(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＣＧＭＣＣ  １３６５１のＰｅｒｆｅｃｔ−２０１７−０００２であるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）菌株および薬学的に許容される担体または食用担体、から成る組成物。
【請求項２】
受託番号ＣＧＭＣＣ  １３６５０のＰｅｒｆｅｃｔ−２０１７−０００１菌株、および/または、受託番号ＣＧＭＣＣ  １３６５３のＰｅｒｆｅｃｔ−２０１７−０００３菌株、および/または、受託番号のＣＧＭＣＣ  １３６５４のＰｅｒｆｅｃｔ−２０１７−０００４菌株をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、医薬組成物、栄養補助剤または栄養組成物である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１０３から１０１４個、前記菌株のコロニー形成単位またはミリメーター組成物を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ラクトバチルス・ムコサエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｏｓａｅ）菌株をさらに含む請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記菌株の細胞成分、代謝物、分泌される分子、またはこれらの任意の組み合わせを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物の製造方法であって、
前記ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株を適切な組成物に調製することを特徴とする製造方法。
【請求項８】
前記組成物は前記菌株およびラクトバチルス・ムコサエ菌株をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
過重、肥満、高血糖症、糖尿病、脂肪肝、脂質異常、メタボリックシンドローム、肥満または過重者の感染、および／または、脂肪細胞肥大化から選ばれる疾患を予防および／または治療するための薬剤調製での請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
前記組成物は前記菌株およびラクトバチルス・ムコサエ菌株を含む請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
必要対象者における単純性または遺伝性肥満の減少、代謝低下緩和または炎症および脂肪蓄積低下のための薬剤調製での請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
前記組成物はラクトバチルス・ムコサエ菌株をさらに含む請求項１１の使用。
【請求項１３】
病原性細菌と有害な細菌に不都合な腸内環境にし、未処理コントロールに関しては腸内容物中の腸内細菌の濃度を減少し、健康な腸内生態系の構造を決定する基礎種として確立するための薬剤調製での請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
前記組成物は前記菌株およびラクトバチルス・ムコサエ菌株をさらに含む請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記糖尿病はＩＩ型糖尿病である請求項９の使用。
【請求項１６】
前記対象者はプラダー・ウィリー症候群に罹患する請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新型ビフィズス菌菌株およびそれらの用途に関し、それらを含む食品、飼料製品、サプリメントおよび医薬製剤に関し、これらの組成物の製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスには、一般的に「適切な量で投与する時に宿主に対して健康な利益を発揮する活性微生物」を意味することが理解され、多種疾患の予防および治療に広く応用され、そして、それらの効力はいくつかの臨床ケースにおいて強く裏づけされている。例えば、ＷＯ２００７/０４３９３３には、体重増加の抑制、肥満の予防、満腹感の高め、満腹感の延長、食物摂取量の低減、脂肪蓄積の低減、エネルギー代謝の改善、インスリン感受性の増強、肥満およびインスリン抵抗性の治療するために、プロバイオティクスを食品、飼料製品、サプリメントを製造することに用いることが記載される。
【０００３】
ＷＯ２００９/０２４４２９には、基本組成物が代謝障害の治療または予防および/または体重管理をサポートすることにおける用途が記載され、前記基本組成物は、プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）特に腸内デフェロバクター（ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｉａ）および/または腸内細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）の数量を低減させる薬剤を含む。
【０００４】
ＷＯ２００９/００４０７６には、プロバイオティクスは血漿グルコース濃度を正常化し、インスリン感受性を改善し、妊婦における発育リスクを低減させて妊娠糖尿病を予防することにおける用途が記載される。
【０００５】
ＷＯ２００９/０２１８２４には、プロバイオティクス、特にラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）が肥満の治療、代謝障害の治療およびダイエットをサポートすることおよび/または体重を維持することにおける用途が記載される。
【０００６】
ＷＯ２００８/０１６２１４には、プロバイオティク乳酸菌のラクトバチルス・ガセリＢＮＲ１７（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＢＮＲ１７）菌株およびその体重増加を抑制することにおける用途が記載される。
【０００７】
ＷＯ０２/３８１６５には、乳酸桿菌菌株（特に、ラクトバチルスプランタリウム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ））が内臓脂肪症候群に参与するリスク因子を低下することにおける用途が記載される。
【０００８】
ＵＳ２００２/００３７５７７には、乳酸桿菌ような微生物は体内に吸収され得る単糖または二糖量を低減してこのような組成物を腸が吸収できない重合材料に変換することにより、肥満または糖尿病の治療または予防における用途が記載される。
【０００９】
Ｌｅｅ等（Ｊ．ＡＰＰＬ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７、１０３、１１４０-１１４６）には、トランス-１０、シス-１２-共役リノール酸（ｔｒａｎｓ-１０、ｃｉｓ-１２-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ＣＬＡ）の細菌を生成するラクトバチルスプランタリウムＰＬ６２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍＰＬ６２）菌株のマウスにおける抗肥満活性が記載される。
【００１０】
Ｌｉ等（ＨｅｐａｔｏＬｏｇｙ、２００３、３７（２）、３４３-３５０）には、プロバイオティクスおよび抗-ＴＮＦ抗体が非アルコール性脂肪肝疾患マウスモデルにおける用途が記載される。
【００１１】
ＵＳ２０１４/０３６９９６５には、健康な母乳で飼うマウスの糞便から分離されたビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）菌株が開示されている。該ファイルはさらに該菌株およびその細胞成分、代謝物、分泌する分子、および他の微生物との組み合わせは、過重、肥満、高血糖症および糖尿病、肝脂肪症または脂肪肝、脂質異常症、内臓脂肪症候群、肥満および過重に関連する免疫系機能障害および肥満および過体重に関連する腸内細菌叢の構成不均衡の予防および/または治療における用途が開示されている。しかしながら、この菌株はヒトに由来しない。
【００１２】
ＰＣＴ/ＣＮ２０１５/０８２８８７にはビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株が開示され、それは全穀類、伝統的な中国薬膳およびプレバイオティクスの確立に基づく食事（ＷＴＰ食事）に基づいて入院介入を行う個体の糞便サンプルに多く含まれることが発見される。これらの個体は３０日の食事介入を経た後、遺伝性肥満と単純性肥満の児童の代謝低下がいずれも顕著に緩和される。しかしながら、これらの菌株はそれらの介入された後の個体に多く含まれるが、これらの菌株は介入で顕著に増加するかまたは患者の健康状態を改善することを確定しない。
【００１３】
言い換えれば、現在、存在するプロバイオティクスは多くの限界性を有し、新たなプロバイオティク微生物菌株を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ヒトの腸内善玉菌が食事介入に応答するゲノム基盤は依然として明らかではなく、これはヒト健康に用いられる腸内細菌叢に対する正確な操作を阻害する。消化しにくい炭水化物に富む食事の１０５日間の介入を受けた後、プラダー・ウィリー症候群（Ｐｒａｄｅｒ-Ｗｉｌｌｉ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に罹患する遺伝性肥満の児童の体重が１８．４％減少し、しかもその生物学的臨床パラメータの顕著な改善が示される。介入された糞便サンプルから豊度が最大限に向上された菌種の一つのビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの５つの分離株（受託番号はＣＧＭＣ１３６５０であるＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１、受託番号はＣＧＭＣ１３６５１であるＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２、受託番号はＣＧＭＣ１３６５３であるＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００３、受託番号はＣＧＭＣ１３６５４であるＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４、およびＣ９５と称される）を得る。興味深いことは、これらの５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は介入期間に異なる応答を示すものである。２種類の菌株はほとんど影響を受けず、他の３種類は食事炭水化物源の変化に応じて異なる程度で増加する。これらの菌株の差異応答は、ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒｏｕｐ、オルソログクラスタグループ）（ＡＢＣ型糖輸送系に参与するそれらを含む）に基づく機能クラスタと一致し、菌株特異性ゲノム変異がニッチアダプテーション（ｎｉｃｈｅ ａｄａｐｔｉｏｎ）に役立つ可能性があると表明する。特に、最も多様なタイプと最も高い遺伝子コピー数を有して植物多糖の炭水化物活性酵素に対してターゲティングするビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２は介入した後に最高豊度を有する。
【００１５】
したがって、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌またはその混合物が哺乳動物で肥満の治療、体重増加の抑制および/または体重減少の誘導に用いられる食品、サプリメントまたは薬物を製造することにおける用途を提供する。
【００１６】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１またはＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２または非常に似ている菌株（１）、またはそれから誘導される菌株（２）、薬学的に許容される担体または食用担体を含む組成物（３）を開示する。
【００１７】
本発明は、本発明の組成物を製造する方法を開示し、それは、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１またはＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２または非常に似ている菌株を用いて適切な組成物に調製することを含む。
【００１８】
また、本発明は、過重、肥満、高血糖症、糖尿病、脂肪肝、脂質異常症、内臓脂肪症候群、肥満または過重対象の感染および/または脂肪細胞肥大化から選択される疾患を予防および/または治療する方法を開示し、前記方法は本発明の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【００１９】
また、本発明はそれを必要とする対象における単純性肥満または遺伝性肥満の減少、代謝低下緩和または炎症および脂肪蓄積低下（ｆａｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）の方法を開示し、それを必要とする対象に本発明の組成物を投与することを含む。
【００２０】
また、本発明は、健康な腸内生態系の構造を定義する基礎菌種を確立し、腸内環境を病原性および有害な細菌にとって不利にし、腸内内容物中の腸内細菌の濃度を未処理対照に対して減少させる方法を開示し、前記方法は本発明の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【００２１】
また、本発明は、それを必要とする対象における糖尿病を治療する方法を開示し、前記方法は本発明の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１は介入後の生物学的臨床パラメータおよび炎症状況の改善を示す。（赤色）人体測定マーカー。（緑色）血漿脂質恒常性。（青色）血漿グルコース恒常性。（紫色）炎症関連マーカー。ＢＭＩ（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ）：ボディマス指数、ＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）：経口ブドウ糖耐糖能試験、ＬＢＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ-ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）：リポ多糖結合タンパク質。
【００２３】
図２は食事介入期間に腸内細菌叢の転換を示す。（Ａ）は７つの時点の属レベル腸内細菌叢の構成である。頂部図はシャノン指数（Ｓｈａｎｎｏｎ  ｉｎｄｅｘ）値を示し、底部図は各属のパーセントを示す。平均豊度に応じて、前の１５個属はその分類学名称でマークされる。（Ｂ）５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株の差異豊度。ステージＩ：０日目から６０日目まで、基礎食事の介入、ステージＩＩ：６０日目から７５日目まで、基礎介入+１００ｇ以上３号処方、ステージＩＩＩ：１００ｇ以下１号処方+１００ｇ以上３号処方）。
【００２４】
図３は臨床パラメータの変化と５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株の豊度との間の相関性を示す。スピアマン相関性を実行する。*校正Ｐ<０．０５、**校正Ｐ<０．０１（ＢｅｎＪａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ１９９５）。
【００２５】
図４はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのオルソログ遺伝子のオルソログクラスタ（ＣＯＧ）分類を示し、各ＣＯＧに対して、６つの完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムの平均百分率を指摘する。
【００２６】
図５はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株の間のゲノム変異を示す。（Ａ）６つの完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムの間はＭＵＭｍｅｒを利用して行われたゲノム配列アライメントのペアリング散布図に基づいて比較する。（Ｂ）ベン図Ｖｅｎｎｄｉａｇｒａｍ）は各菌株における独特なコアゲノムの数を示す。
【００２７】
図６は少なくとも２つコピーのコピー数差異を有すコアＣＯＧの分布である。ヒートマップは、特定のＣＯＧ機能に付された遺伝子のコピー数を示す。菌株はユークリッド距離（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）とウォード-連結法（Ｗａｒｄｌｉｎｋａｇｅ）によりクラスタされる。
【００２８】
図７は介入中の生物医学パラメーターの変化について示す。（赤色）人体計測マーカー。（緑色）血漿脂質恒常性。（青色）血漿グルコース恒常性。（紫色）炎症関連マーカー。ＳＡＡ：血清アミロイドＡタンパク質；ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質。
【００２９】
図８は１０５日目の腸内細菌糞においてどうていされた９種類のビフィズス菌種の豊度について示す。
【００３０】
図９はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのパンゲノムおよびコアゲノムの曲線を示す。（Ａ）追加されたゲノム数に対してプロットされたビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムパンゲノムにおける累積遺伝子数。演繹数学関数もまた示す。
【００３１】
図１０は６個の完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムに由来する予測されたｅｔｓクラスターの物理的マップを示す。潜在的機能にしたがって、遺伝子が有色矢印で示されている。
【００３２】
図１１は６株のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムの非必須でユニークなＣＯＧの分布について示す。ヒートマップは、特定ＣＯＧ機能として注釈される遺伝子のコピー数を示している。菌株は、ジャガード距離とウォード連結法により群わけされる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明者はすでに哺乳動物における単純性肥満または遺伝性肥満の減少、代謝低下緩和または炎症および脂肪蓄積低下のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの菌株を発見した。腸内に構築する場合、本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は単独でまたは他のプロバイオティク微生物と組み合わせて、基礎菌種として機能し、前記基礎菌種は例えば酢酸塩/エステルの生成を向上させることで不利な腸内環境を病原性および有害な細菌にとって不利にすることにより健康な腸内生態系の構造を定義する。
【００３４】
以下、より詳細な説明のように、本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は全穀類、伝統的な中国薬膳およびプレバイオティクス（ＷＴＰ食事）に基づく前に開示された食事を入院介入を行われた個体から分離したものである。（Ｓ．Ｘｉａｏ等、Ａ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ-ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｎｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｅｃｏｌ８７、３５７（Ｆｅｂ，２０１４））である。これらの個体は３０日の食事介入を経た後、遺伝性および単純性肥満の児童の代謝低下がいずれも顕著に緩和される。
【００３５】
以下の実施例における詳細な説明のように、本発明者は本発明の基礎菌種の大量の菌株を成功に取得し、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムと同定する。代表的な分離株はＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１およびＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２菌株であり、２０１７年１月２３日に中国普通微生物菌種寄託センター（Ｃｈｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号はそれぞれＣＧＭＣ１３６５０とＣＧＭＣ１３６５１である。
【００３６】
本発明に係るプロバイオティクス菌株は当業者によく知られる従来方法で培養し、維持し、繁殖することができ、そのうち、ある方法を以下の実施例に例示される。
【００３７】
本発明に使用されるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株またはこれらの混合物である。好ましくは、本発明に使用されるビフィズス菌はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１またはＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２菌株である。
【００３８】
本明細書に記載される作用を発揮することができる任意の形態で該細菌を利用することができる。好ましくは、該細菌は生菌である。
【００３９】
該細菌は、細菌全体を含んでいてもよく、細菌成分を含んでいてもよい。このような成分の実施例は、例えば、ペプチドグリカンのような細菌細胞壁成分、ＤＮＡやＲＮＡのような細菌核酸、細菌膜成分、および細菌構成成分、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質およびこれらの組み合わせ、例えば、リポタンパク質、糖脂質、糖タンパク質などを含んでいる。
【００４０】
細菌はさらに細菌代謝物を含むかまたは代替的に含むことができる。本明細書においておける用語「細菌代謝物」は、哺乳動物におけるプロバイオティク生成物の生成および輸送の期間および胃腸輸送期間に細菌の成長、生存、持続、輸送または存在期間の細菌代謝のために、（プロバイオティク）細菌により生成または修飾された全ての分子を含んでいる。例えば、有機酸、無機酸、塩基、タンパク質とペプチド、酵素と補酵素、アミノ酸と核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、ビタミン、全ての生物活性化合物、無機成分を含んでいる代謝物、および全ての小分子、例えば窒素含有分子または亜硫酸含有分子を含んでいる。好ましくは、該細菌は細菌全体を含み、より好ましくは、生菌全体である。
【００４１】
本発明に使用されるビフィズス菌は、ヒトおよび/または動物の摂取に適用するビフィズス菌であることが好ましい。本発明に使用されるビフィズス菌は、同じタイプの（菌種および菌株）であってもよく、または菌種および/または菌株を含む混合物であってもよい。
【００４２】
適切なビフィズス菌は以下の菌種から選択される：ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）およびビフィドバクテリウム・アンギュラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ）およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる
【００４３】
以下の実施例に示すように、ラクトバチルス・ムコサエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｏｓａｅ）、特に、ラクトバチルス・ムコサエ菌株３２と非常に似ているものであり、食事の介入後に顕著に上昇する。したがって、好ましくは、本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株と組み合わせて用いられる菌はラクトバチルス・ムコサエであり、特に菌株３２である。
【００４４】
一実施形態では、本発明に使用される細菌はプロバイオティクスである。本明細書において、用語「プロバイオティクス」は適切な量で生菌を投与する場合にすべての宿主健康に利益を与える非病原性細菌を含むと定義される。これらのプロバイオティクス菌株は一般的に消化管の上部を通る場合に生存することができる。それらは非病原性、無毒であり、消化管における常在菌（ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｆｌｏｒａ）と生態相互作用を行うこと、および「ＧＡＬＴ」（腸管関連リンパ組織）を介して免疫系の能力に積極的に影響を与えることにより、それらの健康への有益な作用を発揮する。プロバイオティクスの定義によれば、これらの細菌は十分な数量が提供される場合に活着して腸管を通ることができるが、それらは腸管バリアを通ることができないため、それらの主な作用は胃腸管の腔および/または壁に誘発されることである。そして、それらは投与される期間に常在菌の一部に形成される。この定着（または短い定着）は該プロバイオティクスを有益な作用を発揮させ、例えば、菌群に存在する潜在的な病原性微生物と腸管の免疫系と相互作用を行うことを抑制する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明に係る該ビフィズス菌はラクトバチルス属細菌と併用する。本発明に係るビフィズス菌と乳酸桿菌の組み合わせは、あるの応用において相乗効果（即ち単独で使用する細菌の相乗効果より大きい）を示す。例えば、単一成分として哺乳動物に作用する以外、併用は該組み合わせの他の成分に対して有益な効果を生成することができ、例えば、該組み合わせの他の成分の作用により、その後にエネルギー供給源とする代謝物または他の成分に対して有利な生理的条件を保持する。
【００４６】
一般的に、乳酸桿菌は、以下の菌種ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）、ラクトバシラス・ビフィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓ  ａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・カーバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラスサケアイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラスラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｅｕｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラスクリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｄ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、およびラクトバシラス・ジェネセニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に使用される乳酸桿菌はプロバイオティクラクトバチルスである。好ましくは、本発明に使用される乳酸桿菌はラクトバチルス・アシドフィルス菌種である。
【００４８】
投与量および投与方法  生体を消化管に導入することができるすべでの方法でプロバイオティクスの投与を完了することができる。該細菌を担体と混合し、および液体または固体の飼料または飲用水に加えることができる。担体材料は細菌と動物に無毒であるべきである。好ましくは、該担体は、保存期間の細菌の生存力を高める成分を含む。細菌を動物の口に直接注入するための接種ペースト（ｉｎｏｃｕｌａｎｔ  ｐａｓｔｅ）を調製することもできる。該製剤は口当たりを向上させ、賞味期限を延ばし、栄養効果を付与するように、他の成分を含んでもよい。再生可能でかつ測定された投与量が必要であれば、ルーメン挿管（ｒｕｍｅｎ  ｃａｎｎｕｌａ）で細菌を投与することができる。投与を待つプロバイオティクスの量は、効力に影響を与える因子により制御する。飼料または飲用水に投与する場合に、投与量を数日または数週間の時間帯内に分散することができる。数日に投与された低投与量の累積効果は、単回投与の大きな投与量の効果よりよい可能性がある。優位のプロバイオティクスを投与する前、期間および後の糞便におけるヒトのサルモネラ菌症を引き起こすサルモネラ菌菌株の数量を監視することにより、当業者は動物が携帯するヒトのサルモネラ菌症を引き起こすサルモネラ菌菌株の量を減少するための必要な投与量を容易に決定することができる。優位のプロバイオティクスの一種または２種以上の菌株はともに投与することができる。各動物は所与個体で最も持続的な菌株が異なる可能性があるため、菌株の組み合わせは有益である可能性がある。
【００４９】
本発明に使用されるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムは１０６〜１０１２ＣＦＵ細菌/ｇ支持体を含み、より好ましくは、１０８〜１０１２ＣＦＵ細菌/ｇ支持体であり、凍結乾燥形態は、１０９〜１０１２ＣＦＵ/ｇが好ましい。
【００５０】
適切に、約１０６〜約１０１２ＣＦＵの微生物/投与量、好ましくは約１０８〜約１０１２ＣＦＵの微生物/投与量の投与量でビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムを投与することができる。用語“各投与量”は毎日または毎回に摂取し、好ましくは毎日対象にこの量の微生物を提供することを意味する。例えば、食品（例えばヨーグルト）に該微生物を投与すれば、ヨーグルトは約１０８〜１０１２ＣＦＵの微生物を含むことが好ましい。あるいは、微生物の量を複数回に分けて使用してもよく、毎回の投与は少量の微生物が担持されていることにより構成する--対象に許容される微生物総量はいかなる特定時間内に（例えば２４時間内）１０６〜１０１２ＣＦＵの微生物であり、好ましくは１０８〜１０１２ＣＦＵの微生物である。
【００５１】
本発明によれば、少なくとも１種微生物の有効量は少なくとも１０６ＣＦＵ微生物/投与量であってもよく、好ましくは、約１０６〜約１０１２ＣＦＵの微生物/投与量であり、好ましくは、約１０８〜約１０ＣＦＵの微生物/投与量である。
【００５２】
一実施形態では、約１０６〜約１０１２ＣＦＵ微生物/日、好ましくは、約１０８〜約１０１２ＣＦＵの微生物/日の投与量でビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株を投与することができる。したがって、該実施形態における有効量は約１０６〜約１０１２ＣＦＵ微生物/日であり、好ましくは、約１０８〜約１０１２ＣＦＵ微生物/日である。
【００５３】
ＣＦＵは、「コロニー形成単位」を示す。「支持体」は食品、サプリメントまたは薬学的に許容される支持体を指す。
【００５４】
本発明においてビフィズス菌と他のプロバイオティクスを併用する場合に、該細菌は本明細書において記載される本発明の所期の効果を奏する任意の比例で存在し得る。
【００５５】
対象/医学的適用応症
【００５６】
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株を哺乳動物に投与し、例えば、家畜（ウシ、馬、豚、鶏およびヒツジを含む）およびヒトを含む。本発明のいくつかの態様では、哺乳動物はパートナー動物（ペットを含む）、例えば、犬または猫である。本発明のいくつかの態様では、対象は適切に人であってもよい。
【００５７】
該ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は哺乳動物（特にヒトである）における多種疾患または病症を治療することに適用することができる。本明細書において用語「治療」は、（１）哺乳動物における特定の疾患の発生を防止し、前記哺乳動物は該疾患に罹患しやすいがまだ経験しないまたは該疾患の病理または症状（該疾患に関連する一つ以上のリスク因子を含む予防）をあらわさない可能性があり、（２）該疾患の病理または症状を経験しまたは表している哺乳動物で該疾患を抑制し、または（３）該疾患の病理学または症状を経験または表している哺乳動物で該疾患を抑制することを意味する。
【００５８】
本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は、糖尿病および肥満を兼ねる哺乳動物に適用する。これらは糖尿病および非肥満症を罹患する哺乳動物および糖尿病リスク因子を有するがまだ糖尿病状態に置かれていない肥満哺乳動物に適用する。以下は、これについてより詳細に説明する。
【００５９】
以下の実施例により詳細な説明のように、本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は多種類の生物学的活性を有する。具体的には、本発明に使用されるビフィズス菌は、哺乳動物でインスリン感受性を正常化し、食後インスリンの分泌を向上させ、空腹時インスリン分泌を低減し、耐糖能を改善することができる。これらの作用は、糖尿病および糖尿病関連病症（特に、２型糖尿病および耐糖能劣化）を治療するための潜在力を付与する。
【００６０】
また、本発明に使用されるビフィズス菌は、体重減少および体の脂肪重量（特に腸間膜の脂肪重量）の減少を誘導することができる。これらの作用は哺乳動物で肥満の治療するおよび体重増加の制御および/または体重減少の誘導ための潜在力を与える。
【００６１】
具体的には、以下の実施例により詳細な説明のように、本発明によれば、乳酸桿菌（特にラクトバチルス・アシドフィルス）と併用するビフィズス菌は、体重減少と体の脂肪重量（特に腸間膜の脂肪重量）の減少を誘導することができる。これらの作用は哺乳動物で肥満の治療および体重増加の制御および/または体重減少の誘導ための潜在力を与える。
【００６２】
本明細書においては、用語「肥満」はボディマス指数（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ、ＢＭＩ）と関連する。ボディマス指数（ＢＭＩ）（ｋｇで示される体重を米で示される身長の２乗で割ることで計算）は、一般的に認められる過重および/または肥満の標準である。ＢＭＩが２５を超えると過重と考えられる。ＢＭＩが３０または以上であると、肥満と定義され、ＢＭＩが３５または以上であると、深刻な合併症肥満と考えられ、ＢＭＩが４０または以上であると、病的な肥満と考えられる。
【００６３】
以上に指摘されたように、本明細書において使用される用語「肥満」は肥満、合併症肥満および病的な肥満を含む。したがって、ここで用いられる用語「肥満」はＢＭＩが３０以上の対象と定義することができる。いくつかの実施形態では、肥満対象は適切に３０以上、適切に３５、適切に４０のＢＭＩを有することができる。
【００６４】
本発明の組成物は特に糖尿病および肥満症を兼ねる患者に適用するが、該組成物も非肥満型の糖尿病の患者に適用する。肥満（ただし糖尿病がない）の人肥満の代謝結果、即ち糖尿病または少なくともインスリン抵抗性発展を制限することを予期できるので、糖尿病リスク因子を有するがまだ糖尿病状態に置かれていない肥満患者にも適用することができる。
【００６５】
また、本発明に使用されるビフィズス菌は哺乳動物で内臓脂肪症候群を治療するために用いる。内臓脂肪症候群は心臓血管疾患と糖尿病リスクを高める医学疾患の組み合わせである。内臓脂肪症候群は内臓脂肪症候群Ｘ、Ｘ症候群、インスリン抵抗性症候群、レブンズ症候群（Ｒｅａｖｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）またはＣＨＡＯＳ（オーストラリア）とも呼ばれる。
【００６６】
遺伝性肥満
【００６７】
別の実施形態では、本発明に使用されるビフィズス菌（および存在すれば、乳酸桿菌）は哺乳動物で組織炎症（特に、肝臓組織炎症、筋肉組織炎症および/または脂肪組織炎症であるが、これに限定されない）を低減するために用いることができる。
【００６８】
本発明に係るビフィズス菌（および存在すれば、乳酸桿菌）を用いて心臓血管疾患を治療する実例は、脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化、脳血管障害（脳卒中）、脳血管疾患、鬱血心不全（ＣＨＦ）、冠動脈性心疾患、心筋梗塞（心臓病発作）および末梢血管疾患を含む。
【００６９】
本発明の範囲内で本発明の実施形態を組み合わせることができ、本明細書において記載のいかなる特徴の組み合わせは本発明の範囲内に含まれる。具体的には、本発明の範囲内で該細菌のいかなる治療作用はいずれも随伴して現れると推測する。
【００７０】
組成物
【００７１】
本発明によれば、本発明に係るビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株（即ちいかなる支持体、希釈剤または賦形剤がない）を単独で投与することができるが、本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は、一般的に好ましくは、製品の一部として支持体上または支持体内に投与され、特に食品、サプリメントまたは医薬製剤の成分とする。これらの製品は一般的に当業者によく知られた追加成分を含む。
【００７２】
該組成物から利益を受けるいかなる製品はいずれも本発明に用いることができる。これらは食物に限定されず、特に果物ジャム、乳製品および乳製品の派生製品、および医薬製品である。本発明に係るビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は本明細書において「本発明の組成物」または「該組成物」と呼ばれる。
【００７３】
食物
【００７４】
一実施形態では、本発明のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は食品、例えば食品補給剤、飲料または乳粉に適用する。ここで、「食物」は広義に使用されて、ヒトの食物および動物の食物（即ち飼料）を含む。好ましい態様では、食物は人間の消耗に用いられる。
【００７５】
食物は溶液または固体の態様であてもよい--用途および/または応用方式および/または投与方式によって決定する。機能性食物などの食物を製造に用いられる場合に、本発明の組成物は、以下の１種類または２種類以上と併用してもよい：栄養許容可能な担体、栄養許容可能な希釈剤、栄養許容可能な賦形剤、栄養許容可能な補助剤、栄養活性成分。
【００７６】
例えば、本発明の組成物は、以下の各項の成分として使用される：清涼飲料、果汁またはホエイタンパク質を含有する飲料、健康茶、ココア飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、酸乳とドリンクヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、シャーベット（ｗａｔｅｒ  ｉｃｅｓ）とデザート、キャンディ、ビスケット菓子とケーキミックス、レジャー食品、バランスのフードと飲料、フルーツフィリング、ｃａｒｅ  ｇｌａｚｅ、チョコレートアンパン、チーズケーキ風味の詰物（ｃｈｅｅｓｅ  ｃａｋｅ  ｆｌａｖｏｕｒｅｄ  ｆｉｌｌｉｎｇ）、フルーツ風味のケーキの詰物（ｆｒｕｉｔ  ｆｌａｖｏｕｒｅｄ  ｃａｋｅ  ｆｉｌｌｉｎｇ）、ケーキとドーナツのアイシング（ｃａｋｅ  ａｎｄ  ｄｏｕｇｈｎｕｔ  ｉｃｉｎｇ）、インスタントベーカリーの詰物のクリーム（ｉｎｓｔａｎｔ  ｂａｋｅｒｙ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｃｒｅａｍｓ）、ビスケットクッキーの詰物（ｆｉｌｌｉｎｇｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｋｉｅｓ）、インスタント型焼き食品の詰物、低カロリー詰物（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｆｉｌｌｉｎｇ）、成人の栄養飲料、酸性化大豆/ジュース飲料（ａｃｉｄｉｆｉｅｄ  ｓｏｙ/jｕｉｃｅ  ｂｅｖｅｒａｇｅ）、無菌/滅菌チョコレート飲料（ａｓｅｐｔｉｃ/ｒｅｔｏｒｔｅｄ  ｃｈｏｃｏｌａｔｅ  ｄｒｉｎｋ）、バーミックス（ｂａｒ  ｍｉｘｅｓ）、飲料用粉末（ｂｅｖｅｒａｇｅ  ｐｏｗｄｅｒｓ）、カルシウム強化ダイズ／プレーンおよびチョコレートミルク（ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ  ｓｏｙ/ｐｌａｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｏｃｏｌａｔｅ  ｍｉｌｋ）、カルシウム強化コーヒー飲料。
【００７７】
該組成物はさらに以下の食品の成分として使用することができる：アメリカンチーズソース（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｃｈｅｅｓｅ  ｓａｕｃｅ）、チーズパウダー＆チーズ固化防止剤、チップディップ（ｃｈｉｐ  ｄｉｐ）、クリームチーズ（ｃｒｅａｍ  ｃｈｅｅｓｅ）、ドライブレンドホイップトッピングファットフリー  サワークリーム（ｄｒｙ  ｂｌｅｎｄｅｄ  ｗｈｉｐ  ｔｏｐｐｉｎｇ  ｆａｔ  ｆｒｅｅ  ｓｏｕｒ  ｃｒｅａｍ）、凍結/解凍乳製品ホイップクリーム（ｆｒｅｅｚｅ/ｔｈａｗ  ｄａｉｒｙ  ｗｈｉｐｐｉｎｇ  ｃｒｅａｍ）、凍結/解凍安定ホイップチップ（ｆｒｅｅｚｅ/ｔｈａｗ  ｓｔａｂｌｅ  ｗｈｉｐｐｅｄ  ｔｉｐｐｉｎｇ）、低脂肪および軽量天然チェダーチーズ（ｌｏｗ  ｆａｔ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈｅｄｄａｒ  ｃｈｅｅｓｅ）、低脂肪スイス風ヨーグルト、冷凍デザート（ａｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｚｅｎ  ｄｅｓｓｅｒｔｓ）、ハードパックアイスクリーム（ｈａｒｄ  ｐａｃｋ  ｉｃｅ  ｃｒｅａｍ）、ラベルにやさしい、経済的/贅沢なハードパックアイスクリーム（ｌａｂｅｌ  ｆｒｉｅｎｄｌｙ，  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ＆ｉｎｄｕｌｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈａｒｄ  ｐａｃｋ  ｉｃｅ  ｃｒｅａｍ）、低脂肪アイスクリーム、ソフトアイスクリーム、バーベキューソース（ｂａｒｂｅｃｕｅ  ｓａｕｃｅ）、チーズディップソース（ｃｈｅｅｓｅ  ｄｉｐ  ｓａｕｃｅ）、カッテージチーズドレッシング（ｃｏｔｔａｇｅ  ｃｈｅｅｓｅ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、ドライミックスアルフレドソース（ｄｒｙ  ｍｉｘ  Ａｌｆｒｅｄｏ  ｓａｕｃｅ）、ミックスチーズソース（ｍｉｘ  ｃｈｅｅｓｅ  ｓａｕｃｅ）、ドライトマトソース等。
【００７８】
本明細書において使用される用語「乳製品」は動物由来および/または植物由来の乳の媒体を含むことを意図する。動物由来の乳として、乳牛、綿羊、ヤギまたはスイギュウ由来の乳が挙げられる。植物由来の乳として、本発明で使用される植物由来のいかなる発酵可能な物質、特にダイズ、コメまたは穀物由来の乳が挙げられる。
【００７９】
いくつかの態様では、好ましくは、本発明はヨーグルト生産に用いることができ、例えば、発酵ヨーグルト飲料、飲用型ヨーグルト、チーズ、発酵乳、牛乳ベースのデザートなど。ｍｉｌｋ  ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｓｅｒｔｓ）などである。
【００８０】
適切に、該組成物はさらに以下の１種類または２種類以上の成分として使用することができる：チーズ応用、肉類応用、または鮮度保持菌（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を含む応用である。
【００８１】
本発明はさらに食物または食物成分を製造する方法を提供し、該方法は本発明に係る組成物を別の食物成分と混合することを含む。
【００８２】
好ましくは、本発明は本発明の組成物（および任意選択的に他の成分/成分）と接触した製品に関し、ここで、該組成物は製品の栄養および/または健康利益を改善できる量で使用される。
【００８３】
本明細書において使用される用語「接触」とは、本発明の組成物を製品に間接的または直接に応用することを指す。使用可能な応用方法の実施例としては、該組成物を含む材料で該製品を処理すること、該組成物を該製品と混合することにより直接応用すること、該組成物を該製品の表面にスプレーすること、または該製品を該組成物の製剤に浸漬することが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
本発明の製品は食品であれば、本発明の組成物と該製品を混合することが好ましい。または、該組成物は食品の原料成分または乳化液に含まれてもよい。または、該組成物は調味料、卵白、着色剤混合物などとして応用することができる。
【００８５】
本発明の組成物を制御量の微生物で装飾、塗布および/または注入製品に応用することができる。
【００８６】
該組成物を発酵乳または蔗糖強化ミルク（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ  ｍｉｌｋ）、蔗糖および/または麦芽糖を有する乳酸媒体に用いられ、該組成物の全ての成分を含有すれば−即ち、本発明に係る前記微生物−の得られた媒体を成分として適切な濃度で酸乳に添加することができ、例えば最終製品において１０６-１０１０ＣＦＵの日投与量の濃度を提供する。本発明に係る微生物は、酸乳の発酵前または発酵後に使用することができる。
【００８７】
いくつかの態様では、本発明に係る微生物は動物飼料、例えば家畜飼料、特に家禽（例えば鶏）飼料、またはペットフードの製造または製造に用いられる。
【００８８】
好ましくは、製品は食物であれば、本発明に係るビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は、小売業者が該食品を販売する正常な「最も遅い販売」または「有効期間」内に、有効を保持すべきである。好ましくは、有効な時間はこのような食物の腐敗が顕著になる正常な鮮度保持期が終了する期日を超えるまで延長すべきである。食品に応じて所望の時間長度と正常な賞味期限が変化し、かつ当業者は食品のタイプ、食品の大きさ、貯蔵温度、加工条件、包装材料、包装装置に応じて賞味期限が変化することを知られる。
【００８９】
食物成分、食物補助剤および機能性食物
【００９０】
本発明の組成物は、食物成分および/または飼料成分として使用される。本明細書において使用される用語「食物成分」または「飼料成分」は、栄養補助剤または栄養補助剤として機能性食物または食材に添加することができる製剤を含む。食物成分は溶液または固体の形態であてもよい-用途および/または応用方式および/または投与方式によって決定される。
【００９１】
本発明の組成物は食物補助剤であてもよく、または食物補助剤に添加することができる（本明細書においてサプリメントとも呼ばれる）。
【００９２】
本発明の組成物は機能性食物あってもよく、または機能性食物に添加することができる。本明細書において使用される用語「機能性食物」は、消費者に栄養作用を提供することができるだけでなく、さらに有益な効果を提供することができる食物を指す。
【００９３】
したがって、機能性食物は、純粋な栄養作用以外の特定機能-例えば、医薬または生理的利点−のある成分または成分（本明細書において記載のこれらの）を食物に付与する一般的な食物である。いくつかの機能性食物は保健用食品であり、ここで、用語「保健用食品」とは、消費者に栄養作用および/または味覚的な満足感を提供することができるだけでなく、さらに治療（または他の有益な）の作用を提供する食物を指す。保健用食品は食物と薬物との間の伝統的な境界線を跨ぐ。
【００９４】
薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）
【００９５】
本明細書に使用される用語「薬剤」は、ヒトおよび獣医学にヒトおよび動物に用いられる薬剤を含む。また、本明細書において使用される用語「薬剤」は、治療および/または有益な効果を提供するいかなる物質を指す。本明細書に使用される用語「薬剤」は市場許可を必要とする物質に限定されず、さらに化粧品、保健用食品、食物（例えば、飼料および飲料を含む）、プロバイオティクス培養物（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）および自然療法に用いる物質を含む。また、本明細書に使用される用語「薬剤」は、動物飼料（例えば家畜飼料および/またはペットフード）に組みあわせるために設計する製品を含む。
【００９６】
薬物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
【００９７】
本発明の組成物は−薬物として使用することができ−または薬物の製造に用いられる。ここで、用語「薬物」は広義の使用であり−かつヒトための薬物および動物ための薬物（即ち、獣医応用）を含む。好ましい態様では、該薬物はヒト用途および/または牧畜業に用いる。該薬物は治療目的として使用される--性質上で治療または寛解または予防の性質であてもよい。該薬物はさらに診断目的として使用される。
【００９８】
薬学的に許容される支持体は、例えば圧縮錠剤、錠剤、カプセル、軟膏、坐剤または飲用可能な溶液（ｄｒｉｎｋａｂｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）形態の支持体であってもよい。他の適切な形態は以下のとおりである。
【００９９】
本発明の組成物は、薬物として使用されるまたは薬物の調製に用いる場合に、以下の一種類または２種類以上と併用することができる：薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される補助剤、薬物活性成分。薬物は溶液または固体の形態であてもよい-用途および/または応用形態および/または投与形態によって決定される
【０１００】
これらのような形態の栄養学的に許容される担体としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖類、ゼラチン、乳糖、アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ）、ステアリン酸マグネシウム、滑石粉、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸モノグリセリド、およびジグリセリド、石油（Ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１０１】
水性懸濁剤および/またはエリキシル剤に対して、本発明の組成物は、各種類甘味剤または調味剤、着色剤または染料と組み合わせることができ、乳化剤および/または懸濁剤と組み合わせことができ、および水、プロピレングリコールおよびグリセリンの希釈剤およびその組み合わせと組み合わせことができる。剤型はさらにゼラチンカプセル、繊維カプセル、繊維シートなど、またはさらに繊維飲料を挙げることができる。剤型の他の例としてクリームが挙げられる。いくつか態様に対して、本発明に使用される微生物は薬物および/または化粧品のクリームに用いられ、例えば日焼け止めクリームおよび/または日光浴後用クリーム（ａｆｔｅｒ-ｓｕｎ  ｃｒｅａｍｓ）である。
【０１０２】
プレバイオティクスとの組み合わせ
【０１０３】
本発明の組成物はさらに一種類または２種類以上のプレバイオティクスを含むことができる。プレバイオティクスは機能性食物であり、結腸内の一種類または少数の細菌の成長および/または活性を選択的に刺激することにより、宿主に有益な作用が発生し、宿主健康を改善する消化しにくい食物成分をと定義される。一般的に、プレバイオティクスは炭水化物（例えばオリゴ糖）であるが、該定義は非炭水化物を排除しない。プレバイオティクスは最も普遍的な態様で栄養学的に可溶性繊維に分類される。ある程度で、多くの態様の食物繊維はある程度の健康促進の作用を示す。
【０１０４】
一実施形態では、プレバイオティクスは選択的発酵成分であり、それは胃腸管微生物コロニーの組成および/または宿主の健康に役立つ活性的な特定の変化を許容する。
【０１０５】
適切に、本発明によれば、プレバイオティクスは０．０１〜１００グラム/日の量で使用することができ、好ましくは、０．１〜５０グラム/日であり、より好ましくは０．５〜２０グラム/日である。一実施形態では、本発明によれば、１〜１００グラム/日の量でプレバイオティクスを使用することができ、好ましくは、２〜９グラム/日であり、より好ましくは、３〜８グラム/日である。別の実施形態では、本発明によれば、５〜５０グラム/日の量でプレバイオティクスを使用することができ、好ましくは、１０〜２５グラム/日である。
【０１０６】
プレバイオティクスの食物由来の実施例は、大豆、イヌリン由来（例えばキクイモ、クズイモおよびチコリ根）、未精製エンバク、未精製小麦、未精製オオムギおよびヤーコンを含む。適切なプレバイオティクスとしては、アルギン酸塩、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ 糖（ＦＯＳ）、ポリデキストロース（即ちＬｉｔｅｓｓｅ(R)）、ラクチトール、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、イソマルツロース（Ｐａｌａｔｉｎｏｓｅ.ＨＭ.）、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、キシロオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、β?グルカン、セロビオース、ラフィノース、ゲンチオビオース、メリビオース、キシロビオース、シクロデキストリン、イソマルトース、トレハロース、スタキオース、パトース、プルラン、ベルバスコース、ガラクトマンナンおよびあらゆる形態のレジスタントスターチが挙げられる。特にプレバイオティクスの好ましい例としては、ポリデキストロースである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株とプレバイオティクスとの組み合わせは、いくつかの応用において相乗効果（即ち単独で細菌を使用する時の相乗効果より大きい）を示す。
【実施例】
【０１０８】
最近の証拠によると、腸内微生物群の菌群のバランスがくずれるのは、肥満および糖尿病などのヒト疾患に肝心な作用（１、２）を果たすことを表明する。疾患/健康の表現型に影響を与える腸内細菌叢の特定メンバーは、疾患診断の有力なツール（３、４）だけでなく、標的として薬物（５）、糞便微生物移植（６）および飲食（７）などの多種方法で疾患の緩和/治療に用いることができる。しかしながら、腸内細菌叢自体の複雑さおよび個体間の差異およびそれと宿主と飲食の相互作用（８）のために、最適用なヒト健康を実現して腸内微生物群に対する正確な操作は、ゲノムおよび分子レベルにより深く理解する必要がある。
【０１０９】
我々の前の食事介入研究の中で、全穀類、伝統的な中国薬膳およびプレバイオティクスから構成される消化しにくいが発酵可能な炭水化物の食事（ＷＴＰ食事）は、腸内細菌叢を顕著改善するだけでなく、プラダー・ウィリー症候群に罹患する遺伝性肥満児童の生物学的臨床パラメータおよび炎症状況（９）を改善する。特定の善玉菌ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムは、介入した後に顕著に濃化され、それは他の潜在的な有害菌種と負の相関であり、かつ宿主臨床パラメータの改善と正の相関である（９）。
【０１１０】
該グループからの一つの児童は１０５日の介入を完了する。他の生物学的臨床パラメータが改善され、初期の体重減少が２５．８ｋｇを超え、同時に腸内微生物コロニーが顕著に転換し、例えば、大便桿菌（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が多くなる。また、介入した後のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムはビフィドバクテリウム属における最も優位な菌種であることを発見する。興味深いことは、我々は１０５日目に彼の糞便サンプルから５種類菌株（１０）を分離し、これらの菌株は炭水化物に富む介入に対して差異応答を有する。腸内生態系における細菌ニッチアダプテーションを参与する遺伝的特性および宿主と食物との相互作用（１１）を知るために、我々はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムに対して比較ゲノミクス（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の研究を行う。
【０１１１】
結果および検討
【０１１２】
改善された生物学的臨床パラメータおよび転換された腸内細菌叢
【０１１３】
介入期間に該肥満児童の生物学的臨床変数が改善される（図１および図７）。体重が１４１．１ｋｇから１１４．３ｋｇに低下し、かつ血漿グルコースおよび脂質内恒常性の両方が正常範囲に改善する。介入した後、二種全身性炎症マーカーＣ-反応性タンパク質（Ｃ-ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＰ）および血清アミロイドタンパク質Ａ（ＳｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＡｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＡ）が低下する。アディポネクチンは２．１７μｇ/ｍｌから５．３９μｇ/ｍｌに向上し、レプチンは６３．８２ｎｇ/ｍｌから３４．４７ｎｇ/ｍｌに低下し、「リスク」表現型（１２）の緩和を示す。また、血液中の細菌抗原に担持された代替マーカーとしてのリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）（１３）が低下した。
【０１１４】
我々はメタゲノムシークエンスにより７つの時点（０、１５、３０、４５、６０、７５および１０５日）に各糞便のサンプル２５．２±４．８百万（平均値±ｓ．ｄ．）個の高品質ペアエンドリード（ｐａｉｒｅｄ-ｅｎｄ  ｒｅａｄｓ）を取得する。介入期間の腸内細菌叢の組成が転換し（図２Ａ）、かつ三つの介入ステージ（ステージＩ：０日目から６０日目までの基礎介入、ステージＩＩ：６０日目から７５日目までの基礎介入+１００ｇ以上の３号処方、ステージＩＩＩ：７５日目から１０５日目までの１００ｇ以下の１号処方+１００ｇ以上の３号処方（詳しくは、方法参照）に応答して、異なるパターンを示した。該肥満児童は、異なるステージにおける排便頻度が類似し（１日当たり３〜４回）、下痢が発生しない。介入期間にコロニーの多様性が低下し、それはグループの変化と一致する（９）。ベースラインにある場合、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびブブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）は二つの最も豊富な属であり、それぞれ２６．９５％および１８．４１％を占める。同時に、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびプレボテイラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）は低い豊度を有し、該コロニーが腸型３（１４）に属する可能性があることを示す。介入した後に、ルミノコッカス属およびブブラウティア属は低い豊度まで低下し、バクテロイデス属およびプレボテイラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）はほとんど介入の影響を受けない。ベースラインと比べて、抗炎症菌種（１５、１６）および有益な（５）共生細菌の大便桿菌はステージＩで増加し、１５日目の豊度は４１．９５％に達する。前の１５日の大便桿菌の急激な増加は炎症の緩和に役立つ可能性があり、該ステージで、ＣＲＰおよびＳＡＡがそれぞれ３３．３７％および５５．８５％低下する。より多くのオリゴ糖を提供する場合、大便桿菌は、ステージＩＩおよびステージＩＩＩで、低い豊度まで低下する。一方、オリゴ糖（１７）を代謝するように好適に配備されたラクトバチルス属は、ベースラインとステージＩの期間に低い豊度があるが、ステージＩＩから最も優位属の１つようになる。複数の研究は既にインスリン抵抗に対してラクトバチルス属菌株の有益な作用（１８、１９）を報告した。ラクトバチルス属の急激な増加は、ステージＩＩからのインスリン感受性の改善に役立ち、例えば、該時期の期間ＯＧＴＴインスリンＡＵＣ（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、曲線下の面積）の顕著な低下および安定したＯＧＴＴグルコースＡＵＣに示されるように、細胞内および細胞外のルートによって複数種類の炭水化物（２０）を代謝するビフィズス菌の豊度は１５日目から顕著になり、かつ介入期間に亘って依然として優位である：該児童が基礎介入を受け始まる時の２７．４７％から７５日目の６５．５３％まで上昇し、次に少ない複合食物繊維を含む１号処方を提供する時に、３６．４１％まで低下する。これらの結果は、ビフィズス菌種群が三つのステージで提供された炭水化物源の変化に応答し、かつ各ステージで、それが優位な生態的地位を占めることを示す。我々は、ビフィズス菌菌株の肥満に対する既知の有益な作用（２１、２２）、およびそれが従来のグループ研究の相互作用ネットワークにおける重要な作用（９）、およびそれが介入期間の持続的な高い豊度から考えると、これらが体重、ＢＭＩ、胴囲および腰回りを持続的に低下させることに役立つ可能性があると推測する。したがって、我々は該属をより深く分析する。
【０１１５】
介入後のサンプルにおいて、合計９種類のビフィドバクテリウム属菌種を同定した（図８）。ここで、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムが最も優位を占め、１０５日目の腸内細菌叢全体における豊度は２９．３６％である。ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベおよびビフィドバクテリウム・アドレセンティスはそれぞれ９．９４％、７．６１％および３．７５％を占め、他の５つの菌種の豊度は１％未満である。
【０１１６】
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株の介入に対する差異応答
【０１１７】
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム群を詳細に研究するために、我々は、１０５日目に我々の対象から収集された糞便サンプルから５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株（以下、菌株ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１、ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００３、ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４およびＣ９５（２３）と定義する）を分離して完全なシークエンス（１０）を行う。メタゲノムデータを完全なゲノムデータと比べることにより、Ｓｉｇｍａ（２４）を利用して該５種類の菌株の各時点の豊度の変化を同定する（図２Ｂ）。介入前に、全ての菌株は低い豊度（最大値=０．５％で、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１）を有する。前者は試験期間全体に低い豊度を維持し、後者はステージＩＩおよびステージＩＩＩの期間に小さな増加を示すため、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００３とビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＣ９５の豊度は食事の介入に応答しなさそうである。比べてみると、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２の菌株は食物介入に応答し、それらの豊度変化はビフィドバクテリウム属に対して観察されたものと一致し、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は主にこれらの変化をもたらすことを示す。実際に、介入後、これらの三種類の菌株は顕著に増加し、特にビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２である。
【０１１８】
従来の研究（９）における発見と一致し、生物学的臨床変数の改善はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株の増加に関連する（図３）。ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＣ９５は人体測定マーカー（体重、ＢＭＩ、胴囲および腰回りを含む）と負の相関である。また、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２も、炎症マーカーの改善（レプチンの減少とアディポネクチンの増加を含む）に関する。
【０１１９】
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのパンゲノム解析
【０１２０】
我々の５個の完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムおよび利用可能な共通データ（５個のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノム略図とビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔの完全なゲノム（２５）を含む）に基づいて、パンゲノム解析に１１個ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムを含む。パンゲノム曲線は、ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１の生物学的臨床変数が漸近傾向を呈し、前の６個反復における平均成長速度はゲノムあたり１００個遺伝子で、その後、これよりもっと低い速度に低下することを示す（図９Ａ）。曲線は最終的に２４８２個遺伝子に達する。これは、さらに追加のゲノムを併入することはパンゲノムの大きさのわずかな増加をもたらす可能性があることを示す。コアゲノム曲線は前の６個反復におけるより明らかな漸近傾向およびより明らかな低下を示す（図９Ｂ）。曲線は最終的に１４２７遺伝子に達する。パンゲノムとコアゲノムの傾向は、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムは、閉めたパンゲノムを示し、６個ゲノムはほとんどビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの遺伝子特徴を説明できる。これらの結果に基づき、ゲノム略図でファジィをもたらすことを回避するために、我々は、後の分析において６個の完全なゲノムを使用してビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのゲノム特徴を探索する。
【０１２１】
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの一般的な特徴
【０１２２】
我々の５種類の菌株およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔのゲノムは、平均２３５５、１８５ｂｐおよび５６．６３Ｇ+Ｃ％を示し、これはビフィドバクテリウム属のＧ+Ｃ％の範囲と一致する（２６）。ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのゲノム中において５個または６個のｒＲＮＡオペロン遺伝子座を同定し、かつ各ゲノムに５ＳｒＲＮＡｒＲＮＡ遺伝子の一つの追加コピー（表１）を有する。また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の異質性は、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔのゲノム以外のすべてのゲノムに存在する（表Ｓ１）。各ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノム中に平均的に５４個のｔＲＮＡ遺伝子を含む。
【表１】
0006974483.tif 000002
【表Ｓ１】
0006974483.tif 000003
0006974483.tif 000004
【０１２３】
各ゲノムに平均的に１８７１個のオープンリーディングフレームがある（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）と予測し、ここで、検出された８０％ＯＲＦは、ＮＣＢＩデータベース上のＢＬＡＳＴに基づいて、コンピュータ予測（Ｓｉｌｉｃｏ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）によって機能的な割り当てを行って、残りの２０％の予測は仮説タンパク質である（表１）。ＣＯＧ（オルソログクラスタグループ）（２７）に応じてオルソログ遺伝子を同定することは、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムにおける大部分の遺伝子が様々なハウスキーピング機能（ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に参与し、特に炭水化物の輸送および代謝（１２．５４％）およびアミノ酸輸送および代謝（１０．２３％）に用いるものを表明する。これらの百分率は他のビフィズス菌ゲノムの百分率と一致する（２８、２９）。
【０１２４】
ゲノム解析に基づいて、かつ実験の証拠によって支持され、ビフィズス菌の複数種類の宿主定着因子を同定した、これは胆汁抵抗性およびアドヘシン(ａｄｈｅｓｉｎｓ)に参与する機能（１１）を含む。胆汁酸は生理的濃度で抗微生物活性（３０）を有することができるので、胆汁抵抗性は多くの腸内細菌の定着にとって重要である。全ての６種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株において胆汁抵抗性を付与した胆汁酸塩加水分解酵素および/または胆汁酸輸送タンパク質を同定した。粘着の面で、全てのゲノムはエノラーゼ酵素およびＤｎａＫをコードする遺伝子を有し、ＤｎａＫはビフィドバクテリウム・アニマリス乳酸菌亜種類ＢＩ０７（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＢＩ０７）におけるプラスミノーゲン結合の関連タンパク質（３１、３２）であることが証明される。また、コードで４つのビフィズス菌（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）菌株に存在するタムスチン結合に参与するトランスアルドラーゼ（３３）、および細胞外マトリックスとの接着を促進すると報告された血管性血友病因子Ａ（ｖｏｎ  ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ）（３４）の遺伝子もゲノム中に存在する。これらの機能遺伝子の存在は、他のビフィズス菌の菌種と類似し、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムが腸内に定着するゲノム基盤を有することを示す。
【０１２５】
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのゲノムマイクロ多様性
【０１２６】
６個の完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノム中の平均ヌクレオチド同一性（ａｖｅｒａｇｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ，ＡＮＩ）は菌種の境界の閾値（３５）を満たし、最小値は９７．７６％である。異なる生育環境から分離したビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔと比較した場合（最大ＡＮＩ=９７．８０％）、同一生育環境から分離した菌株内でやや高い類似性（ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２、ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００３、ＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４およびＣ９５、最小ＡＮＩ=９９．８８％）が観察される。これらの結果は、スポットダイアグラムでビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔと他の５種の菌株との間に小さな共線性と若干の差異（挿入欠失を含む）が存在するが、全てのこれらのゲノムにおける高い共線性がゲノムのスポットダイアグラムの対照により実証されることを示す（図５Ａ）。このような変異の一つの注意する価値がある実施例は細胞外多糖（ＥＰＳ）をコードするｅｐｓ遺伝子クラスターである。ＥＰＳは細胞に付着した粘液層を形成してもよく、環境中に放出してもよい（３６）。ビフィズス菌により生成されるいくつかのＥＰＳが潜在的に宿主に役立つ多種の有益な活性を有すると考えられ、例えば、免疫系の調節、病原体の抵抗、捕捉剤としておよび微生物コロニーの調節を含む（３７）。ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの完全なゲノムにおいて、ｅｐｓ遺伝子クラスターのコピーを同定し（図４）、かつ我々の５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株においてこれらのｅｐｓクラスターが同じであるが、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔにおいて発見されたものと全く異なる。
【０１２７】
６種類の完全なゲノムで同定された全てのＯＲＦをＢＬＡＳＴＰと比較し、かつＭＣＬアルゴリズムでさらにクラスタし、２１１５個のゲノムが存在することを示す（図５Ｂ）。ここで、〜７２％（１５２０）は全ての６種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムに共有され、それはビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのコアゲノムを代表する。試験されたビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムの部分集合のみに存在する合計３１２個の非必須ゲノムが同定され、６１．４８％を超える独特なグループはビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔの特有ものである。ＣＯＧ割り当てに基づいて類似の結果が得られ、６個の完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムから１１０１個のＣＯＧファミリーを同定した。５９個のＣＯＧファミリーは検査されたビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムの部分集合のみに存在し、かつ３７個の別のＣＯＧは独特な単一菌株であり、３５個はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔのみに同定された（図５）。なお、４６個のＣＯＧファミリーは我々の分離株に存在するが、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔゲノム中には存在しなかった。興味深いことは、これらの差異の少なくとも一部はモバイルゲノム（ｍｏｂｉｌｏｍ）およびＤＮＡ再編成に関連し、我々の分離株はより多くのプロファージ機能、細胞プロセスおよびシグナル伝達に関連する独特なＣＯＧを有し、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔはより多くの独特なＣＯＧを有し、ＣＲＩＳＰＲ/ＣＡＳシステムに参与するものを含む。
【０１２８】
特に、我々の分離株とビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔは異なる炭水化物源に暴露される。前者は介入後の児童の糞便サンプルから得られ、前記児童は、食物繊維に富み、およびオリゴ糖およびマルトオリゴ糖を含む粉末の全穀類由来とＴＣＭ食用植物由来の混合材料を受けるが、後者は相対的により簡単な炭水化物を受けると推測される乳児の糞便から分離する。それに対して、炭水化物の輸送および代謝に参与する遺伝子変異を発見し、例えばビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００ＴはＣＯＧ０３８３（α-マンノシダーゼ）、ＣＯＧ３５９４（フコース４−Ｏ−アセチラーゼまたは関連アセチルトランスフェラーゼ）、ＣＯＧ４２０９（ＡＢＣ型多糖輸送システム、透過酵素成分）、ＣＯＧ４２１４（ＡＢＣ型キシロース輸送システム、透過酵素成分）を欠いているが、独特にＣＯＧ１５５４（トレハロースおよびマルトース加水分解酵素（ホスホリラーゼなど））を有する。
【０１２９】
コアＣＯＧの異なるコピー数はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのマイクロ多様性にも役立つ。各種の完全なビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムゲノムに存在する１００５個コアＣＯＧにおいて多種機能カテゴリーに参与する５１個ＣＯＧはコピー数の面で少なくとも２つのコピーが異なる（図６）。これらのＣＯＧの分布によれば、我々の５種類の菌株と比べてビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔが最も異なる。
【０１３０】
従来の研究において、既に同じ生育環境からの異なる菌株のマイクロ多様性（３８-４０）を報告した。我々の５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株において、差異は特定のコアＣＯＧファミリーに割り当てられた遺伝子のコピー数の変異により引き起こされ、独特なおよび/または非必須なＣＯＧの存在/非存在の面の差異ではない。クラスタ結果（図６）は菌株の炭水化物の介入に対する差異性応答と一致する。この場合に、ほとんど介入の影響を受けないビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＣ９５およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００３は、三種類の応答菌株と明らかに分離され、介入に対して適度な応答を有するビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４の両者をともにグルーピングし、介入に対する応答が最も高い菌株であるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２は、他の４種類の菌株とさらに分離することができるが、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４と最も類似する。
【０１３１】
炭水化物の輸送および代謝について、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２は、ＣＯＧ２８１４（予測されたアラビノース流出透過酵素、ＭＦＳファミリー）およびＣＯＧ３２５０（β−ガラクトシダーゼ／β−グルクロニダーゼ）の最高コピー数を有する。また、５種類の菌株において、１０６±２（平均値±Ｓ．ｄ．）個のＯＲＦは炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）遺伝子であり、４１個のＣＡＺｙファミリーを占めることを同定した。ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２ゲノムは全ての同定されたＣＡＺｙファミリーを有し、かつこれらの遺伝子の最大コピー数を有する。それはさらに炭水化物エステラーゼをコードする遺伝子の最高コピー数を有し、前記酵素は複雑さを克服するように植物多糖を脱アセチル化させ、かつ植物多糖の分解中にグリコシド加水分解酵素と協力する（４１）。これらの特徴はビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２が食物介入に対して応答する主な差異であり、従って、それは全てのビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの５０％以上を占め、かつ介入期間全体にビフィズス菌群全体に占める割合が大きい。
【０１３２】
結論
【０１３３】
ＷＴＰ食事がどのように遺伝性肥満者の体重を減少させるかを研究している従来の研究において、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムは最も豊富なビフィズス菌菌種であると同定される。本明細書においてビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの特定菌株が食物介入の応答に対する変化を示し、比較ゲノミクスを利用してこれらの動態背後の可能な原因を同定した。本研究の一部として分離された５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株は乳児の糞便から分離されたビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＪＣＭ１２００Ｔに対してある差異を示し、これは異なる環境パラメータがゲノムのマイクロ多様性への影響（４２）を示す。我々の５種類の分離株に観察されたマイクロ多様性は、だいたいコアＣＯＧファミリーのコピー数の変化であり、かつこれらの差異は介入期間の５種類の菌株の種群変化のため推測性説明を提供する。具体的には、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２は、遺伝的により多様化と植物多糖遺伝子のより多くのコピー数を有し、食事介入に応答する最大豊度を有す。グループ全体が同遺伝子グループより広い環境条件下で生存すること（４３）をサポートするため、複数種類の菌株の共存および分布は直感的である。したがって、食事に異なる応答を有する５種類の菌株の共存は、１つのメカニズムとしてヒト腸管におけるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのような重要な善玉菌の安定および回復を保証することができる。しかし、重要なことは、本研究において同定された５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株も宿主生物学的臨床パラメータと異なる相関性を有し、少なくともある腸内細菌叢の変化によって有益な機能は菌株の特異性（４４）であることが示される。腸内微生物群の食事操作から得られた健康への促進する全ての潜在力を実現される確保するように、本明細書において紹介されたこのようなタイプのさらなる研究は必要である。
【０１３４】
材料および方法
【０１３５】
臨床研究
【０１３６】
該研究は上海交通大学の生命科学と生物技術学院倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉａｏ  Ｔｏｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の承認（Ｎｏ．２０１２-２０１６）のもとで行われる。臨床試験は中国臨床試験登録センター（Ｃｈｉｎｅｄｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）で登録する（Ｎｏ．ＣｈｉＣＴＲ-ＯＮＣ-１２００２６４６）。肥満児童の後見人から書面の同意書を取得する。
【０１３７】
中国広東省広州市婦女児童病院（ＧｕａｎｇＤｏｎｇ  Ｗｏｍｅｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｈｏｓｉｐｔａｌ、Ｇｕａｎｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）で、該肥満児童は１０５日間の入院食事介入を受けた。該ボランティアはいかなる運動計画を実施していない。栄養士のアドバイスに応じて、適量の野菜、果物およびナッツと組み合わせて全穀類、伝統的な中国薬膳およびプレバイオティクスに基づく食事（ＷＴＰ食事）（７）（食事における三種類のプレハブ即席食品、１号処方、２号処方および３号処方は完美（中国）株式会社により製造される）を投与した。介入は三つのステージに分けられる。ステージＩ（０日目から６０日目）で、該児童は基礎介入（９）を受ける。ステージＩＩ（６０日目から７５日目）で、１００ｇ以上の３号処方を消耗する。ステージＩＩＩ（７５日目〜１０５日目）の期間、彼は依然として１００ｇ以上の３号処方を消耗するが、１００ｇ以下の１号処方が提供される。
【０１３８】
７つの時点（０、１５、３０、４５、６０、７５および１０５日）に生体サンプル、人体測定データおよび臨床実験室分析を取得する。生物学的臨床パラメータの測定結果は従来の研究（９）と同じである。
【０１３９】
メタゲノムシークエンスおよび分析
【０１４０】
糞便サンプルからのＤＮＡ抽出は、以上の説明した（４５）ように実施されたメタゲノムシークエンスに用いる。上海Ｇｅｎｅｒｇｙバイオテクノロジー株式会社（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｒｇｙ  Ｂｉｏ-ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）でＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅq２０００プラットフォームを使用して７個サンプルに対してシークエンスを行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａの説明書に従ってＤＮＡライブラリーを構築する。サプライヤーが指示したワークフローに応じて、クラスタ生成、鋳型ハイブリダイズ、等温増幅、線形化、ブロッキングおよび変性およびシークエンスプライマーのハイブリダイズを行う。ライブラリーを構築し、次に順方向および逆方向にハイスループットシークエンスを行い、１５１ｂｐを有するペアエンドリードを取得する。
【０１４１】
Ｆｌｅｘｂａｒ（４６）を利用してリードからのアダプタを調整する。（ａ）Ｐｒｉｎｓｅq（４７）を利用して２０の品質閾値で３’端からリードを調整し、一番目のヌクレオチドまで達すこと、（ｂ）リードは７５ｂＰ以下であるまたは「Ｎ」塩基を含む場合、リードペアを除去すること、および（ｃ）リードを重複排除すること。ヒトゲノム（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、ＵＣＳＣ  ｈｇ１９）とアライメント可能なリードを除去する（Ｂｏｗｔｉｅ２（４８）とアライメントする）、使用-再編成-ｎｏ-ｈｄ-含んでない-ダブテール（-ｒｅｏｒｄｅｒ-ｎｏ-ｈｄ-ｎｏ-ｃｏｎｔａｉｎ-ｄｏｖｅｔａｉｌ）。平均的に、各サンプルは２５．３±４．１百万（平均値±Ｓ．ｄ．）のペアエンドリードを保持し、かつさらに分析するために用いられる。
【０１４２】
１０５日目にＭｅｔａｐｈｌａｎ（４９）（--ｂｔ２_ｐｓに非常に敏感な局所）を利用してビフィズス菌種の豊度を計算する。Ｓｉｇｍａを利用して、我々の５種類のビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム菌株の豊度（２４）を計算する。
【０１４３】
全ゲノムシークエンスおよびデータ組み合わせ
【０１４４】
ＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩシークエンサーを利用してビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００１、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００２、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００３、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＰＥＲＦＥＣＴ-２０１７-０００４およびビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＣ９５のゲノムをシークエンスし、それぞれ約２４５、４１５、２８５、４５９および１９８倍の被覆率（Ｎｅｘｔｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｕｈａｎ  ４３００００、Ｃｈｉｎａ）を有する。ＨＧＡＰ/Ｑｕｉｖｅｒ（５０）を用いてサブリードを新たに組み合わせ、次にＭｉｎｉｕｍｓ２（５１）およびQｕｉｖｅｒを組み合わせる。各菌株をその染色体に対応する一つのコンティグにアセンブルに組み合わせる。
【０１４５】
一般的な特徴予測
【０１４６】
Ｐｒｏｄｉｇａｌ  ｖ２_６０（５２）とＢＬＡＳＴアライメントの組み合わせにより、オープンリーディングフレーム予測（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）を行う。次にＮＣＢＩｎｒデータベースにＢＬＡＳＴＰを利用して同定されたＯＲＦに注釈を行う。Ｒｎａｍｍｅｒ  ｖ１．２（５３）を利用してリボソームＲＮＡ遺伝子を検出し、ｔＲＮＡｓｃａｎ  ＳＥｖ．１４（５４）を利用してトランスファーＲＮＡ遺伝子を同定した。ＵＳＥＡＲＣＨ  ｖ８．０．１５１７（５５）を利用して全ての１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の間の同一性マトリックスを計算する。ＣＯＧｔｒｉａｎｇｌｅｓ（ｆｔｐ：//ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ/ｐｕｂ/ｗｏｌｆ/ＣＯＧｓ/ＣＯＧｓｏｆｔ/）を利用してＣＯＧの割り当てを完了する。
【０１４７】
パンゲノム計算
【０１４８】
ＰＧＡＰｖ１．１２（５６）を利用して、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムのパンゲノムを計算した。ＧＦ（Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ、遺伝子ファミリー）方法により機能遺伝子クラスタを行い、次にパンゲノムスペクトルを構築する。
【０１４９】
ゲノム比較
【０１５０】
ソフトウェアパッケージＭＵＭｍｅｒｖ３．０（５７）を利用してヌクレオチドレベルで全ゲノム配列アライメントを行った。各ゲノムペアに対して、プログラムＪＳｐｅｃｉｅｓバージョン１．２．１（３５）を利用して平均的なヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を計算した。タンパク質レベルでＢＬＡＳＴＰ（各タンパク質に対して、最大Ｅ値１ｅ-１０、最小アライメント同一性５０％および最小アライメント被覆率５０％）を利用してａｌｌ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｌｌ  方式（ａｌｌ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｌｌ  ｗａｙ）で配列を比較し、次にＰＧＡＰｖ１．１２の中でマルコフクラスタアルゴリズム（Ｍａｒｋｏｖ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，ＭＣＬ）を利用して遺伝子ファミリーにクラスタする。
【０１５１】
細胞外多糖（Ｅｘｏｐｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＥＰＳ）遺伝子クラスターの同定
【０１５２】
各ゲノム（３７）で仮定されたプライミング?ＧＴＦ（ｐ?ｇｔｆ）遺伝子:ｒｆｂｐ（ＮＰ_６９５４４４）とｃｐｓＤ（ＮＰ_６９５４４７）を捜索して、手動でｐ-ｇｔｆ周辺の遺伝子を検査することにより、Ｂｉｆｉｄｏ-ｅｐｓクラスターのコンピュータ解析を行った。
【０１５３】
炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙＳ）の同定
【０１５４】
ｄｂＣＡＮｖ３．０（５８）のローカルバージョンデータベースをダウンロードする。ＨＭＭｓｃａｎ（５９）を利用して各ゲノムにおける遺伝子とデータベースをアライメントする。ｄｂＣＡＮによって提供されたｈｍｍｓｃａｎ-ｐａｒｓｅｒ．ｓｈでアライメントに解析を行い、かつ最適なヒットを保留する。
【０１５５】
データおよび材料の入手可能性
【０１５６】
本研究で生成された全てのゲノムおよびメタゲノムデータのデータは登録番号ＰＲＪＥＢ１８５５７でヨーロッパのヌクレオチドライブラリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ、ＥＮＡ）（ＷＷＷ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ/ｅｎａ）のもとに寄託される。我々の分析に用いるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの全ての他のゲノムはいずれも以下の登録番号でＮＣＢＩデータベースからダウンロードする：ＡＰ０１２３３０．１、ＣＤＰＷ００００００００．１、ＡＢＸＸ０２０００００１、ＪＥＯＤ０１０００００１、ＪＧＺＦ０１０００００１，ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＤ２ＣＡは、ＭｅｔａＨＩＴ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ/ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ/ｄｏｗｎｌｏａｄｓ/ｂａｃｔｅｒｉａ/ｍｅｔａｈｉｔ/）からダウンロードする。
【０１５７】
以上の明細書に言及された全ての出版物はいずれも本明細書において参考として援用される。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載された本発明の方法およびシステムの様々な修正および変更は当業者にとって明らかである。以上、具体的な好適な実施形態を挙げて本発明を説明したが、保護請求された発明は適切にこのような具体例に限定されることを理解するべきである。実際に、記載された本発明の実施形態の生化学的および生物学的技術または関連分野の当業者にとって明らかな様々な修正はいずれも下記特許請求の範囲内にある。
【０１５８】
引用文献
１．Zhao L. 2013. The gut microbiota and obesity: from correlation to causality. Nat Rev Microbiol 11:639-647.
２．Boulange CL, Neves AL, Chilloux J, Nicholson JK, Dumas ME. 2016. Impact of the gut microbiota on inflammation, obesity, and metabolic disease. Genome Med 8:42.
３．Qin N, Yang F, Li A, Prifti E, Chen Y, Shao L, Guo J, Le Chatelier E, Yao J, Wu L, Zhou J, Ni S, Liu L, Pons N, Batto JM, Kennedy SP, Leonard P, Yuan C, Ding W, Chen Y, Hu X, Zheng B, Qian G, Xu W, Ehrlich SD, Zheng S, Li L. 2014. Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis. Nature 513:59-64.
４．Zhang X, Zhang D, Jia H, Feng Q, Wang D, Liang D, Wu X, Li J, Tang L, Li Y, Lan Z, Chen B, Li Y, Zhong H, Xie H, Jie Z, Chen W, Tang S, Xu X, Wang X, Cai X, Liu S, Xia Y, Li J, Qiao X, Al-Aama JY, Chen H, Wang L, Wu QJ, Zhang F, Zheng W, Li Y, Zhang M, Luo G, Xue W, Xiao L, Li J, Chen W, Xu X, Yin Y, Yang H, Wang J, Kristiansen K, Liu L, Li T, Huang Q, Li Y, Wang J. 2015. The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment. Nat Med 21:895-905.
５．Xu J, Lian F, Zhao L, Zhao Y, Chen X, Zhang X, Guo Y, Zhang C, Zhou Q, Xue Z, Pang X, Zhao L, Tong X. 2015. Structural modulation of gut microbiota during alleviation of type 2 diabetes with a Chinese herbal formula. ISME J 9:552-562.
６．Kelly CR, Kahn S, Kashyap P, Laine L, Rubin D, Atreja A, Moore T, Wu G. 2015. Update on Fecal Microbiota Transplantation 2015: Indications, Methodologies, Mechanisms, and Outlook. Gastroenterology 149:223-237.
７．Xiao S, Fei N, Pang X, Shen J, Wang L, Zhang B, Zhang M, Zhang X, Zhang C, Li M, Sun L, Xue Z, Wang J, Feng J, Yan F, Zhao N, Liu J, Long W, Zhao L. 2014. A gut microbiota-targeted dietary intervention for amelioration of chronic inflammation underlying metabolic syndrome. FEMS Microbiol Ecol 87:357-367.
８．Human Microbiome Project C. 2012. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486:207-214.
９．Zhang C, Yin A, Li H, Wang R, Wu G, Shen J, Zhang M, Wang L, Hou Y, Ouyang H, Zhang Y, Zheng Y, Wang J, Lv X, Wang Y, Zhang F, Zeng B, Li W, Yan F, Zhao Y, Pang X, Zhang X, Fu H, Chen F, Zhao N, Hamaker BR, Bridgewater LC, Weinkove D, Clement K, Dore J, Holmes E, Xiao H, Zhao G, Yang S, Bork P, Nicholson JK, Wei H, Tang H, Zhang X, Zhao L. 2015. Dietary Modulation of Gut Microbiota Contributes to Alleviation of Both Genetic and Simple Obesity in Children. EBioMedicine 2:966-982.
１０．Wu H, Wang R, Zhao Y, Pang X, Shen J, Zhang C. 2015. Exploring Carbohydrate Utilization Capacity of Bifidobacterium pseudocate-
nulatum Isolated from a Morbidly Obese Child after Dietary Intervention. Genomics and Applied Biology 34:1384-1391.
１２．Grimm V, Westermann C, Riedel CU. 2014. Bifidobacteria-host interactions--an update on colonisation factors. Biomed Res Int 2014:960826.
１３．Labruna G, Pasanisi F, Nardelli C, Caso R, Vitale DF, Contaldo F, Sacchetti L. 2011. High leptin/adiponectin ratio and serum triglycerides are associated with an "at-risk" phenotype in young severely obese patients. Obesity (Silver Spring) 19:1492-1496.
１４．Zweigner J, Schumann RR, Weber JR. 2006. The role of lipopolysaccharide-binding protein in modulating the innate immune response. Microbes Infect 8:946-952.
１５．Arumugam M, Raes J, Pelletier E, Le Paslier D, Yamada T, Mende DR, Fernandes GR, Tap J, Bruls T, Batto JM, Bertalan M, Borruel N, Casellas F, Fernandez L, Gautier L, Hansen T, Hattori M, Hayashi T, Kleerebezem M, Kurokawa K, Leclerc M, Levenez F, Manichanh C, Nielsen HB, Nielsen T, Pons N, Poulain J, Qin J, Sicheritz-Ponten T, Tims S, Torrents D, Ugarte E, Zoetendal EG, Wang J, Guarner F, Pedersen O, de Vos WM, Brunak S, Dore J, Meta HITC, Antolin M, Artiguenave F, Blottiere HM, Almeida M, Brechot C, Cara C, Chervaux C, Cultrone A, Delorme C, Denariaz G, et al. 2011. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature 473:174-180.
１６．Fujimoto T, Imaeda H, Takahashi K, Kasumi E, Bamba S, Fujiyama Y, Andoh A. 2013. Decreased abundance of Faecalibacterium prausnitzii in the gut microbiota of Crohn's disease. J Gastroenterol Hepatol 28:613-619.
１７．Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Bermudez-Humaran LG, Gratadoux JJ, Blugeon S, Bridonneau C, Furet JP, Corthier G, Grangette C, Vasquez N, Pochart P, Trugnan G, Thomas G, Blottiere HM, Dore J, Marteau P, Seksik P, Langella P. 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc Natl Acad Sci U S A 105:16731-16736.
１８．Ganzle MG, Follador R. 2012. Metabolism of oligosaccharides and starch in lactobacilli: a review. Front Microbiol 3:340.
１９．Andreasen AS, Larsen N, Pedersen-Skovsgaard T, Berg RM, Moller K, Svendsen KD, Jakobsen M, Pedersen BK. 2010. Effects of Lactobacillus acidophilus NCFM on insulin sensitivity and the systemic inflammatory response in human subjects. Br J Nutr 104:1831-1838.
２０．Hulston CJ, Churnside AA, Venables MC. 2015. Probiotic supplementation prevents high-fat, overfeeding-induced insulin resistance in human subjects. Br J Nutr 113:596-602.
２１．Charbonneau MR, Blanton LV, DiGiulio DB, Relman DA, Lebrilla CB, Mills DA, Gordon JI. 2016. A microbial perspective of human developmental biology. Nature 535:48-55.
２２．Wang J, Tang H, Zhang C, Zhao Y, Derrien M, Rocher E, van-Hylckama Vlieg JE, Strissel K, Zhao L, Obin M, Shen J. 2015. Modulation of gut microbiota during probiotic-mediated attenuation of metabolic syndrome in high fat diet-fed mice. ISME J 9:1-15.
２３．Stenman LK, Waget A, Garret C, Klopp P, Burcelin R, Lahtinen S. 2014. Potential probiotic Bifidobacterium animalis ssp. lactis 420 prevents weight gain and glucose intolerance in diet-induced obese mice. Benef Microbes 5:437-445.
２４．STALEY J, KRIEG N. 1984. Classification of prokaryotes organisms: an overview. KRIEG, NR,HOLT, JG Bergey’s manual of systemayic bacteriology 1.
２５．Ahn TH, Chai J, Pan C. 2015. Sigma: strain-level inference of genomes from metagenomic analysis for biosurveillance. Bioinformatics 31:170-177.
２６．Morita H, Toh H, Oshima K, Nakano A, Arakawa K, Takayama Y, Kurokawa R, Takanashi K, Honda K, Hattori M. 2015. Complete genome sequence of Bifidobacterium pseudocatenulatum JCM 1200(T) isolated from infant feces. J Biotechnol 210:68-69.
２７．Bottacini F, Medini D, Pavesi A, Turroni F, Foroni E, Riley D, Giubellini V, Tettelin H, van Sinderen D, Ventura M. 2010. Comparative genomics of the genus Bifidobacterium. Microbiology 156:3243-3254.
２８．Galperin MY, Makarova KS, Wolf YI, Koonin EV. 2015. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Res 43:D261-269.
２９．Bottacini F, O'Connell Motherway M, Kuczynski J, O'Connell KJ, Serafini F, Duranti S, Milani C, Turroni F, Lugli GA, Zomer A, Zhurina D, Riedel C, Ventura M, van Sinderen D. 2014. Comparative genomics of the Bifidobacterium breve taxon. BMC Genomics 15:170.
３０．O'Callaghan A, Bottacini F, O'Connell Motherway M, van Sinderen D. 2015. Pangenome analysis of Bifidobacterium longum and site-directed mutagenesis through by-pass of restriction-modification systems. BMC Genomics 16:832.
３１．Begley M, Gahan CGM, Hill C. 2005. The interaction between bacteria and bile. Fems Microbiology Reviews 29:625-651.
３２．Candela M, Biagi E, Centanni M, Turroni S, Vici M, Musiani F, Vitali B, Bergmann S, Hammerschmidt S, Brigidi P. 2009. Bifidobacterial enolase, a cell surface receptor for human plasminogen involved in the interaction with the host. Microbiology 155:3294-3303.
３３．Candela M, Centanni M, Fiori J, Biagi E, Turroni S, Orrico C, Bergmann S, Hammerschmidt S, Brigidi P. 2010. DnaK from Bifidobacterium animalis subsp. lactis is a surface-exposed human plasminogen receptor upregulated in response to bile salts. Microbiology 156:1609-1618.
３４．Gonzalez-Rodriguez I, Sanchez B, Ruiz L, Turroni F, Ventura M, Ruas-Madiedo P, Gueimonde M, Margolles A. 2012. Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation. Appl Environ Microbiol 78:3992-3998.
３５．Pareti FI, Fujimura Y, Dent JA, Holland LZ, Zimmerman TS, Ruggeri ZM. 1986. Isolation and characterization of a collagen binding domain in human von Willebrand factor. J Biol Chem 261:15310-15315.
３６．Richter M, Rossello-Mora R. 2009. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition. Proc Natl Acad Sci U S A 106:19126-19131.
３７．Schmid J, Sieber V, Rehm B. 2015. Bacterial exopolysaccharides: biosynthesis pathways and engineering strategies. Front Microbiol 6:496.
３８．Hidalgo-Cantabrana C, Sanchez B, Milani C, Ventura M, Margolles A, Ruas-Madiedo P. 2014. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Appl Environ Microbiol 80:9-18.
３９．Zhang XL, Gao PP, Chao QF, Wang LH, Senior E, Zhao LP. 2004. Microdiversity of phenol hydroxylase genes among phenol-degrading isolates of Alcaligenes sp from an activated sludge system. Fems Microbiology Letters 237:369-375.
４０．Mao YJ, Zhang XJ, Xia X, Zhong HH, Zhao LP. 2010. Versatile aromatic compound-degrading capacity and microdiversity of Thauera strains isolated from a coking wastewater treatment bioreactor. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 37:927-934.
４１．Patra R, Chattopadhyay S, De R, Ghosh P, Ganguly M, Chowdhury A, Ramamurthy T, Nair GB, Mukhopadhyay AK. 2012. Multiple Infection and Microdiversity among Helicobacter pylori Isolates in a Single Host in India. Plos One 7.
４２．Biely P. 2012. Microbial carbohydrate esterases deacetylating plant polysaccharides. Biotechnol Adv 30:1575-1588.
４３．Jezbera J, Jezberova J, Kasalicky V, Simek K, Hahn MW. 2013. Patterns of Limnohabitans microdiversity across a large set of freshwater habitats as revealed by Reverse Line Blot Hybridization. PLoS One 8:e58527.
４４．Moore LR, Rocap G, Chisholm SW. 1998. Physiology and molecular phylogeny of coexisting Prochlorococcus ecotypes. Nature 393:464-467.
４５．Zhang C, Zhao L. 2016. Strain-level dissection of the contribution of the gut microbiome to human metabolic disease. Genome Med 8:41.
４６．Fei N, Zhao L. 2013. An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice. ISME J 7:880-884.
４７．Dodt M, Roehr JT, Ahmed R, Dieterich C. 2012. FLEXBAR-Flexible Barcode and Adapter Processing for Next-Generation Sequencing Platforms. Biology (Basel) 1:895-905.
４８．Schmieder R, Edwards R. 2011. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics 27:863-864.
４９．Langmead B, Salzberg SL. 2012. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods 9:357-359.
５０．Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. 2012. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nat Methods 9:811-814.
５１．Chin CS, Alexander DH, Marks P, Klammer AA, Drake J, Heiner C, Clum A, Copeland A, Huddleston J, Eichler EE, Turner SW, Korlach J. 2013. Nonhybrid, finished microbial genome assemblies from long-read SMRT sequencing data. Nat Methods 10:563-569.
５２．Sommer DD, Delcher AL, Salzberg SL, Pop M. 2007. Minimus: a fast, lightweight genome assembler. BMC Bioinformatics 8:64.
５３．Hyatt D, Chen GL, Locascio PF, Land ML, Larimer FW, Hauser LJ. 2010. Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification. BMC Bioinformatics 11:119.
５４．Lagesen K, Hallin P, Rodland EA, Staerfeldt HH, Rognes T, Ussery DW. 2007. RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res 35:3100-3108.
５５．Lowe TM, Eddy SR. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res 25:955-964.
５６．Edgar RC. 2010. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26:2460-2461.
５７．Zhao Y, Wu J, Yang J, Sun S, Xiao J, Yu J. 2012. PGAP: pan-genomes analysis pipeline. Bioinformatics 28:416-418.
５８．Kurtz S, Phillippy A, Delcher AL, Smoot M, Shumway M, Antonescu C, Salzberg SL. 2004. Versatile and open software for comparing large genomes. Genome Biol 5:R12.
５９．Yin Y, Mao X, Yang J, Chen X, Mao F, Xu Y. 2012. dbCAN: a web resource for automated carbohydrate-active enzyme annotation. Nucleic Acids Res 40:W445-451.
６０．Finn RD, Clements J, Eddy SR. 2011. HMMER web server: interactive sequence similarity searching. Nucleic Acids Res 39:W29-37.
【図１】
0006974483.tif 000005
【図２】
0006974483.tif 000006
【図３】
0006974483.tif 000007
【図４】
0006974483.tif 000008
【図５】
0006974483.tif 000009
【図６】
0006974483.tif 000010
【図７】
0006974483.tif 000011
【図８】
0006974483.tif 000012
【図９】
0006974483.tif 000013
【図１０】
0006974483.tif 000014
【図１１Ａ】
0006974483.tif 000015
【図１１Ｂ】
0006974483.tif 000016
【図１１Ｃ】
0006974483.tif 000017
【図１１Ｄ】
0006974483.tif 000018