(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）。
【請求項２】
肥満および糖尿病を同時に予防または治療する効能があるラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）。
【請求項３】
ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）を含み、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または糖尿病の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項４】
脂肪分解阻害は、リパーゼの活性を抑制することによって達成されることを特徴とする、請求項３に記載の肥満または糖尿病の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項５】
食欲調節は、レプチンホルモンの分泌を減少させることによって達成されることを特徴とする、請求項３に記載の肥満または糖尿病の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項６】
前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株がインスリン抵抗性を減少させることを特徴とする、請求項３に記載の肥満または糖尿病の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項７】
ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）を含み、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または糖尿病の予防または改善用の食品組成物。
【請求項８】
前記食品組成物は、健康機能食品、乳製品、発酵製品または食品添加物であることを特徴とする、請求項７に記載の肥満または糖尿病の予防または改善用の食品組成物。
【請求項９】
ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）を含み、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または糖尿病の予防または改善のための動物用飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）菌株およびこれを含む肥満または糖尿病の予防および治療用の組成物に関する。具体的には、本発明のラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、脂肪細胞、中性脂肪、皮下脂肪およびコレステロールを減少させて肥満を予防および治療する効果を有すると共に、血中グルコース濃度およびインスリン濃度を減少させてインスリン抵抗性を抑制することによって糖尿病を予防および治療する効果を有する。また、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）は、脂肪分解酵素であるリパーゼ、食欲調節ホルモンであるレプチン、肥満関連遺伝子Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＴ）の発現にも関与する。
【背景技術】
【０００２】
最近、所得水準の向上および産業の発達によって食生活、食習慣などのライフスタイルが速やかに西欧化するにつれて慢性疾患や成人病の患者が急激に増加している実情であり、その原因のうちの一つが肥満であることが知られている。
【０００３】
肥満は、摂取エネルギーと消費エネルギーの不均衡によるエネルギー代謝異常であり、結果的に脂肪細胞に中性脂肪が過度に蓄積された状態に定義される。
【０００４】
肥満は、全世界的に問題になっている慢性疾患であって、効果的な治療方法がなく、増加し続ける傾向にある深刻な疾患である。肥満は、他の疾患とは異なり、単に外形上の問題のみならず、体重増加と共に、代謝性疾患、高血圧、糖尿、高脂血症、動脈硬化症、虚血性心臓疾患、脂肪肝、胆石症などのような関連疾患を伴うという特徴がある。
【０００５】
肥満は、それ自体で深刻な疾病であるが、美容上の問題ももたらすため、その間世界各国で様々な肥満治療剤を開発しようと努力しており、様々な肥満治療剤が開発された。現在まで開発された肥満治療剤は、大きく、食欲低下剤系列の肥満治療剤と脂肪分解阻害剤系列の肥満治療剤に分けられる。
【０００６】
食欲低下剤系列の肥満治療剤は、体重減少効能に優れるという長所はあるものの、これらの食欲低下剤系列の肥満治療剤は、中枢神経系に作用して食欲を落とすことによって食べ物の摂取量を減らす作用機序を有しているため、長期間にかけて効果が持続しなかったり、長期間の使用時に深刻な副作用を誘発したりするという決定的な問題がある。
【０００７】
初期に食欲低下剤系列の肥満治療剤としてｆｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ、ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅおよびｒｉｍｏｎａｂａｎｔが製品化されたが、心臓疾患、血圧上昇、心臓麻痺の増加、うつ症および自殺などのような深刻な精神疾患副作用の問題のために販売が中断された。
【０００８】
脂肪分解阻害剤系列の肥満治療剤としてｏｒｌｉｓｔａｔ（商品名：ゼニカル）は、中性脂肪を分解する膵臓の脂肪分解酵素であるｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅに非可逆的な結合をして非活性化させることによって中性脂肪およびコレステロールの吸収を減少させると共に排泄を促すメカニズムにより抗肥満作用をする。
【０００９】
したがって、ｏｒｌｉｓｔａｔを服用すれば、脂肪分解が抑制され、食べ物から摂取された脂肪が体内に吸収されることなく排出され、人体に吸収される脂肪の量が減って体重が減少する。しかし、このような効能にもかかわらず、ｏｒｌｉｓｔａｔは、腹部苦痛、下痢、脂溶性ビタミンの吸収抑制などの副作用があり、長期間の服用時に深刻な肝の損傷が発生すると報告されており、ｏｒｌｉｓｔａｔの安全性に対する再検討の議論が進行中である。
【００１０】
現在市販中の大半の肥満治療剤はいずれも深刻な副作用があるため、副作用がなく、且つ、肥満を効果的に治療できる肥満治療剤に関する社会的需要が非常に高い実情である。よって、世界各国で副作用なしに肥満を治療できる肥満治療剤を開発するために様々な研究を進めているが、現在までこのような肥満治療剤が未だに開発および市販されていない。
【００１１】
これに対し、体内に吸収されず腸内空間に留まり、人体と共生する状態で存在するので安全性が卓越した乳酸菌を治療剤として使用できる方案が研究されている。
【００１２】
乳酸菌は、人体の消化系に共生しつつ繊維質および複合タンパク質を分解して重要な栄養成分に作る役割を司る。このように、ヒトを含む動物の胃腸管内で宿主の腸内微生物環境を改善して宿主の健康に有益な影響を与える、生きている微生物を称してプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）という。
【００１３】
プロバイオティクスは、代謝および免疫学的機能を調節できる能力を有していると認識されており、代表的なプロバイオティクスとしては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）菌株などが挙げられる。その中でもラクトバチルス属の菌株は、人体の腸内に生息している正常微生物群集の主要なメンバーであって、健康な消化器官と膣内環境の維持に非常に重要なものとして以前から知られている。
【００１４】
これと関連し、日本特許出願第２０１６５２０３０５号（２０１６．０７．１４．公開）には抗肥満活性を有するラクトバチルス・サケイ種のＷＩＫＩＭ３１菌株が、米国特許出願第２０１５／０２８３１８６号（２０１５．１０．０８．公開）には肥満管理に効果があるラクトバチルス・ラムノサスＣＮＣＭ  Ｉ−３６９０菌株が、韓国登録特許第１０１６１１８３７号（２０１６．０４．０６．公開）には肥満および肥満により引き起こされた代謝性疾患の予防または治療のためのラクトバチルス・ラムノサスＣＢＴ  ＬＲ５菌株が開示されているが、これらの菌株の小腸細胞または消化管における脂肪分解抑制効果および食欲調節効果に対しては明らかにしていない。
【００１５】
そこで、本発明者らは、プロバイオティクスの中でもラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞分化誘導に関与する遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を抑制することによって、窮極的に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞分化抑制および脂肪蓄積を抑制するということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、優れた抗肥満効果を有するプロバイオティクスを発掘するために研究し続けた結果、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が優れた抗肥満効果を有することを確認して本発明を完成した。
【００１７】
驚くべきことに、ＬＭ１０１９菌株は、脂肪細胞分化抑制、脂肪蓄積抑制および食欲調節効果を同時に達成するだけでなく、それに加えてインスリン抵抗性も減少させる顕著な効果を有する。
【００１８】
本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が脂肪細胞分化抑制、脂肪蓄積抑制の効果のみならず、それと共に食欲減少および食餌効率減少の効果を示すことによって、一般食餌または高栄養食餌をしながらも肥満および過体重の予防および治療に効果的であることを見出した。
【００１９】
また、本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が血中グルコース濃度およびインスリン濃度を減少させ、肥満と共に発生しうるインスリン抵抗性を減少させることを確認した。
【００２０】
本発明において、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化および細胞内の脂肪蓄積を抑制し、体重、腹部脂肪を減少および血中コレステロールを減少させるなど、様々な作用機序、酵素、ホルモンおよび遺伝子発現を通じて、肥満のみならず、高脂血症、代謝性疾患および糖尿病の治療および予防にも効果を有することを確認した。
【００２１】
また、本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株およびこれを含む肥満、過体重、高脂血症、代謝性疾患および糖尿病の予防および治療用の組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ；ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ１２３０８Ｐとして寄託されたラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）に関する。
【００２３】
本発明のラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９は、２０１７年０８月１１日付けで韓国微生物保全センターにＫＦＣＣ１１７２５Ｐとして国内寄託（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｄｅｐｏｓｉｔ）され、同一な菌株に対して、２０１８年０９月０５日付けで韓国微生物保全センターにＫＣＣＭ１２３０８Ｐとして国際寄託（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎaｌ  ｄｅｐｏｓｉｔ）された。
【００２４】
本発明は、肥満および糖尿病を同時に予防または治療する効能があるラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）に関する。
【００２５】
本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株を含み、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または糖尿病の予防または治療用の薬学組成物に関する。
【００２６】
この時、前記脂肪分解阻害はリパーゼの活性を抑制することによって達成され、前記食欲調節はレプチンホルモンの分泌を減少させることによって達成される。
【００２７】
また、前記薬学組成物において、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、インスリン抵抗性を減少させることができる。
【００２８】
本発明は、肥満または糖尿病の治療を必要とする対象に、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株の有効量を投与することを含む、肥満または糖尿病の治療方法に関する。
【００２９】
この時、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、投与対象の小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことができる。
【００３０】
また、前記脂肪分解阻害はリパーゼの活性を抑制することによって達成され、前記食欲調節はレプチンホルモンの分泌を減少させることによって達成される。
【００３１】
また、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、投与対象のインスリン抵抗性を減少させることができる。
【００３２】
本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）を含み、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または糖尿病の予防または改善用の食品組成物に関し、この時、前記食品組成物は、健康機能食品、乳製品、発酵製品または食品添加物であってもよい。
【００３３】
本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株（ＫＣＣＭ１２３０８Ｐ）を含み、前記ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または糖尿病の予防または改善のための動物用飼料組成物に関する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、脂肪細胞分化および細胞内の脂肪蓄積を抑制して、優れた抗肥満効果を有する。
【００３５】
また、本発明のラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、体脂肪量の減少、総コレステロールの減少、血漿中性脂肪および肝組織中性脂肪の減少により、肥満または肥満により引き起こされた代謝性疾患および高脂血症の予防または治療効果を示す。
【００３６】
なお、本発明のラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、血中グルコースおよびインスリン濃度の減少を通じてインスリン抵抗性を改善させることによって、肥満および肥満により引き起こされた糖尿病の予防または治療効果を示す。
【００３７】
さらに、本発明のラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株は、脂肪分解酵素であるリパーゼの活性を抑制して体内脂肪吸収を阻害し排出を促進し、食欲調節ホルモンであるレプチンの合成を減少させて食欲を抑制し、脂肪を酸化させてエネルギーに変化させるのに関与する酵素であるＣａｒｎｉｔｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＴ）の遺伝子発現を増加させることによって、様々な酵素およびホルモンの調節を通じて肥満および肥満により引き起こされる疾患を予防または治療する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞にＬＭ１０１９培養抽出物の１％処理群、１０％処理群、および対照群としてＰＢＳを各々処理して、分化した脂肪細胞をＯｉｌ−ｒｅｄ−Ｏで染色した後、見える脂肪細胞内の脂肪球の個数（矢印）を示す。
【図２】第１群〜第３群の時間に応じた体重増加率を示す。
【図３】各群の皮下脂肪、副睾丸脂肪および褐色脂肪組織の重さを示す。
【図４】副睾丸脂肪において各群をＨ＆Ｅ  ｓｔａｉｎで染色した脂肪組織の個数および脂肪細胞の大きさを測定したものである。
【図５】各群の肝臓、脾臓および腎臓の重さを示す。
【図６】各群の肝臓をＨ＆E  ｓｔａｉｎで染色してｍａｃｒｏ  ｆａｔ  ｖａｃｕｏｌｅの有無を２０倍率（Ａ、Ｂ、Ｃ）および４０倍率（Ｄ、Ｅ、Ｆ）で観察した結果を示す。
【図７】各群の肝臓または副睾丸脂肪におけるＣＰＴ−２遺伝子の発現を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）は、食べ物の摂取とエネルギー消費の間の不均衡による代謝障害であって、体内に脂肪が過剰蓄積された状態を意味する。また、肥満は、インスリン抵抗性、グルコース耐性、高脂血症、代謝性疾患などと密接に関わっている。よって、肥満により、高脂血症、代謝性疾患および糖尿病などが発生しうる。
【００４０】
高脂血症は、必要以上に多くの脂肪成分物質が血液内に存在することにより血管壁に積もって炎症を起こし、その結果、心血管系疾患を起こす状態であって、遺伝的な要因により血液内に特定の脂質が増加して高脂血症が発生する場合が多いが、肥満および糖尿病などのような他の原因によっても高脂血症が発生しうる。
【００４１】
代謝性疾患は多数の代謝疾患からなっており、これらのうちの多数は、動脈硬化症の発病を促進させ、心血管疾患発病の危険性を増加させる。代謝性疾患の作用機序は完全に明らかになってはいないが、代謝性疾患を患う大半の患者は、インスリン濃度が増加し、インスリン抵抗性を有する。
【００４２】
糖尿病は、ブドウ糖代謝に異常が生じて起きる代謝疾患の一種である。血中ブドウ糖の濃度が高くなる高血糖を特徴とし、それにより種々の症状および兆候が現れ、尿からブドウ糖を排出するようになる。糖尿病発生の３０〜７０％程度は遺伝的影響によって決定されると知られているが、最近、韓国で急激に増加しているのは第２型糖尿であって、これは、生活方式の西欧化および肥満患者の増加と密接な関わりがあることが明らかになった。
【００４３】
本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株が小腸細胞または消化管において脂肪分解阻害効果および食欲調節効果を同時に示すことを特徴とする、肥満または肥満による疾患の予防または治療用の組成物に関する。
【００４４】
前記「脂肪分解阻害」は、菌株がリパーゼの活性を抑制して小腸細胞または消化管において脂肪が分解されるのを減少させ、脂肪が体内に吸収されるのを抑制することによって達成される。
【００４５】
リパーゼは、膵臓で作られて十二指腸に分泌される中性脂肪分解酵素であり、脂肪の分解および吸収を助ける。よって、この酵素の活性が抑制されると、中性脂肪の分解と共に小腸細胞および消化管への脂肪吸収が阻害されるため、中性脂肪は吸収されず糞として排出されるようになり、その結果、体内に蓄積される脂肪を減らすことができる。菌の中には、自体的にリパーゼを分泌する菌もある。
【００４６】
前記「食欲調節」は、菌株がレプチンホルモンの分泌を増加させ、食欲を抑制または低下させることによって達成される。
【００４７】
また、本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株がインスリン抵抗性を減少させることを特徴とする、肥満または肥満による疾患の予防または治療用の組成物に関する。
【００４８】
インスリン抵抗性は血糖を下げるインスリンの機能が落ちて細胞がブドウ糖を効果的に燃焼できないことをいい、肥満はインスリン抵抗性に直接的な影響を及ぼす。インスリン抵抗性が大きくなるにつれて、肝においてブドウ糖の生成が調節されず、筋肉においてブドウ糖が利用できず、脂肪においても血糖が脂肪に変わって蓄積されなくなる。インスリン抵抗性が高い場合、人体は多量のインスリンを作り出し、それにより高血圧や高脂血症、糖尿病などを誘発させる。
【００４９】
インスリン抵抗性は遺伝的な理由および様々な環境的な要因により作られ、環境的な要因としては運動不足、肥満および過度なカロリー摂取などが挙げられる。
【００５０】
本発明の組成物は、医薬品、健康機能食品、乳製品、発酵製品、食品添加物または動物用飼料などに用いられることができる。
【００５１】
以下では、実施例を通じて本発明についてより詳しく説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００５２】
＜実施例１＞
３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制および脂肪蓄積の抑制作用
韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ；ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ１２３０８Ｐとして寄託されたラクトバチルス・ラムノサスＬＭ１０１９菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＭ１０１９）の脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制作用および細胞内の脂肪蓄積の抑制作用を確認するために、次のように実験した。
【００５３】
先ず、３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞にＬＭ１０１９培養抽出物１％、１０％、および対照群としてＰＢＳを各々処理して、分化を終えた脂肪細胞をｏｉｌ−ｒｅｄ−Ｏ染色した後、１時間の経過後に顕微鏡で染色された細胞を観察した。
【００５４】
図１に示すように、ＬＭ１０１９培養抽出物の代わりにＰＢＳを添加した対照群と比較して、ＬＭ１０１９培養抽出物で処理した処理群では、脂肪細胞内の脂肪球の個数（矢印）が顕著に減少したことを確認した。同一な実験を３回繰り返して行った。
【００５５】
特に、ＬＭ１０１９の１０％処理群の場合、ＬＭ１０１９の１％処理群と比較して明らかに脂肪細胞および脂肪球の個数が減少し、濃度に応じて脂肪細胞の分化が明らかに変わる結果を示した。
【００５６】
したがって、ＬＭ１０１９培養抽出物は、脂肪細胞の分化および細胞内の脂肪蓄積を抑制する効果を有し、抽出物の含量が高いほど優れた効果を示すことが分かる。
【００５７】
＜実施例２＞
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞内の中性脂肪の分解促進および蓄積抑制作用
脂肪細胞への分化過程で蓄積される細胞内の中性脂肪（ＴＧ、トリグリセリド）の量を測定するために、ＬＭ１０１９菌株の抽出物１％および１０％を各々添加して培養し、対照群として菌株の抽出物の代わりにＰＢＳを用いて培養した。分化９日目の脂肪細胞を収穫して用いた。
【００５８】
収穫した細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、菌体を破砕した後、４℃で１５，０００ｒｐｍで遠心分離して上層液を試料として用いた。前記試料１０μＬとｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  １５０μＬを添加し、１５分間常温で反応させ、５３０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５９】
脂肪細胞内の中性脂肪を測定した結果を下記表１に示す。
【００６０】
【表１】
0006864784.tif 000002
表１に示すように、ＬＭ１０１９の１％処理群および１０％処理群では、対照群に対比して、中性脂肪減少量が各々１４．１および６３．４％に確認された。
【００６１】
したがって、ＬＭ１０１９培養抽出物は、脂肪細胞内の中性脂肪の分解を促進し蓄積を抑制することが分かる。
【００６２】
＜実施例３＞
脂肪分解酵素（リパーゼ）の活性測定
ＬＭ１０１９菌株の脂肪分解酵素（リパーゼ）の活性を確認するために、次のように実験した。
【００６３】
ｌｉｐａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ培地を製造し、ＬＭ１０１９をｌｏｏｐでｓｔｒｅａｋｉｎｇして３７℃で一夜培養させた。リパーゼを生成する場合、培地内のオリーブオイル（ｏｌｉｖｅ  ｏｉｌ）を分解してモノグリセリド（ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）を生成する。
【００６４】
モノグリセリドは培地内のＲｈｏｄａｍｉｎ  Ｂと結合してＵＶ  ３５０ｎｍで発光し、Ｅ．ｃｏｌｉを用いた対照群との比較実験をし、対照群とＬＭ１０１９菌株群ではいずれも発光を示さなかった。
【００６５】
対照群でのモノグリセリドの濃度は０．７５ｎｍｏｌ／ｗｅｌｌであり、ＬＭ１０１９菌株群での濃度は０．７０ｎｍｏｌ／ｗｅｌｌであって、対照群と比較して、菌株群でのモノグリセリドの濃度に差がないことを確認した。
【００６６】
したがって、ＬＭ１０１９菌株は、脂肪分解酵素（リパーゼ）の活性を抑制することによって体内脂肪吸収を阻害し排出を促進することが分かる。また、ＬＭ１０１９菌株は、リパーゼを自体的に分泌しないことが分かる。
【００６７】
＜実施例４＞
実験動物における抗肥満効果の実験
マウスにおける抗肥満効果を確認するために、５週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを１週間馴致した後、３群に分けて実験を行った。
【００６８】
第１群は普通食餌（ＮＤ、３．１ｋｃａｌ／ｇ）を投与した群、第２群は高脂肪食餌（ＨＦＤ、５．２ｋｃａｌ／ｇ）を投与した群、第３群は高脂肪食餌（ＨＦＤ）と共にＬＭ１０１９（１０９  ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ）を投与した群であり、週５回経口投与をした。体重と与えられた食餌の量を毎週確認し、９週目に解剖して各主要臓器を摘出して重さを測定した。
【００６９】
体重増加率の減少
０週目の体重を１００％にして時間に応じた体重増加率を測定して図２に示す。図２に示すように、第３群（ＨＦＤおよびＬＭ１０１９の投与群）は、第２群（ＨＦＤ）と比較して、１週後から体重増加率に差を示した。
【００７０】
７週目に、第３群の体重増加率は１４９．４３％であり、第２群の体重増加率は１５９．４４％であって、第３群は第２群より体重増加率が１０％減少した。８週目に、第３群の体重増加率は１４９．３３％であって、７週目と比較して体重の減少を示したのに対し、第２群の体重増加率は１７１．４６％であって、７週目と比較して１０％以上体重が増加した。特に、８週目に、第３群は第２群より体重増加率が２０％以上減少した。
【００７１】
下記表２に示すように、第３群の８週間の体重増加量は１０．５０であり、第２群の８週間の体重増加量は１４．８４であって、約３０％程度の差を示すことを確認した。
【００７２】
したがって、高脂肪食餌をした第２群と高脂肪食餌をしつつＬＭ１０１９を同時投与した第３群とを比較した結果、１週後から体重増加率に差を示し始め、時間が経過するほど体重増加率の差が顕著に大きくなることが分かる。
【００７３】
【表２】
0006864784.tif 000003
食餌効率（ｆｏｏｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の減少
８週間の体重増加量、週当たりの食餌摂取量、カロリー摂取量、食餌効率を下記表３に示す。
【００７４】
【表３】
0006864784.tif 000004
表３に示すように、週当たりの食餌摂取量およびカロリー摂取量を比較すると、第３群は第２群に比べて減少したことを確認した。また、体重増加量と食餌摂取量により食餌効率を計算した結果、第２群は０．１１であったが、第３群は０．０８であって、食餌摂取量に比べて体重増加量が遥かに低いことが分かった。
【００７５】
皮下脂肪、副睾丸脂肪および褐色脂肪組織の減少
８週間の皮下脂肪、副睾丸脂肪および褐色脂肪組織の量を測定して下記表４に示す。
【００７６】
【表４】
0006864784.tif 000005
表４および図３に示すように、第３群の体脂肪は、第２群の体脂肪の量と比較して顕著に減少したことを確認した。
【００７７】
また、副睾丸脂肪をＨ＆Ｅ  ｓｔａｉｎで染色し、その結果を図４に示す。図４に示すように、第２群は脂肪細胞の大きさが最も大きく、第３群の脂肪細胞の大きさは第２群と比較して半分以下に減少したことを確認した。
【００７８】
肝臓の重さの減少
８週間の肝臓、脾臓および腎臓の重さを測定して下記表５に示す。
【００７９】
【表５】
0006864784.tif 000006
表５に示すように、第３群の肝臓の重さは第２群と比較して顕著に減少した。脾臓および腎臓の重さは各群において大きな差を示さなかった。
【００８０】
肥満の場合、体内脂肪代謝が非正常的に起こって肝内に脂質成分が蓄積され、肝の重さが増加すると知られている。表５および図５に示すように、ＬＭ１０１９菌株を投与した群（第３群）では肝の重さが正常レベルに近く減少しており、ＬＭ１０１９菌株は肝における脂質代謝に関与して肝細胞の脂肪蓄積を抑制する効果があることが分かる。
【００８１】
脂肪肝の減少
肝臓をＨ＆Ｅ  ｓｔａｉｎで染色してｍａｃｒｏ  ｆａｔ  ｖａｃｕｏｌｅの有無（Ｘ２０倍率およびＸ４０倍率）を観察して図６に示す。
【００８２】
図６に示すように、第２群の肝臓組織の所々でｍａｃｒｏ  ｆａｔ  ｖａｃｕｏｌｅが観察され（赤色の矢印）、第１群および第３群の肝臓組織ではｍａｃｒｏ  ｆａｔ  ｖａｃｕｏｌｅが観察されなかった。
【００８３】
したがって、ＬＭ１０１９菌株は脂肪肝抑制効果を有することが分かる。
【００８４】
血中グルコース、中性脂肪およびコレステロール数値の減少
８週間の血中グルコース、中性脂肪およびコレステロール数値を測定して下記表６に示す。
【００８５】
【表６】
0006864784.tif 000007
肥満がある場合、インスリン抵抗性が生じ、それにより血中インスリンが高くなって代謝により一時的にグルコース濃度が高くなる。表６に示すように、第３群の血中グルコースレベルが第２群のグルコースレベルより低いため、ＬＭ１０１９菌株がインスリン抵抗性にも肯定的な効果を有することが分かった。
【００８６】
また、血中中性脂肪およびコレステロールレベルにおいても、第３群が第２群と比較して低い数値を有することを確認した。
【００８７】
インスリンおよびレプチンの数値の減少
８週間のインスリンおよびレプチンの数値を測定して下記表７に示す。
【００８８】
【表７】
0006864784.tif 000008
前述したように、肥満の場合、インスリン抵抗性が増加してインスリン分泌が増加し、第３群のインスリン濃度が第２群のインスリン濃度と比較して顕著に減少したことを確認することができた。
【００８９】
したがって、血中グルコース濃度およびインスリン濃度の減少を通じて、ＬＭ１０１９菌株は、インスリン抵抗性の改善に顕著な効果を有することが分かる。
【００９０】
また、レプチンは、脂肪細胞から分泌される食欲調節ホルモンであって、脂肪組織に中性脂肪が蓄積されて脂肪細胞の大きさが大きくなると、レプチンの合成が促進されてレプチンの濃度が増加する。
【００９１】
前記血中中性脂肪の濃度に対する実験において、第２群と比較して第３群の中性脂肪の濃度が顕著に減少した。すなわち、第２群において中性脂肪および脂肪細胞が減少することによって、第３群のレプチンの濃度が第２群に比べて顕著に減少したことが分かった。
【００９２】
ＣＰＴ遺伝子の発現増加
８週間ＬＭ１０１９菌株を投与したマウスの肝臓および副睾丸脂肪を摘出してＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  １st  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、Ｊａｐａｎ）を用いてＲＮＡに相補的なＤＮＡを得た後、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ、Ｊａｐａｎ）を用いて脂肪酸化と関連した遺伝子であるＣＰＴ２の発現をリアルタイムＰＣＲにより確認した。
【００９３】
Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＴ）遺伝子は脂肪を酸化してエネルギーに変化させるのに関与する酵素であり、ＣＰＴの数値が高いほど、脂肪の分解が促進され、エネルギーとして消耗されることが分かる。
【００９４】
下記表８は実験に用いたプライマであり、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現は内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）である。
【００９５】
【表８】
0006864784.tif 000009
図７に示すように、肝臓および副睾丸脂肪におけるＣＰＴ−２遺伝子の発現を確認した結果、第２群に比べて、実験群である第３群では発現量が増加したことが分かる。それをＧＡＰＤＨを用いて２＾−ｄｄＣｔの平均数値を表９に示す。
【００９６】
【表９】
0006864784.tif 000010
したがって、ＬＭ１０１９菌株は、肥満抑制遺伝子の発現を促進する効果を有することが分かる。
【００９７】
肝臓における肥満関連遺伝子の発現減少
ＣＴＰ遺伝子の発現実験時に製作したＲＮＡに相補的のＤＮＡを用いて肝臓内の肥満関連遺伝子であるＳＣＤ１、ＦＡＳおよびＳＲＥＢＰ１の発現をリアルタイムＰＣＲにより確認した。
【００９８】
Ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ−１（ＳＣＤ１）は、単不飽和脂肪酸の合成を媒介する酵素であり、肥満な人に発現量が高く、遺伝的に肥満な人や第２型糖尿病患者に見られる脂肪代謝の機能不全と関係が深い。
【００９９】
Ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＦＡＳ）は、脂肪酸合成酵素であって、細胞内の脂肪を生成するのに必須である。その発現が増加すれば、細胞内の脂肪合成が増えたと解釈することができる。
【０１００】
Ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＳＲＥＢＰ１）は、脂肪合成を調節する結合タンパク質酵素であり、この遺伝子も上記の二つの遺伝子と共に脂肪合成に影響を及ぼす遺伝子であって、数値が高いほど体脂肪が蓄積されることが分かる。
【０１０１】
下記表１０は実験に用いたプライマであり、３６Ｂ４遺伝子のｍＲＮＡ発現は内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）である。
【０１０２】
【表１０】
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図８に示すように、肝臓におけるＳＣＤ１、ＦＡＳ、ＳＲＥＢＰ１遺伝子の発現を確認した結果、第２群に比べて、実験群である第３群では発現量が減少したことを確認することができる。それを３６Ｂ４を用いて２＾−ｄｄＣｔの平均数値を表１１に示す。
【０１０３】
【表１１】
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したがって、ＬＭ１０１９菌株は、脂肪合成に関与する遺伝子の発現を抑制する効果を有することを確認することができる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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