(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、固形腫瘍を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項２】
組成物中の各ＲＮＡは、サイトカインをコードし、該組成物中のＲＮＡにコードされるサイトカインは、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質と、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質と、ＩＦＮαタンパク質と、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質とからなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＩＦＮαタンパク質は、ＩＦＮα２ｂタンパク質である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
（ｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；（ｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
（ｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；（ｉｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列、もしくは配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
（ｉ）ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；（ｉｉ）ＩＦＮαタンパク質は、配列
番号１９のアミノ酸配列、もしくは配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２９のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列、もしくは配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＲＮＡの少なくとも１つは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＲＮＡの少なくとも１つは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＲＮＡの各々は、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＲＮＡの各々は、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＲＮＡの少なくとも１つは、１つより多くのタイプの修飾ヌクレオシドを含み、該修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ＲＮＡの少なくとも１つは、５’キャップ  ｍ27,3'-OＧｐｐｐ（ｍ12'-O）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む、請求項１〜１４のいずれか
１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
各ＲＮＡは、５’キャップ  ｍ27,3'-OＧｐｐｐ（ｍ12'-O）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医
薬組成物。
【請求項１７】
ＲＮＡの少なくとも１つは、配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡの各々は、配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少
なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＲＮＡの少なくとも１つは、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＲＮＡの各々は、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＲＮＡの少なくとも１つは、ポリＡテールを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＲＮＡの各々は、ポリＡテールを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ポリＡテールは、配列番号７８で示されるポリＡテールを含む、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
１つまたはそれ以上のＲＮＡは：
ａ．ｍ27,3'-OＧｐｐｐ（ｍ12'-O）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ7Ｇ（５’）ｐｐ
ｐ（５’）Ｇを含む５’キャップ；
ｂ．（ｉ）配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲ；
ｃ．（ｉ）配列番号８のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲ；ならびに
ｄ．少なくとも１００ヌクレオチドを含むポリＡテール
を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ポリＡテールは、配列番号７８を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡのコード配列は、各ウリジンの代わりにＮ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）を有する配列番号１８の配列からなり、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡのコード配列は、各ウリジンの代わりにＮ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）を有する配列番号２６の配列からなり、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡのコード配列は、各ウリジンの代わりにＮ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）を有する配列番号２３の配列からなり、および、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡのコード配列は、各ウリジンの代わりにＮ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）を有する配列番号２３の配列からなり、
ここで、各ＲＮＡは：
・  ｍ27,3'-OＧｐｐｐ（ｍ12'-O）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ7Ｇ（５’）ｐｐ
ｐ（５’）Ｇを含む５’キャップ；
・  配列番号２、４または６のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲ；
・  配列番号８のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲ；および
・  配列番号７８を含む、ポリＡテール；
を含み、そして組成物中のモル比または重量比は、１：１：１：１である
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
医薬組成物は、薬学的に許容される水溶液をさらに含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
薬学的に許容される水溶液は、リンガー液である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
医薬組成物は、ＲＮＡと複合体を形成している脂質部分をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
脂質部分は、カチオン性脂質および中性脂質を含むリポソームまたはリポプレックスである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の医薬組成物を含み、場合によりＲＮＡは、別々のバイアル内にある、固形腫瘍を処置または予防するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年２月２８日に出願した米国仮出願第６２／４６４，９８１号、２０１７年１２月１２日に出願した米国仮出願第６２／５９７，５２７号、および２０１７年８月２３日に出願した欧州特許出願第１７３０６０８９．８号の優先権の利益を主張するものであり、これらの出願のすべてを、それら全体として、参照によって組み入れる。
【０００２】
本開示は、固形腫瘍がんを処置するための治療用ＲＮＡの分野に関する。米国国立がん研究所は、固形腫瘍を、嚢胞も液状領域も通常は含有しない組織の異常な塊と定義している。固形腫瘍は、良性および悪性（がん性）肉腫、癌腫およびリンパ腫を含み、身体的には、脳、卵巣、乳房、結腸および他の組織を含むあらゆる組織または器官に位置することがある。がんは、主に２種類に分けられることが多い：固形腫瘍がんおよび血液学的（血液）がん。１５０万件を超えるがん症例が毎年米国で診断され、５００，０００人を超える米国人が毎年がんで死亡することになると、推定される。
【背景技術】
【０００３】
固形腫瘍がんは、特に処置が難しい。現行の処置は、外科手術、放射線療法、免疫療法および化学療法を含む。単独での外科手術は、小さい限局性腫瘍には適切な処置であることもあるが、大きい浸潤腫瘍およびほとんどの転移性悪性腫瘍は、通常は、外科手術では切除不能である。放射線療法および化学療法のような他の一般的な処置は、望ましくない副作用を伴い、健常細胞に損傷を与える。
【０００４】
外科手術および現行の治療は、固形腫瘍の大部分を死滅させることができる場合もあるが、さらなる細胞（がん幹細胞を含む可能性がある）が、治療しても生き残ることもある。これらの細胞は、やがて新たな腫瘍を形成することができ、その結果、がんが再発することになる。集学的な従来の治療にもかかわらず、無病生存率は、多くの種類の固形腫瘍について２５％未満である。集学的治療に抵抗性である固形腫瘍または治療後に再発した固形腫瘍は、処置がさらにいっそう難しく、長期生存率は、１０％未満である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書で開示されるのは、固形腫瘍の処置の現在の欠点を克服することができる組成物、使用および方法である。本明細書で開示される治療用ＲＮＡの投与は、腫瘍サイズを縮小することができ、生存期間を延長することができ、ならびに／または腫瘍の転移および／もしくは再発を防ぐことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態１．配列番号１４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、配列番号２７のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、組成物。
実施形態２．配列番号２４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３．配列番号９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態１に記載の組成物。
実施形態４．配列番号１９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＦＮα２ｂタンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態１に記載の組成物。
実施形態５．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ；および
ｃ．配列番号１９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＦＮα２ｂタンパク質をコードするＲＮＡ。
実施形態６．配列番号２４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態５に記載の組成物。
実施形態７．配列番号９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一であるＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態５に記載の組成物。
実施形態８．少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９．各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態８〜９のいずれか１つに記載の組成物。
【０００７】
実施形態１１．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態１０に記載の組成物。
実施形態１２．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップをさらに含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３．各ＲＮＡは、５’キャップをさらに含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態１２〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５．少なくとも１つのＲＮＡは、５’ＵＴＲをさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６．各ＲＮＡは、５’ＵＴＲをさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７．５’ＵＴＲは、配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド、もしくは配列番号２、４もしくは６に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態１５〜１６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８．少なくとも１つのＲＮＡは、３’ＵＴＲをさらに含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９．各ＲＮＡは、３’ＵＴＲをさらに含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２０．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド、もしくは配列番号８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態１８〜１９のいずれか１つに記載の組成物。
【０００８】
実施形態２１．少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡテールをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２２．各ＲＮＡは、ポリＡテールをさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２３．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、実施形態２１〜２２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２４．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２５．各ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２６．
ａ．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり；
ｂ．５’ＵＴＲは、配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド、もしくは配列番号２、４もしくは６に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり；
ｃ．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド、もしくは配列番号８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり；および
ｄ．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、
実施形態２４〜２５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２７．対象におけるがんを処置もしくは予防する、腫瘍のサイズを縮小する、寛解期のがんの再発を予防する、またはがん転移を予防する方法であって、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
実施形態２８．対象におけるがんを処置もしくは予防する、腫瘍のサイズを縮小する、寛解期のがんの再発を予防する、またはがん転移を予防する方法であって、対象に：
ａ．配列番号１４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡと；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡと
を投与することを含み、
それによって、対象におけるがんを処置もしくは予防する、腫瘍のサイズを縮小する、寛解期のがんの再発を予防する、またはがん転移を予防する、方法。
実施形態２９．配列番号１９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０．配列番号２４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態２８に記載の方法。
【０００９】
実施形態３１．配列番号９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３２．
ａ．配列番号２４のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質；ならびに
ｂ．配列番号１９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＦＮα２ｂタンパク質、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むＩＦＮα２ｂタンパク質
をコードするＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３３．
ａ．配列番号９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＬ−２タンパク質、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むＩＬ−２タンパク質；ならびに
ｂ．配列番号１９のアミノ酸と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％同一であるＩＦＮα２ｂタンパク質、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むＩＦＮα２ｂタンパク質
をコードするＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３４．がんは、肉腫、癌腫、またはリンパ腫である、実施形態２７〜３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５．がんは、固形腫瘍である、実施形態２７〜３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６．固形腫瘍は、肺、結腸、卵巣、子宮頸部、子宮、腹膜、精巣、陰茎、舌、リンパ節、膵臓、骨、乳房、前立腺、軟部組織、結合組織、腎臓、肝臓、脳、甲状腺または皮膚におけるものである、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７．固形腫瘍は、上皮腫瘍、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、腎細胞腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、脈管構造を伴う腫瘍、中皮腫腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、肉腫腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、メラノーマ腫瘍、小細胞肺腫瘍、神経芽腫、精巣腫瘍、癌腫腫瘍、腺癌腫瘍、神経膠腫腫瘍、精上皮腫腫瘍、網膜芽細胞腫、または骨肉腫腫瘍である、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３８．組成物は、腫瘍内または腫瘍周囲投与される、実施形態２７〜３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９．被注射腫瘍および未注射腫瘍は、両方とも、第１の腫瘍へのまたはその付近への腫瘍内または腫瘍周囲注射後にサイズが縮小される、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０．対象はヒトである、実施形態２７〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００１０】
実施形態４１．別の治療も投与される、実施形態２７〜４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２．他の治療は、腫瘍を摘出、切除または減量するための外科手術である、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．他の治療は、免疫療法、放射線療法または化学療法である、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４４．少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態２７〜４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５．各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態２７〜４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態４４〜４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップをさらに含む、実施形態２７〜４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９．各ＲＮＡは、５’キャップをさらに含む、実施形態２７〜４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態４８〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【００１１】
実施形態５１．少なくとも１つのＲＮＡは、５’ＵＴＲをさらに含む、実施形態２７〜５０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５２．各ＲＮＡは、５’ＵＴＲをさらに含む、実施形態２７〜５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３．５’ＵＴＲは、配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド、もしくは配列番号２、４もしくは６に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態５１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４．少なくとも１つのＲＮＡは、３’ＵＴＲをさらに含む、実施形態２７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．各ＲＮＡは、３’ＵＴＲをさらに含む、実施形態２７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド、もしくは配列番号８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態５４〜５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７．少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡテールをさらに含む、実施形態２７〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８．各ＲＮＡは、ポリＡテールをさらに含む、実施形態２７〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、実施形態５７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態２７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【００１２】
実施形態６１．各ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態２７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．
ａ．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり；
ｂ．５’ＵＴＲは、配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド、もしくは配列番号２、４もしくは６に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり；
ｃ．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド、もしくは配列番号８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり；および
ｄ．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、
実施形態６０〜６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．コドン最適化ＤＮＡであって、配列番号１１に対して少なくとも８３％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、コドン最適化ＲＮＡ。
実施形態６４．配列番号１１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態６３に記載のＤＮＡ。
実施形態６５．コドン最適化ＲＮＡであって、配列番号１３に対して少なくとも８３％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、コドン最適化ＲＮＡ。
実施形態６６．配列番号１３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態６５に記載のＲＮＡ。
実施形態６７．実施形態６３または６４のいずれか１つに記載のＤＮＡから産生されるＲＮＡ。
実施形態６８．以下を含むか、またはそれらからなる、コドン最適化ＤＮＡ：
ａ．配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも７８％の同一性を有する連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも８１％の同一性を有する連続したヌクレオチド；および
ｃ．ａ）のヌクレオチドとｂ）のヌクレオチド間のリンカーをコードするヌクレオチド。
実施形態６９．リンカーは、配列番号１６のヌクレオチド９８５〜１０２６を含む、実施形態６８に記載のＤＮＡ。
実施形態７０．部分ａ）は、配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％または７５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含み；および部分ｂ）は、配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％または８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含む、実施形態６８および６９のいずれか１つに記載のＤＮＡ。
【００１３】
実施形態７１．以下を含むか、またはそれらからなる、コドン最適化ＲＮＡ：
ａ．配列番号１８のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも７８％の同一性を有する連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１８のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも８１％の同一性を有する連続したヌクレオチド；および
ｃ．ａ）のヌクレオチドとｂ）のヌクレオチド間のリンカーをコードするヌクレオチド。
実施形態７２．リンカーは、配列番号１８のヌクレオチド９８５〜１０２６を含む、実施形態７１に記載のＲＮＡ。
実施形態７３．部分ａ）は、配列番号１８のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％または７５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含み；および部分ｂ）は、配列番号１８のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％または８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含む、実施形態７１および７２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態７４．実施形態６８〜７０のいずれか１つに記載のＤＮＡから産生されるＲＮＡ。
実施形態７５．コドン最適化ＤＮＡであって、配列番号２１に対して少なくとも８０％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、コドン最適化ＤＮＡ。
実施形態７６．配列番号２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態７５に記載のＤＮＡ。
実施形態７７．コドン最適化ＲＮＡであって、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、コドン最適化ＲＮＡ。
実施形態７８．配列番号２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態７７に記載のＲＮＡ。
実施形態７９．実施形態７５〜７６のいずれか１つに記載のＤＮＡから産生されるＲＮＡ。
実施形態８０．以下を含むか、またはそれらからなる、ＤＮＡ：
ａ．配列番号２５のヌクレオチド１〜３２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号２５のヌクレオチド３８２〜７２９に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．ａ）のヌクレオチドとｂ）のヌクレオチド間のリンカーをコードするヌクレオチド。
【００１４】
実施形態８１．実施形態８０に記載のＤＮＡから産生されるＲＮＡ。
実施形態８２．以下を含むか、またはそれらからなる、ＲＮＡ：
ａ．配列番号２６のヌクレオチド１〜３２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号２６のヌクレオチド３８２〜７２９に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．ａ）のヌクレオチドとｂ）のヌクレオチド間のリンカーをコードするヌクレオチド。
実施形態８３．ＤＮＡであって、配列番号２８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、ＤＮＡ。
実施形態８４．実施形態８３に記載のＤＮＡから産生されるＲＮＡ。
実施形態８５．ＲＮＡであって、配列番号２９に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有する連続したヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、ＲＮＡ。
実施形態８６．ＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写される、実施形態６７、７４、７９、８１および８４のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態８７．少なくとも１つのウリジンは、修飾核酸塩基で置換されている、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜８５のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態８８．各ウリジンは、修飾核酸塩基で置換されている、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜８５のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態８９．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態８７または８８に記載のＲＮＡ。
実施形態９０．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態８９に記載のＲＮＡ。
【００１５】
実施形態９１．５’キャップをさらに含む、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜９０のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態９２．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態９１に記載のＲＮＡ。
実施形態９３．５’ＵＴＲをさらに含む、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態９４．５’ＵＴＲは、配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド、もしくは配列番号２、４もしくは６に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態９３に記載のＲＮＡ。
実施形態９５．３’ＵＴＲをさらに含む、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜９４のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態９６．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド、もしくは配列番号８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる、実施形態９５に記載のＲＮＡ。
実施形態９７．ポリＡテールをさらに含む、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜９６のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態９８．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、実施形態９７に記載のＲＮＡ。
実施形態９９．５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールをさらに含む、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、および８４〜９７のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態１００．
ａ．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり；
ｂ．５’ＵＴＲは、配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド、もしくは配列番号２、４もしくは６に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり；
ｃ．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド、もしくは配列番号８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％もしくは８５％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり；および
ｄ．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、
実施形態９９に記載の組成物。
【００１６】
実施形態１０１．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号１１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８３％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｂ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）およびｂ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
実施形態１０２．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％もしくは７８％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％もしくは８１％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１０３．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｂ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）およびｂ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１０４．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２８と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｂ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）およびｂ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１０５．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２５のヌクレオチド１〜３２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号２５のヌクレオチド３８２〜７２９に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも８０％の同一性を有する連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１０６．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号１１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８３％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｂ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）およびｂ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
実施形態１０７．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％もしくは７８％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％もしくは８１％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
実施形態１０８．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｂ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）およびｂ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１０９．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｂ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）およびｂ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
実施形態１１０．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２５のヌクレオチド１〜３２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号２５のヌクレオチド３８２〜７２９に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
【００１７】
実施形態１１１．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号１１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８３％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１１２．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％もしくは７８％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％もしくは８１％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｃ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｄ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１１３．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド（ここで、この部分ｂ）のヌクレオチドは、部分ａ）のヌクレオチドの発現を調節するものである）；
ｃ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、ＤＮＡ。
実施形態１１４．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２８に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｃ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）およびｃ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
実施形態１１５．ＤＮＡであって：
ａ．配列番号２５のヌクレオチド１〜３２１に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｂ．配列番号２５のヌクレオチド３８２〜７２９に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；
ｃ．配列番号１、３もしくは５に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド；および
ｄ．配列番号７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチドを含むか、もしくはそのようなヌクレオチドからなる連続したヌクレオチド
を含むか、またはこれらからなり、転写されたとき、部分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のヌクレオチドが単一の転写物を形成する、前記ＤＮＡ。
実施形態１１６．実施形態１０１〜１１５のいずれか１つに記載のＤＮＡから産生されるＲＮＡ。
実施形態１１７．少なくとも１つのウリジンは、修飾核酸塩基で置換されている、実施形態１１６に記載のＲＮＡ。
実施形態１１８．各ウリジンは、修飾核酸塩基で置換されている、実施形態１１６に記載のＲＮＡ。
実施形態１１９．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態１１７〜１１８のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態１２０．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態１１９に記載のＲＮＡ。
【００１８】
実施形態１２１．５’キャップをさらに含む、実施形態１１６〜１２０のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態１２２．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態１２１に記載のＲＮＡ。
実施形態１２３．二本鎖ＲＮＡが実質的にない、実施形態１１６〜１２２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態１２４．二本鎖ＲＮＡは除去された、実施形態１１６〜１２２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態１２５．ＨＰＬＣによってまたはセルロースに基づくクロマトグラフィーによって精製された、実施形態１２３〜１２４のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態１２６．実施形態６３〜１２５に記載のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか１つと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤。
実施形態１２７．対象におけるがんを処置もしくは予防する、腫瘍のサイズを縮小する、寛解期のがんの再発を予防する、またはがん転移を予防する方法であって、実施形態６３〜１２５に記載のＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれか１つもしくはそれ以上、または実施形態１２６に記載の医薬製剤を、投与することを含む方法。
実施形態１２８．ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂをコードするポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで産生させる方法であって、実施形態６３〜１２５のいずれか１つに記載のＤＮＡもしくはＲＮＡの１つもしくはそれ以上、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態１２６に記載の医薬製剤を、対象に投与することを含む方法。
実施形態１２９．少なくとも２つのＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、異なるタンパク質をコードし、ならびに該ＲＮＡは、実施形態６５〜６７、７１〜７４、７８〜７９、８１〜８２、８４〜１００、および１１６〜１２５のいずれか１つに記載のＲＮＡから選択される、組成物。
実施形態１３０．ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２ｓｃをコードする２つのＲＮＡを含む、実施形態１２９に記載の組成物。
【００１９】
実施形態１３１．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃおよびＩＦＮα２ｂをコードする３つのＲＮＡを含む、実施形態１２９に記載の組成物。
実施形態１３２．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＦＮα２ｂをコードする３つのＲＮＡを含む、実施形態１２９に記載の組成物。
実施形態１３３．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＬ−２およびＩＦＮα２ｂをコードする４つのＲＮＡを含む、実施形態１２９に記載の組成物。
実施形態１３４．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉおよびＩＦＮα２ｂをコードする４つのＲＮＡを含む、実施形態１２９に記載の組成物。
実施形態１３５．ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡは、実施形態８４〜８５のいずれか１つに記載のＲＮＡから選択される、実施形態１３０〜１３４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３６．ＩＬ−１２ｓｃをコードするＲＮＡは、実施形態７１〜７４のいずれか１つに記載のＲＮＡから選択される、実施形態１３０〜１３４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３７．ＩＦＮα２ｂをコードするＲＮＡは、実施形態７７〜７９のいずれか１つに記載のＲＮＡから選択される、実施形態１３１〜１３４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３８．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＲＮＡは、実施形態８１〜８２のいずれか１つに記載のＲＮＡから選択される、実施形態１３４に記載の組成物。
実施形態１３９．ＩＬ−２をコードするＲＮＡは、実施形態６５〜６７のいずれか１つに記載のＲＮＡから選択される、実施形態１３２〜１３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４０．固形腫瘍がんを処置または予防する方法であって、以下のＲＮＡの各々：
ａ．ＩＬ−１２ｓｃをコードするＲＮＡ（配列番号１７または１８）を含むＲＮＡ；
ｂ．ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡ（配列番号２９）を含むＲＮＡ；および
ｃ．ＩＦＮα２ｂをコードするＲＮＡ（配列番号２２または２３）を含むＲＮＡ
についての治療有効量を腫瘍に直接投与することを含み、
各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含み、ならびに
各ＲＮＡは、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記方法。
【００２０】
実施形態１４１．固形腫瘍がんを処置または予防する方法であって、以下のＲＮＡの各々：
ａ．ＩＬ−１２ｓｃをコードするＲＮＡ（配列番号１７または１８）を含むＲＮＡ；
ｂ．ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡ（配列番号２９）を含むＲＮＡ；
ｃ．ＩＦＮα２ｂをコードするＲＮＡ（配列番号２２または２３）を含むＲＮＡ；および
ｄ．ＩＬ−２をコードするＲＮＡ（配列番号１２または１３）を含むＲＮＡ
についての治療有効量を腫瘍に直接投与することを含み、
各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含み、ならびに
各ＲＮＡは、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記方法。
実施形態１４２．固形腫瘍がんを処置または予防する方法であって、以下のＲＮＡの各々：
ａ．ＩＬ−１２ｓｃをコードするＲＮＡ（配列番号１７または１８）を含むＲＮＡ；
ｂ．ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡ（配列番号２９）を含むＲＮＡ；
ｃ．ＩＦＮα２ｂをコードするＲＮＡ（配列番号２２または２３）を含むＲＮＡ；および
ｄ．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＲＮＡ（配列番号２６）を含むＲＮＡ
についての治療有効量を腫瘍に直接投与することを含み、
各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含み、ならびに
各ＲＮＡは、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、方法。
実施形態１４３．ＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号９のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードし、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記組成物。
実施形態１４４．ＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号１４のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードし、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記組成物。
実施形態１４５．ＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号２７のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードし、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記組成物。
実施形態１４６．ＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号１９のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードし、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記組成物。
実施形態１４７．ＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている、配列番号２４のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードし、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、組成物。
実施形態１４８．ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている、配列番号１７または１８に対して少なくとも９５％の同一性を有する、ヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１４９．ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている、配列番号２９に対して少なくとも９５％の同一性を有する、ヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５０．ＩＦＮα２ｂ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンがウリジンアナログで置換されている、配列番号２２または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、ヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、ＩＦＮα２ｂ  ＲＮＡ組成物。
【００２１】
実施形態１５１．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている、配列番号２６に対して少なくとも９５％の同一性を有する、ヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５２．ＩＬ−２  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている、配列番号１２または１３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、ヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記ＩＬ−２  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５３．ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号１７または１８のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５４．ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号２９のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５５．ＩＦＮα２ｂ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号２２または２３のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、前記ＩＦＮα２ｂ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５６．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号２６のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５７．ＩＬ−２  ＲＮＡ組成物であって、各ウリジンが修飾核酸塩基で置換されている配列番号１２または１３のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなり、さらに、５’ＵＴＲ（配列番号２、４または６）、３’ＵＴＲ（配列番号８）、５’キャップ、およびポリＡテールを含む、ＩＬ−２  ＲＮＡ組成物。
実施形態１５８．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態１４３〜１５７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５９．ＩＦＮα２ｂをコードするＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、非改変ＲＮＡと比較して免疫原性が低下するように改変されている、組成物。
実施形態１６０．改変は、少なくとも１つのウリジンの修飾核酸塩基での置換を含む、実施形態１５９に記載の組成物。
【００２２】
実施形態１６１．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態１５９に記載の組成物。
実施形態１６２．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態１６１に記載の組成物。
実施形態１６３．改変は、二本鎖ＲＮＡの量の低減を含む、実施形態１５９〜１６２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６４．二本鎖ＲＮＡの低減は、ＨＰＬＣによる精製またはセルロースに基づくクロマトグラフィーによる精製の結果である、実施形態１６３に記載の組成物。
実施形態１６５．改変は、自然免疫系によるＲＮＡ認識を非改変ＲＮＡと比較して低下させる、実施形態１５９〜１６４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６６．改変は、ＲＮＡへの５’キャップの付加を含む、実施形態１５９〜１６５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６７．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態１６６に記載の組成物。
実施形態１６８．目的のペプチドまたはタンパク質をコードする第２のＲＮＡをさらに含む、実施形態１５９〜１６７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６９．目的のペプチドまたはタンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、自殺遺伝子産物、免疫原性タンパク質またはペプチド、アポトーシス誘導因子、血管新生阻害剤、熱ショックタンパク質、腫瘍抗原、β−カテニン阻害剤、ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子、レチノイン酸誘導性遺伝子（ＲＩＧ）−Ｉ経路の活性化因子、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）経路のアゴニスト、チェックポイントモジュレーター、自然免疫活性化因子、抗体、ドミナントネガティブ受容体およびデコイ受容体、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の阻害剤、ＩＤＯ経路阻害剤、ならびにアポトーシスの阻害剤に結合するタンパク質またはペプチドから選択される、またはこれらに由来するペプチドまたはタンパク質である、実施形態１６８に記載の組成物。
実施形態１７０．第２のＲＮＡは、非改変ＲＮＡと比較して免疫原性が低下するように改変されている、実施形態１６８または１６９に記載の組成物。
【００２３】
実施形態１７１．改変は、少なくとも１つのウリジンの修飾核酸塩基での置換を含む、実施形態１７０に記載の組成物。
実施形態１７２．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態１７１に記載の組成物。
実施形態１７３．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態１７２に記載の組成物。
実施形態１７４．改変は、二本鎖ＲＮＡの量の低減を含む、実施形態１６８〜１７３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７５．二本鎖ＲＮＡの低減は、ＨＰＬＣによる精製またはセルロースに基づくクロマトグラフィーによる精製の結果である、実施形態１７４に記載の組成物。
実施形態１７６．改変は、ＲＮＡへの５’キャップの付加を含む、実施形態１６８〜１７３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７７．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態１７６に記載の組成物。
実施形態１７８．第二のＲＮＡは：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／もしくは配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／もしくは配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／もしくは配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；または
ｄ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／もしくは配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ
を含む、実施形態１６８〜１７７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７９．対象におけるがんを処置もしくは予防する、腫瘍のサイズを縮小する、寛解期のがんの再発を予防する、またはがん転移を予防する方法であって、実施形態１５９〜１７８に記載の組成物のいずれか１つを投与することを含む方法。
実施形態１８０．がんを処置するもしくは予防する、腫瘍のサイズを縮小させる、寛解期のがんの再発を予防する、またはがん転移を予防する方法における使用のための、実施形態１５９〜１７８のいずれか１つに記載の組成物。
【００２４】
実施形態１８１．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物。
実施形態１８２．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物。
実施形態１８３．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物。
実施形態１８４．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｈｉタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物。
実施形態１８５．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物。
実施形態１８６．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、配列番号１７または１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、組成物。
実施形態１８７．ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、組成物。
実施形態１８８．ＩＦＮα２ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、配列番号２２または２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、組成物。
実施形態１８９．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、組成物。
実施形態１９０．ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物であって、該ＲＮＡは、配列番号１２または１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、組成物。
【００２５】
実施形態１９１．以下のＲＮＡのうちのいずれか２つを含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｄ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｅ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９２．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９３．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２または２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９４．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９５．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２または１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９６．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９７．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９８．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態１９９．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドをコードする、ＲＮＡ。
実施形態２００．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
【００２６】
実施形態２０１．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｂ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０２．以下のうちのいずれか３つを含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｄ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｅ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０３．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０４．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０５．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０６．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０７．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０８．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２０９．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１０．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
【００２７】
実施形態２１１．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１２．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１３．以下のうちのいずれか４つを含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｄ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｅ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１４．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｄ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１５．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｄ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１６．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｄ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１７．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｄ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１８．以下を含む組成物：
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｄ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２１９．以下を含む組成物：
ａ．配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、および／または配列番号１７もしくは１８のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする、および／または配列番号２９のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｃ．配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＦＮα２ｂタンパク質をコードする、および／または配列番号２２もしくは２３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；
ｄ．配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする、および／または配列番号２６のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ；ならびに
ｅ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、および／または配列番号１２もしくは１３のヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
実施形態２２０．実施形態１８１〜２１９に記載の組成物のいずれか１つを含む、医薬製剤。
【００２８】
実施形態２２１．実施形態１８１〜２１９に記載の組成物のいずれか１つと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤。
実施形態２２２．がんを処置または予防する方法における使用のための、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤。
実施形態２２３．腫瘍のサイズを縮小する方法における使用のための、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤。
実施形態２２４．寛解期のがんの再発を予防する方法における使用のための、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤。
実施形態２２５．がん転移を予防する方法における使用のための、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤。
実施形態２２６．がんを処置または予防する方法であって、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤を投与することを含む方法。
実施形態２２７．腫瘍のサイズを縮小する方法であって、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤を投与することを含む方法。
実施形態２２８．寛解期のがんの再発を予防する方法であって、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤を投与することを含む方法。
実施形態２２９．がん転移を予防する方法であって、実施形態１８１〜２１９のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態２２０もしくは２２１に記載の医薬製剤を投与することを含む方法。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、以下の通りである：
実施形態Ａ１．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、医療用製剤。
実施形態Ａ２．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態Ａ１に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３．ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態Ａ１または２に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４．ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡをさらに含む、実施形態Ａ１〜３のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５．ＩＦＮαタンパク質は、ＩＦＮα２ｂタンパク質である、実施形態Ａ４に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ６．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、実施形態Ａ２に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ７．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡとを含む、実施形態Ａ３に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ８．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、実施形態Ａ４または５に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ９．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、実施形態Ａ４または５に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１０．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、実施形態Ａ４または５に記載の医療用製剤。
【００３０】
実施形態Ａ１１．（ｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜１０のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１２．（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列、もしくは配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜１１のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１３．（ｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列、もしくは配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２〜１２のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１４．（ｉ）ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号１２もしくは１３のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１２もしくは１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−２タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列、もしくは配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ３〜１３のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１５．（ｉ）ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＦＮαタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくは配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ４〜１４のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１６．少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態Ａ１〜１５のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１７．各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態Ａ１〜１６のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１８．各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態Ａ１〜１７のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ１９．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態Ａ１６〜１８のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２０．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態Ａ１９に記載の医療用製剤。
【００３１】
実施形態Ａ２１．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップを含む、実施形態Ａ１〜２０のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２２．各ＲＮＡは、５’キャップを含む、実施形態Ａ１〜２１のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２３．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態Ａ２１または２２に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２４．少なくとも１つのＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む、実施形態Ａ１〜２３のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２５．各ＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む、実施形態Ａ１〜２４のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２６．５’ＵＴＲは、配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ２４または２５に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２７．少なくとも１つのＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む、実施形態Ａ１〜２６のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２８．各ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む、実施形態Ａ１〜２７のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ２９．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ２７または２８に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３０．少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡテールを含む、実施形態Ａ１〜２９のいずれか１つに記載の医療用製剤。
【００３２】
実施形態Ａ３１．各ＲＮＡは、ポリＡテールを含む、実施形態Ａ１〜３０のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３２．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ３０または３１に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３３．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態Ａ１〜３２のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３４．各ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態Ａ１〜３３のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３５．
ａ．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり；
ｂ．５’ＵＴＲは、配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
ｃ．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み； 
ｄ．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、
実施形態Ａ３３または３４に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３６．ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、実施形態Ａ１〜３５のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３７．さらなる治療剤を含む、実施形態Ａ１〜３６のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３８．さらなる治療剤は、抗がん治療剤である、実施形態Ａ３７に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ３９．さらなる治療剤は、チェックポイントモジュレーターである、実施形態Ａ３７または３８に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４０．チェックポイントモジュレーターは、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せである、実施形態Ａ３９に記載の医療用製剤。
【００３３】
実施形態Ａ４１．前記ＲＮＡの少なくとも１つを各々の容器が含む、少なくとも２つの容器を含むキットである、実施形態Ａ１〜４０のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４２．別々の容器に各ＲＮＡを含む、実施形態Ａ４１に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４３．さらなる治療剤は、ＲＮＡを含まない容器内にある、実施形態Ａ４１または４２に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４４．がんを処置または予防するための医療用製剤の使用説明書をさらに含む、実施形態Ａ４１〜４３のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４５．ＲＮＡを含む医薬組成物である、実施形態Ａ１〜４０のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４６．医薬組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、実施形態Ａ４５に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４７．ＲＮＡは、液体形態、固体形態、またはこれらの組合せから選択される形態で存在する、実施形態Ａ１〜４６のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４８．固体形態は、凍結形態または脱水形態である、実施形態Ａ４７に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ４９．脱水形態は、凍結乾燥または噴霧乾燥形態である、実施形態Ａ４８に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５０．薬学的使用のための、実施形態Ａ１〜４９のいずれか１つに記載の医療用製剤。
【００３４】
実施形態Ａ５１．薬学的使用は、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む、実施形態Ａ５０に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５２．がんを処置または予防する方法における使用のための、実施形態Ａ１〜５１のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５３．がんは、肉腫、癌腫、またはリンパ腫である、実施形態Ａ３８〜５２のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５４．がんは、固形腫瘍である、実施形態Ａ３８〜５３のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５５．固形腫瘍は、肺、結腸、卵巣、子宮頸部、子宮、腹膜、精巣、陰茎、舌、リンパ節、膵臓、骨、乳房、前立腺、軟部組織、結合組織、腎臓、肝臓、脳、甲状腺または皮膚におけるものである、実施形態Ａ５４に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５６．固形腫瘍は、上皮腫瘍、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、腎細胞腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、脈管構造を伴う腫瘍、中皮腫腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、肉腫腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、メラノーマ腫瘍、小細胞肺腫瘍、神経芽腫腫瘍、精巣腫瘍、癌腫腫瘍、腺癌腫瘍、神経膠腫腫瘍、精上皮腫腫瘍、網膜芽細胞腫、または骨肉腫腫瘍である、実施形態Ａ５４または５５に記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５７．ＲＮＡは、腫瘍内または腫瘍周囲投与のためのものである、実施形態Ａ１〜５６のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５８．さらなる治療剤は、全身投与のためのものである、実施形態Ａ３７〜５７のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ５９．ヒトへの投与のためのものである、実施形態Ａ１〜５８のいずれか１つに記載の医療用製剤。
実施形態Ａ６０．対象におけるがんを処置または予防することは、腫瘍のサイズを縮小させること、寛解期のがんの再発を予防すること、またはがん転移を予防することを含む、実施形態Ａ４４および４７〜５９のいずれか１つに記載の医療用製剤。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、以下の通りである：
実施形態Ｂ１．対象におけるがんを処置または予防する方法において使用するためのＲＮＡであって、方法は、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡを投与することを含む、ＲＮＡ。
実施形態Ｂ２．方法は、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態Ｂ１に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３．方法は、ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態Ｂ１または２に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４．方法は、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡを投与することをさらに含む、実施形態Ｂ１〜３のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５．ＩＦＮαタンパク質は、ＩＦＮα２ｂタンパク質である、実施形態Ｂ４に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６．方法は、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡを投与することを含む、実施形態Ｂ２に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ７．方法は、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡを投与することを含む、実施形態Ｂ３に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ８．方法は、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡを投与することを含む、実施形態Ｂ４または５に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ９．方法は、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡを投与することを含む、実施形態Ｂ４または５に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１０．方法は、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡを投与することを含む、実施形態Ｂ４または５に記載のＲＮＡ。
【００３６】
実施形態Ｂ１１．（ｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ１〜１０のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１２．（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列、もしくは配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ１〜１１のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１３．（ｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列、もしくは配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ２〜１２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１４．（ｉ）ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号１２もしくは１３のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１２もしくは１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−２タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列、もしくは配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ３〜１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１５．（ｉ）ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＦＮαタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくは配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ４〜１４のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１６．少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態Ｂ１〜１５のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１７．各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態Ｂ１〜１６のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１８．各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含む、実施形態Ｂ１〜１７のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ１９．修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、実施形態Ｂ１６〜１８のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２０．修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である、実施形態Ｂ１９に記載のＲＮＡ。
【００３７】
実施形態Ｂ２１．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップを含む、実施形態Ｂ１〜２０のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２２．各ＲＮＡは、５’キャップを含む、実施形態Ｂ１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２３．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、実施形態Ｂ２１または２２に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２４．少なくとも１つのＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む、実施形態Ｂ１〜２３のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２５．各ＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む、実施形態Ｂ１〜２４のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２６．５’ＵＴＲは、配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ２４または２５に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２７．少なくとも１つのＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む、実施形態Ｂ１〜２６のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２８．各ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む、実施形態Ｂ１〜２７のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ２９．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ２７または２８に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３０．少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡテールを含む、実施形態Ｂ１〜２９のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
【００３８】
実施形態Ｂ３１．各ＲＮＡは、ポリＡテールを含む、実施形態Ｂ１〜３０のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３２．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ３０または３１に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３３．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態Ｂ１〜３２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３４．各ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、実施形態Ｂ１〜３３のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３５．
ａ．５’キャップは、ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり；
ｂ．５’ＵＴＲは、配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
ｃ．３’ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み； 
ｄ．ポリＡテールは、少なくとも１００ヌクレオチドを含む、
実施形態Ｂ３３または３４に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３６．ｍＲＮＡである、実施形態Ｂ１〜３５のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３７．方法は、さらなる治療を投与することをさらに含む、実施形態Ｂ１〜３６のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ３８．さらなる治療は、次の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなる群から選択される１つまたはそれ以上を含む、実施形態Ｂ３７に記載のＲＮＡ：（ｉ）腫瘍を摘出、切除または減量するための外科手術、（ｉｉ）免疫療法、（ｉｉｉ）放射線療法、および（ｉｖ）化学療法。
実施形態Ｂ３９．さらなる治療は、さらなる治療剤を投与することを含む、実施形態Ｂ３７または３８に記載のＲＮＡ
実施形態Ｂ４０．さらなる治療剤は、抗がん治療剤である、実施形態Ｂ３９に記載のＲＮＡ。
【００３９】
実施形態Ｂ４１．さらなる治療剤は、チェックポイントモジュレーターである、実施形態Ｂ３９または４０に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４２．チェックポイントモジュレーターは、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せである、実施形態Ｂ４１に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４３．がんは、肉腫、癌腫、またはリンパ腫である、実施形態Ｂ１〜４２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４４．がんは、固形腫瘍である、実施形態Ｂ１〜４３のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４５．固形腫瘍は、肺、結腸、卵巣、子宮頸部、子宮、腹膜、精巣、陰茎、舌、リンパ節、膵臓、骨、乳房、前立腺、軟部組織、結合組織、腎臓、肝臓、脳、甲状腺または皮膚におけるものである、実施形態Ｂ４４に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４６．固形腫瘍は、上皮腫瘍、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、腎細胞腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、脈管構造を伴う腫瘍、中皮腫腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、肉腫腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、メラノーマ腫瘍、小細胞肺腫瘍、神経芽腫腫瘍、精巣腫瘍、癌腫腫瘍、腺癌腫瘍、神経膠腫腫瘍、精上皮腫腫瘍、網膜芽細胞腫、または骨肉腫腫瘍である、実施形態Ｂ４４または４５に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４７．腫瘍内または腫瘍周囲投与される、実施形態Ｂ１〜４６のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４８．さらなる治療剤は、全身投与される、実施形態Ｂ３９〜４７のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ４９．対象はヒトである、実施形態Ｂ１〜４８のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５０．複数のＲＮＡは、同時に投与される、実施形態Ｂ１〜４９のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５１．複数のＲＮＡは、該ＲＮＡの組合せを含む組成物を投与することにより投与される、実施形態Ｂ１〜５０のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５２．複数のＲＮＡのうちの少なくとも２つは、異なる時点で投与される、実施形態Ｂ１〜４９のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５３．複数のＲＮＡは、前記ＲＮＡの少なくとも１つを各々の組成物が含む、少なくとも２つの組成物を投与することにより投与される、実施形態Ｂ１〜４９および５２のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５４．がんを処置または予防することは、対象における腫瘍のサイズを縮小させること、寛解期のがんの再発を予防すること、またはがん転移を予防することを含む、実施形態Ｂ１〜５３のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５５．前記方法で投与される複数のＲＮＡの１つもしくはそれ以上であるか、１つもしくはそれ以上を含む、実施形態Ｂ１〜５４のいずれか１つに記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５６．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡ、ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡからなる群から選択される１つもしくはそれ以上である、または１つもしくはそれ以上を含む、実施形態Ｂ５５に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５７．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５８．ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ５９．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６０．ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
【００４０】
実施形態Ｂ６１．ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６２．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６３．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６４．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６５．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６６．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
実施形態Ｂ６７．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡ、ＩＬ−２タンパク質をコードするＲＮＡ、およびＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそのようなＲＮＡを含む、実施形態Ｂ５５または５６に記載のＲＮＡ。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｇは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにｍＲＮＡを８、１０、１２、１４日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長を４１日目までモニターした実験の結果を示す図である。図１Ａおよび図１Ｄは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＡ）  ｍＲＮＡ使用時の結果を示す。図１Ｂおよび図１Ｅは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）  ｍＲＮＡを示す。図１Ｃおよび図１Ｆは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＡ）使用時の結果を示す。図１Ｇは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）使用時の結果を示す。（Ａ〜Ｃについてはマウス  Ｎ＝１０／群、およびＤ〜Ｇについてはマウス  Ｎ＝９／群）。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図１−４】図１−３の続き。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにｍＲＮＡを１９、２１、２４、２６、２８および３１日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長を４８日目までモニターした実験の結果を示す図である。図２Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＡ）を示す。図２Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ）を示す。図２Ｃは、対照としてのルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＡ）を示す。図２Ｄは、対照としてのリンゲル液を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにｍＲＮＡを１３、１５、１８、２０および２２日目に腫瘍内注射し、腫瘍成長を４２日目までモニターした実験の結果を示す図である。図３Ａは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ）を示す。図３Ｂは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ）を示す。図３Ｃは、対照としてのルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を示す。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｆは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにサイトカインｍＲＮＡ混合物を１１、１３、１５、１７日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長を４５日目までモニターした実験の結果を示す図である。図４Ａは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＡ）を示す。図４Ｂは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）を示す、図５Ａに記載のものと同じ実験での反復実験である。図４Ｃは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＡ）を示す。図４Ｄは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）を示す、図５Ｂに記載のものと同じ実験での反復実験である。図４Ｅは、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＡ）を示す。図４Ｆは、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を示す、図５Ｄおよび６Ｄに記載のものと同じ実験での反復実験である。（マウス  Ｎ＝８／群）。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｄは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにサイトカインｍＲＮＡ混合物を１１、１３、１５、１７日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長を４５日目までモニターした実験の結果を示す図である。図５Ａは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）を示す、図４Ｂに記載のものと同じ実験での反復実験である。図５Ｂは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）を示す、図４Ｄに記載のものと同じ実験での反復実験である。図５Ｃは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す、図６Ｃに記載のものと同じ実験での反復実験である。図５Ｄは、対照としてのルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を示す、図４Ｆおよび６Ｄに記載のものと同じ実験での反復実験である。（マウス  Ｎ＝８／群）。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６−１】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにサイトカインｍＲＮＡ混合物を１３、１５、１７、１９、２１、２３日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長をプロットした実験の結果を示す図である。図６Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す、図７Ａに記載のものと同じ実験での反復実験である。図６Ｂは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を示す、図７Ｃに記載のものと同じ実験での反復実験である。マウス  Ｎ＝８／群。
【図６−２】図６Ｃおよび６Ｄは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにｍＲＮＡを、１１、１３、１５、１７日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長をプロットした実験の結果を示す図である。図６Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す、図５Ｃに記載のものと同じ実験での反復実験である。図６Ｄは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を示す、図４Ｆおよび５Ｄに記載のものと同じ実験での反復実験である。マウス  Ｎ＝８／群。
【図６−３】図６Ｅおよび６Ｆは、ＭＣ３８腫瘍担持マウスにサイトカインｍＲＮＡ混合物を、１１、１５、１９、２３日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長をプロットした実験の結果を示す図である。図６Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図６Ｆは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を示す。マウス  Ｎ＝５／群。
【図７−１】図７Ａおよび７Ｆは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにサイトカインｍＲＮＡ混合物を１３、１５、１７、１９、２１、２３日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長をプロットした実験の結果を示す図である。図７Ａは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す、図６Ａに記載のものと同じ実験での反復実験である。図７Ｂは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図７Ｃは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）対照を示す、図６Ｂに記載のものと同じ実験での反復実験である。同様のデザインの反復研究では、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにサイトカインｍＲＮＡ混合物を１９、２１、２３、２６、２８および３０日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長をプロットした。図７Ｄは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す、図９Ａに記載のものと同じ実験での反復実験である。図７Ｅは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図７Ｆは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）対照を示す、図９Ｆに記載のものと同じ実験での反復実験である。図Ａ〜Ｃについてはマウス  Ｎ＝８／群、および図Ｄ〜Ｆについてはマウス  Ｎ＝１０〜１１／群。
【図７−２】図７−１の続き。
【図７−３】図７−２の続き。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｈは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにｍＲＮＡを１２、１５、１９および２２日目に腫瘍内注射し、個々の腫瘍成長を３５日目までモニターし、プロットした実験の結果を示す図である。図８Ａは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図８Ｂは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図８Ｃは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図８Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図８Ｅは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ）を示す。図８Ｆは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）対照を示す。（Ｎ＝１０／群）。図８Ｇおよび８Ｈは、図８Ａ〜８Ｆに示されている研究の腫瘍成長動態を示す。図８Ｇは、すべての処置群についての３３日目までの平均腫瘍体積を示す。図８Ｈは、腫瘍成長抑制を示す。１９日目までのＴ／Ｃ（平均腫瘍体積に基づく、腫瘍／対照）を計算した。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図８−４】図８−３の続き。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスにｍＲＮＡを１９、２１、２３、２６、２８および３０日目に腫瘍内注射し、腫瘍成長を５０日目までモニターした実験を示す図である。図９Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す、図７Ｄに記載のものと同じ実験での反復実験である。図９Ｂは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図９Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図９Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）を示す。図９Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ）を示す。図９Ｆは、対照としてのルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＡ）を示す、図７Ｆに記載のものと同じ実験での反復実験である。（図９Ａ〜９ＥについてはＮ＝１１／群；図９ＦについてはルシフェラーゼｍＲＮＡ群Ｎ＝１０）。
【図９−２】図９−１の続き。
【図９−３】図９−２の続き。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、図９に示されている研究の腫瘍成長動態を示す図である。図１０Ａは、すべての処置群についての３６日目までの平均腫瘍体積を示す。図１０Ｂは、腫瘍成長抑制を示す。３０日目までのＴ／Ｃ（平均腫瘍体積に基づく、腫瘍／対照）を計算した。
【図１１】腫瘍体積の有意な低減があったｍＲＮＡ混合物を示す、図９に示されている実験からのデータの棒グラフであって、有意な腫瘍低減があった処置群の各々におけるマウスの数を、腫瘍体積のＺスコア、および腫瘍体積変化と対照群の平均との間の比に基づいて、ルシフェラーゼ対照群と比較した棒グラフを示す図である。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、マウスが、１）腫瘍無処置であったか、または２）以前にＢ１６Ｆ１０細胞５×１０５個の皮下注射を受け、腫瘍内サイトカインｍＲＮＡ処置後に最初の腫瘍を拒絶した、実験の結果を示す図である。両方の群にＢ１６Ｆ１０腫瘍を再負荷した。図１２Ａは、腫瘍無処置宿主マウスを示す。図１２Ｂは、以前に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）での腫瘍内サイトカインｍＲＮＡ処置後にＢ１６Ｆ１０腫瘍を拒絶したマウスを示す。マウスをＢ１６Ｆ１０注射後５５日間にわたってモニターし、各マウスの腫瘍成長をプロットした。Ｂ１６Ｆ１０細胞を生着させた無処置マウス９匹すべては腫瘍を発生した（図１２Ａ）が、無腫瘍マウス８匹はすべてがＢ１６Ｆ１０細胞を拒絶し、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の成長を示さなかった（図１２Ｂ）。図１２Ｂのグラフは、すべての実測値がゼロであった、すなわち、横軸と重なっていたため、目に見えるデータトレースがなかった。図１２Ｃは、腫瘍部位における限局性白斑の例を示す。図１２Ｄは、マウスが、腫瘍無処置であった（三角記号）か、または以前にＣＴ２６腫瘍細胞の皮下注射を受け、腫瘍内サイトカインｍＲＮＡ処置後に最初の腫瘍を拒絶した（丸記号）、実験の結果を示す。両方の群に、ＣＴ２６腫瘍細胞（ＣＴ２６−ＷＴ）、またはｇｐ７０−エピトープがノックアウトされていたＣＴ２６Δｇｐ７０腫瘍細胞、どちらかを再負荷した。腫瘍細胞注射後２１日間にわたってマウスをモニターした。ＣＴ２６−ＷＴ細胞を生着させた１匹を除く９匹すべての無処置マウス、およびＣＴ２６−Δｇｐ７０細胞を生着させたすべての無処置マウスは、腫瘍を発生したが、３匹すべての無腫瘍マウスは、ＣＴ２６細胞を拒絶し、ＣＴ２６およびＣＴ２６−Δｇｐ７０腫瘍それぞれの成長を示さなかった。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１２−３】図１２−２の続き。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、０日目にマウスの右側腹部（被注射）および左側腹部（未注射）（図１３Ａ）にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植した実験の結果を示す図である。マウスに、右側の腫瘍内へのＭｏｄＢサイトカインｍＲＮＡ（ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα）またはＭｏｄＢ対照ｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ）の一連の４回の腫瘍内注射を１１、１５、１９および２３日目に施した。平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ（ｎ＝１２）が、注射を施した腫瘍（図１３Ｂ）および反対側の未注射の腫瘍（図１３Ｃ）について示されている。生存率中央値は、図１３Ｄに示されている。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｆは、ヒトＨＥＫ２９３（図１４Ｂ）およびメラノーマ細胞株（Ａ１０１Ｄ（図１４Ｃ）、Ａ２０５８（図１４Ｄ）、Ａ３７５（図１４Ｅ）、およびＨｓ２９４Ｔ（図１４Ｆ））にヒトサイトカインｍＲＮＡ混合物（ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉおよびＩＦＮα２ｂ）を様々なｍＲＮＡ用量でトランスフェクトした実験の結果を示す図である。トランスフェクションの２４時間後に上清を回収し、タンパク質濃度をサイトカイン特異的ＥＬＩＳＡで決定した。図１４Ａは、実験の模式図を示す。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１４−３】図１４−２の続き。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｂは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂをコードするヒトサイトカインｍＲＮＡ混合物、または個々のサイトカインｍＲＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、条件培地を２４時間の時点で回収し、希釈し、ヒトＰＢＭＣに添加した研究からの、模式図（図１５Ａ）および結果（図１５Ｂ）を示す図である。ＰＢＭＣ培養物上清中のＩＦＮγを２４時間の時点で測定した（ドナー  Ｎ＝６、平均）。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｅは、ヒトＡ３７５腫瘍異種移植片を担持している免疫不全マウスに、ヒトサイトカインをコードするＭｏｄＢ  ｍＲＮＡ混合物（ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ；「ＩＬ１５  ｓｕｓｈｉ混合物」）または（ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ；「ＩＬ２混合物」）の単回注射を施した実験結果を示す図である。腫瘍細胞溶解物を、注射後２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点で調製し、腫瘍溶解物中の全タンパク質に対する各サイトカインの濃度を測定した（マウス  ｎ＝３／時点、＋／−ＳＥＭ）。図１６Ａは、ＩＦＮα２ｂを示し、図１６Ｂは、ＩＬ−２を示し、図１６Ｃは、ＩＬ−１２ｓｃを示し、図１６Ｄは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉを示し、図１６Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦを示す。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１６−３】図１６−２の続き。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｃは、ＭｏｄＢサイトカインｍＲＮＡ混合物（ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ｂ）または（ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ｂ）の注射後２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点でＡ３７５腫瘍からｍＲＮＡを単離した実験の結果を示す図である。インターフェロンアルファ応答遺伝子の発現を、ｑＰＣＲによりモニターした。図１７Ａは、ヒトＩＳＧ１５を示し、図１７Ｂは、ヒトＩＳＧ５４を示し、ヒト１７Ｃは、ヒトＭＸ１を示す。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｅは、マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を移植し、ＩＦＮαを伴うまたは伴わないｍＲＮＡ混合物（ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−２、４１ＢＢＬ、およびＣＤ２７Ｌ−ＣＤ４０Ｌ）で処置した実験の結果を示す図である。ＩＦＮαを伴わない、標準形態（ＭｏｄＡ、図１８Ｂ）および修飾形態（ＭｏｄＢ、図１８Ｃ）のｍＲＮＡ混合物を、ＩＦＮαを含む、標準形態（ＭｏｄＡ、図１８Ｄ）および修飾形態（ＭｏｄＢ、図１８Ｅ）のものと比較した。図１８Ａは、ｍＲＮＡを伴わないリンゲル培地を供給した負の対照である。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１８−３】図１８−２の続き。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｅは、マウスの一方の側腹部に腫瘍を移植し、肺にホーミングするルシフェラーゼ発現腫瘍細胞のＩＶ注射を施した（図１９Ａ）実験の結果を示す図である。処置群のマウスの側腹部腫瘍のみにｍＲＮＡ混合物  ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの腫瘍内注射を施したが、肺における腫瘍は処置しなかった。図１９Ｂは、肺における生物発光測定、および同じ日（２０日目）に摘出した、相応する肺の写真を例として示し；腫瘍結節が黒い印として見え；図１９Ｃは、ノギス測定により判定された側腹部腫瘍の平均腫瘍体積を示し；図１９Ｄは、２０日目の生物発光測定の全光束の分析を示し：図１９Ｅは、肺重量を示す。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図１９−３】図１９−２の続き。
【図１９−４】図１９−３の続き。
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｇは、二重側腹部腫瘍モデルにおいて抗体の全身投与と組み合わせたｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射の効果を評定するために計画した実験の結果を示す図である。左右側腹部へのＢ１６Ｆ１０腫瘍の移植または左右側腹部へのＭＣ３８腫瘍の移植のどちらかを施したマウスの一方の側腹部の腫瘍のみにＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦＩＮα（Ｍｏｄ  Ｂ）のｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射を施し、その一方で、他方の側腹部は、処置しなかった。マウスに抗ＰＤ１抗体の腹腔内（全身）注射も施した。図２０は、Ｂ１６Ｆ１０（図２０Ａ）およびＭＣ３８（図２０Ｂ）腫瘍モデルにおける全生存率を示す。図２０Ｃ〜Ｇは、抗ＰＤ−１抗体を評価する実験の結果を示し、この実験では、マウスの一方の側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、肺にホーミングするルシフェラーゼ発現Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞のＩＶ注射を施した。マウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦＩＮαのｍＲＮＡ混合物の３回の腫瘍内注射を施し、抗ＰＤ−１抗体の３回の腹腔内（全身）注射も施した。ＳＣ腫瘍の腫瘍成長が図２０Ｃ〜Ｆに描示されている。図２０Ｃは、対照ｍＲＮＡおよび対照抗体を示し；図２０Ｄは、対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＰＤ１抗体を示し；図２０Ｅは、サイトカインｍＲＮＡ混合物、加えて、アイソタイプ対照抗体を示す。図２０Ｆは、サイトカインｍＲＮＡ、加えて、抗ＰＤ−１抗体を示す。図２０Ｇは、ＩＶ腫瘍接種後７０日目までの４つすべての処置群についての生存パーセントを示し；ｍＲＮＡ、加えて、抗ＰＤ−１抗体を施した処置群は、最も強い抗腫瘍活性を示し、マウス１５匹のうちの６匹が腫瘍接種後４０日目に無腫瘍であった。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２０−３】図２０−２の続き。
【図２０−４】図２０−３の続き。
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｉは、抗体の全身投与と組み合わせたｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射の効果を評定するために計画した追加実験の結果を示す図である。ＣＴ２６腫瘍担持マウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαのｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射を施した。マウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内（全身）注射も施した。図２１Ａは、腫瘍内サイトカインｍＲＮＡとＩＰ注射抗ＣＴＬＡ−４の併用療法が、最も強い抗腫瘍活性を生じさせる結果となり、マウス１６匹のうちの１２匹が、腫瘍接種後５５日目に無腫瘍であったことを示す。図２１Ｂは、サイトカインｍＲＮＡ混合物、加えて、アイソタイプ対照抗体を示し；図２１Ｃは、対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体を示し；図２１Ｄは、対照ｍＲＮＡおよび対照抗体を示す。図２１Ｅ〜２１Ｉは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射の効果を評定するために計画した追加実験の結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαのｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射を施した。マウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内（全身）注射も施した。図２１Ｅは、腫瘍内サイトカインｍＲＮＡとＩＰ注射抗ＣＴＬＡ−４の併用療法が、最も強い抗腫瘍活性を生じさせる結果となり、マウス９匹のうちの６匹が、腫瘍接種後７０日目に無腫瘍であったことを示す。図２１Ｆは、サイトカインｍＲＮＡ混合物、加えて、アイソタイプ対照抗体を示し；図２１Ｇは、対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体を示し；図２１Ｈは、対照ｍＲＮＡおよび対照抗体を示す。図２１Ｉは、腫瘍接種後７０日目までの４つすべてについての処置群についての生存パーセントを示す。
【図２１−２】図２１−１の続き。
【図２１−３】図２１−２の続き。
【図２１−４】図２１−３の続き。
【図２１−５】図２１−４の続き。
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｄは、異なるヒトがんのヒト腫瘍異種移植片におけるサイトカインｍＲＮＡ（Ｍｏｄ  Ｂ）の腫瘍内注射の効果を評価するために計画した実験の結果を示す図である。４つのｍＲＮＡにコードされたサイトカイン：ＩＬ−１２ｓｃ（図２２Ａ）、ＩＦＮα２ｂ（図２２Ｂ）、ＧＭ−ＣＳＦ（図２２Ｃ）およびＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ（図２２Ｄ）の各々についての腫瘍内発現が示されている。
【図２２−２】図２２−１の続き。
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｄは、コードされたサイトカイン：ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ（図２３Ａ）、ＩＬ−１２ｓｃ（図２３Ｂ）、ＧＭ−ＣＳＦ（図２３Ｃ）およびＩＦＮα２ｂ（図２３Ｄ）の発現に対する異なる腫瘍内ｍＲＮＡ用量の効果を評価するために計画した実験の結果を示す図である。
【図２３−２】図２３−１の続き。
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｇは、マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（ＭｏｄＢ）のサイトカインｍＲＮＡ混合物、または単一のサイトカインをコードするｍＲＮＡの、４回の腫瘍内注射で処置した実験の結果を示す図である。明らかになる腫瘍体積をおおよそ７０日目まで測定した。図２４Ａは、ルシフェラーゼ対照を示し；図２４Ｂは、４つのサイトカインの混合物を示し；図２４Ｃは、ＩＬ−１２ｓｃ  ｍＲＮＡのみを示し；図２４Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡのみを示し；図２４Ｅは、ＩＦＮα  ｍＲＮＡのみを示し；図２４Ｆは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉのみを示す。図２４Ｇは、サイトカインｍＲＮＡ混合物でまたはｍＲＮＡにコードされた個々のサイトカインで処置したＢ１６Ｆ１０腫瘍の全生存率を示す。生存率データは、図２４Ａ〜Ｆに提示されている実験からのものである。
【図２４−２】図２４−１の続き。
【図２４−３】図２４−２の続き。
【図２４−４】図２４−３の続き。
【図２５】対照ｍＲＮＡ（「プラセボ」）およびサイトカインｍＲＮＡ処置後の皮下腫瘍におけるＣＤ８＋免疫細胞浸潤物を示す図である。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｃは、サイトカインｍＲＮＡ処置および対照ｍＲＮＡの腫瘍内投与をそれぞれ施したＣＴ２６腫瘍担持マウスの血液中のｇｐ７０のｇｐ７０腫瘍抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の測定結果を示す図である。図２６Ｃは、抗マウスＣＤ８抗体でおよび対照ｍＲＮＡを施した動物から得たｇｐ７０特異的四量体で染色した、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡＣＳヒストグラムを例として示し、図２６Ｂは、サイトカインｍＲＮＡで処置した１匹の動物からの例を示す。図２６Ｃは、４回の対照ｍＲＮＡ注射を施したマウス９匹および４回のサイトカインｍＲＮＡ注射を施したマウス１０匹からの処置開始後１３日目の血液中のｇｐ７０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの分析を示す。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｃは、左右の側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの一方の腫瘍のみにサイトカインｍＲＮＡまたは対照ｍＲＮＡの単回腫瘍内ｍＲＮＡ注射を施した実験を示す図である。ｍＲＮＡ注射後７日目に、左右の腫瘍を採取し、ＲＮＡ配列決定に供した。図２７Ｂは、対照ｍＲＮＡで処置した腫瘍に対するサイトカインｍＲＮＡ処置の、これらの間の遺伝子発現変化を比較する、インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシスの結果を示す。処置した腫瘍側部（カラム１）および未処置の腫瘍側部（カラム２）の因果関係ネットワーク分析を行い、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｚスコア（上半分）およびＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｚスコア（下半分）を分析して、発現が上方および下方調節される経路をそれぞれ定義した。図２７は、注射を施した腫瘍および未注射の腫瘍のクラスター分析を、３２７個のインターフェロンガンマ調節遺伝子に基づいて行ったことを示す。サイトカインｍＲＮＡで処置したマウスの被注射腫瘍と未注射腫瘍の両方が、対照ｍＲＮＡで処置したマウスと比較して、複数のＩＦＮガンマ遺伝子の上方調節を示した。
【図２７−２】図２７−１の続き。
【図２７−３】図２７−２の続き。
【図２８−１】図２８Ａ〜２８Ｄは、Ｂ１６Ｆ１０二重腫瘍モデルからの細胞の蛍光顕微鏡写真を示す図である。パネルＡは、サイトカインｍＲＮＡで処置した被注射腫瘍を示し、パネルＢは、対応する未注射腫瘍を示す。パネルＣは、対照ｍＲＮＡで処置した被注射腫瘍を示し、パネルＤは、対応する未注射腫瘍を示す。スライドをＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＦＯＸＰ３＋細胞について染色した。図２８Ｅ〜Ｇは、免疫蛍光画像で定量されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＦｏｘＰ３＋細胞の出現頻度を示す図である。１ｍｍ２当たりのＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の出現頻度が、図２８Ｅおよび２８Ｆに提示されている。ＦＯＸＰ３＋出現頻度で割ったＣＤ８＋出現頻度の比が、図２８Ｇに提示されている。
【図２８−２】図２８−１の続き。
【図２８−３】図２８−２の続き。
【図２９−１】図２９Ａ〜２９Ｇは、Ｔｈｙ１．１細胞表面タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはビヒクル（リンゲル液）のどちらか単独での単回注射を施した単一Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスを示す図である。腫瘍内注射後おおよそ１６〜１８時間の時点で、腫瘍を摘出し、消化し、抗体のパネルで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｔｈｙ１．１を発現する細胞の細胞型および出現頻度を特徴づけた。
【図２９−２】図２９−１の続き。
【図２９−３】図２９−２の続き。
【図３０−１】図３０Ａ〜３０Ｆは、実施例１５に記載の、様々な用量のサイトカインｍＲＮＡまたはルシフェラーゼ対照ｍＲＮＡ後に腫瘍溶解物中で検出された、示されているタンパク質の発現を示す図である。図３０Ｅ中の「ＩＦＮｙ」は、ＩＦＮγを示す。
【図３０−２】図３０−１の続き。
【図３０−３】図３０−２の続き。
【図３１−１】図３１Ａ〜３１Ｂは、実施例１５に記載の、対照またはサイトカインｍＲＮＡ処置後のＣＤ８＋およびＦＯＸＰ３＋（Ｔｒｅｇ）細胞についてのフローサイトメトリー結果を示す図である。ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞に対する実測比が、各パネルに示されている。図３１Ｃ〜３１Ｄは、実施例１５に記載の、対照またはサイトカインｍＲＮＡ処置後の多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞についてのフローサイトメトリー結果を示す図である。多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が、各パネルに示されている。図３１Ｅは、実施例１５に記載の、対照またはサイトカインｍＲＮＡ処置後の浸潤性骨髄系細胞上のＰＤ−Ｌ１のレベルを示す図である。図３１Ｆは、実施例１５に記載の、対照またはサイトカインｍＲＮＡ処置後の浸潤性ＣＤ８＋細胞上のＰＤ−１のレベルを示す図である。図３１Ｇ〜Ｈは、実施例１５に記載の、対照またはサイトカインｍＲＮＡ処置後の腫瘍内グランザイムＢ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を示す図である。
【図３１−２】図３１−１の続き。
【図３１−３】図３１−２の続き。
【図３１−４】図３１−３の続き。
【図３２−１】図３２Ａ〜３２Ｂは、実施例１６に記載の、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ  ５０μｇの腫瘍内注射後の様々な組織におけるルシフェラーゼ発現を示す図である。
【図３２−２】図３２−１の続き。
【図３３】本質的には図１２に示されている通りの実験に関するデータを示す図である。
【図３４】実施例１７に記載の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスにおけるサイトカインｍＲｎＡでの処置前のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の枯渇の生存率に対する効果を示す図である。
【図３５】実施例１に記載の通りＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植した、および実施例１８に記載の通り対照またはサイトカインｍＲＮＡで処置した、ＷＴおよびＩＦＮγ  ＫＯマウスの生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
配列の説明
表１および２は、本明細書で言及される、ある特定の配列の一覧表を提供するものである。
【００４３】
【表１】
0006949131.tif 000002
【００４４】
【表２】
0006949131.tif 000003
【００４５】
【表３】
0006949131.tif 000004
【００４６】
【表４】
0006949131.tif 000005
【００４７】
【表５】
0006949131.tif 000006
【００４８】
【表６】
0006949131.tif 000007
【００４９】
【表７】
0006949131.tif 000008
【００５０】
【表８】
0006949131.tif 000009
【００５１】
【表９】
0006949131.tif 000010
【００５２】
【表１０】
0006949131.tif 000011
【００５３】
【表１１】
0006949131.tif 000012
【００５４】
【表１２】
0006949131.tif 000013
【００５５】
【表１３】
0006949131.tif 000014
【００５６】
【表１４】
0006949131.tif 000015
【００５７】
【表１５】
0006949131.tif 000016
【００５８】
【表１６】
0006949131.tif 000017
【００５９】
【表１７】
0006949131.tif 000018
【００６０】
【表１８】
0006949131.tif 000019
【００６１】
【表１９】
0006949131.tif 000020
【００６２】
【表２０】
0006949131.tif 000021
【００６３】
【表２１】
0006949131.tif 000022
【００６４】
【表２２】
0006949131.tif 000023
【００６５】
【表２３】
0006949131.tif 000024
【００６６】
【表２４】
0006949131.tif 000025
【００６７】
【表２５】
0006949131.tif 000026
【００６８】
【表２６】
0006949131.tif 000027
【００６９】
【表２７】
0006949131.tif 000028
【００７０】
【表２８】
0006949131.tif 000029
【００７１】
詳細な説明
Ｉ．定義
用語「ＭｏｄＢ」は、少なくとも１つの（例えば、あらゆる）ウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含むＲＮＡであって、該ＲＮＡの５’末端にＣａｐ１構造をさらに含むＲＮＡを表す。一部の実施形態では、ＭｏｄＢ  ＲＮＡの５’ＵＴＲは、配列番号４または６を含む。ＭｏｄＢ  ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を低減させるように処理されている。「Ｃａｐ１」構造は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後に酵素的キャッピングにより生成されることもあり、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳中に生成（同時翻訳キャッピング）されることもある。
【００７２】
一部の実施形態では、ＭｏｄＢ修飾ＲＮＡの構成要素キャップは、同時翻訳キャッピングの際に使用され、次の通り：
ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧ
（ｍ２７，３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’−ＯＡｐＧと呼ばれることもある）
であり、これは、次の構造を有する：
【化１】
0006949131.tif 000030
【００７３】
下記は、ＲＮＡとｍ２７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’−ＯＡｐＧとを含む、同時翻訳キャッピング後の例示的Ｃａｐ１  ＲＮＡである：
【化２】
0006949131.tif 000031
【００７４】
下記は、酵素的キャッピング後の別の例示的Ｃａｐ１  ＲＮＡ（キャップアナログなし）である：
【化３】
0006949131.tif 000032
【００７５】
用語「ＭｏｄＡ」は、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾核酸塩基を含まない、ｄｓＲｎＡ低減のないＲＮＡを表す。ＭｏｄＡ  ＲＮＡは、該ＲＮＡの５’末端にＣａｐ０構造を含む。ＭｏｄＡ  ＲＮＡの５’ＵＴＲは、配列番号２を含むこともある。「Ｃａｐ０」構造は、一実施形態では、次の構造を有するキャップアナログアンチリバースキャップ（ＡＲＣＡ  Ｃａｐ（ｍ２７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ））：
【化４】
0006949131.tif 000033
を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳中に生成（同時翻訳キャッピング）される。
【００７６】
下記は、ＲＮＡとｍ２７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ’とを含む、例示的Ｃａｐ０  ＲＮＡである：
【化５】
0006949131.tif 000034
【００７７】
一部の実施形態では、「Ｃａｐ０」構造は、構造：
【化６】
0006949131.tif 000035
を有するキャップアナログベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（ｍ２７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳中に生成（当時翻訳キャッピング）される。
【００７８】
下記は、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（ｍ２７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）とＲＮＡとを含む、例示的Ｃａｐ０  ＲＮＡである：
【化７】
0006949131.tif 000036
【００７９】
用語「ウラシル」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡの核酸中に存在することができる核酸塩基の１つを表す。ウラシルの構造は、下記である：
【化８】
0006949131.tif 000037
【００８０】
用語「ウリジン」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ中に存在することができるヌクレオシドの１つを表す。ウリジンの構造は、下記である：
【化９】
0006949131.tif 000038
【００８１】
ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）は、次の構造を有する：
【化１０】
0006949131.tif 000039
【００８２】
プソイド−ＵＴＰ（プソイドウリジン５’−三リン酸）は、次の構造を有する：
【００８３】
【化１１】
0006949131.tif 000040
【００８４】
「プソイドウリジン」は、ウラシルが、窒素−炭素グリコシド結合ではなく炭素−炭素結合によってペントース環に結合されている、ウリジンの異性体である、修飾ヌクレオシドの一例である。プソイドウリジンは、例えば、ＣｈａｒｅｔｔｅおよびＧｒａｙ、Ｌｉｆｅ；４９：３４１〜３５１頁（２０００）に記載されている。
【００８５】
別の例示的修飾ヌクレオシドは、構造：
【化１２】
0006949131.tif 000041
を有するＮ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）である。
【００８６】
Ｎ１−メチルプソイド−ＵＴＰは、次の構造を有する：
【化１３】
0006949131.tif 000042
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「ポリＡテール」または「ポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３’末端に通常は位置する、アデニル酸残基の分断されていないまたは分断された配列を指す。ポリＡテールまたはポリＡ配列は、当業者に公知であり、本明細書に記載されるＲＮＡ中の３’ＵＴＲの後に続くことがある。分断されていないポリＡテールは、連続したアデニル酸残基を特徴とする。本来、分断されていないポリＡテールが定型である。本明細書で開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリＡテールを有することもあり、またはＤＮＡにコードされており、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたポリＡテールを有することもある。
【００８８】
約１２０ＡヌクレオチドのポリＡテールは、トランスフェクトされた真核細胞内のＲＮＡレベルにはもちろん、ポリＡテールの上流（５’）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルにも、有益な影響を及ぼすことが、実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐら、２００６、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻、４００９〜４０１７頁）。
【００８９】
ポリＡテールは、いずれの長さのものであってもよい。一実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００、かつ５００以下、４００以下、３００以下、２００以下または１５０以下のＡヌクレオチド、特に、約１２０のＡヌクレオチドを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。この文脈での「から本質的になる」は、ポリＡテール中の大部分のヌクレオチド、通常は、ポリＡテール中のヌクレオチドの数で少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、Ａヌクレオチドであることを意味するが、残りのヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えば、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）またはＣヌクレオチド（シチジル酸）であることを許容する。この文脈での「からなる」は、ポリＡテール中のすべてのヌクレオチド、すなわち、ポリＡテール中のヌクレオチドの数で１００％が、Ａヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」は、アデニル酸を指す。
【００９０】
一部の実施形態では、ポリＡテールは、ＲＮＡ転写中に、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの調製中に、コード鎖と相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて結合される。ポリＡテールをコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。
【００９１】
本発明の一実施形態では、ＤＮＡのコード鎖内に存在するポリ（Ａ）カセットは、ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４ヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）のランダム配列により分断されている。このようなランダム配列は、５〜５０ヌクレオチド長であることもあり、１０〜３０ヌクレオチド長であることもあり、または１０〜２０ヌクレオチド長であることもある。このようなカセットは、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／００５３２４  Ａ１に開示されている。ＷＯ２０１６／００５３２４  Ａ１に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを、本発明で使用することができる。ｄＡヌクレオチドから本質的になるが、４ヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）の同じ分布および例えば５〜５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列によって分断されている、ポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは大腸菌においてプラスミドＤＮＡの一定の伝播を示し、ＲＮＡレベルではＲＮＡ安定性および翻訳効率の支援に関する有益な特性に、なお関連する。それ故、本発明の一実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ分子に含有されるポリＡテールは、Ａヌクレオチドから本質的になるが、４ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）のランダム配列により分断されている。このようなランダム配列は、５〜５０ヌクレオチド長であることもあり、１０〜３０ヌクレオチド長であることもあり、または１０〜２０ヌクレオチド長であることもある。
【００９２】
本発明の一実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、ポリＡテールの３’末端に隣接しない、すなわち、ポリＡテールの３’末端はマスクされず、またはその３’末端の後にＡ以外のヌクレオチドが続かない。
【００９３】
一部の実施形態では、ポリＡテールは、配列：
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＵＡＵＧＡＣＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７８）
を含み、これは、表２中にも３’ＵＴＲ配列に続いて示されている。
【００９４】
「ＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」は、本明細書では同義で使用される。
【００９５】
「ＩＦＮα」は、本明細書では、ＩＦＮα２ｂおよびＩＦＮα４を含む任意のインターフェロンアルファＩ型サイトカインを記述するために同義で使用される。実施例セクションに記載の実験では、ヒトＩＦＮα２ｂおよびマウスＩＦＮα４を利用した。任意のＩＦＮαを組成物に組み込むことができ、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【００９６】
用語「処置」は、本明細書で使用される場合、対象における疾患のための治療薬の投与または適用を包含し、疾患を抑制すること、その発症を阻止すること、疾患の１つもしくはそれ以上の症状を軽減すること、疾患を治癒させること、または疾患の再発を予防することを含む。例えば、固形腫瘍の処置は、固形腫瘍の症状を緩和すること、固形腫瘍のサイズを減少させること、固形腫瘍を消失させること、腫瘍のさらなる成長を低減させること、または処置後の固形腫瘍の再発を低減させるもしくは無くすことを含むこともある。処置は、有効性のバイオマーカーの変化として測定されることもあり、またはイメージングもしくはＸ線撮影測定量の変化として測定されることもある。
【００９７】
用語「予防」は、本明細書で使用される場合、がんがないと考えられる対象における、固形腫瘍を含むがんの発症を抑制または阻止することを意味する。
【００９８】
「転移」は、がんが、原発性腫瘍として最初に生じた場所から体内の他の位置に拡散する過程を意味する。
【００９９】
用語「腫瘍内に」は、本明細書で使用される場合、腫瘍の中へを意味する。例えば、腫瘍内注射は、腫瘍に接触している任意の位置に治療薬を注射することを意味する。
【０１００】
用語「腫瘍周囲に」または「腫瘍周囲の」は、本明細書で使用される場合、約２ｍｍ幅である領域であって、腫瘍周辺の浸潤先進部に隣接する領域である。腫瘍周囲領域は、宿主組織を含む。例えば、下記を参照されたい：
【化１４】
0006949131.tif 000043
【０１０１】
「投与すること」は、対象に医薬品または医薬組成物を提供することを意味し、これらに限定されないが、医療専門家が投与すること、および自己投与することを含む。
【０１０２】
本開示は、所与の核酸配列またはアミノ酸配列それぞれ（参照配列）に対してある特定の同一度を有する、核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
【０１０３】
２核酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。２アミノ酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【０１０４】
用語「％同一の」、「％の同一性」または同様の用語は、特に、比較すべき配列間の最適アラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すように意図されている。前記パーセンテージは、純粋に統計に基づくものであり、２配列間の差は、比較すべき配列の全長にわたってランダムに分布していることもあるが、必ずしもそうとは限らない。２配列の比較は、対応する配列の局所領域を同定するために、前記配列を最適アラインメント後にセグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって通常は行われる。比較のための最適アラインメントは、手動で行ってもよく、またはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２、４８２頁による局所相同性アルゴリズムを用いて、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３頁による局所相同性アルゴリズムを用いて、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、２４４４頁による類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは前記アルゴリズムのコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を用いて、行ってもよい。
【０１０５】
同一性パーセンテージは、比較すべき配列が対応する同一の位置の数を判定すること、この数を比較した位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で割ること、およびこの結果に１００を掛けることにより得られる。
【０１０６】
一部の実施形態では、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域についての、同一度が得られる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、一部の実施形態では連続したヌクレオチドでの、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチドについての、同一度が得られる。一部の実施形態では、参照配列の全長についての同一度が得られる。
【０１０７】
所与の核酸配列またはアミノ酸配列それぞれに対して特定の同一度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所与の配列の少なくとも１つの機能的特性を有することができ、例えば、および場合によっては、前記所与の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性としては、特に、対象に投与されたとき、サイトカインとして作用することができることが挙げられる。一部の実施形態では、所与の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一度を有する核酸配列およびアミノ酸配列は、前記所与の配列と機能的に等価である。
【０１０８】
ＩＩ．組成物および医療用製剤
Ａ．インターロイキン−２（ＩＬ−２）
一部の実施形態では、組成物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（配列番号９）をコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列は、配列番号１０で提供される。
【０１０９】
一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、コドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１１のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、配列番号１１に対して８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。
【０１１０】
ネイティブＩＬ−２に対するコドン最適化ＩＬ−２のアラインメントが下に示され、このアラインメント中の「Ｑ」は、ネイティブＩＬ−２（ＮＭ＿０００５８６．３；配列番号１０）であり、「Ｓ」は、コドン最適化ＩＬ−２（配列番号１１）である。同一性パーセントは、８２．７９％である。
【０１１１】
【化１５】
0006949131.tif 000044
【０１１２】
一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１０または１１を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１２もしくは１３を含むか、または配列番号１２もしくは１３からなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１２もしくは１３に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含むか、またはそのようなＲＮＡ配列からなる。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡは、５’末端に改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡは、５’キャップを含む。当技術分野において公知のいずれの５’キャップを使用してもよい。一部の実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、チオリン酸修飾を含む５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、２’−Ｏまたは３’−Ｏ−リボースメチル化ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、修飾グアノシンヌクレオチドまたは修飾アデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、７−メチルグアニル酸を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、Ｃａｐ０またはＣａｐ１である。例示的キャップ構造としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７，２’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＧ、およびｍ７，３’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＡが挙げられる。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、開始コドンの上流にある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの翻訳を調節する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、安定化配列である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期を延長する。当技術分野において公知のいずれの５’ＵＴＲを使用してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号１、３または５を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４もしくは６を含むか、または配列番号２、４もしくは６からなる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４または６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンの後に続く。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在または安定性を調節する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号７を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８からなる。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＩＬ−２組成物は、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を含む。一部の実施形態では、組成物は、５’ＵＴＲのみを含む。一部の実施形態では、組成物は、３’ＵＴＲのみを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡは、ポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも約２５、少なくとも約３０，少なくとも約５０、少なくとも約７０または少なくとも約１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、２００またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、配列番号７８を含むか、または配列番号７８からなる。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＩＬ−２をコードする核酸、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを、この順序で含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１０もしくは１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１０もしくは１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１２２】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１０もしくは１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１０もしくは１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１２４】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１０もしくは１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１０もしくは１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。
【０１２６】
一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１２７】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１２もしくは１３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号２、４もしくは６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；かつ配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１２８】
Ｂ．インターロイキン−１２単鎖（ＩＬ−１２ｓｃ）
一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−１２  ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂと呼ばれることもある）と、ＧＳリンカーのようなリンカーと、ＩＬ−１２  ｐ３５（ＩＬ−１２Ａと呼ばれることもある）とを含む、インターロイキン−１２単鎖（ＩＬ−１２ｓｃ）（例えば、配列番号１４）をコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０、リンカー、およびＩＬ−１２ｐ３５は連続しており、介在ヌクレオチドを有さない。ＩＬ−１２ｓｃをコードする例示的ＤＮＡ配列は、配列番号１５で提供される。
【０１２９】
ネイティブＩＬ−１２  ｐ４０に対するコドン最適化ＩＬ−１２  ｐ４０のアラインメントが下に示され、このアラインメント中の「Ｓ」は、ネイティブＩＬ−１２  ｐ４０（ＮＭ＿００２１８７．２；配列番号１５のヌクレオチド１〜９８４）であり、「Ｑ」は、コドン最適化ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４）である。同一性パーセントは、７７％である。
【０１３０】
【化１６】
0006949131.tif 000045
【化１７】
0006949131.tif 000046
【０１３１】
ネイティブＩＬ−１２  ｐ３５に対するコドン最適化ＩＬ−１２  ｐ３５のアラインメントが下に示され、このアラインメント中の「Ｓ」は、ネイティブＩＬ−１２  ｐ３５（ＮＭ＿００８８２．３；配列番号１５のヌクレオチド１０２７〜１６２３）であり、「Ｑ」は、コドン最適化ＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３）である。同一性パーセントは、８０％である。
【０１３２】
【化１８】
0006949131.tif 000047
【０１３３】
一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−１２ｓｃをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−１２  ｐ４０をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−１２  ｐ３５をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、コドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１６を含むか、または配列番号１６からなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、配列番号１６に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２  ｐ４０をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、ＩＬ−１２ｓｃ−ｐ４０（配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４）をコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２  ｐ３５をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、ＩＬ−１２ｓｃ−ｐ３５（配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３）をコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１６のＩＬ−１２ｓｃ−ｐ４０部分（配列番号１６のヌクレオチド１〜９８４）およびＩＬ−１２ｓｃ−ｐ３５部分（配列番号１６のヌクレオチド１０２７〜１６２３）をコードするヌクレオチドを含み、さらに、ｐ４０部分とｐ３５部分を接続するリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド（例えば、配列番号１６のヌクレオチド９８５〜１０２６）をｐ４０部分とｐ３５部分の間に含む。当業者に公知のいずれのリンカーを使用してもよい。ｐ４０部分は、ｐ３５部分の５’側にあってもよく、または３’側にあってもよい。
【０１３４】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１５または１６を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１７もしくは１８を含むか、または配列番号１７もしくは１８からなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１７もしくは１８に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含むか、またはそのようなＲＮＡ配列からなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号１７または１８のＩＬ−１２ｓｃ−ｐ４０部分（配列番号１７または１８のヌクレオチド１〜９８４）およびＩＬ−１２ｓｃ−ｐ３５部分（配列番号１７または１８のヌクレオチド１０２７〜１６２３）をコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃをコードするコドン最適化ＲＮＡ配列は、配列番号１８のＩＬ−１２ｓｃ−ｐ４０部分（配列番号１８のヌクレオチド１〜９８４）およびＩＬ−１２ｓｃ−ｐ３５部分（配列番号１８のヌクレオチド１０２７〜１６２３）をコードするヌクレオチドを含み、さらに、ｐ４０部分とｐ３５部分を接続するリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドをｐ４０部分とｐ３５部分の間に含む。当業者に公知のいずれのリンカーを使用してもよい。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡは、５’末端に改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップを含む。当技術分野において公知のいずれの５’キャップを使用してもよい。一部の実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、チオリン酸修飾を含む５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、２’−Ｏまたは３’−Ｏ−リボースメチル化ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、修飾グアノシンヌクレオチドまたは修飾アデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、７−メチルグアニル酸を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、Ｃａｐ０またはＣａｐ１である。例示的キャップ構造としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７，２’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＧ、およびｍ７，３’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＡが挙げられる。
【０１３７】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、開始コドンの上流にある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの翻訳を調節する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、安定化配列である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期を延長する。当技術分野において公知のいずれの５’ＵＴＲを使用してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号１、３または５から転写される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４もしくは６を含むか、または配列番号２、４もしくは６からなる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４または６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンの後に続く。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在または安定性を調節する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号７から転写される。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８からなる。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ組成物は、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ組成物は、５’ＵＴＲのみを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ組成物は、３’ＵＴＲのみを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡは、ポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも約２５、少なくとも約３０，少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、２００またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、配列番号７８を含むか、または配列番号７８からなる。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＩＬ−１２ｓｃをコードする核酸、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを、この順序で含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１５もしくは１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１５もしくは１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１４４】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１５もしくは１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１５もしくは１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１４６】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１５もしくは１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１５もしくは１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１４８】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１７もしくは１８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり；配列番号２、４もしくは６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり；かつ配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０１４９】
Ｃ．インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）
一部の実施形態では、組成物は、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）（例えば配列番号１９）をコードするＤＮＡ配列を含む。ＩＦＮαをコードする例示的ＤＮＡ配列は、配列番号２０で提供される。
【０１５０】
ネイティブＩＦＮαに対するコドン最適化ＩＦＮαのアラインメントが下に示され、このアラインメント中の「Ｓ」は、ネイティブＩＦＮα（ＮＭ＿０００６０５．３；配列番号２０）であり、「Ｑ」は、コドン最適化ＩＦＮα（配列番号２１）である。同一性パーセントは、７９％である。
【０１５１】
【化１９】
0006949131.tif 000048
【０１５２】
一部の実施形態では、組成物は、ＩＦＮαをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、コドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号２１のヌクレオチドを含むか、またはそのようなヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、配列番号２１に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するコドン最適化ＤＮＡ配列を含むか、またはそのようなコドン最適化ＤＮＡ配列からなる。
【０１５３】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、ＩＦＮαをコードするＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２０または２１を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２２もしくは２３を含むか、または配列番号２２もしくは２３からなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２２もしくは２３に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含むか、またはそのようなＲＮＡ配列からなる。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の各ウリジンは、修飾されている。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の各ウリジンは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（Ｍ１ψ）で修飾されている。
【０１５５】
一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡは、５’末端に改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡは、５’キャップを含む。当技術分野において公知のいずれの５’キャップを使用してもよい。一部の実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、チオリン酸修飾を含む５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、２’−Ｏまたは３’−Ｏ−リボースメチル化ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、修飾グアノシンヌクレオチドまたは修飾アデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、７−メチルグアニル酸を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、Ｃａｐ０またはＣａｐ１である。例示的キャップ構造としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７，２’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＧ、およびｍ７，３’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＡが挙げられる。
【０１５６】
一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、開始コドンの上流にある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの翻訳を調節する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、安定化配列である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期を延長する。当技術分野において公知のいずれの５’ＵＴＲを使用してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号１、３または５を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４もしくは６を含むか、または配列番号２、４もしくは６からなる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４または６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１５７】
一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンの後に続く。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在または安定性を調節する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号７を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８からなる。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１５８】
一部の実施形態では、ＩＦＮα組成物は、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を含む。一部の実施形態では、組成物は、５’ＵＴＲのみを含む。一部の実施形態では、組成物は、３’ＵＴＲのみを含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡは、ポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡは、少なくとも約２５、少なくとも約３０，少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、２００またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、配列番号７８を含むか、または配列番号７８からなる。
【０１６０】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＩＦＮαをコードする核酸、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを、この順序で含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号２０もしくは２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列を含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２０もしくは２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１６３】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号２０もしくは２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２０もしくは２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１６５】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号２０もしくは２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２０もしくは２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり、配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２２もしくは２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり、配列番号２、４もしくは６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり、かつ配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０１６７】
Ｄ．ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ」は、可溶性インターロイキン１５（ＩＬ−１５）受容体アルファｓｕｓｈｉドメインと成熟インターロイキンアルファ（ＩＬ−１５）とを融合タンパク質として含む構築物を表す。一部の実施形態では、組成物は、可溶性ＩＬ−１５受容体アルファ鎖（ｓｕｓｈｉ）、続いてグリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、続いてＩＬ−１５の成熟配列を含む、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ（配列番号２４）をコードするＤＮＡ配列を含む。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２５で提供される。
【０１６８】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２５を含むヌクレオチド配列から転写される。一部の実施形態では、リンカーをコードするヌクレオチドは、完全に非存在であることもあり、または適切なリンカーをコードする任意のヌクレオチドで一部がもしくは全体が置換されていることもある。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２６を含むか、または配列番号２６からなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２６に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、ＩＬ−１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインをコードするヌクレオチド（例えば、配列番号２５または２６のヌクレオチド１〜３２１）、および成熟ＩＬ−１５をコードするヌクレオチド（例えば、配列番号２５または２６のヌクレオチド３８２〜７２９）を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、ＩＬ−１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインをコードするヌクレオチド（例えば、配列番号２５または２６のヌクレオチド１〜３２１）、および成熟ＩＬ−１５をコードするヌクレオチド（例えば、配列番号２５または２６のヌクレオチド３８２〜７２９）を含み、さらに、これらの部分の間に、これらの部分を接続するリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２５または２６のヌクレオチド３２２〜３８１を含む。当業者に公知の任意のリンカーを使用することができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１７０】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡは、５’末端に改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡは、５’キャップを含む。当技術分野において公知のいずれの５’キャップを使用してもよい。一部の実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、チオリン酸修飾を含む５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、２’−Ｏまたは３’−Ｏ−リボースメチル化ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、修飾グアノシンヌクレオチドまたは修飾アデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、７−メチルグアニル酸を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、Ｃａｐ０またはＣａｐ１である。例示的キャップ構造としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７，２’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＧ、およびｍ７，３’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＡが挙げられる。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、開始コドンの上流にある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの翻訳を調節する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、安定化配列である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期を延長する。当技術分野において公知のいずれの５’ＵＴＲを使用してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号１、３または５から転写される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４もしくは６を含むか、または配列番号２、４もしくは６からなる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４または６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１７２】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンの後に続く。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在または安定性を調節する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号７から転写される。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８からなる。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、５’ＵＴＲのみを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、３’ＵＴＲのみを含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  ＲＮＡは、ポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも約２５、少なくとも約３０，少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、２００またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、配列番号７８を含むか、または配列番号７８からなる。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードする核酸、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを、この順序で含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡから転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１７８】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１８０】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡから転写される。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１８２】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ組成物は、配列番号２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号２、４もしくは６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり；かつ配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＩＦＮα  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０１８３】
Ｅ．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
一部の実施形態では、組成物は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば配列番号２７）をコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２８で提供される。
【０１８４】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列から転写される。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２８から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２９を含むか、または配列番号２９からなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、配列番号２９に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡは、５’末端に改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップを含む。当技術分野において公知のいずれの５’キャップを使用してもよい。一部の実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、チオリン酸修飾を含む５’−５’三リン酸結合を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、２’−Ｏまたは３’−Ｏ−リボースメチル化ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、修飾グアノシンヌクレオチドまたは修飾アデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’キャップは、７−メチルグアニル酸を含む。一部の実施形態では、５’キャップは、Ｃａｐ０またはＣａｐ１である。例示的キャップ構造としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７，２’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＧ、およびｍ７，３’Ｏ−ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ−ｍＡが挙げられる。
【０１８６】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、開始コドンの上流にある。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの翻訳を調節する。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、安定化配列である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡの半減期を延長する。当技術分野において公知のいずれの５’ＵＴＲを使用してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号１、３または５から転写される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４もしくは６を含むか、または配列番号２、４もしくは６からなる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号２、４または６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１８７】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンの後に続く。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在または安定性を調節する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号７から転写される。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８からなる。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＲＮＡ配列は、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１８８】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を含む。一部の実施形態では、組成物は、５’ＵＴＲのみを含む。一部の実施形態では、組成物は、３’ＵＴＲのみを含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡは、ポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも約２５、少なくとも約３０，少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、２００またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、配列番号７８を含むか、または配列番号７８からなる。
【０１９０】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを、この順序で含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むか、またはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＤＮＡ配列を含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ配列を含み、該ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号１、３もしくは５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり；かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなるＤＮＡ配列から転写される。ＲＮＡは、組換えにより産生されることもある。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）である。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ組成物は、配列番号２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり；配列番号２、４もしくは６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であり；かつ配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそのような核酸配列からなる、ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０１９８】
Ｆ．修飾形態
本明細書に記載されるＲＮＡおよび組成物の各々を、当業者に公知のいずれの方法で修飾してもよい。一部の実施形態では、修飾形態は、本明細書に記載の通り修飾された「ＭｏｄＡ」または「ＭｏｄＢ」である。
【０１９９】
一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾ウリジンである。
【０２００】
一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ウリジンは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のシトシン、アデニンまたはグアニンは、修飾核酸塩基により置換されている。一実施形態では、シトシンを置換する修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）である。別の実施形態では、アデニンを置換する修飾核酸塩基は、Ｎ６−メチルアデニン（ｍ６Ａ）である。別の実施形態では、分子の免疫原性を低下させるための、当該技術分野において公知の、いずれの他の修飾核酸塩基を使用してもよい。
【０２０２】
ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンもしくは５−ブロモ−ウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカ���ボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンまたは当技術分野において公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つまたはそれ以上であってもよい。
【０２０３】
Ｇ．組合せ組成物
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１つより多くのＲＮＡを含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、２つのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、３つのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、４つのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、５つのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ１２ｓｃ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮαをコードするＲＮＡのいずれかまたはすべては、例えば、本明細書に記載のこれらのＲＮＡを含む組成物および製剤のいずれにおいても、ＩＬ−２、ＩＬ１２ｓｃ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＦＮαポリペプチドによって置換されていてもよい。
【０２０４】
一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ１２ｓｃ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＦＮαをコードする修飾または非修飾ＲＮＡは、例えば、本明細書に記載されるこれらのＲＮＡを含む組成物および製剤のいずれにおいても、ＩＬ−２、ＩＬ１２ｓｃ、ＩＬ１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαポリペプチドから選択される２つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする修飾または非修飾多シストロン性ＲＮＡによって置換されていてもよい。
【０２０５】
いずれの組合せ組成物も、賦形剤または希釈剤をさらに含むことがある。賦形剤または希釈剤は、対象への投与のために薬学的に許容されるものである。
【０２０６】
一部の実施形態では、組合せ組成物は、同じ修飾を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組合せ組成物は、異なる修飾を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組合せ組成物は、ＭｏｄＡ修飾を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組合せ組成物は、ＭｏｄＢ修飾を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組合せ組成物は、ＭｏｄＡおよびＭｏｄＢ修飾を有するＲＮＡを含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、ＩＬ−２をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉおよびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの１つまたはそれ以上とを含む組成物が、包含される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の、ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたはコドン最適化ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１０〜１３）と、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１５〜１８）、ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号２０〜２３）、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２５〜２６）およびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２８〜２９）の１つまたはそれ以上とを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、組成物中のＲＮＡの１つまたはそれ以上は、本明細書中の組成物セクションに記載の５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリＡテールをさらに含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、ＩＬ−２、ＩＦＮα、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉおよびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの１つまたはそれ以上とを含む組成物が、包含される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたはコドン最適化ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１５〜１８）と、ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１０〜１３）、ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号２０〜２３）、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２５〜２６）およびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２８〜２９）の１つまたはそれ以上とを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。
【０２０９】
一部の実施形態では、組成物中のＲＮＡの１つまたはそれ以上は、本明細書中の組成物セクションに記載の５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリＡテールをさらに含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、ＩＦＮαをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉおよびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの１つまたはそれ以上とを含む組成物が、包含される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の、ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたはコドン最適化ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号２０〜２３）と、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１５〜１８）、ＩＬ−２αをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１０〜１３）、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２５〜２６）およびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２８〜２９）の１つまたはそれ以上とを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、組成物中のＲＮＡの１つまたはそれ以上は、本明細書中の組成物セクションに記載の５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリＡテールをさらに含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮαおよびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの１つまたはそれ以上とを含む組成物が、包含される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２５〜２６）と、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１５〜１８）、ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号２０〜２３）、ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１０〜１３）およびＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２８〜２９）の１つまたはそれ以上とを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、組成物中のＲＮＡの１つまたはそれ以上は、本明細書中の組成物セクションに記載の５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリＡテールをさらに含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの１つまたはそれ以上とを含む組成物が、包含される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２８〜２９）と、ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−１２ｓｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１５〜１８）、ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＦＮαをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号２０〜２３）、ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたは最適化ＩＬ−２をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（配列番号１０〜１３）およびＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（配列番号２５〜２６）の１つまたはそれ以上とを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたはそれ以上のウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドにより置換されている。一部の実施形態では、ウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一部の実施形態では、組成物中のＲＮＡの１つまたはそれ以上は、本明細書中の組成物セクションに記載の５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリＡテールをさらに含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、修飾されており、例えば、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢとして修飾されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡは、配列番号１８で示されるように最適化されている。
【０２１４】
一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、およびＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、修飾されており、例えば、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢとして修飾されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡは、配列番号１８で示されるように最適化されている。
【０２１５】
一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＩＦＮα  ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、修飾されており、例えば、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢとして修飾されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡおよびＩＦＮα  ＲＮＡは、それぞれ、配列番号１８および２３で示されるように最適化されている。
【０２１６】
一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＩＦＮα  ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、修飾されており、例えば、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢとして修飾されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｓｃ  ＲＮＡおよびＩＦＮα  ＲＮＡは、それぞれ、配列番号１８および２３で示されるように最適化されている。
【０２１７】
一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、およびＩＦＮα  ＲＮＡを含み、該ＲＮＡは、配列番号１８（ＩＬ−１２ｓｃ）、２３（ＩＦＮα）、２６（ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ）もしくは２９（ＧＭ−ＣＳＦ）で示されるヌクレオチドを含むか、そのようなヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、組成物は、修飾されており、例えば、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢとして修飾されている。
【０２１８】
一部の実施形態では、ＲＮＡの組合せは、等しいＲＮＡ質量に基づいて、１：１、１：１：１、または１：１：１：１比として投与される。例えば、ＩＬ１５  ｓｕｓｈｉ  ２０μｇ、ＩＬ−１２ｓｃ  ２０μｇ、ＩＦＮα２ｂ  ２０μｇ、およびＧＭ−ＣＳＦ  ２０μｇ。一部の実施形態では、比は、異なる質量比、例えば、１：１０：１：１０比（２０μｇ、２００μｇ、２０μｇ、２００μｇ）が投与されるように調整される。同様に、一部の実施形態では、例えば、１：２：３：４（２０μｇ、４０μｇ、６０μｇ、８０μｇ）の比が使用される。あるいは、ＲＮＡの質量に基づく比を基準として用いるのではなく、比は、ＲＮＡのモル濃度に基づくこともある。
【０２１９】
一部の実施形態では、混合物中の各ＲＮＡが等比である、ＲＮＡの混合物が、投与される。
【０２２０】
一部の実施形態では、混合物中の各ＲＮＡが不等比である、ＲＮＡの混合物が、投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮＡは、混合物中の別のＲＮＡより１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きい比で、投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＲＮＡは、混合物中の別のＲＮＡの１／１、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９または１／１０である比で、投与される。
【０２２１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、医療用製剤であってもよい。一部の実施形態では、医療用製剤は、含まれているＲＮＡが、同じバイアルの内にあってもよく、または別々のバイアルの中にあってもよい、キットを含む。一部の実施形態では、医療用製剤は、固形腫瘍を処置または予防するための組成物の使用説明書をさらに含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物を含むキットであって、含まれているＲＮＡが、同じバイアルの内にあってもよく、または別々のバイアルの中にあってもよい、キットが提供される。一部の実施形態では、キットは、固形腫瘍を処置または予防するための組成物の使用説明書をさらに含む。
【０２２３】
Ｈ．修飾ｍＲＮＡ処置へのＩＦＮα追加の効果
ＲＮＡは、様々なパターン認識受容体（ＰＲＲ）を刺激することによって免疫系を活性化することができ、その結果、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮαのような）の産生に至る。様々な修飾ヌクレオチド、または投与されるｄｓＲＮＡの量を低減させることのような他の改変を組み込むことで、ＲＮＡの免疫刺激効果を低下させることができる。意外にも、実施例で説明されるように、インターフェロンアルファをコードする、ヌクレオチド修飾型およびｄｓＲＮＡ低減型ｍＲＮＡの包含は、ヌクレオチド修飾がなく、ｄｓＲＮＡを低減させないｍＲＮＡの包含と比較して、抗腫瘍活性を向上させた。インターフェロンアルファをコードするｍＲＮＡの追加は、修飾ヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ精製の包含により除去された免疫刺激効果の一部分を回復させた。
【０２２４】
一部の実施形態では、ＩＦＮ（任意の形態またはサブタイプのもの）をコードするＲＮＡであって、ＩＦＮ  ＲＮＡが、非改変ＲＮＡと比較して免疫原性が低下するように改変されている、ＲＮＡが提供される。ある特定の実施形態では、このＩＦＮの投与は、ＩＦＮをコードしていないＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。一部の実施形態では、ＩＦＮαをコードするＲＮＡは、他のＲＮＡが、免疫原性を低下させるように改変されていない限り、他のＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。一実施形態では、免疫原性を低下させる改変は、ｄｓＲＮＡの量の低減である。一部の態様では、免疫原性を低下させる改変は、１つまたはそれ以上のウリジンの修飾ヌクレオシドでの置換である。一部の態様では、免疫原性を低下させる改変は、ｄｓＲＮＡの量の低下と、１つまたはそれ以上のウリジンの修飾ヌクレオシドでの置換の両方である。一部の実施形態では、ＩＦＮは、ＩＦＮαである。
【０２２５】
一部の実施形態では、ＩＦＮ  ＲＮＡは、修飾ＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。一部の実施形態では、ＩＦＮ  ＲＮＡは修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。一部の実施形態では、ＩＦＮ  ＲＮＡは、プソイドウリジンを含むｍＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。一部の実施形態では、ＩＦＮ  ＲＮＡは、ＭｏｄＢ修飾を有するＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。
【０２２６】
一部の実施形態では、ＩＦＮ  ＲＮＡは、ＩＬ−２（配列番号１２もしくは１３）、ＩＬ−１２ｓｃ（配列番号１７もしくは１８）、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ（配列番号２６）またはＧＭ−ＣＳＦ（配列番号２９）のＲＮＡの抗腫瘍応答を向上させる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ＭｏｄＢ修飾を含む。
【０２２７】
一部の実施形態では、ＩＦＮは、ＩＦＮαである。
【０２２８】
一部の実施形態では、ＩＦＮ  ＲＮＡ構築物は、配列番号２２または２３である。
【０２２９】
ＩＩＩ．方法および使用
本明細書に記載されるいずれのＲＮＡ、組成物、医療用製剤および組合せ組成物も、がんまたは固形腫瘍を処置するために対象に投与することができる。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、嚢胞も液状領域も含有しない組織の異常な塊である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、良性であってもよく、または悪性であってもよい。一部の実施形態では、固形腫瘍は、前がん性病変である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、肺、結腸、卵巣、子宮頸部、子宮、腹膜、精巣、陰茎、舌、リンパ節、膵臓、骨、乳房、前立腺、軟部組織、結合組織、腎臓、肝臓、脳、甲状腺または皮膚に存在する。
【０２３０】
一部の実施形態では、固形腫瘍は、肉腫、癌腫またはリンパ腫である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、上皮腫瘍、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、腎細胞腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、脈管構造を伴う腫瘍、中皮腫腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、肉腫腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、メラノーマ腫瘍、基底細胞癌、扁平上皮癌、小細胞肺腫瘍、神経芽腫、精巣腫瘍、癌腫腫瘍、腺癌腫瘍、神経膠腫腫瘍、精上皮腫腫瘍、網膜芽細胞腫、または骨肉腫腫瘍である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、光線角化症などの前がん性病変である。
【０２３１】
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物を注射によって腫瘍の中に（例えば、腫瘍内に）または腫瘍の付近に（腫瘍周囲に）送達することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物を腫瘍除去部位にまたはその付近に送達することができる。
【０２３２】
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物を局所用溶液、軟膏またはクリームによって送達することができる。
【０２３３】
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物をウイルスによって送達することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物を、該ＲＮＡ組成物をコードするウイルス、例えば腫瘍溶解性ウイルス、による感染によって送達することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物を腫瘍溶解性ウイルスによって送達することができる。
【０２３４】
一部の実施形態では、１回より多くの投与が送達される。一部の実施形態では、複数回投与のためにカテーテルが腫瘍部位内にまたはその付近に留置される。一部の実施形態では、複数回投与のためにカテーテルが腫瘍除去部位に留置される。
【０２３５】
一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタである。
【０２３６】
一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、別の治療と組み合わせられる。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、１つより多くの他の治療と組み合わせられる。一部の実施形態では、ＲＮＡ組成物は、集学的治療に組み合わせられる。
【０２３７】
一部の実施形態では、他の治療は、腫瘍を摘出、切除または減量するための外科手術である。一部の実施形態では、治療的ＲＮＡ組成物は、腫瘍を摘出、切除または減量するための外科手術中に投与される。
【０２３８】
一部の実施形態では、他の治療は、放射線療法である。一部の実施形態では、放射線療法は、外照射療法または粒子線照射である。一部の実施形態では、放射線療法は、カテーテルまたは大口径針による直接腫瘍への放射性同位元素の一時的または永久移植を含む、密封小線源療法である。一部の実施形態では、放射性同位元素は、１３７セシウム、１９２イリジウム、または放射性ヨウ素である。一部の実施形態では、放射線療法は、静脈内投与される放射性同位元素製剤である。一部の実施形態では、放射性同位元素製剤は、放射性ヨウ素（１３１Ｉ）、ストロンチウム（８９Ｓｒ）またはサマリウム（１５３Ｓｍ）である。
【０２３９】
一部の実施形態では、他の治療は、化学療法である。一部の実施形態では、化学療法は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または細胞傷害性抗体である。
【０２４０】
一部の実施形態では、化学療法は、抗浸潤剤（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）を含む。一部の実施形態では、化学療法は、増殖因子機能（例えば、血小板由来増殖因子および肝細胞増殖因子）、増殖因子抗体または増殖因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチン（商標）］および抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ（商標））の阻害剤を含む。一部の実施形態では、化学療法は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、化学療法は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブ（イレッサ（商標））、エルロチニブ（タルセバ（商標））、およびカネルチニブ（ＣＩ  １０３３）、またはセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤）である。
【０２４１】
一部の実施形態では、化学療法は、抗増殖／抗悪性腫瘍薬、例えば、代謝拮抗薬（例えば、葉酸代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート；フルオロピリミジン、例えば５−フルオロウラシル、テガフール；プリンおよびアデノシン類似体、シトシンアラビノシド）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アントラサイクリン系薬剤、例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシン；マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン）；白金誘導体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテパ）；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンカアルカロイド類、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン；およびタキソイド類、例えばタキソール、タキソテール）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロトキシン類、例えばエトポシドおよびテニポシド；アムサクリン、トポテカン、カンプトテシンおよびまたイリノテカン）；またはチミジル酸シンターゼ阻害剤（例えば、ラルチトレキセド）を含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、化学療法は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、細胞傷害（抗がん）薬に連結された抗体である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、腫瘍細胞への細胞傷害薬の標的化送達を可能にする。一部の実施形態では、ＡＤＣは、正常組織に対して腫瘍細胞への優先的な細胞傷害薬送達を可能にする。
【０２４３】
一部の実施形態では、化学療法は、異なる薬剤の組合せでの併用化学療法である。一部の実施形態では、その組合せは、異なる作用機序および／または異なる、重複しない毒性を有する、異なる薬剤を含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、他の治療は、例えば、チェックポイントモジュレーター／阻害剤などの、免疫刺激因子または免疫療法である。チェックポイントモジュレーター／阻害剤は、宿主免疫系がそれ自体を攻撃するのを防ぐことは当技術分野において周知であり、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３を含む。一部の実施形態では、免疫刺激因子、免疫療法、またはチェックポイントモジュレーター／阻害剤は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、４１ＢＢ、４１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ３８またはＴＧＦベータに対する抗体である。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、免疫刺激因子は、細胞に基づく免疫療法である。一部の実施形態では、免疫刺激因子は、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態において、免疫刺激因子は、がんワクチンである。広範な免疫刺激因子が、当技術分野における技能を有する科学者および臨床医に公知であるので、本発明は、特定の免疫刺激因子との特異的な組合せに限定されない。
【０２４５】
一部の事例では、本明細書に記載のいずれのＲＮＡ、ＲＮＡ組成物、医療用製剤およびＲＮＡ組合せ組成物も、免疫刺激因子、免疫療法、またはチェックポイントモジュレーターと組み合わせて投与することができる。一部の事例では、本明細書に記載のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物およびＲＮＡ組合せ組成物は、固形腫瘍を含むがんを処置するために抗体と組み合わせて対象に投与される。一部の実施形態では、抗体は、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体の組合せである。一部の実施形態では、抗体は、例えば三重特異性または二重特異性抗体などの、多重特異性抗体である。
【０２４６】
一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、単離されている、および／または組換え体である。抗ＰＤ−１抗体の例は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、ＭＥＤＩ０６０８（旧名ＡＭＰ−５１４；例えば、ＷＯ２０１２／１４５４９３および米国特許第９，２０５，１４８号を参照されたい）、ＰＤＲ００１（例えば、ＷＯ２０１５／１１２９００を参照されたい）、ＰＦ−０６８０１５９１（例えば、ＷＯ２０１６／０９２４１９を参照されたい）、ＢＧＢ−Ａ３１７（例えばＷＯ２０１５／０３５６０６を参照されたい）である。
【０２４７】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＷＯ２０１５／１１２８００において開示されているもの（例えば、このＰＣＴ公報の表１においてＨ１Ｍ７７８９Ｎ、Ｈ１Ｍ７７９９Ｎ、Ｈ１Ｍ７８００Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８８Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９１Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９４Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９６Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ９０１９Ｐ、Ｈ４ｘＨ９０３４Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３７Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１１９Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２０Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ８９９２Ｐ、Ｈ４ｘＨ８９９９ＰおよびＨ４ｘＨ９００８Ｐとして言及されているもの、ならびにこのＰＣＴ公報の表３においてＨ４Ｈ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２、Ｈ４Ｈ９００８ＰおよびＨ４Ｈ９０４８Ｐ２として言及されているもの）の１つである。ＷＯ２０１５／１１２８００の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。例えば、ＷＯ２０１５／１１２８００において開示されている抗体、および関連抗体（このＰＣＴ公報において開示されているＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列または重鎖および軽鎖配列を有する抗体および抗原結合断片、ならびにこのＰＣＴ公報において開示されている抗体と同じＰＤ−１エピトープと結合する抗体および抗原結合断片を含む）を、がんを処置および／または予防するために本発明のＲＮＡ組成物とともに使用することができる。
【０２４８】
関連する実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号７９および８０としてそれぞれ下に示される重鎖および軽鎖アミノ酸配列；配列番号８７および８８におけるＶＨおよびＶＬ配列（イタリック体で示される）、または配列番号７９および８０における１つもしくはそれ以上（例えば、６つすべて）のＣＤＲ（太字枠内に示される）を含むこともある。一部の実施形態では、次のＣＤＲを含む抗体が包含される：
ＨＣＤＲ１＝ＧＦＴＦＳＮＦＧ（配列番号８１）
ＨＣＤＲ２＝ＩＳＧＧＧＲＤＴ（配列番号８２）
ＨＣＤＲ３＝ＶＫＷＧＮＩＹＦＤＹ（配列番号８３）
ＬＣＤＲ１＝ＬＳＩＮＴＦ（配列番号８４）
ＬＣＤＲ２＝ＡＡＳ（配列番号８５）
ＬＣＤＲ３＝ＱＱＳＳＮＴＰＦＴ（配列番号８６）。
【０２４９】
配列番号８７および８８におけるＶＨおよびＶＬ配列（イタリック体で示される）を含む重鎖を含む例示的抗体は、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）として公知の完全ヒト抗ＰＤ−１抗体である。
【０２５０】
抗ＰＤ−１  Ｍａｂ重鎖
【化２０】
0006949131.tif 000049
ＨＣＤＲ１＝ＧＦＴＦＳＮＦＧ（配列番号８１）
ＨＣＤＲ２＝ＩＳＧＧＧＲＤＴ（配列番号８２）
ＨＣＤＲ３＝ＶＫＷＧＮＩＹＦＤＹ（配列番号８３）
【０２５１】
抗ＰＤ−１  Ｍａｂ軽鎖
【化２１】
0006949131.tif 000050
ＬＣＤＲ１＝ＬＳＩＮＴＦ（配列番号８４）
ＬＣＤＲ２＝ＡＡＳ（配列番号８５）
ＬＣＤＲ３＝ＱＱ  ＳＳＮＴＰＦＴ（配列番号８６）。
【０２５２】
一部の実施形態では、ＲＮＡ、ＲＮＡ組成物、およびＲＮＡ組合せ組成物を、注射によって腫瘍の中に（例えば、腫瘍内に）、腫瘍の付近に（腫瘍周囲に）、または腫瘍除去部位の付近に送達してもよく、抗体を同じ方法で送達してもよく、または全身送達、例えば、注射、注入および移植によるものを含む、経腸または非経口方法などで送達してもよい。「組み合わせて投与」は、同時投与または逐次投与を含む。逐次的な場合、投与は、いずれの順序であってもよく、当業者に公知のいずれの適切な時間間隔であってよい。
【０２５３】
一部の実施形態では、他の治療は、ホルモン療法である。一部の実施形態では、ホルモン療法は、乳がんの処置のための抗エストロゲン薬、または前立腺がんを処置するための抗アンドロゲン薬である。薬剤の例としては、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン）、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、プロゲストーゲン（例えば、メゲストロール酢酸エステル）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトラゾール、ボロゾール、エキセメスタン）、抗プロゲストーゲン、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、シプロテロン酢酸エステル）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド、ブセレリン）、ならびに５−アルファ−レダクターゼ阻害剤（例えば、フィナステリド）が挙げられる。
【０２５４】
一部の実施形態では、他の治療は、標的療法である。一部の実施形態では、標的療法は、キナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、標的療法は、がん原遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害するものである。一部の実施形態では、標的療法は、抗血管新生剤である。一部の実施形態では、標的療法は、ＶＥＧＦ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲまたはＡＬＫの活性を調節することに関するものである。
【０２５５】
一部の実施形態では、他の治療は、幹細胞移植である。
【０２５６】
一部の実施形態では、治療用ＲＮＡ組成物は、別の治療と同時に送達される。
【０２５７】
一部の実施形態では、治療用ＲＮＡ組成物は、別の治療の前に送達される。
【０２５８】
一部の実施形態では、治療用ＲＮＡ組成物は、別の治療の後に送達される。
【０２５９】
一部の実施形態では、治療用ＲＮＡ組成物は、別の治療と一緒に、直接腫瘍に、または腫瘍のもしくは腫瘍除去部位の付近に、送達される。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡ組成物は、直接腫瘍に、または腫瘍のもしくは腫瘍除去部位の付近に、送達されるが、別の薬剤は、全身送達される。
【０２６０】
ＩＶ．医薬製剤
一部の実施形態では、本明細書に記載のいずれのＤＮＡ、ＲＮＡおよび組成物も医薬製剤である。一部の実施形態では、医薬製剤は、希釈剤、賦形剤、または他の薬学的に許容される担体を含む。したがって、本明細書で提供されるＤＮＡ、ＲＮＡ、組成物またはその組合せと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、水溶液である。ある特定の実施形態では、水溶液は、食塩溶液である。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される賦形剤は、無菌であると理解される。一部の実施形態では、医薬組成物は、投薬単位の形態で投与される。例えば、ある特定の実施形態では、投薬単位は、錠剤、カプセル、植込み型デバイス、またはボーラス注入の形態でのものある。
【０２６１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、医薬組成物中で従来見いだされる他の補助成分をさらに含有することがある。例えば、組成物は、例えば鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔剤または抗炎症剤などの、追加の、適合性の、薬学的に活性の材料を含有することもある。組成物はまた、例えば賦形剤、希釈剤および担体などの、追加の、適合性の、薬学的に不活性の材料を含有することもある。
【０２６２】
注射用のある特定の医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの、製剤用薬剤を含有することもある。注射のための医薬組成物における使用に適しているある特定の溶媒は、これらに限定されないが、親油性溶媒および脂肪油、例えばゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、およびリポソームが含まれる。水性懸濁注射剤は、懸濁液の粘度を上昇させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有することもある。場合により、そのような懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤と、医薬品の溶解度を上昇させる薬剤とを含有することもある。
【０２６３】
脂質部分を使用して、本明細書で提供されるＲＮＡを送達してもよい。１つの方法では、ＲＮＡは、カチオン性脂質と中性脂質の混合物で製造された既成のリポソームまたはリポプレックスに導入される。別の方法では、中性脂質が存在しない、モノまたはポリカチオン性脂質とＲＮＡ複合体が形成される。ある特定の実施形態では、脂質部分は、特定の細胞または組織への医薬品の分配を増加させるように選択される。
【０２６４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、本明細書で提供されるＤＮＡまたはＲＮＡと複合体を形成している、ポリアミン化合物または脂質部分を含む。
【０２６５】
一部の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、送達系を含む。送達系の例としては、リポソームおよびエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の送達系は、疎水性化合物を含むものを含む、ある特定の医薬組成物の調製に有用である。ある特定の実施形態では、ジメチルスルホキシドなどの、ある特定の有機溶媒が、使用される。
【０２６６】
注射のためのある特定の医薬組成物は、単位剤形で、例えば、アンプルで、または複数回投与用容器で、提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、ＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを治療有効量で含む。ある特定の実施形態では、治療有効量は、処置される対象におけるがんを処置または予防するのに十分な量ある。
【０２６７】
以下の条項は、非常に多くの実施形態を提供するものであり、非限定的である：
条項１．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡとを含む、組成物。
条項２．ＩＦＮαタンパク質は、ＩＦＮα２ｂタンパク質である、条項１に記載の組成物。
条項３．（ｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１７もしくは１８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１に記載の組成物。
条項４．（ｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列、もしくは配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１に記載の組成物。
条項５．（ｉ）ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２２もしくは２３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＩＦＮαタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくは配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１に記載の組成物。
条項６．（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号２９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、および／または（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列、もしくは配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１に記載の組成物。
条項７．少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、該修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）、またはこれらの組合せである、条項１に記載の組成物。
条項８．各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、該修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）、またはこれらの組合せである、条項１に記載の組成物。
条項９．少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、またはｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む、条項１に記載の組成物。
条項１０．少なくとも１つのＲＮＡは、（ｉ）配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、もしくは（ｉｉ）配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲ、および／または（ｉ）配列番号８のヌクレオチド配列、もしくは（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、条項１に記載の組成物。
条項１１．少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む、条項１に記載の組成物。
条項１２．ポリＡテールは、配列番号７８で示されるポリＡテールを含む、条項１１に記載の組成物。
条項１３．１つまたはそれ以上のＲＮＡは：
−  ｍ２７，３’−ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’−Ｏ）ＡｐＧまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む５’キャップ；
−  （ｉ）配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２、４および６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲ；
−  （ｉ）配列番号８のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲ；ならびに
−  少なくとも１００ヌクレオチドを含むポリＡテール
を含む、条１に記載の組成物。
条項１４．ポリＡテールは、配列番号７８を含む、条項１３に記載の組成物。
条項１５．条項１に記載の組成物と薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
条項１６．固形腫瘍を処置するまたは固形腫瘍の可能性を低下させる方法であって、それを必要とする対象に条項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
条項１７．固形腫瘍を処置するまたは固形腫瘍の可能性を低下させる方法であって、それを必要とする対象に第１のＲＮＡを投与することを含み、第１のＲＮＡは、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＦＮαタンパク質、またはＧＭ−ＣＳＦタンパク質、およびさらなるＲＮＡをコードし、ここで：
−  第１のＲＮＡがＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする場合には、さらなるＲＮＡは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＦＮαタンパク質、およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードし；
−  第１のＲＮＡがＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードする場合には、さらなるＲＮＡは、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質、ＩＦＮαタンパク質、およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードし；
−  第１のＲＮＡがＩＦＮαタンパク質をコードする場合には、さらなるＲＮＡは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質、およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードし；
−  第１のＲＮＡがＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする場合には、さらなるＲＮＡは、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＦＮαタンパク質、およびＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする、前記方法。
条項１８．第１のＲＮＡは、さらなるＲＮＡと同時に対象に投与される、条項１７に記載の方法。
条項１９．ＲＮＡは、腫瘍内または腫瘍周囲投与される、条項１７に記載の方法。
条項２０．対象は、（ｉ）腫瘍を摘出、切除もしくは減量するための外科手術、（ｉｉ）免疫療法、（ｉｉｉ）放射線療法、または（ｉｖ）化学療法を含む、追加の治療でさらに処置される、条項１７に記載の方法。
条項２１．対象は、チェックポイントモジュレーターでさらに処置される、条項１７に記載の方法。
条項２２．チェックポイントモジュレーターは、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せである、条項２１に記載の方法。
条項２３．ＲＮＡは、注射によって腫瘍内または腫瘍周囲投与され、チェックポイントモジュレーターは、全身投与される、条項２１に記載の方法。
条項２４．固形腫瘍は、肉腫、癌腫またはリンパ腫である、条項１７に記載の方法。
条項２５．固形腫瘍は、肺、結腸、卵巣、子宮頸部、子宮、腹膜、精巣、陰茎、舌、リンパ節、膵臓、骨、乳房、前立腺、軟部組織、結合組織、腎臓、肝臓、脳、甲状腺または皮膚におけるものである、条項１７に記載の方法。
条項２６．固形腫瘍は、上皮腫瘍、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、腎細胞腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、脈管構造を伴う腫瘍、中皮腫腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、肉腫腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、メラノーマ腫瘍、小細胞肺腫瘍、神経芽腫腫瘍、精巣腫瘍、癌腫腫瘍、腺癌腫瘍、神経膠腫腫瘍、精上皮腫腫瘍、網膜芽細胞腫、または骨肉腫腫瘍である、条項１７に記載の方法。
条項２７．固形腫瘍を処置することまたは固形腫瘍の可能性を低下させることは、対象における、腫瘍のサイズを縮小すること、寛解期のがんの再発の可能性を低下させること、またはがん転移の可能性を低下させることを含む、条項１７に記載の方法。
条項２８．固形腫瘍を処置するまたは固形腫瘍の可能性を低下させる併用治療方法であって、それを必要とする対象にＲＮＡおよびさらなる治療を投与することを含み、ＲＮＡは、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＦＮαタンパク質、およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードし、さらなる治療は、免疫療法、化学療法またはチェックポイントモジュレーターを含む、併用治療方法。
条項２９．さらなる治療は、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せを含む、条項２８に記載の併用治療方法。
条項３０．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸であって、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードする配列は、ａ）配列番号１６または１８のヌクレオチド１〜９８４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％または７８％の同一性を有する連続したヌクレオチドと、ｂ）配列番号１６または１８のヌクレオチド１０２７〜１６２３に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８１％の同一性を有する連続したヌクレオチドと、ｃ）ａ）のヌクレオチドとｂ）のヌクレオチドの間のリンカーをコードするヌクレオチドとを含む、単離された核酸。
条項３１．ＤＮＡである、条項３０に記載の核酸。
条項３２．ＲＮＡである、条項３０に記載の核酸。
条項３３．ＩＦＮαタンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸であって、ＩＦＮαタンパク質をコードする配列は、配列番号２１または２３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を有する、前記単離された核酸。
条項３４．ＤＮＡである、条項３３に記載の核酸。
条項３５．ＲＮＡである、条項３３に記載の核酸。
条項３６．固形腫瘍を処置するまたは固形腫瘍の可能性を低下させる方法であって、それを必要とする対象に条項３４に記載のＲＮＡを投与することを含み、対象は、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＦＮαタンパク質およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするさらなるＲＮＡでさらに処置される、前記方法。
条項３７．固形腫瘍を処置するまたは固形腫瘍の可能性を低下させる方法であって、それを必要とする対象に条項３５に記載のＲＮＡを投与することを含み、対象は、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質、ＩＬ−１２ｓｃタンパク質およびＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするさらなるＲＮＡでさらに処置される、前記方法。
条項３８．ＩＬ−１２ｓｃをコードするＲＮＡを産生する方法であって、プロモーターに作動可能に連結された条項３２に記載の核酸を含む発現構築物を、転写可能な条件下で、ＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、前記方法。
条項３９．ＩＦＮαをコードするＲＮＡを産生する方法であって、プロモーターに作動可能に連結された条項３５に記載の核酸を含む発現構築物を、転写可能な条件下で、ＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、前記方法。
条項４０．条項１に記載の組成物を含む、キット。
条項４１．ＩＬ−１２ｓｃタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉタンパク質をコードするＲＮＡと、ＩＦＮαタンパク質をコードするＲＮＡと、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするＲＮＡとを含むキットであって、これらのＲＮＡは、同じ容器内にない、前記キット。
条項４２．各ＲＮＡは、別々の容器内にある、条項４１に記載のキット。
条項４３．固形腫瘍を処置するまたは固形腫瘍の可能性を低下させるための組成物またはＲＮＡの使用説明書をさらに含む、条項４０〜４２のいずれか１項に記載のキット。
【０２６８】
この説明および例示的実施形態は、限定と考えるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲に関して、別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される、量、パーセンテージまたは割合を表すすべての数、および他の数値は、すべての場合、用語「約」により修飾されていると、それらがまだそのように修飾されていなくても、解されたい。したがって、相反する指示がない限り、以下の明細書および付属の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、得ようとする所望の特性に依存して変ることがある近似値である。最低でも、また本特許請求の範囲に記載の範囲への均等論の適用を制限しないようにして、各数値パラメータは、少なくとも、報告有効桁数に照らして、また通常の丸め技法を適用することにより、解釈されたい。
【０２６９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」、ならびに任意の語の任意の単数形の使用は、１つの指示対象に明確にかつ明白に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」およびその文法上の異表記は、非限定的であるように意図されており、したがって、リスト内の品目の言及は、挙げられている品目の代わりに使用することができるまたは挙げられている品目に加えることができる他の同様の品目の除外への言及ではない。
【実施例】
【０２７０】
以下の実施例は、ある特定の開示する実施形態を例証するために提供するものであり、いかなる点においても本開示の範囲を制限するものと見なしてはならない。
【実施例１】
【０２７１】
材料および方法
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデル：６〜８週齢で１７．０〜２０．９ｇの間の体重を有する雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）および滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、２２℃±２℃、相対湿度５５％±１５％でマウスを飼育した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡ）（カタログ番号ＣＲＬ−６４７５）から入手し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩ  ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１００８２−１４７）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１９９５）において５％ＣＯ２で、３７℃で培養した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５２００−０５６）を使用して細胞を回収し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１４４）に再浮遊させ、マウス１匹当たり細胞０．５×１０６個／２００μｌを、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部に皮下（ＳＣ）移植した。二重側腹部腫瘍モデルには、０日目に、マウス１匹当たりＢ１６Ｆ１０細胞０．５×１０６個／２００μｌを右側腹部に皮下（ＳＣ）移植し、マウス１匹当たりＢ１６Ｆ１０細胞０．２５×１０６個／２００μｌを左側腹部にＳＣ移植した。サイトカインｍＲＮＡの局所投与が、遠位効果を及ぼすことができるかどうかを試験するために（図１９を参照されたい）、１７〜２４ｇの間の体重を有する６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｒｏｓｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、研究登録前に少なくとも６日間、順化させた。マウスは、餌（加熱滅菌処理可能なｓｓｎｉｆｆ  Ｍ−Ｚ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、２２℃±２℃、相対湿度５５％±１０％でマウスを飼育した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６４７５（商標））から入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、カタログ番号Ｓ  ０１１５）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９６６０４７）において、７．５％ＣＯ２で、３７℃で培養した。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞解離試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１１０５０１）を使用して細胞を回収し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１６９）に再浮遊させ、マウス１匹当たり細胞０．３×１０６個／１００μｌを、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剪毛した側腹部に皮下（ＳＣ）移植した。遠位肺腫瘍の播種には、Ｂ１６Ｆ１０＿ｌｕｃ−ｇｆｐ細胞を使用した。これらの細胞は、ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードするプラ��ミドでの安定したトランスフェクションによってＢ１６Ｆ１０から得た。Ｂ１６Ｆ１０＿ｌｕｃ−ｇｆｐ細胞を、Ｂ１６Ｆ１０と同じ条件で培養し；だがしかし０．５μｇ／ｍＬ  ピューロマイシンを培養培地に添加した。ＳＣ移植の翌日、マウス１匹当たりＢ１６Ｆ１０＿ｌｕｃ−ｇｆｐ細胞０．３×１０６個／２００μｌを尾静脈に静脈内（ＩＶ）注射した。腫瘍のＳＣ接種の１０〜１４日後に、腫瘍内ｍＲＮＡ注射を開始した。腫瘍成長を２〜３日ごとにノギス測定によって評定し、次の式を使用して垂直直径の積として表した：ａ２×ｂ／２（式中、ａ＜ｂ）。肺におけるルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞の生着を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングにより分析した。Ｌ−ルシフェリンの水溶液（２５０μｌ、１．６ｍｇ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内注射した。生存動物から放出される光子を１分の露光時間で１０分後に定量した。関心領域（ＲＯＩ）を、平均放射輝度（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用してマウスのグレースケール写真に重ね合せたカラースケールの画像として表される、光子・ｓ−１ｃｍ−２ｓｒ−１）として定量した。絶対定量のために、生物発光シグナルを全光束（光子・ｓ−１）としてブロットした。図２０Ｃ〜Ｇおよび２１Ｅ〜Ｉに関して行った研究には、肺転移の播種を伴わない、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｒｏｓｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の上記モデルも、使用した。
【０２７２】
ＣＴ２６腫瘍モデル：図２、３、７Ｄ〜Ｆ、８、９、１２Ｄおよび２１に関して行った実験については、１７〜２４ｇの間の体重を有する６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ  Ｒｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ．−Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を研究登録の前に少なくとも６日間、順化させた。マウスは、餌（加熱滅菌処理可能なｓｓｎｉｆｆ  Ｍ−Ｚ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、２２℃±２℃、相対湿度５５％±１０％でマウスを飼育した。ＣＴ２６細胞を（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６３８（商標））から入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、カタログ番号Ｓ  ０１１５）を補充したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６１８７０−０４４）において、５％ＣＯ２で、３７℃で培養した。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞解離試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１１０５０１）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１６９）に再浮遊させ、マウス１匹当たり細胞０．５×１０６個／１００μｌを、雌Ｂａｌｂ／ｃ  Ｒｊマウスの右側の剪毛した側腹部にＳＣ移植した。腫瘍接種の１３〜１９日後に、腫瘍内ＲＮＡ注射を開始した。腫瘍成長を２〜３日ごとにノギス測定によって評定し、次の式を使用して垂直直径の積として表した：ａ２×ｂ／２（式中、ｂは、２つの直径の長い方である（ａ＜ｂ））。
【０２７３】
図６および７Ａ〜Ｃに関して行った研究については、６〜８週齢で１７．０〜２０．９ｇの間の体重を有する雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）および滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、温度（２２℃±２℃）、相対湿度（５５％±１５％）でマウスを飼育した。ＣＴ２６細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡ）（カタログ番号ＣＲＬ−２６３８）から入手し、１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１００８２−１４７）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１８７５−０９３）において５％ＣＯ２で、３７℃で培養した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５２００−０５６）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１４４）に再浮遊させ、マウス１匹当たり細胞０．５×１０６個／２００μｌを、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２７４】
ＣＴ２６腫瘍モデルに関しては、腫瘍成長に加えて、示した箇所の血液中のｇｐ７０反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。血液試料は、ＥＤＴＡ被覆チューブを使用して採取した。血液１００μＬをＦＡＣＳチューブに移し、Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｈ−２Ｌｄ  ＭｕＬＶ  ｇｐ７０四量体−ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ−ＡＰＣ（ＭＢＬ（ＴＳ−Ｍ−５２１−２）、血液１００μＬに対して４μＬ）と、抗ＣＤ８ａ  ＦＩＴＣ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＣＤ８０１）、血液１００μＬに対して１μＬ）と、抗ＣＤ４５  Ｖ５００（ＢＤ（５６１４８７）、血液１００μＬに対して１μＬ）とを含有する抗体混合物を添加した。室温で２０分インキュベーション後、Ｂｌｏｏｄ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ（３４９２０２）、チューブ１本当たり３００μＬ）を添加し、さらに６分間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ試料をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。
【０２７５】
ＭＣ３８腫瘍モデル：６〜８週齢で１７．０〜２０．９ｇの間の体重を有する雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）および滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、２２℃±２℃、相対湿度５５％±１５％でマウスを飼育した。ＭＣ３８細胞は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ博士（米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）からの寛大な寄贈品であった。細胞株を、１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０００８２）を補充した、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）において５％ＣＯ２で、３７℃で培養した。細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）に再浮遊させ、マウス１匹当たり細胞１×１０６個／２００μｌを雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２７６】
Ａ３７５腫瘍モデル：６〜８週齢で１７．０〜２０．９ｇの間の体重を有する雌重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、２２℃±２℃、相対湿度５５％±１５％でマウスを飼育した。Ａ３７５細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡ）（カタログ番号ＣＲＬ−１６１９）から入手した。１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１００８２−１４７）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１９９５）において５％ＣＯ２で、３７℃で細胞株を培養した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５２００−０５６）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１４４）に再浮遊させ、ＰＢＳ  １００μＬ当たり３．０×１０６個をＢＤマトリゲルマトリックス（ＢＤ、カタログ番号３５４２３４）１００ｕｌと混合し、雌ＳＣＩＤマウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２７７】
ＫＭ１２（ＣＲＣ）異種移植モデル：１０週齢で１７．３ｇ〜２１．９ｇの間の体重を有する雌ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、（２２±２℃）で、相対湿度（５５±１５％）でマウスを飼育した。ＫＭ−１２細胞は、米国国立がん研究所（ＮＣＩ）（カタログ番号５０７３４５）から入手した。１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１００８２）を補充した、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）において細胞を増殖させ、３７℃で、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）に再浮遊させ、マウスごとに、５０％マトリゲル（ＢＤ、カタログ番号３５６２３４）を含有するＤＰＢＳ  ２００μｌ中の細胞５．０×１０６個を、雌ＳＣＩＤマウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２７８】
ＲＰＭＩ８２２６（骨髄腫）異種移植モデル：１２週齢で１９．８ｇ〜２６．６ｇの間の体重を有する雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、（２２±２℃）で、相対湿度（５５±１５％）でマウスを飼育した。ＲＰＭＩ８２２６細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＣＬ−１５５）から入手した。１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００８２）を補充した、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）において細胞を増殖させ、３７℃で、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）に再浮遊させ、マウスごとに、５０％マトリゲル（ＢＤ、カタログ番号３５６２３４）を含有する  ＤＰＢＳ  ２００μｌ中の細胞５．０×１０６個を、雌ＮＳＧマウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２７９】
ＮＣＩ−Ｎ８７（胃がん）異種移植モデル：１１週齢で１８．３〜２２．７ｇの間の体重を有する雌ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳＣＩＤ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、（２２±２℃）で、相対湿度（５５±１５％）でマウスを飼育した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ−５８２２）から入手した。１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００８２）を補充した、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）において細胞を増殖させ、３７℃で、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）に再浮遊させ、マウスごとに、５０％マトリゲル（ＢＤ、カタログ番号３５６２３４）を含有するＤＰＢＳ  ２００μｌ中の細胞３．０×１０６個を、雌ＳＣＩＤマウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２８０】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＮＳＣＬＣ）異種移植モデル：１０週齢で１８．８ｇ〜２６．０ｇの間の体重を有する雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、研究登録前に少なくとも３日間、放置して順化させた。マウスは、餌（Ｈａｒｌａｎ  ２９１６齧歯動物用飼料、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、滅菌水を自由に入手でき、１２時間の昼夜サイクルで、（２２±２℃）で、相対湿度（５５％±１５％）でマウスを飼育した。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞をＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ−５９０８）から入手し、１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００８２）を補充した、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）において培養し、３７℃で、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００）を使用して細胞を回収し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）に再浮遊させ、マウスごとに、５０％マトリゲル（ＢＤ、カタログ番号３５６２３４）を含有するＤＰＢＳ  ２００μｌ中の細胞５．０×１０６個を、雌ＮＳＧマウスの右側腹部にＳＣ移植した。
【０２８１】
腫瘍再負荷：雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、上で説明したようにＢ１６Ｆ１０細胞を移植した。ＭｏｄＢサイトカインｍＲＮＡ混合物（ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα）を用いる１１、１３、１５および１７日目における４回の腫瘍内注射（ｍＲＮＡ  ８０μｇ／標的ごとに２０μｇ）で、マウスを処置した。サイトカインｍＲＮＡ処置後、マウス８匹に腫瘍がなかった。最後のサイトカインｍＲＮＡ処置の４週間後、無腫瘍マウスに、マウス１匹当たりＢ１６Ｆ１０細胞０．５×１０６個／２００μｌをＳＣ注射により再負荷し、腫瘍成長をモニターした。
【０２８２】
腫瘍モニタリング：最終的な屠殺まで週に２回、ノギスで腫瘍を測定した。腫瘍サイズがおおよそ２０００ｍｍ３に達した場合、または動物に健康問題（２０％の腫瘍領域の潰瘍化）があった場合、動物を安楽死させた。腫瘍退縮は、ｉ）研究終了時の腫瘍体積＜２０ｍｍ３、またはｉｉ）ＴＦ／Ｔ０＜１（式中、ＴＦは、最終腫瘍体積に等しく、Ｔ０は、初回腫瘍内ｍＲＮＡ注射当日の腫瘍体積に等しい）と定義した。
【０２８３】
ｍＲＮＡ修飾Ａ（ＭｏｄＡ）：５’−ＵＴＲ（一部のケースでは配列番号１に対応する）と、ＦおよびＩと呼ばれる２つのエレメントからなる３’ＵＴＲ（一部のケースでは配列番号７に対応する）と、合計で１１０ヌクレオチドのポリ（Ａ）テール（Ａ３０−リンカー−Ａ７０構造；一部のケースでは配列番号７８に対応する）とを含む一般的な開始ベクターに、目的の遺伝子をコードする合成ＤＮＡ断片をクローニングした。クラスＩＩＳ制限酵素を用いてプラスミドＤＮＡの線形化をポリ（ｄＡ：ｄＴ）の下流で行って、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の先に追加のヌクレオチドがない鋳型を生成した（Ｈｏｌｔｋａｍｐら、Ｂｌｏｏｄ  １０８（１３）：４００９〜１７２００６頁（２００６）を参照されたい）。線形化されたプラスミドＤＮＡを、７．５ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよび６ｍＭ  Ｄ１、ベータ−Ｓ−アンチリバースキャップ類似体（ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ、Ｃａｐ０）（Ｋｕｈｎ  ＡＮら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７（８）：９６１〜７１頁（２０１０）を参照されたい）の存在下で、以前に記載されたような（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ  Ｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．９６９：５５〜７２頁（２０１３）を参照されたい）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に供した。磁性粒子を使用してＲＮＡを精製し（Ｂｅｒｅｎｓｍｅｉｅｒ  Ｓ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３（３）：４９５〜５０４頁（２００６）を参照されたい）、ＲＮＡの濃度および質を、それぞれ、分光光度法により評定し、キャピラリーゲル電気泳動システムにより分析した。
【０２８４】
ｍＲＮＡ修飾Ｂ（ＭｏｄＢ）：５’−ＵＴＲ（一部のケースではタバコエッチウイルスリーダー配列ＴＥＶ、配列番号３に対応する）と、ＦおよびＩと呼ばれる２つのエレメントからなる３’ＵＴＲ（一部のケースでは配列番号７に対応する）と、合計で１１０ヌクレオチドのポリ（Ａ）テール（Ａ３０−リンカー−Ａ７０構造）とを含む一般的な開始ベクターに、目的の遺伝子をコードする合成ＤＮＡ断片をクローニングした。上で説明したようにプラスミドＤＮＡを線形化し次第、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行った。この転写は、ＭｏｄＡについて説明したように行ったが、キャップ構造を反応に加えず、ＵＴＰをＮ１−メチル−プソイドウリジン三リン酸の代わりに使用した。次いで、磁性粒子を使用してＲＮＡを精製し（Ｂｅｒｅｎｓｍｅｉｅｒ  ２００６）、その後、ワクシニアウイルスキャッピング酵素に基づく市販の系（ＮＥＢ）およびｍＲＮＡ  Ｃａｐ  ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）の付加を使用して、Ｃａｐ１構造を酵素的に導入した。その後、ＲＮＡをセルソースに基づくクロマトグラフィーによるさらなる精製手順に供して、二本鎖ＲＮＡ夾雑物を除去した（Ｄａｙ  ＰＲら、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６７：１３９３頁（１９７７）；Ｍｏｒｒｉｓ  ＴＪら、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６９：８５４〜８５８頁（１９７９）；およびＣａｓｔｉｌｌｏ  Ａら、Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．８：３８（２０１１）を参照されたい）。ＲＮＡの濃度および質を、それぞれ、分光光度法により評定し、キャピラリーゲル電気泳動により分析した。Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（２１）：ｅ１４２（２０１１）に記載されているように、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２  ｍＡｂ（Ｅｎｇｌｉｓｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）を使用するノースウェスタンドットブロットアッセイで、ｄｓＲＮＡの存在を評定した。
【０２８５】
ｍＲＮＡコドン最適化：タンパク質のコード配列は、タンパク質翻訳の効率はもちろん、精度にも影響を及ぼすことがある（Ｂｏｓｓｉ  Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ．２８６（５７６９）：１２３〜７頁（１９８０）およびＩｒｗｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０（３９）：２２８０１〜６頁（１９９５）を参照されたい）。
【０２８６】
それ故、各標的の異なるコドンバリアントを設計し、試験した。各標的についての異なるコドンバリアントの設計には、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨからの公開ソフトウェアＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｒａａｂ  Ｄら、Ｓｙｓｔ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．４（３）：２１５〜２５頁（２０１０）を参照されたい）およびＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの公開ソフトウェアを利用した。加えて、コドン最適化を手動で行って、各コドンを別々に編集した。野生型配列に匹敵するＧＣ含有量を最適化工程中に維持した。
【０２８７】
構築物の評価および選択は、（ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞のｍＲＮＡリポフェクションおよび（ｉｉ）Ｋ５６２細胞のｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用して行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現によって決定した。
【０２８８】
４万（４０，０００）個のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標））を、平底９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号７３４−１７９４）における、０．５％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、カタログ番号Ｓ  ０１１５）を含有する、ＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１９６６０４７）に、播種した。９６ウェルプレート内の播種細胞を３７℃、７．５％ＣＯ２で１６〜１８時間インキュベートした。ＲＮＡｓｅ不含１．５ｍｌセーフロックチューブバイオピュア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号００３０１２１５８９）においてトランスフェクション試薬１．２μｌをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５０７０）２０μｌに添加することにより、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ）を製造業者の手順書に従って使用して、接着ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞にＲＮＡをトランスフェクトした；第２のチューブにおいて、示したＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ  ２０μｌに添加した。１０分のインキュベーション後、ＲＮＡが入っているチューブをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＭＡＸが入っているチューブに移して希釈し、さらに５分インキュベートした後、培地１００μｌ中のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞層が入っている、９６ウェルプレートの１つのウェルに、ＲＮＡ−脂質複合体１０μｌを滴下した。このＲＮＡ−脂質複合体１０μｌは、標的ＲＮＡ  ５ｎｇ、２５ｎｇおよび１００ｎｇをそれぞれ含有した。プレートをインキュベーター内に３時間置いた後、追加の新鮮培地（ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ）１４０μｌを添加した。トランスフェクトされた細胞を１５〜１８時間インキュベートし、上清を回収し、本明細書の中で説明するようにＥＬＩＳＡによってタンパク質含有量を分析した。
【０２８９】
慢性骨髄性白血病由来のヒト細胞株であるＫ５６２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４３（商標））を、５％ＦＢＳを補充した、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６１８７０−０４４）において培養した。Ｋ５６２を９６ウェルプレートシステムで次のようにエレクトロポレーションした。細胞をＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ０２−０６０Ｑ）で１回洗浄し、細胞２５万（２５０，０００）個／１５０μｌの最終濃度になるようにＸ−ＶＩＶＯ１５に浮遊させた。細胞浮遊液１５０μｌを、ＲＮＡ  ５ｎｇ、２５ｎｇおよび１００ｎｇが入っている９６ウェルプレートのウェルごとに添加した。細胞とＲＮＡを混合し、Ｂｉｏｒａｄからの９６ウェルＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸ細胞エレクトロポレーションシステム（２５０Ｖ、パルス１×３０ｍｓ）でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの直後に、細胞を、抗生物質不含の新鮮培地が入っている新たな培養プレートに移し、１時間、３７℃のインキュベーター内に静置した。０．５％ＦＣＳを補充した新鮮ＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸに培地を交換し、１５〜１８時間インキュベートした。上清を回収し、本明細書の中で説明するようにＥＬＩＳＡによってタンパク質含有量について分析した。
【０２９０】
タンパク質濃度を、ＲＮＡにコードされたサイトカインに特異的なＥＬＩＳＡにより製造業者の手順書に従って判定した。（ｉ）ヒトＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ／ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ  Ｒ  ａｌｐｈａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（ｉｉ）マウスＩＬ−１２ｓｃ  Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＹ４１９−０５）（ｉｉｉ）マウスＧＭ−ＣＳＦ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＤＹ４１５）（すべて、ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓから入手した）、およびマウスＩＦＮα  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＴＣＭ）（ＰＢＬ  ａｓｓａｙ  ｓｃｉｅｎｃｅ、４２１２０−２）。
【０２９１】
ｍＲＮＡ標的ごとに、タンパク質発現を、ｗｔ配列および種々のコドン最適化バリアントについて評価した。３つの異なる量の修飾ＲＮＡを用いて各々試験したＨＥＫ２９３Ｔ／１７のリポフェクションおよびＫ５６２のエレクトロポレーションからの両方のデータセットを、タンパク質コード配列の選択のために考慮した。コドン最適化配列は、ＷＴ配列と比較して少なくとも１．５倍のタンパク質発現増加が測定された場合に選択した。そうでなかった場合には、ＷＴ配列を選択した。すべての構築物について、ＷＴアミノ酸を保存しつつＤＮＡ認識配列（５’−ＣＴＣＴＴＣ−３’）を変異させることによりＥａｒＩ制限配列を除去した。
【０２９２】
細胞株：ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）細胞株、ならびにヒトメラノーマ細胞株Ａ１０１Ｄ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−７７９８）、Ａ３７５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１９）、Ａ２０５８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１１４７）およびＨｓ２９４Ｔ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４０）をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ  ＨＩ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１００８２）を補充したＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１１８８５−０８４）において５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、３７℃で培養した。
【０２９３】
ｍＲＮＡトランスフェクション：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ００１）を製造業者の手順書に従って使用して細胞にトランスフェクトした。簡単に言うと、ウェルごとに、トランスフェクション試薬０．３μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ３１９８５０６２）５μｌで希釈し、１０分間、室温でインキュベートし；ｍＲＮＡ混合物をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（１ウェル当たり５μｌ）で希釈し、希釈したＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ試薬と混合し、５分間、室温でインキュベートし、９６ウェルプレートに分取した。細胞を完全増殖培地で希釈し、１ウェル当たり細胞４０，０００個をトランスフェクション混合物に添加した。細胞を２４時間、３７℃でＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベートし、次いで培地を回収し、サイトカイン濃度をＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＤＳ）アッセイにより判定した。
【０２９４】
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイ：サイトカイン濃度は、ＭＳＤアッセイ：ＩＬ１２ｐ７０についてはＰｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  １（ヒト）ＭＳＤキット（カタログＮ０５０４９Ａ−１）、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉについてはＣｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ  １（ヒト）ＭＳＤキット（カタログＮ０５０５０Ａ−１）、およびＩＦＮαについてはＨｕｍａｎ  ＩＦＮ−α  ２ａ  Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅキット（カタログＮ０５０５０Ａ−１）を使用して、判定した。データは、ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｖ．４．０．１２ソフトウェアおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ．６．００ソフトウェアを使用して解析した。
【０２９５】
ＰＢＭＣ単離および処置：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、ロイコパック（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）から密度勾配媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）により単離した。９６ウェルプレートの１ウェルにつき６００，０００個のＰＢＭＣを添加した。細胞をサイトカイン混合物で２４時間処理し、ヒトＩＦＮγ３８４−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＭＳＤアッセイを使用して細胞培養培地におけるＩＦＮγ産生を測定した。
【０２９６】
ＣＤ８応答の測定：Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスに、Ｉｍｍｕｎｏ  ｍＲＮＡ（ＩＦＮα、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２ｓｃ、ＭｏｄＢ）または対照ルシフェラーゼｍＮＲＡ（プラセボ）の単回腫瘍内注射を施した。腫瘍内ｍＲＮＡ注射の７日後、腫瘍を摘出し、免疫蛍光検査のために処理し、ＣＤ８について抗体で染色した（灰色）。図２５に示すように、ＣＤ８細胞は、サイトカインｍＲＮＡ腫瘍内注射後に存在した。
【０２９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のためのｍＲＮＡの調製：水の中で等量（マイクログラム）のｍＲＮＡを所期の２倍の用量で混合することによりｉｎ  ｖｉｖｏ研究のためのそれぞれのｍＲＮＡ混合物を調製した。そのｍＲＮＡ混合物を、−８０℃で、腫瘍内注射日まで凍結しておいた。注射当日に、ｍＲＮＡを解凍し、等体積の２Ｘ無菌リンゲル液と混合した。得られた１Ｘ  ｍＲＮＡ／リンガー液を腫瘍内注射に使用した。
【０２９８】
遺伝子発現分析：Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、Ａ３７５腫瘍をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で均質化した。ＤＮａｓｅ処理に関する回転手順書に従ってＲＮｅａｓｙ−９６  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをヌクレアーゼ不含水で溶離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して紫外吸光度により定量した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の推奨手順に従って用いて、ｃＤＮＡ合成を行った。標準手順書に従ってＶｉｉＡ（商標）７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＰＣＲを行った。増幅は、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および予め指定されたＴａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。遺伝子発現を内在性対照ＧＡＰＤＨに正規化した。比較ｄｄＣＴ法を使用して、遺伝子発現を評価した。
【０２９９】
【表２９】
0006949131.tif 000051
【実施例２】
【０３００】
３つのｍＲＮＡの組合せはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍体積を低減させる
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２ｓｃをコードする修飾ｍＲＮＡの混合物をＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスに注射し、腫瘍成長を４１日目までモニターした。図１に示すように、ＭｏｄＡを有する、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２ｓｃをコードする３つのｍＲＮＡ（配列番号３２、３８および５６；図１）の組合せ、またはＭｏｄＢを有する、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２ｓｃをコードする３つのｍＲＮＡ（配列番号３５、４１および５９；図１Ｂ）の組合せの腫瘍内注射は、マウス１０匹のうちの６匹において退縮を誘導したが、ルシフェラーゼをコードする対照ｍＲＮＡ（ＭｏｄＡ）で処置したマウスは、動物１０匹のうちの１匹において腫瘍退縮を示した（図１Ｃ）。これらのデータを同様のデザインの反復研究（図１Ｄ〜１Ｇ）で確認した。反復実験では、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢを有するサイトカインｍＲＮＡ（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ）の混合物は、マウス９匹のうち５匹において腫瘍退縮をもたらしたが、ＭｏｄＡおよびＭｏｄＢでの対照ｍＲＮＡを用いる処置は、それぞれ、９匹のうち２匹、および９匹のうち０匹において腫瘍退縮を示した。
【０３０１】
サイトカインｍＲＮＡ処置の効果をＣＴ２６腫瘍において評価した。ＣＴ２６腫瘍が樹立されたマウスに、ＭｏｄＡおよびＭｏｄＢ形式でのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２ｓｃをコードするサイトカインｍＲＮＡ混合物をそれぞれ注射した。次の２つの対照群を含めた：ｉ）ｍＲＮＡリンゲル希釈液およびｉｉ）ホタルルシフェラーゼをコードするＭｏｄＡ  ｍＲＮＡ。合計６回の腫瘍内注射を第１９、２１、２４、２６、２８および３１日目に投与した。図２に示すように、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２ｓｃ  ｍＲＮＡ  ＭｏｄＡ（配列番号５６、３２および３８；図２Ａ）とＭｏｄＢ（配列番号５９、３５および４１；図２Ｂ）の両方は、マウス８匹のうちのそれぞれ５匹および６匹において腫瘍退縮を生じさせる結果となったが、ＭｏｄＡでの対照ｍＲＮＡで処置した腫瘍（図２Ｃ）も、リンゲル液で処置した腫瘍（図２Ｄ）も、腫瘍退縮を示さなかった。
【０３０２】
ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ；配列番号５３、５９および４１）ならびにＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ；配列番号３５、５９および４１）をコードするサイトカインｍＲＮＡ混合物を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性について評価した。腫瘍接種後１３、１５、１８、２０および２２日目に、腫瘍に腫瘍内ｍＲＮＡ注射を施した。図３に示すように、ＩＬ−２混合物（図３Ａ）またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ混合物（図３Ｂ）のどちらかの腫瘍内注射は、それぞれ、担腫瘍動物１０または１１匹のうちの５匹において腫瘍退縮を生じさせる結果となった（図３Ａおよび３Ｂ）が、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）を注射した対照群では、腫瘍退縮は観察されなかった（図３Ｃ）。
【０３０３】
ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ混合物（図４Ａ−ＭｏｄＡ［配列番号３２、３８および５６］、４Ｂ−ＭｏｄＢ［配列番号３５、４１および５９］）、またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ混合物（図４Ｃ−ＭｏｄＡ［配列番号５０、３８および５６］、４Ｄ−ＭｏｄＢ［配列番号５３、４１および５９］）の抗腫瘍活性を、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいてさらに評価した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスに、１１、１３、１５および１７日目にｍＲＮＡを腫瘍内注射した。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦをコードするサイトカインｍＲＮＡ混合物でのＢ１６Ｆ１０腫瘍の処置は、ＭｏｄＡおよびＭｏｄＢで、マウス８匹のうちそれぞれ３匹および４匹において腫瘍退縮を生じさせる結果となった。ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ混合物（ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢ）で処置した腫瘍は、マウス８匹のうちの４匹において腫瘍退縮を有したが、ルシフェラーゼをコードするＭｏｄＡまたはＭｏｄＢ  ｍＲＮＡで処置したマウスについて腫瘍退縮は認められなかった（図４Ｅ−ＭｏｄＡ、図４Ｆ−ＭｏｄＢ）。
【実施例３】
【０３０４】
４つのｍＲＮＡの組合せはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍体積を低減させる
本発明者らは、次に、サイトカインｍＲＮＡ混合物に第４のｍＲＮＡを加えることの効果を試験した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスに、ｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、３５および４１；図５Ａ）、ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３および４１；図５Ｂ）およびｉｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα（配列番号５９、５３、４１および４７；図５Ｃ）をコードするＭｏｄＢサイトカインｍＲＮＡ混合物の４回の腫瘍内注射を施し、腫瘍成長を４５日目までモニターした。サイトカインｍＲＮＡ混合物の各々には抗腫瘍効果があり、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−２とＩＬ−１２ｓｃのまたはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉとＩＬ−１２ｓｃとのサイトカインｍＲＮＡ混合物の腫瘍内注射後に腫瘍８個のうちの４個が退縮し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃおよびＩＦＮαでの処置時には腫瘍８個のうちの７個が退縮した。対照ｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）で処置したマウスは、腫瘍退縮を示さなかった（図５Ｄ）。
【０３０５】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＩＦＮαの抗腫瘍活性を、３つの異なるマウスｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデル、ＣＴ２６、Ｂ１６Ｆ１０およびＭＣ３８において検査した。担腫瘍マウスに、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（配列番号３５、４１、５９および４７）をコードするＭｏｄＢサイトカインｍＲＮＡ、またはホタルルシフェラーゼをコードする対照ＭｏｄＢ  ｍＲＮＡの、４〜６回の腫瘍内注射を施した。抗腫瘍活性を各腫瘍モデルにおいて評定した。サイトカインｍＲＮＡのこの組合せで処置したマウスは、ＣＴ２６（図６Ａ）、Ｂ１６Ｆ１０（図６Ｃ）およびＭＣ３８（図６Ｅ）モデルにおいて、それぞれ、４／８、７／８および５／５の退行性腫瘍を有した。ルシフェラーゼｍＲＮＡで処置した比較対照担腫瘍マウスでは腫瘍退縮は観察されなかった（図６Ｂ［ＣＴ２６］、６Ｄ［Ｂ１６Ｆ１０］、および６Ｆ［ＭＣ３８］）。
【０３０６】
ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ、配列番号３５、４１、５９および４７）またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ、配列番号５３、４１、５９および４７）の各々をコードする４成分サイトカインｍＲＮＡ混合物の抗腫瘍活性を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて評価した。担腫瘍マウスを６回の腫瘍内注射で処置し、腫瘍成長をモニターした。ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（図７Ａ）と、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（図７Ｂ）の両方での処置は、それぞれ、マウス４／８匹および８／８匹において腫瘍退縮を有効に誘導したが、対照ｍＲＮＡで処置したマウスについては腫瘍退縮は観察されなかった（図７Ｃ）。これらのデータを同様のデザインの反復研究（図７Ｄ〜Ｆ）で確認した。
【０３０７】
ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ、配列番号５３、４１、５９および４７）のｍＲＮＡ混合物から個々の成分を系統的に除去する研究を行った。ＣＴ２６腫瘍に、接種後１２、１５、１９および２２日目にサイトカインｍＲＮＡを注射した。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαをコードするｍＲＮＡの４回の注射で処置した腫瘍は、処置した腫瘍１０個すべてにおいて退縮を誘導した（図８Ａ）。ｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃおよびＩＦＮαの、ｉｉ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの、ｉｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの、ｉｖ）ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦの、ＭｏｄＢ  ｍＲＮＡ混合物で処置した腫瘍は、腫瘍１０個のうちのそれぞれ８、６、８、７個の退縮を生じさせる結果となった（図８Ｂ〜Ｅ）。対照ｍＲＮＡ（ＭｏｄＢ）で処置した腫瘍は、腫瘍退縮を示さなかった（図８Ｆ）。腫瘍成長動態を分析するために、平均腫瘍体積を処置群ごとに３３日目まで計算した（図８Ｇ）。最小平均腫瘍体積は、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの混合物で処置したマウスについて観察され、その一方で、最大平均腫瘍体積は、ルシフェラーゼ処置動物において観察された。腫瘍成長抑制Ｔ／Ｃ（平均腫瘍体積の基づく、腫瘍／対照）を、処置群の各々について１９日目までプロットした（図８Ｈ）。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの４成分混合物は、最大Ｔ／Ｃを示した。
【０３０８】
図８に示す研究に類似した研究を行い、この研究では、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号３５、４１、５９および４７）のｍＲＮＡ混合物から個々の成分を系統的に除去した。ＣＴ２６腫瘍に合計６回の腫瘍内ｍＲＮＡ注射を第１９、２１、２３、２６、２８および３０日目に施した。ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαのサイトカインｍＲＮＡ混合物での処置は、動物１０匹のうち４匹において腫瘍退縮を生じさせる結果となり、動物４匹において完全腫瘍退縮を、個体２匹において４０日目を超えて病状安定をもたらした（図９Ａ）。ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＩＦＮαの、ｉｉ）ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの、ｉｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの、ならびにｉｖ）ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２の、ＭｏｄＢ  ３成分ｍＲＮＡ混合物で処置した腫瘍は、それぞれ、腫瘍２、３、３および４個の退縮を生じさせる結果となり（図９Ｂ〜Ｅ）、対照ルシフェラーゼｍＲＮＡで処置したＣＴ２６腫瘍は、腫瘍退縮を示さなかった（図９Ｆ）。
【０３０９】
腫瘍成長動態を分析するために、平均腫瘍体積を処置群ごとに３６日目まで計算した。最小平均腫瘍体積は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの混合物で処置したマウスについて観察され、その一方で、最大平均腫瘍体積は、ルシフェラーゼ処置動物において観察された（図１０Ａ）。腫瘍成長抑制Ｔ／Ｃ（平均腫瘍体積の基づく、腫瘍／対照）を、処置群の各々について３０日目までプロットした（図１０Ｂ）。ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαの４成分混合物は、最大Ｔ／Ｃを示した。
【０３１０】
図９における異なるサイトカインｍＲＮＡ混合物からの抗腫瘍応答を、次のようにさらに分析した：実験の終了のまたは停止時の測定値（Ｖｔ）と実験の開始時の測定値（Ｖｂ）との腫瘍体積の差によって定義される腫瘍体積変化（ΔＶ）（ΔＶ＝Ｖｔ−Ｖｂ）を、４成分サイトカインｍＲＮＡ混合物（ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα）で処置したマウス、４つのサイトカインのうちの１つが欠けている３成分混合物で処置したマウス、および対照ルシフェラーゼｍＲＮＡで処置したマウスを含む、６つの処置群の各々におけるすべてのマウスについて計算した。腫瘍体積変化に関するトリミングしたデータ（元データの上１０％と下１０％を除去）の平均（μ）および標準偏差（σ）を対照ルシフェラーゼ群について計算し、このトリミングしたデータのシャピロ−ウイルク正規性検定は、そのデータが、正規分布にほぼ従うことを示した。次いで、Ｚスコア（Ｚ＝（ΔＶ−μ）／σ）を、すべての処置群からの個々のマウス各々に関する腫瘍体積変化データについて計算した。各腫瘍体積変化値と対照群のトリミングした平均との間の比（Ｒ）を計算した（Ｒ＝ΔＶ／μ）。定義を考慮して、本発明者らは、Ｚスコアを「腫瘍体積低減の有意性」と考え、Ｒを「腫瘍体積低減の程度」と考えた。対照ルシフェラーゼ群におけるものより有意に小さい腫瘍体積増加（言い換えると、対照群と比較して「有意な腫瘍低減」）を示すマウスを同定するために、Ｚ≦−１．６４５（ｐ（Ｚ≦−１．６４５）＝０．０５）およびＲ≦０．１５のカットオフを適用した。結果は、対照群より有意に小さい腫瘍体積増加を有する各処置群におけるマウスの数を、次のように示した：ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ）のサイトカインｍＲＮＡ混合物についてはマウス８匹のうちの６匹、ｉｉ）ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ）についてはマウス８匹のうちの２匹、ｉｉｉ）ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα、ならびにＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＩＦＮαについては、８匹のうちの３匹、およびｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃおよびＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）のサイトカインｍＲＮＡ混合物で処置したマウス８匹のうちの４匹（図１１）。
【０３１１】
雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、上で説明したようにＢ１６Ｆ１０細胞を移植した。１１、１５、１９および２３日目におけるＭｏｄＢサイトカインｍＲＮＡ混合物（ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα）または対照ルシフェラーゼｍＲＮＡの４回の腫瘍内注射（ｍＲＮＡ８μｇ／標的ごとに２μｇ）で、マウスを処置した。サイトカインｍＲＮＡの４成分混合物での処置は、処置したマウス６／１０匹において腫瘍拒絶が生じる結果となった。図２４Ｂを参照されたい。比較して、単一のｍＲＮＡで処置したいずれの群においても無腫瘍マウスは観察されなかった（図２４Ｃ〜Ｆ）。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαの組合せは、全生存率上昇をもたらし、７０日目に腫瘍のないマウスについて６０％であったが、単一のサイトカインｍＲＮＡで処置したマウスのすべての腫瘍は、動物に安楽死を施す必要がある病期まで進行した（図２４Ｇ）。ルシフェラーゼ対照を図２４Ａに示す。
【実施例４】
【０３１２】
サイトカインｍＲＮＡは腫瘍再負荷から保護する
免疫学的記憶の発生に対するサイトカインｍＲＮＡ混合物の効果を評価するために、再負荷実験を行った。簡単に言うと、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスを、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物で処置した。サイトカインｍＲＮＡ処置Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の一部分は完全に退縮し、無腫瘍動物をもたらした。次いで、これらの無腫瘍動物に、適応免疫記憶を評定する手段としてＢ１６Ｆ１０細胞を再負荷し、腫瘍生着の正の対照として、無処置マウス９匹にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植した（図１２Ａ）。Ｂ１６Ｆ１０細胞を生着させたマウス９匹すべてが腫瘍を発生したが、無腫瘍マウス８匹すべては、Ｂ１６Ｆ１０細胞を拒絶し、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の成長を示さなかった（図１２Ｂ）。サイトカインｍＲＮＡで以前に処置したマウスの一部分は、最初の腫瘍部位に限局性白斑を発症した（図１２Ｃ）。この実験を本質的に反復した。結果を図３３に示す。
【０３１３】
免疫学的記憶の発生に対するサイトカインｍＲＮＡ混合物の効果を評価するために、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して再負荷実験を行った。したがって、ＣＴ２６腫瘍担持マウスを、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物で処置した。サイトカインｍＲＮＡ処置ＣＴ２６腫瘍の一部分は完全に退縮し、無腫瘍動物をもたらした。次いで、無腫瘍動物３匹にＣＴ２６腫瘍細胞を再負荷し、次いで、無腫瘍動物３匹に、ｇｐ７０エピトープをノックアウトしたＣＴ２６腫瘍細胞（ＣＴ２６−Δｇｐ７０）を再負荷した。腫瘍生着の正の対照として、無処置マウスそれぞれ９および１０匹にＣＴ２６腫瘍細胞およびＣＴ２６−Δｇｐ７０を移植した。腫瘍接種後２１日目に、ＣＴ２６腫瘍細胞を生着させた無処置マウス９匹のうちの８匹が腫瘍を発現し、ＣＴ２６−Δ７０ｇｐ腫瘍細胞を生着させた無処置マウス１０匹すべてが腫瘍を発現したが、各群内の無腫瘍マウス３匹すべてが、ＣＴ２６およびＣＴ２６−Δｇｐ７０細胞をそれぞれ拒絶し、ＣＴ２６腫瘍およびＣＴ２６−Δｇｐ７０の成長をそれぞれ示さなかった（図１２Ｄ）。この実験は、ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるサイトカインｍＲＮＡ注射時の免疫学的記憶が、免疫優性エピトープｇｐ７０に特異的なＴ細胞に限定されないことを示す。
【実施例５】
【０３１４】
サイトカインｍＲＮＡの全身性抗腫瘍活性
全身性抗腫瘍応答を発揮する局所腫瘍内サイトカインｍＲＮＡの能力を評価するために、マウスの左右両方の側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を生着させた（図１３Ａ）。両側Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスに、ルシフェラーゼをコードする対照ｍＲＮＡ、またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）をコードするサイトカインｍＲＮＡ混合物の、４回の腫瘍内注射を施した。右側の腫瘍にｍＲＮＡを３つの異なる用量レベル（２０μｇ、２μｇおよび０．２μｇ  ｍＲＮＡ／標的に対応する、８０μｇ、８μｇおよび０．８μｇ  ｍＲＮＡ）で注射したが、左側腹部の腫瘍を処置しなかった。用量依存的な抗腫瘍活性が、注射を施した腫瘍（図１３Ｂ）と未注射の腫瘍（図１３Ｃ）の両方で観察され、腫瘍成長阻害は、未注射の腫瘍における８８％から注射を施した腫瘍における９６％に及んだ。サイトカインｍＲＮＡ処置で処置した群には、ルシフェラーゼ対照ｍＲＮＡで処置した群と比較して生存率中央値上昇があった（図１３Ｄ）。
【０３１５】
全身性抗腫瘍応答を発揮する局所腫瘍内サイトカインｍＲＮＡの能力をさらに評価するために、マウスの右側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を生着させ、肺における腫瘍の誘導のためにルシフェラーゼ発現Ｂ１６Ｆ１０細胞のＩＶ注射を施した（図１９Ａ）。ＳＣ腫瘍移植後１１、１４および１８日目に、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの側腹部の腫瘍のみに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の合計３回の腫瘍内注射を施したが、肺における腫瘍は処置しなかった。対照群には、いずれのコード配列も有さない等量の対照ｍＲＮＡの腫瘍内注射を施した。マウスを２０日目にエンドポイント分析のために屠殺し、このときに肺を摘出し、計量した。図１９Ｂは、動物４匹の生物発光測定、および暗色の腫瘍結節を可視化するための摘出した相応する肺の写真を、例として示す。ＳＣ腫瘍の腫瘍成長は、サイトカインｍＲＮＡ混合物の注射によって強く抑制されたが、対照ｍＲＮＡを注射した腫瘍は、各群内のマウス１５匹の平均腫瘍体積を示す図１９Ｃに描示されている通り、漸進的に成長した。肺腫瘍成長は、ＳＣ腫瘍の場合、腫瘍内サイトカインｍＲＮＡ注射を施した動物では、対照ｍＲＮＡで処置した動物と比較して抑制された；図１９Ｄは、２０日目の１群当たり１５匹の動物すべてについての生物発光測定の全光束分析を示し、この全光束は、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞に起因する腫瘍量と相関するものであり；線は、中央値を示し、アスタリスクは、Ｔ検定により分析したｐ＜０．０５を示す。加えて、サイトカインｍＲＮＡで処置した動物の肺のほうが、有意に軽い重量を有した（図１９Ｅ、線は中央値を示す）。対照ＲＮＡで処置した動物の肺のより重い重量は、より多い腫瘍量に起因した。
【実施例６】
【０３１６】
ヒトサイトカインｍＲＮＡ
ヒトサイトカインｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を評価するために、ヒトサイトカインＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ（配列番号２６、１８、２９および２３）（ＭｏｄＢ）をコードするｍＲＮＡ混合物を、４つのメラノーマ腫瘍細胞株（Ａ３７５、Ａ１０１Ｄ、Ａ２０５８およびＨｓ２９４Ｔ）に加えてＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトした（図１４Ａ）。サイトカインｍＲＮＡ混合物は、５つのヒト細胞株のパネルにわたって用量依存的発現および分泌を示した（図１４Ｂ〜Ｆ）。
【０３１７】
ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂのヒトｍＲＮＡ混合物の薬力学的効果を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。手短に言えば、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ（ＭｏｄＢ）のヒトサイトカインｍＲＮＡ混合物、またはＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα２ｂ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉもしくはＧＭ−ＣＳＦ（ＭｏｄＢ）をコードする個々のサイトカインｍＲＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトし、条件培地を２４時間の時点で回収し、希釈し、ヒトＰＢＭＣに添加した（図１５Ａ）。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂのサイトカインｍＲＮＡ混合物で処置したドナー６名からのＩＦＮγレベル中央値は、５６２３ｐｇ／ｍＬであったが、ＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮα２ｂ、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉまたはＧＭ−ＣＳＦの個々のサイトカインｍＲＮＡでの処置は、それぞれ、５３４、６７、１７および４ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγレベル中央値を誘導した（図１５Ｂ）。
【０３１８】
ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ（ＭｏｄＢ）ならびにＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ（ＭｏｄＢ）のヒトサイトカインｍＲＮＡ混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を、Ａ３７５ヒトメラノーマ異種移植片においてモニターした。担腫瘍マウスにサイトカインｍＲＮＡの単回注射を施し、ｍＲＮＡ注射後２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点で腫瘍試料を採取した。腫瘍溶解物を調製し、個々のヒトサイトカインＩＦＮα２ｂ（図１６Ａ）、ＩＬ−２（図１６Ｂ）、ＩＬ−１２ｓｃ（図１６Ｃ）、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ（図１６Ｄ）、ＧＭ−ＣＳＦ（図１６Ｅ）の発現を評価した。
【０３１９】
時間依存的発現が、個々のサイトカイン各々について観察され、最大濃度（Ｃｍａｘ）は、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂの混合物（表４）ならびにＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂの混合物（表５）について２〜８時間の間に発生した。
【０３２０】
【表３０】
0006949131.tif 000052
【０３２１】
【表３１】
0006949131.tif 000053
【０３２２】
ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ（ＭｏｄＢ）ならびにＩＬ−２、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα２ｂ（ＭｏｄＢ）のサイトカインｍＲＮＡ混合物のｍＲＮＡ注射後２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点で、薬力学的マーカーとしてのヒトインターフェロンアルファ遺伝子ＩＳＧ１５、ＩＳＧ５４およびＭＸ１の導入を、Ａ３７５腫瘍においてモニターした。対照処置腫瘍と比較して、サイトカインｍＲＮＡで処置したＡ３７５腫瘍は、ＩＳＧ１５（図１７Ａ）、ＩＳＧ５４（図１７Ｂ）およびＭＸ１（図１７Ｃ）の１００倍を超える誘導を示し、腫瘍内ｍＲＮＡ注射後８時間までにピーク誘導が発生した。
【実施例７】
【０３２３】
インターフェロン効果
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスに、ＩＬ−２、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、４１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌまたは腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー９としても公知）およびＣＤ２７Ｌ−ＣＤ４０Ｌ（これは、ＣＤ７０としても公知のＣＤ２７Ｌの可溶性ドメインとＣＤ４０Ｌの可溶性ドメインの融合タンパク質を含み；ＣＤ２７ＬとＣＤ４０Ｌの両方が、ＣＤ２７ＬまたはＣＤ４０Ｌのどちらかの３つの可溶性ドメインを含み、これらの可溶性ドメインのすべてが、ＧＳ−リンカー配列によって隔てられている）（図１８Ａ、配列番号３２、６２、６８、および７４）をコードする、ＭｏｄＡ（「標準」）サイトカインｍＲＮＡ、またはＩＬ−２、ＦＬＴ３Ｌ、４１ＢＢＬおよびＣＤ２７Ｌ−ＣＤ４０Ｌ（図１８Ｂ、配列番号３５、６５、７１、および７７）をコードするＭｏｄＢ（「修飾」）サイトカインｍＲＮＡの腫瘍内注射を施した。加えて、ＩＦＮαをコードするＭｏｄＡ  ｍＲＮＡ（配列番号４４）、またはＩＦＮαをコードするＭｏｄＢ  ｍＲＮＡ（配列番号４７）のどちらかを、それぞれ、ＭｏｄＡまたはＭｏｄＢ  ｍＲＮＡ混合物に加えた（図１８Ｄおよび１８Ｅ）。抗腫瘍活性を評定した。
【０３２４】
ＭｏｄＡ  ｍＲＮＡのこの組合せで処置したマウスは、ＩＦＮαがないとマウス４／９匹が無腫瘍であり（図１８Ｂ）、ＩＦＮαがあるとマウス３／９匹が無腫瘍であった（図１８Ｄ）。それ故、ＩＦＮα  ｍＲＮＡでの処置は、ｍＲＮＡをＭｏｄＡ形態で投与したとき、サイトカインに対する応答を増大させないように見えた。
【０３２５】
対照的に、ＭｏｄＢ  ｍＲＮＡの組合せで処置したマウスは、ＩＦＮαがないとマウス１／９匹が無腫瘍であり（図１８Ｃ）、ＩＦＮαがあるとマウス７／９匹が無腫瘍であった（図１８Ｅ）。したがって、ＩＦＮα  ｍＲＮＡでの処置は、ｍＲＮＡをＭｏｄＢ形態で投与したとき、サイトカインの混合物に対する応答を増大させた。
【実施例８】
【０３２６】
抗体と組み合わせたサイトカインｍＲＮＡ
抗体の全身投与と組み合わせたサイトカインｍＲＮＡの腫瘍内注射の効果を評価するために、マウスの左右両方の側腹部にＢ１６Ｆ１０またはＭＣ３８腫瘍細胞を生着させた。マウスの側腹部の腫瘍の一方のみに、１１、１５、１９、２３日目に、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の４回の腫瘍内注射を施したが、他方の側腹部の腫瘍は、未処置のまま放置した。マウスには、１０、１３、１６、１９、２２、２５日目に、抗ＰＤ１抗体（５ｍｇ／ｋｇでの、ラットＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１クローンＲＭＰ１−１４のＳａｎｏｆｉマウス化バージョン）の腹腔内注射も施した。群は、次の通りであった：１）対照ｍＲＮＡ（全ｍＲＮＡ  ８０μｇ；１．６ｍｇ／ｍＬでの５０μＬ腫瘍内注射）、加えて、アイソタイプ抗体（クローンＭＯＰＣ−２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；５ｍｇ／ｋｇ）；２）対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＰＤ１抗体；３）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、対照アイソタイプ抗体；および４）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、抗ＰＤ１。Ｂ１６Ｆ１０（図２０Ａ）およびＭＣ３８（図２０Ｂ）腫瘍モデル両方において全生存率をモニターした。両方の腫瘍モデルにおいて、最高全生存率は、サイトカインｍＲＮＡと抗ＰＤ−１の組合せでの処置で観察され、この研究の終了時にＢ１６Ｆ１０担持マウスの６０％およびＭＣ３８担持マウスの８０％が無腫瘍であった。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルでは、抗ＰＤ−１またはサイトカインｍＲＮＡ単独で処置したマウスの１０％が無腫瘍であったが、ＭＣ３８モデルでは、抗ＰＤ−１で処置したマウスの４０％、およびサイトカイン単独で処置したマウスの３０％が無腫瘍であった。これらの結果は、サイトカインｍＲＮＡと抗ＰＤ−１抗体の組合せに関連する強い抗腫瘍活性を示す。
【０３２７】
全身性抗腫瘍応答を発揮する、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた局所腫瘍内サイトカインｍＲＮＡの能力をさらに評価するために、マウスの右側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を生着させ、翌日、肺転移誘導のためにルシフェラーゼ発現Ｂ１６Ｆ１０細胞のＩＶ注射を施した。ＩＶ腫瘍移植後１１、１４および１７日目に、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの側腹部の腫瘍のみに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の合計３回の腫瘍内注射を施したが、肺における腫瘍は処置しなかった。同じ日に、マウスには、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇでの、ラットＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１クローンＲＭＰ１−１４のＳａｎｏｆｉマウス化バージョン）の腹腔内（ＩＰ）注射も施した。群は、次の通りであった：１）対照ｍＲＮＡ（全ｍＲＮＡ  ４０μｇ；対照アイソタイプ抗体（クローンＭＯＰＣ−２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；１０ｍｇ／ｋｇ）の５０μＬ腫瘍内注射（図２０Ｃ）；２）対照ｍＲＮＡ、加えて抗ＰＤ１抗体（図２０Ｄ）；３）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、対照アイソタイプ抗体（図２０Ｅ）；および４）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、抗ＰＤ１（図２０Ｆ）。ＳＣ腫瘍の腫瘍成長をモニターし（図２０Ｃ〜Ｆ）、生存率もモニターした（図２０Ｇ）。このモデルにおける全生存率は、ＳＣ腫瘍に起因する腫瘍量はもちろん、肺仮性転移腫瘍（lung pseudometastasis tumor）（この図には示されていない）に起因する腫瘍量にも左右され；一部のマウスでは、ＳＣ腫瘍は拒絶されたが、肺転移は徐々に増した。最高全生存率は、サイトカインｍＲＮＡと抗ＰＤ−１の組合せ処置で観察された。サイトカインｍＲＮＡ単独で処置したマウスの６〜７％は無腫瘍であったが、単独での抗ＰＤ−１、または対照ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体を施したマウスはすべて、高い腫瘍量のため、２２日目に屠殺した。これらの結果は、肺疑似転移を有するこのＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるサイトカインｍＲＮＡと抗ＰＤ−１抗体の組合せに関連する強い抗腫瘍活性を示すが、単独での抗ＰＤ−１抗体は、抗腫瘍活性を一切示さなかった。
【０３２８】
抗体の全身投与と組み合わせたサイトカインｍＲＮＡの腫瘍内注射の効果をさらに評価するために、マウスの右側腹部にＣＴ２６腫瘍細胞を生着させた。マウスに、腫瘍接種後１１、１４、１８および２１日目に、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の４回の腫瘍内注射を施した。同じ日に、マウスに、抗ＣＴＬＡ−４抗体（マウス１匹当たり１００μｇ／２００μＬ；ＩｎＶｉｖｏＭＡｂからのクローン９Ｈ１０）またはアイソタイプ対照抗体（マウス１匹当たり１００μｇ／２００μＬ；ＢｉｏＸＣｅｌｌからのアルメニアハムスターＩｇＧ）の腹腔内（ＩＰ）注射も施した。群は、次の通りであった：１）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（図２１Ａ）；２）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体（図２１Ｂ）；３）対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（図２１Ｃ）および４）対照ｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体（図２１Ｄ）。腫瘍内サイトカインｍＲＮＡとＩＰ注射抗ＣＴＬＡ−４の併用療法は、最も強い抗腫瘍活性を生じさせる結果となり、腫瘍接種後５５日目にマウス１６匹のうちの１２匹は無腫瘍マウスであった（図２１Ａ）。サイトカインｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体（図２１Ｂ）、または対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（図２１Ｃ）のどちらかでの処置は、抗腫瘍活性を然程誘導せず、研究終了時に、無腫瘍マウスはそれぞれ５匹および７匹であった。比較して、対照ｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体を施した群（図２１Ｄ）では、研究の終わりに無腫瘍マウスは１匹しか残存しなかった。
【０３２９】
抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたサイトカインｍＲＮＡの腫瘍内注射の効果をさらに評価するために、マウスの右側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を生着させた。マウスに、腫瘍接種後１３、１７および２０日目に、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の３回の腫瘍内注射を施した。腫瘍接種後１３、１７、２０および２４日目に、マウスに、抗ＣＴＬＡ−４抗体（マウス１匹当たり１００μｇ／２００μＬ；ＩｎＶｉｖｏＭＡｂからのクローン９Ｈ１０）またはアイソタイプ対照抗体（マウス１匹当たり１００μｇ／２００μＬ；ＢｉｏＸＣｅｌｌからのアルメニアハムスターＩｇＧ）の腹腔内（ＩＰ）注射も施した。ＳＣ腫瘍の腫瘍成長はもちろん生存率もモニターした。群は、次の通りであった：１）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（図２１Ｅ）；２）サイトカインｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体（図２１Ｆ）；３）対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（図２１Ｇ）および４）対照ｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体（図２１Ｈ）。腫瘍内サイトカインｍＲＮＡとＩＰ注射抗ＣＴＬＡ−４の併用療法は、最も強い抗腫瘍活性を生じさせる結果となり、腫瘍接種後６０日目にマウス９匹のうちの６匹が無腫瘍マウスであった（図２１Ｅ）。サイトカインｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体での処置（図２１Ｆ）は、抗腫瘍活性を然程誘導せず、マウス９匹のうち２匹が無腫瘍マウスであった。比較して、対照ｍＲＮＡ、加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体（図２１Ｇ）または対照ｍＲＮＡ、加えて、アイソタイプ対照抗体（図２１Ｈ）のどちらかを施した２群では、研究の終わりに無腫瘍マウスは残存しなかった。生存パーセントは、図２１Ｉに描示されており、この図は、サイトカインｍＲＮＡ単独で処置したマウスの３３％が無腫瘍であった一方で、サイトカインｍＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４の組合せ処置では研究終了時（７０日目）に腫瘍担持マウスについて６７％である最高全生存率を示す。これらの結果は、単独での抗ＣＴＬＡ−４抗体が抗腫瘍活性を一切示さなかったこのＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、単独でのサイトカインｍＲＮＡ、およびサイトカインｍＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せに関連する、強い抗腫瘍活性を示す。
【実施例９】
【０３３０】
複数のがんの種類におけるｍＲＮＡサイトカイン注射
様々な種類のがんにおけるサイトカインｍＲＮＡの腫瘍内注射の効果を評価するために、５つの異種移植マウスモデル−ＫＭ１２（ＣＲＣ）、ＲＰＭＩ８２２６（骨髄腫）、ＮＣＩ−Ｎ８７（胃がん）、Ａ３７５（メラノーマ）およびＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＮＳＣＬＣ）−を、実施例１で説明したように試験した。ＫＭ１２（ＣＲＣ）、ＲＰＭＩ８２２６（骨髄腫）、ＮＣＩ−Ｎ８７（胃がん）、Ａ３７５（メラノーマ）、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＮＳＣＬＣ）腫瘍を担持しているマウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号２６、１８、２９および２３）のヒトサイトカインｍＲＮＡ混合物  ８μｇ（２μｇ／標的）の単回腫瘍内注射を施し、２４時間の時点で腫瘍内のコードされたサイトカインを評定した。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ（図２２Ｄ）、ＩＬ−１２ｓｃ（図２２Ａ）、ＧＭ−ＣＳＦ（図２２Ｃ）およびＩＦＮα（図２２Ｂ）の４つのサイトカインの各々についての発現が、異種移植モデル５つすべてにおいて検出され、ＮＣＩ−Ｈ１９７５に関して観察されたサイトカインレベルが最も高く、これにＡ３７５、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＲＰＭＩ８２２６、そしてＫＭ１２が続いた。
【実施例１０】
【０３３１】
腫瘍内ｍＲＮＡサイトカイン注射後のサイトカインの用量依存的血清中発現
コードされたサイトカインの発現に対する種々の腫瘍内ｍＲＮＡ用量の効果を、右側腹部に単一Ａ３７５腫瘍を生着させたマウスの血清において検査した。マウスに、ヒトＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＩＬ−１２ｓｃ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮα（ＭｏｄＢ；配列番号２６、１８、２９および２３）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の単回腫瘍内注射を施した。腫瘍内ｍＲＮＡ注射後６時間の時点で血清を採取し、サイトカイン発現をＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイによって分析した。ｍＲＮＡにコードされたサイトカインの各々についての用量依存的発現が、８０μｇ（２０μｇ）の最高用量から０．０２５６μｇ（０．００６４μｇ）の最低用量まで、血清中で観察された。結果を図２３Ａ〜Ｄに示す。
【実施例１１】
【０３３２】
サイトカインｍＲＮＡはｇｐ７０＋ＣＤ８Ｔ細胞の発現をもたらす
一方の側腹部に単一のＣＴ２６腫瘍を担持しているマウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（ＭｏｄＢ；配列番号５３、４１、５９および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物の４回の腫瘍内注射を施した。初回腫瘍内ｍＲＮＡ投与の１３日後に血液を採取し、ｇｐ７０腫瘍抗原に対して特異的なＴ細胞をフローサイトメトリーにより定量した。血液中のｇｐ７０腫瘍抗原に対して特異的なＴ細胞の出現頻度は、ｍＲＮＡサイトカインの腫瘍内注射時のマウスにおいて、対照ＲＮＡを施したマウスと比較して強く増加された。
【実施例１２】
【０３３３】
サイトカインｍＲＮＡは、複数の炎症誘発性経路を誘導し、処置した腫瘍においても、未処置の腫瘍においても、免疫浸潤を増加させる
左右側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの、細胞０．５×１０６個で発症させた右側の腫瘍に、ｍＲＮＡ  ８０μｇ（２０μｇ／標的）の単回腫瘍内注射を施した（腫瘍を処置した）が、細胞０．２５×１０６個で発症させた腫瘍は、未処置のままとした。ｍＲＮＡの腫瘍内注射後７日の時点で、両方の腫瘍を採取し、ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ配列決定分析に供した。図２７Ａ〜Ｃに示すように、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物での処置は、様々なＩＦＮガンマ応答遺伝子を含む複数の炎症誘発性経路を上方調節した。炎症誘発性／ＩＦＮガンマ関連経路の上方調節は、処置した腫瘍においても、未処置の腫瘍においても発生し、これは、局所腫瘍内処置に全身性免疫調節効果があることを支持した。
【０３３４】
因果関係ネットワーク分析（インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシスツールの一部）を、被注射側腹部におけるサイトカインｍＲＮＡ処置と対照との間で差次的に発現された遺伝子３２９８個（１６９９個が上方調節、１５９９個が下方調節）、および未注射側腹部における遺伝子４９７３個（２５４６個が上方調節、２４２７個が下方調節）に関して行って、観察された遺伝子発現変化を説明することができるシグナル伝達経路の変化を同定した。経路の変化を示すために、値の符号が変化の方向を示す（正の符号は活性化を示唆するが、負の符号は阻害を示唆する）Ｚスコアを計算した。
【０３３５】
ＩＦＮＧにより調節される遺伝子３２８個の発現（２９５個が上方調節、３３個が下方調節）に関する階層的クラスタリングを、被注射腫瘍と未注射腫瘍の両方における対照ｍＲＮＡで処置した試料およびサイトカインｍＲＮＡで処置した試料の両方に関して行った。試料全体にわたって各遺伝子の発現のｚスコアを正規化した。類似度の尺度は、ピアソン相関係数に基づき、完全連結を使用してデンドログラムを生成した。表６を参照されたい。
【０３３６】
浸潤免疫細胞の相対的存在量は、免疫細胞型特異的遺伝子シグネチャーの平均発現を計算することによって決定した。
【０３３７】
【表３２】
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【０３３８】
【表３３】
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【０３３９】
【表３４】
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【０３４０】
【表３５】
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【０３４１】
【表３６】
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【０３４２】
【表３７】
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【０３４３】
【表３８】
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【０３４４】
【表３９】
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【０３４５】
【表４０】
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【０３４６】
【表４１】
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【０３４７】
【表４２】
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【０３４８】
【表４３】
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【０３４９】
【表４４】
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【実施例１３】
【０３５０】
サイトカインｍＲＮＡは、処置した腫瘍においても未処置の腫瘍においてもＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させる
左右側腹部にＢ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの、細胞０．５×１０６個で発症させた右側の腫瘍、腫瘍の一方のみ、にｍＲＮＡ  ８０μｇ（２０μｇ／標的）の単回腫瘍内注射を施した（腫瘍を処置した）が、細胞０．２５×１０６個で発症させた他方の腫瘍は、未処置のままとした。腫瘍内ｍＲＮＡ注射後７日の時点で、両方の腫瘍を採取し、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＦｏｘＰ３＋細胞について抗体で染色するＩＨＣ（免疫蛍光顕微鏡法）のために処理した。図２８Ａおよび２８Ｂにおける腫瘍からのマウスは、サイトカインｍＲＮＡで処置し、その一方で、図２８ＣおよびＤにおける腫瘍からのマウスは、対照ｍＲＮＡで処置した。パネルＡおよびＣは、ｍＲＮＡの注射を施した腫瘍からのものであり、その一方で、パネルＢおよびＤは、注射を施していない対応する反対側の腫瘍からのものである。（図２８Ａ〜Ｄ）。サイトカインｍＲＮＡ処置群と対照ｍＲＮＡ処置群の両方について、ＲＮＡの注射を施した腫瘍５つ、および未注射の対応する反対側の腫瘍５つを、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＦＯＸＰ３＋細胞について免疫蛍光染色した。細胞の相対出現頻度および比を図２８Ｅ、Ｆ、Ｇにプロットした。これらの結果は、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物が、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を増加させて、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比の変化をもたらすことを示す。免疫浸潤の増加は、処置した腫瘍においても未処置の腫瘍においても発生し、これは、局所腫瘍内処置に全身性免疫調節効果があるという考えを支持した。
【実施例１４】
【０３５１】
ｍＲＮＡは、腫瘍細胞と浸潤性免疫細胞の両方において発現される
単一Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスに、Ｔｈｙ１．１タンパク質をコードするｍＲＮＡの単回腫瘍内注射を施した（図２９Ａ〜Ｇ）。腫瘍内注射のおおよそ１８時間後、腫瘍を解離させ、抗体のパネルで染色し、フローサイトメトリーを行って、Ｔｈｙ１．１タンパク質を発現する細胞を定義した。これらの結果は、腫瘍細胞と免疫細胞の両方がｍＲＮＡを取込み、発現することを示す。
【実施例１５】
【０３５２】
腫瘍内サイトカインｍＲＮＡ注射後の用量依存的腫瘍発現およびＰＤ応答
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物８０、８または０．８μｇの単回ｍＲＮＡ注射を施した。腫瘍内注射のおおよそ６時間後、腫瘍を除去し、溶解し、腫瘍溶解物中のＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ、ＩＦＮガンマおよびＩＰ−１０のレベルを定量した。図３０Ａ〜Ｆは、サイトカインｍＲＮＡが用量依存的に腫瘍内に発現されたことを示す。
【０３５３】
別個の実験で、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物８０、８または０．８ｕｇの単回ｍＲＮＡ注射を施した。腫瘍内サイトカインｍＲＮＡ注射後７日の時点で、腫瘍を解離させ、抗体のパネルで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。使用した抗体は、マウス：ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７９、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、ＦＯＸＰ３、グランザイムＢに対するものであった。これらの結果は、サイトカインｍＲＮＡ混合物による処置が、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を変化させたこと（図３１Ａ〜Ｂ）、腫瘍微小環境における多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度増加をもたらしたこと（図３１Ｃ〜Ｄ）、浸潤性骨髄系細胞上のＰＤ−Ｌ１を増加させたこと（図３１Ｅ）、および浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１レベルを上昇させたこと（図３１Ｆ）を示す。
【０３５４】
さらなる実験では、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの左右側腹部の腫瘍の一方のみに、ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物、または対照ｍＲＮＡの単回腫瘍内注射を施した（腫瘍を処置した）が、他方の腫瘍は、未処置のままであった。腫瘍内ｍＲＮＡ注射後７日の時点で、注射を施した腫瘍を採取し、ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋およびグランザイムＢについて抗体で染色するフローサイトメトリーのために処理した。これらの結果は、サイトカインｍＲＮＡ混合物が、腫瘍における腫瘍内グランザイムＢ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を上昇させたことを示す（図３１Ｇ〜Ｈ）。
【実施例１６】
【０３５５】
腫瘍内注射されたｍＲＮＡは主として腫瘍内に発現される
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスに、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ  ５０μｇの単回腫瘍内注射を施した。６および２４時間の時点で、マウス３匹を屠殺し、腫瘍、肝臓、脾臓、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）および非腫瘍流入領域リンパ節（ＮＤＬＮ）をｅｘ  ｖｉｖｏでルシフェラーゼ発現について分析した。図３２Ａ〜Ｂは、ルシフェラーゼ発現が腫瘍内で最も高度であり、腫瘍内での発現が、いずれの他の組織より１００倍を超えて高度であったことを示す。
【実施例１７】
【０３５６】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＮＫ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０モデルにおいてサイトカインｍＲＮＡの抗腫瘍活性の一因となる
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウスの群を、合計４週間にわたって枯渇用抗体（抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＮＫ１．１）１００μｇでの週１回の腹腔内注射により処置した。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物  ８０μｇでの処置の前日に、抗体媒介細胞枯渇を開始した。全生存率に対する抗体の枯渇効果をモニターした。図３４に示すこれらの結果は、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋またはＮＫ細胞の個々の枯渇が、サイトカインｍＲＮＡの抗腫瘍活性および全生存率を、様々な程度に、低下させたことを示す。
【実施例１８】
【０３５７】
サイトカインｍＲＮＡの抗腫瘍活性は、ＩＦＮ−ガンマ欠損マウスでは観察されない
ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、およびマウスＩＦＮγが欠損している（ＩＦＮγＫＯ）Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに、実施例１で説明したようにＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植した。ＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＩＬ−１２ｓｃ（配列番号５９、５３、４１および４７）のサイトカインｍＲＮＡ混合物８０μｇ（２０μｇ／標的）または対照ｍＲＮＡ  ８０μｇの腫瘍内注射によってマウスを処置し、全生存率をモニターした。図３５に描示されているこれらの結果は、ＩＦＮγを欠いているマウスが、サイトカインｍＲＮＡで処置されたときに検出可能な抗腫瘍応答を示さなかったことを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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