(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、
前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、
前記標識ヌクレオチドは下記式Ｉの化合物であって、
【化１】
0006938690.tif 000078
式Ｉ中、
ｎは、３〜１０の整数であって、
ｍは、１〜１０の整数であって、
ｔは、０〜５０の整数であって、
Ｘ１は、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであって、
Ｘ２は、１つ以上の個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり、ここで、ａは、１〜２４の整数であって、
Ｘ３は直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリダイズし、
Ｆ１はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつＦ２は非存在であるかまたはフルオロホアであって、
Ａは、
【化２】
0006938690.tif 000079
であり、
Ｙは、
【化３】
0006938690.tif 000080
であり、
式Ｉ中、
Ｂは、１つ以上の構成繰り返し単位および複数の末端単位を含むｚ世代のデンドロンであり、ここで、ｚは１〜６の整数であり、前記構成繰り返し単位は以下から選択され：
【化４】
0006938690.tif 000081
ここで、
ｐ１は１〜３の整数であり、前記ｐ１個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、
ｐ２は１〜３の整数であり、前記ｐ２個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、
前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、スペルミニル基、アミノ基、および第４級アンモニウム基から選択され、
Ｂは電荷および電荷密度を有し、
ｑは１であり、
前記伝導性チャネルは前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法。
【請求項２】
前記電荷は、約−１００ｅ〜約＋１００ｅである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電荷は、約−２００ｅ〜約＋２００ｅである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記電荷密度は、約−１００ｅ／ｎｍ３〜約＋１００ｅ／ｎｍ３である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記電荷密度は、約−２００ｅ／ｎｍ３〜約＋２００ｅ／ｎｍ３である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項６】
Ａは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュゲーションから選択される、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Ｙと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Ｙとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記電荷と異なり；
任意に、前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド鎖に取り込まれた１つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Ｙを識別することを更に含む、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
Ｘ２は、（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａであり、ここで、ａは１〜２４の整数である、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ａは４、８、１２、１６または２４である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、２０１８年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７１０，３２７号、２０１８年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７１０，３３３号、２０１８年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７１０，３６２号、および２０１８年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７１０，４６１号に対する優先権を主張する；上記のすべての出願の全内容は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
現在のシークエンシングプラットフォームの大部分は、「合成によるシークエンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（ＳＢＳ）テクノロジーと蛍光ベースの検出方法を使用している。ＳＢＳを補完するものとして、より費用対効果が高く、迅速で便利なシークエンシングおよび核酸検出を可能にする代替シーケンシング方法が望ましい。電荷ベースのシークエンシングは魅力的なアプローチである。
【０００３】
現在の合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）テクノロジーは、２つの位置で修飾されたヌクレオチドを使用する：１）デオキシリボースの３’ヒドロキシル（３’−ＯＨ）、および２）窒素塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）のピリミジンの５位またはプリンの７位。３’−ＯＨ基はアジドメチル基でブロックされ、可逆的なヌクレオチドターミネーターを生成する。これは、単一ヌクレオチドの付加後のさらなる伸長を防止し得る。窒素塩基のそれぞれはフルオロホアで個別に修飾され、単一塩基の取り込みを識別する蛍光読み取り値を与える。続いて、３’−ＯＨブロッキング基とフルオロホアが除去され、サイクルが繰り返される。
【０００４】
デオキシリボースの３’−ＯＨと窒素塩基の両方を修飾するという合成上の課題により、修飾ヌクレオチドの現在のコストは高くなり得る。修飾ヌクレオチドのコストを削減するいくつかの可能な方法がある。１つの方法は、窒素塩基の代わりに、５’末端ホスフェートに読み取り標識（ｒｅａｄｏｕｔ  ｌａｂｅｌ）を移動させることである。一例では、これにより、別々の切断ステップの必要がなくなり、入ってくる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）ヌクレオチドのリアルタイム検出が可能になる。取り込み中、ピロホスフェートはタグと一緒に伸長プロセスの副産物として放出されるため、切断可能な結合は関与しない。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書で提供される例は、ポリメラーゼによって新生ポリヌクレオチド鎖に取り込まれたヌクレオチドを検出するための方法、および前記方法で使用するための組成物を含む。本明細書で提供される一例は、伝導性チャネルを用いて、そのような取り込み中に電荷タグを有するヌクレオチド、およびそのような電荷タグを有するそのようなヌクレオチドの化合物を検出する方法である。一例は、ホスホジエステル基、アミノ酸、デンドロンアーキテクチャ（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）、および電荷密度を高める他のアーキテクチャ構造を含む電荷タグを有するヌクレオチド、電荷密度を高めた電荷タグにヌクレオチドを連結する（ｌｉｎｋｉｎｇ）方法、および電荷密度を高めた電荷タグを有するヌクレオチドを使用する方法、を提供する。
【０００６】
一態様では、ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは下記式Ｉの化合物であって、
【化１】
0006938690.tif 000002
式Ｉ中、ｎは、３〜１０の整数であって、ｍは、１〜１０の整数であって、ｔは、０〜５０の整数であって、Ｘ１は、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであって、Ｘ２は、１つ以上の個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり、ここで、ａは、１〜２４の整数であって、Ｘ３は直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリダイズし、Ｆ１はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつＦ２は非存在であるかまたはフルオロホアであって、Ａは、
【化２】
0006938690.tif 000003
であり、Ｙは、以下から選択され：
【化３】
0006938690.tif 000004
ｑは、１〜１００の整数であり、Ｂは、以下から選択され：
【化４】
0006938690.tif 000005
式中、Ｒは、Ｙおよび水素から選択され、Ｂがデンドロンである場合、ｑは１に等しく、前記ｑ個のＢは、電荷および電荷密度を有し、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
【０００７】
一例では、前記電荷は、約−１００ｅ〜約＋１００ｅである。別の例では、前記電荷密度は、約−１００ｅ／ｎｍ３〜約＋１００ｅ／ｎｍ３である。更に別の例では、前記電荷は、約−２００ｅ〜約＋２００ｅである。更なる例では、前記電荷密度は、約−２００ｅ／ｎｍ３〜約＋２００ｅ／ｎｍ３である。
【０００８】
更なる例では、前記ｑ個のＢは、ポリヌクレオチドを含む。更なる例では、前記ポリヌクレオチドは、分岐ポリヌクレオチドおよび１つ以上のヘアピンループから選択される。更に別の例では、前記ポリヌクレオチドは、２〜５つのヘアピンループを含む。
【０００９】
別の例では、前記ｑ個のＢは、ポリペプチドを含む。更に別の例では、前記ポリペプチドは、分岐ポリペプチド、コイルドポリペプチド、およびコイルドコイルポリペプチドからなる群から選択される。更に別の例では、Ｂはアミノ酸を含み、かつ前記ｑ個のＢのうちの１つ以上はメチルリジン、ジメチルリジン、またはトリメチルリジンを含む。
【００１０】
別の例では、Ｂは、１つ以上の構成繰り返し単位および複数の末端単位を含むｚ世代のデンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ  ｏｆ  ｚ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）であり、ここで、ｚは１〜６の整数であり、前記構成末端単位は以下から選択され：
【化５】
0006938690.tif 000006
ここで、ｐ１は１〜３の整数であり、前記ｐ１個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、ｐ２は１〜３の整数であり、前記ｐ２個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、スペルミニル基、アミノ基、および第４級アンモニウム基から選択される。
【００１１】
更に別の例では、Ａは、連結反応（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応（ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｏｐｐｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応（ａｚｉｄｅ−ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、およびチオール−マレイミドコンジュゲーション（ｔｈｉｏｌ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）から選択される。
【００１２】
更に別の例では、前記方法は、複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Ｙと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Ｙとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド鎖に取り込まれた１つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Ｙを識別することを更に含む。
【００１３】
更なる例では、Ｘ２は、（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａであり、ここで、ａは１〜２４の整数である。一例では、ａは２４である。別の例では、ａは１２である。別の例では、ａは８である。更に別の例では、ａは４である。
【００１４】
別の態様では、ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは下記式Ｉの化合物であって、
【化６】
0006938690.tif 000007
式Ｉ中、ｎは、３〜１０の整数であって、ｍは、１〜１０の整数であって、ｔは、０〜５０の整数であって、Ｘ１は、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであって、Ｘ２は、１つ以上の個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり、ここで、ａは、１〜２４の整数であって、Ｘ３は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリダイズし、Ｆ１はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつＦ２は非存在であるかまたはフルオロホアであって、Ａは、
【化７】
0006938690.tif 000008
であり、Ｙは、以下から選択され：
【化８】
0006938690.tif 000009
ｑは、１〜１００の整数であり、Ｂは、アミノ酸を含み、前記ｑ個のＢは、電荷および電荷密度を有し、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
【００１５】
一例では、前記電荷は、約−１００ｅ〜約＋１００ｅである。別の例では、前記電荷密度は、約−１００ｅ／ｎｍ３〜約＋１００ｅ／ｎｍ３である。更に別の例では、前記電荷は、約−２００ｅ〜約＋２００ｅである。更なる例では、前記電荷密度は、約−２００ｅ／ｎｍ３〜約＋２００ｅ／ｎｍ３である。
【００１６】
別の例では、前記ｑ個のＢは、ポリペプチドを含む。更に別の例では、前記ポリペプチドは、分岐ポリペプチド、コイルドポリペプチド、およびコイルドコイルポリペプチドからなる群から選択される。更に別の例では、Ｂはアミノ酸を含み、かつ前記ｑ個のＢのうちの１つ以上はメチルリジン、ジメチルリジン、またはトリメチルリジンを含む。
【００１７】
更に別の例では、Ａは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュゲーションから選択される。
【００１８】
更に別の例では、前記方法は、複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Ｙと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Ｙとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド鎖に取り込まれた１つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Ｙを識別することを更に含む。
【００１９】
更なる例では、Ｘ２は、（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａであり、ここで、ａは１〜２４の整数である。一例では、ａは２４である。別の例では、ａは１２である。別の例では、ａは８である。更に別の例では、ａは４である。
【００２０】
更に別の態様では、ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは下記式Ｉの化合物であって、
【化９】
0006938690.tif 000010
式Ｉ中、ｎは、３〜１０の整数であって、ｍは、１〜１０の整数であって、ｔは、０〜５０の整数であって、Ｘ１は、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであって、Ｘ２は、１つ以上の個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり、ここで、ａは、１〜２４の整数であって、Ｘ３は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリダイズし、Ｆ１はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつＦ２は非存在であるかまたはフルオロホアであって、Ａは、
【化１０】
0006938690.tif 000011
であり、Ｙは、以下から選択され：
【化１１】
0006938690.tif 000012
ｑは、１〜１００の整数であり、Ｂは、以下から選択され：
【化１２】
0006938690.tif 000013
式中、Ｒは、Ｙおよび水素から選択され、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
【００２１】
一例では、前記電荷は、約−１００ｅ〜約＋１００ｅである。別の例では、前記電荷密度は、約−１００ｅ／ｎｍ３〜約＋１００ｅ／ｎｍ３である。更に別の例では、前記電荷は、約−２００ｅ〜約＋２００ｅである。更なる例では、前記電荷密度は、約−２００ｅ／ｎｍ３〜約＋２００ｅ／ｎｍ３である。
【００２２】
更なる例では、前記ｑ個のＢは、ポリヌクレオチドを含む。更なる例では、前記ポリヌクレオチドは、分岐ポリヌクレオチドおよび１つ以上のヘアピンループから選択される。更に別の例では、前記ポリヌクレオチドは、２〜５つのヘアピンループを含む。
【００２３】
更に別の例では、Ａは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュゲーションから選択される。
【００２４】
更に別の例では、前記方法は、複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Ｙと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Ｙとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの前記各々の電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドの前記その他の電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド鎖に取り込まれた１つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Ｙを識別することを更に含む。
【００２５】
更なる例では、Ｘ２は、（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａであり、ここで、ａは１〜２４の整数である。一例では、ａは２４である。別の例では、ａは１２である。別の例では、ａは８である。更に別の例では、ａは４である。
【００２６】
更なる態様では、ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法であって、前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは下記式Ｉの化合物であって、
【化１３】
0006938690.tif 000014
式Ｉ中、ｎは、３〜１０の整数であって、ｍは、１〜１０の整数であって、ｔは、０〜５０の整数であって、Ｘ１は、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであって、Ｘ２は、１つ以上の個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり、ここで、ａは、１〜２４の整数であって、Ｘ３は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリダイズし、Ｆ１はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつＦ２は非存在であるかまたはフルオロホアであって、Ａは、
【化１４】
0006938690.tif 000015
であり、Ｙは、以下から選択され：
【化１５】
0006938690.tif 000016
ｑは１であり、Ｂは、デンドロンを含み、Ｂは、電荷および電荷密度を有し、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する、方法が提供される。
【００２７】
一例では、前記電荷は、約−１００ｅ〜約＋１００ｅである。別の例では、前記電荷密度は、約−１００ｅ／ｎｍ３〜約＋１００ｅ／ｎｍ３である。更に別の例では、前記電荷は、約−２００ｅ〜約＋２００ｅである。更なる例では、前記電荷密度は、約−２００ｅ／ｎｍ３〜約＋２００ｅ／ｎｍ３である。
【００２８】
別の例では、Ｂは、１つ以上の構成繰り返し単位および複数の末端単位を含むｚ世代のデンドロンであり、ここで、ｚは１〜６の整数であり、前記構成末端単位は以下から選択され：
【化１６】
0006938690.tif 000017
ここで、ｐ１は１〜３の整数であり、前記ｐ１個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、ｐ２は１〜３の整数であり、前記ｐ２個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、スペルミニル基、アミノ基、および第４級アンモニウム基から選択される。
【００２９】
更に別の例では、Ａは、連結反応を含む反応によって形成され、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応、およびチオール−マレイミドコンジュゲーションから選択される。
【００３０】
更に別の例では、前記方法は、複数の標識ヌクレオチドを連続的に取り込むことを更に含み、前記複数の標識ヌクレオチドの各々の前記Ｙと、前記複数の標識ヌクレオチドのその他の前記Ｙとが互いに異なる場合、前記複数の標識ヌクレオチドの前記各々の電荷は、前記複数の標識ヌクレオチドの前記その他の電荷と異なる。更なる例では、前記方法は、前記伝導性チャネルによって検出された前記電荷に基づいて、前記新生ポリヌクレオチド鎖に取り込まれた１つ以上の標識ポリヌクレオチドの前記Ｙを識別することを更に含む。
【００３１】
更なる例では、Ｘ２は、（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａであり、ここで、ａは１〜２４の整数である。一例では、ａは２４である。別の例では、ａは１２である。別の例では、ａは８である。更に別の例では、ａは４である。
【００３２】
前述の概念および以下でより詳細に説明する追加の概念のすべての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しない場合）は、本明細書で開示される本発明の主題の一部として企図されることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本開示のこれらおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるようになるであろう。
【図１】一例において、テザーを介して伝導性チャネルに付着したポリメラーゼを示す図である。
【図２】一例において、核酸テザーを介して伝導性チャネルに付着し、電荷または電荷検出器への近接性に基づいて区別され得るヌクレオチドに結合したポリメラーゼを示す図である。
【図３】一例において、核酸テザーを介して伝導性チャネルに付着し、電荷に基づいて区別され得るヌクレオチドに結合したポリメラーゼを示す図である。
【図４】一例において、伝導性チャネルにつながれた（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ポリメラーゼを示す図であり、当該伝導性チャネルはアクセプター領域にも付着しており、この例では、ヌクレオチド上のリンカー内の特異性領域に結合（例えば、ハイブリダイズ）可能な複数のオリゴヌクレオチドを含む。
【図５】本開示による電荷タグを有するヌクレオチドアナログの非限定的な例を示す図である。ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドポリホスフェート（表示されたｄＴヘキサホスフェートなど）、特異性領域を任意に含むリンカー領域、および電荷タグを含み得る。この非限定的な例では、リンカーは、アジド−アルキンクリックケミストリーによって形成された共有結合を含む。以下にさらに説明するように、特異性領域はリンカーに含まれ得、ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込み中に、伝導性チャネルとの電荷タグ近接を促進するのを助け得る。
【図６】一例において、ヌクレオチド標識を示す図であり、当該ヌクレオチド標識は、当該標識のオリゴヌクレオチド部分のホスホジエステル骨格中に負に荷電した酸素を有する。
【図７】一例において、伝導性チャネルを使用して検出することができる分岐電荷タグを構築するための例示的なマルチプライヤユニット（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｕｎｉｔｓ）を示す図である。
【図８】一例において、核酸配列（一般的に、１０個のＮの配列として表される）を有するテザーを介してポリメラーゼ（Ｐｏｌ）に付着した伝導性チャネルを示す図である。Ｎヌクレオチドは、ユニバーサル塩基、および電荷タグに付着したリンカー（例えば、特異性領域）内のヌクレオチドに相補的な塩基から選択される。
【図９】一例において、アクセプター領域、この例では核酸配列（一般的に、ＡＢＣ領域を有する７つのＮの配列として表される；電荷タグ部分は示されていない）を有するテザーを介してポリメラーゼ（Ｐｏｌ）に付着した伝導性チャネルを示す図である。ポリメラーゼは、標的核酸および標識ＣＴＰアナログと複合体を形成する。ＣＴＰアナログ上のリンカーは、イノシン（Ｉ）と、テザー上のアクセプター領域（ＡＢＣ）にハイブリダイズする特異性領域（Ａ’Ｂ’Ｃ’）とを有する核酸領域を含む。
【図１０】一例において、４つの異なるヌクレオチドアナログのそれぞれが、各リンカーの特異性領域を介して、テザーのアクセプター領域と結合することによる、伝導性チャネルに対する４つの異なる位置状態のテザーポリメラーゼ（ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を示す図である。この例示的な例では、ヌクレオチドアナログはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＴＴＰとして識別されるが、任意のヌクレオチドアナログを使用することができる（例えば、デオキシリボヌクレオチドアナログを使用してもよい）。各ヌクレオチドアナログは、他の３つのヌクレオチドアナログと同じ長さのオリゴヌクレオチド部分を有するが、各ヌクレオチドアナログは、他のヌクレオチドアナログのリンカーが結合する領域と比較して、テザー内のアクセプター領域の異なる領域に結合する特異的結合配列を有する。電荷タグは、この例ではオリゴヌクレオチドであり、他の例では他のホスホジエステル含有電荷タグであるが、ヌクレオチドの反対側のリンカー端部のハイブリダイゼーション領域の外側に延びている。
【図１１】一例において、ポリメラーゼｐｈｉ２９によるホスホジエステルベースの電荷タグの単一ヌクレオチド取り込みを示す図である。
【図１２】本開示の態様によるペプチドベースの電荷タグの例を示す図である（図１２Ａ〜１２Ｄ）。
【図１３】一例において、電荷タグとして構造化オリゴヌクレオチドを有する修飾ヌクレオチドのいくつかの構造を示す図である（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。そこから伸びる電荷タグを有する修飾ヌクレオチドが示されており、当該電荷タグはアクセプター領域に結合した（「Ｇｌｕｅ」として示されている）特異性領域を含む。ステムループ型の電荷タグ（図１３Ａ）、クローバー型の電荷タグを示す（図１３Ｃ）。
【図１４】十字形の電荷タグの例を示す図である（図１４Ａ、図１４Ｂ）。ホリデイ構造様構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）で互いに結合した４つのオリゴヌクレオチドおよび一本鎖オリゴヌクレオチドオーバーハングを含む十字形の電荷タグを示す（図１４Ａ）。オリゴヌクレオチドオーバーハングに結合したペプチド核酸の配列、および当該ペプチド核酸の配列の末端から伸びるコイルドポリペプチド構造とともに、図１４Ａの構造を示す（図１４Ｂ）。この例では、ポリペプチド配列は正電荷を有する。
【図１５】コイルドポリペプチド（ｃｏｉｌｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）およびそのアセンブリを含むポリペプチド電荷タグのいくつかの例を示す図である。
【図１６】コイルドコイル構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に配置されたポリペプチドを含む電荷タグの例を示す図である。
【図１７】分岐したデンドロン様構造を有するホスホジエステルベースの電荷タグの例を示す図である（図１７Ａ、図１７Ｂ）。
【図１８】分岐したペプチドベースの電荷タグの例を示す図である（図１８Ａ、図１８Ｂ）。
【図１９】本開示の態様によるスペルミンベースの電荷タグの例を示す図である（図１９Ａ、図１９Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示の例は、一般に、核酸シークエンシング手順において検出されるヌクレオチド取り込みイベントための組成物および方法に関する。例えば、高スループットで長いシークエンシング読み取りを可能にするために、電荷の違いに基づいてヌクレオチドの識別認識を提供する改善された検出システムに対するニーズが存在する。本明細書に記載される例は、このニーズを満たし、他の利点も提供する。
【００３５】
本明細書に開示されるように、異なる検出システムで使用するための異なる標識を有するヌクレオチド上の高価で感光性の蛍光標識。従来の蛍光標識の検出は、レーザーおよび検出光学素子などの高価なハードウェアを含む場合があり、それらは検出装置のサイズを増加させる。さらに、生成される多数の情報をデコードするために、より強力なソフトウェアが使用される。重要なことは、本明細書に開示されているように、高価なフルオロホアは必要とされない。蛍光標識を電荷標識に置き換えることにより、システム内の電流をモニターする伝導性チャネルによって電荷を検出することができる。このことは、「リアルタイム」シークエンシングが実施されることを可能とし、各ヌクレオチド取り込みのサイクル時間を削減することで、より速いターンアラウンドタイムを達成する可能性を有する。
【００３６】
「リアルタイム」シークエンシングを可能にすることにより、一例では、３’−ＯＨのブロッキング基は関与しない。これにより、合成ステップが少なくなるため、修飾ヌクレオチドのコストが削減される。追加の利点は、ポリメラーゼが、化学修飾された嵩高い３’保護基と比較して、ネイティブシステムにより近い３’ＯＨを有するヌクレオチドを取り込むのにより適していることである。
【００３７】
電荷を含む修飾ヌクレオチドを検出するための伝導性チャネルは、周囲の電場に敏感であり得る。この電場は、伝導性チャネルの表面に近接した電荷を有する修飾ヌクレオチドを配置することにより変調される。いくつかの場合では、例えば、溶液中の塩または他のイオンが、伝導性チャネルによる検出から電荷を遮蔽する場合には、電荷タグの当該表面への近接性が重要であり得る。特徴的な遮蔽の長さはデバイ長と呼ばれ、デバイ長を超えると伝導性チャネルは電荷を検出できない場合がある。
【００３８】
修飾ヌクレオチドに含まれる電荷は、−２００ｅ〜＋２００ｅの間のどこかであり得、それは完全に直線的に引き伸ばされた場合、１６０オングストロームを超える場合があるが、伝導性チャネルのデバイゾーン（Ｄｅｂｙｅ  ｚｏｎｅ）は約１ｎｍであり得る。したがって、伝導性チャネルによるその検出を促進するために、ヌクレオチドの帯電修飾の構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ）が望ましい。
【００３９】
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、通常の意味をとると理解される。本明細書で使用されるいくつかの用語の例とその定義を以下に示す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「アレイ（ａｒｒａｙ）」という用語は、１つ以上の固相基板に付着した伝導性チャネルまたは分子の集団を指し、伝導性チャネルまたは分子は、それらの相対的な位置によって互いに区別することができる。アレイは、固相基板上の異なるアドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）な位置（例えば、異なる伝導性チャネル）にそれぞれ位置する異なる分子を含むことができる。あるいは、アレイは、それぞれ異なる分子を有する別々の固相基板を含むことができ、異なるプローブ分子は、固相基板が付着している表面上の当該固相基板の位置、または流体ストリームなどの液体中の固相基板の位置によって識別され得る。アレイの分子は、核酸プライマー、核酸プローブ、核酸鋳型、またはポリメラーゼやエキソヌクレアーゼなどの核酸酵素であり得る。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「付着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」という用語は、２つのものが互いに接合、固定、接着、接続、または結合されている状態を指す。例えば、ポリメラーゼなどの反応成分は、共有結合または非共有結合によって、伝導性チャネルなどの固相成分に付着させることができる。共有結合は、原子間で電子対を共有することで特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を伴わない化学結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「電気伝導性チャネル（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）」という用語は、その表面またはその周囲の電場における摂動を電気信号に変換する検出デバイスの一部を意味することを意図している。伝導性チャネル（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）は、電気伝導性チャネル（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）であり得る。例えば、図１に示すように、電気伝導性チャネル５は、反応成分（例えば、標識ヌクレオチド）の到着または離脱を電気信号に変換することができる。本明細書に開示される例では、電気伝導性チャネル５は、標識ヌクレオチドの酸化還元活性のある（ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ）電荷タグとの相互作用を通じて、２つの反応成分（鋳型核酸と標識ヌクレオチドのヌクレオチド）の間の相互作用を検出可能な信号に変換することもできる。
【００４３】
電気伝導性チャネル５は、伝導性チャネル２のチャネルであり得る。伝導性チャネル２は、ソース端部Ｓおよびドレイン端部Ｄ、ならびに端部Ｓ、Ｄを接続するチャネル５を含み得る。当該チャネルは、例えばチューブ、ワイヤ、プレートなどの任意の適切な形状を有し得る。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「伝導性チャネル（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）」という用語は、その表面またはその周囲の電場における摂動を電気信号に変換する検出デバイスを意味することを意図している。例えば、伝導性チャネルは、反応成分の到着または離脱を電気信号に変換することができる。伝導性チャネルは、２つの反応成分の間の相互作用、または単一の反応成分のコンホメーション変化も電気信号に変換することができる。例示的な伝導性チャネルは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）ベースのＦＥＴ、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）ＦＥＴ、グラフェンナノリボンＦＥＴ（およびＭｏＳ２、シリセンなどの２Ｄ材料から製造された関連ナノリボンＦＥＴ）、トンネルＦＥＴ（ＴＦＥＴ）、および急峻サブスレッショルドスロープデバイス（ｓｔｅｅｐ  ｓｕｂｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｌｏｐｅ  ｄｅｖｉｃｅｓ）などの電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である（例えば、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５１ｓｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１−６頁，ＩＳＢＮ：９７８−１−４５０３−２７３０−５（２０１４年）、およびＩｏｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４７９，３２９−３３７頁（２０１１年）を参照；それぞれの全体が参照により援用される）。本開示の方法および装置で使用され得るＦＥＴおよびＳＷＮＴ伝導性チャネルの例は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／００７８６２２  Ａ１号に記載されている。
【００４５】
端部Ｓ、Ｄは、任意の適切な伝導性材料であり得る。適切なソース材料およびドレイン材料の例は、コバルト、ケイ化コバルト、ニッケル、ケイ化ニッケル、アルミニウム、タングステン、銅、チタン、モリブデン、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化亜鉛インジウム、金、プラチナ、カーボンなどを含む。
【００４６】
伝導性チャネル５は、酸化還元活性のある電荷タグを酸化または還元することができる任意の伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）材料または半伝導性（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）材料を含み得る。当該材料は、有機材料、無機材料、またはその両方を含み得る。適切なチャネル材料のいくつかの例は、シリコン、カーボン（例えば、グラッシーカーボン、グラフェンなど）、伝導性ポリマーなどのポリマー（例えば、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリ（４−スチレンスルホネート）でドープされたポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ）など）、金属、生体分子などを含む。
【００４７】
いくつかの例では、伝導性チャネル５はまた、少なくとも１つの寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）をナノスケール（１ｎｍ〜１μｍ未満の範囲）で有するナノ構造であり得る。一例では、この寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は最大寸法を指す。例として、伝導性チャネル５は、半伝導性ナノ構造、グラフェンナノ構造、金属ナノ構造、および伝導性ポリマーナノ構造であり得る。ナノ構造は、多層または単層ナノチューブ、ナノワイヤ、ナノリボンなどであり得る。
【００４８】
本明細書で使用される「異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）」という用語は、核酸に関して使用される場合、核酸が互いに同じではないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つ以上の異なる核酸は、その全長にわたって異なるヌクレオチド配列を有することができる。あるいは、２つ以上の異なる核酸は、それらの長さの相当な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）部分にわたって異なるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、２つ以上の異なる核酸は、当該２つ以上の分子で異なる標的ヌクレオチド配列部分を有することができ、一方で、当該２つ以上の分子で同じであるユニバーサル配列部分も有することができる。「異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）」という用語は、ポリメラーゼや核酸酵素などの他の分子にも同様に適用することができる。
【００４９】
本明細書で使用される「各々（各、それぞれ）」という用語は、アイテムのコレクションに関して使用される場合、当該コレクション中の個々のアイテムを識別することを意図しているが、必ずしもコレクション中のすべてのアイテムを指すわけではない。明示的な開示または文脈が明らかにそうでないことを示す場合、例外が発生し得る。
【００５０】
本明細書で使用される「標識（ｌａｂｅｌ）」という用語は、反応成分に関して使用される場合、検出可能な反応成分または反応成分の検出可能な部分を意味することを意図している。有用な標識は、伝導性チャネルによって検出され得る電荷標識（電荷タグとも呼ばれる）である。標識は、検出対象の反応成分に固有のもの（例えば、ポリメラーゼの荷電アミノ酸）であり得、または標識は当該反応成分に対して外因性のもの（例えば、アミノ酸の天然に存在しない修飾）であり得る。いくつかの例では、標識は、別々の機能を有する複数の部分を含むことができる。例えば、標識は、リンカー成分（例えば、核酸）および電荷タグ成分を含むことができる。
【００５１】
本明細書で使用される「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）」という用語は、分子の部分に関連して使用される場合、その自然環境または人間の技術的介入の影響を受けない生物学的システムにおいて、当該分子に付着していることが判明していない部分を指すことを意図している。典型的には、非天然部分は分子の合成修飾であり、当該合成修飾は未修飾分子または天然修飾を有する分子から、当該分子を構造的または化学的に区別させる。本明細書で使用される「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）」という用語は、プロセスに使用されるアナログに関連して使用される場合、当該プロセスが生じる自然環境では見られないアナログを意味することを意図している。通常、非天然アナログは、当該アナログが属するクラス中の他のタイプの分子と構造的または化学的に異なる合成アナログである。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」という用語は、当技術分野におけるその使用と一致することを意図しており、天然に存在する核酸またはその機能的アナログを含む。特に有用な機能的アナログは、配列特異的様式で核酸にハイブリダイズすることができるか、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然に存在する核酸は一般に、ホスホジエステル結合を含む骨格を有する。アナログ構造は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）などの当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替の骨格結合を有することができる。天然に存在する核酸は一般に、（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られる）デオキシリボース糖または（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見られる）リボース糖を有する。
【００５３】
核酸は、当技術分野で知られているこれらの糖部分の様々なアナログのいずれかを含むことができる。核酸は、天然塩基または非天然塩基を含むことができる。これに関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン、およびグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野で公知である。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、天然ヌクレオチド、そのアナログ、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、およびヌクレオチドとして知られる他の分子を含むことを意図している。この用語は、例えばＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に存在するサブユニットを識別するために、ポリマー中に存在する単量体単位を指すために使用することができる。この用語はまた、ポリマー中に必ずしも存在しない分子、例えば、ポリメラーゼによって鋳型依存的な様式でポリヌクレオチドに取り込まれ得る分子を指すためにも使用され得る。この用語は、例えば、５’炭素上に０、１、２、３またはそれ以上のホスフェートを有するヌクレオシド単位を指すことができる。例えば、テトラホスフェートヌクレオチド、ペンタホスフェートヌクレオチド、およびヘキサホスフェートヌクレオチドは、５’炭素上に６超のホスフェート、例えば７、８、９、１０、またはそれ以上のホスフェートを有するヌクレオチドと同様に、特に有用であり得る。例示的な天然ヌクレオチドは、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ（総称してＮＴＰ）、ならびにＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰおよびＧＤＰ（総称してＮＤＰ）、またはＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰもしくはＧＭＰ（総称してＮＭＰ）、またはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（総称してｄＮＴＰ）、ならびにｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰおよびｄＧＤＰ（総称してｄＮＤＰ）、ならびにｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＧＭＰ（総称してｄＮＭＰ）を含むが、これらに限定されない。例示的なヌクレオチドは、例外なく、任意のＮＭＰ、ｄＮＭＰ、ＮＤＰ、ｄＮＤＰ、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ならびに他のＮＸＰおよびｄＮＸＰを含み得、ここでＸは２〜１０の数を表す（総称してＮＰＰ）。
【００５５】
本明細書においてヌクレオチドアナログとも呼ばれる非天然ヌクレオチドは、天然の生物学的システムに存在しないもの、またはその自然環境、例えばポリメラーゼを発現する非組換え細胞においてポリメラーゼによってポリヌクレオチドに実質的に取り込まれないものを含む。特に有用な非天然ヌクレオチドは、同じワトソン−クリック相補的塩基と塩基対を形成する天然ヌクレオチドなどの別のヌクレオチドがポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖に取り込まれる速度よりも実質的に速いまたは遅い速度で、ポリメラーゼによって当該ポリヌクレオチド鎖に取り込まれるものを含む。例えば、非天然ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドの取り込み速度と比較した場合、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１００００倍またはそれ以上異なる速度で取り込まれ得る。非天然ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに取り込まれた後、さらに伸長され得る。例は、３’ヒドロキシルを有するヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドアナログを取り込んだポリヌクレオチドのさらなる伸長を可能にするために除去され得る３’位に可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログを含む。使用され得る可逆的ターミネーター部分の例は、例えば、米国特許第７，４２７，６７３号；米国特許第７，４１４，１１６号；および米国特許第７，０５７，０２６号、ならびに国際公開第９１／０６６７８号および国際公開第０７／１２３７４４号に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。いくつかの例では、ヌクレオチドアナログを取り込んだポリヌクレオチドがさらに伸長されない条件下で、３’ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログまたは３’ヒドロキシルを欠くヌクレオチドアナログ（ジデオキシヌクレオチドアナログなど）を使用し得ることが理解されよう。いくつかの例では、ヌクレオチドは可逆的ターミネーター部分を含まないかもしれず、あるいは当該ヌクレオチドは非可逆的ターミネーター部分を含まないか、または当該ヌクレオチドはターミネーター部分を全く含まないであろう。５’位に修飾を有するヌクレオチドアナログも有用である。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「保護部分（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、反応成分が特定の反応を受けることを防ぐために、反応成分に付着している化合物またはその部分を意味することを意図している。例えば、核酸分子は、そうでなければ核酸酵素の分解または修飾を引き起こすであろう処理による分解または修飾から核酸酵素を防ぐように、核酸酵素に結合することができる。抗体も、反応成分を分解、不活性化、または他の反応から保護するために、当該反応成分に結合するのに役立ち得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「反応成分（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」という用語は、反応に関与する分子を意味することを意図している。例は、反応で消費される反応物、反応によって生成される生成物、反応を促進する酵素などの触媒、溶媒、塩、緩衝液、およびその他の分子を含む。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「反発部分（ｒｅｐｅｌｌａｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、空間を占有する分子またはその部分を意味することを意図しており、当該空間における別の分子の占有を防止または抑制するか、または当該空間の近くにおける別の分子の並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を抑制する。反発部分は、立体排除、電荷反発、疎水性−親水性反発、またはその他の力によって作用することができる。
【００５９】
本明細書で使用される「ターミネーター部分（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、ヌクレオチドに関連して使用される場合、ヌクレオチドが第２のヌクレオチドへの共有結合を形成することを阻害または防止するヌクレオチドの一部を意味する。例えば、ペントース部分を有するヌクレオチドの場合、ターミネーター部分は、ヌクレオチドの３’酸素と２番目のヌクレオチドの５’ホスフェートとの間のホスホジエステル結合の形成を防止することができる。ターミネーター部分は、核酸ポリマー中に存在する単量体単位であるヌクレオチドの一部であり得るか、またはターミネーター部分は、遊離ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドトリホスフェート）の一部であり得る。ヌクレオチドの一部であるターミネーター部分は可逆的であり得、その結果、当該ターミネーター部分は、ヌクレオチドが第２のヌクレオチドへの共有結合を形成できるようにするために修飾され得る。特定の例では、可逆的ターミネーター部分などのターミネーター部分は、ヌクレオチドアナログのペントース部分の３’位または２’位に付着することができる。
【００６０】
以下に記載される例、および特許請求の範囲において列挙される例は、上記の定義を考慮して理解することができる。
【００６１】
本開示は、とりわけ、核酸シークエンシング手順で検出されるヌクレオチド取り込みイベントに有用な組成物、そのような組成物を作製する方法、およびそのような手順でそれらを使用する方法を提供する。本明細書に記載の組成物および方法は、例えば、合成によるシ−クエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）などの単一分子核酸シ−クエンシング反応において特に有用である。しかしながら、本明細書に記載の組成物および方法は、単一分子検出を含むがこれに限定されない他の任意の適切な検出スキームに使用できることが理解されよう。本明細書に開示される組成物が使用され得る核酸シ−クエンシングのための装置および方法は、例えば、参照によりその全体が援用される米国特許出願番号１４／７９８，７６２に開示されている。
【００６２】
例えば、核酸シ−クエンシングの方法は、（ａ）固体支持伝導性チャネル（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）につながれたポリメラーゼを提供するステップ；（ｂ）１つ以上の標識ヌクレオチドを提供するステップであって、それにより、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記伝導性チャネルにより前記標識の存在を検出することができるステップ；および（ｃ）鋳型核酸に相補的な新生鎖への前記標識ヌクレオチドの取り込みを検出するステップ、を含むことができる。
【００６３】
核酸シ−クエンシングの方法のいくつかの例では、ポリメラーゼは、伝導性チャネルに対して１０ｎｍ未満、９ｎｍ未満、８ｎｍ未満、７ｎｍ未満、６ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満、または１ｎｍ未満の近傍に保持される。
【００６４】
いくつかの例では、標識またはその一部（例えば、電荷タグ）は、例えば、ポリメラーゼによる取り込み後に、ヌクレオチドから切断され得る。
【００６５】
本明細書で提供されるように、１つ以上の標識ヌクレオチドは、複数の電荷タグを含み得る。例えば、１つ以上の標識ヌクレオチドは、各種類のヌクレオチドについて、固有の電荷タグを含むことができる。例えば、電荷タグを有するヌクレオチドは、鋳型配列に従ってポリメラーゼによりＤＮＡ鎖を合成する際に使用され得、当該鋳型配列は、例えば、アデニン塩基、チミン塩基、グアニン塩基、およびシトシン塩基を含むヌクレオチドの列（ｓｔｒｉｎｇ）を含み得る。本明細書に開示されるような電荷タグを有するヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素により、鋳型配列に相補的なヌクレオチドの列に取り込まれ得る。本明細書に開示されるように、電荷タグを有するヌクレオチドがそのように取り込まれると、伝導性チャネルは、ヌクレオチドの各種に特異的かつ示差的に関連する所定の価数（ｖａｌｅｎｃｅ）および大きさの電荷を検出することができ、伸長中の鎖に取り込まれた連続ヌクレオチドのアイデンティティの記録を可能にし、それにより、伸長中の鎖が相補的な鋳型鎖中に存在するヌクレオチドの配列の記録を可能にする。電荷タグは、負の電荷タグまたは正の電荷タグであることができ、−２００ｅ〜＋２００ｅ、例えば、−１７５ｅ〜＋１７５ｅ、または−１５０ｅ〜＋１５０ｅ、または−１２５ｅ〜＋１２５ｅ、または−１００ｅ〜＋１００ｅ、または−７５ｅ〜＋７５ｅ、または−５０ｅ〜＋５０ｅのどこかに電荷を有し得る。
【００６６】
核酸シークエンシングの方法で使用される伝導性チャネルは、ナノワイヤＦＥＴを含むことができる。任意で、伝導性チャネルはカーボンナノチューブを含み得る。伝導性チャネルは、伝導性チャネルのアレイの一部であり得る。検出ステップは、複数の取り込みイベントを連続して検出することを含むことができる。
【００６７】
本明細書に記載の組成物、装置、および方法は、長い核酸シークエンシング読み取り（ｌｏｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）；高速読み取り；シークエンシングのための高スループット機能；およびシークエンシングのためのスケーラブルなプラットフォームを提供することができる。いくつかの例では、並行して実行される読み取りの数においてスループットを提供するための本明細書に記載の方法および装置の能力により、単一読み取り精度におけるいかなる妥協（ａｎｙ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓ）も、複数の重複読み取りを実行することで軽減され得る。
【００６８】
例示的な伝導性チャネルが図１に示されている。ここで、ポリメラーゼ１は反応部位を生成し、当該反応部位においてヌクレオチドがプライミングされた（ｐｒｉｍｅｄ）ＤＮＡ鋳型４に取り込まれ得る。ポリメラーゼ１は、テザー３を介してナノワイヤＦＥＴ２に付着している。この装置は、単一分子感度（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を提供する。反応部位での電荷分布の変化（例えば、ポリメラーゼのコンンホメ−ション変化、ヌクレオチドの取り込み、電荷タグの到着または離脱、ポリメラーゼの伝導性チャネルへの近接性の変化など）がゲートに伝達され、検出され得る。
【００６９】
特定の例では、本開示の装置または方法は、単一分子伝導性チャネルとしてディープスケーリングされた（ｄｅｅｐｌｙ  ｓｃａｌｅｄ）ＦｉｎＦＥＴトランジスタを使用し得る。ＦｉｎＦＥＴ伝導性チャネルは、最先端の半導体メーカーが既に開発中の技術の恩恵を受ける。更に、以前に公開されたコンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を使用することができ、これには、（１）Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３５，  ３１９  （２０１２年）に記載されるように、ＣＮＴにリゾチームを固定化してリアルタイムで酵素の処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を観察するために使用されるもの、（２）Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３５，  ７８８５  （２０１３年）に記載されるように、Ｐｏｌ  １  ＫｌｅｎｏｗフラグメントをＣＮＴに固定し、リアルタイムでＤＮＡの処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を観察するために使用されるもの、（３）Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  ＮａｎｏＬｅｔｔ  １３，  ６２５  （２０１３年）に記載されるように、タンパク質のアロステリックモーションにより移動する荷電残基のような伝達機構を解明するために使用されるものが含まれるが、これらに限定されない。本方法はまた、前記装置、前記装置のコンポーネント、および米国特許出願公開第２０１３／００７８６２２  Ａ１号に記載の方法も使用することができる。上記の参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００７０】
標識ヌクレオチドのいくつかの例は、特異性領域も含み得る。したがって、標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチドのホスフェート基に付着した連結分子（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）またはリンカー、およびリンカーに付着した電荷タグを含み得る。連結分子またはリンカーは、伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域にハイブリダイズし得る特異性領域を含み得る。例として、特異性領域は、テザー上のアクセプター領域に一時的に付着または結合することができる任意のヌクレオチド配列またはペプチドであり得る。例えば、特異性領域はヌクレオチド配列を含み得、アクセプター領域はヌクレオチド配列を含み得、特異性領域およびアクセプター領域の配列中のヌクレオチド間で対結合が形成される。この場合の対結合は、Ｇ残基とＣ残基の間、またはＡ残基とＴ残基またはＵ残基の間など、ヌクレオチド間の標準的な対結合を指す。
【００７１】
特異性領域はヌクレオチド配列を含み得、アクセプター領域は対応する相補的なヌクレオチド配列を含み得る。一例では、ポリメラーゼが、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な伸長中のポリヌクレオチド鎖への取り込みのためにヌクレオチドを受け入れる場合、特異結合領域とアクセプター領域は、対結合がそれらの間に形成されるほど十分に互いに近接し得る。特異性領域とアクセプター領域の間のそのような対結合は、電荷タグと伝導性チャネルの間の十分な近接性を促進し得、ヌクレオチドの取り込み中に伝導性チャネルによる電荷タグの検出を促進し得る。
【００７２】
一例では、特異性領域は、約１ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含み得る。別の例では、特異性領域は、ヌクレオチド配列の両側に隣接するイノシンを更に含み得る。いくつかの例では、特異性領域は電荷タグの一部に含まれる。例えば、特異性領域は、電荷タグの部分などにより線形配列に沿って互いに分離されているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のセグメントまたは部分から構成され得、アクセプター領域への結合は、電荷タグによる所定の三次元構造の採用を可能にしながら、特異性領域の別個の領域が互いに近接するように誘導することができる。
【００７３】
テザーに関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｅｔｈｅｒ）標識ヌクレオチドの一例では、標識ヌクレオチドとテザーとの間の特異的な結合親和性は、非特異的な結合相互作用により生じる弱い親和性と組み合わされる。標識ヌクレオチドは、テザーの一部に相補的な特異性領域を含み得る。これらの領域の間の特異的結合は、標準的なワトソン−クリック塩基対または他の非共有結合から生じ得る。この例では、特異性領域は、ヌクレオチド配列に隣接するイノシン（Ｉ）も含むことができる。イノシンはユニバーサル塩基であるため、ＤＮＡの４つの天然ヌクレオチドのすべてと対合することができる。追加の結合相互作用は、テザー上の天然ヌクレオチドとユニバーサル塩基（例えば、イノシンＩ）との相互作用から生じ得る。したがって、取り込み中に標識ヌクレオチドがポリメラーゼに結合すると、標識ヌクレオチドの特異性領域とテザーのアクセプター領域との間に相乗的な結合が起こり得、標識ヌクレオチドとテザーの間の相互作用の安定性が大幅に向上し得る。
【００７４】
標識ヌクレオチドとポリメラーゼとの間の相互作用、またはポリメラーゼとテザーとの間の相互作用は、電荷タグが伝導性チャネルの感知ゾーン内に入ることを引き起こし得る。そのような相互作用はまた、効率的かつ完全な電荷検出に十分な時間、感知ゾーン内に電荷タグを維持するのに役立ち得る。このような時間は、最大で数十ミリ秒になり得る。このような比較的長時間の相互作用は、溶液中に存在する他の標識ヌクレオチドについての相互作用とは異なり、当該他の標識ヌクレオチドは理論的には拡散し得、伝導性チャネルに短時間接触または接近し得る。そのような短時間の相互作用は、十分な電荷検出が行われるほど十分に長くない場合があり、したがって、そのような場合、電荷タグは伝導性チャネルによって検出されない。
【００７５】
本明細書に開示されるように、電荷タグは、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴマーペプチド核酸、または前述の２つ以上の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、電荷タグは、アミノ酸、ヌクレオチド、およびリンカーから選択される複数の要素を含み得る。そのような分子は三次元構造を形成し、電荷タグのアスペクト（ａｓｐｅｃｔｓ）によって運ばれる電荷の凝縮を可能にし、総電荷がより小さな領域に凝縮され得るようにすることができる。そのような増加した電荷密度は、ポリメラーゼによる伸長鎖へのヌクレオチドアナログの取り込み中に伝導性チャネルにより検出される電荷を増加させ得、その結果、そのような合成における所定のヌクレオチド種の存在を決定することができる。そのような凝縮されたコンホメーションをとる電荷タグは、伝導性チャネルからの電荷の分散、または伝導性チャネルの大きな表面積にわたる電荷の分散、またはその両方を最小限に抑えることができる。結果として、伝導性チャネルが、電荷タグのより大きな量または割合の電荷を検出する可能性が高くなり得る。
【００７６】
本明細書に開示されるいくつかの例は、伝導性チャネルの感知ゾーンの近傍に電荷タグをもたらしかつ保持するために、単独でまたはテザーと組み合わせて、標識ヌクレオチドのポリメラーゼへの相乗的な結合（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を利用する。テザーを用いて形成された複合体の安定性は比較的低いため、複合体は、ポリメラーゼにも結合しない標識ヌクレオチドでは形成されない（即ち、溶液中でフリーの標識ヌクレオチドは、テザーに実質的に結合しない場合がある）。換言すれば、そのような複合体のオフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）は十分に高く、寿命が短くなり得る。しかしながら、標識ヌクレオチドとポリメラーゼの間に安定した結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が形成されると、連結分子の局所濃度がテザーの周りで増加し得、したがってオン速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）が高くなる。このようにして、ポリメラーゼ結合状態（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）では、非結合状態と比較して、全体的な結合時間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）が大幅に増加し得る。全体的にかなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）結合親和性を可能にするために、単独でまたはテザーと組み合わせて、ポリメラーゼに対する標識ヌクレオチドの親和性の相乗効果が合計され得る。ポリメラーゼによる切断後、相乗効果が失われ、電荷タグも伝導性チャネルから解離し得る。
【００７７】
特定の例は、ガンマホスフェート標識ヌクレオチドのポリメラーゼおよびテザーへの相乗的な結合を利用することができる。オリゴヌクレオチド部分：テザー複合体の安定性、または特異性領域：アクセプター領域複合体の安定性は比較的低いため、複合体は、ポリメラーゼにも結合していないガンマホスフェート標識ヌクレオチドでは形成されず、溶液中でフリーのガンマホスフェート標識ヌクレオチドは、テザーに実質的に結合しない。しかしながら、ポリメラーゼに対するヌクレオチド部分の親和性と、テザーのアクセプター領域に対するオリゴヌクレオチド部分などの特異性領域の親和性の相乗効果が合計されて、全体的にかなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）結合親和性を可能にし得る。いくつかの例では、相乗効果は、非特異的な結合相互作用によって生じる弱い親和性と、ヌクレオチド標識とテザーの間の特異的な結合親和性の組み合わせを利用することができる。例えば、上記のように、いくつかの例では、特異的な結合は標準的なワトソン−クリック塩基対から生じ得、非特異的な結合相互作用は、プロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基（例えば、イノシン）と天然ヌクレオチドとの相互作用から生じ得る。したがって、取り込み中にガンマホスフェート標識ヌクレオチドがポリメラーゼに結合すると、相乗的な結合が起こり得、オリゴヌクレオチド部分とテザーの間の相互作用の安定性が大幅に向上する。ガンマホスフェートがポリメラーゼによって切断された後、相乗効果が失われ得、オリゴヌクレオチド部分がテザーから解離する。ヌクレオチド部分：テザー結合の他の種類、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アミノ酸、またはそれらのアナログもしくは組み合わせの間の非共有相互作用によるものは、そのような相乗効果に寄与する。
【００７８】
図２に示すように、ポリメラーゼは、単層カーボンナノチューブ、シリコンナノワイヤ、またはＦｉｎＦＥＴなどの伝導性チャネルに固定化することができる。固定化は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アミノ酸、またはそれらのアナログもしくは組み合わせを含むテザーを介して行うことができる。実証の便宜上、図２は、伝導性チャネルにつながれた４つのポリメラーゼを示し、各ポリメラーゼは異なるガンマホスフェート標識ヌクレオチドタイプにも結合している。示されているように、ヌクレオチドは、ガンマホスフェートに付着したオリゴヌクレオチド部分を有し得る。標的核酸の鋳型鎖に適切にマッチするベータホスフェート標識ヌクレオチドまたはガンマホスフェート標識ヌクレオチドは、ポリメラーゼによって所定の位置に保持され得、オリゴヌクレオチド部分または他の特異性領域をテザーのアクセプター領域に（例えば、ワトソン−クリック塩基相補性またはその他の非共有結合を介して）一時的にハイブリダイズするのに十分に長い間、当該ポリメラーゼは鋳型に結合していることもできる。ハイブリダイゼーションにより、電荷タグが伝導性チャネルの周りの電場を乱し、伝導性チャネルを通るトランジスタ電流の変化により検出可能な信号を生成し得る。この図は、伝導性チャネルから１〜２ｎｍ以内にある場（ｆｉｅｌｄ）に入る電荷タグを示している。適切にマッチしたベータホスフェート標識ヌクレオチドまたはガンマホスフェート標識ヌクレオチドは、鋳型核酸にハイブリダイズした新生鎖に取り込まれ得る。これにより、今度は、ベータホスフェートと新しく取り込まれたヌクレオチドとの間の結合が破壊される。その結果、電荷タグは（ヌクレオチドのベータ位に付着していようと、またはヌクレオチドのガンマ位に付着していようと）、自由にテザーから解離して伝導性チャネルから拡散して、それにより伝導性チャネルの周りの電場を非摂動状態に戻す。伝導性チャネルの周囲の場が摂動され、そして非摂動状態に戻るのに伴う信号の出現と消失は、標的核酸の新生鎖へのヌクレオチドの取り込みと相関させる（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）ことができる。
【００７９】
鋳型鎖の各位置で新生鎖に取り込まれたヌクレオチドの種類は、各種類のヌクレオチドに取り込まれた標識の固有特性に基づいて決定することができる。例えば、４種類のｄＮＴＰは、特異性領域がテザーのアソシエーション領域（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）にハイブリダイズする位置、特異性領域の長さ、および／または標識上の電荷部分の存在、電荷の価数、ならびに電荷の大きさによって識別することができる。例えば、所定のヌクレオチドは、異なる原子価および／または大きさの電荷を有する他のヌクレオチドによって共有されない所定の原子価および大きさの電荷を有し得る。伝導性チャネルは、電荷の価数および／または大きさの違いを検出可能であり得る。伝導性チャネルにつながれたポリメラーゼによる新生ポリヌクレオチドへの荷電タグを有するヌクレオチドの取り込み中、伝導性チャネルは、鋳型鎖のヌクレオチドの相補体として取り込まれたヌクレオチドのタグの原子価および／または大きさを検出し得る。ポリメラーゼが、今度は鋳型の次のヌクレオチドと相補的な次のヌクレオチド種を取り込むために移動すると、新生鎖に取り込まれたそのような次のヌクレオチド種の電荷の価数および／または大きさも、伝導性チャネルによって検出され得る。そして、電荷タグを有する連続したヌクレオチドが新生鎖に取り込まれるにつれて、以下同様である。
【００８０】
連続する電荷タグが伝導性チャネルによって検出されると、電荷タグの違いに起因する伝導性チャネルを流れる電流の違いが、コンピュータ可読記憶媒体などに記録および保存され得、当該コンピュータ可読記憶媒体などは、ポリメラーゼによって重合される取り込みごとに、所定の同定されたヌクレオチド種を記録するようにプログラムされ得る（伸長中の新生鎖が合成されるにつれて、そのような取り込みごとに伝導性チャネルによって検出された電荷の価数および／または大きさに基づいて）。
【００８１】
図２は、２つの電荷タグおよび２つのテザーハイブリダイゼーション位置を用いて、塩基Ｇ、Ａ、Ｃ、およびＴの間の４状態識別が達成される例を示している。具体的には、ｄＣＴＰは負に帯電した外因性部分（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）で一意に標識され、ｄＴＴＰは正に帯電した外因性部分（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）で一意に標識され、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰは、外因性電荷部分が非存在であることに基づいて他の２つのヌクレオチドタイプと区別され、ｄＡＴＰは、テザーにハイブリダイズしたときの伝導性チャネルへのオリゴヌクレオチド部分の近接差に基づいて、ｄＧＴＰと区別される。
【００８２】
正電荷部分、負電荷部分、および／またはテザーハイブリダイゼーション位置の様々な組み合わせのいずれかに基づいて、異なるヌクレオチドの種類を識別できることが理解されるであろう。代替的または追加的に、異なる種類のヌクレオチドを識別するために使用される電荷部分は、たとえ電荷が同じ符号を有しているとしても、電荷の強度が異なり得る。図３に示す例示的な構成は、単一のテザーハイブリダイゼーション位置と４つの異なる電荷部分に基づく、塩基Ｇ、Ａ、Ｃ、およびＴの間の４状態識別を提供する。具体的には、この非限定的な例では、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの両方は、それらをｄＡＴＰおよびｄＴＴＰと区別する負に帯電した部分を含み、ｄＧＴＰは、ｄＣＴＰの電荷よりも明らかに高い電荷のため、ｄＣＴＰと区別することができる。同様に、ｄＡＴＰとｄＴＴＰは、ｄＴＴＰ部分に比べてｄＡＴＰ部分の正電荷が高いため、互いに区別することができる。
【００８３】
本明細書で前述したように、テザーに沿った特定のハイブリダイゼーション位置でのタグ配置の精度は、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド標識を有するテザーの使用により強化することができ、当該ヌクレオチド標識は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）および２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾ＲＮＡ塩基を有する。代替の構成は、リボヌクレオチドを有する標識を備えた２’−Ｏ−Ｍｅおよび２’Ｆ修飾リボヌクレオチドを含むテザーを使用することができ、またはテザーと標識の両方は、天然リボヌクレオチドと２’−Ｏ−Ｍｅおよび２’Ｆ修飾リボヌクレオチドとの混合物を含むことができる。主にＲＮＡで構成されるテザーおよび／またはオリゴヌクレオチド部分を使用することは可能であるが、ＲＮＡに関連するヌクレアーゼ感受性を避けるために、ＤＮＡベースのテザーもしくはＰＮＡベースのテザーもしくはアミノ酸ベースのテザー、および／またはオリゴヌクレオチドを使用することが望ましいかもしれない。例えば、ＤＮＡベースのテザーもしくはＰＮＡベースのテザーもしくはアミノ酸ベースのテザー、および／またはオリゴヌクレオチドは、不所望のヌクレアーゼ消化のリスクを低減しながら、本明細書に記載の結合の利点を達成するために、天然リボヌクレオチドまたは非天然リボヌクレオチドアナログを含むことができる。更なる例では、テザーはヌクレオチド標識中のデオキシリボヌクレオチドに相補的な１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含むことができるか、またはテザーはヌクレオチド標識中のデオキシリボヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。
【００８４】
ポリメラーゼを伝導性チャネルに付着させるテザーは、本明細書に開示されるいくつかの例に示されるように、異なるヌクレオチド配列に対して異なる結合位置（例えば、アクセプター領域）を有し得る。２つ以上のヌクレオチド配列に対する結合位置は重複していても、重複せずに離散していてもよい。例示の目的で、テザー配列が一連の包括的な（ｇｅｎｅｒｉｃ）「Ｎ」ヌクレオチドとして、図８に描かれている。相補性のルール、および所望のハイブリダイゼーションの強度および特異性に従って、任意の様々な配列を使用することができる。テザーの長さ、アクセプター領域の長さ、および特異性領域の長さに応じて、テザー上の結合部位の一部が重複するか、テザー上の結合部位のすべてが重複するか、またはテザー上の結合部位は全く重複しないかもしれない。いくつかの態様では、相補的塩基は標準的なＤＮＡ塩基であるが、任意のヌクレオチドアナログを使用することもできる（例えば、デオキシリボヌクレオチドアナログを使用してもよい）。
【００８５】
ヌクレオチドアナログの特異性領域のテザー結合オリゴヌクレオチド部分は、テザーのアクセプター領域上の相補配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの例では、テザー結合オリゴヌクレオチド部分は、テザーに非特異的に結合するプロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヌクレオチド位置も含むことができる。そのような位置は、テザー結合オリゴヌクレオチド部分とテザーの間に弱い相互作用を提供することができ、当該相互作用は特定のハイブリッド構造の形成を促進する。例えば、図９に示すように、オリゴヌクレオチド部分は、ＤＮＡの４つのすべての天然ヌクレオチドと弱くはあるがプロミスキャスに（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｌｙ）結合することが知られているいくつかのイノシン（Ｉ）を含むことができる。テザー結合オリゴヌクレオチド部分（例えば、特異性領域）およびテザー（例えば、アクセプター領域）は、テザー結合オリゴヌクレオチド部分中のイノシンとテザー中の天然ヌクレオチドとの間の相互作用を介して、弱い複合体を形成することができる。これにより、配列の特定の部分（例えば、図中でＡＢＣおよびその相補体Ａ’Ｂ’Ｃ’として示されている）が、弱い複合体の形成がない場合に拡散する必要がある場合よりも素早く結合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）ことができる。更に、特異的な複合体が形成されると、イノシンは更なる安定性を与えることができる。
【００８６】
図９の非限定的な例のテザー結合オリゴヌクレオチド部分は、特異的配列の両側に隣接するプロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヌクレオチド位置を含む。しかしながら、１つ以上のプロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヌクレオチド位置は、特異的配列の５’側のみまたは３’側のみに配置され得ることが理解されよう。プロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヌクレオチド位置の他の例は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチド合成によって形成されるもの、または２種類以上のヌクレオチドとプロミスキャスに（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｌｙ）ハイブリダイズする当技術分野で知られている他のヌクレオチドアナログで形成されるものを含む。
【００８７】
本明細書に記載されるいくつかの例は、異なる長さのオリゴヌクレオチド特異性領域を有する複数の異なるヌクレオチドアナログの使用を例示した。そのような例では、異なるヌクレオチドアナログの種類が、それらの特異性領域の異なる長さに基づいて識別され得る。あるいは、異なるヌクレオチドアナログは、互いに区別することができないかもしれない同じまたは類似の長さのテザー結合オリゴヌクレオチド部分を有し得る。しかしながら、各ヌクレオチドアナログは、他のヌクレオチドアナログの特異性領域が結合する１つまたは複数のアクセプター領域と比較して、テザーの異なるアクセプター領域に結合する特異性配列を有することができる。例示的な構成が図１０に示されており、異なるヌクレオチドアナログへのポリメラーゼの結合は、ポリメラーゼを４つの識別可能な状態の１つに配置する。図１０に示す非限定的な例では、ＡＴＰアナログのテザー結合オリゴヌクレオチド部分は、テザーのポリメラーゼへの付着点に最も近いテザー上の位置に結合し、ＴＴＰアナログのテザー結合オリゴヌクレオチド部分は、テザーのポリメラーゼへの付着点から最も遠いテザー上の位置に結合し、ＧＴＰアナログおよびＣＴＰアナログのテザー結合オリゴヌクレオチド部分は、他の２つのヌクレオチドアナログのテザー結合オリゴヌクレオチド部分の結合部位から中間距離にあるテザー上のそれぞれ異なる場所に結合する。ポリメラーゼへの異なるヌクレオチドアナログの結合は、伝導性チャネルから異なる距離にポリメラーゼを配置し得る（例えば、図中に示すように、テザーに異なるサイズのループを形成させる）。ヌクレオチドアナログの１つ以上が、電荷タグまたは他の検出可能な部分（例えば、ポリメラーゼによってヌクレオチド配列に取り込まれるヌクレオチドから伸びる末端から遠位のテザー結合オリゴヌクレオチド部分の末端から伸びる）を含む例では、テザー結合オリゴヌクレオチド部分とテザーとの間の結合は、伝導性チャネルから異なる距離に電荷タグ部分を配置し得る。そのような場合、伝導性チャネルからの検出可能な電荷タグ部分の異なる距離に対して生成されるシグナルの差に少なくとも部分的に基づいて、異なる種類のヌクレオチドアナログは識別され得る。この例示的な例では、ヌクレオチドアナログはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＴＴＰとして識別されるが、任意のヌクレオチドアナログを使用することができる（例えば、デオキシリボヌクレオチドアナログを使用してもよい）。
【００８８】
図１３Ａおよび１３Ｂに示すような他の例では、本明細書に開示されるタグ付きヌクレオチドの特異性領域は、テザーのアクセプター領域の異なる部分にそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含み得る。特異性領域のそのような配列の間には、アクセプター領域の一部にハイブリダイズしないヌクレオチドのスパン（ｓｐａｎ）があり得る。したがって、２つの配列は、テザーのアクセプター領域のそれに対応して相補的な部分および特異性領域の介在部分にハイブリダイズし得、介在配列は他の場所で自由にハイブリダイズする（例えば、図１３Ａに示すようなヘアピン構造を形成するために互いにハイブリダイズする特異性領域のそのような介在配列の２つの相補的部分）か、または自由にハイブリダイズするかそれ自体が特異的に非結合のままになる（例えば、図１３Ｂに示すように）。図１３Ａおよび１３Ｂにおいて、「Ｇｌｕｅ」は、タグ付きヌクレオチドの特異性領域にハイブリダイズするか、そうでなければ一時的に結合するテザーのアクセプター部分を意味する。いくつかの例では、このような結合は、伝導性チャネル（図１３Ａおよび１３Ｂにおいて、テザー／アクセプター領域／「Ｇｌｕｅ」が付着したワイヤによって表される）による電荷タグの検出を増加させ得る。
【００８９】
図４に図解された例によって実証されるように、ポリメラーゼを伝導性チャネルに付着させるテザーは、アナログヌクレオチド上に存在し得る電荷タグまたは特異性配列にハイブリダイズする必要はない。むしろ、伝導性チャネルは、ヌクレオチドアナログの特異性領域が結合し得るポリメラーゼのテザーとは別のアクセプター領域の付着によって機能化することができる。アクセプター領域がポリメラーゼテザーの一部であろうと、伝導性チャネルに付着していようと、電荷タグの電荷の価数、電荷の強度、特異性領域：アクセプター領域の結合複合体の長さ、伝導性チャネルへのまたは伝導性チャネルに対するアクセプター領域：特異性領域複合体の形成の近接性もしくは位置、またはそれらの組み合わせに基づいて、異なるヌクレオチドの識別を達成することができる。
【００９０】
本開示による電荷タグを有するヌクレオチドアナログの例示的な例が図５に示されている。これは、本明細書に記載および開示されるヌクレオチドアナログの多くの例のうちの１つにすぎず、本開示の範囲を限定するものではない。この非限定的な例では、ｄＴヘキサホスフェートは、特異性領域を含むリンカー領域を介して電荷タグに接続されている。この非限定的な例のリンカーは、アジド−アルキンクリック反応によって形成された共有結合を含むが、本明細書でさらに開示されるように、他のケミストリーが代わりに使用されてもよい。参照を容易にするために、本明細書でヌクレオチドアナログの部分を説明する場合、ヌクレオチドのデオキシリボース上の遊離３’ヒドロキシル基を指す慣例に従って、図５に示す分子の右側の領域は、３’末端と呼ばれる。それに対応して、この例では電荷タグが配置されている図５に示す分子の左側の領域は、ヌクレオチドのリボースの５’炭素に結合したホスフェート基の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）として、５’末端と呼ばれる。
【００９１】
表Ｉは、本明細書に記載される装置または方法において標識として使用され得るいくつかの有用な修飾および電荷の非限定的なリストを提供する。
【００９２】
【表１】
0006938690.tif 000018
【００９３】
一態様では、本開示は、以下を含む修飾ヌクレオチドに関する：ヌクレオチド；  ヌクレオチドのホスフェート基に付着した連結分子；および連結分子に付着した電荷タグ。ここで、当該電荷タグは、ヌクレオチドおよびアミノ酸からなる群から選択される複数の要素、および要素間の任意のリンカーを含み、電荷タグは内部折り畳み（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｏｌｄｅｄ）構造または二次構造を含む。一例では、電荷タグは、１つ以上のホスホジエステル基、および要素間の任意のリンカーを含む。いくつかの態様では、ヌクレオチドは天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドの構造は、当業者に知られており、塩基または糖部分への構造的修飾（例えば、アルキル化、アミノ基、または保護基）を含み得る。いくつかの例では、連結分子は特異性領域を含む。いくつかの例では、特異性領域は、１〜６つのヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、電荷タグは、約１の電荷〜約１００または約２００の電荷を含む。いくつかの例では、連結分子は、以下の式Ｉに示す−Ｘ２から（ＣＨ２）ｍ基までの構造を含む。一例では、電荷タグは、本明細書の方法で使用されるポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９）に結合しない。いくつかの例では、電荷タグは、ポリメラーゼテザーのアクセプター領域に結合する２つの非隣接領域を含有する複数のヌクレオチドを含み、それにより電荷タグにおいてヘアピン構造を形成する。
【００９４】
ヌクレオチドアナログまたは標識ヌクレオチドの一例は、以下の式Ｉの化合物によって表される：
【化１７】
0006938690.tif 000019
式Ｉ中、ｎは、３〜１０の整数であって、ｍは、１〜１０の整数であって、ｔは、０〜５０の整数であって、Ｘ１は、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであって、Ｘ２は、１つ以上の個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり、ここで、ａは、１〜２４の整数であって、Ｘ３は、直接結合またはオリゴヌクレオチドであり、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合に、前記オリゴヌクレオチドは前記テザーのアクセプター領域にハイブリダイズし、Ｆ１はフルオロホアおよび直接結合から選択され、かつＦ２は非存在であるかまたはフルオロホアであって、Ａは、
【化１８】
0006938690.tif 000020
であり、Ｙは、以下から選択され：
【化１９】
0006938690.tif 000021
ｑは、１〜１００の整数であり、Ｂは、以下から選択され：
【化２０】
0006938690.tif 000022
ここで、Ｒは、Ｙおよび水素から選択され、Ｂがデンドロンである場合、ｑは１に等しく、前記ｑ個のＢは、電荷および電荷密度を有する。一例では、ポリメラーゼによる鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生ポリヌクレオチド鎖への標識ヌクレオチドの取り込みを検出することを含む方法が提供され、前記ポリメラーゼは、テザーによって固体支持伝導性チャネルにつながれ、前記標識ヌクレオチドは式Ｉの化合物であって、前記伝導性チャネルは、前記取り込み中に前記標識ヌクレオチドを検出する。
【００９５】
一例では、Ｂは電荷タグを含み、前記電荷タグはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド核酸、またはそれらの組み合わせを含み、前記電荷タグは内部折り畳み（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｏｌｄｅｄ）構造または二次構造を有する。
【００９６】
本明細書で更に説明するように、式Ｉの化合物を調製することは、連結反応を含む反応によってＡを形成することを含み得、前記連結反応は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応（ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｏｐｐｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、テトラジン−トランス−シクロオクテンライゲーション（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）、アジド−ジベンゾシクロオクチン基銅フリークリック反応（ａｚｉｄｅ−ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、およびチオール−マレイミドコンジュゲーション（ｔｈｉｏｌ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される。
【００９７】
また、式Ｉの化合物のヌクレオチド部分のポリヌクレオチドの新生鎖への取り込み中などに、式Ｉの化合物の電荷タグを電荷検出器で検出する方法が提供される。非限定的な例では、検出は、核酸のシークエンシング中に行われ得、以下を含む：（ａ）固体支持伝導性チャネル（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）につながれたポリメラーゼを提供すること；（ｂ）式Ｉの１つ以上の化合物を提供すること。それにより、前記標識が前記伝導性チャネルに近接している場合、前記伝導性チャネルによって前記化合物の存在を検出することができる；および（ｃ）前記伝導性チャネルを使用して、鋳型核酸に相補的な新生鎖への前記化合物の取り込みを検出すること。
【００９８】
また、Ｂが１つ以上のステムループ形（ｓｔｅｍ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上のクローバー形（ｃｌｏｖｅｒｌｅａｆ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の管状形（ｔｕｂｕｌａｒ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の環状形（ａｎｎｕｌａｒ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の直方体形（ｃｕｂｏｉｄａｌ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の十字形（ｃｒｕｃｉｆｏｒｍ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の球形（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の長方形（ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の角錐形（ｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の菱形（ｄｉａｍｏｎｄ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の層形（ｌａｍｉｎａｒ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の円柱形（ｃｏｌｕｍｎａｒ  ｓｈａｐｅ）、１つ以上の波形（ｃｏｒｒｕｇａｔｅｄ  ｓｈａｐｅ）、または前述の２つ以上の任意の組み合わせを有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、式Ｉの化合物も提供される。式Ｉの化合物の別の例では、Ｂは、１つ以上のコイル形（ｃｏｉｌｅｄ  ｓｈａｐｅ）を有する１つ以上のポリペプチドを含む。また、Ｂが十字形（ｃｒｕｃｉｆｏｒｍ  ｓｈａｐｅ）を形成する１つ以上のオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドの１つ以上に結合した１つ以上のペプチド核酸分子、および前記１つ以上のペプチド核酸分子に結合した１つ以上のポリペプチドを含む、式Ｉの化合物も提供される。
【００９９】
また、Ｂが−１００ｅ〜＋１００ｅの電荷を有する、式Ｉの化合物も提供される。また、Ｂが−１００ｅ〜＋１００ｅの電荷、および約−１００ｅ／ｎｍ３〜約＋１００ｅ／ｎｍ３の電荷密度を有する式Ｉの化合物も提供される。また、Ｂが−２００ｅ〜＋２００ｅの電荷を有する、式Ｉの化合物も提供される。また、Ｂが−２００ｅ〜＋２００ｅの電荷、および約−２００ｅ／ｎｍ３〜約＋２００ｅ／ｎｍ３の電荷密度を有する式Ｉの化合物も提供される。
【０１００】
いくつかの例では、式Ｉの化合物は、フルオロホア、例えばＦ１、Ｆ２または両方によって表されるものを任意に含み得る。フルオロホアのいくつかの非限定的な例は、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、またはＣｙ５）、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンフルオロホア（例えば、テトラメチルローダミン）、またはその他を含む。式Ｉの化合物におけるフルオロホアの任意の存在は、フルオロホアを含むタグ付きヌクレオチドの検出などの追加の用途を提供し得る。例えば、フルオロホア含有電荷タグの存在は、当該タグによって運ばれる電荷の存在、価数、および大きさの検出だけでなく、蛍光共鳴エネルギー移動などの蛍光発光を検出する方法によっても検出され得る。
【０１０１】
また、前記電荷タグが１つ以上のペプチド核酸を含む、タグ付きヌクレオチドも提供される。いくつかの例では、前記電荷タグは１つ以上のペプチド核酸を含み、前記ペプチド核酸の１つ以上は１つ以上の荷電アミノ酸に付着される。
【０１０２】
また、前記電荷タグはオリゴヌクレオチドを含み、ＤＮＡオリガミによって形成される、式Ｉの化合物を形成する方法が提供される。当業者によって理解されるように、ＤＮＡオリガミは、ナノスケールでの任意でない形状の作成においてＤＮＡを折り畳むことを含む。コンパクト化されたオリガミＤＮＡ構造は、高い電荷密度を可能にし得、式Ｉの異なる化合物において電荷密度の変動を可能にし得る。より高い電荷、より高い電荷密度、ならびに電荷タグの電荷および電荷密度の変動におけるより高いフレキシビリティ（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）は、伝導性チャネルによる電荷タグの検出の可能性を高め得、また伝導性チャネルによって検出された異なる電荷タグ間の識別を可能にし得る。電荷タグによって運ばれ得る、より広い範囲の電荷は、式Ｉの化合物の異なる例によって運ばれる電荷間のより大きな差別化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を可能にする。いくつかの例では、異なるヌクレオチドは、それらが式Ｉの化合物として結合しているタグによって運ばれる電荷によって互いに区別され得る。それにより、伝導性チャネルは、異なるそのようなヌクレオチドによって運ばれる電荷の大きさの違いに基づいて、式Ｉの化合物の一部を構成する異なるヌクレオチドを差別的に検出し得る。
【０１０３】
Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンなどの正に帯電したアミノ酸を含み得、正の電荷を有する電荷タグを生成し得る。代わりに、Ｂはアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み得、負の電荷を有する電荷タグを生成し得る。いくつかの例では、Ｂは分岐ポリペプチド、または直鎖ポリペプチド、または環状ポリペプチドである。いくつかの例では、Ｂは、単一のアミノ酸または２〜１０個もしくは１１〜２０個のアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。いくつかの例では、Ｂのアミノ酸のいくつかは非荷電であり得、他の例では、ＢはＢの他のアミノ酸と反対に荷電するいくつかのアミノ酸を含み得るが、Ｂは全体的に正または負の電荷を保持し得る。
【０１０４】
式Ｉのこの非限定的な例では、ｎ個のホスフェート基に直接結合したヌクレオチドは、ポリメラーゼによって認識可能なヌクレオチドであり、それにより鋳型配列に相補的に合成されるヌクレオチド配列に取り込まれる。ヌクレオチドアナログは、伸長中の合成ポリヌクレオチド配列への付加中にポリメラーゼによって所定の位置に保持されるが、当該アナログの残り（ｒｅｍａｉｎｄｅｒ）はそこから伸長し得、本明細書に開示されるように、伝導性チャネルに近接するポリメラーゼについて、伝導性チャネルが電荷の価数および大きさを感知し得るように、電荷タグ（式Ｉおよびそれが直接結合した荷電ペプチド中のＢによって表されるものなど）は、伝導性チャネルの近傍にに移動または移動させられることができる。異なるヌクレオチドアナログは、当該アナログの３’末端に異なるヌクレオチド、およびそれに対応して当該アナログの５’末端に異なるペプチド電荷タグを含むことがあり、その結果、合成中のヌクレオチド配列にヌクレオチドを取り込むためにポリメラーゼが異なるヌクレオチドアナログと結合する際に、ポリメラーゼにつながれた伝導性チャネルは、電荷の価数および大きさの違いを検出し得る。これらの例では、ポリメラーゼは、ヌクレオチドアナログの５’ヌクレオチドに直接結合した１つのホスフェート基を除くすべてを切断し得、その結果、当該ヌクレオチドアナログのｄＮＭＰ部分は合成されるヌクレオチド配列中に残り、５’ホスフェート基は取り込まれる次のヌクレオチドに自由に結合し、ヌクレオチドアナログの切断された残り（ｒｅｍａｉｎｄｅｒ）は複合体から自由に解離する。
【０１０５】
３’ヌクレオチドに直接結合したホスフェートまたは一連のホスフェート基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のホスフェート基を含み得る。他の例は、１０個を超えるホスフェート基を含み得る。次いで、ヌクレオチドアナログのこの部分は、１〜１０個の−ＣＨ２−基を含むアルキル結合（ａｌｋｙｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）により連結され得る。他の例は、この位置に１１〜２０個のそのような基を含み得る。他の例では、これらの１〜１０個または１１〜２０個の−ＣＨ２−基の１つ以上は、Ｃ１〜Ｃ２０炭化水素で置換され得る。
【０１０６】
ヌクレオチドアナログのこの部分は、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基などの０〜５０個のオキサアルキル基によってさらに連結され得る。他の例では、これらの０〜５０個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基の１つ以上は、Ｃ１〜Ｃ１５０炭化水素で置換され得る。ヌクレオチドアナログのこの部分は、Ｘ１で表される０〜１０個の−ＣＨ２−基を含むアルキル結合（ａｌｋｙｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）によってさらに連結され得る。Ｘ１の他の例は、この位置に１１〜２０個のそのような基を含み得る。Ｘ１の他の例では、これらの１〜１０個または１１〜２０個の−ＣＨ２の基１つ以上は、Ｃ１〜Ｃ２０炭化水素で置換され得る。Ｘ１はまた、直接結合、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０オキサアルキル、Ｃ１−Ｃ１０チアアルキル、またはＣ１−Ｃ１０アザアルキルであり得る。
【０１０７】
以下により完全に記載されるように、Ａは、ヌクレオチドアナログの５’末端が当該ヌクレオチドアナログの３’末端に向かって電荷タグに接続され得る連結基を表す。例えば、ヌクレオチドポリホスフェートは、デオキシリボース（またはリボース）の最も遠位の５’ホスフェート基に付加された官能基を有してもよく、その末端の官能基は反応基であり得る。反応基は、特定の１つ以上の試薬の存在下、または所定のｐＨもしくは温度などの制御された条件下で、別の化学基と反応することができる化学基であり（まとめて２つの反応基であり）、それらの間に共有結合または結合を形成する。例えば、３’ヌクレオチドからＡ、または３’ヌクレオチドからＡの何個かの結合手前まで（ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ３′  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｕｐ  ｔｏ  ｏｒ  ｓｏｍｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｂｏｎｄｓ  ｓｈｏｒｔ  ｏｆ  Ａ）の式Ｉの部分に類似する組成物または当該部分の例は、市販されているか、既知の方法に従って合成され得る。次いで、第一の反応基が反応して共有結合を形成することができる別の反応基を有する電荷タグも一緒に反応し得るように、そのような化合物の末端に反応基を付加して、それにより電荷タグを３’ヌクレオチドに共有結合させて式Ｉの化合物を形成する。
【０１０８】
Ａに付着するのはＸ２であり得る。Ｘ２は、個々のＣＨ２残基がペプチド結合および（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ａの１つ以上で任意に置換されたＣ１−Ｃ２０アルキルであり得、ここで、ａは、１〜２４の整数である。Ｘ２の他の例では、ａは、６〜２０の整数であり得る。さらに他の例では、Ｘ２の１〜２０個のアルキル基の１つ以上は、Ｃ１〜Ｃ２０炭化水素で置換され得る。
【０１０９】
一例では、Ｂは、ホスフェート結合によってＸ２に接続された電荷タグを表し得る。Ｂは、ホスホジエステル基を含む１〜１００個の部分を含み得る。一例では、Ｂは、ホスホジエステル基を含む１〜２００個の部分を含み得る。そのようなホスホジエステル基の酸素原子によって運ばれる負電荷は、Ｂ電荷タグに負電荷を与え、その大きさは部分の数に比例する。Ｂのｑ個の部分のそれぞれは、Ｂの他の部分のいずれとも異なる部分であってもよく、またはそれらはすべて互いに同じであってもよい。Ｂの任意の１つ以上の部分は、例えば、アデニン、チミン、シトシン、またはグアノシン塩基を有するｄＮＭＰであり得る。Ｂのいずれか１つ以上の部分は、
【化２１】
0006938690.tif 000023
であり、ここで、Ｒは水素である。
【０１１０】
いくつかの例では、Ｂの任意の部分は、任意のＮＰＰ（ヌクレオチドポリホスフェート）を含み得る。異なる３’ヌクレオチドが結合している他の電荷タグと、その価数、大きさ、または両方が異なる電荷タグは、それらがポリヌクレオチド合成中にそこにつながれたポリメラーゼによって保持されるため、伝導性チャネルによるヌクレオチドアナログの差別化された識別を可能にする。いくつかの例では、いくつかのヌクレオチドアナログは、式Ｉの化合物または本明細書に開示される類似の化合物である。いくつかの例では、合成によるシークエンシング反応で使用されるすべてのヌクレオチドは、式Ｉの化合物または関連化合物の例など、本明細書に開示される１つ以上のホスホジエステル基を含む電荷タグを含有する。他の例では、合成によるシークエンシング反応で使用されるいくつかのヌクレオチドは、式Ｉの化合物または関連化合物の例など、本明細書に開示される１つ以上のホスホジエステル基を含む電荷タグを含有するのに対し、合成によるシークエンシング反応で使用される他のヌクレオチドは、そのような化合物を含まない電荷タグを含有する。
【０１１１】
他の例では、各Ｂは、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンから独立して選択され得、正電荷を有する電荷タグを生成する。別の例では、各Ｂはアスパラギン酸およびグルタミン酸から独立して選択され得、負電荷を有する電荷タグを生成する。いくつかの例では、ｑ個のＢは、分岐ポリペプチド、または直鎖ポリペプチド、または環状ポリペプチドである。いくつかの例では、ｑ個のＢは、単一のアミノ酸または２〜１０個もしくは１１〜２０個のアミノ酸を有するポリペプチドであり得る。いくつかの例では、Ｂのアミノ酸のいくつかは非荷電であり得、他の例では、ＢはＢの他のアミノ酸と反対に荷電するいくつかのアミノ酸を含み得るが、Ｂは全体的に正または負の電荷を保持し得る。いくつかの例では、Ｂは非天然アミノ酸を含み得る。
【０１１２】
更に他の例では、Ｂは、１つ以上の構成繰り返し単位および複数の末端単位を含むｚ世代（ｚ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）のデンドロンであり、ここで、ｚは１〜６の整数であり、前記構成末端単位は以下からなる群から選択され：
【化２２】
0006938690.tif 000024
ここで、ｐ１は１〜３の整数であり、前記ｐ１個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、ｐ２は１〜３の整数であり、前記ｐ２個の−ＣＨ２−基のいずれか１個以上は、１〜３個の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−基で任意に置換され、前記末端の基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、アミノ基、および第４級アンモニウム基からなる群から選択される。
【０１１３】
Ｂは、その自由原子価末端（ｆｒｅｅ  ｖａｌｅｎｃｅ  ｅｎｄ）によりＸ２に接続されたデンドロン電荷タグを表し得る。いくつかの例では、本明細書に開示されるデンドロンは、ヌクレオチドアナログに化学的に結合される前などに、ヌクレオチドアナログに付着していなくてもよい。Ｂは、以下によって表されるような、２度の分岐（２  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）を有する構成繰り返し単位を含み得る：
【化２３】
0006938690.tif 000025
【０１１４】
または、Ｂは、以下によって表されるような、３度の分岐（３  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）を有する構成繰り返し単位を含み得る：
【化２４】
0006938690.tif 000026
【０１１５】
本明細書でさらに開示されるように、デンドロン電荷タグは、サイズが１〜６世代のどこであってもよい。末端構成繰り返し単位の末端基は、正または負のいずれかに帯電し得る。したがって、２度の分岐を有するデンドロンは２ｚの電荷を有する電荷タグを生成し得、３度の分岐を有するデンドロンは３ｚの電荷を有する電荷タグを生成し得る（末端基ごとの電荷の大きさは１である）。
【０１１６】
Ｂがデンドロンを表す一例では、末端基は、例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、アミノ基、または第４級アンモニウム基などの多くの荷電官能基、または他の荷電官能基のいずれかであり得る。いくつかの例では、デンドロンの構成繰り返し単位は、末端構成繰り返し単位の末端基以外の原子上に電荷を含み得る。例えば、１つの非限定的な例として、構成繰り返し単位は、分岐点に第４級アンモニウム基を含有し得、当該第４級アンモニウム基は正電荷を帯びていてもよい。末端構成繰り返し単位にのみ存在する荷電末端基とは異なり、このような内部電荷は、デンドロン内の構成繰り返し単位のすべての場合（ｉｎｓｔａｎｃｅ）に存在し得る。
【０１１７】
式Ｉ中のＸ２において任意に表されるようなペプチド結合が存在し得る。他の例では、式Ｉに示されるペプチド結合の代わりに、Ｃ１〜Ｃ２０の炭化水素が存在してもよく、または直接結合が存在してもよい。
【０１１８】
Ａについて、ヌクレオチドを電荷タグに連結するリンカーは、反応基間の連結反応によって形成され得る。例えば、Ａは、アジド（またはアルキン）基を有するヌクレオチドと、アルキン（またはアジド）基を有する電荷タグとの間のアジド−アルキン銅アシストクリック反応（ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｏｐｐｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を生成する：
【化２５】
0006938690.tif 000027
【０１１９】
または、Ａは、テトラジン（またはトランスシクロオクテン）基を有するヌクレオチドと、トランスシクロオクテン（またはテトラジン）基を有する電荷タグとの間のテトラジン（ＴＥＴ）−トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）ライゲーション（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ  （ＴＥＴ）−ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ  （ＴＣＯ）  ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を生成する：
【化２６】
0006938690.tif 000028
【０１２０】
または、Ａは、アジド（またはジベンゾシクロオクチン）基を有するヌクレオチドと、ジベンジルシクロオクチル（またはアジド）基を有する電荷タグとの間のアジド−ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基銅フリークリック反応（ａｚｉｄｅ−ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ  （ＤＢＣＯ）  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を生成する：
【化２７】
0006938690.tif 000029
【０１２１】
または、Ａは、チオール（またはマレイミド）基を有するヌクレオチドと、マレイミド（またはチオール）基を有する電荷タグとの間のチオール−マレイミドコンジュゲーション（ｔｈｉｏｌ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって形成され得、以下のような化学構造またはその均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を生成する：
【化２８】
0006938690.tif 000030
【０１２２】
または、Ａは、アミン（またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）基を有するヌクレオチドと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（またはアミン）基を有する電荷タグとの間のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−アミン結合反応（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ−ａｍｉｎｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって形成され得、アミド結合を生成する。
【０１２３】
当業者によって理解されるように、適切な反応基間の他のライゲーションケミストリーにより形成される他の連結基を本開示に取り込んで、３’ヌクレオチドを電荷タグに連結し得るＡの他の構造を形成してもよい。
【０１２４】
式ＩのＢは電荷タグを表す。本明細書に開示されるように、電荷タグは、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴマーペプチド核酸、デンドロン、または前述の少なくとも２つの組み合わせを含み得る。電荷タグの電荷は、そのような部分の荷電官能基、例えば、ホスホジエステル結合、アミド基、カルボン酸基、またはそのような化合物に追加し得る他の荷電官能基、例えば、１つ以上のスルホン酸、ホスホン酸、または第４級アンモニウム基によって運ばれ得る。本明細書に開示されるように、電荷タグは、その要素によって運ばれる電荷が一緒に保持され、伝導性チャネルから広がり、離れるのを防ぐように、特定の三次元方向をとり得る。電荷タグの電荷密度を高めることによるこのような電荷の凝縮は、伝導性チャネルによって検出される電荷を増加させ得る。
【０１２５】
電荷タグは、前述のクリックケミストリーまたはライゲーション反応を形成するのに適した反応基を有するように合成され得る。例えば、電荷タグは、アジド基またはアルキン基（例えば、アジド−アルキン銅アシストクリック反応による電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの共有結合および包含のため）、またはテトラジン（ＴＥＴ）基またはトランス−シクロオクテン基（例えば、テトラジン（ＴＥＴ）−トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）ライゲーションによる電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの共有結合および包含のため）、またはアジド基またはＤＢＣＯ基（例えば、アジド−ＤＢＣＯ基銅フリークリック反応による電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの共有結合および包含のため）、またはチオール基（システイン残基など）またはマレイミド基（例えば、チオール−マレイミドコンジュゲーションによる電荷タグとしてのヌクレオチドアナログへの共有結合および包含のため）を有し得る。他の既知のライゲーション、クリックケミストリー、または他の共有結合ケミストリー（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）も使用し得、対応する反応基が電荷タグに付着され、ヌクレオチドアナログへの共有結合が可能になる。
【０１２６】
式ＩにおけるＡおよび５’ヌクレオチドの間に示されるように、ペプチド結合が存在し得る。他の例では、式Ｉに示されるペプチド結合の代わりに、Ｃ１〜Ｃ２０の炭化水素が存在してもよく、または直接結合が存在してもよい。
【０１２７】
当業者には理解されるように、いくつかの例は式Ｉの化合物の改変または変形を含み、当該改変または変形は、テザーのアクセプター領域（これによりポリメラーゼが伝導性チャネルにつながれる）がどのようにヌクレオチドアナログの特異性領域とハイブリダイズするか、またはそうでなければ非共有結合を形成するかに関連する上記の特徴を取り込む。例えば、３’ヌクレオチドと５’電荷タグの間のアナログヌクレオチドの一部は、テザーと非共有結合を形成可能なヌクレオチド、ＰＮＡ残基、またはアミノ酸を取り込むことができ、当該テザーによってポリメラーゼは伝導性チャネル、またはそれ自体はそのようなテザーの一部でなくてもよく、ヌクレオチド、ＰＮＡ残基、またはアミノ酸、またはそれらの組み合わせを含み得る伝導性チャネルから伸びてそれに付着するアクセプター領域で機能化された部分に接続される。上記のものは、本明細書に開示されている式Ｉの化合物の５’電荷タグと３’ヌクレオチドの間の領域に置換または付加され得る。そのような置換または付加は、ポリメラーゼおよびテザー（または、そのような置換または付加に結合する目的のための、テザーとは別の伝導性チャネルの機能化された部分）へのアナログヌクレオチドの相乗的結合に寄与し得、本明細書に開示されるように、電荷タグの検出が記録され、そのような電荷を有するヌクレオチドアナログの取り込みを示すことを可能にするために、電荷検出器の検出領域と電荷タグとの適切に長い持続時間の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を促進する。
【０１２８】
いくつかの例では、チャージタグが三次元構造をとると、特異性領域のそうでなければ空間的に異なる要素を集めることで特定領域が形成され得、そのように集められた特異性領域のアクセプター領域への結合が可能になる。そのような特異性領域の形成およびアクセプター領域の結合は、電荷タグの特定の三次元構造の形成の非存在下では、発生しないか、発生する可能性が非常に低いか、または非常に一時的にのみ発生する可能性がある。他の例では、アクセプター領域への結合時に特異性領域の別の異なる要素を集めることは、電荷タグの所定の三次元コンホメーションの形成を誘導または促進する可能性がある。いくつかの例では、電荷タグの三次元コンホメーションの形成と、特異性領域の空間的に遠位の要素の集合が相乗効果をもたらし、各々が他方を促進する場合がある。いくつかの場合では、電荷タグによってそのようにとられた三次元コンホメーションは、そうでない場合に発生する可能性がある電荷密度よりも高い電荷密度をもたらし、伝導性チャネルによる電荷タグの検出を増加させ得る。
【０１２９】
様々なデザインのペプチド電荷タグを使用することができる。固相ペプチド合成を使用すると、２１個のアミノ酸のいずれかを電荷タグに含めることができる。さらに、修飾アミノ酸も市販されており、ペプチド電荷タグに付加してその特性をさらに調節することができる。アルギニン、ヒスチジンおよびリジン（正）、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸（負）などの電気的に荷電した側鎖を有するアミノ酸を使用するほか、他のアミノ酸をペプチド荷電タグにを組み込んで、その親水性、長さおよびサイズを微調整することができる。
【０１３０】
上記で開示したように、一例では、ペプチド電荷タグは、直鎖（図１２Ａ参照）、分岐鎖（図１２Ｂおよび図１２Ｃ参照）または環状鎖（図１２Ｄ参照）の形態で提示され得る。
【０１３１】
ＫＫＫＫＫやＥＥＥＥＥなどの様々な長さのアミノ酸の異なる組み合わせ（または追加の非荷電アミノ酸の有無にかかわらず、荷電アミノ酸のその他の組み合わせ）を使用することにより、４つの異なるヌクレオチドアナログをシーケンシングのために区別することができ、あるいは様々なヌクレオチドアナログを各ペプチド電荷タグからの特徴的な電流シグネチャに基づいて区別することができる。他のより複雑な三次元コンホメーションも可能である。例えば、ペプチド電荷タグは、α−ヘリックスなどのコイル構造をとり得る。そのような構造は、正および負のアミノ酸を含むが、全体的に正または負の電荷を含む。例えば、反対に帯電したアミノ酸の配置は、それらの間の結合と、α−ヘリックスまたは他の構造の形成とを誘導し得、過剰な正電荷または過剰な負電荷が近接して一緒に保持され、電荷密度が増加する。他の例では、同様の結合は、正味の正または負の電荷密度を含むコイルドコイル構造の形成を促進し得る。
【０１３２】
］電荷タグはまたオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチド電荷タグは、ペプチド電荷タグをヌクレオチドアナログに付着させるための上記のクリックケミストリーおよびライゲーション化学反応を使用して、ヌクレオチドアナログに付着させ得る。
【０１３３】
オリゴヌクレオチド電荷タグは、より高い電荷密度でのその電荷の圧縮を促進する様々な三次元の向きをとり得る。例えば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のホスホジエステル結合は負電荷を有し得る。凝縮した三次元構造をとることにより、オリゴヌクレオチドの負電荷は互いに近接して保持され得、伝導性チャネルによるそのような電荷タグの検出を増加させる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ステップアンドループ構造（ｓｔｅｐ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、クローバーリーフ構造、または十字形構造（例えば、ホリデイジャンクション）などの周知の構造をとり得る。ポリヌクレオチドオリガミ技術を使用して、電荷密度を増加させる他のコンホメーションをとるポリヌクレオチド電荷タグを設計することもできる。ポリヌクレオチド電荷タグは、管状形状、環状形状、直方体形状、または球形状をとり得る。そのような形状は、同じヌクレオチド組成を有するが三次元コンホメーションをとらないオリゴヌクレオチド、例えば線形コンホメーションに引き伸ばされた場合よりも、高い電荷密度を有するオリゴヌクレオチド電荷タグをもたらし得る。
【０１３４】
便宜上および明確にするために、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で使用される特定の用語をここで説明する。
【０１３５】
別段の指定がない限り、アルキルは、直鎖または分岐の飽和炭化水素構造およびそれらの組み合わせを含むことを意図している。アルキルは、１〜２０の炭素原子（例えば、１〜６の炭素原子などの１〜１０の炭素原子）のアルキル基を指す。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルなどを含む。
【０１３６】
シクロアルキルは炭化水素のサブセットであり、３〜８の炭素原子の環状炭化水素基を含む。シクロアルキル基の例は、ｃ−プロピル、ｃ−ブチル、ｃ−ペンチル、ノルボルニルなどを含む。
【０１３７】
Ｃ１〜Ｃ２０炭化水素は、アルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびそれらの組み合わせを含む。例は、ベンジル、フェネチル、プロパルギル、アリル、シクロヘキシルメチル、アダマンチル、カンホリルおよびナフチルエチルを含む。炭化水素は、唯一の元素成分として水素および炭素で構成される任意の置換基を指す。
【０１３８】
別段の指定がない限り、「炭素環」という用語は、環原子がすべて炭素であるが任意の酸化状態のものである環系を含むことを意図している。したがって、（Ｃ３−Ｃ１２）炭素環は、シクロプロパン、ベンゼン、シクロヘキセンなどの系を含む、非芳香族系および芳香族系の双方を指す。炭素環は、別段の制限がない限り、単環、二環、「および」多環を指す。（Ｃ８−Ｃ１２）炭素多環は、ノルボルナン、デカリン、インダン、ナフタレンなどの系を指す。
【０１３９】
アルコキシまたはアルコキシルとは、酸素を介して親構造に付着した直鎖構造または分岐構造の１〜２０の炭素原子（例えば、１〜６の炭素原子などの１〜１０の炭素原子）の基を指す。例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシなどを含む。
【０１４０】
オキサアルキルは、１つ以上の炭素（およびそれらに関連する水素）が酸素で置換されたアルキル残基を指す。例は、メトキシプロポキシ、３，６，９−トリオキサデシルなどを含む。用語オキサアルキルは、当該技術分野で理解されているように意図されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００２  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９６で発行された「Ｎａｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ」を参照。ただし、１２７（ａ）の制限なく、当該文献は参照によりその全体が援用される。）―用語オキサアルキルは、酸素が単結合を介してその隣接原子に結合している（エーテル結合を形成している）化合物を指す；カルボニル基に見られるような二重結合酸素は指さない。同様に、チアアルキルおよびアザアルキルは、それぞれ１つ以上の炭素が硫黄または窒素で置換されたアルキル残基を指す。アザアルキルの例は、エチルアミノエチルおよびアミノヘキシルを含む。
【０１４１】
複素環は、１〜４の炭素がＮ、ＯおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子で置換されたシクロアルキルまたはアリール炭素環残基を意味する。ヘテロアリールは複素環のサブセットで、当該複素環が芳香族である。複素芳香環の例は以下を含む：フラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ピロール、インドール、イソインドール、チオフェン、ベンゾチオフェン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、プリン、ピラゾール、インダゾール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、イソオキサゾール、ベンズイソオキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピリジン、キノリン、イソキノリン、ピラジン、キノキサリン、アクリジン、ピリミジン、キナゾリン、ピリダジン、シンノリン、フタラジン、およびトリアジン。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「任意に置換された」という用語は、「非置換または置換された」と交換可能に使用され得る。「置換」という用語は、指定された基内の１つ以上の水素原子を指定されたラジカルで置換することを指す。例えば、置換アルキル、置換アリール、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリルなどは、各残基中の１つ以上のＨ原子がハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アシル、アルコキシアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、カルボニル、フェニル、ヘテロアリール、ベンゼンスルホニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ハロアルコキシ、オキサアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル］、アルコキシカルボニルアミノ［ＨＮＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル］、カルボキサミド［−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２］、アルキルアミノカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル］、シアノ、アセトキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、（アルキル）（アリール）アミノアルキル、アルキルアミノアルキル（シクロアルキルアミノアルキルを含む）、ジアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルコキシ、ヘテロシクリルアルコキシ、メルカプト、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン、スルホニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニル、アリールスルホニルアミノ、アシルアミノアルキル、アシルアミノアルコキシ、アシルアミノ、アミジノ、アリール、ベンジル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヒドロキシイミノ、アルコキシイミノ、オキサアルキル、アミノスルホニル、トリチル、アミジノ、グアニジノ、ウレイド、ベンジルオキシフェニル、およびベンジルオキシで置換されているアルキル、アリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルを指す。「オキソ」も「任意に置換された」で言及された置換基に含まれる；オキソは二価のラジカルであるため、オキソが置換基として適切ではない状況（例えば、フェニル上）が存在することは当業者には理解されよう。一例では、１、２、または３個の水素原子が特定のラジカルで置換され得る。アルキルおよびシクロアルキルの場合、３個超の水素原子がフッ素で置換され得る；実際、利用可能なすべての水素原子をフッ素で置換することができる。そのような化合物（例えば、ペルフルオロアルキル）は「フルオロ炭化水素」のクラスに含まれる。明確にするために、総称（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｔｅｒｍ）は複数の置換基を包含し得、すなわち、例えば「ハロアルキル」または「ハロフェニル」とは、少なくとも１つ、だがおそらくは２つ以上の水素がハロゲンで置換されているアルキルまたはフェニルを指す。いくつかの例では、置換基はハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、オキサアルキル、カルボキシ、シアノ、アセトキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノアリールスルホニル、アリールスルホニルアミノ、およびベンジルオキシである。
【０１４３】
本明細書の化合物の説明において、用語「少なくとも１つの酸素化された置換基で置換されている」が使用される。酸素化された置換基は、炭素および水素に加えて酸素を含む置換基である；酸素化された置換基は、窒素などの追加のヘテロ原子も含み得る（例えば、カルボキサミドまたはメタンスルホニル）。酸素化された置換基の典型的な例は、アルコキシ、ヒドロキシ、フルオロアルコキシ、ホルミル、アセチル、および他のＣ１〜Ｃ６アシル鎖を含む。
〔実施例〕
非限定的な実施例
【０１４４】
以下の例は、本開示の特定の例を説明することを意図しているが、その範囲を限定することを決して意図していない。
【０１４５】
本開示に従って作製された、ヌクレオチドへの取り込みのための電荷タグのいくつかの例は、以下を含む：
【化２９】
0006938690.tif 000031
（ポリＴもしくは他のポリヌクレオチドまたはヌクレオチドの組み合わせ）、
【化３０】
0006938690.tif 000032
（ポリｄスペーサー）、および
【化３１】
0006938690.tif 000033
（ポリＣスペーサー）、または前記のいずれかの組み合わせ。
【０１４６】
そのような電荷タグの電荷は、ホスフェート基含有部分の数を（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれらの間の任意の数もしくは範囲に）変更することにより変化させ得る。最大４０、または１〜４０の任意の数が含まれ得る。４０超が含まれ得る。本開示に従って、これらの実施例に示されるトランスシクロオクテン基以外の適切な反応基を使用してもよい。
【０１４７】
ホスホジエステル結合中のホスフェートにより付与された様々な長さの電荷を有するオリゴヌクレオチド配列を、電荷タグとして使用することができる。さらに、ｄスペーサー（ｄＳｐａｃｅｒ）およびＣ３スペーサー（Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ）ヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドを使用して、異なる親水度およびサイズの電荷タグを作製することもできる。配列特異性を調節し、ポリメラーゼへの阻害を最小限に抑え、表面およびリンカーとの相互作用を最適化するために、異なる塩基および疎水性修飾を使用してオリゴヌクレオチド配列を修飾することができる。
【０１４８】
ホスホジエステルベースの電荷タグは、ヌクレオチドの５’末端ホスフェートに付着され得る。鋳型鎖に対する相補鎖の合成中にポリメラーゼによって伸長中の鎖に各ヌクレオチドが取り込まれると、電荷標識がピロホスフェート副産物の一部として放出される場合がある。標識上の電荷は、伝導性チャネル上の検出システムによって検出される。各タグからの特徴的な電流シグネチャ（例えば、電荷の大きさ）に基づいて、合成鎖に取り込まれた塩基は、タグによって付与された電荷の差次的な大きさ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ）を使用して区別され得る。
【０１４９】
本開示によるアナログヌクレオチドの例は以下を含むが、これらに限定されない：
【化３２−１】
0006938690.tif 000034
【化３２−２】
0006938690.tif 000035
【０１５０】
ホスホジエステルベースの電荷タグは、ホスホルアミダイトケミストリーおよび自動化オリゴヌクレオチド合成を使用して合成された。それらは合成後に精製され、オルソゴナルケミストリー法（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ）により特定のヌクレオチドに付着された。オルソゴナルケミストリー法は、銅触媒アルキン−アジド（ｃｏｐｐｅｒ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ａｌｋｙｎｅ−ａｚｉｄｅ）、ＤＢＣＯおよびアジドを使用した銅フリークリック化学（ｃｏｐｐｅｒ  ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ＤＢＣＯ  ａｎｄ  ａｚｉｄｅ）、ＴＣＯ−テトラジンライゲーション、またはチオール−マレイミドライゲーションが含むが、これらに限定されない。
【０１５１】
以下の非限定的な例は、ホスホジエステル電荷タグへのオルソゴナル結合ケミストリーを可能にする、様々なリンカーによる５’アミノヌクレオチドヘキサホスフェートの修飾を示す。５’−アミンデオキシ−チミンヘキサホスフェート（ｄＴ６Ｐ）（または他のＮＰＰ）（１）は、アジド−酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ａｚｉｄｏ−ｂｕｔｙｒｉｃ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）エステル（２ａ）またはメチルテトラジンＮＨＳエステル（２ｂ）で官能化され得、それぞれアジドｄＴ６Ｐ（３ａ）またはメチルテトラジンｄＴ６Ｐ（３ｂ）を形成し得る（スキーム１）。
【化３３】
0006938690.tif 000036
スキーム１．５’−アミンｄＴ６Ｐの官能化
【０１５２】
アジドｄＴ６Ｐ（３ａ）は、ＣｕＳＯ４、トリスヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン（ＴＨＰＴＡ）リガンドおよびアスコルビン酸ナトリウムの存在下における銅（Ｉ）アシストアジド−アルキン環化付加（ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＣｕＡＡＣ）を介して、５’−ヘキシニル基を有するポリ−Ｔオリゴヌクレオチド（４）の直鎖にコンジュゲートされ得、オリゴヌクレオチドコンジュゲート（５ａ）を形成することができる。精製はＣ１８逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行い、５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）およびアセトニトリルで溶出した。ポリ−ＴオリゴヌクレオチドとのＣｕＡＡＣ反応の代表的な例をスキーム２に示す。
【化３４】
0006938690.tif 000037
スキーム２．代表的なＣｕＣＣＡ反応
【０１５３】
メチルテトラジンｄＴ６Ｐ（３ｂ）は、５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７．４）中で、５’−トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）基を有するポリ−Ｔオリゴヌクレオチド（６）の直鎖にコンジュゲートされ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート（５ｂ）を形成した。精製はＣ１８逆相ＨＰＬＣで行い、５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）およびアセトニトリルで溶出した。メチルテトラジン−ＴＣＯライゲーションの代表的な例をスキーム３に示す。
【化３５】
0006938690.tif 000038
スキーム３．代表的なメチルテトラジン−ＴＣＯライゲーション
【０１５４】
アジドｄＴ６Ｐ（３ａ）は、５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７．４）中における銅フリーひずみ促進アジド−アルキン環化付加（ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＳＰＡＡＣ）を介して、５’−ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）基を有するポリ−Ｔオリゴヌクレオチド（７）の直鎖にコンジュゲートされ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート（５ｃ）を形成した。精製はＣ１８逆相ＨＰＬＣで行い、５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）およびアセトニトリルで溶出した。ポリ−ＴオリゴヌクレオチドとのＳＰＡＡＣ反応の代表的な例をスキーム４に示す。
【化３６】
0006938690.tif 000039
スキーム４．代表的なＤＢＣＯ−アジドコンジュゲーション
【０１５５】
以下のスキームにおいて、アジド−アルキンクリック反応は、ヌクレオチドポリホスフェートを電荷タグに連結した：
【化３７】
0006938690.tif 000040
スキーム５．クリックケミストリーによる代表的なコンジュゲーション
【０１５６】
当業者には理解されるように、ライゲーション反応またはクリックケミストリー反応の各反応基の配置を逆にするなど、前述の例は変更され得、前述の結合であるがアナログヌクレオチドの５’および３’末端に関して反対方向に配向した結合が生成される。
【０１５７】
反応基およびリンカーケミストリーは、本開示による様々な適用可能なケミストリーに従って、ヌクレオチドおよび電荷タグに付加され得る。いくつかの非限定的な例では、アジドまたはメチルテトラジンテールは、適切なＮＨＳ残基との反応によってアミノ化ＮＰＰに付加され得、それは様々な長さのリンカー部分、例えばＰＥＧ４リンカーや様々な長さのＰＥＧリンカーを含み得る。そのような合成スキームの非限定的な例は、以下およびそのバリエーションを含む：
【化３８】
0006938690.tif 000041
【０１５８】
アジドまたはメチルテトラジン反応基を付加するために、様々なリンカー長を有する異なるＮＨＳ部分が使用された。非限定的な例は以下を含む：
【化３９】
0006938690.tif 000042
【０１５９】
様々なＮＰＰが、それらを電荷タグと共有結合させるために、クリックまたはライゲーション化学反応のための異なる反応基を用いて形成された。いくつかの非限定的な例は、
【化４０】
0006938690.tif 000043
を含み、アルキン含有電荷タグと反応して、例えば以下を生成した：
【化４１】
0006938690.tif 000044
【０１６０】
あるいは、以下のようなＮＰＰ含有メチルテトラジン
【化４２】
0006938690.tif 000045
をＴＣＯ含有電荷タグと反応させて、以下を形成した：
【化４３】
0006938690.tif 000046
【０１６１】
他の例では、ＮＰＰと電荷タグの間のＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリーを使用して、以下のような化合物を形成した：
【化４４】
0006938690.tif 000047
【０１６２】
他の例では、ヌクレオチドまたは電荷タグ上のマレイミド基を、電荷タグまたはヌクレオチド上のチオール基とそれぞれ反応させて、マレイミド−チオール反応を介して当該２つを連結することができる。
【０１６３】
マレイミド基を含むＮＰＰまたは電荷タグ
【化４５】
0006938690.tif 000048
は、（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）などの還元剤の存在下で、チオール含有基を含む電荷タグまたはＮＰＰとそれぞれ反応し、例えば当該２つの間の共有結合
【化４６】
0006938690.tif 000049
を生成した。
【０１６４】
表２に示すように、様々な銅塩、リガンド、添加剤、溶媒、反応時間、および反応温度が、異なる銅アシストクリックケミストリーのために使用され得る。
【０１６５】
【表２】
0006938690.tif 000050
【０１６６】
見てわかるように、一般的に言えば、高Ｃｕローディングでは、反応は完了するまで進行し得るが、収率は低い。対照的に、低Ｃｕローディングでは、反応が完全に完了するまで進行しない可能性があるが、収率はより高くなり得る。中間のＣｕローディングでは、反応は完了するまで進行し得、反応生成物はＨＰＬＣによって８６％の収率で単離され得る。
【０１６７】
ホスホジエステルベースの電荷タグ修飾ヌクレオチドの取り込みが実証されている。取り込みは、ｐｈｉ２９（およびそのバリアント）およびＫｌｅｎｏｗフラグメントなどの異なるポリメラーゼ、または合成によるシークエンシングプロセスで使用されるその他のものを用いて実施され得る。両方のポリメラーゼは、電荷タグを正常に（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ）取り込むことができる。この例についてのｐｈｉ２９による取り込みを図１１に示す。この例では、鋳型に基づくプライマーへの単一ヌクレオチドの取り込みのために、一本鎖ＤＮＡ鋳型ポリヌクレオチド配列を重合基板に固定し、そのような鋳型配列の一部に相補的な１００ｎＭの５’−Ｃｙ５標識化ＤＮＡプライマー（２２ｍｅｒ）、１μＭのｐｈｉ２９、および１０μＭの所定のヌクレオチドを含む緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ）とインキュベートした。（プライマーに相補的な部分のすぐ５’側（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ５’）の鋳型鎖上のアデノシン残基に相補的な）電荷タグ付きチミジンの５’取り込みを可能にするために、３０℃で様々な期間インキュベーションした後、ポリメラーゼ反応はクエンチされ、プライマーは脱ハイブリダイズされて単一ヌクレオチドの取り込みの検出のためにゲル上で分離された。デオキシリボ−チミジン５’−ヘキサホスフェート（ｄＴ６Ｐ）間の結合は、Ｔ５、Ｔ１０、およびＴ１５を含んでおり、Ｔ５、Ｔ１０、およびＴ１５は、電荷タグとして示されたリピートのチミジンヌクレオチドを有していた；Ｔ５、Ｔ１０、およびＴ１５はクリックケミストリーを介して付着され、Ｔ５−Ｔｅｔはテトラジン−ＴＣＯライゲーションを介して付着される。Ｃ３スペーサー（Ｃ３）およびｄスペーサー（ｄ）オリゴは、ＴＣＯ−テトラジンライゲーションを介して付着される電荷タグとしても用いられた。ＴＭＲは、以下の式を有するテトラメチルローダミン標識化ｄＴ６Ｐであり、
【化４７】
0006938690.tif 000051
ｄＴＴＰは、コントロールとして機能する、電荷または標識のないデオキシチミジントリホスフェートである。
【０１６８】
図１１を参照すると、１１１０、１１２０、および１１３０は、それぞれ、ｄＴＴＰ、Ｔ１０、またはＴ５の取り込み割合（％）を個別に表し（図１１では、それらのプロットは互いにオーバーラップしているため、互いにほとんど区別できない）、１１４０はＴ１５による取り込みを表し、１１５０はＴ５−Ｔｅｔによる取り込みを表し、１１６０、１１７０、および１１８０は、それぞれ、ＴＭＲ、ｄ、およびＣ３の取り込み割合（％）を個別に表す（図１１では、それらのプロットは互いにオーバーラップしているため、互いにほとんど区別できない）。
【０１６９】
本開示に従ってペプチド電荷タグを有するヌクレオチドアナログを合成するために使用される合成スキームの非限定的な例を以下に示す：
【化４８】
0006938690.tif 000052
【０１７０】
別の例では、上記のような正に荷電したリジン残基ではなく、以下のような負に荷電したアミノ酸を有する電荷タグを合成するために、同等の（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）スキームが使用された：
【化４９】
0006938690.tif 000053
【０１７１】
当業者には明らかであるように、このスキームの多くのバリエーションが、本開示の教示に沿って可能である。例えば、上記の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸のいずれかを含む、リジン以外のアミノ酸が使用され得、それらはこの例に示されるペプチド荷電タグの長さよりも多くても少なくてもよい。したがって、異なる価数および大きさの電荷を有するペプチド電荷タグが使用され得る。
【０１７２】
更に、異なる反応基がヌクレオチドアナログの５’末端に付加され得、例えば、以下のような追加の非限定的な例の異なるタイプおよび長さのリンカー部分を有する：
【化５０】
0006938690.tif 000054
【０１７３】
これらの付加は、非限定的な例として、以下のような様々なタイプおよび長さのリンカーが付加されたアジドまたはメチルテトラジン反応基を含む様々な反応基を有するヌクレオチドアナログを生成し得る：
【化５１】
0006938690.tif 000055
【０１７４】
更に他の例では、アルキン、ＴＣＯ、またはＤＢＣＯ基、またはチオール基が同様に追加された。次に、対応する反応基をペプチド電荷タグに追加して、上記のクリックケミストリーもしくはライゲーションケミストリー、または当業者に知られている他のものによって、当該２つを結合することができる。ペプチドベースの電荷タグは、固相ペプチド合成用のフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基ケミストリーを使用して合成することができる。オルソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）な「ハンドル」反応基を末端で（ａｔ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）ペプチド合成に導入して、ヌクレオチドまたは核酸への結合を可能にすることができる。オルソゴナルケミストリー法は、アジド−アルキン銅アシストクリック反応、ＤＢＣＯおよびアジドを用いた銅フリークリックケミストリー、およびＴＣＯ−テトラジンライゲーションを含む。システインのチオールなどのアミノ酸の反応性側鎖も、チオール−マレイミドケミストリーにおいて使用することができる。
【０１７５】
異なるｐＫａを有する側鎖を含むアミノ酸が利用できることで、異なるｐＨで荷電するペプチド電荷タグも可能になる。例えば、ヒスチジンはｐＫａ＝６．０４を有し、リジンはｐＫａ＝１０．５４の側鎖を有する。したがって、中性のｐＨでは、リジンのみが荷電している。これにより、バッファー環境のｐＨを変更することで、電荷数および電荷密度の更なる調製も可能になる。
【０１７６】
更に、ペプチドおよびＰＮＡの両方が同じ固相ペプチドケミストリーで合成されるため、ペプチド電荷タグをペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーに容易に付加することができる。これは、ペプチド電荷タグの特性をさらに変更するため、または電荷タグのアソシエーション特性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を核酸ベースリンカーなどのリンカーに追加するために使用される。
【０１７７】
デンドロン電荷タグの合成に使用される化合物の例、および末端構成繰り返し単位ごとの対応する電荷は、以下を含む：
【化５２】
0006938690.tif 000056
【０１７８】
これらの例では、個々の構成繰り返し単位の分岐点と自由末端との間の異なる潜在的ステム長と同様に、異なる反応基がデンドロンの自由原子価末端に示されるが、これらは単なる非限定的な例である。
【０１７９】
以下のスキームは、可能なデンドロン電荷タグ構造の例示的な例を提供する：
【化５３】
0006938690.tif 000057
【０１８０】
例えば、アミド結合と（Ａ）末端カルボン酸または（Ｂ）末端アミノ基とを有するデンドロン；ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）結合と（Ｃ）末端カルボン酸または（Ｄ）末端アミノ基とを有するデンドロン；および、エステル結合と（Ｅ）末端カルボン酸または（Ｆ）末端アミノ基とを有するデンドロンが示されている。
【０１８１】
一般的に、デンドロン電荷タグは、以下の代表的なスキームに従って、分岐的合成法または収束的合成法によって合成され得る。
【化５４】
0006938690.tif 000058
【０１８２】
分岐的合成（Ａ）では、デンドロンは、通常はマイケル付加の反復により、一連のコアから外向きに拡張する反応により組み立てられる。収束的合成（Ｂ）では、デンドロンは一連の周辺から内向きの構築反応によって構築され、最終的にコアに付着される。
【０１８３】
本開示によるそのような分岐的合成スキームのいくつかの例は、以下の通りであった：
【化５５】
0006938690.tif 000059
【０１８４】
これらの例では、メタクリレート基は、マイケル付加によりアルキンステムに付加され、その後、アセチル基の脱保護によりカルボン酸基が形成されるか、またはエチレンジアミンの付加によりアミノ基が形成された。マイケル付加の繰り返しサイクルにより、前世代と比較して２倍の数の末端官能基を有するデンドロンの連続的生成がもたらされた。追加の世代が付加され得、別の反応基がステム／自由原子価末端に使用され得る。いくつかの例では、タグによって運ばれる電荷を増やすために、前述の合成スキームに従って追加の１世代以上が繰り返し追加され得る。電荷の価数は、正または負に帯電したアミノ酸を末端基に取り込むことにより変更され得る。図１８Ａおよび図１８Ｂに例が示されている。両方の非限定的な例において、末端がシステイン残基の（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ）電荷タグが示されており、本明細書に開示されるような他のケミストリーも例として意図されているが、当該電荷タグは本明細書に開示されるようなヌクレオチドを帯電させるためにリンカー部分に連結され得る。図１８Ａでは、２、３、または４の分岐に続く末端基のための正に帯電したリジン残基は、異なる末端電荷の大きさをもたらす。あるいは、図１８Ｂに示すように、グルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸は、様々な世代の分岐後に末端基を形成することができ、ここでも異なる大きさの末端電荷を生成する。
【０１８５】
別の例では、電荷タグ内の１つ以上のリジン残基はメチル化（例えば、トリメチル化）されていてもよい。非メチル化リジンとは異なり、トリメチル化リジンの電荷はｐＨ依存性ではない。
【０１８６】
自由原子価末端にＤＢＣＯを有する別の例は、以下の通りである：
【化５６】
0006938690.tif 000060
【０１８７】
デンドロン電荷タグおよびそれらの合成のためのアミドベースおよびＰＰＩデンドロン設計のいくつかの例は、以下を含む：
【化５７】
0006938690.tif 000061
【０１８８】
例Ｃ−１およびＣ−２に含まれる第４級アンモニウム基のいくつかの利点は、それらがｐＨの影響を受けないかもしれず、金属を配位しないかもしれず、合成中およびハンドリング中にポリ（ビニルホスホン酸）（ＰＶＰＡ）に付着する可能性がより低いかもしれないことである。
【０１８９】
別の例では、３度までの分岐を有する構成繰り返し単位が使用され得る。更なる例では、分岐的合成（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）ではなく、収束的合成（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が使用され得る。３度の分岐を有する単位を使用する利点は、２度の分岐しか有さない単位を備えるデンドロンと比較して、世代ごとにより多くの電荷を付加し得、所定の有利な電荷を達成するために必要とされる世代数が少なくなることである。一例は以下の通りであった：
【化５８】
0006938690.tif 000062
【０１９０】
この例では、構成繰り返し単位は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で官能化されている。その後、
【化５９】
0006938690.tif 000063
ＤＢＣＯ基が付加され得、アセチル基の脱保護によりカルボン酸基が形成される。得られた化合物は、この場合、−３の電荷を有する。その次の反応で、以下のように、９の電荷を与えるために、上記の化合物Ａが第２世代のデンドロン中に加えられた：
【化６０】
0006938690.tif 000064
【０１９１】
上記の手順を繰り返し組み合わせることにより、以下の例による収束的合成を介して、３つの第２度デンドロン（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｇｒｅｅ  ｄｅｎｄｒｏｎｓ）を組み合わせて、−２７の電荷を有する第３世代デンドロンを作製することができる：
【化６１】
0006938690.tif 000065
【０１９２】
負に帯電したカルボン酸基を有するデンドロンは、以下のように、正に帯電したアミン基を有するデンドロンに変換された：
【化６２】
0006938690.tif 000066
【０１９３】
別の例では、以下のスキームに従って、カルボン酸基はアミン基に変換された：
【化６３】
0006938690.tif 000067
【０１９４】
＋９の電荷を有する第２世代については、以下のスキームが使用され得る：
【化６４】
0006938690.tif 000068
【０１９５】
そして、以下のように、＋２７の電荷を有するデンドロンを生成するために、第３世代デンドロンが収束的合成スキームにより合成され得る：
【化６５】
0006938690.tif 000069
【０１９６】
限定されることなく上記の例のいずれかを含み得る本開示に従って合成されたデンドロンの自由原子価末端の反応基に応じて、電荷タグデンドロンのヌクレオチドアナログへのライゲーションを可能にするために、対応する対の反応基をヌクレオチドアナログに付加し得る。上記によれば、−３２、−２７、−１６、−９、−８、−４、−３、−２、＋２、＋３、＋４、＋８、＋９、＋１６、＋２７、および＋３２を含む広範囲の電荷がヌクレオチドアナログに含まれ得る。前述の非限定的な例示的合成スキームに例示されたもの以外の荷電官能基も使用され得る。
【０１９７】
いくつかの例では、そのような分岐構造を使用して、複数のホスホジエステルベースの電荷を電荷タグに付加することができる。例えば、ポリヌクレオチドの一本直鎖または本明細書に開示される他のホスホジエステル含有電荷ではなく、例えば本明細書に示されるデンドロン構造による分岐構造は、末端基としてヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に開示されるデンドロン構造に従ってそのようなホスホジエステル含有タグの連続した世代での分岐を基にすることにより、複数のポリヌクレオチドまたは他のホスホジエステルベースの電荷を組み合わせて、単一の電荷タグにすることができる。例えば、図１７Ａおよび図１７Ｂに示すようなデンドロンベースの構造。図１７Ａは、３つのポリＴ配列を組み合わせて単一のタグにしたタグの一例を示し、本明細書に開示される方法に従って式Ｉの化合物に取り込むことができる。この例では、タグは−３０の電荷を有する。図１７Ｂは、ホスホジエステル含有タグを組み合わせて所定の電荷（この例では−３０）を生成するいくつかの方法を示す：３０のホスホジエステル電荷の線形配列、３つの１０のホスホジエステル配列を末端に有する（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）三重分岐構造、または三重に２回分岐し６つの５のホスホジエステル配列を末端に有する（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）構造。最初の例と比較して最後の例のように分岐が増加する利点は、伝導性チャネルから離れて延びる単一の引き延ばされた（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）配列とは対照的に、互いに近接した短い荷電配列の濃度が高くなり、電荷密度が高くなり得ることである。
【０１９８】
別の例では、電荷は、電荷タグのスペルミンベース（ｓｐｅｒｍｉｎｅ−ｂａｓｅｄ）コンポーネントによって提供され得る。例えば、スペルミンベースのオリゴカチオン性電荷がヌクレオチドに付加され、本開示による電荷タグとして正電荷を提供し得る。オリゴ−スペルミンコンジュゲートは、ｐＨ７で約２．５のプロトン化アミンを有する。そのような電荷タグ付きヌクレオチドの例は、図１９Ａおよび図１９Ｂに示されている。図１９Ａは、本開示の一態様によるオリゴ−スペルミンコンジュゲートの例を示し、図１９Ｂは、電荷タグの末端に置くことができる電荷の量を大きくするためのスペルミン由来（ｓｐｅｒｍｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ）末端基を有するデンドロン構造化タグを示す。両方の例において、電荷タグをヌクレオチドに付着させるための本明細書に開示のケミストリーは、本開示の態様に従って、そのようなスペルミン由来電荷タグをヌクレオチドに付着させるために当業者によって適合され得る。
【０１９９】
以下の非限定的な例は、デンドロン電荷タグへのオーソゴナル結合ケミストリー（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を可能にするための、様々なリンカーによる５’アミノヌクレオチドヘキサホスフェートの修飾を示す。５’−アミンデオキシ−チミンヘキサホスフェート（ｄＴ６Ｐ）（または他のＮＰＰ）（１）は、アジド−酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（２ａ）またはメチルテトラジンＮＨＳエステル（２ｂ）で官能化され、アジドｄＴ６Ｐ（３ａ）またはメチルテトラジンｄＴ６Ｐ（３ｂ）をそれぞれ形成し得る（スキーム６）。
【化６６】
0006938690.tif 000070
スキーム６．５’−アミンｄＴ６Ｐの官能化
【０２００】
アジドｄＴ６Ｐ（３ａ）は、ＣｕＳＯ４、トリスヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン（ＴＨＰＴＡ）リガンドおよびアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、銅（Ｉ）アシストアジド−アルキン環化付加（ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＣｕＡＡＣ）を介して、５’−ヘキシニル基を有するポリ−Ｔオリゴヌクレオチド（４）の直鎖にコンジュゲートされ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート（５ａ）を形成し得る。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製を行い、５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）およびアセトニトリルで溶出した。次に、メチルテトラジンｄＴ６Ｐ（３ｂ）は、５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７．４）中で、トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）基を有するデンドロンにコンジュゲートされ、デンドロン電荷タグを有するヌクレオチドアナログを形成し得る。
【０２０１】
あるいは、アジドｄＴ６Ｐ（３ａ）は、５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ  ７．４）中における銅フリーひずみ促進アジド−アルキン環化付加（ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＳＰＡＡＣ）を介して、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）基を有するデンドロン電荷タグにコンジュゲートされ、デンドロン電荷タグを有するヌクレオチドアナログを形成し得る。
【０２０２】
以下のスキームでは、ヌクレオチドポリホスフェートを電荷タグ、例えばその自由原子価末端にアルキン基を有するデンドロン電荷タグに連結させるために、アジド−アルキンクリック反応が実施され得る：
【化６７】
0006938690.tif 000071
【０２０３】
当業者によって理解されるように、ライゲーション反応またはクリックケミストリー反応の各反応基の配置を逆にすることなどにより、前述の例は変更され得、前述の結合を生じるが、アナログヌクレオチドの５’および３’末端に関して逆向きに配向されている。
【０２０４】
反応基およびリンカーケミストリー（ｌｉｎｋｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）は、本開示による様々な適用可能なケミストリーに従って、ヌクレオチドおよび電荷タグに付加され得る。いくつかの非限定的な例では、アジドまたはメチルテトラジンテール（ｔａｉｌ）は、適切なＮＨＳ残基との反応によってアミノ化ＮＰＰに付加され得、当該ＮＨＳ残基はＰＥＧ４リンカーなどの様々な長さのリンカー部分、または様々な長さのＰＥＧリンカーを含み得る。そのような合成スキームの非限定的な例は、以下およびそのバリエーションを含む：
【化６８】
0006938690.tif 000072
【０２０５】
アジドまたはメチルテトラジン反応基を付加するために、様々なリンカー長を有する異なるＮＨＳ部分が使用され得る。非限定的な例は以下を含む：
【化６９】
0006938690.tif 000073
【０２０６】
クリックまたはライゲーション化学反応用の異なる反応基を用いて様々なＮＰＰを形成し、それらを電荷タグと共有結合させることができる。いくつかの非限定的な例は、以下を含み、それらはアルキン含有電荷タグ、例えばその自由原子価末端にアルキン基を有するデンドロン電荷タグと反応させることができる：
【化７０】
0006938690.tif 000074
【０２０７】
あるいは、以下のようなＮＰＰ含有メチルテトラジンは、ＴＣＯ含有電荷タグ、例えばその自由原子価末端にＴＣＯ基を有するデンドロン電荷タグと反応させることができる：
【化７１】
0006938690.tif 000075
【０２０８】
他の例では、ＮＰＰとデンドロン電荷タグの間のＤＢＣＯ−アジドクリックケミストリー（ＤＢＣＯ−ａｚｉｄｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が使用され得る。他の例では、以下のようなヌクレオチドまたはデンドロン電荷タグ上のマレイミド基を、それぞれ電荷タグまたはヌクレオチド上のチオール基と反応させ、マレイミド−チオール反応を介して当該２つを連結し得る：
【化７２】
0006938690.tif 000076
【０２０９】
（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）などの還元剤の存在下で、チオール含有基を含む電荷タグまたはＮＰＰとそれぞれ反応した、マレイミド基を含むＮＰＰまたは電荷タグは、例えば、当該２つの間の共有結合を生成し得る：
【化７３】
0006938690.tif 000077
【０２１０】
高い電荷密度をもたらし得る三次元コンホメーションを有する電荷タグのいくつかの非限定的で例示的な例が、図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５、および図１６に示されている。図１３Ａ〜図１３Ｃは、オリゴヌクレオチド電荷タグを有するヌクレオチドアナログの３つの例を示す。例えば、オリゴヌクレオチド電荷タグは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。また、伝導性チャネル、この場合はナノワイヤ、および当該伝導性チャネルへの機能化された付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、具体的にはアクセプター領域も示されている。アクセプター領域は「Ｇｌｕｅ」として示されている。オリゴヌクレオチド電荷タグは、修飾ヌクレオチドの５’末端から伸びる破線として示されている。電荷タグがとり得る３つの異なるコンホメーションが示されている。例えば、図１３Ａは、認識可能なステムループ構造を示している。そのような構造では、ステム部分に沿ったヌクレオチドは互いに塩基対を形成し、その間にループ部分を残し、この例ではアクセプター領域から離れる方向に配向するように示されている。それにより、オリゴヌクレオチド電荷タグのヌクレオチド間のホスホジエステル結合由来の負電荷が互いに近接して維持され得、それらが線形の伸長されたコンホメーションをとる場合に得られるよりも高い電荷密度が維持される。
【０２１１】
例えば、図１３Ｂは、ステムループ構造ではなく、電荷タグのバルジ領域を示す別の例を示している。この場合、図１３Ａのように、電荷タグは、アクセプター領域への結合が示された特異性領域を含む。ここで、特異性領域は、オリゴヌクレオチドが直線的に引き伸ばされる状況下で空間的に互いに異なる（ｄｉｓｐａｒａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｅａｃｈ  ｏｔｈｅｒ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ）オリゴヌクレオチドのセグメントを含む。しかし、静電引力によって誘導されてアクセプター領域と結合すると、特異性領域の当該部分は互いに接近する。このコンホメーションは、ステムループコンホメーション（図１３Ａ）またはバルジコンホメーション（図１３Ｂ）の採用（ａｄｏｐｔｉｏｎ）と一致しており、何れの場合も電荷タグの電荷密度の増加をもたらす。
【０２１２】
図１３Ｃは、クローバーアーキテクチャをとる電荷タグを示している。ステムループコンホメーションと同様に、中央のハブから伸びるステムは、ワトソン−クリック対結合ルールによって互いに引き付けられたヌクレオチド鎖によって形成され、その間のループによって互いに保持される。中央のハブから放射状に伸びるステムの間に、オリゴヌクレオチドの鎖が接続している。他の例と同様に、電荷タグ内のヌクレオチドの塩基の対結合は、タグが、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の負電荷を一緒に凝縮させるコンホメーションをとるように誘導し、その結果、オリゴヌクレオチドが直線的に引き伸ばされた場合の電荷密度と比較して、電荷密度が増加する。
【０２１３】
オリゴヌクレオチド電荷タグの他の三次元コンホメーションが可能である。ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の負電荷は、ワトソン−クリック塩基対形成のために、高い電荷密度で集合するように誘導され得る。例えば、ＤＮＡオリガミ方法論を使用して、管状、円形、直方体、らせん、凝縮らせん、球状もしくは回転楕円体、または高い電荷密度を生成する他のコンホメーションのオリゴヌクレオチド電荷タグを作製し、様々な３次元形状を採用することができる。
【０２１４】
図１４は、２つの電荷タグの例を示し、一方はオリゴヌクレオチド配列を含み（図１４Ａ、左側）、他方はペプチド核酸配列およびポリペプチドに加えてそのような配列を含む（図１４Ｂ、右側）。これらの電荷タグとヌクレオチドアナログとの間の接続は示されていないが、そのような付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）は、例えば、本明細書に開示されているまたは他の既知のケミカルリンキング（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｎｋｉｎｇ）技術によって実行され得る。左側の図１４Ａのコンホメーションは十字形である。４つのオリゴヌクレオチド配列は、（ＤＮＡ組換えイベント中に生じ得るような）Ｈｏｌｉｄａｙ構造に似たコンホメーションで一緒に結合している。図１４Ａに示すように、４つのポリヌクレオチドの部分は、ワトソン−クリック塩基対形成に従って互いに結合している。各オリゴヌクレオチドはまた、対結合した中央部分から一本鎖オーバーハングに伸びている。対結合は、オリゴヌクレオチド内のホスホジエステル結合の負電荷を互いに近接して保持し、電荷密度を増加させる。
【０２１５】
右側の図１４Ｂでは、ペプチド核酸およびポリペプチド配列が図１４Ａに示される電荷タグに付加され、電荷タグの別の非限定的な例をもたらす。この例では、ペプチド核酸の４つの配列はそれぞれ、その末端でポリペプチド配列を接続する。ポリペプチド配列は、当該ポリペプチド内の一部のアミノ酸間の静電引力のためにらせん構造（ｈｅｌｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する。しかしながら、これらの例では、（らせん構造の形成をアシストするいくつかの負に帯電したアミノ酸が含まれているにもかかわらず）ポリペプチドは正味の正電荷を有する。ポリペプチドのペアを接続するペプチド核酸配列の部分も、塩基対コアから伸びるポリヌクレオチドの一本鎖部分にハイブリダイズする。ペプチド核酸と正に帯電したポリペプチドの巻き締められた（ｔｉｇｈｔｅｎｅｄ）コイルコンホメーションとの間の強い結合は、高い電荷密度を有する電荷タグの正味の正電荷を可能にする。同様のアーキテクチャをとる電荷タグの他の例は、正味の負電荷を有し得る。
【０２１６】
図１５は、ポリペプチド電荷タグのいくつかの例を示し、ポリペプチドは高い電荷密度をもたらす異なる三次元アーキテクチャをとる。ポリペプチドのコイル部分（ｃｏｉｌｅｄ  ｐｏｒｔｉｏｎｓ）は、リンカー配列によって接続され得る。リンカー配列がかなり短い場合、コイル構造はほぼ全体的に線形のアレイ（ｒｏｕｇｈｌｙ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｌｉｎｅａｒ  ａｒｒａｙ）で互いに結合し得る。そのようなコンホメーションは、ポリペプチド内の正に帯電したアミノ酸と負に帯電したアミノ酸の間の静電引力のために可能である。しかしながら、全体として、ポリペプチド電荷タグは正味の正電荷または正味の負電荷を有し得る。しかしながら、電荷タグのポリペプチドのコイル部分間のリンカーが長くなると、低減された立体障害により、隣接するコイル部分間のより大きなベンド（ｂｅｎｄｉｎｇ）が可能になり、例えば図１５の下部に示すようなより複雑なアーキテクチャの採用が可能になる。これらの可能性は、さらに高い電荷密度をもたらし得る。図１４Ａおよび図１４Ｂに示される例と同様に、これらの例示的な電荷タグは、ヌクレオチドアナログ（示されていない）に付着させることができる。
【０２１７】
図１６は、コイルドコイルアーキテクチャをとるポリペプチド電荷タグの例を示し、ヘリックス内のアミノ酸間および異なるヘリックスのアミノ酸間の静電引力は、ポリペプチドが凝縮構造を形成するように誘導することができる。その結果、コイルドコイルは正味の負電荷または正味の正電荷を有し得、当該正味の電荷は、（ポリペプチド配列が直線的に引き伸ばされた場合の電荷密度と比較して）高い電荷密度で一緒に保持される。
【０２１８】
ヌクレオチドアナログを電荷タグに付着させるための上記のクリックケミストリーもしくはライゲーションケミストリーのいずれか、または共有結合を形成するための他のケミストリーを使用して、前述の電荷タグのいずれかをヌクレオチドアナログに付着させることができる。
【０２１９】
したがって、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、またはその両方を含む電荷タグは、ペプチド核酸の有無にかかわらず、直線的に引き伸ばされた線形電荷タグと比較して、より高い電荷密度を有する異なる三次元アーキテクチャをとるように作製され得る。電荷タグは、正電荷に比べて過剰のホスホジエステルまたは負のアミノ酸を含む場合などに正味の負電荷を有し得、または負に帯電した基よりも多くの正に帯電したアミノ酸を有する場合などに正味の正電荷を有し得る。コイルドコイルは、アミノ酸成分間の十分に特徴付けられた分子相互作用に基づいて、特定のコンパクト構造をとるように計算的に設計することができる。使用し得るコイルドコイルの例は、ロイシンジッパーを含み、当該ロイシンジッパーは、例えば、長さおよび直径が制御された二量体または三量体の形態であり得る。更に、コイルドコイルのコンパクト構造を支配する相互作用が内部に局在化するため、その表面は、広範囲の電荷を担持するように独立して設計され得る。
【０２２０】
本明細書で開示される電荷タグは、−２００ｅ〜＋２００ｅ、または−１００ｅ〜＋１００ｅ、または−４０ｅ〜＋４０ｅ、または−２０ｅ〜＋２０ｅ、またはそれらの中の任意の範囲内の電荷を有し得る。いくつかの例では、電荷タグの正味電荷または部分正味電荷は、−２００ｅ／ｎｍ３〜＋２００ｅ／ｎｍ３、または−１００ｅ／ｎｍ３〜＋１００ｅ／ｎｍ３、または−４０ｅ／ｎｍ３〜＋４０ｅ／ｎｍ３、または−２０ｅ／ｎｍ３〜＋２０ｅ／ｎｍ３、またはそれらの中の任意の範囲内の密度にパックされ得る。
【０２２１】
本明細書に開示される技術のいくつかの例では、コンピュータ可読命令を記憶する１つ以上のコンピュータ可読記憶装置またはメモリであって、当該コンピュータ可読命令はコンピュータによって実行されると、当該コンピュータに本明細書に開示された方法の少なくともいずれか１つを実行させる。いくつかの例では、システムは、本明細書に開示される方法のいずれか１つの少なくとも一部を実行するように構成される。いくつかの例では、システムは、コンピュータ可読命令を格納するコンピュータ可読記憶装置またはメモリに結合され、当該コンピュータ可読命令は、実行されると、当該システムに本明細書に開示される方法の少なくともいずれか１つを実行させる。
【０２２２】
特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびＷｅｂページを含むがこれらに限定されない、本出願で引用されたすべての文献および類似資料は、そのような文献および類似資料の形式に関係なく、参照によりその全体が明示的に援用される。援用された文献および類似の資料の１つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含むがこれらに限定されない点で、本出願と異なるかまたは矛盾する場合、本出願が支配する（ｃｏｎｔｏｒｌ）。
【０２２３】
前述の概念および以下でより詳細に議論される追加の概念のすべての組み合わせは、（そのような概念が相互に矛盾しないという条件で）本明細書に開示される発明の主題の一部として企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる特許請求の範囲に記載される主題（ｃｌａｉｍｅｄ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｍａｔｔｅｒ）のすべての組み合わせは、本明細書に開示される本発明の主題の一部として企図される。また、参照により援用される任意の開示にも現れ得る、本明細書で明示的に使用される用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味を与えられるべきであることも理解されたい。
【０２２４】
本明細書全体にわたる「一例」、「別の例」、「例」などへの言及は、当該例に関連して説明される特定の要素（例えば、機能、構造、および／または特性）が本明細書で説明される少なくとも１つの例に含まれ、かつ他の例に存在する場合も存在しない場合もあることを意味する。加えて、文脈がそうではないことを明確に指示しない限り、任意の例について説明した要素は、様々な例において任意の適切な方法で組み合わせれ得ることを理解されたい。いくつかの例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解されたい。したがって、前述の説明は非限定的であると見なされるべきである。いくつかの例が本明細書中で詳細に図示および説明されてきたが、本開示の精神から逸脱することなく、様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは、添付の特許請求の範囲で定義される本開示の範囲内にあるとみなされることが当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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