(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮からの天然分子の単離方法であって、前記方法が：
ａ．アルトカルプス・ヒルスタスの前記幹皮を切断及び乾燥し、及びすり潰して粗粉末にする工程、
ｂ．工程ａの前記幹皮粉末をエタノール（ｗ／ｖ比率  １：１０）で３回、各３時間還流して、３つの分離した抽出物を得る工程、
ｃ．工程ｂの前記抽出物をまとめ、及び減圧で５５〜６０℃の間で濃縮し、及び２倍量の水で懸濁し、続いてｎ−ヘキサン（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）、クロロホルム（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）、及び酢酸エチル（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）を用いて分画する工程、
ｄ．工程ｃの前記クロロホルム層をシリカゲルカラム（６０〜１２０メッシュ）で精製し、続いてジクロロメタン及びジクロロメタン／アセトン（９８：２から９０：１０）を用いて溶出し、及び各２５０ｍＬの８０分画を収集する工程、
ｅ．工程ｄの前記分画を、ＴＬＣを用いて比較し、及び類似した分画（３３〜６７）をまとめ、続いて真空下で濃縮及び乾燥して濃縮物質を得る工程、
ｆ．工程ｅで得られた前記濃縮物質を、ジクロロメタンを用いて洗浄して、分光技術を用いてＳＴＲ＃１で表されるα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの９０〜５０：１０〜５０の比率のアノマー混合物として特徴づけられる粉末を供給し、及び濾過する工程、
0006896885.tif 000010
ｇ．工程ｆの前記濾過液をシリカゲルでさらに精製し、かつｎ−ヘキサン−酢酸エチル（７０：３０）を用いて溶出して、分光技術を用いてＳＴＲ＃２で表されるアルトニンＥとして特徴づけられる化合物を供給する工程、
0006896885.tif 000011
を含む、方法。
【請求項２】
α対βピラノシクロアルトビロキサントンＡの前記比率が、７０：３０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトの身体に適用される方法を除いた、アクネ菌の阻害方法であって、前記方法が、アクネ菌を、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された有効濃度のピラノシクロアルトビロキサントンＡに接触させる工程を含む、方法。
【請求項４】
ピラノシクロアルトビロキサントンＡが、９０〜５０：１０〜５０の比率のα及びβアノマーとして存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
α対βピラノシクロアルトビロキサントンＡの前記比率が、７０：３０である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトの身体に適用される方法を除いた、アクネ菌の阻害方法であって、前記方法が、アクネ菌を、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された有効濃度のアルトニンＥに接触させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してアルトカルプス・ヒルスタス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）の天然分子に関連する。より具体的には、本発明はアルトカルプス・ヒルスタスから天然分子を単離する方法及びそれらの尋常性ざ瘡の治療管理における使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の主要な疾患のうちの一つである尋常性ざ瘡（アクネ）は、毛嚢脂腺ユニット（油胞に関連する毛嚢）に影響を及ぼす。それは、変化した濾胞性の角化、ホルモンのアンバランス、免疫過敏症、及び細菌（アクネ菌：Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ又はＰ．ａｃｎｅｓ）によって引き起こされ、皮膚に膿疱、小瘤、小さなこぶ（丘疹）、及びニキビ又は吹き出物のいずれかを伴う面疱をもたらす（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，  Ｌａｎｃｅｔ，３７９：３６１−３７２）。多くの局所的及び経口の薬品がアクネ菌を制御するために市販されているが、合成性質及び重大な副作用のために、法的に制限されている。注目すべき効能；最小限の毒性及び患部のみを標的とする能力、を有する薬学的活性には、多くの需要がある。したがって、増大した安全性、忍容性及びアクネ菌に対する効能を有する植物化学物質は、尋常性ざ瘡の治療にとって非常に有効であろう。クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）に属するアルトカルプス・ヒルスタスは、広範囲の治療用途を有することが報告されている。当該植物の樹皮は、ニキビ及び皮膚亀裂の治療で知られている（アルトカルプス・ヒルスタス：インド政府の、環境・森林・気候変動省の、薬用植物の保全に関するＥＮＶＩＳセンター）。これは、アルトカルプス・ヒルスタス樹皮の創傷治癒及び抗炎症能力を示唆している。しかしながら、アクネ菌に対するアルトカルプス・ヒルスタスの抗菌効果は未だ予想されておらず、又は自明でない。本発明はこの技術的問題を、アルトカルプス・ヒルスタスからの生理活性分子の単離方法を開示すること及びそれらのアクネ菌に対する抗菌活性を評価することにより、解決する。
【０００３】
アルトカルプス・ヒルスタスに存在する天然分子を単離及び同定する方法を開示することは、本発明の主目的である。
アクネ菌の成長を阻害することによるアルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された分子の抗アクネ能力を開示することは、本発明のさらなるもう一つの目的である。
本発明は前記目的を達成し、かつさらなる関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮からの天然の生物学的に活性のある分子を、単離及び特徴づける方法を開示する。本発明は、アルトカルプス・ヒルスタスの単離された分子の、アクネ菌の成長を阻害する能力による抗アクネの可能性も開示する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下のより詳細な記述説明によって、例として発明の原理を説明する添付の図面と併せて、明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡ（Ｐｙｒａｎｏｃｙｃｌｏａｒｔｏｂｉｌｏｘａｎｔｈｏｎｅ  Ａ）の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２ａ】図２ａは、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの大気圧化学イオン化−質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）データを示す。
【図３ａ】図３ａは、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの大気圧化学イオン化−質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）データを示す。
【図４】図４は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡのフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）スペクトルを示す。
【図５】図５は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡのＤ2Ｏを交換した1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたアルトニンＥの大気圧化学イオン化−質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）データを示す。
【図６ａ】図６ａは、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたアルトニンＥの大気圧化学イオン化−質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）データを示す。
【図７】図７は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたアルトニンＥの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】図８は、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離されたアルトニンＥの13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】図９は、単離された化合物α及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡ並びにアルトニンＥのアクネ菌に対する阻害領域を示す。標準試料（クリンダマイシン）をコントロールとして含む。
【図１０】図１０は、化合物α及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡ並びにアルトニンＥのアクネ菌に対する阻害領域のグラフ表示を示す。標準試料（クリンダマイシン）をコントロールとして含む。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の最も好ましい実施形態においては、アルトカルプス・ヒルスタスの樹皮からの天然分子の単離方法であって、前記方法は：
ａ）アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮を切断及び乾燥し、及びすり潰して粗粉末にする工程、
ｂ）工程ａの前記幹皮粉末をエタノール（ｗ／ｖ比率  １：１０）で３回、各３時間還流して、３つの分離した抽出物を得る工程、
ｃ）工程ｂの抽出物をまとめ、及び減圧で５５〜６０℃の間で濃縮し、及び２倍量の水で懸濁し、続いてｎ−ヘキサン（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）、クロロホルム（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）、及び酢酸エチル（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）を用いて分画する工程、
ｄ）工程ｃの前記クロロホルム層をシリカゲルカラム（６０〜１２０メッシュ）で精製し、続いてジクロロメタン及びジクロロメタン／アセトン（９８：２から９０：１０）を用いて溶出し、及び各２５０ｍＬの８０分画を収集する工程、
ｅ）工程ｄの前記分画を、ＴＬＣを用いて比較し、及び類似した分画（３３〜６７）をまとめ、続いて真空下で濃縮及び乾燥して濃縮物質を得る工程、
を含む。
ｆ）工程ｅで得られた前記濃縮物質を、ジクロロメタンを用いて洗浄して、分光技術を用いてＳＴＲ＃１で表されるα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの９０〜５０：１０〜５０の比率のアノマー混合物として特徴づけられる粉末を供給し、及び濾過する工程、
0006896885.tif 000002
STR #1
ｇ）工程ｆの前記濾過液をシリカゲルでさらに精製し、かつｎ−ヘキサン−酢酸エチル（７０：３０）を用いて溶出して、分光技術を用いてＳＴＲ＃２で表されるアルトニンＥとして特徴づけられる化合物を供給する工程、
0006896885.tif 000003
STR #2
を含む、方法。
【０００７】
関連する実施形態においては、ピラノシクロアルトビロキサントンＡは、７０：３０の比率のα及びβアノマーとして存在する。
【０００８】
好ましい実施形態においては、本発明はアクネ菌の阻害方法を開示し、前記方法は、アクネ菌を、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された有効濃度のピラノシクロアルトビロキサントンＡに接触させる工程を含む。関連する実施形態においては、ピラノシクロアルトビロキサントンＡは、９０〜５０：１０〜５０の比率のα及びβアノマー（＃ＳＴＲ１）として存在する。より具体的には、ピラノシクロアルトビロキサントンＡは、７０：３０の比率のα及びβアノマーとして存在する。さらなる別の好ましい実施形態においては、本発明はアクネ菌の阻害方法を開示し、前記方法は、アクネ菌を、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された有効濃度のアルトニンＥに接触させる工程を含む。
【０００９】
以下に含まれる具体例は、本発明の最も好ましい実施形態を説明する。
【００１０】
実施例Ｉ：アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮からの生理活性分子の単離
植物材料の収集
アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮を、インドのカルナータカ州ウドゥピ地区から収集した。すべてのサンプルは植物学者によって本物であることが証明され、かつサンプル証書をハーバリウム（ＲＤ／ＨＡＲ−ＡＨ／１１）の中で保管した。幹皮を小片に切断し、かつ日陰で乾燥させた。乾燥した材料を粗粉末に粉砕し、かつ気密容器中に貯蔵した。
【００１１】
抽出物の調製
アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮粉末（３ｋｇ）を、エタノール（ｗ／ｖ比率  １：１０）を用いて３回、各３時間還流した。抽出物を、減圧で５５〜６０℃の間で、まとめかつ濃縮した。エタノール抽出物（収量：１３８ｇ）を、気密容器で貯蔵する前に、真空下で濾過しかつ完全に乾燥させた。
【００１２】
分析方法
順相ＴＬＣを、プレコートされたシリカゲルＦ254プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｔｄ．、インド、ムンバイ）で実行し、かつ産出物のスポットをＵＶ（ＵＶ−２５４／３６６ｎｍ）又はヨウ素蒸気のいずれかにより可視化した。液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）分析を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＬＡＭ  １０２３４）で行った。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）及び13Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ）スペクトルを、ＶＡＲＩＡＮ  ＮＭＲ  分光計に記録した。ケミカルシフト（δ値）を、ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）で、ＴＭＳに関しては内部標準として報告し、ＤＭＳＯ−ｄ6を溶媒として用いた。カラムクロマトグラフィーをシリカゲル（メッシュ  ６０−１２０）で実行した。赤外スペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＦＴＩＲ分光計上に記録した。
【００１３】
活性分子の単離
エタノール抽出物を、水で懸濁し、かつヘキサン、クロロホルム及び酢酸エチルを用いて分画した。クロロホルム抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。カラムをジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）中でシリカゲル（６０−１２０  メッシュ）を用いてロードし、ＣＨ2Ｃｌ2及びＣＨ2Ｃｌ2／アセトンで溶出し、かつ各２５０ｍＬの８０分画を収集した。類似の分画を、ＴＬＣ分析の実証の後にまとめた。分画３３から６７を、真空下でまとめ、濃縮し、かつ乾燥させた。得られた材料を、ＣＨ2Ｃｌ2を用いて洗浄して、黄色の粉末であるピラノシクロアルトビロキサントンＡ（ＳＴＲ＃１）を供給した。濾過液をシリカゲルでさらにクロマトグラフし、かつヘキサン−酢酸エチル（７０：３０）を有する溶出液により、黄色の固体であるアルトニンＥ（Ａｒｔｏｎｉｎｅ  Ｅ）（ＳＴＲ＃２）が供給された。
【００１４】
アルトカルプス・ヒルスタス幹皮のエタノール抽出物の、シリカゲルでの広範な分画及び精製により、２つの化合物、ｉ）キサントン誘導体である、ピラノシクロアルトビロキサントンＡ（ＳＴＲ＃１）、及び、フラボノイドである、アルトニンＥが単離された。ピラノシクロアルトビロキサントンＡは、融解点２６８−２７０℃（ｄｅｃ．）を有する黄色の粉末として得られた。ピラノシクロアルトビロキサントンＡの1Ｈ（図１）及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図２、２ａ及び２ｂ）は、７０及び３０の比率の２つの異性体の存在を明確に証明し、かつ分子中の糖鎖の存在に起因して構成される、２つの立体構造異性体であるα（７０％）及びβ（３０％）に割り当てられた。結果として、1Ｈ（図１）及び13Ｃ  ＮＭＲ（図２、２ａ及び２ｂ）スペクトル中の他のシグナルはアノマーの比率が７０：３０であることを、明確に立証した。
【００１５】
ピラノシクロアルトビロキサントンＡのＡＰＣＩ−ＭＳ（図３及び３ａ）は、ｍ／ｚ  ４５１．２０（Ｍ＋Ｈ）+のポジティブモード及びｍ／ｚ  ４４９．０９（Ｍ−Ｈ）-のネガティブモードにおける分子イオンピークに一致し、当該分子の分子量が４５０であることを表している。ＦＴＩＲスペクトル（図４、表１）は、ヒドロキシル基及びコンジュゲートされたカルボニル基の存在を示し、それぞれ３３８７及び１６５９ｃｍ-1の吸光を有していた。
【表１】
0006896885.tif 000004
【００１６】
化合物の可溶性は、ＤＭＳＯを除いたほとんどの溶媒において比較的低く、したがって1Ｈ  ＮＭＲ及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトルをＤＭＳＯ−ｄ６において記録した。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいては、カルボニルに近接したフェノールＯＨ（５−ＯＨ）は、δ１３．３６ｐｐｍ（７０％）及び１３．３３ｐｐｍ（３０％）の低磁場シグナルから割り当てられ、かつこれらの２つのシグナルは、約７０：３０の比率の２つの立体構造異性体α及びβの存在が原因であることが明らかとなった。δ７．１５ｐｐｍ（〜３０％）及び６．９４ｐｐｍ（〜７０％）の２つのダブレットの割り当ては、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて重要である。Ｄ２Ｏを交換した1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図５）におけるこれらの２つのシグナルの消失にもかかわらず、これらの２つのダブレットシグナルが、アノメリックプロトン（１４−Ｈ）との強力なカップリングを維持するヒドロキシル基（１４−ＯＨ）の存在により出現したことに他ならないことを確実にした。したがって、δ７．１５ｐｐｍ（ｄ、〜３０％、β−ＯＨ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）及び６．９４ｐｐｍ（ｄ、〜７０％、α−ＯＨ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）のシグナルが、アノメリック１４−ＯＨに一致して割り当てられた。同様に、アノメリックプロトン（１４−Ｈ）が、１４−ＯＨとのさらなるカップリングのためにダブレットとして現れると予想されたが、１つはδ５．３２ｐｐｍ（ｄｄ、〜７０％、１４−α−Ｈ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、２．１Ｈｚ）の２つのダブレット及びもう１つは４．８７ｐｐｍ（ｔ、〜３０％、１４−β−Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）である２つのシグナルとして現れた。１４−α／β−Ｈにおける１４−ＯＨによるカップリング干渉はＤ２Ｏを交換した1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図５）において消失し、かつシグナルはδ５．２８（ｄ、〜７０％、１４−α−Ｈ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）及び４．８１ｐｐｍ（ｄ、〜３０％、１４−β−Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）でダブレットとして明確に出現した。予想したように、〜７０：３０のシグナル比は、13Ｃ  ＮＭＲスペクトルにも反映されていた。カルボニル（Ｃ−４）ピークがδ１７９．２（〜７０％）及び１７９．２（〜３０％）ｐｐｍに出現することが観察された。最も重要なことに、特徴的なアノメリックＣ−１４シグナルが、それぞれＣ−１４β及びＣ−１４αアノマーに一致する、δ９７．６（〜３０％）及びδ９３．２（〜７０％）ｐｐｍの２つの位置に見つかった。1Ｈ及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトルの他の特徴的なシグナルの存在は、化合物がおよそ７０：３０の比のα及びβ−ピラノシクロアルトビロキサントンＡの混合物であることを確証した（表２）。ピラノシクロアルトビロキサントンＡの分析データは、Ｈａｓｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｘａｎｔｈｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｏｂｔｕｓｕｓ，Ｊ  Ａｓｉａｎ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ，１２（２）：１０６−１１２によって報告されているピラノシクロアルトビロキサントンＡに匹敵するものであった。しかしながら、報告されている構造は単一の立体構造異性体として立証される一方で、本発明は、この分子を２つの立体構造異性体（α及びβ）の混合物として報告している。上記説明したような、α及びβ−ピラノシクロアルトビロキサントンＡの混合物の７０：３０の説明した比率にもかかわらず、当技術分野の通常の技術を有する者にとっては、当該比率が、原材料、季節及び気候の変動並びに原材料の原産地に依存して変動し得ることは明らかである。したがって、α及びβ−ピラノシクロアルトビロキサントンＡの間の比率におけるすべての例示的な変動は、本特許出願において想定され、かつ包含される。α及びβ−ピラノシクロアルトビロキサントンＡの1Ｈ  ＮＭＲ及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、以下のデータとともに表２に明示した：
【００１７】
α及びβ−ピラノシクロアルトビロキサントンＡ：融解点：２６８−２７０℃（ｄｅｃ．）を有する黄色の粉末；ＩＲ（ＫＢｒ）νmax。（表１）1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、ｄ−６、３００ＭＨｚ）（表２）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ）（表２）；ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５１．２０（Ｍ＋Ｈ+）及び４４９．０９（Ｍ−Ｈ-）（Ｃ25Ｈ22Ｏ8は４５０．４３７３を要する）（図３及び３ａ）。
【表２】
0006896885.tif 000005
0006896885.tif 000006
【００１８】
アルトニンＥ（ＳＴＲ＃２）は、黄色の粉末として単離された。質量スペクトル（ＡＰＣＩ−ＭＳ）（図６及び６ａ）は、ｍ／ｚ  ４３７．０９（Ｍ＋Ｈ）+のポジティブモード及び４３５．０５（Ｍ−Ｈ）-のネガティブモードにおける分子イオンピークを示し、化合物２の分子量４３６に一致した。1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図７）においては、δ６．６８、６．４６及び６．２１の３つのシングレットは、（Ｈ−３’、Ｈ−６’及びＨ６）の３つのアノメリックプロトンに一致する一方で、δ１３．２ｐｐｍのシグナルはキレート化したフェノールプロトン（５−ＯＨ）を示した。プレニル側鎖の存在は、δ５．０５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｈ−１０）、３．０３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、Ｈ−９）、１．５６（ｓ、３Ｈ、Ｈ−１３）及び１．４１（ｓ、３Ｈ，Ｈ−１２）の対応する特徴的シグナルから確認された。同様に、δ６．５２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．９Ｈｚ、Ｈ−１４）、δ５．６９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．９Ｈｚ、Ｈ−１５）、δ１．４１（６Ｈ、ｓ、Ｈ−１７及びＨ−１８）は、２，３−ジメチルピラン環の存在を確実にした。13Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図８）における特徴的シグナルの存在も、当該構造を確証した。当該分析値がＳｒｉｔｕｌａｒａｋ  ｅｔ．ａｌ．，（２０１０）Ｎｅｗ  ２−Ａｒｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｒｏｏｔ  Ｂａｒｋ  ｏｆ  Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｌａｋｏｏｃｈａ，Ｍｏｒｅｃｕｌｅｓ，１５：６５４８−６５５８に十分に相関することが見つかり、かつその結果、以下のスペクトルデータを有するアルトニンＥとして同定された。
【００１９】
アルトニンＥ：２４２−２４６℃の融解点を有する黄色の粉末；ＩＲ（ＫＢｒ）νmax３４２６、２９８２、１６４２、１５６０、１５２３、１４６２、１３５５、１１５４、８２８、７６７、６９８ｃｍ-1。ＵＶ（メタノール）ｍａｘ  ２０４、２６７．５、３５０ｎｍ。1Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δ１３．２（ｓ、１Ｈ、５−ＯＨ）、９．５、９．３、８．６（３ｓ、３Ｈ、２’、４’、５’−ＯＨ）、６．６８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−６’）、６．５２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．９Ｈｚ、Ｈ−１４）、６．４６（ｓ、１Ｈ、Ｈ−３’）、６．２１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−６）、５．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．９Ｈｚ、Ｈ−１５）、５．０５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、Ｈ−１０）、３．０３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、Ｈ−９）、１．５６（ｓ、３Ｈ、Ｈ−１３）、１．４１（ｓ、９Ｈ、Ｈ−１２、Ｈ−１７及びＨ−１８）（図７）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ）：δ１８１．８（Ｃ−４）、１６１．７（Ｃ−２）、１６０．９（Ｃ−５）、１５８．５（Ｃ−７）、１５１．７（Ｃ−８ａ）、１４８．８（Ｃ−２’）、１４８．５（Ｃ−４’）、１３８．０（Ｃ−５’）、１３１．４（Ｃ−１１）、１２７．７（Ｃ−１５）、１２１．５（Ｃ−１０）、１１９．９（Ｃ−３）、１１６．１（Ｃ−６’）、１１４．２（Ｃ−１４）、１０９．３（Ｃ−１’）、１０４．２（Ｃ−４ａ）、１０３．９（Ｃ−３’）、１００．５（Ｃ−８）、９８．８（Ｃ−６）、７８．１（Ｃ−１６）、２９．６（Ｃ−１７）、２７．７（Ｃ−１８）、２５．５（Ｃ−１３）、２３．７（Ｃ−９）、１７．４（Ｃ−１２）（図８）；ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４３７．０９（Ｍ＋Ｈ+）及び４３５．０５（Ｍ−Ｈ-）、（Ｃ25Ｈ24Ｏ7は４３６．４５３９を要する）（図６及び６ａ）。
【００２０】
実施例ＩＩ：ピラノシクロアルトビロキサントンＡ及びアルトニンＥの抗アクネ能力
アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮抽出物から単離された化合物１及び２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗アクネ活性を、ざ瘡（アクネ）を引き起こす細菌であるアクネ菌に対して評価した。抗菌性活性を、寒天ウェル拡散法（ａｇａｒ  ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって測定した。次いで、当該化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、微量液体希釈法によって確認した。
【００２１】
微生物：ざ瘡（アクネ）を引き起こすアクネ菌（ＡＴＣＣ１１８２７）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、アメリカから調達した。
【００２２】
培地：Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ａｇａｒ（Ｈｉ  Ｍｅｄｉａ；Ｍ１５４）及びＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｒｏｔｈ（Ｈｉ  Ｍｅｄｉａ；Ｍ４４３）を、本実験で用いた。
【００２３】
抗菌性活性の測定
単離された化合物の抗菌性活性を、寒天ウェル拡散法により実行した。サンプルをＤＭＳＯに溶解して、０．５−１００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度を得た。アクネ菌を、Ｈｉ  Ｍｅｄｉａから調達したＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ａｇａｒ（ＲＣＡ）Ｍ１５４上で培養し、かつ８０％窒素、１０％二酸化炭素、及び１０％の水素を含有する混合ガスを供給する嫌気性チャンバー内で、３７℃で４８時間インキュベートした。細菌培養液を無菌生理食塩水中に懸濁し、かつ１．０×１０8ＣＦＵ／ｍＬ（ＣＬＳＩ、Ｍ０２−Ａ１１；Ｖｏｌ．３２  Ｎｏ．１）に調整した。無菌ＲＣＡを標準化したアクネ菌の培養液とともに播種し、プレートに注いだ。寒天培地を、凝固させた。直径７ｍｍの互いに等距離のウェルを、寒天の表面に無菌のボーラーを用いて穴あけした。各サンプル、希釈液コントロール（ＤＭＳＯ）、及び標準抗生物質としてのクリンダマイシンのアリコートを、ウェル中にロードした。プレートを４−８℃に３時間保ち、次いで嫌気性チャンバー内で４８時間インキュベートした。ウェルの周囲の阻害領域の直径を計測しかつ記録した。
【００２４】
単離された化合物、即ちピラノシクロアルトビロキサントンＡ及びアルトニンＥの阻害領域ウェルの周囲は、良好な阻害性を示した。阻害性は、すべての試験濃度（１０−１．２５μｇ／ｍＬ）において検出された（図９及び図１０）。
【００２５】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
単離された化合物のアクネ菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、微量液体希釈法を用いて測定した。単離された化合物の２倍希釈液をＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｒｏｔｈ（ＲＣＢ）中に調製して、０．１−２０００μｇ／ｍＬの範囲の濃度を得た。希釈したサンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレート中にロードした。サンプルをアクネ菌の試験培養液とともに播種し、各ウェル中の細菌の終濃度が１×１０5ＣＦＵ（ＣＬＳＩ、Ｍ１１−Ａ８；Ｖｏｌ．３２  Ｎｏ．５）になるようにした。プレートを嫌気性条件下で、３７℃で４８時間インキュベートし、その後、細菌成長の阻害を観察した。アクネ菌の成長阻害に必要な最小濃度を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とみなした。
【００２６】
単離された化合物が、各ＭＩＣ値が２μｇ／ｍＬで、アクネ菌に対する極めて強力な抗アクネ活性を示すことが観察された（表３）。
【表３】
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【００２７】
要約すると、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮からのエタノール抽出物の分画は、キサントン誘導体の混合物である、α及びβ立体構造異性体をおおよそ７０：３０の比率で構成するピラノシクロアルトビロキサントンＡを産出した。立体構造異性体を、初めてスペクトル分析により確証し、かつ報告した。アルトニンＥは幹皮から単離された第２の分子であり、かつ両方の化合物は各ＭＩＣ値が２μｇ／ｍＬで有意な抗アクネ活性を示し、及び抗生物質クリンダマイシン（ＭＩＣ＝０．０３μｇ／ｍＬ）に匹敵した。
【００２８】
本発明を好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明がそれに限定されないことは、当技術分野の当業者に明確に理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は添付の請求の範囲と併せてのみ理解されるべきである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮からの天然分子の単離方法であって、前記方法が：
ａ．アルトカルプス・ヒルスタスの前記幹皮を切断及び乾燥し、及びすり潰して粗粉末にする工程、
ｂ．工程ａの前記幹皮粉末をエタノール（ｗ／ｖ比率  １：１０）で３回、各３時間還流して、３つの分離した抽出物を得る工程、
ｃ．工程ｂの前記抽出物をまとめ、及び減圧で５５〜６０℃の間で濃縮し、及び２倍量の水で懸濁し、続いてｎ−ヘキサン（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）、クロロホルム（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）、及び酢酸エチル（＞９９％  ｖ／ｖ、２倍量）を用いて分画する工程、
ｄ．工程ｃの前記クロロホルム層をシリカゲルカラム（６０〜１２０メッシュ）で精製し、続いてジクロロメタン及びジクロロメタン／アセトン（９８：２から９０：１０）を用いて溶出し、及び各２５０ｍＬの８０分画を収集する工程、
ｅ．工程ｄの前記分画を、ＴＬＣを用いて比較し、及び類似した分画（３３〜６７）をまとめ、続いて真空下で濃縮及び乾燥して濃縮物質を得る工程、
ｆ．工程ｅで得られた前記濃縮物質を、ジクロロメタンを用いて洗浄して、分光技術を用いてＳＴＲ＃１で表されるα及びβピラノシクロアルトビロキサントンＡの９０〜５０：１０〜５０の比率のアノマー混合物として特徴づけられる粉末を供給し、及び濾過する工程、
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ｇ．工程ｆの前記濾過液をシリカゲルでさらに精製し、かつｎ−ヘキサン−酢酸エチル（７０：３０）を用いて溶出して、分光技術を用いてＳＴＲ＃２で表されるアルトニンＥとして特徴づけられる化合物を供給する工程、
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を含む、方法。
〔２〕α対βピラノシクロアルトビロキサントンＡの前記比率が、７０：３０である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕アクネ菌の阻害方法であって、前記方法が、アクネ菌を、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された有効濃度のピラノシクロアルトビロキサントンＡに接触させる工程を含む、方法。
〔４〕ピラノシクロアルトビロキサントンＡが、９０〜５０：１０〜５０の比率のα及びβアノマーとして存在する、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕α対βピラノシクロアルトビロキサントンＡの前記比率が、７０：３０である、前記〔３〕に記載の方法。
〔６〕アクネ菌の阻害方法であって、前記方法が、アクネ菌を、アルトカルプス・ヒルスタスの幹皮から単離された有効濃度のアルトニンＥに接触させる工程を含む、方法。
【図１】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図３ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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