(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマトキシリン色素と、ヘマトキシリン溶液の総容積に対して約０．２％〜約４％の量の酸とを含み、酸が、塩酸または硫酸であり、ヘマトキシリン溶液が２．４未満のｐＨを有する、安定化ヘマトキシリン製剤。
【請求項２】
ｐＨが、２．３未満、２．２未満、または２．１未満である、請求項１に記載の安定化ヘマトキシリン製剤。
【請求項３】
ｐＨが、約２．１〜約２．２の範囲である、請求項１に記載の安定化ヘマトキシリン製剤。
【請求項４】
媒染剤および酸化剤をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の安定化ヘマトキシリン製剤。
【請求項５】
保存期間延長剤をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の安定化ヘマトキシリン製剤。
【請求項６】
保存期間延長剤が、ポリオールであり、
ポリオールは、プロピレングリコール、エチレングリコール、およびその混合物からなる群から選択されてもよい、請求項５に記載の安定化ヘマトキシリン製剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量のｐＨを上昇させて、約２．４〜約２．６の範囲のｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供することと、生物学的試料を、約２．４〜約２．６の範囲のｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液と接触させることとを含む、生物学的試料を染色する方法。
【請求項８】
安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量のｐＨが、強塩基またはバッファーを含む再調整溶液を添加することにより高められる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
強塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、およびアンモニアからなる群から選択されるか、または
バッファーが、約１．５〜約３．５の範囲のｐＫａを有するか、または
再調整溶液が、保存期間延長剤、酸化剤、および媒染剤からなる群から選択される添加剤を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨが、生物学的試料をヘマトキシリン染色溶液と接触させる前に高められる、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の成分と第２の成分を含むキットであって、
第１の成分は、ヘマトキシリン色素と、安定化ヘマトキシリン製剤の総容積に対して約０．１％〜約１０％の量で酸とを含む、安定化ヘマトキシリン製剤を含み、酸は、塩酸または硫酸であり、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．４未満のｐＨを有し、
第２の成分は、強塩基またはバッファーを含み、第２の成分は、第１および第２の成分が混合されたとき、ヘマトキシリン溶液のｐＨが２．４を上回り上昇するような、第１の成分に対する量で提供される、
キット。
【請求項１２】
第１および第２の成分が混合されたとき、ヘマトキシリン溶液のｐＨが２．５を上回り上昇するような、第１の成分に対する量で第２の成分が提供されるか、または
第１および第２の成分が混合されたとき、ヘマトキシリン溶液のｐＨが、約２．４５〜約２．５４の範囲となるような、第１の成分に対する量で第２の成分が提供されるか、または
第１および第２の成分が混合されたとき、ヘマトキシリン溶液のｐＨが、約２．５〜約２．６の範囲となるような、第１の成分に対する量で第２の成分が提供される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
第１の成分が、媒染剤および酸化剤をさらに含む、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
第１の成分が、保存期間延長剤をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
保存期間延長剤が、ポリオールであり、
ポリオールは、プロピレングリコール、エチレングリコール、およびその混合物からなる群から選択されてもよい、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
第２の成分が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化リチウムからなる群から選択される強塩基を含むか、または
第２の成分が、シアノ酢酸塩、フマル酸塩、および硫酸塩からなる群から選択されるバッファーを含む、
請求項１１から１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
第３の成分をさらに含み、第３の成分が対比染色剤を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５０４，０６６号の出願日の利益を主張し、その開示は、本明細書により参照として本明細書にそのまま援用されている。
【背景技術】
【０００２】
ヘマトキシリンおよびヘマテインを含む組成物は、病理学（固定された細胞学標本、すなわち塗抹または細胞ブロック内の個々の顕微鏡検査）、および組織学（特別な機能を有する構造を形成する細胞凝集物の顕微鏡検査）において一般的に使用される。例えば、ヘマトキシリンおよびヘマテインは、顕微鏡検査前に細胞核を染色するのに多くの場合使用される。
【０００３】
染色は、通常透明な細胞を着色し、分析を容易にする。ヘマトキシリン染色は、浸漬（ディップ・アンド・ダンク）技術を使用して手作業により、またはＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．社より提供されるＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）自動システム等の自動システムを使用することにより実現可能である。染色プロセスは、：（ａ）顕微鏡スライドに固定された標本からパラフィンを除去すること、および標本を水中に浸漬することにより水和させること；（ｂ）ヘマトキシリンを適用して細胞核を染色すること；（ｃ）水で水洗することにより過剰のヘマトキシリンを除去すること；（ｄ）スライドを、５．０より高いｐＨを有する濃縮溶液と接触させて、ヘマトキシリンを青色に変化させること（例えば、青色化溶液）；ならびに（ｅ）水で水洗することにより青色化溶液を除去することを一般的に伴う。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の１つの態様は、２．４未満のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤である。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．３未満のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．２未満のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約２．１〜約２．２の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、沈殿物を含まないまま少なくとも３０日間存続する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は沈殿物を含まないまま少なくとも６０日間存続する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、組織試料を染色するのに適するヘマトキシリン溶液を提供するための再調整溶液で処理され得る。
【０００５】
本開示の別の態様は、溶媒、ヘマトキシリン色素、および酸（例えば、強酸）を含む安定化ヘマトキシリン製剤であり、該酸は安定化ヘマトキシリン製剤中に、安定化ヘマトキシリン製剤の総容積に対して約０．０５％〜約１０％の範囲の量で存在し、そして安定化ヘマトキシリン製剤は２．４未満のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨは２．３未満である。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨは２．２未満である。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約２．１〜約２．２の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、酸は、塩酸、硫酸、過塩素酸、および硝酸からなる群から選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、媒染剤および酸化剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、酸化剤はヨウ素酸ナトリウムであり、および媒染剤はアルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、保存期間延長剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、保存期間延長剤はポリオールである。いくつかの実施形態では、製剤は、ヘマトキシリン色素、媒染剤、酸化剤、および酸から実質的に構成される。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、沈殿物を含まないまま少なくとも３０日間存続する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、沈殿物を含まないまま少なくとも６０日間存続する。
【０００７】
本開示の別の態様は、開始ヘマトキシリン染色組成物（例えば、ヘマトキシリン色素および任意選択的に媒染剤を含む組成物）のｐＨを２．４未満のｐＨまで低下させることを含む、安定化ヘマトキシリン製剤を形成する方法であり、該ｐＨはヘマトキシリン染色組成物に酸を添加することにより下げられる。いくつかの実施形態では、ｐＨは１Ｍの塩酸をヘマトキシリン染色溶液に導入することにより下げられる。いくつかの実施形態では、ｐＨは０．５Ｍの硫酸を使用して下げられる。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨは、２．１〜約２．３の範囲である。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨは、２．１〜約２．２５の範囲である。
【０００８】
本開示の別の態様は、安定化ヘマトキシリン製剤（例えば、２．４未満のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤等）のｐＨを再調整してヘマトキシリン染色溶液を提供する方法であり、該ｐＨは、強塩基またはバッファーのうちの１つを安定化ヘマトキシリン製剤に添加することにより、ｐＨが少なくとも２．４に上昇するまで再調整される。いくつかの実施形態では、事前処方化された強塩基または事前処方化されたバッファーが、安定化ヘマトキシリン製剤に、事前に決定されたｐＨに達するまで漸増添加される。いくつかの実施形態では、事前に決定されたｐＨは、生物学的試料を染色するのに適するｐＨである（例えば、２．４を上回るｐＨ；２．４〜２．７の間のｐＨ；２．４〜２．６の間のｐＨ等）。いくつかの実施形態では、事前に決定されたｐＨは、約２．４〜約２．６の範囲にある。いくつかの実施形態では、事前に決定されたｐＨは、約２．４５〜約２．６の範囲にある。いくつかの実施形態では、事前に決定されたｐＨは、約２．５〜約２．６の範囲にある。いくつかの実施形態では、事前に決定されたｐＨは、約２．５５〜約２．６の範囲にある。いくつかの実施形態では、再調整方法は、得られたヘマトキシリン染色溶液に追加の媒染剤または酸化剤を添加することをさらに含む。
【０００９】
本開示の別の態様は、（ｉ）安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨを上昇させて、染色に適するｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供することと、（ｉｉ）ヘマトキシリン染色溶液を生物学的試料に適用することとを含む生物学的試料を染色する方法である。いくつかの実施形態では、染色に適するｐＨは、２．４〜約２．６の範囲である。いくつかの実施形態では、染色に適するｐＨは、２．５〜約２．６の範囲である。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨは、製剤に事前決定量の強塩基を漸増添加することにより高められる。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨは、製剤に事前決定量のバッファーを漸増添加することにより高められる。
【００１０】
本開示の別の態様は、第１および第２の成分を含むキットであり、第１の成分は２．４未満のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤を含み、第２の成分は再調整溶液を含む。いくつかの実施形態では、再調整溶液は、安定化ヘマトキシリン製剤に対して比較的塩基性である。いくつかの実施形態では、キットは、第１および第２の成分を混合して２．４を上回るｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供するための指示書をさらに含む。いくつかの実施形態では、指示書は、事前に決定されたｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供するために、第１の成分に添加される特定量の第２の成分について記載する。いくつかの実施形態では、第１および第２の成分は、別個のコンテナにそれぞれ収容される。いくつかの実施形態では、第１および第２の成分は、別個の液体ディスペンサー中に提供され、各液体ディスペンサーは、例えば本明細書に開示されるような自動染色機構での使用に適する。
【００１１】
本開示の別の態様は、安定化ヘマトキシリン製剤を含む第１の成分であって、安定化ヘマトキシリン製剤が、ヘマトキシリン色素と、安定化ヘマトキシリン製剤の総容積に対して約０．２％〜約４％の量で酸とを含み、２．４未満のｐＨを有する、第１の成分と、強塩基またはバッファーを含む第２の成分であって、第１および第２の成分が混合されたとき、得られたヘマトキシリン染色溶液のｐＨが２．４を上回り上昇するような、第１の成分に対する量で提供される第２の成分とを含むキットである。いくつかの実施形態では、ｐＨが少なくとも２．５まで上昇するような量の第２の成分が提供される。
【００１２】
本開示の別の態様は、安定化ヘマトキシリン製剤を含む第１のコンテナであって、安定化ヘマトキシリン製剤が、ヘマトキシリン色素と、安定化ヘマトキシリン製剤の総容積に対して約０．１％〜約６％の量で酸とを含み、２．４未満のｐＨを有する、第１のコンテナと、再調整溶液を含む第２のコンテナとを備え、第１および第２のコンテナが、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液を混合して２．４より高いｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供できるように、流体連通している（例えば混合容器を介して）、生物学的試料（基材、例えば顕微鏡スライド上に取り付けられた生物学的試料等）を染色するためのシステムである。いくつかの実施形態では、得られたヘマトキシリン染色溶液のｐＨは２．４５を上回る。いくつかの実施形態では、得られたヘマトキシリン染色溶液のｐＨは２．５を上回る。
【００１３】
標準的なヘマテイン染色手順は、ヘマトキシリン−ヘマテインおよび媒染剤の両方を含有する事前混合されたストックを利用する。多くの場合この事前混合されたストックの中で沈殿物が生ずる。これは、スライドが、コンテナ、例えばガラスコンテナ等内のヘマトキシリン染色溶液を用いて処理されるマニュアル染色手順では一般的に問題ではない。ただし、沈殿物が、送達ラインを汚染しまたは詰まらせ、そして送達ラインの洗浄またはパージングを困難にするおそれのある自動染色システムでは問題となり得る。染色溶液内で生ずるヘマトキシリンの変化および沈殿物は、染色のばらつきを引き起こすおそれがある。例えば、媒染剤を含有するヘマトキシリン染色ストックは、多くの場合長期にわたり熟成が進み、ヘマテイン−媒染剤複合体の生成を可能にする。このプロセスは良好な染色結果を可能にし得る一方、望ましくない沈殿物の形成も引き起こす。
【００１４】
チューブ、バルブ、ディスペンスマニフォールド等の表面に蓄積したヘマテイン沈殿物は、オンスライド沈殿物からヘマトキシリンディスペンスの障害または閉塞に及ぶ影響を有し得る。沈殿は、金属との接触によっても悪化する。これは、沈殿物により詰まるおそれのある極小径の開口部を有する金属部品、例えばノズルおよびスプレーヘッド等を含有する自動システムにとって特に問題である。スライド上の沈殿物の場合、影響は、病理学者がスライドを読み取る際にわずらわしさを感じる程度の、低いものから、診断上の有用性に影響を及ぼすほどに高いものまであり得る。染色モジュール内に沈殿物がかなり蓄積すると、この問題を緩和するために、部品交換、または最悪の場合には染色モジュール全体の交換が必要となるおそれがある。当業者は、何らかのヘマトキシリン沈殿物が染色剤の診断上の有用性に影響を及ぼす可能性があることも認識する。
【００１５】
出願者らは、沈殿物の実質的な形成を伴わない、安定化ヘマトキシリン製剤の長期保管を可能にする２パートヘマトキシリン染色組成物を開発した。実際、出願者らは、低ｐＨ（例えば、約２．４未満のｐＨ）においてヘマトキシリン染色溶液を最初に製剤化することにより、容易に沈殿しない安定なヘマトキシリン製剤を提供することが可能であることを実証した。出願者らは、この低ｐＨにおいて、溶液は、数週間または数カ月さえも安定に保管され、そして存続し得ることを驚くべきことに発見した。出願者らは、提案された安定化ヘマトキシリン製剤が、複雑な化学的変換を伴わずに、任意の診断用途で容易に使用可能であることをさらに提示する。実際には、溶液が組織を染色するのに使用される時に、本明細書に開示される安定化ヘマトキシリン製剤は、染色するのに適するレベル（例えば、約２．４５〜約２．６の範囲のｐＨ）まで安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨを復元する、事前処方化された再調整溶液と混合され得る。このようなその他の思いがけない優れた結果が、本明細書にさらに記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２．１６、２．２６、２．３７、および２．４８（ｐＨは塩酸を使用して下げられている）のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤を含む４つのチューブについて例証する図である。６０℃で７日間インキュベートしたとき、２．１６および２．２６のｐＨを有するチューブでは、最小量の沈殿物が認められた。
【図２】２．１６、２．２６、２．３７、および２．４８（ｐＨは塩酸を使用して下げられている）のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤を含む４つのチューブについて例証する図である。４５℃で３０日間インキュベートしたとき、２．１６および２．２６のｐＨを有するチューブでは、最小量の沈殿物が認められた。
【図３】２．１６、２．２５、２．３３、２．４３、および２．５３（ｐＨは硫酸を使用して下げられている）のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤を含む５つのチューブについて例証する図である。６０℃で７日間インキュベートしたとき、２．１６および２．２５のｐＨを有するチューブでは、最小量の沈殿物が認められた。
【図４】２．１６、２．２５、２．３３、２．４３、および２．５３（ｐＨは硫酸を使用して下げられている）のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤を含む５つのチューブについて例証する図である。４５℃で２９日間インキュベートしたとき、２．１６および２．２５のｐＨを有するチューブでは、最小量の沈殿物が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
概要
本開示は、ヘマトキシリン染色溶液中での沈殿物の蓄積を緩和または防止するための方法および組成物を提供する。本明細書に開示される方法および組成物の結果として、自動ヘマトキシリン染色機構のヘマトキシリン保管コンテナ、送達ライン、ノズル、液体ディスペンサー、およびその他の試薬送達コンポーネントは、実質的に沈殿物を含まないまま存続し得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、長期間、例えば１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、９カ月、１２カ月、またはそれより長い期間、実質的に沈殿物を含まないまま存続する安定化ヘマトキシリン製剤を提供する。保管後、本開示は、自動染色機構における安定化ヘマトキシリン製剤の使用を促進する方法および組成物を提供する。本開示のその他の態様は、生物学的試料を染色する方法、特にヘマトキシリン染色溶液を用いて生物学的試料を染色する自動化された方法と関連する。
【００１９】
定義
反例が明確に示されない限り、２つ以上の工程または行為が含まれる、本明細書において主張される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、該方法の工程または行為が列挙される順序に必ずしも限定されないものとやはり理解されるべきである。
【００２０】
本明細書で使用する場合、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈において別途明示されない限り、複数形の指示物が含まれる。同様に、単語「または」には、文脈において別途明示されない限り、「および」が含まれるように意図されている。用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は包含的に定義され、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。
【００２１】
慣用句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、そのように結びつけられる複数の要素のうちの「いずれか、または両方」を意味する、すなわち複数の要素は、あるケースでは結合的に存在し、そしてその他のケースでは非結合的に存在することを意味するものと理解すべきである。「および／または」を用いて列挙されている複数の要素は、同様に、すなわちそのように結びつけられている複数の要素のうちの「１つまたは複数」と解釈されるべきである。「および／または」の節により特に識別される要素以外のその他の要素が、特に識別された要素に関連するまたは関連しないに関わらず任意選択的に存在する場合もある。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」という記述は、非制限的言語、例えば「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等と連携して使用されるとき、１つの実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意選択的に含む）；なおも別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（その他の要素を任意選択的に含む）等を意味し得る。
【００２２】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、１つまたは複数の要素のリストと関連する慣用句「少なくとも１つの」は、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、しかし要素のリスト内に特に列挙されている要素それぞれについて少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、また要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除しないものと理解すべきである。この定義は、慣用句「少なくとも１つ」が関係する要素のリスト内で特に識別された要素以外の要素が、特に識別された要素と関連するまたは関連しないに関わらず、任意選択的に存在し得ることも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、等価的に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、等価的に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂは存在せず、任意選択的に２つ以上含む、少なくとも１つ、Ａ（およびＢ以外の要素を任意選択的に含む）；別の実施形態では、Ａは存在せず、任意選択的に２つ以上を含む、少なくとも１つ、Ｂ（およびＡ以外の要素を任意選択的に含む）；なおも別の実施形態では、任意選択的に２つ以上を含む、少なくとも１つ、Ａ、および任意選択的に２つ以上を含む、少なくとも１つ、Ｂ（およびその他の要素を任意選択的に含む）等を意味し得る。
【００２３】
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」等は、交換可能に使用され、そして同一の意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」等は、交換可能に使用され、そして同一の意味を有する。特に、用語のそれぞれは、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と整合するように定義され、そしてオープン・タームの意味「少なくとも下記の」として解釈され、また追加の特性、制限、側面等を除外しないものとやはり解釈される。したがって、例えば「成分ａ、ｂ、およびｃを有するデバイス」は、デバイスには少なくとも成分ａ、ｂ、およびｃが含まれることを意味する。同様に、慣用句：「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」とは、方法には少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃが含まれることを意味する。さらに、工程およびプロセスは、本明細書において特定の順序で概説され得るが、当業者は、工程およびプロセスの順序は変化し得ることを認識する。
【００２４】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「または」は、上記で定義したような「および／または」と同一の意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト内で項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包含的である、すなわち複数の要素の数またはリストのうちの少なくとも１つ、および任意選択的に追加の列挙されない項目が含まれるが、ただし２つ以上もやはり含まれるものと解釈されなければならない。明確に反例が示された用語に限り、例えば「のうちの１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用されるときの「からなる」等は、複数の要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素が含まれることを意味する。一般的に、用語「ｏｒ」は、本明細書で使用する場合、排他性の用語、例えば「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」等が先行するとき、代替物の排除を示すものとのみ解釈されねばならない（すなわち、「１つまたは他方、しかし両方ではない」）。「から実質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、その特許法の分野で使用される通常の意味を有さなければならない。
【００２５】
用語「生物学的試料」とは、生物学的実体、例えば動物等から得られる、さもなければそれに由来する任意の試料、例えば、ヒトまたは獣医学的動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、またはウシ等から得られる試料を指す。生物学的試料の例として、細胞学試料、組織試料および生体液が挙げられる。非限定的で具体的な生物学的試料の例として、血液、尿、カウパー液、乳頭吸引液、精液、ミルク、痰、粘液、胸膜液、骨盤液、滑液（sinovial fluid）、腹水、体腔洗浄液、アイブラッシング、皮膚擦過検体、バッカルスワブ、膣腔スワブ、パップスメア、直腸スワブ、吸引液、針生検、例えば手術または検死により取得される組織の切片、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、汗、涙液、唾液、腫瘍、臓器、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞または組織培養から得られる試料が挙げられる。一般的に、試料は、固定化され、水を取り除くために処理され、およびパラフィンまたは組織切片に切断するのに適する別の蝋状物質に包埋された生検試料である。生物学的試料は、処理および／または検査するために、基材、例えば顕微鏡スライド等上に取り付けられ得る。
【００２６】
用語「媒染剤」とはイオン性の金属種を指し、それと共に、色素（例えばヘマテイン等）は、該色素（例えば、ヘマテイン等）を特定の細胞成分、例えば核のＤＮＡ、ミエリン、弾性線維およびコラーゲン線維、筋肉の横紋、およびミトコンドリア等に結合させるように機能する複合体（例えば、カチオン性の複合体等）を形成することができる。
【００２７】
安定化ヘマトキシリン製剤
本開示は、安定化ヘマトキシリン製剤を提供する。一般的に、安定化ヘマトキシリン製剤は、溶媒、ヘマトキシリン色素、および酸を含む。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリンの形成は、媒染剤、酸化剤、保存期間延長剤、抗酸化剤、および安定剤のうちの少なくとも１つを含む。本開示の安定化ヘマトキシリン製剤のいずれかにおいて使用に適する追加の成分は、Ａｖｗｉｏｒｏらの「Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  Ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、ＪＰＣＳ  Ｖｏｌ（１）、２０１１年４月〜６月、およびＢｒｙａｎ  Ｄ  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ、「Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｅ」、ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｉｎｓｆｉｌｅ．ｉｎｆｏ、２０１３年１０月により記載されており、その本開示は、本明細書により本明細書における参照としてそのまま援用されている。例えば、安定化ヘマトキシリン製剤には、捕捉剤（例えば、ヨウ素）が含まれ得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．４未満のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．３７５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．３５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．３２５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．３未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．２７５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．２５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．２２５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．２未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．１７５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．１５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．１２５未満のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、２．１未満のｐＨを有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約１．５〜約２．４の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約１．５〜約２．３の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約１．６〜約２．３の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約１．８〜約２．３の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約２〜約２．３の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約２〜約２．３の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約２〜約２．２の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、約１．５〜約２．２の間のｐＨを有する。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、１．６〜２．２の間のｐＨを有する。
【００３０】
任意の酸が、安定化ヘマトキシリンの形成において利用され得る。好適な酸の非限定的な例として、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、塩酸、硝酸、フッ化水素酸、亜硝酸、およびギ酸が挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、酸は強酸である。いくつかの実施形態では、強酸は、塩酸、硫酸、過塩素酸、硝酸、またはその混合物から選択される。その他の実施形態では、強酸は塩酸である。いくつかの実施形態では、強酸は１Ｍの塩酸である。その他の実施形態では、強酸は０．５Ｍの塩酸である。その他の実施形態では、強酸は０．５Ｍの硫酸である。なおもその他の実施形態では、強酸は０．２５Ｍの硫酸である。もちろん、当業者は、組成物が事前に決定されたｐＨを実現するのを可能にする任意の酸を選択することができる。
【００３２】
当業者は、製剤内の酸の量は、もちろん安定化ヘマトキシリン製剤内の選択された具体的な酸、酸のモル濃度、酸の規定濃度、および／またはその他の成分の存在に応じて変化し得ることを認識する。いくつかの実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．０５％〜約１５％の範囲である。その他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．０５％〜約１２％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．１％〜約１０％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．１％〜約７．５％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．１％〜約６％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．１％〜約５％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．１％〜約４％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．２％〜約４％の範囲である。
【００３３】
その他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．５％〜約１２％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．５％〜約１０％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．５％〜約７．５％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．５％〜約６％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．５％〜約５％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約０．５％〜約４％の範囲である。なおもその他の実施形態では、任意の安定化ヘマトキシリン形成における酸の量は、製剤の総容積に対して約１％〜約４％の範囲である。
【００３４】
様々な溶媒が、安定化ヘマトキシリン製剤において利用可能である。いくつかの実施形態では、溶媒として、水、低級アルカノール、例えばエタノール等、およびポリオールのうちの１つまたは複数が挙げられる。その他の実施形態では、溶媒として水性溶媒が挙げられるが、該水性溶媒は水およびポリオールを含む。有用なポリオールの好適な例として、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（プロピレングリコール）が挙げられる。水性溶媒組成物は、一般的に、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのうちの１つまたは複数について５〜４５体積％を含み、より一般的には、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのうちの１つまたは複数について１０〜３０体積％を含む。
【００３５】
任意の安定化ヘマトキシリン製剤で使用される好適な媒染剤として、アルミニウム媒染剤、鉄媒染剤、ビスマス媒染剤、銅媒染剤、モリブデン媒染剤、バナジウム媒染剤、およびジルコニウム媒染剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、媒染剤はミョウバンを含む。その他の実施形態では、媒染剤は硫酸アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、媒染剤は、組成物内のヘマテインの濃度（屈折率測定法、薄層クロマトグラフィー、または分光法により決定可能）を上回る濃度で組成物中に存在することができ、または組成物内のヘマテインの濃度を下回る濃度で組成物中に存在することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、組成物内の媒染剤に対するヘマトキシリンのモル比は、２：１〜１：１００の間である。その他の実施形態では、組成物内の媒染剤に対するヘマトキシリンのモル比は、１：５〜１：２０の間である。
【００３６】
好適な酸化剤には、ヘマトキシリン中に拡散しそれを酸化させる、大気中の天然に存在する分子状酸素、および少なくともヘマトキシリンの一部分をヘマテインに変換する、ヘマトキシリンと積極的に混合された「化学的酸化剤」（一般的に溶液の状態にある）が含まれる。半分酸化されたヘマトキシリン溶液は、その開示の全内容が本明細書に参照により援用されるＧｉｌｌ、Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ、１８巻（４）：３００〜１１頁（１９７４年）に記載されるように、利用可能なヘマトキシリンのおよそ半分を酸化させる量で酸化剤が含まれる溶液である。有用な化学的酸化剤の例として、ヨウ素酸塩（例えばヨウ素酸ナトリウムおよびヨウ素酸カリウム等）、酸化第二水銀、過マンガン酸塩（例えば、過マンガン酸カリウム等）、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム等）、および過酸化物（例えば、過酸化水素等）のうちの１つまたは複数が挙げられる。特別な実施形態では、化学的酸化剤は、ヨウ素酸ナトリウムを含む。
【００３７】
酸化剤は、完全に（例えば実質的定量的に）ヘマトキシリンをヘマテインに酸化するのに十分な量で、またはヘマトキシリンをヘマテインに部分的に酸化するのに十分な量だけ存在し得る。特別な実施形態では、ヘマトキシリンの半分超が、化学的酸化剤によりヘマテインに酸化され、およびその他では、ヘマトキシリンの半分未満が、化学的酸化剤によりヘマテインに酸化される。例えば、１％〜５０％の間のヘマトキシリンが、化学的酸化剤によりヘマテインに酸化され得るが、しかしより一般的には、約１０％〜約３０％の間のヘマトキシリンが、化学的酸化剤によりヘマテインに酸化される。特別な実施例では、組成物で使用される酸化剤に対するヘマトキシリンのモル比は、６：１〜１：１の間である。化学的酸化剤は、組成物の一部であると考えられるものの、それはヘマトキシリンと反応した際にその還元生成物に変換され、その還元生成物は組成物中に留まるものと理解すべきである。
【００３８】
任意の安定化ヘマトキシリン製剤で使用するのに適する抗酸化剤の例として、ハイドロキノン；没食子酸；還元性の糖、例えばソルビトールおよびマンニトール等；ベンゾエートおよびヒドロキシベンゾエート；亜硫酸塩およびメタ重亜硫酸塩；特定の酸、例えばクエン酸、酒石酸、乳酸、エリトルビン酸、アスコルビン酸、尿酸、タンニン酸等、およびそのような酸の塩（例えばＭｇ２＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣａ２＋の塩等）が挙げられる。
【００３９】
安定剤の例として、アミロース、シクロデキストリン、クリプタンド、クリプトファン、キャビタンド、クラウンエーテル、デンドリマー、ナノチューブ、カリックスアレーン、バリノマイシン、およびニゲリシンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示に基づく安定化ヘマトキシリン製剤を含むコンテナ（チューブ等を含む）は、少なくとも１カ月間、実質的に沈殿物を含まない。その他の実施形態では、コンテナは、少なくとも３カ月間、実質的に沈殿物を含まない。なおもその他の実施形態では、コンテナは、少なくとも６カ月間、実質的に沈殿物を含まない。なおもその他の実施形態では、コンテナは、少なくとも１２カ月間、実質的に沈殿物を含まない。なおもその他の実施形態では、コンテナは、少なくとも１８カ月間、実質的に沈殿物を含まない。なおもその他の実施形態では、コンテナは、少なくとも２４カ月間、実質的に沈殿物を含まない。
【００４１】
安定化ヘマトキシリン製剤を作製する方法
本開示のいくつかの態様は、安定化ヘマトキシリン製剤を作製する方法と関連する。いかなる特定の理論にも拘泥するつもりもないが、ヘマトキシリン製剤のｐＨを下げることにより、沈殿物の発生は、緩和され得るまたは完全に阻止され得ると考えられている。
【００４２】
ヘマトキシリン染色剤中の有効成分は、ヘマラム（アルミニウムイオンおよびヘマテインの複合体）である。いかなる特定の理論にも拘泥するつもりもないが、導入された酸に由来するプロトン（Ｈ＋）は、ヘマラム形成反応（すなわち、Ａｌ３＋＋Ｈｍ−→ＨｍＡｌ＋＋Ｈ）を逆転させる、またヘマラムからアルミニウムを置換することができると考えられている。やはり、いかなる特定の理論にも拘泥するつもりもないが、沈殿物が形成されるためには、ヘマテイン分子およびアルミニウム原子からなる鎖の形成を開始するのに十分高いレベルで、ヘマラムが存在しなければならないと考えられている。低ｐＨレベルでは、このような鎖を形成するにはヘマラムは十分存在しないと考えられている。
【００４３】
一般的に、任意のヘマトキシリン溶液、例えば媒染剤および酸化剤を含むヘマトキシリン溶液等は、本明細書に記載される組成物および方法を使用してヘマトキシリン製剤のｐＨを下げることにより安定化され得る。例として、Ａｖｗｉｏｒｏらの「Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、ＪＰＣＳ  Ｖｏｌ（１）、２０１１年４月〜６月、およびＢｒｙａｎ  Ｄ  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ、「Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｅ」、ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｉｎｓｆｉｌｅ．ｉｎｆｏ、２０１３年１０月において開示されているヘマトキシリン溶液が、本明細書に開示される方法および成分を使用して安定化され得る。いくつかの実施形態では、開始ヘマトキシリン製剤は、エールリッヒのミョウバンヘマトキシリン（Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ  Ａｌｕｍ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（例えば、ヘマトキシリン、エタノール、カリウムミョウバン、水、グリセロール、氷酢酸を含む製剤）、ハリスのミョウバンヘマトキシリン（Ｈａｒｒｉｓ  Ａｌｕｍ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（例えば、ヘマトキシリン、カリウムミョウバン、水、エタノール、酸化第二水銀、および氷酢酸を含む製剤）、マイヤーのヘマラム（Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈａｅｍａｌｕｍ）（例えば、ヘマトキシリン、アンモニウムミョウバン、カリウムミョウバン、水、エタノール、グリセロール、ヨウ素酸ナトリウム、および氷酢酸を含む製剤）、コールのヘマトキシリン（Ｃｏｌｅ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（例えば、ヘマトキシリン、アンモニウムミョウバン、水、エタノール、グリセロール、ヨウ素、および氷酢酸を含む製剤）、ギルのヘマトキシリン（Ｇｉｌｌ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（例えば、ヘマトキシリン、硫酸アルミニウム、水、エチレングリコール、ヨウ素酸ナトリウム、および氷酢酸を含む製剤）、カラッチのヘマトキシリン（例えば、ヘマトキシリン、カリウムミョウバン、水、グリセロール、およびヨウ素酸ナトリウムを含む製剤）、イイオラ及びアヴィオロのミョウバンヘマトキシリン（Ｉｙｉｏｌａ，ａｎｄ  Ａｖｗｉｏｒｏ’ｓ  Ａｌｕｍ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）のうちの１つである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、開始ヘマトキシリン溶液は、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００ヘマトキシリン溶液である（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺから入手可能）。いくつかの実施形態では、開始ヘマトキシリン溶液は、水、ポリオール、ヘマトキシリン色素、ヨウ素酸ナトリウム、および硫酸アルミニウム水和物を含む。その他の実施形態では、開始ヘマトキシリン溶液は、蒸留された脱イオン水、ポリオール、ヘマトキシリン色素、ヨウ素酸ナトリウム、硫酸アルミニウム水和物、ハイドロキノン、およびβ−シクロデキストリンを含む。
【００４５】
一般的に、ヘマトキシリン溶液のｐＨは、酸をヘマトキシリン製剤に添加することにより低下し得る。いくつかの実施形態では、ヘマトキシリン製剤のｐＨが約２％〜約２０％低下するような量の酸が添加される、すなわちヘマトキシリン溶液の初期ｐＨが、約２％〜約２０％低下して第２のより低いｐＨを有するヘマトキシリン溶液を提供する。その他の実施形態では、ヘマトキシリン製剤のｐＨが、約２．５％〜約１５％低下するような量の酸が添加される。なおもその他の実施形態では、ヘマトキシリン製剤のｐＨが、約３％〜約１２．５％低下するような量の酸が添加される。さらなる実施形態では、ヘマトキシリン製剤のｐＨが、約４％〜約１２％低下するような量の酸が添加される。いっそうさらなる実施形態では、ヘマトキシリン製剤のｐＨが、約５％〜約１０％低下するような量の酸が添加される。当業者は、選択される開始ヘマトキシリン溶液の如何を問わず、ヘマトキシリン溶液のｐＨを下げるために適切な量の酸を添加することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化（すなわち、ｐＨの低下）は、約０．２５である（すなわち、約０．２５のｐＨ単位（unites）の低下）。その他の実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．２２５である。その他の実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．２である。いくつかの実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．１７５である。その他の実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．１５である。その他の実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．１２５である。その他の実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．１である。その他の実施形態では、酸を添加した際のヘマトキシリン製剤のｐＨの変化は、約０．０７５である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが２．４を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、製剤のｐＨが２．３５を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、製剤のｐＨが２．３を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、製剤のｐＨが２．２５を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、製剤のｐＨが２．２を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、製剤のｐＨが２．１５を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、製剤のｐＨが２．１を下回り低下するような量の酸がヘマトキシリン製剤に添加される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、酸性化溶液が、ヘマトキシリン製剤に添加され、該酸性化溶液は強塩基および添加剤を含む。いくつかの実施形態では、酸性化溶液の添加剤は、媒染剤、酸化剤、保存期間延長剤、および抗酸化剤のうちの１つである。酸性化溶液の添加剤は、本明細書に記載される安定化ヘマトキシリン製剤について本明細書に記載される量または比と同一の量または比で存在し得る。
【００４９】
再調整溶液
本開示は、本明細書に開示される安定化ヘマトキシリン製剤と混合され得る再調整溶液も提供する。一般的に、再調整溶液は、溶媒および強塩基またはバッファーのうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、本明細書に記載される安定化ヘマトキシリン製剤について、本明細書において列挙された溶媒から選択される。いくつかの実施形態では、同一の溶媒が、安定化ヘマトキシリン組成物および再調整溶液で使用される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、強塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、およびアンモニアからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、強塩基は、１Ｍの水酸化ナトリウムである。その他の実施形態では、強塩基は、０．５Ｍの水酸化ナトリウムである。なおもその他の実施形態では、強塩基は、０．１Ｍの水酸化ナトリウムである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、バッファーは、マレイン酸塩、リン酸塩、グリシン、クエン酸塩、グリシルグリシン、リンゴ酸塩、ギ酸塩、シアノ酢酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、硫酸塩、アラニン、アルギニン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン（noleucine）、プロリン、セリン、スレオニン、または任意のこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、バッファーは、約１．５〜約３．５の範囲のｐＫａを有する。その他の実施形態では、バッファーは、約１．８〜約３．２の範囲のｐＫａを有する。なおもその他の実施形態では、バッファーは、約２〜約３の範囲のｐＫａを有する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、再調整溶液は、媒染剤、酸化剤、保存期間延長剤、および抗酸化剤からなる群から選択される添加剤をさらに含む。添加剤は、本明細書に記載されるような量または比と同一の量または比で存在し得る。
【００５３】
安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨを再調整する方法
本開示のいくつかの態様は、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨを再調整してヘマトキシリン染色溶液を提供することと関連する。いくつかの実施形態では、方法は、強塩基またはバッファー溶液を安定化ヘマトキシリン製剤に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるような再調整溶液を安定化ヘマトキシリン製剤に添加することを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨが少なくとも２．４まで上昇するような十分量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液が、ヘマトキシリン製剤に添加される。その他の実施形態では、ｐＨが少なくとも２．４５まで上昇するような量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液がヘマトキシリン製剤に添加される。なおもその他の実施形態では、ｐＨが少なくとも２．５まで上昇するような量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液がヘマトキシリン製剤に添加される。さらなる実施形態では、ｐＨが少なくとも２．５５まで上昇するような量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液がヘマトキシリン製剤に添加される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、方法は、安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量について、その初期ｐＨを測定することと、一定分量のｐＨが少なくとも約２．４に上昇するまで、ある量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液を添加することとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量について、その初期ｐＨを測定することと、一定分量のｐＨが少なくとも約２．４５に上昇するまで、ある量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液を添加することとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量について、その初期ｐＨを測定することと、一定分量のｐＨが少なくとも約２．５に上昇するまで、ある量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液を添加することとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量について、その初期ｐＨを測定することと、一定分量のｐＨが少なくとも約２．５５に上昇するまで、ある量の強塩基、バッファー溶液、または再調整溶液を添加することを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、再調整された製剤、例えば溶媒、ヘマトキシリン色素、媒染剤、酸化剤、および形成された塩を含むヘマトキシリン染色溶液等を提供する。いくつかの実施形態では、形成された塩は、酸および強塩基間の反応副生成物、例えばＮａＣｌである）。
【００５７】
キット
本開示の別の態様は、安定化ヘマトキシリン製剤を調製するためのキット、および安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨを再調整するためのキットである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、キットは、安定化ヘマトキシリン組成物を含む第１の成分であって、安定化ヘマトキシリン製剤がヘマトキシリン色素と酸とを含み、２．４未満のｐＨを有する、第１の成分と、強塩基またはバッファーを含む第２の成分であって、第１および第２の成分が混合されたとき、得られたヘマトキシリン染色溶液のｐＨが２．４を上回り上昇するような、第１の成分に対する量で提供される第２の成分とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、第１および第２の成分が共に混合されたときのｐＨの変化を確認するための手段をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１または第２の成分のうちの少なくとも一方は、媒染剤および酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、第１および第２の成分を混合するための指示書をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、追加の染色剤をさらに含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、キットは、第１の液体ディスペンサーおよび第２の液体ディスペンサーを含み、第１の液体ディスペンサーは安定化ヘマトキシリン製剤を含み、第２の液体ディスペンサーは、再調整溶液、バッファー、または強塩基のうちの１つを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、キットは、第１および第２の成分を含み、第１の成分は２．４未満のｐＨを有する安定化ヘマトキシリン製剤を含み、第２の成分は再調整溶液を含む。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤は、溶媒、ヘマトキシリン色素、酸、媒染剤、および酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、第１および第２の成分を混合して２．４を上回るｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供するための指示書をさらに含む。いくつかの実施形態では、指示書は、第１の成分に添加して事前に決定されたｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供するための第２の成分の所定量について記載する。いくつかの実施形態では、第１および第２の成分は、別個の液体ディスペンサー内に提供され、各液体ディスペンサーは、例えば本明細書に開示されるような自動染色機構内で使用するのに適する。好適な液体ディスペンサーとして、その本開示が本明細書により本明細書における参照としてそのまま援用されるＰＣＴ公開番号国際公開第／２０１２／１６３９９２号および米国特許第６，１９２，９４５号で開示される用具が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００６１】
生物学的試料を染色する方法
本開示のその他の態様は、ヘマトキシリン製剤を用いて生物学的試料を染色する方法と関連する。いくつかの実施形態では、生物学的試料を染色する方法は、（ｉ）安定化ヘマトキシリン製剤からヘマトキシリン染色溶液を調製すること；および（ｉｉ）ヘマトキシリン染色溶液を生物学的試料に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ヘマトキシリン染色溶液は、安定化ヘマトキシリン製剤のｐＨが染色に適するｐＨまで上昇するような量の再調整溶液を安定化ヘマトキシリン製剤に添加することにより調製される。いくつかの実施形態では、ｐＨは２．４を上回るまで上昇する。いくつかの実施形態では、ｐＨが２．５を上回るまで上昇するような十分量の再調整溶液が添加される。いくつかの実施形態では、再調整溶液は、強塩基を含む。いくつかの実施形態では、再調整溶液はバッファーを含む。いくつかの実施形態では、再調整溶液は添加剤を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、生物学的試料を染色する方法は、（ｉ）安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量のｐＨを上昇させて、約２．４〜約２．６のｐＨ範囲を有するヘマトキシリン染色溶液を提供すること；および（ｉｉ）生物学的試料を、得られたヘマトキシリン染色溶液と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試料を追加の染色剤または対比染色剤と接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤の一定分量のｐＨを上昇させる工程は、製剤のｐＨが事前に決定されたレベルに到達するまで、安定化ヘマトキシリン製剤にある量の再調整溶液を漸増添加することを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、生物学的試料を染色する方法は、（ｉ）安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液を混合して２．４〜約２．６の間のｐＨを有するヘマトキシリン染色溶液を提供すること；および（ｉｉ）ヘマトキシリン染色溶液を生物学的試料に分注することを含む。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤の再調整溶液に対する比は、約５：１〜約２５：１の範囲である。その他の実施形態では、比は、約１０：１〜約２０：１の範囲である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、得られたヘマトキシリン溶液が生物学的試料に導入される前に、１秒〜約４００秒間混合される。その他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、得られたヘマトキシリン溶液が生物学的試料に導入される前に、５秒〜約２４０秒間混合される。なおもその他の実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、得られたヘマトキシリン溶液が生物学的試料に導入される前に、５秒〜約１２０秒間混合される。さらなる実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、得られたヘマトキシリン溶液が生物学的試料に導入される前に、５秒〜約６０秒間混合される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、同時にまたは連続して生物学的試料に分離して導入され、そして生物学的試料と接触したまま混合状態に置かれる。いくつかの実施形態では、再調整溶液はバッファーを含み、そして該バッファーは、安定化ヘマトキシリン製剤を適用する前に生物学的試料に適用される。いくつかの実施形態では、バッファーが試料に適用され、そして混合物のｐＨが事前に決定されたレベルに達するまで、安定化ヘマトキシリン製剤が試料上に存在するバッファーに漸増添加される。
【００６６】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色のためのシステム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される溶液および製剤は、手作業により試料に適用または導入される、またはディップ・アンド・ダンク技術を使用して適用される。その他の実施形態では、溶液および製剤は、例えば自動染色機構等により、試料に適用または分注される。当業者は、任意の溶液または製剤を分注することとは、当該溶液または製剤を試料または基材（例えば、スライド）に適用することを指すものと認識する。
【００６７】
本明細書に開示される方法および組成物は、既存の自動処理システムと共に使用されるように考案され得る。例えば、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社は、米国特許第５，６５０，３２７号、同第５，６５４，２００号、同第６，２９６，８０９号、同第６，３５２，８６１号、同第６，８２７，９０１号、および同第６，９４３，０２９号、ならびに米国特許公開出願第２００３０２１１６３０号および同第２００４００５２６８５号（そのそれぞれは、本明細書において参照として援用されている）を含む、自動化された分析を実施するためのシステムおよび方法について開示するいくつかの米国特許の承継者である。これらのシステムは、本発明に適合するように構成され得る。要するに、上記出願に記載されている自動スライド処理システムは、スライド上で様々なスライド処理作業を実施するワークステーション間において、実質的に水平な位置（相互汚染を最低限に抑えるため）にある複数のスライドを保持するトレイを往復させる高容量スライド処理システムである。新鮮な試薬が、処理期間中に各スライドに適用され得るが、またスライドはトレイ内で間隔が置かれて個別に処理されるので、スライドと試薬との相互汚染は実質的に排除可能である。１つの構成では、システムは、放射放熱器、複合型の脱パラフィン装置／染色装置／溶媒置換ワークステーション、コンベクションオーブン、およびカバースリッパーを備える。パラフィン包埋組織試料を担持するスライドのトレイは、試料中のパラフィンを拡散させて、パラフィンの除去、また試料とスライドとの接着についてもより容易にするために、システムの放射放熱器の下で加熱可能である。トレイは、次に多機能型の脱パラフィン装置／染色装置／溶媒置換ワークステーションに搬送可能であり、そこでスライドは、脱パラフィン、染色、および溶媒置換可能である。いつでもカバースリッピングできる状態になっている染色済みのスライドのトレイは、次にシステムのカバースリッパー（カバースリップがスライドに付加される場所）まで往復することができる。カバースリップがスライドに付加されたら、トレイは、次に染色されたスライド上のカバースリップを乾燥させるためにコンベクションオーブンまで搬送可能である。今ここに記載されている高容量染色装置は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚから市販されている。
【００６８】
本明細書に記載される溶液および製剤はその他の市販試料処理システムを通じて適用され得るが、その例として、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＳＹＭＰＨＯＮＹ（個別スライド染色装置）、およびＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００（個別スライド染色装置）シリーズ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からのＤａｋｏ  ＣｏｖｅｒＳｔａｉｎｅｒ（バッチ式染色装置）；Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｕｓｓｌｏｃｈ  ＧｍｂＨ社からのＬｅｉｃａ  ＳＴ４０２０  Ｓｍａｌｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｔａｉｎｅｒ（バッチ式染色装置）、Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０２０  Ｍｕｌｔｉｓｔａｉｎｅｒ（バッチ式染色装置）、およびＬｅｉｃａ  ＳＴ５０１０  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬシリーズ（バッチ式染色装置）Ｈ＆Ｅ  Ｓｔａｉｎｅｒが挙げられる。
【００６９】
上記染色システムは、あらゆる組織学的染色プロセスを実施するように構成され得るが、例示的なヘマトキシリンおよびエオシン染色プロトコールは、試料をスライドに接着させるベーキング工程、パラフィン包埋試料からパラフィンを取り除く脱パラフィン工程、ヘマトキシリン染色工程（開示されるヘマトキシリン組成物を利用することができる）、ｐＨを上昇させ、そしてヘマトキシリンを青色に変化させて下流において添加されるエオシンとより良好な対比をもたらす青色化工程、エオシン染色工程、過剰のエオシンを取り除き、そしてエオシンを様々な印影の赤色〜ピンク色に変化させるのに使用される区別化工程、１００％のエタノールを使用して試料から水を取り除く脱水工程、エタノールを取り除くためにスライドが高温および気流に曝露される工程、リモネンが試料に分注されるカバースリッピング工程、および乾燥工程を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、自動染色システムは、別個の安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液を含有する別個のリザーバーまたはコンテナを備える。いくつかの実施形態では、システムは、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液を、生物学的試料、例えばスライド上に取り付けられた生物学的試料に送達する分注システムをさらに備える。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、生物学的試料に適用される前に混合される。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤のコンテナおよび再調整溶液のコンテナは、加圧され、そして混合容器と流体連通している。混合容器は、混合された溶液を保持するまたは移動させる能力を有する任意のコンテナ、例えば剛性または可撓性のチューブ等であり得る。いくつかの実施形態では、混合容器は、ディスペンサーと流体連通しているチューブである。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、チューブを介してＴ字型フィッティングと流体連通している。Ｔ字型フィッティングからのアウトプットは、次にディスペンサーと流体連通している。これらの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液はＴ字型フィッティングに供給され、そして溶液の混合がチューブ内で生じてＴ字型フィッティングの外部に流出する。いくつかの実施形態では、安定化ヘマトキシリン製剤および再調整溶液は、生物学的試料上に個別に分注される。これらの実施形態では、溶液は、試料上で拡散させることにより混合状態に置くことができる、または例えばピペットを用いて撹拌することにより機械的に混合することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、自動試料処理機構は、複数の基材、例えば顕微鏡スライドを保持するためのカルーセルを備え得るが、その場合、各基材には染色される生物学的試料が含まれる。いくつかの実施形態では、自動式染色機器は、事前に決定されたスピードでカルーセルを回転させるデバイス、ならびにカルーセルが回転している期間中に、基材および試料上への試薬（本明細書に記載される溶液および製剤を含む）の適用を指示および制御するための機構も備えることができる。いくつかの実施形態では、スライドが装置内に負荷されたら、テストプロトコールが、どの液体が所定時刻において基材上に分注されるかを規定する。しかるべき時刻において、いくつかの実施形態では、基材上の該当する液体の位置合わせを行うためにディスペンサーラックが回転し、そして装置は事前に決定された量の液体を基材上に分配する。いくつかの実施形態では、装置は、液体が事前に決定された時間、生物学的試料と接触したまま存続するのを可能にする。
【００７２】
いくつかの実施形態では、システムは、実質的に水平な位置で複数のスライドを（例えばスライドが水平から約０．２度〜約１．２度の間の角度に維持される２列等で）保持するスライドトレイ、およびスライドトレイを受け入れる１つまたは複数のワークステーション（例えば、垂直な重なりで配置されている）を備え、ならびにスライドトレイ内のスライドについて１つまたは複数のスライド処理作業を実施する自動スライド処理システムである。いくつかの実施形態では、ワークステーションは、スライドトレイ内の１つまたは複数の個々のスライド、例えばスライドトレイ内の少なくとも２または４つのスライド上でスライド処理作業を実施することができ、またはスライドトレイ内のすべてのスライドについてスライド処理作業を同時に実施することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のワークステーションは、第１のスライドと接触している試薬のかなりの量を第２のスライドと接触させることなくスライドトレイ内のスライドに試薬を分配し、これによりスライド間の相互汚染を最低限に抑える。そのようなワークステーションは、スライド上に試薬を分配する１つまたは複数の指向性のノズルを備え得るが、例えば１つまたは複数の指向性のノズルは、スライドの表面を横断して試薬を反対方向に分配する一対の指向性のノズルを備えることができる。より特別な実施形態では、１つまたは複数の指向性のノズルは、スライドの底部表面に向かって試薬を分配する指向性のノズルをさらに備えることができる。その他の特定の実施形態では、１つもしくは複数のワークステーションは、所定のワークステーション内に配置されたスライドトレイ内に保持された少なくとも２つのスライドに、試薬（例えば、同一の試薬）を同時に分配することができる、または１つもしくは複数のワークステーションは、所定のワークステーション内に配置されたスライドトレイ内に保持されたすべてのスライドに、試薬（例えば同一の試薬等）を同時に分配することができる。追加のシステムコンポーネントおよびトレイコンフィギュレーション（ならびに制御システム）は、米国特許第８，６６３，９９１号、同第７，４６８，１６１号、および同第９，５２８，９１８号（これらの開示は、本明細書により本明細書における参照としてそのまま援用されている）に記載されている。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示は、生体試料を自動的に処理するための機構であって、実質的に水平な位置で複数のスライドを保持する少なくとも１つのスライドトレイ（前記生体試料は前記スライド上に位置する）；前記スライドトレイを受け入れ、および前記スライドトレイ内に保持された前記複数のスライド上で１つまたは複数のスライド処理作業を実施する１つまたは複数のワークステーション；前記スライドトレイを前記１つまたは複数のワークステーション内および外へ移動させるトランスポーター；試薬を前記１つまたは複数のワークステーションに供給する、前記１つまたは複数のワークステーションと流体連通している流体工学モジュール；前記１つまたは複数のワークステーションおよび前記流体工学モジュールと流体連通しているニューマチックモジュール（前記ニューマチックモジュールは、減圧および／または加圧ガスを前記１つまたは複数のワークステーションおよび前記流体工学モジュールに供給する）；ならびに前記トランスポーター、前記１つまたは複数のワークステーション、前記流体工学モジュール、および前記ニューマチックモジュールと電気的に導通している制御モジュール（前記生体試料の処理期間中に、機構のコンポーネントの機能を調和させる）を含む機構を提供する。機構は、本明細書に記載される溶液および／または製剤のうちの１つまたは複数を送達するために考案され得る。
【００７４】
対比染色
いくつかの実施形態では、システムおよび方法は、追加の染色剤、例えば対比染色剤等を用いて生物学的試料を染色することをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料を対比染色剤と接触させることは、試料を、エオシンＹ（ＣＡＳ番号１５０８６−９４−９）、オレンジＧ（ＣＡＳ番号１９３６−１５−８）、ライトグリーンＳＦイエロー（ＣＡＳ番号５１４１−２０−８）、ビスマルクブラウン（ＣＡＳ番号：８００５−７７−４）、ファストグリーンＦＣＦ（ＣＡＳ番号２３５３−４５−９）、ＯＧ−６（オレンジＧを含む）、ＥＡ２５（ライトグリーンＳＦ、ビスマルクブラウン、およびエオシンＹを含む）、ＥＡ３６（ライトグリーンＳＦ、ビスマルクブラウン、およびエオシンＹを含む）、ＥＡ５０（ライトグリーンＳＦ、ビスマルクブラウン、およびエオシンＹを含む）、ならびにＥＡ６５（ライトグリーンＳＦ、ビスマルクブラウン、およびエオシンＹを含む）のうちの１つまたは複数と接触させることを含む。そのような対比染色剤を作製する処方箋および方法は、例えば、ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ（Ｂｒｙａｎ  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎにより維持される組織技術者のためのインターネット資源）；Ｋｉｅｒｎａｎ、「Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第３版、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国において；ならびにＨｏｒｏｂｉｎおよびＫｉｅｒｎａｎ、「Ｃｏｎｎ’ｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｓ：ａ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｄｙｅｓ，  ｓｔａｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、第１０版、Ｏｘｆｏｒｄ：ＢＩＯＳ、ＩＳＢＮ  １８５９９６０９９５、２００２において見出され得る。その他の実施形態では、試料をヘマトキシリン組成物と接触させることは、進行性のヘマトキシリン染色プロトコールを含む。その他の実施形態では、試料をヘマトキシリン組成物と接触させることは、退行性のヘマトキシリン染色プロトコールを含む。方法は、自動化され得るが、また基材、例えば顕微鏡スライド等上で支持されている生物学的試料について実施可能である。特別な実施形態では、方法は、顕微鏡スライド上に取り付けられた組織切片または細胞学試料を染色するのに使用される。対比染色工程をさらに含む特別な実施形態では、方法は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色法またはＰＡＰ染色法、より具体的には自動化されたヘマトキシリンおよびエオシンまたはＰＡＰ染色法であり得る。
【００７５】
本発明の染色手順と関連して有用なその他の組織学的染色剤として、色素、例えばアクリジン色素、アントラキノン色素、アリールメタン色素、アゾ色素、ジアゾニウム色素、ニトロ色素、フタロシアニン色素、キニーネイミン色素、テトラゾリウム色素、チアゾール色素、及びキサンテン色素等が挙げられる。組織学的染色に有用な色素の例として、アセチルイエロー、アシッドブラック１、アシッドブルー２２、アシッドブルー９３、酸性フクシン、アシッドグリーン、アシッドグリーン１、アシッドグリーン５、アシッドマゼンタ、アシッドオレンジ１０、アシッドレッド４、アシッドレッド２６、アシッドレッド２９、アシッドレッド４４、アシッドレッド５１、アシッドレッド６６、アシッドレッド７３、アシッドレッド８７、アシッドレッド９１、アシッドレッド９２、アシッドレッド９４、アシッドレッド１０１、アシッドレッド１０３、アシッドロゼイン、アシッドルビン、アシッドバイオレット１９、アシッドイエロー１、アシッドイエロー９、アシッドイエロー２３、アシッドイエロー２４、アシッドイエロー３６、アシッドイエロー７３、アシッドイエローＳ、アシッドイエローＴ、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アルシアンブルー、アルシアンイエロー、アルコール可溶型エオシン、アリザリン、アリザリンブルー、アリザリンブルー２ＲＣ、アリザリンカルミン、アリザリンシアニンＢＢＳ、アリザロールシアニンＲ、アリザリンレッドＳ、アリザリンプルプリン、アルミノン、アミドブラック１０Ｂ、アミドナフトールレッド、アミドシュワルツ、アニリンブルーＷＳ、アニリンパープル、アントラセンブルーＳＷＲ、アントラセンブルーＳＷＸ、オーラミン０、アゾ−エオシン、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アゾエオシンＧ、アゾイックジアゾ５、アゾイックジアゾ４８、アゾフロキシン、アゾバンブルー、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、ベーシックブルー８、ベーシックブルー９、ベーシックブルー１２、ベーシックブルー１５、ベーシックブルー１７、ベーシックブルー２０、ベーシックブルー２６、ベーシックブラウン１、塩基性フクシン（basic fuschsin）、ベーシックグリーン４、ベーシックグリーン５、ベーシックオレンジ１４、ベーシックレッド２、ベーシックレッド５、ベーシックレッド９、ベーシックバイオレット２、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット１４、ベーシックイエロー１、ベーシックイエロー２、ビーブリッヒスカーレット、ビーブリッヒスカーレットＲ、ビスマルクブラウンＹ、ブラジレイン、ブラジリン、ブリリアントクロセイン、ブリリアントクリスタルスカーレット６Ｒ、カルシウムレッド、カルミン、カルミン酸カルモイシン６Ｒ、セレスティンブルーＢ、チャイナブルー、クロランチンファストレッド５Ｂ、コチニール、コエレスチンブルー、シカゴブルー４Ｂ、クロムバイオレットＣＧ、クロモトロープ２Ｒ、クロモキサンシアニンＲ、コンゴコリント、コンゴレッド、コットンブルーコットンレッド、クロセインスカーレット、クロセインスカーレット３Ｂ、クロセインスカーレットＭＯＯ、クロシン、クリスタルポンソー６Ｒ、クリスタルスカーレット、クリスタルバイオレット���ダリア、ダイヤモンドグリーンＢ、ダイレクトブルー１４、ダイレクトブルー５８、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド１０、ダイレクトレッド２８、ダイレクトレッド８０、ダイレクトレッド８１、ダイレクトイエロー７、デュラゾールブルー４Ｒ、デュラゾールブルー８Ｇ、エオシンＢ、エオシンブルーイッシュ、エオシン、エオシンＹ、エオシンイエロウィッシュ、エオシノール、エリーガーネットＢ、エリオクロムシアニンＲ、エリスロシンＢ、エチルエオシン、エチルグリーン、エチルバイオレット、エバンスブルー、ファストブルーＢ、ファストグリーンＦＣＦ、ファストレッドＢ、ファストイエロー、ファストイエローエクストラ、ファストイエローＧ、ファットブラックＨＢ、フルオレセイン、食用緑色３号、ガレオン、ガラミンブルーガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ヘリオファストルビンＢＢＬ、ヘルベチアブルー、ホフマンバイオレット、ヒドラジンイエロー、インペリアルレッド、イングレインブルー１、イングレインイエロー１、ＩＮＴ、ケルメス、ケルメス酸、ケルンエヒトロート（kemechtrot）、ラック、ラッカイン酸、ラウツバイオレット、ライトグリーン、リッサミンファストイエロー、リッサミングリーンＳＦ、ルクソールファストブルー、マゼンタ０、マゼンタＩ、マゼンタＩＩ、マゼンタＩＩＩ、マラカイトグリーン、マンチェスターブラウン、マルチウスイエロー、モーブ、モーベイン、メルブロミン、マーキュロクロム、メタニルイエロー、メチレンアズールＡ、メチレンアズールＢ、メチレンアズールＣ、メチレンブルー、メチレングリーン、メチルブルー、メチルグリーン、メチルバイオレット、メチルビオレット（ｍｅｔｈｙｌ  ｂｉｏｌｅｔ）２Ｂ、メチルバイオレット１０Ｂ、ミーリングイエロー３Ｇ、モーダントブルー３、モーダントブルー１０、モーダントブルー１４、モーダントブルー２３、モーダントブルー３２、モーダントブルー４５、モーダントレッド３、モーダントレッド１１、モーダントバイオレット２５、モーダントバイオレット３９、ナフタレンブルーブラック、ナフトールブルーブラック、ナフトールグリーンＢ、ナフトールイエローＳ、ナチュラルブラック１、ナチュラルレッド、ナチュラルレッド３、ナチュラルレッド４、ナチュラルレッド８、ナチュラルレッド１６、ナチュラルレッド２４、ナチュラルレッド２５、ナチュラルレッド２８、ナチュラルイエロー６、ＮＢＴ、ニュートラルレッド、ニューフクシン、ナイアガラブルー３Ｂ、ナイトブルー、ナイルブルー、ナイルブルーＡ、硫酸ナイルブルー、ナイルレッド、ニトロＢＴ、ニトロブルーテトラゾリウム、ヌクレアファストレッド、オイルレッド０、オレンジＧ、オルセイン、パラロザニリン、パーキンバイオレット、フロキシンＢ、ピクリン酸、ポンソー２Ｒ、ポンソー６Ｒ、ポンソーＢ、ポンソードキシリジン（Ｐｏｎｃｅａｕ  ｄｅ  Ｘｙｌｉｄｉｎｅ）、ポンソーＳ、ポンタミンスカイブルー５Ｂ、プリムラ、プリムリン、プルプリン、ピロニンＢ、ピロニンＧ、ピロニンＹ、ローダミンＢ、ロザニリン、ローズベンガル、サフロン、サフラニン０、スカーレットＲ、スカーレットレッド、シャーラッハＲ、シェラック、シリウスレッドＦ３Ｂ、シリウスレッド４Ｂ、シリウススープラブルーＦ３Ｒ、ソロクロームシアニンＲ、可溶型ブルー、ソルベントブラック３、ソルベントブルー３８、ソルベントレッド２３、ソルベントレッド２４、ソルベントレッド２７、ソルベントレッド４５、ソルベントイエロー９４、スピリット可溶型エオシン、スダンＩＩＩ、スダンＩＶ、スダンブラックＢ、スダンレッドＢＫ、サルファーイエローＳ、スイスブルー、タートラジン、チオフラビンＳ、チオフラビンＴ、チオニン、トルイジンブルー、トルイレンレッド（toluoyline red）、トロペオリンＧ、トリパフラビン、トリパンブルー、ウラニン、ビクトリアブルー（Vicoria blue）４Ｒ、ビクトリアブルーＢ、ビクトリアブルーＲ、ビクトリアグリーンＢ、ウォーターブルーＩ、水溶性エオシン、ウッドステインスカーレット、キシリジンポンソー、及びイエロウィッシュエオシン、およびその組み合わせが挙げられる。本パラグラフで考察される組織化学的色素溶液を（例えば、特定の組織学的情況で用いられる「特殊染色」手順において、または対比染色剤として）作製および使用する処方箋および方法は、例えば、ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ（Ｂｒｙａｎ  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎにより維持される組織技術者のためのインターネット資源）；Ｋｉｅｒｎａｎ、「Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第３版、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国において；ならびにＨｏｒｏｂｉｎおよびＫｉｅｒｎａｎ、「Ｃｏｎｎ’ｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｓ：ａ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｄｙｅｓ，ｓｔａｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、第１０版、Ｏｘｆｏｒｄ：ＢＩＯＳ，ＩＳＢＮ  １８５９９６０９９５、２００２において見出され得る。上記で引用された２件の併記された参考資料の内容は、本明細書における参照として援用される。
【実施例】
【００７６】
下記の非限定的な実施例は、本開示の特定の実施形態についてさらに例証するために提供される。
【００７７】
機能的色素を製造するために、ヘマトキシリンは、ヘマテインに酸化され、その後アルミニウム（Ａｌ＋３）、鉄（Ｆｅ＋３）、およびクロム（Ｃｒ＋３）を含むいくつかの金属イオンの１つに結合する。いくつかの異なるアルミニウム塩が、Ａｌ＋３の供給源として使用され得る。これには、硫酸アルミニウムアンモニウム［ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２］、硫酸アルミニウム［Ａｌ２（ＳＯ４）３］、および硫酸アルミニウムカリウム［ＡｌＫ（ＳＯ４）２］が含まれる。色素と組織との結合に関与する、色素に結合した金属イオンは媒染剤と呼ばれる。ヘマトキシリンのヘマテインへの変換は、いくつかの薬剤の作用により達成され得る。現在、ほとんどの製剤には、ヘマトキシリンをヘマテインに迅速変換する化学的酸化剤、例えばヨウ素酸ナトリウム等が組み込まれている。ヨウ素酸ナトリウムの濃度は、ヘマトキシリンの量に一般的に基づき、通常ヘマトキシリン１グラム当たりヨウ素酸ナトリウム０．１０〜０．２０グラムの範囲である。
【００７８】
実施例１
ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００ヘマトキシリン溶液の２Ｌバッチを、各５００ｍＬの４つの等しい体積に分割し、そしてそのｐＨレベルを、１Ｍの塩酸を各分量に添加することにより、表１に示すように調整した。いくつかの実施形態では、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００ヘマトキシリン溶液は、蒸留された脱イオン水（約７００ｇ／Ｌ）、エチレングリコール（約２８０ｇ／Ｌ）、ヘマトキシリン色素（約６ｇ／Ｌ）、ヨウ素酸ナトリウム（約０．６５ｇ／Ｌ）、硫酸アルミニウム１６〜１８水和物（約２７ｇ／Ｌ）、ハイドロキノン（約９ｇ／Ｌ）、およびβ−シクロデキストリン（約１１ｇ／Ｌ）を含んだ。
0006940626.tif 000002
【００７９】
各ヘマトキシリン試料を、４ｍｍの密閉されたチューブループ（長さ３０ｃｍ）内に配置し、そして試料を含有するチューブを、６０℃に維持されたオーブン内に１４日間配置した。１４日後、ループをオーブンから取り出し、内容物を流出させ、そしてＤＩ水でリンスした。チューブのそれぞれは沈殿物のコーティングを示したが、しかしＥＸＰ１−Ｄ（ｐＨ＝２．１６）を含有するチューブ上では、沈殿物のコーティングはより少量であった。
【００８０】
チューブループ内に保持された試料を用いて、上記チューブループ実験を、６０℃で７日間繰り返した。たった７日間のインキュベーションであったがその後、異なるチューブにおいて沈殿物のコーティングの量に顕著な差異が認められた（図１を参照）。溶液のｐＨが上昇するに従い、沈殿物のコーティングの増加に差異が認められた。
【００８１】
チューブループ内に保持された試料を用いて、上記チューブループ実験を、４５℃で３０日間繰り返した。やはり、チューブ上の沈殿物のコーティングの量に顕著な差異が認められた（図２を参照）。前回同様、チューブ上の沈殿物のコーティングの量は、ヘマトキシリン溶液のｐＨが上昇するに従い増加した。
【００８２】
実施例２
約１８０日後、これまでにｐＨ調整されたヘマトキシリン試料の一部分のｐＨ（表１を参照）を、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いて約ｐＨ＝２．５に再調整した（表２を参照）。
0006940626.tif 000003
【００８３】
ｐＨ再調整された試料を、次に染色実験で使用した（５個１組のマルチ組織ブロック（ＭＴＢ）からなるスライドの染色）。ＥＸＰ１−Ａをコントロールとして使用し、そして８対比較試験において他の３つの染色剤（ＥＸＰ２−Ａ、ＥＸＰ２−Ｂ、およびＥＸＰ２−Ｃ）と比較した。
【００８４】
コントロール（ＥＸＰ１−Ａ）を用いて染色された各スライドでは、スライド上にかなりの量の沈殿物が認められた。より低いｐＨレベルに維持された溶液（ＥＸＰ２−Ａ、ＥＸＰ２−Ｂ、およびＥＸＰ２−Ｃ）を用いて染色されたスライドでは、スライド上に沈殿物は認められなかった。沈殿物のレベルの顕著な差異以外に、染色されたスライド間でその他の有意差は認められなかった。
【００８５】
実施例３
約５００日後、何らかのｐＨ調整を受けなかった試料（ＥＸＰ１−Ａ）を含有するボトルは、内側表面に多量の沈殿物のコーティングを示したことが認められた。ｐＨ調整を受けた試料（ＥＸＰ１−Ａ、ＥＸＰ１−Ｂ、ＥＸＰ１−Ｃ、およびＥＸＰ１−Ｄ）を含有するボトルでは、沈殿物のフィルムは認められなかった。
【００８６】
この時点（５００日）において、これまでにｐＨ調整されたヘマトキシリン試料の一部分のｐＨレベル（表１を参照）を１．２Ｍのシアノ酢酸／シアノ酢酸塩バッファー溶液（ｐＨ＝２．６）を用いて約ｐＨ＝２．５に再調整した。表３を参照。この場合、強塩基よりはむしろバッファーを、染色するのにふさわしいレベルに溶液ｐＨを再調整するために使用した。ｐＨ再調整期間中、過剰の強塩基が添加された場合には、数ｐＨユニットほど、目標ｐＨレベルを容易に超えてしまうおそれがある。バッファーは、ｐＨを再調整することになったとしても、より許容度が高い。過剰のバッファーが添加されたとしても、使用されるバッファーのｐＨおよび濃度に応じてわずかしか、またはまったく目標ｐＨを超えない可能性がある。
0006940626.tif 000004
【００８７】
表３において識別されたｐＨ再調整後の試料を、次に染色実験で使用した（５個１組のマルチ組織ブロック（ＭＴＢ）からなるスライドの染色）。コントロール（ここでは、Ｖｅｎｔａｎａ  ＨＥ６００ヘマトキシリン溶液の使用期限前のロット、パート番号０７０２４２８２００１）を、試料ＥＸＰ３−Ａ、ＥＸＰ３−Ｂ、およびＥＸＰ３−Ｃと比較した。５００日間、ｐＨ約２．３０未満に保持された染色剤（ＥＸＰ３−ＢおよびＥＸＰ３−Ｃ）では、沈殿物はスライド上に最低限度しか、またはまったく認められなかったことが判明した。
【００８８】
実施例４
約５５０日後、これまでにｐＨ調整されたヘマトキシリン試料（表１を参照）の一部分のｐＨレベルを、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００青色化溶液（０．１Ｍのトリスバッファー、ｐＨ＝８〜９）を用いて約ｐＨ＝２．５に調整した。表４を参照。
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【００８９】
表４に提示されるｐＨ再調整溶液を用いてその他の実験は実施されなかった。容易に入手可能な試薬（ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００青色化溶液）が酸性ヘマトキシリン溶液のｐＨ再調整に使用可能であるという概念を証明するために、ｐＨ再調整を実施した。
【００９０】
実施例５
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、ヘマトキシリン染色溶液中に塩化物イオンが存在すれば、溶液内で沈殿物が形成される速度は低下する可能性があると考えられている。実施例１〜４は、酸性化剤として塩酸を使用して設計および実施された。これは、ヘマトキシリン染色溶液に塩化物イオンを導入し、このことから、沈殿物阻害効果は、単に溶液のｐＨレベルが低いだけでなく、塩化物イオンが存在したことに起因した可能性があると主張され得る。塩化物イオンと低ｐＨの効果を分離するために、この実験のヘマトキシリン染色剤について、硫酸添加によりそのｐＨを下げるｐＨ調節を実施した。ヘマトキシリン染色溶液を、表５に示す下記の処方箋を使用して調製した。
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【００９１】
溶液を、各２００ｍＬの５つの等しい部分に分割した。表６に示すように、５つの異なる溶液のｐＨレベルを０．２５Ｍの硫酸を用いて調整した。
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【００９２】
各ヘマトキシリン溶液の試料を、４ｍｍの密閉されたチューブループ（長さ３０ｃｍ）内に配置し、そして試料を含有するチューブを、６０℃に維持されたオーブン内に７日間配置した。チューブからそのヘマトキシリン溶液を流出させ、該チューブをＤＩ水でリンスした。チューブのそれぞれには、ヘマトキシリン沈殿物のフィルムが認められたが、しかし沈殿物のコーティングのレベルは、溶液のｐＨに応じて異なった。ｐＨレベルが高い溶液ほど、チューブループ表面上に多量の沈殿物のコーティングが残留した。これは図３において例証される。
【００９３】
次にチューブループ実験を、ただし４５℃で２９日間繰り返した。同一の傾向が認められた。ｐＨレベルが高い溶液ほどチューブ表面に多量の沈殿が認められた（図４を参照）。
【００９４】
実施例６
約３６０日後、これまでにｐＨ調整されたヘマトキシリン試料のｐＨレベル（表６を参照）を、１．２Ｍのシアノ酢酸／シアノ酢酸塩バッファー溶液（ｐＨ＝２．６）を用いて約ｐＨ＝２．５に調整した。表７を参照。
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【００９５】
表７において識別されたｐＨ再調整後の試料を、次に染色実験（５個１組のマルチ組織ブロック（ＭＴＢ）からなるスライドの染色）で使用した。コントロール（ここでは、Ｖｅｎｔａｎａヘマトキシリン溶液の使用期限前のロット、パート番号０７０２４２８２００１）を試料ＡＮＳ  Ｒｅｖ  Ｄ００２（ここでは、使用期限前のロット）と比較し、コントロールとして使用し、そして他の４つの染色剤（ＥＸＰ５−Ａ、ＥＸＰ５−Ｂ、ＥＸＰ５−Ｃ、ＥＸＰ５−Ｄ）と比較した。約２．２５よりも低いｐＨに３６０日間維持された染色剤（ＥＸＰ５−ＣおよびＥＸＰ５−Ｄ）では、沈殿物がスライド上に最低限度しか、またはまったく認められなかった。
【００９６】
実施例７
約４００日後、これまでにｐＨ調整されたヘマトキシリン試料のｐＨレベル（表６を参照）を、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００青色化溶液（０．１Ｍのトリスバッファー、ｐＨ＝８〜９）を用いて約ｐＨ＝２．５に調整した。表８を参照。これらのｐＨ再調整後の溶液を用いて、その他の実験は実施されなかった。容易に入手可能な試薬（ＶＥＮＴＡＮＡ  ＨＥ６００青色化溶液）が酸性ヘマトキシリン溶液のｐＨ再調整に使用可能であるという概念を証明するために、ｐＨ再調整を実施した。
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【００９７】
分析
出願者は、ヘマトキシリン染色溶液のｐＨを低く（例えば、２．４未満のｐＨ）保つことにより、沈殿物形成速度が有意に低下し得ることを発見した。これは、染色溶液のｐＨを下げるために、酸性化剤として塩酸および硫酸の両方を使用した２つの異なるヘマトキシリン染色溶液の使用により明らかにされた。それまでは酸性化されていたヘマトキシリン染色溶液を、染色にふさわしいｐＨにまで再度上昇させるのに、強塩基溶液（水酸化ナトリウム溶液）またはｐＨ緩衝化溶液（シアノ酢酸／シアノ酢酸塩溶液、トリス／Ｈ−トリス＋溶液）のいずれも有効であることが判明した。
【００９８】
１年よりもかなり長期間経時したヘマトキシリン溶液は、新規調製溶液と比較して染色上の差異（色調および非特異的染色）を示した。この効果は、ヘマトキシリン染色剤の新旧の製剤を比較したときに一般的に観測されるので、これは驚くべきことではない。なにが顕著かといえば、経時過程においてそのｐＨレベルが低下したとき、経時した溶液において沈殿物が生じないことが見出されたことである。
【００９９】
ｐＨが低い（ｐＨ＜約２．４）ヘマトキシリン溶液を最初に製剤化することにより、溶液は、数カ月間安定に保管可能であると同時に存続可能である。染色時にｐＨを再調整すれば、正常なヘマトキシリン染色が実現する。本製剤を使用すれば、容易に沈殿しない染色溶液からの高品質ヘマトキシリン染色剤の製造が可能となる。
【０１００】
本明細書で参照され、および／または出願データシートに記載されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許公開資料のすべては、本明細書において参照としてそのまま援用されている。実施形態の側面は、様々な特許、用途、および公開資料の概念を採り入れてなおもさらなる実施形態を提供するために、必要な場合には修正可能である。
【０１０１】
本開示は、いくつかの例証的実施形態を参照しながら記載されてきたが、本開示の原理の精神および範囲に該当する非常に多くのその他の修正形態および実施形態が、当業者により考案され得るものと理解すべきである。より具体的には、本開示の精神から逸脱せずに、上記開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせアレンジメントのコンポーネントパートおよび／またはアレンジメントにおいて合理的な変更および修正が可能である。コンポーネントパートおよび／またはアレンジメントにおける変更および修正に付加して、代替的使用もまた、当業者にとって明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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