(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種のポリペプチドからなるサイトグロビンタンパク質と、前記サイトグロビンタンパク質に結合したオリゴヒスチジンのタグと、を含む修飾サイトグロビンタンパク質を有効成分として含む、抗線維化剤。
【請求項２】
前記オリゴヒスチジンの長さが、３〜１０アミノ酸残基である、請求項１に記載の抗線維化剤。
【請求項３】
前記タグが、前記サイトグロビンタンパク質のＮ末端に結合している、請求項１又は２に記載の抗線維化剤。
【請求項４】
前記ポリペプチドの長さが、１５２〜１９０アミノ酸残基である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、
（１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ、線維化抑制能をするポリペプチド
の少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、
（２１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２２）配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（２３）配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、
（３１）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３２）配列番号１及び配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３３）配列番号１及び配列番号３で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、
（４１）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４２）配列番号１及び配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（４３）配列番号１及び配列番号４で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、
（５１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５２）配列番号１及び配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（５３）配列番号１及び配列番号５で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項１０】
肝線維化抑制剤である、請求項１〜９のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項１１】
肝硬変治療薬である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項１２】
肝癌予防薬である、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗線維化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗線維化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肝癌患者数の増大が問題となっている。２０１２年度国立がん研究センターの報告によると、国内の肝癌死亡者数は男女ともに全癌中４位であり、２０１０年には年間３３０００人にも及んでいる。肝癌は、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス感染、多量飲酒や糖尿病肥満と関連する非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を土台として発生する。即ち、肝癌は慢性炎症と線維化肝を母地として生じ、病因の如何を問わず年率８％で発癌し、一旦肝癌が生じると再発と肝内転移を繰り返す。肝硬変とは、肝実質がＩ型コラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白で置換されて機能的肝細胞が減少する病態である。この線維性肝臓は、生理的状態ではビタミンＡ貯蔵を主機能とする肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ、ＨＳＣ）が活性化して形質を変えた筋線維芽細胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＦＢ）で肝実質が置換される病態である。この形質転換には、トランスフォーミング増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β）や結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）が関与し、これらの因子が肝星細胞の持続活性化や実質での筋線維芽細胞の増加が肝細胞機能を低下させる要因であり、肝癌発症に寄与することが報告されている（非特許文献１及び２）。そのため、肝星細胞の活性化抑制と筋線維芽細胞の制御が肝繊維化及び肝癌の治療法開発に繋がると考えられている。【０００３】
線維化前後の線維芽細胞におけるプロテオーム解析において、サイトグロビン（ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ，  Ｃｙｇｂ）が肝星細胞（ＨＳＣ）で見出された。サイトグロビンは肝外臓器の膵臓（膵星細胞）や腎臓の尿細管上皮近傍の線維芽細胞にも発現することが知られている（非特許文献３）。サイトグロビンの肝病態における役割を明らかにする目的でサイトグロビン欠損マウス（Ｃｙｇｂ-/-）を作製されており（特許文献１）、その結果、サイトグロビン欠損マウスが、肝発がん物質であるジエチルニトロサミン（ｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ，ＤＥＮ）投与に対して易発がん性を呈すること、及び、その過程に酸化ストレス亢進が関与することが見出されている（非特許文献４）。さらに、サイトグロビン過剰発現が肝星細胞活性化を抑制することも見出されている（非特許文献５）。【０００４】
サイトグロビンの発現誘導に関しては、更に次の知見が報告されている。例えば、組織や細胞において低酸素状態にするとサイトグロビンが誘導されること（非特許文献６）、肝臓の星細胞をアルンジン酸に暴露させるとサイトグロビンが誘導されること（非特許文献７）、及び、肝臓のヒト星細胞をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２に暴露させるとサイトグロビンが誘導されること（非特許文献８）が報告されている。【０００５】
一方、肝疾患の治療又は予防剤としては、次の報告がある。例えば、メナテトレノン（ビタミンＫ−ＩＩ）を有効成分とする肝疾患治療・予防剤が、肝細胞癌の細胞増殖を抑制したり、肝細胞癌治療後の門脈浸潤の発生を抑制したりできること（特許文献２〜４）、メナテトレノンが、慢性肝疾患由来、肝硬変由来、又は、Ｃ型肝炎ウイルス性肝硬変由来の肝癌の発癌を抑制し得ること（特許文献５）、アポトーシス促進活性または抗増殖活性に関係する１，４−ナフトキノン系化合物を抗癌剤として使用する提案（特許文献６）が報告されている。【０００６】
また、Ｃ型肝炎については、厚生労働省が進める肝炎総合対策の推進により、１Ｂ型高ウイルス症例でも９５％以上の根治率が得られるようになっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００１，１７：１６６８
【非特許文献２】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，５６：７６９
【非特許文献３】Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００４；８４：９１
【非特許文献４】Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１１；１７９：１０５０
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  ＣＨｅｍ  ２０１７；２９２：１８９６１
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００４  Ｊｕｎ  ２５；３１９（２）：３４２−８
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１２  Ａｕｇ  ３１；４２５（３）：６４２−８
【非特許文献８】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１７  Ｎｏｖ  １７；２９２（４６）：１８９６１−１８９７２
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−５１２７７号
【特許文献２】特開２００４−６７５１３号公報
【特許文献３】特開２００４−１０７３３０号公報
【特許文献４】特開２００４−２０３７４５号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０６５６７１号パンフレット
【特許文献６】特表２００９−５３４４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
肝線維化を直接治療する方法は今のところ存在しない。上述のとおり、肝疾患の治療又は予防剤としていくつか報告されているが、それらの薬剤は、発癌の抑制、又は、一旦発癌した場合の治療薬であって、発癌の前段階である肝線維化の治療又は予防については一切検討されていない。また、Ｃ型肝炎では高い根治率が得られるようになっているが、肝硬変まで症状が進行した場合はウイルス排除率が低い。たとえウイルスが排除されたとしても、残存活性化星細胞により肝機能を回復できず発癌する。特に肝硬変は治療満足度が低い疾患であるため、肝硬変治療薬に対するアンメット・メディカル・ニーズは高い。有効な肝硬変治療薬が開発されれば、患者のＱＯＬ向上や医療費の削減など社会に与えるインパクトは大きく、医学的価値は極めて高い。【００１０】
肝癌の母地となる肝線維化を治療することは、肝硬変の治療や肝癌の予防において非常に有効であると考えられる。サイトグロビンが肝臓の微小環境の恒常性維持に不可欠で、その欠損は肝線維化を促進し発癌誘導させると考えられることから、肝星細胞におけるサイトグロビン維持に寄与する薬剤は、肝線維化の治療剤として候補物質となりうる。上述のとおり、アルシジン酸やｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２が、サイトグロビンを誘導することが示されている。しかしながら、アルンジン酸はヒトへの臨床応用が中止になった化合物である。また、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２は多機能性物質であり様々な不所望の作用が懸念されるため、ヒトへの臨床応用には困難が予想される。【００１１】
そこで本発明は、線維化を抑制するために有効な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らが鋭意研究を重ねたところ、サイトグロビン自体を細胞に暴露させることで、線維化反応を低減できることを見出した。さらに、サイトグロビンに特定のタグを付すことによって、線維化反応をより一層低減できることも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１３】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種のポリペプチドからなるサイトグロビンタンパク質と、前記サイトグロビンタンパク質に結合したオリゴヒスチジン及びＴＡＴペプチドの少なくともいずれかのタグと、を含む修飾サイトグロビンタンパク質を有効成分として含む、抗線維化剤。
項２．  前記オリゴヒスチジンの長さが、３〜１０アミノ酸残基である、項１に記載の抗線維化剤。
項３．  前記タグがオリゴヒスチジンである、項１又は２に記載の抗線維化剤。
項４．  前記タグが、前記サイトグロビンタンパク質のＮ末端に結合している、項１〜３のいずれかに記載の抗線維化剤。
項５．  前記ポリペプチドの長さが、１５２〜１９０アミノ酸残基である、項１〜４のいずれかに記載の抗線維化剤。
項６．  前記ポリペプチドが、
（１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能をするポリペプチド
の少なくとも１種である、項１〜５のいずれかに記載の抗線維化剤。
項７．  前記ポリペプチドが、
（２１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２２）配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（２３）配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、項１〜５のいずれかに記載の抗線維化剤。
項８．  前記ポリペプチドが、
（３１）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３２）配列番号１及び配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３３）配列番号１及び配列番号３で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、項１〜５のいずれかに記載の抗線維化剤。
項９．  前記ポリペプチドが、
（４１）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４２）配列番号１及び配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（４３）配列番号１及び配列番号４で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、項１〜５のいずれかに記載の抗線維化剤。
項１０．  前記ポリペプチドが、
（５１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５２）配列番号１及び配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（５３）配列番号１及び配列番号５で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種である、項１〜５のいずれかに記載の抗線維化剤。
項１１．  肝線維化抑制剤である、項１〜１０のいずれかに記載の抗線維化剤。
項１２．  肝硬変治療薬である、項１〜１１のいずれかに記載の抗線維化剤。
項１３．  肝癌予防薬である、項１〜１２のいずれかに記載の抗線維化剤。
項１４．  （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種のポリペプチドからなるサイトグロビンタンパク質と、前記サイトグロビンタンパク質に結合したオリゴヒスチジン及びＴＡＴペプチドの少なくともいずれかのタグと、を含む修飾サイトグロビンタンパク質の、抗線維化剤の製造のための使用。
項１５．  線維化疾患患者に、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
の少なくとも１種のポリペプチドからなるサイトグロビンタンパク質と、前記サイトグロビンタンパク質に結合したオリゴヒスチジン及びＴＡＴペプチドの少なくともいずれかのタグと、を含む修飾サイトグロビンタンパク質を有効成分として含む、抗線維化剤を投与する工程を含む、線維化疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗線維化剤によると、組織の線維化の予防又は治療に有効である。さらに、癌の母地となる線維化抑制を抑制するため、癌の予防にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】試験例１で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、暴露時間と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２】試験例１で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図３】試験例１で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連遺伝子の転写量との関係を示す。
【図４】試験例２で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを肝線維化マウスモデルに投与した際の、血清中のＡＳＴ及びＡＬＴレベルの測定結果を示す。
【図５】試験例２で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを肝線維化マウスモデルに投与した際の、線維症関連遺伝子の転写量を示す。
【図６】試験例２で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを肝線維化マウスモデルに投与した際の、肝臓組織の肝星細胞の組織染色結果を示す。
【図７】試験例３で得られた、ＴＡＴペプチドを有するサイトグロビンＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、暴露時間と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図８】試験例３で得られた、ＴＡＴペプチドを有するサイトグロビンＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図９】試験例３で得られた、ＴＡＴペプチドを有するサイトグロビンＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連遺伝子の転写量との関係を示す。
【図１０】試験例４で得られた、タグを有しないサイトグロビンＮａｔｉｖｅ−ＣＹＧＢと、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢとについての細胞膜透過性の検証結果である。
【図１１】試験例４で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢと、ＴＡＴペプチドタグを有するサイトグロビンＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢとについての細胞膜透過性の検証結果である。
【図１２】試験例５で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢのＨＨＳｔｅＣ細胞中における存在態様を示す結果である。
【図１３】試験例５で得られた、ＴＡＴペプチドタグを有するサイトグロビンＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢのＨＨＳｔｅＣ細胞中における存在態様を示す結果である。
【図１４】試験例６で得られた、６Ｒペプチドタグを有するサイトグロビン６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、暴露時間と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す（比較例）。
【図１５】試験例６で得られた、６Ｒペプチドタグを有するサイトグロビン６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す（比較例）。
【図１６】試験例６で得られた、６Ｒペプチドタグを有するサイトグロビン６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、暴露時間と線維症関連遺伝子の転写量との関係を示す（比較例）。
【図１７】試験例７で得られた、コバルト置換されたサイトグロビンＣｏ−ＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の線維症関連タンパク質の発現量を示す（参考例）。
【図１８】試験例７で得られた、コバルト置換されたサイトグロビンＣｏ−ＣＹＧＢをＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の線維症関連遺伝子の転写量を示す（参考例）。
【図１９】試験例８で得られた、各種サイトグロビンの鉄ヘム活性を示す可視吸収スペクトルである。
【図２０】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ４をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２１】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ４をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連遺伝子の転写量との関係を示す。
【図２２】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ５をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２３】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ６をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２４】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ７をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２５】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ１をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２６】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ１をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連遺伝子の転写量との関係を示す。
【図２７】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ２をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２８】試験例８で得られた、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質ｐｐ３をＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露した際の、用量と線維症関連タンパク質の発現量との関係を示す。
【図２９】試験例９で得られた、肝炎・肝線維化モデルにオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンを投与した際の血清中ＡＳＴ値及びＡＬＴ値を示す。
【図３０】試験例９で得られた、肝炎・肝線維化モデルにオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンを投与した際の線維症関連遺伝子転写量を示す。
【図３１】試験例９で得られた、肝炎・肝線維化モデルにオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンを投与した際の肝組織の組織染色結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗線維化剤は、特定のタグにより修飾された修飾サイトグロビンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の抗線維化剤について詳述する。
【００１７】
有効成分
本発明の抗線維化剤の有効成分におけるサイトグロビンタンパク質とは、全長サイトグロビンと、全長サイトグロビンの部分タンパク質（サイトグロビン断片）との両方を含む意である。
【００１８】
サイトグロビンタンパク質は、以下の（１）〜（３）の少なくとも１種のポリペプチドである。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列を含み、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド
【００１９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ヒト由来のサイトグロビン（後述配列番号５）において抗線維化能を示す部分タンパク質のアミノ酸配列（後述配列番号５の１８〜１７０番目）に相当する。サイトグロビン（後述配列番号５）は、第８１位と第１１３位のヒスチジン残基のイミダゾール基がヘムを挟み込むように６配位構造をとり（ヘム結合活性）、酸素及び一酸化窒素等と結合する機能を有する。本発明における有効成分による抗線維化効果の発現には少なくともヘム結合活性が関与するため、サイトグロビンタンパク質は、当該第８１位及び第１１３位（ヘム結合部位）を含んでいる。一方、サイトグロビンタンパク質は、両方のヘム結合部位を含むだけでは本発明における有効成分による抗線維化効果は発現せず、当該効果の発現には、ヘム結合部位を含め１８〜１７０番目のアミノ酸配列を要する。上記（２）及び（３）に示すポリペプチドは、前記（１）に示すポリペプチドの変異体である。
【００２０】
上記（２）のポリペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。上記（２）のポリペプチドにおいて、導入される置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は数個であればよく、例えば、１〜３２個、好ましくは１〜１６個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、一層好ましくは１〜３個、より一層好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個が挙げられる。
【００２１】
また、上記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
【００２２】
ここで、上記（３）のポリペプチドおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００２３】
また、上記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対してアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の好適な一態様として保存的置換が挙げられる。ここで、「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００２４】
上記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、「線維化抑制能を有する」とは、（１）に示すポリペプチドと同等の線維化抑制能を有することをいう。具体的には、線維化関連遺伝子の転写量（ｍＲＮＡへの転写量）を測定した場合に、上記（１）のポリペプチドと線維化関連遺伝子の転写量が同等（即ち、上記（１）のポリペプチドによる線維化関連遺伝子の転写量を１００％とした場合に、８０〜１２０％程度であること）であることを意味する。線維化関連遺伝子としては、αＳｍａ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｆｇβ−１等が挙げられる。
【００２５】
サイトグロビンタンパク質としては、抗線維化能を示す配列番号１で示されるアミノ酸配列が含まれているポリペプチドであれば特に限定されないが、より高い抗線維化能を得る観点から、１５２〜１９０アミノ酸残基の長さのポリペプチドであることが好ましい。具体的なサイトグロビンタンパク質の例としては、以下のものが挙げられる。
【００２６】
（サイトグロビンタンパク質の具体例１）
サイトグロビンタンパク質の具体例１として、以下の（１１）〜（１３）の少なくとも１種のポリペプチドが挙げられる。
（１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能をするポリペプチド。
【００２７】
上記（１１）のポリペプチドは、ヒト由来のサイトグロビン（後述配列番号５）において抗線維化能を示す部分タンパク質（後述配列番号５の１８〜１７０番目）である。上記（１２）及び（１３）に示すポリペプチドと上記（１１）に示すポリペプチドとの関係は、前記（２）及び前記（３）に示すポリペプチドと前記（１）に示すポリペプチドとの関係と同様である。
【００２８】
（サイトグロビンタンパク質の具体例２）
サイトグロビンタンパク質の具体例２として、以下の（２１）〜（２３）の少なくとも１種のポリペプチドが挙げられる。
（２１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２２）配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（２３）配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド。
【００２９】
上記（２１）のポリペプチドは、ヒト由来のサイトグロビン（後述配列番号５）において抗線維化能を示す部分を含むアミノ酸配列（後述配列番号５の４〜１７６番目）からなる。上記（２２）及び（２３）に示すポリペプチドと上記（２１）に示すポリペプチドとの関係は、前記（２）及び前記（３）に示すポリペプチドと前記（１）に示すポリペプチドとの関係と同様である。
【００３０】
（サイトグロビンタンパク質の具体例３）
サイトグロビンタンパク質の具体例３として、以下の（３１）〜（３３）の少なくとも１種のポリペプチドが挙げられる。
（３１）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３２）配列番号１及び配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（３３）配列番号１及び配列番号３で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド。
【００３１】
上記（３１）のポリペプチドは、ヒト由来のサイトグロビン（後述配列番号５）において抗線維化能を示す部分を含むアミノ酸配列（後述配列番号５の１８〜１９０番目）からなる。上記（３２）及び（３３）に示すポリペプチドと上記（３１）に示すポリペプチドとの関係は、前記（２）及び前記（３）に示すポリペプチドと前記（１）に示すポリペプチドとの関係と同様である。
【００３２】
（サイトグロビンタンパク質の具体例４）
サイトグロビンタンパク質の具体例４として、以下の（４１）〜（４３）の少なくとも１種のポリペプチドが挙げられる。
（４１）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４２）配列番号１及び配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（４３）配列番号１及び配列番号４で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド。
【００３３】
上記（４１）のポリペプチドは、ヒト由来のサイトグロビン（後述配列番号５）において抗線維化能を示す部分を含むアミノ酸配列（後述配列番号５の４〜１９０番目）からなる。上記（４２）及び（４３）に示すポリペプチドと上記（４１）に示すポリペプチドとの関係は、前記（２）及び前記（３）に示すポリペプチドと前記（１）に示すポリペプチドとの関係と同様である。
【００３４】
（サイトグロビンタンパク質の具体例５）
サイトグロビンタンパク質の具体例５として、以下の（５１）〜（５３）の少なくとも１種のポリペプチドが挙げられる。
（５１）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５２）配列番号１及び配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド、及び
（５３）配列番号１及び配列番号５で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、且つ、線維化抑制能を有するポリペプチド。
【００３５】
上記（５１）のポリペプチドは、ヒト由来のサイトグロビン（配列番号５）である。上記（５２）及び（５３）に示すポリペプチドと上記（５１）に示すポリペプチドとの関係は、前記（２）及び前記（３）に示すポリペプチドと前記（１）に示すポリペプチドとの関係と同様である。
【００３６】
これらのポリペプチドの中でもより高い抗線維化能を得る観点から、Ｎ末端に位置するアミノ酸残基が、配列番号５の２〜１７番目（又は、３〜１５番目、３〜１３番目、３〜１１番目３〜９番目、３〜７番目、特に３〜５番目）のいずれかであるもの以外であることが好ましい。より好ましくは、これらのポリペプチドの中でも、サイトグロビンタンパク質の具体例１、サイトグロビンタンパク質の具体例３、サイトグロビンタンパク質の具体例５として示したものが挙げられ、特に好ましくは、サイトグロビンタンパク質の具体例５として示したものが挙げられる。
【００３７】
本発明の抗線維化剤は、上記のサイトグロビンタンパク質が、特定のタグによって修飾されている。本発明者らにより、サイトグロビンタンパク質自体が細胞膜を透過することが見出されたが、当該特定のタグを有することにより、サイトグロビンタンパク質の細胞膜透過性を一層向上させることができる。本発明の抗線維化剤で用いられるタグは、オリゴヒスチジン又はＴＡＴペプチドである。オリゴヒスチジン及びＴＡＴペプチドは、細胞膜透過能を有するペプチドである。公知の細胞膜透過能を有するペプチドの中でも、オリゴヒスチジン及びＴＡＴペプチドは、サイトグロビンタンパク質に結合した場合に、特に優れた細胞膜透過能を発揮する。
【００３８】
オリゴヒスチジンは、ヒスチジン残基からなるペプチドである。オリゴヒスチジンの長さとしては特に限定されず、本発明の抗線維化剤の適用対象の症状に対して求められる薬効の程度に応じ、適宜設定することができる。例えば、オリゴヒスチジンの長さとしては、３〜１０アミノ酸残基が挙げられ、好ましくは４〜８アミノ酸残基が挙げられ、より好ましくは５〜６アミノ酸残基が挙げられる。
【００３９】
ＴＡＴペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスの転写制御に係わるTransactivator of transcriptionタンパク質（Ｔａｔタンパク質）由来のアルギニンに富む塩基性ペプチドとして知られいる。具体的には、ＴＡＴペプチドは、Ｔａｔタンパク質のＲＮＡ結合領域、つまり、Ｔａｔタンパク質の核移行シグナル（Nuclear Localization Signal: ＮＬＳ）とＲＮＡとの結合に必須の配列を構成するペプチドである。Ｔａｔペプチドの長さとしては、９〜１５アミノ酸残基が挙げられる。Ｔａｔタンパク質の具体例としては配列番号６で示されるタンパク質が挙げられる。配列番号６で示されるＴａｔタンパク質に由来するＴＡＴペプチドは、配列番号６で示されるＴａｔタンパク質のＲＮＡ結合領域に相当する４９〜５７位の配列RKKRRQRRR（配列番号７）を有する。
【００４０】
ＴＡＴペプチドがＴａｔタンパク質のＲＮＡ結合領域以外のアミノ酸残基を有する場合、そのようなＴＡＴペプチド全体の配列がＴａｔタンパク質に由来していることが好ましい。例えば、ＴＡＴペプチドが配列番号７に示される９アミノ酸残基を超える長さを有する場合も、ＴＡＴペプチド全体の配列が配列番号６に示すＴａｔタンパク質に由来していることが好ましい。具体的には、ＴＡＴペプチドは、配列番号６に示すＴａｔタンパク質の４９〜５７位を含み、且つ、Ｎ末端に配列番号６に示すＴａｔタンパク質の４５〜４８位、４６〜４８位、４７〜４８位、又は４８位のアミノ酸残基並びに／若しくはＣ末端に５８〜６０位、５８〜５９位、又は５８位のアミノ酸残基を含むことができる。上記の他、本発明においては、ＴＡＴペプチドがＴａｔタンパク質のＲＮＡ結合領域以外のアミノ酸残基を有する場合、ＲＮＡ結合領域以外のアミノ酸残基がＴａｔペプチドに由来していなくてもよい。
【００４１】
本発明で用いられるＴＡＴペプチドの具体例としては、以下が挙げられる。
・RKKRRQRRR（配列番号７；配列番号６に示すＴａｔタンパク質の４９〜５７位からなるペプチド）
・GRKKRRQRRRAHQ（配列番号８；配列番号６に示すＴａｔタンパク質の４８〜６０位からなるペプチド）
・GRKKRRQRRRA（配列番号９；配列番号６に示すＴａｔタンパク質の４８〜５８位からなるペプチド）
・YGRKKRRQRRR（配列番号１０；配列番号６に示すＴａｔタンパク質の４７〜５７位からなるペプチド）
・GRKKRRQRRRPPQ（配列番号１１）
・GRKKRRQRRRP（配列番号１２）
【００４２】
これらのタグのうち、サイトカインの細胞膜透過能の向上作用がより優れているのはＴＡＴペプチドである。一方、オリゴヒスチジンは、サイトグロビンタンパク質の細胞膜透過能の向上作用自体はＴＡＴペプチドに劣るが、オリゴヒスチジンを有するサイトグロビンタンパク質は、ＴＡＴペプチドを有するサイトグロビンタンパク質よりも低用量で抗線維化能を発揮することができる点で好ましい。このように、細胞膜透過能とは無関係にオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質の方がＴＡＴペプチドタグを有するサイトグロビンタンパク質よりも効能が高い理由としては定かではないが、少なくとも、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビンタンパク質とＴＡＴペプチドタグを有するサイトグロビンタンパク質とに関して細胞膜を透過した後の細胞内における存在場所が互いに大きく異なることが挙げられる。
【００４３】
本発明において、サイトグロビンタンパク質におけるタグの結合場所としては特に限定されないが、サイトグロビンタンパク質の好ましい細胞膜透過能を得る観点、及び／又は、好ましい抗線維化能を得る観点から、Ｎ末端が挙げられる。また、タグは、サイトグロビンタンパク質に直接結合していてもよいし、数個のアミノ酸残基、例えば１〜５個のアミノ酸残基を介して間接的に結合していてもよい。更に、本発明において、タグで修飾されたサイトグロビンタンパク質は、上記のサイトグロビンタンパク質配列、上記のタグ配列、並びに、上記のサイトグロビンタンパク質配列及びタグ配列の間に介在してよいアミノ酸残基の他に、タグ配列のサイトグロビンタンパク質側とは反対側、及び／又はサイトグロビンタンパク質のタグ配列とは反対側に、１〜５個のアミノ酸残基を更に有していてもよい。
【００４４】
本発明の抗線維化剤は、上記（１）〜（３）のポリペプチドと上記のタグとが結合したポリペプチドであり、その製造方法としては特に限定されない。上記（１）〜（３）のポリペプチドと上記のタグとを別々に調製し、その後、両者を結合させてもよいし、上記（１）〜（３）のポリペプチドと上記のタグとの融合ポリペプチドとして調製してもよい。上記（１）〜（３）のポリペプチド、タグ、及び融合ポリペプチドは、当業者に利用可能な各種の遺伝子組み換え技術によって宿主細胞を用いて生物学的に調製することができる。また、上記（１）〜（３）のポリペプチド、タグ、及び融合ポリペプチドは、当業者に利用可能な固相合成法などのペプチド合成反応を利用した有機化学的方法で調製することもでき、また、ペプチドシンセサイザーを用いた自動合成により調製することもできる。
【００４５】
他の成分
本発明の抗線維化剤は、前述の有効成分の他に、治療対象となる疾患の種類に応じて、他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００４６】
また、本発明の抗線維化剤は、前記有効成分の他に、所望の投与形態及び製剤形態に調製するために、必要に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。このような担体や添加剤としては、希釈剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、粘稠化剤等が挙げられる。
【００４７】
剤型
本発明の抗線維化剤の剤型については、特に制限されず、その投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明の抗線維化剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤；錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００４８】
用途
本発明の抗線維化剤は、生体内で組織の線維化を抑制することによって予防又は治療効果が期待される疾患に適用して使用される。
【００４９】
本発明の抗線維化剤は、線維化の予防又は治療に用いることができ、また、線維化組織を母地とする癌の予防にも用いることができる。本発明の抗線維化剤は、様々な組織の線維化の予防又は治療に用いることができ、組織の具体例としては、肝臓（肝星細胞）、膵臓（膵星細胞）、腎臓（尿細管上皮近傍の線維芽細胞）、脳、胸腺、肺、乳房、心臓、胃、腸、皮膚、骨髄等が挙げられ、好ましくは、肝臓、膵臓、腎臓が挙げられ、より好ましくは肝臓が挙げられる。
【００５０】
より具体的には、本発明の抗線維化剤は、様々な線維化疾患の予防又は治療に用いることができ、線維化疾患の具体例としては、肝線維症、肝硬変、膵嚢胞性線維症、腎線維症、グリオーシス、びまん性胸腺線維症、肺線維症、間質性肺炎、心筋線維症、心筋梗塞、胃繊維症、腸線維症、皮膚線維症、骨髄繊維症が挙げられ、好ましくは、肝線維症、肝硬変、膵嚢胞性線維症、腎線維症が挙げられ、より好ましくは肝線維症、肝硬変が挙げられ、さらに好ましくは肝硬変が挙げられる。
【００５１】
また、本発明の抗線維化剤は、様々な癌の予防にも用いることができ、癌の具体例としては、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、脳腫瘍、胸腺癌、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫が挙げられ、好ましくは、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌が挙げられ、より好ましくは肝臓癌が挙げられる。
【００５２】
本発明の抗線維化剤において、投与対象となる生物は、線維化抑制が求められる生物であればよく、ヒト、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物等が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
【００５３】
投与方法
本発明の抗線維化剤の投与形態としては、例えば、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等の非経口投与；経口投与が挙げられ、適用する疾患の種類等に応じて適宜設定すればよい。
【００５４】
本発明の抗線維化剤の投与量については、適用する疾患の種類、投与対象者の年齢、性別、体重、症状の程度、投与形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１日当たり、８〜１０ｍｇ／６０ｋｇ、好ましくは９〜１０ｍｇ／６０ｋｇ、より好ましくは９．５〜９．７ｍｇ／６０ｋｇ程度となる量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。なお、図面において、「*」はP＜0.05、「**」はP＜0.01、「***」はP＜0.001であることを示している。【００５６】
試験例１：ＨＨＳｔｅＣ細胞及び初代培養ヒト星細胞に及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
本試験例では、６個のヒスチジン残基からなるオリゴヒスチジンタグが配列番号５に示すサイトグロビンのＮ末端に結合した融合ポリペプチドＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを調製し、調製されたＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢについて、ＨＨＳｔｅＣ細胞及び初代培養ヒト星細胞に及ぼす影響を検証した。【００５７】
（Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの調製）
ヒトＣｙｇｂ  ｃＤＮＡをｐＲＳＥＴＡベクター（ヒスチジンタグサイトを含む）に挿入してシークエンスを確認した。ベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＡＩに感染させ、感染クローンを取得後、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１０μｇ／ｍｌ  テトラサイクリンを含む３．２ＬのLuria-Bertani溶液で３７℃振盪培養した。０．１ｗ／ｗ％アラビノースによって、融合ポリペプチドＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを誘導した。Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢはfast protein liquid chromatography（ＦＰＬＣ）を用いてクリーンアップし、引き続いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを用いてさらなるクリーンアップと脱塩とを行った。精製したＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢにエンドトキシンのコンタミネーションはなく、細胞への毒性も否定された。さらに、ピリジンヘモクロモーゲンアッセイにてヘムの存在も確認された。なお、調製されたＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢは、配列番号１３に示す配列を有している。【００５８】
（線維症関連タンパク質の発現に及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果）
細胞株のＨＨＳｔｅＣ細胞（ScienCell Research Laboratoriesより購入）を実験に用いた。４０μｇ／ｍＬのＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをリン酸緩衝溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に含む溶液を調製し、０〜４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、暴露前（０分）、並びに暴露開始後１時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点における細胞内ＣＹＧＢ及び線維症関連タンパク質をウエスタンブロットにて確認した。ウエスタンブロット像を図１に示す。図１に示されるように、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞内のＣＹＧＢ濃度は時間依存的に増加した。また、発現していたαＳＭＡは時間依存的に減少した。発現していたＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）も時間依存的に減少し、４８時間後には消失した。なお、ＧＡＰＤＨはハウスキーピングタンパク質である。なお、ウエスタンブロットは３回独立して実験し、再現性を確認した。【００５９】
また、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを含まない（０μｇ／ｍＬ）リン酸緩衝溶液、並びに、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、又は８０μｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液中に含む溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、細胞内ＣＹＧＢをウエスタンブロットにて確認した。ウエスタンブロット像を図２に示す。図２に示されるように、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞内のＣＹＧＢ濃度は用量依存的に増加し、４０μｇ／ｍＬ以上でプラトーに達した。また、発現していたαＳＭＡ、及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は用量依存的に減少した。なお、ウエスタンブロットは３回独立して実験し、再現性を確認した。【００６０】
（線維症関連遺伝子の転写に及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果）
４０μｇ／ｍＬのＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをリン酸緩衝溶液中に含む溶液を調製し、０〜４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、暴露前（０分）、並びに暴露開始後１時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点におけるαＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１（Transforming growth factor β-1）のｍＲＮＡ量を測定した。その結果、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞におけるαＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１のｍＲＮＡ発現量が時間依存的に低下したことを確認した。【００６１】
また、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを含まない（０μｇ／ｍＬ）リン酸緩衝溶液、並びに、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、又は４０μｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、αＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１のｍＲＮＡ量を測定した。結果を図３に示す。図３に示されるように、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞において、αＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１のｍＲＮＡ発現は用量依存的に低下した。また、いずれの線維症関連遺伝子についても、わずか１０μｇ／ｍＬの用量で転写量の有意な低下が認められ、αＳｍａについては、わずか５μｇ／ｍＬの用量でも転写量の有意な低下が認められた。【００６２】
（初代培養ヒト星細胞に対する効果）
なお、ＨＨＳｔｅＣ細胞の代わりに、ユニバーシティーカレッジロンドンから提供された初代培養ヒト星細胞を用い、上述と同様の試験を行った。その結果、線維症関連タンパク質の発現に及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果、及び線維症関連遺伝子の転写に及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果のいずれについても、図１〜図３と同様の結果が得られた。【００６３】
試験例２：肝線維化モデルに及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
本試験例では、試験例１で調製されたＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢについて、チオアセトアミド（ＴＡＡ）で誘発される肝炎・肝線維化マウスモデルに対する効果を検証した。【００６４】
次の３群の肝炎・肝線維化マウスモデルを作製した。
（ｉ：ＴＡＡモデル）ＴＡＡを１０週間、週２回、腹腔内投与した。投与期間中に、ＴＡＡ投与量を、５０ｍｇ／ｋｇから４００ｍｇ／ｋｇに漸増した。また、６週間目〜１０週目の５週間は、ＴＡＡに加えて生理食塩水を、週２回、尾静脈から静脈投与した（コントロール）。
（ii：ＴＡＡ−ＣＹ２モデル）ＴＡＡを上記（ｉ）と同様に１０週間腹腔内投与し、９週目〜１０週目の２週間は、ＴＡＡに加えて、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを、２ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、尾静脈から静脈投与した。
（iiiＴＡＡ−ＣＹ５モデル）ＴＡＡを上記（ｉ）と同様に１０週間腹腔内投与し、６週目〜１０週目の５週間は、ＴＡＡに加えて、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを、２ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、尾静脈から静脈投与した。
投与量はパイロットスタディーの結果に基づいて決定した。【００６５】
上記３群における血清中のＡＳＴ及びＡＬＴレベルの測定結果を図４に示す。図４に示すように、ＴＡＡ投与により血清中ＡＳＴ、ＡＬＴはそれぞれ１５７．９、１３０．１ＩＵ／Ｌへと上昇した一方、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを２週間投与した群（ＴＡＡ−ＣＹ２）ではそれらの値がそれぞれ８８．４、５０．１ＩＵ／Ｌへと有意に低下し（ｐ＜０．０１）、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを５週間投与した群（ＴＡＡ−ＣＹ５）ではさらに６５．９、５１．５ＩＵ／Ｌへと有意に低下した（ｐ＜０．００１）。つまり、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢ投与によって血清中ＡＳＴ・ＡＬＴレベルが有意に低下したことが認められた。【００６６】
上記３群における線維症関連遺伝子αＳｍａ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆβ−１、Ｔｇｆβ−３、Ｔｉｍｐ−１  と  炎症性因子  Ｔｎｆ−α、Ｃｃｌ−２、Ｃｘｃｌ−２それぞれのｍＲＮＡを測定した結果を図５に示す。図５に示すように、いずれのｍＲＮＡへの転写も、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの投与によって有意に低減されることが認められた。【００６７】
上記３群について、肝臓組織を、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオジン）染色；コラーゲン繊維を染色するためのＳｉＲ（シリウスレッド）染色；並びに星細胞活性化マーカーαＳＭＡ、好中球マーカーＮｅｕ、及びマクロファージマーカーＣＤ６８を核対比染色するためのＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色に供した。結果を図６に示す。図６のＨ＆Ｅ染色及びシリウスレッド染色の結果に示されるとおり、組織学的にも、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの投与によって線維化反応が抑制されたことを確認した。また、図６のαＳＭＡ−ＤＡＰＩ、Ｎｅｕ−ＤＡＰＩ、及びＣＤ６８−ＤＡＰＩの染色結果に示されるとおり、星細胞活性化マーカーであるαＳＭＡ、好中球マーカーであるＮｅｕ、及びマクロファージマーカーであるＣＤ６８の全ての発現がＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの投与によって低減したことを確認した。【００６８】
試験例３：ＨＨＳｔｅＣ細胞に及ぼすＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢの効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
本試験例では、配列番号１０に示すＴＡＴペプチドタグが配列番号５に示すサイトグロビンのＮ末端に結合した融合ポリペプチドＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを調製し、調製されたＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢについて、星細胞に及ぼす影響を検証した。【００６９】
（ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢの調製）
試験例１で用いたベクターに、ＴＥＶプロテアーゼ認識シークエンスとＴＡＴサイトとを導入し、試験例１と同様にして融合タンパク質を誘導した。誘導された融合タンパク質は、ＴＡＴタグだけでなくＨｉｓタグも有しているため、ＴＥＶプロテアーゼで融合タンパク質を処理することでＨｉｓタグを除去した。これによって、ＴＡＴペプチドタグがサイトグロビンに結合したＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを得た。なお、調製されたＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢは、配列番号１４に示す配列を有している。【００７０】
（線維症関連タンパク質の発現に及ぼすＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢの効果）
細胞株のＨＨＳｔｅＣ細胞を実験に用いた。４０μｇ／ｍＬのＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢをリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、０〜４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、暴露前（−）、並びに暴露開始後０．２５時間、０．５時間、１時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点における細胞内ＣＹＧＢ及び線維症関連タンパク質を測定した。結果を図７に示す。図７に示されるように、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞内のＣＹＧＢ濃度は時間依存的に増加し、発現していたαＳＭＡ及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は時間依存的に減少した。なお、ＧＡＰＤＨはハウスキーピングタンパク質である。【００７１】
また、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを含まない（−）リン酸緩衝溶液、並びに、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを０．８μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水中に含むリン酸緩衝溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、細胞内ＣＹＧＢを測定した。結果を図８に示す。図８に示されるように、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞内のＣＹＧＢ濃度は用量依存的に増加した。また、発現していたαＳＭＡ、及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は用量依存的に減少した。【００７２】
（線維症関連遺伝子の転写に及ぼすＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの効果）
４０μｇ／ｍＬのＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢをリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、０〜４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、暴露前（Ｓ−）、並びに暴露開始後１時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点におけるαＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１（Transforming growth factor β-1）のｍＲＮＡ量を測定した。その結果、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞におけるαＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１のｍＲＮＡ発現量が時間依存的に低下したことを確認した。【００７３】
また、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを含まない（０μｇ／ｍＬ）リン酸緩衝溶液、並びに、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、又は８０μｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、αＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１（Transforming growth factor β-1）のｍＲＮＡ量を測定した。結果を図９に示す。図９に示されるように、TAT−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞におけるαＳｍａ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｇｆβ−１（Transforming growth factor β-1）のｍＲＮＡ発現量は用量依存的に低下した。【００７４】
試験例４：細胞透過性の比較（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
本試験例では、タグを有しない野生型サイトグロビンＣＹＧＢ（配列番号５のアミノ酸配列を有するもの；Ｎａｔｉｖｅ−ＣＹＧＢ）、試験例１で調製されたオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビン（Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢ）及び試験例３で調製されたＴＡＴペプチドタグを有するサイトグロビン（ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ）について、細胞膜透過性を検証した。【００７５】
まず、野生型サイトグロビン（Ｎａｔｉｖｅ−ＣＹＧＢ）、及びオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビン（Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢ）を用意し、いずれもそれぞれ４０μｇ／ｍＬを生理食塩水中に含む溶液に調製し、それぞれの溶液を、ＨＨＳｔｅＣ細胞に４８時間暴露した。暴露後４８時間時点における細胞内のＣＹＧＢ発現をウエスタンブロットにて解析した。その結果を図１０に示す。図１０に示されるように、Ｎａｔｉｖｅ−ＣＹＧＢ自体に細胞膜透過性が認められた。さらにサイトグロビンにタグを付すことによって、細胞膜透過性が向上することが認められた。なお、Ｎａｔｉｖｅ−ＣＹＧＢの細胞膜透過性を基準として、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの細胞膜透過性は１７０％向上した。【００７６】
次に、オリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビン（Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢ）、及びＴＡＴペプチドタグの両方を有するサイトグロビン（ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを、いずれもそれぞれ４０μｇ／ｍＬを生理食塩水中に含む溶液を調製し、それぞれの溶液を、ＨＨＳｔｅＣ細胞に４８時間暴露した。暴露前（−）、並びに暴露後０．２５時間、０．５時間、１時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点における細胞内のＣＹＧＢ発現をウエスタンブロットにて解析した。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、オリゴヒスチジンタグを有するＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢと、ＴＡＴペプチドタグを有するＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢとでは、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢの方がより迅速に（具体的には０．２５時間の時点で）細胞内濃度がプラトーに達したことから、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢの方が細胞膜透過性により優れることを確認した。しかしながら、試験例１（具体的には、図３）と試験例３（具体的には、図９）との対比で示されるとおり、細胞膜透過性により劣るＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの方が、より低用量で線維化関連遺伝子の転写を抑制することができる。【００７７】
試験例５：ＨＨＳｔｅＣ細胞中におけるタグ−ｒｈＣＹＧＢ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
本試験例では、試験例１で調製されたオリゴヒスチジンタグを有するサイトグロビン（Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢ）及び試験例３で調製されたＴＡＴペプチドタグを有するサイトグロビン（ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ）について、ＨＨＳｔｅＣ細胞中における存在態様を検証した。【００７８】
（Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢのＨＨＳｔｅＣ細胞中における存在態様）
（１）Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒでラベル化し、生理食塩水中１０μｇ／ｍＬに調製し、ＨＨＳｔｅＣ細胞に４８時間暴露した。暴露後の細胞を、リソソーム、及び小胞体についてマーカー多重染色を行った。また、ＤＡＰＩで核酸を染色した。結果を図１２（ａ）に示す。図１２（ａ）に示すように、ＨＨＳｔｅＣ細胞に取り込まれたＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢは、リソソームに局在するが、小胞体には存在しないことが分かった。【００７９】
（２）Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８でラベル化し、生理食塩水中１０μｇ／ｍＬに調製し、ＨＨＳｔｅＣ細胞に２４時間暴露した。暴露後の細胞に対して、リソソームのオルガネラマーカー（LysoTracker、Molecular Probes、USA；１００ｎＭ；１５分、３７℃、５％ＣＯ2）、ミトコンドリアのオルガネラマーカー（MitoTracker、Molecular Probes；１００ｎＭ；１５分、３７℃、５％ＣＯ2）、小胞体のオルガネラマーカー（ER-Tracker、Molecular Probes；０．５μＭ；１５分、３７℃、５％ＣＯ2）、初期エンドソームのオルガネラマーカー（Early Endosomes-RFP、Thermo Fisher Scientific；３７℃、５％ＣＯ2）後期エンドソームのオルガネラマーカー（Late Endosomes-RFP、Thermo Fisher Scientific；３７℃、５％ＣＯ2）による二重免疫蛍光染色を行った。なお、核の対比染色にHoechst 33258（Thermo Fisher Scientific）を用いた。各オルガネラマーカーでの処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Zeiss LSM 800共焦点顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy、Germany）で細胞内局在を観察し、Pearson値により共局在を決定した。結果を図１２（ｂ）に示す。【００８０】
図１２（ｂ）から明らかなように、ＨＨＳｔｅＣ細胞に取り込まれたＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢは、ミトコンドリア、初期エンドソーム、後期エンドソーム、及びリソソームに局在するが、小胞体には存在しないことが分かった。【００８１】
（ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢのＨＨＳｔｅＣ細胞中における存在態様）
ＨＨＳｔｅＣ細胞を２群用意し、一方をコントロール（No treatment）群、他方をＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ投与群とした。ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ投与群においては、１０μｇ／ｍＬのＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢを４８時間暴露した。コントロール群とＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ投与群それぞれについて、ＣＹＧＢ、ＳＭＡ、及びＤＡＰＩ染色を行った。ＣＹＧＢは赤、αＳＭＡは緑、ＤＡＰＩ（ＤＡＰＩによる核対比染色）は青で染色される。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ投与群ではＣＹＧＢの染色が細胞内で均一に存在することが認められたため、ＨＨＳｔｅＣ細胞に取り込まれたＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢは細胞内に均一に存在することが分かった。なお、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ投与群ではαＳＭＡの染色が減弱したことが認められたため、ＴＡＴ−ｒｈＣＹＧＢ投与によりαＳＭＡの発現が低下したことも確認できた。【００８２】
試験例６：ＨＨＳｔｅＣ細胞に及ぼす６Ｒ−ＣＹＧＢの効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）（比較例）
本試験例では、比較用の６Ｒペプチドタグ（GRRRRRRRAS：配列番号１５）が配列番号５に示すサイトグロビンのＮ末端に結合した融合ポリペプチド６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢを調製し、調製された６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢについて、星細胞に及ぼす影響を検証した。【００８３】
（６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢの調製）
試験例１で用いたベクターに、ＴＥＶプロテアーゼ認識シークエンスと６Ｒサイトとを導入し、試験例１と同様にして融合タンパク質を誘導した。誘導された融合タンパク質は、６ＲタグだけでなくＨｉｓタグも有しているため、ＴＥＶプロテアーゼで融合タンパク質を処理することでＨｉｓタグを除去した。これによって、６Ｒペプチドタグがサイトグロビンに結合した６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢを得た。なお、調製された６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢは、配列番号１６に示す配列を有している。【００８４】
（線維症関連タンパク質の発現に及ぼす６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢの効果）
細胞株のＨＨＳｔｅＣ細胞を実験に用いた。４０μｇ／ｍＬの６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢをリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、０〜４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、暴露前（−）、並びに暴露開始後１時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点における細胞内ＣＹＧＢ及び線維症関連タンパク質を測定した。結果を図１４に示す。図１４では、試験例１の６Ｒ−ＣＹＧＢの４８時間の時点における結果を併せて示している。図１４に示されるように、６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞内のＣＹＧＢ濃度は時間依存的に増加したが、発現していたαＳＭＡ及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）の量は変わらなかった。なお、ＧＡＰＤＨはハウスキーピングタンパク質である。【００８５】
また、６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢを含まない（−）リン酸緩衝溶液、並びに、６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢを５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、又は８０μｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水中に含むリン酸緩衝溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、細胞内ＣＹＧＢを測定した。結果を図１５に示す。図１５に示されるように、６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞内のＣＹＧＢ濃度は用量依存的に増加したが、発現していたαＳＭＡ、及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）の量は用量に関わらず変化しなかった。【００８６】
（線維症関連遺伝子の転写に及ぼす６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢの効果）
６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢを含まない（０μｇ／ｍＬ）リン酸緩衝溶液、並びに、６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢを５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、又は８０μｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、αＳｍａのｍＲＮＡ転写量を測定した。結果を図１６に示す。図１６に示されるように、６Ｒ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞におけるαＳｍａのｍＲＮＡ転写量は用量に関わらず変化しなかった。【００８７】
試験例７：サイトグロビンの鉄ヘム結合と抗線維化効果（参考例）
本試験例では、野生型のサイトグロビンのヘムに含まれる鉄イオンをコバルトイオンに置き換えたＣｏ−ＣＹＧＢの、ＨＨＳｔｅＣ細胞の抗線維化に及ぼす効果を検証した。【００８８】
（サイトグロビンのコバルト置換）
以下のようにして、サイトグロビンに結合しているヘムに含まれる鉄イオンをコバルトイオンに置き換えた。まず、野生型サイトグロビンの補助分子族を除去することでアポタンパク質（Ａｐｏ−ＣＹＧＢ）を調製し、コバルト−プロトポルフィリン（Ｃｏ−ＰＰＩＸ）をＡｐｏ−ＣＹＧＢに挿入することでＣｏ−ＣＹＧＢを作製した。Ｃｏ−ＣＹＧＢをＰＤ−１０カラムで精製し、リン酸緩衝液で平衡化した。Ｃｏ−ＣＹＧＢの紫外線吸収スペクトルは、波長４２６ｎｍのコバルトピークで確認した。【００８９】
（線維症関連タンパク質の発現に及ぼすＣｏ−ＣＹＧＢの効果）
Ｃｏ−ＣＹＧＢを４０μｇ／ｍＬの濃度でＨＨＳｔｅＣ細胞に４０時間暴露し、細胞内ＣＹＧＢ及び線維症関連タンパク質を測定した（Ｃｏ−ＣＹ−１，Ｃｏ−ＣＹ−２）。結果を図１７に示す。図１７では、ＨＨＳｔｅＣ細胞にＣｏ−ＣＹＧＢを暴露しなかったことを除いて同様の操作を行った場合（Ｃｏｎｔ−１，Ｃｏｎｔ−２）、及びＣｏ−ＣＹＧＢの代わりに野生型サイトグロビンを同様の条件で暴露した場合（ＰＣ１，ＰＣ２）の結果を併せて示している。【００９０】
図１７に示されるように、サイトグロビンのヘム鉄をコバルトに置き換えたＣｏ−ＣＹ−１，Ｃｏ−ＣＹ−２では、野生型サイトグロビンを暴露したＰＣ１，ＰＣ２とは異なり、サイトグロビンを暴露しなかったＣｏ−ＣＹ−１，Ｃｏ−ＣＹ−２と同様に、発現していたαＳＭＡ及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）の量は変化しなかった。なお、ＧＡＰＤＨはハウスキーピングタンパク質である。この結果から、ヘム鉄のコバルトへの置換がサイトグロビンの抗線維化効果を阻害すること、つまり、サイトグロビンの鉄ヘム活性が抗線維化効果に関連していることが示された。【００９１】
（線維症関連遺伝子の転写に及ぼすＣｏ−ＣＹＧＢｓの効果）
Ｃｏ−ＣＹＧＢを含まない（Ｓ−）リン酸緩衝溶液、並びに、Ｃｏ−ＣＹＧＢを４０μｇ／ｍＬの濃度（Ｃｏ−ｃｙｇｂ４０）でリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、αＳｍａのｍＲＮＡ転写量を測定した。結果を図１８に示す。図１８に示されるように、Ｃｏ−ｒｈＣＹＧＢに暴露された細胞におけるαＳｍａのｍＲＮＡ転写量の量に変化は無かった。この結果からも、ヘム鉄のコバルトへの置換がサイトグロビンの抗線維化効果を阻害すること、つまり、サイトグロビンの鉄ヘム結合が抗線維化効果に関連していることが示された。【００９２】
試験例８：各種サイトグロビンタンパク質と抗線維化効果
本試験例では、全長サイトグロビンの部分タンパク質のＨｉｓタグ修飾体について、抗線維化効果を検証した。【００９３】
（サイトグロビンタンパク質）
検証したサイトグロビンタンパク質は以下の通りである。
・ｐｐ１：全長サイトグロビン（配列番号５）の１〜２０番目（配列番号１７）（比較用）
・ｐｐ２：全長サイトグロビン（配列番号５）の７５〜９５番目（配列番号１８）（比較用）
・ｐｐ３：全長サイトグロビン（配列番号５）の７５〜１２０番目（配列番号１９）（比較用）
・ｐｐ４：全長サイトグロビン（配列番号５）の１８〜１７０番目（配列番号１）
・ｐｐ５：全長サイトグロビン（配列番号５）の４〜１７６番目（配列番号２）
・ｐｐ６：全長サイトグロビン（配列番号５）の１８〜１９０番目（配列番号３）
・ｐｐ７：全長サイトグロビン（配列番号５）の４〜１９０番目（配列番号４）
・ｐｐ８（ＣＹＧＢ）：全長サイトグロビン（配列番号５）【００９４】
これらｐｐ１〜ｐｐ８について、亜ジチオン酸塩による還元状態の鉄ヘム活性を、可視吸収スペクトルを用いて調べた。結果を図１９に示す。なお、鉄ヘム活性が認められる場合、通常、５００〜６００ｎｍ領域に２つのピークが約１：３の比率で得られる。図１９に示されるように、ｐｐ４、ｐｐ５、ｐｐ６、ｐｐ７、ｐｐ８について、５００〜６００ｎｍ領域に２つのピークが約１：３の比率で認められ、鉄ヘム活性があることが分かった。【００９５】
（線維症関連タンパク質の発現に及ぼすＨｉｓ−ｐｐ４の効果）
細胞株のＨＨＳｔｅＣ細胞を実験に用いた。Ｈｉｓ−ｐｐ４を含まない（０μｇ／ｍＬ）リン酸緩衝溶液、並びに、Ｈｉｓ−ｐｐ４を５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、又は８０μｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水中に含むリン酸緩衝溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、細胞内ＣＹＧＢを測定した。結果を図２０に示す。図２０に示されるように、Ｈｉｓ−ｐｐ４に暴露された細胞内に発現していたαＳＭＡ、及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は用量依存的に減少した。なお、ＧＡＰＤＨはハウスキーピングタンパク質である。【００９６】
（線維症関連遺伝子の転写に及ぼすＨｉｓ−ｐｐ４の効果）
Ｈｉｓ−ｐｐ４を含まない（０μｇ／ｍＬ）リン酸緩衝溶液、並びに、Ｈｉｓ−ｐｐ４を１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、又は８０μｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液に含む溶液を調製し、４８時間、ＨＨＳｔｅＣ細胞に暴露し、αＳｍａのｍＲＮＡ転写量を測定した。結果を図２１に示す。図２１に示されるように、Ｈｉｓ−ｐｐ４に暴露された細胞におけるαＳｍａのｍＲＮＡ転写量は用量依存的に低下した。【００９７】
（線維症関連タンパク質の発現、線維症関連遺伝子の転写に及ぼす他のサイトグロビンタンパク質の効果）
Ｈｉｓ−ｐｐ５〜Ｈｉｓ−ｐｐ７及びＨｉｓ−ｐｐ１〜Ｈｉｓ−ｐｐ３についても上記と同様に線維症関連タンパク質の発現に及ぼす影響を検証した。Ｈｉｓ−ｐｐ１については、線維症関連遺伝子の転写に及ぼす影響も検証した。Ｈｉｓ−ｐｐ５〜Ｈｉｓ−ｐｐ７の結果を図２２〜図２４に示す。また、Ｈｉｓ−ｐｐ１の結果を図２５（線維症関連タンパク質の発現結果）及び図２６（線維症関連遺伝子の転写結果）を示し、Ｈｉｓ−ｐｐ２及びＨｉｓ−ｐｐ３の結果を図２７及び図２８に示す。なお、図中のＰＣは、Ｈｉｓ−ｐｐ８（Ｈｉｓ−ＣＹＧＢ）の結果を示す。【００９８】
図２２〜図２４から明らかな通り、Ｈｉｓ−ｐｐ５〜Ｈｉｓ−ｐｐ７に暴露された細胞内に発現していたＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は用量依存的に減少した。図２０、図２２〜図２４の結果を対比すると、特に、Ｈｉｓ−ｐｐ５、Ｈｉｓ−ｐｐ７、Ｈｉｓ−ｐｐ８（ＰＣ；Ｈｉｓ−ＣＹＧＢ）においてＣＯＬ１Ａ１低減効果が高かった。【００９９】
一方で、図２５，２７，２８から明かな通り、Ｈｉｓ−ｐｐ１〜Ｈｉｓ−ｐｐ３に暴露された細胞内に発現していたＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は用量に関わらず変化しなかった。なお、図２６に示すようにＨｉｓ−ｐｐ１に暴露された細胞におけるαＳｍａの転写量にも変化はなかった。【０１００】
以上の結果より、抗線維化効果の発現に、少なくともｐｐ４が有するアミノ酸配列（配列番号１）が必要であることが分かった。【０１０１】
試験例９：肝炎・肝線維化モデルに及ぼすＨｉｓ−ＣＹＧＢ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスをグループ１（Ｃｏｎｔ），グループ２（ＤＤＣ４ｗ），グループ３（ＤＤＣ４ｗ−ｒｈＣＹ２ｗ）（各群ｎ＝９）に分けた。グループ１（Ｃｏｎｔ）には通常食を、グループ２（ＤＤＣ４ｗ）には０．１重量％３、５−ジエトキシカルボニル−１、４−ジヒドロコリジン添加食（ＤＤＣ食）を、いずれも４週間給餌し、３週目と４週目では２回／週の頻度で生理食塩水を尾静脈注射した。グループ３（ＤＤＣ４ｗ−ｒｈＣＹ２ｗ）にはＤＤＣ食を４週間給餌し、３週目と４週目では１日１回２回／週の頻度、２ｍｇ／ｋｇ体重の容量で尾静脈注射した。グループ２及びグループ３は、ＤＤＣ誘発マウス胆汁うっ滞モデル（肝炎・肝線維化モデル）である。マウスは最後の腹腔内注射の２日後に屠殺し、血清及び肝臓組織を採取した。【０１０２】
血清中のＡＳＴ値及びＡＬＴ値の測定を図２９に示す。図２９に示すように、グループ２（ＤＤＣ４ｗ）ではグループ１（Ｃｏｎｔ）より血清中ＡＳＴ、ＡＬＴはそれぞれ４２３．３ＩＵ／Ｌ、２０５．１ＩＵ／Ｌへと上昇しており、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢを２週間投与したグループ３（ＤＤＣ４ｗ−ｒｈＣｙ２ｗ）ではそれらの値がそれぞれ２６６．９ＩＵ／Ｌ、１２９．５ＩＵ／Ｌへと有意に低下した（ｐ＜０．０５）。つまり、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢ投与によって肝炎・肝線維化モデルの血清中ＡＳＴ・ＡＬＴレベルが有意に低下したことが認められた。【０１０３】
また、線維症関連遺伝子αＳｍａ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆβ−１、Ｔｇｆβ−３及び炎症性因子Ｔｎｆ−α、Ｃｃｌ−２それぞれのｍＲＮＡ転写量の測定結果を図３０に示す。図３０に示すように、いずれのｍＲＮＡ転写量も、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの投与によって有意に低減された。【０１０４】
更に、グループ１（Ｃｏｎｔ），グループ２（ＤＤＣ４ｗ），グループ３（ＤＤＣ４ｗ−ｒｈＣＹ２ｗ）の肝組織について、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオジン）染色；コラーゲン線維を染色するためのＳｉＲ（シリウスレッド）染色；並びに星細胞活性化マーカーαＳＭＡ、好中球マーカーＮｅｕ、及びマクロファージマーカーＣＤ６８，胆管細胞マーカーＣＫ１９を核対比染色するためのＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色に供した。結果を図３１に示す。図３１のＨ＆Ｅ染色及びシリウスレッド染色の結果に示されるとおり、組織学的にも、Ｈｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの投与によって線維化反応が抑制されたことが示された。また、図３１のαＳＭＡ−ＤＡＰＩ、Ｎｅｕ−ＤＡＰＩ、及びＣＤ６８−ＤＡＰＩの染色結果に示されるとおり、星細胞活性化マーカーであるαＳＭＡ、好中球マーカーであるＮｅｕ、及びマクロファージマーカーであるＣＤ６８、胆管細胞マーカーＣＫ１９の全ての発現がＨｉｓ−ｒｈＣＹＧＢの投与によって低減したことが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号１３は、ヒスチジンタグ付きサイトグロビンである。
配列番号１４は、ＴＡＴタグ付きサイトグロビンである。
配列番号１５は、６Ｒペプチドタグである。
配列番号１６は、６Ｒペプチドタグ付きサイトグロビンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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