(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする、豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）由来の非複製抗原および生きている豚生殖器・呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む混合ワクチン。
【請求項２】
１〜９％ｗ／ｖの量でスクワランを含む、請求項１に記載の混合ワクチン。
【請求項３】
１〜１０％ｗ／ｖの量でビタミンＥ−アセテートを含む、請求項１または２に記載の混合ワクチン。
【請求項４】
前記水中油型エマルションがサブミクロンエマルションである、請求項１〜３の何れか１項に記載の混合ワクチン。
【請求項５】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｈｙｏ）由来の非複製抗原も含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の混合ワクチン。
【請求項６】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）（ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ））由来の非複製抗原も含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の混合ワクチン。
【請求項７】
少なくとも２つの容器を含むキットオブパーツ（kit of parts）であって、
１つの容器が、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルション中にＰＣＶ２由来の非複製抗原を含み；
１つの容器が、凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを含む、キットオブパーツ。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載の混合ワクチンの調製方法であって、
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含む水相を調製する工程；および
−スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションと前記水相とを混合する工程
を含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項に記載の混合ワクチンの調製方法であって、
−凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを調製する工程；
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相を調製する工程；
−スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションと前記水相とを混合する工程；および
−水相および油性エマルションの前記混合物を用いて前記凍結乾燥生ＰＲＲＳＶを再構成する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜６の何れか１項に記載の混合ワクチンの調製方法であって、
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相およびスクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションの混合物を調製する工程；および
−前記混合物を用いて凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを再構成する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する豚のワクチン接種での使用のための、スクワランおよびビタミンＥ−アセテート、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含む、水中油型エマルション。
【請求項１２】
豚用混合ワクチンの製造のための、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶの使用であって、
前記ワクチンが、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする、使用。
【請求項１３】
ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する豚のワクチン接種の方法であって、請求項１〜６の何れか１項に記載の混合ワクチンの前記豚への投与による、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医ワクチン学の分野、すなわち豚用混合ワクチンに関する。特に、本発明は、豚サーコウイルス２型由来の非複製抗原、および生きている豚生殖器・呼吸器症候群ウイルスを含む混合ワクチンに関する。また、本発明は、混合ワクチンを統合するキットオブパーツ（kit of parts）、およびその混合ワクチンのための方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、集約的養豚は、動物の健康を維持し、経済的運営を可能にするために獣医学用医薬品に大きく依存している。飼料および農場管理システムの最適化に次いで、ホルモンまたは抗生物質などの医薬品および細菌性またはウイルス性病原体に対するワクチン接種など、様々な処置が定期的に使用される。幼若期から豚に影響を与える最も顕著な疾患の一部は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）などの細菌により、および豚サーコウイルス２型および豚生殖器・呼吸器症候群ウイルスなどのウイルスにより起こる。
【０００３】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｈｙｏ）は、世界中で発生している豚の慢性呼吸器疾患である、（豚）流行性肺炎を引き起こす主な病原体である。特に、幼若仔豚はこの伝染性の強い疾患に対して脆弱である。この細菌は比較的小さく、細胞壁を欠き、モリキュート属に属する。これらの細菌は、宿主細胞上または宿主細胞中で寄生的な生活様式で生きている。
【０００４】
Ｍｈｙｏからの肺疾患は、主に、コンソリデーションがある（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ）肺炎につながる免疫介在性病態である。この細菌は肺線毛上皮に定着して損傷を引き起こし、線毛活動の喪失につながる。飼育施設の状態および環境ストレスに依存して、この疾患の最も厄介な結果は、これが、他の細菌およびウイルス性病原体による豚呼吸器系の様々な二次感染に対する素因になることである。これは、いわゆる、重度の肺病変を呈する、豚呼吸器病症候群（ＰＲＤＣ）を引き起こす。動物にとっての不快感は別にして、流行性肺炎およびＰＲＤＣは、成長率および飼料転換率における性能低下ゆえに、ならびに獣医学的ケアおよび抗生物質使用のためのコストを通じて、養豚業にとって重大な経済的損失を引き起こす。
【０００５】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）（ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ））は、回腸炎としても知られ、世界中でよく見られる離乳後の豚の腸疾患である、増殖性腸炎を引き起こす。特徴的な病変は、回腸の腸陰窩における未成熟腸細胞の増殖であり；これらの細胞は原因細菌を含有する。腸細胞からの細菌の除去は、関連する増殖性病変の消散につながる。組織学的病変は、腸細胞中だけでなく腸のマクロファージ内でも、長さ１．５〜２．５μｍのビブリオイド様細菌の可視化によってローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）陽性と確認され得る。臨床例または無症状症例において、ＰＣＲを介して細菌を検出し得る。臨床例は通常、育成−仕上げ期に存在する。
【０００６】
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）細菌は、１９９５年に最初に記載された（ＭｃＯｒｉｓｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．４５，ｐ．８２０〜８２５）。それらは、デスルホビブリオ科（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）からの偏性細胞内および非運動性グラム陰性桿菌である。
【０００７】
豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、幼若豚で観察される離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に関連付けられる。臨床的徴候および病態は１９９６年に公開され、これには、進行性の衰弱、呼吸困難、頻呼吸および時として黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓおよびｊａｕｎｄｉｃｅ）が含まれる。この新しい病原体は、ＰＫ−１５細胞の天然の汚染物質であった既知のＰＣＶとは異なったため、ＰＣＶ２と呼ばれた。
【０００８】
ＰＣＶ２は、サーコウイルス属の非常に小さい非エンベロープウイルスである。これは２つの主要遺伝子を有する環状１本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。ＯＲＦ２遺伝子は、約２３３個のアミノ酸のウイルスキャプシドタンパク質をコードする。組み換え発現されたＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質は、サブユニットワクチンとして非常に有効であるウイルス様粒子を形成する。
【０００９】
豚生殖器・呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は１９８７年に最初に報告され、１９９０年代初期に大流行した。これは、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）属の小型のエンベロープＲＮＡウイルスであり、１本鎖、プラス鎖の、ＲＮＡゲノムを含有する。このウイルスは、繁殖障害および成長遅滞のために養豚業において重大な損失を引き起こす。Ｍｈｙｏのように、ＰＲＲＳＶは多因子ＰＲＤＣにおいて重要な役割を果たす。臨床症状は、流産および死産またはミイラ変性胎児ならびに耳および外陰部のチアノーゼである。新生豚において、このウイルスは呼吸促迫を引き起こし、（ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）により引き起こされる）グレーサー病などの続発性呼吸器感染症に対する感受性が上昇する。しかし、無症状感染もよくある。このウイルスは、非常に多様で：ヨーロッパ型（１型）および北米型（２型）に次いで、現在は３番目の遺伝子型があり、これは、２０００年に中国で出現し、現在ではアジアにおいて豚に深刻な疾患を引き起こしている、病原性が高い変異型である。
【００１０】
これらの病原体のそれぞれに対して市販のワクチンが存在する：
Ｍｈｙｏに対して、様々な市販のワクチンが存在し、これらは養豚業の業務の大部分で日常的に使用されている。一般に、これらのワクチンは、典型的には非経口注射によって投与される、サブユニットタンパク質および／またはバクテリン（すなわち、死菌、無処理または処理）などの非複製免疫原を含む。いくつかの例は、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（商標）Ｍ．ｈｙｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＭ＋Ｐａｃ（商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）である。
【００１１】
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）に対するワクチンが市販されており、例えば弱毒化生ワクチンであるＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ，ＵＳＡ）およびアジュバント添加バクテリンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ（商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）である。
【００１２】
ＰＣＶ２感染に対するワクチンは、完全不活性化ＰＣＶ２ウイルス、例えば、Ｃｉｒｃｏｖａｃ（商標）（Ｍｅｒｉａｌ）または不活性化キメラＰＣＶ１／ＰＣＶ２ウイルス（Ｓｕｖａｘｙｎ（商標）ＰＣＶ，Ｚｏｅｔｉｓ）に基づき得る。より一般的なものは、例えばバキュロウイルス−昆虫細胞に基づく発現系からの、組み換え発現ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質のサブユニットワクチンである。例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標）ＰＣＶ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）およびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＣｉｒｃｏＦｌｅｘ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）である。
【００１３】
不活性化ウイルスに基づくＰＲＲＳＶに対するワクチンは記載されており、市販されている。しかし、弱毒化生ウイルスに基づくワクチンはより有効であると考えられる。例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標）ＰＲＲＳ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ（商標）ＭＬＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＦｏｓｔｅｒａ（商標）ＰＲＲＳ（Ｚｏｅｔｉｓ）である。
【００１４】
動物へのストレスおよび費用および飼育者に対する労力を制限するために、いくつかの豚ワクチンが混合ワクチンとして調製されてきた。例えば、Ｆｏｓｔｅｒａ（商標）ＰＣＶ  ＭＨ（Ｚｏｅｔｉｓ）およびＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ  Ｍｈｙｏ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）であり、これらはＰＣＶ２およびＭｈｙｏ由来の抗原を組み合わせたものである。
【００１５】
国際公開第２０１３／１５２０８６号（Ｚｏｅｔｉｓ）は、ＰＣＶ２およびＭｈｙｏ由来の抗原を生ＰＲＲＳＶと組み合わせた豚用の三価混合ワクチンを記載しているが、記載のワクチンは市販されていない。その結果として、この分野において、関連する豚の疾患に対する豚用の有効な混合ワクチンについて関心が持たれている。
【００１６】
非複製抗原を含むワクチンの重要な成分はアジュバントである。これは、非複製抗原に対する免疫刺激を提供し、免疫原性ではない。これは免疫系の様々な経路を誘発し、その基本的な機序はよく理解されていない。獣医用ワクチンにおいて、非常に様々な化合物をアジュバントとして使用し得、例えば、鉱物油、例えばＢａｙｏｌ（商標）またはＭａｒｋｏｌ（商標）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）またはパラフィン油など；非鉱物油、例えばスクワレン、スクワランまたは植物油など、例えばオレイン酸エチル；アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム；ペプチド、例えばジメチルグリシンまたはタフトシンなど；細菌細胞壁成分、例えばリピッドＡおよびムラミルジペプチドなど；（合成）ポリマー、例えばプルロニック、デキストラン、カルボマー、ピランまたはサポニンなど；サイトカイン；およびトール様受容体の刺激剤、例えば非メチル化ＣｐＧ基を含有する免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドなどである。
【００１７】
アジュバント添加混合ワクチンの作製で克服するべき主な問題は、免疫反応またはワクチンの安全性もしくは安定性に悪影響を及ぼすであろう様々なワクチン成分間の相互作用を防ぐことである。このような相互作用は、例えば抗原自体の間で起こり得るが、それは、例えば、一部が、ＭｈｙｏおよびＬａｗｓｏｎｉａ（ローソニア）のバクテリンなど、かなり未精製の生成物であるからである。また、アジュバントはワクチン抗原を妨害し得るか、またはそれを損傷することさえあり得る。このような有害な相互作用は、混合物が生きている微生物を含む場合に特に関連性がある。これはまた、販売承認を提供する登録認定機関によっても認められており、例えばＵＳＤＡにより、生ウイルスを含む不活化ワクチン中での殺ウイルス活性の検出に関する規則９ＣＦＲ１１３．３５が施行されている。
【００１８】
複合型混合ワクチンの開発におけるこれらの潜在的な問題は一般に認識されており；例えば、ＥＭＥＡからの刊行物：「Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」（ＥＭＥＡ，２０００，ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７−ＦＩＮＡＬ）；およびＵ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｆｒｏｍ  Ａｐｒｉｌ  １９９７：「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ」，Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．９７Ｎ−００２９からの刊行物を参照のこと。これらの刊行物は両方とも、抗原およびアジュバントを組み合わせるときに、ワクチンの効力および安全性に対する干渉の影響について警告している。
【００１９】
したがって、特に複数種の病原体に関する複雑な組み合わせについて、非複製抗原と複製微生物との組み合わせに対して有効な免疫反応を誘導する混合ワクチンを開発することは困難である。さらに、混合ワクチンは動物での使用時に安全であるべきであり、すなわち、発熱、局所的腫脹、食欲不振などの顕著な副反応を引き起こすべきではない。また、より実用的な特性も関連する：混合ワクチンは理想的には経済的生産が可能であり、処方および保管中に十分に安定であり、他の抗原の存在下で各抗原に対する効力試験方法を可能にするべきである。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、先行技術における１つ以上の欠点を克服すること、およびＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染に関連する疾患に対する豚用の有効かつ安全な混合ワクチンを提供することによって、この分野でのニーズに対処することである。
【００２１】
残念ながら、既存のアジュバント製剤中のＰＣＶ２の非複製抗原および生ＰＲＲＳウイルスとの直接的な組み合わせは成功しなかった。例えば、いくつかの他の豚ワクチンで使用されるアジュバント製剤は、Ｘｓｏｌｖｅ（商標）（以前はＭｉｃｒｏｓｏｌ−Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（商標）と呼ばれていた；ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  ｈｅａｌｔｈ）である。これは、アジュバントの軽油およびビタミンＥ−アセテートと乳化剤Ｔｗｅｅｎ（商標）８０の組み合わせを含有する。これは、例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ（ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原を含む）、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｉｌｅｉｔｉｓ（ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）バクテリンを含む）、およびＣｉｒｃｕｍｖｅｎｔ  ＰＣＶ−Ｍ  Ｇ２（ＰＣＶ２およびＭｈｙｏ抗原を含む）のために使用される。
【００２２】
しかし、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＣＶ２由来の非複製抗原とＸｓｏｌｖｅ中の生ＰＲＲＳＶとの混合ワクチンは、一貫して効果がなかった。これは主に、生ＰＲＲＳＶ成分に対する殺ウイルス効果ゆえである。さらに、Ｘｓｏｌｖｅは、鉱油を含有する他のアジュバントのように、比較的強力なワクチン接種反応を誘発する。これらは十分に許容範囲内であるが、改善が望まれる。
【００２３】
同様に、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）として知られるアジュバント中のこれら４つの抗原の組み合わせもまた、ＰＲＲＳＶにおいて殺ウイルス効果を示した。Ａｍｐｈｉｇｅｎは、アジュバントとして鉱油および乳化剤としてレシチンを含む。
【００２４】
また、アジュバントＥｍｕｎａｄｅ（鉱油＋水酸化アルミニウム）は、生ＰＲＲＳＶに対して殺ウイルス性であった。
【００２５】
国際公開第２０１３／１５２０８６号（「‘０８６」）に記載のアジュバント処方物の１つは、生ＰＲＲＳＶに対して顕著に殺ウイルス性がないとされている：「ＳＰ油」と呼ばれる処方物の１０％希釈液。このアジュバントは、Ｍｅｔａｓｔｉｍ（商標）として市販されている。残念ながら、試験された処方物の正確な組成は開示されていないが、ＳＰ油の好ましい組成範囲は、‘０８６の２４〜２５ページにわたる段落で与えられる。したがって、このＳＰ油をワクチン中１０％希釈で使用することは、試験したワクチンが、０．１〜０．３％ｖ／ｖのＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）、０．３〜０．６％ｖ／ｖのスクワランおよび０．０１〜０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ８０を含んでいたことを意味する。
【００２６】
‘０８６では、多くの他の「適切な」アジュバントも推奨されており（‘０８６、２５ページ、７〜１５行目）、中でもＡｍｐｈｉｇｅｎおよびＸｓｏｌｖｅが挙げられる。しかし、実際には、これらは適切ではないことが分かり；‘０８６の図１０からも明らかなものがある。
【００２７】
別の既知のワクチンアジュバントは、乳化剤としての１．０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０とともに、２．１％ｗ／ｖのスクワレンおよび２．４％ｗ／ｖのビタミンＥを含有するＡＳ０３（商標）（ＧＳＫ）である。しかし、このアジュバントは、ヒトへの適用、および単一種の病原体からの抗原、主に不活性化ヒトインフルエンザウイルスからの抗原に対して記載されている。さらに、ＡＳ０３の使用は、アナフィラキシーのリスク上昇および自己免疫疾患の誘発に科学的に関連している。
【００２８】
さらに、一価Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標）ＭｈｙｏワクチンはビタミンＥ−アセテートの水性可溶化物中で処方されるが、ＰＣＶ２抗原と組み合わせた場合、全く異なるアジュバントおよび処方物が最適であることが分かった一方で、国際公開第２０１６／０９１９９８号に記載のように、２価混合ワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ  ＭｈｙｏにＥｍｕｎａｄｅ（商標）、鉱油および水酸化アルミニウムの混合物をアジュバントとして添加し、抗原を特別な方法で組み合わせる必要がある。
【００２９】
ワクチンのＰｒｏＳｙｓｔｅｍ（商標）シリーズ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）は、様々な細菌種由来の様々な非複製抗原を含有する一連の豚ワクチンである。これらのワクチンは、水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして添加した水性処方物である。これらは、伝染性胃腸炎ウイルスおよびロタウイルスなどの弱毒化生ウイルスを用いた豚用凍結乾燥ワクチンの再懸濁液に対して認可されている。
【００３０】
使用される処方物およびアジュバントに関してまた異なるのは、三価混合ワクチン３Ｆｌｅｘ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）である。これは、生ＰＲＲＳＶと組み合わせて、ＭｈｙｏおよびＰＣＶ２由来の非複製抗原を有する、３本の個別のボトルとして市販されている。これらは、その場で混合して、カルボポールを含有するＩｍｐｒａｎｆｌｅｘ（商標）と呼ばれるアジュバントと水性組成物を形成させるものである。
【００３１】
このあまりにも多くの選択肢にわたって、安全かつ安定であり、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染に関連する疾患に対して有効であった混合ワクチンの開発のために、どのタイプの処方物およびどのタイプの（１つまたは複数の）アジュバントを使用すべきかについて、発明者らは全く指標を持たなかった。
【００３２】
驚くべきことに、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含む、豚用の混合ワクチンを提供することによって、この目的を達成し得、その結果として、先行技術の１つ以上の欠点を克服し得ることが分かり、これにより、ワクチンが、水中油型エマルションとして処方され、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートがアジュバントとして添加される。
【００３３】
このタイプおよび組成の混合ワクチンは、生ＰＲＲＳＶに対して非殺ウイルス性であることが分かり、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染を豚において予防するのに有効であった。また、本ワクチンは、標的動物にとって安全であり、経済的に生産され得、処方および保管時に安定であり、最終ワクチン中の全ての抗原についての効力試験を可能にした。
【００３４】
なぜこの特定の処方およびこの特定のアジュバント選択がこの抗原の組み合わせにとって非常に好ましいのかは正確には分からない。発明者らはこれらの知見を説明し得る何れの理論またはモデルによっても束縛されることを望まないが、これらは水中油型処方物におけるスクワランおよびビタミンＥ−アセテートの特定の組み合わせが、これらの抗原からまさに適切なレベルの免疫刺激をもたらして、それらの関連疾患に対して有効となると推測する。これは、顕著なワクチン接種副反応を引き起こすことはなく、アジュバントおよび他の抗原の顕著な殺ウイルス効果から生ＰＲＲＳＶを明らかに保護する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１５２０８６号
【特許文献２】国際公開第２０１６／０９１９９８号
【非特許文献】
【００３６】
【非特許文献１】ＭｃＯｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．４５，ｐ．８２０〜８２５
【非特許文献２】”Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”（ＥＭＥＡ，２０００，ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７−ＦＩＮＡＬ）
【非特許文献３】Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｆｒｏｍ  Ａｐｒｉｌ  １９９７：”Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．９７Ｎ−００２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
これらの抗原を含む混合ワクチンは他にないので、これは先行技術から全く明らかではなかった。また、他の豚混合ワクチンについて記載されているいくつかのアジュバントは、この特定の組み合わせには有用ではないことが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
したがって、一態様において、本発明は、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする、豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）由来の非複製抗原および生きている豚生殖器・呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む混合ワクチンに関する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
「混合ワクチン」は、２つ以上の種の微生物由来の抗原を含むワクチンである。
【００４０】
「ワクチン」が医学的効果を有する組成物であることは周知である。ワクチンは、免疫学的に活性がある成分と薬学的に許容可能な担体とを含む。「免疫学的に活性がある成分」は、ここではＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶである、１つ以上の（１つまたは複数の）抗原分子である。これらは標的豚の免疫系によって認識され、防御免疫学的反応を誘導する。この反応は、標的の生来の免疫系および／または後天性免疫系から生じ得、細胞性および／または液性タイプのものであり得る。
【００４１】
ワクチンは一般に、例えば病原体の数を減少させるか、または宿主動物における病原体複製の持続時間を短縮することによって、感染の重症度を軽減するのに効果的である。
【００４２】
また、もしくはおそらく、その結果として、ワクチンは一般に、このような感染もしくは複製によって、またはその感染もしくは複製に対する動物の反応によって引き起こされ得る疾患の（臨床的）症状を軽減または改善するのに有効である。
【００４３】
本発明による混合ワクチンは、標的豚において防御的免疫反応を誘導し、その効果は、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染の重症度の予防または軽減である。また、混合ワクチンは、このような感染または複製に関連する疾患の１つ以上の徴候を予防または軽減する。これは、飼料効率、１日の平均体重増加、枝肉品質および同腹仔のサイズおよび品質などの経済的パラメータにプラスの影響を与えることになる。本発明による混合ワクチンの観察される効果は以下のとおりである：
ＰＣＶ２の場合：血液およびリンパ組織におけるウイルス量の減少；肥育豚において：死亡率および体重減少の減少および、
ＰＲＲＳＶの場合：肥育豚について：成長および飼料効率の改善につながる、壊死性間質性肺炎による呼吸器疾患の軽減。繁殖豚について：経胎盤ウイルス移行の減少、および早産、死産またはミイラ化変性仔豚などの生殖機能障害および生存仔豚における衰弱および離乳後呼吸器疾患の改善。
【００４４】
ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染の場合、免疫防御の誘導および、したがって本発明による混合ワクチンの効力は、血清学的に病原体特異的抗体の血清レベルの上昇として検出され得、ＥＬＩＳＡに基づく技術を用いて容易に検出可能である。
【００４５】
本発明による混合ワクチンは、俗に、ＰＣＶ２および−ＰＲＲＳＶに「対する」ワクチン、またはＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶワクチンとも呼ばれ得る。
【００４６】
本発明による混合ワクチンの詳細および優先度は、本明細書中で以下に記載する。
【００４７】
本発明のための「薬学的に許容可能な担体」は、高純度の、好ましくは滅菌性の水性液体、例えば、水、生理食塩水溶液またはリン酸緩衝食塩水溶液である。担体は、さらなる添加物、例えば安定化剤または保存剤などを含み得る。
【００４８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの変形物）は、本明細書中で使用される場合、全ての要素を、文章セクション、段落、請求項などによってカバーされるかまたはそれに含まれる、本発明に対して想定可能なあらゆる可能な組み合わせで指すものとし、この用語は、このような要素または組み合わせが明らかに示されない場合でも使用され；いかなるこのような（１または複数の）要素または組み合わせの排除も指すものではない。
【００４９】
このように、何らかのこのような文章セクション、段落、請求項なども、したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（またはその変形物）が、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「を主成分とする（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語により置き換えられる１つ以上の実施形態に関し得る。
【００５０】
「抗原」は、適切な条件下で免疫学的反応を誘導し得る分子を指す。抗原は、合成的に調製され得るか、または生物学的供給源に由来し得、例えばそれらは微生物またはその一部であり得る。
【００５１】
「非複製」抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質または核酸などの分子に関するか、またはそれらの複雑な組み合わせであり、程度の差はあるが純粋である。微生物から調製される場合、非複製抗原は、インタクトであるが死んでいる（すなわち非複製）微生物を指し得るか、または抽出物、分画、ホモジネートもしくは超音波処理物など、その一部であり得る。また非複製抗原は、核酸に基づく、または組み換え産物、例えば発現ベクターもしくは発現タンパク質など、またはインビトロ発現系の産物であり得る。これらは全て、当技術分野で周知である。
【００５２】
本発明について、ＰＲＲＳＶは複製性である。
【００５３】
「生ＰＲＲＳＶ」とは、ワクチン成分としての使用に適している、すなわち病原性レベルが低下している、弱毒化されているかまたは改変されている生ウイルスとしても知られている、生ＰＲＲＳＶを指す。
【００５４】
本発明に関して「弱毒化された」とは、より低いレベルの病変を引き起こすこと、および／または感染率もしくは複製率が低下していることとして定義される。全て、未改変または「野生型」のＰＲＲＳＶと比較した場合である。
【００５５】
ＰＲＲＳＶの弱毒化は、インビトロで、例えば実験動物を通じた、または細胞培養および選択において継代することにより、または組み換えＤＮＡ技術を介して得ることができ、これらは全て、当技術分野で周知である。
【００５６】
ウイルスを「生」と見なすのは生物学的には正しくないが、これは不活性化されていないウイルスを指す一般的な方法である。その結果として、本発明に関して、ＰＲＲＳＶに関する場合、「生」という用語は、適切な条件下、例えば適切な宿主細胞または動物において複製化能であるＰＲＲＳウイルスを指す。
【００５７】
「豚サーコウイルス２型」および「豚生殖器・呼吸器症候群ウイルス」は全て、ウイルスとして当技術分野で周知であり、それらのそれぞれの属および科に属する。これらは、「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ  ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）または「Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ」，１０ｔｈ  ｅｄ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｄｔ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ａｍｅｓ，ＩＡ．，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：０８１３８２２６７Ｘなどの周知の教科書に記載のような疾患を誘導する。
【００５８】
これらの病原体のそれぞれは、その分類学的な群のメンバーの特徴的な特性、例えば形態学的、ゲノム的および生化学的特徴など、ならびに生物学的特徴、例えば生理学的、免疫学的または病理学的挙動などを示す。
【００５９】
当技術分野で知られているように、特定の種としての微生物の分類はこのような特徴の組み合わせに基づく。したがって、本発明はまたＰＣＶ２またはＰＲＲＳＶも含み、これらは、例えば亜種、株、単離株、遺伝子型、変異体、サブタイプまたはサブグループなどとして、何れかの方法で細分類される。
【００６０】
当業者にとって当然のことながら、本発明に対する特定のＰＣＶ２またはＰＲＲＳＶは現在、特定の種に割り当てられ得るが、これは、新しい洞察が新しいかまたは異なる分類群への再分類につながり得るので、時間が経つにつれて変化し得る分類学的分類である。しかし、これは、微生物そのものまたはその抗原レパートリーを変化させず、変化するのはその科学名または分類だけなので、このような再分類微生物は、本発明の範囲内に留まる。
【００６１】
本発明での使用のためのＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶは、様々な供給源から得られ得、例えば野生または農場の豚から、または様々な研究室、（保管）機関または（獣医科）大学からの野外単離物として得られ得る。
【００６２】
「水中油型エマルション」は、内部分散油相を含有する外部水相を含む周知の組成物である。適切な種類および濃度の（１つまたは複数の）乳化剤の選択によって、このようなエマルションを形成させ得る。ワクチンとしての使用のための水中油エマルションの調製のための手順および装置は当技術分野で周知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）などのハンドブックに記載されている。
【００６３】
本発明の場合、外側の水相は、薬学的に許容可能な担体中にＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含み、油相は、アジュバントとしてスクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む。
【００６４】
本発明による混合ワクチンは、水中油型エマルションとして調製された場合、非常に有効、安全かつ安定であることが分かった。
【００６５】
本発明による混合ワクチンのための水中油型エマルションの製造のための実施形態および好ましいものを本明細書中で以下に記載する。
【００６６】
「スクワラン」は、ＣＡＳ番号１１１−０１−３の化合物を指す。一部の代替名は、水素添加サメ肝油、ヘキサメチルテトラコサンまたはパーヒドロスクワレンである。これは、多価不飽和Ｃ３０油であり、コレステロール経路の化合物として代謝可能であるスクワレン（ＣＡＳ番号  １１１−０２−４）と混同すべきではない。しかし、スクワランはスクワレンの完全水素添加形態であり、したがって酸化されにくい。それゆえに、スクワランは非鉱物油であり、注射部位から輸送される一方で、代謝可能ではない。
【００６７】
元来、スクワランに対する前駆物質はサメ肝臓から得られたが、環境への懸念から、これは、オリーブ油などの他の天然供給源へ、または化学合成物へと移った。したがって、スクワランの定義に含まれるものは、天然、合成もしくは半合成形態、またはそれらの混合物である。スクワランは、様々な純度で、例えば、植物の供給源から、Ｗｏｒｌｅｅ（スクワラン、植物性）から、もしくはＣｒｏｄａ（Ｐｒｉｐｕｒｅスクワラン）から；または合成物、例えばクラレ（スクワラン−ＰＥ）から市販されている。本発明について、高純度のスクワランが好ましく；好ましくは７５％を超える純度、より好ましくは８０、９０を超える、またはさらに９５％を超える純度が好ましく、これらは好ましい順である。
【００６８】
「ビタミンＥ−アセテート」はＣＡＳ号５８−９５−７の化合物を指す。いくつかの代替名は、酢酸トコフェリルまたは酢酸アルファ−トコフェロールである。ビタミンＥ−アセテートは、ビタミンＥの酢酸エステル（トコフェロール）であり、種子、堅果、果実または葉などの植物性材料由来または脂身由来であり得るが、また合成によっても作製され得る。したがって、ビタミンＥ−アセテートの定義に含まれるものは、天然、合成もしくは半合成形態またはそれらの混合物である。ビタミンＥ−アセテートは、様々な純度で市販されている。
【００６９】
本発明について、ＰＣＶ２の非複製抗原は、好ましくはＯＲＦ２タンパク質である。
【００７０】
本発明による混合ワクチン中の各抗原は、単一のタイプのものであってもよいし、または複数のタイプのものであってもよく、例えば個々の病原体の１つの株由来、または複数の株由来であってもよい。
【００７１】
本発明による混合ワクチン中のスクワランは、ワクチンの約１〜約９％ｗ／ｖの量で存在する。より好ましくは、スクワランは、ワクチンの２〜７％ｗ／ｖまたはさらには２〜５％ｗ／ｖの量で存在し、これらは好ましい順である。
【００７２】
最も好ましくは、スクワランはワクチンの約３．４％ｗ／ｖの量で存在する。
【００７３】
したがって、本発明による混合ワクチンの実施形態において、本ワクチンは、約１〜約９％ｗ／ｖの量でスクワランを含む。
【００７４】
本発明について、「約」は、数値がその指定値の前後±２５％の間で変動し得ることを示す。好ましくは、「約」は、その値の前後±２０％を意味し、より好ましくは、「約」は、その値の前後±１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２％を意味し、またはさらに「約」は、その値の前後±１％を意味し、これらは好ましい順である。
【００７５】
本発明による混合ワクチン中のビタミンＥ−アセテートは、本ワクチンの約１〜約１０％ｗ／ｖの量で存在する。より好ましくは、ビタミンＥ−アセテートは、本ワクチンの２〜８％ｗ／ｖまたはさらには３〜５％ｗ／ｖの量で存在し、これらは好ましい順である。
【００７６】
最も好ましくは、ビタミンＥ−アセテートは本ワクチンの約４％ｗ／ｖの量で存在する。
【００７７】
したがって、本発明による混合ワクチンの実施形態において、本ワクチンは、約１〜約１０％ｗ／ｖの量でビタミンＥ−アセテートを含む。
【００７８】
本発明による混合ワクチン中でのこれらの量のスクワランおよびビタミンＥ−アセテートの使用は、各病原体：ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する免疫反応を補助すること、および安定性を提供することにおいて有利であったことを発明者らは見出した。しかし、驚くべきことに、これは、標的豚に投与されたときにいかなる顕著なワクチン接種副反応も引き起こさず、また生ＰＲＲＳＶに対していかなる顕著な殺ウイルス効果も引き起こさなかった。
【００７９】
本発明による混合ワクチンでの使用のためのビタミンＥ−アセテートは、好ましくは酢酸ＤＬ−アルファ−トコフェロールであり、これはＣＡＳ番号：７６９５−９１−２の化学物質のラセミ体である。
【００８０】
本発明による混合ワクチンの一実施形態において、抗原は以下のとおりである：
ＰＣＶ２の非複製抗原の場合：ＯＲＦ２タンパク質は、組み換え発現系から得られるか、またはレプリコン粒子を介して送達および発現され；ＡｌｐｈａＶａｘによって開発されたように、レプリコン粒子は欠損アルファウイルス粒子である。発現されるＯＲＦ２配列の親ＰＣＶ２は、ＰＣＶ２血清型ａ、ｂ、ｃまたはｄの何れかであり得るか、またはこれらの血清型のうちの１つ以上からのキメラ由来であり得る。
【００８１】
ＰＲＲＳＶの場合：弱毒化生ウイルスは１つ以上の遺伝子型、例えば１型、２型および／または３型に由来する。より好ましくは、生ＰＲＲＳＶはＤＶ株またはＮｅｂｒａｓｋａ株由来の弱毒化型である。
【００８２】
本発明によるワクチンの実施形態において、医薬的に許容可能な担体は水である。好ましくは、水は、二重蒸留水、精密濾過水または逆浸透水など、高純度のものである。より好ましくは、水は注射用水であり、無菌であり、基本的に発熱物質不含である。
【００８３】
水中油型エマルションに基づくワクチンの都合の良い特性は、抗原が通常水相にあるということである。これは、ワクチン抗原の品質または生存率を維持することにはそれ自体相容れない方法および技術を用いて、油相を別個に水中で調製し、乳化し得ることを意味する。例えば、高温で高エネルギー乳化を使用する。これにより、水中のスクワラン、ビタミンＥ−アセテートおよびポリソルベート８０の水中油型エマルションである、本発明に対する油性エマルションが生じる。
【００８４】
本発明による混合ワクチンを調製するために、抗原を伴う水相、およびアジュバントを伴う油性エマルションを、室温で穏やかに混合することによって合わせる。
【００８５】
２つの組成物の組み合わせはそれらのそれぞれの希釈を引き起こす。その結果、それぞれは、適用される希釈度に等しい係数によって、様々な成分の濃度が、それが最終ワクチン中にあるときよりも高い中間組成物として調製される必要がある。典型的には、水相および油性エマルションは、１０：９０〜９０：１０の間の何れかの体積比で混合され得る。
【００８６】
本発明による混合ワクチンは、好ましくは、水相および油性エマルション（両方とも記載どおり）を約２０：８０〜約８０：２０の体積比で含む。
【００８７】
したがって、一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、水相および油性エマルションの混合物から、約２０：８０〜約８０：２０の体積比で調製される。
【００８８】
好ましくは、体積比は、約３０：７０〜約７０：３０；約４０：６０〜約６０：４０であるか；またはさらに、体積比は約５０：５０であり、これらは好ましい順である。
【００８９】
明らかに、水相と油性エマルションとの組み合わせ比が５０：５０であるとき、この２つの組成物のそれぞれは、その２つの中間組成物の組み合わせから調製される最終ワクチン処方物において所望されるよりも２倍高い量または濃度でその様々な成分を含むはずである。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明に対する油性エマルションは、約８〜約２０のＨＬＢ値（親水性−親油性バランス）を有する乳化剤を用いて調製され；好ましい乳化剤はポリソルベート８０である。
【００９１】
ポリソルベート８０は、ＣＡＳ番号  ９００５−６５−６の化学物質を指し、これはまた、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとも呼ばれる。これはＨＬＢ値１４を有し、例えばＴｗｅｅｎ８０として広く市販されている。
【００９２】
好ましくは、ポリソルベート８０は、本発明による混合ワクチン中に本ワクチンの約０．１〜約５％ｗ／ｖの量で存在する。より好ましくは、ポリソルベート８０は、本ワクチンの０．３〜３％ｗ／ｖ、０．５〜２．５％またはさらには１〜２％ｗ／ｖの量で存在し、これらは好ましい順である。
【００９３】
最も好ましくは、ポリソルベート８０は本ワクチンの約１．６％ｗ／ｖの量で存在する。
【００９４】
したがって、一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、約０．１〜約５％ｗ／ｖの量でポリソルベート８０を含む。
【００９５】
本発明に対する油性エマルションは、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ，Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ（商標）またはＤｉｓｐａｘ反応器（ＩＫＡ）からのような何らかの規模で、何らかの適切な均質化装置を使用して調製され得る。当業者は、分散相（ここでは油性アジュバント）の粒子のサイズを調節するためにこのような乳化工程を実施し、最適化し得る。（１つまたは複数の）乳化剤のタイプおよび濃度の選択とともに、これはエマルションの薬学的特性を、およびまたその安定性も調節する。乳化工程自体の主なパラメータは、エネルギー入力（出力およびｒｐｍ）、温度、持続時間および反復サイクル数である。乳化工程の実施形態の詳細は以下で提示する。
【００９６】
分散相の粒径は好ましくはかなり小さい。分散相の粒子の直径が約１マイクロメートルを下回るとき、このようなエマルションは一般に「サブミクロンエマルション」と呼ばれる。
【００９７】
本発明による混合ワクチンの水中油型エマルションの一実施形態において、エマルションはサブミクロンエマルションである。
【００９８】
１マイクロメートル以下の粒径を測定するための装置は、例えばレーザー回折測定によって一般に利用可能である。典型的には、粒径はナノメートル（ｎｍ）で、および平均粒径として表され、これはメジアン径としても知られ、累積粒径分布のＤ５０として表される。
【００９９】
本発明について、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ（商標）（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて決定されるように、粒径はＤ５０のｎｍで表される。粒径測定は、（濃縮）油性エマルションまたは混合ワクチン中で行われ得；本発明の油相の粒子屈折率は１．４８である。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒのサイズ分析報告では、Ｄ５０がＤ（０．５０）として表示される。これは全て、当業者にとって周知である。
【０１００】
典型的には、例えば、高圧ホモジナイザー、ローターステーター装置、ブレンダー、超音波、微孔性膜またはマイクロチャネリング装置を使用する、高エネルギー乳化工程の使用によってこのようなサブミクロンエマルションを製造するために利用可能な多くの方法がある。
【０１０１】
本発明のための高エネルギー乳化のための好ましい工程は、高圧ホモジナイザー、好ましくはＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ（商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の使用である。典型的には、５００〜１５００ｂａｒ（すなわち７０００〜２２０００ｐｓｉ）の圧力で３回の通過で十分である。
【０１０２】
このようにして調製されたエマルションは、典型的には、５００ｎｍ以下のＤ５０を有する分散相粒子を有し、狭いサイズ分布を有し；本発明については、分散相は油性アジュバントの液滴である。
【０１０３】
典型的には、分散相のこのような非常に微細なサイズの粒子を有するエマルションは、いくつかの工程で調製される。このようにして、初期の比較的粗い油性エマルションは、低エネルギー混合によって調製され、その後、粒径のさらなる低減を達成するために引き続き１回以上の高エネルギー処理が続く。
【０１０４】
次に、抗原を含む水相と水中にアジュバントおよび乳化剤を含む「微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）」油性エマルションを合わせて、本発明による混合ワクチンを調製する。
【０１０５】
したがって、本発明による混合ワクチンのサブミクロン水中油型エマルションの一実施形態において、油滴は５００ｎｍ以下のＤ５０を有し；好ましくはＤ５０が２５０ｎｍ以下である。より好ましくは、Ｄ５０は１５０ｎｍ以下である。
【０１０６】
製品の一貫性および品質の理由で、メジアン径だけでなく、粒径分布としても知られる粒径の広がりもまた有利に監視および調節され得る。本発明による混合ワクチンのサブミクロン水中油型エマルション中の油滴の粒径分布は、好ましくは比較的狭い。粒径分布の指標は累積粒径分布のＤ９０である。
【０１０７】
したがって、本発明による混合ワクチンのサブミクロン水中油型エマルションの一実施形態において、油滴は９００ｎｍ以下のＤ９０を有し；より好ましくは、Ｄ９０は、５００ｎｍ、４００ｎｍを下回るか、またはさらに３００ｎｍを下回り、これらは好ましい順である。最も好ましくは、Ｄ９０は約２５０ｎｍである。
【０１０８】
このような小さな粒径および分布を有するエマルションの利点の１つは、材料の著しい損失なく、これを濾過により滅菌し得ることである。これは典型的な滅菌フィルターの孔径が約０．２マイクロメートルであるからである。このようなフィルター滅菌によって、加熱、化学物質または照射などによる、油性エマルションの成分の品質に損害を与え得る他の滅菌方法の必要がなくなる。
【０１０９】
例えば野外条件、または標的種の詳細など、本発明による混合ワクチンの目的の用途の状況に応じて、ワクチンを最適化することが好ましい場合がある。これは十分に当業者の能力の範囲内であり、一般にワクチンの効力、安全性または安定性の微調整を含む。
【０１１０】
本発明による混合ワクチンは、上記のように、豚標的においてそれらの関連疾患に対する防御的免疫反応を誘導可能な量で、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含む。
【０１１１】
本発明の分野の熟練者は、例えばワクチン接種後または攻撃感染後の免疫反応を  監視することによって、例えば標的の疾患の徴候、臨床スコアを監視することによって、または病原体の再単離およびこれらの結果を疑似ワクチン接種動物で見られるワクチン接種負荷試験反応と比較することによって、本発明による混合ワクチンの有効性を十二分に決定可能である。
【０１１２】
指標として、本発明による混合ワクチンで使用しようとする抗原の量は、これらの抗原を有するそれぞれの一価ワクチンまたは混合ワクチンに使用されるものに基づき得る。例えば、本発明による混合ワクチンは、１ミリリットルあたり：ＰＣＶ２：１〜５０μｇ  ＯＲＦ２；およびＰＲＲＳＶ：１０＾３〜１０＾６  ＴＣＩＤ５０を含み得る。これらの抗原を定量するための方法は当技術分野で周知であり、また具体的な標準物質に対するＥＬＩＳＡに基づく定量にも依存し得る。
【０１１３】
本発明による混合ワクチンは、有利には、複製型または非複製型の、全体的なまたは破壊された、１つ以上のさらなる抗原と組み合わせられ得る。しかし、組み合わせは、好ましくは、混合ワクチン全体の安定性および効力、ならびに複製型ワクチン成分の生存率を保護するように慎重になされ得る。このような選択は、当業者の日常的な能力の範囲内である。
【０１１４】
したがって、一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、少なくとも１つのさらなる抗原を含む。
【０１１５】
追加の抗原は、豚に対して病原性である微生物の弱毒化型であるかまたは豚に対して病原性である微生物由来の非複製抗原であるかの何れかである。微生物は、豚に対して病原性である何らかのウイルス、細菌、寄生虫、真菌、リケッチア、原生動物および／または寄生虫であり得る。
【０１１６】
豚に対して病原性であるこのような微生物の例は、仮性狂犬病ウイルス、豚パルボウイルス、豚コレラウイルス、豚インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、豚伝染性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、豚呼吸器コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クロストリジウム、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）およびトリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）である。
【０１１７】
好ましいさらなる抗原は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ブラキスピラ・ハイオディセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）および豚インフルエンザウイルスからの１つ以上である。
【０１１８】
したがって、好ましい実施形態において、本発明による混合ワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｈｙｏ）由来の非複製抗原も含む。
【０１１９】
代替的な好ましい実施形態において、本発明による混合ワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）（ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ））由来の非複製抗原も含む。
【０１２０】
Ｍｈｙｏおよびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）由来の非複製抗原は好ましくはバクテリンである。
【０１２１】
本発明について、「バクテリン」は、不活化（死）細菌を含み、それによって、例えば不活化培養物全体などで、不活化細菌が完全な無傷細胞であり得るか、または不活化によってある程度まで損傷を受けるようになり得る組成物またはそれらの混合物である。
【０１２２】
Ｍｈｙｏまたはローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）バクテリンは、好ましくは死滅全細胞培養物である。Ｍｈｙｏバクテリンは、好ましくは株１１または株Ｊ．ＮＢ由来である：Ｍｈｙｏは以前、Ｍ．スイプニューモニエ（Ｍ．ｓｕｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と呼ばれた。
【０１２３】
本発明による混合ワクチンで使用しようとする抗原の量は以下のとおりであり得る：Ｍｈｙｏ：不活性化濃縮Ｍｈｙｏ培養物の２〜２０％ｗ／ｖ；および／またはローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）：細胞１ｘ１０＾７〜１ｘ１０＾１０個の不活化細胞全体。
【０１２４】
観察された本発明による混合ワクチンの効果は以下のとおりである：
Ｍｈｙｏに対して：Ｍｈｙｏによって引き起こされる肺病変、例えばコンソリデーションがある（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ）肺炎など、および慢性呼吸器疾患の予防または軽減；
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）に対して：ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）によるコロニー形成および糞便排出の減少および腸過形成を伴う回腸炎、豚出血性腸症または豚腸腺腫症の徴候の軽減。
【０１２５】
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の場合、本発明による混合ワクチンの効力は、血清学的にローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）特異的抗体の血清レベルの上昇として検出され得、これはＥＬＩＳＡに基づく技術を用いて容易に検出可能である。
【０１２６】
Ｍｈｙｏの場合、ワクチン効力の最も信頼できる尺度は、Ｍｈｙｏ攻撃感染後の肺病変スコアの低下である。このような病変は、典型的には、Ｇｏｏｄｗｉｎスケール（Ｇｏｏｄｗｉｎら、１９６９，Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．４６５−４７６）に基づくような、肺コンソリデーションの肉眼的評価によって剖検中にスコア化されるが、このスケールは、ゼロから、完全罹患肺に対する最大５５ポイント／動物にまで及ぶ。
【０１２７】
本発明による混合ワクチンは、抗生物質、ホルモンおよび／または抗炎症薬などの医薬化合物と有利に組み合わせられ得る。
【０１２８】
本発明による混合ワクチンは、ワクチンの効力または安定性を最適化するための賦形剤、例えば安定化剤または保存剤などをさらに含み得る。安定化剤の例は、粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、トレハロース、アミノ酸、スペルミジン、デキストランまたはポリビニルピロリドンである。保存剤の例は、チメロサール、メルチオラート、フェノール化合物またはゲンタマイシンである。
【０１２９】
本発明による混合ワクチンに使用される抗原が特別に選択される場合、混合ワクチンはいわゆるマーカーワクチンとして使用され得る。これは、病原体のうちの１つに対するワクチンによって引き起こされる免疫が、野生型病原体による標的の感染時に起こる免疫反応からいくつかの検出方法によって区別され得ることを意味する。これは、ＤＩＶＡ：「感染動物の、ワクチン接種動物からの区別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌｓ）」としても知られる。それゆえに、本ワクチンは野生型感染と比較した場合、陽性または陰性「マーカー」を有する。
【０１３０】
したがって、一実施形態において、本発明による混合ワクチンはマーカーワクチンである。
【０１３１】
一実施形態において、混合ワクチンは豚用である。
【０１３２】
「豚」という用語は、イノシシ科の動物および、好ましくは豚（ｐｏｒｃｉｎｅ）とも呼ばれるイノシシ属の動物を指す。例は、野生または家畜豚、雄豚、野生イノシシ、バビルサまたはイボイノシシである。これはまた、例えば、雌豚、クイーン（ｑｕｅｅｎ）、成熟雄豚、去勢豚、雄豚、未経産雌豚、離乳直後の仔豚または仔豚などのそれらの性別または年齢を指す、任意の名称により示される豚を含む。
【０１３３】
さらに、豚という用語は、繁殖型または肥育型などの何れかのタイプの豚動物、およびこれらのタイプの何れかの親系統を指す。
【０１３４】
本発明による混合ワクチンのさらなるまたは追加の実施形態が想定され、当業者にとって完全に達成可能である。また、これらのさらなる実施形態は、既に記載の実施形態への１つ以上の組み合わせで適用され得る。
【０１３５】
したがって、本発明による混合ワクチンの一実施形態において、以下からなる群から選択される１つ、複数または全ての条件が適用される：
−本混合ワクチンは、約１〜約９％ｗ／ｖの量のスクワランを含み、好ましくはスクワランは、２〜５％ｗ／ｖの量で含まれる；
−本混合ワクチンは、約１〜約１０％ｗ／ｖの量のビタミンＥ−アセテートを含み、好ましくは、ビタミンＥ−アセテートは、３〜５％ｗ／ｖの量で含まれる；
−ビタミンＥ−アセテートは、好ましくは、酢酸ＤＬ−アルファ−トコフェロールである；
−混合ワクチンは、水相および油性エマルションの混合物から、約２０：８０〜約８０：２０の体積比で調製される。
【０１３６】
−本混合ワクチンは、約０．１〜約５％ｗ／ｖの量のポリソルベート８０を含み；好ましくは、ポリソルベート８０は、１〜２％ｗ／ｖの量で含まれる；
−水中油型エマルションはサブミクロンエマルションであり；より好ましくは、油滴は５００ｎｍ以下のＤ５０を有する。
【０１３７】
−本混合ワクチンは、少なくとも１つのさらなる抗原を含み；好ましくは、１つ以上の抗原は、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ブラキスピラ・ハイオディセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）および豚インフルエンザウイルス由来である；
−本混合ワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の非複製抗原も含む；
−本混合ワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）由来の非複製抗原も含んでいる；
−本混合ワクチンはマーカーワクチンである；および
−本混合ワクチンは豚用である。
【０１３８】
本発明による混合ワクチンの一実施態様において、本ワクチンは約１〜約９％ｗ／ｖの量でスクワランを含み；本ワクチンは、約１〜約１０％ｗ／ｖの量のビタミンＥ−アセテートを含み；ビタミンＥ−アセテートは酢酸ＤＬ−アルファ−トコフェロールであり；本ワクチンは、水相と油性エマルションとの混合物から、約２０：８０〜約８０：２０の体積比で調製され；本ワクチンは、約０．１〜約５％ｗ／ｖの量のポリソルベート８０を含み；水中油型エマルションはサブミクロンエマルションであり；本ワクチンは豚用である。
【０１３９】
本発明による混合ワクチンは、本明細書中に記載のように、様々な方法で構成され得る。
【０１４０】
本発明による混合ワクチンを調製するための１つの有利な方法は、生ＰＲＲＳＶの凍結乾燥調製物の再構成によるものである。例えば、ＰＲＲＳＶをまだ含有していない本発明による混合ワクチンの不完全型は、好都合なことに、弱毒化生ＰＲＲＳＶの凍結乾燥調製物、例えば豚ＰＲＲＳＶまたはＰｒｉｍｅ  Ｐａｃ（商標）ＰＲＲＳ＋などの既存の凍結乾燥生ＰＲＲＳＶワクチン用の希釈剤として使用し得る。
【０１４１】
結果として、本発明による混合ワクチンは、少なくとも２つの容器を含むキットオブパーツから製造され得；１つの容器は、生ＰＲＲＳＶウイルスを除き、本発明による混合ワクチンの全成分を含み；１つの容器が凍結乾燥形態の弱毒化生ＰＲＲＳＶを含む。キットオブパーツの要素は、一緒になって本発明による混合ワクチンを統合する。
【０１４２】
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つの容器を含むキットオブパーツに関する：１つの容器は、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルション中にＰＣＶ２由来の非複製抗原を含み；１つの容器は凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを含む。
【０１４３】
生ＰＲＲＳＶの再構成時に、本発明による完全混合ワクチンが形成される。これは、ワクチンを「現場」で混合する、または「フィールドサイド（ｆｉｅｌｄ  ｓｉｄｅ）」で混合するとも言われる。
【０１４４】
混合ワクチンはＰＲＲＳＶに対して有害ではないが、ワクチンの最高品質を保証するために、ワクチンの投与直前に再構成を行うことが好ましい。好ましくは、再構成は、投与の８時間以内、より好ましくは投与の６、５、４、３時間以内、またはさらに２時間以内に行われ、これは好ましい順である。
【０１４５】
本発明によるキットオブパーツおよびその要素は、本発明による混合ワクチンについて本明細書中に記載のような実施形態の何れか（好ましいか否か）、または本発明による混合ワクチンのこれらの実施形態の２つ以上の何らかの組み合わせを含み得る。
【０１４６】
本発明によるキットオブパーツのさらなる有利な有用性は、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）からの非複製抗原および生ＰＲＲＳＶの両方が凍結乾燥調製物の再構成によって本発明による混合ワクチンに取り込まれるということである。
【０１４７】
したがって、一実施形態において、本発明によるキットオブパーツは、少なくとも３個の容器を含み：１つの容器は、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルション中にＰＣＶ２由来の非複製抗原を含み；１つの容器は凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを含み；１つの容器は、凍結乾燥形態のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）由来の非複製抗原を含む。
【０１４８】
少なくとも３個の容器を含む本発明によるキットオブパーツの好ましい実施形態において、容器には、スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルション中にＰＣＶ２由来の非複製抗原が含まれ、また、Ｍｈｙｏ由来の非複製抗原も含まれる。
【０１４９】
凍結乾燥形態は、容器、例えばボトル中で凍結乾燥ケーキであり得るが、Ｓｐｈｅｒｅｏｎ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで適用されるように、リオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）でもあり得る。
【０１５０】
凍結乾燥体の性質のために、その再構成は使用される希釈液の体積を顕著に変化させない（すなわち約５％未満；より好ましくは約１％未満）。その結果として、生ＰＲＲＳＶを除く全ての成分を有する、または生ＰＲＲＳＶおよびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）由来の非複製抗原を除く全ての成分を有する本発明による混合ワクチンの調製物は、本発明によるキットオブパーツで提供しようとするものであり、本質的にその他の成分とともに最終量でまたはそれらの最終濃度で提供され得る。
【０１５１】
本発明による混合ワクチンは、当技術分野で周知であり、当業者の日常的な能力の範囲内である方法によって、それぞれの抗原および賦形剤から調製され得る。例えば、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、昆虫細胞培養において組み換えバキュロウイルスによって発現され得、回収され得；あるいは、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質がレプリコン粒子を用いて送達および発現され得る（上出）。ＰＲＲＳＶは、適切な宿主細胞、例えば初代豚マクロファージまたはＭａｒｃ−１４５もしくはＭＡ１０４などの細胞株上で培養し得る。
【０１５２】
これらの抗原は定量され、必要量で水相に取り込まれる。これは、Ｍｈｙｏ由来の非複製抗原、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）および／または生ＰＲＲＳＶありでもよいし、またはなしでもよく；これは、本発明による混合ワクチンの場合、本発明によるキットオブパーツとして商品化しようとするものである。
【０１５３】
個別に、水中のアジュバントおよび乳化剤を含む油性エマルションは、乳化工程によって調製される。次に、抗原を伴う水相と所望の体積比でこれを混合する。
【０１５４】
適正な試験によって、例えば細菌およびウイルスまたは何らかのさらなる抗原の品質および量に対する微生物学的および免疫学的試験によって；外来因子がないことについての試験によって；化学的および生物学的安定性に対する試験によって；および最終的にはワクチンの効力および安全性を判定するためのインビトロまたはインビボ実験によって、製造工程の様々な段階が監視される。これらは全て当業者にとって周知であり、薬局方などの政府の規制、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｏｒｅｔなどのハンドブック（両方とも上出）において処方される。
【０１５５】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による混合ワクチンの調製方法に関し、この方法は、
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原、および生ＰＲＲＳＶを含む水相を調製する工程；および
−スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションと前記水相を混合する工程
を含む。
【０１５６】
記載のように、本発明による混合ワクチンの調製方法は、例えばこれらの抗原の個々の凍結乾燥調製物の再構成により、Ｍｈｙｏ由来、またはローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）由来および／または生ＰＲＲＳＶ由来の抗原を後の段階で組み込むのに有利に適応させ得る。
【０１５７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による混合ワクチンの調製方法に関し、この方法は、
−凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを調製する工程；
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相を調製する工程；
−スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションと前記水相を混合する工程；および
−水相および油性エマルションの前記混合物を用いて前記凍結乾燥生ＰＲＲＳＶを再構成する工程
を含む。
【０１５８】
ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相は、Ｍｈｙｏ由来の非複製抗原を含んでいてもよい。
【０１５９】
同様に
さらなる態様において、本発明は、本発明による混合ワクチンの調製方法に関し、この方法は、
−凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを調製する工程；
−凍結乾燥形態の非複製ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原を調製する工程；
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相を調製する工程；
−スクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションと前記水相を混合する工程；および
−水相および油性エマルションの前記混合物を用いて前記凍結乾燥生ＰＲＲＳＶおよび前記非複製ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原を再構成する工程
を含む。
【０１６０】
ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相は、Ｍｈｙｏ由来の非複製抗原を含んでいてもよい。
【０１６１】
または、同様の実施形態において、本発明は、本発明による混合ワクチンの調製方法に関し、この方法は、
−ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相およびスクワランおよびビタミンＥ−アセテートを含む油性エマルションの混合物を調製する工程；および
−前記混合物を用いて凍結乾燥形態の生ＰＲＲＳＶを再構成する工程
を含む。
【０１６２】
ＰＣＶ２由来の非複製抗原を含む水相は、Ｍｈｙｏ由来の非複製抗原を含んでいてもよい。
【０１６３】
これらの方法の異なる時点で、例えば精製または保存などのための追加処理のために追加工程を追加し得る。また、調製の方法は、追加の抗原、または薬学的に許容可能な賦形剤、例えば安定剤もしくは保存剤などと混合することを含み得る。
【０１６４】
これらの変形形態、および場合によってはさらに多くのものを、本発明による調製方法の適切な時点でさらなる工程として組み込み得る。
【０１６５】
したがって、本発明による調製方法は、本発明による混合ワクチンについて本明細書中に記載のような実施形態の何れか（好ましいか否か）、または本発明による混合ワクチンのこれらの実施形態の２つ以上の何らかの組み合わせを含み得る。
【０１６６】
記載のように、本発明による方法によって調製され得る本発明による混合ワクチンは、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染および／またはそれに関連する疾患に対する防御のために、豚への投与に対して有利に使用され得る。
【０１６７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する豚のワクチン接種での使用のための、スクワランおよびビタミンＥ−アセテート、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含む水中油型エマルションに関する。
【０１６８】
あるいは：
さらなる態様において、本発明は、豚用の混合ワクチンの製造のための、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶの使用であって、このワクチンが、スクワランとビタミンＥ−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする使用に関する。
【０１６９】
本発明による混合ワクチンは、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する豚のワクチン接種に適用され得る。
【０１７０】
したがって、さらなる態様において、本発明は、スクワランおよびビタミンＥ−アセテート、ＰＣＶ２由来の非複製抗原および生ＰＲＲＳＶを含む水中油型エマルションの豚への投与による、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する豚のワクチン接種の方法に関する。
【０１７１】
または、同様の実施形態において：本発明は、本発明による混合ワクチンの豚への投与による、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶに対する豚のワクチン接種の方法に関する。
【０１７２】
本発明による混合ワクチンなどの水中油型エマルションは、好ましくは非経口投与のいくつかの方法により、例えば皮膚への、または皮膚を通じた注入の全経路を通じて、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下、または皮下に投与される。これは様々な方法で、例えば古典的なシリンジおよび皮下針を用いて達成され得る。
【０１７３】
あるいは、非経口投与は、ＩＤＡＬ（商標）などの皮内または経皮アプリケータによってワクチンを送達する無針注射の、ある方法によって行われ得る。
【０１７４】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、投与は筋肉内経路によって適用される。
【０１７５】
本発明による混合ワクチンの動物用量の体積は、効果的な免疫防御が得られるならば重要ではない。これは、筋肉内、皮下または皮内などの投与経路によって異なり得る。好ましくは、１回の動物用量の体積は、動物１匹あたり約０．１〜１０ｍＬであり；より好ましくは、１回の動物用量あたり、０．２〜５ｍＬ、０．５〜３またはさらには０．５〜２ｍＬであり、この順序で好ましい。
【０１７６】
したがって、本発明による投与方法の一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、動物１匹あたり約０．１〜１０ｍＬの間の用量で投与される。
【０１７７】
標的豚への本発明によるワクチン接種方法のための投与計画は、単回投与または複数回投与で、または豚畜産業の実際的な態様に適合する方法であり得る。
【０１７８】
必要に応じて、豚標的に対して、生涯の後の時期に、本発明による組み合わせの２回目またはさらなる投与、いわゆる追加免疫ワクチン接種を施し得る。しかし、本発明による混合ワクチンは、単回ワクチン接種用量が一般的に、豚の生涯の適切な期間中、例えば６か月齢までの豚の肥育段階中に、免疫防御を提供するのに十分であるように最適化される。
【０１７９】
結果として、好ましい実施形態において、本発明による混合ワクチンは、豚標的あたり１回だけ投与される、すなわちこれは単回投与ワクチンである。
【０１８０】
好ましくは、ワクチン接種方法に対する管理体制は、さらに動物へのストレスを軽減し、労働コストを軽減するために、標的豚が必要とし得る他のワクチンの既存のワクチン接種計画に統合される。これらの他のワクチンは、それらの登録された使用と適合する方式で同時、同時的または逐次的な方式で投与され得る。
【０１８１】
したがって、本発明による豚のワクチン接種の方法の一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、別の豚ワクチンと組み合わせて投与される。
【０１８２】
本発明のためのワクチン接種に対する標的豚は、それらがワクチン接種に反応し易い、および／またはそれに対してワクチンが防御する疾患または感染に罹患し易いあらゆる時期のものであり得る。
【０１８３】
さらに、本発明によるワクチン接種のための標的豚の、体重、性別、免疫学的状態などはあまり重要ではないが、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２またはＰＲＲＳＶの早期感染（の結果）を防ぐために、健康な標的にワクチン接種することおよび可能な限り早期にワクチン接種することは有利である。
【０１８４】
したがって、本発明による豚のワクチン接種の方法の一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、幼若豚に投与される。
【０１８５】
本発明について、「幼若豚」は約２か月齢までの豚である。
【０１８６】
Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶの有病率が高いため、およびこれらの病原体の１つ以上に対するワクチンが広く使用されているため、多くの雌豚は、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶの１つ以上に対する抗体に対して血清反応陽性になる。その結果として、このような雌豚からの初乳を摂取した幼若豚は、ＭＤＡ＋となろう（母体由来抗体陽性）。これは、ＭＤＡ＋豚においても有効であるので、本発明による混合ワクチンの効力を妨げるものではない。
【０１８７】
したがって、本発明によるワクチン接種の方法の一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、ＭＤＡ＋幼若豚に投与される。
【０１８８】
ＰＲＲＳＶは成豚において呼吸器疾患を特異的に誘発する。
【０１８９】
したがって、本発明による豚のワクチン接種の方法の一実施形態において、本発明による混合ワクチンは、成豚に投与される。
【０１９０】
本発明について、「成豚」は約６か月齢からの豚である。
【０１９１】
本発明による混合ワクチンの投与は、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶによる感染の確立および進行の両方を妨げるので、予防的または治療的処置の何れかとして、またはその両方として適用され得る。
【０１９２】
本発明による混合ワクチンの使用は、豚集団中、農場において、または地理的領域中の豚において、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶのうちの１つまたは全てによる感染の軽減に役立つ。
【０１９３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、豚における、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２もしくはＰＲＲＳＶによる感染または疾患の関連徴候の軽減のための方法に関し、この方法は、本発明による混合ワクチンの前記豚への投与を含むことを特徴とする。
【０１９４】
ここで、次の非限定的な実施例を辿ることにより本発明をさらに説明する。
【０１９５】
［実施例］
１．混合ワクチンの調製
本発明による混合ワクチンは以下のように調製した：
２ｘ濃度の油性エマルションは１００ｇあたり次のものを含有する：
ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）：３．２４ｇ；
スクワラン：６．７５ｇ；
ＤＬ−アルファトコフェロールアセテート：７．９４ｇ；
注射用水：８２．０７ｇ
この油性エマルションは、次の後続工程段階に従って調製した：
−Ｔｗｅｅｎ  ８０およびスクワランの必要量を秤量し、ビーカー中で合わせた：
−Ｔｗｅｅｎ  ８０／スクワラン混合物を室温で低エネルギー混合（マグネチックスターラー）により均質化し、
−酢酸ＤＬ−アルファトコフェロールの必要量を秤量し、均質化したＴｗｅｅｎ  ８０／スクワラン混合物に添加し、
−室温で低エネルギー混合することによって、合わせた混合物を再び均質化し、
−混合物を６５〜７５℃に加熱し、
−注射用水を６５〜７５℃に加熱し、
−Ｎ１８ロッド付きのＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘによる高エネルギー混合を使用して、加熱した油相および水を５〜１５分間、予め混合し、温度を６５℃から５５℃に低下させ、
−予備混合物を８００ｂａｒでマイクロフルイダイザーに３回通し、冷却スパイラルで温度を５０℃未満に保った。
【０１９６】
−微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）油性エマルションを０．２マイクロメートルフィルター（Ｐａｌｌ，Ｕｌｔｉｐｏｒ（商標）Ｎ６６）に通して濾過することにより滅菌し；フィルターは、その二重壁を介して５５〜７５℃に予め加熱しておいた。
【０１９７】
（２ｘ濃縮物中の）最終油性エマルションのうち、完全性および均質化の程度を光学顕微鏡によって調べた。さらなるｐＨ（７．３４）および浸透圧（２２１ｍＯｓｍ／ｋｇ）もまたチェックした。粒径測定から次のことが明らかになった：Ｄ１００＝３００ｎｍ；Ｄ９９＝２５０ｎｍ；Ｄ９０＝２００ｎｍおよびＤ５０＝１３０ｎｍ。
【０１９８】
（２ｘ濃縮物中の）水相は、非複製抗原のそれぞれの必要量を採取することによって調製した：Ｍｈｙｏ：１０ｘ濃縮不活性化培養物６％ｖ／ｖ；ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）：２ｘ１０＾９個の不活性化細胞；およびＰＣＶ：５０μｇのＯＲＦ２。
【０１９９】
次に、両方の濃縮組成物（アジュバントを含む油性エマルションおよび抗原を含む水相）を、室温で低エネルギー混合することによって５０：５０の体積比で合わせた。
【０２００】
このワクチン混合物を用いて、２ｍＬの混合ワクチンあたりのＰＲＲＳＶの全用量（１０＾５  ＴＣＩＤ  ５０）に達するようにするために必要な体積で、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳのアンプルを再懸濁した。
【０２０１】
最終混合ワクチンは以下のもの：３．３７５％ｗ／ｖのスクワラン；３．９７％ｗ／ｖのビタミンＥ−アセテートおよび１．６２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０を含有し、０．９９１３ｇ／ｍＬの密度であった。生成物を２〜８℃で保存した。
【０２０２】
２．殺ウイルス効果についての試験
本発明の油性エマルションを生ＰＲＲＳＶの試料とともに温置し、何らかの殺ウイルス効果が生じるか否かを判定した。
【０２０３】
手短に述べると、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳＶのアンプルをＰＢＳ中で最終体積７ｍＬに再構成して、６Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのタイターに到達させた。このウイルス懸濁液の５０μＬ試料を、実施例１と同様に調製し、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＣＶ２の非複製抗原とともに、水中で微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）したスクワラン、ビタミンＥ−アセテートおよびポリソルベート８０を含む、４５０μＬの生ＰＲＲＳＶなしの混合ワクチンと組み合わせた。ＰＲＲＳＶの対照試料を４５０μＬのＰＢＳと混合した。両方の試料を室温で１時間温置した。次に、温置した試料を滴定して、ＰＲＲＳＶの残存タイターを決定した。
【０２０４】
滴定は１日齢のＭＡ１０４細胞の単層上で行った。１０列の出発ウェルに２５μＬの温置ウイルス試料を入れ、これを７個の続くウェルを通じて１：１０希釈した。２列の未処理細胞を陰性対照として用いた。これはデュプロで（ｉｎ  ｄｕｐｌｏ）行った。次にプレートを５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で３日間温置した。最後に、抗ＰＲＲＳＶモノクローナル抗体および蛍光標識検出抗体を用いてＰＲＲＳＶウイルス複製を免疫蛍光法により検出した。タイターは、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｅｒｂｅｒアルゴリズムを用いて計算した。
【表１】
0006931059.tif 000002
【０２０５】
タイター値の広がりが±０．２Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０であることが分かったので、結果から、本発明による０．９ｘ濃縮混合ワクチン中で温置された生ＰＲＲＳＶの試料はタイターの有意な減少がなかったことが示された。
【０２０６】
３．ワクチン接種−負荷試験実験
３．１．導入
実施例１のように調製され、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＣＶ２の非複製抗原とともに、水中で微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）されたスクワラン、ビタミンＥ−アセテートおよびポリソルベート８０を含む、生ＰＲＲＳＶなしの混合ワクチンを動物において試験した。ワクチン接種は、３週齢で筋肉内経路によりワンショット用量として与えた。Ｍｈｙｏの効力は、ワクチン接種４週間後に攻撃感染によって試験した。いくつかの他のアジュバントを比較した。
【０２０７】
３．２．試験設計
この実験に対して８４匹のＳＰＦ仔豚を使用した。１２匹の動物の６つの群に、３週齢（＋／−３日）で１回、筋肉内にワクチン接種した。１２匹の豚の１つの群はワクチン未接種のままにして、負荷試験の対照群とした。ワクチン接種前およびワクチン接種の２日後に直腸温を測定した。さらに、ＳＶＥＡ群に対しては、局所反応について注射部位を毎週触診した。ワクチン接種の４週間後に、全ての動物に病原性Ｍｈｙｏ株を感染させた。負荷試験の３週間後、全ての動物を安楽死させ、死後に肺病変について調べた。全ての動物から、ワクチン接種前、負荷試験前および死後に血液試料を採取した。
【表２】
0006931059.tif 000003
【０２０８】
３．３．試験したアジュバント
いくつかのワクチン処方物を試験したが、これらは使用した処方物のタイプおよびアジュバントの点が異なるだけであり；抗原含有量は同じであった。以下のアジュバントを試験した：
・Ａｍｐｈｉｇｅｎ：レシチン入りの鉱物油の水中油
・ＳＶＥＡ：スクワラン、ビタミンＥ−アセテートおよびＴｗｅｅｎ８０入りの微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）水中油型エマルション
・ＳＶＥＡ＋Ａｌ（ＯＨ）３：０．２％ｗ／ｖ水酸化アルミニウム入りのＳＶＥＡ（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ  Ｍｈｙｏの場合と同じ）
・ＭＦ５９＋ＤＤＡ：ＭＦ５９は、スクワレン、ポリソルベート８０およびＳｐａｎ８５入りの水中油型エマルションであり；ＤＤＡはカチオン性脂質：ジメチルジオクタデシルアンモニウムである。
【０２０９】
・ＳＰ油：国際公開第２０１３／１５２０８６号パンフレットに記載のような、プルロニック、スクワランおよびＴｗｅｅｎ。
【０２１０】
・Ｖａｘｌｉａｎｔ（商標）Ｓ５：未知の組成の専売アジュバント。
【０２１１】
３．４方法および材料
負荷試験：
負荷試験材料は、Ｍｈｙｏ、病原性野外株、豚血清入りのＦＲＩＩＳ培地中の新鮮な３日間培養物であった。９ＣＣＵを含有する１０ｍＬの培養物を２日連続で動物１匹に対して気管内投与した。全ての動物を通常の獣医学的管理下に置いた。
【０２１２】
ワクチン接種：
ワクチン接種は３週齢であったが、そのとき、動物はまだその母豚と一緒であった。用量は３ｍＬであり、頸部右側に筋肉内投与した。離乳は４週齢であった。負荷試験の１週間前に、豚を負荷試験施設に移した。
【０２１３】
血清学：
血液試料（頸静脈由来）をワクチン接種直前（Ｔ＝０）、負荷試験直前（Ｔ＝４）および死後（Ｔ＝７）に採取した。血清が得られるまで、試料を周囲温度で保持した。（Ｅｌｉｓａを介した）ＰＣＶ２またはローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）に対する血清試料中の関連抗体の存在は、標準的な手順に従って決定した。
【０２１４】
触診
ワクチン接種直前、ワクチン接種４時間後、ワクチン接種後２日間にわたり毎日および５週間にわたり毎週、ＳＶＥＡ群の注射部位を局所反応について検査した。ワクチン接種の５週間後に依然として局所反応を示した動物は、局所反応が消失するまで毎週個別に触診した。
【０２１５】
直腸温および臨床観察
直腸温を測定し、ワクチン接種の１日前および直前、ワクチン接種の４時間後ならびに１および２日後に臨床観察（０＝正常、１＝低活動性、２＝嘔吐、３＝臥位）を行った。
【０２１６】
死後検査：
この実験の終了時、負荷試験の３週間後に、全ての豚を安楽死させた。個々の動物における局所反応について注射部位を調べた。Ｇｏｏｄｗｉｎ＆Ｗｈｉｔｔｌｅｓｔｏｎｅスコアに従って、個々に各豚について％肺病変スコアを記録した。
【０２１７】
３．５．結果
【表３】
0006931059.tif 000004
【０２１８】
触診および体温の結果：
ワクチン接種部位の触診によって監視し、温度について調べた群は、ＳＶＥＡをアジュバントとして添加されたワクチンを投与された群（群２）であった。これらは、監視期間を通して検出可能な局所的腫脹および温度上昇が観察されなかったことを示した。
【０２１９】
３．６．結論
表２は、混合ワクチンに対する広い効力が達成困難であることを実証しており；試験したアジュバントのうちのいくつかは、病原体の１つまたはさらには２つに対して防御的であるとして示され得る免疫を誘導し；これは、低いＭｈｙｏ肺病変スコアに関して、またはＰＣＶ２およびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）に対する十分に高い特異的抗体タイターとしての何れかである。しかし、ＳＶＥＡアジュバント添加ワクチンについてのみ、３つ全ての病原体に効果的となるのに十分な防御であった。他のアジュバントは何れもその広範な効力レベルに達しなかった。
【０２２０】
生ＰＲＲＳＶに対するＳＶＥＡアジュバント添加混合ワクチンの殺ウイルス効果の欠如に対する実施例２からのデータにより、ＳＶＥＡアジュバント入りの混合ワクチンもＰＲＲＳＶに対して有効であろうと予測される。
【０２２１】
まとめると、このことから、本発明による混合ワクチンが、病原体Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶのそれぞれに対して免疫学的に有効であることが実証される。さらにこれは豚にも安全である。
【０２２２】
４．４種ワクチン接種−負荷実験
さらなるワクチン接種−負荷実験を実施し、それによって豚に本発明による４種混合ワクチンをワクチン接種し、４回の個別の実験において、このワクチンを４つの成分全て：Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、ＰＣＶおよびＰＲＲＳＶの効力について試験した。
【０２２３】
具体的には、Ｍｈｙｏおよびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の不活化抗原を含む水相と１：１で混合された、スクワラン、ビタミンＥアセテートおよびＴｗｅｅｎ  ８のサブミクロンエマルションおよびＰＣＶ２−Ｏｒｆ２の組み換え発現産物を含有する、３種混合ワクチンを実施例１および３に記載のとおり調製した。続いて、および豚のワクチン接種の直前に、４種混合ワクチンの２ｍＬ動物用量あたり１０＾５  ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶの全用量に達するのに必要な体積を使用して、凍結乾燥市販ＰＲＲＳワクチンのアンプルを溶解させるために、この３種ワクチンを使用した。ワクチン接種は、３週齢の豚に筋肉内経路によりワンショット投与として与えた。
【０２２４】
これら４つのワクチン抗原のそれぞれのワクチン効力のその後の分析は、これらの異なる状態に対する感染および疾患の特定の症状に焦点を合わせることを可能にするために、ワクチン接種および対照の攻撃感染によって個別の実験で行った。
【０２２５】
しかし、上記の実施例３に記載の結果と比較した場合、これらの攻撃感染の何れに対してもワクチン接種効力の結果における差異は予想されず；不活化抗原に対する防御に関して、４種ワクチンと比較した場合、３種の使用で何らかの異なる効果があるという可能性は非常に低かった。言い換えれば、４種混合ワクチン中のＰＲＲＳＶウイルスの存在は、Ｍｈｙｏ、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）またはＰＣＶ攻撃感染の何れか１つに対して、その混合ワクチンの効力に影響を与えることは予想され得なかった。さらに、以前の実験から、ＰＲＲＳウイルスの生存率に対してＳＶＥＡアジュバント中の３種ワクチンの有意な影響がなかったことが既に示されていたので、生ＰＲＲＳＶ成分の生存率および効力に対する影響は予想されなかった。その結果として、３種ワクチンへの混合によって、ＰＲＲＳウイルスが死滅させられなかったか、またはその感染性が損なわれなかったので、それが有効な防御を誘導することができない理由はなかった。
【０２２６】
これらの予想は、下記の４回の負荷実験の結果によって実際に確認された：本発明による４種混合ワクチンは、その４つの成分のそれぞれから、病原体による攻撃感染によって誘導される感染および疾患の徴候に対する有効な免疫防御を誘導することが分かった。また、その組み合わせからの悪影響または干渉はなかった。
【０２２７】
４．１．Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の効力
４種混合ワクチンは、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ凍結乾燥ワクチンを用いて上記のように調製した。
【０２２８】
実験の概要
この実験には２４匹のＳＰＦ仔豚を使用した。１２匹の動物の１つの群に、約３週齢で１回、筋肉内にワクチン接種した。１２匹の豚の１つの群はワクチン未接種のままにして、負荷試験の対照群とした。ワクチン接種の４週間後に、全ての動物に病原性Ｍｈｙｏ株を用いて負荷試験を行った。負荷試験の３週間後、全ての動物を安楽死させ、死後に肺病変について調べた。全ての動物から、ワクチン接種前、負荷試験前および死後に血液試料を採取した。
【０２２９】
実験の詳細
負荷試験材料は、豚血清入りのＦＲＩＩＳ培地中の新鮮な３日間培養物としてのＭｈｙｏ病原性野外株由来であった。動物１匹につき、それぞれ１０および９ＣＣＵを含有する１０ｍＬの培養物を２日連続で気管内投与した。全ての動物を通常の獣医学的管理下に置いた。
【０２３０】
ワクチン接種は３週齢であったが、そのとき動物はまだその母豚と一緒であった。用量は２ｍＬであり、頸部右側に筋肉内投与した。離乳は４週齢であった。負荷試験の１週間前に、豚を負荷試験施設に移した。
【０２３１】
血液試料（頸静脈由来）をワクチン接種直前（Ｔ＝０週）、負荷試験直前（Ｔ＝４週）および死後（Ｔ＝７週）に採取した。血清が得られるまで、試料を周囲温度で保持した。ＰＣＶ２またはローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）に対する血清試料中の関連抗体の存在は、標準的な手順に従ってＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２３２】
データ分析：
この実験の終了時、負荷試験の３週間後に、全ての豚を安楽死させた。Ｇｏｏｄｗｉｎ＆Ｗｈｉｔｔｌｅｓｔｏｎｅスコア（上出）に従って、個々に各豚について％肺病変スコアを記録した。
【０２３３】
結果
【表４】
0006931059.tif 000005
【０２３４】
結論：
本発明による４種混合ワクチンを用いた豚のワクチン接種は、Ｍｈｙｏ攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。また、血清学によって測定した場合、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＣＶ２に対する防御の良好な発達もあった。
【０２３５】
４．２．ＰＣＶ２効力
４種混合ワクチンは、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ凍結乾燥ワクチンを用いて上記のように調製した。
【０２３６】
実験概要および実験の詳細
仔豚を１０匹ずつの処置群に割り当てた。仔豚は、およそ５週齢のときに皮内または筋肉内にワクチン接種した：
−１群にＳＶＥＡアジュバント中の４種混合ワクチンを筋肉内にワクチン接種した：ＰＣＶ２−Ｏｒｆ２（２５００ＡＵ／ｍＬ）、Ｍｈｙｏ（１．０ＰＣＶＵ／ｍＬ）、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）（５０００ＡＵ／ｍＬ）および１０５ＴＣＩＤ５０／用量のＰＲＲＳＶとともに処方したワクチンの単回２ｍＬ用量。ＰＲＲＳワクチンを溶解してからワクチン接種するまでの時間は１時間であった。
【０２３７】
−群２は陽性対照であり、これは市販のワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ  ＩＤおよびＰｏｒｃｉｌｌｉｓ  ＰＲＲＳ  ＩＤを使用して、両方とも皮内経路によってワクチン接種したが、豚の背中の異なる部位に混合せずに与えた。
【０２３８】
−第３群の仔豚にはワクチン接種しなかった（陰性対照群）が、負荷試験を行った。
【０２３９】
ワクチン接種の３週間後（８週齢、ワクチン接種の３週間後、試料の日付［ＳＤ］２２日）に、鼻孔あたり３ｍＬの鼻腔内接種で、野生型ＰＣＶ２ｂ負荷試験ウイルス、株Ｉ１２／１１の５．０ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬを使用して、全動物に負荷試験を行った。
【０２４０】
負荷試験の３週間後、全動物を剖検し、鼠径リンパ節、腸間膜リンパ節、扁桃腺および肺を、ＰＣＶ２、ｂｔ  ｑＰＣＲの検出のために、および免疫組織化学によって、試料採取した。
【０２４１】
全仔豚を臨床徴候についてワクチン接種後に毎日観察した。ＳＤ−１、ＳＤ０、ＳＤ０＋４時間およびＳＤ１で温度を測定した。
【０２４２】
血清試料を全動物から回収し、これらをＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶおよびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）に対する抗体について試験した。
【０２４３】
血清、組織ならびに糞便および鼻腔スワブ試料を全動物から回収し、ｑＰＣＲによってＰＣＶ核酸について調べた。
【０２４４】
データ分析および結果：
温度の読み取りは有意な結果を示さなかった。
【０２４５】
組み合わせた血清学的結果を以下の表４で表す。
【０２４６】
ＰＣＶ２血清学：
２つのワクチン接種群からの仔豚は全て、試料日付２２（３週ｐ．ｖ．）で既に抗ＰＣＶ２抗体について１００％血清転換に達した。実際のタイターはその後さらに増加し、ＳＤ３５からプラトーに達した。ワクチン未接種の対照は、負荷試験後にのみ血清転換したが、２０％を超える血清転換には到達しなかった。
【０２４７】
ＰＣＶ２  ＩＨＣおよびｑＰＣＲ：
リンパ節および扁桃腺におけるＰＣＶの徴候について免疫組織学的スクリーニングおよびスコア化を行った。結果から、両ワクチン接種群において、スコアが平均０．３であり、一方ワクチン未接種の対照群において、ＩＨＣスコアが平均１．６であったことが示された。
【０２４８】
ｑＰＣＲの結果から、両ワクチン接種群で、豚において、血清、鼻腔もしくは糞便スワブまたは組織試料（リンパ節、扁桃腺および肺）に存在するＰＣＶ２が非常に少なかったことが示された。しかし、対照群は、負荷試験後にＰＣＶ２核酸に対して強く陽性になった。
【０２４９】
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）血清学
群１についてのローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）血清学は、ＳＤ２２からのタイターの上昇を示したが、一方で、対照群においては、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）タイターは着実な減少を示した。
【０２５０】
ＰＲＲＳＶ血清学
ＰＲＲＳＶについての血清学的結果は、典型的にはＳＰ（試料対陽性）比として表す。この比が０．４を上回ると、試料はＰＲＲＳＶ血清転換について陽性と見なされる。ＰＲＲＳＶについての表４のセクションは、これらのＳＰ値を表す。これらは、陽性対照群２（ｉｄ経路によるＰＲＲＳＶワクチン）の動物がＰＲＲＳＶ血清転換に対して強く陽性であったことを示し；それにもかかわらず、群１の動物（ｉｍ経路による４種混合ワクチン）もまた良好な血清転換率に達した。ワクチン未接種対照は、０．０５を上回るＳＰ比が見られなかったので、ＰＲＲＳＶについていかなる血清転換も殆ど示さなかった。
【表５】
0006931059.tif 000006
【０２５１】
結論：
本発明による４種混合ワクチンによる豚のワクチン接種は、ＰＣＶ２攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。また、血清学によって測定した場合、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＲＲＳＶに対する防御の良好な発達があった。
【０２５２】
４．３．ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）効力
４種混合ワクチンは、Ｐｒｉｍｅ  Ｐａｃ  ＰＲＲＳ凍結乾燥ワクチンを用いて上記のように調製した。
【０２５３】
実験の概要
３週齢豚の３つの群に４種混合ワクチンを接種し、５週間後に病原性ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）細菌による攻撃感染を行った。一方の群には完全４種ワクチンを与え、他方の群にはローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原を除く全ての同じ成分を含む対照ワクチンを与えた。第３群には対照ワクチンを与えたが、これらは負荷試験の前に集団にローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）感染がないことを確認するために負荷試験時に剖検したので、負荷試験を行わなかった。
【０２５４】
これらの群を比較して、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）負荷試験によって引き起こされた疾患：回腸炎、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）による回腸のコロニー形成、脱粒および体重増加に対する影響に対する混合ワクチンの単回投与の効力を決定した。
【０２５５】
ワクチン接種後に２１日間、または消散するまで、全ての豚を１日おきに局所的および全身的反応について評価した。負荷試験前にローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）による野外感染がないことを確認するために糞便試料を回収した。ワクチン接種および負荷試験に対する抗体反応を評価するために試験を通して血液試料を回収し、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）ｑＰＣＲ用に糞便試料も回収し、体重データを記録した。
【０２５６】
負荷試験の３週間後（１１週齢）に、残りの全ての動物を剖検し、回腸の肉眼的病変のスコアを決定し、粘膜擦過物をローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために回収した。回腸の切片も免疫組織化学（ＩＨＣ）および組織病理学のために回収した。
【０２５７】
実験の詳細
豚は雄雌混合であり、混血アメリカン・ヨークシャー−ランドレース−デュロック（ｍｉｘｅｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ−Ｌａｎｄｒａｃｅ−Ｄｕｒｏｃ）種であった。水および齢に適切な飼料を自由に摂取させた。
【０２５８】
完全４種ワクチンは、２ｍＬの動物用量あたり：Ｍｈｙｏ抗原  ２．０ＲＰ；ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原６０００  Ｅｌｉｓａ単位／ｍＬ；ＰＣＶ２  Ｏｒｆ２抗原５．７μｇ／ｍＬおよびＰＲＲＳＶ  １０＾５  ＴＣＩＤ５０を含んだ。
【０２５９】
負荷試験直前に、対照ワクチンを接種した２匹の豚を剖検して、負荷試験前にローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）感染がないことを検証した。
【０２６０】
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）負荷試験は、ワクチン接種の５週間後に（約８週齢）、動物１匹あたり病原性の生ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）４．６  １０Ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０の接種物で経口経路により行った。
【０２６１】
回腸の病変スコア化を回腸の２．５ｃｍ切片で行い、摘出し、１０％緩衝ホルマリン中で回収し、これを組織病理学的検査および免疫組織化学によるローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の存在のために使用した。
【０２６２】
回腸の残りの部分を開き、腸壁の肥厚を伴う粘膜増殖、浮腫、充血、鬱血、壊死および出血を含む、回腸炎（豚増殖性腸炎またはＰＰＥとも呼ばれる）のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）関連病変の存在について目視で粘膜表面を検査した。肉眼的病変に０（正常粘膜）から５（出血および／または壊死を伴う重症ＰＰＥ）の範囲のスコアを与えた。回腸擦過物も回収し、分析まで凍結した。
【０２６３】
データ分析：
回腸炎に対するスコアは、組織病理学による回腸炎の顕微鏡的病変スコアおよび回腸の肉眼的病変重症度スコアに基づいた。
【０２６４】
ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）感染（コロニー形成）は、顕微鏡的ＩＨＣスコアに基づいて決定された。
【０２６５】
直腸スワブおよび腸粘膜擦過物におけるローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の存在、および糞便中の排出について、ｑＰＣＲを用いてスコア化した。
【０２６６】
結果
糞便排出：
負荷試験から１４日後（ｄｐｃ）に群間で有意差は見られなかった。しかし、２０ｄｐｃでの糞便排出の結果から、この時点でワクチン接種豚が排出していたローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）はプラセボ群よりも有意に少ないことが示され（ｐ＝０．０１３４）、これによって、ワクチン接種物による、より早期の回復が示される。
【０２６７】
コロニー形成：
２０ｄｐｃで回収された回腸擦過物のｑＰＣＲから、プラセボワクチンを投与された群においてローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）による有意により多くのコロニー形成が示された（ｐ＝０．００９４）。
【０２６８】
毎日の重量増加：
負荷試験後、プラセボワクチンを投与された群と比較した場合、４種ワクチン接種豚において１日の重量増加も有意に改善された（ｐ＝０．０３３７）。
【０２６９】
結論：
本発明による４種混合ワクチンによる豚のワクチン接種は、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。
【０２７０】
４．４．ＰＲＲＳＶ効力
４種混合ワクチンを上記のように調製し、これに、ワクチン接種の直前に、ＰｒｉｍｅＰａｃ（商標）ＰＲＲＳワクチンのアンプルの再構成からのＰＲＲＳＶが含まれるようにした。
【０２７１】
実験の概要
この試験の目的は、３週齢豚のワクチン接種および４．５週間後に病原性ＰＲＲＳＶを用いて負荷試験を行うことにより、本発明による混合ワクチンのＰＲＲＳ分画の免疫原性を評価することであった。
【０２７２】
抗ＰＲＲＳＶ抗体およびＰＣＶ２ウイルス血症に対して陰性である、それぞれ２５匹の健康な豚の２つの群に、３週齢で、４種混合ワクチンの２ｍＬ用量またはＰＲＲＳＶを含まないプラセボ（３種）ワクチンを、筋肉内経路により接種した。抗原は全て、推定野外用量レベルで存在した。
【０２７３】
およそ７．５週齢で、豚に対してＰＲＲＳウイルス株ＮＡＤＣ−２０を用いて鼻腔内に負荷試験を行った。負荷試験後の期間を通じて、豚を臨床所見および臨床スコアについて評価し、血液および鼻腔スワブ試料を回収した。負荷試験の１４日後に、全ての豚を安楽死させ、剖検した。肺の肉眼的病変をスコア化し、組織病理学および免疫組織化学（ＩＨＣ）のために肺切片およびリンパ節を回収した。攻撃感染後の呼吸器疾患、ウイルス血症および／またはＰＲＲＳＶの排出の軽減に対する単回用量の混合ワクチンの効力を決定するために、結果を評価した。
【０２７４】
ワクチン接種時、負荷試験時および試験終了時に体重を記録した。
【０２７５】
実験の詳細
鼻腔あたり２ｍＬの希釈負荷試験材料を用いて、鼻腔内にＰＲＲＳＶ負荷試験を行った。負荷試験ウイルスを投与直前に調製し、使用前および使用中は氷上で維持した。総負荷試験用量は、動物１匹あたりおよそ４．２ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０であった。
【０２７６】
完全４種ワクチンは、２ｍＬの動物用量あたり：Ｍｈｙｏ抗原  ２．０ＲＰ；ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原７０００  Ｅｌｉｓａ単位／ｍＬ；ＰＣＶ２  Ｏｒｆ２抗原  ５．７μｇ／ｍＬおよびＰＲＲＳＶ  １０＾５  ＴＣＩＤ５０を含んだ。
【０２７７】
データ分析
負荷試験の直前および続いてその後に、呼吸促迫および嗜眠の臨床所見を記録した。臨床スコアは、０：正常から３：重度の呼吸困難および／または頻呼吸および／またはストレス時の顕著な腹式呼吸の範囲で示され、豚の急速な動きを短時間誘発することによってストレスが誘発された。
【０２７８】
肺スコア化は、Ｈａｌｂｕｒら（１９９５，Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．３２，ｐ．６４８〜６６０［Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ７，Ｒｅｆ．１］）に従って適用した。肺炎に冒された肺のパーセンテージを推定するために、肉眼的肺病変にスコアを与えた。各肺葉には、その肺葉によって表される肺全体のおおよその体積パーセンテージを反映させるために点数が割り当てられた。１０点の見込まれる点（背側が５点、腹側が５点）を右前葉、右中葉、左前葉の前部および左前葉の後部にそれぞれ割り当てた。副葉に５点の見込まれる点を割り当て、２７．５点の見込まれる点（背側に１５、腹側に１２．５）を合計１００点の見込まれる点に達するように左右後葉のそれぞれに割り当てた。肉眼的肺病変スコアは、ＰＲＲＳ関連肺炎によって影響を受けたその葉のおおよその体積パーセンテージを反映する点数として記録した。各肺に対する総肺病変スコアは、全葉の肉眼的肺病変スコアの合計として計算した。
【０２７９】
組織病理学的検査のために各豚から肺試料を採取し、具体的には、左中葉の先端、副葉の一部および右後葉の前部であった。さらに、切片を縦隔および気管支リンパ節から採取した。組織病理学およびＩＨＣのために、組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。
【０２８０】
さらなる回収物は、抗ＰＲＲＳＶ抗体の検出のための血清試料；定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰＲＲＳＶ核酸の検出のための鼻腔スワブ；および顕微鏡分析およびＩＨＣ用の組織試料であった。
【０２８１】
ＭＡＲＣ１４５細胞株においてＰＲＲＳＶ試料を滴定した。各反復物について、予め形成された細胞単層を含有する９６ウェルプレート中の１０個のウェルに連続１０倍希釈液を添加し、５％ＣＯ２とともに３５〜３９℃で５日間、プレートを温置した。次にプレートを固定し、抗ＰＲＲＳＶ蛍光抗体で染色し、ＩＦＴによりスコア化した。
【０２８２】
ワクチン接種効力に対する結果変数は、負荷試験の１４日後の、負荷試験後の期間の臨床所見および臨床スコア、体温、体重、鼻腔排出およびＰＣＲにより判定した場合のウイルス血症の分析ならびに、肺病変の肉眼的および顕微鏡的分析によって評価した。肉眼的肺病変スコアにより呼吸器疾患を評価した。
【０２８３】
組織病理学およびＩＨＣによる組織分析による効力、ウイルス血症の最大量、排出の最大量、負荷試験後の体重増加、負荷試験後の臨床所見および負荷試験後の呼吸器臨床スコアの副次的変数。
【０２８４】
結果
関与する肺の％での肺病変スコアの中央値は、プラセボワクチン群については２０％であり、それに対して４種ワクチン群については７％であった（ｐ＝０．００１４）。
【０２８５】
３つの回収された肺試料の組織病理学を０（正常）から４（重症間質性肺炎）の尺度でスコア化した。最大スコアは、プラセボワクチン群については３、それに対して４種ワクチン群については２であった（ｐ＝０．００１０）。
【０２８６】
肺試料の免疫組織化学を０（ＰＲＲＳＶ抗原陽性細胞なし）から４（組織切片あたり陽性細胞が＞１００個）の尺度でスコア化した。３つの回収肺試料のスコアの最大値は、プラセボワクチン群では２、それに対して４種ワクチン群では１であった（ｐ＝０．０００６）。
【０２８７】
結論：
本発明による４種混合ワクチンによる豚のワクチン接種は、ＰＲＲＳＶ攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。