(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置に、それぞれトレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びアラニン（Ａ）のアミノ酸残基を有する修飾されたヒトＦｃフラグメントを含み、
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、かつ、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことを特徴とするＩｇＧ抗体。
【請求項２】
Ｆｃフラグメントが、タイプＩｇＧ１、タイプＩｇＧ２、タイプＩｇＧ３、又はタイプＩｇＧ４である請求項１に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項３】
Ｆｃフラグメントが、タイプＩｇＧ４である請求項１に記載のＩｇＧ抗体。
【請求項４】
細胞内でＩｇＧ抗体をコードするポリヌクレオチドを発現することを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のＩｇＧ抗体を調製する方法。
【請求項５】
前記細胞が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞である請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫学及び抗体工学の分野に関し、特に、ＩｇＧ様抗体のＦｃＲｎへの結合親和性を増加させ、その血清半減期を延長させる方法、及び修飾されたＩｇＧ様抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体は、ジスルフィド結合によって結合されている、４つのペプチド鎖、即ち５０ｋＤの高分子量の２つの重鎖（Ｈ鎖）及び２３ｋＤの小さい分子量の２つの軽鎖（Ｌ鎖）からなる抗原に特異的に結合するタンパク質である。アミノ酸の安定した種、数、及び順序を有するポリペプチドのＣ末端における領域は、定常領域又は安定領域（即ち、Ｃ領域）と呼ばれ、Ｌ鎖の配列の１／２及びＨ鎖の配列の３／４を占める。アミノ酸の異なる種及び順序を有するポリペプチドのＮ末端における領域は、可変領域（即ち、Ｖ領域）と呼ばれ、超可変性による抗体の多様性を決定し、それによって抗体と抗原との間の特異的結合を決定する。
【０００３】
ヒトは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスを更に含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスを含む）、及びＩｇＭを含む５つの異なるタイプの抗体を主に含み、ＩｇＧは、ヒトにとって最も重要な免疫グロブリンであるので、一般的に治療に使われている。しかしながら、天然のＩｇＧ抗体は、血液循環における低い持続性及び短い血清半減期などの深刻な欠陥を示し、ＩｇＧクリアランス速度による治療の有効性に直接影響を及ぼすこととなり、更に患者に副作用を引き起こし、薬物投与の頻度と用量を増加させる。したがって、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体（特に天然のＩｇＧ様抗体）の結合親和性を増加させ、その血清半減期を延長することは非常に重要である。
【０００４】
しかしながら、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体（特に天然のＩｇＧ様抗体）の結合親和性を増加させ、その血清半減期を延長させる方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の実施形態は、関連技術に存在する問題の少なくとも１つを少なくともある程度まで解決することを目的とする。この目的のために、本開示の目的は、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させ、その血清半減期を延長させるための手段を提供することである。
【０００６】
本開示は、以下の発見及び研究に従って本発明者らによって達成されることに留意されたい。
【０００７】
ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＮ末端におけるジスルフィド結合を切断することによって、パパインで加水分解されることができ、それによって３つのフラグメント、即ち抗体結合性の２つの同一のフラグメント（即ち、Ｆａｂ）及び結晶化できるフラグメント（即ち、Ｆｃ）を得ることができる。抗体の結晶化できるフラグメントＦｃは、様々なＦｃ受容体及びリガンドと相互作用し、それによって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ファゴサイトーシス、及び抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の開始、並びにトランスサイトーシスを介した細胞バリアによる抗体の輸送を含む、抗体に対して重要なエフェクター機能を与える。更に、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ様抗体の血清半減期を維持するのに重要である。
【０００８】
胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、上皮細胞による免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の能動輸送を担う受容体であり、非共有結合で結合されている、α鎖サブユニットとβ鎖サブユニットからなるヘテロ二量体である。ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントは、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、それぞれはその個々のＦｃＲｎ結合部位によって単一のＦｃＲｎ分子に結合する。成体哺乳動物において、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃフラグメントを介してＦｃＲｎに結合し、それによってＩｇＧ抗体を分解から保護するので、Ｆｃフラグメントは血清抗体レベルを維持する上で極めて重要である。内皮細胞によって形質膜陥入された後にＦｃＲｎに結合したＩｇＧ抗体は、血流中を循環し、一方ＦｃＲｎに結合しなかったＩｇＧ抗体は、リソソームによって分解される。従って、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ抗体がＦｃＲｎに結合する結合親和性にとって重要である。
【０００９】
そこで、本発明者らは、ＩｇＧ様抗体（即ち、Ｆｃフラグメントの配列）の重鎖定常領域の配列を変えることで、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させ、ＩｇＧ様抗体（特に、天然のＩｇＧ様抗体）の血清半減期を延長させる方法を提案することを試みた。即ち、本発明者らは、ＩｇＧ様抗体のＦｃフラグメント中のアミノ酸を変異させることによって、血清半減期及びＦｃＲｎに対する結合親和性を改善することを目的とする。驚くべきことに、一連の実験設計及び調査の後、ヒトＩｇＧ様抗体のＦｃフラグメントにアミノ酸変異を導入することによって、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性が改善され、それによってＩｇＧ様抗体の血清半減期を増加させることができることが本発明者らによって見出された。具体的には、ＩｇＧ様抗体のＦｃフラグメントは、アミノ酸２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置で、野生型ＩｇＧ様抗体（アミノ酸変異を含まない）におけるものとは異なるアミノ酸で変異し、それによって野生型ＩｇＧ様抗体と比べて延長した血清半減期を示す最適化された抗体を得る。言い換えれば、本発明者らは、ＩｇＧ様抗体の重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸を変異させることによって、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を効果的に増加させ、その血清半減期を延長させることができることを見出した。
【００１０】
したがって、一つの態様においては、実施形態における本開示は、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させ、その血清半減期を延長させる方法を提供する。実施形態においては、前記方法は、前記ＩｇＧ様抗体の重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸を変異させることを含む。したがって、得られた修飾されたＩｇＧ様抗体は、特異的抗原に対する結合親和性を維持しながら、ＦｃＲｎに対する結合親和性を効果的に増加させ、血清半減期を延長させた。
【００１１】
更に、前記ＩｇＧ様抗体の重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸を変異させる方法としては、２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸を変異させることが達成可能であれば、特に限定されず、例としては化学誘導法、部位特異的変異誘発などが挙げられることに留意されたい。一般的に、変異されたアミノ酸に対応する特定のヌクレオチドで、ＩｇＧ様抗体をコードする遺伝子におけるヌクレオチド（２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸に対応する）を変異させることによって、アミノ酸変異は、遺伝子レベルで得られることができ、それによって変異されたコード遺伝子に基づいて、ＩｇＧ様抗体変異体（本明細書では「修飾されたＩｇＧ様抗体」とも呼ばれる）を得ることができる。したがって、この態様から、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させ、その血清半減期を延長させる方法は、既知のＩｇＧ様抗体と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加し、血清半減期が延長したＩｇＧ様抗体変異体を調製する方法として見なされることができる。
【００１２】
実施形態においては、前記ＩｇＧ様抗体の前記重鎖定常領域の前記ＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置の前記アミノ酸が、それぞれトレオニン、プロリン、及びアラニンに変異される。したがって、ＩｇＧ様抗体の血清半減期は延長され、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性は、著しく増加される。
【００１３】
別の態様においては、実施形態における本開示は、修飾されたＩｇＧ様抗体を提供する。実施形態においては、修飾されたＩｇＧ様抗体は、野生型ＩｇＧ様抗体に対して、重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置でアミノ酸変異を有する。驚くべきことに、修飾されたＩｇＧ様抗体が、野生型ＩｇＧ様抗体と比較して、ＦｃＲｎに対する増加した結合親和性及び延長された血清半減期を示しながら、特異的抗原に対する結合親和性を維持することを本発明者らによって見出された。
【００１４】
実施形態においては、前記野生型ＩｇＧ様抗体に対して、前記修飾されたＩｇＧ様抗体の前記重鎖定常領域の前記ＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置の前記アミノ酸変異が、それぞれトレオニン、プロリン、及びアラニンである。したがって、修飾されたＩｇＧ様抗体は、野生型ＩｇＧ様抗体と比較して、延長した血清半減期及びＦｃＲｎに対する顕著に増加した結合親和性を示す。
【００１５】
更なる態様において、実施形態における本開示は、上記に記載された修飾されたＩｇＧ様抗体を調製する方法を提供する。実施形態においては、前記方法は、標的ＩｇＧ様抗体をコードする核酸配列を前記標的ＩｇＧ様抗体のアミノ酸配列に係る遺伝子合成を介して生成することと；前記標的ＩｇＧ様抗体をコードする前記核酸配列を含む発現ベクターを構築することと；前記発現ベクターで抗体産生細胞をトランスフェクトし、前記抗体産生細胞が、前記標的ＩｇＧ様抗体を発現し、分泌するようにすることと、を含み、前記標的ＩｇＧ様抗体は、前記修飾されたＩｇＧ様抗体である。
【００１６】
したがって、野生型ＩｇＧ様抗体に対して、ＦｃＲｎに対する増加した結合親和性及び延長した血清半減期を示す修飾されたＩｇＧ様抗体（即ち、標的ＩｇＧ様抗体）は、容易且つ効果的な方法で調製されることができる。言い換えれば、実施形態によれば、上記に記載された方法を用いることによって、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長した血清半減期を有する、新しいＩｇＧ様抗体を調製することができる。更に、修飾されたＩｇＧ様抗体とその特異的抗原との間の結合親和性は、野生型ＩｇＧ様抗体に対して維持されることに留意されたい。
【００１７】
使用される抗体産生細胞の種類は、修飾されたＩｇＧ様抗体が効率よく発現、及び分泌されることができるのであれば、特に限定されず、例えば、抗体産生細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ヒトなどに由来する細胞であることができる。実施形態においては、前記抗体産生細胞は、２９３細胞である。したがって、修飾されたＩｇＧ様抗体は、高収率かつ優れた効果で容易に製造されることができる。
【００１８】
更に、発現ベクターの種類及び具体的なトランスフェクション方法は、修飾されたＩｇＧ様抗体が発現されることができるのであれば、特に限定されない。
【００１９】
更に、本明細書で用いられる「アミノ酸」という用語は、特定の定義された位置に存在することができる２０個の天然アミノ酸又はその非天然類似体の任意の１つを意味することに留意されたい。前記２０個の天然アミノ酸は、３文字コード又は１文字コードに略されることができる。
【表１】
0006974500.tif 000002
【００２０】
２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸などの「ｎ番目の位置のアミノ酸」という表現は、タンパク質のアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置を指す。本開示のＦｃフラグメントについて、アミノ酸位置は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って番号付けされることができる。
【００２１】
本開示の更なる態様及び利点は、部分的に以下の説明に記載され、その一部は、その説明から明らかになるか、又は本開示の実施から理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本開示の上記及び／又は追加の態様及び利点は、以下の図と組み合わせた実施例の記載から明らかとなり、容易に理解されるであろう。
【図１】図１は、本開示の幾つかの実施形態に係るＰＤ−１に結合しているＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体のＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本開示の幾つかの実施形態に係る、ＰＤ−１の結合においてＰｄＬ１と競合しているＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の競合ＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本開示の幾つかの実施形態に係る、ＰＤ−１の結合においてＰｄＬ２と競合しているＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の競合ＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本開示の幾つかの実施形態に係るＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータを示すグラフである。
【図５】図５は、本開示の幾つかの実施形態に係るＰＤ−１タンパク質の活性化のブロッキングを介して、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＬ−２の含有量を示すグラフである。
【図６】図６は、本開示の幾つかの実施形態に係るＰＤ−１タンパク質の活性化のブロッキングを介して、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγの含有量を示すグラフである。
【図７】図７は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の血清濃度研究においてＥＬＩＳＡによって測定されたＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の濃度―時間の曲線を示すグラフである。
【図８】図８は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、１ｍｇ／ｋｇのＨ８Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。
【図９】図９は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、３ｍｇ／ｋｇのＨ８Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、１０ｍｇ／ｋｇのＨ８Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、１０ｍｇ／ｋｇの野生型のＨ２Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、野生型Ｈ２Ｌ２抗体及びＨ８Ｌ２抗体の有効平均半減期を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示の実施例を詳細に参照する。当業者であれば、以下の実施例は説明のためのものであり、本開示の範囲を限定するものと解釈されることができないことを理解するであろう。具体的な技術又は条件が実施例において明記されていない場合、当技術分野における文献（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｈｕａｎｇ  ＰＴにより翻訳）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓを参照）に記載されている技術又は条件に従って、又は製品の説明書に従って、工程が行われる。試薬又は機器の製造元が明記されていない場合、試薬又は機器は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に利用可能であることがある。
【００２４】
実施例１  Ｈ８Ｌ２抗体のタンパク質発現
ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体（ＰＤ−１に対するＩｇＧ様抗体）において、重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸は、それぞれトレオニン、プロリン、及びアラニンに変異し、ＰＤ−１に対するＩｇＧ様抗体Ｈ８Ｌ２（即ち、Ｈ８Ｌ２抗体）として名付けられたバリアントを得る。
【００２５】
即ち、目的のＨ８Ｌ２抗体は、重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位におけるアミノ酸位置２５４番目でトレオニン変異、アミノ酸位置３０８番目でプロリン変異、及びアミノ酸位置４３４番目でアラニン変異を有し、残ったアミノ酸は、ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体と比較して変わらなかった。
【００２６】
実際には、遺伝子合成を介して形成されたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体をコードする核酸配列を発現ベクターで構築し、哺乳類細胞２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、哺乳類細胞２９３細胞によって、ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体が発現され、分泌された。次いで、得られたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体をプロテイン−Ａアフィニティーカラムで精製し、精製されたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体を得た。
【００２７】
上記に記載されるように、ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体とヒト化Ｈ８Ｌ２抗体との間の差は、重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸のみにあるので、参考までに単にＨ８Ｌ２抗体のアミノ酸配列を提供する。
【００２８】
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖は、下記のアミノ酸配列のものである。
【化１】
0006974500.tif 000003
Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖可変領域に下線を引き、Ｈ８Ｌ２抗体の変異部位（Ｈ２Ｌ２抗体に対して）は、四角で囲み、それぞれ、重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸変異である。
【００２９】
具体的には、Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖定常領域のＦｃＲｎ−結合部位におけるアミノ酸変異について、ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体と比較して、２５４番目の位置のアミノ酸は、セリンからトレオニンに変異し、３０８番目の位置のアミノ酸は、バリンからプロリンに変異し、４３４番目の位置のアミノ酸は、アスパラギンからアラニンに変異している。
【００３０】
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖をコードする核酸配列は、下記の通りである。
【化２】
0006974500.tif 000004
重鎖可変領域をコードする核酸配列に線が引かれる。
【００３１】
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の軽鎖は、下記のアミノ酸配列のものである。
【化３】
0006974500.tif 000005
Ｈ８Ｌ２抗体の軽鎖可変領域に下線が引かれる。
【００３２】
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の軽鎖をコードする核酸は、下記のヌクレオチド配列のものである。
【化４】
0006974500.tif 000006
軽鎖可変領域をコードする核酸配列に線が引かれる。
【００３３】
実施例２  組み換えのヒト化Ｈ８Ｌ２抗体のＥＬＩＳＡ実験
ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体及び実施例１で調製したヒト化Ｈ８Ｌ２抗体を、以下に詳細に記載されるように、比較のためにＥＬＩＳＡ結合実験及び競合ＥＬＩＳＡ実験に付した。
【００３４】
２．１  １８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体のＥＬＩＳＡ結合実験
具体的には、ＥＬＩＳＡ結合実験を下記の通り行った。
【００３５】
工程ａ）：抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＰＤ−１−ｈｉｓ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
【００３６】
工程ｂ）：ブロッキング
ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡを用いて、ＰＤ−１−ｈｉｓ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間ブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
【００３７】
工程ｃ）：一次抗体によるインキュベーション
１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体を、それぞれ２μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。ブランクコントロールとしてのＰＢＳ溶液と共に、１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体のそれぞれの７つの勾配抗体溶液を、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００３８】
工程ｄ）：二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００３９】
工程ｅ）発色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェル当たり１００μｌ添加し、５分間〜１０分間室温でインキュベーションした。
【００４０】
工程ｆ）：発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
【００４１】
工程ｇ）：読み（ｒｅａｄｉｎｇ）
マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００４２】
図１は結果を示し、ＰＤ−１に結合するＨ８Ｌ２及びＨ２Ｌ２のＥＣ５０値は、それぞれ０．０４ｎＭ及び０．０５ｎＭであると算出される。図１から分かるように、ＦｃＲＮ−結合部位における変異は、ＰＤ−１への抗体の結合に影響を及ぼさない。
【表２】
0006974500.tif 000007
【００４３】
２．２  ＰＤＬ１と、１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体との競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的には、以下のようにして競合ＥＬＩＳＡ実験を行った。
【００４４】
工程ａ）：抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）の濃度のＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
【００４５】
工程ｂ）：ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄した。
【００４６】
工程ｃ）：一次抗体によるインキュベーション
１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体を、それぞれ６μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。ブランクコントロールとしてのＰＢＳ溶液と共に、１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体のそれぞれの７つの勾配抗体溶液（ウェル当たり５０μｌ）を、ブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
【００４７】
工程ｄ）：リガンドとのインキュベーション
ウェル当たり５０μｌで、０．６μｇ／ｍｌのＰＤＬ１−ｍＩｇＧ２ａＦｃ溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００４８】
工程ｅ）：二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体としての１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり５０μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００４９】
工程ｆ）：発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり５０μｌ添加し、５分間〜１０分間室温でインキュベーションした。
【００５０】
工程ｇ）：発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
【００５１】
工程ｈ）：読み
マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００５２】
図２は結果を示し、ＰＤ−Ｌ１の存在下でＰＤ−１に競合的に結合するＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体のＥＣ５０値は、それぞれ０．４７４ｎＭ及び０．７８３ｎＭであり、ＦｃＲＮ−結合部位における変異は、ＰＤ−Ｌ１の存在下で、ＰＤ−１に対する競合的な結合に影響を及ぼさないことを実証する。
【表３】
0006974500.tif 000008
【００５３】
２．３  ＰＤＬ２と、１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体との競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的には、以下のようにして競合ＥＬＩＳＡ実験を行った。
【００５４】
工程ａ）：抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１．０μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
【００５５】
工程ｂ）：ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで４回洗浄した。
【００５６】
工程ｃ）：一次抗体によるインキュベーション
１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体を、それぞれ２０μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。ブランクコントロールとしてＰＢＳ溶液と共に、１８Ａ１０  Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０  Ｈ２Ｌ２抗体のそれぞれの７つの勾配抗体溶液（ウェル当たり５０μｌ）を、ブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
【００５７】
工程ｄ）：リガンドとのインキュベーション
１．０μｇ／ｍｌのＰＤＬ２−ｈｉｓ  ｔａｇ溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００５８】
工程ｅ）：二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで５回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：７５０希釈（ウェル当たり５０μｌ）で、二次抗体としてのＨＲＰ−結合モノクローナルマウス抗ｈｉｓ  ｔａｇを添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００５９】
工程ｆ）：発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで６回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
【００６０】
工程ｇ）：発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
【００６１】
工程ｈ）：読み
マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００６２】
図３は結果を示し、ＰＤＬ２の存在下でＰＤ−１に競合的に結合するＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体のＥＣ５０値は、それぞれ１．８３ｎＭ及び１．５８ｎＭであり、ＦｃＲＮ−結合部位における変異は、ＰＤＬ２の存在下で、ＰＤ−１に対する競合的な結合に影響を及ぼさないことを実証する。
【表４】
0006974500.tif 000009
【００６３】
実施例３  Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機器を用いたＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータの決定
【００６４】
比較のために、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機器を用いて、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータを決定し、詳細を下記に記載する。
【００６５】
ＳＡセンサーの表面にビオチン標識ＰＤ−１抗原を固定化した。ＰＢＳＴバッファで平衡化した後、ＰＢＳＴを用いて１：３で段階希釈したＨ８Ｌ２抗体（それぞれ２００ｎＭ、６６．６７ｎＭ、２２．２２ｎＭ、７．４１ｎＭ、２．４７ｎＭ、０．８２ｎＭ、０．２７ｎＭ、及び０ｎＭ）をビオチン標識ＰＤ−１抗原に結合するためのＳＡセンサーに適用し、その後、解離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のためにＰＢＳＴをＳＡセンサーに適用した。Ｈ２Ｌ２抗体についてのアッセイは、Ｈ８Ｌ２抗体と同じである。Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータの結果を図４に示し、ＦｃＲＮ−結合部位における変異は抗体の速度論的特性パラメータに影響を及ぼさないことが理解できる。
【００６６】
実施例４  混合リンパ反応下のＰＤ１に対する抗体の生物学的活性のアッセイ
比較のために、混合リンパ反応（ＭＬＲ）により、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下で、ＩＬ−２分泌及びＩＦＮγ分泌についてＴリンパ球を分析し、以下に詳細に記載される。
【００６７】
ＭＬＲについては、ＤＣ細胞の抗原提示機能下で、Ｔ細胞がＩＬ−２及びＩＦＮγを分泌するように、異なるヒト供給源からのＴ細胞（ＴＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）を混合した。具体的には、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の誘導下で血中の単球が未成熟ＤＣ細胞に分化し、その後、未成熟ＤＣ細胞が腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の刺激を介して成熟するように誘導された。続いて、成熟ＤＣ細胞と同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＴＣ細胞を混合し、５日間培養した後、細胞上清中の分泌されたＩＬ−２及びＩＦＮγを決定した。この実施例では、ＴＣ細胞（ウェル当たり１×１０５）及び成熟ＤＣ細胞（ウェル当たり１×１０４）を９６ウェルプレート中で混合し、その後個々の抗体の存在下で、８つの勾配濃度（即ち、１０μＭ〜０．０９７６５６２５ｎＭ）で５日間培養し、その後細胞上清中のＩＬ−２の量をＩＬ−２アッセイキットで検出した。同様に、ＴＣ細胞（ウェル当たり１×１０５）及び成熟ＤＣ細胞（ウェル当たり１×１０４）を９６ウェルプレート中で混合し、その後個々の抗体の存在下で、５つの勾配濃度（即ち、３００ｎＭ〜０．１ｎＭ）で５日間培養し、その後、細胞上清中のＩＦＮγの量をＩＦＮγアッセイキットで検出した。
【００６８】
図５は、それぞれＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＬ−２の含有量を示し、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体は、Ｔ細胞を刺激し、効果的にＩＬ−２を分泌することができることが分かり、ＦｃＲＮ−結合部位における変異が抗体の刺激下で、Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌に影響を及ぼさないことを実証する。
【００６９】
図６は、それぞれＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγの含有量を示し、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体は、Ｔ細胞を刺激し、効果的にＩＦＮγを分泌することができることが分かり、ＦｃＲＮ−結合部位における変異が抗体の刺激下で、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌に影響を及ぼさないことを実証する。図６中の「ＩｇＧ」は、コントロールとしてのアイソタイプ抗体である。
【００７０】
実施例５  カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の血清濃度研究
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の血清濃度を比較のためにそれぞれ検出し、以下に詳細に記載する。
【００７１】
４頭のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）について、１群当たり２頭の動物で、それらの体重として２つの群に無作為に分け、それぞれＨ８Ｌ２群とＨ２Ｌ２群と名付けた。それぞれ投与前、及び投与後５分間、５時間、２４時間、７２時間、１６８時間、及び２４０時間で、全血をサンプリングして、１ｍｇ／ｋｇの用量で各群をその個々の抗体で静脈内注射により投与した。血清を全血から分離し、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の含有量をそれぞれＥＬＩＳＡ法によって測定し、図７及び下記の表で見ることができる。
【表５】
0006974500.tif 000010
【００７２】
実施例６  カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の薬物動態を比較のために試験し、詳細を下記に記載する。
【００７３】
２４頭のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）について、１群当たり６頭の動物（各群において雄と雌半分）で、それらの体重として４つの群に無作為に分け、それぞれＨ２Ｌ２群（１０ｍｇ／ｋｇ）と、異なる投与量における３つのＨ８Ｌ２群（投与量が低い１ｍｇ／ｋｇ、中程度の３ｍｇ／ｋｇ、及び高い１０ｍｇ／ｋｇ）と名付けた。静脈内注射により、各群にその個々の抗体を投与し、それぞれ投与前、及び投与後５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、１４４時間、及び２１６時間で全血をサンプリングした。全血から血清を分離し、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）６．４によって計算された関連する薬物動態パラメータを用いて、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の含有量をそれぞれ、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【００７４】
単回投与前には、全カニクイザルの個体におけるＨ２Ｌ２抗体及びＨ８Ｌ２抗体の血清濃度は、定量の下限値よりも低い。投与後、３つのＨ８Ｌ２群のカニクイザルにおけるＨ８Ｌ２抗体の血清濃度は、投与量につれて上昇し、低投与量群（即ち、１ｍｇ／ｋｇ）、中投与量群（即ち、３ｍｇ／ｋｇ）、及び高投与量群（即ち、１０ｍｇ／ｋｇ）の有効平均半減期は、それぞれ、２１５．７２時間（図８を参照）、２８８．７８時間（図９を参照）、及び２６８．９２時間（図１０を参照）である。更に、野生型Ｈ２Ｌ２群の有効平均半減期（１０ｍｇ／ｋｇの投与量）は２２４時間である（図１１を参照）。１０ｍｇ／ｋｇの同じ投与量下で、Ｈ８Ｌ２群は野生型Ｈ２Ｌ２群よりも長い有効平均半減期を示すことが見られる（図１２を参照）。
【００７５】
実施例７  ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の皮下移植腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルにおけるＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果
ＮＳＧマウスにおいてヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株を用いて樹立された皮下移植腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルを使用することによって、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果を調査し、詳細を下記に記載する。
【００７６】
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、及びＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ欠失又は変異を特徴とするＮＳＧマウスは、最も高い免疫不全を有すので、ヒト由来細胞及び組織に対して拒絶することなく、ヒト由来細胞移植に最も適したツールとなる。上記に基づき、本発明者らは、ＮＳＧマウスへのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の養子移植によって樹立された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨ８Ｌ２抗体の薬学的効果を評価した。また、本発明者らは、ＮＳＧマウスを用いて皮下移植腫瘍モデル（即ち、ＭｉＸｅｎｏモデル）を樹立し、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の皮下移植腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルにおけるＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果を更に見出した。
【００７７】
具体的には、０日目（Ｄａｙ０）にマウス当たり５×１０６細胞の用量で、各４０頭のＮＣＧマウス（３２頭の実験用マウス及び予備用に８頭のマウス）の背面右側に、皮下注射によってＨＣＣ８２７細胞を接種した。接種後６日目（Ｄａｙ６）に、６６ｍｍ３までの腫瘍の大きさを有する３２頭のＮＣＧマウスを１群当たり８頭のマウスで４つの群に分け、そして各マウスを０．１ｍｌのＰＢＭＣ（ＰＢＳバッファ中で懸濁）の尾静脈内移植に付した。表１に示されるように、４つの群（即ち、３２頭のマウス）において、Ｈ８Ｌ２  ５ｍｇ／ｋｇ処置群（群１）、Ｈ８Ｌ２  １０ｍｇ／ｋｇ処置群（群２）、ポジティブコントロールとしてのＯｐｄｉｖｏ  ５ｍｇ／ｋｇ処置群（群３）、及びコントロールとしてのアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ４）５ｍｇ／ｋｇ群（群４）をそれぞれ接種後６日目、９日目、１３日目、１６日目、１９日目、及び２２日目に、全部で６回の投与によって、尾静脈を介して皮下投与した。相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）に従って有効性を評価し、マウスの体重変化及び死亡によって、安全性を評価した。
【００７８】
【表６】
0006974500.tif 000011
【００７９】
表２を参照すると、コントロールとしてのアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ４）５ｍｇ／ｋｇ群に対して、Ｈ８Ｌ２  １０ｍｇ／ｋｇ処置群は、腫瘍細胞の接種後９日目及び１３日目に、腫瘍増殖の有意な抑制を示し、相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）は、それぞれ、３０％（ｐ＝０．００７）及び３０％（ｐ＝０．０３９）であり、Ｈ８Ｌ２  ５ｍｇ／ｋｇ処置群も、腫瘍細胞の接種後９日目及び１３日目に、腫瘍増殖の有意な抑制を示し、相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）は、それぞれ、１８％（ｐ＝０．０４９）及び２５％（ｐ＝０．０４１）であるが、一方、Ｏｐｄｉｖｏ  ５ｍｇ／ｋｇ処置群は、腫瘍細胞の接種後９日目及び１３日目に、腫瘍増殖の有意な抑制を示さず、相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）は、それぞれ、１７％（ｐ＝０．０８４）及び２３％（ｐ＝０．０７３）である。結果は、Ｈ８Ｌ２抗体が、ポジティブコントロールとして使用されるＯｐｄｉｖｏ群よりも更に良好な有効性で、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルの腫瘍増殖を有意に抑制することができることを実証する。更に、Ｈ８Ｌ２  ５ｍｇ／ｋｇ処置群及びＨ８Ｌ２  １０ｍｇ／ｋｇ処置群は、最初の投与から１６日間以内に（即ち、接種後６日目から２２日目）に、Ｏｐｄｉｖｏ  ５ｍｇ／ｋｇ処置群と同様の薬剤関連毒性（重度の体重減少又は死亡など）を発症せず、Ｈ８Ｌ２抗体の処置に対する良好な寛容性を示す。
【００８０】
【表７】
0006974500.tif 000012
【００８１】
Ｈ８Ｌ２抗体（即ち、ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体）は、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した場合、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルにおいて腫瘍増殖の有意な抑制を示し、１０ｍｇ／ｋｇの投与量でＨ８Ｌ２抗体が腫瘍増殖の更に有意な抑制を示し、ポジティブコントロールとしてのＯｐｄｉｖｏ  ５ｍｇ／ｋｇ処置群よりも良好な有効性を示し、１０ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの両方の用量下で担癌マウスにおける良好な寛容性を有する。
【００８２】
実施例８  ＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞株のＨｕＧＥＭＭモデルにおけるＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果
結腸直腸癌の処置に対する実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体の有効性は、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭ  ＭＣ３８保有マウスにおいて臨床前に検証され、下記に詳細に記載される。
【００８３】
ＭＣ３８細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマウス結腸直腸癌細胞株である。ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＰＤ−Ｌ１タンパク質分子と相互作用するマウスＰＤ−１タンパク質の幾つかのフラグメントを対応するヒト由来タンパク質で置き換えることによって遺伝子操作されたモデル化マウスである。
【００８４】
マウス１頭当たり１×１０６細胞の用量で、皮下注射により各対象マウスの右側にＭＣ３８細胞を接種した。１３４ｍｍ３までの腫瘍の大きさを有するマウスを腫瘍の大きさとして４つの群に無作為に分け、１群当たり８頭のマウス及びケージ当たり４頭のマウスとし、群１〜群４と名付け、それぞれ、Ｈ８Ｌ２  ５ｍｇ／ｋｇ処置群、Ｈ８Ｌ２  １０ｍｇ／ｋｇ処置群、ポジティブコントロールとしてのＫｅｙｔｒｕｄａ  １０ｍｇ／ｋｇ処置群、及びコントロールとしてのアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ４）５ｍｇ／ｋｇ群である。各群に対応する抗体をマウスの尾静脈を介して静脈内投与し、合計６回投与した（表３を参照）。
【表８】
0006974500.tif 000013
【００８５】
群分け後１３日目に、群１のマウスは、１９３３．６７ｍｍ３までの平均腫瘍の大きさを有し、群２（Ｋｅｙｔｒｕｄａ  １０ｍｇ／ｋｇ処置群、高用量）、群３（Ｈ８Ｌ２  ５ｍｇ／ｋｇ処置群、低用量）、及び群４（Ｈ８Ｌ２  １０ｍｇ／ｋｇ処置群、高用量）は、それぞれ８５％、９３％、及び９０％の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）（％）を有し（表４を参照）、４つの群は、それぞれ８．７２％、０．９４％、−２．０７％、及び１．６８％の体重変化率を有する。各マウスは、有意な予想外の体重減少又は死亡を示さない。群２〜群４は、群１と比較して抑制効果において統計的に有意な差を示し、それぞれＰ＜０．０５である。
【表９】
0006974500.tif 000014
【００８６】
群２〜群４では、Ｔ−Ｃ値（マウスの腫瘍の大きさが１０００ｍｍ３までに達したとき）は、それぞれ１０日、１４日、及び１４日超（＞１４日）であった。更に、群２〜群４については、５５日目に実験が完了したときに、１ヵ月以上も腫瘍が完全に退行したマウスが、それぞれ３頭、５頭、及び５頭残った（表５を参照）。
【表１０】
0006974500.tif 000015
【００８７】
Ｈ８Ｌ２抗体（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの用量において）は、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭ  ＭＣ３８保有マウスにおいて、統計的に有意な抗腫瘍効果を示し、Ｋｅｙｔｒｕｄａ  １０ｍｇ／ｋｇ処置群と比較して腫瘍の完全な退行においてより効果的である。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させ、血清半減期を延長させる本開示に係る方法は、効果的にＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させ、ＩｇＧ様抗体の血清半減期を延長させることができ、生成された修飾されたＩｇＧ様抗体は、特異的抗原に対して変わらない結合親和性を示す。
【００８９】
本開示の実施形態が詳細に説明されたが、当業者であれば、開示された教示としてこれらの実施形態において様々な修正及び置換が可能であり、そのような変更が全て、添付された特許請求の範囲及び任意の均等物によって与えられる本開示の範囲内であることが理解される。
【００９０】
本開示の明細書において、「実施形態」、「幾つかの実施形態」、「特定の実施形態」、「例」、「特定の例」、「幾つかの例」などの用語は、実施例又は実施形態によって記載される特定の特徴、構造、材料、又は特性を指すことを意図し、本開示の少なくとも１つの実施形態又は実施例に含まれる。本明細書においては、上記の用語の概略図は、必ずしも同じ実施形態又は例を指すものではない。更に、記載された特定の特徴、構造、材料、又は特性は、１つ以上の実施形態又は実施例において任意の適切な方法で組み合わされることができる。
【図１】
0006974500.tif 000016
【図２】
0006974500.tif 000017
【図３】
0006974500.tif 000018
【図４】
0006974500.tif 000019
【図５】
0006974500.tif 000020
【図６】
0006974500.tif 000021
【図７】
0006974500.tif 000022
【図８】
0006974500.tif 000023
【図９】
0006974500.tif 000024
【図１０】
0006974500.tif 000025
【図１１】
0006974500.tif 000026
【図１２】
0006974500.tif 000027
【配列表】
0006974500000001.app