(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、前記コンピュータにより実施される方法は、前記推測することが、
前記対象の試料中で測定される、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを受信するステップと、
前記対象の前記試料中の３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の転写を制御する、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、前記決定するステップは、前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の前記発現レベルを、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの前記活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデルを査定することに基づく、前記決定するステップと、
前記対象における前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の前記活性を、前記対象の前記試料中の前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップと
を有し、
前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３からなる群から、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択され、
一方が、Ｉ型ＩＦＮ活性に対して較正され、他方が、ＩＩ型ＩＦＮ活性に対して較正される、２つの較正された数学的経路モデルを使用することにより、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の前記活性が、Ｉ型ＩＦＮ活性又はＩＩ型ＩＦＮ活性であると推測される、
コンピュータにより実施される方法。
【請求項２】
前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される、６つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を含む、請求項１に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項３】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が前記対象において異常に作動しているのかどうかを、前記対象における前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき決定するステップ
をさらに有する、請求項１又は２に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項４】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の前記異常な作動を是正する薬物を、前記対象に処方することを推奨するステップをさらに有し、
前記推奨するステップは、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が、前記対象において異常に作動すると、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づき決定される場合に実施される、請求項３に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項５】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の前記異常な作動が、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が前記対象において腫瘍プロモーターとして作動する作動である、請求項３又は４に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項６】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき、腫瘍抗原免疫療法に対する前記対象の応答を予測するステップをさらに有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項７】
以下の活性：
前記対象における前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく薬物処方；
前記対象における前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく薬物有効性の予測；
前記対象における前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく有害作用の予測；
薬物有効性のモニタリング；
薬物の開発；
アッセイの開発；
経路の探索；
がんの病期分類；
前記対象における前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された前記活性に基づく臨床試験における前記対象の登録；
実施される後続の試験の選択；及び
コンパニオン診断試験の選択
のうちの少なくとも１つにおいて使用される、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項８】
較正された前記数学的経路モデルが、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの前記活性レベルと、前記３つ若しくはこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の前記発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は前記数学的経路モデルが、前記３つ若しくはこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の前記発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づく、請求項１から７のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法。
【請求項９】
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体であって、前記非一時的記憶媒体は、請求項１から８のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する、非一時的記憶媒体。
【請求項１０】
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムであって、前記コンピュータプログラムは、前記コンピュータプログラムがデジタル処理デバイス上で実行される場合に、前記デジタル処理デバイスに、請求項１から８のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法を実施させるためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム。
【請求項１１】
対象の試料中の前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットであって、前記キットは、
前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を対象とするポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーと、
前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を対象とするプローブと、
請求項９に記載の非一時的記憶媒体、又は請求項１０に記載のコンピュータプログラムと、を含み、
前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３からなる群から、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される、
キット。
【請求項１２】
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットであって、前記キットは、
前記対象の試料中の前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを決定するための１つ又は複数の構成要素と、
請求項９に記載の非一時的記憶媒体、又は請求項１０に記載のコンピュータプログラムと
を含み、
前記１つ又は複数の構成要素が、好ましくは、ＤＮＡアレイチップ、オリゴヌクレオチドアレイチップ、タンパク質アレイチップ、抗体、複数のプローブ、例えば、標識されたプローブ、ＲＮＡ逆転写酵素シーケンシング構成要素のセット、及び／又はｃＤＮＡ、増幅プライマーを含む、ＲＮＡ若しくはＤＮＡからなる群から選択され、
ここで、前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３からなる群から、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される、
キット。
【請求項１３】
前記３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される、６つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれか一項に記載のコンピュータにより実施される方法の実施における、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、バイオインフォマティクス、ゲノムデータ処理、プロテオームデータ処理、及び関連技術の分野に関する。より詳細には、本発明は、デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、推測することが、対象の試料中で測定されるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルに基づく、コンピュータにより実施される方法に関する。本発明は、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置であって、装置は、方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサーを含む装置、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体であって、非一時的記憶媒体は、方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する非一時的記憶媒体、及び対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムがデジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、方法を実施させるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムにさらに関する。本発明は、対象の試料中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキット、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキット、及び方法の実施におけるキットの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析及びプロテオーム解析は、多様ながんが、がんの増殖及び進化、例えば、細胞の増殖及び転移において役割を果たす、特異的な遺伝子について、ゲノム突然変異／変異の特異的な組合せ、及び／又は高度若しくは低度の発現レベルと関連することが知られている腫瘍学など医療分野における臨床適用にとって相当に実現され、潜在的な可能性を有する。
【０００３】
ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２とは、免疫応答及びがんに関与する多くの遺伝子の発現を調節する、誘導型転写因子である。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路は、免疫系が直面する、多様な課題であって、多様な課題は、感染への抵抗から、免疫寛容の維持、障壁機能の強化、及びがんに対する防御に至る、多様な課題に関与する、鍵となるシグナル伝達経路である。ＩＦＮなどの異なる刺激は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路が、潜在的な、細胞質ゾルＳＴＡＴ単量体をリン酸化することを誘発して、それらが、ＳＴＡＴ１ホモ二量体及びＳＴＡＴ１／２ヘテロ二量体を形成し、これが、特異的なＤＮＡ標的部位に結合し、遺伝子の転写を調節することを可能とする。Ｉ型インターフェロンが、典型的に、転写因子としてのＳＴＡＴ１／２ヘテロ二量体を活性化させるのに対し、ＩＩ型インターフェロンは、主に、ＳＴＡＴ１／１ホモ二量体を活性化させる。両方の転写因子複合体は、それぞれ、ＩＳＲＥ及びＧＡＳと称する、個別に規定された応答エレメントを介して、標的遺伝子の転写を活性化させる（また、Ｐｌａｔａｎｉａｓ  Ｌ．Ｃ．、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ−Ｉ−  ａｎｄ  ｔｙｐｅ−ＩＩ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５巻、２０１５年５月、３７５〜３８６頁に基づく、図１も参照されたい）。この理由で、それらの標的遺伝子は、一般に、重複する可能性が高く、どの標的遺伝子が、転写複合体のうちの一方又は他方に特異的であるのかが完全に明らかなわけではないが、ＳＴＡＴ１／２による転写と、ＳＴＡＴ１／１による転写を識別しうるモデルを有することが好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、ターゲティングされた薬物処置の正しい選択を可能とするために、がんにおけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２シグナル伝達に関して、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２シグナル伝達活性の異常を検出できることが重要である。現在、抗ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２療法が開発されつつある（Ｌｉｕ  Ｂ．ら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＩＡＳ１」、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９５巻、１９９８年９月、１０６２６〜１０６３１頁を参照されたい）。しかし現在、その活性の状態において、例えば、その不活性状態と比較して、腫瘍促進性である可能性が高いことを指し示す、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の機能状態及び活性のそれぞれについて評価するのに利用可能な臨床アッセイは存在しない。したがって、がん、例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、若しくは前立腺がん、又は免疫障害などの疾患であって、異常なＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性により、少なくとも部分的に駆動され、したがって、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の阻害剤に応答する可能性が高い疾患を有する患者を特徴付ける可能性を改善することが可能であることが所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主要な態様に従い、上記の問題は、デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、推測することが、
対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを受信するステップと、
対象の試料中の３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の転写を制御する、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するステップであって、決定するステップは、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルを、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける較正された数学的経路モデルを査定することに基づく、決定するステップと、
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップと
を有し、
３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３からなる群から、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される、
コンピュータにより実施される方法により解決される。
【０００６】
本明細書に、ＴＦエレメントの「活性レベル」とは、その標的遺伝子の転写に関する、ＴＦエレメントの活性のレベルを表示する。
【０００７】
本発明は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路内で生じる作用を同定する、適切な方式は、（他にもまして）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路により制御される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子（ＴＦ）エレメントにより制御される、標的遺伝子の転写である、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路シグナル伝達出力の測定に基づきうるという、本発明者らによる、新しい考え方に基づく。本発明者らによる、この新しい考え方は、ＴＦ活性レベルが、試料では、準定常状態にあり、これは、（他にもまして）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現値により検出されうることを仮定する。本明細書で標的とされるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路は、増殖、分化、及び創傷の治癒など、ヒトの、多くの細胞型において、多くの機能を制御することが知られている。がん（例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がん）などの病理学的障害に関して、異常なＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達活性は、重要な役割を果しており、これは標的遺伝子の発現プロファイル内で検出可能であり、したがって、較正された数学的経路モデルの手段として利用される。
【０００８】
本発明は、（ｉ）対象の試料中の、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルを決定するステップであって、決定するステップは、その転写が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントにより制御される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける、較正された数学的モデルを査定することに基づく、決定するステップと、（ｉｉ）対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づき推測するステップとにより、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を決定することを可能とする。これは、がん、例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がんなどの疾患であって、異常なＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性により、少なくとも部分的に駆動され、したがって、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の阻害剤に応答する可能性が高い疾患を有する患者を特徴付ける可能性の改善を可能とすることが好ましい。特定の実施形態では、処置の決定は、特異的なＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性に基づきうる。特定の実施形態では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達状態は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズのカットオフ値、例えば、１０：１、５：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：５、又は１：１０に設定することができる。
【０００９】
本明細書では、「ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子エレメント」又は「ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメント」又は「ＴＦエレメント」という用語は、特異的なＤＮＡ配列、好ましくは、それぞれ、ＩＳＲＥ（結合モチーフＡＧＴＴＴＣＮＮＴＴＣＮＣ／Ｔ）応答エレメント又はＧＡＳ（結合モチーフＴＴＣ／ＡＮＮＮＧ／ＴＡＡ）応答エレメントに結合し、これにより、標的遺伝子の転写を制御することが可能である、少なくとも、ＳＴＡＴ１−ＳＴＡＴ２ヘテロ二量体又はＳＴＡＴ１ホモ二量体を含有するタンパク質複合体であると規定される。好ましくは、用語は、下流のシグナル伝達を結果としてもたらす、刺激リガンドの、その受容体への結合により誘発される、ＩＦＮなど、異なる刺激により形成される、タンパク質又はタンパク質複合体である転写因子を指す。
【００１０】
較正された数学的経路モデルは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルと、３つ若しくはこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであってもよく、又は３つ若しくはこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づいてもよい。特に、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性の推測は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において開示される通りに、又は国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において記載される通りに実施される。標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の推測に関するさらなる詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁において見出されうる。
【００１１】
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の生物を指す。一部の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト対象、好ましくは、医学的対象である。さらに他の実施形態では、対象は、細胞系である。
【００１２】
本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、その転写が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子エレメントにより、直接的に、又は間接的に制御される遺伝子を意味する。「標的遺伝子」は、「直接的標的遺伝子」及び／又は「間接的標的遺伝子」（本明細書で記載される）である。さらに、「標的遺伝子」は、「直接的標的遺伝子」及び／又は「間接的標的遺伝子」（本明細書で記載される）である。
【００１３】
特に適するＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子については、以下の本文の節のほか、下記の例（例えば、下記の表１及び表２を参照されたい）においても記載される。
【００１４】
したがって、好ましい実施形態に従い、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子は、下記の表１又は表２に列挙されるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子からなる群から選択される。
【００１５】
本発明者らにより、短いリストの中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を決定するための強力な証拠となることが見出されている。
【００１６】
本発明の別の態様は、一方が、Ｉ型ＩＦＮ活性に対して較正され、他方が、ＩＩ型ＩＦＮ活性に対して較正される、２つの較正された数学的経路モデルを使用することにより、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性が、Ｉ型ＩＦＮ活性又はＩＩ型ＩＦＮ活性であると推測される方法（本明細書で記載される）に関する。推測するステップは、好ましくは、決定された活性レベルの比較を含む。例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルが、活性経路を報告し、かつ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルが、活性レベルを報告しないか、又はＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルより低度の活性レベルを報告する場合、試料は、Ｉ型ＩＦＮ活性化ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２であると結論づけられる。他方、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルが、活性経路を報告し、かつ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルが、活性レベルを報告しないか、又は低度の活性レベルを報告する場合、ＩＩ型ＩＦＮ活性化ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２を結論づけることができる。代替的に、両方のモデルの間の活性レベルの差違を計算することもでき、差違が正であるのか、負であるのかを決定する代わりに、差違を、ゼロ以外の閾値と比較することもできる。
【００１７】
本発明の別の態様は、
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が対象において異常に作動しているのかどうかを、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき決定するステップ
をさらに有する方法（本明細書で記載される）に関する。
【００１８】
本発明はまた、
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の異常な作動を是正する薬物を、対象に処方することを推奨するステップ
をさらに有し、
推奨するステップは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が、対象において異常に作動すると、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき決定される場合に実施される、方法（本明細書で記載される）にも関する。
【００１９】
「細胞シグナル伝達経路は、作動が異常である」という語句は、経路の「活性」が、予期される通りではない場合を指し、この場合、「活性」という用語は、標的遺伝子を発現へと駆動するときの、転写因子複合体の活性、すなわち、標的遺伝子が転写される速度を指す。「正常」とは、不活性であることが予期される組織内で不活性であり、活性であることが予期される組織内で活性である場合である。さらに、「正常」と考えられる、ある特定のレベルの活性が存在し、これより高いか、又は低い、何らかのレベルは、「異常」であると考えられる。
【００２０】
本発明はまた、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の異常な作動が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が対象において腫瘍プロモーターとして作動する作動である方法（本明細書で記載される）にも関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づき、腫瘍抗原免疫療法に対する対象の応答を予測するステップをさらに有する方法（本明細書で記載される）に関する。
【００２２】
本発明に従い使用される試料は、抽出された試料、すなわち、対象から抽出された試料でありうる。試料の例は、対象の組織、細胞、血液、及び／又は体液を含むがこれらに限定されない。対象が、がんを有するか、又はがんを有する可能性がある医学的対象である場合、試料は、例えば、好ましくは、生検手順又は他の試料抽出手順を介して、がん病変、又はがんが疑われる病変、又は転移性腫瘍、又は体液が存在する体腔であって、がん細胞で汚染された体腔（例えば、胸腔又は腹腔又は膀胱腔）、又はがん細胞を含有する他の体液などから得られた試料でありうる。試料が抽出される細胞はまた、血液悪性腫瘍（白血病又はリンパ腫など）に由来する腫瘍細胞でもある。場合によって、細胞試料はまた、循環腫瘍細胞、すなわち、血流に入り、適切な単離技法、例えば、アフェレーシス又は従来の静脈の血採取法を使用して抽出される腫瘍細胞でもある。血液以外に、試料が抽出される体液は、尿、消化管内容物、又は滲出物である。本明細書で使用される「試料」という用語はまた、例えば、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が、対象から採取され、例えば、顕微鏡のスライドガラス上に置かれ、特許請求される方法を実施するために、この試料の一部が、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により、又はスライドガラスから、関心のある細胞を削ぎ落とすことにより、又は蛍光活性化細胞分取技法により抽出される場合も包摂する。加えて、本明細書で使用される「試料」という用語はまた、例えば、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が、対象から採取され、 顕微鏡のスライドガラス上に置かれ、特許請求される方法が、スライドガラス上で実施される場合も包摂する。
【００２３】
開示される別の態様に従い、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置は、本明細書で記載される、本発明の方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサーを含む。
【００２４】
開示される別の態様に従い、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体は、本明細書で記載される、本発明の方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する。非一時的記憶媒体は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光学ディスク若しくは他の光学記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリなどのコンピュータ−読取り型記憶媒体、又は他の電子記憶媒体、ネットワークサーバーなどである。デジタル処理デバイスは、携帯型デバイス（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型コンピュータ又はタブレット型デバイス、リモートネットワークサーバーなどである。
【００２５】
開示される別の態様に従い、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムが、デジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、本明細書で記載される、本発明の方法を実施させるためのプログラムコード手段を含む。デジタル処理デバイスは、携帯型デバイス（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型コンピュータ又はタブレット型デバイス、リモートネットワークサーバーなどでありえる。
【００２６】
開示される別の態様に従い、対象の試料中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットは、
対象の試料中の３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルを決定するための１つ又は複数の構成要素
を含み、
３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子は、ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３からなる群から、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される。
【００２７】
３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルを測定するための１つ又は複数の構成要素又は手段は、ＤＮＡアレイチップ、オリゴヌクレオチドアレイチップ、タンパク質アレイチップ、抗体、複数のプローブ、例えば、標識されたプローブ、ＲＮＡ逆転写酵素シーケンシング構成要素のセット、及び／又はｃＤＮＡ、増幅プライマーを含む、ＲＮＡ若しくはＤＮＡからなる群から選択されうる。ある実施形態では、キットは、本明細書で記載される、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の、ｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列の部分を対象とする標識されたプローブのセットを含む。ある実施形態では、キットは、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の、ｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列の部分を対象とするプライマー及びプローブのセットを含む。ある実施形態では、標識されたプローブは、標準化された９６ウェルプレート内に含有される。ある実施形態では、キットは、基準遺伝子のセットを対象とするプライマー又はプローブをさらに含む。このような基準遺伝子は、例えば、本明細書で記載される、標的遺伝子発現レベルの正規化又は標準化に有用な、構成的に発現させた遺伝子でありうる。
【００２８】
ある実施形態では、対象の試料中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットは、
３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を対象とするポリメラーゼ連鎖反応プライマーと、
３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を対象とするプローブと
を含み、
３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子は、ＢＩＤ、ＧＮＡＺ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＬＧＡＬＳ１、ＮＣＦ４、ＮＦＡＭ１、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＲＡＢ３６、ＲＢＸ１、ＲＦＰＬ３、ＳＡＭＭ５０、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＳＴＲ３、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＭＴ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＳＰ１８、及びＺＮＲＦ３からなる群から、好ましくは、ＩＲＦ１、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＯＡＳ１、ＰＤＣＤ１、ＳＴ１３、ＳＴＡＴ１、及びＵＳＰ１８からなる群から選択される。
【００２９】
開示される別の態様に従い、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットは、
本明細書で記載される、本発明のキットと、
本明細書で記載される、本発明の装置、本明細書で記載される、本発明の非一時的記憶媒体、又は本明細書で記載される、本発明のコンピュータプログラムと
を含む。
【００３０】
開示される別の態様に従い、本明細書で記載される、本発明のキットは、本明細書で記載される、本発明の方法の実施において使用される。
【００３１】
本明細書で記載される本発明は、例えば、以下の活性：
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく診断；
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく予後診断；
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく薬物処方；
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく薬物有効性の予測；
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく有害作用の予測；
薬物有効性のモニタリング；
薬物の開発；
アッセイの開発；
経路の探索；
がんの病期分類；
対象における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく臨床試験における対象の登録；
実施される後続の試験の選択；及び
コンパニオン診断試験の選択
のうちの少なくとも１つにおいてもまた、有利に使用されうる。
【００３２】
さらなる利点は、添付の図面、以下の記載を読み、これらを理解すれば、特に、本明細書の下記に提示される詳細な例を読めば、当業者に明らかであろう。
【００３３】
請求項１に記載の方法、請求項９に記載の装置、請求項１０に記載の非一時的記憶媒体、請求項１１に記載のコンピュータプログラム、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のキット、及び請求項１５に記載のキットの使用は、特に、従属請求項において規定される通り、類似の好ましい実施形態及び／又は同一の好ましい実施形態を有することを理解されたい。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態はまた、従属請求項又は上記の実施形態の、それぞれの独立請求項との任意の組合せでもありうることを理解されたい。
【００３５】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、本明細書の後出で記載される実施形態から明らかであり、これらを参照することにより解明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路を、概略的、かつ、例示的に示す図である。ＩＦＮなどの異なる刺激は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路が、潜在的な、細胞質ゾルＳＴＡＴ単量体をリン酸化することを誘発して、それらが、ＳＴＡＴ１ホモ二量体及びＳＴＡＴ１／２ヘテロ二量体を形成し、これが、特異的なＤＮＡ標的部位に結合し、遺伝子の転写を調節することを可能とする。Ｉ型インターフェロンが、典型的に、転写因子としてのＳＴＡＴ１／２ヘテロ二量体を活性化させるのに対し、ＩＩ型インターフェロンは、主に、ＳＴＡＴ１／１ホモ二量体を活性化させる。両方の転写因子複合体は、それぞれ、ＩＳＲＥ及びＧＡＳと称する、個別に規定された応答エレメントを介して、標的遺伝子の転写を活性化させる（また、Ｐｌａｔａｎｉａｓ  Ｌ．Ｃ．、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ−Ｉ−  ａｎｄ  ｔｙｐｅ−ＩＩ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５巻、２０１５年５月、３７５〜３８６頁に基づく、図１も参照されたい）。
【図２】本明細書では、ベイジアンネットワークモデルである、数学的モデルであって、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の転写プログラムをモデル化するのに使用される数学的モデルを、概略的、かつ、例示的に示す図である。
【図３】対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の発現レベルに基づき、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図４】本明細書で記載される、較正された数学的経路モデルを得るための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図５】本明細書で記載される、対象の試料中の、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図６】離散可観測量を使用して、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図７】連続可観測量を使用して、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図８】ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析から、Ｃｑ値を決定するための工程を例示的に図解するためのフローチャートを示す図である。
【図９】データセットであるＧＳＥ３８３５１による、１１例の健常ドナーに由来する、血中単球について公開されている発現データセットを使用する、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの、Ｉ型ＩＦＮについての較正結果を示す図である。
【図１０】データセットであるＧＳＥ３８３５１による、１１例の健常ドナーに由来する、血中単球について公開されている発現データセットを使用する、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの、ＩＩ型ＩＦＮについての較正結果を示す図である。
【図１１】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１２】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１３】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１４】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１５】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１６】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１７】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１８】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す図である。
【図１９】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデル、及び表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルのそれぞれの間の相関を示す図である。
【図２０】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデル、及び表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルのそれぞれの間の相関を示す図である。
【図２１】表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルについての、さらなるバリデーション結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下の例は、特に、好ましい方法、及びこれと関連する、選択された態様を例示するだけのものである。例においてもたらされる教示は、例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の異常な活性を検出、予測、及び／又は診断するためのいくつかの試験及び／又はキットの構築に使用される。さらに、本明細書で記載される方法を使用すると、薬物処方を、有利に誘導することができ、薬物応答の予測及び薬物の有効性（及び／又は有害作用）のモニタリングを行うことができ、薬物耐性を予測及びモニタリングして、例えば、（コンパニオン診断試験のような）実施される後続の試験を選択することができる。以下の例は、本発明の範囲を限定するものとは見なさないものとする。
【００３８】
[実施例１]
数学的モデルの構築
国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている通り、確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルを構築し、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路である細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルと、本明細書では、細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の転写を制御するＴＦエレメントであるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントである転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルとの間に、条件付き確率関係を組み込むことにより、このようなモデルを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性を、高精度で決定することができる。さらに、確率モデルは、条件付き確率を補正し、かつ／又はさらなる情報源を表すように、新たなノードを、モデルへと付加することにより、その後の臨床研究により得られる、さらなる知見を組み込むように、たやすく更新することができる。このようにして、確率モデルは、最新の医学的知見を具体化するために、適宜更新されうる。
【００３９】
国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている、理解及び解釈が容易な、別の手法では、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性は、細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルと、本明細書では、細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の転写を制御するＴＦエレメントである、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントである転写因子（ＴＦ）エレメントのレベルとの間の関係を組み込むことで、線形モデル又は（疑似）線形モデルを構築及び査定することにより、決定することができ、この線形モデルは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく。
【００４０】
いずれの手法でも、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルは、好ましくは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列と関連するプローブを使用する、（ＲＴ）ＰＣＲ技法及びマイクロアレイ技法、並びにＲＮＡシーケンシングの結果でありうる、ｍＲＮＡレベルの測定値である。別の実施形態では、３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルは、タンパク質レベル、例えば、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の濃度及び／又は活性により測定することもできる。
【００４１】
前述の発現レベルは、任意選択で、適用によく適合する場合もあり、よく適合しない場合もある、多くの方式で転換される。例えば、発現レベル、例えば、マイクロアレイベースのｍＲＮＡレベルの、４つの異なる変換は、
「連続データ」、すなわち、ＭＡＳ５．０及びｆＲＭＡなど、よく知られているアルゴリズムを使用して、マイクロアレイの前処理の後で得られる発現レベル、
「ｚスコア」、すなわち、全ての試料にわたる平均が０であり、標準偏差が１であるようにスケーリングされた、連続発現レベル、
「離散」、すなわち、ある特定の閾値を上回る、あらゆる発現を１とし、これを下回る値を０とする（例えば、プローブセットについての閾値は、多数の陽性臨床試料、及び同じ数の陰性臨床試料のセット内のその値の（重み付け）中央値として選び出される）、
「ファジー」、すなわち、以下のフォーマット：１／（１＋ｅｘｐ（（ｔｈｒ−ｅｘｐｒ）／ｓｅ））のシグモイド関数を使用して、連続発現レベルが、０〜１の間の値へと転換されるが、式中、ｅｘｐｒは、連続発現レベルであり、ｔｈｒは、前述の閾値であり、ｓｅは、０〜１の間の差違に影響を及ぼすソフトニングパラメータである、連続発現レベル
である。
【００４２】
構築されうる、最も簡単な線形モデルのうちの１つは、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントである、転写因子（ＴＦ）エレメントを表すノードを、第１の層に有し、例えば、マイクロアレイ実験又は（ｑ）ＰＣＲ実験において、特定の標的遺伝子と、特に、高度に相関する、例えば、１つのプローブセットによる、標的遺伝子発現レベルの直接的測定を表す、重み付けノードを、第２の層に有するモデルである。重みは、トレーニングデータセットに由来する計算に基づくか、計算専門家の知見に基づくかのどちらかである。標的遺伝子１つ当たり、おそらく、複数の発現レベルが測定される場合に（例えば、１つの標的遺伝子が、複数のプローブセットにより測定されうる、マイクロアレイ実験の場合に）、標的遺伝子１つ当たり、１つの発現レベルだけを使用する、この手法は、特に、簡単である。特定の標的遺伝子に使用される、１つの発現レベルを選択する、具体的な方式は、トレーニングデータセットの活性試料と、不活性試料とを、最も良好に分離することが可能なプローブセットに由来する発現レベルを使用することである。このプローブセットを決定する１つの方法は、統計学的検定、例えば、ｔ検定を実施し、ｐ値が最小となるプローブセットを選択することである。ｐ値が最小となるプローブセットの、トレーニングデータセットの発現レベルとは、定義上、（知られている）活性試料の発現レベルと、及び不活性試料の発現レベルとが重複する確率が最小となるプローブセットの発現レベルである。別の選択方法は、オッズ比に基づく。このようなモデルでは、１つ又は複数の発現レベルは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々についてもたらされ、１つ又は複数の線形結合は、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々について、重み付け項を含む線形結合を含み、各重み付け項は、それぞれの標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルのうちの、１つの発現レベルだけに基づく。上記で記載した標的遺伝子１つ当たり、１つの発現レベルだけが選び出される場合、モデルを、「最も弁別力のあるプローブセット」モデルと呼ぶ。
【００４３】
「最も弁別力のあるプローブセット」モデルに対する代替法では、標的遺伝子１つ当たり、おそらく、複数の発現レベルが測定される場合に、標的遺伝子１つ当たりにもたらされる、全ての発現レベルを使用することも可能である。このようなモデルでは、１つ又は複数の発現レベルは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々についてもたらされ、１つ又は複数の線形結合は、３つ又はこれを超える標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルの、全ての発現レベルの線形結合を含む。言い換えれば、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々について、それぞれの標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルの各々は、線形結合において、それ自身の（個別の）重みにより重み付けされる。この変化形は、「全てのプローブセット」モデルと呼ばれる。「全てのプローブセット」は、もたらされる全ての発現レベルを使用しながら、比較的簡単であることの利点を有する。
【００４４】
上記で記載したいずれのモデルも、それらが、ＴＦエレメントの活性レベルが、３つ又はこれを超える標的遺伝子についての、１つ又は複数のプローブセットの発現レベルの線形結合に基づき計算される「単一層」モデルと考えられるものであるという点を共有する。
【００４５】
それぞれのモデルを査定することにより、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントである、ＴＦエレメントの活性レベルを決定した後で、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性を推測するために、決定されたＴＦエレメントの活性レベルを閾値化することができる。このような適切な閾値を計算するのに好ましい方法は、不活性の細胞シグナル伝達経路を有することが知られているトレーニング試料の、決定されたＴＦエレメントの活性レベルｗｌｃ（重み付け線形結合）と、活性の細胞シグナル伝達経路を伴うトレーニング試料のｗｌｃとを比較することによる方法である。このようにし、また、これらの群における分散も考慮する方法は、閾値
【数１】
0006931125.tif 000002
を使用することにより与えられ、式中、σ及びμは、トレーニング試料についての、決定された、ＴＦエレメントの活性レベルｗｌｃの標準偏差及び平均値である。活性のトレーニング試料中及び／又は不活性のトレーニング試料中で、少数の試料だけが利用可能な場合、２つの群の分散の平均に基づき、シュードカウントを計算された分散に加算する：
【数２】
0006931125.tif 000003
が、式中、νは、群について決定されたＴＦエレメントの活性レベルｗｌｃの分散であり、ｘは、正のシュードカウント、例えば、１又は１０であり、ｎａｃｔ及びｎｐａｓは、活性試料及び不活性試料のそれぞれの数である。次に、分散νの平方根を取ることにより、標準偏差σを得ることができる。
【００４６】
解釈を容易とするために、閾値を、決定されたＴＦエレメントの活性レベルであるｗｌｃから差し引く結果として、負の値が、不活性の細胞シグナル伝達経路に対応し、正の値が、活性の細胞シグナル伝達経路に対応する、細胞シグナル伝達経路の活性スコアをもたらすことができる。
【００４７】
上記で記載された「単一層」モデルに対する代替法として、例ではまた、「二層」も使用される。このようなモデルでは、合計値は、その関連するプローブセットの、測定された強度に基づく線形結合を使用して、あらゆる標的遺伝子について計算される（「第１（下）層」）。その後、さらなる線形結合を使用して、計算された合計値を、細胞シグナル伝達経路の、他の標的遺伝子についての合計値と組み合わせる（「第２（上）層」）。ここでもまた、重みは、トレーニングデータセットから学習されるか、専門家の知見に基づくかのどちらか、又はこれらの組合せもある。言い換えれば、「二層」モデルでは、１つ又は複数の発現レベルは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々についてもたらされ、１つ又は複数の線形結合は、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々について、それぞれの標的遺伝子についてもたらされる、１つ又は複数の発現レベルの、全ての発現レベルのうちの、第１の線形結合を含む。モデルは、３つ又はこれを超える標的遺伝子の各々について、重み付け項を含む、さらなる線形結合にさらに基づき、各重み付け項は、それぞれの標的遺伝子についての、第１の線形結合に基づく（「第２（上）層」）。
【００４８】
「二層」モデルの好ましい変化形では、合計値の計算は、トレーニングデータを使用して、各標的遺伝子について、閾値を規定することと、計算された線形結合から、閾値を差し引くことと、標的遺伝子の合計を求めることとを含む。この場合、閾値は、負の標的遺伝子合計値が、下方調節される標的遺伝子に対応し、正の標的遺伝子合計値が、上方調節される標的遺伝子に対応するように選び出される。また、例えば、上記で記載された変換（ファジー変換、離散変換など）のうちの１つを使用して、標的遺伝子の合計値を、「第２（上）層」において組み合わせる前に変換することも可能である。
【００４９】
「二層」モデルを査定することにより、ＴＦエレメントの活性レベルを決定した後で、上記で記載した通りに、細胞シグナル伝達経路の活性を推測するために、決定されたＴＦエレメントの活性レベルを、閾値化することができる。
【００５０】
以下では、上記で記載したモデルを、「（疑似）線形」モデルとして、総体的に表示する。トレーニング及び確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルの使用についてのより詳細な記載は、下記の実施例３に提示される。
【００５１】
[実施例２]
標的遺伝子の選択
転写因子（ＴＦ）とは、特異的ＤＮＡ配列への結合により、標的遺伝子からの転写を調節し、これにより、ＤＮＡから、ｍＲＮＡへの遺伝情報の転写を制御することことが可能な、タンパク質複合体（すなわち、特異的構造内で一体に結合したタンパク質の組合せ）又はタンパク質である。本明細書では、ＴＦ複合体のこの作用により直接的に産生されるｍＲＮＡを、「直接的標的遺伝子」（転写因子の）と称する。細胞内シグナル伝達経路の活性化はまた、「間接的標的遺伝子」と称する、より副次的な遺伝子転写も結果としてもたらす。以下では、細胞シグナル伝達経路活性と、ｍＲＮＡレベルとの直接的連関としての、直接的標的遺伝子を含むか、又はこれからなる、（疑似）線形モデル、又はベイジアンネットワークモデル（例示的な数学的モデルとしての）が好ましいが、直接的標的遺伝子と、間接的標的遺伝子との区別は、常に明白であるわけではない。本明細書では、利用可能な学術文献データに基づくスコアリング関数を使用して、直接的標的遺伝子を選択する方法が提示される。しかしながら、限定的な情報のほか、生物学的ばらつき、及び不確実性に起因して、間接的標的遺伝子の、意想外の選択を除外することはできない。標的遺伝子を選択するために、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ」においてアクセス可能であり、本明細書ではさらに、「Ｐｕｂｍｅｄ」とも称する、米国国立保健研究所のＭＥＤＬＩＮＥデータベースを援用して、標的遺伝子のリストを作成した。さらに、それらの発現の証拠となる性質に基づき、標的遺伝子の、１つのさらなるリストを選択した。
【００５２】
２０１７年の第１四半期及び第２四半期の期間において、「“ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２”ＡＮＤ“ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ”」などのクエリーを使用して、推定ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子を含有する刊行物を検索した。結果として得られる刊行物を、下記で、より詳細に記載される方法に従い、手作業で、さらに解析した。
【００５３】
証拠が蓄積される科学的実験の種類に応じて、特異的な標的遺伝子についての科学的証拠に評定を与える、ランク付けシステムを使用することにより、特異的な細胞シグナル伝達経路のｍＲＮＡ標的遺伝子を、学術文献から選択した。一部の実験の証拠が、例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が活性であることが知られている細胞系のマイクロアレイ上の、プローブセットの強度の増大により検出される、ｍＲＮＡの増大のように、遺伝子が、直接的標的遺伝子であることを示唆するに過ぎないのに対し、他の証拠は、同定されたＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路のＴＦ結合部位と、細胞内の特異的細胞シグナル伝達経路の刺激の後の、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにおける、この部位の回収と、細胞系内の細胞シグナル伝達経路の、特異的な刺激の後における、ｍＲＮＡの増大との組合せのように、極めて強力でありうる。
【００５４】
学術文献では、特異的な細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子を見出すための、いくつかの種類の実験を同定することができる：
１．関心のある細胞シグナル伝達経路のＴＦの、ゲノム上のその結合部位への、直接的結合を示すＣｈＩＰ実験。例：例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２を伴う刺激による、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の能動的誘導を伴うクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）技術、及びこの能動的誘導を伴わないＣｈＩＰ技術を使用することにより、細胞系のＤＮＡ内の、推定機能性ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦ結合部位を、ヌクレオチド配列に純粋に基づいて認識される結合部位のサブセットとしてその後同定した。推定機能性は、ＴＦが、ＤＮＡ結合部位に結合することを見出す、ＣｈＩＰ由来の証拠として同定した。
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＴＦの、結合配列を含有するＤＮＡの断片への結合を示す、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。ＣｈＩＰベースの証拠と比較して、ＥＭＳＡベースの証拠は、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況へと置きかえることができないので、それほど強力ではない。
３．細胞シグナル伝達経路の刺激、及びマイクロアレイ、ＲＮＡシーケンシング、定量的ＰＣＲ、又は他の技法を使用する、ｍＲＮＡの発現の測定であり、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路誘導型細胞系を使用し、少なくとも１つであるが、好ましくは、誘導（タンパク質への翻訳を阻害するので、誘導されたｍＲＮＡを、直接的標的遺伝子であると仮定する、シクロヘキシミドの存在下における）の後の、いくつかの時点において測定される、ｍＲＮＡプロファイルを測定する。
４．３と同様であるが、代替的に、さらに下流における、ウェスタンブロットなど、タンパク質の存在度の測定を伴いながら、ｍＲＮＡの発現を測定する。
５．バイオインフォマティクス法を使用する、ゲノム内のＴＦ結合部位の同定。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２ＴＦエレメントについての例：ＩＳＲＥ結合性モチーフである「ＡＧＴＴＴＣＮＮＴＴＣＮＣ／Ｔ」及びＧＡＳ結合性モチーフである「ＴＴＣ／ＡＮＮＮＧ／ＴＡＡ」を使用して、遺伝子プロモーター領域内の、潜在的結合部位を同定した。
６．シクロヘキシミドの非存在下であることを除き、３と同様である。
７．シクロヘキシミドの非存在下であることを除き、４と同様である。
【００５５】
最も簡単な形態では、遺伝子を、転写因子のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２ファミリーの標的遺伝子であると同定した、これらの実験の手法の各々について、あらゆる潜在的な遺伝子に、１ポイントを与えることができる。この相対ランク付け戦略を使用して、最も信頼できる標的遺伝子のリストを作成することができる。
【００５６】
代替的に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける直接的標的遺伝子の、最も大きな証拠をもたらす技術に、大きな数のポイントを与えることによる、別の方式によるランク付けを使用して、直接的標的遺伝子である可能性が最も高い標的遺伝子を同定することができる。上記のリストでは、これは、実験の手法１）については、７ポイント、２）については、６ポイントを意味し、実験の手法７）については、１ポイントへと低下することを意味する。このようなリストは、「標的遺伝子についての一般リスト」と呼ばれる。
【００５７】
生物学的変動及び不確実性にもかかわらず、本発明者らは、直接的標的遺伝子が、組織非依存的に誘導される可能性が最も高いことを仮定した。これらの標的遺伝子のリストは、「標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト」と呼ばれる。このような、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリストを使用して、異なる組織供給源に由来する試料へと適用されうる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の算出モデルを構築した。
【００５８】
以下は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路について、証拠をキュレートした標的遺伝子リストの選択を、どのように具体的に構築したのかを、例示的に説明する。
【００５９】
ＣｈＩＰ、ＥＭＳＡ、示差的発現、ノックダウン／ノックアウト、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイ、刊行物において報告された配列解析など、各種の実験の証拠にポイントを与える、スコアリング関数を導入した。場合によって、同じ実験の証拠が、複数の刊行物において言及される結果として、対応するポイント数がもたらされる、例えば、２つの刊行物が、ＣｈＩＰ所見に言及する結果として、単一のＣｈＩＰ所見に与えられるスコアは２倍になる。さらなる解析を実施して、１種類の実験の証拠、例えば、示差的発現だけではなく、多様な種類の実験の証拠を有する遺伝子だけを許容した。２種類以上の利用可能な実験の証拠を有する遺伝子（表１において示される）を選択した。
【００６０】
本発明者らは、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（表２に列挙される）のさらなる選択を行った。トレーニング試料から、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２シグナル伝達経路の活性を決定するときに、強力な証拠となる証拠をキュレートしたリストの標的遺伝子を選択した。本明細書では、データセットであるＧＳＥ３８３５１による、１１例の健常ドナーに由来する血中単球についての、利用可能な発現データセットを使用した。刺激を伴わずにインキュベートされた単球を伴う、１１例の試料と、採血直後に単離された単球を伴う、８例の試料とを含む、１９例の試料は、ＳＴＡＴ１／２不活性であった。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性群は、ＩＦＮα２ａにより刺激された７例の試料と、ＩＦＮγにより刺激された７例の試料とを含んだ。表１による、「標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト」（２３の標的遺伝子のリスト）についての遺伝子発現値を、ＧＳＥ３８３５１データセットによる、ＳＴＡＴ１／２活性試料と、ＳＴＡＴ１／２不活性試料との間で比較した。標的遺伝子の発現レベルが、経路活性群と、経路不活性の群との間で、明らかに差別化された場合、これは、標的遺伝子を使用して、経路活性群と、経路不活性群とを識別しうることを意味し、この場合に、標的遺伝子を選択した。これは、表２に示される、「９つの標的遺伝子についてのショートリスト」を結果としてもたらした。
【００６１】
表1:JAK-STAT1/2細胞シグナル伝達経路モデルにおいて使用される、JAK-STAT1/2細胞シグナル伝達経路の「標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト」(23の標的遺伝子リスト)、及び標的遺伝子のmRNAの発現レベルを測定するのに使用される、関連するプローブセット
【表１】
0006931125.tif 000004
【００６２】
表2:JAK-STAT1/2標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリストに基づく、JAK-STAT1/2標的遺伝子の「9の標的遺伝子についてのショートリスト」(関連するプローブセットは、表1の場合と同じである)
【表２】
0006931125.tif 000005
【００６３】
[実施例３]
数学的モデルのトレーニング及び使用
数学的モデルを使用して、対象における、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性を推測しうる前に、モデルを、適切にトレーニングしなければならない。
【００６４】
数学的経路モデルが、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルと、対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルである場合、トレーニングは、好ましくは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている通りに実施される。
【００６５】
数学的経路モデルが、対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく場合、トレーニングは、好ましくは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において、詳細に記載されている通りに実施される。
【００６６】
本明細書では、図２に示される、例示的なベイジアンネットワークモデルを使用して、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の転写プログラムを、簡単にモデル化した。モデルは、３種類のノード：（ａ）第１の層である１における、転写因子（ＴＦ）エレメント（「存在しない」状態及び「存在する」状態を伴う）；（ｂ）第２の層である２における、標的遺伝子ＴＧ１、ＴＧ２、ＴＧｎ（「低下」状態及び「上昇」状態を伴う）、及び；（ｃ）第３の層である３における、標的遺伝子の発現レベルへと連関させた測定ノードからなる。これらは、好ましくは、本明細書で使用されるマイクロアレイプローブセットである、ＰＳ１，１、ＰＳ１，２、ＰＳ１，３、ＰＳ２，１、ＰＳｎ，１、ＰＳｎ，ｍ（「低度」状態及び「高度」状態を伴う）でありうるが、また、ＲＮＡｓｅｑ又はＲＴ−ｑＰＣＲなど、他の遺伝子発現測定値でもありうる。
【００６７】
本明細書では、例示的なベイジアンネットワークモデルである数学的モデルの適切な実施は、マイクロアレイデータに基づく。モデルは、（ｉ）標的遺伝子の発現レベルが、ＴＦエレメントの活性化に、どのくらい依存するのか、及び（ｉｉ）同様に、プローブセットの強度が、それぞれの標的遺伝子の発現レベルに、どのくらい依存するのかについて記載する。（ｉｉ）のために、プローブセットの強度は、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）及びＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）から、広く入手可能な、ｆＲＭＡにより前処理された、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイから取る。
【００６８】
例示的なベイジアンネットワークモデルは、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路についての生物学の簡略化であり、生物学的測定は、典型的に、ノイズに富むので、確率的手法を選び取る、すなわち、（ｉ）ＴＦエレメントと、標的遺伝子との関係、及び（ｉｉ）標的遺伝子と、それらのそれぞれのプローブセットとの関係を、確率的に記載する。さらに、腫瘍の増殖を駆動する、発がん性の細胞シグナル伝達経路の活性は、一過性、かつ、劇的に変更されるのではなく、長期的又はさらに不可逆的に変更されることを仮定した。したがって、静的な細胞状態を解釈するための、例示的なベイジアンネットワークモデルを開発した。この理由で、複雑な動的細胞シグナル伝達経路の特徴は、モデルへと組み込まなかった。
【００６９】
例示的なベイジアンネットワークモデルを、構築し、較正したら（下記を参照されたい）、第３層である３における観測値としてのプローブセットの測定値を入力し、ＴＦエレメントが「存在する」ためには、確率はいくつでなければならなかったのかを、モデルにおいて後ろ向きに推測することにより、モデルを、新たな試料のマイクロアレイデータに対して使用することができる。この場合、「存在する」とは、ＴＦエレメントが、ＤＮＡに結合し、細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の転写を制御している現象であると考えられ、「存在しない」とは、ＴＦエレメントが、転写を制御していない現象であると考えられる。よって、この確率は、本明細書では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路である、細胞シグナル伝達経路の活性を指し示すのに使用される、一次リードアウトである。これは、次に、細胞シグナル伝達経路が活性である確率に対する細胞シグナル伝達経路が不活性である確率との比（すなわち、オッズは、ｐ／（１−ｐ）により与えられ、ここで、ｐは、細胞シグナル伝達経路が活性であることの予測確率である）を取ることにより、細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズへと置きかえることができる。
【００７０】
例示的なベイジアンネットワークモデルでは、定量的な確率的推測を可能とするために、確率的関係は定量化された。組織型にわたる一般化挙動を改善するために、（ｉ）ＴＦエレメントと、標的遺伝子との確率的関係について記載するパラメータを、注意深く厳選した。ＴＦエレメントが「存在しない」場合、標的遺伝子は「低下」する可能性が極めて高く、よって、０．９５の確率を、このために選び出し、０．０５の確率を、標的遺伝子が「上昇」することのために選び出す。０．０５（非ゼロ）の確率は、標的遺伝子が、他の因子により調節されるか、又は意想外に「上昇」することが観察される（例えば、測定ノイズのために）、（稀少な）確率に相応する。ＴＦエレメントが「存在する」場合、０．７０の確率で、標的遺伝子は「上昇」すると考えられ、０．３０の確率で、標的遺伝子は「低下」すると考えられる。０．３の値は、標的遺伝子は、ＴＦエレメントが存在する場合であっても、高度に発現しない原因がいくつかあるために、例えば、遺伝子のプロモーター領域がメチル化されているため、このように選び出される。標的遺伝子が、ＴＦエレメントにより上方調節されず、下方調節される場合も、確率は、同様に選び出されるが、ＴＦエレメントの存在時における下方調節を反映する。（ｉｉ）標的遺伝子と、それらのそれぞれのプローブセットとの関係について記載するパラメータを、実験データ上で較正した。後者について、この例では、実験データのために、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路を有することが知られている患者試料に由来するマイクロアレイデータを使用する一方で、同じデータセットに由来する正常な健常試料を、不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路試料として使用したが、これはまた、細胞系による実験、又は既知の細胞シグナル伝達経路活性状態を伴う、他の患者試料を使用しても実施されうる。結果として得られる条件付き確率表を、以下により示す：
【００７１】
【表３】
0006931125.tif 000006
【００７２】
【表４】
0006931125.tif 000007
【００７３】
これらの表では、変数である、ＡＬｉ，ｊ、ＡＨｉ，ｊ、ＰＬｉ，ｊ、ａｎｄ  ＰＨｉ，ｊは、それぞれ、「低度」（Ｌ）又は「高度」（Ｈ）のプローブセットの強度を有する、転写複合体が「存在しない」（Ａ）か、又は「存在する」（Ｐ）較正試料の数を指し示す。０〜１の極端な確率を回避するために、ダミーカウントを加算した。
【００７４】
観察されたプローブセットの強度を離散化するために、各プローブセットＰＳｉ，ｊについて、それを下回る観測値が「低度」と呼ばれ、それを上回る観測値が「高度」と呼ばれる、閾値ｔｉ，ｊを使用した。この閾値は、使用される較正データセット内のプローブセットの、（重み付け）中央値強度となるように選び出された。マイクロアレイデータのノイズ性のために、観察されたプローブセットの強度を、その閾値と比較する場合に、報告された強度の近傍において、標準偏差を０．２５とする（ｌｏｇ２スケール上で）正規分布を仮定し、閾値を下回る確率質量及び閾値を上回る確率質量を決定することにより、ファジー法を使用した。
【００７５】
上記で記載した、例示的なベイジアンネットワークの代わりに、上記の実施例１で記載された（疑似）線形モデルを援用した場合、ノードと閾値との相関の符号及び大きさを指し示す重みであって、ノードが「存在しない」のか、「存在する」のかを判定する重みを、モデルを使用して、被験試料中の、細胞シグナル伝達経路活性を推測しうる前に決定する必要がある。専門家の知見を使用して、重み及び閾値を、事前に充填しうるが、典型的には、好ましくは、そのグラウンドトゥルースが知られている、トレーニング試料の代表的セット、例えば、既知の「存在する」転写因子複合体（＝活性の細胞シグナル伝達経路）、又は「存在しない」転写因子複合体（＝不活性の細胞シグナル伝達経路）を伴う、試料中のプローブセットの発現データを使用して、モデルをトレーニングする。
【００７６】
本分野では、モデルの出力、ここでは、重み付け線形スコアを最適化するように、モデルトポロジーを考慮に入れ、モデルパラメータ、ここでは、重み及び閾値を変化させる、多数のトレーニングアルゴリズム（例えば、回帰）が知られている。代替的に、また、最適化アルゴリズムを必要とせずに、観察された発現レベルから直接、重みを計算することも可能である。
【００７７】
本明細書で「ブラックアンドホワイト」法と称する第１の方法は、各重みが、集合｛−１、０、１｝の要素である、三元システムへと縮約される。これを生物学的文脈で述べれば、−１及び１は、細胞シグナル伝達経路活性の場合、それぞれ、下方調節及び上方調節された、標的遺伝子又はプローブセットに対応する。プローブセット又は標的遺伝子が、上方調節又は下方調節されることが、統計学的に実証できない場合、プローブセット又は標的遺伝子は、０の重みを受け取る。一例では、活性の細胞シグナル伝達経路試料の発現レベルを、不活性の細胞シグナル伝達経路を伴う試料の発現レベルと対比した、左側及び右側の、２つのｔ検定を使用して、使用されるトレーニングデータを与えたときに、プローブ又は遺伝子が、上方調節されるのか、下方調節されるのかを決定することができる。活性試料の平均が、不活性試料の平均より、統計学的に大きい、すなわち、ｐ値が、ある特定の閾値、例えば、０．３を下回る場合、標的遺伝子又はプローブセットは、上方調節されることが決定される。逆に、活性試料の平均が、不活性試料の平均より、統計学的に小さい場合、標的遺伝子又はプローブセットは、細胞シグナル伝達経路の活性化時に、下方調節されることが決定される。万一、最小のｐ値（左側又は右側）が、前述の閾値を超える場合、標的遺伝子又はプローブセットの重みは、０であると規定することができる。
【００７８】
本明細書で「対数オッズ」法と称する第２の方法は、対数（例えば、底をｅとする）オッズ比に基づく。各標的遺伝子又は各プローブセットについてのオッズ比は、プローブセット／標的遺伝子のレベルが、対応する閾値、例えば、全てのトレーニング試料の（重み付け）中央値を上回る場合、及びこれを下回る場合の、陽性のトレーニング試料の数及び陰性のトレーニング試料の数に基づき計算する。ゼロによる除算を回避するために、疑似カウントを加算することができる。さらなる精緻化は、プローブセット／標的遺伝子レベルが、例えば、ある特定の指定された標準偏差（例えば、２ｌｏｇスケールで、０．２５）、その観察された値の近傍に正規分布することを仮定し、閾値を上回る確率質量及び下回る確率質量をカウントすることにより、或る程度確率的に、閾値を上回る／下回る試料をカウントすることである。本明細書に、決定論的測定値の代わりに、疑似カウントと組み合わせ、確率質量を使用して計算されたオッズ比を、「ソフトな」オッズ比と呼ぶ。
【００７９】
標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の推測に関するさらなる詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁において見出されうる。
【００８０】
本明細書においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、サイトカイン：ＩＦＮα２ａ（Ｉ型ＩＦＮ）及びＩＦＮγ（ＩＩ型ＩＦＮ）により刺激された、健常ドナーに由来する血中単球についての、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０による、公開されているｍＲＮＡ発現データを使用した。標的遺伝子発現レベルに対する影響がわずかに異なる、ＳＴＡＴ１／２経路は、Ｉ型ＩＦＮ又はＩＩ型ＩＦＮにより活性化させられうるため、それぞれ、Ｉ型ＩＦＮ刺激及びＩＩ型ＩＦＮ刺激による刺激として規定される、ＳＴＡＴ１／２活性化の２つの方式を表す、２つの異なる較正データセットを使用した。刺激を伴わない、健常ドナーに由来する、血中単球は、対照群を形成する。よって、同じ標的遺伝子リスト（表１を参照されたい）を使用して、２つの異なるモデルを、ＩＦＮα２ａ刺激（Ｉ型ＩＦＮ）又はＩＦＮγ刺激（ＩＩ型ＩＦＮ）を伴う較正試料に対して、個別に較正した。
【００８１】
以下では、Ｉ型ＩＦＮ刺激及びＩＩ型ＩＦＮ刺激を伴うデータセットに対する、ベイジアンネットワークモデルの較正結果を、図９及び図１０に示す。
【００８２】
図９は、データセットであるＧＳＥ３８３５１による、１１例の健常ドナーに由来する、血中単球について公開されている発現データセットを使用する、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの、Ｉ型ＩＦＮについての較正結果を示す。刺激を伴わずにインキュベートされた血中単球を伴う、１１例の試料と、採血直後に単離された単球を伴う、８例の試料血液とを含む、１９例の試料を、対照群、すなわち、不活性の較正試料（群３）として使用する。トレーニング群、すなわち、活性の較正試料は、ＩＦＮα２ａにより刺激された、７例の試料（Ｉ型ＩＦＮ；群１）を含んだ。モデルを、ＩＦＮγ（ＩＩ型ＩＦＮ；群２）により刺激された、同じドナーに由来する、別の７例の試料上でテストした。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルは、不活性の較正試料を、活性の較正試料から、明確に分離することが可能であった。
【００８３】
図１０は、データセットであるＧＳＥ３８３５１による、１１例の健常ドナーに由来する、血中単球について公開されている発現データセットを使用する、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）、及び本明細書で記載される方法に基づく、ベイジアンネットワークモデルの、ＩＩ型ＩＦＮについての較正結果を示す。刺激を伴わずにインキュベートされた血中単球を伴う、１１例の試料と、採血直後に単離された単球を伴う、８例の試料血液とを含む、１９例の試料を、対照群、すなわち、不活性の較正試料（群３）として使用する。トレーニング群、すなわち、活性の較正試料は、ＩＦＮγにより刺激された、７例の試料（ＩＩ型ＩＦＮ；群１）を含んだ。モデルを、ＩＦＮα２ａ（Ｉ型ＩＦＮ；群２）により刺激された、同じドナーに由来する、別の７例の試料上でテストした。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルは、不活性の較正試料を、活性の較正試料から、明確に分離することが可能であった。
【００８４】
経路活性レベルを、同一の試料上で、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデル（図９）と、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデル（図１０）との間で比較することにより、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性が、Ｉ型刺激又はＩＩ型刺激により誘導されるのかどうかを推測することができる。ＩＦＮα２ａ（Ｉ型ＩＦＮ；群１）により刺激された試料について、図９におけるＩ型モデル活性スコアは、図１０におけるＩＩ型モデル活性スコアより高く、それらのＩ型ＩＦＮ刺激と、明らかに符合する。ＩＦＮγ（ＩＩ型ＩＦＮ；群２）により刺激された試料について、図１０における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデル活性スコアは、図９における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデル活性スコアより高く、それらのＩＩ型ＩＦＮ刺激と符合する。刺激が未知である試料について、このような比較は、どの型の刺激が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性化を誘発したのかを指し示しうる。
【００８５】
以下では、表１の、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルについてのバリデーション結果を、図１１〜図１６に示す。
【００８６】
図１１は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。５例の健常対照の、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のうちのＮＫ細胞を、直接（群１）、又は刺激を伴わずに、６時間にわたり培養した後で（群２）単離した（データセット：ＧＳＥ１５７４３）。１００ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌの組換えＩＦＮα−２ｂによる、６時間にわたる刺激（Ｉ型ＩＦＮ刺激）（それぞれ、群３及び群４）により、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２を活性化させる。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性である可能性が高いことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルは、ＩＦＮα−２ｂ（Ｉ型ＩＦＮ）刺激を伴う試料についての、高ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性を正確に予測し、高用量のＩＦＮα−２ｂで刺激された試料が、高度の経路活性を有することも正確に予測する。
【００８７】
図１２は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。ＩＦＮ−βによる処置（Ｉ型ＩＦＮ）の開始の前及び後に、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、健常ドナー及びＭＳ（多発性硬化症）患者から分離した（データセット：ＧＳＥ３７７５０）。略図では、グラフの左側における単一のドットは、対照群における健常ドナーを表す。グラフの垂直軸において、ｌｏｇ２（オッズ）単位で与えられた活性値から見られる通り、対照群に由来する試料は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２不活性である。これに対し、結びつけられたドットは、処置の前（グラフの左側）及び処置の後（グラフの右側）における、ＭＳを伴う、９例の患者のＳＴＡＴ１／２活性値を表す。各直線は、各患者について、処置の前におけるＳＴＡＴ１／２活性と、処置の後におけるＳＴＡＴ１／２活性とを結びつけるが、これは、ＳＴＡＴ１／２活性が、８例の患者について、処置の後で著明に高いことを示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性レベルが、ＩＦＮ−βによる処置の後で上昇することを正確に予測する。
【００８８】
図１３は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。データセットであるＧＳＥ１４３８６では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の診断を示唆する、いわゆる「単発性脱髄性症候群（ＣＩＳ）」を伴う患者に由来し、ＩＦＮβ−１α（Ｉ型ＩＦＮ）（１０００Ｕ／ｍｌ）の非存在下（群１）又は存在下（群２）において、プレートに固定化された抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、２４時間にわたり刺激した。略図では、結びつけられたドットは、処置の前（グラフの左側）及び処置の後（グラフの右側）における、ＣＩＳを伴う、１４例の患者のＳＴＡＴ１／２活性値を表す。結果は、処置後において、１４例の患者全てについて、ＳＴＡＴ１／２活性が、有意に高いことを示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性レベルが、ＩＦＮβ−１α（Ｉ型ＩＦＮ）を伴うインキュベーションの後で上昇することを正確に予測する。
【００８９】
図１４は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。データセットであるＧＳＥ１１３２７において、樹状細胞（ＤＣ）を、ＩＦＮγ（ＩＩ型ＩＦＮ）の存在下で、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４により、６時間にわたり成熟させた。ＤＣのＲＮＡを、成熟の６、１２、２４、又は４８時間後に単離した（群１；４つのバーは、時間における４つの逐次点：６、１２、２４、４８時間後を表す）。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルは、ＤＣ内の、高度なＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性レベル（群１）及び非刺激対照群における不活性ＳＴＡＴ１／２（群２）を正確に予測する。
【００９０】
図１５は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。データセットであるＧＳＥ５８０９６において、ＴＨＰ１−ＳＰ１１０ｂ細胞を、ＩＦＮγ（ＩＩ型ＩＦＮ）により処理した。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルは、ＩＦＮγ（ＩＩ型ＩＦＮ）により、２日間にわたり処理された細胞（群２）、Ｄｏｘ＋ＩＦＮγにより、２日間にわたり処理された細胞（群３）、ＩＦＮγにより、４日間にわたり処理された細胞（群４）、及びＤｏｘ＋ＩＦＮγにより、４日間にわたり処理された細胞（群５）における、非処理対照群（群１）と比較した、高ＪＡＫ−ＳＴＡＴの活性レベルを正確に予測する。
【００９１】
図１６は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。末梢血単核細胞を、１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮγの存在下又は非存在下、１０％のウシ胎仔血清及び１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦが補充されたＲＰＭＩ  １６４０中で、２４時間にわたり培養した（データセット：ＧＳＥ１１８６４）。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２が、新鮮な血中単球内（群１）及びＭ−ＣＳＦ下で培養された細胞内（群２）で不活性であるのに対し、ＩＦＮγで刺激された細胞が、高ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性レベルを示す（群３）ことを正確に予測する。
【００９２】
標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルについての、さらなるバリデーション結果を、図１７及び図１８に示す。ここで、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性予測結果における差違について探索するために、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデル及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルを、同じデータセットへと適用した。
【００９３】
図１７は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。Ｉ型ＩＦＮについて較正されたＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２ベイジアンネットワークモデルを、５つの群が、同じ試料を表す、図１５の場合と同じデータセットであるＧＳＥ５８０９６へと適用した。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルは、ＩＦＮγにより誘導されるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２活性の活性レベルを、ＩＩ型ＩＦＮについて較正されたＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２モデルと比較して、低活性レベルで予測した。図１５における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルによる予測結果では、ＩＦＮγにより処理された４群を、活性であると考えたのに対し、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルでは、ＩＦＮγにより、４日間にわたり処理された細胞である、１つの群（群４）だけを、活性であると考える一方、ＩＦＮγにより、２日間にわたり処理された細胞（群２）、Ｄｏｘ＋ＩＦＮγにより、２日間にわたり処理された細胞（群３）、及びＤｏｘ＋ＩＦＮγにより、４日間にわたり処理された細胞（群５）については、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルに基づき、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２が不活性であると考える。図１５における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルによる結果は、群２〜５について、図１７における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルによるより高い活性レベルを示すため、これは、Ｉ型ＩＦＮにより誘導された細胞モデル及びＩＩ型ＩＦＮにより誘導された細胞モデルのそれぞれについて、個別に較正されたＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２モデルが、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩ型ＩＦＮのそれぞれにより誘導されるＳＴＡＴ１／２活性を識別しうることを実証する、良好な例である。
【００９４】
図１８は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。Ｉ型ＩＦＮについて較正されたＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２ベイジアンネットワークモデルを、３つの群が、同じ試料を表す、図１６の場合と同じデータセットであるＧＳＥ１１８６４へと適用した。略図では、垂直軸は、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示し、ここで、水平軸を上回る値は、ＴＦエレメントが「存在する」／活性であるオッズが大きいことに対応し、水平軸を下回る値は、ＴＦエレメントが「存在しない」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズより大きいことを指し示す。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデルは、群３における試料中で、群１及び２と比較して高度の活性を明らかに示すが、図１６による、群３における試料についての活性スコアの、Ｉ型モデルと、ＩＩ型モデルとの間の比較は、後者のモデルについて、高活性スコアを明らかにすることから、群３による試料が、ＩＩ型ＩＦＮによる、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２の活性化に対応することが指し示される。
【００９５】
表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）、及び表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルについての、さらなるバリデーション結果を、図１９及び図２０に示す。ここで、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  Ｉ型ＩＦＮモデル及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＩＩ型ＩＦＮモデルの両方のために、表１の、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を、表２の、９つの標的遺伝子についてのショートリストと、同じデータセットについて比較する。
【００９６】
図１９は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデル、及び表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルのそれぞれの間の相関を示す。略図では、水平軸は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルにより予測される、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ（ｌｏｇ２スケールにおける）及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示す。垂直軸は、表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリスト（データセットであるＧＳＥ１５７４３、ＧＳＥ３７７５０、ＧＳＥ１４３８６）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルにより予測される、同じ情報を指し示す。２つのモデルは、２．２×１０−１６のｐ値、及び０．９８８の相関係数により、有意に相関する。
【００９７】
図２０は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデル、及び表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリストを使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルのそれぞれの間の相関を示す。略図では、水平軸は、表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なＩＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルにより予測される、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路及び不活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路のそれぞれに対応する、ＴＦエレメントが「存在する」オッズ（ｌｏｇ２スケールにおける）及び「存在しない」オッズのそれぞれを指し示す。垂直軸は、表２による、９つの標的遺伝子についてのショートリスト（データセットであるＧＳＥ５８０９６、ＧＳＥ１１３２７、ＧＳＥ１１８６４）を使用してトレーニングされた、例示的なＩ型ＩＦＮベイジアンネットワークモデルにより予測される、同じ情報を指し示す。２つのモデルは、２．２×１０−１６のｐ値、及び０．９９２の相関係数により、有意に相関する。
【００９８】
表１による、標的遺伝子についての、証拠をキュレートしたリスト（２３の標的遺伝子のリスト）を使用してトレーニングされた、例示的なベイジアンネットワークモデルについての、さらなるバリデーション結果を、図２１に示す。略図は、転移性黒色腫を伴う患者を、ＭＡＧＥ−Ａ３免疫療法（６回又はこれを超える回数の免疫療法剤の投与）で処置し、レスポンダー及び非レスポンダーを同定した、臨床研究の結果を示す。研究に組み入れた６５例の試料のうち、９例の試料は、査定不能（ＮＥ）であり、２２例の試料は、レスポンダー（Ｒ）であり、３４例の試料は、非レスポンダー（ＮＲ）であった。略図では、各ボックスは、各群（ＮＲ、Ｒ、ＮＲ）についての、ＳＴＡＴ１／２経路活性スコアの分布を表す。分布は、レスポンダー（Ｒ）の群が、非レスポンダー（ＮＲ）と比較して、有意に高いＳＴＡＴ１／２経路スコアを有することを示す。査定不能（ＮＥ）であった群は、なお低度のＳＴＡＴ１／２経路スコアを有する。
【００９９】
較正された数学的モデル、例えば、例示的なベイジアンネットワークモデルを、マイクロアレイ又はＲＮＡシーケンシングに由来する、入力されたｍＲＮＡデータに適用する代わりに、臨床適用では、例えば、ｑＰＣＲを使用して、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定する、統合型プラットフォーム上で、試料測定を実施するための、専用アッセイを開発することが有益である。次いで、開示された標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡ配列を使用して、どのプライマー及びプローブを、このようなプラットフォーム上で選択するのかを決定する。
【０１００】
このような専用アッセイのバリデーションは、マイクロアレイベースの数学的モデルを、基準モデルとして使用し、開発されたアッセイが、バリデーション試料のセットに対して、同様な結果をもたらすのかどうかを検証することにより行うことができる。専用アッセイに次いで、このバリデーションもまた、ＲＮＡシーケンシングデータを、入力された測定値として使用する、同様な数学的モデルを構築し、較正するために行うことができる。
【０１０１】
較正された数学的モデル、例えば、例示的なベイジアンネットワークモデルを使用する、マイクロアレイ／ＲＮＡシーケンシングベースの探索に基づき、特異的な細胞シグナル伝達経路活性を、最もよく指し示すことが見出された、標的遺伝子のセット、例えば、表１及び表２は、対象の試料及び／又はコンピュータ上で実施される、マルチプレックス定量的ＰＣＲアッセイに移行し、発現測定値を解釈し、かつ／若しくはＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測することができる。細胞シグナル伝達経路活性についての、このような試験（例えば、セントラルサービスラボにおける、ＦＤＡの承認若しくはＣＬＩＡの認証を受けた試験、又は探索使用だけのための、検査室により開発された試験）を開発するためには、規制機関による承認を得るのに、臨床試験における臨床の場でのバリデーションを必要とする、標準化された試験キットの開発が要求される。
【０１０２】
本発明は、デジタル処理デバイスにより実施される、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータにより実施される方法は、推測することが、対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ又はこれを超える標的遺伝子の発現レベルに基づく、コンピュータにより実施される方法に関する。本発明は、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置であって、装置は、方法を実施するように構成されたデジタルプロセッサーを含む装置、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体であって、非一時的記憶媒体は、方法を実施するための、デジタル処理デバイスにより実行可能な命令を保存する非一時的記憶媒体、及び対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムが、デジタル処理デバイス上で実行される場合に、デジタル処理デバイスに、方法を実施させるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムにさらに関する。
【０１０３】
方法は、例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の（異常な）活性の診断、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく予後診断、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の推測された活性に基づく臨床試験における対象の登録、実施される後続の試験の選択、コンパニオン診断試験の選択、臨床決定支援システムなどにおいて使用される。この点で、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）、及びこれらの適用について、より詳細に記載する、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁が参照される。
【０１０４】
[実施例４]
本発明を例示するためのさらなる情報
（１）遺伝子発現のレベルの測定
本明細書で記載される方法を使用して、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測するのに、本明細書で記載される標的遺伝子の固有のセットから導出されるデータを、さらに活用する。
【０１０５】
抽出された試料中の遺伝子発現レベルを解析するための方法は、一般に知られている。例えば、方法など、ノーザンブロット法、ＰＣＲ、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、又はマイクロアレイの使用は、いずれも、遺伝子発現レベルのデータを導出するのに使用することができる。本明細書では、標的遺伝子の遺伝子発現を解析するための、当技術分野で知られている全ての方法が想定される。
【０１０６】
ＰＣＲベースの方法を使用して、遺伝子の発現産物を決定する方法は、特に、有用である。ＰＣＲを使用して、遺伝子発現のレベルを定量するためには、各増幅サイクルの後における、リアルタイムのＰＣＲ産物の蓄積を測定するのに、従来の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、関心のある各ＰＣＲ産物の量を推定することが典型的である。これは、典型的に、挿入色素、副溝結合色素、又は光の適用が、蛍光を発するように、レポーターを励起する、蛍光発生プローブなど、検出可能なレポーターを活用し、結果として得られる蛍光は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７１３，２９７号において開示されているＣＣＤカメラ又は光電子増倍検出システムなどの、ＣＣＤカメラ又は光電子増倍検出システムを使用して検出されることが典型的である。
【０１０７】
一部の実施形態では、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイにおいて、ＰＣＲ産物の検出に使用されるプローブは、蛍光マーカーを含みうる。多数の蛍光マーカーが市販されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）は、多種多様な蛍光色素を販売している。非限定例は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、及びＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）を含む。さらなる蛍光マーカーは、ｑＰＣＲアッセイにおける、従来の５’加水分解型プローブを伴う、ＩＤＴ  ＺＥＮ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｑｕｅｎｃｈｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓを含みうる。これらのプローブは、例えば、３’  ＴＡＭＲＡ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、３’  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はインターナル型のＺＥＮ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ及び３’  Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＩＢＦＱ）を伴う５’ＦＡＭ色素を含有しうる。
【０１０８】
当技術分野でよく知られている方法を使用して、本発明に従う、有用な蛍光色素を、オリゴヌクレオチドプライマーへと接合させることができる。例えば、蛍光標識を、オリゴヌクレオチドへと付加するための、一般的な方式は、色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを、標的上の反応性アミノ基と反応させることである。ヌクレオチドは、例えば、ヌクレオ塩基上の、アリルアミン基の組入れにより、反応性アミノ基を保有するように修飾することができる。アリルアミンを介する標識付けについては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７６，９２８号及び同第５，９５８，６９１号において記載されている。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドを、蛍光標識付けする他の手段は、当業者によく知られている。
【０１０９】
他の蛍光発生手法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４３６，１３４号及び同第５，６５８，７５１号において開示される通り、任意の遺伝子発現産物から増幅されたＤＮＡと共に挿入されると、蛍光を発する、ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ色素など、一般的な検出システムの使用を含む。
【０１１０】
標的遺伝子発現レベルを決定するための、別の有用な方法は、異なる整理学的条件の間の、遺伝子発現レベルの差違、又は発生時に、若しくは疾患進行の経過にわたり生じる変化を含む、トランスクリプトーム解析のために使用される、強力な解析ツールである、ＲＮＡ−ｓｅｑを含む。
【０１１１】
遺伝子発現レベルを決定するための、別の手法は、マイクロアレイ、例えば、当技術分野でよく知られている、ＲＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマイクロアレイの使用を含む。マイクロアレイを使用して、多数の遺伝子の発現を、同時に定量することができる。
【０１１２】
（２）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達の活性を決定するための、一般的ワークフロー
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達の活性を、対象から単離された試料から推測するための工程を例示的に図解するフローチャートを、図３に示す。第１に、試料からｍＲＮＡを単離する（１１）。第２に、当技術分野で知られている、遺伝子発現を測定するための方法を使用して、本明細書で記載される、少なくとも３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の固有のセットのｍＲＮＡ発現レベルを測定する（１２）。次に、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルを、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルと関連付ける、較正された数学的経路モデル（１４）を使用して、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベル（１３）を決定する。最後に、対象の試料中の、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの、決定された活性レベルに基づき、対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を推測する（１５）。例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路を、活性が、ある特定の閾値を上回れば、活性であると決定し、活性が、ある特定の閾値を下回れば、不活性であると類別することができる。
【０１１３】
（３）較正された数学的経路モデル
本明細書で想定される通り、本明細書で記載される、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の固有のセットの発現レベルは、本明細書でさらに記載される、較正された数学的経路モデルを使用して、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルを決定するのに使用される。較正された数学的経路モデルは、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルを、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントの活性レベルへと関連付ける。
【０１１４】
本明細書で想定される通り、較正された数学的経路モデルは、数学的経路モデルの適用に基づく。例えば、較正された数学的経路モデルは、確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデル、又は線形モデル若しくは疑似線形モデルに基づきうる。
【０１１５】
ある実施形態では、較正された数学的経路モデルは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントと、３つ又はこれを超えるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける、条件付き確率関係を組み込む確率モデルである。ある実施形態では、確率モデルは、ベイジアンネットワークモデルである。
【０１１６】
代替的実施形態では、較正された数学的経路モデルは、線形モデルの場合もあり、疑似線形モデルの場合もある。ある実施形態では、線形モデル又は疑似線形モデルは、本明細書でさらに記載される、線形結合モデル又は疑似線形結合モデルである。
【０１１７】
較正された数学的経路モデルを作出するための工程を、図４を例示的に図解するためのフローチャートに示す。最初のステップとして、ｍＲＮＡ発現レベルのトレーニングデータを、収集し、正規化する。データは、例えば、当技術分野で知られている、マイクロアレイプローブセットの強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲのＣｑ値（１０２）、ＲＮＡｓｅｑの生リード（１０３）、又は代替的測定モダリティー（１０４）を使用して収集することができる。次いで、発現レベルの生データを、各方法に応じて、それぞれ、正規化アルゴリズム、例えば、フローズンロバストマルチアリー解析（ｆＲＭＡ）又はＭＡＳ５．０を使用する正規化（１１１）、基準遺伝子の平均Ｃｑに照らした正規化（１１２）、リードの、マッピングされたリード１００万当たりの転写物１キロベース当たりのリード／フラグメント量（ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ）への正規化（１１３）、又は基準遺伝子／タンパク質に照らした正規化（１１４）を使用する正規化により正規化することができる。この正規化手順は、各方法に応じて、それぞれ、正規化されたプローブセットの強度（１２１）、正規化されたＣｑ値（１２２）、正規化されたＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化された測定値（１２４）をもたらし、これらは、トレーニング試料中の標的遺伝子発現レベルを指し示す。
【０１１８】
トレーニングデータを正規化したら、１つ又は複数のトレーニング試料ＩＤ（１３１）を得、これらの特異的試料のトレーニングデータを、遺伝子発現を決定するための方法のうちの１つから得る（１３２）。トレーニング試料からの、最終的な遺伝子発現結果を、トレーニングデータ（１３３）として出力する。多様なトレーニング試料に由来するデータ（例えば、閾値、例えば、確率的ネットワーク又はベイジアンネットワークの場合のＣＰＴ、例えば、線形モデル又は疑似線形モデルの場合の重みなどを含む）の全てを組み込んで、モデルを較正する（１４４）。加えて、経路の標的遺伝子及び測定ノード（１４１）を使用して、例えば、図２に記載されるモデル構造を作出する（１４２）。次いで、結果として得られる、経路のモデル構造（１４３）を、トレーニングデータ（１３３）と共に組み込んで、モデルを較正するが（１４４）、ここで、標的遺伝子の遺伝子発現レベルは、転写因子エレメントの活性を示す。トレーニング試料中の、ＴＦエレメントの決定の結果として、較正された経路モデル（１４５）を作出し、これにより、トレーニング試料中の標的遺伝子発現レベルに基づき、その後検討される関心のある試料、例えば、がんを伴う対象に由来する試料のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性に割り当てる。
【０１１９】
（４）ＴＦエレメントの決定
ＴＦエレメントの活性レベルを決定するための工程を例示的に図解するフローチャートを、図５に示す。対象から抽出された試料に由来する発現レベルのデータ（被験データ）（１６３）を、較正された数学的経路モデル（１４５）へと入力する。数学的経路モデルは、確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデル、線形モデル、又は疑似線形モデルである。
【０１２０】
数学的経路モデルは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２  ＴＦエレメントと、対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ若しくはこれを超える標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に基づく確率モデル、例えば、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は対象の試料中で測定される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の３つ若しくはこれを超える標的遺伝子の発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づく。特に、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性の決定は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２号（「標的遺伝子発現の確率モデル化を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において開示される通りに実施される。略述すると、データを、ベイジアンネットワーク（ＢＮ）推測エンジン判定（例えば、ＢＮＴツールボックス）へと入力する（１５４）。これは、ＢＮ内の全てのノードの、計算された周辺ＢＮ確率についての値のセット（１５５）をもたらす。これらの確率から、転写因子（ＴＦ）ノードの確率を決定し（１５６）、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を確立する。
【０１２１】
代替的に、数学的モデルは、線形モデルである。例えば、線形モデルは、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「標的遺伝子発現の線形結合を使用する、細胞シグナル伝達経路活性の評価」）において記載される通りに使用されうる。標的遺伝子発現の数学的モデル化を使用して、細胞シグナル伝達経路活性を計算／決定することに関する、さらなる詳細はまた、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、１１号、２０１４年、２９３６〜２９４５頁においても見出されうる。略述すると、データを、計算された重み付け線形結合スコア（ｗ／ｃ）へと入力する（１５１）。これは、計算された重み付け線形結合スコアのための値のセット（１５２）をもたらす。これらの重み付け線形結合スコアから、転写因子（ＴＦ）ノードの重み付け線形結合スコアを決定し（１５３）、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を確立する。
【０１２２】
（５）離散可観測量のための手順
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を、離散可観測量として推測するための工程を、図６を例示的に図解するためのフローチャートに示す。まず、被験試料を抽出し、被験試料ＩＤ（１６１）を与える。次に、ｍＲＮＡの発現レベルについての被験データを収集し、正規化する（１６２）。被験データは、図５で、トレーニング試料について論じたのと同じ方法を使用して、マイクロアレイプローブセットの強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲのＣｑ値（１０２）、ＲＮＡｓｅｑの生リード（１０３）、又は代替的測定モダリティー（１０４）を使用して収集することができる。次いで、発現レベルの生データを、各方法に応じて、それぞれ、アルゴリズム、例えば、ｆＲＭＡ又はＭＡＳ５．０を使用する正規化（１１１）、基準遺伝子の平均Ｃｑに照らした正規化（１１２）、リードの、ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭへの正規化（１１３）、及び基準遺伝子／タンパク質に照らした正規化（１１４）を使用する正規化により正規化することができる。この正規化手順は、各方法に応じて、それぞれ、正規化されたプローブセットの強度（１２１）、正規化されたＣｑ値（１２２）、正規化されたＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化された測定値（１２４）をもたらす。
【０１２３】
被験データを正規化したら、結果として得られる被験データ（１６３）を、較正された数学的経路モデル（１４５）に基づく閾値化ステップ（１６４）において解析する結果として、閾値化された被験データ（１６５）をもたらす。１つの非限定的な例では、離散可観測量を使用すると、ある特定の閾値を上回るあらゆる発現には、例えば、１の値を与え、閾値を下回る値には、０の値を与えるか、又は、代替的実施形態では、本明細書で記載される閾値を上回る確率質量を、閾値化された値として使用する。較正された数学的経路モデルに基づくと、この値は、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を表し、次いで、これを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性を計算する（１７１）。最終的な出力は、対象における、細胞シグナル伝達経路の活性（１７２）をもたらす。
【０１２４】
（６）連続可観測量のための手順
対象におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性を、連続可観測量として推測するための工程を、図７を例示的に図解するためのフローチャートに示す。まず、被験試料を抽出し、被験試料ＩＤ（１６１）を与える。次に、ｍＲＮＡの発現レベルについての被験データを収集し、正規化する（１６２）。被験データは、図５で、トレーニング試料について論じたのと同じ方法を使用して、マイクロアレイプローブセットの強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲのＣｑ値（１０２）、ＲＮＡｓｅｑの生リード（１０３）、又は代替的測定モダリティー（１０４）を使用して収集することができる。次いで、発現レベルの生データを、各方法に応じて、それぞれ、アルゴリズム、例えば、ｆＲＭＡ（１１１）、基準遺伝子の平均Ｃｑに照らした正規化（１１２）、リードの、ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭへの正規化（１１３）、又は基準遺伝子／タンパク質に照らした正規化（１１４）を使用する正規化により正規化することができる。この正規化手順は、各方法に応じて、それぞれ、正規化されたプローブセットの強度（１２１）、正規化されたＣｑ値（１２２）、正規化されたＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化された測定値（１２４）をもたらす。
【０１２５】
被験データを正規化したら、結果として得られる被験データ（１６３）を、較正された数学的経路モデル（１４５）により解析する。１つの非限定的な例として、連続可観測量を使用すると、本明細書で、さらに詳細に記載される通り、シグモイド関数を使用して、発現レベルを、０〜１の間の値へと転換する。本明細書で記載されるＴＦエレメントの決定を使用して、被験データを、較正された数学的経路モデルと組み合わせて解釈すると、結果として得られる値は、ＴＦエレメントの活性レベル（１５７）を表し、次いで、これを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性（１７１）を計算する。最終的な出力は、対象における、細胞シグナル伝達経路の活性（１７２）をもたらす。
【０１２６】
（７）標的遺伝子発現レベルの決定手順
標的遺伝子発現レベルを、対象から抽出された試料から導出するための工程を、例示的に図解するフローチャートを、図８に示す。例示的な実施形態では、試料を、検査室で受領し、登録する。試料は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料（１８１）又は新鮮凍結（ＦＦ）試料（１８０）を含みうる。ＦＦ試料は、直接溶解させることができる（１８３）。ＦＦＰＥ試料については、プロテイナーゼＫ添加時における、加熱インキュベーションステップにより、パラフィンを除去することができる（１８２）。次いで、細胞を溶解させ（１８３）、これにより、細胞膜及び核膜を破壊し、これにより、核酸（ＮＡ）を、さらなる加工のために利用可能とする。核酸を、例えば、ビーズ又はフィルターでありうる固相へと結合させる（１８４）。次いで、核酸を、洗浄緩衝液で洗浄して、溶解の後で存在する、全ての細胞破砕物を除去する（１８５）。次いで、清浄な核酸を、溶離緩衝液により、固相から引き離す（１８６）。ＤＮＡを、ＤＮアーゼ処理により除去して、ＲＮＡだけが、試料中に存在することを確保する（１８７）。次いで、核酸試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲ試料ミックス中で、直接使用することができる（１８８）。ＲＴ−ｑＰＣＲ試料ミックスは、ＲＮＡ試料、ｃＤＮＡを、ＲＮＡ試料から調製するＲＴ酵素、及びｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ酵素、酵素の機能を確認する緩衝液を含有し、潜在的に、一定の濃縮物容量を設定するための分子グレードの水を含有しうる。次いで、試料ミックスを、乾燥ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを含有する、マルチウェルプレート（すなわち、９６ウェル又は３８４ウェルプレート）へと添加することができる（１８９）。次いで、指定されたプロトコールに従い、ＰＣＲマシン内で、ＲＴ−ｑＰＣＲを作動させることができる（１９０）。例 ＰＣＲプロトコールは、ｉ）５０℃で、３０分間；ｉｉ）９５℃で、５分間；ｉｉｉ）９５℃で、１５秒間；ｉｖ）６０℃で、４５秒間；ｖ）ステップｉｉｉ及びｉｖを反復する５０サイクルを含む。次いで、生データに対して、二次導関数法を使用することにより、Ｃｑ値を決定する（１９１）。解析のために、Ｃｑ値をエクスポートする（１９２）。
【０１２７】
（８）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２に媒介される疾患及び障害、並びに処置の方法
本明細書で想定される通り、本発明の方法及び装置を活用して、対象、例えば、疾患若しくは障害を有することが疑われるか、又はこれを有する対象における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性について評価することができ、ここで、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２シグナル伝達経路の状態は、疾患の存在又は進行の、全体的又は部分的な証拠となる。ある実施形態では、本明細書では、対象を処置する方法であって、処置する方法は、本明細書で記載される方法を使用して、対象から抽出された試料から導出される、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性状態に関する情報を受信するステップと、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路の活性に関する情報が、活性のＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２シグナル伝達経路を示す場合、対象へと、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２阻害剤を投与するステップとを含む、処置する方法が提示される。特定の実施形態では、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路活性の指数は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズについての、１０：１、５：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：５、１：１０のカットオフ値に設定される。
【０１２８】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路は、例えば、胃食道接合部がん、肝細胞癌、肺癌、及び胃がん、並びにがん駆動経路としての活性ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２シグナル伝達経路を有する、他のがん型及びがん亜型など、多様ながん型、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、ＳＬＥ、多発性硬化症などの免疫系媒介性疾患、並びに喘息、アテローム性動脈硬化、糖尿病などの炎症性疾患、うつ病及び統合失調症などの精神疾患、座瘡、子宮内膜症など、多数の疾患において役割を果たす。このような疾患に関して、組織内及び血液中の免疫細胞型における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ１／２経路活性プロファイルを測定することは、診断し、亜型分類し、免疫調節療法、とりわけ、免疫抑制療法、及びターゲティングされた免疫抑制療法への応答を予測し、かつ／又はこれをモニタリングし、免疫応答状態をモニタリングするのに有用であることが期待される。薬物に対する応答の予測を使用して、抗ＳＴＡＴ１／２経路薬物を、患者へとマッチさせることができる。例えば、統合失調症（フェーズＩＶの臨床試験）、子癇前症（フェーズＩ）、高脂血症（フェーズＩ／ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ）、肝硬変（フェーズＩＩ／ＩＩＩ）、胃食道接合部がん（フェーズＩＶ）、骨髄性白血病（フェーズＩ／ＩＩ）、肺炎（フェーズ０）のための処置としての、抗ＳＴＡＴ１薬であるプラバスタチン、関節リウマチ（フェーズＩ／ＩＩ／ＩＩＩ）、若年性特発性関節炎（フェーズＩ／ＩＩ／ＩＩＩ）、乾癬（フェーズＩ／ＩＩ／ＩＩＩ）、強直性脊椎炎（フェーズＩＩ）、乾性角結膜炎（フェーズＩＩ）、潰瘍性大腸炎（フェーズＩＩＩ）の処置のためのトファシチニブ、肝細胞癌、肺癌、及び胃がん（フェーズＩ）、本態性血小板血症及び真性赤血球増加症後骨髄線維症（フェーズＩ）の処置のためのＡＺＤ、並びに頭頸部がんの処置のためのオリゴデオキシヌクレオチドデコイ（フェーズ０）である（また、Ｍｉｋｌｏｓｓｙ  Ｇ．ら、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ＳＴＡＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１２巻、８号、２０１３年８月、６１１〜６２９頁も参照されたい）。
【０１２９】
本出願は、いくつかの好ましい実施形態について記載する。前出の詳細な記載を読み、理解すれば、他の研究者らは、改変及び変更に想到する。本出願は、それらが、付属の特許請求の範囲又はそれらの同等物の範囲内に収まる限りにおいて、全てのこのような改変及び変更を含むものとみなされる。
【０１３０】
開示される実施形態に対する、他の変動も、図面、本開示、及び付属の特許請求の範囲の検討から、当業者により理解され、特許請求された本発明の実施においてなされうる。
【０１３１】
特許請求の範囲では、「〜を含むこと」という語は、他の要素又はステップを除外せず、単数形は、複数形を除外しない。
【０１３２】
単一のユニット又はデバイスは、特許請求の範囲において列挙された、いくつかの項目の機能を果たす。ある特定の手段が、互いに異なる従属請求項内に列挙されるという事実だけで、これらの手段の組合せを使用しても有利でありえないことが指し示されるわけではない。
【０１３３】
１つ又はいくつかのユニット又はデバイスにより実施される、危険性スコアの決定などの計算は、他の任意の数のユニット又はデバイスにより実施することができる。
【０１３４】
コンピュータプログラムは、光学記憶媒体又は半導体媒体など、適切な媒体上に保存／分配され、他のハードウェアと併せて、又はこの一部として供給されるが、また、インターネット又は他の有線若しくは無線の通信システムなど、他の形態でも供給される。
【０１３５】
[実施例５]
本出願において使用される配列表
配列表：
配列番号        遺伝子：
配列番号１      ＢＩＤ
配列番号２      ＧＮＡＺ
配列番号３      ＩＲＦ１
配列番号４      ＩＲＦ７
配列番号５      ＩＲＦ８
配列番号６      ＩＲＦ９
配列番号７      ＬＧＡＬＳ１
配列番号８      ＮＣＦ４
配列番号９      ＮＦＡＭ１
配列番号１０    ＯＡＳ１
配列番号１１    ＰＤＣＤ１
配列番号１２    ＲＡＢ３６
配列番号１３    ＲＢＸ１
配列番号１４    ＲＦＰＬ３
配列番号１５    ＳＡＭＭ５０
配列番号１６    ＳＭＡＲＣＢ１
配列番号１７    ＳＳＴＲ３
配列番号１８    ＳＴ１３
配列番号１９    ＳＴＡＴ１
配列番号２０    ＴＲＭＴ１
配列番号２１    ＵＦＤ１Ｌ
配列番号２２    ＵＳＰ１８
配列番号２３    ＺＮＲＦ３
【図１】
0006931125.tif 000008
【図２】
0006931125.tif 000009
【図３】
0006931125.tif 000010
【図４】
0006931125.tif 000011
【図５】
0006931125.tif 000012
【図６】
0006931125.tif 000013
【図７】
0006931125.tif 000014
【図８】
0006931125.tif 000015
【図９】
0006931125.tif 000016
【図１０】
0006931125.tif 000017
【図１１】
0006931125.tif 000018
【図１２】
0006931125.tif 000019
【図１３】
0006931125.tif 000020
【図１４】
0006931125.tif 000021
【図１５】
0006931125.tif 000022
【図１６】
0006931125.tif 000023
【図１７】
0006931125.tif 000024
【図１８】
0006931125.tif 000025
【図１９】
0006931125.tif 000026
【図２０】
0006931125.tif 000027
【図２１】
0006931125.tif 000028
【配列表】
0006931125000001.app