(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（１１）：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（２）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（３）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミン酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（５）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（６）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（７）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（８）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（９）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；
（１０）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３；および
（１１）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３
のいずれか１つのＣＤＲの組合わせを含み、炭酸脱水素化酵素ＸＩＩ（カーボニックアンヒドラーゼ  ＸＩＩ、ＣＡ  ＸＩＩ）に結合し、
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド断片、または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチド断片に結合する、抗−ＣＡ  ＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号４３〜４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のフレームワークを追加的に含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号４７、４８、５１および５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のフレームワークを追加的に含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のフレームワークは、配列番号４９または５０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体は、配列番号５３のＶＨ領域のアミノ酸配列および配列番号５４〜６３からなる群より選択されたＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０を有するハイブリドーマから生産された抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０を有するハイブリドーマから生産された抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ＣＡ−ＸＩＩに対して作用剤（アゴニスト）の活性を有するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗原結合断片は、前記抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合断片は、標識基、毒性物質または抗癌剤が追加的に結合したものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記標識基は、放射線同位元素、ハプテン、蛍光物質、クロモゲンおよび染色物質からなる群より選択されたものである、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記毒性物質は、放射線同位元素、小分子、ペプチド、またはタンパク質である、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合断片は、毒性物質と結合して融合タンパク質を形成するものである、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体または抗原結合断片は、抗体に結合したフコースの一部または全部が除去されたものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の炭酸脱水素化酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）に結合する抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸分子が導入されたベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の炭酸脱水素化酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を発現する宿主。
【請求項１９】
前記宿主は、ハイブリドーマ細胞である、請求項１８に記載の宿主。
【請求項２０】
前記宿主は、炭酸脱水素化酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を生産し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９を有するハイブリドーマ細胞である、請求項１８に記載の宿主。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の炭酸脱水素化酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、固形癌の予防、軽減または治療用薬学組成物。
【請求項２２】
前記固形癌は、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌又は肝癌である、請求項２１に記載の薬学組成物。
【請求項２３】
乳癌は、三重陰性乳癌である、請求項２２に記載の薬学組成物。
【請求項２４】
前記抗体またはその抗原結合断片は、毒性物質が追加的に結合したものである、請求項２１に記載の薬学組成物。
【請求項２５】
化学的抗癌剤または異なる抗体抗癌剤が追加的に含まれるものである、請求項２４に記載の薬学組成物。
【請求項２６】
前記薬学組成物の投与は、放射線抗癌方法と共に行われるものである、請求項２５に記載の薬学組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の炭酸脱水素化酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、対象試料と前記抗体または抗原結合断片の陽性反応を示す試料を固形癌として探知する固形癌の検出用組成物。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合断片は、標識基が結合したものである、請求項２７に記載の固形癌の検出用組成物。
【請求項２９】
前記固形癌は、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、肝癌である、請求項２７に記載の固形癌の検出用組成物。
【請求項３０】
前記陽性反応は、酵素反応、蛍光、発光または放射線を検出して判断するものである、請求項２７に記載の固形癌の検出用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭酸脱水素酵素を認識し結合する抗体、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞および前記抗体または抗原結合断片の炭酸脱水素酵素関連疾病、例えば、固形癌の軽減、予防、治療または診断用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭酸脱水素酵素（Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ、ＣＡ）は、炭酸水素塩およびプロトンへの炭酸の可逆的水和を触媒して、このように生体内のｐＨ恒常性の維持に関与する酵素ファミリーに属する酵素である。大部分の炭酸脱水素酵素は活性部位に亜鉛イオンを含有するため、これらは金属酵素と分類される。
【０００３】
炭酸脱水素酵素のファミリーは、いくつかのグループに区分され、少なくとも５の特異的なＣＡサブファミリーがある（α、β、γ、δ、ε）。α−炭酸脱水素酵素（ＣＡ）は、哺乳動物において見られる。α−ＣＡ酵素は、４個の広い小グループ、つまり、細胞質基質ＣＡ（ＣＡ−Ｉ、ＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＩＩ、ＣＡ−ＶＩＩおよびＣＡ−ＸＩＩＩ）、ミトコンドリアＣＡ（ＣＡ−ＶＡおよびＣＡ−ＶＢ）、分泌ＣＡ（ＣＡ−ＶＩ）および膜結合型ＣＡ（ＣＡ−ＩＶ、ＣＡ−ＩＸ、ＣＡ−ＸＩＩ、ＣＡ−ＸＩＶおよびＣＡ−ＸＶ）に分類される。
【０００４】
ＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＸおよびＣＡ−ＸＩＩは腫瘍に関連付けられていて、これらは、多様な腫瘍に対する潜在的な組織学的かつ予後的なバイオマーカーである［Ｎｏｒｄｆｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ；１０：１４８］。ＣＡ−ＩＩは、最も広範囲に発現している、α−ＣＡ遺伝子ファミリーのメンバーであり、ヒトの組織および臓器においても実質的に存在する。膜貫通酵素のＣＡ−ＩＸは、様々な種類のヒトの癌腫瘍および正常胃腸組織において発現する腫瘍関連抗原として認知された。ＣＡ−ＩＸは、細胞接着、分化、増殖および発癌プロセスに機能的に関連付けられていて、その酵素活性はＣＡ−ＩＩに匹敵する。他の膜貫通ＣＡアイソザイムのＣＡ−ＸＩＩは、正常腎臓組織および腎臓細胞癌腫瘍において最初に発見された。しかし、新たな研究によって、ＣＡ−ＸＩＩは、その他のいくつかの腫瘍［Ｕｌｍａｓｏｖ，Ｂ．，（２０００）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＡ  ＸＩＩ，ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９７，１４２１２−１４２１７］において、結腸および子宮などのいくつかの正常臓器においても発現していることが明らかになった。特に低酸素条件下における腫瘍ではＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＸおよびＣＡ−ＸＩＩが高発現していることから、これらの酵素が細胞外空間の酸性化によって促進される浸潤プロセスに機能的に関与する可能性があることがさらに示唆されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一例は、炭酸脱水素酵素に結合する抗体およびその抗原結合断片に関する。
【０００６】
本発明の一例は、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【０００７】
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含む炭酸脱水素酵素関連疾患の探知または診断方法、または診断キットに関する。
【０００８】
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含む炭酸脱水素酵素関連疾患の予防、治療、または軽減用組成物または用途に関する。
【０００９】
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物を炭酸脱水素酵素関連疾患を有する対象に投与する段階を含む、炭酸脱水素酵素関連疾患の予防、治療、または軽減方法に関する。
【００１０】
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含む固形癌または固形癌細胞の大きさの減少や、腫瘍退化の誘導または促進用組成物、または方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、炭酸脱水素酵素を認識し結合する抗体、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞および前記抗体またはその抗原結合断片のＣＡ−ＸＩＩ陽性の固形癌の軽減、予防、治療または診断用途に関する。
【００１２】
本発明による抗体は、炭酸脱水素酵素を特異的に認識し結合する抗体である。具体的には、本発明の抗体は、ＣＡ−ＸＩＩに結合し、具体的には抗体が結合する部位である抗原決定部位は、Ｎ−末端に位置するＣＡ−ＸＩＩの非触媒部位（ｎｏｎ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）である。前記ＣＡ−ＸＩＩは、ヒト由来酵素であることが好ましい。具体的には、ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００１３】
本発明による「触媒ドメイン」という用語は、当該技術分野において周知の用語であり、なお一層、本発明とのバランスからは、炭酸から重炭酸塩およびプロトンへの触媒が発生する、ＣＡ−ＸＩＩの領域に関する。そこで、本発明による「非触媒ドメイン」とは、前記炭酸から重炭酸塩およびプロトンへの触媒が発生する領域である、触媒ドメイン以外の領域をいう。本明細書において、前記ＣＡ−ＸＩＩの非触媒ドメインは、Ｎ−末端の非触媒ドメインであり、好ましくは、前記非触媒部位は、ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩアイソタイプＩのアミノ酸配列（配列番号５）におけるＮ−末端の１番目〜９３番目のアミノ酸で構成されたペプチドまたはその断片を意味することができる。
【００１４】
本発明による抗体が結合する抗原の部位は、前記非触媒部位またはその断片であってもよいし、つまり、ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩアイソタイプＩのアミノ酸配列（配列番号５）におけるＮ−末端の１番目〜９３番目のアミノ酸で構成されたペプチドまたはその断片、配列番号５のアミノ酸配列のうち、Ｎ−末端の２５番目〜９３番目、または２５番目〜５７番目のアミノ酸で構成されたペプチドまたはその断片であってもよい。
【００１５】
具体例として、本発明による抗体が結合する抗原の部位または抗原決定部位（エピトープ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む、連続する７個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さ、７個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さ、７個のアミノ酸〜３３個のアミノ酸の長さ、１４個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さ、１４個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さ、１４個のアミノ酸〜３３個のアミノ酸の長さ、１９個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さ、１９個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さ、または１９個のアミノ酸〜３３個のアミノ酸の長さを有するペプチドであってもよい。
【００１６】
さらに具体的には、前記抗体が結合する抗原の部位または抗体の抗原決定部位（エピトープ）は、配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列を必須として含み、連続する７個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さまたは７個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さを有するペプチドであってもよいし、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号２のアミノ酸配列を必須として含み、連続する１４個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さまたは１４個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さを有するペプチド、さらに好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列を必須として含む、連続する７個〜１４個のアミノ酸の長さを有するペプチド、最も好ましくは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００１７】
ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩのアミノ酸配列の配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列は、３２番目〜３８番目のアミノ酸を含み、配列番号２のアミノ酸配列は、２５番目〜３８番目のアミノ酸を含む。
【００１８】
あるいは、前記抗体が結合する抗原の部位または抗体の抗原決定部位（エピトープ）は、配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号３のアミノ酸配列を必須として含み、連続する１４個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さまたは１４個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さを有するペプチドであってもよいし、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号４のアミノ酸配列を必須として含み、連続する１９個のアミノ酸〜９３個のアミノ酸の長さまたは１９個のアミノ酸〜６９個のアミノ酸の長さを有するペプチド、さらに好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列のうち、配列番号３のアミノ酸配列を必須として含む、連続する１４個〜１９個のアミノ酸の長さを有するペプチド、最も好ましくは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００１９】
ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩのアミノ酸配列の配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号３のアミノ酸配列は、３９番目〜５２番目のアミノ酸を含み、配列番号４のアミノ酸配列は、３９番目〜５７番目のアミノ酸を含む。
【００２０】
本発明において、抗原であるヒト由来ＣＡ−ＸＩＩのアミノ酸配列の配列番号５のアミノ酸配列と、配列番号１〜４の抗原決定部位のアミノ酸配列を下記表１にまとめる。
【表１】
0006947435.tif 000002
【００２１】
本発明による抗体は、炭酸脱水素化酵素の非触媒部位を特異的に認識し結合する抗体でマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む。炭酸脱水素化酵素の非触媒部位は、ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩアイソタイプＩのアミノ酸配列（配列番号５）におけるＮ−末端の１番目〜９３番目のアミノ酸で構成されたペプチドまたはその断片、２５番目〜９３番目のアミノ酸で構成されたペプチド、または２５番目〜５７番目のアミノ酸で構成されたペプチドまたはこれらペプチドの断片であってもよい。
【００２２】
前記抗体の一例は、ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩアイソタイプＩのアミノ酸配列（配列番号５）におけるＮ−末端の１番目〜９３番目のアミノ酸で構成されたペプチド、または配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号１、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を必須として含むペプチド断片に結合することができる。
【００２３】
本発明の一例において、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体であって、前記抗体の一例は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０ハイブリドーマ細胞により生産された抗体の重鎖可変部位のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３と、軽鎖可変部位のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むことができる。前記ハイブリドーマ細胞株は、大韓民国、ソウル市、鍾路区、蓮建洞２８所在のソウル大学癌研究所韓国細胞株研究財団に２０１２年２月１４日付で寄託し、２０１２年２月２０日付で受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０を与えられた。前記受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０ハイブリドーマが生産する抗体を２７Ｂ６と名付け、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体である。
【００２４】
具体的には、本発明による抗体の一例は、配列番号６〜８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲおよび配列番号９〜１１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲからなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列として配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）および／またはＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列の配列番号９（ＣＤＲ１）、配列番号１０（ＣＤＲ２）および配列番号１１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。また、本発明による抗体は、配列番号１２のアミノ酸を含むＶＨ領域および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含むことができる。
【００２５】
前記抗体の一例は、ヒト由来ＣＡ−ＸＩＩアイソタイプＩのアミノ酸配列（配列番号５）におけるＮ−末端の１番目〜９３番目のアミノ酸で構成されたペプチド、または配列番号５のアミノ酸配列のうち、配列番号３、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列を必須として含むペプチド断片に結合することができる。
【００２６】
本発明の一例において、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体であって、前記抗体の一例は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９ハイブリドーマ細胞により生産された抗体の重鎖可変部位のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３と、軽鎖可変部位のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３とを含むことができる。前記ハイブリドーマ細胞株は、大韓民国、ソウル市、鍾路区、蓮建洞２８所在のソウル大学癌研究所韓国細胞株研究財団に２０１２年２月１４日付で寄託し、２０１２年２月２０日付で受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９を与えられた。前記受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９を有するハイブリドーマが生産する抗体を４Ｂ４と名付け、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体である。
【００２７】
具体的には、本発明による抗体の一例は、配列番号１４〜１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲおよび配列番号１７〜１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲからなる群より選択された１種以上のＣＤＲを含む抗体であってもよいし、好ましくは、ＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列として配列番号１４（ＣＤＲ１）、配列番号１５（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）および／またはＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列の配列番号１７（ＣＤＲ１）、配列番号１８（ＣＤＲ２）および配列番号１９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。また、本発明による抗体は、配列番号２０のアミノ酸を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含むことができる。
【００２８】
前記マウス抗体またはキメラ抗体の一例によるＣＤＲ配列と可変領域配列を下記表にまとめる。
【表２】
0006947435.tif 000003
【００２９】
本発明の具体的な一例により、配列番号１を含む抗原決定部位に結合する抗体と、配列番号３を含む抗原決定部位に結合する抗体は、１つの抗原に共に結合可能である。したがって、前記２つの抗体を用いてＣＡ−ＸＩＩ抗原に対するサンドイッチＥＬＳＩＡ分析などを行うことができ、特に、サンドイッチＥＬＩＳＡ分析で配列番号１を含む抗原決定部位に結合する抗体、例えば、２７Ｂ６抗体をＣＡＰＴＵＲＥ抗体として、配列番号３を含む抗原決定部位に結合する抗体、例えば、４Ｂ４抗体をＤＥＴＥＣＴＯＲ抗体として用いることがさらに好ましい。
【００３０】
本発明により、ＣＡ−ＸＩＩ抗原に結合するヒト化抗体（以下、ＤＮＰ００４という）は、ＣＡ−ＸＩＩに特異的に結合するマウス単クローン抗体４Ｂ４（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９）の軽鎖および重鎖可変領域の遺伝子を鋳型として作製した抗体であって、一例は、配列番号１４、１５および２８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲおよび配列番号２９、３０および３１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲからなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。
【００３１】
配列番号２９：ＡＳＳＸ１ＶＴＹ（Ｘ１＝Ｐ  ｏｒ  Ｓ）
配列番号３０：Ｘ２ＴＳＸ３ＬＸ４Ｘ５（Ｘ２＝Ａ、Ｇ  ｏｒ  Ｒ；Ｘ３＝Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｍ；Ｘ４＝Ａ、Ｖ、Ｉ  ｏｒ  Ｍ；Ｘ５＝Ｐ  ｏｒ  Ｓ）
【００３２】
前記抗体のＶＬ領域のＣＤＲ１は、配列番号２９の一般式で表現され、具体的な一例は、配列番号３２または３３のアミノ酸配列を含むことができ、ＶＬ領域のＣＤＲ２は、配列番号３０の一般式で表現され、具体的な一例は、配列番号３３〜４２からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００３３】
前記ヒト化抗体（ＤＮＰ００４）の一例によるＣＤＲ配列と可変領域配列を下記表にまとめる。下記表３の配列番号３２番目〜４２番目の配列において、濃く表示した部分は、変形されたアミノ酸配列を示す。
【表３】
0006947435.tif 000004
【００３４】
本発明によるヒト化抗体（ＤＮＰ００４）の一例が含むフレームワーク配列を下記表４にまとめ、前記抗体は、重鎖可変領域のフレームワーク１〜４および軽鎖可変領域のフレームワーク１〜４のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のフレームワーク配列を含む抗体であってもよい。重鎖可変領域のフレームワーク１〜４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３〜４６を含むことができ、軽鎖可変領域のフレームワーク１〜４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４８、５１および５２を含むことができる。前記軽鎖可変領域のフレームワーク２は、配列番号４８の一般式で表現され、具体的な一例は、配列番号４９または５０のアミノ酸配列を含むことができる。
【００３５】
配列番号４８：ＭＨＷＹＸ６ＱＫＰＧＫＡＰＸ７ＰＷＩＹ（Ｘ６＝Ｑ  ｏｒ  Ｈ；Ｈ７＝Ｒ  ｏｒ  Ｋ）
【００３６】
前記ヒト化抗体（ＤＮＰ００４）の一例によるフレームワーク配列を下記表にまとめる。
【表４】
0006947435.tif 000005
【００３７】
一例として、本発明によるヒト化抗体（ＤＮＰ００４）は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５４〜６３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むことができる。
【００３８】
本発明によるヒト化抗体（ＤＮＰ００４）は、図３１に示すように、キメリック４Ｂ４抗体より抗原結合力が高い抗体を候補群の中から選定し（実施例１６）、これは、多様な細胞株においてもより高い細胞結合力を示して（実施例１８）、マウスまたはキメラ抗体に内在した免疫原性の可能性を大きく減少させると共に、ヒト化抗体（ＤＮＰ００４）がキメリック４Ｂ４抗体より優れていることを示す。
【００３９】
本発明による抗体またはその断片は、腫瘍退化（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）活性および腫瘍細胞株に対して直接的な抑制効果を有する。本明細書において、腫瘍の退化は、腫瘍の大きさの減少および／または腫瘍細胞の成長阻害、中断または減少などを誘導または促進することを含む。腫瘍の大きさの減少は、例えば、本発明の抗体またはその断片を含む組成物を処理する前を１００％を基準として、前記抗体またはその断片を含む組成物を投与した場合に得られた腫瘍の大きさが９７％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下の大きさを有する場合などが挙げられる。
【００４０】
本発明による抗体は、抗体−依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）と補体系依存（ＣＤＣ、 ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する。
【００４１】
本発明による抗体は、抗体に結合した糖残基のＦＵＣＯＳＥを一部または全部除去したものであってもよい。本発明によるフコース除去抗体も、固形癌に対する成長抑制および腫瘍退化活性を維持する。一例において、２７Ｂ６抗体および４Ｂ４抗体とも、ｄｅｆｕｃｏｓｅ形態の抗体がｆｕｃｏｓｅ形態の抗体に比べて腫瘍に対する効能に優れている（図１４、１７参照）。
【００４２】
本発明による抗体または抗原結合断片は、生体から分離された（生体に存在しない）ものまたは非自然に生産（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）されたものであってもよいし、例えば、合成的または遺伝工学技術で生産されたものであってもよい。前記方法は、公知の技術で容易に実施できる。
【００４３】
また、本発明は、ＣＡ−ＸＩＩ抗原決定部位を認知する物質を提供する。この物質は、抗体、抗体切片、リガンドなどからなる群より選択され、抗体は、単クローンまたは多クローン抗体であってもよいし、好ましくは、ヒトと動物に起源したものである。多クローン抗体または単クローン抗体であってもよいし、例えば、単クローン抗体であってもよい。単クローン抗体は、当業界で広く知られた方法通りに製造される。例えば、ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ手法を利用して製造される。本発明による抗体は、前記マウス抗体、キメラ抗体を含む。
【００４４】
用語、「ＣＤＲ（相補正決定領域）」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するうえで主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知の意味と同じものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
【００４５】
用語、「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体構造に対するその断片で、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。
【００４６】
前記抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体は、単クローン抗体であってもよい。単クローン抗体は、当業界で広く知られた方法通りに製造される。例えば、ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ手法を利用して製造される。あるいは、抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体は利用して通常の方法によってマウス由来の単クローン抗体に製造される。
【００４７】
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）フォーマットを利用して、ＣＡ−ＸＩＩとの結合能に基づいて個別単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析または細胞ベースの分析（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）のような機能性分析により阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対して、ＣＡ−ＸＩＩに対するそれぞれの親和度（Ｋｄ  ｖａｌｕｅｓ）を検定する。
【００４８】
最終的に選択された抗体は、抗原結合部を除いた残りの部分がヒトの免疫グロブリン抗体化された抗体だけでなく、ヒト化抗体として製造して使用することができる。ヒト化抗体の製造方法は、当業界でよく知られている（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．，「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３（２００８），１６１９−１６３３）。
【００４９】
他の例は、前記抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体を生産するハイブリドーマを提供する。具体例において、前記ハイブリドーマは、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０のものであってもよい。
【００５０】
他の例は、前記ハイブリドーマが生産する抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００５１】
他の例は、前記ハイブリドーマが生産する抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体の重鎖相補性決定部位（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖相補性決定部位（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせ；または前記ハイブリドーマが生産する抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含む抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片を提供する。この時、前記相補性決定部位は、通常のすべての方法によって決定可能であり、例えば、ＩＭＧＴ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）またはＣａｂａｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）によって決定可能であるが、これに制限されるわけではない。
【００５２】
ＣＡ−ＸＩＩ抗体または抗体切片は、多様な標識基（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、毒性物質または抗腫瘍剤と結合することができる。当該技術分野における周知の方法によって、本発明の抗体は、前記標識基、毒素、または抗腫瘍剤と結合できることは当業者に明らかである。このような結合は、抗体または抗原の発現後、付着部位に化学的に行うことも可能であり、あるいは、ＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原内に結合産物を組み込んでも良い。次に、本明細書において、以下に記載する適切な宿主系においてＤＮＡを発現させ、そして発現させたタンパク質を回収して、必要に応じて再生させる。結合は、当該技術水準において知られたリンカーを介して達成しても良い。特に、この技術と共に、酸性条件あるいは還元条件下、または特定のプロテアーゼに対する露出時に毒素または抗腫瘍剤を放出する、多様なリンカーを用いることができる。特定の様態においては、標識基、毒素、または抗腫瘍薬剤を多様な長さのスペーサアームによって結合させ、潜在的な立体障害を減少させることが好ましい場合もある。
【００５３】
前記標識基としては、放射線同位元素、ハプテン、蛍光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）および染色物質からなる群より選択された物質で標識され、具体的には、フラグ（ＦＬＡＧ）、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄトマト（ｄＴｏｍａｔｏ）、チェリー（ｃｈｅｒｒｙ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、タムラ（Ｔａｍｒａ）、テキサスレッド、ローダミン、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｓ）、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣから選択される。あるいは、標識基は、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、または１３１Ｉなどの放射性同位体であっても良い。適切な標識基の新しい例は、酵素基（例えば、西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ、西洋ワサビガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または第２のレポーターによって認識される、予め決定されたポリペプチドエピトープである。
【００５４】
前記毒性物質としては、細胞または生物に対して毒性を有する任意の化合物に関する。したがって、毒素は、例えば、放射線同位元素、小分子、ペプチド、またはタンパク質でも良い。抗体あるいは抗体切片は、毒性物質と結合して融合タンパク（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を形成することができる。毒素タンパク質としては、リシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ジフテリア毒素、またはシュードモナス毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｘｉｎ）であってもよいし、放射線同位元素としては、１３１Ｉ、１８８Ｒｈと９０Ｙがあるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
前記「抗腫瘍剤」との用語は、本発明によれば、組織の異常増殖を停止させるか、または遅延させるかのいずれか１つが可能な薬剤を特定する。したがって、抗腫瘍剤は、特に癌を治療する時に有用である。抗腫瘍剤は、血管新生阻害剤、ＤＮＡ挿入剤あるいはＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写制御因子、酵素阻害剤、遺伝子制御因子、微小管阻害剤、またはその他の抗腫瘍剤であってもよい。
【００５６】
本発明は、本発明による抗体をコードする核酸分子に関する。本発明の抗体をコードする、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成により産生されるＤＮＡあるいはＲＮＡ、あるいはこれらの核酸分子のいずれか１つを単独でまたは組み合わせて含む組換え技術により産生されるキメラ核酸分子でも良い。核酸分子はさらに、遺伝子全体あるいはその相当部分、またはその断片および誘導体に対応するゲノムＤＮＡでも良い。抗体のアミノ酸配列のうち、１つのアミノ酸が置換されているこれらの配列をコードする核酸を含むのに必要な単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または付加をヌクレオチド配列が含有しても構わない。本発明の特に好ましい実施形態においては、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。
【００５７】
本発明の一実施形態はまた、核酸分子が発現可能な形態で含むベクターにも関する。本発明のベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターでも良い。レトロウイルスベクターは、複製可能でも良く、あるいは複製欠損でも良い。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に補完宿主／細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ／ｃｅｌｌｓ）で発生する。
【００５８】
前記に引用する核酸分子を他のポリヌクレオチドという翻訳融合が発生するように、ベクター内に挿入することができる。一般に、ベクターは、１以上の複製起点（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現に関する遺伝系（ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、宿主の選択のための１以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性および１以上の発現カセットを含有することができる。適切な複製起点（ｏｒｉ）には、例えば、Ｃｏｌ  Ｅ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３の複製起点が含まれる。
【００５９】
本明細書において上述する核酸分子は、宿主への直接導入、あるいはリポソーム、ファージベクターまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を介した導入のために設計される。また、バキュロウイルスシステム、またはワクチニアウイルスあるいはセムリキフォレストウイルスに基づくシステムを、本発明の核酸分子のための真核生物発現システムとして用いることができる。
【００６０】
本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む非ヒト宿主に関する。前記宿主は、原核細胞または真核細胞でも良い。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノム内に結合していても良く、あるいは染色体外に維持されているいずれでも良い。
【００６１】
本発明はさらに、本発明の抗体を生産するのに用いられる、本発明の１以上の核酸分子を含む遺伝子移植非ヒト動物にも関する。ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたはその他の哺乳動物の組織、または牛乳、血液あるいは小便などの体液において抗体を生産して、これらから回収することも可能である。
【００６２】
また、本発明は、ＣＡ−ＸＩＩ抗原決定部位を選択的に認知する物質を生産する方法と、抗体を生産する生産株を提供する。ＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位に対する抗体または抗体切片は、ＣＡ−ＸＩＩタンパク質、ＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位、ＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位を含むＣＡ−ＸＩＩタンパク質の一部、またはＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位を発現する細胞を抗原として用いて、通常の方法で製造可能である。一例として、ＣＡ−ＸＩＩ抗体の製造方法は、（ａ）ＣＡ−ＸＩＩタンパク質、ＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位、ＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位を含むＣＡ−ＸＩＩタンパク質の一部、またはＣＡ−ＸＩＩの抗原決定部位を発現する細胞を動物に注入して免疫化させる段階、（ｂ）ＣＡ−ＸＩＩに特異的な抗体を生産する脾臓細胞を得る段階、および（ｃ）前記脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ＣＡ−ＸＩＩに対する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を選別する段階を含むＣＡ−ＸＩＩ抗体を生産する生産株の製造方法により実施可能である。前記生産株は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養したり、生体内注入して抗体を分離することができる。一例として、マウスの腹腔内に挿入し、腹水から分離、精製する。単クローン抗体の分離および精製は、培養上層液または腹水をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗免疫グロブリンカラムまたはプロテインＡカラムなどの親和性クロマトグラフィーを用いて実施することができる。
【００６３】
本発明による抗体が結合する抗原決定部位は、固形癌特異的な発現を示す。したがって、ＣＡ−ＸＩＩ抗体は、腫瘍細胞の検出に有用に使用できるだけでなく、毒性物質を含めて腫瘍細胞のみ特異的に細胞殺傷（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）させることができる。
【００６４】
他の例は、ＣＡ−ＸＩＩ、具体的には、ＣＡ−ＸＩＩの非触媒領域に位置する抗原決定部位の固形癌の検出のためのマーカーとしての用途を提供する。抗原決定部位と相互作用する物質を含む固形癌の癌幹細胞検出用組成物を提供する。前記相互作用する物質は、ＣＡ−ＸＩＩ、具体的には、ＣＡ−ＸＩＩの非触媒領域に位置する抗原決定部位と相互作用可能なすべての物質、例えば、化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗体、抗体の抗原結合断片、アプタマーなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００６５】
他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主を含む診断組成物に関する。本明細書において用いられる組成物とは、本発明の少なくとも１つの抗体、核酸分子、ベクターおよび／または宿主を含む組成物を定義するものである。
【００６６】
本発明の診断組成物は、多様な細胞、組織または他の適切な試料における、ＣＡ、特にＣＡ−ＸＩＩの好ましくない発現または過剰発現の検出であって、試料を本発明の抗体と接触させること、および試料においてＣＡ、特にＣＡ−ＸＩＩの存在を検出することを含む検出に有用である。したがって、本発明の診断組成物を以下に定義する発病または疾患状態を評価するために用いても良い。特にＣＡ、特にＣＡ−ＸＩＩを発現する、癌細胞などの悪性細胞を本発明の抗体、抗体断片または誘導体でターゲッティングしても良い。本発明の抗体が結合した細胞は、そのため、補体系などの免疫系機能によって、または細胞媒介性細胞毒性によって攻撃され、したがって、ＣＡ、特にＣＡ−ＸＩＩの好ましくない発現または過剰発現を示す細胞の数が減少するか、またはこのような細胞が根絶される。
【００６７】
本発明の一態様においては、本発明の抗体、抗体断片または誘導体を標識基に結合させる。このような抗体は、診断アプリケーションに特に適合する。
【００６８】
本発明の診断組成物は、単独活性薬剤として投与可能であり、または他の薬剤と組み合わせて投与される。
【００６９】
腫瘍細胞の検査方法は、（ａ）ＣＡ−ＸＩＩ抗体を腫瘍細胞を含む試料に反応させ、（ｂ）前記抗体に対して陽性反応を示す試料を腫瘍として判断するものである。前記試料は、リンパ液、骨髄、血液または血球であってもよいが、これに限定されるものではない。前記腫瘍細胞は、好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、または肝癌細胞であってもよい。
【００７０】
前記ＣＡ−ＸＩＩ抗体を用いて腫瘍細胞を検査する場合、前記ＣＡ−ＸＩＩ抗体は、抗原−抗体反応性を確認できる物質で標識されたものであってもよい。使用可能な前記物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、またはその他の染色物質などがある。
【００７１】
また、本発明のＣＡ−ＸＩＩ抗体は、固形癌を診断するための診断キットとして提供される。
前記診断キットは、ＣＡ−ＸＩＩ抗体のほか、抗原−抗体反応検出手段を含むことができる。前記検出手段は、流細胞測定、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）および発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）からなる群より選択された方法を実施するための通常の物質であってもよい。つまり、標識手段としては、酵素の場合、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）があり、蛍光物質としてはＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｔｈｉｏｃａｒｂａｍｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）が、発光物質としてはルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、イソルミノールおよびルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）が、放射線同位元素としては１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１３１Ｉがあるが、これに限定されるものではない。前記標識手段による標識の有無は、酵素の基質や、蛍光、発光または放射線を測定するためのツールを用いて確認可能である。一例として、ＣＡ−ＸＩＩ抗体は、ＥＬＩＳＡキットまたはストリップキットに製造される。
【００７２】
本発明の具体的な一例による２７Ｂ６と４Ｂ４抗体は、抗原結合部位が重なっておらず、１つの抗原に共に結合可能である。したがって、前記２つの抗体を用いてＣＡ−ＸＩＩ抗原に対するサンドイッチＥＬＳＩＡ分析などを行うことができ、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ分析において２７Ｂ６抗体をＣＡＰＴＵＲＥ抗体として、４Ｂ４抗体をＤＥＴＥＣＴＯＲ抗体として用いることがさらに好ましい。
【００７３】
一実施例において、本発明は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主を含む医薬組成物に関する。本発明の一実施形態によれば、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主は、固形癌を治療または阻害するのに用いるためのものである。本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主の有効量を投与の必要がある対象に投与することによって、固形癌を治療または阻害するための方法である。
【００７４】
本発明による「固形癌」との用語は、嚢胞または液体領域を通常は含有しない組織の異常な塊を定義するものである。固形癌は、陽性（癌ではない）または悪性（当該技術分野において癌とよく称される）をすべて含む。本発明による抗体を適用可能な固形癌の例は、肉腫、神経膠腫、癌腫瘍、中皮腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、子宮頸部腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝臓腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍および頭頚部腫瘍から選択され、好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、または肝癌である。前記乳癌は、好ましくは、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ（ＴＮＢＣ））も含み、前記三重陰性乳癌は、ＨＥＲ２、ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ）、およびｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＲ）を含む３つの乳癌診断マーカーによってもすべて陰性として検出される乳癌であって、検出が非常に難しい問題点がある。前記肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、廃の腺癌、廃の扁平上皮癌であってもよい。
【００７５】
前記固形癌の治療効果は、癌細胞（特に、癌幹細胞）またはこれを含む癌組織の成長抑制（量的減少）、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制して、これによる癌の悪化を抑制する効果を含む。
【００７６】
本明細書において、「対象」または「患者」は、固形癌の軽減、予防および／または治療を必要とする患者を意味するもので、すべての哺乳類、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類であってもよく、固形癌を病んでいたり固形癌の症状を有したり、固形癌発病の危険がある患者であってもよい。
【００７７】
本発明による抗体あるいは抗体切片の投与は、許容されたすべての薬物投与方法によって施される。具体的には、例えば、ＣＡ−ＸＩＩ抗体を有効成分として含む治療剤を腫瘍細胞を有する対象、つまり、ヒトまたは動物に経口または非経口、好ましくは、非経口投与することである。前記治療剤は、薬理学的に許容可能な賦形剤を含むことができ、その投与量は、患者の状態に応じて適切に調節することが好ましいが、一例として、１日、３ｍｇ〜６，０００ｍｇであってもよい。治療剤の剤形は、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤、または注射剤であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７８】
本発明は、ＣＡ−ＸＩＩ抗原決定部位に対する抗体、抗体切片（Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦｖなど）、およびリガンドからなる群より選択された抗体を用いて、急性白血病、母細胞危機の発生した慢性白血病およびリンパ芽球リンパ腫を治療する方法を提供する。
【００７９】
抗体あるいは抗体切片は、好ましくは、単クローンまたは多クローン抗体からなる群より選択され、好ましくは、ヒトと動物に起源するものである。前記ＣＡ−ＸＩＩ抗体または抗体切片は、前記で言及した毒素物質がさらに含まれたものであってもよい。毒素物質は、抗体に融合、接合、結合、またはリンクされてもよいし、これは、公知の技術で実施可能である。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、単独活性薬剤として投与しても良く、またはその他の薬剤と組み合わせ、好ましくは、当該技術分野において問題の疾患の治療に適すると知られたものと組み合わせて投与しても良い。また、本発明の抗体を投与する方法は、他の抗癌治療、例えば、化学的療法、放射線療法、細胞治療剤と並行して行うことができる。前記化学的療法または細胞治療剤に使用される多様な固形癌治療抗癌剤は、知られた抗癌剤を使用することができる。
【００８１】
他の例は、ＣＡ−ＸＩＩ、具体的には、ＣＡ−ＸＩＩの非触媒領域に位置する抗原決定部位に候補化合物を接触させる段階、および前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して固形癌治療剤の候補物質として決定する段階を含む、固形癌治療剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。他の例において、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。
【００８２】
前記候補化合物は、人工的に合成されるか、天然の各種化合物、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド構造体またはタンパク質構造体（例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、ペプチボディ、ナノボディなど）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンス−ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）、アプタマー、天然物抽出物などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００８３】
前記候補化合物と抗原決定部位の結合は、候補化合物と抗原決定部位の複合体の形成を確認することにより行われ、これは、当業界で公知の多様な方法により行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線の検出により測定可能であり、具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などからなる群より選択された方法により測定可能であるが、これに制限されるわけではない。
【発明の効果】
【００８４】
本発明は、炭酸脱水素酵素を認識し結合する抗体、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞および前記抗体またはその抗原結合断片の炭酸脱水素化酵素関連疾病、例えば、固形癌の軽減、予防、治療または診断用途に関する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】実施例１により固形癌特異的なマウス単クローン抗体２７Ｂ６の末梢血液での反応度検査を示す。
【図２】実施例２により２７Ｂ６キメラ抗体の抗原特異性および親和度を確認した結果を示す。
【図３】実施例３によるマウス単クローン抗体４Ｂ４の抗原反応度のスクリーニング過程を示す。
【図４】実施例４により４Ｂ４キメラ抗体の抗原特異性および親和度を確認した結果を示す。
【図５Ａ】実施例６により多様な乳癌細胞で４Ｂ４キメラ抗体のＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する発現様相を確認した結果を示す。
【図５Ｂ】実施例６により多様な乳癌細胞で４Ｂ４キメラ抗体のＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する発現様相を確認した結果を示す。
【図５Ｃ】実施例６により多様な乳癌細胞で４Ｂ４キメラ抗体のＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する発現様相を確認した結果を示す。
【図６】実施例６により２７Ｂ６キメラ抗体および４Ｂ４キメラ抗体で作製したカラムで肺腺癌Ａ５４９細胞株溶解物からそれぞれの抗原を分離精製して得られた試料を電気泳動で確認した結果である。
【図７】実施例６によりマウス単クローン抗体４Ｂ４およびマウス単クローン抗体２７Ｂ６に対する抗原がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２であることをＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙで検証した結果である。
【図８】実施例６によりマウス単クローン抗体４Ｂ４およびマウス単クローン抗体２７Ｂ６に対する抗原がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２であることをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙで検証した結果である。
【図９】実施例７によりマウス単クローン抗体２７Ｂ６およびマウス単クローン抗体４Ｂ４のエピトープマッピングを示す実験および結果である。
【図１０】実施例８により２７Ｂ６キメラ抗体が補体依存性細胞毒性を示すことを確認できたものである。
【図１１】実施例９−１により２７Ｂ６キメラ抗体の抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果である。
【図１２】実施例９−２により２７Ｂ６キメラ抗体の三重陰性乳癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果である。
【図１３】実施例１０−１により多様な固形癌細胞株におけるｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ２７Ｂ６キメラ抗体の抗体依存性細胞毒性検査を示す。
【図１４】実施例１０−２により乳癌細胞株におけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙを用いたＤｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ２７Ｂ６、４Ｂ４キメラ抗体の抗体依存性細胞毒性検査を示す。
【図１５】実施例１１により三重陰性乳癌細胞株におけるＣＡ  ＸＩＩ抗原の発現程度と２７Ｂ６、４Ｂ４キメラ抗体の結合の有無を確認した結果である。
【図１６】三重陰性乳癌動物モデルにおける２７Ｂ６キメラ抗体および４Ｂ４キメラ抗体が腫瘍の成長を抑制していることを示した結果である。
【図１７】実施例１１により三重陰性乳癌に対する４Ｂ４抗体の有効性の結果を示す。
【図１８】実施例１２により４Ｂ４抗体単独の直接的な結合は癌細胞の成長に影響を及ぼさないことを示した結果である。
【図１９】実施例１２により４Ｂ４抗体単独の直接的な結合は癌細胞の成長に影響を及ぼさないことを示した結果である。
【図２０】実施例１３により２７Ｂ６抗体と放射線治療の併用効果を示した結果である。
【図２１】実施例１４により選択されたクローン（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｓｃＦｖ）のＣＡ−ＸＩＩに対する結合力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）をＥＬＩＳＡでテストした試験結果を示す。
【図２２】実施例１４により選択された１０個のクローン（クローン番号＃１、２、８、１１、１５、１９、２２、２５、２６および３０）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列とＣＤＲ１およびＣＤＲ２の配列を示す。
【図２３】実施例１４により選択された１０個のクローン（クローン番号＃１、２、８、１１、１５、１９、２２、２５、２６および３０）の全長ＩｇＧの親和度試験結果を示すグラフである。
【図２４】実施例１４により選択された１０個のクローン（クローン番号＃１、２、８、１１、１５、１９、２２、２５、２６および３０）の全長ＩｇＧの親和度試験結果を示すグラフである。
【図２５】実施例１５によるヒト化抗体ＤＮＰ００４のＣＡ−ＸＩＩ陽性三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ−２３１における結合の確認を示すものである。
【図２６】実施例１６により抗体候補群のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた物性を分析した結果を示す写真である。
【図２７】実施例１６により抗体候補群のＣＡ  ＸＩＩ陽性細胞株との結合力評価を示す。
【図２８】実施例１７により多様な乳癌細胞におけるＤＮＰ００４ヒト化抗体のｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する結合様相を確認した結果である。
【図２９】実施例１７により多様な乳癌細胞におけるＤＮＰ００４ヒト化抗体のｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する結合様相を確認した結果である。
【図３０】実施例１８によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の乳癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果を示す。
【図３１】実施例１８によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の肺癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果を示す。
【図３２】実施例１８によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の肝癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果を示す。
【図３３】実施例１８によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の胃癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果を示す。
【図３４】実施例１９によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の三重陰性乳癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果を確認した結果を示す。
【図３５】実施例１９によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の三重陰性乳癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果を確認した結果を示す。
【図３６】実施例１９によりＤＮＰ００４ヒト化抗体の腎臓癌細胞株マウス動物モデルにおける抗腫瘍効果を確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
下記の例示的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明の保護範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【００８７】
＜実施例１＞抗ＣＡ−ＸＩＩ単クローン抗体（２７Ｂ６）の製造
ＣＡ−ＸＩＩに特異的な新たな抗体を開発するために次の実験を行い、開発抗体は、肺腺癌だけでなく、乳癌と大腸癌および前立腺癌においても一部発現し、固形癌特異的な抗体で２７Ｂ６および４Ｂ４と名付けることとした。
【００８８】
１−１：２７Ｂ６単クローン抗体作製のためのターゲット部位の設計
固形癌細胞特異的な抗体を作製するために、固形癌細胞を直接マウスに免疫し、これに対する単クローン抗体を細胞融合方法で確立した。その後、固形癌細胞特異的な単クローン抗体と結合する抗原を分析して同定した。
【００８９】
１−２：マウスの免疫化
固形癌で発現する特異的な抗原に対する単クローン抗体を開発するために、肺腺癌細胞株のＡ５４９を免疫化した後、流細胞測定器を用いたハイブリドーマ選別過程により、Ａ５４９細胞に陽性反応を示しながら正常肺細胞株のＬ１３２に陰性反応を示す抗体クローンを選んで選別した。単クローン抗体に対する陽性細胞のパーセントは、実験対象５０００個の細胞の中からＤＮＰ００４抗体と結合する細胞の数を％で計算して、−（陰性）は陽性細胞数が１０％未満、＋は陽性細胞数が１０〜３０％の範囲、＋＋は陽性細胞数が３０〜７０％の範囲であり、＋＋＋は陽性細胞数が７０〜１００％に指定した。
固形癌特異的な単クローン抗体を開発するために、６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス１匹あたり、肺腺癌細胞株のＡ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）を１×１０７の数だけマウス腹腔（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｖｉｔｙ）に３週間の間隔で３回注入し、静脈から血液検体を取って血清を分離した。前記分離された血清にＡ５４９細胞に希釈した血清を入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１５００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を水洗し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−ＦＩＴＣ（Ｄｉｎｏｎａ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で水洗した後、流細胞分析器で測定してＡ５４９細胞株に対する力価を確認した。Ａ５４９細胞に対する力価を流細胞分析器で確認した結果、Ａ５４９細胞を免疫化した血清でＡ５４９細胞株に対する陽性が高くなったことを確認した（結果未記載）。具体的には、細胞融合を実施する３日前に５０ｕｇ  ａｎｔｉ−ＣＡ−ＸＩＩ  アゴニスト  ｍＡｂを入れて免疫反応を増加させ、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）を１×１０７の数だけ注入して、Ａ５４９表面抗原に対する抗体が増幅されるように誘導した。
【００９０】
１−３：ハイブリドーマ細胞の製造
前記のように免疫化されたマウスの脾臓な切除して単一細胞浮遊液を得てＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）で２回程度洗浄した後、０．４％ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ（ｓｉｇｍａ）を１：１（ｖ／ｖ）で混合した後、顕微鏡で染色されない細胞を測定するトリパンブルー（ｔｒｙｐｈａｎ  ｂｌｕｅ）染色法で細胞数を計数した。細胞融合ｐａｒｔｎｅｒ細胞としてはＸ６３  ｍｏｕｅ  ｍｙｅｌｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）を使用し、前記脾臓細胞と同一に洗浄後に細胞数を計数した。
前記骨髄（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と脾臓細胞は１：５の比率で混合し、遠心分離後に上澄液を除去した。予め３７℃に予熱された５０％ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）１５００  １ｍｌを１分かけて徐々に添加した。約１分程度停滞させてからＲＰＭＩ培地を徐々に追加して段階的に希釈した。これを遠心分離した後、１ｘＨＡＴが含まれているＲＰＭＩ（２０％ＦＢＳ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）に浮遊させ、９６−ウェルプレートに１５０ｕｌ／ウェルで分注した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。前記融合後、一定期間ＨＡＴ  ｆｅｅｄｉｎｇを進行させ、群落を形成したウェルが観察されると、ＨＴ培地を１５０ｕｌ添加して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で４８時間培養後、３カラー蛍光染色を実行し、流細胞測定器で分析した。それぞれ異なる波長の染色剤で染色した肺腺癌細胞株のＡ５４９細胞と正常肺細胞株のＬ１３２はそれぞれ蛍光染色剤で染色後に１：１で混合して準備した後、準備された細胞にハイブリドーマ培養上層液を１００ｕｌずつ入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１５００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を水洗し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−ＡＰＣ（Ｄｉｎｏｎａ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で水洗した後、流細胞分析器で測定した。
末梢血液に対する結合程度を確認するために、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ、赤十字血液院）にハイブリドーマ上層液を１００ｕｌ入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１５００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体をｗａｓｈｉｎｇし、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−ＦＩＴＣ（Ｄｉｎｏｎａ）を２００倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法でｗａｓｈｉｎｇした後、流細胞分析器で測定し、その結果を記載した（図１）。図１は、肺腺癌特異的な２７Ｂ６単クローン抗体の末梢血液での反応度検査の結果を示す。
前記方法において、肺癌細胞株のＡ５４９に陽性でかつ正常肺細胞株のＬ１３２と末梢血液の顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）とリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）および単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）にすべて陰性の単クローン抗体（以下、２７Ｂ６と名付ける）を選別し、最終的に制限稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）により単一コロニーの２７Ｂ６ハイブリドーマ細胞を確保した。
前記２７Ｂ６抗体を生産するハイブリドーマ細胞株は、大韓民国、ソウル市、鍾路区、蓮建洞２８所在のソウル大学癌研究所韓国細胞株研究財団に２０１２年２月１４日付で寄託し、２０１２年２月２０日付で受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８０を与えられた。
【００９１】
１−４：２７Ｂ６単クローン抗体のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の決定
＜実施例１−３＞で製造された２７Ｂ６単クローン抗体のアイソタイプを決定するために、ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。具体的には、ｉｓｏｔｙｐｉｎｇは、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｕｒｉｎｅ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｓｅｒａ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｄａ）を用い、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙは、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを使用した。発色反応は、ｏｒｔｈｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）とｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて誘導し、４５０ｎｍの吸光度を測定して値を確認した。
前記実験の結果、２７Ｂ６単クローン抗体は、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１／ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎで確認された（結果未記載）。
【００９２】
１−５：２７Ｂ６抗体ＣＤＲ配列
抗体クローニング過程は図１に示した。具体的には、２７Ｂ６抗体遺伝子は、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。２７Ｂ６ハイブリドーマから分離したＲＮＡからＭｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔを用いてＰＣＲを行い、これをｐＧｅｍ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シーケンシングによりＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ  ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通してマウス抗体遺伝子を確認した。
２７Ｂ６  Ａｂ  ｇｅｎｅ  ＣＤＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅの重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２および１３に示し、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６〜８に示し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９〜１１に示した（前記表２参照）。
【００９３】
＜実施例２＞２７Ｂ６  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙの製造
マウス起源の単クローン抗体を治療目的で人体に投与する場合、人体の免疫体系は種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が異なるため、この単クローン抗体を外来抗原として認知してヒト抗−マウス抗体（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＨＡＭＡ）反応を起こして血液内のマウス抗体を速やかに除去し、さらに、マウス抗体のＦｃ部分が人体内で効果的な生物学的機能を行えないなど治療効果が急減し、同時に、激しいアレルギー反応および腎臓機能の低下などの副作用が伴う。したがって、人体投与時、２７Ｂ６抗体の免疫原性を低減するために、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を除いた残りの部分をヒトのＩｇＧ１のＦｃに代替したキメラ抗体を作製した後、抗原特異性および親和度が本来のマウス由来２７Ｂ６抗体と類似していることを確認した。
キメラ抗体を開発するために前述した方法で製造された２７Ｂ６−ＨｕＩｇＦｃ  ＤＮＡをＣＨＯ細胞由来のＤＨＦＲ  ＤＧ４４細胞株に形質転換後、選択培地で選択培養過程を経て２７Ｂ６組換え抗体を発現する安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を開発した。詳しい実験方法は以下の通りである。
まず、ＤＧ４４細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ａ１１００００１）を形質転換する３時間前に、６−ウェルプレートに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で接種し、ＧＩＢＣＯ（商標名）ＣＤ  ＤＧ４４  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）１ｍｌを入れて、３７℃、５％ＣＯ２条件で３時間培養後、前記で製造された２７Ｂ６−ＨｕＩｇＦｃ  ＤＮＡをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、準備されたＤＧ４４細胞に形質転換した。
前記形質転換して３日後、上層液を取ってＡ５４９細胞に入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌを入れて１５００ｒｐｍで３分間遠心分離して、結合しない抗体を水洗し、結合した抗体を確認するために、二次抗体のｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｉｇ−ＦＩＴＣ（Ｄｉｎｏｎａ）を１５０倍希釈して入れた後、４℃で１５分間反応させた後、ＰＢＳ３ｍｌで前記と同様の方法で水洗した後、流細胞分析器で測定してＡ５４９細胞株に対する力価を確認した。この後、安定した細胞株を作るために、３０ｎＭ  ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と２００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を添加したＰｏｗｅｒＣＨＯ（ＬＯＮＺＡ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）培地に切り替え後、クローン選択過程を開始した。ＭＴＸとＧ４１８が含まれている培地での選択過程は、ＭＴＸとＧ４１８の添加濃度を漸進的に高めるものの、各濃度別の選択過程期間は３週に固定した。最終的に選択過程を終えた細胞株は、１０００ＮＭ  ＭＴＸと４００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８が添加されたＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ培地で適応過程を終えた状態で選別過程を仕上げ、選別過程の進行後、最終的な細胞株を確立するために、制限稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を実施して単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）を確保した。
前述した方法通りに開発した２７Ｂ６キメラ抗体の抗原特異性および親和度を流細胞測定器を用いて確認した結果、抗原特異性および親和度が本来のマウス由来２７Ｂ６抗体と類似していることを確認した（図２）。図２は、２７Ｂ６キメラ抗体の抗原特異性および親和度を確認した結果を示す。
【００９４】
＜実施例３＞抗ＣＡ−ＸＩＩ単クローン抗体（４Ｂ４）の製造
３−１：２７Ｂ６ペア抗体の開発
同一抗原に結合するものの他のエピトープを認知する抗体を追加的に確保するために、２７Ｂ６ペアリング抗体を開発した。まず、２７Ｂ６ペアリング抗体の開発の可能性を評価するために、キメリック２７Ｂ６とマウス血清を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを実現した。
前記実施例＜１−２＞に記述された方法と同様に、ヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９  １×１０７細胞を６週齢雌マウスの腹腔に３週間隔で免疫し、血清を取った。
具体的には、キメリック２７Ｂ６精製抗体を１００ｎｇ／ｍＬの濃度でｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに入れて、３７℃で１時間コーティングした。２７Ｂ６がコーティングされたｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｓｉｇｍａ）を２００ｕｌ／ｗｅｌｌで入れて、３７℃で１時間遮断した。Ａ５４９細胞を１％ＮＰ４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いて１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度のｌｙｓａｔｅを準備した。準備されたＡ５４９  ｌｙｓａｔｅを５０ｕＬ／ｗｅｌｌでｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに入れて、３７℃の温度で１時間反応した後、ＰＢＳで３回水洗した。Ａ５４９免疫で確保したマウス血清１０００倍希釈液１００ｕＬ／ｗｅｌｌをｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに入れて、３７℃で１時間反応した後、ＰＢＳで３回水洗した。最後に、二次抗体ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）２０００希釈液を１００ｕＬ／ｗｅｌｌで入れて、３７℃で３０分反応した後、ＰＢＳで３回水洗した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を５０ｕＬ／ｗｅｌｌで入れた後、常温で１０分間反応して発色を誘導し、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）を同量入れて発色反応を終了した。この後、４５０ｎｍの波長における吸光値を測定した。
予想した通り、２７Ｂ６とマウス血清で実現したサンドＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）で陽性反応を確認することができた。
【００９５】
３−２：単クローン抗体の製造
前記のように免疫化されたマウスの脾臓な切除してハイブリドーマを生産する方法は、＜実施例１−３＞に記載の方法と同様に進行させた。
前記方法において、肺癌細胞株のＡ５４９に陽性でかつ正常肺細胞株のＬ１３２と末梢血液の顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）とリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）および単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）にすべて陰性の単クローン抗体２７Ｂ６とペアの単クローン抗体（以下、４Ｂ４と名付ける）を選別し、最終的に制限稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）により単一コロニーの４Ｂ４ハイブリドーマ細胞を確保した（図３）。図３は、４Ｂ４抗体の抗原反応度のスクリーニングを示す。前記４Ｂ４抗体を生産するハイブリドーマ細胞株は、大韓民国、ソウル市、鍾路区、蓮建洞２８所在のソウル大学癌研究所韓国細胞株研究財団に２０１２年２月１４日付で寄託し、２０１２年２月２０日付で受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９を与えられた。
【００９６】
３−３：４Ｂ４抗体の分析
前記＜実施例１−５＞と実質的に同様の方法で抗体のＣＤＲアミノ酸配列を分析した。前記＜実施例３−２＞で得られた４Ｂ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０および２１に示し、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１４〜１６に示し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９に示した（前記表２参照）。
【００９７】
＜実施例４＞４Ｂ４キメラ抗体の製造
前記＜実施例２＞で記述したように、人体投与時、４Ｂ４抗体の免疫原性を低減するために、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を除いた残りの部分をヒトのＩｇＧ１のＦｃに代替したキメラ抗体を作製した後、抗原特異性および親和度が本来のマウス由来４Ｂ４抗体と類似していることを確認した。
４Ｂ４キメラ抗体の製造方法は、＜実施例２＞と同様の方法で行い、その結果、開発した４Ｂ４キメラ抗体の抗原特異性および親和度を流細胞測定器を用いて確認した結果、抗原特異性および親和度が本来のマウス由来４Ｂ４抗体と類似していることを確認した（図４）。図４は、ＡＢ４キメラ抗体の抗原特異性および親和度を示す。
【００９８】
＜実施例５＞多様な細胞株における抗体発現の分析
５−１：多様な細胞株における抗体発現
ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）とＳＮＵ（Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を通して確保した多様な癌細胞株における実施例２および実施例４でそれぞれ得られたキメリック２７Ｂ６抗体とキメリック４Ｂ４抗体の結合の有無を流細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。
具体的には、癌細胞株は、ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）とＳＮＵ（Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を通して得ており、Ｌ−１３２、ＳＷ−９００、ＤＵ１４５、ＬＮＣａｐ、ＭＣＦ−７、Ｈｕｈ７、Ｈｓ−５７８Ｔは１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＤｕｂｃｏ’ｓ  ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ４１７、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９、ＳＷ−４８０、ＳＷ−６２０、ＬＳ１７４Ｔ、ＰＣ−３、ＳＮＵ１、ＳＮＵ６３８、ＳＮＵ７１９、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４５３は１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を用いて、３７℃で５％ＣＯ２．状態の培養器を用いて培養した。また、Ｃａｌｕ−３、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＫ−ＨＥＰ−１、Ｃ３Ａ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＢＴ−２０は１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を、ＫＡＴＯ  ＩＩＩは２０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を、ＳＷ４８０、ＭＤＡ−ＭＢ４６８は１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍを用いて、３７℃で５％ＣＯ２．状態の培養器を用いて培養した。
前記培養された癌細胞株に本発明の２７Ｂ６、４Ｂ４単クローン抗体をそれぞれ入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＤｉＮｏｎａ  Ｉｎｃ、Ｋｏｒｅａ）を入れて、４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）で分析して、その結果を以下に記載した。（表５）多様な固形癌細胞株における２７Ｂ６および４Ｂ４抗体の反応を確認した。
下記表５は、多様な固形癌細胞株におけるｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する発現様相を示す。表１６で、実験対象５０００個の細胞の中から２７Ｂ６および４Ｂ４単クローン抗体に対する陽性細胞のパーセントはＦＡＣＳ分析法で分析し、−は陽性細胞数が１０％未満、＋は陽性細胞数が１０〜３０％の範囲、＋＋は陽性細胞数が３０〜７０％の範囲であり、＋＋＋は陽性細胞数が７０〜１００％を示し、−で表された１０％未満の陽性細胞数を陰性と見て、それ以上の細胞はすべて陽性と判断する。
【００９９】
【表５】
0006947435.tif 000006
【０１００】
前記表５に記載したように、本発明の２７Ｂ６および４Ｂ４単クローン抗体は、多様な種類の肺腺癌、大腸癌、胃癌、肝癌および乳癌細胞株における結合程度の差は見られるが、陽性反応を示すことを確認した。反面、末梢血液由来リンパ球と単核球、顆粒球にはすべて陰性の反応を確認した。これは、本発明の２７Ｂ６および４Ｂ４抗体がＣＡ  ＸＩＩ抗原を発現する固形癌に対する治療剤として使用できることを示したものである。
【０１０１】
５−２：多様な類型の乳癌細胞における発現様相
２７Ｂ６と４Ｂ４は、ＥＲ、ＰＲだけでなく、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞においてもすべて陽性反応を示す。したがって、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）だけでなく、多様な類型の乳癌においても治療剤として使用可能である。したがって、３つの互いに異なる表現型の乳癌細胞株における２７Ｂ６と４Ｂ４単クローン抗体の結合の有無を流細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。
ＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞株、ＥＲ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＤｕｂｃｏ’ｓ  ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（悪性乳癌由来細胞株）、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｈｅｒ２（Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２）ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）は１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を用いて、３７℃で５％ＣＯ２．状態の培養器を用いて培養した。
前記培養された乳癌細胞株に本発明の２７Ｂ６、４Ｂ４単クローン抗体をそれぞれ入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＤｉＮｏｎａ  Ｉｎｃ、Ｋｏｒｅａ）を入れて、４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）で分析して、その結果を表６に記載した。
【０１０２】
【表６】
0006947435.tif 000007
【０１０３】
したがって、本発明による２７Ｂ６と４Ｂ４抗体は、ＥＲ、ＰＲだけでなく、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞においてもすべて陽性反応を示すので、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）だけでなく、多様な類型の乳癌においても治療剤として使用可能である。
【０１０４】
５−３：ＩＨＣ（ＩｍｍｕｎｏＨｉｓｔｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）
人体の正常組織で２７Ｂ６と４Ｂ４単クローン抗体の結合抗原の分布は免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）法で確認した。人体の正常胸腺と扁桃組織は忠北大学病院で得ており、忠北大学病院病理課で凍結切片を作製した。
前記作製された凍結切片組織に本発明の２７Ｂ６、４Ｂ４単クローン抗体の免疫組織化学染色は次の通りである。−２０℃以下で保管された胸腺と扁桃凍結切片組織を常温で３０〜６０分間乾燥し、１ｘ  ＰＢＳに６０分間浸漬しておいた。次に、３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に常温で１０分間反応して内在性ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｓａｓｅ）の活性を抑制した後、流れる水に水洗し、ヤギ由来免疫グロブリンが含まれている血清で組織を覆い、常温で３０分間反応させてマウス抗体による非特異染色を除去した。次に、一次抗体（２７Ｂ６、４Ｂ４）を常温で６０分間反応させた。使用された抗体の濃度はそれぞれ１０ｕｇ／ｍｌである。次に、５分間３回１ｘ  ＰＢＳで水洗した後、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ抗体（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を入れて、常温で３０分間反応後、５分間３回１ｘ  ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｘ  ＰＢＳ）で水洗した。Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）で発色し、流れる水に５分間水洗した後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対照染色をし、流れる水に７分間水洗した。染色を終えたスライドは脱水と封入をした後、染色結果は顕微鏡で分析し、以下に記載した。
【表７】
0006947435.tif 000008
【０１０５】
前記表７に記載したように、本発明の２７Ｂ６および４Ｂ４単クローン抗体が認知する抗原は、正常胸腺と扁桃組織には分布しておらず、特に正常成熟、未成熟Ｔ細胞とＢ細胞で発現しないことを確認した。２７Ｂ６抗体の場合、扁桃のｂａｓａｌ  ｌａｙｅｒに弱く染色されたが、これは非特異結合の結果として把握される。
【０１０６】
＜実施例６＞単クローン抗体に対する抗原分析
６−１：４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗原の分離精製
４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体の開発に使用された肺腺癌Ａ５４９細胞株を１×１０８培養してｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０；ＮＰ−４０  ｉｎ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ａｎｄ  １ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ−ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）５０ｍｌに懸濁した後、常温で１５分間溶解させた後、遠心分離により細胞残存物を除去し、上層液を集めて溶解物を準備した。準備された溶解物は４Ｂ４および２７Ｂ６抗体が認知する抗原分離材料として使用された。
精製された４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体５ｍｇを結合バッファー（０．２Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、０．５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ８．３）に透析して２種の抗体溶液を製造した。ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）２ｍｌを５ｍｌ  ｃｏｌｕｍｎにパッキングし、１ｍＭ  ＨＣｌ２０ｍｌを流して洗浄した後、再び結合バッファー（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、０．５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ８．３）２０ｍｌで水洗して、前記で準備された抗体がよく結合するようにカラム（ｃｏｌｕｍｎ）を準備した。準備されたカラム出口（ｃｏｌｕｍｎ  ｏｕｔ−ｌｅｔ）を塞ぎ、準備された２種の抗体溶液をそれぞれのカラム（ｃｏｌｕｍｎ）に入れた後、カラム入口（ｃｏｌｕｍｎ  ｉｎ−ｌｅｔ）を塞いで、常温で４時間反応した。Ｒｅｓｉｎと反応して結合しない余分の抗体を除去するために水洗バッファー（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、０．５Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ５．４）２０ｍｌを流してカラム（ｃｏｌｕｍｎ）を洗浄し、Ｒｅｓｉｎに残存する反応基を除去するためにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、０．５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ８．３）５０ｍｌを流した。準備された２種のカラム（ｃｏｌｕｍｎ）は保全バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ、ｐＨ８．０）を２０ｍｌ流した後、使用前まで冷蔵保管した。
準備されたｃｏｌｕｍｎはＦＰＬＣ（Ａｃｔａ  ＦＰＬＣ）に連結してＲｅｓｉｎに結合した抗体が抗原を認知して抗原を分離できるように準備した。肺腺癌Ａ５４９細胞株溶解物はＦＰＬＣに連結されたカラムに注入（ｌｏａｄｉｎｇ）され、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体が認知する抗原の原料として使用された。抗原分離する方法は、平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）、原料注入（ｓａｍｐｌｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）、２次洗浄（ｓｅｃｏｎｄ  ｗａｓｈｉｎｇ）、溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）の４段階で行われた。平衡および洗浄バッファーは、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０、２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｐＨ７．４であり、平衡には１０ｍｌ、洗浄には２０ｍｌがそれぞれ使用された。溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）は、０．３Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、１．０Ｍ  ｕｒｅａ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ３．０溶液２０ｍｌが使用された。２次洗浄溶液（ｓｅｃｏｎｄ  ｗａｓｈｉｎｇ）は、溶出バッファーを洗浄バッファーに２５％の比率で混合した混合液を使用した。抗原分離過程で得られた溶出液（ｅｌｕａｔｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２０ｍｌにＴＣＡ５ｍｌを添加して３０分間冷蔵保管し、この後、遠心分離して沈殿物を得て、アセトンで２回追加洗浄した。最終的に得られた沈殿物は１Ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁して電気泳動を行い、コマジ染色を実施した。前述のように、４Ｂ４および２７Ｂ６抗体でそれぞれ作製したカラムで最終分離精製された抗原は図６の通りである。図６で、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体で作製したカラムで肺腺癌Ａ５４９細胞株溶解物からそれぞれの抗原を分離精製して得られた試料を電気泳動で確認した結果である。
【０１０７】
６−２：４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗原の同定
４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体を結合させて作製したｒｅｓｉｎで分離精製された抗原は図７のように確認された。矢印で表された約５８ｋＤａの主要タンパク質バンド２種はソウル医薬研究所に同定依頼された。同定はＩｎ−Ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎでペプチドを準備し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析して得られた結果をＰＬＧＳ（Ｗａｔｅｒｓ）とＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）でプロセシングして完了した。一連の分析方法は次の通りである。
Ｇｅｌ状態のタンパク質は１００％ＡＣＮ（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）で脱水し、Ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて完全に乾燥した。乾燥した状態でトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を添加して１５分間ｄｉｇｅｓｔｉｏｎした。試料は６０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡで抽出してＳｐｅｅｄｖａｃで濃縮した。試料を５％ＣＡＮ、０．２％ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液２０ｕｌに溶かしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ  ｃｏｌｕｍｎはｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（１．７μｍ、３００Å、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）が使用され、移動相バッファーＡ（０．１％ＴＦＡ  ｉｎ  １００％ＤＷ）を移動相バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ  ｉｎ  １００％ＡＣＮ）に漸進的切り替え方法（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ）を用いてペプチドを分離した。ＭＳ検出器はＥＳＩ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｓｕｒｖｅｒ  ｓａｃｎ  ｍｏｄｅを使用した。この後、得られた結果はＰＬＧＳおよびＭＡＳＣＯＴでプロセシングした。前記のような一連の分析で下記表のような最終同定結果を取得して、下記表８に示した。
【０１０８】
【表８】
0006947435.tif 000009
【０１０９】
分析された結果のうち、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２は、期待した通り、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体で精製した抗原で共通して同定され、細胞表面に存在するタンパク質として知られていることを確認した。その他のタンパク質は細胞内部に存在するタンパク質であるため、４Ｂ４と２７Ｂ６単クローン抗体の抗原になれず、不完全な分離精製過程で含まれている不純物として把握される。
２７Ｂ６から分離されたペプチド配列は、ＱＦＬＬＴＮＮＧＨＳＶＫ（配列番号２２）、ＷＴＹＦＧＰＤＧＥＮＳＷＳＫ（配列番号２３）、ＧＱＥＡＦＶＰＧＦＮＩＥＥＬＬＰＥＲ（配列番号２４）およびＹＫＧＱＥＡＦＶＰＧＦＮＩＥＥＬＬＰＥＲ（配列番号２５）の４種であり、４Ｂ４から分離されたペプチド配列は、ＱＦＬＬＴＮＮＧＨＳＶＫ（配列番号２２）、ＥＭＩＮＮＦＲ（配列番号２６）、ＧＶＩＹＫＰＡＴＫ（配列番号２７）の３種である。このうち、ＱＦＬＬＴＮＮＧＨＳＶＫ配列は、４Ｂ４および２７Ｂ６で共通して分析された。図８は、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｈｙｄｒａｓｅ１２  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ１のアミノ酸配列であり、太い文字で分析されたペプチド配列を表示した。図８は、分離精製された抗原をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析して同定されたタンパク質リストである。表９は、実施例６によりＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２  ｉｓｏｆｏｒｍ１のタンパク質配列に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで検出された抗原ペプチド断片に基づいて分析した結果、２７Ｂ６および４Ｂ４抗体が認知する抗原がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２  ｉｓｏｆｏｒｍ１であることを表示したものである。
【０１１０】
【表９】
0006947435.tif 000010
【０１１１】
６−３：４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗原の検定（ＥＬＩＳＡ）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで得られた抗原同定の結果を検定するために、組換えタンパク質Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体の反応性をＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙで確認した。
Ｍａｘｉｓｒｏｐ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたり組換えタンパク質ＣＡ  ＸＩＩを１００ｎｇ入れて、３７℃で１時間反応させて抗原をコーティングした後、１ｘ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｓｉｇｍａ）をｗｅｌｌあたり２００ｕｌ入れて、３７℃で１時間反応させてブロッキングした。前記準備されたプレートに４Ｂ４、２７Ｂ６、抗ＣＡ  ＸＩＩ単クローン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＰＢＳ１００ｕｌを入れた後、３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳで水洗して結合しない抗体は除去した。この後、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を希釈して入れて３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ入れて１０分間反応させた後、硫酸５０ｕｌを入れて反応を中止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。組換えタンパク質Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２に対して２７Ｂ６単クローン抗体の反応性はやや低いものの、４Ｂ４、２７Ｂ６、ａｎｔｉ−ＣＡ  ＸＩＩ単クローン抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）がいずれも図７のような反応性を示した。
図７は、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体に対する抗原がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２であることをＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙで検証した結果である。
【０１１２】
６−４：４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗原の検定（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
前記実験から、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２を抗原として認知することを示したが、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇでもう一度検定した。組換えタンパク質Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２を３分間沸かした後、８％ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌにｌｏａｄｉｎｇして電気泳動を実施した。これをニトロセルロース膜にｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒさせた後、５％ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ（ｓｉｇｍａ）溶液でブロッキングし、それぞれ４Ｂ４、２７Ｂ６、抗−ＣＡ  ＸＩＩ単クローン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を結合させた後（２７Ｂ６：１、２ｌａｎｅ、４Ｂ４：３、４ｌａｎｅ、抗−ＣＡ  ＸＩＩ単クローン抗体：５、６ｌａｎｅ）、洗浄バッファー（０．１％ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を結合させた。前記ニトロセルロース膜を洗浄バッファーで洗浄した後、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）でバンドを確認して、その結果を図８に記載した。図８は、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体に対する抗原がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２であることをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙで検証した結果である。４Ｂ４、２７Ｂ６、Ａｎｔｉ−ＣＡ  ＸＩＩ単クローン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）がすべて４０ｋＤａに達する組換えＣＡ  ＸＩＩに対する反応性を示した。
【０１１３】
６−５：４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗原の検定（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）
前記ＥＬＩＳＡとＷＢで４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体がＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２を抗原として認知することを証明したが、相対的に２７Ｂ６単クローン抗体は相対的に反応性が低い。これを補完するために、Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを下記のように行った。Ｍａｘｉｓｒｏｐ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたりｃｈｉｍｅｒｉｃ  ４Ｂ４またはｃｈｉｍｅｒｉｃ  ２７Ｂ６単クローン抗体をｗｅｌｌあたり１００ｎｇ入れて、３７℃で１時間反応させて抗体をコーティングした後、１ｘ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｓｉｇｍａ）をｗｅｌｌあたり２００ｕｌ入れて、３７℃で１時間反応させてブロッキングした。組換えタンパク質Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２を１００ｎｇ／ｍｌから２倍ずつ希釈してそれぞれのｗｅｌｌに入れて、３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで水洗して結合しない抗原を除去した。この後、ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ２７Ｂ６がコーティングされたｗｅｌｌには４Ｂ４単クローン抗体を、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ４Ｂ４がコーティングされたｗｅｌｌには２７Ｂ６単クローン抗体をｗｅｌｌあたり１００ｎｇを入れて、３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで水洗して結合しない抗体を除去した。この後、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を希釈して入れて３０分反応させた後、ＰＢＳで水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ入れて１０分間反応させた後、硫酸５０ｕｌを入れて反応を中止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。コーティング抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてＣｈｉｍｅｒｉｃ  ２７Ｂ６を用い、検出抗体（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）として４Ｂ４を用いた時、組換えタンパク質Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２に対する高い反応性が表１０のように確認された。したがって、４Ｂ４および２７Ｂ６単クローン抗体ともＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２を抗原として認知することを証明した。
下記表１０は、２７Ｂ６および４Ｂ４単クローン抗体をＣａｐｔｕｒｅ／Ｄｅｔｅｃｔｏｒ抗体に組み合わせてＳａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙで実現し、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２を２７Ｂ６と４Ｂ４単クローン抗体が同時に認知していることを検証した結果である。
【０１１４】
【表１０】
0006947435.tif 000011
【０１１５】
＜実施例７＞エピトープ  ｍａｐｐｉｎｇ
エピトープ（エピトープ）を検証するために、図１３に記載したように、下記の実施で決定されたエピトープ部位を含むか、含まない組換え抗原を作製して、実施例１および３でそれぞれ得られたマウス２７Ｂ６単クローン抗体および４Ｂ４単クローン抗体に対する免疫反応を実施した。
【０１１６】
７−１：ＣＡ  ＸＩＩ  ｍｕｔａｎｔ組換え遺伝子の製造および発現
ｐＳｅｃ−Ｔａｇ−ＣＡ  ＸＩＩ  ｆｕｌｌ−ｈＦｃ組換え遺伝子を用いて制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてＣＡ−ＸＩＩ  ｍｕｔａｎｔ組換え遺伝子を作った。ＣＡ−ＸＩＩ抗原の全体塩基配列とｈＦｃが結合した遺伝子をｐＳｅｃ−Ｔａｇに挿入することによってＣＡ−ＸＩＩ全体発現ｈＦｃ融合タンパク質を製造し、図１３のように、Ｎ末端からアミノ酸３００番目までのｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ−ｈＦｃを製造した。
前記ＣＡ  ＸＩＩ  ｆｕｌｌ−ｈＦｃおよび５種のｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ−ｈＦｃが挿入されたｐＳｅｃ−ＴａｇベクターをＶｉａＦｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＣＨＯ細胞に挿入することによって形質転換した。より具体的には、前記各遺伝子およびＶｉａＦｅｃｔ  ｃｏｍｐｌｅｘを前日にプレーティングして新しい培地に入れ替えたＣＨＯ細胞に散布し、４８時間培養した。前記形質感染して２日後に培養上澄液を収穫してｈｕｍａｎ  Ｆｃ（ｈＦｃ）を検出するｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを用いて発現の有無を確認した。
【０１１７】
７−２：単クローン抗体のエピトープ（エピトープ）の検証
本発明の単クローン抗体のＣＡ−ＸＩＩに対するエピトープを検証するために、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｉｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）をｗｅｌｌあたり５０ｎｇ入れて、３７℃で１時間反応させてｃａｐｔｕｒｅ抗体としてコーティングし、１ｘ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｓｉｇｍａ）をウェルあたり２００ｕｌ入れて、３７℃で１時間反応させてブロッキングした。前記準備されたプレートに製造されたＣＡ  ＸＩＩ  ｆｕｌｌ−ｈＦｃおよび５種のｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ−ｈＦｃの培養上層液をウェルあたり１００ｕｌずつ入れた後、３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳで水洗して結合しない抗体は除去した。これにａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ、Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を希釈して入れて３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗した後、ＴＭＢ溶液をウェルあたり５０ｕｌずつ入れて１０分間反応させた後、硫酸５０ｕｌを入れて反応を中止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。前記培養上層液にＣＡ  ＸＩＩ  ｍｕｔａｎｔ−ｈＦｃタンパク質が存在することを確認するために、対照群としてａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｉｇ抗体を用いてＣａｐｔｕｒｅ＆ｄｅｔｅｃｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを行い、前記実験の結果を図９に記載した。
図９に示すように、ＣＡ−ＸＩＩのＮ−末端から２５番目のアミノ酸から５７番目のアミノ酸からなる断片であってｎｏｎ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎで確認された。したがって、ＣＡ−ＸＩＩのｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎには結合せず、よって、ＣＡ−ＸＩＩ酵素活性を阻害しないと見られる。
具体的には、前記実験の結果から、切断方法で確認した２７Ｂ６抗体の抗原結合部位は、配列番号２のＡＰＶＮＧＳＫＷＴＹＦＧＰＤ（配列番号５の２５番目のアミノ酸〜３８番目のアミノ酸で構成される）であり、ＣＡ  ＸＩＩの３次元的結晶構造に基づいて再び確認した好ましい抗原結合部位は、配列番号２のアミノ酸配列のうち、７個のアミノ酸で構成された配列番号１のＷＴＹＦＧＰＤである（配列番号５の３２番目のアミノ酸〜３８番目のアミノ酸で構成される）。また、前記実験の結果から、切断方法で確認した４Ｂ４抗体の抗原結合部位は、配列番号４のＧＥＮＳＷＳＫＫＹＰＳＣＧＧＬＬＱＳＰ（配列番号５の３９番目のアミノ酸〜５７番目のアミノ酸で構成される）であり、ＣＡ  ＸＩＩの３次元的結晶構造に基づいて再び確認した好ましい抗原結合部位は、配列番号４のアミノ酸配列のうち、１４個のアミノ酸で構成された配列番号３のＧＥＮＳＷＳＫＫＹＰＳＣＧＧである（配列番号５の３９番目のアミノ酸〜５２番目のアミノ酸で構成される）。
【０１１８】
＜実施例８＞固形癌におけるキメラ抗体の治療効果（ＣＤＣ）
８−１：肺腺癌細胞株におけるＣＤＣ効果
肺腺癌細胞株のＡ５４９  ｃｅｌｌを９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、３７℃、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２０〜２４時間培養する。各ウェル（ｗｅｌｌ）の培養培地を除去した後、ウシ胎児血清が含まれないＲＰＭＩ培地に精製したキメリック２７Ｂ６抗体を最終濃度１０ｕｇ／ｍｌとなるように１０％のｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍを混合して混合液を作った後、各ｗｅｌｌに１００ｕｌずつ分注した。
キメリック４Ｂ４抗体も同様の方法を用いた。３７℃、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで３ｈｒ培養後、Ｅｚ−ＣｙＴｏｘ  ａｇｅｎｔ（ＤＯＧＥＮ、ＫＯＲＥＡ）をウェル（ｗｅｌｌ）あたり１０ｕｌずつ添加した。３７℃、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで３ｈｒ３０分培養後、プレートリーダー（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いてＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図１０に示し、図１０は、２７Ｂ６抗体の補体依存性細胞毒性効果を示す図である。
【０１１９】
図１０に示すように、本発明の実施例２および４でそれぞれ得られたキメリック２７Ｂ６およびキメリック４Ｂ４単クローン抗体が補体依存性細胞毒性を示すことを確認することができた。
【０１２０】
８−２：三重陰性乳癌におけるＣＤＣ効果
前記＜実施例８−１＞と実質的に同様の方法で治療効果を評価するが、ただし、標的細胞としてＡ５４９細胞株の代わりに三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ−２３１を行ってＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、下記表１１に示した。表１１は、実施例８により４Ｂ４キメラ抗体が三重陰性乳癌で補体依存性細胞毒性を示すことを確認した結果である。
【表１１】
0006947435.tif 000012
【０１２１】
前記表１１に示すように、本発明の２７Ｂ６単クローン抗体が肺腺癌で補体依存性細胞毒性作用を示すことを確認することができた。
【０１２２】
＜実施例９＞固形癌におけるキメラ抗体の治療効果（ＡＤＣＣ）
９−１：抗体依存性細胞毒性検査（ＡＤＣＣ−ＬＤＨ  ａｓｓａｙ）
エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）準備のために、ヒトの血液を採取してフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）溶液を添加した後（血液：ｆｉｃｏｌｌ＝１：２）、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ）を得た。得られたＰＢＭＣを５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地で３７℃で保管した。抗体依存性細胞毒性検査は、ＬＤＨ  ａｓｓａｙ方法とＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ方法を利用して実験した。
標的細胞として、多様な固形癌細胞株であってＨＴ２９（大腸癌）、Ａ５４９（肺腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺腺癌）、ＭＣＦ７（乳癌）細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに準備した後、３７℃、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで１８〜２０時間培養する。各ウェル（ｗｅｌｌ）の培養液をすべて除去した後、５％ウシ胎児血清が含まれている培養培地にキメリック２７Ｂ６抗体を０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１３ｇ／ｍＬとなるように添加して準備し、これを培養液を除去したプレートに１００ｕｌずつ分注した後、３７℃のインキュベータで３０分間反応させた。この後、準備されたエフェクター細胞を各ｗｅｌｌあたり５×１０５（標的細胞の５０倍）となるように入れて、２４時間、３７℃のＣＯ２インキュベータで培養した。陽性対照群としては溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れて、３７℃で２４時間培養した。２４時間培養した後に、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層液のみ得た後、標的細胞から溶解して出たＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を測定して細胞の溶解程度を計算した（Ｐｒｏｍｅｇａ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。その結果、図１１に示すように、本発明の２７Ｂ６単クローン抗体が多様な固形癌で抗体依存性細胞毒性作用を示すことを確認することができた（図１１）。図１１は、２７Ｂ６抗体の抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果である。
【０１２３】
９−２：三重陰性乳癌における抗体依存性細胞毒性検査（ＡＤＣＣ−ＬＤＨ  ａｓｓａｙ）
エフェクター細胞は、前記９−１の方法と同様の方法で準備し、抗体依存性細胞毒性検査を行った。
２７Ｂ６抗体は、乳癌の分類のうち、現在治療剤が開発されていない三重陰性乳癌細胞株であるＭＤＡＭＢ−２３１、ＭＤＡＭＢ−４６８、ＭＤＡＭＢ−４５３、ＢＴ−２０細胞株で高い抗体依存性細胞毒性作用を示すことを確認することができた（図１２）。図１２は、２７Ｂ６抗体の三重陰性乳癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果を確認した結果である。
【０１２４】
＜実施例１０＞固形癌におけるｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎキメラ抗体の治療効果（ＡＤＣＣ）
１０−１：ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ２７Ｂ６抗体のＡＤＣＣ効能の確認（Ｃｏｌｏｎ、ｌｕｎｇ、ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）
抗体タンパク質のｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎを誘導するために、実施例２による２７Ｂ６と実施例４による４Ｂ４キメラ抗体細胞株の培養時、ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎを誘導する薬物のｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを１００ｎｇ／ｍｌで培養液に添加して培養した後、精製してｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎされていない抗体とのＡＤＣＣ効果を比較した。Ｃｏｌｏｎ、ｌｕｎｇ、ｂｒｅａｓｔ癌で、ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ処理ＡＤＣＣ強化ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ２７Ｂ６抗体のＡＤＣＣ効能を確認した。
その結果、図１３に示すように、ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを処理してｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎを誘導した抗体を多様な固形癌細胞株に処理した時、抗体依存性細胞毒性が増加することを確認することができた。図１３は、Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ２７Ｂ６キメラ抗体の抗体依存性細胞毒性の検査結果である。
【０１２５】
１０−２：ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ２７Ｂ６抗体のＡＤＣＣ効能の確認−三重陰性乳癌
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＡＤＣＣ  ａｓｓａｙ方法を利用して、三重陰性乳癌細胞株のＭＤＡＭＢ２３１とＨＥＲ２受容体陽性の乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ３の抗体依存性細胞毒性効果を調べた時、同じく、ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを処理してｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎを誘導した抗体を処理した時、ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを処理しない抗体より抗体依存性細胞毒性が増加することを確認することができた（図１４）。図１４は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙを用いたＤｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ２７Ｂ６、４Ｂ４キメラ抗体の抗体依存性細胞毒性検査を示す。
具体的には、標的細胞として乳癌細胞株のＭＤＡＭＢ２３１とＳＫ−ＢＲ３を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでｐｌａｔｉｎｇ後、３７℃のＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２０〜２４時間培養する。各ウェル（ｗｅｌｌ）の培養液を除去した後、ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ４％が含まれているＲＰＭＩを細胞のプレーティングされているｗｅｌｌに２５ｕｌずつ添加する。２７Ｂ６、４Ｂ４抗体を最大１０ｕｇ／ｍｌで３−ｆｏｌｄに希釈して最低約１．２ｎｇ／ｍｌまでｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ４％が含まれているＲＰＭＩを用いて希釈した抗体試料を準備する。準備されたそれぞれの抗体試料を当該ｗｅｌｌに２５ｕｌずつ添加した後、ｐｌａｔｅの蓋を閉じてクリーンベンチ内で維持させた。培養していたＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｅｌｌ（ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）をｈａｒｖｅｓｔした後、ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ４％が含まれているＲＰＭＩで３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁する。各ｗｅｌｌにＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｅｌｌ懸濁液を２５ｕｌずつ添加した後、３７℃のＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２４時間培養する。プレートを取り出す前に、予め凍結されているｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを湯煎器に溶かして準備しておく。プレートを取り出して室温で１５分放置後、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを各ｗｅｌｌあたり７５ｕｌずつ添加した後、暗室で３０分間反応させた後、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて発光度を測定した。前記Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙを用いたＤｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ２７Ｂ６、４Ｂ４キメラ抗体の抗体依存性細胞毒性検査の結果を図１４に示した。
図１４に示すように、ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅを処理してｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎを誘導したキメリック２７Ｂ６または４Ｂ４抗体をＭＤＡＭＢ２３１、ＳＫ−ＢＲ−３それぞれに処理した時、抗体依存性細胞毒性が増加することを確認した。
【０１２６】
＜実施例１１＞マウス実験モデルにおける２７Ｂ６、４Ｂ４抗体の治療効果
１１−１：細胞株の確立
ヒトの乳癌動物モデルは、三重陰性乳癌（ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株に確立した。まず、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を１．５×１０８（ｉｎ  ＲＰＭＩ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｍｉｘｔｕｒｅ）で準備した後、マウスの右脇腹に皮下接種し、対照群、試験群としてランダム割り当てる。
図１５は、動物実験に用いたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に対する実施例２のキメリック２７Ｂ６、実施例４のキメリック４Ｂ４抗体の細胞表面結合を追加確認したものであり、図１６は、これを用いた動物実験に関する結果であって、抗体投与によってＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株により生成された癌の成長が阻害されて大きさが減少する結果である。
試験物質は、２７Ｂ６  ｆｕｃｏｓｅキメラ抗体、２７Ｂ６  ｄｅｆｕｃｏｓｅキメラ抗体、４Ｂ４  ｆｕｃｏｓｅキメラ抗体４Ｂ４  ｄｅｆｕｃｏｓｅキメラ抗体であり、乳癌細胞を接種して３日後からマウス１匹あたり１２ｍｇ／ｋｇの用量を腹腔内に投与した。試験物質の投与回数は週２回投与で３週間投与し、腫瘍の大きさを週２回治療剤投与前に測定する。Ａｎｔｉ−ＣＡ  ＸＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓの乳癌に対する有効性は、次の式（ａ×ｂ）／２、（ａは短径、ｂは長径）で計算して体積に換算された結果で比較する。実施例２０−１の体積の計算式と同一である。
［数式］
体積計算式（体積＝（ａ×ｂ）／２、ａは短径、ｂは長径）
【０１２７】
１１−２：三重陰性乳癌に対する抗ＣＡ−ＸＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓの有効性評価
三重陰性乳癌特異発現するＣＡ  ＸＩＩエピトープを標的として三重陰性乳癌に対するキメリック４Ｂ４抗体の有効性を評価した（図１７）。
４Ｂ４を投与した乳癌の体積が抑制されることを確認し、ｆｕｃｏｓｅ抗体よりｄｅｆｕｃｏｓｅ抗体の方が成長抑制効能に優れていた。４Ｂ４  ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｅｄ抗体の乳癌の成長抑制効能は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＤＡ−ＭＢ−４５３の両腫瘍から確認され、特に、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３モデルの場合、２１日目から腫瘍がそれ以上成長しない完全寛解状態を示した（図１７）。図１７は、三重陰性乳癌に対する４Ｂ４抗体の有効性の結果である。
【０１２８】
＜実施例１２＞抗体投与による細胞生存への影響の確認
実施例４のキメリック４Ｂ４抗体を用いて細胞の生存に及ぼす影響を確認した。抗原ＣＡ  ＸＩＩ陽性癌細胞に抗体投与時、細胞の成長および生存に影響を及ぼすかを確認するために、９６ウェルのｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅにｃｅｌｌを３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで前日分注した（１０％ＲＰＭＩ）。２４ｈｒ後にＲＰＭＩ除去し、抗体を含む体積が１００ｕｌとなるように新しい５％ＲＰＭＩを分注した。２４時間後、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（商標名）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃Ｇ１７８０）をｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ分注し、３０分間ＲＴで反応した後、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで細胞の活性度を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に抗体投与後、２４時間経過後の細胞活性度を測定した。
前記測定結果を図１８に示し、抗体投与による細胞活性度の促進または阻害現象は現れておらず、ＣＡ  ＸＩＩ酵素の阻害はなく腫瘍細胞の成長に無影響であることを示す。したがって、本発明による抗体は、免疫システムによるＡＤＣＣ、ＣＤＣで抗腫瘍活性を示した。
Ａ５４９に抗体投与後、２４時間、４８時間、７２時間経過後の細胞活性度を測定した。抗体を投与しない場合に比較して、細胞活性度の変化が大きく現れなかった。図１８および図１９は、４Ｂ４抗体単独の直接的な結合は癌細胞の成長に影響を及ぼさないことを示した結果である。
抗ＣＡ−ＸＩＩ抗体としてキメリック４Ｂ４抗体自体の細胞結合だけでは細胞の成長に影響を及ぼさなかった。このような理由は、キメリック４Ｂ４抗体の場合、ＣＡ−ＸＩＩ抗原のＮ−末端非酵素部位（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）に結合するので、ＣＡ−ＸＩＩ酵素の活性には影響を及ぼさないためと見られる。
【０１２９】
＜実施例１３＞抗体およびＲａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙの併用による治療効果評価
本発明による抗体と放射線療法を共に処理する場合に抗癌効果が増大するかを確認した。
具体的には、本発明による実施例２のキメリック２７Ｂ６抗体と共に、それぞれｃｉｓｐｌａｔｉｎ５ｕｇ／ｍｌ処理、２Ｇｙ放射線照射、または４Ｇｙ放射線照射を行った後に、Ａ５４９細胞におけるＣＡ  ＸＩＩ発現程度の変化を流細胞分析器で確認した。その結果、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ処理および放射線照射後にＣＡ  ＸＩＩ抗原の細胞表面の発現が増加することが確認され、放射線４Ｇｙ照射時に最も高い発現様相を示した。これは、放射線照射と本発明によるＣＡ  ＸＩＩ抗体の併用投与で癌細胞の成長抑制に影響を及ぼしうるとの可能性を提起する（図２０の上のグラフ）。
そこで、併用処理に対する癌細胞死滅効果を検証するために、図２０の下のグラフのように、２７Ｂ６抗体と放射線照射を併用処理した後、Ａ５４９癌細胞株の細胞死滅効果をＭＴＴ  ａｓｓａｙで測定した。図２０の下のグラフは、２７Ｂ６抗体と放射線治療の併用効果を示した結果である。図２０に示すように、抗体単独処理または抗体に対する陰性対照群としてｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ抗体と放射線照射併用処理と比較して、２７Ｂ６と放射線照射併用処理時、高い比率で癌細胞を死滅させる結果を確認した。
【０１３０】
＜実施例１４＞抗−ＣＡ−ＸＩＩキメラ抗体のヒト化
１４−１：ヒト化可変ドメインの構築（ＤＮＰ００４  ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍの選択）
＜実施例４＞で得られたｆｕｌｌ  ＩｇＧ形態の４Ｂ４キメラ抗体を鋳型としてＤＨラボ所有Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ技術でａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇのためにｓｃＦｖ形態に転換した。このために、キメリック４Ｂ４抗体のｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎをＥ．ｃｏｌｉ  ｃｏｄｏｎに切り替えてＶＬとＶＨをＰＣＲで連結してｓｃＦｖ  ｇｅｎｅを作製した。ＶＬとＶＨの順序およびｌｉｎｋｅｒの長さを組み合わせて多様なｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓを作製した後、ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒにｌｉｇａｔｉｏｎした。ｌｉｇａｔｉｏｎしたｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒは、抗原のＣＡ  ＸＩＩと結合力分析により結合力が最も高いＤＮＰ００４  ｓｃＦｖのＶＨ−ｌｏｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ形態を選択してｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｅｍｐｌａｔｅに使用した。
【０１３１】
１４−２：サブライブラリーの作製およびスクリーニング
ＤＨラボ社のノウハウにより、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ全体または部分に対してｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｂｌｉｂｒａｒｙまたはｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙを計１１種作製した。作製されたＳｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙの種類は次の通りである：
（１）Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙ：ＶＬ１種、ＶＨ１種、ＶＨ＆ＶＬ２種
【０１３２】
（２）Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙ：ＬＣＤＲ３種、ＨＣＤＲ３種、ＶＨ＆ＶＬ１種
前記作製した１１種のサブライブラリーを対象にＣＡ  ＸＩＩに対するｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇを行った。１次スクリーニングによりＶＬ部分にｓｉｇｎａｌの高いｃｌｏｎｅ５５２個を選定した後、２次スクリーニングによりｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅのｓｉｇｎａｌより高いｃｌｏｎｅ７８個を選別した。この後、塩基配列を確認して塩基配列が互いに異なる計３２個のｃｌｏｎｅを選別した。
選定された３２個のｃｌｏｎｅをＥＬＩＳＡ方法でＣＡ  ＸＩＩに対する結合力を再確認して、ＥＬＩＳＡ  ｓｉｇｎａｌが、ｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅの４Ｂ４キメラ抗体と対比して１．５倍以上のｃｌｏｎｅ１０種（ｃｌｏｎｅ  ＩＤ１、２、４、５、８、１５、２４、２５、２６、２８）を選定し、これらのＣＤＲの配列分析の結果、ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２部分に変異があることを確認した（図２２）。
その後に、ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２部分をｈｏｔ−ｓｐｏｔで判断して、前記１０種（ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：１、２、４、５、８、１５、２４、２５、２６、２８）、そして追加的にＬＣＤＲ２部分に変異がある４種（ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：１１、２２、１９、３０）を選別してｆｕｌｌ  ＩｇＧ転換［ＬＫ  ｓｕｎ、Ｐ  Ｃｕｒｔｉｓ、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ１７−１Ａ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７Ｊａｎ；８４（１）：２１４−８］をした（図２１および図２２）。しかし、ｆｕｌｌ  ＩｇＧに転換したクローン１４種のうち、Ｌｏｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎなどの理由からｃｌｏｎｅ  ＩＤ：４、５、２４、および２８は後の物質テスト実験で除外した。前記１０種の選択されたクローンの変異部位を下記表１２にまとめる。
【０１３３】
【表１２】
0006947435.tif 000013
【０１３４】
１４−３：ヒト化ライブラリーの形質感染およびＩｇＧの培養および測定
ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに接種し、ヒト化クローンのミニプレップＤＮＡで形質感染させた。詳しい実験方法は以下の通りである。
まず、ＣＨＯ細胞株を形質転換する１２時間前に６−ウェルプレートに１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で接種し、５％ウシ胎児血清が含まれているＤＭＥＭ３ｍｌを入れて、３７℃、５％ＣＯ２条件で１２時間培養後、前記で製造された１０種のＦｕｌｌ  ＩｇＧ  ＤＮＡをＶｉａＦｅｃｔ  ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて、準備されたＣＨＯ細胞に形質転換した。細胞培養物上層液を形質感染４８時間後に収集し、各ヒト化クローンおよび対照群のＩｇＧ抗体の反応性をＥＬＩＳＡで確認した。
Ｍａｘｉｓｒｏｐ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたり組換えタンパク質ＣＡ  ＸＩＩを１００ｎｇ入れて、３７℃で１時間反応させて抗原をコーティングした後、１ｘ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｓｉｇｍａ）をｗｅｌｌあたり２００ｕｌ入れて、３７℃で１時間反応させてブロッキングした。前記準備されたプレートに４Ｂ４、２７Ｂ６、抗ＣＡ  ＸＩＩ単クローン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＰＢＳ１００ｕｌを入れた後、３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳで水洗して結合しない抗体は除去した。この後、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を希釈して入れて３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌあたり５０ｕｌずつ入れて１０分間反応させた後、硫酸５０ｕｌを入れて反応を中止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１３５】
１４−４：ＥＬＩＳＡを用いたヒト化抗体候補群の抗原親和力テスト
抗原ＣＡ−ＸＩＩにヒト化クローンの結合をＤＨラボから提供されたプロトコルおよび抗原を用いて平行試験した。活性（親和力）を各クローンに対して計算し、同一のプレート上で陽性対照群（キメラクローン４Ｂ４）の活性と比較した。１０種のｖａｒｉａｎｔｓ（ｃｌｏｎｅ  ＩＤ１、２、４、５、８、１５、２４、２５、２６、２８）の抗原結合力は、ｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅ（４Ｂ４キメリック）に比べて大して高くないことが確認されたが、ＥＬＩＳＡ上で予想されるｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅのａｆｆｉｎｉｔｙは約ＫＤ１０−１０Ｍ水準とされ、これは非常に高い水準で、１０種の候補抗体の抗原結合力がｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅに届かなくてもその結合力が低いわけではないと判断される（図２３および図２４）。
【０１３６】
＜実施例１５＞ヒト化抗体ＣＤＲ配列／抗体ｓｅｑｕｅｎｃｅ
１５−１：抗−ＤＮＰ００４ヒト化抗体遺伝子配列の選定
ＤＮＰ００４ヒト化抗体遺伝子は、ＣＡ−ＸＩＩに特異的に結合するマウス単クローン抗体４Ｂ４（ハイブリドーマ寄託番号：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７９）の軽鎖および重鎖可変領域遺伝子を鋳型としてヒト化抗体の作製を進行させるものの、前記ＤＨラボ社のＩｎ  ｓｉｌｉｃｏノウハウによりｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ全体または部分に対してｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｂｌｉｂｒａｒｙまたはｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙを計１０種を作製した。
このように作製されたｌｉｂｒａｒｙを用いて、ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ方法で計５５２個の個別的なｃｌｏｎｅをｓｃｒｅｅｎｉｎｇして、これらのうちｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅより高いｓｉｇｎａｌを見せたｃｌｏｎｅ７８個を選別した。塩基配列確認の結果、計３２個の互いに異なるｃｌｏｎｅを選別した。３２種のＣＡ  ＸＩＩに対する結合力を再確認した結果、ＥＬＩＳＡ  ｓｉｇｎａｌがｍｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｎｅ対比１．５倍以上のｃｌｏｎｅ１０種が確認され、主にＬＣＤＲ１、２部分にｍｕｔａｔｉｏｎがあることが確認された。したがって、ＬＣＤＲ１、２部分をｈｏｔ−ｓｐｏｔで判断して１０種を選別し、追加的にＬＣＤＲ２部分にｍｕｔａｔｉｏｎがある４種（１１、２２、１９、３０）を選別してｆｕｌｌ  ＩｇＧ１転換をした。このように準備されたｆｕｌｌ  ＩｇＧ１４種のうち、Ｌｏｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎなどの理由からｃｌｏｎｅ  ＩＤ４、５、２４、２８を除いた１０種を発現／精製後、ＥＬＩＳＡを進行させて最終的に１０種を選別した。
最終的には、マウス単クローン抗体４Ｂ４と最も類似のヒト化抗体＃８番の抗体候補を選定した。各候補抗体は、シーケンシングによりヒト化抗体遺伝子を確認し、分析されたＤＮＰ００４抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列は次の通りである（表１３、表１４）。下記表１３に示すように、重鎖可変領域のＣＤＲは同一であるか一部が異なるが、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は異なっていてもよい。下記の配列番号１５、１６、２８、３２〜４２で濃く表示したアミノ酸は変形したものを示す。
【０１３７】
【表１３】
0006947435.tif 000014
【０１３８】
【表１４】
0006947435.tif 000015
【０１３９】
下記の表１５で、前記選定されたクローンの重鎖および軽鎖可変領域配列を表示し、いずれも重鎖可変領域は同一であり（配列番号５３）、軽鎖可変領域は異なり（配列番号５４〜６３）、下線で表示した配列部分がＣＤＲ配列に相当する。
【０１４０】
【表１５】
0006947435.tif 000016
【０１４１】
１５−２：ヒト化抗体の製造
前記作製された抗−ＣＡ  ＸＩＩヒト化抗体ＤＮＰ００４のアミノ酸配列に基づいて、ヒト化抗体を作製した。
抗−ＣＡ−ＸＩＩヒト化抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ作製した。重鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを用い、軽鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを用いた。
追加的なアミノ酸の挿入なしに抗体それぞれの可変領域コーディングｃＤＮＡと不変領域コーディングｃＤＮＡを連続的なアミノ酸配列として発現させるために、前記クローニングした可変領域のコーディング塩基配列と知られたｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１不変領域（重鎖）およびｋａｐｐａ不変領域（軽鎖）コーディング塩基配列を連結した遺伝子片それぞれを合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）した。このように合成した重鎖および軽鎖発現遺伝子は、制限酵素Ｘｈｏ  ＩとＳａｌ  Ｉで切断した後、重鎖遺伝子片はｐｃＤＮＡ３．４ベクターに、軽鎖遺伝子片はｐＯｐｔｉＶｅｃベクターにそれぞれｌｉｇａｔｉｏｎして完全な抗体発現用プラスミドを作製した（ｐｃＤＮＡ３．４−４Ｂ４の重鎖発現プラスミドおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ−４Ｂ４軽鎖発現プラスミド）。
前記作製されたｐｃＤＮＡ３．４−４Ｂ４の重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ−４Ｂ４軽鎖発現プラスミドを、ＣＨＯ細胞由来のＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて形質転換過程を行った。
まず、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ３日前に浮遊状態のＤＧ４４細胞を５％ＦＢＳが含まれているＭＥＭａ培地に適応させることにより、付着状態の細胞に変換させて形質転換効率を高められるように適応させた。形質転換は、ＶｉａＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ｅ４９８１）を用いて６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで行った。形質転換前日、１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で継代培養して付着状態で適応されたＤＧ４４細胞を準備し、形質転換に使用されたＤＮＡの量は、ｐＯｐｔｉＶＥＣ−４Ｂ４軽鎖発現プルラスミドとｐｃＤＮＡ３．４−４Ｂ４重鎖発現プラスミドをそれぞれ３ｕｇ、１ｕｇずつ３：１の比率の組み合わせで使用した。形質転換は４８時間行った。形質転換された細胞群を分析するために、流細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた。
図２５は、ヒト化抗体ＤＮＰ００４のＣＡ−ＸＩＩ陽性三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ−２３１における結合の確認を示すものである。
【０１４２】
＜実施例１６＞抗体候補群の物性評価
ヒト化抗体変異体の発現および物理的特性を比較評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＡＮＳ反応性などを比較評価した。
【０１４３】
１６−１：抗体候補群−発現量分析
発現量およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａの精製による沈澱発生の有無を確認するために、８種の変異体組換えベクターをＨＥＫ２９３Ｆに導入して一時的な形質転換を誘導した。
それぞれの培養液３００ｍＬをｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１−００３４−９３）に注入し、溶出バッファー（２０ｍＭ  ｃｉｔｒｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ３．０）を用いて精製した。取得した抗体をリン酸塩緩衝食塩水で透析し、透析前後の定量を実施して損失の有無を確認した。発現量は１．０〜１０．０ｕｇ／ｍＬの範囲で非常に多くの差を示し、２５、２６番の変異体で高い発現率を確認することができた（表１６）。
【０１４４】
【表１６】
0006947435.tif 000017
【０１４５】
１６−２：抗体候補群に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ヒト化抗体変異体の重鎖／軽鎖結合安定性、重鎖および軽鎖の単一性などを評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。
非還元分析条件では抗体５ｕｇを、還元分析では抗体１０ｕｇを２Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒｅａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６１−０７３７）に混合した後、１００℃で５分間沸かし、ｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：４５６−１０８３）に試料をｌｏａｄした。１５０Ｖで１時間電気泳動を実施し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＬＣ６０６０）で２時間染色し、蒸留水で脱染した。ヒト化抗体変異体８種のうち、クローン＃１５番の変異体の場合、軽鎖染色が不明確であったが、それ以外の変異体７種では異常がないことを確認した（図２６）。
図２６は、抗体候補群のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた物性を分析した結果を示す写真である。ヒト化抗体変異体８種のうち、１５番の変異体の場合、軽鎖染色が不明確であったが、それ以外の変異体７種では異常がないことを確認した（図２６）。
【０１４６】
１６−３：抗体候補群に対するＳＥ−ＨＰＬＣ分析
純度評価のために、Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ分析を実施した。
それぞれの抗体をリン酸塩緩衝食塩水で希釈して１．０ｍｇ／ｍＬ準備し、平衡バッファー（０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ）に２０ｕＬ注入した。０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で平衡バッファーを４０分間流しながら溶出するタンパク質を２８０ｎｍの波長で検出した。検出されたピークを自動積分で積分してそれぞれのピークに対する面積を計算し、主ピークの面積比を百分率で記した。
大部分の変異体の主ピークの面積比は９５％以上の純度を示したが、変異体＃１１、２６番の場合、９４．３％、９４．１％の純度で相対的にやや低く評価された（表１７）。
【０１４７】
【表１７】
0006947435.tif 000018
【０１４８】
１６−４：抗体候補群−Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｍ）分析
強固性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）比較評価のために、ヒト化抗体変異体のＭｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを測定した。
抗体変異体０．４４ｕｇにＰｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｈｉｆｔ  ｄｙｅとｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：４４６２２６３）を製造会社のマニュアルに従って添加して混合液２０ｕＬを製造して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．０が搭載されたＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲに注入した。０．０５℃／ｓｅｃの速度で２５℃から９５℃まで連続的に温度を増加させながら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｈｉｆｔ  ｄｙｅと抗体との間の結合によって放出される蛍光値を検出した。試験完了後、ＶｉｉＡ（商標名）７ＳｏｆｔｗａｒｅでＢｏｌｔｚｍａｎｎ  ｆｉｔｔｉｎｇを実現し、それぞれの抗体に対するｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｍ）を計算した。８番の変異体の場合、Ｔｍ７１．４１℃で最も強固な抗体として評価された。Ｔｍと純度との間の相関関係を確認するために、それぞれの変異体を６２℃の高温条件で３時間放置した後、Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ分析を実施し、主ピークの面積比を計算した。
変異体８番の場合、６２℃の高温条件で最も多くの主ピーク比率を示し、Ｔｍ分析値と同じく最も強固な変異体として測定された（表１８）。
【０１４９】
【表１８】
0006947435.tif 000019
【０１５０】
１６−５：ＣＡ  ＸＩＩ陽性細胞株の結合力評価
ＣＡ  ＸＩＩ抗原を発現するＭＤＡＭＢ２３１乳癌細胞株１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した後、Ｔｒｙｐｓｉｎｅ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で脱着した後、リン酸塩緩衝食塩水を入れて遠心分離して洗浄し、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅで分注した。
ヒト化抗体変異体を１．０ｕｇ／ｍＬの濃度となるようにそれぞれのｔｕｂｅに入れて、冷蔵で３０分反応した。リン酸塩緩衝食塩水を入れて遠心分離して洗浄し、ＦＩＴＣ標識二次抗体Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ（ＤｉＮｏｎａ）を入れて、冷蔵で２０分反応した。リン酸塩緩衝食塩水でもう一度遠心分離して洗浄し、１％ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅが添加されたリン酸塩緩衝食塩水で細胞を浮遊して流細胞分析器（Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ、Ｓ１０００ＥＸｉ）で蛍光を分析した。
ＭＤＡＭＢ２３１細胞株に結合する４Ｂ４キメラ抗体のＭｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を基準として変異体の結合力を百分率で図２７のように示した。すべての変異体がいずれも９０％以上の相対的結合力を示し、変異体８、１１、１５および２６番は９９％の相対的結合力を示して、キメラ抗体とほとんど差がなかった（図２７）。
【０１５１】
＜実施例１７＞多様な細胞株におけるヒト化抗体の発現分析
１７−１：多様な細胞株における抗体の発現
ＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）とＳＮＵ（Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により確保した多様な癌細胞株におけるヒト化抗体（ＤＮＰ００４）の抗体結合の有無を流細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。具体的には、癌細胞株はＫＣＬＢ（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）とＳＮＵ（Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を通して得ており、ＬＮＣａｐ、ＭＣＦ−７、Ｈｕｈ７、Ｈｓ−５７８Ｔは、１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＤｕｂｃｏ’ｓ  ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＤＬＤ−１、ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＰＣ−３、ＳＮＵ６３８、ＳＮＵ７１９、ＭＫＮ４５、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４５３は１０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を用いて、３７℃で５％ＣＯ２状態の培養器を用いて培養した。また、Ｈｅｐ３Ｂ．１−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５は１０％  ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を、ＫＡＴＯ  ＩＩＩは２０％ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地が添加されたＭｅｄｉｕｍを用いて、３７℃で５％ＣＯ２．状態の培養器を用いて培養した。
前記培養された癌細胞株に本発明のヒト化抗体（ＤＮＰ００４）をそれぞれ入れて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａ  ＩｇＧ（ＤｉＮｏｎａ  Ｉｎｃ、Ｋｏｒｅａ）を入れて、４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）で分析して、その結果を以下に記載した（表１９）。下記表１９は、多様な固形癌細胞株におけるｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する発現様相を示す。表１９で、ＤＮＰ００４陽性細胞のパーセントはＦＡＣＳ分析法で分析し、実験対象５０００個の細胞の中からＤＮＰ００４抗体と結合する細胞の数を％で計算して、−は陽性細胞数が１０％未満、＋は陽性細胞数が１０〜３０％の範囲、＋＋は陽性細胞数が３０〜７０％の範囲であり、＋＋＋は陽性細胞数が７０〜１００％に指定した。
【０１５２】
【表１９】
0006947435.tif 000020
前記表１９に記載のように、同じｏｒｉｇｉｎの細胞でも、細胞株の構築時、Ｔｉｓｓｕｅソースが異なるため、細胞の種類によって陽性反応の程度は差が生じうるが、本発明のヒト化抗体ＤＮＰ００４は、多様な種類の肺腺癌、大腸癌、胃癌、肝癌および乳癌細胞株における結合程度の差は見られるものの陽性反応を示し、前立腺癌では陰性反応を示すことを確認した。反面、末梢血液由来リンパ球と単核球、顆粒球にはすべて陰性の反応を示すことを確認した。このような結果は、本発明のヒト化抗体ＤＮＰ００４が陽性反応を示す固形癌を適応症とする治療剤として使用できることを示したものである。
【０１５３】
１７−２：多様な類型の乳癌細胞における発現様相
ＤＮＰ００４抗体は、ＥＲ、ＰＲだけでなく、ＨＥＲ２  ｐｏｓｉｔｉｖｅのＢｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌにおいてもすべて陽性反応を示す。したがって、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）だけでなく、多様な類型の乳癌治療剤としても使用可能である。３つの互いに異なる表現型の乳癌細胞株におけるＤＮＰ００４ヒト化抗体の結合の有無を流細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認し、ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ４Ｂ４と結合程度の差を比較した。
具体的には、ＭＤＡＭＢ−２３１およびＭＤＡＭＢ４５３、ＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ−３細胞株は、前記＜実施例５−２＞と同様の方法で培養した。前記培養された癌細胞株にＤＮＰ００４ヒト化抗体をそれぞれ入れて、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ＤｉＮｏｎａ  Ｉｎｃ、Ｋｏｒｅａ）を入れて、４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）で分析して、その結果を図２８および図２９に記載した。
図２８および図２９は、多様な類型の乳癌細胞におけるＤＮＰ００４ヒト化抗体のｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ１２抗原に対する結合様相を確認した結果である。したがって、本発明によるＤＮＰ００４ヒト化抗体は、ＥＲ、ＰＲだけでなく、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞においてもすべて陽性反応を示すので、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）だけでなく、多様な類型の乳癌においても治療剤として使用可能である。
【０１５４】
＜実施例１８＞多様な固形癌に対するヒト化抗体の治療効果（ＡＤＣＣ）
多様な固形癌における抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで評価した。標的細胞として乳癌細胞株のＭＤＡＭＢ−２３１とＭＤＡＭＢ−４５３、ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ３、肺癌細胞株のＡ５４９、肝癌細胞株のＨｕｈ７とＨＥＰ３Ｂ、胃癌細胞株のＫＡＴＯ  ＩＩＩ、ＳＮＵ７１９、ＭＫＮ−４５を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでｐｌａｔｉｎｇ後、３７℃、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２０〜２４時間培養する。各ウェル（ｗｅｌｌ）の培養液を除去した後、ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ４％が含まれているＲＰＭＩをプレーティングされているｗｅｌｌに２５ｕｌずつ添加する。実施例１５によるＤＮＰ００４ヒト化抗体を最大１０ｕｇ／ｍｌで３−ｆｏｌｄに希釈して最低約１．２ｎｇ／ｍｌまでｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ４％が含まれているＲＰＭＩを用いて希釈した抗体試料を準備する。準備されたそれぞれの抗体試料を当該ｗｅｌｌに各濃度に合わせて添加した後、ｐｌａｔｅの蓋を閉じてクリーンベンチ内で維持させた。培養していたＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｅｌｌ（ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉ５  ｏａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）をｈａｒｖｅｓｔした後、ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ４％が含まれているＲＰＭＩで３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。各ｗｅｌｌにＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｅｌｌ懸濁液を２５ｕｌずつ添加した後、３７℃、ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２４時間培養した。
プレートを取り出す前に予め凍結されているｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを湯煎器に溶かして準備しておく。プレートを取り出して室温で１５分放置後、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを各ｗｅｌｌあたり７５ｕｌずつ添加した後、暗室で３０分間反応させた後、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて発光度を測定した。
図３０は、ＤＮＰ００４ヒト化抗体の乳癌細胞株における抗体依存性細胞毒性効果の確認結果であり、図３１は、ＤＮＰ００４ヒト化抗体の肺癌細胞株Ａ５４９における抗体依存性細胞毒性効果の確認結果であり、図３２は、ＤＮＰ００４ヒト化抗体の肝癌細胞株Ｈｕｈ７とＨＥＰ３Ｂにおける抗体依存性細胞毒性効果の確認結果であり、図３３は、ＤＮＰ００４ヒト化抗体の胃癌細胞株ＫＡＴＯ  ＩＩＩ、ＳＮＵ７１９、ＭＫＮ−４５における抗体依存性細胞毒性効果の確認結果を示す。
したがって、本発明によるＤＮＰ００４ヒト化抗体は、ＤＮＰ００４抗原（ＣＡ  ＸＩＩ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ＸＩＩ）が発現する多様な類型の固形癌細胞における抗体依存性細胞毒性効果による細胞死滅機序があることを立証した。
【０１５５】
＜実施例１９＞マウス実験モデルを用いたヒト化抗体の治療効果評価
１９−１：乳癌動物モデル／単一濃度の抗体投与群実験
ヒトの乳癌動物モデルは、三重陰性乳癌（ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株に確立した。まず、１．５×１０７細胞数のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をマウスの右脇腹に皮下接種し、腫瘍の形成と成長を観察し、腫瘍の大きさは下記の数式によって計算した。
（体積＝（ａ×ｂ）／２、ａは短径、ｂは長径）
腫瘍の大きさが１００ｍｍ３±２０に到達した時、マウスをランダムに対照群グループ（５匹）と処理群グループ（５匹）に分離し、処置群グループにＤＮＰ００４ヒト化抗体は１０ｍｇ／ｋｇの量をマウスの尾静脈に投与した。この後、腫瘍は、実験期間、３〜４日間隔で１週間に２回測定し、腫瘍成長曲線は抗体投与開始日から実験終了時点までとし、前記結果の平均値を図３４Ａに示した。したがって、ヒト化抗体投与群は大部分の腫瘍成長が抑制される結果を示した（図３４）。
【０１５６】
１９−２：乳癌動物モデル／複数の濃度の抗体投与群実験
前記実施例１９−１と同一の乳癌動物モデルを用いて、ＤＮＰ００４ヒト化抗体を多様な濃度で投与する実験を進行させた。
具体的には、４ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇとして４つの濃度で投与した抗体投与群（グループ）を各グループあたり５匹ずつ実験を進行させた。１６ｍｇ／ｋｇ用量の抗体投与群では部分的な腫瘍抑制効果を示し、全体的に用量と比例的に腫瘍抑制効果を示してはいなかったが、腫瘍成長が完全に抑制される完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）状態の結果は、抗体投与用量が高いほど、増加する傾向を示した（図３５、表２０）。
【０１５７】
【表２０】
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【０１５８】
１９−３：腎臓癌動物モデル／単一濃度の抗体投与群実験
ヒト化抗体（ＤＮＰ００４）のターゲット抗原（ＣＡ−ＸＩＩ）が高く発現する腎臓癌（Ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株の７８６−Ｏ細胞を用いて、マウス動物モデルの確立および抗腫瘍効果を確認した（図３６）。
具体的には、ヌードマウスに１．５×１０７細胞数の７８６−Ｏ細胞株を皮下注射した。しかし、この実験セットの場合、腫瘍形成は前記乳癌細胞株の場合とは異なって非常に遅く行われ、約７０日後に腫瘍形成を確認した。前記腫瘍形成が確認された処置群グループにＤＮＰ００４ヒト化抗体は３２ｍｇ／ｋｇの量をマウスの尾静脈に投与した。この後、腫瘍は、実験期間、３〜４日間隔で１週間に２回測定し、腫瘍成長曲線は抗体投与開始日から実験終了時点までとし、対照群３匹対比、ＤＮＰ００４ヒト化抗体投与群８匹の個別マウスの平均腫瘍成長曲線を図３６に示した。
したがって、乳癌だけでなく、腎臓癌においてもＤＮＰ００４ヒト化抗体の抗癌効果を確認した。
【０１５９】
【表２１】
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【０１６０】
【表２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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