(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物であって、
該細胞は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ
該組成物は、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇとなるようにヒトに投与される、
医薬組成物。
【請求項２】
ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）由来細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が、１×１０6細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性ＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞を５６ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒを含む培養培地で培養する工程、及び
該培養工程により得られた細胞に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量を測定し、細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が１×１０6個の細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である細胞を選択する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工アジュバント細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｅｌｌ：ａＡＶＣ）を用いた有効且つ安全ながんの治療又は予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の特徴を有する免疫細胞であり、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）上の主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）様分子であるＣＤ１ｄに積載された糖脂質からなるＣＤ１ｄリガンドにより活性化される。活性化されたＮＫＴ細胞は、パーフォリン／グランザイムＢ等を介した直接的な細胞傷害性の増強に加え、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）やインターロイキン−４（ＩＬ−４）等のサイトカイン産生を介して、ＮＫＴ細胞自身の分化及び増殖を誘導し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞を活性化することが知られている。【０００３】
ＮＫＴ細胞を活性化し得るＣＤ１ｄリガンドとしては、例えば、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）、α−Ｃ−ガラクトシルセラミド（α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒ）、７ＤＷ８−５、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）等が存在する。ＣＤ１ｄを発現するＡＰＣとしては、例えば、マクロファージ、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ性白血病（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｂ−ＣＬＬ）細胞等が知られている。【０００４】
α−ＧａｌＣｅｒをパルスしたＤＣによって活性化されたＮＫＴ細胞は、各種がん細胞に対して細胞傷害性を示す。また、α−ＧａｌＣｅｒをパルスしたＤＣは、遊離α−ＧａｌＣｅｒを投与した場合と比べてＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞をより強く誘導し、高い抗腫瘍効果を示すことが報告されており（非特許文献１及び２）、肺がん患者を対象とした臨床試験も行われた（非特許文献３及び４）。【０００５】
マウスモデルにおいて、α−ＧａｌＣｅｒ投与によって、ＮＫＴ細胞活性化を介した自然免疫の活性化による抗腫瘍効果が誘導される一方で、ＮＫＴ細胞の活性化に伴う炎症性サイトカインの産生等による肝細胞壊死等の副作用の発現が報告されている（非特許文献５）。さらに、α−ＧａｌＣｅｒの臨床試験においては、α−ＧａｌＣｅｒ投与により抗腫瘍効果につながる免疫反応が誘導される一方で、頭痛、嘔吐、悪寒、倦怠感等の全身状態悪化を示す有害事象が認められており、種々の副作用を誘発する可能性が示されている（非特許文献６）。【０００６】
藤井らは、ヒト由来細胞に外来的にＣＤ１ｄ及びがん抗原を発現させ、さらに該細胞にα−ＧａｌＣｅｒをパルスしたａＡＶＣを作製した（特許文献１〜３）。当該ａＡＶＣは、ＣＤ１ｄ／α−ＧａｌＣｅｒ複合体を介してＮＫＴ細胞を活性化し、活性化されたＮＫＴ細胞はＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生してＮＫ細胞等を活性化する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるＮＫ細胞依存的な抗腫瘍効果が示されている（特許文献１〜３、非特許文献７及び８）。また、マウスに投与されたａＡＶＣは生体内において活性化されたＮＫＴ細胞により速やかに殺傷され、該細胞断片は樹状細胞に取り込まれる。当該ａＡＶＣ断片を取り込んだ樹状細胞は、該細胞表面上のＭＨＣに取り込んだがん抗原を抗原提示し、がん抗原特異的なＴ細胞を誘導する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるがん抗原特異的Ｔ細胞の誘導を介した抗腫瘍効果も示されている（特許文献１〜３、非特許文献７及び８）。このように、ａＡＶＣはＮＫＴ細胞活性化を介したＮＫ細胞活性化による自然免疫活性化及び抗原特異的Ｔ細胞誘導による獲得免疫誘導の二つの免疫機構を強力に誘導し得ることが示されている。しかしながら、現在までに、自然免疫活性化による抗腫瘍効果を発揮し且つ安全に使用し得る、ａＡＶＣの適切な臨床用量については検討がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開番号２００７／０９７３７０
【特許文献２】国際公開番号２０１０／０６１９３０
【特許文献３】国際公開番号２０１３／０１８７７８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「ザ  ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９９；１６３（５）：２３８７−２３９１
【非特許文献２】「ネイチャー  イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００２；３（９）：８６７−８７４
【非特許文献３】「ザ  ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００９；１８２（４）：２４９２−２５０１
【非特許文献４】「クリニカル  キャンサー  リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２００５；１１（５）：１９１０−１９１７
【非特許文献５】「アンチキャンサー  リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０１６；３６（７）：３６６７−３６７２
【非特許文献６】「クリニカル  キャンサー  リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２００２；８（１２）：３７０２−３７０９
【非特許文献７】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１３；７３（１）：６２−７３
【非特許文献８】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１６；７６（１３）：３７５６−３７６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ａＡＶＣを用いた有効且つ安全ながんの治療又は予防方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ａＡＶＣの臨床応用について鋭意検討を行った。本発明者らは、ａＡＶＣの製造過程において、ａＡＶＣに積載されるα−ＧａｌＣｅｒの量が、細胞の種類及びα−ＧａｌＣｅｒを細胞にパルスする条件等によって変動することを見出した。これにより、ａＡＶＣを医薬品として製造するために、ａＡＶＣに積載されたα−ＧａｌＣｅｒの量を規格化する必要性が見出された。よって、本発明者らは、ａＡＶＣのα−ＧａｌＣｅｒの積載量を定量するため、該細胞表面に積載されるα−ＧａｌＣｅｒ量の測定法を確立した。そして、ａＡＶＣにα−ＧａｌＣｅｒをパルスする際に、培地中に種々の濃度のα−ＧａｌＣｅｒを添加することにより、細胞へのα−ＧａｌＣｅｒ積載量に変動が生じることを確認した（実施例２）。さらに、本発明者らは、ａＡＶＣに積載されたα−ＧａｌＣｅｒの投与量がＮＫＴ細胞を介した自然免疫活性化による抗腫瘍効果及び副作用の誘導に関連することを見出した（実施例３〜５）。かくして、本発明者らは、ａＡＶＣを用いたがんの治療及び予防における有効性及び安全性の観点から好ましいａＡＶＣに積載されたα−ＧａｌＣｅｒの投与量、及びａＡＶＣを含む医薬組成物に含まれるａＡＶＣに積載されるα−ＧａｌＣｅｒの好ましい量を見出すことに成功した。即ち、本発明は、ａＡＶＣを用いる有効且つ安全ながんの治療又は予防方法、有効且つ安全ながんの治療又は予防のためのａＡＶＣ及びそれを含む医薬組成物等を提供する。【００１１】
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。【００１２】
［１］ヒト由来細胞をヒトに投与する工程を含むがんを治療又は予防する方法であって、
該細胞は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ
該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、
方法。
［２］ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、［１］に記載の方法。
［３］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）由来細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が、１×１０６細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物であって、
該細胞は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ
該組成物は、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、
医薬組成物。
［７］ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、［６］に記載の医薬組成物。
［８］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［６］又は［７］に記載の医薬組成物。
［９］ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）由来細胞である、［６］〜［８］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が、１×１０６細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である、［６］〜［９］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１１］がんの治療又は予防のための医薬組成物を製造するためのヒト由来細胞の使用であって、
該細胞は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ
該組成物は、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、
使用。
［１２］ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、［１１］に記載の使用。
［１３］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［１１］又は［１２］に記載の使用。
［１４］ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）由来細胞である、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の使用。
［１５］細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が、１×１０６細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である、［１１］〜［１４］のいずれかに記載の使用。
［１６］がんの治療又は予防に使用するためのヒト由来細胞であって、
該細胞は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ
該細胞は、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、
ヒト由来細胞。
［１７］ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、［１６］に記載のヒト由来細胞。
［１８］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［１６］又は［１７］に記載のヒト由来細胞。
［１９］ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）由来細胞である、［１６］〜［１８］のいずれかに記載のヒト由来細胞。
［２０］細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が、１×１０６個の細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である、［１６］〜［１９］のいずれかに記載のヒト由来細胞。
［２１］外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性ＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞を５６ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒを含む培養培地で培養する工程を含む、方法。
［２２］前記培養工程により得られた細胞に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量を測定し、細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が１×１０６個の細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である細胞を選択する工程をさらに含む、［２１］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法は、ａＡＶＣを用いて有効且つ安全にがんの予防又は治療を行うために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｂ１６メラノーマ細胞静注肺転移モデルにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１投与後の生存率の推移を示す。７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスの尾静脈に２×１０４ｃｅｌｌｓのＢ１６−Ｆ１０細胞を投与し、投与３時間後に該マウスの尾静脈にＢＩＣＡＮＡＴＥ又は各用量のａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１を投与した（各群１６例）。マウスの生存を投与後６１日間観察した。ログランク検定を用いてａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１投与群の生存期間をＢＩＣＡＮＡＴＥ投与群の生存期間と比較し有意確率Ｐ値を求めた。図中の＊及び＊＊は、Ｐ値がそれぞれ、ボンフェローニの方法にて補正した有意水準０．０５／３より小さい群と０．０１／３より小さい群を示す。
【図２】表２に記載のａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１及び各種ａＡＶＣ−ＷＴ１を投与した後の脾臓細胞中のＮＫＴ細胞の割合（％）を示す。５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスの尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥ、各用量のａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１又はａＡＶＣ−ＷＴ１を投与した（各群３例）。投与３日後に脾臓を採取しフローサイトメトリーにてＮＫＴ細胞を検出した。ＮＫＴ細胞割合は前方散乱光と側方散乱光のサイトグラムのリンパ球画分細胞におけるＣＤ１ｄ／Ｇａｌ−ｄｉｍｅｒ陽性且つＣＤ１９陰性の細胞の割合とし、平均値±標準誤差をグラフに示した。Ｘ軸の数値はａＡＶＣのα−ＧａｌＣｅｒ積載量（ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓ）を示す。
【図３】ａＡＶＣ−ＷＴ１のマウス単回静脈内投与毒性試験における雄マウス又は雌マウスの体重測定結果を示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌雄マウスの尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥ又は各用量のａＡＶＣ−ＷＴ１を単回投与した（各群５例）。投与前日（−１日）、投与日（０日）、投与翌日（１日）、投与３日後（３日）及び投与７日後（７日）に体重を測定し、グラフに示した。
【図４】マウス単回静脈内投与毒性試験における雄マウス又は雌マウスの摂餌量測定結果を示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌雄マウスの尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥ又は各用量のａＡＶＣ−ＷＴ１を単回投与した（各群５例）。投与３日前〜投与前日（−３〜−１日）、投与日〜投与翌日（０〜１日）、投与翌日〜投与３日後（１〜３日）、投与３日後〜投与７日後（３〜７日）における１日当たりの摂餌量（ｇ／ｄａｙ）を測定し、グラフに示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００１６】
＜本発明のがんの治療又は予防方法＞
本発明は、以下に示すがんの治療又は予防する方法を提供する：
ヒト由来細胞をヒトに投与する工程を含むがんを治療又は予防する方法であって、
該細胞は、外来性又は内在性のＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ
該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、
方法。
【００１７】
１．ａＡＶＣ
本発明の方法は、外来性又は内在性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞（本明細書中、ａＡＶＣとも称する）を使用しうる。ａＡＶＣはさらに１以上の任意の外来性又は内在性のがん抗原を発現していてもよい。がん抗原を発現していないａＡＶＣは、ＮＫＴ細胞の活性化によりある程度の抗腫瘍効果をもたらすが、がん抗原を発現するａＡＶＣは、がんに対する獲得免疫も誘導するため、より多くの利点がある。ａＡＶＣは、当該分野で公知の方法を使用して当業者に容易に作製され得る（例えば、非特許文献７及び８、特許文献１〜３）。
【００１８】
本発明で使用されるヒト由来細胞は、例えば、胃、小腸、大腸、肺、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、皮膚、筋肉、末梢血等の任意のヒト組織由来の細胞であってよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、非血球細胞である。本発明で使用されるヒト由来細胞は、増殖能を有し得る。本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト組織における特定の細胞種（例えば、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪組織、乳腺細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、外分泌上皮細胞、内分泌細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨芽細胞、胚細胞、免疫細胞等）由来の細胞であってよい。本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞又はがん細胞であってもよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞である。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．；１９７７；３６：５９−７４）、ＷＩ−３８細胞、ＳＣ−０１ＭＦＰ細胞、若しくはＭＲＣ−５細胞、又はそれらの細胞に由来する細胞であってよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ＨＥＫ２９３由来細胞である。１つの実施形態において、本発明において使用されるヒト由来細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞である。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト組織由来の不死化細胞又は株化細胞である。不死化細胞及び株化細胞は当業者により公知の方法を用いて作製することができる。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞は当業者により公知の方法を用いて作製することができる。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）由来の細胞である。
【００２１】
本発明で使用されるＣＤ１ｄは、天然に存在するＣＤ１ｄ又はその改変体であってよい。ＣＤ１ｄは、使用するヒト由来細胞に内在的に発現するＣＤ１ｄであってもよく、使用するヒト由来細胞に外来的に発現させたＣＤ１ｄであっても良い。１つの実施形態において、発現とは、細胞のいずれかの場所に発現していることを意味し、１つの実施形態において、細胞表面に発現していることを意味する。１つの実施形態において、ａＡＶＣは外来性ＣＤ１ｄを発現する。１つの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ１ｄは哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）由来のＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ１ｄはヒトＣＤ１ｄである。
【００２２】
本明細書中、「外来性」又は「外来的」とは、遺伝子又は核酸を遺伝子操作又は遺伝子導入等の操作により目的の細胞内に人為的に導入すること、及び目的の細胞内に人為的に導入された遺伝子又は核酸、並びにそれら発現タンパク質を指す用語として交換可能に使用される。外来性の遺伝子は、遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結されうる。
【００２３】
本明細書中、「内在性」又は「内在的」とは、細胞に元々備わったもの、例えば、元々備わっている遺伝子、核酸、又はタンパク質であることを意味する。
【００２４】
本明細書中、「由来」とは、細胞が得られた動物種を示すために用いられる。例えば、ヒト由来細胞は、当該細胞がヒトから得られた細胞であること、又は当該細胞を継代培養して得られた細胞株であることを意味する。例えば、ヒト由来細胞はヒト細胞であることを意味する。
【００２５】
本明細書における「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．；２０１５；４３：Ｗ５８０−Ｗ５８４）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  １０
Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．５
Ｍａｔｒｉｘ  ＝  ＥＢＬＯＳＵＭ６２
Ｅｎｄ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ｆａｌｓｅ
【００２６】
１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１又は数個、ある実施形態では１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、又は１〜２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するタンパク質である。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するタンパク質である。さらに１つ実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号３に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２７】
ＣＤ１ｄの機能としては、ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α−ＧａｌＣｅｒ）に結合する能力が挙げられる。ＣＤ１ｄのＣＤ１ｄリガンドへの結合能は公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。また、ＣＤ１ｄの機能は、ａＡＶＣによるヒトＮＫＴ細胞を活性化する能力を指標に評価することもできる。このヒトＮＫＴ細胞の活性化能は、特許文献１又は本願実施例４に記載の方法で評価することができる。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明で使用されるａＡＶＣは、がん抗原を発現する。本発明で使用されるがん抗原として、がん細胞において発現がみられる任意のタンパク質が使用できる。がん抗原の例としては、Ｗｉｌｍｓ  Ｔｕｍｏｒ  １（ＷＴ−１）、Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １２５（ＣＡ−１２５）、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）、Ｍｕｃｉｎ−１（Ｍｕｃ−１）、Ｍｕｃｉｎ−２（Ｍｕｃ−２）、Ｃａｎｃｅｒ／Ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  １Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ／ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＰＡＰ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｂ、変異ｒａｓ、変異ｐ５３等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明で使用されるがん抗原として、Ｗｉｌｍｓ  Ｔｕｍｏｒ  １（ＷＴ−１）が挙げられる。１つの実施形態において、ＷＴ−１はヒトＷＴ−１である。１つの実施形態において、ヒトＷＴ−１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。１つの実施形態において、ヒトＷＴ−１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個、ある実施形態では１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、又は１〜２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。１つの実施形態において、ヒトＷＴ−１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、１種のがん抗原を発現する。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、複数種のがん抗原を発現する。がん抗原としては、それを発現するａＡＶＣが該がん抗原に対する免疫作用により抗腫瘍効果を示すものである限り、天然に存在するがん抗原又はその改変体であってもよい。がん抗原は、使用するヒト由来細胞に内在的に発現する抗原であってもよく、又、使用するヒト由来細胞に外来的に発現させた抗原であってもよい。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、外来性がん抗原を発現する。１つの実施形態において、ａＡＶＣは、複数種の外来性がん抗原を発現する。
【００２９】
α−ＧａｌＣｅｒはＣＤ１ｄリガンドの１つであり、ＣＡＳ  ＲＮ：１５８０２１−４７−７、分子式：Ｃ５０Ｈ９９ＮＯ９及び分子量：８５８．３４で表される物質である。α−ＧａｌＣｅｒは、当該分野で公知の技術に従って合成してもよく、商業的に入手可能なもの（例えば、α−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（フナコシ、Ｃａｔ．ＫＲＮ７０００））を使用してもよい。細胞へのα−ＧａｌＣｅｒの積載は、「２．ａＡＶＣの作製方法」の項に記載のように、ＣＤ１ｄを発現する細胞をα−ＧａｌＣｅｒを含有する培地において培養するすることによって行いうる。
【００３０】
２．ａＡＶＣの作製方法
本発明は、α−ＧａｌＣｅｒを積載する前の段階の細胞（本明細書中、ａＡＶＣ前駆細胞とも称する）を作製すること、及びａＡＶＣ前駆細胞にα−ＧａｌＣｅｒを積載させることを含みうる。また、本発明は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性ＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞を５６ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒを含む培養培地で培養する工程を含む、方法を提供する。また、本発明は、外来性ＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性ＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞を５６ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒを含む培養培地で培養する工程と、細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量が１×１０６個の細胞当たり３．９〜２７５ｎｇの範囲である細胞を選択する工程を含む、ヒト由来細胞の製造方法を提供する。
【００３１】
２−１．ａＡＶＣ前駆細胞の作製
ａＡＶＣ前駆細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄ遺伝子若しくはがん抗原をコードする遺伝子のいずれか、又はＣＤ１ｄ遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。ＣＤ１ｄ遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＲｅｇＳｅｑ  ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、標準的な分子生物学及び／又は化学的手法を用いて設計及び作製することができる。例えば、前記遺伝子は、塩基配列をもとにホスホロアミダイト法等を用いて合成することができ、又ｃＤＮＡライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られるＤＮＡ断片を組み合わせて作製することができる。ヒト由来細胞への目的の遺伝子の導入はｃＤＮＡやｍＲＮＡ等の形態にて導入する遺伝子を含む発現ベクターを用いて行うことができる。又ヒト由来細胞へエレクトロポレーション、リポフェクション等の方法によって目的遺伝子を直接細胞に導入してもよい。さらに、ヒト由来細胞に目的の遺伝子を導入してａＡＶＣ前駆細胞を作製した後、該細胞を培養して増殖させてもよい。
【００３２】
本発明で使用される発現ベクターは、ヒト由来細胞中でＣＤ１ｄ若しくは目的のがん抗原又はＣＤ１ｄ及び目的のがん抗原を発現できるものであれば特に制限されない。当該発現ベクターは、例えば、プラスミドベクター（例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ（プロメガ）、ｐＨＥＫ２９３  Ｕｌｔｒａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）等）、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス等）であってもよい。ウイルスベクターの産生には、例えば、レンチウイルスの作製に用いるｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ／ＥＦ１αベクター（タカラバイオ社）、ｐＬｅｎｔｉベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。ヒト由来細胞においてＣＤ１ｄ及びがん抗原を外来的に発現させる場合、ＣＤ１ｄとがん抗原を１つのベクターを用いて発現させてもよく、別々のベクターを用いて発現させてもよい。
【００３３】
発現ベクターは、ＣＤ１ｄ又はがん抗原をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターとしては、恒常的に発現を促進するプロモーター又は薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン等）により誘導されるプロモーターのいずれも用いることができる。恒常的に発現を促進するプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。誘導型プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ３Ｇプロモーター）、Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列、λオペレーター配列（１２×λＯｐ）、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
【００３４】
発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。また、発現ベクターには、目的の遺伝子の発現を確認するためのマーカーとなり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を含んでいてもよい。
【００３５】
１つの実施形態において、ａＡＶＣ前駆細胞は、ウイルスベクターを用いてヒト由来細胞にＣＤ１ｄ遺伝子を導入することにより作製される。１つの実施形態において、本発明で使用されるａＡＶＣ前駆細胞は、ウイルスベクターを用いてＣＤ１ｄを外来的に発現させた細胞である。この態様において、ａＡＶＣ前駆細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１ｄをコードする遺伝子を含みうる。１つの実施形態において、ａＡＶＣ前駆細胞は、ウイルスベクターを用いてヒト由来細胞にＣＤ１ｄ遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子を導入することにより作製される。１つの実施形態において、本発明で使用されるａＡＶＣ前駆細胞は、ウイルスベクターを用いてＣＤ１ｄ及びがん抗原を外来的に発現させた細胞である。この態様において、ａＡＶＣ前駆細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１ｄ遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子を含みうる。
【００３６】
１つの実施形態において、ａＡＶＣ前駆細胞は、レンチウイルスベクターを用いてヒト由来細胞にＣＤ１ｄ遺伝子を導入することにより作製される。１つの実施形態において、本発明で使用されるａＡＶＣ前駆細胞は、レンチウイルスベクターを用いてＣＤ１ｄを外来的に発現させた細胞である。１つの実施形態において、ａＡＶＣ前駆細胞は、レンチウイルスベクターを用いてヒト由来細胞にＣＤ１ｄ遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子を導入することにより作製される。１つの実施形態において、本発明で使用されるａＡＶＣ前駆細胞は、レンチウイルスベクターを用いてＣＤ１ｄ及びがん抗原を外来的に発現させた細胞である。
【００３７】
ａＡＶＣ前駆細胞の培養は、公知の方法により行われる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６−３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９−５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１−８）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０２２）、ＣＤ  ２９３  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１１９１３０１９）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ１４３５１０１）を使用することができる。培養培地は、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清）、血清代替物（例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＫＳＲ）、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等を含むことができる。培養条件（例えば、培養時間、温度、培地のｐＨ、ＣＯ２濃度等の培養条件）は当業者により適宜選択されうる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は約１〜１０％、好ましくは約５％である。培養時間は、特に限定されるものではないが、約１５〜３３６時間行われる。必要により通気や撹拌を行うこともできる。テトラサイクリン又はドキシサイクリン等の薬剤により誘導されるプロモーターを使用する場合、当該薬剤を加えた培地にてａＡＶＣ前駆細胞を培養し、ＣＤ１ｄ及びがん抗原の発現を誘導させる工程を含んでもよい。当該工程は、一般的な遺伝子誘導システムを用いた遺伝子誘導方法に準拠して行うことができる。
【００３８】
２−２．細胞へのα−ＧａｌＣｅｒの積載
ａＡＶＣ前駆細胞にα−ＧａｌＣｅｒをパルスすることによって、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載したａＡＶＣを作製する。本明細書において、「細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載した」とは、ａＡＶＣ細胞の表面にα−ＧａｌＣｅｒが結合している状態を指す。その結合量は「２−３．ａＡＶＣに積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量の測定」の項に記載の方法を用いて測定することができる。本明細書において、α−ＧａｌＣｅｒを「パルスする」とは、ａＡＶＣ前駆細胞をα−ＧａｌＣｅｒと接触させて、ＣＤ１ｄを発現するａＡＶＣ前駆細胞の細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを結合させることを指す。パルスは、細胞の培養培地中で行うことができる。
【００３９】
ａＡＶＣ前駆細胞のパルス条件（例えば、細胞の培養培地にα−ＧａｌＣｅｒを添加するタイミング、培養培地中のα−ＧａｌＣｅｒの濃度及び培養時間等）は、使用するａＡＶＣ前駆細胞及び培養時の諸条件を考慮して当業者にて適宜調整されうる。ａＡＶＣ前駆細胞の培養培地に添加するα−ＧａｌＣｅｒの濃度は、特に限定されないが、例えば、５６ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬの範囲で適宜選択されうる。
【００４０】
α−ＧａｌＣｅｒ存在下でヒト由来細胞へのＣＤ１ｄ若しくはがん抗原又はＣＤ１ｄ及びがん抗原の遺伝子導入を行うことによって、ａＡＶＣ前駆細胞の作製と細胞へのα−ＧａｌＣｅｒのパルスを同時に行ってもよい。
【００４１】
細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載した後には、細胞表面に積載されていないα−ＧａｌＣｅｒ（培地中の過剰なα−ＧａｌＣｅｒ）を除去することができる。
【００４２】
ａＡＶＣ前駆細胞をα−ＧａｌＣｅｒでパルスした後、人為的な方法を用いてａＡＶＣの増殖を停止させてもよい。ａＡＶＣの増殖を停止させる方法は、特に限定されないが、例えば、放射線（例えば、Ｘ線又はγ線）等の粒子線の照射にて細胞増殖を停止させる方法、マイトマイシンＣ等の薬剤を添加する方法等を使用し得る。
【００４３】
２−３．ａＡＶＣに積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量の測定
本発明者らは、ａＡＶＣ細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量の測定方法を確立した。ａＡＶＣ細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの量の測定は、ａＡＶＣの細胞抽出液を調製し、質量分析（ＭＳ）を用いる方法（例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ））にて当該抽出液中のα−ＧａｌＣｅｒを定量することにより行うことができる。
【００４４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた一般的な定量分析において、以下のようなステップにて試料中のα−ＧａｌＣｅｒの定量分析が行われる。
ステップ１：数種の濃度に調製したα−ＧａｌＣｅｒの標準物質の分析を行う。
ステップ２：標準物質由来のイオンのｍ／ｚ（質量／電荷比）に対し、イオン強度の時間変化（マスクロマトグラム）を取得し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。
ステップ３：ステップ２において求めた各標準物質のピーク面積と物質濃度との関係より、検量線を作成する。
ステップ４：定量する試料を分析し、試料中のα−ＧａｌＣｅｒのマスクロマトグラムのピーク面積を求める。
ステップ５：ステップ３にて作成した検量線に基づき、ステップ４のマスクロマトグラムのピーク面積に対応する試料のα−ＧａｌＣｅｒの濃度を決定する。
【００４５】
α−ＧａｌＣｅｒのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定は、例えば、α−ＧａｌＣｅｒをエレクトロスプレーイオン化法により前駆イオン及びプロダクトイオンにイオン化する方法によって検出して行うことができる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける液体クロマトグラフィーに用いるカラム及び移動相の組成は、細胞由来の成分とα−ＧａｌＣｅｒを分離可能であり、且つ、ＭＳ／ＭＳにて細胞由来の成分とα−ＧａｌＣｅｒを識別可能な限りにおいて、いかなるカラム及び移動相の組み合わせを使用してもよい。
【００４６】
１つの実施形態において、ａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒ量は、１×１０６個の細胞当たり３．９ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲である。１つの実施形態において、ａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの量は、１×１０６個の細胞当たり１０〜２７５ｎｇ、１０〜１４０ｎｇ又は１０〜１００ｎｇの範囲内であり得る。
【００４７】
３．ａＡＶＣによるがんの治療又は予防
本発明の治療又は予防方法は、ヒトに投与されるａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの１回用量が所定の用量となるように対象に投与されうる。
【００４８】
１つの実施態様において、本発明の治療又は予防方法は、ヒトに投与されるａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるように対象に投与されることを特徴とする。
【００４９】
１つの実施態様において、ヒトに投与されるａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの１回用量は、特定の数値範囲でありうる。当該特定の数値範囲は、ヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲に含まれる数値範囲（すなわち、上限値が２７５ｎｇ以下であり、下限値が１．７ｎｇ以上である数値範囲）でありうる。当該数値範囲は、例えば、その上限値が２７５ｎｇ以下、２７０ｎｇ以下、２６０ｎｇ以下、２５０ｎｇ以下、２４０ｎｇ以下、２３８ｎｇ以下、２３０ｎｇ以下、２２０ｎｇ以下、２１０ｎｇ以下、２００ｎｇ以下、１９０ｎｇ以下、１８０ｎｇ以下、１７０ｎｇ以下、１６０ｎｇ以下、１５０ｎｇ以下、１４０ｎｇ以下、１３０ｎｇ以下、１２０ｎｇ以下、１１０ｎｇ以下、１００ｎｇ以下、９０ｎｇ以下、８０ｎｇ以下、７０ｎｇ以下、６６ｎｇ以下、６０ｎｇ以下、５０ｎｇ以下、４７ｎｇ以下、４０ｎｇ以下、３６ｎｇ以下、３０ｎｇ以下、２４ｎｇ以下、２０ｎｇ以下、１９ｎｇ以下、１８ｎｇ以下、１７ｎｇ以下、１６ｎｇ以下、１５ｎｇ以下、１４ｎｇ以下、１３ｎｇ以下、１２ｎｇ以下、１１ｎｇ以下、１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６．６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４．７ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３．６ｎｇ以下、３ｎｇ以下、又は２ｎｇ以下の数値であり、その下限値が２７０ｎｇ以上、２６０ｎｇ以上、２５０ｎｇ以上、２４０ｎｇ以上、２３８ｎｇ以上、２３０ｎｇ以上、２２０ｎｇ以上、２１０ｎｇ以上、２００ｎｇ以上、１９０ｎｇ以上、１８０ｎｇ以上、１７０ｎｇ以上、１６０ｎｇ以上、１５０ｎｇ以上、１４０ｎｇ以上、１３０ｎｇ以上、１２０ｎｇ以上、１１０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、９０ｎｇ以上、８０ｎｇ以上、７０ｎｇ以上、６６ｎｇ以上、６０ｎｇ以上、５０ｎｇ以上、４７ｎｇ以上、４０ｎｇ以上、３６ｎｇ以上、３０ｎｇ以上、２４ｎｇ以上、２０ｎｇ以上、１９ｎｇ以上、１８ｎｇ以上、１７ｎｇ以上、１６ｎｇ以上、１５ｎｇ以上、１４ｎｇ以上、１３ｎｇ以上、１２ｎｇ以上、１１ｎｇ以上、１０ｎｇ以上、９ｎｇ以上、８ｎｇ以上、７ｎｇ以上、６．６ｎｇ以上、６ｎｇ以上、５ｎｇ以上、４．７ｎｇ以上、４ｎｇ以上、３．６ｎｇ以上、３ｎｇ以上、２．４ｎｇ以上、２ｎｇ以上、又は１．７ｎｇ以上である数値である。例えば、当該特定の数値範囲は、１．７ｎｇ〜５０ｎｇの範囲、５０ｎｇ〜１００ｎｇの範囲、１００ｎｇ〜１５０ｎｇの範囲、１５０ｎｇ〜２００ｎｇの範囲、２００ｎｇ〜２７５ｎｇ、１．７ｎｇ〜２３８ｎｇ、１．７ｎｇ〜１７０ｎｇ、６．６ｎｇ〜２３８ｎｇ、又は６．６ｎｇ〜１７０ｎｇの範囲からなる群から選択される１以上の範囲に含まれる数値範囲でありうる。
【００５０】
１つの実施形態において、ヒトに投与されるａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの量は、投与後の対象における脾臓細胞中のＮＫＴ細胞の割合を指標として決定し得る。脾臓細胞中のＮＫＴ細胞の割合が高まると、投与の効果が高まると考えられる。
【００５１】
１つの実施形態において、ヒトに投与されるａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの量は、１×１０６個の細胞当たり３．９ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲である。１つの実施形態において、ヒトに投与されるａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの量は、１×１０６個の細胞当たり１０〜２７５ｎｇ、１０〜１４０ｎｇ又は１０〜１００ｎｇの範囲内であり得る。
【００５２】
ａＡＶＣは、当業者に公知の方法を用いてがんの治療又は予防を必要とする対象に投与され得る。ａＡＶＣを対象へ投与する場合、ａＡＶＣ及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態で対象に投与することができる。ａＡＶＣを含む医薬組成物は、当該分野において通常用いられる賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。医薬組成物の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられる。
【００５３】
本発明の治療又は予防の対象となるがんとしては、特に限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、膀胱がん、脳腫瘍等の固形がん、及び骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。
【００５４】
ヒトへのａＡＶＣの投与量及び投与回数は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調節できる。ａＡＶＣの投与量は、例えば、対象への一回の投与において１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの範囲内の任意の量で設定できる。１つの実施形態において、ａＡＶＣの投与量は１．７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、又は１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣの投与量は６．２×１０3ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜７．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇの範囲内の任意の量で設定できる。ここで、下限値は、α−ＧａｌＣｅｒ積載量が２７５ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓの細胞を、細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量が１．７ｎｇ／ｋｇとなるように投与するときのヒト体重１ｋｇ当たりの細胞数である。上限値は、α−ＧａｌＣｅｒ積載量が３．９ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓの細胞を、細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量が２７５ｎｇ／ｋｇとなるように投与するときのヒト体重１ｋｇ当たりの細胞数である。１つの実施態様において、ａＡＶＣの投与量は、特定の数値範囲でありうる。当該特定の数値範囲は、６．２×１０3ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜７．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇの範囲に含まれる数値範囲（すなわち、上限値が７．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下であり、下限値が６．２×１０3ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上である数値範囲）でありうる。当該数値範囲は、例えば、その上限値が７．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、６．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、５．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、４．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、３．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、２．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、１．７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、１．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、１．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、９．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、８．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、７．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、６．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、４．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、２．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下、又は１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以下の数値であり、その下限値が１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、４．４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、６．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、６．６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、８．１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、９．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、１．７×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、３．２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、５．０×１��５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、６．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、７．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上、又は９．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ以上の数値であり、例えば、当該特定の数値範囲は、１．７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、６．６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜２．７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、６．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、８．１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、３．２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜８．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、４．４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜７．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、４．４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜７．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、２．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜４．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜２．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、６．６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの範囲、からなる群から選択される１以上の範囲に含まれる数値範囲でありうる。
【００５５】
ヒトへのａＡＶＣの投与方法としては、例えば、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内等への注射又は点滴により投与することができる。
【００５６】
本発明の治療又は予防方法は、他のがん治療方法と併用して用いることができる。他のがん治療方法としては、手術、放射線治療、造血幹細胞移植、又は、他の抗がん剤による治療が挙げられる。
【００５７】
＜本発明の医薬組成物等＞
本発明はまた、ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、外来性又は内在性のＣＤ１ｄを発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞を含み、且つ、ヒトに投与される該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される。当該ヒト由来細胞は、１以上の外来性又は内在性のがん抗原をさらに発現していてもよい。本発明はまた、がんの治療又は予防のための医薬組成物を製造するためのヒト由来細胞の使用であって、該細胞は、外来性又は内在性のＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ、該組成物は、ヒトに投与される該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、使用を提供する。当該ヒト由来細胞は、１以上の外来性又は内在性のがん抗原をさらに発現していてもよい。本発明はまた、がんの治療又は予防のためのヒト由来細胞であって、該細胞は、外来性又は内在性のＣＤ１ｄを発現し、該細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しており、且つ、該細胞は、ヒトに投与される該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲となるようにヒトに投与される、細胞を提供する。当該ヒト由来細胞は、１以上の外来性又は内在性のがん抗原をさらに発現していてもよい。
【００５８】
前述の本発明の医薬組成物、使用、及び細胞において、使用する細胞（ａＡＶＣ）、並びにその製法及びがんの治療又は予防における使用等に関する実施形態については「本発明のがんの治療又は予防方法」の項に記載のとおりである。
【００５９】
＜本発明の医薬組成物等の製造方法＞
本発明はまた、ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物の製造方法を提供する。本発明の医薬組成物の製造方法は、外来性又は内在性ＣＤ１ｄを発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞を提供することと、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの１回用量がヒト体重１ｋｇ当たり１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの範囲でヒトに投与されうるように該細胞を医薬組成物としてパッケージングすることを含む、方法でありうる。当該方法は、さらに、ヒト由来細胞の増殖を放射線照射等の方法により停止させる工程を含んでいてもよい。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物の製造方法は、外来性又は内在性ＣＤ１ｄを発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞を提供することと、該細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量を指標として医薬組成物としてパッケージングする該細胞を選択するまたは該細胞の数を決定すること、及び、選択または決定された該細胞をパッケージングして医薬組成物を得ることを含む、方法であり得る。この実施形態において、医薬組成物に含まれる細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの総量は、１．７ｎｇ〜２７５ｎｇの任意の数値に平均的なヒトの体重を乗じて算出された一定の数値範囲となり得る。本発明の医薬組成物の製造方法は、＜細胞に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量の測定法＞の項に記載の、細胞表面に積載されているα−ＧａｌＣｅｒの量を測定する方法をさらに含みうる。本発明の医薬組成物の製造方法は、細胞当たりのα−ＧａｌＣｅｒの積載量が一定の数値範囲である細胞集団を選択することと、当該選択された細胞集団を医薬組成物としてパッケージングすることをさらに含みうる。細胞当たりのα−ＧａｌＣｅｒの積載量は、例えば、１×１０６個の細胞当たり３．９ｎｇ〜２７５ｎｇ、１０〜２７５ｎｇ、１０〜１４０ｎｇ又は１０〜１００ｎｇの範囲内であり得る。製造される当該医薬組成物は、上記の用量でヒトに投与される。
【００６０】
＜細胞に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ量の測定法＞
本発明はまた、以下のような、細胞に積載されたα−ＧａｌＣｅｒ量を測定する方法を提供する：
細胞に積載されたα−ＧａｌＣｅｒ量を測定する方法であって、該細胞は、ＣＤ１ｄを発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒが積載されている細胞であり、該方法は、
該細胞の細胞抽出液を調製する工程、及び
細胞抽出液を質量分析（ＭＳ）に供し、該液中のα−ＧａｌＣｅｒ量を測定する工程
を包含する、方法。
【００６１】
１つの実施形態において、質量分析（ＭＳ）は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である。
【００６２】
１つの実施形態において、本方法で使用される細胞は、外来性又は内在性のＣＤ１ｄを発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞（ａＡＶＣ）である。１つの実施形態において、本方法で使用される細胞は、１以上の外来性又は内在性のＣＤ１ｄ及び外来性又は内在性のがん抗原を発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞（ａＡＶＣ）である。１つの実施形態において、本方法で使用される細胞は、１以上の外来性のＣＤ１ｄ及び外来性がん抗原を発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているヒト由来細胞（ａＡＶＣ）である。
【００６３】
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６４】
［実施例１−１：ａＡＶＣ−ＷＴ１の作製及び調製］
ＷＴ１、ＣＤ１ｄ、及びＴｅｔ３Ｇ（リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子）遺伝子をそれぞれ搭載したプラスミドを用いてレンチウイルスを作製した。当該レンチウイルスを用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｒ７９００７）に該遺伝子を導入することにより、ＣＤ１ｄ及びＷＴ１を発現し、細胞表面にα−ＧａｌＣｅｒを積載しているａＡＶＣを構築した。【００６５】
（１）レンチウイルス作製用プラスミドの構築
ＷＴ１遺伝子（配列番号１）の５’末側にＸｈｏＩ認識配列、３’末側にＮｏｔＩ認識配列を付加した遺伝子を、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ  Ｐｕｒプラスミド（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６１８３）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入することによりｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−ＷＴ１プラスミドを構築した。配列番号１の遺伝子は、Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ  Ｄ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０７７７４４．３）のアミノ酸配列を基に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の人工遺伝子合成サービスにてヒトのコドンへ最適化して作製した。ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−ＷＴ１プラスミドのＣＭＶプロモーターを制限酵素ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩにて切断した後に、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社、Ｃａｔ．ＴＰＬ−１０１）にて切断面を平滑化し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６０２３）にてライゲーション反応を行い、ｐＬＶＳＩＮ−Δ−ＷＴ１プラスミドを構築した。ｐＬＶＳＩＮ−Δ−ＷＴ１プラスミドのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに、ｐＴＲＥ３Ｇ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１１７３）から制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切り出したＴＲＥ３Ｇプロモーターを挿入し、ｐＬＶＳＩＮ−ＴＲＥ３Ｇ−ＷＴ１プラスミドを構築した。ｐＬＶＳＩＮ−ＴＲＥ３Ｇ−ＷＴ１プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｌｕＩで切断し、ＰＧＫプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子を除去した後に、当該プラスミドの切断面をＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにて平滑化し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにてライゲーション反応を行い、ｐＬＶＳＩＮ−ＴＲＥ３Ｇ−ＷＴ１Δｐｕｒプラスミドを構築した。【００６６】
ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ  Ｐｕｒプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＭｌｕＩで切断し、ＰＧＫプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子を除去した。当該プラスミドのＸｈｏＩ−ＭｌｕＩサイトの両側１５塩基とそれぞれ相補的な配列を付加したプライマーを用いてＣＤ１ｄ遺伝子（配列番号３）をＰＣＲ法にて増幅した。切断した前記プラスミドに増幅したＣＤ１ｄ遺伝子をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３９６４８）を用いて挿入し、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−ＣＤ１ｄΔｐｕｒプラスミドを構築した。配列番号３の遺伝子は、ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＤ１ｄ  ｉｓｏｆｏｒｍ  １  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１７５７．１）のアミノ酸配列（配列番号４）を基にＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の人工遺伝子合成サービスにてヒトのコドンへの最適化を行い作製した。【００６７】
ＰＣＲ法を用いてｐＣＭＶ−Ｔｅｔ−Ｏｎ  ３Ｇプラスミド（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１３３５）よりＴｅｔ３Ｇ遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ  ＰｕｒプラスミドのＸｈｏＩ−ＭｌｕＩサイトに挿入し、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−Ｔｅｔ３ＧΔｐｕｒプラスミドを構築した。【００６８】
（２）レンチウイルス作製
（１）で作製したｐＬＶＳＩＮ−ＴＲＥ３Ｇ−ＷＴ１Δｐｕｒプラスミド、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−ＣＤ１ｄΔｐｕｒプラスミド、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−Ｔｅｔ３ＧΔｐｕｒプラスミドを用いて、ＷＴ１搭載レンチウイルス、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス及びＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスを作製した。【００６９】
ｐＬＶＳＩＮ−ＴＲＥ３Ｇ−ＷＴ１Δｐｕｒプラスミド３０μｇとＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｋ４９７５００）３０μＬを混合し、１ｍＬになるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．３１９８５−０７０）を加えて混合して５分静置した（Ａ）。ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社、Ｃａｔ．１１５−０１０）６０μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  ９４０μＬを混合して５分静置した（Ｂ）。（Ａ）と（Ｂ）を混合して室温で１５分静置後、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）ベントキャップタイプフラスコ８００ｍＬスラントネック（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．３５３１３８）に播種した２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ−３２１６）に全量を添加して遺伝子導入を行った。２９３Ｔ細胞の播種は、遺伝子導入の前日に行い、１０％量のウシ胎児血清(ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．１２００７Ｃ（γ線照射品）)と０．１％量のゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１５７５０−０６０）を含むＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１０５６９−０１０）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行った。遺伝子導入後２日間培養し、培養液を室温にて２３０×ｇで５分間遠心して，ＷＴ１遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。上清を０．２２μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）でろ過し、４×ＰＥＧ溶液（３２％  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ＢｉｏＵｌｔｒａ、６０００（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．８１２５３−２５０Ｇ）、０．４Ｍ  ＮａＣｌ（関東化学株式会社  Ｃａｔ．３７１４４−０２）、０．０４Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１５６３０−０８０））を上清液量の１／３量添加して混合し、４℃で終夜静置した。２５００×ｇ、４℃、３０分間遠心して上清を除去し、再度２５００×ｇ、４℃、３０分間遠心して上清を完全に除去した。沈殿物を適量のＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、回収した培養上清に対して３０倍濃縮とし、ＷＴ１搭載レンチウイルスを得た。【００７０】
Ｔｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスはｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−Ｔｅｔ３ＧΔｐｕｒプラスミドを用いて、上記と同様の方法にて作製した。遺伝子導入後の培養期間は２日又は３日間とした。４×ＰＥＧ溶液と混合後の静置は４℃で終夜又は４日間で実施した。また最終懸濁液はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０１８）を使用した。【００７１】
ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−ＣＤ１ｄΔｐｕｒプラスミド１２μｇとＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ  ３６μＬを混合し、６ｍＬになるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３０９−０１９）を加えて混合して５分静置した（Ａ−２）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ＣＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２５６６−０１４）１４４μＬとＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＦＭ  ６ｍＬを混合して５分静置（Ｂ−２）した。Ａ−２とＢ−２を混合して室温で２０分間静置後、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）ベントキャップタイプフラスコ８００ｍＬスラントネックに播種した２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｒ７０００７）に全量を添加して遺伝子導入を行った。２９３ＦＴ細胞の培養培地は、１０％量のウシ胎児血清(ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．１２００７Ｃ（γ線照射品）)と０．１％量のゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地にＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１０１３１−０２７）とＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１１１４００５０)をそれぞれ終濃度５００μｇ／ｍＬ、０．１ｍＭになるように添加して使用した。遺伝子導入後２日間培養し、培養液を５４０×ｇ、４℃で１０分間遠心して，ＣＤ１ｄ遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。上清を０．４４μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）でろ過し、ＰＥＧ−ｉｔＴＭ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ｘ）（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．ＬＶ８２５Ａ−１）を上清液量の１／５量添加して混合し、４℃で終夜静置した。１５００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を除去し、再度１５００×ｇ、４℃で５分間遠心して上清を完全に除去した。ペレットを適量のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、回収した培養上清に対して７５倍濃縮とし、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスを得た。【００７２】
（３）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ＿ＷＴ１＿ＣＤ１ｄ＿Ｔｅｔ３Ｇ細胞の作製
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞に（２）で作製した３種のレンチウイルスを順次感染させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ＿ＷＴ１＿ＣＤ１ｄ＿Ｔｅｔ３Ｇ細胞を得た。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞の培養は、０．１％量のゲンタマイシンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍにて行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製し、１ｍＬ／ウェル量でＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャー  １２ウェル  細胞培養用マルチウェルプレート  平底  フタ付き（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．３５３０４３、以後１２ウェルプレートという。）に播種し、（２）で作製したＷＴ１搭載レンチウイルス５０μＬとＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルス１００μＬを添加した。５４０×ｇ、室温で３０分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。３日後に１２ウェルプレートからＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ポリカーボネート製三角フラスコベントキャップ１２５ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．４３１１４３、以後１２５ｍＬ三角フラスコという。）に継代し、さらに３日又は４日間隔で継代して１１日間培養した。この細胞を再度１２ウェルプレートに播種して、（２）で作製したＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス１００μＬを添加し、１回目と同様の手順で２回目のレンチウイルス感染を行った。１日後に１２ウェルプレートから１２５ｍＬ三角フラスコに継代し、さらに３日又は４日間隔で継代して１０日間培養した。これをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ＿ＷＴ１＿ＣＤ１ｄ＿Ｔｅｔ３Ｇ細胞とした。【００７３】
（４）クローニング
（３）で作製したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ＿ＷＴ１＿ＣＤ１ｄ＿Ｔｅｔ３Ｇ細胞から限外希釈法によるシングルセルクローニングを行い、全ての遺伝子が安定的に発現するクローンを選抜した。９６ウェルプレートに１ｃｅｌｌ／ウェルとなるように細胞を播種し、細胞の増殖に合わせて継代を行った。増殖した細胞のＷＴ１タンパク質及びＣＤ１ｄタンパク質の発現量を、ＷＴ１はＥＬＩＳＡにて、ＣＤ１ｄはフローサイトメトリーにて測定し、ＷＴ１及びＣＤ１ｄタンパク質を安定的に発現するクローンを選抜した。ＷＴ１は、培地に終濃度１００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１３１１）を添加し、Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを介して発現を誘導して評価を行った。ＥＬＩＳＡには固相化用抗体としてＡｎｔｉ−Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＮＴ  ｃｌｏｎｅ  ６Ｆ−Ｈ２（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．ＭＡＢ４２３４−Ｃ）、一次抗体としてＡｎｔｉ  ＷＴ１抗体（Ｗｕｘｉ  ＡｐｐＴｅｃ社、Ｃａｔ．ＡＰ１１９６４ｃ）、二次抗体としてＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ．ＨＡＦ００８）を使用し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリーには、ＡＰＣ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１ｄ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．５６３５０５）を使用し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて測定を行った。選抜されたクローンを、ａＡＶＣ−ＷＴ１前駆細胞とした。【００７４】
（５）α−ＧａｌＣｅｒ積載量が異なるａＡＶＣ−ＷＴ１の作製
ａＡＶＣ−ＷＴ１前駆細胞に種々の濃度のα−ＧａｌＣｅｒ（十全化学株式会社に合成を委託）を添加して培養することによりパルスを行い、α−ＧａｌＣｅｒ積載量が異なるａＡＶＣ（ａＡＶＣ−ＷＴ１とも称する）を作製した。【００７５】
ａＡＶＣ−ＷＴ１前駆細胞を培養し、培地に終濃度１００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンと、終濃度がそれぞれ５６ｎｇ／ｍＬ、１６７ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ又は３０００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒ溶液を添加してα−ＧａｌＣｅｒのパルスを行った。１５００ｎｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒ溶液を添加したａＡＶＣ−ＷＴ１前駆細胞の培養は、３つの異なる培養量にて独立して行った。α−ＧａｌＣｅｒ溶液は後段の実施例２（１）に準拠した方法にて作製した。添加２日後に細胞を遠心法により回収し、洗浄と濃縮を行い、Ｘ線照射装置ＭＢＲ−１５２０Ｒ−３又はＭＢＲ−１５２０Ｒ−４（株式会社  日立パワーソリューションズ）を用いて３０、４０又は１００Ｇｙ量のＸ線を照射し、ａＡＶＣ−ＷＴ１を作製した。【００７６】
［実施例１−２：マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１の作製］
マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ−１６５８）にＷＴ１遺伝子及びＣＤ１ｄ遺伝子のｍＲＮＡを導入し、α−ＧａｌＣｅｒ（十全化学株式会社に合成を委託）を添加することによりマウス型ａＡＶＣ（ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１とも称する）を作製した。【００７７】
ｐＧＥＭ−４Ｚプラスミド（プロメガ社、Ｃａｔ．Ｐ２１６１）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに、ＷＯ２０１３／０１８７７８に記載のｐｃＤＮＡ３−ＡＴＧ−ＷＴ１から制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにて切り出したＷＴ１遺伝子を挿入したｐＧＥＭ−４Ｚ−ＷＴ１プラスミドを作製した。ｐＧＥＭ−４ＺプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに配列番号５に示す塩基配列からなるマウスＣＤ１ｄ遺伝子（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＤ１ｄ１、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１１６０９−１のアミノ酸配列（配列番号６）を基にＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の人工遺伝子合成サービスにてヒトのコドンへの最適化を行い、遺伝子を合成）を挿入しｐＧＥＭ−４Ｚ−ｍＣＤ１ｄプラスミドを構築した。ｐＧＥＭ−４Ｚ−ＷＴ１プラスミドとｐＧＥＭ−４Ｚ−ｍＣＤ１ｄプラスミドをそれぞれＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断して直鎖にし、これらをテンプレートにｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥＴＭ  Ｔ７  ＵＬＴＲＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＡＭＢ１３４５５）を用いて、ＷＴ１  ｍＲＮＡとＣＤ１ｄ  ｍＲＮＡを作製した。α−ＧａｌＣｅｒ（十全化学株式会社に合成を委託）を５００ｎｇ／ｍＬ添加した１０％量のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１０５６９）にて２日間培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞を回収し、細胞懸濁液にＷＴ１  ｍＲＮＡとＣＤ１ｄ  ｍＲＮＡを添加し、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（ネッパジーン株式会社）を用いてエレクトロポレーション（ポアーリングパルス：電圧１５０Ｖ、パルス幅８ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓ、回数２回、減衰率１０％、極性＋、トランスファーパルス：電圧２０Ｖ、パルス幅５０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓ、回数±５回、減衰率４０％、極性＋／−）を行った。細胞を回収し、Ｘ線照射装置ＭＢＲ−１５２０Ｒ−３（株式会社  日立パワーソリューションズ）を用いて３０Ｇｙ量のＸ線を照射し、ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１を作製した。【００７８】
［実施例２：ａＡＶＣ−ＷＴ１及びａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１に積載されているα−ＧａｌＣｅｒ濃度の測定］
（１）α−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ調製
４００ｍＬの注射用水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｃａｔ．Ａ１２８７３−０２）にＳｕｃｒｏｓｅ（Ｍｅｒｃｋ社、  Ｃａｔ．Ｓ７９０３）２８ｇ及びＬ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社、  Ｃａｔ．Ｈ８０００）３．７５ｇを加え、８０℃の恒温水槽で加熱して溶解した。上記溶液にα−ＧａｌＣｅｒ  １００ｍｇ、１０％  ポリソルベート２０（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、Ｃａｔ．１９４７２４）２５ｇを加え、８０℃の恒温槽で１時間以上加熱した。溶液中の固形物が溶解していることを確認した後、注射用水を加えて５００ｇとし、この溶液を２００μｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒ溶液とした。２００μｇ／ｍＬのα−ＧａｌＣｅｒ溶液を希釈液（１０％水及び９０％移動相Ｂ（７０％エタノール、２９．５％メタノール、０．５％ギ酸））で希釈し、１０００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度のα−ＧａｌＣｅｒ溶液をそれぞれ調製し、α−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。【００７９】
（２）細胞抽出液の調製
実施例１にて作製した、種々の濃度のα−ＧａｌＣｅｒでパルスした１×１０６ｃｅｌｌｓのａＡＶＣに１ｍＬ又は０．２５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、超音波ホモジナイザー（ＳＭＴ社、Ｃａｔ．ＵＨ−５０）を用いて、細胞を２０秒間ホモジナイズした。ホモジナイズした細胞破砕液１００μＬに９００μＬの移動相Ｂを加え、１０分以上撹拌した。１００００×ｇで５分間遠心し、上清２５０μＬをポリプロピレン型スクリューバイアル（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｃａｔ．１０３０−６１０２４）に回収し細胞抽出液を調製した。【００８０】
（３）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
（１）で調製したα−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎと、（２）で調製した細胞抽出液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳの多重反応モニタリングによって測定した。α−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは測定回数１、細胞抽出液は（５）の表１の通り測定回数６回、３回、又は１回で測定を実施した。ＬＣは１２００ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、ＭＳは６４１０  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｔ．Ｇ６４１０Ｂ）を使用した。ＬＣでサンプルの分離を行った。１０μＬのα−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び細胞抽出液を、Ａｃｃｕｃｏｒｅ−１５０−Ｃ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１６５２６−１０３０３０）カラムに供し、移動相Ａ（０．１％ギ酸）および移動相Ｂ（７０％エタノール、２９．５％メタノール、０．５％ギ酸）で移動相Ｂが６０％〜１００％のグラジエント勾配にてサンプルを分離した。カラムへの流速は０．４ｍｌ／分、カラム温度は４０℃で実施した。分離した溶液を順次ＭＳに導入し、溶液中の化合物をエレクトロスプレーイオン化法によりイオン化した。発生したイオンの中から、α−ＧａｌＣｅｒの前駆イオンとして８５８．７［ｍ／ｚ］を選択した。さらにこの前駆イオンを分解し、６９６．７［ｍ／ｚ］をα−ＧａｌＣｅｒのプロダクトイオンとして検出した。前駆イオンとプロダクトイオンは、α−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを上記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析して予め求めた値を使用した。【００８１】
（４）解析
解析ソフト（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用してα−ＧａｌＣｅｒ濃度の定量を行った。α−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの測定結果からα−ＧａｌＣｅｒの保持時間を判断し、測定サンプルが同様の保持時間を示すことを確認し、各測定サンプルのα−ＧａｌＣｅｒ量をピーク面積法で解析を行った。（１）で調製したα−ＧａｌＣｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの解析結果から検量線を作成し、目的サンプルの定量を行った。検量線の作成には測定した１０００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬの６点又は５００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬの６点の中から４点又は５点の測定結果を用いた。【００８２】
（５）α−ＧａｌＣｅｒ含量の測定結果
ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１又はａＡＶＣ−ＷＴ１に積載されたα−ＧａｌＣｅｒ量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて測定した結果を下表に示す。表１において、α−ＧａｌＣｅｒ添加濃度１５００ｎｇ／ｍＬに示す３つの値は、培養スケールが異なる独立した３回の実験にて得られた細胞に積載されたをα−ＧａｌＣｅｒ量示す。
【表１】
0006912765.tif 000002
【００８３】
［実施例３：薬理学的に有効性を示すａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１の投与細胞数の設定］
ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１を用い、マウスＢ１６メラノーマ細胞静注肺転移モデルにおける、ａＡＶＣに積載されたα−ＧａｌＣｅｒを介したＮＫＴ細胞の活性化による抗腫瘍活性を評価した。各群１６例の７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の尾静脈から、ＰＢＳに懸濁したＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ−６４７５）を２×１０４ｃｅｌｌｓ投与して、マウスＢ１６メラノーマ細胞静注肺転移モデルを作製した。投与３時間後、前記マウスの尾静脈から、ＢＩＣＡＮＡＴＥ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（株式会社大塚製薬工場）に懸濁したａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１（実施例２  表１最上段、α−ＧａｌＣｅｒ積載量は２．４ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓ）を、それぞれ１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇとなるように投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。Ｂ１６−Ｆ１０投与から６１日にわたり生存を観察した結果、コントロール群の生存期間中央値が２９．５日であったのに対し、ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１投与群の生存期間中央値はそれぞれ、１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与群が３１．５日、１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与群が４２．０日、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与群が３７．０日であった。ログランク検定により生存期間を比較したところ、ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１を１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与した群は、コントロール群と比較して有意に生存期間が延長された（図１）。よって、本モデルにおいてａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１は１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇで有効であると判定した。α−ＧａｌＣｅｒを積載した細胞の本モデルにおける抗腫瘍効果はＮＫＴ細胞欠損マウスやＮＫ細胞の除去により減弱することが報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．；２００７；１７８：２８５３−２８６１）。従って、本モデルにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１の抗腫瘍効果は、積載されたα−ＧａｌＣｅｒによるＮＫＴ細胞の活性化を介したものと考えられる。【００８４】
［実施例４：α−ＧａｌＣｅｒ積載量とＮＫＴ細胞活性化］
マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１を用いてヒト型ａＡＶＣ−ＷＴ１の薬効用量を推定するために、実施例２の表１に記載のａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１及び各種ａＡＶＣ−ＷＴ１について、マウスにおけるＮＫＴ細胞活性化能を測定し、比較を行った。この結果を用いて、ヒトにおけるａＡＶＣ−ＷＴ１投与によるＮＫＴ細胞活性化を介した薬効発現に必要なα−ＧａｌＣｅｒ投与量を設定した。ＮＫＴ細胞活性化能の指標として、ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１投与後の脾臓細胞中ＮＫＴ細胞割合を測定した。【００８５】
各群３例の５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールスリバー）の尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁したａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１と実施例２の表１に記載のα−ＧａｌＣｅｒ積載量を有する各種ａＡＶＣ−ＷＴ１をそれぞれ１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与した。コントロール群にはＢＩＣＡＮＡＴＥ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを２００μＬ投与した。投与３日後にマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から一般的な方法に従い脾臓細胞を調製した。脾臓細胞に含まれるＮＫＴ細胞をα−ＧａｌＣｅｒを結合させたｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１ｄ：Ｉｇ  ｆｕｓｉｏｎ（ＣＤ１ｄ／Ｇａｌ−ｄｉｍｅｒ、ＢＤ社、Ｃａｔ．５５７５９９）、ＡＰＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＢＤ社、Ｃａｔ．５６００８９）及びＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．１１５５０６）にて染色し、フローサイトメトリーにて測定した。ＮＫＴ細胞の割合は、前方散乱光と側方散乱光のサイトグラムのリンパ球画分細胞におけるＣＤ１ｄ／Ｇａｌ−ｄｉｍｅｒ陽性且つＣＤ１９陰性の細胞の割合をＦｌｏｗＪｏ  ｖｅｒ．１０．２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）にて解析することにより算出した。結果、ａＡＶＣ−ＷＴ１へのα−ＧａｌＣｅｒ積載量が多くなるほど、また投与細胞数が多くなるほど、脾臓細胞中ＮＫＴ細胞割合が高くなる傾向となった（図２）。この結果は、投与された細胞数よりも、投与されたα−ＧａｌＣｅｒの総量がＮＫＴ細胞活性化と顕著に強く相関することを示唆している。【００８６】
ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１を１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与した時（実施例３でコントロール群と比較して有意に生存期間が延長された投与量）の脾臓細胞中ＮＫＴ細胞割合は１．１％であった（図２、ａＡＶＣ（３Ｔ３）−ＷＴ１の斜線の棒グラフ）。ａＡＶＣ−ＷＴ１を投与したマウスにおいて１．１％以上のＮＫＴ細胞割合を示したα−ＧａｌＣｅｒの投与量の最小値は１．７ｎｇ／ｋｇ（図２、α−ＧａｌＣｅｒ積載量が１０ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓであるａＡＶＣ−ＷＴ１  １０の斜線の棒グラフ、表２、１０ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓのα−ＧａｌＣｅｒを１．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ投与時＝α−ＧａｌＣｅｒ量として１．７ｎｇ／ｋｇ）であった。従って、α−ＧａｌＣｅｒ投与量は１．７ｎｇ／ｋｇ以上であれば脾臓細胞中のＮＫＴ細胞の割合を有意に高めることができると考えられる。
また、ａＡＶＣ細胞表面のα−ＧａｌＣｅｒ積載量は、最小値である３．９ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓの濃度であっても、α−ＧａｌＣｅｒ投与量が１．７ｎｇ／ｋｇを超える投与量であれば、１．１％以上のＮＫＴ細胞割合を示した（図２、α−ＧａｌＣｅｒ積載量が３．９ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓであるａＡＶＣ−ＷＴ１  ３．９の黒の棒グラフ）。従って、α−ＧａｌＣｅｒ積載量が３．９ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓ以上の濃度である細胞を用いることが望ましいと考えられる。【００８７】
表２に、実施例３及び実施例４にて使用した細胞の種類、α−ＧａｌＣｅｒ積載量、投与細胞数、及び該投与細胞数をマウスに投与した際のα−ＧａｌＣｅｒ投与量をまとめた。
【表２】
0006912765.tif 000003
【００８８】
［実施例５：マウス単回静脈内投与毒性試験］
ａＡＶＣ−ＷＴ１（α−ＧａｌＣｅｒ積載量は２７５ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓ）をマウスに単回静脈内投与した後の毒性を評価した。動物は各群５例ずつ、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雌雄マウス（日本チャールスリバー）を使用した。投与群として、溶媒対照群、低用量群（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ）、中用量群（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ）及び高用量群（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇ）の４群を設定した。溶媒として細胞投与液作製にはＢＩＣＡＮＡＴＥ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（大塚製薬）を用い、ａＡＶＣ−ＷＴ１をＢＩＣＡＮＡＴＥ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁して、低用量群用投与液１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、中用量群用投与液１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、高用量群用投与液１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬをそれぞれ調製した。マウスへの投与容量は１０ｍＬ／ｋｇとし、投与日に測定した体重をもとにマウスごとに投与液量を算出し、溶媒又は細胞投与液をマウスの尾静脈内に単回投与した。投与後のマウスは、投与後７日間にわたり一般状態の観察、体重測定を行い、投与７日後に屠殺して剖検に供した。一般状態の観察（投与日は投与前、投与１時間後、投与４時間後の計３回、投与翌日〜剖検までは１日１回の観察）において、溶媒又は各細胞投与による影響（死亡、瀕死、その他自発運動低下など）は認められなかった。体重測定は投与前日、投与日、投与翌日、３日後及び７日後にに行った。高用量群の雌雄で投与３日後に体重減少が認められた（図３）。摂餌量測定（投与３日前〜投与前日、投与日〜投与翌日、投与翌日〜投与３日後、投与３日後〜投与７日後における１日当たりの摂餌量を測定）において、中用量群の雌及び高用量群の雌雄で、投与日〜投与翌日、及び投与翌日〜投与３日後における摂餌量の減少が認められた（図４）。本試験結果より、低用量群においては体重及び摂餌量に影響は認められないことから、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇが体重と摂餌量に影響を及ぼさない投与量の上限（α−ＧａｌＣｅｒ積載量から換算して、α−ＧａｌＣｅｒ投与量は２７５ｎｇ／ｋｇに相当）であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、ａＡＶＣを用いて有効且つ安全ながんの治療又は予防に有用であることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。
配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ヒトＷＴ１タンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号３で示される塩基配列は、ヒトＣＤ１ｄタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号５で示される塩基配列は、マウスＣＤ１ｄタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列である。
【要約】
ａＡＶＣを用いた有効且つ安全ながんの治療又は予防方法の提供。
ａＡＶＣを用いたがんの治療及び予防における有効性及び安全性確保の観点から好ましいａＡＶＣ細胞表面に積載されたα−ＧａｌＣｅｒの投与量、及びａＡＶＣを含む医薬組成物に含まれるａＡＶＣ細胞表面に積載されるα−ＧａｌＣｅｒの量の好適な範囲を見出し、ａＡＶＣを用いる有効且つ安全ながんの治療又は予防方法、有効且つ安全な、がんの治療又は予防のためのａＡＶＣ及びそれを含む医薬組成物等を提供する。【図１】
0006912765.tif 000004
【図２】
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【図３】
0006912765.tif 000006
【図４】
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【配列表】
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