(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物であって、
前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、前記光感作剤は、エチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリン及び５−ＡＬＡから構成された群より選ばれた光感作剤である、５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射して、赤色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞を選択的に死滅させるための、光力学治療用組成物。
【請求項２】
蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物であって、
前記蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、前記光感作剤は、ローズベンガルである、４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射して、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞を選択的に死滅させるための、光力学治療用組成物。
【請求項３】
蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物であって、
前記蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、前記光感作剤は、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡである、５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射して、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞を選択的に死滅させるための、光力学治療用組成物。
【請求項４】
前記赤色蛍光タンパク質の発光スペクトルの頂点が５７０〜６００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の光力学治療用組成物。
【請求項５】
前記黄色蛍光タンパク質の発光スペクトルの頂点が５２０〜５５０ｎｍであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の光力学治療用組成物。
【請求項６】
前記細胞は、癌細胞、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、免疫細胞及び脂肪細胞から構成された群より選ばれたいずれか１つ以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物。
【請求項７】
前記癌細胞は、乳癌細胞または肺癌細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の光力学治療用組成物。
【請求項８】
前記組成物は、癌組織に選択的に蓄積され、レーザの照射によって一重項酸素または自由ラジカルの生成が可能であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物。
【請求項９】
前記癌は、大腸腺腫、大腸癌、直腸癌、肛門癌、小腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、慢性または急性白血病、骨髄癌、リンパ球リンパ腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、軟組織腫瘍、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、バレット食道（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、子宮頸部異形成症（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、腎癌及び輸尿管癌から構成されたグループより選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の光力学治療用組成物。
【請求項１０】
前記組成物を用いて、生体内または生体外で光活性化させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物；及び光源を含む、光力学治療に用いるためのキット。
【請求項１２】
前記キットは、癌治療用キットであることを特徴とする、請求項１１に記載の光力学治療に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を用いた光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法に関し、より具体的に、蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射することにより、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞を選択的に死滅させることができる光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
光力学治療（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、光に鋭敏な反応を示す物質である光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を体内に投与すると、外部から光を照射した場合に、体内の豊富な酸素と外部光による化学反応で一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ）または自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）が生成され、このような一重項酸素または自由ラジカルが各種の病変部位や癌細胞の細胞死滅を誘導して破壊する原理を用いた治療法であって、近年、嘱望される癌治療方法の一つである。
【０００３】
しかし、現在、使用中の光力学治療は、光の透過制限により、体積が大きい腫瘍には用いられておらず、特に、光感作剤の人体内の代謝が遅いことから光毒性の副作用が発見されており、腫瘍内の光感作剤の濃度が低くて効率的な治療効果を奏していない。また、治療以外の長時間体内に累積して副作用を誘発したりもする。従って、腫瘍選択性を高めて副作用を減らし、レーザによる効率的な治療のための新たな光感作剤の開発が要求される。また、光力学治療の腫瘍細胞致死効果は、癌塊内の光の浸透深さと関連するが、組織内の光の影響は、距離に対して幾何級数的に減少する。組織の弱化は、最適な吸収、内因性分子及び薬物発色団自体による散乱によって影響を受ける。皮膚組織の最大透過率は７００〜８００ｎｍの領域にあり、この領域内で最大吸収を示す光感作剤の開発が要求される。６３０ｎｍでの有効な浸透深さは１〜３ｍｍの間であるのに対して、７００〜８５０ｎｍでは最小で６ｍｍの光の浸透が観察された。従って、理想的な光感作剤は、近赤外線領域で強い吸収を示さなければならない。
【０００４】
光力学治療は、バレット食道（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、子宮頸部異形成症（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）のような悪性になる前の病変だけでなく、頭と首を含む皮膚、膀胱のような悪性部位の治療にも用いられてきた。最近、光力学治療の使用を拡大させ、癌細胞に対する有効性及び特異性を増加させるために、いくつか他の方式の方法が開発された。例えば、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）及びＢＲＥＴ（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）のような共鳴エネルギー伝達メカニズムを用いる方法がある。ＦＲＥＴは、ドナーの発光波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）とレセプターの励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）とがオーバーラップされるときに、２つの発色団の間に起こる現象であって、ドナーから受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）へエネルギーが移動することになる。ＦＲＥＴを用いた癌治療のための前臨床試験で進展があった。ＢＲＥＴは、生物発光源（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ）の代わりに、外部光とドナー発色団を用いる。生物発光は、酵素−基質反応のため、疾患部位にかかわらず、光感作剤の活性化を可能にする。ルシフェリンが放出する光は、細胞内の蛍火がルシフェラーゼと反応して光感作剤を活性化させ、光は、最大９０％程度の腫瘍細胞を破壊させる。Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌでは、ＢＲＥＴ−基盤量子点を光力学治療に必要な光源の代替剤として用いることについて、その可能性を提示している。
【０００５】
よって、本発明者等は、癌細胞に対する有効性及び特異性を増加させた光力学治療方法を開発するために努力した結果、多様な蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認して、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を有効成分として含有する光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法を開発することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物、光力学治療方法及び光力学治療用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的を達成するために、本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、個体における光力学治療方法であって、前記方法は、前記個体に、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上を導入するステップ；光感作剤を投与するステップ；及び光を照射するステップを含む、光力学治療方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤を含有する、光力学治療用組成物；及び光源を含む、光力学治療に用いるためのキットを提供する。
【００１０】
また、本発明は、光力学治療用組成物として用いるための、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤の用途を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者等は、癌幹細胞、特にＬｇｒ５＋細胞にローズベンガル（ｒｏｓｅ  ｂｅｎｇａｌ；ＲＢ）を活用した、ｃＦＲＥＴ−基盤ＰＤＴを用いて除去する新規の方法を提供し、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）のマウスを用いてその有効性を立証した。本発明では、Ｌｇｒ５＋細胞の疾患の「シード（ｓｅｅｄ）」及び治療的標的としての役割を究明し、本発明による方法によって、正常なＬｇｒ５＋幹細胞に害を与えることなく、Ｌｇｒ５＋大腸癌幹細胞を除去することができるという点をさらに究明した。
【００１２】
また、本発明者等は、多様な蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された癌細胞に光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療用組成物の有効成分として有用に用いることができるという点を究明した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ｃＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）の実験コンセプトを図示しているものであって、ｅＧＦＰ及びローズベンガル（ＲＢ）の吸光度及び蛍光発光を示している。
【図１Ｂ】ｃＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）の実験コンセプトを図示しているものであって、ｅＧＦＰ及びローズベンガル（ＲＢ）の吸光度及び蛍光発光を示している。
【図１Ｃ】ＲＢ活性化のためにブルーレーザ光を図示しているときに誘導される選択的な細胞死滅を図で示しているものである。
【図２Ａ】レーザの照射後、ｅＧＦＰ−細胞に比べてｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞で選択的に細胞死滅が生じる程度を、ＭＴＴ分析に基づいて測定した結果を示しているものであって、Ｃｅ６はクロリンｅ６；ＲＢはローズベンガルを示し、灰色はＧＦＰ−細胞を；緑色はｅＧＦＰ＋細胞を示し、スケールバーは５０μｍである。
【図２Ｂ】ｅＧＦＰ−及びｅＧＦＰ＋ ４Ｔ１細胞の顕微鏡像を示し（上側カラム）；４８８ｎｍレーザ光に露出した後、６時間後にｅＧＦＰ＋細胞に対して選択的に誘導された細胞毒性を示し（中間カラム）；中間カラムにおいて赤い点で表示している領域をズームインした像である（下側カラム）。
【図２Ｃ】細胞毒性を、多様な光敏感剤の濃度及び露出時間による濃度勾配ビットマップグラフィックを用いて示しているものであって、左側はｅＧＦＰ−を、右側はｅＧＦＰ＋を示す。
【図２Ｄ】ＬＤＨ分析で４種類のｅＧＦＰ＋細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０）の細胞毒性における差を測定したものである。
【図２Ｅ】トランスフェクションされたＥＧＦＰ遺伝子の濃度による細胞毒性の変化を測定した結果を示しているものである。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【図２Ｆ】トランスフェクションされたＥＧＦＰ遺伝子の濃度による細胞毒性の変化を測定した結果を示しているものである。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【図３Ａ】ｅＧＦＰ−細胞移植のマウスモデルでｃＧＲＥＴ  ＰＤＴの実験結果を示しているものであり、移植された腫瘍部位に皮膚をフラップした状態で、腫瘍に４８８ｎｍのレーザ光を照射することを示しているものである。
【図３Ｂ】照射前及び照射２ラウンド後のｅＧＦＰ＋細胞の蛍光共焦点顕微鏡像を示しているものである。
【図３Ｃ】ｅＧＦＰ＋細胞を示す領域をＩｍａｇｅ  Ｊ  ２．０で分析した結果を示しているものであって（上側カラム：Ｂ１６Ｆ１０、下側カラム：Ｈ４６０）；スケールバーは１００μｍであり、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【図３Ｄ】その他の処理配合群の間で移植されたＧＦＰ−またはＧＦＰ＋  Ｂ１６Ｆ１０の腫瘍の体積をモニタリングした結果を示しているものであって、＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図３Ｅ】処置後の代表的な分離した腫瘍を示しているものであって、スケールバーは１ｃｍを示す。
【図３Ｆ】腫瘍表面下の広い部位で細胞死滅が観察されることを示しているものであって、バックス抗体を死滅細胞部位の免疫染色のために用いており、スケールバーは２００μｍである。
【図３Ｇ】カスパーゼ３及びＴＮＦ−αの発現または分泌水準を示しているものであって、免疫組織化学法で測定したものであり、＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、スケールバーは５０μｍである。
【図３Ｈ】カスパーゼ３及びＴＮＦ−αの発現または分泌水準を示しているものであって、免疫組織化学法で測定したものであり、＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、スケールバーは５０μｍである。
【図４Ａ】炎症誘導性大腸癌のマウスモデルでｃＦＲＥＴ  ＰＤＴの実験結果を示しているものであり、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインのマウスモデルのクリプトにおけるＬｇｒ５＋大腸幹細胞の共焦点像である（スケールバーは５０μｍ）。
【図４Ｂ】散発的な大腸腫瘍におけるＬｇｒ５＋ｅＧＦＰ細胞の存在を示しているものである（スケールバーは５０μｍ）。
【図４Ｃ】マウスの大腸上皮に光を均一に照射する場合、６００μｍの直径を有するシリンダー型拡散繊維である（上：照射前；下：照射後）。
【図４Ｄ】シリンダー型拡散繊維を用いて肛門を経由してマウスの大腸に照射することを示しているものである。
【図４Ｅ】多様な条件のＰＤＴ下でポリープ数を測定した結果を示しているものである（ｎｓは、ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図４Ｆ】大腸ビューシステムを用いて得られた、野生型（上側カラム）及びＬＧＲ５（下側カラム）の大腸の代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄの映像である。
【図４Ｇ】未処理群及び光のみを照射した群の全て（陰性対照群）で細胞死滅を追跡した結果を示しているものである。
【図４Ｈ】ＲＢ投与及び光照射後の周辺のｅＧＦＰ＋細胞領域における特定の死滅シグナルを示しているものである（＊＊：Ｐ＜０．０１；スケールバー：１００μｍ）。
【図５】Ｃｅ６処理及び６５０ｎｍの赤色光処理時のｅＧＦＰ発現癌細胞及びｎｏｎ−ＧＦＰ癌細胞の間における細胞毒性の測定結果を示しているものであって、２つのグループにおいて差がないという点が分かる。
【図６】図６はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血液循環システムを示したものである。左の図は血液循環システムを模倣したｉｎ  ｖｉｔｒｏ流体システムとレーザ照射の概要を、右上の図は青色レーザ照射後の死細胞の割合（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）を、右下の図は３回までのレーザ照射後のＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞間の細胞死の差を示している。青色及び赤色シグナルはそれぞれＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びヨウ化プロピジウムの染色によるものである。
【図７】ＣＴＣ大腿静脈が照射を受けた後の癌細胞数の測定結果を示している。
【図８】ＣＴＣターゲット療法の概略である。
【図９】赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）の励起スペクトル及び発光スペクトル、及び光感作剤としてのエチルエチオプルプリンすず（ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）の吸光度を示しているものである。
【図１０】ＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いたＦＲＥＴの実験コンセプトを模式化した図を示しているものである。
【図１１】ＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、５８０ｎｍの黄色光の照射時間による細胞死滅をＬＤＨ分析法で確認したものである。
【図１２】ＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、５８０ｎｍの黄色光の照射時間による細胞死滅をＭＴＴ分析法で確認したものである。
【図１３】ＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを濃度別に処理し、５８０ｎｍの黄色光の照射時間による細胞死滅をＭＴＴ分析法で確認したものである。
【図１４】ＧＦＰまたはＲＦＰを導入した乳癌細胞に、光感作剤として、Ｃｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎｅ（ｅ６））、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ  ｂｅｎｇａｌ）またはエチルエチオプルプリンすずを処理し、６５０ｎｍの赤色光、４８０ｎｍの青色光または５８０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞毒性を確認したものである。
【図１５】ＧＦＰを導入した肺癌細胞にローズベンガルを処理し、青色光の照射後、蛍光強度を確認したものである。
【図１６】実際の皮膚環境の条件下で、ＧＦＰまたはＲＦＰが導入された細胞に光感作剤を処理し、光照射した後、細胞死滅の程度を確認するための実験方法を模式化した図を示しているものである。
【図１７】実際の皮膚環境の条件下で、ＧＦＰを導入した乳癌細胞にローズベンガルを処理し、４７３ｎｍの青色光を照射した後、またはＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、５８０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。
【図１８】ＲＦＰが導入された細胞が、５８０ｎｍの黄色光の照射後、エチルエチオプルプリンすずの活性によって選択的な細胞死滅が生じる過程を模式化した図を示しているものである。
【図１９】ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）またはＲＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞を蛍光共焦点顕微鏡で確認した図を示しているものであって、Ｇは、ＧＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、Ｙは、ＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、Ｒは、ＲＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、ＥＶは、ｐｃＤＮＡ  ３．１ベクターが導入された非小細胞肺癌細胞を示す。
【図２０】ＧＦＰ、ＹＦＰまたはＲＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、または対照群の細胞（ＥＶ）に、光感作剤としてローズベンガルを処理し、４８８ｎｍの青色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図２１】ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、または対照群の細胞（ＥＶ）に、光感作剤としてヘマトポルフィリン（Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を処理し、５７０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１である。
【図２２】ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、または対照群の細胞（ＥＶ）に、光感作剤として５−ＡＬＡ（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｎｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を処理し、５７０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物を提供する。
【００１６】
前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得る。
【００１７】
前記緑色蛍光タンパク質の場合、具体的に、発光スペクトルの頂点（ｐｅａｋ）は５０８ｎｍであり、励起スペクトルの頂点（ｐｅａｋ）は４８９ｎｍであるが、メーカーによって発光スペクトルの頂点の範囲が一部異なることもあり、いずれも本発明に含まれる。
【００１８】
前記赤色蛍光タンパク質の場合、具体的に、発光スペクトルの頂点は５７０〜６００ｎｍであり、より具体的に、発光スペクトルの頂点は５８４ｎｍであり、励起スペクトルの頂点は５５５ｎｍであるが、メーカーによって発光スペクトルの頂点の範囲が一部異なることもあり、いずれも本発明に含まれる。
【００１９】
前記黄色蛍光タンパク質の場合、具体的に、発光スペクトルの頂点は５２０〜５５０ｎｍであり、より具体的に、発光スペクトルの頂点は５３９ｎｍであり、励起スペクトルの頂点は５２９ｎｍであるが、メーカーによって発光スペクトルの頂点の範囲が一部異なることもあり、いずれも本発明に含まれる。
【００２０】
前記蛍光染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ）または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）は、アクリジンオレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ）、ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｅ−２’−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）、蛍光性イソチオネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ；ＴＲＩＣＴ）、ローダミンイソチオチオネート（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）またはシアニン（ｃｙａｎｉｎ）、例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５であり得るが、これに制限されるものではない。
【００２１】
前記光感作剤は、ローズベンガル（ｒｏｓｅ  ｂｅｎｇａｌ）、エチルエチオプルプリンすず（ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）または５−ＡＬＡ（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）であり得る。
【００２２】
前記ローズベンガルは、５４９ｎｍの最大吸光度スペクトル及び５１０ｎｍのショルダー吸光度スペクトルを有する。緑色蛍光タンパク質の発光波長がローズベンガルのショルダー吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じ得る。
【００２３】
前記エチルエチオプルプリンすずは、光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）であって、「Ｓｎ（ＩＶ）エチオプルプリン（Ｓｎ（ＩＶ）ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）」、「ＳｎＥＴ２」、「フォトポイントＳｎＥＴ２（ＰｈｏｔｏＰｏｉｎｔ  ＳｎＥＴ２）」、「エチオプルプリンすず（ｔｉｎ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）」または「ロスタポルフィン（Ｒｏｓｔａｐｏｒｆｉｎ）」とも呼ばれ、６４０ｎｍ〜６６０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。赤色蛍光タンパク質の発光波長がエチルエチオプルプリンすずの吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴが生じ得る。
【００２４】
前記ヘマトポルフィリンは、６２０ｎｍ〜６４０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質の発光波長がヘマトポルフィリンの吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴが生じ得る。
【００２５】
前記５−ＡＬＡは、３５０〜６４０ｎｍ、より具体的に６１０〜６４０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質の発光波長がヘマトポルフィリンの吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴが生じ得る。
【００２６】
本発明による、緑色蛍光タンパク質−ローズベンガル、赤色蛍光タンパク質−エチルエチオプルプリンすず、赤色蛍光タンパク質−ヘマトポルフィリン、赤色蛍光タンパク質−５−ＡＬＡ、黄色蛍光タンパク質−ローズベンガル、黄色蛍光タンパク質−ヘマトポルフィリン、または黄色蛍光タンパク質−５−ＡＬＡの組み合わせによる光力学治療の際に、細胞蛍光共鳴エネルギー伝達（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって光力学治療が可能になる。
【００２７】
前記組成物は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞、または蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物で標識された細胞を標的化して選択的に除去することができ、具体的に、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入、または蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物で標識された癌細胞、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、免疫細胞または脂肪細胞を標的化して選択的に除去することができ、より具体的に、Ｌｇｒ５陽性癌幹細胞、乳癌細胞または肺癌細胞を標的化して選択的に除去することができるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
前記組成物は、癌組織に選択的に蓄積され、レーザの照射によって一重項酸素または自由ラジカルの生成が可能になる。より具体的に、光に鋭敏な反応を示す物質である光感作剤を体内に投与すると、外部から光を照射した場合に、体内の豊富な酸素と外部光による化学反応で一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ）または自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）が生成されるが、本発明は、このような一重項酸素または自由ラジカルが各種の病変部位や癌細胞の細胞死滅を誘導して破壊する原理を用いた治療法である。
【００２９】
前記癌は、大腸腺腫、大腸癌、直腸癌、肛門癌、小腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、慢性または急性白血病、骨髄癌、リンパ球リンパ腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、軟組織腫瘍、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、バレット食道（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、子宮頸部異形成症（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、腎癌及び輸尿管癌から構成されたグループより選ばれ得、より具体的に、乳癌または肺癌であり得るが、これに限定されるものではない。
【００３０】
前記光力学治療用組成物は、緑色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射する場合、癌細胞が選択的に死滅するメカニズムによって癌疾患の治療が可能である。また、４７０ｎｍ未満の青色光を照射する場合、細胞内で緑色蛍光タンパク質が光反応をすることができないこともあり、４９０ｎｍを超えた青色光を照射する場合、緑色蛍光タンパク質が導入された癌細胞の周辺の正常細胞にも影響を及ぼして細胞死滅を誘発することができる。
【００３１】
また、赤色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にエチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を２秒以上照射する場合、癌細胞が選択的に死滅するメカニズムによって癌疾患の治療が可能である。また、５６５ｎｍ未満の黄色光を照射する場合、細胞内で赤色蛍光タンパク質が光反応をすることができないこともあり、５９０ｎｍを超えた黄色光を照射する場合、赤色蛍光タンパク質が導入された癌細胞の周辺の正常細胞にも影響を及ぼして細胞死滅を誘発することができる。また、２秒未満で光照射を行う場合、細胞内で赤色蛍光タンパク質が光反応をすることができないこともある。
【００３２】
また、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射するか、または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射する場合、癌細胞が選択的に死滅するメカニズムによって癌疾患の治療が可能である。
【００３３】
前記組成物を用いて、生体内または生体外で光活性化され得、より具体的に生体外で光活性化され得る。
【００３４】
本発明の具体的な実施例において、本発明者等は、緑色蛍光タンパク質が導入されたＬｇｒ５陽性癌幹細胞または肺癌細胞に、光感作剤としてローズベンガルを処理した後、青色光を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認した。
【００３５】
また、本発明者等は、赤色蛍光タンパク質が導入された乳癌細胞または肺癌細胞に、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理した後、黄色光を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認した。
【００３６】
さらに、本発明者等は、黄色蛍光タンパク質が導入された肺癌細胞に、光感作剤としてローズベンガルを処理した後に青色光を照射するか、またはヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理した後に黄色光を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認した。
【００３７】
従って、本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療用組成物の有効成分として有用に用いることができる。
【００３８】
また、本発明は、
個体における光力学治療方法であって、
前記方法は、前記個体に、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上を導入するステップ；
光感作剤を投与するステップ；及び
光を照射するステップを含む、光力学治療方法を提供する。
【００３９】
前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質であり得、前記光感作剤は、ローズベンガル、エチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡであり得る。
【００４０】
前記蛍光染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ）または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）は、アクリジンオレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ）、ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｅ−２’−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）、蛍光性イソチオネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ；ＴＲＩＣＴ）、ローダミンイソチオチオネート（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）またはシアニン（ｃｙａｎｉｎ）、例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５であり得るが、これに制限されるものではない。
【００４１】
前記光は、４７０〜４９０ｎｍの青色光、または５６５〜５９０ｎｍの黄色光であり得る。
【００４２】
具体的に、前記光力学治療方法は、緑色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射する場合、細胞が選択的に死滅するメカニズムによって光力学治療が可能である。
【００４３】
また、赤色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にエチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射する場合、細胞が選択的に死滅するメカニズムによって光力学治療が可能である。
【００４４】
また、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射するか、または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射する場合、細胞が選択的に死滅するメカニズムによって光力学治療が可能である。
【００４５】
前記個体は、癌を保有している個体、例えば、癌幹細胞によって特徴付けられる癌を保有しているヒト、またはヒトを除く個体であり得る。
【００４６】
本発明において、用語の「ヒトを除く個体」は、本発明による光力学治療用組成物の投与によって症状が好転することができる、ヒトのみを除く、豚、牛、馬、羊、ヤギ、犬などの動物を意味し、具体的に、癌を保有しているヒトのみを除く動物を意味する。本発明による光力学治療方法で癌疾患を効果的に治療することができる。
【００４７】
本発明の治療方法は、血液透析方法を用いて個体の血液中の癌細胞を死滅させることができ、本発明による光力学治療用組成物が投与された個体の血液を体外へ排出させた後、ここに光源を照射することにより、癌細胞をより効果的に死滅させることができる。ここで、血液透析とは、個体の血液を機械に連結された透析機械に通して特殊なフィルターで水分及び老廃物をろ過した後、血液を再度患者の体内に注入する治療方法をいう。
【００４８】
一方、胃、小腸、大腸などに腫瘍または癌が存在する場合、本発明による光力学治療用組成物が処理された状態で、内視鏡形の光源を照射することのできる装置を入れて光源を照射することにより、癌細胞をより効果的に死滅させることができる。しかし、前記部位に限定されるものではなく、上記のような方法が適用され得る全ての癌疾患部位に適用され得ることは、上記の記載内容からこの技術分野における通常の技術者にとって自明であろう。
【００４９】
本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療に有用に用いることができる。
【００５０】
また、本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤を含有する光力学治療用組成物；及び
光源を含む、
光力学治療に用いるためのキットを提供する。
【００５１】
前記蛍光タンパク質、蛍光染料、蛍光物質、光感作剤及び光源については、前記光力学治療用組成物についての説明と同一であるところ、具体的な説明は、上記の内容を援用し、以下においては、キットの特有な構成についてのみ説明することとする。
【００５２】
前記キットは、癌治療用キットであり得、前記癌は、大腸腺腫、大腸癌、直腸癌、肛門癌、小腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、慢性または急性白血病、骨髄癌、リンパ球リンパ腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、軟組織腫瘍、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、バレット食道、子宮頸部異形成症、腎癌及び輸尿管癌から構成されたグループより選ばれ得、より具体的に乳癌または肺癌であり得るが、これに限定されるものではない。
【００５３】
本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を、光力学治療に用いるためのキットの有効成分として有用に用いることができる。
【００５４】
さらに、本発明は、光力学治療用組成物として用いるための、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤の用途を提供する。
【００５５】
前記蛍光タンパク質、光感作剤については、前記光力学治療用組成物についての説明と同一であるところ、具体的な説明は、上記の内容を援用する。
【００５６】
本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療に有用に用いることができる。
【００５７】
以下、本発明について、実施例及び実験例を通じてさらに詳細に説明する。下記の実施例及び実験例は、本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の権利範囲がこれに限定されることを意図しない。
【００５８】
１−１．細胞の培養
Ｂ１６−Ｆ１０（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｓｋｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、４Ｔ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍａｍｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）及びＡ５４９（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｂａｓａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の細胞株を韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）から購入した。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ダルベッコ修正イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に置き；他の細胞は、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）−１６４０の培地に１０％ＦＢＳを添加した培地で、３７℃、５％ＣＯ２を含有する加湿条件（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）で培養した。
【００５９】
１−２．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−及びＧＦＰ＋細胞の製造
細胞の形質転換及び安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）のスクリーニング方法
リポフェクタミン２０００反応剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて一時的な形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を行った。細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生剤を含有するＲＰＭＩ培養液（Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。細胞成長率を倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。コンフルエンスが８５％に達したときに、細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、ウェル当たり２μｇ  ｐＥＧＦＰ−１（ｃｌｏｎｔｅｃｔ、＃６０８６−１）プラスミドを添加した［プラスミド（μｇ）：リポフェクタミン２０００（μｌ）＝１：３］。形質転換から２４時間後、細胞を０．２５％トリプシンで消化させ、培養液を０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８及び１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地でさらに培養するためにプレートに移した後、１０日間培養した。
【００６０】
抵抗力のある細胞クローンの量を観察するときに、０．２５％トリプシンで消化させ、その後、追加の培養のためにエイセプティックピペットを用いて新たな培養フラスコに移し、これらは、ＧＦＰ−クローン及びＧＦＰ＋クローンである。類似した成長率及び腫瘍の成長に基づいて、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞を選別した。
【００６１】
１−３．赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）−及びＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞の製造
光力学治療（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）に赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）を用いることができるのかを確認するために、ＲＦＰが導入された乳癌細胞を作製した。
【００６２】
具体的に、前記１−１．に記載された方法と同一の方法で、マウスの乳癌細胞株である４Ｔ１細胞株にｐＣＭＶ  ＲＦＰ  Ｃ−ＨＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ、８２０２５）プラスミドを添加し、培養して、ＲＦＰ−及びＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞を選別した。
【００６３】
１−４．ＧＦＰ＋、ＲＦＰ＋及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）＋  Ａ５４９細胞の製造
ＧＦＰ＋、ＲＦＰ＋またはＹＦＰ＋細胞で光源及び光感作剤による光力学治療活性を確認するために、ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞を作製した。
【００６４】
具体的に、前記１−１．に記載された方法と同一の方法で、ヒトの非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株にｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ  Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃７４１６５、ｐｃＤＮＡ３．２  ＹＦＰ  Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃８４９１０、またはｐｃｍＣｈｅｒｒｙ  ３．１（−）Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃６２８０３を添加し、培養して、ＧＦＰ＋  Ａ５４９、ＲＦＰ＋  Ａ５４９及びＹＦＰ＋  Ａ５４９細胞を選別した。
【００６５】
２−１．ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞とローズベンガルを用いて、光照射後、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＤＴ実験
青色光の照射後、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の光破壊を、ローズベンガル（ＲＢ）の存在または不存在の条件でＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【００６６】
ＲＢを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで希釈して、６．２５、１２．５、２５、５０及び１００μＭの濃度のＲＢを製造した。ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞を、９６ウェル、ブラック及びクリアな底プレートでウェル当たり２×１０４の細胞の密度で前培養した。細胞をＲＢと共に４時間で培養した。ウェルに光敏感剤のないフレッシュな培養培地を添加したものを未処理対照群とした。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。
【００６７】
ＰＤＴ処理群の場合、細胞にブルーレーザ光（４７３ｎｍ；放射線量比率＝８０ｍＷ／ｃｍ２）を１〜６０秒間照射した。純粋なＲＢのＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞に対する毒性を暗室で測定した。照射後、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、培地をＭＴＴ分析で測定した。１５０μＬの可溶化溶液及びストップ溶液を添加し、３７℃で４時間培養した。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞の生存能力を次の式で計算した：
（ＯＤｔｒｅａｔｅｄ／ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ）×１００％
【００６８】
各実験は、独立して行われた。細胞死滅は、ＬＤＨ分析で測定した。
【００６９】
細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり５×１０４の密度でシーディングし、光敏感剤で処理した後、青色光を前述したように照射した。培地をそれぞれ準備した。ＬＤＨ分析用としては、ＬＤＨ細胞毒成分析キット（ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）をメーカーのプロトコルに従って用いた。培養された細胞の上澄液１００μＬを、ウェルから新たなプレートの対応するウェルへ移動させた後、１００μＬの反応溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間オービタルシェーカーでジェントルにシェーキングしながら培養した。マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７０】
２−２．ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞とエチルエチオプルプリンすずを用いて、時間別の光照射後、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＤＴ実験
黄色光を時間別に照射後、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞の光破壊をエチルエチオプルプリンすず（Ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）存在の条件でＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【００７１】
具体的に、エチルエチオプルプリンすず（Ｍｉｒａｖａｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈して、１μＭの濃度のエチルエチオプルプリンすずを製造した。また、前記１−３．で選別したＲＦＰ−またはＲＦＰ＋４Ｔ１細胞を、２４ウェルプレートにウェル当たり５×１０４の細胞の密度で前培養した。その後、前記前培養した細胞をエチルエチオプルプリンすずと共に４時間で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を０、５及び１０秒間照射した。その後、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの手続きに従ってＬＤＨ分析を行った。培養された細胞の上澄液１００μｌを、ウェルから新たなプレートの対応するウェルへ移動させた後、１００μｌの反応溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間オービタルシェーカーでジェントルにシェーキングしながら培養した。マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７２】
また、上記と同一の方法で、前記１−３．で選別したＲＦＰ−またはＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞に、黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を０、１、２、５、７または１０秒間照射した後、ＭＴＴ分析を行った。ＭＴＴ分析のために、前記照射済みの細胞に、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、ＭＴＴ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて、メーカーの手続きに従ってＭＴＴ分析を行った。１５０μｌの可溶化溶液及びストップ溶液を添加し、３７℃で４時間培養した。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞の生存能力を次の式で計算した：
（ＯＤｔｒｅａｔｅｄ／ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ）×１００％
【００７３】
２−３．ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞と濃度別のエチルエチオプルプリンすずを用いて、光照射後、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＤＴ実験
黄色光を照射後、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞の光破壊を、エチルエチオプルプリンすず（Ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）の濃度別の条件で、ＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【００７４】
具体的に、上記に記載された方法と同一の方法で、エチルエチオプルプリンすずを０、０．５、１及び２μＭの濃度で製造した。その後、前記１−３．で選別したＲＦＰ−またはＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞と共に４時間で培養し、黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を５秒間照射した後、ＭＴＴ分析を行った。
【００７５】
２−４．ＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞と光感作剤を用いて、光照射後、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＤＴ実験
赤色光、青色光または黄色光の照射後、ＲＦＰ＋またはＧＦＰ＋細胞の細胞毒性を、光感作剤として、Ｃｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎｅ（ｅ６））、ローズベンガルまたはエチルエチオプルプリンすずの存在下で、ＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【００７６】
具体的に、光感作剤として、Ｃｅ６（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−２６３０６７）、ローズベンガル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、３３００００−５Ｇ）またはエチルエチオプルプリンすずを、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈して、１μＭの濃度で製造した。また、前記１−３．で選別したＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞及び前記１−４．で選別したＧＦＰ＋４Ｔ１細胞を、９６ウェル、ブラック、及びクリアな底プレートでウェル当たり２×１０４の細胞の密度で前培養した。その後、前記前培養した細胞をＣｅ６、ローズベンガルまたはエチルエチオプルプリンすずと共に４時間で培養した。ＲＦＰまたはＧＦＰが導入されていない４Ｔ１細胞を対照群とした。４時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、赤色のレーザ光（６５０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）、青色のレーザ光（４８８ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）または黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を５秒間照射した。照射後、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、ＭＴＴ分析を行った。
【００７７】
２−５．ＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞及びＹＦＰ＋細胞と光感作剤を用いて、光照射後、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＤＴ実験
ＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞、ＹＦＰ＋細胞で光感作剤による光破壊をＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【００７８】
具体的に、ＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞、ＹＦＰ＋細胞で光感作剤による光破壊を調べるために、光感作剤として、ローズベンガル、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ  ＃５５１８）または５−ＡＬＡ（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ａ３７８５）を、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ培地で希釈して、１μＭの濃度で製造した。また、前記１−４．で選別したＧＦＰ＋  Ａ５４９細胞、ＲＦＰ＋  Ａ５４９細胞及びＹＦＰ＋  Ａ５４９細胞を、９６ウェル、ブラック、及びクリアな底プレートでウェル当たり５×１０３の細胞の密度で前培養した。対照群として、ｐｃＤＮＡ  ３．１ベクターを導入したＡ５４９細胞を培養した。その後、前記前培養した細胞に、前記前培養した細胞に、前記製造した光感作剤のそれぞれを処理または無処理し、４時間で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、青色のレーザ光（４８８ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）または黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を５秒間照射または非照射した。照射または非照射後、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、ＭＴＴ分析を行った。
【００７９】
３．腫瘍移植された動物試験
１６Ｆ１０及びＧＦＰ−Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞を、細胞リフターを用いて得て、血清フリーＤＭＥＭに再懸濁した。約２×１０６／１００μＬのＢ１６Ｆ１０及びＧＦＰ−Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞を雌性のＣ５７ＢＬ／６マウスの両脇腹に皮下注射した。１０〜１５日後、平均腫瘍直径が少なくとも０．３ｃｍに達したときに、直径に基づいてマウスを４グループに分けた。その後、このマウスをランダムに４グループに分けた（グループ当たり、ｎ＝５）。対照群の動物には、化学物質の代わりに０．９％生理食塩水のみを与えた。
【００８０】
実験群には、１週間に２回、ＲＢ（３６３ｍｇ／ｍＬ、５３ｎＭ／ｍＬ）を静脈内に投与した後、注射から４時間後、青色光（２ｍｉｎ）を腫瘍部位に照射した。１週間に２回、マウスの体重（ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）及び腫瘍の体積を測定した。３週間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を除去して１０％中性緩衝ホルマリンに固定した。翌日、映像をキャプチャーした。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−  Ｈ４６０細胞についても、類似した過程の実験を行った。約２×１０６／１００μＬの細胞を両脇腹に皮下注射した。
【００８１】
４．Ｃ−ＦＲＥＴ  ＰＤＴ処理されたＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスのポリープスｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージング
散発的な腫瘍（ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｔｕｍｏｕｒｓ）を生成させるために、アゾキシメタン（１０ｍｇ／ｋｇ）を野生型マウスまたはＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスに腹腔内注射した。注射から１週間後、マウスに飲用水として２％ＤＳＳを７日間与え、その後の７日間は、正常に水を与えた。このようなＤＳＳ適用サイクルを、３回繰り返した。マウスを４グループにランダムに分けた（グループ当たり、ｎ＝５）。
【００８２】
野生型及びＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスの各５匹のさらに他のグループは、化学処理を行っていないグループとした。７週間、１週間に２回、各実験群の野生型及びＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスにＲＢを静脈内注射し（５０ｎＭ／ｍＬ、０．７５ｍｌ／ｋｇ）、ＲＢ注射後、４時間後に青色光（２ｍｉｎ）を肛門挿入で照射した。
【００８３】
ポリープ（ｐｏｌｙｐ）の成長を、ポリープの直径を測定することにより、内視鏡でモニタリングした。麻酔後、マウスを大腸内視鏡検査のためにステージに位置させた。曲がりにくい真っ直ぐな望遠鏡を有する内視鏡（ＣｏｌｏＶｉｅｗ；Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｔｚ，Ｉｎｃ．）を用いた。これは、ゼノンランプの光源強度をチューニングするための繊維化チューブ（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｔｕｂｅｓ）及びスイッチを有している（ＸＥＮＯＮ  ｎｏｖａ  １７５；Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｔｚ，Ｉｎｃ．）。コーディネートに基づいて、大腸内視鏡（ｏｕｔｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ、１．９ｍｍ）を肛門に通して入れた。大腸壁のコラプスを防ぎ、鮮明なビューを担保するために、大腸にエアポンプを用いて注意深く吹き込んだ。高解像度の３チップカメラを用いてビデオを得て、これをコンピュータに保存した。フレーム抽出ソフトウェアを用いて、録画されたビデオファイルからキャプチャーして、各映像を得た。映像から腫瘍のサイズを測定した（幅×高さ×２）。大腸内視鏡の距離依存性倍率（ｄｉｓｔａｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、同一のフィールドでルーラーを用いてイメージングすることにより計算した。
【００８４】
ＦＲ−ＰＤＴ前後の腫瘍の大きさを比較するために、よく分離した腫瘍を選択し、腹腔鏡検査で用いられるロコモーションパス（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ  ｐａｔｈ）を各腫瘍について詳細に録画した。腫瘍位置は、取り囲む組織の構造に基づいて決定し、これを以前の映像と比較した。腫瘍像に焦点を合わせた後、本発明者は、腫瘍の大きさを計算するために、同一のフィールドでルーラー像に焦点を合わせた。
【００８５】
５．ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死滅の視角化
生きている動物で細胞死滅を測定するために、動物の体重による容量で、ＦＬＩＶＯＴＭプローブを、１％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳで希釈した。蛍光レッドプローブＦＬＩＶＯＴＭ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ，ＡｂＣｙｓ  ＳＡ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を野生型及びＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスに静脈内注射した。マウスを１時間後に安楽死させた後、大腸組織を分離した。ＦＬＩＶＯＴＭからの蛍光シグナルを共焦点顕微鏡を用いて映像化した。
【００８６】
６．ＰＤＴのために大腸癌細胞にレーザを照射
大腸癌細胞に均一にレーザを照射するために、オーダーメイドのシリンダー型拡散繊維（ｃｕｓｔｏｍ−ｍａｄｅ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｆｉｂｒｅ）を用いた（ＳＯＭＴＡ，Ｌｔｄ．）。光学繊維のコアを介して拡散される光を拡散パートに放射状に照射し（３６０°）、ここで、前記光は多数方式（ｍｕｌｔｉｔｕｄｉｎｏｕｓ  ｍａｎｎｅｒ）で散在された。
【００８７】
シリンダー型拡散繊維は、曲げることができるものであって、ディフューザーの直径及び長さはそれぞれ６００μｍ及び２ｃｍであった。拡散繊維をマウスのコロンに肛門を通して注意して挿入した後、４７３ｎｍの青色光を光学ウェーブガイドを介して照射し、放射状に均一に照射されるようにした。ユニットエリア（ｍＷ／ｍｍ２）における拡散パートの放射電力（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｐｏｗｅｒ）は、２２及び２５ｍＷの間に調整した。繊維伝達損失は、短い長さの繊維を用いた（５ｍ）ため、無視できる水準であった。
【００８８】
７．ペリスタルティックポンプを用いた実験
（１）ｎｏｎ−ＧＦＰとＧＦＰ細胞を１００ｍｍのディッシュにそれぞれ１×１０７の細胞となるようにシーディングした。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ、ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−２０３７５７）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。暗室でＥＰ−１エコノポンプ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、７３１−９００１）に４ｍｍ  ＩＤ×６ｍｍ  ＯＤ×１ｍｍ  Ｗａｌｌものの透明なチューブ（Ｔｙｇｏｎ、Ｅ−３６０３）を連結し、レーザ装備を準備した。
【００８９】
ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、２０ｍｌに培養液で浮遊させ、５０ｍｌのチューブに入れておいた。ポンプを用いて細胞液がチュービングを１ｍｌ／ｍｉｎの速度で通るようにし、８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を照射した。２、４、８、１０回繰り返して移動させたそれぞれの細胞液を、１ｍｌ  １２ウェルプレートにシーディングした。翌日、ダブル染色を行ってｎｏｎ−ＧＦＰとＧＦＰ細胞との間の死滅程度を比較した。
【００９０】
ｎｏｎ−ＧＦＰ細胞とＧＦＰ細胞のそれぞれ０．５×１０７個ずつ（合計１×１０７）を混ぜた。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ、ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−２０３７５７）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。暗室でＥＰ−１エコノポンプ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、７３１−９００１）に４ｍｍ  ＩＤ×６ｍｍ  ＯＤ×１ｍｍ  Ｗａｌｌものの透明なチューブを連結し、レーザ装備を準備した。
【００９１】
ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、２０ｍｌに培養液で浮遊させ、５０ｍｌのチューブに入れておいた。ポンプを用いて細胞液がチュービングを１ｍｌ／ｍｉｎの速度で通るようにし、８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を照射した。２、４、８、１０回繰り返して移動させたそれぞれの細胞液を、１ｍｌ  １２ウェルプレートにシーディングした。翌日、ダブル染色を行ってｎｏｎ−ＧＦＰとＧＦＰ細胞との間の死滅程度を比較した。その結果、ＧＦＰ細胞のみが特異的に死滅することが確認された。
【００９２】
８．ＰＤＴ後の細胞死滅確認試験−Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＰＩダブル染色
ＰＤＴ処理を行った細胞を１２ウェルプレートに５０％以上のコンフルエンスとなるように調節してシーディングした（ウェル当たり１ｍＬ）。ＰＢＳにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈ３５７０）とＰＩストック溶液（１０００Ｘ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ４１７０）をそれぞれ２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ（２Ｘ）となるように希釈させた（光を注意）。この溶液をサンプルに１ｍｌずつ入れ（培養培地と同一の体積で）、３７℃で２０分間培養した。サンプルを取り出して細胞リフターで掻き出した後、１．５ｍｌのチューブに集めて１２００ｒｐｍで３分程度遠心分離し、ＰＢＳで懸濁し、４８（２００μｌ）または９６（１００μｌ）ウェルプレートに移し替えた。光顕微鏡によって細胞を観察し、写真撮影（Ｍｅｒｇｅ写真）した。細胞写真当たりの死んだ細胞数（ＰＩ染色された細胞）／全細胞数＊１００して３枚の平均値を求めることにより、細胞死滅の程度を測定した。
【００９３】
９．ラットカニュレーション（Ｒａｔ  ｃａｎｕｌａｔｉｏｎ）を用いた実験
（１）ＧＦＰ細胞（ＧＦＰ−Ｈ４６０）を１００ｍｍのディッシュの２つにそれぞれ１×１０７となるようにシーディングした。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、２×１０６ｃｅｌｌｓ／３００μｌにＦＢＳフリー培地に浮遊させ、１．５ｍｌのチューブに入れておいた。グルーピングは、下記の表に示しているようにした。
【００９４】
【表１】
0006940185.tif 000002
【００９５】
８週齢のＳＤラットの総１０匹のうち６匹に前記細胞液をＩＶ（尻尾）注射した。５匹のＳＤラットの気管支がある部位を切開して頸動脈、静脈を探し、ｈｅｐａｒｉｎを付けた２７９μｍ  ＩＤ×６０９μｍ  ＯＤ×１５２μｍ  Ｗａｌｌのポリエチレンチュービング（ＢＤ、４２７４０１）を用いてカニュレーションして、血液が流れるようにした。カニュレーションされたチュービング部位に８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を５分間照射した。光照射済みのラットを手抄し、恒温恒湿動物室に一晩間培養した。心臓採血によって１０匹のラットからそれぞれ５ｍｌずつ採血し、そのうち１ｍｌをｈｅｐａｒｉｎが付いたチューブに取り、ＣＢＣテストを依頼した。
【００９６】
ＧＦＰ−癌細胞を注射したラットの血液４ｍｌに２０ｍｌのＲＢＣリーシス緩衝液を入れて注意して混合し、１０分間常温で培養した。３００ｇ、５分間遠心分離して上層液を除去し、１ｍｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液で１０分間固定した。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。
【００９７】
０．１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ／ＰＢＳＴ溶液１ｍｌを入れて１０分間培養して、染色を行った。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。上層液を除去し、観察緩衝液（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍｇ  Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ（ＢＤ、１５１４０−１２２）／１００ｍｌ  ＰＢＳ）５ｍｌを入れ、９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌずつプレーティングした。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００）を用いてＧＦＰ−癌細胞を計数し、光照射の有無による個数を比較した。
【００９８】
（２）ｎｏｎ−ＧＦＰ細胞とＧＦＰ−細胞のそれぞれ０．５×１０７個ずつ（合計１×１０７）を混ぜてシーディングした。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、１×１０６ｃｅｌｌｓ／３００μｌにＦＢＳフリー培地に浮遊させ、１．５ｍｌのチューブに入れておいた。８週齢のＳＤラットの総１０匹のうち、６匹に前記細胞液をＩＶ（尻尾）注射した。
【００９９】
５匹のＳＤラットの気管支がある部位を切開して頸動脈、静脈を探し、ｈｅｐａｒｉｎを付けた２７９μｍ  ＩＤ×６０９μｍ  ＯＤ×１５２μｍ  Ｗａｌｌのポリエチレンチュービングを用いてカニュレーションして、血液が流れるようにした。カニュレーションされたチュービング部位に８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を５分間照射した。光照射済みのラットを手抄し、恒温恒湿動物室で一晩培養した。心臓採血によって１０匹のラットからそれぞれ５ｍｌずつ採血し、そのうち１ｍｌをｈｅｐａｒｉｎが付いたチューブに取り、ＣＢＣテストを依頼した。ＧＦＰ−癌細胞を注射したラットの血液４ｍｌに２０ｍｌのＲＢＣリーシス緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、＃１５８９０４）を入れて注意して混合し、１０分間常温で培養した。３００ｇ、５分間遠心分離して上層液を除去し、１ｍｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液で１０分間固定した。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。
【０１００】
０．１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ／ＰＢＳＴ溶液１ｍｌを入れて１０分間培養して、染色を行った。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。上層液を除去し、観察緩衝液（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍｇ  Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ／１００ｍｌ  ＰＢＳ）５ｍｌを入れ、９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌずつプレーティングした。蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ−癌細胞を計数し、光照射の有無による個数を比較した。その結果、ＧＦＰ細胞のみが特異的に死滅することが確認された。
【０１０１】
１０．人工皮膚を用いた実験
実際の皮膚環境の条件を適用してＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞に光感作剤を処理し、光を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【０１０２】
具体的に、前記２−４．に記載された方法と同一の方法で、ローズベンガル及びエチルエチオプルプリンすずを１μＭの濃度で製造した。その後、前記１−３．で選別したＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞に前記エチルエチオプルプリンすずを処理し、前記１−４．で選別したＧＦＰ＋  ４Ｔ１細胞に前記ローズベンガルを処理した後、４時間で培養し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。その後、図１６に示している模式図のように、人工皮膚（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ：ＡＳＴ、厚さ１ｍｍ）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｍｕｃｏｇｒａｆｔ，Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）を光源（ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ）と細胞との間に置いて実際の皮膚環境の条件を設けた後、ＧＦＰ＋細胞の場合、青色のレーザ光（４７３ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を、ＲＦＰ＋細胞の場合、黄色のレーザ光（５８０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）を５秒間照射した。照射してから２時間後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、前記実験例２−２．に記載された方法と同一の方法で、ＭＴＴ分析を行った。前記実験は、ＧＦＰ、ＲＦＰの発現の強さと光の強さにより絶対数値の比較が困難であるため、人工皮膚が存在しない場合と人工皮膚が存在する場合とに分けて細胞死滅効果の減少値を比較した。
【０１０３】
１１．ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞とローズベンガルを用いて、光照射後、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛍光強度測定実験
青色光の照射後、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を、ＲＢの存在または不存在の条件で測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。
【０１０４】
前記１−１．に記載された方法で製造したＧＦＰ−及びＧＦＰ＋  ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株１×１０６個を、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で７５ｃｍ２の細胞培養ティシュィで培養した。１２時間後、前記細胞株の培養培地をＦＢＳがないＲＰＭＩ−１６４０培地に交替し、多様な濃度（０μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ）のＲＢを添加した。ＲＢが細胞内に蓄積されるように４時間で培養した後、細胞を遠心分離して得た。各細胞グループのペレットを１ｍｌ  ＰＢＳに懸濁した。その後、前記細胞にブルーレーザ光（４７３ｎｍ；放射線量比率＝８０ｍＷ／ｃｍ２）を照射し、分光蛍光測定器（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ，ＪＡＳＣＯ  Ｉｎｃ．）を用いて各細胞グループの発光スペクトルを測定した。各グループの測定は５回繰り返した。ＦＲＥＴ効率は、次の数式によって計算された：
Ｅ＝１−［Ｆ（ＤＡ）／Ｆ（Ｄ）］、
Ｅ：ＦＲＥＴ効率、
Ｆ（ＤＡ）：ＲＢ存在時のＧＦＰの蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、及び
Ｆ（Ｄ）：ＲＢ非存在時のＧＦＰの蛍光強度。
【０１０５】
＜実験結果＞
１．ｃＦＲＥＴ基盤光力学治療
ＲＢの最大吸光度及びショルダー吸光度のスペクトルは、それぞれ５４９ｎｍ及び５１０ｎｍである。ｅＧＦＰの最大吸光度が４８９ｎｍであり、発光スペクトルの頂点が５０８ｎｍであるため、ＲＢのショルダー吸光度の範囲は、ブルーレーザ光（Ｌａｓｅｒ−ｓｔａｒ  ｃｏ，．Ｌｔｄ、ＬＳＢ４７３−８０−ｄｏｔ）が照射されたｅＧＦＰの発光波長をカバーする（図１Ａ）。従って、ＦＲＥＴ現象がＲＢ及びｅＧＦＰの間で可能である。
【０１０６】
本発明による、生きている細胞の蛍光を用いたＦＲＥＴ技術を、ｃＦＲＥＴと命名した。ＲＢがｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−  ４Ｔ１細胞を処理するために用いられており、ブルーレーザ光（４７３ｎｍ）を照射したときに選択的に細胞が死滅することが示された（図１Ｂ）。
【０１０７】
これは、ＲＢが、ＧＦＰ＋細胞においてＧＦＰから放出される、５１０ｎｍの光によってさらに比較的容易に活性化し、活性化したＲＢが、隣り合う酸素の豊富な環境から反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成させることを助けることができるためであると予想される（図１Ｃ）。しかし、ＧＦＰ−細胞は、単に４７３ｎｍの光に対してしか反応できないため、活性化の程度は不十分である。
【０１０８】
２．ｅＧＦＰ＋細胞に対するｃＦＲＥＴで誘導された選択的な細胞毒性
略６０％のｅＧＦＰ＋細胞は、ＲＢ処理後、４７３ｎｍのレーザ光に露出したときに選択的に死滅したのに対して、ｅＧＦＰ−細胞の場合、単に２０％程度のみが類似の条件で死滅した（図２Ａ）。２０％の細胞が死滅した理由は、持続的なレーザ光の照射によって生成された一重項酸素のモイエティ及び誘導された熱ストレスのためであると見られる。
【０１０９】
２つのタイプの癌細胞（ｅＧＦＰ−及びｅＧＦＰ＋  ４Ｔ１細胞）を準備して、１：１の割合でランダムに混合した。レーザ光（４７３ｎｍ）に６時間露出した後、選択的な細胞毒性はｅＧＦＰ＋細胞から誘導された（図２Ｂ）。
【０１１０】
ＭＴＴ分析の結果、レーザ照射後、ｅＧＦＰ−細胞に比べてｅＧＦＰ＋細胞において細胞毒性が顕著に高く示された（図２Ｂ）。光敏感剤の濃度及び露出時間によって死滅細胞の比が多様に示された。
【０１１１】
低い水準のｅＧＦＰ−細胞死滅及び高い水準のｅＧＦＰ＋細胞死滅が同一の割合で観察された（図２Ｃ）。さらに高い容量のＲＢ及びさらに長い時間の露出を与えた場合、ｅＧＦＰ−細胞と比較したとき、ｅＧＦＰ＋細胞の細胞死滅の程度がさらに高くなった。しかし、極度に高い濃度のＲＢを処理し、露出時間も極度に長くしたときは、ｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞において類似した水準の細胞毒性が示された（図２Ｃ）。
【０１１２】
また、ＬＤＨ分析を用いて得られた実験結果も類似に示されたが、これは、異なる種類の癌細胞について得られた細胞毒性の程度は異なるということを示唆する。
【０１１３】
４種類のｅＧＦＰ＋細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０）について、ＲＢ処置による効果を同一の方法で測定した。たとえ、細胞毒性の程度は環境条件及び種に依存的であることが示されたとしても、ｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞に示された傾向性はかなり類似していた（図２Ｄ）。類似に、クロリンｅ６（Ｃｅ６）及び６５０ｎｍの赤色のレーザ光を用いた実験において、ｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞に対する細胞毒性は差がなかった（図５を参照）。また、ｃＦＲＥＴ−誘導性細胞毒性は、ＧＦＰトランスフェクションの程度が増加するにつれて増加した（図２Ｅ及び２Ｆ）。
【０１１４】
３．ｅＧＦＰ＋細胞移植動物におけるｃＦＲＥＴの腫瘍成長抑制効果
Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０細胞株のｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−サブラインの混合物をマウスの脇腹に移植した。１０〜１５日間で腫瘍を成長させた後、ブルーレーザ光（４７３ｎｍ）を各マウスの皮膚フラップ内部の腫瘍に繰り返して照射した（図３Ａ）。照射の２回目のラウンド後、選択的なｅＧＦＰ＋細胞死滅が観察された。ＧＦＰシグナルは、初期の腫瘍領域に比べて照射された領域で比較的顕著に減少することが示された。
【０１１５】
略８０％のｅＧＦＰ＋細胞が除去されており、ｅＧＦＰ＋細胞による暗い領域が拡大したことが分かる。類似の現象が、移植された癌細胞のタイプにかかわらず、観察された（図３Ｂ及び３Ｃ）。
【０１１６】
その後、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−  Ｂ１６Ｆ１０細胞を分離して注射し、腫瘍の成長をモニタリングした。４７３ｎｍのレーザ光を照射した場合、光敏感剤処理を行わなくても、ＧＦＰ＋細胞の場合、腫瘍の成長が若干阻害されることが示されており、光敏感剤処理及び４７３ｎｍのレーザ光の照射を共に行った場合、腫瘍の成長が顕著に減少することが示された。しかし、このような阻害は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによって、統計学的に有意味な水準であることは示されていない。
【０１１７】
ＲＢ処理したＧＦＰ＋細胞の場合、４７３ｎｍのレーザ光を照射した場合に、顕著な腫瘍阻害効果を奏した（図３Ｄ及び３Ｅ）。ＧＦＰ＋細胞が移植されたマウスの腫瘍において、顕著な組織損傷及び細胞死滅がさらに観察された（図３Ｆ）。Ｂａｘ及びｐ５３のような細胞死滅マーカーの発現水準が細胞死滅部位で測定され、ｃＦＲＥＴ  ＰＤＴの後に顕著な損傷が観察された。ＴＮＦ−αを用いた免疫組織化学試験の結果は、細胞死滅がほとんど怪死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）に起因したものであることを示す。
【０１１８】
４．大腸腫瘍が発達する間のＬｇｒ５＋細胞の選択的標的化：治療効果
Ｌｇｒ５＋大腸幹細胞は、ＡＯＭ、ＤＳＳの後、管腔の表面に移動し；Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインマウスを用いた実験において、ｅＧＦＰ＋−Ｌｇｒ５＋大腸幹細胞の移動が観察された。ＢＡＢＢ溶液できれいにした組織を観察した結果、多くのｅＧＦＰ＋−Ｌｇｒ５＋細胞がクリプトの管腔の表面に位置し、ポリープに含浸（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）されていることが示された（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０１１９】
マウスの大腸上皮に均一に光を照射するために、放射状の光の放出が可能な光学繊維を製造した（図４Ｃ）。シリンダー型拡散繊維（直径：６００μｍ）を肛門を通してマウスの大腸中に注意して挿入し；４７３ｎｍのブルーレーザ光をレーザの放出に用いた（図４Ｄ）。
【０１２０】
ＲＢ処理及びＰＤＴ基盤レーザの放出後、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインマウスにおいて、野生型マウスに比べてポリープの成長が阻害されることが示されており（図４Ｅ及び４Ｆ）；ポリープの数は、ｃＦＲＥＴ治療時に減少した。
【０１２１】
また、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインマウスにＲＢ処理及び緑色のレーザ光の照射後、細胞死滅の未処理群及びレーザのみを照射した群において、十分に強力でない細胞死滅のシグナルが観察されたのに対して、周辺の低い−ＧＦＰ−発現領域と比較して、ｅＧＦＰ＋−Ｌｇｒ５＋細胞の同一の細胞領域部位において、細胞死滅のシグナルがより強力に示された。
【０１２２】
５−１．光照射時間によるＲＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
図９に示しているように、ＲＦＰの場合、励起スペクトルの頂点は５５５ｎｍであり、発光スペクトルの頂点は５８４ｎｍである。光感作剤としてのエチルエチオプルプリンすず（Ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）は、６４０〜６６０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。一方、エチルエチオプルプリンすずの６４０〜６６０ｎｍの吸光領域におけるＲＦＰ発光収得率（ｙｉｅｌｄ）は、５０％程度を有する。従って、図１０の模式図のように、ＦＲＥＴを用いた光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができるのかを確認するために、ＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、ＲＦＰが光反応をすることのできる波長の光を時間別に照射した後、ＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）分析法及びＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。
【０１２３】
その結果、ＲＦＰ＋細胞の場合、黄色のレーザ光によってＲＦＰが光反応し、これにより、活性化したエチルエチオプルプリンすずが細胞死滅を誘導することを確認した。また、ＲＦＰ＋細胞の場合、ＲＦＰ−細胞に比べて、細胞死滅が、光照射してから２秒が経過した後から顕著に増加した（図１１及び図１２）。
【０１２４】
５−２．エチルエチオプルプリンすずの処理濃度によるＲＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
ＦＲＥＴを用いた光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができるのかを確認するために、ＲＦＰ＋  ４Ｔ１細胞にエチルエチオプルプリンすずを濃度別に処理し、ＲＦＰが光反応をすることのできる波長の光を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。
【０１２５】
その結果、ＲＦＰ＋細胞の場合、エチルエチオプルプリンすずの処理濃度に依存的に細胞死滅が顕著に増加することを確認した（図１３）。
【０１２６】
従って、前記結果により、光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができ、光力学治療のために少なくとも２秒の光照射が行わなければならないことを確認した。
【０１２７】
６．光照射によるＲＦＰ＋細胞の細胞毒性の確認
赤色光、青色光または黄色光の照射後、ＲＦＰ＋またはＧＦＰ＋細胞の細胞毒性を、光感作剤として、Ｃｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎｅ（ｅ６））、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ  ｂｅｎｇａｌ）またはエチルエチオプルプリンすずの存在下で、ＭＴＴ分析によって測定した。
【０１２８】
その結果、光感作剤としてＣｅ６を処理し、赤色のレーザ光を照射した場合、対照群、ＲＦＰ＋、ＧＦＰ＋細胞のいずれも毒性が示された。これに対して、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすずを処理し、黄色のレーザ光を照射した場合、ＲＦＰ＋細胞のみにおいて細胞毒性が示され、対照群及びＧＦＰ＋細胞においては細胞毒性が示されないことを確認した。また、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすずを処理し、黄色のレーザ光を照射したＲＦＰ＋細胞の場合、光感作剤としてローズベンガルを処理し、青色のレーザ光を照射したＧＦＰ＋細胞よりも、細胞毒性の程度がさらに高くなることを確認した（図１４）。
【０１２９】
７．光照射によるＧＦＰ＋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛍光強度の確認
青色光の照射後、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を、ＲＢの存在または不存在の条件で測定した。
【０１３０】
その結果、ＲＢの濃度が高くなるほど、ＧＦＰの放出ピーク（ｐｅａｋ）である５０８ｎｍにおける放出強度が減少し、前記減少したエネルギーがＲＢの放出ピークである５８０〜５９０ｎｍにおいて増加することが示された。従って、前記結果により、ＦＲＥＴ原理によってＧＦＰとＲＢによって細胞を選択的に死滅させることができることを確認した（図１５）。
【０１３１】
８．皮膚環境の条件下における光照射によるＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
ＲＦＰが光反応をすることのできる波長は、ＧＦＰが光反応をすることのできる波長よりも長波長の領域にため、生きている組織に対する浸透深さの差によって細胞死滅に影響があるのかを調べるために、実際の皮膚環境の条件を適用してＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞に光感作剤を処理し、光を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。
【０１３２】
その結果、人工皮膚が存在しない場合だけでなく、人工皮膚が存在する場合も、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすずを処理し、黄色のレーザ光を照射したＲＦＰ＋細胞の場合、光感作剤としてローズベンガルを処理し、青色のレーザ光を照射したＧＦＰ＋細胞よりも、長波長領域の光が照射されてより深く細胞に浸透可能であることから、細胞死滅の程度がさらに高くなることを確認した（図１７）。
【０１３３】
従って、前記結果により、図１８の模式図のように、ＧＦＰと同様に、ＲＦＰが導入された癌細胞の場合も、黄色光の照射によって、正常細胞には影響を及ぼすことがないと共に、ＲＦＰが導入された癌細胞のみを選択的に死滅するため、光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができることを確認した。また、前記ＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いた光力学治療の場合、ＧＦＰ及びローズベンガルを用いた光力学治療よりも優れた効果を奏することができることを確認した。
【０１３４】
９．光感作剤によるＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞及びＹＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
ＦＲＥＴを用いた光力学治療のために、ＲＢ及びエチルエチオプルプリンすず以外に他の光感作剤を適用することができるのか、ＧＦＰ及びＲＦＰ以外に蛍光タンパク質を適用することができるのかを確認するために、図１９のように、ＧＦＰを発現するＧＦＰ＋  Ａ５４９細胞、ＲＦＰを発現するＲＦＰ＋  Ａ５４９細胞及びＹＦＰを発現するＹＦＰ＋  Ａ５４９細胞を作製し、前記細胞にＲＢ、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、青色のレーザ光（４８８ｎｍ）または黄色のレーザ光（５７０ｎｍ）を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。
【０１３５】
その結果、光感作剤としてＲＢを処理し、青色のレーザ光を照射した場合、ＧＦＰ＋細胞よりもＹＦＰ＋細胞において細胞死滅効果に優れていることを確認した（図２０）。これは、ＹＦＰの放出ピークが５４０ｎｍ程度であって、ＲＢの吸収波長ピークにさらに近接することを示唆する。
【０１３６】
また、光感作剤としてヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、黄色のレーザ光を照射した場合、ＹＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞において有意的な細胞死滅効果が奏され、ＲＦＰ＋細胞の場合、顕著に優れた細胞死滅効果が奏されることを確認した（図２１及び図２２）。
【０１３７】
従って、前記結果から、ＹＦＰが導入された癌細胞の場合も、光感作剤を処理し、光照射によって、正常細胞には影響を及ぼさないと共に、ＹＦＰが導入された癌細胞のみを選択的に死滅するため、光力学治療のためにＹＦＰを用いることができ、ＹＦＰを光力学治療に用いる場合、光感作剤として、ＲＢ、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを適用することができることを確認した。また、ＲＦＰを光力学治療に用いる場合、光感作剤として、エチルエチオプルプリンすずだけでなく、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡも適用することができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を用いた光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法に関し、本発明の蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を癌疾患の治療に有用に用いることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006940185.tif 000009
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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