(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、
該コアの一つ以上の平面に結合され、（Ｔｈｒ）ｎ−または（Ａｌａ）ｎ−を含み、前記ｎは２〜７の整数であるオリゴペプチドとを含むナノ構造体であって、
水中でコロイド状に存在することができる結氷制御用の多面体形状である、ナノ構造体。
【請求項２】
前記コアは、四面体、切頂四面体、六面体、切頂六面体、八面体、切頂八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体、六八面体、または菱形十二面体である、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項３】
前記コアは、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、アルミニウム（Ａｌ）、銅（Ｃｕ）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、又はこれらのうち少なくとも２種を含む合金で製造される、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項４】
前記コアは、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、鉄（Ｆｅ）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、ケイ素（Ｓｉ）、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、又はこれらのうち少なくとも２種を含む合金で製造される、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項５】
前記ｎは３〜６である、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項６】
前記コアの直径は５０ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項７】
前記平面には、ｎｍ２あたり０．０７〜０．２５個のオリゴペプチドが結合される、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項８】
前記コアは、六面体または八面体である、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項９】
前記コアは、金（Ａｕ）である、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項１０】
前記ｎは５である、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項１１】
前記平面には、ｎｍ２あたり０．１〜０．２個のオリゴペプチドが結合される、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項１２】
氷の再結晶化を抑制して結氷を制御する、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む、凍結制御用組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む、細胞凍結用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む、食品凍結用組成物。
【請求項１６】
氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合され、（Ｔｈｒ）ｎ−または（Ａｌａ）ｎ−を含み、前記ｎは２〜７の整数であるオリゴペプチドとを含み、水中でコロイド状に存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体を溶媒に添加するステップを含む、結氷の制御方法。
【請求項１７】
氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合され、（Ｔｈｒ）ｎ−または（Ａｌａ）ｎ−を含み、前記ｎは２〜７の整数であるオリゴペプチドとを含み、水中でコロイド状に存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体を細胞を含む溶液に添加するステップを含む、細胞の凍結保存方法。
【請求項１８】
氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合され、（Ｔｈｒ）ｎ−または（Ａｌａ）ｎ−を含み、前記ｎは２〜７の整数であるオリゴペプチドとを含み、水中でコロイド状に存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体を食品に処理するステップを含む、食品の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドが結合された金ナノ粒子を含む抗凍結組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗凍結タンパク質（antifreeze protein、ＡＦＰ）および抗凍結糖タンパク質（antifreeze glycoprotein、ＡＦＧＰ）（以下、総称して「ＡＦ（Ｇ）Ｐ」という。）の氷結晶成長の抑制効果は、当該技術分野の通常の技術者が抗凍結活性の機序を理解し、それを利用することにインスピレーションを与えた。これにより、通常の技術者は、広範囲に変形された用途にＡＦ（Ｇ）Ｐを利用することができるようになった。規則的に配列された、特定の配列を有するＡＦ（Ｇ）Ｐは、氷結晶に付着して成長する氷結晶の、ＡＦ（Ｇ）Ｐが埋め込まれた領域の間に形成されるマイクロまたはナノ屈曲は、水分子の結晶化を熱力学的にさらに困難にする。 
【０００３】
機序に関する理論は確立されていないが、二つの原因がＡＦ（Ｇ）Ｐの氷への付着に関連していると予想される。研究の初期段階では、最も一般的には、水素結合が理論的な根拠として提示された。すべてのアミノ酸には、カルボニル基とアミン基が存在するので、ＡＦ（Ｇ）Ｐのカルボニル基およびアミン基が水分子と水素結合を形成することができ、直観的な説明が可能である。ヒドロキシル基が多数存在するポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）及びグラフェンオキサイド（ＧＯ）などの人工的な凍結防止剤は、氷結晶の阻害の観点で水素結合の重要性を裏付ける。
【０００４】
しかし、水素結合のみに依存する説明では、ＡＦ（Ｇ）Ｐで一致しない場合が発見された（Sonnichsen, F. D.; DeLuca, C. I.; Davies, P. L.; Sykes, B. D. Refined solution structure of type III antifreeze protein: hydrophobic groups may be involved in the energetics of the protein-ice interaction. Structure 1996, 4, 1325-1337.; Chao, H.; Houston, M. E.; Hodges, R. S.; Kay, C. M.; Sykes, B. D.; Loewen, M. C.; Davies, P. L.; Sonnichsen, F. D. A diminished role for hydrogen bonds in antifreeze protein binding to ice. 1997 Biochemistry, 36, 14652-14660.; Zhang, W.; Laursen, R. A. Structure-function relationships in a type I antifreeze polypeptide the role of threonine methyl and hydroxyl groups in antifreeze activity. J. Biol. Chem. 1998, 273, 34806-34812.; Haymet, A. D. J.; Ward, L. G.; Harding, M. M. Winter flounder““antifreeze”proteins: synthesis and ice growth inhibition of analogues that probe the relative importance of hydrophobic and hydrogen-bonding interactions. J. Am. Chem. Soc.1999, 121, 941-948.; Yang, C.; Sharp, K. A. Hydrophobic tendency of polar group hydration as a major force in type Iantifreeze protein recognition. Proteins 2005, 59, 266-274.; Wierzbicki, A.; Dalal, P.; Cheatham III, T. E.; Knickelbein, J. E.; Haymet, A. D. J.; Madura, J. D. Antifreeze proteins at the ice/water interface: three calculated discriminating properties for orientation of type I proteins. Biophys. J. 2007, 93, 1442-1451.; Nutt, D. R.; Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13066-13073.; Smolin, N.; Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B 2008, 112, 6193-6202.; Mochizuki, K.; Molinero, V. Antifreeze Glycoproteins Bind Reversibly to Ice Via Hydrophobic Groups. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 4803-4811.）。例えば、Ｔｈｒ及びＳｅｒで構成されるオリゴペプチドは、Ｓｅｒに比べてＴｈｒの割合が高い場合に氷の成長をより効果的に阻害できることが示された（Chao, H.; Houston, M. E.; Hodges, R. S.; Kay, C. M.; Sykes, B. D.; Loewen, M. C.; Davies, P. L.; Sonnichsen, F. D. A diminished role for hydrogen bonds in antifreeze protein binding to ice. 1997 Biochemistry, 36, 14652-14660.; Zhang, W.; Laursen, R. A. Structure-function relationships in a type I antifreeze polypeptide the role of threonine methyl and hydroxyl groups in antifreeze activity. J. Biol. Chem. 1998, 273, 34806-34812.）。ＴｈｒがＳｅｒに比べてより疎水性を帯びるので、水素結合の観点では論理に合わない。この結果は、ＡＦ（Ｇ）Ｐの疎水性もまた氷への結合に貢献し、結果的に氷の成長を抑制することを意味する。氷成長の抑制に疎水性および親水性の二重性が重要であるかどうかは、両親媒性の糖高分子（glycopolymer）を使用することで確認された。最近では、このような実証的な観察だけでなく、数値的シミュレーションにより理論的な裏付けがなされている。
【０００５】
氷の成長を抑制させるための他の重要な要因は、この両親媒性モイエティの表面構造である。通常、ＡＦ（Ｇ）Ｐは、平面的配列を有し、それにより氷とＡＦ（Ｇ）Ｐとの相互作用を促進する。これまでに開発された殆どの小分子、高分子または巨大分子の人工凍結防止剤は、この平面的な構造なしに使用された。この分子的凍結防止剤の一般的な利点は、氷成長の阻害という目的に合致する、これらの化学的モイエティの多様性、多目的性および生産プロセスのコスト効率性にあると考えられる。適切なマイクロ／ナノ物質の不在は、幾何学的に定義されていない分子的凍結防止剤を使用するようにし、結果として、氷の成長を抑制するために相対的に高濃度の凍結防止剤を使用するようにする。
【０００６】
一方、金コロイド性ナノ粒子の合成および活用は、過去２０年間で著しく進歩してきた。高度に均一に様々な形の金を生産するために様々な合成経路が開発されたことにより、金コロイドは、生物医学的な治療／センサー、プラズモニクス、光学物質、オプトエレクトロニクス、太陽エネルギー変換、および他の多くの分野で関心を集めている。これらの発展の多くは、金コロイド性プラズモン効果の利点（つまり、局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ））に主に焦点が合わせられている。             
【０００７】
しかし、金ナノ粒子の形状および大きさの両方を正確に制御できる能力は、ＬＳＰＲ効果の調節だけでなく、氷と凍結防止剤の分子モイエティの間のナノスケールの界面間相互作用の改善にも利用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ２５６５２００Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、結氷を制御できる物質及び／又はそれを含む組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、細胞の生存率を高めるための凍結保存用組成物および方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、食品の凍結時にも食感を維持できる食品凍結保存用組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１．氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合されており、（Ｔｈｒ）ｎ−、（Ａｌａ）ｎ−、（Ｓｅｒ）ｎ−、または（Ｇｌｙ）ｎ−を含むオリゴペプチドとを含むナノ構造体であって、前記ナノ構造体は、水中でコロイド状で存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体：前記ｎは、２〜７の整数である。    
【００１３】
２．項目１において、前記コアは、四面体、切頂四面体、六面体、切頂六面体、八面体、切頂八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体（tetrahexahedron）、六八面体（hexoctahedron）、または菱形十二面体である、ナノ構造体。                
【００１４】
３．項目１において、前記コアは、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、アルミニウム（Ａｌ）、銅（Ｃｕ）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、又はこれらのうち少なくとも２種を含む合金で製造される、ナノ構造体。
【００１５】
４．項目１において、前記コアは、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、鉄（Ｆｅ）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、ケイ素（Ｓｉ）、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、又はこれらのうち少なくとも２種を含む合金で製造される、ナノ構造体。   
【００１６】
５．項目１において、前記ｎは３〜６である、ナノ構造体。  
【００１７】
６．項目１において、前記オリゴペプチドは、（Ｔｈｒ）ｎ−または（Ａｌａ）ｎ−を含む、ナノ構造体。    
【００１８】
７．項目１において、前記コアの直径は５０ｎｍ〜１００ｎｍである、ナノ構造体。   
【００１９】
８．項目１において、前記平面にはｎｍ２あたり０．０７〜０．２５個のオリゴペプチドが結合される、ナノ構造体。
【００２０】
９．項目１において、前記コアは、六面体または八面体である、ナノ構造体。   
【００２１】
１０．項目１において、前記コアは、金（Ａｕ）である、ナノ構造体。   
【００２２】
１１．項目１において、前記ｎは５である、ナノ構造体。   
【００２３】
１２．項目１において、前記平面にはｎｍ２あたり０．１〜０．２個のオリゴペプチドが結合される、ナノ構造体。    
【００２４】
１３．項目１において、氷の再結晶化を抑制して結氷を制御する、ナノ構造体。
【００２５】
１４．項目１〜１３のいずれか一つに記載のナノ構造体を含む、凍結制御用組成物。   
【００２６】
１５．項目１〜１３のいずれか一つに記載のナノ構造体を含む、細胞凍結用組成物。  
【００２７】
１６．項目１〜１３のいずれか一つに記載のナノ構造体を含む、食品凍結用組成物。   
【００２８】
１７．氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合されており、（Ｔｈｒ）ｎ−、（Ａｌａ）ｎ−、（Ｓｅｒ）ｎ−、または（Ｇｌｙ）ｎ−を含むオリゴペプチドとを含み、水中でコロイド状で存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体を溶媒に添加するステップを含む、結氷の制御方法：前記ｎは、２〜７の整数である。     
【００２９】
１８．氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合されており、（Ｔｈｒ）ｎ−、（Ａｌａ）ｎ−、（Ｓｅｒ）ｎ−、または（Ｇｌｙ）ｎ−を含むオリゴペプチドとを含み、水中でコロイド状で存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体を、細胞を含む溶液に添加するステップを含む、細胞の凍結保存方法：前記ｎは、２〜７の整数である。
【００３０】
１９．氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含むコアと、該コアの一つ以上の平面に結合されており、（Ｔｈｒ）ｎ−、（Ａｌａ）ｎ−、（Ｓｅｒ）ｎ−、または（Ｇｌｙ）ｎ−を含むオリゴペプチドとを含み、水中でコロイド状で存在することができる、結氷制御用の多面体形状のナノ構造体を食品に処理するステップを含む、食品の凍結保存方法：前記ｎは、２〜７の整数である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明による物質及び／又はそれを含む組成物を用いることにより、氷の再結晶化を抑制し、結氷を制御することができる。これにより、細胞の凍結保存時の細胞生存率を高めることができ、食品の凍結時にも食感を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１ａ】図１ａ（ａ）は、金コロイドの合成方法を示すものであり、（ｂ）は、本発明の一実施形態に係る方法で製造された金ナノ粒子の長さ（Ｌ）および縦横比（aspect ratio）による分布を確認した結果である。
【図１ｂ】図１ｂ（ａ）は、四面体と切頂四面体を、（ｂ）は、六面体と切頂六面体を、（ｃ）は、八面体と切頂八面体を示す。
【図２】図２（ａ）は、金ナノ粒子の形態による透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡の画像を示し、（ｂ）は、金ナノ球体の大容量（２００ｍＬ）の合成バスの写真およびそれに相応するＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを示すものであり、小容量（２０ｍＬ）と大容量（２００ｍＬ）の合成で実質的にピークの差がないことを示し、（ｃ）は、チオール基で媒介された、金コロイドの表面にオリゴペプチドを付着する方法を示す。
【図３】図３（ａ）は、シミュレーションモデルを示すものであり、２ｍｅｒ、５ｍｅｒおよび７ｍｅｒのオリゴペプチドは、それぞれ０．６０ｎｍ、１．００ｎｍおよび１．４０ｎｍとした。（ｂ）〜（ｄ）は、何も付着されていない金コロイドと、オリゴペプチドが結合された金コロイドの吸収スペクトルを示す。
【図４】図４（ａ）は、オリゴペプチドの蛍光定量のための標準濃度曲線であり、（ｂ）は、分離されたオリゴペプチドから取得された蛍光の強度を示すグラフである。
【図５】図５（ａ）は、シミュレーションモデルを示し、（ｂ）は、オリゴペプチド密度による、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブのＬＳＰＲ消光ピークの移動を計算した結果である。
【図６】図６（ａ）は、精製水および金ナノキューブ溶液から氷結晶の再結晶化の時間によるＭＬＧＳを示すグラフであり、（ｂ）は、精製水（１行）、何も結合されていない金ナノキューブサスペンション（２行）、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−（３行）、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ−（４行）、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ−（５行）、および（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓ−（６行）結合された金ナノ粒子サスペンションからの再結晶化氷のＤＦＯＭ画像である。
【図７】図７は、精製水（１行）、何も結合されていない金ナノキューブサスペンション（２行）、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−（３行）、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ−（４行）、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ−（５行）、および（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓ−（６行）結合された金ナノ粒子サスペンションから取得したＢＦＰＯＭ画像である。
【図８】図８（ａ）は、精製水、何も結合されていない金ナノキューブサスペンション、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ−、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ−、および（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ粒子の氷の粒の時間による平均半径の三乗値を示すグラフであり、（ｂ）は、それぞれのナノ粒子に相応するＤＦＯＭ画像である。
【図９】図９（ａ）は、（Ｔｈｒ）ｎ−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブの濃度による３０分間の再結晶化された氷ドメインのＭＬＧＳ値を示すグラフであり、（ｂ）は、（Ｔｈｒ）ｎ−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブでｎがそれぞれ２、５及び７のときの再結晶化された氷のＤＦＯＭ画像である。
【図１０】図１０（ａ）は、オリゴペプチド濃度による再結晶化された氷のＭＬＧＳを示すグラフであり、（ｂ）は、それぞれ１、１０、１００、２５０、５００および１０００μＭ（左から右、および上から下への順）を含有する再結晶化される氷結晶のＤＦＯＭ画像である。
【図１１】図１１（ａ）は、単結晶性氷の方向性成長のために使用される冷却装置を撮影した写真であり、（ｂ）は、（ａ）を用いて撮影した、成長する単結晶性氷のＤＦＯＭ画像であり、（ｃ）は、何も結合されていない金ナノキューブを含有する溶液で成長する氷結晶のＤＦＯＭ画像であり、（ｄ）は、何も結合されていない金ナノキューブが無作為に蓄積された水−氷界面と、何も結合されていない金ナノキューブが均一に分散された超冷却された水で選択的に撮影したＤＦ顕微鏡散乱スペクトルであり、（ｅ）は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブを含有する溶液で成長する氷結晶のＤＦＯＭ画像であり、（ｆ）は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブの氷および超冷却された水の領域で撮影したＤＦ顕微鏡散乱スペクトルである。
【図１２】図１２は、図１１（ｂ）に相応する時間の経過によるＢＦＰＯＭ画像である。
【図１３】図１３（ａ）は、シミュレーションモデルを示し、（ｂ）〜（ｅ）は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブ及びそのクラスタの数値的にシミュレートされたＤＦ散乱スペクトルである。
【図１４】図１４は、氷および水で分散された金ナノキューブのＤＦ散乱をＦＤＴＤ計算したグラフである。
【図１５】図１５（ａ）は、ＺｒＡｃのＤＩＳ活性を簡単に示す図であり、（ｂ）は、０及び１０秒で２０ｍｇ／ｍｌのＺｒＡｃを含有する方向性を持って成長する氷を撮影した写真であり、（ｃ）は、精製水、０．２０ｎＭの（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−金ナノキューブ、および２０ｍｇ／ｍｌのＺｒＡｃに対してスクロース補助されたＤＩＳ分析結果を示すものである。
【図１６】図１６（ａ）は、何も結合されていない金ナノキューブ（１行）およびオリゴペプチドが結合された金ナノキューブ（２行〜５行）に対する氷の成長を時間によってシミュレーションしたことを撮影した写真であり、（ｂ）は、氷の成長中に何も結合されていない金ナノ粒子、および（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ−、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ−、および（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ粒子のｚ軸方向の移動を時間によって示すグラフであり、（ｃ）は、アンブレラサンプリング（umbrella sampling）シミュレーションから取得した、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブの自由エネルギー変化を計算したグラフであり、（ｄ）は、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブの水素結合の寿命を計算した結果である。
【図１７】図１７は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブのＡＡ ＭＤシミュレーションの中で、（ａ）開始時点（０ｓ）及び（ｂ）終了時点（３００ｎｓ）での形態を示すものである。
【図１８】図１８（ａ）は、様々な密度を有する（Ｔｈｒ）ｎ−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブのＡＡ ＭＤモデルを示すものであり、（ｂ）は、様々なｎ及びオリゴペプチド密度に対する（Ｔｈｒ）ｎ−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブのｚ軸移動を時間によって示すグラフである。
【図１９】図１９（ａ）は、金コロイドの形状による水と氷の境界面間の接触を示す図であり、（ｂ）は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ球体、ナノ八面体およびナノキューブに対する再結晶化された氷の時間によるＭＬＧＳ及び最も大きな粒子の成長速度を示すグラフであり、（ｃ）は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ球体、およびナノキューブの一般的な配列に関する氷結晶の成長をシミュレートした写真である。
【図２０】図２０（ａ）は、異なる超冷却温度で精製水、０．２ｎＭまたは０．６ｎＭの（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ球体サスペンションの条件での氷結晶の成長速度、および（ｂ）精製水、０．２ｎＭまたは０．６ｎＭの（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ球体サスペンションの条件での時間による単一の氷結晶のＧＦＯＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、添付の図面を参照して、本発明をより具体的に説明するが、本発明の全てではなく、いくつかの具体例を例示する。実際、これらの発明は、様々な形態で具体化することができ、本明細書に示す具体例のみに限定されて解釈されるものではない。本明細書及び請求の範囲で使用される単数形は、特に他の明示がない限り複数の対象を含む。
【００３４】
「熱履歴現象」は、凍結温度と溶融温度が異なることになる現象を意味する。水に核形成剤が存在する場合には、凍結温度と溶融温度が実質的に同一である。しかし、核形成剤が存在しないか、または核形成剤が抗凍結タンパク質である場合には、凍結温度が溶融温度よりも低く形成される。
【００３５】
「氷の再結晶化」は、小さな氷結晶から更に大きな氷結晶に成長する過程を意味し、オストヴァルト熟成（Ostwald ripening）は、常温と結晶の間の表面エネルギーの差による圧力によって発生する再結晶化を意味し、融解−拡散−再凍結または昇華−拡散−凝縮のメカニズムで進行され得る。  
【００３６】
凍結保存時、溶かす過程での氷の再結晶化は、細胞膜を損傷させ、細胞の脱水を進行させることにより、細胞および組織に損傷を与える。低温環境に住む有機体は、氷の再結晶化によって、より損傷されやすいので、ＡＦＰまたはＡＦＧＰが発達された。ＡＦ（Ｇ）Ｐは、氷の表面に付着して氷が成長することを抑制するため、氷の再結晶化が問題となる分野で添加剤として活用された。本発明では、ＡＦ（Ｇ）Ｐに由来するペプチドを用いた凍結制御用物質を開発し、特にＡＦ（Ｇ）Ｐ由来のペプチドの空間的配置が抗凍結効果に大きな影響を及ぼすことを証明することにより、本発明を完成した。 
【００３７】
本発明では、「抗凍結タンパク質」または「ＡＦＰ」は、相互交換して使用可能であり、「抗凍結糖タンパク質」または「ＡＦＧＰ」は、相互交換して使用可能である。また、ＡＦＰ及びＡＦＧＰを統合して「ＡＦ（Ｇ）Ｐ」と称する。ＡＦ（Ｇ）Ｐは、様々な動物、植物、カビ及びバクテリアから発見され、これらのタンパク質は、氷結晶に結合することにより、氷の成長および再結晶化を抑制することが知られている。このＡＦ（Ｇ）Ｐの性質は、低温で生物学的試料を保存するのに利用されてきた。最近の研究によると、ＡＦ（Ｇ）Ｐは、その種類に応じて、氷に結合するための特殊な形態の３次構造を有するが、氷と接触する方向にＴｈｒが多数存在し、補助的にＡｌａが存在することが知られている。
【００３８】
本発明で使用する用語「抗凍結」、「凍結制御」、「結氷制御」、「凍結抑制」および「結氷抑制」は、相互交換して使用可能であり、氷点を下げたり、氷が形成されないようにするか氷の形成速度を遅らせたり、氷の再結晶化が行われないようにしたり、氷再結晶化の速度を遅らせたり、氷結晶の大きさを小さく維持する作用を意味する。       
【００３９】
本発明で使用する用語「コロイド」は、微視的に分散された可溶性粒子または不溶性粒子が他の物質に浮遊している混合物、または分散された物質を意味する。溶媒と溶質が一つの相を有する溶液とは異なり、コロイドは分散相および連続相を有する。    
【００４０】
本発明で使用する用語「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換して使用され、ペプチド結合により共有結合されたアミノ酸残基で構成された重合体化合物を指す。本発明では、公知の技術により合成されたペプチドを用いることができる。ペプチドの合成方法は、化学的方法または生物学的方法であってもよい。化学的方法は、例えば、溶液相方法；ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｂｏｃ）／ｂｅｎｚｙｌ（Ｂｚｌ）戦略および９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ（ｔ−Ｂｕ）戦略を含む固相方法（Kent SBH，Mitchell AR，Engelhard M，Merrifield RB（1979）Mechanisms and prevention of trifluoroacetylation in solid-phase peptide synthesis．Proc Natl Acad Sci USA 76（5）：2180-2184）；レジンに最初のアミノ酸を固定化し、配列順にペプチド鎖を延長する方法；またはマイクロ波を用いる方法であってもよく、生物学的方法は、微生物を用いた方法であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明で使用する用語「平面接触」または「面接触」は、相互交換して使用可能であり、面と面が接触したとき、その境界に実質的に平面が形成される場合を意味し、線接触または点接触、あるいは境界に曲面が形成される曲面接触の場合とは区別して使用される。本発明のナノ構造体は、氷結晶面と平面的に接触可能な一つ以上の平面を有するが、当該面には疎水性の作用基または親水性の作用基を有するか、または疎水性の作用基および親水性の作用基を有するアミノ酸残基が露出している。前記平面接触が可能な多面体としては、四面体、切頂四面体、六面体、切頂六面体、八面体、切頂八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体、六八面体、または菱形十二面体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、前記多面体は六面体または八面体である。
【００４２】
本発明で使用する用語「切頂（truncated）多面体」は、アルキメデスの多面体の一つであり、多面体の頂点を切り取った形の多面体を意味する（図１ｂ）。
【００４３】
本発明で使用する用語「コア」は、ナノ構造体の基本骨格をなす部分を意味する。コアは、細胞または身体に毒性がないか、毒性が実質的にないか、毒性が少ない元素を用いることができる。本発明の一実施形態では、コアは、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、アルミニウム（Ａｌ）、銅（Ｃｕ）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、又はこれらのうちの少なくとも２種を含む合金で製造できる。本発明の他の実施形態では、前記コアは、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、鉄（Ｆｅ）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、ケイ素（Ｓｉ）、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、又はこれらのうちの少なくとも２種を含む合金で製造できるが、これらに限定されるものではない。本発明のまた他の実施形態では、前記コアは金で製造される。
【００４４】
本発明の一実施形態では、前記コアの直径は、１５０ｎｍ以下、１０ｎｍ〜１４０ｎｍ、２０ｎｍ〜１３０ｎｍ、３０ｎｍ〜１２０ｎｍ、４０ｎｍ〜１１０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、６０ｎｍ〜９０ｎｍ、または７５ｎｍであるが、本発明に係るナノ構造体がコロイド状で溶液中で浮遊できれば、前記範囲に限定されない。通常の技術者は、使用されるコアの材料、密度および形状などを考慮して、コロイド特性を持つように直径を調節することができる。ただし、コアの直径が１０ｎｍ未満の場合には、凍結制御の効果が奏されないことがある。             
【００４５】
本発明で使用する用語「直径」は、多面体で向かい合う面の間の最短距離を意味し、ナノ構造体が球状である場合には、直径を意味する。   
【００４６】
本発明に係るナノ構造体は、コアと、該コアに結合されるオリゴペプチドとを含む。前記オリゴペプチドは、疎水性の作用基を有するアミノ酸、例えば、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔであってもよく、親水性の作用基を有するアミノ酸、例えば、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕであってもよく、疎水性及び親水性の作用基を有するアミノ酸、Ｔｈｒであってもよい。
【００４７】
本発明の一実施形態において、コアに結合されるオリゴペプチドは、（Ｔｈｒ）ｎ、（Ａｌａ）ｎ、（Ｇｌｙ）ｎおよび（Ｓｅｒ）ｎで構成される群から選択される一つ以上を含み、一実施形態において、前記オリゴペプチドは、（Ｔｈｒ）ｎまたは（Ａｌａ）ｎである：前記ｎは、１〜８の整数、２〜７の整数、３〜６の整数、または５であるが、これらに制限されるものではない。特に説明がない限り、本発明でオリゴペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に配列を記載する。たとえば、（Ｔｈｒ）５−は、（Ｎ−末端）Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−（Ｃ−末端）を意味し、Ｃ末端に結合された追加のアミノ酸を介して、または直接に本発明のナノ構造体に結合されていることを意味する。
【００４８】
本発明の他の実施形態では、前記オリゴペプチドは、ＡＦ（Ｇ）Ｐの構造的特性を用いて、（Ｔｈｒ）５が結合された金ナノ粒子（nanoparticles、ＮＰｓ）を製造した。これに加えて、親水性または疎水性の作用基の役割を確認するために、Ｔｈｒで−ＣＨ３がＨで置換された（Ｓｅｒ）５、Ｔｈｒで−ＯＨがＨで置換された（Ａｌａ）５、およびＴｈｒで−ＣＨ３および−ＯＨの両方がＨで置換された（Ｇｌｙ）５が結合された金ナノ粒子をそれぞれ製造した。特に、前記オリゴペプチドをコアに結合させるために、Ｃ−末端にＣｙｓがさらに含まれてもよいが、その他にも、当該技術分野で知られている、コアの表面にオリゴペプチドを結合するための構成が追加されてもよい。 
【００４９】
本発明の一実施形態では、コアに結合されたオリゴペプチドは、ｎｍ２あたり最大０．０７個〜０．２５個、０．０７５個〜０．２３個、０．１個〜０．２個、または０．１３個〜０．１７個が結合できるが、オリゴペプチドの長さ、または配列のようなオリゴペプチドの特性によって変更し得る。氷界面への結合力は、単位面積当たりの結合されたオリゴペプチドの数、および水と相互作用できる作用基（疎水性基および親水性基）の数に相関する。            
【００５０】
本発明は、実質的に同一の直径を持つ球状のナノ構造体と比較して、氷再結晶化の抑制効果が高いことを確認した。また、氷が鋸歯形状や針状ではなく、先端が鋭くない形状に形成されるようにする効果を有する。    
【００５１】
氷結晶が鋸歯形状又は針状を有する場合には、細胞または食品を凍結して保存したとき、細胞膜及び／又は細胞壁が破壊されて細胞の生存率が低くなり、食品の食感が低下する問題が発生する。これに対して、本発明に係るナノ構造体を含む組成物を添加する場合には、前記のように形成される氷は、方向性なしに成長することになるので、細胞凍結保存時の細胞生存率を高めることができ、食品の凍結保存時の食感を維持できる利点がある。したがって、本発明に係るナノ構造体は、通常の結氷制御のための原料として使用できるだけでなく、細胞および食品の凍結に使用するにも適している。  
【００５２】
本発明の一実施形態では、本発明に係る結氷制御用組成物は、氷結晶の一つ以上の面と平面接触が可能な一つ以上の平面を含み、四面体、切頂四面体、六面体、切頂六面体、八面体、切頂八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体、六八面体、または菱形十二面体形状のコアと、該コアの一つ以上の平面に結合されており、（Ｔｈｒ）ｎ−、（Ａｌａ）ｎ−、（Ｓｅｒ）ｎ−、または（Ｇｌｙ）ｎ−を含むオリゴペプチドとを含むナノ構造体を含む。本発明の他の実施形態では、本発明に係る結氷制御用組成物に含まれるコアは、四面体、切頂四面体、六面体、切頂六面体、八面体、切頂八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体、六八面体、および菱形十二面体で構成される群から選択される２種以上の形状である。                                 
【００５３】
本発明の一実施形態において、本発明に係る細胞凍結保存用組成物を用いて凍結保存することができる細胞は、原核細胞；真核細胞；微生物；動物細胞；癌細胞、精子；卵子；成体幹細胞、胚性幹細胞、逆分化幹細胞を含む幹細胞；臍帯血、白血球、赤血球および血小板を含む血液細胞；腎臓細胞、肝細胞および筋肉細胞を含む組織細胞であってもよいが、これらに限定されない。                    
【００５４】
本発明の一実施形態では、本発明に係るナノ構造体を溶媒に添加することにより結氷を制御する方法、本発明に係るナノ構造体を、細胞を含む溶液に添加するステップを含んで細胞を凍結保存する方法、および本発明に係るナノ構造体を食品に処理するステップを含んで食品を凍結保存する方法を提供する。   
【００５５】
本明細書で数値が範囲で記載されている場合には、当該範囲内のすべての数値が本発明に開示されたものとみなす。   
【００５６】
通常の技術者は、「約」を使用せざるを得ない場合があることを理解するはずである。本明細書で用語「約」は、誤差範囲内の数値を含むものと理解されるはずである。  
【００５７】
本発明で使用する用語「実質的に同一」は、誤差範囲内で同一であるか、認識できない程度の差があることを意味する。本発明で使用する用語「実質的にない」又はそれと類似した意味の表現は、０または誤差範囲内に０が含まれる場合、または通常の技術者からみて無視できる場合を指す。   
【００５８】
実施例
実施例１．方法
１．１  金コロイドの合成
金コロイド（金ナノ球体（Au nanospheres；ＮＳｓ）、金ナノキューブ（Au nanocubes、ＮＣｓ）、および金ナノ八面体（Au nanooctahedra、ＮＯｓ））を頂点／角の選択的なエッチングと共にシード−媒介法（seed-mediated method）により合成した。まず、金ナノロッド（Au nanorods、ＮＲｓ）を銀援助方法（silver-assisted methods）を用いて合成した（図１）。金ナノロッドのための金シードは、１０ｍＭソジウムボロハイドライド３００μＬを、１０ｍＭ ＨＡｕＣｌ４の１２５μＬおよび１００ｍＭ ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（hexadecyltrimethylammonium bromide、ＣＴＡＢ）５ｍＬを含有する溶液に注入して製造した。その後、１００ｍＭ ＣＴＡＢ ２００ｍＬ、１０ｍＭ ＨＡｕＣｌ４１０ｍＬ、１０ｍＭ硝酸銀１．８ｍＬ、１００ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸１．１４ｍＬ、および２４０μＬのシード溶液１．１４ｍＬを順次添加し、金ナノロッドを成長させた。１分間穏やかに攪拌した後、２時間静置した。                   
【００５９】
均一なナノ球体シードを得るために、金ナノロッドを２ＯＤ（optical density）で含有する５０ｍＭ ＣＴＡＢ水溶液に６０μＭ ＨＡｕＣｌ４を注入することにより、金ナノロッドの両末端を選択的にエッチングした。４０℃で４時間穏やかに攪拌した後、エッチングされた金ナノロッドを１００ｍＭセチルピリジニウムクロリド（cetylpyridinium chloride、ＣＰＣ）に再懸濁した。２０ｍＬの１０ｍＭ ＣＰＣ、３５０μＬの１０ｍＭ ＨＡｕＣｌ４、４．５ｍＬの１００ｍＭアスコルビン酸、および１ＯＤ値のエッチングされた金ナノロッド１ｍＬを混合してエッチングされた金ナノロッドを凹んだ菱形の１２面体（concave rhombic dodecahedra、ＣＲＤ）に成長させ、６０μＭ ＨＡｕＣｌ４水溶液と４０℃で４時間穏やかに攪拌することにより、ナノ球体にエッチングした。エッチングされたＣＲＤ５ｍＬをシードとして使用して、ＣＤＲ成長後の頂点／角のエッチングを２回繰り返すことにより、ナノ球体シードを均一にした。                      
【００６０】
これらのナノ球体シードを使用して、金ナノ球体、金ナノキューブおよび金ナノ八面体を製造した。金ナノ球体は、前記のＣＲＤ成長およびエッチング方法の後、エッチングされたＣＲＤ２ｍＬをシードとして使用して製造した。金ナノキューブは、５ｍＬの１００ｍＭ ＣＰＣ、５００μＬの１００ｍＭ ＫＢｒ、１００μＬの１０ｍＭ ＨＡｕＣｌ４、１５０μＬの１００ｍＭアスコルビン酸、および１ＯＤ値のナノ球体シード５００μＬを混合し、１時間反応して製造した。金ナノ八面体は、１００μＬの１０ｍＭ ＨＡｕＣｌ４、１３μＬの１００ｍＭアスコルビン酸、および１ＯＤ値のナノ球体シード５００μＬを５ｍＬの１００ｍＭ ＣＰＣに添加し、１時間穏やかに攪拌して製造した。
【００６１】
１．２  金コロイドへのオリゴペプチドの融合
金コロイドに抗凍結オリゴペプチドを融合させるために、Ｃ−末端システイン（Cys）の擬似共有結合（pseudocovalent bond）を用いた。精製水（DI water）に分散された前記方法で製造された金コロイドを過量のオリゴペプチドと混合し、３０分間培養して完全に覆われるようにした。培養後、３回の遠心分離により過量のオリゴペプチドを除去し、水中０．０１ｗｔ．％ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate、ＳＤＳ）に再分散した。        
【００６２】
１．３  金コロイド性分散の数値模擬（Numerical simulation）
金コロイドの分散特性を理論的に予測するために、商業的に利用可能なソフトウェアパッケージであるＦＤＴＤ（2014 CST Microwave Studio）を用いた。金の誘電率は、 Johnson, P. B.; Christy, R. W. Optical constants of the noble metals. Phys. Rev. B 1972, 6 (12), 4370-4379 に基づいており、オリゴペプチドの厚さは、単量体の数値によって０．６０ｎｍ〜１．４０ｎｍとした。この厚さはオリゴペプチドの構造（conformation）に基づいて決定し、これは全原子（ＡＡ）分子動力学（ＭＤ）シミュレーションで計算した。暗視野顕微鏡のスペクトルの分析（図１１）を反映するために、金コロイドの分散横断面（ｎｍ２）スペクトルを数値的に計算した。オリゴペプチドが付着されていない金コロイドおよびオリゴペプチドが付着されている金コロイドの吸収横断面（ｎｍ２）スペクトルを、図３ｂ−ｄに示されるＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを説明するために計算した。           
【００６３】
金コロイドのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトル上のオリゴペプチドの厚さの効果を理論的に定量するために、ＬＳＰＲ消光ピークの移動を、異なる厚さを持つオリゴペプチド層の屈折率の関数として数値的にシミュレートした。その後、数値的なシミュレーションのために使用された屈折率を下記の有効媒質理論（Maxwell-Garnett近似）を用いて、オリゴペプチドと相関させた：  
【００６４】
0006913964.tif 000002
【００６５】
前記εeff、εi、εh、およびδｉは、それぞれ媒質の有効誘電定数、含有物の有効誘電定数、ホストの有効誘電定数、および含有物の容積分率である。含有物およびホスト媒質は、それぞれオリゴペプチドおよび水（εh＝１．３３）とした。オリゴペプチドの誘電定数は、McMeekin, T. L.; Groves, M. L.; Hipp, N. J. Refractive indices of amino acids, proteins, and related substances; American Chemical Society: Washington, DC, 1964から得た。        
【００６６】
１．４  金コロイドに付着したオリゴペプチドの定量
金コロイド上に付着したオリゴペプチドを実験的に定量するために、オリゴペプチドをＮａＢＨ４で還元させて分離し、チオール−選択的検出器媒介蛍光測定法（Lee, H. E.; Ahn, H. Y.; Mun, J.; Lee, Y. Y.; Kim, M.; Cho, N. H.; Chang, K.; Kim, W. S.; Rho, J.; Nam, K. T. Amino-acid-and peptide-directed synthesis of chiral plasmonic gold nanoparticles. Nature 2018, 556 (7701), 360-365.）を行った。まず、オリゴペプチドで改質された金コロイドを３回遠心分離し、０．０１ｗｔ％ＳＤＳに再懸濁して、結合されていないオリゴペプチドを完全に除去した。金コロイドからオリゴペプチドを分離するために、２５μＬの１００ｍＭ ＮａＢＨ４を７５μＬのオリゴペプチドで改質された金コロイドに添加した。室温で５分間培養し、溶液を再び遠心分離して、金コロイドと放出されたオリゴペプチドを分離した。自由分散したオリゴペプチドを含有する上澄み液を一晩培養し、残りのＮａＢＨ４を非活性化した。          
【００６７】
分離したオリゴペプチドをチオール検出蛍光検出器（Thiol detection assay kit, Cayman Chemical, 700340）を用いて定量した。オリゴペプチドをチオール検定緩衝液（100mM Potassium Phosphate、1mM EDTA、pH7.4）で蛍光チオール検出器と１：１で混合し、室温で５分間培養することにより、検出器がチオール基と反応して蛍光シグナルが放出されるようにした。蛍光は、３８０ｎｍの励起波長および４８０〜５２０ｎｍの放出波長で観察した。最後に、分離したオリゴペプチドの濃度は、標準曲線（図４）を基準にして測定された蛍光強度から計算した。
【００６８】
１．５  氷再結晶化の抑制（ice recrystallization inhibition、ＩＲＩ）の特性
スプラット分析法（splat assay）及びスクロースサンドイッチ分析法を同時に行って氷再結晶化の程度を確認することにより、ＩＲＩ活性を分析した（Mitchell, D.E.; Clarkson, G.; Fox, D.J.; Vipond, R.A.; Scott, P.; Gibson, M.I. Antifreeze protein mimetic metallohelices with potent ice recrystallization inhibition activity. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139 (29), 9835-9838.; (9) Budke, C.; Heggemann, C.; Koch, M.; Sewald, N.; Koop, T. Ice recrystallization kinetics in the presence of synthetic antifreeze glycoprotein analogues using the framework of LSW theory. J. Phys. Chem. B 2009, 113 (9), 2865-2873.）。オリゴペプチドで改質された金コロイドを遠心分離し、精製水に再分散することにより、特性を把握する前に残存した有機リガンドによる作用を完全に除去した。スプラット分析法によりＩＲＩ活性を試験するために、１０μＬの試料を１．５ｍの高さから−７０℃に既に冷却されたカバーガラスの表面に水滴を落として薄い氷膜を形成させた。薄い氷膜が形成された硝子カバーガラスを−２０℃のペルチェ冷却器（Peltier cooler）に移し、硝子カバーガラスの温度を−６℃まで５℃／ｍｉｎの速度でゆっくりと昇温した後、この温度で試料をアニールした。氷が再結晶化する３０分間、暗視野光学顕微鏡（Dark-field optical microscopy、ＤＦＯＭ）画像を撮影した。これらのＤＦＯＭ画像を再結晶化した氷の粒子サイズを確認するために開発したコードで定量した。見える範囲で最も大きな１０個の氷結晶を選定し、これらの平均直径を求めてＩＲＩ活性を測定した。３回の独立した実験の平均値から平均最大粒子径（mean largest grain size、ＭＬＧＳ）を算出した。
【００６９】
スクロースサンドイッチ検定でＩＲＩ活性を特徴づけるために、４５ｗｔ％のスクロースの存在下で試料を２つのカバーガラスの間に挟んでペルチェ冷却器に位置させた。−５０℃まで試料を冷却した後、ペルチェ冷却器の温度を１０℃／ｍｉｎの速度で−８℃まで昇温した。その後、試料を当該温度で３０分間アニールした。ＩＲＩ活性を測定するために、ＤＦＯＭ画像を５分ごとに撮影し、氷結晶の半径を前記開発したコードを用いて測定した。時間による平均氷結晶の半径の三乗を計算してＩＲＩ活性を定量した。３回の独立した実験を行い、その結果から平均値を導出した。
【００７０】
１．６  単結晶氷の方向的成長
まず、スライドガラス上に両面テープを貼着し、その上にカバーガラスを位置させることにより、ガラスマイクロ流体チャネルを製造した。その後、このチャネルに精製水を注入し、透明なマニキュア液で密封した。空間的に温度（Ｔ）勾配を誘導するために、チャネルの一端は、−２０℃のペルチェ冷却器上に位置させ、他端は室温（１５〜２０℃）に位置させた。これらの条件の下で、単結晶氷−水界面がペルチェ冷却器と室温エリアとの間に形成された。          
【００７１】
１．７  スクロースの存在下での動力学的氷形状（dynamics ice shaping、ＤＩＳ）の分析
ＤＩＳ活性を確認するために、氷結晶の形状をスクロース水溶液で観察した。まず、４５ｗｔ％スクロース溶液に溶解された試料を二つのカバーガラスの間に位置させ、５０℃に冷却した。その後、試料を０．５℃／ｍｉｎの速度で、氷がほとんど残らなくなるまで昇温した後、試料を−０．１℃／ｍｉｎの速度で冷却させながら氷結晶の成長を誘導した。ＤＦＯＭ画像を冷却１０分後に撮影した。
【００７２】
１．８  熱履歴現象（thermal hysteresis、ＴＨ）的な特性
試料のＴＨ活性を確認するために、単一の氷結晶の成長速度を様々な過冷却温度でモニタリングした。試料を、注文製作したナノリットル浸透圧計を用いて−５０℃まで急速に冷却し、多結晶質の氷結晶を製造した。その後、単一の氷結晶が残るまでゆっくり昇温した。単一の氷結晶の大きさが４分以上維持された場合、その温度を融点に設定した。その後、温度を標的温度まで下げて、氷結晶の成長速度を４分間モニタリングした。ＴＨは、融点と氷結晶の成長が観察される温度との差で測定した（成長速度＞０μｍ／ｍｉｎ）。
【００７３】
１．９  全原子分子動力学（All atom molecular dynamics、ＡＡ ＭＤ）シミュレーション
ＡＡ ＭＤシミュレーションは、ＣＨＡＲＭＭ３６力場を用いて、ＧＲＯＭＡＣＳ ｖ５．１．４で行った（Abraham, M.J.; Murtola, T.; Schulz, R.; Pall, S.; Smith, J.C.; Hess, B.; Lindahl, E. GROMACS: high performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX2015, 1, 19-25.; Huang, J.; MacKerell Jr, A. D. CHARMM36 all-atom additive protein force field: validation based on comparison to NMR data. J. Comput. Chem. 2013, 34 (25), 2135-2145.）。オリゴペプチドの構造は、マービンスケッチ（MarvinSketch）を用いて製作し、パラメータはＣＧｅｎＦＦを用いて誘導した（Vanommeslaeghe, K.; MacKerell, A. D. Automation of the CHARMM general force field (CGenFF) I: bond perception and atom typing. J. Chem. Inf. Model. 2012, 52 (12), 3144-3154.）。氷の実際の溶融点（Ｔｍ）（２７２．２Ｋ）を考慮して、ＴＩＰ４Ｐ／ＩＣＥ水モデルを使用した（Berendsen, H. J. C.; Postma, J. P. M.; van Gunsteren, W. F.; DiNola, A.; Haak, J. R. Molecular dynamics with coupling to an external bath. J. Chem. Phys. 1984, 81 (8), 3684-3690.）。金ナノキューブは、６６５金原子で構成されるように設計した（すなわち、２ｎｍの一辺の長さ）。ＣＨＡＲＭＭ−Ｍｅｔａｌ力場は、無機界面での生体分子間の相互作用を説明する（Abascal, J. L.; Sanz, E.; Garcia Fernandez, R.; Vega, C. A potential model for the study of ices and amorphous water: TIP4P/Ice. J. Chem. Phys. 2005, 122 (23), 234511.）。様々なサイズと形状の金コロイドをＭａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｔｕｄｉｏ（Accelrys Inc.，San Diego，CA，2011）でナノクラスター製造機を用いて製造した。すべてのＭＤシステムは、平衡および生産稼動のために、それぞれＢｅｒｅｎｄｓｅｎ及びＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ−Ｒａｈｍａｎアルゴリズムを用いて、１ｂａｒで維持した（Heinz, H.; Vaia, R. A.; Farmer, B. L.; Naik, R. R. Accurate simulation of surfaces and interfaces of face-centered cubic metals using 12-6 and 9-6 Lennard-Jones potentials. J. Phys. Chem. C 2008, 112 (44), 17281-17290.; Parrinello, M.; Rahman, A. Polymorphic transitions in single crystals: a new molecular dynamics method. J. Appl. Phys. 1981, 52 (12), 7182-7190.）。近接リスト（Neighbour list）は、カットオフ半径１．２ｎｍでＶｅｒｌｅｔカットオフ方式を用いて作成し、それぞれの段階ごとに更新した。結合の長さを制限するために、ＬＩＮＣＳアルゴリズムを使用した(Hess, B.; Bekker, H.; Berendsen, H. J.; Fraaije, J. G. LINCS: a linear constraint solver for molecular simulations. J. Comput. Chem. 1997, 18 (12), 1463-1472.）。すべてのシミュレーションは、２ｆｓの時間段階でリープ・フロッグ法（leap-frog integrator）を用いて行った。静電相互作用は、１．２ｎｍのカットオフでＰＭＥを用いて計算した（Darden, T.; York, D.; Pedersen, L. Particle mesh Ewald: An N log(N) method for Ewald sums in large systems. J. Chem. Phys. 1993, 98 (12), 10089-10092.）。               
【００７４】
２ｎｍの金ナノキューブ、５ｎｍの金ナノ球体および５ｎｍの金ナノキューブを、それぞれ６６５、３９２５および７８１３個の金原子を用いて製造し、オリゴペプチドを金ナノ粒子の表面に約２．５ペプチド／ｎｍ２で均一に付着した。これにより、６０、１９６、および３７５個のオリゴペプチドが２ｎｍの金ナノキューブ、５ｎｍの金ナノ球体、および５ｎｍの金ナノキューブにそれぞれ付着した。     
【００７５】
連続的な氷成長システムを２ｎｍの金コロイドに対して１０．８ｎｍ×１０．４ｎｍ×８．６ｎｍの部屋、５ｎｍの金コロイドに対して１４．７ｎｍ×１４．９ｎｍ×１３．０ｎｍの部屋で設計した。氷の成長のためにシード氷を入れ、固定された無秩序な水分子を用いて、下方向への氷の成長を抑制した。  
【００７６】
ＧＲＯＭＡＣＳ及びＭＤＡｎａｌｙｓｉｓ２０のツールを水素結合寿命分析の評価に使用した。オリゴペプチドと水／氷の分子間の水素結合の寿命は、２９８〜３００ナノ球体の計算時間の期間に統合された。アミン、カルボニル、およびヒドロキシル基のようなオリゴペプチドの機能性モイエティから全ての水素結合の可能性を計算した。ＰｙＭＯＬ（The PyMOL Molecular Graphics System、Version 2.0 Schrodinger、LLC）をシミュレーション結果の可視化に使用した。       
【００７７】
１．１０  ペプチドが結合された金コロイドの結合エネルギーを計算するためのＡＡ ＭＤシミュレーション
ペプチドが結合された金コロイドと氷結晶との間の結合エネルギー（即ち、自由エネルギー変化）を計算するために、本発明者は、プリングシステム(pulling system)（umbrella sampling simulation）を数値的にシミュレートした。このために、金粒子、氷表面および液体の水層を含有する合計２００，０００個の原子を有する１０×１０×１２ｎｍ３のシステムボックスを製作した。Ｚ−軸の反応配位を作るために、金粒子を１０００ｋＪ／ｍｏｌ ｎｍ２の力定数のＤＭＰでプリングコードを使用して、氷の界面から５００ｐｓの間、約４ｎｍ引っ張った。その後、１Aで試料ウィンドウの空間を定義し、４０アンブレラサンプリング（umbrella sampling）ウィンドウを抽出した。それぞれのウィンドウを１ｎｓの間、平衡を合わせ、１０ナノ球体の生産実行を行った。ＰＭＦ（potential of mean force）をＧＲＯＭＡＣＳパッケージでＷＨＡＭツールを用いて取得した。ＰＭＦ最大エネルギー状態と最低エネルギー状態との差として曲線から結合自由エネルギーを計算した。            
【００７８】
実施例２．結果および議論
２．１  抗凍結金コロイドの合成
異なる形態の、非常に均一な金ナノ粒子を十分に高い収率および拡張性を持って合成した。図２ａは、本発明で使用される金ナノ粒子のＳＥＭ（scanning electron microscopy）およびＴＥＭ（transmission electron microscopy）画像を示す。氷の成長および再結晶化の抑制に二つの界面間の接触の効果を調査するために、金ナノ粒子が７５ｎｍと同じサイズでありながら、ナノ球体、ナノ八面体、およびナノキューブを有するように合成した。多角形の金コロイドの成長およびその後の頂点の選択的なエッチングにより、非常に均一な金コロイドを十分に多くの量で取得した（図２ｂ）。金ナノ球体のＬＳＰＲは、合成バッチを２０ｍＬから２００ｍＬまで拡張した後でも維持した（図２ｂの右側図でのＵＶ-Ｖｉｓ吸収スペクトル）。これは本発明での金コロイドの合成方法の収率および拡張性を裏付ける。           
【００７９】
前記製造された金ナノ粒子に、システインのチオール基と金との間の擬似共有結合によりオリゴペプチドを結合した。ＡＦ（Ｇ）Ｐ及び氷の界面間の相互作用の完璧な理論的根拠は把握しにくいが、線状に、規則的に配列された親水性および疎水性を有する機能性モイエティ（例えば、Ｔｈｒ）が氷の成長および再結晶化の抑制に関与することが知られている（Doxey, A. C.; Yaish, M. W.; Griffith, M.；McConkey, B. J. Ordered surface carbons distinguish antifreeze proteins and their ice-binding regions. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 852-855.; Garnham, C. P.; Campbell, R. L.; Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108, 7363-7367.; Davies, P. L. Ice-binding proteins: a remarkable diversity of structures for stopping and starting ice growth. Trends Biochem. Sci.2014, 39, 548-555.; Meister, K.; Lotze, S.; Olijve, L. L.; DeVries, A. L.; Duman, J. G.; Voets, I. K.; Bakker, H. J. Investigation of the ice-binding site of an insect antifreeze protein using sum-frequency generation spectroscopy. J. Phys. Chem. Lett. 2015, 6, 1162-1167.; Dolev, M. B.; Braslavsky, I.; Davies, P. L. Ice-binding proteins and their function. Annu. Rev. Biochem. 2016, 85, 515-542.; Hudait, A.; Odendahl, N.; Qiu, Y.; Paesani, F.; Molinero, V. Ice-nucleating and antifreeze proteins recognize ice through a diversity of anchored clathrate and icelike motifs. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 4905-4912.）。複数の水素結合および疎水性の位置を提供するオリゴペプチドは、金ナノ粒子上に直接に結合された（図２ｃ）。異なる配列を有するＣｙｓ−末端の（Ｃ'）オリゴペプチドを用いて、Ｎ末端−Ｃ末端の順に（Ｔｈｒ）ｎ−Ｃｙｓ、（Ｓｅｒ）ｎ−Ｃｙｓ、（Ａｌａ）ｎ−Ｃｙｓ、および（Ｇｌｙ）ｎ−Ｃｙｓを含んで様々なモイエティの氷成長への影響を調査した。それぞれの異なるオリゴペプチド配列で氷成長の阻害を比較するために、ｎは５に固定した。また、（Ｔｈｒ）ｎ−Ｃｙｓに対して、ｎが２、５及び７のときの氷への結合および結果的な氷成長の抑制に対するｎの効果を調べた。図２ｃに示す各々のオリゴペプチドの形態は、ＡＡ ＭＤシミュレーションから決定された。これらの合成されたオリゴペプチドが結合される前に、氷との相互作用への副作用を回避するために、合成プロセスの間に金ナノ粒子の表面に形成された有機リガンドをほぼ除去した。   
【００８０】
反応物を混合した後、オリゴペプチドを擬似共有結合により自発的に結合した。この合成されたオリゴペプチドの金ナノ粒子上の結合は、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルで測定された、ＬＳＰＲ消光に対する赤色偏移されたピークを通じて結合過程の間にモニタリングした。これらのＬＳＰＲのピーク偏移は、数回のシミュレーションにおいて、すべて同様な結果が示された（有限差分時間領域（finite-difference time-domain、ＦＤＴＤ）法、図３）。      
【００８１】
オリゴペプチドのこのような結合は、ＬＳＰＲ消光ピークがこれ以上偏移しなくなるまで継続して進行した。これはオリゴペプチドが金ナノ粒子に最大に結合したことを意味し、本発明者は、これらの金ナノ粒子で氷の成長を阻害するために最大に使用した。  
【００８２】
ｎの値を５に固定し、ペプチドが完全に結合した後、金ナノ粒子の形状やオリゴペプチド配列とは無関係に、ほぼ一貫したＬＳＰＲ消光ピークの赤色偏移が観察された。一方、より長いオリゴペプチドが結合された金ナノキューブのＬＳＰＲ焼結ピークは、より短いオリゴペプチドが結合された場合に比べて、より多くの赤色偏移が発見された（図３ｄ）。
【００８３】
その後、オリゴペプチドを、金ナノ粒子から化学的に分離して計数することにより、結合されたオリゴペプチドの密度を定量した（図４）。５ｍｅｒの場合、結合されたオリゴペプチドの数（即ち、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ）は、金ナノ粒子の形状およびペプチド配列とは無関係に、金ナノ粒子の表面ｎｍ２あたり０．１３〜０．１７個とほぼ一定していた。この結果は、オリゴペプチドの結合後、ＬＳＰＲ消光ピークの赤色偏移がほぼ一定程度に示されることと一致する。Ｔｈｒに対するｎ値が増加する場合には、金ナノ粒子に結合されるようにアクセス可能なオリゴペプチドの数が減少する。２ｍｅｒから７ｍｅｒにオリゴペプチドの長さが長くなると、金ナノ粒子の表面ｎｍ２あたりオリゴペプチドの数は、約０．２３から約０．０７５に減少した。より長いオリゴペプチドに対し、静電斥力及び立体障害がより重要になり、結果として、金ナノ粒子に結合できるオリゴペプチドの最大密度が減少した。より長いオリゴペプチドが結合された金ナノキューブのより多く赤色偏移されたＬＳＰＲ消光ピーク（図３）は、相対的に低い表面密度を有するものの、理論的予測と一致した（図５）。これは、より長いオリゴペプチドが結合された金ナノキューブに対するＬＳＰＲ偏移が、より短いオリゴペプチドが結合された場合に比べて、オリゴペプチド密度の増加に敏感であることを示す。                     
【００８４】
２．２  抗凍結金コロイドの氷再結晶化の抑制 
次に、オリゴペプチドが結合された金ナノ粒子の氷再結晶化の抑制（ice recrystallization inhibition、ＩＲＩ）の効果を確認した（図６）。そのために、ＩＲＩの定量測定の標準であるスプラット分析法（すなわち、非平衡、急速冷却）を行った（Voets, I. K. From ice-binding proteins to bio-inspired antifreeze materials. Soft Matter 2017, 13, 4808-4823.; Biggs, C. I.; Bailey, T. L.; Graham, B.; Stubbs, C.; Fayter, A.; Gibson, M. I. Polymer mimics ofbiomacromolecular antifreezes. Nat. Commun. 2017, 8, 1546.; Wu, S.; Zhu, C.; He, Z.; Xue, H.; Fan, Q.; Song, Y.; Francisco, J.S.; Zeng, X.C.; Wang, J.Ion-specific ice recrystallization provides a facile approach for the fabrication of porous materials. Nat. Commun. 2017, 8, 15154.）。具体的には、精製水の水滴を冷却段階（−７０℃）に位置させることにより、氷切片を作製した。その後、暗視野（dark field、ＤＦ）モードで光学顕微鏡（ＯＭ）を用いて、再結晶化された氷粒子サイズの空間的分布を確認した。ＤＦＯＭ画像に基づいて、再結晶化された氷ドメインの平均最大粒子サイズ（ＭＬＧＳ）を調査し、ＩＲＩ特性を導出した。スプラット分析法で引き起こされる偽陽性を回避するために、スプラット方法から観察されるＩＲＩ特性を二重に確認するために、スクロースサンドイッチ分析を行った。 
【００８５】
オストヴァルト熟成と同様に（Gibson, M. I. Slowing the growth of ice with synthetic macromolecules: beyond antifreeze(glyco) proteins. Polym. Chem. 2010, 1, 1141-1152.; Budke, C.; Heggemann, C.; Koch, M.; Sewald, N.; Koop, T. Ice recrystallization kinetics in the presence of synthetic antifreeze glycoprotein analogues using the framework of LSW theory. J. Phys. Chem. B 2009, 113, 2865-2873.; Budke, C.; Dreyer, A.; Jaeger, J.; Gimpel, K.; Berkemeier, T.; Bonin, A. S.; Nagel, L.; Plattner, C.; DeVries, A. L.; Sewald, N.; Koop, T. Quantitative efficacy classification of ice recrystallization inhibition agents. Cryst. Growth Des. 2014, 14, 4285-4294.）、再結晶化は、３０分間のアニールの間、氷粒子の大きさが継続して増加するようにする（時間の経過によるＭＬＧＳ、図６ａ及びそれに相応する図６ｂの１行目のＤＦＯＭ画像）。３０分間アニールした後、約８９μｍのＭＬＧＳが観察された。改質されていない０．２ｎＭ濃度の金ナノキューブは、氷の再結晶化にほとんど影響を与えなかった（図６ａ、図６ｂの２行目）。それぞれの氷の粒は、図７のＢＦＰＯＭから確認できるように単結晶型を有する。赤色クラックは、凝集、および気質と成長する単結晶氷の間の何も結合していない金ナノキューブに由来した。この結果は、オリゴペプチドが結合されていない金ナノキューブと再結晶化される氷結晶との間に結合力が殆どないことを示す。        
【００８６】
これに対して、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブを添加した場合には、同じ濃度（０．２ｎＭ）に対して氷の粒の再結晶化が著しく抑制された。（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ、及び（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓのような異なるオリゴペプチドが結合された金ナノキューブのＩＲＩ特性は、図６ａでそれぞれ緑色、赤色、橙色および紫色で表示した。それに相応するＤＦＯＭ画像は、図６ｂに示す。（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが結合された金ナノキューブでＭＬＧＳが著しく減少し、他の５ｍｅｒオリゴペプチドに比べてＩＲＩで高い効果を示した。（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ及び（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓが結合された金ナノキューブの場合には、ＩＲＩ活性がほとんど示されないのに対して（ＭＬＧＳ：８５〜８７μｍ）、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブは、中間程度のＩＲＩ活性を示した（ＭＬＧＳ：約５５μｍ）。         
【００８７】
Ｓｅｒ及びＧｌｙと比較して、Ｔｈｒは、さらにメチル基を有するので、より疎水性を示す一方で、ヒドロキシル基を有するので、Ａｌａに比べてより親水性を有する。総合的に、Ｔｈｒは、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＧｌｙと比較して、疎水性および親水性においてよりバランスを取っている。この観点から、（Ｔｈｒ）５のヒドロキシル基とメチル基の両方が氷への結合に貢献することが分かる。スクロースサンドイッチ分析の結果は、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ、及び（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓが結合された金ナノキューブと明らかに対比される、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブの相違するＩＲＩ効果を裏付ける（図８）。       
【００８８】
また、例えば、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、およびグリセロールのような有機分子凍結防止剤の束一的特性とは異なり、減少したＭＬＧＳの傾向は、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが結合された金ナノキューブの濃度によって、約０．１５ｎＭからはだんだん飽和することが示された（図９ａ及びｂ）。前述のように、金ナノキューブと結合された（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓの密度は、金ナノキューブｎｍ２あたり約０．１３であり、オリゴペプチドが結合された金コロイドの濃度が０．２ｎＭのとき、金ナノキューブに結合された（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓの総濃度は、約０．８７μＭであった。０．８７μＭの（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが金ナノキューブに結合せずに精製水に自由分散された場合には、ＩＲＩ活性が全く観察されなかった（図１０）。ＩＲＩは、自由分散された（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが１００μＭを超える濃度のときに示され、濃度が増加するにつれてＩＲＩ活性もまた増加した。ＩＲＩを示すための最小限の分子濃度は、金ナノキューブに結合された（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓの場合に比べて１０２倍高く示された。これは金ナノキューブの平らな面に結合された抗凍結モイエティが氷結晶の成長にさらに大きな影響を与え、結果として、氷の再結晶化をさらに抑制することを示す。
【００８９】
また、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブのＴｈｒ単量体の数がＩＲＩに及ぼす影響を評価した（図９ａ及び４ｂ）。５ｍｅｒの方が７ｍｅｒに比べて良い効果を有することが示された。これは、５ｍｅｒのＴｈｒ（金ナノキューブｎｍ２当たり約０．１３）が７ｍｅｒのＴｈｒ（金ナノキューブｎｍ２当たり約０．０７５）に比べて、金ナノキューブにさらに容易に結合することに起因するものであり得る。結合されたオリゴペプチドが遥かに小さい数であるにも関わらず、（Ｔｈｒ）５が結合された金ナノキューブの方が、（Ｔｈｒ）２が結合された金ナノキューブ（金ナノキューブｎｍ２あたり約０．２３）に比べて、より高いＩＲＩを示した。これは、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブが、（Ｔｈｒ）２−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブに比べて、より多くのＴｈｒ含有量を有するためであると考えられる。この結果は、下記の分子動力学シミュレーションの結果と合致する。            
【００９０】
金ナノキューブと、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブとの氷結合性のこのような大きな差は、融点よりも大きく低い温度で急速に冷却するときではなく、融点に近似した温度で氷を連続して、そしてゆっくりと結晶化（再結晶化を除く。）する環境でも確認される。このために、本発明者は、図１１ａに示すような冷却段階を用いた。特に、ペルチェ装置を用いて、温度を局所的に−２０℃未満に下げ、もう一方は１５〜２０℃に維持した。このようにして−２０℃から室温まで４ｃｍの空間的な温度勾配を誘導した。前記装置に位置させたガラスマイクロ流体チャネルに精製水を投入し、−２０℃から室温までの領域で単結晶型の氷の漸進的な成長を誘導した（図１１ｂ）。単色明視野偏光光学顕微鏡（bright field polarized optical microscope、ＢＦＰＯＭ）画像（図１２）と共に、粒子境界の不在（図１１ｂ）は、成長する氷の単結晶性を証明する。
【００９１】
単結晶性氷のこの方向性成長の間に、金ナノキューブは、成長する氷結晶から押し出されて水と氷の境界面に無作為に蓄積された（図１１ｃ、ｄ）。これに対して、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブは、成長する結晶性の氷に引き込まれた（図１１ｅ、ｆ）。特に、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブは、成長する氷結晶で均一に分布することを確認した。この観点から、ＡＦ（Ｇ）Ｐ由来のオリゴペプチド（Ｔｈｒ）５は、氷と金ナノキューブとの界面間接触を改善し、ＩＲＩ効果を増強する核心的役割を果たすものと考えられる。ＤＦＯＭ画像に示されるように、単量体および二量体の（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブは、成長する氷に均一に分散するのに対して、何も結合されていない単量体から五量体にわたる金ナノキューブの様々なクラスタモチーフは、水／氷の界面に無作為に凝集した（図１１、図１３及び図１４）。        
【００９２】
（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが金ナノキューブ上に不規則に配列されることは、ＡＦ（Ｇ）Ｐの抗凍結モイエティとは対照される。ＡＦ（Ｇ）Ｐの抗凍結モイエティの規則性は、氷の結晶性と効果的に合致する（Garnham, C. P.; Campbell, R. L.; Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108, 7363-7367.; Meister, K.; Lotze, S.; Olijve, L. L.; DeVries, A. L.; Duman, J. G.; Voets, I. K.; Bakker, H. J. Investigation of the ice-binding site of an insect antifreeze protein using sum-frequency generation spectroscopy. J. Phys. Chem. Lett. 2015, 6, 1162-1167.; Hudait, A.; Odendahl, N.; Qiu, Y.; Paesani, F.; Molinero, V. Ice-nucleating and antifreeze proteins recognize ice through a diversity of anchored clathrate and icelike motifs. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 4905-4912.; Nutt, D. R.; Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13066-13073.）。このように、ＡＦ（Ｇ）Ｐは、氷結晶の特定の平面と結合できるのに対して、ＡＦ（Ｇ）Ｐが結合された金ナノキューブは、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓの不規則な空間上の配列により、すべての氷結晶の平面に結合することができる。ＡＦ（Ｇ）Ｐが結合された金ナノキューブのこの非特異的結合は、単結晶性氷の平衡−類似方向性成長の下で力動的な氷の形成（dynamic ice shaping、ＤＩＳ）の不在により確認することができる：成長する氷と水との境界線（即ち、図１１ｅのｆｒｅｅｚｉｎｇ ｆｒｏｎｔ）は、超冷却された所から室温領域に均等に成長する。一方、特定の氷の平面（即ち、プリズム平面）に結合することが知られているジルコニウムアセテート（ＺｒＡｃ）は、相応する氷結晶の平面の成長を選択的に抑制し、ＤＩＳの結果、水と成長する氷との境界面で鋸歯状が形成されるようにする（図１５ａ−ｂ） 。スクロースが添加されたＤＩＳ分析は、本発明に係るＡＦ（Ｇ）Ｐが結合された金ナノキューブにおけるＤＩＳの不在を示す（図１５ｃ）。成長する氷の尖った突出部は、細胞や組織を破壊することがあるので（Ishiguro, H.; Rubinsky, B. Mechanical interactions between ice crystals and red blood cells during directional solidification. Cryobiology1994, 31, 483-500.; Wang, J. H. A comprehensive evaluation of the effects and mechanisms of antifreeze proteins during lowtemperature preservation. Cryobiology 2000, 41, 1-9.）、全方向性で氷の成長を抑制することは、凍結防止剤を使用する生物医学的な適用において利点として作用することができる。   
【００９３】
前記のような、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブと成長する氷との界面での改善された相互作用を、ＭＤシミュレーションにより理論的に確認した。図１１での実際の実験条件を反映するように、ＡＡシミュレーションを用いた。図１６ａに示すように、下から上に成長する継続的な氷成長システムを設計した。金ナノキューブは、成長する氷結晶の最も速い成長表面（１ １ ２ ０）として知られている２次プリズム平面（a secondary prism plane）に位置させた。成長する氷結晶と金ナノキューブとの間の適切な空間（１ｎｍ）を介して自由接触を継続して誘導し、氷−シーディングの効果を最小限に抑えることができた。オリゴペプチドが結合された金ナノキューブを模倣するために、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ、（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ、及び（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓ配列を有するオリゴペプチドを金ナノキューに無作為に付着した。何も付着していない金ナノキューブと、オリゴペプチドが結合された金ナノキューブとを、それぞれ２６８Ｋで３００ｎｓの間、連続的な氷成長の間に観察した。 
【００９４】
実験結果と同様に、何も付着していない金ナノキューブは、成長する氷結晶によって継続して上方に押し出されたが、オリゴペプチドが結合した金ナノキューブは、氷結晶に直接的に吸収されて氷の成長を強く阻害した（図１６ａ）。このように、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノキューブの直接的な吸収により阻害された、成長する氷平面は、より屈曲することになってＫｅｌｖｉｎ効果が誘導された。これに対して、他のオリゴペプチドが結合された金ナノキューブは、２６８Ｋで成長する氷結晶に、より少なく吸収され、有意な曲面なしに平らな凍結面が維持された。実際に、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブのｚ軸方向の移動はほとんど完全であった（３００ｎｓの間０．０４ｎｍを移動）。これは何も結合していない金ナノキューブ（３００ｎｓの間１．２ｎｍを移動）、または（Ｓｅｒ）５−Ｃｙｓ／（Ｇｌｙ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブ（３００ｎｓの間１．０〜１．２ｎｍを移動）とは顕著な差を示す。一方、（Ａｌａ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブは、３００ｎｓの間０．８ｎｍの通常の移動を示した。このようなＭＤシミュレーションからの予測は、ＩＲＩ実験結果と合致した（図６）。（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブが成長する氷に完全に吸収されることは、温度を２６８Ｋから２６３Ｋに下げることにより起こった（図１７）。 
【００９５】
また、５ｍｅｒ−Ｔｈｒ／−Ｓｅｒ／−Ａｌａ／−Ｇｌｙオリゴペプチド結合された金ナノキューブと氷水分子間の結合の間、自由エネルギー変化（ΔＧｂｉｎｄ）および水素結合寿命を測定した（図１６ｃ及びｄ）。ＩＲＩ／氷結合性に関する実験的分析およびｚ軸方向の移動に関する理論的分析と同様に、金ナノキューブ上のＴｈｒアセンブリは、成長する氷結晶に吸収される間、最も大きな自由エネルギーの減少および最も長い水素結合寿命を示した：ΔＧｂｉｎｄ及び水素結合寿命は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＳｅｒおよびＧｌｙの順であった。成長する氷にオリゴペプチドが結合された金ナノキューブが直接的に吸収されることは、水素結合および疎水性残基の相互作用により、氷の成長を相乗的に抑制することを確認した。        
【００９６】
ＭＤシミュレーションにより、ｚ軸方向の移動においてｎがＩＲＩに及ぼす影響を確認した（図１８）。金ナノキューブ上に結合されたオリゴペプチドの表面密度を固定したとき、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが（Ｔｈｒ）２−Ｃｙｓおよび（Ｔｈｒ）７−Ｃｙｓに比べて顕著な効果を示した。また、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓの数を半分にした場合でも、より良い性能を示した。この結果は、実験結果と完全に一致する。   
【００９７】
２．３  ＩＲＩ特性への金コロイド形状の効果 
金コロイドの形状がＩＲＩ効果に及ぼす影響を評価した（図１９）。異なる形状の金コロイドは、成長する氷とオリゴペプチドアセンブリとの界面接触を調節することができる（図１９ａ）。金ナノ球体、ナノ八面体であるナノキューブのサイズは、７５ｎｍとすべて同一であり、（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金ナノ粒子の濃度は、０．２ｎＭに固定した。図１９ｂに示すように、ＩＲＩ効果は、金ナノキューブ、金ナノ八面体および金ナノ球体の順に低くなった。この実験結果は、点接触に比べて面接触時に、成長する氷と（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ−結合された金コロイドとの界面相互作用に有利であることを説明する。      
【００９８】
大規模のＡＡ ＭＤシミュレーションにより、金コロイドの形状がＩＲＩ効果に及ぼす影響をさらに証明した。（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓが結合された金ナノ球体と金ナノキューブとの間で、氷成長の阻害を比較した（図１９ｃ及びｄ）。ＭＤシミュレーションにおいて、金ナノ球体と金ナノキューブは同じ空間に均一に配置した。２６８Ｋで１００ｎｓの間の連続的な氷成長において、金ナノキューブの間の成長する氷の屈曲の半径は、金ナノ球体の間よりも小さく示された。これは、金ナノキューブの方が金ナノ球体に比べて、成長する氷結晶にさらに容易に接触できるためである。このように、金ナノキューブの面接触は、金ナノ球体の点接触に比べて、凍結の制御に有利に作用するが、これは成長する氷の曲率半径を減少させることによって、Ｋｅｌｖｉｎ効果により凍結温度をより大きく減少させるためである。（Ｔｈｒ）５−Ｃｙｓ結合された金ナノキューブは、０．６ｎＭを超え、０．０１℃の熱履歴現象（thermal hysteresis、ＴＨ）を誘導し始めるのに対して、金ナノ球体はそうではない（図２０）。したがって、コロイド性の凍結防止剤の形態は、ＩＲＩ効果を増幅させる重要な役割を果たすことがわかる。 
【００９９】
例えば、請求項の構成の目的のために、以下に記載される請求項は、その文字通りの言語よりも狭く解釈してはならず、明細書からの例示的な具現例を請求項として解釈してはならない。したがって、本発明は、例示として記載されたものであり、請求項の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。よって、本発明は、下記の請求項によってのみ制限される。本明細書中に引用するすべての刊行物、特許、特許出願、書籍及び文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。 
【図１ａ】
0006913964.tif 000003
【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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