(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含む、紫外線損傷を軽減するために使用する組成物であって、
前記ハママンネングサの酢酸エチル抽出物は、
（ａ）一価アルコール溶液を用いてハママンネングサを抽出して、ハママンネングサからアルコール抽出物を得るステップであって、前記一価アルコールは、メタノール、エタノール及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれるステップ、
（ｂ）該アルコール抽出物を水とｎ−ヘキサンで分配し、水層とｎ−ヘキサン層を得るステップ、及び、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた水層を酢酸エチルで分配した後、形成された酢酸エチル層を回収して、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を得るステップ、を含む方法により得られたものである、組成物。
【請求項２】
前記紫外線損傷は、光老化を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記紫外線損傷は、ＵＶ誘発の正常細胞の死亡及びＵＶ誘発の正常細胞のアポトーシスのいずれかを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記紫外線損傷は、皮膚がんを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
対象の紫外線損傷を軽減するための医薬組成物の製造用の、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物の使用であって、前記医薬組成物に前記ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含める工程を含み、
前記ハママンネングサの酢酸エチル抽出物は、
（ａ）一価アルコール溶液を用いてハママンネングサを抽出して、ハママンネングサからアルコール抽出物を得るステップであって、前記一価アルコールは、メタノール、エタノール及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれるステップ、
（ｂ）該アルコール抽出物を水とｎ−ヘキサンで分配し、水層とｎ−ヘキサン層を得るステップ、及び、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた水層を酢酸エチルで分配した後、形成された酢酸エチル層を回収して、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を得るステップ、を含む方法によって得られたものである、前記使用。
【請求項６】
前記紫外線損傷は、光老化を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記紫外線損傷は、ＵＶ誘発の正常細胞の死亡及びＵＶ誘発の正常細胞のアポトーシスのいずれかを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記紫外線損傷は、皮膚がんを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
化粧品である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
化粧品として許容される補助剤を更に含む、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ハママンネングサの酢酸エチル抽出生成物を含有する組成物を用いて紫外線（ＵＶ）損傷を緩和する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線は、空間または物質媒体を介して波または粒子の形態でエネルギーを放出または伝達するものである。一般的に、放射線は次のように分類され：（１）電離放射線、これは原子または分子を電離することができる高エネルギー電磁波（例えばＸ線及びガンマ線）または粒子（例えばアルファ粒子、ベータ粒子及び中性子）を指し、そして、（２）非電離放射線、これは原子または分子を電離することができない低エネルギー電磁波（例えば、可視光、赤外線、紫外線（ＵＶ）、マイクロ波及び電波）を指す。ＵＶ誘発の細胞損傷を引き起こすメカニズムの１つは、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤｓ）と６−４の光生成物（６,４ＰＰｓ）との形成による変異原性ＤＮＡ損傷である。
【０００３】
紫外線（ＵＶ）損傷は、生物体（例えばヒトなど）の一部が十分な長期間に亘って紫外線に曝されると発生する。紫外線損傷の症状は、皮膚の炎症、遅発性日焼け反応、皮膚の老化（光老化とも呼ばれる）、関節や筋肉や目の周りの激しい痛み、ショック、発熱、悪心、嘔吐、全身性脱力などがあり、最終的に腫瘍またはがん（例えば皮膚がんなど）の形成も誘発される可能性がある。
【０００４】
紫外線損傷を軽減するために臨床的に使用されている薬は、局所用ステロイド（例えばシュマン軟膏など）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えばイブプロフェンやナプロキセンなど）、抗ヒスタミン薬（例えばシプロヘプタジンやアステミゾールなど）及び日焼け止め剤（例えばパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、オキシベンゾン及びビタミンＡパルミテートなど）などである。しかしながら、これらの薬物は所望の治療効果を達成しない恐れがある上、また深刻な副作用を引き起こす恐れがある。従って、この分野の研究者は、紫外線損傷を治療及び／または予防するために使用できる伝統的な漢方薬から活性成分を特定することを試してきた。
【０００５】
シナマンネングサとしても知られているハママンネングサ（慣用名：Ａｌｆｒｅｄ Ｓｔｏｎｅｃｒｏｐ、中国語名（ピンイン）：ｆｏ ｊｉａ ｃａｏ）は、ベンケイソウ科マンネングサ属に属する多年生草本である。ハママンネングサは、台湾、日本、琉球諸島、フィリピンなどで見つけることができる。研究により、ハママンネングサは、抗炎症作用、血糖降下作用及び脂質低下作用を有し、且つ、糖尿病、のどの痛み、腸炎、赤痢などの治療に使用できることが示されている。
【０００６】
２０１２年にＹｕ−Ｃｈｅｎ Ｗａｎｇが弘光科技大学のバイオテクノロジー学科で修了した修士論文（論文名：ヒト前立腺がん細胞ＤＵ１４５の放射線治療におけるハママンネングサ抽出物による細胞内仲介物質の変化）では、乾燥、粉砕したハママンネングサをメタノールで超音波処理しながら抽出することにより得られたメタノール抽出物を、ｎ−ヘキサンで分配し、得られた水層を更に酢酸エチルで分配し、得られた酢酸エチル層（即ち、酢酸エチル画分）に対して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を行なうことにより、アストラガリン、ビテキシン及びケンペロール−３−Ｏ−マロニルグルコシドを含有することを発見し、更に、酢酸エチル画分は、前立腺がん細胞ＤＵ１４５の増殖を阻害することができる上に、電離放射線誘発の細胞アポトーシスからＤＵ１４５を保護することもできることが示された。
【０００７】
本願発明者が知る限りでは、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物がＵＶ損傷の軽減に利用できることを開示している文献または先行技術特許はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本開示の目的は、先行技術の欠点のうちの少なくとも１つを軽減することができるＵＶ損傷を緩和する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
該方法は、それを必要の対象にハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含有する組成物を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下の実施形態の詳細に説明することにより明白になる。
【図１】０分の保持時間と８０分の保持時間との間に検出され得る７つのピーク（それぞれａ１〜ａ７で標識されている）を有する、実施例１で製造された第１の酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣ溶出プロファイルの図である。
【図２】０分の保持時間と８０分の保持時間との間に検出され得る９つのピーク（それぞれｂ１〜ｂ９で標識されている）を有する、実施例１で製造された第２の酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣ溶出プロファイルの図である。
【図３】クローンアッセイによって測定された、下記の実施例３の各群におけるＨａＣａＴ細胞の生存率を示す図である。
【図４】クローンアッセイによって測定された、下記の実施例３の各群におけるＨａＣａＴ細胞の生存率を示す図であり、記号「＊」は、それぞれのＵＶ対照群と比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図５】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例５の各群のＨａＣａＴ細胞における切断されたカスパーゼ−３の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」及び「＃」のそれぞれは、正常対照群１及びＵＶ対照群１とそれぞれ比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図６】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例６の各群のＷＳ１細胞におけるＭＭＰ−１の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」及び「＃」のそれぞれは、正常対照群及びＵＶ対照群とそれぞれ比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図７】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例６の各群のＷＳ１細胞におけるＭＭＰ−２の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」及び「＃」のそれぞれは、正常対照群及びＵＶ対照群とそれぞれ比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図８】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例７の各群のＷＳ１細胞におけるＭＭＰ−１の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」及び「＃」のそれぞれは、正常対照群及びＵＶ対照群とそれぞれ比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図９】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例７の各群のＷＳ１細胞におけるＭＭＰ−２の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」及び「＃」のそれぞれは、正常対照群及びＵＶ対照群とそれぞれ比較した際、ｐ ＜０．０５であることを表す。
【図１０】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例８の各群のＡ４３１細胞における切断されたカスパーゼ−３の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」は、対照群とそれぞれ比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図１１】ウエスタンブロッティング分析により測定された、下記の実施例８の各群のＡ３７５細胞における切断されたカスパーゼ−３の相対正規化発現量を示す図であり、記号「＊」は、対照群とそれぞれ比較した際、ｐ＜０．０５であることを表す。
【図１２】下記の実施例９の各群におけるＳＫＨ−１無毛マウスの１２週間の実験期間後の背部皮膚状態を示す図である。
【図１３】下記の実施例９の各群におけるＳＫＨ−１無毛マウスの１２週間の実験期間後のマッソン染色により得られた背部皮膚組織の膠原線維の組織画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００１２】
当業者であれば、本開示の実施において、本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法及び材料を認識し、利用することができる。実際、本開示は記載された方法及び材料に決して限定されない。明確にするために、本明細書では以下の定義を使用する。
【００１３】
本明細書を利用する時、用語「緩和する」または「緩和」は、疾患または障害の１つまたは複数の臨床的徴候を少なくとも部分的に軽減、改善、除去、制御、治療、排除すること、または治療中の状態または症状に関する重症度の進行を低下、遅延、停止または逆転させ、且つ、その可能性または確率を防止または減少させることを指す。
【００１４】
本明細書を利用する時、用語「紫外線（ＵＶ）損傷」とは、生物の任意の部分（ヒト対象など）へのＵＶ過剰曝露によって引き起こされる症状を指し、該症状は、紅斑、浮腫、皮膚の炎症、ＵＶ誘発の細胞死、ＵＶ誘発アポトーシス、遅発性日焼け反応、皮膚の老化、関節や筋肉や目の周りの激しい痛み、ショック、発熱、悪心、嘔吐、全身性脱力、皮膚がんを含むがこれらに限定されない。
【００１５】
本明細書を利用する時、用語「皮膚老化」及び「光老化」は言い換え可能に使用することができ、そして環境要因、特にＵＶ光への皮膚の曝露による外因性皮膚老化を指す。皮膚老化の症状は、毛細血管拡張症、皮膚の菲薄化、皮膚萎縮、コラーゲン線維及び弾性線維の減少、弾性線維症、結合組織病、皮膚線維症、皮膚の弾性の喪失、肌荒れ、乾燥、しわ形成、炎症性細胞浸潤及び色素変化（例えば、ほくろ、そばかす、低色素沈着または色素沈着過剰）を含むがこれらに限定されない。
【００１６】
本開示において、本発明者は、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物がＵＶ損傷を緩和する可能性があることを見出した。特に、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物は、通常の皮膚細胞（例えばヒト皮膚ケラチノサイトやヒト胎児皮膚線維芽細胞など）をＵＶ誘発の死亡、ＵＶ誘発のアポトーシス及びＵＶ誘発の皮膚老化から効果的に保護することが証明されている。更に、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物は、主にＵＶによって引き起こされる皮膚がん、特にヒト皮膚黒色腫及び扁平上皮がんの細胞増殖を抑制できることが証明されている。
【００１７】
従って、本開示は、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含有し、ＵＶ損傷の緩和に使用するための組成物を提供する。
【００１８】
また、本開示は、それを必要とする対象にハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含有する組成物を投与することを含む、紫外線損傷を緩和する方法を提供する。
【００１９】
特定の実施形態において、前記ハママンネングサの酢酸エチル抽出物は、以下のステップを含む方法により製造され、
（ａ）一価アルコール溶液を用いてハママンネングサを抽出して、ハママンネングサからアルコール抽出物を得るステップ、
（ｂ）該アルコール抽出物を水とｎ−ヘキサンで分配し、水層とｎ−ヘキサン層を得るステップ、及び、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた水層を酢酸エチルで分配した後、形成された酢酸エチル層を回収して、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を得るステップ。
【００２０】
本開示に使用することに適した一価アルコールの例としては、メタノール、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、ステップ（ａ）で使用される一価アルコールはメタノールである。他の例示的な実施形態において、ステップ（ａ）で使用される一価アルコールはエタノールである。
【００２１】
本開示によれば、一価アルコールの溶液は、７０％〜１００％の範囲の濃度を有することができる。特定の実施形態において、一価アルコールの溶液は、８５％〜１００％の範囲の濃度を有する。例示的な実施形態において、一価アルコールの溶液は、９５％〜１００％の範囲の濃度を有する。
【００２２】
本開示によれば、一価アルコールの溶液とハママンネングサとの比は、１：５（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）〜１：１５（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）の範囲にあることができる。特定の実施形態において、一価アルコールの溶液とハママンネングサとの比は、１：８（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）〜１：１２（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）の範囲にある。例示的な実施形態では、ハママンネングサと一価アルコールの溶液との比は１：１０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）である。
【００２３】
本開示によれば、抽出ステップ（ａ）は、３０℃〜５０℃の範囲の温度で行うことができる。例示的な実施形態では、抽出ステップ（ａ）は、室温で行う。
【００２４】
特定の実施形態において、所望の抽出結果を達成するために、一価アルコールの溶液による抽出は、超音波処理下で行うことができる。
【００２５】
本開示によれば、分配ステップ（ｂ）における水とｎ−ヘキサンとの比は、１：０．５（ｖ／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）の範囲にあることができる。特定の実施形態において、水とｎ−ヘキサンとの比は、１：１（ｖ／ｖ）〜１：３（ｖ／ｖ）の範囲にある。例示的な実施形態において、分配ステップ（ｂ）における水とｎ−ヘキサンとの比は、１：１（ｖ／ｖ）である。
【００２６】
本開示によれば、分配ステップ（ｂ）及び／または（ｃ）は、室温で独立に行うことができる。
【００２７】
特定の実施形態において、所望の抽出結果を達成するために、抽出ステップ（ａ）並びに分配ステップ（ｂ）及び／または（ｃ）を繰り返し行ってもよい。
【００２８】
特定の実施形態において、緩和されるべきＵＶ損傷は、正常細胞のＵＶ誘発の死亡及び正常細胞のＵＶ誘発のアポトーシスのうちの１つを含み得る。
【００２９】
本開示の例示的実施形態において、緩和されるべきＵＶ損傷は、皮膚老化を含み得る。本開示の他の例示的実施形態において、緩和されるべきＵＶ損傷は、皮膚がんを含み得る。
【００３０】
本開示によれば、皮膚がんは、扁平上皮がん（ＳＣＣ）、悪性黒色腫、基底細胞がん（ＢＣＣ）及びメルケル細胞がん（ＭＣＣ）のうちの少なくとも１つであり得る。
【００３１】
本開示によれば、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含有する組成物は、当業者に周知の技術を使用して非経口、経口または局所投与に適した剤形を処方することができる医薬組成物であり得る。適切な剤形は、注射用製品（例えば、無菌水溶液または分散液）、無菌粉末、錠剤、トローチ、ロゼンジ、ペレット、カプセル、分散性粉末または顆粒、溶液、懸濁液、乳剤、シロップ、エリキシル剤、スラリー、外用剤及び同類のものを含むが、これらに限定されない。つまり、本開示はまた、ＵＶ損傷を緩和するための医薬組成物の製造において、上記のハママンネングサの酢酸エチル抽出物の使用に関する。
【００３２】
本開示による医薬組成物は、製薬業界で広く使用され、薬学的に許容される担体を更に含み得る。例えば、薬学的に許容される担体は、以下の薬剤のうちの１つ以上を含むことができる：溶媒、緩衝剤、懸濁化剤、分解剤、崩壊剤、分散剤、結合剤、賦形剤、安定剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、潤滑剤、吸収遅延剤、リポソーム及び同類のもの。前述の薬剤の選択及び量は、当業者の専門知識及び通常の技術の範囲内である。
【００３３】
本開示による医薬組成物は、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射及び静脈内注射といった非経口経路のうちの１つを介して投与されることができる。本開示の一実施形態において、医薬組成物は皮下注射に適した剤形に処方される。
【００３４】
本開示による医薬組成物は、当業者に周知の技術を用いて皮膚に局所投与に適した外用剤に処方することができる。外用剤としては、乳剤、ゲル、軟膏、クリーム、パッチ、塗布剤、粉末、エアロゾル、スプレー、ローション、セラム、ペースト、フォーム、ドロップ、懸濁液、膏薬及び包帯が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本開示によれば、外用剤は、医薬組成物を当技術分野において周知で一般的に使用されている基剤と混合することによって調製される。
【００３６】
本開示によれば、基剤は、以下の添加剤のうちの１つ以上を含むことができる：水、アルコール、グリコール、炭化水素（例えば、ワセリン及びホワイトワセリンなど）、ワックス（例えば、パラフィン及び黄色ワックスなど）、保存剤、酸化防止剤、界面活性剤、吸収促進剤、安定剤、ゲル化剤（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９４１、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースなど）、活性剤、保湿剤、臭気吸収剤、香料、ｐＨ調整剤、キレート剤、乳化剤、閉塞剤、皮膚軟化剤、増粘剤、溶解補助剤、浸透促進剤、抗刺激剤、着色剤、噴射剤など。前述の添加剤の選択及び量は、当業者の専門知識及び通常の技術の範囲内である。
【００３７】
本開示による医薬組成物の投与の量及び頻度は、緩和すべき疾患の重症度、投与経路、並びに対象の年齢、治療対象の体調及び反応といった要因に応じて変えることができる。
【００３８】
例えば、本開示による医薬組成物の局所投与の量及び頻度は、皮膚面積に対して０．０１ｍｇ／ｃｍ２〜０．０５ｍｇ／ｃｍ２、１日に１〜３回であり得る。医薬組成物の非経口または経口投与の量及び頻度は、２５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、1日に１〜４回であり得る。
【００３９】
本開示において、本発明者は、ハママンネングサの酢酸エチル抽出生成物による細胞の前処理はＵＶ誘発のアポトーシスからヒト皮膚ケラチノサイトを効果的に保護することができるだけでなく、ヒト胎児皮膚線維芽細胞における細胞外マトリックス（例えば、コラーゲンやエラスチンなど）のＵＶ誘発の破壊も著しく減少することを見出した。従って、本開示は、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を含有する組成物の化粧品用途に向いている。つまり、本開示の方法で使用される組成物は化粧品組成物であり得る。
【００４０】
本開示によれば、化粧品組成物は、化粧品製造業において広く採用されて、化粧品として許容される補助剤を更に含むことができる。例えば、化粧品として許容される補助剤は、以下の試薬のうちの１つ以上を含むことができる：溶媒、ゲル化剤、活性化剤、保存料、酸化防止剤、スクリーニング剤、キレート剤、界面活性剤、着色剤、増粘剤、充填剤、芳香剤及び臭気吸収剤。前述の試薬の選択及び量は、当業者の専門知識及び通常の技術の範囲内である。
【００４１】
本開示において提供される化粧品組成物は、当業者に周知の技術を用いてスキンケアまたは化粧品製品の形態に製造することができる。上記の形態としては、水溶液、アルコール水溶液または油性溶液、乳剤（水中油型、油中水型または複合型）、ゲル、軟膏、クリーム、マスク、パッチ、パック、塗布剤、パウダー、エアロゾル、スプレー、ローション、セラム、ペースト、フォーム、懸濁液、ドロップ、ムース、日焼け止め、トニックウォーター、ファンデーション、アイシャドウ、メイク落とし製品、石鹸及び他の身体洗浄製品が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本開示による化粧品組成物は、以下の外用剤と共に使用され得る：美白剤（例えば、トレチノイン、カテキン、コウジ酸、アルブチン及びビタミンＣなど）、保湿剤、抗炎症剤、殺菌剤、紫外線吸収剤、植物抽出物（例えば、アロエのエキスなど）、皮膚栄養素、麻酔剤、抗ニキビ剤、かゆみ止め剤、鎮痛剤、抗皮膚炎剤、抗過角質溶解剤、抗乾燥皮膚剤、乾癬治療剤、老化防止剤、抗しわ剤、抗脂漏剤、創傷治癒剤、コルチコステロイド、ホルモン剤、遊離基捕捉剤（例えば、カタラーゼなど）、抗酸化剤（例えば、ビタミンＥなど）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１など）、チオール（例えば、アミホスチンなど）及びステロイド（例えば、５−アンドロステンジオール）。前述の外用剤の選択及び量は、当業者の専門知識及び通常の技術の範囲内である。
【００４３】
本開示によれば、化粧品組成物は局所投与用の形態である。例えば、本開示による化粧品組成物の１日局所投与の量及び頻度は、皮膚面積に対して１ｍｇ／ｃｍ２〜５ｍｇ／ｃｍ２、１日に２〜５回であり得る。
【００４４】
以下、本開示の実施例について説明する。これらの実施例は、例示的かつ説明的なものであり、且つ、本開示を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
実施例
一般実験材料
細胞株の由来と培養
実施例で使用した細胞株は以下の通りである。
【００４５】
（ａ）Ｄｒ. Ｃｈｉｈ−Ｙａｎｇ Ｈｕａｎｇ（台湾、台中市、中国医科大学大学院基礎医学研究科）により提供されたヒト皮膚ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ及びヒト皮膚のメラノーマ細胞株Ａ３７５。
【００４６】
（ｂ）台湾の財団法人食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）から購入したヒト胎児皮膚線維芽細胞株ＷＳ１（ＢＣＲＣ ６０３００）。
【００４７】
（ｃ）Ｄｒ. Ｃｈｉａ−ｈｓｉｕｎｇ Ｃｈｅｎｇ（台湾台北医科大学大学院医学研究所）により提供されたヒト扁平上皮がん細胞株Ａ４３１。
【００４８】
各細胞株を、表１に示される対応培地及び６ｃｍペトリディッシュを培養器（３７℃及び５％ＣＯ２）中で培養した。２日ごとに培地を交換した。培養細胞の集密度が８０％〜９０％に達した時に細胞継代を実施した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
一般的な実験手順
統計分析
以下の実施例において、各群は同じ実験を３回行った。実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表し、且つ、対応のスチューデントのｔ検定を使用して分析して、すべての群の間の差を評価した。統計学的有意性は、ｐ ＜０．０５で表示された。
【００５１】
実施例１．ハママンネングサの酢酸エチル抽出物の製造
１００ｇのハママンネングサの凍結乾燥粉末（台湾行政院農業評議会、台湾種子改良繁殖場から提供された）を以下のようにメタノール抽出した。
【００５２】
フラスコ中で該粉末を１Ｌの１００％メタノールと混合した。超音波処理装置（ＤＣ２００Ｈ、ＤＥＬＴＡ）を用いて得られた混合物を周波数４０ｋＨｚで超音波処理した後、メタノール含有濾液を得るために、孔径６μｍのグレード１定性濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて濾過した。
【００５３】
得られた濾過残渣を更に上記のようにメタノール抽出（即ち、混合−超音波−濾過）を３回行い、メタノール含有濾液を得た。このように得られた全てのメタノール含有濾液を混ぜ合わせ、そして真空下で濃縮してメタノールを除去して、ハママンネングサ由来のメタノール抽出物が形成された。
【００５４】
メタノール抽出物をｄｄＨ２Ｏに１：１０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）の比率で溶解した。この溶液とｎ−ヘキサン（ｄｄＨ２Ｏとｎ−ヘキサンの体積比は１：１）を混合した後、室温で１時間分配させて水層とｎ−ヘキサン層を得た。該水層を上記のようにｎ−ヘキサンで３回分配した。最後のｎ−ヘキサンによる分配ラウンドから得られた水層を酢酸エチルと１：１（ｖ／ｖ）の比で混合し、そして混合物を室温で１時間分配して、水層と酢酸エチル層を得た。該水層を上記のように酢酸エチルで３回分配した。このように得られた全ての酢酸エチル層を混ぜ合わせ、そして真空濃縮機（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（登録商標）Ｒ ＩＩ、ＢＵＣＨＩ）を用いて４０℃で真空下で濃縮して酢酸エチルを除去し、ペースト状のハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物が形成された。濃度５０ｍｇ／ｍＬの第１の酢酸エチル抽出物の原液を調製するように、第１の酢酸エチル抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。
【００５５】
また、ハママンネングサの凍結乾燥粉末を９５％エタノールで抽出してハママンネングサ由来のエタノール抽出物を得た以外、第１の酢酸エチル抽出物及びその原液と同様の方法で、第２の酢酸エチル抽出物及びその原液を製造した。
【００５６】
実施例２．ハママンネングサの酢酸エチル抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
上記実施例１に従って製造されたハママンネングサの第１及び第２の酢酸エチル抽出物をメタノールに溶解して、５ｍｇ／ｍＬの濃度の試験サンプルを得た後、ＨＰＬＣ分析を行って、その中の主成分を測定した。
【００５７】
使用したＨＰＬＣ機器は以下の通りである：ポンプ（Ｌ−２１３０、日立）、ＵＶ検出器（Ｌ２４００、日立）及びＬｕｎａ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、サイズ：１５０ｍｍ×２ｍｍ）を備えた日立高速液体クロマトグラフィーシステム。
【００５８】
ＨＰＬＣの操作条件は以下の通りである。ＵＶ検出器を波長２７０ｎｍに設定する。移動相は、０．１％ギ酸／アセトニトリルの０．１％ギ酸（９０：１０、ｖ／ｖ）を添加した脱イオン水であり、且つ、移動相の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎである。移動相を用いたグラジエント溶離は、以下のように８０分間行った：０．１％ギ酸のアセトニトリルの量は、０〜１０分間で１０％〜２０％に増加し、１０〜４５分間で２０％〜９５％に増加し、４５〜５５分間９５％に維持され、５５〜６０分間９５％〜１０％に減少し、そして６０〜８０分間１０％に維持された。
【００５９】
更に、上海ＢｅｉＺｈｕｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.、Ｌｔｄ.から購入したビテキシン及びアストラガリンの標準試料（５００μＭ）についても、上記の機器及び操作条件を用いてＨＰＬＣを行った。
【００６０】
結果：
図１及び図２は、実施例１で製造されたハママンネングサの第１及び第２の酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣ溶出プロファイルである。図１及び図２に示されるように、０分の保持時間と８０分の保持時間との間に、７つの主要ピーク（それぞれａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６及びａ７と表示する）及び９つの主要ピーク（それぞれｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｂ６、ｂ８及びｂ９と表示する）が、第１及び第２の酢酸エチル抽出物のそれぞれにおいて見受けられる。特に、第１及び第２の酢酸エチル抽出物は、２４分の保持時間と２８分の保持時間との間で同様の溶出プロファイルを有し（即ち、第１の酢酸エチル抽出物のピークａ３〜ａ５及び第２の酢酸エチル抽出物のピークｂ５〜ｂ７）、そのうち、ピークａ３及びｂ４はビテキシンを表すと同定され、ピークａ４及びｂ６はアストラガリンを表すと同定された。
【００６１】
実施例３．皮膚細胞の紫外線（ＵＶ）誘発の死亡に対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の効果の評価
実験手順
Ａ．ハママンネングサの酢酸エチル抽出物とＵＶ照射を用いたＨａＣａＴ細胞処理
ＨａＣａＴ細胞を４つの対照群（即ち、正常対照群及びＵＶ対照群１〜３）及び８つの実験群（即ち実験群Ｌ−０〜Ｌ−３及びＨ−０〜Ｈ−３）を含む１２群に分けた。
【００６２】
各群のＨａＣａＴ細胞を、５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したもの）を含む６ｃｍペトリディッシュ中で培養し、そして培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。新鮮培地で培地を交換した後、８つの実験群の細胞培養物を、実施例１で得られたハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の適切な量の原液で処理して、これら実験群の細胞培養物をそれぞれ培養し、これらの実験群の細胞培養物のそれぞれは、表２に示される最終濃度を有するようにされた。４つの対照群の細胞培養物は、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物で処理していなかった。
【００６３】
その後、各群の処理ＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養し、そしてＣＬ−１０００紫外線クロスリンカー（ＵＶＰ）を用いて表２に示された放射線量でＵＶ照射を行った。
【００６４】
【表２】
0006901167.tif 000003
【００６５】
ＵＶ照射後、各群のＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した。得られた細胞培養物を以下のクローン形成法に使用した。
【００６６】
Ｂ．クローンアッセイ
ペトリディッシュの表面から細胞を分離するために、０．５ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを上記で得た各群の細胞培養物に添加した。その後、２ｍＬの新鮮培地を加えてトリプシンの活性を中和し、ピペットで繰り返し吸引することによって、分離された細胞を十分に分散させた。得られた各群の細胞懸濁液を、表３に示されるように、適切な細胞数で新しい６ｃｍペトリディッシュに入れ、そして培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２週間培養した。
【００６７】
【表３】
0006901167.tif 000004
【００６８】
各群において得られた細胞コロニーを３ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ホルマリンで固定し、次いで固定した細胞コロニーを３ｍＬの１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで２５℃で３０分間染色した。倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＨ４０）を用いて１００倍の倍率で細胞コロニー数を数えた。
【００６９】
各群のプレート効率（ＰＥ）は、下記式（１）を用いて算出した。
【００７０】
Ａ＝Ｂ/Ｃ（１）
式中、Ａ＝プレート効率
Ｂ＝細胞コロニー数
Ｃ＝プレート細胞数
各実験群Ｌ−０〜Ｌ−３の生存率は、各群のプレート効率を実験群Ｌ−０のそれで割ることによって計算した。同様に、実験群Ｈ−０〜Ｈ−３のそれぞれの生存率は、各群のプレート効率を実験群Ｈ−０のそれで割ることによって計算した。また、正常対照群及びＵＶ対照群１〜３のそれぞれの生存率は、各群のプレート効率を正常対照群のそれで割ることによって計算した。このように得られたデータを、「一般的な実験手順」の「統計分析」と題した前の節に記載した方法に従って分析した。
【００７１】
結果：
図３及び図４は、クローンアッセイによって測定された各群におけるＨａＣａＴ細胞の生存率を示す。図３に示されるように、ＵＶ対照群１〜３は正常対照群と比較して生存率の減少を示し、これはＨａＣａＴ細胞の細胞増殖がＵＶ曝露によって阻害されることを示している。同様に、実験群Ｌ−２及びＬ−３は、実験群Ｌ−０と比較して生存率の減少を示す。
【００７２】
更に、実験群Ｈ−１〜Ｈ−３は、実験群Ｈ−０と比較して生存率の著しい減少を示し、そのような減少はＵＶ照射の線量が増加するにつれてより明白になる（図４参照）。これらの結果は、ＨａＣａＴ細胞の細胞増殖がＵＶ照射によって阻害されることを示唆している。
【００７３】
しかしながら、同じ線量のＵＶ照射下で、実験群Ｌ−１〜Ｌ−３及びＨ−１〜Ｈ−３においてそれぞれ測定された生存率は、ＵＶ対照群１〜３のそれぞれにおける生存率よりも高い。実験群Ｈ−１〜Ｈ−３において測定された生存率もそれぞれ実験群Ｌ−１〜Ｌ−３において測定されたものより高い。従って、出願人は、本開示のハママンネングサの酢酸エチル抽出物の前処理はＵＶ誘発の死亡に対して細胞を保護することができると考えている。
【００７４】
実施例４．皮膚細胞の細胞周期分布に対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の効果の評価
実験手順
Ａ．ハママンネングサの酢酸エチル抽出物を用いたＨａＣａＴ細胞の処理及びＵＶ照射
ＨａＣａＴ細胞を２つの対照群（即ち、正常対照群及びＵＶ対照群）及び２つの実験群（即ち、実験群Ｌ及びＨ）を含む４つの群に分けた。
【００７５】
各群のＨａＣａＴ細胞を、５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したもの）を含む６ｃｍペトリディッシュ中で培養し、そして培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。新鮮培地で培地を交換した後、実験群Ｌ及びＨの細胞培養物を、実施例１で得られたハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の適切な量の原液で処理して、実験群１及び２がそれぞれ、１２５μｇ／ｍＬ及び２５０μｇ／ｍＬの最終酢酸エチル抽出物濃度を有するようにした。２つの対照群の細胞培養物は、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物で処理していなかった。
【００７６】
各群の処理したＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した。そして、ＵＶ対照群及び実験群１及び２の培養物に、５０ｍＪ／ｃｍ２の放射線量でＵＶ照射を行った。正常対照群の培養物は紫外線照射を受けていなかった。
【００７７】
ＵＶ照射後、各群のＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養した。得られた細胞培養液について、以下の細胞周期解析を行った。
【００７８】
Ｂ．細胞周期分析
各群の細胞培養物にそれぞれ１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを添加してペトリディッシュの表面から細胞を分離させた。新しい培地１ｍＬを加えてトリプシンの活性を中和した後、得られた細胞懸濁液を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットを冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１ｍＬの冷メタノールで細胞を固定した。このように得られた固定細胞を−２０℃で一晩培養し、そして冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。各群の細胞を懸濁するために、２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｄｄＨ２Ｏ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５０μＬの冷ＤＮＡ染色溶液を添加した。染色された細胞を得るために、細胞を３７℃で３０分間暗所に保った。
【００７９】
続いて、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（登録商標） Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色された細胞を細胞周期分析させて、各分析において１．０×１０６細胞を分析した。細胞が４８８ｎｍのアルゴンイオンのレーザービームによって励起されると蛍光を発し、そして蛍光強度は、５８５ｎｍの波長で検出された。各細胞周期相における細胞の割合を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【００８０】
その後、このように得られたデータを、「一般的な実験手順」の「統計分析」と題した前の節に記載した方法に従って分析した。
【００８１】
結果：
表４は、各群におけるＨａＣａＴ細胞の細胞周期分布を示す。
【００８２】
【表４】
0006901167.tif 000005
【００８３】
表４から、ＵＶ対照群におけるＳｕｂ−Ｇ１期の細胞百分率は正常対照群のそれよりも高いことが分かり、これはＵＶがＨａＣａＴ細胞においてアポトーシスを誘発し得ることを示している。更に、実験群Ｌ及びＨにおけるＳｕｂ−Ｇ１期の細胞百分率は、ＵＶ対照群のそれよりも低く、そしてそのようなより低い百分率は、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の濃度が増加するに伴って、より明らかになる。この結果は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物がＵＶ誘発の細胞の死亡から細胞を保護することに有効であることを示唆している。
【００８４】
実施例５．ＵＶ誘発のアポトーシスに対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の効果の評価
この実施例では、本出願人は、細胞を、ハママンネングサの第１及び第２の酢酸エチル抽出物の１つ、アストラガリンまたはビテキシン、を用いて前処理して、ＵＶ誘発のアポトーシスに対して該前処理の効果を研究した。更に、比較の目的のために、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物で前処理した細胞についてＸ線誘発のアポトーシスを研究した。
【００８５】
実験材料
原液の製造
実施例で使用した２つの原液の製造方法は以下の通りである。
【００８６】
（１）アストラガリンの原液
アストラガリン（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢｅｉＺｈｕｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.、Ｎｏ. ４８０−１０−４）をＤＭＳＯに溶解して、４．４８４ｍｇ／ｍＬの濃度を有する原液を得た。
【００８７】
（２）ビテキシン原液
ビテキシン（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢｅｉＺｈｕｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.、Ｎｏ. ３６８１−９３−４）をＤＭＳＯに溶解して、４．３２３ｍｇ／ｍＬの濃度を有する原液を得た。
【００８８】
実験手順：
Ａ．試験サンプルの前処理及び照射処理
ＨａＣａＴ細胞は、３つの対照群（即ち、正常対照群１、ＵＶ対照群１及びＸ線対照群１）、２つの実験群（即ち、実験群１Ｌ及び１Ｈ）及び６つの比較群（即ち、比較群１Ｌ、１Ｈ、ＡＬ、ＡＨ、ＶＬ及びＶＨ）を含む１１群に分けられた。
【００８９】
ＨａＣａＴ細胞の各群を、５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したもの）を含む６ｃｍペトリディッシュで、４×１０５細胞の細胞数に培養し、そして、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。新鮮培地で培地を交換した後、２つの実験群及び６つの比較群の細胞培養物を試験サンプルで、これらの群の細胞培養物がそれぞれ表５に示される試験サンプルの最終濃度を有するように前処理した。３つの対照群の細胞培養物はいかなる試験サンプルでも処理されなかった。
【００９０】
各群の前処理されたＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した。その後、正常対照群の培養物は照射を受けなかった以外、各群の培養物に、表５に示す所定の放射線量で、線型加速器（ＥＬＥＫＴＡ）を用いたＸ線照射またはＣＬ−１０００紫外線クロスリンカーを用いたＵＶ照射を行った。
【００９１】
【表５】
0006901167.tif 000006
【００９２】
Ｂ．アポトーシスアッセイ
上記の節Ａに記載したようにＵＶまたはＸ線を照射した後、各群のＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養した。得られた各群の細胞培養液にそれぞれ１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを加えてペトリディッシュの表面から細胞を分離させた。１ｍＬの新鮮培地を加えてトリプシンの活性を中和した後、得られた細胞懸濁液を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットを冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で1回洗浄した後、１２００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を除去した後、得られた細胞ペレットを１００μＬの冷アネキシンＶ１Ｘ結合緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標））で十分に懸濁し、細胞濃度１．０×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を得た。その後、５μＬのＦＩＴＣアネキシンＶ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標））及び５μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標））を得られた細胞懸濁液に添加し、そして細胞懸濁液を均一に混合して、４℃で暗所で３０分間培養した。
【００９３】
このように得られた染色された細胞をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメトリーを用いて分析し、ここで、ＦＩＴＣアネキシンＶで染色されたがＰＩでは染色されなかった細胞（即ち、ＦＩＴＣアネキシンＶ陽性及びＰＩ陰性）は、早期アポトーシスで誘発された細胞を表し、ＦＩＴＣアネキシンＶ及びＰＩの両方で染色された細胞（即ち、ＦＩＴＣアネキシンＶ陽性及びＰＩ陽性）は、末期アポトーシスで誘発された細胞を表し、ＦＩＴＣアネキシンＶ及びＰＩで染色できなかった細胞（すなわち、ＦＩＴＣアネキシンＶ陰性及びＰＩ陰性）は、生存細胞を表した。染色された細胞の数は、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴ（登録商標）Ｃ６ソフトウェアを用いて計算された。
【００９４】
各群のアポトーシス百分率（％）は、下記式（２）を用いて算出した。
【００９５】
Ｄ＝[（Ｅ＋Ｆ）／Ｇ]×１００（２）
Ｄ＝アポトーシス百分率（％）
Ｅ＝ＰＩ ＦＩＴＣアネキシンＶ陽性及びＰＩ陰性の細胞数
Ｆ＝ＦＩＴＣアネキシンＶ陽性及びＰＩ陽性の細胞数
Ｇ＝総細胞数
その後、得られたデータを、「一般的な実験手順」の「統計分析」と題した前の節に記載した方法に従って分析した。
【００９６】
一方、実施例１で得られたハママンネングサの第２の酢酸エチル抽出物についても、表６に示した各群をハママンネングサの第２の酢酸エチル抽出物が所定の最終濃度にするように前処理した後、所定の放射線量でＵＶ照射したこと以外、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物と同様のアポトーシスアッセイを行った。
【００９７】
【表６】
0006901167.tif 000007
【００９８】
Ｃ．切断されたカスパーゼ−３の発現プロファイル
上記の節Ａに記載したようにＵＶまたはＸ線を照射した後、正常対照群１、ＵＶ対照群１及び実験群１ＨのＨａＣａＴ細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。各群に得られた細胞培養物をＰＢＳで２回洗浄し、そして１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００９９】
上清を除去した後、残りの細胞に、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍタンパク質抽出試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びプロティナーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶解緩衝液１２０μＬを加え、そして均一に混合して４℃で３０分間静置した。
【０１００】
得られた細胞混合物を微量遠心管に入れ、４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離した。このように得られた上清を総タンパク質試料とした。総タンパク質試料中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットを用いて測定された。
【０１０１】
各群の総タンパク質試料を、当業者に周知で且つ日常的に使用されている技術に従って、切断されたカスパーゼ−３の検出のためにドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析及びウエスタンブロッティング分析にかけた。更に、β−アクチンを内部標準として使用した。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウエスタンブロッティング分析に使用した機器及び試薬は以下の通りである。
【０１０３】
（１）電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。
【０１０４】
（２）セミドライ型電気泳動転写セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用いてタンパク質転写を行った。
【０１０５】
（３）ウエスタンブロッティング分析において、各タンパク質の検出に用いた一次及び二次抗体を表７に示す。
【０１０６】
【表７】
0006901167.tif 000008
【０１０７】
（４）化学発光染色は、化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｎｏ.ＷＢＫＬＳ０５００）を用いて行い、且つ、シグナル検出は、イメージスキャナーイメージングソフトウェア（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて行った。
【０１０８】
そして、イメージスキャナイメージングソフトウェアを使用して、対応するタンパク質発現量を半定量的に計算した。各群における切断されたカスパーゼ−３の発現量は、対応するβ−アクチンの発現量で正規化した。正常対照群１における切断カスパーゼ−３の規格化発現量は１００％と見なされた。このように正常対照群１のそれに対する他の各群の切断カスパーゼ−３の規格化発現量の百分率を計算した。その後、データを、「一般的な実験手順」の「統計分析」と題した前の節に記載した方法に従って分析した。
【０１０９】
結果
Ａ．アポトーシスアッセイ
アポトーシスアッセイにより測定された各群のアポトーシスの百分率を表８に示す。
【０１１０】
【表８】
0006901167.tif 000009
【０１１１】
表８に示されるように、ＵＶ対照群１／２及びＸ線対照群１のアポトーシスの百分率は、正常対照群１／２のそれより著しく高く、ＵＶ及びＸ線の両方がＨａＣａＴ細胞におけるアポトーシスを誘発することができることを示している。更に、ＵＶ対照群１と比較して、実験群１Ｌ及び１Ｈは、（ＵＶ対照群１のそれと比較して）アポトーシス百分率においてそれぞれが７４．７％及び８８．３％の著しい減少を示し、且つ、ＵＶ対照群２と比較して、実験群２Ｌ及び２Ｈは、アポトーシス百分率においてそれぞれが３２．４％及び３８．５％の著しい減少を示す（ＵＶ対照群２のそれと比較して）。同様に、Ｘ線対照群１と比較して、比較実験群１Ｌ及び１Ｈはまた、アポトーシス百分率においてそれぞれが１０．８％及び６２％の減少を示す（Ｘ線対照群１のそれと比較して）。そのような減少は、ハママンネングサの第１または第２の酢酸エチル抽出物の濃度の増加と共により明白になり、そしてＸ線照射と比較して、ＵＶ照射の結果はより顕著である。
【０１１２】
更に、比較群ＡＬ及びＶＬにおけるアポトーシス百分率は、ＵＶ対照群１のそれよりも著しく低いが、実験群１Ｌのそれよりは高い。対照的に、比較群ＡＨ及びＶＨのアポトーシス百分率は、ＵＶ対照群１のそれよりも著しく高い。これらの結果は、低濃度のアストラガリン及びビテキシンは、ＵＶ誘発のアポトーシスから細胞を保護するかもしれないが、高濃度のアストラガリン及びビテキシンは、ＵＶ誘発のアポトーシスを悪化させることを示している。
【０１１３】
前述の結果は、本開示のハママンネングサの酢酸エチル抽出物の前処理は、Ｘ線誘発のアポトーシス及びＵＶ誘発のアポトーシスから細胞を効果的に保護することができ、また、この保護効果はＵＶ誘発のアポトーシスに対してより優れていることを示している。
【０１１４】
Ｂ．切断されたカスパーゼ−３の発現プロファイル
図５は、ウエスタンブロッティング分析により測定され、各群のＨａＣａＴ細胞における切断されたカスパーゼ−３の相対正規化発現量を示す。図５から、正常対照群１と比較して（正常対照群１における切断されたカスパーゼ−３の正規化発現量を１００％と見なした）、ＵＶ対照群１は、切断されたカスパーゼ−３の正規化発現量が著しい増加を示すことが分かり、ＵＶがＨａＣａＴ細胞のアポトーシスを誘発できることを示している。更に、実験群１Ｈは、ＵＶ対照群１と比較して、切断されたカスパーゼ−３の正規化発現量の著しい減少を示す。これらの結果は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物がＵＶ照射によって誘発された切断されたカスパーゼ−３の過剰発現を阻害することができ、それによりＵＶ誘発のアポトーシスから細胞を保護することを示す。
【０１１５】
実施例６．ＵＶ誘発の皮膚老化に対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の効果の評価
この実施例では、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）及びマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の発現プロファイルを調べて、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物のＵＶ誘発の皮膚老化に対する保護効果を評価した。
【０１１６】
実験手順：
ＷＳ１細胞を、正常対照群、ＵＶ対照群及び実験群を含む３つの群に分けた。各群のＷＳ１細胞を、１０ｍＬのα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１×ＭＥＭ ＮＥＡＡを添加したもの）を含有する１０ｃｍペトリディッシュ中で１×１０６細胞の細胞数に培養した後、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。
【０１１７】
新鮮培地で培地を交換した後、実験群の細胞培養物を、実施例１で得られたハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の原液で前処理して、細胞培養物が同じく２５０μｇ/ｍＬの最終濃度を有するようにした。正常対照群及びＵＶ対照群の細胞培養物は、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物で処理されなかった。培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した後、ＵＶ対照群及び実験群の培養物に、２０ｍＪ／ｃｍ２の線量でＣＬ−１０００紫外線クロスリンカーを使用してＵＶ照射を行い、一方、正常対照群の培養物は照射を受けなかった。
【０１１８】
次いで、各群のＷＳ１細胞をタンパク質発現プロフィール分析させ、これは、表９に示される一次及び二次抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を行ってＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の発現を検出したことを除くこと以外、一般的に、上記実施例５の「Ｂ．切断カスパーゼ−３''の発現プロフィール」と題した節に記載の方法に従って行った。
【０１１９】
【表９】
0006901167.tif 000010
【０１２０】
その後、データを、「一般的な実験手順」の「統計分析」と題した前の節に記載した方法に従って分析した。
【０１２１】
結果：
図６及び図７は、それぞれ、ウエスタンブロッティング分析により測定された各群のＷＳ１細胞におけるＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の相対正規化発現量を示している。図６及び図７から、正常対照群と比較して（正常対照群のＭＭＰ−１またはＭＭＰ−２の正規化発現量を１００％と見なした）、ＵＶ対照群は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の正規化発現量が著しい増加を分かり、これは、ＵＶがＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２を活性化して、ＷＳ１細胞のコラーゲン及びエラスチンの分解を誘発できることを示している。更に、ＵＶ対照群と比較して、実験群は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の正規化発現量が大幅に低下した。
【０１２２】
これらの結果は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物の前処理は、ＵＶ照射及び細胞外マトリックス（例えば、コラーゲンやエラスチンなど）の破壊によって引き起こされるＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の過剰発現を効果的に抑制できることにより、ＵＶ誘発の皮膚老化が緩和されることを示している。
【０１２３】
実施例７．細胞のＵＶ誘発の皮膚老化に対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の治療効果の評価
この実施例では、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の発現プロファイルを調べて、ＵＶ照射により誘発された老化した皮膚細胞に対する本開示によるハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の治療効果を評価した。
【０１２４】
実験手順：
ＷＳ１細胞を、正常対照群、ＵＶ対照群及び実験群を含む３つの群に分けた。各群のＷＳ１細胞を、１０ｍＬのα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１×ＭＥＭ ＮＥＡＡを添加したもの）を含有する１０ｃｍペトリディッシュ中で１×１０６細胞の細胞数に培養したあと、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。
【０１２５】
ＵＶ対照群及び実験群の培養物に、２０ｍＪ／ｃｍ２の放射線量でＣＬ−１０００紫外線クロスリンカーを使用してＵＶ照射を行って皮膚老化を誘発し、一方、正常対照群の培養物は照射を受けなかった。
【０１２６】
培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した後、新鮮培地で培地を交換し、実験群の細胞培養物を、実施例１で得られたハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の原液で前処理して、細胞培養物が、同じく２５０μｇ/ｍＬの最終濃度を有するようにした。正常対照群及びＵＶ対照群の細胞培養物は、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物で処理されなかった。
【０１２７】
細胞を培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養し、ＷＳ１細胞の各群のＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の発現プロファイルを上記実施例６記載した方法に従って分析した。
【０１２８】
その後、データを、「一般的な実験手順」の「統計分析」と題した前の節に記載した方法に従って分析した。
【０１２９】
結果
図８及び図９は、それぞれ、ウエスタンブロッティング分析により測定された各群のＷＳ１細胞におけるＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の相対正規化発現量を示している。図８及び図９から、正常対照群と比較して（正常対照群のＭＭＰ−１またはＭＭＰ−２の正規化発現量を１００％と見なした）、ＵＶ対照群は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２が著しい増加を示すことが分かり、これは、ＵＶがＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２を活性化して、ＷＳ１細胞のコラーゲン及びエラスチンの分解を誘発できることを示している。更に、ＵＶ対照群と比較して、実験群は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の正規化発現量が大幅に低下した。
【０１３０】
これらの結果は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物がＵＶ誘発の光老化を改善できることを示している。
【０１３１】
実施例８．皮膚がん細胞に対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の効果の評価
本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物の皮膚がんに対する治療効果を測定するために、２つの最も一般的なＵＶ誘発皮膚がん（即ち、扁平上皮がん及び皮膚メラノーマ）のがん細胞株を次の実験で使用した。
【０１３２】
実験手順：
Ａ．ハママンネングサの酢酸エチル抽出物の処理
Ａ４３１細胞及びＡ３７５細胞を、それぞれ対照群（即ち、Ａ４３１対照群１及びＡ３７５対照群１）及び実験群（即ち、Ａ４３１実験群１及びＡ３７５実験群１）に分けた。
【０１３３】
Ａ４３１細胞とＡ３７５細胞の各群を、１皿あたり３×１０５細胞量で表１に示される５ｍＬの対応する培地を含む６ｃｍペトリディッシュ中で培養し、そして培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。
【０１３４】
新鮮培地で培地を交換した後、Ａ４３１及びＡ３７５実験群１の細胞培養物の濃度を５００μｇ/ ｍＬにするように、それぞれを実施例１で得られたハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物の適切な量の原液で処理した。Ａ４３１及びＡ３７５対照群１の細胞培養物は、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物で処理していなかった。
【０１３５】
Ｂ．細胞周期分析
上記節Ａで得られた各群のＡ４３１細胞と各群のＡ３７５細胞のそれぞれを培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間と７２時間培養し、そして得られた細胞培養物を上記の実施例４の「Ｂ．細胞周期分析」と題した前の節に記載した方法に従って細胞周期分析した。
【０１３６】
Ｃ．アポトーシスアッセイ
上記節Ａで得られた各群のＡ４３１細胞と各群のＡ３７５細胞のそれぞれを培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間と７２時間培養し、そして得られた細胞培養物を上記の実施例５の「Ｂ. アポトーシスアッセイ」と題した前の節に記載した方法に従ってアポトーシス分析した。
【０１３７】
一方、各群のＡ４３１細胞と各群のＡ３７５細胞を表１０に示されるハママンネングサの第２の酢酸エチル抽出物の所定の最終濃度で処理した以外、実施例１で得られたハママンネングサの第２の酢酸エチル抽出物も、ハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物と同様にアポトーシスアッセイを行うように使用した。
【０１３８】
【表１０】
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【０１３９】
Ｄ．切断されたカスパーゼ−３の発現プロファイル
上記節Ａで得られた各群のＡ４３１細胞と各群のＡ３７５細胞のそれぞれを培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間と７２時間培養し、そして得られた細胞培養物を上記の実施例５の「Ｂ．切断されたカスパーゼ−３の発現プロファイル」と題した前の節に記載した方法に従って切断されたカスパーゼ−３の発現プロファイルを測定した。
【０１４０】
結果：
Ａ. 細胞周期分析
表１１には、各群の各細胞周期相におけるＡ４３１細胞とＡ３７５細胞との分布を示している。
【０１４１】
【表１１】
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【０１４２】
表９から、Ａ４３１及びＡ３７５実験群1のサブＧ１期の細胞の百分率は、それぞれＡ４３１及びＡ３７５対照群１のそれよりも高いことが分かる。この結果は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物は、皮膚がん細胞の死亡を促進することができることを示している。
【０１４３】
Ｂ．アポトーシスアッセイ
アポトーシスアッセイにより測定された各群のＡ４３１及びＡ３７５細胞のアポトーシス百分率を表１２に示す。
【０１４４】
【表１２】
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【０１４５】
表１２に示されるように、Ａ４３１及びＡ３７５実験群のアポトーシス百分率は、Ａ４３１及びＡ３７５対照群のアポトーシス百分率よりも著しく高く、この開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物が皮膚がん細胞にアポトーシスを誘発できることを示している。
【０１４６】
Ｃ．切断されたカスパーゼ−３の発現プロファイル
図１０及び図１１のそれぞれは、ウエスタンブロッティング分析により測定された各群のＡ４３１及びＡ３７５細胞における切断されたカスパーゼ−３の相対的正規化発現量を示している。図１０及び図１１から、Ａ４３１及びＡ３７５対照群１（これらの対照群の切断されたカスパーゼ−３の正規化発現量を１００％とみなした）と比較して、Ａ４３１及びＡ３７５実験群１のそれぞれは、切断されたカスパーゼ−３の正規化発現量の著しい増加を示し、ハママンネングサの酢酸エチル抽出物が皮膚がん細胞のアポトーシスを誘発し、それによってがん細胞の死亡を促進し、がん細胞の成長を阻害できる。従って、出願人は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物が皮膚がんを治療できると推測している。
【０１４７】
実施例９．無毛マウスのＵＶ誘発の皮膚老化に対するハママンネングサの酢酸エチル抽出物の効果の評価
一般実験材料
１．実験動物：
ＳＫＨ−１無毛マウス（４〜５週齢、体重２０±５ｇ）はＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ.、Ｌｔｄから購入した。該マウスは、以下の実験室条件下で独立した空調システムを備えた動物室に飼育された。１２時間の明/１２時間の暗のサイクル、温度２４±１℃、相対湿度６０±１０％。更に、水と飼料はすべて実験動物に自由に提供された。動物に関するすべての実験は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って行われた。
【０１４８】
２．試験溶液
実施例１で得られたハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物を３５％ＤＭＳＯ及び６５％エタノールを含む溶液に溶解し、次の実験で使用される、４％（ｗ／ｖ、ｇ／１００ｍＬ）のハママンネングサの第１の酢酸エチル抽出物を含む試験溶液を製造した。
【０１４９】
実験手順：
ＳＫＨ−１無毛マウスは、正常対照群（ｎ＝３）、ＵＶ対照群（ｎ＝５）及び実験群（ｎ＝１）にランダムに分けられた。正常対照群のＳＫＨ−１無毛マウスはＵＶ照射を受けなかった。 各ＳＫＨ−１無毛マウスの背部皮膚は、皮膚の老化を誘発するために、Ｃ８Ｔ５Ｅ ＵＶ−Ｂランプ（３０２ｎｍ）を備えたＣＬ−１０００紫外線クロスリンカーを使用して、１２週間に亘って週３回のＵＶ照射にさらされた。表１３に、各照射における１回のＵＶ照射量を示す。
【０１５０】
【表１３】
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【０１５１】
１２週間の実験期間中の各ＵＶ照射の約２時間前に、実験群の各マウスの背部皮膚に、上記で得られた試験溶液を、１ｃｍ２あたり２００μＬの試験溶液で投与した。正常対照群及びＵＶ対照群のマウスは、試験溶液で処理されなかった。
【０１５２】
１２週間の実験期間の後、各マウスの背中を撮影し、各群のマウスから外科用ハサミを使用して、１．５ｃｍ３の背部皮膚組織を採取した。
【０１５３】
採取した組織を１０％ホルマリンで４８時間固定した。固定された組織をパラフィンに包埋し、スライスして厚さ４〜６μｍの組織切片を得た。
【０１５４】
組織切片は、当業者によく知られ、日常的に使用されている技術に従ってマッソン染色をした。染色された組織切片を、光学顕微鏡（オリンパスＢＸ４１、日本）で１００倍の倍率で検査し、デジタルカメラを使用して撮影した。
【０１５５】
結果：
図１２は、１２週間の実験期間後の各群のＳＫＨ−１無毛マウスの背部皮膚の状態を示している。図１１に示されるように、ＵＶ対照群のマウスの背部皮膚は、正常対照群と比較して、薄く、腫れ、弾力性が低く、落屑が示され、ＵＶ照射が皮膚損傷を誘発できることを示している。更に、実験群の皮膚損傷の上記の症状は、ＵＶ対照群の症状と比較して大幅に緩和されることができる。
【０１５６】
図１３は、１２週間の実験期間後の各群のＳＫＨ−１無毛マウスでマッソン染色により得られた背部皮膚組織のコラーゲン線維の組織像を示している。図１３から、正常対照群のＳＫＨ−１無毛マウスの真皮のコラーゲン線維は、波状であったが、ＵＶ対照群のコラーゲン線維は、真皮から皮下組織に至る不規則な増殖として現れた。更に、実験群で観察された結果は、正常対照群の結果と類似していた、つまり、ＵＶ対照群と比較して不規則な増殖が少ない。これらの結果は、本開示によるハママンネングサの酢酸エチル抽出物が、ＵＶ照射によって引き起こされる光損傷を軽減できることを示している。
【０１５７】
本明細書で引用されているすべての特許および文献の参考文献、ならびにそこに記載されている参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含む本説明が優先される。
【０１５８】
上記においては、説明のため、本発明の全体的な理解を促すべく多くの具体的な詳細が示された。しかしながら、当業者であれば、一またはそれ以上の他の実施形態が具体的な詳細を示さなくとも実施され得ることが明らかである。また、本明細書における「一つの実施形態」「一実施形態」を示す説明において、序数などの表示を伴う説明は全て、特定の態様、構造、特徴を有する本発明の具体的な実施に含まれ得るものであることと理解されたい。更に、本説明において、時には複数の変化例が一つの実施形態、図面、またはこれらの説明に組み込まれているが、これは本説明を合理化させるためのもので、また、本発明の多面性が理解されることを目的としたものであり、また、一実施形態における一またはそれ以上の特徴あるいは特定の具体例は、適切な場合には、本開示の実施において、他の実施形態における一またはそれ以上の特徴あるいは特定の具体例と共に実施され得る。
【０１５９】
以上、本発明の好ましい実施形態及び変化例を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々な構成として、全ての修飾および均等な構成を包含するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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