(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、複数の微生物と非特異的に相互作用可能なプローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、
（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、
（ｂ）環境応答性蛍光団と
を含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、前記環境応答性蛍光団が、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団、キサンテン骨格を有する蛍光団、ピレン骨格を有する蛍光団および凝集誘起発光性蛍光団からなる群から選択され、
（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、微生物叢を含有する分析試料を添加するステップと、その結果、前記分析試料中の微生物と前記プローブとが非特異的に相互作用し、
（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、
（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップと
を含む、微生物叢の分析方法。
【請求項２】
前記環境応答性蛍光団が、凝集誘起発光性蛍光団である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集誘起発光性蛍光団が、テトラフェニルエチレンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カチオン性ポリマーが、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリアミノ酸が、ポリリジンまたはポリオルニチンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の１〜５０％に前記環境応答性蛍光団が共有結合している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記カチオン性ポリマーの前記環境応答性蛍光団が共有結合していない前記１級アミノ基の少なくとも一部に対して、グアニジウム基、カルボキシル基およびアミノ酸からなる群から選択される官能基が導入されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（３）における蛍光強度の測定が、複数の励起波長および蛍光波長について行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（４）により、前記微生物叢に含有される微生物株の種類および／または量が判定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物叢が動物個体由来であり、前記ステップ（４）により、前記動物個体の状態および／または特性が判定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物個体がヒト個体である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物叢に含まれる微生物の種類ならびに／または量を判定する方法、ならびに、微生物叢が由来する動物個体の状態および特性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの身体には、細菌、真菌、ウイルスなどの、１００兆個以上もの微生物が常在する。それらは、皮膚、口腔、消化管などの部位それぞれに固有の構成を保って定着して棲息しており、このような微生物群は一括して常在微生物叢と呼ばれる。常在微生物叢は、宿主と密接に相互作用し、宿主に対して様々な影響を与えていることが知られる。近年、常在微生物叢、とりわけ、腸内微生物叢（腸内フローラ）が、宿主の健康状態／疾患状態に強く関連することが見出され、肥満症、２型糖尿病、アレルギー、自閉症スペクトラム障害などの種々の疾患の患者において、腸内微生物叢の構成の破綻や多様性の減少（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）が見られることが指摘されている（非特許文献１、２）。そのため、健康管理や疾患の予防または治療の観点から、腸内微生物叢の理解および制御が重要視されつつある（非特許文献２）。【０００３】
現在、常在微生物叢の解析は、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡの配列に基づく系統分類（１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析）または全ゲノムショットガンメタゲノム解析によって行われており、これらはいずれも微生物叢を構成する微生物の種類を網羅的に同定するものである。しかし、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析の場合には、ＰＣＲ増幅できない未知の微生物の存在を否定できないことや、微生物の種類を同定できても、それらを定量的に分析することが難しいという問題がある。また、全ゲノムショットガンメタゲノム解析は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析よりは精度が高いものの、全ゲノムを解析するため、多大な労力、時間、コストを要し、日常的に行うことは現実的ではない。【０００４】
上記の諸問題を解決できる可能性がある方法としては、交差反応型センシング法に基づく微生物叢の解析方法が挙げられる。この場合には、微生物叢を構成する微生物を網羅的に同定するのではなく、分析対象とする微生物叢に含まれる種々の微生物に交差反応する分子を用いて、種々の微生物と交差反応分子との非特異的な相互作用反応の総和を統計的に解析することにより、微生物叢の構成を判別する。そのため、交差反応型センシング法に基づく解析方法では、特定の微生物に特異的に相互作用する分子を個々に開発する必要がないという利点がある。【０００５】
最近になって、交差反応型センシング法を利用して、２または３種類の細菌の混合サンプルを判別できることが報告された（非特許文献３、４）。しかし、微生物叢は数百種類以上の微生物から構成されており、そのような広範かつ膨大な種類の微生物の混合試料を交差反応型センシング法により判別することができるプローブおよび方法は、現時点では報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat. Microbiol., 2018, Vol. 3, pp. 8-16
【非特許文献２】Nature, 2016, Vol. 535, pp. 94-103
【非特許文献３】Adv. Healthcare Mater., 2018, Vol. 7, Article No. 1701370
【非特許文献４】Anal. Chem., 2017, Vol. 89, pp. 3208-3216
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、動物個体由来の微生物叢を高精度かつ容易に判別する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、広範な種類のタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を交差反応型センシング法により判別することに成功している（国際公開第２０１８／０８８５１０号）。本発明者らは、上記方法を基に、微生物叢ならびにそれが由来する動物個体の状態および／または特性を高精度で判別できる方法を確立した。【０００９】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、複数の微生物と非特異的に相互作用可能なプローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、微生物叢を含有する分析試料を添加するステップと、その結果、前記分析試料中の微生物と前記プローブとが非特異的に相互作用し、（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップであって、その結果、前記微生物叢を構成する微生物の種類および／または量が判定される、ステップとを含む、微生物叢の分析方法を提供するものである。【００１０】
前記環境応答性蛍光団は、凝集誘起発光性蛍光団であることが好ましく、例えば、テトラフェニルエチレンまたはその誘導体であることが好ましい。【００１１】
前記カチオン性ポリマーは、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンであることが好ましい。【００１２】
前記ポリアミノ酸は、ポリリジンまたはポリオルニチンであることが好ましい。【００１３】
前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の１〜５０％に前記環境応答性蛍光団が共有結合していることが好ましい。【００１４】
前記カチオン性ポリマーの前記環境応答性蛍光団が共有結合していない前記１級アミノ基の少なくとも一部に対して、グアニジウム基、カルボキシル基およびアミノ酸からなる群から選択される官能基が導入されていることが好ましい。【００１５】
前記（３）における蛍光強度の測定は、複数の励起波長および蛍光波長について行われることが好ましい。【００１６】
前記ステップ（４）により、前記微生物叢に含有される微生物株の種類および／または量が判定されることが好ましい。【００１７】
前記微生物叢が動物個体由来であり、前記ステップ（４）により、前記動物個体の状態および／または特性が判定されることが好ましい。【００１８】
前記動物個体は、ヒト個体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る方法によれば、わずか１種類または数種類のプローブをイオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に溶解して用いることにより、微生物叢を構成する広範かつ膨大な種類の微生物を網羅的に同定する必要なしに、微生物叢を構成する種々の微生物とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターンに基づいて、微生物叢を構成する微生物を、高精度かつ容易に、定性的かつ定量的に分析することができる。そのため、本発明に係る方法によれば、例えば健康状態や体質が異なる動物個体由来の微生物叢を参照試料とし、単に蛍光強度パターンを比較するのみにより、分析対象の微生物叢が由来する動物個体の状態および／または特性を容易に判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例において合成したプローブ（プローブ１〜１２）の構造式を示す図である。括弧内の数値は官能基を導入した部位のＣｌｏｇＰ値を示す。
【図２】図２は、プローブ１（−Ｎｏｎｅ）およびプローブ５（−Ｎｌｅ）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図３】図３は、細菌１６種×２溶媒条件×１２プローブ×２波長セット×１１測定により得られた蛍光強度（Ｉ）のヒートマップである。
【図４】図４は、図３の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図５】図５は、細菌１６種×２溶媒条件×１２プローブ×２波長セット×１１測定により得られた蛍光強度の変化（Ｉ−Ｉ０）を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図６】図６は、図３の結果について、細菌のラベルを「門」に変更して線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図７】図７は、肥満モデル微生物叢試料の組成を示すグラフである。
【図８】図８は、４肥満モデル微生物叢試料×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×２２測定により得られた蛍光強度（Ｉ）のヒートマップである。
【図９】図９は、図８の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１０】図１０は、（ａ）対照群および（ｂ）睡眠障害モデル群のマウスの典型的なアクトグラムである。
【図１１】図１１は、８試料（４対照群および４ストレス群）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×２２測定により得られた蛍光強度（Ｉ）のヒートマップである。
【図１２】図１２は、図１１の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１３】図１３は、図１２の結果について、試料のラベルをストレスの有無に変更して線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアをプロットした図である。
【図１４】図１４は、マウスの運動量の変化を示すグラフである。
【図１５】図１５は、８マウス微生物叢試料×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度（Ｉ）のヒートマップである。
【図１６】図１６は、図１５の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１７】図１７は、図１６の結果について、試料のラベルを回転輪固定の有無に変更して線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアをプロットした図である。
【図１８】図１８は、大腸菌８種×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１１測定により得られた蛍光強度（Ｉ−Ｉ０）のヒートマップである。
【図１９】図１９は、図１８の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図２０】図２０は、図１８の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアおよび第三判別スコアをプロットした図である。
【図２１】図２１は、実施例において合成したプローブ（プローブ１３〜１７）の構造式を示す図である。括弧内の数値は官能基を導入した部位のＣｌｏｇＰ値を示す。
【図２２】図２２は、プローブ１３（−Ｎｏｎｅ／Ｆ）およびプローブ１４（−Ｎｌｅ／Ｆ）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図２３】図２３は、異なる経過日数における発酵液による綿織物の染色結果を示す図である。
【図２４】図２４は、１５藍染細菌叢試料×２溶媒条件×５プローブ×３波長セット×９測定により得られた蛍光強度（Ｉ−Ｉ０）のヒートマップである。
【図２５】図２５は、図２４の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、第一の実施形態によれば、（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、複数の微生物と非特異的に相互作用可能なプローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、微生物叢を含有する分析試料を添加するステップと、その結果、前記分析試料中の微生物と前記プローブとが非特異的に相互作用し、（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、微生物叢の分析方法である。
【００２３】
最初に、本実施形態の方法において使用するプローブについて説明する。本実施形態の方法において使用するプローブは、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものである。
【００２４】
本実施形態におけるプローブのカチオン性ポリマー（ａ）は、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であり、当該ポリマー１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有するものであれば、任意のものであってよい。ここで、「ポリマー」とは、同一であっても異なってもよい２以上のモノマーが重合された化合物を意味し、したがって、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。また、ポリマーの重合度も特に限定されず、したがって、「ポリマー」にはオリゴマーも含まれる。
【００２５】
本実施形態におけるプローブのカチオン性ポリマーの重量平均分子量は、１，０００〜５００，０００であり、好ましくは１，５００〜２００，０００であり、特に好ましくは２，０００〜１００，０００である。
【００２６】
本実施形態におけるプローブのカチオン性ポリマーは、当該ポリマー１分子中に少なくとも５個、好ましくは７個以上、特に好ましくは１０個以上の１級アミノ基を有する。
【００２７】
本実施形態において、プローブに用いることができるカチオン性ポリマーは、好ましくは、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンである。さらに、これらのカチオン性ポリマーを、ポリエチレングリコールとのコポリマーとしてもよい。
【００２８】
本実施形態において、プローブに用いることができるポリアミノ酸は、同種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよいし、異なる種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよい。また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基は、Ｌ体またはＤ体のいずれであってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン、ポリオルニチン、リジンとフェニルアラニンのランダムコポリマー、リジンとチロシンのランダムコポリマーなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアミノ酸は、ポリリジンまたはポリオルニチンである。
【００２９】
本実施形態において、プローブに用いることができるポリアルキレンイミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミンなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンである。
【００３０】
本実施形態におけるプローブの環境応答性蛍光団（ｂ）は、蛍光分子周辺の環境に応じて蛍光特性が変化する蛍光団であれば、任意のものであってよい。そのような蛍光団としては、例えば、蛍光分子周辺の極性に応じて蛍光特性が変化する蛍光団や、蛍光分子周辺のｐＨに応じて蛍光特性が変化する蛍光団や、蛍光分子周辺の混雑度に応じて蛍光特性が変化する蛍光団などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
蛍光分子周辺の極性に応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル（ダンシル）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）、Ｎ−メチル−２−アニリノナフタレン−６−スルホン酸（ＭＡＮＳ）、２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸（ＴＮＳ）のような、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団；４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ）、７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）、４−（アミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＡＢＤ）、２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホン酸アンモニウム（ＳＢＤ）のような、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
【００３２】
蛍光分子周辺のｐＨに応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５（６）−カルボキシフルオレセイン（５（６）−ＦＡＭ）、２’−７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）、セミナフタロダフルオレセイン（ＳＮＡＲＦ）のような、キサンテン骨格を有する蛍光団；８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＨＴＰＳ）のような、ピレン骨格を有する蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
【００３３】
蛍光分子周辺の混雑度に応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、テトラフェニルエチレン（ＴＰＥ）、１０，１０’ ，１１，１１’−テトラヒドロ−５，５’−ビジベンゾ［ａ，ｄ］［７］アヌレニリデン（ＴＨＢＡ）、１，１，２，３，４，５−ヘキサフェニルシロール（ＨＰＳ）などの凝集誘起発光性（ＡＩＥ）蛍光団またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。本実施形態においてプローブに用いることができる環境応答性蛍光団は、好ましくはＡＩＥ蛍光団であり、特に好ましくはＴＰＥである。
【００３４】
本実施形態におけるプローブは、カチオン性ポリマー（ａ）中の１級アミノ基の一部に環境応答性蛍光団（ｂ）が共有結合により導入されてなる。ここで、「一部」とは、カチオン性ポリマー分子中の１級アミノ基のうちの１〜５０％であることが好ましく、特に好ましくは５〜２０％である。
【００３５】
本実施形態におけるプローブは、従来公知の化学合成方法や、以下の実施例において記載する化学合成方法およびそれに準ずる化学合成方法により合成することができる。
【００３６】
本実施形態におけるプローブは、環境応答性蛍光団が導入されていない１級アミノ基の少なくとも一部に対して、官能基が導入されていてもよい。官能基は、負電荷または正電荷のいずれを有するものであってよく、好ましくは、グアニジウム基、カルボキシル基およびアミノ酸からなる群から選択される官能基を用いることができる。また、アミノ酸としては、例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、またはそれらの誘導体などが挙げられる。本実施形態におけるプローブには、上記の官能基の１または複数を任意に選択して導入することができる。
【００３７】
アミノ基への官能基の導入は、従来公知の化学合成方法により行うことができる。アミノ基へのグアニジウム基の導入は、例えば、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩を用いて行うことができる。アミノ基へのカルボキシル基の導入は、例えば、無水酢酸、無水フタル酸、ナフタレンジカルボン酸無水物などのカルボン酸無水物を用いたアセチル化反応により行うことができる。アミノ基へのアミノ酸の導入は、例えば、アミノ酸のカルボキシル基を脱水縮合させることにより行うことができる。
【００３８】
本実施形態におけるプローブは、複数の微生物と非特異的に相互作用することができる。本実施形態におけるプローブが対象とする「微生物」は、細菌、真菌、原虫、ウイルスなどの任意の分類の微生物であってよく、それらの複数の分類の微生物の混合物であってよい。また、本実施形態におけるプローブが対象とする微生物には、既知の微生物のみならず、未知の微生物が含まれ得る。
【００３９】
本実施形態におけるプローブが対象とする微生物は、好ましくは、細菌である。本実施形態におけるプローブが対象とする細菌は、任意の分類のものであってよく、例えば、グラム陰性またはグラム陽性菌のいずれであってもよく、嫌気性または好気性菌のいずれであってもよく、または、それらの複数の種類の細菌の混合物であってもよい。また、本実施形態におけるプローブは、生菌または死菌のいずれにも相互作用し得る。
【００４０】
本実施形態の方法では、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、上記プローブを溶解する。プローブを溶解するための溶媒は、任意のバッファーおよび／または塩を含む水性溶媒であってよい。バッファーとしては、例えば、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸、グリシンなどが挙げられる。塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮなどが挙げられる。本実施形態において、溶媒のｐＨは、好ましくは４．０〜１０．０であり、特に好ましくは５．０〜７．０である。また、本実施形態において、溶媒のイオン強度は、１０〜５００ｍＭであることが好ましい。また、本実施形態におけるプローブの濃度は、０．１〜１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００４１】
本実施形態の方法では、溶媒は、例えば２種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができ、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができる。また、本実施形態の方法では、１種類のプローブを用いてもよいが、多種類のプローブを用いることがより好ましく、例えば２種類以上、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上のプローブを用いることができる。例えば、２種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば、６種類のプローブ溶液を調製することができ、その結果、１つの分析試料について６次元のデータを得ることができる。例えば、５種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば、１５種類のプローブ溶液を調製することができ、その結果、１つの分析試料について１５次元のデータを得ることができる。このように、溶媒の種類とプローブの種類を増やすことにより、より多次元のデータを得ることができる。
【００４２】
次いで、複数のプローブ溶液に対して、微生物叢を含有する分析試料を添加する。ここで、「微生物叢」とは、ある特定の環境中に存在する複数の微生物の集まりを意味する。微生物叢は、例えば、少なくとも１００種類、３００種類、５００種類、７００種類、１，０００種類、またはそれ以上の種類の微生物から構成され得る。微生物叢は、細菌、真菌、原虫、ウイルスなどの、種々の分類および／または種類の微生物から構成されることができ、本実施形態の方法は、任意の分類および／または種類の微生物から構成される微生物叢を対象とすることができる。微生物叢が存在する環境としては、例えば、動植物個体の表面または内部、土壌、海水、河川水などが挙げられる。
【００４３】
本実施形態の方法は、任意の環境に由来する任意の微生物叢を対象とすることができるが、好ましくは、動物個体由来の微生物叢を対象とする。微生物叢が由来する動物個体は、任意の脊椎動物個体または無脊椎動物個体であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物個体であり、特に好ましくはヒト個体である。動物個体における微生物叢は、組織（例えば、消化管、口腔、鼻腔、皮膚、呼吸器、生殖器など）の上皮に存在し、本実施形態の方法において分析される微生物叢は、いずれの組織上皮由来の微生物叢であってもよい。本実施形態の方法において分析される動物個体由来の微生物叢は、好ましくは、口腔内微生物叢（口内フローラ）または腸内微生物叢（腸内フローラ）であり、特に好ましくは、腸内微生物叢である。
【００４４】
動物個体由来の微生物叢を含有する分析試料は、従来公知の方法により調製することができる。例えば、口腔内細菌叢を含有する分析試料であれば、歯垢や唾液などから調製することができ、腸内微生物叢を含有する分析試料であれば、糞便から調製することができる。プローブ溶液に添加される微生物の最終濃度は、例えばＯＤ６００＝０．００２〜０．５００であってよく、好ましくはＯＤ６００＝０．０１０〜０．１００であってよい。分析試料中の微生物濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈してプローブ溶液に添加してもよい。
【００４５】
本ステップにおいて、プローブは、微生物叢に含まれるあらゆる微生物に対して、その分類や種類に関係なく、非特異的に相互作用する。例えば、ヒト腸内微生物叢であれば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）などの門に属する、１，０００種類以上もの細菌が含まれており、それらのすべてに対してプローブが非特異的に相互作用し得る。
【００４６】
次いで、分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定する。本実施形態の方法では、励起波長３００〜５００ｎｍ、蛍光波長４００〜７００ｎｍにおいて蛍光強度を測定することができる。また、本実施形態の方法では、各測定対象につき、複数の励起波長／蛍光波長のセット（例えば、励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）：３３０／４８０、３４５／５０５、３６０／５３０など）における蛍光強度を測定することが好ましく、例えば２セット、３セット、または４セットの励起波長／蛍光波長により蛍光強度を測定することができる。
【００４７】
プローブ溶液の蛍光強度は、添加された試料中に含まれる微生物の種類や量に応じて変化し、さらに、プローブを溶解する溶媒の条件によっても変化する。そのため、本ステップにより、試料に固有の蛍光強度のパターン（蛍光フィンガープリント）を得ることができる。
【００４８】
次いで、分析試料について得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較する。参照試料についての蛍光強度パターンは、分析試料と並行して蛍光強度の測定を行うことにより取得してもよいし、予め準備された所定の蛍光強度パターンであってもよい。蛍光強度パターンの比較は、好ましくは、主成分分析、線形判別分析、階層的クラスター分析などの多変量解析により次元数を圧縮し、蛍光フィンガープリント間の差異を２次元または３次元に圧縮変換して比較することができる。
【００４９】
本実施形態の方法は、蛍光強度のパターンの違いのみに基づいて、微生物叢を分析する。従来方法では、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析や全ゲノムショットガンメタゲノム解析によって、微生物叢を構成する微生物の種類を網羅的に同定することにより、微生物叢プロファイルを取得する必要があった。また、その場合には、微生物叢を構成する微生物種を同定することはできても、それらを網羅的に定量することは困難であり、同一微生物種の異なる株を識別することも困難であった。これに対し、本実施形態の方法では、微生物叢を構成する種々の微生物とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターン（蛍光フィンガープリント）を取得し、参照試料についての蛍光強度パターンと比較することにより、微生物叢を構成する微生物の定性的および定量的な差異を検出する。
【００５０】
したがって、本実施形態の方法では、例えば、異なる環境Ａ、ＢまたはＣ由来の微生物叢を含有する参照試料について得られた蛍光フィンガープリントと、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントとを比較する。その結果、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントと、環境Ａに由来する微生物叢を含有する参照試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に最も近ければ、分析試料に含有される微生物叢が環境Ａに由来するものであると推定または特定することができる。
【００５１】
特定の実施形態によれば、微生物叢に含有される微生物株の種類および／または量を判定することができる。例えば、異なる菌株Ａ、ＢまたはＣを含有する発酵食品試料（参照試料）について得られた蛍光フィンガープリントと、不明の菌株を含有する発酵食品試料（分析試料）について得られた蛍光フィンガープリントを比較し、不明の菌株を含有する発酵食品試料について得られた蛍光フィンガープリントと、菌株Ａを含有する発酵食品試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に近いとき、分析対象の発酵食品が菌株Ａを含有するものであると推定または特定することができる。
【００５２】
特定の実施形態によれば、動物個体由来の微生物叢を含有する分析試料を用いることにより、動物個体の状態および／または特性を判定することができる。微生物叢を構成する微生物の種類および／または量は、それが由来する動物個体の健康状態や体質によって異なる。したがって、特定の実施形態では、異なる健康状態や体質の動物個体由来の微生物叢を含有する参照試料を用いることが好ましい。
【００５３】
特定の実施形態において、参照試料は、例えば、肥満個体または非肥満個体由来の細菌叢を含有するものであってよい。参照試料および分析試料について得られた蛍光フィンガープリントを比較し、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントと、肥満個体由来の細菌叢を含有する参照試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に近いとき、その分析試料が由来する被験者を、肥満またはそのリスクが高い個体として推定または特定することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、参照試料は、例えば、健常個体または感染症に罹患した個体由来の細菌叢を含有するものであってよい。参照試料および分析試料について得られた蛍光フィンガープリントを比較し、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントと、感染症に罹患した個体由来の細菌叢を含有する参照試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に近いとき、その分析試料が由来する被験者を、感染症の原因菌株に感染しているまたはそのリスクが高い個体として推定または特定することができる。
【００５５】
本実施形態の方法は、微生物叢を構成する菌種を同定および／または定量する必要なしに、かつ、未知の微生物の存在の可能性を考慮する必要なしに、わずか１種類または数種類のプローブを用いて、微生物叢を分析することを可能とする。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５７】
＜１．プローブの合成（プローブ１〜１２）＞
以下に示す手順により、ポリエチレングリコールとポリ−Ｌ−リジンのブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ）に対してテトラフェニルエチレン（ＴＰＥ）を導入したプローブ群を合成した。【００５８】
ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ−Ｌ−リジントリフルオロ酢酸塩（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ、Ｍｗ：１７２００）［エチレングリコール繰り返しユニット数：１０４、Ｌ−リジントリフルオロ酢酸塩繰り返しユニット数：５２］は、Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓから購入した。Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ（ｓｃ−２３５１９９）、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＰｆｐ（ｓｃ−３１９８７８）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ（ｓｃ−２５００１４）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ（ｓｃ−２３５１９２）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。無水コハク酸（２３９６９０）、無水フタル酸（２３００６４）、２，３−ピラジンジカルボン酸無水物（４０５０１９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン（Ｂ３６３４）は東京化成工業株式会社から購入した。ｎ−ブチルリチウム（１．６ｍｏｌ／Ｌヘキサン溶液）（０２０−１９０７１）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（超脱水）（２０７−１７９０５）、硫酸ナトリウム（１９７−０３３４５）、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（３２６−３２８８１）、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩（３２２−３１８８１）、メタノール（１３１−０１８２６）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（０４９−０７２１３）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０４９−０２９１４）、ピペリジン（１６６−０２７７３）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０５９−０５３５２）、トリエチルアミン（２０８−０２６４３）は、富士フイルム和光純薬株式会社から購入した。Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｙ）３−ＯＨ（Ｒ００１３２）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（４−Ｐｙｒｉ）−ＯＨ（Ｍ００６６９）、Ｆｍｏｃ−ＤＡＰ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Ｌ００７９７）は、渡辺化学工業株式会社から購入した。【００５９】
（１−１）４−（１，２，２−トリフェニルエテニル）安息香酸ペンタフルオロフェニル（ＴＰＥ−ＣＯ−ＯＰｆｐ）の合成
【化１】
0006957064.tif 000002
【００６０】
（ｉ）４−（１，２，２−トリフェニルエテニル）安息香酸（ＴＰＥ−ＣＯＯＨ）（化合物２）の合成
アルゴン雰囲気下、１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン（化合物１）（２．０６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（７０ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却した。この溶液に、ｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍヘキサン溶液）（４．３８ｍＬ、７．０ｍｍｏｌ）を５分かけてゆっくりと滴下し、−７８℃で４０分撹拌した。この反応液に、細かく砕いたドライアイス（１５ｇ）を加え、−７８℃で１時間撹拌した。その後、反応液を室温に戻し、さらに１時間撹拌した後、塩酸（１．０Ｎ、５０ｍＬ）を加えて室温で３０分撹拌した。その後、反応液に酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えて水層を分離し、得られた有機層を水（５０ｍＬ）で１回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。その後、硫酸ナトリウムを濾過により除き、溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−クロロホルム）により精製して、化合物２（１．６８ｇ、収率８９％）を白色固体状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．８３（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．１４〜７．１０（ｍ，１１  Ｈ，ＡｒＨ），７．０４〜７．００（ｍ，６  Ｈ，ＡｒＨ）．【００６１】
（ｉｉ）４−（１，２，２−トリフェニルエテニル）安息香酸ペンタフルオロフェニル（ＴＰＥ−ＣＯ−ＯＰｆｐ）（化合物３）の合成
アルゴン雰囲気下、化合物２（７５０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．６８ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．５１ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１００分間撹拌した。反応液に酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて、水（５０ｍＬ）で４回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過により除き、溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して、化合物３（９８０ｍｇ、収率９０％）を白色泡状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９２（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２０（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．１６〜７．１１（ｍ，９  Ｈ，ＡｒＨ），７．０６〜７．０１（ｍ，６  Ｈ，ＡｒＨ）．  【００６２】
（１−２）Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｙ）３−ＯＰｆｐ（化合物５）の合成
【化２】
0006957064.tif 000003
【００６３】
アルゴン雰囲気下、Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｙ）３−ＯＨ（化合物４）（９０５ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．７５ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．５６ｍＬ、３．３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて、水（６０ｍｌ）で４回、飽和食塩水（６０ｍＬ）で１回洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過により除き、溶液を減圧下で濃縮した。得られた白色固体を酢酸エチル（１５ｍＬ）とヘキサン（４５ｍＬ）の混合溶液に懸濁し、沈殿物を濾取することにより、化合物５（９６６ｍｇ、収率７６％）を白色粉末状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．５７（ｔ，１Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），８．２１（ｔ，１  Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），７．８９（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７１（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．５７（ｔ，１  Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．４２（ｔ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．３３（ｔ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．３３（ｄ，２  Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝５．８Ｈｚ），４．２９（ｄ，２  Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．２３（ｔ，１  Ｈ，ＣＨ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．８０（ｄ，２  Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝５．８Ｈｚ），３．６８（ｄ，２  Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝６．０Ｈｚ）．【００６４】
（１−３）Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（４−Ｐｙｒｉ）−ＯＰｆｐ（化合物７）の合成
【化３】
0006957064.tif 000004
【００６５】
アルゴン雰囲気下、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（４−Ｐｙｒｉ）−ＯＨ（化合物６）（１．５５ｇ、４．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１．３６ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．０２ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１．５時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２００ｍＬ）を加えて、水（８０ｍＬ）で４回、飽和食塩水（８０ｍＬ）で１回洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過により除き、溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して、化合物７（１．８６ｇ、収率８４％）を白色固体状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．４９（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），８．２６（ｄ，１  Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．８８（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．６２（ｄｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝７．０，５．２Ｈｚ），７．４０（ｍ，２  Ｈ，ＡｒＨ），７．３４（ｄ，２  Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），７．２９（ｍ，２  Ｈ，ＡｒＨ），４．８２（ｄｄｄ，１  Ｈ，ＣＨ，Ｊ＝１０．５，７．８，５．０Ｈｚ），４．３９（ｄｄ，１  Ｈ，ＣＨ２ａ，Ｊ＝１０．７，６．９Ｈｚ），４．３０（ｄｄ，１  Ｈ，ＣＨ２ｂ，Ｊ＝１０．７，６．８Ｈｚ）．４．２０（ｄｄ，１  Ｈ，ＣＨ，Ｊ＝６．９，６．８Ｈｚ），３．２７（ｄｄ，１  Ｈ，ＣＨ２ａ，Ｊ＝１３．８，５．０Ｈｚ），３．１３（ｄｄ，１  Ｈ，ＣＨ２ｂ，Ｊ＝１３．８，１０．５Ｈｚ）．【００６６】
（１−４）Ｆｍｏｃ−ＤＡＰ（Ｆｍｏｃ）−ＯＰｆｐ（化合物９）の合成
【化４】
0006957064.tif 000005
【００６７】
アルゴン雰囲気下、Ｆｍｏｃ−ＤＡＰ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（化合物８）（１．１０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．６８ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．５１ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて、水（６０ｍＬ）で４回、飽和食塩水（６０ｍＬ）で１回洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過により除き、溶液を減圧下で濃縮した。得られた白色固体を酢酸エチル（１０ｍＬ）とヘキサン（５０ｍＬ）の混合溶媒に懸濁し、沈殿物を濾取することで化合物９（１．３２ｇ、収率９２％）を白色粉末状物質として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．１０（ｄ，１  Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．９０〜７．８７（ｍ，４  Ｈ，ＡｒＨ），７．７０〜７．６９（ｍ，２  Ｈ，ＡｒＨ），７．６７〜７．６４（ｍ，２  Ｈ，ＡｒＨ），７．５６（ｔ，１  Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），７．４２〜７．３９（ｍ，４  Ｈ，ＡｒＨ），７．３２〜７．２７（ｍ，４  Ｈ，ＡｒＨ），４．６４（ｍ，１  Ｈ，ＣＨ），４．４２〜４．３６（ｍ，２  Ｈ），４．３４〜４．３０（ｍ，２  Ｈ），４．２６〜４．２０（ｍ，２  Ｈ），３．５７〜３．５４（ｍ，２  Ｈ，ＣＨ２）．【００６８】
（１−５）ＴＰＥ基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ１）の合成
４００ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（２３．３μｍｏｌ，アミノ基のモル数：１２００μｍｏｌ）を４０ｍＬのＤＭＦに溶解し、撹拌しながら５００μＬのトリエチルアミンを加え、さらに、ＤＭＦに溶解させた４０ｍＭのＴＰＥ−ＣＯ−ＯＰｆｐを１．５１ｍＬ加えた。その後、アルゴン雰囲気下で密栓・遮光して２４時間室温で撹拌した。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６（ＭＷＣＯ：８ｋＤａ））を用いて、超純水で１回、メタノールで２回、超純水で１回、１ｍＭのＨＣｌで２回、超純水で１回の順に透析した後、凍結乾燥により、ＴＰＥ基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ１：−Ｎｏｎｅ（図１））の粉末を得た。【００６９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）から、Ｌｙｓ側鎖のα−ＣＨのプロトン（δ＝３．９７ｐｐｍ）のピークに対する、アミド結合の隣のフェニル環の２つのプロトン（δ＝７．６４ｐｐｍ）を除いたＴＰＥの１５つのプロトン（δ＝６．１−７．１ｐｐｍ）のピークの面積比より、２．６個のＴＰＥが１分子のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬに導入されていることを確認した（データは省略）。【００７０】
（１−６）ＴＰＥ基および官能基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ２〜１２）の合成
（ｉ）アミノ酸の導入
３０ｍｇのプローブ１（−Ｎｏｎｅ）（２．１４μｍｏｌ，アミノ基：１０６μｍｏｌ）を３ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、撹拌しながら５４．４μＬのＤＩＥＡを加え、さらにＤＭＳＯに溶解させた２００ｍＭのＦｍｏｃ−各種アミノ酸−ＯＰｆｐを２．６５ｍＬ加えた。その後、アルゴン雰囲気下で密栓・遮光して７２時間室温で撹拌した。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６（ＭＷＣＯ：８ｋＤａ））を用いて、超純水で１回、メタノールで２回の順に透析した後、エバポレーターでメタノールを除去し、４ｍＬのＤＭＳＯを加え、撹拌しながら１ｍＬのピペリジンを加え、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。その後、アルゴン雰囲気下で密栓・遮光して４０時間室温で撹拌した。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６（ＭＷＣＯ：８ｋＤａ））を用いて、超純水で１回、メタノールで３回、超純水で１回、１ｍＭのＨＣｌで２回、超純水で１回の順に透析した後、凍結乾燥により、各種アミノ酸を導入したプローブ（プローブ３〜９：−Ｄａｐ、−Ｐｒｏ、−Ｎｌｅ、−Ｌｅｕ、−Ｇｌｙ３、−Ｐｈｅ、−Ｐｙｒｉ（図１））の粉末を得た。【００７１】
１Ｈ−ＮＭＲチャートにおける、反応後のＬｙｓ側鎖のεＣＨ２のプロトン（δ＝２．９７ｐｐｍ  ｉｎ  ＭｅＯＤ，δ＝３．０４ｐｐｍ  ｉｎ  Ｄ２Ｏ）のピークの消失から、残存するＬｙｓ側鎖のほぼ全てが反応したことを確認した（−Ｐｈｅに関しては、アミド結合の隣のフェニル環の２つのプロトン（δ＝７．６４ｐｐｍ）を除いたＴＰＥの１５つのプロトン（δ＝６．１−７．１ｐｐｍ）のピークに対する、Ｐｈｅ側鎖のフェニル環の５つのプロトン（δ＝７．２８ｐｐｍ）のピークの面積比より完全に反応が進行したことを別途確認した）（データは省略）。【００７２】
（ｉｉ）グアニジウム化
３０ｍｇのプローブ１（−Ｎｏｎｅ）（２．１４μｍｏｌ，アミノ基：１０６μｍｏｌ）を３．８ｍＬのメタノールに溶解し、撹拌しながら７４．０μＬのトリエチルアミンを加え、さらにメタノールに溶解させた２００ｍＭの１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩（ＰＣＡ−Ｃｌ）を１．５９ｍＬ加えた。その後、アルゴン雰囲気下で密栓・遮光して２４時間室温で撹拌した。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６（ＭＷＣＯ：８ｋＤａ））を用いて、超純水で１回、メタノールで２回、超純水で１回、１ｍＭのＨＣｌで２回、超純水で１回の順に透析した後、凍結乾燥により、アミノ基をグアニジウム化したプローブ（プローブ２：−ｈＡ（図１））の粉末を得た。【００７３】
１Ｈ−ＮＭＲチャートにおける、反応後のＬｙｓ側鎖のεＣＨ２のプロトン（δ＝２．９７ｐｐｍ  ｉｎ  ＭｅＯＤ）のピークの消失から、残存するＬｙｓ側鎖のほぼ全てが反応したことを確認した（データは省略）。【００７４】
（ｉｉｉ）カルボキシル化
３０ｍｇのプローブ１（−Ｎｏｎｅ）（２．１４μｍｏｌ，アミノ基：１０６μｍｏｌ）を３．８ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、撹拌しながら１４７．６  μＬのトリエチルアミンを加え、さらにＤＭＳＯに溶解させた１Ｍの各種酸無水物を１．０６ｍＬ加えた。その後、アルゴン雰囲気下で密栓・遮光して４８時間室温で撹拌した。２．５ｍＬの超純水を加え、１時間室温で撹拌した後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６（ＭＷＣＯ：８ｋＤａ））を用いて、２０％メタノールで１回、超純水で１回、１ｍＭのＮａＯＨで２回、超純水で１回の順に透析し、凍結乾燥により、アミノ基をカルボキシル化したプローブ（プローブ１０〜１２：−Ｓｕｃ、−Ｐｈｔ、−Ｐｙｒ（図１））の粉末を得た。【００７５】
１Ｈ−ＮＭＲチャートにおける、反応後のＬｙｓ側鎖のεＣＨ２のプロトン（δ＝２．９７ｐｐｍ  ｉｎ  ＭｅＯＤ，δ＝２．７７ｐｐｍ  ｉｎ  ＤＭＳＯ−ｄ６）のピークの消失から、残存するＬｙｓ側鎖のほぼ全てが反応したことを確認した（データは省略）。【００７６】
＜２．腸内細菌の培養＞
本実施例において用いた腸内細菌を表１に示す。腸内細菌株はＪａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ）およびＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）のカルチャーコレクションから入手した。大腸菌ＤＨ５α株は、ＧＭｂｉｏｌａｂ社から購入した。大腸菌ＪＭ１０９株は、タカラバイオ社から購入した。【００７７】
表１．実施例において用いた腸内細菌
【表１】
0006957064.tif 000006
【００７８】
培地作製：  Ｎ２／ＣＯ２嫌気性混合ガス（８０：２０，ｖ／ｖ）により置換した超純水に、４１．７ｇ／Ｌの変法ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬株式会社）を添加し、完全に溶解させた。培地をガラス製の５０ｍＬバイアル瓶に分注し、再度Ｎ２／ＣＯ２ガスによりに液層および気層を十分置換した後、ブチルゴム栓とアルミキャップ（日電理化硝子）で密閉した。バイアル瓶は１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌した後、使用まで４℃で保存した。【００７９】
培養条件：  腸内細菌株は、それぞれの取扱説明書に従って復元培養した後、ＧＡＭ培地に接種し、３７℃で静置培養した。細菌の増殖は、培地の濁度（ＯＤ６００）測定または顕微鏡観察により直接確認した。次いで、各培養液のグリセロールストックを以下の手順により作製した。１０ｍＬバイアル瓶中に８０％グリセロール溶液を調製し、Ｎ２ガスで液層および気層を置換した。高圧蒸気滅菌後、このグリセロール液１ｍＬに対して各培養液４ｍＬを添加し（グリセロール終濃度２０％）、使用するまで−８０℃で保存した。大腸菌ＤＨ５α株およびＪＭ１０９株は、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）に植菌し、３７℃で振とう培養した。その後、上記と同様の手順によりグリセロールストックを作製し、−８０℃で保存した。【００８０】
＜３．プローブのキャラクタリゼーション＞
プローブ１（−Ｎｏｎｅ）および５（−Ｎｌｅ）（終濃度１８０ｎＭ）を、以下の３種類の溶媒：（１）２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、（２）２４ｍＭのＭＯＰＳ＋１８０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）、または（３）２４ｍＭの酢酸＋１８０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）（いずれも終濃度）に溶解させたプローブ溶液を調製した。ＭＯＰＳ（Ｍ１２５４）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。酢酸（０１７−００２５６）は富士フイルム和光純薬株式会社から購入した。各プローブ溶液（１００μＬ）を９６ウェルハーフエリア低吸着ブラックマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９９３）に加え、さらに、超純水により溶媒置換された種々の濃度の細菌（Ｐ．Ｅ．１またはＦ．Ａ）懸濁液を２０μＬ加え、３５℃で１０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ５、ＢｉｏＴｅｋ）により、励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長３７２〜７００ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。【００８１】
結果を図２に示す。図２（ａ）は、細菌（Ｆ．Ａ）をＯＤ６００＝０〜０．１０で添加した場合の、プローブ１（−Ｎｏｎｅ）／溶媒（１）の典型的な蛍光スペクトルである。縦軸（Ｆ．Ｉ．ｒａｔｉｏ）は、細菌（Ｆ．Ａ）をＯＤ６００＝０．０５で添加した場合の励起波長（ｎｍ）３３０ｎｍ、蛍光波長（ｎｍ）＝４６０ｎｍの蛍光強度を１とした場合の蛍光強度を示す。細菌の濃度が増加するにしたがって、蛍光強度が最大で約４０倍まで増大した。図２（ｂ）は、プローブ１（−Ｎｏｎｅ）／溶媒（２）または（３）のプローブ溶液、図２（ｃ）は、プローブ５（−Ｎｌｅ）／溶媒（２）または（３）のプローブ溶液の、細菌濃度による蛍光強度変化を示す（蛍光波長４６０ｎｍ）。縦軸（ΔＦ．Ｉ．）は、細菌を添加していない試料の蛍光強度と細菌を添加した試料の蛍光強度との差を示す。プローブの種類、溶媒の種類および細菌の種類に依存して、それぞれに固有の蛍光強度変化がみられた。この結果から、カチオン性ポリマー−ＴＰＥプローブが、細菌の種類および／または濃度を識別できる可能性が示唆された。【００８２】
＜４．腸内細菌の種類の識別＞
自動分注装置（ｐｉｐｅｔｍａＸ、Ｇｉｌｓｏｎ）を用いて、１２μＬのプローブ１〜１２溶液（１５００ｎＭ／超純水）と、９６μＬの溶媒（４）２５ｍＭのＭＯＰＳ＋１８７．５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）または溶媒（５）２５ｍＭの酢酸＋１８７．５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）とを９６ウェルハーフエリア低吸着ブラックマイクロプレートに加え、３５℃で１０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３３０／４８０、（Ｃｈ２）３６０／５３０。続いて、マイクロプレートに、超純水により溶媒置換された細菌（表１、１６種類）の懸濁液（ＯＤ６００＝０．４０）を１２μＬ加え、３５℃で１０分間インキュベートした。終濃度は以下の通りである。プローブ：１５０ｎＭ、溶媒：２０ｍＭのＭＯＰＳまたは酢酸＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、細菌：ＯＤ６００＝０．０４。その後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ）を測定した：（Ｃｈ１）３３０／４８０、（Ｃｈ２）３６０／５３０。各混合溶液につき、１１回の反復測定を行った。【００８３】
測定結果（１６細菌×２溶媒条件×１２プローブ×２波長セット×１１測定）のヒートマップを図３に示す。各種プローブの蛍光強度は、細菌の種類や溶媒条件に応じて異なり、異なる細菌ごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られた。【００８４】
また、上記測定結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図４に示す。各細菌についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらにこの結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法（ランダムに選択した４測定結果を検定用データとして使用）により解析したところ、１００％の精度で各細菌を識別することができた。以上の結果から、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて、細菌を種レベルで識別できることが示された。また、図４は、細菌の門レベルに対応するメタクラスター（破線で示す）が存在することも示した。この結果から、カチオン性ポリマー−ＴＰＥプローブを用いて、細菌を種レベルで識別できるだけでなく、門レベルでも識別できることが示された。【００８５】
また、上記測定結果の線形判別分析において、細菌を添加した後の蛍光強度（Ｉ）ではなく、細菌を添加する前後の蛍光強度の変化量（Ｉ−Ｉ０）を用いた場合の結果を図５に示す。Ｉ−Ｉ０を用いた場合には、いくつかの細菌についてのクラスターが重なっており、ジャックナイフ法により解析したところ、識別精度は９９％であった。これは、カチオン性ポリマー−ＴＰＥプローブのバックグラウンド蛍光が極めて小さいために、Ｉ０により測定値を正規化することによるメリットを、Ｉ０の測定誤差によるデメリットが上回ったためであると推察された。以上の結果から、カチオン性ポリマー−ＴＰＥプローブを用いた場合には、細菌を添加した後の蛍光強度の測定のみにより、高精度の解析が可能であることが示された。【００８６】
さらに、上記測定結果について、各細菌のラベルを種から門に変更し（例えば、Ｆ．Ｃ．およびＦ．Ｅ．はいずれも単に、「Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ」とラベルする）、線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図６に示す。各門についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、９９％の識別精度であった。また、図６は、グラム陽性菌とグラム陰性菌を分離できることも示した（破線より右上がグラム陽性菌、左下がグラム陰性菌）。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、この結果は、細菌の細胞壁構造（ペプチドグリカン層）の違いが認識された可能性を示す。【００８７】
＜５．肥満モデル微生物叢試料の識別＞
ヒトの腸内微生物叢におけるフィルミクテス門に属する細菌とバクテロイデス門に属する細菌との比（Ｆ／Ｂ比）が、肥満と相関するという知見（ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１７，１７：１２０）に基づき、６種の細菌を異なる比率で含む４種類の肥満モデル微生物叢試料（ＯＤ６００＝０．４０）を調製した（図７）。６種類のプローブ（プローブ１、３、６、７、８および１１：−Ｎｏｎｅ、−Ｄａｐ、Ｇｌｙ３、−Ｌｅｕ、−Ｐｈｅおよび−Ｐｈｔ）を用いて、上記４と同様の手順および条件により蛍光強度を測定した。各試料につき、２２回の反復測定を行った。【００８８】
測定結果（４試料×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×２２測定）のヒートマップを図８に示す。試料ごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られることが示された。【００８９】
また、この結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図９に示す。各モデル微生物叢試料についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらにこの結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法（ランダムに選択した８測定結果を検定用データとして使用）により解析したところ、それぞれ１００％および９７％（３２測定結果中３１正解）の精度で各試料を識別することができた。以上の結果から、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて、異なる肥満状態の個体由来の腸内微生物叢を識別できる可能性が示唆された。【００９０】
＜６．睡眠障害モデルマウスの腸内微生物叢試料の識別＞
（６−１）睡眠障害モデルマウスの作製
睡眠障害モデルマウスを、本発明者らの過去の報告に基づいて作製した（ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，２０１３，８：ｅ５５４５２；  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，２０１７，６５３−３６２）。Ｃ３Ｈ−ＨｅＮマウス（オス８週齢、計８匹）を２群にわけ（４匹：睡眠障害ストレスなし（対照群）、４匹：睡眠障害ストレスあり（ストレス群））を回転輪ケージ（ＳＷ−１５；メルクエスト社製）において飼育し、１〜２週間にわたり自由に通常の食物と水を与えた。２２℃、湿度５０％、明期：暗期＝１２時間：１２時間の条件下で、１０日間、馴化飼育した（−１０〜０日）。その後、対照群は、そのままの条件で飼育を継続し、ストレス群は、睡眠障害モデルマウス作製用ケージ（ＳＷ−１５−ＳＤ、メルクエスト社製）に移し替えた以外は同条件により飼育を継続した（０日〜２８日）。行動リズムデータとして、Ｃｈｒｏｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｋｉｔ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、１分毎に回転輪活動量を測定した。【００９１】
結果を図１０に示す。馴化飼育期間は、対照群およびストレス群ともに、明期（日中）に比べ暗期（夜間）の方が活動的であったが、睡眠障害ストレスにより、ストレス群は明期・暗期を問わずランダムに活動するように変化した（図１０（ｂ））。【００９２】
（６−２）マウス糞便試料の解析
２８日後、マウスを滅菌した新しいケージに移し、排泄された糞便を速やかにマイクロチューブに回収し、液体窒素にて凍結した。その後、解析まで−８０℃で保管した。辨野らの報告（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１１，２：２３３）を基にした方法により、凍結糞便から腸内微生物叢試料を調製した。糞便試料を秤量し、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて４０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得た。この懸濁液について、１分間混合し、４℃で５分間静置する処理を複数回繰り返した。その後、８０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を除去した。得られたペレットをＰＢＳにより懸濁し、再度８０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を除去した。得られたペレットをＰＢＳにより懸濁し、ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（商標）（メッシュサイズ４０μｍ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製）により濾過したものを腸内微生物叢試料（２００μｇ／ｍＬ  ｆｅｃｅｓ  ｉｎ  ＰＢＳ）とした。得られた試料について、上記５と同様の手順および条件により蛍光強度を測定した。各試料につき、１１回の反復測定を行った。【００９３】
測定結果（８試料×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１１測定）のヒートマップを図１１に示す。試料ごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られることが示された。【００９４】
また、この結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１２に示す。各試料についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した（ジャックナイフ法による識別精度：９０％）。【００９５】
さらに、上記測定結果について、各試料のラベルを睡眠障害ストレスの有無（Ｓｔｒｅｓｓｅｄ／Ｕｎｓｔｒｅｓｓｅｄ）に変更し、再度線形判別分析により解析した結果を図１３に示す。対照群とストレス群との間には、わずかな重なりがあるものの、明確な差異があることが示された（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．００３）。また、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法（ランダムに選択した１６測定結果を検定用データとして使用）により解析したところ、それぞれ９１％および９４％（３２測定結果中３０正解）の精度で対照群とストレス群とを識別することができた。以上の結果から、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて腸内微生物叢試料を解析することにより、動物個体の状態を判定できることが示された。【００９６】
＜７．運動不足モデルマウスの腸内微生物叢試料の識別＞
睡眠障害による変化よりもさらに微小な腸内微生物叢の変化を検出できるかを調べるために、運動不足モデルマウスを作製した。Ｃ３Ｈ−ＨｅＮマウス（オス６週（約４０日）齢、計４匹）を回転輪ケージ（ＳＷ−１５、メルクエスト）において、２２℃、湿度５０％、明期：暗期＝１２時間：１２時間の条件下で、自由に通常の食物と水を与え、２週間にわたり馴化飼育した。その後、各マウスの腹部に運動量計測装置（ｎａｎｏ  ｔａｇ、ＫＩＳＳＥＩ  ＣＯＭＴＥＣ）を埋め込み（−３４日）、各マウスを個別の回転輪ケージに移し（−２４日）、回転輪を開放した状態で飼育した（〜０日）。その後、回転輪を固定した状態で一週間飼育し（１〜８日）、再び回転輪を開放した状態で飼育し（９〜２１日）、その後、回転輪を固定した状態で一週間飼育した（２２〜２９日）。運動量計測装置により測定された振動数の積算値をマウスの行動データとして得た。【００９７】
結果を図１４に示す。回転輪を固定した最初の期間では４０，０００〜６０，０００カウント／日であったのに対し、回転輪を開放した期間では徐々に運動量が増加し、２０日時点では１２０，０００〜１４０，０００カウント／日であった。その後、再度回転輪を固定した期間では４０，０００〜６０，０００カウント／日に戻った。【００９８】
回転輪を開放してから１２日後（２０日時点）およびその後回転輪を固定してから５日後（２７日時点）に、排泄された糞便を速やかにマイクロチューブに回収し、液体窒素にて凍結し、解析まで−３０℃で保管した。上記（６−２）と同様の手順により、凍結糞便から腸内微生物叢試料を調製した。得られた試料について、上記５と同様の手順および条件により蛍光強度を測定した。各試料につき、６回の反復測定を行った。【００９９】
測定結果（８試料×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×６測定）のヒートマップを図１５に示す。試料ごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られることが示された。【０１００】
また、この結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１６に示す。各試料についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。また、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法（ランダムに選択した１６測定結果を検定用データとして使用）により解析したところ、それぞれ９６％および９４％（１６測定結果中１５正解）の精度で、マウス個体ならびにそれらの回転輪固定時および解放時を識別することができた。【０１０１】
さらに、上記測定結果について、各試料のラベルを運動制限（回転輪固定）の有無（Ｆｉｘｅｄ／Ｕｎｆｉｘｅｄ）に変更し、再度線形判別分析により解析した結果を図１７に示す。運動制限されなかった群と運動制限された群との間には重なりがなく、明確な差異があることが示された。また、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法（ランダムに選択した１６測定結果を検定用データとして使用）により解析したところ、いずれも１００％の精度で運動制限の有無を識別することができた。以上の結果から、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて腸内微生物叢試料を解析することにより、動物個体の運動習慣の有無を判定できることが示された。【０１０２】
＜８．腸内細菌の株の識別＞
上記４で示したように、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて、種々の腸内細菌を「種」レベルで識別できるだけでなく、「門」レベルでも識別できる。しかし、細菌の場合、これらの階層よりもさらに下位の分類である「株」が存在する。同一菌種から分離された異なる菌株は、原則的に同じ遺伝形質を有しているため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析などの現在一般的な遺伝子解析手法によってそれらを識別することは困難である。一方、近年、特許取得菌株の無断使用などによる特許侵害が問題となっており、微生物叢の構成を株レベルで判別できる方法が望まれている。そこで、本実施例では、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて、同一菌種から分離された異なる菌株を識別できるかどうかを試験した。本実施例において用いた大腸菌を表２に示す。【０１０３】
表２．実施例において用いた腸内細菌
【表２】
0006957064.tif 000007
【０１０４】
培養条件：  各大腸菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）に植菌し、３７℃で振とう培養した。その後、高圧蒸気滅菌をした８０％グリセロール溶液を１ｍＬに対して、各培養液４ｍＬを添加し（グリセロール終濃度２０％）、使用するまで−８０℃で保存した。【０１０５】
６種類のプローブ溶液（プローブ１、３、６、７、８、１１：−Ｎｏｎｅ、−Ｄａｐ、−Ｇｌｙ３、−Ｌｅｕ、−Ｐｈｅ、−Ｐｈｔ、１５００ｎＭ／超純水）と、超純水により置換された大腸菌懸濁液（ＯＤ６００＝０．４０）とを用いて、上記４と同様の手順および条件により蛍光強度を測定した。【０１０６】
大腸菌を添加する前後の蛍光強度の変化量（Ｉ−Ｉ０）の測定結果（８大腸菌×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１１測定）のヒートマップを図１８に示す。各種プローブの蛍光強度は大腸菌の株や溶媒条件に応じて異なり、異なる株ごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られた。【０１０７】
また、上記測定結果を線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図１９に、第二判別スコアおよび第三判別スコアをプロットした結果を図２０に示す。Ｒｏｓｅｔｔａ−ＧａｍｉＢ（ＤＥ３）株およびＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株を除いて、各株についてのクラスターは、第一判別スコアおよび第二判別スコアのプロット上でそれぞれ重なることなく分布した。Ｒｏｓｅｔｔａ−ＧａｍｉＢ（ＤＥ３）株およびＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株のクラスターは、第二判別スコアおよび第三判別スコアのプロット上で重なることなく分布した。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、９９％の精度で各細菌を識別することができた。以上の結果から、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて、細菌を株レベルでも識別できることが示された。【０１０８】
＜９．プローブの合成（プローブ１３〜１７）＞
以下に示す手順により、ポリエチレングリコールとポリ−Ｌ−リジンのブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ）に対してフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を導入したプローブ群を合成した。【０１０９】
（９−１）ＦＩＴＣ基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ１３）の合成
２００ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（１１．６μｍｏｌ，アミノ基のモル数：６００μｍｏｌ）を１０ｍＬのメタノールに溶解し、撹拌しながら２５０μＬのトリエチルアミンを加え、さらに、メタノールに溶解させた８ｍＭのＦＩＴＣ（Ｆ００７、同仁化学研究所）を７．６ｍＬ加えた。その後、アルゴン雰囲気下で密栓・遮光して２４時間室温で撹拌した。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６（ＭＷＣＯ：８ｋＤａ））を用いて、超純水で１回、メタノールで２回、超純水で１回、１ｍＭのＨＣｌで２回、超純水で１回の順に透析した後、凍結乾燥により、ＦＩＴＣ基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ１３：−Ｎｏｎｅ／Ｆ（図２１））の粉末を得た。１０ｍＭのＮａＯＨ中での４９５ｎｍの吸光度から、３．９個のＦＩＴＣが１分子のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬに導入されていることを確認した（データは省略）。【０１１０】
（９−２）ＦＩＴＣ基および官能基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ１４〜１７）の合成
プローブ１（−Ｎｏｎｅ）に代えてプローブ１３（−Ｎｏｎｅ／Ｆ）を用いた以外は上記（１−６）と同様にして、ＦＩＴＣ基および官能基を導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＬ（プローブ１４〜１７：−Ｎｌｅ／Ｆ、−Ｐｈｅ／Ｆ、−Ｓｕｃ／Ｆ、Ｐｈｔ／Ｆ（図２１））の粉末を得た。【０１１１】
＜１０．藍染細菌叢試料の調製＞
藍染細菌叢を、本発明者らの過去の報告を改変した方法により調製した（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１７，３３：７０）。藍の葉の堆肥化物（スクモ）と木灰の抽出液（灰汁）とをバットで混合することにより、藍染細菌叢を含有する藍発酵液（ｐＨ１１．２）を調製した。スクモは、藍熊染料より購入した（０３２５０５０３）。灰汁は、木灰を水と混合し、１０分間煮沸することにより調製した。藍発酵液を２６℃で静置し、１日１回撹拌棒で撹拌した。水酸化カルシウムを加えることにより、藍発酵液のｐＨを１０．３〜１１．３の範囲に調節した。【０１１２】
一定時間ごとに藍発酵液をマイクロチューブに採取し、グリセロールを２５％になるように加えて藍染細菌叢懸濁液を調製し、解析まで−２０℃で凍結保管した。４℃で融解した後、ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（商標）（メッシュサイズ４０μｍ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製）により濾過し、さらにｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（商標）（メッシュサイズ１０μｍ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製）により濾過した。得られた濾液を８０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上澄みを除去した。得られたペレットを１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１００ｍＭのＮａＣｌにより懸濁し、８０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上澄みを除去した。この工程をさらに２回繰り返した。得られたペレットを１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１００ｍＭのＮａＣｌにより懸濁したものを藍染細菌叢試料とした。【０１１３】
＜１１．プローブのキャラクタリゼーション＞
プローブ１３（−Ｎｏｎｅ／Ｆ）および１４（−Ｎｌｅ／Ｆ）（終濃度７５ｎＭ）を、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（終濃度）に溶解させたプローブ溶液を調製した。各プローブ溶液（１００μＬ）を９６ウェルハーフエリア低吸着ブラックマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９９３）に加え、さらに、１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１００ｍＭのＮａＣｌにより溶媒置換された種々の濃度の藍染細菌叢試料（８４日または２８０日時点の藍発酵液から調製）を２０μＬ加え、３５℃で１０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ５、ＢｉｏＴｅｋ）により、励起波長４６０ｎｍ、蛍光波長５０１〜７００ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。【０１１４】
結果を図２２に示す。図２２（ａ）は、藍染細菌叢試料（８４日時点の藍発酵液から調製）をＯＤ８５０＝０〜０．０３で添加した場合の、プローブ１３（−Ｎｏｎｅ／Ｆ）の典型的な蛍光スペクトルである。藍染細菌の濃度が増加するにしたがって、蛍光強度が最大で約１９％まで減少した。図２２（ｂ）は、プローブ１３（−Ｎｏｎｅ／Ｆ）およびプローブ１４（−Ｎｌｅ／Ｆ）のプローブ溶液の、藍染細菌濃度による蛍光強度変化を示す（蛍光波長５２１ｎｍ）。図中、「８４ｄ」は８４日時点の藍発酵液から調製された藍染細菌叢試料を、「２８０ｄ」は２８０日時点の藍発酵液から調製された藍染細菌叢試料を示す。プローブの種類および藍発酵液の状態に依存して、それぞれに固有の蛍光強度変化がみられた。この結果から、カチオン性ポリマー−ＦＩＴＣプローブが、状態の異なる藍発酵液を識別できる可能性が示唆された。【０１１５】
＜１２．藍発酵液の識別＞
藍染めでは、色の濃淡や鮮やかさなどの染色性は、藍発酵液中の藍染細菌叢の組成によって変化する。そのため、藍発酵液の状態を見極め、発酵を促進または停止する判断を迅速に下すことが要求される。しかし、現状そのような判断は発酵液の見た目や臭いに基づいて行われており、職人の経験と勘に頼っている。そこで、本実施例では、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて藍発酵液の染色性を判別できるかどうかを試験した。【０１１６】
（１２−１）藍発酵液の染色性の評価
綿織物の小片を発酵液に３０秒間浸し、染色強度を目視により３段階（Ｈｉｇｈ／Ｍｉｄ／Ｌｏｗ）に分類した。結果を図２３に示す。なお、０日、２日、４日、８日時点の藍発酵液ではほとんど染色されなかったため、これらは全てＬｏｗに分類した（データは省略）。【０１１７】
（１２−２）藍染細菌叢試料の解析
自動分注装置（ｐｉｐｅｔｍａＸ、Ｇｉｌｓｏｎ）を用いて、１０μＬのプローブ１３〜１７溶液（７５０ｎＭ／超純水）と、８０μＬの溶媒（４）２５ｍＭのＭＯＰＳ＋１８７．５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）または溶媒（５）２５ｍＭの酢酸＋１８７．５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）とを９６ウェルハーフエリア低吸着ブラックマイクロプレートに加え、３５℃で１０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーにより、以下の３セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３５０／５２０、（Ｃｈ２）４７０／５２０、（Ｃｈ３）５１５／５６０。続いて、マイクロプレートに、１０ｍＭのＭＯＰＳ＋１００ｍＭのＮａＣｌにより溶媒置換された藍染細菌叢試料（１５種類）（ＯＤ８５０＝０．１０）を１０μＬ加え、３５℃で１０分間インキュベートした。終濃度は以下の通りである。プローブ：７５ｎＭ、溶媒：２０ｍＭのＭＯＰＳまたは酢酸＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、細菌：ＯＤ８５０＝０．０１。その後、マイクロプレートリーダーにより、以下の３セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ）を測定した：（Ｃｈ１）３５０／５２０、（Ｃｈ２）４７０／５２０、（Ｃｈ３）５１５／５６０。各混合溶液につき、９回の反復測定を行った。【０１１８】
測定結果（１５藍染細菌叢×２溶媒条件×５プローブ×３波長セット×９測定）のヒートマップを図２４に示す。藍染細菌叢試料ごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られることが示された。【０１１９】
上記測定結果の各試料のラベルを染色強度（Ｈｉｇｈ／Ｍｉｄｄｌｅ／Ｌｏｗ）として、線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図２５に示す。ＨｉｇｈおよびＬｏｗのクラスター間にはわずかな重なりが見られたものの、Ｍｉｄｄｌｅのクラスターは他のクラスターと重なることなく分布した。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、７６％の精度で各染色強度群を識別することができた。以上の結果から、カチオン性ポリマー−環境応答性蛍光団プローブを用いて、藍染細菌叢の染色強度を識別できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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