(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
‐ ホルボールミリステートアセテート、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の存在下で、B細胞をフィーダー細胞と共培養する段階
を含む、該B細胞を共培養するための方法であって、
胸腺細胞培養上清もマクロファージ培養上清もT細胞培養上清も該培養に加えない、該方法。
【請求項２】
前記共培養する段階が、
0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
0.5〜5 ng/ml IL-2、
0.1〜1 ng/ml IL-10、および
0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記共培養する段階が、
0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.2 ng/ml IL-1β、
0.2 ng/ml TNFα、
5 ng/ml IL-2、
1 ng/ml IL-10、および
1 ng/ml IL-6
の存在下である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記共培養する段階が、
0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.064 ng/ml IL-1β、
0.064 ng/ml TNFα、
1.6 ng/ml IL-2、
0.32 ng/ml IL-10、および
0.32 ng/ml IL-6
の存在下である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
前記共培養する段階が、
1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.064 ng/ml IL-1β、
0.064 ng/ml TNFα、
1.6 ng/ml IL-2、
0.32 ng/ml IL-10、および
0.32 ng/ml IL-6
の存在下である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記IL-1βが5.5〜14*108 IU/mgの活性を有し、
前記TNFαが2.3〜2.9*108 U/mgの活性を有し、
前記IL-2が6〜7*106 IU/mgの活性を有し、
前記IL-10が6〜7.5*105 IU/mgの活性を有し、かつ
前記IL-6が9.2〜16.1*108 U/mgの活性を有する、
請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィーダー細胞がEL4-B5細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記共培養する段階がさらにSACの存在下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項に記載の共培養方法を含む、抗体を生成するための方法。
【請求項１０】
0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
0.5〜5 ng/ml IL-2、
0.1〜1 ng/ml IL-10、および
0.1〜1 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
【請求項１１】
0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.2 ng/ml IL-1β、
0.2 ng/ml TNFα、
5 ng/ml IL-2、
1 ng/ml IL-10、および
1 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
【請求項１２】
0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.064 ng/ml IL-1β、
0.064 ng/ml TNFα、
1.6 ng/ml IL-2、
0.32 ng/ml IL-10、および
0.32 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
【請求項１３】
1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.064 ng/ml IL-1β、
0.064 ng/ml TNFα、
1.6 ng/ml IL-2、
0.32 ng/ml IL-10、および
0.32 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
【請求項１４】
前記IL-1βが5.5〜14*108 IU/mgの活性を有し、
前記TNFαが2.3〜2.9*108 U/mgの活性を有し、
前記IL-2が6〜7*106 IU/mgの活性を有し、
前記IL-10が6〜7.5*105 IU/mgの活性を有し、かつ
前記IL-6が9.2〜16.1*108 U/mgの活性を有する、
請求項10〜13のいずれか一項に記載のフィーダー混合物。
【請求項１５】
B細胞とフィーダー細胞の共培養における、請求項10〜14のいずれか一項に記載のフィーダー混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
十分に規定された合成フィーダー混合物を適用する、B細胞をフィーダー細胞と共培養するための方法が本明細書において報告される。本方法は、例えば、共培養したB細胞によって分泌されるモノクローナル抗体の少なくとも可変ドメインのアミノ酸配列を得るために、および抗体を生成するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るためには、KoehlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術が広く用いられている。しかし、ハイブリドーマ技術では、免疫化実験動物から採取されたB細胞のごく一部のみが融合および増殖され得るにすぎない。B細胞の供給源は一般的に、免疫化実験動物の脾臓などの臓器である。
【０００３】
Zubler et al.は、1984年に、モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るための異なるアプローチを開発し始めた（例えば、Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183（非特許文献1）を参照されたい）。そこでは、免疫化実験動物の血液からB細胞を採取し、フィーダー混合物を構成するサイトカインの存在下でこれをマウスEL-4 B5フィーダー細胞と共培養する。この方法論では、共培養の10〜12日後に、最大で50 ng/mlまでの抗体を得ることができる。
【０００４】
Kwekkeboom, J. et al. (J. Immunol. Meth. 160 (1993) 117-127（非特許文献2）) は、マウス胸腺腫細胞株によるヒトBリンパ球の活性化に基づいたヒトモノクローナル抗体の作製のための効率的な手順を報告した。彼らは、ヒトB細胞に関して、培養条件は、PMA (5 ng/ml) + 5% T細胞上清の存在下で照射済みEL4B5を伴うべきであることを報告した。
【０００５】
Weitkamp, J-H. et al. (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237（非特許文献3）) は、蛍光ウイルス様粒子を用いて選択された単一の抗原特異的B細胞からの、ロタウイルスに対する組換えヒトモノクローナル抗体の作製を報告している。
【０００６】
Weber, M. et al. (J. Immunol. Meth. 278 (2003) 249-259（非特許文献4）) は、ヒト抗Scl-70自己抗体断片の単離の成功のための、EL4-B5ベースのB細胞刺激とファージディスプレイ技術の組み合わせを報告した。細胞混合物を、10% FCS、3% マクロファージ／T細胞培養上清、非必須アミノ酸、および3 ng/ml ホルボールミリステートアセテートが補充されたRPMI 1640培地中で、37℃でインキュベートした。
【０００７】
複数の同族抗原に対する複数の単離された抗体を生成する方法は、US 2006/0051348（特許文献1）において報告されている。
【０００８】
WO 2008/144763（特許文献2）およびWO 2008/045140（特許文献3）では、IL-6に対する抗体およびその使用、ならびに抗原特異的B細胞のクローン集団を得るための培養法がそれぞれ報告されている。
【０００９】
抗原特異的B細胞のクローン集団を得るための培養法は、US 2007/0269868（特許文献4）において報告されている。
【００１０】
Masri et al. (Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106（非特許文献5）) は、炭疽毒素に対する単一のヒトリンパ球から得られた機能的Fab断片の大腸菌 (E. coli) におけるクローニングおよび発現を報告している。
【００１１】
免疫グロブリンライブラリーを調製するための方法は、WO 2007/ 031550（特許文献5）において報告されている。
【００１２】
WO 2011/147903（特許文献6）において、共培養が、IL-1βと、TNFαと、IL-10と、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4、およびIL-6より選択される1つまたは複数とを含む合成フィーダー混合物の存在下である、単一B細胞培養法が報告されている。
【００１３】
WO 2013/076139（特許文献7）において、CD40L発現哺乳動物細胞およびその使用が報告されている。
【００１４】
WO 2013/092716（特許文献8）において、同起源の抗体可変領域遺伝子セグメントをクローニングおよび発現させるための迅速な方法が報告されている。
【００１５】
US 7,807,415（特許文献9）において、安定した不死化Bリンパ球を生成するための方法が報告されている。EP 0 488 470（特許文献10）において、抗体の生成法が報告されている。
【００１６】
WO 2015/000624（特許文献11）において、ヒツジB細胞とホルボールミリステートアセテート (PMA) の共培養が報告されている。
【００１７】
US 2013/177987（特許文献12）において、抗原特異的抗体産生細胞株およびモノクローナル抗体を発生させるための方法が報告されている。
【００１８】
Tucci, A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784（非特許文献6）により、IL-1β（インターロイキン-1β）、TNF-α（腫瘍壊死因子α）、IL-2（インターロイキン-2）、およびIL-10（インターロイキン-10）からなる合成フィーダー混合物が公知である。
【００１９】
その他の合成サイトカイン混合物が、Bovia, F. et al. (Blood 101 (2003) 1727-1733（非特許文献7）) およびWerner-Favre (Eur. J. Immunol. 31 (2001) 243-249（非特許文献8）) によって報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】US 2006/0051348
【特許文献２】WO 2008/144763
【特許文献３】WO 2008/045140
【特許文献４】US 2007/0269868
【特許文献５】WO 2007/ 031550
【特許文献６】WO 2011/147903
【特許文献７】WO 2013/076139
【特許文献８】WO 2013/092716
【特許文献９】US 7,807,415
【特許文献１０】EP 0 488 470
【特許文献１１】WO 2015/000624
【特許文献１２】US 2013/177987
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Zubler et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183
【非特許文献２】Kwekkeboom, J. et al., J. Immunol. Meth. 160 (1993) 117-127
【非特許文献３】Weitkamp, J-H. et al., J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237
【非特許文献４】Weber, M. et al., J. Immunol. Meth. 278 (2003) 249-259
【非特許文献５】Masri et al., Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106
【非特許文献６】Tucci, A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784
【非特許文献７】Bovia, F. et al., Blood 101 (2003) 1727-1733
【非特許文献８】Werner-Favre, Eur. J. Immunol. 31 (2001) 243-249
【発明の概要】
【００２２】
すべての細胞増殖刺激添加物が、規定されている、例えば合成起源のものである、任意の供給源のものであってよい単一の置かれたB細胞を適切な共培養培地中でフィーダー細胞と共培養するための方法が本明細書において報告される。1つの態様においては、胸腺細胞培養上清もマクロファージ培養上清もT細胞培養上清も培養に加えない。
【００２３】
本発明は少なくとも一部は、ホルボールミリステートアセテート単独、またはホルボールミリステートアセテート (PMA) と規定された（合成）サイトカインおよび規定された（合成）インターロイキンの組み合わせが、B細胞とマウスEL4-B5フィーダー細胞などのフィーダー細胞の共培養において使用される、一般的に用いられる規定されていないマクロファージ／T細胞培養上清に取って代ることができるという知見に基づく。
【００２４】
本発明はさらに、少なくとも一部は、ホルボールミリステートアセテートを規定された（合成）サイトカインおよび規定された（合成）インターロイキンと組み合わせて用いる場合、プラス効果を保証するためには、これらの成分のそれぞれの濃度がある特定の範囲内になくてはならないという知見に基づく。
【００２５】
本明細書において報告される個々の局面は、
(i) 単離されたB細胞またはB細胞クローンが、標的（抗原）に特異的に結合する抗体を産生する、B細胞の集団からのB細胞またはB細胞クローンの単離、
(ii) 単一の置かれたB細胞の共培養、および
(iii) 抗体の生成
のための方法である。
【００２６】
前記方法に付随して、対応する使用もまた包含および開示される。
【００２７】
本明細書において報告される1つの局面は、
‐ ホルボールミリステートアセテート (PMA) の存在下で、1個または複数個のB細胞をフィーダー細胞と共培養する（かつそれによって免疫グロブリンを生成する）段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するため（免疫グロブリンを生成するため）の方法である。
【００２８】
1つの態様において、共培養する段階は1.5〜7.25 ng/ml ホルボールミリステートアセテートの存在下である。
【００２９】
1つの態様において、共培養する段階は胸腺細胞の培養上清 (TSN) の非存在下である。1つの態様において、方法は胸腺細胞の培養上清 (TSN) を加えることを伴わない。
【００３０】
1つの態様において、共培養する段階はさらに、黄色ブドウ球菌株Cowans細胞 (SAC) の存在下である。
【００３１】
本明細書において報告される1つの局面は、
‐ ホルボールミリステートアセテート (PMA)、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の存在下で、1個または複数個のB細胞をフィーダー細胞と共培養する（かつそれによって免疫グロブリンを生成する）段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するため（免疫グロブリンを生成するため）の方法である。
【００３２】
すべての態様は、本明細書において報告されるすべての局面の態様である。
【００３３】
1つの態様において、共培養において使用されるホルボールミリステートアセテート (PMA)、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の量は、重量によって与えられる。
【００３４】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００３５】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００３６】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００３７】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００３８】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００３９】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４０】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４１】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４２】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４３】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４４】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約5 ng/ml（マウス）IL-2、
約1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４５】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４６】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４７】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約0.9 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1 ng/ml（マウス）IL-6
の存在下である。
【００４８】
1つの態様において、共培養において使用されるホルボールミリステートアセテート (PMA) の量は重量によって与えられ、共培養において使用されるIL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の量は（比）活性によって与えられる。
【００４９】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５０】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５１】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５２】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５３】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５４】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５５】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５６】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５７】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５８】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００５９】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００６０】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００６１】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００６２】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約0.9 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【００６３】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、胸腺細胞の培養上清 (TSN) の非存在下である。1つの態様において、方法は胸腺細胞の培養上清 (TSN) を加えることを伴わない。
【００６４】
1つの態様において、フィーダー細胞は（マウス）EL4-B5細胞である。
【００６５】
1つの態様において、共培養する段階はさらに、黄色ブドウ球菌株Cowans細胞 (SAC) の存在下である。
【００６６】
1つの態様において、方法は1個のB細胞の共培養のためのものである。1つの好ましい態様において、1個のB細胞は単一の置かれたB細胞である。
【００６７】
1つの態様において、インキュベートする段階は5〜14日間である。
【００６８】
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される共培養方法を含む、抗体を生成するための方法である。
【００６９】
共培養の結果は、B細胞クローン、すなわち、単一B細胞の子孫であるB細胞の集団である。
【００７０】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、共培養する段階の前に、
- （1〜3種類の）蛍光色素／フルオロフォアで標識されたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階
を含む。
【００７１】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、共培養する段階の前に、
- 異なるB細胞表面抗原にそれぞれが特異的に結合する（2〜4種類の）抗体と接触させたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階であって、各抗体が、異なる蛍光色素にコンジュゲートされている（が、1〜3種類の蛍光色素でのみ標識されている）、段階
を含む。
【００７２】
標識化は、1つの態様において、B細胞集団を（連続してまたは同時に）（2〜4種類の）蛍光標識抗体と接触させることによる。それによって、標識B細胞集団が得られる。蛍光標識抗体の各々は、異なるB細胞表面マーカー／標識に結合する。
【００７３】
置く段階は、標識されたB細胞調製物をフローサイトメーターに導入し、かつ（1〜3種類の）蛍光標識で標識された細胞を単一細胞として置くことによる。セルソーターにおいて細胞を選別するために用いられるより多くの蛍光色素と共に細胞をインキュベートすることが可能であるため、細胞を特定の表面マーカーの存在、および（任意で）同時に他の表面マーカーの非存在について選択することができる。
【００７４】
標識化および単一細胞デポジションは、意図される特徴を有する抗体を産生する可能性が低いB細胞を枯渇させることによりB細胞集団の複雑さを減少させるために行われる。標識抗体は、B細胞の表面上に提示された特定のポリペプチドに結合し、したがって陽性選択標識を提供する。同様に、B細胞と共にインキュベートされた標識抗体の数と比較して、少ない数の蛍光色素でしか標識されない細胞、例えば2種類のうち1種類（すなわち、2種類の蛍光標識抗体とのインキュベーションが行われたが、そのうちの1種類のみがB細胞に結合する）の蛍光標識を有する細胞などを選択することも可能である。B細胞集団の個々のB細胞に対する蛍光標識抗体の結合／非結合に基づき、マイクロ流体選別装置を用いて標的B細胞を同定および分離することが可能である。選別と同時に、標識の量を決定することもできる。
【００７５】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、単一細胞を置くこと／単一細胞デポジションの前に、B細胞の集団を共培養培地中でインキュベートする段階を含む。1つの態様において、インキュベーションする段階は約37℃である。1つの態様において、インキュベーションする段階は0.5〜2時間である。1つの態様において、インキュベーションする段階は約1時間である。1つの好ましい態様において、インキュベーションする段階は約37℃で約1時間である。
【００７６】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、置く段階の後かつ共培養する段階の前に、単一細胞として置かれたB細胞を遠心分離する段階を含む。1つの態様において、遠心分離する段階は約1分〜約30分間である。1つの態様において、遠心分離する段階は約5分間である。1つの態様において、遠心分離する段階は約100×g〜約1,000×gである。1つの態様において、遠心分離する段階は約300×gである。1つの好ましい態様において、遠心分離する段階は約300×gで約5分間である。
【００７７】
1つの態様において、B細胞（クローン）を選択する／得るための方法は、
(a) （任意で、B細胞集団を、2〜4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより）B細胞の集団のB細胞を（1〜3種類の）蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) （1〜3種類の蛍光色素で）標識された（および任意で、他の蛍光色素で標識されていない）B細胞の集団のB細胞を単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と（個々に）共培養する段階、
(f) 段階(e)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階
を含む。
【００７８】
1つの態様において、標的に特異的に結合する抗体を生成するための方法は、
(a) （任意で、B細胞集団を、2〜4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより）B細胞の集団のB細胞を（1〜3種類の）蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) （1〜3種類の蛍光色素で）標識された（および任意で、他の蛍光色素で標識されていない）B細胞の集団のB細胞を単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と（個々に）共培養する段階、
(f) 抗体を分泌する段階(e)のB細胞クローンを選択する段階、
(g) (i) 段階(f)において選択されたB細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る段階、
(ii) B細胞クローンがヒトB細胞クローンではない場合、可変ドメインをヒト化し、各コード核酸を提供する段階、および
(iii) 1つまたは複数の核酸を1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(h) 段階(g)の1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトした細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階
を含む。
【００７９】
1つの態様において、抗体を生成するための方法は、
(a) （任意で、B細胞集団を、2〜4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより）B細胞の集団のB細胞を（1〜3種類の）蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) （1〜3種類の蛍光色素で）標識された（および任意で、他の蛍光色素で標識されていない）B細胞の集団のB細胞を単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と（個々に）共培養する段階、
(f) 個々のB細胞の培養液中に分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
(g) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、B細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る（およびそれによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る）段階、
(h) B細胞が非ヒトB細胞である場合、可変軽鎖および重鎖ドメインをヒト化し、ヒト化可変ドメインをコードする核酸を提供する段階、
(i) モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、（ヒトまたはヒト化）抗体の発現用の1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(j) 発現ベクターを細胞に導入する段階、
(k) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階
を含む。
【００８０】
1つの態様において、B細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る段階は、以下の段階：
- 抗体産生B細胞クローンからの全RNAの抽出、
- 抽出されたポリA+ mRNAの一本鎖cDNA合成／逆転写の実施、
- 1組の種特異的プライマーを用いてPCRの実施、
- 任意で、PCRプライマーの除去／PCR産物の精製、
- 任意で、PCR産物の配列決定
を含む。
【００８１】
1つの態様において、モノクローナル抗体可変軽鎖および／または重鎖可変ドメインをコードする核酸を、（ヒトまたはヒト化）抗体の発現用の発現ベクターに導入する段階は、以下の段階：
- 可変軽鎖および重鎖可変ドメインのT4ポリメラーゼインキュベーション、
- 発現ベクターの線状化および増幅、
- 増幅された発現ベクターのT4ポリメラーゼインキュベーション、
- 増幅された発現ベクター中への、可変ドメインをコードする核酸の配列およびライゲーション非依存的クローニング、ならびに
- ベクターで形質転換された大腸菌細胞のプールからのベクターの調製
を含む。
【００８２】
すべての局面の1つの態様において、方法は、標識する段階の直前に、
- B細胞の集団を、固体表面上に固定化されている（標的）抗原と共にインキュベートし、固定化抗原に結合しているB細胞（のみ）を回収する段階
を含む。
【００８３】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団は非ヒト動物B細胞集団である。1つの態様において、B細胞集団はマウスB細胞集団またはハムスターB細胞集団またはウサギB細胞集団である。1つの好ましい態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団である。
【００８４】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団は、免疫化の4日後に非ヒト動物の血液から採取される。1つの態様において、B細胞の集団は、免疫化の4日後から最長9日後までに非ヒト動物の血液から採取される。
【００８５】
1つの態様において、B細胞集団はヒトB細胞集団である。
【００８６】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団は密度勾配遠心分離によって血液から採取される。
【００８７】
すべての局面の1つの態様において、B細胞は成熟B細胞である。
【００８８】
すべての局面の1つの態様において、単一細胞はマルチウェルプレートのウェル中に（個々に）置かれる。
【００８９】
すべての局面の1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００９０】
すべての局面の1つの態様において、置かれる細胞は1種類または3種類の蛍光色素で標識され、インキュベーションは2〜4種類の蛍光標識抗体を伴う。
【００９１】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団のB細胞の標識化は、（全）B細胞集団の細胞の0.1%〜2.5%の標識化をもたらす。
【００９２】
すべての局面の1つの態様において、標識化はB細胞表面IgGのものである。
【００９３】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗IgM抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面IgMのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面IgMについて陰性の細胞のものである（IgG+IgM--B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００９４】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗軽鎖抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面抗体軽鎖のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面抗体軽鎖について陽性の細胞のものである（IgG+LC+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００９５】
すべての局面の1つの好ましい態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗IgM抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面IgMのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面IgMについて陰性の細胞のものであり（IgG+IgM--B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）、この場合、B細胞の集団は、固体表面上に固定化されている（標的）抗原と共にインキュベートされ、かつ固定化抗原に結合しているB細胞（のみ）が回収されて蛍光標識抗体とのインキュベーションに供される。
【００９６】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD19抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD19のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつまた細胞表面CD19について陽性の細胞のものである（IgG+CD19+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００９７】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD38抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD38のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつまた細胞表面CD38について陽性の細胞のものである（IgG+CD38+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００９８】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面IgGについて陰性でかつ細胞表面CD138について陽性の細胞のものである（IgG-CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００９９】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD268抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD268のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつまた細胞表面CD269について陽性の細胞のものである（IgG+CD268+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１００】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗CD27抗体および蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面CD27および細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面CD27について陽性でかつ細胞表面CD138について陽性の細胞のものである（CD27+CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０１】
すべての局面の1つの態様において、インキュベーションは蛍光標識抗CD3抗体および蛍光標識抗CD27抗体を伴い（標識化は細胞表面CD3および細胞表面CD27のものである）、選択は細胞表面CD3について陰性でかつまた細胞表面CD27について陽性の細胞のものである（CD3-CD19+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０２】
すべてのこれまでの態様の1つの態様において、インキュベーションは加えて蛍光標識抗軽鎖抗体を伴い（標識化は、他の2つの標識に加えて細胞表面抗体軽鎖のものである）、選択は細胞表面抗体軽鎖について陽性の細胞のものである（LC+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０３】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性の細胞のものである（IgG+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０４】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面CD138について陽性の細胞のものである（CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０５】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつまた細胞表面CD138についても陽性の細胞のものである（IgG+CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０６】
すべての局面の1つの好ましい態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗IgM抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面IgMのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面IgMについて陰性の細胞のものである（IgG+IgM--B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０７】
すべてのこれまでの態様の1つの態様において、ウサギB細胞のインキュベーションは加えて蛍光標識抗軽鎖抗体を伴い（標識化は、他の2つの標識に加えて細胞表面抗体軽鎖のものである）、選択は細胞表面抗体軽鎖について陽性の細胞のものである（LC+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０８】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はハムスターB細胞集団であり、インキュベーションは、蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗IgM抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面IgMのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面IgMについて陰性の細胞のものである（IgG+IgM--B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１０９】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はマウスB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性の細胞のものである（IgG+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１１０】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はマウスB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD19抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD19のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつまた細胞表面CD19について陽性の細胞のものである（IgG+CD19+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１１１】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はマウスB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面IgGについて陰性でかつ細胞表面CD138について陽性の細胞のものである（IgG-CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【０１１２】
すべての局面の1つの態様において、共培養する段階は、10% (v/v) FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む1% (w/v) の200 mMグルタミン溶液、2% (v/v) の100 mMピルビン酸ナトリウム溶液、ならびに1% (v/v) の1 M 2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン)-エタンスルホンサン (HEPES) 緩衝液を補充したRPMI 1640培地を含む共培養培地中においてである。1つの態様において、共培養培地は0.05 mM β-メルカプトエタノールをさらに含む。
【０１１３】
1つの態様において、動物は実験動物である。1つの態様において、実験動物はマウス、ハムスター、およびウサギより選択される。1つの態様において、実験動物はウサギである。
【０１１４】
本明細書において報告される1つの局面は、ホルボールミリステートアセテート (PMA)、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6を含む（規定されたおよび／または合成）フィーダー混合物である。
【０１１５】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１１６】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１１７】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１１８】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１１９】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２０】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２１】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２２】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２３】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２４】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5〜5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２５】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.2 ng/ml（マウス）TNFα、
約5 ng/ml（マウス）IL-2、
約1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２６】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２７】
1つの好ましい態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.064 ng/ml（マウス）TNFα、
約1.6 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.32 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.32 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２８】
1つの好ましい態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02 ng/ml（マウス）IL-1β、
約0.02 ng/ml（マウス）TNFα、
約0.5 ng/ml（マウス）IL-2、
約0.1 ng/ml（マウス）IL-10、および
約0.1 ng/ml（マウス）IL-6
を含む。
【０１２９】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３０】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３１】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３２】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３３】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３４】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３５】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３６】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３７】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*05 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３８】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１３９】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１４０】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１４１】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１４２】
1つの態様において、（合成）フィーダー混合物は、
約0.9 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-6
を含む。
【０１４３】
すべての局面の1つの態様において、B細胞はウサギB細胞である。
[本発明1001]
- 1.5〜7.25 ng/ml ホルボールミリステートアセテートの存在下で、単一の置かれたB細胞をフィーダー細胞と共培養する段階
を含む、該B細胞を共培養するための方法であって、
胸腺細胞培養上清もマクロファージ培養上清もT細胞培養上清も該培養に加えない、該方法。
[本発明1002]
‐ ホルボールミリステートアセテート、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の存在下で、B細胞をフィーダー細胞と共培養する段階
を含む、該B細胞を共培養するための方法であって、
胸腺細胞培養上清もマクロファージ培養上清もT細胞培養上清も該培養に加えない、該方法。
[本発明1003]
前記共培養する段階が、
0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
0.5〜5 ng/ml IL-2、
0.1〜1 ng/ml IL-10、および
0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記共培養する段階が、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.2 ng/ml IL-1β、
約0.2 ng/ml TNFα、
約5 ng/ml IL-2、
約1 ng/ml IL-10、および
約1 ng/ml IL-6
の存在下である、本発明1002または1003の方法。
[本発明1005]
前記共培養する段階が、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である、本発明1002または1003の方法。
[本発明1006]
前記共培養する段階が、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である、本発明1002または1003の方法。
[本発明1007]
前記IL-1βが5.5〜14*108 IU/mgの活性を有し、
前記TNFαが2.3〜2.9*108 U/mgの活性を有し、
前記IL-2が6〜7*106 IU/mgの活性を有し、
前記IL-10が6〜7.5*105 IU/mgの活性を有し、かつ
前記IL-6が9.2〜16.1*108 U/mgの活性を有する、
本発明1003〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記フィーダー細胞がEL4-B5細胞である、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記共培養する段階がさらにSACの存在下である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
本発明1001〜1009のいずれかの共培養方法を含む、抗体を生成するための方法。
[本発明1011]
ホルボールミリステートアセテート、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6を含む、フィーダー混合物。
[本発明1012]
0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
0.5〜5 ng/ml IL-2、
0.1〜1 ng/ml IL-10、および
0.1〜1 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
[本発明1013]
0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.2 ng/ml IL-1β、
約0.2 ng/ml TNFα、
約5 ng/ml IL-2、
約1 ng/ml IL-10、および
約1 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
[本発明1014]
0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
[本発明1015]
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
を含む、フィーダー混合物。
[本発明1016]
前記IL-1βが5.5〜14*108 IU/mgの活性を有し、
前記TNFαが2.3〜2.9*108 U/mgの活性を有し、
前記IL-2が6〜7*106 IU/mgの活性を有し、
前記IL-10が6〜7.5*105 IU/mgの活性を有し、かつ
前記IL-6が9.2〜16.1*108 U/mgの活性を有する、
本発明1012〜1015のいずれかのフィーダー混合物。
[本発明1017]
B細胞とフィーダー細胞の共培養における、本発明1011〜1016のいずれかのフィーダー混合物の使用。
【発明を実施するための形態】
【０１４４】
定義
「活性」という用語は、特定のアッセイにおける化合物の生物学的効果を意味する。
【０１４５】
1つの態様において、TNFαの活性は、ML929などの感受性細胞株の培養を伴って、試験試料を力価測定し、続いて染色細胞の形態学的検査により、または予め標識された細胞からの[3H]チミジンの放出の測定により、細胞溶解について観察することで決定される（例えば、Jensen, J.B., et al., Infect. Immun. 55 (1987) 1722-1724；Mannel, D. N., et al., Infect. Immun. 30 (1980) 523-530；Ruff, M. R. and G. E. Gifford, Infect. Immun. 31 (1981) 380-385を参照されたい）。
【０１４６】
1つの態様において、IL-1βの活性は、D10.G4.1マウスヘルパーT細胞を用いる細胞増殖アッセイにおいて決定される；読み取りはD10.G4.1増殖である（例えば、Symons, J.A., et al. (1987) in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach. Clemens, M.J. et al. (Eds): IRL Press, page 272；Orencole, S.F. and Dinarello, C.A., Cytokine 1 (1989) 14-22を参照されたい）。
【０１４７】
1つの態様において、IL-2の活性は、マウス細胞傷害性T細胞株、CTLL-2に対するIL-2の増殖効果として決定される；読み取りは増殖である（例えば、Weston, L., et al., Immunol. Cell Biol. 76 (1998) 190-192；Wadhwa, M., et al., J. Immunol. Meth. 397 (2013) 1-7を参照されたい）。
【０１４８】
1つの態様において、IL-10の活性は、マウスMC/9細胞を用いるIL-4（例えば、5 pg/ml)との共刺激バイオアッセイにおいて決定される；読み取りは増殖である（例えば、Imlach, W., et al., J. Gen. Virol. 83 (2002) 1049-1058；Thompson-Snipes, L., et al., J. Exp. Med. 173 (1991) 507-510を参照されたい）。
【０１４９】
1つの態様において、IL-6の活性は、成長および生存がIL-6依存性であるマウス7TD1細胞株（LPS活性化Bリンパ球とSP2/0-AG14マウス形質細胞腫細胞株との細胞融合に由来するハイブリドーマ；Van Snick, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83 (1986) 9679-9683）を用いて決定される；読み取りは増殖である（例えば、Manfredini, R., et al., Peptides 24 (2003) 1207-1220；Hausherr, A., et al., Oncogene 26 (2000) 4987-4998を参照されたい）。
【０１５０】
本明細書における「抗体」という用語は、天然に存在するそれらの構造変種を含めた、天然に存在する抗体を意味するために用いられる。
【０１５１】
例えば、天然（ヒト、マウス、ラット、ウサギ）IgG抗体は、約150,000ダルトンの分子量を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。天然IgG抗体は、鎖間および鎖内ジスルフィド結合を含む2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖から構成され、結果として4本の鎖はすべて互いに共有結合している。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも称される可変領域 (VH)、続いて3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）を有し、この場合、第1定常ドメインと第2定常ドメインの間には可動性のヒンジ領域が位置している。抗体の重鎖は、それらの配列およびドメイン構造に応じて、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMと称される5つのタイプのうちの1つに割り当てられ得る（抗体の「クラス」）。これらのうちのいくつかはさらに、サブタイプ（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも称される可変領域 (VL)、続いて定常軽鎖定常ドメイン (CL) を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、カッパ (κ) およびラムダ (λ) と称される2つのタイプのうちの1つに割り当てられ得る。
【０１５２】
例えば、天然（ラクダ科の動物、すなわち、ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマを含むラクダ科、ラクダ亜目由来）の重鎖のみの抗体（VHH抗体）は、従来のIgG重鎖において見出される古典的なCH1ドメインを含まず、したがって抗体のヒンジ-CH2-CH3ドメインに直接融合されたVHHドメインとして発現される。例えばラマ由来VHH抗体からの可変領域配列は、ヒトVH3ファミリーの可変ドメインにおける配列に類似している (Schroeder et al., Int. Immunol. 2 (1989) 41-50)。IgGタイプの抗体と比較して、L. ラマVHHドメインにおけるCDR3ドメインアミノ酸配列は、重鎖および軽鎖を含む古典的なIgGタイプ抗体の大部分のCDR3ドメインよりも平均して長い。古典的なIgG抗体と同様に、VHH抗体におけるCDRの位置も、当技術分野で周知の方法によって決定することができる（例えば、US 5,637,677を参照されたい）。残基11、37、44、45、および47は、鎖界面の形成に重要である（例えば、WO 99/42077を参照されたい）。
【０１５３】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体（IgG/VHH＝4本の鎖／2本の鎖）が結合するのと同じ抗原に結合する、インタクトな抗体の一部のみを含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；直線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、scFv）；単一ドメイン抗体；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
「細胞」という用語は、プラスミドの増殖のために用いられる原核細胞、および核酸の発現のために用いられる真核細胞の両方を含む。1つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、任意で、CHO K1細胞（例えば、ATCC CCL-61もしくはDSM ACC 110)、またはCHO DG44細胞（CHO-DHFR[-]、例えばDSM ACC 126としても公知である)、またはCHO XL99細胞、CHO-T 細胞（例えば、Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963を参照されたい)、またはCHO-S細胞、またはSuper-CHO細胞 (Pak, S.C.O., et al. Cytotechnol. 22 (1996) 139-146)、またはBHK細胞、またはNS0細胞、またはSp2/0細胞、またはHEK 293細胞、またはHEK 293 EBNA細胞、またはPER.C6（登録商標）細胞、またはCOS細胞である。これらの細胞が無血清培地中または懸濁液中での増殖に適合しない場合には、本方法における使用の前に適合化を行うことができる。本明細書で用いられる場合、「細胞」という表現は、対象細胞およびその子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、および移行または継代培養の回数に関係なくそれらに由来する培養物を含む。意図的または偶発的な変異のために、すべての子孫のDNA内容物が正確に同一でなくてもよいこともまた理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変種子孫が含まれる。
【０１５５】
「クローン」という用語は、単一のB細胞から生じる／起こる、分裂しかつ抗体を分泌するB細胞の集団を意味する。したがって、B細胞クローンは、B細胞の均一な集団であり、モノクローナル抗体を産生する。
【０１５６】
「実験動物」という用語は、非ヒト動物を意味する。1つの態様において、実験動物は、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ラマ、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、サメ、およびハ虫類より選択される。1つの態様において、実験動物はウサギである。
【０１５７】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、細胞内で起こる転写および/または翻訳ならびに分泌過程を指す。細胞における関心対象の核酸配列の転写レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、関心対象の配列から転写されたmRNAは、qPCRもしくはRT-PCRによって、またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) を参照されたい）。核酸によってコードされるポリペプチドは、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることによって、またはポリペプチドを認識して結合する免疫グロブリンを用いる、ウェスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイなどの、そのような活性に依存しないアッセイを用いることによって、定量することができる（Sambrook, et al., (1989)、前記を参照されたい）。
【０１５８】
当業者にとって、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するため、およびその逆のための手順および方法は周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列、および同様に、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴決定される。
【０１５９】
「発現カセット」は、少なくとも含まれる核酸を細胞において発現させるための、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの必要な調節エレメントを含む構築物を意味する。
【０１６０】
発現は、一過性発現または安定発現のいずれかとして行われ得る。抗体は一般的に、それを産生する細胞によって培養液中に分泌される。したがって、非成熟抗体鎖は、抗体を細胞壁を通って細胞外培地に輸送／分泌するのに必要なN末端伸長（シグナル配列としても公知である）を含む。一般的に、抗体の組換え産生のためのシグナル配列は、分泌型ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来し得る。異種シグナル配列が用いられる場合、それは、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものでなければならない。例えば酵母における分泌の場合、発現されるべき異種遺伝子の天然シグナル配列は、分泌型遺伝子に由来する相同酵母シグナル配列、例えば、酵母インベルターゼシグナル配列、α因子リーダー（サッカロマイセス属 (Saccharomyces)、クリベロマイセス属 (Kluyveromyces)、ピキア属 (Pichia)、およびハンゼヌラ属 (Hansenula) α因子リーダーを含む、2番目のものはUS 5,010,182に記載されている）、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC. アルビカンス (C. albicans) グルコアミラーゼシグナル配列 (EP 0 362 179) などによって置換され得る。哺乳動物細胞では、天然シグナル配列は満足のいくものであるが、同一種または近縁種の他の分泌型ポリペプチドに由来するシグナル配列などの、他の哺乳動物シグナル配列、およびウイルス分泌シグナル配列、例えば単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列が適切である場合がある。そのようなプレセグメントをコードするDNA断片は、抗体鎖をコードするDNA断片にインフレームで連結される、すなわち機能的に連結される。
【０１６１】
「発現機構」という用語は、核酸または遺伝子の転写段階（すなわち、「遺伝子発現機構」とも称される）から始まり、核酸によってコードされるポリペプチドの翻訳後修飾までの遺伝子発現の段階に関与する細胞の酵素、補因子等の総和を意味する。発現機構は、例えば、DNAのプレmRNAへの転写、成熟mRNAへのプレmRNAのスプライシング、mRNAのポリペプチドへの翻訳、およびポリペプチドの翻訳後修飾の段階を含む。
【０１６２】
「発現プラスミド」または「発現ベクター」とは、含まれる構造遺伝子を宿主細胞において発現させるために必要なすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的に、発現プラスミド／ベクターは、複製開始点および選択マーカーを含む、例えば大腸菌用の原核生物プラスミド増殖単位、真核細胞選択マーカー、ならびに各々がプロモーター、構造遺伝子、任意で転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、関心対象の構造遺伝子を発現させるための1つまたは複数の発現カセットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結される」と称される。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントおよびコアプロモーターは機能的に連結されている。
【０１６３】
「フィーダー混合物」という用語は、増殖因子、サイトカイン、ならびに／またはB細胞の活性化および／もしくは生存ならびに／または抗体分泌を促進するさらなるタンパク質などの様々な添加物の組み合わせを意味する。フィーダー混合物は、本明細書においていかなる場合でも天然フィーダー混合物ではなく、すなわち、それは、サイトカインの規定されていない組み合わせである胸腺細胞の培養上清 (TSN) から得られない。本明細書において報告される方法において、フィーダー混合物は、組換えによって産生されたまたは化学的に合成された様々な添加物の規定された組み合わせ、すなわち、B細胞の活性化および／もしくは生存ならびに／または抗体分泌を促進する、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、ならびにPMAの規定された組み合わせである、合成フィーダー混合物である。
【０１６４】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に用いられ、そのような細胞の子孫も含め、外因性の核酸が導入されている細胞を指す。宿主細胞は、初代形質転換細胞、および継代回数に関係なくそれらに由来する子孫を含む、「形質転換体」または「トランスフェクタント」および「形質転換細胞」および「トランスフェクトした細胞」を含む。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、本明細書中に含まれる。
【０１６５】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【０１６６】
「個体」または「対象」は脊椎動物である。1つの態様において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の態様において、個体または対象はヒトである。他の態様において、個体または対象はウサギである。
【０１６７】
「標識化」という用語は、特異的に結合しかつ標識された抗表面マーカー抗体の細胞に対する結合／非結合によって決定され得る、表面マーカーの有無を決定するための過程を意味する。したがって、表面マーカーの存在は、例えば蛍光標識の場合には蛍光の出現によって決定され、表面マーカーの非存在は、特異的に結合しかつ標識された各抗表面マーカー抗体と細胞とのまたは細胞の集団とのインキュベーション後の蛍光の非存在によって決定される。
【０１６８】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、単一細胞クローンによって産生された実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば自然に生じる変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる可能性のある、一般的に少量で存在する変種抗体を除いて、同一でありかつ／または同じエピトープと結合する。典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られたという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含むトランスジェニック動物を用いる方法を含むがこれに限定されない種々の手法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法およびその他の例示的な方法は、本明細書において記載されている。
【０１６９】
「PMA」という用語は、小化合物であるホルボール-12-ミリステート-13-アセテートを意味する。そのIUPAC名は、(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(アセチルオキシ)-4a,7b-ジヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-1,1,6,8-テトラメチル-5-オキソ-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-デカヒドロ-H-シクロプロパ[3,4]ベンゾ[1,2-e]アズレン-9-イルミリステートである。この化合物は、TPA、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート、テトラデカノイルホルボールアセテート (tetradecanoylphorbol acetate)、テトラデカノイルホルボールアセテート(tetradecanoyl phorbol acetate)、ホルボールミリステートアセテート、12-0-テトラデカノイルホルボール13-アセテート、12-テトラデカノイルホルボール13-アセテート、12-テトラデカノイルホルボール13-モノアセテート、13-0-アセチルホルボール12-ミリステート、4β-ホルボール12-ミリステート13-アセテート、1,1aα,1bβ,4,4a,7aα,7b,8,9,9a-デカヒドロ-4aβ,7bα,9β,9aα-テトラヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-1,1,6,8α-テトラメチル-5H-シクロプロパ[3,4]ベンズ[1,2-e]アズレン-5-オン9a-アセテート, (+)-を伴うミリスチン酸, 9-エステル、ホルボール12-ミリステート13-アセテート、ホルボール12-テトラデカノエート13-アセテート、ホルボールミリステートアセテート、PMA、PMA（腫瘍プロモーター）、テトラデカン酸, (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(アセチルオキシ)-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-デカヒドロ-4a,7bジヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-1,1,6,8-テトラメチル-5-オキソ-1H-シクロプロパ[3,4]ベンズ[1,2-e]アズレン-9-イルエステル、テトラデカン酸, 9a-(アセチルオキシ)-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-デカヒドロ-4a,7b-ジヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-1,1,6,8-テトラメチル-5-オキソ-1H-シクロプロパ[3 ,4]ベンズ[1,2-e]アズレン-9-イルエステル, [1aR(1aα,1bβ,4aβ,7aα,7bα,8α,9β,9aα)]-、TPA、およびTPA（ホルボール誘導体）としても表示される。
【０１７０】
「トランスフェクションプラスミド／ベクター」とは、トランスフェクションプラスミド／ベクター中に含まれるコード核酸／構造遺伝子を宿主細胞において発現させるために必要なすべてのエレメントを提供する核酸（核酸分子としても表される）である。トランスフェクションプラスミド／ベクターは、例えば大腸菌用の原核生物プラスミド増殖単位を含み、これは、原核生物複製開始点、および原核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸を含み、トランスフェクションプラスミド／ベクターは、真核生物選択剤に対する耐性を付与する1つまたは複数の核酸、および関心対象のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸をさらに含む。選択剤に対する耐性を付与する核酸および関心対象のポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ発現カセット内に配置され、それによって各発現カセットは、プロモーター、コード核酸、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結される」と称される。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントおよびコアプロモーターは機能的に連結されている。
【０１７１】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体のその抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖の領域を指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む（例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するには、単一のVHまたはVLドメインで十分な場合がある。さらに、特定の抗原と結合する抗体に由来するVHまたはVLドメインを用いて、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして、その抗原と結合する抗体を単離することができる（例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clarkson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい）。
【０１７２】
「若齢動物」という用語は、性成熟が起こる前の動物を意味する。若齢ハムスターは、例えば、6週齢未満、特に4週齢未満のハムスターである。若齢マウスは、例えば、8週齢未満、特に5週齢未満のマウスである。
【０１７３】
発明の詳細な説明
本発明は少なくとも一部は、ホルボールミリステートアセテート単独、またはホルボールミリステートアセテート (PMA) と合成サイトカインおよび合成インターロイキンの組み合わせが、B細胞とマウスEL4-B5フィーダー細胞などのフィーダー細胞の共培養において使用される、一般的に用いられるマクロファージ／T細胞培養上清に取って代ることができるという知見に基づく。
【０１７４】
B細胞とフィーダー細胞の共培養において、規定されていないマクロファージ／T細胞培養上清を使用する必要性が排除されることで、共培養過程は、とりわけ、より頑強になり、より安価になり、かつ異なる種に由来するB細胞に容易に適応できるようになる。
【０１７５】
本発明はさらに、少なくとも一部は、ホルボールミリステートアセテートを合成サイトカインおよび合成インターロイキンと組み合わせて用いる場合、プラス効果を保証するためには、これらの成分のそれぞれの濃度がある特定の範囲内になくてはならないという知見に基づく。
【０１７６】
免疫化
治療用抗体の作製については、非ヒト動物を治療標的で免疫化して（単独で、または免疫原性刺激と組み合わせて）免疫応答を誘発するか、またはファージディスプレイライブラリーなどの合成アプローチを使用するかのいずれかである。トランスジェニック動物（すなわち、ヒト免疫系を有する）またはヒトファージディプレイライブラリーが用いられる場合には、ヒト抗体が得られる。そうでなければ、非ヒト動物抗体が得られ、これはその後ヒト化される。潜在的な治療用抗体を得るための稀な可能性は、疾患から回収されたヒトの血液によるものである。
【０１７７】
多くの場合、抗体に基づく治療法を評価するための動物モデルとして、マウス、ウサギ、ハムスター、およびラットなどの非ヒト動物が用いられる。したがって、通常は、非ヒト動物抗原およびヒト抗原に結合する交差反応性抗体を提供することが必要である。
【０１７８】
本明細書において報告される方法では、任意の供給源、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、またはウサギから採取されたB細胞を用いることができる。B細胞の供給源に応じて、フィーダー細胞およびフィーダー混合物が調整／選択される。
【０１７９】
ウサギB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞、またはウサギCD40Lを発現する、CHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞などの哺乳動物細胞のいずれかである。1つの態様において、ウサギは、ニュージーランドホワイト (NZW) ウサギ、ツィンマーマンウサギ (ZIKA)、Alicia変異株ウサギ、basilea変異株ウサギ、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックウサギ、rbIgMノックアウトウサギ、およびそれらの交雑種より選択される。
【０１８０】
ヒトB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞、またはヒトCD40Lを発現する、CHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞などの哺乳動物細胞のいずれかである。
【０１８１】
マウスB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞、またはマウスCD40Lを発現する、CHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞などの哺乳動物細胞のいずれかである。1つの態様において、マウスはNMRIマウスまたはbalb/cマウスである。
【０１８２】
ハムスターB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞であるか、または、ハムスターCD40Lを発現する哺乳動物細胞、例えばCHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞である。1つの態様において、ハムスターは、アルメニアンハムスター（タビキヌゲネズミ (Cricetulus migratorius)）、チャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ (Cricetulus griseus)）、およびシリアンハムスター（ゴールデンハムスター (Mesocricetulus auratus)）より選択される。1つの態様において、ハムスターはアルメニアハムスターである。
【０１８３】
B細胞の供給源および単離
血液は、高度な多様性の抗体産生B細胞を提供する。そこから採取されたB細胞クローンは、CDR内にほとんど同一ではないまたは重複しないアミノ酸配列を有する抗体を分泌し、よって高度な多様性を示す。
【０１８４】
1つの態様において、例えば血液または脾臓に由来するB細胞は、免疫化の4日後から非ヒト動物の免疫化または最も近い追加免疫の最長14日後までに採取される。この期間により、本明細書において報告される方法における高い適応性が可能になる。この期間中に、最も親和性の高い抗体を提供するB細胞が脾臓から血液に移動する可能性が高い（例えば、Paus, D., et al., JEM 203 (2006) 1081-1091；Smith, K.G.S., et al., The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006；Wrammert, J., et al., Nature 453 (2008) 667-672を参照されたい）。
【０１８５】
例えば非ヒト動物の血液由来またはヒト血液由来のB細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって採取することができる。例えば、密度勾配遠心分離 (DGC) または赤血球溶解（溶解）を用いることができる。密度勾配遠心分離は低張溶解と比較して、より高い全収率、すなわちB細胞クローン数を提供する。加えて、密度勾配遠心分離によって採取された細胞からは、共培養段階においてより多数の細胞が分裂し、増殖する。また、分泌された抗体の濃度は、異なる方法で採取された細胞と比較してより高い。したがって、1つの態様において、B細胞の集団の提供は密度勾配遠心分離による。
【０１８６】
共培養前の選択段階
抗原と特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮することができる。したがって、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、B細胞集団は末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮される。
【０１８７】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、PBMCからマクロファージを枯渇させる。このことは、共培養段階のために、ウサギ起源のB細胞にとって有利である。
【０１８８】
マクロファージは、細胞培養プレートの表面への接着によってPBMCから枯渇させることができる（プレインキュベーション段階を参照されたい）。
【０１８９】
単一細胞を置く前にB細胞の集団を共培養培地中でインキュベートすることにより、非ヒト動物の血液からB細胞の集団を単離し、任意で濃縮した直後に単一細胞を置く場合と比較して、単一細胞を置いた後に得られる抗体分泌細胞の総数が増加する（1つの態様において、非ヒト動物はウサギである）。具体的には、インキュベーションは、例えば細胞培養インキュベーターを用いた、EL-4 B5培地中で約37℃で約1時間である。
【０１９０】
本明細書において報告される方法の1つの態様において、細胞はタンパク質免疫化動物に由来し、標識化の前にそこからマクロファージを枯渇させる。
【０１９１】
抗原と結合する抗体を産生しない細胞、または同様に抗原に結合する抗体を産生する細胞を、パニングアプローチを用いてそれぞれ減少させるまたは濃縮することができる。そこでは、各抗原が表面に結合して提示され、それに結合する細胞は、結合した細胞をさらに処理する場合には細胞集団内で選択的に濃縮されるか、または溶液中に残存する細胞をさらに処理する場合には細胞集団内で減少する。
【０１９２】
本明細書において報告される方法は、1つの態様において、単一細胞を置く前に、特異的および／または非交差反応性抗体を産生するB細胞が細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別／ゲーティングに基づいて選択される選択段階を含む。1つの態様において、成熟B細胞が選別／濃縮／選択される。異なる非ヒト動物種からB細胞を選択するためには、異なる細胞表面マーカーを用いることができる。
【０１９３】
非標的細胞集団および非特異的結合リンパ球を標識することにより、これらの細胞を選択的に枯渇させることが可能である。この枯渇段階では、部分的な枯渇が達成され得るにすぎない。枯渇は定量的でないにもかかわらず、これにより、妨害細胞の数を減少することまたはさらには最小限にすることができるために残存細胞のその後の蛍光標識化における利点が与えられる。標識化を用いる蛍光活性化細胞選別により成熟B細胞（記憶B細胞、親和性成熟形質芽球、および形質細胞）を単一細胞として置くことによって、共培養段階においてより多くの数のIgG+ウェル／細胞クローンを得ることができる。
【０１９４】
異なる細胞集団は、CD3+細胞（T細胞）、CD19+細胞（B細胞）、IgM+細胞（成熟ナイーブB細胞）、IgG+細胞（成熟B細胞）、LC+細胞、CD38+細胞（例えば、形質芽球）、およびIgG+CD38+細胞（前形質細胞）などの異なる表面マーカーを用いることによって標識することができる。
【０１９５】
記憶B細胞、形質芽球、および形質細胞などの成熟IgG+ B細胞を選択するための免疫蛍光標識化が使用可能である。B細胞の選択または濃縮のためには、細胞を単一標識するか、または二重標識するか、または三重標識するかのいずれかである。また、全細胞集団のうちの約0.1%〜2.5%の標識化された細胞をもたらす標識も必要とされる。
【０１９６】
1つの態様においては、集団中のB細胞の0.1%〜2.5%に、別の態様においては、集団のB細胞の0.3%〜1.5%に、さらなる態様においては、集団のB細胞の0.5%〜1%に存在する表面分子の標識化によって選択された単一細胞として、B細胞が置かれる。
【０１９７】
（表）マウス、ハムスター、およびウサギの成熟B細胞を決定するための免疫蛍光標識化
0006916884.tif 000002
【０１９８】
1つの態様において、方法は、B細胞集団からマクロファージを枯渇させ、標的抗原と特異的に結合する抗体を分泌するB細胞集団のB細胞を濃縮する段階を含む。
【０１９９】
単一細胞を置くこと
本明細書において報告される方法は、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く段階を含む。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、単一細胞として置く段階は蛍光活性化細胞選別 (FACS) による。FACSで単一細胞を置く段階に必要な標識化のために用いられる表面マーカーは、本明細書において概説されるような特異的マーカー組み合わせであってよい。
【０２００】
単一細胞を置く段階の後かつ共培養前のさらなる遠心分離段階は、抗体分泌細胞の数を増加させ、かつ分泌されるIgGの量を増加させる。
【０２０１】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、方法は、共培養の前に、単一の置かれた細胞を遠心分離する段階を含む。1つの好ましい態様において、遠心分離する段階は300×gで5分間である。
【０２０２】
共培養
本明細書で報告されるとおりに、単一の置かれたB細胞を合成フィーダー混合物の存在下でフィーダー細胞と共培養する。
【０２０３】
1つの態様において、単一の置かれたB細胞を、フィーダー細胞としてのマウスEL-4 B5細胞と共培養する。
【０２０４】
上記に概説されるように、適切な免疫蛍光標識化によって、共培養段階における収率（IgG+ウェル/細胞クローンの数およびIgG濃度）の増加、ならびにまたPBMCからの成熟IgG+ B細胞の濃縮または単離が達成され得る。
【０２０５】
免疫化および非免疫化非ヒト動物のB細胞については、IgG+IgM-細胞の単一細胞を置くことが使用され得る。
【０２０６】
ウサギB細胞については、IgG+-、および／またはIgG+CD138+-、および／またはCD138+-、および／またはIgG+IgM--B細胞、および／またはIgG+LC+-、および／またはIgG+CD138+LC+-、および／またはCD138+LC+-、および／またはIgG+IgM-LC+-B細胞の単一細胞を置くことが使用され得る。
【０２０７】
実験用非ヒト動物の血液から採取されたB細胞に対して用いられる免疫蛍光標識化はまた、マウス、ハムスター、およびウサギなどの実験用非ヒト動物の脾臓およびその他の免疫器官から採取されたB細胞の標識化に用いることもできる。ウサギ血液由来B細胞については、マクロファージの枯渇後に0.2%のIgG+細胞が見出された。マクロファージの枯渇後に、ウサギ由来のパイエル板は0.4%のIgG+細胞を示し、脾臓は0.3%のIgG+細胞を示した。
【０２０８】
本明細書において報告される方法により、共培養の約7日後に、すなわち5日、6日、7日、または8日後に、特に7日または8日後に、十分な抗体濃度が得られ得る。例えば結合特異性に関して、より詳細に抗体を特徴決定するために、それによって提供される抗体量を用いて、多数の異なる解析を行うことができる。スクリーニング／選択過程のこの初期段階における抗体の特徴決定の改善により、行うべき必要な核酸単離および配列決定反応の回数を減らすことが可能である。加えて、B細胞クローンは、縮重PCRプライマーの使用を可能にする一定量の、モノクローナル軽鎖および重鎖可変領域をコードするmRNAを提供し、それによって高度に特異的なプライマーの必要性がなくなる。また、必要なPCRサイクル数も減少する。したがって、1つの態様において、逆転写PCRは、軽鎖および重鎖可変ドメイン用の縮重PCRプライマーを用いて行われる。
【０２０９】
いくつかのさらなる段階が先行しておよびまた後続して、フィーダー細胞との共培養段階を行うことができる。
【０２１０】
培養上清としてのフィーダー混合物の起源、すなわち培養胸腺細胞の上清（胸腺細胞培養上清（thymocyte cultivation supernatant - TSN））からのその生成に起因して、かなりのバッチ間変動が生じる。
【０２１１】
TSNは、（単一の置かれた）B細胞を刺激し、それによって増殖および抗体分泌を誘導するために、フィーダー細胞と組み合わせて必要とされる。
【０２１２】
この変動性を克服するために、同じまたは匹敵する刺激特性を有する合成フィーダー混合物を用いることができる。
【０２１３】
合成フィーダー混合物用のB細胞種特異的添加物は、各B細胞クローンによる分泌抗体の量の増加をもたらす。同時に、高産生細胞はより多くのmRNAを含み、次にこれにより、例えば重複非特異的プライマーセットを用いたコード核酸の逆転写および配列決定が容易になる。 
【０２１４】
共培養は、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、丸底を有するウェルを備えたポリスチレンマルチウェルプレート中においてである。ウェルの作業容積は、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、50μl〜250μlである。1つの態様において、ウェルは、ポリマープラスチック樹脂と両親媒性分子の混合物から調製された非繊維性基材で少なくとも部分的にコーティングされ、両親媒性分子は親水性部分および疎水性領域を含み、疎水性領域は該基材内に固定され、親水性部分は該基材上に露出している。1つの態様において、両親媒性分子は、エトキシ化アルキルアミン、ポリ（エチレンイミン）、オクチルデカミン、またはそれらの混合物より選択される（例えばEP 1 860 181を参照されたい）。
【０２１５】
共培養した細胞の特徴決定
共培養後の分泌されたIgGの（定性的および定量的）測定には、一般的に、ELISAなどの当業者に公知のすべての方法を用いることができる。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、ELISAが用いられる。
【０２１６】
特徴決定の結果に応じて、B細胞クローンを得ること、すなわち選択することができる。「クローン」という用語は、単一のB細胞から生じる／起こる、分裂しかつ抗体を分泌するB細胞の集団を意味する。したがって、B細胞クローンはモノクローナル抗体を産生する。
【０２１７】
mRNAの単離、クローニング、および配列決定
B細胞から全mRNAを単離し、cDNAに転写することができる。特異的プライマーを用いて、同族のVH領域およびVL領域コード核酸を増幅することができる。同一の配列はほとんど得られない。前記方法は、同一抗原に結合する高度に多様な抗体を提供する。
【０２１８】
VHコード核酸を増幅するために用いられるプライマーは、NMRIマウス、アルメニアンハムスター、Balb/cマウス、ならびにシリアンハムスター、およびウサギに由来する細胞から得られたcDNAに用いることができる。
【０２１９】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、アミノ酸配列は増幅されたVHコード核酸から導かれ、正確な開始点および終点は、EVQL/QVQL〜VSS（VH領域）ならびにDIVM/DIQM〜KLEIK（VL領域）のアミノ酸配列を位置づけることによって同定される。
【０２２０】
本明細書において、
(a) （実験用非ヒト動物の血液から採取された）（成熟）B細胞の集団を提供する段階、
(b) B細胞の集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素で（1つの態様においては、1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素で）染色する段階、
(c) 個々の容器（1つの態様においては、容器はマルチウェルプレートのウェルである）に、染色されたB細胞の集団の単一細胞を置く段階、
(d) 置かれた個々のB細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物（本明細書において報告されるとおり、1つの態様においてフィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様においてフィーダー混合物は合成フィーダー混合物である）の存在下で培養する段階、
(e) 個々のB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
(f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る段階、
(g) モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、抗体発現用の発現カセットに導入する段階、
(h) 該核酸を細胞に導入する段階、
(i) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階
を含む、抗体を生成するための方法もまた報告される。
【０２２１】
1つの態様において、非ヒト動物は、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類より選択される。
【０２２２】
本明細書において報告される方法
すべての細胞増殖刺激添加物が合成起源のものである、任意の供給源のものであってよい単一の置かれたB細胞を適切な共培養培地中でフィーダー細胞と共培養するための方法が本明細書において報告される。
【０２２３】
本発明は、少なくとも一部は、ホルボールミリステートアセテート単独、またはホルボールミリステートアセテート (PMA) と合成サイトカインおよび合成インターロイキンの組み合わせが、B細胞およびマウスEL4-B5フィーダー細胞などのフィーダー細胞の共培養において使用される、一般的に用いられるマクロファージ／T細胞培養上清に取って代ることができるという知見に基づく。
【０２２４】
本発明はさらに、少なくとも一部は、ホルボールミリステートアセテートを合成サイトカインおよび合成インターロイキンと組み合わせて用いる場合、プラス効果を保証するためには、これらの成分のそれぞれの濃度がある特定の範囲内になくてはならないという知見に基づく。
【０２２５】
本明細書において報告される1つの局面は、
‐ ホルボールミリステートアセテート (PMA) の存在下で、1個または複数個のB細胞をフィーダー細胞と共培養する（かつそれによって免疫グロブリンを生成する）段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するため（免疫グロブリンを生成するため）の方法である。
【０２２６】
1つの態様において、共培養する段階は1.5〜7.25 ng/ml ホルボールミリステートアセテートの存在下である。
【０２２７】
本明細書において報告される1つの局面は、
‐ ホルボールミリステートアセテート (PMA)、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の存在下で、1個または複数個のB細胞をフィーダー細胞と共培養する（かつそれによって免疫グロブリンを生成する）段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するため（免疫グロブリンを生成するため）の方法である。
【０２２８】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
約0.5〜5 ng/ml IL-2、
約0.1〜1 ng/ml IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２２９】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３０】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
約0.5〜5 ng/ml IL-2、
約0.1〜1 ng/ml IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３１】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３２】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02 ng/ml IL-1β、
約0.02 ng/ml TNFα、
約0.5 ng/ml IL-2、
約0.1 ng/ml IL-10、および
約0.1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３３】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
約0.5〜5 ng/ml IL-2、
約0.1〜1 ng/ml IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３４】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３５】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
約0.5〜5 ng/ml IL-2、
約0.1〜1 ng/ml IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３６】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３７】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02〜0.2 ng/ml IL-1β、
約0.02〜0.2 ng/ml TNFα、
約0.5〜5 ng/ml IL-2、
約0.1〜1 ng/ml IL-10、および
約0.1〜1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３８】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.2 ng/ml IL-1β、
約0.2 ng/ml TNFα、
約5 ng/ml IL-2、
約1 ng/ml IL-10、および
約1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２３９】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２４０】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.064 ng/ml IL-1β、
約0.064 ng/ml TNFα、
約1.6 ng/ml IL-2、
約0.32 ng/ml IL-10、および
約0.32 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２４１】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約0.9 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
約0.02 ng/ml IL-1β、
約0.02 ng/ml TNFα、
約0.5 ng/ml IL-2、
約0.1 ng/ml IL-10、および
約0.1 ng/ml IL-6
の存在下である。
【０２４２】
1つの態様において、共培養において使用されるホルボールミリステートアセテート (PMA) の量は重量によって与えられ、共培養において使用されるIL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の量は活性によって与えられる。
【０２４３】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２４４】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.3〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２４５】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２４６】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２４７】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.9〜3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２４８】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２４９】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.5〜2.5 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５０】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５１】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.2〜0.35 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５２】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02〜0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5〜5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1〜1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５３】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.2 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.2 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５４】
1つの態様において、共培養する段階は、
約0.05〜0.7 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５５】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約1.3 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.064 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約1.6 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.32 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５６】
1つの好ましい態様において、共培養する段階は、
約0.9 ng/ml ホルボールミリステートアセテート、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約0.02 ng/mlの（マウス）TNFα、
6〜7（好ましくは6.3）*106 IU/mgを有する約0.5 ng/mlの（マウス）IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-10、および
9.2〜16.1*108 U/mgを有する約0.1 ng/mlの（マウス）IL-6
の存在下である。
【０２５７】
1つの態様において、フィーダー細胞はEL-4 B5細胞である。
【０２５８】
1つの態様において、方法は1個のB細胞の共培養のためである。1つの好ましい態様において、1個のB細胞は単一の置かれたB細胞である。
【０２５９】
1つの態様において、共培養する段階はさらに、黄色ブドウ球菌株Cowans細胞 (SAC) の存在下である。
【０２６０】
1つの態様において、インキュベートする段階は5〜14日間である。
【０２６１】
本明細書において報告されるすべての方法において、共培養する段階は胸腺細胞の培養上清の非存在下である。したがって、添加されるフィーダー混合物は培養上清ではない。
【０２６２】
1つの態様においては、胸腺細胞培養上清もマクロファージ培養上清もT細胞培養上清も培養に加えない。
【０２６３】
本明細書において報告される1つのさらなる局面は、約2 ng/ml（マウス）IL-1β、約2 ng/ml（マウス）TNFα、約50 ng/ml（マウス）IL-2、約10 ng/ml（マウス）IL-10、および約10 ng/ml（マウス）IL-6を含む（からなる）フィーダー混合物である。
【０２６４】
本明細書において報告される1つのさらなる局面は、（マウス）EL-4 B5細胞と（単一の置かれた）ヒト、マウス、またはウサギB細胞の共培養における、約2 ng/ml（マウス）IL-1β、約2 ng/ml（マウス）TNFα、約50 ng/ml（マウス）IL-2、約10 ng/ml（マウス）IL-10、および約10 ng/ml（マウス）IL-6を含む（からなる）（合成）フィーダー混合物の使用である。
【０２６５】
（マウス）EL4-B5細胞と（単一の置かれた）（ウサギ）B細胞の共培養において、約2 ng/ml（マウス）IL-1β、約2 ng/ml（マウス）TNFα、約50 ng/ml（マウス）IL-2、約10 ng/ml（マウス）IL-10、および約10 ng/ml（マウス）IL-6を含む合成フィーダー混合物を使用する場合、IgG陽性ウェルの頻度は、TSNが使用される場合のものと匹敵する。
【０２６６】
（表）
0006916884.tif 000003
【０２６７】
平均生産性もまた、TSNが使用される場合のものと匹敵する（以下の表を参照されたい）。
【０２６８】
（表）
0006916884.tif 000004
【０２６９】
合成フィーダー混合物に加えてPMA (3 ng/ml) を添加した場合には、結果は有意に異なる（以下の表を参照されたい）。
【０２７０】
（表）
0006916884.tif 000005
【０２７１】
ホルボールミリステートアセテートを合成サイトカインおよび合成インターロイキンと組み合わせて用いる場合、相乗効果を保証するためには、これらの成分のそれぞれの濃度がある特定の範囲内になくてはならないということが見出された。
【０２７２】
2 ng/ml（マウス）IL-1β、2 ng/ml（マウス）TNFα、50 ng/ml（マウス）IL-2、10 ng/ml（マウス）IL-10、および10 ng/ml（マウス）IL-6を含む合成フィーダー混合物は、以下の表中で1×CMと称される。
【０２７３】
したがって、以下の表中の0.1×CMフィーダー混合物は、0.2 ng/ml（マウス）IL-1β、0.2 ng/ml（マウス）TNFα、5 ng/ml（マウス）IL-2、1 ng/ml（マウス）IL-10、および1 ng/ml（マウス）IL-6を含む合成フィーダー混合物に相当する。
【０２７４】
驚いたことに、PMAの存在下では、IgG陽性ウェルの数の増加も生産性の増加も損なうことなく、合成フィーダー混合物の濃度を低下させることができることが見出された。同時に、細胞は過剰に刺激されず、それによってプラス効果は無効にならない。
【０２７５】
驚いたことに、PMAを単独で使用することにより、すなわちサイトカインおよびインターロイキンの非存在下では、匹敵するIgG陽性ウェルの数およびさらには生産性の増加が達成され得ることもまた見出された。
【０２７６】
IgG陽性ウェルの数［全体に対する%］：
0006916884.tif 000006
n.d. = 未測定
【０２７７】
平均IgG生産性 [μg/ml]：
0006916884.tif 000007
n.d. = 未測定
【０２７８】
抗原特異的クローンの数は影響を受けない（ヒト血清アルブミン (HSA) で免疫化されたウサギから採取されたB細胞に関して、以下に示される）。
【０２７９】
抗HSA抗体陽性ウェルの数［全体に対する%］：
0006916884.tif 000008
n.d. = 未測定
【０２８０】
抗HSA抗体陽性ウェルの数［IgG陽性ウェルに対する%］：
0006916884.tif 000009
n.d. = 未測定
【０２８１】
0.1×CM、0.032×CM、およびCMなしの条件について、PMA濃度の影響をさらに評価した（oから+++++までの相対的重みづけ）。
0006916884.tif 000010
0006916884.tif 000011
0006916884.tif 000012
【０２８２】
この理論によって縛られることはないが、頑強な方法を得るためには、最良な全体のIgG陽性ウェル数、生産性、および抗原特異的ウェル数をもたらす重複範囲内の値が使用されるべきであると想定される。
【０２８３】
以下の実施例および配列は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載の手順において変更がなされ得ることが理解される。
【実施例】
【０２８４】
材料および方法
組換えDNA法
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) に記載されているような標準方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
【０２８５】
培地および緩衝液
ELISA用のブロッキング緩衝液は、1×PBSおよび1% BSAを含む。
【０２８６】
ELISA用のコーティング緩衝液は4.29 g Na2CO3* 10 H2Oおよび2.93 g NaHCO3を含み、最終量1リットルまで水を添加し、2 N HClでpH 9.6に調整する。
【０２８７】
RNA単離用のエタノール溶液は、70%エタノールまたは80%エタノールを含む。
【０２８８】
免疫蛍光染色用のFACS緩衝液は、1×PBSおよび0.1% BSAを含む。
【０２８９】
ELISA用のIMDM緩衝液は、1×PBS、5% IMDM、および0.5% BSAを含む。
【０２９０】
ELISA用のインキュベーション緩衝液1は、1×PBS、0.5% CroteinCを含む。
【０２９１】
ELISA用のインキュベーション緩衝液2は、1×PBS、0.5% CroteinC、および0.02% Tween 20を含む。
【０２９２】
ELISA用のインキュベーション緩衝液3は、1×PBS、0.1% BSAを含む。
【０２９３】
ELISA用のインキュベーション緩衝液4は、1×PBS、0.5% BSA、0.05% Tween、PBS (10×)、0.01 M KH2PO4、0.1 M Na2HPO4、1.37 M NaCl、0.027 M KCl、pH 7.0を含む。
【０２９４】
ELISA用の洗浄緩衝液1は、1×PBS、0.05% Tween 20を含む。
【０２９５】
ELISA用の洗浄緩衝液2は、1×PBS、0.1% Tween 20を含む。
【０２９６】
ELISA用の洗浄緩衝液3は、水、0.9% NaCl、0.05% Tween 20を含む。
【０２９７】
EL-4 B5培地は、10% FCS、2 mMグルタミン、1%ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、2 mMピルビン酸ナトリウム、10 mM HEPES、および0.05 mM β-メルカプトエタノールが補充されたRPMI 1640を含む。
【０２９８】
動物の管理および免疫化
実験動物は、ドイツ動物保護法 (TierSCHG) に従って、および各欧州指針に従って維持した。
【０２９９】
免疫化には、Charles River Laboratories International, Inc.から入手したNZWウサギを使用した。動物は、AAALACiによって認可された動物施設において、Appendix A 「Guidelines for accommodation and care of animals」に従って収容した。動物の免疫化プロトコールおよび実験はすべて、Upper Bavariaの政府によって承認され（許可番号55.2-1-54-2532-90-14）、ドイツ動物福祉法 (German Animal Welfare Act) ならびに欧州議会および理事会 (European Parliament and Council) の指令2010/63に従って実施した。
【０３００】
一般的に、抗原を1 mg/mlの濃度でK3PO4緩衝液pH 7.0に溶解し、安定した乳濁液が作製されるまで完全フロイントアジュバント (CFA) と混合した (1:1)。ウサギに2 mlの乳濁液を皮内 (i.d.) 注射し、その後1週間間隔でそれぞれ1 mlを2度目には筋肉内 (i.m.) 注射および3度目には皮下 (s.c.) 注射した。2週間後に4度目の1 mlのi.m.注射を行い、続いて4週間間隔で1 mlの2回のさらなるs.c.注射を行った。
【０３０１】
免疫化の期間中に、抗原特異的アッセイを用いて血清抗体価を測定した。抗体価が1:10000のIC50を有する時点で、免疫化動物の血液または脾臓を取り出した。抗原特異的B細胞の再活性化のため、血液または脾臓を取り出す3日前に、30μg〜50μgの抗原を実験動物の静脈内に適用した。
【０３０２】
より詳細には、12〜16週齢のNZWウサギを、0日目に皮内適用によって、完全フロイントアジュバントで乳化された400μg組換えヒト血清アルブミンタンパク質（HSA；CAS RN 70024-90-7；Sigma）で免疫化し、続いて1、2、6、10、および23週目に、筋肉内注射と皮下注射を交互に行うことによって、完全または不完全フロイントアジュバントで乳化された200μg HSAで免疫化した。
【０３０３】
器官、血液、およびマクロファージの取り出し
一般的に、ウサギ由来の血液は、耳静脈、またはより大量の場合には耳動脈の穿刺によって採取した。3度目、4度目、5度目、および6度目の免疫化の4〜6日後にウサギから全血 (10 ml) を回収し、FACSによる単一細胞選別に使用した。
【０３０４】
具体的には、3回目の免疫化から開始してそれ以降、免疫化後の4、5、および6日目に血液（推定全血液量の10%）を採取した。ELISAによる免疫原特異的IgG力価測定のために血清を調製し、かつ末梢血単核細胞を単離し、それをB細胞クローニング過程において抗原特異的B細胞の供給源として使用した。
【０３０５】
マクロファージは、細胞培養プラスチックへの付着により、採取された血液から単離した。
【０３０６】
EDTAを含有する全血を1×PBSで2倍に希釈した後に、lympholyte mammal (Cedarlane Laboratories) またはFicoll Paque Plus（GE Healthcare、カタログ番号17-1440-03）によって密度遠心分離を行ったが、これはウサギPBMCを単離するために行った。PBMCを2回洗浄した後に、抗体で染色した。
【０３０７】
密度勾配遠心分離
末梢血単核細胞 (PBMC) の単離は、製造業者の説明書A（Lympholyte（登録商標）-mammal、Cedarlane）に従ってLympholyte（登録商標）を用いて密度勾配分離により行った。
【０３０８】
採血した血液をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で2:1に希釈した。遠心分離バイアル中に同量の密度分離培地を提供し、希釈した血液をバイアルの壁を介して注意深く添加した。バイアルを、ブレーキをかけずに800×gで20分間遠心分離した。白い中間層からリンパ球を採取した。取り出した細胞にPBS 10 mlを補充し、800×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、かつペレットを再懸濁し、洗浄し、遠心分離した。最終ペレットをPBSまたは培地に再懸濁した。
【０３０９】
マクロファージの枯渇
滅菌した6ウェルプレート（細胞培養等級）を使用して、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させた。ウェルを、コーティングしなかったか、KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）でコーティングしたか、またはストレプトアビジンでコーティングした。各ウェルを3 ml〜（最大）4 mlの培地、および免疫化ウサギ由来の最大で6×106個までの末梢血単核細胞で満たし、インキュベーター内で37℃で60〜90分間結合させた。その後、リンパ球含有上清を遠心分離バイアルに移し、かつ800×gで10分間遠心分離した。ペレットをPBSまたは培地に再懸濁した。
【０３１０】
抗原特異的B細胞の濃縮
各抗原を、最終濃度2μg/mlまでコーティング緩衝液で希釈した。この溶液3 mlを6ウェルマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。使用する前に上清を除去し、ウェルをPBSで2回または3回洗浄した。B細胞溶液を細胞2×106個/mlの細胞密度に調整し、3 mlを6ウェルマルチウェルプレートの各ウェルに添加した（培地3〜4 ml当たり最大で細胞6×106個まで）。プレートを37℃で60〜90分間インキュベートした。上清を除去し、ウェルを1×PBSで1〜4回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。付着性の抗原特異的B細胞を回収するため、1 mlのトリプシン／EDTA溶液をマルチウェルプレートのウェルに添加し、37℃で5〜15分インキュベートした。培地を添加することによりインキュベーションを停止し、上清を遠心分離バイアルに移した。ウェルをPBSで2回洗浄し、この上清を他の上清と混合した。細胞を800×gで10分間遠心分離してペレット化した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。任意で、ペレットをPBSに再懸濁した。
【０３１１】
T細胞の培養
4〜5週齢のウサギからT細胞を単離した。細胞を遠心分離し、直ちに培養するか、または細胞3×107個の一定分量で凍結した。胸腺細胞は、175 cm2培養フラスコ中で、細胞5×105個／EL-4 B5培地1 mlの最小細胞密度で播種し、37℃で48時間インキュベートした。
【０３１２】
マクロファージの培養
ウサギ由来の血液単核細胞を、175 cm2培養フラスコ中細胞少なくとも1×105個／mlの細胞密度で、EL-4 B5培地中で37℃にて1.5時間培養した。その後、培地を取り出し、付着したマクロファージから付着しなかった細胞を、温めたEL-4 B5培地で洗浄することによって取り出し、続いて35 ml培地中で48時間培養した。
【０３１３】
T細胞とマクロファージの共培養
T細胞およびマクロファージを別々のフラスコ中で48時間培養した。両方の細胞集団を混合する前に、T細胞を800×gで10分間遠心分離した。上清を破棄し、細胞ペレットを培地10 mlに再懸濁した。T細胞を細胞5×105個／mlの最小細胞密度に調整し、培地1 ml当たり10 pgホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA) および5 ngまたは50 ngフィトヘマグルチニンM (PHA-M) を添加した。マクロファージから培養液を取り出し、マクロファージを含むフラスコにT細胞懸濁液を添加した。36時間の共培養後に培養液を取り出し、これをTSN溶液と命名した。残存細胞を取り出すため、TSN溶液を0.22μmフィルターを通して濾過した。TSN溶液を4 mlの一定分量で-80℃で凍結した。
【０３１４】
免疫蛍光染色
プロトコール1：
染色しようとする細胞の数に応じて、細胞をそれぞれ100μl培地（細胞106個未満）または200μl培地（細胞106個超）中に提供した。蛍光標識抗体を実験動物の5%血清およびFACS緩衝液で、それぞれ100μlまたは200μlの最終量に希釈した。反応混合物をローラーラック上で、暗所で4℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を300×gで5分間、2回洗浄した。ペレットをPBS 400μlに再懸濁し、70μmふるいを通して濾過した。濾過した溶液をFACSバイアルに移し、FACS実験の直前に、死細胞をヨウ化プロピジウム (6.25μg/ml) の添加により染色した。抗体がビオチンにコンジュゲートされている場合には、該抗体はストレプトアビジン標識フルオロフォア（例えば、Alexa Fluor（登録商標）647（抗体197））を用いて第2段階で検出した。
【０３１５】
プロトコール2：
単一細胞選別のために使用した抗ウサギ IgG FITCは、AbD Serotec（STAR121F、Dusseldorf, Germany）から入手した。
【０３１６】
表面染色のために、細胞を、PBSで最適に希釈した抗ウサギIgG FITC抗体と共に、回転させながら暗所で4℃にて30分間インキュベートした。遠心分離後に、上清を吸引によって除去した。PBMCを2サイクルの遠心分離に供し、氷冷PBSで洗浄した。最後に、PBMCを氷冷PBSに再懸濁し、直ちにFACS解析に供した。FACS解析の前に5μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen、San Diego, CA, USA）を添加して、死細胞と生細胞を区別した。他の実験では、染色細胞をFACSによって単一で置いた。
【０３１７】
コンピュータおよびFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences、USA）を備えたBecton Dickinson FACSAriaを用いて、データを収集し解析した。
【０３１８】
増殖アッセイ
(a) Cell Titer Glo (CTG) 生存アッセイ
CTG生存アッセイ（Promega；#G7571）は、製造業者の説明書に従って使用した。
【０３１９】
(b) 3Hチミジンアッセイ
6日間インキュベートした後、3H-チミジンを添加し（0.5μCi/ウェル）、さらに16時間インキュベートした。細胞増殖中の3H-チミジンの取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウンター (Wallac) を用いて決定した。
【０３２０】
(c) 顕微鏡解析
顕微鏡画像を取得するために、高解像度カメラ (Leica DFC290 HD) と組み合わせたLeicaの位相差顕微鏡 (Leica DM IL) を使用した。
【０３２１】
(d) CFSE標識によるB細胞活性化の解析
単離されたB細胞を、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄した。1×107個までの細胞をタンパク質不含PBS 1mlに再懸濁し、最終濃度2.5μMのCFSE（#C34554、Invitrogen/Molecular Probes）と共に37℃で3〜10分間インキュベートした。過剰量のFCS補充培地を添加することにより、CFSE負荷を停止した。FCS含有培地で大規模に洗浄した後、B細胞を共培養実験において使用した。CFSE希釈の結果としてのCD19+ゲート化 (B)細胞の増殖を、表示の時点後にフローサイトメトリー解析（FL-1チャネル）によって確認した。
【０３２２】
IgGの定量化
一般的に、7日間の共培養後に、共培養を行った96ウェルマルチウェルプレートを300×gで5分間遠心分離した。上清150μlを取り出し、2枚目の96ウェルマルチウェルプレート中でPBSを2:1の比に希釈した。抗体は50 ng/mlの濃度で使用した。5分間のインキュベーション時間後にODが1または1超である場合には、0.8〜108 ng/ml IgGの希釈系列を試験した。
【０３２３】
具体的には、0.5μg/mlのビオチン化マウス抗ウサギIgG抗体 (Sigma-Aldrich) および0.35μg/ml抗ウサギIgG HRPコンジュゲート (Sigma-Aldrich) の混合物を384ウェル・ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート (MicroCoat Biotechnologie GmbH) に移した。0.5% BSAおよび0.05% Tween（登録商標）-20が補充されたPBS中のB細胞上清の希釈物を添加し、RTで90分間インキュベートした。PBST（0.2% Tween（登録商標）-20を含むリン酸緩衝生理食塩水）緩衝液で繰り返し洗浄した後 (6×)、プレートをBM blue（登録商標）HRP基質溶液で発色させ、色形成を370 nmにおける吸光度によって測定した。市販のウサギIgG (Sigma-Aldrich) を較正標準として使用した。
【０３２４】
抗原特異的IgGの検出
一般的に、単一で置かれかつ共培養したB細胞により産生された抗体、または免疫化実験動物から採取されたB細胞から産生された抗体を、特異的抗原結合に関して特徴決定することができる。ELISAを室温で行い、個々の段階の間にELISA溶液を20×gの振盪機上でインキュベートした。第1段階では、抗原を96ウェルマルチウェルプレートのウェルに結合させた。抗原がタンパク質である場合には、それをコーティング緩衝液で希釈し、プレートに直接適用した。ペプチド抗原は、特異的結合対であるビオチン／ストレプトアビジンを介して結合させた。マルチウェルプレートのウェルは、製造業者によって可溶性CroteinC (CrC) で既にコーティングされていてよい。そうでない場合には、抗原の固定化後に、ウェルをブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした。それぞれウェル1個当たり100μlの抗原溶液（予めコーティングされたマルチウェルプレート）またはブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした後、非結合の抗原またはブロッキング緩衝液を洗浄緩衝液での洗浄により除去した。希釈したB細胞上清をウェル1個当たり100μlの量で添加し、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄した。その後、検出抗体をウェル1個当たり100μlの量で添加した。該抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合していてもよいか、またはビオチンで標識されていてもよい。検出抗体は、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートにより決定した。インキュベーション後、マルチウェルプレートを洗浄し、その後3,3',5,5'テトラメチルベンジジン (TMB) を含む基質溶液をウェル1個当たり50μl添加し、表Xに示される期間インキュベートした。硫酸50μlの添加により酵素反応を停止し、光度計（Rainbow Thermo ELISAリーダー）およびXread plusソフトウェアを用いて450 nmおよび680 nmの吸光度を測定した。
【０３２５】
具体的には、アッセイは、0.5%ゼラチンおよび0.025% Tween（登録商標）-20が補充されたPBS（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液を用いて、384-ウェルMaxisorpマイクロタイタープレート (Thermo Scientific) において室温 (RT) で行った。プレートを0.5μg/mlのヒト血清アルブミン (HSA、Sigma-Aldrich)で少なくとも2時間から一晩コーティングした。PBST（0.1% Tween（登録商標）-20を含むPBS）緩衝液で洗浄した後 (3×)、0.5%ゼラチンおよび0.1% Tween（登録商標）-20を含むPBSでウェルをブロッキングした。再度、プレートを3×洗浄し、その後B細胞上清の希釈物を添加した。60分のインキュベーションおよびPBSTによる3回の洗浄段階の後、HRP結合抗ウサギIgG抗体 (Amersham) の1:4000希釈物をウェルに移し、60分間インキュベートした。最後に、プレートをPBSTで繰り返し洗浄し(6×)、BM blue（登録商標）HRP基質溶液で30分間発色させた。392〜405 nmで吸光度を測定した。
【０３２６】
抗原上でのパニング
(a) プレートのコーティング
ビオチン／ストレプトアビジン： 滅菌したストレプトアビジンコーティング6ウェルプレート（細胞培養等級）を、PBS中の0.5〜1 (2) μg/mlの濃度のビオチン化抗原と共に室温で1時間インキュベートした。プレートは、使用する前に滅菌したPBSで3回洗浄した。
【０３２７】
タンパク質の共有結合： 滅菌した細胞培養6ウェルプレートを、炭酸緩衝液（0.1 M炭酸水素ナトリウム、34 mM炭酸水素二ナトリウム、pH 9.55）中の2μg/mlタンパク質で、4℃で一晩コーティングした。プレートは、使用する前に滅菌したPBSで3回洗浄した。
【０３２８】
(b) ペプチド上でのB細胞のパニング
各抗原でコーティングされた6ウェル組織培養プレートに、培地4 ml当たり6×106個までの細胞を播種し、インキュベーター内で37℃で1時間結合させた。ウェルを1×PBSで1〜2回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。残存する付着細胞を、インキュベーター内で37℃で10分間にわたりトリプシンによって剥離し、次いで培地で2回洗浄した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。
【０３２９】
実施例1
EL-4 B5細胞の培養
凍結EL-4 B5細胞を37℃の水浴中で迅速に融解し、EL-4 B5培地10 mlで希釈した。300×gで10分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを培地1 mlに再懸濁した。
【０３３０】
EL-4 B5細胞をT175培養フラスコ中に細胞8×10個／mlの細胞密度で接種した。細胞密度を1日おきに測定し、細胞8×104個／mlに調整した。細胞はおよそ18時間の倍加時間を有する。
【０３３１】
細胞を回収し、50 Gyでのγ照射の前に細胞1×106個／mlの細胞密度に調整した。
【０３３２】
実施例2
B細胞とEL-4 B5細胞の共培養
単一細胞の選別したB細胞を96ウェルプレート中で、Pansorbin細胞 (SAC)（Calbiochem (Merck)、Darmstadt, Deutschland）、EL-4-B5細胞（5×104個/ウェル）、およびウサギ胸腺細胞上清 (TSN)またはPMAとのサイトカイン混合物（CM）を有する200μl／ウェルEL-4 B5培地を用いて、それぞれ、インキュベーター内の5% CO2の雰囲気中37℃で7日間培養した。スクリーニングのためにB細胞培養上清を取り出し、細胞は可変領域遺伝子クローニングのために直ちに回収するか、または100μl RLT緩衝液（Qiagen、Hilden, Germany）中で-80℃で凍結した。