(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のリポソームを含む医薬組成物であって、
前記リポソームは、
（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と
（ｂ）約５０ｍＭから約８００ｍＭの濃度である重炭酸塩および約１から約６のｐＫａを有する弱酸性薬物を含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含み、
前記リポソームは外部水性媒体に懸濁され、前記外部水性媒体のｐＨは前記弱酸性薬物のｐＫａと約７との間であり、前記内部水性媒体のｐＨは、前記外部水性媒体のｐＨよりも少なくとも１単位高い、医薬組成物。
【請求項２】
前記弱酸性薬物と前記重炭酸塩のモル比は約０．１：１〜約１：１である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記重炭酸塩の濃度は約２５０ｍＭから約８００ｍＭである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記弱酸性薬物のカプセル化効率は少なくとも８０％である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記小胞形成脂質は、第１のリン脂質および第２のリン脂質の混合物、または第１のリン脂質と荷電脂質の混合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第１のリン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびその任意の組み合わせからなる群から選択され、前記第２のリン脂質はＰＥＧ修飾リン脂質、正に帯電したまたは負に帯電したリン脂質であり、前記荷電脂質は正に帯電したまたは負に帯電した脂質である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記第１のリン脂質はＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣまたはそれらの組み合わせから選択され、前記第２のリン脂質はＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＭＰＧ、ＰＥＧ−ＤＳＰＥまたはそれらの組み合わせから選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記第１のリン脂質はＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣまたはそれらの組み合わせから選択され、前記荷電脂質はステアリルアミン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、Ｎ４−コレステロール−スペルミン（ＧＬ６７）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２−ジ−０−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、エチルホスホコリン（エチルＰＣ）またはそれらの組み合わせから選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
コレステロール、ヘキサスクシネートコレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるステロールをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記第１のリン脂質：コレステロール：前記第２のリン脂質または前記荷電脂質のモル比は５０〜７０：２０〜４５：０．１〜１０である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記重炭酸塩は、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸マグネシウム、重炭酸セシウム、重炭酸リチウム、重炭酸ニッケル、重炭酸第一鉄またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記弱酸性薬物は、プロスタグランジン、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、または抗凝固剤である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
治療有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、呼吸器疾患を治療するための治療剤。
【請求項１４】
１つ以上のリポソームを含む医薬組成物であって、
前記リポソームは、
（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層；および
（ｂ）約５０ｍＭから約８００ｍＭの濃度である重炭酸塩およびプロスタサイクリンを含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含み、前記リポソームは外部水性媒体に懸濁され、前記外部水性媒体のｐＨは前記弱酸性薬物のｐＫａと約７との間であり、前記内部水性媒体のｐＨは、前記外部水性媒体のｐＨよりも少なくとも１単位高い、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年７月２４日に出願された米国出願第６２／５３６，０３４号及び２０１７年１２月６日に出願された米国出願第６２／５９５，２０７号の利益を主張しており、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、本明細書に開示される高い医薬カプセル化効率または充填の医薬組成物、製造方法および医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リポソームは、内部水性媒体を含む脂質二重層によって形成される小胞である。リポソームはさまざまな治療薬のキャリアとして使用され、血液循環時間の延長、細胞毒性の低減、持続的な薬物放出、特定の組織への特定の薬物送達などの改善された送達特性を提供する。治療薬の送達にリポソームを使用する場合、より高い薬物カプセル化効率が望ましい。
【０００４】
現在、薬物をリポソームに組み込むために、多くの薬物充填方法が利用可能である。弱酸性薬物については、例えば、米国特許第５，９３９，０９６号において、薬物充填に関してより高い内部／より低い外部ＰＨ勾配を有するリポソームが報告されている。ＰＨ勾配は、ギ酸、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、およびそれらの置換誘導体などのカルボン酸を含む弱酸の塩によって設定される。ＷＯ９６／２５１４７は、薬物充填のための重炭酸塩の使用を開示している。しかし、後の研究では、リポソームの調製に重炭酸塩を使用すると、ガスの蓄積が生じ、リポソームが破壊され不安定化され、早期の薬物放出が引き起こされることが示唆されている（Ｎａｈｉｒｅ他；ｐＨ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｅｃｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ。  ２０１４、  Ｎｏｖ  ３；  １１（１１）：４０５９−６８；およびＣｈｅｎ他；Ａ  ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｂｕｂｂｌｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．  ２０１３、  Ｊａｎ  ２２；７（ｌ）：４３８−４６）リポソームに対する破壊的および不安定化効果のため、重炭酸塩は添加剤として避けるべきであることを示唆している。
【０００５】
従来のリポソームを使用した弱酸性薬物に関連する多くの問題は、薬物充填の低さや不十分な制御放出速度を含めて未解決のままである。治療効果を高めるための高い薬物充填効率を備えたリポソーム懸濁液のニーズは未だ満たされていない。本発明は、この必要性および他の必要性に対処するものである。
【発明の概要】
【０００６】
発明の簡単な概要
一実施形態では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と（ｂ）重炭酸塩と弱酸性薬物を含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含む、１つ以上のリポソームを含む医薬組成物を開示し、リポソームは外部媒体に懸濁され、薬物と重炭酸塩のモル比は約０．１：１〜１：１である。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と（ｂ）重炭酸塩と弱酸性薬物を含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含む、１つ以上のリポソームとを含む医薬組成物を提供し、リポソームは外部媒体に懸濁され、重炭酸塩の濃度は約５０ｍＭから約１０００ｍＭ未満である。
【０００８】
本発明の第３の実施形態は、（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と（ｂ）重炭酸塩および弱酸性薬物を含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含む、１つ以上のリポソームとを含む医薬組成物を提供し、リポソームは外部媒体に懸濁され、外部媒体のｐＨは弱酸性薬物のｐＫａを超える。
【０００９】
本発明の第４の実施形態は、（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と（ｂ）重炭酸塩とプロスタサイクリンを含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含む、１つ以上のリポソームとを含む医薬組成物を提供し、リポソームは外部媒体に懸濁され、プロスタサイクリンと重炭酸塩のモル比は約０．１：１から約１：１である。
【００１０】
本発明の第５の実施形態は、（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と（ｂ）重炭酸塩およびプロスタサイクリンを含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含む、１つ以上のリポソームとを含む医薬組成物を提供し、リポソームは外部媒体に懸濁され、重炭酸塩の濃度は約５０ｍＭから約１０００ｍＭ未満である。
【００１１】
さらに別の実施形態では、（ａ）少なくとも１つの小胞形成脂質を含む脂質二重層と、（ｂ）重炭酸塩とプロスタサイクリンを含む脂質二重層内部の内部水性媒体を含む、１つ以上のリポソームを含む医薬組成物を提供し、外部媒体のｐＨはプロスタサイクリンのｐＫａを超える。
【００１２】
本発明は、本明細書に開示される医薬組成物を調製する方法をさらに提供し、以下のステップを含む：
（ｉ）少なくとも１つの小胞形成脂質を使用して脂質溶液を調製する；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の脂質溶液を重炭酸塩と混合して、脂質二重層と内部水性媒体を含む少なくとも１つのリポソームを形成し、リポソームは外部媒体に懸濁している；
（ｉｉｉ）外部媒体中の重炭酸塩の濃度を調整して、リポソームの外部媒体のｐＨを低くし、リポソームの内部水性媒体のｐＨを高くし、外部媒体のｐＨは弱酸性薬のｐＫａを超える；そして
（ｉ∨）弱酸性薬物を外部媒体に加える。
【００１３】
本明細書に開示される医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、呼吸器疾患を治療する方法も提供される。
【００１４】
本発明はまた、呼吸器疾患の治療および／または予防的治療における使用のための本明細書に開示された医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、呼吸器疾患の治療的および／または予防的治療のための薬剤の製造のための本明細書に開示された医薬組成物の使用を含む。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。これらの用語を含む陳述は、本明細書に記載の主題を限定するものではなく、または以下の特許請求の意味または範囲を限定するものではないことを理解されたい。この概要は、本発明の様々な態様の高レベルの概要であり、以下の詳細な説明セクションでさらに説明される概念のいくつかを紹介する。この概要は、請求された主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、請求された主題の範囲を決定するために単独で使用されることも意図していない。主題は、明細書全体の適切な部分、任意のまたはすべての図面、および各請求項を参照することにより理解されるべきである。
【００１７】
発明の詳細な説明
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００１９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、一般に、１つ以上の特徴、成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）または成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）の存在を可能にすることを含むという意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語を包含する。
【００２０】
すべての数字は、「約」という用語によって修正されている。本明細書で使用される「約」という用語は、指定値の±１０％の範囲を指す。
【００２１】
「対象」という用語は、呼吸器疾患を有する脊椎動物、または呼吸器疾患の治療を必要とすると考えられる脊椎動物を指すことができる。対象には哺乳動物など、、霊長類などの温血動物が含まれるが、、より好ましくはヒトである。非人霊長類も対象である。対象という用語には、猫、犬などの家飼いの動物、家畜（牛、馬、豚、羊、ヤギなど）および実験動物（マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）が含まれる。したがって、本明細書では、獣医学的用途および医療製剤が企図されている。
【００２２】
本明細書で使用する「実質的に含まない」とは、医薬組成物が特定の物質を５％、４％、３％、２％または１％未満しか含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は特定の物質を含まない。
【００２３】
本明細書で使用される「リポソーム」という用語は、内部水性媒体を封入する１つ以上の脂質二重層で構成される顕微鏡的な小胞または粒子を指す。リポソームを形成するには、少なくとも１つの「小胞形成脂質」の存在が必要であり、これは脂質二重層を形成するかまたは脂質二重層に組み込むことができる小胞形成脂質である。任意の適切な小胞形成脂質を使用して、リポソームを構成する脂質二重層を形成することができる。小胞形成脂質には、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）またはホスファチジルセリン（ＰＳ）などのリン脂質、および正に帯電した脂質または負に帯電した脂質などの荷電脂質などが含まれる。
【００２４】
リポソームの脂質二重層は、これらに限定されないが、少なくとも１つの小胞形成脂質と、コレステロール、コレステロールヒドロキシラーゼ、エルゴステロール、ラノステロールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるステロールと、を含む。例示的な実施形態では、前記ステロールはコレステロールである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、小胞形成脂質は、第１のリン脂質と第２のリン脂質の混合物である。特定の実施形態では、第１のリン脂質は、水素化卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアリロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジペトロセリノイルホスファチジルコリン、パルミトイルエレイドイルホスファチジルコリン、パルミトイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジウンデカノイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジノナノイルホスファチジルコリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるホスファチジルコリン（ＰＣ）である。他の実施形態では、第２のリン脂質は、１，２−ジステアロリ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）またはジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）または（ＤＯＰＧ）などの負に帯電したリン脂質など、約５００〜約１０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含むポリエチレングリコール修飾リン脂質である。例示的な実施形態では、第１のリン脂質：コレステロール：第２のリン脂質のモル比は、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜１０、５０〜７０：２０〜４５：０．５〜８または５５〜６５：２５〜４０：１〜６である。
【００２６】
他の実施形態では、小胞形成脂質は、第１のリン脂質と荷電脂質の混合物である。例示的な実施形態では、小胞形成脂質は、第１のリン脂質、第２のリン脂質、および荷電脂質の混合物である。荷電脂質には、ステアリルアミン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、Ｎ４−コレステロールスペルミン（ＧＬ６７）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２−ジ−０−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、エチルホスホコリン（エチルＰＣ）またはそれらの組み合わせを含む。別の例示的な実施形態では、第１のリン脂質：コレステロール：荷電脂質のモル比は、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜１０、５０〜７０：２０〜４５：０．５〜８または５５〜６５：２５〜４０：１〜６である。
【００２７】
一実施形態では、脂質二重層中のＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＧのモル比は、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜１０、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜５または５５〜６５：２５〜４０：０．５〜８である。別の実施形態では、脂質二重層中のＨＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比は、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜１０、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜５または５５〜６５：２５〜４０：０．５〜８である。別の実施形態では、脂質二重層中のＤＰＰＣ：、コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比は、５０〜７０：２０〜４５：０．５〜８、５０〜７０：２０〜４５：０．１〜５または５５〜６５：２５〜４０：１〜６である。
【００２８】
一実施形態では、リポソームの脂質二重層は、少なくとも１つの小胞形成脂質および界面活性剤を含んでもよく、これは非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または双性イオン性界面活性剤であり得る。非イオン性界面活性剤は、そのヘッドに正式に帯電した基を持たない。カチオン性界面活性剤は、そのヘッドに正味の正電荷を持つ。双性イオン界面活性剤は電気的に中性であるが、異なる原子に正と負の正式な電荷を持つ。
【００２９】
非イオン性界面活性剤の非限定的な例には、非イオン性水溶性モノ、ジ、およびトリグリセリド；ポリエチレングリコールの非イオン性水溶性モノおよびジ脂肪酸エステル；非イオン性水溶性ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート）などのソルビタンモノオレエート、ＳＰＡＮ  ８０）；非イオン性水溶性トリブロック共重合体（例えば、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ  ４０６（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７）などのポリ（エチレンオキシド）／ポリ−（プロピレンオキシド）／ポリ（エチレンオキシド）トリブロック共重合体）またはその誘導体が含まれる。
【００３０】
カチオン性界面活性剤の非限定的な例には、臭化ジメチルジアルキルアンモニウムまたは臭化ドデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。
【００３１】
両性イオン性界面活性剤の非限定的な例には、３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）−プロパンスルホネートが含まれる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、リポソームは、リポソーム膜を横切るＨ＋またはＯＨ−の輸送を促進することができる化合物であるイオノフォアを実質的に含まない。
【００３３】
リポソームの調製のための小胞形成脂質を溶解するための溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、エーテル、およびそれらの組み合わせであり得る。場合により、溶媒は後で超臨界流体によって除去することができ、有機溶媒除去ステップを実行する時間を短縮するために最小量で使用することが好ましい。
【００３４】
本発明によれば、リポソームは重炭酸塩を含む培地で調製される。特に、小胞形成脂質が重炭酸塩を含む培地と接触すると、リポソーム懸濁液が形成される。
【００３５】
本明細書で使用される「重炭酸塩」は、好ましくは、重炭酸アニオンおよびカチオン成分を含む薬学的に許容される塩化合物である。一実施形態では、塩化合物のカチオン成分は金属である。金属の非限定的な例には、カリウム（Ｋ）、ナトリウム（Ｎａ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、セシウム（Ｃｓ）、リチウム（Ｌｉ）などのＩＡまたはＩＩＡ族金属や、鉄（Ｆｅ）やニッケル（Ｎｉ）などのグループＩＡまたはＩＩＡ以外の金属が含まれる。重炭酸塩の例には、これらに限定されないが、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸マグネシウム、重炭酸セシウム、重炭酸リチウム、重炭酸ニッケル、重炭酸第一鉄またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００３６】
懸濁液中のリポソームは、サイズの縮小に供される。リポソームのサイズは通常、その直径を指す。リポソームサイズの縮小は、押出、超音波処理、均質化技術または粉砕技術などの多くの方法によって達成することができ、これらはよく知られており、当業者によって実施することができる。押出には、リポソームを加圧下で、規定の孔径を有するフィルターに１回以上通すことが含まれる。フィルターは一般にポリカーボネートでできているが、リポソームと相互作用せず、十分な圧力下で押し出すことができるほど十分に強い耐久性のある材料で作ることもできる。リポソームのサイズは、超音波処理によって小さくすることができる。超音波処理では、音波エネルギーを使用して、自発的に小さなリポソームに再形成されるリポソームを破壊またはせん断する。例えば、超音波処理は、リポソーム懸濁液を含むガラス管を、バス型ソニケーターで生成された音波震源に浸漬することによって実施できる。または、プローブ型のソニケーターを使用してもよく、その場合、音波エネルギーは、リポソーム懸濁液と直接接触するチタンプローブの振動によって生成される。本発明において、リポソームは一般に、約５００ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約３００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下または約１００ｎｍ以下などの約５０ｎｍ〜５００ｎｍの直径を有する。
【００３７】
サイジング後、外部媒体中の重炭酸塩の濃度を調整して、内部水性媒体と外部媒体の間にｐＨ勾配を提供する。これは、たとえば外部媒体を透析ろ過、透析、限外ろ過、接線流ろ過などの方法により、クエン酸緩衝液（Ｈ３Ｃ６Ｈ５Ｏ）やリン酸緩衝液（Ｈ３ＰＯ４）などの重炭酸塩を含まない適切な緩衝液と交換するなど、さまざまな方法で実行できる。
【００３８】
一実施形態において、重炭酸塩は、リポソームの外部媒体と内部水性媒体との間に、より低い外部とより高い内部のｐＨ勾配を提供する。別の実施形態では、内部水性媒体のｐＨは、外部媒体のｐＨよりも少なくとも１単位高い。さらに別の実施形態では、内部水性媒体のｐＨは約７、８、９または１０であり、外部媒体のｐＨは７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、約３〜７、約３．５〜６．５、または約４〜６である。さらに別の例示的な実施形態では、外部媒体のｐＨは、弱酸性薬物のｐＫａを超える。
【００３９】
調製されたリポソームは、薬物の充填および対象への投与の前にかなりの期間保存することができる。例えば、リポソームは、薬物を充填する前のかなりの期間、冷蔵状態で保存することができる。あるいは、投与前に、リポソームを脱水し、保存し、続いて再水和し、必要に応じて１つ以上のの活性剤を充填することができる。リポソームは、１つ以上の弱酸性薬物を充填した後に、脱水することもできる。脱水は、当技術分野で利用可能で知られている多くの方法によって実施することができる。いくつかの実施形態において、リポソームは、標準的な凍結乾燥装置、すなわち低圧条件下での脱水を使用して脱水される。また、リポソームは例えば、液体窒素を使用して凍結することができる。脱水の前に、サッカリドをリポソーム環境、例えばリポソームを含む緩衝液に加え、脱水中のリポソームの安定性と完全性を確保することができる。サッカリドの例には、これらに限定されないが、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００４０】
上記のように低い外側／高い内側のｐＨ勾配を有するリポソーム懸濁液は、薬物充填の準備ができている。通常、充填する弱酸性薬物をリポソームの外部媒体に添加し、得られた懸濁液を、リポソームの水性媒体内部への弱酸性薬物の拡散を可能にし、および所望の充填濃度およびカプセル化効率（組成物中の薬物の総量に対する薬物の内部／カプセル化量の割合）が達成されるまでリポソームの内部水性媒体に薬物を充填する条件下でインキュベートする。
【００４１】
本明細書で使用される弱酸性薬物は、反対の指示がない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、その薬学的に許容される塩およびそのプロトン化形態も含む。一実施形態では、弱酸性薬物は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、リン酸基（−ＰＯ４）およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの官能基を含む。別の実施形態では、弱酸性薬物は、約７未満、約６未満、１〜約７未満、２〜約６未満、２〜６．９、または２．５〜６のｐＫａを有する。弱酸性薬は、上記のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、およびリン酸基（−ＰＯ４）に加えて、１つ以上の官能基を含むこともあり得る；そのような追加の官能基は、薬物の酸性度をその非官能化対応物の酸性度から大きく変えるべきではない。表１は、本発明の弱酸性薬物の非限定的な例を示している。
【００４２】
【表１】
0006974670.tif 000002
【００４３】
本発明は、本明細書に開示される医薬組成物を調製する方法をさらに提供し、以下のステップを含む：
（ｉ）少なくとも１つの小胞形成脂質を使用して脂質溶液を調製する；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の脂質溶液を重炭酸塩と混合して、脂質二重層と内部水性媒体を含む少なくとも１つのリポソームを形成し、ここでリポソームは外部媒体に懸濁している；
（ｉｉｉ）外部媒体中の重炭酸塩の濃度を調整して、リポソームの外部媒体のｐＨを低くし、リポソームの内部水性媒体のｐＨを高くし、ここで外部媒体のｐＨは弱酸性薬のｐＫａを超える；そして
（ｉｖ）弱酸性薬物を外部媒体に加える。
【００４４】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｉ）は、少なくとも１つの小胞形成脂質を有機溶媒に溶解して脂質溶液を形成することを含む。小胞形成脂質は、第１のリン脂質と第２のリン脂質の混合物、または第１のリン脂質と荷電脂質の混合物であり得る。次いで、ステップ（ｉｉ）において、脂質溶液を金属の重炭酸塩の緩衝水溶液と混合して、外部媒体および少なくとも１つのリポソームを含む懸濁液を形成し、ここでリポソームは外部媒体に懸濁される。ステップ（ｉｉｉ）で、外部媒体を重炭酸塩を含まない別の緩衝液と置き換えて外部媒体の重炭酸塩の濃度を調整し、リポソームの外部媒体と内部相との間に低い外部／高い内部ｐＨ勾配を生成する。ステップ（ｉｖ）では、弱酸性薬物を懸濁液の外部媒体に加え、得られた懸濁液を所定の条件下でインキュベートして、リポソームの内部相への薬物充填をもたらす。
【００４５】
いくつかの実施形態では、内部水性媒体中の重炭酸塩の濃度は、方法のステップ（ｉｉｉ）で約５０ｍＭから約１０００ｍＭ未満である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、外部媒体のｐＨは、方法のステップ（ｉｉｉ）のプロスタサイクリンのｐＫａを超える。他の実施形態では、外部媒体のｐＨは、内部水性媒体のｐＨより少なくとも１単位低い。
【００４７】
いくつかの実施形態では、内部水性媒体中の薬物と重炭酸塩のモル比は、方法のステップ（ｉｖ）で約０．１：１から１：１である。
【００４８】
さらに、本発明は、本明細書に開示される凍結乾燥または凍結リポソームの方法を利用して、弱酸性薬物をリポソームの内相に充填する方法を提供する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、リポソームの内部水性媒体中の重炭酸塩の濃度は、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、３５０ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、４５０ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００Ｍ以上、８００ｍＭ以上、最大で１０００ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、水性緩衝液中の重炭酸塩の濃度は、５０ｍＭ〜１０００ｍＭ未満、５０ｍＭ〜８００ｍＭ、２００ｍＭ〜１０００ｍＭ未満、２００ｍＭ〜８００ｍＭ、または２００ｍＭ〜６００ｍＭ、、２５０ｍＭ〜１０００ｍＭ未満、、２５０ｍＭ〜８００ｍＭ、または２５０ｍＭ〜６００ｍＭ、３００ｍＭ〜６００ｍＭである。例示的な実施形態では、リポソームの内部水性媒体中の重炭酸塩濃度は、既知のまたは当技術分野で既知の任意の方法によって、または以下のステップによって測定することができる：（ａ）外部媒体中の重炭酸塩を透析またはサイズ排除クロマトグラフィーによって内部水性媒体の重炭酸塩と離す；（ｂ）外部媒体に重炭酸塩を含まないリポソーム懸濁液をメタノールで溶解し、内部水性媒体中の重炭酸塩の濃度をイオンクロマトグラフィーで決定する。いくつかの実施形態では、外部媒体は重炭酸塩を実質的に含まない。
【００５０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の薬物カプセル化効率を有する。
【００５１】
別の実施形態では、リポソームの内部水性媒体中の薬物と重炭酸塩のモル比（以下、薬物／塩のモル比）は約０．１：１〜約１：１である。例示的な実施形態では、薬物／塩比は、約０．１：１〜０．９：１、約０．１：１〜０．８：１、約０．１：１〜０．７：１、約０．１：１〜０．６：１または約０．１：１〜０．５：１である。
【００５２】
さらに別の実施形態では、リポソームの内相にカプセル化弱酸性薬物は、１ｍＭから８００ｍＭ以上の濃度である。いくつかの実施形態では、リポソームの内相にカプセル化された薬物は、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、そして最大で８００ｍＭである。
【００５３】
本発明によれば、本明細書に記載の医薬組成物は、より高い薬物カプセル化効率、弱酸性薬物と重炭酸塩のモル比の約０．１〜約１の増加、および高いカプセル化薬物の濃度を有する。特定の理論に束縛されることなく、本明細書に記載の医薬組成物におけるより高いカプセル化薬物または高い薬物充填は、より多くの薬物を作用部位に送達し、カプセル化された薬物の効果を延長し、病気の症状または兆候を低減するのにより効果的であると考えられる。
【００５４】
本明細書に記載の高い薬物カプセル化効率または高い薬物充填を有する本発明の医薬組成物は、呼吸器疾患を治療する必要のある対象に治療的有効量で投与することができる。呼吸器疾患の例には、これらに限定されないが、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、下気道感染症、気管支拡張症、気管支炎、細気管支炎またはクループが含まれる。例示的な実施形態では、呼吸器疾患は肺高血圧症であり、弱酸性薬はプロスタサイクリンまたはプロスタグランジンである。別の例示的な実施形態では、呼吸器疾患はＣＯＰＤであり、弱酸性薬はステロイドまたはプロスタグランジンである。さらに別の例示的な実施形態では、呼吸器疾患は喘息であり、弱酸性薬はステロイドである。さらに別の例示的な実施形態では、呼吸器疾患は下気道感染症であり、弱酸性薬は抗生物質である。
【００５５】
一般に、本明細書で使用される「治療する」という用語は、呼吸器疾患、病気、病気の症状もしくは状態、病気によって引き起こされる障害、または病気の進行を治癒（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、軽減、緩和、変更、改善（ｒｅｍｅｄｙ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）、または影響することを目的とし、呼吸器疾患、呼吸器疾患の症状もしくは状態、またはその進行に苦しむ対象への少なくとも１つの弱酸薬を含む本明細書に記載の医薬組成物の適用または投与を指す。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、対象に治療効果を及ぼす弱酸性薬物の量を指す。治療有効量は、投与経路と頻度、体重と年齢などのさまざまな要因に応じて変化し得る。当業者は、本明細書の開示、確立された方法、および自身の経験に基づいて、各場合の投与量を決定し得る。
【００５６】
特に、本明細書に記載の弱酸性薬物を含むリポソーム組成物は、吸入、非経口注射、すなわち、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、硝子体内、くも膜下腔内、関節内、筋肉内、他の人体空洞内への注射、またはエアロゾルによる拡散で投与される。エアロゾルの投与方法には、鼻腔内および肺投与が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のリポソーム組成物は、ボーラス注射または注入により静脈内または腹腔内に投与される。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は限定ではなく実証の目的で提供される。当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【００５８】
実施例１：薬物充填のための異なる塩の効果
１．材料および方法
１．１  酢酸ナトリウム（ＮａＣ２Ｈ２Ｏ２）を使用したＰＧＥ１リポソーム調製
リポソームコロイド懸濁液は、エタノール注入技術により調製された。簡単に言うと、４９６．８ｍｇの水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１５４．６５ｍｇのコレステロール、および４２．１５ｍｇの１，２−ジステアロリ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）をエタノール２．８６ｍｌに溶解した。エタノール中の脂質溶液を、１７．４ｍｌの酢酸ナトリウム（２００ｍＭまたは４００ｍＭ）に注入し、６０℃で激しく攪拌した。脂質溶液が酢酸ナトリウムと接触するとすぐにリポソームが形成された。これに続いて、リポソーム懸濁液を２００ｎｍおよび１００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出した（それぞれ６回）。約１００ｎｍのリポソームが得られ、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対してダイアフィルトレーションして、リポソームの外部媒体と内部水性媒体の間に高い内側／低い外側ｐＨ勾配を形成した。空のリポソーム懸濁液は、薬物充填プロセスの前に４℃で保存された。
【００５９】
ＰＧＥ１（アルプロスタジル）を、室温（２５℃）で２０分間、様々な薬物／脂質モル比で前段落のリポソーム懸濁液に加えた。ＰＧＥ１を充填したリポソーム懸濁液は４℃で保存した。
【００６０】
１．２  重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を使用するＰＧＥ１リポソーム調製
リポソーム懸濁液は、酢酸ナトリウム（２００ｍＭまたは４００ｍＭ）を重炭酸ナトリウム（たとえば２００ｍＭ、４００ｍＭまたは他の濃度）に置き換えたことを除いて、セクション１．１に記載の方法に従って調製した。
【００６１】
１．３  薬物の定量的決定
リポソームにカプセル化された薬物の量は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＨＰＬＣシステムを使用して定量化された。簡単に説明すると、１００μＬの各サンプル溶液のアリコートを、流速１．０  μｍＬ／分の移動相として、体積比８０：２０のメタノールとリン酸緩衝液（６．７  ｍＭ濃度、ｐＨ  ３．０）の混合物と共にＨＰＬＣシステムに直接注入した。Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  ５Ｕ  ＯＤＳ−３  １５０×４．６ｍｍ）で分離を行い、その後、６５℃でＫＯＨの１Ｎと混合して後反応を行った。薬物のピーク、例えば、ＰＧＥ１は２８０ｎｍで検出された。保持時間は約４．６分だった。
【００６２】
１．４  カプセル化効率
カプセル化効率（ＥＥ）、すなわち、リポソーム懸濁液に存在する薬物の総量（すなわち、外部媒体中の薬物およびリポソームの内部水性媒体に充填された薬物）に対するリポソームの内部水性媒体にカプセル化（または充填）された薬物の割合を以下のように定量化した。簡単に言えば、リポソーム懸濁液をカラムクロマトグラフィーにかけた。遊離または非関連薬物（すなわち、外部媒体中の薬物）および内部水性媒体中にカプセル化された薬物を含むリポソームは、Ｇ−２５カラムを通してリポソーム懸濁液を溶出することによりそれぞれに分離された。遊離薬物の量は、ＰＤＡ検出を備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣを使用して決定され、リポソームをメタノール（９０％メタノール及び１０％リポソーム懸濁液）で破壊した後、リポソームの内部水性媒体中のカプセル化された薬物の量も同じ方法を使用して決定された。カプセル化効率は、次の式を使用して計算された。
【００６３】
【数１】
0006974670.tif 000003
【００６４】
ここで、Ｌはリポソームの内部水性媒体中のカプセル化された薬物の量であり、Ｆは外部媒体中の遊離薬物の量である。
【００６５】
さらに、内部薬物濃度（ｍＭ）は次のように計算された。
【００６６】
【数２】
0006974670.tif 000004
【００６７】
（＊特定の条件では、トラップ容積はリポソーム懸濁液１ｍＬあたり０．０３１４ｍＬで、リポソームの粒子サイズは約１１０ｎｍ、リン脂質濃度は１０ｍＭである。トラップ容積は、当技術分野で既知の方法（Ｘｕ他。  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２０１２）４２３（２）、ｐｐ．４１０−４１８）で計算される。
【００６８】
１．５  平均粒径と多分散性指数（ＰｄＩ）
リポソームの平均粒子サイズは、動的光散乱により値が求められた。リポソームのサイズ分布を示す値である多分散性指数（ＰｄＩ）は、平均粒子に対するものと同じ評価手法を使用して、粒子サイズ分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤｅｌｓａＴＭ  Ｎａｎｏ  Ｃ粒子分析器）で決定された。
【００６９】
２．結果
２．１  重炭酸ナトリウムは、より高い薬物カプセル化効率を提供する
表２は、薬物のカプセル化効率（Ｅ．Ｅ．）および充填塩として重炭酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムを使用したリポソーム懸濁液の薬物と塩のモル比を示す。
【００７０】
【表２】
0006974670.tif 000005
【００７１】
表２の結果は、酢酸ナトリウムと比較して、重炭酸ナトリウムが弱酸性薬物の薬物カプセル化効率を高め、リポソームの内部水性媒体内の薬物濃度を大幅に高めることを示している。具体的には、重炭酸塩に対する薬物のモル比は、充填剤として酢酸ナトリウムを使用すると０．１：１未満であり、酢酸ナトリウムの濃度を２倍にしてもモル比はそれ以上増加しないが、重炭酸ナトリウムを充填剤として使用すると塩に対する薬物のモル比は０．１：１より高くなる。
【００７２】
実施例２：薬物充填のために重炭酸塩を使用する医薬組成物におけるヒトの生理学的状態の影響
実施例１のセクション１．１に従って、ＰＧＥ１充填のために様々な濃度の重炭酸ナトリウムを使用するリポソーム懸濁液を調製した。リポソーム懸濁液を、オスモル濃度２８０〜３００ｍＯｓｍ／Ｋｇの外部緩衝液中で２５℃および３７℃で２０分間インキュベートし、人間の生理学的状態をシミュレートした。
【００７３】
【表３】
0006974670.tif 000006
【００７４】
ヒトの生理的条件（３７℃および２８０−３００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）で約１０００ｍＭを超える重炭酸塩濃度で製剤をインキュベートすると、より多くのＣＯ２が生成され、リポソームの漏出につながった。漏出したリポソームは、重炭酸塩と薬物を内部水性媒体から外部媒体に放出し、外部媒体のｐＨを６．５より高くした。
【００７５】
実施例３：薬物充填における異なる重炭酸塩濃度の効果
実施例１のセクション１．１の方法に従ってリポソーム懸濁液を調製し、ＰＧＥ１に異なる濃度の重炭酸ナトリウム（５０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、および８００ｍＭ）を充填した。
【００７６】
表４は、薬物充填における重炭酸塩濃度の効果を示す。
【００７７】
【表４】
0006974670.tif 000007
【００７８】
結果は、一定量のリン脂質について、薬物カプセル化効率が９０％以上であり、薬物と塩のモル比が５０ｍＭから８００ｍＭの重炭酸塩で０．１：１より高いことを示唆している。５００ｍＭの重炭酸塩濃度は、最高の薬物カプセル化効率と塩に対する薬物のモル比を提供した。
【００７９】
実施例４：重炭酸塩を使用した異なる弱酸性薬物の充填漏出
実施例１の方法に従って、３：２：０．０７５のモル比でＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含む最初の（４−１）リポソーム懸濁液を調製した。
【００８０】
実施例１の方法に従って、３：２：０．０７５のモル比でＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＧを含む第２の（４−２）リポソーム懸濁液を調製した。
【００８１】
実施例１の方法に従って、３：２：０．０７５のモル比でＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含む第３の（４−３）リポソーム懸濁液を調製した。
【００８２】
実施例１の方法に従って、２．７：０．３：２：０．０７５のモル比でＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを含む第４（４−４）リポソーム懸濁液を調製した。
【００８３】
実施例１の方法に従って、３：２：０．０７５：０．０２５のモル比でＨＳＰＣ、コレステロール、ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥおよびステアリルアミンを含む第５（４−５）リポソーム懸濁液を調製した。
【００８４】
実施例１の方法に従って、２．７：０．３：２：０．０７５のモル比でＨＳＰＣ、ＤＭＰＣ、コレステロール、およびｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを含む第６（４−６）リポソーム懸濁液を調製した。
【００８５】
２００ｍＭ〜４００ｍＭの重炭酸塩を使用して、２５℃または４０℃で２０分かけて第１、第２および第３のリポソーム懸濁液に様々な弱酸性薬物を充填した。充填された薬物リポソーム懸濁液は４℃で保存された。
【００８６】
表５は、重炭酸塩が、様々なリポソーム製剤にカプセル化された様々な弱酸性薬物の有効な充填剤であり、薬物カプセル化効率が高く（８０％以上）、薬物と塩のモル比が０．１：１より大きいことを示す。
【００８７】
【表５】
0006974670.tif 000008
【００８８】
実施例５：薬物充填におけるリポソーム懸濁液の外部媒体のｐＨの効果
ＨＳＰＣ、コレステロールおよびｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを３：２：０．０７５のモル比で含む第１（５−１）リポソーム懸濁液、ならびにＨＳＰＣ、コレステロール、およびｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを３：２：０．２８のモル比で含む第２（５−２）および第３（５−３）リポソーム懸濁液を調製した。トレプロスチニルを、２００ｍＭの重炭酸塩でリポソーム懸濁液に充填した。
【００８９】
第１（５−１）リポソーム懸濁液の外部媒体のｐＨは薬物のｐＫａ（トレプロスチニルのｐＫａは４．５である）を超え、第２リポソーム懸濁液（５−２）および３番目のリポソーム懸濁液（５−３）の外部媒体のｐＨは、薬物のｐＫａ未満である。
【００９０】
表６は、リポソーム懸濁液の外部媒体のｐＨが薬物充填において重要な役割を果たすことを示している。具体的には、リポソーム懸濁液の外部媒体のｐＨが、薬物のｐＫａ（９０．６％対２７．３％及び３３．５％）を下回るリポソーム懸濁液のｐＨと比較して、薬物のｐＫａを上回る場合、薬物のカプセル化効率は著しく高くなる。同様に、０．１：１未満の薬物のｐＫａよりも低いリポソーム懸濁液のｐＨと比較してリポソーム懸濁液の外部媒体のｐＨが薬物のｐＫａよりも高い場合、内部薬物と塩のモル比は０．１：１よりも高い。
【００９１】
【表６】
0006974670.tif 000009
【００９２】
実施例６：高薬物充填を伴う医薬組成物の治療効果
実施例４の医薬組成物（４００ｍＭ重炭酸塩を使用して約１．５ｍｇのトレプロスチニルをカプセル化した４−２リポソーム懸濁液）の肺高血圧症に対する治療効果のインビボ評価を、それぞれ約３００〜３５０ｇの重さの１８匹のオスのスプラーグドーリーラットを使用して実施した。
【００９３】
肺高血圧症を誘発するために、圧力カテーテルを各ラットの肺動脈に挿入した。カテーテルの一方の端は首のうなじから露出しており、圧力変換器に接続されていた。カテーテル挿入の２４時間後に、ラットを窒素（Ｎ２）のレベルを上げて酸素（Ｏ２）レベルを１０％（ＦｉＯ２＝０．１）に減らした低酸素チャンバーに移した。安定した肺高血圧が確立されたところで、各ラットに３つの試験物質の単回投与を行った：生理食塩水（Ｎ＝６）、６μｇ／Ｋｇの遊離トレプロスチニル（Ｎ＝６）または６μｇ／Ｋｇのトレプロスチニルを含む実施例４の医薬組成物（リポソームトレプロスチニル、Ｎ＝６）。ラットの気管分岐部にマイクロスプレーを使用して試験物質を投与した。試験物質の投与後、予定された時点で平均肺動脈圧（ＰＡＰ）が測定された。
【００９４】
結果は、リポソームトレプロスチニルが、遊離トレプロスチニルと比較して、注射後の平均ＰＡＰの最大減少を達成するのにより効果的であることを示す（リポソームトレプロスチニル群の４０％平均ＰＡＰ減少対遊離トレプロスチニル群の２０％平均ＰＡＰ減少）。