(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント、ここで該抗体フラグメントはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖからなる群より選択されるものである。
【請求項２】
該抗体が、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント、ここで該抗体フラグメントはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖからなる群より選択されるものである。
【請求項４】
該抗体が、配列番号６８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項３に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント、ここで該抗体フラグメントはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖからなる群より選択されるものである。
【請求項６】
該抗体が、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント、ここで該抗体フラグメントはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖからなる群より選択されるものである。
【請求項８】
該抗体が、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号９０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項７に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント、ここで該抗体フラグメントはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖからなる群より選択されるものである。
【請求項１０】
該抗体が、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項９に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む、抗癌剤。
【請求項１２】
癌が、胃癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌および骨髄腫からなる群より選択される、請求項１１に記載の抗癌剤。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む、抗癌アジュバント。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗癌アジュバントおよび細胞療法剤を含む、癌処置用組成物。
【請求項１５】
該細胞療法剤が、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞である、請求項１４に記載の癌処置用組成物。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを含む、ＣＥＡＣＡＭ１発現腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを含む、癌の予防または処置のための組成物。
【請求項１８】
癌の予防または処置用の薬剤を調製するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１に特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
膜貫通糖タンパク質である癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（以降、ＣＥＡＣＡＭ１と称する）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーに属する。ＣＥＡファミリーメンバーのうち、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８はヒトで発現されている。さらに重要なことには、ＣＥＡＣＡＭ１は、活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を含むリンパ球集団で発現されるＣＥＡファミリーの唯一のメンバーである。ＣＥＡＣＡＭ１は、癌細胞で高度に発現されると報告されている。さらに、上皮細胞、内皮細胞および骨髄細胞でも低レベルのＣＥＡＣＡＭ１発現が観察されている。リンパ球の表面上では、ＣＥＡＣＡＭ１は、免疫応答の調節の役割を果たしている。具体的には、ＣＥＡＣＡＭ１は、ヒト腸上皮内に含まれるＴ細胞を含む活性化Ｔ細胞の阻害受容体であることが判明している（Gray-Owen & Bloomberg, Nat. Rev. Immunol. 2006; 6:433-446; Morales et al., J. Immunol, 1999; 163: 1363-1370）。
【０００３】
特に、ＣＥＡＣＡＭ１は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４と同様の免疫チェックポイント分子として認識され、Ｔ細胞活性化の調節に重要な役割を果たしている。免疫チェックポイント経路は、非炎症性の生理的条件下で免疫介在損傷から組織を保護する。ＣＥＡＣＡＭ１は、主にＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ１トランス−ホモ親和性係合（engagement）により、Ｔリンパ球上で活性化されると、それ自体の細胞質ＩＴＩＭモチーフにホスファターゼを動員することによってＴＣＲ介在炎症経路を阻害するためのシグナルを伝達する（Chen et al., J. Immunol. 2008; 180: 6085-6093）。従って、癌において免疫チェックポイント経路の抑制は、有望な抗癌治療戦略として出現した。
【０００４】
いくつかのヒト腫瘍タイプに関連する試験は、腫瘍がＣＥＡＣＡＭ１を誘導することを免疫により回避できることを報告している。加えて、前臨床動物腫瘍モデルにおいて、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いるＣＥＡＣＡＭ１相互作用の阻止は、腫瘍に対する免疫応答を増強し、腫瘍抑制を促進し得ることが示されている（Ortenberg et al., Mol. Cancer Ther. 2012; 11(6):1300-1310）。
【０００５】
従来の抗癌剤の最大の問題の１つは、その処置が、限定された抗がん効果と再発率の高さに比べて、有害な副作用をもたらすことである。一方、最近注目されているアプローチである、所謂免疫チェックポイント遮断は、癌細胞を直接殺すのではなく、腫瘍反応性の疲弊したＴ細胞を再活性化することにより癌を排除する。このタイプのアプローチは、宿主の免疫機能を利用して癌を排除し、無関係な正常細胞に影響を与えないことができるため、比較的安全かつ有効である。Bristol-Myers SquibbのＰＤ−１標的化ニボルマブの場合、毒性プロファイルは、従来の抗癌剤の毒性プロファイルと比較して管理可能な範囲にあるが、その抗癌作用は、従来の薬剤の作用よりも顕著に高くなっている。２０１５年に刊行された、転移性黒色腫患者の処置における、標準的な化学療法薬であるニボルマブとダカルバジンとの直接比較の第III相治験では、例えば、ニボルマブは、ダカルバジンによる１３．９％ ＯＲＲ（９５％ ＣＩ、９．５から１９．４）と比較して、４０％の客観的奏効率を示した(９５％ ＣＩ、３３．３から４７．０）。無増悪生存期間の中央値は、ニボルマブ群で５．１月、ダカルバジン群で２．２月であった。また、毒性プロファイルは、ダカルバジンに対するニボルマブの有意性を確信させた（Robert et al., New Engl. J. Med. 2015; 372:320-330）。
【０００６】
一方、ＣＥＡＣＡＭ１ブロッキング抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の表面上に発現するＣＥＡＣＡＭ１に作用し、腫瘍細胞に過剰発現するＣＥＡＣＡＭ１と相互作用する。従って、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現する腫瘍の場合、ＣＥＡＣＡＭ１標的化抗体は、Ｔ／ＮＫ細胞と腫瘍細胞との間のＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ１ホモ親和性抑制相互作用を阻止し、それにより抗腫瘍Ｔ／ＮＫ細胞応答を再活性化すると予期される。現在開発中のＣＥＡＣＡＭ１標的化抗体（２０１７年２月に第１相臨床治験を早期終結）は、ＣＥＡＣＡＭ１に加えてＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５を認識する。このＢＭＳクローンのこのようなオフターゲット（off-target）認識特性は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５間で高度に相同なＮ−ドメイン内のエピトープ配列に起因し得る。
【発明の概要】
【０００７】
発明の開示
技術的問題
従って、ＣＥＡＣＡＭ１に特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を開発するために、本発明者らは、ＣＥＡＣＡＭ１のＮ−ドメインに結合し、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６またはＣＥＡＣＡＭ８と交差反応しない、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を見出そうと努め、本発明を完成させた。
【０００８】
問題の解決策
本発明の１つの目的は、配列番号１〜８からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９〜１６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１７〜２９からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；配列番号３０〜３８からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号３９〜４６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；および、配列番号４７〜５５からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを提供することである。
【００１０】
さらに、本発明の別の目的は、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む抗癌剤を提供することである。
【００１１】
さらに、本発明の別の目的は、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む抗癌アジュバントを提供することである。
【００１２】
また、本発明の別の目的は、上記の抗癌アジュバントおよび細胞療法剤を含む、癌を処置するための組成物を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の別の目的は、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントと接触させたリンパ球を対象に投与することを含む、癌を処置するための方法を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明の別の目的は、ＣＥＡＣＡＭ１を発現する腫瘍細胞と抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントとを接触させることを含む、該ＣＥＡＣＡＭ１を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の有利な効果
本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１に特異的に結合し、それにより細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の抗癌免疫機能を活性化するため、抗癌剤および癌処置用組成物として有効に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、一態様により調製される組換えＣＥＡＣＡＭｌの構造の概略図である。
【図２】図２は、組換えＣＥＡＣＡＭ１の構成的ドメインに依存する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合能を示す。
【図３】図３は、Ｃ２５の濃度に依存する組換えＣＥＡＣＡＭ１へのＣ２５の結合の比較結果を示す。
【図４】図４は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１への抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合を示している。
【図５】図５は、Ｃ２５およびＣ２５由来抗体クローンの濃度に応じた、ＣＥＡＣＡＭ１−Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の表面上に発現されるＣＥＡＣＡＭ１の結合能を示している：（ａ）Ｃ２５の濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１−Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の表面上に発現されるＣＥＡＣＡＭ１の結合能を表す；および（ｂ）Ｃ２５由来抗体クローンの濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１−Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の表面上に発現されるＣＥＡＣＡＭ１への結合能を表す。
【００１７】
【図６】図６は、ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の親和性を示す表である。親和性は、運動速度定数ＫｏｎおよびＫｏｆｆならびに平衡解離定数ＫＤによって得られた。
【図７】図７は、Ｃ２５の等電点を示す写真である。第１、第２および第３レーンは、ＩＥＦ−マーカー３−１０、ｈｕＩｇＧ４、およびＣ２５それぞれの結果である。
【図８】図８は、ＣＤ６９、ＣＤ２５およびＫｉ６７マーカー発現によって、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；０．１μｇ／ｍｌ）抗体と共にＣ２５によるＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞株の活性化を示す。Ｃ２５およびｈｕＩｇＧ４の濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【図９】図９は、ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ）と共にＣ２５により活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数およびＩＬ−２の分泌レベルを示すグラフである。Ｃ２５およびｈｕＩｇＧ４の濃度は１０μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により増殖されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数を表す；（ｂ）ＣＤ６９およびＫｉ６７マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の数を示す；および、（ｃ）Ｃ２５により活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルを示す。
【図１０】図１０は、ＣＤ６９、ＣＤ２５およびＫｉ６７マーカー発現によって、ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ）と共にＣ２５によるＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞株の活性化を示す。Ｃ２５およびｈｕＩｇＧ４の濃度は２５μｇ／ｍｌであった。
【００１８】
【図１１】図１１は、ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ）と共にＣ２５により活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数およびＩＬ−２の分泌レベルを示すグラフである。Ｃ２５およびｈｕＩｇＧ４の濃度は２５μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＯＫＴ３と共にＣ２５によって増殖されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数を示す；（ｂ）ＣＤ６９およびＫｉ６７マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の数を示す；および、（ｃ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されるＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルを示す。ＯＫＴ３の濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。
【図１２】図１２は、ＣＤ６９、ＣＤ２５およびＫｉ６７マーカー発現によって、ＯＫＴ３と共にＣ２５によるＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞株の活性化を示す。ＯＫＴ３の濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。
【図１３】図１３は、Ｃ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数およびＩＬ−２の分泌レベルを示すグラフである。ＯＫＴ３およびＣ２５または対照Ａｂの濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により増殖したＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数を示す；（ｂ）ＣＤ６９およびＫｉ６７マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の数を示す；および、（ｃ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルを示す。
【図１４】図１４は、ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数およびＩＬ−２の分泌レベルを示すグラフである。ＯＫＴ３およびＣ２５または対照Ａｂの濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により増殖したＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数を示す；（ｂ）ＣＤ６９およびＫｉ６７マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の数を示す；および、（ｃ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルを示す。
【００１９】
【図１５】図１５は、ＣＤ６９、ＣＤ２５およびＫｉ６７マーカー発現によって、ＯＫＴ３と共にＣ２５によるＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞株の活性化を示す。ＯＫＴ３の濃度は、１μｇ／ｍｌであった。
【図１６】図１６は、ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数およびＩＬ−２の分泌レベルを示すグラフである。ＯＫＴ３およびＣ２５または対照Ａｂの濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により増殖されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数を示す；（ｂ）ＣＤ６９およびＫｉ６７マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の数を示す；および、（ｃ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルを示す。
【図１７】図１７は、ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数およびＩＬ−２分泌レベルを示すグラフである。ＯＫＴ３およびＣ２５または対照Ａｂの濃度は、それぞれ１μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により増殖されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞の数を示す；（ｂ）ＣＤ６９およびＫｉ６７マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の数を示す；および、（ｃ）ＯＫＴ３と共にＣ２５により活性化されたＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルを示す。
【００２０】
【図１８】図１８は、ＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化によって、Ｃ２５処置によるＴ細胞活性化を示すグラフである。ＯＫＴ３およびＣ２５または対照Ａｂの濃度は、それぞれ０．０５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＣＥＡＣＡＭ１を発現しないＪｕｒｋａｔ−ＧＦＰ/ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞をＣ２５で処置することによる、ＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化の測定結果を示す；および、（ｂ）ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現しているＪｕｒｋａｔ−ＣＣＭ１／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞のＣ２５での処置によるＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化の測定結果を示す。
【図１９】図１９は、ＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化によって、Ｃ２５処置によるＴ細胞活性化の結果である。ＯＫＴ３およびＣ２５または対照Ａｂの濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった：（ａ）ＣＥＡＣＡＭ１を発現しないＪｕｒｋａｔ−ＧＦＰ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞のＣ２５での処置によるＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化の測定結果を示す；および、（ｂ）ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現しているＪｕｒｋａｔ−ＣＣＭ１／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞のＣ２５での処置によるＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化の測定結果を示す。
【図２０】図２０は、対照と比較した、Ｃ２５を含む抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるＴ細胞のＮＦＡＴルシフェラーゼ活性の増加を示すグラフである。ＯＫＴ３および抗ＣＥＡＣＡＭ抗体または対照Ａｂの濃度は、それぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった。
【００２１】
【図２１】図２１は、ヒトおよびサルの正常組織におけるＣＥＡＣＡＭ１発現の程度を評価するための、Ｃ２５による染色結果を示す写真である。
【図２２】図２２は、ヒトおよびサルの正常組織におけるｈｕＩｇＧ４による染色結果を示す写真である。
【図２３】図２３は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体とＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質との交差反応性を示す。
【図２４】図２４は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体とＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質との交差反応性を示す。
【図２５】図２５は、Ｃ２５（ａ）およびＣ２５由来抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体クローン（ｂ）が、細胞表面上に発現されたＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６またはＣＥＡＣＡＭ８と交差反応しないことを示す。
【図２６】図２６は、Ｃ２５（ａ）およびＣ２５由来抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体クローン（ｂ）が、細胞表面上に発現されたタンパク質への結合能を試験することにより、ヒトＣＥＡＣＡＭ１だけでなくサルＣＥＡＣＡＭ１にも結合することを示す。
【図２７】図２７は、ＣＥＡＣＡＭ１＋癌細胞に対する、ＣＥＡＣＡＭ１＋ ＴＡＬＬ−１０４ Ｔ細胞の抗癌活性へのＣ２５介在増強効果を示す：（ａ）ＴＡＬＬ−１０４ Ｔ細胞およびＣＥＡＣＡＭ１＋ ＭＮＫ４５癌細胞を、Ｃ２５の存在下、種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養した場合の、癌細胞の生存率を示す；および、（ｂ）ＴＡＬＬ−１０４ Ｔ細胞およびＣＥＡＣＡＭ１− ＭＮＫ１癌細胞を、Ｃ２５の存在下、種々のＥ：Ｔ比で共培養した場合の、癌細胞の生存率を示す。
【００２２】
【図２８】図２８は、ＣＥＡＣＡＭ１＋ 癌細胞に対する、ＣＥＡＣＡＭ１＋ ＮＫ９２ＭＩ ＮＫ細胞の抗癌活性へのＣ２５介在増強効果を示すグラフである：（ａ）ＣＥＡＣＡＭ１＋ ＮＫ９２ＭＩ ＮＫ細胞およびＣＥＡＣＡＭ１＋ ＭＮＫ４５癌細胞を、Ｃ２５の存在下、種々のＥ：Ｔ比で共培養した場合の、癌細胞の生存率を示す；および、（ｂ）ＣＥＡＣＡＭ１＋ ＮＫ９２ＭＩ ＮＫ細胞およびＣＥＡＣＡＭ１＋ ＭＮＫ１癌細胞を、Ｃ２５の存在下、種々のＥ：Ｔ比で共培養した場合の、癌細胞の生存率を示す。
【図２９】図２９は、ＣＥＡＣＡＭ１＋ 癌細胞に対する、Ｃ２５およびＣ２５由来抗体クローンにより活性化されたＣＥＡＣＡＭ１＋ ＴＡＬＬ−１０４細胞の抗癌活性への増強レベルを示すグラフである：Ｃ２５およびＣ２５由来抗体クローンによって促進されたＴＡＬＬ−１０４細胞による癌細胞死は、ＣＥＡＣＡＭ１＋ ＴＡＬＬ−１０４ Ｔ細胞が、１：１のＥ：Ｔ比でＣＥＡＣＡＭ１＋ 癌細胞（ＭＫＮ４５）と共培養されたとき、対照抗体による癌細胞の生存率と比較して該細胞の生存率として示された。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号１〜８からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９〜１６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１７〜２９からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；配列番号３０〜３８からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号３９〜４６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；および、配列番号４７〜５５からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００２４】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００２５】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号５６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一の場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００２６】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１０６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００２７】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００２８】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号５８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一の場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００２９】
加えて、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１０７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００３０】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００３１】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００３２】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００３３】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００３４】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００３５】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１０９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００３６】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００３７】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００３８】
上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００３９】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００４０】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００４１】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００４２】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００４３】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００４４】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００４５】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００４６】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００４７】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００４８】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００４９】
上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号９０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００５０】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００５１】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００５２】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号７２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号９２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００５３】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００５４】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００５５】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号７４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号９４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００５６】
上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００５７】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００５８】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号７６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号９６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００５９】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００６０】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００６１】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号７８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号９８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００６２】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００６３】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００６４】
上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号８０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１００で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００６５】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００６６】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００６７】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号８２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００６８】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００６９】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００７０】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号８４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００７１】
上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１２０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００７２】
具体的には、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００７３】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００７４】
さらに、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００７５】
本明細書で用いる用語“抗体”とは、抗原に結合し、抗原の作用を妨害するか、または抗原を排除する、免疫タンパク質を意味する。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの５種類の抗体が存在し、それぞれ重鎖定常領域遺伝子μ、δ、γ、αおよびεから生成された重鎖を含んでいる。抗体技術において、ＩｇＧが主に用いられている。ＩｇＧの４種のアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４であり、それらの構造および機能特性は、異なり得る。
【００７６】
また、ＩｇＧは、２つの重鎖タンパク質（約５０ｋＤａ）および２つの軽鎖タンパク質（約２５ｋＤａ）からなる高度に安定な構造（分子量、約１５０ｋＤａ）のＹ字型を有する。抗体の軽鎖および重鎖は、抗体間でアミノ酸配列が同一の定常領域と、抗体間でアミノ酸配列が異なる可変領域に分けられる。重鎖定常領域には、ＣＨ１ドメイン、Ｈ（ヒンジ）ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが含まれる。各ドメインは２つのβシートで構成され、分子内のジスルフィド結合によって連結されている。重鎖および軽鎖の２つの可変領域を組み合わせて、抗原結合部位を形成している。抗原結合部位は、抗体の２つのアームに、各アームに１つずつ存在し、ここで、抗原に結合できる部分はＦａｂ（抗体結合フラグメント）と呼ばれ、抗原に結合できない部分はＦｃ（結晶化可能フラグメント）と呼ばれる。ＦａｂおよびＦｃは、フレキシブルなヒンジ領域により連結されている。
【００７７】
また、本明細書で用いる用語“ＣＤＲ”とは、抗体の重鎖および軽鎖可変領域における各抗体について異なるアミノ酸配列を有する部位である超可変領域を意味し、抗原結合部位を意味する。抗体の立体構造に関して、ＣＤＲは抗体表面にループ形状を形成し、フレームワーク領域（ＦＲ）はＣＤＲを構造的に支持するためにループ下に存在する。重鎖および軽鎖のそれぞれに３つのループ構造があり、これらの６つのループ構造は互いに結合して抗原に直接接触する。
【００７８】
また、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖからなる群より選択されるものであり得る。抗体フラグメントは、抗原との結合刺激を細胞または補体などへ伝えるエフェクター機能を果たす、Ｆｃ領域を除く抗原結合ドメインを意味し、単一ドメイン抗体またはミニボディなどのような第三世代交代フラグメントが含まれ得る。
【００７９】
さらに、抗体フラグメントは、完全構造ＩｇＧと比べてサイズが小さいため、組織および腫瘍への良好な浸透性を有する。細菌内で生産できるため、生産コストが低いという利点があり、Ｆｃがないため、抗原との結合刺激を細胞または補体に伝達する機能が望まれないときに用いられ得る。抗体フラグメントは、ヒト身体での半減期が短いため、インビボ診断に適している。しかしながら、抗体を構成するアミノ酸のうち、いくつかの塩基性、酸性、または中性のアミノ酸が相互に置換されると、等電点（ｐＩ）が変わり得る。抗体の等電点の変化は、インビボでの毒性副作用の減少または抗体の水溶性の増加などの変化をもたらす可能性があるため、治療用抗体の場合、完全構造ＩｇＧは、その親和性および構造形態を考慮して用いられ得る。
【００８０】
また、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントの軽鎖可変ドメインは、配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２または８４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列を有し得るか、または上記の軽鎖可変ドメイン配列と９７％、９８％または９９％の相同性を有し得る。
【００８１】
さらに、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントの重鎖可変ドメインは、配列番号８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１０２または１０４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列を有し得るか、または上記の重鎖可変ドメイン配列と９７％、９８％または９９％の相同性を有し得る。
【００８２】
さらに、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２または８４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１０２または１０４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列と９７％、９８％または９９％の相同性を有し得る。
【００８３】
さらに、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体とは、ＣＥＡＣＡＭ１に結合する抗体を意味する。本明細書で用いる用語“Ｃ２５”とは、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の一態様である。Ｃ２５は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。
【００８４】
また、上記の抗体またはそのフラグメントは、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。本明細書中、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同一である場合、フレームワーク部分は改変され得る。とりわけ、フレームワーク部分のいくつかのアミノ酸配列を改変して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００８５】
上記のＣＤ２５は、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００８６】
Ｃ２５の変異体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９、１０もしくは１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号３０もしくは３１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４７もしくは４８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る。具体的には、本発明の一態様において、Ｃ２５の変異体は、表１に１−１９、１−２３、３−０７、３−２７、４Ｒ９、４Ｒ２０、４Ｒ２６、４Ｒ９＿Ｈ２−２および４Ｒ９＿Ｈ４−ｎ２０として示されている。
【００８７】
また、上記の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、ＣＥＡＣＡＭ１のＮ−ドメインおよびＢ−ドメインをエピトープとして認識する。また、該抗体は、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６またはＣＡＥＣＡＭ８と交差反応しない。
【００８８】
さらに、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、公知のモノクローナル抗体調製技術により容易に調製することができる。モノクローナル抗体製造法は、免疫動物由来のＢリンパ球を用いてハイブリドーマを調製することによるか、またはファージディスプレイ技術を用いることにより実施できるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明はまた、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む抗癌剤を提供する。
【００９０】
抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む本発明の抗癌剤は、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現する癌または腫瘍を処置するために用いられ得る。具体的には、癌細胞の除去に役割を果たす細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、癌または腫瘍細胞のエピトープを認識するとき、ＴＣＲの１つの構成成分であるＣＤ４（分化のクラスター４）に結合したＬＣＫ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）タンパク質は、ＴＣＲの別の構成成分であるＣＤ３ζ（分化のクラスター ３ζ）をリン酸化する。ＺＡＰ７０（ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ７０）タンパク質がリン酸化ＣＤ３ζに結合すると、ＺＡＰ７０タンパク質の末端部分は、ＬＣＫタンパク質により再びリン酸化され、それによりＲＡＳ−ＭＡＰＫ（Ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼ）シグナル伝達を含むＴ細胞炎症経路が活性化されるため、Ｔ細胞が活性化される。
【００９１】
しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現する癌細胞または腫瘍細胞の場合、ＳＨＰ１（Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１）タンパク質は、ＣＥＡＣＡＭ１-ＣＥＡＣＡＭ１相互作用によりＴＣＲのＣＤ４の末端に結合したＬＣＫタンパク質によりリン酸化されるＣＥＡＣＡＭ１ ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ）に結合する。また、ＣＤ３ζの末端は、ＳＨＰ１タンパク質によりＺＡＰ７０と同様に脱リン酸化されるため、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路を含むＴＣＲの下流のシグナル伝達経路は活性化されず、その結果、Ｔ細胞は活性化されない。
【００９２】
従って、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントは、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および癌細胞で発現されるＣＥＡＣＡＭ１への結合により、ＣＥＡＣＡＭ１-ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を事前に阻止することにより抗癌剤として用いられ得る。
【００９３】
また、本明細書で用いる用語“抗癌(anti-cancer)”には、“予防”および“処置”が包含される。本明細書中、“予防”とは、抗癌剤の投与により癌の増殖を阻止し、癌の進行を遅らせる全ての作用を意味し、“処置”とは、本発明の抗体の投与により、癌の症状を改善または軽減する全ての作用を意味する。
【００９４】
また、本明細書で用いる“癌”は、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌および骨髄腫からなる群より選択され得るが、これらに限定されない。それには、固形癌および血液の癌が含まれ、受容体としてＣＥＡＣＡＭ１を有し、その免疫チェックポイント経路が異常である限り、特に限定されない。また、本発明は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを有効成分として含む抗癌アジュバントを提供する。
【００９５】
加えて、本発明は、上記の抗癌アジュバントおよび細胞療法剤を含む、癌を処置するための組成物を提供する。細胞療法剤は、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を含んでもよい。
【００９６】
また、本明細書で用いる用語“細胞療法剤”は、生存している自己細胞、同種細胞および異種細胞をインビトロで増殖および選択して細胞および組織の機能を回復することにより生物学的特性を変化させる一連の作用による予防または処置の目的で用いられる薬剤を意味する。具体的には、それは、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞であり得る。
【００９７】
また、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを用いて癌を処置する方法を提供する。具体的には、該方法は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントと接触させたリンパ球を対象に投与することを含み得る。リンパ球は白血球の一種であり、全ての白血球の約２５％を占め、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞であり得る。また、リンパ球は対象から得られてもよい。好ましくは、リンパ球は、細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の少なくとも１つを含み得る。癌は上記の通りである。
【００９８】
また、本明細書で用いる用語“対象”とは、本発明の抗癌アジュバントを投与することにより疾患を緩和、抑制または処置できる状態にあるヒト、または疾患に罹患しているヒトを意味する。
【００９９】
また、本明細書で用いる用語“接触する”はまた、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントとＣＥＡＣＡＭ１を発現する細胞とを混合することも意味する。
【０１００】
本明細書で用いる用語“投与”とは、適切な方法による有効量の物質の対象への導入を意味し、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを含む組成物の投与は、該物質が標的組織に到達するのを可能にする一般的な投与経路を介して実施することができる。具体的には、投与は、意図する用途に応じて非経腸投与（すなわち、静脈内、皮下、腹腔内または局所投与など）であってよく、好ましくは、静脈内投与であり得る。固形腫瘍への投与の場合、抗体の迅速かつ容易なアクセスの観点から局所投与が好ましいであろう。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率、および疾患の重篤度によって変わる。単回用量は、約０．００１から１０ｍｇ／ｋｇであり、毎日または毎週投与されてもよい。有効量は、患者を処置する医師の裁量に従って調整され得る。
【０１０１】
本発明の癌を処置するための組成物は、癌細胞もしくはそれらの転移を処置するため、または癌の増殖を阻害するために薬学的に有効な量で投与され得る。投与量は、癌の種類、患者の年齢および体重、症状の性質および重篤度、現在の処置の種類、処置回数、投与のタイプおよび経路などによって変わる場合があり、当該分野の専門家により容易に決定され得る。
【０１０２】
本発明の組成物に関して、上記の薬理学的または生理学的構成成分は、同時にもしくは連続して投与されてもよく、または追加の従来の治療薬と組み合わせて連続的にもしくは同時に投与されてもよい。かかる投与は、単回投与でも複数回投与でもよい。上記の要因の全てを考慮し、副作用のない最小量で最大の効果をもたらす量を投与することが重要であり、これは当該分野の熟練者によって容易に決定され得る。
【０１０３】
また、本発明は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントを用いてＣＥＡＣＡＭ１を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。具体的には、ＣＥＡＣＡＭ１を発現する腫瘍細胞を抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはそのフラグメントと接触させることを含み得る。
【０１０４】
本発明の態様
以降、本発明を実施例により詳しく説明する。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明することを意図する。
【実施例】
【０１０５】
実施例１．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体（Ｃ２５）
実施例１．１ 抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の調製
ｐＣｏｍｂ３Ｘベクター（Addgene；カタログ番号６３８９１）に単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態で挿入された抗体フラグメント遺伝子を、ＰＣＲに供し、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３または８５で表される軽鎖可変領域遺伝子、および配列番号８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３または１０５で表される重鎖可変領域遺伝子を得た（それらには、各制限酵素により認識される配列が含まれる）。重鎖遺伝子はＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限酵素で処理され、軽鎖遺伝子はＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理された。
【０１０６】
重鎖および軽鎖遺伝子は、重鎖または軽鎖遺伝子と同じ制限酵素で消化されたｐｃＩＷベクター（Promega；カタログ番号Ｅ１７３１）中に挿入された。その後、重鎖転写ユニットおよび軽鎖転写ユニットの両方を含むベクターを、制限酵素を用いて選択した。選択されたベクターを、QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit（QIAGEN；カタログ番号１２９４３）を用いて抽出し、抽出されたＤＮＡのいくつかを用いた塩基配列分析により、抗体の塩基配列を最終的に同定した。上記の塩基配列に基づいて抗体のアミノ酸配列を分析した。分析した抗体のアミノ酸配列および塩基配列を表１および表２に示す。
【０１０７】
【表１】
0006931072.tif 000002
【表２】
0006931072.tif 000003
【０１０８】
２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度のＥｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ThermoFisher scientific；カタログ番号Ａ１４５２７）３０ｍｌを処理し、３０μｇの抗体ＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、エンハンサー（ThermoFisher；カタログ番号Ａ１４５２４）を、トランスフェクトしたＥｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞に添加し、３７℃、８％ ＣＯ２および１２５ｒｐｍの条件下で、７日間、振とうインキュベーターにより培養して、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を産生した。
【０１０９】
培養後、遠心分離により培養液から分離された上清を、１００μｌのプロテインＡビーズ（Repligen；カタログ番号ＣＡ−ＰＲＩ−０１００）と共に２時間インキュベートした。その後、ビーズを１０ｍｌの結合緩衝液（ThermoFisher Scientific；カタログ番号２１０１９）で洗浄した。その後、２００μｌの溶出緩衝液（ThermoFisher Scientific；カタログ番号２１００４）をビーズに添加して、ビーズに結合した抗体を分離した。分離した抗体を、１０μｌの１．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８）溶液（Bio-Rad；カタログ番号２１０００５８９７）を添加して中和した。
【０１１０】
実施例１．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合能の評価
実施例１．１．ＣＥＡＣＡＭ１ドメインによる抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合能の評価
濃度２．５×１０６細胞／ｍｌのＥｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ThermoFisher scientific；カタログ番号Ａ１４５２７）３０ｍｌを処理し、３０μｇの、ヒト免疫グロブリンＣカッパドメインと連結したＣＥＡＣＡＭ１変異タンパク質のＤＮＡでトランスフェクトした。また、エンハンサー（ThermoFisher；カタログ番号Ａ１４５２４）を、トランスフェクトしたＥｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞に添加し、３７℃、８％ ＣＯ２および１２５ｒｐｍの条件下で、７日間、振とうインキュベーターにより培養した。
【０１１１】
次いで、上清を培養液から分離し、カッパ選択ビーズ（GE Healthcare；カタログ番号１７−５４５８−０１）と共に２時間反応させた。その後、該ビーズを１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、２００μｌの溶出緩衝液を添加して、ビーズからＣＥＡＣＡＭ１変異タンパク質を分離、精製した（図１）。
【０１１２】
精製したＣＥＡＣＡＭ１変異タンパク質（２．５μｇ）それぞれを、１，０００μｌのＰＢＳに溶解させ、各ウェルに２０μｌ／ウェルで分注し、次いで４℃で１６時間反応させた。また、１μｌのＣ２５を１，０００μｌのＰＢＳで希釈し、各ウェルに２５μｌ／ウェルで分注し、次いで、３７℃で１時間反応させた。その後、各ウェルを、９９０μｌのＰＢＳで１０μｌのＴｗｅｅｎ ２０（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｐ９１４６）を希釈することにより調製した洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、１μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させたヒトＩｇＧ（ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ：Sigma；カタログ番号Ａ０１７０）を、５０００μｌのＰＢＳで希釈し、その後、それを各ウェルに２５μｌ／ウェルで分注して、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１３】
反応完了後、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μｌのＴＭＢ溶液（KPL；カタログ番号５２−００−０３）を各ウェルに添加して、発色させた。次いで、２５μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０１１４】
その結果、Ｃ２５の場合、ＮドメインおよびＢドメインが完全な親和性で結合するために必須の部位であることが見いだされた。Ａ１およびＡ２は直接結合には必要ないことが見いだされた。従って、Ｃ２５は主にＣＥＡＣＡＭ１のＮドメインに結合し、完全な親和性での結合にはＢドメインがさらに必要とされる。対照的に、Ｃ２５由来の変異クローンのいくつかは、Ｃ２５と比較して、完全な親和性での結合についてＢドメインへの依存が最小または僅かで、ＣＥＡＣＡＭ１のＮドメインに結合する（図２）。
【０１１５】
実施例１．２．ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質への抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合能の評価
２μｇの組換えＣＥＡＣＡＭ１タンパク質を１０００μｌのＰＢＳ中に溶解させ、それを５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Nunc；カタログ番号４６７６７９）に分注し、４℃で１６時間インキュベートした。その後、３００μｌの３％（ｖ/ｖ）ウシ血清アルブミンを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。Ｃ２５抗体（０．７５μｇ）を１０００μｌのＰＢＳ中に溶解させた。希釈したＣ２５溶液を、ＰＢＳで１：１の体積比で１４回連続希釈した。１５個の異なる希釈したＣ２５溶液のそれぞれを各ウェルに５０μｌ／ウェルで分注し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、各ウェルを、９９０μｌのＰＢＳで１０μｌのＴｗｅｅｎ ２０（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｐ９１４６）を希釈することにより調製した洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、１μｌのＨＲＰと結合させたヒトＩｇＧを、５０００μｌのＰＢＳで希釈し、その後、それを各ウェルに５０μｌ／ウェルで分注して、１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに添加して、発色させ、次いで、５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させた。４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０１１６】
その結果、ＥＣ５０（５０％効果濃度）値は、０．３５ｎＭと測定された（図３）。
【０１１７】
また、２．５μｇの組換えＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａタンパク質（R&D systems；カタログ番号２２４４−ＣＭ）を１０ｍｌのＰＢＳに溶解させ、９６ウェルプレート（Nunc；カタログ番号４６７６７９）に１００μｌ／ウェルで分注して、４℃で一晩インキュベートした。その後、３００μｌの１％（ｖ/ｖ）ウシ血清アルブミンを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１８】
Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２５およびＣ２６抗体（３μｇ）のそれぞれを、１０００μｌのＰＢＳに溶解させた。希釈した抗体それぞれを、ＰＢＳで１：１の体積比で６回連続希釈した。７種の濃度に希釈された抗体のそれぞれを各ウェルに１００μｌ／ウェルで分注し、それを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、各ウェルを、９９０μｌのＰＢＳで１０μｌのＴｗｅｅｎ ２０（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｐ９１４６）を希釈することにより調製した洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、２μｌのＨＲＰと結合させたヒトＩｇＧを、１０ｍｌのＰＢＳで希釈し、その後、それを各ウェルに１００μｌ／ウェルで分注して、１時間インキュベートした。
【０１１９】
反応完了後、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに添加して発色させた。次いで、１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０１２０】
その結果、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２５およびＣ２６抗体はＣＥＡＣＡＭ１タンパク質に結合することが見いだされた（図４）。
【０１２１】
実施例１．３．細胞表面上に発現されるＣＥＡＣＡＭ１タンパク質への抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合能の評価
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Jurkat E6.1 (ATCC; TIB-152TM)）をＣＥＡＣＡＭ１ｃＤＮＡでトランスフェクトし、そして７００μｇ／ｍｌの選択用Ｇ４１８抗生物質で処理した。選択されたＣＥＡＣＡＭ１−Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、２％（ｖ/ｖ）ＦＢＳを添加したＤＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ緩衝液と称する）中に再懸濁させ、１，５００ｒｐｍで遠心分離し、その後、細胞数が３×１０６／ｍｌとなるようにＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。細胞を、Ｕ字底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルで分注した。次いで、細胞を１，５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。回収した細胞を、０．５μｌのヒトＦｃブロック（BD Pharmingen；カタログ番号５６４２２０）溶液を添加した５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた後、細胞を４℃で１５分間インキュベートした（図５）。
【０１２２】
抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはヒトＩｇＧ４（Sigma；カタログ番号Ｉ４６３９）を５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に希釈して、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌおよび０．１５６２５μｇ／ｍｌの濃度を得た。上記希釈された５０μｌの抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはヒトＩｇＧ４を細胞に添加し、４℃で１．５時間インキュベートした。
【０１２３】
抗体と共にインキュベートした細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、１，５００ｒｐｍで溶液を遠心分離する洗浄手順を反復して行った。フィコエリトリンで標識されたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２（以降、ＰＥと称する）（フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２；（Sigma；カタログ番号Ｐ８０４７））を、１：２００の体積比でＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、次いで１００μｌの各溶液を各ウェルに添加し、４℃で３０分間、暗所にて、インキュベートした。
【０１２４】
細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、１，５００ｒｐｍで溶液を遠心分離し、上清を廃棄する洗浄手順を反復して行った。次いで、細胞を１００μｌの固定緩衝液（BD Cytofix（商標）；カタログ番号５５４６５５）中に再懸濁させて、４℃で３０分間、暗所にて、インキュベートした。
【０１２５】
固定緩衝液と共にインキュベートした細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、１，５００ｒｐｍで溶液を遠心分離し、上清を廃棄する洗浄手順を反復して行った。洗浄した細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＰＥ標識細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａで比較した。すべてのＦＡＣＳ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実施した。
【０１２６】
５μｇ／ｍｌの濃度で、標的に結合するＣ２５の最大レベル（ＭＦＩ １８００以上）に到達したが、その結合能は、５μｇ／ｍｌの濃度未満では急低下したことが観察された（図５ａ）。
【０１２７】
上記で調製されたＣＥＡＣＡＭ１−Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＦｃブロック溶液で処理し、１５分間インキュベートした。次いで、ヒトＩｇＧ４と共に４Ｒ９、４Ｒ９＿Ｈ２−２、４Ｒ９＿Ｈ４−ｎ２０および４Ｒ２６を含むＣ２５およびＣ２５由来のクローンを、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で濃度２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００１６μｇ／ｍｌおよび０．０００３２μｇ／ｍｌにそれぞれ希釈し、次いで、細胞に分注して、４℃で１．５時間インキュベートした。ここで、細胞数は１ｘ１０に調整された。抗体と共にインキュベートした細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、１，５００ｒｐｍで溶液を遠心分離する洗浄手順を反復して行った
【０１２８】
ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２（Sigma；カタログ番号Ｐ８０４７）を、ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００の体積比で希釈した後、１００μｌ／ウェルで細胞に添加した。細胞を再懸濁させ、４℃で３０分間、暗所にて、インキュベートした。
【０１２９】
固定緩衝液と共にインキュベートした細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、１，５００ｒｐｍで溶液を遠心分離し、上清を廃棄する洗浄手順を反復して行った。洗浄した細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＰＥ標識細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａによりモニターした。すべてのＦＡＣＳ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実施した。
【０１３０】
図５ａの結果と一致して、Ｃ２５は、５μｇ／ｍｌの濃度でその標的結合の最大レベル（ＭＦＩ ８００８以上）を示したが、結合能は５μｇ／ｍｌの濃度未満では急低下した。一方で、Ｃ２５由来クローン４Ｒ９、４Ｒ２６および４Ｒ９＿Ｈ２−２の標的結合能は、０．２μｇ／ｍｌの濃度でさえもその最大レベルの８０％またはそれ以上まで維持された。加えて、４Ｒ９＿Ｈ４−ｎ２０クローンのＭＦＩ値は、最大１２，０００以上に達し、他のクローンのＭＦＩ値よりも１．５倍高かった（１２，０００ ｖｓ ８，０００）が、Ｃ２５と同様に、５μｇ／ｍｌの濃度未満では、その結合能は急低下した（図５ｂ）。
【０１３１】
実施例１．４．各抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の標的結合親和性の測定
Ｃ２５、４Ｒ９、４Ｒ２６、４Ｒ９＿Ｈ２−２、４Ｒ９＿Ｈ４−ｎ２０および４Ｒ９＿Ｈ４−ｎ２０ＨＣ＋４Ｒ２６ＬＣのＣＥＡＣＡＭ１への定量的結合能を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（Pall ForteBio）を用いて測定した。実施例１で単離および精製された濃度４００ｎＭの抗体を、１：１で６回に連続希釈し、得られた抗体溶液、濃度４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび６．２５ｎＭを、Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェルプレート（Greiner；カタログ番号６５５２０９）に一列に分注した。各列の最後のウェルには、濃度０ｎＭの抗体のサンプルを入れた。組換えヒトＣＥＡＣＡＭ１タンパク質（R&D Systems；カタログ番号２２４４−ＣＭ）を希釈し、６．２５μｇ／μｌの濃度を得て、別のカラムの各ウェルに２００μｌ／ウェルで分注した。
【０１３２】
洗浄緩衝液、中和緩衝液、ベースライン緩衝液については、試薬／キネティクス（Kinetics）緩衝液（１０Ｘ）（Fortebio；カタログ番号１８−１０９２）を１：１０で希釈し、２００μｌ／ウェルで一列の各カラムに分注し、再生緩衝液を各ウェルに２００μｌ／ウェルで分注した。Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェルプレートを別に準備し、試薬／キネティクス緩衝液（１Ｘ）を、一列に用いられる多数のバイオセンサーの各ウェルに２００μｌ／ウェルで分注し、バイオセンサー／抗Ｈｉｓ（Ｈｉｓ１Ｋ）（Fortebio；カタログ番号１８−５１２０）カセットを取り付けた。結合および解離時間を、それぞれ３００秒および６００秒に設定し、ＫＤ値を測定した。
【０１３３】
その結果、ＣＥＡＣＡＭ１に対するそれらの親和性は、１．８２ｎＭから３９．０ｎＭの親和性（ＫＤ）値であると決定された（図６）。
【０１３４】
実施例２．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の物性評価
実施例２．１．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の等電点の決定
２０ｍｌのＩＥＦアノード緩衝液（５０ｘ）を、９８０ｍｌの脱イオン水（以降、ＤＷと称する）と混合して、１Ｘ ＩＥＦアノード緩衝液を作製し、２０ｍｌのＩＥＦカソード緩衝液 ｐＨ３−１０（１０Ｘ）を１８０ｍｌのＤＷと混合して、１Ｘ ＩＥＦカソード緩衝液を作製した。１Ｘ ＩＥＦアノード緩衝液および１ｘＩＥＦカソード緩衝液を４℃に冷却し、用いた。
【０１３５】
ＩＥＦゲル（Invitrogen/pH 3-10 IEF ゲル；1.0 mm x 10 ウェル／EC6655BOX）を用いて、上部チャンバーに２００ｍｌの１Ｘ ＩＥＦカソード緩衝液を充填し、下部チャンバーに６００ｍｌの１Ｘ ＩＥＦアノード緩衝液を充填した。１．１２ｍｇ／ｍｌ濃度のＣ２５を１０μｌとＩＥＦサンプル緩衝液（ｐＨ３−１０、２Ｘ）１０μｌとの混合液を含む２０μｌの溶液のうち１５μｌを負荷し、５μｌのＩＥＦマーカー ３−１０（SERVA/10 mg/mL/SERVA 液体混合物；３９２１２．０１）をマーカーとして用いた。
【０１３６】
電気泳動を、電圧１００Ｖ：１時間、２００Ｖ：１時間および５００Ｖ：３０分の３段階に変えて行い、１２％ＴＣＡ溶液を用いて３０分間固定した。固定後、等電点を、クーマシーブルーＲ−２５０イントロンバイオテクノロジー（IBS-BC006）を用いて評価した。
【０１３７】
その結果、Ｃ２５の実際の等電点の値は８．０となり、理論値の７．７６よりわずかに高くなった（図７）。
【０１３８】
実施例３．Ｔ細胞活性化に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の効果の測定
実施例３．１．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるＴ細胞活性化の評価
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１（ATCC； TIB-152TM)細胞を、１０％（ｖ/ｖ）ウシ胎仔血清（Gibco；カタログ番号１６００００４４）および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（100X; Gibco；カタログ番号１５１４０１２２）を添加した完全イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM; Invitrogen；カタログ番号１２４４００５３）中に、１ × １０５／２００μｌで再懸濁させ、プレートに被覆された抗ＣＤ３（OKT3; ０．１μｇ／ｍｌ； eBioscience；カタログ番号１６−００３７）と共に、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのＣ２５の存在下、３７℃、５％ ＣＯ２で９６時間、インキュベートした。ＨｕＩｇＧ４を対照として用いた。
【０１３９】
９６時間後、細胞および培地を回収し、１，５００ｒｐｍで遠心した。上清をＩＬ−２測定のために取り置き、残留する細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で置換し、そして４℃で１５分間、Ｆｃ受容体を用いるブロッキング工程に供した。
【０１４０】
細胞を、抗ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７抗体または抗ＣＤ６９−ＡＰＣ抗体（eBioscience;抗ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７：カタログ番号２５−０２５９；抗ＣＤ６９−ＡＰＣ：カタログ番号１７−０６９９）と共に、４℃で１５分間、インキュベートした。
【０１４１】
細胞を最大２００μｌまでのＦＡＣＳ緩衝液で満たし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、上清を除去した。細胞を新鮮なＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、この手順を３回反復して、結合していない抗体を完全に除去した。細胞を、１％（ｖ/ｖ）パラホルムアルデヒドを添加したＤＰＢＳに再懸濁させて、４℃で３０分間固定化した。
【０１４２】
細胞をｌＸ ＦｏｘＰ３染色緩衝液（eBioscience；カタログ番号００−５５２３−００）中に再懸濁させ、遠心した。この手順を２回反復した後、異なる色素で標識された抗Ｋｉ６７抗体（eBioscience；カタログ番号３５０５２０）を、１： １００体積比で、１Ｘ ＦｏｘＰ３染色緩衝液で希釈し、それを細胞に添加して、総量５０μｌを得た後、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。細胞を１Ｘ ＦｏｘＰ３染色緩衝液で満たし、遠心した。洗浄を３回繰り返した後、細胞を、ＦＡＣＳ ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置にて活性化ＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋細胞およびさらにＫｉ６７＋ 増殖集団を計数するためにフローサイトメトリーを適用し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した（図８および１０）。
【０１４３】
その結果、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞のＣＣＭ１誘導条件下（OKT3: ０．１μｇ／ｍｌ、ｃＩＭＤＭ中、４日間培養）、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの抗体濃度でＣ２５で処理したとき、高レベルの活性化が観察された。より具体的には、ｈｕＩｇＧ４で処理した対照と比較して、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化ＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋ 集団の割合および数が２倍以上増加し、増殖するＫｉ６７＋細胞の割合および数も２倍以上増加した（図９ｂおよび１１ｂ）。
【０１４４】
実施例３．２．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるＴ細胞のＩＬ−２分泌の評価
抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるＴ細胞からのＩＬ−２分泌の変化を評価するために、抗ＩＬ−２抗体（捕捉Ａｂ：eBioscience；カタログ番号１４−７０２９−８５）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ 炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６）で最初に希釈した。その後、希釈した抗ＩＬ−２抗体溶液を、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μｌ／ウェルで分注し、４℃で１６〜１８時間インキュベートした。その後、９６ウェルプレートをＤＰＢＳで洗浄し、２００μｌのブロッキング緩衝液（SuperBlock（商標）ブロッキングバッファー：ThermoFisher Scientific；カタログ番号３７５１５）を各ウェルに添加して、室温で３０分間インキュベートした。
【０１４５】
標準曲線を得るために、ＩＬ−２組換えタンパク質（R&D Systems；カタログ番号Ｐ６０５６８）をブロッキング緩衝液で希釈して濃度２０μｇ／ｍｌとした。希釈したＩＬ−２組換えタンパク質溶液を１：１の体積比で１１回連続希釈した。１２個のＩＬ−２組換えタンパク質試料および実施例３．１にて−８０℃で貯蔵したＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞培養液からの上清を、抗ＩＬ−２抗体でコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルで分注し、室温で２時間インキュベートした。
【０１４６】
該９６ウェルを、９９０μｌのＰＢＳで１０μｌのＴｗｅｅｎ ２０（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｐ９１４６）を希釈することにより調製した洗浄緩衝液で４回洗浄した後、ビオチン結合抗ＩＬ−２抗体（検出抗体：eBioscience；カタログ番号１３−７０２８）をブロッキング緩衝液で１：１，０００の体積比で希釈して調製した溶液を、１００μｌ／ウェルずつ各ウェルに分注し、その後、室温で２時間インキュベートした。
【０１４７】
９６ウェルプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Sigma；カタログ番号Ｓ５５１２）をブロッキング緩衝液で１：１，０００の体積比で希釈して調製した溶液を、１００μｌ／ウェルで各ウェルに分注し、それを室温で２時間インキュベートした。
【０１４８】
９６ウェルプレートを洗浄緩衝液で再び４回洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（KPL；カタログ番号５２−００−０２）を各ウェルに１００μｌ／ウェル分注し、それを１０分間インキュベートした。次いで、停止溶液（KPL；カタログ番号５０−８５−０５）を各ウェルに１００μｌ／ウェル添加し、反応を停止させた。分子動力学読み取り装置を用いて４５０ｎｍの波長でＯ.Ｄ値を測定した。測定値を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５．４.１を用いて分析した。
【０１４９】
その結果、細胞を、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１のＣＥＡＣＡＭ１誘導条件下（０．１μ／ｍｌのＯＫＴ３、４日間培養）、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの抗体濃度でＣ２５で処理したとき、上清を用いた測定された分泌ＩＬ−２レベルは、対照のそれよりも約３倍高かった（図９ｃおよび１１ｃ）。
【０１５０】
実施例３．３．抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体によるＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＴ細胞の活性化の評価
ＥＦ１プロモーター−ＣＥＡＣＡＭ１−ＧＦＰベクターを、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞中にトランスフェクトし、その後、選択のために、７００μｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８二硫酸塩溶液（Sigma；Ｇ８１６８）で処理した。ＧＦＰ＋ ＣＥＡＣＡＭ１＋細胞を蛍光活性化セルソーターを用いて分離し、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞）を構築した。
【０１５１】
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１(ATCC; TIB-152（商標）)細胞由来のＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１Ｘ ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ２００μｌに再懸濁して、１×１０５の細胞数とし、その後、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのＣ２５の存在下で４８時間、プレートにコーティングしたＯＫＴ３（０．１または１μｇ／ｍｌ；eBioscience；１６−００３７）で刺激した。ＨｕＩｇＧ４を対照として用いた。
【０１５２】
４８時間後、細胞および培地を回収して、１，５００ｒｐｍで遠心した。上清を、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡのために−８０℃で貯蔵し、残りの細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で置換し、そしてＦｃ受容体のブロッキングを４℃で１５分間行った。細胞をＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７抗体または抗ＣＤ６９−ＡＰＣ抗体で処理し、４℃で１５分間インキュベートした。
【０１５３】
細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で最大２００μｌまで満たし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を新鮮なＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁後、この手順を３回繰り返し、結合していない抗体を完全に除去した。細胞を、１％（ｖ/ｖ）パラホルムアルデヒドを添加したＤＰＢＳに再懸濁させて、４℃で３０分間固定化した。
【０１５４】
細胞を、ｌＸ ＦｏｘＰ３染色緩衝液で最大２００μｌまで満たし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、上清を除去した。この手順を２回繰り返した後、異なる色素で標識した抗Ｋｉ６７抗体を、１： １００の体積比で希釈して、それを細胞に添加し、最終容量５０μｌとし、その後、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。
【０１５５】
細胞をｌＸ ＦｏｘＰ３染色緩衝液で最大２００μｌまで満たし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、上清を除去した。この手順を３回繰り返した後、最終的にＦＡＣＳ緩衝液に置き換えて、それらのうち活性化されたＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋細胞を増殖しているＫｉ６７＋細胞をＦＡＣＳ ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置で同定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いた分析した（図１２および１５）。
【０１５６】
その結果、抗ＣＥＡＣＡＭ１の存在下で低濃度のＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ）により、ＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、高レベルの活性化を示した。より具体的には、ＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋集団は、ｈｕＩｇＧ４処理群のそれと比較して、１．５倍（２５μｇ／ｍｌのＣ２５）または４倍（１０μｇ／ｍｌのＣ２５）もしくはそれ以上活性化された（図１３ｂおよび１４ｂ）。
【０１５７】
また、抗ＣＥＡＣＡＭ１の存在下、高濃度のＯＫＴ３（１μｇ／ｍｌ）により、ＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、高レベルの活性化を示した。より具体的には、ＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋集団は、ｈｕＩｇＧ４処理群のそれと比較して、２倍（２５μｇ／ｍｌのＣ２５）または６倍（１０μｇ／ｍｌのＣ２５）もしくはそれ以上活性化された（図１６ｂおよび１７ｂ）。
【０１５８】
実施例３．４．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｔ細胞のＩＬ−２分泌の評価
抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体により誘導される、ＣＥＡＣＡＭ１過剰発現Ｔ細胞のＩＬ−２分泌レベルの変化を評価するために、実施例３．３で−８０℃で貯蔵したＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ Ｔ細胞から分離した上清を、実施例３．２と同じ方法でＥＬＩＳＡに適用した。
【０１５９】
その結果、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、培養条件下（０．１μｇ／ｍｌの濃度のＯＫＴ３、２日間培養）、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの抗体濃度でＣ２５で処理したとき、上清を用いて測定されたＩＬ−２分泌レベルは、対照よりも２０倍以上高かった（図１３ｃおよび１４ｃ）。
【０１６０】
さらに、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＣＥＡＣＡＭ１-Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、別の培養条件下（１μｇ／ｍｌの濃度のＯＫＴ３、２日間培養）、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの抗体濃度でＣ２５で処理したとき、上清を用いて測定されたＩＬ−２分泌レベルは、対照よりも１．５倍以上高かった（図１６ｃおよび１７ｃ）。
【０１６１】
実施例３．５．ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼアッセイを用いた抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるＴ細胞活性化の評価
Ｊｕｒｋａｔ−ＧＦＰ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞（ＣＥＡＣＡＭ１を発現しない細胞、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター過剰発現細胞）またはＪｕｒｋａｔ−ＣＣＭ１／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞（ＣＥＡＣＡＭ１過剰発現細胞、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター過剰発現細胞）を、各ウェルに６ｘ１０５の細胞数で再懸濁し、０．０５または０．１μｇ／ｍｌのＯＫＴ３でコーティングした９６ウェルプレートに分注し、実施例１で調製した１０μｇ／ｍｌ濃度の各抗体および抗ＣＤ２８（２８．２；eBioscience；カタログ番号１６−０２８９−８５；１μｇ／ｍｌ）を添加した。ヒトＩｇＧ４を陰性対照として用いた。
【０１６２】
６時間インキュベート後、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、８０μｌの受動的溶解緩衝液（passive lysis buffer）に溶解させた。２０μｌの細胞溶解液を白色９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注し、その後、それをルミノメーターデバイスに入れた。ルシフェラーゼ緩衝液をルミノメーターインジェクターにローディングし、８０μｌのルシフェラーゼ緩衝液を各ウェルに添加して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１６３】
その結果、ＣＣＭ１依存性Ｔ細胞阻害に対するＣ２５による阻害効果が、６時間の培養条件でＣＥＡＣＡＭ１を発現しなかったＪｕｒｋａｔ−ＧＦＰ/ＮＦＡＴ−ｌｕｃでは観察されなかったが、６時間の培養中、Ｃ２５によるＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴ活性化の増大レベルが、０．０５および０．１μｇ／ｍｌの両濃度でＯＫＴ３と共に培養したＪｕｒｋａｔ−ＣＣＭ１/ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞で２倍以上高かった（図１８および１９）。
【０１６４】
また、Ｃ２５由来抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で処理した試験群は、０．１μｇ／ｍｌ濃度のＯＫＴ３でのＩｇＧ４処理群の活性よりも、１．５から２倍高いＮＦＡＴ−ｌｕｃルシフェラーゼ活性を示し、それは統計学的に有意であった（図２０）。
【０１６５】
実施例４．ヒトおよびサル組織におけるＣＥＡＣＡＭ１の発現評価
ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標） Ｓｕｌｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（ThermoFisher Scientific；カタログ番号２１３３８）の１０ｍＭ溶液を調製し、１ｍｇのＣ２５あたり１３．３μｌの溶液を添加し、４℃で２時間、ビオチニル化させた。ヒトおよびサルＴＭＡスライドを、オーブン中、６０℃で１時間、脱パラフィン化した。水和を、キシレン（１００％）、アルコール（９０％）、アルコール（８０％）およびアルコール（アルコール−ＤＷ）の順に徐々に行った。
【０１６６】
抗原賦活化（antigen retrieval）のために、ＴＭＡスライドを、１．５ＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）緩衝液を含む水浴中、一定温度で処理し、１００℃で２０分間インキュベートした。細胞内ペルオキシダーゼ活性を防ぐため、１００μｌの３％過酸化水素をそれに添加し、６分間インキュベートして、１００μｌの５％（ｖ/ｖ）正常ウマ血清をそれに添加し、３０分間インキュベートした。
【０１６７】
一次抗体（ビオチン結合ｈＩｇＧ４またはＣ２５；１ｍｇ／ｍｌ）を、１：１または１：５の体積比で１００μｌの染色緩衝液で希釈し、室温にて２時間インキュベートした。１００μｌのＡＢＣ試薬を添加し、３０分間インキュベートした。ＤＡＢ基質キット（VECTOR LABORATORIES；カタログ番号ＳＫ−４１００）を添加し、２分間発色させた後、分析のために、ヘマトキシリンで比較染色した。正常細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１発現レベルは顕著に低いため、抗体は、比較的高濃度で用いた。
【０１６８】
カニクイザルの正常組織でのＣ２５の染色強度は、ヒト正常組織でのそれと同様であり、正常組織でのＣＥＡＣＡＭ１の発現レベルは顕著に低かった。従って、ＣＥＡＣＡＭ１発現は、組織を高濃度のＣ２５で処理したときのみ検出された（図２１）。Ｃ２５の対照として、ヒトＩｇＧ４を同じ濃度で用いた（図２２）。
【０１６９】
実施例５．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の交差反応性の評価
実施例５．１．ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体を用いた、ＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の交差反応性の評価
組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａタンパク質（R&D systems；カタログ番号２２４４−ＣＭ、ＨＣＣＭ１）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−５／ＣＤ６６ｅタンパク質（R&D systems；カタログ番号４１２８−ＣＭ、ＨＣＣＭ５）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−６／ＣＤ６６ｃタンパク質（R&D systems；カタログ番号３９３４−ＣＭ、ＨＣＣＭ６）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−３／ＣＤ６６ｄタンパク質（Sino Biological；カタログ番号１１９３３−Ｈ０８Ｈ、ＨＣＣＭ３）、組換えマウスＰＤ−１ Ｆｃキメラタンパク質（R&D systems；カタログ番号１０２１−ＰＤ、ｍＰＤ−１−Ｆｃ）、組換えＣＥＡＣＡＭ１−Ｆｃ（ＩｇＧ４）タンパク質（Mogam、自社生産、ＨＣＣＭ１−Ｆｃ）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａタンパク質バルク（R&D systems；カタログ番号２２４４−ＣＭ、ＨＣＣＭ１（ｂｕｌｋ））およびマウスＣＥＡＣＡＭ１／ＣＤ６６ａタンパク質（Sino Biological；カタログ番号５０５７１−Ｍ０８Ｈ、マウスＣＣＭ１）（各２．５μｇ）の全てを、１０ｍｌのＰＢＳにそれぞれ溶解させ、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Nunc；カタログ番号４６７６７９）に分注し、それを４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを３００μｌの１％（ｖ/ｖ）ウシ血清アルブミンで処理し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１７０】
３μｇのＣ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２５およびＣ２６抗体を、それぞれ１０００μｌのＰＢＳに溶解させた。希釈した抗体を、各タンパク質でコーティングした各ウェルに１００μｌ／ウェルで分注し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、各ウェルを、９９０μｌのＰＢＳで１０μｌのＴｗｅｅｎ ２０（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｐ９１４６）を希釈することにより調製した洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、２μｌのＨＲＰ結合ヒト抗ＩｇＧ−Ｆａｂ抗体（抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ；Sigma；カタログ番号Ａ０２９３）を、１０ｍｌのＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルで各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。
【０１７１】
反応完了後、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに添加して、発色誘導させた。その後、１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。
【０１７２】
その結果、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２５およびＣ２６抗体の全てが、ＨＣＣＭ１、ＨＣＣＭ１（バルク）およびＨＣＣＭ１−Ｆｃに対して高レベルの結合能を示した。Ｃ１７、Ｃ１９、Ｃ２２を除くＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ＨＣＣＭ３、ＨＣＣＭ５およびＨＣＣＭ６に対する基底レベルの結合能を示した（図２３）。従って、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ抗体はＣＥＡＣＡＭ１のみに特異的に結合すると結論付けられた。
【０１７３】
実施例５．２．ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いた、ＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質と抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体との交差反応性
組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａタンパク質（R&D systems；カタログ番号２２４４−ＣＭ、ＨＣＣＭ１）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−５/ＣＤ６６ｅタンパク質（R&D systems；カタログ番号４１２８−ＣＭ、ＨＣＣＭ５）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−６／ＣＤ６６ｃタンパク質（R&D systems；カタログ番号３９３４−ＣＭ、ＨＣＣＭ６）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−３／ＣＤ６６ｄタンパク質（Sino Biological；カタログ番号１１９３３−Ｈ０８Ｈ、ＨＣＣＭ３）、ヒトＢ７−Ｈ５/Ｇｉ２４/ＶＩＳＴＡタンパク質（Sino Biological；カタログ番号１３４８２−Ｈ０８Ｈ、ＨＶＩＳＴＡ）、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａタンパク質バルク（R&D systems；カタログ番号２２４４−ＣＭ、ＨＣＣＭ１（ｂｕｌｋ））、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ１−Ｎドメイン−カッパタンパク質（Mogam、自社生産、ＨＣＣＭ１−Ｎドメイン−カッパ）およびＢＳＡタンパク質（各２．５μｇ）の全てを、１０ｍｌのＰＢＳにそれぞれ溶解させ、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに分注し、それを４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを３００μｌの１％（ｖ/ｖ）ウシ血清アルブミンで処理し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１７４】
Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２５およびＣ２６抗体（３μｇ）の各々を、１０００μｌのＰＢＳに溶解させた。希釈した抗体を、各タンパク質でコーティングした各ウェルに１００μｌ／ウェルで分注し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、各ウェルを、９９０μｌのＰＢＳで１０μｌのＴｗｅｅｎ ２０（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｐ９１４６）を希釈することにより調製した洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、２μｌのＨＲＰ結合ヒト抗ＩｇＧ−Ｆｃ抗体（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ；Sigma；カタログ番号Ａ０１７０）を、１０ｍｌのＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルで各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。
【０１７５】
反応完了後、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ溶液を添加して、発色を誘導した。その後、１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。
【０１７６】
その結果、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２５およびＣ２６抗体の全てが、ＨＣＣＭ１、ＨＣＣＭ１（バルク）およびＨＣＣＭ１−Ｎドメイン−カッパに対して高レベルの結合能を示し、かつＣ１７、Ｃ１９、Ｃ２２を除くＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ＨＣＣＭ３、ＨＣＣＭ５およびＨＣＣＭ６に対する基底レベルの結合能を示した（図２４）。従って、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ抗体はＣＥＡＣＡＭ１のみに特異的に結合すると結論付けられた。
【０１７７】
実施例５．３．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を用いた、細胞表面に発現されるＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質の交差反応性の評価
ＨＥＫ２９３細胞に、各１０μｇの、対照ベクターとしてのｐＥＦ１α−ＡｃＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech、カタログ番号６３１９７３）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８プラスミドベクターを添加し、次いで、パルス電圧１，１００Ｖ、パルス幅２０ｍｓおよびパルス数２の条件下でトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡で確認した。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（ThermoFisher Scientific；カタログ番号１２６０５０１０）１ｍｌで処理して分離させ、９ｍｌの１０％（ｖ/ｖ）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Gibco、カタログ番号１１９９５−０６５）に再懸濁させて、１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、得られた上清を除去した。
【０１７８】
ＰＢＳで１回洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させて５ｘ１０５細胞／１００μｌ濃度とした。ヒトＦｃブロック溶液をサンプルに１μｌ／サンプルで添加し、それを４℃で１０分間インキュベートした。細胞をｈｕｌｇＧ４または列記した抗ＣＥＡＣＡＭ１クローンのいずれか１つと共に１μｇ／５ｘ１０５細胞で処理し、それを４℃で１０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、ＰＥ標識したヤギ抗ｈｕＩｇＧ４抗体を１：２００の体積比でＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、１００μｌ／サンプルで該サンプルに添加し、それを４℃で３０分間インキュベートした。サンプルにＦＡＣＳ緩衝液を最大２００μｌまで充填し、その後１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、得られた上清を除去した。細胞を再懸濁するために、固定緩衝液（３００μｌ）を添加した。ＧＦＰを発現する細胞をＦＡＣＳ ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置で選択し、ＣＥＡＣＡＭメンバーの発現を、各ＣＥＡＣＡＭメンバーに特異的な抗体（表３）を用いてそれぞれ評価した。また、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合を、ＰＥ蛍光チャネルで評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
その結果、Ｃ２５およびＣ２５由来クローンは、ＣＥＡＣＡＭ１が属するＣＥＡＣＡＭメンバーのうちＣＥＡＣＡＭ１のみに特異的に結合することが見いだされた（図２５）。
【０１８１】
さらに、ＨＥＫ２９３細胞を、それぞれ１０μｇの対照ベクター、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ１プラスミドベクターおよびヒトＣＥＡＣＡＭ１プラスミドベクターと混合した後、パルス電圧１，１００Ｖ、パルス幅２０ｍｓおよびパルス数２の条件下で、Neonトランスフェクションシステムを用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡で確認し、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液で処理して分離させ、ＦＡＣＳ緩衝液に置き換えて、反応を停止させた。
【０１８２】
ＰＢＳで１回洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させて、５ ｘ １０５細胞／１００μｌの濃度を得た。ヒト Ｆｃブロック溶液をサンプルに１μｌ／サンプルで添加し、それを４℃で１０分間インキュベートした。サンプルを１μｇ／５ｘ１０５細胞の濃度のヒトＩｇＧ４またはＣ２５で処理し、それを４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、ＰＥ標識したヤギ抗ｈｕＩｇＧ４抗体を、１： ２００の体積比でＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、サンプルに１００μｌ／サンプルで添加し、それを４℃で３０分間インキュベートした。サンプルをＦＡＣＳ緩衝液で２００μｌまで満たし、その後１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、得られた上清を除去した。固定緩衝液（３００μｌ）を加えて細胞を再懸濁させた。ＧＦＰを発現する細胞を、ＦＡＣＳ ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置で選択し、ＣＥＡＣＡＭメンバーそれぞれの発現を、ＣＥＡファミリーの各メンバーに特異的な抗体を用いて評価した。また、Ｃ２５との結合をＰＥ蛍光チャネルによって評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０１８３】
その結果、Ｃ２５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１のみでなく、サル（カニクイザル）ＣＥＡＣＡＭ１もまた認識することが見いだされた（図２６ａ）。Ｃ２５由来クローンはまた、カニクイザルのＣＥＡＣＡＭ１およびヒトタンパク質も認識した（図２６ｂ）。
【０１８４】
実施例６．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の抗癌効果の評価
癌細胞（ＭＫＮ４５：ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ；カタログ番号ＪＣＲＢ０２５４；ＭＫＮ１：ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ；カタログ番号ＪＣＲＢ０２５２）を、ＲＰＭＩ １６４０培地（ThermoFisher Scientific；カタログ番号１１８７５０９３）に１ｘ１０４／２００μｌの濃度で再懸濁させて、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μｌ／ウェルで分注し、３７℃および５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。非結合の細胞を培地と共に除去し、ＴＡＬＬ−１０４（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１１３８６ＴＭ）またはＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−２４０８ＴＭ）細胞を、癌細胞に対して種々の比（０：１、０．１：１、１：１、１０：１）でそれに添加した。本明細書中、Ｃ２５もまた、１０μｇ／ｍｌの濃度でウェルに添加された。対照として、ｈｕＩｇＧ４を同様の方法で処理した。
【０１８５】
６時間の共培養後、非結合の可溶性細胞を培地と共に除去し、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Aqueous One 溶液（Promega；カタログ番号Ｇ３５８２）、ＭＴＳアッセイ試薬を、１：４の比でＲＰＭＩ １６４０培地で希釈した。希釈した溶液をウェルに２００μｌ／ウェルで加え、暗所でさらに３時間培養した。その後、各サンプルのＯ.Ｄ値を分光光度計で４９０ｎｍの波長で測定し、測定値をＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５．４.１プログラムを用いて分析した。
【０１８６】
その結果、ＣＴＬ（図２７：ＴＡＬＬ−１０４）またはＮＫ（図２８：ＮＫ−９２ＭＩ）細胞の抗癌効果を、Ｃ２５のインビトロでの有効性を評価する方法で評価したとき、Ｃ２５は、ＣＥＡＣＡＭ１を高レベルで発現したＭＫＮ４５胃癌細胞株の場合、ＣＴＬおよびナチュラルキラー細胞の抗癌免疫反応を増加させたが、一方で、ＣＥＡＣＡＭ１発現が検出されなかったＭＫＮ１胃癌細胞株の場合、Ｃ２５の抗癌効果は観察されなかったことを見い出した（図２７および２８）。
【０１８７】
加えて、Ｃ２５由来抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体クローンのインビトロ効果を、上記と同様の方法でＣＥＡＣＡＭ１＋ ＭＫＮ４５癌細胞株で試験したとき、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体による癌細胞死は、対照と比較して、４０から５０％のレベルに低下した（図２９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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