(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
通式Iの化合物において、
0006911248.tif 000061
（Ｉ）
Ｘは原子価が少なくとも４である原子又は分子骨格であり、
Ａ１は、第１リンカー及びその３’末端で第１リンカーに接続される第１の一本鎖オリ
ゴヌクレオチドを含む第１部分であり、
Ａ２は、第２リンカー及びその５’端部末で第２リンカーに接続される第２一本鎖オリ
ゴヌクレオチドを含む第２部分であり、前記第２オリゴヌクレオチドと前記第１オリゴヌ
クレオチドとが少なくとも部分的に相補であり、
Ｍ１は、第１官能基に合わせて少なくとも１つの共有結合を形成することのできる第１
官能基を含む第３部分であり、
Ｍ２は、第２官能基に合わせて少なくとも１つの共有結合を形成することのできる第２
官能基を含む第４部分であり、
Ｘは、炭素原子、リン原子、又はＣ１-１２アルキル基、Ｃ２-１２アルケニル基、Ｃ３
-１２アルキニル基、Ｃ５-１８シクロアルキル基、Ｃ５-１８シクロアルケニル基、Ｃ３-
１８ヘテロシクロアルキル基、Ｃ３-１８ヘテロシクロアルケニル基、Ｃ６-１８アリール
基又はＣ３-１８ヘテロアリール基のような多原子の骨格であり、
前記通式Iの化合物は、さらに下記の通式ＩＩの構造を有し、
0006911248.tif 000062
（ＩＩ）
Ｌ１は、原子価が少なくとも２である前記第１リンカーであり、
Ｚ１は、前記第１オリゴヌクレオチドであり、必要に応じてヒドロキシ基を含んでよく
、
Ｌ２は、原子価が少なくとも２である前記第２リンカーであり、
Ｚ２は、前記第２オリゴヌクレオチドであり、
Ｎ１は、前記第１官能基を含み、
Ｎ２は、前記第２官能基を含み、
Ｓ１及びＳ２は、それぞれ独立して原子価が少なくとも２であるリンカーであり、[Ｙ
１]ｎ１は前記第１官能基を含み、[Ｙ２]ｎ２は前記第２官能基を含み、
Ｙ１及びＹ２は、出現するたびにそれぞれ独立して１つ又は複数のシントンを含む官能
基であり、
ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して少なくとも１である整数であり、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ-ＯＰＯ-３-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-ＰＯ-３-であり、ｎは１〜
１０から選ばれる整数である化合物。
【請求項２】
前記第１及び／又は第２官能基はアミン基であり、必要に応じて、２つの共有結合を形
成することができる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ１及び／又はＹ２は、出現するたびに異なる官能基である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｙ１及び／又はＹ２は、出現するたびに同じである官能基である請求項１に記載の化合
物。
【請求項５】
Ｓ１及びＳ２は、それぞれ独立してアルキレン鎖（例えば、-（ＣＨ２）ｎ-）又はポリ
（エチレングリコール）鎖（例えば、-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-）を含み、ｎは１〜２０の
整数であり、好ましくは２〜約１２であり、より好ましくは４〜１０である請求項１に記
載の化合物。
【請求項６】
Ｚ１及びＺ２は、それぞれＰＣＲプライマー結合位置配列を更に含む請求項１に記載の
化合物。
【請求項７】
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して好ましくはアミノ基、ヒドロキシル基、カルボン酸
基、チオール基、ハロゲン化物、アジド基、アルキニル基又はアルケン基から選ばれる官
能基を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
毎種類は、請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物を有し、且つ二本鎖のオリゴヌク
レオチドに操作可能に接続される少なくとも２つの官能基を含み、前記二本鎖のオリゴヌ
クレオチドが前記少なくとも２つの官能基を独特的に識別する少なくとも約１０２種類の
異なる化合物種を含む化合物ライブラリー。
【請求項９】
前記ライブラリーは、毎種類の前記異なる化合物種の少なくとも約１０５又は少なくと
も約１０７個のコピーを含む請求項８に記載の化合物ライブラリー。
【請求項１０】
初期オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される少なくとも２つの反応基を含む開始化
合物を提供する工程（ａ）と、
前記開始化合物を前記少なくとも２つの反応基と相補する相補的な反応基を含む第１シ
ントンに反応させて、それに接続される前記第１シントンの２つのコピーを有するサイク
ル１の産物を生成する工程（ｂ）と、
前記初期オリゴヌクレオチドと前記第１シントンを識別する第１引入オリゴヌクレオチ
ドとを接続させて、前記サイクル１の産物をエンコードする第１エンコードオリゴヌクレ
オチドを生成する工程（ｃ）と、
必要に応じて、前記サイクル１の産物と第２シントンとを反応させ、且つ前記第１エン
コードオリゴヌクレオチドを第２引入オリゴヌクレオチドに接続させて、第２エンコード
オリゴヌクレオチドによりエンコードされるサイクル２の産物を生成する工程（ｄ）と、
必要に応じて、ｉ番目のシントン及びｉ番目の引入オリゴヌクレオチドを使用して工程
（ｄ）をｉ-１回繰り返し、ｉは２以上の整数であり、請求項１〜７の何れか１項に記載
の前記第１及び第２官能基を有する化合物を生成する工程（ｅ）と、
を備える請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物の合成方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）は工程（ｂ）の前に、或いは工程（ｂ）は工程（ｃ）の前に発生する請求項
１０に記載の方法。
【請求項１２】
シントンの各々は、アミノ酸又は活性化アミノ酸である請求項１０又は１１に記載の方
法。
【請求項１３】
前記反応基及び前記相補的な反応基は、それぞれ独立してアミノ基、アルデヒド基、ケ
トン基、ヒドロキシル基、アルキニル基、アジド基、カルボキシル基、スルホニル基、ホ
スホリル基、エポキシド基、アジリジン基、ホスホラスイリド基、イソシアネート基、ハ
ロゲン化複素芳香族基及び求核試薬から選ばれ、好ましくは、前記ハロゲン化複素芳香族
基は塩素化ピリミジン、塩素化トリアジン及び塩素化プリンから選ばれ、且つ／或いは好
ましくは、前記求核試薬はアミノ基を含む請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）は、還元状態で行われる請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）は、付加環化反応によって環状構造を生成することを含む請求項１０又は１
１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）は、好ましくは、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、
ＲＮＡポリメラーゼ及びトポイソメラーゼから選ばれる酵素の存在下で行われる請求項１
０又は１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記初期オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー結合位置配列を含む請求項１０又は
１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記初期オリゴヌクレオチドは一本鎖のものであり且つ引入オリゴヌクレオチドの各々
は一本鎖のものであり、或いは前記初期オリゴヌクレオチドは二本鎖のものであり且つ引
入オリゴヌクレオチドの各々は二本鎖のものである請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
引入オリゴヌクレオチドの各々の長さは３〜３０個のヌクレオチドである請求項１０又
は１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｉ番目の引入オリゴヌクレオチドはＰＣＲ閉鎖プライマーを含む請求項１０に記載
の方法。
【請求項２１】
工程（ｅ）の後で、前記第１及び／又は第２官能基を環化させることを更に備える請求
項１０、１１及び２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１及び／又は第２官能基はそれぞれアルキニル基及びアジド基を含み、且つ前記
化合物はトリアゾール基を生成するための前記アルキニル基とアジド基との付加環化反応
に適する条件にさらされ、前記第１及び／又は第２官能基を環化する請求項２１に記載の
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
【０００２】
本出願は、２０１７年３月１６日に提出されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０
７７１０８号の優先権及び権益を主張するものであり、引用によりその全体を本明細書に
包含する。
［配列表］
【０００３】
ここで提出された「ＨＵＢ配列．ｔｘｔ」というＡＳＣＩＩテキストファイルは、２０
１８年３月１５日に作成されたものであり、１２３３９２バイトであり、引用によりその
全体を本明細書に包含する。
【０００４】
本発明は、分子ライブラリーを合成するための方法及び組成物を提供し、各分子がコー
ト化オリゴヌクレオチドタグを有する。
【背景技術】
【０００５】
有用な生物活性を持つ化合物を識別するためのより有効な方法の探索により、組合ライ
ブラリーという集合に存在する異なる化合物を大量に選別する方法が開発されてきた。こ
のようなライブラリーは、１０５種類又はより多くの種類の異なる化合物を含んでよい。
現在、組合ライブラリーを発生させるための様々な方法があり、且つペプチド、模倣ペプ
チド及び有機小分子の組合せ合成が報告された。
【０００６】
創薬に組合せ方法を使用する場合の挑戦としては、主に、複雑性及び多様性を十分に持
つライブラリーの合成、及びこれらのライブラリーの有効なデコンボリューションに用い
られる選別からの活性を持つ分子の識別の２つがある。一般的に、ライブラリーの複雑さ
が大きいほど、つまりライブラリーにある異なる構造の数が多いほど、ライブラリーに目
的活性を持つ分子のある可能性が高いと考えられる。そのため、ライブラリーの合成に用
いられる化学過程は、合理的な時間範囲内で適当な数の化合物を発生させなければならな
い。しかしながら、所定の合成規模については、ライブラリー内の異なる成員の数を増え
ると、例えば何なる特定なライブラリー成員の濃度を低下させるので、デコンボリューシ
ョンによる高複雑度のライブラリーからの活性分子の識別が複雑になる。
【０００７】
これらの障害を克服する１つの方法は、ライブラリーコードに関わる戦略を制定するこ
とであり、特に化合物の各々も付属された増幅可能な実体のライブラリーを含む。このよ
うなライブラリーはＤＮＡエンコードのライブラリーを含み、ライブラリー成員のＤＮＡ
実体を識別するために、分子生物学の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）によって拡
大及び特性化を行ってよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多くの方法は、二本鎖のＤＮＡ構成によって小分子の１つのコピーをエンコードし、又
は開発された化学配列によってこの分子を組み立てる。共有結合された二本鎖のオリゴヌ
クレオチドの方法を使用すれば、これらの種類に関するポリメラーゼ連鎖反応の基質とし
ての問題を引き起こして、これらの構成のシークエンシン分析の真実性を低下させて、更
にエンコードされた小分子の識別に影響をとえることが提出された。そのため、生物学的
標的用の小分子配位子を発見する可能性を増えるように、このようなライブラリーの設計
及び構成に用いられる改良された、より健全な方法の開発は依然として非常に望まれてい
る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの方面では、本発明は、通式Ｉの化合物を提供する。
0006911248.tif 000002
Ｘは原子価が少なくとも４である原子又は分子骨格であり、
Ａ１は、第１リンカー及びその３’末端で第１リンカーに接続される第１の一本鎖オリ
ゴヌクレオチドを含む第１部分であり、
Ａ２は、第２リンカー及びその５’端部末で第２リンカーに接続される第２一本鎖オリ
ゴヌクレオチドを含む第２部分であり、前記第２オリゴヌクレオチドと前記第１オリゴヌ
クレオチドとが少なくとも部分的に相補であり、
Ｍ１は、第１官能基に合わせて少なくとも１つの共有結合を形成することのできる第を
含む第３部分であり、
Ｍ２は、第２官能基に合わせて少なくとも１つの共有結合を形成することのできる第２
官能基を含む第４部分である。
【００１０】
ある実施例において、Ｘは、炭素原子、リン原子、又は例えばＣ１-１２アルキル基、
Ｃ２-１２アルケニル基、Ｃ３-１２アルキニル基、Ｃ５-１８シクロアルキル基、Ｃ５-１
８シクロアルケニル基、Ｃ３-１８ヘテロシクロアルキル基、Ｃ３-１８ヘテロシクロアル
ケニル基、Ｃ６-１８アリール基又はＣ３-１８ヘテロアリール基のような多原子の骨格で
あってよい。
【００１１】
ある実施例において、前記第１及び／又は第２官能基はアミン基であり、必要に応じて
、２つの共有結合を形成することができる。
【００１２】
ある実施例において、前記化合物は、通式ＩＩを有してよい。
0006911248.tif 000003
（II）
Ｌ１は、原子価が少なくとも２である前記第１リンカーであり、必要に応じてヒドロキ
シ基を含んでよく、
Ｚ１は、前記第１オリゴヌクレオチドであり、必要に応じてヒドロキシ基を含んでよく
、
Ｌ２は、原子価が少なくとも２である前記第２リンカーであり、
Ｚ２は、前記第２オリゴヌクレオチドであり、
Ｎ１は、前記第１官能基を含み、
Ｎ２は、前記第２官能基を含み、
Ｓ１及びＳ２は、それぞれ独立して原子価が少なくとも２であるリンカーであり、
[Ｙ１]ｎ１は前記第１官能基を含み、[Ｙ２]ｎ２は前記第２官能基を含み、
Ｙ１及びＹ２は、出現するたびにそれぞれ独立して１つ又は複数のシントンを含む官能
基であり、
ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して少なくとも１である整数である。
【００１３】
ある実施例において、Ｙ１及び／又はＹ２は、出現するたびに異なる官能基である。あ
る実施例において、Ｙ１及び／又はＹ２は、出現するたびに同じである官能基である。各
種の実施例において、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して好ましくはアミノ基、ヒドロキ
シル基、カルボン酸基、チオール基、ハロゲン化物、アジド基、アルキニル基又はアルケ
ン基から選ばれる官能基を含む。
【００１４】
ある実施例において、Ｓ１及びＳ２は、それぞれ独立してアルキレン鎖（例えば、-（
ＣＨ２）ｎ-）又はポリ（エチレングリコール）鎖（例えば、-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-）
を含み、ｎは１〜２０の整数であり、好ましくは２〜約１２であり、より好ましくは４〜
１０である。
【００１５】
ある実施例において、Ｚ１及びＺ２は、それぞれＰＣＲプライマー結合位置配列を更に
含む。
【００１６】
ある実施例において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ-ＯＰＯ-３-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-ＰＯ
-３-であり、ｎは１〜１０から選ばれる整数であり、好ましくは２〜約６であり、より好
ましくは３である。
【００１７】
もう一つの方面では、本発明は、毎種類が本文に記載の何れの化合物（例としては、通
式Ｉ-ＩＶ）を有し、且つ二本鎖のオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される少なくと
も２つの官能基を含み、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも２つの官能基
を独特的に識別する少なくとも約１０２種類の異なる化合物種を含む化合物ライブラリー
に関する。ある実施例において、前記ライブラリーは、毎種類の前記異なる化合物種の少
なくとも約１０５又は少なくとも約１０７個のコピーを含む。
【００１８】
また一つの方面では、本発明は、
初期オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される少なくとも２つの反応基を含む開始化
合物を提供する工程（ａ）と、
前記開始化合物を前記少なくとも２つの反応基と相補する相補的な反応基を含む第１シ
ントンに反応させて、それに接続される前記第１シントンの２つのコピーを有するサイク
ル１の産物を生成する工程（ｂ）と、
前記初期オリゴヌクレオチドと前記第１シントンを識別する第１引入オリゴヌクレオチ
ドとを接続させて、前記サイクル１の産物をエンコードする第１エンコードオリゴヌクレ
オチドを生成する工程（ｃ）と、
必要に応じて、前記サイクル１の産物と第２シントンとを反応させ、且つ前記第１エン
コードオリゴヌクレオチドを第２引入オリゴヌクレオチドに接続させて、第２エンコード
オリゴヌクレオチドによりエンコードされるサイクル２の産物を生成する工程（ｄ）と、
必要に応じて、ｉ番目のシントン及びｉ番目の引入オリゴヌクレオチドを使用して工程
（ｄ）をｉ-１回繰り返して（ｉは２以上の整数である）、請求項４〜１０の何れか１項
に記載の前記第１及び第２官能基を有する化合物を生成する工程（ｅ）と、
を備える通式（ＩＩ）の化合物の合成方法に関する。
【００１９】
ある実施例において、工程（ｃ）は工程（ｂ）の前に、又は工程（ｂ）は工程（ｃ）の
前に発生する。
【００２０】
ある実施例において、シントンの各々は、アミノ酸又は活性化アミノ酸である。
【００２１】
ある実施例において、前記反応基及び前記相補的な反応基は、それぞれ独立してアミノ
基、アルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基、アルキニル基、アジド基、カルボキシル
基、スルホニル基、ホスホリル基、エポキシド基、アジリジン基、ホスホラスイリド基、
イソシアネート基、ハロゲン化複素芳香族基及び求核試薬から選ばれる。好ましくは、前
記ハロゲン化複素芳香族基は塩素化ピリミジン、塩素化トリアジン及び塩素化プリンから
選ばれ、且つ／或いは好ましくは、前記求核試薬はアミノ基を含む。
【００２２】
ある実施例において、工程（ｂ）は、還元状態で行われる。ある実施例において、工程
（ｂ）は、付加環化反応によって環状構造を生成することを含む。
【００２３】
ある実施例において、工程（ｃ）は、好ましくは、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及びトポイソメラーゼから選ばれる酵素の存在
下で行われる。
【００２４】
ある実施例において、前記初期オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー結合位置配列
を含む。
【００２５】
ある実施例において、前記初期オリゴヌクレオチドは一本鎖のものであり且つ引入オリ
ゴヌクレオチドの各々は一本鎖のものであり、或いは前記初期オリゴヌクレオチドは二本
鎖のものであり且つ引入オリゴヌクレオチドの各々は二本鎖のものである。
【００２６】
ある実施例において、引入オリゴヌクレオチドの各々の長さは３〜３０個のヌクレオチ
ドである。
【００２７】
ある実施例において、前記ｉ番目の引入オリゴヌクレオチドはＰＣＲ閉鎖プライマーを
含む。
【００２８】
ある実施例において、この方法は、工程（ｅ）の後で、前記第１及び／又は第２官能基
を環化することを更に備える。例えば、前記第１及び／又は第２官能基はそれぞれアルキ
ニル基及びアジド基を含んでよく、且つ前記化合物はトリアゾール基を生成するための前
記アルキニル基とアジド基との付加環化に適する条件にさらされ、前記第１及び／又は第
２官能基を環化する。
【００２９】
本発明は、化合物が少なくとも２つの官能基を含み、官能基がオリゴヌクレオチドに操
作可能に接続される２つの又は複数の構造単位を含み、前記オリゴヌクレオチドは前記少
なくとも２つの官能基の構造を識別する化合物ライブラリーの合成方法において、
ｍ個の開始化合物を含む溶液を提供し、ｍは１以上の整数であり、前記ｍ個の開始化合
物はそれぞれ少なくとも２つの開始官能基を含み、前記開始官能基はｎ個の構造単位を含
み、ｎは１以上の整数であり、前記構造単位が前記ｎ個の構造単位を識別する初期オリゴ
ヌクレオチドに操作可能に接続される工程（ａ）と、
工程（ａ）の溶液をｒ個の反応容器に分けて、ｒは２以上の整数であり、前記溶液のｒ
個の等分試料を発生させる工程（ｂ）と、
反応容器の各々における前記開始化合物とｒ個の構造単位の１つとを反応させて、少な
くとも２つの官能基を含む化合物のｒ個の等分試料を発生させ、前記官能基は初期オリゴ
ヌクレオチドに操作可能に接続されるｎ＋１個の構造単位を含む工程（ｃ）と、
前記引入オリゴヌクレオチドと前記初期オリゴヌクレオチドとの酵素による接続に適す
る条件で、前記引入オリゴヌクレオチドと前記初期オリゴヌクレオチドとの接続の触媒酵
素の存在下で、等分試料の各々における前記初期オリゴヌクレオチドと１組のｒ個の異な
る引入オリゴヌクレオチドの１つとを反応させる工程（ｄ）と、
を備え、
少なくとも２つの官能基を含む化合物のｒ個の等分試料を発生させ、前記官能基が前記
構造単位をエンコードする延長したオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される化合物ラ
イブラリーの合成方法を更に提供する。
【００３０】
ある実施例において、この方法は、前記ｒ個の等分試料における２つの又は複数を組み
合わせて、少なくとも２つの官能基を含む化合物の溶液を発生させ、前記官能基が前記構
造単位をエンコードする延長したオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される工程（ｅ）
を更に備える。
【００３１】
ある実施例において、サイクル１〜ｉを発生させるように工程（ａ）〜（ｅ）は１回又
は複数回行われてよく、ｉは２以上の整数であり、サイクルｓ＋１において、ｓはｉ-１
以下の整数であり、工程（ａ）におけるｍ個の開始化合物を含む溶液はサイクルｓにおけ
る工程（ｅ）の溶液である。ある実施例において、サイクル１〜ｉにおける少なくとも１
つのサイクルにおいて、工程（ｄ）は工程（ｃ）の前に発生する。
【００３２】
もう一つの方面では、本発明は、
前記化合物ライブラリーにおける少なくとも１つの成員と前記標的との結合に適する条
件で、前記生物学的標的を本文の何れの方法により調製された化合物ライブラリーに接触
させる工程（ａ）と、
前記標的に結合されていないライブラリー成員を除去する工程（ｂ）と、
前記標的に結合される前記化合物ライブラリーにおける少なくとも１つの成員の前記コ
ート化オリゴヌクレオチドを拡大する工程（ｃ）と、
工程（ｃ）における前記コート化オリゴヌクレオチドに対してシークエンシンを行う工
程（ｄ）と、
工程（ｄ）で確定された配列を使用して前記化合物ライブラリーにおける前記生物学的
標的に結合される成員の官能基の構造を確定する工程（ｅ）と、
を備え、
前記生物学的標的に結合される１つ又は複数の化合物を識別する生物学的標的に結合さ
れる１つ又は複数の化合物を識別するための方法に関する。
【００３３】
もう一つの方面では、本発明は、
前記化合物ライブラリーにおける少なくとも１つの成員と前記標的との結合に適する条
件で、前記生物学的標的を本発明の公開する化合物ライブラリーに接触させる工程（ａ）
と、
前記標的に結合されていないライブラリー成員を除去する工程（ｂ）と、
前記標的に結合される前記化合物ライブラリーにおける少なくとも１つの成員の前記コ
ート化オリゴヌクレオチドを拡大する工程（ｃ）と、
工程（ｃ）における前記コート化オリゴヌクレオチドに対してシークエンシンを行う工
程（ｄ）と、
工程（ｄ）で確定された配列を使用して前記化合物ライブラリーにおける前記生物学的
標的に結合される成員の官能基の構造を確定する工程（ｅ）と、
を備え、
生物学的標的に結合される１つ又は複数の化合物を識別する生物学的標的に結合される
化合物の識別方法に関する。
【００３４】
ある実施例において、前記ライブラリーは、毎種類の前記異なる化合物種の少なくとも
約１０５又は少なくとも約１０７個のコピーを含む。
【００３５】
もう一つの方面では、本発明は、化合物ライブラリーの合成方法を提供し、前記化合物
は少なくとも２つの官能基を含み、前記官能基はオリゴヌクレオチドに操作可能に接続さ
れる２つの又は複数の構造単位を含み、前記オリゴヌクレオチドは前記少なくとも２つの
官能基の構造を識別することに用いられる。この方法は、「スプリット＆プール（ｓｐｌ
ｉｔ  ａｎｄ  ｐｏｏｌ）」の戦略を利用し、誘発剤を含む溶液は複数の部分に分解（「
スプリット」）され、前記誘発剤はコート化オリゴヌクレオチドに接続される第１構造単
位を含む。毎部分において、前記誘発剤が第２特異（ｕｎｉｑｕｅ）構造単位及び第２特
異オリゴヌクレオチドと反応し、前記第２特異オリゴヌクレオチドが前記第２構造単位を
識別する。これらの反応は同時又は順次に行われてよい。順次に行われる場合、何れの反
応も別の反応に優先して発生してよい。各成分の発生した二量体分子を組み合わせて（「
プール」）、また複数の部分に分解する。そして、これらの部分の各々を第３特異（成分
特異的な）構造単位及び第３特異のコード構造単位のオリゴヌクレオチドに反応させる。
産物ライブラリーにある特異分子の数は、（１）合成の各工程に用いられる異なる構造単
位数と（２）プール及び分解過程の繰り返される回数との関数である。
【００３６】
１つの実施例において、前記方法は、ｍ個の開始化合物を含む溶液を提供し、ｍは１以
上の整数であり、前記ｍ個の開始化合物はそれぞれ少なくとも２つの開始官能基を含み、
前記開始官能基はｎ個の構造単位を含み、ｎは１以上の整数であり、前記構造単位が前記
ｎ個の構造単位を識別する初期オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される工程（ａ）と
、工程（ａ）の前記溶液をｒ個の反応容器に分けて、ｒは２以上の整数であり、前記溶液
のｒ個の等分試料を発生させる工程（ｂ）と、反応容器の各々における前記開始化合物と
ｒ個の構造単位の１つとを反応させて、少なくとも２つの官能基を含むｒ個の化合物の等
分試料を発生させ、前記官能基は前記初期オリゴヌクレオチドに操作可能に接続されるｎ
＋１個の構造単位を含む工程（ｃ）と、前記引入オリゴヌクレオチドと前記初期オリゴヌ
クレオチドとの酵素による接続に適する条件で、前記引入オリゴヌクレオチドと前記初期
オリゴヌクレオチドとの接続の触媒酵素の存在下で、等分試料の各々における前記初期オ
リゴヌクレオチドと１組のｒ個の異なる引入オリゴヌクレオチドの１つとを反応させる工
程（ｄ）と、を備え、少なくとも２つの官能基を含む化合物のｒ個の等分試料を発生させ
、前記官能基が前記構造単位をエンコードする延長したオリゴヌクレオチドに操作可能に
接続される。必要に応じて、この方法は、前記ｒ個の等分試料における２つの又は複数を
組み合わせて、少なくとも２つの官能基を含む化合物の溶液を発生させ、前記官能基が構
造単位をエンコードする延長したオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される工程（ｅ）
を更に備えてよい。サイクル１〜ｉを発生させるように工程（ａ）〜（ｅ）は１回又は複
数回行われてよく、ｉは２以上の整数である。サイクルｓ＋１において、ｓはｉ-１以下
の整数であり、工程（ａ）におけるｍ個の開始化合物を含む溶液はサイクルｓにおける工
程（ｅ）の前記溶液である。同様に、サイクルｓ＋１の工程（ａ）の開始化合物はサイク
ルｓの工程（ｅ）の化合物である。
【００３７】
１つの好適な実施例において、前記構造単位は各工程において一般的にの化学反応によ
って接続する。前記構造単位は、線状又は分枝状重合体又はオリゴマー（例えば、ペプチ
ド、模倣ペプチド及びペプトイド類）、又は非オリゴマー（ｎｏｎ-ｏｌｉｇｏｍｅｒ）
分子（例えば、骨格構造を含む分子、この骨格構造に１つ又は複数の追加の化学部分が接
続される）を発生させるように接続されてよい。例えば、前記構造単位がアミノ酸残基で
あれば、標準ペプチドの合成戦略（例えば、本分野の既知の適合な保護／脱保護戦略の溶
液相又は固相の合成）によって構造単位を結合させてよい。好ましくは、前記構造単位は
、溶液相によって化学的に結合する。前記コート化オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二
本鎖のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖のオリゴヌクレオチドである。前記
コート化オリゴヌクレオチドは、好ましくは、構造単位ごとに４〜１２個の塩基又は塩基
対のオリゴヌクレオチドである。前記コート化オリゴヌクレオチドは、標準溶液相又は固
相オリゴヌクレオチドの合成方法によって結合されてよいが、好ましくは、溶液相の酵素
法によって結合される。例えば、前記コート化オリゴヌクレオチドの配列がこれらの酵素
の１つによって接続される開始配列を含めば、前記オリゴヌクレオチドは、トポイソメラ
ーゼ、リガーゼ又はＤＮＡポリメラーゼによって結合されてよい。前記コート化オリゴヌ
クレオチドの酵素による結合は、（１）標準合成の（非酵素的な）結合よりも、付加の正
確性がより高いこと、及び（２）より簡単な保護／脱保護戦略を採用することというメリ
ットを有する。
【００３８】
もう一つの方面では、本発明は、生物学的標的に結合される１つ又は複数の化合物を識
別するための方法を提供する。前記方法は、化合物ライブラリーにおける少なくとも１つ
の成員と生物学的標的との結合に適する条件で、前記標的と請求項５５に記載の方法によ
り調製された化合物ライブラリーに接触させる工程（ａ）と、前記標的に結合されていな
いライブラリー成員を除去する工程（ｂ）と、前記標的に結合される前記化合物ライブラ
リーにおける少なくとも１つの成員の前記コート化オリゴヌクレオチドを拡大する工程（
ｃ）と、工程（ｃ）におけるコート化オリゴヌクレオチドに対してシークエンシンを行う
工程（ｄ）と、工程（ｄ）で確定された配列を使用して前記化合物ライブラリーにおける
前記生物学的標的に結合される成員の官能基の構造を確定する工程（ｅ）と、を備え、前
記生物学的標的に結合される１つ又は複数の化合物を識別する。
【００３９】
また一つの方面では、本発明は、生物学的標的に結合される化合物の識別方法を提供す
る。この方法は、前記化合物ライブラリーにおける少なくとも１つの成員と前記標的との
結合に適する条件で、前記生物学的標的を少なくとも約１０２種類の異なる化合物を含む
化合物ライブラリーに接触させ、前記化合物は少なくとも２つの官能基を含み、前記官能
基はオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される２つの又は複数の構造単位を含み、前記
オリゴヌクレオチドが少なくとも２つの官能基の構造を識別する工程（ａ）と、前記標的
に結合されていないライブラリー成員を除去する工程（ｂ）と、前記標的に結合される前
記化合物ライブラリーにおける少なくとも１つの成員の前記コート化オリゴヌクレオチド
を拡大する工程（ｃ）と、工程（ｃ）における前記コート化オリゴヌクレオチドに対して
シークエンシンを行う工程（ｄ）と、工程（ｄ）で確定された配列を使用して前記化合物
ライブラリーにおける前記生物学的標的に結合される成員の官能基の構造を確定する工程
（ｅ）と、を備え、前記生物学的標的に結合される１つ又は複数の化合物を識別する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、目的性質を持つ分子の識別の方面に一定の優勢を有する。例えば、本発明の
方法は、オリゴヌクレオチドタグの存在下で、一連の化学反応によって分子を構成するこ
とができる。本発明の方法は、オリゴヌクレオチドタグをこのように発生した化学構造に
合併する高再現的な方法を更に提供する。また、これらの方法により、成員の各々のコピ
ーを大量に有するライブラリーを合成することができるので、生物学的標的を複数回選択
すると共に、オリゴヌクレオチドタグの拡大及びシークエンシンのために、最終回の後で
十分な数の分子を残すことができる。また、本発明は、選別の前に、ライブラリーにおけ
る化学物質のＤＮＡ配列に対する比例を増えることで、選別の期間中にタンパク質が親和
性共役をより良好に識別することができ、且つシークエンシンの後でより良好な信号対雑
音比を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】２つの官能基を有する化合物の例示的な合成案である。
【図２】４つの官能基を有する化合物の例示的な合成案である。
【図３】〜２．９×１０７倍過剰バックグラウンＤＮＡエンコード化合物ライブラリー０９３６（ＤＥＬ０９３６）（３-サイクルＤＥＬ、大きさ：２８６９万）（２回りの選択）を混ぜ合わせた２価と１価共役の濃縮倍数を示す。
【図４】〜１．１×１０９倍過剰バックグラウンＤＮＡエンコード化合物ライブラリー１０１９（ＤＥＬ１０１９）（４-サイクルＤＥＬ、大きさ：１１．０８億）（３回り選択）を混ぜ合わせた２価と１価共役の濃縮倍数を示す。
【図５】ＡＯＰ-ＨＵＢと例示的な化合物１とを結合させた例示的な合成案である。
【図６】共役の例示的なコード過程である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、化合物及び組合化合物ライブラリーを発生する方法及び組成物、本発明の方
法及び組成物により発生する化合物及びライブラリー、及び使用これらのライブラリー識
別有する目的性質（例えば、目的生物の活性）の化合物の方法に関する。本発明は、更に
、これらの方法により識別される化合物に関する。
【００４３】
組合化学ライブラリーを発生及び選別するために、様々な方法が使用されている。一例
としては、ライブラリーにおける各成員同士を物理的分離する方法を含み、例えば複数の
反応容器の各々において単一化合物を合成する。しかしながら、これらのライブラリーが
一般的に１回で１つの化合物しか選別できず、或いはせいぜい１回で幾つかの化合物しか
選別できないため、最も効果的な選別過程を発生させることはできない。他の方法におい
て、化合物は固体サポータにおいて合成される。このような固体サポータはチップを含み
、特定化合物はチップ又は膜の特定領域（「アドレス可能点」）を占める。他の方法にお
いて、化合物はビーズにおいて合成され、ビーズの各々が異なる化学構造を含む。
【００４４】
大型ライブラリーを選別する場合、（１）選別可能な異なる化合物の数、及び（２）選
別に当たって活性を持つ化合物の識別という２つの困難がある。１つの方法において、本
来のライブラリーをより小さい成分及びサブフラクションに縮小して、選別に当たって活
性を持つ化合物を識別し、各々の状況で、活性化合物を含む成分又はサブフラクションを
選択して、十分に小さい化合物を含む１組の活性サブフラクションを取得するまで更に細
かく分けて、このサブセットの全ての成員を単独に合成して目的活性を評価することがで
きる。これは複雑で手間取ることである。
【００４５】
組合ライブラリーの選別結果に対してデコンボリューションを行う別の方法としては、
識別ラベル付きのライブラリー成員のライブラリーを使用し、つまり、ライブラリーにあ
るラベルの各々もライブラリーにある離散化合物構造に関係付けているので、識別ラベル
からタグされた分子の構造を分かることができる。ライブラリーのタグ方法の１つとして
は、例えば、米国特許第５５７３９０５、５７０８１５３、５７２３５９８、６０６０５
９６号、開示されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／０６１２１、ＷＯ  ９３／２０２４２、ＷＯ
９４／１３６２３、ＷＯ  ００／２３４５８、ＷＯ  ０２／０７４９２９及びＷＯ  ０
２／１０３００８、及びＢｒｅｎｎｅｒ  &  Ｌｅｒｎｅｒ『米国科学アカデミー紀要（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）』８９、５３８１-５３８３（１９９
２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  &  Ｊａｎｄａ『方法：酵素学方法の手引き（Ｍｅｔｈｏｄｓ:  
Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）』６、
３６１-３７１（１９９４）及びＮｉｅｌｓｅｎ、Ｂｒｅｎｎｅｒ  &  Ｊａｎｄａ『米国
化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）』１１５、９８１２-９８１３（１９９３）
という文献に記載されるような、オリゴヌクレオチドによるタグがあり、そのそれぞれの
全ての内容も引用されるように本文に合併される。このようなタグは拡大されることがで
き、例えば、ポリメラーゼの連鎖反応によってタグの複数のコピーを発生させて、シーク
エンシンによってラベルを識別する。タグの配列により結合分子の構造が確定されるため
、単純な形態で分子を合成してテストすることができる。本発明は、ＤＮＡエンコードの
ライブラリーの発生方法の改良、及びＤＮＡエンコードの分子の大型（１０５個の成員又
はより大きい）ライブラリーの例示を提供し、その官能基利用溶液相合成方法合成。
【００４６】
本発明は、複数の異なる化合物種の合成方法を提供し、化合物種の各々が構造単位から
なる少なくとも２つの官能基、及びこの少なくとも２つの官能基に操作可能に接続される
バーコード（コート化オリゴヌクレオチド）を含む。バーコードの各々は、この少なくと
も２つの官能基の構造を独特的に識別するオリゴヌクレオチドタグを含んでよい。ある実
施例において、オリゴヌクレオチドタグは、どれらの構造単位がこの少なくとも２つの官
能基の構成に用いられるか、及びこれらの構造単位の接続順位を指示する。一般的に、オ
リゴヌクレオチドタグの提供する情報によって活性部分を構成するための構造単位を確定
することには十分である。ある実施例において、オリゴヌクレオチドタグの配列によって
官能基における構造単位の排列を確定することには十分であり、例えば、ペプチド部分（
アミノ酸配列）に対する。
定義
【００４７】
便利にするために、明細書、例示及び添付の請求項に用いられる幾つかの用語をここで
まとめる。別に定義されない限り、本文で使用される全ての科学技術用語の意図が当業者
の一般的に理解される意図と同じである。
【００４８】
「一（ａ）」及び「一（ａｎ）」という冠詞は、本文においてこの冠詞の１つ又は複数
の（つまり少なくとも１つの）文法対象を指す。例としては、「一元素」は、１つの元素
又は複数の元素を表す。
【００４９】
本文に用いられる「約（ａｂｏｕｔ）」の用語は、２０％内、より好ましくは１０％内
、最も好ましくは５％内を指す。「基本的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」の用語は、
５０％よりも大きく、好ましくは８０％よりも大きく、最も好ましくは９０％又は９５％
よりも大きいことを指す。
【００５０】
本文に用いられる「複数の（ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ）」とは、１以上、例えば
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０又はより多く、例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、
９０、１００、２００、３００、４００、５００又はより多く、又はその間の如何なる整
数を指す。
【００５１】
本文に用いられれるように、「オリゴヌクレオチド」といる用語とは、デオキシリボヌ
クレオチド及び／又はリボヌクレオチド、又はその類似物又は修飾物を含む、各種の長さ
（例えば、５〜５００個の塩基）の重合形態を有してよいヌクレオチドである。この用語
は一本鎖（ｓｓ）及び二本鎖の（ｄｓ）分子を含み、後者は互いに少なくとも部分的に相
補する二本鎖を含有する。「相補」のオリゴヌクレオチド配列は、標準のワトソン・クリ
ック（Ｗａｔｓｏｎ-Ｃｒｉｃｋ）相補法（例えば、ＡとＴ、ＧとＣ塩基対合）によって
塩基対合を行うことのできる配列である。
【００５２】
本文に用いられれるように、「官能基」は、例えば求電子基、求核基、ジエン、親ジエ
ン体等の、別のラジカルと反応可能な化学基である。官能基の一例としては、-ＮＨ２、-
ＳＨ、-ＯＨ、-ＣＯ２Ｈ、ハロゲン、-Ｎ３、-ＣＯＮＨ２等を含むが、それらに限定され
ない。
【００５３】
本文に用いられれるように、「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」とは、オリゴヌクレオチド
に操作可能に接続され且つ少なくとも１つの官能基を含む如何なる接続分子である。
【００５４】
「ハロゲン化」又は「ハロゲン」の用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素の如何なる
ラジカルを指す。
【００５５】
一般的に、別に説明しない限り、置換基（ラジカル）の接頭語は母体の水素化物に由来
し、下記２つの形態の何れにより取得される。（ｉ）「ｙｌ」、「ｄｉｙｌ」、「ｔｒｉ
ｙｌ」、「ｔｅｔｒａｙｌ」等の接尾語で母体の水素化物における「ａｎｅ」に取って代
わる。（ｉｉ）「ｙｌ」、「ｄｉｙｌ」、「ｔｒｉｙｌ」、「ｔｅｔｒａｙｌ」等の接尾
語で母体の水素化物における「ｅ」に取って代わる（ここで、自由価を有する原子（例え
ば、指定される場合）は、例えば設立された何なる母体の水素化物の番号と一致であるよ
うな低い数字が与えられる）。本文は、例えばアダマンチル基、ナフチル基、アントリル
基、フェナントリル基、フリル基、ピリジル基、イソキノリル基、キノリル基及びピペリ
ジル基のような公認の略称、及び例えばビニール基、アリル基、フェニル基及びチエニル
基のような俗称を更に使用する。縮合した二環、三環、多環置換基の番号及び命名につい
ても、従来の番号／レタリングシステムを守る。
【００５６】
「アルキル基」の用語とは、飽和した炭化水素鎖であり、特定数の炭素原子を含有する
直鎖又は支鎖であってよい。例えば、Ｃ１-６アルキル基は、このラジカルに１〜６個の
炭素原子を有する可能性がある。如何なる原子も任意で置換されてよく、例えば、１つ又
は複数の置換基により置換されてよい。アルキル基の一例としては、メチル基、エチル基
、ｎ-プロピル基、イソプロピル基及びｔ-ブチル基を含むが、それらに限定されない。
【００５７】
「アルケニル基」の用語は、特定数の炭素原子を含有し且つ１つ又は複数の炭素二重結
合を有する直鎖又は支鎖の炭化水素鎖である。如何なる原子も任意で置換されてよく、例
えば、１つ又は複数の置換基により置換されてよい。アルケニル基は、例えば、ビニール
基、アリル基、１-ブテニル基及び２-ヘキセニル基を含んでもよい。炭素の二重結合の何
れは、任意でアルケニル基の置換基の付着点であってよい。
【００５８】
「アルキニル基」の用語とは、特定数の炭素原子を含有し且つ１つ又は複数の炭素三重
結合を有する直鎖又は支鎖の炭化水素鎖である。アルキニル基も、任意で置換されてよく
、例えば、１つ又は複数の置換基により置換されてよい。アルキニル基は、例えば、エチ
ニル基、プロパルギル基及び３-ヘキセニル基を含んでよい。炭素の三重結合の何れも、
任意でアルキニル基置換基の付着点であってよい。
【００５９】
「シクロアルキル基」の用語とは、完全飽和した単環、二環、三環又は他の多環炭化水
素基である。如何なる原子も任意で置換されてよく、例えば、１つ又は複数の置換基によ
り置換されてよい。環炭素は、シクロアルキル基の別のラジカルとの付着点とされる。シ
クロアルキル基のラジカルは、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペン
チル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル、アダマンチル基及びノルボルニル基（ビシ
クロ[２．２．１]ヘプチル基）を含んでよい。
【００６０】
「シクロアルケニル基」の用語とは、１つ又は複数の炭素二重結合を含有する非芳香族
の単環、二環、三環又は他の多環炭化水素基である。如何なる原子も任意で置換されてよ
く、例えば、１つ又は複数の置換基により置換されてよい。環炭素は、シクロアルケニル
基の別のラジカルとの付着点とされる。シクロアルケニル基部分は、例えば、シクロペン
テニル基、シクロヘキセニル基及びシクロペンテニル基を含んでもよい。
【００６１】
「ヘテロシクロアルキル基」の用語とは、完全飽和した単環、二環、三環又は他の多環
システムであり、独立してＯ、Ｎ（理解すべきなのは、窒素価を完璧にし及び／又は塩を
形成するように、１つ又は２つの他のラジカルが存在してもよい）又はＳから選ばれるヘ
テロ原子環を構成する１つ又は複数の原子を含有する。ヘテロ原子又は環炭素は、ヘテロ
シクロアルキル基置換基の別のラジカルとの付着点であってよい。如何なる原子も任意で
置換されてよく、例えば、１つ又は複数の置換基により置換されてよい。ヘテロシクロア
ルキル基は、例えば、テトラヒドロフルフリル基、テトラヒドロピラニル基、ピペリジニ
ル基（ピペリジノ基）、ピペラジニル基、モルホリニル基（モルホリノ）、ピロリニル基
及びピロリジニル基を含んでよい。
【００６２】
「ヘテロシクロアルケニル基」の用語とは、非芳香族の単環、二環、三環又は他の多環
炭化水素基であり、１つ又は複数の炭素二重結合及び独立してＯ、Ｎ（理解すべきなのは
、窒素価を完璧にし及び／又は塩を形成するように、１つ又は２つの他のラジカルが存在
してもよい）又はＳから選ばれるヘテロ原子環を構成する１つ又は複数の原子を含有する
。ヘテロ原子又は環炭素は、ヘテロシクロアルケニル基の置換基の別のラジカルとの結合
位置であってよい。如何なる原子も任意で置換されてよく、例えば、１つ又は複数の置換
基により置換されてよい。
【００６３】
「アリール基」の用語とは、芳香族単環、二環（２つの縮合環）、又は三環（３つの縮
合環）、又は多環（>３つの縮合環）環状炭化水素系である。１つ又は複数の環状原子も
任意で置換されてよく、例えば１つ又は複数の置換基により置換されてよい。アリール基
のラジカルは、例えば、フェニル基及びナフチル基を含む。
【００６４】
「ヘテロアリール基」の用語とは、指芳香族単環、二環（２つの縮合環）、三環（３つ
の縮合環）又は多環（>３つの縮合環）炭化水素基であり、独立してＯ、Ｎ（理解すべき
なのは、１つ又は２つの他のラジカルが存在してもよい窒素価を完璧にし及び／又は塩を
形成するように、）又はＳから選ばれる１つ又は複数のヘテロ原子環原子を含有する。１
つ又は複数の環状原子も任意で置換されてよく、例えば、１つ又は複数の置換基により置
換されてよい。ヘテロアリール基の一例としては、２Ｈ-ピロリル基、３Ｈ-インドリル基
、４Ｈ-キノリル基、アクリジニル基、ベンゾ[ｂ]チエニル基、ベンゾチアゾリル基、β-
カルボリニル基、カルバゾリル基、クマリニル基、クロメニル基、シンノリニル基、ジベ
ンゾ[ｂ，ｄ]フリル基、フラザニル基、フリル基、イミダゾリル基、イミジゾリル基、イ
ンダゾリル基、インドリル基、イソベンゾフラニル基、イソインドリル基、イソキノリル
基、イソチアゾリル基、イソオキサゾリル基、ナフチリジニル基、オキサゾリル基、ペリ
ミジニル基、フェナントリジニル基、フェナントロリニル基、フェナルサジニル基、フェ
ナジニル基、フェノチアジニル基、フェノキサチイニル基、フェノキサジニル基、フタラ
ジニル基、プテリジニル基、プリニル基、ピラニル基、ピラジニル基、ピラゾリル基、ピ
リダジニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピロリル基、キナゾリニル基、キノリル基
、キノキサリニル基、チアジアゾリル基、チアントレニル基、チアゾリル基、チエニル基
、トリアゾリル基及びキサンテニル（ｘａｎｔｈｅｎｙｌ）を含むが、それらに限定され
ない。
【００６５】
「アミン」の用語は、第１級アミン（-ＮＨ２）、第２級アミン（-ＮＨＲ）、第３級ア
ミン（-ＮＲＲ'）及び第４級アミン（-Ｎ＋ＲＲ'Ｒ''）を含み、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は独立
して例えば直鎖又は支鎖のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基
、アリール基、ヘテロアリール基、複素環等から選ばれる置換基である。
【００６６】
「置換基」の用語とは、このラジカルの如何なる原子において例えばアルキル基、ハロ
アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基、
シクロアルケニル基、アリール基又はヘテロアリール基を「置換」するラジカルである。
一つの方面では、ラジカルにおける置換基は、独立してこの置換基としての如何なる単一
、又は２つの又は複数の許容可能な原子の如何なる組成又は原子団である。
【００６７】
元素の「原子価」の用語は、元素から化学化合物又は分子を形成する場合に他の原子と
の結合力の度量である。原子又はラジカルが２つの共有結合を形成することができる場合
、２価等である。例えば、炭素は４価である。
【００６８】
本文に用いられれるように、「官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）」の用
語とは、１つ又は複数の構造単位を含む化学基である。好ましくは、官能基における構造
単位は核酸ではない。官能基は、線状又は支鎖状又は環状の重合体又はオリゴマー又は小
さな有機分子である。
【００６９】
本文に用いられれるように、「構造単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）」の用語は
、「シントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）」と交換して使用することができ、他の化学構造単位に
接続され、或いは他のこのような単位に接続可能な化学構造単位である。官能基が重合体
又はオリゴマーである場合、構造単位は重合体又はオリゴマーの単体単位である。構造単
位は、１つ又は複数の追加構造（「末梢構造単位」）が接続され又は接続可能である骨格
構造（「骨格構造単位」）を含んでもよい。
【００７０】
理解すべきなのは、本文に用いられれるように、「構造単位」の用語とは、官能基に存
在し且つ官能基を合成するための反応形態で存在するので、化学構造単位である。官能基
内において、構造単位があるが構造単位の如何なる部分もなく、この部分は構造単位を官
能基に合併することで失われる。例えば、結合形成で小分子を釈放する状況で、官能基に
存在する構造単位は「構造単位残基」であり、つまり合成過程で使用する構造単位が原子
を失った後の残りの部分であり、原子を失って釈放した分子に貢献する。
【００７１】
構造単位は如何なる相補である化合物であってよく、つまり、合わせて反応して２つの
又は複数の構造単位を含む構造を形成できなければならない。用いられるある構造単位（
例えば、オリゴマー官能基における最後の構造単位）の各々に１つの反応基しかない可能
性があるが、一般的に、用いられる全ての構造単位の何れも少なくとも２つの反応基を有
する。２つの異なる構造単位における反応基は相補であるべきであり、つまり、合わせて
反応して共有結合を形成することができ、それに従って、例えば水、ＨＣｌ、ＨＦ等の小
分子を失う可能性がある。
【００７２】
本発明の目的のために、２つの反応基が合わせて反応して共有結合を形成できれば、そ
れらは相補的である。１つの実施例において、副産物を大量に形成せずに、結合形成が環
境条件で迅速に発生する。好ましくは、所定の反応基が所定の相補的な反応基とちょうど
１回反応する。１つの実施例において、２つの構造単位の相補的な反応基が反応し、例え
ば、求核置換によって、共有結合を形成する。１つの実施例において、一対の相補的な反
応基の１つの成員は求電子基であり、この対における他方の成員は求核基である。
【００７３】
相補的な求電子基及び求核基は、適当な条件で求核置換反応によって共有結合を生成す
る如何なる２つのラジカルを含む。各種の適合な結合形成は、従来の技術において既知の
ものである。例えば、Ｍａｒｃｈ、『高等有機化学、第４版（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇ
ａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）』、ニューヨーク：ジ
ョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）（１９９
２）、第１０〜１６章；Ｃａｒｅｙ  &  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、『高等有機化学、Ｂ部分（
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｐａｒｔ  Ｂ）』、ｐｌｅｎ
ｕｍ出版社（１９９０）、第１〜１１章、及びＣｏｌｌｍａｎ等、『有機過渡金属化学の
原理及び適用（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒ
ｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ（１９８７
）、第１３〜２０章を参照されたい。そのそれぞれの全ての内容も引用されるように本文
に合併される。適合な求電子基の一例としては、塩化アシル基、エステル基（カルボニル
ペンタフルオロフェニルエステル（ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎ
ｙｌ  ｅｓｔｅｒ）及びスクシニミドエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）
を含む）、ケトン基及びアルデヒド基のような反応的なカルボニル基、塩化スルホニル基
のような反応的なスルホニル基及び反応的なホスホリル基を含む。他の求電子基としては
、末端エポキシド基、イソシアネート基及びハロゲン化アルキル基を含む。適合な求核基
としては、第１級アミノ基及び第２級アミノ基及びヒドロキシル基及びカルボキシル基を
含む。
【００７４】
適合な相補的な反応基は下記のとおりである。当業者であれば、本方法に利用可能な他
の反応基対を容易に確定することができ、本文の提供する例示は本発明を制限するための
ものではない。
【００７５】
第１実施例において、相補的な反応基は、活性化カルボキシル基、反応的なスルホニル
基又は反応的なホスホリル基又はその組成、及び第１級アミノ基又は第２級アミノ基を含
む。本実施例において、相補的な反応基が適合な条件で反応してアミド、スルホンアミド
又はホスホノアミダートボンドを形成する。
【００７６】
第２実施例において、相補的な反応基は、エポキシド基及び第１級又は第２級アミノ基
を含む。エポキシド含有の構造単位は、適合な条件でアミン含有の構造単位と反応して炭
素-窒素結合を形成し、β-アミノ・アルコールを発生させる。
【００７７】
別の実施例において、相補的な反応基は、アジリジン基及び第１級又は第２級アミノ基
を含む。適合な条件で、アジリジン含有の構造単位がアミン含有の構造単位と反応して炭
素-窒素結合を形成し、１,２-ジアミンを発生させる。第３実施例において、相補的な反
応基は、イソシアネート基及び第１級又は第２級アミノ基を含む。イソシアネート含有の
構造単位は、適合な条件でアミノ基含有の構造単位と反応して炭素-窒素結合を形成し、
尿素を生成することができる。
【００７８】
第４実施例において、相補的な反応基は、イソシアネート基及びヒドロキシル基を含む
。イソシアネート含有の構造単位は、適合な条件でヒドロキシル基含有の構造単位と反応
して炭素-酸素結合を形成して、カルバマート基を生成することができる。
【００７９】
第５実施例において、相補的な反応基は、アミノ基及びカルボニル基含有のラジカル、
例えばアルデヒド基又はケトン基を含む。アミンは、還元的アミノ化によってこれらのラ
ジカルと反応して新しい炭素-窒素結合を生成する。
【００８０】
第６実施例において、相補的な反応基は、ホスホラスイリド基及びアルデヒド基又はケ
トン基を含む。リンイリド含有の構造単位は、適合な条件でアルデヒド含有又はケトン含
有の構造単位と反応して炭素二重結合を形成して、アルケンを生成する。
【００８１】
第７実施例において、相補的な反応基は、付加環化反応によって環状構造を生成する。
このような相補的な反応基の１つの例示としては、アセチレン及び有機アジドがあり、そ
れらが適合な条件で反応してトリアゾール環構造を生成する。このような反応の適当な条
件は、本分野で既知され且つ特許ＷＯ  ２００３／１０１９７２の公開したものを含み、
この特許の全ての内容は引用されるように本文に合併される。
【００８２】
第８実施例において、相補的な反応基は、ハロゲン化アルキル基及び求核基、例えばア
ミノ基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基である。これらのラジカルが適合な条件で反
応して炭素-窒素（ハロゲン化アルキル基＋アミン）又は炭素-酸素（ハロゲン化アルキル
基＋ヒドロキシル基又はカルボキシル基）を形成する。
【００８３】
第９実施例において、相補の官能基は、ハロゲン化複素芳香族基及び求核基である。且
つ構造単位は、適合な条件で芳香族求核置換によって接続される。適合なハロゲン化複素
芳香族基は、塩素化ピリミジン、トリアジン及びプリンを含み、それらが温和な条件で水
溶液において求核試薬（例えば、アミン）と反応する。
【００８４】
理解すべきなのは、官能基の合成は、１つの特定なタイプの結合反応によって行われて
よく、例としては上記反応の一つを挙げてよいがそれに限定されず、或いは２つ又は複数
の結合反応の組み合わせによって行われてよく、例としては上記の２つ又は複数の結合反
応を挙げてよい。例えば、１つの実施例において、構造単位は、アミド生成（アミノ基と
カルボン酸との相補基）と還元的アミノ化（アミノ基とアルデヒド又はケトンとの相補基
）との組み合わせてによって接続される。結合化学過程とオリゴヌクレオチドの存在とが
両立できれば、如何なる結合化学過程を使用してもよい。本発明の幾つかの実施例に用い
られる二本鎖の（ｄｕｐｌｅｘｓ）オリゴヌクレオチドタグが化学において一本鎖のタグ
よりも安定であるため、より広い反応条件を耐え且つ一本鎖のタグの達成できない結合形
成の使用を許容することができる。
【００８５】
反応基或いは官能基を形成するためのラジカル以外、構造単位は、１つ又は複数の追加
官能基を更に含んでもよい。これらの追加官能基における１つ又は複数は、これらの官能
基の所望されていない反応の発生を防止するよに保護されてよい。各種の官能基の適当な
保護基は、本分野において既知されるものである（Ｇｒｅｅｎｅ  &  Ｗｕｔｓ、『有機
合成における保護基、第２版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎ
ｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）』、ニューヨーク：ジョン
・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）（１９９１）
、ここで引用されるように本文に合併される）。特に有用な保護基は、ｔ-ブチルエステ
ル及びエーテル、アセタール、トリチルエーテル及びアミン、アセチルエステル、トリメ
チルシリルエーテル、トリクロロエチレンエーテル及びエステル及びカルバメートを含む
。
【００８６】
１つの実施例において、構造単位の各々も２つの反応基を含み、この２つの反応基は同
一であっても異なってもよい。例えば、サイクルｓに加える構造単位の各々も２つの同じ
の反応基を含むが、それらの何れも工程ｓ-１及びｓ＋１に加える構造単位の反応基と相
補である。別の実施例において、構造単位の各々は２つの自身で相補的な反応基を含む。
例えば、ポリアミド分子を含むライブラリーは、２つの第１級アミノ基を含む構造単位と
２つの活性化カルボキシル基を含む構造単位との反応によって発生してよい。交互のアミ
ド基が反対する方向性を有するため、生成した化合物にＮ又はＣ端部はない。或いは、ポ
リアミドライブラリーは、何れもアミノ基及び活性化カルボキシル基を含む構造単位によ
って発生することができる。この実施例において、サイクルの工程ｎに加える構造単位が
１つの自由反応基を有し、この自由反応基と第ｎ-１構造単位における利用可能な反応基
と相補であると共に、好ましくは、第ｎ構造単位における別の反応基が保護される。例え
ば、ライブラリーの成員がＣからＮ方向まで合成されれば、添加される構造単位は活性化
カルボキシル基及び保護されるアミノ基を含む。
【００８７】
この官能基は、例えばペプチド、模倣ペプチド、ペプチド核酸又はペプトイド類のよう
な、重合又はオリゴマー部分であってよく、或いは例えば、中心骨格を含む構造及び骨格
末梢を囲んで排列する構造を有する分子のような、小さな非重合分子であってよい。線状
重合体又はオリゴマーライブラリーは２つの活性基を有する構造単位を使用することで発
生し、分枝状重合体又はオリゴマーライブラリーは３つ又はより多くの反応基を有する構
造単位を使用することで発生し、必要に応じて２つの反応基のみを有する構造単位と組み
合わせてよい。これらの分子は通式Ｘ１Ｘ２〜Ｘｎにより表され、Ｘの各々はｎ個の単体
単位を含む重合体の単体単位であり、ｎは１より大きい整数である。オリゴマー又は重合
化合物の例示において、末端構造単位は２つの官能基を含む必要はない。例えば、ポリア
ミドライブラリーの実例において、Ｃ端部構造単位はアミノ基を含んでもよいが、カルボ
キシル基の存在は選択的である。類似に、Ｎ端部構造単位は、カルボキシル基を含んでよ
いが、アミノ基を含む必要はない。
【００８８】
少なくとも１つの構造単位が他の構造単位と反応可能な３つの官能基を含めば、支鎖オ
リゴマー又は重合化合物を合成することもできる。本発明のライブラリーは、線状分子、
支鎖分子又は線状分子と支鎖分子との組み合わせを含んでよい。
【００８９】
例えば２つの又は複数の反応基を有する骨格構造単位と１つの利用可能な反応基のみを
有する他の構造単位とを結合させてライブラリーを構成してもよい。例えば、何なる追加
の反応基は保護され又は骨格構造単位にある他の反応基と反応しない。
【００９０】
１つの実施例において、本発明のライブラリーはポリアミド化合物を含む。このポリア
ミド化合物は、例えばアラニン（Ａｌａ；Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、アスパラギン
（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン（Ｇｌｕ；Ｅ）、ヒスチジン
（Ｈｉｓ；Ｈ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、フェニルアラニン（
Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、セリン（Ｓｅｒ；
Ｓ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、
イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、
プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）のような（毎種類のアミノ酸
の３文字及び１文字のコードが与えられる）、２０種類の天然α-アミノ酸を含む、如何
なるアミノ酸から誘導された構造単位により構成されてよい。それらの天然形態において
、前記毎種類のアミノ酸の何れもＬ-配置で存在し、別に説明しない限り、本文において
Ｌ-配置とされる。しかしながら、これらのアミノ酸のＤ-配置形態は本方法に使用されて
もよい。これらのＤ-アミノ酸は本文において、ａｌａ（ａ）、ｇｌｙ（ｇ）、ｌｅｕ（
ｌ）、ｇｌｎ（ｑ）、ｔｈｒ（ｔ）、ｓｅｒ（ｓ）等のような、小文字の３文字又は１文
字のコードで表す。構造単位は、他のα-アミノ酸から誘導されてもよい。例えばナフチ
ルアラニン、フェニル基置換のフェニルアラニン（４-フッ素、４-塩素、４-臭素及び４-
メチルフェニルアラニンを含む）のような３-アリールアラニン（３-ａｒｙｌａｌａｎｉ
ｎｅｓ）、例えば３-ピリジルアラニン、３-チエニルアラニン、３-キノリルアラニン及
び３-イミダゾリルアラニンのような３-ヘテロアリールアラニン（３-ｈｅｔｅｒｏａｒ
ｙｌａｌａｎｉｎｅｓ）、オルニチン、シトルリン、ホモシトルリン、サルコシン、ホモ
プロリン、ホモシステイン、例えばヒドロキシプロリン及びフルオロプロリンのような置
換されたプロリン、デヒドロプロリン、ノルロイシン、Ｏ-メチルチロシン、Ｏ-メチルセ
リン、Ｏ-メチルトレオニン及び３-シクロヘキシルアラニンを含むが、それらに限定され
ない。前記のアミノ酸の各々も、Ｄ-又はＬ-配置で使用されてよい。
【００９１】
構造単位は、α-アミノ酸ではないアミノ酸、例えばα-アザアミノ酸、β、γ、δ、ε
-アミノ酸、及びＮ-置換アミノ酸、例えばＮ-置換グリシンであってもよい。Ｎ-置換基は
、例えば、置換又は非置換のアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアル
キル基又はヘテロアリールアルキル基であってよい。１つの実施例において、Ｎ-置換基
は、自然発生的又は非自然発生的なα-アミノ酸の側鎖である。
【００９２】
構造単位は、模倣ペプチド構造、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又
はペンタペプチド模倣ペプチドであってもよい。このような模倣ペプチド構造単位は、ア
ミノアシル化合物から誘導されてよく、これにより、付加することで長くなったポリ（ア
ミノアシル基）基のこれらの構造単位の化学性質が他の構造単位に用いられる化学性質と
同一又は類似になる。構造単位は、ペプチド骨格修飾を含む模倣ペプチド官能基例えばψ
[ＣＨ２Ｓ]、ψ[ＣＨ２ＮＨ]、ψ[ＣＳＮＨ２]、ψ[ＮＨＣＯ]、ψ[ＣＯＣＨ２]及びψ[
（Ｅ）又は（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ]を形成するように、ペプチド結合と等配電子の（ｉｓｏｓ
ｔｅｒｉｃ）結合を形成可能な分子であってもよい。上文で使用する命名方法において、
ψはアミドが存在しないことを表す。角括弧内にアミド基を置換する構造が指定される。
ライブラリー構成用の方法及び組成物及びその用途
【００９３】
１つの実施例において、本発明は、少なくとも２つの官能基を含む分子の合成方法を提
供し、この官能基がコート化オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される。この方法は、
少なくとも２つの開始官能基を含む開始化合物を提供し、開始官能基の各々はｎ個の構造
単位を含み、ｎは１以上の整数であり、この少なくとも２つの開始官能基はそれぞれ少な
くとも１つの反応基を含み、且つ初期オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される工程（
ａ）と、共有結合を形成するための相補的な反応基の反応に適する条件で、開始化合物と
少なくとも１つの相補的な反応基を含む構造単位とを反応させ、この少なくとも１つの相
補的な反応基と工程（ａ）の少なくとも１つの反応基とが相補である工程（ｂ）と、引入
オリゴヌクレオチドと初期オリゴヌクレオチドとを接続させてコート化オリゴヌクレオチ
ドを形成することに適する条件で、触媒初期オリゴヌクレオチドと引入オリゴヌクレオチ
ド接続の酵素の存在下で、初期オリゴヌクレオチドと引入オリゴヌクレオチドとを反応さ
せて、コート化オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される少なくとも２つの官能基を含
む分子を発生させて、この引入オリゴヌクレオチドが工程（ｂ）における構造単位を識別
する工程（ｃ）と、を備える。工程（ｃ）の少なくとも２つの官能基が少なくとも１つの
反応基を含めば、工程（ａ）〜（ｃ）を１回又は複数回繰り返して、サイクル１〜ｉを形
成してよく、ｉは２以上の整数であり、サイクルｓにおける工程（ｃ）の産物はサイクル
ｓ＋１における工程（１）の開始化合物になり、ｓはｉ-１以下の整数である。サイクル
の各々において、１つの構造単位を長くなった官能基に加えて、且つ新しい構造単位をコ
ードする１つのオリゴヌクレオチド配列を長くなったコート化オリゴヌクレオチドに加え
る。
【００９４】
１つの実施例において、単独した構造単位の各々は異なるオリゴヌクレオチドに関連付
けられることで、所定のサイクルに加えられたオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド
配列が同一サイクルに添加される構造単位を識別するようになる。
【００９５】
構造単位の結合及びオリゴヌクレオチドの接続は、一般的に、類似な濃度の初期物料及
び試薬に発生する。構造単位に有効的に結合されるように、例えば、マイクロモル乃至ミ
リモルのレベルの反応物濃度、例えば約１０μＭ〜約１０ｍＭを使用してよい。
【００９６】
ある実施例において、この方法は、工程（ｂ）の後で、如何なる反応しなかった開始官
能基を捕捉する工程を更に備える。特定サイクルにおける如何なる反応しなかった開始官
能基を捕捉して、このサイクルにおける開始官能基が後のサイクルで添加される構造単位
と反応しないようにする。このような反応は、１つ又は複数の構造単位の欠ける官能基を
生成して、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応するある官能基構造を発生させることは
可能である。このような捕捉は、如何なる残りの開始官能基と化合物とを反応させること
で完成されてよく、この化合物が工程（ｂ）における反応基と反応する。ある実施例にお
いて、捕捉剤化合物が工程（ｂ）における反応基と快速に反応し、且つ後のサイクルで添
加される構造単位と反応可能な他の反応基を含有しない。例えば、化合物の合成において
、工程（ｂ）の反応基がアミノ基である場合、適合な捕捉剤化合物としては、Ｎ-ヒドロ
キシスクシンイミドエステル、例えば酢酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルであっ
てよい。
【００９７】
本発明は、更に、本発明の方法で生産可能な化合物、及びこれらの化合物の集合、これ
らの化合物又は独立した種類として、又はプールして形成した化学構造ライブラリーに関
する。ある実施例において、前記化合物は通式（Ｉ）を有してよい。
0006911248.tif 000004
（Ｉ）
Ｘは原子又は分子骨格であり、Ａ１は２価のリンカー及びオリゴヌクレオチドを含む部
分であり、Ａ２は２価のリンカー及びオリゴヌクレオチドを含む部分であり、Ｍ１は官能
基を含む部分であり、Ｍ２は官能基を含む部分である。ある実施例において、Ｘは原子又
は原子団を含む４価又はより高価の多価ラジカルである。１つの実施例において、Ｘは炭
素原子、ホウ素原子、窒素原子、リン原子又は多原子の骨格である。別の実施例において
、Ｘはヒドロキシ基、環状基又は多環基である。また１つの実施例において、Ｘはシクロ
アルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基
、アリール基又はヘテロアリール基である。
【００９８】
ある実施例において、前記化合物は通式（ＩＩ）を有する。
0006911248.tif 000005
（ＩＩ）
Ｌ１は２価のリンカーであり、Ｚ１はその３’末端でＬ１に接続されるオリゴヌクレオ
チドであり、Ｌ２は２価のリンカーであり、Ｚ２はその５’末端でＬ２に接続されるオリ
ゴヌクレオチドであり、Ｎ１は多官能リンカーＳ１に接続される官能基を含む部分であり
、この多官能リンカーＳ１がまた基Ｙ１のｎ１個のコピーに接続され、Ｙ１のコピーの各
々が独立して少なくとも１つのシントンを含み、Ｎ２は多官能リンカーＳ２に接続される
官能基を含む部分であり、この多官能リンカーＳ２がまた基Ｙ２のｎ２つのコピーに接続
され、Ｙ２のコピーの各々が独立して少なくとも１つのシントンを含み、シントンは１組
の化学的に類似である構造単位であり、これらの構造単位は合わせて分子基Ｙ１及びＹ２
を構成することができる。基Ｙ１のｎ１個のコピーは同一であっても異なってもよい。基
Ｙ２のｎ２つのコピーは同一であっても異なってもよい。Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立
してアミノ基、ヒドロキシル基、カルボン酸基、チオール基、ハロゲン化物、アジド基、
アルキニル基又はアルケニル基を含んでよい。
【００９９】
各種の実施例において、Ｚ１及びＺ２は基本的に相補であり且つ前記化合物において適
合な条件でワトソン・クリック塩基対合及び二本鎖の形成を許容できるように配向される
。Ｚ１及びＺ２の長さは同一又は異なる。Ｚ１及びＺ２は基本的に同じの長さを有してよ
く、或いはＺ１及びＺ２の一方が他方よりも１〜１０個の塩基長い。ある実施例において
、Ｚ１及びＺ２の長さはそれぞれ１０個又はより多くの塩基であり、１０個又はより多く
の塩基対の相補領域を有する。１つの実施例において、Ｚ１及びＺ２はその全体の長さに
おいて基本的に相補であり、つまり、それらの十個の塩基対ごとに１つを超えないミスマ
ッチを有する。Ｚ１及びＺ２はその全体の長さで相補であり、つまり、Ｚ１又はＺ２にお
ける如何なるオーバーハング領域以外に、鎖がワトソン・クリック塩基対によって交配し
、その全体の長さにミスマッチはない。
【０１００】
Ｓ１及びＳ２はそれぞれ独立してアルキレン鎖又はオリゴ（エチレングリコール）鎖を
含んでよい。Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立してヒドロキシ基を含んでよい。
【０１０１】
１つの実施例において、Ｌ１及びＬ２は下記構造を有してよい。
0006911248.tif 000006
【０１０２】
別の実施例において、本発明は、化合物ライブラリーの発生方法を提供し、毎種類の化
合物は少なくとも２つの官能基を含み、この官能基はオリゴヌクレオチドに操作可能に接
続される２つの又は複数の構造単位を含む。１つの実施例において、分子の各々に存在す
るオリゴヌクレオチドは識別分子内の構造単位であり、及び必要に応じて、構造単位の添
加順位は十分な情報を提供する。この実施例において、本発明の方法は化合物ライブラリ
ーの合成方法を含み、前記化合物は少なくとも２つの官能基を含み、この官能基はオリゴ
ヌクレオチドに操作可能に接続される２つの又は複数の構造単位を含み、このオリゴヌク
レオチドが少なくとも２つの官能基の構造を識別する。この方法は、ｍ個の開始化合物を
含む溶液を提供し、ｍは１以上の整数であり、前記ｍ個の開始化合物はそれぞれ少なくと
も２つの開始官能基を含み、この開始官能基はｎ個の構造単位を含み、ｎは１以上の整数
であり、このｎ個の構造単位がｎ個の構造単位を識別する初期オリゴヌクレオチドに操作
可能に接続される工程（ａ）と、工程（ａ）の溶液をｒ個の反応容器に分けて、ｒは２以
上の整数であり、この溶液のｒ個の等分試料を発生させる工程（ｂ）と、反応容器の各々
における開始化合物とｒ個の構造単位の１つとを反応させ、少なくとも２つの官能基を含
む化合物のｒ個の等分試料を発生させ、この官能基は初期オリゴヌクレオチドに操作可能
に接続されるｎ＋１個の構造単位を含む（ｃ）と、引入オリゴヌクレオチドと初期オリゴ
ヌクレオチドとの酵素による接続に適する条件で、引入オリゴヌクレオチドと初期オリゴ
ヌクレオチドとの接続を触媒する酵素の存在下で、等分試料の各々における初期オリゴヌ
クレオチドと１組のｒ個の異なる引入オリゴヌクレオチドの１つとを反応させて、少なく
とも２つの官能基を含む化合物のｒ個の等分試料を発生させ、前記官能基が前記構造単位
をエンコードする延長したオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される工程（ｄ）と、を
備える。任意で、この方法は、ｒ個の等分試料における２つの又は複数を組み合わせて、
少なくとも２つの官能基を含む化合物の溶液を発生させ、この官能基が構造単位をエンコ
ードする延長したオリゴヌクレオチドに操作可能に接続される工程（ｅ）を更に備えても
よい。工程（ａ）〜（ｅ）は１回又は複数回行われてよく、サイクル１〜ｉを形成し、ｉ
は２以上の整数である。サイクルｓ＋１において、ｓはｉ-１以下の整数であり、工程（
ａ）におけるｍ個の開始化合物を含む溶液はサイクルｓにおける工程（ｅ）の溶液である
。同様に、サイクルｓ＋１において、工程（ａ）の開始化合物はサイクルｓにおける工程
（ｅ）の産物である。
【０１０３】
ある実施例において、工程（ｂ）の溶液は、ライブラリーの合成のサイクルの各々にお
いてｒ部分に分けられる。この実施例において、各部分の何れも特異構造単位と反応する
。
【０１０４】
本発明の方法において、構造単位及び引入オリゴヌクレオチドの添加順位は重要ではな
く、分子の合成の工程（ｂ）及び（ｃ）及びライブラリーの合成における工程（ｃ）及び
（ｄ）は逆であってもよく、つまり、新しい構造単位を添加する前に、引入オリゴヌクレ
オチドを初期オリゴヌクレオチドに接続してよい。ある実施例において、この２つの工程
は同時に行われてもよい。
【０１０５】
ある実施例において、この方法は、工程（ｂ）の後で、如何なる反応しなかった開始官
能基を捕捉する工程を更に備える。特定サイクルにおける如何なる反応しなかった開始官
能基を捕捉して、このサイクルにおける開始官能基が後のサイクルで添加される構造単位
と反応しないようにする。このような反応は、１つ又は複数の構造単位の欠ける官能基を
生成して、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応するある官能基構造を発生させることは
可能である。このような捕捉は、如何なる残りの開始官能基と化合物とを反応させること
で完成されてよく、この化合物が工程（ｂ）における反応基と反応する。ある実施例にお
いて、捕捉剤化合物が工程（ｂ）における反応基と快速に反応し、且つ後のサイクルで添
加される構造単位と反応可能な他の反応基を含有しない。例えば、化合物の合成において
、工程（ｂ）の反応基がアミノ基である場合、適合な捕捉剤化合物としては、Ｎ-ヒドロ
キシスクシンイミドエステル、例えば酢酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルであっ
てよい。
【０１０６】
１つの実施例において、ライブラリーの合成用の構造単位は、侯選構造単位がライブラ
リーの合成用の条件で適合な相補官能基との反応能力を評価することで、１組の侯選構造
単位から選別される。このような条件で適当な反応性を示す構造単位が選別されてライブ
ラリーに合併される。必要に応じて、所定のサイクルの産物を純化することができる。サ
イクルが中間サイクルであり、つまり最終サイクルの前の如何なるサイクルである場合、
これらの産物は中間体であり且つ次のサイクルが開始する前に純化してよい。サイクルが
最終サイクルである場合、サイクル産物は最終生産物であり、且つ化合物を使用する前に
いつでも純化してもよい。この純化工程は、例えば、反応していない又は過剰の反応物及
びオリゴヌクレオチドの接続用の酵素を除去してよい。例えば高速液体クロマトグラフ（
ＨＰＬＣ）のような液相クロマトグラフィー法、及び適合な共溶剤（例えば、エタノール
）沈殿を含む、産物と溶液にある他の種類のものとを分離させる如何なる適合な方法を使
用してもよい。適合な純化方法は、産物の性質及び合成用の溶剤系によって決められる。
【０１０７】
ある実施例において、反応は例えば緩衝水溶液のような水溶液において行われるが、構
造単位、オリゴヌクレオチド、中間体及び最終生産物及びオリゴヌクレオチドの接続を触
媒するための酵素の溶解特性と一致である混合水／有機媒体において行われてもよい。
【０１０８】
理解すべきなのは、上記方法において所定のサイクルの発生した化合物の論理数はサイ
クルに用いられる異なる開始化合物の数ｍとサイクルに加えられた異なる構造単位の数ｒ
との積であり、サイクルの発生した異なる化合物の実際的な数はｒとｍとの積（ｒ×ｍ）
と同じように高いである場合があるが、幾つかの構造単位と幾つかの他の構造単位との反
応性の差異を考慮すると、それよりも低い可能性もある。例えば、特定な構造単位を特定
な開始化合物に添加する動力学としては、合成サイクルの時間スケールにおいて、この反
応の産物が滅多にあり又は全然ないものであってよい。
【０１０９】
ある実施例において、サイクル１の前に、最後のサイクルの後で、又は任意の２つのサ
イクルの間によく見られる構造単位を添加する。例えば、官能基がポリアミドである場合
、最終のサイクルの後でよく見られるＮ末端キャップ構造単位を添加してよい。-任意の
２つのサイクルの間によく見られる構造単位を引き入れてもよく、例えばアセチレン又は
アジド基のような官能基を添加し、例えば環化によって、ライブラリーの合成の後で官能
基を修飾することができる。
【０１１０】
本文に用いられれるように、「操作可能に接続（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」
の用語とは、２つの化学構造が各種の所望の処理を経過した後でも接続を保持するように
接続される。一般的に、官能基とコート化オリゴヌクレオチドとが適合なリンカーによっ
て共有結合される。リンカーは２価基であり、オリゴヌクレオチドの接続位置及び官能基
の接続位置を有する。例えば、官能基がポリアミド化合物である場合、ポリアミド化合物
は、そのＮ端部、Ｃ端部又はその中の１つの側鎖における官能基によってリンカーに接続
される。リンカーは、少なくとも１つの原子のみによってポリアミド化合物とオリゴヌク
レオチドとを分けることができる。且つある実施例において、例えば少なくとも２つ、少
なくとも３、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも６つの原子のような複数の
原子によってもよい。ある実施例において、リンカーは、ポリアミド化合物がオリゴヌク
レオチドから独立するように目的分子に結合されることを許容するのに十分に柔軟的であ
る。
【０１１１】
１つの実施例において、リンカーがポリアミド化合物のＮ端部及びオリゴヌクレオチド
の５'-ヒドロキシ基に接続される。例えば、リンカーはリンカー前駆体から誘導されてよ
く、この接続集団前駆体は一端の活性化カルボキシル基及び他端の活性化エステルを含む
。リンカー前駆体とＮ-端の窒素原子との反応により、リンカーとポリアミド化合物又は
Ｎ端部構造単位とを接続させるアミドが形成され、リンカー前駆体とオリゴヌクレオチド
５'-ヒドロキシル基との反応により、オリゴヌクレオチドがエステル結合によってリンカ
ーに接続される。リンカーは、例えば、ポリメチレン鎖、例えば-（ＣＨ２）ｎ-鎖又はポ
リ（エチレングリコール）鎖、例えば-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖を含んでよく、２つの状
況の何れにも、ｎは１〜約２０の整数である。好ましくは、ｎは２〜約１２であり、より
好ましくは約４〜約１０である。１つの実施例において、リンカーは、ヘキサメチレン（
-（ＣＨ２）６-）基を含む。
【０１１２】
構造単位がアミノ酸残基である場合、得られた官能基はポリアミドである。アミノ酸は
、如何なる適合な化学方法によって結合してアミドを形成してもよい。ある実施例におい
て、アミノ酸構造単位の結合は、オリゴヌクレオチドの酵素の触媒接続と両立できる条件
で行われ、例えば、ｐＨが中性であり又は中性に近い水溶液において行われる。１つの実
施例において、ポリアミド化合物はＣ端部からＮ端部への方向で合成される。この実施例
において、第１又はＣ端部構造単位はそのカルボキシル基のラジカルにおいて適合なリン
カーによってオリゴヌクレオチドに結合される。第１構造単位が第２構造単位と反応する
。ある実施例において、第２構造単位は、活性化カルボキシル基及び保護されるアミノ基
を有してよい。溶液相のアミド結合形成に適する如何なる活性化／保護基戦略を使用して
もよい。例えば、適合な活性化カルボキシル基の種類としては、酸フッ化物（米国特許第
５,３６０,９２８号、その全ての内容が引用されるように本文に合併される）、対称的な
無水物及びＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。従来の技術により知られるよ
うに、アシル基は、適合な活性化化合物と反応することで原位置で活性化されてもよい。
適合な活性化化合物は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカ
ルボジイミド（ＤＩＣ）、１-エトキシカルボニル-２-エトキシ-１,２-ジヒドロキノリン
（ＥＥＤＱ）、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Ｅ
ＤＣ）、ｎ-プロパン無水燐酸（ＰＰＡ）、Ｎ,Ｎ-ビス（２-オキソ-３-オキサゾリジン）
イミド-塩化ホスホリル（ＢＯＰ-ＣＩ）、ブロモ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサ
フルオロリン酸塩（ＰｙＢｒｏｐ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、カストロ試
薬（ＢＯＰ、ＰｙＢｏｐ）、Ｏ-ベンゾトリアゾリル-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニ
ウム塩（ＨＢＴＵ）、シアノホスホン酸ジエチル（ＤＥＰＣＮ）、２,５-ジフェニル-２,
３-ジヒドロ-３-オキソ-４-ヒドロキシル-チオフェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ’ｓ
試薬；ＨＯＴＤＯ）、１,１'-カルボニル-ジイミダゾール（ＣＤＩ）及び４-（４,６-ジ
メトキシ-１,３,５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ-
ＭＭ）を含む。カップリング試薬は、単独して使用してもよいし、Ｎ,Ｎ-ジメチル-４-ア
ミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ-ｈｙｄｒｏｘｙ  ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅヒドロキ
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、Ｎ-ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（Ｈ
ＯＡｔ）、アザベンゾトリアゾリル-テトラメチルウロニウム塩（ＨＡＴＵ、ＨＡＰｙＵ
）又は２-ヒドロキシピリジンのような添加剤と組み合わせて使用してもよい。ある実施
例において、ライブラリーの合成は、構造的に異なる１組の構造単位を使用できるように
、２つ又は複数の活性化戦略を使用する必要がある。構造単位ごとに、当業者は、適合な
活性化戦略を確定することができる。
【０１１３】
Ｎ末端保護基は、この方法の条件と両立できる如何なる保護基、例えば、溶液相の合成
条件に適する保護基であってよい。例示的な保護基はフルオレニルメチルオキシカルボニ
ル基（「Ｆｍｏｃ」）基である。アミノアシル基の構造単位の側鎖における如何なる潜在
的な反応性官能基も適当な保護を要する可能性がある。ある実施例において、側鎖保護基
がＮ端部保護基と直交し、つまり、側鎖保護基Ｎ-端保護基の除去の必要とする条件と異
なる条件で除去される。適合な側鎖保護基は、側鎖カルボキシル基及び側鎖アミノ基を保
護することに用いられることのできるニトロベラトリル基を含む。別の適合な側鎖アミン
保護基は、Ｎ-ペント-４-エノイルである。
【０１１４】
構造単位は、例えば、１つ又は複数の構造単位における官能基に係る適当な反応によっ
て、官能基に合併された後で修飾されてよい。構造単位の修飾は、最終構造単位を添加し
た後で又は官能基合成における如何なる中間点で、例えば、合成過程の任意のサイクルの
後で行われてよい。本発明の二官能分子ライブラリーを合成する場合、ライブラリー全体
又はその一部において構造単位の修飾を加えて、ライブラリーの複雑さを増えてよい。適
合な構造単位の修飾反応は、官能基とコート化オリゴヌクレオチドとの両立できる条件で
行われる反応を含む。これらの反応の一例としては、アミノ基又はヒドロキシル基のアシ
ル化及びスルホン化、アミノ基のアルキル化、カルボキシル基のエステル化又はチオエス
テル化、カルボキシル基のアミド化、アルケンのエポキシ化、及び本分野の既知の他の反
応を含む。官能基がアセチレン又はアジド官能基含有の構造単位を含む場合、アジド／ア
セチレンの付加環化反応は、構造単位の誘導に用いられることができる。例えば、アセチ
レンを含む構造単位は有機アジドと反応することができ、或いはアジドを含む構造単位は
アセチレンと反応することができ、２つの状況の何れにも、トリアゾールを形成する。構
造単位の修飾反応は、最終構造単位を添加した後で又は合成過程の中間点で行われてよく
、且つ官能基に炭水化物、金属結合基及びある生物分子又は組織型をターゲティングする
ための構造を含む各種の化学構造を追加することに用いられてよい。
【０１１５】
別の実施例において、官能基は、一連の線状の構造単位を含む。この線状シリーズは、
適合な反応によって環化を行う。例えば、線状アレイにおける少なくとも２つの構造単位
がチオール基を含めば、チオール基は酸化されてジスルフィド結合を形成し、線状アレイ
を環化する。例えば、官能基は、２つの又はより多くのＬ-又はＤ-システイン及び／又は
Ｌ又はＤ-ホモシステイン部分を含むオリゴペプチドであってよい。構造単位は、例えば
カルボキシル基及びアミノ基又はヒドロキシル基のような、合わせて反応して線状アレイ
を環化することのできる他の官能基を更に含んでもよい。
【０１１６】
１つの実施例において、線状アレイの１つ構造単位はアルキニル基を含み、線状アレイ
における別の構造単位はアジド基を含む。アジド基及びアルキニル基は、付加環化によっ
て反応するように誘導されて、大環状の構造を形成することができる。１つの具体的な実
施例において、官能基は、そのＣ端部にプロパルギルグリシン構造単位を含み、そのＮ端
部にアジドアセチル基のポリペプチドを含む。アセチレン及びアジド基の適当な条件での
反応により、大環状内にトリアゾール構造を含む環状化合物が形成される。ライブラリー
については、１つの実施例において、ライブラリーの各成員の何れもアセチレン及びアジ
ドを含有する構造単位を含み、且つこのように環化することができる。第２実施例におい
て、ライブラリーの全ての成員の何れもアセチレン及びアジドを含有する構造単位を含む
が、一部分のライブラリーのみが環化される。第３実施例において、幾つかの官能基のみ
がアセチレン及びアジドを含有する構造単位を含み、且つこれらの分子のみが環化される
。前記第２及び第３実施例において、付加環化反応をしたライブラリーは、環状官能基も
線状官能基も含む。
【０１１７】
酵素的方法によってオリゴヌクレオチドを接続する。１つの実施例において、初期構造
単位が初期オリゴヌクレオチドに操作可能に接続される。第２構造単位を初期構造単位に
結合する前に又はその後で、第２構造単位を識別する第２オリゴヌクレオチド配列を初期
オリゴヌクレオチドに接続する。１つの実施例において、初期オリゴヌクレオチドは二本
鎖のものであり、且つ一本の鎖がオーバーハング配列を含み、このオーバーハング配列が
第２オリゴヌクレオチドの一端と相補し且つ第２オリゴヌクレオチドが初期オリゴヌクレ
オチドに接触させるようにする。ある実施例において、初期オリゴヌクレオチドのオーバ
ーハング配列及び第２オリゴヌクレオチドの相補配列の何れも少なくとも約４つの塩基で
ある。より好ましくは、２つの配列の長さが同一である。適合な酵素によって初期オリゴ
ヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを接続してよい。初期オリゴヌクレオチドがそ
の中の一本の鎖（「上鎖」）の５’端部に第１構造単位に接続されれば、上鎖と相補する
鎖（「下鎖」）は５’端部にオーバーハング配列を含み、且つ第２オリゴヌクレオチドは
その５’端部に相補配列を含む。第２オリゴヌクレオチドに接続された後で、第２オリゴ
ヌクレオチド配列と相補する鎖を添加してよく、前記第２オリゴヌクレオチド配列が３’
末端においてオーバーハング相補配列に対応し、且つ他のオーバーハング配列を含む。
【０１１８】
１つの実施例において、長くなった官能基及び引入オリゴヌクレオチドに結合されたオ
リゴヌクレオチドは、「つぎ板」配列を使用することで接続されるように位置決めされる
。前記「つぎ板」配列は、初期オリゴヌクレオチドの３’末端と相補する領域及び引入オ
リゴヌクレオチドの５’端部と相補する領域を含む。つぎ板によりオリゴヌクレオチドの
５’端部が引入オリゴヌクレオチドの３’末端に接近し、酵素による接続によって接続を
完成する。１つの具体的な実施例において、初期オリゴヌクレオチドは１６個の核酸塩基
により構成され、つぎ板が初期オリゴヌクレオチド３’末端の６個の塩基と相補する。引
入オリゴヌクレオチドは１２個の核酸塩基により構成され、つぎ板が引入オリゴヌクレオ
チド５’端部の６個の塩基と相補する。つぎ板の長さ及び相補領域の長さは重要ではない
。しかしながら、相補領域は、接続条件で安定した二量体を形成するのに十分に長いが、
最終分子において過大なコードヌクレオチドを発生するまで長くなってはいけない。相補
領域の長さは、好ましくは約４つの塩基〜約１２個の塩基であり、より好ましくは約５個
の塩基〜約１０個の塩基であり、最も好ましくは約５個の塩基〜約８個の塩基の長さであ
る。
【０１１９】
１つの実施例において、初期オリゴヌクレオチドは二本鎖のものであり、且つ二本鎖は
共有結合されている。リンカーは、二本鎖及び官能基を接続することに用いられる。リン
カーは、如何なる化学構造であってよく、構造単位と好適に反応する第１官能基、オリゴ
ヌクレオチド３’末端と好適に反応する第２官能基、及びオリゴヌクレオチド５’端部と
好適に反応する第３官能基を含む。好ましくは、第２及び第３官能基は、２本のオリゴヌ
クレオチド鎖を二本鎖の交雑を許容する対向方向に位置決めするように配向される。
【０１２０】
初期オリゴヌクレオチドが二本鎖のものである実施例において、引入オリゴヌクレオチ
ドも二本鎖のものである。１つの実施例において、初期オリゴヌクレオチドは、オーバー
ハング配列を提供するように、一本の鎖が他方の鎖よりも長くてよい。この実施例におい
て、引入オリゴヌクレオチドは、初期オリゴヌクレオチドのオーバーハング配列と相補す
るオーバーハング配列を含有する。相補する２つのオーバーハング配列の交雑により、引
入オリゴヌクレオチドが初期オリゴヌクレオチドとの接続位置に入る。この接続は、ＤＮ
Ａ又はＲＮＡリガーゼ触媒によって行われてよい。引入オリゴヌクレオチド及び初期オリ
ゴヌクレオチドのオーバーハング配列は、同じの長さを有し、且つ例えば、２〜約１０個
ヌクレオチド、又は２〜約６個のヌクレオチドのように、２つの又は複数のヌクレオチド
により構成されてよい。１つの実施例において、引入オリゴヌクレオチドは、二本鎖のオ
リゴヌクレオチドであり、各末端にオーバーハング配列を有する。一端のオーバーハング
配列が初期オリゴヌクレオチドのオーバーハング配列と相補し、引入オリゴヌクレオチド
が初期オリゴヌクレオチドに接続された後で、他端のオーバーハング配列が次のサイクル
の初期オリゴヌクレオチドのオーバーハング配列になる。１つの実施例において、３つオ
ーバーハング配列の長さの何れも２〜６個のヌクレオチドであり、且つ引入オリゴヌクレ
オチドのコード配列長さは３〜１０個のヌクレオチドであり、好適な長さは３〜６個のヌ
クレオチドである。１つの具体的な実施例において、オーバーハング配列の長さの何れも
２つのヌクレオチドであり、コード配列の長さは５個のヌクレオチドである。
【０１２１】
別の実施例において、引き入れる鎖はその３’末端に初期オリゴヌクレオチド３’末端
と相補する領域を有するので、二本鎖の５’端部にオーバーハング部分を残す。二本鎖の
の延長したオリゴヌクレオチドを発生させるように、例えばＤＮＡポリメラーゼ（例えば
、ｖｅｎｔポリメラーゼ）によって５’端部を充填してよい。このオリゴヌクレオチドの
下鎖を除去して、同じの方法によって追加の配列を上鎖の３’末端に添加してよい。
【０１２２】
コート化オリゴヌクレオチドタグは、各連続構造単位を鑑別するオリゴヌクレオチドを
連続的に添加することで形成される。本発明の方法の１つの実施例において、連続のオリ
ゴヌクレオチドタグは、コート化オリゴヌクレオチドを発生させるように、酵素による接
続によって結合してよい。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドの酵素による接続を行うには、核酸断片を接続可能な如何なる酵素
を使用してもよい。例示的な酵素としては、リガーゼ、ポリメラーゼ及びトポイソメラー
ゼを含む。本発明の具体的な実施例において、ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ６．５．１．１）、
ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．７）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．６
）又はトポイソメラーゼ（ＥＣ５．９９．１．２）はオリゴヌクレオチドを接続すること
に用いられる。各ＥＣ類別に含まれる酵素としては、例えば、Ｂａｉｒｏｃｈ（２０００
）『核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』２８：３０４-３
０５に記載の内容に見つけられることができる。
【０１２４】
１つの実施例において、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドは、オリゴデオ
キシヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの接続を触媒するための酵素はＤＮＡリガ
ーゼである。リガーゼの存在下で接続を形成するために、つまり、２つのオリゴヌクレオ
チドの間にリン酸二エステル結合を形成するために、一方のオリゴヌクレオチドは遊離し
た５’ヒドロキシ基を含有するが他方のオリゴヌクレオチドが遊離した３'ヒドロキシル
基を含有しなければならない。本発明の方法に利用可能な例示的なＤＮＡリガーゼは、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ（
大腸菌）（何れも例えばニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；ＭＡ）から購入される）を含む。
【０１２５】
当業者であれば、接続するための毎種類の酵素が特定の条件（例えば、温度、バッファ
濃度、ｐＨ及び時間）で最高の活性を有することは理解すべきである。例えば、オリゴヌ
クレオチドタグの最高の接続を取得するように、製造明細書に基づいてこれらの条件の各
々を調整してよい。
【０１２６】
引入オリゴヌクレオチドは、如何なる所望の長さ、例えば、長さが少なくとも３つの核
酸塩基であってよい。引入オリゴヌクレオチドの長さは、４つ以上の核酸塩基であってよ
い。１つの実施例において、引入オリゴヌクレオチドの長さは、３〜約１２個の核酸塩基
である。好ましくは、本発明のライブラリーにおける分子のオリゴヌクレオチドは共通の
末端配列を有する。この末端配列は、例えば、従来の技術により既知されるように、ＰＣ
Ｒプライマーとして使用されてよい。このような共通の末端配列は、ライブラリー合成の
最終サイクルに加えられた引入オリゴヌクレオチドの末端として合併され、或いはライブ
ラリーの合成の後で添加されてよく、例えば、本文の公開する酵素による接続の方法を使
用してよい。
【０１２７】
１つの実施例において、この過程は、合成されるＤＮＡ配列から開始し、この合成のＤ
ＮＡ配列がその５’端部でアミノ基まで終止するリンカーに接続される。工程１において
、トリスバッファにおけるつぎ板ＤＮＡ鎖、ＤＮＡリガーゼ及びジチオスレイトールの存
在下で、この初期ＤＮＡ配列が引入ＤＮＡ配列に接続される。これにより、タグされたＤ
ＮＡ配列が発生し、その後、このタグされたＤＮＡ配列は直接次の工程に使用され又は次
の工程を行う前に純化し、例えば、ＨＰＬＣ又はエタノールで沈殿する。工程２において
、タグされたＤＮＡが保護される活性化アミノ酸と反応（この例示において、Ｆｍｏｃ保
護のアミノ酸フッ素化物である）し、保護されるアミノ酸-ＤＮＡ共役を発生させる。工
程３において、例えば、ピペリジンの存在下で、保護されるアミノ酸-ＤＮＡ共役を脱保
護し、且つ必要に応じて、発生した脱保護される共役は例えばＨＰＬＣ又はエタノールに
よって沈殿して純化される。脱保護される共役は、第１合成サイクルの産物であり、且つ
第２サイクルの初期物料になり、第２アミノ酸残基を脱保護される共役の遊離アミノ基に
添加する。
【０１２８】
ＰＣＲが選択された分子のコート化オリゴヌクレオチドを拡大するための実施例におい
て、コート化オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー結合位置配列を含んでよい。例え
ば、ＰＣＲプライマー結合位置配列は、合成の１番目のサイクルの前に初期オリゴヌクレ
オチドに含まれ、或いは第１引入オリゴヌクレオチドに含まれてよい。コート化オリゴヌ
クレオチドは、更に、コード配列の後のキャップＰＣＲプライマー結合位置配列を含んで
よい。このキャップ配列は、ライブラリーの合成の最終サイクルの後でコート化オリゴヌ
クレオチドに接続され、或いは最終サイクルの引入オリゴヌクレオチドに含まれてよい。
ＰＣＲプライマー結合位置配列が引入オリゴヌクレオチドに含まれる状況で、これらの引
入オリゴヌクレオチドは、コード配列、またＰＣＲプライマー結合位置配列を含むため、
他のサイクルに加えられた引入オリゴヌクレオチドより著しく長くてよい。
【０１２９】
最終構造単位及び最終引入オリゴヌクレオチドを添加した後でキャップ配列を添加する
状況で、例えば本文に記載のライブラリーの合成は、キャップ配列をコート化オリゴヌク
レオチドに接続する工程を含み、基本的に全てのライブラリー成員のオリゴヌクレオチド
部分がＰＣＲプライマー結合位置配列を含む配列に終止する。本発明のライブラリーに好
適に使用されるＰＣＲプライマー結合位置配列は、従来の技術において既知されている。
適合なプライマー及び方法は、例えば、Ｉｎｎｉｓ等、『ＰＣＲプロトコル：方法及び適
用ガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ:  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａ
ｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）』、サンチアゴ：学術出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐ
ｒｅｓｓ）（１９９０）に公開され、その全ての内容が引用されるように本文に合併され
る。ある実施例において、接続によってキャップ配列を混ぜ合わせた成分（最終合成サイ
クルの産物）に添加する。ライブラリー構成に用いられる酵素による方法によってキャッ
プ配列を添加してよい。
【０１３０】
前記のように、本発明の方法の一部分のオリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列と
して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確定されてよい。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドタグは、本文に記載の官能基を構成する構造単位を識別するポリヌ
クレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドタグに対して下記のようなＰＣＲ反応を
行うことで、オリゴヌクレオチドタグの核酸配列を確定する。適合なアンプルとＰＣＲプ
ライマー対とを接触させることで、このプライマー対における各成員が予定のヌクレオチ
ド配列を有する。ＰＣＲプライマー対は、コート化オリゴヌクレオチドタグにおけるＰＣ
Ｒプライマー結合位置と交雑することでプライマー延長反応を起動させることができる。
ＰＣＲプライマー結合位置は、コート化オリゴヌクレオチドタグとして設計されてよい。
例えば、ＰＣＲプライマー結合位置は初期オリゴヌクレオチドタグに合併されてよく、第
２ＰＣＲプライマー結合位置は最終のオリゴヌクレオチドタグにあってよい。或いは、第
２ＰＣＲプライマー結合位置は本文に記載されるようにキャップ配列に合併されてよい。
ある実施例において、ＰＣＲプライマー結合位置の長さは、少なくとも約５、７、１０、
１３、１５、１７、２０、２２又は２５個のヌクレオチドであってよい。
【０１３２】
（例えば、予定量の）ＰＣＲプライマー対と（例えば、予定量の）コート化オリゴヌク
レオチドタグの核酸とをＰＣＲバッファにおいて混合させてＰＣＲ反応混合物を形成する
ことで、ＰＣＲ反応を行う。この混合物は、複数回の熱サイクル（一般的に、事前に確定
されている）で、ＰＣＲ反応産物を十分に形成する。十分な産物とは、得られた産物を分
離させるための十分な量であり、ＤＮＡ配列の測定に用いられる。
【０１３３】
ＰＣＲは、一般的に、熱サイクルによって行われ、つまり、最低限度が約３０℃〜約５
５℃で、最高限度が約９０℃〜約１００℃である温度範囲内でＰＣＲ反応混合物の温度の
上昇や低下を繰り返す。このような上昇及び低下は、連続的であってもよいし、或いはポ
リヌクレオチドの合成、変性及び交雑に寄与する温度で相対温度安定性を持つ各時間段に
おいて段階的なものであってよい。
【０１３４】
ＰＣＲ反応は如何なる適合な方法で行われてよい。一般的に、ＰＣＲ反応は、緩衝水溶
液、つまりＰＣＲバッファで、好ましくは７〜９のｐＨで発生する。ある実施例において
、モル過剰のプライマーがある。大きなモル過剰は、過程効率の向上に役立つ。
【０１３５】
ＰＣＲバッファは、更に、デオキシリボヌクレオシド３リン酸（ポリヌクレオチド合成
基質）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、及び一般的に熱安定的なポリメラー
ゼを含有し、全ての上記物質の何れもプライマーの延長（ポリヌクレオチド合成）反応に
十分なものである。得られた溶液（ＰＣＲ混合物）を約９０℃〜１００℃約まで１〜１０
分間、好ましくは１〜４分間加熱する。この加熱期の後で、溶液を５４℃まで冷却させ、
これはプライマーの交雑に好適である。合成反応は、室温乃至ある温度よりも高い温度範
囲内で発生してよい。ここで、ある温度とは、ポリメラーゼ（誘導剤）がもう有効的に作
用を果たしない温度である。そのため、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用すれば、温度
が一般的に約４０℃より高くない。所望量のＰＣＲ産物が発生するまで熱サイクルを繰り
返す。例示的なＰＣＲバッファは、５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．００１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゼラチン、２００
μＭのｄＡＴＰ；２００ｐＭのｄＴＴＰ；２００μＭのｄＣＴＰ；２００μＭのｄＧＴＰ
、及び１００マイクロリットルごとのバッファに２．５単位のサーマス・アクアチクス（
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）を含有するＤＮＡポリメラーゼＩとい
う試薬を含む。
【０１３６】
プライマー配列を延ばすための適合な酵素としては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及び他の酵素
を含む。その他の酵素としては、各核酸鎖と相補するプライマー延長産物を形成するため
に、ヌクレオチドが適当な形態で組み合わせるように促進する熱安定酵素を含む。一般的
に、合成は各プライマーの３’末端から開始してテンプレート鎖に沿って５'方向で、合
成が終止するまで行われ、異なる長さの分子を発生させる。
【０１３７】
新しく合成されるＤＮＡ鎖がそれと相補する鎖と共に二本鎖の分子を形成し、分析過程
の後の工程に用いられることができる。
【０１３８】
ＰＣＲ拡大方法については、米国特許第４,６８３,１９２号、第４,６８３,２０２号、
第４,８００,１５９号及び第４,９６５,１８８号において詳しく説明され、及び少なくと
も『ＰＣＲ技術：ＤＮＡ拡大原理及び適用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）』、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編集、ストックトン出版社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅ
ｓｓ）、ニューヨーク（１９８９）、及び『ＰＣＲプロトコル：方法及び適用ガイド（Ｐ
ＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ:  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ）』、Ｉｎｎｉｓ等の編集、学術出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅ
ｓｓ）、サンチアゴ、カリフ（１９９０）で説明される。全ての前記文献の内容も引用さ
れるように本文に合併される。
【０１３９】
本文に用いられれるように、プライマーの延長によって合成されたプライマー、プロー
ブ及び核酸断片又はセグメントの「ポリヌクレオチド」の用語については、２つの又は複
数のデオキシリボヌクレオチドを含む分子として定義され、３つよりも多いものは好まし
い。
【０１４０】
本文に用いられれるように、「プライマー」の用語とは、核酸制限酵素により純化或い
は合成的に発生されたポリヌクレオチドである。核酸鎖と相補するプライマーの延長産物
の合成を誘導する条件下で、つまりヌクレオチド及び重合剤（例えば、ＤＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵素等）の存在下で、及び適当な温度及びｐＨで、前記ポリヌクレオチドは、
核酸合成の初期点とされることができる。最大効率を取得するように、プライマーは、好
ましくは一本鎖であるが、二本鎖の形態であってもよい。二本鎖のものであれば、延長産
物の調製に使用される前に、まず、相補する鎖と分けるように、プライマーを処理する。
好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤
の存在下で延長産物の合成を誘発するのに十分に長くなければならない。プライマーの確
実な長さは、温度及びプライマー由来を含む多くの要素によって決められる。
【０１４１】
本文で使用されるプライマーとしては、毎種類の拡大される特定配列の異なる鎖と「基
本的」に相補するものを選択する。これは、プライマーがそれぞれのテンプレート鎖と不
規則に交雑するのに十分に相補でなければならないことを意図する。そのため、プライマ
ー配列は、テンプレートの確実な配列を反映し又は反映しなくてもよい。
【０１４２】
ポリヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｎａｒａｎｇ等（１９７９）、『酵素学方法
（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）』、６８：９０；米国特許４,３５６,２７０、４,４５
８,０６６、４,４１６,９８８、４,２９３,６５２、及びＢｒｏｗｎ等（１９７９）、『
酵素学方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）』、６８：１０９で述べられるリン酸トリエ
ステル又はリン酸ジエステルのような、如何なる適合な方法によって調製されてもよい。
全ての前記文献の内容も引用されるように本文に合併される。
【０１４３】
一旦コート化オリゴヌクレオチドタグが拡大されると、タグの配列及び選択された分子
の最終構成は核酸配列分析によって確定されてよい。核酸配列分析は、ヌクレオチド配列
の配列を確定するための公知の方法である。核酸配列分析は、（ａ）プローブ鎖及びその
相補標的の交雑又は変性に基づいた物理化学技術及び（ｂ）ポリメラーゼによる酵素によ
る反応との組み合わせによって行われる。
【０１４４】
１つの実施例において、本発明のライブラリーは、少なくとも２つの構造単位からなる
官能基を含む分子を含む。前記少なくとも２つの官能基がコート化オリゴヌクレオチドに
操作可能に接続される。コート化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、官能基に存
在する構造単位を指示し、且つある実施例において、構造単位の接続又は排列を指示する
。本発明は、官能基の構成方法やオリゴヌクレオチドタグの構成方法が同じの反応媒体（
例えば、水性媒体）において行われることができるというメリットを有するため、従来の
技術に比べると、ライブラリーの調製方法が簡単化される。ある実施例において、オリゴ
ヌクレオチド接続工程及び構造単位付加工程の何れも水性媒体において行われ、各反応が
異なる最適なｐＨを有する。これらの実施例において、構造単位付加反応は、適合なｐＨ
及び温度で、適合な水性バッファにおいて行われてよい。その後、バッファをオリゴヌク
レオチドの接続に適合なｐＨを与える水性バッファに変更してよい。
【０１４５】
本発明の方法の１つのメリットは、化合物を大量に含むライブラリーの調製に使用され
ることができることにある。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）のような既知方法を使
用してコート化オリゴヌクレオチド配列を拡大する能力は、割りに少ないコピーを回収し
ても選択された分子を識別できることを意図する。これにより、大きいライブラリーの実
際的な適用が可能になる。その高度な複雑性の原因で、このライブラリーは如何なる所定
のライブラリー成員の割りに少ないコピーを含み、或いは大きい体積を使用する必要があ
る。１０８個の特異構造からなるライブラリーを例として、各構造が１×１０１２個のコ
ピー（約１ピコモル）を有すると、１μＭの有効濃度で、約１００Ｌの溶液を必要とする
。同一のライブラリーに対して、各成員が１００００００個のコピーを有すれば、１μＭ
の有効濃度で１００μＬの体積を必要とする。
【０１４６】
１つの実施例において、ライブラリーは、ライブラリー成員の各々の約１０２個の〜約
１０１５個のコピーを含む。ライブラリー成員における合成効率の差異に鑑みて、異なる
ライブラリー成員は、如何なる所定のライブラリーにおいて異なるコピー数を有する可能
性がある。そのため、論理的に、ライブラリーに存在する各成員のコピー数が同一である
可能性があるが、何れの所定のライブラリー成員の実際のコピー数も何れの他の成員のコ
ピー数と関係ない。ある実施例において、本発明の化合物ライブラリーは、ライブラリー
成員の各々又は基本的に全てのライブラリー成員の少なくとも約１０５、１０６又は１０
７個のコピーを含む。「基本的に全ての」ライブラリー成員とは、少なくとも約８５％の
ライブラリー成員であり、好ましくは少なくとも約９０％であり、より好ましくは少なく
とも約９５％のライブラリー成員である。
【０１４７】
ある実施例において、ライブラリーが各成員の十分な数のコピーを含むので、生物学的
標的に対する複数回り（つまり、２回り又は複数回り）の選択を行って、最終回の選択の
後で十分量の結合分子を残して、残された分子のオリゴヌクレオチドタグが拡大できるよ
うになることで、結合分子の官能基を識別することができる。
【０１４８】
１つの実施例において、何れの一回りの選択の後で残された化合物が拡大しない（より
多くのコピーを合成する）。このような拡大により、化合物の混合物が生成し、それが選
択された後で残された化合物の相対量と一致していない。このような不一致は、ある化合
物が他の化合物よりも合成されやすい事実により引き起こされる。そのため、選択された
後でそれらの存在量に比例しないように拡大する可能性がある。例えば、化合物２が化合
物１よりも合成されやすければ、２番目の回りの後で残された分子の拡大により、化合物
２が化合物１に比例せずに拡大し、且つ得られた化合物の混合物において、化合物１の濃
縮（例えば、ある場合）が化合物２よりも大いに低い。
【０１４９】
１つの実施例において、既知の如何なる固定化技術によって標的を固体サポータに固定
する。この固体サポータは、例えば、クロマトグラフィーカラム又は膜内に含まれる水に
溶けない基質であってよい。コードのライブラリーは、クロマトグラフィーカラムに含ま
れる水に溶けない基質に適用されることができる。その後、非特異共役を除去するように
、カラムを洗浄する。その後、ｐＨ、塩濃度、有機溶剤の濃度を変えること又は他の方法
（例えば、標的の既知の配位子と競争する）によって標的の結合された化合物を分離して
よい。
【０１５０】
別の実施例において、標的は、溶液において遊離しており、コードのライブラリーと共
に培養される。ゲルろ過又は超ろ過のようなサイズ分離工程によって、標的に結合された
化合物（本文において、「配位子」とも呼ばれる）を選択的に分離する。１つの実施例に
おいて、コードの化合物と目的生物分子との混合物は、サイズ排除クロマトグラフィーカ
ラム（ゲルろ過）を通過して、如何なる配位子-標的複合体と結合していない化合物を分
離させる。配位子-標的複合体を逆相クロマトグラフィーカラムに移転して、配位子と標
的とを分離させる。その後、ＰＣＲ拡大及びコート化オリゴヌクレオチドの配列分析によ
って、分離した配位子を分析する。この方法は、標的の固定化により活性が失う可能性の
ある状況で、特に有利である。
【０１５１】
一旦、上記方法によって単一の配位子を識別すると、構造-活性関係の情報を発生させ
て、配位子の親和力、特異性及び生物活性の更なる最適化を指導するように、各種の水平
の分析を適用してよい。同一骨格から誘導される配位子については、三次元分子モデリン
グによって配位子の共有の顕著な構造特徴を鑑別して、標的生物分子における共通位置で
結合可能な小分子の配位子族を発生させてよい。
【０１５２】
様々な選別方法によって、１つの標的に対して高親和力を有するが別の密接に関連する
標的に対して明確に弱い親和力を有する配位子を取得することができる。１つの選別戦略
としては、平行実験において２つの生物分子の配位子を識別し、その後で相互参照比較に
よって共通配位子を解消する。この方法において、毎種類の生物分子の配位子は、前記の
ように別々に識別されてよい。この方法は、固定化された標的生物分子にも、溶液で遊離
した標的生物分子にも適合である。
【０１５３】
固定化された標的生物分子に対して、別の戦略としては、ライブラリーからの非標的生
物分子に結合される全ての配位子を捕捉する予選工程を添加するものである。例えば、第
１生物分子は、前記のようにコードのライブラリーに接触してよい。その後、前記第１生
物分子に結合されない化合物と形成された如何なる第１生物分子-配位子複合体とを分離
させる。その後、第２生物分子と第１生物分子に結合されない化合物とを接触させる。第
２生物分子に結合される化合物は、前記のように識別されてよい。且つ、この化合物は、
第２生物分子に対する親和力が第１生物分子に対する親和力よりも著しく高い。
【０１５４】
上文の公開した方法により識別された未知の機能を持つ生物分子の配位子も、生物分子
の生物学機能の確定に使用されてよい。新しい遺伝子配列が持続的に識別されるので、こ
れは有利であるが、これらの配列によりコードされたタンパク質の機能及びこれらのタン
パク質の新薬として発見及び開発された標的の有効性は確定されにくいため、これはゲノ
ム情報の病気治療への適用の最大な障害になる。本発明の前記方法により取得された標的
の特異的配位子は、標的タンパクの機能及び標的タンパクの干渉治療への使用の有効性を
理解させるために、全細胞の生物測定又は適当な動物モデルに有効的に使用されてよい。
この方法により、更に、標的が小分子の薬物の発見に特に好適であることが証明される。
【０１５５】
１つの実施例において、本発明のライブラリー内の１種類又は多種類の化合物が特定の
生物分子の配位子として識別される。その後、体外テストによってこれらの化合物の生物
分子に対する結合能力を評価してよい。ある実施例において、オリゴヌクレオチドタグ又
はリンカーのない状況で、化合物と結合する官能基を合成して、これらの官能基の生物分
子に対する結合能力を評価する。
【０１５６】
更に、体外無細胞（ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ-ｆｒｅｅ）又は細胞に基づいたテストによ
って、官能基と生物分子結合の生物分子機能への影響を評価してよい。既知の機能を持つ
生物分子に対して、このテストは、配位子の存在及び非存在の状況下での生物分子の活性
に対する比較を含んでよく、例えば、酵素活性のような活性を直接測定し、又は生物分子
により影響された細胞機能のように間接に測定してよい。生物分子が未知の機能を有すれ
ば、この生物分子を発現する細胞と配位子とを接触させて、配位子の細胞に対する活力、
機能、表現型及び／又は遺伝子発現の影響を評価してよい。体外テストとしては、例えば
、細胞死テスト、細胞増殖テスト又はウイルス複製テストであってよい。生物分子がウイ
ルスにより発現されるタンパク質であれば、このウイルスに感染した細胞とこのタンパク
質の配位子と接触させてよい。その後、この配位子とタンパク質との結合のウイルス活力
に対する影響を評価してよい。
【０１５７】
本発明の方法により識別される配位子は、活体モデル又は人体で評価されてもよい。例
えば、生物分子を発生させる動物又は生体で配位子を評価してよい。動物又は生体の健康
状態（例えば、病気の進展）により引き起こされる如何なる変化を確定することができる
。
【０１５８】
例えば、タンパク質又は核酸分子のような、未知の機能を有する生物分子については、
この生物分子に結合される配位子のこの生物分子を発生させる細胞又は生体に対する影響
は、この生物分子の生物学機能に係る情報を提供することができる。例えば、配位子の存
在下で特定の細胞過程が抑制される観測結果により、この過程は、少なくとも部分的にこ
の生物分子の機能によって決められることが判明される。
【０１５９】
本発明の方法により識別される配位子は、また、それらの結合の生物分子の親和試薬と
されてもよい。１つの実施例において、このような配位子は、生物分子の親和純化された
達成、例えば、１種類又は多種類のこのような配位子に接続される固相を使用して、この
生物分子を含有する溶液に対してクロマトグラフィー分析を行うことに用いられる。
【０１６０】
本発明を下記実施例によって更に説明するが、これらの実施例は限定的なものとして理
解されるべきではない。本出願で引用される全ての参照文献、特許及び公開された特許出
願の内容、及び添付図面及び配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ）も、ここで引
用されるように合併される。
実施例
【０１６１】
実施例１：ＨＵＢの調製
オリゴヌクレオチドの合成用のホスホロアミダイト
0006911248.tif 000007
【０１６２】
（２）の調製：１（１３．４ｇ、１００ｍｍｏｌ、『有機化学雑誌（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ
ｅｍ．）』２００４、６９、２００８-２０１６）のＴＨＦ／飽和ＮａＨＣＯ３（３：１
、８００ｍＬ）溶液にＦｍｏｃＣｌ（７７．６ｇ、３００ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を
室温で３時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏで希釈した後で、酢酸エチルで抽出した。混
ぜ合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過した後で、濾液を真空で濃縮し、
粗生成物を得、粗生成物をシリカゲルカラム（ＰＥ：ＥＡ＝３：１）で純化し、白い固体
２（４６．３ｇ、８０．１％の歩留り）を得た。１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ
３）：δｐｐｍ７．７８（ｄ、Ｊ＝７．５２Ｈｚ、４Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝７．４４
Ｈｚ、４Ｈ）、７．４２（ｍ、４Ｈ）、７．３３（ｍ、４Ｈ）、５．７９（ｔ、Ｊ＝６．
７２Ｈｚ、２Ｈ）、４．４５（ｄ、Ｊ＝６．７６Ｈｚ、２Ｈ）、４．２３（ｔ、Ｊ＝６．
７２Ｈｚ、２Ｈ）、３．９２（ｔ、Ｊ＝６．９２Ｈｚ、２Ｈ）、３．２７（ｄ、Ｊ＝６．
９２Ｈｚ、４Ｈ）、３．０２（ｄ、Ｊ＝６．８０Ｈｚ、４Ｈ）。ＥＳＩ-ＬＣＭＳ：ｍ／
ｚ５７９[Ｍ＋Ｈ]＋。
【０１６３】
（３）の調製：室温で２（５０ｇ、８６．５ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（５００ｍＬ）溶
液にＡｇＮＯ３（２２ｇ、１２９．４ｍｍｏｌ）、コリジン（１５ｍＬ、１１４ｍｍｏｌ
）及びＤＭＴｒ-Ｃｌ（４３．６ｇ、１２８．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一
晩置いた撹拌した。混合物をＭｅＯＨで急冷してＤＣＭで希釈し、塩水で洗浄し、Ｎａ２
ＳＯ４で乾燥し、有機溶剤を真空で除去し、粗生成物を得、粗生成物をゲルシリカゲルカ
ラムで純化し（ＰＥ：ＥＡ＝５：１）、白い固体産物（５４ｇ、歩留り７０．９％）を得
た。１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ７．８４（ｍ、４Ｈ）、７．
４９（ｍ、２０Ｈ）、７．２２（ｍ、２Ｈ）、６．８９（ｍ、４Ｈ）、５．１１（ｍ、２
Ｈ）、４．３９（ｍ、４Ｈ）、４．２２（ｍ、２Ｈ）、３．９４（ｍ、１Ｈ）、３．７５
（ｓ、６Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）、３．４５（ｄ、Ｊ＝５．４２Ｈｚ、２Ｈ）、３．
２１（ｍ、２Ｈ）、３．０７（ｓ、２Ｈ）、２．７４（ｍ、２Ｈ）。ＥＳＩ-ＬＣＭＳ：
ｍ／ｚ  ８８１[Ｍ＋Ｈ]＋。
【０１６４】
（リンカー２）の調製：室温で３（１０ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（１００
ｍＬ）溶液にＤＩＥＡ（６．３ｍＬ、３４．２）及びＣＥＰＣｌ（３．２４ｇ、１３．７
ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で急冷
し、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、有機溶剤を真空で除去し、粗生成物を得、粗
生成物をゲルシリカゲルカラムで純化し（ＰＥ：ＥＡ＝８：１）、白い固体産物（９．５
ｇ、歩留り７７％）を得た。１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ７．
７８（ｍ、４Ｈ）、７．５９（ｍ、４Ｈ）、７．３６（ｍ、１７Ｈ）、６．８４（ｍ、４
Ｈ）、５．４７（ｍ、２Ｈ）、４．３８（ｍ、４Ｈ）、４．２２（ｍ、２Ｈ）、４．００
（ｍ、１Ｈ）、３．８１（ｍ、１Ｈ）、３．５８（ｍ、１１Ｈ）、３．２８（ｍ、３Ｈ）
、２．４８（ｔ、Ｊ＝６．４０Ｈｚ、２Ｈ）、１．１９（ｍ、１２Ｈ）。３１Ｐ-ＮＭＲ
（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１４８．３。
【０１６５】
用いられるオリゴヌクレオチド配列（上鎖：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１；下鎖：ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ．：２）は、下記のような式（ＩＩＩ）に示す。メーカの提供するプロトコ
ルによると、０．０２Ｍのヨウ素溶液を使用して、ＡＢＩ３９４シンセサイザにおいてオ
リゴヌクレオチドの合成を行った。前記オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣによって純化
された（理論的質量：４９２１．８；観測質量：４９２１．６）。
0006911248.tif 000008
（ＩＩＩ）
（ＨＵＢ構造、
0006911248.tif 000009
と省略される）
【０１６６】
デオキシリボヌクレオチドの１文字のコード（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）：
Ａ＝アデノシン
Ｔ＝チミジン
Ｃ＝シチジン
Ｇ＝グアノシン
【０１６７】
ＤＮＡにおける（ｏｎ-ＤＮＡ）反応及び接続の検査及び反応監視の普通の順序：
酵素によるタグの連結又は小分子の反応後のエタノールの沈殿の標準な順序としては、
１０％（体積）の５ＭのＮａＣｌ（水溶液）、２００%〜３００％（体積で算出）の低温
エタノールを加えた後で、−２０℃まで少なくとも１時間冷却させることを含んだ。その
後、沈殿した物質を粒子として遠心分離した後で、上清を除去する。２６０ｎｍでＯＤ吸
光度を測定することでＨＵＢを含有する全ての保存液の濃度を確定する。ライブラリーの
生成期間中、タグ連結の質量を制御するために、３％のアガロースゲル板でのゲル電気泳
動及びＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳによって各板２つの孔（一般的に、Ａ１及びＢ２である）
に対して分析を行った。化学反応の質量を制御するために、ＬＣ-ＭＳによって各板２つ
の孔（一般的に、Ａ１及びＢ２である）に対してい分析を行った。ＬＣ-ＭＳによって反
応コースに対して監視及び分析を行って、特異的化学反応を形成した。
【０１６８】
実施例２：アミド形成反応の官能基への適用
化学リンカーのインスタレーション（ＡＯＰ-ＨＵＢの合成、ＡＯＰ-ＨＵＢの構造は下
記のような通式（ＩＶ）により示される）。
0006911248.tif 000010
（ＩＶ）
【０１６９】
ＨＵＢ（２０μｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２０ｍＬ）
に溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量のＮ-Ｆｍｏｃ-１５-アミノ-４,７,１
０,１３-テトラオキサデカン（ＡＯＰ）の０．４ＭのＤＭＡ溶液原液（４．０ｍＬ、１．
６ｍｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ溶液原液（４．０ｍＬ、１．６ｍ
ｍｏｌ）、８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ溶液原液（４．０ｍＬ、１．６ｍｍ
ｏｌ）を４℃で５分間あらかじめ冷やさせた後で混合させた。渦巻で混合させた後で、「
プレミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させ、室温で一
晩置いた。ＬＣＭＳで反応のコースを表示した。
【０１７０】
アシル化後、０．１倍体積の５ＭのＮａＣｌ水溶液（３．２ｍＬ）及び３倍体積のエタ
ノール（１０５．６ｍＬ）を加え、混合物を−２０℃で少なくとも１時間静置させた。そ
の後、混合物を遠心（１２０００ｒｐｍ、３０分間）させ、白い沈殿を得た。固体を１０
ｍＬの水に溶解させて、逆相ＨＰＬＣによってＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ
Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（５μｍ、１０×１５０ｍｍ）カラムで純化した。純化された
物質は、凍結乾燥によって濃縮された後で、得られた残りのものを１０ｍＬの水に溶解し
た。０．１倍体積のピペリジン（１ｍＬ）を溶液に加え、混合物を室温で１時間反応させ
た。その後、産物を前記のようにエタノール沈殿によって純化し遠心分離によって分離さ
れた。脱Ｆｍｏｃ反応は完全的であり、産物はいつでも利用されてよかった。得られた沈
殿物を冷凍乾燥によって、純化されたＡＯＰ-ＨＵＢ（ＯＤによると９．３μｍｏｌとし
て測定され、理論的質量：５４１６．１；観測質量：５４１７．２）を得た。
【０１７１】
アミン含有のＤＮＡ-リンカーと酸構造単位によるアミド形成の普通の順序：
ＤＮＡ（２０ｎｍｏｌ）をホウ酸ナトリウムバッファ（２５０ｍＭ、ｐＨ９．４、２０
μＬ）に溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量の酸構造単位の０．２ＭのＤＭ
Ａ溶液原液（８．０μＬ、１．６μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ溶
液原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）及び８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ溶
液原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）を４度で５分間冷却させた後で、混合させた。渦
巻で混合させた後で、「プレミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液
まで移転させた。渦巻で混合させた後で、室温で一晩置いて反応を行わせた。ＬＣ-ＭＳ
で分析した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離さ
せた。
【０１７２】
実施例３：還元的アミノ化反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０１７３】
第２級アミン含有のＤＮＡ-リンカーとアルデヒド構造単位との還元的アミノ化の普通の
順序：
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をホウ酸ナトリウムバッファ（２５０ｍＭ、ｐＨ９．
４、２０μＬ）に溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量のＦｍｏｃ保護の第２
級アミン含有のアミノ酸の０．２ＭのＤＭＡ原液（８．０μＬ、１．６μｍｏｌ）、８０
当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）及び８０当量の
ＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）を０度で５分間を冷
却させた後で、混合させた。渦巻で混合させた後で、「プレミックス」原液を４℃で５分
間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させ、再び渦巻で混合させた。反応を室温で一晩
行った。ＬＣＭＳで分析した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分
離によって分離させた。脱Ｆｍｏｃ工程は上記と同一である。
【０１７４】
第２級アミン含有のＤＮＡ-リンカー（２０ｎｍｏｌ）をホウ素酸塩バッファ（２５０
ｍＭ、ｐＨ９．４、２０μＬ）に溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した。その後、１００
当量のアルデヒドの０．２ＭのＤＭＡ溶液（１０μＬ、２．０μｍｏｌ）を加えた。得ら
れた混合物を３０分間静置した後で、３００当量のＮａＢＨ４（１５μＬ、４００ｍＭの
水溶液、新製の原液）を加えた。反応を室温で一晩行った。ＬＣＭＳで分析した後で、産
物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。
【０１７５】
実施例４：アジド-アセチレンの付加環化反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０１７６】
アジド含有のＤＮＡ-リンカーとアセチレン構造単位とのアジド-アセチレン付加環化の普
通の過程：
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量のアジド酢酸の０．２Ｍの新製の
ＤＭＡ溶液（８．０μＬ、１．６μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原
液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）及び８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ原液（
４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）を４℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混合
させた後で、「プレミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転
させた。渦巻で混合させた後で、反応を室温で一晩行った。この物料の反応が完成した後
で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られ
たＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０１７７】
１ｍＭの上記産物（２０ｎｍｏｌ）のｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２０μＬ）溶
液に４当量のＣｕＳＯ４の０．２Ｍの新製の水溶液（０．４μＬ、８０ｎｍｏｌ）、１０
当量のアスコルビン酸の０．２Ｍの新製の水溶液（１μＬ、２００ｎｍｏｌ）を加えた後
で、３０当量のＴＢＴＡの０．２Ｍの新製のＤＭＡ溶液（３μＬ、６００ｎｍｏｌ）を加
えた。渦巻で混合させた後で、混合物を室温で一晩反応させた。ＬＣＭＳによって物料の
反応が完成したと監視した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離
によって分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０１７８】
実施例５：Ｓｕｚｕｋｉ相互結合反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０１７９】
ハロゲン化アリール物含有のＤＮＡ-リンカーと硼酸エステル又はホウ素酸構造単位との
Ｓｕｚｕｋｉ相互結合の普通の過程：
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量のハロゲン化アリール物（一般的
に、臭化アリール又はヨウ化アリールである）の０．２ＭのＤＭＡ原液（８．０μＬ、１
．６μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍ
ｏｌ）及び８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ
）を４℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混合させた後で、「プレミックス
」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させた。渦巻で混合させた後
で、反応を室温で一晩行った。ＬＣＭＳによって物料の反応が完成したと監視した後で、
産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤ
ＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０１８０】
１ｍＭの上記産物（２０ｎｍｏｌ）の水（２０μＬ）溶液に１２０当量の硼酸エステル
又はホウ素酸構造単位の０．６ＭのＤＭＡ原液（２．４μｍｏｌ、４μＬ）及び１５０当
量のＫＯＨ（１Ｍの水溶液、３μＬ）を加えた後で、０．６７当量のＰＯＰｄ（[（ｔ-Ｂ
ｕ）２Ｐ-（ＯＨ）]２ＰｄＣｌ２、２０ｍＭのＤＭＡ溶液、０．６７μＬ）及び１．３３
当量の配位子ナトリウム２'-（ジシクロヘキシルホスフィノ）-２,６-ジメトキシ-[１,１
'-ビフェニル]-３-スルフォン酸（２０ｍＭのＤＭＡ溶液、１．３３μＬ）を加えた。渦
巻で混合させた後で、反応を９５℃で２時間行った。ＬＣＭＳによって物料の反応が完成
したと監視した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分
離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０１８１】
実施例６：約１０７個の成員のＤＮＡエンコードのライブラリーの合成及び特性化
例示的な合成案は図１に示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ如何なる目的構造単位で
あってもよかった。１つの例示的なライブラリーにおいて、下記構造単位を使用する。
Ｒ１：９６個のアミノ酸＋１つの空白
Ｒ２：９９個のアミノ酸＋１つの空白
Ｒ３：１９６個の（酸、アルデヒド、塩化スルホニル、イソシアネート）＋４つの空白
【０１８２】
下記工程及び試薬を使用して、このようなライブラリーの合成を完成した。
【０１８３】
上記と同じ順序でＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０１８４】
構造単位、オリゴヌクレオチドタグ及びその対応関係は、下記各サイクルのように示さ
れた。
正向プライマー（５'-ＰＨＯ）の配列は、下記のように示された。
0006911248.tif 000011
【０１８５】
連結反応に用いられる１０×連結緩衝原液の構成は、５００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５
、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＡ
ＴＰであった。
【０１８６】
大腸菌によってＴ４ＤＮＡリガーゼを発現し取得して、使用前に活性をテストした（３
０Ｕ／μＬ）。
【０１８７】
ステップ１：サイクル１の合成：
過程：
サイクル１に９６個のＦｍｏｃ保護のアミノ酸及び１つの空白対照を混ぜ合わせた。化
合物ＨＵＢ-ＡＯＰ（合計８．７３μｍｏｌ）を９７個の等分試料に分けた。ＰＣＲチュ
ーブ（２ｍＬ）の各々に９０μＬの１ｍＭＨＵＢ-ＡＯＰ水溶液（各々に９０ｎｍｏｌの
ＤＮＡ）、９０μＬの１ｍＭの正向プライマー溶液、９０μＬの１ｍＭのサイクル１のタ
グ溶液、７２μＬの１０×リガーゼバッファ、８．２μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ及び９．
８μＬの水を加えた。渦巻で混合させた後で、得られた溶液を１６℃で１６時間培養した
。ゲル電気泳動によって反応過程をテストした。
【０１８８】
連結反応の後で、３６μＬの５ＭのＮａＣｌ水溶液を直接各パイプに加えた後で、１１
８８μＬのエタノールを加え、−２０℃で１時間保持した。プレートを１２０００ｒｐｍ
で３０分間遠心して、白い沈殿を得、上清を除去した。分離された沈殿を改めて９０μＬ
の水に溶解させて凍結乾燥させた。
【０１８９】
その後、パイプにおけるＤＮＡ沈殿の各々をホウ酸ナトリウムバッファ（９０μＬ、１
５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に溶解させて、濃度が１ｍＭである溶液を調製した。８０当量の
構造単位の前駆体の０．２ＭのＤＭＡ原液（３６μＬ、７．２μｍｏｌ）、８０当量のＨ
ＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原液（１８μＬ、７．２μｍｏｌ）及び８０当量のＤＩＰＥＡ
の０．４ＭのＤＭＡ原液（１８μＬ、７．２μｍｏｌ）を４℃で５分間冷却させた後で、
混合させて４℃で５分間反応させた。その後、混合物をＤＮＡアンプルに加え、溶液を室
温で１６時間反応させた。このサイクルにおいて、１つの空白対照実験（試薬を添加した
が、構造単位を添加しない）を設計した。
【０１９０】
アシル化後、０．１倍体積の５ＭのＮａＣｌ水溶液及び３倍体積のエタノールを加え、
混合物を−２０℃で少なくとも１時間静置させた。その後、混合物を１２０００ｒｐｍで
３０分間遠心させた。遠心の後で上清を除去して、沈殿を改めて９０μＬのＨ２Ｏに溶解
した。溶液に０．１倍体積のピペリジンを加え、混合物を室温で１時間反応させた。産物
を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤＮＡ
沈殿を改めてＨ２Ｏに溶解させて凍結乾燥によって乾燥させ、ＯＤ測定によると、８．７
μｍｏｌが産出された。
【０１９１】
表１．サイクル１の構造単位及びオリゴヌクレオチドタグ：
0006911248.tif 000012
0006911248.tif 000013
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【０１９２】
ステップ２：骨格インスタレーション：
過程：
各パイプにおけるＤＮＡ沈殿（各々に９０ｎｍｏｌ）を改めてホウ酸ナトリウムバッフ
ァ（９０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に溶解させて１ｍＭ原液を調製した。８０当量
の骨格の０．２ＭのＤＭＡ原液（３６μＬ、７．２μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０
．４ＭのＤＭＡ原液（１８μＬ、７．２μｍｏｌ）、８０当量のＤＩＰＥＡの０．４Ｍの
ＤＭＡ原液（１８μＬ、７．２μｍｏｌ）を４℃で３０分間冷却させてから混合させ、４
℃で５分間反応させた。その後、混合物をＤＮＡアンプルを含有する各パイプに加えて、
溶液を室温で１６時間培養させた。ＬＣ-ＭＳによって反応過程をテストした。
【０１９３】
アシル化後、９７個の反応混合物をプールして、エタノールで沈殿させて、逆相ＨＰＬ
Ｃによって純化された。純化された物質を、凍結乾燥によって濃縮させた。純化された物
質を再びホウ酸ナトリウムバッファ（１８ｍＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に濃度が０．
２５Ｍになるまで溶けて、混合物を９０℃まで加熱して１６時間持続した。完成後、産物
を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。ＯＤによってア
ンプルを定量し、５．３μｍｏｌを産出した。
【０１９４】
ステップ３：サイクル２の合成：
過程：
工程２からの上記産物（５μｍｏｌ）を１００等分に分けた。ＰＣＲチューブ（２ｍＬ
）の各々に３８．８μＬのサイクル１の産物（５０ｎｍｏｌ）の水溶液を加えた。各パイ
プに２０μＬの１０×リガーゼバッファ、２．３μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ及び８８．９
μＬの水を加えた。得られた溶液を１６℃で１６時間培養した。ゲル電気泳動によって反
応過程をテストした。
【０１９５】
連結反応の後で、将２０μＬの５ＭのＮａＣｌ水溶液を直接各パイプに加えた後で、６
６０μＬのエタノールを加え、−２０℃で１時間保持した。プレートを１２０００ｒｐｍ
で３０分間遠心させ、白い沈殿を得、上清を除去した。分離された沈殿を改めて１０μＬ
の水に溶解させて、再び凍結乾燥によって白い沈殿にした。
【０１９６】
その後、パイプにおけるＤＮＡ沈殿の各々を（５０ｎｍｏｌ）ホウ酸ナトリウムバッフ
ァ（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に溶解させて、１ｍＭ原液を調製した。８０当
量の構造単位の０．２ＭのＤＭＡ原液（２０μＬ、４．０μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴ
Ｕの０．４ＭのＤＭＡ原液（１０μＬ、４．０μｍｏｌ）、８０当量のＤＩＰＥＡの０．
４ＭのＤＭＡ原液（１０μＬ、４．０μｍｏｌ）を４℃で５分間冷却させた後で、混合さ
せ、４℃で５分間反応させた。その後、混合物を各パイプに加えて、溶液を室温で１６時
間反応させた。このサイクルにおいて、１つの空白対照実験（試薬を添加したが、構造単
位を添加しない）を設計した。
【０１９７】
アシル化後、０．１倍体積の５ＭのＮａＣｌ水溶液及び３倍体積のエタノールを加え、
混合物を−２０℃で少なくとも１時間静置させた。その後、混合物を１２０００ｒｐｍで
３０分間遠心させた。遠心の後で上清を除去して、沈殿をプールして改めて５０μＬのＨ
２Ｏに溶けた。０．１倍体積のピペリジンを溶液に加えて、混合物を室温で１時間反応さ
せた。その後、産物を前記のようにエタノール沈殿によって純化し遠心分離によって分離
された。分離された沈殿を改めて１０μＬの水に溶解させて、再び凍結乾燥させた。その
後、このＤＮＡ沈殿をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ-１５遠心濾過器
（３０００-ＭＷ閾値）によって更に純化させた。混ぜ合わせたＤＮＡアンプルをＯＤに
よって更に定量した（４．６μｍｏｌ）。
【０１９８】
表２．サイクル２構造単位及びオリゴヌクレオチドタグ
0006911248.tif 000023
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【０１９９】
ステップ４：サイクル３の合成：
過程：
サイクル２の産物（１．０ｍＭの水溶液原液、合計４．５μｍｏｌ）を２００個の孔（
２２．５μＬ、毎孔２２．５ｎｍｏｌ）に分けた。その後、毎孔に２２．５μＬのオリゴ
ヌクレオチドタグの一の１ｍＭの溶液（サイクル２の産物とタグとのモル比は１：１であ
る）、９μＬの１０×リガーゼバッファ、２．１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ及び５６．４
μＬの水を加えた。得られた溶液を１６℃で１６時間培養した。ゲル電気泳動によって反
応過程をテストした。
【０２００】
連結反応の後で、９μＬの５ＭのＮａＣｌ水溶液を直接各パイプに加えた後で、２９７
μＬのエタノールを加え、−２０℃で１時間保持した。プレートを１２０００ｒｐｍで３
０分間遠心させ、白い沈殿を得、上清を除去した。分離された沈殿を改めて１０μＬの水
に溶解させて、再び凍結乾燥させた。
【０２０１】
酸Ｒ-ＣＯＯＨによるキャッピング：
１５０個の孔のＤＮＡ沈殿を酸と反応させた。毎孔をホウ酸ナトリウムバッファ（２２
．５μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で溶解させて、１ｍＭの原液にした。各孔に４０当
量の酸の２００ｍＭのＤＭＡ原液（４．５μＬ、０．９μｍｏｌ）を加えた後で、４０当
量のＤＭＴ-ＭＭの２００ｍＭの水溶液（４．５μＬ、０．９μｍｏｌ）を加えた。アシ
ル化反応を室温で１６時間行った。アシル化後、産物を前記のようにエタノール沈殿で純
化して遠心分離によって分離させた。１つの空白対照実験（試薬を添加したが、構造単位
を添加しない）を設計した。
【０２０２】
アルデヒドＲ-ＣＨＯによるキャッピング：
３０個の孔のＤＮＡ沈殿をアルデヒドと反応させた。毎孔をＰＢＳバッファ（２２．５
μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ５．５）で溶解させて、１ｍＭの原液を調製した。１００当量の
アルデヒドの２００ｍＭのＤＭＡ原液（１１．３μＬ、２．２５μｍｏｌ）、１００当量
のＮａＣＮＢＨ３の２００ｍＭのＤＭＡ原液（１１．２μＬ、２．２５μｍｏｌ）を各孔
に加えた。反応を６０℃で一晩行った。ＬＣＭＳで分析した後で、産物を前記のようにエ
タノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。１つの空白対照実験（試薬を添加
したが、構造単位を添加しない）を設計した。
【０２０３】
塩化スルホニルＲ-ＳＯ２Ｃｌによるキャッピング：
１０個孔のＤＮＡ沈殿を塩化スルホニルと反応させた。毎孔（２２．５ｎｍｏｌ）をホ
ウ酸ナトリウムバッファ（２２．５μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で溶解させて、１ｍ
Ｍ原液を調製した。５０当量の塩化スルホニルの５００ｍＭのＣＨ３ＣＮ原液（２．３μ
Ｌ、１．１３μｍｏｌ）を各孔に加えた。反応を室温で一晩行った。ＬＣＭＳで分析した
後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。１つ
の空白対照実験（試薬を添加したが、構造単位を添加しない）を設計した。
【０２０４】
イソシアネートＲＮ＝Ｃ＝Ｏによるキャッピング：
１０個孔のＤＮＡ沈殿をイソシアネートと反応させた。毎孔（２２．５ｎｍｏｌ）をホ
ウ酸ナトリウムバッファ（２２．５μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で溶解させて、１ｍ
Ｍの原液を調製した。５０当量のイソシアネートの５００ｍＭのＣＨ３ＣＮ原液（２．３
μＬ、１．１３μｍｏｌ）を各孔に加えた。反応を室温で一晩行った。ＬＣＭＳで分析し
た後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。１
つの空白対照実験（試薬を添加したが、構造単位を添加しない）を設計した
【０２０５】
最後、上記キャッピングの産物を全てプールして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ
Ｕｌｔｒａ-１５遠心濾過器（３０００-ＭＷ閾値）によって更に純化させた。混ぜ合わ
せたＤＮＡアンプルをＯＤによって更に定量した（４．１μｍｏｌ）。
【０２０６】
表３．サイクル３の構造単位及びオリゴヌクレオチドタグ
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【０２０７】
ステップ５：閉鎖プライマーの連結：
選択の前に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって１００ｎｍｏｌのライブラリーの等分試料を
閉鎖プライマーと連結させた。その後、Ｋｌｅｎｏｗ重合によってプライマー二本鎖を充
填した。閉鎖プライマーの共通の配列は、下記の通りであった。
５'      Ｘ１Ｘ２Ｘ３〜Ｘｎ  ３'
３'  ＣＴＸ１'Ｘ２'Ｘ３'〜Ｘｎ'Ｎ１Ｎ２Ｎ３〜ＮｍＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＣＧＣ
ＧＡＧＧＧ  ５'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７９９）
【０２０８】
上鎖の５’端部はリン酸化された。可変領域Ｘ１Ｘ２Ｘ３〜Ｘｎ（ｎは５以上の整数で
ある）（Ｘ１'Ｘ２'Ｘ３'〜Ｘｎ'がＸ１Ｘ２Ｘ３〜Ｘｎと逆に相補する）は、各閉鎖プラ
イマーに対しては唯一のものであり且つ特定なライブラリー及び選択実験の識別子とされ
た。可変領域Ｎ１Ｎ２Ｎ３〜Ｎｍ（ｍは５以上の整数である）は、配列データにおけるＰ
ＣＲ複製を鑑別するためのランダムな配列であった。Ｘの各々及びＮの各々は、独立して
Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣから選ばれる。
【０２０９】
実施例７：逆転縮合（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）反応の官能基への適
用
酸含有のＤＮＡ-リンカーとアミン構造単位の逆転縮合の普通の過程：
ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２０μＬ）
に溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量の二酸の０．２ＭのＤＭＡ原液（８．
０μＬ、１．６μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、
１．６μｍｏｌ）及び８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．
６μｍｏｌ）を４℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混合させた後で、「プ
レミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させた。渦巻で混
合させた後で、反応を室温で一晩行った。ＬＣＭＳによって物料の反応が完成したと監視
した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。
得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２１０】
１ｍＭの上記産物（２０ｎｍｏｌ）のｐＨ５．５のＰＢＳ緩衝溶液（２５０ｍＭ、２０
μＬ）に３００当量のアミンの０．６ＭのＭｅＣＮ原液（１０μＬ、６μｍｏｌ）を加え
た後で、９００当量のＤＭＴＭＭの０．９のＭ水溶液（２０μＬ、１８μｍｏｌ）を加え
た。反応物を混合させた後で、混合物を室温で一晩置いた。ＬＣＭＳによって物料の反応
が完成したと監視した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によ
って分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２１１】
実施例８：アジド還元反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０２１２】
アジド含有のＤＮＡ-リンカーとＴＰＰＴＳのアジド還元の普通の過程：
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量のアジド酢酸の０．２Ｍの新製の
ＤＭＡ溶液（８．０μＬ、１．６μｍｏｌ）、８０当量のＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原
液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）、及び８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ原液
（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）を４℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混
合させた後で、「プレミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移
転させた。渦巻で混合させた後で、反応を室温で一晩行った。物料の反応が完成した後で
、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られた
ＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２１３】
上記産物（２０ｎｍｏｌ）を水（２０μＬ）に溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した後
で、４０当量のＴＰＰＴＳの０．２Ｍ水溶液（４μＬ、０．８μｍｏｌ）を加えた。反応
物を混合させた後で、混合物を室温で一晩置いた。その後、０．５ＭのＨＣｌ水溶液でｐ
Ｈを５〜６まで調節した。反応物を混合させた後で、混合物を室温で４時間続けた。ＬＣ
ＭＳによって物料の反応が完成したと監視した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿
で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥
させた。
【０２１４】
実施例９：原位置のカルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０２１５】
イソシアネート含有のＤＮＡ-リンカーとアミドとの原位置のカルバミル化の普通の過程
：
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製し、４０当量のクロロぎ酸４-ニトロフェニル（
ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）の０．２Ｍの新製のＣＨ３ＣＮ
溶液（４μＬ、０．８μｍｏｌ）を加えた。その後、４０当量のアミンの０．２ＭのＣＨ
３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）原液（４μＬ、０．８μｍｏｌ）を加えた。反応を室温で一晩
行った。ＬＣＭＳで分析した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分
離によって分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２１６】
実施例１０：原位置のチオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０２１７】
イソチオシアン酸塩含有のＤＮＡ-リンカーとアミドとの原位置のチオ尿素の普通の過程
：
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製し、２０当量のチオノ炭酸ジ-２-ピリジル（ｐｙ
ｒｉｄｙｌ  ｔｈｉｏｎａｃａｒｂｏｎａｔｅ）の０．２Ｍの新製のＣＨ３ＣＮ溶液（２
μＬ、０．４μｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１０〜１５分間静置させた。その後、
２００当量のアミンの０．２ＭのＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）原液（８μＬ、４μｍｏ
ｌ）を加えた。反応を６０℃で一晩行った。ＬＣＭＳで分析した後で、産物を前記のよう
にエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結
乾燥によって乾燥させた。
【０２１８】
実施例１１：ＳＮＡｒ反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０２１９】
アミド含有のＤＮＡ-リンカーとハロゲン化アリールのＳＮＡｒの普通の過程
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製し、１００当量のハロゲン化アリールの０．２Ｍ
のＤＭＡ溶液（１０μＬ、２μｍｏｌ）を加えた。反応システムを封止して６０℃で一晩
加熱した。ＬＣＭＳによって物料の反応が完成したと監視した後で、産物を前記のように
エタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾
燥によって乾燥させた。
【０２２０】
実施例１２：Ｂｕｃｈｗａｌｄ反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０２２１】
含有ハロゲン化アリールのＤＮＡ-リンカーとアミドのＢｕｃｈｗａｌｄの普通の過程
ＡＯＰ-ＨＵＢ（２０ｎｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ、２
０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量のハロゲン化アリール物（一般的
に、臭化アリール又はヨウ化アリールである）の０．２ＭのＤＭＡ原液（８．０μＬ、１
．６μｍｏｌ）、８０当量ＨＡＴＵの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍｏ
ｌ）及び８０当量のＤＩＰＥＡの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）
を４℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混合させた後で、「プレミックス」
原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させた。渦巻で混合させた後で
、反応を室温で一晩行った。ＬＣＭＳによって物料の反応が完成したと監視した後で、産
物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤＮ
Ａ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２２２】
上記産物（２０ｎｍｏｌ）を水（１３．５μＬ）に溶けて、１．５ｍＭの溶液を調製し
た後で、８０当量のアミンの０．４ＭのＤＭＡ原液（４．０μＬ、１．６μｍｏｌ）、３
００当量のＮａＯＨの１Ｍの水溶液（６μＬ、６μｍｏｌ）、１．２５当量のＰｄｔ-Ｂ
ｕｐｈｏｓＧ３の１２．５ｍＭのＤＭＡ溶液（２μＬ、２５ｎｍｏｌ）を加えた。反応を
８０℃で１時間行った。ＬＣＭＳによって物料の反応が完成したと監視した後で、産物を
前記のようにエタノール沈殿で純化して遠心分離によって分離させた。得られたＤＮＡ沈
殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２２３】
実施例１３：ニトロ基還元反応の官能基への適用
上記と同じ過程によってＡＯＰ-ＨＵＢを調製した。
【０２２４】
ニトロ基含有のＤＮＡ-リンカーのニトロ基還元の普通の順序
ニトロ基（２０ｎｍｏｌ）含有のＤＮＡ-リンカー産物をｐＨ９．４のホウ素酸塩バッ
ファ（２５０ｍＭ、２０μＬ）に溶けて、１ｍＭの溶液を調製した。５０当量のＦｅＳＯ
４の０．２Ｍの新製の水溶液（５μＬ、１μｍｏｌ）及び１ＭのＮａＯＨ新製の水溶液（
１０％ｖ／ｖ、２．５μＬ）を加えた。反応を８０℃で２時間行った。ＬＣＭＳによって
物料の反応が完成したと監視した後で、産物を前記のようにエタノール沈殿で純化して遠
心分離によって分離させた。得られたＤＮＡ沈殿物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２２５】
実施例１４：単一化合物に接続される４つ以上の官能基への拡大
図２は、それに接続される４つの官能基を有する化合物の合成を示す例示的なプロトコ
ルである。
【０２２６】
実施例６と同じように、ＨＵＢにおけるＭｉｃｈａｅｌ付加から始まり、その後、加水
分解及びアミド結合をして、直接ＤＮＡエンコードのライブラリーの合成の初期オリゴヌ
クレオチドとして利用可能なアジド末端オリゴヌクレオチドを得た。ここで、アミン末端
オリゴヌクレオチドを提供するために、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ還元を使用した。実施例６
における確実な工程によると、新しい１０７個の成員のＤＮＡエンコードのライブラリー
を合成することができ、４つの同じ分子ごとが１つのＤＮＡ配列に接続されて、１組のコ
ードを共有した。
Ｒ１：９６個のアミノ酸＋１つの空白
Ｒ２：９９個のアミノ酸＋１つの空白
Ｒ３：１９６（酸、アルデヒド、塩化スルホニル、イソシアネート）＋４つの空白
【０２２７】
下記試薬によってライブラリーの合成を完成した。
【０２２８】
構造単位、オリゴヌクレオチドタグ及びその対応関は、下記各サイクルのように示され
た。
【０２２９】
実施例６と同じ正向プライマー（５’-ＰＨＯを有する）を使用した。
【０２３０】
実施例１５：ＨＵＢに基づいた選択研究用のツール化合物共役の合成
【０２３１】
Ｒｏｃｋ２タンパクによって下記ツール化合物及び共役をＨＵＢに基づいた選択研究に使
用した。
0006911248.tif 000057
【０２３２】
ＡＯＰ-ＨＰと化合物１（Ｒｏｃｋ２抑制剤）との結合合成
【０２３３】
２００ｎｍｏｌのＡＯＰ-ＨＰをｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ）に溶
解させて、１ｍＭの溶液を調製した。４０当量の化合物１（２００ｍＭのＤＭＡ溶液）、
４０当量のＨＡＴＵ（２００ｍＭのＤＭＡ溶液）及び４０当量のＤＩＰＥＡ（２００ｍＭ
のＤＭＡ溶液）の原液を０℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混合させた後
で、「プレミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させ、再
び渦巻で混合させた。反応を３０℃で一晩行った。ＬＣＭＳで監視した後で、３２μＬの
１０％の５ＭのＮａＣｌ水溶液及び３倍体積１０５６μＬの無水ＥｔＯＨを加えることで
反応物を沈殿させた後で、ドライアイスで３０分間冷却させた。３０分間遠心することで
オリゴヌクレオチドを沈殿として分離させ、上清を除去して、産物を得た。
【０２３４】
ＡＯＰ-ＨＵＢと化合物１（Ｒｏｃｋ２抑制剤）との結合合成
【０２３５】
例示的な合成案を図５に示した。
【０２３６】
７００ｎｍｏｌのＡＯＰ-ＨＵＢをｐＨ９．４のホウ素酸塩バッファ（２５０ｍＭ）に
溶解させて、１ｍＭの溶液を調製した。８０当量の化合物１（２００ｍＭのＤＭＡ溶液）
、８０当量ＨＡＴＵ（２００ｍＭのＤＭＡ溶液）及び８０当量ＤＩＰＥＡ（２００ｍＭの
ＤＭＡ溶液）の原液を０℃で５分間冷却させた後で、混合させた。渦巻で混合させた後で
、「プレミックス」原液を４℃で５分間冷却させた後で、ＤＮＡ溶液まで移転させ、再び
渦巻で混合させた。反応を３０℃で一晩行った。ＬＣＭＳで監視した後で、１５４μＬの
１０％（体積）の５ＭのＮａＣｌ水溶液及び３倍体積５．０８ｍＬの無水ＥｔＯＨを加え
ることで反応物を沈殿させた後で、ドライアイスで３０分間冷却させた。３０分間遠心す
ることでオリゴヌクレオチドを沈殿として分離させて、上清を除去した。分離された沈殿
を改めて７００μＬの水に溶解させ、調製型ＨＰＬＣによって純化し、凍結乾燥によって
乾燥させ、産物を得た。
【０２３７】
共役のコード順序
共役の例示的なコード順序を図６に示した。注意すべきなのは、Ｐ１が実施例６の正向
プライマーと同一であった。「ライブラリーＩＤ」は、下記配列を有する。
0006911248.tif 000058
【０２３８】
0006911248.tif 000059
【０２３９】
化合物１を含有する／含有しないＡＯＰ-ＨＰ又は化合物１を含有し／含有しないＡＯ
Ｐ-ＨＵＢに用いられるコード戦略及びＤＮＡ配列は、上記のようなものであった。まず
、Ｐ１配列（２ｂｐオーバーハング端を有する二本鎖のＤＮＡ配列）を初期材料Ｒ-ＨＰ
又はＲ-ＨＵＢに接続して、Ｒ-ＨＰ-Ｐ１又はＲ-ＨＵＢ-Ｐ１を発生させた。その後、コ
ード配列Ｃ１-Ｃ２-Ｃ３（２ｂｐオーバーハング端を有し且つＤＮＡエンコードのライブ
ラリーと同一のコード長さを有する二本鎖のＤＮＡ配列）をＲ-ＨＰ-Ｐ１又はＲ-ＨＵＢ-
Ｐ１に接続して、Ｒ-ＨＰ-Ｃ３又はＰ-ＨＵＢ-Ｃ３を発生させた。最後、将ライブラリー
ＩＤ及び閉鎖プライマー配列（２ｂｐオーバーハング端を有する二本鎖のＤＮＡ配列）を
Ｒ-ＨＰ-Ｃ３又はＰ-ＨＵＢ-Ｃ３に接続して、所望の共役Ｒ-ＨＰ-共役又はＲ-ＨＵＢ-共
役を取得した。詳細な接続方法については、前記の適用実施例６（大約１０７個の成員の
ＤＮＡエンコードのライブラリーの合成及び特性化）を参照されたい。
【０２４０】
実施例１６：ＤＥＬに混ぜ合わせられた２価と１価共役の標的タンパク質Ｒｏｃｋ２に基
づいた選択
共役のＤＥＬへの混ぜ合わせ過程
２価と１価共役の混ぜ合わせられたバックグラウンＤＥＬとして化合物規模の異なる２
つのＤＥＬライブラリーを選択して、ＤＥＬにおけるｑＰＣＲにより定量された化合物の
の各々の１０５個のコピーを使用した。ＤＥＬ０９３６の大きさは２８６９万であり、Ｄ
ＥＬ１０１９の大きさは１１．０８億であった。混ぜ合わせられた（ｓｐｉｋｅ-ｉｎｔ
ｏ）ＤＥＬの各々に対して、ＨＵＢの含有分：ＨＰの含有分：ＤＥＬ成分の比例が１：１
：１又は０．５：１：１である２組のアンプルを調製した。論理的に、同じ化合物レベル
を達成させるために、２価のＨＵＢ共役として、１価のＨＰ共役のＤＮＡコピー数（ｑＰ
ＣＲで定量）の半分を使用すべきであった。具体的に、下記表に、５つの成分を有する４
つアンプルのそれぞれの詳細な情報を示した。
【０２４１】
0006911248.tif 000060
【０２４２】
選択
選択用のＲｏｃｋ２タンパクは、Ｎ-（Ｈｉｓ）６タグを有する昆虫ＳＦ９細胞に発現
した。タンパクをＮｉ-ＮＴＡアフィニティー・カラムに続いてサイズ排除カラムによっ
て純化した。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  Ｄｕｏ  Ｐｒｉｍｅ純化システムによって９６ウェ
ルプレートにおいて自動的に選択した。１５０μＬのセレクションバッファ（４０ｍＭの
トリス、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＤＴＴ、０．１％のＴｗｅｅｎ-２０、０．
３ｍｇ／ｍＬの剪断されたサケ精子ＤＮＡ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）で２
０μＬのＮｉの充填された磁気ビーズを釣り合わせた後で、ビーズをウェルプレートの新
しい列に移転して、３００ｐｍｏｌヒスチジンタグのＲｏｃｋ２と室温で６０μＬの体積
でセレクションバッファにおいて３０分間培養した。その後、固定化されたタンパク及び
磁気ビーズを合わせてＤＥＬアンプルに混ぜ合わせられた共役を７５μＬのセレクション
バッファにおいて室温で１時間培養した後で、５０μＬのセレクションバッファにおいて
室温で１分間洗浄した。残されたＤＥＬ成員を６０μＬの溶離バッファ（４０ｍＭのトリ
ス、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）において７５℃で１５分間熱解離することで回
収した。第１回りの選択の後で、別の回り又は２回りの選択を繰り返した。毎回りの熱解
離された部分と新鮮なタンパクを次の回りの投入物とした。アンプル濃縮を含有するＤＥ
Ｌ０９３６に対して２回りの選択を行い、アンプル濃縮を含有するＤＥＬ１０１９に対し
て３回りの選択を行った。毎回りの後で、産出物をｑＰＣＲによって量化した。ＤＮＡ産
出物が１０７〜１０８個のコピーまで低下すると、選択を完成し、産出物をＰＣＲによっ
て拡大し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ純化キットによって製造明細書に基づいて更に純化した
。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００においてＰＣＲに対してアンプルを
拡大してシークエンシンを行った。
【０２４３】
-ｌｏｇ１０変換付きのポアソン分布によって濃縮度を算出した。図３に示すように、
ＨＵＢ＋ＨＰ＋ＤＥＬ０９３６（１：１：１）の選択条件で、化合物１-ＨＰ共役に比べ
ると、化合物１-ＨＵＢ共役は、約３倍も高い濃縮を表し、且つＨＵＢ＋ＨＰ＋ＤＥＬ０
９３６（０．５：１：１）の選択条件で同一のレベルの濃縮を達成させた。全てのＡＯＰ
共役も同一の選択条件で濃縮を表示しないので、濃縮は化合物１によって決められた。Ｈ
ＵＢ＋ＨＰ＋ＤＥＬ１０１９（１：１：１）の選択条件（図４）にも、類似な結果が観察
され、ＤＥＬ０９３６の選択アンプルに比べると、ＨＵＢ＋ＨＰ＋ＤＥＬ１０１９（１：
１：１）の選択条件により高いバックグラウン噪声があった。
【０２４４】
省略語
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＦｍｏｃＣｌ：９-フルオレニルメチルクロロぎ酸
ＰＥ：石油エーテル
ＥＡ：酢酸エチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＴｒ-Ｃｌ：４,４'-ジメトキシトリチルクロリド
ＤＩＥＡ；ＤＩＰＥＡ：Ｎ,Ｎジイソプロピルエチルアミン
ＣＥＰＣｌ：２-シアノエチルＮ,Ｎ-ジイソプロピルクロロホスホロアミジト
ＤＭＡ：Ｎ,Ｎ-ジメチルアニリン
ＨＡＴＵ：Ｏ-（７-アザ-１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル）-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラ
メチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩
ＴＢＴＡ：ｔ-ブチル２,２,２-トリクロロアセトイミダート
ＰＯＰｄ（[（ｔ-Ｂｕ）２Ｐ-（ＯＨ）]２ＰｄＣｌ２）：ジクロロビスビス（ジ-ｔ-ブ
チルホスフィニト-Ｋｐ）ジパラジウム酸（２-）二水素（ＤＩＨＹＤＲＯＧＥＮ  ＤＩＣ
ＨＬＯＲＯＢＩＳ（ＤＩ-Ｔ-ＢＵＴＹＬＰＨＯＳＰＨＩＮＩＴＯ-ＫＰ）ＰＡＬＬＡＤＡ
ＴＥ（２-））
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＤＭＴ-ＭＭ：４-（４,６-ジメトキシ-１,３,５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモル
ホリニウムクロリド
【０２４５】
等同物
本発明は、特に、ＤＮＡエンコードのライブラリー及びＤＮＡエンコードのライブラリ
ーの調製及び使用を提供する。本発明の具体的な実施例を検討したが、上記明細書は、説
明するためのものであり、制限するためのものではない。本明細書を読んだ後で、本発明
の多くの変形は、当業者により容易に理解される。本発明の全ての範囲も特許請求の範囲
及びその等同物の全部範囲及び明細書及びこれらの変形を参照することで確定されるべき
である。
【０２４６】
［引用による合併］
本文の言及した全ての公開文献及び特許も、引用によりその全体を本明細書に合併する
。具体的に及び単独に指明されるように、単独した公開文献又は特許の各々も引用により
その全体を本明細書に合併する。
配列表
SEQUENCE LISTING
<110>  HITGEN LTD.
<120>  METHOD FOR SYNTHESIS OF ENCODED LIBRARIES
<130>  WK17-037-SCXDYY-USP004
<160>  809   
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  6
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  1
gagtca                                                                 6
<210>  2
<211>  8
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  2
tgactccc                                                               8
<210>  3
<211>  12
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  3
accttcggtc gg                                                         12
<210>  4
<211>  12
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  4
gaccgaaggt tg                                                         12
<210>  5
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  5
atcagaacta gag                                                        13
<210>  6
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  6
ctagttctga tca                                                        13
<210>  7
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  7
gaggaacgct aag                                                        13
<210>  8
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  8
tagcgttcct cca                                                        13
<210>  9
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  9
cgcgaatgat gag                                                        13
<210>  10
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  10
catcattcgc gca                                                        13
<210>  11
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  11
ttaacgcgct tag                                                        13
<210>  12
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  12
aagcgcgtta aca                                                        13
<210>  13
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  13
tgtgcgtgta tag                                                        13
<210>  14
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  14
atacacgcac aca                                                        13
<210>  15
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  15
atgaacggcg aag                                                        13
<210>  16
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  16
tcgccgttca tca                                                        13
<210>  17
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  17
caatctcaga gag                                                        13
<210>  18
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  18
ctctgagatt gca                                                        13
<210>  19
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  19
ctgccgatcg aag                                                        13
<210>  20
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  20
tcgatcggca gca                                                        13
<210>  21
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  21
gacacctagc gag                                                        13
<210>  22
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  22
cgctaggtgt cca                                                        13
<210>  23
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  23
tgaccgttcc gag                                                        13
<210>  24
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  24
cggaacggtc aca                                                        13
<210>  25
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  25
tccagagcag tag                                                        13
<210>  26
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  26
actgctctgg aca                                                        13
<210>  27
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  27
cagacgcctc aag                                                        13
<210>  28
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  28
tgaggcgtct gca                                                        13
<210>  29
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  29
aggagaagtt cag                                                        13
<210>  30
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  30
gaacttctcc tca                                                        13
<210>  31
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  31
ttcaccgttc gag                                                        13
<210>  32
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  32
cgaacggtga aca                                                        13
<210>  33
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  33
atgattcgag aag                                                        13
<210>  34
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  34
tctcgaatca tca                                                        13
<210>  35
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  35
agatggatgt tag                                                        13
<210>  36
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  36
aacatccatc tca                                                        13
<210>  37
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  37
acagtcacta cag                                                        13
<210>  38
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  38
gtagtgactg tca                                                        13
<210>  39
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  39
atcggaatag tag                                                        13
<210>  40
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  40
actattccga tca                                                        13
<210>  41
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  41
agtcgtatta tag                                                        13
<210>  42
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  42
ataatacgac tca                                                        13
<210>  43
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  43
gagtgtggta gag                                                        13
<210>  44
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  44
ctaccacact cca                                                        13
<210>  45
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  45
caggtaatgt tag                                                        13
<210>  46
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  46
aacattacct gca                                                        13
<210>  47
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  47
aaggttacgt cag                                                        13
<210>  48
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  48
gacgtaacct tca                                                        13
<210>  49
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  49
ttgtatgaat aag                                                        13
<210>  50
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  50
tattcataca aca                                                        13
<210>  51
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  51
accataacct tag                                                        13
<210>  52
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  52
aaggttatgg tca                                                        13
<210>  53
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  53
ctacaggtaa tag                                                        13
<210>  54
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  54
attacctgta gca                                                        13
<210>  55
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  55
aggctgctag aag                                                        13
<210>  56
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  56
tctagcagcc tca                                                        13
<210>  57
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  57
caattacgat aag                                                        13
<210>  58
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  58
tatcgtaatt gca                                                        13
<210>  59
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  59
acgacgatcc aag                                                        13
<210>  60
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  60
tggatcgtcg tca                                                        13
<210>  61
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  61
ttaacagctt aag                                                        13
<210>  62
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  62
taagctgtta aca                                                        13
<210>  63
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  63
atgatacatg aag                                                        13
<210>  64
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  64
tcatgtatca tca                                                        13
<210>  65
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  65
agcactaaca tag                                                        13
<210>  66
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  66
atgttagtgc tca                                                        13
<210>  67
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  67
ttcgcctgct tag                                                        13
<210>  68
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  68
aagcaggcga aca                                                        13
<210>  69
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  69
acatagtccg aag                                                        13
<210>  70
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  70
tcggactatg tca                                                        13
<210>  71
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  71
ttacgagagc aag                                                        13
<210>  72
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  72
tgctctcgta aca                                                        13
<210>  73
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  73
ttctggctcg tag                                                        13
<210>  74
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  74
acgagccaga aca                                                        13
<210>  75
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  75
ttagactcga gag                                                        13
<210>  76
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  76
ctcgagtcta aca                                                        13
<210>  77
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  77
gaaggcatca cag                                                        13
<210>  78
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  78
gtgatgcctt cca                                                        13
<210>  79
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  79
gaccaacgag tag                                                        13
<210>  80
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  80
actcgttggt cca                                                        13
<210>  81
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  81
cggcgttccg cag                                                        13
<210>  82
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  82
gcggaacgcc gca                                                        13
<210>  83
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  83
aataatcaac gag                                                        13
<210>  84
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  84
cgttgattat tca                                                        13
<210>  85
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  85
aatggttaag aag                                                        13
<210>  86
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  86
tcttaaccat tca                                                        13
<210>  87
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  87
ttactctagg cag                                                        13
<210>  88
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  88
gcctagagta aca                                                        13
<210>  89
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  89
aacagcacgt gag                                                        13
<210>  90
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  90
cacgtgctgt tca                                                        13
<210>  91
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  91
gcacaactgg tag                                                        13
<210>  92
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  92
accagttgtg cca                                                        13
<210>  93
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  93
gctacaattg aag                                                        13
<210>  94
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  94
tcaattgtag cca                                                        13
<210>  95
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  95
ctcgtgtgct aag                                                        13
<210>  96
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  96
tagcacacga gca                                                        13
<210>  97
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  97
attccgtccg cag                                                        13
<210>  98
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  98
gcggacggaa tca                                                        13
<210>  99
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  99
gccgttgtcg cag                                                        13
<210>  100
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  100
gcgacaacgg cca                                                        13
<210>  101
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  101
gtacgagccg cag                                                        13
<210>  102
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  102
gcggctcgta cca                                                        13
<210>  103
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  103
tcaatccacg tag                                                        13
<210>  104
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  104
acgtggattg aca                                                        13
<210>  105
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  105
agtcaccttg tag                                                        13
<210>  106
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  106
acaaggtgac tca                                                        13
<210>  107
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  107
ttagtggctt aag                                                        13
<210>  108
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  108
taagccacta aca                                                        13
<210>  109
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  109
tggcaatgta tag                                                        13
<210>  110
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  110
atacattgcc aca                                                        13
<210>  111
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  111
aattacggca gag                                                        13
<210>  112
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  112
ctgccgtaat tca                                                        13
<210>  113
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  113
tggagcggaa cag                                                        13
<210>  114
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  114
gttccgctcc aca                                                        13
<210>  115
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  115
gagtcaggac gag                                                        13
<210>  116
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  116
cgtcctgact cca                                                        13
<210>  117
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  117
acaaggtatg aag                                                        13
<210>  118
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  118
tcataccttg tca                                                        13
<210>  119
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  119
ttggagatta gag                                                        13
<210>  120
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  120
ctaatctcca aca                                                        13
<210>  121
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  121
ttaagcgtaa gag                                                        13
<210>  122
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  122
cttacgctta aca                                                        13
<210>  123
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  123
gtagttgatt aag                                                        13
<210>  124
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  124
taatcaacta cca                                                        13
<210>  125
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  125
agtcctatca cag                                                        13
<210>  126
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  126
gtgataggac tca                                                        13
<210>  127
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  127
gaccgttctg tag                                                        13
<210>  128
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  128
acagaacggt cca                                                        13
<210>  129
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  129
gaaggaacta gag                                                        13
<210>  130
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  130
ctagttcctt cca                                                        13
<210>  131
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  131
gttgtaattg tag                                                        13
<210>  132
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  132
acaattacaa cca                                                        13
<210>  133
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  133
ccgatgtcag tag                                                        13
<210>  134
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  134
actgacatcg gca                                                        13
<210>  135
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  135
atcactaccg aag                                                        13
<210>  136
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  136
tcggtagtga tca                                                        13
<210>  137
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  137
caacgccgat tag                                                        13
<210>  138
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  138
aatcggcgtt gca                                                        13
<210>  139
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  139
gaaccgtcta gag                                                        13
<210>  140
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  140
ctagacggtt cca                                                        13
<210>  141
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  141
gtaatccggc tag                                                        13
<210>  142
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  142
agccggatta cca                                                        13
<210>  143
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  143
ttccgagttc gag                                                        13
<210>  144
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  144
cgaactcgga aca                                                        13
<210>  145
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  145
cctcaccaag cag                                                        13
<210>  146
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  146
gcttggtgag gca                                                        13
<210>  147
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  147
aatccaccat tag                                                        13
<210>  148
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  148
aatggtggat tca                                                        13
<210>  149
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  149
ttccactagt tag                                                        13
<210>  150
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  150
aactagtgga aca                                                        13
<210>  151
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  151
tggactgctt cag                                                        13
<210>  152
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  152
caagcagtcc aca                                                        13
<210>  153
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  153
caagtaagta gag                                                        13
<210>  154
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  154
ctacttactt gca                                                        13
<210>  155
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  155
gcgcacagct gag                                                        13
<210>  156
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  156
cagctgtgcg cca                                                        13
<210>  157
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  157
cctgtcacat tag                                                        13
<210>  158
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  158
aatgtgacag gca                                                        13
<210>  159
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  159
ctcggtccgc gag                                                        13
<210>  160
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  160
cgcggaccga gca                                                        13
<210>  161
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  161
gtatccagtt aag                                                        13
<210>  162
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  162
taactggata cca                                                        13
<210>  163
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  163
caccgtaaga cag                                                        13
<210>  164
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  164
gtcttacggt gca                                                        13
<210>  165
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  165
ctactgtcaa tag                                                        13
<210>  166
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  166
attgacagta gca                                                        13
<210>  167
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  167
gcttcaccgt tag                                                        13
<210>  168
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  168
aacggtgaag cca                                                        13
<210>  169
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  169
ttatggaatt cag                                                        13
<210>  170
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  170
gaattccata aca                                                        13
<210>  171
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  171
gtagccgcct cag                                                        13
<210>  172
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  172
gaggcggcta cca                                                        13
<210>  173
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  173
tctgtagtgc tag                                                        13
<210>  174
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  174
agcactacag aca                                                        13
<210>  175
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  175
agtgatacta tag                                                        13
<210>  176
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  176
atagtatcac tca                                                        13
<210>  177
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  177
ttgctccatc gag                                                        13
<210>  178
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  178
cgatggagca aca                                                        13
<210>  179
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  179
aatctcggag tag                                                        13
<210>  180
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  180
actccgagat tca                                                        13
<210>  181
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  181
tcacttacct cag                                                        13
<210>  182
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  182
gaggtaagtg aca                                                        13
<210>  183
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  183
catgtcggcg aag                                                        13
<210>  184
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  184
tcgccgacat gca                                                        13
<210>  185
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  185
cctggagccg cag                                                        13
<210>  186
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  186
gcggctccag gca                                                        13
<210>  187
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  187
aatgcgtggt tag                                                        13
<210>  188
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  188
aaccacgcat tca                                                        13
<210>  189
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  189
gacacggtcg tag                                                        13
<210>  190
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  190
acgaccgtgt cca                                                        13
<210>  191
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  191
tgttctcgag cag                                                        13
<210>  192
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  192
gctcgagaac aca                                                        13
<210>  193
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  193
cgagtccagc aag                                                        13
<210>  194
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  194
tgctggactc gca                                                        13
<210>  195
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  195
tataccaata cag                                                        13
<210>  196
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  196
gtattggtat aca                                                        13
<210>  197
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  197
ccgcgtggaa gag                                                        13
<210>  198
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  198
cttccacgcg gca                                                        13
<210>  199
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  199
atagagcgca ggt                                                        13
<210>  200
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  200
ctgcgctcta tct                                                        13
<210>  201
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  201
gacacgcagt cgt                                                        13
<210>  202
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  202
gactgcgtgt cct                                                        13
<210>  203
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  203
gtatccagac cgt                                                        13
<210>  204
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  204
ggtctggata cct                                                        13
<210>  205
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  205
aatactcaga cgt                                                        13
<210>  206
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  206
gtctgagtat tct                                                        13
<210>  207
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  207
gaggacaacc agt                                                        13
<210>  208
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  208
tggttgtcct cct                                                        13
<210>  209
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  209
ttacaatgga ggt                                                        13
<210>  210
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  210
ctccattgta act                                                        13
<210>  211
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  211
tcgagttgga ggt                                                        13
<210>  212
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  212
ctccaactcg act                                                        13
<210>  213
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  213
tgcctcacgg tgt                                                        13
<210>  214
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  214
accgtgaggc act                                                        13
<210>  215
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  215
tctggagctt cgt                                                        13
<210>  216
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  216
gaagctccag act                                                        13
<210>  217
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  217
cggcggcaac agt                                                        13
<210>  218
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  218
tgttgccgcc gct                                                        13
<210>  219
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  219
gtccgaagac tgt                                                        13
<210>  220
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  220
agtcttcgga cct                                                        13
<210>  221
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  221
ttacgctaat ggt                                                        13
<210>  222
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  222
cattagcgta act                                                        13
<210>  223
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  223
atcttggcaa cgt                                                        13
<210>  224
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  224
gttgccaaga tct                                                        13
<210>  225
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  225
ctgcggtcta agt                                                        13
<210>  226
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  226
ttagaccgca gct                                                        13
<210>  227
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  227
tccaagcgat ggt                                                        13
<210>  228
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  228
catcgcttgg act                                                        13
<210>  229
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  229
aacaccaatc tgt                                                        13
<210>  230
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  230
agattggtgt tct                                                        13
<210>  231
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  231
tgtaccttca tgt                                                        13
<210>  232
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  232
atgaaggtac act                                                        13
<210>  233
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  233
cttccgactc agt                                                        13
<210>  234
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  234
tgagtcggaa gct                                                        13
<210>  235
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  235
cgtagtgagt cgt                                                        13
<210>  236
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  236
gactcactac gct                                                        13
<210>  237
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  237
cggagtgtaa tgt                                                        13
<210>  238
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  238
attacactcc gct                                                        13
<210>  239
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  239
tgcagtaact ggt                                                        13
<210>  240
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  240
cagttactgc act                                                        13
<210>  241
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  241
atacaacagc cgt                                                        13
<210>  242
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  242
ggctgttgta tct                                                        13
<210>  243
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  243
tgtcatcatg agt                                                        13
<210>  244
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  244
tcatgatgac act                                                        13
<210>  245
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  245
gaacgatagg cgt                                                        13
<210>  246
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  246
gcctatcgtt cct                                                        13
<210>  247
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  247
ttccgacgag agt                                                        13
<210>  248
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  248
tctcgtcgga act                                                        13
<210>  249
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  249
acaaggcggc agt                                                        13
<210>  250
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  250
tgccgccttg tct                                                        13
<210>  251
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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aactgtagtg cgt                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  252
gcactacagt tct                                                        13
<210>  253
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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tcctccttgc ggt                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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cgcaaggagg act                                                        13
<210>  255
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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ctgaggtgtc ggt                                                        13
<210>  256
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  256
cgacacctca gct                                                        13
<210>  257
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  257
atcttactct cgt                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  258
gagagtaaga tct                                                        13
<210>  259
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  259
gattgcgatc tgt                                                        13
<210>  260
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  260
agatcgcaat cct                                                        13
<210>  261
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  261
cgtcaactaa cgt                                                        13
<210>  262
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  262
gttagttgac gct                                                        13
<210>  263
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  263
gacgtggaga cgt                                                        13
<210>  264
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  264
gtctccacgt cct                                                        13
<210>  265
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  265
tagccacagc tgt                                                        13
<210>  266
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  266
agctgtggct act                                                        13
<210>  267
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  267
tcctatgcct agt                                                        13
<210>  268
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  268
taggcatagg act                                                        13
<210>  269
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  269
gcgtagacgc tgt                                                        13
<210>  270
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agcgtctacg cct                                                        13
<210>  271
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  271
cgcctatctt cgt                                                        13
<210>  272
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  272
gaagataggc gct                                                        13
<210>  273
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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acaacggtct tgt                                                        13
<210>  274
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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aagaccgttg tct                                                        13
<210>  275
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  275
cgtccgatag tgt                                                        13
<210>  276
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  276
actatcggac gct                                                        13
<210>  277
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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atgtgtcagg agt                                                        13
<210>  278
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  278
tcctgacaca tct                                                        13
<210>  279
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  279
taggcattac ggt                                                        13
<210>  280
<211>  13
<212>  DNA
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cgtaatgcct act                                                        13
<210>  281
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  281
tcaccaagat tgt                                                        13
<210>  282
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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aatcttggtg act                                                        13
<210>  283
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  283
acagcgtcat cgt                                                        13
<210>  284
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  284
gatgacgctg tct                                                        13
<210>  285
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  285
cctactgtcg cgt                                                        13
<210>  286
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  286
gcgacagtag gct                                                        13
<210>  287
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  287
gtcatcgtga tgt                                                        13
<210>  288
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  288
atcacgatga cct                                                        13
<210>  289
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  289
cagccgtgct cgt                                                        13
<210>  290
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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gagcacggct gct                                                        13
<210>  291
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  291
gagctacact tgt                                                        13
<210>  292
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  292
aagtgtagct cct                                                        13
<210>  293
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  293
caccatcaac ggt                                                        13
<210>  294
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  294
cgttgatggt gct                                                        13
<210>  295
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  295
tctgccgtaa ggt                                                        13
<210>  296
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  296
cttacggcag act                                                        13
<210>  297
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  297
gagactgaag cgt                                                        13
<210>  298
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  298
gcttcagtct cct                                                        13
<210>  299
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  299
gatgttcact ggt                                                        13
<210>  300
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  300
cagtgaacat cct                                                        13
<210>  301
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  301
agtgctaaca ggt                                                        13
<210>  302
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  302
ctgttagcac tct                                                        13
<210>  303
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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aacgcagcat agt                                                        13
<210>  304
<211>  13
<212>  DNA
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tatgctgcgt tct                                                        13
<210>  305
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agtgagtagc agt                                                        13
<210>  306
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tgctactcac tct                                                        13
<210>  307
<211>  13
<212>  DNA
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taggctcctc ggt                                                        13
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<212>  DNA
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cgaggagcct act                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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tcaacggcgc agt                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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tgcgccgttg act                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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actcttatcg tgt                                                        13
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acgataagag tct                                                        13
<210>  313
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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tctcctaatg cct                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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taagaagcca agt                                                        13
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ttggcttctt act                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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atatactaca tgt                                                        13
<210>  318
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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atgtagtata tct                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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ttacatccga cgt                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtcggatgta act                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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tagaggtcgt tgt                                                        13
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aacgacctct act                                                        13
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<212>  DNA
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taccaccgta cgt                                                        13
<210>  324
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtacggtggt act                                                        13
<210>  325
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gagttatgct cgt                                                        13
<210>  326
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<212>  DNA
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gagcataact cct                                                        13
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<212>  DNA
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gtcgtgagtc cgt                                                        13
<210>  328
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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ggactcacga cct                                                        13
<210>  329
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  329
ccactgccta cgt                                                        13
<210>  330
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtaggcagtg gct                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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ttcgattgtg tgt                                                        13
<210>  332
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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acacaatcga act                                                        13
<210>  333
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<212>  DNA
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cacaactgga cgt                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtccagttgt gct                                                        13
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<213>  Unkown
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tgaacatcag cct                                                        13
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<210>  338
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<212>  DNA
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gatggtctca cct                                                        13
<210>  339
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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attacagacc ggt                                                        13
<210>  340
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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cggtctgtaa tct                                                        13
<210>  341
<211>  13
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<213>  Unkown
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gaactcctag agt                                                        13
<210>  342
<211>  13
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tctaggagtt cct                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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tggccttagt cgt                                                        13
<210>  344
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  344
gactaaggcc act                                                        13
<210>  345
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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atatcaacgc ggt                                                        13
<210>  346
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<213>  Unkown
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cgcgttgata tct                                                        13
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gcatggtatc agt                                                        13
<210>  348
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<210>  349
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<213>  Unkown
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cgaatagaat ggt                                                        13
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<213>  Unkown
<400>  351
gacaagcata ggt                                                        13
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ctatgcttgt cct                                                        13
<210>  353
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<213>  Unkown
<400>  353
aatacgagac tgt                                                        13
<210>  354
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agtctcgtat tct                                                        13
<210>  355
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agcttgtgct agt                                                        13
<210>  356
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  356
tagcacaagc tct                                                        13
<210>  357
<211>  13
<212>  DNA
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cagtcacgcg tgt                                                        13
<210>  358
<211>  13
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acgcgtgact gct                                                        13
<210>  359
<211>  13
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gcaggcggag tgt                                                        13
<210>  360
<211>  13
<212>  DNA
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actccgcctg cct                                                        13
<210>  361
<211>  13
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<213>  Unkown
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agagtggtct ggt                                                        13
<210>  362
<211>  13
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cagaccactc tct                                                        13
<210>  363
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<212>  DNA
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atatgaagca ggt                                                        13
<210>  364
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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ctgcttcata tct                                                        13
<210>  365
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  365
cggcttcatc agt                                                        13
<210>  366
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  366
tgatgaagcc gct                                                        13
<210>  367
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  367
tagacaacca tgt                                                        13
<210>  368
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  368
atggttgtct act                                                        13
<210>  369
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  369
agcacaactg tgt                                                        13
<210>  370
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  370
acagttgtgc tct                                                        13
<210>  371
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  371
agattattag cgt                                                        13
<210>  372
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  372
gctaataatc tct                                                        13
<210>  373
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  373
tattgaactt ggt                                                        13
<210>  374
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  374
caagttcaat act                                                        13
<210>  375
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  375
cgttccagac agt                                                        13
<210>  376
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  376
tgtctggaac gct                                                        13
<210>  377
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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cactaagagc cgt                                                        13
<210>  378
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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ggctcttagt gct                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  379
gccgcataag cgt                                                        13
<210>  380
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  380
gcttatgcgg cct                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gccttcagga cgt                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtcacggtaa tgt                                                        13
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<212>  DNA
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attaccgtga cct                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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atggctgctt ggt                                                        13
<210>  386
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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caagcagcca tct                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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cctgtcttgt ggt                                                        13
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cacaagacag gct                                                        13
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<212>  DNA
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ccgaacaggc tgt                                                        13
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<212>  DNA
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agcctgttcg gct                                                        13
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<212>  DNA
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tagagataat agt                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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tattatctct act                                                        13
<210>  393
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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agccattagt ggt                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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cactaatggc tct                                                        13
<210>  395
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  395
catgaaccta cgt                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtaggttcat gct                                                        13
<210>  397
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agcgaatcta cgt                                                        13
<210>  398
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  398
gtagattcgc tct                                                        13
<210>  399
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  399
atactagtcg tga                                                        13
<210>  400
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  400
acgactagta tac                                                        13
<210>  401
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cgaacgtagc aga                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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tgctacgttc gac                                                        13
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<212>  DNA
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tcgatatgtg aga                                                        13
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tcacatatcg aac                                                        13
<210>  405
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gagatattgt aga                                                        13
<210>  406
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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tacaatatct cac                                                        13
<210>  407
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agatatcctc aga                                                        13
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<211>  13
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<400>  408
tgaggatatc tac                                                        13
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<211>  13
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<213>  Unkown
<400>  409
cgaggcctac cga                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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<400>  411
tcggaccgga gga                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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ctccggtccg aac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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ataccgtatc cga                                                        13
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<212>  DNA
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<400>  414
ggatacggta tac                                                        13
<210>  415
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gtgcgcaacc tga                                                        13
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<213>  Unkown
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aggttgcgca cac                                                        13
<210>  417
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ctagctatcg cga                                                        13
<210>  418
<211>  13
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<400>  418
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tagagtctcg tga                                                        13
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<211>  13
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cagcgcataa gga                                                        13
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<213>  Unkown
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cttatgcgct gac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  423
atctacgtgg tga                                                        13
<210>  424
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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accacgtaga tac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  425
aagtacaata tga                                                        13
<210>  426
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  426
atattgtact tac                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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tgcttagcac tga                                                        13
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<213>  Unkown
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tgcatgtctc gga                                                        13
<210>  430
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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cgagacatgc aac                                                        13
<210>  431
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  431
ataggatccg aga                                                        13
<210>  432
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  432
tcggatccta tac                                                        13
<210>  433
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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gttggccggt gga                                                        13
<210>  434
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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caccggccaa cac                                                        13
<210>  435
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agtattaagt tga                                                        13
<210>  436
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  436
aacttaatac tac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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aagcgtacag aga                                                        13
<210>  438
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<213>  Unkown
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tctgtacgct tac                                                        13
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ccacctagta gga                                                        13
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cggacatgcg cga                                                        13
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tgacatgtct gac                                                        13
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ccaacatgat cga                                                        13
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tgttggatca cac                                                        13
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agcttgcagc tac                                                        13
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gagcgcagct tga                                                        13
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gcgcattaat cac                                                        13
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ctcagctggt gga                                                        13
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cagcgcttgt tga                                                        13
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<210>  491
<211>  13
<212>  DNA
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tcctggcctc gga                                                        13
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taagaacgtg tac                                                        13
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tcggaattca aga                                                        13
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<210>  497
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  497
acgtacactc gga                                                        13
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<213>  Unkown
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cgagtgtacg tac                                                        13
<210>  499
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<400>  499
tgccggctga aga                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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ttcagccggc aac                                                        13
<210>  501
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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gaagtacgac cga                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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ggtcgtactt cac                                                        13
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aacatattag tga                                                        13
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actaatatgt tac                                                        13
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gtacatgagg aga                                                        13
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tcctcatgta cac                                                        13
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<213>  Unkown
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<213>  Unkown
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<400>  566
attctagaac gac                                                        13
<210>  567
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  567
ataccatgtc gga                                                        13
<210>  568
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  568
cgacatggta tac                                                        13
<210>  569
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  569
tcgaattgtc gga                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  570
cgacaattcg aac                                                        13
<210>  571
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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actccggttc aga                                                        13
<210>  572
<211>  13
<212>  DNA
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tgaaccggag tac                                                        13
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acagtaccag cga                                                        13
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<400>  574
gctggtactg tac                                                        13
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atctaggcgc aga                                                        13
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tgcgcctaga tac                                                        13
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ctacaattca cac                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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<400>  580
tgaccggatc gac                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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ccttacgtaa tga                                                        13
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attacgtaag gac                                                        13
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<212>  DNA
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ttcgcgccgc tac                                                        13
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taccatgtta cac                                                        13
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agaacgtatg cga                                                        13
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gcatacgttc tac                                                        13
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<212>  DNA
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agacatatct aga                                                        13
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tagatatgtc tac                                                        13
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gagtagctta gga                                                        13
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ctaagctact cac                                                        13
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<212>  DNA
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<212>  DNA
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gagcagctcg aga                                                        13
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tcgagctgct cac                                                        13
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gtggctaggc cga                                                        13
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aagtacagag aga                                                        13
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tctctgtact tac                                                        13
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gacatggtgc cga                                                        13
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gttactaacg tga                                                        13
<210>  612
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acgttagtaa cac                                                        13
<210>  613
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ctgatcctag tga                                                        13
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actaggatca gac                                                        13
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taatggccgt aga                                                        13
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tctcgacatg aga                                                        13
<210>  618
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tcatgtcgag aac                                                        13
<210>  619
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  619
ccaattctga gga                                                        13
<210>  620
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<213>  Unkown
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ctcagaattg gac                                                        13
<210>  621
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  621
cgctaggaca tga                                                        13
<210>  622
<211>  13
<212>  DNA
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atgtcctagc gac                                                        13
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<213>  Unkown
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acaggaatcc gac                                                        13
<210>  625
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  625
gttagtaatg cga                                                        13
<210>  626
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  626
gcattactaa cac                                                        13
<210>  627
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  627
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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ggtcatggta gac                                                        13
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<213>  Unkown
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  630
gaccgcgaca cac                                                        13
<210>  631
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  631
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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tgaatgtacc tac                                                        13
<210>  633
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tccatattgt tga                                                        13
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<213>  Unkown
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<211>  13
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<211>  13
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ccagctagga cga                                                        13
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cttcaattgc gga                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  768
cgcaattgaa gac                                                        13
<210>  769
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  769
tagccgctca aga                                                        13
<210>  770
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
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ttgagcggct aac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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gcgtcatgac tga                                                        13
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<213>  Unkown
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agtcatgacg cac                                                        13
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cactccggcg cac                                                        13
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<213>  Unkown
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cttcctagat tga                                                        13
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aatctaggaa gac                                                        13
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tgagaattgt cac                                                        13
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cctgcgctag aga                                                        13
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tctagcgcag gac                                                        13
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acggcatgtg aga                                                        13
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tcacatgccg tac                                                        13
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tctgcgctct gga                                                        13
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<212>  DNA
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cagagcgcag aac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  785
tcagctagct tga                                                        13
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<212>  DNA
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aagctagctg aac                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
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atgcaattat aga                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  788
tataattgca tac                                                        13
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gtccggtctc gga                                                        13
<210>  790
<211>  13
<212>  DNA
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cgagaccgga cac                                                        13
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  791
tagatcaagt cga                                                        13
<210>  792
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  792
gacttgatct aac                                                        13
<210>  793
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  793
gaggttaaca aga                                                        13
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<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  794
ttgttaacct cac                                                        13
<210>  795
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  795
tgctagtgga tga                                                        13
<210>  796
<211>  13
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<213>  Unkown
<400>  796
atccactagc aac                                                        13
<210>  797
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  797
aatcgacctt aga                                                        13
<210>  798
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<213>  Unkown
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taaggtcgat tac                                                        13
<210>  799
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  799
agatctgatg gcgcgaggg                                                  19
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  800
aggcttacgn nnnnnnnnnn nnagatctga tggcgcgaggg                          40
<210>  801
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<212>  DNA
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<400>  801
cttccgaatg c                                                          11
<210>  802
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  802
agtccgtgat tcgtgaactg ctgccagata cgacgctgt                            39
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<212>  DNA
<213>  Unkown
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acacagcgtc gtatctggca gcagttcacg aatcacgga                            39
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<211>  39
<212>  DNA
<213>  Unkown
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agtggcaaga tggtgtctgc ctcattgaca cgactatgc                            39
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  805
acgcatagtc gtgtcaatga ggcagacacc atgttgcca                            39
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<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  806
agtccgtgat tcgtgaagac tgagacgata cgacgctgt                            39
<210>  807
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  807
acacagcgtc gtatcgtctc agtcttcacg aatcacgga                            39
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<212>  DNA
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agtggcaaga tggtgtctca ccgatagaca cgactatgc                            39
<210>  809
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Unkown
<400>  809
acgcatagtc gtgtctatcg gtgagacacc atgttgcca                            39
【図１】
0006911248.tif 000063
【図２】
0006911248.tif 000064
【図３】
0006911248.tif 000065
【図４】
0006911248.tif 000066
【図５】
0006911248.tif 000067
【図６】
0006911248.tif 000068
【配列表】
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