用し、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００４８】
本発明の組成物にさらに同一または類似した機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。本発明の組成物は、組成物の総重量に対して前記タンパク質を０．０００１〜１０重量％で、好ましくは０．００１〜１重量％を含む。
【００４９】
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキサイド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール及びタルク等が使用され得る。本発明に係る薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部〜９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）または経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明に係る組成物の１日投与量は、０．０００１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌであり、１日１回〜数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【００５１】
本発明の組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が共に含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤等が含まれる。
【００５２】
本発明の薬学組成物は、がん及びその合併症の予防または治療に利用され得、抗がん補助剤としても使用され得る。
【００５３】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記核酸分子を個体に投与するステップを含むがんの予防及び治療方法を提供する。
【００５４】
本発明の薬学組成物は、治療的有効量または薬学に有効な量で投与する。用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効容量水準は、個体種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定され得る。
【００５５】
下記の実施例を通して本発明をより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであるだけで、これにより本発明が限定されるものではない。
【００５６】
実施例１．二重標的ｓｉＲＮＡの作製
【００５７】
ＡＲ（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を同時に抑制できる二重標的ｓｉＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）セットを下記表１の配列で作製した（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）。
【００５８】
【表１】
0006944584.tif 000002
【００５９】
前記配列番号１及び２からなる２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１は１８ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号３及び４からなる１９ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット２は１７ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号５及び６からなる１８ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット３は１６ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号７及び８からなる１７ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット４は１５ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号９及び１０からなる１９ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット５は１５ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号１１及び１２からなる１８ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット６は１４ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号１３及び１４からなる１７ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット７は１３ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号１５及び１６からなる２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット８は１９ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号１７及び１８からなる２２ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット９は１８ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号１９及び２０からなる２２ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１０は１８ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号２１及び２２からなる２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１１は１７ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号２３及び２４からなる２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１２は１６ｍｅｒが互いに相補的である。配列番号２５及び２６からなる２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡセット１３は１７ｍｅｒが互いに相補的である。
【００６０】
前記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５のｓｉＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＡＲ）がＡＲのｍＲＮＡに相補的に結合する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のｓｉＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍＴＯＲ）がｍＴＯＲのｍＲＮＡに相補的に結合する。従って、本発明のｓｉＲＮＡセット１−１３は、ＡＲ及びｍＴＯＲ遺伝子の発現を同時に減少させる。
【００６１】
実施例２．二重標的ｓｈＲＮＡの作製
【００６２】
前記実施例１で作製した二重標的ｓｉＲＮＡを細胞内で発現できるようにするために、前記二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）のＤＮＡ変換配列（配列番号２７及び２８）とループ配列を含むｓｈＲＮＡ（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧループｓｈＲＮＡ及びＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡループｓｈＲＮＡ）を作製した（表２）。作製したｓｈＲＮＡをそれぞれｐＥ３．１ベクター（図１）の制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＶ切断位置にＵ７プロモーター（配列番号３１）以後にくるように配置して、ＡＲ及びｍＴＯＲを標的とする二重標的ｓｉＲＮＡを含む二種のｓｈＲＮＡを細胞内で発現できる組換え発現ベクターを作製した。
【００６３】
【表２】
0006944584.tif 000003
【００６４】
実験例１．二重標的ｓｉＲＮＡセット１−１３のＡＲ及びｍＴＯＲ遺伝子発現抑制効果の確認
【００６５】
１−１．二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）のＡＲ及びｍＴＯＲ遺伝子発現抑制効果の確認
【００６６】
１２ウェルプレートにＰＣ３細胞株及びｈ４６０細胞株をそれぞれ分注した後、細胞が５０％コンフルエントとなるまで１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）が添加されたＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。その後、前記細胞が培養されたウェルに前記実施例１で作製した二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）を１ウェル当たり８０ｐｍｏｌｅずつ３μｌのリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）でトランスフェクションしてＡＲ及びｍＴＯＲを同時にノックダウンした。併せて、これに対する陽性対照群として下記表３に記載されたＡＲに対するｓｉＲＮＡとｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、細胞を破砕してＧｅｎｅＪＥＴ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で総ＲＮＡを抽出した。抽出した総ＲＮＡを鋳型として使用し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を通してｃＤＮＡに逆転写した後、ｑ−ＰＣＲ反応を通してそれぞれのｓｉＲＮＡと本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）によるＡＲ及びｍＴＯＲのｍＲＮＡ発現量を確認した。ｍＲＮＡ発現量を確認するために、下記表４のプライマーセットと表５の反応混合物を利用して表６のＰＣＲ条件でノックダウンした細胞破砕物でのＡＲ及びｍＴＯＲのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。また、逆転写されたｃＤＮＡを鋳型として利用して、下記表７の組成で反応混合物を準備し、表８の条件でｑＰＣＲを遂行した。参考までに、使用したプローブは、ＡＲ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｈｓ００１７１１７２＿ｍ１）、ｍＴＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｈｓ００２３４５０８＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）であり、ＱＳ３装備を利用して遂行した。全ての反応は、３回ずつ繰り返し遂行され、これらの平均値が取られた。このように得た結果は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ値に対して正規化した。
【００６７】
【表３】
0006944584.tif 000004
【００６８】
【表４】
0006944584.tif 000005
【００６９】
【表５】
0006944584.tif 000006
【００７０】
【表６】
0006944584.tif 000007
【００７１】
【表７】
0006944584.tif 000008
【００７２】
【表８】
0006944584.tif 000009
【００７３】
その結果、ＰＣ３細胞及びｈ４６０細胞株のいずれにおいても本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）によりＡＲ及びｍＴＯＲの発現が全て減少し、減少程度はそれぞれのｓｉＲＮＡによる効果と類似するか、さらに優れるように示された。これを通して、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡが二つの遺伝子の発現を同時に効果的に抑制できることが分かった（図２ａ及び図２ｂ）。
【００７４】
１−２．二重標的ｓｉＲＮＡセット２−１３（ｓｉ−ＡＴ２〜ｓｉ−ＡＴ１３）のＡＲ及びｍＴＯＲ遺伝子発現抑制効果の確認
【００７５】
前記実験例１−１に記載された方法にＡ５４９細胞株を利用してＡＲ及びｍＴＯＲ遺伝子発現抑制効果を確認した。
【００７６】
その結果、Ａ５４９細胞株で本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット２−１３（ｓｉ−ＡＴ２〜ｓｉ−ＡＴ１３）によりＡＲ及びｍＴＯＲの発現が減少し、前記二つの遺伝子の発現を同時に効果的に抑制できることが分かった（図３）。
【００７７】
実験例２．二重標的ｓｉＲＮＡと抗がん剤の併用処理によるがん細胞死滅効果の確認
【００７８】
ＤＵ１４５細胞株及びＨ４６０細胞株を６ウェルプレートにそれぞれ培養した後、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）をそれぞれトランスフェクションした後、４８時間後にシスプラチン５０ｕＭ、エトポシド２０ｕＭまたはタキソール１ｕＭを処理し、１６時間の間インキュベーションした。その後、５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｌｔｄ．）を細胞に処理し、４時間の間インキュベーションした後、培地を除去し、可溶化溶液（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１５０μｌを処理して３７℃で４時間の間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定し、下記数式を利用して細胞生存率を計算した。
【００７９】
【数１】
0006944584.tif 000010
【００８０】
その結果、前立腺がん細胞株であるＤＵ１４５細胞株に対して本発明の二重標的ｓｉＲＮＡが単独でも細胞死滅を誘発し（抗がん剤ｎｏ  ｔｒｅａｔ群）、細胞死滅効果を奏さないシスプラチン処理群でも本発明の二重標的ｓｉＲＮＡが細胞死滅を誘発することが分かった。また、若干の抗がん活性を示したエトポシドとタキソールに対しても本発明の二重標的ｓｉＲＮＡセット１（ｓｉ−ＡＴ１）を併用処理することでＤＵ１４５細胞死滅を顕著に向上させることを確認することができた（図４ａ）。
【００８１】
また、肺がん細胞株であるＨ４６０に対してもＤＵ１４５細胞株と類似するように本発明の二重標的ｓｉＲＮＡ自体が細胞死滅効果を奏し、エトポシドとタキソールと併用処理時、顕著に抗がん活性を示すことが分かった（図４ｂ）。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【配列表】
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