(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識物質が結合された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階；および
（４）段階（３）で測定された信号値を、前記試験試料中の第１タンパク質の重量、濃度、または発現水準で割ることによって、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階、または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を、前記試験試料中の第１タンパク質の重量、濃度、または発現水準で割ることによって、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階
を含み、
前記試験試料は、哺乳類個体から分離された細胞、組織、細胞もしくは組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物、または体液である、
標的薬物に対する個体の反応性予測または標的治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
【請求項２】
前記試験試料は、癌細胞、癌組織、または癌細胞もしくは癌組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識物質は、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出を通じて測定可能な信号を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
段階（２）の標識物質は、蛍光を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上であり、段階（３）の信号を測定する段階は、全反射蛍光顕微鏡もしくは蛍光カメラまたはこれらの両方を用いて行われるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光カメラの１フレーム当り露出時間が約０．００１秒乃至約１秒である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される１種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１タンパク質は、細胞膜タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ、トル様受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体類（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、ＲＯＳ１；ＢＣＲ−Ａｂｌ１融合タンパク質；非受容体型キナーゼ；ＧＴＰ加水分解酵素（ＧＴＰａｓｅｓ）；ホルモン受容体；抗アポトーシスタンパク質；および免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択された１種以上である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される２種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質であり、
段階（４）または（４−２）で得られた、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値は、それぞれの第１タンパク質とそれぞれの第２タンパク質に対して得られた値を全て合算した値である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
段階（４）または（４−２）以降に、
（５）段階（４）または（４−２）で得られた結果を、基準試料で得られた結果と比較する段階を追加的に含み、
前記基準試料は、正常細胞または前記第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性が確認された細胞を含むものである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識物質が結合された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階；ならびに
（４）段階（３）で測定された信号値を、前記試験試料中の第１タンパク質の重量、濃度、または発現水準で割ることによって、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階、または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を、前記試験試料中の第１タンパク質の重量、濃度、または発現水準で割ることによって、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階；ならびに
（５）前記段階で得られた結果を比較する段階を含み、
前記試験試料は、哺乳類個体から分離された細胞、組織、細胞もしくは組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物、または体液であり、
段階（５）は、２種以上の第１タンパク質に対して得られた結果を互いに比較するものである、
個体に適用することに適した薬物の選別のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
タンパク質−タンパク質相互作用分析を通じて細胞または組織内の信号伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性化状態を分析する方法およびこれを利用して個人注文型治療剤を選定および／または治療剤の効能をモニタリングする方法およびこれに用いるための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近までは疾病の個人に応じた注文型診断、予後予測および治療は主に遺伝子分析（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）に集中してきている。しかし、癌をはじめとする特定の疾病の発病原因は、身体を構成する細胞の非正常的な活動、より詳細には細胞を構成して調節する多様なタンパク質間の非正常的な相互作用によるものであるため、遺伝子分析を通じたタンパク質のみの個別的な観察のみでは理解し難いという問題がある。実際に、このような遺伝子突然変異のプロファイリングによれば同一の遺伝的性質を有するとされる患者でも、標的抗癌剤に対する感受性が異なり、予後も多様に現れると知られている。タンパク質−タンパク質相互作用の正確な分析は、細胞内信号伝達ネットワーク（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ）が如何に変化するのかを理解できるだけでなく、個別的な癌の進行と特性およびその治療方法に対する情報までも提供できると期待される。
【発明の概要】
【０００３】
一例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定（または確認または決定または分析）方法を提供する。
【０００４】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、前記細胞または組織、または前記細胞または組織が由来する個体の前記第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を予測する方法または予測のために情報を提供する方法を提供する。
【０００５】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、前記第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法または選別のために情報を提供する方法を提供する。
【０００６】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質であり、前記タンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を２個以上の第１タンパク質に対して行う、前記細胞または組織、または前記細胞または組織が由来する個体（個別患者）に適用することに適した標的としての第１タンパク質またはこれを標的とする薬物を選別する方法または選別のために情報を提供する方法を提供する。
【０００７】
他の例は、第１タンパク質を標的とする薬物で処理された細胞または組織、または前記薬物を投与した個体から分離された細胞または組織で第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、前記細胞または組織、または前記個体の前記第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性をモニタリングする方法またはモニタリングのために情報を提供する方法を提供する。
【０００８】
他の例は、第１タンパク質を標的とする候補薬物で処理された分離された細胞または組織、または前記薬物を投与した個体から分離された細胞または組織で第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、前記第１タンパク質を標的とする薬物のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
他の例は、前記された方法に用いるための装置を提供する。
【００１０】
本明細書に提供された一例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質のなかから選択されたものである、細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定（または確認または決定または分析）方法または活性化測定のために情報を提供する方法に関するものである。
【００１１】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質のなかから選択されたものである、前記細胞または組織、または前記細胞または組織が由来する個体の前記第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を予測する方法または予測のために情報を提供する方法に関するものである。第１タンパク質が２種以上用いられる場合、前記第１タンパク質を標的とする薬物は、前記２種以上の第１タンパク質のうちのいずれか一つまたは２種以上を標的とする薬物であってもよい。
【００１２】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質のなかから選択されたものである、前記第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法または選別のために情報を提供する方法に関するものである。第１タンパク質が２種以上用いられる場合、前記第１タンパク質を標的とする治療は、前記２種以上の第１タンパク質のうちのいずれか一つまたは２種以上を標的とする治療であってもよい。前記治療は、第１タンパク質を標的とする薬物を処方および／または投与することを含むことができる。この場合、前記第１タンパク質を標的とする治療に適した個体は、前記第１タンパク質を標的とする薬物が所望する効果を発揮できる個体を意味し得る。
【００１３】
他の例は、第１タンパク質を標的とする薬物で処理された細胞または組織、または前記薬物を投与した個体から分離された細胞または組織で第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、前記細胞または組織、または前記個体の前記第１タンパク質を標的とする薬物処理後の前記薬物に対する反応性をモニタリングする方法またはモニタリングのために情報を提供する方法を提供する。
【００１４】
他の例は、第１タンパク質を標的とする候補薬物で処理された、分離された細胞または組織で第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質である、前記第１タンパク質を標的とする薬物のスクリーニング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】単分子タンパク質相互作用測定方法に関する模式図である。
【図２】基板に固定された標的タンパク質（第１タンパク質）確認結果を示すグラフである。
【図３】蛍光標識された相互作用タンパク質（第２タンパク質）注入後のタンパク質相互作用を示す蛍光イメージである。
【図４】図３で観測されたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの個数を定量化したグラフである。
【図５】注入された細胞溶解液量によるＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数変化を示すグラフである。
【図６】単分子ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを通じて第１タンパク質を定量する過程を示す模式図である。
【図７】単分子ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ方法を通じて得られた特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）結果を示すグラフである。
【図８】細胞株種類（赤色（丸１）ｖｓ空色（丸３））および状態（赤色（丸１）ｖｓ黒色（丸２））によるＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数変化を示すグラフである。
【図９】細胞の状態による、多様な標的ＲＴＫ（第１タンパク質）ごとのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数変化を示すグラフである。
【図１０】ＥＧＦＲ変異状態によるＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの変化、および、これに基づいて細胞当りの活性化されたＥＧＦＲの比率を計算した結果を示すグラフである。
【図１１】図１０でＥＧＦＲに対して行った方法をＨＥＲ２、ＨＥＲ３に対して同じように行った結果を示すグラフである。
【図１２】それぞれの細胞株に対してＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３（第１タンパク質）と下流信号伝達タンパク質（第２タンパク質）の間の相互作用を全て測定してヒートマップ形式で表示した結果を示す。
【図１３】図１２の結果を定量的に示すグラフ（左側および中間）およびＥＧＦＲ標的抗癌剤の一種であるＡＺＤ９２９１の反応性結果を示すグラフ（右側）である。
【図１４】ＥＧＦＲ標的抗癌剤（ＡＺＤ９２９１）の反応性（左側、ｙ軸）とＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ（左側、ｘ軸）の間の相関関係、および遺伝子タイプによる標的抗癌剤反応の多様性（右側）を示すグラフである。
【図１５】乳癌細胞株でＨＥＲ２とＨＥＲ３信号の強さを示すヒートマップである。
【図１６】乳癌細胞株で既にトラスツズマブ抗癌剤の反応性を予測するために用いられるバイオマーカーであるＨＥＲ２（上段）、ＨＥＲ３（中間）の発現量を測定した結果およびトラスツズマブにより細胞成長が抑制される程度（下段）を測定して示すグラフである。
【図１７】ＨＥＲ２またはＨＥＲ３信号を利用してＰＰＩ  ｓｃｏｒｅを測定した結果とトラスツズマブ反応性（ｌｏｇＧＩ５０）の間の相関関係を示すグラフである。
【図１８】ＰＤＴＸマウスモデルで測定した、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の、３種の下流信号タンパク質とのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ信号結果をそれぞれ示すヒートマップである。
【図１９】ＰＤＴＸマウスモデルでＥＧＦＲの発現量（上段）および前記ＥＧＦＲの発現量図１８の結果を利用してａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅを計算した結果（下段）を示すグラフである。
【図２０】ＰＤＴＸマウスモデルにゲフィチニブを投与して腫瘍大きさの変化を測定した結果を示すグラフである。
【図２１】ＰＤＴＸマウスモデルでゲフィチニブによる腫瘍成長抑制（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）程度とＥＧＦＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの間の相関関係を示すグラフである。
【図２２】ＰＤＴＸマウスモデルでゲフィチニブを処方する前、後の組織でそれぞれ測定されたＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数の測定結果を示すグラフである。
【図２３】肺癌ＰＤＴＸモデルでのＥＧＦＲ標的阻害剤反応性を示すものであって、  図２３ａは、ＰＤＴＸモデル生成過程を例として示す模式図であり、  図２３ｂは、ビヒクルまたは表示されたＥＧＦＲ−特異的抑制剤処理時のＰＤＴＸでの腫瘍体積変化を示すグラフとして、肺腺癌腫ＰＤＴＸｓ（ＰＤＴＸ−Ａ１〜Ａ３）はオシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ；５ｍｇ  ｐｅｒ  １ｋｇ  ｏｆ  ｗｅｉｇｈｔ  ｄａｉｌｙ）で処理し、肺扁平細胞癌（ＳＱＣＣ）ＰＤＴＸｓ（ＰＤＴＸ−Ｓ１〜Ｓ５）はゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ；５０ｍｇ  ｐｅｒ  １ｋｇ  ｏｆ  ｗｅｉｇｈｔ  ｄａｉｌｙ）で処理して得られた腫瘍大きさの変化を示し（各ＰＤＴＸ当り試験個体数は３以上である）、  図２３ｃは、表示された受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＭＥＴ）の下流信号タンパク質に対するＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｕｎｔｓ（ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの数）を示すグラフであり、  図２３ｄは、８匹のＰＤＴＸ（Ａ１〜Ａ３およびＳ１〜Ｓ５）個体でのＥＧＦＲ発現水準をＡ５４９細胞（対照群）でのＥＧＦＲ発現水準に対してｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎした結果を示すグラフであり、  図２３ｅおよび図２３ｆは、腫瘍成長抑制率（％）をｙ軸にし、肺腺癌腫ＰＤＴＸモデル（Ｅ）およびＳＱＣＣ  ＰＤＴＸモデル（ｆ）から得られたＥＧＦＲ  ＰＰＩ合計をＥＧＦＲ水準で割る値をｘ軸にして示すグラフであり、  図２３ｇは、ゲフィチニブで１５日間毎日処理した場合のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｕｎｔｓ（ＥＧＦＲとｘ軸に記載された第２タンパク質間のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの数）の変化を示すグラフであり、  図２３ｈは、ＰＤＴＸ−Ｓ１（ｎ＝２）をゲフィチニブとＢＫＭ１２０で１５日間併用処理した場合の腫瘍成長程度を、単独処理時と比較して示すグラフであり、  図２３ｉは、８匹のＰＤＴＸ（Ａ１〜Ａ３およびＳ１〜Ｓ５）個体の全てから得られたＥＧＦＲ水準でＰＰＩ合計を割った値をｘ軸にし、腫瘍成長抑制率（％）をｙ軸にして示すグラフである（エラーバー：ｓ．ｄ．）。
【図２４】単分子（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ｃｏ−ＩＰおよび単分子免疫標識法（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ）をヒト腫瘍試料に適用した例を示すものであって、  図２４ａは、二人の腫瘍患者（Ｐ１およびＰ２）の腫瘍切除手術で得られたヒト腫瘍組織を示し、  図２４ｂは、単分子免疫標識法により得られた１０個のタンパク質の発現量とＰＴＭ水準（Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）、および高効率単分子映像化システムを用いた各試料の単分子ｃｏ−ＩＰにより得られた１０個のタンパク質−タンパク質対のＰＰＩ水準を示すグラフで、陽性対照群としてＰＣ９細胞（ＥＧＦＲについて）、ＨＣＣ８２７細胞（ＭＥＴについて）、およびＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２およびＨＥＲ３について）がそれぞれ用いられ、  図２４ｃは、Ｐ１およびＰ２での表示されたＲＴＫに対するＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｕｎｔｓを示すグラフであり、  図２４ｄは、表面上でＥＧＦＲをｐｕｌｌｉｎｇ  ｄｏｗｎした後、ＰＴＰＮ１処理した場合のＰＬＣｇａｍｍａＳＨ２およびＧｒｂ２のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｕｎｔ変化を示すグラフである（エラーバー：ｓ．ｄ．）。
【図２５】ＰＤＴＸ−ｍｏｄｅｌ（ｎ＝３）の特性を示すものであって、  図２５ａ乃至図２５ｃは、ＭＥＴ水準（ａ）、ＨＥＲ２水準（ｂ）、およびＨＥＲ３水準（ｃ）をＨＣＣ８２７細胞（ＭＥＴについて）およびＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２およびＨＥＲ３について）でのＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の水準と比較した結果を示すグラフで、（エラーバー：ｓ．ｄ．；ｎ＝５）、これらＲＴＫの中のいずれも過発現されなかったことを確認することができ、  図２５ｄは、代表的に５匹のＳＱＣＣ  ＰＤＴＸで測定されたＥＧＦＲの免疫組織化学染色（ＩＨＣ）結果を示すイメージであり、ＥＧＦＲの発現はｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｌｅでＥＧＦＲ  Ｈ−ｓｃｏｒｅを計算して算定し、  図２５ｅは、単分子免疫標識法により決定されたＥＧＦＲ水準とＥＧＦＲＨ−ｓｃｏｒｅの間の相関関係を示す散布図であり、ＩＨＣ  Ｈ−ｓｃｏｒｅは単分子免疫標識法により決定された全体ＥＧＦＲ発現水準と完全な線形相関関係を示すと確認され、  図２５ｆおよび２５ｇは、ＳＱＣＣ  ＰＤＴＸのＥＧＦＲ水準（ｇ）およびＰＰＩ合計（ｈ）と腫瘍成長抑制の相関関係を示す散布図であり、  図２５ｈは、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）またはゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）処理したＰＤＴＸ−Ｓ２のイミュノブロット分析結果を示すものであり、１５日ゲフィチニブ処理後のＥＧＦＲの１０６８番目の残基であるチロシンのリン酸化（ｐＥＧＦＲ）が完全に無くなり、ゲフィチニブ処理によりＡＫＴおよびＳ６Ｋのリン酸化（それぞれｐＡｋｔとｐＳ６Ｋ）も抑制されることを示し、このような結果は、ＰＤＴＸ−Ｓ２での腫瘍成長抑制効果がゲフィチニブ処理によるＥＧＦＲ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋ信号伝達経路を抑制することによって得られるものであることを示す。
【図２６】ＰＤＴＸ−Ｓ１およびＰＤＴＸ−Ｓ２でのゲフィチニブ処理効果を示すものであって、  図２６ａは、１５日間ゲフィチニブ処理した場合のＥＧＦＲ水準変化を示すグラフであり（エラーバー：ｓ．ｄ．；ｎ＝５）、  図２６ｂは、 ＰＤＴＸ−Ｓ１およびＰＤＴＸ−Ｓ２でのゲフィチニブ処理効果を示すもので、ゲフィチニブ処理によるＥＧＦＲ  ＰＰＩ抑制程度を示すグラフであり、Ａ５４９細胞のＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｕｎｔを陰性対照群として示した（エラーバー：ｓ．ｄ．；ｎ＝５）．
【図２７】本発明の一実施例によるマルチウェルを概略的な示す斜視図である。
【図２８】マルチウェルをひっくり返して示した図面である。
【図２９】マルチウェルを製造する過程を示した図面である。
【図３０】マルチウェルを製造する過程を示した図面である。
【図３１】本実施例と比較例によりそれぞれ製造されたマルチウェル内に存在するＧＦＰを測定した結果である（Ｙ軸：ＧＦＰカウント）。
【図３２】抗体が固定化されていない一実施例のマルチウェルＡでのＧＦＰ個数測定結果を示すグラフである。
【図３３】抗体が固定化されていない比較例のマルチウェルＢでのＧＦＰ個数測定結果を示すグラフである。
【図３４】一実施例のマルチウェルＡでの抗体固定化の有無によるＧＦＰ個数測定結果を示すグラフである。
【図３５】一実施例のマルチウェルＡでの細胞試料量によるＧＦＰ個数測定結果を示すグラフである。
【図３６】一実施例のマルチウェルＡでの抗体固定化の有無によるＧＦＰ個数測定結果を示すグラフである。
【図３７】一実施例のマルチウェルＡでの抗体固定化の有無によるＧＦＰ個数測定結果を示すグラフである。
【図３８】一実施例のマルチウェルＡのナンバリングされた状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、より詳細に説明する。
【００１７】
本明細書で使用されたものとして、用語「タンパク質−タンパク質相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ＰＰＩ）」は、第１タンパク質と第２タンパク質の間の物理的および／もしくは化学的結合または複合体形成を意味し得、例えば、結合頻度、結合強さ（強度）、および結合時間などの因子の中の一つ以上により測定され得る。また、前記第１タンパク質と第２タンパク質間の相互作用（結合）はこれら間の直接的な相互作用（結合）だけでなく、中間に他のタンパク質（信号伝達経路中で第１タンパク質および第２タンパク質の間に位置するタンパク質）を媒介とした相互作用（結合）も含むことができる。本明細書でのタンパク質−タンパク質相互作用は、単分子（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）反応（１分子の第１タンパク質と１分子の第２タンパク質間の反応）であってもよい。
【００１８】
本明細書で、第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して真核有機体（例えば、多細胞動物、多細胞植物など）の細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される１種以上である。したがって、前記第１タンパク質および第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用は、生体信号経路上の相互作用であるため、弱くかつ一時的な相互作用（ｗｅａｋ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）ではないこともある。
【００１９】
本明細書で使用されたものとして、第１タンパク質は、信号伝達経路に関与する１種以上（例えば、１種乃至１０種、１種乃至８種、１種乃至６種、１種乃至５種、１種乃至４種、１種乃至３種、２種乃至１０種、２種乃至８種、２種乃至６種、２種乃至５種、２種乃至４種、２種乃至３種、３種乃至１０種、３種乃至８種、３種乃至６種、３種乃至５種、または３種乃至４種）のタンパク質を意味し得る。また、第２タンパク質は、前記第１タンパク質と相互作用（結合）するタンパク質であって、前記第１タンパク質が関与する信号伝達経路の下流経路に関与するタンパク質のなかから選択された１種以上、２種以上または３種以上（例えば、１種乃至１０種、１種乃至８種、１種乃至６種、１種乃至５種、１種乃至４種、１種乃至３種、２種乃至１０種、２種乃至８種、２種乃至６種、２種乃至５種、２種乃至４種、２種乃至３種、３種乃至１０種、３種乃至８種、３種乃至６種、３種乃至５種、または３種乃至４種）のタンパク質を意味し得る。第１タンパク質が２種以上である場合、前記第２タンパク質は第１タンパク質それぞれに対して独立して１種以上選択されてもよく、それぞれの第１タンパク質に対して選択された第２タンパク質は互いに異なるか、部分的にまたは全部重複していてもよい。
【００２０】
本明細書において、前記第１タンパク質は、病的状態（例えば、癌、炎症、その他免疫疾患など）と関連するタンパク質群の中で選択されることによって、これらが関連する病的状態（例えば、癌、炎症、その他免疫疾患など）の治療（および／または改善および／または軽減）に有用な情報を提供することができる。このような側面から、前記第１タンパク質は治療しようとする疾病の治療ターゲットになるタンパク質であってもよい。具体的に、前記第１タンパク質は治療しようとする疾病に対する標的治療剤または効果を試験しようとする治療剤の標的になるタンパク質であってもよい。したがって、前記第１タンパク質は治療しようとする疾病または効果を把握しようとする治療剤により適切に選択されてもよい。
【００２１】
一例で、前記第１タンパク質は、細胞または組織の生体信号伝達経路のうち、上流経路に関与するタンパク質のなかから選択されてもよく、薬物の治療ターゲットとして有利に作用するために、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）環境（例えば、水性環境）に露出したドメインを有し、細胞膜に存在する、細胞膜タンパク質のなかから１種以上、２種以上または３種以上（例えば、１種乃至１０種、１種乃至８種、１種乃至６種、１種乃至５種、１種乃至４種、１種乃至３種、２種乃至１０種、２種乃至８種、２種乃至６種、２種乃至５種、２種乃至４種、２種乃至３種、３種乃至１０種、３種乃至８種、３種乃至６種、３種乃至５種、または３種乃至４種）選択されてもよい。例えば、前記第１タンパク質は、細胞膜に存在する多様な受容体、マイクロフィラメント（ｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ）と結合された構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、細胞接着分子（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、細胞膜酵素（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、細胞膜受容体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、キャリアタンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、チャンネルタンパク質（ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、輸送タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、脂質固定タンパク質（ｌｉｐｉｄ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）など、全ての種類の細胞膜タンパク質からなる群より選択された１種以上、２種以上または３種以上（例えば、１種乃至１０種、１種乃至８種、１種乃至６種、１種乃至５種、１種乃至４種、１種乃至３種、２種乃至１０種、２種乃至８種、２種乃至６種、２種乃至５種、２種乃至４種、２種乃至３種、３種乃至１０種、３種乃至８種、３種乃至６種、３種乃至５種、または３種４種）であってもよい。
【００２２】
一具体例で、前記第１タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ類（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）（例えば、上皮細胞成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥｒｂＢ３）、肝細胞成長因子受容体（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＨＧＦＲ）；ＭＥＴ）、血小板由来成長因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＤＧＦＲ、例えば、ＰＤＧＦＲ−ａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａなど）、血管内皮細胞成長因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ；ＶＥＧＦＲ、例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３など）、インシュリン様成長因子１受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体（ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、線維芽細胞成長因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２など）、インシュリン様成長因子受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦＲ、例えば、ＩＧＦ１Ｒなど）、ｃ−ＫＩＴ、ＲＥＴ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｋｉｎａｓｅ（ＡＬＫ）、など）；トル様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、ＴＬＲ１３）；Ｇ−タンパク質共役受容体類（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）；トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体；ＲＯＳ１；ＢＣＲ−Ａｂｌ１融合タンパク質；非受容体型キナーゼ類（例えば、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）、Ｓｒｃ、ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ）、ＣＤＫ（Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ；例えば、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６など）など）；ＧＴＰ加水分解酵素類（ＧＴＰａｓｅｓ）（例えば、ＫＲＡＳなど）；ホルモン受容体類（例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲストロン（ＰＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）など）；抗アポトーシスタンパク質類（Ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（例えば、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）、ＢＩＭ（Ｂｃｌ−２−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １１）；免疫チェックポイントタンパク質類（Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ���ｒｏｔｅｉｎｓ）（例えば、ＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４）、ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  １）、ＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １など）などからなる群より選択された１種以上、２種以上または３種以上（例えば、１種乃至１０種、１種乃至８種、１種乃至６種、１種乃至５種、１種乃至４種、１種乃至３種、２種乃至１０種、２種乃至８種、２種乃至６種、２種乃至５種、２種乃至４種、２種乃至３種、３種乃至１０種、３種乃至８種、３種乃至６種、３種乃至５種、または３種乃至４種）であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２３】
前記「肝細胞成長因子受容体（ＭＥＴまたはｃ−Ｍｅｔ）」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、あらゆる種に由来し得、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６．２）、サルｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ＮＰ＿００１１６２１００）などのような霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５．１）などのような齧歯類由来のものなどであってもよい。前記タンパク質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００２４５．３に提供されたヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０００２３６．２に提供されたアミノ酸配列を含むタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、癌発生、癌転移、癌細胞移動、癌細胞浸透、新生血管生成過程などの多様な機作に関与する。
【００２４】
前記「上皮細胞成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）」、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＨＥＲ３（ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、それぞれＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から構成されているＨＥＲファミリーの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）の一員である。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３の細胞外ドメインに対するリガンドの結合は他のＥｒｂＢ受容体とのレセプターホモ−またはヘテロ−二量体化を誘導し、これは特異的なチロシン残基の細胞内自己リン酸化を誘発する。ＥＧＦＲ自己リン酸化は、細胞増殖、血管新生および転移に影響を与えるＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化を含むダウンストリーム信号伝達ネットワークを率いる。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、および／またはＨＥＲ３の過発現、遺伝子増幅、突然変異、または再配列は、多様な種類のヒト悪性腫瘍で頻繁に観察され、癌治療の不良な予後および悪い臨床的結果と関連がある。このような理由で、これらＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、および／またはＨＥＲ３は抗癌療法において重要な標的になる。
【００２５】
前記ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記ＥＧＦＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＪＱ７３９１６０、ＪＱ７３９１６１、ＪＱ７３９１６２、ＪＱ７３９１６３、ＪＱ７３９１６４、ＪＱ７３９１６５、ＪＱ７３９１６６、ＪＱ７３９１６７、ＮＭ＿００５２２８．３、ＮＭ＿２０１２８４．１、ＮＭ＿２０１２８２．１、またはＮＭ＿２０１２８３．１などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。例えば、前記ＨＥＲ２は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｘ０３３６３．１などに提供されるヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。例えば、前記ＨＥＲ３は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９８２などに提供されるヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００２６】
前記「血管内皮細胞成長因子受容体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＥＧＦＲ）」は、血管内皮細胞成長因子正常細胞でも存在し、特に癌細胞で分泌される血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）と結合して血管新生を起こし、癌細胞に必要な養分を供給する。ＶＥＧＦＲの過発現は多様な疾病の原因になり、特に癌の発生だけでなく、侵襲、転移などの悪い予後にも関与する。このような理由で、ＶＥＧＦは抗癌療法において重要な標的になる。前記ＶＥＧＦＲはヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記ＶＥＧＦＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ０６３６５７．２などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００２７】
前記「血小板由来成長因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＤＧＦＲ）」は、表面受容体チロシンキナーゼのうちの一つであり、細胞増殖、細胞分化、細胞成長などの調節および癌を起こす多くの疾病と関連がある。前記ＰＤＧＦＲは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記ＰＤＧＦＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＭ＿００６２０６．４（ＰＤＧＦＲ−Ａ）、ＮＭ＿００２６０９．３（ＰＤＧＦＲ−Ｂ）、ＮＭ＿０１６２０５．２（ＰＤＧＦＲ−Ｃ）などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００２８】
前記「インシュリン様成長因子１受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）」は、受容体チロシンキナーゼのうちの一つであり、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）により活性化される膜通過受容体である。前記ＩＧＦ１Ｒは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記ＩＧＦ１Ｒは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０００８７５．３などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００２９】
前記「エフリン受容体（ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」は、表面受容体チロシンキナーゼのうちの一つであり、ａｘｏｎ  ｇｕｉｄａｎｃｅ、ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ、ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ、ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎなどの胚発生過程を調節する。前記エフリン受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記エフリン受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＭ＿００４４４０．３、ＮＭ＿００４４３８．３、ＮＭ＿００４４３１．３、ＮＭ＿００４４４２．６、ＮＭ＿０１７４４９．３、ＮＭ＿００４０９３．３、ＮＭ＿００４４４１．４、ＮＭ＿１８２４７２．２、ＮＭ＿００５２３２．４、ＮＭ＿００５２３３．５、ＮＭ＿１７３６４１．２、ＮＭ＿００１０９９４３９．１、ＮＭ＿００１０８０４４８．２、ＮＭ＿００１０８０４４８．２、ＮＭ＿００４４４３．３、ＮＭ＿１８２６８９．１、ＮＭ＿００４４２８．２、ＮＭ＿００４４３９．５、ＮＭ＿００１９６２．２、ＮＭ＿００４４２９．４、ＮＭ＿１８２６４４．２、ＮＭ＿００４９５２．４、ＮＭ＿１７３６５５．２、ＮＭ＿１８２６９０．２、ＮＭ＿０２０５２６．３、ＮＭ＿００１４０６．３、ＮＭ＿００５２２７．２、ＮＭ＿１８２６８５．１などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００３０】
前記「トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であり、受容体−媒介エンドサイトーシスを通じて鉄の細胞内移動に関与し、細胞内鉄濃度を調節する。前記トランスフェリン受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記トランスフェリン受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＭ＿００１１２８１４８．１、ＮＭ＿００３２３４．２、ＮＭ＿００１２０６８５５．１、ＮＭ＿００３２２７．３、ＢＣ００１１８８．１、Ｍ１１５０７．１などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００３１】
前記「低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体」は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であり、受容体−媒介エンドサイトーシスを通じて鉄の細胞内移動に関与し、細胞内鉄濃度を調節する。前記ＬＤＬ受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記トランスフェリン受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＭ＿０００５２７．４、ＮＭ＿００１１９５８０２．１、ＮＭ＿００１１９５７９９．１、ＮＭ＿００１１９５８０３．１、ＮＭ＿００１１９５８００．１、ＮＭ＿００１１９５７９８．１などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００３２】
前記「表面分化抗原類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ；ＣＤ）」は、受容体またはリガンドとして多様に作用するタンパク質であり、ヒトの場合、約３５０種類が知られており、細胞信号化（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、細胞付着などの多様な細胞過程に関与する。前記表面分化抗原類は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、前記表面分化抗原類は、全てのＣＤ系であってもよく、特に癌転移と関連したＣＤ４４、ＣＤ１４７、またはそのバリアントであってもよく、より具体的にＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  （ＮＭ＿０００６１０．３、ＮＭ＿００１７２８．３、Ｘ５５１５０．１）などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００３３】
前記「Ｇ−タンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）」は、膜通過受容体タンパク質であり、信号導入経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）および細胞反応を活性化し、多様な疾病に関与する。ＧＰＣＲは、巨大なタンパク質群で配列相同性および機能的類似性に基づいて６個のクラスに分類され得る：クラスＡまたはクラス１（Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；クラスＢまたはクラス２（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）；クラスＣまたはクラス３（Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ／ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）；クラスＤまたはクラス４（Ｆｕｎｇａｌ  ｍａｔｉｎｇ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；クラスＥまたはクラス５（Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；およびクラスＦまたはクラス６（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）。前記ＧＰＣＲは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類に由来するものであってもよい。例えば、ＧＰＣＲは、癌転移に関連するケモカイン受容体（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）、例えば、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、などであってもよく、より具体的にＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＭ＿００１１２３０４１．２、ＮＭ＿００５５０８．４ＮＭ＿００５２０１．３、ＮＭ＿０１６６０２．２などに提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドであってもよい。
【００３４】
前記第２タンパク質は、前記で説明したとおり、選択された第１タンパク質が関与する細胞または組織の生体信号伝達経路の下流経路に関与するタンパク質群のなかから１種以上、２種以上または３種以上（例えば、１種乃至１０種、１種乃至８種、１種乃至６種、１種乃至５種、１種乃至４種、１種乃至３種、２種乃至１０種、２種乃至８種、２種乃至６種、２種乃至５種、２種乃至４種、２種乃至３種、３種乃至１０種、３種乃至８種、３種乃至６種、３種乃至５種、または３種乃至４種）選択されてもよい。細胞または組織、例えば、ヒトの細胞または組織の信号伝達経路およびこれに関与するタンパク質群は比較的よく確定されているため（Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １２７  （２００１）；  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ，  Ｃｅｌｌ  １４１，  １１１７  （２０１０）参照）、第１タンパク質が選定されると、その下流の信号伝達経路に関与するタンパク質を選定することは本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとっては明確な事項といえる。
【００３５】
また、前記「第２タンパク質が前記第１タンパク質の下流信号伝達経路に関与する」ということは、第２タンパク質が、その第１タンパク質が上流で信号を伝達する信号伝達経路上で第１タンパク質と直接的に相互作用するタンパク質および一つ以上のタンパク質を媒介として第１タンパク質と間接的に相互作用するタンパク質の全てから選択されるタンパク質であることを意味する。
【００３６】
また、一つのタンパク質が多様な生体信号伝達経路に関与して、多数の信号伝達経路がネットワークを形成することができることもよく知られている。したがって、第１タンパク質が２種以上である場合、いずれか一つの第１タンパク質に対する第２タンパク質のうちの一つ以上は、他の第１タンパク質（複数可）に対する第２タンパク質のうちの一つ以上と重複していてもよい（つまり、第１タンパク質が２個以上である場合、これら２個以上の第１タンパク質群に対する第２タンパク質群は互いに異なるか、一部または全部が同一であってもよい）。
【００３７】
一具体例で、前記第１タンパク質は、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３からなる群より選択された１種以上であってもよく、それぞれの第１タンパク質に対する第２タンパク質は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）（例えば、ＰＬＣ−ｇａｍｍａ（ＰＬＣ−ｇａｍｍａ１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿００２６５１．２、ＮＰ＿８７７９６３．１、ＮＰ＿０３７３１９．１など）、またはそのＳＨ２ドメイン（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２  ｄｏｍａｉｎ：Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＳＨ２  ｄｏｍａｉｎおよびＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＳＨ  ｄｏｍａｉｎ中の一つ以上を含む；例えば、ＮＰ＿０３７３１９．１のうちの５４５番目から７６５番目までのアミノ酸配列部位またはＮＰ＿００２６５１．２のうちの５４０番目または５４５番目から７６５番目までのアミノ酸序列部位など）、成長因子受容体結合タンパク質（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｇｒｂ；例えば、Ｇｒｂ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿００２０７７．１、ＮＰ＿９８７１０２．１など）またはその一部（例えば、ＳＨ２ドメイン（ＮＰ＿００２０７７．１の５７番目から１５５番目までのアミノ酸配列部位）、ＳＨ３＿Ｎ−ＳＨ２ドメイン（ＮＰ＿００２０７７．１の１番目から１５４番目までのアミノ酸配列部位）、ＳＨ２−ＳＨ３＿Ｃドメイン（ＮＰ＿００２０７７．１の５７番目から２１７番目までのアミノ酸配列部位））、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ調節サブユニット（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ；ＰＩＫ３Ｒ１；ｐ８５−ａｌｐｈａ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿００１２２９３９５．１、ＮＰ＿８５２５５６．２、ＮＰ＿８５２６６４．１、ＮＰ＿８５２６６５．１、Ｐ２６４５０．２など）またはそのＳＨ２ドメイン（例えば、ＮＰ＿８５２６６４．１（ｈｕｍａｎｐ  ８５ａ）のＳＨ２＿Ｎドメイン（３３３番目から４２８番目までのアミノ酸配列部位）、ＳＨ２）＿Ｃドメイン（６２４番目から７１８番目までのアミノ酸配列部位）、またはｔａｎｄｅｍ  ＳＨ２ドメイン（３３３番目から７１８番目までのアミノ酸配列部位）；またはＰ２６４５０（ｍｏｕｓｅｐ  ８５ａ）のＳＨ２＿Ｎドメイン（３３３番目から４２８番目までのアミノ酸配列部位）、ＳＨ２＿Ｃドメイン（６２４番目から７１８番目までのアミノ酸配列部位）またはｔａｎｄｅｍ  ＳＨ２ドメイン（３３３番目から７１８番目までのアミノ酸配列部位））などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３８】
本明細書に提供された具体例では、肺癌の場合、第１タンパク質としてＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の組み合わせを用い、これら第１タンパク質の共通した第２タンパク質としてＰＬＣ−ｇａｍｍａ  １、Ｇｒｂ２、およびｐ８５−ａｌｐｈａを用い、乳癌の場合、第１タンパク質としてＨＥＲ２およびＨＥＲ３の組み合わせを用い、これら第１タンパク質の共通した第２タンパク質としてＰＬＣ−ｇａｍｍａ  １、Ｇｒｂ２、およびｐ８５−ａｌｐｈａを用いることを例示しているが、これに制限されるものではなく、前記で説明した内容に基づいて、治療しようとする疾病または効果を調査しようとする治療剤に応じて適切に選択されてもよく、これは本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとって明確な事項である。
【００３９】
本明細書で提供される方法で行われる第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階は、分離された細胞または組織に対して生体外または細胞外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で行われるものであってもよい。
【００４０】
前記第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階は、以下の段階を含むことができる：
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識された（標識物質が結合された）第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階（タンパク質−タンパク質相互作用測定）；および
（４）段階（３）で測定された信号を利用して第１タンパク質の活性化水準（レベル）を測定する段階。
【００４１】
前記段階（３）で測定された信号を利用して第１タンパク質の活性化水準を測定する段階（４）は、段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料内の第１タンパク質単位量に対する信号値を求める段階であってもよい。
【００４２】
一例で、前記段階（４）は、
段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料内の第１タンパク質単位量に対する信号値を求める段階を通じて行われるか、
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階（タンパク質−タンパク質相互作用水準測定）；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）
を含むことができる。
【００４３】
前記測定された第１タンパク質と第２タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を利用して所望する事項を測定（確認、決定または分析）するために、前記段階（４）以降に、
（５）段階（４）で得られた結果を、基準試料で得られた結果と比較する段階を追加的に含むことができる。
【００４４】
以下、前記段階をより詳細に説明する：
【００４５】
段階（１）：第１タンパク質が固定化された基板準備段階
前記段階（１）は、第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階である。
【００４６】
前記第１タンパク質は前記で説明したとおりである。
【００４７】
前記試験試料は、細胞または組織内の信号伝達経路の活性化第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性などを試験することに使用可能な、あらゆる生物試料であり得る。
【００４８】
例えば、前記試験試料は、個体から分離された細胞、組織、細胞または組織の溶解物、破砕物、または抽出物、体液（例えば、血液（全血、血漿、または血清）、唾液など）であってもよい。前記個体は、第１タンパク質が関与する細胞または組織内の信号伝達経路の活性化試験、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性試験、第１タンパク質標的治療に適切な対象であるか否かの決定、第１タンパク質標的治療効果のモニタリング、および／または効果的な第１タンパク質標的治療剤の選定などを行おうとする全ての哺乳類（例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類など）からなる群より選択されてもよい。一例で、前記個体は、第１タンパク質と関連した疾病を有する患者であってもよい。前記第１タンパク質と関連した疾病は、第１タンパク質の過発現または第１タンパク質が関与する細胞または組織内の信号伝達経路の活性化と関連した疾病であってもよく、例えば、癌であってもよい。一具体例で、前記試験試料は、個別の癌患者（例えば、第１タンパク質が関与する細胞または組織内の信号伝達経路の活性化程度または第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を試験したり、第１タンパク質標的治療に適切な対象であるか否かを決定したり、または効果的な第１タンパク質標的治療剤の選定しようとする特定の個体）から分離された細胞、例えば、癌細胞を含むものであってもよい。組織の場合、粉砕のために最小１２５ｍｍ３以上の大きさであれば十分であり、１回測定に必要な組織試料の量は前記で言及した組織の量（最小１２５ｍｍ３以上）の約１／５０乃至約１／７５範囲にすることができるが、これに制限されるものではない。細胞（癌細胞）の場合、１回測定に必要な細胞試料の量は、約１０細胞乃至１０１０細胞、約１０細胞乃至１０７細胞、約１０細胞乃至１０５細胞、約１０３細胞乃至１０１０細胞、約１０３細胞乃至１０７細胞、約１０３細胞乃至１０５細胞、例えば約１０４±５０細胞程度であってもよいが、これに制限されるものではなく、細胞株の種類により適切に決定され得る値である。
【００４９】
一例で、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測および／または第１タンパク質標的治療に適切な対象の選別方法の場合、前記試験試料は、第１タンパク質を標的とする治療（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物の投与）が行われない細胞または組織、または前記治療（または薬物の投与）が行われない個体から分離された細胞または組織であってもよく、第１タンパク質を標的として治療に対する反応性をモニタリングする方法の場合、前記試験試料は第１タンパク質を標的とする治療（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物の投与）が行われた細胞または組織、または前記治療（または薬物の投与）が行われた個体から分離された細胞または組織であってもよい。
【００５０】
前記基板は、表面に第１タンパク質を固定させることができるあらゆる材質および／またはあらゆる構造を有するものであり得る（結晶質または非結晶質の全てが使用可能である）。一例で、前記基板は、標識信号の検出容易性を考慮して、光の屈折率が、生体物質の多くの部分を占める水の屈折率（約１．３）以上である材質であってもよい。一例で、前記基板は、厚さが約０．１乃至約１ｍｍ、約０．１乃至約０．５ｍｍ、０．１乃至約０．２５ｍｍ、または約０．１３乃至約０．２１ｍｍ程度であってもよく、屈折率が約１．３乃至約２、約１．３乃至約１．８、約１．３乃至約１．６、または約１．５乃至約１．５４程度であるものであってもよい。前記基板は、前記屈折率範囲を満足させるあらゆる材質であってもよく、例えばガラス（屈折率：約１．５２）、石英などからなる群より選択された材質から得られたものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記基板は、生物試料観察に通常使用されるあらゆる形態を有するものであってもよく、例えば、ウェルタイプ、スライドタイプ、チャンネルタイプ、アレイ形態、マイクロ流体チップ、微細管（キャピラリ）などであってもよいが、これに制限されるものではない。蛍光顕微鏡観察時、前記試料が適用された基板上にカバーグラスを装着して観察することができ、カバーグラスの材質は前記の基板で説明したとおりであり、厚さは基板で説明した範囲またはそれより薄く形成されてもよい（例えば、屈折率１．５２、厚さ０．１７ｍｍであってもよいが、これに制限されるものではない）。
【００５１】
前記第１タンパク質に特異的に結合する物質は、第１タンパク質と特異的に結合できる全ての物質から選択されたものであってもよく、例えば、第１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２など）、アプタマー（タンパク質または核酸分子）、小分子化合物などからなる群より選択された１種以上であってもよい。この時、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質は、第１タンパク質と第２タンパク質との相互作用を妨害しない部位、つまり、第１タンパク質と第２タンパク質が相互作用（結合）する部位でない部位で第１タンパク質と結合するものであってもよい。
【００５２】
一例で、前記基板は、前記第１タンパク質に特異的に結合する生物学的物質（例えば、抗体など）を表面に包含（固定）するために適切に表面改質されたり、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質が表面に直接固定されたものであってもよい。前記基板が表面改質される場合、前記基板は、一面に前記第１タンパク質に特異的に結合する生物学的物質（例えば、抗体など）を固定化させることができる作用基を有するあらゆる化合物で処理（例えば、塗布）されてもよく、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基およびアミン基からなる群より選択された作用基を含む化合物で処理されてもよい。一具体例で、前記アルデヒド基、カルボキシル基およびアミン基からなる群より選択された作用基を含む化合物は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、ビオチンが結合されたウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）、ビオチンが結合されたＰＥＧ（ポリエチレングリコール−ビオチン；ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ）、ポリソルベート（ｅ．ｇ．，  Ｔｗｅｅｎ２０）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。前記表面処理された基板は、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）などからなる群より選択された１種以上が追加的に処理（例えば、塗布）されてもよい。
【００５３】
段階（２）：第１タンパク質と第２タンパク質を反応させる段階
前記段階（２）は、前記準備された第１タンパク質が固定された基板に、標識された第２タンパク質を添加して反応させる段階である。
【００５４】
前記第２タンパク質は、前記で説明したとおりである。
【００５５】
前記標識された第２タンパク質は、第２タンパク質が、検出可能な信号を発生させる標識物質で標識されたり（標識物質が、例えば、化学的（例えば、共有的または非共有的）、組み換え的、または物理的に、結合されたり）、標識物質が結合され得るタグが付着されたりした形態を意味し得る。前記検出可能な信号は、通常の酵素反応、蛍光、発光、および／または放射線検出を通じて測定され得る全ての信号（例えば、光、放射線など）の中から選択されてもよい。前記標識物質は、前記標識信号を発生させることができる全ての小分子化合物、タンパク質、ペプチド、核酸分子などからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えば、蛍光染料（小分子化合物；Ｃｙａｎｉｎｅ、Ａｌｅｘ、Ｄｙｌｉｇｈｔ、Ｆｌｕｏｐｒｏｂｅｓなど）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＰＦ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＰＦ）など）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記タグは、Ｈｉｓ−ｔａｇ／Ｎｉ−ＮＴＡなどのように通常使用されるあらゆる種類から選択された１種以上であってもよい。前記標識物質の使用濃度は、ノイズを発生させずに正確かつ容易な検出が可能になるようにするために、約１ｕＭ以下の範囲で適切に決定することができ、例えば、１ｎＭ乃至１０００ｎＭ、１ｎＭ乃至５００ｎＭ、１ｎＭ乃至１００ｎＭ、１０ｎＭ乃至１０００ｎＭ、１０ｎＭ乃至５００ｎＭ、または１０ｎＭ乃至１００ｎＭ程度であってもよいが、これに制限されるものではない。このような標識物質から発生する信号は、これを検出または測定することに通常使用されるあらゆる信号検出手段（例えば、通常の蛍光顕微鏡、蛍光カメラ、蛍光強さ測定（定量）装置など）により測定され得る。
【００５６】
第１タンパク質と第２タンパク質の間の相互作用をより正確に測定するために、反応させる段階（段階（２））と後続するタンパク質−タンパク質相互作用測定段階（段階（３））の間に、前記反応が起こった基板を通常の方法で洗浄する段階を追加的に含むことができる。
【００５７】
段階（３）：タンパク質−タンパク質相互作用測定段階
前記段階（３）は、前記段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階である。前記信号測定は、段階（２）で用いられた標識信号（例えば、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出などの通常の方法を通じて測定可能な信号）を検出（または測定または確認）することができるあらゆる手段を用いて行われ得る。
【００５８】
一例で、段階（３）でのタンパク質−タンパク質相互作用測定は、リアルタイム分析によるものであってもよい。
【００５９】
一例で、前記標識信号が蛍光信号である場合、前記信号検出は、前記蛍光信号を発生させる標識物質が吸収する光の光源を供給して、発生する蛍光信号を、例えば、蛍光顕微鏡、蛍光カメラ、および／または蛍光強さ測定（定量）装置などを使用して、映像化するか、および／または定量することができる。
【００６０】
一具体例で、前記信号が蛍光信号である場合、前記蛍光信号は蛍光カメラを利用して映像化および／または定量することができる。
前記信号が蛍光信号である場合、段階（３）（タンパク質−タンパク質相互作用測定段階）は
（ｉ）前記段階（２）の反応物に光源を供給する段階；および
（ｉｉ）前記供給された光源により発生した蛍光信号を検出する段階
を含むことができる。
【００６１】
前記段階（ｉ）の光源を供給する段階は、前記段階（２）で得られた第１タンパク質と第２タンパク質の反応物に光源を供給する段階として、このような目的を達成できれば、光源の供給時期には特別な制限がない。例えば、前記光源は、段階（１）以前、段階（１）と同時、または段階（１）以降から段階（２）以降まで持続的に供給されたり、段階（２）直前、段階（２）と同時、または段階（２）直後に所定の時間供給され得るが、これに制限されるものではない。
【００６２】
前記光源は、蛍光信号に該当する波長を有するあらゆる光源であり得、例えば、レーザ、ハロゲンランプなどであってもよい。
【００６３】
前記光源の波長は、用いられる蛍光信号に応じて調節されてもよく、例えば、約３００ｎｍ乃至約６００ｎｍまたは約３５０ｎｍ乃至約５６０ｎｍ範囲で選択されてもよい。より具体的に、緑色蛍光タンパク質は約４８０ｎｍを吸収し、黄色蛍光タンパク質は約５４０ｎｍを吸収し、青色蛍光タンパク質は約３７５ｎｍを吸収し、青緑色蛍光タンパク質は約４２５ｎｍを吸収するため、蛍光信号として緑色蛍光を用いる場合、前記光源の波長は約４６０乃至約５００ｎｍ、蛍光信号として黄色蛍光を用いる場合、前記光源の波長は約５２０乃至約５６０ｎｍ、蛍光信号として青色蛍光を用いる場合、前記光源の波長は約３５０乃至約４００ｎｍ、蛍光信号として青緑色蛍光を用いる場合、前記光源の波長は約４００乃至約４５０ｎｍ範囲で選択されてもよい。
【００６４】
一具体例で、段階（３）のタンパク質−タンパク質相互作用測定段階は、全反射蛍光顕微鏡（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  （ＴＩＲＦ）  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または共焦点顕微鏡などを用いて光源を供給し、通常の方法で蛍光信号を観察して行われてもよい。他の例で、前記全反射蛍光顕微鏡に信号映像化のための蛍光カメラ、例えばＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラまたはＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）カメラを装着して用いることによって、光源供給および蛍光信号の映像化および／または定量を行うことができる。
【００６５】
次に、段階（３）のタンパク質−タンパク質相互作用測定段階を全反射顕微鏡および蛍光カメラを用いて行うことを例に挙げてより詳細に説明する：
【００６６】
イ）前記段階（１）または段階（２）の基板を全反射顕微鏡に装着させる。全反射顕微鏡で光源の供給位置は通常下側であり、全反射顕微鏡種類によって、蛍光信号を基板の上（この場合、下から上方向に、光源供給部、基板、レンズ、または基板、光源供給部、レンズの順に位置することができる）または下で（この場合、下から上方向に、レンズ、光源供給部、基板、または光源供給部、レンズ、基板、またはレンズ、基板、光源供給部の順に位置することができる）観察することができる。
【００６７】
ロ）光源は、レーザであってもよく、光源の強さは、約０．５ｍＷ乃至約５ｍＷ、約０．５ｍＷ乃至約４．５ｍＷ、約０．５ｍＷ乃至約４ｍＷ、約０．５ｍＷ乃至約３．５ｍＷ、約０．５ｍＷ乃至約３ｍＷ、約０．５ｍＷ乃至約２．５ｍＷ、約０．５ｍＷ乃至約２ｍＷ、約１ｍＷ乃至約５ｍＷ、約１ｍＷ乃至約４．５ｍＷ、約１ｍＷ乃至約４ｍＷ、約１ｍＷ乃至約３．５ｍＷ、約１ｍＷ乃至約３ｍＷ、約１ｍＷ乃至約２．５ｍＷ、約１ｍＷ乃至約２ｍＷ、約１．５ｍＷ乃至約５ｍＷ、約１．５ｍＷ乃至約４．５ｍＷ、約１．５ｍＷ乃至約４ｍＷ、約１．５ｍＷ乃至約３．５ｍＷ、約１．５ｍＷ乃至約３ｍＷ、約１．５ｍＷ乃至約２．５ｍＷ、または約１．５ｍＷ乃至約２ｍＷ、例えば、約２ｍＷであってもよく、光源の波長は、前記で説明したとおり蛍光信号または用いられる標識物質、および／または装備の構成（例えば減衰フィルターを用いる場合、強さが強い光源を用いることができる）に応じて適切に選択することができる。
【００６８】
ハ）前記光源供給により発生した蛍光信号を蛍光カメラで撮影して映像化および／または定量することができる。
【００６９】
前記蛍光信号の撮影（または映像化）は、標識物質の蛍光信号発生維持時間（発光時間、ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を考慮して、光源供給と同時または前記信号発生維持時間以内に行うことができる。
【００７０】
蛍光カメラ（例えば、ＥＭＣＣＤカメラ）で蛍光信号を撮影（または映像化）することに当たって、１フレーム当り露出時間、レーザパワー、カメラｇａｉｎ値、総撮影フレームなどを適切に調節することができる。例えば、１フレーム当り露出時間が短いほど１フレームに累積する信号が減るようになり、これを相殺するためにレーザパワーを高めたり、蛍光カメラの感度を高めることができる。一例で、１フレーム当り露出時間を約０．００１秒乃至約５秒、約０．００１秒乃至約３秒、約０．００１秒乃至約２秒、約０．００１秒乃至約１秒、約０．００１秒乃至約０．５秒、約０．００１秒乃至約０．３秒、約０．００１秒乃至約０．１秒、約０．０１秒乃至約５秒、約０．０１秒乃至約３秒、約０．０１秒乃至約２秒、約０．０１秒乃至約１秒、約０．０１秒乃至約０．５秒、約０．０１秒乃至約０．３秒、約０．０１秒乃至約０．１秒、約０．０５秒乃至約５秒、約０．０５秒乃至約３秒、約０．０５秒乃至約２秒、約０．０５秒乃至約１秒、約００５秒乃至約０．５秒、約０．０５秒乃至約０．３秒、約０．０５秒乃至約０．１秒、約０．０７秒乃至約５秒、約０．０７秒乃至約３秒、約０．０７秒乃至約２秒、約０．０７秒乃至約１秒、約０．０７秒乃至約０．５秒、約０．０７秒乃至約０．３秒、約０．０７秒乃至約０．１秒、約０．１秒乃至約５秒、約０．１秒乃至約３秒、約０．１秒乃至約２秒、約０．１秒乃至約１秒、約０．１秒乃至約０．５秒、または約０．１秒乃至約０．３秒、例えば約０．１秒にすることができるが、これに制限されるものではない。
【００７１】
例えば、ＥＭＣＣＤカメラを用いる場合、標識物質（例えば、ｅＧＦＰ）から生成された光子（ｐｈｏｔｏｎ）は、ＥＭＣＣＤの素子を通じて電子に変わって計測される（光電効果、ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）。この時、光子一つ当り生成される電子の個数を、ｇａｉｎ値を通じて変更することができる。設定されたｇａｉｎ値が高いほど光子一つ当り生成される電子の個数が増えて、ＥＭＣＣＤの感度が高まると同時にバックグラウンドノイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｎｏｉｓｅ）も共に増加するため、シグナル対ノイズ（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ）比率が重要である。一具体例で、優れたｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ比率を得るために、ｇａｉｎ値を約１０乃至約１００、約１０乃至約８０、約１０乃至約６０、約１０乃至約５０、約２０乃至約１００、約２０乃至約８０、約２０乃至約６０、約２０乃至約５０、約３０乃至約１００、約３０乃至約８０、約３０乃至約６０、または約３０乃至約５０、例えば、約４０程度に決定することができるが、これに限定されず、カメラの感度、寿命、装備構築現況、ノイズ、試験条件などを考慮して適切に選択されてもよい。
【００７２】
総撮影フレーム個数と露出時間をかけると総撮影時間が得られる（露出時間＊総撮影フレーム個数＝撮影時間）。蛍光物質の発光時間（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）以降は蛍光信号が無くなるため、前記撮影時間が発光時間内に進行されるように総撮影フレーム個数および／または露出時間を調節することができる。
【００７３】
タンパク質−タンパク質相互作用測定結果の正確度を高めるために、前記映像化を一つ以上、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、７個以上、または１０個以上（上限値は基板の大きさおよび映像化可能な面積により決定される）の基板またはこれを含む一つ以上のチャンネル（各チャンネルは２個以上の基板を含む）で行い、信号が現れたｓｐｏｔ（ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘともいう）の個数を求めて、前記得られた蛍光信号を定量化することができ、これはタンパク質−タンパク質相互作用を定量化したものとみることができる。
【００７４】
他の例で、段階（３）で測定された蛍光強さを通常の装置を利用して数値化することによってタンパク質−タンパク質相互作用を定量することもできる。
【００７５】
第１タンパク質および／または第２タンパク質を２種以上用いる場合、段階（１）乃至３は、それぞれの第１タンパク質と第２タンパク質の組み合わせに対してそれぞれ行われてもよい （つまり、段階（１）乃至（３）は、第１タンパク質と第２タンパク質の組み合わせの数の分だけ、反復して行われてもよい）。
【００７６】
段階（４）：第１タンパク質の活性化水準測定段階
段階（４）の第１タンパク質の活性化水準測定段階は、段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料内の第１タンパク質の単位量に対する信号値（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ（活性化スコア））を求める段階であってもよい。
【００７７】
本明細書で、「第１タンパク質の活性化」は、第１タンパク質の第２タンパク質との相互作用（結合）を意味し、「第１タンパク質の活性化水準」は、第１タンパク質の第２タンパク質との相互作用（結合）の程度を意味し、「活性化した第１タンパク質」は、第２タンパク質と相互作用（結合）した第１タンパク質を意味し得る。
【００７８】
第１タンパク質の単位量に対する信号値とは、第１タンパク質の単位重量または濃度（例えば、１ｕｇ／ｍｌ）に対する、段階（３）で測定された信号値（信号または信号の強度の定量化された値）を意味するもので、
（ａ）段階（３）で測定された信号値を、試験試料内の第１タンパク質の重量または濃度で割るか、
（ｂ）試験試料内の第１タンパク質重量または濃度増加による、段階（３）で測定された信号値の増加分（つまり、試験試料内の第１タンパク質重量または濃度をｘ軸にし、段階（３）で測定された信号値をｙ値にして得られるグラフの傾き）を求めて得られてもよい。
【００７９】
本明細書では、試料内の第１タンパク質の量より、活性化された第１タンパク質の比率が、前記試料が由来する個体での第１タンパク質を標的とする薬物反応性にさらに有意な相関関係を示すことを提案する。つまり、試料内の第１タンパク質の水準が低くても（つまり、量が少なくとも）、活性化された第１タンパク質の比率（活性化水準：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）が高い場合には、第１タンパク質量が多いが活性化された第１タンパク質の比率は低い場合と比較して、薬物反応性が顕著に優れる（図１９および２０参照）。したがって、本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用を測定してこれを第１タンパク質単位量に対する値で計算（第１タンパク質量で分けて割る）して薬物反応性の判断にさらに正確な情報を提供するという点を１つの特徴とする。
【００８０】
段階（４）の第１タンパク質の活性化水準測定段階は
（ｉ）段階（３）で測定された信号値を、段階（１）で添加した試験試料内の第１タンパク質の重量または濃度で割って直接的に求めるか、
（ｉｉ）段階（３）で測定された信号値を、段階（１）で添加した試験試料の重量または濃度で割って試験試料の単位量に対する信号値を求める段階（タンパク質−タンパク質相互作用水準測定段階）（４−１）、および前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を、段階（１）で添加した試験試料内の第１タンパク質の重量または濃度で割って、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する信号値を求める段階（活性化水準測定）（４−２）を通じて行われてもよい。
【００８１】
タンパク質−タンパク質相互作用水準測定段階（４−１）
段階（４−１）のタンパク質−タンパク質相互作用水準測定段階は、段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階である。
【００８２】
前記タンパク質−タンパク質相互作用水準は、タンパク質−タンパク質相互作用強度（ＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）とも表現することができ、段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求めることによって、試験試料の使用量などの試験試料条件による誤差を減らすことができる。
【００８３】
段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階は、段階（３）で測定された信号を試験試料の量（濃度または重量）で割るか、段階（３）で測定された信号をｙ軸にし、段階（１）で添加した試験試料の量（濃度または重量）をｘ軸にして得られるグラフの傾きを求めることによって行われてもよい。
【００８４】
第１タンパク質および／または第２タンパク質を２種以上用いる場合、前記タンパク質−タンパク質相互作用水準測定段階は、それぞれのタンパク質組み合わせに対して行われてもよい。
【００８５】
第２タンパク質（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が２種以上である場合、次の数式で表現したとおり、それぞれの第２タンパク質に対して得られたＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ（強度）の合計（Ｓｕｍ）を求めて、タンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ（ＰＰＩスコア））として決定することができる：
【数１】
0006931942.tif 000002
【００８６】
第１タンパク質が２種以上である場合、それぞれの第１タンパク質に対して得られたＰＰＩ  ｓｃｏｒｅを合算した値をタンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）として決定することができる。
【００８７】
他の例で、前記得られたタンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈまたはＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）を、下記で説明する基準試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準が１になるように標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）して、試験試料のＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈを基準試料のＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈに対する相対値として示すことができる。
【００８８】
活性化水準測定段階（段階（４）または（４−２））
段階（４）（前記で説明した段階（４−１）のタンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）測定段階なしに直接活性化水準を測定する場合）または段階（４−２）は、前記段階（３）で得られた信号値または段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階である。本明細書で、前記段階（４）または段階（４−２）で得られた結果を活性化水準（またはａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）と称する。
【００８９】
前記活性化水準は、段階（３）で得られた信号値または段階（４−１）で得られたタンパク質−タンパク質相互作用水準を、試験試料に含まれている第１タンパク質の量で割ることによって、試験試料に存在する第１タンパク質の量および／または分布などによる誤差を減らして第１タンパク質の活性化程度をより正確に測定することができる。
【００９０】
本明細書で提供される方法は、試験試料内の第１タンパク質の量を測定する段階を追加的に含むことができる。試験試料内の第１タンパク質の量を測定する段階は、段階（４）または段階（４−２）の遂行前またはそれと同時に行われてもよい。
【００９１】
前記第１タンパク質の量は、通常のあらゆる方法で測定することができ、例えば、通常の免疫ブロット法（例えば、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ｄｉｒｅｃｔ  ａｓｓａｙ、ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ａｓｓａｙ、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙなど）などを用いて測定することができるが、これに制限されるものではない。一例で、第１タンパク質が固定化された基板に、標識された検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を添加して、標識で発生する信号を測定することによって第１タンパク質を定量することができるが、これに制限されるものではない。
【００９２】
第１タンパク質および／または第２タンパク質を２種以上用いる場合、前記活性化水準測定段階は、それぞれの第１タンパク質と第２タンパク質の組み合わせに対してそれぞれ行われてもよい。
【００９３】
第２タンパク質（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が２種以上である場合、前記で説明したとおり、それぞれの第２タンパク質に対して得られたＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈの合計または前記ＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈの合計から得られたタンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）を用いて活性化水準（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）を決定するか、それぞれの第２タンパク質に対して得られたａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの合計を求めて、前記２種以上の第２タンパク質に対する活性化水準（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）として決定することができる。
【００９４】
第１タンパク質が２種以上である場合、前記で説明したとおり、それぞれの第１タンパク質に対して得られたＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈの合計または前記ＰＰＩ  ｓｔｒｅｎｇｔｈの合計から得られたタンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）を用いて活性化水準（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）を決定するか、それぞれの第１タンパク質に対して得られたａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの合計を求めて、前記２種以上の第１タンパク質に対する活性化水準（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）として決定することができる。
【００９５】
他の例で、前記得られた活性化水準を、下記で説明する基準試料の活性化水準が１になるように標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）して、試験試料の活性化水準を基準試料の活性化水準に対する相対値として示すことができる。
【００９６】
段階（５）：基準試料と比較する段階
段階（５）は、前記段階（４）または段階（４−１）または段階（４−２）で得られた結果（タンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）または活性化水準（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ））を、基準試料で得られた結果（タンパク質−タンパク質相互作用水準（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）または活性化水準（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ））と比較する段階である。
【００９７】
前記基準試料は、発明の目的に応じて適切に選択されてもよい。
【００９８】
例えば、細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定（または確認または決定または分析）方法または活性化測定のために情報を提供する方法の場合、前記基準試料は、（１）正常細胞、および／または、（２）第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が知られた（確認された）細胞（例えば、正常細胞または癌細胞）、および／または、（３）第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が知られた（確認された）個体から分離された細胞（例えば、正常細胞または癌細胞）を含むことができる。一具体例で、前記試験試料が個体から分離された癌細胞を含む場合、その個体から分離された癌細胞と同一組織または同一器官の正常細胞を含むものであってもよい。
【００９９】
本明細書で使用されたものとして、用語「正常細胞」は、非病理的状態のあらゆる細胞を意味し得、前記「非病理的状態」は、疾病状態ではないか、突然変異、腫瘍形成、機能的および／または形態的異常などを有する疾病を誘発できる状態ではないことを意味し得る。例えば、正常細胞は、第１タンパク質と関連した疾病または試験対象薬物の治療対象疾病を有さない細胞であってもよく、試験試料が由来する個体または組織と同種または同一の個体または組織に由来するものであってもよい。
【０１００】
また、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を予測する方法または予測のために情報を提供する方法の場合、前記基準試料は、正常細胞または前記薬物に対する反応性が知られた（確認された）細胞（例えば、癌細胞）を含むか、前記試験試料が個体から分離された癌細胞を含む場合、癌細胞と同一組織または同一器官の正常細胞を含むものであってもよい。
【０１０１】
また、第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法または選別のために情報を提供する方法の場合、前記基準試料は、正常細胞または前記第１タンパク質を標的とする治療の効果が知られた（確認された）細胞（例えば、癌細胞）を含むか、前記試験試料が個体から分離された癌細胞を含む場合、癌細胞と同一組織または同一器官の正常細胞を含むものであってもよい。
【０１０２】
段階（５）を行うために、前記方法は、段階（５）以前に、前記基準試料に対して以下の段階（１’）、（２’）、（３’）、および（４’）、または（１’）、（２’）、（３’）、（４−１’）、および（４−２’）を追加的に含むことができる：
（１’）第１タンパク質を含む基準試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含み固定された基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２’）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３’）前記（２’）段階で得られた反応物から信号を測定する段階（タンパク質−タンパク質相互作用測定）；および
（４’）前記測定された信号を利用して、前記（１’）段階で添加した基準試料に含まれている第１タンパク質の量で割る段階（活性化水準測定）
（または（４−１’）前記測定された信号を利用して、前記（１’）段階で添加した基準試料の重量または濃度で割る段階（タンパク質−タンパク質相互作用水準測定段階）および（４−２’）前記段階（４−１’）で得られた結果を、基準試料に含まれている第１タンパク質の量で割る段階（活性化水準測定））。
【０１０３】
各段階の詳細な事項は、前記で試験試料に対する各段階で説明したとおりである。
【０１０４】
段階（６）
本明細書で提供される方法は、前記段階（５）以降に、段階（５）で得られた比較結果から目的とする事項を確認（決定）する段階を追加的に含むことができる。
【０１０５】
これをより具体的に説明すると以下のとおりである：
【０１０６】
（ｉ）細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定（または確認または決定または分析）方法または活性化測定のために情報を提供する方法
段階（６）は、以下の段階を含むものであってもよい：
段階（４）または（４−２）で測定された、試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準より高い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体で第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が、正常細胞の活性化程度または基準試料で知られた（確認された）活性化程度より高いと確認（決定）する段階；
段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準と同等な場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体で第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が、正常細胞の活性化程度または基準試料で知られた（確認された）活性化程度と同等であると確認（決定）する段階；および／または
段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準より低い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体で第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が、正常細胞の活性化程度または基準試料で知られた（確認された）活性化程度より低いと確認（決定）する段階。
【０１０７】
（ｉｉ）第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を予測する方法または予測のために情報を提供する方法
段階（６）は、以下の段階を含むものであってもよい：
段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準より高い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性が、基準試料の薬物反応性より高いと確認（決定）する段階；
段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準と同等な場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性が、基準試料の薬物反応性と同等であると確認（決定）する段階；および／または
段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準より低い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性が、基準試料の薬物反応性より低いと確認（決定）する段階。
【０１０８】
基準試料を、試験対象個体に要求される程度の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を有する細胞を含むように選定して、前記薬物が、試験試料または前記試験試料が由来する試験対象個体に所望する効果を有するか否かを調査するか、基準試料を正常細胞として選定して、前記薬物が、正常細胞より試験試料または試験対象個体で第１タンパク質と関連した疾病に特異的に作用するか否かを調査することができる。
【０１０９】
例えば、試験対象個体に要求される程度の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を有する細胞を前記基準試料として選定する場合、段階（６）は、段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準と比較して同等以上、例えば、高い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性に優れるか、および／または前記薬物が試験試料または前記試験試料が由来する個体に効果を有すると決定する段階を含むことができる。
【０１１０】
前記第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性を予測する方法または予測のために情報を提供する方法において、段階（６）で、試験試料または前記試験試料が由来する個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性に優れるか、および／または、前記薬物が、試験試料または前記試験試料が由来する個体に効果を有すると決定された場合、第１タンパク質を標的とする薬物を前記個体に投与する段階を追加的に含むことができる。
【０１１１】
他の側面で、前記の決定内容に基づいて各個体に適した個別注文型治療手段が提供される。一例は、前記第１タンパク質を標的とする薬物を有効成分として含む、前記段階（６）で第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性に優れるか、および／または前記薬物が効果を有すると決定された個体での、第１タンパク質と関連した疾病の治療のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記第１タンパク質を標的とする薬物の、前記段階（６）で第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性に優れるか、および／または前記薬物が効果を有すると決定された個体での第１タンパク質と関連した疾病の治療のための用途を提供する。他の例は、前記段階（６）で第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性に優れるか、および／または前記薬物が効果を有すると決定された個体に、前記第１タンパク質を標的とする薬物を投与する段階を含む、前記個体での第１タンパク質と関連した疾病の治療方法を提供する。
【０１１２】
（ｉｉｉ）第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法または選別のために情報を提供する方法
前記基準試料は、正常細胞、または前記第１タンパク質を標的とする治療の効果が知られた（確認された）細胞（例えば、癌細胞）を含むか、前記試験試料が個体から分離された癌細胞を含む場合、癌細胞と同一組織または同一器官の正常細胞を含むものであってもよい。
【０１１３】
段階（６）は、段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準と比較して、同等以上、例えば、高い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体を、第１タンパク質を標的とする治療に適した患者として確認（決定）する段階を含むことができる。
【０１１４】
前記第１タンパク質を標的とする治療は、第１タンパク質を標的とする薬物を処方および／または投与することを意味し得る。
【０１１５】
前記基準試料は、第１タンパク質を標的とする治療が効果を有する細胞を含むものであってもよい。
【０１１６】
前記第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法または選別のために情報を提供する方法において、段階（６）で、試験試料または前記試験試料が由来する個体が、第１タンパク質を標的とする治療に適した患者として確認（決定）された場合、前記個体に第１タンパク質を標的とする治療を行う（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物を処方および／または投与する）段階を追加的に含むことができる。
【０１１７】
他の側面で、前記の確認（決定）内容に基づいて各個体に適した個別注文型治療手段が提供される。一例は、前記第１タンパク質を標的とする薬物を有効成分として含む、前記段階（６）で第１タンパク質を標的とする治療に適したと確認された個体での第１タンパク質と関連した疾病の治療のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記第１タンパク質を標的とする薬物の、前記段階（６）で第１タンパク質を標的とする治療に適したと確認された個体での第１タンパク質と関連した疾病の治療のための用途を提供する。他の例は、前記段階（６）で第１タンパク質を標的とする治療に適したと確認された個体に前記第１タンパク質を標的とする治療を行う（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物を処方および／または投与する）段階を含む、前記個体での第１タンパク質と関連した疾病の治療方法を提供する。
【０１１８】
（ｉｖ）第１タンパク質を標的とする治療の効果（第１タンパク質を標的とする薬物の反応性）をモニタリングする方法またはモニタリングのために情報を提供する方法
前記基準試料は、正常細胞、または前記第１タンパク質を標的とする治療の効果が知られた（確認された）細胞（例えば、癌細胞）を含むか、前記試験試料が個体から分離された癌細胞を含む場合、癌細胞と同一組織または同一器官の正常細胞を含むものであってもよい。
【０１１９】
段階（６）は、段階（４）または（４−２）で測定された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準と比較して、同等以上、例えば、高い場合、試験試料または前記試験試料が由来する個体で、第１タンパク質を標的とする治療が効果を発揮している（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物の投与後、投与を受けた個体で前記薬物に対する反応性が維持されているか、または投与を受けた個体で前記薬物に対する抵抗性が発生しない）と確認（決定）する段階を含むことができる。
【０１２０】
前記第１タンパク質を標的とする治療は、第１タンパク質を標的とする薬物を処方および／または投与することを意味し得る。
【０１２１】
前記基準試料は、第１タンパク質を標的とする治療が効果を有する細胞を含むものであってもよい。
【０１２２】
前記第１タンパク質を標的とする治療の効果をモニタリングする方法またはモニタリングのために情報を提供する方法において、段階（６）で、試験試料または前記試験試料が由来する個体で第１タンパク質を標的とする治療の効果が発揮されていると確認（決定）された場合、前記個体に、前記第１タンパク質を標的とする治療を継続して行う（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物を処方および／または投与する）段階を、あるいは段階（６）で、試験試料または前記試験試料が由来する個体で第１タンパク質を標的とする治療の効果が発揮されない（例えば、治療効果（薬物反応性）減少または抵抗性獲得など）と確認（決定）された場合、前記個体において、前記第１タンパク質を標的とする治療を中止する段階、および／または、第１タンパク質を標的とする他の薬物を投与したり、異なる第１タンパク質を標的とする治療を行う段階を追加的に含むことができる
【０１２３】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質であり、前記タンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を２個以上の第１タンパク質に対して行う、前記細胞もしくは組織または前記細胞もしくは組織が由来する個体（個別患者）に適用することに適した治療標的としての第１タンパク質またはこれを標的とする薬物を選別する方法または選別のために情報を提供する方法を提供する。
【０１２４】
前記方法は、
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階（タンパク質−タンパク質相互作用測定）；および
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）；または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階（タンパク質−タンパク質相互作用水準測定）、および（４−２）段階（４−１）で得られた、試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）；および
（５）２以上の第１タンパク質に対して、前記段階（４）または段階（４−２）で得られた結果を互いに比較する段階
を含むことができる。
【０１２５】
この時、前記第１タンパク質として、細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される２種以上が用いられ、
段階（１）、（２）、（３）および（４）、または段階（１）、（２）、（３）、（４−１）、および（４−２）は、２種以上の第１タンパク質それぞれに対して行われ、
段階（５）の比較する段階は、２種以上の第１タンパク質に対して得られた結果を互いに比較するものであってもよい。
【０１２６】
前記段階（５）での比較の結果、タンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が高い第１タンパク質を、前記試験試料または試験試料が由来する個体の治療標的として選択するか、前記第１タンパク質を標的とする薬物を、試験試料または試験試料が由来する個体の治療のための候補薬物として選択する段階（段階（６））を追加的に含むことができる。
【０１２７】
前記段階（１）乃至（６）および、試験試料、第１タンパク質、第２タンパク質などの用語説明は前記で定義したとおりである。
【０１２８】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質であり、前記タンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を、候補物質処理前および処理後に行う、第１タンパク質を標的とする候補薬物の選別方法または第１タンパク質を標的とする候補薬物の効能確認方法を提供する。
【０１２９】
前記方法は、
試験試料に候補化合物を処理する（例えば、接触させる）段階、および
前記候補化合物で処理されていない試験試料および処理された試験試料のそれぞれに対して下記の段階（１）、（２）、（３）、および（５）、または（１）、（２）、（３）、（４）、および（５）、または（１）、（２）、（３）、（４−１）、および（５）、または（１）、（２）、（３）、（４−１）、（４−２）、および（５）を行う段階を含むことができる：
【０１３０】
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階（タンパク質−タンパク質相互作用測定）；および
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）；または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階（タンパク質−タンパク質相互作用水準測定）、および（４−２）段階（４−１）で得られた、試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）；および
（５）前記候補化合物で処理されていない試験試料および処理された試験試料に対して、前記段階（３）、段階（４）、段階（４−１）、または段階（４−２）で得られたそれぞれの結果を互いに比較する段階。
【０１３１】
前記候補化合物で処理されていない試験試料と処理された試験試料は、それぞれ候補化合物の処理前試験試料および処理後試験試料を意味するか、試験試料を分量して、前記候補化合物で処理した一部の試験試料および前記候補化合物で処理していない他の一部の試験試料を意味し得る。
【０１３２】
前記段階（５）での比較の結果、候補化合物で処理された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、候補化合物で処理されていない試験試料におけるより高い場合、前記候補化合物を、前記第１タンパク質を標的とする候補薬物として選択するか、前記候補化合物が、第１タンパク質を標的とする薬物として効果があると確認することができる。
【０１３３】
したがって、前記第１タンパク質を標的とする候補薬物の選別方法または第１タンパク質を標的とする候補薬物の効能確認方法は、前記段階（５）以降に、前記段階（５）での比較の結果、候補化合物で処理された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、候補化合物で処理されていない試験試料におけるより高い場合、前記候補化合物を、前記第１タンパク質を標的とする候補薬物として選択するか、前記候補化合物が第１タンパク質を標的とする薬物として効果があると確認する段階（段階（６））を追加的に含むことができる。
【０１３４】
前記候補化合物は、第１タンパク質の標的薬物として使用可能なあらゆる生体適合性物質のなかから選択されてもよく、例えば、小分子化学薬物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、またはその類似体など）、ペプチド、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アプタマー、など）、植物抽出物、動物抽出物、細胞抽出物などからなる群より１種以上選択されてもよいが、これに制限されるのではない。
【０１３５】
前記試験試料は、第１タンパク質が過発現および／または（過）活性化した細胞（例えば、細胞溶解液など）または組織（例えば、組織溶解液など）、または第１タンパク質と関連した疾病もしくは選別しようとする第１タンパク質を標的とする薬物の適用（治療）対象の疾病と関連した、分離された細胞（例えば、細胞溶解液など）または組織（例えば、組織溶解液など）であってもよく、一例で、確立された細胞株、または前記疾病（例えば、癌）を病む患者から分離された細胞もしくは組織であってもよい。例えば、前記試験試料は、確立された癌細胞株または癌患者から分離された細胞もしくは組織であってもよい（前記癌は第１タンパク質の過発現および／または（過）活性化と関連したものであってもよい）。
【０１３６】
前記段階（１）乃至（６）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるものであってもよい。
【０１３７】
前記段階（１）乃至（６）および第１タンパク質、第２タンパク質などの用語説明は、前記で定義したとおりである。
【０１３８】
前記第１タンパク質を標的とする候補薬物の選別方法は、第１タンパク質を標的とする新薬開発において、候補薬物として開発された薬物の効能検定（または確認または試験）に有用に適用され得る。
【０１３９】
候補化合物で処理された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、候補化合物で処理されていない試験試料におけるより高い場合、前記候補化合物を、前記第１タンパク質を標的とする候補薬物として選択する段階（段階（６））を追加的に含むことができる。
【０１４０】
前記候補化合物は、第１タンパク質の標的薬物として使用可能なあらゆる生体適合性物質のなかから選択されてもよく、例えば、小分子化学薬物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、またはその類似体など）、ペプチド、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アプタマー、など）、植物抽出物、動物抽出物、細胞抽出物などからなる群より１種以上選択されてもよいが、これに制限されるのではない。
【０１４１】
前記試験試料は、第１タンパク質が過発現および／または（過）活性化した細胞（例えば、細胞溶解液など）または組織（例えば、組織溶解液など）、または、第１タンパク質と関連した疾病、もしくは選別しようとする第１タンパク質を標的とする薬物の適用（治療）対象の疾病と関連した分離された細胞（例えば、細胞溶解液など）または組織（例えば、組織溶解液など）であってもよく、一例で、確立された細胞株、または前記疾病（例えば、癌）を病む患者から分離された細胞もしくは組織であってもよい。例えば、前記試験試料は、確立された癌細胞株、または癌患者から分離された細胞もしくは組織であってもよい（前記癌は第１タンパク質の過発現および／または（過）活性化と関連したものであってもよい）。
【０１４２】
前記段階（１）乃至（６）および第１タンパク質、第２タンパク質などの用語説明は、前記で定義したとおりである。
【０１４３】
前記第１タンパク質を標的とする候補薬物の選別方法は、第１タンパク質を標的とする新薬開発において、候補薬物として開発された薬物の効能検定（または確認または試験）に有用に適用され得る。
【０１４４】
他の例は、第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階を含み、前記第１タンパク質は、細胞または組織内の信号伝達経路に関与するタンパク質であり、第２タンパク質は、前記細胞または組織内の信号伝達経路中で前記第１タンパク質の下流タンパク質のなかから選択された１種以上である、第１タンパク質の標的治療と併行するための併行治療標的を選定する方法もしくは前記選定のために情報を提供する方法、または第１タンパク質の標的薬物と併用投与するための併用薬物を選定する方法もしくは前記選定のために情報を提供する方法を提供する。
【０１４５】
前記方法は、
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階（タンパク質−タンパク質相互作用測定）；および
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）段階；または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階（タンパク質−タンパク質相互作用水準測定）、および（４−２）段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階（活性化水準測定）；および
（５）前記段階（３）、段階（４）、段階（４−１）、または段階（４−２）で得られた結果を比較する段階
を含むことができる。
【０１４６】
前記段階（５）の比較する段階は、
（ａ）試験試料に対して得られた前記段階（４）または段階（４−２）の結果を、基準試料に対して得られた結果と比較するか（この場合、前記方法は、基準試料は前記で説明したとおりであり、基準試料に対して前記で説明した段階（１’）、（２’）、（３’）、および（４’）、または（１’）、（２’）、（３’）、（４−１’）、および（４−２’）を追加的に含むことができる）、
（ｂ）２種以上の第２タンパク質に対して得られた前記段階（４）または段階（４−２）の結果を互いに比較して行われてもよい。
【０１４７】
前記段階（５）の比較の結果、
（ａ）試験試料に対して得られた前記段階（４）または段階（４−２）のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料より高い場合、前記第２タンパク質を、第１タンパク質の標的治療と併行するための併行治療標的として選定するか、前記第２タンパク質を標的とする薬物を、第１タンパク質の標的薬物と併用投与するための薬物として選定するか；
（ｂ）２種以上の第２タンパク質中で、前記段階（４）または段階（４−２）で得られたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が最も高い第２タンパク質を、第１タンパク質の標的治療と併行する併行治療標的として選定するか、前記第２タンパク質を標的とする薬物を、第１タンパク質の標的薬物と併用投与するための薬物として選定することができる。
【０１４８】
したがって、前記第１タンパク質の標的治療と併行するための併行治療標的を選定する方法（または前記選定のために情報を提供する方法）、または第１タンパク質の標的薬物と併用投与するための併用薬物を選定する方法（または前記選定のために情報を提供する方法）は、前記段階（５）以降に、
（６−１）試験試料に対して得られた前記段階（４）または段階（４−２）のタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が、基準試料より高い場合、前記第２タンパク質を、第１タンパク質の標的治療と併行する併行治療標的として選定するか、前記第２タンパク質を標的とする薬物を、第１タンパク質の標的薬物と併用投与するための薬物として選定する段階；または
（６−２）２種以上の第２タンパク質中で、前記段階（４）または段階（４−２）で得られたタンパク質−タンパク質相互作用水準または活性化水準が最も高い第２タンパク質を、第１タンパク質の標的治療と併行する併行治療標的として選定するか、前記第２タンパク質を標的とする薬物を、第１タンパク質の標的薬物と併用投与するための薬物として選定する段階
を追加的に含むことができる。
【０１４９】
他の側面で、前記の決定内容に基づいた併用治療手段が提供される。一例は、前記第１タンパク質を標的とする薬物、および前記段階（６−１）または（６−２）で併行治療標的として選定された第２タンパク質を標的とする（例えば、阻害する）薬物を含む、第１タンパク質と関連した疾病の治療のための併用投与用薬学組成物を提供する。前記薬学組成物は、前記試験試料または前記試験試料が由来する個体における第１タンパク質と関連した疾病の治療のための併用投与用途として用いられ得る。他の例は、前記第１タンパク質を標的とする薬物、および前記段階（６−１）または（６−２）で併行治療標的として選定された第２タンパク質を標的とする（例えば、阻害する）薬物の、第１タンパク質と関連した疾病の治療のための併用治療に用いるための用途を提供する。他の例は、第１タンパク質と関連した疾病の治療を必要にする患者に、第１タンパク質を標的とする治療（例えば、第１タンパク質を標的とする薬物の投与）、および前記段階（６−１）または（６−２）で併行治療標的として選定された第２タンパク質を標的とする治療（例えば、前記第２タンパク質を標的とする（例えば、阻害する）薬物の投与）を、同時にまたは順序に関係なく連続して行う段階を含む、第１タンパク質と関連した疾病の治療方法を提供する。前記患者は、前記試験試料または前記試験試料が由来する個体であってもよい。
【０１５０】
本明細書で使用されるものとして、用語「第１タンパク質を標的とする」とは、第１タンパク質の活性を促進または阻害することを意味し得、例えば、第１タンパク質の活性を阻害することを意味し得る。第１タンパク質の活性の阻害は、第１タンパク質と結合するか、および／または第１タンパク質を分解および／または構造的変形させて、固有の機能、例えば、細胞および／または組織での固有の生体信号伝達機能を減少させたり除去するものであってもよい。
【０１５１】
本明細書で使用されたものとして、用語「薬物」は、薬理的効果を示すあらゆる物質、例えば、小分子化合物、タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、またはその類似体など）、ペプチド、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アプタマー、など）、植物抽出物、動物抽出物、細胞抽出物などからなる群より１種以上選択されるものであってもよい。
【０１５２】
本明細書で使用されるものとして、用語「第１タンパク質を標的とする薬物」は、第１タンパク質の活性を阻害するあらゆる物質、例えば、第１タンパク質の活性を阻害する小分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、またはその類似体など）、ペプチド、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、など）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アプタマー、など）、植物抽出物、動物抽出物、細胞抽出物などからなる群より選択される１種以上であってもよい。より具体的に、「第１タンパク質を標的とする薬物」は、第１タンパク質と結合するか、および／または第１タンパク質を分解および／または構造的変形させて固有の機能、例えば、細胞および／または組織での固有の生体信号伝達機能を減少させたり除去するあらゆる物質、例えば、第１タンパク質の活性を阻害する小分子化合物、タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、またはその類似体など）、ペプチド、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アプタマー、など）、植物抽出物、動物抽出物、細胞抽出物などからなる群より選択される１種以上であってもよい。
【０１５３】
一具体例で、前記「第１タンパク質を標的とする薬物」は、第１タンパク質を標的とする治療剤、例えば、第１タンパク質の標的阻害剤を意味するものであってもよい。一例で、前記第１タンパク質を標的とする薬物は、ＥＧＦＲ標的治療剤（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ａｆａｔｉｎｉｂ、ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ９２９１）、各種抗−ＥＧＦＲ抗体など）、ＭＥＴ標的治療剤（各種抗−ＭＥＴ抗体、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂなど）、ＨＥＲ２標的治療剤（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｌａｐａｔｉｎｉｂなど）、ＨＥＲ３標的治療剤（各種抗−ＨＥＲ３抗体など）、ＦＧＦＲ（１、２）標的治療剤（Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂなど）、ＶＥＧＦＲ（１、２、３）標的治療剤（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂなど）、ＰＤＧＦＲ標的治療剤（Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂなど）、ＩＧＦ１Ｒ標的治療剤（Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂなど）、ｃ−ＫＩＴ標的治療剤（Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂなど）、ＲＥＴ標的治療剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂなど）、ＢＲＡＦ標的治療剤（Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂなど）、ＭＥＫ標的治療剤（Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂなど）、Ｓｒｃ標的治療剤（Ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂなど）、ＰＩ３Ｋ標的治療剤（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂなど）、ＣＤＫ（４、６）標的治療剤（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂなど）、ＲＯＳ１標的治療剤（Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂなど）、ＡＬＫ標的治療剤（Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂなど）、ＢＣＲ−Ａｂｌ１標的治療剤（Ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂなど）、ＡＲ標的治療剤（Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ、Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅなど）、ＣＴＬＡ４標的治療剤（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂなど）、ＰＤ−１標的治療剤（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂなど）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。
【０１５４】
本明細書で使用されるものとして、用語「第１タンパク質を標的とする治療」は、第１タンパク質の活性を阻害するあらゆる医学的および／または薬学的行為を意味し得、例えば、前記で説明したように、第１タンパク質の活性を阻害する薬物を、第１タンパク質の活性を阻害することを必要とする対象に処方および／または投与するものであってもよい。より具体的に、「第１タンパク質を標的とする治療」は、第１タンパク質と結合するか、および／または第１タンパク質を分解および／または構造的変形させて固有の機能、例えば、細胞および／または組織での固有の生体信号伝達機能を減少させたり除去する薬物を、これを必要とする対象に処方および／または投与するものであってもよい。
【０１５５】
前記投与は、経口または非経口経路で行われてもよい。非経口投与である場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、病変部位局所投与、鼻内投与、肺内投与、または直腸内投与などの経路で行われてもよい。
【０１５６】
前記個体、患者または対象は、あらゆる哺乳類、例えばヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などであってもよく、例えば第１タンパク質と関連した疾病を有する患者であってもよい。前記第１タンパク質と関連した疾病は、第１タンパク質の過発現または第１タンパク質が関与する細胞または組織内の信号伝達経路の活性化と関連した疾病であってもよく、例えば、癌、炎症、その他免疫疾患などであってもよい。具体例で、前記個体、患者または対象は癌患者であってもよい。
【０１５７】
前記癌は、全ての固形癌および血液癌の中で選択されてもよく、例えば第１タンパク質の過発現または第１タンパク質が関与する細胞または組織内の信号伝達経路の活性化と関連した癌であってもよい。例えば、前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色種、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。前記癌は、原発性癌だけでなく、転移性癌を含むことができる。また、前記癌は、既存の抗癌治療に対して抵抗性を有する癌や抵抗性を獲得した癌であってもよい。
【０１５８】
本明細書で使用されたものとして、用語「薬物に対する反応性」は、薬物の投与を受けた個体で前記薬物が効果を発揮する程度を意味し得る。
【０１５９】
本明細書で使用されたものとして、用語「効果」は、薬物または治療が処置対象で達成しようとする医学的および／または薬学的効果を意味するもので、処置対象が有する疾病の予防および／または治療、および／または症状の緩和および／または改善などを意味するものであってもよい。例えば、前記薬物が抗癌剤であり、治療が抗癌治療であり、前記処置対象が癌患者である場合、前記効果は抗癌効果（癌の予防および／または治療効果）であってもよく、前記抗癌効果は癌細胞の成長を抑制する効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、および／または転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制、および／または癌の悪化を抑制、および／または抵抗性を減少または除去する効果などを含むものであってもよい。
【０１６０】
他の例で、前記で説明した細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測方法、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性モニタリング方法、第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法、および／または薬物のスクリーニング方法に用いるための、タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置を提供する。前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、組織内の信号伝達経路の活性化測定用装置、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測および／またはモニタリング用装置、第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別するための装置、および／または第１タンパク質を標的とする薬物の効能確認用装置として適用可能である。
【０１６１】
前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、前記で説明した細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測方法、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性モニタリング方法、第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別する方法、および／または薬物のスクリーニング方法に適用されることによって、少量の試料での生体分子間の相互作用も正確であり、効率的に観察、分析、検出、および／または測定することができるという利点を有する。タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置またはこれを利用する分析方法は、生検（例えば、ｎｅｅｄｌｅ  ｂｉｏｐｓｙ）試料のように非常に少量の試料に対しても有用かつ効果的に適用され得る。また、前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置またはこれを利用する分析方法は、多様な生体分子（例えば、タンパク質、核酸など）間の相互作用を少量の試料を利用して正確かつ効率的に観察、分析、検出、および／または測定することができる。
【０１６２】
前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、
第１タンパク質に特異的に結合する、第１タンパク質の捕獲用物質を含むマルチウェル、および
信号検出手段
を含むことができる。
【０１６３】
前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、前記第１タンパク質と相互作用する（例えば、前記第１タンパク質が関与する細胞または組織の生体信号伝達経路の下流経路に関与する）タンパク質（第２タンパク質）を追加的に含むことができ、一例で、前記第２タンパク質は、検出可能な信号を発生させる標識物質で標識されたり（標識物質が、例えば、化学的（例えば、共有的または非共有的）、組み換え的、または物理的に、結合されたり）、標識物質が結合され得るタグが付着された形態であってもよい。また、前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、信号検出手段で測定された信号値を第１タンパク質の水準（レベル）に対して標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）させるために、第１タンパク質に結合する探知用物質および前記探知用物質に結合する標識用物質を追加的に含むことができる。前記第１タンパク質に結合する探知用物質は、前記で説明したマルチウェルに含まれている第１タンパク質の捕獲用物質と異なる部位で第１タンパク質と結合する生物分子（例えば、抗体）であってもよく、前記標識用物質は、検出可能な信号を発生させる標識物質で標識され（標識物質が、例えば、化学的に（例えば、共有的または非共有的に結合）前記第１タンパク質に結合する探知用物質に結合可能な生物分子（例えば、抗体）であってもよい（図６参照）。
【０１６４】
一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置に含まれているマルチウェルは、一面が開放された複数の管を含むか、支持プレートに離隔形成された複数の非貫通型ホール（例えば、支持プレートに形成された溝形態）を含む構造であって、前記一面が開放された管または非貫通型ホールをウェルと定義することができ、前記ウェルが第１方向に２個以上配置された一列構造が、前記第１方向と交差する第２方向に一つ存在するか、２個以上配置（格子構造）された構造体を意味し得る（図３０参照）。この時、前記マルチウェルは、前記管または非貫通型ホールの開放された一面に位置する試料注入部、前記管または非貫通型ホールの内部の、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、第１タンパク質と第２タンパク質間の相互作用）が起こる反応部、および前記管または非貫通型ホールの内部と接触する少なくとも一部の内壁の表面に第１タンパク質の捕獲用物質（例えば、第１タンパク質に特異的に結合する物質（例えば、抗体））が固定化されもしくは固定化可能な、第１タンパク質の捕獲部（または基板）を含むことができる。一具体例で、前記マルチウェルは、第１タンパク質と第２タンパク質間の相互作用が起こる反応部（第１タンパク質と第２タンパク質の反応部：第１反応部）を含む一つ以上のウェル、および第１タンパク質と第１タンパク質に結合する探知用物質が結合する反応部（第１タンパク質探知部：第２反応部）を含む一つ以上のウェルを含むことができる。前記第１タンパク質に結合する探知用物質は前記で説明したとおりである。前記第１タンパク質探知部は、試験試料内の第１タンパク質水準を測定して、装置に含まれている信号検出手段で測定された信号値を第１タンパク質の水準に標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）することに用いられてもよい。
【０１６５】
一具体例で、前記マルチウェルは、第１方向に沿って延長された支持プレート、前記支持プレート上に配置され、前記第１方向に沿って互いに離隔配置された複数の収容部、前記複数の収容部それぞれに形成され、前記第１方向と交差する第２方向に沿って前記収容部を貫通する貫通ホール、および前記複数の収容部の上に配置されて前記貫通ホールの一側端部を覆い、前記貫通ホールに向かう一面が表面処理された基板を含むことができる（図２７参照）。この場合、離隔配置された貫通ホールとその一側端部を覆う基板が形成する空間をウェルと定義することができ、前記で説明したとおり、マルチウェルは、前記ウェルが第１方向に２個以上配置されたり（一列構造）または第１方向および前記第１方向と交差する第２方向に２以上配置（格子構造）された構造体を意味し得る。
【０１６６】
前記マルチウェルは、１種以上または２種以上の第１タンパク質の捕獲用物質をそれぞれ含む多数のウェルを含むものであってもよく、前記マルチウェルが２種以上の第１タンパク質と特異的に結合する物質を含む場合、２種以上の第１タンパク質と特異的に結合する物質をそれぞれ含むウェルらは、第１方向または第１方向と交差する第２方向に、互いに異なる第１タンパク質に特異的に結合する物質を含むように配置されてもよい。
【０１６７】
前記第１タンパク質捕獲部または基板の一面の表面は、第１タンパク質捕獲物質（第１タンパク質に特異的に結合する物質、例えば、抗体など）を基板一面に固定化させることができる作用基を有するあらゆる化合物で表面処理されたものであってもよく、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基およびアミン基からなる群より選択された作用基を含む１種以上の化合物で処理されたものであってもよい。一具体例で、前記アルデヒド基、カルボキシル基およびアミン基からなる群より選択された作用基を含む化合物は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ビオチンが結合されたウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）、ビオチンが結合されたＰＥＧ（ポリエチレングリコール−ビオチン；ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ）、ポリソルベート（例えばＴｗｅｅｎ２０）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。前記表面処理された基板に、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）などからなる群より選択された１種以上が追加的に処理（例えば、塗布）されてもよい。
【０１６８】
互いに向き合う前記基板と前記収容部の間には接着剤が介在してもよい。
【０１６９】
前記接着剤は、エポキシ（例えば、ＵＶエポキシ）を含むことができる。
【０１７０】
前記基板と前記収容部が接触する領域に隣接して、前記基板と前記収容部を囲む接着剤を含むことができる。
【０１７１】
前記接着剤は、エポキシを含むことができる。
【０１７２】
前記複数の支持プレートは、前記第１方向および前記第２方向と交差する第３方向に沿って互いに離隔して配置されてもよい。
【０１７３】
前記貫通ホールの断面は、円形形状を有することができる。
【０１７４】
前記収容部は、前記支持プレート上に突出した形状を有することができる。
【０１７５】
前記収容部と前記支持プレートは、一体に形成されてもよい。
【０１７６】
前記収容部と前記支持プレートは、アクリルを含むことができる。
【０１７７】
前記基板は、ガラスを含むことができる。
【０１７８】
前記信号検出手段は、用いられた標識物質から発生させる信号により通常使用されるあらゆる信号検出手段であり得る。例えば、前記信号検出手段は、信号刺激部および信号検出部を含むことができ、これに加えて、測定された信号を分析（例えば、定量または映像化）する信号分析部を追加的に含むことができる。一例で、信号刺激、信号検出、および信号分析はそれぞれ異なる部位で行われるか、これらの中の少なくとも２種類以上が一つの部位で同時にまたは連続して行われてもよい。一例で、前記標識が蛍光物質である場合、前記信号検出手段は、蛍光信号を発生および検出できるあらゆる手段のなかから選択されてもよく、例えば、蛍光信号刺激部（例えば、光源）、および蛍光信号検出部、および／または蛍光信号分析部を含むことができる。具体例で、前記信号検出手段は、全反射蛍光顕微鏡（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  （ＴＩＲＦ）  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または共焦点顕微鏡（光源および蛍光信号検出用）を含むか、これに加えて、蛍光カメラ、例えばＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラまたはＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）カメラを追加的に含み、光源供給および蛍光信号の映像化および／または定量を行うことができる。前記光源の波長、強さ、蛍光カメラ測定条件（例えば、１フレーム当り露出時間、レーザパワー、カメラｇａｉｎ値、総撮影フレームなど）は前記で説明したとおりである。
【０１７９】
前記第１タンパク質、基板、第１タンパク質に特異的に結合する物質、第２タンパク質、標識物質、前記標識物質による信号検出手段は、前記で説明したとおりである。
【０１８０】
前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置を図２７乃至３０に例示的に示したが、これに制限されるのではない。
【０１８１】
一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置の製造方法は、第１方向に沿って延長され、前記第１方向に沿って互いに離隔配置される複数の収容部が上に配置される支持プレートを設ける段階、および前記支持プレートの上に、表面処理された基板を付着する段階を含み、前記複数の収容部のそれぞれには前記第１方向と交差する第２方向に沿って前記収容部を貫通する貫通ホールが形成され、前記表面処理された前記基板の一面が前記貫通ホールに向かうように、前記基板の一面が前記貫通ホールの一側端部を覆うことができる。
【０１８２】
前記基板の表面処理は、前記で説明したとおりであり、一具体例でポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）とビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）の混合物を処理して行われてもよい。
【０１８３】
前記ポリエチレングリコールとビオチンの比率は、重量基準に、１００：１乃至１００：３（ポリエチレングリコール重量：ビオチン重量）であってもよい。
【０１８４】
前記表面処理された基板上にはニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）などからなる群より選択された１種以上が追加的に塗布されてもよい。
【０１８５】
前記支持プレートの上に前記基板を付着する段階は、前記基板と向き合う前記収容部の上面にＵＶエポキシを塗布する段階、前記収容部の上に前記基板を覆う段階、および前記基板で前記収容部に向かってＵＶを照射する段階を含むことができる。
【０１８６】
前記ＵＶを照射する段階で、前記貫通ホールと対応する前記基板の領域に前記ＵＶが通過することを遮断するマスクを用いることができる。
【０１８７】
前記支持プレートの上に前記基板を付着する段階は、前記収容部の上に前記基板を覆う段階、および前記基板と前記収容部が接触する領域に隣接して、前記基板と前記収容部を囲むようにシーリング材を塗布する段階を含むことができる。
【０１８８】
前記シーリング材は、エポキシを含むことができる。
【０１８９】
本明細書で提供されるタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、多様な生体分子（例えば、タンパク質、核酸など）間の相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用など）を観察、分析、検出、および／または測定することに有用に適用され得る。
【０１９０】
したがって、他の例は、分析しようとする生体分子（例えば、第１タンパク質）を含む試料を前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置または前記装置に含まれているマルチウェルに接触させる段階を含む、生体分子間相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）分析方法を提供する。前記分析方法は、前記接触させる段階以降に、試料で発生する信号を測定する段階を追加的に含むことができる。この時、前記信号は、生体分子分析に通常使用されるあらゆる信号（例えば、蛍光、発光、など）のなかから適切に選択されてよく、前記信号の測定は、用いられた信号の種類により通常使用されるあらゆる方法のなかから適切に選択して行うことができる。前記生体分子は、生体から分離されたタンパク質、核酸、細胞などからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えばタンパク質であってもよい。前記生体分子がタンパク質である場合、タンパク質−タンパク質相互作用分析に用いられるタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置に含まれているマルチウェルは、分析対象タンパク質のうちのいずれか一つに特異的に結合する分子（例えば、抗体）が表面に固定されたものであってもよい。
【０１９１】
以下、添付した図面を参考として、本発明の実施例について、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができるように詳細に説明する。本発明は、多様な異なる形態に実現することができ、ここで説明する実施例に限定されない。図面において、本発明を明確に説明するために、説明上不要な部分は省略し、明細書全体にわたって同一または類似の構成要素については同一の参照符号を付した。
【０１９２】
また、図面に示された各構成の大きさおよび厚さは、説明の便宜のために任意に示したため、本発明は必ずしも図示されたものに限定されるのではない。
【０１９３】
図面において、複数の層および領域を明確に表現するために厚さを拡大して示した。そして、図面において、説明の便宜のために、一部の層および領域の厚さを誇張して示した。層、膜、領域、板などの部分が他の部分の「上に」あるという時、これは他の部分の「直上」にある場合だけでなく、その中間にまた他の部分がある場合も含む。
【０１９４】
また、明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という時、これは特に相反する記載がない限り、他の構成要素を除くのではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。また、明細書全体で、「〜上に」ということは、対象部分の上または下に位置することを意味するものであり、必ずしも重力方向を基準に上側に位置することを意味するのではない。
【０１９５】
以下、図２７を参照して本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置に含まれているマルチウェルについて例として説明するが、前記装置がこの構造に制限されるのではない。
【０１９６】
図２７は、本発明の一実施例によるタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置に含まれているマルチウェルを概略的に示す斜視図である。図２７を参照すると、タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置に含まれているマルチウェルの一例は、支持プレート１５５、１６５、１７５、複数の収容部１５３、貫通ホール１５１および基板３００を含むことができる。本実施例では、支持プレート１５５、１６５、１７５に形成された複数の収容部１５３それぞれに貫通ホール１５１が形成され、貫通ホール１５１の一側端部を、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）で表面処理された基板３００が覆うことができる。
【０１９７】
支持プレート１５５、１６５、１７５それぞれは、第１方向（Ｘ軸方向）に沿って延長された板状部材である。複数の支持プレート１５５、１６５、１７５は第３方向（Ｙ軸方向）に沿って予め定められた間隔で互いに離隔して配置されてもよい。本実施例では、支持プレート１５５、１６５、１７５が３個であると説明するが、これに限定されず、支持プレートは１個のみが配置されてもよく、４個以上配置されてもよい。
【０１９８】
複数の支持プレート１５５、１６５、１７５の両側端部は、一対の支持台１１０、１３０に固定結合されてもよい。これによって、複数の支持プレート１５５、１６５、１７５は互いに一定の間隔を維持したまま固定されることができる。
【０１９９】
複数の支持プレート１５５、１６５、１７５それぞれには複数の収容部１５３が配置されてもよい。複数の収容部１５３は、支持プレート１５５、１６５、１７５上に第１方向（Ｘ軸方向）に沿って互いに離隔して配置されてもよい。具体的に、複数の収容部１５３が支持プレート１５５、１６５、１７５の上に第１方向（Ｘ軸方向）に沿って一定の間隔で離隔して配置されてもよい。
【０２００】
複数の収容部１５３は突出形状からなることができる。例えば、複数の収容部１５３は支持プレート１５５、１６５、１７５の上に突出して形成されてもよい。図１に示されているように、複数の収容部１５３は六面体形態で支持プレート１５５、１６５、１７５の上に形成されてもよい。しかし、複数の収容部１５３の形状はこれに限定されず、多様な形態で配置され得る。
【０２０１】
本実施例では、支持プレート１５５、１６５、１７５と複数の収容部１５３は一体に形成されてもよい。例えば、支持プレート１５５、１６５、１７５と複数の収容部１５３は、一つの板状部材をレーザで加工して製造されてもよい。
【０２０２】
複数の収容部１５３それぞれには、収容部１５３を貫通する貫通ホール１５１が形成されてもよい。貫通ホール１５１は第２方向（Ｚ軸方向）に沿って形成されてもよい。具体的に、貫通ホール１５１は、図１で上から下方向に貫通する形状を有することができる。ただし、貫通ホール１５１の一側端部は基板３００により閉鎖されてもよい。貫通ホール１５１は円形の断面形状を有することができる。
【０２０３】
前述のように、貫通ホール１５１の一側端部が閉鎖されることによって、収容部１５３は円筒形の容器（ｗｅｌｌ）形状を有することができる。複数の収容部１５３それぞれに形成された貫通ホール１５１により、複数の収容部１５３内部には試料、例えばタンパク質が収容されてもよい。
【０２０４】
一具体例で、複数の支持プレート１５５、１６５、１７５それぞれに複数の収容部１５３が形成されて、それぞれの収容部１５３に貫通ホール１５１が形成されることによって、マルチウェル（ｍｕｌｔｉ  ｗｅｌｌ）構造が形成されてもよい。前記ウェルの個数は、基板の大きさ、支持プレートおよび／または収容部の個数に応じて適切に調節することができる。各ウェルの大きさに特別な制限はないが、生体分子間の相互作用の検出が容易になるように、各ウェルの直径は約２ｍｍ以上、例えば、２乃至１０ｍｍ、２乃至８ｍｍ、２乃至６ｍｍ、２乃至５ｍｍ、２乃至４ｍｍ、または約３ｍｍであり、各ウェルの深さは直径の約１／２倍以上、例えば、直径の１／２乃至５倍、１／２乃至３倍、１／２乃至２倍、１乃至５倍、１乃至３倍、１乃至２倍であってもよい。また、各ウェルの反応信号の漏出（ｌｅａｋａｇｅ）および／または干渉を防止するために、隣接したウェル間の間隔は、ウェル中心間距離を基準に約５ｍｍ以上にし、ウェルの直径を考慮して適切に決めることができる。
【０２０５】
一方、複数の収容部１５３の上には基板３００が配置されてもよい。基板３００は透明材質からなることができるが、例えば基板３００はガラス基板であってもよい。
【０２０６】
基板３００は、複数の収容部１５３に形成された貫通ホール１５１の一側端部を覆うことができる。これによって、貫通ホール１５１の一側が基板３００により閉鎖されるようになり、前述のように収容部１５３は容器（ｗｅｌｌ）形状を有することができる。
【０２０７】
一例で、基板３００と収容部１５３は接着剤Ｅにより互いに付着されてもよい。接着剤Ｅはエポキシであってもよい。
【０２０８】
接着剤Ｅは、基板３００と収容部１５３が互いに接触する領域に隣接して塗布されるが、基板３００と収容部１５３を囲むように配置されてもよい（例えば、接着剤Ｅが貫通ホール内部に浸透しないように、接着剤Ｅを収容部１５３の外部周縁に適用する）。収容部１５３と基板３００を互いに結合させる過程で、基板３００と収容部１５３が互いに接触するように基板３００を収容部１５３の上に配置させ、接着剤Ｅを、基板３００と収容部１５３を囲むように塗布することができる。
【０２０９】
接着剤Ｅを、基板３００および収容部１５３を囲むように塗布することによって、接着剤Ｅが貫通ホール１５１内部に浸透することを防止することができる。前述のように接着剤Ｅがエポキシからなる場合、エポキシが貫通ホール１５１内部に浸透すれば、エポキシが、貫通ホール１５１内部に収容される試料と接触し得る。これによって、タンパク質のような試料などがエポキシと反応するようになり、試料などが非特異的に吸着され得る。したがって、本実施例では、貫通ホール１５１内部に収容される試料などが接着剤Ｅであるエポキシなどと接触して変形することを防止することができる。
【０２１０】
また、支持プレート１５５、１６５、１７５の上に形成される収容部１５３が、互いに離隔して配置されて、それぞれの収容部１５３周縁に沿って接着剤Ｅを容易に塗布することができる。
【０２１１】
一方、本実施例の変形例では、収容部１５３と基板３００の間に接着剤Ｅが介在することもできる。この時、収容部１５３と基板３００を互いに接触させる前に、収容部１５３または基板３００に接着剤Ｅを塗布する。その後、収容部１５３と基板３００を互いに接触させ、ＵＶを照射すると、接着剤を迅速に硬化させることができる。前記で用いられる接着剤ＥはＵＶエポキシであってもよい。
【０２１２】
収容部１５３と基板３００の間に位置する接着剤Ｅは、貫通ホール１５１内部には配置されない。つまり、接着剤Ｅは貫通ホール１５１の内面から一定の間隔（Ｌ１）の分だけ、入るように配置されてもよい。接着剤Ｅが一定の間隔（Ｌ１）分だけ、内部に入ることによって、貫通ホール１５１内部に収容される試料が接着剤Ｅと接触することを減少させることができる。この時、基板３００の厚さ（Ｈ）は０．１７ｍｍ〜０．１９ｍｍであってもよい。接着剤Ｅにより、収容部１５３と基板３００を付着する具体的な過程については、タンパク質−タンパク質相互作用測定用装置の製造方法で説明する。
【０２１３】
前述のように、接着剤Ｅを基板３００および収容部１５３を囲むように塗布することによって、接着剤Ｅが貫通ホール１５１内部に浸透することを防止することができる。接着剤Ｅがエポキシからなる場合、エポキシが貫通ホール１５１内部に浸透すれば、エポキシが、貫通ホール１５１内部に収容される試料と接触し得る。これによって、タンパク質のような試料などがエポキシと反応するようになり、試料などが変形することがある。したがって、本実施例では、貫通ホール１５１内部に収容される試料などが接着剤Ｅであるエポキシなどと接触して変形することを防止することができる。
【０２１４】
基板３００と収容部１５３の間に介在する接着剤Ｅが、貫通ホール１５１内部に配置されないように、基板３００と接触する収容部１５３にのみ接着剤Ｅを塗布する。
【０２１５】
ＵＶエポキシが硬化する過程で、貫通ホール１５１内部に浸透せずに迅速に硬化するように、ＵＶエポキシにＵＶを照射する。この時、ＵＶを照射すると、ＵＶエポキシが硬化する時間を短縮することができる。
【０２１６】
本実施例では、ＵＶを照射する時、マスク５００を用いることができる。マスク５００は、貫通ホール１５１に対応する基板３００領域にＵＶが通過することを遮断することができる。より詳細に、図２６に示されているように、マスク５００には、貫通ホール１５１に対応する位置にＵＶ遮断領域が形成されている。このようなＵＶ遮断領域により、貫通ホール１５１に対応する基板３００領域にＵＶが照射されることを遮断することができる。
【０２１７】
前述のように、貫通ホール１５１に対応する基板３００表面には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）とビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を混合して表面処理が行われてもよい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）で表面処理された基板３００を、接着剤Ｅを利用して収容部１５３と付着させた後、ＵＶを照射すると、表面処理された基板３００が変形または損傷されることがある。貫通ホール１５１内に配置された基板３００にＵＶが照射されると、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）がＵＶにより損傷して、基板３００にニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）が固定されることができない。
【０２１８】
基板３００にニュートラアビジンが固定されなければ、基板３００に特定のビオチン−抗体が付着し難い。結局、特異的抗体であるビオチン−抗体と結合できる特異的抗原を捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）することができなくなる。つまり、本変形例によると、ＵＶエポキシを迅速に硬化させるためにＵＶを用いる時、貫通ホール１５１に対応する基板３００の領域にＵＶが照射されることを遮断すれば、貫通ホール１５１内部に収容される試料、例えば特定のタンパク質が基板３００表面に良好に付着するようにできる。
【０２１９】
図３１は、貫通ホール１５１に対応する基板３００領域にＵＶが照射されることを遮断する場合（本変形例（Ａ））と、ＵＶが照射されることを遮断しない場合（比較例（Ｂ））を実験した結果である。図３１の横軸の結果値は、基板３００表面で検出されるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の個数を相対的に示す値である。
【０２２０】
図３１（Ａ）、（Ｂ）を参照すると、当該基板３００領域にＵＶが照射されることを遮断する場合に、遮断しない場合に比べて、抗原であるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が多量検出されることを確認できる。
【０２２１】
図３１（Ａ）のように、基板３００領域にＵＶが照射されることを遮断すれば、基板３００にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が損傷されずに塗布されることができる。これによって、基板３００にニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）も固定され得る。結局、基板３００に抗体（ＧＦＰ抗体）が固定され、抗原のＧＦＰを捕獲することができる。
【０２２２】
反対に、図３１（Ｂ）のように、基板３００領域にＵＶが照射されると、基板３００に塗布されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が損傷されることがある。これによって、基板３００にニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）も固定されにくくなる。結局、基板３００に抗体（ＧＦＰ抗体）が固定されることができなくなり、抗原であるＧＦＰも捕獲することができなくなる。
【０２２３】
他の例で、前記で説明したように、第１タンパク質に特異的に結合する第１タンパク質の捕獲用物質を含むマルチウェルを含む、タンパク質−タンパク質相互作用測定用キットが提供される。前記タンパク質−タンパク質相互作用測定用キットは、組織内の信号伝達経路の活性化測定用キット、第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測および／またはモニタリング用キット、第１タンパク質を標的とする治療に適した個体を選別するためのキット、および／または第１タンパク質を標的とする薬物の効能確認用キットとして適用可能である。
【０２２４】
本明細書に提供されたタンパク質−タンパク質相互作用測定用装置は、少量の試料での生体分子間の相互作用も正確かつ効率的に観察、分析、検出、および／または測定することができるという利点を有する。したがって、前記マルチウェルまたはこれを利用する分析方法は、生検（例えば、ｎｅｅｄｌｅ  ｂｉｏｐｓｙ）試料のような非常に少量の試料に対しても有用かつ効果的に適用され得る。
【０２２５】
本明細書で提供される方法は、特定標的治療が個々の患者で如何なる反応を示すのかに対する予測または個別患者に適した標的治療の選定が可能になるため、患者一人一人の注文型治療戦略開発のためのプラットホームとして有用であると期待される。
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
以下の段階を含む、細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法：
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識物質が結合された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階；ならびに
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料内の第１タンパク質の単位量に対する信号値を求める段階、または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階。
［２］
前記試験試料は、哺乳類個体から分離された細胞、組織、細胞もしくは組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物、または体液である、［１］に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［３］
前記標識物質は、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出を通じて測定可能な信号を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上である、［１］に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［４］
段階（２）の標識物質は、蛍光を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上であり、段階（３）の信号を測定する段階は、全反射蛍光顕微鏡もしくは蛍光カメラまたはこれら両方を用いて行われるものである、［１］に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［５］
前記蛍光カメラの１フレーム当り露出時間が約０．００１秒乃至約１秒である、［４］に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［６］
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される１種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質である、［１］乃至［５］のいずれか一項に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［７］
前記第１タンパク質は、細胞膜タンパク質である、［６］に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［８］
前記第１タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ、トル様受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、ＲＯＳ１；ＢＣＲ−Ａｂｌ１融合タンパク質；非受容体型キナーゼ；ＧＴＰ加水分解酵素（ＧＴＰａｓｅｓ）；ホルモン受容体；抗アポトーシスタンパク質；および免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択された１種以上である、［７］に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［９］
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される２種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質であり、
段階（４）または（４−２）で得られた、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値は、それぞれの第１タンパク質とそれぞれの第２タンパク質に対して得られた値を全て合算した値である、［１］乃至［５］のいずれか一項に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［１０］
段階（４）または（４−２）以降に、
（５）段階（４）または（４−２）で得られた結果を基準試料で得られた結果と比較する段階を追加的に含み、
前記基準試料は、正常細胞、第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が確認された細胞、または第１タンパク質が関与する信号伝達経路の活性化程度が確認された個体から分離された細胞を含むものである、
［１］乃至［５］のいずれか一項に記載の細胞または組織内の信号伝達経路の活性化測定方法。
［１１］
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識物質が結合された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階；および
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階、または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階
を含み、
前記試験試料は、哺乳類個体から分離された細胞、組織、細胞もしくは組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物、または体液である、
個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１２］
前記試験試料は、癌細胞、癌組織、癌細胞または癌組織の溶解物、破砕物、または抽出物である、［１１］に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１３］
前記標識物質は、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出を通じて測定可能な信号を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上である、［１１］に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１４］
段階（２）の標識物質は、蛍光を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上であり、段階（３）の信号を測定する段階は、全反射蛍光顕微鏡もしくは蛍光カメラまたはこれらの両方を用いて行われるものである、［１１］に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１５］
前記蛍光カメラの１フレーム当り露出時間が約０．００１秒乃至約１秒である、［１４］に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１６］
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される１種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質である、［１１］乃至［１５］のいずれか一項に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１７］
前記第１タンパク質は、細胞膜タンパク質である、［１６］に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１８］
前記第１タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ、トル様受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体類（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、ＲＯＳ１；ＢＣＲ−Ａｂｌ１融合タンパク質；非受容体型キナーゼ；ＧＴＰ加水分解酵素（ＧＴＰａｓｅｓ）；ホルモン受容体；抗アポトーシスタンパク質；および免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択された１種以上である、［１７］に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［１９］
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される２種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質であり、
段階（４）または（４−２）で得られた、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値は、それぞれの第１タンパク質とそれぞれの第２タンパク質に対して得られた値を全て合算した値である、
［１１］乃至［１５］のいずれか一項に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［２０］
段階（４）または（４−２）以降に、
（５）段階（４）または（４−２）で得られた結果を、基準試料で得られた結果と比較する段階を追加的に含み、
前記基準試料は、正常細胞、正常細胞または前記第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性が確認された細胞を含むものである、
［１１］乃至［１５］のいずれか一項に記載の個体の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測のために情報を提供する方法。
［２１］
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識物質が結合された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階；ならびに
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階、または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階
を含み、
前記試験試料は、哺乳類個体から分離された細胞、組織、細胞もしくは組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物、または体液である、
第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２２］
前記試験試料は、癌細胞、癌組織、癌細胞または癌組織の溶解物、破砕物、または抽出物である、［２１］に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２３］
前記標識物質は、酵素反応、蛍光、発光、または放射線検出を通じて測定可能な信号を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上である、［２１］に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２４］
段階（２）の標識物質は、蛍光を発生させる小分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸分子からなる群より選択された１種以上であり、段階（３）の信号を測定する段階は、全反射蛍光顕微鏡もしくは蛍光カメラまたはこれらの両方を用いて行われるものである、［２１］に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２５］
前記蛍光カメラの１フレーム当り露出時間が約０．００１秒乃至約１秒である、［２４］に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２６］
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される１種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質である、［２１］乃至［２５］のいずれか一項に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２７］
前記第１タンパク質は、細胞膜タンパク質である、［２６］に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２８］
前記第１タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ、トル様受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体類（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、ＲＯＳ１；ＢＣＲ−Ａｂｌ１融合タンパク質；非受容体型キナーゼ；ＧＴＰ加水分解酵素（ＧＴＰａｓｅｓ）；ホルモン受容体；抗アポトーシスタンパク質；および免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択された１種以上である、［２７］に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［２９］
前記第１タンパク質と第２タンパク質は、それぞれ独立して細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される２種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質であり、
段階（４）または（４−２）で得られた、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値は、それぞれの第１タンパク質とそれぞれの第２タンパク質に対して得られた値を全て合算した値である、
［２１］乃至［２５］のいずれか一項に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［３０］
段階（４）または（４−２）以降に、
（５）段階（４）または（４−２）で得られた結果を、基準試料で得られた結果と比較する段階を追加的に含み、
前記基準試料は、正常細胞、正常細胞または前記第１タンパク質を標的とする治療の効果が確認された細胞を含むものである、
［２１］乃至［２５］のいずれか一項に記載の第１タンパク質を標的とする治療に適した個体選別のために情報を提供する方法。
［３１］
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識物質が結合された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定する段階；ならびに
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階、または
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求める段階；および
（４−２）前記段階（４−１）で得られた試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求める段階；ならびに
（５）前記段階で得られた結果を比較する段階を含み、
前記試験試料は、哺乳類個体から分離された細胞、組織、細胞もしくは組織の溶解物、破砕物、もしくは抽出物、または体液であり、
前記第１タンパク質は、細胞または組織の信号伝達経路に関与するタンパク質のなかから選択される２種以上であり、前記第２タンパク質は、信号伝達経路上で第１タンパク質より下流経路に関与するタンパク質であり、
段階（５）は、前記２種以上の第１タンパク質に対して得られた結果を互いに比較するものである、
個体に適用することに適した標的薬物の選別のために情報を提供する方法。
［３２］
（Ｉ）試験試料を候補化合物で処理する段階、ならびに
（ＩＩ）前記候補化合物で処理された試験試料および処理されていない試験試料のそれぞれに対して、下記の段階（１）、（２）、（３）、および（５）、または（１）、（２）、（３）、（４）、および（５）、または（１）、（２）、（３）、（４−１）、および（５）、または（１）、（２）、（３）、（４−１）、（４−２）、および（５）を行う段階
を含む、第１タンパク質を標的とする候補薬物の選別方法：
（１）第１タンパク質を含む試験試料を、前記第１タンパク質に特異的に結合する物質を表面に含む基板に加えて、第１タンパク質が固定された基板を準備する段階；
（２）前記準備された、第１タンパク質が固定された基板に、標識された第２タンパク質を添加して反応させる段階；
（３）段階（２）で得られた反応物から信号を測定してタンパク質−タンパク質相互作用を測定する段階；
（４）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求めて活性化水準を測定する段階；
（４−１）段階（３）で測定された信号を利用して、段階（１）で添加した試験試料の単位量に対する信号値を求めてタンパク質−タンパク質相互作用水準を測定する段階；
（４−２）段階（４−１）で得られた、試験試料の単位量に対する信号値を利用して、試験試料に含まれている第１タンパク質の単位量に対する値を求めて活性化水準を測定する段階；
（５）前記候補化合物で処理されていない試験試料および処理された試験試料に対して、前記段階（３）、段階（４）、段階（４−１）、または段階（４−２）で得られたそれぞれの結果を互いに比較する段階。
［３３］
前記段階（５）以降に
（６）前記段階（５）での比較の結果、候補化合物で処理された試験試料のタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用水準、または活性化水準が、候補化合物で処理されていない試験試料におけるより高い場合、前記候補化合物を、前記第１タンパク質を標的とする候補薬物として選択する段階を追加的に含む、［３２］に記載の第１タンパク質を標的とする候補薬物の選別方法。
［３４］
第１タンパク質に特異的に結合する、第１タンパク質の捕獲用物質を含むマルチウェル、および
信号検出手段
を含み、
前記第１タンパク質は、信号伝達経路に関与するタンパク質から選択された１種以上であり、
前記マルチウェルは、一面が開放された複数の管を含むか、支持プレートに離隔形成された複数の非貫通型ホールを含むものであって、
前記管または非貫通型ホールの開放された一面に位置する試料注入部、
前記管または非貫通型ホールの内部の、タンパク質−タンパク質相互作用が起こる反応部、および
前記管または非貫通型ホールの内部と接触する少なくとも一部の内壁の表面に第１タンパク質の捕獲用物質が固定化されまたは固定化可能な、第１タンパク質の捕獲部を含み、
前記第１タンパク質の捕獲部の表面は、アルデヒド基、カルボキシル基およびアミン基からなる群より選択された作用基を含む化合物で表面処理されたものである、
第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測用装置。
［３５］
前記表面処理は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ビオチンが結合されたウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール−ビオチン（ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ）、またはポリソルベートを用いるものである、［３４］に記載の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測用装置。
［３６］
前記表面処理は、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、およびアビジン（ａｖｉｄｉｎ）からなる群より選択された１種以上を追加的に塗布するものである、［３５］に記載の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測用装置。
［３７］
前記マルチウェルは、検出可能な信号を発生させる標識物質で標識された、信号伝達経路上で前記第１タンパク質の下流経路に関与する１種以上の第２タンパク質を追加的に含むものである、［３４］乃至［３６］のいずれか一項に記載の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測用装置。
［３８］
前記マルチウェルは、
第１タンパク質と第２タンパク質の間の相互作用が起こる反応部（第１反応部）を含む一つ以上のウェル、および第１タンパク質と第１タンパク質に結合する探知用物質とが結合する反応部（第２反応部）を含む一つ以上のウェルを含むものである、［３４］乃至［３６］のいずれか一項に記載の第１タンパク質を標的とする薬物に対する反応性予測用装置。
【実施例】
【０２２６】
下記の実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【０２２７】
実施例１：第１タンパク質（ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３）の準備
第１タンパク質としてＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３を選定し、これを含む細胞株（例えば、癌細胞株）または癌細胞組織を溶解して得られた溶解物（ｌｙｓａｔｅ）から前記第１タンパク質を得た。以下で本過程をより詳細に説明する：
【０２２８】
１．１．細胞溶解物の準備
１．１．１．細胞株の準備
細胞株を培地（ＲＰＭＩ１６４０、ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  １１９６５−０９２）に２ｘ１０６細胞の量で分けて培養した。１００−ｐｉ培養ディッシュ（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ）で９０％集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）以上である時、前記細胞株を収集して２個の１．５ｍｌチューブに分けて入れた。前記チューブを遠心分離（５ｍｉｎｘ１５，０００ｇ）して培養培地を除去した後、細胞のみを残して−８０℃に凍らせて保管した。
【０２２９】
準備された細胞株を下記の表１に整理した：
【０２３０】
【表１】
0006931942.tif 000003
【０２３１】
１．１．２．細胞溶解物の準備
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８３４０）１００Ｘ、およびチロシンホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６）１００Ｘの組成を有する細胞溶解バッファーを準備した。
【０２３２】
前記実施例１．１．１で準備された細胞株試料をピペッティングして、かたまっている細胞をピペットで解いた。前記ピペッティングした細胞株試料に、前記準備された細胞溶解バッファーを、各チューブ当り２００ｕｌの量で入れ、氷上におかれたｃｏｌｄ  ｂｌｏｃｋ（０−４℃）に保管しながら総３０分間反応させた。この時、１０分間隔で周期的なピペッティングを通じて物理的に混合する過程を繰り返して、界面活性剤による細胞溶解反応が活発に起こるようにした。
【０２３３】
前記のように３０分反応後、遠心分離を行った（１０ｍｉｎ、１５，０００ｇ、４℃）。その後、沈んだ部分（ｐｅｌｌｅｔ）は捨て、上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のみを取って０．２ｕｍ大きさの気孔を有するメンブレンを用いて濾過させて、前記メンブレンを通過した部分を新しいチューブに移して入れ、次の試験に使用時まで保管した。
【０２３４】
全タンパク質計量法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、ＢＣＡ、ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙなど）を利用して前記反応結果物内の全タンパク質濃度を測定した結果、タンパク質濃度が約５−１０ｍｇ／ｍｌ程度に測定された。
【０２３５】
１．２．組織溶解液の準備
１．２．１．患者由来腫瘍異種移植モデルの準備
肺扁平細胞癌（Ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＳＱＣＣ）患者由来の腫瘍異種移植片（ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を延世大学研究チームから入手した。患者由来腫瘍異種移植片（Ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ（ＰＤＴＸｓ））の製作過程を簡略に説明すると以下のとおりである：６乃至８週齢の重症複合免疫不全症の雌マウス（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ；ＮＯＧ）およびヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ  ｍｉｃｅ；ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ）を準備した。全ての動物試験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたガイドラインに従って行った。患者由来の臨床腫瘍サンプルを、３ｍｍ以下の大きさの切片に切断した後、前記準備されたＮＯＧマウスの横腹に皮下移植した。腫瘍の大きさはカリパスで週２回測定して、皮下組織での成長率を測定した。腫瘍の大きさが直径１．５ｃｍ程度になると、腫瘍組織を摘出して、小さい切片（１辺の長さが約５ｍｍである六面体）に切断した。その後、切断された組織を他のマウスに再移植して連続的に後継腫瘍（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ）を含む個体を得た。このように得られた患者由来腫瘍を有するマウスをＦ０と命名し、これから連続的に由来するｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｕｍｏｒを有するマウスを、一連番号を付けてＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４などと称した。３世代目のｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｕｍｏｒを有するマウス（Ｆ３）に、ビヒクル（ＰＢＳ）またはゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）を投与して試験に用いた。前記準備されたＰＤＴＸｓに５０ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブまたはビヒクルを一日一回腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）投与した。ゲフィチニブ投与から１５日後、ＰＤＴＸから腫瘍組織を回収して、下記のＰＰＩおよび発現水準変化モニタリングに用いた。
【０２３６】
１．２．２．組織溶解液の準備
前記実施例１．２．１．で得られた腫瘍組織を２０ｍｍ３程度の量で準備したが、これより大きい場合でも構わない。
【０２３７】
前記準備された腫瘍組織２０ｍｍ３当り、前記の実施例１．１．２で準備された溶解バッファーを約３００ｕＬ程度添加し、４℃冷蔵庫で１時間継続して回転させながら反応させた。この時、手術用はさみを利用して組織の大きさを最大限細かく作り、単位体積当り表面積を広くして、溶解バッファー内の界面活性剤による化学反応が最大限効率的に起こり得るようにした。
【０２３８】
前記のように１時間反応後、遠心分離を行った（１０ｍｉｎ、１５，０００ｇ、４℃）。その後、沈んだ部分（ｐｅｌｌｅｔ）は捨て、上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のみを取って０．２ｕｍの大きさの気孔を有するメンブレンを用いて濾過させて、前記メンブレンを通過した部分を新しいチューブに移して入れ、次の試験に使用時まで保管した。
【０２３９】
全タンパク質計量法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、ＢＣＡ、ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙなど）を利用して、前記反応結果物内の全タンパク質濃度を測定した結果、タンパク質濃度が約５−１０ｍｇ／ｍｌ程度に測定された。
【０２４０】
実施例２：第２タンパク質の準備
本実施例では、前記実施例１で準備された第１タンパク質の下流信号伝達タンパク質に蛍光タンパク質が付着された形態である第２タンパク質の準備過程が例示される。
【０２４１】
本実施例で例示される第２タンパク質を下記の表２に整理した：
【０２４２】
【表２】
0006931942.tif 000004
【０２４３】
前記第２タンパク質の準備のために、前記実施例１で準備された第１タンパク質の発現が少ない細胞株であるＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）およびＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を準備した。
【０２４４】
前記表２に記載された第２タンパク質それぞれについての発現ベクターを、前記準備されたＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａ細胞に注入して培養し、第２タンパク質を発現させた。２４時間培養後、細胞を収集した後、適切な量に分配して−８０℃に保管した。
【０２４５】
前記細胞に溶解液（（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８３４０）１００Ｘ、チロシンホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６）１００Ｘ））を入れた。高濃度の界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）はタンパク質相互作用を妨害することがあるため、まず５ｘ１０５細胞に対して６０ｕＬの溶解液を投入した。
【０２４６】
ピペッティングを通じて、かたまっている前記得られた反応混合物内の細胞を全て解いた後、これを氷上におかれたｃｏｌｄ  ｂｌｏｃｋ（０−４℃）に保管しながら総３０分間反応させた。この時、１０分間隔で周期的なピペッティングを通じて物理的に混合する過程を行って、界面活性剤による溶解反応が活発に起こるようにした。
【０２４７】
３０分反応後、遠心分離を行った（１０ｍｉｎ、１５，０００ｇ、４℃）。沈んだ部分（ｐｅｌｌｅｔ）は捨て、水溶液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のみ、実験のために新しいチューブに移し入れた。
【０２４８】
前記得られた水溶液６０ｕＬを取って１４０ｕＬのＰＢＳに添加した。このようにすると、最終的に０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含まれている第２タンパク質の溶解液を得ることができる。蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｅｍｅｔｅｒ）を利用して、第２タンパク質に付着された蛍光タンパク質の濃度を測定した。その結果、用いられた３種の第２タンパク質の濃度がほぼ４００乃至１０００ｎＭ範囲内に測定された。
【０２４９】
実施例３：基板の準備
カバースリップをＫＯＨ  １Ｍ溶液に浸漬させた後、ソニケーターに入れて洗浄した（２０−３０ｍｉｎ）。その後、３次蒸溜水でよく洗った後、ピラニア溶液（硫酸：過酸化水素＝２：１〜３：１（ｖ／ｖ））を利用して洗浄した。洗浄したカバースリップ表面に対してアミノプロピルシランとＰＥＧで順次に処理してコーティングを行った。
【０２５０】
２時間反応後、３次蒸溜水で洗浄した後、ＰＥＧコーティングされた面が接触しないようにして、使用時まで−２０℃で保管した。
【０２５１】
同時に、石英材質のチャンネル（ｃｈａｎｎｅｌ）形態の基板またはアクリル材質のウェル（ｗｅｌｌ）形態の基板を準備した。石英材質の基板の場合、前記で説明したカバースリップ処理過程を参照して洗浄およびＰＥＧコーティング過程を行った。
【０２５２】
アクリル材質の基板の場合、製作後、３次蒸溜水に浸漬させた後、ソニケーションして洗浄した。洗浄されたアクリル材質の基板を５％  ＢＳＡ溶液に浸漬させて２時間反応させることにより非特異的なタンパク質吸着（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）を防止し、使用時まで−２０℃で保管した。
【０２５３】
下記試験では、前記準備されたカバースリップとアクリル材質の基板を用い、試験前に前記カバースリップとアクリル材質の基板を解凍して組み立て、あるいはＰＥＧコーティングが終わった後に予め組み立てて、組み立てられた形態で−２０℃に保管して使用前に解凍して用いた。
【０２５４】
実施例４：第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用のイメージング
前記準備された基板に、アビジン系のタンパク質であるＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２６６６）を０．１ｍｇ／ｍｌ濃度に投入した。常温で５分間反応させた後、ＰＢＳバッファー３０ｕｌを利用して２回基板を洗浄した。
【０２５５】
前記準備された基板に、標的になる第１タンパク質に対する抗体を投入した。この時、用いられる抗体は、ビオチンが接合された形態であるものを準備した。抗体の濃度は抗体−抗原の親和性（解離定数、ＫＤ）に応じて適切に調節されてもよく、本実験例では２ｕｇ／ｍｌ程度に用い、反応時間は５分程度にした。もしビオチンが接合されていない抗体を用いる場合には、二次抗体を利用して第１タンパク質の抗体を付着することができる。
【０２５６】
この時、用いられた第１タンパク質に対する抗体を次の表３に整理した：
【０２５７】
【表３】
0006931942.tif 000005
【０２５８】
前記抗体で処理された基板を、ＰＢＳバッファー３０ｕｌを利用して２回洗浄した。前記準備された基板に、前記の実施例１で準備した第１タンパク質を含んでいる細胞溶解液または組織溶解液を投入した。抗原−抗体反応の場合、１５分までは継続して増加することがあり、１５分を超えると時間と対比して抗原−抗体反応効率が低くなることがあるため、反応時間を１５分程度に設定した。
【０２５９】
反応後、ＰＢＳにｔｗｅｅｎ２０が０．０５％（ｖ／ｖ）含まれているバッファーを利用して基板を洗浄した。Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％は非特異的結合を減らすと同時に、膜タンパク質の疎水性領域が壊れないように助ける。
【０２６０】
その後、前記基板に、実施例２で得られた第２タンパク質溶解液を投入した。用いられた第１タンパク質溶解液内の第２タンパク質の濃度は、蛍光タンパク質を基準に１−５０ｎＭの間の値（約３０ｎＭ）にした。第２タンパク質濃度が１００ｎＭ以上になると蛍光顕微鏡でバックグラウンドノイズが大きくなって正確な蛍光信号の測定に妨害になりうる。
【０２６１】
蛍光顕微鏡に基板を固定させてイメージングして、それぞれの第１タンパク質／第２タンパク質についてのデータを得た。
【０２６２】
実施例５：タンパク質−タンパク質相互作用複合体（ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の分析
Ｍａｔｌａｂプログラム（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ提供）で提供されるｔｏｏｌｋｉｔに基づいてタンパク質複合体を分析した。
【０２６３】
前記実施例４で得られた蛍光イメージを１６ｂｉｔ  ｕｎｓｉｇｎｅｄ  ｉｎｔｅｇｅｒ形式で保存した。蛍光信号はｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）から得ており、前記信号を観測するためにレーザの波長を４８８ｎｍにし、ｅＧＦＰの発光時間を１１秒程度維持させるためにレーザパワーを２ｍＷに調節して用いた。全フレーム（３０フレーム）中の初期フレームを捨て、３個のフレーム（２２−２５番目フレーム）のイメージを平均化して一つのイメージを生成し、このような過程をウェル内で位置を移しながら反復して行って、全５個のイメージを獲得して以下の過程を行った。初期の２０フレーム程度を捨てる理由は、何もない基板の表面でも発生する不必要な信号（自己蛍光：ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が無くなり、ｅＧＦＰ信号が維持される区間を選別して用いるためである。このように選別される区間はイメージング条件／装備構築状態により変わり得る。本実施例ではＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ；Ａｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８９７  ＥＸ２（ＤＵ−８９７Ｕ−ＣＳ０−ＥＸＦ））カメラを用いて、１フレーム当り露出時間を０．１秒にし、ＥＭＣＣＤ  ｇａｉｎ値は４０にして蛍光イメージを得た。
【０２６４】
ノイズを除去するために、各フレーム毎に以下のような手順を行った：
（ａ）最初の開始は左側上端から始まる。１フレームは５１２ｘ５１２個のピクセルで構成されている。基準ピクセルを基準に、右側に１１個、下側に１１個である１１ｘ１１個のピクセルでｍｅｄｉａｎ値（中央値）を求め、このｍｅｄｉａｎ値を基準ピクセルの数値から除いた［（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＿ｐｉｘｅｌ）−（ｍｅｄｉａｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ＿１１ｘ１１ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）］。５１２ｘ５１２の全てのピクセルに対しての上記手順を行った。Ｍｅｄｉａｎ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇを通じてｐｅｐｐｅｒ＆ｓａｌｔ  ｎｏｉｓｅを除去した。
（ｂ）前記の処理されたイメージで、ｓｉｇｍａ＝０．７、ｓｉｚｅ＝５ｘ５のＧａｕｓｓｉａｎ  ｓｍｏｏｔｈｉｎｇを行って、イメージを柔らかく作った。
（ｃ）Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（閾値）を設定した。Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄは、全体イメージでピクセル強度（ｐｉｘｅｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）がｔｈｒｅｓｈｏｌｄ以下になるピクセルの値をｔｈｒｅｓｈｏｌｄ値に全部作る（Ｍａｔｌａｂ  ｔｏｏｌｋｉｔでｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍを探すアルゴリズムを用いる）。これによって、イメージで蛍光信号により作られない局所極大値（ｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍ）を除去することができる。本実施例のイメージング条件で用いられるｔｈｒｅｓｈｏｌｄ値は７０である。
【０２６５】
蛍光タンパク質から出る信号は、特定の位置に集まっている形態（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＰＳＦ））で発生するが、このＰＳＦ個数（物理的な値）が、測定しようとする第１タンパク質と第２タンパク質の間のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ数字（生物学的な値）である。前記ＰＳＦ値は以下のような過程を経て生物学的な値であるＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ値に転換させた：
（ａ）Ｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍの位置を求めた（例えば、ｉ番目ｒｏｗ、ｊ番目ｃｏｌｕｍｎ  ｐｉｘｅｌ）。前記で記述したとおり、単分子蛍光信号は、５１２ｘ５１２ピクセル中で特定の位置（現在の観測装備下でほぼ５ｘ５ピクセルサイズ、１ｐｉｘｅｌ＝０．１６７マイクロメーター）に集まって形成されるため、Ｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍを探せば個別のＰＳＦを選別することができる。これはＭａｔｌａｂで提供されるｔｏｏｌｋｉｔを利用して求めることができる。
（ｂ）前記（ａ）で求めたＬｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍが、実際ＰＳＦから発生したものであるかについての判別過程を経る。まず、Ｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍの最小値（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を定義し、前記得られたＬｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍ中でこの最小値より大きい場合のみを分析に用いた。本実施例で用いられた最小値は７５であり、この値はレーザパワー／露出時間／装備構築状況により変わり得る。最終的に得られたＬｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍ座標を中心に５ｘ５ピクセルの情報を呼び出した後、この５ｘ５ピクセルで明るさについての中心を求めた（ｃｅｎｔｒｏｉｄ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）。この時、求められた明るさの中心が、既存のＬｏｃａｌ  ｍａｘｉｍｕｍ座標に対して０．５ｐｉｘｅｌ以上外れるようになると（ＰＳＦパターンについての２Ｄ対称性が無くなると）、正常的でない蛍光信号と判断して分析から除外させた。
（ｃ）全ての条件を通過したＰＳＦのみを最終的に選別して、座標と全体個数を求めた。この時、得られたＰＳＦ全体個数がＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの個数となる。
【０２６６】
同じ条件下で撮影された全てのファイルについて前記過程を行ってＰＳＦ個数を求めた後、これを集めて平均と標準偏差を求めた。この値が、最終的に特定の条件でＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの個数を示す値になる（図面中に「Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」で表示される）。
【０２６７】
実施例６：ＰＰＩ強さ、ＰＰＩスコア（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）、および活性化スコア（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）の決定
細胞溶解物（実施例１．１．２参照）の濃度をｘ軸にし、各細胞溶解物で測定されたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ値（実施例５参照）をｙ軸にして得られたグラフの傾き、つまり、［（ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ）／（細胞溶解液単位濃度１μｇ／ｍｌ）当りＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数）］を、前記細胞での第１タンパク質と第２タンパク質の間のＰＰＩ強さ（またはＰＰＩ  ｓｌｏｐｅ）と定義した。各細胞株別に、得られた全てのＰＰＩ強さを合算してＰＰＩ強さの総和を求め、この値をその細胞株に対するＰＰＩスコア（ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ）と定義した。前記ＰＰＩ強さの総和（またはＰＰＩスコア）は、各細胞株の細胞溶解物単位濃度での試験された第１タンパク質と第２タンパク質の総ＰＰＩ程度を示す。
【０２６８】
前記ＰＰＩ強さの総和を求める方法を数式で表現すれば以下のとおりである：
【数２】
0006931942.tif 000006
【０２６９】
（第１タンパク質：ＲＴＫ（肺癌の場合、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３；乳癌の場合ＨＥＲ２およびＨＥＲ３；
第２タンパク質：下流タンパク質（ＰＬＣ−ｇａｍｍａ−ＳＨ２、Ｇｒｂ２、ｐ８５−ａｌｐｈａ））。
【０２７０】
また、複数の細胞株の間の相対的なＰＰＩスコアを示すために、特定の細胞株（以下、「基準細胞」と称する；本試験例で、肺癌細胞株中ではＰＣ９細胞を、乳癌細胞株中ではＳＫＢＲ３細胞をそれぞれ用いる）のＰＰＩスコアが１になるように、他の細胞（前記基準細胞を除いた細胞として、以下、「試験細胞」と称する）で得られたＰＰＩスコアを標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）し、この時、それぞれの細胞株について得られた値を、その細胞株についての標準化ＰＰＩスコアと定義した。
【０２７１】
また、各細胞溶解物内の第１タンパク質（例えば、ＲＴＫ（肺癌の場合、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３；乳癌の場合、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）の総量を測定した。前記第１タンパク質の総量は、前記で記載したそれぞれの抗体（表３参照）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡまたは定量的ウェスタンブロットなどを通じて定量した後、細胞溶解物の重量（細胞溶解物内の総タンパク質重量）で割った値に定めた。
【０２７２】
前記得られたＰＰＩスコアまたは標準化ＰＰＩスコアを、第１タンパク質の総量で割って得られた値を、活性化スコア（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）と定義した。この時、複数の細胞株の間の相対的な活性化スコアを示すために、基準細胞（肺癌細胞株：ＰＣ９細胞、乳癌細胞株：ＳＫＢＲ３細胞）の活性化スコアが１になるように、試験細胞で得られた活性化スコアを標準化し、この時、それぞれの細胞株について得られた値をその細胞株についての標準化活性化スコアと定義した。
【０２７３】
ＰＤＴＸ（ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒｆｔ）マウスモデルでＰＰＩスコアを求める場合、前記方法で得られた値でｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ（陰性バックグラウンド）値を測定してこれを控除してバックグラウンドノイズを減らすことができる。この場合、陰性バックグラウンドは、同一患者の正常組織またはＥＧＦＲが正常である癌細胞溶解物を用いることができる。一例として、ＥＧＦＲ遺伝子が正常状態であるＡ５４９細胞で、ＥＧＦＲと各下流タンパク質の間の相互作用程度を測定してＰＰＩスコアを求める。これを陰性バックグラウンドに設定して、各ＰＤＴＸマウスモデルで得られたＰＰＩスコアにおいて陰性バックグラウンドを除いて最終のＰＰＩスコアを算出する。
【０２７４】
実施例７：ヒートマップ作成
データを実施例５で数値化したことに加えて、その分析に補充的判断を追加するためにヒートマップを作成した。ヒートマップはデータを示す一方法に過ぎず、データ解釈を特に制限するためのものではない。
【０２７５】
Ｘ軸とＹ軸のうち、一方の軸は第２タンパク質（下流信号タンパク質）にし、他方の軸は細胞種類にして、３ｘ１６（第２タンパク質個数（総３個：表２参照（ｐ８５−ａｌｐｈａ、Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−ｇａｍｍａ−ＳＨ２）ｘ細胞株個数（総１５個（肺癌細胞株）または総１１個（乳癌細胞株）：表１参照））の格子体を作り、このような格子体は、第１タンパク質別に総４つ（ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３；肺癌）、または総２個（ＨＥＲ２およびＨＥＲ３；乳癌）を作った（但し、ＨＥＲ３の場合、第２タンパク質としてｐ８５−ａｌｐｈａのみを用いる）。その後、当該細胞で得られた第１タンパク質と第２タンパク質の間のＰＰＩ強さに応じて色と明るさを変化させてヒートマップを作成した（例えば、ＰＰＩ強さが高くなるほど暗く、黒色から中間の明るさの赤色、明るい緑色の順に表示され得るが、これは各試験ごとに試験者が決定する値に定められた値ではない）。如何なる細胞を基準にするとしても、細胞株間の相対的な差は変わらない。
【０２７６】
実施例８：薬物反応性と、ＰＰＩスコアおよび活性化スコアの間の相関関係
前記実施例１乃至７に記載された方法で試験した結果を、図面を挙げて以下で説明する：
【０２７７】
図１は、単分子タンパク質相互作用測定方法に関する模式図である。左側は、ポリエチレングリコールがコーティングされた基板にＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、ＲＴＫ抗体、および分析しようとする細胞溶解液または組織溶解液を順に注入した後、洗浄する方法を模式的に示し、中央は、これによって標的ＲＴＫタンパク質を基板に固定する様相を示し、右側は、蛍光標識された相互作用タンパク質を基板に注入して蛍光信号を観測および計量して、単分子タンパク質相互作用程度を測定する様相を示す。
【０２７８】
図２は、基板に固定された標的タンパク質（第１タンパク質）確認の結果を示すグラフである。実施例４および５に記載された方法を参照して試験した。ＥＧＦは１００ｎｇ／ｕｌの量で３分間処理し、図２の左側グラフはＨ１６６６を用いて、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に結合する抗体（ＭＡ５−１３２６６、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を通じて基板に付着させ、ＥＧＦＲの細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に対する抗体（＃４２６７、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を入れて付着確認した結果であり、図２の中央のグラフは、ＥＧＦＲがＨＥＲ２とダイマーを形成するか否かを、ＨＥＲ２の抗体を入れて確認した結果であり、図２の右側グラフは、ＥＧＦＲがＳｈｃ１とダイマーを形成するか否かを、Ｓｈｃ１の抗体を入れて確認した結果を示す。
【０２７９】
基板における抗体注入の有無により、標的ＲＴＫタンパク質（第１タンパク質）が固定されたり（＋で表示）、固定されなくなる（−で表示）。これによって、適切な抗体選別を経て、多様な標的タンパク質を基板に付着させることができる。またＥＧＦＲ−ＨＥＲ２やＥＧＦＲ−Ｓｈｃ１の場合のように、単一標的タンパク質だけでなく、生体内に存在していたタンパク質結合体の形態でも基板に固定可能であることを確認できる。
【０２８０】
図３は、第１タンパク質が固定化された基板に、蛍光標識された相互作用タンパク質（第２タンパク質）を注入した後のタンパク質相互作用を示すイメージである。実施例５で説明した方法で観測されたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘはＰｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＰＳＦ）形態で現れ、コンピュータアルゴリズムを通じてＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘを選別した。下流信号伝達タンパク質が注入された状態でのみ、蛍光信号が発生することをみることができる。緑色円形は観察されたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘを示したものである。
【０２８１】
図４は、図３で観測されたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの個数を定量化したグラフである。下流信号伝達タンパク質（第２タンパク質）が注入された場合（ｘ軸でＰＬＣｇａｍｍａＳＨ２、Ｇｒｂ２、およびｐ８５−ａｌｐｈａで表示）にのみ、選択的に高いＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘが観測されたことを確認できる。対照的に、標的ＲＴＫタンパク質（第１タンパク質（ＥＧＦＲ））の抗体がないか（黒い棒）、注入された下流信号伝達タンパク質がない場合（ｘ軸のＢｕｆｆｅｒ）には、観測される信号が非常に小さいことをみることができる。二つのいずれの場合にも観測されることはバックグラウンドノイズと解釈することができる。
【０２８２】
図５は、注入された細胞溶解液量に応じたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数増加を示すグラフである。標的ＲＴＫタンパク質（第１タンパク質：ＥＧＦＲ）を含む細胞溶解液の量が増加することによって（ｘ軸）、観測されるＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの量（ｙ軸）も線形的に増加することをみることができる。これによって、特定の細胞溶解液の量で試料間のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの定量的比較が可能である。
【０２８３】
図６は、単分子サンドイッチＥＬＩＳＡを通じて第１タンパク質を定量する過程を示す模式図である。基板の表面に標的ＲＴＫタンパク質（第１タンパク質）を付着させる過程は図１と同一である。蛍光標識された下流信号タンパク質（第２タンパク質）の代わりに、標的ＲＴＫタンパク質を認識する第２抗体を注入して、標的ＲＴＫタンパク質の量を測定することができる。この時、用いられる第２抗体（検出抗体：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、標的ＲＴＫタンパク質を基板の表面に固定させるために用いられた第１抗体（プルダウン抗体：ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と比べて、標的ＲＴＫタンパク質上で互いに異なる抗体認識部位（エピトープ：ｅｐｉｔｏｐｅ）を有していなければならない。第２抗体を認識する、蛍光標識された抗体（ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を通じて、基板の表面に固定されたＲＴＫタンパク質の量を単分子技法（実施例５参照）を通じて測定することができる。
【０２８４】
図７は、単分子サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を通じて得られた特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の結果を示すグラフである。図６の模式図に示された構成要素中、一つの構成要素のみが抜けても、単分子サンドイッチＥＬＩＳＡ信号結果が抑制されることをみることができる。
【０２８５】
図８は、細胞株種類（赤色（丸１）ｖｓ空色（丸３））および状態（赤色（丸１）ｖｓ黒色（丸２））に応じたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数の変化を示すグラフである。細胞に存在する標的ＲＴＫタンパク質（第１タンパク質；ＥＧＦＲ）が当該リガンドにより活性化された時（ＥＧＦ＋）、そうではない場合と比較して、同一の注入量で高いＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘが観測されることをみることができる。また標的ＲＴＫに活性変異が存在すれば（ＰＣ９、空色）、観測される標的ＲＴＫのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数が増加することを確認できる。
【０２８６】
図９は、細胞の状態に応じた、多様な標的ＲＴＫ（第１タンパク質）別の、試料の単位濃度当りのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数変化（ＰＰＩ  ｓｌｏｐｅ）を示すグラフである。実施例６に記載された単分子ｃｏ−ＩＰ技術を利用して、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３それぞれの標的タンパク質（第１タンパク質）に対してリガンド刺激（ｌｉｇａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）した時（灰色）とそうではない状態（黒色）でＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数が変わることを定量的に測定した。これに基づいて、ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ定量を通じて標的ＲＴＫの活性度を測定することができる。
【０２８７】
図１０は、ＥＧＦＲ変異状態に応じたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの変化、およびこれに基づいて細胞当り活性化されたＥＧＦＲの比率を計算した結果を示すグラフである。上段は、ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ測定法を通じて個別細胞別にＥＧＦＲと下流信号伝達タンパク質の間の相互作用を測定した結果を示すものであり、下段は、単分子サンドイッチＥＬＩＳＡ（図６参照）を通じて細胞当りＥＧＦＲ発現量を測定した後、二つの値を分けて、各細胞当り活性化されたＥＧＦＲの量を計量した結果（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ（％））を示す。
【０２８８】
図１１は、図１０でＥＧＦＲに対して行った方法をＨＥＲ２、ＨＥＲ３に対して同様に行って得られたＡｂｓｏｌｕｔｅ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ（％）結果を示すグラフである。ＨＥＲ２の場合、活性度が非常に低いのに対し、ＨＥＲ３は非常に高い活性比率を示す。
【０２８９】
図１２は、肺癌細胞株についてＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３（第１タンパク質）と下流信号伝達タンパク質（第２タンパク質）の間の相互作用（信号の強さ）を全て測定してヒートマップ形式（実施例７）で表示した結果を示す。各信号の強さに対する色尺度（ｃｏｌｏｒ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）は下に表示されている。
【０２９０】
図１３は、図１２の結果中でＥＧＦＲ（第１タンパク質）と３種の第２タンパク質間の信号の強さをそれぞれ定量した数値を加えた値を示すグラフ（左側および中央）、および、ＥＧＦＲ標的抗癌剤の一種であるＡＺＤ９２９１（オシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ））に対する各細胞株の反応性（ＩＣ５０；細胞生存率が処理前と比較して５０％になる処理濃度）結果を示すグラフ（右側）である。
【０２９１】
各棒の色は、ＥＧＦＲ遺伝子変異状態に応じて、右側に表示されたグループに区別される。ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅと比較して、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅが薬物反応性（ＩＣ５０）とより有意な相関関係を示すことを確認できる（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅが高いほどＩＣ５０値が低くなる（薬物反応性が高くなる））。
【０２９２】
図１４は、ＥＧＦＲ標的抗癌剤（ＡＺＤ９２９１）の反応性（ｙ軸）とＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ（ｘ軸）の間の相関関係（左側）および遺伝子タイプに応じた標的抗癌剤反応の多様性（右側）を示すグラフである。Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅはＡＺＤ９２９１の反応性について高い相関関係（ｒ＝０．８５）を示し、既存のＥＧＦＲ遺伝子検査では同一の遺伝子型を有しているとされても、薬物反応性が異なるように示され得ることをみることができる。
【０２９３】
図１５は、乳癌細胞株におけるＨＥＲ２およびＨＥＲ３（第１タンパク質）と下流信号伝達タンパク質（第２タンパク質）との間の信号の強さ（相互作用）をヒートマップ形式（実施例７）で示すものである。
【０２９４】
図１６は、乳癌細胞株で従来からトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）抗癌剤の反応性を予測するために用いられるバイオマーカーであるＨＥＲ２（上段）、ＨＥＲ３（中央）の発現量を測定した結果、およびトラスツズマブにより細胞成長が抑制される程度（下段）を測定して示すグラフである。
【０２９５】
図１７は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３信号を利用してＰＰＩ  ｓｃｏｒｅを測定した結果とトラスツズマブ反応性（ｌｏｇＧＩ５０）の間の相関関係を示すグラフである。ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅ（ｒ＝０．９１）は、既存のバイオマーカーであるＨＥＲ２（ｒ＝０．５４）やｐＨＥＲ２（ｒ＝０．４４）発現量（下段）と比較して、トラスツズマブ反応性とより高い相関関係を示すことを確認できる。
【０２９６】
図１８は、ＰＤＴＸマウスモデルで得られた組織溶解液（実施例１．２）（ｎ＝５；ＰＤＴＸ−１、−２、−３、−４、および−５で表示）で測定したＥＧＦＲとＭＥＴ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の３種の下流信号タンパク質とのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ信号結果をそれぞれ示すヒートマップである。
【０２９７】
図１９は、ＰＤＴＸマウスモデルで得られた組織溶解液（実施例１．２）におけるＥＧＦＲの発現量（上段）、および前記ＥＧＦＲの発現量（図１８の結果）を利用してａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅを計算した結果（下段）を示すグラフである。
【０２９８】
図２０は、ＰＤＴＸマウスモデル（実施例１．２．１）にゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与して腫瘍の大きさの変化を測定した結果を、ビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）（ＰＢＳ）投与群での結果と比較して示すグラフである。ＰＤＴＸ−２の場合、ＥＧＦＲ発現水準は高くないが、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅは高く示され（図１９参照）、抗腫瘍効果にも優れるように示される（図２０参照）ことを確認できる。このような結果は、ＥＧＦＲ発現水準よりも、活性化されたａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ（つまり、活性化されたＥＧＦＲ比率）が薬物反応性とより密接な相関関係を示すことを確認させる。
【０２９９】
図２１は、ＰＤＴＸマウスモデル（実施例１．２．１）でゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）による腫瘍成長抑制（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）程度とＥＧＦＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの間の相関関係を示すグラフである。前記で説明したとおり、ゲフィチニブによる腫瘍成長抑制（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）程度とＥＧＦＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの間に有意な相関関係（ｒ＝０．９６）があることを確認できる。
【０３００】
図２２は、ＰＤＴＸマウスモデル（実施例１．２．１）でゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）５０ｍｇ／ｋｇ）を投与する前（Before）、後（After）の組織溶解液試料でそれぞれ測定された、試料の単位濃度当りＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ個数の測定結果を示すグラフである。ゲフィチニブを処理した後に得た組織ではＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘが顕著に減ったことをみることができる。これはゲフィチニブによりＥＧＦＲ信号が抑制された証拠になり得る。
【０３０１】
実施例９
９．１．抗体および試薬の準備
それぞれの当該タンパク質のプルダウン（ｐｕｌｌｉｎｇ  ｄｏｗｎ）のために、次の抗体を用いた：抗−ＥＧＦＲ抗体（ＭＳ−３７８−Ｂ０  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗−ＭＥＴ抗体（ａｂ８９２９７  Ａｂｃａｍ）、抗−ＨＥＲ２抗体（ＢＭＳ１２０ＢＴ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗−ＨＥＲ３抗体（ＢＡＭ３４８  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）  ｍＣｈｅｒｒｙ  （ａｂ３４７７１  Ａｂｃａｍ）、および抗−ＫＲａｓ抗体（ｓｃ−５２１  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。
【０３０２】
それぞれの当該タンパク質およびＰＴＭｓ（翻訳後修飾：ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）に対する検出抗体として、次の抗体を用いた：抗−ＥＧＦＲ抗体（４２６７  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＥＧＦＲ（ｐＴｙｒ  １０６８）抗体（ａｂ３２４３０  Ａｂｃａｍ）、抗−ＥＧＦＲ（ｐＴｙｒ  １０８６）抗体（ａｂ３２０８６  Ａｂｃａｍ）、抗−ＥＧＦＲ（ｐＴｙｒ  １１７３）抗体（４４０７  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＭＥＴ抗体（８４９４  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＨＥＲ２抗体（ＭＡ５−１５０５０  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗−ＨＥＲ２（ｐＴｙｒ１２２１／１２２２）抗体（２２４３  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＨＥＲ３抗体（ａｂ３２１２１  Ａｂｃａｍ）、抗−ＨＥＲ３（ｐＴｙｒ  １２８９）抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．４７９１）、抗−Ｇｒｂ２抗体（ａｂ３２０３７  Ａｂｃａｍ）、抗−Ｓｈｃ１抗体（ａｂ３３７７０  Ａｂｃａｍ）、抗−Ｓｈｃ１（ｐＴｙｒ  ２３９／２４０）抗体（ａｂ１０９４５５  Ａｂｃａｍ）、抗−ＨＳＰ９０抗体（ＰＡ３−０１３  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗−ＭＩＧ６抗体（１１６３０−１−ＡＰ  Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、抗−ＧＡＰＤＨ抗体（３９０６  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および抗−ｃ−Ｃｂｌ抗体（２１７９  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【０３０３】
ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）接合された抗−マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（４０５３０３  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣｙ３接合された抗−ラビットＩｇＧ（１１１−１６５−０４６  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）抗体を二次抗体として用いた。
【０３０４】
ウエスタンブロッティングは、次の抗体を用いて行った：抗−ＥＧＦＲ（ｐＴｙｒ  １０６８）抗体（２２３４  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＥＧＦＲ抗体（２２３２  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−Ｅｒｋ（ｐＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（９１０６  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−Ｅｒｋ抗体（４６９６  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−Ａｋｔ（ｐＳｅｒ４７３）抗体（４０６０  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−Ａｋｔ抗体（４６９１  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−Ｓ６Ｋ（ｐＳｅｒ２３５／２３６）抗体（４８５８  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−Ｓ６Ｋ抗体（２２１７  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および抗−アクチン（ａｃｔｉｎ）抗体（ａｂ８２２７  Ａｂｃａｍ）。
【０３０５】
１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＰＨＧ０３１１Ｌ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用（３分間）してＥＧＦＲを刺激した。
【０３０６】
ゲフィチニブ（Ｓ１０２５  Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、オシメルチニブ（Ｓ７２９７  Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＢＫＭ１２０（Ｓ２２４７  Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ダブラフェニブ（Ｓ２８０７  Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、およびトラスツズマブ（Ａ１０４６  ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を、肺腺癌（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞でのＰＰＩ変化および乳癌細胞でのＨＥＲ２−／ＨＥＲ３−ＰＰＩ測定、ＭＴＴアッセイによる細胞生存率測定、およびＰＤＴＸモデルでの腫瘍成長測定に用いた。
【０３０７】
９．２．細胞培養
全ての細胞株は１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（２６１４０−０７９  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（１５７１０−０６３  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（１５１４０−１２２  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（２２４００−１０５  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。ＰＣ９−ＧＲ（ゲフィチニブ耐性細胞株；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＶＣＬ＿Ｓ７０６）、ＨＣＣ８２７−ＧＲ５（ゲフィチニブ耐性細胞株；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＶＣＬ＿Ｖ６２２）、およびＨＣＣ４００６−ＥＲ（エルロチニブ耐性細胞株；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＶＣＬ＿Ｓ７４６）細胞株はそれぞれ１００ｎＭのゲフィチニブまたはエルロチニブの存在下で培養した。全ての細胞株は３７℃および５％ＣＯ２条件の加湿培養器で培養した。培養した細胞を冷たいリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。冷たいＰＢＳ  １ｍｌとスクレイパー（９００２０  ＳＰＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞を迅速に収集した。一つのペトリディッシュ（直径１００ｍｍ）から得られた細胞懸濁液を、３〜４のアリコートに分量した。この分液を４℃で３，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清液を捨てて得られたペレットを−８０℃で保管し、以降分析に用いた。
【０３０８】
９．３．ｅＧＦＰ標識されたｐｒｅｙタンパク質の製作および形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）
ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩを用いて、タンデムＳＨ２ドメイン（ＮＭ＿０１３１８７．１の５４２〜７６５アミノ酸）を含むラットＰＬＣγＳＨ２  ｃＤＮＡを、ラットｃＤＮＡライブラリーから直接分離した。Ｇｒｂ２（ヒトＧｒｂ２；Ａｄｄｇｅｎｅ  ４６４４２）、ｐ８５α（マウス  ｐ８５α  Ａｄｄｇｅｎｅ  １３９９）、Ｓｈｃ１（ヒトＳｈｃ１、Ａｄｄｇｅｎｅ  ７３２５５、Ｅａｔ２（ヒトＥａｔ２、Ａｄｄｇｅｎｅ  ４６４２３）、ＡＰＣＳ（ヒトＡＰＣＳ、Ａｄｄｇｅｎｅ  ４６４７７）、Ｎｃｋ１（ヒトＮｃｋ１、Ａｄｄｇｅｎｅ  ４５９０３）およびＳＯＳ１（ヒトＳＯＳ１、Ａｄｄｇｅｎｅ  ３２９２０）のｃＤＮＡを、それぞれ元来のプラスミドに含まれている制限酵素部位に対応する制限酵素を用いて切除した。ｅＧＦＰ−タグＣＡＲＭ１（ヒトＣＡＲＭ１）およびＥＧＦＲ遺伝子は、それぞれソウル大学（韓国）とＫＡＩＳＴ（韓国）から提供を受けた。全てのｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にクローニングして、対応するｅＧＦＰ−標識ｐｒｅｙタンパク質を製作した。Ｇｒｂ２遺伝子にＷ３６Ｋ、Ｒ８６ＭおよびＷ１９３Ｋ点突然変異をそれぞれ導入して、Ｇｒｂ２変異体であるＮ＊−、ＳＨ２＊−、およびＣ＊−コンストラクトをそれぞれ製作した。ＥＧＦＲ遺伝子においてＥ７４６−Ａ７５０を欠失させたり８５８番目残基であるライシンをアルギニンに置換して、ＥＧＦＲ変異体を製作した。
【０３０９】
前記得られたプラスミドを、Ｎｅｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＰＫ５０００  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造会社の指示により電気穿孔法を通じてＨＥＫ２９３細胞に導入した。プラスミドＤＮＡ  ３０μｇを、〜２ｘ１０６細胞を含有するＨＥＫ２９３細胞懸濁液１０μｌと混合した。２番の９５０Ｖ電気パルス（各パルスにつき３５ｍｓの長さ）をＨＥＫ２９３細胞に適用した。形質感染後２４時間経過した後に、形質感染された細胞を収穫し、−８０℃で保管した。
【０３１０】
９．４．肺癌患者由来の腫瘍異種移植モデル
全ての動物研究はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）から承認を受けた指針に従い行った。６乃至８週齢の雌マウス（重症複合免疫不全症（ＮＯＧ）およびヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）；ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ）を用いた。臨床腫瘍サンプル（肺腺癌腫（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者由来または肺扁平上皮癌（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＳＱＣＣ）患者由来）を〜３ｍｍ３の大きさの切れに切断した後、前記ＮＯＧマウスの横腹内部に皮下移植（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）した。移植後１〜４ヶ月経過後、移植された部位で腫瘍が観察された。カリパスで週２回、腫瘍の体積を測定して、腫瘍の皮下成長率を測定した。腫瘍の大きさが直径１．５ｃｍに到達した時、腫瘍組織を切除し、小さい切片（ほぼ５ｍｍ３の大きさ）に切断した。前記切断された組織を他のマウス集団に再移植して、続発性腫瘍（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ）を得た。患者由来腫瘍を有するマウス世代をＦ０と命名し、以降の後続世代は順に番号を付けた（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３など）（図２３ａ参照）。３世代目（Ｆ３）マウスをビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）、オシメルチニブ、またはゲフィチニブ処理試験に用いた。
【０３１１】
前記得られた患者由来腫瘍異種移植マウス（ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ；ＰＤＴＸ）の中で、肺腺癌腫患者由来腫瘍が移植されたマウス（Ｆ３；ｎ＝３）をＰＤＴＸ−Ａ１、ＰＤＴＸ−Ａ２、およびＰＤＴＸ−Ａ３と命名し、肺ＳＱＣＣ患者由来腫瘍が移植されたマウス（Ｆ３；ｎ＝５）をＰＤＴＸ−Ｓ１、ＰＤＴＸ−Ｓ２、ＰＤＴＸ−Ｓ３、ＰＤＴＸ−Ｓ４、およびＰＤＴＸ−Ｓ５と命名した。
【０３１２】
前記得られた患者由来腫瘍異種移植マウス（ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ；ＰＤＴＸ）に、体重（ｋｇ）当り５ｍｇのオシメルチニブもしくは５０ｍｇのゲフィチニブまたはビヒクルをそれぞれ１日１回腹腔内注射で注入した。前記薬物処置後１５日経過した後に、ＰＤＴＸから腫瘍組織を切除して、ＰＰＩおよび発現水準変化をモニタリングした。
【０３１３】
９．５．単分子ｃｏ−ＩＰ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏ−ＩＰ）および免疫標識イメージング（ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ｉｍａｇｉｎｇ）
単分子ｃｏ−ＩＰおよび免疫標識イメージングについての詳細なプロトコルは「Ｌｅｅ，  Ｈ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅａｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ８，  ２０４５−２０６０，  （２０１３）」を参照した。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（０．１ｍｇ／ｍｌを１０μｌ；Ａ２６６６  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれの個別反応チャンバーに入れた。１０分間インキュベーション後、未結合ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを除去した。小型イメージングチャンバーを、ＰＢＳが満たされた貯液器に浸漬してから１００回程度側面方向に揺さぶって完全に洗った。ＰＢＳを完全に除去した後、ビオチン化プルダウン抗体を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコーティングされた表面上で１０分間インキュベートして層を作った。ＭＥＴ抗体の場合、ビオチン化二次抗体（α−マウスＩｇＧ）を用いて１次抗体を結合させた。ＰＢＳでチャンバーを洗浄した後、癌細胞または腫瘍組織の抽出物を、抗体がコーティングされた表面に適用した。１５分後、未結合抽出物を除去し、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０が補充されたＰＢＳで満たされた貯液器にチャンバーを浸漬した。
【０３１４】
一分子ｃｏ−ＩＰイメージングのために、形質転換されたＨＥＫ２９３細胞の抽出物を３０ｎＭ（ｅＧＦＰ−タグ化プローブタンパク質）に希釈した後、イメージングチャンバーにローディングした。チャンバーをＴＩＲＦ顕微鏡上に配置して、ｅＧＦＰ蛍光をＥＭＣＣＤで記録した（２０フレーム；１００−ｍｓ露出）。
【０３１５】
一分子免疫標識イメージングの場合、５フレームの間に、ｅＧＦＰ−タグ化プローブタンパク質の代わりに色素標識検出抗体を用いた。検出抗体およびプルダウン抗体の間の重複を避けるために、検出抗体は細胞質キナーゼ部位または末端（ｔａｉｌ）上のチロシン残基内にエピトープを有するものと選定した。検出抗体はＡｌｅｘａ４８８（ＭＥＴ抗体）で直接標識したり、Ｃｙ３−標識された２次抗体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびｐＴｙｒ抗体）で間接的に可視化した。ＴＩＦＦ  ｓｔａｃｋでの５または２０フレームの蛍光（０．１秒露出）を記録した後、蛍光スポットの個数をカウンティングして、単分子ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘまたは免疫標識された（ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質の数を測定した。単分子カウント数（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｕｎｔｓ）の平均および標準偏差は、同一の反応チャンバー内で１０個の異なる位置から求めた。
【０３１６】
実施例９．６．ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘおよび免疫標識されたタンパク質のカウント
蛍光イメージングして得られたＴＩＦＦファイルをｃｕｓｔｏｍ  ＧＵＩ（ｗｒｉｔｔｅｎ  ｉｎ  Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｌａｂ  ２０１６ａ、ＭａｔｈＷｏｒｋｓ））で分析した。３個のフレーム（ｅＧＦＰの場合、１７〜１９、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ４８８の場合、３〜５）を用いて、単一ＰＰＩ複合体または免疫標識されたタンパク質を代表する強さ（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）のｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍａを確認した。バックグラウンド補正のために、空間的中央値フィルタリング（ｓｐａｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｎ−ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）（１１ｘ１１ピクセル）で得たイメージを、原本イメージでフレーム別に控除（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）した。得られたイメージは平均化して閾値化後、ｌｏｃａｌ  ｍａｘｉｍａを検出することに用いた（ｃｕｓｔｏｍ  Ｍａｔｌａｂ  ＧＵＩ使用）。
【０３１７】
実施例１０：ＥＧＦＲ標的抑制剤に対するＰＤＴＸの反応性予測
【０３１８】
１０．１．肺腺癌異種移植されたＰＤＴＸにおけるオシメルチニブに対する反応性予測
ＨＥＲ系受容体のＰＰＩ測定指標が癌の薬物反応性と密接に関連していることを確認し、ＨＥＲ系受容体標的治療に反応性を有する（ＨＥＲ系受容体標的治療が抗癌効果を示す）特定癌のスクリーニングに一分子レベルの免疫標識またはｃｏ−ＩＰ分析を適用できるのか調査した。このために、前記実施例９で記述した方法で３種の肺腺癌腫患者由来腫瘍異種移植マウス（ＰＤＴＸｓ；図２３のＰＤＴＸ−Ａ１〜Ａ３）を製作した。
【０３１９】
これら肺腺癌腫ＰＤＴＸは、ＥＧＦＲ遺伝子で活性化突然変異（エクソン１９（exon 19）またはＬ８５８Ｒ突然変異）を有すると確認された。
【０３２０】
前記肺腺癌腫ＰＤＴＸｓ（ＰＤＴＸ−Ａ１〜Ａ３；それぞれの個体数は３以上であり、下記結果はその平均値で示す）に対して、３０日間オシメルチニブ（体重１ｋｇ当たり毎日５ｍｇ）で処理して腫瘍の大きさを測定して、対照群（ビヒクル投与群）と比較し、その結果を図２３ｂ左側に示した。図２３ｂ左側の結果から分かるように、ＰＤＴＸ−Ａ１〜Ａ３はオシメルチニブ処理により腫瘍の大きさ（Size）の顕著な減少を示した（Ａ１＞Ａ２＞Ａ３）。
【０３２１】
また各ＰＤＴＸ（ＰＤＴＸ−Ａ１〜Ａ３）において、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＭＥＴ受容体それぞれと、下流信号タンパク質であるＰＬＣｇａｍｍａＳＨ２、Ｇｒｂ２、およびｐ８５−ａｌｐｈａそれぞれとの間のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ数（図２３ｃでＰＰＩ  ｃｏｕｎｔで表示する）を測定して、図２３ｃ左側に示した。図２３ｃに示されているように、ＥＧＦＲと３種の下流信号タンパク質との間のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｕｎｔはＡ１＞Ａ２＞Ａ３の順に現れ、これは図２３ｂに示されたＥＧＦＲ阻害剤であるオシメルチニブ処理時の腫瘍の大きさの減少効果様相と同一であることを確認できる。このような結果は、肺腺癌腫のＰＤＴＸモデルで、標的タンパク質と下流信号タンパク質の間のＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントが、前記標的タンパク質を標的とする標的治療剤の抗癌効果と有意な相関関係を示すことを示すものである。
【０３２２】
また、８匹のＰＤＴＸ（Ａ１〜Ａ３およびＳ１〜Ｓ５）個体において、ＥＧＦＲと異なる受容体（ＭＥＴ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）の発現水準を測定し、前記それぞれの受容体の発現水準を、対照群（ＥＧＦＲ：Ａ５４９細胞、ＭＥＴ：ＨＣＣ８２７−ＧＲ５、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３：ＳＫＢＲ３）での発現水準に対して標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）して、その結果を図２３ｄおよび図２５ａ−ｃに示した。
【０３２３】
図２３ｃに示されているように、試験されたＰＤＴＸモデル（Ａ１〜Ａ３）は全て、ＭＥＴ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３受容体について有意なＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ数値を示さなかったが、ＥＧＦＲに対してはある程度有意なＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ数値を示した。このような結果は、ＰＤＴＸｓがタンパク質とＰＰＩ水準でＥＧＦＲ信号伝達に腫瘍遺伝子中毒（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）を示すことを意味するといえる。
【０３２４】
次に、標準化ＰＰＩカウント（第１タンパク質の単位濃度当りのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ数；ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ該当）によって、肺腺癌腫細胞株で立証されたとおり、オシメルチニブ治療に対するＰＤＴＸの反応性を予測できるか否かを調査した。前記でＰＤＴＸモデル（Ａ１〜Ａ３）に３０日間オシメルチニブ（体重１ｋｇ当たり毎日５ｍｇ）を処理して得られた、各モデルでの腫瘍成長抑制率（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）＝［（ΔＶビヒクル−ΔＶゲフィチニブ）／ΔＶビヒクル］ｘ１００；ΔＶビヒクル：ビヒクル処理前後の腫瘍体積変化；ΔＶゲフィチニブ：ゲフィチニブ処理前後の腫瘍体積変化）をｙ軸にし、ＰＰＩ  ｓｕｍ／ＥＧＦＲ  ｌｅｖｅｌ（ＰＰＩ  ｓｕｍ：ＰＰＩ  ｓｃｏｒｅであり、ＰＰＩ  ｓｕｍ／ＥＧＦＲ  ｌｅｖｅｌ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）をｘ軸にして図２３ｅに示した。図２３ｅに示されているように、標準化ＰＰＩカウント（ＰＰＩ  ｓｕｍ／ＥＧＦＲ  ｌｅｖｅｌ；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）が実際にオシメルチニブによる腫瘍成長抑制と高い相関関係（ｒ＝１）を示すことを確認できる。
【０３２５】
１０．２．肺ＳＱＣＣ（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）異種移植ＰＤＴＸにおけるオシメルチニブに対する反応性予測
肺腺癌の２９％がＥＧＦＲの感作突然変異と関連しているのに対し、肺ＳＱＣＣの０．５％のみがＥＧＦＲの感作突然変異を有している。したがって、現在は肺ＳＱＣＣにおいてＥＧＦＲ標的治療のための適切なバイオマーカーがないのが実情である。
【０３２６】
本実施例では、肺ＳＱＣＣ患者組織から５匹のＰＤＴＸ（ＰＤＴＸ−Ｓ１〜Ｓ５）を製作し、単分子免疫標識およびｃｏ−ＩＰプロファイリング（実施例９．５）を行った。５匹のＰＤＴＸ（ＰＤＴＸ−Ｓ１〜Ｓ５）が全て、ＭＥＴ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３受容体タンパク質ならびにこれらと関連したＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘが最小水準を示すことを確認した（図２３ｃ、右側および図２５ａ−ｃ）。
【０３２７】
一方、総ＥＧＦＲカウント（ＥＧＦＲレベル）とＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントが相当な水準で検出されることを確認した（図２３ｃおよび２３ｄ、および図２５ｄおよび２５ｅ）。
【０３２８】
このような結果は、肺ＳＱＣＣが増殖信号においてしばしばＥＧＦＲに依存するためであると予想される。
【０３２９】
１０．３．肺ＳＱＣＣ（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）異種移植ＰＤＴＸにおけるゲフィチニブに対する反応性予測
５匹のＰＤＴＸ（ＰＤＴＸ−Ｓ１〜Ｓ５）に全て１５日間ゲフィチニブを投与し、腫瘍成長程度を測定して図２３ｂ右側に示した。ＰＤＴＸ−Ｓ１〜Ｓ５の中で、Ｓ１とＳ２で顕著な腫瘍抑制効果が見られると確認された。試験された多様なＰＤＴＸ個体の中で、ＥＧＦＲ水準に対して標準化されたＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウント（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）が、腫瘍成長抑制と非常に高い相関関係（０．９のスピアマン相関）を有することを再度確認した（図２３ｆおよび図２５ｆ−ｈ）。
【０３３０】
前記得られた結果は、標準化ＰＰＩカウントが非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）のＥＧＦＲ標的抑制剤に対する反応性と密接な相関関係があることを示す。ＰＰＩ数値の合計でない標準化ＰＰＩ数値が抗腫瘍薬物に対する反応性とより高い関連性を有するのかを理解するために、固有のシグナル伝達表現型とゲフィチニブ反応性を示した２匹の肺ＳＱＣＣ  ＰＤＴＸ（ＰＤＴＸ−Ｓ１およびＳ２）を集中的に観察した。
【０３３１】
ゲフィチニブ処理前（Ｂｅｆｏｒｅ）と処理後１５日経過後（Ａｆｔｅｒ）、ＰＤＴＸ−Ｓ１とＰＤＴＸ−Ｓ２におけるＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントを測定して図２３ｇおよび図２６ａ−ｂに示した。
【０３３２】
前記結果からみることができるように、ＰＤＴＸ−Ｓ１は、特にＰＩ３Ｋの調節ｐ８５αサブユニットで検出可能な水準のＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントを維持した。それに対し、ＰＤＴＸ−Ｓ２は、Ａ５４９細胞を用いた陰性対照群と比較して減少しあるいは区別されない程度のＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントを示した（図２３ｇおよび図２６）。したがって、試験に用いられたゲフィチニブ投与量（５０ｍｇ／ｋｇ）は、ＰＤＴＸ−Ｓ２において、より小さいプールであるがハイパーアクティブであるＥＧＦＲｓを完全に抑制して当該癌の萎縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）を誘導するといえる。それに対し、同一のゲフィチニブ投与量はＰＤＴＸ−Ｓ１においてＥＧＦＲ活性を抑制できず、相当なＥＧＦＲ過発現を示した。このような結果は、高い標準化ＰＰＩカウントを有するＰＤＴＸ−Ｓ２が、高いＥＧＦＲ水準と総ＰＰＩカウントを有するＰＤＴＸ−Ｓ１と比較して、ゲフィチニブに対してより優れた反応性を示す理由を提示しているといえる。
【０３３３】
前記結果で、ＰＤＴＸ−Ｓ１が、増加されたＥＧＦＲ−ｐ８５α結合を示すという事実に基づいて、ＰＤＴＸ−Ｓ１をＰＩ３Ｋ阻害剤であるＢＫＭ１２０（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した（図２３ｈ）。
【０３３４】
前記結果からみることができるように、ＢＫＭ１２０は、同一の投与容量（５０ｍｇ／ｋｇ）でゲフィチニブより強力な腫瘍成長抑制効果を示した。また、ゲフィチニブとＢＫＭ１２０の併用治療（ゲフィチニブ（５０ｍｐｋ（体重１ｋｇ当たりのｍｇ））／ＢＫＭ１２０（５０ｍｐｋ））は腫瘍を萎縮させた。このような結果は、異なるダウンストリームタンパク質を用いてＰＰＩを検査する一分子ｃｏ−ＩＰプロファイリングが、標的信号化経路の選択および複数の薬物の併用治療戦略を設計することに有用に用いられ得ることを提示する。
【０３３５】
１０．４．非小細胞性肺癌異種移植ＰＤＴＸでの反応性予測
２種類の非小細胞性肺癌移植モデルであるＰＤＴＸ−Ａ１〜Ａ３およびＰＤＴＸ−Ｓ１〜Ｓ５から得た標準化ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントをプーリングして単一プロットを比較した（図２３ｉ）。
【０３３６】
遺伝子変異様相および癌サブタイプでの全ての差にもかかわらず、データポイントは一定の様相を示し、スピアマン相関関係が０．９５であり腫瘍成長抑制とよく一致する模様を形成した。
【０３３７】
このような結果は、標準化ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントが、ＥＧＦＲ−標的療法に対する効能予測マーカ−として作用することができるＥＧＦＲ信号強度の尺度（ｇａｕｇｅ）であることを提示する。
【０３３８】
実施例１１．ヒト患者試料に関する単分子免疫標識（Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ）およびｃｏ−ＩＰプロファイリング（ｃｏ−ＩＰ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）
本発明で提示されるマイクロチャンバーとハイスループット単分子映像システム（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ヒト患者の腫瘍組織を特性化した（図２４）。
【０３３９】
ＰＤＴＸ標本（ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）に対して開発された通常の極低温溶解プロトコル（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を、肺腺癌腫患者から外科的切除で得た二つの肺腺癌腫患者組織（延世大学セブランス病院）に適用した（図２４ａ、Ｐ１およびＰ２という）。
【０３４０】
簡略に説明すると、前記準備された患者組織を粉砕（〜０．６ｃｍ）し、液体窒素に浸漬させる。追加粉砕後、ＰＢＳを投与して完全に溶解させ、遠心分離して、ペレットを取った。以降、ＰＢＳを投与し、継続して混合しながら４℃で培養した。その後、遠心分離して上清液を取った。
【０３４１】
大きさが１５ｍｍ３（Ｐ１）および１８ｍｍ３（Ｐ２）である組織を使用し、前記記載した方法で得られた各組織溶解物に対して、１０個の互いに異なるＰＰＩレベル（陽性対照でのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘを１．０にした時のＰ１およびＰ２でのＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘの相対値）および１０個の互いに異なるタンパク質およびＰＴＭ（翻訳後修飾）水準（発現量）を測定（実施例９．５の免疫標識参照）した（図２４ｂ）。陽性対照群としてＰＣ９細胞（ＥＧＦＲについて）、ＨＣＣ８２７細胞（ＭＥＴについて）、およびＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２およびＨＥＲ３について）をそれぞれ用いた。
【０３４２】
二つの腫瘍組織（Ｐ１およびＰ２）全てが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９突然変異（エクソン１９欠失変異）を有していたが、サンプルＰ１のみが有意なＥＧＦＲ  ＰＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘカウントを示した（図２４ｂ、ｃおよび表４）。
【０３４３】
【表４】
0006931942.tif 000007
【０３４４】
（ＰＲ＝部分的反応（Ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、ＰＤ＝病態進行（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ））
【０３４５】
他の受容体であるＨＥＲ受容体とＭＥＴ受容体に関しては、二つのサンプルの全てで有意なＰＰＩカウントが観察されなかった（図２４ｂ、ｃ）。
【０３４６】
患者Ｐ１は、進行性疾患（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）診断前に約１年半の間にゲフィチニブ治療に対する部分的反応性（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＰＲ；固形腫瘍での反応性評価基準（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ；ＲＥＣＩＳＴ）による部分的反応性）を維持したのに対し、患者Ｐ２は、ＰＤ認定前に１年間、疾患安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ＳＤ））の診断を維持した。
【０３４７】
最後に、最も高い活性のＥＧＦＲ信号を示すＰＤＴＸ−Ａ１およびヒト患者サンプルＰ１に由来する変異型ＥＧＦＲ（エクソン１９欠失）に対してＰＴＰＮ１を処理して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱リン酸化を行った（図２４ｄ）。
【０３４８】
脱リン酸化後、ｅＧＦＰ−標識化ＰＬＣｇａｍｍａＳＨ２およびＧｒｂ２と、変異型ＥＧＦＲ複合体との結合を測定して図２４ｄに示した。図２４ｄに示されているように、脱リン酸化（＋ＰＴＰＮ１）によって、ｐＴｙｒ−ＳＨ２ドメイン相互作用に全面的に依存するＰＬＣｇａｍｍａＳＨ２の結合はほぼ完全に中止されるのに対し、Ｇｒｂ２結合カウントの場合には、５０％以上および８０％以上が脱リン酸化後にも維持された。このような結果は、変異型ＥＧＦＲのｐＴｙｒ−非依存性シグナリング機序がＰＤＴＸモデルと外科的腫瘍組織で実際に作動することを提示する。
【０３４９】
実施例１２：接着剤適用形態による影響試験
接着剤（Ｅ；ＵＶエポキシ）が収容部１５３と基板３００接触面の外部周縁に塗布されたマルチウェル（マルチウェルＡ；試験群）と、接着剤（Ｅ；ＵＶエポキシ）が収容部１５３と基板３００接触面全体に塗布されたマルチウェル（マルチウェルＢ；比較群）をそれぞれ製作し、図３８のようにナンバリングした：
【０３５０】
全てのウェルはビオチンで表面処理し、抗体は固定化させなかった。
【０３５１】
前記ウェルに、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でタグ化されたＧｒｂ２タンパク質（ＮＰ＿００２０７７．１）を３０ｎＭの量で添加し、常温（２３〜２７℃）で５〜１０分間反応させ、ＰＢＳ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を伴う）を含む洗浄溶液で洗浄した後、イメージングして、ウェルに残っているＧＦＰ個数（ＧＦＰカウント）を測定してＧｒｂ２タンパク質を定量した。この時、前記洗浄は低濃度（例えば約０．１％（ｖ／ｖ）以下）の非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００など）を含む洗浄溶液を用いて行うことがよい（以下、タンパク質定量過程に同様に適用可能である）。ＧＦＰ個数は、ＥＭＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ；Ａｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８９７  ＥＸ２（ＤＵ−８９７Ｕ−ＣＳ０−ＥＸＦ））カメラを用いて１フレーム当り露出時間を０．１秒にし、ＥＭＣＣＤ  ｇａｉｎ値は４０にして得た蛍光イメージ上の蛍光ｓｐｏｔ個数を計数して測定した。
【０３５２】
前記のようにＧＦＰ個数を測定した結果を、図３２（マルチウェルＡ）および図３３（マルチウェルＢ）に示した。図３２および図３３で、各＃数字は、前記でナンバリングされたウェルの位置を意味する。
【０３５３】
図３２に示されているように、マルチウェルＡの場合、洗浄後にウェルに残っているＧＦＰ個数が、全てのウェルで類似した水準に低く示されたのに対し、図３３に示されているように、マルチウェルＢの場合には、洗浄後にウェルに残っているＧＦＰ個数が、一部のウェル（＃５、＃６．＃７）で約１５倍乃至２０倍以上多く示された。
【０３５４】
ウェルに抗体を固定化させなかったため、洗浄後にウェルに残っているＧＦＰは非特異的結合によるものといえるため、図３２および図３３の結果は、接着剤が収容部の外部周縁に適用されたマルチウェルＡの場合、接着剤が収容部の基板と接触する面全体に適用されたマルチウェルＢの場合と比較して、タンパク質の非特異的結合水準が非常に低いことを示すものである。マルチウェルＢでタンパク質の非特異的結合水準が高く示されたことは、基板と接触する収容部の面全体に適用された接着剤（エポキシ）の一部が、反応が起こる貫通ホール内部に浸透して、エポキシの粘着性により、タンパク質−タンパク質反応に意図していない影響を与えて非特異的結合を誘導することに起因しているといえる。それに対し、マルチウェルＡの場合には、接着剤が収容部の外部周縁に適用されて貫通ホール内部に浸透しないか、非常に少量のみが浸透してタンパク質−タンパク質反応に影響を与えないか、その程度が非常に微小であるため、タンパク質の非特異的結合水準が非常に低くなる。
【０３５５】
マルチウェルＡでタンパク質の特異的反応が誘導されることを追加的に確認するために、＃１、＃５、および＃９の３個のウェルにはＧＦＰ抗体を固定化させず、残りの＃２、＃３、＃４、＃６、＃７、＃８、＃１０、＃１１、および＃１２の９個のウェルにはＧＦＰ抗体を固定化させて、前記試験を再び行い、ＧＦＰ個数を測定した。
【０３５６】
前記のように得られたＧＦＰ個数測定結果を図３４に示した。図３４に示されているように、ＧＦＰ抗体が固定化されていない＃１、＃５、および＃９の３個のウェルと比較して、ＧＦＰ抗体が固定化された＃２、＃３、＃４、＃６、＃７、＃８、＃１０、＃１１、および＃１２の９個のウェルでのＧＦＰ個数が顕著に高い水準であることを確認できる。このような結果は、接着剤が収容部の外部周縁に適用されたマルチウェルＡで特異的タンパク質反応が誘導されることを再度確認させるものといえる。
【０３５７】
実施例１３：タンパク質−タンパク質相互作用の測定例
実施例１２と同様な方法でマルチウェルＡを準備した後、表面に抗−ＥＧＦＲ抗体（ＭＳ−３７８−Ｂ０、Ｔｈｅｒｍｏ）を固定化させた。抗体が固定化された各ウェルに、ＥＧＦＲを多く発現する細胞株（Ｈ１６６６；ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−５８８５）を細胞株溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８３４０）１００Ｘ、チロシンホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６）１００Ｘ）に溶解して得られた細胞試料を添加し、常温（２３〜２７℃）で１５分間反応させた後、ＰＢＳ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を伴う）を含む洗浄溶液で洗浄して、ウェル表面にＥＧＦＲを捕獲した。表面にＥＧＦＲが捕獲された各ウェルに、ＧＦＰタグ化されたｐ８５−ａタンパク質（ＮＰ＿８５２６６４．１）を添加し、イメージングした。
【０３５８】
実施例１２の方法を参照して、ウェルに残っているＧＦＰ個数（ＧＦＰカウント）を測定して、ＥＧＦＲとｐ８５−ａの間のタンパク質−タンパク質相互作用を試験した。
【０３５９】
細胞試料の量に応じたＧＦＰ個数（５回測定したデータの平均値）を図３５に示し、ＧＦＰ個数（５回測定したデータの平均値）と標準偏差を表５に示した：
【０３６０】
【表５】
0006931942.tif 000008
【０３６１】
図３５および表５に示されているように、マルチウェルＡを用いる場合、細胞試料濃度と線形の正比例相関性を示すタンパク質−タンパク質相互作用が明確に測定され、反復試験時に得られる結果が比較的低い水準の標準偏差を示すことを確認できる。
【０３６２】
一方、実施例１２と同様な方法でマルチウェルＡを２つ準備し、一つ（ブランク）はウェル表面にＧＦＰ抗体を塗布せず、他の一つ（ＧＲＢ２−ＧＦＰ）はＧＦＰ抗体を塗布して準備し、それぞれにＧＦＰ−ＧＲｂ２を１００ｐＭ注入後、実施例１２と同様な方法で信号を測定した。
【０３６３】
前記得られた結果を図３６および３７に示した。図３６および３７に示されているように、マルチウェルＡを用いる場合、標的タンパク質（ＧＦＰ）を捕獲する抗体が塗布されていない場合には信号がほとんど示されないのに対し（ブランク）、抗体が塗布された場合には信号が低い標準偏差を示し、非常に良好に検出された（ＧＲＢ２−ＧＦＰ）。このような結果は、マルチウェルＡを用いる場合、偽陽性結果（Ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｕｌｔ）がほとんど示されないことを意味する。
【符号の説明】
【０３６４】
１００  マルチウェル
１１０、１３０  支持台
１５５、１６５、１７５  支持プレート
１５１  貫通ホール
１５３  収容部
３００  基板
【図１】
0006931942.tif 000009
【図２】
0006931942.tif 000010
【図３】
0006931942.tif 000011
【図４】
0006931942.tif 000012
【図５】
0006931942.tif 000013
【図６】
0006931942.tif 000014
【図７】
0006931942.tif 000015
【図８】
0006931942.tif 000016
【図９】
0006931942.tif 000017
【図１０】
0006931942.tif 000018
【図１１】
0006931942.tif 000019
【図１２】
0006931942.tif 000020
【図１３】
0006931942.tif 000021
【図１４】
0006931942.tif 000022
【図１５】
0006931942.tif 000023
【図１６】
0006931942.tif 000024
【図１７】
0006931942.tif 000025
【図１８】
0006931942.tif 000026
【図１９】
0006931942.tif 000027
【図２０】
0006931942.tif 000028
【図２１】
0006931942.tif 000029
【図２２】
0006931942.tif 000030
【図２３ａ】
0006931942.tif 000031
【図２３ｂ】
0006931942.tif 000032
【図２３ｃ】
0006931942.tif 000033
【図２３ｄ】
0006931942.tif 000034
【図２３ｅ】
0006931942.tif 000035
【図２３ｆ】
0006931942.tif 000036
【図２３ｇ】
0006931942.tif 000037
【図２３ｈ】
0006931942.tif 000038
【図２３ｉ】
0006931942.tif 000039
【図２４ａ】
0006931942.tif 000040
【図２４ｂ】
0006931942.tif 000041
【図２４ｃ】
0006931942.tif 000042
【図２４ｄ】
0006931942.tif 000043
【図２５ａ】
0006931942.tif 000044
【図２５ｂ】
0006931942.tif 000045
【図２５ｃ】
0006931942.tif 000046
【図２５ｄ】
0006931942.tif 000047
【図２５ｅ】
0006931942.tif 000048
【図２５ｆ】
0006931942.tif 000049
【図２５ｇ】
0006931942.tif 000050
【図２５ｈ】
0006931942.tif 000051
【図２６ａ】
0006931942.tif 000052
【図２６ｂ】
0006931942.tif 000053
【図２７】
0006931942.tif 000054
【図２８】
0006931942.tif 000055
【図２９】
0006931942.tif 000056
【図３０】
0006931942.tif 000057
【図３１】
0006931942.tif 000058
【図３２】
0006931942.tif 000059
【図３３】
0006931942.tif 000060
【図３４】
0006931942.tif 000061
【図３５】
0006931942.tif 000062
【図３６】
0006931942.tif 000063
【図３７】
0006931942.tif 000064
【図３８】
0006931942.tif 000065