(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意で含まれる医薬上許容される担体の他は、活性成分とするアクテインとデオキシアクテインのみからなる薬物組成物であって、アクテインとデオキシアクテインの質量比が１：５〜５：１である、自己免疫疾患を治療するための薬物組成物。
【請求項２】
前記アクテインとデオキシアクテインの質量比は１：３〜３：１である、請求項１に記載の薬物組成物。
【請求項３】
前記アクテインとデオキシアクテインの質量比は１：１である、請求項２に記載の薬物組成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の薬物組成物の自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における使用。
【請求項５】
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載の薬物組成物の炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製における使用。
【請求項７】
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野に関し、具体的には、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製におけるショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫細胞と適応免疫細胞の異常活性化は自己免疫疾患の重要な発病メカニズムであり、典型的な疾患は自己免疫性肝炎と関節リウマチである。自己免疫性肝炎は自己免疫反応によって引き起こされる慢性進行型炎症性肝疾患であり、程度の異なる血清トランスアミナーゼの上昇、自己抗体陽性が示され、リンパ球、プラズマ細胞の浸潤を主とするインターフェイス肝炎によって引き起こされる肝機能損傷と免疫障害を組織学的特徴とする。関節リウマチは炎症性滑膜炎を主とする全身性疾患であり、手足の小さな関節の多関節、対称性、侵襲性関節炎を特徴とし、多くの場合、血清リウマチ因子と炎症性サイトカインの上昇を伴い、関節変形や機能喪失を引き起こす可能性がある。身体の免疫を調節するという観点からの新薬や健康食品の開発は自己免疫疾患を治療するための突破口であり、我が国の伝統的な医薬資源に基づいて免疫調節薬または機能性健康食品を開発することは幅広い見通しがある。
【０００３】
ショウマ（Ｃｉｍｉｃｉｆｕｇａ  ｆｏｅｔｉｄａｅ）はキンポウゲ科ショウマ属の植物であり、トリテルペノイドサポニン抽出物はショウマの根、茎および地上部を抽出することによって得られ、一般的には、抗腫瘍、内分泌調節、抗骨粗鬆など複数の生理活性を有すると考えられ、開発の見通しのある天然産物である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一つの目的は、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン（別名：２７−デオキシアクテイン）、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の新しい使用を提供することにある。
【０００５】
本発明は、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用を提供する。
【０００６】
上記使用において、前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである。
【０００７】
本発明は、さらに、炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製における、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用を提供する。
【０００８】
上記使用において、前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含んでもよい。
【０００９】
上記使用において、前記炎症性サイトカインは、複数の細菌やウイルスの感染によって引き起こされる疾患、例えば、肝炎、肺炎、敗血症、インフルエンザ、麻疹、単純ヘルペスなどに関し、また、複数の自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、全身性血管炎、強皮症、多発性脳脊髄炎などに関し、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物は、いずれも、上記疾患を予防、緩和、治療するための薬物または機能性健康食品として使用することができる。
【００１０】
上記使用において、アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物におけるアクテインとデオキシアクテインの質量比は、１〜５：５〜１であってもよく、好ましくは、１〜３：３〜１であり、より好ましくは、１：１である。
【００１１】
上記使用において、前記薬物は、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物を活性成分とするほか、医薬上許容される担体を含んでもよい。医薬上許容される担体は、賦形剤、結合剤、潤滑剤、充填剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、着色剤、矯味剤、防腐剤などを含むがこれらに限らない。前記薬物は、医薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤などの経口剤形、および注射剤、凍結乾燥剤などの非経口剤形を含むがこれらに限らない。
【００１２】
上記使用において、前記機能性健康食品は、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物を活性成分とするほか、ありふれた添加物を添加してもよく、栄養素、ビタミン、ミネラル、香味料、着色剤、粘着付与剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤などを含むがこれらに限らない。前記機能性健康食品は、単独で使用することができるし、既存の薬物または健康食品と同時に使用することもできる。
【００１３】
本発明の二つ目の目的は、薬物組成物を提供することにある。本発明により提供される薬物組成物は自己免疫疾患を治療するための薬物組成物であってもよく、前記薬物組成物は以下の成分を活性成分とする：ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物。
【００１４】
上記薬物組成物において、前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである。
【００１５】
本発明により提供される薬物組成物は炎症性サイトカインを抑制するための薬物組成物であってもよく、前記薬物組成物は以下の成分を活性成分とする：ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物。
【００１６】
上記薬物組成物において、前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含んでもよい。
【００１７】
上記薬物組成物において、アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の中のアクテインとデオキシアクテインの質量比は、１〜５：５〜１、好ましくは、１〜３：３〜１、より好ましくは１：１である。
【００１８】
上記薬物組成物において、活性成分に加え、医薬上許容される担体を含んでいてもよく、賦形剤、結合剤、潤滑剤、充填剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、着色剤、矯味剤、防腐剤などを含むがこれらに限らない。前記医薬組成物は単独で使用することができ、既存の自己免疫疾患の治療薬と同時に使用することもでき、それは医薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤などの経口剤形および注射剤、凍結乾燥剤などの非経口剤形を含むがこれらに限らない。
【００１９】
上記薬物組成物において、薬物組成物はショウマを含有する漢方薬組成物、例えば、ショウマと他の生薬トウキ、サイコ、チンピなどと調製される配合薬であってもよい。前記漢方薬組成物は単独で使用することができ、既存の自己免疫疾患の治療薬と同時に使用することもでき、それは漢方薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、煎薬、薬酒、薬茶、薬露、丸剤、散剤、軟膏剤、エリキシル剤、錠剤、トローチ剤などを含むがこれらに限らない。
【００２０】
本発明では、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ、ＣｏｎＡ）のモデル動物実験から、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはその組成物、薬物組成物などがコンカナバリンＡによる急性免疫性肝損傷に対して保護作用を有し、自己免疫性肝炎モデル動物の生存率、肝機能レベル、肝臓の病理学的損傷および炎症性サイトカインの分泌能を著しく改善することが分かり、それは自己免疫性肝炎を治療または緩和するための薬物または健康食品の調製に用いられることができると考えられる。
【００２１】
本発明では、さらに、コラーゲン誘発関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＣＩＡ）モデル動物の実験から、アクテイン、デオキシアクテイン、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、またはその組成物、薬物組成物などがＣＩＡによる多発性関節損傷に対して保護作用を有し、ＣＩＡモデル動物の発病率、平均関節炎指数を著しく低下させ、骨の構造的損傷を改善し、抗ＩＩ型コラーゲン抗体および複数の炎症性サイトカインの分泌を抑えることが分かり、それは確実な抗関節炎作用を有することが示され、関節リウマチ症状を治療、緩和するための薬物または健康食品の調製に用いられることができると考えられる。
【００２２】
本発明はさらにＬＰＳで刺激したマクロファージ（ＢＭＤＭ）から、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはその組成物、薬物組成物などが確実な抗炎症作用を有することが認められ、マクロファージの活性化とＩＬ−１２、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの分泌を顕著に抑制できると考えられ、生体外実験により、ＮＫ、ＮＫＴとＴリンパ球の活性化および炎症性サイトカインＩＦＮ−γの分泌を顕著に抑制できると考えられる。そのため、免疫抑制剤として複数の炎症性サイトカインによって引き起こされる炎症などの疾患の治療や改善に用いられることができると考えられる。
【００２３】
要するに、本発明はショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、アクテイン、デオキシアクテインの新しい使用を提供し、それが広範な免疫抑制作用を有するため、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品における応用領域を開拓し、化学合成や抽出によってこれらの成分を得て使用することができるだけでなく、ショウマ抽出物またはショウマを含有する漢方薬の配合薬を直接使用することもでき、簡単に調製でき、原料の由来が広範であり、コストが低く、高い市場応用価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実験例１の各群マウスの生存率に関する図表である。
【図２】実験例２の各群モデルマウスの肝組織の顕微鏡写真（ＨＥ染色）である。
【図３】実験例３の各群マウスの前後足趾関節の写真である。
【図４】実験例６の各群マウスの右後肢膝関節、足首関節および足趾関節のＭｉｒｃｏ−ＣＴ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、調製例と実験例により、本発明を更に詳しく説明し、それによって本発明の特徴や利点をより明らかになる。しかし、調製例と実験例は本発明の理解を助けるためのものであり、本発明の範囲は本文に記載される調製例と実験例に限定されるものではない。
【００２６】
以下の調製例と実験例に記載される実験方法は特に断りがない限り、いずれも従来の方法である。使用される材料、試薬などは、別段の指示がない限り、市販で入手することができる。
【００２７】
（調製例：ショウマトリテルペノイドサポニン抽出物の調製）
ショウマは同仁堂前門本社から購入される。参考文献（潘瑞楽、陳迪華、斯建勇、趙暁宏、沈連鋼、『ショウマ地上部のサポニン類成分についての研究（升麻地上部分○○類成分研究）』、薬学学報、２００２年、３７（２）：１１７−１２０）の方法に従ってトリテルペノイドサポニンの抽出を行う（訳注：丸括弧で示した前述の参考文献の正式名称は本来は簡体字表記、「○○」はサポニンを意味する二文字の中国語、一文字目は「白」の下に「七」、二文字目はくさかんむりの下に「甘」である。）。
【００２８】
ショウマ１２ｇを取って蒸留水に１〜２時間浸漬し、強火で１０分煎じてから、弱火で１時間煎じ、７５ｍＬまで濃縮する。ショウマ煎出液７５ｍＬを取り、９５％エタノールを加えて１０００ｍＬとし、１晩放置し、上澄液を分離する。上澄液を減圧蒸留してエタノールと余剰水を十分に除去し、７５ｍＬまで濃縮し、ショウマのアルコール抽出物が得られる。室温条件下で、有機溶媒酢酸エチルを用いて５回抽出し、攪拌・抽出し、遠心して上澄液が得られ、さらに５％炭酸ナトリウムで抽出し、減圧回収してから、ショウマ総フェノール酸の抽出物が得られ、水を加えて正確に７５ｍＬとする。
【００２９】
（実験例１：ＣｏｎＡ肝炎モデルマウスの生存率に対する作用に関する実験）
試験材料：ＣｏｎＡはＳｉｇｍａ社から購入される。アクテインとデオキシアクテインは米国ＣｈｒｏｍａＤｅｘ社から購入される。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
割り当て：Ｃ５７ＢＬ／６マウス４０匹、雄、１８−２０ｇ、１日間順応飼育してから、以下の４群にランダムに割り当てる（各群１０匹）：ＣｏｎＡモデル群、トリテルペノイドサポニン群、アクテイン群、デオキシアクテイン群。
モデル動物の作製および投与処置：ＣｏｎＡ粉末１５０ｍｇを秤量し、滅菌ＰＢＳ４０ｍＬを加えて溶解し、室温下で時々軽く振盪しながら１〜２時間放置し、低温超音波によって溶解を促進し（毎回５分以下）、過度の発泡を避けるように注意する。完全に溶解してから、正確に５０ｍＬとし、濃度が３ｍｇ／ｍＬになるように調製し、０．４５μｍのフィルタで加圧濾過する。２５ｍｇ／ｋｇに従ってマウスに単回静脈内注射し、各マウスに１００μＬ注射する。アクテインとデオキシアクテインを４ｍｇずつ取り、滅菌二段蒸留水１０ｍＬを加えて溶解し、濃度が０．４ｍｇ／ｍＬになるように調製する。ＣｏｎＡモデル群は、蒸留水２５０μＬを強制経口投与し、トリテルペノイドサポニン群は、調製例１のショウマトリテルペノイドサポニン抽出物２５０μＬを強制経口投与し、投与量は１５ｍｇ／ｋｇであり、アクテイン群は、アクテイン溶液２５０μＬを強制経口投与し、投与量は５ｍｇ／ｋｇであり、デオキシアクテイン群は、デオキシアクテイン溶液２５０μＬを強制経口投与し、投与量は５ｍｇ／ｋｇであり、動物の９６時間以内の死亡率を観察する。
【００３０】
結果を図１に示す。ＣｏｎＡモデル群では４−６時間後から死亡するマウスが観察され始め、２４時間以内に死亡するマウスが比較的集中し、その後死亡率が低下し、４８−９６時間以内はほぼ安定する。ＣｏｎＡモデル群の生存率は１０％であり、薬物処置後のマウスの生存率が上昇し、トリテルペノイドサポニン群の生存率は７０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊＊＊、ｐ＜０．００１）、アクテイン群の生存率は６０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊＊、ｐ＜０．０１）、デオキシアクテイン群の生存率は４０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊＊、ｐ＜０．０１）である。生存率についてはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ統計解析により、各薬物処置群はモデル群に比べ有意な差が認められる。これらの結果により、ショウマトリテルペノイドサポニン抽出物、アクテイン、およびデオキシアクテインはいずれもＣｏｎＡ急性肝炎モデルマウスの生存率を向上させることができると考えられる。
【００３１】
（実験例２：肝臓炎症に対する治療に関する実験）
試験材料および動物は実験例１と同様である。
割り当て：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雄、１８−２０ｇ、１日間順応飼育してから、以下の５群にランダムに割り当てる：正常対照群、ＣｏｎＡモデル群、トリテルペノイドサポニン群、アクテイン群、およびデオキシアクテイン群。
モデル動物の作製および投与処置：正常対照群を除き、ＣｏｎＡ  １５ｍｇ／ｋｇの投与量に応じてマウスに単回静脈内注射する。各投与群の投与量は実験例１と同様である。
（１）各投与群の薬物によるＣｏｎＡモデルマウス血清中のＡＬＴ、ＡＳＴへの作用を調べる。各群８匹ずつをＣｏｎＡ注射１０時間後麻酔下で屠殺し、末梢血を採取して血清を分離し、ＡＬＴ、ＡＳＴを測定する。
（２）各投与群の薬物によるＣｏｎＡモデルマウス肝臓の病理的損傷への作用を調べる。各群３匹ずつをＣｏｎＡ注射１０時間後麻酔下で屠殺し、肝臓左葉を摘出し、約５ｍｍ３のサイズで切り、１０％ホルマリン溶液に浸し、脱水、透徹・パラフィン浸透、包埋、薄切、伸展、染色を行ってから観察する。
（３）各投与群の薬物によるＣｏｎＡモデルマウスの血清サイトカインの分泌への作用を調べる。各群６匹ずつをＣｏｎＡ注射３時間後末梢血を採取し且つ血清を分離し、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、およびＭＣＰ−１の分泌能を測定する。ＣｏｎＡ注射１０時間後血清を分離し、サイトカインＩＦＮ−γの分泌能を測定する。
【００３２】
結果（１）：薬物によるＣｏｎＡ肝炎モデルマウス血清中のＡＬＴおよびＡＳＴへの作用
結果を表１に示す。ＣｏｎＡモデル群は正常群に比べＡＬＴ、ＡＳＴが顕著に上昇する（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。各投与群のＡＬＴ、ＡＳＴはいずれも顕著に低下し、ＣｏｎＡモデル群に比べ統計的有意差が認められる（＃、ｐ＜０．０５；＃＃、ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１）。ショウマトリテルペノイドサポニン抽出物、アクテイン、およびデオキシアクテインはいずれもＣｏｎＡマウスの肝損傷を軽減できると考えられる。
【００３３】
表１：ショウマトリテルペノイドサポニン提取物、アクテイン、およびデオキシアクテインによるＣｏｎＡ肝炎モデルマウス血清中のＡＬＴとＡＳＴへの作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表１】
0006961020.tif 000002
注：＊はＣｏｎＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣｏｎＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００３４】
結果（２）：薬物によるＣｏｎＡ肝炎モデルマウス肝臓の病理学的損傷への作用
結果を図２示す。ＣｏｎＡモデル群マウスの肝細胞が広範囲な変性を呈し、肝小葉の構造に乱れが認められ、肝細胞の中心静脈が著しく拡張し、中心静脈および肝類洞が著しく充血し、ひいては肝細胞の大きなシート状壊死巣、大量の免疫細胞浸潤が認められる。ショウマトリテルペノイドサポニン群は、ＣｏｎＡ群に比べ、肝細胞のシート状壊死巣が著しく軽減し、白血球のやや浸潤が認められる。アクテイン群、デオキシアクテイン群は、ＣｏｎＡ群に比べ、肝細胞のシート状壊死巣が著しく軽減し、白血球の浸潤が減少する。
【００３５】
結果（３）：薬物によるＣｏｎＡ肝炎モデルマウスの血清サイトカインへの作用
結果を表２に示す。ＣｏｎＡモデル群は、正常群に比べ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの分泌能が顕著に上昇し、統計学的有意差が認められる（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。トリテルペノイドサポニン抽出物とアクテインはいずれも血清炎症性サイトカインＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの分泌能を著しく低下させることができ、デオキシアクテインはＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６とＩＦＮ−γの分泌能を著しく低下させることができると考えられる（＃、ｐ＜０．０５；＃＃、ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１）。
【００３６】
表２：ショウマトリテルペノイドサポニン提取物、アクテインおよびデオキシアクテインがＣｏｎＡ肝炎モデルマウス血清炎症性サイトカインの分泌に対する作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表２】
0006961020.tif 000003
注：＊はＣｏｎＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣｏｎＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００３７】
（実験例３：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの関節炎指数への作用）
試験材料：ウシＩＩ型コラーゲン酢酸溶液、完全フロイントアジュバントはＣｈｏｎｄｒｅｘ社から購入される。イソフェルラ酸は天津一方科技有限公司から購入される。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
割り当て：Ｃ５７ＢＬ／６マウス２４匹、雄、１８−２０ｇ、１日間順応飼育してから、以下の３群にランダムに割り当てる：正常群とＣＩＡモデル群、ｎ＝５；アクテイン併用デオキシアクテイン群（以下、アクテインデオキシアクテイン群という）、ｎ＝７。
モデル動物の作製および投与処置：２ｍｇ／ｍＬウシＩＩ型コラーゲン酢酸溶液を調製し、１晩放置してからウシＩＩ型コラーゲン酢酸溶液２ｍＬを取り、完全フロイントアジュバント２ｍＬとよく混ぜ乳化させ（氷上操作）、調製されるウシＩＩ型コラーゲン乳剤の最終濃度はｌｍｇ／ｍＬである。各マウスに０．１ｍＬを皮内注射する。アクテインとデオキシアクテインを４ｍｇずつとり、滅菌二段蒸留水１０ｍＬを加えて溶解し、０．４ｍｇ／ｍＬアクテインと０．４ｍｇ／ｍＬデオキシアクテインとを含有する混合溶液が調製され、アクテインデオキシアクテイン群の投与治療の用に供する。マウス初回免疫２１日目から、２回目の免疫を行い、２回目の免疫の０日目から、ＣＩＡモデル群は、蒸留水２５０μＬを強制経口投与し、アクテインデオキシアクテイン群は、アクテインとデオキシアクテインの混合溶液２５０μＬを強制経口投与し、投与量は５ｇ／ｋｇであり、１日ごとに強制経口投与し、２１日間連続飼育する。
２回目の免疫の０日目から、３日ごとに関節評価を行う。関節評価法によって動物を評価し（０−４段階）、評価の根拠は関節の赤みや腫れの程度および関節の腫脹と変形の状況である。０点：赤みや腫れがない。１点：赤みがあるが腫れがない。２点：関節に軽度の赤みや腫れがある。３点：関節に中程度の赤みや腫れがある。４点：関節に重度の赤みや腫れがあり且つ機能障害を伴う。四肢は別々にスコア付けされ、四肢のスコアの合計が当該マウスの関節炎指数である。最高点は１６点である。点数が高ければ高いほど、関節症状が深刻になる。
【００３８】
結果を表３に示す。２回目の免疫の３日目、ＣＩＡモデル群マウスに赤みや腫れおよび軽度の腫脹が認められ、関節炎指数の平均値は０．５７であり、疾患の持続時間の延長に伴い、関節炎指数が徐々に上昇し、１５日目、足首と足趾の関節に重度の腫脹があり、関節表面に充血が認められ、後肢で体重を支えることができず、平均関節炎指数は最高値７．８６±０．９６になり且つプラトー期に達する。アクテインデオキシアクテイン群の平均関節炎指数は３．７１±１．１７であり、平均関節炎指数を著しく低下させ、ＣＩＡモデル群に比べ有意差が認められる。
【００３９】
表３：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの関節炎指数への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表３】
0006961020.tif 000004
注：＊はＣＩＡ群が正常群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。
【００４０】
図３は１５日目ＣＩＡモデル群および投与群マウスの前後足趾関節の腫脹の写真を示す。写真から、ＣＩＡ関節炎モデルマウスの足首関節が著しく腫脹し、アクテインデオキシアクテイン群マウスの関節腫脹が著しく軽減することがわかる。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用はＣＩＡ関節炎モデルマウスの関節の赤みや腫れおよび機能障害を改善できると考えられる。
【００４１】
（実験例４：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡモデルマウスの体重への作用）
試験材料と動物は実験例３と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：実験例３と同様である。マウスの２回目の免疫の２１日目、体重を測る。
【００４２】
結果を表４に示す。各投与群では、マウス体重の平均値に有意差が認められない。この結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用はＣＩＡ関節炎モデルマウスの体重に影響を与えないと考えられる。
【００４３】
表４：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの体重への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表４】
0006961020.tif 000005
【００４４】
（実験例５：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡモデルマウスの臓器指数への作用）
試験材料と動物は実験例３と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：実験例３と同様である。マウスの２回目の免疫の２１日目、麻酔下で屠殺し、脳、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、精巣を摘出し、体重を迅速に測り、臓器指数を評価する。
【００４５】
結果を表５に示す。アクテインデオキシアクテイン群は、ＣＩＡ群に比べ、平均臓器指数に有意差が認められない。この結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用はＣＩＡモデルマウスの臓器指数に影響を与えないと考えられる。
【００４６】
表５：アクテインとデオキシアクテインとによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの臓器指数への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ、単位ｍｇ）
【表５】
0006961020.tif 000006
【００４７】
（実験例６：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスへの治療作用）
試験材料と動物：実験例３と同様である。抗ＩＩ型コラーゲン抗体ＥＬＩＳＡキットはＣｈｏｎｄｒｅｘ社から購入され、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ３６−Ｐｌｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）Ｐａｎｅｌ  １Ａ  サイトカインおよびケモカイン検出キットはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から購入される。
モデル動物の作製および投与処置：各投与群の投与量は実験例３と同様である。２回目の免疫の２１日目、マウスに麻酔をかけ、血清を採取し四肢を切断する。
（１）Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ技術を用いて各投与群の薬物によるＣＩＡモデルマウスの関節構造への作用を調べる。各群からマウスを３匹ずつ取って首の骨を折って処置してから、直ちに右後肢を切り、４％中性ホルマリンで固定する。２−３日間固定してから、生体動物画像診断システムでＭｉｃｒｏ−ＣＴスキャンを行う。採集部位：マウス右後肢脛骨骨端プレートの上の区域のデータを採集する。３群のデータを採集する。サイズ選択：脛骨骨端プレートの上の部位（０．２５＊０．２５＊０．２５）；骨測定指標のデータを採集する：骨密度、骨体積、骨体積分率および骨梁の数。
（２）各投与群薬物によるＣＩＡモデルマウスの血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量への作用を調べる。各群７匹、末梢血を採取し且つ血清を分離し、Ｅｌｉｓａで抗ＩＩ型コラーゲン抗体を測定する。
（３）各投与群薬物によるＣＩＡモデルマウスの血清と関節組織のサイトカインの分泌への作用を調べる。各群７匹、末梢血を採取し且つ血清を分離し、多因子により血清サイトカイン：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの分泌能を測定する；右後肢膝を採取し、関節と足趾などを液体窒素内で急速凍結し、均質化後にタンパク質を抽出し、多因子により組織サイトカインＩＬ−９、ＩＬ−１８およびＭＩＰ−２の分泌能を測定する。
【００４８】
結果（１）：Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ技術を用いて各投与群薬物によるＣＩＡモデルマウスの関節構造への作用を調べる。
結果を図４に示す。ＣＩＡモデルマウス足首の関節構造がぼやけ、骨粗鬆が認められ延いてはひどく破壊し、アクテインデオキシアクテイン群の関節構造がほぼ無傷であり、特に骨の破壊程度がモデル群より著しく軽い。表６に示すように、ＣＩＡ群マウスは、正常群に比べ、骨密度、骨体積、骨体積分率および骨梁の数はいずれも低下し、アクテインデオキシアクテイン群は、ＣＩＡモデル群に比べ、骨測定指標が著しく上昇する。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用は関節破壊を効果的に緩和できると考えられる。
【００４９】
表６：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの骨損傷への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表６】
0006961020.tif 000007
注：＊はＣＩＡ群が正常群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。
【００５０】
結果（２）：ＣＩＡモデルマウスの血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量への作用。
結果を表７に示す。ＣＩＡ群は、正常群に比べ、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の分泌能が顕著に上昇し、統計学的有意差が認められる（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。アクテインデオキシアクテインは血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の分泌能を顕著に低下させる。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用は自己抗体の分泌能を低下させることができると考えられる。
【００５１】
表７：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表７】
0006961020.tif 000008
注：＊はＣＩＡ群が正常群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００５２】
結果（３）：ＣＩＡモデルマウスの血清および関節組織のサイトカインの分泌への作用。
結果を表８に示す。アクテインデオキシアクテイン群は、ＣＩＡ群に比べ、血清サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１８、ケモカインＭＣＰ−１およびコロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦの分泌能が顕著に低下し、統計学的有意差が認められる。それと同時に、関節組織中のＩＬ−１８とＭＩＰ−２の分泌能が顕著に低下し、統計学的有意差が認められる。これらの結果により、アクテインとデオキシアクテインとの併用は血清と関節組織中の複数のサイトカイン、ケモカイン、コロニー刺激因子の分泌能を顕著に低下させことができ、広範な抗炎症作用を有すると考えられる。
【００５３】
表８：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの血清および関節組織のサイトカインへの作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表８】
0006961020.tif 000009
注：＊はＣＩＡ群が正常群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００５４】
（実験例７：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球の割合への作用）
試験材料と動物：ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＮＫ１．１−ＡＰＣ抗体、Ｋｉ６７−ＰＥ抗体、細胞内染色キットＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＳｅｔはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入される。Ｂ２２０−ＦＩＴＣ抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入される；その他の試薬はいずれも実験例３と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：各投与群の投与量は実験例３と同様である。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
脾臓単細胞懸濁液の調製：Ｃ５７ＢＬ／６マウス麻酔後、マウスの脾臓を分離し、脾臓をＰＢＥＢ  ４ｍＬの入った小さな皿に置き、スライドガラスの粗い面で脾臓を研磨し、４００メッシュの濾過用網で脾臓細胞をフローチューブに濾過し、遠心分離して上澄液を除去し、ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２ｍＬを加え、室温下で１５分溶解してから、遠心分離して上澄液を除去し、脾臓細胞が得られる。そしてＰＢＳ  １ｍＬを加えて再懸濁し、ピペットで繰り返し吸引・排出して均一になるように混合し、１００μＬを吸引してフローチューブに入れる。抗ＣＤ３、Ｂ２２０、ＮＫ１．１抗体を加えて表面染色を行い、４℃下で１５分インキュベートしてから、ＰＢＥＢ  ２ｍＬを加え、遠心分離して上澄液を除去する。細胞内染色を行う。
細胞内染色：１）細胞固定透過処理液Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μＬを加え、室温遮光下で、４０分固定透過処理する。２）Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬを加えて２回洗浄し、上澄液を除去する。３）Ｋｉ−６７−ＰＥ抗体１μＬを加えて室温遮光下で４０分放置する。４）ステップは２）のステップと同様である。５）フローサイトメーターＢＤ  ＣａｌｉｂａｒでＣＤ３−ＮＫ１．１＋Ｂ２２０−ＮＫ細胞におけるＫｉ−６７の発現率を測定する。
【００５５】
結果を表９に示す。ＣＩＡ関節炎モデルマウスは、正常マウスに比べ、脾臓ＮＫ細胞のＫｉ−６７＋細胞の割合が上昇し、ＮＫ細胞の増殖能が上昇することが示唆される。アクテインデオキシアクテイン群は、ＣＩＡ群に比べ、Ｋｉ−６７＋細胞の割合が低下し、有意差が認められ、アクテインとデオキシアクテインとの併用がＮＫ細胞の増殖を抑制できると考えられる。
【００５６】
表９：アクテインとデオキシアクテインとの併用によるＣＩＡ関節炎モデルマウスのＮＫ細胞の増殖能への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表９】
0006961020.tif 000010
注：＊はＣＩＡ群が正常群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊はｐ＜０．０５を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００５７】
（実験例８：アクテインとデオキシアクテインとによるマクロファージのサイトカイン分泌への抑制作用に関する実験）
試験材料：ＬＰＳはＳｉｇｍａ社から購入される。アクテインとデオキシアクテインは米国ＣｈｒｏｍａＤｅｘ社から購入される。ＦＢＳは米国ＰＡＡ社から購入される。ＤＭＥＭ高グルコース培地、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入される。ＥＬＩＳＡキットは米国ＢＤ社から購入される。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の分離と培養：Ｃ５７ＢＬ／６マウス麻酔後、無菌環境下でマウスの両側大腿骨と脛骨を分離し、２ｍＬシリンジを使用して滅菌ＰＢＳを吸引し骨髄細胞をフローチューブに流し込み、ピペットで繰り返し吸引・排出し、骨髓単細胞懸濁液とする。遠心分離後、骨髓細胞が得られ、１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％二重抗体（抗ペニシリン、ストレプトマイシン）を含有する完全培地１０ｍＬ、および１０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦを加え、１００ｍｍ細胞培養用皿に接種し培養し、３７度で培養する。４日後上記新鮮な培地に交換し、培養７日目、顕微鏡により大きな体積、付着増殖、分化成熟のマクロファージが観察されることができる。細胞スクレーパーで細胞を掻き落とし、ピペットで繰り返し吸引・排出し均一になるように混合し、単細胞懸濁液としてから、１×１０５個／ウェルに従って９６ウェルプレートに入れる。
ＢＭＤＭ細胞の誘導活性化と投与処置：投与量の異なるアクテインとデオキシアクテインでＢＭＤＭ細胞を処置し、１時間後１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳで細胞を刺激し、細菌感染によるマクロファージの活性化をシミュレートする。４時間後細胞上澄液を収集し、ＥＬＩＳＡでサイトカイン分泌能を測定する。
【００５８】
結果を表１０に示す。ＬＰＳでＢＭＤＭ細胞を刺激して活性化させ、大量の炎症性サイトカインＩＬ−１２とＴＮＦ−αが分泌されることが認められる。アクテインは２．５ｎｇ／ｍＬから３１２．５ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲内においてＩＬ−１２の分泌を顕著に抑制することができ、０．５ｎｇ／ｍＬから３１２．５ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲内においていずれもＴＮＦ−αの分泌を抑制することができる。デオキシアクテインは２５０ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲内においてＩＬ−１２の分泌を顕著に抑制することができ、５０ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲内においてＴＮＦ−αの分泌を抑制することができる。これらの結果により、２．５ｎｇ／ｍＬから３１２．５ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲内におけるアクテインおよび２５０ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲内におけるデオキシアクテインはいずれもマクロファージの活性化を顕著に抑制する作用を有すると考えられる。
【００５９】
表１０：アクテインとデオキシアクテインとによるマクロファージのＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの分泌への抑制作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表１０】
0006961020.tif 000011
注：＊はＬＰＳ群がブランク群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＬＰＳ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００６０】
（実験例９：アクテインとデオキシアクテインとによるＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γの発現への抑制作用に関する実験）
試験材料：ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＮＫ１．１−ＡＰＣ抗体、細胞内染色キットＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ、細胞刺激剤Ｃｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ＣｏｃｋｔａｉｌはいずれもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入される。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
骨髄単細胞懸濁液の調製：Ｃ５７ＢＬ／６マウス麻酔後、無菌環境下でマウスの両側大腿骨と脛骨を分離し、２ｍＬシリンジを使用して滅菌ＰＢＳを吸引して骨髄細胞をフローチューブに流し込み、ピペットで繰り返し吸引・排出し、骨髓単細胞懸濁液とする。遠心分離後、骨髓細胞が得られ、１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％二重抗体（抗ペニシリン、ストレプトマイシン）を含有する完全培地１．５ｍＬを加える。
投与処置およびＮＫ細胞誘導活性化後の細胞内染色：中濃度の６２．５ｎｇ／ｍＬアクテインと２５０ｎｇ／ｍＬデオキシアクテインで細胞を処置し、１時間後Ｃｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＭＡ、イオノマイシンとタンパク質輸送阻害剤を含有する）で細胞を５時間刺激し、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＮＫ１．１−ＡＰＣ抗体を用いて表面染色を行い、ＩＬ−１２−ＡＰＣ抗体を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメーターによりＣＤ４５＋ＣＤ３−ＮＫ１．１＋のＮＫ細胞においてＩＦＮ−γを発現する陽性細胞の割合を測定する。
【００６１】
結果を表１１に示す。ＰＭＡ＋イオノマイシンの刺激により、骨髄中のＮＫ細胞が活性化し、炎症性サイトカインＩＦＮ−γの大量分泌が示される。ＰＭＡ＋イオノマイシン群に比べ、アクテインとデオキシアクテインとによる処置はいずれもＩＦＮ−γの発現に顕著に低下させ、ＮＫ細胞の活性化を抑制することができる（＊、ｐ＜０．０５）。
【００６２】
表１１：アクテインとデオキシアクテインとによるＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γの発現への抑制作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表１１】
0006961020.tif 000012
注：＊はＰＭＡ＋イオノマイシン群がブランク群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＰＭＡ＋イオノマイシン群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５を表す。
【００６３】
（実験例１０：アクテインとデオキシアクテインとによるＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γの発現への抑制作用に関する実験）
試験材料：実験例９と同様である。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
骨髄単細胞懸濁液の調製：実験例９と同様である。
投与処置およびＮＫ細胞誘導活性化後の細胞内染色：実験例９と同様である。フローサイトメーターによりＣＤ４５＋ＣＤ３−ＮＫ１．１＋のＮＫ細胞においてＩＦＮ−γを発現する陽性細胞の割合を測定する。
【００６４】
結果を表１２に示す。ＰＭＡ＋イオノマイシンの刺激により、骨髄中のＮＫ細胞が活性化し、炎症性サイトカインＩＦＮ−γの大量分泌が示される。ＰＭＡ＋イオノマイシン群に比べ、アクテインとデオキシアクテインによる処置はいずれもＩＦＮ−γの発現に顕著に低下させ、ＮＫ細胞の活性化を抑制することができる（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）。
【００６５】
表１２：アクテインとデオキシアクテインとによるＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γの発現への抑制作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表１２】
0006961020.tif 000013
注：＊はＰＭＡ＋イオノマイシン群がブランク群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊はｐ＜０．０１を表す。＃は投与群がＰＭＡ＋イオノマイシン群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。
【００６６】
（実験例１１：アクテインとデオキシアクテインとによるＴリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現への抑制作用に関する実験）
試験材料：ＣＤ３−ＰＥ抗体は米国ＢＤ社から購入され、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入される。その他の試薬はいずれも実験例９と同様である。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
脾臓単細胞懸濁液の調製：Ｃ５７ＢＬ／６マウス麻酔後、マウスの脾臓を分離し、脾臓をＰＢＥＢ  ４ｍＬの入った小さな皿に置き、スライドガラスの粗い面で脾臓を研磨し、４００メッシュの濾過用網で脾臓細胞をフローチューブに濾過し、遠心分離して上澄液を除去し、ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２ｍＬを加えて室温下で１５分溶解してから、遠心分離して上澄液を除去し、脾臓細胞が得られる。そして１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％二重抗体（抗ペニシリン、ストレプトマイシン）を含有する完全培地１．５ｍＬを加え、ピペットで繰り返し吸引・排出して均一になるように混合する。
投与処置およびＮＫ細胞誘導活性化後の細胞内染色：中濃度の６２．５ｎｇ／ｍＬアクテインと２５０ｎｇ／ｍＬデオキシアクテインで細胞を処置し、１時間後Ｃｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＭＡ、イオノマイシンおよびタンパク質輸送阻害剤を含有する）で細胞を５時間刺激し、フローサイトメーターによりＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γを発現する陽性細胞の割合、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γを発現する陽性細胞の割合を測定する。
【００６７】
結果を表１３に示す。ＰＭＡ＋イオノマイシンの刺激により、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔは炎症性サイトカインＩＦＮ−γを大量に発現する。ＰＭＡ＋イオノマイシン群に比べ、アクテインとデオキシアクテインとの単独投与はＩＦＮ−γの発現を低下させることができないが、両者の併用は相乗作用を有し、ＩＦＮ−γの発現を顕著に低下させることができる（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【００６８】
表１３：アクテインとデオキシアクテインとによるＴリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現への抑制作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
【表１３】
0006961020.tif 000014
注：＊はＰＭＡ＋イオノマイシン群がブランク群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＰＭＡ＋イオノマイシン群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。
【００６９】
要約すれば、ショウマトリテルペノイドサポニン抽出物、アクテイン、デオキシアクテインはいずれも肝炎モデルマウスの生存率を著しく向上させ、肝機能を改善し、肝臓の病理学的損傷を軽減し、炎症性サイトカインの放出を抑え、著しい肝保護作用を有する。
【００７０】
アクテインとデオキシアクテインとの併用は関節炎モデルマウスの平均関節炎指数を顕著に低下させ、骨の構造を改善し、骨の侵食を軽減し、炎症性サイトカインの放出を抑制し、ＮＫ細胞の増殖を抑え、著しい免疫調節および関節保護の作用を有する。
【００７１】
それに、ショウマトリテルペノイドサポニン抽出物およびその主要成分であるアクテインとデオキシアクテインとは顕著な抗炎症作用を有し、いずれもマクロファージ、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の活性化を抑制することができ、両者の併用はＴリンパ球の活性化を抑制することができ、広範な免疫抑制作用を有する。
【００７２】
特に断りがない限り、本発明で使われる用語はいずれも本分野の当業者が一般的に理解する意味と同様の意味を有するものとする。
【００７３】
本発明にかかる実施形態は例示のみを目的として提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本分野の当業者は本発明の範囲から逸脱せずに様々な置換、変更、および改良を行うことができ、そのため、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって決定される。
【００７４】
［付記］
［付記１］
自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用。
【００７５】
［付記２］
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記１に記載の使用。
【００７６】
［付記３］
炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製における、ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物の使用。
【００７７】
［付記４］
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む、付記３に記載の使用。
【００７８】
［付記５］
前記アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物において、アクテインとデオキシアクテインの質量比は、１〜５：５〜１、好もしくは、１〜３：３〜１、より好もしくは、１：１である、付記１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【００７９】
［付記６］
ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物を活性成分とする自己免疫疾患を治療するための薬物組成物。
【００８０】
［付記７］
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記６に記載の薬物組成物。
【００８１】
［付記８］
ショウマトリテルペノイドサポニン類抽出物、ショウマ、アクテイン、デオキシアクテイン、またはアクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物を活性成分とする炎症性サイトカインを抑制するための薬物組成物。
【００８２】
［付記９］
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む、付記８に記載の薬物組成物。
【００８３】
［付記１０］
前記アクテインとデオキシアクテインとから形成される組成物において、アクテインとデオキシアクテインの質量比は、１〜５：５〜１、好もしくは、１〜３：３〜１、より好もしくは、１：１である、付記６〜９のいずれか１つに記載の薬物組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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