(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＬＡＧ‐３と結合する分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
前記重鎖可変領域を有する重鎖を含み、前記重鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域を有する軽鎖を含み、前記軽鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
（ａ）ヒトＬＡＧ−３と結合する特性、（ｂ）サルＬＡＧ−３と結合する特性、（ｃ）マウスＬＡＧ−３と結合しない特性、（ｄ）ＬＡＧ−３と主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩとが結合するドメインにおいてＬＡＧ−３と結合する特性、（ｅ）主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子へのＬＡＧ−３の結合を阻害する特性、（ｆ）ＬＳＥＣｔｉｎへのＬＡＧ−３の結合を阻害する特性、（ｇ）免疫応答を刺激する特性、及び（ｈ）抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する特性、のうちの１種又はそれらの組み合わせを示す、請求項１から６のいずれか一項に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４タイプである、請求項１から７のいずれか一項に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１２】
抗がん剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
腫瘍又はウイルス感染の治療に用いられる請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
前記腫瘍は、黒色腫、腎がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、直腸がんまたは肺がんである、請求項１３に記載の腫瘍又はウイルス感染の治療に用いられる分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１５】
前記腫瘍は、大腸がんである、前記請求項１４に記載の腫瘍又はウイルス感染の治療に用いられる分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
治療用抗体、特に、特定の疾患関連細胞タンパク質を標的とするモノクローナル抗体は、製薬産業における最も急成長しているセグメントの一つである。
【０００２】
このような標的タンパク質の一つは、ヒトのＬＡＧ−３遺伝子でコードされるリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３））である。ＬＡＧ−３は、ＣＤ４様タンパク質であり、ＣＤ４と同様にＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、機能的に負の共刺激グループ（共抑制性受容体）に分類され［Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＪ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１７９−８６（２００９）］、Ｔ細胞応答の低下／抑制に関与する。
【０００３】
詳細な分析により、ＬＡＧ−３はＴ細胞のホメオスタシス、細胞増殖及び活性化を負に制御することが示された［Ｗｏｒｋｍａｎ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３：９７０−９（２００３）］。がん治療のために抗体を用いてＬＡＧ−３をブロックする前臨床研究は、腫瘍部位での抗原特異的Ｔ細胞の活性化の増強及び腫瘍成長の破壊を示している［Ｇｒｏｓｓｏ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７：３３８３−９２（２００７）］。さらに、単一の抗体治療に強い耐性を示す確立された腫瘍のマウスのほとんどは、デュアル抗ＬＡＧ−３／抗ＰＤ−１抗体治療によって治癒された［Ｗｏｏ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７２：９１７−２７（２０１１）］。
【０００４】
ＬＡＧ−３結合モノクローナル抗体が知られているが（例えば、ＵＳ２０１１／０１５０８９２及びＵＳ２０１４／００９３５１１）、増強された結合親和性及び他の望ましい医薬特性を有するモノクローナル抗体が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明によれば、ＬＡＧ−３（例えば、ヒトＬＡＧ−３及びサルＬＡＧ−３）に結合し、既存の抗ＬＡＧ−３抗体（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたＢＭＳ−９８６０１６）よりも強い親和性を有する分離されたモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体が提供される。
【０００６】
本発明の抗体は、担がん又はウイルス感染被験体におけるＬＡＧ−３タンパク質の検出及び抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激などの様々な用途に適用できる。
【０００７】
従って、本発明の一態様は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を有する分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）又はその抗原結合部分に関する。一実施形態において、配列番号２、４及び６のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、３及び５の核酸配列によってコードされ得る。
【０００８】
一態様において、本発明の分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）又はその抗原結合部分は、配列番号３１の核酸配列によってコードされ得る配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【０００９】
一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を有する。一実施形態において、配列番号８、１０及び１２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、９及び１１の核酸配列によってコードされ得る。
【００１０】
一態様において、本発明の分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）又はその抗原結合部分は、配列番号３３の核酸配列によってコードされ得る配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００１１】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１４、１６、１８及び２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に４つのフレームワーク領域を含み、配列番号２２、２４、２６及び２８アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に４つのフレームワーク領域を含む。一実施形態において、配列番号１４、１６、１８及び２０のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、１５、１７及び１９の核酸配列によってコードされ得る。一実施形態において、配列番号２２、２４、２６及び２８のアミノ酸配列は、配列番号２１、２３、２５及び２７の核酸配列によってコードされ得る。
【００１３】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、それぞれ配列番号３５及び３７の核酸配列によってコードされ得る。一実施形態において、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３６のアミノ酸配列を有する２つの重鎖、及びそれぞれ配列番号３８のアミノ酸配列を有する２つ軽鎖を含む。さらに、本発明の抗体は、配列番号２９の核酸配列によってコードされ得る配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
他の実施形態において、前記抗体は、抗原特異的Ｔ細胞応答におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）又はインターフェロン−２（ＩＬ−２）の産生などの抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。他の実施形態において、前記抗体は、抗腫瘍応答（例えば、生体内腫瘍移植モデルにおける腫瘍成長の抑制）又は自己免疫応答（例えば、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症）などの免疫応答を刺激する。
【００１５】
他の実施形態において、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合し、ＬＡＧ−３とＭＨＣクラスＩＩ又はＬＳＥＣｔｉｎとの相互作用をブロックする。
【００１６】
本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの全長抗体であることができ、必要に応じて、重鎖定常領域のヒンジ領域（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８に記載のように２４１位に対応する部位）にセリンからプロリンへの変異を有することにより、重鎖間ジスルフィド架橋不均一性が低減又は回避される。一態様において、前記定常領域アイソタイプは、アミノ酸残基２２０（例えば、Ｓ２２０Ｐ）に変異を有するＩｇＧ４である。或いは、前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'若しくはＦａｂ'２断片などの抗体断片又は一本鎖抗体であってもよい。
【００１７】
本発明の他の態様において、前記抗体又はその抗原結合部分は、抗体に結合した治療剤（例えば、細胞毒素又は放射性同位体）を含む免疫結合体の一部である。他の態様において、前記抗体は、前記抗体と異なる結合特異性を有する第２機能部分（例えば、第２抗体）を含む二重特異性分子の一部又はその抗原結合部分である。他の態様において、前記抗体又はその抗原結合部分（例えば、後述するｓｃＦｖ）は、養子Ｔ細胞免疫療法戦略の一部として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部にすることができる。
【００１８】
本発明の抗体又はその抗原結合部分、免疫結合体又は二重特異性分子、必要に応じて薬学的に許容される担体を含む組成物がさらに提供される。
【００１９】
本発明の抗体又はその抗原結合部分（例えば、可変領域及び／又はＣＤＲ）をコードする核酸分子、並びに核酸を含む発現ベクター及び発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。発現ベクターを含む宿主細胞を用いる抗ＬＡＧ−３抗体の調製方法であって、宿主細胞において抗体を発現するステップ（ｉ）と、宿主細胞から抗体を分離するステップ（ｉｉ）とを含む方法がさらに提供される。
【００２０】
他の態様において、本発明は、被験体において本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を用いて免疫応答を刺激する方法を提供する。一実施形態において、前記方法は、Ｔ細胞を本発明の抗体と接触することにより抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するステップを含む。  好ましい実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及び／又はインターフェロン−２（ＩＬ−２）の産生が刺激される。他の実施形態において、前記被験体は、担がん被験体であり、腫瘍に対応する免疫応答が刺激される。他の実施形態において、前記被験体は、ウイルス感染被験体であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法であって、前記被験体に本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与するステップを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、被験体におけるウイルス感染を治療する方法であって、前記被験体に本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態において、前記方法は、本発明の組成物、二重特異性分子又は免疫結合体を投与するステップを含む。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、被験体における免疫応答を刺激する方法であって、前記被験体に本発明の抗体又はその抗原結合部分、及び少なくとも１つの追加の免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体）を投与することにより、前記被験体において免疫応答が刺激されることで、例えば、腫瘍成長が抑制されるか、又は抗ウイルス応答が刺激されるステップを含む方法を提供する。一実施形態において、前記追加の免疫刺激抗体は、抗ＰＤ−１抗体である。他の実施形態において、追加の免疫刺激剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。さらに別の実施形態において、前記追加の免疫刺激剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。さらに別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−２１）又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与される。前記抗体は、例えば、ヒト、キメラ及びヒト化抗体であり得る。
【００２３】
他の態様において、本発明は、前記方法で使用するための本発明の抗ＬＡＧ−３抗体及び組成物、又は前記方法（例えば、治療）で使用するための医薬品の製造のための本発明の抗ＬＡＧ−３抗体及び組成物を提供する。
【００２４】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかであり、これらは限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＰＣＲ増幅及び一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリの構築を示すフローチャートである。
【図２】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＬＡＧ−３組換えタンパク質に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、８＃、１３＃及びＬＡＧ−３．５の結合活性を示すグラフである。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＬＡＧ−３組換えタンパク質のドメイン１−２に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、８＃、１３＃及び１４＃の結合活性を示すグラフである。
【図４】Ｊｕｒｋａｔ−ＬＡＧ−３細胞上の抗ＬＡＧ−３抗体２＃及びＬＡＧ−３．５の内在化を示すグラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウスＬＡＧ−３組換えタンパク質に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、６＃、８＃、１３＃及び１４＃の結合活性を示すグラフである。
【図６】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＣＤ４組換えタンパク質に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、６＃、８＃、１３＃及び１４＃の結合活性を示すグラフである。
【図７】ＭＨＣクラスＩＩ分子とＬＡＧ−３との相互作用に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、８＃及びＩｇＧのブロッキング効果を示すグラフである。
【図８】ＬＳＥＣｔｉｎとＬＡＧ−３との相互作用に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、６＃及びＩｇＧのブロッキング効果を示すグラフである。
【図９】活性化ヒトＴ細胞の表面で発現されたＬＡＧ−３に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃、８＃及び１３＃の結合活性を示すグラフである。
【図１０】抗ＰＤ１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体２＃又はＩｇＧ４と共に培養されたヒトＴ細胞によって放出されるＩＬ−２のレベルを示すグラフである。
【図１１】抗ＬＡＧ−３抗体２＃と共に培養されたヒトＴ細胞によって放出されるＩＦＮｇを示すグラフである。
【図１２】抗ＬＡＧ−３抗体２＃及び／又は抗ＰＤ１抗体の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明全体で記載されている。
【００２７】
用語「ＬＡＧ−３」は、リンパ球活性化遺伝子−３を指す。用語「ＬＡＧ−３」は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含む。例えば、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的な抗体は、特定の例では、以外の種に由来するＬＡＧ−３タンパク質と交差反応することができる。他の実施形態において、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に完全に特異的であり、他の種又は他のタイプと交差反応性を示さないか、或いは他のすべての種ではなく、他の特定の種に由来するＬＡＧ−３と交差反応することができる（例えば、マウスＬＡＧ−３ではなく、サルＬＡＧ−３と交差反応する）。
【００２８】
用語「ヒトＬＡＧ−３」とは、ヒト配列のＬＡＧ−３、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ  ００２２７７（配列番号３９）を有する完全アミノ酸配列のヒトＬＡＧ−３を指す。用語「マウスＬＡＧ−３」とは、マウス配列のＬＡＧ−３、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３２５０５を有する完全アミノ酸配列のマウスＬＡＧ−３を指す。ＬＡＧ−３は、当分野において例えばＣＤ２２３としても知られている。ヒトＬＡＧ−３配列は、例えば、保存的変異又は非保存領域の変異を有することによりＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ  ００２２７７のヒトＬＡＧ−３と異なる可能性があり、ＬＡＧ−３は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は、本開示の抗体が特異的に結合するＬＡＧ−３の細胞外ドメインにエピトープを有することであるか、又はヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することである。
【００２９】
用語「免疫応答」とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び前記細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用を指す。当該作用は、侵入した病原体、病原体に感染した細胞及び組織、がん細胞、又は正常なヒト細胞又は組織（自己免疫若しくは病的炎症の場合）に対する選択的な損傷、破壊、及び人体からの排除をもたらす。
【００３０】
「抗原特異的Ｔ細胞応答」とは、Ｔ細胞が特異的な抗原でＴ細胞を刺激することにより引き起こされるＴ細胞による応答を指す。抗原特異的刺激時のＴ細胞による応答の非限定的な例は、増殖及びサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２産生）を含む。
【００３１】
本明細書において、用語「抗体」は、全抗体及びそのいずれかの抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここで、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域（ここでＣＨと略される）から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここで、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（ここで、ＣＬと略される）から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への免疫グロブリンの結合を媒介できる。
【００３２】
本明細書で使用されている抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）との用語とは、抗原（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって達成できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）２つのＦｃ断片から構成されるｂｉ−Ｆｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖｉｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法により、それらを単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーを用いて結合することができる。前記単一タンパク質鎖において、ＶＬ及びＶＨがペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）を形成する。このような一本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれることが意図されている。これらの断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００３３】
本明細書で使用されている「分離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する分離された抗体は、ＬＡＧ−３タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する分離された抗体は、他の抗原（例えば、他の種に由来するＬＡＧ−３タンパク質）に対して交差反応性を有してもよい。さらに、分離された抗体は、他の細胞物質及び／及び化学物質を実質的に含まない。
【００３４】
本明細書で使用されている用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の調製を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００３５】
本明細書で使用されている用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来するフレームワーク及びＣＤＲ領域に可変領域がある抗体を含むことを意図している。さらに、前記抗体は、定常領域を含み、この定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム及び部位特異的変異誘発及びインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかし、本明細書で使用されている用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。
【００３６】
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、単一の結合特異性を示す抗体を指す。この抗体は、可変領域を有する。この可変領域において、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域はいずれもヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより調製される。
【００３７】
本明細書で使用されている用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段により調製、発現、作成及び分離されるすべてのヒト抗体を含む。組換えヒト抗体の例として、（ａ）ヒトイムノグロブイン遺伝子のために形質転換及びトランス染色体されている動物（例えば、マウス）から分離された抗体、及びそれらから調製したハイブリドーマから分離した抗体（以下にさらに明記される）、（ｂ）ヒト抗体発現のために形質転換した宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから分離した抗体、（ｃ）組み換え、組み合わせヒト抗体ライブラリーから分離した抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングする抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がいずれもヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。特定の実施形態において、このような組み換えヒト抗体をインビトロ変異誘発処理（及び、ヒトＩｇ配列のために形質転換処理した動物を使用する際には、インビボ体細胞変異誘発処理）に供することができ、したがって、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列はヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それに関連しているもののインビボでヒト抗体生殖細胞系列レパートリ内部に天然には存在しないであろう配列である。
【００３８】
用語「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【００３９】
用語「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
【００４０】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の修飾型（例えば、抗体と別の薬剤及び抗体との複合体）のいずれかを指す。
【００４１】
用語「ヒト化抗体」は、マウスのような別の哺乳種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を指すことを意図している。追加のフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内部で行うことできる。
【００４２】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が一種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指す（例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体）ことを意図としている。
【００４３】
本明細書において、「ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する」抗体は、非ＬＡＧ−３タンパク質に実質的に結合せず、ヒトＬＡＧ−３タンパク質（例えば、１つの以上の非ヒト種に由来するＬＡＧ−３タンパク質）に結合する抗体を指すことを意図している。好ましくは、前記抗体は、「高親和性」（即ち、１ｘ１０−７Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ、さらに好ましくは５ｘ１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤ）でヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
【００４４】
本明細書において、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか、又は高親和性で結合しないことを意味する。即ち、１ｘ１０−６Ｍ以上、好ましくは１ｘ１０−５Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−４Ｍ以上、さらに好ましくは１ｘ１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１ｘ１０−２Ｍ以上のＫＤでタンパク質又は細胞に結合する。
【００４５】
本明細書において、用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図している。また、用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。用語「ＫＤ」は、解離定数であり、Ｋａに対するＫｄの比（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られａｎモル濃度（Ｍ）で示される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。好ましくは、抗体のＫＤの決定は、表面プラズモン共鳴、より好ましくは、バイオセンサーシステム（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム）を使用して行われる。
【００４６】
ＩｇＧ抗体についての「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１ｘ１０−６Ｍ以下、より好ましくは５ｘ１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５ｘ１０−９Ｍ以下、特に好ましくは１ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプによって異なる。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００４７】
用語「ＥＣ５０」は、最大有効濃度の半分として知られており、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との中間の反応を誘発する抗体の濃度を指す。
【００４８】
用語「被験体」には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、爬虫類のような哺乳類及び非哺乳類が含まれる。非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマのような哺乳類動物が好ましい。
【００４９】
以下、本発明の様々な態様をさらに詳しく説明する。
【００５０】
＜有利な機能特性を有する抗ＬＡＧ−３抗体＞
本発明の抗体は、前述した抗ＬＡＧ−３抗体、特にＢＭＳ−ＢＭＳ９８６０１６と比較して、より高い結合能力でヒトＬＡＧ−３に結合する。
本発明の抗体は、好ましくは１ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは５ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
【００５１】
本発明の抗体は、好ましくは０．２ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
【００５２】
本発明の抗体は、ヒトＬＡＧ−３の最初の２つのＮ末端ドメイン（即ち、ＭＨＣクラスＩＩが結合する同じドメイン）に結合する。ＬＡＧ−３とＭＨＣクラスＩＩの結合は、本発明の抗体により阻害され得る。本発明の抗体は、ＬＡＧ−３とＬＳＥＣｔｉｎの相互作用をブロックすることもできる。前記ＬＳＥＣｔｉｎは、ＣＬＥＣ４Ｇ（Ｃ型レクチンスーパーファミリー４、メンバーＧ）としても知られているタンパク質であり、メラノーマ細胞で発現されると、腫瘍の進行を促進することが発見された（Ｆ  Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７４（１３）・Ａｐｒｉｌ  ２０１４）。
【００５３】
追加の機能特性には、カニクイザル及びアカゲザルなどの他の種由来のＬＡＧ−３との交差反応性が含まれる。本発明の抗体は、マウスＬＡＧ−３に実質的に結合しない。好ましくは、本発明の抗体は、高親和性でヒトＬＡＧ−３と結合する。
【００５４】
他の機能特性には、抗原特異的Ｔ細胞応答などの免疫応答を刺激する抗体の能力が含まれる。これは、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答でインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を刺激する抗体の能力を評価することにより検証することができる。特定の実施形態において、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。他の実施形態において、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に結合するが、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激しない。免疫応答を刺激する抗体の能力を評価するための他の手段は、例えば、生体内腫瘍移植モデルでの腫瘍成長抑制能力、又は自己免疫モデルでの自己免疫疾患の発症促進能力のような自己免疫応答の刺激能力、例えば、ＮＯＤマウスモデルでの糖尿病発症促進能力を含む。本発明の抗体は、特に抗ＰＤ１抗体と共に投与される場合、腫瘍成長を抑制することができる。
【００５５】
本発明の好ましい抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。追加及び代替として、前記抗体は、例えば、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体であってもよい。
【００５６】
＜モノクローナル抗ＬＡＧ−３抗体＞
本発明の好ましい抗体は、以下及び下記実施例に記載されるように構造的及び化学的に特徴付けられたヒトモノクローナル抗体、抗ＬＡＧ−３抗体２＃である。抗ＬＡＧ−３抗体２＃のＶＨアミノ酸配列は、配列番号３２に示される。抗ＬＡＧ−３抗体２＃のアミノ酸配列は、配列番号３４に示される。さらに、抗ＬＡＧ−３抗体２＃の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６及び配列番号３８に示され、抗ＬＡＧ−３抗体２＃の全長アミノ酸配列は、配列番号３０に示される。
【００５７】
ヒトＬＡＧ−３に結合する他の抗ＬＡＧ−３抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は、抗ＬＡＧ−３抗体２＃のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）と「組み合わせる」ことができる。好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖（又はこれらの鎖におけるＣＤＲ）が組み合わせられる場合、ＶＨ／ＶＬペアリングからのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えられる。同様に、特定のＶＨ／ＶＬペアリングからのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置換されることが好ましい。
【００５８】
従って、一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、以下の（ａ）及び（ｂ）を含む。
（ａ）は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃のＶＨ）である。
（ｂ）は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃のＶＬ）、又は他の抗ＬＡＧ−３抗体（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃と異なる抗ＬＡＧ−３抗体のＶＬ）であり、ここで、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【００５９】
他の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、以下の（ａ）及び（ｂ）を含む。
（ａ）は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃のＣＤＲ配列（それぞれ配列番号２、４及び６））である。
（ｂ）は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃のＣＤＲ配列（それぞれ配列番号８、１０及び１２）、又は他の抗ＬＡＧ−３抗体（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃と異なる抗ＬＡＧ−３抗体）のＣＤＲであり、ここで、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【００６０】
さらに別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＬＡＧ−３に結合する他の抗体のＣＤＲ（例えば、異なる抗ＬＡＧ−３抗体の重鎖可変領域由来のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３、並びに／或いは軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）と組み合わせた抗ＬＡＧ−３抗体２＃の重鎖可変ＣＤＲ２領域を含む。
【００６１】
さらに、当分野で周知されているように、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１及び／及びＣＤＲ２ドメインとは独立して単独で、同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定でき、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測可能に生成される。例えば、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ  ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：８０７−１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９（１９９４）ａｎｄ  Ｘｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６；６，９１４，１２８；６，０９０，３８２；６，８１８，２１６；６，１５６，３１３；６，８２７，９２５；５，８３３，９４３；５，７６２，９０５及び５，７６０，１８５も参照されたい。これらの参考文献のそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００６２】
従って、他の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体２＃の重鎖可変領域のＣＤＲ２（配列番号４）、少なくとも抗ＬＡＧ−３抗体２＃の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３（配列番号６及び／又は１２）、或いは他のＬＡＧ−３抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。ここで、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる。好ましくは、これらの抗体は、（ａ）競合してＬＡＧ−３と結合し、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープと結合し、及び／又は（ｄ）抗ＬＡＧ−３抗体２＃と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、前記抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体２＃の軽鎖可変領域のＣＤＲ２（配列番号１０）、又は他のＬＡＧ−３抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含み得る。ここで、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体２＃の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２及び／又は８）、又は他のＬＡＧ−３抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得る。ここで、前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる。
【００６３】
＜保存的修飾＞
他の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の保存的修飾により抗ＬＡＧ−３抗体２＃と異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。当分野で理解されているように、抗原結合機能が維持されたままで特定の保存的配列修飾を行うことができる。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１１８０−８、ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２、Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５、Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６及びＢｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３を参照されたい。
【００６４】
従って、一実施形態において、前記抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域、並びに／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２及び／又はその保存的修飾を含み、
（ｂ）前記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号６及びその保存的修飾を含み、並びに／或いは
（ｃ）前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号１２、並びに／或いはその保存的修飾を含み、
（ｄ）前記抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【００６５】
本発明の抗体は、上記機能特性、例えば、ヒト及びサルＬＡＧ−３に対する高親和性結合、マウスＬＡＧ−３への結合の欠如、ＭＨＣクラスＩＩ又はＬＳＥＣｔｉｎへのＬＡＧ−３結合の阻害能力、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激能力、及び／又は腫瘍成長の抑制能力のうちの１つ以上を有する。
【００６６】
様々な実施形態において、前記抗体は、例えば、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であり得る。
【００６７】
本明細書において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性を顕著に影響及び変化を与えないアミノ酸修飾を指すことを意図している。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠失を含む。修飾は、部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入などの当分野で知られている標準的な技術により本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。このようにして、本発明の抗体のＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更された抗体は、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して、保持機能（即ち、上記の機能）について試験することができる。
【００６８】
＜改造抗体及び修飾体＞
本発明の抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体２＃の１つ以上のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体を修飾抗体を改造するための出発材料として使用して調製することができる。抗体は、一方及び両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより改造され得る。追加及び代替として、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を修飾することにより改造され得る。
【００６９】
特定の実施形態において、ＣＤＲ移植を採用して抗体の可変領域を改造することができる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）にあるアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用の原因であるため、異なる特性を有する異なる抗体に由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然型抗体に由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３、米国特許第５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０）。
【００７０】
従って、本発明の他の実施形態は、それぞれ配列番号２、４、６を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及び／又はそれぞれ配列番号８、１０、１２を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有する分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体は、モノクローナル抗体２＃のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を含み、かつ異なるフレームワーク配列を含み得る。
【００７１】
このようなフレームワーク配列は、公共ＤＮＡデータベース又は生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開された参考文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネット上で利用可能：ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），ｃｉｔｅｄ  ｓｕｐｒａ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ヒトＧｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  セグメントｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  ヒトＧｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  セグメントｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６から見出される。それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。他の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから見出される。例えば、以下のＨＣｏ７  ＨｕＭＡｂマウスで見出される重鎖生殖細胞系列配列は、付随のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１−６９（ＮＧ−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）及び３−７（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）で入手可能である。他の例として、以下のＨＣｏ１２  ＨｕＭＡｂマウスで見出される重鎖生殖細胞系列配列は、付随のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１−６９（ＮＧ−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）、４−３４（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３−２３（ＡＪ４０６６７８）で入手可能である。
【００７２】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知であるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴと呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），ｓｕｐｒａ）。
【００７３】
本発明の抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、本発明の抗体で使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するもの、例えば、配列番号１４、１６、１８及び２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域における４つのフレームワーク領域、及び配列番号２２、２４、２６及び２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域における４つのフレームワーク領域である。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得る。或いは、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の例では、フレームワーク領域内の残基を変異させて抗体の抗原結合能力を維持及び強化することが有益であることが発見された（例えば、米国特許第５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０）．
【００７４】
他の可変領域修飾のタイプは、内ＶＨ及び／又はＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域のアミノ酸残基を変異させることで目的抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を向上させることである。部位特異的変異導入又はＰＣＲ媒介変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の目的機能特性に対する影響は、本明細書に記載され、実施例に提供されているインビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的修飾（当分野で知られている）が導入されるのが好ましい。変異は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ及び５つ以下の残基が変更される。
【００７５】
従って、他の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域を含む分離された抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。前記重鎖可変領域は、（ａ）配列番号２、又は配列番号２と比べて１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号４、又は配列番号４と比べて１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号６、又は配列番号６と比べて１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号８、又は配列番号８と比べて１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号１０、又は配列番号１０と比べて１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域；及び（ｆ）配列番号１２、又は配列番号１２と比べて１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域；を含む。
【００７６】
本発明の改造抗体は、例えば、抗体の特性を改善するためのＶＨ及び／又はＶＬにおけるフレームワーク残基に対する修飾を含む。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る．このような残基は、前記抗体フレームワーク配列を前記抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。
【００７７】
他のフレームワーク修飾のタイプは、フレームワーク領域、又は１つ以上のＣＤＲ領域における１つ以上の残基をＴ細胞エピトープが除去されるように変異させることにより、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公開第２００３０１５３０４３号に詳しく記載されている。
【００７８】
フレームワーク又はＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて又はその代わりに、本発明の抗体は、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、及び／及び抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内の修飾を含むように改造されてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されてもよく（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に取り付けられてもよく）、そのグリコシル化を変更するように修飾されてもよく、又は１つ以上の抗体の機能特性を変更するように修飾されてもよい。以下、これらの各実施形態についてさらに詳細に説明する。Ｆｃ領域の残基の番号は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号である。
【００７９】
好ましい実施形態において、前記抗体は、重鎖定常領域のヒンジ領域における２４１位に対応する位置にセリンからプロリンへの変異（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８）を含むＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。この変異により、ヒンジ領域の重鎖間ジスルフィド架橋の異質性が回避されることが報告されている（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ、２４１位は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに基づく）。
【００８０】
一実施形態において、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更（例えば、増加又は減少）されるようにＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に詳しく記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを促進するために、及び抗体の安定性を増加若しくは減少させるために変更される。
【００８１】
他の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させることにより、生物学的半減期を短縮させる。より具体的には、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に１つ以上のアミノ酸変異を導入することにより、抗体は、天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下する。このアプローチは米国特許第６，１６５，７４５号に詳しく記載されている。
【００８２】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製される（即ち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化を変更することにより、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列における１つ以上のグリコシル化部位を変更することにより達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を導入することにより、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去することで、その部位のグリコシル化を除去することができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【００８３】
追加及び代替として、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体及び二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などのグリコシル化のタイプが変更された抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が変更された宿主細胞で発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が変更された細胞は、当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現する抗体の炭水化物がフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製された（米国特許公開第２００４０１１０７０４及びＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照）。他の例として、ＥＰ１，１７６，１９５には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子（フコシルトランスフェラーゼをコードする）を持つ細胞株が記載されている。このような細胞株で発現される抗体は、α−１，６結合関連酵素を減少及び除去することにより低フコシル化を示す。ＥＰ１，１７６，１９５には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を持たないＮ−アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性が低い細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）がさらに記載されている。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合する能力が低下し、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照）。ＰＣＴ公開ＷＯ  ０６／０８９２３１に記載されているように、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は鶏の卵でも産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、レムナなどの植物細胞で産生され得る。植物系で抗体を産生する方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ  ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されています。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように改造された細胞株が記載されている。この改造された細胞株で発現された抗体は、増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、これにより、抗体のＡＤＣＣ活性が増加する（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０を参照）。或い���、フコシダーゼ酵素により抗体のフコース残基を切り離すことができる。例えば、α−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【００８４】
本発明の抗体の他の修飾はペグ化である。抗体をペグ化することにより、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を延長することができる。抗体をペグ化するために、１つ以上のＰＥＧ基が抗体及び抗体断片に結合する条件下で、抗体及びその断片を、典型的に、ＰＥＧの反応性エステル及びアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（及び類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応及びアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意図している。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化方法は当分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰＯ１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【００８５】
＜抗体の物理的性質＞
本発明の抗体は、それらの異なるクラスを検出及び／及び区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。
【００８６】
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合の変化により、抗体の免疫原性の増加、及び抗体のｐＫの変化をもたらす可能性がある（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２、Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４、Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９、Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ、Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７、Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。いくつかの例では、可変領域グリコシル化を含まない抗ＬＡＧ−３抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることにより達成できる。
【００８７】
好ましい実施形態において、抗体にはアスパラギン異性部位が含まれない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−Ｇ及びＤ−Ｇ配列で起こり、ポリペプチド鎖にキンクを導入し、その安定性を低下させるイソアスパラギン酸残基の生成をもたらす可能性がある（イソアスパラギン酸効果）。
【００８８】
各抗体には固有の等電点（ｐＩ）があり、一般的に６〜９．５のｐＨ範囲にある。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内にあり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内にある。正常範囲外のｐＩを持つ抗体は、インビボ条件下でいくらかの展開及び不安定性を有する可能性があると推測されている。したがって、正常範囲にあるｐＩ値を含む抗ＬＡＧ−３抗体を有することが好ましい。これは、ｐＩが正常範囲の抗体を選択するか、又は帯電した表面残基を変異させることにより達成できる。
【００８９】
＜本発明の抗体をコードする核酸分子＞
他の態様において、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物に存在し、又は部分的に精製された形若しくは実質的に純粋な形で存在し得る。核酸は、標準技術により他の細胞成分及び他の汚染物質、例えば他の細胞核酸及びタンパク質から精製されると、「分離」されるか、又は「実質的に純粋に」なる。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００９０】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに説明するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって作られた抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅及びｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体の場合（例えば、ファージディスプレイ技術を使用する）、このような抗体をコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【００９１】
本発明の核酸分子は、ＬＡＧ−３モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ（それぞれ配列番号３１及び３３）又はＣＤＲ（それぞれ配列番号１、３、５、７、９及び１１）配列をコードする核酸分子を含むことが好ましい。ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することにより、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域や柔軟なリンカーなどの、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に機能的に連結される。本明細書において、用語「機能的に連結される」は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持されるように２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味する。
【００９２】
ＶＨ領域をコードする分離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），ｓｕｐｒａ）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅により得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよくいが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に機能的に連結することができる。
【００９３】
ＶＬ領域をコードする分離されたＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当業者で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ及びλ定常領域であり得る。
【００９４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬコードＤＮＡ断片を柔軟なリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする他の断片に機能的に連結することにより、ＶＨ及びＶＬ配列は、柔軟なリンカーを介してＶＬ及びＶＨ領域が結合された連続した一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４）。
【００９５】
＜本発明のモノクローナル抗体の調製＞
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、よく知られている体細胞ハイブリダイゼーション技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５）を使用して調製することができる。モノクローナル抗体を調製するための他の実施形態には、Ｂリンパ球のウイルス及び発がん性形質転換及びファージディスプレイ技術が含まれる。キメラ抗体及びヒト化抗体も当分野で周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７、５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０号を参照されたい。それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００９６】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトＬＡＧ−３に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を持つ遺伝子導入及び染色体導入マウスを使用して調製することができる。これらの遺伝子導入及び染色体導入マウスには、本明細書でそれぞれＨｕＭＡｂ  ＭｏｕｓｅＴＭ及びＫＭ  ＭｏｕｓｅＴＭと呼ばれるマウスが含まれ、本明細書ではまとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
【００９７】
ＨｕＭＡｂ  ＭｏｕｓｅＴＭ（ＭｅｄａｒｅｘＴＭ，Ｉｎｃ．）は、内因性のμ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異とともに、再配列されていないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９）。したがって、マウスはマウスＩｇＭ及びκの発現低下を示し、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子はクラススイッチング及び体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ｓｕｐｒａ、ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｌｏｎｂｅｒｇ（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３，ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭＡｂ  ＭｏｕｓｅＴＭの準備と使用、及びこのようなマウスによって運ばれるゲノム修飾は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１、及びＦｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に記載されている。これらのすべての内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。米国特許第５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，６２５，１２６、５，６３３，４２５、５，７８９，６５０、５，８７７，３９７、５，６６１，０１６、５，８１４，３１８、５，８７４，２９９、５，７７０，４２９及び５，５４５，８０７号、並びにＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４、ＷＯ９９／４５９６２及びＷＯ０１／１４４２４をさらに参照されたい。これらのすべての内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００９８】
他の実施形態において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子及び導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを使用して調製することができる。本明細書では、このマウスは、「ＫＭ  ＭｏｕｓｅＴＭ」と呼ばれ、その詳細はＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されている。このマウスの修飾型は、内因性ＦｃγＲＩＩＢ受容体遺伝子のホモ接合型破壊をさらに含み、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されており、本明細書では、「ＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄ  ｍｏｕｓｅ」と呼ばれる。さらに、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２重鎖導入遺伝子のいずれか及び両方を有するマウスを使用できる。
【００９９】
他の遺伝子導入動物の実施形態は、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｓｕｓｅ）が含む（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，米国特許第５，９３９，５９８、６，０７５，１８１、６，１１４，５９８、６，１５０，５８４及び６，１６２，９６３号）。さらなる実施形態は、「ＴＣマウス」（Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７）及びヒト重鎖及び軽鎖導入染色体を有するウシ（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２８１２）を含む。これらの特許及び出版物の内容は、参照により全体としてが本明細書に組み込まれる。
【０１００】
一実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製される。例えば、米国特許第５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、５，５７１，６９８、５，４２７，９０８、５，５８０，７１７、５，９６９，１０８、６，１７２，１９７、５，８８５，７９３、６，５２１，４０４、６，５４４，７３１、６，５５５，３１３、６，５８２，９１５及び６，５９３，０８１号を参照されたい。これらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＳＣＩＤマウスを用いて調製することができる。このＳＣＩＤマウスには、ヒト免疫細胞が再構成されていることにより、免疫化時にヒト抗体応答が発生することができる。例えば、米国特許第５，４７６，９９６及び５，６９８，７６７号を参照されたい。これらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
他の実施形態において、ヒト抗ＬＡＧ−３抗体は、ファージディスプレイにより調製することができる。前記ファージは、前にＬＡＧ−３で免疫化された遺伝子導入動物で生成された抗体をコードする核酸を含む。好ましい実施形態において、前記遺伝子導入動物は、ＨｕＭａｂ、ＫＭ又はＫｉｒｉｎマウスである。例えば、米国特許第６，７９４，１３２号を参照されたい。その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
＜ヒトＩｇマウスの免疫化＞
本発明の一実施形態において、ヒトＩｇマウスは、ＬＡＧ−３抗原、組換えＬＡＧ−３タンパク質、及びＬＡＧ−３タンパク質を発現する細胞の精製及び濃縮調製物で免疫される。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ｓｕｐｒａ、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），ｓｕｐｒａ、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／２４８８４又はＷＯ０１／１４４２４を参照されたい。これらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態において、６−１６週齢のマウスを５−５０μｇのＬＡＧ−３タンパク質で免疫する。或いは、非ＬＡＧ−３ポリペプチドに融合したＬＡＧ−３の一部が使用される。
【０１０４】
一実施形態において、遺伝子導入マウスを完全フロイントアジュバントにおけるＬＡＧ−３抗原で腹腔内（ＩＰ）及び静脈内（ＩＶ）免疫した後、不完全フロイントアジュバントにおける抗原でＩＰ又はＩＶ免疫する。他の実施形態において、フロイント以外のアジュバント及びアジュバントのない細胞全体が使用される。ＥＬＩＳＡにより血漿をスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ＬＡＧ−３ヒト免疫グロブリンを有するマウスの細胞を融合に適用できる。
【０１０５】
＜本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製＞
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製するために、免疫したマウスからの脾細胞及び／及びリンパ節細胞を分離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合させることができる。抗原特異的抗体を産生するために、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることができる。ハイブリドーマの調製は、当分野で周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１０６】
＜本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの調製＞
本発明の抗体は、例えば、組換えＤＮＡ技術と当分野で周知である遺伝子トランスフェクション方法との組み合わせにより宿主細胞トランスフェクトーマ内で産生することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られた部分及び全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に機能的に連結されるように１つ以上の発現ベクターに挿入される。本明細書において、用語「機能的に連結される」とは、ベクター内の転写及び翻訳調制御列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味する。
【０１０７】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写及び翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素（例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及び／及びエンハンサー（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマ）が含まれる。或いは、ユビキチンプロモーターやβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用してもよい。さらに、調節要素は、異なる由来源からの配列から構成され、例えば、ＳＲαプロモーターシステムは、ＳＶ４０初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列に由来する配列を含む（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
【０１０８】
抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別々の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態において、可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに機能的に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能的に連結されるように、可変領域を目的のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製する。追加及び代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド及び異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【０１０９】
本発明の組換え発現ベクターは、前記抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの追加の配列を持ってもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７号）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞で使用）及びＮｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【０１１０】
軽鎖及び重鎖の発現のために、標準的な技術により発現ベクターをコードする重鎖及び軽鎖を宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」のさまざまな形態は、外因性ＤＮＡを原核生物及び真核生物の宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど）を包含することを意図している。原核及び真核宿主細胞のいずれかで本発明の抗体を発現させることは理論的には可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。これは、このような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核細胞よりも免疫学的活性を有する適切に折りたたまれた抗体を組み立てて分泌する可能性が高いためである。
【０１１１】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択マーカー（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１）と共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８，８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。組換え発現ベクターをコードする抗体遺伝子が哺乳動物宿主細胞に導入された場合、抗体は、宿主細胞での抗体の発現、又は好ましくは宿主細胞が成長する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。標準的なタンパク質精製法により培地から抗体を回収することができる。
【０１１２】
＜免疫結合体＞
本発明の抗体を治療薬に結合させて、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）などの免疫結合体を形成することができる。適切な治療薬には、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が含まれる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療薬は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、及びヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介して結合される。より好ましくは、前記リンカーは、ペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＧｌｕである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００、６，９８９，４５２及び７，１２９，２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０、ＷＯ０７／０３８，６５８、ＷＯ０７／０５１，０８１、ＷＯ０７／０５９，４０４、ＷＯ０８／０８３，３１２及びＷＯ０８／１０３，６９３、米国特許公開第２００６００２４３１７、２００６０００４０８１及び２００６０２４７２９５号に記載のように調製され得る。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
＜二重特異性分子＞
他の態様において、本開示は、少なくとも１つの他の機能分子に連結された本発明の１つ及び複数の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。前記他の機能分子は、例えば、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を産生する他のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体のための別の抗体及びリガンド）である。前記二重特異性分子は、例えば、ＬＡＧ−３及びＴＩＭ３、ＬＡＧ−３及びＰＤ１、又はＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１に結合する。したがって、本明細書で使用される「二重特異性分子」には、３つ以上の特異性を有する分子が含まれる。
【０１１４】
一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＬＡＧ−３  結合特異性に加えて、第３特異性を有する。第３特異性は、抗エンハンスメント因子（ＥＦ）に対するものであり得る。前記抗エンハンスメント因子（Ｅ）は、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、これにより標的細胞に対する免疫応答を増強させる分子。例えば、前記抗エンハンスメント因子は、（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０又はＩＣＡＭ−１を介して）細胞毒性Ｔ細胞又は他の免疫細胞に結合することにより、標的細胞に対する免疫応答を増強させることができる。
【０１１５】
二重特異性分子は、多くの異なる形式及びサイズになり得る。サイズスペクトルにおいて、二重特異性分子は、同一の特異性を持つ２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を持つ２つの結合アームを有する以外、従来の抗体形式を保持する。もう１つの極端な例では、二重特異性分子は、ペプチド鎖、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物によって連結された２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）からなる。中間サイズの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片が含まれる。これら及び他の形式の二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞交雑、及び化学的方法によって調製することができる。例えば、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｃｉｔｅｄ  ｓｕｐｒａ，Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５−６４４（１９９８），ａｎｄ  ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１−３９７（２０００）を参照されたい。これらの参考文献は本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
＜医薬組成物＞
他の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、他の抗体及び薬物などの１つ以上の追加の薬学的有効成分を任意に含有してもよい。本発明の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤又はワクチンとの併用療法で投与することができる。抗ＬＡＧ−３抗体がワクチンに対する免疫応答を増強させる。
【０１１７】
医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含み得る。使用できる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤及び乳化剤、固体バインダー、分散及び懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択と使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
好ましくは、前記医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄及び表皮投与（例えば、注射及び注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物は、酸の作用及びそれを不活性化する可能性のある他の自然条件から保護するために材料でコーティングすることができる。本明細書で使用される「非経口投与」という用語は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内注射及び注入を含むがこれらに限定されない。或いは、本発明の抗体は、局所、表皮及び粘膜投与経路などの非腸管外経路を介して、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下及び局所的に投与することができる。
【０１１９】
医薬組成物は、滅菌水溶液及び分散液の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、及び高薬物濃度に適した他の秩序構造に製剤化することができます。
【０１２０】
担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる有効成分の量は、治療される被験体及び特定の投与経路に応じて異なり、一般的に、治療効果を奏する組成物の量である。一般的には、有効成分と薬学的に許容される担体の合計１００％に対して、有効成分の量は、約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％である。
【０１２１】
投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、治療状況の緊急性によって経時的に分割された用量で投与してもよいか、又は用量を比例的に減少及び増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性の観点から、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される被験体の単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬品担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与してもよく、この場合、投与頻度を減少させる必要がある。
【０１２２】
抗体の投与については、投与量は宿主体重の約０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１−５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１−１０ｍｇ／ｋｇであり得る。例示的な治療計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回及び３〜６か月に１回の投与を伴う。本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の好ましい投与計画には、１ｍｇ／ｋｇ体重及び３ｍｇ／ｋｇ体重での静脈内投与が含まれ、各薬剤は、投薬計画（ｉ）４週間に１回で６回後、３か月に１回、（ｉｉ）３週間に１回及び（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回後、１ｍｇ／ｋｇ体重で３週間に１回のうちの１種により同時に与えられる。いくつの方法では、投与量は、血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように調整される。
【０１２３】
本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の「治療有効用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患の症状のない期間の頻度と時間の増加、又は疾患の苦痛による障害若しくは障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する被験体の治療のために、「治療有効用量」は、治療されていない被験体と比較して腫瘍の成長を、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療的化合物の治療的有効量は、被験体の腫瘍サイズを減少させるか、又は症状を改善することができる。被験体は、典型的にはヒト、他の哺乳動物であり得る。
【０１２４】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ｃｏｌＬＡＧｅｎ、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１２５】
治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４及び４，５９６，５５６号）、（２）微量注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）点滴装置（米国特許第４，４４７，２３３及び４，４４７，２２４号）、及び（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６及び４，４７５，１９６号）などの医療機器により投与することができる。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
特定の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、生体内での適切な分布が確保されるように製剤化することができる。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を通過することを確保するために、リポソームに製剤化することができ、特定の細胞及び器官への選択的輸送を促進する標的化部分をさらに含んでもよい。例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８、５，４１６，０１６及び５，３９９，３３１号、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５、Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８、Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０、Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０、Ｋｅｉｎａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、並びにＫｉｌｌｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい。
【０１２７】
＜発明の使用及び方法＞
本発明の抗体（組成物、二重特異性体及び免疫結合体）は、例えば、ＬＡＧ−３の検出及びＬＡＧ−３の遮断による免疫応答の増強を含む多数のインビトロ及びインビボでの有用性を有する。好ましい実施形態において、前記抗体はヒト抗体である。このような抗体は、インビトロ及びエクスビボで培養中の細胞に投与でき、或いは様々な状況で免疫を強化するために、例えばインビボでヒト被験者に投与することができる。したがって、一態様において、本発明は、被験体における免疫応答が改変されるように本発明の抗体及びその抗原結合部分を被験体に投与するステップを含む、被験体における免疫応答を改変する方法を提供する。好ましくは、応答は、強化、刺激及びアップレギュレートされる。
【０１２８】
好ましい被験体は、免疫応答の増強を必要とするヒト被験体を含む。該方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介免疫応答）を増強することにより治療できる障害を有するヒト患者の治療に特に適している。特定の実施形態では、この方法はインビボでのがんの治療に特に適している。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＬＡＧ−３抗体を目的抗原と一緒に投与することができ、或いは抗原が治療被験体（例えば、担がん又はウイルス感染被験体）にすでに存在している可能性がある。ＬＡＧ−３に対する抗体を他の薬剤と一緒に投与する場合、両者は順序で及び同時に投与することができる。
【０１２９】
本発明は、サンプル中のヒトＬＡＧ−３抗原の存在を検出する方法、及びヒトＬＡＧ−３抗原の量を測定する方法をさらに提供する。前記方法は、サンプル及び対照サンプルとヒトＬＡＧ−３に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体及びその抗原結合部分とを、抗体及びその一部とヒトＬＡＧ−３との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む。次いで、複合体の形成が検出され、対照サンプルと比較したサンプル間の差異複合体形成は、サンプル中のヒトＬＡＧ−３抗原の存在を示す。さらに、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を使用して免疫親和性精製によりヒトＬＡＧ−３を精製することができる。
【０１３０】
本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の、ＬＡＣ−３のＭＨＣクラスＩＩ／ＬＳＥＣｔｉｎへの結合を阻害し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を考えると、本発明は、抗体を使用して抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激、増強及びアップレギュレートするインビトロ及びインビボの方法をさらに提供する。例えば、本発明は、前記Ｔ細胞を本発明の抗体と接触することにより抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するステップを含む抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激方法を提供する。抗原特異的Ｔ細胞応答の適切な指標のいずれかは、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために使用できます。
【０１３１】
このような適切な指標の非限定的な例には、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増加及び／及び抗体の存在下でのサイトカイン産生の増加が含まれる。好ましい実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン２の産生が刺激される。
【０１３２】
本発明は、本発明の抗体を被験体に投与することにより前記被験体において免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激することを含む被験体における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）の刺激方法をさらに提供する。好ましい実施形態において、前記被験体は担がん被験体であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。他の好ましい実施形態において、前記被験体はウイルス感染被験体であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０１３３】
他の実施形態において、本発明は、被験体に本発明の抗体を投与することにより被験体において腫瘍の成長を抑制することを含む被験体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、被験体に本発明の抗体を投与することにより被験体においてウイルス感染を治療することを含む被験体におけるウイルス感染の治療方法を提供する。
【０１３４】
本発明の上記方法及び他の方法の詳細は、後述する。
【０１３５】
＜がん＞
抗体によるＬＡＧ−３の遮断は、患者のがん性細胞に対する免疫応答を増強させることができる。一態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体を使用することによりがん性腫瘍の成長を抑制する被験体のインビボ治療に関する。抗ＬＡＧ−３抗体を単独で使用してがん性腫瘍の成長を阻害することができる。或いは、抗ＬＡＧ−３抗体は、後述のように、他の免疫原性薬剤、標準的ながん治療剤又は他の抗体と組み合わせて使用することができる。
【０１３６】
したがって、一実施形態において、本発明は、被験体に治療有効量の抗ＬＡＧ−３抗体又はその抗原結合部位を投与するステップを含む被験体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。好ましくは、前記抗体は、ヒト抗ＬＡＧ−３抗体（例えば、本明細書に記載の任意のヒト抗ヒトＬＡＧ−３抗体）である。追加的及び代替的に、抗体はキメラ及びヒト化抗ＬＡＧ−３抗体であり得る。
【０１３７】
本発明の抗体を使用することで成長が抑制され得る好ましいがんは、免疫療法に典型的に応答するがんを含む。治療に好ましいがんの非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、乳がん、大腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用することにより成長が抑制され得る難治性及び再発性の悪性腫瘍を含む。
【０１３８】
本発明の方法によって治療可能ながんの他の例には、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚及び眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病を含む慢性及び急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓及び尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発されるがん、及びこれらのがんの組み合わせが含まれる。本発明は、転移性がん、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの治療にも有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【０１３９】
必要に応じて、ＬＡＧ−３に対する抗体は、がん性細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、炭水化物分子を含む）、細胞、免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞などの免疫原性薬剤と組み合わせることができる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９−２８）。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、メラノーマ抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼ、又はサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞のペプチド（後述）が含まれる。
【０１４０】
ヒトでは、黒色腫などの一部の腫瘍は免疫原性であることが示されている。ＬＡＧ−３遮断によるＴ細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主の腫瘍反応を活性化できる。
【０１４１】
ＬＡＧ−３遮断は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせた場合、より効果的である。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的な戦略が考案されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２、Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８、Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８，Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３  ｉｎ  ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。これらの戦略の１つでは、自己及び同種の腫瘍細胞を使用してワクチンを調製する。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたときに最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力な活性化剤であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９−４３）．
【０１４２】
様々な腫瘍における遺伝子発現及び大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義がもたらされた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−７）．多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍及び腫瘍が発生した細胞で発現する分化抗原（例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、及びＴｒｐ−２）である。さらに重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。ＬＡＧ−３遮断は、これらのタンパク質に対する免疫応答を生成するために、腫瘍で発現した組換えタンパク質及び／及びペプチドのコレクションと組み合わせて使用できます。これらのタンパク質は通常、免疫系によって自己抗原とみなされるため、それらに対して耐性がある。腫瘍抗原には、染色体のテロメアの合成に必要なタンパク質テロメラーゼが含まれる場合があり、タンパク質テロメラーゼは８５％以上のヒト癌及び限られた数の体組織でのみ発現される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１３）。これらの体組織は、様々な手段によって免疫攻撃から保護され得る。腫瘍抗原は、タンパク質配列の変化、又は２つの無関係な配列（即ち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ）間での融合タンパク質の形成を引き起こす体細胞変異のため、がん細胞で発現する「新抗原」又はＢ細胞腫瘍のイディオタイプでもある。
【０１４３】
他の腫瘍ワクチンは、ヒトのがんに関係するウイルス（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ及びＨＣＶ）、カポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ））に由来するタンパク質を含み得る。ＬＡＧ−３遮断物と併用できる腫瘍特異的抗原のもう１つの形態は、腫瘍組織自体から分離された精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質の断片を含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達において非常に効率的である（Ｓｕｏｔ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８５−１５８８、Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１１７−１２０）。
【０１４４】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を刺激するために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣはｅｘ  ｖｉｖｏで生成され、腫瘍細胞抽出物と同様に様々なタンパク質及びペプチド抗原を搭載することができる（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２８−３３２）。ＤＣは、これらの腫瘍抗原を発現させるための遺伝的手段によっても形質導入することができる。ＤＣは、免疫の目的で腫瘍細胞に直接融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２−３３６）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫をＬＡＧ−３遮断と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
【０１４５】
ＬＡＧ−３遮断は、標準的ながん治療と組み合わせることができる。ＬＡＧ−３遮断は、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。これらの場合、投与される化学療法剤の用量を減らすことが可能である（Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４）。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のためのデカルバジンと組み合わせた抗ＬＡＧ−３抗体である。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせた抗ＬＡＧ−３抗体である。ＬＡＧ−３遮断と化学療法の併用の科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路の腫瘍抗原レベルの増加をもたらすことである。細胞死によるＬＡＧ−３遮断との相乗効果をもたらすことができる他の併用療法は、放射線、外科手術、及びホルモン除去である。これらのプロトコルのそれぞれにより、宿主において腫瘍抗原のソースが形成される。血管新生阻害剤は、ＬＡＧ−３遮断物と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給する腫瘍細胞死を引き起こす。
【０１４６】
ＬＡＧ−３遮断抗体は、Ｆｃα及びＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用することもできる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５及び５，８３７，２４３号）。二重特異性抗体を使用して、２つの異なる抗原を標的にすることができる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化することができる。これらの応答のＴ細胞アームは、ＬＡＧ−３遮断物の使用により増強される。或いは、腫瘍抗原及び樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用により、抗原は、ＤＣに直接送達され得る。
【０１４７】
腫瘍は多種多様なメカニズムにより宿主の免疫監視を回避することができる。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現される免疫抑制性のあるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらのタンパク質は、特にＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ'Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）、及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５）を含む。これらの各実体に対する抗体を抗ＬＡＧ−３と組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０１４８】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体は、抗ＬＡＧ−３と組み合わせて使用することができる。これらの抗体は、ＤＣ機能と抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に置換することができ（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、ＬＡＧ−３抗体と組み合わせて使用できる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０）。ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５（１９９７）及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）などのＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体は、Ｔ細胞活性化のレベルを高めることができる。
【０１４９】
現在、骨髄移植は造血起源の様々な腫瘍の治療に使用されている。移植片対宿主病はこの治療の結果ですが、治療効果は移植片対腫瘍反応から得られる。ＬＡＧ−３遮断物は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めるために使用できる。
【０１５０】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化及び拡大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的治療プロトコルもある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：５４６−５１）。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するためにも使用できる。抗ＬＡＧ−３抗体の存在下でのエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度と活性を増加させることができる。
【０１５１】
＜感染症＞
本発明の他の方法は、特定の毒素及び病原体に曝露された患者を治療するために使用される。したがって、本発明の他の態様は、被験体に抗ＬＡＧ−３抗体又はその抗原結合部分を投与することにより前記被験体の感染症を治療することを含む被験体における感染症の治療方法を提供する。好ましくは、前記抗体は、ヒト抗ヒトＬＡＧ−３抗体（例えば、本明細に記載の任意のヒト抗ＬＡＧ−３抗体）である。追加的及び代替的に、抗体はキメラ及びヒト化抗体であり得る。
【０１５２】
上記の腫瘍への応用と同様に、抗体媒介ＬＡＧ−３遮断は、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独で、及びワクチンと組み合わせてアジュバントとして使用できる。この治療アプローチが特に有用な病原体の例は、現在有効なワクチンがない病原体、又は従来のワクチンが完全に有効ではない病原体を含む。このような病原体は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ＆Ｃ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＬＡＧ−３遮断は、感染過程で変化した抗原を提示するＨＩＶなどにより構築された感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＬＡＧ−３投与時に異物として認識されるため、ＬＡＧ−３を介した負のシグナルによって減衰されない強力なＴ細胞応答を引き起こす。
【０１５３】
本発明の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例には、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ及びＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟体動物ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルス脳炎ウイルスが含まれる。
【０１５４】
本発明の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原菌のいくつかの例には、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、アンスラックス、ｐＬＡＧｕｅ、レプトスピラ症、及びライム病細菌が含まれる。
【０１５５】
本発明の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例には、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリスなど）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガーツス、ニジェールなど）、ムコラレス属（ムコール、アブシディア、リゾプス）、スポロトリクスシェンキー、ブラストミセスデルマ、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチス及びヒストプラズマ・カプスラーツムが含まれる。
【０１５６】
本発明の方法により治療可能な感染を引き起こす病原性寄生虫のいくつかの例には、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属原虫、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属原虫、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア‐ミクロチ、ブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノヴァン・リーシュマニア、トキソプラズマ、ブラジル鉤虫が含まれる。
【０１５７】
上記すべての方法において、ＬＡＧ−３遮断は、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）などの他の形態の免疫療法、及び腫瘍抗原の増強された提示を提供する二重特異性抗体療法と組み合わせることができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３）．
【０１５８】
＜自己免疫応答＞
抗ＬＡＧ−３抗体は、自己免疫応答を誘発及び増幅することができる。実際、腫瘍細胞及びペプチドワクチンを使用した抗腫瘍応答の誘導は、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性を伴うことを明らかにしている（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１−４８９、Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２９８２−２９８７、Ｈｕｒｗｉｔｚ，（２０００）ｓｕｐｒａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｗｈｉｔｅ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９（１）：８１−４）。したがって、疾患治療のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成するためのワクチン接種プロトコルを考案するために、様々な自己タンパク質と組み合わせて抗ＬＡＧ−３遮断物を使用することを検討することが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳内のアミロイド沈着物へのＡβペプチドの不適切な蓄積を伴う。アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着物を除去することができる（Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７）。
【０１５９】
他の自己タンパク質も、アレルギーや喘息の治療のためのＩｇＥ、関節リウマチのＴＮＦαなどの標的として使用できる。最後に、抗ＬＡＧ−３抗体を使用することにより、様々なホルモンに対する抗体応答が誘導され得る。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は避妊に使用できる。特定の腫瘍の成長に必要なホルモンやその他の可溶性因子に対する中和抗体応答も、ワクチン接種のターゲットとして考えられる。
【０１６０】
抗ＬＡＧ−３抗体の使用に関する上記の類似の方法は、アルツハイマー病のＡβ、ＴＮＦαなどのサイトカイン、ＩｇＥなどの他の自己抗原の不適切な蓄積（例えば、アミロイド沈着）を有する患者を治療するための治療的自己免疫応答の誘導に使用できる。
【０１６１】
＜ワクチン＞
抗ＬＡＧ−３抗体を使用して、抗ＬＡＧ−３抗体と目的抗原（例えば、ワクチン）を同時投与することにより、抗原特異的免疫応答を刺激することができる。したがって、本発明の他の態様において、被験体における抗原に対する免疫応答を増強させる方法を提供する。前記方法は、被験体に（ｉ）抗原、（ｉｉ）抗ＬＡＧ−３抗体又はその抗原結合部分を投与することにより、前記被験体における抗原に対する免疫応答を増強させることを含む。好ましくは、前記抗体は、ヒト抗体ヒトＬＡＧ−３抗体（例えば、本明細書に記載の任意のヒト抗ＬＡＧ−３抗体）である。追加的又は代替的に、抗体はキメラ抗体及びヒト化抗体であり得る。前記抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原及び病原体由来の抗原であり得る。このような抗原の非限定的な例には、上記のセクションで説明したもの（例えば、上記の腫瘍抗原（及び腫瘍ワクチン）、及びウイルス、細菌、及び上記のその他の病原体からの抗原）が含まれる。
【０１６２】
本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子、二重特異性分子、及び免疫結合体）をインビボ及びインビトロで投与する適切な経路は、当分野で周知であり、当業者によって選択され得る。例えば、前記組成物は、注射（例えば、静脈内及び皮下）により投与され得る。使用される分子の適切な用量は、被験体の年齢及び体重、ならびに抗体組成物の濃度及び／及び製剤に依存する。
【０１６３】
前述したように、本発明のヒト抗ＬＡＧ−３抗体は、１つ以上の他の治療薬（例えば、細胞毒性剤、放射毒性剤及び免疫抑制薬）と同時投与することができる。抗体は薬剤に結合する（免疫複合体として）か、又は薬剤とは別に投与することができる。後者の場合（別個の投与）、抗体は、薬剤の前、後若しくは同時に投与することができ、及び他の既知の療法（例えば、抗がん療法（例えば、放射線））と同時投与することができる。このような治療剤は、特に抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジン及びシクロホスファミドヒドロキシ尿素を含む。これらは単独で患者に対して毒性及び亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは４週間に１回、１００ｍｇ／ｍｌで静脈内投与され、アドリアマイシンは２１日に１回、６０−７５ｍｇ／ｍｌで静脈内投与される。本発明のヒト抗ＬＡＧ−３抗体及びその抗原結合断片と化学療法剤との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なるメカニズムを介して作用する２つの抗がん剤を提供する。このような同時投与は、薬物に対する耐性の発達及び腫瘍細胞を抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【０１６４】
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性分子、多重特異性分子、及び免疫複合体）及び使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、及び本発明の１つ以上の追加のヒト抗体をさらに含んでもよい（例えば、最初のヒト抗体とは異なるＬＡＧ−３抗原のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体）。キットには、典型的には、キットの内容物の使用目的を示すラベルが含まれる。ラベルという用語には、キット上若しくはキットに供給されているか、キットに付属している文書、及び記録された資料が含まれる。
【０１６５】
＜併用療法＞
他の態様において、本発明は、併用療法を提供する。この併用療法では、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体（又はその抗原結合部分）を免疫応答の刺激に有効な１つ以上の追加抗体と同時に投与することにより、被験体における免疫応答をさらに増強、刺激又はアップレギュレートする。一実施形態において、本発明は、被験体における免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、被験体に抗ＬＡＧ−３抗体及び１つ以上の追加の免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体）を同時に投与することにより、被験体において免疫応答を刺激する（例えば、腫瘍成長を抑制するか、又は抗ウイルス応答を刺激する）ことを含む。他の実施形態において、前記被験体に抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＰＤ−１抗体を投与する。さらに別の実施形態において、前記被験体に抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。さらに別の実施形態において、前記被験体に抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。一実施形態において、前記抗ＬＡＧ−３抗体はヒト抗体、例えば、本明細書に記載の抗体である。或いは、前記抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、キメラ及びヒト化抗体（例えば、マウス抗ＬＡＧ−３  ｍＡｂから調製される）であり得る。他の実施形態において、少なくとも１つの追加の免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体）はヒト抗体である。或いは、少なくとも１つの免疫刺激抗体は、例えば、キメラ及びヒト化抗体（例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体から調製される）であり得る。
【０１６６】
他の実施形態において、本発明は、過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療方法を提供する。この方法は、ＬＡＧ−３抗体及びＣＴＬＡ−４抗体を被験体に投与することを含む。さらなる実施形態において、前記抗ＬＡＧ−３抗体は、治療量以下の用量で投与され、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体は、治療量以下の用量で投与され、又は両方とも治療量以下の用量で投与される。他の実施形態において、本発明は、免疫刺激剤による過剰増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法を提供する。この方法は、抗ＬＡＧ−３抗体及び治療量以下の抗ＣＴＬＡ−４抗体を被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、前記被験体はヒトである。他の実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体１０Ｄ１（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４）及び抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載の抗ＬＡＧ−３抗体２＃である。本発明の方法に含まれる他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、ＷＯ９８／４２７５２、ＷＯ００／３７５０４、米国特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７−１００７１、Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２５０５（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＰ−６７５２０６）、及びＭｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５３０１−５３０４に記載の抗体を含む。特定の実施形態において、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体は、５ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合し、１ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合し、５ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合し、又は１ｘ１０−８Ｍから１ｘ１０−１０Ｍの間のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１６７】
他の実施形態において、本発明は、過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療方法を提供する。この方法は、ＬＡＧ−３抗体及びＰＤ−１抗体を被験体に投与することを含む。さらなる実施形態において、前記抗ＬＡＧ−３抗体は、治療量以下の用量で投与され、前記抗ＰＤ−１抗体は、治療量以下の用量で投与され、又は両方ともは、治療量以下の用量で投与される。他の実施形態において、本発明は、免疫刺激剤による過剰増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法を提供する。この方法は、抗ＬＡＧ−３抗体及び治療量以下の抗ＰＤ−１抗体を被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、前記被験体はヒトである。特定の実施形態において、前記抗ＰＤ−１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、前記抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体である。ヒト配列抗ＰＤ−１抗体の例には、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４及び４Ａ１１が含まれる（ＰＣＴ公開ＷＯ０６／１２１１６８）。他の抗ＰＤ−１抗体は、例えば、ランブロリズマブ（ＷＯ２００８／１５６７１２）及びＡＭＰ５１４（ＷＯ２０１０／０２７４２３、ＷＯ２０１０／０２７８２７、ＷＯ２０１０／０２７８２８、ＷＯ２０１０／０９８７８８）を含む。特定の実施形態において、前記抗ＰＤ−１抗体は、５ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、１ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、５ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、又は１ｘ１０−８Ｍから１ｘ１０−１０Ｍの間のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。
【０１６８】
他の実施形態において、本発明は、過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療方法を提供する。前記方法は、ＬＡＧ−３抗体及びＰＤ−Ｌ１抗体を被験体に投与することを含む。さらなる実施形態において、前記抗ＬＡＧ−３抗体は、治療量以下の用量で投与され、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、治療量以下の用量で投与され、又は両方とも治療量以下の用量で投与される。他の実施形態において、本発明は、免疫刺激剤による過剰増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法を提供する。この方法は、抗ＬＡＧ−３抗体及び治療量以下の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、前記被験体はヒトである。他の実施形態において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、前記抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体である。ヒト配列抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例には、３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７及び１３Ｇ４が含まれる（ＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５，８７４）。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）（ＷＯ２０１０／０７７６３４）、ＭＥＤＩ４７３６（ＷＯ２０１１／０６６３８９）及びＭＤＸ１１０５（ＷＯ２００７／００５８７４）を含む。特定の実施形態において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、５ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、１ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、５ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、又は１ｘ１０−８から１ｘ１０−１０Ｍの間のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１６９】
抗体によるＬＡＧ−３及び１つ以上の第２標的抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１）の遮断は、患者におけるがん細胞に対する免疫応答を増強することができる。本開示の抗体を使用して成長が抑制され得るがんは、典型的に免疫療法に応答するがんを含む。本開示の併用療法による治療のためのがんの代表例には、上記抗ＬＡＧ−３抗体による単剤療法の説明において具体的に上記に列挙された癌が含まれる。
【０１７０】
特定の実施形態において、本明細書に記載の治療用抗体の組み合わせは、薬学的に許容される担体において単一組成物として同時に、及び薬学的に許容される担体において各抗体を含む別個の組成物として同時に投与することができる。他の実施形態において、治療用抗体の組み合わせは順次投与することができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体及び抗ＬＡＧ−３抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が投与されてから抗ＬＡＧ−３抗体が投与され、又は抗ＬＡＧ−３抗体が投与されてから抗ＣＴＬＡ−４抗体が投与されるように順次投与することができる。追加的又は代替的に、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＬＡＧ−３抗体は、抗ＰＤ−１抗体が投与されてから抗ＬＡＧ−３抗体が投与され、又は抗ＬＡＧ−３抗体が投与されてから抗ＰＤ−１抗体が投与されるように順次投与することができる。追加的又は代替的に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＬＡＧ−３抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が投与されてから抗ＬＡＧ−３抗体が投与され、又は抗ＬＡＧ−３抗体が投与されてから抗ＰＤ−Ｌ１抗体が投与されるように順次投与することができる。
【０１７１】
さらに、併用療法の複数の用量が順次投与される場合、順次投与の順序は、投与の各時点で逆にするか、同じ順序に保つことができ、順次投与は、同時投与と組み合わせることができ、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。例えば、第１投与は、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＬＡＧ−３抗体の組み合わせの同時投与であり得る。第２投与は、抗ＣＴＬＡ−４が投与されてから抗ＬＡＧ−３が投与される順次投与であり得る。第３投与は、抗ＬＡＧ−３が投与されてから抗ＣＴＬＡ−４が投与される順次投与であり得る。追加的又は代替的に、第１投与は、抗ＰＤ−１抗体と抗ＬＡＧ−３抗体の組み合わせの同時投与であり得る。第２投与は、抗ＰＤ−１が投与されてから抗ＬＡＧ−３が投与される順次投与であり得る。第３投与は、抗ＬＡＧ−３が投与されてから抗ＰＤ−１が投与される順次投与であり得る。追加的又は代替的に、第１投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗ＬＡＧ−３抗体の組み合わせの同時投与であり得る。第２投与は、抗ＰＤ−Ｌ１が投与されてから抗ＬＡＧ−３が投与される順次投与であり得る。第３投与は、抗ＬＡＧ−３が投与されてから抗ＰＤ−Ｌ１が投与される順次投与であり得る。別の代表的な投与スキームは、抗ＬＡＧ−３が投与されてから抗ＣＴＬＡ−４が投与される（及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１）順次投与を含んでもよく、後続の投与は、同時であってもよい。
【０１７２】
必要に応じて、抗ＬＡＧ−３と１つ以上の追加抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体）の組み合わせは、免疫原性物質（例えば、がん細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び炭水化物分子）、細胞、及び免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞）とさらに組み合わせることができる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９−２８）。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、メラノーマ抗原のペプチド、例えばｇｐ１００のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼ、或いはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞（後述）が含まれる。組み合わせたＬＡＧ−３とＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及び／及びＰＤ−Ｌ１遮断は、抗ＬＡＧ−３抗体を用いた単剤療法に関して上記で詳細に記載されたワクチン接種プロトコルのいずれかなどのワクチン接種プロトコルとさらに組み合わせることができる。
【０１７３】
組み合わせたＬＡＧ−３とＣＴＬＡ−４及び／及びＰＤ−１及び／及びＰＤ−Ｌ１遮断は、標準的ながん治療とさらに組み合わせることができる。例えば、組み合わせたＬＡＧ−３とＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断は、化学療法と効果的に組み合わせることができる。これらの場合には、本開示の組み合わせで投与される他の化学療法試薬の用量を減らすことが可能である（Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４）。このような組み合わせの例は、抗ＬＡＧ−３と抗ＣＴＬＡ−４抗体及び／又は抗ＰＤ−１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせが、黒色腫を治療するためにさらにデカルバジンと組み合わせることである。他の例は、抗ＬＡＧ−３と抗ＣＴＬＡ−４抗体及び／又は抗ＰＤ−１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせが、黒色腫を治療するためにさらにインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせることである。ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断と化学療法の併用の科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路の腫瘍抗原レベルの増加をもたらすことである。細胞死による組み合わせたＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断との相乗効果をもたらすことができる他の併用療法は、放射線、外科手術、及びホルモン除去である。これらのプロトコルのそれぞれにより、宿主において腫瘍抗原のソースが形成される。血管新生阻害剤も、組み合わせたＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１と組み合わせることができる。血管新生の阻害は腫瘍細胞死を引き起こし、これは宿主抗原提示経路に供給される腫瘍抗原のソースとなり得る。
【０１７４】
ＬＡＧ−３とＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断抗体の組み合わせは、Ｆｃα又はＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用することもできる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５及び５，８３７，２４３号）。二重特異性抗体を使用して、２つの異なる抗原を標的にすることができる。これらの応答のＴ細胞アームは、組み合わせたＬＡＧ−３とＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断物の使用により増強される。
【０１７５】
他の例においた、抗ＬＡＧ−３と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせは、抗腫瘍性抗体と組み合わせて使用することができる。前記抗腫瘍性抗体は、例えば、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ（リツキシマブ）、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ）、ＢｅｘｘａｒＴＭ（トシツモマブ）、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ（イブリツモマブ）、ＣａｍｐａｔｈＴＭ（アレムツズマブ）、ＬｙｍｐｈｏｃｉｄｅＴＭ（パーツズマブ）、ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ）及びＴａｒｃｅｖａＴＭ（エルロチニブ）などである。理論に拘束されない一例としてと、抗がん抗体及び毒素に結合した抗がん抗体による治療は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３によって媒介される免疫応答を強化するがん細胞死（例、腫瘍細胞）を引き起こすことができる。例示的な実施形態では、過剰増殖性疾患（例えば、がん腫瘍）の治療は、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／及び抗ＰＤ−１及び／及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた抗癌抗体を同時、順次、及びそれらの任意の組み合わせで含むことができ、これにより、宿主による抗腫瘍免疫応答を強化することができる。
【０１７６】
腫瘍は多種多様なメカニズムにより宿主の免疫監視を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現される免疫抑制性のあるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらのタンパク質は、特にＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ'Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）、及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５）を含む。他の例では、これらの各実体に対する抗体を抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による抗腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０１７７】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体は、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせと組み合わせて使用することができる。これらの抗体は、ＤＣ機能と抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）は、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせと組み合わせて使用できる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。Ｔ細胞共刺激分子に対する他の活性化抗体（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ，Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）もＴ細胞活性化レベルを高めることができる。
【０１７８】
上記のように、骨髄移植は造血起源の様々な腫瘍の治療に使用されている。組み合わせたＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めるために使用できる。
【０１７９】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化及び拡大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的治療プロトコルもある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，ｓｕｐｒａ）。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するためにも使用できる。抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下でのエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度と活性を増加させることができる。
【０１８０】
特定の実施形態において、本発明は、免疫刺激剤による過剰増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法を提供する。この方法は、抗ＬＡＧ−３抗体及び治療量以下の抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−ｌ及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を被験体に投与することを含む。例えば、本発明の方法は、非吸収性ステロイドを患者に投与することにより、免疫刺激性治療抗体誘発大腸炎及び下痢の発生率を低下させる方法を提供する。免疫刺激性治療抗体を投与される患者は、このような抗体によって誘発される大腸炎及び下痢を発症するリスクがあるため、このような患者はいずれも本発明の方法による治療に適する。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療及びＩＢＤの悪化の予防のためにステロイドが投与されているが、ＩＢＤと診断されていない患者のＩＢＤの予防（発生率の低下）には使用されていない。ステロイドに関連する重大な副作用は、非吸収性ステロイドであっても、予防的使用を妨げている。
【０１８１】
さらなる実施形態において、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断物（即ち、免疫刺激性治療用抗体である抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体）の組み合わせは、任意の非吸収性ステロイドの使用とさらに組み合わせることができる。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、は、広範囲の初回通過代謝を示す糖質コルチコイドであり、肝臓での代謝の後、ステロイドの生物学的利用能は低い、すなわち約２０％未満である。本発明の一実施形態において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは局所的に作用する糖質コルチコステロイドであり、経口投与後、主に肝臓で広範囲に代謝される。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭ（アストラゼネカ）回腸及び結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨ及び時間依存経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭは、回腸及び／及び上行結腸が関与する軽度から中度のクローン病の治療薬として米国で承認されている。クローン病の治療のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭの通常の経口投与量は６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭは、腸粘膜で吸収されて保持される前に腸に放出される。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭは腸粘膜の標的組織を通過すると、肝臓のシトクロムＰ４５０システムにより、糖質コルチコイド活性が無視できるほどの代謝物に広範囲に代謝される。したがって、生物学的利用能は低い（約１０％）。ブデソニドの生物学的利用能が低いため、初回通過代謝がそれほど大きくない他のグルココルチコイドと比較して治療率が向上する。ブデソニドは、全身的に作用するコルチコステロイドよりも、副作用が少なく、視床下部下垂体の抑制が弱い。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭの慢性投与は、副腎皮質機能亢進症や副腎抑制などの全身性グルココルチコイド効果を引き起こす可能性がある（ＰＤＲ  ５８ｔｈ  ｅｄ．２００４、６０８−６１０）。
【０１８２】
さらなる実施形態において、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１遮断物（即ち、免疫刺激性治療用抗体である抗ＬＡＧ−３  ａｎｄ  抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体）の組み合わせと非吸収性ステロイドとの組み合わせは、サリチル酸塩とさらに組み合わせることができる。サリチル酸塩は、５−ＡＳＡ薬、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥＴＭ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）、オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭＴＭ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）、バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬＴＭ，Ｓａｌｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、及びメサラミン（ＡＳＡＣＯＬＴＭ，Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＰＥＮＴＡＳＡＴＭ，Ｓｈｉｒｅ  ＵＳ、ＣＡＮＡＳＡＴＭ，Ａｘｃａｎ  Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．、ＲＯＷＡＳＡＴＭ，Ｓｏｌｖａｙ）を含む。
【０１８３】
本発明の方法によれば、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体、並びに非吸収性ステロイドと組み合わせて投与されるサリチル酸塩は、免疫刺激抗体によって誘発される大腸炎の発生率を減少させる目的のために、サリチル酸塩と非吸収性ステロイドの重複投与及び順次投与を含み得る。したがって、例えば、本発明に係る免疫刺激性抗体によって誘発される大腸炎の発生率を低下させる方法は、サリチル酸塩及び非吸収性物質を同時、順次（例えば、非吸収性ステロイド投与の６時間後にサリチル酸塩を投与）、及びそれらの任意の組み合わせで投与することを含む。さらに、本発明によれば、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドは、同じ経路（例えば、両方とも経口投与）、又は異なる経路（例えば、サリチル酸塩が経口投与、非吸収性ステロイドが直腸投与）で投与することができる。これは、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与に使用される経路とは異なってもよい。
【０１８４】
本開示は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これらの実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての図及びすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５，９５７、ＷＯ０９／０７３，５３３、ＷＯ０９／０７３，５４６及びＷＯ０９／０５４，８６３の開示は、参照により本書に明示的に組み込まれる。
【０１８５】
〔実施例〕
［実施例１］
＜ファージのパンニング及びスクリーニング＞
図１に示すように、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）のレパートリーをクローニングすることにより、抗体一本鎖ファージディスプレイライブラリーを作成した。重鎖及び軽鎖のレパートリーは、主に末梢及び新生児の臍帯血から収集されたヒトリンパ球からのＰＣＲ増幅によって作成された。ＶＬレパートリーとＶＨレパートリーを混合し、オーバーラッププライマーを使用してＰＣＲを行なった。抗体の最終形態は、ＶＨ及びＶＬ断片が柔軟なリンカーペプチド（ＳＧＧＳＴＩＴＳＹＮＶＹＹＴＫＬＳＳＳＧＴ（配列番号４０））によって結合された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であった。プライマリライブラリは、ＬｏｘＰ−ｃｒｅシステムによってさらに拡張された。
【０１８６】
特定のｓｃＦｖ断片を提示するファージ粒子の選択は、Ｉｍｍｕｎｏ  ９６  ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）で実施された。まず、，５０μｇ／ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）におけるＬＡＧ−３組換えタンパク質（Ｃａｔ＃ＬＡ３−５２２２，Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をプレートに塗布し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳ（２％ＭＢＰＳ）中の２％（ｗ／ｖ）粉乳でブロッキングした後、約１０１１個のファージ粒子を含むライブラリを加え、プレートを室温で２時間インキュベートした（ＲＴ、２５−２８℃）。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳで１０−２０回洗浄することにより、非結合ファージを除去した後、ＰＢＳで１０−２０回洗浄した。結合したファージを、５０μｌの１μｇ／μｌトリプシンと共に１０分間インキュベートした後、５０μｌの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．０でインキュベートすることにより溶出させた（１０分間後に５０μｌの２００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）ですぐに中和した）。溶出したファージを使用して、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、指数関数的に成長する大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた。感染細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）とグルコース（１％ｗ／ｖ）を含むＴＹＥプレートに広げ、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。個々のファージ感染コロニーを取り、９６ウェルプレートで成長させることでファージミド粒子を産生した。Ｍ１３ＫＯ７及びＫＭ１３ヘルパーファージを使用して培養物をレスキューした。レスキューされたファージ粒子を使用して、同様の条件を使用した後続の選択ラウンドを開始した。ＬＡＧ３タンパク質について３ラウンドの選択が行われた。
【０１８７】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）でＬＡＧ−３結合をテストするために、最後のパニングから個々のクローンを選択し、３７℃で成長させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージでレスキューしました。増幅されたファージ調製物をＰＢＳ中の５％脱脂乳で３７℃で１時間ブロックし、ＬＡＧ−３（Ｃａｔ＃ＬＡ３−５２２２、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（０．５μｇ／ｍｌ）でコーティングされた９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ）に加えた。３７℃でさらに１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３ファージ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートした。慎重に洗浄した後、３，３０，５，５０−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を基質として加えました。Ｔｈｅｒｍｏ  ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、４５０  ｎｍで呈色反応を測定した。
【０１８８】
第３ラウンドのスクリーニングから、３００個のファージをピックアップし、ヒトＬＡＧ−３結合について試験した結果、２９個のクローンがヒトＬＡＧ−３（Ｃａｔ＃ＬＡ３−５２２２、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的に結合できることが分かった。
【０１８９】
２９個のクローンのうち、１６個のクローンがさらなる試験でヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することが確認された。これらの１６個のクローンは、クローン１−１６として番号が付け直され、配列決定されました。そのうち、クローン２＃、６＃、８＃、１３＃及び１４＃（即ち、抗ＬＡＧ−３抗体２＃、６＃、８＃、１３＃及び１４＃）を含む５つの固有の配列が識別された。
【０１９０】
抗ＬＡＧ−３抗体６＃、８＃、１３＃及び１４＃のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４２、４４、４６及び４８に示され、それぞれ配列番号４１、４３、４５及び４７の核酸配列によってコードすることができる。
【０１９１】
＜クローン６のアミノ酸配列（配列番号４２）＞
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＰＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＡＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＳＹＹＬＥＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（重鎖可変領域）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（重鎖定常領域）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＥＡＰＲＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＤＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＴＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＥＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＫＧＹＶＦＧＴＧＴＫＬＴＶＬＧ（軽鎖可変領域）
ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（軽鎖  定常領域）
【０１９２】
＜クローン８のアミノ酸配列（配列番号４４）＞
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＮＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＳＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（重鎖可変領域）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（重鎖定常領域）
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＫＹＴＳＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＬＬＶＩＹＱＳＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＤＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＰＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＡＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（軽鎖可変領域）
ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（軽鎖定常領域）
【０１９３】
＜クローン１３のアミノ酸配列（配列番号４６）＞
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＮＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＳＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（重鎖可変領域）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（重鎖定常領域）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（軽鎖可変領域）
ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（軽鎖定常領域）
【０１９４】
＜クローン１４のアミノ酸配列（配列番号４８）＞
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＧＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＦＲＳＳＳＷＹＤＹＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（重鎖可変領域）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（重鎖定常領域）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＳＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（軽鎖可変領域）
ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（軽鎖定常領域）
【０１９５】
［実施例２］
＜全長抗体の発現及び精製＞
ｓｃＦｖから全長ヒトＩｇＧ１抗体を調製する方法を確立した。抗ＬＡＧ３抗体のＶＨ及びＶＬ領域をコードする遺伝子を、ｈＩｇＧ１重鎖定常領域及びカッパ軽鎖定常領域の遺伝子を含む発現ベクターｐＩｇＧに順次挿入した。哺乳動物細胞における可溶性抗体の発現のために、組換えｐＩｇＧをリポファクタミンでヒト２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクされた細胞を２９３  ＳＦＭ、３７℃で８日保持した。この間に、培地を２回交換し、培養上清を回収した。培地に分泌された全長抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。精製された抗体を１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、滅菌ろ過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、及び等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）により特徴付けた。
【０１９６】
［実施例３］
＜物理的及び化学的分析＞
５つのクローンについて、重鎖及び軽鎖の完全性並びに抗体の完全性を、それぞれ還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０１９７】
クローン＃２は、サイズ排除クロマトグラフィーでさらに試験された。特に、ランニングバッファーとして１００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４（ｐＨ７．０）を使用して、２０μｇのサンプルをＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムに注入した。実行時間は３０分であった。すべての測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ＨＰＬＣで実行された。ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェアを使用してデータを分析した。抗ＬＡＧ３抗体２＃のメインピークはＳＥＣで９５％を超えており、これは、精製された抗体の高純度と完全性を示している。
【０１９８】
［実施例４］
抗ＬＡＧ−３抗体がヒトＬＡＧ−３に特異的に結合した。
ＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトＬＡＧ−３のドメイン１−２に対する抗体の相対的結合活性の決定に使用された。
【０１９９】
ヒトＬＡＧ−３タンパク質（Ｃａｔ＃ＬＡ３−５２２２、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートをＰＢＳにおける１％ＢＳＡ中で３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロックした後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈抗ＬＡＧ−３抗体（クローン２＃、８＃、１３＃及びＬＡＧ−３．５（ＢＭＳ−９８６０１６，  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ））を結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製された後、固定化タンパク質と共に３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファーで１／１５，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢで展開した後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。
【０２００】
ヒトＬＡＧ−３に結合するクローンのＥＣ５０と代表的な結合曲線を図２に示した。
結果は、すべての抗体がヒトＬＡＧ−３に特異的に結合し、クローン２＃の結合能力が最も高いことを示した
【０２０１】
［実施例５］
抗ＬＡＧ−３抗体がヒトＬＡＧ−３のドメイン１−２に結合した。
ＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトＬＡＧ−３のドメイン１−２に対する抗体の相対的結合活性の決定に使用された。
【０２０２】
組換えＬＡＧ−３ドメイン１−２（アミノ酸１−２６２、配列番号４９）をヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合し、ＥｘｐｉＣＨＯシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で一時的に発現し、上清を収集してプロテインＡ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。組換えＬＡＧ−３ドメイン１−２を４℃で一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートをＰＢＳにおける１％ＢＳＡ中で３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロックした後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈抗ＬＡＧ−３抗体（クローン２＃、８＃、１３＃及び１４＃）を結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製された後、固定化タンパク質と共に３７℃でプレートで１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファーで１／１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ'）２（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢで展開した後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。
【０２０３】
ヒトＬＡＧ３のドメイン１−２に結合するこれらのクローンのＥＣ５０及び代表的な結合曲線を図３に示した。
結果は、クローン２＃、８＃、及び１３＃がＬＡＧ−３のドメイン１−２に結合でき、クローン１４＃がドメイン１−２に結合できないことを示した。
【０２０４】
［実施例６］
＜ヒトＬＡＧ−３に対する抗ＬＡＧ−３抗体の親和性＞
抗ＬＡＧ−３クローンのヒトＬＡＧ−３（Ｃａｔ＃ＬＡ３−５２２２、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対する動的結合活性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴により測定した。
【０２０５】
約６８００  ＲＵの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＧＥカタログ番号ＢＲ−１００８−３９）をＣＭ５センサーチップ上にアミンカップリング化学により固定化した。抗体（クローン２＃、６＃、８＃、１３＃、及び１４＃）を固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の表面に注入した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーを使用した。６．２５ｎＭ−２００ｎＭの範囲の様々な濃度のヒトＬＡＧ−３タンパク質を抗体表面に注入した。各注入サイクルの後、３Ｍ塩化マグネシウム溶液の注入により、ＣＭ５チップ表面を再生しました。バックグラウンド減算結合センサーグラムを使用して、会合速度Ｋａ、解離速度Ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤを分析した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアにより１：１ラングミュ結合モデルを得られたデータセットとフィッティングした。
【０２０６】
以下の表１は、組換えヒトＬＡＧ−３に対する抗ＬＡＧ３抗体の親和性をまとめたものである。
【表１】
0006896989.tif 000002
結果は、クローン２＃が組換えヒトＬＡＧ−３に対して最も高い親和性を有することを示した。
【０２０７】
［実施例７］
＜Ｊｕｒｋａｔ−ＬＡＧ−３細胞上の抗ＬＡＧ−３抗体の内在化＞
抗ＬＡＧ−３抗体についてＪｕｒｋａｔ−ＬＡＧ−３細胞上に内在化される能力を試験した。
【０２０８】
ヒトＬＡＧ−３遺伝子がトランスフェクトされることでヒトＬＡＧ−３を安定して発現するＪｕｒｋａｔ−ＬＡＧ３細胞を、抗ＬＡＧ−３抗体（ＬＡＧ３  ２＃及びＬＡＧ−３．５（ＢＭＳ））と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、２群に分け、１群は３７℃でインキュベートし、もう１群は４℃でインキュベートした。２時間後、４℃で３０分間インキュベートしたＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉｔｙＰｕｒｅロバ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）二次試薬を使用して結合を検出し、１回洗浄した。その後、細胞をＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。ヒトＬＡＧ−３結合の分析は、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施された。
【０２０９】
図４に示すように、抗ＬＡＧ−３抗体２＃はＪｕｒｋａｔ−ＬＡＧ−３細胞に内在化された。
【０２１０】
［実施例８］
＜ヒト、カニクイザル、アカゲザルＬＡＧ−３タンパク質に対する抗ＬＡＧ３抗体の結合親和性＞
ヒトＬＡＧ−３タンパク質（Ｃａｔ＃ＬＡ３−５２２２、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カニクイザルＬＡＧ−３タンパク質（Ｃａｔ＃ＬＡ３−Ｃ５２Ａ０、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び組換えアカゲザルＬＡＧ−３タンパク質に対する抗ＬＡＧ−３抗体２＃の動的結合活性をそれぞれＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）により測定した。組換えアカゲザルＬＡＧ−３タンパク質は、ＸＭ＿００１１０８９２３．３（配列番号５０）のアミノ酸１−４５０をヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合し、ＥｘｐｉＣＨＯシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）でタンパク質を一時的に発現させ、上清を収集し、プロテインＡ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製することにより調製された。
【０２１１】
ビオチン標識抗ＬＡＧ−３抗体２＃及びＬＡＧ３．５は、事前平衡化ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーに結合していた。３．１２５ｎＭから１００ｎＭの範囲の様々な濃度のヒトＬＡＧ−３、カニクイザルＬＡＧ−３及びアカゲザルＬＡＧ−３タンパク質が抗体に結合していた。Ｏｃｔｅｔソフトウェアにより１：１結合モデルをデータセットとフィッティングした。
【０２１２】
表２は、ヒト、カニクイザル及びアカゲザルのＬＡＧ−３タンパク質に対する抗ヒトＬＡＧ３抗体２＃及びＬＡＧ３．５の親和性をまとめた。
【０２１３】
【表２】
0006896989.tif 000003
抗ＬＡＧ−３抗体２＃は、ヒトＬＡＧ−３への結合においてＬＡＧ３．５よりも低いＫＤ値を有していた。
【０２１４】
［実施例９］
抗ＬＡＧ−３抗体はマウスＬＡＧ−３と交差反応しない。
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウスＬＡＧ−３に対する抗体の相対的結合活性を決定した。
【０２１５】
マウスＬＡＧ−３（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。非特異的結合部位を、３７℃、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロックした後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈抗ＬＡＧ−３抗体（クローン２＃、６＃、８＃、１３＃及び１４＃）を結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製された後、固定化タンパク質と共に３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファーで１／１５，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢで展開した後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。
【０２１６】
マウスＬＡＧ−３に結合するこれらのクローンの代表的な結合曲線を図５に示した。
【０２１７】
結果は、クローンがマウスＬＡＧ−３と交差反応しないことを示した。
【０２１８】
［実施例１０］
抗ＬＡＧ−３抗体はヒトＣＤ４と交差反応しない。
ＣＤ４がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したため、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＣＤ４に対する抗ＬＡＧ−３抗体の相対的結合活性を決定した。
【０２１９】
ＣＤ４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を４℃で一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。非特異的結合部位を、３７℃、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロックした後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈抗ＬＡＧ−３抗体（クローン２＃、６＃、８＃、１３＃及び１４＃）を結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製された後、固定化タンパク質と共に３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファーで１／１５，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢで展開した後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。
【０２２０】
ヒトＣＤ４に結合するクローンの代表的な結合曲線を図６に示した。
結果は、これらのクローンがヒトＣＤ４に結合しないことを示した。
【０２２１】
［実施例１１］
抗ＬＡＧ−３抗体は、ＭＨＣクラスＩＩとＬＡＧ−３の相互作用をブロックした。
抗ＬＡＧ−３抗体がＭＨＣクラスＩＩ分子へのヒトＬＡＧ−３の結合を阻害する能力を評価するために、マウスＦｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ｈＬＡＧ−３−ｍＦｃ）に融合したヒトＬＡＧ−３細胞外ドメインを含むＬＡＧ−３融合タンパク質を、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するDaudi細胞と反応させるインビトロ結合アッセイを実施した。
【０２２２】
このアッセイで抗体阻害を試験するために、抗ＬＡＧ−３抗体（クローン２＃及び８＃）を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、これらの連続希釈物にそれぞれｈＬＡＧ−３−ｍＦｃ融合タンパク質を加えた。この混合物を室温で２０分間インキュベートし、２ｘ１０５個のＤａｕｄｉ細胞に適用した。得られた混合物を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し（３分、４００×ｇ）、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーを使用して１回洗浄し、再ペレット化した。ｈＬＡＧ−３−ｍＦｃのＤａｕｄｉ細胞への結合は、Ｒ−ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次試薬を使用して検出された。その後、上記のように細胞を２回洗浄し、ＰＢＳバッファーに再懸濁した。ＬＡＧ−３−ｍＦｃ結合の分析はＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で実施された。
【０２２３】
ＭＨＣクラスＩＩ及びＬＡＧ−３相互作用を遮断するためのＩＣ５０値及び代表的な曲線を図７に示した。
【０２２４】
これらのクローンは、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＬＡＧ−３の間の相互作用をブロックし、クローン２＃がより良い効果を示していることが分かった。
【０２２５】
［実施例１２］
抗ＬＡＧ−３抗体はＬＡＧ−３とＬＳＥＣｔｉｎの相互作用をブロックした。
抗ＬＡＧ−３抗体がヒトＬＳＥＣｔｉｎへのヒトＬＡＧ−３結合を阻害する能力を評価するために、ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイを実施した。
【０２２６】
ヒトＬＡＧ−３（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩インキュベートすることにより９６ウェルプレートに固定化した。非特異的結合部位を、３７℃、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロックした後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈抗ＬＡＧ−３抗体とヒトＩｇＧコントロールを結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で調製し、ビオチン標識ＬＳＥＣｔｉｎ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合し、３７℃で１時間プレートに加えた。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により室温で３０分間インキュベートした。その後、プレートを再度洗浄し、ＴＭＢで展開した後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。
【０２２７】
４５０ｎｍ−６２０ｎｍの吸光度を測定した。これらの抗体の代表的な結合曲線を図８に示した。
【０２２８】
結果は、抗ＬＡＧ−３抗体２＃がヒトＬＡＧ−３とＬＳＥＣｔｉｎの間の相互作用をブロックすることを示した。
【０２２９】
［実施例１３］
抗ＬＡＧ−３抗体がヒトＴ細胞により発現された細胞表面ＬＡＧ−３に結合した。
抗ＬＡＧ３抗体（クローン２＃、８＃、１３＃）を、活性化ヒトＴ細胞上に発現したヒトＬＡＧ−３への結合能力について試験した。
【０２３０】
初代Ｔ細胞は、磁気ビーズを用いて末梢血単核細胞から分離され、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でコーティングされた組織培養プレートで培養された。抗ＬＡＧ−３抗体（クローン２＃、８＃、１３＃）及び陰性対照ＩｇＧ４を細胞に添加し、混合物を４℃で３０分間インキュベートしました。細胞を２回洗浄した。Ｔ細胞上に発現したＬＡＧ−３に対する抗ＬＡＧ−３抗体の結合活性を、Ｒ−ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次試薬を使用して検出し、混合物を４℃で３０分間インキュベートした後、２回洗浄した。次いで、細胞をＰＢＳバッファーに再懸濁した。ＬＡＧ−３結合の分析はＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で実施された。
【０２３１】
ヒトＴ細胞によって発現されたＬＡＧ−３に結合するこれらのクローンの代表的な曲線を図９に示した。
【０２３２】
［実施例１４］
抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＴ細胞にＩＬ−２を放出させた。
初代Ｔ細胞に対する抗ＬＡＧ３抗体（クローン２＃）の機能的活性を、スーパー抗原ＳＥＢにより刺激されたヒトＰＢＭＣ培養物を使用して、抗ＰＤ１抗体（ニボルマブ、ＢＭＳ）及びＩｇＧ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と比較して評価した。
【０２３３】
健康なドナーからのヒトＰＢＭＣをＳＥＢで２４時間刺激した。抗ＬＡＧ３抗体２＃、抗ＰＤ１抗体及びＩｇＧ４をそれぞれ培地に添加した。３日後にＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ２レベルを検出した。
【０２３４】
ＩＬ２レベルを図１０に示した。
【０２３５】
［実施例１５］
抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＴ細胞に用量依存的にＩＦＮｇを放出させた。
初代Ｔ細胞に対する抗ＬＡＧ３抗体２＃の機能的活性を、ヒトＰＢＭＣを使用して評価した。健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でコーティングした組織培養プレートで２４時間培養した。抗ＬＡＧ３抗体２＃を連続希釈し、培地に加えた。３日後に上清中のＩＦＮｇをＥＬＩＳＡにより検出した。
【０２３６】
ＰＢＭＣによって放出されたＩＦＮｇレベルを図１１に示した。
【０２３７】
［実施例１６］
＜カニクイザルにおける抗ＬＡＧ−３抗体の薬物動態＞
カニクイザルにおける抗ＬＡＧ３抗体２＃の薬物動態プロファイルを評価した。研究における動物の世話と使用を含む手順がレビューされ、承認された。中国起源の４匹のナイーブなカニクイザルが使用さした。この研究において、抗ＬＡＧ３抗体２＃を３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で動物に静脈内注射した。血液サンプルは、０〜６７２時間（０〜２８日）のさまざまな時点で取得された。すべてのサンプルを血漿に加工し、分析するまで−７０〜−８６℃で冷凍保存した。血清中に存在する抗ＬＡＧ３抗体２＃の濃度を決定した。
【０２３８】
表３に上記の薬物動態特性を示した。
【０２３９】
【表３】
0006896989.tif 000004
【０２４０】
［実施例１７］
＜ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍に対する抗ＬＡＧ３抗体のインビボ有効性＞
抗ＬＡＧ３抗体単独及び抗マウスＰＤ−１抗体と組み合わせたインビボ有効性をＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍モデルで研究した。
【０２４１】
ここでの実験のために、ヒトＬＡＧ−３の細胞外部分を発現するヒト化マウスＢ６．１２９−ＬＡＧ−３ｔｍ１（ｈＬＡＧ−３）Ｓｍｏｃは上海モデル生物から購入した。
【０２４２】
５０個のＢ６．１２９−ＬＡＧ−３ｔｍ１（ｈＬＡＧ−３）Ｓｍｏｃマウスに０日目に５ｘ１０５個のＭＣ３８−ＯＶＡ細胞を皮下移植し、５つの治療群にランダムに分けた。ＰＢＳ群においてＮ＝８であり、ＩｇＧ４アイソタイプ対照群、ＬＡＧ−３  ２＃群、抗ｍＰＤ１（ラットＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１抗体、クローンＲＰＭＩ−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＢＥ００８９）群、及びＬＡＧ−３  ２＃＋抗ｍＰＤ１併用治療群のそれぞれにおいてＮ＝１０である。３、７、１０、１４及び１７日目に、腹腔内注射によりマウスにＬＡＧ−３  ２＃（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＰＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、アイソタイプ対照抗体（２０ｍｇ／ｋｇ）又はＬＡＧ−３  ２＃（１０ｍｇ／ｋｇ）＋抗ｍＰＤ１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。実験中に、腫瘍体積をキャリパー測定により週に２回監視した（２０日）。
【０２４３】
図１２に示すように、抗ＬＡＧ３抗体２＃及び抗ｍＰＤ１単剤療法により、ＰＢＳ及びＩｇＧ４アイソタイプ対照群と比較して腫瘍成長抑制が得られ、抗ＬＡＧ３抗体２＃と抗ｍＰＤ１の併用により、腫瘍成長の低下を含む有効性の改善が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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