(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心伝導を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)心伝導を測定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間に空間的に制限された直接の接触があるように配置される、方法。
【請求項２】
(iii)で測定された心伝導の、参照値との比較
を含み、
前記比較が、
(iv)参照物質を投与するステップ、
(v)(iv)による参照物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)(iii)に従って測定された値及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
参照物質が、心拍数減少物質の群又は心拍数増加物質の群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
参照物質が、イソプレナリン、ZD-7288、ザテブラジン及びイバブラジンからなる群から選択される、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項５】
(vii)(iv)、(v)による参照物質を洗い流すステップ、
(viii)心伝導を測定するステップ、
(ix)(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ；又は(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、請求項2〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
心伝導に対する物質の効果を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)(iv)による調査される物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間に空間的に制限された直接の接触があるように配置される、方法。
【請求項７】
心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法であって、
(i)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)心伝導を測定するステップ、
(vi)(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ、並びに(vi)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間に空間的に制限された直接の接触があるように配置される、方法。
【請求項８】
(vii)(iv)による調査される物質を洗い流すステップ、
(vii)心伝導を測定するステップ、
(viii)(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ；又は(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ、
(ix)(viii)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含む、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
(ii)による作業心筋の心筋細胞が、心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
(ii)による作業心筋の心筋細胞が、(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間に空間的に制限された直接の接触があるように配置される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
in vitroで実施される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から生成される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から生成される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
心伝導を決定するためのデバイスであって、
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、デバイス。
【請求項１６】
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を含む第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、請求項15に記載の心伝導を決定するためのデバイス。
【請求項１７】
(b)による第2の領域2が、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3が、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、  (c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む、請求項15又は16に記載のデバイス。
【請求項１８】
ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなる、請求項15から17のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
プラスチックが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される、請求項18に記載のデバイス。
【請求項２０】
心伝導を決定するためのキットであって、
(A)(a)誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1及び第2の領域と伝導的に連絡しており、第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含むデバイス、
(B)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)
を含む、キット。
【請求項２１】
(b)による第2の領域2が、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3が、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、  (c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
デバイスが、ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなる、請求項20又は21に記載のキット。
【請求項２３】
プラスチックが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される、請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
薬物のin vitro評価、又は心伝導に対して効果を有する物質の特定のための、請求項15から19のいずれか一項に記載のデバイス、又は請求項20から23のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項２５】
試験対象の心伝導障害の診断若しくは前診断、特にin vitro診断若しくはin vitro前診断のための、又は試験対象が心伝導障害を発症するリスクの決定のための、請求項15から19のいずれか一項に記載のデバイス、又は請求項20から23のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心伝導、特に試験対象の心伝導を決定する方法であって、心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(induced sinoatrial body)(iSABs)を用意するステップ、作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、及び心伝導を測定するステップを含み、誘導洞房体及び作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓の伝導系は、心臓のポンプ活動を調節する電気信号を送達する。同時に、これらの興奮の基本的なリズムはペースメーカー系により生成される。両方の系、すなわち心臓のペースメーカー系及び伝導系は、特殊な心筋細胞を含む。
【０００３】
ペースメーカー系は、洞結節の心筋細胞及び房室結節(AV結節)の心筋細胞を含み、洞結節は心臓の一次興奮イニシエーター(ペースメーカー)として機能し、AV結節は心臓の二次ペースメーカーとして機能する。洞結節の頻度がより高い(1分あたり約60〜80回の刺激)ことから、それ自体1分あたり約40〜50回の刺激を生成することができるAV結節のペースメーカー活動は、洞結節不全の場合にのみ有効となる。正常に機能する洞結節の場合、その電気的興奮がAV結節を介して送達される。さらなる伝導がヒス-プルキンエ系を介して発生する、すなわち、電気的興奮がAV結節から、その1分あたり約20〜30回の刺激の固有のリズムにより心臓の三次ペースメーカーとも呼ばれるヒス束まで送達される。洞結節のペースメーカー細胞により誘導されると、刺激はAV結節及びヒス-プルキンエ系を介して作業心筋に拡散する。ここで、活動電位が心房組織(心房、心房細胞)から心室組織(心室、心室細胞)にいつ伝達されるか、及び伝達されるかどうかをAV結節及びヒス束が決定する。
【０００４】
心臓の伝導系は、規則的かつ独立した心臓のリズムに関与する。伝導における障害は、伝導系内のシグナルが適切に送達されなくなると発生しうる。伝導における障害はとりわけ、例えば冠動脈性心疾患又は洞不全症候群などの疾患、及び電解質ハウスキーピングにおける障害により引き起こされることがあり、さらに例えばジギタリス又は特定の抗不整脈薬などの一部の医薬が、伝導における障害につながることもある。伝導における障害の診断は通常、ECG検査により行われる。療法として可能なのは、根底にある疾患の治療、誘発効果を有する医薬の用量減少又は中止、ペースメーカーの使用、及び心臓不整脈に対する医薬(抗不整脈薬)の使用である。ECGベースの診断はこれまで、試験対象に対して直接的にのみ可能であり、このことから、場合によっては長期的なECG検査を実施する必要があり、通常、ECG装置を体に24時間装着している必要がある。伝導に対する効果に関して、及び伝導における障害の治療への適合性に関して医薬を研究することはこれまで、試験対象に対して直接的に、又は動物実験を用いてのみ可能であった。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、本発明の根底にある目的の1つは、特に、試験対象に対する長いECGの回避又は動物実験の回避という点で、心伝導を決定する改善された方法を提供することである。
【０００６】
驚くべきことに、このような方法が、作業心筋の心筋細胞と併せて心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意し、心伝導を測定するのにそれらを使用することによって提供可能であることが判明した。
【０００７】
したがって本発明は、心伝導、特に試験対象の心伝導を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)心伝導を測定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法を提供する。
【０００８】
「互いに伝導的に連絡して配置される」は、例えば(i)による誘導洞房体から(ii)による作業心筋の心筋細胞への電気的興奮の伝達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味し、好ましくは、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間には空間的に制限された直接の接触があり、さらに好ましくはその接触を介して、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の間にコネキシン結合が形成されうる。「空間的に制限された直接の接触」は、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が位置する空間的に隔離された領域が、そこを介してiSABS及び作業心筋の心筋細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有することを意味する。好ましくは、方法は(i)、(ii)及び(iii)を含む。好ましい実施形態において、方法は(i)、(ii)及び(iii)からなる。本発明の文脈において、ローマ数字によるステップの命名は概して、前記ステップが最小の値から最大の値へ連続した順序で実施されることを意味する。
【０００９】
最近、例えば転写因子TBX3の過剰発現及びMyh6プロモーターベースの抗生物質選択の組合せを用いて、マウス多能性幹細胞を、これまで観察されたことのないペースメーカー細胞凝集物にプログラムすることができることを示すことが可能となった。1分あたり300〜400回の拍動で、前記「誘導洞房体」(iSABs)は、マウス心臓の収縮頻度に近く、同時に、外植されたin vitro培養マウス洞結節細胞の収縮頻度に相当する収縮頻度を初めて示している(Jung, J.J., et al., Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports, 2014. 2(5): p. 592-605、Rimmbach, C., J.J. Jung, and R. David, Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J Vis Exp, 2015(96)、DE 10 2013 114 671 A1、WO 2015/091157 A1)。共焦点顕微鏡法、FACS、個別細胞パッチクランプ(individual-cell patch clamp)、ファニーチャネル(funny channel)密度測定及びCa2+イメージングを用いての詳細な解析により、iSABsが80%超の最終分化洞結節細胞からなることを示すことが可能となった。残りの細胞の解析により、前記細胞がまだ完全には分化していない洞結節細胞であることが明らかとなった。心室切片培養物のex vivoモデルを用いて、iSABsのペースメーカー機能を示すことが可能となった。iSABsは切片に組み込まれ、切片の強力な同調的収縮を誘導することができた。したがってiSABsは、高純度の、in vitroで生成された機能性洞結節組織の最初の例となる。マウス系からヒト系への移行可能性は、根底にあるプロセスが高度に保存されているため可能である。
【００１０】
本発明による方法により、モデル系においてex vivo又はin vitroで伝導を研究することが可能となる。ここで、例えば、試験対象由来の作業心筋細胞を使用することが可能であることから、必要に応じて特定の試験対象で研究を行うことが可能である。伝導は、ECGを用いて、例えばいわゆるmini-ECGを使用して、又は微小電極アレイ(MEA)を用いて測定することができる。「伝導」はここでは、ペースメーカー、この場合はiSABs、特にiSABsの洞結節細胞から作業心筋細胞への電気的興奮の伝達を意味すると理解されるべきである。iSABsは、上記のように、Jung, J.J., et al., Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports, 2014. 2(5): p. 592-605、Rimmbach, C., J.J. Jung, and R. David, Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J Vis Exp, 2015(96)、DE 10 2013 114 671 A1又はWO 2015/091157 A1に従って産生される。
【００１１】
好ましくは、本発明による方法は、(iii)で測定された心伝導の、参照値との比較をさらに含み、比較は好ましくは、
(iv)参照物質を投与するステップ、
(v)(iv)による参照物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)(iii)に従って測定された値及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む。
【００１２】
(vi)による比較では、(v)の心伝導の値が(iii)に従って測定された値と少なくとも5%異なっていれば、(iii)に従って測定された値と比較した(v)の心伝導の変化が有意であると考えることができる。好ましくは、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも20%の差が有意であると格付けされる。好ましくは、方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)及び(vi)を含む。好ましい実施形態において、方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)及び(vi)からなる。
【００１３】
基本的に、参照物質の性質に関して制限はない。好ましくは、参照物質は、心拍数減少物質の群又は心拍数増加物質の群から、好ましくはイソプレナリン、ZD-7288、ザテブラジン及びイバブラジンからなる群から選択される。
【００１４】
好ましい実施形態において、方法は、
(vii)(iv)、(v)による参照物質を洗い流すステップ、
(viii)心伝導を測定するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、又は(v)に従って測定された値を比較するステップ
をさらに含む。
【００１５】
(ix)による比較では、(viii)の心伝導の値が(iii)に従って、又は(v)に従って測定された値と少なくとも5%異なっていれば、(iii)に従って、又は(v)に従って測定された値と比較した(viii)の心伝導の変化が有意であると考えることができる。好ましくは、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも20%の差が有意であると格付けされる。好ましくは、方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)及び(viii)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)及び(ix)を含む。好ましい実施形態において、方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)及び(viii)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)及び(ix)からなる。
【００１６】
(ii)による作業心筋の心筋細胞は、好ましくは心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、さらに好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞は、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される。好ましくは、空間的な並びは最初に(i)、次いで(ii.1)さらに(ii.2)である、すなわち、(i)による心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が(ii.1)による心房細胞と空間的に隔離されて、しかし伝導的に連絡して配置され、(ii.1)による心房細胞が(ii.2)による心室細胞と空間的に隔離されて、しかし伝導的に連絡して配置される。「互いに伝導的に連絡して配置される」は、ここで、(i)による誘導洞房体から(ii.1)による心房細胞への、及び前記細胞から(ii.2)による心室細胞への電気的興奮の伝達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを同様に意味し、好ましくは、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii.1)による心房細胞の少なくとも一部の間には、さらに(ii.1)による心房細胞の少なくとも一部及び(ii.2)による心室細胞の少なくとも一部の間にも空間的に制限された直接の接触があり、さらに好ましくはその接触を介してコネキシン結合が形成されうる。「空間的に制限された直接の接触」は、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が位置する空間的に隔離された領域が、そこを介してiSABS及び心房細胞、又は心房細胞及び心室細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有することを意味する。
【００１７】
好ましい実施形態において、方法はin vitroで実施される。
【００１８】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、複能性(multipotent)又は多能性(pluripotent)幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される。好ましい実施形態において、ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される。基本的に、iSABsの生成は特定の方法に何ら制限されない。例えば、iSABsの生成はDE 10 2013 114 671 A1又はWO 2015/091157 A1に記載されるように実現することができる、すなわち、iSABsは、例えばTBX3の過剰発現及びMyh6プロモーターベースの抗生物質選択の組合せを用いて、多能性幹細胞から心筋細胞の凝集物に再プログラムされうる。
【００１９】
心伝導に対する物質の効果の決定
本発明は、心伝導、特に試験対象の心伝導に対する物質の効果を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)任意選択で心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)(iv)による調査される物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)任意選択で、(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法にさらに関する。
【００２０】
好ましくは、心伝導に対する物質の効果を決定する方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)及び(v)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)及び(vi)を含む。好ましい実施形態において、心伝導に対する物質の効果を決定する方法は(i)、(ii)、(iv)及び(v)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)及び(v)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)及び(vi)からなる。
【００２１】
「互いに伝導的に連絡して配置される」は、例えば(i)による誘導洞房体から(ii)による作業心筋の心筋細胞への電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味し、好ましくは、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間には空間的に制限された直接の接触があり、さらに好ましくはその接触を介して、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の間にコネキシン結合が形成されうる。「空間的に制限された直接の接触」は、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が位置する空間的に隔離された領域が、そこを介してiSABS及び作業心筋の心筋細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有することを意味する。
【００２２】
(vi)による比較では、(v)の心伝導の値が(iii)に従って測定された値と少なくとも5%異なっていれば、(iii)に従って測定された値と比較した(v)の心伝導の変化、例えばECGで測定された(v)の頻度の変化が有意であると考えることができる。好ましくは、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも20%の差が有意であると格付けされる。
【００２３】
好ましい実施形態において、方法は、
(vii)(iv)、(v)による調査される物質を洗い流すステップ、
(viii)心伝導を測定するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)に従って測定された値、及び(v)に従って、若しくは(iii)に従って測定された値を比較するステップ、又は(viii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値を比較するステップ
をさらに含む。
【００２４】
(ix)による比較では、(viii)の心伝導の値が(iii)に従って、及び/又は(v)に従って測定された値と少なくとも5%異なっていれば、(iii)に従って、及び/又は(v)に従って測定された値と比較した(viii)の心伝導の変化が有意であると考えることができる。好ましくは、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも20%の差が有意であると格付けされる。好ましくは、心伝導に対する物質の効果を決定する方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vii)及び(viii)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)及び(viii)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)及び(ix)を含む。好ましい実施形態において、心伝導に対する物質の効果を決定する方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vii)及び(viii)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)及び(viii)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)及び(ix)からなる。
【００２５】
好ましくは、(ii)による作業心筋の心筋細胞は心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞は、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される。好ましくは、空間的な並びは最初に(i)、次いで(ii.1)さらに(ii.2)である、すなわち、(i)による心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が(ii.1)による心房細胞と空間的に隔離されて、しかし伝導的に連絡して配置され、(ii.1)による心房細胞が(ii.2)による心室細胞と空間的に隔離されて、しかし伝導的に連絡して配置される。「互いに伝導的に連絡して配置される」は、ここで、(i)による誘導洞房体から(ii.1)による心房細胞への、及び前記細胞から(ii.2)による心室細胞への電気的興奮の伝達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを同様に意味し、好ましくは、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii.1)による心房細胞の少なくとも一部の間には、さらに(ii.1)による心房細胞の少なくとも一部及び(ii.2)による心室細胞の少なくとも一部の間にも空間的に制限された直接の接触があり、さらに好ましくはその接触を介してコネキシン結合が形成されうる。「空間的に制限された直接の接触」は、ここで、(i)によるiSABs及び(ii.1)による心房細胞が位置する空間的に隔離された領域が、そこを介してiSABs及び心房細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有すること、並びに(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が位置する領域が、そこを介して心房細胞及び心室細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有することを同様に意味する。
【００２６】
好ましくは、方法はin vitroで実施される。
【００２７】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される。好ましい実施形態において、ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される。基本的に、iSABsの生成は特定の方法に何ら制限されない。例えば、iSABsの生成はDE 10 2013 114 671 A1又はWO 2015/091157 A1に記載されるように実現することができる、すなわち、iSABsは、例えばTBX3の過剰発現及びMyh6プロモーターベースの抗生物質選択の組合せを用いて、多能性幹細胞から心筋細胞の凝集物に再プログラムされうる。
【００２８】
心伝導に対して効果を有する物質の特定
本発明は、心伝導、特に試験対象の心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法であって、
(i)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)任意選択で心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)心伝導を測定するステップ、
(vi)任意選択で、(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ、並びに任意選択で、(vi)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法にさらに関する。
【００２９】
好ましくは、心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)及び(v)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)及び(vi)を含む。好ましい実施形態において、心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法は(i)、(ii)、(iv)及び(v)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)及び(v)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)及び(vi)からなる。
【００３０】
「互いに伝導的に連絡して配置される」は、例えば(i)による誘導洞房体から(ii)による作業心筋の心筋細胞への電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味し、好ましくは、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部の間には空間的に制限された直接の接触があり、さらに好ましくはその接触を介して、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞の間にコネキシン結合が形成されうる。「空間的に制限された直接の接触」は、(i)によるiSABs及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が位置する空間的に隔離された領域が、そこを介してiSABS及び作業心筋の心筋細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有することを意味する。(vi)による比較では、(viii)の心伝導の値が(iii)に従って測定された値と少なくとも5%異なっていれば、(iii)に従って測定された値と比較した(v)の心伝導の変化が有意であると考えることができる。好ましくは、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも20%の差が有意であると格付けされる。
【００３１】
好ましい実施形態において、方法は、
(vii)(iv)による調査される物質を洗い流すステップ、
(vii)心伝導を測定するステップ、
(viii)任意選択で、(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ；又は(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ、
(ix)(viii)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
をさらに含む。
【００３２】
(ix)による比較では、(viii)の心伝導の値が(iii)に従って、及び/又は(v)に従って測定された値と少なくとも5%異なっていれば、(iii)に従って、及び/又は(v)に従って測定された値と比較した(viii)の心伝導の変化が有意であると考えることができる。好ましくは、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも20%の差が有意であると格付けされる。好ましくは、心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vii)及び(ix)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)及び(ix)を含み、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)及び(ix)を含む。好ましい実施形態において、心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法は(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vii)及び(ix)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)及び(ix)からなり、さらに好ましくは(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)及び(ix)からなる。
【００３３】
好ましくは、(ii)による作業心筋の心筋細胞は心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞は、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される。好ましくは、空間的な並びは最初に(i)、次いで(ii.1)さらに(ii.2)である、すなわち、(i)による心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が(ii.1)による心房細胞と空間的に隔離されて、しかし伝導的に連絡して配置され、(ii.1)による心房細胞が(ii.2)による心室細胞と空間的に隔離されて、しかし伝導的に連絡して配置される。「互いに伝導的に連絡して配置される」は、ここで、(i)による誘導洞房体から(ii.1)による心房細胞への、及び前記細胞から(ii.2)による心室細胞への電気的興奮の伝達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを同様に意味し、好ましくは、(i)によるiSABsの少なくとも一部及び(ii.1)による心房細胞の少なくとも一部の間には、さらに(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞の間にも空間的に制限された直接の接触があり、さらに好ましくはその接触を介してコネキシン結合が形成されうる。「空間的に制限された直接の接触」は、ここで、(i)によるiSABs及び(ii.1)による心房細胞が位置する空間的に隔離された領域が、そこを介してiSABs及び心房細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有すること、並びに(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が位置する領域が、そこを介して心房細胞及び心室細胞が接触可能となる、共通の開放接触区域又は接触領域を有することを同様に意味する。
【００３４】
好ましくは、方法はin vitroで実施される。
【００３５】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される。好ましい実施形態において、ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される。基本的に、iSABsの生成は特定の方法に何ら制限されない。例えば、iSABsの生成はDE 10 2013 114 671 A1又はWO 2015/091157 A1に記載されるように実現することができる、すなわち、iSABsは、例えばTBX3の過剰発現及びMyh6プロモーターベースの抗生物質選択の組合せを用いて、多能性幹細胞から心筋細胞の凝集物に再プログラムされうる。
【００３６】
心伝導を決定するデバイス
本発明は、心伝導、特に試験対象の心伝導を決定するためのデバイスであって、
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、デバイスにさらに関する。
【００３７】
「第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した」は、第1の領域及び第2の領域が第3の領域を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であることを意味する。「伝導的に連絡して」は、例えば第1の領域から第2の領域への第3の領域を介した電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味し、第3の領域は好ましくは、第1及び第2の領域の間の空間的に制限された直接接触区域又は接触領域である。iSABs及び作業心筋の心筋細胞が存在する場合、これは、iSABsの少なくとも一部及び作業心筋の心筋細胞の少なくとも一部が、第3の領域を介して、さらに好ましくは、空間的に隔離されたiSABs及び作業心筋の心筋細胞の間のコネキシン結合形成を介して接触可能となることを意味する。第3の領域は接触区域であってよい、すなわち、第1及び第2の領域は共通の開放接触区域を有してよい。あるいは、第3の領域は、第1及び第2の領域の軸に沿った空間的広がりを含んでいてもよい。
【００３８】
基本的に、デバイスはその構造に関して何ら制限を受けない。例として、考えられる1つの構造はプレート上の2つの凹部であり、第1の凹部及び第2の凹部はそれぞれ(a)による第1の領域1及び(b)による第2の領域2であり、第3の凹部((c)による第3の領域3)を介して連結されており、第3の凹部の深さは第1又は第2の凹部の最小の深さと同じかそれ未満である。対応する構造を図1Aに図式的に示す。第3の領域3tにおける、第1の領域1からのiSABsの、第2の領域2からの作業心筋の心筋細胞との接触により、伝導的連絡を確立することが可能である。ここで、第3の領域は直接接触区域である。あるいは、第3の領域が、第1及び第2の領域の軸に沿った空間的広がりを含むことも可能であり、第3の領域又は対応する凹部の深さは同様に、第1又は第2の凹部の最小の深さと同じかそれ未満である。ここで、伝導的連絡は、第1の領域から第3の領域へのiSABsの伸長、及び第2の領域から第3の領域への作業心筋の心筋細胞の伸長により実現され、これにより、第3の領域において、第1の領域からのiSABsの、第2の領域からの作業心筋の心筋細胞との接触を確立することが可能となる。対応する構造を図1Bに図式的に示す。
【００３９】
一実施形態において、心伝導、特に試験対象の心伝導を決定するためのデバイスは、
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を含む第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む。
【００４０】
「第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した」は、ここでも、第1の領域及び第2の領域が第3の領域を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であることを意味する。「伝導的に連絡して」は、例えば第1の領域から第2の領域への第3の領域を介した電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味する。デバイスの構造に関しては、上記したものが適用される。
【００４１】
好ましい実施形態において、(b)によるデバイスの第2の領域2は、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3は、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、
(c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む。
【００４２】
「第1の領域1から(b.1)による領域2.1に、及び(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した」は、ここでも、第1の領域及び領域2.1が領域3.1を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であること、並びに領域2.1及び領域2.2が領域3.2を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であることを意味する。「第1の領域から第2の領域に伝導させるのに適した」は、第1の領域及び第2の領域が第3の領域を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であることを意味する。「伝導的に連絡して」は、第1の領域1から領域2.1への領域3.1を介した、及びさらに、領域2.1から領域2.2への領域3.2を介した電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味する。デバイスの構造並びに領域1、2.1、2.2、3.1及び3.2に関しては、デバイスの構造に関して初めに言及したものが同様に適用される。対応する構造を図2A及び2Bに図式的に示す。
【００４３】
基本的に、デバイスを構成する材質に関して制限はない。好ましくは、デバイスは、ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなり、プラスチックは好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群、好ましくはポリスチレンから選択される。
【００４４】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される。好ましくは、ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される。
【００４５】
心伝導を決定するためのキット
本発明は、心伝導、特に試験対象の心伝導を決定するためのキットであって、
(A)(a)誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含むデバイス、
(B)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)
を含む、キットにさらに関する。
【００４６】
「第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した」は、ここでも、第1の領域及び第2の領域が第3の領域を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であることを意味する。「伝導的に連絡して」は、例えば第1の領域から第2の領域への第3の領域を介した電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味する。
【００４７】
基本的に、デバイスはその構造に関して何ら制限を受けない。例として、考えられる構造はプレート上の2つの凹部であり、第1の凹部及び第2の凹部はそれぞれ(a)による第1の領域1及び(b)による第2の領域2であり、第3の凹部((c)による第3の領域3)を介して連結されており、第3の凹部の深さは第1又は第2の凹部の最小の深さと同じかそれ未満である。対応する構造を図1Aに図式的に示す。第3の領域3における、第1の領域1からのiSABsの、第2の領域2からの作業心筋の心筋細胞との接触により、伝導的連絡を確立することが可能である。ここで、第3の領域は直接接触区域である。あるいは、第3の領域が、第1及び第2の領域の軸に沿った空間的広がりを含むことも可能であり、第3の領域又は対応する凹部の深さは同様に、第1又は第2の凹部の最小の深さと同じかそれ未満である。ここで、伝導的連絡は、第1の領域から第3の領域へのiSABsの伸長、及び第2の領域から第3の領域への作業心筋の心筋細胞の伸長により実現され、これにより、第3の領域において、第1の領域からのiSABsの、第2の領域からの作業心筋の心筋細胞との接触を確立することが可能となる。対応する構造を図1Bに図式的に示す。
【００４８】
キットの好ましい実施形態において、(b)による第2の領域2は、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
第3の領域(c)は、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、
(c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む。
【００４９】
「第1の領域1から(b.1)による領域2.1に、及び(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した」は、ここでも、第1の領域及び領域2.1が領域3.1を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であること、並びに領域2.1及び領域2.2が領域3.2を介して伝導的に連絡している、すなわち、伝導的な方法で連絡可能であることを意味する。「伝導的に連絡して」は、領域第1の領域1から領域2.1への領域3.1を介した、及びさらに、領域2.1から領域2.2への領域3.2を介した電気的興奮の伝達、すなわち刺激の送達が、空間的隔離にもかかわらず可能であることを意味する。デバイスの構造並びに領域1、2.1、2.2、3.1及び3.2に関しては、デバイスの構造に関して初めに言及したものが同様に適用される。対応する構造を図2A及び2Bに図式的に示す。
【００５０】
基本的に、キットのデバイスを構成する材質に関して制限はない。好ましくは、デバイスは、ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなり、プラスチックは好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群、好ましくはポリスチレンから選択される。
【００５１】
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される。好ましくは、ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)は、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される。
【００５２】
使用
基本的に、デバイス及びキットが何に使用されるかに関して制限はない。好ましくは、デバイス又はキットは薬物のin vitro評価のために使用される。
【００５３】
好ましい実施形態において、デバイス又はキットは、心伝導に対して効果を有する物質を特定するために使用される。
【００５４】
さらに好ましい実施形態において、デバイス又はキットは、試験対象の心伝導障害の診断若しくは前診断(prediagnosis)、特にin vitro診断若しくはin vitro前診断、又は試験対象が心伝導障害を発症するリスクを決定するためのものである。
【００５５】
本発明は、対応する従属参照(dependency reference)及びその他の参照から生じる以下の実施形態及び実施形態の組合せによってより詳細に説明される。ここで、実施形態の範囲について言及される全ての場合において、例えば「実施形態1〜4のいずれかによる方法」などの表現の文脈において、この範囲の各実施形態が当業者に明確に開示されているものと考えられるべきである、すなわち、前記表現は「実施形態1、2、3及び4(のそれぞれ)のいずれかによる方法」と同義であると当業者に理解されるべきであることに留意すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
実施形態
1.  心伝導、特に試験対象の心伝導を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)心伝導を測定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法。
2.  (iii)で測定された心伝導の、参照値との比較
を含み、
前記比較が好ましくは、
(iv)参照物質を投与するステップ、
(v)(iv)による参照物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)(iii)に従って測定された値及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、実施形態1による方法。
3.  参照物質が、心拍数減少物質の群又は心拍数増加物質の群から、好ましくはイソプレナリン、ZD-7288、ザテブラジン及びイバブラジンからなる群から選択される、実施形態2による方法。
4.  (vii)(iv)、(v)による参照物質を洗い流すステップ、
(viii)心伝導を測定するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、又は(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、実施形態1〜3のいずれかによる方法。
5.  (ii)による作業心筋の心筋細胞が、心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、実施形態1〜4のいずれかによる方法。
6.  in vitroで実施される、実施形態1〜5のいずれかによる方法。
7.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される、実施形態1〜6のいずれかによる方法。
8.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、実施形態1〜7のいずれかによる方法。
9.  心伝導、特に試験対象の心伝導に対する物質の効果を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)任意選択で心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)(iv)による調査される物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)任意選択で、(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法。
10.  (vii)(iv)、(v)による調査される物質を洗い流すステップ、
(viii)心伝導を測定するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ、又は(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、実施形態9による方法。
11.  (ii)による作業心筋の心筋細胞が、心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、実施形態9〜10による方法。
12.  in vitroで実施される、実施形態9〜11のいずれかによる方法。
13.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される、実施形態9〜12のいずれかによる方法。
14.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、実施形態9〜13のいずれかによる方法。
15.  心伝導、特に試験対象の心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法であって、
(i)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)任意選択で心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)心伝導を測定するステップ、
(vi)任意選択で、(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ、並びに任意選択で、(vi)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法。
16.  (vii)(iv)による調査される物質を洗い流すステップ、
(vii)心伝導を測定するステップ、
(viii)任意選択で、(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ、又は(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含む、実施形態15による方法。
17.  (ii)による作業心筋の心筋細胞が、心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、実施形態16による方法。
18.  in vitroで実施される、実施形態16又は17による方法。
19.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される、実施形態16〜18のいずれかによる方法。
20.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、実施形態16〜19のいずれかによる方法。
21.  心伝導、特に試験対象の心伝導を決定するためのデバイスであって、
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、デバイス。
22.  (a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を含む第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、実施形態21による、心伝導、特に試験対象の心伝導を決定するためのデバイス。
23.  (b)による第2の領域2が、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3が、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、
(c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む、実施形態21による、又は実施形態22によるデバイス。
24.  ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなり、プラスチックが好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群、好ましくはポリスチレンから選択される、実施形態21〜22のいずれかによるデバイス。
25.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される、実施形態21〜24のいずれかによるデバイス。
26.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、実施形態21〜25のいずれかによるデバイス。
27.  心伝導、特に試験対象の心伝導を決定するためのキットであって、
(A)
(a)誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞、特に試験対象の作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1及び第2の領域と伝導的に連絡しており、第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含むデバイス、
(B)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)
を含む、キット。
28.  (b)による第2の領域2が、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3が、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、
(c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む、実施形態27によるキット。
29.  デバイスが、ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなり、プラスチックが好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群、好ましくはポリスチレンから選択される、実施形態27又は28によるキット。
30.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される、実施形態27〜29のいずれかによるキット。
31.  ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、実施形態27〜30のいずれかによるキット。
32.  薬物のin vitro評価のための、実施形態21〜26のいずれかによるデバイス、又は実施形態27〜31のいずれかによるキットの使用。
33.  心伝導に対して効果を有する物質の特定のための、実施形態21〜26のいずれかによるデバイス、又は実施形態27〜31のいずれかによるキットの使用。
34.  試験対象の心伝導障害の診断若しくは前診断、特にin vitro診断若しくはin vitro前診断のための、又は試験対象が心伝導障害を発症するリスクの決定のための、実施形態21〜26のいずれかによるデバイス、又は実施形態27〜31のいずれかによるキットの使用。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域(1)、作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域(2)、並びに第1及び第2の領域と伝導的に連絡しており、第1の領域から第2の領域に伝導させるのに適した第3の領域(3)を有するデバイスの構造を図式的に示す図である。図1Aでは、第3の領域(3)は第1の領域(1)及び第2の領域(2)の間の直接接触領域であり、図1Bでは、第3の領域(3)は第1及び第2の領域の軸に沿った空間的広がりを含む。
【図２】誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域(1)、作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域(2)、及び第3の領域(3)を有するデバイスの構造を図式的に示す図であり、領域(2)は2つの領域2.1及び2.2を含み、2.1は心房細胞を収容するのに適しており、2.2は心室細胞を収容するのに適している。第3の領域(3)は領域3.1及び領域3.2を含む。図2Aでは、第3の領域(3.1)は1.1及び2.1の間の直接接触領域であり、さらに3.2は2.1及び2.2の間の直接接触領域である。図2Bでは、3.1及び3.2は、両方の場合で領域(1)、(2.1)、(2.2)の軸に沿った空間的広がりを含む。
【図３】マウス心室心筋細胞に結合したマウスiSABsから構成される同調したコンダクトイド(conductoid)のプロトタイプを示す図である。図3BはiSABs及び心室心筋細胞を示し、iSABs(点線の囲い)は心室心筋細胞(斜線の矢印)に結合して、約300bpmの、そのリズミカルに同調した収縮を誘導することができる。図3Aは対応するふれを示す。
【００５８】
引用文献
-  Jung, J.J., et al., Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports, 2014. 2(5): p. 592-605
-  Rimmbach, C., J.J. Jung, and R. David, Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J Vis Exp, 2015(96)
-  DE 10 2013 114 671 A1
-  WO 2015/091157 A1
【００５９】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明される。
【実施例】
【００６０】
iSABs及び心室心筋細胞の結合
Jung et al.,(2014)及びRimmbach et al.,(2015)に記載されるように誘導洞房体(「iSABs」)を調製した。分化28日目に、高速(>300bpm)かつ規則的に拍動しているiSABsを光学顕微鏡下で採取した。前日にPrimary Cardiomyocyte Isolation Kit (Pierce、USA)を用いて播種し、一晩増殖させた新生仔マウス心筋細胞の培地を吸引し、iSAB培地を添加した。24ウェルプレートのウェル1つあたりにiSABs10個を播種した。増殖に十分な時間をiSABsに与えるため、プレートを37℃及び5%CO2で24hインキュベートした。培地交換後、光学顕微鏡下で、増殖したiSABsについてプレートを探索した。Zeiss ZENblackソフトウェアを用いて、心筋細胞の頻度及びiSABsの頻度の両方を決定し、同調について検査した。
【００６１】
これらの結果に基づくと、心伝導を再構築するため、iSABsを心室心筋細胞との共培養物において維持することにより、そこから第1の単純なコンダクトイド構築物を、この場合はまだ空間的隔離なしであるが生成することが可能であったことが明白である。これは、医薬試験のための手法の実現可能性についてエビデンスを提供することも基本的に可能であったことを意味する。
（付記）
（付記１）
心伝導を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)心伝導を測定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法。
（付記２）
(iii)で測定された心伝導の、参照値との比較
を含み、
前記比較が好ましくは、
(iv)参照物質を投与するステップ、
(v)(iv)による参照物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)(iii)に従って測定された値及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、付記1に記載の方法。
（付記３）
参照物質が、心拍数減少物質の群又は心拍数増加物質の群から、好ましくはイソプレナリン、ZD-7288、ザテブラジン及びイバブラジンからなる群から選択される、付記2に記載の方法。
（付記４）
(vii)(iv)、(v)による参照物質を洗い流すステップ、
(viii)心伝導を測定するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ；又は(viii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ
を含む、付記2又は3に記載の方法。
（付記５）
心伝導に対する物質の効果を決定する方法であって、
(i)心臓ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)任意選択で心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)(iv)による調査される物質の存在下で心伝導を測定するステップ、
(vi)任意選択で、(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法。
（付記６）
心伝導に対して効果を有する物質を特定する方法であって、
(i)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を用意するステップ、
(ii)作業心筋の心筋細胞を用意するステップ、
(iii)任意選択で心伝導を測定するステップ、
(iv)調査される物質を投与するステップ、
(v)心伝導を測定するステップ、
(vi)任意選択で、(iii)に従って測定された心伝導及び(v)に従って測定された心伝導を比較するステップ、並びに任意選択で、(vi)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含み、
(i)による誘導洞房体及び(ii)による作業心筋の心筋細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、方法。
（付記７）
(vii)(iv)による調査される物質を洗い流すステップ、
(vii)心伝導を測定するステップ、
(viii)任意選択で、(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って、若しくは(v)に従って測定された値を比較するステップ；又は(vii)に従って測定された値、及び(iii)に従って測定された値、及び(v)に従って測定された値を比較するステップ、
(ix)任意選択で、(viii)による比較に基づいて、調査される物質が心伝導に対して効果を有するかどうかを決定するステップ
を含む、付記5又は6に記載の方法。
（付記８）
(ii)による作業心筋の心筋細胞が、心房細胞若しくは心室細胞又は心房及び心室細胞を含み、好ましくは(ii.1)心房細胞及び(ii.2)心室細胞を含み、好ましくは(i)による誘導洞房体、(ii.1)による心房細胞及び(ii.2)による心室細胞が、空間的に隔離されて、しかし互いに伝導的に連絡して配置される、付記1から7のいずれか一項に記載の方法。
（付記９）
in vitroで実施される、付記1から8のいずれか一項に記載の方法。
（付記１０）
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、複能性又は多能性幹細胞から、好ましくは多能性幹細胞から生成される、付記1から9のいずれか一項に記載の方法。
（付記１１）
ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞又は単為発生幹細胞又は精原幹細胞から、好ましくは非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト誘導多能性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から生成される、付記1から9のいずれか一項に記載の方法。
（付記１２）
心伝導を決定するためのデバイスであって、
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、デバイス。
（付記１３）
(a)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)を含む第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含む、付記12に記載の心伝導を決定するためのデバイス。
（付記１４）
(b)による第2の領域2が、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3が、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、  (c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む、付記12又は13に記載のデバイス。
（付記１５）
ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなり、プラスチックが好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群、好ましくはポリスチレンから選択される、付記12から14のいずれか一項に記載のデバイス。
（付記１６）
心伝導を決定するためのキットであって、
(A)(a)誘導洞房体(iSABs)を収容するのに適した第1の領域1、
(b)作業心筋の心筋細胞を収容するのに適した第2の領域2、
(c)第1及び第2の領域と伝導的に連絡しており、第1の領域1から第2の領域2に伝導させるのに適した第3の領域3
を含むデバイス、
(B)ペースメーカー細胞を含む誘導洞房体(iSABs)
を含む、キット。
（付記１７）
(b)による第2の領域2が、
(b.1)心房細胞を収容するのに適した領域2.1、
(b.2)心室細胞を収容するのに適した領域2.2
を含み、
(c)による第3の領域3が、
(c.1)(a)による第1の領域1から(b.1)による領域2.1に伝導させるのに適した領域3.1、  (c.2)(b.1)による領域2.1から(b.2)による領域2.2に伝導させるのに適した領域3.2
を含む、付記16に記載のキット。
（付記１８）
デバイスが、ガラス、セラミック、プラスチック及びこれらの材質のうち2つ以上の混合物からなる群から選択される材質からなり、プラスチックが好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及びこれらの物質のうち2つ以上の混合物からなる群、好ましくはポリスチレンから選択される、付記16又は17に記載のキット。
（付記１９）
薬物のin vitro評価、又は心伝導に対して効果を有する物質の特定のための、付記12から15のいずれか一項に記載のデバイス、又は付記16から18のいずれか一項に記載のキットの使用。
（付記２０）
試験対象の心伝導障害の診断若しくは前診断、特にin vitro診断若しくはin vitro前診断のための、又は試験対象が心伝導障害を発症するリスクの決定のための、付記12から15のいずれか一項に記載のデバイス、又は付記16から18のいずれか一項に記載のキットの使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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