(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｂｍｉ１タンパク質またはＢｍｉ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸；および
（ｉｉ）ｄＮＰ６３ａタンパク質またはｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸；
を含む、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
【請求項２】
前記尿細胞は、尿に由来した体細胞である、請求項１に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
【請求項３】
前記組成物は、Ｂｍｉ１タンパク質およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挿入された発現ベクターを含む、請求項１に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
【請求項４】
前記組成物は、Ｂｍｉ１タンパク質およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が導入されたウイルスを含む、請求項１に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
【請求項５】
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階；
（ｂ）前記培養した尿細胞にＢｍｉ１タンパク質およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を導入する段階；および
（ｃ）前記核酸配列が導入された尿細胞をケラチノサイト幹細胞培養条件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階；
（ｄ）前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階；
を含む、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法。
【請求項６】
前記段階（ｂ）でＢｍｉ１タンパク質およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸の導入は、前記核酸配列が挿入されたレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）を前記尿細胞に感染させたものである、請求項５に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法。
【請求項７】
前記段階（ｃ）で前記培養条件は、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、Ｔ３、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地で培養するものである、請求項５に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法。
【請求項８】
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階；
（ｂ）前記分離培養された尿細胞にＢｍｉ１タンパク質およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を導入する段階；および
（ｃ）前記核酸配列が導入された尿細胞をケラチノサイト幹細胞培養条件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階；
（ｄ）前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階；および
（ｅ）前記選別された逆分化ケラチノサイト幹細胞を無血清培地で培養してコンデイションド培地またはその培養液を得る段階を含む、尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
【請求項９】
前記段階（ｂ）でＢｍｉ１タンパク質およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸の導入は、前記核酸が挿入されたレトロウイルスを前記尿細胞に感染させたものである、請求項８に記載の尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
【請求項１０】
前記段階（ｃ）で前記培養条件は、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、Ｔ３、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地で培養するものである、請求項８に記載の尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
【請求項１１】
前記コンデイションド培地は、逆分化ケラチノサイト幹細胞から生成されたＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびｂＦＧＦを含むものである、請求項８に記載の尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への直接逆分化方法および逆分化したケラチノサイト幹細胞を利用した皮膚再生促進用組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、身体内での特徴的な条件および環境が与えられたり、自体内での必要に応じて程度に応じた無限自己増殖能力および身体内で必要な特定の細胞および組織への分化能を有している細胞を意味する。幹細胞は、その種類を３個に分類しており、その種類としては、初期胚芽から分離した胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、胚芽期の遠視生殖細胞から分離した胚芽生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ、ＥＧ細胞）、および成体の骨髄から分離した多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＡＰＣ細胞）がある。
【０００３】
幹細胞は、特化した機能を有する細胞に発達する潜在力を有しているので、各種臓器の機能回復のための細胞治療剤としての研究対象となっており、最近には、成形と美容に至るまでその活用範囲が拡大されている傾向にある。
【０００４】
成体幹細胞の体内での役割は、大きく、二つに要約することができ、第一は、幹細胞自体が身体で損傷した組織と細胞に分化してさらに再生させる役割であり、第二は、一生の間持続的に成長因子およびサイトカインなどのタンパク質を分泌して近隣細胞の成長および再生を助ける役割を行う。
【０００５】
ケラチノサイト幹細胞とは、皮膚内深いところに位置する一層からなる組織の一部であって、皮膚再生に最も核心的な役割を行う。上層の皮膚がダメージ（ｄａｍａｇｅ）を受けたり老化して剥けていく場合、ケラチノサイト幹細胞から一部の細胞が分化して新しい皮膚細胞を構成するようにすることが主な役割の一つであり、したがって、火傷や深い傷によって発生する皮膚組織の再生の困難は、内部のケラチノサイト幹細胞まで破壊される場合に発生する。ケラチノサイト幹細胞は、成体幹細胞の一種類であって、採取のために苦痛を伴う侵襲的医療行為が必須であり、これを通じて得ることができる細胞の量も、治療素材を収集するには量が極微であると言える。
【０００６】
直接逆分化（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）方式は、体細胞を所望の他のタイプの細胞に転換できる技術である。日本の山中教授の逆分化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）とは異なって、万能性幹細胞状態を経ないため、少ない時間と高い効率を示す同時に、万能性幹細胞の腫瘍発生の危険や再分化費用などを解決することができる。
【０００７】
幹細胞技術を利用した抗炎および傷治癒の効果を有する幹細胞培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｄｅｉｕｍ）を利用した医薬品素材の開発技術は、成功の可能性が希薄な疾患治療剤の開発の代わりに、さらに可能性が高く、展望が確実な新しい市場の開拓と共に、新しいバイオ産業のモデルを提示するという観点から、その意味が大きいと言える。
【０００８】
ケラチノサイト幹細胞の場合、単に細胞代替の役割だけでなく、皮膚再生において重要な役割をする各種成長因子およびサイトカインなどのタンパク質を分泌する役割も有している。したがって、皮膚再生治療剤材を開発するにあたって皮膚再生のスペシャリスト(ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ)であるケラチノサイト幹細胞を利用するということは、論理的、科学的にきわめて当然の接近方式である。
【０００９】
これより、本発明者らは、逆分化因子Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａを導入して過発現させた尿細胞をケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞を誘導する方法を探した。逆分化ケラチノサイト幹細胞を利用してコンデイションド培地を生産して皮膚再生効能を評価し、それに対する主要因者を選別して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞を利用したコンデイションド培地の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞を利用して製造されたコンデイションド培地を有効成分とする皮膚再生および皮膚傷治癒用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、（ｉ）Ｂｍｉ１タンパク質または、Ｂｍｉ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸；および（ｉｉ）ｄＮＰ６３ａタンパク質またはｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を含む、尿細胞から逆分化ケラチノサイト幹細胞を誘導する組成物を提供する。
【００１５】
本発明において用語「逆分化ケラチノサイト幹細胞」とは、角質形成細胞などの細胞に分化され得る能力を有する幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）であり、体細胞の逆分化によって起源した皮膚幹細胞である。本発明の明細書において逆分化ケラチノサイト幹細胞は、ケラチノサイト幹細胞と記述されることもある。
【００１６】
本発明において用語「尿細胞（Ｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ；ＵＣｓ）」は、尿で何らの不便と苦痛なしにいつでも容易に繰り返し得ることができる体細胞と知られている。
【００１７】
本発明者らは、尿細胞において逆分化因子であるＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａを過発現させる場合、すでに分化した細胞タイプである尿細胞が分化能を有するケラチノサイト幹細胞に逆分化（ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することを発見した。
【００１８】
前記用語「逆分化因子Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａ」は、２００６年にＹａｍａｎａｋａ教授チームによって導入された概念である逆分化（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）から始まった。成体のすべての組織は、正常発達過程を経て分化しない状態で次第に分化して、各機能が専門化した細胞に変化する。そのうち受精卵の細胞は、全能性（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有しており、以後、発達段階が進行されるに伴い、胚盤胞になれば、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）と外側細胞とに区分が可能であるが、この際の内部細胞塊細胞が胚芽体細胞と生殖細胞に発生することができ、これを万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）と呼ぶ。この胚芽幹細胞は、万能性特有の遺伝子発現様相を示すが、その代表的な例がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８などである。逆分化は、体細胞にこのような特異的な遺伝子発現を誘導して胚芽幹細胞および成体幹細胞など未分化細胞と類似した性質に戻す技術といえる。Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａは、それによる一連の研究で使用されてきた多様な因子のうち二つであって、Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒを利用して細胞内に遺伝子を導入して過発現させる技術で本発明者が利用した。
【００１９】
本発明の組成物に使用されるＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａは、ヒトと馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、犬などの動物由来のすべてのＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａを含み、好ましくはヒトＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａである。また、ケラチノサイト幹細胞への逆分化に使用される本発明のＢｍｉ１タンパク質は、その野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質の変異体を含む。
【００２０】
Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質の変異体とは、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａの天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質を意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同じ生物学的活性を示す機能的等価物や必要に応じてタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体でありうる。物理、化学的環境に対する構造的安定性が増大したり生理学的活性が増大した変異体である。
【００２１】
前記Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸は、野生型または上記したような変異体形態のＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸であって、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせにより変移され得、天然から分離したり化学的合成法を利用して製造することができる。
【００２２】
前記Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、単鎖または二重鎖であり得、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子でありうる。
【００２３】
一つの好ましい様態において、本発明において尿細胞をケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する組成物は、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含むＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質を発現するベクターを含むことができる。
【００２４】
本発明において用語「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構築物をいう。
【００２５】
前記用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、一般的機能を行うように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野においてよく知られた遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断および連結は、当該技術分野において一般的に知られた酵素などを使用する。
【００２６】
本発明のベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素の他にも膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造され得る。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性でありうる。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製起源を含む。ベクターは、自己複製したり宿主ＤＮＡに統合され得る。
【００２７】
ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクターなどを含む。
好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えばＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ  ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）などに由来したベクターを含むが、これに制限されない。本発明の具体的な実施例では、ＭＭＬＶ−基盤−ウイルスベクター（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）としてｐＭＸｓベクターを利用した。
【００２８】
Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、当該分野の公知方法、例えばベクター形態のネイキッドＤＮＡで細胞内に伝達したり（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０：Ｗｏｌｆｆｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０３：１２４９−５９，１９９２）、リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、カチオン性高分子（Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）等を利用して細胞内に伝達することができる。リポソームは、遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡやＤＯＴＡＰなどのカチオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であって、カチオン性のリポソームとアニオン性の核酸が一定比率で混合すると、核酸−リポソーム複合体が形成される。
【００２９】
さらに他の好ましい様態において、本発明において尿細胞をケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する組成物は、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を含むＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質を発現するウイルスを含むことができる。
【００３０】
本発明において用語「ウイルス」とは、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含むウイルスベクターをパッケージング細胞で形質転換および感染させて製作した、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａを発現するウイルスを意味する。
【００３１】
本発明のＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質を発現するウイルスの製造に使用され得るウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどを含み、これに制限されない。好ましくは、レトロウイルスである。
【００３２】
本発明の具体的な実施例では、ｐＭＸｓベクターにＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードする核酸配列を挿入して製造したベクター（ｐＭＸｓ−Ｂｍｉ１およびｐＭＸｓ−ｄＮＰ６３ａ）を広範囲な哺乳類宿主細胞に感染が可能な高力価ウイルスを生成するパッケージング細胞である２９３ｇｐｇ細胞に形質転換させて、Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質を発現させるウイルスを製造して、尿細胞を感染させた。
【００３３】
本発明は、尿細胞にＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入する段階を含む尿細胞をケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する方法を提供する。
【００３４】
より具体的に、
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階；
（ｂ）前記培養した尿細胞にＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入する段階；
（ｃ）前記核酸配列が導入された尿細胞を培養槽件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階；および
（ｄ）前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階；を含むことができる。
【００３５】
前記段階（ａ）で尿細胞の培養は、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）およびｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）含有培地で行われ得る。
【００３６】
本発明において使用された用語「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で細胞の成長および生存を支持できるようにする培地を意味し、尿細胞および逆分化ケラチノサイト幹細胞の誘導および培養に適切な当該分野において使用される通常の培地を全て含む。細胞の種類によって培地および培養条件を選択することができる。培養に使用される培地は、好ましくは細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＣＭＭ）であって、一般的に炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭＥＭ（αＭｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、およびＩＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）などがあるが、これに制限されない。また、前記培地は、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）またはゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）などの抗生剤を含むことができる。
【００３７】
本発明の具体的な実施例において、尿から分離した細胞をＦＢＳ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含有する基本培地で培養することによって収得することができ、具体的にＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭおよびＲＥＧＭ（Ｒｅｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地にｂＦＧＦおよびＥＧＦを添加して培養することによって収得することができる。本発明のより具体的に、上記ハイグルコースＤＭＥＭおよびＲＥＧＭ培地は、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンをさらに含むことができる。
【００３８】
前記段階（ｃ）でＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸が導入された尿細胞をＦＢＳおよびＥＧＦを含有する基本培地で培養することによって、ケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導することができ、より具体的に、前記ＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地にインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、Ｔ３、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）およびＥＧＦを添加して培養することによって、ケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導することができる。本発明の好ましい実施例において、上記ハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地は、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンをさらに含むことができる。
【００３９】
前記段階（ｄ）で選別された逆分化ケラチノサイト幹細胞は、ＦＢＳおよびＥＧＦを含有する基本培地で培養することによって収得することができ、具体的にＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地にインスリン、ヒドロコルチゾン、コレラトキシン、Ｔ３、アスコルビン酸およびＥＧＦを添加して培養することによって収得することができる。本発明の具体的な実施例において、上記ハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ  ３：１培地は、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンとインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、Ｔ３、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）およびＥＧＦ溶液をさらに含むことができる。
【００４０】
また、本発明は、
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階；
（ｂ）前記培養した尿細胞にＢｍｉ１およびｄＮＰ６３ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入する段階；および
（ｃ）前記核酸配列が導入された尿細胞を培養槽件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階；
（ｄ）前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階；および
（ｅ）前記選別された逆分化ケラチノサイト幹細胞を無血清培地で培養して、コンデイションド培地またはその培養液を得る段階を含む、尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法を提供する。
【００４１】
前記段階（ａ）〜（ｄ）と関連した内容は、上述した内容と同一であるので省略する。
【００４２】
本発明において用語「コンデイションド培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」とは、細胞を液体懸濁培養して細胞分裂最盛期である対数増殖期に到達したとき、分裂細胞を遠心分離または濾過して除去し、培養液だけを採取してこれを培養基質に混合した培地をいう。これは、分裂中の細胞から培地内で抽出されて出る未知の成長要素（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を利用するものであって、低密度の細胞プレーティングや原形質体の培養に多く利用される。本発明の一実施例において、前記コンデイションド培地または培地から収得した培養液が利用された。
【００４３】
前記段階（ｅ）で無血清培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であり得、具体的に前記ＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地にインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、Ｔ３、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）およびＥＧＦを添加したものでありうる。より具体的な実施例において、上記ハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地は、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンをさらに含むことができる。前記コンデイションド培地は、前記無血清培地で逆分化ケラチノサイト幹細胞を１〜５日間培養して製造され得、より具体的には、３日間培養して製造され得る。
【００４４】
前記方法によって製造されたコンデイションド培地またはその培養液は、逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来した成長因子などの物質が含まれている組成物であり得、より具体的に、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＡＮＧ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ ＩＩＩ、ＣＸＣＬ１６、ＤＰＰＩＶ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ／Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩＩＩ、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦＢＰ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＰＴＸ３（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ３）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＰＩＧＦ（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ５／Ｍａｓｐｉｎ、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１／ＰＡＩ−１、ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、ｕＰＡ（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）およびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）から選択される一つ以上の物質を含むことができる。しかしながら、これに制限されない。より好ましくは、前記コンデイションド培地に含まれた物質のうち皮膚再生促進成長因子であるｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）およびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含むことができる。
【００４５】
本発明によって製造された逆分化ケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液は、皮膚再生効果がある。本発明の具体的な実施例において、皮膚由来繊維細胞またはマウスの皮膚に人為的な傷（ｗｏｕｎｄ）を加えた後、本発明のコンデイションド培地を処理した結果、繊維細胞移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）される程度がさらに高いので、傷治癒（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）効果に優れていることを確認することができた（図４Ｂ〜Ｃおよび図５）。
【００４６】
なお、本発明は、前記製造されたコンデイションド培地またはその培養液を有効成分として含む皮膚再生促進用化粧料組成物を提供する。
【００４７】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としての逆分化ケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液以外に化粧品組成物に通常的に利用される成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常の補助剤、そして担体を含む。また、前記化粧料組成物は、その効果を増進させるために皮膚吸収促進物質をさらに含むことができる。
【００４８】
本発明の化粧料組成物は、当業界において通常的に製造されるいかなる剤形でも製造され得、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジングオイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーションおよびスプレーなどに剤形化され得るが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造され得る。本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用され得る。
【００４９】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが利用され得、特にスプレーである場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール  オイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが利用され得る。本発明の剤形が界面−活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミド  エーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用され得る。
【００５０】
また、本発明は、前記製造されたコンデイションド培地またはその培養液を有効成分として含む皮膚傷治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００５１】
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００５２】
本発明の薬剤学的組成物は、マウス、ラット、家畜、ヒトなどの哺乳動物に経口または非経口などの多様な経路で投与することができ、例えば経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与することができる。好ましくは、非経口投与のうち経皮投与、より好ましくは塗布による局部投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）方式で適用される。
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。本発明の薬剤学的組成物の投与量は、経口型剤形である場合、成人基準として０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回〜数回投与することができ、外用剤である場合には、成人基準として１日当たり１．０〜３．０ｍｌの量で１日１〜５回塗布して１ヶ月以上継続した方が良い。ただし、前記投与量は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することによって、単位用量の形態で製造されたりまたは多用量容器内に内入させて製造され得る。この際、剤形は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの外用剤、坐剤および滅菌注射溶液などをはじめとして薬剤学的製剤に適合したいかなる形態でも使用することができ、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００５５】
本発明は、何らの不便と苦痛なしにいつでも容易に繰り返して得ることができる体細胞と知られている尿細胞を利用して個人オーダーメード型逆分化ケラチノサイト幹細胞の大量生産が可能である。なお、前記逆分化ケラチノサイト幹細胞を利用して製造された多様なヒト成長因子が含まれたコンデイションド培地を製造することによって、皮膚傷治癒と皮膚再生の分野に拡大可能な難病分野および細胞治療剤の生産技法にも適用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１Ａは、尿細胞にＲｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍを利用して逆分化因子Ｂｍｉ１（Ｂ）／ｄＮＰ６３ａ（Ｎ）／Ｋｌｆ４（Ｋ）を組み合わせ別（ＢＮＫ、ＢＮ、ＢＫ、ＮＫ、Ｂ、ＮおよびＫ）に導入して逆分化ケラチノサイト幹細胞を誘導した後、ケラチノサイト幹細胞マーカーであるＫＲＴ１５／ＩＴＧＡ６  ｃｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅしたコロニー数を確認したものである。  図１Ｂは、尿細胞で前記逆分化因子の組み合わせの発現が起きているかを確認するためにＲＴ−ＰＣＲ実験を行った結果である。  図１Ｃは、男性または女性由来尿細胞を利用して逆分化ケラチノサイト幹細胞を誘導した結果を示したものである。
【図２】図２Ａは、ｃｏｌｏｎｙ−ｐｉｃｋｉｎｇ方法を利用してケラチノサイト幹細胞マーカーであるＫＲＴ１５／ＩＴＧＡ６  ｃｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅしたコロニーを選別して拡張培養して逆分化ケラチノサイト幹細胞株ＢＮ２８−２、ＢＮ２８−５、ＢＮ２８−６を確立した。  図２Ｂは、確立されたケラチノサイト幹細胞株でケラチノサイト幹細胞マーカーであるＡＮＧＰＴＬ２、ＣＤ２００、ＩＴＧＡ６、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１４およびＧＪＢ２発現を確認することによってケラチノサイト幹細胞であることを確認した。  図２Ｃおよび図２Ｄは、Ｂｍｉ１（Ｂ）／ｄＮＰ６３ａ（Ｎ）／Ｋｌｆ４（Ｋ）を組み合わせ別（ＢＮＫ、ＢＮ、ＮＫおよびＮ）に誘導された逆分化ケラチノサイト幹細胞の安定性を確認した結果である。  図２Ｅは、Ｂｍｉ１（Ｂ）／ｄＮＰ６３ａ（Ｎ）／Ｋｌｆ４（Ｋ）を組み合わせ別（ＢＮＫおよびＢＮ）に誘導された逆分化ケラチノサイト幹細胞の安定性を確認した結果である。
【図３】図３は、逆分化ケラチノサイト幹細胞のケラチノサイトへの分化能を確認した結果である：（Ａ）ｑＰＣＲ実験を通じてｍＲＮＡ水準でのケラチノサイトマーカー確認結果、（Ｂ）免疫化学（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を通じてタンパク質水準でケラチノサイトマーカー確認結果。
【図４】図４は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで逆分化ケラチノサイト幹細胞由来コンデイションド培地の濃度に応じた皮膚再生効能を検証した結果である。（Ａ）コンデイションド培地の濃度に応じた細胞成長観察；（Ｂ）、（Ｃ）５０％コンデイションド培地およびＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１基本培地での繊維細胞移動状況の観察を通した傷治癒効果の比較。
【図５】図５は、Ｉｎ  ｖｉｖｏで逆分化ケラチノサイト幹細胞由来コンデイションド培地の組成に応じた皮膚再生効能を検証した結果である。
【図６】図６は、逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の成分分析のためにサイトカインアレイ（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｒｒａｙ）実験を通じて確認した。
【図７】図７は、皮膚再生促進成長因子ＰＤＧＦ−ＡＡ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ  Ｐｒｏｔｅｉｎの量をＥＬＩＳＡを利用して測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明しようとする。しかしながら、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１：尿から尿細胞（Ｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ）の分離
尿細胞は、尿を容器に２００ｍｌ収集して２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を除去した。抗生剤が含まれたＰＢＳでペレットを洗浄した後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去した。抗生剤が含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１＋１０％ＦＢＳ培地で細胞ペレット再懸濁（ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔ  ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）コーティングされた１２ウェルプレートにシーディングした。
【００５９】
５日間毎日１ｍｌ抗生剤が含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１＋１０％ＦＢＳ培地を追加した後に、５％ＦＢＳ、ｂＦＧＦ  ２．５ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ  ２．５ｎｇ／ｍｌ、０．５％Ｌ−グルタミンおよび０．５％ペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた４４％ハイグルコースＤＭＥＭ、５０％ＲＥＧＭ（Ｒｅｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地に交替した。９５％コンフルーエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）以上に達成時、継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）を通じて尿細胞を培養（ｐａｓｓａｇｉｎｇ）した。Ｐａｓｓａｇｅ  ３であるときの尿細胞を逆分化ケラチノサイト幹細胞を誘導するのに使用した。
【００６０】
実施例２：尿由来逆分化ケラチノサイト幹細胞株の誘導逆分化因子の組み合わせの選別
逆分化ケラチノサイト幹細胞株を取得するために、尿細胞にＲｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍを利用して逆分化因子Ｂｍｉ１（Ｂ、ＮＣＢＩ  ＩＤ：６４８、ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００５１８０．８）、ｄＮＰ６３ａ（Ｎ、ＮＣＢＩ  ＩＤ：８６２６、ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１１１４９８０．１）およびＫｌｆ４（Ｋ、ＮＣＢＩ  ＩＤ：９３１４、ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１３１４０５２．１）を組み合わせ別（ＢＮＫ、ＢＮ、ＢＫ、ＮＫ、Ｂ、ＮおよびＫ）に導入して、逆分化ケラチノサイト幹細胞で誘導した。具体的な方法は、次の通りである：
【００６１】
実施例１で分離培養した尿細胞にｐＭＸｓベクターにＢｍｉ１、ｄＮＰ６３ａおよびＫｌｆ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入して製造したベクター（ｐＭＸｓ−Ｂｍｉ１、ｐＭＸｓ−ｄＮＰ６３ａおよびｐＭＸｓ−Ｋｌｆ４）をｈｕｍａｎ  ２９３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（２９３ＧＰＧ）を利用して製造された前記逆分化因子の組み合わせが導入されたウイルスを感染させて、尿細胞に前記逆分化因子を導入した。
【００６２】
前記逆分化因子が導入された尿細胞は、１％  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、インスリン５ｕｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．５ｕｇ／ｍｌ、コレラトキシン８．３ｎｇ／ｍｌ、Ｔ３  １．３７ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸  ５２．８ｕｇ／ｍｌ、ＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌおよび２％ＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地で培養した。
【００６３】
前記培養された尿細胞をそれぞれ４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で２０分固定した後、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。その後、０．３％ｔｒｉｔｏｎＸ１００（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１０％ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ）を利用してｂｌｏｃｋｉｎｇおよびｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ｎｕｃｌｅａｒおよびｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ４０分、ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  １０分）進行後、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。次に、第１抗体（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１０％  ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ）で１時間室温で反応させた後、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄した後、第２抗体（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）で１時間室温で反応させた後、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。次に、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）で５分間室温で反応させた後、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄した後、顕微鏡で観察した。前記第１抗体および第２抗体は、ケラチノサイト幹細胞マーカーであるＫＲＴ１５およびＩＴＧＡ６を利用した。
【００６４】
また、ウイルス感染によって逆分化因子の過発現が正確に起きているかを確認するために、次のようにＲＴ−ＰＣＲ実験を進めた：
【００６５】
発現の有無を確認するためのＢｍｉ１、ｄＮＰ６３ａ、Ｋｌｆ４またはこれらの組み合わせをコードするｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌを利用して細胞から分離した。ｏｌｉｇＤＴおよびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩを使用しててＴ３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）装備でｍＲＮＡをｃＤＮＡで作った後、Ｂｍｉ１、ｄＮＰ６３ａまたはＫｌｆ４遺伝子に特異的なプライマー（ｐＢＭＮ５：ＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣＧＣ（配列番号１）；Ｂｍｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＣＧ（配列番号２）；ｄＮＰ６３ａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＣ（配列番号３）；Ｋｌｆ４−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＴＡＣＡＣＣＧＧＧＴＣＣＡＡＴＴ（配列番号４））を利用してＴ３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ装備でＰＣＲを進めて、特定の配列断片を確認した。ＧＡＰＤＨは、ｈｏｕｓｅ−ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅとして使用した。
【００６６】
その結果、ケラチノサイト幹細胞特異的マーカーであるＫＲＴ１５およびＩＴＧＡ６  ｃｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅしたコロニー数を通じて最も高い効率を示す遺伝子の組み合わせＢｍｉ１／  ｄＮＰ６３ａ（ＢＮ）を最適な組み合わせとして選別した。（図１Ａ）。細胞で逆分化因子の過発現が正確に起きているかを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ実験を進め、ｍＲＮＡ水準での各組み合わせのｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  Ｂｍｉ１／ｄＮＰ６３ａ／Ｋｌｆ４遺伝子の発現を確認することができた（図１Ｂ）。男女の性別の差異なしに遺伝子の組み合わせＢｍｉ１／ｄＮＰ６３ａ（ＢＮ）を通じて尿細胞から逆分化ケラチノサイト幹細胞まで成功裏に誘導することができた（図１Ｃ）。
【００６７】
実施例３：Ｂｍｉ１およびｄＮＰ６３ａが導入された尿由来逆分化ケラチノサイト幹細胞株の確立
実施例２で誘導された細胞のうちケラチノサイト幹細胞と類似したコロニーをｃｏｌｏｎｙ−ｐｉｃｋｉｎｇ方法を利用してケラチノサイト幹細胞特異的マーカーであるＫＲＴ１５／ＩＴＧＡ６にｃｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅしたコロニーを選別した後、１％  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、インスリン５ｕｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．５ｕｇ／ｍｌ、コレラトキシン８．３ｎｇ／ｍｌ、Ｔ３  １．３７ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸  ５２．８ｕｇ／ｍｌ、ＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌおよび１０％  ＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１培地で拡張培養して逆分化ケラチノサイト幹細胞株ＢＮ２８−２、ＢＮ２８−５、ＢＮ２８−６を確立した（図２Ａ）。
【００６８】
前記確立された細胞株に対してｍＲＮＡ水準でのケラチノサイト幹細胞マーカーであるＡＮＧＰＴＬ２、ＣＤ２００、ＩＴＧＡ６、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１４およびＧＪＢ２発現を前記マーカーに特異的なプライマー（ＡＮＧＰＴＬ２−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡ（配列番号５）；ＡＮＧＰＴＬ２−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＧＣＧＴＴＡＴ（配列番号６）；ＣＤ２００−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＴＧＴＴＡＣ（配列番号７）；ＣＤ２００−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＧＣ（配列番号８）；ＩＴＧＡ６−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴＧＡ（配列番号９）；ＩＴＧＡ６−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧ（配列番号１０）；ＫＲＴ１５−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＧＣＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号１１）；ＫＲＴ１５−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴ（配列番号１２）；ＫＲＴ１４−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＧＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧ（配列番号１３）；ＫＲＴ１４−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＡＴＣＴＣＣ（配列番号１４）；ＧＪＢ２−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号１５）；ＧＪＢ２−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＡＧＡＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧ（配列番号１６）；）を利用してＲＴ−ＰＣＲ実験を進めて確認した。
【００６９】
また、継代培養（Ｐａｓｓａｇｅ）別に各細胞株のｄｏｕｂｌｉｎｇ−ｔｉｍｅを計算して長期間培養能力を確認し、各細胞株を３Ｔ３Ｊ２  ｆｅｅｄｅｒの上に２５００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）でシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）後、７日培養後、次のようにクリスタルバイオレット染色を実施して、コロニー形成を確認した：
１０％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）または４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）でコロニーを２０分固定後、蒸留水で２回洗浄した後、０．０５％クリスタルバイオレット溶液を利用して２０分間反応させた後、水で１０回程度洗浄した後、一晩中乾燥させた後、コロニーを顕微鏡または肉眼で観察した。
【００７０】
その結果、ケラチノサイト幹細胞特異的マーカーであるＡＮＧＰＴＬ２、ＣＤ２００、ＩＴＧＡ６、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１４およびＧＪＢ２の発現を確認することができるので、ケラチノサイト幹細胞に逆分化したことを確認した（図２Ｂ）。また、持続的に継代培養時にＢＮ組み合わせを通じて確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株は、その他組み合わせ（ＢＮＫ、ＮＫまたはＮ）より長期間の間成長速度および細胞状態を維持することができた（図２Ｃ〜Ｄ）。確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株の幹細胞の性質確認のために、コロニー形成（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ）実験を進め、ＢＮ組み合わせで確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株は、ＢＮＫ組み合わせよりさらに長期間の間幹細胞の性質を維持することができることを確認した（図２Ｅ）。
【００７１】
実施例４：逆分化ケラチノサイト幹細胞の分化能力確認
実施例３で確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株をＣａ２＋１．２ｍＭを追加した前記実施例３の培地に７日間培養した後、逆分化ケラチノサイト幹細胞の分化実験を進めた。ケラチノサイトへの分化の有無を確認するために、ｑＰＣＲ実験を利用してｍＲＮＡ水準でのケラチノサイトマーカー（ＩＴＧＡ６、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＫＲＴ１、ＩｎｖｏｌｕｃｒｉｎおよびＦｉｌａｇｇｒｉｎ）に特異的なプライマー（ＫＲＴ１８−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣ（配列番号１７）；ＫＲＴ１８−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＴＣ（配列番号１８）；ＫＲＴ８−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＣＡ（配列番号１９）；ＫＲＴ８−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＣ（配列番号２０）；ＫＲＴ１−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号２１）；ＫＲＴ１−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣ（配列番号２２）；Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＡＣＣＣＡＴＣＡＧ（配列番号２３）；Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣ（配列番号２４）；Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＴＣＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ（配列番号２５）；Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＴＣ（配列番号２６）；）を利用して前記マーカーの発現を確認した。
【００７２】
また、免疫化学（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を利用してタンパク質水準での前記ケラチノサイト特異的マーカーを確認した。 免疫化学実験は、実施例２と同じ方法を行い、第１抗体および第２抗体は、前記ケラチノサイト特異的マーカーであるＩＴＧＡ６、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＫＲＴ１、インボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）およびフィラグリン(Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ)を利用した。
【００７３】
その結果、ケラチノサイト特異的マーカーであるＫＲＴ１、インボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）およびフィラグリン(Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ)の発現が逆分化ケラチノサイト幹細胞より顕著に向上し、反対に逆分化ケラチノサイト幹細胞特異的マーカーであるＫＲＴ１５の発現は減少したことを確認することができた（図３Ａ）。また、免疫化学実験を通じてタンパク質水準でケラチノサイト特異的マーカーであるＩＴＧＡ６、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１０およびインボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）の発現を確認することができた（図３Ｂ）。
【００７４】
実施例５：逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の生産およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚再生効能の検証
実施例３で確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株を利用して１００ｍｍディッシュで９５％以上コンフルーエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）されたとき、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１無血清培地で３日間培養して、コンデイションド培地を製造する。コンデイションド培地の濃度を様々なパーセンテージで区別した後、繊維細胞に処理して５日間細胞成長を前記培地が処理された逆分化ケラチノサイト幹細胞株にｃｃｋ−８溶液を１時間処理後４５０ｎｍに吸光度を測定するｃｃｋ−８方法で確認した。その結果、５０％および７５％濃度のコンデイションド培地を処理したとき、あまり差異なく、最も高い成長速度を示し、５０％逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を皮膚再生効果の検証に使用した（図４Ａ）。
【００７５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の皮膚再生効能を確認するために、次のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙ実験を進めた：コンフルエンス（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）された７×１０６繊維細胞を６ウェルプレートにシーディングし、６時間後に２００−μＬピペットチップを使用してスクラッチを形成させた後、コンデイションド培地を処理して、１２ｈ間繊維細胞移動状況を顕微鏡観察した。その結果、５０％逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を処理したとき、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１基本培地より顕著に良好な傷回復（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）効果を確認することができた（図４Ｂ〜Ｃ）。
【００７６】
実施例６：逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚再生効能の検証
逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚再生効能を検証するためにＩＣＲマウスを使用した。ＩＣＲマウスの背中に毛を除去した後、皮膚に物理的に８ｍｍの傷を作る。各傷に毎日羊水由来間葉系幹細胞由来コンデイションド培地、５０％逆分化ケラチノサイト幹細胞由来したコンデイションド培地およびＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１基本培地を７日間処理して皮膚再生状況を観察した。結果によれば、傷回復状況がＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１基本培地より５０％逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を処理したとき、顕著に良好な効果を確認することができ、この傷回復効果は、すでに皮膚再生の良い効果と知られた羊水由来間葉系幹細胞由来コンデイションド培地と類似した結果を確認した（図５Ａ〜Ｂ）。組織学的にＨ＆Ｅ染色で確認して、５０％逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を処理したとき、羊水由来間葉系幹細胞由来コンデイションド培地と同様に上肢組織を形成することを確認することができた（図５Ｃ）。
【００７７】
実施例７：逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の成分分析
逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の成分分析のためにＲ＆Ｄ  ＡＲＹ００７サイトカインアレイキットを使用してサイトカインアレイを行った。逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地でＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＡＮＧ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ ＩＩＩ、ＣＸＣＬ１６、ＤＰＰＩＶ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ／Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩＩＩ、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦＢＰ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＰＴＸ３（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ３）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＰＩＧＦ（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ５／Ｍａｓｐｉｎ、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１／ＰＡＩ−１、ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）、ＴＳＰ−１（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、ｕＰＡ（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）およびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）など多様な成長因子およびサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が組成物であることが確認された（図６）。
【００７８】
特に、皮膚再生促進成長因子であるＰＤＧＦ−ＡＡ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦの量は、ＲａｙＢｉｏ(登録商標)Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ｂＦＧＦ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを利用してＰＤＧＦ−ＡＡ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦの濃度を測定した（図７）。測定によれば、ＰＤＧＦ−ＡＡは、約５．２ｐｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦは、９．６ｐｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦは、約３．７ｐｇ／ｍＬが存在していた。これは、逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の内部に皮膚再生関連タンパク質も含まれていることを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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