(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株と、
（ｂ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物。
【請求項２】
前記組成物は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有し、免疫細胞の活性化を促進してサイトカインの分泌量を増加させるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記サイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＧＦ−ｂｅｔａからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、個体に投与すると免疫を増強させるものであり、前記個体が哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記個体は、家畜又はペットである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、個体に投与すると体内の抗体を増加させるものであり、前記個体が哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、個体に投与するとその個体から生まれた子個体の免疫力を向上させるものであり、前記個体が哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、個体に投与するとその個体から生まれた子個体のウイルス感染症状を緩和するものであり、前記個体が哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記（ａ）及び（ｂ）は、菌株そのもの、菌株を含むその培養液、その濃縮液又はその乾燥物の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記凍結保護剤は、グリセリン、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及びデンプンからなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記賦形剤は、グルコース、デキストリン及び脱脂牛乳からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、哺乳動物における免疫増強用、哺乳動物における抗ウイルス用、医薬品用、飼料又は飼料添加剤用、及び食品用からなる群から選択される用途に用いられる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、またはネコである、請求項５、７〜９および１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物がブタである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物をヒトを除く個体に投与するステップを含む、ヒトを除く個体の免疫増強方法であって、ここで前記個体が哺乳動物である、方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、またはネコである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物がブタである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物をヒトを除く個体に投与するステップを含む、ヒトを除く個体のウイルス感染疾患の予防又は治療方法であって、ここで前記個体が哺乳動物である、方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、またはネコである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物がブタである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株を含む組成物、及び寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物をそれぞれ準備するステップと、
前記ＣＪＬＰ４７５菌株を含む組成物、及び前記ＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物を混合するステップとを含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２３】
前記ＣＪＬＰ４７５菌株を含む組成物、前記ＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物、又は前記プロバイオティクス組成物の少なくとも１つの組成物に添加剤を投与するステップをさらに含む、請求項２２に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２４】
前記添加剤は凍結保護剤であり、前記添加剤を投与するステップの後に凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項２３に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２５】
前記凍結乾燥した組成物中の菌株は、生菌状態である、請求項２４に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２６】
前記混合するステップの後に所定の含有量で包装するステップを含む、請求項２２に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２７】
前記所定の含有量で包装するステップは、前記ＣＪＬＰ４７５菌株と前記ＣＪＬＰ１７菌株とを含む菌株総量が１０６ＣＦＵ／ｇ以上となるように包装するものである、請求項２６に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む、耐酸性、耐胆汁性、抗ウイルス性及び免疫増強活性を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の畜産業界においては、伝染性の高いウイルス性疾患により家畜が斃死し、それに伴って農家に経済的被害が発生することが多い。特に、養豚産業において、４大慢性消耗性疾患である豚呼吸器病症候群（porcine respiratory disease complex）、離乳後全身性消耗症候群（Postweaning multisystemic wasting syndrome）、豚生殖器・呼吸器症候群（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome）、豚流行性下痢（Porcine epidemic diarrhea）などのウイルスや細菌による感染性疾患により莫大な経済的損失が発生している。
【０００３】
前記豚流行性下痢は、コロナウイルス科（corona virus family）に属する豚流行性下痢ウイルス（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）の感染により発生する豚消化器性疾病である。前記ウイルスは、小腸や大腸の絨毛細胞で増殖し、全ての日齢の豚、特に子豚において急性腸炎、嘔吐、水様性下痢を誘発する。特に、１１月から４月までの主に冬期に被害が深刻であり、生後１週齢以内の哺乳子豚の斃死率は約５０％に達し、重篤な場合は激しい脱水により斃死率が約１００％に達することが知られている。
【０００４】
ＰＥＤウイルスは１９７１年にヨーロッパで初めて観察され、１９７６年にベルギーでＧ１ａ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶ ＣＶ７７７がさらに検出及び分離され、８０年代にヨーロッパで流行し、９０年代に中国、韓国、日本、台湾などの東アジア地域で発生した。また、前記Ｇ１ａ ｔｙｐｅより病原性の高いＧ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶが２０１０年に中国をはじめとして発生した。前記新種ｔｙｐｅのＰＥＤＶは、北米地域（米国，カナダ）だけでなく、東南アジア、ヨーロッパでも発生して大きな被害をもたらした。２０１３年には米国養豚産業において生産性損失により約２兆２，０００億韓国ウォンの被害が発生し、韓国においては現在年間２０〜４０％の農家で毎年発生し、それにより子豚全体の６％が斃死すると報告されている。さらに、屠殺場出入車両の感染率が約６０％に達すると報告されている（韓国農村経済研究院，韓国養豚獣医師協会）。
【０００５】
現在までＧ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤウイルスに対する根本的な予防は、徹底して消毒する方法が唯一であった。多くの農場でウイルス疾患による被害を予防するために、人工感染法を用いたり、従来のＧ１ａ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶワクチンを接種しているが、Ｇ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶ感染を予防するには限界がある。また、新規に開発されたＧ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶ死毒ワクチンが接種されているが、生毒ワクチンが開発されておらず、死毒ワクチンのみ接種されているので、消化器疾病の予防において死毒ワクチンには限界があるなど、ＰＥＤＶの予防対策における様々な問題を抱えている。前記問題を補完するために、ＰＥＤウイルス予防（ワクチンなど）及び治療（ＩｇＹ、精油（Essential oil）、有機酸、プロバイオティクスなど）用製剤の開発が盛んに行われており、最近は特に抗ウイルス効果を有すると共に生体内の免疫系を刺激する機能性素材を用いて免疫を増強する方法が研究されている。
【０００６】
免疫は、一般に先天性免疫（Innate immunity）と後天性免疫（Adaptive immunity）に分けられる。先天性免疫は、病原体の感染を第一線で速やかに防御するシステムであり、侵入因子（抗原）に直接作用したり、後天性免疫を誘導する。後天性免疫は、より複雑で精密なシステムであり、侵入因子を認知して除去したり、当該侵入因子に対する記憶などの作用を有し、先天性免疫に比べてより永久的な免疫作用を有する。先天性免疫に関する抗原提示細胞（Antigen-presenting cells）である樹状細胞（Dendritic cells, DCs）、マクロファージ（Macrophages）、ナチュラルキラー細胞（natural killer cells）などは、直接の先天性免疫作用を有し、各種Ｔ細胞の活性を促進する受容体を有するので、それを介してサイトカイン（cytokines）を分泌する。後天性免疫は、体内に侵入した抗原に対する２次防御システムであり、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球により起こる特異的免疫反応である。抗原により活性化するＴ細胞の免疫反応としては、細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T cell）反応、ヘルパーＴ細胞（Helper T cell, Th）反応などが挙げられる。先天性免疫に関する樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などにおいても、外部侵入物質を認知してＩＬ−１２やＩＬ−４などの各種サイトカインを分泌し、宿主動物の免疫を適切に変化させる反応を引き起こして免疫防御メカニズムを好ましい方向に導く。Ｔ細胞の前駆体の役割を果たすＮａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞は、中心的なサイトカインにより分化が決定されるが、高濃度のＩＬ−１２（interleukin-12）が存在する場合は、Ｔｈ１（T helper 1）細胞分化を促進し、細胞内病原体（intracellular pathogen）を退治するＣＴＬ（Cytotoxic T lymphocyte）反応を誘導する。ＩＬ−４（interleukin-4）が高濃度の場合は、外部侵入物質を特異的に退治する（Ｂ細胞の抗体分泌）反応を誘導する。また、前述した免疫細胞は、炎症反応などの過度の免疫反応を抑制するためにＴＧＦ−ｂｅｔａ（Beta transforming growth factor）とＩＬ−１０を分泌したり、過度の免疫反応を抑制するためにＴＧＦ−ｂｅｔａを分泌することによりｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ細胞を活性化したり、ＴＧＦ−ｂｅｔａやＩＬ−６（interleukin-6）などの分泌によりＢ細胞をプラズマ細胞に変形させて抗体生成を促進したり、誤った自己免疫と外部侵入物質を退治する免疫反応（Ｔｈ１７）を誘導するなど、精巧かつ複雑な過程を経て体内に侵入した因子に対して適宜対応する。しかし、時にこのような免疫反応において均衡が取れないこともあり、免疫反応が不十分なこともあるので、適切な免疫増強剤をさらに必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、前記ウイルスに抑制活性を示すと共に免疫系を活性化する微生物を分離及び同定してその活性を確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、（ａ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株と、（ｂ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
本出願の一実施例によれば、前記（ａ）及び（ｂ）は、菌株、その破砕物、その培養液、その濃縮液又はその乾燥物の形態であってもよい。
【００１０】
また、本出願は、前記組成物を含む飼料又は飼料添加剤を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本出願は、前記組成物を含む食品を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本出願は、前記組成物を含む化粧品を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本出願は、前記組成物を含む医薬品を提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本出願は、前記組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体の免疫増強方法を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本出願は、前記組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体のウイルス感染疾患の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
【００１６】
さらに、本出願は、前記組成物のウイルス感染疾患の予防又は治療用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１７】
本出願の組成物は、耐酸性、耐胆汁性に優れるのでプロバイオティクスとして提供することができ、生体内免疫細胞を活性化することにより免疫機能を調節することができ、特に豚流行性下痢ウイルスに対しても優れた感染抑制活性を示す。また、本出願の組成物を家畜に経口投与し、その後分娩した子豚にＰＥＤウイルスを攻撃接種した場合、免疫調節により子豚の斃死率が大幅に低下する効果を発揮する。よって、本出願は、ＰＥＤウイルスに対する抗ウイルス活性、免疫増強活性、増体重改善効果及び家畜の下痢発生率減少効果を有する組成物を提供することができ、前記組成物は、飼料もしくは飼料添加剤用組成物、食品組成物、化粧品組成物又は医薬品組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株に溶血性がないことが確認される血液寒天平板培地の写真である。
【図２】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物に細胞毒性がないことが確認されるグラフである。
【図３】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物によるＰＥＤウイルス感染抑制効果を示す顕微鏡写真である。
【図４】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚の血液中のｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ抗体増加率を示すグラフである。
【図５】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚の血液中のｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＡ抗体増加率を示すグラフである。
【図６】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚の初乳中の中和抗体価を示すグラフである。
【図７】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の子豚の血液中のｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ抗体含有量を示すグラフである。
【図８】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の子豚の血液中のＴＧＦ−ｂｅｔａ含有量を示すグラフである。
【図９】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の子豚の空腸のＶ／Ｃ ｒａｔｉｏを示すグラフである。
【図１０】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の子豚の結腸のｇｏｂｌｅｔ ｃｅｌｌを示すグラフである。
【図１１】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の７日間の平均体温を示すグラフである。
【図１２】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の７日間の下痢率を示すグラフである。
【図１３】ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚へのＰＥＤウイルス攻撃接種後の７日間の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【００２０】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、（ａ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株と、（ｂ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を提供する。
【００２１】
具体的には、前記組成物は、抗ウイルス性、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有するものであってもよい。
【００２２】
本出願における「ラクトバチルス（Lactobacillus）」とは、自然界に広く分布する好気性又は通性嫌気性のグラム陽性桿菌属微生物である。ラクトバチルス属に属する微生物にはラクトバチルス・プランタルムなどがある。本発明者らは、ラクトバチルス・プランタルムに属する新規な菌株をそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐ及び寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託して提供し、それらをそれぞれ「ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５」及び「ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７」と命名した。これらは、プロバイオティクス菌株に該当し、人体に無害であり、副作用を引き起こすことなく用いられる。
【００２３】
本出願における「プロバイオティクス」とは、体内に入って健康によい効果を与える生きた菌を意味する。これまでに知られているほとんどのプロバイオティクスは、ラクトバチルスなどの乳酸菌を用いて製造された発酵乳製品として摂取されてきたが、最近はラクトバチルス以外に、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカスなどの一部の菌株を含む発酵乳、顆粒、粉末などの形態で販売されている。本出願の前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７も、発酵乳、顆粒、粉末などの形態で用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本出願における「耐酸性」とは、高い酸度に耐えられる性質を意味する。プロバイオティクスが耐酸性を有すると、経口をはじめとする様々な投与経路で摂取されて胃腸内の強い酸性条件にさらされても、分解されたり、損傷することを防止することができる。
【００２５】
本出願における「耐胆汁性」とは、胆汁内の消化酵素に対する抵抗性を意味する。胆汁は、肝臓で生成されて胆嚢に一時貯蔵され、小腸内の十二指腸で脂肪の消化作用を助ける弱アルカリ性の緑褐色の液体であり、脂肪質を乳化して消化、吸収を助ける。このような胆汁は、経口をはじめとする様々な経路で摂取されたプロバイオティクスに対しても作用するので、プロバイオティクス投与効果を減少させる主要原因の一つとなる。
【００２６】
具体的には、本出願の組成物のうち、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、伝統発酵食品である醤油から分離して得たものであり、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は、豚流行性下痢ウイルスが発生した韓国の農場の母豚、子豚の糞便及び初乳から分離して得たものである。前記各菌株の形態学的特徴はグラム陽性桿菌であり、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は配列番号１の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有し、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は配列番号２の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有する。前記塩基配列を分析した結果、それぞれラクトバチルス・プランタルムと約９９％の相同性を示した。よって、本発明者らは、新規に分離したラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を２０１８年４月１３日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託し、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を２０１８年７月１１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託した。
【００２７】
本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を長期間安定して保存するために、水にグリセリン成分を所定量混合して作製した保存液に菌株を浮遊させて−７０℃で保管するか、滅菌した１０％脱脂乳に懸濁して凍結乾燥してもよいが、これらに限定されるものではなく、様々な公知の方法で長期保存形態にされてもよい。
【００２８】
本出願の組成物は、赤血球に対する溶血性を示さないものであってもよい。溶血とは、赤血球が破壊されてヘモグロビンが外部に流出することを意味し、生体内の有害菌から産生された酵素により赤血球が溶血する。よって、前記組成物が生体内に投与されても血管内で溶血を起こさない。
【００２９】
また、本出願の組成物は、抗生剤に対する耐性が弱いか、ないものであってもよい。前記抗生剤は、具体的にはアンピシリン、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン、アンピシリン／スルバクタム、クロラムフェニコール又はストレプトマイシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。よって、前記組成物を医薬品、機能性食品、飼料添加剤などに用いても、抗生剤に対する耐性がないので、それによる薬理効果や環境面で問題となる可能性が低い。
【００３０】
前記組成物は、免疫細胞の活性化を促進してサイトカインの分泌量を増加させるか、生体内に投与されて免疫機能を促進するものであってもよい。
【００３１】
前記「免疫細胞」とは、生体内の免疫機能に関与するあらゆる細胞を意味し、大きくＴ細胞とＢ細胞に分けられる。前記免疫細胞には、Ｔｈ１又はＴｈ２細胞が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。本出願の前記組成物は、免疫細胞を刺激してＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂｅｔａなどのサイトカインの分泌量を増加させる活性を有してもよい。
【００３２】
一般に、高い斃死率を示すウイルス性疾病においては、ウイルスによる細胞や組織自体の壊死により、他の菌株の２次感染及び敗血症、過度に活性化した免疫反応による炎症疾患、又は食欲低下及び脱水症が発生する。よって、ウイルス感染を抑制する抗ウイルス効能（Ｔｈ１、Ｔｈ２関連）と、２次感染と過度な炎症反応を調節する免疫反応（Ｔｈ２，Antiinflammation）が同時に増強されると、効果的なウイルス性疾病の予防及び治療効果が得られる。このように、プロバイオティクスによる免疫増強効能において、Ｔｈ１とＴｈ２を同時に増強させる方法は公知ではなく、本発明者により見出されたものである。また、本出願の組成物には、Ｔｈ１／Ｔｈ２の不均衡を調節する免疫調節力がある。
【００３３】
本出願における「サイトカイン」とは、身体防御システムを制御して刺激する信号物質として用いられる糖タンパク質を意味し、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−ｂｅｔａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
前記組成物は、個体に投与すると、個体の成長を促進したり、下痢発生率を低下させるものであってもよい。
【００３５】
本出願における「個体」とは、免疫が弱まっているか、弱まる可能性のある、ヒトを含むあらゆる動物を意味する。例えば、前記個体としては、ヒトを除く動物、又はヒトを含む動物が挙げられる。前記動物には、ヒトだけでなく、前記効能の発揮を必要とするあらゆる動物が含まれ、具体的にはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、ネコなどの哺乳動物が含まれ、その他家畜又はペットが含まれる。
【００３６】
前記投与方法は、特に限定されるものではなく、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。例えば、経口投与を用いることができる。
【００３７】
前記組成物は、体内の抗体を増加させるものであってもよい。このような免疫機能に関与する抗体の分泌量を増加させることにより、個体の免疫力を向上させることができる。前記組成物は、個体に投与することができ、投与方法は、特に限定されるものではなく、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。例えば、経口投与を用いることができる。前記体内は、血液、初乳などの体液であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又は中和抗体であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
前記組成物は、個体に投与すると、母体移行抗体により、その個体から生まれた子個体の免疫力を向上させるものであってもよい。前記免疫力向上は、抗体又はサイトカインの分泌量を増加させるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
前記組成物は、個体に投与すると、その個体から生まれた子個体のウイルス感染症状を緩和するものであってもよい。前記ウイルスは、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）であってもよいが、本出願の組成物により感染が抑制されるウイルスが全て含まれる。前記症状緩和は、消化器状態緩和、正常体温維持、下痢減少、生存率増加であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
前記組成物は、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有するものであってもよい。
【００４１】
本出願における「抗ウイルス」とは、ウイルス感染を抑制する性質を意味する。プロバイオティクスは、独自にウイルスを不活性化することはできないが、免疫活性によりウイルスに感染した個体の免疫力を向上させてウイルス感染に抵抗できるようにする。
【００４２】
前記豚流行性下痢ウイルスは、豚の小腸細胞に感染するコロナウイルスであると共に、激しい下痢及び脱水症を伴う豚流行性下痢を誘発するウイルスであり、本出願の組成物により感染が抑制されるウイルスが全て含まれる。
【００４３】
本出願の組成物のうち、前記（ａ）及び（ｂ）に該当する各菌株は、菌株そのもの、その破砕物、その培養液、その濃縮液又はその乾燥物の形態であってもよい。それで個体を処理すると、前記豚流行性下痢ウイルスの活性及び感染が著しく抑制されるので、前記組成物は、豚流行性下痢ウイルスに対する抗ウイルス用組成物、豚流行性下痢の予防もしくは治療用薬学組成物、又は豚流行性下痢の予防もしくは改善用機能性食品、医薬部外品もしくは飼料組成物として活用することができる。
【００４４】
本出願の一実施例によれば、本出願の組成物のうち、前記（ａ）及び（ｂ）は、菌株、その破砕物、その培養液、その濃縮液又はその乾燥物の形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記組成物の詳細については前述した通りである。
【００４５】
本出願の前記菌株は、通常のラクトバチルス菌株の培養方法で培養することができる。培地としては、天然培地又は合成培地が挙げられる。培地の炭素源としては、例えばグルコース、スクロース、デキストリン、グリセリン、スターチなどが用いられ、窒素源としては、ペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥酵母、大豆、アンモニウム塩、ナイトレート、及びその他有機もしくは無機窒素含有化合物が用いられるが、これらの成分に限定されるものではない。培地に含まれる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カリウムなどが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。前記炭素源、窒素源及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸及びそれに関する化合物が培地に添加されてもよい。本出願の組成物は、培養温度条件を２０〜４０℃の温度範囲として１２時間〜４日間培養することができる。
【００４６】
本出願における前記培養液とは、培養終了後の組成物を意味し、より具体的には、前記培養液は、菌体を含んでもよく、含まなくてもよい。よって、前記培養液には、培養上清、培養上清を除去した組成物、又はそれらを濃縮した組成物が含まれてもよい。前記培養液の組成は、通常のラクトバチルス培養に必要な成分だけでなく、ラクトバチルスの生長に相乗的に作用する成分をさらに含んでもよく、それらの組成は当該技術分野において通常の技術を有する者が容易に選択することができる。
【００４７】
さらに、菌株の状態は、液状状態又は乾燥状態であってもよく、乾燥方法としては、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥が用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
前記組成物は、（ａ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株と、（ｂ）寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを同時に含むことを特徴とする２種菌株複合製剤であってもよい。よって、前記組成物は、前記（ａ）及び（ｂ）に該当する２種の菌株そのもの、その破砕物、その培養液、その濃縮液又はその乾燥物のみで構成されるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。この場合、前記（ａ）及び（ｂ）に該当する２種の菌株は、組成物中で同一形態である必要はなく、必要に応じて（ａ）は菌株そのものであり、（ｂ）は菌株の破砕物などであってもよく、各形態の組み合わせであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
前記組成物におけるラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の混合物の濃度は、これらに限定されるものではないが、１０５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０９ＣＦＵ／ｍｌ、１０５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ、１０５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０７ＣＦＵ／ｍｌ、１０５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１０６ＣＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０７ＣＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０９ＣＦＵ／ｍｌ〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０６ＣＦＵ／ｍｌ〜１０９ＣＦＵ／ｍｌ、１０６ＣＦＵ／ｍｌ〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ、１０６ＣＦＵ／ｍｌ〜１０７ＣＦＵ／ｍｌ、１０７ＣＦＵ／ｍｌ〜１０９ＣＦＵ／ｍｌ、１０７ＣＦＵ／ｍｌ〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ、又は１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜１０９ＣＦＵ／ｍｌであってもよい。
【００５０】
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株が自然に接触しない物質、又は前述した２つの菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、一具体例として、前記組成物は、グリセリン、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及びデンプンからなる群から選択される少なくとも１つの凍結保護剤、並びに／又はグルコース、デキストリン及び脱脂牛乳からなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含んでもよい。本出願の凍結保護剤は、前記組成物の総重量に対して０．０１重量％〜２０重量％、０．０１重量％〜１０重量％含まれてもよく、具体的には、前記グリセリンは５重量％〜２０重量％、前記トレハロースは２重量％〜１０重量％、前記マルトデキストリンは２重量％〜１０重量％、前記脱脂粉乳は０．５重量％〜２重量％、前記デンプンは０．１重量％〜１重量％の割合で前記組成物に含まれてもよい。また、前記賦形剤は、前記組成物の総重量に対して７５重量％〜９５重量％、又は８５重量％〜９５重量％含まれてもよい。
【００５１】
また、前記組成物を製造する方法は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株そのもの、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物と添加剤を混合するステップを含んでもよい。前記添加剤は、前述した凍結保護剤又は賦形剤であってもよい。
【００５２】
前記組成物は、食品用組成物、機能性食品用組成物、飼料用組成物、飼料添加剤用組成物、化粧品用組成物又は医薬品用組成物であってもよい。
【００５３】
前記組成物は、免疫増強用であってもよい。
【００５４】
前記組成物は、抗ウイルス用であってもよい。
【００５５】
本出願の他の態様は、本出願の組成物を有効成分として含むプロバイオティクス組成物を提供する。
【００５６】
プロバイオティクスは、腸内の消化管の壁に定着して有害菌の定着を抑制し、ウイルスの増殖を抑制する。また、プロバイオティクスが産生する有益な消化酵素は、栄養素の吸収と利用を容易にすることにより成長を促進する。
【００５７】
前記プロバイオティクス組成物を製造する方法は、寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株を含む組成物、及び寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物をそれぞれ準備するステップと、前記ＣＪＬＰ４７５菌株を含む組成物、及び前記ＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物を混合するステップとを含んでもよい。
【００５８】
一具体例として、前記製造方法は、前記ＣＪＬＰ４７５菌株を含む組成物、前記ＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物、又は前記プロバイオティクス組成物の少なくとも１つの組成物に添加剤を投与するステップをさらに含んでもよい。
【００５９】
他の具体例として、前記添加剤は凍結保護剤であってもよく、前記添加剤を投与するステップの後に凍結乾燥するステップをさらに含んでもよい。
【００６０】
ここで、前記凍結乾燥した組成物中の菌株は、生菌状態であってもよい。
【００６１】
他の具体例として、前記製造方法は、前記混合するステップの後に所定の含有量で包装するステップを含んでもよい。
【００６２】
ここで、前記所定の含有量で包装するステップは、前記ＣＪＬＰ４７５菌株と前記ＣＪＬＰ１７菌株とを含む菌株総量が１０６ＣＦＵ／ｇ以上となるように包装するものであってもよい。
【００６３】
本出願のさらに他の態様は、前記組成物を含む飼料又は飼料添加剤を提供する。
【００６４】
前記組成物については前述した通りである。具体的には、本出願の組成物は、成長促進、下痢率減少、ウイルス活性抑制のために、飼料添加剤又は前記飼料添加剤を含む飼料組成物に添加されてもよい。
【００６５】
本出願における「飼料添加剤」とは、栄養素補充及び体重減少予防、飼料中の繊維素の消化利用性向上、乳質改善、繁殖障害予防及び受胎率向上、夏期高温ストレス予防など様々な効果を目的として飼料に添加する物質を意味する。本出願の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助詞料に該当し、炭酸水素ナトリウム、ベントナイト（bentonite）、酸化マグネシウム、複合鉱物質などの鉱物質製剤、亜鉛、銅、コバルト、セレンなどの微量鉱物質であるミネラル製剤、カロテン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸、ビタミンＢ複合体などのビタミン剤、メチオニン、リシンなどの保護アミノ酸剤、脂肪酸カルシウム塩などの保護脂肪酸剤、生菌剤（乳酸菌剤）、酵母培養物、カビ発酵物などの生菌、酵母剤などがさらに含まれてもよい。
【００６６】
本出願における「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、又はそれに適した任意の天然又は人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味し、本出願による代謝疾患の予防又は治療用組成物を有効成分として含む飼料は、当該技術分野で公知の様々な形態の飼料に製造することができ、具体的には濃厚飼料、粗飼料及び／又は特殊飼料に製造することができる。
【００６７】
飼育対象には、本出願の飼料を摂取できる生命体が全て含まれ、本出願の目的上、豚が含まれる。
【００６８】
本出願による飼料組成物中の組成物の含有量は、適用個体の種類及び年齢、適用形態、目的とする効果などに応じて適宜調節することができ、例えば０．０１〜２０重量％、０．０１〜１５重量％、０．０１〜１０重量％、０．０１〜５重量％、０．０１〜１重量％、１〜２０重量％、１〜１５重量％、１〜１０重量％、１〜５重量％、５〜２０重量％、５〜１５重量％、５〜１０重量％、１０〜２０重量％、１０〜１５重量％、又は１５〜２０重量％であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
本出願の飼料組成物は、投与のために、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸などの有機酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、重合リン酸塩などのリン酸塩、ポリフェノール、カテキン、トコフェロール、ビタミンＣ、緑茶抽出物、キトサン、タンニン酸などの天然抗酸化剤の少なくとも１種をさらに混合して用いてもよく、必要に応じて抗インフルエンザ剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤又は滑沢剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化してもよい。
【００７０】
さらに、本出願の飼料組成物は、補助成分としてのアミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗酸化剤、抗真菌剤、抗菌剤などの各種補助剤、及び粉砕又は破砕したコムギ、オオムギ、トウモロコシなどの植物性タンパク質飼料、血粉、肉粉、魚粉などの動物性タンパク質飼料、動物性脂肪、植物性脂肪などの主成分以外にも、栄養補充剤、成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と共に用いてもよい。
【００７１】
本出願の飼料組成物を飼料添加物として用いる場合は、前記飼料組成物をそのまま添加してもよく、他の成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いられてもよい。飼料組成物の投与形態は、非毒性の製薬上許容される担体と組み合わせて即時放出又は徐放性剤形を用いてもよい。前記担体は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株が自然に接触しない物質、又は前述した２つの菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。このような食用担体は、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、プロピレングリコールであってもよい。固体担体の場合は錠剤、散剤、トローチ剤などの投与形態であってもよく、液体担体の場合はシロップ剤、液体懸濁液剤、エマルジョン剤、溶液剤などの投与形態であってもよい。また、投与剤は、保存剤、滑沢剤、溶解促進剤、安定化剤を含有してもよく、他の炎症疾患改善剤及びウイルス予防上有用な物質を含有してもよい。
【００７２】
本出願による飼料組成物は、飼料に乾燥重量で１ｋｇ当たり約１０〜５００ｇ、具体的には１０〜１００ｇの量で混合してもよく、完全に混合してからマッシュで供給してもよく、追加加工工程によりペレット化、膨張化、押出工程を経てもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本出願のさらに他の態様は、前記組成物を含む食品又は機能性食品を提供する。
【００７４】
具体的には、本出願の組成物は、成長促進、免疫促進、下痢率減少、ウイルス活性抑制のために、食品に添加されてもよい。組成物については前述した通りである。食品は、食品学的に許容される担体を含んでもよい。前記担体は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株が自然に接触しない物質、又は前述した２つの菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
本出願の食品には、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）、食品添加剤（food additive）などのあらゆる形態が含まれ、前記タイプの食品は、当該技術分野で公知の通常の方法で様々な形態に製造することができる。
【００７６】
前記組成物を食品添加物として用いる場合は、組成物をそのまま添加してもよく、他の食品又は食品成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いられる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康又は治療的処置）に応じて適宜決定される。一般に、食品又は飲料の製造時に、組成物を含む原料組成物中に０．０００１〜１重量％、具体的には０．００１〜０．１重量％の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、又は健康調節を目的とする長期間の摂取においては、前記量は前記範囲以下であってもよい。
【００７７】
前記食品の種類は特に限定されるものではない。前記物質を添加する食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類をはじめとする乳製品、各種スープ、清涼飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味における健康食品が全て含まれる。
【００７８】
本出願の健康飲料組成物は、通常の飲料のように、様々な香味剤や天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述した天然炭水化物は、グルコース、フルクトースなどの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、ソーマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを用いることができる。前記追加成分の割合は、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．０４重量部、具体的には０．０２〜０．０３重量部であってもよい。
【００７９】
前記以外に、本出願の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有してもよい。これらの添加剤の割合はそれほど重要でないが、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。その他に、本出願の組成物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの果肉の割合はそれほど重要でないが、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１〜１０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。これらの成分は独立して又は組み合わせて用いることができる。
【００８０】
本出願のさらに他の態様は、前記組成物を含む化粧品を提供する。
【００８１】
具体的には、本出願の組成物は、免疫促進による抗炎症効果、ウイルス活性抑制効果を有するので、化粧品に用いられてもよい。組成物については前述した通りである。
【００８２】
前記本出願による組成物を化粧品として用いる場合は、当該化粧品技術分野で公知の通常の剤形の様々な化粧品に製造することができる。各剤形に製剤化する場合は、各剤形の製造に必要な化粧品製造上許容される担体又は添加剤を付加して製造することができる。前記担体又は添加剤は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体又は添加剤は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株が自然に接触しない物質、又は前述した２つの菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
本出願のさらに他の態様は、前記組成物を含む医薬品を提供する。具体的には、本出願の組成物は、成長促進、下痢率減少、免疫促進による抗炎症効果、ウイルス活性抑制効果を有するので、医薬品に用いられてもよい。組成物については前述した通りである。
【００８４】
本出願による組成物を医薬品として用いる場合は、当該技術分野で公知の通常の薬剤学的剤形に製剤化することができる。前記医薬品は、経口剤形に製剤化することが好ましく、例えば液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、エキス剤などの経口投与用剤形に製剤化することが好ましい。前述した各剤形に製剤化する場合は、各剤形の製造に必要な薬剤学的に許容される担体又は添加剤を付加して製造することができる。前記担体又は添加剤は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体又は添加剤は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株が自然に接触しない物質、又は前述した２つの菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。代表的には、経口投与用剤形に製剤化する場合は、前記担体として希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、安定剤及び防腐剤から少なくとも１種を選択して用いることができ、添加剤として香料、ビタミン類及び抗酸化剤から少なくとも１種を選択して用いることができる。前記担体及び添加剤は、薬剤学的に許容されるものであれば全て用いることができ、具体的には、希釈剤として、ラクトース、トウモロコシデンプン、大豆油、微晶質セルロース又はマンニトールを用い、滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム又はタルクを用い、結合剤として、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルセルロースを用いることが好ましい。また、崩壊剤として、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ポラクリリンカリウム又はクロスポビドンを用い、甘味剤として、白糖、フルクトース、ソルビトール又はアスパルテームを用い、安定剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−シクロデキストリン、白蝋又はキサンタンガムを用い、防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸カリウムを用いることが好ましい。
【００８５】
本出願のさらに他の態様は、本出願の組成物を個体に投与するステップを提供する。前記組成物及び個体については前述した通りである。
【００８６】
前記投与により、個体において前記組成物の効能、すなわち免疫増強活性、抗ウイルス活性などを発揮する。
【００８７】
前記投与における投与量は、これらに限定されるものではないが、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の混合物に換算して１０６ＣＦＵ／日以上、１０７ＣＦＵ／日以上、１０８ＣＦＵ／日以上、１０９ＣＦＵ／日以上、１０１０ＣＦＵ／日以上又は１０１１ＣＦＵ／日以上であってもよい。
【００８８】
本出願のさらに他の態様は、前記組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体の免疫増強方法を提供する。前記組成物及び個体については前述した通りである。
【００８９】
本出願における「投与」とは、任意の適切な方法で個体に本出願の組成物を導入することを意味し、投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。
【００９０】
本出願のさらに他の態様は、前記組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体のウイルス感染疾患の予防又は治療方法を提供する。前記組成物及び個体については前述した通りである。
【００９１】
本出願における「予防」とは、本出願の組成物の投与によりウイルス感染疾患を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。また、本出願における「治療」とは、本出願の組成物の投与により感染疾患の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９３】
菌株の分離及び選択
１−１．ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株の試料確保及び分離
１．５％寒天（agar）を含むＭＲＳ固体培地（Difco, USA）に、醤油から分離したラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を塗抹し、３７℃で２４時間培養した。各試料から分離した菌株を新たな培地に移して培養する方法で純粋分離し、２０％グリセリンを添加した栄養培地に純粋分離して培養した菌を接種し、零下７０℃以下で保存した。その結果、全１，５５２種の菌株を確保し、以下の実施例により、優れた抗ウイルス活性などを有する菌株を選択した。
【００９４】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列分析の結果、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（Lactobacillus plantarum NBRC15891, GenBank accession number AB326351）と最も高い相同性（９９．９％）を示したので、ラクトバチルス・プランタルムとして同定し、「ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５」と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年７月１１日付けで寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐ）。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５の分析された１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、配列番号１の通りである。
【００９５】
一方、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、グラム染色の結果、グラム陽性であった。また、生化学的特性を分析するために、ＡＰＩ ５０ＣＨＬ ｓｙｓｔｅｍ（biomerieux Vitek, Inc., フランス）により前記菌株の糖発酵パターンを分析した（表１）。
【００９６】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株の糖発酵パターンの分析
【表１−１】
0006931088.tif 000002
【表１−２】
0006931088.tif 000003
＋：陽性，−：陰性
【００９７】
１−２．ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の試料確保及び分離
ＰＥＤＶが慢性的に発生した韓国の農場の母豚、子豚の糞便サンプル及び初乳サンプルを確保した。確保した試料を段階的に希釈してＭＲＳ及びＢＨＩ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した。各試料から分離した菌株を新たな培地に移して培養する方法で純粋分離し、２０％グリセリンを添加した栄養培地に純粋分離して培養した菌を接種し、零下７０℃以下で保存した。その結果、全１，５５２種の菌株を確保し、以下の実施例により、優れた抗ウイルス活性などを有する菌株を選択した。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列分析の結果、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（Lactobacillus plantarum NBRC15891, GenBank accession number AB326351）と最も高い相同性（９９％）を示したので、ラクトバチルス・プランタルムとして同定し、「ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７」と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年４月１３日付けで寄託した（寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐ）。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の分析された１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、配列番号２の通りである。
【００９８】
一方、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は、グラム染色の結果、グラム陽性であった。また、生化学的特性を分析するために、ＡＰＩ ５０ＣＨＬ ｓｙｓｔｅｍ（biomerieux Vitek, Inc., フランス）により前記菌株の糖発酵パターンを分析した（表２）。
【００９９】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の糖発酵パターンの分析
【表２−１】
0006931088.tif 000004
【表２−２】
0006931088.tif 000005
＋：陽性，−：陰性
【実施例２】
【０１００】
菌株の耐酸性及び耐胆汁性の評価
プロバイオティクスとして活用できる菌株を選択するために、前記確保した菌株に対して耐酸性及び耐胆汁性に関する評価を行った。
【０１０１】
耐酸性の評価のために、人工胃液培地を作製した。より具体的には、前記人工胃液培地は、ＭＲＳ液体培地にペプシンを添加してｐＨ２．５になるように調整し、その後滅菌して準備した。
【０１０２】
実施例１の菌株を２回継代培養し、その後ＭＲＳ液体培地にて３７℃で１８時間静置培養した。前記人工胃液培地に前培養した菌株を１％接種して３７℃で静置培養し、０時間及び３時間経過時点で培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養して生菌数を測定した。
【０１０３】
耐胆汁性の評価のために、人工胆汁液培地を作製した。より具体的には、前記人工胆汁液培地は、０．５％ｏｘｇａｌｌ（黄牛の胆汁）を添加したＭＲＳ液体培地を滅菌して準備した。
【０１０４】
実施例１の菌株を２回継代培養し、その後ＭＲＳ液体培地にて３７℃で１８時間静置培養した。前記人工胆汁液培地に前培養した菌株を１％接種して３７℃で静置培養し、０時間及び２４時間経過時点で培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養して生菌数を測定した。
【０１０５】
前記評価により、最も耐酸性及び耐胆汁性に優れる菌株を選択し、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７として特定した。前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の耐酸性及び耐胆汁性を従来公知の菌株と比較するために、韓国微生物保存センターから分譲されたラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）の耐酸性及び耐胆汁性を前記と同様の方法で評価した。
【０１０６】
耐酸性の評価（単位：ＣＦＵ／ｍｌ）
【表３】
0006931088.tif 000006
【０１０７】
耐胆汁性の評価（単位：ＣＦＵ／ｍｌ）
【表４】
0006931088.tif 000007
【０１０８】
表３及び表４に示すように、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）は、人工胃液培地及び人工胆汁培地において菌株数が減少した。よって、一般に知られている全てのラクトバチルス・プランタルムが耐酸性及び耐胆汁性を有するのではないことが分かる。
【０１０９】
それに対して、耐酸性の評価において、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は、菌株数が逆に増加したので、耐酸性に優れる菌株であることが分かる。
【０１１０】
耐胆汁性の評価において、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は、菌株数が増加し、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）と比較して菌株数の減少幅が小さいので、２つの菌株はどちらも耐胆汁性に優れる菌株であることが分かる。
【０１１１】
また、各菌株が耐酸性及び耐胆汁性に優れるので、前述した２つの菌株の両方を含む組成物も耐酸性及び耐胆汁性に優れるといえる。
【実施例３】
【０１１２】
菌株の安定性の評価
３−１．菌株の溶血性の確認
β−溶血とは、赤血球により供給されるリン脂質が有害菌から産生されたリン脂質酵素により加水分解され、結果として赤血球が溶血する作用を意味する。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の溶血性を調べるために、血液寒天平板培地（sheep blood 5% agar, （株）ハンイルコメッド, 韓国）を用いた。準備した血液寒天平板培地に各菌株を画線接種（streaking）し、３７℃で２４時間培養して溶血の有無を確認した。
【０１１３】
その結果、図１に示すように、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は溶血性を示さないことが確認された。これらの結果は、生体内で有害菌として作用しないことを示唆するものである。
【０１１４】
３−２．抗生剤感受性の評価
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株をそれぞれＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間静置培養した。培養した菌を滅菌綿棒につけてＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ固体培地（Difco）に塗抹し、その後前記培地上に抗生剤ディスクを載せて３７℃で２４時間培養した。抗生剤検査のための抗生剤ディスクとしては、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、ｋａｎａｍｙｃｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎディスク（Oxoid, 英国）を準備して用いた。
【０１１５】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の抗生剤感受性検査の結果、各菌株は前記抗生剤に対する耐性がないことが確認された（表５）。よって、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を医薬品、機能性食品、飼料添加剤などに用いても、抗生剤に対する耐性がないので、それによる耐性問題や環境的問題は発生する可能性が低いことが分かる。
【０１１６】
抗生剤による菌株成長阻害度
【表５】
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【実施例４】
【０１１７】
細胞毒性の評価
前記菌株が細胞の生存に及ぼす影響を調べるために、ＭＴＳ分析方法（3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, promega, USA）を用いて、ＩＰＥＣ−Ｊ２（ブタ腸上皮細胞，intestinal pig epithelium cells）細胞上で細胞毒性レベルを評価した。各細胞を９６ウェル細胞培養プレートで培養し、その後ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を１：１で混合した各濃度（１０５〜１０７ＣＦＵ／ｍｌ）の菌株混合物で処理して培養した。２４時間後に細胞培養液にＭＴＳ溶液を添加して２時間培養し、マイクロプレートリーダにて波長４９０ｎｍで吸光度を測定して細胞生存率（％）を計算した。
【０１１８】
その結果、図２に示すように、３つの濃度で処理した場合、１０７ＣＦＵ／ｍｌ以下の濃度では細胞死滅がほとんど起こらないことが確認された。よって、組成物は実質的に１０７ＣＦＵ／ｍｌ以下の濃度では細胞毒性をほとんど示さないことが分かる。
【実施例５】
【０１１９】
ウイルス感染抑制効果
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物のウイルス感染抑制効果を測定するために、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）を準備した。具体的には、前記ウイルスをＶｅｒｏ（ＣＣＬ−８１，アフリカミドリザル由来腎臓上皮細胞）細胞で増殖培養し、前記Ｖｅｒｏ細胞を培養するための培地としてＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）、熱処理により不活性化した１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum, ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを用いた。前記Ｖｅｒｏ細胞を単層培養し、その後培地で２回洗浄して全溶液を除去した。５μｇ／ｍｌ ＴＰＣＫ（N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone）で処理したトリプシンを含むＦＢＳ無添加のＭＥＭに０．１ＭＯＩ（Multiplicity of infection）レベルのウイルスを混合し、その最小量を用いて準備した培養細胞を処理し、その後５％ＣＯ２を含有する３７℃の細胞培養器で２〜３日間培養した。
【０１２０】
ウイルス感染の有無は、ウイルスシンシチウム（virus syncytium）形成の有無により判断した。シンシチウムが形成された場合は、３〜６時間以内にウイルス培養液を回収し、遠心分離機にて細胞を除去して−８０℃で保管した。ウイルス感染力価の計算においては、９６−ｗｅｌｌプレートでＶｅｒｏ細胞を２×１０４ｃｅｌｌ／０．１ｍｌのレベルに培養して細胞をＰＢＳで洗浄し、その後ウイルスを２倍連続希釈した培養液を入れて２４〜４８時間培養してウイルス感染の有無を確認し、Ｒｅｅｄ ＆ Ｍｕｅｎｃｈ法によりウイルス感染力価を計算した。
【０１２１】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物のウイルス感染抑制効果を測定するために、前記組成物と２１日齢の離乳子豚から抽出した末梢血単核細胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cell）及び腸間膜リンパ節（mLN, lymphocytes in mesenteric lymph nodes）を２０〜２４時間反応させ、その後ＩＰＥＣ−Ｊ２が培養された９６ウェル細胞培養プレートをそれぞれ処理し、５％ＣＯ２を含有する３７℃の細胞培養器で２〜４時間培養した。それぞれのプレートに１００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（50% of tissue cell infectious dose）のＰＥＤウイルス（ＳＭ９８又はＫＰＥＤＶ９）をスポッティングし、その後４８時間培養した。ウイルス感染の有無を確認するために、培養終了後に細胞培養プレートをメタノールで固定してクリスタルバイオレットで染色し、その後細胞変性したウェルを顕微鏡で確認し、ウイルス感染の有無を判断した。
【０１２２】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７を混合して活性化した免疫細胞によるＰＥＤウイルス感染抑制効果
【表６】
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＋＋：完全抑制，＋：部分的抑制，−：感染
【０１２３】
その結果、表６及び図３に示すように、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の両方を含む組成物と豚免疫細胞で共に処理すると、前記組成物により活性化された免疫細胞がブタ腸上皮細胞（ＩＰＥＣ−Ｊ２）のＰＥＤウイルス感染を抑制するものと判断される。
【０１２４】
表６において、３つの実験群（ＣＪＬＰ４７５，ＣＪＬＰ１７，ＣＪＬＰ１７及びＣＪＬＰ４７５）のそれぞれの総菌株数が同一であることに鑑みると、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の両方を含む組成物のＰＥＤウイルス感染抑制効果は、ＣＪＬＰ４７５菌株又はＣＪＬＰ１７菌株を含む組成物のＰＥＤウイルス感染抑制効果に比べて著しく優れることが分かる。
【実施例６】
【０１２５】
母豚の免疫力及び初乳に及ぼす影響の確認
実施例５でラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物の抗ウイルス効果が確認されたので、前記組成物を母豚に給餌した場合に母豚の免疫力と初乳に及ぼす影響を確認するために次の実験を行った。ＰＥＤウイルスが発生していない農場で同時期に分娩予定の分娩６週間前の母豚を１実験群当たり１５頭ずつ任意に選定した。実験に用いた全ての母豚にＰＥＤウイルスワクチンを分娩８週間前、３週間前に接種し、菌株を給餌していない対照群グループ（control）と、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌したグループの計２つの実験群に分けた。飼料としては抗生剤を添加していない一般のクランブル飼料を供給し、水は無制限に与えた。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株及びラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を凍結乾燥粉末の形態に生産して冷蔵保管しておき、１日に１頭当たり１０１０ＣＦＵ／日以上摂取できるように飼料給与時にトップドレッシングした。このように全６週間給与し、前記菌株が母豚の免疫力と初乳に及ぼす影響を確認するために、母豚の血液中のｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ抗体増加率、ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＡ抗体増加率、及び初乳中の中和抗体価を測定した。それを図４、図５及び図６に示す。
【０１２６】
この実験の結果として、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物は、対照群に比べて母豚の血液中のｖａｃｃｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ及びＩｇＡを増加させ、前記組成物の給餌による分娩時の初乳の中和抗体価の変化において、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物が対照群より高い中和抗体価を示した。
【実施例７】
【０１２７】
母豚への組成物の給餌による子豚の免疫力改善効果
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた子豚の免疫力に及ぼす影響を確認するために、実施例６と同様に母豚での実験を行い、その後さらにその母豚から生まれた子豚から初乳摂取４日後の血液を採取し、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて免疫学的分析を行った。前述したように全６週間にわたる母豚に対する前記組成物の給餌が子豚の免疫力に及ぼす影響を図７に示す。
【０１２８】
その結果、子豚の血液中のＶａｃｃｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ含有量は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した群において対照群より高い値が検出された（図７）。
【０１２９】
これは、母豚の初乳から高いＶａｃｃｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧを子豚が摂取したことを示すので、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物の母豚への給餌が子豚の免疫力を向上させることが分かる。
【実施例８】
【０１３０】
組成物を給餌した母豚から生まれた哺乳子豚に攻撃接種した場合に及ぼす影響
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた子豚がＰＥＤウイルスに感染した場合に子豚の斃死に及ぼす影響を確認するために、実施例６と同様に母豚での実験を行った。この実験は子豚にＰＥＤウイルスを攻撃接種しなければならないので、動物実験倫理委員会の助言に従って実験群を最小限に抑え、単独菌株については行わず、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物についてのみ行った。
【０１３１】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した母豚から生まれた４日齢の哺乳子豚を各処理群当たり２０頭ずつ選択して攻撃接種を行った（PEDv QIAP 1401, 100LD50/ml）。攻撃接種後全７日間にわたって毎日体温測定及び下痢スコアリングを行った（０〜３，０：正常便，１：軟便，２：普通の下痢，３：激しい下痢）。代用乳及び水は自由に与え、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物は代用乳に混合して１頭当たり１×１０１０ＣＦＵずつ給餌した（１日１回）。子豚が斃死したら剖検して空腸、結腸をサンプリングし、中性ホルマリンを用いて固定し、パラフィンを浸透させてｅｍｂｅｄｄｉｎｇし、薄切りした組織切片を脱パラフィン化してｈｙｄｒａｔｉｏｎした。その後、Ｈ＆Ｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇし、絨毛の高さと陰窩の深さの比を測定してＶ／Ｃ ｒａｔｉｏを確認し、結腸の粘膜をサンプリングして１ｍｍ２当たりのｇｏｂｌｅｔ ｃｅｌｌ数を確認した。また、各個体の血液を採取して血清を分離し、各処理群の炎症抑制の程度を比較評価するために、炎症抑制の代表因子であるＴＧＦ−ｂｅｔａ含有量レベルをＥＬＩＳＡ（R&D Systems, USA）により測定した。攻撃接種実験の結果を図８〜図１３に示す。
【０１３２】
子豚の血液中のＴＧＦ−ｂｅｔａは、組成物を給餌した群において対照群より高い値が検出された。よって、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む組成物を給餌した群の抗炎反応のほうが活性化されていることが確認された（図８）。
【０１３３】
子豚の空腸のＶ／Ｃ ｒａｔｉｏは、組成物を給餌した群において対照群より高い値であったので、ウイルスによる絨毛の脱落が対照群より緩和されたことが確認された（図９）。
【０１３４】
子豚の結腸内のｇｏｂｌｅｔ ｃｅｌｌは、組成物を給餌した群において対照群より多かったので、ＰＥＤウイルス感染により発生する腸粘膜形成の阻害が有意に少ないことが確認された（図１０）。
【０１３５】
ＰＥＤウイルス攻撃接種後の子豚の体温変化において、組成物を給餌した群は対照群に比べて正常範囲内で体温が維持されることが確認された。特に、５、６、７ｄｐｉにおいては、前記組成物を給餌した母豚から生まれた子豚における体温変化が対照群に比べて平均体温を有意に維持している（図１１）。
【０１３６】
ＰＥＤウイルスによる子豚の下痢スコア（clinical significance score）を確認した結果、組成物を給餌した実験群は、６、７ｄｐｉにおいて対照群に比べて下痢スコアが有意に低下した（図１２）。
【０１３７】
ＰＥＤウイルス攻撃接種後７日間の生存率を確認した結果、対照群は５５％の生存率を示し、組成物を給餌した母豚から生まれた子豚においてはＰＥＤウイルス感染時に６５％の生存率を示したので、対照群より優れた抗ウイルス効果を発揮した（図１３）。
【０１３８】
これらの結果から、組成物の給餌により母豚の免疫及び初乳中の抗体を改善することができ、子豚の免疫に影響を与えてウイルス感染時の斃死率減少をもたらすことが確認された。
【実施例９】
【０１３９】
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株とを含む生菌剤の作製
実施例１で同定されたプロバイオティクスラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株とプロバイオティクスラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を混合して医薬品、食品、飼料、飼料添加剤又は化粧品の原料として適用するために大量生産し、それを凍結乾燥して生菌剤化した。
【０１４０】
各菌株の生産のために、前記各菌株をＭＲＳ液体培地（Difco）にて２５％ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを６．０に調節し、３７℃で約１８時間培養して遠心分離を行うことにより菌体を回収した。回収した各菌体は、デキストリン５％と脱脂牛乳１０％を凍結保護剤として用いて−４０℃で凍結し、その後３７℃で乾燥した菌体をミキサーで粉砕して粉体化した。粉体化した各生菌を混合して目標とする菌数に調節し、保管のために適量のグルコース、ラクトース、脱脂牛乳などの賦形剤と混合し、密封可能なアルミニウムパウチに入れて包装した。
【０１４１】
このように作製した生菌剤は、飼料の原料として用いられる穀粉と混合して飼料用生菌剤として活用したり、担体や添加剤などを混合して錠剤、カプセルなどの医薬品、食品用生菌剤として活用したり、化粧品の原料に所定量を混合することにより化粧品用生菌剤として活用するなど、医薬品、食品、飼料、飼料添加剤、化粧品などの様々な分野において当該技術分野における通常の方法で活用することができる。
【０１４２】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【０１４３】
【表７】
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【０１４４】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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