(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドソケイの花の抽出物を有効成分とするＰＤＫ１の活性化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＤＫ１の活性化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、プルメリアスキューバー（Plumeria sucuuba）の抽出液又は樹液がメラニン生成抑制作用を有し、日焼けなどにより生じる皮膚の黒化、色素沈着により生じるシミ、ソバカス等の現象を防止する美白剤の薬効を有することが開示されている。
また、特許文献２には、ケイタンカ（Plumeria rubra L. cv. acutifolia）の花部からの抽出物が、ホスホリパーゼＡ２阻害剤、抗炎症剤、活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は抗酸化剤として使用できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−２６１５４４号公報
【特許文献２】特開２００２−９７１５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
マクロファージは、体内に侵入した細菌やウイルスなどの病原体、ウイルスに感染した細胞や、細胞の死骸等を貧食する細胞であり、食べたものを無毒化するための殺菌成分を産生する。産生される殺菌成分の一つが一酸化窒素である。マクロファージが活性化すると、炎症性サイトカインを分泌し、炎症反応を誘導する。
マクロファージの適切な活性化は免疫において重要であるが、荒れた肌やアトピー性皮膚炎ではバリア機能が低下しているために、異物の侵入が過剰となる。異物の侵入が過剰になるとマクロファージが過剰に活性化するため、過剰な炎症を引き起こし、ピリつきや痒み、赤み等が誘発される。
マクロファージの過剰な活性化は、転写因子であるＮＦ−κＢによって制御される。
ＮＦ−κＢは、通常状態では細胞質に局在しているが、マクロファージが活性化すると、核内に移行することで、炎症性サイトカイン・ケモカイン等の炎症反応に関与する物質の産生を誘導する。
ＮＦ−κＢの核内への移行は、ＮＦ−κＢの抑制因子であるＩκＢαの分解によって誘導される。
【０００５】
本発明は、ＰＤＫ１の活性化抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、インドソケイの花の抽出物が、マクロファージの活性化刺激として、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）を添加した際に起こる一酸化窒素（ＮＯ）の産生を抑制することを見出した。
この見地に基づいた本発明の免疫抑制剤は、インドソケイの花の抽出物を有効成分としてマクロファージの活性化を抑制することを特徴とする。
マクロファージの中で、特にＭ１マクロファージは、炎症誘導型Ｔ細胞（Ｔｈ１）の産生するサイトカインにより、分化・活性化し、ＴＮＦやＩＬ−６を産生することで、過剰な炎症（サイトカインストーム）、肥満脂肪組織でのインスリン抵抗性の誘導等の免疫の過剰な活性化を行う。従って、インドソケイの花の抽出物によって、Ｍ１マクロファージの過剰な活性化を抑制し、免疫の制御を行うことは、サイトカインストームの抑制、肥満によるインスリン抵抗性の抑制に効果があると考えられる。
また、インドソケイの花の抽出物は、ＬＰＳを添加した際のマクロファージにおける、ｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）タンパク質発現及びｉＮＯＳ遺伝子発現を抑制することを見出した。
この見地に基づいた本発明は、マクロファージにおける、ｉＮＯＳタンパク質発現及びｉＮＯＳ遺伝子発現を抑制することを特徴とする。
ｉＮＯＳタンパク質の過剰な産生は、必要以上の血管拡張を誘導し、敗血症、肝炎、肝硬変、関節リウマチを誘導する。従って、ｉＮＯＳのタンパク質・遺伝子発現の抑制は、これら疾患に対して効果があると考えられる。
また、インドソケイの花の抽出物は、ＬＰＳを添加した際のＩκＢαの分解を抑制し、ＮＦ−κＢの核局在を抑制することを見出した。
この見地に基づいた本発明は、ＮＦ−κＢの抑制因子であるＩκＢαの分解を抑制することで、マクロファージの活性化を抑制することを特徴とする。
ＩκＢαはＮＦ−κＢの抑制因子である為、ＩκＢαの分解抑制はＮＦ−κＢの関与する疾患に対して抑制効果を持つと考えられる。従って、ＩκＢαの分解抑制によるＮＦ−κＢの抑制は、ＮＦ−κＢの活性化が強く関与するとされている、腫瘍の悪性化（癌）、癌の転移、白血病、アトピー性皮膚炎、動脈硬化などの癌・炎症性疾患・自己免疫疾患に対して効果があると考えられる。
また、インドソケイの花の抽出物は、ＮＦ−κＢの活性化を誘導する酵素であるＰＤＫ１（３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ）の活性化を抑制することを見出した。
この見地に基づいた本発明は、ＮＦ−κＢの活性化を誘導するＰＤＫ１の活性化を抑制することを特徴とする。
ＰＤＫ１とその下流で活性化するAktは、過剰に活性化することで、腫瘍の悪性化（癌）、糖尿病、心筋梗塞などに関与する。従って、ＰＤＫ１／Ａｋｔ経路の活性化抑制はこれら疾患に対して効果があると考えられる。
本発明による皮膚外用剤は、免疫抑制剤を含有することを特徴とする。
皮膚外用剤は、例えば、洗顔料、クレンジング、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック、ファンデーション、サンスクリーン、ボディケアとして利用できる。
ＮＦ−κＢ抑制成分を配合することで、アトピー性皮膚炎などの過剰な免疫による症状に対しての予防的効果が期待できる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＰＤＫ１の活性化抑制剤によれば、腫瘍の悪性化（癌）、糖尿病、心筋梗塞などの疾患に対して効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｇｒｉｅｓｓ法による一酸化窒素の産生抑制を示すグラフ
【図２】ｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）タンパク質発現及びｉＮＯＳ遺伝子発現の抑制を示すグラフ
【図３】Protein blottingによるＮＦ−κＢの抑制効果を示す写真
【図４】Protein blottingによるＩκＢαの分解抑制を示す写真及びグラフ
【図５】Protein blottingによるＡｋｔのリン酸化の抑制を示す写真
【図６】In vitro kinase assayによるＰＤＫ１の抑制効果を示すグラフ
【図７】化粧水の配合例を示す成分表
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明におけるインドソケイは、リンドウ目、キョウチクトウ科の植物で、学名はプルメリアルブラ（Plumeria rubra）である。
本発明の免疫抑制剤は、インドソケイの花の抽出物であり、以下に示す解析では、インドソケイの花を含水エタノールで抽出したエキスを用いた。
ここで、抽出物は、抽出処理によって得られる抽出液、又はこの抽出液を乾燥させた乾固物のいずれでもよく、抽出液は適宜、希釈したり、濃縮して用いることができる。
抽出に用いるインドソケイの花は、乾燥させたものを用いることもでき、抽出にあたっては粉砕したものを用いることが好ましい。
【実施例】
【００１０】
[製造例]
インドソケイの花の粉砕物に、８０％エタノール（水とエタノールの重量比１：４）を１５倍量加え、還流抽出を行い、インドソケイの花からの抽出液を得た。この抽出液からエタノールを減圧除去し、抽出液を凍結乾燥することでインドソケイ花抽出乾燥物（以下、インドソケイ花抽出物）を得た。
【００１１】
[試験方法]
マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４に対し、ＬＰＳを処理することで誘導される一酸化窒素の産生量を測定することで、インドソケイ花抽出物の一酸化窒素の産生に与える効果の検証を行った。具体的には、９６穴プレートに１ウェルあたり約１０,０００細胞を１００μｌの培地で播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した後、ＤＭＳＯに溶解させたインドソケイ花抽出物を１時間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃で２０時間培養した。培養完了後、Ｇｒｉｅｓｓ法により一酸化窒素の産生量を測定し、ＭＴＴ法により、細胞数の測定を行った。Ｇｒｉｅｓｓ法は、培養上清５０μｌを別の９６穴プレートに取り、５０μｌのSulfanilamide Solution（1% sulfanilamide［Wako, Japan］ in 5％ phosphoric acid ［Wako, Japan］）を添加した後、５０μｌのNED Solution（0.1% N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride ［Wako, Japan］ in water)を添加して呈色反応を行った後、５６２ｎｍの吸光度を測定することで実施した。ＭＴＴ法は、一酸化窒素測定用の培養上清除去後の９６穴プレートに対し、５％ＭＴＴ（MTT［Wako, Japan］in water）を５μｌ添加し、３７℃で２時間培養することでホルマザン沈殿を生成させた。培地を除去した後に、ホルマザン沈殿を１００μｌのイソプロパノール［Wako, Japan］で溶解させ、５７０ｎｍの吸光度を測定することで実施した。
【００１２】
[試験結果]
図１は、Ｇｒｉｅｓｓ法による一酸化窒素の産生抑制を示すグラフである。
ＬＰＳを添加することで６倍の一酸化窒素を産生するが、インドソケイ花抽出物を１００[ｕｇ／ｍｌ]添加することで一酸化窒素の産生を２４％程度抑制している。
【００１３】
[試験方法]
インドソケイ花抽出物の一酸化窒素合成酵素ｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）のタンパク質発現に与える効果の検討はProtein blottingによって行った。具体的には、ＲＡＷ２６４細胞を、６穴プレートに１ウェルあたり約５００,０００細胞で播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した後、ＤＭＳＯに溶解させたインドソケイ花抽出物を１時間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃で２０時間培養し、RIPA buffer（Cell Signaling Technology, USA）を用いて細胞内のタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質濃度をブラッドフォード法（Bio-Rad, USA）で測定し、４〜２０％ＴＧＸゲル（Bio-Rad, USA）を用い、1ウェル当たり１０μgのタンパク量の条件で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad, USA）に転写し、抗ｉＮＯＳ抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（Cell Signaling Technology, USA）を用いてタンパク質バンドの検出を行った。
インドソケイ花抽出物の一酸化窒素合成酵素ｉＮＯＳの遺伝子発現に与える効果の検討は定量化ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法によって行った。具体的には、ＲＡＷ２６４細胞を、６穴プレートに１ウェルあたり約５００,０００細胞で播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した後、ＤＭＳＯに溶解させたインドソケイ花抽出物を１時間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃で２０時間培養し、ReliaPrep RNA Miniprep Systems（Promega, USA）を用いてＲＮＡの抽出を行った。抽出したＲＮＡをHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, USA）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。逆転写したｃＤＮＡをTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO, Japan）を用いて解析し、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、ｉＮＯＳの遺伝子発現の検出を行った。
【００１４】
[試験結果]
図２はｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）タンパク質発現及びｉＮＯＳ遺伝子発現の抑制を示すグラフである。
図２（ａ）はProtein blottingによるｉＮＯＳタンパク質発現を示す写真、図２（ｂ）は定量ＰＣＲによるｉＮＯＳ遺伝子発現の抑制を示すグラフである。
図２に示すように、インドソケイ花抽出物は、ｉＮＯＳタンパク質発現及びｉＮＯＳ遺伝子発現を抑制している。
【００１５】
[試験方法]
インドソケイ花抽出物の一ＮＦ−κＢ活性化に与える効果の検討は核内タンパク質を用いたProtein blottingによって行った。具体的には、ＲＡＷ２６４細胞を、６cmディッシュに１ディッシュあたり約１,０００,０００細胞で播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した後、ＤＭＳＯに溶解させたインドソケイ花抽出物を１時間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃で培養した。培養完了後、Buffer CE（10 mM HEPES-KOH[pH 7.9], 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 600 μg/ml PMSF）を５００μｌ添加し細胞質を溶解し、セルスクレーパーを用いて細胞核を回収し、４,０００ｘｇで５分間遠心をかけ、上清を除去することで核ペレットを得た。核ペレットに対しBuffer CEを５００μｌ添加し、核ペレットの洗浄を行い、４,０００ｘｇで５分間遠心をかけ、上清を除去した後にBuffer NE（250 mM Tris-HCl [pH 7.8], 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mg/ml PMSF）を５０μｌ添加し、凍結融解を５回繰り返して核内タンパク質の抽出を行った。その後、1４,０００ｘｇで５分間遠心をかけ、上清を核内タンパク質画分として回収した。抽出したタンパク質濃度をブラッドフォード法（Bio-Rad, USA）で測定し、４〜２０％ＴＧＸゲル（Bio-Rad, USA）を用い、１ウェル当たり５μgのタンパク量の条件で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad, USA）に転写し、抗ＲｅｌＡ抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗ＲｅｌＢ抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗ｐ５０抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（Cell Signaling Technology, USA）、を用いてタンパク質バンドの検出を行った。
【００１６】
[試験結果]
図３はProtein blottingによるＮＦ−κＢの抑制効果を示す写真である。
０．１％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide））と１００[ｕｇ／ｍｌ]のインドソケイ花抽出物を用い、ＮＦ−κＢを構成するタンパク質として、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、及びｐ５０を用い、核内タンパク質のコントロールとしてラミンＡ／Ｃ（Lamin A/C）を用い、１００[ｎｇ／ｍｌ]のＬＰＳに対して１２０ｍｉｎまでの時間経過による変化を示している。
図３に示すように、インドソケイ花抽出物は、ＮＦ−κＢを抑制している。
【００１７】
[試験方法]
インドソケイ花抽出物のＮＦ−κＢ抑制因子ＩκＢαの分解に対する効果の検討はProtein blottingによって行った。具体的には、ＲＡＷ２６４細胞を、ＲＡＷ２６４細胞を、６穴プレートに１ウェルあたり約５００,０００細胞で播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した後、ＤＭＳＯに溶解させたインドソケイ花抽出物を１時間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃で培養し、RIPA buffer（Cell Signaling Technology, USA）を用いて細胞内のタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質濃度をブラッドフォード法（Bio-Rad, USA）で測定し、４〜２０％ＴＧＸゲル（Bio-Rad, USA）を用い、1ウェル当たり１０μgのタンパク量の条件で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad, USA）に転写し、抗phospho-ＩκＢα抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗ＩκＢα抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗β−ａｃｔｉｎの抗体（Cell Signaling Technology, USA）を用いてタンパク質バンドの検出を行った。
【００１８】
[試験結果]
図４はProtein blottingによるＩκＢαの分解抑制を示す写真及びグラフである。
０．１％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide））と１００[ｕｇ／ｍｌ]のインドソケイ花抽出物を用い、図４（ａ）はProtein blottingによる、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢα、ＩκＢα、及びβ−ａｃｔｉｎについて、１００[ｎｇ／ｍｌ]のＬＰＳに対して１２０ｍｉｎまでの時間経過による変化を示す写真、図４（ｂ）はβ−ａｃｔｉｎに対するＩκＢαの比率を示すグラフである。
図４に示すように、インドソケイ花抽出物は、ＩκＢαの分解を抑制することでＮＦ−κＢを抑制している。
【００１９】
[試験方法]
インドソケイ花抽出物のAktのリン酸化に対する効果の検討はProtein blottingによって行った。具体的には、ＲＡＷ２６４細胞を、６穴プレートに１ウェルあたり約５００,０００細胞を播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した後、ＦＢＳ不含の培地に変え、６時間培養することで、Starvationを行った。Starvationの後、ＤＭＳＯに溶解させたインドソケイ花抽出物を１時間前処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃で培養し、RIPA buffer（Cell Signaling Technology, USA）を用いて細胞内のタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質濃度をブラッドフォード法（Bio-Rad, USA）で測定し、４〜２０％ＴＧＸゲル（Bio-Rad, USA）を用い、1ウェル当たり１０μgのタンパク量の条件で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad, USA）に転写し、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Thr３０８）抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ser４７３）抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＫ１抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＴＥＮ抗体（Cell Signaling Technology, USA）、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（Cell Signaling Technology, USA）を用いてタンパク質バンドの検出を行った。
【００２０】
[試験結果]
図５はProtein blottingによるＡｋｔのリン酸化の抑制を示す写真である。
０．１％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide））と１００[ｕｇ／ｍｌ]のインドソケイ花抽出物を用い、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、Ａｋｔ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＫ１、及びＰｈｏｓｐｈｏ−ＰＴＥＮについて、１００[ｎｇ／ｍｌ]のＬＰＳに対して１２０ｍｉｎまでの時間経過による変化を示している。
図５に示すように、インドソケイ花抽出物は、Ａｋｔのリン酸化を抑制している。
【００２１】
[試験方法]
インドソケイ花抽出物のＰＤＫ１の活性に対する効果の検討はPDK1 kinase assay kit（MBL, Japan）を用いたIn vitro kinase assayによって行った。
【００２２】
[試験結果]
図６はIn vitro kinase assayによるＰＤＫ１の抑制効果を示すグラフである。
図６に示すように、インドソケイ花抽出物は、溶媒に対してＰＤＫ１の活性を抑制している。
【００２３】
図７は化粧水の配合例を示す成分表である。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、腫瘍の悪性化（癌）、糖尿病、心筋梗塞などに関与するＰＤＫ１の活性化を抑制できる。
【要約】
【課題】マクロファージの活性化を抑制する免疫抑制剤を提供すること。
【解決手段】本発明の免疫抑制剤は、インドソケイの花の抽出物を有効成分としてマクロファージの活性化を抑制することを特徴とし、マクロファージにおける、ｉＮＯＳタンパク質発現及びｉＮＯＳ遺伝子発現を抑制する。特に、過剰な炎症（サイトカインストーム）や肥満脂肪組織でのインスリン抵抗性の誘導等の免疫の過剰な活性化を行うＭ１マクロファージの過剰な活性化を、インドソケイの花の抽出物によって抑制して免疫の制御を行う。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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