(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１で表示される塩基配列を有する、Ｐ８タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項２】
前記外因性プロモーターは、配列番号３〜配列番号８からなる群から選択される１種以上のプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項３】
前記微生物は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラトコックス（Ｌａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、又はビフィドバクテリアム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株であることを特徴とする、請求項１に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項４】
前記微生物は、ラクトバシラスラムノスス、ラクトバシラスアシドフィルス、ラクトバシラスパラカセイ、ラクトバシラスプランタルム、ペジオコックスペントサセウス、又はラクトバシラスブレビス菌株であることを特徴とする、請求項３に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項５】
前記分泌信号ペプチドは、ＵＳＰ４５分泌信号ペプチド、Ｕｓｐ４５  Ｎ４又はラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項６】
前記微生物はペジオコックスペントサセウス菌株であり、前記分泌信号ペプチドはＵＳＰ４５分泌信号ペプチドであることを特徴とする、請求項５に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項７】
前記遺伝子コンストラクトは、前記プロモーターの下流に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び二番目治療ポリペプチドをコーディングする異種核酸配列をさらに含み、前記二番目プロモーターは一番目プロモーターと同一であるか異なることを特徴とする、請求項１に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項８】
前記胃腸管疾患は、大膓癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性胃腸管疾患、赤痢、腸血管異形成症、憩室症、過敏性大腸症候群、又はクローン病であることを特徴とする、請求項１に記載のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有する、Ｐ８タンパク質を生産及び分泌する菌株を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物及びそれを含む胃腸管疾患予防又は治療用組成物に係り、より詳しくは経口経路によって抗癌活性タンパク質のような胃腸管疾患治療用ポリペプチドを胃腸管に局所的に伝達するための微生物及びこれを含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【０００２】
本発明は、大韓民国の中小ベンチャー企業部の監督の下に、産業通商資源部によって後援されたＷＣ３００プロジェクト技術開発支援の一環として行った研究から導き出されたものである［課題固有番号：Ｓ２367890、研究課題名：内臓疾患の治療用薬物伝達プロバイオティックスの開発、課題期間: 2016.02.01.~2020.12.31］。
【背景技術】
【０００３】
乳酸菌は自然界に広く分布する微生物であり、炭水化物を嫌気的に用いて乳酸を生産し、乳酸菌が非病原性菌であるという利点によって最近には産業分野はもちろんのこと、医学分野に至るまでその利用範囲が広く増加している。このような乳酸菌は胃膓の健康を維持するのに重要な役割をすると知られているだけではなく、乳酸菌を摂取することによって健康を増進させることができることが報告されている。
【０００４】
現代にはひんぱんなストレスと西欧化した食習慣、飲酒などの影響で胃腸管疾患の患者数が大幅増加している。大膓癌治療のために合成化合物としての５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＵＦＴ（ｔｅｇａｆｕｒ−ｕｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）のようなフルオロピミリジン（ｆｌｏｕｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）系薬物とイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）などが開発されて使われており、標的治療剤であるベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名アバスチン）及びセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、商品名エルビタックス）などが使われている。しかし、高濃度投与及び長期使用による副作用の危険が高くて天然物治療剤の開発が切実に要求されている。
【０００５】
大膓癌及び大腸炎を含む大腸疾患の患者に乳酸菌を投与して治療効果を期待することができるというのが公知となり、乳酸菌を大腸疾患治療剤として使おうとする技術が開発されている。例えば、韓国特許公開第２０１１−００７３８９７号は、ラクトバシラスプランタルムＰＭＯ０８（ＫＦＣＣ−１１０２８）を有効成分として含む坑癌用組成物を開示しており、韓国特許公開第２００９−０１１４２７９号は寄託番号ＫＣＴＣ  １８１２０Ｐとして寄託された、癌細胞株増殖抑制活性を有するビフィドバクテリアムアドレセンチスＳＰＭ０２１２菌株のブタノール抽出物を有効成分とする坑癌用薬学的組成物を開示している。しかし、乳酸菌を大腸又は胃腸管疾患に用いようとする従来技術は乳酸菌そのものを用いるもので、乳酸菌に坑癌活性タンパク質をコーディングする遺伝子を組み換えして乳酸菌株自体を薬物伝達システムとして使おうとする試みはほとんどない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上述した従来技術の限界を克服するためのもので、本発明の一目的は、胃腸管疾患に有効な治療ポリペプチドを胃腸管の特定の部位に伝達するための、治療ペプチドをコーディングする遺伝子によって形質転換されて薬物伝達システムとして作用することができる微生物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、胃腸管疾患治療に有益な物質をその胃腸管の特定の部分に伝達するための、生物学的に活性なポリペプチドを胃腸管の所定位置で治療に効果的な高レベルで発現及び分泌することができる薬物伝達システムとしての微生物を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するための本発明の一様相は、外因性プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１で表示される塩基配列を有する、Ｐ８タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物に関する。
【０００９】
前記外因性プロモーターは、ペジオコックスペントサセウスに来由した配列番号３（ｅｒｍＥプロモーター）、配列番号４（ＰＫプロモーター）、配列番号５（ＧＫプロモーター）、配列番号６（ＧＰＦＫプロモーター）、配列番号７（Ｇ６Ｐｉプロモーター）、配列番号８（Ｌ−ＬＤＨプロモーター）、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターである。
【００１０】
前記菌株は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラトコックス（Ｌａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、又はビフィドバクテリアム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株であってもよい。
【００１１】
前記菌株の具体的な例は、ラクトバシラスラムノスス、ラクトバシラスアシドフィルス、ラクトバシラスパラカセイ、ラクトバシラスプランタルム、ペジオコックスペントサセウス、又はラクトバシラスブレビス菌株を含み、好ましくは前記菌株はペジオコックスペントサセウス菌株であってもよい。
【００１２】
前記分泌信号ペプチドは、ＵＳＰ４５分泌信号ペプチド、Ｕｓｐ４５  Ｎ４又はラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドである。
【００１３】
薬物伝達システム（Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）としての微生物菌株に形質転換される前記遺伝子コンストラクトは、前記プロモーターの下流に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び二番目治療ペプチドをコーディングする異種核酸配列をさらに含み、前記二番目プロモーターは一番目プロモーターと同一であっても異なってもよい。
【００１４】
本発明の菌株は、大膓癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性胃腸管疾患、赤痢、腸血管異形成症、憩室症、過敏性大腸症候群、及びクローン病のような胃腸管疾患の予防又は治療に用いられることができる。
【００１５】
上述した目的を達成するための本発明の他の様相は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するＰ８タンパク質を生産する菌株を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００１６】
上述した目的を達成するための本発明のさらに他の様相は、ペジオコックスペントサセウス菌株を含む胃腸管疾患治療用組成物であって、前記ペジオコックスペントサセウス菌株は少なくとも一つの胃腸管疾患に対する治療効果を有する治療ペプチドをコーディングする異種核酸を含み、前記異種核酸は異種核酸に作動可能に連結されたペジオコックスペントサセウスに由来する配列番号３〜配列番号８及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含むことを特徴とする胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による乳酸菌の該当経路から分離されたプロモーターを含む薬物伝達用微生物菌株は腸内に滞留するうちに活性ペプチドを持続的に高レベルで発現及び分泌して薬物伝達システムとして効果的に機能することができる。
【００１８】
また、本発明の微生物は癌細胞増殖を抑制して転移を抑制するものであると確認されたヒト来由の天然タンパク質をコーディングする遺伝子コンストラクトを乳酸菌に形質転換させて副作用なしに治療効果を極大化することができる。
【００１９】
本発明の薬剤学的組成物によれば、大膓癌細胞において優れた癌細胞増殖抑制効果を示すだけでなく、正常細胞に対する毒性がない安全な物質であり、副作用なしに大膓癌の予防及び治療に非常に有用に活用することができる。
【００２０】
本発明で、経口投与経路を通して組み換え微生物によるｉｎ  ｓｉｔｕ合成による治療ペプチドの局所的伝達によって、治療に必要な投与量及びタイミングを正確に調節することができ、全身投与の必要性をなくす。
【００２１】
本発明は不安定であるか大量生産が難しい物質の局所的伝達に有用に用いられることができ、本発明によれば、副作用の問題なしに全身伝達によって収得されるものより高い濃度の治療ペプチドを持続的に局所的に伝達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施例で、ペジオコックスペントサセウス菌株を形質転換させるのに使用された単独及び二重プロモーターを含む発現ベクターの構成図である。
【図２】本発明の実施例で、ペジオコックスペントサセウス菌株を形質転換させるのに使用された発現ベクターの開裂地図である。
【図３】本発明のＰ８タンパク質をコーディングする遺伝子をクローニングした組み換え菌株によるＰ８タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法で定性的に分析した結果を示した写真である。
【図４】本発明のＰ８タンパク質をコーディングする遺伝子をクローニングした組み換え菌株におけるＰ８タンパク質の発現／分泌量の変化をＥＬＩＳＡ法で定量的に分析した結果を示した写真である。
【図５】ＰＫ−ＰＫ二重プロモーターの組合せによるＰ８タンパク質の発現／分泌量の変化をウエスタンブロッティング法で定性的に分析した結果を示した図である。
【図６】ＰＫ−ＰＫ二重プロモーターの組合せによるＰ８タンパク質の発現／分泌量の変化をＥＬＩＳＡ法で定量的に分析した結果を示したグラフである。
【図７】本発明の多様なプロモーターの組合せによるＰ８タンパク質の発現／分泌量の変化をＥＬＩＳＡ法で定量的に分析した結果を示したグラフである。
【図８】本発明の組み換え菌株の経口投与後の坑癌活性を比較して示した写真である。
【図９】本発明の薬剤学的組成物を投与したヌードマウスの小腸から分離した本発明のＰ８タンパク質を発現及び分泌するペジオコックスペントサセウス菌株から検出したＰ８タンパク質検出結果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下で図面を参照して本発明についてより詳細に説明する。
【００２４】
他に定義しない限り、本発明で使用された全ての技術的用語及び科学的用語は本発明が属する技術分野の熟練者によって通常に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２５】
“核酸”と言う用語は一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド重合体を指称し、別途の制限がない限り、天然的に発生するヌクレオチドと類似した方式で核酸にハイブリッドされる天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む。別途の言及がない限り、特定の核酸配列はその相補配列を含む。
【００２６】
本明細書で、“プロモーター”という用語はコーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは近位及び遠位の上流エレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）から構成されている。近位エレメントとしては、通常的にＲＮＡ重合酵素ＩＩが適切な転写開始位置でＲＮＡの合成を開始することができるようにするＴＡＴＡボックスを含む。
【００２７】
“生物学的に活性な物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”と言う用語は遺伝子治療に関与するか又は免疫反応を調節することができる物質であり、細胞内信号伝達機構（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）又は他の特定遺伝子の発現を調節することができる物質を含む。このような物質としては、成長因子、癌治療用物質、腫瘍抑制物質、サイトカイン、インターフェロンなどを含むことができる。
【００２８】
本発明で、“異種配列”又は”異種核酸”とは外来供給源（又は種）から由来するか、又は同じ供給源から由来する場合、その固有形態から改質されたものを意味する。したがって、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸はプロモーターが誘導される供給源とは違う供給源から誘導されるか、あるいは同じ供給源の場合、その固有の形態から改質される。
【００２９】
“作動可能に連結される”と言う用語は核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、信号配列又は一連の転写因子結合部位）と異種核酸配列間の機能的連結を指称する。ここで、発現調節配列は異種核酸配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与える。
【００３０】
本明細書で使われる“タンパク質”と“ポリペプチド”という用語は互いに互換的な意味として使われる。“ポリペプチド”はアミノ酸のポリマーを意味し、特定の長さの分子を意味しない。このような用語はポリペプチドの解読後の変形、例えばグリコシル化、リン酸化及びアセチル化したものも含む意味である。
【００３１】
明細書で、“予防”という用語は疾患の治療又は治癒よりは予防を目的とする医学的又は公衆衛生手続を意味する。
【００３２】
本明細書で使われる“治療”という用語は疾患の治療又は治癒を目的とする医学的又は公衆衛生手続を意味する。
【００３３】
本明細書で、“治療有効量”という用語は、被検体、例えばヒト又は動物において疾患又は障害を治療するための、すなわち所望の局所又は全身の効果及び性能を得るために有効な治療用物質又は組成物の量を示す。
【００３４】
本明細書で、“製薬学的に許容可能な”という用語は薬剤学的組成物の他の成分と適合性であり、その受容体に有害ではないことを意味する。
【００３５】
本発明の一様相は、外因性プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１で表示される塩基配列を有する、Ｐ８タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物に関する。
【００３６】
本発明の一具体例で、“Ｐ８タンパク質”とは、乳酸菌であるラクトバシラスラムノススから抽出された分子量８ｋＤａ大きさのタンパク質断片であり、ラクトバシラスラムノスス菌体破砕液に来由した坑癌タンパク質である。本発明による胃腸管でＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物は、Ｐ８タンパク質の坑癌効果に加え、乳酸菌自体の坑癌作用によって相乗効果を提供することができる。乳酸菌株は腸内微生物叢の改善による発癌物質の生成抑制と腸内免疫機能の活性化による癌細胞増殖抑制の効果を提供することができる。
【００３７】
【表１】
0006843997.tif 000002
【００３８】
本発明では標的タンパク質の乳酸菌での発現のための力強いプロモーターの５種を選別した。前記外因性プロモーターはペジオコックスペントサセウスに来由した配列番号３（ｅｒｍＥ、ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）、配列番号４（ＰＫプロモーター、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）、配列番号５（ＧＫプロモーター、ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）、配列番号６（ＧＰＦＫプロモーター、６−ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）、配列番号７（Ｇ６Ｐｉプロモーター、ｇｌｕｃｏｓｅ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、配列番号８（Ｌ−ＬＤＨプロモーター、Ｌ−ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びこれらの組合せから選択されることができる。
【００３９】
【表２】
0006843997.tif 000003
【００４０】
前記プロモーターは、微生物細胞に導入される場合、生物学的に活性な外来タンパク質をコーディングする異種核酸の発現を促進する。配列番号３〜配列番号８のプロモーターのうち５種（ｅｒｍＥプロモーター、ＰＫプロモーター、ＧＫプロモーター、ＧＰＦＫプロモーター、Ｇ６Ｐｉプロモーター）はペジオコックスペントサセウスの該当作用代謝経路から選別され、１種（Ｌ−ＬＤＨプロモーター）は二次代謝産物であるラクテート生産経路から選別されたもので、乳酸菌（例えば、ペジオコックスペントサセウス）内で異種核酸を高濃度に発現するようにする力強いプロモーターである。このようなプロモーターによって本発明の微生物は薬物伝達システムとして機能して胃腸管の特定部位で十分な量のＰ８タンパク質を生産して分泌することができる。
【００４１】
本発明の遺伝子コンストラクトは異種核酸の発現量を増加させるだけでなく分泌も向上させることができる。本明細書で、タンパク質が“分泌される”と言う表現はタンパク質が微生物細胞から細胞外に伝達されることを意味するもので、タンパク質の全体分子が全く遊離した形態で培地に実際に存在する場合を含み、またタンパク質の全ての分子が細胞の表面層に存在する場合、及びタンパク質分子の一部が培地に存在し、分子の残部は細胞の表面層に存在する場合を含む。
【００４２】
前記遺伝子コンストラクトは微生物細胞内で複製可能な複製基点を含むこともできる。これはベクターの操作が乳酸菌株内でより効率的であるからであり、好ましい複製基点としては、例えばＣｏｌＥ１、Ｏｒｉ、ｏｒｉＴなどがある。
【００４３】
前記遺伝子コンストラクトは治療ポリペプチドが微生物薬物伝達システム（例えば、ペジオコックスペントサセウス）から分泌又は放出されるようにするのに適した分泌信号ペプチド配列を含むことができる。治療ペプチドが分泌されるようにするために、ペジオコックスペントサセウスにおける使用に適した分泌信号ペプチドをコーディングする断片を異種核酸配列の５’末端又は３’末端に添加することができる。
【００４４】
前記分泌信号ペプチドはＵＳＰ４５分泌信号、野生型Ｕｓｐ４５分泌信号の位置４にあるリシンがアスパラギンに置換されたＵｓｐ４５  Ｎ４又は、ラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドなどの強いタンパク質分泌を指示する分泌信号ペプチドを含むことができる。このような分泌信号ペプチドは目的とする外来タンパク質の分泌を提供することができる。このような分泌信号ペプチド配列は目的とする治療ポリペプチドの生産及び分泌をさらに制御することができるようにする。
【００４５】
本発明の他の実施例の遺伝子コンストラクトは、前記プロモーターの下流に、上述した配列番号３〜配列番号８のいずれか一つのプロモーター以外に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び治療ポリペプチドをコーディングする二番目核酸配列をさらに含むことができる。
【００４６】
本発明の他の実施例の遺伝子コンストラクトは発現させようとする異種核酸の上流に必ず第１プロモーターを有し、また発現させようとする異種核酸の下流に第２プロモーターを含むことができる。これらの第１プロモーターと第２プロモーターは互いに同一であっても異なってもよい。大部分の細胞又は組職で外来遺伝子の発現を促進させることができる非特異的プロモーターも組職又は器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生又は分化特異的プロモーターなどの特異的又は選択的プロモーターも用いることができる。例えば、第１プロモーターとして特異的プロモーターを用い、第２プロモーターとして非特異的プロモーターを用いることができる。このように、二重プロモーターを含む遺伝子コンストラクトによって形質転換された微生物は非常に高い収率で所望の異種ポリペプチド又はタンパク質を発現することができる。
【００４７】
前記微生物菌株は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラトコックス（Ｌａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、又はビフィドバクテリアム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株であってもよい。前記菌株の具体的な例は、ラクトバシラスラムノスス、ラクトバシラスアシドフィルス、ラクトバシラスパラカセイ、ラクトバシラスプランタルム、ペジオコックスペントサセウス、又はラクトバシラスブレビス属に属する菌株を含むことができる。
【００４８】
好ましくは、前記菌株はペジオコックスペントサセウス菌株（例えば、ＫＣＣＭ１２１８１Ｐ）であってもよい。ペジオコックスペントサセウスは耐酸性及び耐胆汁性に優れて胃腸管を通過する過程で生存して生きている形態で腸粘膜に到逹してよく定着し、薬物伝達システムとしての機能を持続的に遂行することができる。
【００４９】
前記薬物伝達システムとして使われる菌株は受託番号ＫＣＣＭ１２１８１Ｐとして寄託されたペジオコックス属ＰＰ  Ｐ８であることが好ましいが、本発明のＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用菌株であればいずれも本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
本発明の微生物は遺伝子コンストラクトを挿入した発現ベクターで微生物菌株をトランスフェクションすることにより、胃腸管の所定位置で微生物菌株によって目的とする治療ペプチドをコーディングする異種核酸を発現させ、治療ペプチドを生産することができる。
【００５１】
本発明の他の様相は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するＰ８タンパク質を生産及び分泌する上述した微生物菌株を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００５２】
本発明のさらに他の様相は、ペジオコックスペントサセウス菌株を含む胃腸管疾患治療用組成物であって、前記ペジオコックスペントサセウス菌株は少なくとも一つの胃腸管疾患に対する治療効果を有する治療ペプチドをコーディングする異種核酸を含み、前記異種核酸は異種核酸に作動可能に連結されたペジオコックスペントサセウスに由来する配列番号３〜配列番号８及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含むことを特徴とする胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００５３】
前記異種核酸は、好ましくは治療用又は疾病に関連したポリペプチドをコーディングすることができる。また、異種核酸はワクチン用途の抗原性ポリペプチドをコーディングすることができる。本発明で、前記異種核酸は、ホルモン、サイトカイン、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、抗原、抗体などを暗号化する遺伝子であってもよい。その具体的な例としては、トロンボポエチン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン様ペプチド、Ｇ−タンパク質連結型受容体、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞怪死糖タンパク質、抗毒素、リンホトキシン、腫瘍怪死因子、腫瘍抑制因子、形質転換成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板来由成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合織活性因子、組職因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状線ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン類似成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵膓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチココロピン放出因子、甲状腺刺戟ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス来由抗原、単一クローン抗体、多重クローン抗体及び抗体断片などを暗号化する遺伝子であってもよく、これらに制限されない。
【００５４】
本発明の薬剤学的組成物で治療するのに適した胃腸管疾患には、口腔、食道、胃、小腸、大腸、直腸、及び膵膓、肝及び胆嚢のような臓器に影響を及ぼす疾患又は障害が含まれる。例えば、口内乾燥、口腔潰瘍、歯肉疾患、胃食道逆流性疾患、胃潰瘍、炎症性腸疾患、炎症性大腸炎、クローン病、ミコシチス（ｍｙｃｏｓｉｔｉｓ）、胃癌、大膓癌を含む。特に、本発明の菌株は、大膓癌、大腸ポリープ、虚血性胃腸管疾患、赤痢、腸血管異形成症、憩室症、過敏性大腸症侯群又はクローン病の治療に有利に用いられることができる。
【００５５】
ペジオコックスペントサセウス菌株は耐酸性及び耐胆汁性に優れて胃腸管を通過する過程で生きている状態で腸粘膜に到逹してよく定着し、薬物伝達システムとしての機能を持続的に遂行することができる。
【００５６】
本発明のさらに他の様相は、本発明の菌株、すなわち外因性プロモーターに作動可能に連結されたＰ８タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でＰ８タンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００５７】
前記分泌信号ペプチドはＵＳＰ４５分泌信号ペプチド、Ｕｓｐ４５  Ｎ４又はラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドのような分泌信号ペプチドであってもよい。
【００５８】
前記菌株は、前記プロモーターの下流に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び二番目治療ペプチドをコーディングする異種核酸配列をさらに含み、前記二番目プロモーターは一番目プロモーターと同一であっても異なってもよい。一番目治療ペプチドをコーディングする異種核酸配列と二番目治療ペプチドをコーディングする異種核酸配列は互いに同一であっても異なってもよい。さらに他の例で、一番目治療ペプチドをコーディングする異種核酸の塩基配列と二番目治療ペプチドをコーディングする異種核酸の塩基配列は同じアミノ酸配列を有する同じ治療ペプチドをコーディングしながらも塩基配列は互いに異なってもよい。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物は薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な塩をさらに含むことができる。一方、前記薬剤学的組成物は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＵＦＴ（ｔｅｇａｆｕｒ−ｕｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名アバスチン）及びセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、商品名エルビタックス）のような化学療法治療剤をさらに含むこともできる。
【００６０】
本発明の組成物の投与経路は治療時に最も効果的なものを使うことが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与を介しても投与可能である。
【００６１】
経口投与のために胃耐性経口剤形を製剤化しても良く、この剤形は宿主細胞の制御放出を提供する化合物を含み、そこにコーディングされる目的治療ペプチドの制御放出を提供することができる。例えば、経口剤形（錠剤、ペレット、料粒、粉末含み）は胃内での溶解又は破壊に耐性を有するが、腸内では耐性を有しなく、これによって腸内での崩壊、溶解及び吸収に有利な、胃を介しての移行ができるようにする賦形剤（一般に、ポリマー、セルロース誘導体及び／又は親油性物質）の薄層でコーティングしても良い。
【００６２】
経口剤形を、例えば制御放出、持続放出、延長放出、持続作用錠剤又はカプセルに、宿主細胞及びその組み換えタンパク質の徐放ができるように設計しても良い。これらの剤形には、一般的に親油性、ポリマー性、セルロース性、不溶性、膨潤性賦形剤などの従来の周知の賦形剤が含有される。制御放出製剤は、腸、結腸、生体接着又は舌下伝達（すなわち、歯牙粘膜伝達）及び気管支伝達を含む他の任意の伝達部位にも使うことができる。
【００６３】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などを挙げることができる。乳剤及びシロップ剤のような液体調剤物は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、豆油などの油類、パラオキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、いちごフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造することができる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは乳糖、葡萄糖、蔗糖、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造することができる。
【００６４】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などを挙げることができる。注射剤は、塩溶液、葡萄糖溶液、又は両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。もしくは、菌株を常法で凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調剤することもできる。座剤は、カカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて調剤される。また、噴霧剤は、前記化合物そのもの又は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激しなく、かつ前記化合物を微細な粒子に分散させて吸収を容易にする担体などを用いて調剤される。
【００６５】
本発明による薬剤学的組成物の有効成分である治療ペプチドを生産する菌株の使用量は、患者のお年、性別、体重、疾患によって変わるが、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇで一日１回〜数回投与することができる。
【００６６】
また、本発明による菌株の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、お年などによって増減することができる。よって、前記投与量は何の面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００６７】
以下で本発明を実施例に基づいて見て詳細に説明する。しかしこれら実施例は本発明を例示的に説明するためのことで本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
【００６８】
以下で本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６９】
実施例
実施例１．乳酸菌来由タンパク質過発現及び分泌のためのシステム構築
実施例１−１．過発現誘導のためのプロモーターの選別
標的タンパク質（Ｐ８タンパク質）の乳酸菌での発現のための力強いプロモーター６種（ｅｒｍＥ、エリスロマイシン耐性遺伝子のプロモーター；ＰＫ、ピルビン酸キナーゼ；ＧＫ、グルコキナーゼ；ＧＰＦＫ６−ホスホフルクトキナーゼ、Ｇ６Ｐｉ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ；Ｌ−ＬＤＨ、Ｌ−乳酸脱水素酸素）をペジオコックスペントサセウスの解糖作用代謝経路から選別した。標的タンパク質の発現ホストはペジオコックスペントサセウスＳＬ４（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ  ＳＬ４）（受託番号：ＫＣＴＣ  １０２９７ＢＰ）であり、糖の消費速度が非常に早いことを実験で確認し、また消費された糖のほぼ１００％が二次代謝産物であるＬ−ラクテートに転換されることをＨＰＬＣ分析で確認した。したがって、プロモーターのうち５種は解糖作用代謝経路から、そして１種は二次代謝産物であるラクテート生産経路から選別した。
【００７０】
実施例１−２．標的タンパク質の過発現及び分泌システム構築
プラスミドｐＣＢＴ２４−２（配列番号９）（ＫＣＣＭ１２１８２Ｐ）をＰ８タンパク質のクローニングに使った。
【００７１】
実施例１−１で選別された６種のプロモーターをｕｓｐ４５信号ペプチドと連結してＤＮＡ断片を合成した。プロモーターと信号ペプチドにＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ制限酵素部分を挿入した。合成完了したプロモーターと信号ペプチドの一部をＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ制限酵素で切除した後、ＤＮＡゲル抽出法でＤＮＡ断片を分離／精製し、同じ制限酵素で切除されたｐＣＢＴ２４−２−Ｐ８／ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩベクターに挿入した。完成されたｐＣＢＴ２４−２−ＰＫ−Ｐ８、ｐＣＢＴ２４−２−ＧＫ−Ｐ８、ｐＣＢＴ２４−２−６ＰＦＫ−Ｐ８、ｐＣＢＴ２４−２−ＦＫ−Ｐ８、ｐＣＢＴ２４−２−Ｇ６Ｐｉ−Ｐ８、ｐＣＢＴ２４−２−Ｌ−ＬＤＨ−Ｐ８、ｐＣＢＴ２４−２−Ｄ−ＬＤＨ−Ｐ８をペジオコックスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＳＬ４菌株に形質転換した。
【００７２】
前段階で高い活性を示したプロモーターどうしの結合によってｐＣＢＴ２４−２−ＧＫ−Ｐ８−Ｌ−ＬＤＨ−ｏｒｉＰ８、ｐＣＢＴ２４−２−ＰＫ−Ｐ８−ＰＫ−ｏｒｉＰ８、ｐＣＢＴ２４−２−ＧＫ−Ｐ８−ＧＫ−ｏｒｉＰ８を製作した。製作されたＤＮＡをペジオコックスペントサセウスＳＬ４菌株に形質転換させた。
【００７３】
本発明の前記菌株のうちｐＣＢＴ２４−２−ＰＫ−Ｐ８−ＰＫ−ｏｒｉＰ８によって形質転換された菌株をＰＰＰ８と名付け、韓国ソウル特別市西大門ホンゼネ−２ガ−ギル４５ユリムビル所在の韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１７年１１月３０日付で寄託番号ＫＣＣＭ１２１８１Ｐとして寄託した。
【００７４】
前記形質転換体をＬＢ液体培地に混合した後、３７℃で１時間培養させた。前記１時間培養した培養液をエリスロマイシン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含有したＬＢ寒天培地に平板塗抹して、前記抗生剤に対して耐性を示す菌株を本発明で薬物伝達システムとして使用する菌株（ＰＰ  ＤＤＳ）として選別した。
【００７５】
実施例１−３．ペジオコックスペントサセウスＳＬ４形質転換体の培養
ＭＲＳ固体培地（ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ）で培養された形質転換体を１０ｍｌ  ＭＲＳ液体培地（エリスロマイシン、１０ｍｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃で１５時間静置培養（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。この培養液１ｍｌを１０ｍｌ  Ｍ９最小培地（エリスロマイシン、１０ｍｇ／Ｌ）に接種した後、３７℃で４８時間静置培養し、培養液５ｍｌを遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液５ｍｌはＴＣＡ沈澱法で総タンパク質を濃縮した。これをウエスタンブロッティング法でＰ８タンパク質の発現及び分泌量を比較分析した。菌体の場合、緩衝溶液で希釈し、超音波粉砕機を用いて菌体を破砕した後、細胞抽出物をウエスタンブロッティング法で発現した後、分泌されなかったＰ８タンパク質の量を分析した。
【００７６】
実施例１−４．Ｐ８タンパク質の分離及び検出
乳酸菌形質転換体を培養した後、培養上澄み液５ｍｌに１００％ＴＣＡ（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）を添加して最終濃度が２０％となるようにした。混合後、氷で３０分間反応し、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して全てのタンパク質の沈澱を誘導した。遠心分離後、上澄み液を除去し、アセトン２００μｌを添加し、さらに４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈澱したタンパク質を洗浄した。常温で乾燥によって残ったアセトンを全く除去した後、培養上澄み液に存在する目的タンパク質分泌量を測定した。この際、分泌量のはウエスタンブロッティング法で測定し、測定結果を図４〜図７に示した。
【００７７】
図４〜図７を参照すると、本発明のプロモーターの使用時、Ｐ８タンパク質の発現及び分泌量が著しく増加することを確認した。特に、図７を参照すると、二重プロモーター（ＰＫ−ＰＫ、ＧＫ−ＰＫ、ＧＫ−ＧＫ）を使う場合には、Ｐ８タンパク質の発現及び分泌量が最も高く現れた。
【００７８】
実施例２．生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）乳酸菌発現／分泌システムを用いたＰ８タンパク質の坑癌効果確認
実施例２−１．腫瘍細胞移植と腫瘍増殖
韓国細胞株銀行（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から分譲された大膓癌細胞株ＤＬＤ−１は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）、ペニシリン（０．０２ＵＩ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ストレプトマイシン（０．０２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）、グルタミン（２ｍＭ：Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）、非必須アミノ酸（１％；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで継代培養して維持した。培養されたＤＬＤ−１細胞を懸濁して獲得した腫瘍細胞懸濁液を雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＮａｒｌ；５週齢）の背中皮下に０．２ｍｌ（２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｏｕｓｅ）ずつ移植して固形腫瘍を形成した。継代群で形成された腫瘍組職を解剖するため、動物を犠牲して腫瘍塊（ｔｕｍｏｒ  ｌｕｍｐ）を摘出し、表面に分布した血管と脂肪層を除去した後、新鮮な腫瘍組職のみを選別し、套管針を用いて無処置動物の皮下に移植した。
【００７９】
実施例２−２．実験群分離及び物質投与
腫瘍塊の移植後、個別腫瘍の容積が１００〜１５０ｍｍ３に至れば、体重と腫瘍の大きさを測定し、無作為に群分離した。実験動物は群当たり１０匹ずつ下記の表３のように陰性対照群（腫瘍移植対照群：Ｇ１）、陽性対照群（抗癌剤投与群、４０ｍｇ／Ｋｇ  ５−Ｆｕ；５−フルオロウラシル、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ：Ｇ２）、試験群｛１×１０１０ＣＦＵ／Ｈｅａｄ投与群（薬物伝達システム（ＤＤＳ）ペジオコックスペントサセウス（Ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）投与群：Ｇ３；１×１０９ＣＦＵ／Ｈｅａｄ  ＰＰ−ＤＤＳ（ＰＫ−Ｐ８−ＣｈｏＳ−ｏｒｉＰ８）：２−プロモーターシステム投与群：Ｇ４；１×１０１０ＣＦＵ／Ｈｅａｄ  ＰＰ−ＤＤＳ（ＰＫ−Ｐ８−ＣｈｏＳ−ｏｒｉＰ８）：２−プロモーターシステム投与群：Ｇ５；１×１０９ＣＦＵ／Ｈｅａｄ  ＰＰ−ＤＤＳ（ＰＫ−Ｐ８−ＰＫ−ｏｒｉＰ８：２−プロモーターシステム）投与群：Ｇ６；１×１０１０ＣＦＵ／Ｈｅａｄ  ＰＰ−ＤＤＳ（ＰＫ−Ｐ８−ＰＫ−ｏｒｉＰ８：２−プロモーターシステム投与群：Ｇ７｝に総７ヶ群に区分し、一日一１回で７週間経口投与して試験した。形質転換体はＭＲＳ培地で培養し、これを１０１０／２００μｌとなるように懸濁して経口で投与した。一日に一回ずつ総６週間投与した。
【００８０】
【表３】
0006843997.tif 000004
【００８１】
実施例２−３．固形癌の容積変化測定
大膓癌細胞株ＤＬＤ−１を移植したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＮａｒｌ；５週齢）７群（群当たり１０匹）で腫瘍の増殖を確認し、右側わき腹の皮下に移植された腫瘍の容積は移植後に５日経過時に皮下結節として現れた。
【００８２】
腫瘍組職をヌードマウスに移植した後、前記表３のようにグルーピングし、投与計画に従って投与前０日から投与後４９日まで週１回ずつ腫瘍組職の大きさをノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）で測定した。試験後の第４９日にＸｅｎｏｇｒａｆｔモデル（固形癌モデル）を犠牲して組職サンプルを得、腫瘍の転移を確認した。腫瘍容積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）の計算は広さ２×長さ／２（ｍｍ３）の公式を使った。測定された腫瘍の大きさを図８に示した。
【００８３】
図８を参照すると、ペジオコックスペントサセウス薬物伝達システム（ＰＰ−ＤＤＳ）（ＰＫ−Ｐ８−ＣｈｏＳ−ｏｒｉＰ８）２−プロモーターシステムとＰＰ−ＤＤＳ（ＰＫ−Ｐ８−ＰＫ−ｏｒｉＰ８）：２−プロモーターシステムに装着されたＰ８タンパク質の抗癌効能を比較した。同じ条件（１×１０１０ＣＦＵ／Ｈｅａｄ）で経口投与するとき、ペジオコックスペントサセウス薬物伝達システム（ＰＰ−ＤＤＳ）（ＰＫ−Ｐ８−ＣｈｏＳ−ｏｒｉＰ８）よりペジオコックスペントサセウス薬物伝達システム（ＰＫ−Ｐ８−ＰＫ−ｏｒｉＰ８）の投与時に坑癌活性が４４．６％から４９．４％に５％程度もっと増加することが確認された。
【００８４】
本発明のＰ８タンパク質を分泌／発現する薬物伝達システムであるペジオコックスペントサセウス菌株（ＫＣＣＭ１２１８１Ｐ）を投与した場合（Ｇ４、Ｇ５）、陰性対照群（Ｇ１）、陽性対照群（Ｇ３）に比べて腫瘍の大きさが著しく減少し、腫瘍の大きさが５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）を投与したグループ（Ｇ２）と類似した大きさに減少した。一方、特に二重プロモーターを使って、高濃度投与群（Ｇ６及びＧ７）の場合には、腫瘍の大きさが５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）を投与したグループ（Ｇ２）より大幅小さくなって、非常に優れた坑癌活性を確認した。
【００８５】
実施例２−４．マウス腸内ＰＰＤＤＳの生存及びプラスミドＤＮＡの安全性確認
マウスに投与されたＰ８タンパク質を分泌／発現する薬物伝達システムであるペジオコックスペントサセウス菌株（ＫＣＣＭ１２１８１Ｐ）がマウスの腸まで生きて到逹することができるかを確認するために、マウスにペジオコックスペントサセウス菌株を投与し、６週後にマウスの腸内物質を回収し、これをＭＲＳ（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、１０μｇ／ｍｌ）プレートで培養して、ペジオコックスペントサセウス菌株がいくら存在するかを確認した。生き残ったペジオコックスペントサセウス菌株でＰ８タンパク質の分泌／発現量を測定した。
【００８６】
６週間の実験が終了したマウスの小腸内物質を回収し、これをＰＢＤ緩衝液と遠心分離機を用いて２回洗浄した後、残った上澄み液を２０％ＴＣＡに濃縮し、ウエスタンブロッティング法でＰ８タンパク質を検出し、その結果を図９に示した。図９で、ｐＣ、ｐＣＢＴ２４−２−ＣｈｏＳ−ＣＯＳＰ８を有するペジオコックスペントサセウス菌株の培養上澄み液でウエスタンブロッティングを行った。Ｃは分離精製したＰ８タンパク質でウエスタンブルロッを行った結果であり、１は腸内から回収した物質で育ったペジオコックスペントサセウス菌株を培養してウエスタンブロッティングを行った結果であり、２は腸内から回収した物質で育ったペジオコックスペントサセウス菌株を培養してウエスタンブロッティングを行った結果を示した結果である。
【００８７】
図９を参照すると、検出されたＰ８タンパク質の量は定量的な分析ができなくて実際の量を確認することができなかったが、Ｐ８タンパク質が検出されることを見ると、Ｐ８タンパク質を分泌／発現するペジオコックスペントサセウス菌株がマウスの腸内に定着した後、Ｐ８タンパク質を持続的に発現及び分泌することを間接的に確認することができた。
【００８８】
大膓癌、大腸炎、過敏性大腸症候群、クローン病などを含む大腸疾患に対して乳酸菌を治療剤として使うことは公知の技術であるが、乳酸菌内で標的タンパク質を過発現及び分泌するシステムを開発し、これを薬物伝達システムとして用いることについての技術の開発はほとんどない実情であった。本発明は、乳酸菌来由タンパク質を乳酸菌発現／分泌システムに導入し、これを過発現及び分泌する乳酸菌薬物伝達システムを開発し、これを動物モデルに適用してその効果を立証した。したがって、本発明は天然タンパク質大腸疾患治療剤として医学分野で大きく活用されることに期待される。
【００８９】
以上で本発明の好適な実施例について詳細に記述したが、本発明は上述した実施例に限定されるものではない。本発明が属する技術分野の通常の技術者は上述した実施例に基づいて多様な変形及び変更を容易になし得ることを理解することができるであろう。したがって、本発明の真正な保護範囲は後述する特許請求範囲及びそれと均等な範囲内で決定されなければならないであろう。
【００９０】
0006843997.tif 000005
【００９１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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