(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３のうちのいずれか１種を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:４を含む重鎖可変領域と、を含むことを特徴とする抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖の定常領域は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を含むポリペプチド又はタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ発現ベクターであって、前記組換えＤＮＡ発現ベクターが、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体の前記重鎖可変領域、重鎖の定常領域、前記軽鎖可変領域及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターが導入された宿主細胞であって、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌又はイーストを含み、好ましくは哺乳動物細胞を含み、さらに好ましくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞を含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を含む全長抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を含む二重特異抗体又は抗体薬物複合体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を含む人工ベクター、薬物又は薬物組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を含む検出試薬又は検出キット。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を含む抗体を含む組成物であって、腫瘍及び黄斑変性症を含む、新生血管による疾患を治療するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物製薬の技術分野に関し、具体的には改良型抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の増殖が新生血管の形成に依存することは、腫瘍生物学において既に徹底的に研究されている。血管新生が酸素、栄養物質、成長因子、ホルモン及びタンパク質分解酵素を提供でき、それにより腫瘍細胞の遠い所への拡散及び転移を促進し、腫瘍の増殖及び悪化を加速する。血管新生は、非常に複雑な動的過程であり、多くの血管新生促進分子／抑制分子によって調節される。血管新生のスイッチは、血管新生促進が血管新生抑制を超えたという悪性マーカーであると考えられる。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ軸が多重シグナル・ネットワークを活性化し、上皮細胞の生存、有糸分裂、転移及び分化、血管浸透を引き起こし、ＶＥＧＦ及びその受容体は、正常と病的血管新生において中枢作用を発揮している。ヒトの様々な癌症には、増加した腫瘍血管新生作用及び腫瘍の血管新生促進因子の発現が腫瘍の等級付け及び悪性であるか否かに関連することが証明されている。
【０００３】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管透過性因子とも呼ばれ、内皮細胞の特異的有糸分裂源であり、有効な血管形成と透過性誘導因子でもあり、既に鑑定された対応する受容体がＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とも呼ばれ、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体、胎児肝キナーゼ−１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、神経フィブリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）、神経フィブリン−２である。ＶＥＧＦＲ−２は、血管内皮細胞の主要なＶＥＧＦ受容体であり、糖タンパク質であり、その細胞外ドメインに７つの免疫グロブリン様領域（配位体結合ドメイン及び受容体二量化ドメインを含む）が含まれ、細胞内にチロシンキナーゼ触媒用ドメインが挿入され、主に内皮細胞に発現し、その他は、例えば巨核球、網膜前駆細胞、間葉系幹細胞、黒色腫細胞、脳腫瘍及び一部の白血病細胞などに発見する。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ−２受容体は、重要な血管内皮細胞特異的因子シグナル伝達経路の分子として腫瘍新生血管の新生に関与し、ＶＥＧＦの主要な生物学的機能がいずれもＶＥＧＦＲ−２により実現され、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦとが結合した後に二量化され、そしてＶＥＧＦＲ−２細胞内のチロシン残基自体がリン酸化され、それにより活性化されて細胞膜／細胞質キナーゼ・カスケード反応シグナルを細胞核に伝達し、血管内皮細胞の増殖、生存、細胞骨格の再配列、細胞の遊走及び遺伝子発現などを含む内皮細胞の一連の変化を発生させ、最終的に血管増殖を引き起こすことが可能である。
【０００４】
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２シグナル経路が腫瘍の発生進行において重要な役割を果たすため、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２のシグナル経路に対処する薬物が多くあり、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブ及び抗ＶＥＧＦＲ−２抗体であるラムシルマブである。
【０００５】
抗体は、生物医薬品の中で技術含有量が最も高く、難易度が最も大きい薬物であり、２０１２年から、全世界で販売量のトップ１０の単剤のうちの６つが抗体系薬物であり、したがって、抗体系薬物の潜在的な市場が非常に大きい。抗体薬物スクリーニングにおいて最も一般的に応用される技術は、ファージ・ディスプレイ抗体ライブラリ技術であり、ファージ・ディスプレイ抗体ライブラリ技術は、ファージ・ディスプレイ技術から開発した遺伝子抗体工事の新たな技術であり、異なる物種の全ての抗体の可変領域遺伝子を含む遺伝子ライブラリを、ファージ表面にディスプレイされるタンパク質ライブラリに変換でき、モノクローナル抗体を体外でより容易に、迅速に、高効率的に製造できるだけでなく、モノクローナル抗体のヒト化の新たなアプローチを開拓し、ヒト・モノクローナル抗体の製造の開発を促進する。弊社の特許番号ＣＮ１０３３３３２４７Ｂの特許は、コンピュータ支援設計及びファージ・ディスプレイ抗体ライブラリ技術によりスクリーニングして得られた一連の抗ＶＥＧＦＲ−２抗体であり、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体薬物を取得するための基礎を定めている。弊社は、さらなる研究において、上記特許に係る抗体が親和力及び生物学的活性などの面においてさらに改善する可能性があることを見付けて、これを基に、我々は、従来の研究に基づき、上記抗体を改良することによって最適化させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、改良型抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を提供し、本発明は、中国特許ＣＮ１０３３３３２４７Ｂに係る親和力が最も高い２つの抗体をテンプレートとして、コンピュータ支援シミュレーション設計を行い、新たなファージ・ディスプレイ抗体ライブラリを設計し、そして複数回スクリーニングして、親和力も生物学的活性も原の特許に係る抗体より高い新たな抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を取得した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は、
可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３のうちのいずれか１種を含む軽鎖と、可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:４を含む重鎖と、を含む改良型抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む抗体、ポリペプチド又はタンパク質を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチド配列又は組み合わせを含む組換えＤＮＡ発現ベクターであって、前記組換えＤＮＡ発現ベクターは、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体の上記重鎖の可変領域、重鎖の定常領域、前記軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、上記組換えＤＮＡ発現ベクターが導入される宿主細胞であって、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌又はイーストを含み、好ましくは哺乳動物細胞を含み、さらに好ましくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞を含む宿主細胞を提供する。
【００１２】
ここで、本発明の重鎖の定常領域は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂから選択される。
【００１３】
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む全長抗体提供する。
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む断片であって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖを含むがそれらに限定されない断片を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異抗体、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫治療法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含むモノクローナル抗体、人工ベクター、薬物又は薬物組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む検出試薬又は検出キットを提供する。
【００１７】
前記抗体は、新生血管による疾患を治療するために用いられ、前記疾患は、腫瘍及び黄斑変性症を含むが、それらに限定されない。
【００１８】
前記ＳｃＦｖは、単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）であり、前記ＨＥＫ２９３Ｅ細胞は、ヒト胎児腎２９３Ｅ細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３Ｅ  ｃｅｌｌ）であり、ＣＨＯ細胞は、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ）であり、ＮＳ０細胞は、マウスＮＳ０胸腺腫瘍細胞である。
【発明の効果】
【００１９】
従来技術に比べて、本発明は以下の利点を有する。
本発明に係る抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体は、高い親和力を有し、体外でＶＥＧＦＲ−２とその配位子ＶＥＧＦとの結合を効果的に抑制でき、体外で良好な生物学的活性を有し、開発において大きな将来性がある。
本発明に係る抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体は、腫瘍新生血管の新生による疾患を治療するために用いられ、前記疾患は、非小細胞肺癌、転移性非小細胞肺癌、神経膠腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、転移性肝細胞癌、ＨＥＲ２陰性の転移性乳癌、転移性胃腺癌、転移性結腸直腸癌、転移性黒色腫、転移性腎細胞癌などの癌症及び黄斑変性症を含むが、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−Ｓプラスミドのプロファイルである。
【図２】階段的ＥＬＩＳＡによる抗ＶＥＧＦＲ−２単鎖抗体の相対的親和力の比較である。
【図３】タンパク質発現ｐＴＳＥプラスミドのプロファイルである。
【図４】抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体とＫＤＲとの結合能力の比較である。
【図５】本発明の抗体と細胞表面のＶＥＧＦＲ−２との結合状況である。
【図６】本発明の抗体のヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ増殖に対する抑制作用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の詳細な実施方法について実施例を参照するが、実施例に記載する実験方法及び試薬は、特別に説明がない限りいずれも一般的な実験方法及び試薬である。以下の実施例は、単に本発明を説明し解釈するのみで、本発明を何ら制限するものではない。
【００２２】
本発明は、
可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３のうちのいずれか１種を含む軽鎖と、可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:４を含む重鎖と、を含む改良型抗ＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体を提供する。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１（ＶＥＧＦＲ−２軽鎖可変領域の配列１）は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＡＩＤＮＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＧＳＮＬＮＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫであり、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２（ＶＥＧＦＲ−２軽鎖可変領域の配列２）は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＤＡＩＤＱＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＬＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＮＱＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫであり、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３（ＶＥＧＦＲ−２軽鎖可変領域の配列３）は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＤＱＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＧＳＮＬＮＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＮＱＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫであり、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:４（ＶＥＧＦＲ−２重鎖可変領域の配列１）は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＬＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳである。
【００２３】
ＳＥＱ  ＮＯ．１（ＶＥＧＦＲ−２軽鎖可変領域の配列１）は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＡＩＤＮＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＧＳＮＬＮＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫであり、
ＳＥＱ  ＮＯ．２（ＶＥＧＦＲ−２軽鎖可変領域の配列２）は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＤＡＩＤＱＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＬＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＮＱＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫであり、
ＳＥＱ  ＮＯ．３（ＶＥＧＦＲ−２軽鎖可変領域の配列３）は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＤＱＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＧＳＮＬＮＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＮＱＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫであり、
ＳＥＱ  ＮＯ．４（ＶＥＧＦＲ−２重鎖可変領域の配列１）は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＬＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳである。
【００２４】
好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は重鎖の可変領域を含む抗体、ポリペプチド又はタンパク質を提供する。
【００２５】
より好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００２６】
より好ましくは、本発明はさらに、上記ポリヌクレオチド配列又は組み合わせを含む組換えＤＮＡ発現ベクターであって、前記組換えＤＮＡ発現ベクターは、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体の上記重鎖の可変領域、重鎖の定常領域、前記軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００２７】
より好ましくは、本発明はさらに、上記組換えＤＮＡ発現ベクターが導入される宿主細胞であって、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌又はイーストを含み、好ましくは哺乳動物細胞を含み、さらに好ましくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞を含む宿主細胞を提供する。
【００２８】
より好ましくは、本発明の重鎖の定常領域は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂから選択される。
【００２９】
より好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む全長抗体を提供する。
より好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む断片であって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖを含むがそれらに限定されない断片を提供する。
【００３０】
より好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異抗体、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫治療法を提供する。
【００３１】
より好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含むモノクローナル抗体、人工ベクター、薬物又は薬物組成物を提供する。
【００３２】
より好ましくは、前記モノクローナル抗体は、完全ヒト型である。
【００３３】
より好ましくは、本発明はさらに、上記軽鎖の可変領域又は上記重鎖の可変領域を含む検出試薬又は検出キットを提供する。
【００３４】
より好ましくは、前記抗体は、新生血管による疾患を治療するために用いられ、前記疾患は、非小細胞肺癌、転移性非小細胞肺癌、神経膠腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、転移性肝細胞癌、ＨＥＲ２陰性の転移性乳癌、転移性胃腺癌、転移性結腸直腸癌、転移性黒色腫、転移性腎細胞癌などの癌症及び黄斑変性症を含むがそれらに限定されない。
【実施例】
【００３５】
以下、図面及び実施例を参照しながら、本発明を詳細に説明する。
実施例１、抗ＶＥＧＦＲ−２単鎖抗体のバイオパンニング
一連の遺伝子クローン方法でｐＣｏｍ３ベクター（中国プラスミド・ベクター細菌株細胞株遺伝子保存センターから購入される）を改造して、それをファージ単鎖抗体ライブラリの構築及び発現に用いる。改造されたベクターはｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−Ｓと名付けられ、そのプラスミド・プロファイルを図１に示すとおりであり、このベクターを基礎として、特許ＣＮ１０３３３２４７Ｂに係る抗体配列に基づく新たな全合成ファージ・ディスプレイ抗体ライブラリを構築する。
【００３６】
ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインを抗原として免疫チューブを被覆し、抗原の被覆量を２ｕｇ／５００ｕｌ／チューブとし、４℃で一晩被覆する。次に４％の脱脂粉乳／ＰＢＳＴでそれぞれ免疫チューブ及び全合成ファージ・ディスプレイ抗体ライブラリを密封し、常温で１時間密封する。密封したファージ・ディスプレイ抗体ライブラリを免疫チューブ内に入れて抗原と抗体とを結合させ、ファージの添加量を約１０９−１０１２個とし、室温で１時間反応させる。ＰＢＳＴ−ＰＢＳで複数回洗浄して結合していないファージを除去し、０．１ＭのＰＨ２．２のグリシンで溶出させ、１．５ＭのＰＨ８．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌで、溶出したファージ抗体溶液をＰＨ７．０程度まで中和させる。
【００３７】
上記中和させたファージで、対数期に増殖した１０ｍｌのＴＧ１細菌溶液を感染させ、３７℃のインキュベータ内で３０ｍｉｎ静置し、一部の細菌溶液を取り出して階段的に希釈し、２ＹＴＡＧプレートにコーティングし、ファージの生産量を計算する。残りの細菌溶液を遠心分離して上清を除去し、沈殿された菌体を少量の培地に再懸濁してから、吸い出して２ＹＴＡＧ大きなプレートにコーティングし、次のスクリーニングのために用意する。
【００３８】
上記感染してプレートにコーティングされた菌体を大きなプレートから掻き落とし、２ＹＴＡＧ液体培地に植菌し、対数期になるまで揺動してＭ１３補助ファージを添加して重複感染させ、２８℃で一晩培養してファージを増殖させ、ＰＥＧ６０００−ＮａＣｌでファージを沈降させ精製して次回のスクリーニングのために用意する。合計３回のファージライブラリ富化スクリーニングを行う。
【００３９】
実施例２、抗ＶＥＧＦＲ−２ファージ単鎖抗体陽性クローンの測定
３回スクリーニングした後、上手く分離しているモノクローナル・コロニーを選び出し、２ＹＴＡＧ液体培地が添加された９６ウェルのディープ・ウェル・プレートに接種し、３７℃で２２０ｒｐｍで対数増殖期になるまで培養し、各ウェルに約１０１０個の補助ファージＭ１３ＫＯ７を添加し、３７℃で３０分間静止感染させる。４０００ｒｐｍで、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を２ＹＴＡＫ再懸濁して沈殿させ、２８℃で、２２０ｒｐｍで一晩培養する。ファージを含む上清を吸い取ってＥＬＩＳＡ測定を行い、同じベクター及び同様な構築方法によるＣＮ１０３３３２４７Ｂの生物学的抗体配列（重鎖は、ＣＮ１０３３３２４７Ｂの配列Ｎｏ．３であり、軽鎖は、ＣＮ１０３３３２４７Ｂの配列Ｎｏ．９である）のファージを陽性対照（Ｏ−１と名付けられた）とする。スクリーニングして親和力の高いモノクローナル抗体Ｎ−１、Ｎ−２及びＮ−３を得て、遺伝子配列測定により元の特許ＣＮ１０３３３２４７Ｂにおける配列と異なると決定した。
【００４０】
実施例３、階段的希釈ファージＥＬＩＳＡによる抗ＶＥＧＦＲ−２単鎖抗体の相対的親和力の比較
実施例２で得られたクローンに対してモノクローナル・ファージのディスプレイ及び精製を行い、ファージ階段的希釈ＥＬＩＳＡ実験を行って親和力を測定した。
【００４１】
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液でＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインを被覆し、２０ｎｇ／ウェル／１００ｕｌとし、４℃で一晩被覆する。ＰＢＳＴで３回洗浄し、４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで３７℃で１時間密封する。純粋化されたファージを４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで５倍階段的に希釈し、各ウェルに１００ｕｌの希釈されサンプルを添加し、常温で１時間静置する。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで希釈されたＨＲＰ−ａｎｔｉ−Ｍ１３モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレート内に添加し、常温で１ｈ静置する。ＴＭＢ発色キットで発色し、室温で１０分間発色する。２ＭのＨ２ＳＯ４で終了した後、４５０ｎｍ／６３０ｎｍで数値を読取る。結果を図２に示し、スクリーニングされた３株の異なる単鎖抗体は、いずれもＶＥＧＦＲ−２と特異的に結合でき、かつ結合能力がいずれもＯ−１より高い。
【００４２】
実施例４、抗ＫＤＲ全抗体の作製
上記３つの抗体Ｎ−１、Ｎ−２及びＮ−３の重鎖ＶＨ及び軽鎖ｋ遺伝子をそれぞれ重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子を備えたベクターｐＴＳＥ（図３を参照）、ヒトＩｇＧ１の定常領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:５を参照）及びｋ鎖の定常領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６を参照）をコードするｐＴＳＥベクター（ｐＴＳＥベクターは図３に示され、作製過程はＣＮ１０３５２５８６８Ａ明細書の第３ページの第［００１９］段落を参照）にクローンする。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:５（ヒトＩｇＧ１の定常領域の配列）は、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧであり、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６（ｋ鎖の定常領域の配列）は、ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣであり、
【００４４】
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的に導入し、全抗体発現を行う。ＡＫＴＡ器械ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性カラムを用いて精製して全抗体タンパク質を取得する。ＢＣＡキットを用いてタンパク質の濃度を測定する。
【００４５】
実施例５、全抗体とＶＥＧＦＲ２細胞外ドメインとの結合実験
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液でＶＥＧＦＲ細胞外ドメインを被覆し、２０ｎｇ／ウェル／１００ｕｌとし、４℃で一晩被覆する。３００ｕｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、次に４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴを添加して３７℃で１ｈ密封する。異なる希釈度のビオチンで標識された全抗体を添加した。ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）をアイソタイプ対照としながら、様々な全抗体の最大濃度が１００ｎｇ／ｍｌであり、５倍で８階段希釈して、３７℃で２−３ｈ保育する。３００ｕｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、次に４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで１：１００００に希釈されたストレプトアビジンを添加して３７℃で１ｈ保育する。３００ｕｌ／ウェルのＰＢＳＴで８回洗浄し、ＴＭＢ発色キットで発色させ、１００ｕｌ／ウェルとし、室温で１０ｍｉｎ発色させ、次に２ＭのＨ２ＳＯ４で終了する。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで数値を読取る。実験結果は、図４に示すように、全ての抗体は、いずれも細胞表面のＫＤＲ分子と上手く結合でき、そのうちＮ３の親和力が比較的に高く、Ｎ−１、Ｎ−２、Ｎ−３はいずれも従来のＯ−１より高い。
【００４６】
実施例６、全抗体と細胞表面ＶＥＧＦＲ２との結合特異性についての分析
本発明はＶＥＧＦＲ−２が過剰発現したＣＨＯ細胞を用いて異なる全抗体と細胞表面ＶＥＧＦＲ−２との結合状況を検出し、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）をアイソタイプ対照とする。０．２５％のパンクレアチンで細胞を消化して、遠心分離して収集する。同時に様々な抗体を希釈し、最高濃度を１００ｎＭとし、４倍階段的に希釈する。収集した細胞をＰＢＳ＋１％のＢＳＡで３回洗浄し、次にＰＢＳ＋１％のＢＳＡで細胞を再懸濁し、その後に１×１０５個の細胞／ウェルで細胞を９６ウェルのプレート内に敷き広げ、１００ｕｌの希釈された全抗体を添加し、常温で１時間保育し、遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次に希釈されたＡｌｅｘａ４８８で標識された抗ヒトＩｇＧ  ＦＣ抗体で細胞を再懸濁し、常温で１時間遮光保育し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらに１００ｕｌのＰＢＳで再懸濁し、フロー・サイト・メトリーで蛍光強度を検出する。結果をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで分析する。結果によれば、Ｎ３は、細胞が発現したＶＥＧＦＲ−２とより上手く結合でき、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３の結合能力は、いずれもＯ−１より強い（図５を参照）。
【００４７】
実施例７、全抗体がＨＵＶＥＣ細胞増殖を抑制する実験
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、既に血管内皮細胞の増殖、細胞シグナル経路及び様々な腫瘍発生メカニズムの研究に広く応用され、本発明では異なる抗ＶＥＧＦＲ−２抗体がＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する抑制作用を研究した。ＨＵＶＥＣ細胞が存在率８０％まで増殖すると、５％のＦＢＳを含む新鮮なＥＧＭ培地と交換し、６時間後にパンクレアチンで消化し、さらに無血清培地で消化された細胞を４−５回洗浄し、遠心分離したたびに培地をできるだけ完全に捨て、細胞を再懸濁してカウントし、５０００個の細胞／ウェルで９６ウェル・プレートに接種し(但し、９６ウェル・プレートのふちウェルを接種せず)、１００ｕｌの無血清培地／ウェルとし、一晩飢餓する。１４−１６時間後に上清を吸い取り、最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるまで５０ｕｌのＶＥＧＦ／ＥＣＭ（２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、異なる濃度の異なる抗体と均一に混合してから２４時間培養する。その後にＣＣＫ−８を添加し、細胞の増殖状況を検出する。結果によれば、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３のＩＣ５０（ｎｇ／Ｌ）は、それぞれ１２．７６、１７．３２及び１０．５３であり、Ｏ−１のＩＣ５０（ｎｇ／Ｌ）は、１８．５９であり、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３の血管内皮細胞増殖の抑制能力はいずれもＯ−１より高く、そのうちＮ３が最もよい（図６を参照）。実施例５〜７を組み合わせて分かるように、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、分子的にも細胞学的にも、結果がいずれも元の特許ＣＮ１０３５２５８６８Ａの最適な抗体Ｏ−１より優れ、これは本願の候補の分子が開発及び応用においてより大きな将来性を有することを意味する。
【００４８】
本発明の上記抗体は、新生血管による疾患を治療するために用いられ、前記疾患は、非小細胞肺癌、転移性非小細胞肺癌、神経膠腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、転移性肝細胞癌、ＨＥＲ２陰性の転移性乳癌、転移性胃腺癌、転移性結腸直腸癌、転移性黒色腫、転移性腎細胞癌などの癌症及び黄斑変性症を含むがそれらに限定されない。
【００４９】
当業者に対しては、具体的には実施例は、単に本発明を例示的に説明するのみで、明らかに本発明の具体的な実現が上記方式に制限されず、本発明の方法の構想及び技術的解決手段を用いて行った様々な非実質的な改良、又は本発明の構想及び技術的解決手段を改良せずに他の場面に直接的に応用することは、いずれも本発明の保護の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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