(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の特定のＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）当該試料を、当該特定のＤＮＡを標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡに接触させる工程、および
（ｂ）当該試料中に当該特定のＤＮＡが存在した場合に生じる、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる一本鎖プローブＤＮＡの切断を検出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により試料中の特定のＤＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）当該特定のＤＮＡを標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム、および
（ｂ）一本鎖プローブＤＮＡ
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡを利用して、試料中の特定のＤＮＡを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集技術は、動物や植物の細胞の中でゲノムＤＮＡ配列を特異的に切断し、内在の修復機構を利用することで、任意の配列に自由に書き換える技術である。バイオサイエンス研究だけでなく、農作物や畜産動物の品種改良、再生医療やゲノム編集治療など、世界中でその利用が広がっている。【０００３】
細菌や古細菌が持つＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、複数のタンパク質の複合体により標的配列を切断するクラス１と、一つのタンパク質により切断するクラス２に分かれる。これまでゲノム編集ツールとして開発されてきたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）システム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３システムなどは、全てクラス２に分類される。【０００４】
このような状況下、本発明者は、クラス１に属するタイプＩ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが真核細胞のゲノム編集ツールとして利用できることを見出した（特許文献１）。【０００５】
しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、どのようにＤＮＡを切断して変異を導入するのか、その詳細な分子機構は、いまだ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開２０１８／２２５８５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによるＤＮＡ切断の分子機構を解明し、当該分子機構を利用した標的ＤＮＡの検出方法を提供することを目的とする。本発明のさらなる目的は、当該検出方法に用いるためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが試料中の標的ＤＮＡを認識して結合すると、周囲に存在する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を無差別に切断することを見出した。さらに、本発明者らは、この知見に基づけば、標的ＤＮＡを検出する試料とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムとを含む反応系に、その切断が検出可能な一本鎖プローブＤＮＡを混在させておくことにより、当該一本鎖プローブＤＮＡの切断により生じるシグナルを指標に、試料中の標的ＤＮＡを検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる一本鎖ＤＮＡの無差別な切断を利用した標的ＤＮＡの検出方法、および当該検出方法に用いるためのキットに関し、より詳しくは、以下を提供するものである。【００１０】
（１）試料中の特定のＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）当該試料を、当該特定のＤＮＡを標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡに接触させる工程、および
（ｂ）当該試料中に当該特定のＤＮＡが存在した場合に生じる、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる一本鎖プローブＤＮＡの切断を検出する工程、
を含む方法。【００１１】
（２）（１）に記載の方法により試料中の特定のＤＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）当該特定のＤＮＡを標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム、および
（ｂ）一本鎖プローブＤＮＡ
を含むキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡを利用することにより、試料中の標的ＤＮＡを検出することが可能となる。本発明の方法は、一本鎖プローブＤＮＡの切断により生じるシグナルを指標に、試料中の標的ＤＮＡを検出することができ、簡便である（図１０を参照のこと）。標的ＤＮＡを正確に認識して結合した場合にのみ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが一本鎖プローブＤＮＡを切断するが、この標的ＤＮＡの検出における特異性は、１塩基レベルであり、極めて高い。また、本発明の方法では、試料中に存在する標的ＤＮＡが微量であっても検出することができる。例えば、ＲＰＡ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの遺伝子増幅法と組み合わせることにより、試料中に１コピー〜１０コピーの標的ＤＮＡしか存在しない場合でも検出することができ、感度が高い。【００１３】
本発明の方法は、例えば、様々な体液（尿、唾液、血清、血漿、全血など）を試料とした短時間でのウイルスの同定、血中の微量ＤＮＡやその変異を検出するリキッドバイオプシーへの応用、あるいはメタゲノム中に含まれる微量な病原体ＤＮＡの種類別の検出など、次世代型診断のためのツールとして利用できる。【００１４】
類似の方法として、クラス２２に属するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａやＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａを用いたＤＥＴＥＣＴＲやＣａｓ１４−ＤＥＴＥＣＴＲが報告されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１８  Ａｐｒ  ２７；３６０（６３８７）：４３６−４３９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１８  Ｎｏｖ  １６；３６２（６４１６）：８３９−８４２）。これらのシステムにおけるの標的配列は、それぞれ２１塩基、２０塩基であるのに対し、クラス１に属するタイプＩ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、標的配列が２７塩基と長い。従って、従来のシステムよりも、高い特異性で標的ＤＮＡを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、ｈＥＭＸ１標的配列存在下で一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することを示す図である。図上は、試料の組成を示し、図下は、キャピラリー電気泳動の結果を示す。適切なＰＡＭ配列および標的配列を含むＤＮＡ断片が存在する試料４、５のみ、非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性が見られた（矢印）。
【図２】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、ｈＥＭＸ１標的配列存在下でも二本鎖ＤＮＡは非特異的に切断しないことを示す図である。図上は、試料の組成を示し、図下は、キャピラリー電気泳動の結果を示す。適切なＰＡＭ配列および標的配列を含むＤＮＡ断片が存在する試料４、５でも、非特異的ニ本鎖ＤＮＡ切断活性は見られなかった（矢印）。
【図３】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、ｈＥＭＸ１標的配列存在下で一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することを、切断により蛍光を発する一本鎖ＤＮＡプローブ（ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔＴＭ）を用いて検出した結果を示す図である。図上は、試料の組成を示し、図下は、蛍光を検出した結果を示す。適切なＰＡＭ配列および標的配列を含むＤＮＡ断片が存在する試料４、５のみ、経時的な非特異的ヌクレアーゼ活性（蛍光）が検出された。
【図４】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、ｍＴｙｒ標的配列の存在下で、一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することを、切断により蛍光を発する一本鎖ＤＮＡプローブ（ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔＴＭ）を用いて検出した結果を示す図である。図上は、試料の組成を示し、図下は、蛍光を検出した結果を示す。ＰＡＭ配列および標的配列を含むＤＮＡ断片が存在する試料４、５のみ、経時的な非特異的ヌクレアーゼ活性（蛍光）が検出された。
【図５Ａ】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、ｈＥＭＸ１標的配列存在下で一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することを、切断により蛍光を発する一本鎖ＤＮＡプローブ（ＴａｑｍａｎＴＭプローブ）を用いて検出した結果を示す図である。図上は、試料の組成を示し、図下は、蛍光を検出した結果を示す。適切なＰＡＭ配列および標的配列を含むＤＮＡ断片が存在する試料２、３のみ、経時的な非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性（蛍光）が検出された。
【図５Ｂ】図５Ａにおける蛍光強度の上昇度を活性強度として表したグラフである。
【図６】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、ｈＥＭＸ１標的配列またはｍＴｙｒ標的配列の存在下で一本鎖ＤＮＡを非特異的に切断することを、切断により蛍光を発するプローブ（ＴａｑｍａｎＴＭプローブ）を用いて検出した結果を示す図である。本実験では、標的配列に一本鎖ＤＮＡを用いた。図上は、試料の組成を示し、図下は、蛍光強度の上昇度を活性強度として表した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３が認識する標的配列が一本鎖ＤＮＡ断片の場合であっても、二本鎖ＤＮＡ断片の場合と同様に、非特異的一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができた。Ｎ＝３。
【図７】図５と同様の実験を、様々なＰＡＭ配列（６４種類）で評価した結果を示す図である。図上は、活性強度の測定結果を示し、図下は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｏｇｏによるＰＡＭ配列の指向性の可視化したものである。Ｎ＝３。
【図８】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３の検出限界濃度を評価した結果を示す図である。標的配列（図上は、ｈＥＭＸ１、図下は、ｍＴｙｒ）を含むＤＮＡ断片を限界希釈して、図５と同様の実験を行った。１ｘ１０１０コピー以上の存在下で有意にシグナルが検出された。Ｎ＝３。
【図９】１コピーＤＮＡ断片を図５と同様の実験で検出した結果を示す図である。試料中の１コピーＤＮＡ断片を検出するために、ＲＰＡ法によるＤＮＡ増幅を利用した。Ｎ＝３。
【図１０】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性を利用した、本発明の検出法の概要を示す図である。
【図１１】標的ＤＮＡ断片とマウスゲノムＤＮＡを含む混合ゲノム溶液を用いて、図９と同様の実験を行った結果を示す図である。
【図１２】ＲＴ−ＬＡＭＰ法により増幅した新型コロナウイルスゲノムを用いて、図９と同様の実験を行った結果を示す図である。
【図１３Ａ】新型コロナウイルスの検出に利用したラテラルフローアッセイの検出原理を示す図である。
【図１３Ｂ】新型コロナウイルスを図１３Ａのラテラルフローアッセイで検出した結果を示す図である。
【図１４】段階希釈したウイルスＲＮＡのサンプルに対して、図１３Ｂと同様にラテラルフローアッセイを行った結果を示す図である。
【図１５】ＲＮＡウイルスをラテラルフローアッセイで検出するための本発明の方法（ＣＯＮＡＮ法）の流れを示す図である。
【図１６】Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）のゾフルーザ耐性変異部位をＴａｑｍａｎＴＭプローブを用いて検出した結果を示す図である。変異部位が野生型である遺伝子を検出した。
【図１７】Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）のタミフル耐性変異部位をＴａｑｍａｎＴＭプローブを用いて検出した結果を示す図である。変異部位が変異型である遺伝子を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜試料中の特定のＤＮＡを検出する方法＞
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡを利用した、試料中の特定のＤＮＡを検出する方法を提供する。
【００１７】
本発明の検出方法は、（ａ）当該試料を、当該特定のＤＮＡを標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡに接触させる工程、および（ｂ）当該試料中に当該特定のＤＮＡが存在した場合に生じる、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる一本鎖プローブＤＮＡの切断を検出する工程、を含む。
【００１８】
−標的ＤＮＡ−
本発明の検出方法において、検出の対象となる特定のＤＮＡ（以下、「標的ＤＮＡ」と称する）としては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの標的となる限り、特に制限はない。標的ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡであっても、一本鎖ＤＮＡであってもよい（図６を参照のこと）。
【００１９】
標的ＤＮＡの由来は、特に制限はなく、自然界に由来するＤＮＡであっても、人工的なＤＮＡであってもよい。自然界に由来するＤＮＡとしては、例えば、ウイルス（例えば、動物ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス）に由来するＤＮＡ、原核生物（例えば、細菌、放線菌、原核藻類、古細菌）に由来するＤＮＡ、真核生物（例えば、動物、植物、真核藻類、真菌、原虫）に由来するＤＮＡが挙げられる。
【００２０】
本発明の検出方法の一つの好ましい態様の例は、ウイルス感染の診断である。検出対象となる標的ＤＮＡが由来するウイルスとしては、特に制限はなく、ＤＮＡウイルスであっても、ＲＮＡウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスの場合には、逆転写を行うことにより、標的ＤＮＡとすることができる。具体的なウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ピコルナウイルス、カルシウイルス、トガウイルス、フラウイルス、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルス「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２」）、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブンガウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ビルナウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ジェミニウイルス、フィコドナウイルスなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２１】
本発明の検出方法の他の好ましい態様の例は、病原菌感染や原虫感染の診断である。検出対象となる標的ＤＮＡが由来する病原菌や原虫としては、例えば、赤痢菌、チフス菌、サルモネラ菌、病原性大腸菌、コレラ菌、ビブリオ属菌、カンピロバクター、ウェルシュ菌、セレウス菌、エルシニア、黄色ブドウ球菌、赤痢アメーバ、リーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ、トキソプラズマ、ランブリア、トリコモナス、バランチジウム、コクシジウムなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２２】
本発明の検出方法の他の好ましい態様の例は、遺伝子の変異や多型の診断である。例えば、ウイルス遺伝子の変異は、当該ウイルスの薬剤耐性などの指標として利用することができる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（以下、「ＰＡ遺伝子」と称する）のＩ３８Ｔ変異（ＡＴＡ→ＡＧＡ）およびＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のＰＡ遺伝子のＩ３８Ｔ変異（ＡＴＡ→ＡＣＡ）がゾフルーザに対する耐性に関連し、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のノイラミニダーゼ遺伝子（以下、「ＮＡ遺伝子」と称する）のＩ２２２Ｒ変異（ＡＴＡ→ＡＧＡ）、Ｈ２７４Ｙ変異（ＣＡＣ→ＴＡＣ）、Ｎ２９４Ｓ変異（ＡＡＣ→ＡＧＣ）、並びにＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のＮＡ遺伝子のＥ１１９Ｖ変異（ＧＡＡ→ＧＴＡ）、Ｒ２９２Ｋ変異（ＡＧＡ→ＡＡＡ）、Ｎ２９４Ｓ変異（ＡＡＣ→ＡＧＣ）がタミフルやリレンザに対する耐性に関連していることが知られている（Ｐｉｚｚｏｒｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１９  Ｍａｒｃｈ  １９，  ｄｏｉ．１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．００５３１）。従って、これらウイルス遺伝子の変異を本発明の方法で検出することにより、ウイルス治療薬に対する耐性を評価することができる。
【００２３】
また、ヒトなどの遺伝子の変異や多型（例えば、一塩基多型）は、例えば、疾患の発症リスク、薬剤の有効性や副作用などの指標として利用することができる。
【００２４】
本発明においては、試料中に標的ＤＮＡが１０１０コピー以上存在する場合、好適に検出することができるが（図８を参照のこと）、試料中のＤＮＡの増幅を行うことにより、当初の試料中に標的ＤＮＡが１コピー〜１０コピーしか含まれない場合であっても検出することができる（図９、１１、１２を参照のこと）。
【００２５】
試料中のＤＮＡの増幅は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムとの接触前に、または、接触中に実施することができる。また、ＤＮＡの増幅は、標的ＤＮＡ（あるいはその特定の領域）に特異的な増幅あるいは標的ＤＮＡ（あるいはその特定の領域）を偏重した増幅であってもよい。
【００２６】
ＤＮＡの増幅の手法は、当業者に公知であり、種々の方法を利用することができる。例えば、各種ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法など）、ＲＰＡ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、各種ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＲＡＭＰ法、定量ＬＡＭＰ法など）、ＨＤＡ（ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＥＡＲ（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＡＭ（Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２７】
−被検試料−
本発明の検出方法における試料としては、標的ＤＮＡの存在を検出したい所望の試料（以下、「被検試料」と称する）を用いることができる。被検試料としては、例えば、体液（尿、唾液、血清、血漿、全血など）、生体組織、細胞、細胞溶解物、精製もしくは合成したＤＮＡ、を含む試料が挙げられる。
【００２８】
ウイルス、病原菌、あるいは原虫の感染を診断する場合、被検試料は、例えば、これらの感染が疑われるヒト患者、動物、植物などに由来しうる。
【００２９】
被検試料の由来する動物としては、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。哺乳動物は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。非ヒト哺乳動物は、家畜またはコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。動物細胞には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。
【００３０】
被検試料の由来する植物としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類が挙げられ、具体的には、例えば、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられる。植物細胞には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、カルス、繁殖材料（例えば、種子、塊根、塊茎など）が含まれる。
【００３１】
−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム−
クラス１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、タイプＩおよびタイプＩＩＩに分類され、さらに、タイプＩは、カスケードを構成するタンパク質（以下、単に「カスケード」または「カスケードタンパク質」と称する。）の種類によって、タイプＩ−Ａ、タイプＩ−Ｂ、タイプＩ−Ｃ、タイプＩ−Ｄ、タイプＩ−Ｅ、およびタイプＩ−Ｆの６種類、並びにタイプＩ−ＢのサブタイプであるタイプＩ−Ｇに分類される（例えば、［ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｍ，  ２０１４  １２（７）：４７９−４９２］、［Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１４  ２４：１０６−１１４］を参照）。
【００３２】
タイプＩのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ３（ヌクレアーゼ活性およびヘリカーゼ活性を有するタンパク質）、カスケードおよびｃｒＲＮＡが協同することにより、ＤＮＡを切断する機能を有する。ヌクレアーゼとしてＣａｓ３を用いることから、本発明において「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム」と称する。
【００３３】
本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを用いることにより、例えば、次の利点が得られる。
【００３４】
まず、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムで使用されるｃｒＲＮＡは、一般的には、３２〜３７塩基の標的配列を認識する（Ｍｉｎｇ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１７  Ｍａｙ  ５；  ４５（８）：  ４６４２−４６５４）。これに対して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムで使用されるｃｒＲＮＡは、一般に１８〜２４塩基の標的配列を認識する。このため、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムよりも、より正確に標的配列を認識できると考えられる。
【００３５】
また、クラス２のタイプＩＩのシステムであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのＰＡＭ配列は、標的配列の３’側に隣接する「ＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）」である。また、クラス２のタイプＶのシステムであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１システムのＰＡＭ配列は、標的配列の５’側に隣接する「ＡＡ」である。これに対して、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムのＰＡＭ配列は、標的配列の５’側に隣接する「ＡＡＧ」またはそれに類似した塩基配列（例えば、「ＡＧＧ」、「ＧＡＧ」、「ＴＡＣ」、「ＡＴＧ」、「ＴＡＧ」等）である。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを用いれば、従来法では認識できなかったＤＮＡ領域を標的にすることが可能である。
【００３６】
本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、タイプＩの６種類のサブタイプのすべてを包含する。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを構成するタンパク質は、サブタイプにより、若干その構成などが異なる場合がある（例えば、カスケードを構成するタンパク質が異なる）が、本発明は、これらのタンパク質の全てを包含する。また、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、その由来する細菌の種類は問わない。
【００３７】
タイプＩのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの中でも一般的であるタイプＩ−ＥのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、ｃｒＲＮＡがＣａｓ３およびカスケード（Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７）と協同することにより、ＤＮＡを切断する。
【００３８】
タイプＩ−Ａのシステムでは、カスケードとしてＣａｓ８ａ１、Ｃｓａ５（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７を構成要素とし、タイプＩ−Ｂでは、カスケードとしてＣａｓ８ｂ１、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７を構成要素とし、タイプＩ−Ｃでは、カスケードとしてＣａｓ８ｃ、Ｃａｓ５、およびＣａｓ７を構成要素とし、タイプＩ−Ｄでは、カスケードとしてＣａｓ１０ｄ、Ｃｓｃ１（Ｃａｓ５）、Ｃａｓ６、およびＣｓｃ２（Ｃａｓ７）を構成要素とし、タイプＩ−Ｆでは、カスケードとしてＣｓｙ１（Ｃａｓ８ｆ）、Ｃｓｙ２（Ｃａｓ５）、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ３（Ｃａｓ７）を構成要素とし、タイプＩ−Ｇのシステムでは、カスケードとしてＣｓｔ１（Ｃａｓ８ａ１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｔ２（Ｃａｓ７）を構成要素とする。本発明においては、Ｃａｓ３およびカスケードを総称して「Ｃａｓタンパク質群」と称する。
【００３９】
以下、タイプＩ−ＥのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを代表例として説明するが、その他のタイプのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムについては、システムを構成するカスケードを、適宜、読み替えればよい。
【００４０】
−Ｃａｓタンパク質群、当該タンパク質群をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター−
本発明の検出方法において、Ｃａｓタンパク質群は、タンパク質の形態で、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態で、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形態で利用することができる。
【００４１】
本発明に用いられるＣａｓタンパク質群を構成する各タンパク質の一つの好ましい態様は、以下の野生型大腸菌のタンパク質である。
Ｃａｓ３；配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号７に記載の塩基配列によりコードされるタンパク質）
Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）；配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号８に記載の塩基配列によりコードされるタンパク質）
Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）；配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号９に記載の塩基配列によりコードされるタンパク質）
Ｃａｓ５；配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１０記載の塩基配列によりコードされるタンパク質）
Ｃａｓ６；配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１１に記載の塩基配列によりコードされるタンパク質）
Ｃａｓ７；配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１２に記載の塩基配列によりコードされるタンパク質）。
【００４２】
本発明に用いられるＣａｓタンパク質群を構成する各タンパク質の他の一つの好ましい態様は、上記各タンパク質のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。ここで「複数」とは、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは２０アミノ酸以内、特に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００４３】
本発明に用いられるＣａｓタンパク質群を構成する各タンパク質の他の一つの好ましい態様は、上記各タンパク質のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。高い同一性とは、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列の同一性である。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を利用して（例えば、デフォルト、すなわち初期設定のパラメータを用いて）決定することができる。
【００４４】
本発明に用いられるＣａｓタンパク質群を構成する各タンパク質の他の一つの好ましい態様は、上記各タンパク質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質である。
【００４５】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、２本のポリヌクレオチド鎖が、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドを形成するが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成しない条件をいう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、換言すれば、配列同一性が高い核酸同士（例えば完全にマッチしたハイブリッド）の融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、より好ましくは５℃低い温度までの温度範囲において、ハイブリダイズできる条件ともいえる。
【００４６】
ストリンジェントな条件の一例を示すと、以下の通りである。まず、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０〜６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１６〜２４時間、２種類のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。その後、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０〜６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１５分間の洗浄を２回行う。
【００４７】
他の例としては、以下の方法が挙げられる。まず、２５％ホルムアミド（より厳しい条件では５０％ホルムアミド）、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃にて、一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することにより、２種類のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う。
【００４８】
次に、次の条件のいずれかで洗浄を行う。通常の条件；１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを洗浄液として、３７℃程度で洗浄。厳しい条件；０．５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ洗浄液として、４２℃程度で洗浄。さらに厳しい条件；０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを洗浄液として、６５℃程度で洗浄。
【００４９】
このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。なお、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは、単なる例示に過ぎない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上述の要素、または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することができる。このことは、例えば、［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１］などに記載されている。
【００５０】
上記の各タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを構成する他の分子と複合体を形成して標的ＤＮＡを認識したときに、当該複合体に一本鎖ＤＮＡの非特異的な切断活性をもたらす（実施例を参照のこと）。
【００５１】
上記Ｃａｓタンパク質群を構成する各タンパク質には、必要に応じて、さらに機能的分子を付加してもよい。機能的分子としては、例えば、真核細胞の核内への移行を促進するための核移行シグナル、精製を容易にするためのタグ、検出を容易にするためのレポータータンパク質などが挙げられるが、これらに制限されない。これら機能的分子は、例えば、Ｃａｓタンパク質群を構成する各タンパク質のＮ末端側および／またはＣ末端側に付加することができる。
【００５２】
核移行シグナルとしては、例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１３）やＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号１４）などが挙げられる。タグとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などが挙げられる。また、レポータータンパク質としては、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどの化学発光タンパク質などが挙げられる。
【００５３】
本発明においては、Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドを利用することができ、その一つの好ましい態様は、以下である。
Ｃａｓ３；配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）；配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）；配列番号９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃａｓ５；配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃａｓ６；配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃａｓ７；配列番号１２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００５４】
これらは、大腸菌の野生型Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドであるが、目的に応じて、人工的に改変したポリヌクレオチドを利用することもできる。ポリヌクレオチドの人工的な改変としては、例えば、宿主細胞内あるいはインビトロ発現系での発現に適した塩基配列への改変（例えば、コドンの最適化）が挙げられる。
【００５５】
本発明においては、Ｃａｓタンパク質群を発現させるための発現ベクターを利用することができる。発現ベクターとしては、種々の公知のベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター（細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソームなど）、酵母染色体エレメントおよびウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、および、それらの組み合わせに由来するベクター（コスミド、ファージミドなど）が挙げられる。
【００５６】
発現ベクターは、さらに、転写開始および転写終結のための部位を含んでおり、かつ、転写領域中にリボソーム結合部位を含んでいることが好ましい。ベクター中の成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含む。
【００５７】
本発明において、Ｃａｓタンパク質群を発現させるための発現ベクターは、プロモーター配列を含んでいてよい。プロモーター配列は、遺伝子発現の場（例えば、宿主の種類）に応じて適宜選択すればよい。また、発現ベクターは、ＤＮＡからの転写を亢進させるための配列、例えば、エンハンサー配列を含んでいてよい。エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の下流の１００〜２７０ｂｐに配置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の下流に配置されるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、発現ベクターは、転写されたＲＮＡを安定化させるための配列、例えば、ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）を含んでいてよい。ポリＡ付加配列の例としては、成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列、ＳＶ４０ウイルス由来ポリＡ付加配列、ヒトまたはウサギのβグロビン遺伝子由来のポリＡ付加配列が挙げられる。
【００５８】
Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドは、１種類の（同一の）ベクターに搭載するという設計が可能であり、また、各Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの全てまたは一部を別々のベクターに搭載するという設計も可能である。例えば、カスケードタンパク質をコードするポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクターに搭載し、Ｃａｓ３をコードするポリヌクレオチドを別のベクターに搭載するという設計が可能である。
【００５９】
また、Ｃａｓタンパク質群をコードする複数の塩基配列を含んでおり、当該複数の塩基配列の間に、細胞内のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列（２Ａペプチドなど）をコードする塩基配列が挿入されている発現ベクターを用いてもよい。このような塩基配列を有するポリヌクレオチドが転写・翻訳されると、細胞内で一つに連結されたポリペプチド鎖が発現する。その後、細胞内プロテアーゼの作用により、Ｃａｓタンパク質群が分離され、個別のタンパク質となった後に複合体を形成し、機能する。これにより、発現するＣａｓタンパク質群の量比を調整することができる。
【００６０】
本発明に用いられる発現ベクターは、公知の手法によって作製することができる。このような手法としては、ベクター作製用のキットに付属する実施マニュアルに記載の手法に加え、種々の手引書に記載の手法が挙げられる。例えば、［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１］は、包括的な手引書である。
【００６１】
−ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター−
本発明に用いられるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、特定のＤＮＡへの標的化のために、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【００６２】
ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部を形成するＲＮＡであり、標的ＤＮＡ中の標的配列と相補的な塩基配列を有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、ｃｒＲＮＡにより、標的配列を特異的に認識してその配列を切断することを可能とする。
【００６３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの機能的な複合体を細胞内で形成させる場合においては、ｃｒＲＮＡとして、プレｃｒＲＮＡを用いることが好ましい（国際公開２０１８／２２５８５８号公報）。
【００６４】
プレｃｒＲＮＡは、典型的には、「リーダー配列−リピート配列−スペーサー配列−リピート配列（ＬＲＳＲ構造）」または「リピート配列−スペーサー配列−リピート配列（ＲＳＲ構造）」の構造を有する。リーダー配列は、ＡＴリッチな配列で、プレｃｒＲＮＡを発現させるプロモーターとして機能する。リピート配列は、スペーサー配列を介して反復している配列であり、スペーサー配列は、標的ＤＮＡ中の標的配列に相補的な配列として設計する配列である（本来は、アダプテーションの過程において取り込まれた、外来ＤＮＡ由来の配列である）。プレｃｒＲＮＡは、カスケードを構成するタンパク質（例えば、タイプＩ−Ａ、Ｂ、Ｄ〜ＥではＣａｓ６、タイプＩ−ＣではＣａｓ５）により切断されると成熟ｃｒＲＮＡとなる。
【００６５】
典型的には、リーダー配列の鎖長は、８６塩基、リピート配列の鎖長は、２９塩基である。スペーサー配列の鎖長は、例えば、１０〜６０塩基、好ましくは２０〜５０塩基、より好ましくは２５〜４０塩基、典型的には３２〜３７塩基である。従って、本発明において用いられるプレｃｒＲＮＡの鎖長は、ＬＲＳＲ構造の場合、例えば、１５４〜２０４塩基、好ましくは１６４〜１９４塩基、より好ましくは１６９〜１８４塩基、典型的には、１７６〜１８１塩基である。また、ＲＳＲ構造の場合、例えば、６８〜１１８塩基、好ましくは７８〜１０８塩基、より好ましくは８３〜９８塩基、典型的には、９０〜９５塩基である。
【００６６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの複合体を細胞内で形成させて機能させるためには、プレｃｒＲＮＡのリピート配列が、カスケードを構成するタンパク質により切断される過程が重要であると考えられる。従って、上記リピート配列は、このような切断が生じる限り、上記鎖長より短くても、長くてもよいことは理解されたい。すなわち、プレｃｒＲＮＡは、後述の成熟ｃｒＲＮＡの両端に、カスケードを構成するタンパク質による切断に十分な配列が付加されたｃｒＲＮＡと言うことができる。
【００６７】
一方、プレｃｒＲＮＡが切断されて生成する成熟ｃｒＲＮＡは、「５’ハンドル配列−スペーサー配列−３’ハンドル配列」の構造を有する。典型的には、５’ハンドル配列は、リピート配列の２２〜２９番目の８塩基からなりＣａｓ５にホールドされる。また、典型的には、３’ハンドル配列は、リピート配列の１〜２１番目の２１塩基からなり、６〜２１番目の塩基でステムループ構造を形成して、Ｃａｓ６にホールドされる。従って、成熟ｃｒＲＮＡの鎖長は、通常、６１〜６６塩基である。但し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムのタイプによっては、３’ハンドル配列をもたない成熟ｃｒＲＮＡもあることから、この場合には、鎖長は、２１塩基短くなる。
【００６８】
なお、ＲＮＡの配列は、標的配列に応じて適宜設計すればよい。また、ＲＮＡの合成は、当該分野で既知の任意の方法を用いて行うことができる。
【００６９】
−一本鎖プローブＤＮＡ−
本発明の検出方法に用いる一本鎖プローブＤＮＡは、その切断が検出可能なものであれば、特に制限はない。一本鎖プローブＤＮＡは、直鎖状であっても、環状であってもよいが、直鎖状であることが好ましい（図１を参照のこと）。一本鎖プローブＤＮＡを構成する核酸は、１つ以上の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾）が含まれていてもよい。
【００７０】
一本鎖プローブＤＮＡに結合される標識の一つの好ましい態様は、蛍光色素／クエンチャー対である。この態様においては、蛍光色素／クエンチャー対が一本鎖プローブＤＮＡに結合して接近している状態では、蛍光色素からのシグナルが低減または消滅しているが、一本鎖プローブＤＮＡが切断されて蛍光色素がクエンチャーと分離されると、蛍光色素からの十分なシグナルが検出される。従って、標的ＤＮＡを認識して結合したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムにより切断された一本鎖プローブＤＮＡから生じる蛍光シグナルを指標として、被検試料中の標的ＤＮＡを検出することができる。
【００７１】
蛍光色素およびクエンチャーの一本鎖プローブＤＮＡへの結合は、消光が生じるのに十分に両者が近接しており、かつ、一本鎖プローブＤＮＡが切断された場合に、両者が分離する限り、特に制限はないが、例えば、一本鎖プローブＤＮＡの一方の末端に蛍光色素を、他方の末端にクエンチャーを結合させることができる。プローブ内の消光作用を増大するために、追加のクエンチャーを結合させてもよい。この場合、一本鎖プローブＤＮＡの内部に追加のクエンチャー（内部クエンチャー）を結合させたダブルクエンチャープローブとすることができる。
【００７２】
蛍光色素／クエンチャー対に用いられる蛍光色素としては、例えば、ＡＴＴＯ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、テトラメチルローダミン（例えば、ＴＲＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テキサスレッド、ヤキマイエロー（Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ）などが挙げられ、クエンチャーの具体例としては、例えば、ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＢＨＱ（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＩＢＦＱ（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｋ  ＦＱ）、ＩＢＲＱ（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｋ  ＲＱ）、Ｅｃｌｉｐｓｅなどが挙げられるが、これらに制限されない。内部クエンチャーとしては、例えば、ＺＥＮやＴＡＯを好適に用いることができる。プローブＤＮＡの切断を検出するための蛍光色素／クエンチャー対の利用は、当業者に公知である（例えば、国際公開２０１９／１０４０５８号公報を参照のこと）。
【００７３】
一本鎖プローブＤＮＡに結合される標識の他の好ましい態様は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のためのドナー／アクセプター対である。この態様においては、ドナー／アクセプター対が一本鎖プローブＤＮＡに結合して接近している状態では、ドナーの励起がアクセプターの励起および発光を引き起こす（すなわち、ＦＲＥＴシグナルが生じる）が、一本鎖プローブＤＮＡが切断されてドナーとアクセプターが分離されると、ＦＲＥＴシグナルが低減または消滅する。従って、標的ＤＮＡを認識して結合したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムにより切断された一本鎖プローブＤＮＡにおけるＦＲＥＴシグナルの低減または消滅を指標として、被検試料中の標的ＤＮＡを検出することができる。
【００７４】
ＦＲＥＴのドナーおよびアクセプターの一本鎖プローブＤＮＡへの結合は、ＦＲＥＴが生じるのに十分に両者が近接しており、かつ、一本鎖プローブＤＮＡが切断された場合に両者が分離する限り、特に制限はないが、例えば、一本鎖プローブＤＮＡの一方の末端にドナーを、他方の末端にアクセプターを結合させることができる。
【００７５】
ＦＲＥＴのためのドナー／アクセプター対としては、例えば、ＢＦＰ／ｅＧＦＰ、ＢＦＰ／ＹＦＰ、ＢＦＰ／ＤｓＲｅｄ２、ＣＦＰ／ＹＦＰ、ＣＦＰ／ＤｓＲｅｄ２、ミドリイシシアン／クラビラオレンジ、ｅＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ、ｅＧＦＰ／Ｒｈｏｄ−２、ＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ／Ｒｈｏｄ−２、ＦＩＴＣ／Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ４８８／Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ４８８／Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ４８８／Ｃｙ３、ＹＦＰ／ＴＲＩＴＣ、ＹＦＰ／Ｃｙ３、Ｃｙ３／Ｃｙ５、Ｃｙ３／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／ＦＩＴＣ、ＩＡＥＤＡＮＳ／５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン、フルオレセイン／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ダンシル、トリプトファン／ダンシル、トリプトファン／ピレン、ダンシル／フルオレセイン、ナフタレン／ダンシル、ピレン／クマリン、フィコエリスリン／Ｃｙ５などが挙げられるが、これらに制限されない。プローブＤＮＡの切断を検出するためのドナー／アクセプター対の利用は、当業者に公知である（例えば、国際公開２０１９／１０４０５８号公報を参照のこと）。
【００７６】
また、一本鎖プローブＤＮＡを利用した本発明の検出方法は、イムノクロマトグラフィー（ラテラルフローアッセイ）に適用することができる。この態様においては、例えば、一本鎖プローブＤＮＡとして、第一のタグおよび第二のタグが結合したものを用い、タグが結合した一本鎖プローブＤＮＡを捕捉する標識体として、標識した第二のタグに対する抗体（以下、「標識抗体」と称する）を用いる。そして、イムノクロマトグラフィー用ストリップの第一のライン（ストリップの上流のライン）には、第一のタグへの結合分子を、第二のライン（ストリップの下流のライン）には、上記標識抗体への結合分子を固定しておく。
【００７７】
このイムノクロマトグラフィーにおいては、試料中に標的ＤＮＡが存在しない場合には、一本鎖プローブＤＮＡ（切断されていない）の第二のタグを介して、当該一本鎖プローブＤＮＡと標識抗体との複合体が形成され、当該複合体は、一本鎖プローブＤＮＡ（切断されていない）の第一のタグを介して、第一のラインに固定された第一のタグへの結合分子に捕捉され、第一のライン上で、標識抗体から生じるシグナルが検出される。
【００７８】
一方、試料中に標的ＤＮＡが存在する場合には、一本鎖プローブＤＮＡの切断により第一のタグと第二のタグが分離する。分離された第二のタグと標識抗体との複合体が形成され、当該複合体は、第二のラインに固定された当該標識抗体への結合分子によって第二のラインに捕捉され、第二のライン上で、標識抗体から生じるシグナルが検出される。第二のタグと標識抗体との複合体は、第一のタグを保持せず、第一のラインには捕捉されないため、第一のライン上では当該シグナルは検出されない。
【００７９】
第一のタグおよび第二のタグの一本鎖プローブＤＮＡへの結合は、一本鎖プローブＤＮＡが切断された場合に両タグが分離する限り、特に制限はないが、例えば、一本鎖プローブＤＮＡの一方の末端に第一のタグを、他方の末端に第二のタグを結合させることができる。
【００８０】
第一のタグおよびその結合分子としては、例えば、ストレプトアビジンとビオチンの組み合わせが挙げられ、第二のタグとしては、例えば、ＦＩＴＣが挙げられ、標識抗体における標識としては、例えば、金粒子が挙げられ、標識抗体への結合分子としては、例えば、プロテインＡや二次抗体（標識抗体に結合する抗体）が挙げられる。イムノクロマトグラフィーを利用した一本鎖プローブＤＮＡの切断の検出の原理は、当業者に公知である（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１８；  ３６０：４３９−４４４）。当該イムノクロマトグラフィーにおける試験紙には、市販品（例えば、ＨｙｂｒｉＤｅｔｅｃｔ（Ｍｉｌｅｎｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ社））を利用することもできる。
【００８１】
一本鎖プローブＤＮＡの切断の検出においては、上記以外の様々な手法を利用することができる（例えば、国際公開２０１９／１０４０５８号公報を参照のこと）。
【００８２】
−被検試料、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム、および一本鎖プローブＤＮＡの接触−
本発明の検出方法における、被検試料、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム、および一本鎖プローブＤＮＡの接触は、例えば、被検試料、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム、および一本鎖プローブＤＮＡの混合によって行うことができる。被検試料が細胞を含む場合には、被検試料中の細胞へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡの導入のための、さらなる操作を含むことができる。
【００８３】
被検試料とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムとの接触においては、ｃｒＲＮＡとＣａｓタンパク質群とを個別に調製して、それらを被検試料に接触させてもよく、また、ｃｒＲＮＡとＣａｓタンパク質群との複合体を予め調製して、当該複合体を、被検試料に接触させてもよい。被検試料中の細胞にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを導入する場合には、当該細胞内でｃｒＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質群を発現させてもよい。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを構成する分子をポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形態で細胞に導入する方法としては、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ウイルスベクターを用いた感染などの公知の方法を利用することができ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを構成する分子をタンパク質（あるいは、リボヌクレオタンパク質複合体）の形態で細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、カチオン性脂質媒介トランスフェクションなどの公知の方法を利用することができる。このような方法は、「Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ．  Ｄａｖｉｓｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９８６」など、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【００８５】
＜試料中の特定のＤＮＡを検出するためのキット＞
本発明における、試料中の特定のＤＮＡを検出するためのキットは、（ａ）特定のＤＮＡを標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システム、および（ｂ）一本鎖プローブＤＮＡ、を含む。本発明のキットの構成要素は、各々が独立している態様であっても、全てまたは一部が混合された態様であってもよい。
【００８６】
また、本発明のキットは、検出方法の態様に応じて、例えば、標準試料（各濃度）、対照試料、試料希釈液、反応緩衝液、洗浄液などを、さらに含んでいてもよい。また、一本鎖プローブＤＮＡにおける標識の種類に応じて、例えば、標識（例えば、タグ）に対する結合分子（例えば、タグに結合する標識抗体）、標識の検出に必要な試薬などを、さらに含んでいてもよい。本発明のキットは、さらに、使用説明書を含んでいてもよい。
【実施例】
【００８７】
実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８８】
Ａ．材料と方法
（１）Ｃａｓ３およびカスケードタンパク質の調製
本検出システムでは、大腸菌由来タイプＩ−Ｅ  ＣＲＩＳＰＲを利用した。Ｃａｓ３タンパク質は昆虫細胞Ｓｆ９を用いて精製した。Ｈｉｓタグ化した核移行シグナル（ｂｐＮＬＳ）付きＣａｓ３配列をバキュロウイルス遺伝子発現ベクターに組み込んだ後、大腸菌株ＤＨ１０ｂａｃを用いてバキュロウイルスを作成した。作成したバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９に感染させてＣａｓ３タンパク質を発現させた後、全タンパク質を回収し、ニッケルカラムおよびゲル濾過精製によりＣａｓ３タンパク質を精製した。ｃｒＲＮＡを含むＮＬＳ付きカスケード複合体の調製においては、Ｈｉｓタグ化したＣａｓ１１発現プラスミド（ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ１１発現プラスミド（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１）、標的ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１）の３種類を作成し、すべてを大腸菌ＢＬ２１に導入して発現させた。全タンパク質を回収後、ニッケルカラムおよびゲル濾過精製によりカスケード複合体を精製した。【００８９】
なお、標的配列は、ヒトＥＭＸ１遺伝子内配列（ＴＧＧＣＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＧＮＮＮＣＡＧＧＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＧ／配列番号：１５）およびマウスＴｙｒ遺伝子内配列（ＧＣＡＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＣＮＮＮＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＡ／配列番号：１６）とした。「ＮＮＮ」は、各実験で利用したＰＡＭ配列である。また、Ｃａｓタンパク質群の配列は、配列番号１〜１２に、核移行シグナル（ｂｐＮＬＳ）の配列は、配列番号１４に示した。【００９０】
（２）電気泳動による非特異的切断の測定
反応バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ）中に、Ｃａｓ３タンパク質（５ｎｇ／μＬ）、カスケード複合体（２５ｎｇ／μＬ）、標的配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片（２ｎｇ／μＬ）、および非特異的切断を確認するためのドナーＤＮＡ（４．５ｎｇ／μＬ）を混合した。この反応溶液を３７℃で１時間インキュベートし、キャピラリー電気泳動装置「ＭｕｌｔｉＮａ」（島津製作所）を用いて電気泳動を行った。二本鎖ＤＮＡ断片のＰＡＭ配列としては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが認識できる「ＡＡＧ」および「ＡＴＧ」に加え、認識できない「ＣＣＡ」を用い、それぞれ検討した。ドナーＤＮＡとしては、約１ｋｂの直鎖状一本鎖ＤＮＡ、約７ｋｂの環状一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡ）、および約３ｋｂの環状二本鎖ＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）を用い、それぞれＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる切断活性を検討した。【００９１】
（３）ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔＴＭを用いたヌクレアーゼ活性測定
非特異的切断を蛍光プローブで検出するため、ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔＴＭ  Ｋｉｔ（ＩＤＴ社）を用いて非特異的切断の測定を行った。反応バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ）中に、Ｃａｓ３タンパク質（２０ｎｇ／μＬ）、カスケード複合体（３２ｎｇ／μＬ）、標的配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片（２ｎｇ／μＬ）を混合した。ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔの基質チューブに５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒと１０×Ａｌｅｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて基質溶液を調製した後、試料２０μＬと基質溶液（蛍光プローブ溶液）５μＬを混合し、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて３７℃で３０秒ごとにＨＥＸシグナルの強度を経時観察した。【００９２】
（４）ＴａｑｍａｎＴＭプローブを用いたヌクレアーゼ活性測定
一本鎖ＤＮＡの蛍光プローブでも検出するため、ＴａｑｍａｎＴＭプローブ（配列情報：ＨＥＸ−ＡＡＧＧＴＣＧＧＡ−ＺＥＮ−ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣ−ＩＢＦＱ／配列番号：１７；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて非特異的切断の測定を行った。反応バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ）中に、Ｃａｓ３タンパク質（２０ｎｇ／μＬ）、カスケード複合体（３２ｎｇ／μＬ）、標的配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片（２ｎｇ／μＬ）を混合した。ＴａｑｍａｎＴＭプローブ０．５μＬを５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒと１０×Ａｌｅｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて調製した後、試料２０μＬと基質溶液５μＬを混合し、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、３７℃で３０秒ごとにＨＥＸシグナルの強度を経時観察した。【００９３】
（５）ＰＡＭ配列の標的特異性評価
二本鎖ＤＮＡ断片のＰＡＭ配列（３塩基）をすべての配列パターン（６４種類）に変更したものを調製し、（４）と同様にＴａｑｍａｎＴＭプローブを用いた非特異的切断活性を測定した。反応開始後１分間における蛍光シグナルの上昇速度を算出してその値を比較することで、ＰＡＭ配列の標的認識の差による活性強度を評価した。【００９４】
（６）検出限界濃度の測定
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ断片溶液における測定
二本鎖ＤＮＡ断片の濃度を段階希釈により調整し、（４）と同様にＴａｑｍａｎＴＭプローブを用いて各濃度における活性強度を測定した。また、希釈したＤＮＡ試料に対して、ＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃ  ｋｉｔ（ＴｗｉｓｔＤｘ社）を用いたＲＰＡ法を、３７℃で２０分間のインキュベートの条件で実施して、試料中のＤＮＡを増幅し、再度活性強度を測定した。【００９５】
（ｉｉ）ゲノム混合溶液における測定
二本鎖ＤＮＡ断片の濃度を段階希釈したＤＮＡ溶液に非特異的ＤＮＡとしてマウスゲノム２０ｎｇを混合したゲノム混合溶液を調製した後、ＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃ  ｋｉｔ（ＴｗｉｓｔＤｘ社）を用いたＲＰＡ法を、３７℃で２０分間のインキュベートの条件で実施して、試料中のＤＮＡを増幅し、（４）と同様にＴａｑｍａｎＴＭプローブを用いて各濃度における活性強度を測定した。【００９６】
（７）新型コロナウイルスＲＮＡの検出
新型コロナウイルス（ＳＡＳ−ＣｏＶ２）のＮ遺伝子を標的として、検出に用いるＳＡＲＳ特異的Ｃａｓｃａｄｅ複合体を調製した。新型コロナウイルスＲＮＡは、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞株を用いて増殖させたウイルスをＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製したものを用いた。ウイルスＲＮＡ溶液を段階希釈した後、ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＬＡＭＰ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社）を用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法を、６２℃で３０分間のインキュベートの条件で実施して、ウイルスゲノムを増幅した。反応バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、４００ｎＭ  Ｃａｓ３タンパク質、１００ｎＭ  カスケード複合体、２５０ｎＭ  ＴａｑｍａｎＴＭプローブ）１８μｌに、上記ウイルスゲノム増幅液２μｌを混合し、リアルタイムＰＣＲにより各濃度における活性強度を測定した。標的増幅に用いるプライマーセットは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ５（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｌａｍｐｖ５／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて設計した。【００９７】
なお、ウイルス特異的標的配列は、次の通りである。
ＳＡＲＳ−Ｎ１：ａａｇｇｃｃａａａｃｔｇｔｃａｃｔａａｇａａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇ／配列番号：１８
ＳＡＲＳ−Ｎ２：ａａｇｇａａｃｔｇａｔｔａｃａａａｃａｔｔｇｇｃｃｇｃａａａｔｔｇｃａ／配列番号：１９
また、ＲＴ−ＲＡＭＰ法に用いたプライマーは、次の通りである。【００９８】
＜ＳＡＲＳ−Ｎ１  ｓｅｔ＞
ＳＡＲＳ−Ｎ１−ＦＩＰ：ＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴ／配列番号：２０
ＳＡＲＳ−Ｎ１−ＢＩＰ：ＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＴＧＣ／配列番号：２１
ＳＡＲＳ−Ｎ１−Ｆ３：ＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧ／配列番号：２２
ＳＡＲＳ−Ｎ１−Ｂ３：ＧＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＴ／配列番号：２３
ＳＡＲＳ−Ｎ１−ＬＦ：ＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ／配列番号：２４
ＳＡＲＳ−Ｎ１−ＬＢ：ＧＧＣＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＡ／配列番号：２５。【００９９】
＜ＳＡＲＳ−Ｎ２  ｓｅｔ＞
ＳＡＲＳ−Ｎ２−ＦＩＰ：ＴＣＴＧＡＴＴＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＣＡＡＧＣ／配列番号：２６
ＳＡＲＳ−Ｎ２−ＢＩＰ：ＣＧＣＡＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＡＧ／配列番号：２７
ＳＡＲＳ−Ｎ２−Ｆ３：ＧＣＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＴＧＣＣＡＣ／配列番号：２８
ＳＡＲＳ−Ｎ２−Ｂ３：ＧＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＣＣ／配列番号：２９
ＳＡＲＳ−Ｎ２−ＬＦ：ＴＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＡ／配列番号：３０
ＳＡＲＳ−Ｎ２−ＬＢ：ＡＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＴ／配列番号：３１。【０１００】
（８）ラテラルフロー試験紙による検出
ラテラルフロー試験紙でシグナルを可視化するため、ＦＡＳＭＡＣ社に委託してＦＩＴＣとビオチンでラベル化したシグナルプローブ（ＦＩＴＣ−ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣ−ＢＩＯ／配列番号：３２）を合成した。反応バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、４００ｎＭ  Ｃａｓ３タンパク質、２００ｎＭ  カスケード複合体、１００ｎＭプローブ）１８μｌに、上記ウイルスゲノム増幅液２μｌを混合し、３７℃で１０分間、インキュベートした。水５０μｌを加えた後、反応バッファーに、ＨｙｂｒｉＤｅｔｅｃｔ（Ｍｉｌｅｎｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ社）の試験紙の一端（コントロールライン側）を浸し、室温で２分間静置した後、検出した。【０１０１】
（９）薬剤耐性変異インフルエンザウイルス配列の検出
薬剤耐性変異インフルエンザウイルスの一塩基変異を検出するため、バロキサビルマルボキシル製剤およびノイラミニダーゼ阻害薬の耐性変異部分に対して、ｃｒＲＮＡの標的配列を設計し、当該ｃｒＲＮＡを含むカスケード複合体を調製した。野生型配列および変異型配列を持つ二本鎖ＤＮＡ断片溶液（４０ｎｇ／μｌ）と反応バッファー（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、４００ｎＭ  Ｃａｓ３タンパク質、１００ｎＭ  カスケード複合体、２５０ｎＭ  ＴａｑｍａｎＴＭプローブ）の混合液２０μｌを調製し、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて活性強度を測定した。【０１０２】
なお、ｃｒＲＮＡ配列は、次の通りである。【０１０３】
＜ゾフルーザ耐性変異＞
野生型検出用；Ｈ１Ｎ１−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｉ３８：ＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＡＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＧＴ／配列番号：３３
野生型検出用；Ｈ３Ｎ２−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｉ３８：ＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣ／配列番号：３４。【０１０４】
＜タミフル耐性変異＞
変異型検出用；Ｈ１Ｎ１−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｉ２２２：ＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧ／配列番号：３５
変異型検出用；Ｈ１Ｎ１−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｈ２７４：ＴＡＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＴＴＧＡＴ／配列番号：３６
変異型検出用；Ｈ３Ｎ２−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｎ２９４：ＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＧＧＡＴＡ／配列番号：３７。【０１０５】
また、インフルエンザウイルスの薬剤耐性変異を検出するためのＤＮＡ断片配列は、次の通りである（アンダーラインは変異部位に対応する塩基を示す）。
Ｈ１Ｎ１−ＰＡ−Ｉ３８：ＧＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＡＴＴＴＣ／配列番号：３８
Ｈ１Ｎ１−ＰＡ−Ｉ３８Ｔ：ＧＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＡＴＴＴＣ／配列番号：３９
Ｈ３Ｎ２−ＰＡ−Ｉ３８：ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴ／配列番号：４０
Ｈ３Ｎ２−ＰＡ−Ｉ３８Ｔ：ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴ／配列番号：４１
Ｈ１Ｎ１−ＮＡ−Ｉ２２２：ＧＧＣＡＴＡＡＴＡＡＣＡＧＡＣＡＣＴＡＴＣＡＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧＧ／配列番号：４２
Ｈ１Ｎ１−ＮＡ−Ｉ２２２Ｒ：ＧＧＣＡＴＡＡＴＡＡＣＡＧＡＣＡＣＴＡＴＣＡＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧＧ／配列番号：４３
Ｈ１Ｎ１−ＮＡ−Ｈ２７４：ＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＴＴＡＴＣＡＣＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＴＧＡＡＡ／配列番号：４４
Ｈ１Ｎ１−ＮＡ−Ｈ２７４Ｙ：ＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＴＧＡＡＡ／配列番号：４５
Ｈ３Ｎ２−ＰＡ−Ｎ２９４：ＴＡＴＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＴＡＧＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴ／配列番号：４６
Ｈ３Ｎ２−ＰＡ−Ｎ２９４Ｓ：ＴＡＴＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＴＡＧＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴ／配列番号：４７。【０１０６】
Ｂ．結果
電気泳動による非特異的切断の測定の結果、Ｃａｓ３タンパク質単独、カスケード複合体単独、Ｃａｓ３タンパク質とカスケード複合体の組み合わせ、のいずれの場合でも、標的配列を含むＤＮＡ断片なしでは一本鎖ＤＮＡの切断活性は検出されなかった。一方、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが認識可能なＰＡＭ配列（ＡＡＧまたはＡＴＧ）および標的配列を含むＤＮＡ断片を混合させた場合、ドナー一本鎖ＤＮＡの分解が検出された（図１矢印）。一方、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが認識できないＰＡＭ配列（ＣＣＡ）に変更したＤＮＡ断片を混合した場合、ドナーＤＮＡの分解は検出されなかった。環状の一本鎖ＤＮＡを対象とした場合でも、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる切断活性が認められたが、直鎖状の一本鎖ＤＮＡを対象とした場合と比較して、切断活性は若干低かった。一方、二本鎖ＤＮＡをドナーＤＮＡとして用いた結果、標的配列を含むＤＮＡ断片存在下でもＤＮＡの分解は検出されなかった（図２矢印）。以上の結果から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、標的配列の存在下でのみ、非特異的な一本鎖ＤＮＡの切断活性を示すことが明らかになった。【０１０７】
次に、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの特徴を利用して、標的配列の有無を蛍光プローブ（ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔＴＭ；蛍光色素「ＨＥＸ」とクエンチャー「ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ」が各端に結合したプローブ）で検出できるか否かを検討した。ＤＮＡ分解（ＤＮａｓｅ）により蛍光を発する基質（蛍光プローブ）を混合して経時的に蛍光シグナルを計測した結果、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが認識可能なＰＡＭ配列（ＡＡＧまたはＡＴＧ）および標的配列を含むＤＮＡ断片を混合した場合のみ、蛍光シグナルが強く検出されることが明らかになった（図３）。標的配列をｍＴｙｒにした場合でも同様の結果が得られた（図４）。より正確に一本鎖ＤＮＡ分解を検出するため、蛍光プローブ（ＴａｑｍａｎＴＭプローブ；蛍光色素「ＨＥＸ」とクエンチャー「ＩＢＦＱ」が各端に結合し、内部クエンチャーとして「ＺＥＮ」が導入されたダブルクエンチャープローブ）を用いて検討した結果、同様に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが標的配列を認識できる場合にのみ、蛍光シグナルが検出されることが明らかになった（図５）。【０１０８】
さらに、標的ＤＮＡが一本鎖であっても、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性を示すか否かを確認するため、標的ＤＮＡとして一本鎖ＤＮＡ断片を用いた実験を行った。その結果、標的ＤＮＡが一本鎖（標的鎖）であっても、有意に非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性を示すことが明らかになった（図６）。【０１０９】
以上の結果から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが標的ＤＮＡ配列（一本鎖ＤＮＡであっても、二本鎖ＤＮＡであっもよい）を認識することで、周囲に存在する一本鎖ＤＮＡの非特異的な切断活性が誘導されることが判明した。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの当該活性は、蛍光プローブを用いることで簡便かつ効率的に判別することができることが判明した。【０１１０】
次に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの標的特異性の違いによる一本鎖ＤＮＡ切断活性の差を検討するため、標的二本鎖ＤＮＡ断片内のＰＡＭ配列を改変し、全てのＰＡＭ配列のパターンで当該活性の測定を行った。その結果、従来報告されているＰＡＭ配列（ＡＡＧやＡＴＧなど）では高い活性強度を示す一方、１塩基目もしくは２塩基目がＣの場合や３塩基目がＴの場合は、ほぼ活性を示さないことが明らかになった（図７）。ＰＡＭ配列上の１塩基の変化がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムによる非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性に影響を与えたことから、当該活性を指標として、１塩基レベルの特異性で試料中の標的ＤＮＡを検出できることが判明した。【０１１１】
次に、検出できる標的ＤＮＡの限界濃度を検討するため、標的ＤＮＡ断片を限界希釈して１コピーから１０１２コピーまで調整し、各濃度の標的ＤＮＡ断片における活性強度を測定した。その結果、１０１０コピー以上の標的ＤＮＡを用いた場合に有意なシグナルを検出することができた（図８）。Ｃａｓ１２ａやＣａｓ１３を利用した既存のシステムでも、１０１０コピー程度の検出感度を示すことが報告されており、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムが、これらと同等の検出感度を示すことが明らかになった。さらに、これらの希釈試料中のＤＮＡを、ＲＰＡ法を用いて増幅し、再度活性強度を測定した結果、当初、標的ＤＮＡが１コピーしか含まれない試料であっても、非特異的一本鎖ＤＮＡ切断活性が検出された（図９）。以上から、ＲＰＡ法などの簡便な遺伝子増幅法を組み合わせるだけで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムにより試料中の極微量（例えば、１コピー）の標的ＤＮＡを検出できることが明らかとなった。【０１１２】
また、非特異的なＤＮＡ配列が多数存在している状況での標的ＤＮＡの限界濃度を検討するため、標的ＤＮＡ断片を限界希釈したものにマウスゲノムＤＮＡを混合して、活性強度を測定した。その結果、図９と同様に、標的ＤＮＡが１コピーしか含まれない試料であっても検出することができた（図１１）。すなわち、ＲＰＡ法などの方法で標的ＤＮＡを増幅することにより、他のＤＮＡを含んだ状態でも１コピー以上の標的ＤＮＡを特異的に検出できることができることが明らかになった。【０１１３】
実際に新興感染症などのウイルス検出に利用できることを示すため、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）のＮ遺伝子に特異的なカスケード複合体を２種類（Ｎ１、Ｎ２）合成した。それぞれの領域についてＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施し、増幅したウイルスゲノムをＣａｓ３およびカスケード複合体タンパク質と混合した。その結果、Ｎ１は１コピー、Ｎ２は１０コピーのウイルスＲＮＡサンプルでシグナルを検出することができた。どちらも１０００コピー以上のウイルスが含まれるサンプルは１００％検出することができた（図１２）。【０１１４】
次に、新型コロナウイルスをラテラルフローアッセイ（図１３Ａ）で検出するため、ＲＴ−ＬＡＭＰ法により増幅したウイルスゲノムを、ＦＩＴＣとビオチンでラベル化したシグナルプローブ、Ｃａｓ３、およびＣａｓｃａｄｅ複合体タンパク質と混合し、当該反応系にラテラルフロー試験紙の一端（コントロールライン側）を浸した。その結果、反応時間に応じてラテラルフロー試験紙での陽性バンドのシグナルが強くなり、３７℃で１０分間反応させた段階で、十分にバンドの有無を判別できることが明らかとなった（図１３Ｂ）。【０１１５】
さらに、段階希釈したウイルスＲＮＡのサンプルに対してラテラルフローアッセイを行った結果、１００コピーサンプルを用いた場合、十分に判別できることが明らかになった（図１４）。【０１１６】
本実験のアッセイの概要を図１５にまとめた。以上の結果から、Ｃａｓｃａｄｅ複合体およびＣａｓ３タンパク質を用いることで、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）を簡便に検出できることが実証された。【０１１７】
次に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを用いて、バロキサビルマルボキシル製剤（ゾフルーザなど）およびノイラミニダーゼ阻害薬（タミフル、リレンザなど）に対する耐性インフルエンザウイルスが持つ一塩基変異を検出できるかを検討した。Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）のゾフルーザ耐性変異として知られているＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ）遺伝子のＩ３８Ｔについてそれぞれ検出した結果、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２ともに野生型配列で有意に強いシグナルを得ることに成功した（図１６）。【０１１８】
続いて、Ａ型インフルエンザウイルスのタミフルおよびリレンザ耐性変異として知られているノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子の変異（Ｈ１Ｎ１：Ｉ２２２ＲまたはＨ２７４Ｙ、Ｈ３Ｎ２：Ｎ２９４Ｓ）についてそれぞれ検出した結果、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２ともに変異型配列で有意に強いシグナルを得ることに成功した（図１７）。【０１１９】
以上から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムにおけるｃｒＲＮＡの標的配列を変異部位に対して設計することで、一塩基レベルの薬剤耐性変異を検出することに成功した。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムおよび一本鎖プローブＤＮＡを利用することにより、試料中の標的ＤＮＡを簡便かつ効率的に検出することが可能となる。本発明は、例えば、ウイルス、病原菌、原虫による感染の診断や、疾患リスクや薬剤有効性などに関連する遺伝子変異や多型の診断などに大きく貢献するものである。
【要約】
標的ＤＮＡを検出する試料とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムとを含む反応系に、その切断が検出可能な一本鎖プローブＤＮＡを混在させておくことにより、当該一本鎖プローブＤＮＡの切断により生じるシグナルを指標に、試料中の標的ＤＮＡを検出することが可能であることを見出した。【図１】
0006940086.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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