(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のF3プライマー、B3プライマー、FIPプライマー及びBIPプライマーを含む、ジャガイモシストセンチュウ(Globodera rostochiensis)に特異的な塩基配列をLAMPにより増幅するためのプライマーセット。
配列番号１記載の塩基配列から成るF3プライマー；
配列番号２記載の塩基配列から成るB3プライマー；
配列番号３記載の塩基配列から成るFIPプライマー；及び
配列番号４記載の塩基配列から成るBIPプライマー。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットを含む、LAMPによるジャガイモシストセンチュウ検出又は同定用キット。
【請求項３】
請求項１記載のプライマーセット又は請求項２記載のキットを用いて、ジャガイモシストセンチュウの標的核酸領域の増幅反応をLAMPにより行う工程を含む、ジャガイモシストセンチュウ検出又は同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばジャガイモシストセンチュウ(Globodera rostochiensis)由来の核酸をLAMP法により特異的に検出するためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモの重要害虫であるジャガイモシストセンチュウ(Globodera rostochiensis：以下「Gr」と称する)は、1972年に我が国で初めて確認されて以来、種苗検疫対象として植物防疫法の規制を受けている。本線虫に対する有効な抵抗性品種が利用できることから、その普及が進められているところである。
【０００３】
一方、近縁種であるジャガイモシロシストセンチュウ(Globodera pallida：以下「Gp」と称する)が2015年に我が国で初めて確認された。本線虫はGr抵抗性品種にも寄生するなど、防除対策も異なること等から、政府による緊急防除事業が行われ、発生地における寄主植物地下部の移動規制等が行われている。
【０００４】
これら2種の線虫は、形態が酷似するにもかかわらず同所的に混発することもある一方、求められる対策が異なっていることから、Grのみを簡便且つ特異的に検出・同定する技術が求められている。
【０００５】
Grのみを簡便且つ特異的に検出・識別するため、主観的で熟練を要する形態観察に代わって、一定のプロトコルに従って客観的な結果が得られる分子生物学的同定技術が用いられてきており、特定のDNA断片を増幅するPCR法に基づく同定技術が主に用いられている。このような技術としては、特定のPCR産物(核リボソームRNA遺伝子のITS領域)を制限酵素により切断して電気泳動したパターンの違いを観察するPCR-RFLP法(非特許文献１〜３)、種特異的プライマーを同時に用いて種ごとに異なるサイズのDNA断片を同時に増幅するマルチプレックスPCR法（非特許文献４〜１０）、PCR増幅を行いながら増幅産物に対して種特異的配列を標的とする蛍光プローブによる検出を行うリアルタイムPCR法(非特許文献１１〜１９)等がある。
【０００６】
しかしながら、Grを特異的に検出するための従来の分子生物学的同定技術は、全てPCR法に基づく手法であり、少なくとも2つ以上の温度処理を繰り返すため、このような温度処理がプログラム可能なPCR装置(サーマルサイクラー)が必要となる。また、結果を観察するためには電気泳動関連装置を要する。より簡便且つ高感度なリアルタイムPCRを行うためには、高価なリアルタイムPCR装置が必要となる。このようにPCR法に基づく手法では、研究室レベルの機材を必要とするため、従来技術により生産者レベルで分子生物学的同定を簡便に行うことは困難な状況である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Thiery and Mugniery, 1996, Fundam. Appl. Nematol. 19, 471-479
【非特許文献２】Fleming et al., 2000, EPPO Bull. 30, 585-590
【非特許文献３】Subbotin et al., 2010, Systematics of Cyst Nematodes (Nematoda: Heteroderinae). Nematology Monographs and Perspectives 8A, Brill, Leiden, 512 pp
【非特許文献４】Mulholland et al., 1996, Diagnostics in Crop Production, British Crop Protection Council, Farnham, 247-252
【非特許文献５】Shields et al., 1996, Fundam. Appl. Nematol. 19, 167-173
【非特許文献６】Bulman and Marshall, 1997, N. Z. J. Crop Hort. Sci. 25, 123-129
【非特許文献７】Fullaondo et al., 1999, Nematology 1, 157-163
【非特許文献８】Zouhar et al., 2000, Plant Protect. Sci. 36, 81-84
【非特許文献９】Vejl et al., 2002, Rostlinna vyroba 48, 486-489
【非特許文献１０】Van de Vossenberg et al., 2014, EPPO Bull. 44, 27-33
【非特許文献１１】Bates et al., 2002, Mol. Plant Pathol. 3, 153-161
【非特許文献１２】Madani et al., 2008, Can. J. Plant Pathol. 30, 554-564
【非特許文献１３】Toyota et al., 2008, Soil Sci. Plant Nutr. 54, 72-76
【非特許文献１４】Nakhla et al., 2010, Plant Dis. 94, 959-965
【非特許文献１５】Madani et al., 2011, Eur. J. Plant Pathol., 271-285
【非特許文献１６】Papayiannis et al., 2013, J. Phytopathol. 161, 459-469
【非特許文献１７】Beniers et al., 2014, Nematology 16, 1219-1232
【非特許文献１８】Chronis et al., 2014, Eur. J. Plant Pathol. 139, 245-252
【非特許文献１９】Gamel et al., 2017, Nematology 19, 789-804
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述の実情に鑑み、一定温度で迅速にDNA断片を増幅・検出できるLAMP法により、Gr由来のDNAを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することで、当該線虫を簡便且つ特異的に検出・同定できる手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Grは複数の異なるミトコンドリアサブゲノムDNA(small circular mitochondrial DNA: scmtDNA)を有しており、その構成や塩基配列においてGpや他の近縁種との種間差が見られることを見出し、英国産Grについてデータベース登録された塩基配列の比較検討により、Grについて種特異的領域の探索が期待できると考えられたscmtDNA Iの非コード領域部分配列(GenBank accession number EF193005：6189−8119，1931 bp)に対してLAMPプライマーを設計し、それらのプライマーとLAMPの手法を用いることで、Grを簡便且つ特異的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）以下のF3プライマー、B3プライマー、FIPプライマー及びBIPプライマーを含む、Grに特異的な塩基配列をLAMPにより増幅するためのプライマーセット。
配列番号１記載の塩基配列から成るF3プライマー；
配列番号２記載の塩基配列から成るB3プライマー；
配列番号３記載の塩基配列から成るFIPプライマー；及び
配列番号４記載の塩基配列から成るBIPプライマー。
（２）（１）記載のプライマーセットを含む、LAMPによるGr検出又は同定用キット。
（３）（１）記載のプライマーセット又は（２）記載のキットを用いて、Grの標的核酸領域の増幅反応をLAMPにより行う工程を含む、Gr検出又は同定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ジャガイモの重要害虫であるGrを簡便且つ特異的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列(GenBank accession number EF193005：6189−8119，1931 bp)上における本発明に係るプライマー領域の位置及び配列を示す。[43]、[126]、[180]、[1］、[74]は、それぞれプライマーセットGRmt1_43、GRmt1_126、GRmt1_180、GRmt1_1、GRmt1_74である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図１−５】図１−４の続きである。
【図１−６】図１−５の続きである。
【図１−７】図１−６の続きである。
【図２】実施例における60℃でのLAMP反応の結果を示す。濃色が増幅を表す(図３及び４についても同様である）。
【図３】実施例における63℃でのLAMP反応の結果を示す。
【図４】実施例における選抜したプライマーセット(GRmt1_74)の特異性検証の結果を示す。番号は、表３に示す同じ番号の線虫由来のDNAを用いたLAMP反応の結果であり、番号24は、水を加えた陰性対照である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプライマーセットは、Grに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするLAMP用プライマーを含む、LAMPによりGrに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットである。
【００１４】
本発明者がその構成や塩基配列においてGpや他の近縁種との種間差が見られることを見出したGrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列(GenBank accession number EF193005：6189−8119，1931 bp)に基づき作製したLAMP用プライマーセットを用いたLAMPによれば、Grを簡便且つ特異的に検出することができる。
【００１５】
本発明における核酸増幅法であるLAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)は、納富らが開発した、PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な核酸増幅法であるループ媒介等温増幅法(国際公開第00/28082号パンフレット；栄研化学株式会社ホームページ(http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/))である。当該方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、LAMPでは、プライマーの3'末端が常にサンプルに由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度に且つ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００１６】
LAMPで使用されるプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計6領域、すなわち3'末端側からF3c、F2c、F1cという領域と、5'末端側からB3、B2、B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって、各々インナープライマーF(FIP)及びB(BIP)とアウタープライマーF(F3)及びB(B3)と呼ぶ。また、F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補配列をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2領域」及び「F1c領域」を含むプライマーをインナープライマーF(FIP)、そして「B2領域」及び「B1c領域」を含むプライマーをインナープライマーB(BIP)と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の3'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3領域」を含むプライマーをアウタープライマーF(F3)、「B3領域」を含むプライマーをアウタープライマーB(B3)と呼ぶ。
【００１７】
LAMPでは、先ずGrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列に対して、FIPプライマーがアニーリングし、そこから鎖置換型DNA合成酵素の作用により伸長する。FIPプライマーは、GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の「F2c領域」に相補的な「F2領域」を3'末端側に有し、且つ5'末端側にGrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の「F1c領域」と同一の領域を有する。また、鎖置換型DNA合成酵素とは、伸長方向に二本鎖領域が存在する場合に、当該二本鎖を解離しながら、相補鎖合成を行うことができるDNA合成酵素を意味する。
【００１８】
次いで、FIPの外側に位置するF3プライマーがGrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の相補的な配列「F3c領域」に対してアニーリングし、鎖置換型DNA合成酵素の作用により、既に合成されたFIPから伸長した一本鎖DNAを剥がす一方で、F3プライマーより伸長する。F3プライマーは、GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の「F3c領域」に相補的な「F3領域」を有する。剥がされたFIPからの一本鎖DNAは、FIPが有する5'末端側の「F1c領域」と伸長部分の「F1領域」とが相補的であることから、自己アニーリングすることでループを形成することとなる。
【００１９】
当該ループを形成した一本鎖DNAに、もう一方のインナープライマーであるBIPプライマーがアニーリングし、そこから鎖置換型DNA合成酵素の作用により伸長する。BIPプライマーは、GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の「B2領域」と同一の領域を3'末端側に有し、且つ5'末端側にGrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の「B1領域」に相補的な「B1c領域」を有する。
【００２０】
さらに、BIPプライマーの外側に位置するB3プライマーが当該ループを形成した一本鎖DNAにアニーリングし、鎖置換型DNA合成酵素の作用により、既に合成されたBIPプライマーからの一本鎖DNAを剥がす一方で、B3プライマーより伸長する。B3プライマーは、GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上の「B3領域」と同一の領域を有する。剥がされたBIPから伸長した一本鎖DNAは、両端でそれぞれに相補的な配列を有するので、それぞれが自己アニーリングすることでループを形成することとなる。すなわち、当該剥がされたBIPから伸長した一本鎖DNAは、両端にループを形成することでダンベル型構造となる。このダンベル型構造がLAMPにおける増幅サイクルの起点構造となり、一連の増幅サイクルが行われる。
【００２１】
具体的な本発明に係るプライマーセットとして、図１及び表１に示すように、Grに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるLAMPのプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列を標的配列として、以下の1組のプライマーセットを選定した。
プライマーセットGRmt1_74：
配列番号１記載の塩基配列を含む、又はそれから成るF3プライマー；
配列番号２記載の塩基配列を含む、又はから成るB3プライマー；
配列番号３記載の塩基配列を含む、又はから成るFIPプライマー；及び
配列番号４記載の塩基配列を含む、又はから成るBIPプライマー。
【００２２】
あるいは、各プライマーの配列番号で示される塩基配列において、1又は数個(例えば、1〜10個、1〜5個、1〜3個、好ましくは1又は2個)の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を有し、且つLAMPにおけるそれぞれのプライマー機能を有するプライマーを代替的に含むことができる。
【００２３】
また、本発明に係るプライマーセットは、単独で、又はLAMPに必要な試薬と共に、LAMPによるGr検出又は同定用キットとして提供することができる。LAMPに必要な試薬としては、例えば鎖置換型DNA合成酵素、dNTP、緩衝液、滅菌水、反応生成物の検出に必要な試薬等が挙げられる。
【００２４】
鎖置換型DNA合成酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばBst DNAポリメラーゼ(ニッポンジーン株式会社)、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Csa DNAポリメラーゼ(ニッポンジーン株式会社)、96-7 DNAポリメラーゼ(ニッポンジーン株式会社)等が挙げられる。
【００２５】
さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係るプライマーセット又はキットを用いて、Grの標的核酸領域の増幅反応をLAMPにより行い、Grを検出又は定量する、Gr検出又は同定方法(以下、「本方法」と称する)に関する。換言すれば、当該検出又は定量により、Grの有無又は個体数を検査又は評価することができる。
【００２６】
本方法では、先ず、サンプルとして土壌中から分離したGrの幼虫やシスト、ジャガイモなどの寄主植物の根に寄生・付着する雌成虫やシストなどからDNAを抽出及び精製する。また、ジャガイモなどの寄主植物が生育したことのある土壌をサンプルとしてDNAを抽出及び精製してもよい。DNA抽出法としては、市販のDNA抽出試薬を用いる方法が挙げられる。
【００２７】
次いで、得られた鋳型DNAをLAMPに供する。LAMPの反応液には、例えば、反応液15μl当たり、鋳型DNAを含む粗抽出液1 μl、本発明に係るプライマーセットに含まれる各プライマーのうちF3及びB3プライマー：各3 pmol、FIP及びBIPプライマー：各24 pmol、DNA増幅試薬キット（栄研化学社株式会社製）のBst DNA Polymerase 0.6 μl及び2×Reaction Mix. 7.5 μlが含まれる。また、LAMPの増幅反応条件としては、例えば、温度60℃〜63℃で50〜70分（好ましくは60分）が挙げられる。
【００２８】
LAMP反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、核酸合成の副産物であるピロリン酸マグネシウムにより生成される濁度を肉眼で確認、あるいは、リアルタイム濁度測定装置(例えば、栄研化学株式会社製のLoopampEXIA)で光学的に確認する。また、Loopamp(登録商標)蛍光・目視検出試薬(栄研化学株式会社製)をLAMP反応時に反応液に予め添加しておくことで、紫外線照射装置により目視により核酸増幅を検出することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
１．プライマー設計
LAMP法プライマー設計支援ソフトウェアPrimerExplorer(栄研化学，https://primerexplorer.jp/）を用いて、GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列（GenBank accession number EF193005：6189−8119，1931 bp)に対してGr用プライマーセットを設計した。
【００３１】
GrのscmtDNA Iの非コード領域部分配列上における設計したプライマーの位置及び配列を図１に示し、且つ、設計したGr用プライマーセットを以下の表１に示す。
【００３２】
【表１】
0006940191.tif 000002
【００３３】
２．LAMP反応
LAMP反応における反応液の組成を以下の表２に示す。
【００３４】
【表２】
0006940191.tif 000003
【００３５】
LAMP反応では、反応液を60〜65℃・60分間の温度処理に供した後、95℃・2分間の酵素変性処理を加えてからUV又はCyan LEDを照射して増幅の有無を確認した。
【００３６】
３．設計したプライマーセットの選抜
Grに加え、近縁種であるGp、Globodera ellingtonae(以下「Ge」と称する）及びタバコシストセンチュウ(Globodera tabacum：以下「Gt」と称する）の幼虫粗抽出DNAをLAMP反応に供して、反応温度を変えてDNA増幅の有無を確認した。
【００３７】
具体的には、Sakai et al.(Hiromichi Sakai, Atsuhiko Kushida and Takashi Narabu (2019) Identification of the potato cyst nematodes based on two-step multiplex endpoint PCR with the dUTP/UNG system for carry-over prevention. Nematological Research 49(2), 19-27)の方法に従い、以下のように、DNA抽出を行った：
(1) 2期幼虫を1頭、抽出液20μLを含むPCRチューブ中に入れた
※ 抽出液：0.1％ SDS、0.5〜1 mg/mLプロティネースK、25 mM DTTをTE(pH8.0)に溶解
(2) 55℃・30分→95℃・10分の熱処理
(3) 滅菌水80μLを加えて希釈(全量100μL)。
【００３８】
このように、幼虫1頭から粗抽出したDNA全量100μLのうち1μLを供して、LAMP法用DNA増幅試薬キット及び蛍光・目視検出試薬(栄研化学)を用いてマニュアルに従い、標準反応量25μLに対して15μLにスケールダウンした反応液を調製し、60〜65℃・60分間の温度処理を行った。
【００３９】
結果を図２及び３に示す。図２及び３に示すように、Grに対する特異的検出が確認できた1セットのプライマーを選抜した(GRmt1_74)。なお、65℃では増幅しなかった。
【００４０】
４．選抜したプライマーセットの特異性検証
選抜したプライマーセット(GRmt1_74)について、以下の表３に示す9個体群のGr、4個体群のGp及び他のシストセンチュウ10種を供して、同様のLAMP反応を63℃で行った。
【００４１】
【表３】
0006940191.tif 000004
【００４２】
結果を図４に示す。図４に示すように、Grに対する特異的検出が確認できた。
【要約】
【課題】ジャガイモの重要害虫であるジャガイモシストセンチュウ(Globodera rostochiensis)を検出又は同定する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ジャガイモシストセンチュウのミトコンドリアサブゲノムDNA(small circular mitochondrial DNA: scmtDNA) Iの非コード領域部分配列に対するLAMP用プライマーセットを用いて、ジャガイモシストセンチュウの標的核酸領域の増幅反応をLAMPにより行う工程を含む、ジャガイモシストセンチュウ検出又は同定方法。
【選択図】なし【図１−１】
0006940191.tif 000005
【図１−２】
0006940191.tif 000006
【図１−３】
0006940191.tif 000007
【図１−４】
0006940191.tif 000008
【図１−５】
0006940191.tif 000009
【図１−６】
0006940191.tif 000010
【図１−７】
0006940191.tif 000011
【図２】
0006940191.tif 000012
【図３】
0006940191.tif 000013
【図４】
0006940191.tif 000014
【配列表】
0006940191000001.app