(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）活性を強化することによって、ＮＡＤＰＨ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）の生産能が非変形微生物に比べて増加した、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記微生物が、
（１）トランスケトラーゼ（Transketolase）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Glucose-6-phosphate dehydrogenase）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD（P）transhydrogenase）、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinate phosphoribosyltransferase）、及びＮＡＤ＋キナーゼ（NAD+ kinase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性がさらに強化されるか、
（２）グルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）及びＮＡＤ＋ジホスファターゼ（NAD+ diphosphatase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性がさらに不活性化されるか、
（３）（１）及び（２）のさらなる組み合わせで構成されて、
ＮＡＤＰＨ生産能が非変形微生物に比べて増加した、請求項１に記載のプトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記微生物が、さらにオルニチンジカルボキシラーゼの活性が導入された、請求項１に記載のプトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記微生物が、さらにプトレシンアセチルトランスフェラーゼの活性が弱化された、請求項１に記載のプトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記微生物が、さらにプトレシン排出タンパク質の活性が強化された、請求項１に記載のプトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項７】
（i）請求項１〜６のいずれか１項に記載のプトレシンを生産する微生物を培地で培養する段階；及び
（ii）前記培養された微生物または培地からプトレシンを回収する段階を含む、プトレシンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、プトレシンを生産する微生物及び当該微生物を用いたプトレシンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型微生物は、Ｌ−アミノ酸及び様々な核酸を含む飼料、医薬品及び食品などの様々な用途を有する物質を産業的に生産するのに頻繁に用いられるグラム陽性微生物である。近年では、ジアミン（diamine）、ケト酸（keto-acid）などをコリネ型微生物から生産することもある。
【０００３】
微生物発酵を介して有用産物を生産するために、微生物内の目的産物の生合成経路の強化とともにエネルギー源または還元力に対する要求が増加する。この中で、還元力を供給する上で、ＮＡＤＰＨ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）は必須要素である。酸化型であるＮＡＤＰ＋と還元型であるＮＡＤＰＨは、互いに生体内の電子伝達物質であり、色んな合成過程に関与する。中央代謝経路の中で、ＮＡＤＰＨを生成する経路には、１）酸化的ペントースリン酸経路（oxidative pentose phosphate pathway）と２）ＴＣＡ経路のＮＡＤＰ依存性イソクエン酸脱水素酵素（NADP-dependent isocitrate dehydrogenase；Ｉｃｄ遺伝子）によって主に生産されることが知られている。その他の複数の微生物からＮＡＤＰＨを供給するための様々な代替経路として、リンゴ酸酵素（malate enzyme）、グルコースデヒドロゲナーゼ（glucose dehydrogenase）、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（nonphosphorylation glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を有している。
【０００４】
また、中央代謝経路とは無関係にＮＡＤＰＨを生成する酵素としては、トランスヒドロゲナーゼ（transhydrogenase）、フェレドキシンＮＡＤＰ＋酸化還元酵素（Ferredoxin：NADP+ oxidoredutase）などがある。
【０００５】
一方、プトレシンはポリアミドの原料の一つとして知られている。プトレシンは主に石油化合物を原料とする化学的な方法で生産され、最近になって、微生物の遺伝子操作技術及び発酵技術を用いたプトレシン発酵生産技術が研究されている。例えば、大腸菌とコリネバクテリウム属微生物を形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開されている（特許文献１〜２、 非特許文献１〜４）。
【０００６】
しかし、還元力とプトレシン生産能との関係については、まだ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開  ＷＯ０６／００５６０３
【特許文献２】国際特許公開  ＷＯ０９／１２５９２４
【特許文献３】国際特許公開  ＷＯ２００９／０９６６８９
【特許文献４】国際特許公開  ＷＯ２００６／０６５０９５
【特許文献５】国際特許公開  ＷＯ２００９／１２５９９２
【特許文献６】大韓民国登録特許第１１８２０３３号
【特許文献７】大韓民国公開特許第２０１３−０００３６４８号
【特許文献８】大韓民国公開特許第２０１４−０１１５２４４号
【特許文献９】大韓民国公開特許第２０１４−００４９７６６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996
【非特許文献２】Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009
【非特許文献３】Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010
【非特許文献４】Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011
【非特許文献５】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献６】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献７】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献８】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（198１） 2:482
【非特許文献９】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical research Foundation, pp. 353-358（1979）
【非特許文献１０】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献１１】A. Soukri et al., Protein Expression and Purification; 25; (2002) 519-529
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、プトレシン生産微生物でプトレシンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、高濃度のプトレシン生産のためのＮＡＤＰＨを強化する多方面の研究を介して、コリネバクテリウム属微生物でプトレシンの生産が増加するのを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願の一つの目的は、ＮＡＤＰＨ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）の生産能が非変形微生物に比べて増加した、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、プトレシンを生産する微生物及び当該微生物を用いたプトレシンの生産方法に関するもので、コリネバクテリウム属微生物でプトレシンの生産が増加する優れた効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されると見ることができない。
【００１３】
前記目的を達成するための本出願の一つの様態は、ＮＡＤＰＨ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）の生産能が非変形微生物に比べて増加した、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１４】
本出願において、用語、「ＮＡＤＰＨ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）」は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド構造を共有するＮＡＤＨと一緒に多くの酸化還元酵素（oxidoreductaseとdehydrogenase）の反応に電子供与体として参与して還元力を提供する補酵素の一種である。これら補酵素の酸化物（ＮＡＤ＋とＮＡＤＰ＋）は、生体異化反応で生成されるエネルギーを電子とプロトンの形態で収容する重要な機能を担っており、酸化還元酵素の反応に電子受容体として関与することが知られている。
【００１５】
具体的には、前記プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物は、ＮＡＤＰＨの生産能を増加させるために、（１）ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、トランスケトラーゼ（Transketolase）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD（P）transhydrogenase）、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinate phosphoribosyltransferase）、及びＮＡＤ＋キナーゼ（NAD+ kinase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性が強化されるか、（２）グルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）及びＮＡＤ＋ジホスファターゼ（NAD+ diphosphatase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性が不活性化されるか、（３）（１）及び（２）の組み合わせで構成されてもよいが、これに制限されない。
また、前記（１）ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、トランスケトラーゼ（Transketolase）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Glucose -6-phosphate dehydrogenase）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD（P）transhydrogenase）、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinate phosphoribosyltransferase）、及びＮＡＤ＋キナーゼ（NAD+ kinase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性の強化は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上またはすべての酵素の活性が増加するものであってもよい。
【００１６】
また、前記（２）グルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）及びＮＡＤ＋ジホスファターゼ（NAD+ diphosphatase ）で構成されるグループのいずれか、または２の両方の活性が不活性化されるものであってもよい。
【００１７】
また、前記（３）において、（１）及び（２）の組み合わせは、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、トランスケトラーゼ（Transketolase）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Glucose-6-phosphate dehydrogenase）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD（P）transhydrogenase ）、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinate phosphoribosyltransferase）、及びＮＡＤ＋キナーゼ（NAD+ kinase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性の強化は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上またはすべての酵素の活性が増加し、グルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）及びＮＡＤ＋ジホスファターゼ（NAD+ diphosphatase）で構成されるグループのいずれか、または２の両方の活性が不活性化される組み合わせであってもよい。
【００１８】
本出願において、用語、「ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）」は、D−グリセルアルデヒド−３−リン酸（D-glyceraldehyde-3-phosphate ）から３−ホスホ−D−グリセリン酸（3-phospho-D-glycerate）に転換しながら、ＮＡＤＰＨ １分子を合成する酵素を通称する。
【００１９】
具体的には、前記ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１または配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号１または配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号１または配列番号７で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
本出願において、用語、「トランスケトラーゼ（Transketolase）」は、ペントースリン酸経路に影響を与える酵素であって、Ｄ−キシルロース−５−リン酸とＤ−リボース−５−リン酸からＤ−セドヘプツロース−７−リン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を生成する。
【００２０】
具体的には、前記トランスケトラーゼは、配列番号１０または配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号１０または配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号１０または配列番号１６で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００２１】
本出願において、用語、「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Glucose-6-phosphate dehydrogenase）」は、β−Ｄ−グルコース６−リン酸から６−ホスホＤ−グルコノ−１,５−ラクトンに転換しながら、ＮＡＤＰＨ １分子を合成する酵素を通称する。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、別名としてＧ６ＰＤ、Ｇ６ＰＤＨなどで呼ばれている。また、本出願では、前記グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはＧ６ＰＤまたはＧ６ＰＤＨと混用されてもよい。
具体的には、前記グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２０または配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号２０または配列番号２７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号２０または配列番号２７で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００２２】
本出願において、用語、「６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase）」は、Ｄ−グルコン酸６−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸に転換しながら、ＮＡＤＰＨ １分子を合成する酵素を通称する。６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは別名として６ＰＧＤなどで呼ばれている。また、本出願では、前記６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは６ＰＧＤと混用されてもよい。
【００２３】
具体的には、前記６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３２または配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号３２または配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号３２または配列番号３６で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００２４】
本出願において、用語、「ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD（P）transhydrogenase）」は、ＮＡＤＨの水素をＮＡＤＰ＋に伝達しながら、ＮＡＤＰＨ １分子を合成する酵素を通称する。
【００２５】
具体的には、前記ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼは、配列番号３９または配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号３９または配列番号４１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号３９または配列番号４１で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００２６】
本出願において、用語、「グルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）」は、ペントースリン酸化経路の中間体である６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸（6-phospho-D-gluconate）からグルコン酸に転換することができる酵素を通称する。
【００２７】
具体的には、前記グルコン酸キナーゼは、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５１または配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号５１または配列番号５９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号５１または配列番号５９で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００２８】
本出願において、用語、「ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinate phosphoribosyltransferase）」は、ニコチン酸からβ−ニコチン酸Ｄ−リボヌクレオチド（（β-nicotinate D-ribonucleotide）を合成する酵素を通称する。前記β−ニコチン酸Ｄ−リボヌクレオチドは、デアミノ−ＮＡＤ＋を経てＮＡＤ＋に転換され、また、ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＰ＋に転換されうるため、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの強化はＮＡＤＰＨの前駆体の量を増加させることができる。
【００２９】
具体的には、前記ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号６１、配列番号６５または配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号６５または配列番号６９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号６５または配列番号６９で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００３０】
本出願において、用語、「ＮＡＤ＋ジホスファターゼ（NAD+ diphosphatase）」は、ＮＡＤ＋からβ−ニコチンアミドＤ−リボヌクレオチド（β-nicotinamide D-ribonucleotide）に分解する酵素であって、ＮＡＤ＋ジホスファターゼの弱化はＮＡＤＰＨの前駆体であるＮＡＤの量を増加させることができる。
【００３１】
具体的には、前記ＮＡＤ＋ジホスファターゼは、配列番号７３または配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号７３または配列番号７９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号７３または配列番号７９で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００３２】
本出願において、用語、「ＮＡＤ＋キナーゼ（NAD kinase）」は、ＮＡＤ＋からＮＡＤＰ＋を合成する酵素であって、ＮＡＤＰ＋はＮＡＤＰＨの前駆体である。
【００３３】
具体的には、前記ＮＡＤ＋キナーゼは、配列番号８１または配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されず、配列番号８１または配列番号８５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは配列番号８１または配列番号８５で表されるアミノ酸配列で構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。
【００３４】
前記ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グルコン酸キナーゼまたはＮＡＤ＋ジホスファターゼの遺伝的情報は、公知のデータベースから得ることができ、その例として、米国国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information；ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、これに制限されない。
【００３５】
前記ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グルコン酸キナーゼまたはＮＡＤ＋ジホスファターゼは、微生物の種または微生物に応じて活性を示すタンパク質のアミノ酸配列の違いが存在する場合があるため、その由来や配列に限定されない。
【００３６】
また、本出願において、前記酵素は記載された配列番号だけではなく、前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性または同一性を示すタンパク質を含んでもよい。
【００３７】
また、前記配列と相同性または同一性を有する配列として、実質的に記載された配列番号の酵素タンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００３８】
本出願のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グルコン酸キナーゼまたはＮＡＤ＋ジホスファターゼをコードするポリヌクレオチドは、前記ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グルコン酸キナーゼまたはＮＡＤ＋ジホスファターゼ酵素タンパク質と同一または相応する生物学的活性を有する限り、記載された配列番号のアミノ酸配列または前記配列と８０％以上、８５％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性または同一性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは配列は、配列番号２または配列番号８のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、トランスケトラーゼは、配列番号１１または配列番号１７のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは配列番号２１または配列番号２８のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３３または配列番号３７のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼは、配列番号４０または配列番号４２のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号６２、配列番号６６または配列番号７０のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、ＮＡＤ＋キナーゼは、配列番号８２または配列番号８６のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、グルコン酸キナーゼは、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５４または配列番号６０のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよく、ＮＡＤ＋ジホスファターゼは、配列番号７４または配列番号８０のポリヌクレオチド配列で暗号化されてもよいが、これに制限されるものではない。
【００３９】
また、前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。したがって、前記ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グルコン酸キナーゼまたはＮＡＤ＋ジホスファターゼをコードするポリヌクレオチドは、前記酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であれば制限なく含まれてもよい。
【００４０】
または、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記ポリヌクレオチド配列の全体または一部の相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化して、前記ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＮＡＤ＋キナーゼ、グルコン酸キナーゼまたはＮＡＤ＋ジホスファターゼ酵素タンパク質の活性を有するタンパク質を暗号化する配列であれば制限なく含まれてもよい。
【００４１】
相同性（homology）及び同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。
【００４２】
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
【００４３】
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）同一な（identical）の配列は、一般的に、配列全体または全長と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に従い中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００４４】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献５と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献６）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献７）を用いて決定してもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA／.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００４５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献８に公知されたように、例えば、非特許文献７のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献９に開示されたように、非特許文献１０の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
本出願において、用語、「活性の強化」は、酵素タンパク質の活性が導入されたり、微生物が有する内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記活性の「導入」は、微生物が本来有していなかった特定のタンパク質の活性が自然的あるいは人為的に示されることを意味する。「非変形微生物」は、比較対象微生物の特定のタンパク質が自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親菌株が本来有していた特定のタンパク質の活性を有している微生物を言う。「内在的活性」は、自然的または人為的要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親菌株が本来有していた特定のタンパク質の活性をいう。本出願では、非変形は遺伝的変異が起きていない内在的活性を有する形態と混用して用いられてもよい。
【００４６】
例えば、前記の活性の強化は、外来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び／またはＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼを導入したり、導入して強化すること、または内在的トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ及び／またはＮＡＤ＋キナーゼの活性を強化することを含んでもよい。具体的には、本出願で活性増加の方法としては、
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
【００４７】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行なわれてもよい。また、コピー数の増加の一様態として、酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記酵素と同じ／類似した活性を示す限り、その由来や配列に制限されず用いられてもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行われてもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによって酵素が生成され、その活性が増加されてもよい。
【００４８】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するような発現調節配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。
【００４９】
具体的には、ポリヌクレオチド発現単位の上部には本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがある。より具体的には、コリネバクテリウム属由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献３）、あるいはＣＪ７プロモーター（特許文献４）と作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させてもよいが、これに限定されない。
【００５０】
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して実行するか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。
【００５１】
最後に、４）前記１）〜３）の組み合わせによって強化されるように変形する方法は、前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形の中の１つ以上の方法を一緒に適用して行ってもよい。
【００５２】
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ生産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００５３】
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
【００５４】
本出願で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体に挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別できる。
【００５５】
本出願において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知のように適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、 ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【００５６】
また、前記において、用語、「作動可能に連結」されたというのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を利用して製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
【００５７】
本出願の用語「不活性化」は、本来微生物が有している酵素タンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて、その活性が弱化される場合、全く発現されない場合、または発現してもその活性がない場合を意味する。前記不活性化は、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの変異などで酵素自体の活性が本来の微生物が有している酵素の活性に比べて弱化したり除去された場合と、それをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などで、細胞内で全体的な酵素活性の程度が天然型微生物に比べて低いか除去された場合、前記遺伝子の一部または全体欠失された場合、及びこれらの組み合わせも含む概念であり、これに限定されない。
【００５８】
これらの酵素活性の不活性化は、当該分野でよく知られている様々な方法の適用で達成されうる。前記の方法の例として、１）前記酵素の活性が除去された場合を含めて、前記酵素の活性が弱化されるように突然変異された遺伝子で染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を置換する方法；２）前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列を変形する方法；３）前記酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱いかない配列に交替する方法；４）前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；５）前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；６）前記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造物を形成させ、リボソーム（ribosome）の付着が不可能にさせる方法または７）該当配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせでも達成できるが、これに特に制限されるものではない。
【００５９】
前記染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記酵素の活性をさらに弱化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列に交替することにより行ってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６０】
前記発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的たは保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列に交替することにより行ってもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【００６１】
また、酵素をコードするポリヌクレオチドの一部または全体を欠失させる方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを用いて染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行われてもよい。これらのポリヌクレオチドの一部または全体を欠失させる方法の一例として、相同組換えによってポリヌクレオチドを欠失させる方法を用いてもよいが、これに限定されない。
【００６２】
前記ポリヌクレオチドは、機能をすることができるポリヌクレオチド集合体である場合、遺伝子で記載してもよい。本出願でポリヌクレオチドと遺伝子は混用されてもよい。
【００６３】
前記で「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、さらに具体的には、１〜５０個であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【００６４】
本出願で用いられる用語、「プトレシンを生産する微生物」、「プトレシン生産能を有する微生物」とは、自然的にプトレシン生産能を有している微生物またはプトレシン生産能がないか著しく少ない親菌株に天然型または変異を介してプトレシン生産能を有する微生物を意味する。
【００６５】
具体的には、本出願でプトレシンを生産する微生物は、天然型微生物自体または外部プトレシン生産メカニズムに関するポリヌクレオチドが挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化したり、不活性させてプトレシン生産能を有するようになった微生物を意味する。
【００６６】
より具体的には、本出願でプトレシンを生産する微生物は「コリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）」微生物であってもよい。前記コリネバクテリウム属微生物は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであるが、必ずしもこれに限定されるものではない。より具体的には、本出願でコリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。
【００６７】
前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されないが、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ＯＤＣ）の活性が導入されたものであってもよい。前記オルニチンデカルボキシラーゼは、オルニチンの脱炭酸（decarboxylation）を媒介してプトレシンを生産する酵素を意味する。コリネバクテリウム属微生物には、プトレシン生合成経路がないが外部からオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ＯＤＣ）を導入すれば、プトレシン合成されうる。
【００６８】
また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されないが、さらにオルニチンでアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransfrase、ＡｒｇＦ）、グルタミン酸の排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）が不活性化されたものであってもよい。
【００６９】
また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに限定されないが、例えば、グルタミン酸からオルニチンまでの生合成経路を強化するためにグルタミン酸をアセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）に転換するアセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンをオルニチンに転換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルリン酸（N-acetylglutamyl phosphate）に転換するアセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルリン酸をアセチルグルタミン酸セミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に転換するアセチルガンマグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に転換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性に比べて強化されてプトレシンの生合性原料として用いられるオルニチンの生産性が向上されたものであってもよい。
【００７０】
また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されるものではないが、さらにプトレシンアセチルトランスフェラーゼの活性が弱化された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
【００７１】
また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されるものではないが、プトレシン排出タンパク質の活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記プトレシン排出タンパク質の活性の強化は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物で配列番号８７のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００７２】
また、前記プトレシン排出タンパク質の活性の強化は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物で配列番号８８のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が不活性化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００７３】
もう一つの様態として、本出願は、（１）ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、トランスケトラーゼ（Transketolase）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Glucose-6-phosphate dehydrogenase）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase）、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD（P）transhydrogenase）、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinate phosphoribosyltransferase）、及びＮＡＤ＋キナーゼ（NAD+ kinase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性が強化されるか、（２）グルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）とＮＡＤ＋ジホスファターゼ（NAD+diphosphatase）で構成されるグループの中で１つ以上の活性が不活性化されるか、（３）（１）及び（２）の組み合わせで構成されて、ＮＡＤＰＨの生産能が増加されたプトレシンを生産するコリネバクテリウム属生物を培地で培養する段階；及び（ｂ）前記段階で得られる微生物または培地からプトレシンを回収する段階を含むプトレシン生産方法を提供する。
【００７４】
「ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」、「トランスケトラーゼ」、「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ」、「６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ」、「ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ」、「ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ」、「ＮＡＤキナーゼ（NAD kinase）」、「活性の強化」、「グルコン酸キナーゼ」「ＮＡＤ＋ジホスファターゼ 」、「活性の不活性化」及び「プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物」については、前記説明した通りである。
【００７５】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたプトレシンは、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
【００７６】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００７７】
本出願の前記培養段階で生産されたプトレシンを回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野に公知の適合した方法3092用いて培地または微生物から目的とするプトレシンを回収してもよい。前記プトレシンを回収する方法は、精製段階をさらに含んでもよい。
【実施例】
【００７８】
以下、本出願の実施例により、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００７９】
実施例１：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の強化時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【００８０】
１−１：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種ＢｕｌｇａｒｉｃｕｓＡＴＣＣ １１８４２由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコリネ型微生物染色体内のトランスポゾン内導入のためのベクターの製作
コリネバクテリウムに親和力が高いＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを選定した。その後、前記活性を向上させるために次の実験を行った。
【００８１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １１８４２由来のｇａｐＮを暗号化するＬｄｂ１１７９遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）と塩基配列（配列番号２）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【００８２】
また、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内Ｌｄｂ１１７９遺伝子を導入するために形質転換用ベクターであるｐＤＺＴｎ（特許文献５）を用い、プロモーターはｃｊ７（特許文献４）を用いた。Ｌｄｂ１１７９遺伝子はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １１８４２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いて開始コドンＴＴＧをＡＴＧに変更した形態であり、約１．４３ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表１）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、約１．４ｋｂのバンドを溶離して精製した。また、ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて同じ条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を収得した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。ｐＤＺＴｎベクターはＸｈｏＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニング（fusion cloning）した。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−（Ｌ）と命名した。
【００８３】
【表１】
0006901621.tif 000002
【００８４】
１−２：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコリネ型微生物の染色体内のトランスポゾン遺伝子内導入のためのベクターの製作
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １１８４２由来のｇａｐＮの対照群として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５内のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するＳＭＵＦＲ_０５９０（特許文献６）を導入するために、次の実験を行った。
【００８５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮを暗号化するＳＭＵＦＲ_０５９０遺伝子のアミノ酸配列（配列番号７）の塩基配列（配列番号８）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保し、トランスポゾン遺伝子内のＣＪ７プロモーターによって発現されるＳＭＵＦＲ_０５９０を導入するためのベクターを作製した。
【００８６】
実施例１−１と同様に形質転換用ベクターであるｐＤＺＴｎを用い、プロモーターはｃｊ７を用いた。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＳＭＵＦＲ_０５９０遺伝子はｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１（特許文献６）を鋳型とし、配列番号５及び９のプライマーを用いて約１．７ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表２）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で２分の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺＴｎベクターはＸｈｏＩを処理し、前記で収得したＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）と命名した。
【００８７】
【表２】
0006901621.tif 000003
【００８８】
１−３．プトレシンを生産するコリネ型菌株にＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入を介したプトレシンの発酵
＜１−３−１＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内のトランスポゾン遺伝子内ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入
実施例１−１で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）と実施例１−２で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献７）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ（特許文献９）に導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Braine heart infusion ３７ｇ／ｌ、ソルビトール９１ｇ／ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。このことから形成されたコロニーの中で青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）またはｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）が導入された菌株を選抜した。
【００８９】
前記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、牛肉エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ、尿素 ２ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に接種し、３０℃で８時間振とう培養し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ−ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的に低い割合で示される白色のコロニーを選択して、ｇａｐＮ（Ｌ）またはｇａｐＮ（Ｓ）を暗号化する遺伝子であるＬｄｂ１１７９とＳＭＵＦＲ_０５９０が導入されたプトレシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を製作した。このことから製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ （ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ （Ｓ）と命名した。
【００９０】
＜１−３−２＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内のトランスポゾン遺伝子内ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２−ｂ（特許文献７）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３（特許文献９）を対象に前製作したｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）とｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を実施例＜１−３−１＞と同様の方法で形質転換した。このことから製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ） 、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）と命名した。
【００９１】
＜１−３−３＞ ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入時プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜１−３−１＞及び＜１−３− ２＞で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【００９２】
具体的には、６種の対照群（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ、ＤＡＢ１２−ｂ、ＤＡＢ１２−ｂＰ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３）と１２種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７ ）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂＰ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂＰ（ＣＪ７） −ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ））をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地に塗抹して３０℃で２４時間培養した。このことから培養された各菌株を２５ｍｌの生産培地に一白金耳程度で接種した後、これを３０℃、２００ｒｐｍで５０時間後にサンプルし、最終的に９８時間にサンプリングした。すべての菌株の培養時培地に１ｍＭアルギニンを添加した。
【００９３】
＜ＣＭ平板培地（ｐＨ６．８）＞
グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５％、牛肉エキス０．５％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ０．２５％、尿素 ０．２％、５０％ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ） １００μｌ、寒天 ２％、ｐＨ６．８（蒸留水１Ｌ基準）
【００９４】
＜生産培地（ｐＨ ７．０）＞
グルコース８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形  ０．５０％、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）４％、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．１％、硫酸マグネシウム７水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．０５％、尿素０．１５％、ビオチン１００μg、チアミン塩酸塩 ３ｍｇ、パントテン酸 カルシウム ３ｍｇ、ニコチン酸アミド ３ｍｇ、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％（蒸留水１Ｌ基準）。
【００９５】
５０時間にサンプリングした培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表３に示した。
【００９６】
【表３】
0006901621.tif 000004
【００９７】
前記表３に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＬ. ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １１８４２由来のｇａｐＮ（Ｌ）遺伝子またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮ（Ｓ）遺伝子が導入された１２種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株すべて対照群に比べてプトレシン生産性が増加した。このことから、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを介してＮＡＤＰＨ供給時にプトレシン生産性が増加することを確認した。
【００９８】
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮ（Ｓ）が導入された６種の変異株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、 ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）に比べてＬ.ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来のｇａｐＮ（Ｌ）が導入された６種の変異株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）菌株のプトレシン生産性がより高いことを確認した。
【００９９】
また、９８時間にサンプリングした培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表４に示した。
【０１００】
【表４−１】
0006901621.tif 000005
【０１０１】
【表４−２】
0006901621.tif 000006
【０１０２】
同様に、表４でＫＣＣＭ１１２４０ＰまたはＤＡＢ１２−ｂベースでｇａｐＮを強化した４種の変異菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）は、対照群に比べて同等以上のレベルのプトレシン生産量を示し、プトレシン排出能が強化されたＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７ ）−ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３ベースでｇａｐＮを強化した８種の変異菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７ ）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）のプトレシン生産性がさらに増加することを確認した。
【０１０３】
これにより、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を強化したとき、生産性と生産量の両方が増加することを確認し、プトレシン排出能が一緒に強化する時に、増加幅がさらに大きくなることを確認した。
【０１０４】
１−４：プトレシン菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の比較
Ｌｄｂ１１７９遺伝子またはＳＭＵＦＲ_０５９０遺伝子が導入されたＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）菌株からＬ.ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来のｇａｐＮ（Ｌ）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のｇａｐＮ（Ｓ）のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を比較した。対照群としてｇａｐＮ遺伝子のないＫＣＣＭ１１２４０Ｐ菌株を用いた。各菌株を１ｍＭアルギニン含有の複合平板培地で１日程度培養した後、１ｍＭアルギニン含有種培地に初期ＯＤ６００＝０．２に合わせて培養した後、ＯＤ６００＝１０で細胞を回収した。
【０１０５】
＜種培地＞
グルコース ２０ｇ、ペプトン １０ｇ、酵母エキス １０ｇ、尿素 ５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン １００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ（工程水 1Ｌ基準）
【０１０６】
公知の方法（非特許文献１１）を用いてＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を測定し、その結果を下記表５に示した。
【０１０７】
【表５】
0006901621.tif 000007
【０１０８】
前記表５に示すように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のｇａｐＮ（Ｓ）が導入されたＫＣＣＭ １１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を１００と見たとき、Ｌ.ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来のｇａｐＮ（Ｌ）が導入されたＫＣＣＭ １１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）菌株のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、１．５倍以上より高いことを確認した。これにより、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が高いほど、供給されたＮＡＤＰＨが多ければ多いほどプトレシン生産性及び生産量が増加することを確認した。
【０１０９】
実施例２：トランスケトラーゼ強化を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でトランスケトラーゼ活性を強化する時にプトレシンの生産に及ぼす効果を確認した。
【０１１０】
２−１：トランスケトラーゼを強化するための開始コドンの置換
＜２−１−１＞トランスケトラーゼの開始コドンＴＴＧをＡＴＧに置換するためのベクターの製作
トランスケトラーゼの活性を強化するため、これをコードする遺伝子の開始コドンＴＴＧをＡＴＧに変えるためのベクターを作製した。
【０１１１】
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来のトランスケトラーゼを暗号化するＮＣｇｌ１５１２遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１０）と塩基配列（配列番号１１）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１１２】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号１２及び１３のプライマーと配列番号１４及び１５のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表６）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−１’ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１１３】
【表６】
0006901621.tif 000008
【０１１４】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のトランスケトラーゼを暗号化するＮＣｇｌ１５１２と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１６）と塩基配列（配列番号１７）を確保した。
【０１１５】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、同じプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅して前記の方法のようにベクターを製作した。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−２’ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１１６】
＜２−１−２＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスポゾン遺伝子内のトランスケトラーゼの開始コドンの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ（特許文献９）を対象に、実施例２−１−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ−１’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ ｔｋｔ（ＡＴＧ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１１７】
＜２−１−３＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスポゾン遺伝子内のトランスケトラーゼの開始コドンの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３（特許文献９）を対象に実施例２−１−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ−２’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ ｔｋｔ（ＡＴＧ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１１８】
＜２−１−４＞トランスケトラーゼの開始コドンに置換されたコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でトランスケトラーゼを暗号化する遺伝子であるｔｋｔの発現が増加したときにプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例２−１−２及び２−１−３で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に、実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０１１９】
【表７】
0006901621.tif 000009
【０１２０】
前記表７に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株で、ｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換された変異株のすべてが対照群に比べてプトレシン生産性が増加した。
【０１２１】
２−２：トランスケトラーゼの強化及びペントースリン酸経路を強化するためのプロモーターの置換
＜２−２−１＞トランスケトラーゼのプロモーターを置換したベクターの作製
トランスケトラーゼ活性を有するＮＣｇｌ１５１２の活性を強化するために、染色体内ＮＣｇｌ１５１２遺伝子の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターを導入するためのベクターを作製した。
【０１２２】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号１２及び１３のプライマーと配列番号１９及び１５のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表８）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号１８と６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１２３】
【表８】
0006901621.tif 000010
【０１２４】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、同じプライマーを用いて遺伝子断片の３つを増幅して、前記方法のようにベクターを製作した。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１２５】
＜２−２−２＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスケトラーゼのプロモーターの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ（特許文献９）を対象に、実施例２−２−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を製作した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１２６】
＜２−２−３＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスケトラーゼのプロモーターの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３（特許文献９）を対象に、実施例２−２−１で製作したプラスミドｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１２７】
＜２−２−４＞トランスケトラーゼのプロモーターを強化したコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でトランスケトラーゼのプロモーターを置換したときにプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例２−２−２及び２−２−３で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０１２８】
【表９】
0006901621.tif 000011
【０１２９】
表９に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株で、ｔｋｔのプロモーターをＣＪ７プロモーターに置換された変異株のすべてが対象群に比べてプトレシン生産性が大幅に増加した。
【０１３０】
実施例３：Ｇ６ＰＤ強化を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を強化時のプトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０１３１】
３−１：Ｇ６ＰＤ強化のためのプロモーターの置換
＜３−１−１＞ Ｇ６ＰＤのプロモーターを置換するためのベクターの製作
Ｇ６ＰＤの活性を強化するために、染色体内のこれをコードする遺伝子の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターを導入するためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来のＧ６ＰＤを暗号化するＮＣｇｌ１５１４遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２０）と塩基配列（配列番号２１）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１３２】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターであるｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２２及び２３のプライマーと配列番号２５及び２６のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表１０）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号２４及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｚｗｆと命名した。
【０１３３】
【表１０】
0006901621.tif 000012
【０１３４】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のＧ６ＰＤを暗号化するＮＣｇｌ１５１４と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２７）と塩基配列（配列番号２８）を米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１３５】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２２及び２９のプライマーと配列番号２５及び２６のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表１１）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号３０及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｚｗｆと命名した。
【０１３６】
【表１１】
0006901621.tif 000013
【０１３７】
＜３−１−２＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内Ｇ６ＰＤのプロモーターの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ（特許文献９）を対象に、実施例３−１−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｚｗｆを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１４の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆと命名した。
【０１３８】
＜３−１−３＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内Ｇ６ＰＤのプロモーターの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３（特許文献９）を対象に、実施例３−１−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｚｗｆを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を製作した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆと命名した。
【０１３９】
<３−１−４> Ｇ６ＰＤのプロモーターを強化したコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でＧ６ＰＤのプロモーターを置換したときにプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例３−１−２及び３−１−３で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０１４０】
【表１２】
0006901621.tif 000014
【０１４１】
前記表１２に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＧ６ＰＤのプロモーターをＣＪ７プロモーターに置換された変異株のすべてが対象群に比べてプトレシン生産性が増加した。
【０１４２】
３−２：Ｇ６ＰＤ強化のためのプロモーター及び開始コドンの同時置換
＜３−２−１＞ Ｇ６ＰＤのプロモーター及び開始コドンが同時に置換されたベクターの製作
Ｇ６ＰＤの活性を強化するために、染色体内のこれをコードする遺伝子の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターを導入すると同時に開始コドンであるＧＴＧをＡＴＧに置換するためのベクターを作製した。
【０１４３】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２２及び２３のプライマーと配列番号３１及び２６のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表１３）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号２４及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｚｗｆ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１４４】
【表１３】
0006901621.tif 000015
【０１４５】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２２及び２９のプライマーと配列番号３１及び２６のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表１４）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号３０及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｚｗｆ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１４６】
【表１４】
0006901621.tif 000016
【０１４７】
＜３−２−２＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内Ｇ６ＰＤのプロモーターの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ（特許文献９）を対象に、実施例３−２−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｚｗｆ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２４の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入されて、開始コドンがＡＴＧに置換された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ（ＡＴＧ）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１４８】
＜３−２−３＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内Ｇ６ＰＤのプロモーターの置換
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３（特許文献９）を対象に、実施例３−２−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｚｗｆ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１２開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ（ＡＴＧ）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１４９】
＜３−２−４＞ Ｇ６ＰＤのプロモーターを強化し、開始コドンをＡＴＧに置換したコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でＧ６ＰＤのプロモーターをＣＪ７プロモーターに置換して開始コドンをＡＴＧに置換したときにプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例３−２−２及び３−２−３で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０１５０】
【表１５】
0006901621.tif 000017
【０１５１】
前記表１５に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でｚｗｆのプロモーターをＣＪ７プロモーターに置換して開始コドンをＡＴＧに置換した変異株のすべての対照群に比べてプトレシン生産性が増加した。
【０１５２】
実施例４：６ＰＧＤ強化を通じたプトレシンの生産
プトレシン生産菌株で６ＰＧＤ（6-phosphogluconate dehydrogenase）活性を強化時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０１５３】
４−１：６ＰＧＤをコリネ型微生物の染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入するためのベクターの製作
６ＰＧＤ活性を有するＮＣｇｌ１３９６の活性を強化するために、染色体内トランスポゾン遺伝子内ＣＪ７プロモーターによって発現されるＮＣｇｌ１３９６を導入するためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来の６ＰＧＤ活性があるＧｎｄを暗号化するＮＣｇｌ１３９６のアミノ酸配列（配列番号３２）と塩基配列（配列番号３３）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１５４】
本出願の具体的な実施例では、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内トランスポゾン遺伝子内の遺伝子を導入するために形質転換用ベクターｐＤＺＴｎを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号３４及び３５のプライマーを用いて約１．４５ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表１６）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｇｎｄと命名した。
【０１５５】
【表１６】
0006901621.tif 000018
【０１５６】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のＧｎｄを暗号化するＮＣｇｌ１３９６と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３６）と塩基配列（配列番号３７）を、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１５７】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、配列番号３４及び３８のプライマーを用いて約１．４５ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表１７）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｇｎｄと命名した。
【０１５８】
【表１７】
0006901621.tif 000019
【０１５９】
４−２：ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスポゾン遺伝子内６ＰＧＤの導入
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ（特許文献９）を対象に、実施例４−１で製作したプラスミドであるｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｇｎｄを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、トランスポゾン内Ｇｎｄを暗号化する遺伝子であるＮＣｇｌ１３９６が導入されたことを確認した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄ、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄと命名した。
【０１６０】
４−３：ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスポゾン遺伝子内６ＰＧＤの導入
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３（特許文献９）を対象に、実施例４−１で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｇｎｄを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、トランスポゾン内Ｇｎｄを暗号化する遺伝子であるＮＣｇｌ１３９６が導入されたこと確認した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄ、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄと命名した。
【０１６１】
４−４：６ＰＧＤを強化したコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株で６ＰＧＤを暗号化するＮＣｇｌ１３９６を染色体内トランスポゾン内に導入したときにプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例４−２及び４−３で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【０１６２】
具体的には、４種の対照群（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３）と４種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７ ）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄ、ＫＣＣＭ１１５２０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄ、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇｎｄ、ＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２５２３Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７） −ｇｎｄ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地に塗抹して３０℃で２４時間培養した。このことから、培養された各菌株を２５ｍｌの生産培地に一白金耳程度接種した後、これを３０℃から２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時培地に１ｍＭアルギニンを添加した。
【０１６３】
＜ＣＭ平板培地（ｐＨ ６．８）＞
グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５％、牛肉エキス０．５％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ０．２５％、尿素 ０．２％、５０％ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ） １００μｌ、寒天 （ａｇａｒ）２％、ｐＨ６．８（蒸留水１Ｌ基準）
【０１６４】
＜生産培地（ｐＨ ７．０）＞
グルコース８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形０．５０％、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）４％、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．１％、硫酸マグネシウム７水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．０５％、尿素０．１５％、ビオチン１００μg、チアミン塩酸塩 ３ｍｇ、パントテン酸 カルシウム ３ｍｇ、ニコチン酸アミド ３ｍｇ、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％（蒸留水１Ｌ基準）。
【０１６５】
９８時間培養した最終産物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記の表１８に示した。
【０１６６】
【表１８】
0006901621.tif 000020
【０１６７】
前記表１８に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＧｎｄの発現量を増加させた変異株のすべての対照群に比べてプトレシン生産量が小幅増加した。
【０１６８】
実施例５：ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼの導入を介したプトレシンの生産
プトレシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムでＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ（NAD(P) transhydrogenase）活性の強化時、ＮＡＤＰＨ供給に伴うプトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０１６９】
５−１：大腸菌（E.coli）Ｗ３１１０由来のＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼをコリネ型微生物の染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入するためのベクターの製作
大腸菌Ｗ３１１０由来のＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ活性を有するＰｎｔＡＢを暗号化するＹ７５_ｐ１５７９とＹ７５_ｐ１５７８の発現を強化するために、染色体内トランスポゾン遺伝子内トランスポゾン遺伝子内にＣＪ７プロモーターによって発現されるＹ７５_ｐ１５７９とＹ７５_ｐ１５７８遺伝子を導入するためのベクターを製作した。大腸菌Ｗ３１１０由来のＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼはＰｎｔＡとＰｎｔＢがｃｏｍｐｌｅｘをなす。ＰｎｔＡを暗号化するＹ７５_ｐ１５７９遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３９）と塩基配列（配列番号４０）及びＰｎｔＢを暗号化するＹ７５_ｐ１５７８遺伝子のアミノ酸配列（配列番号４１）と塩基配列（配列番号４２）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１７０】
本出願の具体的な実施例では、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内トランスポゾン遺伝子内の遺伝子を導入するために形質転換用ベクターｐＤＺＴｎを用いた。大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型とし、配列番号４３及び４４のプライマーを用いて約２．９２ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表１９）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３分の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺＴｎベクターは、ＸｈｏＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢと命名した。
【０１７１】
【表１９】
0006901621.tif 000021
【０１７２】
５−２：ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスポゾン遺伝子内のＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼの導入
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献７）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）を対象に実施例５−１で製作したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、トランスポゾン内ＰｎｔＡＢを暗号化する遺伝子であるＹ７５_ｐ１５７９とＹ７５_ｐ１５７８が導入されたことを確認した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢと命名した。
【０１７３】
５−３：ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株の染色体内トランスポゾン遺伝子内ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼの導入
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２−ｂ（特許文献７）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）を対象に、実施例５−１で作製したプラスミドであるｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、トランスポゾン内ＰｎｔＡＢを暗号化する遺伝子であるＹ７５_ｐ１５７９とＹ７５_ｐ１５７８が導入されたことを確認した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢ、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｔＡＢと命名した。
【０１７４】
５−４：ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼを導入したコリネプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を導入時にプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例５−２及び５−３で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０１７５】
【表２０】
0006901621.tif 000022
【０１７６】
前記表２０に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株で大腸菌由来のＮＡＤＰトランスヒドロゲナーゼｐｎｔＡＢを導入した変異株すべて対照群に比べプトレシン生産性が小幅増加された。
【０１７７】
実施例６：グルコン酸キナーゼの不活性化を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でグルコン酸キナーゼ（Gluconate kinase）活性の弱化時にプトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０１７８】
実施例６−１：グルコン酸キナーゼ遺伝子であるＮＣｇｌ２３９９、ＮＣｇｌ２９０５欠損ベクターの製作
＜６−１−１＞ ＮＣｇｌ２３９９欠損のためのベクターの製作
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２染色体内にはグルコン酸キナーゼ活性を有する遺伝子であるＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５がある。グルコン酸キナーゼ活性を有する２つの遺伝子のうち、ＮＣｇｌ２３９９遺伝子を欠損するためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株のＮＣｇｌ２３９９遺伝子のアミノ酸配列（配列番号４５）と塩基配列（配列番号４６）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１７９】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号４７及び４８のプライマーと配列番号４９及び５０のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表２１）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２３９９（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【０１８０】
【表２１】
0006901621.tif 000023
【０１８１】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のＮＣｇｌ２３９９と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号５１）と塩基配列（配列番号５２）を確保した。
【０１８２】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、同じプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅して前記方法のようにベクターを製作した。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２３９９（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【０１８３】
＜６−１−２＞ ＮＣｇｌ２９０５欠損のためのベクターの製作
グルコン酸キナーゼ活性を有する別の遺伝子であるＮＣｇｌ２９０５遺伝子を欠損するためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株のＮＣｇｌ２９０５遺伝子のアミノ酸配列（配列番号５３）と塩基配列（配列番号５４）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０１８４】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号５５及び５６のプライマーと配列番号５７及び５８のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表２２）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２９０５（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【０１８５】
【表２２】
0006901621.tif 000024
【０１８６】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のＮＣｇｌ２９０５と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号５９）と塩基配列（配列番号６０）を確保した。
【０１８７】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、同じプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅して前記の方法のようにベクターを製作した。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２９０５（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【０１８８】
６−２：グルコン酸キナーゼ遺伝子であるＮＣｇｌ２３９９、ＮＣｇｌ２９０５欠損菌株の製作及び評価
＜６−２−１＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株のＮＣｇｌ２３９９欠損菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献７）を対象に、実施例６−１−１で製作したプラスミドｐＤＺ− １’ＮＣｇｌ２３９９（Ｋ／Ｏ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ２３９９遺伝子が欠損した菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０ＰΔＮＣｇｌ２３９９と命名した。
【０１８９】
＜６−２−２＞ ＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株のＮＣｇｌ２３９９、ＮＣｇｌ２９０５同時欠損菌株の製作
実施例６−２−１で製作したＫＣＣＭ１１２４０ＰΔＮＣｇｌ２３９９を対象に、実施例６−１−２で製作したプラスミドであるｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２９０５（Ｋ／Ｏ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ２３９９遺伝子とＮＣｇｌ２９０５の両方が欠損した菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０ＰΔＮＣｇｌ２３９９ΔＮＣｇｌ２９０５と命名した。
【０１９０】
＜６−２−３＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株のＮＣｇｌ２３９９欠損菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ベースのプトレシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＤＡＢ１２−ｂ（特許文献７）を対象に、実施例６−１−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２３９９（Ｋ／Ｏ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ２３９９遺伝子が欠損した菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２３９９と命名した。
【０１９１】
＜６−２−４＞ ＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株のＮＣｇｌ２３９９、ＮＣｇｌ２９０５同時欠損菌株の製作
実施例６−２−３で製作したＫＣＣＭ１１２４０ＰΔＮＣｇｌ２３９９を対象に、実施例６−１−２で製作したプラスミドであるｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２９０５（Ｋ／Ｏ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ２３９９遺伝子とＮＣｇｌ２９０５の両方が欠損した菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ｂΔＮＣｇｌ２３９９ΔＮＣｇｌ２９０５と命名した。
【０１９２】
＜６−２−５＞グルコン酸キナーゼの活性が不活性化された菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でグルコン酸キナーゼ遺伝子であるＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５が欠損されたときにプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例６−２−１、６−２−２、６−２−３、及び６−２−４で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に、実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０１９３】
【表２３】
0006901621.tif 000025
【０１９４】
前記表２３に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でグルコン酸キナーゼ遺伝子ＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５が欠損した変異株のすべてが対象群に比べてプトレシン生産性が増加した。そして、ＮＣｇｌ２３９９単独に欠損した菌株に比べてＮＣｇｌ２３９９とＮＣｇｌ２９０５両方が欠損された菌株のプトレシン生産性がより高いことを確認した。
【０１９５】
実施例７：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入及びトランスケトラーゼ強化を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性とトランスケトラーゼ活性の両方を強化時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０１９６】
７−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたプトレシン生産菌株でトランスケトラーゼを強化するための開始コドン置換統合菌株の製作
実施例１−４−１で製作したＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例２−１−１で製作したプラスミドｐＤＺ−１’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換した。このことから製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１９７】
同様に、実施例１−４−２で製作したＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例２−１−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ−２’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換した。このことから製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１９８】
７−２：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたプトレシン生産菌株でトランスケトラーゼを強化するためのプロモーター置換統合菌株の製作
実施例１−４−１で製作したＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例２−２−１で製作したプラスミドであるｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換した。このことから製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０１９９】
同様に、実施例１−４−２で製作したＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例２−２−１で製作したプラスミドｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｔｋｔ（ＡＴＧ）を実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換した。このことから製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）と命名した。
【０２００】
７−３：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が導入され、トランスケトラーゼの活性が強化された統合菌株のプトレシン生産能の評価
ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するｇａｐＮ遺伝子が強化されて、同時にトランスケトラーゼであるＮＣｇｌ１５１２の開始コドンがＴＴＧからＡＴＧに置換されたとき、またはＮＣｇｌ１５１２のプロモーターがＣＪ７に置換されたとき、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例７−１と７−２で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【０２０１】
具体的には、２つの対照群（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入された２つの変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ））とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入されてｔｋｔの開始コドンがＴＴＧからＡＴＧに置換された２種の変異株のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ｔｋｔ（ＡＴＧ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ｔｋｔ（ＡＴＧ）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入されてｔｋｔのプロモーターがＣＪ７に置換された２種の変異株のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｔｋｔ（ＡＴＧ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７） −ｔｋｔ（ＡＴＧ））を実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０２０２】
【表２４】
0006901621.tif 000026
【０２０３】
前記表２４に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐＮが導入されてｔｋｔの開始コドンをＡＴＧで置換したり、ｇａｐＮが導入されてｔｋｔプロモーターを置換して発現量を増加させた場合、ｇａｐＮ単独の強化菌株よりプトレシン生産性が増加することを確認できた。
【０２０４】
実施例８：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入及びＧ６ＰＤの強化を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性とＧ６ＰＤ活性がすべて強化される場合、プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０２０５】
８−１：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたプトレシン生産菌株でＧ６ＰＤ強化のためのＣＪ７プロモーター導入統合菌株の製作
実施例１−４−１で製作したＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例３−１−１で製作したプラスミドｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−１’ｚｗｆを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１４の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆと命名した。
【０２０６】
同様に、実施例１−４−２で製作したＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例３−１−１で製作したプラスミドｐＤＺ-Ｐ（ＣＪ７）−２’ｚｗｆを実施例＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１５１４の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆと命名した。
【０２０７】
８−２：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が導入され、Ｇ６ＰＤの活性が強化された統合菌株のプトレシン生産能の評価
ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するｇａｐＮ遺伝子が強化されて、同時にＧ６ＰＤのＮＣｇｌ１５１４の開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入されたとき、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例８−１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【０２０８】
具体的には、２つの対照群（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入された２つの変異株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ （ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入されてＮＣｇｌ１５１４の前ＣＪ７プロモーターが導入された２種の変異株のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ （ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｐ（ＣＪ７）−ｚｗｆ）を実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０２０９】
【表２５】
0006901621.tif 000027
【０２１０】
前記表２５に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐＮが導入されて、ｚｗｆの開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入されたとき、ｇａｐＮ単独の強化菌株よりプトレシン生産性が小幅増加することを確認できた。
【０２１１】
実施例９：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入及びニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ強化を介したプトレシンの生産
本実施例では、ＮＡＤＰからＮＡＤＰＨを合成する反応を活性化させるとともにＮＡＤ、ＮＡＤＰの前駆体であるβ−ニコチン酸Ｄ−リボヌクレオチドもともに強化するために、プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の両方を強化時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、大腸菌由来の遺伝子とコリネバクテリウム・グルタミカム由来の遺伝子をそれぞれ適用した。
【０２１２】
９−１：大腸菌Ｗ３１１０由来のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ.２．４.２．１１）をコリネ型微生物の染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入するためのベクターの作製
大腸菌Ｗ３１１０由来のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するｐｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３を染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入するためのベクターを作製した。大腸菌Ｗ３１１０由来のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するＰｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６１）と塩基配列（配列番号６２）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０２１３】
本出願の具体的な実施例では、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内遺伝子を導入するために形質転換用ベクターｐＤＺＴｎを用いた。Ｙ７５_ｐ０９０３遺伝子は大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型とし、配列番号６３及び６４のプライマーを用いて約１．２ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表２６）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。また、ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて、同じ条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。ｐＤＺＴｎベクターは、ＸｈｏＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）と命名した。
【０２１４】
【表２６】
0006901621.tif 000028
【０２１５】
９−２：ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコリネ型微生物の染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入するためのベクターの製作
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するＰｎｃＢを暗号化するＮＣｇｌ２４３１を染色体内に導入するためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来のＮＣｇｌ２４３１遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６５）と塩基配列（配列番号６６）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。この時、ＮＣｇｌ２４３１の開始コドンＧＴＧではなく、ＡＴＧの形態で導入した。
【０２１６】
本出願の具体的な実施例では、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内遺伝子を導入するために形質転換用ベクターｐＤＺＴｎを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号６７及び６８のプライマーを用いて約１．３ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表２７）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｐｎｃＢと命名した。
【０２１７】
【表２７】
0006901621.tif 000029
【０２１８】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のＮＣｇｌ２４３１と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６９）と塩基配列（配列番号７０）を確保した。
【０２１９】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、配列番号７１及び７２のプライマーを用いて約１．４５ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表２８）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して得た。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｐｎｃＢと命名した。
【０２２０】
【表２８】
0006901621.tif 000030
【０２２１】
９−３：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたコリネベースプトレシン生産菌株でニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ強化を介したプトレシンの発酵
＜９−３−１＞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたコリネベースプトレシン生産菌株でニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ強化菌株の製作
実施例１−４−１で製作したＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例９−１で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）と実施例９−２で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｐｎｃＢを＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、大腸菌Ｗ３１１０由来のｐｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３遺伝子またはコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来のｐｎｃＢを暗号化するＮＣｇｌ２４３１遺伝子がトランスポゾン内に導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ＮＣｇｌ２４３１と命名した。
【０２２２】
同様に、実施例１−４−２で製作したＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例９−１で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）と実施例９−２で作製したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｐｎｃＢを＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、大腸菌Ｗ３１１０由来のｐｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３遺伝子またはコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９由来のｐｎｃＢを暗号化はするＮＣｇｌ２４３１遺伝子がトランスポゾン内に導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）、ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ＮＣｇｌ２４３１と命名した。
【０２２３】
＜９−３−２＞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が導入され、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が強化された統合菌株のプトレシン生産能の評価
大腸菌Ｗ３１１０由来のＰｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３遺伝子またはコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＰｎｃＢを暗号化するＮＣｇｌ２４３１遺伝子が強化されたときプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例９−１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【０２２４】
具体的には、２つの対照群（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入された２つの変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ））とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入されて大腸菌Ｗ３１１０由来のｐｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３遺伝子またはコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｎｃＢを暗号化するＮＣｇｌ２４３１遺伝子が導入された４種の変異株のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７） −ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ＮＣｇｌ２４３１、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｐｎｃＢ（Ｅｃｏ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ （ＣＪ７）−２’ＮＣｇｌ２４３１を実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０２２５】
【表２９】
0006901621.tif 000031
【０２２６】
前記表２９に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐＮが導入されて、大腸菌Ｗ３１１０由来のｐｎｃＢを暗号化するＹ７５_ｐ０９０３遺伝子またはコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｎｃＢを暗号化するＮＣｇｌ２４３１が強化されたときプトレシン生産性が増加することを確認できた。また、大腸菌由来のｐｎｃＢ導入よりもコリネ由来のｐｎｃＢを強化したときよりも、プトレシン生産性がより増加することを確認した。
【０２２７】
実施例１０：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入及びＮＡＤ＋ジホスファターゼの欠損を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性とＮＡＤ＋ジホスファターゼの活性がすべて強化される時プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０２２８】
１０−１：ＮＡＤ＋ジホスファターゼ遺伝子であるＮＣｇｌ０７４４欠損ベクターの製作
ＮＡＤ＋ジホスファターゼの活性を有するＮＣｇｌ０７４４遺伝子のアミノ酸配列（配列番号７３）と塩基配列（配列番号７４）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。ＮＡＤ＋ジホスファターゼの活性を弱めるために、ＮＣｇｌ０７４４遺伝子を欠損するためのベクターを作製した。
【０２２９】
本出願の具体的な実施例では、形質転換用ベクターｐＤＺを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号７５及び７６のプライマーと配列番号７７及び７８のプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅した（表３０）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ０７４４（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【０２３０】
【表３０】
0006901621.tif 000032
【０２３１】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のＮＣｇｌ０７４４と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号７９）と塩基配列（配列番号８０）を確保した。
【０２３２】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、同じプライマーを用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の２つを増幅し、前記の方法のようにベクターを製作した。結果として得られたプラスミドをｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ０７４４（Ｋ／Ｏ）と命名した。
【０２３３】
１０−２：ＮＡＤ＋ジホスファターゼ遺伝子であるＮＣｇｌ０７４４欠損菌株の製作及び評価
＜１０−２−１＞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたコリネベースプトレシン生産菌株でＮＡＤ＋ジホスファターゼ欠損菌株の製作
実施例１−４−１で製作したＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例１０−１で製作したプラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ０７４４（Ｋ／Ｏ）を＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ０７４４遺伝子が欠損した菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ΔＮＣｇｌ０７４４、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ΔＮＣｇｌ０７４４と命名した。
【０２３４】
同様に、実施例１−４−２で製作したＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例１０−１で製作したプラスミドｐＤＺ −２’ＮＣｇｌ０７４４（Ｋ／Ｏ）を＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ０７４４遺伝子が欠損した菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）ΔＮＣｇｌ０７４４、ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７） −ｇａｐＮ（Ｓ）ΔＮＣｇｌ０７４４と命名した。
【０２３５】
＜１０−２−２＞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が導入され、ＮＡＤ＋ジホスファターゼの活性が不活性化された菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でＮＡＤ＋ジホスファターゼ遺伝子であるＮＣｇｌ０７４４が欠損されたときプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例１０−２−１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に実施例１−４−３と同様の方法でプトレシン生産能を比較した。
【０２３６】
【表３１】
0006901621.tif 000033
【０２３７】
前記表３１に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐＮが導入されてＮＡＤ＋ジホスファターゼを暗号化するＮＣｇｌ０７４４が欠損されたとき、プトレシン生産性が小幅増加することを確認できた。
【０２３８】
実施例１１：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの導入及びＮＡＤ＋キナーゼ強化を介したプトレシンの生産
プトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性とＮＡＤ＋キナーゼ活性が両方強化される時プトレシン生産に及ぼす効果を確認した。
【０２３９】
１１−１：ＮＡＤ＋キナーゼをコリネ型微生物の染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入するためのベクターの製作
ＮＡＤ＋キナーゼ活性を有するＮＣｇｌ１３５８の活性を強化するために、染色体内トランスポゾン遺伝子内のＣＪ７プロモーターによって発現されるＮＣｇｌ１３５８を導入するためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２由来のＮＣｇｌ１３５８遺伝子のアミノ酸配列（配列番号８１）と塩基配列（配列番号８２）は、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）から確保した。
【０２４０】
本出願の具体的な実施例では、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内トランスポゾン遺伝子内の遺伝子を導入するために形質転換用ベクターｐＤＺＴｎを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体を鋳型とし、配列番号８３及び８４のプライマーを用いて約０．９６ｋｂの遺伝子断片を増幅した（表３２）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して精製した。ＣＪ７プロモーター部位は、配列番号５及び６のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。ｐＤＺベクターは、ＸｂａＩを処理し、前記で得られたＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｐｐｎｋと命名した。
【０２４１】
【表３２】
0006901621.tif 000034
【０２４２】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２の塩基配列に基づいて、ＰＣＲ反応及びシーケンシングを介してコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９のｐｐｎＫを暗号化するＮＣｇｌ１３５８と相同性を有する遺伝子のアミノ酸配列（配列番号８５）と塩基配列（配列番号８６）を確保した。
【０２４３】
同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３８６９菌株の染色体を鋳型とし、同じプライマーを用いて約０．９６ｋｂの遺伝子断片を増幅した。この際、ＰＣＲ反応とクローニング方法は、前記と同じであり、これから得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｐｐｎｋと命名した。
【０２４４】
１１−２：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたコリネベースプトレシン生産菌株でＮＡＤ＋キナーゼ強化を介したプトレシンの発酵
＜１１−２−１＞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが導入されたコリネベースプトレシン生産菌株でＮＡＤキナーゼの強化菌株の製作
実施例１−４−１で製作したＡＴＣＣ １３０３２ベースプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例１１−１で製作したプラスミドｐＤＺＴｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｐｐｎｋを＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１３５８遺伝子がトランスポゾン内に導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｐｐｎｋと命名した。
【０２４５】
同様に、実施例１−４−２で製作したＡＴＣＣ １３８６９ベースプトレシン生産菌株ＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）を対象に、実施例１１−１で製作したプラスミドｐＤＺＴｎ ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｐｐｎｋを＜１−４−１＞と同様の方法で形質転換し、ＮＣｇｌ１３５８遺伝子がトランスポゾン内に導入された菌株を作製した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｐｐｎＫと命名した。
【０２４６】
＜１１−２−２＞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が導入され、ＮＡＤ＋キナーゼの活性が強化された統合菌株のプトレシン生産能の評価
コリネバクテリウム・グルタミカムＮＡＤＰＨの前駆体であるＮＡＤＰの供給を円滑にするために、ＮＡＤ＋キナーゼ活性を有するＮＣｇｌ１３５８をＣＪ７プロモーターによって発現される形態で染色体内トランスポゾン遺伝子内に導入したとき、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例１１−２−１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【０２４７】
具体的には、２つの対照群（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入された２つの変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ））とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ ２５１７５由来のｇａｐＮが導入されてコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｐｎＫが導入された４種の変異株のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−１’ｐｐｎＫ、ＤＡＢ１２−ｂ Ｐ（ＣＪ７）−ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｓ）Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−２’ｐｐｎＫを実施例１−４−３と同様の方法で９８時間培養した最終産物からプトレシン生産能を比較した。
【０２４８】
【表３３】
0006901621.tif 000035
【０２４９】
前記表３３に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２または１３８６９由来のプトレシン生産菌株でＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐＮが導入されてコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＮＡＤ＋キナーゼであるｐｐｎＫを暗号化するＮＣｇｌ１３５８を強化したときプトレシン生産性が小幅増加することを確認できた。
【０２５０】
本出願でアセチルプトレシン合成経路が欠損したプトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物でトランスポゾン内にＬｄｂ１１７９を導入してＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を強化させたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株が高収率及び高生産性でプトレシンを生成できることを確認し、前記菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ＣＪ７）−ｇａｐＮ（Ｌ）、ＣＣ０１−０８１１と命名した後、ブダペスト条約下で２０１７年６月２９日付で韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２０５２Ｐを与えられた。
【０２５１】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【０２５２】
0006901621.tif 000036
【配列表】
0006901621000001.app