(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とを含む、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体であって、
（Ａ）配列番号１で１６４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、又は
（Ｂ）配列番号２で２番目のアミノ酸、配列番号２で６４番目のアミノ酸若しくは配列番号２で２番目のアミノ酸と６４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、
５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。
【請求項２】
（Ａ）前記配列番号１で１６４番目のアミノ酸が、リジン、アルギニン、アスパラギン、グリシン、トレオニン若しくはプロリンに置換された、又は
（Ｂ）前記配列番号２で２番目のアミノ酸が、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、若しくはアスパラギンに置換された、前記配列番号２で６４番目のアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、システイン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンに置換された、又は配列番号２で２番目のアミノ酸と６４番目のアミノ酸が、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、イソロイシン及びフェニルアラニンから選ばれるアミノ酸に置換された、
請求項１に記載の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載のタンパク質変異体、又は請求項１又は２に記載のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項５に記載の５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び、前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項７に記載の５’−イノシン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−イノシン酸排出能を有する新規タンパク質変異体、これを含む微生物、これを用いた５’−イノシン酸の製造方法及び５’−イノシン酸の排出増加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質の１つである５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate；以下ＩＭＰ）は、核酸代謝経路の中間物質であって、食品、医薬品及び各種医療的利用などの多方面に利用されている。特に、５’−グアニル酸（5'-guanine monophosphate；以下ＧＭＰ）と共に食品調味添加剤または食品用として広く利用されている物質である。ＩＭＰは、それ自体で牛肉の味を出すことが知られているが、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化することが知られて、呈味性核酸系の調味料として脚光を浴びている。
【０００３】
ＩＭＰを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法（特許文献１）、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法（非特許文献１など）及びＩＭＰを直接的に生産する微生物を培養して、培養液内のＩＭＰを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、ＩＭＰを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
【０００４】
一方、自然な状態での酵素は、産業的な活用において要求される活性、安定性、光学異性体に対する基質特異性などにおいて、常に最適の特性を示すことではないため、アミノ酸配列の変異などを介して目的とする用途に適して酵素を改良する様々な試みがなされてきた。その中、酵素の合理的デザイン（rational design）及び部分変異（site−directed mutagenesis）方法が酵素機能を向上するために適用された例があるが、多くの場合、目的酵素の構造に関する情報が不足したり、構造−機能の相関関係が明確ではなく、効果的に適用できないという欠点がある。また、酵素遺伝子のランダム変異を介して構築された変異酵素ライブラリから目的の形質の酵素をスクリーニングする方向的進化（directed evolution）方法により酵素の改良を試みて活性を改善する方法も報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本特許公告第１６１４／１９５７号
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献３】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972)
【非特許文献２】Pearspm et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch,1970,J. Mol. Biol. 48: 443−453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math （1981） 2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353−358 （1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al., supra, 9.50−9.51, 11.7−１1.8
【非特許文献９】van der Rest et al. 1999
【非特許文献１０】Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541−545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
微生物発酵を介して直接ＩＭＰを生産する方法で高収率のＩＭＰを生産するためには、ＩＭＰの排出がスムーズに行われる必要がある。本目的を達成するために、本発明者らはＩＭＰ排出能に関与するタンパク質を究明し、ＩＭＰの生産を増加させるために鋭意努力した結果、ＩＭＰ排出能を有するタンパク質変異体を発掘することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を提供することにある。
本発明の他の目的は、本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のタンパク質変異体及び前記本発明のベクターを含む５’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明の微生物を培地で培養する段階を含む５’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明の５’−イノシン酸排出タンパク質変異体をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、高収率の５’−イノシン酸の排出増加方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＩＭＰを排出するタンパク質変異体を用いて５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培養する場合、５’−イノシン酸の生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。一方、本明細書で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本明細書で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記に記述された具体的な叙述によって、本発明のカテゴリが制限されるとは見られない。
前記目的を達成するための本発明の一つの様態は、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を提供することにある。
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を排出するタンパク質」は、５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate;ＩＭＰ）を細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味する。本発明の目的上、前記用語はＩＭＰ排出能を有するタンパク質、ＩＭＰ排出タンパク質、５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質、５’−イノシン酸排出タンパク質などと混用して使用してもよい。具体的には、前記タンパク質はＩｍｐＥで示してもよく、より具体的には、ＩｍｐＥ１またはＩｍｐＥ２で示してもよいが、これに制限されるものではない。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
【００１１】
前記タンパク質は、例えば、配列番号１または配列番号２で記載されたアミノ酸配列で構成されたものであってもよいが、前記タンパク質と同様の活性を有する配列は制限なく含み、当業者は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから配列情報を得ることができる。また、前記タンパク質は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用できることは自明である。
すなわち、本発明で「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質」または「特定配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質」と記載されていても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、前記変異型タンパク質と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属することは自明である。
【００１２】
本明細書において、用語、「相同性（homology）」または「同一性（identity）」は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と互いに関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されうる。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）または同一（identical）の配列は、中間または高い厳しい条件（stringent conditions）で、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を使用して決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 （1984））、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 （1990）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００１３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で類似の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本明細書で使用されるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。具体的には、本発明の５’−イノシン酸の排出能を有するタンパク質変異体は、配列番号１で１６４番目のアミノ酸、配列番号１で２２２番目のアミノ酸、配列番号２で２番目のアミノ酸、及び配列番号２で６４番目のアミノ酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００１４】
例えば、前記５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は、配列番号１で１６４番目のアミノ酸が、リジン、アルギニン、アスパラギン、グリシン、トレオニンまたはプロリンに置換されるか、前記配列番号２で２番目のアミノ酸が、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンに置換されるか 、または前記配列番号２で６４番目のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、システイン、イソロイシンまたはフェニルアラニンに置換されたタンパク質変異体であってもよいが、これに制限されない。
具体的な例として、前記５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は、配列番号１４１、１４２、１４５、１４７、１４９または１５１からなるアミノ酸配列、または配列番号１５３または１５４のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列またはこれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。さらに、このような相同性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用されることは自明である。
【００１５】
本発明の他の一つの様態は、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（polymer）であって、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、コドン縮退性（codon degeneracy）によって前記配列番号１４１、１４２、１４５、１４７、１４９または１５１のアミノ酸配列、または配列番号１５３または１５４のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはこれと相同性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれることは自明である。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１４３、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５３または１５４の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、より具体的には１４３、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５３または１５４の塩基配列で構成されたポリヌクレオチドであってもよい。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化し、配列番号１４１、１４２、１４５、１４７、１４９または１５１のアミノ酸配列、または配列番号１５３または１５４のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコード（つまり、暗号化）するポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。
【００１６】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイズを可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイズは、たとえハイブリッド化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリッド化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイズ段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
【００１７】
本明細書で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のタンパク質を発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ4、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
【００１８】
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して、染色体内に目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能の表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【００１９】
本発明のもう一つの様態として、本発明は、本発明のタンパク質変異体、本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む、５’−イノシン酸を生産する微生物を提供する。具体的には、前記タンパク質変異体及び/または前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換によって製造される微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００２０】
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
【００２１】
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される用語、「５’−イノシン酸を生産する微生物」とは、自然的に５’−イノシン酸生産能を有している微生物または５’−イノシン酸の生産能及び/または排出能のない親菌株に５’−イノシン酸の生産能及び／または排出能が付与された微生物を意味する。本発明において、前記５’−イノシン酸を生産する微生物は、５’−イノシン酸を排出する微生物または５’−イノシン酸排出能を有する微生物と混用して使用してもよい。
【００２３】
前記５’−イノシン酸を生産する微生物は、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されてタンパク質変異体を発現できる細胞または微生物であって、本発明の目的上、前記「５’−イノシン酸を生産する微生物」の宿主細胞または微生物は、前記タンパク質変異体を含み、５’−イノシン酸を生成しうる微生物であれば、いずれも可能である。例えば、エシェリキア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、エルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。
【００２４】
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介して５’−イノシン酸生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型菌株それ自体または外部５’−イノシン酸の生産メカニズムと関連された遺伝子ガ挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり弱化させて、向上された５’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。より具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体またはこれをコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、向上された５’−イノシン酸生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。前記「向上された５’−イノシン酸生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」は、形質変化前の親菌株または非変形微生物より５’−イノシン酸生産能が向上された微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、天然型菌株それ自体であるか、前記５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を含まない微生物、または前記５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
本発明の一具現例として、本発明の微生物は、アデニロコハク酸シンテターゼ（adenylosuccinate synthetase）、及び/またはＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）の活性がさらに弱化されたコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。
本発明のもう一つの様態として、前記５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法を提供する。
具体的には、本発明の方法は、前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された５’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
【００２５】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油脂及び脂肪 （例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００２６】
本発明の前記培養段階で生産された５’−イノシン酸を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とする５’−イノシン酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とする５’−イノシン酸を回収してもよい。
【００２７】
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された５’−イノシン酸は、精製された形態または５’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい 。
【００２８】
本発明のもう一つの様態として、本発明の５’−イノシン酸排出タンパク質変異体またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む５’−イノシン酸生産用組成物を提供する。
本発明の組成物は、さらに、前記ポリヌクレオチドを作動させることができる構成を制限なく含んでもよい。本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させうるようにベクター内に含まれた形態であってもよい。
【００２９】
また、前記組成物は、５’−イノシン酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。これらの賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物の５’−イノシン酸の生産増加のための、本発明のタンパク質の用途を提供する。
本発明は、もう一つの様態として、５’−イノシン酸排出タンパク質変異体をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、５’−イノシン酸の排出増加方法を提供する。
前記用語、「５’−イノシン酸排出タンパク質」、「強化」及び「コリネバクテリウム属微生物」は、前述したとおりである。
【００３１】
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物の５’−イノシン酸の排出増加のための、本発明のタンパク質の用途を提供する。
【００３２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではなく、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００３３】
実施例１：ＩＭＰ排出タンパク質の発掘
ＩＭＰ排出に関与するコリネバクテリウム属の膜タンパク質を同定するためにコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡライブラリを製作した。以後、コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても、非常に極微量が生産されるだけなので、ＩＭＰ生産能を確認するために、ＩＭＰ生産能を有するＡＴＣＣ６８７２由来のＣＪＩ０３２３菌株を製作した。製作されたＣＪＩ０３２３菌株にＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡライブラリを用いてＩＭＰ排出に関与する膜タンパク質のスクリーニングを行った。具体的な実験は、以下のとおりである。
【００３４】
実施例１−１：ＩＭＰ生産株であるＣＪＩ０３２３菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産株を製作するために、ＡＴＣＣ６８７２をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌで懸濁させた。ここにＵＶ処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄して希釈した後、１．７％寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＩＭＰ生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度ＩＭＰ生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、３,４−デヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてＩＭＰ生産能の優れたＣＪＩ０３２３を最終選別した。下記の表１にＡＴＣＣ６８７２に比べたＣＪＩ０３２３の耐性程度を比較して示した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
−最小培地：ブドウ糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第２カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．３
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２％、ｐＨ７．２
−種培地：ブドウ糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
−発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ブドウ糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００３７】
実施例１−２：ＣＪＩ０３２３の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ０３２３をそれぞれ接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表２のとおりである。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
前記ＣＪＩ０３２３菌株はコリネバクテリウム・スタティオニスＣＮ０１−０３２３と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１７年１１月７日付で寄託し寄託番号ＫＣＣＭ１２１５１Ｐを与えられた。
【００４０】
実施例１−３：排出タンパク質の発掘
１．７％の寒天を添加した最小培地内にさらにＩＭＰを添加してＣＪＩ０３２３菌株の生育低下（growth inhibition）を示すスクリーニング条件を確立した。ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックライブラリプラスミドをＣＪＩ０３２３菌株に電気穿孔法で形質転換させて（非特許文献９）、過量のＩＭＰが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得し、シーケンスの技法により塩基配列を分析した。これから、過量のＩＭＰ添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の１種を同定した。
前記１種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、及び配列番号４の塩基配列（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter）と確認された。前記膜タンパク質は、ＭＦＳトランスポーターとして知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにＩＭＰ排出に関する機能は知られていない。本明細書では、これをＩｍｐＥ２（ＷＴ）と命名した。
【００４１】
実施例２：ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２の同定
実施例２−１：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の確認
前記膜タンパク質ＩｍｐＥ２の機能を調べるため、ＮＣＢＩから配列番号４の遺伝子構造を確認した（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter）。ｉｍｐＥ２（配列番号４）のＯＲＦの開始部分の７ｂｐがその上流に位置した他の遺伝子（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795119、transcriptional regulator）と７ｂｐオーバーラップされることを確認した。ｉｍｐＥ２ の上流に位置した遺伝子及び該当遺伝子からコードされるタンパク質は、まだ機能が確認されなかったので、本明細書ではこれをＩｍｐＥ１（ＷＴ）と命名した（配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号３の塩基配列）。
【００４２】
実施例２−２：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２欠損ベクターの製作
実施例１と２−１を介して同定したＩＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するＩｍｐＥ１またはＩｍｐＥ２をＩＭＰ生産菌株で欠損させた場合、ＩＭＰの排出能が減少するのかを確認するために、各遺伝子の欠損ベクターを製作した。
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。
具体的には、前記ｉｍｐＥ１のＰＣＲは、配列番号５、６のプライマー及び配列番号７、８のプライマーを、ｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号９、１０のプライマー及び配列番号１１、１２のプライマーを用いた（表３）。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis、ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279）及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。
ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５２℃で３分のアニーリング、７２℃で１分の重合を２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。配列番号５と６のプライマー、配列番号７と８のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺ（特許文献２及び３）のベクターにクローニングしてｐＤＺ−△ｉｍｐＥ１を製作した。また、配列番号９と１０のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子断片と配列番号１１と１２のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．７ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩ、ｓｐｅＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−△ｉｍｐＥ２を製作した。
【００４５】
実施例２−３：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２統合欠損ベクターの製作
前記ＩＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質をコードする遺伝子ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２はオーバーラップされているので、二つの遺伝子は同時に調節される必要がある。したがって、ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２の両方が欠損したベクターを製作した。
ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号５と１３のプライマー及び配列番号１４と１２のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis、ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279）及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。配列番号５と１３のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子断片と配列番号１４と１２のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、２．０ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を、それぞれＸｂａＩ、ｓｐｅＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−△ｉｍｐＥ１Ｅ２を製作した。
【００４６】
実施例２−４：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２欠損菌株の製作
実施例２−２で製作した２種と実施例２−３で製作した１種のプラスミドをそれぞれＣＪＩ０３２３に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が欠損されたかどうかは、配列番号５、８及び配列番号９、１２及び配列番号５、１２のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。
選別された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２と命名し、前記菌株のＩＭＰの生産能を評価した。
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＣＪＩ０３２３、ＣＪＩ０３２３＿△ＩＭＰＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ＩＭＰＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ＩＭＰＥ１Ｅ２を接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表４のとおりである。
【００４７】
【表４】
0006839763.tif 000005
【００４８】
この時、親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３と培地内のＩＭＰ蓄積量を比較した結果、前記表４に示すようにＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２菌株が、同一の条件下で親菌株に比べてＩＭＰの濃度が約８ｇ／Ｌ減少したことを確認し、ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２がＩＭＰの排出に関与するタンパク質であることを確認した。
【００４９】
実施例３：ＩＭＰ生産株ＣＪＩ０３２３のｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の塩基配列の確認
前記実施例１で高濃度ＩＭＰ生産をするＣＪＩ０３２３菌株の場合、高濃度のＩＭＰを生産するためにＩＭＰ排出能が向上した可能性がある。したがって、ＣＪＩ０３２３菌株のｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２が変異されたかどうかを確認した。ＣＪＩ０３２３の染色体ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応の方法（以下「ＰＣＲ法」という）を介して増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＩ０３２３の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５と１６のプライマーを用いて（表５）９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間の結合、７２℃で２分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、約２．８ｋｂの塩基対の断片を増幅した。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、野生型ＡＴＣＣ６８７２の塩基配列に比べて、ｉｍｐＥ１遺伝子の４９０番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されていることを確認した。これはＩｍｐＥ１タンパク質の１６４番目のアミノ酸であるグルタミン酸がリジンに置換される変異であることを意味する。
また、ｉｍｐＥ２遺伝子の４番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されて（ｉｍｐＥ１遺伝子の６６６番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されたことを意味する）、１９１番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されていることを確認した。これはＩｍｐＥ２タンパク質の２番目のアミノ酸（ＩｍｐＥ１タンパク質の２２２番目のアミノ酸に該当）であるバリンがイソロイシンに置換され、６４番目のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に置換されていることを意味する。
ＣＪＩ０３２３菌株のｉｍｐＥ１ヌクレオチドはｉｍｐＥ１＿ＣＪＩ０３２３（配列番号１４３）、タンパク質はＩｍｐＥ１＿ＣＪＩ０３２３（配列番号１４１）と命名し、ＣＪＩ０３２３菌株のｉｍｐＥ２ヌクレオチドはｉｍｐＥ２＿ＣＪＩ０３２３（配列番号１４４）、タンパク質はＩｍｐＥ２＿ＣＪＩ０３２３（配列番号１４２）と命名した。
【００５２】
実施例４：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異の復元
実施例４−１：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２ 変異の復元 ベクターの製作
前記実施例３でＩＭＰ生産菌株ＣＪＩ０３２３菌株でｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２が変異されたかどうかを確認した結果、ｉｍｐＥ１に１つ、ｉｍｐＥ２に２つの変異が含まれていることを確認した。ＣＪＩ０３２３菌株は高濃度でＩＭＰを生産する菌株であるため、前記変異がＩＭＰ排出能を向上させる変異である可能性が高い。したがって、変異のない天然の野生型であるＩｍｐＥに復元した後、それぞれの変異がＩＭＰ排出能を付与するかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
復元ベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を鋳型としてＰＣＲを行った。配列番号１７と１８のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１ｉｍｐＥ２遺伝子断片をＸｂａＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）を製作した。
【００５３】
実施例４−２：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２単独変異ベクターの製作
ＩｍｐＥ１のＥ１６４Ｋ単独変異ベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を鋳型として配列番号１９と２０のプライマー及び配列番号２１と２２のプライマーを用いた。配列番号１９と２０のプライマーを用いて増幅されたＥ１６４Ｋ−１遺伝子断片と配列番号２１と２２のプライマーを用いて増幅されたＥ１６４Ｋ−２遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）を製作した。
【００５４】
ＩｍｐＥ２のＶ２Ｉ単独変異ベクターを製作するために、ＡＴＣＣ６８７２を鋳型として配列番号１９と２３のプライマー及び配列番号２４と２２のプライマーを用いた。配列番号１９と２３のプライマーを用いて増幅されたＶ２Ｉ−１遺伝子断片と配列番号２４と２２のプライマーを用いて増幅されたＶ２Ｉ−２遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。 Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）を製作した。
ＩｍｐＥ２のＧ６４Ｅ単独変異ベクターを製作するために、ＡＴＣＣ６８７２を鋳型として配列番号１９と２５のプライマー及び配列番号２６と２２のプライマーを用いた。配列番号１９と２５のプライマーを用いて増幅されたＧ６４Ｅ−１遺伝子断片と配列番号２６と２２のプライマーを用いて増幅されたＧ６４Ｅ−２遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）を製作した。
【００５５】
【表６】
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【００５６】
実施例４−３：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異の復元及び単独変異菌株の製作
実施例４−１で製作したプラスミドをＣＪＩ０３２３に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えにによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が復元したかどうかは、配列番号１５、１６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。以後、製作された菌株をＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）と命名した。
ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）菌株の実施例４−２で製作したプラスミドの３種を形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号１５、１６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。選別された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）と命名した。
前記コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）及びコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１８年１１月２日付で寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２３５９Ｐ、ＫＣＣＭ１２３６０Ｐ及びＫＣＣＭ１２３６１Ｐを与えられた。
【００５７】
実施例４−４：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２統合変異菌株の製作
実施例４−２で製作したｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）プラスミドをＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、 相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号１５、１６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。以後、製作された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）と命名した。
ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）プラスミドをＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）に電気穿孔法で形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号１５、１６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。選別された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）（Ｇ６４Ｅ）と命名した。
【００５８】
実施例４−５：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異菌株の評価
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）（Ｇ６４Ｅ）を接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表７のとおりである。
【００５９】
【表７】
0006839763.tif 000008
【００６０】
前記結果のように、各変異位置において、１種変異、２種統合及び３種統合の変異はすべてＩＭＰ排出に関与していることを確認した。したがって、ＩＭＰを生産していないか、または生産しても極微量のみを生産するコリネバクテリウム属微生物において、本発明のＩｍｐＥタンパク質変異によるＩＭＰ生産量の増加は、非常に意味のあるものと解釈してもよい。
【００６１】
実施例５：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異のアミノ酸を他のアミノ酸に置換
実施例５−１：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異のアミノ酸置換挿入用ベクターの製作
前記の結果を通して５’−イノシン酸の生産能の向上された変異のうち、代表的な３種の変異（ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ））の位置的重要性を確認するために、ｉｍｐＥ１のアミノ酸配列で１６４番目のアミノ酸、ｉｍｐＥ２のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸、または６４番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異導入用ベクターを製作した。
【００６２】
最初にＩｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）変異導入用ベクターの製作過程は次のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号２７と配列番号２８〜４５とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の０．７ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。次に、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離して、配列番号４６と配列番号４７〜６４のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の０．７ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して取得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法を行い、１８種の１．４ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列情報は、表８のとおりである。
【００６３】
【表８】
0006839763.tif 000009
【００６４】
ＰＣＲを通して目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、獲得されたプラスミドの情報は表９のとおりである。
【００６５】
【表９】
0006839763.tif 000010
【００６６】
２番目にＩｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）変異導入用ベクターの製作過程は次のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号６５と配列番号６６〜８３とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の０．７ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。次に、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離して、配列番号８４と配列番号８５〜１０２のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の０．７ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して取得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法を行い、１８種の１．４ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列情報は、表１０のとおりである。
【００６７】
【表１０】
0006839763.tif 000011
【００６８】
ＰＣＲを通して目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、獲得されたプラスミドの情報は、表１１のとおりである。
【００６９】
【表１１】
0006839763.tif 000012
【００７０】
最後にＩｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）変異導入用ベクターの製作過程は次のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号１０３と配列番号１０４〜１２１とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の１ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。次に、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離して、配列番号１２２と配列番号１２３〜１４０のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の１ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して取得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法を行い、１８種の２ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列情報は、表１２のとおりである。
【００７１】
【表１２】
0006839763.tif 000013
【００７２】
ＰＣＲを通して目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、獲得されたプラスミドの情報は、表１３のとおりである。
【００７３】
【表１３】
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【００７４】
実施例５−２：ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２変異体の変異位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された菌株の製作及び５’−イノシン酸生産能の比較
前記実施例５−１で製造した変異導入用ベクター５４種をコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号１５、１６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。挿入された変異による菌株名は次の表１４のとおりである。
【００７５】
【表１４】
0006839763.tif 000015
【００７６】
実施例１と同様の方法で培養して、そこから５’−イノシン酸の濃度を分析した（表１５）。
【００７７】
【表１５】
0006839763.tif 000016
【００７８】
前記の結果のように、すべての変異菌株は、それぞれの対照群に比べてＩＭＰ生産能の増加されたので、前記３種の変異位置は、ＩｍｐＥタンパク質のＩＭＰ排出能の増加に影響を与える重要な変異位置であることを再確認した。
【００７９】
実施例６：ＩＭＰ生産株基盤ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異の導入
実施例６−１：ＩＭＰ生産株基盤ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異菌株の製作
ＩＭＰ生産菌株でｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の変異導入効果を確認するために、ＡＴＣＣ６８７２でＩＭＰの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ （adenylosuccinate synthetase）及びＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）の活性が弱化された菌株を製作した。前記二つの酵素をコードする遺伝子ｐｕｒＡ及びｇｕａＢの各塩基配列から１番目の塩基をａからｔに変更して開始コドンを変更した。ＡＴＣＣ６８７２において、前記二つの遺伝子の発現が弱化された菌株はＣＪＩ９０８８と命名した。製造されたＣＪＩ９０８８菌株に前記実施例４−２で製作されたｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）を電気穿孔法で形質転換し、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（ Ｖ２Ｉ）に実施例５−１で製作したｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）のベクターを電気穿孔法で形質転換した。 相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号１５、１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。
製作されたＣＪＩ９０８８及びＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）及びＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）（Ｇ６４Ｄ）菌株のＩＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１６のとおりである。
【００８０】
【表１６】
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【００８１】
培地内に蓄積されたＩＭＰを確認した結果、親菌株であるＣＪＩ９０８８に比べてＩＭＰ生産能が６１％以上、最大７２７％増加することを確認した。したがって、本発明のＩｍｐＥタンパク質変異によるＩＭＰ生産量の増加は、非常に意味のあるものと解釈することができる。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【配列表】
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