(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）を有する化合物を調製する方法であって、
【化１】
0006940197.tif 000007
式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物とを有機溶媒中で反応させて、前記式（Ｉ）の化合物を得る工程を含み、
【化２】
0006940197.tif 000008
前記式（ＩＩ）の化合物と前記式（ＩＩＩ）の化合物との反応は、下記の工程、
前記式（ＩＩ）の化合物、触媒、および、イオン性液体を窒素雰囲気下で反応容器中に入れる工程であって、前記触媒は１２−モリブド珪酸水和物（Ｈ６Ｍｏ１２Ｏ４１Ｓｉ）である工程と、
前記式（ＩＩＩ）の化合物を前記反応容器に加えて反応混合物を形成する工程と、
前記反応混合物を２５〜５０℃で５〜１０時間加熱する工程と、
前記反応混合物を分液漏斗中に入れて粗生成物を分離する工程と、
メタノール中での再結晶により粗生成物を精製し、前記式（Ｉ）の化合物を得る工程と、を含み、
前記イオン性液体は、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩
（［ＢＭＩＭ］［ＢＦ４］）であり、
前記式（ＩＩ）の化合物と前記式（ＩＩＩ）の化合物は、１：１．１のモル比を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中国特許出願第２０１９１１２６２２７６．６号（２０１９年１２月１１日出願）の優先権を主張し、これは、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように、全ての目的のために参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、食品化学分野、特に抗酸化活性を有するヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
３つの主要な栄養素のうちの１つである脂肪は、毎日の食事の必須部分である。油脂の酸化は、油の品質に影響を及ぼす重要な因子である。油脂の自動酸化は活性化されたオレフィン含有基質（例えば、不飽和油）と空気中の酸素との、室温での完全な自然酸化反応であり、いかなる直接照射またはいかなる触媒も必要としない。油の酸化物は油食品の風味および色に影響を及ぼし、食品の品質を低下させるだけでなく、食べる人の健康に影響を及ぼす多くの毒性物質を生成する。油の過酸化物は膜、酵素およびタンパク質を損傷し、多くの老化疾患を引き起こし、癌を引き起こすことさえあり、ヒトの健康を深刻に危険にさらす。油脂の貯蔵寿命を延長するために、油脂への酸化防止剤の添加は、最も有効な手段の１つである。しかしながら、いくつかの一般的に使用されている合成酸化防止剤はいくつかの隠れた危険性を有しており、これらは、いくつかの国の人々によって強く反対され、禁止または制限されている。抗酸化剤の研究は、天然の抗酸化剤の適用に転じ始めた。
【０００４】
ヒドロキシチロソールは天然のポリフェノールであり、種々の生物学的および薬理学的活性を有し、オリーブ油中に抽出することができる。ヒドロキシチロソールは、抗癌、抗炎症、心血管・脳血管疾患の予防・治療、冠動脈性心疾患の予防・治療、網膜色素上皮細胞の保護などに重要な役割を果たしている。ヒドロキシチロソールの分子構造は、他のフェノール性物質と同様にフェノール性水酸基を有するだけでなく、ベンゼン環と結合したエタノール鎖上にアルコール性水酸基を有する。したがって、ヒドロキシチロソールは、優れた抗酸化活性を有する。多くの不飽和脂肪酸の酸化を制御することによって、外因性および内因性の酸化物およびフリーラジカルを効果的に除去することができる。食品添加物として、それは人間の健康を促進し、食品の抗酸化能力を増加させることができる。同時に、ヒドロキシチロソールは高度に親水性である。
【０００５】
３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸としても知られるジヒドロカフェ酸は、トチュウ（Eucommia ulmoides）、タンジン（Salvia miltiorrhiza）、アーティチョーク（artichoke）、オオバナオケラ（Atractylodes macrocephala）およびLianqincaoから抽出および分離することができる。これは、カテコール構造を有するフェノール酸である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、ヒドロキシチロソール構造によりジヒドロカフェ酸を改変してヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得る。抗酸化実験はヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートが優れた抗酸化活性を有し、抗酸化健康製品の分野において高い医学的研究および応用価値を有することを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
一実施形態では、本発明は、下記の式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
【化１】
0006940197.tif 000002
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を調製する方法を提供する。前記方法は、有機溶媒中で式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて、前記式（Ｉ）の化合物を得る工程を含む。
【化２】
0006940197.tif 000003
【０００９】
別の実施形態では、前記式（ＩＩ）の化合物と前記式（ＩＩＩ）の化合物との反応は、下記の工程、前記式（ＩＩ）の化合物、触媒、および、有機溶媒を窒素雰囲気下で反応容器中に入れる工程であって、前記触媒はＥＤＣである、工程と、前記式（ＩＩＩ）の化合物を反応容器に加えて反応混合物を形成する工程と、反応混合物を５０〜８５℃で１〜４時間加熱し、前記反応混合物を濃縮して粗生成物を得る工程と、シリカゲルカラムで前記粗生成物を精製し、溶離剤として酢酸エチル／石油エーテル溶媒で溶離し、前記式（Ｉ）の化合物を得る工程、とを含む。
【００１０】
別の実施形態では、前記有機溶媒は、トルエン、酢酸エチル、または、アセトニトリルである。
【００１１】
別の実施形態では、前記式（ＩＩ）の化合物および前記式（ＩＩＩ）の化合物は、１：１〜１：１．３のモル比を有する。
【００１２】
別の実施形態では、前記モル比は、１ ： １．１である。
【００１３】
別の実施形態では、前記反応混合物を７５℃で４時間加熱する。
【００１４】
別の実施形態では、前記酢酸エチル／石油エーテル溶媒は、３ ： １０の酢酸エチル：石油体積比を有する。
【００１５】
別の実施形態では、前記式（ＩＩ）の化合物と前記式（ＩＩＩ）の化合物との反応は、下記の工程、前記式（ＩＩ）の化合物、触媒、および、イオン性液体を窒素雰囲気下で反応容器中に入れる工程であって、前記触媒は１２−モリブド珪酸水和物（Ｈ６Ｍｏ１２Ｏ４１Ｓｉ）である、工程と、前記式（ＩＩＩ）の化合物を反応容器に加えて反応混合物を形成する工程と、前記反応混合物を２５〜５０℃で５〜１０時間加熱する工程と、前記反応混合物を分液漏斗中に入れて粗生成物を分離する工程と、メタノール中での再結晶によって前記粗生成物を精製して前記式（Ｉ）の化合物を得る工程、とを含む。
【００１６】
別の実施形態では、前記イオン性液体は、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩（［ＢＭＩＭ］［ＢＦ４］）である。
【００１７】
別の実施形態では、前記式（ＩＩ）の化合物および前記式（ＩＩＩ）の化合物は、１：１〜１：１．３のモル比を有する。
【００１８】
別の実施形態では、前記モル比は、１ ： １．１である。
【００１９】
別の実施形態では、反応混合物を２５℃で８時間加熱する。
【００２０】
前述した一般的な説明と、下記の詳細な説明とは、どちらも例示的および説明的であり、特許請求される本発明のさらなる説明を提供するように意図されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図面の簡単な説明
本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は本発明の実施形態を示し、説明と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。図において、
【図１】図１は、様々な濃度での試料溶液および対照溶液の消去活性を示す。
【図２】ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの１ＨＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの１３ＣＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図示の実施形態の詳細な説明
次に、本発明の実施形態を詳細に参照し、その例を添付の図面に示す。下記の実施例は本発明を説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアート（ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアート、式（Ｉ）の化合物）の調製
【００２４】
１００ｍＬの三つ口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソールおよび１２４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を、窒素雰囲気下で５０ｍＬのアセトニトリルに溶解して、反応混合物を形成した。１２９．３ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸を１５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、分液漏斗で反応混合物に滴下した。滴下終了後、反応混合物の温度を７５℃まで昇温し、４時間反応を行った。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を濃縮し、水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、濃縮して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの粗生成物を得た。粗生成物を、溶離剤として石油エーテル：酢酸エチル＝３：１０で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、１５０．２ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は７２．６５％であった。
【００２５】
１Ｈ−ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）： ８．６４（４Ｈ、ｄ）、６．６２（４Ｈ、ｍ）、６．４５（２Ｈ、ｍ）、３．５２（２Ｈ、ｔ）、２．６５（２Ｈ、ｔ）、２．５２（２Ｈ、ｄ）、２．４４（２Ｈ、ｔ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１７４．４、１４５．３、１４３．８、１３２．１、１３０．６、１１９．９、１１９．２、１１６．７、１１６．０、１１５．８、１１５．１、６３．１、３６．１、３０．２。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
【００２６】
実施例２
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００２７】
１００ｍＬの三つ口フラスコ中で、１２０．３ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソールおよび１２４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＥＤＣを、窒素雰囲気下で５０ｍＬのトルエンに溶解して、反応混合物を形成した。１２９．３ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸を１５ｍＬのトルエンに溶解し、分液漏斗で反応混合物に滴下した。滴下終了後、反応混合物の温度を６０℃まで昇温し、３時間反応を行った。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を濃縮し、水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、濃縮して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの粗生成物を得た。粗生成物を、溶離剤として石油エーテル：酢酸エチル＝３：１０で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、１１５．２ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は５５．７２％であった。
【００２８】
実施例３
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００２９】
１００ｍＬの三つ口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソールおよび１２４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＥＤＣを、窒素雰囲気下で５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解して、反応混合物を形成した。１５３．０ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸を１５ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、次いで分液漏斗によって反応混合物に滴下した。滴下終了後、反応混合物の温度を５０℃まで昇温し、４時間反応を行った。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を濃縮し、水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、濃縮して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの粗生成物を得た。粗生成物を、溶離剤として石油エーテル：酢酸エチル＝３：１０で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、１２０．６ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は５８．３２％であった。
【００３０】
実施例４
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００３１】
１００ｍＬの三つ口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソールおよび１２４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＥＤＣを、窒素雰囲気下で５０ｍＬのトルエンに溶解して、反応混合物を形成した。１２９．３ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸を１５ｍＬのトルエンに溶解し、分液漏斗で反応混合物に滴下した。滴下終了後、反応混合物の温度を６５℃まで昇温し、２時間反応させた。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を濃縮し、水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、濃縮して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの粗生成物を得た。粗生成物を、溶離剤として石油エーテル：酢酸エチル＝３：１０で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、１２７．９ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は６１．８７％であった。
【００３２】
実施例５
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００３３】
１００ｍＬの三つ口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソールおよび１２４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＥＤＣを、窒素雰囲気下で５０ｍＬのアセトニトリルに溶解して、反応混合物を形成した。１１８．４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸を１５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次いで分液漏斗によって反応混合物に滴下した。滴下終了後、反応混合物の温度を６０℃まで昇温し、３時間反応を行った。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を濃縮し、水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、濃縮して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの粗生成物を得た。粗生成物を、溶離剤として石油エーテル：酢酸エチル＝３：１０で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、１３９．５ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は６７．４６％であった。
【００３４】
実施例６
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００３５】
１００ｍＬの三つ口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソールおよび１２４ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のＥＤＣを、窒素雰囲気下で５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解して、反応混合物を形成した。１５３．０ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸を１５ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、次いで分液漏斗によって反応混合物に滴下した。滴下終了後、反応混合物の温度を５５℃まで昇温し、４時間反応を行った。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を濃縮し、水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを乾燥し、濃縮して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの粗生成物を得た。粗生成物を、溶離剤として石油エーテル：酢酸エチル＝３：１０を用いて溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、９３．４ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は４５．１８％であった。
【００３６】
実施例７
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００３７】
１００ｍＬの三口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソール、１２９．３ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸、および１２．０ｍｇ（０．００７ｍｍｏｌ）の１２−モリブド珪酸水和物（Ｈ６Ｍｏ１２Ｏ４１Ｓｉ）を、５０ｍＬのイオン性液体（１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩（［ＢＭＩＭ］［ＢＦ４］））に窒素雰囲気下で溶解させて、反応混合物を形成した。反応混合物を２５℃で８時間反応させた。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を分液漏斗に移した。イオン性液体層からエステル層を分離した。エステル層は粗生成物を含んでいた。粗生成物を５０ｍＬのメタン中で再結晶させて、１７０．２ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は８２．３４％であった。
【００３８】
実施例８
化合物３，４−ジヒドロキシフェネチル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノアートの調製
【００３９】
１００ｍＬの三口フラスコ中で、１００．２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のヒドロキシチロソール、１２９．３ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のジヒドロカフェ酸、および１２．０ｍｇ（０．００７ｍｍｏｌ）の１２−モリブド珪酸水和物（Ｈ６Ｍｏ１２Ｏ４１Ｓｉ）を、５０ｍＬのイオン性液体（１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩（［ＢＭＩＭ］［ＢＦ４］））に窒素雰囲気下で溶解させて、反応混合物を形成した。反応混合物を５０℃で４時間反応させた。薄層クロマトグラフィーを用いて反応を完了まで追跡し、加熱を停止し、保護装置を取り外した。反応混合物を分液漏斗に移した。イオン性液体層からエステル層を分離した。エステル層は粗生成物を含んでいた。粗生成物を５０ｍＬのメタン中で再結晶させて、１５６．２ｍｇの精製ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートを得、総収率は７５．５４％であった。
【００４０】
実施例９
ＤＰＰＨラジカル消去活性アッセイにより測定したヒドロキシチロソールジヒドロカフェアートの抗酸化活性
【００４１】
２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）は安定な有機ラジカルからなる有機化合物である。多重電子吸引性の−ＮＯ２とベンゼン環の大きなπ結合の存在により、窒素フリーラジカルは安定化する。そのメタノール溶液は紫色であり、５１７ｎｍに最大吸収ピークを有する。酸化防止剤の添加後、ＤＰＰＨは自由電子と対になる電子を捕獲し、紫色は退色し、黄色の物質に変わる。５１７ｎｍでの吸収は消失し、退色の程度は、それが捕獲する電子の数に定量的に関連する。この原理に基づいて、分光光度計を用いてＤＰＰＨラジカルおよび試料溶液の吸光度の変化を検出し、水素原子を提供しフリーラジカルを消去する試料の能力を測定することができる。
【００４２】
（ａ）ＤＰＰＨ溶液の調製：
２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）の正確な量を測定し、トルエンに溶解して、０．２ｍｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨ溶液を調製し、暗所にて０℃で保存する。
【００４３】
（ｂ）試験溶液の調製：
Ｖｃ（ビタミンＣ、陽性対照）、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアート（試料）、ヒドロキシチロソール（対照）およびジヒドロカフェ酸（対照）。試料溶液をトルエンで勾配希釈し、一定量のトルエンで３組の対照を別々に試験管に溶解し、試料と同じ濃度勾配を調製した。対応する３群の対照溶液を得た（勾配設定を表１に示す）。
【００４４】
【表１】
0006940197.tif 000004
【００４５】
（ｃ）具体的な工程：
試料溶液吸光度測定：
試験溶液（表１: Ｖｃ、Ａ、Ｂ、Ｃ）２ｍＬをとり、２×１０−４ｍｏＬ／Ｌの濃度のＤＰＰＨ溶液２ｍＬを加え、室温で３０分間暗所で混合して反応させ、トルエンでゼロに調整し、５１７ｎｍで測定する。吸光度Ａｉは、２ｍＬの溶液と混合した２ｍＬのトルエンの吸光度Ａｊと、２ｍＬのトルエンと混合した２ｍＬのＤＰＰＨ溶液の吸光度Ａ０とを同時に測定した（実験結果を表２に示す）。
【００４６】
【表２】
0006940197.tif 000005
【００４７】
クリアランス率は下記の式を用いて算出し、その結果を表３および図１に示す。
【００４８】
クリアランス算出：クリアランス率（％）＝［１−（Ａｉ−Ａｊ）/Ａ０］×１００％
【００４９】
【表３】
0006940197.tif 000006
【００５０】
図１および表１〜３に示すように、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアート（Ａ）の抗酸化活性は濃度依存的な関係を示し、ＤＰＰＨラジカルに対するヒドロキシチロソールジヒドロカフェアート（Ａ）の消去能力は濃度の増加と共に増加した。測定した濃度範囲において、ＤＰＰＨラジカルの最高消去率は９１．２２％であり、Ｖｃ（ビタミンＣ）の消去活性と同様であった。ヒドロキシチロソール（Ｂ）およびジヒドロカフェ酸（Ｃ）単独で処理した対照群と比較して、ヒドロキシチロソールジヒドロカフェアート（Ａ）の消去能力は、ヒドロキシチロソール（Ｂ）対照群およびジヒドロカフェ酸（Ｃ）対照群よりもはるかに高かった。実験結果はヒドロキシチロソールジヒドロカフェアート（Ａ）が優れた抗酸化活性を有し、食品、化粧品、栄養製品、および医薬品において良好な適用見通しを有することを示す。
【図１】
0006940197.tif 000009
【図２】
0006940197.tif 000010
【図３】
0006940197.tif 000011