(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの単一の標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞とを単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞及び前記1つ以上のインデューサー細胞を含む、ステップと、
溶解試薬を含有する水溶液を、前記単分散エマルジョンマイクロ液滴に導入し、それによって、単離した細胞の溶解を誘導するステップと、
単離した細胞から放出されたRNAを、固体表面上に捕捉するステップと、
前記単一の標的細胞に由来する転写産物と連結した前記１つ以上のインデューサー細胞に由来する転写産物を含むハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップであって、前記ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、前記単一の標的細胞における転写の変化を示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、1つ以上のインデューサー細胞における転写の変化をさらに示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記1つ以上のインデューサー細胞における転写の変化が、遺伝子の転写産物の10倍未満の増加を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の標的細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数の標的細胞クローンのそれぞれの標的細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のインデューサー細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数のインデューサー細胞クローンのそれぞれのインデューサー細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記標的細胞クローンが、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入された外因性核酸配列により、遺伝学的に異なる、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記インデューサー細胞クローンが、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入された外因性核酸配列により、遺伝学的に異なる、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
RNA捕捉が、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用して行われ、それぞれのビーズが、10μm未満の直径を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイズしたポリ核酸が、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
ハイブリダイズしたポリ核酸が、第一鎖合成によって生成される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
第1の細胞型が、T細胞受容体を発現する細胞のライブラリーである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
第1の細胞型が、抗体を発現する細胞のライブラリーである、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
第1の細胞型が、ペプチド:MHCを発現する細胞のライブラリーである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
第1の細胞型が、ポリ核酸バーコードを発現する細胞のライブラリーである、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、マイクロ流体技術を使用して、エマルジョン中に単離される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞とを単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞及び前記1つ以上のインデューサー細胞を含む、ステップと、
単離した細胞から、RNAを単離するステップと、
第1のプローブ及び第2のプローブを含む組成物を使用して、前記単一の標的細胞に由来する転写産物と連結した前記1つ以上のインデューサー細胞に由来する転写産物を含むハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップと、
前記ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングするステップとを含み、
前記第1のプローブが、第2の細胞型のインデューサー細胞の転写産物に相補的な第1の部分配列と、第2のプローブの少なくとも一部に相補的な第2の部分配列とを含み、その転写産物が、第2の細胞型に固有であり、
前記第2のプローブが、第1の細胞型の標的細胞の異なる転写産物に相補的な第3の部分配列と、第1のプローブの少なくとも一部に相補的な第4の部分配列とを含み、異なる転写産物の量が、標的細胞をインデューサー細胞とともにインキュベートすると変化する、
方法。
【請求項１７】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、T細胞受容体をコードする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、抗体をコードする、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ペプチド:MHCをコードする、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ポリ核酸バーコードをコードする、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、組換えタンパク質をコードする、請求項16に記載の方法。
【請求項２２】
生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの単一の標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞と、第3の細胞型の複数の中間細胞クローンからの1つ以上の中間細胞とを単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞、前記1つ以上のインデューサー細胞、及び前記1つ以上の中間細胞を含むステップと、
溶解試薬を含有する水溶液を、前記単分散エマルジョンマイクロ液滴中に導入し、それによって、単離した細胞の溶解を誘導するステップと、
単離した細胞から放出されたRNAを、固体表面上に捕捉するステップと、
前記単一の標的細胞に由来する転写産物と連結した前記1つ以上の中間細胞に由来する転写産物を含むハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップであって、前記ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、単一の中間細胞における転写の変化を示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、1つ以上の中間細胞における転写の変化を示す、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記1つ以上の中間細胞における転写の変化が、遺伝子の転写産物の10倍未満の増加を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の標的細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数の標的細胞クローンのそれぞれの標的細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のインデューサー細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数の細胞クローンのそれぞれのインデューサー細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的細胞クローンが、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入された外因性核酸配列により、遺伝学的に異なる、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記インデューサー細胞クローンが、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入された外因性核酸配列により、遺伝学的に異なる、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
RNA捕捉が、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用して行われ、それぞれのビーズが、10μm未満の直径を有する、請求項22に記載の方法。
【請求項３０】
ハイブリダイズしたポリ核酸が、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される、請求項22に記載の方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズしたポリ核酸が、第一鎖合成によって生成される、請求項22に記載の方法。
【請求項３２】
第1の細胞型が、T細胞受容体を発現する細胞のライブラリーである、請求項22に記載の方法。
【請求項３３】
第1の細胞型が、抗体を発現する細胞のライブラリーである、請求項22に記載の方法。
【請求項３４】
第1の細胞型が、ペプチド:MHCを発現する細胞のライブラリーである、請求項22に記載の方法。
【請求項３５】
第1の細胞型が、ポリ核酸バーコードを発現する細胞のライブラリーである、請求項22に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が、マイクロ流体技術を使用して、エマルジョン中に単離される、請求項22に記載の方法。
【請求項３７】
細胞集団の機能性分析のための方法であって、請求項22のハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングすることを含む、方法。
【請求項３８】
生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの標的細胞、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞、及び第3の細胞型の複数の中間細胞クローンからの1つ以上の中間細胞を単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞、前記1つ以上のインデューサー細胞、及び前記1つ以上の中間細胞を含む、ステップと、
単離した細胞から、RNAを単離するステップと、
第1のプローブ及び第2のプローブを含む組成物を使用して、中間細胞に由来する転写産物と連結した前記インデューサー細胞に由来する転写産物を含むハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップと、
前記ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングするステップとを含み、
第1のプローブが、第2の細胞型のインデューサー細胞の転写産物に相補的な第1の部分配列と、第2のプローブの少なくとも一部に相補的な第2の部分配列とを含み、その転写産物が、第2の細胞型に固有であり、
第2のプローブが、第3の細胞型の中間細胞の異なる転写産物に相補的な第3の部分配列と、第1のプローブの少なくとも一部に相補的な第4の部分配列とを含み、異なる転写産物の量が、中間細胞をインデューサー細胞及び標的細胞とともにインキュベートすると変化する、
方法。
【請求項３９】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、T細胞受容体をコードする、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、抗体をコードする、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ペプチド:MHCをコードする、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ポリ核酸バーコードをコードする、請求項38に記載の方法。
【請求項４３】
前記第1の細胞型に固有の転写産物が、組換えタンパク質をコードする、請求項38〜42のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年3月13日に出願された米国仮出願第62/470,836号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、EFS-Webを通じて提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2018年3月13日に作成された前記ASCIIコピーは、39523WO_CRF_SequenceListingという名称であり、サイズが35,480バイトである。
【背景技術】
【０００３】
生体細胞は、極めて多様であり、非常に広範な種類の生物学的機能を有する。したがって、細胞の機能性分析は、ほぼすべての生物学的実験において基礎となる必要条件である。遺伝学的には均一な単一細胞集団であっても、不均一な生物学的機能を有するため、生物学的実験は、単一細胞レベルで行うのが最良である。しかしながら、単一細胞の機能性分析は、従来的な方法を使用した場合、困難であるか又は不可能である。
【０００４】
従来、「インデューサー細胞(inducer cells)」への曝露に応答した「標的細胞」の機能性分析は、組織培養プレート、たとえば、6ウェルプレート又は96ウェルプレートにおいて行われている。目的とされる標的細胞を、インデューサー細胞型とともにインキュベートし、次いで、タンパク質、転写産物、又は他の種類のバイオマーカーを評価することによって、標的細胞の応答を測定する。そのような方法は、通常、バルク集団に対して行われる、すなわち、インデューサー細胞に対する標的細胞の応答を判定するために、数百個、数千個、又は数百万個の標的細胞が、数百個、数千個、又は数百万個のインデューサー細胞とともにインキュベートされる。しかしながら、標的細胞集団及びインデューサー細胞集団は、本質的に、遺伝学的及び表現型的に多様である。区別がつかないゲノム配列を有する細胞であっても、エピジェネティックな違い、環境の違い、又は現時点では科学的に不明な理由のために、インデューサー細胞に対して異なって反応する可能性がある。
【０００５】
さらに、単一の標的細胞又はインデューサー細胞の機能性アッセイを行うのに十分に感度の高い方法は、利用可能ではなかった。典型的には、誘導された細胞と誘導されていない細胞との間の転写産物数の定量的差異は、たった2倍、5倍、又は10倍であり、そのため、感度の高い方法が必要とされる。同様に、数百万個の単一の標的細胞又はインデューサー細胞を並行してアッセイするのに十分に高スループットである方法も、利用可能ではなかった。さらに、機能性分析は、たとえば、2つの細胞型において転写産物を同時に測定し、シーケンシングすることによる、標的細胞及びインデューサー細胞の両方における転写産物の同時測定を必要とすることが多い。そのような高感度で高スループットのコンビナトリアルスクリーニング方法がないため、インデューサー細胞に曝露した単一の標的細胞の機能性応答、ましてや数百万個の単一の標的細胞又はインデューサー細胞の機能性応答を並行して理解することは、非常に困難となっている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、インデューサー細胞に対する標的細胞の応答を検出するための手法と組み合わせた、単一の標的細胞を、単一のインデューサー細胞又はインデューサー細胞集団とともに単離することができる、高スループットの技術に関する(図1)。一部の実施形態において、標的細胞及びインデューサー細胞は、さらに、誘導された細胞の一種である「中間」細胞とともにインキュベートされる。本発明は、誘導された細胞と誘導されていない細胞との間の転写産物数における、たった2倍、5倍、又は10倍の定量的差異を検出するための高感度な方法を提供する。本発明は、さらに、標的細胞及びインデューサー細胞の多様な集団を、数百万個の考えられる対の組合せで分析することができるような、コンビナトリアル測定を可能にする。本発明のいくつかの方法は、1つを上回る細胞型に由来するポリ核酸をつなぐか又は連結させることによって生成されるポリ核酸の定量化を伴う。本方法は、ウェルプレート法では可能ではなかった、単一細胞の機能性スクリーニングの新規な手法を提供する。本方法は、さらに、機能性読取り結果について、単一の標的細胞、中間細胞、又はインデューサー細胞における遺伝的差異までたどる性能を提供する。
【０００７】
本発明の一態様は、生体細胞の機能性分析のための方法であって、(1)単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの単一の標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞とを単離するステップと、(2)単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞及び前記1つ以上のインデューサー細胞を含む、ステップと、(3)溶解試薬を含有する水溶液を、前記単分散エマルジョンマイクロ液滴に導入し、それによって、単離した細胞の溶解を誘導するステップと、(4)単離した細胞から放出されたRNAを、固体表面上に捕捉するステップと、(5)単離した細胞に由来する転写産物を含む、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップであって、ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、前記単一の標的細胞における転写の変化を示す、ステップとを含む、方法に関する。
【０００８】
一部の実施形態において、前記ハイブリダイズしたポリ核酸は、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、1つ以上のインデューサー細胞における転写の変化をさらに示す。一部の実施形態において、1つ以上のインデューサー細胞における前記転写の変化は、遺伝子の転写産物の10倍未満の増加を含む。
【０００９】
一部の実施形態において、複数の標的細胞クローンは、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、ここで、複数の標的細胞クローンのそれぞれの標的細胞クローンは、互いに遺伝学的に異なる。一部の実施形態において、複数のインデューサー細胞クローンは、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、ここで、複数のインデューサー細胞クローンのそれぞれのインデューサー細胞クローンは、互いに遺伝学的に異なる。一部の実施形態において、標的細胞クローンの遺伝学的多様性は、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって作出される。一部の実施形態において、インデューサー細胞クローンの遺伝学的多様性は、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって作出される。
【００１０】
一部の実施形態において、RNA捕捉は、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用して行われ、それぞれのビーズは、10μm未満の直径を有する。
【００１１】
一部の実施形態において、ハイブリダイズしたポリ核酸は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される。一部の実施形態において、ハイブリダイズしたポリ核酸は、第一鎖合成によって生成される。
【００１２】
一部の実施形態において、第1の細胞型は、T細胞受容体を発現する細胞のライブラリーである。一部の実施形態において、第1の細胞型は、抗体を発現する細胞のライブラリーである。一部の実施形態において、第1の細胞型は、ペプチド:MHCを発現する細胞のライブラリーである。一部の実施形態において、第1の細胞型は、ポリ核酸バーコードを発現する細胞のライブラリーである。
【００１３】
一部の実施形態において、細胞は、マイクロ流体技術を使用して、エマルジョン中に単離される。
【００１４】
本発明の別の態様は、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを含む、組成物に関する。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも10,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも1,000,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む。
【００１５】
本発明の別の態様は、細胞集団の機能性分析のための方法であって、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングすることを含む、方法に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを含む組成物から生成される、組換えタンパク質のライブラリーを含む組成物に関する。一部の実施形態において、組換えタンパク質のライブラリーは、T細胞受容体を含む。一部の実施形態において、組換えタンパク質のライブラリーは、ペプチド:MHCを含む。一部の実施形態において、組換えタンパク質のライブラリーは、抗体を含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、第1のプローブ及び第2のプローブを含む、組成物であって、(1)第1のプローブが、第1の細胞型のインデューサー細胞の転写産物に相補的な第1の部分配列と、第2のプローブの少なくとも一部に相補的な第2の部分配列とを含み、転写産物が、第1の細胞型に固有であり、(2)第2のプローブが、第2の細胞型の標的細胞の異なる転写産物に相補的な第3の部分配列と、第1のプローブの少なくとも一部に相補的な第4の部分配列とを含み、異なる転写産物の量が、標的細胞をインデューサー細胞とともにインキュベートすると変化する、組成物に関する。
【００１８】
一部の実施形態において、前記第1の細胞型に固有の転写産物は、T細胞受容体をコードする。一部の実施形態において、前記第1の細胞型に固有の転写産物は、抗体をコードする。一部の実施形態において、前記第1の細胞型に固有の転写産物は、ペプチド:MHCをコードする。一部の実施形態において、前記第1の細胞型に固有の転写産物は、ポリ核酸バーコードをコードする。一部の実施形態において、前記第1の細胞型に固有の転写産物は、組換えタンパク質をコードする。
【００１９】
本発明の別の態様は、生体細胞の機能性分析のための方法であって、(1)単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞とを単離するステップと、(2)単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、単一の標的細胞及び1つ以上のインデューサー細胞を含む、ステップと、(3)単離した細胞からRNAを単離するステップと、(4)第1のプローブ及び第2のプローブを含む組成物を使用して、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップと、(5)ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングするステップとを含む、方法に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、生体細胞の機能性分析のための方法であって、(1)単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの単一の標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞と、第3の細胞型の複数の中間細胞クローンからの1つ以上の中間細胞とを単離するステップと、(2)単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、単一の標的細胞、1つ以上のインデューサー細胞、及び1つ以上の中間細胞を含むステップと、(3)溶解試薬を含有する水溶液を、前記単分散エマルジョンマイクロ液滴に導入し、それによって単離した細胞の溶解を誘導するステップと、(4)単離した細胞から放出されるRNAを、固体表面上に捕捉するステップと、(5)単離した細胞に由来する転写産物を含む、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップであって、ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、中間細胞における転写の変化を示す、ステップとを含む、方法に関する。
【００２１】
一部の実施形態において、前記ハイブリダイズしたポリ核酸は、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、1つ以上の中間細胞における転写の変化を示す。一部の実施形態において、1つ以上の中間細胞における前記転写の変化は、遺伝子の転写産物の10倍未満の増加を含む。
【００２２】
一部の実施形態において、複数の標的細胞クローンは、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、ここで、複数の標的細胞クローンのそれぞれの標的細胞クローンは、複数の細胞クローンのうちの他の細胞クローンとは遺伝学的に異なる。一部の実施形態において、複数のインデューサー細胞クローンは、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、ここで、複数のインデューサー細胞クローンのそれぞれのインデューサー細胞クローンは、複数の細胞クローンのうちの他の細胞クローンとは遺伝学的に異なる。
【００２３】
一部の実施形態において、標的細胞クローンの遺伝学的多様性は、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって作出される。一部の実施形態において、インデューサー細胞クローンの遺伝学的多様性は、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって作出される。
【００２４】
一部の実施形態において、RNA捕捉は、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用して行われ、ここで、それぞれのビーズは、10μm未満の直径を有する。
【００２５】
一部の実施形態において、溶解試薬は、界面活性剤である。
【００２６】
一部の実施形態において、ハイブリダイズしたポリ核酸は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される。一部の実施形態において、ハイブリダイズしたポリ核酸は、第一鎖合成によって生成される。
【００２７】
一部の実施形態において、第1の細胞型は、T細胞受容体を発現する細胞のライブラリーである。一部の実施形態において、第1の細胞型は、抗体を発現する細胞のライブラリーである。一部の実施形態において、第1の細胞型は、ペプチド:MHCを発現する細胞のライブラリーである。一部の実施形態において、第1の細胞型は、ポリ核酸バーコードを転写的に発現する細胞のライブラリーである。
【００２８】
一部の実施形態において、細胞は、マイクロ流体技術を使用して、エマルジョン中に単離される。
【００２９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法によって生成される、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを含む、組成物に関する。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも1,000個、10,000個、100,000個、又は1,000,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む。
【００３０】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法によって生成されるハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングすることによる、細胞集団の機能性分析のための方法に関する。
【００３１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法によって生成されるハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを含む組成物から生成される、組換えタンパク質のライブラリーを含む組成物に関する。一部の実施形態において、組換えタンパク質のライブラリーは、T細胞受容体を含む。一部の実施形態において、組換えタンパク質のライブラリーは、ペプチド:MHCを含む。一部の実施形態において、組換えタンパク質のライブラリーは、抗体を含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、第1のプローブ及び第2のプローブを含む、組成物であって、(1)第1のプローブが、第1の細胞型のインデューサー細胞の転写産物に相補的な第1の部分配列と、第2のプローブの少なくとも一部に相補的な第2の部分配列とを含み、転写産物が、第1の細胞型に固有であり、(2)第2のプローブが、第2の細胞型の中間細胞の異なる転写産物に相補的な第3の部分配列と、第1のプローブの少なくとも一部に相補的な第4の部分配列とを含み、異なる転写産物の量が、中間細胞をインデューサー細胞及び標的細胞とともにインキュベートすると変化する、組成物に関する。
【００３３】
一部の実施形態において、前記第1の細胞型に固有の転写産物は、T細胞受容体、抗体、ペプチド:MHC、ポリ核酸バーコード、又は組換えタンパク質をコードする。
【００３４】
本発明の別の態様は、生体細胞の機能性分析のための方法であって、(1)単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞と、第3の細胞型の複数の中間細胞クローンからの1つ以上の中間細胞とを単離するステップと、(2)単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、単一の標的細胞、1つ以上のインデューサー細胞、及び1つ以上の中間細胞を含む、ステップと、(3)単離した細胞からRNAを単離するステップと、(4)第1のプローブ及び第2のプローブを含む組成物を使用して、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップと、(5)ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングするステップとを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】単一細胞の並行した機能性分析のための本発明の方法を例示する作業フローを示す図である。
【図２】エマルジョンマイクロ液滴への細胞封入を示す図である。1.チャネル狭窄部。2.マイクロチャネルがエッチングされているガラス。3.細胞のインプット。4.溶解/RNA捕捉ビーズ混合物のインプット。5.油のインプット。6.エマルジョンマイクロ液滴。
【図３】細胞溶解のための液滴統合を示す図である。1.PDMSチップ材料。2.インプットチャネル。3.細胞混合物のインプット。4.溶解/ビーズ混合物の液滴。5.液滴融合のための広くなったチャネル。6.排出チャネル。7.電極。8.融合したマイクロ液滴。
【図４】1つがクローンインデューサー細胞で1つが標的細胞である、少なくとも2つの異なる単一細胞を示した、本発明の作業フロー図である。1.細胞混合物封入用エマルジョンマイクロ液滴チップ。2.クローンインデューサー細胞。3.標的細胞。4.クローンインデューサー細胞。5.標的細胞。6.エマルジョンマイクロ液滴内部の細胞培養培地。7.エマルジョンマイクロ液滴融合チップ。8.細胞混合物のエマルジョンマイクロ液滴。9.溶解/RNA捕捉ビーズの混合物のエマルジョンマイクロ液滴。10.クローンインデューサー細胞まで追跡可能な転写産物。11.転写産物をRNA捕捉ビーズに結合させるためのエマルジョンマイクロ液滴。12.インデューサー細胞によって誘導された、標的細胞由来の転写産物。13.OE-RT-PCR用エマルジョンマイクロ液滴チップ。14.RNA結合ビーズ/OE-RT-PCRミックスのインプット。15.RNA結合ビーズ/OE-RT-PCRミックスのインプット。16.クローンインデューサー細胞まで追跡可能な転写産物に由来するcDNAと、インデューサー細胞によって誘導された標的細胞由来の転写産物に由来するcDNAとの融合体を含む、アンプリコン。17.エマルジョンマイクロ液滴中のOE-RT-PCRミックス。
【図５】少なくとも3つの異なる単一細胞に由来する転写産物を、3つの細胞型、標的細胞、インデューサー細胞、及び中間細胞と関連付ける、作業フロー図である。1.細胞混合物封入用エマルジョンマイクロ液滴チップ。2.クローンインデューサー細胞。3.標的細胞及び中間細胞。4.クローンインデューサー細胞。5.中間細胞。6.標的細胞。7.エマルジョンマイクロ液滴内部の細胞培養培地。8.エマルジョンマイクロ液滴融合チップ。9.細胞混合物のエマルジョンマイクロ液滴。10.溶解/RNA捕捉ビーズの混合物のエマルジョンマイクロ液滴。11.クローンインデューサー細胞まで追跡可能な転写産物。12.転写産物をRNA捕捉ビーズに結合させるためのエマルジョンマイクロ液滴。13.インデューサー細胞によって誘導された、標的細胞由来の転写産物。14.OE-RT-PCR用エマルジョンマイクロ液滴チップ。15.RNA結合ビーズ/OE-RT-PCRミックスのインプット。16.RNA結合ビーズ/OE-RT-PCRミックスのインプット。17.クローンインデューサー細胞まで追跡可能な転写産物に由来するcDNAと、インデューサー細胞によって誘導された標的細胞由来の転写産物に由来するcDNAとの融合体を含む、アンプリコン。18.エマルジョンマイクロ液滴中のOE-RT-PCRミックス。
【図６】少なくとも2つの異なる単一細胞に由来する転写産物を、標的細胞及びインデューサー細胞と関連付ける、作業フロー図である。1.インデューサークローン細胞。2.標的細胞。3.インデューサークローン細胞の転写産物。4.標的細胞の転写産物(誘導された表現型、又は誘導された転写の変化を示すもの)。5.インデューサークローン細胞の転写産物のcDNA。6.OE-RT-PCRリンカー配列。7.標的細胞の転写産物(誘導された表現型、又は誘導された転写の変化を示すもの)のcDNA。8.OE-RT-PCRリンカー配列。9.OE-RT-PCRのメジャーアンプリコン又は連結したアンプリコン;標的細胞及びインデューサー細胞の転写産物のcDNAの融合産物。10.OE-RT-PCR融合産物アンプリコンのディープシーケンシング分析。11.OE-RT-PCR融合産物のアンプリコン配列の特定又は起源となるインデューサー細胞クローンへの追跡。
【図７】少なくとも3つの異なる単一細胞に由来する転写産物を、標的細胞、インデューサー細胞、及び中間細胞と関連付ける、作業フロー図である。1.インデューサークローン細胞。2.標的細胞。3.中間細胞。4.中間細胞に対するインデューサー細胞の作用(分子、たとえば、分泌された抗体を介する)。5.インデューサークローン細胞の転写産物。6.標的細胞の転写産物(誘導された表現型、又は誘導された転写の変化を示すもの)。7.インデューサークローン細胞の転写産物のcDNA。8.OE-RT-PCRリンカー配列。9.標的細胞の転写産物(誘導された表現型、又は誘導された転写の変化を示すもの)のcDNA。10.OE-RT-PCRリンカー配列。11.OE-RT-PCRのメジャーアンプリコン又は連結したアンプリコン;標的細胞及びインデューサー細胞の転写産物のcDNAの融合産物。12.OE-RT-PCR融合産物アンプリコンのディープシーケンシング分析。13.OE-RT-PCR融合産物のアンプリコン配列の特定又は起源となるインデューサー細胞クローンへの追跡。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
「含む」。少なくとも、一覧の構成要素からなる、すなわち、列挙されているすべての要素を包含するが、追加の明記されていない要素もまた含み得ること。
【００３７】
「細胞」。細胞は、すべての公知の生物の基礎となる構造的、機能的、及び生物学的な単位である。細胞は、独立して複製し得る、生命の最小単位である。
【００３８】
「トランスクリプトーム」。転写は、DNAの特定のセグメントが、RNAポリメラーゼ酵素によって、RNA(特に、mRNA)にコピーされて、「転写産物」が生じる、遺伝子発現の最初のステップである。これらの転写産物は、広範な機能を有し、特に、細胞内でのタンパク質の翻訳の基礎を提供することを含む。「トランスクリプトーム」は、単一細胞若しくは細胞集団に存在するRNA転写産物の完全なセットであるか、又は単一細胞若しくは細胞集団に存在するRNA転写産物の完全なセットを本質的に含む転写産物のサンプルである。
【００３９】
「転写の変化」。単一細胞又は細胞集団のトランスクリプトームの構成における変化である。前記転写の変化は、1、10、100、1,000、10,000、又は100,000個の転写産物における1つの変化を含み得る。本発明の一部の実施形態において、転写の変化は、単一細胞又は細胞集団の機能に変化をもたらす。本発明の一部の実施形態において、転写の変化は、外部刺激に応答して、誘導される。たとえば、T細胞がそのペプチド:MHC抗原標的に結合することにより、誘導された細胞による適応免疫機能をもたらすタンパク質を産生する、転写の変化が生じる可能性がある。本発明の一部の実施形態において、目的とされる転写産物は、上方制御されるか又は下方制御されるかのいずれかである。
【００４０】
「細胞表現型」。表現型又は「細胞型」は、細胞の観察可能な特徴又は形質、たとえば、その形態学、発達、生物化学的又は生理学的な特性、挙動、及び挙動の産物の複合物である。複雑な多細胞生物において、細胞は、特化して、特定の表現型に適合した様々な細胞型になる。紛らわしさを回避するために、表現型は、細胞の「機能」と同義であることが多いが、細胞の機能における変化は、必ずしも表現型における変化を必要とするものではない。哺乳動物において、主要な細胞表現型には、皮膚細胞、筋肉細胞、ニューロン、T細胞、B細胞、形質細胞、形質芽細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びその他が含まれる。細胞型は、外観及び機能の両方が異なる可能性があるが、遺伝学的には同一であってもよい。細胞は、同じ遺伝子型のものであり得る(すなわち、それらは、「クローン」である)が、細胞が含む遺伝子の差次的発現に起因して、異なる細胞型のものであってもよい。細胞表現型は、遺伝子及びタンパク質の発現が関与する複数の細胞プロセスの集合体であり、これにより、細胞の特定の形態学及び機能の精巧さがもたらされる。多くの種類の細胞、たとえば、免疫細胞は、外部又は内部での刺激に応答して、表現型の(すなわち、機能の)変化を受ける。たとえば、メモリーB細胞は、B細胞表面上のB細胞受容体に結合する抗原での刺激により、形質芽細胞へと成熟する。ある特定の実施形態において、細胞によって発現されるRNA又はタンパク質は、細胞の表現型を特定するためのバイオマーカーとして使用される。
【００４１】
「細胞クローン」。固有の遺伝子配列を有する細胞である。たとえば、T細胞受容体が共通している2つのT細胞は、1つの細胞クローンを構成する。他の実施形態において、外因性ポリ核酸バーコードが共通している2つの細胞は、1つの細胞クローンを構成する。細胞クローンは、細胞表現型が共通している場合もしていない場合もある。たとえば、CD4+T細胞は、CD8+T細胞とT細胞受容体配列が共通していてもよい。ある特定の実施形態において、細胞クローンは、同じ細胞型を含む。
【００４２】
「細胞集団」。複数又は単一のいずれかの細胞表現型を含む、細胞又は細胞クローンの群である。ある特定の実施形態において、細胞集団は、1つの細胞表現型の細胞クローンを10,000個含む。ある特定の実施形態において、細胞集団は、1つの細胞表現型の単一細胞を少なくとも10,000個含み、数千個の細胞クローンが、存在している。ある特定の実施形態において、細胞集団は、10、20、50、又は100個の異なる細胞型の単一細胞を10,000個含む。たとえば、腫瘍は、数百万個の細胞及び数ダースの細胞型を含む。細胞集団は、組換え細胞又は初代細胞を含み得る。
【００４３】
「機能性分析」。機能性分析は、古典的には、実験方法、たとえば、転写産物発現分析(たとえば、定量的PCR、DNAマイクロアレイ、RNAシーケンシング)、ゲノムシーケンシング若しくは遺伝子型判定(たとえば、免疫レパートリーシーケンシング、定量的PCR、全ゲノムショットガンシーケンシング)、タンパク質発現分析(たとえば、フローサイトメトリー、ELISA)、グリカンの測定(たとえば、質量分析)、又は細胞の機能の特徴である任意の分子の測定を通じた、細胞の機能(すなわち、表現型)の判定又は分類を伴う。細胞機能は、可塑性であり得る、すなわち、細胞表現型は、外部からの刺激に応答して変化し得るため、細胞機能の測定は、細胞機能の変化を介して、特定の生物学的機能を誘導する薬物又は分子をスクリーニングするのに特に有用である。紛らわしさを回避するために、機能性分析は、一般的に、表現型分析と同義であるが、細胞機能における変化は、必ずしも表現型における変化を必要とするものではない。
【００４４】
「ライブラリー」。少なくとも2つのポリ核酸、細胞クローン、分子、又はタンパク質のプールである。ある特定の実施形態において、ライブラリーは、生物学的に活性なタンパク質をスクリーニングするために使用される。他の実施形態において、細胞クローンのライブラリーを、薬物と混合し、次いで、生物学的アッセイを使用して、どの細胞クローンが薬物に対して応答性であるかが識別される。他の実施形態において、薬物のライブラリーを、単一細胞クローンと混合し、次いで、生物学的アッセイを使用して、どの薬物が細胞クローンにおいて応答を引き起こすかが識別される。ライブラリーは、ペプチド:MHC標的をコードするポリヌクレオチドライブラリー又はペプチド:MHCを発現するように操作された細胞のいずれかとして、100個、1,000個、10,000個、100,000個、又は100万個の異なるペプチド:MHC標的を含み得る。他の実施形態において、ライブラリーは、100個、1,000個、10,000個、100,000個、又は100万個のポリ核酸バーコード又はポリ核酸バーコードをRNAとして発現するように操作された(engineered)細胞を含む。
【００４５】
「コンビナトリアル」。細胞、タンパク質、ポリ核酸、又は他の種類の分子のライブラリーの組合せに関連する。コンビナトリアル機能性分析は、そのようなライブラリー由来の構成要素のランダムなコンビナトリアル対の機能を判定することを伴う。ライブラリーの構成要素が、ランダムにペアリングされるため、可能な組合せの数は、第1のライブラリーのサイズに第2のライブラリーのサイズを掛けたものである。たとえば、クローン100個のライブラリーを、クローン1,000個のライブラリーに対してコンビナトリアルでスクリーニングすると、理論上の組合せが100,000個得られる。コンビナトリアル機能性分析は、目的とされる細胞機能を誘導する新規な分子又は細胞相互作用を発見するのに有用である。本発明のある特定の実施形態において、細胞クローンの遺伝学的に多様なライブラリーを、細胞クローンの別の多様な(たとえば、クローン100個、1,000個、10,000個、100,000個、又は100万個の)ライブラリーに対してコンビナトリアルでスクリーニングする。本発明のある特定の実施形態において、細胞クローンの多様なライブラリーを、細胞クローンのオリゴクローナルな(たとえば、10個よりも少ない)ライブラリーに対して組み合わせで(combinatorially)スクリーニングする。
【００４６】
「ポリ核酸」。ポリ核酸は、典型的には5個、10個、20個、50個、100個、1,000個、10,000個、又はそれ以上の塩基対を含む、RNA又はDNAの二本鎖又は一本鎖分子である。ポリ核酸は、合成であってもよい、すなわち、個々のヌクレオチドから化学的に製造し、増幅、すなわち、ポリメラーゼを使用して鋳型核酸から酵素的に生成されたか、又は生物学的系から精製されたもの、すなわち、細胞若しくは他の生物学的材料から抽出されたものであってもよい。生体細胞に由来するか又は生体細胞において検出されるポリ核酸は、細胞間又は細胞集団間の機能的差異を示す、「バイオマーカー」としての機能を果たすことが多い。ポリ核酸は、当業者に熟知されている多くの下位分類を有する。相補的DNA又はcDNAは、酵素、たとえば、逆転写酵素を使用してRNA鋳型からcDNAを作製することによって合成される、DNAである。「オリゴヌクレオチド」は、短い(6〜100ヌクレオチドの)一本鎖DNA又はRNA配列であり、典型的には、商業的供給業者、たとえば、IDT DNA又はThermoFisherによって合成で製造される。
【００４７】
「可変性免疫受容体」。可変性免疫受容体は、細胞ごと又は個人ごとに異なる、任意の糖タンパク質又は糖タンパク質複合体である。可変性免疫受容体は、侵襲性(又は病原性)の細胞、ウイルス、細菌、又は他の生物学的材料を特定するために必要とされる、極めて重要な自然免疫及び適応免疫多様性を構成している。ある特定の実施形態において、免疫受容体は、適応免疫系、たとえば、抗体又はT細胞受容体を含む。ほとんどの大人のヒトは、数十億個の異なるT細胞又はB細胞において、数十億個のそのような可変性受容体を発現する。他の実施形態において、免疫受容体は、個体ごとに変化する免疫系構成要素、たとえば、MHC又はキラー細胞免疫グロブリン様(KIR)受容体を含む。
【００４８】
「T細胞受容体」。T細胞受容体すなわちTCRは、T細胞又はTリンパ球の表面上に見出される分子であり、主要組織適合複合体(MHC)分子に結合したペプチドとして抗原のフラグメントを認識することを担う。TCRは、不変性CD3鎖分子との複合体の一部として発現される、通常は高度に可変性のアルファ(α)鎖及びベータ(β)鎖からなる、ジスルフィド結合した膜結合型ヘテロ二量体タンパク質である。この受容体を発現するT細胞は、α/β(又はαβ)T細胞と称されるが、T細胞のごく一部は、可変性ガンマ(γ)鎖及びデルタ(δ)鎖によって形成される、γδT細胞と称される代替的な受容体を発現する。それぞれの鎖は、可変(V)領域及び定常(C)領域という2つの細胞外ドメインから構成され、いずれも、逆平行ベータシートを形成する免疫グロブリンスーパーファミリードメインである。定常領域は、細胞膜の近傍にあり、これに続いて膜貫通領域及び短い細胞質側尾部があり、一方で、可変領域は、ペプチド:MHC複合体に結合する。TCRのα鎖及びβ鎖の両方の可変ドメインは、それぞれが、3つの超可変領域又は相補性決定領域(CDR)を有するが、一方で、β鎖の可変領域は、通常は抗原と接触しないためCDRとは考えられていない追加の超可変領域(HV4)を含む。その残基は、TCRの2つの領域、α鎖及びβ鎖の境界部、並びにCD3シグナル伝達複合体の近傍にあると考えられているβ鎖フレームワーク領域に位置している。CDR3が、プロセシングされた抗原の認識を担う主要なCDRであるが、アルファ鎖のCDR1もまた、抗原性ペプチドのN末端部分と相互作用することが示されており、一方で、β鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用する。CDR2は、MHCを認識すると考えられている。β鎖のCDR4は、抗原認識に関与するとは考えられていないが、スーパー抗原と相互作用することが示されている。TCRドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列からなり、これにより、2つの鎖間の連結が形成される。それぞれの再構成されたTCRは、αβT細胞の場合にはα鎖及びβ鎖、又はγδT細胞の場合にはγ鎖及びδ鎖によって形成される抗原結合性部位の構造によって決定される、固有の抗原特異性を有する。これは、主として、個々の体細胞T細胞におけるDNAコード化セグメントの遺伝子組換え、すなわち、RAG1及びRAG2組換え酵素を使用した体細胞V(D)J組換え、又はシチジンデアミナーゼを使用した遺伝子変換のいずれかに基づく。これらの特定の領域(アルファ鎖又はガンマ鎖についてはV及びJ;ベータ鎖又はデルタ鎖についてはV、D、及びJ)の交点が、ペプチド:MHC認識にとって重要なCDR3領域である。紛らわしさを回避するために、「TCR」という用語は、本開示全体を通じて、すべての種類の可能性のある組換え誘導体形式を総称するものであり、適応免疫系を有する任意の動物、たとえば、ヒト、マウス、ラクダ、ウシ、鳥、又は魚に由来し得る。TCRは、たとえば、CD3又はFcタンパク質ドメインを有するキメラを操作することによって、操作して可溶性形態にすることができる。これらの可溶性TCRは、次いで、疾患、たとえば、がんに関連する分子標的を活性化又はアンタゴナイズすることによって、薬物として作用する。
【００４９】
「T細胞」。T細胞は、胸腺によって産生又はプロセシングされる、免疫応答に能動的に関与する種類のリンパ球である。T細胞は、細胞媒介性免疫において中枢的な役割を果たす。T細胞は、細胞表面上のT細胞受容体の存在によって、他のリンパ球、たとえば、B細胞及びナチュラルキラー細胞と区別することができる。T細胞の複数のサブセットは、それぞれ、異なる機能を有する。ヘルパーT細胞(TH細胞)は、B細胞の形質細胞及びメモリーB細胞への成熟、並びに細胞毒性T細胞及びマクロファージの活性化を含め、免疫学的プロセスにおいて、他の白血球を補助する。これらの細胞はまた、CD4糖タンパク質を細胞表面上に発現するため、CD4+T細胞としても知られている。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面上に発現されるMHCクラスII分子によって、ペプチド抗原が提示されると、活性化される。ヘルパーT細胞は、活性化されると、急速に分裂し、能動的免疫応答を制御又は補助するサイトカインと称される小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、TH1、TH2、TH3、TH17、TH9、又はTFHを含む、複数のサブタイプのうちの1つに分化し得、これらは、異なる種類の免疫応答を促進する異なるサイトカインを分泌する。APCからのシグナル伝達により、T細胞は、特定のサブタイプへと指向される。細胞毒性T細胞(TC細胞、CTL、Tキラー細胞、キラーT細胞)は、ウイルスに感染した細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関係している。これらの細胞はまた、CD8糖タンパク質を細胞表面上に発現するため、CD8+T細胞としても知られている。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面上に存在するMHCクラスI分子と会合した抗原に結合することによって、その標的を認識する。IL-10、アデノシン、及び制御性T細胞によって分泌される他の分子を通じて、CD8+細胞は、不活性化されて免疫不応性状態となり得、これにより、自己免疫疾患が予防される。メモリーT細胞は、感染が解消された後に長期間存続する、抗原特異的T細胞のサブセットである。それらは、コグネイト抗原に再び曝露されると急速に増殖して多数のエフェクターT細胞となり、したがって、過去の感染に対する「記憶」を免疫系に提供する。制御性T細胞(サプレッサーT細胞)は、免疫寛容の維持にとって非常に重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終盤にT細胞に媒介される免疫を停止させること、及び胸腺における負の選択のプロセスをすり抜けた自己反応性T細胞を抑制することである。制御性機能に起因して、サプレッサーT細胞とヘルパーT細胞とを合わせて、集合的に制御性T細胞と称することができる。FOXP3+Treg細胞及びFOXP3-Treg細胞という2つの主要なクラスのCD4+Treg細胞が、説明されている。ヒトT細胞の大半は、細胞受容体上にそれらのアルファ鎖及びベータ鎖を再編成し、アルファベータT細胞(abT細胞)と称され、適応免疫系の一部である。特化したガンマデルタT細胞(ヒトの身体におけるごくわずかなT細胞、反芻動物においてはより頻度が高い)は、限られた多様性を有する不変性T細胞受容体を有し、他のT細胞に抗原を効率的に提示することができ、自然免疫系の一部であると考えられている。TCR発現をもたらす遺伝子再編成及び変異により、T細胞「クローン」が産生される。TCRが、抗原性ペプチド及びMHC(ペプチド:MHC)に結合すると、Tリンパ球が、シグナル伝達、すなわち、関連する酵素、共受容体、特化したアダプター分子、及び活性化若しくは放出された転写因子によって媒介される一連の生物化学的事象を通じて活性化される。不死化細胞株、たとえば、Jurkat細胞株は、T細胞の機能を研究するために実験的に使用されることが多い。本発明の一部の実施形態において、Jurkatによって発現されるTCRabは、ノックアウトされているか、又は脱活性化されており、組換えTCRabは、ゲノムに導入されるか、発現構築物を通じて一過的に発現される。T細胞は、たとえば、レンチウイルス形質導入を通じて、組換えTCR構築物を導入することによって、「細胞治療薬」に操作される。T細胞治療薬は、同種又は自家であり、がん及び他の種類の重篤な疾患を処置するために使用される。操作されたTCRは、したがって、T細胞を介して作用する一種の薬物である。
【００５０】
「抗原」。抗体又はT細胞受容体のコグネイトペアの他方のメンバーである。ある特定の実施形態において、抗体又はT細胞受容体は、単一の抗原に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体又はT細胞受容体は、複数の抗原に結合する。抗体は、典型的には、天然の構成でタンパク質又は糖タンパク質に結合するが、一方で、T細胞受容体は、プロセシングされたペプチド抗原がMHCによって抗原提示細胞の表面上に提示されることを必要とする。ある特定の実施形態において、抗原は、可溶性であるが、一方で他の実施形態において、抗原は、細胞の表面上につながれている。
【００５１】
「抗原提示細胞」。抗原提示細胞(APC)は、その細胞膜上に抗原ペプチドを提示する。抗原ペプチドは、APC内でのタンパク質分解によるプロセシングの産物である。抗原性ペプチドは、次いで、APCの細胞膜上の主要組織適合複合体(MHC)タンパク質に結合される。結合した複合体は、ペプチド:MHC複合体としても知られている。T細胞受容体は、抗原ペプチドに直接結合するのではなく、代わりに、ペプチド:MHC複合体を必要とする。一部の実施形態において、ペプチドは、APCによって発現される全タンパク質に由来する。他の実施形態において、ペプチドは、ウイルスタンパク質に由来し、ウイルス由来のペプチドの提示は、ウイルスに感染した細胞の特徴である。ある特定の実施形態において、全タンパク質、部分的タンパク質、又はポリペプチドをコードする少なくとも1つのプラスミドが、細胞に導入され、プラスミドが、APCの表面上での組換えペプチド:MHCの発現を作動させる。ある特定の実施形態において、APCを、ペプチド、ペプチド混合物、又はタンパク質とともにインキュベートすると、APC膜表面上にペプチド:MHCが得られる。ある特定の実施形態において、細胞アッセイは、APCを用いて行われる。ある特定の実施形態において、細胞アッセイは、不死化細胞株(たとえば、T2細胞)又は初代細胞(たとえば、B細胞)であるAPCを用いて行われる。
【００５２】
「抗体」。免疫グロブリン(Ig)としても知られている、抗体(Ab)は、病原体、たとえば、細菌及びウイルスを中和するために免疫系によって使用される、主として形質細胞によって産生される、大きなY字型のタンパク質である。抗体は、抗原と称される、有害な作用物質の固有の分子を、Fab'の可変領域を通じて認識する。抗体の「Y」のそれぞれの先端には、抗原上の1つの特定のエピトープ(鍵と類似)に特異的なパラトープ(同様に、ロックと類似)が含まれ、これらの2つの構造体が、高い精度で一つに結合することが可能となっている。これらの結合機序を使用して、抗体は、免疫系の他の部分による攻撃のために、微生物若しくは感染した細胞にタグを付けることができるか、又はその標的を直接的に中和することができる(たとえば、微生物の侵入及び生存に必須である微生物の一部を遮断することによって)。抗原に応じて、結合は、疾患を引き起こす生物学的プロセスを妨害することができるか、又は外来物質を破壊するためにマクロファージを活性化することができる。抗体が、免疫系の他の構成要素と通信する能力は、抗体のFc領域(「Y」字の基部に位置する)によって媒介され、これは、これらの相互作用に関与する保存されたグリコシル化部位を含む。抗体の産生は、液性免疫系の主要な機能である。抗体は、血漿中で遊離した状態となる細胞から分泌される可溶性形態、及びB細胞の表面に結合しており、B細胞受容体(BCR)と称される膜結合型形態の2つの物理的な形態で生じ得る。BCRは、B細胞の表面上にのみ見出され、これらの細胞の活性化、及びそれに続く、形質細胞と称される抗体工場(antibody factories)又はメモリーB細胞のいずれかへの分化を促進するが、メモリーB細胞は、体内で生存し、その同じ抗原を記憶しているため、B細胞が将来的な曝露の際により迅速に応答することができる。ほとんどの事例において、B細胞の完全な活性化、及び、したがって抗原結合後の抗体産生をもたらすためには、B細胞とヘルパーT細胞との相互作用が必要である。可溶性抗体は、血液及び組織液、並びに多数の分泌液中に放出されて、侵入している微生物を調査し続ける。それらは、典型的には、それぞれが、2つの大きな重鎖及び2つの小さな軽鎖を有する、基本的な構造単位から作製される。抗原結合性フラグメントに結合され得る、5つの異なる種類の結晶性フラグメント(Fc)を定める、異なる種類の抗体重鎖が複数存在する。5つの異なる種類のFc領域により、抗体は、5つのアイソタイプに分類することが可能である。特定の抗体アイソタイプのそれぞれのFc領域は、その特定のFc受容体に結合することができ(本質的にBCRであるIgDを除く)、したがって、抗原-抗体複合体が、どのFcRに結合するかに応じて、異なる役割を媒介することが可能である。抗体が、その対応するFcRに結合する能力は、さらに、そのFc領域内の保存された部位に提示されるグリカンの構造によって調節される。抗体がFcRに結合する能力は、それらが遭遇する異なる種類の外来物ごとに適切な免疫応答を指示するのに役立つ。すべての抗体の一般的な構造は非常に類似しているが、タンパク質の先端部の小さな領域は、極めて可変性であり、わずかに異なる先端構造又は抗原結合性部位を有する数百万個の抗体が存在することが可能となっている。この領域は、超��変領域として知られている。これらのバリアントのそれぞれは、異なる抗原に結合することができる。抗原結合性フラグメント上の抗体パラトープのこの膨大な多様性により、免疫系は、同等に広範な種類の抗原を認識することが可能である。大きくて多様な抗体パラトープ集団は、異なる抗原結合性部位(又はパラトープ)をコードする遺伝子セグメントのセットのランダムな組換え事象、続いて、抗体遺伝子のこの範囲内でのランダムな変異によりさらなる多様性をもたらすことによって、生成される。クローナル抗体パラトープ多様性をもたらすこのリコンビナトリアルプロセスは、V(D)J又はVJ再編成と称される。基本的には、抗体のパラトープは、多遺伝子性であり、V、D、及びJの3つの遺伝子で構成されている。それぞれのパラトープの遺伝子座はまた、抗体産生中に、Vの1つのアレル、Dの1つ、及びJの1つが選択されるように、多型性である。これらの遺伝子セグメントが、次いで、ランダムな遺伝子再編成を使用して一つに結合されて、パラトープが産生される。遺伝子が一つにランダムに再編成されている領域は、クローンを基準として、異なる抗原を認識するために使用される超可変領域である。可溶性抗体は、治療薬、たとえば、リツキシマブ、アダリムマブ、ペンブロリズマブ、又はトラスツズマブとして、広く使用されている。抗体は、重鎖及び軽鎖がペプチドリンカーを介して単一のタンパク質として一つに融合されたものを含む、一本鎖可変フラグメント(scFv)として、再構成される場合がある。一部の状況において、scFvは、キメラ抗原受容体(CAR)として再構成され、次いで、これを、T細胞に操作して、CAR-Tと称される細胞治療薬が作製される。紛らわしさを回避するために、「抗体」という用語は、本開示全体を通じて、すべての種類の可能性のある組換え誘導体形式を総称するものであり、適応免疫系を有する任意の動物、たとえば、ヒト、マウス、ラクダ、ウシ、鳥、又は魚に由来し得る。
【００５３】
「ナチュラルキラー細胞」。ナチュラルキラー細胞(NK細胞、K細胞、及びキラー細胞としても知られる)は、リンパ球(白血球)の一種であり、自然免疫系の構成要素である。NK細胞は、腫瘍及びウイルス感染細胞の両方の宿主拒絶において主な役割を果たす。典型的には、免疫細胞は、感染した細胞の表面上に提示された主要組織適合複合体(MHC)を検出し、サイトカイン放出をトリガーし、溶解又はアポトーシスを引き起こす。NK細胞は、固有であるが、しかしながら、抗体及びMHCの不在下において、ストレスを受けている細胞を認識する能力を有するため、より迅速な免疫反応が可能となっている。NK細胞は、MHCクラス1の「自己」マーカーを欠如している細胞を殺滅するために、活性化を必要としないという初期の概念のため、「ナチュラルキラー」と命名された。MHC Iマーカーを欠如している有害な細胞は、他の免疫細胞、たとえば、Tリンパ球によって検出及び破壊することができないため、この役割は特に重要である。NK細胞はまた、可溶性抗体が標的細胞の表面上の抗原に結合することで開始される、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)と称される機序によっても細胞を殺滅させる。抗原に結合する抗体を、NK細胞上に発現されるFcgRIII(CD16)受容体によって認識することができ、NK活性化、細胞溶解性粒子の放出、及び結果として生じる細胞のアポトーシスをもたらすことができる。これが、リツキシマブ、オファツムマブ、及びその他などのいくつかのモノクローナル抗体の主要な細胞殺滅機序である。ある特定の実施形態において、NK-92細胞株などの細胞株が、初代NK細胞の代わりに使用される。
【００５４】
「標的」。薬理学的機能を誘導するために、薬物が結合する生物学的分子である。ある特定の実施形態において、標的は、細胞によって産生され、細胞膜に発現される、タンパク質である。標的はまた、核酸、脂質、グリカン、及び糖タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、標的は、抗原、たとえば、抗体によって認識されるタンパク質、又はTCRによって認識されるペプチド:MHCである。
【００５５】
「標的細胞」。抗原又は標的を発現する生体細胞である。本発明のある特定の実施形態において、標的又は抗原は、標的細胞の細胞膜に結合しており、したがって、細胞外空間に曝露されている。本発明のある特定の実施形態において、標的細胞は、インデューサー細胞が、標的細胞の表面上の抗原又は標的と相互作用した結果として、1個、10個、100個、又は10,000個のmRNA転写産物の定量可能な変化を受ける。本発明の一部の実施形態において、標的細胞における定量可能な変化は、内因性転写産物である。本発明の一部の実施形態において、標的細胞における定量可能な変化は、標的細胞に導入されている、遺伝子組換え操作された「レポーター構築物」から生じる転写産物である。本発明の一部の実施形態において、レポーター構築物は、インデューサー細胞が標的細胞と接触することにより生じるシグナルと接触すると転写を誘導する、プロモーター、エンハンサー、又は他の制御性エレメントを含有する。本発明の一部の実施形態において、目的とされる転写産物は、上方制御されるか又は下方制御されるかのいずれかである。
【００５６】
「インデューサー細胞」。標的細胞上の抗原又は標的と結合するリガンド又はインデューサー分子を発現する、生体細胞である。本発明のある特定の実施形態において、インデューサー細胞は、タンパク質又は分子を分泌し、これが、次いで、標的細胞に結合して、定量可能な転写の変化を誘導する。本発明の他の実施形態において、インデューサー細胞表面上のタンパク質又は分子は、標的細胞に結合して、定量可能な転写の変化を誘導する。ある特定の実施形態において、誘導するタンパク質又は分子は、単一の種を含むが、一方で本発明の他の実施形態においては、誘導するタンパク質又は分子は、2個、5個、10個、100個、又は1,000個の個別の種を含む。本発明のある特定の実施形態において、インデューサー細胞は、インデューサー細胞が、標的細胞の表面上の抗原又は標的と相互作用した結果として、1個、10個、100個、又は10,000個のmRNA転写産物の定量可能な変化を被る。
【００５７】
「中間(intermediary)細胞」。インデューサー細胞と標的細胞との間の相互作用に対して、又はインデューサー細胞によって分泌されるタンパク質と標的細胞によって発現されるタンパク質との間の相互作用に対して、機能的に応答する生体細胞である。本発明のある特定の実施形態において、中間細胞は、インデューサー細胞が、標的細胞の表面上の抗原又は標的と相互作用した結果として、1個、10個、100個、又は10,000個のmRNA転写産物の定量可能な変化を受ける。本発明の他の実施形態において、インデューサー細胞表面によって分泌されるタンパク質又は分子は、標的細胞に結合して、中間細胞における定量可能な転写の変化を誘導する。本発明の一部の実施形態において、中間細胞における定量可能な変化は、中間細胞に導入されている、遺伝子組換え操作された「レポーター構築物」から生じる転写産物である。
【００５８】
「合成ポリ核酸」。化学的又は酵素的に合成されたRNA又はDNAである。一本鎖RNA若しくはDNA、又は「オリゴヌクレオチド」を合成するために、化学的合成プロセスは、ホスホラミダイト方法、並びに保護された2'-デオキシヌクレオシド(dA、dC、dG、及びdT)、リボヌクレオチド(A、C、G、及びU)、又は化学的に修飾されたヌクレオシド、たとえば、LNA若しくはBNAに由来するホスホラミダイト構築ブロックを使用した、固相合成として実装され得る。所望されるオリゴヌクレオチドを得るために、化学的構築ブロックを、産物の配列によって必要とされる順序で、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に順番に連結させてもよい。典型的には、合成オリゴヌクレオチドは、長さがおよそ15〜25塩基の一本鎖DNA又はRNA分子である。合成ポリ核酸はまた、酵素的方法、たとえば、逆転写(RT)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ギブソンアセンブリー、オーバーラップ伸長PCR(OE-PCR)、オーバーラップ伸長RT-PCR(OE-RT-PCR)、エマルジョンPCR、エマルジョンRT-PCR、エマルジョンOE-RT-PCR、エマルジョンOE-PCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ハイブリダイゼーション、in vitro転写、又は精製された酵素を利用する任意の他の無細胞分子生物学的方法によって、生成することができる。
【００５９】
「ポリ核酸バーコード」。ポリ核酸バーコードは、実験者が細胞クローンを特定することを可能にする合成ポリ核酸、すなわち、固有の識別子を含む。一部の実施形態において、バーコードは、細胞のゲノム中へと操作されるか、発現プラスミド内に含まれるか、又は組換え若しくは合成RNA配列にコードされる。一部の実施形態において、バーコードは、固体表面、たとえば、直径1ミクロンの磁気ビーズに結合される。一部の実施形態において、クローン集団は、10個、100個、1,000個、10,000個、100,000個、又は100万個の異なるバーコードを含む。バーコードは、バルクシーケンシングを通じてシーケンシングすることができ、細胞機能の高スループットのコンビナトリアル分析を可能にしている。
【００６０】
「逆転写」。逆転写酵素(RT)という酵素を使用してRNA鋳型から相補的DNA(cDNA)を生成するプロセスである。逆転写酵素は、ポリメラーゼ連鎖反応の技法を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)と称される技法でRNAに適用するために、研究において広く使用されている。古典的なPCR技法は、DNA鎖にのみ適用することができるが、逆転写酵素の補助により、RNAをDNAに逆転写することができ、これにより、RNA分子のPCR分析が可能となっている。逆転写酵素はまた、mRNAからcDNAライブラリーを作製するためにも使用される。
【００６１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、分子生物学において、DNA片の単一のコピー又は数個のコピーを、数桁にわたって増幅させ、特定のDNA配列の数千個から数百万個のコピーを生成するために使用される技法である。この方法は、DNA融解及びDNAの酵素的複製のための反復的な加熱及び冷却の反応サイクルからなる、熱サイクリングに依存する。標的領域に相補的な配列を含むプライマー(短いDNAフラグメント)は、この方法の名称の由来であるDNAポリメラーゼとともに、選択的かつ反復的な増幅を可能にするために重要な構成要素である。PCRが進行すると、生成されるDNA自体が、複製の鋳型として使用され、DNA鋳型が指数関数的に増幅される連鎖反応が始まる。PCRは、広範な遺伝子操作を行うように大規模に修飾することができる。PCRは、通常は、組換えDNA方法であるとはみなされないが、これは、PCRが、DNAの切り貼りを伴わず、既存の配列の増幅に過ぎないためである。ほぼすべてのPCR適用は、熱安定性DNAポリメラーゼ、たとえば、Taqポリメラーゼ(もともとは、細菌テルムス・アクウァーティクス(Thermus aquaticus)から単離された酵素)を利用する。このDNAポリメラーゼは、一本鎖DNAを鋳型として使用し、DNA合成の開始に必要とされるDNAオリゴヌクレオチド(DNAプライマーとも称される)を使用して、DNA構築ブロック、ヌクレオチドから新しいDNA鎖を酵素的に構築する。大多数のPCR方法は、熱サイクリングを使用する、すなわち、所定の一連の温度ステップを通じて、PCRサンプルの加熱及び冷却を交互に行う。第1のステップにおいて、DNA二本鎖ヘリックスの2つの鎖を、DNA融解と称されるプロセスにおいて、高温で物理的に分離させる。第2のステップにおいて、温度を低下させると、2つのDNA鎖が、DNAポリメラーゼが標的DNAを選択的に増幅させるためのDNA鋳型となる。PCRの選択性により、特定の熱サイクリング条件下において、増幅の標的とされるDNA領域に相補的なプライマーの使用により生じる。
【００６２】
「ハイブリダイゼーション」。2つのポリ核酸を融合して、単一のポリ核酸分子を形成する、任意のプロセスである。ハイブリダイゼーションは、2つの一本鎖ポリ核酸が塩基対を形成することをもたらす、天然又は人工的な任意のプロセスによって生じ得、それによって、少なくとも部分的に二本鎖になった分子が得られる。塩基対は、従来、逆相補性、たとえば、グアニン-シトシン、アデニン-チミン、又はアデニン-ウラシルを通じて、生じる。一部の実施形態において、ハイブリダイズされた塩基対は隣接し、たとえば、それぞれが100ヌクレオチドの2つの一本鎖ポリ核酸は、逆相補体である20ヌクレオチドの部分配列を含む。適切な条件下において、2つのポリ核酸は、これらの相補的なヌクレオチド部分配列にわたってハイブリダイズして、ハイブリダイズした分子が形成される。「オーバーラップ伸長PCR」と称される増幅プロセスにより、相補的なヌクレオチド部分配列を含む2つのポリヌクレオチド間での最初のハイブリダイゼーションステップにより得られる、複数の融合した二本鎖DNA産物が生成される。
【００６３】
「マイクロ流体技術」。マイクロ流体技術は、通常、マイクロリットル(10-6)〜ピコリットル(10-12)の範囲の流体を、最も小さい寸法が数十マイクロメートル〜数百マイクロメートルであるチャネルのネットワークにおいて操作及び制御するための科学及び技術である。典型的には、流体は、移動し、混合され、分離され、又はさもなければ処理される。多くの適用では、毛管力などの受動的流体制御技法が利用される。一部の適用においては、外部作動手段が、追加として、媒体の指向的輸送のために使用される。例としては、受動チップ上での流体輸送のために遠心力を適用する回転駆動がある。能動的マイクロ流体技術は、能動的(マイクロ)構成要素、たとえば、マイクロポンプ又はマイクロバルブによる作業流体の所定の操作を指す。連続的な様式で流体を供給するマイクロポンプは、投薬に使用することができる。マイクロバルブは、ポンプで送られる液体の流動方向又は移動様式を決定することができる。通常、研究室において実行されているプロセスを、有効性及び移動性を強化するため、並びにサンプル及び試薬の量を低減するために、単一のチップに小型化することができる。マイクロ流体技術の下位分類としての、液滴に基づくマイクロ流体技術は、連続的マイクロ流体技術とは対照的に、低レイノルズ数及び層流のレジメンで非混和相における異なる体積の流体を操作するという特徴を有する。液滴生成に使用される2つの非混和相は、連続相(液滴が生成される媒体)及び分散相(液滴相)と称される。生成される液滴の寸法は、主として、連続相及び分散相の流速、2つの相の間の界面張力、液滴生成に使用される幾何形状によって、制御される。
【００６４】
「マイクロ液滴」。典型的には1マイクロリットル未満の体積を有する、球状の小体積の液体である。マイクロ液滴は、油中水型のマイクロ液滴及び水中油型のマイクロ液滴を含む。油中水型のマイクロ液滴又は水中油型のマイクロ液滴の集団は、「エマルジョン」を含む。エマルジョンは、たとえば、実質的に同じ体積の、たとえば、直径の変動が25%以下であるマイクロ液滴を含む、単分散であってもよく、又はたとえば、様々な体積の、たとえば、直径の変動が25%を上回るマイクロ液滴を含む、多分散であってもよい。マイクロ液滴は、高スループットの分子、細胞、又は生物化学的実験を行うための手段である。マイクロ液滴は、液体の反応を区画化するように機能し、したがって、物理的な容器と同様の機能を果たす。数百万個又は数十億個のマイクロ液滴を、小さな(たとえば、1ミリメートルの)物理的容器に入れることができ、単一細胞に対して非常に大規模なコンビナトリアルスクリーニングを行うことが可能である。本発明の一部の実施形態において、単分散のマイクロ液滴は、マイクロ流体技術、すなわち、「液滴マイクロ流体技術」を使用して生成される。本発明の他の実施形態において、多分散のマイクロ液滴は、振盪又は混合装置を使用して生成される。
【００６５】
「物理的容器」。分子生物学、細胞生物学、又は生物化学において使用される物理的容器は、チューブ、プレート、皿、バイアル、又は固体のプラスチック、ガラス、ポリマー、若しくは他の固体材料を含む他の形式を指す。一部の実施形態において、物理的容器は、不活性である、すなわち、容器は、分子、細胞、又は生物化学的実験のための液体を物理的に格納する機能を果たすだけである。一部の実施形態において、反応性の細胞、分子、タンパク質、薬物、又は生物化学的容器は、物理的容器に固定される。物理的容器は、分子、細胞、又は生物化学的実験を行うための手段である。プロセシングのスループットを増加させるために、物理的容器を、ロボットシステムと一緒に使用してもよい。一部の実施形態において、スループットは、物理的容器を含むマイクロ流体チップ、たとえば、ガラス、プラスチック、又はPDMSマイクロ流体チップ上のナノリットルチャンバを使用することによって、増加する。
【００６６】
「固体支持体」。分子生物学、細胞生物学、又は生物化学において使用される固体支持体とは、ビーズ又は固体のプラスチック、ガラス、ポリマー、若しくは他の固体材料を含む他の幾何形式を指す。本発明の一部の実施形態において、反応性の細胞、ポリ核酸、タンパク質、又は他の分子は、固体支持体に固定される。固体支持体は、次いで、物理的容器又はマイクロ液滴に導入され、その結果、生物化学的、細胞、又は分子の機能が、有効となる。固体支持体は、次いで、洗浄されるか、又は除去され、複数ステップの研究室プロセスが単純化され得る。一部の実施形態において、固体支持体は、1ミクロン、10ミクロン、又は100ミクロンの磁気ビーズである。一部の実施形態において、合成ポリ核酸は、磁気ビーズに固定され、「プローブ」とも称される、合成ポリ核酸に相補的な内因性細胞内ポリ核酸の精製を可能にする。一部の実施形態において、固体支持体は、抗体がコーティングされたビーズであり、これは、続いて、抗体に対して親和性を有する抗原を発現する細胞を精製するために使用される。
【００６７】
「バルクシーケンシング」。ディープシーケンシング、超高スループットシーケンシング、大規模並行シーケンシング、及び次世代シーケンシングと同義である。バルクシーケンシングは、数十万個、数百万個、数億個、又は数十億個のDNA配列の読取りを、並行して得ることを含む。多数の実施形態において、多様なDNAライブラリーは、PCR、RT-PCR、又はハイブリダイゼーションなどの方法を使用して生成され、次いで、複数のライブラリーが、バルクシーケンシングを使用してシーケンシングされる。方法は、合成、ナノポアシーケンシング、及びピロシーケンシングによってシーケンシングすることを含み得る。2017年の時点で、バルクシーケンシングの商業的供給業者は、Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore、及びRocheを含む。
【００６８】
発明の概要
本発明の一態様は、少なくとも2つの異なる細胞型に由来するポリ核酸の同時測定に関する。測定は、少数の細胞に対して大規模に並行した様式で行われ得るか、又はコンビナトリアルスクリーニングが、数百万個の異なる細胞型の組合せに対して行われ得る。一部の実施形態において、細胞を、反応容器に組み合わせで単離し、組み合わせた状況を維持したまま、インキュベートして生物学的反応を誘導し、そして溶解してRNAを単離する。少なくとも2つの異なる細胞型に由来する転写産物を、ハイブリダイゼーションによって物理的に連結させ、次いで、連結されたクローンを、大規模並行スケールでディープシーケンシングに供してもよい(図1)。
【００６９】
本方法は、単一細胞又は細胞の部分集団を、マイクロエマルジョン液滴、ゲル、又はマイクロ流体反応容器中に単離することを含み得る。数百万個の細胞を、大規模並行様式で単離又は区分けして、遺伝学的に異なる対での組合せを示す細胞混合物を生成することができる(図2)。
【００７０】
細胞混合物は、1つ以上の標的細胞、1つ以上のインデューサー細胞、及び/又は1つ以上の中間細胞を含み得る。標的細胞は、均一な細胞又は遺伝学的に異なるクローン(たとえば、B細胞、T細胞、バーコードを有するように操作した細胞、ペプチド抗原を発現するように操作した細胞、単一細胞懸濁液中の初代がん細胞)の集団を含み得る。インデューサー細胞は、均一な細胞又は遺伝学的に異なるクローン(たとえば、B細胞、T細胞、バーコードを有するように操作した細胞、ペプチド抗原を発現するように操作した細胞、NK細胞)の集団を含み得る。一部の実施形態において、中間細胞が使用され、中間細胞は、均一な細胞又は遺伝学的に異なるクローン(たとえば、NK細胞)の集団を含み得る。
【００７１】
一部の実施形態において、標的細胞及びインデューサー細胞は、固体支持体(たとえば、ビーズ又はタンパク質)に固定されたポリ核酸バーコードライブラリーと混合される。一部の実施形態において、細胞混合物は、追加として、同じマイクロエマルジョン液滴、ゲル、又は反応容器において、刺激物質、たとえば、均一な細胞集団、試薬ライブラリー、又は単一の試薬とともにインキュベートされる。
【００７２】
その細胞の混合物を、次いで、試薬をマイクロエマルジョン液滴、ゲル、又はマイクロ流体反応容器に導入することによって、溶解することができる。一部の実施形態において、このステップは、細胞を含有するマイクロエマルジョン液滴を、溶解試薬を含有するマイクロエマルジョン液滴と融合させ、それによって、細胞混合物の区分けを保存することを含む(図3)。溶解後に、細胞混合物に由来する転写産物を、たとえば、オリゴ-dTオリゴヌクレオチドでコーティングしたビーズを使用して、精製してもよい。
【００７３】
一部の実施形態において、2つ以上のポリヌクレオチド標的がハイブリダイズされ、クローンを識別するポリ核酸が、機能の変化を示すRNA転写産物に連結されるる(図4〜5)。少なくとも2つの異なる細胞型に由来する転写産物を融合すること、たとえば、抗体標的をコードする転写産物と、抗体を産生する細胞に由来する抗体をコードする転写産物とを融合することが、重要な見識である(ここで、抗体産生細胞は、インデューサー細胞である)。ハイブリダイズしたポリ核酸分子を、次いで、バルク又は高スループットのシーケンシングによって、シーケンシングすることができる。当該技術分野において公知の任意の高スループットシーケンシング方法を、利用することができる。
【００７４】
次いで、バルクシーケンシングのデータを、アルゴリズムによって分析して、最初のクローンライブラリー由来のどのクローンが、インデューサー細胞の刺激に応答して機能の変化を示すかを判定することができる(図6〜7)。複数の細胞型に由来するハイブリダイズした核酸分子のシーケンシングにより、少なくとも2つの細胞型、たとえば、抗体標的を産生する細胞及び抗体を産生する細胞のそれぞれに由来する少なくとも1つの転写産物の同時測定が可能となる。ディープシーケンシングは感度が極めて高いため、誘導された細胞と誘導されていない細胞との間のたった2倍、5倍、又は10倍しか違わない転写産物数を、検出することができる。したがって、本発明の方法は、数百万個の単一の標的細胞及びインデューサー細胞にわたって、並行して、インデューサー細胞に曝露された単一の標的細胞の機能性応答に関する見識を提供することができ、またこれまで一度も可能であったことがない組み合わせでの機能性スクリーニングを可能にする。一部の実施形態において、ハイブリダイズしたポリ核酸は、さらに、組換えタンパク質のライブラリーを作製するために使用され、このライブラリーは、続いて、結合又は機能に関してさらにスクリーニングされ得る。
【００７５】
本発明の方法の詳細な説明が、本明細書に提供される。本発明の実施形態の例についての詳細な説明もまた、免疫学、創薬、薬物開発、及びがん生物学への特定の適用とともに、本明細書に提供される。
【００７６】
他の解釈上の慣例
本明細書において列挙される範囲は、列挙されている端点を含め、範囲内の値のすべてを略して示すと理解されるものとする。たとえば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、及び50からなる群の任意の数字、数字の組合せ、又は部分範囲を含むと理解されるものとする。
【００７７】
本発明の方法
1)DNAライブラリーの生成
本発明の一部の実施形態は、B細胞を哺乳動物ドナーから単離し、次いで、電気融合などの当業者に周知の技法を使用して、初代細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって、抗体クローンのライブラリーを生成することを含む(Smith & Crowe、Microbiol Spectr. 2015 3(1): AID-0027-2014)。ハイブリドーマとしても知られる、結果として得られた細胞は、初代細胞よりも、培養で育てることが容易であり得る。マウス及びヒトを含む種に由来する初代細胞を使用して、T細胞及びB細胞のハイブリドーマを作製するために、様々な方法が使用されている。これらの方法を使用して、それぞれが固有のTCR又は抗体を発現する、数万個、数十万個、又は数百万個の細胞クローンのライブラリーを、作製することができる。
【００７８】
本発明の一部の実施形態は、初代細胞、たとえば、腫瘍、肝臓、脳、血液、骨髄、末梢血単核細胞、筋肉組織、脳脊髄液、腎臓組織、肺洗浄液、肺組織、不死化細胞株、皮膚組織、又は任意の他の組織若しくは細胞型に由来するRNAを単離することによって、遺伝子のDNAライブラリーを生成する方法に関する。逆転写酵素を使用して、RNAからcDNAを合成することができる。たとえば、RNAを、42℃で、M-MuLV RTを用いて、オリゴ-dTプライマーとともに、1時間、インキュベートする。一部の実施形態において、オリゴ-dTプライマーを、核酸バーコード配列と融合させ、ユニバーサル増幅プライマーを隣接させ、それによって、バーコードの特異的な増幅、及びcDNA配列までのバーコードの追跡が可能である。これにより、クローンの複雑な混合物の脱多重化が可能となる。RTに基づく方法は、並行して、数万個、数十万個、又は数百万個のDNAクローンから構成されるDNAライブラリーを、安価かつ迅速に生成するという利点を有する。目的とされる複数のcDNAクローンを回収するために、完全なcDNAライブラリーを、遺伝子特異的プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、たとえば、Taq、並びに変性(95℃で30秒間)、30サイクルの増幅(95℃で15秒間、62℃で60秒間、及び68℃で3分間)、続いて68℃で5分間の最終的な伸長からなる熱サイクリングを含む反応を使用して、PCRに供してもよい。
【００７９】
本発明の一部の実施形態は、DNA合成により、抗体、TCR、又は任意の他の種類の遺伝子配列のDNAライブラリーを生成する方法に関する。一部の実施形態において、TCR又は抗体レパートリーに対するDNAシーケンシングのデータを、当該技術分野において公知の方法を使用して得、次いで、合成DNAライブラリーが、バルクシーケンシングによって特定された配列から操作される。一部の実施形態において、合成されたDNAライブラリーは、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、又は哺乳動物細胞活性化アッセイを含む方法によって、目的とされる抗原に結合することが判明しているTCR又は抗体を含む。DNAオリゴヌクレオチドは、一緒にインキュベートするとハイブリダイズする、オーバーラップする相補的配列のライブラリーを含むように、設計することができる。数百個、数千個、数万個、又は数十万個の合成オリゴヌクレオチドのライブラリーを、マイクロ流体技術又はアレイに基づく方法によって、たとえば、Twist Bioscience、Agilent Technologies、又はLC Biosciencesなどの商業的供給業者によって、製造され得る。オリゴヌクレオチドのライブラリーは、次いで、5'エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、及びDNAリガーゼを使用して、数百個又は数千個のヌクレオチドのDNA配列に構築することができる(たとえば、「ギブソンアセンブリー」、Gibson et al. Nat Methods. 2009 May;6(5):343-5)。たとえば、T5エキソヌクレアーゼ、Taqポリメラーゼ、及びTaqリガーゼを、オーバーラップするオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、DTT、MgCl2、及び緩衝液を含む反応において混合し、次いで、50℃で60分間インキュベートする。一部の実施形態において、ギブソンアセンブリーを使用して、環状クローン、たとえば、プラスミド発現構築物を合成する。合成DNAが環状である場合、DNAは、ナノグラム又はそれより多い量のプラスミドを産生するために、細菌に形質転換することができる。合成直鎖状DNAを生成する別の方法は、オーバーラップするオリゴヌクレオチドを混合すること、及び熱安定性ポリメラーゼを使用してPCRを行うことを含む。環状DNAを作製するために、これらの直鎖状PCR産物を、次いで、制限酵素及びDNAリガーゼ、ギブソンアセンブリー、又は平滑末端クローニングを含む方法を使用して、プラスミド発現構築物にサブクローニングしてもよい。これらのDNA合成方法のいずれも、96ウェルプレート、384ウェルプレート、マイクロ流体、又はロボットプロセシングのシステムによって、並行で行うことができる。
【００８０】
抗体、TCR、又は任意の他の標的遺伝子のDNAライブラリーはまた、単一細胞の単離及び溶解、続いて、核酸増幅によって、生成することができる。単一B細胞を、96ウェルプレートに単離してもよく、次いで、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン転写産物を、当該技術分野において公知の方法、たとえば、多重化「オーバーラップ伸長」RT-PCR(Oleksiewicz EP1921144 B1)を使用して、連結させることができる。オーバーラップ伸長RT-PCR、又はOE-RT-PCRにおいて、単一細胞から免疫グロブリンを増幅させるために、すべての可能性のある重鎖遺伝子及びすべての可能性のある軽鎖遺伝子に結合し、それらを増幅させるプライマーのプールを、設計してもよい。重鎖プライマーはまた、軽鎖プライマーに対する相補性を有する部分配列を含み得る。OE-RT-PCR中に、相補的部分配列はハイブリダイズすることができ、ポリメラーゼが、ハイブリダイズした一本鎖重鎖及び軽鎖免疫グロブリン由来の、融合したポリ核酸を生成し得る。この様式では、単一細胞の重鎖及び軽鎖免疫グロブリンの内容が、維持され得る。
【００８１】
抗体、TCR、又は任意の他の標的遺伝子のDNAライブラリーは、他の方法、たとえば、OE-RT-PCR及びマイクロ流体技術が関与するものによって、1万個を上回る細胞の集団から、生成することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Johnsonの欧州特許第2652155号に開示されている1つの例示的な方法は、液滴マイクロ流体デバイスの使用を伴う。液滴マイクロ流体デバイスは、油/界面活性剤混合物、溶解及びRNA捕捉混合物、並びに細胞懸濁液をインプットし、単一細胞エマルジョンを、標準的な熱サイクリングマイクロチューブにアウトプットする。油/界面活性剤混合物は、鉱油又はフルオロカーボン油に基づく。溶解及びRNA捕捉混合物は、単一細胞に由来するメッセンジャーRNA(mRNA)転写産物を捕捉する、オリゴ-dTがコーティングされた1μmの磁気ビーズを含む。細胞封入デバイスは、3つの圧力ポンプ、マイクロ流体液滴チップ、及びイメージング装置から構成される。マイクロ流体チップは、ガラスで製造されており、チャネルは、チップの長さの大半に50μm×150μmでエッチングされており、液滴交差部では、55μmに狭まっている。液滴のサイズは、圧力に依存するが、典型的には、約40μmの液滴が、最適に安定しており、単一細胞エマルジョンに適切なサイズである。液滴の生成速度もまた、圧力に依存するが、典型的には、最大3kHzであり、また1時間当たり300万個の細胞を捕捉する。細胞溶解方法は、界面活性剤、たとえば、Triton X-100、NP-40、Tween 20、Tween 80、又はSDSに基づく方法を含む。エマルジョンを、50℃で30分間インキュベートし、次いで、ビーズを、酢酸エチルなどの溶媒を使用して、エマルジョンから抽出する。次に、mRNAが結合したビーズを、上述の細胞封入チップに類似するマイクロ流体チップを使用して、OE-RT-PCRのためにエマルジョンに注入して戻す。たとえば、TCRαβライブラリーを生成するために、独立したTCRα及びTCRβのマイナーアンプリコンを、多重に生成し、次いで、これらを融合して、TCRα及びTCRβの両方から構成される単一のメジャーアンプリコンを生成する。TCRαβプライマープールには、β定常(Cβ)領域及びα定常(Cα)領域のユニバーサルプライマーが含まれる。これにより、J領域プライマーの大型プールの必要性が抑制される。加えて、C領域プライマーは、内因性C領域遺伝子型若しくはアイソタイプを捕捉するように設計されるか、又はプライマーは、内因性C領域遺伝子型若しくはアイソタイプを無視するように設計される。TCRαβプライマープールはまた、TCRαβ及びTCRβのすべての可能性のあるVセグメントに結合する43個のプライマーも含む。したがって、プライマーは、それぞれのモノマーの全可変領域にわたって増幅して、450bpのマイナーアンプリコンを産生する。TCRβ V遺伝子の例示的なプライマーは、本明細書において、配列番号17〜19として提供され、TCRβ C遺伝子の例示的なプライマーは、本明細書において、配列番号20として提供され、TCRα V遺伝子の例示的なプライマーは、配列番号21〜23として提供され、TCRα C遺伝子の例示的なプライマーは、配列番号24として提供される。ビーズエマルジョンを、次いで、RT、遺伝子特異的プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、たとえば、Taq、及び逆転写(42℃で60分間)、変性(95℃で30秒間)、30サイクルの増幅(95℃で15秒間、62℃で60秒間、及び68℃��3分間)、続いて68℃で5分間の最終伸長からなる熱サイクリングを含む反応を使用して、OE-RT-PCRに供する。複数の液滴は、mRNAが結合したビーズを1つだけ含むため、インプットされるT細胞の本来のTCRαβペアリングが、TCRαβ連結ライブラリーにおいて維持される。同様の方法を使用して、連結した重鎖及び軽鎖免疫グロブリンDNAライブラリーを生成することができる。たとえば、配列番号1〜8のうちのいずれかのポリヌクレオチドを含む免疫グロブリンプライマーセットを、使用することができる。配列番号1〜3は、IGG V遺伝子の例示的なプライマー配列を提供し、配列番号4は、IGG C遺伝子の例示的なプライマー配列を提供し、配列番号5〜7は、IGK V遺伝子の例示的なプライマー配列を提供し、配列番号8は、IGK C遺伝子の例示的なプライマー配列を提供する。免疫グロブリンC領域のプライマーは、アイソタイプ特異的であるか、遺伝子型特異的であるか、又は任意のC領域配列を増幅するように設計されたユニバーサルプライマーであるかのいずれかである。一部の実施形態において、TCR又は免疫グロブリンサブユニットは、ブタテッショウウイルス-1(P2A)アミノ酸配列をコードするポリ核酸配列に連結されている。一部の実施形態において、TCR又は免疫グロブリンサブユニットは、Gly-Serペプチドリンカーをコードするポリ核酸配列に連結されている。一部の実施形態において、TCR又は免疫グロブリンサブユニットは、内部リボソーム進入部位(IRES)をコードするポリ核酸配列に連結されている。他の実施形態において、TCR又は免疫グロブリンサブユニットは、いずれの公知の内因性配列に対しても有意な相同性を有さない人工リンカー配列に連結されている。
【００８２】
連結したTCRαβ又は重鎖及び軽鎖免疫グロブリンのDNAライブラリーは、当該技術分野において公知の方法、たとえば、Johnsonの米国特許第9,422,547号B1(この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される方法を使用して、組換え発現構築物に変換することができる。Johnsonの米国特許第9,422,547号B1に記載される例示的な方法は、ネスト型の外部PCRプライマーを使用して、ギブソンアセンブリーのためのオーバーハングを有するアダプターを、アンプリコンライブラリーの5'末端及び3'末端に付加する。C領域のプライマーは、アイソタイプ特異的であるか、遺伝子型特異的であるか、又は任意のC領域配列を増幅するように設計されたプライマーであるかのいずれかであり得る。T5エキソヌクレアーゼ及びTaqリガーゼを、TCRαβ又は免疫グロブリンインサート、インサートに相補的な部分配列を有する直鎖化プラスミド骨格、DTT、MgCl2、及び緩衝液を含む反応において混合し、次いで、50℃で60分間インキュベートする。プラスミド骨格は、プロモーター、ポリ(A)シグナル配列、及びOE-RT-PCRを通じて増幅されないC領域配列を含む。C領域は、連結されたアンプリコンのアイソタイプ若しくは遺伝子型に対応するか、又は非天然のアイソタイプ若しくは遺伝子型を有するアンプリコンを融合するように設計されている。ライブラリーを、次いで、大腸菌(E. coli)に形質転換し、LBアンピシリンプレートにおいて拡大させる。プラスミドライブラリーを、次いで、マキシプレップキットを用いて精製する。精製したマキシプレップライブラリーは、数万個、数十万個、又は数百万個のクローンを含む。いくつかの作業フローは、2回目のギブソンアセンブリーを必要とする。たとえば、全C領域のうちの一方又は両方が、もともとのOE-RT-PCRにおいて増幅されない場合、TCRαβ又は重鎖及び軽鎖免疫グロブリン間のC領域をクローニングすることが必要であり得る。一部の実施形態において、プロモーター、P2A、又はIRES配列は、同時にクローニングされる。挿入された配列は、ギブソンアセンブリー又はPCRを使用して、オリゴヌクレオチドのプールをアセンブリすることによって合成され、次いで、ギブソンアセンブリーを使用して、ポリ核酸インサートを、プラスミドライブラリーに挿入することができる。この反応を、数万個、数十万個、又は数百万個のクローンに対して並行して行ってもよい。最終的な結果として、完全に機能性のタンパク質を発現する数万個、数十万個、又は数百万個のTCRαβ又は重鎖及び軽鎖免疫グロブリンクローンのライブラリーが得られ、これは、もともとの単一細胞インプットの天然のペアリングを保持している。
【００８３】
一部の実施形態において、単一細胞増幅方法は、たとえば、Johnsonの米国出願第15/159,674号(この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるように、核酸バーコード化のための様々な方法を使用して、任意の転写産物、転写産物のセット、又は単一細胞全トランスクリプトームに関する単一細胞cDNAライブラリーを生成するために使用される。
【００８４】
Johnsonの米国出願第15/159,674号に開示される例示的な方法は、単一細胞を有するクローナルポリ核酸バーコードを、反応容器、マイクロ流体チャンバ、又はエマルジョンマイクロ液滴に送達することを含む。1つの方法は、バーコードを含むポリ核酸を、核酸精製を促進するために、磁気材料で作製された1μm、5μm、又は10μmの直径を有する球状ビーズを含む固体支持体に固定することである。オリゴヌクレオチドを、NH2で修飾し、エポキシシラン又はイソチオシアネートをコーティングしたガラス製ビーズに固定するか、又はオリゴヌクレオチドを、ジスルフィド修飾し、メルカプトシラン処理したガラス製支持体に結合させる。液滴封入のために、ビーズ溶液を、細胞と混合し、次いで、複数の液滴が、単一細胞及び単一ビーズを含むように希釈する。そのような方法は、複数の空の液滴又は単一ビーズのみ若しくは単一細胞のみを有する液滴をもたらすため、一部の方法では、細胞及びビーズを、まず、別個の流れ又は別個のデバイスで液滴に封入し、次いで、細胞含有液滴及びビーズ含有液滴を、融合して、単一細胞及び単一ビーズを含有する複数の液滴を生成する。適用に応じて、複数の単一細胞を、複数のバーコード化したビーズとともに封入してもよい。そのような方法により、複数の単一細胞に対して複数のバーコードが存在する場合であっても、個々のバーコードを、単一細胞まで追跡することができる。他の方法は、ビオチン-ストレプトアビジン及び共有結合コンジュゲーション化学を含む。別の方法は、バーコードを含むポリ核酸を抗体に固定し、これを、細胞に結合させた後に、細胞を、反応容器、マイクロ流体チャンバ、又はエマルジョンマイクロ液滴に送達することである。当該技術分野において利用可能な、抗体を核酸にコンジュゲーションするための方法、たとえば、ビオチン-ストレプトアビジン又は共有結合コンジュゲーション化学を利用することができる。細胞溶解方法は、界面活性剤、たとえば、Triton X-100、NP-40、Tween 20、Tween 80、又はSDSに基づく方法を含み得る。一部の実施形態において、エマルジョンを、50℃で30分間インキュベートし、次いで、ビーズを、酢酸エチルなどの溶媒を使用して、エマルジョンから抽出する。次いで、RNAが結合したビーズを、エマルジョンから回収し、次いで、核酸バーコード化に特異的ないくつかの修飾を伴って、上述の方法を使用して、液滴又は反応容器において増幅させる。核酸バーコード化において、第一鎖cDNAを、転写産物に特異的な第一鎖プライマーに融合した核酸バーコードで標識することができる。核酸バーコードに対して5'末端側のユニバーサルプライマーを、PCRにおいて使用して、複数のバーコード化したRT-PCRアンプリコンを増幅することができる。あるいは、RNAを、プライミングし、バーコード配列とは別個に増幅させ、次いで、バーコード及びcDNAアンプリコンを、エマルジョンマイクロ液滴内部でオーバーラップ伸長PCRにおいて融合してもよい。あるいは、第一鎖cDNAバーコード化は、RT-PCR増幅に対してRNA結合ビーズを注入する必要なく、溶解ミックス中で、RTを用いて実行してもよい。これらの方法において、cDNAが結合したビーズを、エマルジョンから抽出することができ、バーコード化したcDNAを、「バルク」PCR、すなわち、エマルジョ��なしのPCRに供してもよい。これらの方法のいずれも、最終的な結果として、完全に機能性のタンパク質を発現する、数万個、数十万個、又は数百万個のバーコード化したcDNAクローンのライブラリーを得ることができ、これにより、同じバーコードを有するcDNAを単一の起源細胞へと追跡することが可能である。cDNAは、必ずしも、全長である必要はなく、たとえば、ペプチド:MHC複合体は、機能性分析のために全cDNAを必要としない。一部の実施形態において、標的ライブラリーは、2つの異なる哺乳動物クローンに操作された、NY-ESO-1標的配列(配列番号13)、又はMART-1標的配列(配列番号16)を含む。
【００８５】
環状プラスミドとして再構成されると、cDNAのライブラリーは、タンパク質産生のために哺乳動物細胞に導入することができる。たとえば、TCRαβ発現構築物は、レンチウイルス又は当該技術分野において公知の任意の他のベクターにパッケージングすることができ、次いで、これを使用して、Jurkat J.RT3-T3.5細胞株(ATCC)又はTCRβ発現を欠如しており、したがって、細胞表面TCRを有さない、他の細胞に形質導入することができる。1つの特定の実施形態において、まず、TCRαβプラスミドで開始して、水疱性口炎ウイルスG(VSV-G)シュード型レンチウイルス粒子を、第3世代のViraSafeレンチウイルスパッケージングシステム(Cell Biolabs)及びLenti-Pac 293Ta細胞(GeneCopoeia)を使用して、生成する。レンチウイルスコピー数を、Lenti-X qRT-PCR Titrationキット(Clontech)を使用して決定して、形質導入を正規化することができる。例示的な実施形態において、105個又は106個のJ.RT3-T3.5細胞に、レンチウイルス構築物のライブラリーを形質導入し、次いで、ピューロマイシンで14日間選択する。例示的な実施形態において、FACS分析により、15〜30%の形質導入効率が示される。他の特定の実施形態において、CHO Flp-In(Life Technologiesにより市販で提供される)細胞に、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンライブラリーの標的化されたゲノム組込みのために、トランスフェクションを行う。レンチウイルスは、哺乳動物ゲノムにランダムに組み込まれるが、Flp-Inのために操作したプラスミドは、FRT部位においてのみ、細胞のゲノムに組み込まれる。CHO Flp-In細胞は、事前に、ゲノム内の単一の位置にFRT部位を含むように操作されている。抗体を発現する細胞のライブラリーを操作するために、2:1の比のFlpリコンビナーゼベクター及び抗体プラスミドライブラリーを使用して、Ingenio緩衝液において400万個のCHO Flp-In細胞をエレクトロポレーションする(Mirus Bio)。選択なしで成長培地に2日間置いた後、成長培地に、600g/mLのハイグロマイシンを補充し、これにより、安定な組込み体を欠如している細胞
を選択する。3週間後に、成功した実験では、エレクトロポレーションした細胞のおよそ約1%が安定な組込み体をもたらすように、コロニーを計数する。下流の実験の必要性に応じて、CHO Flp-In細胞を、分泌型又は膜結合型の抗体を有するように、操作する。当該技術分野において公知の他の方法を使用して、タンパク質発現構築物を、哺乳動物細胞のゲノムへと操作すること、たとえば、レトロウイルス、CRISPR/Cas9、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼのランダムな組込みを行うことができる。任意の方法を利用して、数千個、数万個、数十万個、数百万個、又は数億個の、目的とされる異なる転写産物及びタンパク質配列を発現する細胞クローンのライブラリーを得ることができる。一部の実施形態において、例示的な標的ライブラリーは、2つの異なる哺乳動物クローンに操作された、NY-ESO-1標的配列(配列番号13)、又はMART-1標的配列(配列番号16)を含む。
【００８６】
2)機能性アッセイのための標的細胞、中間細胞、及びインデューサー細胞の調製
本発明の一部の態様は、単一クローン細胞をそれらの標的細胞とともに、又は単一クローン細胞を中間細胞及び標的細胞とともに、区画化する方法に関する。高スループット分析を容易にするために、細胞の区画化は、液滴マイクロ流体チップを使用した、油中水型液滴への封入によって、達成することができる。当該技術分野において公知の任意のマイクロ流体チップを、利用することができる。たとえば、本発明の様々な実施形態に使用することができるマイクロ流体チップには、ガラス、プラスチック、PDMS、又は他のポリマーから製造されたものが含まれるが、これらに限定されない。1つの特定の実施形態では、チャネルがチップの長さの大半に50μm×150μmでエッチングされており、液滴が生成される交差部では、55μmに狭まっている、ガラスで製造されたマイクロ流体チップが利用される。流体は、圧力ポンプ又はシリンジポンプを使用して、マイクロ流体チップにポンプ注入される。細胞が、2つの流れで液滴に注入される。たとえば、APCが1つの流れで注入され、TCRを発現する細胞が第2の流れで注入される。典型的には、APCを含有するほとんどの液滴が、単一のAPCしか含まないように、TCRを発現する細胞は、1マイクロリットル当たり10,000〜20,000個の細胞で注入され、APCは、それよりもわずかに低い濃度、たとえば、1マイクロリットル当たり2,000〜5,000個の細胞で注入される。細胞混合物を含む液滴は、20〜200μmの範囲である。インデューサー細胞と標的細胞との比は、適用ごとに変動するが、区画が、単一のインデューサー細胞を含み、クローン細胞とその標的との間の機能的相互作用の検出を可能にすることが、望ましい。一部の実施形態において、細胞は、水溶液ではなく、ゲルに封入される。たとえば、目的の細胞を埋め込み、封入するために、アガロースゲルが使用される。クローンライブラリーのサイズが、遺伝学的に異なるクローン10,000個を上回らなければ、96ウェルプレート、384ウェルプレート、又はマイクロ流体チャンバチップなどの反応容器を使用することができる。フローサイトメトリー又は手作業によるピペッティングを使用して、細胞を、96ウェルプレートに分配してもよい。細胞は、圧力ポンプ又はシリンジポンプを使用して、マイクロ流体容器チップ(たとえば、Fluidigmなどの供給業者から入手)に分配することができ、マイクロ流体マイクロウェルバルブを使用して、細胞をマイクロ流体チャンバに捕捉する。細胞の混合物の区画化に液滴を使用するか反応容器を使用するかに関係なく、細胞の混合物は、インデューサー細胞が、標的細胞及び/又は中間細胞における転写の変化を誘導するのを可能にする様式で、たとえば、組織培養インキュベーターにおいて37℃で、10%ウシ胎仔血清(FCS)を補充したRPMI、DMEM、又はIMDMでインキュベートされ得る。
【００８７】
一部の実施形態において、ガラス製マイクロ流体チップを使用して、CHO細胞を、油相がフルオロカーボン油及び界面活性剤を含む、10% FCSを含むRPMI中の半径35μmの液滴に注入する。死細胞及び生細胞を染色するために、それぞれ、Sytox Orange及びカルセイン-AM(ThermoFisher)を、培地に含める。次いで、フルオロカーボン油の蒸発は予防するが、ガス交換は可能にするように、エマルジョンに、鉱油の層を重ねる。エマルジョンを、次いで、従来的な組織培養インキュベーターにおいて、37℃、5% CO2で、微量遠心管でインキュベートする。次いで、蛍光顕微鏡を使用して、生/死の染色を評価する。典型的な実験において、49/50個の細胞が、16時間後に依然として生存しており、45/50個の細胞が、24時間後に依然として生存している。72時間後には、細胞のうちの85%よりも多くが、依然として無傷であるが、生/死の判定に十分な蛍光は発さない。
【００８８】
エマルジョンマイクロ液滴においてインキュベートした標的細胞及びインデューサー細胞を、溶解して、複数のポリ核酸を生成することができ、このポリ核酸により、インデューサー細胞に由来するクローン配列が、標的細胞に由来する誘導された転写産物と融合される。このようなプロトコールは、インデューサークローンと標的細胞との間の適切なペアリングを保持することができる。機能性研究に最適な細胞培養培地は、必ずしも、細胞の溶解及び酵素的ポリ核酸増幅に最適ではない。この問題に対処するために、細胞を含有する液滴を、溶解/ビーズ混合物と融合させる、液滴マイクロ流体チップ設計を使用してもよい。
【００８９】
一部の実施形態において、2つの液滴が、同じ体積の単一の液滴よりも大きな界面面積を有する場合に、液滴融合が界面力によって駆動される。この状況を達成するために、2つの液滴を分離している連続相を、除去してもよい。たとえば、2つの液滴が、互いに緊密に接触している場合、液滴間の分子引力に起因して、2つの液滴の間に、薄い液体のブリッジが形成される。ブリッジの周囲に形成される屈曲メニスカスは、表面張力の不均衡をもたらし、これにより、2つの液滴が急速に統合される。エマルジョンマイクロ液滴の融合は、受動的であるか(すなわち、外部エネルギーを必要としない)又は能動的であるか(すなわち、外部エネルギーを必要とする)のいずれかである(たとえば、Xu Micro and Nanosystems 2011 3:131-136に要約される)。受動的方法は、マイクロチャネルの構造又はマイクロチャネルの表面特性に依存し得る。一方で、能動的な液滴の合体は、外部供給源によって、たとえば、磁場、電場、又は温度場を適用することによって、供給されるエネルギーを使用し得る。
【００９０】
1つの例示的な実施形態において、PDMSで製造される1つのチップ設計は、2つの水インプットチャネル及び2つの油インプットチャネルを含む。水/油インプットは、2対となっている、すなわち、1つの水注入口が、1つの油注入口と対になっている。一方の水/油注入口の対は、幅又は直径がおよそ100μmであり、他方は、幅又は直径がおよそ50μmである。約40μmのエマルジョンマイクロ液滴中の細胞の混合物を、およそ100mbarに設定した圧力ポンプを使用して、50μmのチャネルに注入する。約80μmの液滴中の、水性結合緩衝液中のオリゴ-dT磁気ビーズ及びTween-20界面活性剤の混合物を、およそ100mbarに設定した圧力ポンプを使用して、100μmのチャネルに注入する。液滴流は、注入ラインの圧力又は流速によって制御される周期性で一緒に流動するように、単一のチャネルに統合される。2つの油注入ラインを使用して、それぞれの細胞混合物の液滴が、単一の溶解及びビーズ混合物の液滴と対になるような液滴周期性が達成される。電源装置(Mastech)及びインバータ(TDK)を使用して、7VのAC電流を、160μmストレッチの広がった液滴共流動チャネルに適用する。1MのNaCl溶液を、液滴共流動チャネルに接続されていないが、AC電流が160μmストレッチの広がった共流動チャネルに伝導されるのに十分に近接しているチャネルに注入することによって、電流が適用される。約80μmの溶解/ビーズ混合物の液滴は、広くなったチャネルでは、わずかに減速され、変形する。約40μmの細胞混合物の液滴は、広くなったチャネルで減速せず、それぞれの細胞液滴が、溶解/ビーズの液滴と確実に接触するようになっている。電流の同時適用により、融合し、希釈された液滴が得られ、これを、次いで、チップの外でインキュベートして、ポリ(A)RNAをオリゴ-dTビーズに結合させる。この設定での典型的な実験では、100%細胞溶解で、1秒当たり約500個の液滴のスループットで、98%を上回る液滴融合が達成される。
【００９１】
TCRとそのコグネイトペプチド:MHC標的との間の相互作用は、TCRを発現する細胞(たとえば、初代T細胞又はTCR操作Jurkat細胞)及びペプチド:MHCを発現する細胞(たとえば、初代APC又は操作APC)の両方における転写応答を誘導し得る。どの機能性細胞相互作用が目的とされるかに応じて、プライマーセットは、ペプチド:MHC配列をT細胞転写応答と関連付けるか、又はTCR配列をAPC転写応答と関連付けるように設計することができる。一部の実施形態において、相互作用を包括的に調べること、たとえば、ペプチド:MHC、TCR、T細胞応答、及びAPC応答を関連付けることが、望ましい。ペプチド:MHC配列を、T細胞転写応答と関連付けるために、APCを、上述の区画化方法を使用して、コンビナトリアルスクリーニングにおいて、エマルジョンマイクロ液滴中でTCRを発現する細胞とともにインキュベートしてもよい。組換えAPCを、ライブラリー内のそれぞれのペプチド:MHC標的を示す特定のバーコードとともに、ペプチド:MHC標的のライブラリーを発現するように操作してもよい。エマルジョンマイクロ液滴中で6時間、12時間、18時間、24時間、36時間又はそれ以上インキュベートした後、細胞混合物のエマルジョンマイクロ液滴を、上述の方法を使用して、溶解/ビーズのエマルジョンマイクロ液滴と融合してもよい。RNAが結合したビーズを、次いで、多重OE-RT-PCRのために、エマルジョンマイクロ液滴に注入してもよい。少なくとも1つのT細胞活性化マーカー、たとえば、インターフェロンガンマ(IFNg)、CD69、又はインターロイキン-2(IL-2)を増幅させるプライマーを、エマルジョンマイクロ液滴に導入してもよい。バックグラウンドゲノムDNAからの増幅が生じず、アンプリコンのサイズが100bp〜300bpとなるように、プライマーを、イントロン全体に及ぶように設計してもよい。一部の実施形態において、それぞれのT細胞活性化プライマー対の一方のプライマーは、バーコード増幅プライマー対の一方のプライマーに対する相補性を有するポリ核酸部分配列を有する。相補的な部分配列は、OE-RT-PCR中にハイブリダイズするため、複数の連結したアンプリコンが生成される。このようにして、ペプチド:MHC標的配列が、T細胞における機能性応答に関連付けられる。例示的な実施形態において、標的ライブラリーは、NY-ESO-1標的配列(配列番号13)のポリヌクレオチド及びMART-1標的配列(配列番号16)のポリヌクレオチド、並びに標的バーコードプライマー(配列番号14〜15)、IFNGのプライマー(配列番号25〜26)、及びIL-2のプライマー(配列番号27〜28)を含むプライマーセットを有するように操作されたクローンを含む。シーケンシングアダプター(たとえば、Illuminaシーケンシングアダプター)を、上述のネスト型尾部末端PCR(nested, tailed-end PCR)を使用して、連結したアンプリコンのライブラリーに付加してもよい。ペプチド:MHC及びT細胞活性化マーカーのペアリングは、連結したアンプリコンのディープシーケンシング、たとえば、連結したペプチド:MHC及びT細胞活性化マーカー複合体のライブラリーから、100,000個、100万個、又は1000万個の配列を得ることによって、特定及び定量化することができる。次いで、バイオインフォマティクスを使用して、シーケンシングしたバーコードを、上述の方法のいずれかを使用して生成された、ペプチド:MHCバーコードのデータベースを探索することによって、ペプチド:MHCと対応させることができる。一部の実施形態において、TCR配列をペプチド:MHC配列と、及びTCR配列をT細胞活性化マーカーと連結させる、ハイブリダイズしたアンプリコンを並行して生成することが有益である。そのような実施形態については、OE-RT-PCR増幅混合物はまた、TCRβポリ核酸を、ペプチド:MHCバーコード及び/又はT細胞活性化マーカーと連結させる、プライマーも含み得る。TCRプライマーセットは、TCRβ V領域の最も5'末端側から、Cβ領域にあるユニバーサルプライマーまでを増幅させることができる。Cβプライマーは、バーコード増幅プライマー対に由来する1つのプライマー及びT細胞活性化マーカープライマー対のそれぞれに由来する1つのプライマーに対する相補性を有するポリ核酸部分配列を有し得る。TCRβアンプリコンは、サイズが約400〜500bpであり得る。ペプチド:MHCバーコードのプライマー、T細胞活性化マーカーのプライマー、及びTCRβのプライマーを含む、プライマーセットにより、以下のアンプリコン:T細胞活性化マーカーに連結したペプチド:MHC、ペプチド:MHCに連結したTCRβ、及び/又はT細胞活性化マーカーに連結したTCRβを生成することができる。シーケンシングアダプター(たとえば、Illuminaアダプター)を、上述のように、ネスト型尾部末端PCRを使用して、これらのアンプリコンに付加してもよい。ライブラリー(たとえば、Illuminaライブラリー)を、次いで、ディープシーケンシングして、100,000個、100万個、又は1000万個の配列を得ることができる。次いで、バイオインフォマティクスを使用して、未加工の配列をプロセシングした後、ペプチド:MHCとTCRβ、TCRβとT細胞活性化マーカー、及び/又はペプチド:MHCとT細胞活性化マーカーと対応させることができる。このようにして、コンビナトリアルスクリーニングにより、目的の細胞表現型に結合し、それを活性化する、ペプチド:MHCとTCRとのコグネイトペアの一覧が得られる。さらにより包括的な混合物によっても、TCRαβ連結アンプリコンを生成することができ、その結果、APCとT細胞との間の相互作用を使用して、目的とされる連結したTCRαβを特定することができるようになり、これを、次いで、全長組換えTCRαβとして発現させ、さらに、in vitro及びin vivoでの機能が分析される。
【００９２】
他のT細胞機能性応答が目的とされる場合には、他のプライマー混合物を使用することができる。たとえば、いわゆる免疫「チェックポイント」遺伝子は、T細胞活性の共刺激性又は共阻害性制御因子としての機能を果たす。チェックポイント分子は、典型的に、任意T細胞又はT細胞標的細胞の表面上に発現され、同じ細胞又は別の細胞の表面上の他の共刺激性又は共阻害性分子と相互作用する。チェックポイント分子、及びがん療法における「チェックポイント阻害」の有用性は、当該技術分野において公知である(たとえば、Shin Current Opinion in Immunology 2015, 33:23-35)。これらの共刺激性又は共阻害性分子のネットワークは、モノクローナル抗体を含む様々な分子によって、活性化又はアンタゴナイズされ、そのような調節性分子は、T細胞表現型に変化をもたらす。活性化若しくはアンタゴナイズする分子、又は未知の機能を有する分子の様々な組合せに対して、コンビナトリアルスクリーニングを行って、標的T細胞における転写の変化を誘導することができる。これは、たとえば、抗体を分泌するCHO細胞(インデューサー細胞)のライブラリーを、チェックポイント発現細胞(標的細胞、たとえば、T細胞)をとともに区画化することによって、達成することができる。一部の実施形態において、チェックポイント発現細胞は、操作されていない初代T細胞、又はチェックポイント受容体タンパク質を発現するように形質導入された初代T細胞である。抗体を分泌するCHO細胞は、チェックポイント分子に対する公知の活性を有する抗体のライブラリー、又は未知の機能を有する抗体のライブラリー、たとえば、チェックポイントタンパク質で免疫付与したマウスから単離した抗体発現細胞から生成したライブラリーを含み得る。いずれの状況においても、抗体発現細胞は、チェックポイントを発現する標的細胞とともに、エマルジョンマイクロ液滴区画中に単離することができる。この状況における抗体発現細胞と標的細胞との比は、1:1、1:2、若しくは1:5であってもよく、又は抗体の機能が未知である場合には、それらの間の任意の比であってもよい。チェックポイント分子の発現を誘導する抗体の組合せを特定することが目標である場合、この状況における抗体発現細胞と標的細胞との最適な比は、1:1、2:1、又は5:1である。エマルジョンマイクロ液滴中で6時間、12時間、18時間、24時間、36時間又はそれ以上インキュベートした後、細胞混合物のエマルジョンマイクロ液滴を、上述の方法を使用して、溶解/ビーズのエマルジョンマイクロ液滴と融合してもよい。RNAが結合したビーズを、次いで、多重OE-RT-PCRのために、エマルジョンマイクロ液滴に注入してもよい。この適用において、OE-RT-PCRのプライマーは、抗体特異的プライマー及びチェックポイント分子特異的プライマーを含み得る。抗体プライマープールは、重鎖定常(C)領域のユニバーサルプライマーを含み得る。これにより、J領域プライマーの大型プールの必要性が抑制される。プライマープールはまた、IgGのすべての可能性のあるVセグメントに結合するプライマーを含み得る。プライマーは、それぞれのIgモノマーの完全な可変領域全体、すなわち、重鎖及び軽鎖IgのFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を増幅させることができる。抗体重鎖のアンプリコンは、400〜450bpであり得る。少��くとも1つのチェックポイント転写産物プライマー対、たとえば、LAG-3、PD-1、TIM-3、CEACAM-1、CD200R、CTLA-4、TIGIT、又はBTLAのプライマー対が、含まれ得る。一般的な増殖又は活性化のマーカー、たとえば、IFNg又はIL-2もまた、含まれ得る。一部のプライマープールには、これらの転写産物のすべて、又は一覧のサブセットのプライマーが含まれる。プライマープールはまた、T細胞の全トランスクリプトームも含み得る。プライマーは、バックグラウンドゲノムDNAが、増幅シグナルに混入しないように、イントロン全体に及ぶように設計してもよい。これらの転写産物のアンプリコンは、100〜300bp、200〜500bp、300〜600bp、又は1000bp未満であり得る。抗体C領域プライマーは、チェックポイント転写産物のそれぞれのプライマー対の一方のメンバーの部分配列との逆相補性を有する部分配列を含み得る。相補的なポリ核酸部分配列は、OE-RT-PCRにより、CHO細胞に由来する抗体配列を、標的細胞に由来するチェックポイント配列と連結させる、メジャーアンプリコンを生成することを可能にする。シーケンシングアダプター(たとえば、Illuminaシーケンシングアダプター)を、上述のネスト型尾部末端PCRを使用して、連結したアンプリコンのライブラリーに付加してもよい。抗体及びT細胞チェックポイントマーカーのペアリングは、連結したアンプリコンをディープシーケンシングすることによって、たとえば、連結した複合体のライブラリーから、100,000個、100万個、又は1000万個の配列を得ることによって、特定及び定量化することができる。次いで、バイオインフォマティクスを使用して、それぞれの目的とされる抗体に連結したチェックポイント転写産物を定量化することができる。一部の実施形態において、反応性T細胞クローンのクローン性を特定することが有益である。たとえば、複数の抗体発現CHO細胞を、標的細胞とともにエマルジョンマイクロ液滴中に単離する場合、抗体の機能的組合せが、目的とされ得る。この状況において、T細胞クローンは、TCRβプライマーをOE-RT-PCR混合物に含めることによって、特定することができる。一部の実施形態において、バーコードが、抗体の組合せに対して反応性のT細胞クローンを特定するために使用されるように、T細胞を、バーコードを有する転写産物を発現するように操作することができる。任意の実験的設計において、バルクシーケンシングデータは、共刺激性及び共阻害性のチェックポイント分子間での機能的関係性の特定について、有用性を有し得る。たとえば、OX40の活性化は、PD-1又はCTLA4の下方制御をもたらし得、PD-1の阻害は、OX40の活性化をもたらし得るなどである。別の実施例において、抗体配列を、IFNg及びIL-2の増殖及び活性化マーカーと関連付ける、複数の大規模なバルクシーケンシングデータによって明らかなように、2つの抗体の混合物は、任意の他の混合物よりも効率的に、T細胞を活性化する。本発明の一部の実施形態において、目的とされる転写産物は、上方制御されるか又は下方制御されるかのいずれかである。
【００９３】
一部の実施形態において、NK細胞の活性(中間細胞)を、抗体発現細胞(インデューサー細胞)と連結させる、プライマーセットを使用することができる。たとえば、CHO細胞集団は、分泌された抗体のライブラリーを発現するように操作される。別のCHO細胞集団は、目的の抗原を発現するように操作される。あるいは、腫瘍細胞が、抗原発現細胞として使用される。典型的なコンビナトリアルスクリーニングにおいて、数十個、数百個、数千個、数十万個、又は数百万個の抗体発現CHOクローンのライブラリーに由来する複数の単一細胞を、抗原発現細胞とともに区画化する。抗原発現細胞が、多様なクローン集団を含む場合、抗体発現細胞と抗原発現細胞との比は、1:2、1:1、2:1、又はこれらの間の任意の比であり得る。抗原発現細胞が、がん細胞を含む場合、抗体発現細胞とがん細胞との比は、1:1、1:5、1:10、1:100、又はこれらの間の任意の比であり得る。抗体発現細胞と抗原発現細胞との混合物を、NK細胞とともに、エマルジョンマイクロ液滴中に区画化することができる。抗体発現細胞は、抗体発現細胞と標的細胞との直接の細胞間相互作用を通じてではなく、分泌された抗体が標的細胞に結合することによって、NK細胞の発現に変化を誘導するため、NK細胞を、中間細胞と称する。エマルジョンマイクロ液滴中で6時間、12時間、18時間、24時間、36時間又はそれ以上インキュベートした後、細胞混合物のエマルジョンマイクロ液滴を、上述の方法を使用して、溶解/ビーズのエマルジョンマイクロ液滴と融合してもよい。RNAが結合したビーズを、次いで、多重OE-RT-PCRのために、エマルジョンマイクロ液滴に注入してもよい。この適用において、OE-RT-PCRのプライマーは、抗体特異的プライマー及びNK活性化プライマーを含み得る。抗体特異的OE-RT-PCRプライマーは、上述されている。活性化されると上方制御される、NKの転写産物としては、エフェクター(IFNg、TNFa)、プロテアーゼ(グランザイムA[Gzma]、グランザイムB[Gzmb])、転写因子(Tボックス転写因子21[Tbx21/T-bet]、エオメソデルミン(Eomesodermin)[Eomes]、PUボックス転写因子[PU.1]、DNA結合の阻害剤2[Id2])、並びにシグナル伝達アダプタータンパク質(DAP12、脾臓関連チロシンキナーゼ[Syk]、ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70[Zap70])を挙げることができる。目的とされる転写産物はまた、NK細胞が活性化されると下方制御される標的も含み得る。NK細胞活性化プライマーセットは、少なくとも1つのNK細胞活性化転写産物標的を含み得、たとえば、これらは、2個、5個、10個、100個、若しくは1,000個の標的、又はNK細胞の全トランスクリプトームを含み得る。プライマーは、バックグラウンドゲノムDNAが、増幅シグナルに混入しないように、イントロン全体に及ぶように設計してもよい。NK活性化転写産物のアンプリコンは、100〜300bp、200〜500bp、又は1000bp未満であり得る。抗体C領域プライマーは、NK細胞活性化転写産物のそれぞれのプライマー対の一方のメンバーの部分配列との逆相補性を有する部分配列を含み得る。相補的なポリ核酸部分配列は、OE-RT-PCRにより、CHO細胞に由来する抗体配列を、NK細胞活性化配列と連結させる、メジャーアンプリコンを生成することを可能にする。一部の実施形態において、プライマーセットの例は、IGG V遺伝子のプライマー(たとえば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び配列���号4)、GZMBのプライマー(たとえば、配列番号9及び配列番号10)、並びにTBX21のプライマー(たとえば、配列番号11及び配列番号12)を含む。シーケンシングアダプター(たとえば、Illuminaシーケンシングアダプター)を、上述のネスト型尾部末端PCR(nested, tailed-end PCR)を使用して、連結したアンプリコンのライブラリーに付加してもよい。抗体及びNK細胞活性化マーカーのペアリングは、連結したアンプリコンをディープシーケンシングすることによって、たとえば、連結した複合体のライブラリーから、100,000個、100万個、又は1000万個の配列を得ることによって、特定及び定量化することができる。次いで、バイオインフォマティクスを使用して、それぞれの目的とされる抗体に連結したNK活性化転写産物を定量化することができる。このようにして、NK細胞を誘導する抗体を、NK細胞(中間細胞)、抗原発現細胞(標的細胞)、及び抗体発現細胞(インデューサー細胞)の3つの細胞型を含む、機能性アッセ
イを通じて特定することができる。
【００９４】
一部の実施形態において、標的細胞において誘導された転写産物は、特徴付けられていないか、又は標的応答の転写シグネチャーは、複雑であり、数百個又は数千個の転写産物の定量化を必要とする。それらの事例では、遺伝子標的の全トランスクリプトームを定量化する方法を、使用することができる。たとえば、固有のポリ核酸バーコードを、上述の方法を使用して、固体支持体、たとえば、ビーズに固定し、細胞混合物とともにエマルジョンマイクロ液滴に送達する。オリゴ-dT部分配列も含む、ビーズからバーコード化したポリ核酸を使用して、標的細胞の全トランスクリプトームをバーコード化することができる。これは、OE-RT-PCR又は第一鎖標識化を通じて達成することができる。次いで、OE-RT-PCR又はOE-PCRを使用して、インデューサークローンを示すポリ核酸配列を含むメジャーアンプリコンを生成することができる。たとえば、ペプチド:MHCを、TCR発現細胞の全トランスクリプトームに連結させてもよく、又は抗体発現細胞に由来する抗体配列を、T細胞の全トランスクリプトームに連結させてもよい。インデューサークローンが、標的細胞と直接的に相互作用しない場合、たとえば、上述のように、抗体が腫瘍細胞に結合することによってNK細胞が活性化される場合には、そのような方法もまた、可能である。ネスト型尾部末端PCRを使用して、シーケンシングアダプター(たとえば、Illuminaシーケンシングアダプター)を、複数のメジャーアンプリコンに結合してもよい。次いで、バルクシーケンシングを行って、数十万個、数百万個、数億個、数十億個の配列を得ることができる。バイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して、インデューサー細胞に応答して、上方又は下方制御される、標的細胞又は中間細胞における転写産物を特定することができる。そのような方法を使用して、機能性細胞相互作用の新規なバイオマーカーを発見することができる。
【００９５】
上述の方法は、例として提供されるものであり、その任意の変化形を取り入れて、同様の有用性を達成することができる。たとえば、核酸増幅は、パドロックプローブ又はリガーゼ連鎖反応を通じて達成することができる。上述のプロトコールの大半は、クローンの特定にRNA配列を使用するが、クローンの特定に、ゲノムDNA配列を使用することも可能である。たとえば、インデューサークローンのライブラリーを、指向型CRISPR/Cas9ゲノム編集、又はインデューサークローンのライブラリーへの目的のポリ核酸のランダムな挿入によって、作製してもよい。そのような状況において、目的とされるゲノムDNA配列を、増幅させ、標的細胞における転写産物に連結させてもよい。一部の適用において、転写の変化以外の変化が、標的細胞において誘導されてもよい。たとえば、インデューサー細胞は、標的細胞のゲノムにおけるエピジェネティックな変化を誘導し得る。一部の適用において、インデューサー細胞は、標的細胞のタンパク質プロファイルを変化させ得る。インデューサー細胞におけるクローンの特定のために、バーコード化した抗体を、増幅させ、ポリ核酸配列に連結することができるように、そのような変化は、核酸バーコード化した抗体を標的細胞に結合させることによって、定量化することができる。
【００９６】
本発明の一部の実施形態において、ポリ核酸バーコードは、標的細胞及びインデューサー細胞を含む混合物を含有する液滴又は容器に送達される。このポリ核酸バーコードは、固体支持体、たとえば、ビーズ、抗体、又は細胞に固定することができる。細胞は、溶解させることができ、細胞の混合物に由来するRNAは、ポリ核酸バーコードに融合される。標的細胞及びインデューサー細胞に由来する転写産物のcDNAを、次いで、シーケンシングし、ポリ核酸バーコードを使用して、液滴又は容器まで追跡することができる。したがって、一部の実施形態において、標的細胞及びインデューサー細胞に由来する転写産物のcDNAは、直接的に融合されるのではなく、むしろ、これらの組合せが、ポリ核酸バーコードによってバイオインフォマティクスで結びつけられる。
【００９７】
本発明の一部の実施形態において、細胞、細胞混合物、又はエマルジョンマイクロ液滴は、RFID、電気的にインデックスを付けた固体支持体、光によってトリガーされるマイクロトランスポンダー(たとえば、Mandeckiの米国出願第20160175801号)、量子ドット、比色分析インデックス、蛍光マーカー、又はポリ核酸に基づかない他の識別「バーコード」で、標識される。これらの識別子を使用して、クローンを特定するか、細胞の混合物をプロセシングするために使用される研究室プロトコールを記憶するか、又は生物学的アッセイの結果を示すことができる。そのような識別バーコードは、固体支持体、たとえば、一番大きな寸法が50ミクロン未満のマイクロチップ又はビーズに固定され得るか若しくはそれらを含み得るか、タンパク質に固定され得るか、又は刺激物質に応答する発現構築物として細胞に操作され得る。一部の実施形態において、TCR発現クローンの一集団、たとえば、CD4+T細胞を、同じRFIDバーコードで標識する。TCR発現クローンの第2の集団、たとえば、CD8+T細胞を、第2のRFIDバーコードで標識する。次いで、これらの2つの細胞集団を、混合する。本発明の一部の実施形態において、RFIDでタグ付けしたTCR発現クローンの集団を、上述のように、ペプチド:MHC発現細胞のライブラリーとともに、エマルジョンマイクロ液滴中に封入する。次いで、RFIDタグを使用して、マイクロ液滴を、CD4+及びCD8+エマルジョンに分類することができる。このようにして、RFIDバーコードにより、核酸バーコード又はTCRクローンをさらに脱多重化することができる。2個、10個、100個、1,000個、100,000個、又は数百万個の異なるRFID粒子を、使用することができる。一部の実施形態において、識別インデックスは、蛍光マーカーであり、細胞を含有する液滴は、フローサイトメトリー又はFACSによって分類される。一部の実施形態において、エマルジョンマイクロ液滴内で行われる生物学的アッセイは、蛍光マーカーの産生をもたらし、次いで、細胞を含有する液滴が、フローサイトメトリーによって分類される。一部の実施形態において、単一の蛍光波長が使用され、細胞を含有する液滴は、生物学的アッセイにおける陽性の読取りを示す、蛍光閾値に基づいて、陽性又は陰性として分類される。ポリ核酸バーコードは、RFIDを、ディープシーケンシングデータと関連付けるために、RFIDを有する粒子に固定され得る。RFIDを有する粒子はまた、薬物に浸漬してもよいか、又は抗体若しくはタンパク質でコーティングしてもよく、次いで、これを、機能性アッセイにおいて使用し、RFIDリーダーを用いて脱多重化することができる。一部の実施形態において、RFID、電気的にインデックスを付けた固体支持体、量子ドット、比色分析インデックス、蛍光マーカー、又はポリ核酸に基づかない他の識別「バーコード」を使用して、インキュベーションプロトコールを追跡する。たとえば、TCR発現細胞を、ペプチド:MHC発現細胞とともに、2時間、6時間、10時間、又はそれ以上インキュベートすることに、関心が持たれる。RFIDでタグ付けした固体支持体を、細胞混合物とともに、エマルジョンマイクロ液滴に送達する。次いで、エマルジョンマイクロ液滴を、3つの異なるインキュベーションレセプタクルに分類する。レセプタクルを、2時間、6時間、又は10時間、インキュベートする。分類の際に、RFIDを、RFIDリーダーによって読み取り、コンピューターを使用して、それぞれのプロトコールと関連付けられたRFIDを記録する。この方法により、複数のプロトコールが同時に実行される、コンビナトリアルスクリーニングが可能となる。異なるプロトコールは、異なる媒体、インキュベーション温度、相互作用する細胞、薬物、タンパク質、若しくは分子、温度、又はインキュベーション時間を含み得る。
【００９８】
本発明の一部の実施形態において、細胞を使用して、他の細胞における応答の誘導、及びクローンに固有なポリ核酸、たとえば、ポリ核酸バーコード若しくは可変性免疫受容体の区分けの両方が行われる。一部の実施形態において、細胞応答は、固体支持体、たとえば、ビーズ又はマイクロ流体チャンバに固定された、分子試薬によって誘導される。一部の実施形態において、分子試薬及び固体支持体は、細胞ではなく、インデューサーとしての機能を果たす。一部の実施形態において、分子試薬は、細胞又は固体支持体ではなく、繊維状ファージ、又は他の種類のウイルス若しくはウイルス様粒子によって、発現される。一部の実施形態において、粒子は、細胞ではなく、インデューサーとしての機能を果たす。ある特定の実施形態において、前記分子試薬は、サイトカインなどのタンパク質、又は有機薬物物質である。
【００９９】
一部の実施形態において、微生物細胞、たとえば、組換え操作酵母が、インデューサー細胞として使用される。たとえば、高速かつ安価なTCR及び抗体フラグメント(scFv)の発現のために、酵母ディスプレイ方法が、使用され得る。一部の実施形態において、in vivoでの相同性組換えのために、尾部末端PCRを使用して、ポリ核酸「アダプター」を、重鎖及び軽鎖連結アンプリコンに付加する。修飾されたDNAライブラリーを、次いで、GAL1/10プロモーター及びAga2細胞壁テザーを含有する直鎖化ベクター(pYD)を用いて、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞にエレクトロポレーションしてもよい。GAL1/10プロモーターは、ガラクトースを含有する培地において、scFvタンパク質の発現を誘導する。Aga2細胞壁テザーは、scFvを、酵母細胞表面に輸送し、scFvを、細胞外空間に係留するために、使用され得る。形質転換された細胞を、次いで、増殖させ、ガラクトースを用いて誘導することができる。scFvを発現する酵母ライブラリーが、次いで、インデューサークローンのライブラリーとして使用される。
【０１００】
3)高スループットの機能性分析
上述の方法のいずれかによって調製したクローン細胞のライブラリーは、バルクシーケンシングによって特徴付け及び定量化を行うことができる。任意の種類の機能性アッセイを行う前に、クローン集団の内容物の特徴付け及び定量化を行うことが、有用であり得る。たとえば、クローン集団を生成する方法は、いくつかの技術的ステップを含み得るが、これらは、時折、不適切な結果をもたらす可能性があり、したがって、品質管理として、ディープシーケンシングが行われ得る。RNAを、クローン細胞集団から単離し、次いで、RT-PCRに供して、バルクシーケンシングのためのDNAライブラリーを作製してもよい。ライブラリーが、抗体又はTCRを含む場合、RT-PCRは、転写産物の5'末端においてV遺伝子プライマーのプール及び転写産物の3'末端においてC遺伝子プライマーを使用して、行ってもよい。転写産物特異的配列に加えて、RT-PCRプライマーは、バルクシーケンシング(たとえば、Illuminaシーケンシング)を可能にするポリ核酸配列を含む部分配列を含み得る。これらのポリ核酸配列は、シーケンシングアダプター(たとえば、Illuminaシーケンシングアダプター)と称され、合成によるブリッジ増幅及びシーケンシングが生じるように、ライブラリーのバルクシーケンシングフローセルへのハイブリダイゼーションを可能にする。同様の方法を、バーコード化したcDNAライブラリー又は単一細胞クローンまで追跡することが可能な任意の他のRNAに使用することができる。Pacific Biosciences、Oxford Nanopore、及びRocheなどの商業的供給業者によって提供されているシーケンシング方法は、Illuminaによって提供されている方法と同様の有用性を有する。
【０１０１】
バルクシーケンシングにおいて、読取りのエラーは、生物学的変動と区別することが困難であり得るが、これにより、クローンの特定が複雑化している。ベースコールエラーの頻度を低減させるために、当該技術分野において公知の予測されるエラーのフィルタリング方法、たとえば、Edgar及びFlyvbjergの方法(Bioinformatics 2015 Nov 1;31(21):3476-82)を、使用することができる。たとえば、読取りの予測されるエラー数(E)は、そのPhredスコアから計算することができる。Eが1を上回る読取りは、破棄され、最も確率の高いベースコールエラー数がゼロである読取りが、残る。珍しいバリアントに対して高い感度が必要とされる場合、より大きなEの値を、使用してもよい。追加の品質フィルターとして、単一要素の読取り(すなわち、1回しか見出されない配列を有する読取り)を、破棄してもよいが、シーケンシングエラーは、偶発的に再生成される可能性が低いため、2回以上見出される配列は、正しい可能性が高いことに留意されたい。
【０１０２】
上述の方法は、活性化又は不活性化を測定する生物学的アッセイ、並びに転写産物の上方制御又は下方制御を測定する生物学的アッセイに、互換可能に使用することができる。生物学的アッセイを使用して、転写産物の上方制御及び下方制御の両方を、同時に測定することができる。
本発明は、以下の実施形態にも関する。
［１］  生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの単一の標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞とを単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞及び前記1つ以上のインデューサー細胞を含む、ステップと、
溶解試薬を含有する水溶液を、前記単分散エマルジョンマイクロ液滴に導入し、それによって、単離した細胞の溶解を誘導するステップと、
単離した細胞から放出されたRNAを、固体表面上に捕捉するステップと、
単離した細胞に由来する転写産物を含むハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップであって、ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、前記単一の標的細胞における転写の変化を示す、ステップと
を含む、方法。
［２］  前記ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、1つ以上のインデューサー細胞における転写の変化をさらに示す、上記[1]に記載の方法。
［３］  前記1つ以上のインデューサー細胞における転写の変化が、遺伝子の転写産物の10倍未満の増加を含む、上記[2]に記載の方法。
［４］  前記複数の標的細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数の標的細胞クローンのそれぞれの標的細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、上記[1]に記載の方法。
［５］  前記複数のインデューサー細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数のインデューサー細胞クローンのそれぞれのインデューサー細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、上記[1]に記載の方法。
［６］  前記標的細胞クローンの遺伝的多様性が、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって生じる、上記[4]に記載の方法。
［７］  前記インデューサー細胞クローンの遺伝的多様性が、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって生じる、上記[5]に記載の方法。
［８］  RNA捕捉が、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用して行われ、それぞれのビーズが、10μm未満の直径を有する、上記[1]に記載の方法。
［９］  ハイブリダイズしたポリ核酸が、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される、上記[1]に記載の方法。
［１０］  ハイブリダイズしたポリ核酸が、第一鎖合成によって生成される、上記[1]に記載の方法。
［１１］  第1の細胞型が、T細胞受容体を発現する細胞のライブラリーである、上記[1]に記載の方法。
［１２］  第1の細胞型が、抗体を発現する細胞のライブラリーである、上記[1]に記載の方法。
［１３］  第1の細胞型が、ペプチド:MHCを発現する細胞のライブラリーである、上記[1]に記載の方法。
［１４］  第1の細胞型が、ポリ核酸バーコードを発現する細胞のライブラリーである、上記[1]に記載の方法。
［１５］  細胞が、マイクロ流体技術を使用して、エマルジョン中に単離される、上記[1]に記載の方法。
［１６］  上記[1のハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを含む、組成物。
［１７］  少なくとも10,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む、上記[16]に記載の組成物。
［１８］  少なくとも1,000,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む、上記[17]に記載の組成物。
［１９］  細胞集団の機能性分析のための方法であって、上記[1のハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングすることを含む、方法。
［２０］  上記[16]に記載の組成物から生成される、組換えタンパク質のライブラリーを含む、組成物。
［２１］  組換えタンパク質のライブラリーが、T細胞受容体を含む、上記[20]に記載の組成物。
［２２］  組換えタンパク質のライブラリーが、ペプチド:MHCを含む、上記[20]に記載の組成物。
［２３］  組換えタンパク質のライブラリーが、抗体を含む、上記[20]に記載の組成物。
［２４］  第1のプローブ及び第2のプローブを含む、組成物であって、
第1のプローブが、第1の細胞型のインデューサー細胞の転写産物に相補的な第1の部分配列と、第2のプローブの少なくとも一部に相補的な第2の部分配列とを含み、その転写産物が、第1の細胞型に固有であり、
第2のプローブが、第2の細胞型の標的細胞の異なる転写産物に相補的な第3の部分配列と、第1のプローブの少なくとも一部に相補的な第4の部分配列とを含み、異なる転写産物の量が、標的細胞をインデューサー細胞とともにインキュベートすると変化する、組成物。
［２５］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、T細胞受容体をコードする、上記[24]に記載の組成物。
［２６］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、抗体をコードする、上記[24]に記載の組成物。
［２７］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ペプチド:MHCをコードする、上記[24]に記載の組成物。
［２８］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ポリ核酸バーコードをコードする、上記[24]に記載の組成物。
［２９］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、組換えタンパク質をコードする、上記[24]に記載の組成物。
［３０］  生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞とを単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞及び前記1つ以上のインデューサー細胞を含む、ステップと、
単離した細胞から、RNAを単離するステップと、
上記[24]に記載の組成物を使用して、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップと、
ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングするステップとを含む、方法。
［３１］  生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの単一の標的細胞と、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞と、第3の細胞型の複数の中間細胞クローンからの1つ以上の中間細胞とを単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞、前記1つ以上のインデューサー細胞、及び前記1つ以上の中間細胞を含むステップと、
溶解試薬を含有する水溶液を、前記単分散エマルジョンマイクロ液滴中に導入し、それによって、単離した細胞の溶解を誘導するステップと、
単離した細胞から放出されたRNAを、固体表面上に捕捉するステップと、
単離した細胞に由来する転写産物を含むハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップであって、ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、単一の中間細胞における転写の変化を示す、ステップと
を含む、方法。
［３２］  前記ハイブリダイズしたポリ核酸が、単離した細胞をインキュベートするステップの後の、1つ以上の中間細胞における転写の変化を示す、上記[31]に記載の方法。
［３３］  前記1つ以上の中間細胞における転写の変化が、遺伝子の転写産物の10倍未満の増加を含む、上記[32]に記載の方法。
［３４］  前記複数の標的細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数の標的細胞クローンのそれぞれの標的細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、上記[31]に記載の方法。
［３５］  前記複数のインデューサー細胞クローンが、10,000個を上回る固有の細胞クローンを含み、複数の細胞クローンのそれぞれのインデューサー細胞クローンが、互いに遺伝学的に異なる、上記[31]に記載の方法。
［３６］  前記標的細胞クローンの遺伝的多様性が、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって生じる、上記[34]に記載の方法。
［３７］  前記インデューサー細胞クローンの遺伝的多様性が、核酸配列のライブラリーを、少なくとも100,000個の細胞の集団に導入することによって生じる、上記[35]に記載の方法。
［３８］  RNA捕捉が、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用して行われ、それぞれのビーズが、10μm未満の直径を有する、上記[31]に記載の方法。
［３９］  ハイブリダイズしたポリ核酸が、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される、上記[31]に記載の方法。
［４０］  ハイブリダイズしたポリ核酸が、第一鎖合成によって生成される、上記[31]に記載の方法。
［４１］  第1の細胞型が、T細胞受容体を発現する細胞のライブラリーである、上記[31]に記載の方法。
［４２］  第1の細胞型が、抗体を発現する細胞のライブラリーである、上記[31]に記載の方法。
［４３］  第1の細胞型が、ペプチド:MHCを発現する細胞のライブラリーである、上記[31]に記載の方法。
［４４］  第1の細胞型が、ポリ核酸バーコードを発現する細胞のライブラリーである、上記[31]に記載の方法。
［４５］  細胞が、マイクロ流体技術を使用して、エマルジョン中に単離される、上記[31]に記載の方法。
［４６］  上記[31のハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを含む、組成物。
［４７］  少なくとも1,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む、上記[46]に記載の組成物。
［４８］  少なくとも10,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む、上記[47]に記載の組成物。
［４９］  少なくとも100,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む、上記[48]に記載の組成物。
［５０］  少なくとも1,000,000個の固有の配列のハイブリダイズしたポリ核酸を含む、上記[49]に記載の組成物。
［５１］  細胞集団の機能性分析のための方法であって、上記[31のハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングすることを含む、方法。
［５２］  上記[46]に記載の組成物から生成される、組換えタンパク質のライブラリーを含む、組成物。
［５３］  組換えタンパク質のライブラリーが、T細胞受容体を含む、上記[52]に記載の組成物。
［５４］  組換えタンパク質のライブラリーが、ペプチド:MHCを含む、上記[52]に記載の組成物。
［５５］  組換えタンパク質のライブラリーが、抗体を含む、上記[52]に記載の組成物。
［５６］  第1のプローブ及び第2のプローブを含む、組成物であって、
第1のプローブが、第1の細胞型のインデューサー細胞の転写産物に相補的な第1の部分配列と、第2のプローブの少なくとも一部に相補的な第2の部分配列とを含み、その転写産物が、第1の細胞型に固有であり、
第2のプローブが、第2の細胞型の中間細胞の異なる転写産物に相補的な第3の部分配列と、第1のプローブの少なくとも一部に相補的な第4の部分配列とを含み、異なる転写産物の変化の量が、中間細胞をインデューサー細胞及び標的細胞とともにインキュベートすると変化する、組成物。
［５７］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、T細胞受容体をコードする、上記[56]に記載の組成物。
［５８］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、抗体をコードする、上記[56]に記載の組成物。
［５９］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ペプチド:MHCをコードする、上記[56]に記載の組成物。
［６０］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、ポリ核酸バーコードをコードする、上記[56]に記載の組成物。
［６１］  前記第1の細胞型に固有の転写産物が、組換えタンパク質をコードする、上記[56]〜[60]のいずれかに記載の組成物。
［６２］  生体細胞の機能性分析のための方法であって、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中に、第1の細胞型の複数の標的細胞クローンからの標的細胞、第2の細胞型の複数のインデューサー細胞クローンからの1つ以上のインデューサー細胞、及び第3の細胞型の複数の中間細胞クローンからの1つ以上の中間細胞を単離するステップと、
単分散エマルジョンマイクロ液滴中の単離した細胞をインキュベートするステップであって、単離した細胞が、前記単一の標的細胞、前記1つ以上のインデューサー細胞、及び前記1つ以上の中間細胞を含む、ステップと、
単離した細胞から、RNAを単離するステップと、
上記[56]に記載の組成物を使用して、ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーを生成するステップと、
ハイブリダイズしたポリ核酸のライブラリーをディープシーケンシングするステップとを含む、方法。
【実施例】
【０１０３】
[実施例1]
Fcバリアント又は変異体の機能性分析
治療用抗体薬は、様々な機序によって機能する。治療用抗体薬機能の2つの一般的な機序は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)及び補体依存性細胞毒性(CDC)である。ADCC及びCDCのいずれも、抗体の結晶化能フラグメント(Fc)領域によって媒介される。ADCCにおいては、抗体の可変ドメインは、細胞の表面上に露出している抗原に結合する。十分な抗体分子がその抗原に結合すると、NK細胞が、Fc受容体(FcR)としても知られるCD16を介してFcドメインに結合する。CDCの古典的経路においては、抗体は、標的細胞の表面上の抗原に結合する。次いで、補体カスケードのC1複合体が、抗体のFcドメインに結合する。典型的には、C1が結合するには、少なくとも6つの抗体分子が必要である。C1がFcに結合することにより、次いで、古典的補体経路の残りの構成要素が動員され、これにより、標的細胞の細胞膜を破壊するように機能する、膜攻撃複合体が形成される。4つの主要なIgGアイソタイプ(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)は、ADCC及びCDCを媒介する能力が、異なっている。IgG3、IgG1、及びIgG2は、それぞれ、補体を活性化する最も高い〜最も低い能力を有している。IgG4は、補体を活性化しない。IgG1、IgG3、IgG4、及びIgG2は、それぞれ、FcRに結合する最も高い〜最も低い能力を有する。薬物開発者は、したがって、抗体候補にとって最適なFcを見出すことに関心を有する。ある特定の状況において、薬物開発者は、高親和性の可変ドメインを、最適な野生型Fc配列に融合する。他の状況においては、薬物開発者は、野生型Fc配列を変異させて、Fcバリアント又はFc変異体のライブラリーを生成する。従来、薬物開発者は、FcR又はC1への結合物質に関する高スループットスクリーニング、続いて、96ウェルプレートにおける機能性分析によって、最適なFcバリアントを選択している。当該技術分野において、96ウェルプレートでの機能性アッセイの必要性を除去する、機能性Fcバリアントについて直接的にスクリーニングする高スループットの方法に対する必要性が存在する。
【０１０４】
機能性Fcバリアントをスクリーニングするために、当該技術分野において公知の方法(たとえば、ポリ核酸を合成により生成し、これを、次いで、タンパク質をコードするポリ核酸に構築すること、部位特異的変異生成、又はエラープローンPCR)によって、Fc変異体のライブラリーを生成する。Fc変異体のライブラリーを、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、組換えで発現させる。Fc変異体を、膜テザータンパク質ドメインに融合する。こうすることにより、Fc変異体は、FcR又はC1に直接的に結合し、細胞機能を誘導することができるが、依然として細胞膜に結合されたままとなる。結果として得られるFc変異体ライブラリーは、クローン集団を含み、そのうちの複数が、単一のFcバリアントを発現する。
【０１０５】
Fcバリアントを発現するCHO細胞のライブラリーから、複数のクローンを、NK細胞とともに単離する。Fcを発現するCHO細胞とNK細胞との比は、1:10〜1:20の範囲である。NK-92細胞又は初代NK細胞を、この実験に使用する。CD16受容体を発現するように操作した、他の種類の哺乳動物細胞株、たとえば、CHO、HEK293、又はJurkatもまた、NK細胞に代えて試験する。
【０１０６】
CHOクローンによって発現された機能性Fcバリアントが、NK細胞のCD16分子に結合し、それによってNK細胞が活性化されるように、Fcを発現するCHO細胞及びNK細胞を油中水型液滴中に区画化し、次いで、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。溶解ミックスは、界面活性剤、たとえば、SDSを含み、ポリ(A) RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。免疫グロブリン及びNK細胞活性化マーカー、たとえば、TNFa又はIFNgに特異的なプライマーを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて、Fcバリアントをコードするポリヌクレオチドに連結される。操作したCHOのライブラリーにおける任意のFcバリアントを増幅させるために、ユニバーサルプライマーもまた、添加する。ビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、NK細胞活性化マーカーに連結されたFc配列を特定し、定量化する。
【０１０７】
これらの実験に使用することができるNK細胞活性化マーカーは、NK細胞によって発現される内因性転写産物又はNK細胞中へと操作された転写レポーターである。この実験により、NK細胞において機能性応答を誘導する、CHOによって発現されるFcバリアントを、特定する。同様の実験を、好中球、又は補体においてコーティングされた細胞をファゴサイトーシスする他の細胞を用いて行い、Fcバリアントライブラリーとともにインキュベートする。細胞を封入する媒体には、C1及び補体の他の成分が含まれる。好中球活性化転写産物を、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRによって、Fcバリアント配列に連結する。結果として得られる連結したポリ核酸分子のライブラリーを、次いで、バルクシーケンシングに供して、好中球活性化マーカーに連結したFc配列を特定し、定量化することができる。
【０１０８】
同様の実験を、CD16又は他の受容体を発現するように操作した組換え細胞を用いて行い、Fcバリアントライブラリーとともにインキュベートする。
【０１０９】
最適なADCC又はCDC機能を示すバリアントFc受容体を、次いで、目的とされる治療標的に対する親和性を有する抗体可変ドメインに融合する。モノクローナル抗体をクローニング及び精製するための方法は、当業者に周知である。これらのモノクローナル抗体を、次いで、従来的なウェルプレートアッセイによって、ADCC又はCDCに関してさらに検証する。Fcバリアントの薬物動態特性を、調べる。多くの治療モダリティでは、抗体半減期の増加が望まれ、これは、Fcドメインの変異によって増加する。Fcバリアント融合抗体を、がんのマウスモデルを使用した有効性分析、オプソニン化研究を使用した有効性研究、又は他の種類の有効性研究に供する。この実験により、高度に有効なFcバリアント融合抗体が得られる。
【０１１０】
[実施例2]
メモリーB細胞の機能性分析
多数の患者が、現時点では科学的に不明な理由のために、重度の疾患から回復する。たとえば、ある特定のがん患者は、医療処置に対して、他の患者よりも良好に応答する。別の例においては、ある特定の患者は、ウイルス病原体(たとえば、エボラ、ジカ、又はA型インフルエンザ)に、他の患者よりも良好に応答する。他の例としては、細菌病原体及び自己免疫障害が挙げられる。一部の事例において、患者が重度の疾患から回復に成功するのは、疾患に対する免疫応答を備えることに成功しているためであり、たとえば、良好に応答する患者には存在し、活性であるが、応答が乏しい患者には存在しない、T細胞受容体又は免疫グロブリンが、関連する疾患標的に結合することによって機能している可能性がある。
【０１１１】
メモリーB細胞すなわちBmemは、重篤な疾患からの個体の回復に役立った抗体を発見するのに特に有用である。抗原により最初の刺激を受けると、濾胞性ナイーブB細胞は、形質細胞及びBmemに分化する。形質細胞は、抗原に対する一次液性免疫応答を持っている。持続性Bmemは、胚中心における親和性成熟(変異及び抗原による選択)後に、生じる。患者は、数百万個から数十億個の異なるBmemクローンを有し、薬物開発者は、それらのクローン中から、重篤な疾患からの回復に寄与する抗体を発見しようとするかもしれない。従来、反応性Bmemのスクリーニングは、Bmemの集団を、蛍光標識した目的の標的とともにインキュベートし、次いで、結合物質をフロー分別することを伴う。フロー分別の方法は、当業者であれば熟知しており、典型的には、BD、Sony、又はBeckman Coulterなどの供給業者によって商業的に製造されているデバイスを使用して行われる。しかしながら、そのような方法は、Bmemの細胞機能を考慮していない。加えて、フロー分別は、可溶性標的を用いた場合に最も容易であり、一方で標的が多数である場合、細胞膜に埋め込まれた組換えタンパク質として研究するのが最もよい。したがって、当該技術分野において、目的の抗原に曝露した際に、反応性のBmemと非反応性のBmemとを区別することができる、高スループットの細胞的方法に対する必要性が存在する。
【０１１２】
反応性のBmemを特定するために、Bmemを、フローサイトメトリー又は抗体をコーティングした磁気ビーズによって、エボラ感染から回復した患者の末梢血から抽出する。Bmemを、次いで、目的の抗原(たとえば、エボラウイルスの脂質エンベロープの表面突起を含む糖タンパク質(GP)のドメインのライブラリーを発現する組換えインデューサー細胞)とともに、ex vivoでインキュベートする。インキュベーションは、油中水型のマイクロ液滴の中、又はマイクロ流体デバイスのナノリットルウェルにおいて、行う。B細胞を、エマルジョンオーバーラップ伸長RT-PCRに供して、重鎖免疫グロブリン配列を、Bmem細胞の活性化を示す転写産物に連結させる、ポリ核酸のライブラリーを生成する。活性化転写産物は、Bmem細胞の内因性転写産物、たとえば、Ki-67であるか、又はBmem中へと操作されたレポーターの転写産物であり得る。この実験により、抗原に応答する、Bmem細胞によって発現される抗体を、活性化バイオマーカーによって特定し、これらのバイオマーカー転写産物がさらに、標的Bmemと共封入された細胞上のGPドメインの存在を区別する転写産物にハイブリダイズされる。
【０１１３】
Bmem活性化マーカーに連結された抗体配列を、次いで、クローニングし、モノクローナル抗体タンパク質として精製する。本方法は、単一抗体配列又は抗体配列のライブラリーのいずれかについて行う。配列ライブラリーに対して行い、クローニングし、精製した場合、ライブラリーから発現される組換えタンパク質を、続いて、in vitroで結合又は機能に関して、さらにスクリーニングする。組換え抗体をクローニング、精製、及びスクリーニングするための方法は、当業者に周知である。単離したモノクローナル抗体を、次いで、従来的なウェルプレートアッセイ又はマウスモデルにより、結合及び機能に関して検証する。この実験により、エボラ感染からの個々の回復に役立った抗体の特定が可能である。
【０１１４】
抗原に対するBmemの応答はまた、広範に有効性のワクチンの開発のために、適切なポリペプチド配列を特定するための方法として、多数の個体にわたって比較される。たとえば、エボラGPの免疫原性ドメインを、発見し、感染から回復した患者における良好な予後と関連付け、次いで、それらのドメインにより、保護的な抗体応答をもたらすワクチンの基礎を形成し、ワクチンを受けたがエボラウイルスに曝露されたことのない個体のBmem集団を形成する。
【０１１５】
さらに、同様の方法を使用して、T細胞の抗原性ペプチドを見出す。
【０１１６】
[実施例3]
抗体標的の発見のための機能性分析
多数の患者が、現時点では科学的に不明な理由のために、重度の疾患から回復する。たとえば、ある特定のがん患者は、医療処置に対して、他の患者よりも良好に応答する。別の例においては、ある特定の患者は、ウイルス病原体(たとえば、エボラ、ジカ、又はA型インフルエンザ)に、他の患者よりも良好に応答する。他の例としては、細菌病原体及び自己免疫障害が挙げられる。一部の事例において、患者が重度の疾患から回復に成功するのは、疾患に対する免疫応答を備えることに成功しているためであり、たとえば、良好に応答する患者には存在し、活性であるが、応答が乏しい患者には存在しない、免疫グロブリンが、関連する疾患標的に結合することによって機能している可能性がある。
【０１１７】
しかしながら、多数の疾患の複雑さ及び免疫系の複雑さに起因して、免疫グロブリン及びそれらのそれぞれの標的を発見することは、困難なままである。この知識は、疾患の機序、疾患応答の機序、及び疾患を処置するための方法を研究している研究者にとって、極めて有用であると予想される。たとえば、がん患者によって産生される抗体は、腫瘍によって発現される科学的に不明な糖タンパク質標的に対する特異性を通じて、腫瘍に結合する。次いで、この抗体が腫瘍に結合することにより、ADCC及びCDCを誘導し、これにより、がんの完全な寛解へと導かれる。しかしながら、機能性抗体の配列、並びに機能性抗体の標的を発見することは、困難である。薬物開発者は、抗体を、薬として使用するかもしれず、又はその内因性配列が判明すれば、緊密に関連する配列を開発するかもしれない。薬物開発者はまた、新しく発見された標的を使用して、マウスを免疫するか、又はファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることができ、新しく発見された標的に対する親和性を有する新規な抗体を開発することができる。従来、腫瘍に存在する糖タンパク質標的の完全な相補体を得ることは、困難かつ高価である。したがって、当該技術分野では、腫瘍によって発現される糖タンパク質標的及び患者によって発現される免疫レパートリー配列を使用して、抗体及びその標的を特定する高スループットの方法により、利益が得られると予想される。本方法は、がんに限定されず、免疫系が関与する任意の疾患に適用することができる。
【０１１８】
腫瘍によって発現される糖タンパク質標的及び患者によって発現される免疫レパートリー配列を使用して、抗体及びその標的を特定するために、B細胞を、がん患者から、たとえば、末梢血、骨髄、又は腫瘍浸潤リンパ球から単離する。がん患者は、最近、がんから回復したか、又は現在がん闘病中であるか、又はがん闘病中であり免疫調節療法を受けている。B細胞を、非B細胞と分離するための方法としては、フローサイトメトリー及び抗体をコーティングした磁気ビーズが挙げられる。目的の抗原、抗原プール、細胞、又は組織(たとえば、腫瘍又は腫瘍細胞)とともにインキュベートしたB細胞を、研究の目的とされるB細胞を活性化又は増殖させる目的で使用する。B細胞を、エマルジョンオーバーラップ伸長RT-PCRに供して、天然に連結した重鎖及び軽鎖免疫グロブリンのペアリングを有するポリ核酸のライブラリーを生成する。次いで、これらの免疫グロブリンライブラリーを使用して、組換え抗体分泌細胞、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞を操作する。細胞を操作するための方法は、当業者には熟知されており、プラスミドのエレクトロポレーション、レンチウイルス形質導入、脂質に基づくトランスフェクション、又はプラスミドの一過性トランスフェクションを挙げることができる。初代B細胞を使用して、抗体を分泌するハイブリドーマを生成する。
【０１１９】
抗体を分泌する細胞クローンのライブラリーを、推定上の抗体標的を発現する細胞クローンのライブラリーに対してスクリーニングする。抗体標的は、発現プラスミドにクローニングした相補的DNAによってコードされる。cDNAは、腫瘍、たとえば、B細胞のサンプルを提供した患者又は異なる患者から外科手術により摘出した腫瘍から単離したRNAに由来する。腫瘍は、B細胞のサンプルを提供した患者に由来する腫瘍と同じ起源組織であるか、又はB細胞のサンプルを提供した患者に由来する腫瘍とは異なる起源組織に由来する。腫瘍とは無関係の組織、又はがんを有さないヒトドナーに由来するcDNAを、使用する。一部の実験については、発現プラスミドにクローニングした合成DNAを用いて組換え細胞を操作することによって生成した推定上の抗体標的のライブラリーを、使用する。
【０１２０】
抗体を分泌するCHO細胞のライブラリーに由来する複数のクローンを、次いで、対応する腫瘍に由来するcDNAを発現する細胞(「標的クローン」)とともに単離する。複数のNK細胞(中間細胞)もまた、抗体を発現するクローン及びcDNAを発現するクローンとともに単離する。抗体を発現する細胞とcDNAを発現する細胞とNK細胞との典型的な比は、1:1:10又は1:1:20である。NK細胞は、NK-92細胞又は初代NK細胞を含む。CHOクローンから分泌された抗体が、cDNAを発現する細胞に結合し、それによってNK細胞が活性化されるように、細胞を、油中水型液滴に区画化し、次いで、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。免疫グロブリン及びNK細胞活性化マーカー(たとえば、NK細胞の内因性転写産物、たとえば、TNFa若しくはIFNg、又はNK細胞に操作されたレポーターの転写産物)に特異的なプライマーを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドに連結される。免疫グロブリンはまた、ハイブリダイゼーションを通じて、推定上の標的cDNA転写産物における特異的な識別配列に連結されている。たとえば、推定上の標的のcDNA転写産物は、合成ポリ核酸バーコード又は固有の非合成配列を含み得る。ビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、NK細胞活性化マーカーに連結された抗体配列を特定し、定量化した後、これらの抗体配列を、推定上のcDNA標的転写産物に連結させる。抗体タンパク質を産生するのに十分なポリ核酸配列が生成されるように、重鎖免疫グロブリンを、活性化マーカー及び軽鎖免疫グロブリンに連結させて、3つ、4つ、又はそれ以上の転写産物の融合複合体を形成する。2つのみの転写産物、たとえば、重鎖免疫グロブリン及びTNFαが連結されるように、重鎖免疫グロブリンを、活性化マーカー及び軽鎖免疫グロブリンに連結させる。この実験により、NK細胞において機能性応答を誘導する抗体を分泌するCHO細胞によって分泌される抗体を、特定し、これらの抗体を、並行して、推定上の標的cDNA転写産物に連結させる。このようにして、抗体を、高スループットの機能性分析を通じてその標的とペアリングさせる。
【０１２１】
同様の実験を、ヒトレパートリーに由来しない抗体のライブラリーを用いて行う。たとえば、ランダム又は合成により生成した抗体配列を使用する。そのようなライブラリーを発現する細胞は、合成により生成した抗体を有するように操作した組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。抗体のライブラリーを、次いで、腫瘍cDNAを発現する組換え細胞のライブラリーに対してスクリーニングする。単一のモノクローナル抗体を、腫瘍cDNAを発現する組換え細胞のライブラリーに対してスクリーニングする。
【０１２２】
同様の実験を、NK細胞の代わりに、組換えCD16操作細胞を用いて行う。組換えCD16操作細胞はまた、レポーター転写産物を発現し、これを、活性化バイオマーカーとして使用する。同様に、細胞表面に結合する抗体に対して反応性である任意の細胞を、NK細胞の代わりに使用する。
【０１２３】
NK細胞活性化マーカーに連結された抗体配列を、次いで、モノクローナル抗体タンパク質としてクローニング及び精製する。次いで、NK細胞活性化及び免疫レパートリー由来の少なくとも1つの抗体配列に連結したcDNA標的を使用して、たとえば、マウス免疫付与、ファージディスプレイ、又は酵母ディスプレイによって、cDNA標的に対する新規な抗体を発見する。モノクローナル抗体をクローニング及び精製するための方法は、当業者に周知である。並行して、関連する標的cDNAをクローニングし、それを使用して、従来的なウェルプレートアッセイ又はがんのマウスモデルによって、モノクローナル抗体を検証する。
【０１２４】
[実施例4]
治療用抗体候補の機能性スクリーニング
治療用抗体薬は、様々な機序によって機能するが、抗体薬開発の分野における当業者であれば、抗体が所与の標的に結合する能力は、必ずしも、必要とされる生物学的機能を抗体が誘導することを保証するものではないことを理解していると予想される。たとえば、がんを調節する免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質(たとえば、PD-1、OX-40、又はLAG3)は、免疫活性化因子であるかもしれないし、免疫抑制因子であるかもしれない。薬物開発者は、免疫活性化因子又は免疫抑制因子をアゴナイズ又はアンタゴナイズする薬物を探求している。たとえば、抗OX40抗体の推定上の治療的機序は、アゴニストとして作用することである。OX40は、T細胞の表面上に発現され、OX40Lの結合により、T細胞が活性化される。活性化されたT細胞が、次いで、腫瘍に対する免疫応答を高め、これによって、患者の状態が改善される。ある特定の治療モダリティにおいて、OX40の活性化は、OX40のいくつかの分子を架橋させることによって生じ、これにより、次いで、細胞の内部でシグナル伝達カスケードが誘導される。たとえば、OX40Lが、OX40を発現するT細胞に結合すると、TRAF2、3、及び5、並びにPI3Kが、活性化される。OX40に結合するある特定の抗体は、OX40Lの機能的作用を模倣するが、しかしながら、OX40に結合する他の抗体は、OX40Lの機能的作用を模倣しない。当業者が、目的の標的に対する結合物質を特定するために使用する高スループットな方法は、多数存在するが(たとえば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、ハイブリドーマスクリーニングなど)、特定の生物学的機能を誘導する抗体の特定のための方法は、低スループットなままであり、たとえば、実質的には、1人の研究室技師につき、1週間当たり10〜100以下のアッセイに限られている。したがって、特定の生物学的機能を誘導する結合物質を特定するための高スループットな方法に対する必要性が存在する。たとえば、本明細書において提供される高スループットな方法を使用して、免疫アゴニスト若しくはアンタゴニストが特定されるか、又はシグナル伝達カスケードの活性化が特定される。
【０１２５】
特定の生物学的機能を誘導する結合物質を特定するために、マウスに、がん生物学の分野における目的の標的タンパク質で免疫付与を行う。標的は、腫瘍細胞の表面上に過剰発現するタンパク質(たとえば、CD20、Her2、若しくはEGFR)、又はがんを調節する免疫細胞の表面上に発現するタンパク質(たとえば、PD-1、OX40、若しくはLAG3)である。典型的な野生型マウス株としては、BL/6、SJ/L、及びBalb/cが挙げられる。マウスのゲノムは、完全ヒト抗体又はキメラ抗体を発現するように操作されており、たとえば、Medarex又はTrianniのマウスがある。動物を殺処分する前に、血清を取り出し、目的の標的に対する力価に関して評価する。リンパ節を、次いで、マウスから摘出する。脾臓及び骨髄を、マウスから摘出する。次いで、単一細胞懸濁液を、器官から生成し、B細胞を、非B細胞と分離する。マウス器官から単一細胞懸濁液を生成するための方法としては、酵素消化及び物理的脱凝集が挙げられる。B細胞を、非B細胞と分離するための方法としては、フローサイトメトリー及び抗体をコーティングした磁気ビーズが挙げられる。
【０１２６】
具体的には、OX40を、マウス免疫付与のための免疫原として使用する。マウス免疫付与、オーバーラップ伸長RT-PCR、及びCHO細胞の操作を使用して、OX40に対する抗体候補を分泌するCHO細胞のライブラリーを生成する。これらの抗体を、たとえば、scFv酵母又はファージディスプレイを通じて、OX40に対する結合物質を事前富化させる。抗体を分泌するCHO細胞のライブラリーに由来する複数のクローンを、次いで、OX40を発現する細胞、たとえば、OX40を有するように操作した初代T細胞又はJurkat細胞とともに単離する。細胞を、油中水型液滴に区画化し、次いで、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。免疫グロブリン及びT細胞活性化マーカー(たとえば、T細胞の内因性転写産物、たとえば、CD69及びIFNg、又は標的細胞に操作されたレポーターの転写産物)に特異的なプライマーを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドに連結される。ビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、T細胞活性化マーカーに連結された抗体配列を特定し、定量化する。抗体タンパク質を産生するのに十分なポリ核酸配列が生成されるように、重鎖免疫グロブリンを、活性化マーカー及び軽鎖免疫グロブリンに連結させて、3つ、4つ、又はそれ以上の転写産物の融合複合体を形成する。2つの転写産物、たとえば、重鎖免疫グロブリン及びCD69が連結されるように、重鎖免疫グロブリンを、活性化マーカー及び軽鎖免疫グロブリンに連結させる。抗体配列を、全トランスクリプトームに連結させ、次いで、トランスクリプトームを、バイオインフォマティクスにより分析して、細胞機能の変化を示す配列の変化を検出する。この実験により、T細胞において機能性応答を誘導する、抗体を分泌するCHO細胞によって分泌される抗体を、特定する。
【０１２７】
T細胞活性化マーカーに連結された抗体配列を、次いで、モノクローナル抗体タンパク質としてクローニング及び精製する。モノクローナル抗体をクローニング及び精製するための方法は、当業者に周知である。これらのモノクローナル抗体を、次いで、従来的なウェルプレートアッセイ又はがんのマウスモデルにより、T細胞活性化に関して検証する。たとえば、NOD SCIDガンマ(NSG)マウスに、ヒト免疫細胞前駆体を移植し、これにより、マウスにおいて分化したヒトT細胞が生じる。NSGマウスは、商業的供給業者、たとえば、Jackson Labsにより提供されている。マウスに、次いで、腫瘍細胞を移植し、候補モノクローナル抗体を提供する。これらの条件下におけるT細胞の応答を、次いで、様々な対照、たとえば、分化したヒトT細胞及び腫瘍細胞を有するが、抗体を有さないNSGマウスと比較する。
【０１２８】
[実施例5]
大規模に並行な機能性分析を使用したエピトープ特徴付け
抗体は、たとえば、マウスの免疫付与又はファージディスプレイライブラリーを用いたパンニングにより、完全タンパク質又は少なくとも100個のアミノ酸を含むタンパク質のドメインに対する結合物質のスクリーニングによって発見することができる。薬物開発者は、目的とされる抗体の特異的結合エピトープを特徴付けることに関心を持っていることが多い。この情報は、政府の規制の記録に有用であるが、所望される機能性プロファイル、たとえば、タンパク質又は経路の拮抗作用(antagonism)又は作動作用(agonism)を有する抗体を選択するためにも有用であり得る。しかしながら、エピトープ特徴付けは、従来、時間がかかる高価なプロセスである。加えて、エピトープ特徴付けのための従来的な方法は、細胞機能を考慮しておらず、それどころか、従来的な方法は、結合親和性のみを考慮するものである。当該技術分野では、機能性分析に基づく高スループットのエピトープスクリーニング方法により、利益が得られると予想される。
【０１２９】
高スループットのエピトープスクリーニングのために、マウスを、Her2の可溶性完全細胞外ドメインで免疫することによって、抗Her2抗体を生成し、推定上のHer2エピトープのライブラリーを、膜貫通ドメインにより細胞膜につながれた10個、50個、100個、150個、200個、又は250個のアミノ酸を表す、Her2由来のペプチド又はドメインを有するように組換え細胞を操作することによって生成する。Her2エピトープのライブラリーは、Her2タンパク質の完全細胞外ドメイン全体にわたって敷き詰められたオーバーラップするペプチド又はドメインのセットを含む。エピトープ標的をコードするmRNA転写産物はまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接する核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、特定のHer2エピトープクローンを特定する。5個、10個、50個、100個、150個、200個、又は1000個のエピトープ発現クローンのライブラリーに由来する複数の単一細胞を、目的の抗Her2抗体を発現するNK細胞及びCHO細胞とともに、油中水型液滴に区画化し、次いで、細胞混合物を、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。抗体が所与のエピトープに結合する場合、エピトープを発現する細胞をコーティングしている抗体は、NK細胞のCD16分子に結合し、これにより、NK細胞が活性化される。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。エピトープクローン及びNK細胞活性化マーカー、たとえば、TNFa又はIFNgに特異的なプライマーを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて、Her2エピトープをコードするポリヌクレオチドに連結される。NK細胞は、NK-92細胞、又は初代NK細胞、又は人工的なレポーターが内因性NK活性化マーカーと置き換えられた、CD16受容体を発現するように操作された他の種類の哺乳動物細胞、たとえば、CHO、HEK293、若しくはJurkatであり得る。また、ユニバーサルプライマーを使用して、操作されたエピトープ標的発現細胞のライブラリーにおいてエピトープを増幅させる。ビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、NK細胞活性化マーカーに連結されたHer2エピトープクローン配列を特定し、定量化する。この実験により、NK細胞において機能性応答を誘導するHer2エピトープが、特定される。本方法は、ADCCを通じて機能する任意の抗体に使用することができる。
【０１３０】
OX40の細胞外ドメインの可溶性形態もまた、マウス免疫付与の免疫原として使用される。CHO細胞の操作(engineering)を使用して、OX40に対する抗体を分泌するCHOクローンを生成する。細胞が発現する推定上のOX40エピトープのライブラリーを、膜貫通ドメインにより細胞膜につながれた10個、50個、100個、150個、200個、又は250個のアミノ酸を表す、OX40に由来するペプチド又はドメインを有する初代T細胞又はJurkat細胞を操作することによって、生成する。OX40エピトープのライブラリーは、OX40タンパク質の完全細胞外ドメイン全体にわたって敷き詰められたオーバーラップするペプチド又はドメインのセットを含む。エピトープ標的をコードするmRNA転写産物はまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接する核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、OX40エピトープクローンを特定する。5個、10個、50個、100個、150個、200個、又は1000個のエピトープ発現クローンのライブラリーに由来する複数の単一細胞を、目的の抗OX40抗体を発現するNK細胞及びCHO細胞とともに、油中水型液滴に区画化し、次いで、細胞混合物を、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。OX40エピトープ及びT細胞活性化マーカー、たとえば、CD69及びIFNgに特異的なプライマーを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて、OX40エピトープをコードするポリヌクレオチドに連結される。標的細胞が、プラスミド又はゲノム操作の導入によってレポーター遺伝子を含むように操作される場合、レポーター転写産物を、活性化マーカーとして使用する。ビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、T細胞活性化マーカーに連結された抗体配列を特定し、定量化する。このようにして、OX40の活性化に必要及び/十分なエピトープを発見する。エピトープ配列を、全トランスクリプトームに連結させ、次いで、トランスクリプトームを、バイオインフォマティクスにより分析して、細胞機能における変化を示す配列の変化を検出する。この実験から、目的とされる抗OX40抗体の存在下において、T細胞における機能性応答を誘導するOX40エピトープを、特定する。本方法は、チェックポイント阻害を通じて機能する任意の抗体薬に使用することができる。
【０１３１】
同様の方法を使用して、別の種類の細胞に転写の変化を誘導することが公知の抗体の、機能性結合エピトープを特徴付ける。候補抗体を、モノクローナル抗体タンパク質としてクローニング及び精製する。モノクローナル抗体をクローニング及び精製するための方法は、当業者に周知である。これらのモノクローナル抗体を、次いで、従来的なウェルプレートアッセイ又はがんのマウスモデルにより、細胞活性化に関して検証する。たとえば、NOD SCIDガンマ(NSG)マウスに、ヒト免疫細胞前駆体を移植し、これにより、マウスにおいて分化したヒトT細胞が生じる。NSGマウスは、商業的供給業者、たとえば、Jackson Labsにより提供されている。マウスに、次いで、腫瘍細胞を移植し、候補モノクローナル抗体を提供する。これらの条件下におけるT細胞の応答を、次いで、様々な対照、たとえば、分化したヒトT細胞及び腫瘍細胞を有するが、抗体を有さないNSGマウスと比較する。
【０１３２】
次いで、所与の抗体とペアリングした場合に細胞機能を誘導するのに必要及び十分な、新たに発見されたエピトープを使用して、類似又はより良好な機能性を含む新しい抗体を発見する。
【０１３３】
[実施例6]
二重特異性薬物の発見
多くの治療状況において、単一の分子が、2つの異なる標的に結合し、それによって、2つの異なる治療機序を独立して誘導することは望ましい。たとえば、薬物の一方の成分が、1つの標的に結合する抗体フラグメントであり、薬物の他方の成分が、第2の標的に結合する抗体フラグメントである。そのような二重特異性薬物には多数の形式があり、たとえば、2つの異なる特異性を有する2つの異なるscFv配列が、ペプチドリンカーを用いて一つに融合されている、「ビス-scFv」がある。たとえば、一方のscFvは、CD3に結合してそれをアゴナイズし、第2のscFvは、EGFR（これは、ある特定の腫瘍の表面上に過剰発現されることが多い）に結合する。CD3の作動作用(agonism)により、T細胞が活性化され、これは、腫瘍殺滅活性を有する。二重特異性薬物は、抗体に限定されず、たとえば、2つのTCRを融合して、二重特異性TCRを生成してもよく、抗体を、TCRに融合してもよく、又は組換えリガンドを、抗体フラグメントに融合してもよい(たとえば、OX40Lを、抗CD3抗体に融合する)。個々の部分が個別の活性を生成する融合分子は、個々の部分が融合された場合に、必ずしも両方の活性を生成するとは限らない場合がある。従来、二重特異性活性は、研究室技師1人につき、1週間当たり10〜100個以下の候補のスループットで、スクリーニングされている。したがって、当該技術分野において、複数の生物学的機能を同時にスクリーニングする高スループットの方法に対する必要性が存在する。
【０１３４】
複数の生物学的機能を同時にスクリーニングするために、二重特異性薬物候補のライブラリーを、本発明のスクリーニング手順に供する。具体的には、NK細胞活性化スクリーニングを、2つの異なる抗体標的(たとえば、CD3及びEpCAM)を用いて並行して行う。さらに、NK細胞活性化スクリーニングを、TCR活性化スクリーニングと連続して行う。コンビナトリアルスクリーニングの様々な組合せが、本発明の方法では可能である。
【０１３５】
[実施例7]
治療的T細胞受容体候補の機能性スクリーニング
治療的TCR創薬は、合成TCRレパートリーのマイニング、免疫付与、及びマウスからのTCRの回収、又はヒトリンパ球集団のマイニングを含む。治療的T細胞受容体薬は、様々な機序によって機能するが、TCRが所与の標的に結合する能力は、必ずしも、必要とされる生物学的機能をTCRが誘導することを保証するものではない。
【０１３６】
しかしながら、目的の標的に結合することが知られているT細胞受容体の機能的活性を特徴付けることは、困難なままである。たとえば、TCRは、MHC多量体、たとえば、MHC四量体又はMHCデキストラマーを使用して、ライブラリーから発見される。このTCRを、T細胞において組換え発現させる場合、望まれる治療上の作用機序は、TCRを操作したT細胞が、たとえば、疾患状態の標的細胞、たとえば、がん性細胞又はウイルスに感染した細胞上のペプチド:MHC標的に結合することである。しかしながら、TCRと、コグネイトペプチド:MHCとの適切な結合は、必ずしも、T細胞が活性化されることを保証するものではない。したがって、当該技術分野では、目的とされる標的ペプチド:MHCの文脈において、機能的活性に関してTCRのライブラリーをスクリーニングする方法によって、利益が得られると予想される。薬物開発者は、TCRを、可溶性薬物若しくはTCR操作したT細胞として使用するかもしれず、又は機能性配列が判明した後に、緊密に関連するか、高親和性か、若しくは高い活性の配列を、開発するかもしれない。
【０１３７】
TCRのライブラリーを機能性活性に関してスクリーニングするために、T細胞を、がん患者から、たとえば、末梢血、骨髄、又はTILから単離する。がん患者は、最近、がんから回復したか、又は現在がん闘病中であるか、又はがん闘病中であり免疫調節療法を受けている。T細胞を、当該技術分野において公知の方法、たとえば、フローサイトメトリー及び抗体をコーティングした磁気ビーズを使用して、非T細胞と分離する。T細胞を、研究の目的とされるT細胞を活性化又は増殖させる目的で、APCにおいて発現される抗原とともにインキュベートする。初代T細胞を、エマルジョンオーバーラップ伸長RT-PCRに供して、天然に連結したTCRαβペアリングを有するポリ核酸のライブラリーを生成する。次いで、これらのTCRライブラリーを使用して、組換えTCR発現細胞、たとえば、Jurkat細胞を操作する。あるいは、TCRαβライブラリーは、初代T細胞によって発現される天然のTCRαβ配列から導出する代わりに、分子生物学法を使用して、合成で生成される。組換え細胞を操作するための方法としては、プラスミドのエレクトロポレーション、レンチウイルス形質導入、及び脂質に基づくトランスフェクションを挙げることができる。TCRを発現するプラスミド若しくは目的のTCRをコードするmRNAを一過的にトランスフェクトした細胞、TCRを発現する初代T細胞、又は組換えTCRを発現するように操作した初代T細胞を、TCR発現細胞として使用する。
【０１３８】
TCR操作細胞のライブラリーに由来する複数のクローンを、次いで、cDNAを発現する細胞、目的の組織に由来する細胞、又はタンデムミニ遺伝子を発現する細胞(「標的発現クローン」)とともに単離する。cDNAを、MHC発現をコードするポリヌクレオチド配列、たとえば、HLA A*02:01、HLA A*24:02、又はHLA DPB*04:01を含む発現ベクターにクローニングする。これにより、目的のMHCを発現しないヒト抗原提示細胞又は非ヒト抗原提示細胞におけるペプチド標的の提示が可能となる。APCは、細胞株、たとえば、HEK293若しくはCHO細胞、又は初代細胞、たとえば、樹状細胞若しくはB細胞である。
【０１３９】
TCR操作細胞のライブラリーに由来する複数のクローンを、次いで、標的発現クローンとともに単離する。TCR発現細胞と標的発現細胞との比は、1:1、10:1、又は1:10である。TCR発現クローンが、cDNA発現細胞に結合し、それによってT細胞が活性化されるように、細胞を、油中水型液滴中に区画化し、次いで、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。標的バーコード又は標的配列に特異的なプライマー、及びT細胞活性化マーカー、たとえば、CD69又はIFNgを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて標的クローンを特定するポリヌクレオチドに連結される。T細胞由来のTCR配列はまた、ハイブリダイゼーションを通じて、標的cDNA転写産物における特定の識別配列に連結されている。推定上の標的のcDNA転写産物は、合成ポリ核酸バーコード又は固有の非合成配列を含み得る。RNAが結合したビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。T細胞活性化マーカーは、T細胞によって発現される内因性転写産物であるか、又はT細胞に操作された転写レポーターである。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、T細胞活性化マーカーに連結されたTCR配列を特定し、定量化した後、これらのTCRβを、推定上のcDNA標的転写産物に連結させる。TCRタンパク質を産生するのに十分なポリ核酸配列が生成されるように、TCRβを、T細胞活性化マーカー及びTCRαに連結させて、3つ、4つ、又はそれ以上の転写産物の融合複合体を形成する。2つのみの転写産物が、単一の分子、たとえば、TCRβ及びCD69に連結されるように、TCRβを、T細胞活性化マーカー及びTCRαに連結させる。活性化バイオマーカーが活性化されない場合、活性化バイオマーカーのバックグラウンド発現レベルに応じて、生成されるオーバーラップ伸長RT-PCR産物は少なくなるか、又は産物が生成されなくなる。この実験により、目的とされるペプチド:MHCと、T細胞において機能性応答を誘導するTCRライブラリー由来のTCRとの間のコグネイトペアリングが特定される。このようにして、数千個、数万個、数十万個、又は数百万個のTCRが、高スループットの機能性分析を通じて発見される。ペプチド:MHC標的を含むポリ核酸を、T細胞の全トランスクリプトームに連結させ、次いで、トランスクリプトームを、バイオインフォマティクスにより分析して、細胞機能における変化を示す配列の変化を検出する。
【０１４０】
T細胞活性化マーカーに連結したTCR配列を、次いで、再操作して可溶性形態にし、タンパク質として精製する。モノクローナルTCRをクローニング及び精製するための方法は、当業者に周知である。並行して、関連する標的cDNAをクローニングし、それを使用して、従来的なウェルプレートアッセイ又はがんのマウスモデルによって、TCRを検証する。TCRを、T細胞に操作し、治療法、たとえば、養子T細胞がん療法として使用する。TCR操作T細胞を、in vitroでの方法、たとえば、細胞殺滅アッセイを使用して、たとえば、in vitroでのTCR操作T細胞による腫瘍細胞の殺滅を定量化することによって、非臨床的に検証する。TCR操作T細胞を、マウスモデル、たとえば、ヒトリンパ球、TCR操作T細胞、及び腫瘍細胞を移植したNSGマウスを用いて、さらに検証するが、ここで、腫瘍細胞の殺滅は、in vivoで測定される。
【０１４１】
ヒトレパートリーに由来しないか、又はランダム若しくは合成で生成されたTCRライブラリーを、使用してもよい。標的配列を、全トランスクリプトームに連結させる場合、トランスクリプトームを、バイオインフォマティクスにより分析して、細胞機能における変化を示す配列の変化を検出する。
【０１４２】
[実施例8]
T細胞受容体標的の発見のための機能性分析
多数の疾患の複雑さ及び免疫系の複雑さに起因して、天然のT細胞受容体及びそれらのそれぞれの標的を発見することは、困難なままである。この知識は、疾患の機序、疾患応答の機序、及び疾患を処置するための方法を研究している研究者にとって、極めて有用であると予想される。例えば、がん患者によって産生されるTCRは、腫瘍によって発現されるか又は科学的に不明なペプチド:MHC標的に対する特異性を通じて、腫瘍に結合する。次いで、TCRが腫瘍に結合することにより、細胞毒性、クローン増殖、及び他の免疫細胞の刺激が誘導され、これにより、がんの完全な寛解へと導かれる。当業者であれば、機能性TCRの配列、並びに機能性RCRのペプチド:MHC標的を発見することの困難さを理解することができる。薬物開発者は、TCRを、可溶性薬物若しくはTCR操作T細胞として使用するかもしれず、又は内因性配列が判明した後に、緊密に関連する配列を開発するかもしれない。従来、腫瘍に存在するペプチド:MHC標的の完全な相補体を得ることは、困難かつ高価である。したがって、当該技術分野では、腫瘍によって発現される糖タンパク質標的及び患者によって発現される免疫レパートリー配列を使用して、TCR及びそのペプチド:MHC標的を特定する高スループットの方法により、利益が得られると予想される。本方法は、がんに限定されず、免疫系が関与する任意の疾患に適用することができる。
【０１４３】
TCR及びそのペプチド:MHC標的を特定するために、T細胞を、がん患者から、たとえば、末梢血、骨髄、又はTILから単離する。本発明の一部の実施形態において、がん患者は、最近、がんから回復したか、又は現在がん闘病中であるか、又はがん闘病中であり免疫調節療法を受けている。T細胞を、フローサイトメトリー及び抗体をコーティングした磁気ビーズなどの方法によって、非T細胞と分離する。T細胞を、研究の目的とされるT細胞を活性化又は増殖させる目的で、APCにおいて発現される抗原、APCクローンのライブラリーとして発現される抗原プール、細胞株、又は目的とされる初代組織(たとえば、腫瘍若しくは腫瘍細胞)とともに、インキュベートする。T細胞を、エマルジョンオーバーラップ伸長RT-PCRに供して、天然に連結されたTCRabペアリングを有するポリ核酸のライブラリーを生成する。次いで、これらのTCRライブラリーを使用して、組換えTCR発現細胞、たとえば、Jurkat細胞を操作する。細胞を、当該技術分野において公知の方法、たとえば、プラスミドのエレクトロポレーション、レンチウイルス形質導入、及び脂質に基づくトランスフェクションを使用して、操作する。TCRを発現するプラスミド若しくは目的のTCRをコードするmRNAを一過的にトランスフェクトした組換え細胞、TCR発現細胞は、TCRを発現する初代T細胞、又は組換えTCRを発現するように操作した初代T細胞である。
【０１４４】
表面TCRを発現するように操作した細胞クローンのライブラリーを、推定上のTCR標的を発現する細胞クローンのライブラリーに対してスクリーニングする。標的は、発現プラスミド又はレンチウイルスにクローニングした相補的DNAによってコードされる。cDNAは、腫瘍、たとえば、T細胞のサンプルを提供した患者又は異なる患者から外科手術により摘出した腫瘍から単離したRNAに由来する。cDNAを、MHC発現をコードするポリヌクレオチド配列、たとえば、HLA A*02:01、HLA A*24:02、又はHLA DPB*04:01を含む発現ベクターにクローニングする。これにより、目的のMHCを発現しないヒト抗原提示細胞又は非ヒト抗原提示細胞におけるペプチド標的の提示が可能となる。APCは、細胞株、たとえば、HEK293若しくはCHO細胞、又は初代細胞、たとえば、樹状細胞若しくはB細胞である。MHC及び標的cDNAは、単一のmRNA分子にコードされ、これはまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接した核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、cDNAクローンを特定する。腫瘍は、T細胞のサンプルを提供した患者に由来する腫瘍と同じ起源組織であるか、又はT細胞のサンプルを提供した患者に由来する腫瘍とは異なる起源組織に由来する。cDNAは、腫瘍とは無関係の組織、又はがんを有さないヒトドナーに由来する。推定上のTCR標的のライブラリーを、発現プラスミドにクローニングした合成DNAを用いて組換え細胞を操作することによって生成する。
【０１４５】
TCR操作細胞のライブラリーに由来する複数のクローンを、次いで、cDNAのライブラリーを発現する細胞(「標的発現クローン」)とともに単離する。TCR発現細胞と標的発現細胞との典型的な比は、1:1、10:1、又は1:10である。TCR発現クローンが、cDNA発現細胞に結合し、それによってT細胞が活性化されるように、細胞を、油中水型液滴中に区画化し、次いで、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。標的バーコード又は標的配列に特異的なプライマー、及びT細胞活性化マーカー、たとえば、CD69又はIFNgを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて標的クローンを特定するポリヌクレオチドに連結される。T細胞由来のTCR配列はまた、ハイブリダイゼーションを通じて、推定上の標的cDNA転写産物における特定の識別配列に連結されている。推定上の標的のcDNA転写産物は、合成ポリ核酸バーコード又は固有の非合成配列を含む。RNAが結合したビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。これらの実験において使用されるT細胞活性化マーカーは、T細胞によって発現される内因性転写産物であるか、又はT細胞に操作された転写レポーターである。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、T細胞活性化マーカーに連結されたTCR配列を特定し、定量化した後、これらのTCRβを、推定上のcDNA標的転写産物に連結させる。TCRタンパク質を産生するのに十分なポリ核酸配列が生成されるように、TCRβを、T細胞活性化マーカー及びTCRαに連結させて、3つ、4つ、又はそれ以上の転写産物の融合複合体を形成する。2つのみの転写産物が、単一の分子、たとえば、TCRβ及びCD69に連結されるように、TCRβを、T細胞活性化マーカー及びTCRαに連結させる。この実験により、T細胞において機能性応答を誘導するペプチド:MHCとTCRとの間のコグネイトペアリングを特定し、これらのTCRを、並行して、推定上の標的cDNA転写産物に連結させる。このようにして、数千個、数万個、数十万個、又は数百万個のTCRが、高スループットの機能性分析を通じて標的とペアリングされる。ペプチド:MHC標的を含むポリ核酸を、T細胞の全トランスクリプトームに連結させる場合、トランスクリプトームを、バイオインフォマティクスにより分析して、細胞機能における変化を示す配列の変化を検出する。
【０１４６】
ヒトレパートリーに由来しないTCRライブラリー、又はランダム若しくは合成で生成されたTCR配列を、使用してもよい。TCRのライブラリーを、腫瘍cDNAを発現する組換え細胞のライブラリーに対してスクリーニングする。単一のモノクローナルT細胞集団もまた、腫瘍cDNAを発現する組換え細胞のライブラリーに対してスクリーニングする。
【０１４７】
T細胞活性化マーカーに連結したTCR配列を、次いで、再操作して可溶性形態にし、タンパク質として精製する。次いで、T細胞活性化及び免疫レパートリー由来の少なくとも1つのTCR配列に連結したcDNA標的を使用して、たとえば、マウス免疫付与、ファージディスプレイ、又は酵母ディスプレイによって、cDNA標的に対する新規なTCRを発見する。モノクローナルTCRをクローニング及び精製するための方法は、当業者に周知である。並行して、関連する標的cDNAをクローニングし、それを使用して、従来的なウェルプレートアッセイ又はがんのマウスモデルによって、TCRを検証する。TCRを、自家T細胞中へと操作し、治療法、たとえば、養子T細胞がん療法として使用する。TCR操作T細胞を、in vitroでの方法、たとえば、細胞殺滅アッセイを使用して、たとえば、in vitroでのTCR操作T細胞による腫瘍細胞の殺滅を定量化することによって、非臨床的に検証する。TCR操作T細胞を、マウスモデル、たとえば、ヒトリンパ球、TCR操作T細胞、及び腫瘍細胞を移植したNSGマウスを用いて、さらに検証するが、ここで、腫瘍細胞の殺滅は、in vivoで測定される。
【０１４８】
[実施例9]
腫瘍浸潤リンパ球の機能性分析
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、in situで腫瘍に浸潤したT細胞であり、したがって、腫瘍抗原反応性T細胞の豊富な供給源と考えられる。TILを、ex vivoで腫瘍サンプルから増殖させて、培養液に数十億個のTILを産生させる。TILを、次いで、がんを根治させるための細胞療法として、患者に注入して戻す。増殖プロトコールは、成長因子及びサイトカインとともに数ヶ月間培養することが含まれ、これは、有効な細胞をもたらす場合もあるが、有効性のない細胞をもたらすこともある。したがって、患者に注入する前に、TILの有効性を試験することが有用であると予想される。
【０１４９】
TILの有効性を試験するために、TILを標的細胞として、インデューサー細胞としての、臨床的に関連性のあるペプチド:MHCを発現する細胞とともに、共培養する。品質管理のために、TILを、目的とされる腫瘍抗原を発現する細胞クローンのライブラリーに対して、スクリーニングする。標的細胞は、治療上関連性のあるペプチド:MHC標的又は発現プラスミド若しくはレンチウイルスにクローニングした相補的DNAとのペプチド:MHC配列類似性を含む。cDNAは、腫瘍、たとえば、T細胞のサンプルを提供した患者又は異なる患者から外科手術により摘出した腫瘍から単離したRNAに由来する。cDNAを、MHC発現をコードするポリヌクレオチド配列、たとえば、HLA A*02:01、HLA A*24:02、又はHLA DPB*04:01を含む発現ベクターにクローニングする。これにより、目的のMHCを発現しないヒトAPC又は非ヒトAPCにおけるペプチド標的の提示が可能となる。細胞株、たとえば、HEK293若しくはCHO細胞、又は初代細胞、たとえば、樹状細胞若しくはB細胞を、APCとして使用する。MHC及び標的cDNAは、単一のmRNA分子にコードされ、これはまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接した核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、cDNAクローンを特定する。バーコードアンプリコンを、次いで、OE-RT-PCRを通じて、誘導された転写産物又はTCRに連結させる。
【０１５０】
有効性を示すことができなかったTIL培養物は、患者に注入して戻さない。可能な場合には、TIL培養物を、異なる条件下、たとえば、患者に臨床的関連性のある刺激性抗原の存在下において、さらに培養してもよい。
【０１５１】
[実施例10]
薬物に応答した、T細胞の機能性分析
T細胞免疫の制御不能は、がん及び自己免疫を含む、多数の種類のヒト疾患の特徴である。T細胞免疫の刺激及び抑制には、様々なタンパク質、たとえば、LAG-3、OX40、OX40L、PD1、PDL1、TIM3、CTLA4、CD47、4-1BB、GITR、ICOS、及びその他多数の間の複雑な相互作用が関与する。当業者であれば、免疫学の分野では、T細胞免疫の刺激及び抑制をもたらす複雑な相互作用が依然として完全に解明されていない可能性があることを理解することができる。科学的に不明なこの複雑な相互作用には、多数の構成要素が存在する可能性が高い。したがって、T細胞免疫の刺激及び抑制の分子機序のさらなる特徴付けのための、高スループットの単一細胞の方法に対する必要性が残っている。
【０１５２】
T細胞免疫の刺激及び抑制の分子機序を特徴付けるために、組換えDNA技術を使用して、免疫制御経路を調節することが公知である分子、たとえば、PD-1などの分子をアンタゴナイズすることによってチェックポイント阻害剤として作用する抗体、又は免疫制御経路における内因性リガンド、たとえば、PD-L1、又は分泌型若しくは膜結合型免疫制御性分子を発現する細胞のライブラリーを操作する。免疫調節性細胞のライブラリーは、CHO、HEK293、又は初代細胞を含む。組換えタンパク質を発現するように細胞を操作するための方法、たとえば、指向的ゲノム組込み、プラスミド又はレンチウイルスによる一過的発現は、当業者に周知である。免疫調節性分子のライブラリーは、哺乳動物細胞の代わりに、微生物、たとえば、操作された細菌、酵母、又は繊維状ファージを含み得る。免疫調節因子をコードするmRNA転写産物はまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接する核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、免疫調節因子クローンを特定する。
【０１５３】
組換え免疫調節因子を発現する細胞のライブラリーを、T細胞、チェックポイント分子を発現する細胞、又はチェックポイント分子を発現するように操作したT細胞とともに、油中水型液滴中に区画化し、次いで、細胞混合物のエマルジョンを、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。上述の方法を使用した、免疫調節因子クローン及びT細胞活性化マーカー、たとえば、TNFa又はIFNgに特異的なプライマーを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCR。T細胞活性化マーカーは、共刺激性又は共阻害性チェックポイント分子、たとえば、LAG-3、OX40、OX40L、PD1、PDL1、TIM3、CTLA4、CD47、4-1BB、GITR、又はICOSを含む。免疫調節因子クローンに特異的なプライマーを、cDNAとして全標的細胞トランスクリプトームを増幅させるプライマーに連結させる。次いで、バイオインフォマティクスを使用して、これまでに免疫共刺激経路若しくは共阻害経路に関係付けられていない遺伝子を発見するか、又は既に特徴付けられている免疫共刺激経路若しくは共阻害経路の機能をさらに明確にする。バイオインフォマティクスを使用して、全トランスクリプトームのデータをプロセシングして、共刺激経路又は共阻害経路の一部として、上方制御又は下方制御される、10個、100個、又は1,000個の遺伝子の転写産物発現パネルを生成する。これらの転写産物発現パネルを使用して、非臨床的なチェックポイント阻害薬候補が、T細胞又は他の標的細胞に対して望ましい作用を有するかどうかを試験する。転写産物発現パネルはまた、所与のがん患者が、臨床ステージチェックポイント分子に対して応答するかどうかを試験するためにも使用される。
【０１５４】
エマルジョン液滴のスクリーニングを、さらに、FACSと組み合わせる。たとえば、T細胞を、共刺激薬又は共阻害薬とともにインキュベートすると誘導される、蛍光レポーター分子を発現するように操作する。活性化されたレポーターを含有し、したがって、蛍光性である液滴を、FACSを使用して分類する。レポーター陽性細胞混合物を含有する、分類したエマルジョン液滴を、次いで、上述の方法を使用して、プロセシングする。一部の実験において、T細胞を、固体表面に連結された標的タンパク質に結合する分子を分泌するように操作する。前記結合を、次いで、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などの方法によって、検出する。標的タンパク質に結合する液滴は、したがって、蛍光性であり、これを、FACSによって分類する。FRET陽性細胞混合物を含有する、分類したエマルジョン液滴を、次いで、上述の方法を使用して、プロセシングする。実験については、マイクロ流体チップに組み込まれたFACS機器、又は商業的供給業者、たとえば、BD若しくはBeckman Coulterによって提供される従来的なFACS機器を、使用する。標的タンパク質に結合する抗体分泌細胞、又は標的タンパク質に結合するタンパク質を分泌する任意の他の種類の細胞を含有する液滴を特定するために、同様の方法を、使用する。これにより、標的タンパク質に結合するタンパク質を分泌する液滴の集団が得られる。この方法により、アッセイの特異度を増加させ、大規模なコンビナトリアルスクリーニングを行うことが可能である。
【０１５５】
スクリーニングは、様々なインキュベーションプロトコールを、並行して行うことにより、利益が得られる。たとえば、細胞の混合物を、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートした後、20℃、25℃、30℃、35℃、又は40℃で2時間インキュベートするが、これらすべてが単一の実験で行われる。T細胞と混合された、組換え免疫調節因子を発現する細胞の混合物を、上述の方法を使用して、エマルジョンマイクロ液滴中に区画化する。当該技術分野において公知の(たとえば、Mandeckiの米国出願第20160175801号)光によってトリガーされるマイクロトランスポンダーを、細胞混合物を有するマイクロ液滴に送達する。RFID、量子ドット、比色分析法、又は他の物理的手段によってコードされる「バーコード」を使用して、同様の方法を利用する。次いで、光によってトリガーされるマイクロトランスポンダーを使用して、6つのチャンバへの細胞混合物の送達をトラッキングし、これを、37℃のインキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。インキュベーションの後に、それぞれのエマルジョンを、次いで、マイクロトランスポンダーリーダーに供給し戻し、これにより、20℃、25℃、30℃、35℃、又は40℃での5つのチャンバへの細胞混合物の送達をトラッキングする。マイクロコンピューターを使用して、マイクロトランスポンダーのバーコード及びそれらの関連するプロトコールに関するデータベースを生成する。このようにして、6つの異なる第1のインキュベーションプロトコールを、5つの異なる第2のインキュベーションプロトコールと組み合わせで、合計30個の異なる組合せについて、試験する。このアプローチは、任意の種類のコンビナトリアルスクリーニングに使用することができる。
【０１５６】
[実施例11]
操作した養子細胞療法の機能性検証
TCR操作T細胞及びCAR-T細胞は、主としてがん及び感染性疾患に使用されている、新しいクラスの治療法である。操作細胞は、自家(すなわち、患者に由来する)又は同種(すなわち、患者以外の個体に由来する)のいずれかである。すべての養子細胞療法は、患者に注入する前に、機能性を特徴付けておく必要がある。典型的には、そのようなアッセイは、in vitroでの腫瘍細胞殺滅アッセイに限定される。しかしながら、従来的なアッセイでは、治療標的を発現する細胞の特異的な殺滅、及び任意の標的外作用、すなわち、殺滅させるべきではない細胞の殺滅を、明確に特定することができない。養子細胞療法の機能性の品質管理のための方法により、そのような治療法は、たとえば、特定のT細胞形質導入方法の優越性を実証すること、又は移植に使用されている異なる種類の細胞若しくは異なる細胞ドナーの状況におけるTCR又はCAR-Tの特異性を示すことによって、さらに安全かつ有効となり得る。
【０１５７】
本発明の方法を使用して、治療的TCRを発現するように操作した細胞を、品質管理のために、目的とされるTCR標的を発現する細胞クローンのライブラリーに対して、スクリーニングする。そのような標的としては、たとえば、治療上関連性のあるペプチド:MHC標的とのペプチド:MHC配列類似性を有することが公知の標的が挙げられる。標的は、発現プラスミド又はレンチウイルスにクローニングした相補的DNAによってコードされる。cDNAは、腫瘍、たとえば、T細胞のサンプルを提供した患者又は異なる患者から外科手術により摘出した腫瘍から単離したRNAに由来する。cDNAを、MHC発現をコードするポリヌクレオチド配列、たとえば、HLA A*02:01、HLA A*24:02、又はHLA DPB*04:01を含む発現ベクターにクローニングする。これにより、目的のMHCを発現しないヒト抗原提示細胞又は非ヒト抗原提示細胞におけるペプチド標的の提示が可能となる。細胞株、たとえば、HEK293若しくはCHO細胞、又は初代細胞、たとえば、樹状細胞若しくはB細胞を、APCとして使用する。MHC及び標的cDNAは、単一のmRNA分子にコードされ、これはまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接した核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、cDNAクローンを特定する。
【０１５８】
治療的CAR-Tを発現するように操作した細胞を、品質管理のために、目的とされる抗体標的を発現する細胞クローンのライブラリーに対してスクリーニングする。そのような標的としては、たとえば、治療上関連性のある表面タンパク質標的との配列類似性を有することが公知の表面タンパク質標的が挙げられる。標的は、発現プラスミド又はレンチウイルスにクローニングした相補的DNAによってコードされる。cDNAは、腫瘍、たとえば、T細胞のサンプルを提供した患者から外科手術により摘出した自家腫瘍又は異なる患者から単離したRNAに由来する。細胞株、たとえば、HEK293若しくはCHO細胞、又は初代細胞、たとえば、樹状細胞若しくはB細胞を、APCとして使用する。MHC及び標的cDNAは、単一のmRNA分子にコードされ、これはまた、ユニバーサルプライミング部位が隣接した核酸バーコード配列を含む。ユニバーサルプライミング部位を使用して、核酸バーコードを増幅させ、これを使用して、cDNAクローンを特定する。
【０１５９】
TCR発現細胞と標的発現細胞との比は、1:1、10:1、又は1:10である。TCR発現細胞又はCAR-T細胞が、cDNA発現細胞に結合し、それによってT細胞が活性化されるように、細胞混合物を、油中水型液滴中に区画化し、次いで、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、又は24時間インキュベートする。これらの液滴は、直径が20〜200μmである。液滴を、次いで、第2のマイクロ流体チップに注入し、これにより、細胞を含有する液滴を、溶解ミックス及びオリゴ-dTマイクロビーズを含有する液滴と融合させる。細胞を、界面活性剤、たとえば、SDSを用いて溶解させ、ポリ(A)RNA転写産物が、オリゴ-dTマイクロビーズに結合する。標的バーコード又は標的配列に特異的なプライマー、及びT細胞活性化マーカー、たとえば、CD69又はIFNgを使用した、オーバーラップ伸長液滴PCRでは、その活性化マーカーをコードするポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションを通じて標的クローンを特定するポリヌクレオチドに連結される。T細胞由来のTCR又はCAR-T配列はまた、ハイブリダイゼーションを通じて、推定上の標的cDNA転写産物における特定の識別配列に連結されている。推定上の標的のcDNA転写産物は、合成ポリ核酸バーコード又は固有の非合成配列を含み得る。RNAが結合したビーズを、油中水型反応器に注入し、チューブに入れて、従来的なサーマルサイクラーでインキュベートすることによって、液滴オーバーラップ伸長RT-PCRを行う。T細胞活性化マーカーは、T細胞によって発現される内因性転写産物である。オーバーラップ伸長RT-PCRによって生成した複数のポリ核酸を、次いで、バルクシーケンシングに供して、T細胞活性化マーカーに連結されたTCR又はCAR-T配列を特定し、定量化した後、これらのTCRβを、推定上のcDNA標的転写産物に連結させる。抗体タンパク質を産生するのに十分なポリ核酸配列が生成されるように、TCRβを、T細胞活性化マーカー及びTCRαに連結させて、3つ、4つ、又はそれ以上の転写産物の融合複合体を形成する。2つのみの転写産物が、単一の分子、たとえば、TCRβ及びCD69に連結されるように、TCRβを、T細胞活性化マーカー及びTCRαに連結させる。この実験により、T細胞において機能性応答を誘導するペプチド:MHCとTCRとの間、又はCAR-Tと表面標的との間のコグネイトペアリングを特定し、これらのTCR又はCAR-Tを、並行して、推定上の標的cDNA転写産物に連結させる。標的配列を、全トランスクリプトームに連結させ、次いで、トランスクリプトームを、バイオインフォマティクスにより分析して、細胞機能における変化を示す配列の変化を検出する。
【０１６０】
養子TCR操作又はCAR-T細胞療法の有効性及び特異度を、標的に定まった活性化マーカー及び標的外活性化マーカーの配列数をそれぞれ基準とすることによって、推定する。操作T細胞活性化アッセイを使用して、臨床治療薬の製造のための制御範囲を生成する。このアッセイは、CAR-T又はTCR操作養子T細胞療法の非臨床的開発中に使用される。トランスクリプトームにわたる活性化アッセイを使用して、操作T細胞の安全性又は有効性に関する新規なバイオマーカーを含む転写産物を発見することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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