(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のB. microti（バベシア・ミクロティ）、B. divergens（バベシア・ディバージェンス）、B. duncani（バベシア・デュンカニ）、及び／又はB. venatorum（バベシア・ベナトルム）のバベシア（Babesia）種を同時検出する方法であって：
（ａ）該試料を、B. microti、B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅のための１以上のプライマーのセットと接触させて、B. microti、B. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumの標的核酸が該試料中に存在すれば増幅産物を産生することを含んでなる増幅工程を実施すること；
（ｂ）B. microti、B. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumの標的核酸が該試料中に存在すれば、増幅産物を、B. microti、B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅産物へハイブリダイズさせるための１以上のプローブと接触させることを含んでなるハイブリダイゼーション工程を実施すること；及び
（ｃ）増幅産物の存在又は非存在を検出すること（ここで増幅産物の存在は、該試料中のB. microti、B. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumの存在を示唆し、そしてここで増幅産物の非存在は、該試料中のB. microti、B. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumの非存在を示唆する）を含んでなり；そして
ここで１以上のプライマーのセット及び１以上のプローブは以下：
（１）B. microti の増幅用の以下のプライマーのセット：
（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び
（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマー；及び
配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブ；並びに、
（２）B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅用の以下のプライマーのセット：
（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び
（ｉｉ）配列番号６及び７からなる群より選択されるいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマー；及び
配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む、B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含む、前記方法。
【請求項２】
試料が、呼吸器検体、尿、便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、又は軟組織感染物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が全血である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１以上の核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上の第二プライマーがプライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プライマーの混合物が、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ハイブリダイゼーション工程が、増幅産物を１以上のプローブと接触させる工程（ここで１以上のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識される）を含み；そして検出する工程は、１以上のプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで蛍光の存在又は非存在は、試料中のB. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumの存在又は非存在を示唆する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ドナー蛍光部分がＨＥＸ又はＦＡＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アクセプター部分がクエンチャーである、請求項６〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ドナー蛍光部分とアクセプター部分が互いの５〜２０ヌクレオチド以内にある、請求項６〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料中に存在する可能性があるB. microti、B. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumのバベシア種の核酸を同時検出するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドモノマー、B. microti、B. divergens、B. duncani、及B. venatorumの増幅用の１以上のプライマーのセット、及びB. microti、B. divergens、B. duncani、及B. venatorumの増幅産物へハイブリダイズさせるための１以上のプローブを含んでなる増幅試薬を含んでなり、
ここで１以上のプライマーのセット及び１以上のプローブは以下：
（１）B. microti の増幅用の以下のプライマーのセット：
（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び
（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマー；及び
配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブ；並びに、
（２）B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅用の以下のプライマーのセット：
（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び
（ｉｉ）配列番号６及び７からなる群より選択されるいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマー；及び
配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む、B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含む、前記キット。
【請求項１１】
配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１以上の核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーがプライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
プライマーの混合物が、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
１以上のプローブがドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む、請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
ドナー蛍光部分とアクセプター部分が互いの５〜２０ヌクレオチド以内にある、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
試料中のB. microti、B. divergens、B. duncani、及び／又はB. venatorumのバベシア種の同時検出用の１以上のプライマーのセットと１以上のプローブであって、ここで１以上のプライマーのセット及び１以上のプライマーは、以下：
（１）B. microti の増幅用の以下のプライマーのセット：
（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び
（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマー；及び
配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブ；並びに、
（２）B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅用の以下のプライマーのセット：
（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び
（ｉｉ）配列番号６及び７からなる群より選択されるいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマー；及び
配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む、B. divergens、B. duncani、及びB. venatorumの増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含む、前記１以上のプライマーのセットと１以上のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、体外（in vitro）診断薬の技術分野に関する。この分野内で、本発明は、試料中に存在する可能性がある標的核酸の増幅及び検出に、そして特に、プライマーとプローブを使用する、バベシア属種の配列変異及び／又は個体突然変異を含んでなる標的核酸の増幅、検出、及び定量に関わる。さらに本発明は、バベシアの増幅及び検出のためのプライマー及びプローブを含有する反応混合物及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
バベシア属（ナタリア属［Nuttallia］としても知られる）は、赤血球に感染してバベシア症（ピロプラズマ症としても知られる）を引き起こす原虫寄生体である。バベシアは、通常ダニ媒介性（及びダニ伝播性）であるが、輸血によって、又は妊娠若しくは分娩期の母体から幼児へも伝染される。
【０００３】
ほとんどのバベシア症の症例は非症候性であって、症状は、生じたとしても非特異的であって、風邪様の症状（即ち、発熱、悪寒、発汗、頭痛、筋肉痛、及び関節痛）、溶血性貧血、又は血小板減少症が含まれ得る。バベシア症は、特に、無脾症、弱体化した免疫系（例えば、癌、リンパ腫、又はＡＩＤＳによる）、肝疾患又は腎疾患のような併存疾患のある患者、又は５０歳以上の患者で生命を脅かすものになる。そのような患者では、多臓器不全、播種性血管内凝固症候群、及び死亡さえ起こり得る（Vannier, et al., Infect. Dis. Clin. N. Am. 29:357-370 (2015)）。バベシア寄生虫は、マラリア原虫と同様に、赤血球細胞において繁殖して、そこで十字形の封入体として見られて、溶血性貧血を引き起こす。史的な誤分類のために、バベシア症は、テキサス熱、赤水熱、ダニ熱、及びナンタケット熱としても知られてきた。バベシア症は、マラリア様の寄生虫疾患であって、哺乳動物の血液寄生虫疾患では二番目に多い疾患とみなされて、家畜と人間の健康に対して重大な影響がある。ヒトのバベシア症についてはこれまで稀であったが、米国の北東部及び中西部、並びに欧州の一部では新興疾患となっている。
【０００４】
バベシア属は、哺乳動物の血液寄生虫として見出されるものの中で（トリパノソーマに次いで）二番目に多いとみなされている。これまでに１００種を超えるバベシア属種が同定されてきた。米国における輸血関連バベシア感染症例の大多数は、Babesia microti（バベシア・ミクロチ）種によるものであって、報告症例のほぼ２％は、Babesia duncani（バベシア・デュンカニ）によるものである。B. microti のダニ伝染が主に起きているのは、米国の北東部の七州（コネチカット、メイン、マサチューセッツ、ニューハンプシャー、ニュージャージー、ニューヨーク、及びロードアイランド）と北中西部の州（特に、ミネソタとウィスコンシン）である（Herwaldt, et al., Annals of Internal Medicine 155 (8):509-520 (2011) を参照のこと）。B. duncani は、米国の西海岸で流行している（Herwaldt, et al. (2011) を参照のこと）。２０１１年、米国では１，１２４症例のバベシア症が報告されて、そのうち１０症例が輸血に関連していた（Center for Disease Control and Prevention: Morbidity and Mortality Weekly Report 61(27):501-515 (2012) を参照のこと）。１９７９〜２００９に及ぶ３０年間で報告された輸血関連バベシア症が１６２症例であったので、年次的に増加している（Herwaldt, et al. (2011) を参照のこと）。こういった統計には、輸血関連バベシア症の真の割合を有意に過小評価する可能性があるが、バベシアは、ごく普通に伝染される輸血関連感染症なのである（Leiby, Annals of Internal Medicine 155(8):556-557 (2011)）。今のところ、米国では、血液ドナーをスクリーニングするためのバベシア検査は認可されてなくて、バベシアについての病原体低減技術は利用されていない。バベシア症感染の病歴は、血液ドナーとしての無期限延期の根拠であるが、多くのドナーは、自分がその病原体を保有していることに気づかない場合があって、非症候性の寄生虫血症を有して１年以上もの間感染力を持ち続けている場合もある。さらに、バベシア寄生虫は、血液製品において生存可能である。大多数の輸血関連症例は、赤血球製品（白血球除去又は照射済のユニットが含まれる）に関連していて、血小板輸血によるものはごく一部の症例である。米国の流行地域における献血の前向き試験では、バベシア陽性率は、０．３８％であった（Moritz, et al., N. Engl. J. Med. 375(23): 2236-2245 (2016)）。
【０００５】
これまでにＦＤＡ承認されたスクリーニング検査法が利用可能でないので、米国の血液供給品は、現行ではバベシアについてスクリーニングしていない。従って、臨床医は、その臨床症状が非特異的であるが故に、輸血関連バベシア症の診断を見過ごす場合があって、血液製品が全国的に流通するということは、バベシア罹患率が高い地域の外でも、そしてダニ媒介疾患がピークとなる夏月以外でもバベシア症が起こる可能性があることを意味している。
【０００６】
血液や他の組織及び／又は生体試料中のバベシアを検出するための方法（即ち、免疫学的方法）があるものの、これらの方法は感度が不足していて、血液中のバベシアの感染力を正確に予測することができない。さらに、そのような免疫学的方法では、バベシアが存在するが検出に十分なだけの抗体を誘発していない期間の間に感染を検出することができない。献血がスクリーニングされる他の感染症と同様に、被感染ユニットが禁止されて処分されるようにバベシアを検出するための高感度アッセイで献血をスクリーニングしなければならない。
【０００７】
分子診断薬の分野において、核酸の増幅及び検出は、きわめて重要である。そのような方法を利用して、ウイルスや細菌のようないくつもの微生物を検出することができる。最も著名で広く使用されている増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅技術には、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ−ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、及びＱβ−増幅が含まれる。ＰＣＲベースの分析の自動化システムでは、ＰＣＲ法の間の産物増幅のリアルタイム検出を同一容器内で利用することが多い。そのような方法への鍵となるのは、レポーター基又は標識を担う修飾オリゴヌクレオチドの使用である。
【０００８】
このように、バベシアの感染率は、試料中のその検出への信頼し得る高感度アッセイも手段もないままに、米国内で劇的に増加している。バベシアを検出するための信頼し得る感度の手段が無いので、バベシア感染率の増加は、特に、献血供給品の安全性を脅かしている。故に、当該技術分野には、試料中のバベシアの存在を検出して定量するための迅速で信頼し得る、特異的で高感度の方法へのニーズがある。
【発明の概要】
【０００９】
本開示中のいくつかの態様は、生体又は非生体試料中のバベシアの存在又は非存在についての迅速な検出のための方法、例えば、単一の試験管又は容器中でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるバベシアの多重検出及び定量に関する。態様には、少なくとも１回のサイクリング工程（これには、増幅工程とハイブリダイズ工程が含まれ得る）を実施することを含んでなる、バベシアの検出の方法が含まれる。さらに、態様には、単一の試験管又は容器におけるバベシアの検出用に設計される、プライマー、プローブ、及びキットが含まれる。
【００１０】
請求項に係る発明の１つの態様は、試料中のバベシアを検出する方法へ向けられて、該方法は、（ａ）該試料を１以上のプライマーのセットと接触させて、バベシアの標的核酸が該試料中に存在すれば増幅産物を産生することを含んでなる増幅工程を実施すること；（ｂ）バベシアの標的核酸が該試料中に存在すれば、増幅産物を１以上のプローブと接触させることを含んでなるハイブリダイゼーション工程を実施すること；及び（ｃ）増幅産物の存在又は非存在を検出すること（ここで増幅産物の存在は、該試料中のバベシアの存在を示唆し、そしてここで増幅産物の非存在は、該試料中のバベシアの非存在を示唆する）を含んでなり；そしてここで１以上のプライマーのセットは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そしてここで１以上のプローブは、配列番号２及び配列番号５からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含む。１つの態様において、バベシアは、B. microti（バベシア・ミクロティ）、B. divergens（バベシア・ディバージェンス）、B. duncani（バベシア・デュンカニ）、及び B. venatorum（バベシア・ベナトルム）からなる群のいずれか１以上のバベシア属種を含む。さらなる態様において、バベシア属種は、バベシア属種の B. microti からなる。１つの態様において、１以上のプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマーと、配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマーを含み；そしてここで１以上のプローブは、配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む。別の態様において、バベシア属種は、バベシア属種の B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のいずれか１以上からなる。関連した態様において、１以上のプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと、配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１以上の核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み、そしてここで１以上のプローブは、配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む。１つの態様において、配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１以上の核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上の第二プライマーは、プライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む。別の態様において、プライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む。別の態様において、バベシア属種は、バベシア属種の B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のいずれか１以上からなる。関連した態様において、B. microti を検出する方法は、B. microti の増幅用のプライマーのセットと、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含み；そしてここで B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出する方法は、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセ��トと、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へのハイブリダイゼーション用のプローブを含む。関連した態様において、（ａ）B. microti の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマーを含み；そして B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブは、配列番号２の核酸配列又はその相補体を含み；そして（ｂ）B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び（ｉｉ）配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そして B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブは、配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む。別の態様において、配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーは、プライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む。関連した態様において、プライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む。別の態様において、試料は、全血、呼吸器検体、尿、便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、又は軟組織感染物のような生体試料である。関連した態様において、生体試料は、全血である。別の態様において、全血は、増幅工程に先立って核酸安定化溶液と接触させる。別の態様において、核酸安定化溶液は、グアニジニウム塩と緩衝液を含む。別の態様において、グアニジニウム塩は、塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）であって、ここで塩化グアニジニウムの濃度は、４．２Ｍのように、２Ｍ〜６Ｍの間である。別の態様において、緩衝液は、Ｔｒｉｓ（トリス）であって、ここでＴｒｉｓの濃度は、５０ｍＭのように、２０ｍＭ〜１００ｍＭの間である。別の態様において、核酸安定化溶液のｐＨは、７．５のように、６〜８の間である。別の態様において、核酸安定化溶液は、採血容器中にある。関連した態様において、採血容器は、真空チャンバ−を有する。別の態様において、ハイブリダイゼーション工程は、増幅産物を１以上のプローブと接触させる工程（ここで１以上のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識される）を含み；そして検出する工程は、１以上のプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで蛍光の存在又は非存在は、試料中のバベシアの存在又は非存在を示唆する。関連した態様において、ドナー蛍光部分は、ＨＥＸ又はＦＡＭである。別の態様において、アクセプター部分は、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ−２（ＢＨＱ−２）のようなクエンチャーである。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの５〜２０ヌクレオチド以内にある。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの７〜１０ヌクレオチド以内にある。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの８ヌクレオチド以内、又は互いの１０ヌクレオチド以内にある。
【００１１】
請求項に係る発明の別の態様は、全血である試料中のバベシアを検出する方法へ向けられ、該方法は：（ａ）該試料を１以上のプライマーのセットと接触させて、バベシアの標的核酸が該全血試料中に存在すれば増幅産物を産生することを含んでなる増幅工程を実施すること；（ｂ）バベシアの標的核酸が該試料中に存在すれば、増幅産物を１以上のプローブと接触させることを含んでなるハイブリダイゼーション工程を実施すること；及び（ｃ）増幅産物の存在又は非存在を検出すること（ここで増幅産物の存在は、該試料中のバベシアの存在を示唆し、そしてここで増幅産物の非存在は、該試料中のバベシアの非存在を示唆する）を含んでなり；そしてここで１以上のプライマーのセットは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そしてここで１以上のプローブは、配列番号２及び配列番号５からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含む。関連した態様において、全血は、採血容器中に採取される。別の態様において、採血容器は、真空チャンバーを有する。別の態様において、採血容器は、その内部に核酸安定化溶液を含有する。関連した態様において、核酸安定化溶液は、グアニジニウム塩と緩衝液を含む。関連した態様において、グアニジニウム塩は、塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である。１つの態様において、ＧｕＨＣｌは、４．２Ｍの濃度である。別の態様において、緩衝液は、Ｔｒｉｓ（トリス）である。別の態様において、Ｔｒｉｓは、５０ｍＭの濃度である。１つの態様において、核酸安定化溶液は、７．５のｐＨである。別の態様において、バベシア属種は、B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum からなる群のいずれか１以上のバベシア属種を含む。別の態様において、B. microti を検出する方法は、B. microti の増幅用のプライマーのセットと、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含み；そしてここで B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出する方法は、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットと、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へのハイブリダイゼーション用のプローブを含む。別の態様において、（ａ）B. microti の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマーを含み；そして B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブは、配列番号２の核酸配列又はその相補体を含み；そして（ｂ）B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び（ｉｉ）配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そして B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブは、配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む。別の態様では、配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプ���イマーがプライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む。関連した態様において、プライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む。
【００１２】
請求項に係る発明の別の態様は、試料中に存在する可能性があるバベシアの核酸を検出するためのキットへ向けられ、該キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドモノマー、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含んでなる１以上のプライマーのセット、及び配列番号２及び配列番号５からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプローブを含んでなる増幅試薬を含んでなる。別の態様において、バベシアは、B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum からなる群のいずれか１以上のバベシア属種を含む。別の態様において、該キットは、B. microti の増幅用のプライマーのセットと、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含み、そしてここで該キットは、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットと、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へのハイブリダイゼーション用のプローブを含む。別の態様において、（ａ）B. microti の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマーを含み；そして B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブは、配列番号２の核酸配列又はその相補体を含み；そして（ｂ）B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び（ｉｉ）配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そして B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブは、配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む。別の態様において、配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１以上の核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーは、プライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む。関連した態様において、プライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む。別の態様において、試料は、全血、呼吸器検体、尿、便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、又は軟組織感染物のような生体試料である。別の態様において、生体試料は、全血である。別の態様において、キットは、採血容器をさらに含む。別の態様において、採血容器は、真空チャンバ−を有する。別の態様において、採血容器は、その内部に核酸安定化溶液を含有する。別の態様において、核酸安定化溶液は、グアニジニウム塩と緩衝液を含む。別の態様において、グアニジニウム塩は、４．２Ｍの濃度の塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である。別の態様において、緩衝液は、５０ｍＭの濃度のＴｒｉｓである。���の態様において、核酸安定化溶液は、７．５のｐＨである。別の態様において、１以上のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む。関連した態様において、ドナー部分は、ＨＥＸ又はＦＡＭである。別の態様において、アクセプター部分は、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ−２（ＢＨＱ−２）のようなクエンチャーである。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの５〜２０ヌクレオチド以内にある。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの７〜１０ヌクレオチド以内にある。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの８ヌクレオチド以内、又は互いの１０ヌクレオチド以内にある。
【００１３】
請求項に係る発明のなお別の態様は、試料中のバベシアの検出用の１以上のプライマーのセットと１以上のプローブへ向けられ、ここで１以上のプライマーのセットは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号７より選択される群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そしてここで１以上のプローブは、配列番号２及び配列番号５からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含む。別の態様において、バベシア属は、B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum からなる群のいずれか１以上のバベシア属種を含む。別の態様において、B. microti を検出するための１以上のプライマーのセットと１以上のプローブは、B. microti の増幅用のプライマーのセットと、B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるためのプローブを含み；そしてここで、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するための１以上のプライマーのセットと１以上のプローブは、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットと、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へのハイブリダイゼーション用のプローブを含む。別の態様において、（ａ）B. microti の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号１の核酸配列又はその相補体を含んでなる第一プライマー；及び（ｉｉ）配列番号３の核酸配列又はその相補体を含んでなる第二プライマーを含み；そして B. microti の増幅産物へハイブリダイズさせるための１以上のプローブは、配列番号２の核酸配列又はその相補体を含み；そして（ｂ）B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅用のプライマーのセットは、（ｉ）配列番号４の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマー；及び（ｉｉ）配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１つの核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーを含み；そして B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅産物へハイブリダイズさせるための１以上のプローブは、配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む。別の態様において、配列番号６と配列番号７からなる群のいずれか１以上の核酸配列又はその相補体を含んでなる１以上のプライマーは、プライマーの混合物を含み、ここでこのプライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーを含む。別の態様において、プライマーの混合物は、（ｉ）配列番号６の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーと（ｉｉ）配列番号７の核酸配列又はその相補体を含んでなるプライマーの等量を有する混合物を含む。別の態様において、１以上のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む。別の態様において、ドナー部分は、ＨＥＸ又はＦＡＭである。別の態様において、アクセプター部分は、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ−２（ＢＨＱ−２）のようなクエンチャーである。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの５〜２０ヌクレオチド以内にある。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの７〜１０ヌクレオチド以内にある。別の態様において、ドナー蛍光部分とアクセプター部分は、互いの８又は１０ヌクレオチド以内にある。
【００１４】
他の態様は、配列番号１〜配列番号７より選択されるヌクレオチドの配列又はその相補体を含んでなるか又はそれからなるオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは、１００個以下のヌクレオチドを有する。別の態様において、本開示は、配列番号１〜配列番号５の１つに対して少なくとも７０％の配列同一性（例、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、等）を有する核酸又はその相補体が含まれるオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは、１００個以下のヌクレオチドを有する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、上記の態様において、プライマー核酸、プローブ核酸、等であり得る。上記態様のいくつかにおいて、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、１５個以下のヌクレオチド、等）を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドに比べて核酸ハイブリダイゼーション安定性を改変するために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識を含んでもよくて、少なくとも１つのクエンチャー部分を含んでもよい。いくつかの態様において、このオリゴヌクレオチドには、少なくとも１つの保守的修飾変異が含まれる。ある特別な核酸配列の「保守的修飾変異」、又は簡潔には「保守的変異」は、同一又は本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、又は該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を意味する。当業者には、コードされる配列中の単一ヌクレオチド又は数パーセント（典型的には５％未満、より典型的には、４％、２％又は１％未満）のヌクレオチドを改変する、付加する、又は欠失させる個々の置換、欠失、又は付加が、その改変により１個のアミノ酸の欠失、１個のアミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす場合、「保守的修飾変異」であることがわかっている。
【００１５】
１つの側面において、増幅では、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を利用することができる。従って、ドナー蛍光部分とアクセプター部分（例、クエンチャー）は、プローブの長さに沿って互いの５〜２０ヌクレオチド以内（例、７又は１０ヌクレオチド以内）にあり得る。別の側面において、プローブには、二次構造形成を可能にする核酸配列が含まれる。そのような二次構造形成は、第一蛍光部分と第二蛍光部分の間に空間的近接をもたらす場合がある。この方法によれば、プローブ上の第二蛍光部分は、クエンチャーであり得る。
【００１６】
本開示はまた、個体由来の生体試料中のバベシア又はバベシア核酸の存在又は非存在を検出する方法を提供する。これらの方法を利用して、血液スクリーニングと診断検査での使用のために、血漿中のバベシア核酸の存在又は非存在を検出することができる。加えて、この同じ検査は、尿や他の試料タイプについて評価してバベシア核酸を検出及び／又は定量するために当該技術分野の経験者によって使用し得る。このような方法には、一般的に、少なくとも１回のサイクリング工程（これには、増幅工程と色素結合工程が含まれる）を実施することが含まれる。典型的には、増幅工程には、試料中に核酸分子が存在していれば、複数のオリゴヌクレオチドプライマー対と試料を接触させて１以上の増幅産物を産生することが含まれ、そして色素結合工程には、この増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることが含まれる。そのような方法には、二本鎖ＤＮＡ結合色素の増幅産物中への結合の存在又は非存在について検出する工程も含まれ、ここで結合の存在は、試料中のバベシア核酸の存在を示唆して、そしてここで結合の非存在は、試料中のバベシア核酸の非存在を示唆する。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素には、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）と、ＹＯ−ＹＯ（登録商標）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎのようなシアニン色素が含まれる。加えて、そのような方法には、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素間の融点を決定する工程も含まれ得て、ここではその融点によって、バベシア核酸の存在又は非存在が確定される。
【００１７】
さらなる態様では、バベシアの１以上の核酸を検出及び／又は定量するためのキットが提供される。このキットには、標的遺伝子の増幅に特異的な１以上のプライマーセットと、増幅産物の検出に特異的な１以上の検出可能オリゴヌクレオチドプローブが含まれ得る。
【００１８】
１つの側面において、該キットには、ドナー部分及び対応するアクセプター部分（例、別の蛍光部分又はダーククエンチャー）ですでに標識されたプローブが含まれ得るか、又はプローブを標識するための発蛍光（fluorophoric）部分が含まれ得る。該キットには、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液も含めることができる。該キットには、試料中のバベシア核酸の存在又は非存在について検出するためにプライマー、プローブ、及び発蛍光部分を使用することについての添付文書と使用説明書も含めることができる。
【００１９】
他に定義しなければ、本明細書において使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明の主題の実践又は検討では、本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料について、下記に記載する。加えて、その材料、方法、及び実施例は、説明用にすぎないので、限定的であることを企図しない。
【００２０】
本発明の１以上の態様の詳細について、付帯の図面と下記の記載において説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、この図面と詳細な説明より、そして特許請求項より明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図面１は、ｐＥＦ１１３（B. microti）プラスミドＤＮＡ希釈物に対する B.microti 核酸検査（「３９５」）のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す（配列番号１と配列番号３の核酸配列を有するプライマーと配列番号２の核酸配列を有するプローブを使用する）。
【図２】図面２は、B.microti ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ３０２２１Ｄ）希釈物に対する B.microti 核酸検査（「３９５」）のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す（配列番号１と配列番号３の核酸配列を有するプライマーと配列番号２の核酸配列を有するプローブを使用する）。
【図３】図面３は、プラスミド：ｐＥＦ１１４（B. divergens）、ｐＥＦ１１５（B. duncani）、及びｐＥＦ１１６（B. venatorum）と B. duncani（ＡＴＣＣ  ＰＲＡ３０２）由来の全核酸に対する、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum についての核酸検査（「ＤＤＶ」）のＰＣＲ増幅曲線を示す（配列番号４及び配列番号６の核酸配列を有するプライマーと配列番号５の核酸配列を有するプローブを使用する）。
【図４】図面４は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶ」、配列番号４〜配列番号６）のマルチプレックス設定におけるＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図５】図面５は、最適な間隔を決定するための、フルオロフォアとクエンチャーが７塩基の間隔にある場合の B. microti プローブ（配列番号２）のＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図６】図面６は、最適な間隔を決定するための、フルオロフォアとクエンチャーが１０塩基の間隔にある場合の B. microti プローブ（配列番号２）のＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図７】図面７は、最適な色素を決定するための、異なる色素（ＦＡＭとＨＥＸ）で評価した B. microti プローブ（配列番号２）のＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図８】図面８は、オリゴヌクレオチドの欠失とプローブの効率的な切断によって裏付けられるような効率的な増幅を実証する、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）のポストＰＣＲ解析を示す。
【図９】図面９は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶ」、配列番号４〜配列番号６）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. microti についてのＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図１０】図面１０は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶ」、配列番号４〜配列番号６）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani（図面１０Ａ）、B. divergens（図面１０Ｂ）、及び B.venatorum（図面１０Ｃ）についてのＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図１１】図面１１は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶ」、配列番号４〜配列番号６）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani、B. divergens、及び B.venatorum についてのＰＣＲ増幅曲線を示す、図面１０Ａ、図面１０Ｂ、及び図面１０Ｃの単一図面での重なりを示す。
【図１２】図面１２は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶＲ２」、配列番号４〜配列番号７、等量のリバースプライマー：配列番号６と配列番号７の混合物を含む）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. microti についてのＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図１３】図面１３は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶＲ２」、配列番号４〜配列番号７、等量のリバースプライマー：配列番号６と配列番号７の混合物を含む）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani（図面１３Ａ）、B. divergens（図面１３Ｂ）、及び B.venatorum（図面１３Ｃ）についてのＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図１４】図面１４は、B. microti オリゴヌクレオチドセット（「３９５」、配列番号１〜配列番号３）と B. divergens、B. duncani、及び B.venatorum のオリゴヌクレオチドセット（「ＤＤＶ」、配列番号４〜配列番号６）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani、B. divergens、及び B.venatorum についてのＰＣＲ増幅曲線を示す、図面１３Ａ、図面１３Ｂ、及び図面１３Ｃの単一図面での重なりを示す。
【図１５】図面１５は、第一のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１〜配列番号６）（図面１５Ａ）と第二のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１〜配列番号７、等量のリバースプライマー：配列番号６と配列番号７の混合物を含む）（図面１５Ｂ）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani、B. divergens、及び B.venatorum についてのＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図１６】図面１６は、第一のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１〜配列番号６）（図面１６Ａ）と第二のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１〜配列番号７、等量のリバースプライマー：配列番号６と配列番号７の混合物を含む）（図面１６Ｂ）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani についてのＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図１７】図面１７は、第一のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１〜配列番号６）（標識「ＤＤＶＲ」）と第二のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１〜配列番号７、等量のリバースプライマー：配列番号６と配列番号７の混合物を含む）（標識「ＤＤＶＲ２」）を全血（コバスＰＣＲメディアで処理済）でのマルチプレックス設定において使用する、B. duncani についてのＰＣＲ増幅曲線を示す、図面１６Ａと図面１６Ｂの単一図面での重なりを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
バベシア感染の核酸増幅による診断は、ＢＫウイルス感染を迅速に、正確に、信頼可能的に、特異的に、そして高感度で検出及び／又は定量するための方法を提供する。本明細書では、非生物学的又は生物学的な試料中のバベシア核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡが含まれる）を検出及び／又は定量するためのリアルタイムＰＣＲアッセイについて記載する。バベシアを検出及び／又は定量するためのプライマー及びプローブを、そのようなプライマー及びプローブを含有する製造品又はキットと同様に、提供する。バベシアの検出用のリアルタイムＰＣＲの、他の方法と比較した場合の特異性及び感度の増加は、試料封じ込め（containment）と増幅産物のリアルタイム検出及び定量が含まれる、リアルタイムＰＣＲの改善された特徴と共に、バベシア感染症の臨床検査における定型的な診断への本技術の実行を容易にする。加えて、この技術は、血液スクリーニングだけでなく予後判定にも利用され得る。このバベシア検出アッセイはまた、他の核酸（例、他の細菌及び／又はウイルス）の検出用の他のアッセイと並行して多重化し得る。
【００２３】
本開示には、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用してバベシアを特異的に同定するための、バベシアゲノムへハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーと蛍光標識された加水分解プローブが含まれる。
【００２４】
開示の方法には、１以上のプライマー対を使用して、試料由来の核酸分子遺伝子標的の１以上の部分を増幅する工程が含まれる、少なくとも１回のサイクリング工程を実施することが含まれ得る。本明細書に使用されるような「ＢＫプライマー（複数）」は、バベシアゲノムに見出される核酸配列へ特異的にアニールして、それぞれの増幅産物を産生する適正な条件の下でそれからＤＮＡ合成を開始する、オリゴヌクレオチドプライマーを意味する。バベシアゲノムに見出される核酸配列の例には、ＶＰ２領域のような、バベシアゲノムのウイルスカプシドタンパク質領域内の核酸が含まれる。考察されるバベシアプライマーのそれぞれは、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含有するように、標的へアニールする。１以上の核酸が試料中に存在するならば、１以上の増幅産物が産生されるので、１以上の増幅産物の存在は、該試料中のバベシアの存在を示唆する。この増幅産物は、バベシアについて検出可能な１以上のプローブに相補的である核酸配列を含有するはずである。本明細書に使用されるような「バベシアプローブ（複数）」は、バベシアゲノムに見出される核酸配列へ特異的にアニールするオリゴヌクレオチドプローブを意味する。それぞれのサイクリング工程には、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、及び検出工程が含まれ、ここにおいて試料は、該試料中のバベシアの存在又は非存在の検出用の１以上の検出可能なバベシアプローブと接触される。
【００２５】
本明細書において使用されるように、「増幅すること」という用語は、鋳型核酸分子（例、バベシアゲノム由来核酸分子）の一方又は両方の鎖に相補的である核酸分子を合成する方法を意味する。核酸分子を増幅することには、典型的には、鋳型核酸を変性させること、その鋳型核酸へプライマーの融点未満である温度でプライマーをアニールすること、及びこのプライマーから酵素的に延長させて増幅産物を産生することが含まれる。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）、及びポリメラーゼ酵素の最適な活性に適した緩衝液及び／又は補因子（例、ＭｇＣｌ２及び／又はＫＣｌ）の存在が必要とされる。
【００２６】
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られていて、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを意味するが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライムする」ことができる修飾オリゴヌクレオチドも意味し、即ち、例えばオリゴヌクレオチドの３’端は、フリーの３’−ＯＨ基を提供し、ここではさらなる「ヌクレオチド」が鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって付加され得て、デオキシヌクレオシド三リン酸が使用されてピロリン酸が放出されることによって、３’→５’ホスホジエステル連結が確立される。
【００２７】
「ハイブリダイズさせること」という用語は、１以上のプローブの増幅産物へのアニーリングを意味する。「ハイブリダイゼーション条件」には、典型的には、プローブの融点未満であるが、プローブの非特異的なハイブリダイゼーションを回避する温度が含まれる。
【００２８】
「５’→３’ヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には、核酸鎖合成に関連した核酸ポリメラーゼの活性を意味し、それによって核酸鎖の５’端からヌクレオチドが除去される。
【００２９】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を意味し、即ち、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー延長産物の生成を触媒して、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間の間上昇温度へ処されるときに、不可逆的には変性しない。一般に、その合成は、各プライマーの３’端で開始されて、鋳型鎖に沿って５’→３’方向で進行する。熱安定性ポリメラーゼは、Thermus flavus（サーマス・フラブス）、T. ruber（サーマス・ルーバー）、T. thermophilus（サーマス・サーモフィルス）、T. aquaticus（サーマス・アクアチクス）、T. lacteus（サーマス・ラクテウス）、T. rubens（サーマス・ルーベンス）、Bacillus stearothermophilus（バチルス・ステアロサーモフィルス）、及び Methanothermus fervidus（メタノサーマス・フェルビズス）より単離されている。さりながら、熱安定性でないポリメラーゼも、該酵素が必要に応じて補充されるならば、ＰＣＲアッセイにおいて利用することができる。
【００３０】
「〜の相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであるとともに正確に相補的である核酸を意味する。
核酸に関して使用される場合の「拡張（extension）」又は「延長（elongation）」という用語は、追加のヌクレオチド（又は他の類似分子）が該核酸中へ組み込まれる場合を意味する。例えば、核酸は、場合によっては、典型的には核酸の３’末端でヌクレオチドを付加するポリメラーゼのような、ヌクレオチドを組み込む生体触媒によって拡張される。
【００３１】
２以上の核酸配列の文脈における「〜と同一」又は「同一性」パーセントという用語は、例えば当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定するか又は目視検査によって、最大の対応のために比較されて並置される場合に、同じであるか又は同じである特定百分率のヌクレオチドを有する２以上の配列又はサブ配列を意味する。配列同一性パーセントと配列類似性を決定するのに適している例示のアルゴリズムは、例えば、Altschul et al. (1990) 「Basic local alignment search tool（基本のローカルアライメント検索ツール）」 J. Mol. Biol. 215:403-410、Gish et al. (1993) 「Identification of protein coding regions by database similarity search（データベース類似性検索によるタンパク質コーディング領域の同定）」 Nature Genet. 3:266-272、 Madden et al. (1996) 「Applications of network BLAST server（ネットワークＢＬＡＳＴサーバーの応用）」 Meth. Enzymol. 266:131-141、Altschul et al. (1997) 「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs（ギャップありＢＬＡＳＴとＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム）」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402、及び Zhang et al. (1997) 「PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：会話型又は自動の配列解析及び注釈付与への新たなネットワークＢＬＡＳＴ応用」」Genome Res. 7:649-656 に記載されている、ＢＬＡＳＴプログラムである。
【００３２】
オリゴヌクレオチドの文脈における「修飾ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドへ所望の特性を提供する異なるヌクレオチドに置き換える改変を意味する。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換することが可能である例示の修飾ヌクレオチドには、例えば、ｔ−ブチルベンジル、Ｃ５−メチル−ｄＣ、Ｃ５−エチル−ｄＣ、Ｃ５−メチル−ｄＵ、Ｃ５−エチル−ｄＵ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ、Ｃ５−プロピニル−ｄＵ、Ｃ７−プロピニル−ｄＡ、Ｃ７−プロピニル−ｄＧ、Ｃ５−プロパルジルアミノ−ｄＣ、Ｃ５−プロパルジルアミノ−ｄＵ、Ｃ７−プロパルジルアミノ−ｄＡ、Ｃ７−プロパルジルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、シュード−ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’−Ｏ−メチルリボ−Ｕ、２’−Ｏ−メチルリボ−Ｃ、Ｎ４−エチル−ｄＣ、Ｎ６−メチル−ｄＡ、５−プロピニルｄＵ、５−プロピニルｄＣ、７−デアザ−デオキシグアノシン（デアザＧ（ｕ−デアザ））、等が含まれる。該オリゴヌクレオチドにおいて置換することが可能である他の多くの修飾ヌクレオチドが本明細書において言及されるか又は別のやり方で当該技術分野において知られている。ある態様では、修飾ヌクレオチド置換により、対応する非修飾オリゴヌクレオチドの融点に対して、オリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）が変化する。さらに例証すると、ある種の修飾ヌクレオチド置換により、いくつかの態様では、非特異的な核酸増幅を抑える（例えば、プライマーダイマー生成、等を最小化する）、企図される標的アンプリコンの収率を高める、及び／又は同様のことが可能になる。例えば、米国特許第６，００１，６１１号には、この種の核酸修飾の例が記載されている。他の修飾ヌクレオチド置換では、オリゴヌクレオチドの安定性を改変する、又は他の所望される特徴を提供する場合がある。
【００３３】
バベシア標的核酸の検出／定量
本開示は、例えば、バベシア核酸配列の一部を増幅することによって、バベシアを検出するための方法を提供する。具体的には、本開示の態様によって、バベシア核酸分子標的を増幅して検出及び／又は定量するためのプライマーとプローブが提供される。
【００３４】
バベシアの検出及び／又は定量のために、バベシア（核酸）を増幅して検出／定量するためのプライマーとプローブが提供される。試料中のバベシアを検出するために、本明細書に例示される核酸以外のバベシア核酸も使用することができる。例えば、当業者は、定型的な方法を使用して、機能的変異体について特異性及び／又は感度を評価することができる。代表的な機能的変異体には、例えば、本明細書に開示されるバベシア核酸における１以上の欠失、挿入、及び／又は置換を含めることができる。
【００３５】
より具体的には、当該オリゴヌクレオチドの態様には、配列番号１〜配列番号７より選択される配列のある核酸、実質的に同一なその変異体（ここでその変異体は、配列番号１〜配列番号７の１つに対して少なくとも例えば８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する）、又は配列番号１〜配列番号７の相補体とその変異体がそれぞれ含まれる。
【００３６】
【表１】
0006911190.tif 000002
【００３７】
１つの態様において、上記に記載したバベシアのプライマー及びプローブのセットは、バベシアを含有することが疑われる生体試料中のバベシアの検出に提供されるために使用される（表１）。このプライマー及びプローブのセットは、配列番号１〜配列番号７の核酸配列を含んでなるか又はそれからなる、バベシア核酸配列に特異的なプライマー及びプローブを含み得るか又はそれからなり得る。別の態様において、バベシア標的へのプライマー及びプローブは、配列番号１〜配列番号７のプライマー及びプローブのいずれかの機能的に活性な変異体を含むか又はそれからなる。
【００３８】
このプライマー及びプローブを開示の方法において使用することによって、配列番号１〜配列番号７のプライマー及び／又はプローブのいずれかの機能的に活性な変異体を同定することができる。配列番号１〜配列番号７のいずれかのプライマー及び／又はプローブの機能的に活性な変異体とは、記載の方法又はキットにおいて、配列番号１〜配列番号７の各配列に比較して、それと同等か又はより高い特異性及び感度を提供するプライマー及び／又はプローブに関連する。
【００３９】
この変異体は、例えば、配列番号１〜配列番号７の各配列の５’端及び／又は３’端での１以上のヌクレオチド付加、欠失、又は置換のように、配列番号１〜配列番号７より１以上のヌクレオチド付加、欠失、又は置換だけ変化する場合がある。上記に詳述したように、プライマー及び／又はプローブを化学的に修飾し得る、即ち、プライマー及び／又はプローブは、修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含んでよい。そのとき、プローブ（又はプライマー）は、修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）は、天然の「ヌクレオチド」より何らかの修飾により異なるが、それでも塩基又は塩基様化合物、ペントフラノシル糖又はペントフラノシル糖様化合物、ホスフェート部分又はホスフェート様部分、又はこれらの組合せからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分へ「標識（label）」を付ける場合があって、それによって「修飾ヌクレオチド」が得られる。また、「ヌクレオチド」中の天然塩基を例えば７−デスアザプリンに置き換える場合があって、それによっても「修飾ヌクレオチド」が得られる。本出願では、「修飾ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド類似体」という用語が交換可能的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（又は「ヌクレオシド類似体」）は、「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）について上記に概説したようなやり方で、天然のヌクレシチドより何らかの修飾によって異なる。
【００４０】
例えば、ＯＬＩＧＯ（Molecular Biology Insights 社、コロラド州カスケード）のようなコンピュータープログラムを使用して、バベシア標的をコードする核酸分子（例、バベシアの代替部分をコードする核酸）を増幅する、修飾オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体が含まれるオリゴヌクレオチドを設計することができる。増幅プライマーとして使用し得るオリゴヌクレオチドを設計する場合の重要な特徴には、限定されないが、検出（例えば、電気泳動による）を容易にするのに適正なサイズの増幅産物、プライマー対の成員で類似した融点、及び各プライマーの長さ（即ち、当該プライマーは、配列特異性を持ってアニールして合成を開始するのに十分に長い必要があるが、オリゴヌクレオチド合成の間に正確性（fidelity）が低下するほどに長い必要はない）が含まれる。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、８〜５０ヌクレオチドの長さ（例、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、又は５０ヌクレオチドの長さ）である。
【００４１】
プライマーのセットに加えて、本方法では、バベシアの存在又は非存在を検出するために、１以上のプローブを使用する場合がある。「プローブ」という用語は、明確な所定のストリンジェンシーの下で「標的核酸」へ（本事例ではバベシア（標的）核酸へ）特異的に（即ち、選好的に）ハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を設計又は選択によって含有する、合成的に又は生物学的に産生される核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を意味する。「プローブ」は、それが標的核酸を検出するという意味で、「検出プローブ」と言及することができる。
【００４２】
いくつかの態様において、記載されるバベシアプローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識することができる。１つの態様において、このバベシアプローブは、ドナー蛍光部分（例、蛍光色素）及び対応するアクセプター部分（例、クエンチャー）で標識することができる。１つの態様において、当該プローブは、蛍光部分を含むか又はそれからなり、そして核酸配列は、配列番号３を含むか又はそれからなる。
【００４３】
プローブとして使用し得るオリゴヌクレオチドを設計することは、プライマーの設計に類似したやり方で実施することができる。種々の態様では、増幅産物の検出のために、単一のプローブ又は対のプローブを使用し得る。その態様に依存して、使用されるプローブ（複数）は、少なくとも１つの標識、及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含み得る。当該プライマーと同様に、当該プローブは、通常は類似の融点を有して、各プローブの長さは、配列特異的なハイブリダイゼーションが生じるのに十分でなければならないが、合成の間に正確性が低下するほどに長くあってはならない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に、１５〜４０（例、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）のヌクレオチドの長さである。
【００４４】
構築体には、バベシアのプライマー及びプローブの核酸分子（例、配列番号１、２、３、４、及び５）の１つをそれぞれ含有するベクターを含めることができる。構築体は、例えば、対照（control）鋳型核酸分子として使用することができる。使用に適したベクターは、市販されている、及び／又は当該技術分野で定型的な組換え核酸技術の方法によって産生される。バベシア核酸分子は、例えば、化学合成、バベシアからのダイレクトクローニングによって、又は核酸増幅によって入手することができる。
【００４５】
本方法における使用に適した構築体には、典型的には、バベシア核酸分子（例、配列番号１〜配列番号５の１以上の配列を含有する核酸分子）に加えて、所望される構築体及び／又は形質転換体を選択するための選択可能マーカー（例、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、及び複製起点が含まれる。ベクター系の選択は、通常、限定されないが、宿主細胞の選択、複製効率、選択可能性、誘導可能性、及び回収の容易さが含まれる、いくつかの因子に依存する。
【００４６】
バベシア核酸分子を含有する構築体は、宿主細胞において増殖させることができる。本明細書において使用されるように、宿主細胞という用語は、酵母細胞、植物細胞、及び動物細胞のような原核生物と真核生物が含まれることを意味する。原核宿主には、E. coli（大腸菌）、Salmonella typhimurium（チフス菌）、Serratia marcescens（セラチア菌）、Bacillus subtilis（枯草菌）が含まれ得る。真核宿主には、S. cerevisiae（出芽酵母）、S. pombe（分裂酵母）、Pichia pastoris（ピキア酵母）のような酵母、ＣＯＳ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞、、昆虫細胞、及び Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）及びNicotiana tabacum（タバコ）のような植物細胞が含まれる。当該技術分野の当業者によく知られた技術のいずれかを使用して、構築体を宿主細胞の中へ導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、及びウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞の中へ導入するための一般的な方法である。加えて、裸のＤＮＡを細胞へ直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号、及び５，５８９，４６６号を参照のこと）。
【００４７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、４，６８３，１９５号、４，８００，１５９号、及び４，９６５、１８８号は、慣用のＰＣＲ技術を開示する。ＰＣＲは、典型的には、選択される核酸鋳型（例、ＤＮＡ又はＲＮＡ）へ結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。いくつかの態様において有用なプライマーには、記載のバベシア核酸配列（例、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５）内部の核酸合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは、制限酵素消化物より慣用の方法によって精製し得るか、又はそれは合成的に生成することができる。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、プライマーは、二本鎖でもあり得る。二本鎖プライマーは、初めに変性させる、即ち、鎖を分離するように処理する。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱による。
【００４８】
鋳型核酸が二本鎖であれば、それをＰＣＲにおける鋳型として使用し得る前に、２つの鎖へ分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的な手段が含まれるどの好適な変性法によっても達成することができる。核酸鎖を分離させる１つの方法は、核酸が優勢的に変性される（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％以上変性される）までそれを加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度と変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依拠するものであるが、典型的には、温度や核酸長さのような反応の特徴に依拠する時間の間で約９０℃〜約１０５℃に及ぶ。変性は、典型的には、約３０秒〜４分（例、１分〜２分３０秒、又は１．５分）の間実施される。
【００４９】
二本鎖鋳型核酸が加熱によって変性されたなら、この反応混合物を各プライマーのその標的配列へのアニーリングを促進する温度までそのまま冷やす。アニーリングのための温度は、通常、約３５℃〜約６５℃（例、約４０℃〜約６０℃；約４５℃〜約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒〜約１分（例、約２０秒〜約５０秒；約３０秒〜約４０秒）であり得る。次いで、この反応混合物を、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度（即ち、アニールされたプライマーより延長が起きて、鋳型核酸へ相補的な産物を生成するのに十分な温度）へ調整する。この温度は、核酸鋳型へアニールした各プライマーからの延長産物を合成するのに十分であるべきだが、その相補的な鋳型からの延長産物を変性させるほどに高くあってはならない（例えば、延長用の温度は、一般に、約４０℃〜約８０℃（例、約５０℃〜約７０℃；約６０℃）に及ぶ）。延長時間は、約１０秒〜約５分（例、約３０秒〜約４分；約１分〜約３分；約１分３０秒〜約２分）であり得る。
【００５０】
レトロウイルス又はＲＮＡウイルスのゲノムは、リボ核酸、即ち、ＲＮＡから構成される。そのような場合、鋳型核酸のＲＮＡは、初めに、酵素（逆転写酵素）の作用により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ転写されなければならない。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型とそのＲＮＡの３’端へ相補的なショートプライマーを使用して、第一鎖ｃＤＮＡの合成を指令して、次いでこれをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として直接使用することができる。
【００５１】
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のようなバベシア核酸を利用することができる。鋳型核酸は、精製されるに及ばない；それは、ヒト細胞中に含まれるバベシア核酸のような、複雑な混合物の小画分であってよい。バベシア核酸分子は、「Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications（診断の分子微生物学：原理と応用）」（Persing et al.（監修）、1993, American Societyf or Microbiology（米国微生物学会）、ワシントン Ｄ．Ｃ．）に記載されるような定型的な技術によって生体試料より抽出してよい。核酸は、プラスミド、又は細菌、酵母、ウイルス、細胞内小器官、又は植物若しくは動物のような高等生物が含まれる天然の供給源といった、いくつもの供給源より入手することができる。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプライマー（例、配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号５）は、プライマー延長を誘発する反応条件の下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖延長反応物には、概して、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５〜１．０μｇの変性鋳型ＤＮＡ、５０ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、及び１０％  ＤＭＳＯが含まれる。この反応物は、通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、又はこれらの１以上の類似体のそれぞれを１５０〜３２０μＭ含有する。
【００５３】
新たに合成された鎖は、二本鎖分子を形成して、これを後続の反応工程に使用することができる。この鎖分離、アニーリング、及び延長の工程は、標的バベシア核酸分子に対応する増幅産物の所望量を産生するのに必要とされるだけ頻繁に繰り返すことができる。この反応における制限因子は、反応物中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。このサイクリング工程（即ち、変性、アニーリング、及び延長）は、好ましくは、少なくとも１回繰り返す。検出における使用のために、サイクリング工程の回数は、例えば、試料の性質に依存するものである。試料が核酸の複雑な混合物であれば、検出に十分な標的配列を増幅するには、より多くのサイクリング工程が求められよう。一般に、このサイクリング工程は、少なくとも約２０回繰り返されるが、４０回、６０回、又は１００回でも繰り返してよい。
【００５４】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、５，５６５，３２２号、５，８４９，４８９号、及び６，１６２，６０３号を参照のこと）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いにある一定距離内に位置しているときには、この２つの蛍光部分の間でエネルギーの移動が生じて、それを可視化又は他のやり方で検出及び／又は定量することが可能であるという概念に基づいている。ドナーは、典型的には、好適な波長での光放射によって励起される場合に、エネルギーをアクセプターへ移動させる。アクセプターは、典型的には、この移動したエネルギーを異なる波長での光放射の形態で再放射する。ある系では、実質的に非蛍光のドナー部分が含まれる生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分の間で非蛍光エネルギーを移動させることができる（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照のこと）。
【００５５】
１つの例では、オリゴヌクレオチドプローブがドナー蛍光部分又は色素（例、ＨＥＸ又はＦＡＭ）と、対応するクエンチャー（例、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ（ＢＨＱ）（ＢＨＱ−２のような））（これは、蛍光性であってもなくてもよくて、移動したエネルギーを光以外の形態で放散する）を含有することができる。このプローブがインタクトであるとき、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光放射がアクセプター部分によってクエンチされるような、ドナー部分とアクセプター部分の間でのエネルギー移動が生じる。ポリメラーゼ連鎖反応の延長工程の間に、増幅産物へ結合したプローブは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって切断されるので、ドナー蛍光部分の蛍光放射は、もはやクエンチされない。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、５，９９４，０５６号、及び６，１７１，７８５号には、この目的のための例示プローブが記載されている。通常使用されるドナー−アクセプター対には、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が含まれる。通常使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬとＴＡＭＲＡである。通常使用されるダーククエンチャーには、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ（ＢＨＱ）（ＢＨＱ−２のような）（Biosearch Technologies 社、カリフォルニア州ノバト）、Ｉｏｗａ  ＢｌａｃｋＴＭ（Integrated DNA Tech.社、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙＴＭＱｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Berry & Assoc.，ミシガン州デクスター）が含まれる。
【００５６】
別の例では、蛍光部分をそれぞれ含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブを、オリゴヌクレオチドプローブのバベシア標的核酸配列に対する相補性によって決定される特別な位置で増幅産物へハイブリダイズさせることができる。このオリゴヌクレオチドプローブが増幅産物の核酸へ適正な位置でハイブリダイズするとすぐに、ＦＲＥＴシグナルが産生される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒〜約１分の間に約３５℃〜約６５℃に及ぶことが可能である。
【００５７】
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（蛍光放射を特別な範囲でモニターするのに適したダイクロイックミラー及びフィルターを含有する）、光子計数光電子倍増管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始させるか又はフルオロフォアの直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、又は所望範囲での励起のために適正に濾波された他の高強度光源を用いて行うことができる。
【００５８】
ドナー部分及び対応するアクセプター部分に関して本明細書において使用されるように、「対応する」は、アクセプター蛍光部分、又はドナー蛍光部分の発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するダーククエンチャーを意味する。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの極大波長は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの極大波長より少なくとも１００ｎｍ大きくあるべきである。従って、効率的な非放射性エネルギー移動が両者の間で産生され得る。
【００５９】
蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率のフェルスター（Foerster）エネルギー移動；（ｂ）大きな最終ストークス（Stokes）シフト（＞１００ｎｍ）；（ｃ）可能な限り遠い可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって産生されるラマン（Raman）水蛍光放射より高い波長への発光のシフトについて選択される。例えば、その極大励起をレーザ線（例えば、ヘリウム−カドミウム：４４２ｎｍ又はアルゴン：４８８ｎｍ）付近に有し、高い消散計数、高い量子収量、及びその蛍光放射の対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重なりを有するドナー蛍光部分を選択することができる。高い消散計数、高い量子収量、その励起のドナー蛍光部分の発光との良好な重なり、及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）における発光を有する、対応するアクセプター蛍光部分を選択することができる。
【００６０】
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分とともに使用し得る代表的なドナー蛍光部分には、フルオレセイン、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体が含まれる。代表的なアクセプター蛍光部分には、使用されるドナー蛍光部分に依存して、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン（Lissamine）ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタン系イオン（例、ユウロピウム、又はテルビウム）の他のキレートが含まれる。ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分は、例えば、Molecular Probe（オレゴン州ジャンクションシティ）又はシグマ・ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）より入手することができる。
【００６１】
ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分は、リンカーアームを介して適正なプローブオリゴヌクレオチドへ付けることができる。各リンカーアームの長さは、リンカーアームがドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間の距離に影響を及ぼすので、重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Ａ）での距離であり得る。一般に、リンカーアームは、約１０Ａ〜約２５Ａである。リンカーアームは、ＷＯ８４／０３２８５に記載されるようなものであってよい。ＷＯ８４／０３２８５は、リンカーアームを特別なヌクレオチド塩基へ付けるための方法と、また蛍光部分をリンカーアームへ付けるための方法も開示する。
【００６２】
ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０のようなアクセプター蛍光部分を、アミノリンカーを含有するオリゴヌクレオチド（例えば、ABI（カリフォルニア州フォスターシティ）又は Glen Research（バージニア州スターリング）より入手可能なＣ６−アミノホスホロアミダイト）と組み合わせて、例えば、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０−標識化オリゴヌクレオチドを産生することができる。フルオレセインのようなドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドへ結合させるのにしばしば使用されるリンカーには、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣから誘導されるもの、例えば、Glen Research 又は ChemGene（マサチューセッツ州アシュランド）製のフルオレセイン−ＣＰＧ群）、アミドリンカー（BioGenex（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ−フルオレセイン−ＣＰＧのように、フルオレセイン−ＮＨＳ−エステルから誘導されるもの）、又は３’−アミノ−ＣＰＧ群（オリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳ−エステルのカップリングが必要とされる）が含まれる。
【００６３】
バベシア増幅産物（アンプリコン）の検出
本開示は、生体又は非生体試料中のバベシアの存在又は非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法では、試料の異物混入（contamination）、偽陰性、及び偽陽性の問題が回避される。この方法には、１以上のバベシアプライマー対を使用して、試料由来のバベシア標的核酸分子の一部を増幅する工程が含まれる、少なくとも１回のサイクリング工程とＦＲＥＴ検出工程を実施することが含まれる。好ましくはサーモサイクラー（thermocycler）において、複数回のサイクリング工程を実施する。バベシアのプライマー及びプローブを使用してバベシアの存在を検出する種々の方法を実施することができて、バベシアの検出は、試料中のバベシアの存在を示唆する。
【００６４】
本明細書に記載のように、ＦＲＥＴ技術を利用する標識化ハイブリダイゼーションプローブを使用して、増幅産物を検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットでは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用して、増幅産物の存在又は非存在を、ひいてはバベシアの存在又は非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術では、例えば、１つの蛍光部分又は色素（例、ＨＥＸ又はＦＡＭ）と１つのクエンチャー（例、ＢＨＱ−２）（これは、蛍光性であってもなくてもよい）で標識された１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第一蛍光部分が好適な波長の光で励起されるとき、吸収エネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って、第二蛍光部分又はダーククエンチャーへ移される。一般に、第二部分は、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間に、標識化ハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（即ち、増幅産物）へ結合して、後続の延長相の間に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって分解される。結果として、蛍光部分とクエンチャー部分は、互いから空間的に分離するようになる。帰結として、クエンチャーの非存在時の第一蛍光部分の励起があればすぐに、第一蛍光部分からの蛍光放射を検出することが可能になる。例を挙げると、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  配列検出システム（Applied Biosystems）ではＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用して、試料中のバベシアの存在又は非存在を検出するために本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
【００６５】
分子ビーコンをＦＲＥＴと一緒に使用して、リアルタイムＰＣＲ方法を使用して増幅産物の存在を検出することができる。分子ビーコン技術では、第一蛍光部分と第二蛍光部分で標識したハイブリダイゼーションプローブを使用する。第二蛍光部分は、一般に、クエンチャーであって、蛍光標識は、典型的には、このプローブの各端に位置する。分子ビーコン技術では、二次構造（例、ヘアピン）形成を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。このプローブ内部での二次構造形成の結果として、このプローブが溶液状態にあるとき、両方の蛍光部分は、空間的に近接した状態になる。標的核酸（即ち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、このプローブの二次構造は破壊されて、蛍光部分が互いから分離するようになるので、好適な波長の光での励起後に、第一蛍光部分の放射を検出することができる。
【００６６】
ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式では、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。それぞれのプローブを異なる蛍光部分で標識することができて、一般的には、標的ＤＮＡ分子（例、増幅産物）において互いにごく近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えば、フルオレセインをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起する。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ  ６４０（ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ  ７０５（ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５）のようなアクセプター蛍光部分へ移動させる。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長波長の光を放射して、これがＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴが起こり得るのは、蛍光部分が直接的な局所近接状態にある場合と、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なる場合だけである。発光シグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例、バベシアゲノムの数）と相関させることができる。バベシア標的核酸の増幅が起きて増幅産物が産生されるならば、ハイブリダイズさせる工程は、プローブ対の成員間のＦＲＥＴに基づいた検出可能シグナルをもたらす。
【００６７】
一般に、ＦＲＥＴの存在は、試料中のバベシアの存在を示唆して、ＦＲＥＴの非存在は、試料中のバベシアの非存在を示唆する。しかしながら、不十分な標本採取、輸送の遅れ、不適正な輸送条件、又はある種の採取スワブ（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用は、いずれも検査結果の成功及び／又は正確性に影響を及ぼす可能性がある条件である。
【００６８】
本方法を実践する場合に使用し得る代表的な生体試料には、限定されないが、全血、呼吸器標本、尿、糞便標本、血液標本、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、及び軟組織感染物が含まれる。当業者には、生体試料の採取法と保存法が知られている。生体試料は、バベシア核酸を放出するように処理することができる（例えば、当該技術分野で知られた核酸抽出法及び／又はキットによって）、又はある事例では、生体試料をＰＣＲ反応成分と適正なオリゴヌクレオチドに直接接触させることができる。いくつかの事例において、生体試料は、全血である。典型的には、全血が採取される場合、それは、全血が好適な温度で保存されることを可能にする、ヘパリン、クエン酸塩、又はＥＤＴＡのような抗凝固薬を含有する容器においてしばしば採取される。しかしながら、そのような条件下で、全血内の核酸は、かなりの量の分解を受けるものである。故に、核酸が含まれる全血成分を溶解し、変性させ、及び安定化する、核酸安定化溶液のような試薬中に血液を採取することが有利であり得る。このような場合、核酸は、ＰＣＲのような核酸検査によるような、後続の単離及び分析のためによりよく保存されて安定化することができる。当該技術分野では、このような核酸安定化溶液がよく知られていて、限定されないが、コバス（cobas）ＰＣＲメディア（これは、４．２Ｍのグアニジニウム塩（ＧｕＨＣｌ）と５０ｍＭ  ＴｒｉｓをｐＨ７．５で含有する）が含まれる。
【００６９】
試料は、分析に先立って試料を十分に保持及び保存するように設計されたどの方法又は装置（device）によっても採取することができる。当該技術分野では、そのような方法及び装置がよく知られている。試料が全血のような生体試料である場合、この方法又は装置には、採血容器が含まれ得る。当該技術分野では、このような採血容器がよく知られていて、例えば、採血管が含まれ得る。多くの事例では、バキュテイナー（vacutainer）採血管のような、真空チャンバ付き血液容器のように、採血容器が試料取込み用に企図された空間において圧力下にある場合は、採血管を使用することが有利であり得る。当該技術分野では、バキュテイナー採血管のような、そのような真空チャンバ付きの採血管がよく知られている。さらに、核酸が含まれる全血成分を溶解し、変性させ、及び安定化する、核酸安定化溶液のような溶液をその内側に含有する、真空チャンバ有り無しの採血容器に血液を採取して、吸引されている全血が採血容器中の核酸安定化溶液と即座に接触するようにすることが有利であり得る。
【００７０】
融解曲線分析は、サイクリングプロフィールに含め得る追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二重鎖の半分が一本鎖へ分離したときの温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づく。ＤＮＡの融解温度は、そのヌクレオチド組成に主に依存する。従って、Ｇ及びＣのヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、豊富なＡ及びＴのヌクレオチドを有するものより高いＴｍを有する。プローブの融解温度は、シグナルが消失する温度を検出することによって決定することができる。同様に、プローブのアニーリング温度は、シグナルが発生するときの温度を検出することによって決定することができる。バベシア増幅産物由来のバベシアプローブの融解温度（複数）によって、試料中のバベシアの存在又は非存在を確認することができる。
【００７１】
それぞれのサーモサイクラー試行内で、対照試料も同様に循環させることが可能である。陽性対照試料は、例えば対照プライマーと対照プローブを使用して、（標的遺伝子の記載の増幅産物以外の）標的核酸の対照鋳型を増幅することができる。陽性対照試料はまた、例えば、標的核酸分子（例、配列番号８）を含有するプラスミド構築体を増幅することができる。このようなプラスミド対照は、企図される標的の検出に使用されるのと同じプライマー及びプローブを使用して、内部で（例えば、試料内で）も、患者の試料と並行した別の試料試行においても増幅することができる。このような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標となる。それぞれのサーモサイクラー試行には、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠いた陰性対照も含めることができる。陰性対照では、異物混入を測定することができる。このことは、当該システム及び試薬が偽陽性シグナルを決して生じないことを保証する。故に、対照反応により、例えば、配列特異的にアニールして延長を開始させるプライマーの能力、並びに配列特異的にハイブリダイズしてＦＲＥＴを生じさせるプローブの能力を容易に判定することができる。
【００７２】
ある態様において、該方法には、異物混入を回避するための工程が含まれる。例えば、米国特許第５，０３５，９９６号、５，６８３，８９６号、及び５，９４５，３１３号には、１回のサーモサイクラー試行と次の試行の間で異物混入を抑制するか又は消失させるためにウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素法が記載されている。
【００７３】
ＦＲＥＴ技術と一体化した慣用のＰＣＲ法を使用して、本方法を実践することができる。１つの態様では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器を使用する。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術において使用されるようなリアルタイムＰＣＲについて記載する：ＷＯ９７／４６７０７、ＷＯ９７／４６７１４、及びＷＯ９７／４６７１２。
【００７４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して操作し得て、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。この機械では、ＰＣＲキャピラリーが光ユニット全体で連続的に配置されるので、試料由来のシグナルが得られる。このソフトウェアは、蛍光シグナルをそれぞれの測定後すぐにリアルタイムで表示することができる。蛍光獲得時間は、１０〜１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後で、「蛍光」対「サイクル数」の定量的ディスプレイをすべての試料について連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる解析のために保存することができる。
【００７５】
ＦＲＥＴに代わる手段として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Molecular Probe））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用して、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用時に、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、好適な波長の光での励起後に、蛍光シグナルを放射する。核酸挿入色素のような二本鎖ＤＮＡ結合色素も使用することができる。二本鎖ＤＮＡ結合色素が使用される場合、通常は、増幅産物の存在の確認のために融解曲線分析を実施する。
【００７６】
当業者は、他の核酸若しくはシグナル増幅法も利用し得ることを理解されよう。このような方法の例には、限定無しに、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又はスマート（smart）増幅法バージョン２（ＳＭＡＰ２）が含まれる。
【００７７】
本開示の態様は、１以上の市販機器の配置によって制限されないと理解される。
製品（Articles of Manufacture）／キット
本開示の態様は、バベシアを検出するための製品又はキットをさらに提供する。製品には、バベシア遺伝子標的を検出するために使用されるプライマー及びプローブが好適な包装材料と一緒に含まれ得る。バベシアの検出用の代表的なプライマー及びプローブは、バベシア標的核酸分子へハイブリダイズすることが可能である。加えて、このキットには、固体支持体、緩衝液、酵素、及びＤＮＡ標準品のような、ＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーション、及び検出に必要とされる好適に包装された試薬及び材料が含まれる場合もある。プライマーとプローブを設計する方法については本明細書に開示されて、バベシア標的核酸分子を増幅してそれへハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表例が提供されている。
【００７８】
製品には、プローブを標識するための１以上の蛍光部分も含まれ得るか、あるいはまた、キットともに供給されるプローブは、標識化することができる。例えば、製品には、バベシアプローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分も含めてよい。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例が上記に提供されている。
【００７９】
製品はまた、バベシアのプライマー及びプローブを使用して試料中のバベシアを検出するための説明書きがその上にある添付文書又は能書を含有することができる。製品には、本明細書に開示される方法を行うための試薬（例、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は異物混入を防ぐための薬剤）を追加的に含めてよい。このような試薬は、本明細書に記載される市販機器の１つに専用であってよい。
【００８０】
本開示の態様はまた、試料中のバベシアの検出用のプライマーのセットと１以上の検出可能プローブを提供する。
本開示の態様について、以下の実施例においてさらに記載するが、それは、特許請求項において記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例と図面は、主題の理解を助けるために提供されるのであって、その真の範囲は、付帯の特許請求項に説明されている。説明される手順において、本発明の精神より逸脱することなく、種々の修飾をなし得ると理解される。
【００８２】
この検査では、完全に自動化された試料調製（核酸の抽出及び精製）にＰＣＲ増幅及び検出が続いた。使用したシステムは、試料供給モジュール、移動モジュール、処理モジュール、及び分析モジュールからなる、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムであった。
【００８３】
標的核酸の選択的増幅は、標的核酸の高度保存領域より選択される特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーの使用によって達成した。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を逆転写と増幅のいずれにも使用した。マスターミックスには、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の代わりにデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）が含まれて、これが新たに合成されるＤＮＡ（増幅産物又はアンプリコン）の中へ組み込まれる。先のＰＣＲ試行由来のどの混入アンプリコンも、最初の熱サイクリング工程において加熱されるときに、ＰＣＲミックスに含まれるＡｍｐＥｒａｓｅ酵素（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）によって破壊された。しかしながら、一度５５℃を超える温度まで曝露されるとＡｍｐＥｒａｓｅ酵素が不活性化するので、新たに生成されるアンプリコンは、破壊されなかった。
【００８４】
ｃｏｂａｓ（登録商標）バベシアマスターミックスは、バベシア核酸と対照核酸に特異的である検出プローブを含有した。特異的なバベシア検出プローブと対照検出プローブを、レポーターとして作用する２つのユニークな蛍光色素の１つでそれぞれ標識した。それぞれのプローブは、クエンチャーとして作用する第二の色素も有した。このレポーター色素を一定の波長で測定し、それによって増幅されたバベシア標的と対照の検出と識別を可能にする。インタクトなプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制された。ＰＣＲ増幅工程の間、このプローブの特異的な一本鎖ＤＮＡ鋳型へのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性による切断をもたらして、レポーター色素とクエンチャー色素の分離と、蛍光シグナルの産生をもたらした。各ＰＣＲサイクルに伴って増加する量の切断プローブが産生されて、レポーター色素の累積シグナルが同時に増加した。この２つの特異的なレポーター色素は、一定の波長で測定されるので、増幅されたバベシア標的と対照の同時検出及び識別が可能であった。
【００８５】
バベシア検査用のプライマーとプローブは、アライメントに基づいて最も保存されている領域中のゲノムに従ってプライマーとプローブを選別すること（seeding）によって設計した。次いで、このプライマーとプローブをアッセイへ組み合わせて、このアッセイをコンピュータによる（in-silico）評価の包括性及び排他性に基づいてスコア化した。このアッセイのスコア化には、ゲノム保存性に加えて、ゲノムカバレッジ（これは、どんな配列が公的に利用可能であるかにきわめて依存する）も含めた。バベシアゲノムの標的とした領域は、バベシア属種の B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の１８Ｓ遺伝子であった。B. microti を検出するために、オリゴヌクレオチドの１セット（配列番号１〜配列番号３）（本明細書では「３９５」としばしば言及される）を設計して、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するには、別のオリゴヌクレオチドのセット（配列番号４〜配列番号７）を設計した。B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するように設計されたオリゴヌクレオチドのセットには、以下のような２種の異なるオリゴヌクレオチドのセットが含まれた：（１）配列番号４〜配列番号６のオリゴヌクレオチドが含まれる第一セット（本明細書では、「ＤＤＶＲ」としばしば言及される）；及び（２）配列番号４〜配列番号７のオリゴヌクレオチドが含まれる第二セット（本明細書では「ＤＤＶＲ２」としばしば言及される）。
【００８６】
実施例１：リアルタイムＰＣＲによる B.microti の増幅及び検出
B.microti を増幅して検出するために設計されたオリゴヌクレオチドセット（フォワードプライマー：配列番号１、リバースプライマー：配列番号３、及びプローブ：配列番号２）を使用して、そしてｐＥＦ１１３（ｐＵＣ１９中の B. microti 菌株 Gray）（図面１）又は B.microti ゲノムＤＮＡ（図面２）のいずれかを使用して、バベシア  １８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子についての B.microti 核酸検査を試験した。使用した試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ジェネリックＰＣＲマスターミックス（ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００での使用のためのプロフィール及び条件付き）が含まれて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用した。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、プライマーが０．３μＭで、プローブが０．１μＭであった。利用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００  ＰＣＲプロフィールを下記の表２に示す：
【００８７】
【表２】
0006911190.tif 000003
【００８８】
これらの試験は、上記条件の下で、オリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号３）が B.microti を増幅して検出することが可能であったことを示す（図面１と図面２を参照のこと）。
【００８９】
このシステムにおける検出下限について評価するために、エンドポイント希釈系列分析も実施した。ｄｄＰＣＲを使用して、B. microti ｐＵＣ１９プラスミド（ｐＥＦ１１３）を定量し、希釈して、検査した。このエンドポイント希釈分析の結果を下記の表３に示す。
【００９０】
【表３】
0006911190.tif 000004
【００９１】
検出限界は、９５％の信頼度でＰＣＲにつき３．３２コピーのプラスミドＤＮＡであると決定された。
このように、上記の結果は、このプライマーとプローブ（配列番号１〜配列番号３）がリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて B.microti を効率的に増幅してその存在を特異的に検出することを実証する。
【００９２】
実施例２：リアルタイムＰＣＲによる B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅及び検出
B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を増幅して検出するために設計されたオリゴヌクレオチドセット（フォワードプライマー：配列番号４、リバースプライマー：配列番号６、及びプローブ：配列番号５）を使用して、そしてプラスミドのｐＥＦ１１４（B. divergens）、ｐＥＦ１１５（B. duncani）、及びｐＥＦ１１６（B. venatorum）、又は B. duncani（ＡＴＣＣ  ＰＲＡ３０２）由来の全核酸を使用して、バベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子についての B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum（本明細書では「ＤＤＶ」としばしば言及される）核酸検査を試験した（図面３）。使用した試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ジェネリックＰＣＲマスターミックス（ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００での使用のためのプロフィール及び条件付き）が含まれて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用した。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、プライマーが０．３μＭで、プローブが０．１μＭであった。利用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００  ＰＣＲプロフィールを上記の表２に示す。これらの試験は、上記条件の下で、オリゴヌクレオチド（配列番号４〜配列番号６）が B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を増幅して検出することが可能であったことを示す（図面３を参照のこと）。
【００９３】
このように、上記の結果は、このプライマーとプローブ（配列番号４〜配列番号６）がリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を効率的に増幅してその存在を特異的に検出することを実証する。
【００９４】
実施例３：リアルタイムＰＣＲによる B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のマルチプレックス増幅及び検出
B. microti の増幅及び検出のアッセイ（配列番号１〜配列番号３；実施例１；及び図面１〜図面２）と、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅及び検出のアッセイ（「ＤＤＶ」、配列番号４〜配列番号６；実施例２；及び図面３）が良好な性能をシングルプレックス（singleplex）において示したので、このアッセイをシングルプレックス試験について記載したのと同じ条件の下で、マルチプレックス設定において試験した。
【００９５】
図面４は、予測されるように、B.microti 標的がマルチプレックス設定において配列番号１〜配列番号３によって強く増幅されて検出されて、ＤＤＶオリゴヌクレオチド（即ち、配列番号４〜配列番号６）によっては弱く増幅されて検出されることを示す。同様に、図面４はまた、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum が配列番号１〜配列番号３によっては増幅も検出もされないが、ＤＤＶオリゴヌクレオチド（即ち、配列番号４〜配列番号６）によっては強く増幅されて検出されることを示す。
【００９６】
実施例４：プローブのフルオロフォアとクエンチャー間の間隔の最適化
B. microti プローブ（即ち、配列番号２）について、そのフルオロフォアとクエンチャー間の異なる間隔で評価して、最適な間隔を決定した（図面５を参照のこと）。このアッセイは、実施例１〜実施例３において先に記載したのと同じ条件の下で試験した。このプローブは、フルオロフォアとクエンチャーの間が７塩基と１０塩基の間隔で有効であったが、１０塩基間隔のプローブは、同等のエンドポイントＲＦＩとより優れた包括性を明示した（図面５と図面６を参照のこと）。
【００９７】
このように、このバベシアプローブは、７塩基〜１０塩基の間が含まれる、フルオロフォアとクエンチャー間の広範囲の間隔内で効率的かつ特異的である。
実施例５：プローブ色素の最適化
B. microti プローブ（即ち、配列番号２）について、異なる蛍光部分又は蛍光色素である、ＦＡＭとＨＥＸを用いて評価した。実施例１〜実施例４において先に記載したのと同じ条件の下でこのアッセイを試験した。このプローブは、ＦＡＭ又はＨＥＸの蛍光部分／色素のいずれでも有効であったが、ＨＥＸ標識プローブは、より低いベースラインを明示して、大きく増加したシグナルをもたらした（図面７を参照のこと）。
【００９８】
このように、このバベシアプローブは、ＦＡＭとＨＥＸが含まれる、いくつかの異なる種類の蛍光部分／色素で効率的かつ特異的である。
実施例６：ポストＰＣＲ分析
B. microti を検出するオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号３）を用いてポストＰＣＲ分析を実施した。このポストＰＣＲ分析を実施したのは、オリゴヌクレオチドの除去（depletion）とプローブの効率的な切断によって裏付けられるような、効率的な増幅を保証するためである。図面８に見ることができるように、B.microti オリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号３）は、オリゴヌクレオチドの除去とプローブ切断を明示する。
【００９９】
このように、このバベシアオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの除去とプローブの効率的な切断によって裏付けられるように、効率的な増幅を保証する。
実施例７：全血でのリアルタイムＰＣＲによる B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のマルチプレックス増幅及び検出
B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅及び検出用のオリゴヌクレオチドについて全血で試験した。簡潔に言えば、バベシア培養物をコバスＰＣＭ培地（ＣＰＭ）において溶解させることによって、二次標準を作製した。コバスＰＣＲメディアは、核酸が含まれる全血成分を溶解し、変性させて、安定化する分析前試薬である。コバスＰＣＲメディアは、グアニジニウム塩（ここでは、４．２ＭのＧｕＨＣｌ）とＴｒｉｓ（ここでは、５０ｍＭ）をｐＨ７．５で含有する。４種の異なるバベシア属種（B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum）についての４種の別々の標準品をこのやり方で産生した。この二次標準をコバスＰＣＲメディアにおいて中間レベルまで希釈してから、全血：コバスＰＣＲメディア混合物の中へ添加した（spiked）。この全血：コバスＰＣＲメディア混合物は、１分量の全血と７分量のコバスＰＣＲメディアである。各標準品の最終濃度は、下記の表４に示す通りであった。
【０１００】
【表４】
0006911190.tif 000005
【０１０１】
この標準品添加全血を、先に（実施例１〜実施例６）記載したような条件下で、B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅及び検出用のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号３と配列番号４〜配列番号６）へ処した。結果を図面９〜図面１１に示す。図面９は、B. microti を検出するための配列番号１〜配列番号３のオリゴヌクレオチドセットを、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するための配列番号４〜配列番号６のオリゴヌクレオチドセットと（マルチプレックス設定において）組み合わせると、全血中の B. microti を特異的かつ効率的に増幅して検出することが可能であったことを明らかにする。図面１０〜図面１１は、B. microti を検出するための配列番号１〜配列番号３のオリゴヌクレオチドセットを、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するための配列番号４〜配列番号６のオリゴヌクレオチドセットと（マルチプレックス設定において）組み合わせると、全血中の B. divergens（図面１０Ａと図面１１）、B. duncani（図面１０Ｂと図面１１）、及び B. venatorum（図面１０Ｃと図面１１）を特異的かつ効率的に増幅して検出することが可能であったことを明らかにする。従って、これらの結果は、配列番号１〜配列番号６のオリゴヌクレオチドセットが全血中の B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を特異的かつ効率的に増幅して検出することを実証する。これらの結果はまた、コバスＰＣＲメディアが、核酸が含まれる全血成分を溶解し、変性させて、安定化することを実証する。
【０１０２】
実施例８：B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のリバースプライマー対を用いた、全血でのリアルタイムＰＣＲによる B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のマルチプレックス増幅及び検出
さらなる試験を実施して、上記の実施例７におけるように、全血でのリアルタイムＰＣＲによる B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum のマルチプレックス増幅及び検出を実証したが、本実施例では、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅及び検出にリバースプライマーの対を使用した。即ち、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum の増幅及び検出用の新たなオリゴヌクレオチドセットについて試験したのである。特に、新しいリバースプライマー（配列番号７）をリバースプライマー（配列番号６）と協奏的に使用した。次いで、この２種の異なるリバースプライマー（配列番号６と配列番号７）を、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を増幅して検出するために設計された、フォワードプライマー（配列番号４）とプローブ（配列番号５）と組み合わせて使用した。次いで、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するために設計された配列番号４〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセットを、B. microti を検出するために設計された配列番号１〜配列番号３のオリゴヌクレオチドセットと組み合わせて、この組み合わされた配列番号１〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセットが全血中の B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を増幅して検出することが可能であるかを検討した。この条件は、先に記載した先の全血試験について記載したものと同一であった。各標準品の最終濃度は、下記の表５に示す通りであった。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
結果を図面１２〜図面１４に示す。図面１２は、B. microti を検出するための配列番号１〜配列番号３のオリゴヌクレオチドセットを、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するための配列番号４〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセットと（マルチプレックス設定において）組み合わせると、全血中の B. microti を特異的かつ効率的に増幅して検出することが可能であったことを明らかにする。図面１３〜図面１４は、B. microti を検出するための配列番号１〜配列番号３のオリゴヌクレオチドセットを、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出するための配列番号４〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセットと（マルチプレックス設定において）組み合わせると、全血中の B. divergens（図面１３Ａと図面１４）、B. duncani（図面１３Ｂと図面１４）、及び B. venatorum（図面１３Ｃと図面１４）を特異的かつ効率的に増幅して検出することが可能であったことを明らかにする。
【０１０５】
次いで、上記の実験を再現して、オリゴヌクレオチドセット：配列番号１〜配列番号６をオリゴヌクレオチドセット：配列番号１〜配列番号７に対して、全血中の B. microti（データ示さず）、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を検出して増幅するそれらの能力において比較した。これらの結果を図面１５に示す。配列番号１〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセットでは、２つのリバースプライマー（配列番号６と配列番号７）を等しい量で利用した。図面１５は、配列番号１〜配列番号６のオリゴヌクレオチドセット（図面１５Ａ）を配列番号１〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセット（図面１５Ｂ）に対して使用した、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum についてのＰＣＲ曲線を示す。特に、B.duncani のＰＣＲ曲線について分析した（図面１６〜図面１７）。これらのデータは、オリゴヌクレオチドセット：配列番号１〜配列番号７（図面１６Ｂ）が配列番号６のオリゴヌクレオチドセット（図面１６Ａ）に比較して、B.duncani の改善された増幅を示したことを明らかにする。即ち、配列番号１〜配列番号６のオリゴヌクレオチドセット（これには、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を増幅するための単一のリバースプライマー：配列番号６が含まれる）が B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を成功裡に増幅して検出することができる一方で、配列番号１〜配列番号７のオリゴヌクレオチドセット（これには、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を増幅するための２つのリバースプライマー：配列番号６と配列番号７が等量で含まれる）とリバースプライマーの対（配列番号６と配列番号７）は、B.duncani の改善された増幅を明示した（図面１７）。
【０１０６】
このように、上記の結果は、配列番号１〜配列番号６のオリゴヌクレオチドセットが全血中の B. microti、B. divergens、B. duncani、及び B. venatorum を特異的かつ効率的に増幅して検出することを実証する。これらの結果はまた、コバスＰＣＲメディアが、核酸が含まれる全血成分を溶解し、変性させて、安定化することを実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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