(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）または高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）治療用の薬剤学的な組成物であって、
（ａ）タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の薬剤学的な有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含み、
前記高血圧が、高血圧性血管疾患（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高血圧性肺疾患（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高血圧性脳症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、高血圧性腎硬化症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または高血圧性網膜症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）であり、
前記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドが、配列表の配列番号２のアミノ酸配列のみからなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列のみからなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列のみからなるペプチド、配列番号５のアミノ酸配列のみからなるペプチド、または配列番号６のアミノ酸配列のみからなるペプチドである、血管狭窄または高血圧治療用の薬剤学的な組成物。
【請求項２】
前記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドが、配列表の配列番号２のアミノ酸配列のみからなるペプチド、または配列番号３のアミノ酸配列のみからなるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドに細胞膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記薬剤学的な組成物は、経口または非経口投与が可能であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記非経口投与は、血管内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与、鼻腔投与、または気道吸入であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記血管狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）は、心血管狭窄（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、頸動脈狭窄（ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、脳血管狭窄（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、肺動脈狭窄（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、腎動脈狭窄（ｒｅｎａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、大腿動脈狭窄（ｆｅｍｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、下肢動脈狭窄（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｂ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、または血管再狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記血管再狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）は、血管手術（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ）または血管形成術（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）による再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国の未来創造科学部のサポートの下で、課題番号ＧＦ０１３３０により行われたものであって、上記課題の研究管理専門機関は、韓国研究財団、研究事業名は「グローバル研究室事業」、研究課題名は「心臓病のシグナル伝達の研究及び遺伝子治療」、主管機関は広州科学技術院、研究期間は２０１３．４．１．−２０１４．３．３１である。
【０００２】
本特許出願は、２０１６年１０月２４日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１６−０１３８６１２号に対して優先権を主張し、上記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。
【０００３】
本発明は、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドを含む、血管疾患治療用の組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
血管リモデリング（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）は、肺動脈高血圧、冠状動脈再狭窄、動脈硬化などの複数の疾患から誘導される現象で、血管損傷や刺激により行われる（非特許文献１）。血管の構造的な変化を引き起こす、このような現象は、細胞増殖、死、機能異常などに起因する。血管の構成要素のうち、血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ、ＶＥＣｓ）と血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣｓ）が損傷及び刺激に反応する決定的な媒介体として血管のリモデリングを主導する（非特許文献２）。ＶＳＭＣｓとＶＥＣｓの相互作用及び自己の役割は、血管の緊張／弛緩など、血管の恒常性を維持するのに重要である。これらの役割が異常に進行される病理学的な条件でＶＥＣｓの機能異常及びＶＳＭＣｓの異常増殖現象などが起こる。このように、異常増殖により収縮性の特性を示す内膜の表現型と加えて動脈の外膜に存在する線維化細胞らによって起こる細胞外気質の変化は、血管線維化を促進し、結果的には、動脈硬直度をさらに増加させることで、高血圧（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の表現型に至るようになる（非特許文献３）。
【０００５】
ＶＳＭＣｓの異常増殖は、前述した肺動脈高血圧や大動脈弁膜再狭窄のような血管増殖性疾患の根本的な原因である（非特許文献４〜５）。動脈壁が損傷されると、ＶＳＭＣｓが内膜層に移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）して収縮及び停止から表現型を急激に変化させ、結果的に合成及び増殖につながる。合成表現型を有するＶＳＭＣｓの異常増殖は、新生内膜成長（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ）と呼ばれる現象である動脈内膜の拡張をもたらす（非特許文献６〜７）。また、肺動脈高血圧（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ＰＡＨ）でＶＳＭＣｓ増殖を抑制する一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ））、プロスタサイクリン（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ（ＰＧＩ２））などの血管拡張物質が減り、エンドセリン−１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）のような血管収縮物質の影響に応じてＶＳＭＣｓの異常増殖をもたらす（非特許文献８〜９）。したがって、ＶＳＭＣｓ増殖の調節は、血管増殖性疾患の治療に重要な要素である。
【０００６】
ＶＳＭＣｓの増殖は、細胞質Ｃａ２＋レベルの慢性増加と関連があるが、これはリアノジン受容体（ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とＳＥＲＣＡ２ａ（ｓａｒｃｏ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＳＲ）  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ）のようなＣａ２＋処理（ｈａｎｄｌｉｎｇ）タンパク質の損失により引き起こされる（非特許文献１０）。ＳＥＲＣＡ２ａの遺伝子伝達媒介復元は、ＶＳＭＣの増殖と新生内膜形成を減少させる（非特許文献１１〜１２）。したがって、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を調節して、低い細胞質Ｃａ２＋レベルを維持することがＶＳＭＣｓ増殖を予防、改善する合理的な戦略になることができる。
【０００７】
ＳＥＲＣＡ２ａ活性は、ＰＬＢホスホランバン（ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ）との直接的な相互作用によって抑制される。抑制活性は、タンパク質ホスファターゼ１（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １，  ＰＰ１）によるセリン１６番目またはトレオニン１７番目の脱リン酸化によって増加する（非特許文献１３〜１６）。したがって、ＰＬＢのＰＰ１−媒介脱リン酸化の抑制は、損傷された心臓でＳＥＲＣＡ２ａ活性を上方調節する合理的なアプローチである。本発明者らは、以前に９−ｍｅｒペプチドであるΨＰＬＢ−ＳＥがリン酸化されたＰＬＢを模倣してＰＰ１のデコイ（ｄｅｃｏｙ）の役割を果たすということを示した（非特許文献１７）。このペプチドは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＰＬＢの脱リン酸化を抑制することにより、虚血／再灌流後、心臓でＳＥＲＣＡ２ａ活性を回復させた。
【０００８】
一方、血管増殖関連心血管疾患でＶＥＣｓの意味は、単に解剖学的な境界膜に過ぎない。ＶＥＣｓは血管の恒常性を維持する物質を分泌する重要な一つの臓器である。複数の心血管疾患の発生とＶＥＣｓの機能は、密接な関係を持っており、特に、高血圧を誘発する動脈硬化症の発生と進行に重要な役割を果たす。肺動脈高血圧の場合、ＶＥＣｓの機能異常（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）が重要な病因として知られており、実際にＶＥＣｓから分泌される複数の物質のうち、ＮＯとｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎは、血管弛緩剤として作用し、血小板凝集を抑制し、ＶＳＭＣｓの増殖を抑制する役割を果たすが、これは肺動脈高血圧のような動脈硬化性疾患の進行を抑制するのに重要なプロセスである（非特許文献１８〜１９）。
【０００９】
肺動脈高血圧の患者では、上記血管弛緩剤らの減少がよく報告され、ＮＯによって活性化されたグアニル酸シクラーゼ（ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ（ＧＣ））の産物であるサイクリックＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＧＭＰ））がホスホジエステラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔａｒｅａｓｅ−５（ＰＤＥ−５））の活性化のために加水分解される。ｃＧＭＰは、血管拡張及び細胞増殖を抑制する機能をするが、ＰＤＥ−５の活性は、ｃＧＭＰの作用時間を減らすことになる。このような脈絡で、現在ＰＤＥ−５抑制剤であるシルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）などが開発された。しかし、肺動脈高血圧の場合、ＰＤＥ−５の活性が増加しているだけでなく、ＶＥＣｓでＮＯを生成する能力自体を喪失しており、根本的にｃＧＭＰレベルも減少しているので、ＰＤＥ−５の活性を抑制するだけでは限界があると知られている。実際、最近の臨床結果で長期服用に対する危険性が提起された（非特許文献２０）。これは根本的にＮＯの生成を増加させるためのｅＮＯＳ発現幹細胞治療剤とＧＣ活性剤が臨床試験段階を通っている（非特許文献２１〜２２）。
【００１０】
一方、家族歴を持つ肺動脈高血圧患者の７０〜８０％の場合、ＢＭＰＲ２（Ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）遺伝子に突然変異が報告されるが、ＢＭＰＲ２の減少により、ＶＥＣｓの炎症反応に関連するＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−６、そしてＩＬ−８などのサイトカインの生成が増加する現象が現れる。特にＧＭ−ＣＳＦの場合、ｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の活性化により翻訳が増加することになる（非特許文献２３）。現在ＢＭＰＲ２遺伝子を用いた遺伝子治療剤の研究が前臨床段階で活発に進行中であり、ＢＭＰＲ２シグナル伝達系の活性剤であるＦＫ５０６（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）がＰＡＨ患者を対象に臨床試験段階にある（非特許文献２４〜２５）。
【００１１】
細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）は、シグナルペプチドの一種として高分子物質を細胞内に透過させる目的で使用するペプチドである。７−３０余個程度の配列で構成されており、ＨＩＶに由来したＴＡＴの研究をはじめ、関連研究が本格的に進行された。ショウジョウバエに由来したＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、ＨＳＶ−１ウイルスに由来したＶＰ２２、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔに由来したｐｅｐ−１が第１世代のＣＰＰであり、アルギニン、リジンが連続的に接続されたペプチドも、細胞透過性を持つと報告された。しかし、これらのＣＰＰは、ヒト由来のタンパク質の配列ではないので、細胞毒性、免疫原性のリスクを内包している。また、最近のＣＰＰと結合されたバイオ新薬候補物質の臨床結果で、人間細胞に伝達効能が低下したり、輸送（ｃａｒｇｏ）の効果を確認することが難しかった。その結果、ヒト細胞への伝達効能を高めたＨｐｈ−１、ＬＰＩＮ３、そしてｄＮＰ２などのヒト由来のタンパク質のＣＰＰに対する研究が進められている（非特許文献２６〜２９）。
【００１２】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ４５（４）：８４３−８５２
【非特許文献２】Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２２（１２）：４３０６−４３１３
【非特許文献３】Ｈａｒｖｅｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）  Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３２（５）：６５９−６６８；Ｍｉｃｈｅｌｌ  ＧＦ（２０１４）  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ６４（１）：１３−１８
【非特許文献４】Ｄｚａｕ  ＶＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄ  ８：１２４９−１２５６
【非特許文献５】Ｎｏｖａｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ４：９８９−９９０
【非特許文献６】Ａｕｓｔｉｎ  ＧＥ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ６：３６９−３７５
【非特許文献７】Ｈａｎｋｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｈｅｒｚ  １２：３００−３０８
【非特許文献８】Ｈｏｅｐｅｒ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４２：１８６６−１８７０
【非特許文献９】Ｇｉａｉｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２８：１７３２−１７３９
【非特許文献１０】Ｖａｌｌｏｔ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ａｅｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０：１２２５−１２３５
【非特許文献１１】Ｌｉｐｓｋａｉａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９７：４８８−４９５
【非特許文献１２】Ｌｉｐｓｋａｉａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０：３９６−４０６
【非特許文献１３】Ｓｔｅｅｎａａｒｔ  ＮＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２９３：１７−２４
【非特許文献１４】Ｍａｔｔｉａｚｚｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ６８：３６６−３７５
【非特許文献１５】Ｓｃｈｗｉｎｇｅｒ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３１：４７９−４９１
【非特許文献１６】Ｓａｎｄｅ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ５３：３８２−３９１
【非特許文献１７】Ｏｈ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５６：６３−７１
【非特許文献１８】Ｇｉａｉｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２１４−２２１
【非特許文献１９】Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ  ＢＷ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２７：７０−７５
【非特許文献２０】Ｓｉｅｈｒ  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｆｒｏｎｔ  Ｐｅｄｉａｔｒ３：１２
【非特許文献２１】Ｗｅｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ  ３６（５）：４１４−４２１
【非特許文献２２】Ｇｒａｎｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １１７（７）：６４５−６５４
【非特許文献２３】Ｓａｗａｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１１（２）：２６３−２８０
【非特許文献２４】Ｓｐｉｅｋｅｒｋｏｅｔｔｅｒ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １０５：６３９−６４７
【非特許文献２５】Ｓｐｉｅｋｅｒｋｏｅｔｔｅｒ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １９２：２５４−２５７
【非特許文献２６】Ｊｕｎｇ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌａｓｅ  １５２（２）：２９４−３０２
【非特許文献２７】Ｌｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  ３４（６）  ５７７−５８２
【非特許文献２８】Ｌｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）  ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  １１（５）：ｅ０１５５６８９
【非特許文献２９】Ｌｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６：８２４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣ）の異常増殖を調節することができる新しい血管疾患ペプチド治療剤を開発するために、鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、タンパク質ホスファターゼ１（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ１、ＰＰ１）をターゲットにするペプチドであるΨＰＬＢ−ＳＥがバルーン−損傷された（ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ）ラット頸動脈の新生内膜成長（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ）を減少させることを発見し、また、ΨＰＬＢ−ＳＥがＳＥＲＣＡ２ａを活性化させることで、異常なＣａ２＋レベルを調節して、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）でカルパイン−依存性分解からＳＥＲＣＡ２ａを保護することを確認した。これに加えてＶＥＣｓのｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を増加させることで、ＶＥＣｓの機能異常を回復して肺動脈高血圧を緩和させる新たなメカニズムを発見した。本発明者らは、上記の効果らを通じてΨＰＬＢ−ＳＥが血管増殖性疾患の治療戦略の基盤を形成することができることを確認することで、本発明を完成するようになった。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）治療用の薬剤学的な組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）緩和または改善用の食品組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の治療方法を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）を治療するための用途の薬剤学的な組成物を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一態様によると、本発明は、（ａ）タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の薬剤学的な有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）治療用の薬剤学的な組成物を提供する：
【００２１】
本発明者らは平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣ）の異常増殖を調節することができる、新しい血管疾患ペプチド治療剤を開発するために鋭意研究努力した結果、タンパク質ホスファターゼ１（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １、ＰＰ１）をターゲットにするペプチドであるΨＰＬＢ−ＳＥがバルーン−損傷された（ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ）ラット頸動脈の新生内膜成長（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ）を減少させることを発見し、またΨＰＬＢ−ＳＥがＳＥＲＣＡ２ａを活性化させることで、異常なＣａ２＋レベルを調節して、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）でカルパイン−依存性分解からＳＥＲＣＡ２ａを保護することを確認した。これに加えてＶＥＣｓのｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を増加させることで、ＶＥＣｓの機能異常を回復して肺動脈高血圧を緩和させる新たなメカニズムを発見した。本発明者らは、上記の効果らを通じてΨＰＬＢ−ＳＥが血管増殖性疾患の治療戦略の基盤を形成することができることを確認した。
【００２２】
本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、ホスホランバン（ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ）のリン酸化形態（配列表の配列番号１のアミノ酸）で、リン酸化された１６番目のアミノ酸残基セリン（Ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）がこのグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｇｌｕ）、またはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ａｓｐ）に置換された模倣（ｍｉｍｉｃ）ペプチドとしては、タンパク質脱リン酸化酵素１に対して基質類似抑制剤（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として作用する。セリン残基に極性を帯びるリン酸基が結合して負電荷を帯びることになるが、アミノ酸の負電荷を帯びるグルタミン酸とアスパラギン酸の構造的な、電気的な類似性を有する特性を用いて、リン酸化されたセリンの置換モデルとして使用した。アミノ酸が、一般的に、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドは、タンパク質脱リン酸化酵素１（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １、ＰＰ１）の活性部位に結合した後、脱リン酸化されると、基質と酵素が分離されるが、本発明のペプチドは、ＰＰ１酵素の活性部位から分離されなくて（ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）、強力な阻害効果を示すと予想される。
【００２３】
すなわち、本発明の「タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド」は、リン酸化されたＰＬＢの接続ループを模倣したペプチド配列を含むように設計されたペプチドであって、リン酸化されたセリンを含むペプチドと比較してＰＰ１の作用をより強力に遮断することができる。
【００２４】
本発明では、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドである「ΨＰＬＢ−ＳＥ」が血管増殖性疾患である再狭窄の新生内膜成長を阻害し、肺動脈高血圧の症状も緩和できることを示している。ΨＰＬＢ−ＳＥが疾患の表現型として報告されたＶＳＭＣｓの異常増殖とＶＥＣｓの機能異常をそれぞれの特徴的なメカニズムを通じて解決する。
【００２５】
まず、ＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａの分解を抑制することで、ΨＰＬＢ−ＳＥがラット頸動脈の新生内膜成長を弱めることを示す。理学的な条件下で、増加された細胞質Ｃａ２＋レベルは、順番に細胞質Ｃａ２＋レベルを増加させるＳＥＲＣＡ２ａの分解を担当するカルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）の活性化を誘導する。本発明によると、ΨＰＬＢ−ＳＥは、Ｃａ２＋レベルの増加とＳＥＲＣＡ２ａレベルの減少という悪循環を抑制する。
【００２６】
損傷された血管系での新生内膜成長（Ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ）は、血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣｓ）の増殖により大きく促進され、これはＳＥＲＣＡ２ａ（ｓａｒｃｏ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ）活性と連関される。ＳＥＲＣＡ２ａレベルの遺伝子伝達媒介復元は、新生内膜の成長とＶＳＭＣｓの増殖を減少させる。本発明者らは以前の研究で、タンパク質ホスファターゼ１、すなわちΨＰＬＢ−ＳＥをターゲットにするペプチドが心筋細胞でＳＥＲＣＡ２ａ活性を正常化すると報告した。本発明では、ΨＰＬＢ−ＳＥがバルーン−損傷された（ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ）ラット頸動脈の新生内膜増殖を減少させることを発見し、また、高血清培地（合成条件）で培養されたＶＳＭＣｓの増殖及び移動を発見した。
【００２７】
同時に、ΨＰＬＢ−ＳＥは、合成条件下で損傷された頸動脈とＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａの分解を抑制した。カルパイン抑制剤ＭＤＬ２８１７０は、また、合成条件下でＳＥＲＣＡ２ａ分解及びＶＳＭＣ増殖を弱め、これはカルパインがＳＥＲＣＡ２ａを分解することを示す。Ｃａ２＋イオノフォア（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）Ａ２３１８７はＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａ分解を誘導し、これはΨＰＬＢ−ＳＥまたはＭＤＬ２８１７０によって遮断された。また、ΨＰＬＢ−ＳＥはＶＳＭＣｓでＡ２３１８７または合成刺激によって増加された細胞質Ｃａ２＋レベルを正常化させた。総合的に、これらのデータは、ΨＰＬＢ−ＳＥがＳＥＲＣＡ２ａを活性化させることで、異常なＣａ２＋を調節することを示し、これはまた、ＶＳＭＣｓでカルパイン−依存性分解からＳＥＲＣＡ２ａを保護する。これは、肺動脈高血圧でＶＳＭＣｓの異常増殖も同じメカニズムで調節できることをホスホランバンの１６番目のセリン残基のリン酸化を確認しＳＥＲＣＡ２ａの活性を測定することにより証明し、実際に肺動脈平滑筋細胞の増殖を抑制することを細胞増殖の代表タンパク質の発現と増殖分析実験を通じて確認した。
【００２８】
また、これに加えてＶＥＣｓのｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を増加させることで、ＶＥＣｓの機能異常を回復して肺動脈高血圧を緩和させる新しいメカニズムを示す。モノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ、ＭＣＴ）に誘導した肺動脈高血圧ラットとマウスで特徴的な表現型である血管肥厚、血管外膜組織の線維症、また、炎症反応をΨＰＬＢ−ＳＥが緩和させることを証明した。また、肺動脈高血圧の動物モデルの肺組織でΨＰＬＢ−ＳＥの処理がｅＮＯＳのリン酸化を回復させてくれるだけでなく、炎症反応のメカニズムに関するＢＭＰＲ２の発現とｅＩＦ２αのリン酸化レベルも回復されることを確認した。
【００２９】
ＶＥＣｓで新しいメカニズムを糾明するためにＰＰ１とｅＮＯＳ、また知られている上位物質であるＡｋｔとの相互作用を確認し、これを通じてＰＰ１はｅＮＯＳではないＡｋｔと直接的な相互作用を確認し、ΨＰＬＢ−ＳＥによって作用が阻害されることを確認した。また、実際のΨＰＬＢ−ＳＥの処理により増加されたＡｋｔとｅＮＯＳのリン酸化がＰＰ１を抑制することにより調整できるかを確認するために、Ａｋｔの上位リン酸化酵素であるＰＩ３Ｋの阻害剤であるＬＹ２９４００２を処理してリン酸化を相殺しΨＰＬＢ−ＳＥを処理してＡｋｔ−ｅＮＯＳのリン酸化の増加を確認した。また、Ａｋｔ阻害剤であるＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶ処理後、ΨＰＬＢ−ＳＥによるｅＮＯＳのリン酸化の増加効果が相殺されることを確認した。このようなΨＰＬＢ−ＳＥによるｅＮＯＳ活性の増加は、ＭＣＴで肺動脈高血圧を誘導した動物組織実験を通じても確認することができた。
【００３０】
これに加えてＣＰＰの細胞透過効能を確認する実験を進めたが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の比較実験を通じて様々な形態の細胞透過性ペプチドがΨＰＬＢ−ＳＥに対して同じ効果を得ることができることを証明した。本発明者らは、これらの効果を通じてΨＰＬＢ−ＳＥが血管増殖性疾患の治療戦略の基盤を形成することができると結論付けた。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）治療用の組成物に関するものである。
（ｂ）本発明者らは、配列表の配列番号１（ホスホランバン）のアミノ酸配列のうち、１４番目から２２番目のアミノ酸配列を含む模倣（ｍｉｍｉｃ）ペプチド（ΨＰＬＢ−ＳＥ）を製造し、ΨＰＬＢ−ＳＥがタンパク質脱リン酸化酵素１（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １、ＰＰ１）をターゲットすることにより、合成条件（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下のＶＳＭＣでＳＥＲＣＡ２ａのレベルと活性の両方を復元させることを立証した。
（ｃ）さらに、血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ、ＶＥＣｓ）ｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を増加させることで、ＶＥＣｓの機能異常を回復して肺動脈高血圧を緩和させる新たなメカニズムを発見した。
（ｄ）これのより、ΨＰＬＢ−ＳＥは、血管疾患治療のための治療戦略の基礎となることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１ａ】ラット頸動脈にカテーテル−誘導バルーン損傷を誘導した。損傷された部位は、５μｌのΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照（Ｃｏｎ）ペプチドで３０分間処理した。頸動脈を切除しヘマトキシリンとエオシンで染色するか（上部のパネル）、治療１０日後にα−ＳＭＡ（中間のパネル）及びＰＣＮＡ（下段のパネル）に対する抗体で免疫染色した。内膜／培地の割合を計算した（ｎ＝８）。スケールバー、５０μｍ。
【図１ｂ】ラット頸動脈にカテーテル−誘導バルーン損傷を誘導した。損傷された部位は、５μｌのΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照（Ｃｏｎ）ペプチドで３０分間処理した。胸部大動脈（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｏｒｔａ）から分離されたＲＡＳＭＣを０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加されたＤＭＥＭで５日間培養して収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加されたＤＭＥＭで２４時間培養して、３μＭΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照ペプチドの存在下での合成表現型（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した。免疫染色は、ＰＣＮＡに対する抗体（赤）で行った。核はＨｏｅｃｈｓｔ（青）で染色した。代表併合画像を表示した。スケールバー、５０μｍ。
【図１ｃ】ラット頸動脈にカテーテル−誘導バルーン損傷を誘導した。損傷された部位は、５μｌのΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照（Ｃｏｎ）ペプチドで３０分間処理した。細胞生存能力の分析キットを使用して、細胞増殖を定量化した。
【図２ａ】頸動脈を切断してペプチド処理１０日後にＳＥＲＣＡ２ａまたはＳＥＲＣＡ２ｂ（赤）及びα−ＳＭＡ（緑）に対する抗体で免疫染色した。併合された画像を表示した（下段）。ａ、外膜（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａ）；ｅｃ、内皮細胞層（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）；ｍ、内層（ｍｅｄｉａｌ  ｌａｙｅｒ）；ｎｉ、新生内膜層（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｌａｙｅｒ）。スケールバー、５０μｍ。
【図２ｂ】胸部大動脈から分離されたＲＡＳＭＣを５日間、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで収縮させて収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した後、３μＭΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照ペプチドのの存在下で１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで５日間培養して合成表現型を誘導した。ＳＥＲＣＡ２ａまたはＳＥＲＣＡ２ｂ（緑）及びＰＣＮＡ（赤）に対する抗体で免疫染色を行った。核はＨｏｅｃｈｓｔ（青）で染色した。代表併合画像を表示した。スケールバー、５０μｍ。
【図２ｃ】細胞抽出物のウェスタンブロット分析。
【図２ｄ】ΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照ペプチドで処理した胸部大動脈のエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養。組織抽出物をウェスタンブロッティングした。データは、平均±標準偏差で示した（ｎ＝３−４；＊，  Ｐ＜０．０５）。
【図３ａ】ＲＡＳＭＣは、図２ｂに説明されたのと同じ条件でカルパイン抑制剤ＭＤＬ２８１７０またはＤＭＳＯを処理した。ＳＥＲＣＡ２ａまたはＳＥＲＣＡ２ｂ（緑）及びＰＣＮＡ（赤）に対する抗体で免疫染色を行った。核はＨｏｅｃｈｓｔ（青）で染色した。代表併合画像を表示した。スケールバー、５０μｍ。
【図３ｂ】細胞抽出物のウェスタンブロット分析。データは、平均±標準偏差で示した（ｎ＝３−４；＊，  Ｐ＜０．０５）。
【図４ａ】ＨＣＳＭＣを３μＭ  ΨＰＬＢ−ＳＥと１５μＭ  ＭＤＬ２８１７０で１時間の間、前処理した後、５０μＭ  Ａ２３１８７で２時間の間処理した。ＳＥＲＣＡ２ａ及びＳＥＲＣＡ２ｂ（緑）に対する抗体で免疫染色した。核はＨｏｅｃｈｓｔ（青）で染色した。代表併合画像を表示した。スケールバー、５０μｍ。
【図４ｂ】ＨＣＳＭＣを３μＭ  ΨＰＬＢ−ＳＥと１５μＭ  ＭＤＬ２８１７０で１時間の間、前処理した後、５０μＭ  Ａ２３１８７で２時間の間処理した。細胞抽出物を使用してウェスタンブロット分析を行った。データは、平均±標準偏差で示した（ｎ＝３−４；＊，  Ｐ＜０．０５）。
【図４ｃ】ＨＣＳＭＣを３μＭ  ΨＰＬＢ−ＳＥと１５μＭ  ＭＤＬ２８１７０で１時間の間、前処理した後、５０μＭ  Ａ２３１８７で２時間の間処理した。基準Ｃａ２＋濃度はＩｏｎＯｐｔｉｘカルシウムイメージングシステムで測定した。
【図４ｄ】図１ｂと同じ条件下でＲＡＳＭＣにΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照ペプチドを処理した。基準（ｂａｓｅｌｉｎｅ）Ｃａ２＋濃度は、ＩｏｎＯｐｔｉｘカルシウムイメージングシステム（＊，  Ｐ＜０．０５）で測定した。
【図５ａ】ＲＡＳＭＣは収縮性または合成培地で培養した後、スクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ）した。対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチドを添加し、２４時間の間培養した。細胞移動の相対距離は、位相差顕微鏡で測定した。赤線はＲＡＳＭＣ培養物の境界を示す。代表画像（左）及び細胞移動距離（右）を示した（ｎ＝４）。スケールバー、５０μｍ。
【図５ｂ】ＲＡＳＭＣは収縮性または合成培地で培養した後、スクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ）した。対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチドを添加し、２４時間の間培養した。細胞移動の相対距離は、位相差顕微鏡で測定した。赤線はＲＡＳＭＣ培養物の境界を示す。代表画像（左）及び細胞移動距離（右）を示した（ｎ＝４）。スケールバー、５０μｍ。
【図５ｃ】ＲＡＳＭＣは収縮性培地で培養し、合成表現型は、対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチド３μＭの存在下にＰＤＧＦ−ＢＢを添加することによって誘導した。免疫染色は、ＰＣＮＡに対する抗体（赤）で行った。核はＨｏｅｃｈｓｔ（青）で染色した。代表併合画像を表示した。スケールバー、５０μｍ。
【図５ｄ】細胞生存能力の分析キットを使用して、細胞増殖を定量化した。
【図５ｅ】ＲＡＳＭＣは、図５ｃで説明したのと同じ条件下で、スクラッチ分析を実施した。代表画像（左）と細胞移動距離（右）を示す。スケールバー、５０μｍ。
【図５ｆ】ＲＡＳＭＣは、図５ｃで説明したのと同じ条件下で、スクラッチ分析を実施した。代表画像（左）と細胞移動距離（右）を示す。スケールバー、５０μｍ。
【図６ａ】ＲＡＳＭＣは対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチド３μＭの存在下で収縮性または合成培地で培養された。ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成を防止するために、シクロヘキシミド（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を５μｇ／ｍｌの最終濃度で培地に添加した。培養０日、３日及び５日後に細胞を収穫し、タンパク質抽出物をウェスタンブロッティングした。データは、平均±標準偏差で示した（ｎ＝３−４；＊，  Ｐ＜０．０５）。
【図６ｂ】ＲＡＳＭＣは対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチド３μＭの存在下で収縮性または合成培地で培養された。ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成を防止するために、シクロヘキシミド（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を５μｇ／ｍｌの最終濃度で培地に添加した。培養０日、３日及び５日後に細胞を収穫し、タンパク質抽出物をウェスタンブロッティングした。データは、平均±標準偏差で示した（ｎ＝３−４；＊，  Ｐ＜０．０５）。
【図７】ΨＰＬＢ−ＳＥは、ＶＳＭＣでＰＬＢ脱リン酸化を減少させる。図２ｃに示したタンパク質サンプルでウェスタンブロッティングした。ＰＬＢまたはホスホ−ＰＬＢ抗体を使用した。データは、平均±標準偏差で示した（ｎ＝３−４；＊，  Ｐ＜０．０５）。
【図８ａ】ラットに６０ｍｇ／ｋｇのＭＣＴを注入し、１週間間隔で４回ペプチド（ΨＰＬＢ−ＳＥ）を気管内吸入で投与して治療効果を確認するための実験である。４週目のラットを胸部開放状態で右心カテーテル法を実施して収縮期末右心室血圧（ＲＶＥＳＰ）、左心室血圧（ＬＶＥＳＰ）、弛緩期末右心室血圧（ＲＶＥＤＰ）、左心室血圧（ＬＶＥＤＰ）、そして心拍出量（ＣＯ）を測定した（シャム（Ｓｈａｍ）  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝５，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ）。
【図８ｂ】ラットに６０ｍｇ／ｋｇのＭＣＴを注入し、１週間間隔で４回ペプチド（ΨＰＬＢ−ＳＥ）を気管内吸入で投与して治療効果を確認するための実験である。４週目のラットを胸部開放状態で右心カテーテル法を実施して収縮期末右心室血圧（ＲＶＥＳＰ）、左心室血圧（ＬＶＥＳＰ）、弛緩期末右心室血圧（ＲＶＥＤＰ）、左心室血圧（ＬＶＥＤＰ）、そして心拍出量（ＣＯ）を測定した（シャム（Ｓｈａｍ）  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝５，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ）。
【図９ａ】図８ａ−８ｂと同じ条件で、（図９ａ）ヘマトキシリンとエオシン染色を通じて肺動脈の肥厚の程度を確認し、（図９ｂ）ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳとｔｏｔａｌ  ｅ  ＮＯＳ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図９ｂ】図８ａ−８ｂと同じ条件で、（図９ａ）ヘマトキシリンとエオシン染色を通じて肺動脈の肥厚の程度を確認し、（図９ｂ）ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳとｔｏｔａｌ  ｅ  ＮＯＳ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１０ａ】図８ａ−８ｂのような条件で、（図１０ａ）肺動脈外膜の線維症の程度を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を通じて確認し、（図１０ｂ）ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、αＳＭＡ、ＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１０ｂ】図８ａ−８ｂのような条件で、（図１０ａ）肺動脈外膜の線維症の程度を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を通じて確認し、（図１０ｂ）ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、αＳＭＡ、ＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１１ａ】図８ａ−８ｂと同じ条件で、（図１１ａ）ＢＭＰＲ２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２ａ、ＧＡＰＤＨ抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析し、（図１１ｂ−１１ｄ）の肺組織でサイトカインミクスチャーキットを用いて炎症反応性サイトカインの含有量を測定した（Ｓｈａｍ  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝４，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１１ｂ】図８ａ−８ｂと同じ条件で、（図１１ａ）ＢＭＰＲ２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２ａ、ＧＡＰＤＨ抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析し、（図１１ｂ−１１ｄ）の肺組織でサイトカインミクスチャーキットを用いて炎症反応性サイトカインの含有量を測定した（Ｓｈａｍ  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝４，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１１ｃ】図８ａ−８ｂと同じ条件で、（図１１ａ）ＢＭＰＲ２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２ａ、ＧＡＰＤＨ抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析し、（図１１ｂ−１１ｄ）の肺組織でサイトカインミクスチャーキットを用いて炎症反応性サイトカインの含有量を測定した（Ｓｈａｍ  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝４，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１１ｄ】図８ａ−８ｂと同じ条件で、（図１１ａ）ＢＭＰＲ２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２ａ、ＧＡＰＤＨ抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析し、（図１１ｂ−１１ｄ）の肺組織でサイトカインミクスチャーキットを用いて炎症反応性サイトカインの含有量を測定した（Ｓｈａｍ  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝４，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１２ａ】マウスに６００ｍｇ／ｋｇのＭＣＴを注入して２週目から１週間間隔で４回ペプチド（ΨＰＬＢ−ＳＥ）を気管内吸入で投与して治療効果を確認するための実験である。（図１２ａ）ヘマトキシリンとエオシン染色を通じて肺動脈の肥厚の程度を確認し、（図１２ｂ）ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳとｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、ＳＥＲＣＡ２ａ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１２ｂ】マウスに６００ｍｇ／ｋｇのＭＣＴを注入して２週目から１週間間隔で４回ペプチド（ΨＰＬＢ−ＳＥ）を気管内吸入で投与して治療効果を確認するための実験である。（図１２ａ）ヘマトキシリンとエオシン染色を通じて肺動脈の肥厚の程度を確認し、（図１２ｂ）ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳとｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、ＳＥＲＣＡ２ａ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１３ａ】図１２ａ−１２ｂのような条件で、（図１３ａ）肺動脈外膜の線維症の程度を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を通じて確認し、（図１３ｂ）Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、αＳＭＡ、ＧＡＰＤＨのタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。また、（図１３ｃ）のリアルタイム定量的なＲＴ−ＰＣＲを通じて、ＴＧＦ−β１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  １、αＳＭＡのｍＲＮＡ発現の程度を定量分析した。
【図１３ｂ】図１２ａ−１２ｂのような条件で、（図１３ａ）肺動脈外膜の線維症の程度を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を通じて確認し、（図１３ｂ）Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、αＳＭＡ、ＧＡＰＤＨのタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。また、（図１３ｃ）のリアルタイム定量的なＲＴ−ＰＣＲを通じて、ＴＧＦ−β１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  １、αＳＭＡのｍＲＮＡ発現の程度を定量分析した。
【図１３ｃ】図１２ａ−１２ｂのような条件で、（図１３ａ）肺動脈外膜の線維症の程度を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を通じて確認し、（図１３ｂ）Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、αＳＭＡ、ＧＡＰＤＨのタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。また、（図１３ｃ）のリアルタイム定量的なＲＴ−ＰＣＲを通じて、ＴＧＦ−β１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  １、αＳＭＡのｍＲＮＡ発現の程度を定量分析した。
【図１４ａ】図１２ａ−１２ｂと同じ条件で、（図１４ａ）肺組織全体の単核細胞浸潤のような炎症反応の程度をヘマトキシリンとエオシン染色を通じて確認し、（図１４ｂ）リアルタイム定量的なＲＴ−ＰＣＲを通じてＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、Ｆ４／８０、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現の程度を定量分析した（ｓｈａｍ，  ＭＣＴ，  ΨＰＬＢ−ＳＥ，  ｎ＝４；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１４ｂ】図１２ａ−１２ｂと同じ条件で、（図１４ａ）肺組織全体の単核細胞浸潤のような炎症反応の程度をヘマトキシリンとエオシン染色を通じて確認し、（図１４ｂ）リアルタイム定量的なＲＴ−ＰＣＲを通じてＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、Ｆ４／８０、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現の程度を定量分析した（ｓｈａｍ，  ＭＣＴ，  ΨＰＬＢ−ＳＥ，  ｎ＝４；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１５ａ】図１２ａ−１２ｂと同じ条件で、肺組織でサイトカインミクスチャーキットを用いて、炎症反応性サイトカインの含有量を測定した（Ｓｈａｍ  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝４，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１５ｂ】図１２ａ−１２ｂと同じ条件で、肺組織でサイトカインミクスチャーキットを用いて、炎症反応性サイトカインの含有量を測定した（Ｓｈａｍ  ｎ＝３，  ＭＣＴ  ｎ＝４，  ΨＰＬＢ−ＳＥ  ｎ＝６；  ＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｓｈａｍ；  ＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＣＴ）。
【図１６ａ】ＰＡＥＣを３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥで１時間処理し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（ｓｅｒ１１７７）、ｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３、Ｔｈｒ３０８）、ｔｏｔａｌ  Ａｋｔ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質の発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１６ｂ】ＰＡＥＣを３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥで１時間処理し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（ｓｅｒ１１７７）、ｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３、Ｔｈｒ３０８）、ｔｏｔａｌ  Ａｋｔ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質の発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１６ｃ】肺組織の溶解物をＰＰ１抗体を用いた免疫沈降法でΨＰＬＢ−ＳＥを処理の有無によるＰＰ１とｅＮＯＳ、Ａｋｔの相互作用を、それぞれの抗体で確認した。
【図１７ａ】ＰＡＥＣを５０μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２で２４時間処理し、３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥで１時間処理した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（ｓｅｒ１１７７）、ｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３、Ｔｈｒ３０８）、ｔｏｔａｌ  Ａｋｔ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１７ｂ】ＰＡＥＣを１０μＭのＡｋｔ阻害剤であるＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶで２時間処理し、３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥで１時間処理した。ｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１７ｃ】ＰＡＥＣを１００ｎＭのＰＰ１阻害剤であるＯＡを２４時間処理し、３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥで１時間処理した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（ｓｅｒ１１７７）、ｔｏｔａｌ  ｅＮＯＳ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（ｓｅｒ４７３、ｔｈｒ３０８）、ｔｏｔａｌ  Ａｋｔ、そしてＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１８ａ】ＰＡＳＭＣを３日間０．１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭで収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した後、３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥの存在下で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで３日間培養して合成表現型（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＬＢ（ｓｅｒ１６）、ｔｏｔａｌ  ＰＬＢは、そしてＧＡＰＤＨ抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。データは±標準偏差で示した。（ｎ＝３〜４；＊，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ；＃，  Ｐ＜０．０５  ｖｓ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｃｏｎ）
【図１８ｂ】ＰＡＳＭＣを３日間０．１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭで収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した後、３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥの存在下で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで３日間培養して合成表現型（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した。カルシウム再吸収実験を通してＳＥＲＣＡ２ａの活性を測定した。
【図１９ａ】ＰＡＳＭＣｓを３日間０．１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭで収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した後、３μＭのｄＮＰ２で２４時間の間処理した。処理後１２時間と２４時間でＰＣＮＡとＧＡＰＤＨの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図１９ｂ】ＰＡＳＭＣｓを３日間０．１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭで収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した後、３μＭのｄＮＰ２で２４時間の間処理した。ＥＺ−ＣｙＴｏｘ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて、細胞増殖分析を行った。
【図２０ａ】ＰＡＥＣｓに、３つの形態（ｄＮＰ２、ｌｉｎｅａｒ  ＴＡＴ、ｃｙｃｌｉｃ  ＴＡＴ）の３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥを１時間処理してｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ、ｅＮＯＳとｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、Ａｋｔの抗体を用いてタンパク質発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。
【図２０ｂ】図１８と同じ条件で、ＰＡＳＭＣの３つの形態（ｄＮＰ２、ｌｉｎｅａｒ  ＴＡＴ、ｃｙｃｌｉｃ  ＴＡＴ）の３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥの存在下で、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＬＢ（ｓｅｒ１６）、ｔｏｔａｌ  ＰＬＢは、そしてＧＡＰＤＨ抗体を用いてタンパク質の発現をウェスタンブロッティングを通じて定量分析した。（ｌｉＴＡＴ＝ｌｉｎｅａｒ  ＴＡＴ、ｃＴＡＴ＝ｃｙｃｌｉｃ  ＴＡＴ）
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列のうち、１４番目から２２番目のアミノ酸配列を含む模倣（ｍｉｍｉｃ）ペプチドであって、上記配列表の配列番号１のアミノ酸配列のうち、１６番目のアミノ酸残基であるリン酸化されたセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）がグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｇｌｕ）、またはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ａｓｐ）に置換されたアミノ酸配列で構成される。より明確には、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドで、上記の１６番目のアミノ酸配列はセリン（ｓｅｒｉｎｅ）またはリン酸化されたセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ）ではない。
【００３４】
本発明の一実施形態によると、上記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、配列表の配列番号２から配列番号６のアミノ酸配列で構成された群から選択されることができる。本発明の他の実施形態によると、上記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドは、配列表の配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列で構成されている。上記配列表の配列番号２から配列番号６のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドに対しては、大韓民国登録特許第１０−１５１６７９１号に詳細に記載されている。
【００３５】
本発明の実施例で使用されたタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドは、「Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ」配列のペプチドでリン酸化されたセリン残基をグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｇｌｕ）、またはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ａｓｐ）に置換して製造することができる。
【００３６】
上記配列表の配列番号２から配列番号６は、以下の通りである。下線付きの部分は、グルタミン酸またはアスパラギン酸に置換されたアミノ酸部位を示す：
配列表の配列番号２：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
配列表の配列番号４：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
配列表の配列番号４：Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
配列表の配列番号５：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ
配列表の配列番号６：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ
【００３７】
本発明によると、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドは、下記一般式Ｉで表示されるアミノ酸配列で構成することができる：
Ｘ１−Ａｌａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ４  （Ｉ）
上記Ｘ１は、０−２０個のアミノ酸残基、上記Ｘ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ３はＴｈｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ、上記Ｘ４は、０−３０個のアミノ酸残基を示す。
【００３８】
本発明の一実施形態によると、本発明の一般式ＩのＸ１は０−２０個、０−１０個、０−３個または０−１個のアミノ酸残基である。本発明の一実施形態によると、本発明の一般式ＩのＸ４は、０−３０個、０−２０個、０−１０個または０−３個のアミノ酸残基である。
【００３９】
本発明の他の実施形態によると、上記Ｘ１は、０−２０個のアミノ酸残基であり、上記Ｘ４は、０−２０個のアミノ酸残基である。
【００４０】
本発明の他の実施形態によると、上記Ｘ１は、０−１個のアミノ酸残基であり、上記Ｘ４は、０−３個のアミノ酸残基である。本発明の特定の実施形態によると、上記Ｘ１はＡｒｇである。本発明の他の特定の実施形態によると、上記Ｘ４はＭｅｔ、Ｍｅｔ−ＰｒｏまたはＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎである。
【００４１】
上記一般式Ｉに表示されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２から配列番号６のアミノ酸配列で構成された群から選択されることができる。
【００４２】
一方、上記一般式Ｉで、Ｘ１及びＸ４は、本発明のペプチドが細胞質に存在することを妨げることができるアミノ酸ドメイン（例えば、膜−貫通ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）及び／または細胞小器官−ターゲットドメイン（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含まない。
【００４３】
本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、変形された側鎖を有する、一つ以上のアミノ酸があるペプチドを含むことができる。側鎖変形の例は、還元アルキル化反応；メチルアセトイミデートによるアミド化；無水酢酸によるアルキル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ酸のトリニトロベンジル化；無水コハク酸によるアミノ基のアルキル化；及びピリドキサール−５−ホスフェート処理後、ＮａＢＨ４に還元されたピリドキシル化のようなアミノ基の変形を含む。
【００４４】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールとグリオキサールのような試薬によるヘテロ環縮合物の形成に変形されることができる。カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレア形成によってカルボジイミド活性をして続いて誘導体化、例えば、アミド化で誘導体化して変形させることができる。
【００４５】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸へのパフューム酸酸化；他のチオール化合物による混合されたジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドによる反応；４−クロロ第二水銀安息香酸、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール及び他の水銀剤を使用した水銀誘導体の形成；塩基ｐＨでシアネートによるカルバモイル化のような方法によって変形されることができる。システイン残基のどのような変形も、ペプチドが必要とするジスルフィド結合を形成するのに影響を及ぼさないべきである。また、システインのスルフヒドリル基はセレニウム等価物に代替することができ、これによりペプチドには、１つ以上のジスルフィド結合の位置にジセレニウム結合が形成されることができる。
【００４６】
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモコハク酸イミドによる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルホニルハロゲニドによるインドール環のアルキル化によって変形されることができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化により変形して３−ニトロチロシン誘導体を形成させることができる。
【００４７】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の変形は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるＮ−カルベトキシル化によって行われることができる。
【００４８】
プロリン残基は、例えば、４−位置でのヒドロキシ化によって変形されることができる。
【００４９】
本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、これのアミノ酸残基を変形させることで、さらに安定性を向上させることができる。例えば、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、少なくとも一つのアミノ酸は、アセチル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。
【００５０】
本発明の一実施形態によると、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、アセチル基の保護基が結合されることができる。
【００５１】
本明細書において、用語「安定性」は、インビボでの安定性だけでなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。上述した保護基はインビボでタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００５２】
本発明によると、本発明で利用可能なタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のアミノ酸配列は、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド配列に実質的に同一性を有するペプチド配列を含むと解釈される。本明細書の用語「実質的な同一性」は、二つのアミノ酸配列を最大限に対応するようにアライメントし、ＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのような当業界で通常的に用いられるアルゴリズムまたは目視検査を用いて、アライメントされた配列を分析した場合に、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列相同性を共有することを意味する。配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。アライメントに対する様々な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ．（１９８１）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ．（１９７０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ．（１９８８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４：３０７−３１；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ．（１９８８）  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ．（１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｃｏｍｐ  Ａｐｐｌ  ＢｉｏＳｃｉ  ８：１５５−６５  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４：３０７−３１に開示されている。
【００５３】
本発明によると、上記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、細胞膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）がさらに結合されることができる。上記細胞透過性ペプチドは、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドのＮ−末端及び／またはＣ−末端に結合されることができる。
【００５４】
本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を細胞内に運ぶためには、上記のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドが細胞膜透過性ペプチド、またはこれと類似した機能を実行することができる輸送手段を含んでいるべきである。本明細書の用語、細胞膜透過性ペプチドは、特定のペプチドを細胞内に運ぶために必須的なペプチドであって、通常１０−５０個またはそれ以上のアミノ酸の配列で構成されることができる。
【００５５】
上記細胞膜透過性ペプチドは、それ自体にリン脂質二重膜の細胞膜を通過することができるアミノ酸配列を有するペプチドであり、例えば、ｄＮＰ２、Ｔａｔ−由来ペプチド、シグナルペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）、アルギニン−リッチペプチド、トランスポータンまたは両親媒性ペプチドキャリアなどを含むが，これに限定されるものではない（Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：１１７３−１１７６；Ｄｕｐｏｎｔ  ＡＪ．  Ａｎｄ  Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ  Ａ．（２００２）  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｈａｌｏｉｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（３７）：１１１７９−８７；及びＬｕｎｄｂｅｒｇ  Ｐ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ  Ｕ．（２００３）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １６（５）：２２７−２３３）。また、上記のような天然的な配列と共に、レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｏ）及びＤ−異性体ペプチドを含む、細胞膜透過性質を有する様々なアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）−基礎ペプチドらが知られている［Ｂｒｕｇｉｄｏｕ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２１４（２）：６８５−９３；Ｄｅｒｏｓｓｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８：８４−８７］。
【００５６】
本発明の一実施形態によると、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）と細胞膜透過性ペプチドは、リンカーペプチドで接続することができる。上記リンカーペプチドは、１から５０個のアミノ酸からなることができ、４から２０個または４から１５個のアミノ酸からなることができる。また、上記リンカーペプチドは、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ、Ａ）、またはその組み合わせで構成されることができる。本発明の一実施形態によると、上記リンカーペプチドの配列は（Ｇ）ｎのアミノ酸配列で構成されることができる（ただし、上記ｎ及び整数１から２０である）。本発明の他の実施形態によると、上記リンカーペプチドは、（Ｇ）３から（Ｇ）１０のアミノ酸で構成されることができる。本発明の他の実施形態によると、上記リンカーペプチドは、（Ｇ）３から（Ｇ）５のアミノ酸で構成されることができる。本発明の特定の実施形態によると、上記リンカーペプチドは、（Ｇ）３のアミノ酸で構成されることができる。
【００５７】
本明細書において、用語「血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」は、心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、肺血管疾患（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、脳血管疾患（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、動脈硬化症（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、血管狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）または高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を含み、これに限定されるものではない。
【００５８】
本明細書において、用語「高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）」は、様々な形態、診断、レベルまたは段階（ｓｔａｇｅ）の高血圧を意味する。本発明の一実施形態によると、上記高血圧は、肺高血圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）である。上記肺高血圧は、肺動脈高血圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）及び肺静脈高血圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｖｅｎｏｕｓ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）などを含み、これに限定されるものではない。本発明の特定の実施形態によると、上記高血圧は肺動脈高血圧である。
【００５９】
一方、上記高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）は、高血圧性血管疾患（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高血圧性肺疾患（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高血圧性脳症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、高血圧性心疾患（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高血圧性腎硬化症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、または高血圧性網膜症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）などを含むことができる。
【００６０】
本明細書では、血管狭窄は、心血管狭窄（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、頸動脈狭窄（ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、脳血管狭窄（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、肺動脈狭窄（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、腎動脈狭窄（ｒｅｎａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、大腿動脈狭窄（ｆｅｍｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、下肢動脈狭窄（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｂ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）及び血管再狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）を含み、これに限定されるものではない。上記血管再狭窄は、血管外科術（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ）または血管形成術（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）によって発生することができる。
【００６１】
本明細書において、用語「血管増殖性疾患」は、血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣ）の異常増殖によって現れる疾患である。血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣ）の異常増殖は、アテローム性動脈硬化症や大動脈弁膜再狭窄のような複数の血管増殖性疾患の根本的な原因になる。これに本発明では、血管平滑筋細胞の増殖を抑制するためのメカニズムとしてＳＥＲＣＡ２ａの分解を抑制して、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を上向調節する方法を用い、具体的には、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ；ＰＰ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を用いた。上記タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチドは、ＰＬＢ（ホスホランバン）のＰＰ１（タンパク質ホスファターゼ１）−媒介脱リン酸化を強力に抑制する。
【００６２】
本発明で、血管増殖性疾患は、具体的には、合成表現型（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を有するＶＳＭＣの異常増殖に起因する疾患である。本発明の一実施形態によると、１０％ＦＢＳの高濃度血清培地（合成条件、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で培養されたラット大動脈平滑筋細胞（ｒａｔ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＲＡＳＭＣ）は、合成表現型（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示す。本発明の他の実施形態によると、合成条件下でＲＡＳＭＣでＳＥＲＣＡ２ａレベルが減少し（合成表現型の獲得）、このＳＥＲＣＡ２ａ減少は、本発明のタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（例えば、ΨＰＬＢ−ＳＥ）によって再び完全に抑制される（図２ｂ）。
【００６３】
本発明の薬剤学的な組成物は、経口（ｏｒａｌｌｙ）または非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与されることができ、非経口投与される場合、血管内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与、鼻腔投与／吸入または気道吸入（ａｉｒｗａｙ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）に投与されることができる。
【００６４】
吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）を通じた薬物伝達は、鼻腔または気道を通過して肺の粘膜を通じて直接肺細胞に薬物を伝達する非侵襲的な（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）方法の一つで、特に肺疾患の幅広い治療にエアロゾル（またはスプレー）伝達を通じた核酸またはペプチド伝達が有利に用いられることができる。これは、肺の解剖学的な構造及び位置が迅速な、かつ非侵襲的なアプローチを可能にし、他の器官には影響を及ぼさないながら、またはペプチドの伝達システムの局所適用を受けることができるからである。したがって、本発明の治療組成物として肺疾患、特に肺血管疾患（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）に関した（ｉ）核酸を結合させた核酸伝達複合体、または（ｉｉ）ペプチドが担持された担体（ｃａｒｒｉｅｒ）または粉末粒子をエアロゾル方式で肺に伝達すると、上記の疾患に対する予防または治療効果を期待することができる。吸入投与用の剤形のために、核酸伝達複合体またはペプチド伝達担体がナノ粒子のサイズを有するように製造することができる。
【００６５】
一例として、核酸伝達複合体の有効成分を含んでいるエアロゾルの形態の呼吸器内投与用の薬学製剤を製造するために、（ｉ）上記核酸構造の安定化のために共重合体と結合するか、または（ｉｉ）上記核酸配列をウイルス性／非ウイルス性ベクターに挿入することにより、核酸伝達複合体を製造することができる。
【００６６】
他の例として、ペプチドの有効成分を含むエアロゾルの形態の呼吸器内投与用の薬学製剤を製造するために、上記ペプチドの有効成分を安定担体（ｃａｒｒｉｅｒ）またはビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）内に捕集し、薬学的に許容可能な水性または非−水性液体の懸濁液または溶液、または、水中油または油中水エマルジョンと混合することにより製造されることができる。または、ペプチドの有効成分の呼吸可能乾燥粒子を含有する固体微粒子組成物に製造されることができる。上記ペプチドの有効成分を含有する固体微粒子組成物は、選択的にエアロゾルの形成を促進するように提供される分散剤を含むことができる。
【００６７】
本発明の組成物がエアゾールまたはスプレー形態の鼻腔／呼吸器内投与用の薬学製剤として使用される場合には、呼吸器内または鼻腔吸入／投与装置を含むキットに製造されることができる。このキットは、エアロゾルまたはスプレー発生器及び吸入器を含むことができる。上記吸入器は、ネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）またはインサフレータから（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）を含むことができる。
【００６８】
本明細書の用語「薬剤学的な有効量」は、対象体に投与される、血管疾患の治療に十分な量を意味する。
【００６９】
本発明の薬剤学的な組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。上記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的な組成物は、上記成分らの以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００７０】
本発明の薬剤学的な組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食品、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因らによって多様であり、普通に熟練した医師は、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい実施形態によると、本発明の薬剤学的な組成物の１日投与量は、０．００１−１００００ｍｇ／ｋｇである。
【００７１】
本発明の薬剤学的な組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法に応じて、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量形態に製造するか、または多容量容器内に入れて製造されることができる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態である可能性もあり、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。例えば、本発明の治療組成物は、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）又はこれを発現する核酸伝達複合体をエアロゾル伝達を通じて標的部位に伝達されるように、吸入投与用の剤形（エアゾール剤形）に製剤化することができる。
【００７２】
本発明の他の態様によると、本発明は、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）を治療するための用途の組成物であって、（ａ）タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の薬剤学的な有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む薬剤学的な組成物を提供する。
【００７３】
本発明のさらに他の態様によると、本発明は、タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）緩和または改善用の食品組成物を提供する。
【００７４】
本発明の食品組成物は、上述した本発明の血管疾患治療用の薬剤学的な組成物と同じ有効成分を用いるものであって、この両者の間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００７５】
本発明のさらに他の態様によると、本発明は、（ａ）タンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の薬剤学的な有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む薬剤学的な組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の治療方法を提供する：
【００７６】
本発明の血管疾患の治療方法は、上述した本発明の血管疾患治療用の薬剤学的な組成物を利用するものであって、この両者の間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００７７】
本明細書において、用語「投与」は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明の薬剤学的な組成物の投与経路は、目的組織に到達することができる限り、一般的なすべての経路を通じて経口または非経口投与されることができる。また、本発明の組成物は、有効成分を標的細胞に伝達することができる任意の装置（例えば、ナノパーティクル噴射器）を用いて投与することもできる。
【００７８】
本明細書において、用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、特に限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、牛、馬、羊、豚、鶏、七面鳥、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ネズミ、ウサギ、またはモルモットを含み、好ましくは哺乳類、より好ましくは、ヒトを意味する。
【００７９】
以下、実施例を通じて本発明について詳細に説明する。これらの実施例は、ただ、本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明の目的と要旨に応じて、本発明の範囲が実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００８０】
実験方法
１．倫理規定（Ｅｔｈｉｃｓ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）
Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットとＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた動物実験は、ソウル大学病院と梨花女子大学、そして光州科学技術院の動物管理と倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けて、米国立保健院（国立アカデミー）で発行した実験動物の管理及び使用案内書（Ｐｒｅｓｓ、８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１１）に応じて行われた。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒの８週齢雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、すべての実験を行った。環境条件は、２５±２℃の温度、５０±５％の相対湿度及び１２：１２時間の明暗サイクルを提供するように制御された。
【００８１】
２．化学物質（Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びタンパク質脱リン酸化酵素１抑制ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の合成
ΨＰＬＢ−ＳＥ（ＲＡＥ１６ＴＩＥＭＰＱ；配列表の配列番号２）は、Ｓｅｒ１６リン酸化部位を囲むＰＬＢタンパク質配列に由来した。細胞内の流入を容易にするために、上記ペプチドを細胞透過性ペプチドｄＮＰ２（ＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫＧＳＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫ；配列表の配列番号２１）もしくはＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列表の配列番号２２）に接合させた。本発明で使用されたペプチドは、ΨＰＬＢ−ＳＥ（ＲＡＥＴＩＥＭＰＱ；配列表の配列番号２）及び対照群ペプチド（ＲＡＳＴＩＥＭＰＱ；配列表の配列番号２３）である。ΨＰＬＢ−ＳＥと細胞透過性ペプチドは、リンカーペプチド（ＧＧＧ；配列表の配列番号２４）により接続した。ペプチド（純度９５％以上、ＡｎｙＧｅｎ、光州、大韓民国）を３ｍＭ（細胞実験）もしくは２．５ｍｇ／ｍｌ（ラット）、５００μｇ／ｍｌ（マウス）保存濃度で二重蒸留水もしくは生理食塩水に再懸濁した。ラットの場合、１ｍｇ／ｋｇ、マウスの場合、２ｍｇ／ｋｇのペプチドを処理し、ラットの動脈平滑筋細胞（Ｒａｔ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＲＡＳＭＣｓ）と人間の冠状動脈平滑筋細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＣＳＭＣｓ）、肺動脈内皮細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＡＥＣｓ）と肺動脈平滑筋細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＡＳＭＣｓ）は、ペプチド３μＭの最終濃度で１時間の間処理した。ＰＡＥＣｓ（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の実験に使用されたＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、Ａｋｔ阻害剤であるＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）、ＰＰ１阻害剤であるオカダ酸（ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を購入した。モノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ）水溶液は、モノクロタリン粉末（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を少量の１Ｍ塩酸溶液（ＨＣＬ）に溶かした後、滅菌蒸留水で希釈し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加してｐＨ７．３５に合わせて希釈した。決まった実験期間の間、対照群と同じ条件下で飼育しながら観察した。また、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、カルパインＩ及びＩＩ抑制剤ＭＤＬ２８１７０、シクロヘキサミドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）で購入した。
【００８２】
３．ラット頸動脈のバルーン−誘導損傷（Ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ）
左総頸動脈（ｌｅｆｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ）を２Ｆ  Ｆｏｇａｒｔｙ  ｂａｌｌｏｏｎ  ｅｍｂｏｌｅｃｔｏｍｙ  ｃａｔｈｅｔｅｒ挿入で損傷させた。要するに、ラットをイソフルランガス（７０％  Ｎ２Ｏ／３０％  Ｏ２）で麻酔し、左外頸動脈（ｌｅｆｔ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ）を露出させ、そのｂｒａｎｃｈ血管を電気凝固させた（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ）。横行動脈切開を通じてカテーテルを外頸動脈に約１ｃｍ挿入し、総頸動脈に沿ってカテーテルを３回通過させて内皮剥離を起こした。カテーテルを除去した後、貫通領域をクランプし、２００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解された５μｇのペプチドを注入した。１５分間反応させた後、密封された頸動脈を再開放して血流を再開させた。特に明示されない限り、ラットを１０日間回復させた。組織学的な分析のために、ラットを麻酔し、３．７％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含有するヘパリン処理された食塩水で経心灌流  （ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）後、総頸動脈を切除した。標本をパラフィンに取り付け、パラフィンブロックをＬｅｉｃａ  ＲＭ２２５５回転式ミクロトームで切断した。総頸動脈の中心から２つの連続的な組織切片（厚さ、４μｍ）を得て、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。薄層（ｌａｍｉｎａ）、内部弾性層（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｌａｍｉｎａ）及び外部弾性層（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｌａｍｉｎａ）はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＩｍａｇｅＪ  ソフトウェア（バージョン１．６２）で測定した。内膜（ｉｎｔｉｍａｌ）と内側（ｍｅｄｉａｌ）領域は、それぞれ内側弾性薄層領域（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｌａｍｉｎａｌ  ａｒｅａ）で薄層領域（ｌａｍｉｎａｌ  ａｒｅａ）を抜いた値と外側弾性薄層領域（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｌａｍｉｎａｌａｒｅａ）から内側弾性薄層領域を抜いた値に決定した。ラット当たり２つの連続切片からの値を平均した。
【００８３】
４．免疫組織化学
頸動脈を室温で４８時間の間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定させた後、ＰＢＳで洗浄した。標本をパラフィンに埋め立てて組織ブロックを切断した後、過酸化水素で処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断し、抗原回収バッファで沸かした。α−ＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＥＲＣＡ２ｂ（２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及びＰＣＮＡ（Ａｂｃａｍ）に対する抗体で標本を免疫染色した。
【００８４】
５．細胞培養
ラット動脈平滑筋細胞（Ｒａｔ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＲＡＳＭＣｓ）はコラゲナーゼ（５０Ｕ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及び膵臓エラスターゼ（０．２５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、３７で４時間の間、酵素反応によって雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重、１８０−２００ｇ）の胸部大動脈の内層（ｍｅｄｉａｌ  ｌａｙｅｒ）から分離した。細胞を収穫し、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭに再懸濁させた。以降、コラーゲンＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）−コーティングされたガラスカバースリップに塗抹して３７、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２及び９５％（ｖ／ｖ）大気の空気中で培養した。人間冠状動脈平滑筋細胞（ＨＣＳＭＣｓ）、人間肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣｓ）、人間肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣｓ）はＬｏｎｚａで購入して、０．５ｍｇ／ｍＬのｈＥＧＦ、５ｍｇ／ｍＬのインスリン、１ｍｇ／ｍＬのｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン／アムホテリシン−Ｂ及び５％ウシ胎児血清が含有されたＥＢＭ、ＳｍＢＭ（Ｌｏｎｚａ）で培養した。すべての細胞は３７、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２と９５％（ｖ／ｖ）の空気中で培養した。ＲＡＳＭＣとＨＣＳＭＣは、免疫染色とウェスタンブロッティング実験のために、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２と１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でそれぞれ分注された。ＲＡＳＭＣとＰＡＳＭＣの細胞増殖実験の場合、ウシ胎児血清を除去した培地に３日間培養した後、血清を追加して増殖を誘導した。
【００８５】
６．蛍光免疫染色
ラット動脈平滑筋細胞（Ｒａｔ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＲＡＳＭＣｓ）を室温で４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ下の０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で４０分間透過処理した。ＰＢＳ下の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで洗浄し、ブロッキングした後、ＳＥＲＣＡ２ａ（１：２５０）、ＳＥＲＣＡ２ｂ（１：２５０）及びＰＣＮＡ（１：５０）抗体を処理し、細胞を室温で一晩インキュベーションした。次の日、細胞をＰＢＳで洗浄し、それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８及び５９４に接合された抗−ウサギ及び抗−マウスＩｇＧを処理して、室温で１時間の間反応させた。細胞にＦｌｕｏｒｏＧｕａｒｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を処理し、カバースリップを蛍光顕微鏡で観察した。
【００８６】
７．細胞増殖分析
ラット動脈平滑筋細胞（Ｒａｔ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＲＡＳＭＣｓ）と肺動脈平滑筋細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＡＳＭＣｓ）（１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ウェルマイクロプレートに分注し、ペプチドを最終濃度３μＭで２４時間の間処理した。細胞増殖分析は、ＥＺ−ＣｙＴｏｘ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｄａｅｉｌ  Ｌａｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）を用いて行った。
【００８７】
８．大動脈のエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）長期培養
ラットの胸部大動脈を収穫し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。外膜（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａ）を除去し、大動脈を縦に切った後、樹脂（ｒｅｓｉｎ）に固定させた。ＳＥＲＣＡ２ａの分解を調査するために、組織断片を２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で７−１０日間培養した。培地は毎４８時間ごとに交替された。
【００８８】
９．ウェスタンブロッティング
血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣｓ）をブロード−スペクトルプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された最小体積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で均質化させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ポリビニリデンフルオライド膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。５％（ｗ／ｖ）スキムミルクで１時間の間ブロッキングしＴＢＳＴで洗浄した後、膜をＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＥＲＣＡ２ｂ（２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＰＣＮＡ（ａｂｃａｍ）、ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ、ｅＮＯＳ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２α（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α−ＳＭＡ、ＢＭＰＲ２（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、Ａｋｔ（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ（Ｍｅｒｃｋ）、ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗体と共に反応させた。続いて、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と共に反応させ、化学発光気質（Ｄｏｇｅｎ）を使用して現像した。ＬＡＳソフトウェアを使用してブロットをスキャンして定量化した。
【００８９】
１０．細胞内（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）Ｃａ２＋測定
３７で１５分間、Ｃａ２＋−敏感性指標である０．５μＭ  Ｆｕｒａ２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ、ＵＳＡ）をＶＳＭＣにロードして、細胞内Ｃａ２＋レベルを測定した。蛍光はＩｏｎＯｐｔｉｘカルシウムイメージングシステムを使用して記録した。ＶＳＭＣは、３４０ｎｍまたは３８０ｎｍのフィルターを通じて７５Ｗハロゲンランプによって放出される光に露出されるようにして刺激した。蛍光放出は、３４０ｎｍで０．５秒間、そして記録される間、３８０ｎｍで初期調査の後、光電子増倍管によって４８０ｎｍから５２０ｎｍの間で検出された。３４０ｎｍ励起スキャン（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｃａｎ）をプロトコルの最後で繰り返し、細胞内Ｃａ２＋レベルの質的変化を両方の波長のすべてでＦｕｒａ２蛍光強度の比率と推測した。
【００９０】
１１．イン・ビトロ細胞スクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）分析
胸部大動脈（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｏｒｔａ）から分離されたＲＡＳＭＣを０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（収縮性）または１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（合成）添加されたＤＭＥＭで３μＭの対照群ペプチド（Ｃｏｎ；配列表の配列番号２３）またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチド（配列表の配列番号２）と培養した。または０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで培養されたＲＡＳＭＣを３μＭ対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチドの存在下で１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（合成）で処理した。滅菌２００μＬのピペットチップでプレートを引っ掻くことで、ＲＡＳＭＣ層の一部の領域を除去した。細胞を１２時間または２４時間の間培養した後、１×８０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で観察した。ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して、細胞が移動した距離を測定した。
【００９１】
１２．ＳＥＲＣＡ２ａの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）分析
ＲＡＳＭＣを０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（収縮型）添加されたＤＭＥＭ、または３μＭの対照群またはΨＰＬＢ−ＳＥペプチドの存在下で１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（合成）添加されたＤＭＥＭで培養した。シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を５μｇ／ｍｌの最終濃度で培地に添加した。培養０日、３日及び５日後に細胞を収穫し、タンパク質抽出物をウェスタンブロッティングした。
【００９２】
１３．肺動脈高血圧の動物モデル
２５０ｇ−３００ｇの間のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ダムルサイエンス、大韓民国）に６０ｍｇ／ｋｇのＭｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ（ＭＣＴ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔注射を通じて１１匹に投与し、比較群３匹には０．９％の生理食塩水を投与した。投与計画によると、ＭＣＴ投与と同時に、６匹の比較群に３００μｌに希釈したΨＰＬＢ−ＳＥペプチドを１週間間隔で４回気管内吸入を通じて投与した。５匹の対照群には、対照群ペプチドを投与した。最後のペプチド投与の１週間後、ラットを犠牲にして、組織分析及び分子生物学的な実験を行った。
【００９３】
マウスの場合、２５ｇ−３０ｇのＣ５７ＢＬ／６マウス（ダムルサイエンス、大韓民国）１５匹に６００ｍｇ／ｋｇのＭＣＴを１週間に一回ずつ、５回処理し、その中で比較群８匹にΨＰＬＢ−ＳＥペプチドをＭＣＴ投与後１５日目から１週間間隔で４回投与した。５匹の対照群には、対照群ペプチドを投与した。最後の投与の１週間後、マウスを犠牲にして、組織分析及び分子生物学的な実験を行った。
【００９４】
１４．肺動脈圧を測定するため、ラット右心カテーテル法（Ｒｉｇｈｔ  ｈｅａｒｔ  ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）
肺動脈圧を間接的に測定するために右心カテーテル法を実施し、２００８年にｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに報告されたプロセスを基盤に行った。ラットを麻酔した後、気道挿管を実施し、心カテーテル法の間、体温を維持するためにｈｏｍｅｏｔｈｅｒｍｉｃ  ｐｌａｔｅ（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｐｅｃｈｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に乗せて、動物専用人工呼吸器（ＭｉｎｉＶｅｎｔ  ｔｙｐｅ  ８４５、Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、Ｍａｒｃｈ−Ｈｕｇｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で呼吸を維持する。ラットの胸部を開放して、ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  １．４Ｆ  ｍｉｃｒｏｍａｎｏｍｅｔｅｒ／Ｍｉｋｒｏ−Ｔｉｐ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃａｔｈｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を心尖部に浸透させることで、収縮期と弛緩期末の右心室、左心室の圧力（ＲＶＥＳＰ、ＲＶＥＤＰ、ＬＶＥＳＰ、ＬＶＥＤＰ）を測定した。関連数値とデータはＰｏｗｅｒＬａｂ  ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＰＶＳ−Ｕｌｔｒａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）とＬａｂＣｈａｒｔ  ７  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ｓｏｆｔｗａｒｅを通じて収集され、分析した。
【００９５】
１５．組織病理学的な染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法）
動物モデルらからの肺組織を取った後、室温で５日間４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定させた後、ＰＢＳで洗浄した。標本をパラフィンに埋め立てて組織ブロックを７μｍの厚さに切片した後、血管の厚さ及び炎症反応を確認するための方法で、ヘマトキシリン−エオシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）染色し、血管周囲の線維症の程度を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）染色した後、光学顕微鏡を通じて観察した。
【００９６】
１６．サイトカイン分析
ラットとマウスの肺組織を得し、組織のサイトカインレベルをｈｕｍａｎ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  １０ｐｌｅｘ  Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｐｌａｔｅｓ（ＭＳＤ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて定量分析した。
【００９７】
１７．定量的なＲＴ−ＰＣＲ
ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（Ｔａｋａｒａ）を使用して定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、これにより、標的遺伝子らの転写レベルを分析した。トリゾール（ａｍｂｉｏｎ）を使用して、肺組織からＲＮＡを分離して、これをｃＤＮＡに合成した。定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ条件は、４０サイクル：９４℃１０秒、５９℃３０秒、７２℃１０秒であった。実験に使用されたプライマーの情報は、下記の表１の通りである。
【００９８】
【表１】
0006910700.tif 000002
【００９９】
１８．カルシウム再吸収実験（Ｕｐｔａｋｅ  ａｓｓａｙ）
肺動脈平滑筋細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＡＳＭＣｓ）は４０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｍＭ  ＤＴＴを含まれたｐＨ７．０の溶液に均質化させ、２５０μｇの溶解物を１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＮ３、０．５Ｍ  ＥＧＴＡ、４０ｍＭイミダゾールであるｐＨ７．０  ｕｐｔａｋｅ  ｂｕｆｆｅｒに添加して、放射線同位元素が含まれたｐＣａ６カルシウム濃度で吸収実験を実施した。１μＭのルテニウムレッド（Ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  ｒｅｄ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理し、３７℃で３分間待った後、５ｍＭのＫ−ｏｘａｌａｔｅとＭｇ−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｃｉｈ）を処理し、反応を開始し、１分間隔で４分まで５００μｌの反応物を０．４５μＭのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に取り除いて、ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてｃｐｍ（ｃｏｕｎｔ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）を測定した。
【０１００】
１９．統計分析
すべてのデータは、平均±標準偏差で示した。ＳｔａｔＶｉｅｗ５．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を使用してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔまたはｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで統計的な有意性を決定した。ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
【０１０１】
実験結果
１．ΨＰＬＢ−ＳＥは、ＶＳＭＣの細胞増殖を抑制する。
本発明者らは以前の研究で、虚血−再潅流損傷の間ＳＥＲＣＡ２ａ活性を保存することで、心筋細胞の収縮性を向上させる９−ｍｅｒペプチドΨＰＬＢ−ＳＥを発明した［Ｏｈ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５６：６３−７１］。本発明では、上記ペプチドが類似した分子メカニズムを通じて血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣｓ）の増殖を抑制することができるかどうかを実験した。バルーン頸動脈形成術を施行して、ラット頸動脈損傷を誘導した後、ΨＰＬＢ−ＳＥまたは対照ペプチドを損傷部位に投与した。治療４週間後に動脈を収穫し、組織切片でヘマトキシリン及びエオシン染色及び免疫細胞化学検査を行った。ヘマトキシリンとエオシン染色結果は、ΨＰＬＢ−ＳＥで処理した動脈での新生内膜形成（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が対照ペプチドで処理した動脈より抑制されたことを示した。ΨＰＬＢ−ＳＥの影響を受けた内膜層は、α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）とＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）に対する抗体で陽性免疫染色された。これらの結果は、ΨＰＬＢ−ＳＥが新生内膜の成長とイン・ビボのＶＳＭＣｓ増殖を抑制することを示す（図１ａ）。
【０１０２】
本発明者らは、ラット大動脈平滑筋細胞（ｒａｔ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＲＡＳＭＣｓ）に対するΨＰＬＢ−ＳＥの効果を調べた。ＲＡＳＭＣｓは、低濃度の血清（０．１％  ＦＢＳ）が添加された培地で培養したとき、収縮性表現型（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示したが、高濃度の血清（１０％  ＦＢＳ）培地では、合成表現型（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示した。したがって、本発明者らは、高血清培養条件を合成に定義した。ＲＡＳＭＣｓは顕著なＰＣＮＡ発現が現れたように、合成条件下で活動的な細胞分裂を示したが、これはΨＰＬＢ−ＳＥによって完全に遮断された（図１ｂ）。細胞増殖分析はまた、合成条件下でのＲＡＳＭＣｓの増加した細胞増殖がΨＰＬＢ−ＳＥによって抑制されたことを示した（図１ｃ）。合成条件下で、またはＰＤＧＦ−ＢＢの処理時ＲＡＳＭＣｓの増加された移動活性（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、また、ΨＰＬＢ−ＳＥによって抑制された（図５ａ−５ｆ）。これらのデータは、ΨＰＬＢ−ＳＥがイン・ビトロが合成条件下でＶＳＭＣｓの増殖を顕著に抑制することを示す。
【０１０３】
２．ΨＰＬＢ−ＳＥはＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａ分解を遮断する
ＳＥＲＣＡ２ａは、増殖性ＶＳＭＣｓで急激に分解されるのに対し、ＳＥＲＣＡ２ｂは比較的に安定である。遺伝子伝達によるＳＥＲＣＡ２ａレベルの回復は合成条件下でのＶＳＭＣｓの増殖を抑制する。したがって、本発明者らはΨＰＬＢ−ＳＥの抗増殖効果が合成条件下でＳＥＲＣＡ２ａレベル及び活性の維持に関連することができると推論した。図１ａに記載された実験から得られた頸動脈切片をＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＥＲＣＡ２ｂ及びα−ＳＭＡに対する抗体で免疫染色した。ＳＥＲＣＡ２ｂタンパク質のレベルは変わらなかったが、ＳＥＲＣＡ２ａレベルは、バルーン血管形成−媒介損傷で著しく減少され、このような現象は、ΨＰＬＢ−ＳＥによって抑制された（図２ａ）。また、免疫染色は、合成条件下でＲＡＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａレベルが減少し、このＳＥＲＣＡ２ａ減少がΨＰＬＢ−ＳＥによって再び完全に抑制されることを示した（図２ｂ）。また、同一条件でウェスタンブロッティングで合成条件下でＲＡＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａの減少を抑制することを確認した（図２ｃ）。我々は、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成がシクロヘキシミドで遮断された条件下で、ＲＡＳＭＣＳｓでのＳＥＲＣＡ２ａレベルを測定した。ＳＥＲＣＡ２ａの安定性は、合成条件下で著しく減少しており、ΨＰＬＢ−ＳＥ処理時の収縮条件で観察されたレベルにほぼ回復した（図６ａ−６ｂ）。ラット胸部大動脈の生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の培養を準備した。傷による損傷誘発の後、ＶＳＭＣｓはＳＥＲＣＡ２ａレベルが減少し、これは合成表現型の獲得を意味する。ＶＳＭＣｓでのＳＥＲＣＡ２ａの損傷−依存性の減少は、ΨＰＬＢ−ＳＥによって完全に阻害された（図２ｄ）。総合的に、これらのデータは、ΨＰＬＢ−ＳＥがＶＳＭＣＳｓでＳＥＲＣＡ２ａの分解を抑制することを示す。
【０１０４】
３．カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）はＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａ分解に関与する
細胞質Ｃａ２＋レベルの増加は、細胞質タンパク質のカルパイン−媒介分解を誘導する［Ｓａｉｄｏ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ８：８１４−８２２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３：１１３３−１１４２］。ＶＳＭＣｓの増殖にカルパインが関与するので、［Ａｒｉｙｏｓｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  １８：４９３−４９８］、本発明者らはＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａの分解でのカルパイン役割を調査した。免疫染色の結果からわかるように、カルパイン抑制剤ＭＤＬ２８１７０は合成条件でＲＡＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａの分解を抑制した（図３ａ）。ＭＤＬ２８１７０の保護効果は、ウェスタンブロッティングによってさらに確認された（図３ｂ）。これらのデータは、カルパインが合成条件下でＶＳＭｓＣでＳＥＲＣＡ２ａの分解を媒介することを示す。ＭＤＬ２８１７０によって減少されたＰＣＮＡレベルは、持続的な（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）ＳＥＲＣＡ２ａレベルがＶＳＭＣｓ増殖の阻害を起こすということを示す（図３ａ）。
【０１０５】
４．ΨＰＬＢ−ＳＥはカルパイン−依存的なＳＥＲＣＡ２ａ分解を抑制する
Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７は、人間の冠状動脈平滑筋細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＨＣＳＭＣｓ）でＳＥＲＣＡ２ａの分解を起こしたが、ＳＥＲＣＡ２ｂは分解されず、これは増加した細胞質Ｃａ２＋がＳＥＲＣＡ２ａの分解を誘発するということを示す。Ａ２３１８７の効果は、ＭＤＬ２８１７０によって完全に遮断されて細胞質Ｃａ２＋の増加時、ＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａの分解にカルパインが関与することを示した（図４ａ−４ｂ）。ＳＥＲＣＡ２ａのＣａ２＋依存的な分解もΨＰＬＢ−ＳＥによって完全に阻害された（図４ａ−４ｂ）。Ａ２３１８７による細胞質Ｃａ２＋の上昇はΨＰＬＢ−ＳＥによって正常化されたが、カルパイン抑制剤によっては正常化されなかった（図４ｃ）。また、合成条件下で上昇した細胞質Ｃａ２＋レベルは、ΨＰＬＢ−ＳＥによって減少した（図４ｄ）。総合すれば、これらのデータは、ΨＰＬＢ−ＳＥが合成条件下のＶＳＭＣｓで上昇した細胞質Ｃａ２＋レベルを正常化することにより、ＳＥＲＢ２−ＳＥのカルパイン−媒介ＳＥＲＣＡ２ａ分解を抑制することを示唆する。
【０１０６】
５．ΨＰＬＢ−ＳＥは、ラットの肺動脈高血圧を治療する。
本発明では、また、上記ペプチドが類似した、あるいは新しいメカニズムを通じて肺動脈高血圧に治療効果を確認することができるかどうかを実験した。ラットにモノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ、ＭＣＴ）の注入を通じて肺動脈高血圧を誘導し、ΨＰＬＢ−ＳＥを気管内の吸入で週１回、総４週間の間投与した。肺動脈高血圧誘導４週間後、右心カテーテル法を通じて右心室収縮期末血圧（Ｒｉｇｈｔ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｅｎｄ  Ｓｙｓｔｏｌｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を測定した。血圧測定結果を見ると、ＭＣＴを通じて肺動脈高血圧を誘導したグループで、右心室収縮期末血圧が増加したことと示され（６７．４±６．４  ｖｓ  ｓｈａｍ＝３３．７±１．７）ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、比較群のレベルに低くなったことを確認することができた（３３．５±５．８）（図８ａ−８ｂ）。肺動脈高血圧の特徴的に現れる表現型としては、肺動脈内皮細胞及び平滑筋細胞の異常増殖で血管壁が肥厚される現象があり、血管外膜で増加する線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、そして肺組織全体で起こる単核細胞浸潤とサイトカインの増加で代表される炎症反応（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）などがある［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２３（１）：３１−４５；Ｓｔｅｎｍａｒｋ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｃｏｍｐｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １（１）：１４１−１６１；Ａｉｈａｒａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、（２０１２）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２０１２：５９６７９６］。これを組織学的な研究で確認するために、血圧測定後、ラットから得した肺組織でヘマトキシリンとエオシン染色を通じて血管肥厚の程度を確認した結果、肺動脈高血圧が誘導されたグループで表示される血管肥厚の増加がΨＰＬＢ−ＳＥを処理することに応じて減少することが確認できた（図９ａ）。また、肺組織から得したタンパク質定量分析を通じて肺動脈高血圧で特徴的に現れるｅＮＯＳ活性の減少現象が、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより増加することを、ｅＮＯＳリン酸化レベルの増加で確認することができた（図９ｂ）。そして、血管外膜線維症にΨＰＬＢ−ＳＥが及ぼす影響を確認するために、肺組織をＭａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法を通じて、コラーゲン沈着の程度を確認した。肺動脈高血圧で増加された線維症の程度はΨＰＬＢ−ＳＥを通じて減少されたことが確認できた（図１０ａ）。また、タンパク質の定量分析を通じて線維症ターゲット遺伝子として知られているＶｉｍｅｎｔｉｎ、α−ＳＭＡの発現増加がΨＰＬＢ−ＳＥ処理を通じて減少されたことを確認した（図１０ｂ）。最後に、ΨＰＬＢ−ＳＥの炎症反応の減少効果を証明するために、炎症反応のメカニズムに関連するタンパク質であるＢＭＰＲ２発現の程度とそれに関連するシグナル伝達系物質であるｅＩＦ２αのリン酸化レベルを確認した結果、肺動脈高血圧で減少された発現と活性がΨＰＬＢ−ＳＥを処理することによって回復されることを確認した（図１１ａ）。この際、実際のサイトカインのレベルを測定した結果ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＧＦ−βなどのｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅの肺動脈高血圧で増加��、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、通常のレベルに近く回復したことを確認した（図１１ｂ−１１ｄ）。
【０１０７】
６．ΨＰＬＢ−ＳＥは、マウスの肺動脈高血圧を治療する。
ラットで確認したペプチドの回復効果をさらに他の動物モデルであるマウスモデルで確認した。マウスにモノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ、ＭＣＴ）の注入を通じて肺動脈高血圧を誘導し、２週間後からΨＰＬＢ−ＳＥを気管内吸入に週１回、総４週間投与した。ΨＰＬＢ−ＳＥ投与４週間後、血圧測定を除く同じ実験を、マウスの肺組織で行った。まず、マウスから得した肺組織からヘマトキシリンとエオシン染色を通じて血管肥厚の程度を確認した。肺動脈高血圧が誘導されたグループで現れる血管肥厚の増加がΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより減少されることを確認した（図１２ａ）。また、肺組織から得したタンパク質の定量分析を通じて肺動脈高血圧で特徴的に現れるｅＮＯＳ活性の減少現象がΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより増加することを、ｅＮＯＳリン酸化レベルの増加で確認できた。ＳＥＲＣＡ２ａの発現程度もΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、増加されることを確認した（図１２ｂ）。続いて、血管外膜線維症にΨＰＬＢ−ＳＥが及ぼす影響を確認するために、肺組織をＭａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法を通じてコラーゲン沈着の程度を確認した。肺動脈高血圧で増加された線維症の程度はΨＰＬＢ−ＳＥを通じて減少されたことを確認した（図１３ａ）。また、タンパク質の定量分析を通じて線維症ターゲット遺伝子として知られているＴＧＦ−β、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  １、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α−ＳＭＡのタンパク質及びｍＲＮＡ発現の増加がΨＰＬＢ−ＳＥ処理を通じて減少されたことを確認した（図１３ｂ−１３ｃ）。最後に、ΨＰＬＢ−ＳＥの炎症反応の減少効果を証明するために、肺組織内の単核細胞浸潤現象をヘマトキシリンとエオシン染色で確認し、炎症反応に関連するサイトカインのｍＲＮＡレベルを測定した結果、肺動脈高血圧で増加された単核細胞浸潤の増加がΨＰＬＢ−ＳＥ処理によって減少されたことを確認しており（図１４ａ）、炎症反応に関連するターゲット遺伝子であるＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、Ｆ４／８０、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現レベルがΨＰＬＢ−ＳＥの処理によって減少したことを確認した（図１４ｂ）。最後に、ラットの場合と同様に、肺組織で炎症反応に関連するサイトカインのレベルを測定した結果、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＧＦ−βなどの伝染症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が肺動脈高血圧で増加し、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、通常のレベルに近く回復したことを確認した（図１５ａ−１５ｂ）。
【０１０８】
７．ΨＰＬＢ−ＳＥは、肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣｓ）でＰＰ１に起因してｅＮＯＳの活性を増加させる。
肺動脈高血圧で内皮細胞の機能不全により減少したｅＮＯＳの活性が血管拡張剤であるＮＯ生成の減少は、広く知られている特徴である［Ｇｉａｉｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２１４−２２１］。本発明者の組織実験を通じて確認された結果のうち、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、ｅＮＯＳのリン酸化レベルが増加するのにこれに対する新しいメカニズムを明らかにするための研究を行った。まず、ＰＡＥＣｓでΨＰＬＢ−ＳＥによるｅＮＯＳの活性増加を確認するためＰＡＥＣｓに３μＭのΨＰＬＢ−ＳＥを１時間処理した結果、ｅＮＯＳの活性リン酸化残基であるセリン１１７７回のリン酸化が増加し、抑制性リン酸化残基であるトレオニン４９５番目残基のリン酸化は減少した。また、よく知られているｅＮＯＳの上位物質であるＡｋｔ［Ｍｉｃｈｅｌｌ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９（１５）：８４５−８４８］の活性を示すセリン４７３番目の残基とトレオニン３０８番目の残基のリン酸化も増加することを確認した（図１６ａ−１６ｂ）。また、ΨＰＬＢ−ＳＥがＰＰ１の阻害剤として設計された物質であることを勘案した時、実際にこれらの結果は、ＰＰ１の抑制効果を通じて行われるかどうかを確認するために、肺動脈内皮細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＡＥＣｓ）に、一般的なＰＰ１抑制剤である１００ｎＭのオカダ酸（Ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ、ＯＡ）を処理し、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理し、ｅＮＯＳとＡｋｔのリン酸化を確認した。その結果、ＯＡを処理することにより、ｅＮＯＳのＡｋｔのリン酸化が増加したことを確認し、ペプチドを処理することにより、リン酸化がより増加するシナジー効果を確認した。これらの結果は、ΨＰＬＢ−ＳＥがＰＰ１を阻害することにより、ｅＮＯＳとＡｋｔの活性を調節するということを示す（図１６ｃ）。
【０１０９】
これらのＰＰ１とｅＮＯＳ、Ａｋｔの間の相互関係を深く確認するために、肺組織の溶解物でＰＰ１の抗体を用いて免疫沈降法を実施し、沈降時ΨＰＬＢ−ＳＥを添加して、相互作用に及ぼす影響を調べた。その結果、Ａｋｔの場合ｅＮＯＳとは違って、ＰＰ１と直接相互作用することを確認し、この作用は、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、弱化されることを確認した。これらの結果、ΨＰＬＢ−ＳＥは、ＰＰ１とＡｋｔの相互作用を阻害することにより、ＡｋｔとｅＮＯＳの脱リン酸化を抑制することを示す（図１７ａ）。これらのＰＰ１とＡｋｔ間の相互作用阻害を通じたｅＮＯＳの活性化は、Ａｋｔの上位リン酸化酵素を抑制する実験を通じて補強した。Ａｋｔの知られている上位リン酸化酵素であるｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤であるＬＹ２９４００２を５０μＭの濃度に処理することにより、Ａｋｔのリン酸化の条件を相殺しΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより、脱リン酸化抑制に起因するＡｋｔとｅＮＯＳのリン酸化の増加を確認しようとした。その結果、ＰＩ３Ｋ阻害により減少したｅＮＯＳとＡｋｔのリン酸化がΨＰＬＢ−ＳＥを処理することによって増加した（図１７ｂ）。最後に、ΨＰＬＢ−ＳＥの処理効果が実際にＡｋｔを通じて現れるかどうかを判断するために、Ａｋｔ阻害剤であるＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶを１０μＭの濃度に処理した後、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理してｅＮＯＳのリン酸化に及ぼす影響を確認した。その結果、Ａｋｔ阻害剤によって減少したｅＮＯＳのリン酸化は、ΨＰＬＢ−ＳＥを処理しても増加しないことを確認した（図１７ｃ）。これらの結果は、ΨＰＬＢ−ＳＥのｅＮＯＳ活性化効果がＰＰ１とＡｋｔの相互作用を阻害することにより、Ａｋｔ脱リン酸化を防ぎ、Ａｋｔを活性化させることで現れるということを意味する。
【０１１０】
８．ΨＰＬＢ−ＳＥは、肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣｓ）でＰＰ１を起因してＳＥＲＣＡ２ａの活性を調節して、細胞増殖を抑制する。
肺動脈高血圧で内皮細胞の機能不全に起因する肺動脈平滑筋細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＡＳＭＣｓ）の異常増殖は、肺動脈の血圧を高めるのに決定的な役割を果たす要素である。本発明者らは、先行研究を通じてΨＰＬＢ−ＳＥがラットから分離した血管平滑筋細胞のＳＥＲＣＡ２ａ活性を調節することで、異常増殖を抑制することを確認した。同じ現象を肺動脈平滑筋細胞でも確認するために、低濃度の血清（０．１％ＦＢＳ）に誘導させた収縮性表現型（Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に比較して高濃度の血清（１０％ＦＢＳ）で増殖させた合成表現型（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導した。ΨＰＬＢ−ＳＥを処理することによって、合成表現型で減少したホスホランバン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ）のセリン１６番残基のリン酸化が回復されたことを確認することができたし（図１８ａ）、同一条件でカルシウム再吸収実験（Ｃａ２＋  ｕｐｔａｋｅ  ａｓｓａｙ）を通じてＳＥＲＣＡ２ａの活性を測定した結果、合成表現型で減少したＳＥＲＣＡ２ａの活性がΨＰＬＢ−ＳＥの処理に応じて回復されたことを確認した（図１８ｂ）。これらの結果は、本発明者の先行研究の結果と一致する結果であり、ΨＰＬＢ−ＳＥが肺動脈平滑筋細胞においてもＳＥＲＣＡ２ａの活性を調節することができることを示す。
【０１１１】
また、これらのＳＥＲＣＡ２ａ活性の調節を通じて、実際のΨＰＬＢ−ＳＥが肺動脈平滑筋細胞の増殖を防ぐことができているかどうかを確認するために、１８ａ−ｂの条件で細胞増殖関連の代表遺伝子であるＰＣＮＡの発現を確認し、細胞増殖分析を行った。その結果、合成表現型の誘導を通じて増加するＰＣＮＡの発現がΨＰＬＢ−ＳＥを処理することにより減少されることを確認しており（図１９ａ）、細胞増殖分析実験を通じて、実際に細胞の増殖が抑制される効果を確認した（図１９ｂ）。これらの結果は、ΨＰＬＢ−ＳＥが肺動脈高血圧で現れる特徴である平滑筋細胞の異常増殖を抑制することができることを示す。
【０１１２】
９．ΨＰＬＢ−ＳＥの効果は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の種類と形態に応じて影響を受けない。
細胞透過性ペプチドは、シグナルペプチドの一種としてタンパク質、ＤＮＡなどの物質を細胞内に伝達する目的として使用するアミノ酸の組み合わせペプチドである。本発明者らはヒト由来の配列ＣＰＰのｄＮＰ２を使用して先の治療効果らを究明した。これに加えて、本発明者らはＴＡＴだけでなく、ペプチドを環化（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）させることでＣＰＰの種類と形態を多様化させ、既存のｄＮＰ２を基盤にしたペプチドと効果を比較した。その結果、線形ＴＡＴと環化ＴＡＴを配列として有するΨＰＬＢ−ＳＥまたＶＥＣｓでｅＮＯＳとＡｋｔのリン酸化を増加させ（図２０ａ）、合成表現型を誘導したＶＳＭＣｓでＰＬＢのリン酸化を増加させた（図２０ｂ）。これらの結果は、ΨＰＬＢ−ＳＥの効果はＣＰＰの種類と形態に限定されず、効果を示すことを意味する。
【０１１３】
結果分析及び追加論議
心血管系疾患のうち、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）や冠状動脈インターベンション後に現れる再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）の両方ともＶＥＣｓの物理的、病理学的損傷に起因し、最終的に血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ、ＶＳＭＣｓ）の異常増殖によって病因が示される疾病である。このような現象は、広い概念として、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）に含まれることができる。肺動脈高血圧の場合、１０年余り前までも、特別な薬がないと思われており、たとえ数年間、多くの研究結果の累積で多くの治療薬剤の開発に伴い、患者の生活の質と生存期間が増えたことはあるが、他の心血管疾患に比べて高い罹患率と死亡率を示している。また、完璧に解決されていない再狭窄の問題も確実な治療ガイドラインがない状態で研究が進められている。
【０１１４】
心血管疾患の主要な原因の一つは、ＳＲ（ｓａｒｃｏ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）機能の欠陥に起因する異常な細胞内Ｃａ２＋調節である［Ｌｏｕ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ７４０：１１４５−１１７４；Ｈｅｉｊｍａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｗｉｅｎ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  １６２：２８７−２９１］。ＳＲによる異常Ｃａ２＋流入（ｕｐｔａｋｅ）は、主に発現及び／または翻訳後の変形（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって誘発されることができるＳＥＲＣＡ２ａ活性の減少によるものである［Ｍｅｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：７７８−７８４；Ｋｈｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４７７：６０１−６０５］。心臓筋肉細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）でＳＥＲＣＡ２ａレベルの遺伝子伝達媒介復元は、心臓麻痺のマウス及びブタ心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）モデルで心臓保護効果（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）を示す［Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：７９３−７９８；Ｋａｗａｓｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５１：１１１２−１１１９；ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１４２４−１４２９］。また、ＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子の伝達は、バルーン−誘導損傷モデルでＶＳＭＣｓの増殖と新生内膜の成長を抑制する。したがって、ＳＥＲＣＡ２ａは動脈再狭窄（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）及びＰＡＨを含む血管増殖性疾患に対する治療に介入することができる。
【０１１５】
ＳＥＲＣＡ２ａ活性は阻害剤−１（Ｉ−１）、ＰＰ１及びホスホランバン（ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ、ＰＬＢ）を含む一連のシグナル伝達によって調節される。Ｉ−１は、ＰＰ１と結合してＰＰ１を阻害してＰＬＢリン酸化及びＳＥＲＣＡ２ａ活性が上昇する。従って、持続的に活性化されたＩ−１（Ｉ−１ｃ）の過発現は、様々な病的損傷から心筋細胞でのＳＥＲＣＡ２ａ活性を回復させることができる［Ｎｉｃｏｌａｏｕ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｊ  Ｍｏｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４７：３６５−３７１］。また、Ｉ−１ｃ遺伝子伝達は、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を増加させることで、ＶＳＭＣｓ増殖及び新生内膜形成を抑制する。Ｉ−１ｃ及びＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子伝達は、相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌ）を示す［Ｌｉｐｓｋａｉａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｃｉｒｕｃａｔｉｏｎ  １２９：７７３−７８５］。
【０１１６】
本発明者らは以前の研究では、９ｍｅｒペプチドであるΨＰＬＢ−ＳＥがＰＰ１をターゲットし、ＰＬＢの脱リン酸化を抑制して、心筋細胞でＳＥＲＣＡ２ａ活性を増加させることを明らかにした。これと似て、ΨＰＬＢ−ＳＥはＲＡＳＭＣｓとＰＡＳＭＣｓでもＰＬＢの脱リン酸化を抑制した（本明細書の明細書図７、図１８ａ及び図２０ｂを参照）。
【０１１７】
本発明では、合成条件下でＶＳＭＣｓのＳＥＲＣＡ２ａレベルを上昇させることでＶＳＭＣｓの増殖と新生内膜形成を抑制することを示した。以前の研究でＳＥＲＣＡ遺伝子伝達は、ＳＥＲＣＡ２ａレベルを回復させるのに対し、Ｉ−１ｃ遺伝子伝達は、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を回復させた。したがって、ΨＰＬＢ−ＳＥによるＰＰ１ターゲットが、またＳＥＲＣＡ２ａレベルを回復させることは、驚くべきことである。これらの現象を説明するために、本発明では、ＳＥＲＣＡ２ａレベルと活性が密接に相互関連しているモデルを提案する。合成条件下で、増加された細胞質Ｃａ２＋レベルは、カルパインを活性化させてＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を分解することができ、減少されたＳＥＲＣＡ２ａレベルは細胞質Ｃａ２＋レベルをさらに増加させることができる。本発明のデータは、細胞質Ｃａ２＋の増加及びＳＥＲＣＡ２ａ減少の悪循環がＰＰ１をターゲットすることにより、中断されることができることを示す。ΨＰＬＢ−ＳＥにＰＰＩをターゲットすることにより、増加ＳＥＲＣＡ２ａ活性は細胞質Ｃａ２＋レベルをさらに減少させるものであり、これにより、カルパイン−媒介ＳＥＲＣＡ２ａ分解を抑制することにより、ＳＥＲＣＡ２ａのレベルが増加する。
【０１１８】
一方、血管内皮細胞の重要な役割である血管弛緩／緊張を調節する機能のうち、ＮＯ生成は、血管弛緩剤として、そして増殖抑制の効果を持つ。肺動脈高血圧で減少したＮＯの生成は、ｅＮＯＳの活性の減少に起因し、ｅＮＯＳの活性化はＳＥＲＣＡ２ａを通じた細胞内のカルシウム濃度の調節だけでは説明することが十分ではない。ｅＮＯＳの活性化経路には、カルシウム依存的な経路とカルシウム非依存的な経路が存在する［Ｚｈａｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １２９（２）：８３−９４］。カルシウム非依存的な経路の場合は、上位シグナル伝達を通じてＡｋｔ、ＡＭＰＫ、ＣａｍＫＩＩ、ＰＫＡなどを通じてｅＮＯＳのリン酸化を調節することによって行われる。これにより、生成されたＮＯはＶＳＭＣｓに影響を及ぼしてｃＧＭＰ依存的なタンパク質リン酸化酵素の活性を増加させて、細胞内カルシウムを下げる役割を果たすこともある［Ｂｌａｔｔｅｒ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １５（２）：１２２−１３１］。現在までの研究らは、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を基盤にしたｅＮＯＳ遺伝子伝達、ｃＧＭＰ生成酵素活性化剤（ｒｉｏｃｉｇｕａｔ）、ｃＧＭＰ加水分解抑制剤（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）などで、根本的にＮＯの生成や役割を最大化する方向に進行されている［Ｐｒｉｏｒ  ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）  Ｍｅｄ  Ｊ  Ａｕｓｔ  ２０５（６）：２７１−２７６；Ｇｒａｎｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １１７（７）：６４５−６５４］。本発明では、先行研究で立証したΨＰＬＢ−ＳＥのホスホランバンをターゲットにしたメカニズムの以外に、ＰＰ１−Ａｋｔ−ｅＮＯＳシグナル伝達メカニズムを提示することで、ΨＰＬＢ−ＳＥがＶＳＭＣｓの増殖を抑制するだけでなく、血管の機能全体を担当するＶＥＣｓの機能異常も回復させてくれることができることを証明した。ΨＰＬＢ−ＳＥがＰＰ１とＡｋｔの相互作用を抑制して、Ａｋｔの脱リン酸化を防ぎ、これにより、ｅＮＯＳの活性が調節されることを証明した。
【０１１９】
また、本発明では、表現型に現れる特徴のうち、ラットとマウスの肺動脈高血圧モデルの血管で現れるＶＳＭＣｓの異常増殖阻害効果とＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色結果及びＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ、ＴＧＦ−βなどの遺伝子発現レベルの正常化に現れる血管繊維化減少効果は、ΨＰＬＢ−ＳＥが潜在的に高血圧の治療効果を期待することができる可能性を示す。
【０１２０】
結果的に、本発明では、ΨＰＬＢ−ＳＥでＰＰ１をターゲットすることにより、合成条件下のＶＳＭＣｓでＳＥＲＣＡ２ａのレベルと活性を回復されることを立証し肺動脈高血圧でＶＥＣｓのｅＮＯＳ活性を増加させることも立証した。これはΨＰＬＢ−ＳＥは、血管増殖性疾患の治療のための戦略の基礎になることができ、ペプチドとしてはまた、遺伝子療法に比べて他の利点を持つことができる。
【０１２１】
以上で、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は、単に好ましい実施形態だけであり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されることができると言える。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
0006910700.tif 000004
【図１ｃ】
0006910700.tif 000005
【図２ａ】
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【図２ｂ】
0006910700.tif 000007
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
0006910700.tif 000054
【図２０ｂ】
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【配列表】
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