(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性注射剤または注射用凍結乾燥粉剤である、プルサティラサポニンB4、薬学的に許容される賦形剤、および不可避の不純物からなる、注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項２】
静脈内注射剤および/または筋肉内注射剤である、請求項1に記載のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項３】
注射用のプルサティラサポニンB4製剤が水性注射剤であり、薬学的に許容される賦形剤が注射用水であり、水性注射剤中のプルサティラサポニンB4の質量パーセントが0.5％〜5％である、請求項1に記載の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項４】
水性注射剤中のプルサティラサポニンB4の質量パーセントが、2〜3％である、請求項3に記載の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項５】
注射用のプルサティラサポニンB4製剤が注射用凍結乾燥粉剤であり；
薬学的に許容される賦形剤が凍結乾燥賦形剤であり、かつラクトース、スクロース、およびマンニトールからなる群より選択される任意の比率での1種または複数である、請求項1に記載の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項６】
注射用凍結乾燥粉剤中のプルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比が3：10〜3：16である、請求項5に記載の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項７】
注射用凍結乾燥粉剤中のプルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比が3：14である、請求項6に記載の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
【請求項８】
凍結乾燥賦形剤がマンニトールである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の注射用プルサティラサポニンB4製剤。
【請求項９】
溶解、活性炭による脱色、ろ過、最終体積への補充、小分け、および滅菌を含む、請求項3または4で定義されたプルサティラサポニンB4の水性注射剤を調製するための方法。
【請求項１０】
水性注射剤を調製するための方法が以下：
処方量のプルサティラサポニンB4を取り、正確に計量し、注射用水の一部を加え、撹拌してプルサティラサポニンB4を完全に溶解し、次に、該溶液に水性注射剤の総質量に基づいて0.1％〜0.5％の活性炭を加え、沸騰するまで加熱し、15分間撹拌し、注射用水を補充して最終体積とし、十分に混合し、0.22μmの微孔性フィルター膜で熱いうちにろ過して活性炭を除去し、それにより中間溶液を得、小分けし、滅菌して水性注射剤を得ること
である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
中間溶液の調製および凍結乾燥の工程を含む、請求項5〜8のいずれか一項で定義されたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤を調製するための方法。
【請求項１２】
中間溶液の調製工程が以下：
プルサティラサポニンB4を注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、質量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加し、撹拌し、pHを6.0〜8.5に調整し、中間溶液の総質量に基づいて0.05％〜0.1％の活性炭を加え、100℃に加熱して10〜20分間撹拌し、室温に冷却し、プルサティラサポニンB4の濃度が0.5％〜5％になるまで注射用水を追加し、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得ること
である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記凍結乾燥が予備凍結、昇華、および脱着乾燥を含み、予備凍結の温度が−30℃〜−15℃であり、昇華および脱着乾燥段階中の真空圧が0.5〜10Paであり、昇華の温度が−10℃〜0℃であり、脱着乾燥の温度が25℃〜30℃である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
凍結乾燥操作が以下：
中間溶液を小分けし、凍結装置に移し、温度を3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−15℃に下げて、この温度で8〜10時間凍結する；次に、密閉装置に入れ、0.5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの速度で−10℃〜0℃に均一に上げて、この温度で8〜10時間保持し、同じ真空圧下で1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃まで温度を上げて、この温度で4〜6時間保持すること
である、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学的製剤の分野に属し、特に、有効成分としてプルサティラ（Pulsatilla）サポニンB4を含む注射用製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方薬のハクトウオウ（白頭翁）は、キンポウゲ科のヒロハオキナグサ（Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel）の乾燥した根であり、「神農本草経」に最初に記録されており、よく使われている伝統的な漢方薬である。それは、苦味と寒性の性質があり、清熱解毒、涼血止痢、燥湿殺虫などの機能があり、そして熱毒による血便を伴う赤痢、発熱と悪寒を伴うマラリア、鼻出血、および痔疾出血を治療するために使用されている。現代の薬理学的研究では、ハクトウオウには広範囲の抗菌作用があり、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、赤痢菌（Bacillus dysteriae）、皮膚糸状菌、酵母、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などに対する抑制効果があることが実証されている。ハクトウオウの抗腫瘍効果もまた、研究のホットスポットである。さらに、ハクトウオウには抗炎症および免疫増強の機能もある。
【０００３】
ハクトウオウは、トリテルペノイドサポニンが豊富である。プルサティラサポニンB4は、式1の構造を持つルピン型の五環式トリテルペノイドサポニンに属する。
0006947924.tif 000002
【０００４】
プルサティラサポニンB4には強い活性がある。例えば、中国特許公開第CN105213410A号（特許文献1）（公開日：2016年1月6日）は、炎症性因子の過剰発現により引き起こされる急性腎障害、急性肝障害および急性肺障害を含む急性炎症の治療における免疫調節剤としてのプルサティラサポニンB4の使用を開示している。別の例として、中国特許公開第CN105535004A号（特許文献2）（公開日：2016年5月4日）は、抗手足口病薬の調製におけるEV71ウイルス阻害剤としての該化合物の使用を開示している。
【０００５】
プルサティラサポニンB4は5つのグリコシル基を持ち、水溶性に優れている。研究からは、該化合物を（例えば、動物実験において強制栄養法により）経口投与すると、有効用量が高くなり、安全域が狭くなることが示されている。したがって、臨床医学的ニーズを満たすには、安全な用量範囲で積極的役割を促進するためにプルサティラサポニンB4の非経口製剤を開発する必要がある。しかしながら、これまで、プルサティラサポニンB4注射剤に関する報告は存在していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許公開第CN105213410A号
【特許文献２】中国特許公開第CN105535004A号
【発明の概要】
【０００７】
従来技術の欠点を克服するために、本発明は、プルサティラサポニンB4の注射用製剤を提供する。該製剤は安定しており、調製が容易である。経口投与と比較して、シスプラチン誘発性腎損傷を治療するためのプルサティラサポニンB4注射用製剤の有効用量は20倍（20分の1）に減少し、それにより薬物安全性が向上する。したがって、この製剤は、腎損傷および腎不全の臨床治療に新しい選択肢を提供することが期待できる。
【０００８】
前述の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供する。
【０００９】
プルサティラサポニンB4の注射用製剤は、プルサティラサポニンB4と薬学的に許容される賦形剤とを含み、該製剤は水性注射剤または注射用凍結乾燥粉剤である。
【００１０】
好ましくは、プルサティラサポニンB4注射用製剤は、プルサティラサポニンB4、薬学的に許容される賦形剤、および不可避の不純物からなる。
【００１１】
好ましくは、プルサティラサポニンB4注射用製剤は、筋肉内注射剤および/または静脈内注射剤であり、より好ましくは静脈内注射剤である。
【００１２】
好ましくは、プルサティラサポニンB4注射用製剤は水性注射剤であり、その場合、薬学的に許容される賦形剤は注射用水である。
【００１３】
好ましくは、水性注射剤中のプルサティラサポニンB4の質量パーセントは0.5％〜5％、より好ましくは2〜3％である。
【００１４】
本発明はまた、溶解、活性炭による脱色、ろ過、最終用量になるまでの補充、小分け、および滅菌を含む、水性注射剤の調製方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、水性注射剤を調製するための具体的な方法は以下のとおりである：
処方量のプルサティラサポニンB4を取る；正確に計量する；注射用水の一部を加える；撹拌してプルサティラサポニンB4を完全に溶解する；次に、該溶液に水性注射剤の総質量に基づいて0.1％〜0.5％の活性炭を加える；加熱して沸騰させ、15分間撹拌する；最終用量になるまで注射用水を補充する；十分に混合する；0.22μmの微孔性フィルター膜で熱いうちにろ過して活性炭を除去し、それにより中間溶液を得る；小分けし、滅菌して水性注射剤を得る。
【００１６】
水性注射剤の調製方法において、小分けおよび滅菌操作は、当技術分野の従来の方法に従って実施される。例えば、滅菌操作は、高圧蒸気滅菌、115℃で30分の滅菌、または121℃で15分の滅菌であり得る。
【００１７】
より好ましくは、本発明によるプルサティラサポニンB4注射用製剤は注射用の凍結乾燥粉剤であり；薬学的に許容される賦形剤は、ラクトース、スクロース、およびマンニトールからなる群より選択される1種または複数（任意の比率）の凍結乾燥賦形剤である。
【００１８】
好ましくは、注射用凍結乾燥粉剤中のプルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比は3：10〜3：16である。
【００１９】
より好ましくは、注射用凍結乾燥粉剤中のプルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比は3：14である。
【００２０】
さらに好ましくは、凍結乾燥賦形剤はマンニトールである。
【００２１】
本発明はまた、中間溶液を調製して凍結乾燥する工程を含む、注射用凍結乾燥粉剤の調製方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、中間溶液の具体的な調製方法は以下のとおりである：
プルサティラサポニンB4を注射用水に溶解する；撹拌して溶解する；質量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加する；撹拌する；pHを6.0〜8.5に調整する；中間溶液の総質量に基づいて0.05％〜0.1％の活性炭を加える；100℃に加熱して10〜20分間撹拌する；室温に冷却する；プルサティラサポニンB4の濃度が0.5％〜5％になるまで注射用水を追加する；0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得る。
【００２３】
より好ましくは、中間溶液の具体的な調製方法は以下のとおりである：
プルサティラサポニンB4を注射用水に溶解する；撹拌して溶解する；質量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加する；撹拌する；pHを6.5〜8.0に調整する；中間溶液の総質量に基づいて0.05％の活性炭を加える；100℃に加熱して10〜20分間撹拌する；室温に冷却する；プルサティラサポニンB4の濃度が2％〜3％になるまで注射用水を追加する；0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得る。
【００２４】
好ましくは、中間溶液の凍結乾燥は、予備凍結、昇華、および脱着乾燥を含む。予備凍結の温度は−30℃〜−15℃である；昇華および脱着乾燥段階中の真空圧は0.5〜10Paである；昇華の温度は−10℃〜0℃である；脱着乾燥の温度は25℃〜30℃である。
【００２５】
より好ましくは、昇華および脱着乾燥段階中の真空圧は5〜10Paである。
【００２６】
より好ましくは、昇華の温度は−10℃である。
【００２７】
好ましい実施態様として、具体的な凍結乾燥操作は以下のとおりである：
中間溶液を小分けして、凍結装置に移す；3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で温度を−30℃〜−15℃に下げて、この温度で8〜10時間凍結する；次に、密閉装置に入れ、0.5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの速度で−10℃〜0℃に均一に上げて、この温度で8〜10時間保持する；同じ真空圧下で1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃まで温度を上げて、この温度で4〜6時間保持する。
【００２８】
より好ましい実施態様として、具体的な凍結乾燥操作は以下のとおりである：
中間溶液を小分けして、凍結装置に移す；3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で温度を−30℃〜−20℃に下げて、この温度で8時間凍結する；次に、密閉容器に入れ、5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの速度で−10℃に均一に上げて、この温度で8時間保持する；同じ真空圧下で1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃まで温度を上げて、この温度で4時間保持する。
【００２９】
本発明はまた、前記調製方法により得られたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、急性腎損傷、慢性腎不全および/または腎機能障害のための薬物の調製における、前記調製方法により得られたプルサティラサポニンB4の注射用製剤、プルサティラサポニンB4の水性注射剤またはプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤の使用も提供する。
【００３１】
本発明の説明における「不可避の不純物」には、少量のプルサティラサポニンB4の分解により生成された物質、およびプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤中の少量の水が含まれる。不可避の不純物が存在しても、その含有量は薬局方の限度規定を満たす必要がある。
【００３２】
本発明によるプルサティラサポニンB4の注射用製剤は、哺乳動物、特にヒトに投与される。該製剤をヒトに投与する場合、体重60kgの成人の1日用量は2〜120mgである。
【００３３】
プルサティラサポニンB4の水性注射剤またはプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤によって、プルサティラサポニンB4の筋肉内注射または静脈内注射が実現され、有効成分がその元の形で循環系に入って、体内の様々な臓器、特に腎臓、肺などに分布できるようになる。これにより、プルサティラサポニンB4はかなり低い用量で効果的に機能することができ、したがって、治療の安全域が広がり、かつ最終的に投薬の安全性が確保される。
【００３４】
プルサティラサポニンB4は良好な水溶性を示し、水性注射剤に簡単に調製することができる；しかし、その安定性は異なる溶媒によって変化するため、水性注射剤の溶媒は詳細に試験および選択する必要がある。
【００３５】
プルサティラサポニンB4自体とその水溶液は、温度と光に敏感である；例えば、プルサティラサポニンB4の水溶液を60℃で14日間放置した後では、プルサティラサポニンB4の純度は0日目の98.90％から93％に低下し、総不純物は0日目の0.64％から0.94％に増加した。プルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤は、その低い水分量が該製剤の安定性により有益であるため、好ましいものである。
【００３６】
しかし、凍結乾燥分散系の複雑さを考慮すると、注射要件を満たす注射用粉剤を効率的かつ迅速に入手することは容易ではない。これまでのところ、凍結乾燥製剤の選択に関する成熟理論はまだ形成されておらず、凍結乾燥挙動および凍結乾燥効果に影響を及ぼし得る様々な要因の単独または共同の考察が必要である。凍結乾燥製剤中の賦形剤およびその他の添加物は有効成分と相互作用し、また、該製剤の組成と濃度は、その系の凍結凝固および昇華脱水挙動、例えば、最大凍結濃縮相のガラス転移温度（乾燥中に崩壊が起こるかどうかを測定するための重要な指標）、最低凍結温度、冷却速度、凍結アニーリング時間など、に大きく影響すると考えられる。さらに、添加剤の種類と濃度は、乾燥段階で費やされる時間および最終産物の特性に大きな影響を及ぼすであろう。本発明では、凍結乾燥賦形剤の種類と量、中間溶液のpH、予備凍結温度、予備凍結方法、昇華温度、真空圧、および脱着乾燥温度などのパラメータを個別にまたは組み合わせて検討して最も好ましいパラメータを取得し、それにより、望ましい外観、良好な再溶解性および安定した品質を備えたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤が得られる。
[本発明1001]
水性注射剤または注射用凍結乾燥粉剤である、プルサティラサポニンB4と薬学的に許容される賦形剤とを含む注射用のプルサティラサポニンB4製剤であって、
好ましくは、プルサティラサポニンB4、薬学的に許容される賦形剤、および不可避の不純物からなる、
注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
[本発明1002]
静脈内注射剤および/または筋肉内注射剤であり、より好ましくは静脈内注射剤である、本発明1001の注射用プルサティラサポニンB4製剤。
[本発明1003]
注射用のプルサティラサポニンB4製剤が水性注射剤であり、薬学的に許容される賦形剤が注射用水であり；
好ましくは、水性注射剤中のプルサティラサポニンB4の質量パーセントが0.5％〜5％、より好ましくは2〜3％である、
本発明1001の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
[本発明1004]
注射用のプルサティラサポニンB4製剤が注射用凍結乾燥粉剤であり；
薬学的に許容される賦形剤が凍結乾燥賦形剤であり、かつラクトース、スクロース、およびマンニトールからなる群より選択される任意の比率での1種または複数であり；
より好ましくは、注射用凍結乾燥粉剤中のプルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比が3：10〜3：16であり；
より好ましくは、注射用凍結乾燥粉剤中のプルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比が3：14である、
本発明1001の注射用のプルサティラサポニンB4製剤。
[本発明1005]
凍結乾燥賦形剤がマンニトールである、本発明1004の注射用プルサティラサポニンB4製剤。
[本発明1006]
溶解、活性炭による脱色、ろ過、最終体積への補充、小分け、および滅菌を含んでなる、本発明1003で定義されたプルサティラサポニンB4の水性注射剤を調製するための方法であって、
好ましくは、水性注射剤を調製するための具体的な方法が以下：
処方量のプルサティラサポニンB4を取り、正確に計量し、注射用水の一部を加え、撹拌してプルサティラサポニンB4を完全に溶解し、次に、該溶液に水性注射剤の総質量に基づいて0.1％〜0.5％の活性炭を加え、沸騰するまで加熱し、15分間撹拌し、注射用水を補充して最終体積とし、十分に混合し、0.22μmの微孔性フィルター膜で熱いうちにろ過して活性炭を除去し、それにより中間溶液を得、小分けし、滅菌して水性注射剤を得ること
である、方法。
[本発明1007]
中間溶液の調製および凍結乾燥の工程を含んでなる、本発明1004または1005で定義されたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤を調製するための方法であって、
好ましくは、中間溶液の具体的な調製工程が以下：
プルサティラサポニンB4を注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、質量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加し、撹拌し、pHを6.0〜8.5に調整し、中間溶液の総質量に基づいて0.05％〜0.1％の活性炭を加え、100℃に加熱して10〜20分間撹拌し、室温に冷却し、プルサティラサポニンB4の濃度が0.5％〜5％になるまで注射用水を追加し、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得ること
であり、
より好ましくは、中間溶液の具体的な調製工程が以下：
プルサティラサポニンB4を注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、質量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加し、撹拌し、pHを6.5〜8.0に調整し、中間溶液の総質量に基づいて0.05％の活性炭を加え、100℃に加熱して10〜20分間撹拌し、室温に冷却し、プルサティラサポニンB4の濃度が2％〜3％になるまで注射用水を追加し、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得ること
である、方法。
[本発明1008]
前記凍結乾燥が予備凍結、昇華、および脱着乾燥を含み、予備凍結の温度が−30℃〜−15℃であり、昇華および脱着乾燥段階中の真空圧が0.5〜10Paであり、昇華の温度が−10℃〜0℃であり、脱着乾燥の温度が25℃〜30℃であり；
より好ましくは、昇華および脱着乾燥段階中の真空圧が5〜10Paであり；
より好ましくは、昇華の温度が−10℃である、
本発明1007の方法。
[本発明1009]
具体的な凍結乾燥操作が以下：
中間溶液を小分けし、凍結装置に移し、温度を3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−15℃に下げて、この温度で8〜10時間凍結する；次に、密閉装置に入れ、0.5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの速度で−10℃〜0℃に均一に上げて、この温度で8〜10時間保持し、同じ真空圧下で1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃まで温度を上げて、この温度で4〜6時間保持すること
であり、
より好ましくは、具体的な凍結乾燥操作が以下：
中間溶液を小分けし、凍結装置に移し、温度を3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−20℃に下げて、この温度で8時間凍結する；次に、密閉装置に入れ、5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの速度で−10℃に均一に上げて、この温度で8時間保持し、同じ真空圧下で1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃まで温度を上げて、この温度で4時間保持すること
である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
本発明1007〜1009のいずれかの方法により調製された、プルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の具体例を参照してさらに説明される。当業者は、これらの具体例が本発明を例示するためにのみ使用され、決して本発明の範囲を限定するためではないことを理解するであろう。
【００３８】
特に明記しない限り、以下の例の実験方法は従来の方法である。特に指定のない限り、以下の例の医薬材料および試薬材料などは市販されている。一部の試薬および原料の供給元は次のとおりである：
プルサティラサポニンB4：自作、HPLCによる純度98％以上；
マンニトール（注射グレード）：F949A，Guangxi Nanning Chemistry & Pharmaceutical有限会社；
グルコース（注射グレード）：P20160118，Beijing Fengli Jingqiu Pharmaceutical有限会社；
スクロース（注射グレード）：ロット番号20150701，J.Tbaker；
注射用水：自作；
磁気撹拌機：IKAモデル：R015PS25；
凍結乾燥機：GZLY-1.0，Beijing Songyuan Huaxing Technology Development有限会社。
【００３９】
以下の実験例および実施例におけるプルサティラサポニンB4の含有量は、以下の方法に従って測定される。
【００４０】
クロマトグラフィー条件
クロマトグラフカラム：C18，250mm×4.6mm，5μm
移動相：アセトニトリル−水（26：74）（体積比）
流量：1.0ml/分
波長：201nm
【００４１】
対照溶液の調製
適量のプルサティラサポニンB4対照サンプルを取り、正確に計量する；10mlメスフラスコに入れる；メタノールを添加して溶解し、目盛りまで希釈する；該溶液を十分に振とうしてろ過し、溶液1mlあたり1mgのプルサティラサポニンB4対照サンプルを含む溶液を得た。
【００４２】
試験溶液の調製
約25mgの試験サンプルを取り、正確に計量する；25mlメスフラスコに入れる；移動相を添加して溶解し、目盛りまで希釈する；該溶液を十分に振とうし、0.22μmの微孔性膜でろ過し、ろ液を採取して試験サンプルを得た。
【００４３】
測定方法
10μlの試験溶液を取り、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録した。
計算式は次のとおりであった：
0006947924.tif 000003
式中：
C対照サンプル − 対照サンプルの濃度（mg/ml）；
S対照サンプル− 対照サンプルの純度；
A対照サンプル− 対照溶液の主ピーク面積；
A試験サンプル − 試験溶液の主ピーク面積。
【実施例】
【００４４】
実験例1  異なる投与経路でのプルサティラサポニンB4の有効性
プルサティラサポニンB4を並行して経口および静脈内投与し、シスプラチン（CDDP）刺激したマウスの血清において、急性腎炎に対する異なる投与経路でのプルサティラサポニンB4の効果を調べた。
【００４５】
1. 実験材料
1.1 動物：ICRマウス，16〜18g，雄，Hunan SJA Laboratory Animal有限会社，許可番号: SCXK(Xiang)2016-0002。
1.2 試薬：シスプラチン，原液5mg/kg，後で使うために、使用前に適量の生理食塩水をシスプラチンに加えて1.5mg/ml溶液に調製した。
1.3 薬物：プルサティラサポニンB4（自作，以下「B4」と呼ぶ），バッチ番号：20161107；デキサメタゾン，0.75g/錠，Anhui Golden Sun Biochemical Pharmaceutical有限会社，バッチ番号：15032521。
薬物は全て、「試験方法」の項の特定濃度の溶液へと再蒸留水を用いて調製し、指示された方法で投与した。
1.4 機器：デスクトップ低速遠心分離機；自動生化学分析装置。
【００４６】
2. 試験方法
2.1 モデル化前の準備：全ての動物に番号を付けて、体重を量った。
2.2 モデル化方法：モデルは15ml/kgのシスプラチンの用量で作製され、正常群のマウスには生理食塩水を腹腔内注射し、他の群のマウスにはシスプラチンを腹腔内注射した。
2.3 グループ分けと投与：動物を1群10〜12匹で7つの群に無作為に分けた：
(1) 正常群：20ml/kg体重の用量で再蒸留水を強制経口投与した；
(2) モデル群：等量の生理食塩水を尾静脈に注射した；
(3) デキサメタゾン陽性群（0.5mg/kg体重）：デキサメタゾン溶液を20ml/kg体重の用量で強制経口投与した；
(4) 静脈内投与によるB4高用量群（5mg/kg体重）：B4溶液を5ml/kg体重の用量で尾静脈に注射した；
(5) 静脈内投与によるB4低用量群（2.5mg/kg体重）：B4溶液を5ml/kg体重の用量で尾静脈に注射した；
(6) 強制経口投与によるB4高用量群（100mg/kg体重）：B4溶液を20ml/kg体重の用量で強制経口投与した；
(7) 強制経口投与によるB4低用量群（50mg/kg体重）：B4溶液を20ml/kg体重の用量で強制経口投与した。
薬物をモデル化当日から4日間連続して投与した。
2.4 指標の検出
最後の投与から0.5時間後に尿を採取し、尿タンパク質を測定した；投与の1時間後に眼球から血液を採取し、マウスの全血を室温に2時間静置し、3500rpm/分で15分間遠心分離し、200μlの上清を自動生化学分析装置で測定して、総タンパク質（TP）、尿素窒素（BUN）およびクレアチニン（Cre）を決定した。
【００４７】
3. 試験結果
各群の様々な指標の検出結果を表1に示した。
【００４８】
（表１）マウスでのシスプラチン誘発性急性腎損傷に対するB4の効果（平均±SD）
0006947924.tif 000004
#：正常群との比較，P＜0.05；*：モデル群との比較，P＜0.05。
【００４９】
表1のデータは、次のことを示していた：
(1) 正常群と比較して、モデル群の血清中の尿タンパク質、尿素窒素（BUN）およびクレアチニン（Cre）のレベルは有意に増加しており（P＜0.05）、これは、該モデルが成功裏に確立されたことを示している。
(2) モデル群と比較して、陽性対照群の尿素窒素（BUN）および尿タンパク質のレベルは有意に減少した（P＜0.05）。
(3) モデル群と比較して、B4を5mg/kg体重で静脈内投与した場合、尿素窒素（BUN）およびクレアチニン（Cre）のレベルは有意に減少した（P＜0.05）。有意差はないものの、尿タンパク質のレベルは下降傾向を示した。
(4) モデル群と比較して、B4を100mg/kg体重で強制経口投与した場合、マウスでは尿素窒素（BUN）レベルのみが有意に減少した（P＜0.05）。
【００５０】
4. 結論
プルサティラサポニンB4は抗シスプラチン誘発性腎損傷を有し、これは、臨床において急性および慢性腎炎ならびに腎不全を治療するための薬物として開発される可能性があることを示している。そして、プルサティラサポニンB4の投与経路はその有効性に重大な影響を及ぼし、5mg/kg体重で静脈内投与されたB4の効果は、100mg/kg体重で強制経口投与されたものよりも強く、シスプラチンにより引き起こされる異常な腎機能の指標を逆転させるが、その用量は少なくとも20倍（20分の1に）減少する。したがって、注射による投与、特に静脈内注射は、プルサティラサポニンB4の有効性と安全性を改善するのに大きな意義がある。
【００５１】
実施例1  プルサティラサポニンB4の水性注射剤
この実施例での100ml水性注射剤の処方は以下のとおりであった：
0006947924.tif 000005
【００５２】
該注射剤を以下の方法により調製した：
処方量のプルサティラサポニンB4を取り、正確に計量し、注射用水の一部（適量）を加えて、磁気撹拌下でプルサティラサポニンB4原料を完全に溶解した。その溶液の全質量に基づいて0.10％の活性炭を該溶液に添加し、100℃の水浴で15分間加熱撹拌し、注射用水で100mlに希釈し、十分に振とうし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して活性炭を除去した。2mlの中間溶液を正確に計量し、5mlアンプルに充填して、115℃で30分間滅菌すると、水性注射剤が得られた。
【００５３】
実験例2  プルサティラサポニンB4の凍結乾燥粉剤のプロセスに関する研究
1.1 原料および賦形剤の適合性試験
プルサティラサポニンB4原料を様々な賦形剤（注射用水、生理食塩水、マンニトール、ラクトース、スクロース、およびグルコース）と1：5（質量）の比率で混合し、高温（60℃と40℃）および照明（4500Lux±500）の条件下に放置した。サンプルを0、7および14日目に採取して、プルサティラサポニンB4の純度および関連物質を調べた。その結果を表2、表3および表4に示した。
【００５４】
（表２）0日目の原料および賦形剤の適合性試験の結果
0006947924.tif 000006
*：APIはプルサティラサポニンB4を表し、以下のAPIも同じ意味を有する。
【００５５】
表2のデータは、原料と賦形剤を含む全ての組成物中のプルサティラサポニンB4の純度が0日目に同等であり、かつ関連物質の含有量に明らかな差異がないことを示していた。
【００５６】
（表３）7日目の原料および賦形剤の適合性試験の結果
0006947924.tif 000007
【００５７】
表3のデータは、プルサティラサポニンB4自体、および様々な賦形剤を含むその組成物が温度と照明に非常に敏感であり、特に高温（60℃）ではその安定性が注射用水、生理食塩水およびグルコースによって影響を受けることを示していた。
【００５８】
（表４）14日目の原料および賦形剤の適合性試験の結果
0006947924.tif 000008
【００５９】
7日目の結果と比較して、プルサティラサポニンB4自体、およびマンニトール、スクロース、ラクトースをそれぞれ含むその組成物の純度は、60℃でさらなる有意な低下を示さず、これは該サポニンが安定している傾向にあることを示していた。しかし、注射用水、生理食塩水、グルコースを含む組成物中のサポニンB4の純度はさらに低下し、これは該サポニンがまだ分解していることを示していた。
【００６０】
原料および賦形剤の適合性試験の結果は、プルサティラサポニンB4と様々な賦形剤との適合性が40℃および照明の条件下でかなり良好であり、関連物質の純度と含有量には明らかな変化がなく、比較的安定であることを示していた。しかし、プルサティラサポニンB4の原料を注射用水、生理食塩水、またはグルコースと60℃で混合した場合には、主な有効成分は様々な程度に分解する。したがって、プルサティラサポニンB4の水性注射剤または注射用凍結乾燥粉剤は、製造、貯蔵、および輸送中に高温に長時間さらされることを避ける必要がある。
【００６１】
1.2 賦形剤の選択
一般的に使用される凍結乾燥賦形剤には、ラクトース、マンニトール、スクロース、およびグルコースが含まれる。プルサティラサポニンB4、マンニトール、ラクトース、グルコース、およびスクロースをそれぞれ表5に示す処方に従って計量し、以下のプロセスを用いて中間溶液を調製し、凍結乾燥した。
【００６２】
プルサティラサポニンB4を適量の注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、凍結乾燥賦形剤を加え、撹拌し、pHを〜7.0に調整した；0.05gの活性炭を加え、この溶液を100℃で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、注射用水を加えて100gとし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得た。2mlの中間溶液を正確に計量し、10mlバイアルに充填し、温度を凍結装置で5.0℃/分の速度で−20℃に下げ、該バイアルをこの温度で8時間凍結させた；その後、凍結乾燥機に移し、5Paの真空圧下で温度を25℃/3hの一定速度で−10℃に上げて8時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃/分の速度で25℃に上げて6時間保持した。
【００６３】
様々な処方から調製された凍結乾燥産物の外観を観察し、同時にプルサティラサポニンB4の純度および関連物質の含有量を調べた。その結果を表6に示した。
【００６４】
（表５）処方例
0006947924.tif 000009
【００６５】
（表６）賦形剤の選択結果
0006947924.tif 000010
【００６６】
表6に示した結果から、賦形剤としてラクトース、スクロースまたはグルコースを使用した場合、凍結乾燥後にプルサティラサポニンB4が異なる程度に分解し、分解の順序はグルコース＞スクロース＞ラクトースであることがわかる。しかし、マンニトールを賦形剤として使用した場合、その含有量および関連物質は大きく変化しなかった。したがって、スクロース、ラクトースまたはマンニトールは凍結乾燥賦形剤として好適であり、マンニトールが最適であった。
【００６７】
1.3 賦形剤の量の選択
プルサティラサポニンB4およびマンニトールをそれぞれ表7に示す処方に従って計量し、以下のプロセスを用いて中間溶液を調製し、凍結乾燥した。
【００６８】
プルサティラサポニンB4を適量の注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、マンニトールを加え、撹拌し、pHを〜7.0に調整した；0.05gの活性炭を加え、この溶液を100℃で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、注射用水を加えて100gとし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得た。2mlの中間溶液を正確に計量し、10mlバイアルに充填し、温度を凍結装置で5.0℃/分の速度で−20℃に下げ、該バイアルをこの温度で8時間凍結させた；その後、凍結乾燥機に移し、5Paの真空圧下で温度を25℃/3hの一定速度で−10℃に上げて8時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃/分の速度で25℃に上げて6時間保持した。
【００６９】
様々な処方から調製された凍結乾燥産物の外観を観察し、プルサティラサポニンB4の純度および関連物質の含有量を調べた。その結果を表7に示した。
【００７０】
（表７）賦形剤の用量選択のための処方例および結果
0006947924.tif 000011
【００７１】
表7に示した結果から、マンニトールの量は多ければ多いほど良いわけではないことがわかり、適切な範囲に制御する必要がある。B4とマンニトールの質量比が3：10〜3：14である場合は、マンニトールの量が増加するにつれてB4の安定性が増加する傾向にある。その後、マンニトールの量がさらに増加すると、凍結乾燥産物中のB4の分解が加速される。したがって、好ましくは、本発明のプルサティラサポニンB4とマンニトールの質量比は3：10〜3：16、最も好ましくは3：14である。
【００７２】
1.4 中間溶液のpH値の選択
プルサティラサポニンB4はpHに比較的敏感であり、その分解度はpH値によって変化する。そのため、プルサティラサポニンB4の分解を異なるpHで調べて、それに応じて最適なpH範囲を選択した。具体的な実験手順は以下のとおりであった。
【００７３】
表7の処方F8に従って、8部のプルサティラサポニンB4とマンニトールをそれぞれ計量した。プルサティラサポニンB4を適量の注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、マンニトールを加え、撹拌し、表8に従ってpHを調整した；0.05gの活性炭を加え、この溶液を100℃で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、100gになるまで注射用水を加え、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得た；2mlの中間溶液を10mlバイアルに充填し、温度を凍結装置で5.0℃/分の速度で−20℃に下げ、該バイアルをこの温度で8時間凍結させた；その後、凍結乾燥機に移し、5Paの真空圧下で温度を25℃/3hの一定速度で−10℃に上げて8時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃/分の速度で25℃に上げて6時間保持した。
【００７４】
その結果を表8に示した。
【００７５】
（表８）異なるpH条件下での結果
0006947924.tif 000012
【００７６】
表8に示した結果から、関連物質の含有量を指標とすると、中間溶液のpH値は好ましくは6.0〜8.5、最も好ましくは6.5〜8.0であることがわかる。
【００７７】
1.5 活性炭の量の選択
主成分に対する活性炭の量と吸着時間の影響を調べた。具体的な手順は以下のとおりであった。
【００７８】
表7の処方F8に従って、3部のプルサティラサポニンB4とマンニトールをそれぞれ計量した。プルサティラサポニンB4を適量の注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、マンニトールを加え、撹拌し、注射用水を加えて100mlとし、pHを〜7.0に調整して、プルサティラサポニンB4の純度を測定した；次に、表8に従って、この溶液に活性炭を加え、100℃で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、該溶液の一部を0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過し、ろ液のpH値とプルサティラサポニンB4の純度を検出した；残りの溶液は、総吸着が30分間続くまで100℃で撹拌し、該溶液の一部を0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過し、ろ液のpH値とプルサティラサポニンB4の純度を検出した。
【００７９】
その結果を表9に示した。
【００８０】
（表９）主成分に対する活性炭量と吸着時間の影響の結果
0006947924.tif 000013
【００８１】
表9の結果は、活性炭量の増加と吸着時間の延長がプルサティラサポニンB4の純度の低下につながることを示している。したがって、中間溶液の体積に基づいて、活性炭の量（質量）は、好ましくは0.05％〜0.1％、より好ましくは0.05％である。
【００８２】
1.6 凍結乾燥プロセスに関する研究
凍結乾燥プロセスは、産物の外観、再溶解率、水分、および安定性に直接影響を与える。したがって、予備凍結温度、予備凍結方法、昇華温度、真空圧、および脱着乾燥温度のパラメータを検討した。具体的な手順は以下のとおりであった。
【００８３】
表7の処方F8に従って、4部のプルサティラサポニンB4とマンニトールをそれぞれ計量した。プルサティラサポニンB4を適量の注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、マンニトールを加え、撹拌し、pHを〜7に調整した；0.05gの活性炭を加え、この溶液を100℃で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、注射用水を加えて100gとし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得た。2mlの中間溶液を正確に計量し、10mlバイアルに充填し、表10のパラメータおよび条件に従って、該バイアルを凍結装置で凍結させた；次に、凍結乾燥機に移し、表10のパラメータと条件に従って昇華および脱着乾燥を実施した。凍結乾燥産物の外観を観察し、関連物質の含有量を測定し、かつ再溶解試験を実施して再溶解時間を記録した。その結果を表10に示した。
【００８４】
（表１０）凍結乾燥産物に対する様々な凍結乾燥プロセスパラメータの影響の結果
0006947924.tif 000014
【００８５】
表10に示した結果から、昇華および脱着乾燥中の真空圧が重要なパラメータであることがわかる。真空圧が低すぎる場合（例えば、プロセス3での0.1Pa）、得られた凍結乾燥産物は外観が悪くなり、水分が多くなり、関連物質の含有量が他のプロセスで得られた産物よりも著しく高くなる；これは、プルサティラサポニンB4がより分解されていることを示している。したがって、真空圧は好ましくは0.5〜10Pa、より好ましくは5〜10Paである。
【００８６】
好ましくは、本発明による凍結乾燥の工程は、以下のとおりであった：
中間溶液を小分けし、温度を3℃〜5℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−15℃に下げ、この溶液をその温度で8〜10時間凍結させた；次に、密閉装置に入れ、0.5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの一定速度で−10℃〜0℃まで上げて8〜10時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃に上げて4〜6時間保持した。
【００８７】
より好ましくは、本発明による凍結乾燥の工程は、以下のとおりであった：
中間溶液を小分けし、温度を凍結装置において3℃〜5℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−20℃に下げ、この溶液をその温度で8〜10時間凍結させた；次に、密閉装置に入れ、5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの一定速度で−10℃まで上げて8時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃に上げて4時間保持した。
【００８８】
本実験例の結果に基づいて、本発明によるプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤は、プルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤とを含み、凍結乾燥賦形剤は、マンニトール、スクロースおよびラクトースからなる群より選択される任意の比率での1種または複数であり、マンニトールが好ましい；プルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤との質量比は3：10〜3：16、より好ましくは3：14である。
【００８９】
好ましくは、プルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤は、プルサティラサポニンB4と凍結乾燥賦形剤とを3：10〜3：16の質量比で含み、さらに、水分およびプルサティラサポニンB4の分解産物などの不可避の不純物を少量含んでいる。
【００９０】
本発明によるプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤の調製方法は、以下のとおりである。
【００９１】
I. 中間溶液の調製
プルサティラサポニンB4を適量の注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、重量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加し、撹拌し、pHを6.0〜8.5に調整した；この溶液に、中間溶液の総質量に基づいて0.05％〜0.1％の活性炭を添加し、100℃で10〜20分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、プルサティラサポニンB4の濃度が0.5％〜5％になるまで注射用水を追加し、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得た。
【００９２】
II. 凍結乾燥
工程Iで調製された中間溶液を小分けし、凍結装置に移し、温度を3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−15℃に下げ、この溶液をその温度で8〜10時間凍結させた；次に、密閉装置に入れ、0.5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの一定速度で−10℃〜0℃まで上げて8〜10時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃に上げて4〜6時間保持した。
【００９３】
好ましくは、前記調製方法は以下のとおりである。
【００９４】
I. 中間溶液の調製
プルサティラサポニンB4を注射用水に溶解し、撹拌して溶解し、重量比に従って凍結乾燥賦形剤を添加し、撹拌し、pHを6.5〜8.0に調整した；この溶液に、中間溶液の総質量に基づいて0.05％の活性炭を添加し、100℃で10〜20分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、プルサティラサポニンB4の濃度が2％〜3％になるまで注射用水を追加し、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して中間溶液を得た。
【００９５】
II. 凍結乾燥
工程Iで調製された中間溶液を小分けし、凍結装置に移し、温度を3.0℃〜5.0℃/分または1.0℃〜1.5℃/分の速度で−30℃〜−20℃に下げ、この溶液をその温度で8時間凍結させた；次に、密閉装置に入れ、5〜10Paの真空圧下で温度を25℃〜30℃/3hの一定速度で−10℃まで上げて8時間保持し、同じ真空圧下で温度を1.0℃〜1.5℃/分の速度で25℃〜30℃に上げて4時間保持した。
【００９６】
実施例2  プルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤
中間溶液の処方：
0006947924.tif 000015
【００９７】
注射用凍結乾燥粉剤を以下の方法により調製した。
【００９８】
I. 中間溶液の調製
処方量のプルサティラサポニンB4を取り、正確に計量し、適量の注射用水を加えた。プルサティラサポニンB4原料を磁気撹拌下で完全に溶解し、この溶液に処方量のマンニトールを加え、撹拌して完全に溶解し、撹拌を約10分間続けた。0.05gの活性炭を加えた後、この系を100℃の水浴で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、注射用水を追加して100mlにし、十分に振とうし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して活性炭を除去し、中間溶液を得た。
【００９９】
II. 凍結乾燥
工程Iで調製された中間溶液を小分けした：2mlの中間溶液を正確に計量して、10mlバイアルに充填した；そのバイアルを凍結装置に移し、フルスピードで−20℃まで冷却し、この温度を8時間保持した；次に、該バイアルを凍結乾燥機に移し、5Paの真空圧下で温度を25℃/3hの一定速度で−10℃に上げ、−10℃で8時間保持し、温度を一定速度で25℃に上げて4時間保持し、それにより注射用凍結乾燥粉剤を得た。
【０１００】
調製されたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤は、白色のふわふわした塊状物であり、水で再調製するのに要する時間は6秒であった；水分量は1.3％、プルサティラサポニンB4の純度は99.74％、最大単一不純物の含有量は0.12％、総不純物の含有量は0.26％であった。
【０１０１】
実施例3  プルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤
中間溶液の処方：
0006947924.tif 000016
【０１０２】
注射用凍結乾燥粉剤を以下の方法により調製した。
【０１０３】
I. 中間溶液の調製
処方量のプルサティラサポニンB4を取り、正確に計量し、適量の注射用水を加えた。プルサティラサポニンB4原料を磁気撹拌下で完全に溶解し、この溶液に処方量のラクトースを加え、撹拌して完全に溶解し、撹拌を約10分間続けた。0.1gの活性炭を加えた後、この系を100℃の水浴で20分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、注射用水を追加して100mlにし、十分に振とうし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して活性炭を除去し、中間溶液を得た。
【０１０４】
II. 凍結乾燥
工程Iで調製された中間溶液を小分けした：2mlの中間溶液を正確に計量して、10mlバイアルに充填した；そのバイアルを凍結装置に移し、3℃/分の速度で−30℃まで冷却し、この温度を10時間保持した；次に、該バイアルを凍結乾燥機に移し、10Paの真空圧下で温度を25℃/3hの一定速度で−10℃に上げ、−10℃で10時間保持し、温度を1.5℃/分の速度で30℃に上げて、この温度を6時間保持し、それにより注射用凍結乾燥粉剤を得た。
【０１０５】
調製されたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤は、白色のふわふわした塊状物であり、水で再調製するのに要する時間は6秒であった；水分量は1.07％、プルサティラサポニンB4の純度は99.61％、最大単一不純物の含有量は0.28％、総不純物の含有量は0.39％であった。
【０１０６】
実施例4  プルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤
中間溶液の処方：
0006947924.tif 000017
【０１０７】
注射用凍結乾燥粉剤を以下の方法により調製した。
【０１０８】
I. 中間溶液の調製
処方量のプルサティラサポニンB4を取り、正確に計量し、適量の注射用水を加えた。プルサティラサポニンB4原料を磁気撹拌下で完全に溶解し、この溶液に処方量のスクロースを加え、撹拌して完全に溶解し、撹拌を約10分間続けた。0.15gの活性炭を加えた後、この系を100℃の水浴で15分間加熱撹拌し、室温まで冷却し、注射用水を追加して100mlにし、十分に振とうし、0.22μmの微孔性フィルター膜でろ過して活性炭を除去し、中間溶液を得た。
【０１０９】
II. 凍結乾燥
工程Iで調製された中間溶液を小分けした：2mlの中間溶液を正確に計量して、10mlバイアルに充填した；そのバイアルを凍結装置に移し、5℃/分の速度で−15℃まで冷却し、この温度を9時間保持した；次に、該バイアルを凍結乾燥機に移し、0.5Paの真空圧下で温度を30℃/3hの一定速度で0℃に上げ、0℃で8時間保持し、温度を1℃/分の速度で25℃に上げて5時間保持し、それにより注射用凍結乾燥粉剤を得た。
【０１１０】
調製されたプルサティラサポニンB4の注射用凍結乾燥粉剤は、白色のふわふわした塊状物であり、水で再調製するのに要する時間は6秒であった；水分量は1.39％、プルサティラサポニンB4の純度は99.68％、最大単一不純物の含有量は0.22％、総不純物の含有量は0.32％であった。
【０１１１】
要約すると、本発明は、水性注射剤および注射用凍結乾燥粉剤などの、注射用のプルサティラサポニンB4製剤を提供する。経口製剤と比較して、本発明により提供される注射製剤は、シスプラチン誘発性腎損傷を回復させる上でプルサティラサポニンB4の有効用量を大幅に低減させ、これにより投薬治療の安全性が向上する。さらに、本発明の注射用製剤の指標は安定しており、調製プロセスのパラメータを最適化することにより制御可能である。