(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化された、５’−キサンチル酸を生産する、コリネバクテリウム属微生物であって、前記活性の強化が、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、プロモーター活性の強化、開始コドンの交替またはその組み合わせによって達成されるものである、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号１の塩基配列を含む遺伝子によりコードされるものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項１に記載の５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
前記微生物または培地から５’−キサンチル酸を回収する段階
を含む、５’−キサンチル酸の製造方法。
【請求項５】
前記５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項４に記載の５’−キサンチル酸の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；
前記微生物または培地から５’−キサンチル酸を回収する段階；及び
５’−キサンチル酸を５'−グアニル酸（ＧＭＰ）に変換する段階
を含む、５'−グアニル酸の製造方法。
【請求項７】
コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項６に記載の５'−グアニル酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、５’−キサンチル酸を生産する微生物及びこれを用いて５’−キサンチル酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５’−キサンチル酸（5'-xanthosine monophosphate：XMP）は、核酸生合成代謝系の中間物質であって、動植物の体内で生理的に重要な意味があるだけでなく、食品、医薬品及び各種医療的用途に多方面で利用されている。特に、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）と一緒に用いると味の上昇効果が大きく、呈味性調味料として脚光を浴びている核酸系調味料の中の一つである。
【０００３】
また、５’−キサンチル酸は、プリンヌクレオチド（purine nucleotide）生合成代謝系の中間生成物であって、５’−グアニル酸（5'-guanosine monophosphate：GMP）の製造原料としても重要な物質である。呈味性が強く商品的価値が高い５’−グアニル酸の製造方法として現在広く利用されている方法は、微生物発酵法であって、５’−キサンチル酸を生産し、これを酵素学的に５’−グアニル酸に転換させる過程が最も経済的で、５’−グアニル酸の需要と同様に５’−キサンチル酸も必要である。
【０００４】
５’−キサンチル酸の製造方法には、（１）化学合成方法、（２）製造された５’−グアニル酸を脱アミノ化する方法、（３）発酵培地内の前駆物質としてキサンチン（xanthine）を添加して発酵生産する方法、（４）５’−キサンチル酸生産微生物変異株の直接発酵を通じた生産法などが知られている。このうち微生物変異株による５’−キサンチル酸の直接発酵の製造方法が経済的に有利である。しかし、それでも効率的に高収率で５’−キサンチル酸を生産できる方法に対する研究の必要性が台頭している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許第１０-２０１１‐０１０５６６２号
【特許文献２】韓国登録特許第１０‐０９２４０６５号
【特許文献３】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【特許文献４】韓国登録特許１０−０６２００９２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献２】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276−２77
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981） 2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National BiomedicalＲesearch Foundation, pp. 353−３58（1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986）Nucl. AcidsＲes. 14: 6745
【非特許文献８】Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、５’−キサンチル酸を高効率で生産できる微生物を開発しようと鋭意研究した結果、特定タンパク質の活性を強化させる場合、５’−キサンチル酸の生産収率が増加するという事実を確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願の一つの目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化された、５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【０００９】
本出願のもう一つの目的は、前記微生物を用いた５’−キサンチル酸の製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本出願のコリネバクテリウム属由来の微生物は、５’−キサンチル酸排出タンパク質の活性が強化されて５’−キサンチル酸の生産性が増加されたもので、５’−キサンチル酸の生産におけるコスト削減に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【００１２】
前記のような目的を達成するために、本出願は一つの様態として、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化された、５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１３】
本出願において、用語、「５’−キサンチル酸」（5'-xanthylic acid、xanthosine）は、キサントシン一リン酸塩、キサンチル酸、キサンチル酸などと命名された化合物を意味する。本出願では、前記５’−キサンチル酸は「ＸＭＰ」に混用されて命名されてもよい。
【００１４】
本出願において、用語、「配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質」は、微生物で５’−キサンチル酸の排出機能を行うＭＦＳトランスポーター（MFS transporter; Major facilitator superfamily transporter）遺伝子によってコードされるコリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するタンパク質を意味する。具体的には、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在する配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＦＳトランスポータータンパク質であってもよい。また、前記タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよいが、これらに制限されない。また、本出願で前記ＭＦＳトランスポータータンパク質は、「ｘｍｐＥ」または「ｘｍｐＥタンパク質」と命名されてもよい。
【００１５】
また、本出願で「特定の配列番号で記載されたタンパク質」は、該当配列番号のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、該当配列番号のアミノ酸配列の前後に、タンパク質の変異に影響を与えない配列の追加または自然に発生しうる突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（silent mutation）をすべて含み、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属することは自明である。
【００１６】
また、本出願のタンパク質は、前記配列番号２に記載したアミノ酸配列だけでなく、配列番号２と少なくとも６０％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。前記配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質は、前記配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％以上、具体的には、７０％以上、より具体的には、８０％以上、さらに具体的には、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含んでもよい。相同性または同一性を有するアミノ酸配列は、前記カテゴリのうち、１００％同一性を有する配列は除かれるか、１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。前記配列と相同性または同一性を有する配列として、実質的に配列番号２のアミノ酸配列と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００１７】
また、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベースから取得することができ、その例としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、これに制限されない。具体的には、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１の塩基配列を含む遺伝子によってコードされたものであってもよい。また、配列番号１の塩基配列を含むか、配列番号１の塩基配列で構成されるか、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子によってコードされたものであってもよいが、これに制限されない。
【００１８】
また、前記配列番号１の塩基配列は、配列番号１の塩基配列だけでなく、配列番号１と少なくとも８０％の相同性または同一性を有する塩基配列も含むものであってもよい。
【００１９】
具体的には、前記配列番号２と少なくとも８０％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしうる塩基配列であれば、本出願のカテゴリに含まれるが、前記タンパク質は、前記配列番号１の塩基配列に対して少なくとも８０％以上、具体的には、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性または同一性を有する塩基配列を含む遺伝子によってコードされてもよい。しかし、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に相当する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列であれば、これに制限されず、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００２０】
また、遺伝暗号の縮退（genetic code degeneracy）に起因して、同一アミノ酸配列を含むタンパク質またはこれと相同性または同一性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれるのは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製しうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリダイゼーションし、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的分子交雑を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、８５％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリダイゼーションする。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。分子交雑は、たとえ分子交雑の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに分子交雑が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
【００２１】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で分子交雑段階を含む分子交雑条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節してもよい。
【００２２】
ポリヌクレオチドを分子交雑する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献１参照）。
【００２３】
本出願において、用語、「相同性」は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。本明細書では、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」として表示される。
【００２４】
また、用語、「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味し、場合によっては、その配列の文字列間の一致によって決定される。
【００２５】
用語「相同性」及び「同一性」は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
【００２６】
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性または同一性のあるプリヌクレオチドまたはポリペプチドは、一般的に、配列全体、またはターゲットポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の中間または高い厳しい条件でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００２７】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、少なくとも、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（好ましくは、バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988）SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００２８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を示す。
【００２９】
本出願において、前記５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化されたものであってもよい。
【００３０】
ここで、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性強化は、ｘｍｐＥの活性強化、または前記配列番号１の塩基配列を含む遺伝子によってコードされるタンパク質の活性強化と同じ意味で混用されて使用してもよい。
【００３１】
本出願において、用語、「配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が強化された」とは、前記タンパク質の発現が親菌株または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質が非変形された菌株に比べて発現量が増加したり、発現量が同じでありながらその活性が増加されたり、または発現量が増加するとともに、その活性の増加されたことを意味する。また、前記タンパク質が内在活性に比べて増加したことも含む。また、ｘｍｐＥの発現量または活性が親菌株または非変形菌株に比べて増加したことを意味する。
【００３２】
本出願において、前記タンパク質の活性の強化は、当業界によく知られている様々な方法の適用で達成されてもよい。前記方法の例として、前記活性の強化は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、プロモーター活性の強化、開始コドンの交替またはその組み合わせによって達成されてもよく、具体的には、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法；２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節因子（プロモーター、オペレーターなど）の配列を変形させる方法；３）前記タンパク質の活性が増強されるように、染色体上の前記遺伝子（開始コドンなど）の配列を変形させる方法などがあり、これらの組み合わせによっても達成できるが、特にこれに制限されるものではない。
【００３３】
具体的には、前記タンパク質の活性の強化において、前記発現調節因子の配列を変形する方法は、当該分野でよく知られている様々な方法の適用で達成してもよい。前記方法の例として、前記発現調節配列の活性をさらに強化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する塩基配列に交替することにより行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、及び転写と翻訳の終結を調節する配列を含むが、これに制限されるものではない。
【００３４】
また、前記遺伝子配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をさらに強化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良された遺伝子配列に交替することにより行うことができるが、これに制限されるものではない。
【００３５】
本出願の一実施例では、前記タンパク質の活性強化はｘｍｐＥのコピー数を増加させるか；ｘｍｐＥのプロモーターを活性が強化されたプロモーターと交替するか；ｘｍｐＥの開始コドンを交替するか；またはこれらの組み合わせを介して達成することができる。
【００３６】
本出願において、前記用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現できるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００３７】
本出願において、前記用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含む。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００３８】
本出願において、用語、「５’−キサンチル酸を生産する微生物」または「５’−キサンチル酸生産能を有する微生物」は、自然的に５’−キサンチル酸生産能を有している微生物または５’−キサンチル酸の生産能のない親菌株に５’−キサンチル酸の生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質またはｘｍｐＥタンパク質の活性が強化された５’−キサンチル酸生産能を有する微生物であってもよい。
【００３９】
また、本出願の目的上、前記微生物の５’−キサンチル酸の生産能は、５’−キサンチル酸の排出能が強化され向上/増加されるものであってもよい。
【００４０】
具体的には、本出願において、前記「生産能」は、「排出能」と同じ意味で混合して使用されてもよい。また、前記微生物は、「５’−キサンチル酸を排出する微生物」または「５’−キサンチル酸排出能を有する微生物」と同じ意味で混合されて使用されてもよい。また、自然的に５’−キサンチル酸排出能を有している微生物または５’−キサンチル酸の排出能のない親菌株に５’−キサンチル酸の排出能が付与または強化された微生物を意味してもよい。
【００４１】
具体的には、前記５’−キサンチル酸を生産するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニスであってもよいが、これに制限されない。
【００４２】
もう一つの様態として、本出願に係る前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地から５’−キサンチル酸を回収する段階を含む、５’−キサンチル酸を製造する方法を提供する。
【００４３】
本出願に係る前記微生物及び５’−キサンチル酸は前述した通りである。
【００４４】
本出願では、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）であってもよいが、これに制限されない。
【００４５】
本出願の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当業界に知られている任意の培養条件及び培養方法が用いられてもよい。
【００４６】
本出願において、用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願でコリネバクテリウム属微生物を培養する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程で回分式、連続式または流加式で培養してもよいが、これに制限されるものではない。
【００４７】
培養に使用される培地は、適切な方法で特定の菌株の要件を満たす必要がある。コリネバクテリウム属微生物の培養培地は知られている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology、Washington D.C.、USA、1981）。
【００４８】
具体的には、培地中に使用されてもよい糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的に、または混合物として使用することができ、これに制限されるものではない。
【００４９】
使用されてもよい炭素源としては、原糖またはブドウ糖であってもよく、原糖を多量に含む糖蜜であってもよく、具体的には、精製ブドウ糖であってもよいが、これに制限されるものではなく、その他の炭素源が多様に用いられる。
【００５０】
使用されてもよい窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的に、または混合物として使用することができ、これに制限されるものではない。
【００５１】
使用されてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。
【００５２】
また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用されてもよい。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよい。
【００５３】
また、前記微生物の培養中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で使用して培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物内の酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。
【００５４】
具体的には、培養温度は通常３０℃〜３７℃、より具体的には、３２℃〜３３℃であってもよい。培養時間は、所望の５’−キサンチル酸の生成量が得られるまで継続されてもよいが、具体的には、４０〜１２０時間であってもよい。
【００５５】
培養物からの５’−キサンチル酸の分離は、当業界に知られている通常の方法によって分離される。これらの分離方法には、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が用いられる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄み液を、イオン交換クロマトグラフィーを介して分離してもよいが、これに限定されるものではない。
【００５６】
前記回収段階は、精製工程をさらに含んでもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、本出願の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１：５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）排出タンパク質の発掘
５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）の排出に関与するコリネテバクテリウムの膜タンパク質を同定するために、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis、ATCC68７２）のゲノミックＤＮＡライブラリを製作した。コリネバクテリウム・スタティオニス野生型であるＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡは、イントロン（Intron）社のＧスピントータルＤＮＡ抽出ミニキット（Cat. No 17045）を用いて、キットに提供されたプロトコルに基づいて抽出した。前記抽出したゲノミックＤＮＡを鋳型として、膜タンパク質のライブラリを製作した。
【００５９】
どのタンパク質が排出機能をするのかを調べるために、製作したゲノミックＤＮＡライブラリを特許文献１で親菌株として用いたコリネバクテリウムＫＣＣＭ１０５３０菌株に導入した。
【００６０】
以降、１．７％の寒天を添加した最小培地内にさらにＸＭＰを添加してＫＣＣＭ１０５３０菌株が生育低下（growth inhibition）を示すスクリーニング条件を確立した。ＡＴＣＣ６８７２菌株の膜タンパク質ゲノミックライブラリプラスミドをＫＣＣＭ１０５３０菌株に電気穿孔法で形質転換させ、過量なＸＭＰが添加された培地条件で正常に生育するコロニーを選別した。選別されたコロニーのプラスミドを獲得して塩基配列分析法を通じて塩基配列を分析した。このような研究から過量のＸＭＰ添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の１種を同定した。
【００６１】
前記１種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列（NCBI GenBank：NZ_CP014279.1、WP_066795121、MFS transporter）と確認された。前記膜タンパク質は、ＭＦＳトランスポーター（MFS transporter）として知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにＸＭＰ排出に関する機能については知られてなかった。本出願では、これを「ｘｍｐＥ」と命名した。
【００６２】
実施例２：ｘｍｐＥの同定
実施例２−１：ｘｍｐＥ欠損ベクターの製作
前記実施例１を介して同定したＸＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質であるｘｍｐＥをＸＭＰ生産菌株で欠損させる場合、ＸＭＰ排出能が低下するかどうかを確認するために、遺伝子の欠損ベクターを製作した。
【００６３】
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。具体的には、前記ｘｍｐＥのＰＣＲは、配列番号３及び４のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所の遺伝子銀行（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis、ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279.1）及び周辺塩基配列に対する情報を基に製作した。
【００６４】
ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５２℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間重合を２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅されたｘｍｐＥの遺伝子断片で約１．０ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片をソルジェント（Solgent）社のＴベクターを用いてクローニングすることにより、ＴＯＰＯ−△ｘｍｐＥベクターを製作した。
【００６５】
実施例２−２：ｘｍｐＥ欠損菌株の製作
前記実施例２−１で製作した１種のベクターをＫＣＣＭ１０５３０菌株に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献８による形質転換法を利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した栄養培地で選別した。選別したｘｍｐＥ欠損菌株は、「ＫＣＣＭ１０５３０＿△ｘｍｐＥ」と命名し、前記菌株のＸＭＰの生産能を評価した。
【００６６】
下記種培地３ｍｌを含有する１４ ｍｌのチューブ（tube）にコリネバクテリウム・スタティオニス親菌株ＫＣＣＭ１０５３０と、前記製作した１種の菌株（ＫＣＣＭ１０５３０＿△ｘｍｐＥ）を接種し、３０℃で２４時間１７０ｒｐｍで振とう培養した。下記の生産培地３２ｍｌ（本培地２４ｍｌ＋別途殺菌培地８ｍｌ）を含んでいる２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに０．７ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間１７０ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定した。用いられた培地組成と培養液中のＸＭＰ濃度結果（表１）は、下記の通りである。
【００６７】
ＸＭＰ最小培地
【００６８】
ブドウ糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第２カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／Ｌ、グアニン２０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．３
【００６９】
ＸＭＰ栄養培地
ペプトン１％、肉汁０．５％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス１％、ウレア０．３％、アデニン５０ｍｇ／Ｌ、グアニン５０ｍｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２
【００７０】
ＸＭＰフラスコ種培地
ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、ウレア３ｇ／Ｌ、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０
【００７１】
ＸＭＰフラスコ生産培地（本培地）
ブドウ糖５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１００ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．８ｍｇ／Ｌ、ヒスチジン２０ｍｇ／Ｌ、シスチン１５ｍｇ／Ｌ、ベータアラニン１５ｍｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、チアミン５ｍｇ／Ｌ、アデニン５０ｍｇ／Ｌ、グアニン２５ｍｇ／Ｌ、ナイアシン５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０
【００７２】
ＸＭＰフラスコ生産培地（別途殺菌培地）
リン酸第１カリウム１８ｇ／Ｌ、リン酸第２カリウム４２ｇ／Ｌ、ウレア７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ
【００７３】
【表１】
0006938633.tif 000002
【００７４】
親菌株であるＫＣＣＭ１０５３０とｘｍｐＥ欠損菌株であるＫＣＣＭ１０５３０＿△ｘｍｐＥの培地内ＸＭＰ濃度を比較した結果、前記の表１に示すように、同一の条件下でＫＣＣＭ１０５３０＿△ｘｍｐＥ菌株は親菌株に比べて、ＸＭＰの濃度が約１０ｇ／Ｌ以上減少することを確認した。
【００７５】
したがって、ｘｍｐＥはＸＭＰ排出に関与するタンパク質であることを確認した。
【００７６】
実施例３：ｘｍｐＥタンパク質の活性の強化
菌株内ｘｍｐＥタンパク質の活性を下記実施例に基づいて強化し、ｘｍｐＥの活性が強化された菌株はＸＭＰ生産能/排出能が増加するのかを確認した。
【００７７】
実施例３−１：ｘｍｐＥのコピー数の増加
実施例３−１−１：ｘｍｐＥのコピー数の増加ベクターの製作
ＸＭＰ排出能に関与すると予想されるｘｍｐＥの活性を強化する場合、ＸＭＰ排出能が増加するのかを確認するためにｘｍｐＥ遺伝子の強化ベクターを製作し、強化の方法の一つであるコピー数（copy number）増加の方法を利用して、次のような実験を行った。
【００７８】
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。具体的には、ｘｍｐＥのプロモーター部位と思われるｘｍｐＥの上流（upstream）４８４ｂｐを含むようにする配列番号５及び６のプライマー対を用いて増幅した。増幅されたｘｍｐＥ遺伝子断片をＸｂａＩとＳｐｅＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクター（特許文献２及び３）のＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングして、ｐＤＺ−ｘｍｐＥベクターを製作した。以後、２コピーベクター製作のために、ｘｍｐＥは配列番号７及び６のプライマー対でＰＣＲを行った。確保した各ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ制限酵素であるＳｐｅＩで切断し、ＸｂａＩ ＤＮＡ制限酵素で切断したｐＤＺ−ｘｍｐＥベクターに前記遺伝子の断片をクローニングしてベクターを製造した。２コピーのｘｍｐＥが含まれた前記ベクターは「ｐＤＺ−ｘｍｐＥＸ２」と命名した。
【００７９】
実施例３−１−２：ｘｍｐＥのコピー数増加菌株のＸＭＰ生産能の評価
前記実施例３−１−１で製作したｐＤＺ−ｘｍｐＥＸ２ベクターをＫＣＣＭ１０５３０菌株に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献８による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を経て、目標遺伝子が導入された菌株を選別した。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号８及び９のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。選別されたｘｍｐＥコピー数の増加菌株は「ＫＣＣＭ１０５３０＿ｘｍｐＥＸ２」と命名し、前記菌株のＸＭＰの生産能を評価した。
【００８０】
前記菌株のＸＭＰ生産能を測定するために、前記実施例２−２と同様の培養方法を用いた。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表２に示す。
【００８１】
【表２】
0006938633.tif 000003
【００８２】
親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＫＣＣＭ１０５３０とｘｍｐＥコピー数の増加菌株であるＫＣＣＭ１０５３０＿ｘｍｐＥＸ２の培地内ＸＭＰ濃度を比較した結果、前記表２に示すように、同一の条件下でＫＣＣＭ１０５３０＿ｘｍｐＥＸ２菌株は、親菌株に比べてＸＭＰの濃度が１．３ｇ／Ｌで、約１１％増加することを確認した。
【００８３】
前記のようなｘｍｐＥタンパク質活性の増加に起因するＸＭＰ生産量の増加結果は、非常に意味のあるものと解釈することができる。
【００８４】
実施例３−２：ｘｍｐＥのプロモーター交替発現の強化
実施例３−２−１：ｘｍｐＥのプロモーター交替ベクターの製作
ＸＭＰ排出能に関与すると予想されるｘｍｐＥの活性を強化する場合、ＸＭＰ排出能が増加するかを確認するためにｘｍｐＥ遺伝子のプロモーターを発現が強いプロモーターに交替するベクターを製作した。まず、ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを介して獲得した。
【００８５】
プロモーターは、コリネバクテリウム・スタティオニスで強く発現されると報告されているＰｃｊ７（特許文献４）を用いた。
【００８６】
Ｐｃｊ７遺伝子断片を増幅するためにＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型にして配列番号１０及び１１のプライマー対を用いて、ｘｍｐＥ遺伝子のＰＣＲは、配列番号１２及び１３；及び１４及び１５のプライマー対を用いて、それぞれ増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５２℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合を２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。増幅された遺伝子の３つの断片であるＰｃｊ７とｘｍｐＥ−１、ｘｍｐＥ−２を鋳型とし、オーバーラップ（overlapping）ポリメラーゼ連鎖反応を行い、２．３ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片は、制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いてＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターに前記遺伝子の断片をクローニングして「ｐＤＺ−Ｐｃｊ７／ｘｍｐＥ」ベクターを製作した。
【００８７】
実施例３−２−２：ｘｍｐＥのプロモーター交替菌株の製作及びＸＭＰ生産能の評価
前記実施例３−２−１で製作したｐＤＺ−Ｐｃｊ７／ｘｍｐＥベクターをＫＣＣＭ１０５３０菌株に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献８による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を経て、目標遺伝子が強化された菌株を選別した。最終的に形質転換された菌株の遺伝子プロモーター挿入されたかどうかは、配列番号１６及び１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。前記方法により強いプロモーターに交替された菌株は「ＫＣＣＭ１０５３０＿Ｐｃｊ７／ｘｍｐＥ」と命名し、前記菌株のＸＭＰの生産能を評価した。
【００８８】
菌株のＸＭＰ生産能を測定するために、前記実施例２−２と同様の培養方法を用いた。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表３に示す。
【００８９】
【表３】
0006938633.tif 000004
【００９０】
親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＫＣＣＭ１０５３０と強いプロモーターでｘｍｐＥの発現が強化された菌株であるＫＣＣＭ１０５３０＿Ｐｃｊ７／ｘｍｐＥの培地内ＸＭＰ濃度を比較した結果、前記表３に示すように、同一の条件下でＫＣＣＭ１０５３０＿Ｐｃｊ７／ｘｍｐＥ菌株は、親菌株に比べてＸＭＰの濃度が０．７ｇ／Ｌで約６％増加することを確認した。
【００９１】
前記のようなｘｍｐＥタンパク質活性の増加に起因するＸＭＰ生産量増加の結果は非常に意味のあるものと解釈することができる。
【００９２】
実施例３−３：ｘｍｐＥの開始コドンの交替
実施例３−３−１：ｘｍｐＥの開始コドンの交替ベクターの製作
ＸＭＰ排出能に関与すると予想されるｘｍｐＥのタンパク質発現を強化する場合、ＸＭＰ排出能が増加するかを確認するために、既存の開始コドンであるｇｔｇをａｔｇに交替するベクターを製作した。ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを介して獲得した。既存の開始コドンであるｇｔｇをａｔｇに交替するベクターを製作するために、配列番号１８及び１９のプライマー対及び配列番号２０及び２１のプライマー対を用いて遺伝子断片（Ａ、Ｂ）をそれぞれ得た。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２５回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、断片Ａは約０．７ｋｂｐ、断片Ｂは約１ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。前記２つの断片を鋳型として配列番号１８及び２１のプライマーを用いて、オーバーラップＰＣＲを行い、約１．７ｋｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「ｇ１ａ断片」と命名する）を得た。 オーバーラップＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１２０秒間の重合を２５回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００９３】
得られた遺伝子の断片は、制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いてＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターに前記遺伝子の断片をクローニングして「ｐＤＺ−ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）」ベクターを製作した。
【００９４】
実施例3−3−2：ＸＭＰＥの開始コドンの交替菌株の製作とＸＭＰ生産能の評価
前記実施例３−３−１で製作したｐＤＺ−ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）ベクターをＫＣＣＭ１０５３０菌株に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献８による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再度２次交差（cross−over）を経て、目標遺伝子が強化された菌株を選別した。最終的に形質転換された菌株の開始コドンが交替されたかどうかは、配列番号１８及び２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行った後、塩基配列分析法を介して置換された塩基配列を分析して確認した。選別されたｘｍｐＥ開始コドンがａｔｇに交替された菌株は、「ＫＣＣＭ１０５３０＿ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）、ＣＪＸ１６６２」と命名し、前記菌株のＸＭＰ生産能を評価した。
【００９５】
菌株のＸＭＰ生産能を測定するために、前記実施例２−２と同様の培養方法を用いた。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表４に示す。
【００９６】
【表４】
0006938633.tif 000005
【００９７】
親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＫＣＣＭ１０５３０とｘｍｐＥの開始コドンが交替された菌株であるＣＪＸ１６６２の培地内ＸＭＰ濃度を比較した結果、前記表４に示すように、同一の条件下でＣＪＸ菌株は親菌株に比べて、ＸＭＰの濃度が２．３ｇ／Ｌで約２０％増加することを確認した。
【００９８】
前記のようなｘｍｐＥタンパク質活性の増加に起因するＸＭＰ生産量増加の結果は非常に意味のあるものと解釈することができる。
【００９９】
また、前記製作したＫＣＣＭ１０５３０＿ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）、ＣＪＸ１６６２菌株をブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年４月１１日に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２４８Ｐを与えられた。
【０１００】
実施例３−４：野生型由来のＸＭＰ生産株基盤ｘｍｐＥ強化菌株の製作
実施例３−４−１：野生型由来のＸＭＰ生産株基盤ｘｍｐＥ強化菌株の製作
野生型ＡＴＣＣ６８７２菌株においてＸＭＰの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ（adenylosuccinate synthetase）及びＸＭＰデヒドロゲナーゼ（ＸＭＰ dehydrogenase）の活性を弱化させて、ｘｍｐ生産能を有する菌株を製作した。前記２つの酵素の活性を弱化させるために、これらをそれぞれコードする遺伝子であるｐｕｒＡ及びｇｕａＡの各塩基配列の１番目の塩基がａからｔに変更された菌株を製作した。より具体的には、ＡＴＣＣ６８７２菌株において、前記２つの遺伝子の発現が弱化された、製造した菌株は「ＣＪＸ１６６３」と命名した。
【０１０１】
製造したＣＪＸ１６６３菌株に、実施例３−３−２で製作したｐＤＺ−ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）ベクターを電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株に対して再び２次交差を経て、目標遺伝子が導入された菌株を選別した。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号１８及び２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。
【０１０２】
選別されたｘｍｐＥ開始コドンがａｔｇに交替された菌株は、「ＣＪＸ１６６３＿ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）」と命名し、前記菌株のＸＭＰの生産能を評価した。
【０１０３】
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表５のとおりである。
【０１０４】
【表５】
0006938633.tif 000006
【０１０５】
親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＸ１６６３とｘｍｐＥの開始コドンが交替された菌株であるＣＪＸ１６６３＿ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）の培地内ＸＭＰ濃度を比較した結果、前記の表５に示すように、同一の条件下でＣＪＸ１６６３＿ｘｍｐＥ（ｇ１ａ）菌株は、親菌株に比べてＸＭＰの濃度が２．８ｇ／Ｌで約３３％増加することを確認した。
【０１０６】
このことから、本出願の５’−キサンチル酸を排出するタンパク質（ｘｍｐＥ）の活性を強化することによって、ＸＭＰ生産量を増加させうることを確認した。
【０１０７】
一方、本出願で用いられたプライマーの配列は下記表６の通りである。
【０１０８】
【表６】
0006938633.tif 000007
【０１０９】
以上の説明から、本願が属する技術分野の当業者は、本願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【０１１０】
0006938633.tif 000008
【配列表】
0006938633000001.app