(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結され、異種タンパク質が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質であり、ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質が、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質であり、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質が、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーと、抗ウイルスシグナル伝達及びＩ型ＩＦＮ誘導に関与するタンパク質を含有する他のＣＡＲＤドメインと、ＳＴＩＮＧの刺激をもたらすＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳからなる群から選択されるサイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ等のサイクリックジヌクレオチド生成酵素とからなる群から選択される、組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項２】
ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質が、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質であり、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質が、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、並びにｃＧＡＳ、又はその断片からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項３】
増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドをさらに含む、請求項１又は２に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項４】
少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が不十分である、請求項３に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項５】
増殖に必須の内在性タンパク質をコードする遺伝子が、アミノ酸産生に必須の酵素をコードする遺伝子、ペプチドグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、ＬＰＳ生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、ヌクレオチド生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、及び翻訳開始因子をコードする遺伝子から選択される、請求項３又は４に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項６】
増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子が、アミノ酸産生に必須の酵素をコードする遺伝子であり、アミノ酸産生に必須の酵素が、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）である、請求項３から５の何れか一項に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項７】
エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株である、請求項１から６の何れか一項に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項８】
内在性毒性プラスミド上に位置する増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子が、その内在性プロモーター及びその内在性転写ターミネーターを含む、請求項３から７の何れか一項に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項９】
増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子、その内在性プロモーター、及びその内在性転写ターミネーターが、内在性毒性プラスミド上のｏｒｆ１５５（ＳｙｃＯ）の開始点の１２２ｂｐ上流に位置する、請求項８に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項１０】
内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含む、請求項１から９の何れか一項に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項１１】
内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションが、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡヘアピン構造又はその一部を除去する欠失を含む、請求項１０に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項１２】
ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質が、ＶｉｒＦである、請求項１０又は１１に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項１３】
エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）である、請求項１から１２の何れか一項に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株を含む、対象のがんを治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え弱毒化グラム陰性菌株及び対象のがんを治療する方法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、タンパク質を標的細胞に直接打ち込むための様々なメカニズムを進化させてきた１。エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のような細菌により使用されるＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）２は、宿主細胞にいわゆる細菌エフェクタータンパク質を打ち込むナノシリンジのように機能する。
【０００３】
Ｔ３Ｓは、ハイブリッドペプチド及びタンパク質を標的細胞に送達するために活用されてきた。研究対象の細菌が、遺伝学による利用が困難である（トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のような）場合に、異種細菌Ｔ３ＳＳエフェクターが送達されてきた。多くの場合、レポータータンパク質、例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）アデニル酸シクラーゼ、マウスＤＨＦＲ又はリン酸化可能なタグが、Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質送達の研究要件に応じて、潜在的Ｔ３ＳＳ分泌シグナルに融合された。ペプチド送達は、主に、ワクチン接種を目的として行われた。これは、ウイルスエピトープ、細菌エピトープ（リステリオリジンＯ）、並びにヒトがん細胞のエピトープに相当するペプチドを含む。少数の事例では、機能性真核生物タンパク質が、ナノボディ３、核タンパク質（Ｃｒｅ−リコンビナーゼ、ＭｙｏＤ）４、５又はＩｌ１０及びＩＬ  １ｒａ６でなされるように、宿主細胞を調節するために送達されている。何れの場合も一又は複数の内在性エフェクタータンパク質が依然としてコードされているので、上述の系の何れによっても単一のタンパク質を送達することはできない。さらに、使用されたベクターは、最適なタンパク質をコードする他のＤＮＡ断片を簡単にクローニングできるようには設計されておらず、それがこの系の広範な応用を妨げている。
【０００４】
標的薬物送達を可能にする手法が重要である。例えば、腫瘍細胞の表面構造を認識する抗体であって、最適な場合、腫瘍細胞と選択的に結合する抗体が使用される。そのような抗体のメカニズムを向上させるために、それらを治療剤と、又は薬物が充填された脂質小胞と、コンジュゲートさせることができる。そのような小胞に関する課題の１つは、活性試薬の適切な放出である。よりいっそう複雑なのは、治療タンパク質又はペプチドの送達、特に、細胞内機構を標的とする場合の送達である。治療タンパク質の真核細胞への送達の問題を解決するために多くの代替的方法が試みられており、そのような方法には、「細胞透過ペプチド」（ＣＰＰ）又は同様の技術、並びにナノ粒子に基づく様々な方法がある。これらの技術には全て、低い有効性という欠点、及びエンドサイトーシスによって細胞により取り込まれる輸送基質が、最終的にリソソーム内で分解されることになる可能性が高いという欠点がある。さらに、ヒトの体内での輸送基質−担体の安定性と、標的細胞内での不安定化及び遊離の必要性との矛盾は、そのような技術の固有の問題である。
【０００５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）をはじめとする、様々な細菌は、遠位部位から投与された場合、悪性固形腫瘍内で複製することが証明されている。現在、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）に由来する）のみが臨床診療に使用されている。ＢＣＧは、表在性膀胱がんを治療するために投与されるが、その根本的な分子メカニズムは依然としてほとんど分かっていない。例えば、細菌内で産生されたカーゴをがん細胞のような細胞内、すなわち細菌の外、のその作用部位に送達することができる菌株の開発は、依然として大きな課題である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、組換え弱毒化グラム陰性菌株及び対象のがんを治療する方法におけるその使用に関する。一部の実施態様では、本発明は、がん細胞への、例えば、悪性固形腫瘍細胞への、ウイルスタンパク質の様々なＩＩＩ型エフェクターの移行を可能にするが、ＩＶ型エフェクターの移行も可能にし、最も重要なことに、機能性真核生物タンパク質の移行を可能にする組換え弱毒化グラム陰性菌株、並びに対象のがんを治療するためのそれらの使用を提供する。
【０００７】
本発明は、異種タンパク質発現及び分泌増加特性を有する組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、驚くべきことに、数日又はさらには数週間にわたってインビボで異種タンパク質を安定的にコードすることができる組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。
【０００８】
第１の態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドをさらに含む組換え弱毒化グラム陰性菌株に関する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含む組換え弱毒化グラム陰性菌株に関する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、異種タンパク質が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質である、組換え弱毒化グラム陰性菌株に関する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドをさらに含み、対象のがんを治療する方法において使用するためのものであり、前記方法が、対象に前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を投与することを含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、組換え弱毒化グラム陰性菌株に関する。
【００１２】
同様に、本発明は、対象のがんを処置する方法であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株を対象に投与することを含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドをさらに含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、方法に関する。
【００１３】
同様に、本発明は、対象のがんを治療するための医薬を製造するための、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株の使用であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドのをさらに含む、使用に関する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含み、対象のがんを治療する方法において使用するためのものであり、方法が、対象に前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を投与することを含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、組換え弱毒化グラム陰性菌株に関する。
【００１５】
同様に、本発明は、対象のがんを処置する方法であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む組換え弱毒化グラム陰性菌株を対象に投与することを含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、前記組換え弱毒化グラム陰性菌株が、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、方法に関する。
【００１６】
同様に、本発明は、対象のがんを治療するための医薬を製造するための、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む組換え弱毒化グラム陰性菌株の使用であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含む、使用に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、異種タンパク質がインターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質であり、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象のがんを治療する方法において使用するためのものであり、前記方法が、対象に前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を投与することを含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、組換え弱毒化グラム陰性菌株に関する。
【００１８】
同様に、本発明は、対象のがんを治療する方法であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む組換え弱毒化グラム陰性菌株を対象に投与することを含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、異種タンパク質が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質であり、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、方法に関する。
【００１９】
同様に、本発明は、対象のがんを治療するための医薬の製造のための、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む組換え弱毒化グラム陰性菌株の使用であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、異種タンパク質が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質である、使用に関する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、組換え弱毒化グラム陰性菌株と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドをさらに含む、薬学的組成物に関する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、組換え弱毒化グラム陰性菌株と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含む、薬学的組成物に関する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、組換え弱毒化グラム陰性菌株と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されており、異種タンパク質が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質である、薬学的組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｔ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけの図である。Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質の周囲媒体への分泌（インビトロ分泌）（左側）又は真核細胞への分泌（右側）の模式図。Ｉ：３型分泌系を示す。ＩＩは、周囲媒体に分泌されたタンパク質を示し、ＩＩＩは、膜を通って真核細胞のサイトゾル（ＶＩＩ）に移行したタンパク質を示す。ＶＩは、Ｔ３ＳＳが挿入される及び下に細菌サイトゾルがある２つの細菌膜の伸張を示す。ＩＶは、ＹｏｐＥ１−１３８Ｎ末端断片（Ｖ）に結合している融合タンパク質である。
【図２Ａ−Ｂ】ＩＩＩ型分泌に基づく送達ツールボックスの説明の図である。（Ａ）ＹｏｐＥ１−１３８を有する融合構築物を生成するために使用したクローニングプラミドｐＢａｄ＿Ｓｉ１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ２のベクターマップ。シャペロンＳｙｃＥ、及びＹｏｐＥ１−１３８融合体は、ネイティブＹ．エンテロコリティカプロモーターの下にある。２つのプラスミドは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ１上に存在するアラビノース誘導性ＥＧＦＰの存在の点のみが異なる。（Ｂ）ｐＢａｄ＿Ｓｉ１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ２プラスミド上のｙｏｐＥ１−１３８断片の直後の多重クローニング部位。
【図３Ａ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｂ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｃ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｄ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｅ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｆ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｇ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｈ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｉ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｊ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｋ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｌ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｍ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｎ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｏ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｐ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図３Ｑ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカのリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図４】エルシニア・エンテロコリティカＷ２２７毒性プラスミド、ｐＹＶの図である。正確な縮尺率で描かれたＷ２２７株の６９’６７３  ｂｐエルシニア属毒性プラスミド（ｐＹＶ）。Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質、複製開始点、及びヒ素耐性（ａｒｓＣ、Ｂ、Ｒ及びＨ遺伝子によりコードされたもの）が示されている：  Ｉ：複製開始点、ＩＩ：ｙｏｐＯ、ＩＩＩ：ｙｏｐＰ、ＩＶ：ｙｏｐＱ、Ｖ：ｙｏｐＴ、ＶＩ：ｓｙｃＴ、  ＶＩＩ：ｙｏｐＭ、ＶＩＩＩ：ｙｏｐＤ、ＩＸ：ｙｏｐＢ、Ｘ：ｓｙｃＤ、ＸＩＩ：ｙｏｐＨ、ＸＩＩＩ：ｓｙｃＨ、ＸＩＶ：ｓｙｃＥ、  ＸＶ：ｙｏｐＥ、ＸＶＩ：ｙａｄＡ、ＸＶＩＩ−ＸＶＸＸ：ａｒｓＣ、Ｂ、Ｒ及びＨ。
【図５】アポトーシス促進性が増した合成タンパク質の送達の図である。アポトーシス促進性タンパク質ｔ−ＢＩＤ又はＢＡＸ由来の単一ＢＨ３ドメイン又はＢＨ３のタンデムリピートからなる単一の合成タンパク質の送達は、４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０がん性細胞においてアポトーシス誘導増強をもたらす。ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ上にＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３伸長ドメイン、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−リンカー−ｔＢＩＤ  ＢＨ３、ＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３、ＶＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２、ＶＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３−ＢＡＸ  ＢＨ３又はＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＢＡＸ  ＢＨ３−ｔＢＩＤ  ＢＨ３をコードしているＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨＯＰＥＭＴに、４Ｔ１（Ｉ）又はＢ１６Ｆ１０（ＩＩ）細胞を感染させた。細胞に加えた細菌（感染多重度）の滴定を各株について行い、細胞数を決定し、非線形回帰を使用してＩＣ５０を算出した。ＩＣ５０感染多重度が示されている（ＩＩＩ）。
【図６】ｐＹＶによりコードされた合成アポトーシス促進性タンパク質によるアポトーシスの誘導の図である。ｐＹＶ上にコードされた単一ＢＩＤ  ＢＨ３ドメイン又はＢＩＤ  Ｂ３ドメインのタンデムリピートの送達は、４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０がん性細胞においてアポトーシス誘導をもたらす。４Ｔ１（Ｉ）又はＢ１６Ｆ１０（ＩＩ）細胞を、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−ＢＨ３−Ｂｉｄ、又はＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ＢＨ３−Ｂｉｄ）２、又はＶＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ＢＨ３−Ｂｉｄ）２に、３時間、感染させた。細胞に加えた細菌（感染多重度）の滴定を各株について行い、細胞数を決定し、非線形回帰を使用してＩＣ５０（ＩＩＩ）を算出した。
【図７】４Ｔ１乳がん同種移植モデルにおける静脈内注射したＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔの腫瘍定着の図である。腫瘍内の細菌数が組織１グラム当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として示されている（ＩＩＩ）。感染後８日目（Ｉ）及び１４日目（ＩＩ）に腫瘍内の数を評価した。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。
【図８】４Ｔ１乳がん同種移植モデルにおける静脈内注射したＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔの生体内分布の図である。血液（Ｉ）、脾臓（ＩＩ）、肝臓（ＩＩＩ）、肺（ＩＶ）及び腫瘍（Ｖ）内の細菌数が、組織１グラム当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）、又は血液１ｍｌ当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）（ＶＩ）として示されている。感染後１４日目に数を評価した。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。＊は、肺に大きい転移が見られたマウスを示す。
【図９】４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の遅延の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ又はＩＩ：１×１０７＊Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８（ＢＨ３−Ｂｉｄ）２を静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義した。その後数日（ＩＩＩ：細菌の静脈内注射後０日目から９日目）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。０日目の腫瘍体積に正規化した相対腫瘍体積が、ｍｍ３として示されている（ＩＶ）。平均値が記号で示されており、描かれているエラーバーは、平均値の標準誤差を示す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡで測定され、＊は、ｐ値＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ値＜０．００５を示す。
【図１０】４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ又はＩＩ：１×１０７＊Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴを静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義した。その後数日（ＩＩＩ：細菌の静脈内注射後０日目から９日目）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。０日目の腫瘍体積に正規化した相対腫瘍体積が、ｍｍ３として示されている（ＩＶ）。平均値が記号で示されており、描かれているエラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図１１】主制御因子ＶｉｒＦの発現を調節することによる、Ｔ３ＳＳに基づく分泌の制御の図である。Ａ：ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２を送達するＹ．エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ΔＨＯＰＥＭＴ株に関するインビトロ分泌アッセイ（３７℃で行った）。ＶｉｒＦの発現は、その天然のプロモーター（Ｉ＋ＩＩ）、アラビノース誘導性プロモーター（ＩＩＩ＋ＩＶ）、又は温度依存性発現を調節するそのｈａｉｒｐｉｎ  Ｉ領域が欠失しているその天然のプロモーター（Ｖ）の調節下にある。分泌アッセイは、アラビノースの非存在下（Ｉ、ＩＩＩ及びＶ）又は０．２％アラビノースの存在下（ＩＩ及びＩＶ）のどちらかで行った。ＹｏｐＥ１−１３８領域を認識する抗体を用いるウェスタンブロッティングを使用して、分泌されたＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２を検出した。Ｂ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  Ｃａｒｄドメインを送達するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ株に関するインビトロ分泌アッセイ（３７℃で行った）。ＶｉｒＦの発現は、その天然のプロモーター（Ｉ＋ＩＩ）、又は温度依存性発現を調節するそのｈａｉｒｐｉｎ  Ｉ領域が欠失しているその天然のプロモーター（ＩＩＩ）の調節下にある。分泌アッセイは、アラビノースの非存在下（Ｉ及びＩＩＩ）又は０．２％アラビノースの存在下（ＩＩ）のどちらかで行った。ＹｏｐＥ１−１３８領域を認識する抗体を用いるウェスタンブロッティングを使用して、分泌されたＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  Ｃａｒｄドメインを検出した。
【図１２】インビトロでの増殖の比較：ＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＢＡＤ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄ、Ｖ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＢＡＤ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄ（逆方向）、ＶＩ：ｐＹＶ上にＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、及びＶＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＹＶ−ａｓｄ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２についての、インビトロでの増殖の比較の図である。細菌を液体培地中でインキュベートし、３時間増殖させた。その後、ＯＤ６００（Ｉ）を全ての株について判定した。
【図１３】Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄでの腫瘍定着及びｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄの安定性の図である。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下に同種移植した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６  Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄを静脈内注射した。静脈内注射後１日目（Ｉ）又は４日目（ＩＩ）に、血液（Ｖ）、脾臓（ＶＩ）、肝臓（ＶＩＩ）、肺（ＶＩＩＩ）及び腫瘍（ＩＸ）を単離し、ホモジナイズし、段階希釈し、ナリジクス酸を含有する（及びアンピシリンを含有しない、−ＩＶ）ＬＢ−寒天プレート上に、又はｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄに対して選択性のあるアンピシリン（＋ＩＶ）を伴うＬＢ−寒天プレート上に播種した。それぞれの試料中の細菌数が、組織１グラム又は血液１ｍｌ当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として示されている（ＩＩＩ）。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。
【図１４】Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄでの腫瘍コロニー形成の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、１×１０６  Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄを静脈内注射した。細菌の静脈内注射後の示されている日（Ｉ）に、腫瘍を単離し、ホモジナイズし、段階希釈し、ナリジクス酸を含有するＬＢ−寒天プレートに播種した。腫瘍内の細菌数が組織１グラム当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として示されている（ＩＩ）。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。
【図１５】ｐＹＶの遺伝的安定性：インビボでの固形腫瘍における天然ｐＹＶ又はｐＹＶ−ａｓｄの安定性の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、１×１０７のＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ΔｈａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２又はＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＹＶ−ａｓｄ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２を静脈内注射した。細菌の静脈内注射後９日目に、腫瘍を単離し、ホモジナイズし、段階希釈し、ナリジクス酸を含有するＬＢ−寒天プレートに播種した。これらのプレート上での増殖後、個々のマウスからの単一のコロニーを、ｐＹＶに対して選択性のある亜ヒ酸ナトリウムを伴う及び伴わないＬＢ−寒天プレート上に、再採取した。マウスごとに、亜ヒ酸塩を含有する寒天プレート上で増殖するコロニーの、亜ヒ酸塩を含有しないプレート上で増殖するコロニーの数に対するパーセンテージが示されている（Ｉ：％として）。１００％は、固形腫瘍から単離された全てのコロニーが、ｐＹＶプラスミドをまだ含有することを示す。
【図１６】腫瘍定着の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、１×１０７のＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ΔｈａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２又はＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  Δａｓｄ＋ｐＹＶ−ａｓｄ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２を静脈内注射した。細菌の静脈内注射後９日目に、腫瘍を単離し、ホモジナイズし、段階希釈し、ナリジクス酸を含有するＬＢ−寒天プレートに播種した。腫瘍内の細菌数が組織１グラム当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として示されている（Ｉ）。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。
【図１７】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−Ｒｉｇ１経路の図である。ヒト及びマウスＲｉｇ１  Ｃａｒｄドメインの送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＲｉｇ１  Ｃａｒｄドメイン、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲｉｇ１  ＣａｒｄドメインをコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＩＶ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（Ｖ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図１８】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−Ｒｉｇ１経路の図である。ヒトＲｉｇ１  Ｃａｒｄドメインの送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＭｙｃＨｉｓ、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＲｉｇ１  ＣａｒｄドメインをコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＩＶ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（Ｖ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図１９】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−Ｒｉｇ１経路：ポジティブコントロールの図である。ＩＦＮガンマを使用してＢ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株を刺激する、図１８と同じ実験におけるポジティブコントロール。Ｂ１６Ｆレポーター細胞をマウスＩＦＮガンマで刺激した。ＩＦＮガンマの滴定を細胞に加え（Ｉ：Ｕ／ｍｌとして示す）、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２０】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−Ｒｉｇ１経路の図である。ｐＹＶにコードされたマウスＲｉｇ１  Ｃａｒｄドメインの送達は、Ｂ１６Ｆ１０がん細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＹＶ上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲｉｇ１  ＣａｒｄドメインをコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＩＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、ＩＦＮレポーター細胞株に細胞上清を添加することにより、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＶ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２１】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−Ｒｉｇ１経路の図である。ｐＹＶにコードされたマウスＲｉｇ１  Ｃａｒｄドメインの送達は、４Ｔ１がん細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。４Ｔ１細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＹＶ上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲｉｇ１  ＣａｒｄドメインをコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＩＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、ＩＦＮレポーター細胞株に細胞上清を添加することにより、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＶ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２２】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＳＴＩＮＧ経路の図である。サイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＷｓｐＲ（適応スタークドメインを有する）をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＩＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＶ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２３】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＳＴＩＮＧ経路の図である。サイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、未処理で放置した（Ｉ）か、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、若しくはｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩＩ．ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＤｎｃＶ、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）ＤｉｓＡ様タンパク質、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャク（Ａｎｅｍｏｎａｅ）ｃＧＡＳ若しくはＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＭｙｃＨｉｓをコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２４】培養上清へのＩＲＦ３のＴ３ＳＳ依存性分泌の図である。Ｉ．Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＹｏｐＥ１−１３８−マウスｔＢＩＤ  ＢＨ３及びＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＩＲＦ３  Ｓｅｒ３９７Ａｓｐのインビトロでの分泌実験。全細菌溶解物（「Ａ」）及び沈殿培養上清（「Ｂ」）のタンパク質含有量を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図２５】免疫細胞への細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−Ｒｉｇ１及びＳＴＩＮＧ経路の図である。マウスＲｉｇ１  Ｃａｒｄドメイン及びサイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、ＲＡＷ２６４．７  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＲＡＷ２６４．７レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ若しくはＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲｉｇ１  ＣａｒｄドメインをコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２６】Ｂ１６Ｆ１０乳がん同種移植モデルにおける静脈内注射したＹ．エンテロコリティカ株の腫瘍定着の図である。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマがん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、腫瘍が１００−３１５ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ、ＩＩ：１×１０７  Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤｓ１−２４６、又はＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤｓ１−２４６を静脈内注射した。腫瘍内の細菌数が組織１グラム当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として示されている（Ｖ）。感染後５日目又は８日目に腫瘍内の数を評価した。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。
【図２７】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＲＩＧ１の図である。ヒト及びマウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメインの送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４５、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２９、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２８】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＲＩＧ１の図である。ヒト及びマウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメインの送達は、ＲＡＷ  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＲＡＷレポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４５、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２９、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図２９】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＭＤＡ５経路の図である。マウスＭＤＡ５の送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＭＤＡ５１−２９４、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＭＤＡ５１−２３１をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＩＶ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（Ｖ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３０】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＭＡＶＳの図である。ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤの送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（Ｖ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３１】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＭＡＶＳの図である。ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤの送達は、ＲＡＷマクロファージＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＲＡＷマクロファージレポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（Ｖ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３２】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＳＴＩＮＧ経路の図である。サイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ６０−４２２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ＣｄａＡ１０１−２７３、ＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＶＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＸ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３３】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＳＴＩＮＧ経路の図である。サイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、ＲＡＷマクロファージＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＲＡＷマクロファージレポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ６０−４２２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−リステリア属ＣｄａＡ１０１−２７３、ＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＶＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＸ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３４】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達及びＳＴＩＮＧの小分子アゴニストとの比較の図である。サイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。Ｂ１６Ｆ１０レポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（Ｖ：感染多重度として示す）の滴定を行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３５】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達及びＳＴＩＮＧの小分子アゴニストとの比較の図である。サイクリックジヌクレオチドの送達は、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。小分子ＳＴＩＮＧアゴニスト２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）で処理したＢ１６Ｆ１０レポーター細胞。化合物（Ｉ：マイクロモルとして示す）の滴定を行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３６】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達及びＳＴＩＮＧの小分子アゴニストとの比較の図である。サイクリックジヌクレオチド生成酵素の送達は、ＲＡＷ  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＲＡＷレポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８）をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（Ｖ：感染多重度として示す）の滴定を行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＶＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３７】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達及びＳＴＩＮＧの小分子アゴニストとの比較の図である。サイクリックジヌクレオチドの送達は、ＲＡＷ  ＩＦＮ−レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＲＡＷレポーター細胞を、小分子ＳＴＩＮＧアゴニスト２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）で処理した。化合物（Ｉ：マイクロモルとして示す）の滴定を行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性（ＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３８】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達及びＴ３ＳＳ依存性の証明−ＲＩＧ１及びＭＡＶＳの図である。ＹｏｐＥ１−１３８と融合したＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン又はＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメインの送達は、ＲＡＷ  ＩＦＮレポーター細胞株におけるＩ型ＩＦＮ誘導をもたらし、これは、厳格にＴ３ＳＳ依存性である。ＲＡＷレポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ−ｙｏｐＢ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤｓ１−１００をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ−ｙｏｐＢに感染させた。細胞に加えた細菌（ＶＩＩ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型ｌｕｃｉａルシフェラーゼの活性（ＶＩＩＩ：ＯＤ６５０）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【図３９】腫瘍単離物からの粗細胞混合物における細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−ＲＩＧ１の図である。ＹｏｐＥ１−１３８と融合したＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメインの送達は、粗腫瘍単離物においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、腫瘍が＞２００ｍｍ３の体積に達したときに屠殺した。腫瘍をすりつぶし、消化し、２４ウェルプレートに単一細胞懸濁液として播種した。２つの異なる腫瘍からのそのような細胞を、Ｉ及びＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はＩＩ及びＩＶ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。細胞に加えた細菌（Ｖ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、インターフェロンベータ（ＶＩ：ピコグラム／ミリリットル）を用いるＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ刺激を評価した。破線は、未治療の対応する腫瘍を示したものであり、Ｉ／ＩＩ及びＩＩＩ／ＩＶは、各々、同じ腫瘍に由来する細胞である。
【図４０】ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、ＰＢＳを静脈内注射した。ＰＢＳの初回腫瘍内注射の日を０日目と定義し、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０及びｄ１１に治療を行った。その後数日（Ｉ：細菌の初回注射後−１１日目から８０日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。ｍｍ３としての相対腫瘍体積（ｄ０における腫瘍体積で割った対応する日における腫瘍体積）が、各マウスについて、ｌｏｇ−２変換して示されている（ＩＩ）。
【図４１】ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、７．５×１０７  Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴを腫瘍内注射した。細菌の初回腫瘍内注射の日を０日目と定義し、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０及びｄ１１に治療を行った。その後数日（Ｉ：細菌の初回注射後−１１日目から８０日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。ｍｍ３としての相対腫瘍体積（ｄ０における腫瘍体積で割った対応する日における腫瘍体積）が、各マウスについて、ｌｏｇ−２変換して示されている（ＩＩ）。
【図４２】ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６をコードする７．５×１０７のＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴを腫瘍内注射した。細菌の初回腫瘍内注射の日を０日目と定義し、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０及びｄ１１に治療を行った。その後数日（Ｉ：細菌の初回注射後−１１日目から８０日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。ｍｍ３としての相対腫瘍体積（ｄ０における腫瘍体積で割った対応する日における腫瘍体積）が、各マウスについて、ｌｏｇ−２変換して示されている（ＩＩ）。
【図４３】ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２をコードする７．５×１０７のＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴを腫瘍内注射した。細菌の初回腫瘍内注射の日を０日目と定義し、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０及びｄ１１に治療を行った。その後数日（Ｉ：細菌の初回注射後−１１日目から８０日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。ｍｍ３としての相対腫瘍体積（ｄ０における腫瘍体積で割った対応する日における腫瘍体積）が、各マウスについて、ｌｏｇ−２変換して示されている（ＩＩ）。
【図４４】初回完全寛解後にＥＭＴ６乳がん細胞を対側の皮下に再投与した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、７．５×１０７のＩＩ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６をコードしているＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ、ＩＩＩ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２をコードしているＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴで、上記（図４０−４３）の通り腫瘍内治療した。細菌の腫瘍内注射の日を０日目と定義した。完全に腫瘍が退縮したマウス（又はＩ：コントロールとしてナイーブマウス）の対側則腹部の皮下にＥＭＴ６乳がん細胞を同種移植した。その後数日（ＩＶ：細菌の初回注射後８０日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。絶対腫瘍体積が各マウスについてｍｍ３として示されている（Ｖ）。
【図４５】ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が８０〜２５０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ、又は５×１０６のＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２、Ｖ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２を静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義し、全てのマウスをｄ−１にデスフェラールで腹腔内治療した。その後数日（ＶＩ：細菌の初回注射後０日目から１５日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積中央値がｍｍ３として示されている（ＶＩＩ）。
【図４６】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下に同種移植した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腫瘍進行の図である。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下に同種移植した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、腫瘍が６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ、又は７．５×１０７のＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ、ＩＩＩ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６をコードしているＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ、ＩＶ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２をコードしているＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴを腫瘍内注射した。細菌の初回腫瘍内注射の日を０日目と定義し、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６及びｄ９に治療を行った。その後数日（Ｖ：日）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積平均値がｍｍ３として示されている（ＶＩ）。
【図４７】Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウス同種移植モデルにおけるＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカの生体内分布：身体的外見についてのスコア付けの図である。Ｉ：日、ＩＩ：スコアを有するマウスの分率、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ｗｔ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ。矢印は、細菌２×１０５個の静脈内注射の日を示す。
【図４８】Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウス同種移植モデルにおけるＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカの生体内分布：行動についてのスコア付けの図である。Ｉ：日、ＩＩ：スコアを有するマウスの分率、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ｗｔ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ。矢印は、細菌２×１０５個による静脈内感染の日を示す。
【図４９】Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウス同種移植モデルにおけるＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカの生体内分布：マウスの体重の図である。マウスの体重を細菌による静脈内感染後に毎日評価した。Ｉ：日、ＩＩ：グラムでの体重、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ｗｔ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ。矢印は、細菌２×１０５個による静脈内感染の日を示す。
【図５０】Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウス同種移植モデルにおけるＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカの生体内分布：Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔの生体内分布の図である。示されている時点での臓器内の数を、臓器のホモジナイズ、段階希釈、及び結果として得られるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数により評価した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義し、全てのマウスをｄ−１にデスフェラールで腹腔内治療した。Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、ＩＩ：組織１グラム又は血液１ｍｌ当りのＣＦＵ、ＩＩＩ：１日目、ＩＶ：４日目、Ｖ：血液、ＶＩ：脾臓、ＶＩＩ：肝臓、ＶＩＩＩ：肺、ＩＸ：腫瘍。＊は、目に見える腫瘍がないマウスを示す。
【図５１】Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウス同種移植モデルにおけるＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカの生体内分布：Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ｗｔの生体内分布の図である。示されている時点での臓器内の数を、臓器のホモジナイズ、段階希釈、及び結果として得られるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数により評価した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義し、全てのマウスをｄ−１にデスフェラールで腹腔内治療した。Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ｗｔ、ＩＩ：組織１グラム又は血液１ｍｌ当りのＣＦＵ、ＩＩＩ：１日目、ＩＶ：４日目、Ｖ：血液、ＶＩ：脾臓、ＶＩＩ：肝臓；ＶＩＩＩ：肺；ＩＸ：腫瘍。
【図５２】細菌Ｔ３ＳＳを介したＩ型インターフェロン応答誘導タンパク質の送達−内在性ＭＡＶＳとは無関係の細菌Ｔ３ＳＳ送達ＭＡＶＳの働きの図である。ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤのＴ３ＳＳを介した送達は、ＭＡＶＳＫＯ  ＲＡＷマクロファージＩＦＮ−レポーター（ルシフェラーゼ）細胞株においてＩ型ＩＦＮ誘導をもたらす。ＭＡＶＳＫＯ  ＲＡＷマクロファージレポーター細胞を、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ−ｙｏｐＢ、ＩＩＩ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、又はＩＶ：ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ−ｙｏｐＢに感染させた。細胞に加えた細菌（Ｖ：感染多重度として示す）の滴定を各株について行い、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にあるルシフェラーゼの活性（ＶＩ：ＲＬＵ−相対発光単位）に基づいて、ＩＦＮ刺激を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、組換え弱毒化グラム陰性菌株及び対象のがん、例えば、悪性固形腫瘍を治療する方法におけるその使用に関する。
【００２５】
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用されることになり、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数系も含むことになり、また逆に複数形で使用される用語は単数形も含むことになる。本明細書において使用する用語法が特定の実施態様の説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものでないことは、理解されるはずである。
【００２６】
「グラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、次々の細菌を含む：エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）、アナエロミクソバクター・デハロゲナンス（Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｍｏａｔｉｓ）、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、シトロバクター・ローデンチウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エドワージエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ）、エンドゾイコモナス・エリシコラ（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｅｌｙｓｉｃｏｌａ）、火傷病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エシェリキア・アルベルティイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ａｌｂｅｒｔｉｉ）、大腸菌、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、ミクソコッカス・キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、フォトバクテリウム・ダムセラエ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、フォトラブダス・テムペラタ（Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）、シュードアルテロモナス・スポンギアエ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｏｎｇｉａｅ）、緑膿菌、シュードモナス・プレコグロシシダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、根粒菌属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ）、サルモネラ菌及び他のサルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）及び他のシゲラ属種（���ｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ）、ソーダリス・グロスシニディウス（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・アズレウス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｚｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・キャンプベリイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃａｍｐｅｌｌｉｉ）、ビブリオ・カルベンティクス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃａｒｉｂｂｅｎｔｈｉｃｕｓ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・タスマニエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）、ビブリオ・ツビアシイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｔｕｂｉａｓｈｉｉ）、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。本発明の好ましいグラム陰性菌株は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）及びシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に含まれるグラム陰性菌株である。本発明のグラム陰性菌株は、インビトロ及び／又はインビボ、好ましくはインビボでの、細菌Ｔ３ＳＳによる異種タンパク質の真核細胞への送達に通常は使用される。
【００２７】
「組換え弱毒化グラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターのようなヌクレオチド分子で遺伝的に形質転換された組換え弱毒化グラム陰性菌株を意味する。そのような組換えグラム陰性菌株の毒性は、分泌系機構の一部である、一又は複数の細菌タンパク質により輸送される毒性活性を有する細菌エフェクタータンパク質の欠失により通常は減弱される。そのようなエフェクタータンパク質は、分泌系機構により宿主細胞内に送達され、そこでそれらは様々な宿主タンパク質及び細胞機構に対してそれらの毒性活性を発揮する。多くの異なるエフェクタータンパク質は、公知であり、様々な分泌系型により輸送され、宿主調節分子の機能を調節する生化学的活性の幅広いレパートリーを示している。本明細書で使用される組換えグラム陰性菌株の毒性は、グラム陰性菌株がシデロホアを産生しない、例えば、シデロホアの産生が不十分であるために、グラム陰性菌株により通常は生産される又は生産されることもあるシデロホアを欠いていることによって、さらに減弱され得る。したがって、好ましい実施態様では、グラム陰性菌株がシデロホアを産生しない、グラム陰性菌株がシデロホアを産生しない、例えば、シデロホアの産生が不十分であるために、グラム陰性菌株により通常は生産される又は生産されることもあるシデロホアを欠いているグラム陰性菌株が使用され、より好ましくは、グラム陰性菌株がシデロホアを産生しない、例えば、シデロホアの産生が不十分である、特にエルシニアバクチンの産生が不十分であるために、グラム陰性菌株により通常は生産される又は生産されることもあるシデロホアを欠いているエルシニア属株、特に、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ；Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ；又はＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄが、使用される。エルシニアバクチンの産生が不十分であるＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔは、ＷＯ０２０７７２４９に記載されており、特許手続きを目的とした微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に２００１年９月２４日に寄託され、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１０１３を与えられた。組換え弱毒化グラム陰性菌株は、好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのシデロホアを産生せず、例えば、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのシデロホアの産生が不十分であり、より好ましくは、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、何れのシデロホアも産生しない。
【００２８】
本明細書において同義で使用される「シデロホア」、「鉄シデロホア」又は「鉄キレート剤」という用語は、鉄に対して高い親和性を有する化合物、例えば、鉄に対して高い親和性を有する小分子化合物を意味する。
【００２９】
グラム陰性菌のシデロホアは、例えば、サルモネラ属、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シゲラ属、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）による合成される（しかし全て腸内細菌により使用される）エンテロバクチン及びジヒドロキシベンゾイルセリン、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）により合成されるピオベルジン、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）により合成されるビブリオバクチン、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）によるアシネトバクチン及びアシネトフェリン、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）により合成されるエルシニアバクチン及びエアロバクチン、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）により合成されるオルニバクチン、サルモネラ属により合成されるサルモケリン、大腸菌属、シゲラ属、サルモネラ属、及びエルシニア属により合成されるエアロバクチン、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）により合成されるアルカリジン、ビブリオ属により合成されるビスカベリンである。
【００３０】
シデロホアは、ヒドロキサム酸塩、カテコール酸塩及び混合配位子シデロホアを含む。いくつかのシデロホアは、これまでに、主として鉄過剰負荷の治療を目的として、ヒトでの使用に認可されている。好ましいシデロホアは、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢ、デスフェロキサミンＢ、ＤＦＯ−Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢ又はデスフェラルとしても公知）、デスフェリオキサミンＥ、デフェラシロクス（エクジェイド、デシロクス、デフリジェット、デシファー）及びデフェリプロン（フェリプロックス）である。
【００３１】
本明細書で使用される「増殖に必須の内在性タンパク質」という用語は、組換え弱毒化グラム陰性菌株のタンパク質を意味し、これなしではグラム陰性菌株は増殖することができない。増殖に必須の内在性タンパク質は、例えば、アミノ酸産生に必須の酵素、ペプチドグリカン生合成に関与する酵素、ＬＰＳ生合成に関与する酵素、ヌクレオチド生合成に関与する酵素、又は翻訳開始因子である。
【００３２】
本明細書で使用される「アミノ酸産生に必須の酵素」は、組換え弱毒化グラム陰性菌株のアミノ酸産生に関係する酵素を意味し、これなしではグラム陰性菌株は増殖することができない。アミノ酸産生に必須の酵素は、例えば、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｐＳ）若しくはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）、又はトランスケトラーゼ１（ｔｋｔＡ）、トランスケトラーゼ２（ｔｋｔＢ）、リブロースリン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、リブロース−５−リン酸イソメラーゼＡ（ｒｐｉＡ）、トランスアルドラーゼＡ（ｔａｌＡ）、トラスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（ｐｒｓ）、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｉｓＧ）、ヒスチジン生合成二機能性タンパク質ＨｉｓＩＥ（ｈｉｓＩ）、１−（５−ホスホリボシル）−５−［（５−ホスホリボシルアミノ）メチリデンアミノ］イミダゾール−４−カルボキサミドイソメラーゼ（ｈｉｓＡ）、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼサブユニットＨｉｓＨ（ｈｉｓＨ）、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼサブユニットＨｉｓＦ（ｈｉｓＦ）、ヒスチジン生合成二機能性タンパク質ＨｉｓＢ（ｈｉｓＢ）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ｈｉｓＣ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（ａｒｏＢ）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼ２（ａｒｏＬ）、シキミ酸キナーゼ１（ａｒｏＫ）、３−ホスホシキミ酸１−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ａｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）、Ｐタンパク質（ｐｈｅＡ）、Ｔタンパク質（ｔｙｒＡ）、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＧ）、ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＨ）、ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ｙｄｉＢ）、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼアイソザイム１（ｐｆｋＡ）、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼアイソザイム２（ｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼクラス２（ｆｂａＡ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼクラス１（ｆｂａＢ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉＡ）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＦ）、ピルビン酸キナーゼＩＩ（ｐｙｋＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ（ｇａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）、２，３−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＡ）、２，３−ビスホスホグリセリン非酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＭ／ｙｉｂＯ）、高可能性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｙｔｊＣ／ｇｐｍＢ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）、ホスホセリンホスファターゼ（ｓｅｒＢ）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ１（ｓｄａＡ）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ２（ｓｄａＢ）、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ・異化作用性（ｔｄｃＢ）、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ・生合成性（ｉｌｖＡ）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（ｔｄｃＧ）、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）、システインシンターゼＡ（ｃｙｓＫ）、システインシンターゼＢ（ｃｙｓＭ）、ベータ−シスタチオナーゼ（ｍａｌＹ）、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ｍｅｔＣ）、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＥ）、メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）、Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ｍｅｔＫ）、シスタチオニンガンマ−シンターゼ（ｍｅｔＢ）、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、５’−メチルチオアデノシン／Ｓ−アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼ（ｍｔｎＮ）、Ｓ−リボシルホモシステインリアーゼ（ｌｕｘＳ）、シスタチオンベータリアーゼ、シスタチオンガンマリアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｉｔａＥ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ小サブユニット（ｌｅｕＤ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット（ｌｅｕＣ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ）、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ・生合成性（ｉｌｖＡ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム３大サブユニット（ｉｌｖＩ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム３小サブユニット（ｉｌｖＨ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム１小サブユニット（ｉｌｖＮ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム２小サブユニット（ｉｌｖＭ）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１（ｔｈｒＡ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ２（ｍｅｔＬ）、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ）、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａＡ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１（ｔｈｒＡ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ２（ｍｅｔＬ）、リジン感受性アスパルトキナーゼ３（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、２−ケト−３−デオキシ−ガラクトン酸アルドラーゼ（ｙａｇＥ）、４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−ジカルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、スクシニル−ジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）、推定的リアーゼ（ｙｊｈＨ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、アコニット酸ヒドラターゼＢ（ａｃｎＢ）、アコニット酸ヒドラターゼＡ（ａｃｎＡ）、特徴づけられていない推定的アコニット酸ヒドラターゼ（ｙｂｈＪ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａＡ）、グルタミン酸シンターゼ［ＮＡＤＰＨ］長鎖（ｇｌｔＢ）、グルタミン酸シンターゼ［ＮＡＤＰＨ］短鎖（ｇｌｔＤ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＡ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ａｒｇＢ）、Ｎ−アセチル−ガンマ−グルタミル−リン酸レダクターゼ（ａｒｇＣ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（ａｒｇＥ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼＦ鎖（ａｒｇＦ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼＩ鎖（ａｒｇＩ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）、グルタミン酸５−キナーゼ（ｐｒｏＢ）、ガンマ−グルタミルリン酸レダクターゼ（ｐｒｏＡ）、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ（ｐｒｏＣ）、オルニチンシクロデアミナーゼ、ロイシン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｌｅｕＳ）、グルタミン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｇｌｎＳ）、セリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｓｅｒＳ）、グリシン−ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｇｌｙＳ）、グリシン−ｔＲＮＡリガーゼアルファサブユニット（ｇｌｙＱ）、チロシン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｙｒＳ）、スレオニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｈｒＳ）、フェニルアラニン−ｔＲＮＡリガーゼアルファサブユニット（ｐｈｅＳ）、フェニルアラニン−ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｐｈｅＴ）、アルギニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｒｇＳ）、ヒスチジン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｈｉｓＳ）、バリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｖａｌＳ）、アラニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｌａＳ）、イソロイシン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｉｌｅＳ）、プロリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｐｒｏＳ）、システイン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｃｙｓＳ）、アスパラギン−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｓｎＳ）、アスパラギン酸−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｓｐＳ）、グルタミン酸−ｔＲＮＡリガーゼ（ｇｌｔＸ）、トリプトファン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｒｐＳ）、グリシン−ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｇｌｙＳ）、メチオニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｍｅｔＧ）、リジン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｌｙｓＳ）である。アミノ酸産生に必須の好ましい酵素は、ｔｋｔＡ、ｒｐｅ、ｐｒｓ、ａｒｏＫ、ｔｙｒＢ、ａｒｏＨ、ｆｂａＡ、ｇａｐＡ、ｐｇｋ、ｅｎｏ、ｔｄｃＧ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＫ、ｇｌｙＡ、ａｓｄ、ｄａｐＡ／Ｂ／Ｄ／Ｅ／Ｆ、ａｒｇＣ、ｐｒｏＣ、ｌｅｕＳ、ｇｌｎＳ、ｓｅｒＳ、ｇｌｙＳ／Ｑ、ｔｙｒＳ、ｔｈｒＳ、ｐｈｅＳ／Ｔ、ａｒｇＳ、ｈｉｓＳ、ｖａｌＳ、ａｌａＳ、ｉｌｅＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｓｎＳ、ａｓｐＳ、ｇｌｔＸ、ｔｒｐＳ、ｇｌｙＳ、ｍｅｔＧ、ｌｙｓＳであり、より好ましいのは、ａｓｄ、ｇｌｙＡ、ｌｅｕＳ、ｇｌｎＳ、ｓｅｒＳ、ｇｌｙＳ／Ｑ、ｔｙｒＳ、ｔｈｒＳ、ｐｈｅＳ／Ｔ、ａｒｇＳ、ｈｉｓＳ、ｖａｌＳ、ａｌａＳ、ｉｌｅＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｓｎＳ、ａｓｐＳ、ｇｌｔＸ、ｔｒｐＳ、ｇｌｙＳ、ｍｅｔＧ、ｌｙｓＳであり、最も好ましいのは、ａｓｄである。
【００３３】
「増殖に必須のアミノ酸を産生することが不十分なグラム陰性菌株」及び「栄養要求突然変異株」という用語は、本明細書では同義で使用され、外から供給される少なくとも１つの必須アミノ酸又はその前駆体の非存在下で増殖することができないグラム陰性菌株を意味する。株による生産が不十分であるアミノ酸は、例えば、アスパラギン酸塩、メソ−２，６−ジアミノピメリン酸、芳香族アミノ酸又はロイシン−アルギニンである。そのような株を、例えば、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失（Δａｓｄ）により、生じさせることができる。そのような栄養要求突然変異株は、外来メソ−２，６−ジアミノピメリン酸の非存在下では増殖することができない。突然変異株、例えば、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失は、本発明の増殖に必須のアミノ酸を産生することが不十分なグラム陰性菌株にとってここでは好ましい。
【００３４】
「真核細胞表面又は細胞外マトリックスと結合する接着タンパク質の生産が不十分なグラム陰性菌株」という用語は、対応する野生型株により発現される接着タンパク質と比較して少なくとも１つの接着タンパク質を発現しない突然変異型グラム陰性菌株を意味する。接着タンパク質は、例えば、線毛（ｐｉｌｉ）／線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）又は非線毛アドヘシンのような伸長した高分子接着分子を含み得る。線毛アドヘシンは、１型線毛（例えば、ＦｉｍＨアドヘシンを有する大腸菌Ｆｉｍ線毛）、Ｐ線毛（例えば、大腸菌からのＰｇｐＧアドヘシンを有するＰａｐ線毛）、４型線毛（例えば、緑膿菌からのピリンタンパク質）又はｃｕｒｌｉ（サルモネラ菌からのＣｓｇＡアドヘシンを有するＣｓｇタンパク質）を含む。非線毛アドヘシンは、三量体自己輸送体アドヘシン、例えば、Ｙ．エンテロコリティカからのＹａｄＡ、ＢｐａＡ（類鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、Ｈｉａ（インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ＢａｄＡ（バルトネラ・ヘンセラ菌（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））、ＮａｄＡ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はＵｓｐＡ１（モラクセラ・カタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））、並びに他の自己輸送体アドヘシン、例えばＡＩＤＡ−１（大腸菌）、並びに他のアドヘシン／インベイシン、例えば、Ｙ．エンテロコリティカからのＩｎｖＡ、又はインチミン（大腸菌）、又はＤｒファミリー若しくはＡｆａファミリーのメンバー（大腸菌）を含む。ＹａｄＡ及びＩｎｖＡという用語は、本明細書で使用される場合、Ｙ．エンテロコリティカからのタンパク質を意味する。自己輸送体ＹａｄＡ７は、フィブロネクチンはもちろん様々な形態のコラーゲンとも結合し、その一方で、インベイシンＩｎｖＡ８は、真核細胞膜中のβ−インテグリンと結合する。グラム陰性菌株がＹ．エンテロコリティカ株である場合、その株には、好ましくは、ＩｎｖＡ及び／又はＹａｄＡが欠損している。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「腸内細菌科」という用語は、脊椎動物において病原体として出現することが多い、土壌、水、植物及び動物中で見出されるグラム陰性、桿状、通性嫌気性細菌の科を含む。この科の細菌は、類似の生理機能を共有し、それぞれのゲノムの機能性エレメント及び遺伝子内の保存を示す。オキシダーゼ陰性であることはもちろん、この科の全てのメンバーは、グルコース発酵菌であり、大部分が硝酸還元菌である。
【００３６】
本発明の腸内細菌科細菌は、その科からの何れの細菌であってもよく、具体的には、次の属の細菌を、これらに限定されるものではないが、含む：大腸菌属、シゲラ属、エドワージエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属、エンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、又はエルシニア属。より具体的な実施態様では、細菌は、大腸菌、エシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリキア・ファグソニイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリキア・ハーマンニイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｈｅｒｍａｎｉｉ）、エシェリキア・ブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｖｕｎｅｒｉｓ）、サルモネラ菌、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・ジェルゴビアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、偽結核菌、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリティカ、火傷病菌、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ハウセリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｈａｕｓｅｒｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、又はモルガン菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）種のものである。好ましくは、グラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、エルウィニア属、パントエア属、ビブリオ属、バークホリデリア属、ラルストニア属、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ソダリス属（Ｓｏｄａｌｉｓ）、シトロバクター属、エドワージエラ属、根粒菌属、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ボルデテラ属及びデスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）からなる群から、より好ましくは、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属及びシュードモナス属からなる群から、最も好ましくは、エルシニア属及びサルモネ���属、特に、エルシニアからなる群から選択される。
【００３７】
「エルシニア（属）」という用語は、本明細書で使用される場合、エルシニア・エンテロコリティカ、偽結核菌及びペスト菌をはじめとする、エルシニア属の全ての種を含む。好ましいのは、エルシニア・エンテロコリティカである。
【００３８】
「サルモネラ（属）」という用語は、本明細書で使用される場合、サルモネラ菌及びサルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）をはじめとする、サルモネラ属の全ての種を含む。好ましいのは、サルモネラ菌である。
【００３９】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写単位の発現を制御する核酸配列を意味する。「プロモーター領域」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始させることができる、調節領域である。プロモーター領域内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることにより簡便に定義される）、並びに推定−３５領域及びプリブノーボックス等の、ＲＮＡの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。２つのヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ領域間の関係を記載する際の「作用可能に連結されている」という用語は、単に、それらが互いに機能的に関連していること及びそれらが同じ核酸断片上に位置することを意味する。プロモーターが構造遺伝子の転写を調節する場合、及びプロモーターが構造遺伝子と同じ核酸断片状に位置する場合、プロモーターは、構造遺伝子に作用可能に連結されている。通常、プロモーターは、前記グラム陰性菌株内で機能性である、すなわち、プロモーターは、本発明の融合タンパク質を発現することができ、すなわち、プロモーターは、さらなる遺伝子操作も、さらなるタンパク質の発現も伴わずに、本発明の融合タンパク質を発現することができる。さらに、機能性プロモーターは、細菌Ｔ３ＳＳに対する対抗制御を自然に受けてはならない。
【００４０】
本明細書で使用される「染色体外遺伝要素」という用語は、染色体以外の本発明のグラム陰性菌株により内在的に保有される遺伝要素、例えば毒性プラスミド、又はグラム陰性菌株の形質転換に用いられ、染色体に、若しくは染色体以外の内在的に保有される遺伝要素、例えば毒性プラスミドに、一時的に若しくは安定的に組み込まれる、外在性遺伝要素である、遺伝要素を意味する。そのような染色体外遺伝要素は、発現ベクター、染色体への、若しくは染色体以外の内在的に保有される遺伝要素、例えば毒性プラスミドへの、相同組換え若しくは他の組込みのためのベクター、染色体への、若しくは染色体以外の内在的に保有される遺伝要素、例えば毒性プラスミドへの、相同組換え若しくは他の組込みのためのＤＮＡ断片、又は染色体への、若しくは染色体以外の内在的に保有される遺伝要素、例えば毒性プラスミドへの、部位特異的挿入を誘導するＲＮＡ要素、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び関連ガイドＲＮＡのような、ベクターであり得る。
【００４１】
本明細書で使用される「ＲＮＡ温度センサー」という用語は、関連遺伝子の遺伝子発現を制御している温度感受性ノンコーディングＲＮＡ配列を意味する。通常、ＲＮＡ温度センサー領域は、抑制温度で安定的に形成され、許容温度で不安定であり、リボソーム結合部位等の翻訳に必須のＲＮＡ配列を隠蔽し、そうすることで、翻訳に必須のそのようなＲＮＡ配列に関連する遺伝子の発現を制御し、ＲＮＡヘアピンループのような二次構造を形成することにより機能する。
【００４２】
本明細書で使用される「ＲＮＡヘアピン構造又はその一部」という用語は、ステム−ループ構造に至る分子内塩基対合により形成されるＲＮＡ二次構造を意味する。一般に同じＲＮＡ鎖内の、分子内塩基対合は、相補ヌクレオチド配列又はそれらの一部に起因して形成される。
【００４３】
本明細書で使用される、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリーとも称される、「ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質」という用語は、ヘリックスターンヘリックスモチーフによってＤＮＡに結合する細菌転写制御タンパク質を意味する。ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質のほとんどのメンバーは、ポジティブ転写制御因子であり、２つのヘリックスターンヘリックスサブドメインを含有する１００残基ストレッチにわたる最小ＤＮＡ結合ドメインを特徴とし得る。ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質は、特に、ＶｉｒＦ、ＬｃｒＦ、ＹｂｔＡ、Ｒｎｓ、ＭｘｉＥ、ＡｒａＣ、ＸｙｌＳ、ＥｘｓＡ、ＰｅｒＡ、ＭｍｓＲ、ＲｈａＳ、ＴｃｐＮ、ＨｒｐＸ、ＨｒｐＢ、ＧａｄＸ、ＨｉｌＣ、ＨｉｌＤ、ＭａｒＡ、ＣａｆＲ、ＦａｐＲ及びＩｎｖＦを含むが、これらに限定されない。好ましいのは、ＶｉｒＦ、ＬｃｒＦ、ＹｂｔＡ、Ｒｎｓ、ＭｘｉＥ、ＥｘｓＡ、ＰｅｒＡ、ＨｒｐＸ、ＨｒｐＢ、ＧａｄＸ、ＨｉｌＣ、ＨｉｌＤ、ＴｃｐＮ、ＣａｆＲ、ＦａｐＲ及びＩｎｖＦ等の、毒性関連メカニズムの制御に関与するＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質である。より好ましいのは、ＶｉｒＦ、ＬｃｒＦ、ＭｘｉＥ、ＥｘｓＡ、ＰｅｒＡ、ＨｒｐＸ、ＨｒｐＢ、ＧａｄＸ、ＨｉｌＣ、ＨｉｌＤ及びＩｎｖＦのような、３型分泌系活性の制御に関与するＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質であり、最も好ましいのは、ＶｉｒＦ及び／又はＬｃｒＦである。
【００４４】
本明細書で使用される「送達する」という用語は、組換え弱毒化グラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の輸送であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株において異種タンパク質を発現させるステップ、発現されたタンパク質をそのような組換え弱毒化グラム陰性菌株から分泌するステップ、及びそのような組換え弱毒化グラム陰性菌株による分泌タンパク質を真核細胞のサイトゾルに移行させるステップを含む、輸送を意味する。したがって、本明細書では同義で使用される「送達シグナル」又は「分泌シグナル」という用語は、グラム陰性菌株の分泌及び移行系により認識され得るポリペプチド配列であって、グラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の送達を指示するポリペプチド配列を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される「細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル」という用語は、組換えグラム陰性菌株において機能する細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル、すなわち、組換えグラム陰性菌株において発現された異種タンパク質を、ＩＩＩ型、ＩＶ型又はＶＩ型分泌系等の分泌系によってそのような組換えグラム陰性菌株から分泌できるようにする、又はＩＩＩ型、ＩＶ型又はＶＩ型分泌系等の分泌系によってそのような組換えグラム陰性菌株により真核細胞のサイトゾルに移行させることができるようにするシグナルを意味する。本明細書で使用される「細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル」という用語は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片、すなわち、送達シグナルのより短いバージョン、例えば、１０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは５０アミノ酸以下、よりいっそう好ましくは１００アミノ酸以下、特に１４０アミノ酸以下の送達シグナル、例えば天然に存在する送達シグナルも含む。したがって、例えば、細菌エフェクタータンパク質から送達シグナルをコードするＤＮＡ配列等の、ヌクレオチド配列は、完全長送達シグナルをコードすることもあり、又はその断片であって、通常は３０以下、好ましくは６０以下、より好ましくは１５０以下、よりいっそう好ましくは３００以下、特に４２０以下の核酸を含む断片を含むこともある。
【００４６】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「分泌」は、組換え弱毒化グラム陰性菌株の細胞膜を横断して外側への異種タンパク質の移行を意味する。タンパク質の「移行」は、組換え弱毒化グラム陰性菌株から真核細胞の原形質膜を横断してそのような真核細胞のサイトゾルへの異種タンパク質の輸送を意味する。
【００４７】
「分泌系機構の一部である細菌タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）及び６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、好ましくはＴ３ＳＳの必須成分を構成する細菌タンパク質を意味する。そのようなタンパク質がなければ、たとえ分泌系の他の全ての成分及び移行されることになる細菌エフェクタータンパク質が依然としてコードされており、生産されるとしても、それぞれの分泌系は宿主細胞にタンパク質を移行させる点では機能しない。
【００４８】
「細菌エフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への分泌系機構の一部である分泌系により、例えば細菌タンパク質により、輸送される細菌タンパク質を意味する。そのようなエフェクタータンパク質は、分泌系により宿主細胞内に送達され、そこでそれらは、例えば、様々な宿主タンパク質及び細胞機構に対して毒性活性を発揮する。多くの異なるエフェクタータンパク質は、公知であり、様々な分泌系型により輸送され、宿主調節分子の機能を調節する生化学的活性の幅広いレパートリーを示している。分泌系は、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）及び６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）を含む。一部のエフェクタータンパク質（フレクスナー赤痢菌ＩｐａＣのようなもの）も、分泌系機構の一部であってタンパク質移行を可能にする細菌タンパク質のクラスに属する。本明細書で使用される組換え弱毒化グラム陰性菌株は、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）及び／又は６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、好ましくは３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）の必須成分を構成する細菌タンパク質を通常は含む。「細菌Ｔ３ＳＳの必須成分を構成する細菌タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、インジェクチソーム、例えば注射針、を天然に形成しているか、又は真核細胞へのタンパク質の移行におけるその機能に別様に必須である、タンパク質を意味する。インジェクチソームを形成するか、又は真核細胞へのタンパク質の移行におけるその機能に別様に必須である、タンパク質は、ＳｃｔＣ、ＹｓｃＣ、ＭｘｉＤ、ＩｎｖＧ、ＳｓａＣ、ＥｓｃＣ、ＨｒｃＣ、ＨｒｃＣ（セクレチン）、ＳｃｔＤ、ＹｓｃＤ、ＭｘｉＧ、Ｐｒｇ、ＳｓａＤ、ＥｓｃＤ、ＨｒｐＱ、ＨｒｐＷ、ＦｌｉＧ（外部ＭＳリングタンパク質）、ＳｃｔＪ、ＹｓｃＪ、ＭｘｉＪ、ＰｒｇＫ、ＳｓａＪ、ＥｓｃＪ、ＨｒｃＪ、ＨｒｃＪ、ＦｌｉＦ（内部ＭＳリングタンパク質）、ＳｃｔＲ、ＹｓｃＲ、Ｓｐａ２４、ＳｐａＰ、ＳｐａＰ、ＳｓａＲ、ＥｓｃＲ、ＨｒｃＲ、ＨｒｃＲ、ＦｌｉＰ（非主要輸送装置タンパク質）、ＳｃｔＳ、ＹｓｃＳ、Ｓｐａ９（ＳｐａＱ）、ＳｐａＱ、ＳｓａＳ、ＥｓｃＳ、ＨｒｃＳ、ＨｒｃＳ、ＦｌｉＱ（非主要輸送装置タンパク質）、ＳｃｔＴ、ＹｓｃＴ、Ｓｐａ２９（ＳｐａＲ）、ＳｐａＲ、ＳｓａＴ、ＥｓｃＴ、ＨｒｃＴ、ＨｒｃＴ、ＦｌｉＲ（非主要輸送装置タンパク質）、ＳｃｔＵ、ＹｓｃＵ、Ｓｐａ４０、ＳｐａＳ、ＳｐａＳ、ＳｓａＵ、ＥｓｃＵ、ＨｒｃＵ、ＨｒｃＵ、ＦｌｈＢ（輸送装置スイッチタンパク質）、ＳｃｔＶ、ＹｓｃＶ、ＭｘｉＡ、ＩｎｖＡ、ＳｓａＶ、ＥｓｃＶ、ＨｒｃＶ、ＨｒｃＶ、ＦｌｈＡ（主要輸送装置タンパク質）、ＳｃｔＫ、ＹｓｃＫ、ＭｘｉＫ、ＯｒｇＡ、ＨｒｐＤ（細胞質アクセサリータンパク質）、ＳｃｔＱ、ＹｓｃＱ、Ｓｐａ３３、ＳｐａＯ、ＳｐａＯ、ＳｓａＱ、ＥｓｃＱ、ＨｒｃＱＡ＋Ｂ、ＨｒｃＱ、ＦｌｉＭ＋ＦｌｉＮ（Ｃリングタンパク質）、ＳｃｔＬ、ＹｓｃＬ、ＭｘｉＮ、ＯｒｇＢ、ＳｓａＫ、ＥｓｃＬ、Ｏｒｆ５、ＨｒｐＥ、ＨｒｐＦ、ＦｌｉＨ（固定子）、ＳｃｔＮ、ＹｓｃＮ、Ｓｐａ４７、ＳｐａＬ、ＩｎｖＣ、ＳｓａＮ、ＥｓｃＮ、ＨｒｃＮ、ＨｒｃＮ、ＦｌｉＩ（ＡＴＰａｓｅ）、ＳｃｔＯ、ＹｓｃＯ、Ｓｐａ１３、ＳｐａＭ、ＩｎｖＩ、ＳｓａＯ、Ｏｒｆ１５、ＨｒｐＯ、ＨｒｐＤ、ＦｌｉＪ（ストーク）、ＳｃｔＦ、ＹｓｃＦ、ＭｘｉＨ、ＰｒｇＩ、ＳｓａＧ、ＥｓｃＦ、ＨｒｐＡ、ＨｒｐＹ（ニードルフィラメントタンパク質）、ＳｃｔＩ、ＹｓｃＩ、ＭｘｉＩ、ＰｒｇＪ、ＳｓａＩ、ＥｓｃＩ、ｒＯｒｆ８、ＨｒｐＢ、ＨｒｐＪ、（内部ロッドタンパク質）、ＳｃｔＰ、ＹｓｃＰ、Ｓｐａ３２、ＳｐａＮ、ＩｎｖＪ、ＳｓａＰ、ＥｓｃＰ、Ｏｒｆ１６、ＨｒｐＰ、ＨｐａＰ、ＦｌｉＫ（ニードル長制御因子）、ＬｃｒＶ、ＩｐａＤ、ＳｉｐＤ（親水性トランスロケーター、ニードル先端部タンパク質）、ＹｏｐＢ、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢ、ＳｓｅＣ、ＥｓｐＤ、ＨｒｐＫ、ＰｏｐＦ１、ＰｏｐＦ２（疎水性トランスロケーター、孔タンパク質）、ＹｏｐＤ、ＩｐａＣ、ＳｉｐＣ、ＳｓｅＤ、ＥｓｐＢ（疎水性トランスロケーター、孔タンパク質）、ＹｓｃＷ、ＭｘｉＭ、ＩｎｖＨ（Ｐｉｌｏｔｉｎ）、ＳｃｔＷ、ＹｏｐＮ、ＭｘｉＣ、ＩｎｖＥ、ＳｓａＬ、ＳｅｐＬ、ＨｒｐＪ、ＨｐａＡ（ゲートキーパー）を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
「Ｔ６ＳＳエフェクタータンパク質」又は「細菌Ｔ６ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞若しくは細菌のサイトゾルにＴ６Ｓ系により自然に打ち込まれるタンパク質、又は例えば真核生物の膜への移行孔を形成し得るＴ６Ｓ系により自然に分泌されるタンパク質を意味する。「Ｔ４ＳＳエフェクタータンパク質」又は「細菌Ｔ４ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞のサイトゾルにＴ４Ｓ系により自然に打ち込まれるタンパク質、又は例えば真核生物の膜への移行孔を形成し得るＴ４Ｓ系により自然に分泌されるタンパク質を意味する。
【００５０】
「Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」又は「細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞のサイトゾルにＴ３Ｓ系により自然に打ち込まれるタンパク質、又は例えば真核生物の膜への移行孔を形成し得るＴ３Ｓ系により自然に分泌されるタンパク質（孔形成トランスロケーター（エルシニアＹｏｐＢ及びＹｏｐＤのようなもの）、並びにエルシニアＬｃｒＶのようなｔｉｐタンパク質）を意味する。好ましくは、Ｔ３Ｓ系により真核細胞のサイトゾルに自然に打ち込まれるタンパク質が使用される。これらの毒性因子は、病原体のために真核細胞を麻痺させる又は再プログラミングすることになる。Ｔ３Ｓエフェクターは、生化学的活性の幅広いレパートリーを示し、極めて重要な宿主調節分子の機能を調節し、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ  ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡを含む。
【００５１】
「悪性固形腫瘍内に蓄積する組換え弱毒化グラム陰性菌株」又は「組換え弱毒化グラム陰性菌株は悪性固形腫瘍内に蓄積する」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性固形腫瘍内で複製することによって悪性固形腫瘍内のこの組換え弱毒化グラム陰性菌株の細菌数を増加させる、組換え弱毒化グラム陰性菌株を意味する。驚くべきことに、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、対象への投与後、悪性固形腫瘍内に特異的に蓄積し、すなわち、悪性固形腫瘍が存在する臓器に特異的に蓄積し、悪性固形腫瘍が存在しない臓器内の組換え弱毒化グラム陰性菌株の細菌数は、少ないか、又は検出できないことを見出した。
【００５２】
エルシニア属のような細胞外に存在する細菌の場合、細菌は、腫瘍細胞間に形成された細胞間空間内に主として蓄積する。サルモネラ属のような細胞内で増殖する細菌は、主として、腫瘍細胞に侵入し、そのような細胞内に存在するが、細胞外蓄積がさらに起こることもあり得る。悪性固形腫瘍内に蓄積される組換え弱毒化グラム陰性菌株の細菌数は、例えば、腫瘍組織１グラム当り１０４から１０９の細菌範囲であり得る。
【００５３】
本明細書で使用される「がん」という用語は、異常細胞が調節されずに分裂して周囲の組織に浸潤し得る疾患を意味する。がん細胞は、血液及びリンパ系によって他の体部にも広がり得る。がんにはいくつかの主要なタイプがある。癌は、皮膚において又は内臓を裏打ちする若しくは覆う組織において始まるがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又は他の結合若しくは支持組織において始まるがんである。白血病は、骨髄等の血液形成組織において開始し、多数の異常血液細胞を産生させ、血液に侵入させる、がんである。リンパ腫及び多発性骨髄腫は、免疫系の細胞において始まるがんである。中枢神経系がんは、脳及び脊髄の組織において始まるがんである。本明細書で使用される「がん」という用語は、固形腫瘍、すなわち、例えば肉腫、癌及びリンパ腫等の、悪性固形腫瘍、並びに例えば白血病（血液のがん）等の、非固形腫瘍を含む。悪性固形腫瘍が好ましい。
【００５４】
本明細書で使用される「悪性固形腫瘍」又は「悪性固形腫瘍適応症」という用語は、通常は嚢胞も液体領域も有さない、異常な組織塊を意味する。固形腫瘍は、良性である（がんでない）こともあり、又は悪性（がん）であることもある。悪性固形腫瘍は、本発明の方法で治療される。異なるタイプの悪性固形腫瘍は、それらを形成する細胞の型の名を取って名付けられている。悪性固形腫瘍の例は、肉腫、癌及びリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般に、悪性固形腫瘍を構成しない（ＮＩＨの米国国立がん研究所による定義）。悪性固形腫瘍は、これらに限定されるものではないが、肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、口唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺又は肺等の様々な組織型から生じ得る異常な細胞塊を含み、したがって、悪性固形肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、口唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺又は肺腫瘍を含む。本発明の方法で治療することができる好ましい悪性固形腫脹は、皮膚、乳房、肝臓、膵臓、膀胱、前立腺及び結腸から生じる悪性固形腫瘍であり、したがって、悪性固形皮膚、乳房、肝臓、膵臓、膀胱、前立腺及び結腸腫瘍を含む。本発明の方法で治療することができる、同様に好ましい悪性固形腫瘍は、肝細胞がん等の肝臓がんに関連する悪性固形腫瘍である。
【００５５】
「真核細胞に対して毒性である細菌エフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌エフェクタータンパク質が様々な宿主タンパク質及び細胞機構に対してそれらの毒性活性を発揮する宿主細胞に分泌系により輸送される細菌エフェクタータンパク質を意味する。多くの異なるエフェクタータンパク質は、公知であり、様々な分泌系型により輸送され、宿主調節分子の機能を調節する生化学的活性の幅広いレパートリーを示している。分泌系は、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）及び６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）を含む。重要なこととして、真核細胞に対して毒性である一部のエフェクタータンパク質（フレクスナー赤痢菌ＩｐａＣのようなもの）も、分泌系機構の一部である細菌タンパク質のクラスに属する。真核細胞に対して毒性である細菌エフェクタータンパク質が分泌機構の機能にとっても必須である場合、そのようなタンパク質は、この定義から除外される。真核細胞に対して毒性であるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質とは、Ｙ．エンテロコリティカＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ又はフレクスナー赤痢菌ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＩｐｇＢ１、又はサルモネラ菌ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ又は緑膿菌ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、ＥｘｏＹ又は大腸菌Ｔｉｒ、Ｍａｐ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺのような、タンパク質のことである。真核細胞に対して毒性であるＴ４ＳＳエフェクタータンパク質とは、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ＬｉｄＡ、ＳｉｄＣ、ＳｉｄＧ、ＳｉｄＨ、ＳｄｈＡ、ＳｉｄＪ、ＳｄｊＡ、ＳｄｅＡ、ＳｄｅＡ、ＳｄｅＣ、ＬｅｐＡ、ＬｅｐＢ、ＷｉｐＡ、ＷｉｐＢ、ＹｌｆＡ、ＹｌｆＢ、ＶｉｐＡ、ＶｉｐＦ、ＶｉｐＤ、ＶｐｄＡ、ＶｐｄＢ、ＤｒｒＡ、ＬｅｇＬ３、ＬｅｇＬ５、ＬｅｇＬ７、ＬｅｇＬＣ４、ＬｅｇＬＣ８、ＬｅｇＣ５、ＬｅｇＧ２、Ｃｅｇ１０、Ｃｅｇ２３、Ｃｅｇ２９又はバルトネラ・ヘレンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）ＢｅｐＡ、ＢｅｐＢ、ＢｅｐＣ、ＢｅｐＤ、ＢｅｐＥ、ＢｅｐＦ  ＢｅｐＧ又はアグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＶｉｒＤ２、ＶｉｒＥ２、ＶｉｒＥ３、ＶｉｒＦ又はピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＣａｇＡ又は百日咳菌百日咳毒素のような、タンパク質のことである。真核細胞に対して毒性であるＴ６ＳＳエフェクタータンパク質とは、コレラ菌ＶｇｒＧタンパク質（ＶｇｒＧ１）のことである。
【００５６】
「真核細胞に対して毒性であるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質」又は「真核細胞に対して毒性である細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞のサイトゾルにＴ３Ｓ系により自然に打ち込まれるタンパク質、及び真核細胞に対する毒性因子である、例えば真核生物の膜への移行孔を形成し得る、Ｔ３Ｓ系により自然に分泌されるタンパク質、すなわち、病原体のために真核細胞を麻痺させる又は再プログラミングするタンパク質を意味する。エフェクターは、生化学的活性の幅広いレパートリーを示し、例えば、食作用及びアクチン細胞骨格、炎症シグナル伝達、アポトーシス、エンドサイトーシス又は分泌経路等の、極めて重要な宿主調節分子の機能を調節し２，９、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡを含む。
【００５７】
真核細胞に対して毒性であるエルシニア属のＴ３ＳＳエフェクター遺伝子であって、例えばＹ．エンテロコリティカから欠失／変異させることができるＴ３ＳＳエフェクター遺伝子は、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ（別名ＹｏｐＪ）、及びＹｏｐＴ１０である。真核細胞に対して毒性であるそれぞれのエフェクター遺伝子を、フレクスナー赤痢菌（例えば、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＩｐｇＢ１）、サルモネラ菌（例えば、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ）、緑膿菌（例えば、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、ＥｘｏＹ）又は大腸菌（例えば、Ｔｉｒ、Ｍａｐ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ）から欠失／変異させることができる。これらの遺伝子の核酸配列を当業者は、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースから（ＮＣ＿００２１２０  ＧＩ：１０９５５５３６からｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＰ、ｙｏｐＭ、ｙｏｐＴ；ＡＦ３８６５２６．１  ＧＩ：１８４６２５１５からのフレクスナー赤痢菌エフェクタータンパク質；ＮＣ＿０１６８１０．１  ＧＩ：３７８６９７９８３又はＦＱ３１２００３．１  ＧＩ：３０１１５６６３１からのサルモネラ菌エフェクター；ＡＥ００４０９１．２  ＧＩ：１１０２２７０５４又はＣＰ０００４３８．１  ＧＩ：１１５５８３７９６からの緑膿菌エフェクター；及びＮＣ＿０１１６０１．１  ＧＩ：２１５４８５１６１からの大腸菌エフェクタータンパク質）入手することができる。
【００５８】
本発明では、遺伝子は、タンパク質と区別するために小文字の斜字により表示する。遺伝子（小文字の斜字により表示）が細菌種名（例えば、大腸菌）の後に続いている場合、それらは、対応する細菌種における対応する遺伝子の変異を意味する。例えば、ＹｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子によりコードされたエフェクタータンパク質を指す。Ｙ．エンテロコリティカｙｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子に変異があるＹ．エンテロコリティカを表す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチドの」及び「ペプチドの」という用語は、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基間のペプチド結合により互いに連結されている一連のアミノ酸残基を指定するために同義で使用される。好ましいのは、少なくとも１０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０のアミノ酸、を含むアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００６０】
本発明によれば、「異種タンパク質」は、天然に存在するタンパク質又はその一部を含み、人工的に操作されたタンパク質又はその一部も含む。本明細書で使用される場合、「異種タンパク質」という用語は、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれを融合させることができるそのＮ末端断片以外の、タンパク質又はその一部を指す。特に、異種タンパク質は、本明細書で使用される場合、本発明により提供され、使用される特定の組換え弱毒化グラム陰性菌株のプロテオーム、すなわち全天然タンパク質成分に属さない、例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属の特定の菌株のプロテオーム、すなわち全天然タンパク質成分に属さないタンパク質又はその一部を意味する。通常、異種タンパク質は、ヒト起源を含む、動物起源のものである。好ましくは、異種タンパク質は、ヒトタンパク質又はその一部である。より好ましくは、異種タンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される。特に好ましくは、異種タンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、レポータータンパク質、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター及びウイルスタンパク質からなる群から選択される。よりいっそう特に好ましいのは、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、及びアンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、異種タンパク質である。最も好ましいのは、アポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与する動物、好ましくはヒト異種タンパク質、又はインターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導若しくは制御に関与するヒトタンパク質のような、アポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、又はインターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導若しくは制御に関与するタンパク質、特に、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導若しくは制御に関与するタンパク質である。インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質は、好ましくは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、より好ましくは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するヒトタンパク質である。
【００６１】
一部の実施態様では、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで互いに独立して融合している同一の又は２つの異なる異種タンパク質をコードする、２つのヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
一部の実施態様では、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで互いに独立して融合している同一の又は３つの異なる異種タンパク質をコードする、３つのヌクレオチド配列を含む。組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現される異種タンパク質は、通常、１−１５０ｋＤの間、好ましくは１−１２０ｋＤの間、より好ましくは１−１００ｋＤａの間、最も好ましくは１０−８０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００６３】
一部の実施態様では、異種タンパク質の一部は、異種タンパク質のドメインを含む。したがって、一部の実施態様では、本発明のグラム陰性菌株は、異種タンパク質のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明のグラム陰性菌株は、異種タンパク質の１又は２つのドメイン、より好ましくは異種タンパク質の２つのドメイン、をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
一部の実施態様では、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
「タンパク質の同じ機能クラスに属する異種タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、同じ機能を有する異種タンパク質、例えば、酵素活性を有する異種タンパク質、例えば細胞周期制御等の、同じ経路で作用する異種タンパク質、又は細菌エフェクタータンパク質の同じクラスに属していることのような、共通の特異的特徴を共有する異種タンパク質を意味する。タンパク質の機能クラスは、例えば、真核細胞に対する毒性を確立する生物学的プロセスにおいて一緒に作用する、アポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子として作用するタンパク質、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター又はウイルスタンパク質である。
【００６６】
本発明によれば、「異種タンパク質のドメイン」は、天然に存在するタンパク質のドメインを含み、人工的に操作されたタンパク質のドメインも含む。本明細書で使用される場合、「異種タンパク質のドメイン」という用語は、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質のドメイン以外の異種タンパク質のドメイン、又は融合タンパク質を獲得するために融合させることができるそのＮ末端断片を含むドメイン以外のドメインを意味する。特に、異種タンパク質のドメインは、本明細書で使用される場合、本発明により提供され、使用される特定の組換え弱毒化グラム陰性菌株のプロテオーム、すなわち全天然タンパク質成分に属さない、例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属の特定の菌株のプロテオーム、すなわち、全天然タンパク質成分に属さない異種タンパク質のドメインを意味する。通常、異種タンパク質のドメインは、ヒト起源を含む、動物起源のものである。好ましくは、異種タンパク質のドメインは、ヒトタンパク質のドメインである。より好ましくは、異種タンパク質のドメインは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のドメインである。特に好ましくは、異種タンパク質のドメインは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、レポータータンパク質、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター及びウイルスタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のドメインである。よりいっそう特に好ましいのは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、及びアンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される異種タンパク質のドメインである。最も好ましいのは、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与する動物タンパク質、好ましくは、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するヒト異種タンパク質のドメインのような、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質のドメインである。
【００６７】
「異種タンパク質の反復ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、異種タンパク質のドメインの数度の反復からなる融合タンパク質であって、これらのドメインが互いに直接融合していてもよく、又は可変リンカー、例えば、アミノ酸数１−３０の間、好ましくは２−１５の間、よりいっそう好ましくは３−１０の間のリンカーが、ドメイン間に導入されていてもよい、融合タンパク質を意味する。好ましくは、同一のドメイン、又は８０％より高い、通常は８５％より高い、好ましくは９０％より高い、よりいっそう好ましくは９５％より高い、特に９６％より高い、より特に９７％より高い、よりいっそう特に９８％より高い、最も特に９９％より高いアミノ酸配列同一性を有する反復ドメインが使用される。また、好ましいのは、１００％のアミノ酸同一性を有する同一のドメインである。好ましくは、２つの反復ドメイン、より好ましくは２つの同一の反復ドメイン、又は９０％より高い、好ましくは９５％より高い、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する２つの反復ドメインは、本明細書で意味するところの融合タンパク質に含まれる。２つより多くの、例えば、３、４、５又は６つの反復ドメインも、本発明により企図されている。
【００６８】
「異なる異種タンパク質の２つ以上のドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、異なる異種タンパク質の少なくとも２つのドメイン、例えば、８０％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは４０％以下のアミノ酸配列同一性を有する異種タンパク質の少なくとも２つのドメイン、の一度又は数度の反復からなる融合タンパク質であって、これらの異なるドメインが互いに直接融合していてもよく、又は可変リンカー、例えば、アミノ酸数１−３０の間、好ましくは２−１５の間、よりいっそう好ましくは３−１０の間のリンカーが、ドメイン間に導入されていてもよい、融合タンパク質を意味する。好ましくは、異なる異種タンパク質の２つのドメインは、本明細書で意味するところの融合タンパク質に含まれる。異なる異種タンパク質の２つより多くの、例えば、３、４、５又は６つのドメインも、本発明により企図されている。
【００６９】
組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現される異種タンパク質のドメインは、通常、１−１５０ｋＤａの間、好ましくは１−３０ｋＤａの間、より好ましくは１−２０ｋＤａの間、最も好ましくは１−１０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００７０】
本発明によれば、「ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質」は、これらに限定されるものではないが、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＢＫ１、ＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ、ＩＲＦ３、ＴＲＥＸ１、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ９ａ、ＤＤＸ３、ＬＣ３、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ−ＰＫ、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＩＰＳ−１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡ、Ｔｒｉｍ２５、Ｔｒｉｍ３２、Ｔｒｉｍ５６、Ｒｉｐｌｅｔ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＡＮＫ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＰＫＲ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＤＡＩ、ＩＦＩ１６、ＩＦＩＸ、ＭＲＥ１１、ＤＤＸ４１、ＬＳｍ１４Ａ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ１５、Ｋｕ７０、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＴＹＫ２、ＪＡＫ１、ＩＳＧＦ３、ＩＬ１０Ｒ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ４、サイクリックジヌクレオチド生成酵素（サイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ）、例えばＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳ又はその断片を含む。
【００７１】
本発明によれば、「Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質」は、これらに限定されるものではないが、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＢＫ１、ＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ、ＩＲＦ３、ＴＲＥＸ１、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ９ａ、ＤＤＸ３、ＬＣ３、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ−ＰＫ、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＩＰＳ−１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡ、Ｔｒｉｍ２５、Ｔｒｉｍ３２、Ｔｒｉｍ５６、Ｒｉｐｌｅｔ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＡＮＫ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＰＫＲ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＤＡＩ、ＩＦＩ１６、ＩＦＩＸ、ＭＲＥ１１、ＤＤＸ４１、ＬＳｍ１４Ａ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ１５、Ｋｕ７０、サイクリックジヌクレオチド生成酵素（サイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ）、例えばＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳ又はその断片を含む。
【００７２】
Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する好ましいタンパク質は、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＢＫ１、ＩＫＫイプシロン、ＩＲＦ３、ＴＲＥＸ１、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ９ａ、ＤＤＸ３、ＬＣ３、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ−ＰＫ、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＩＰＳ−１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡ、Ｔｒｉｍ２５、Ｔｒｉｍ３２、Ｔｒｉｍ５６、Ｒｉｐｌｅｔ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＡＮＫ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＰＫＲ、ＬＳｍ１４Ａ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ１５、並びにサイクリックジヌクレオチド生成酵素、例えば、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳからなる群から選択されるサイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ又はその断片、からなる群から選択される。
【００７３】
Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するより好ましいタンパク質は、ｃＧＡＳ（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４）、ＲＩＧ１（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｏ９５７８６）、ＭＤＡ５（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９ＢＹＸ４）、ＩＰＳ−１／ＭＡＶＳ（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ７Ｚ４３４）、ＩＲＦ３（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ１４６５３）、ＩＲＦ７（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９２９８５）、ＩＲＦ９（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ００９７８）並びにサイクリックジヌクレオチド生成酵素、例えば、ＷｓｐＲ（例えば緑膿菌タンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９ＨＸＴ９）、ＤｎｃＶ（例えば、コレラ菌タンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９ＫＶＧ７）、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様（例えばセレウス菌タンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８１２Ｌ９）、ＣｄａＡ（例えばリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）タンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｙ５Ｅ４）、ＣｄａＳ（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）タンパク質についての、Ｕｎｉｐｒｏｔ．Ｏ３１８５４、若しくは配列場号１１４におけるような構成的活性Ｌ４４Ｆ突然変異）並びにｃＧＡＳ（例えばヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４）からなる群から選択されるサイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ又はこれらのタンパク質の断片からなる群から選択される。
【００７４】
ＩＰＳ−１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡは、Ｎ末端ＣＡＲＤドメインを含有し、ヒト配列についてＵｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）識別子「Ｑ７Ｚ４３４」及びマウス配列について「Ｑ８ＶＣＦ０」を有する、真核生物ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質を意味する。「ＩＰＳ−１／ＭＡＶＳ」、「ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１」、及び「ＭＡＶＳ」という用語は、本明細書では同義で使用され、Ｎ末端ＣＡＲＤドメインを含有し、ヒト配列についてＵｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）識別子「Ｑ７Ｚ４３４」及びマウス配列について「Ｑ８ＶＣＦ０」を有する、真核生物ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質を意味する。
【００７５】
一部の実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＣＡＲＤドメイン含有タンパク質又はその断片、及びサイクリックジヌクレオチド生成酵素、例えば、サイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ又はその断片からなる群から選択される。
【００７６】
ＩＦＮ応答又はＩ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質の断片は、通常は２５−１０００の間のアミノ酸、好ましくは５０−６００の間のアミノ酸、より好ましくは１００−４００の間のアミノ酸、よりいっそう好ましくは１００−３６２の間のアミノ酸を含有する。一部の実施態様では、ＩＦＮ応答又はＩ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質の断片は、通常は２５−１０００の間のアミノ酸、好ましくは５０−６００の間のアミノ酸、より好ましくは１００−４００の間のアミノ酸、よりいっそう好ましくは１００−３６２の間のアミノ酸、特に１００−２４６の間のアミノ酸を含有する、ＩＦＮ応答若しくはＩ型ＩＦＮ応答の誘導若しくは制御に関与する異種タンパク質のＮ末端断片を含むか、又はＮ末端アミノ酸のアミノ酸１−アミノ酸１６０の間を含有するアミノ酸配列の欠失、好ましくはＮ末端アミノ酸１−５９若しくはＮ末端アミノ酸１−１６０を含有するアミノ酸配列の欠失を有する、ＩＦＮ応答若しくはＩ型ＩＦＮ応答の誘導若しくは制御に関与する異種タンパク質のＮ末端断片であって、通常は２５−１０００の間のアミノ酸、好ましくは５０−６００の間のアミノ酸、より好ましくは１００−４００の間のアミノ酸、よりいっそう好ましくは１００−３６２の間のアミノ酸を含有する、ＩＦＮ応答若しくはＩ型ＩＦＮ応答の誘導若しくは制御に関与する異種タンパク質のＮ末端断片を含む。
【００７７】
ＩＦＮ応答又はＩ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質を含有するＣＡＲＤドメインの断片は、通常は、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−５００の何れかまでのアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−４００の何れかまでのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００３００の何れかまでのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−２９４の何れかまでのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−２４６の何れかまでのアミノ酸配列を含有する。
【００７８】
一部の実施態様では、ＩＦＮ応答又はＩ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質を含有するＣＡＲＤドメインの断片は、ヒトＣＡＲＤドメインの、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２９４を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２４６を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２４５を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２２９を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２２８を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２１８を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２１７を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸１００を含むアミノ酸配列、及び少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸１０１を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、より特に、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２４５を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２２８を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２１７を含むアミノ酸配列、及び少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸１００を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００７９】
一部の好ましい実施態様では、ＩＦＮ応答又はＩ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質を含有するＣＡＲＤドメインの断片は、ヒトＣＡＲＤドメインの、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２９４までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２４６までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２４５までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２２９までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２２８までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２１８までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２１７までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１０１までのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、より特に、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２４５までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２２８までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２１７までのアミノ酸配列、及びＮ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００までのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００８０】
サイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ等の、サイクリックジヌクレオチド生成酵素の断片は、ヒトｃＧＡＳの、通常は、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−６００の何れかまでのアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸５０からＮ末端アミノ酸１００−５５０の何れかまでのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸１００−５３０の何れかまでのアミノ酸配列、特に、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１４６からＮ末端アミノ酸５０７までのアミノ酸配列、又はＮ末端アミノ酸１６１からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列、より特に、Ｎ末端アミノ酸１６１からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列を含有する。一部の実施態様では、ｃＧＡＳの断片は、特に、少なくともＮ末端アミノ酸６０且つ最大でＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸４２２を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１４６且つ最大でＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸５０７を含むアミノ酸配列、及び少なくともＮ末端アミノ酸１６１且つ最大でＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸５２２を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。一部の実施態様では、ｃＧＡＳの断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸４２２までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１４６からＮ末端アミノ酸５０７までのアミノ酸配列、及びＮ末端アミノ酸１６１からＮ末端アミノ酸５２２までのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００８１】
より好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５及びＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１又はその断片並びにｃＧＡＳ及びその断片を含むＣＡＲＤドメインからなる群から選択され、特に、ＲＩＧ１及びその断片を含むＣＡＲＤドメイン、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１及びその断片並びにｃＧＡＳ及びその断片を含むＣＡＲＤドメインからなる群から選択される。これらのタンパク質の断片が特に好ましい。このより好ましい実施態様では、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１を含むＣＡＲＤドメインは、天然に存在するＣＡＲＤドメイン及びさらに、天然に存在するＣＡＲＤドメインに続いて、ＲＩＧ−１場合は、天然に存在するヘリカーゼドメイン若しくはその断片、好ましくは１−５００、より好ましくは１−２５０、よりいっそう好ましくは１−１５０アミノ酸を含有する断片（この天然に存在するヘリカーゼドメイン又は断片は、機能性でなく、すなわち、ＣＡＲＤドメインに結合しない）を含む追加のＣ末端アミノ酸を含み、又はＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１の場合は、下流のＣ末端配列若しくはその断片、好ましくは１−５００、より好ましくは１−２５０、よりいっそう好ましくは１−１５０アミノ酸を含有する断片を含む。これらの実施態様では、ｃＧＡＳ及びその断片は、通常、天然に存在するシンターゼドメイン（ＮＴａｓｅコア及びＣ末端ドメイン；６５に記載されているような及びヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４の通りの、ヒトｃＧＡＳのアミノ酸１６０−５２２）を含み、好ましくは、ｃＧＡＳ及びその断片は、天然に存在するシンターゼドメインを含むが、部分的又は完全なＮ末端ドメインの欠失、好ましくは、完全なＮ末端ヘリカーゼ伸長部（Ｎ末端ヘリカル伸長部；６５に記載されているような及びヒトタンパク質についてのＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４の通りのヒトｃＧＡＳのアミノ酸１−１６０）の欠失を有する。部分的又は完全なＮ末端ドメインの欠失は、好ましくは、アミノ鎖１−５９の欠失である。
【００８２】
一部の実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリー（例えば、ＲＩＧ１及びＭＤＡ５）及びその断片と、抗ウイルスシグナル伝達及びＩ型ＩＦＮ誘導に関与するタンパク質を含有する他のＣＡＲＤドメイン（例えば、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１）及びその断片と、ＳＴＩＮＧの刺激をもたらすＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ及びｃＧＡＳ並びにその断片からなる群から選択されるサイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ等のサイクリックジヌクレオチド生成酵素とからなる群から選択される。
【００８３】
一部の実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳ又はその断片からなる群から選択され、より好ましくは、ＲＩＧ１、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様及びｃＧＡＳ又はその断片からなる群から選択される。
【００８４】
より好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ並びにｃＧＡＳ又はその断片からなる群から選択され、よりいっそう好ましくは、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ及びｃＧＡＳ又はその断片からなる群から選択され、特に、ＲＩＧ１、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１及びｃＧＡＳ又はその断片からなる群から選択される。これらのタンパク質の断片が特に好ましい。
【００８５】
このより好ましい実施態様では、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１の断片は、通常、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−５００の何れかまでのアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−４００の何れかまでのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−３００の何れかまでのアミノ酸配列を含有する。
【００８６】
このより好ましい実施態様では、ＲＩＧ１の断片は、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２４６を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２４５を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２２９を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２２８を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２１８を含むアミノ酸配列並びに少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸２１７を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１の断片は、少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸１００を含むアミノ酸配列並びに少なくともＮ末端アミノ酸１且つ最大でＮ末端アミノ酸１０１を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００８７】
このより好ましい実施態様では、ＲＩＧ１の断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸配列２４６までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２４５を含むアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２２９までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２２８までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２１８までのアミノ酸配列及びＮ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸２１７までのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１の断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００までのアミノ酸配列及びＮ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１０１までのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００８８】
このより好ましい実施態様では、ｃＧＡＳの断片は、ヒトｃＧＡＳの、通常は、Ｎ末端アミノ酸１からＮ末端アミノ酸１００−６００の何れかまでのアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸５０からＮ末端アミノ酸１００−５５０の何れかまでのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸１００−５３０の何れかまでのアミノ酸配列、特に、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１４６からＮ末端アミノ酸５０７までのアミノ酸配列、又はＮ末端アミノ酸１６１からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列、より特に、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列、又はＮ末端アミノ酸１６１からＮ末端アミノ酸５３０までのアミノ酸配列を含有する。
【００８９】
このより好ましい実施態様では、ｃＧＡＳの断片は、特に、少なくともＮ末端アミノ酸６０且つ最大でＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸４２２を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１４６且つ最大でＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸５０７を含むアミノ酸配列、及び少なくともＮ末端アミノ酸１６１且つ最大でＮ末端アミノ酸Ｎ末端アミノ酸５２２を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００９０】
このより好ましい実施態様では、ｃＧＡＳの断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸６０からＮ末端アミノ酸４２２までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１４６からＮ末端アミノ酸５０７までのアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１６１からＮ末端アミノ酸５２２までのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【００９１】
よりいっそう好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質は、ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４５（配列番号３７）、ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２８（配列番号１２８）、ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１７（配列番号１２９）、マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６（配列番号３８）、マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２９（配列番号１１０）、マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８（配列番号１１１）、ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメイン１−１００（配列番号１１６）、マウスＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメイン１−１０１（配列番号１３０）、Ｎ．ベクテンシス（Ｎ．ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ）ｃＧＡＳ（配列番号４３）、ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２（配列番号１１５）、マウスｃＧＡＳ１４６−５０７（配列番号１３１）及びＮ．ベクテンシスｃＧＡＳ６０−４２２（配列番号１１７）からなる群から選択される。
【００９２】
特に好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質、この場合のＩ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質は、ヒトＣＡＲＤドメイン１−２４５（配列番号３７）、ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２８（配列番号１２８）、ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１７（配列番号１２９）、ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメイン１−１００（配列番号１１６）、及びヒトｃＧＡＳ１６１−５２２（配列番号１１５）からなる群から選択される。
【００９３】
より特に好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質は、ヒトＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４５、マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２９、マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８、ヒトＭＡＶＳ１−１００、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ、ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２及びＮ．ベクテンシスｃＧＡＳ６０−４２２からなる群から選択される。
【００９４】
ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーは、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５及びＬＧＰ２からなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する好ましい異種タンパク質は、ＣＡＲＤドメイン含有タンパク質ＲＩＧ１及びＭＤＡ５、特に、ＣＡＲＤドメイン含有タンパク質ＲＩＧ１である。Ｉ型ＩＦＮ誘導に関与する他のＣＡＲＤドメイン含有タンパク質は、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１からなる群から選択されるタンパク質を含む。
【００９５】
一部の好ましい態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＭＤＡ５のＣＡＲＤドメイン、及び／又はＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１のＣＡＲＤドメイン、並びにＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳ並びにその断片を含む群から選択され、好ましくは、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン及び／又はＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１のＣＡＲＤドメイン、並びにＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ並びにｃＧＡＳ又はその断片を含むタンパク質の群から選択される。
【００９６】
一部の好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＭＤＡ５のＣＡＲＤドメイン、ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１のＣＡＲＤドメイン、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ及びＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳ並びにｃＧＡＳからなる群から選択され、より好ましくは、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様及びｃＧＡＳからなる群から選択される。
【００９７】
一部の好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５及び／又はＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１の、好ましくは、ＲＩＧ１及び／又はＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１の、一又は複数（例えば、２、３又は４）のＣＡＲＤドメインを含む。より好ましい実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１又はＭＤＡ５、特にＲＩＧ１の、両方のＣＡＲＤドメインを含む。
【００９８】
一部の実施態様では、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与する異種タンパク質は、酵素機能のないＩ型ＩＦＮ応答誘導タンパク質、又は酵素機能を有するＩ型ＩＦＮ応答誘導タンパク質からなる群から選択される。本発明により包含される酵素機能のないＩ型ＩＦＮ応答誘導タンパク質は、通常は少なくとも１つのＣＡＲＤドメイン、好ましくは２つのＣＡＲＤドメインを含む。ＣＡＲＤドメインは、通常は、アルファヘリックス６−７つの束から構成され、好ましくは、疎水性コアと荷電残基から構成される外面とを有する逆平行アルファヘリックス６−７つという構成から構成される。本発明により包含される酵素機能を有するＩ型ＩＦＮ応答誘導タンパク質は、通常、ＳＴＩＮＧの刺激をもたらすサイクリックジヌクレオチド生成酵素（サイクリック−ジＡＭＰ、サイクリック−ジＧＭＰ及びサイクリック−ジＧＡＭＰシクラーゼ）又はそのドメイン、好ましくは、ジアデニル酸シクラーゼ（ＤＡＣ）、ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）若しくはＧＭＰ−ＡＭＰシクラーゼ（ＧＡＣ）又はそのドメインを含む。
【００９９】
本発明によれば、「アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質」は、これらに限定されるものではないが、Ｂａｄ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂｍｔ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ａｐａｆ１、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ１０、ＤＦＦＡ、ＤＦＦＢ、ＲＯＣＫ１、ＡＰＰ、ＣＡＤ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＥｎｄｏＧ、ＡＩＦ、ＨｔｒＡ２、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ａｒｔｓ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ−１（Ｓ）、ＩＡＰファミリー、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、１４−３−３タンパク質、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ１／２、ｐ９０ＲＳＫ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、ＦＬＩＰｓ、ＦＫＨＲ、ＧＳＫ３、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））、並びにＣｉｐ１／Ｗａｆ１／Ｋｉｐ１−２ファミリー（ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）、ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ｐ５７（Ｋｉｐ２））を含む。好ましくは、Ｂａｄ、Ｂｍｔ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＬ、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ−１（Ｓ）、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、ＴＲＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＦＫＨＲ、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））、最も好ましくは、ＢＩＭ、Ｂｉｄ、切断型Ｂｉｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ３（及びそのサブユニット）、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ａｋｔ、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））が、使用される１１−１３。加えて、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質は、ＤＩＶＡ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｇｓ、シトクロムＣ、ベクリン、ＣＥＤ−１３、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３、Ｂｆｌ−１、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ８を含む。アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質は、アポトーシス促進性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、アポトーシス阻止経路の阻害剤、及び生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤からなる群から選択される。アポトーシス促進性タンパク質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、シトクロムＣ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、並びにＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））からなる群から選択される、又はＢａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ−１、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、シトクロムＣ、ＦＡＤＤ、並びにカスパーゼファミリーからなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ−１、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））である。同じく好ましいのは、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリーである。
【０１００】
抗アポトーシスタンパク質は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３、ＩＡＰファミリー及びＢｆｌ−１からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３及びＢｆｌ−１である。
【０１０１】
アポトーシス阻止経路の阻害剤は、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ及びＣｄｃ２５Ａからなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂａｄ及びＮｏｘａである。
【０１０２】
生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤は、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ、ＰＨＬＰＰ、ＪＮＫ、ｐ３８からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ及びＰＨＬＰＰである。
【０１０３】
一部の実施態様では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、カスパーゼ、及びアポトーシスの細胞死受容体調節の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる群から選択される。ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質が好ましい。ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、Ｂａｄ、ＢＩＭ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｏｄ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１並びにＣＥＤ−１３からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂａｄ、ＢＩＭ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、特にｔＢｉｄである。
【０１０４】
カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、カスパーゼ３、カスパーゼ８及びカスパーゼ９である。
【０１０５】
アポトーシスの細胞死受容体調節の細胞内シグナル伝達タンパク質は、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＡＳＣ、ＢＡＰ３１、ＧＵＬＰ１／ＣＥＤ−６、ＣＩＤＥＡ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＣＩＤＥＣ、ＲＩＰＫ１／ＲＩＰ１、ＣＲＡＤＤ、ＲＩＰＫ３／ＲＩＰ３、Ｃｒｋ、ＳＨＢ、ＣｒｋＬ、ＤＡＸＸ、１４−３−３ファミリー、ＦＬＩＰ、ＤＦＦ４０及び４５、ＰＥＡ−１５、ＳＯＤＤからなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、ＦＡＤＤ及びＴＲＡＤＤである。
【０１０６】
一部の実施態様では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する２つの異種タンパク質であって、一方のタンパク質がアポトーシス促進性タンパク質であり、他方のタンパク質が、アポトーシス阻止経路の阻害剤であるか、又は一方のタンパク質がアポトーシス促進性タンパク質であり、他方のタンパク質が生存促進性シグナル伝達若しくは経路の阻害剤である、２つの異種タンパク質がグラム陰性菌株に含まれる。
【０１０７】
本発明により包含されるアポトーシス促進性タンパク質は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスにより取り囲まれた疎水性ヘリックスを有し、通常は、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３又はＢＨ４ドメインのうちの少なくとも１つを含み、好ましくは、少なくとも１つのＢＨ３ドメインを有する。通常、本発明に包含されるアポトーシス促進性タンパク質は、酵素的活性を有さない。
【０１０８】
本発明に包含される抗アポトーシスタンパク質は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスにより取り囲まれた疎水性ヘリックスを有し、異なるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４ドメインの組合せ、好ましくは、ＢＨ１及びＢＨ２ドメインが存在する異なるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４ドメインの組合せ、より好ましくは、ＢＨ４−ＢＨ３−ＢＨ１−ＢＨ２、ＢＨ１−ＢＨ２、ＢＨ４−ＢＨ１−ＢＨ２又はＢＨ３−ＢＨ１−ＢＨ２（Ｎ末端からＣ末端へ）を含む。加えて、少なくとも１つのＢＩＲドメインを含有するタンパク質も包含される。
【０１０９】
本発明に包含されるアポトーシス阻止経路の阻害剤は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスにより取り囲まれた疎水性ヘリックスを有し、通常は１つのＢＨ３ドメインを含む。
【０１１０】
ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３又はＢＨ４ドメインは、各々、通常は長さが約５−約５０アミノ酸の間である。したがって、一部の実施態様では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質は、長さが約５−約２００、好ましくは約５−約１５０、より好ましくは約５−約１００、最も好ましくは約５−約５０、特に、約５−約２５アミノ酸である、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質からなる群から選択される。
【０１１１】
一部の実施態様では、本発明のグラム陰性菌株は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質の２つのドメイン、好ましくは、アポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与するタンパク質の２つの反復、より好ましくは２つの同一の反復ドメイン、又はアポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与する異なるタンパク質の２つのドメイン、最も好ましくは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質の２つの同一の反復ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様では、本発明のグラム陰性菌株は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質の２つのドメインであって、一方が、アポトーシス促進性タンパク質のドメインであり、他方が、アポトーシス阻止経路の阻害剤であるタンパク質のドメインであるか、又は一方が、アポトーシス促進性タンパク質のドメインであり、他方が、生存促進性シグナル伝達若しくは経路の阻害剤であるタンパク質のドメインである、２つのドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
特に好ましい異種タンパク質は、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン、より詳細には、配列番号２９−３２、好ましくは、配列番号３１又は配列番号３２からなる群から選択される配列を含むＢＨ３ドメインである。
【０１１３】
同じく好ましいのは、アポトーシス調節因子ＢＡＸのＢＨ３ドメイン、より詳細には、配列番号３３−３６、好ましくは配列番号３５又は配列番号３６からなる群から選択される配列を含むＢＡＸドメインである。ヒト及びマウス配列が配列番号に与えられているが、全ての他の種のｔＢＩＤ及びＢＡＸ  ＢＨ３ドメインも同様に含まれる。
【０１１４】
一部の実施態様では、異種タンパク質の反復ドメインは、ＢＨ３ドメイン、好ましくは、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの反復ＢＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号２９−３２又は配列番号２５又は配列番号１９に含まれるアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの反復ＢＨ３ドメイン、よりいっそう好ましくは、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号２９−３２又は配列番号２５又は配列番号１９に含まれるアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメイン、特に、配列番号２７の配列に含まれるアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメインである。したがって、好ましい実施態様では、本発明のグラム陰性菌株及び／又はベクターは、ＢＨ３ドメインの２つの反復ドメイン、より好ましくはアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメイン、をコードする第２のＤＮＡ配列を含む。２つの反復ドメインは、１−３０アミノ酸長、好ましくは２−１５アミノ酸、より好ましくは３−１０アミノ酸長のリンカーにより連結されていることもある。
【０１１５】
一部の実施態様では、異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインは、タンパク質の同じ機能クラスに属する異種タンパク質のドメインであり、好ましくは、２つ以上のドメインの異なる異種タンパク質は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質のクラスとは異なる異種タンパク質である。好ましい実施態様では、異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインは、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン、及びアポトーシス調節因子ＢＡＸのＢＨ３ドメイン、特に、配列番号２４及び２８の配列に含まれる、融合したＢＨ３ドメインである。異なる異種タンパク質の２つのドメインは、１−３０アミノ酸長、好ましくは２−１５アミノ酸、より好ましくは３−１０アミノ酸長のリンカーにより連結されていることもある。
【０１１６】
別の特定の好ましい異種タンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導又は制御に関与するタンパク質のドメイン、より特に、配列番号３７、３８、１１０、１１１、１２８、１２９からなる群から選択される配列を含むＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、配列番号４４−４７，１１２、１１３、好ましくは配列番号１１２若しくは１１３からなる群から選択される配列を含むＭＤＡ５のＣＡＲＤドメイン、又は配列番号１１６、４８−４９からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号１１６、を含むＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１のＣＡＲＤドメイン、完全長ｃＧＡＳ、例えば、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ（配列番号４３）、ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２（配列番号１１５）、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ６０−４２２（配列番号１１７）又はマウスｃＧＡＳ１４６−５０７（配列番号１３１）である。最も特に、配列番号３７、３８、１１０、１１１、１２８、１２９からなる群から選択される配列を含むＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、配列番号１１６、４８−４９からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号１１６を含むＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１のＣＡＲＤドメインタンパク質、及び完全長ｃＧＡＳ、例えば、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ（配列番号４３）、ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２（配列番号１１５）、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ６０−４２２（配列番号１１７）又はマウスｃＧＡＳ１４６−５０７（配列番号１３１）。
【０１１７】
一部の実施態様では、異種タンパク質は、プロドラッグ変換酵素である。これらの実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、プロドラッグ変換酵素を発現する、好ましくは、発現し、分泌する。本明細書で意味するところのプロドラッグ変換酵素は、非毒性プロドラッグを毒性プロドラッグに変換する酵素、好ましくは、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンキナーゼ、ベータガラクトシダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼ及びベータグルクロニダーゼからなる群から選択される酵素、より好ましくは、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンキナーゼ及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素を含む。
【０１１８】
「プロテアーゼ切断部位」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸モチーフを認識する特定のプロテアーゼにより切断される、アミノ酸配列内の、例えば、タンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列内の特定のアミノ酸モチーフを意味する。総説については１４を参照されたい。プロテアーゼ切断部位の例は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ  ３Ｃ）、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼにより切断される、アミノ酸モチーフである。
【０１１９】
以下のアミノ酸モチーフは、それぞれプロテアーゼにより認識される：
−  Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：エンテロキナーゼ（軽鎖）／エンテロペプチダーゼ
−  Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ／ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ  ３Ｃ）
−  ＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウイルス）により認識される、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、及びＧｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ここでのＸは任意のアミノ酸である）に基づく修飾モチーフ
−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ：ＴＶＭＶプロテアーゼ
−  Ｉｌｅ−（Ｇｌｕ又はＡｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ：第Ｘａ因子プロテアーゼ
−  Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／Ｇｌｙ−Ｓｅ：トロンビン。
【０１２０】
本明細書で使用する場合のプロテアーゼ切断部位にはユビキチンが包含される。したがって、一部の好ましい実施態様では、ユビキチンがプロテアーゼ切断部位として使用される。すなわち、ヌクレオチド配列は、Ｎ末端部位で特異的ユビキチンプロセシングプロテアーゼにより切断され得る、例えば、融合タンパク質が送達される細胞において脱ユビキチン化酵素と呼ばれる特異的ユビキチンプロセシングプロテアーゼによりＮ末端部位で内因的に切断され得るプロテアーゼ切断部位として、ユビキチンをコードする。ユビキチンは、そのＣ末端で、内在性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）群により、プロセシングされる。ＤＵＢによるユビキチンの切断は、ユビキチンのまさにＣ末端（Ｇ７６の後）で起こるはずである。
【０１２１】
「個体」、「対象」又は「患者」は、脊椎動物である。ある特定の実施態様では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物は、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、対象はヒトである。
【０１２２】
「変異」という用語は、本明細書で使用される場合、一般用語であり、単一の塩基対と複数の塩基対の両方の変化を含む。そのような変異は、置換、フレームシフト変異、欠失、挿入及びトランケーションを含み得る。
【０１２３】
「核内移行シグナル」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞の核への取り込みのためのタンパク質を知らせるアミノ酸配列を意味し、好ましくは、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のＮＬＳ（ＰＰＫＫＫＲＫＶ）等の、ウイルス核内移行シグナルを含む。
【０１２４】
「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ  ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ  ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、��ｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩ、ＥａｅＩ、好ましくはＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩ等の、制限エンドヌクレアーゼによる切断のためのいくつかの制限部位を含有する短いＤＮＡ配列を意味する。「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＧａｔｅｗａｙクローニング戦略におけるような、組換え事象に使用される、又はギブソンアセンブリ又はＴＯＰＯクローニング等の方法に使用される、短いＤＮＡ配列をさらに意味する。
【０１２５】
「野生型株」「野生型のグラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する変異株、又はベクターの使用を可能にする遺伝子修飾、例えば、制限エンドヌクレアーゼ若しくは抗生物質耐性遺伝子の欠失変異を含有する天然に存在する変異株を意味する。これらの株は、染色体ＤＮＡはもちろん、一部の事例（例えば、Ｙ．エンテロコリティカ、フレクスナー赤痢菌）では未修飾の毒性プラスミドも含有する。
【０１２６】
「エルシニア属野生型株」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する変異株（Ｙ．エンテロコリティカＥ４０のようなもの）、又はベクターの使用を可能にする遺伝子修飾、例えば、制限エンドヌクレアーゼ若しくは抗生物質耐性遺伝子の欠失変異を含有する天然に存在する変異株（Ｙ．エンテロコリティカＥ４０のアンピシリン感受性派生物である、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０のようなものを意味する。これらの株は、染色体ＤＮＡはもちろん、未修飾の毒性プラスミド（ｐＹＶと呼ばれる）も含有する。
【０１２７】
Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカは、より毒性が高い亜種エンテロコリティカ株とは対照的である、低病原性Ｙ．エンテロコリティカ株を意味する１５、１６。Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカは、Ｙ．エンテロコリティカ亜種エンテロコリティカと比較して、高病原性アイランド（ＨＰＩ）を欠く。このＨＰＩは、エルシニアバクチンと呼ばれる鉄シデロホアをコードする１７。Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカにおけるエルシニアバクチンの欠如により、この亜種はより低病原性になり、例えば、肝臓又は脾臓における持続感染は、誘導される全身の利用可能な鉄に左右されることになる１７。例えば、患者の鉄過剰負荷を治療するために使用される鉄キレート剤であるデフェロキサミンでの前治療により、個体の体内の細菌に鉄を利用可能にすることができる１８。
【０１２８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、すなわち、一又は複数の特徴又は成分の存在を可能にするという意味で、一般に使用される。
【０１２９】
「約」という用語は、規定値の値範囲±１０％を意味する。例えば、「約２００」という句は、２００の±１０％、すなわち１８０−２２０を含む。
【０１３０】
一態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドをさらに含む組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。
【０１３１】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のＲＮＡ内のモジュレーションをさらに含む組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。
【０１３２】
さらなる態様では、本発明は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作用可能に連結されている、組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、異種タンパク質が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導又は制御に関与するタンパク質である、組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。
【０１３３】
さらなる態様では、本発明は、対象に前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を投与することを含む、対象のがんを治療する方法であって、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、方法において使用するための本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。好ましくは、本発明は、対象の悪性固形腫瘍がんを治療する方法において使用するための、前記悪性固形腫瘍内に蓄積する、本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株であって、前記方法が、対象に前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を投与することを含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株が、対象を治療するために十分な量で投与される、組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。
【０１３４】
一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、真核細胞に対して毒性である少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が不十分である。
【０１３５】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、５’から３’方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作用可能に連結されている、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のヌクレオチド配列、
前記第１のヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列
を含む、ヌクレオチド分子、例えばベクターで、形質転換される。
【０１３６】
本発明の一実施態様では、組換え弱化毒化グラム陰性菌株は、５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のヌクレオチド配列、
前記第１のヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列
を含む、ヌクレオチド分子、例えばベクターで、形質転換される。
【０１３７】
好ましくは、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、その３’末端に、染色体のヌクレオチド配列と、若しくは内在性毒性プラスミドの細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端におけるヌクレオチド配列と相同な、又はその断片と相同な、ヌクレオチド配列が隣接している。より好ましくは、異種タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、染色体上の若しくは細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端における内在性毒性プラスミド上の１０ｋｂｐ以内に位置するヌクレオチド配列と、又はその断片と相同である。特に、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、染色体上の若しくは内在性毒性プラスミド上の、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと同じオペロン内にあるヌクレオチド配列又はその断片と相同である。この実施態様では、形質転換は、融合ヌクレオチド配列が、組換え弱毒化グラム陰性菌株の内在性毒性プラスミド又は染色体、好ましくは内在性毒性プラスミドに対する相同組換えにより挿入され、融合ヌクレオチド配列が、内在性毒性プラスミドの、又は染色体の、例えば染色体病原性アイランドの、プロモーターに作用可能に連結されるように、通常は行われる。好ましくは、融合ヌクレオチド配列は、内在性毒性プラスミドのプロモーターに作用可能に連結される。この実施態様では、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、内在性プロモーターに作用可能に連結されている染色体又は内在性毒性プラスミド送達シグナルの３’末端とインフレームで配置される結果となるような、染色体の又は内在性毒性プラスミドの、好ましくは内在性毒性プラスミド上の、相同部位での相同組換えをもたらす、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片、好ましくはその断片を含む。
【０１３８】
本発明のさらなる実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列と相同若しくは同一であるか又は細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片をコードするヌクレオチド配列と相同若しくは同一であるヌクレオチド配列とを含むヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡヌクレオチド分子で形質転換され、この場合、細菌エフェクタータンパク質又はその断片からの送達シグナルは、組換え弱毒化グラム陰性菌株の染色体上に又は内在性毒性プラスミド上にコードされている。好ましくは、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルのヌクレオチド配列と又はその断片と相同又は同一であるヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端に位置する。より好ましくは、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列には、その３’末端で、染色体の若しくは内在性毒性プラスミドの細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端におけるヌクレオチド配列と相同な又はその断片と相同なヌクレオチド配列が隣接している。よりいっそう好ましくは、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、染色体上の若しくは内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端において１０ｋｂｐ以内に位置するヌクレオチド配列と又はその断片と相同である。特に、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、上記ヌクレオチド配列と相同であり、染色体上の又は内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片と同じオペロン内にある。この実施態様では、形質転換は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、組換え弱毒化グラム陰性菌株の内在性毒性プラスミド又は染色体の、好ましくは内在性毒性プラスミド上の、該染色体又は該内在性毒性プラスミドによりコードされている細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端に、挿入され、そこで送達シグナルに融合している異種タンパク質が発現され、分泌されるように行われる。
【０１３９】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドを含む。通常、内在性毒性プラスミド上の増殖に必須の内在性タンパク質をコードする遺伝子は、欠失される染色体遺伝子によりコードされているのと同じ、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする。好ましくは、内在性毒性プラスミド上に位置する、増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子は、その内在性プロモーター及びその内在性転写ターミネーターを含む。組換え弱毒化グラム陰性菌株が、エルシニア属株である場合、増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子は、内在性毒性プラスミドｐＹＶ上に位置し、好ましくは、その内在性プロモーター及びその内在性転写ターミネーターを含む。増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子、内在性プロモーター及び内在性転写ターミネーターは、好ましくは、内在性毒性プラスミド上の、例えばｐＹＶ上の、ｏｒｆ１５５（ＳｙｃＯ）の開始点の１２２ｂｐ上流に位置する。増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子、内在性プロモーター及び内在性転写ターミネーターは、通常、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０及びＥ４０株の毒性プラスミドであるｐＹＶｅ４０に見られるが、Ｙ．エンテロコリティカＷ２２７Ｏ３（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦ１０２９９０．１）の毒性プラスミドであるｐＹＶｅ２７７には見られない挿入配列を置換する。
【０１４０】
組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、内在性毒性プラスミドは、ｐＹＶ（エルシニア属毒性のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ））である。組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、挿入のための内在位置は、ＳｐｉＩ又はＳｐｉＩＩと呼ばれる（サルモネラ属病原性アイランド（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ）についての）遺伝子クラスターの１つ、エフェクタータンパク質が他の場所にコードされている位置であるか、或いはサルモネラ属毒性プラスミド（ＳＶＰ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｐｌａｓｍｉｄ）の１つである。
【０１４１】
好ましくは、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質の天然部位に、例えば毒性因子の天然部位に、好ましくは、組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、ＹｏｐＥ若しくは別のＹｏｐ（ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ）の天然部位に、好ましくはＹｏｐＥの天然部位に、又は組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、ＳｐｉＩ、ＳｐｉＩＩ内にコードされている若しくは他の場所にコードされているエフェクタータンパク質の天然部位に、好ましくは、ＳｉｐＩ若しくはＳｐｉＩＩ内にコードされているエフェクタータンパク質の天然部位に、より好ましくは、ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡの天然部位に、挿入される。好ましくは、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質のネイティブプロモーターに、例えば、組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、下で概要を示すようなエルシニア属ビルロン遺伝子からの天然プロモーターに、より好ましくは、天然ＹｏｐＥプロモーター又は別のＹｏｐ（ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ）プロモーターに、好ましくは天然ＹｏｐＥプロモーターに、或いは組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、ＳｐｉＩ若しくはＳｐｉＩＩ病原性アイランドからの又は下で概要を示すような他の場所にコードされているエフェクタータンパク質からの天然プロモーターに、より好ましくは、天然ＳｏｐＥ、ＩｎｖＢ又はＳｔｅＡプロモーターに、作用可能に連結されている。
【０１４２】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドを含み、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする遺伝子は、アミノ酸産生に必須の酵素をコードする遺伝子、ペプチドグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、ＬＰＳ生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、ヌクレオチド合成に関与する酵素をコードする遺伝子、及び翻訳開始因子をコードする遺伝子から選択される。
【０１４３】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、増殖に必須の内在性タンパク質をコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されている増殖に必須の前記内在性タンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドを含み、増殖に必須の内在性酵素をコードする遺伝子は、アミノ酸産生に必須の酵素をコードする遺伝子であり、アミノ酸産生に必須の前記酵素は、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｐＳ）若しくはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）、又はトランスケトラーゼ１（ｔｋｔＡ）、トランスケトラーゼ２（ｔｋｔＢ）、リブロースリン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、リブロース−５−リン酸イソメラーゼＡ（ｒｐｉＡ）、トランスアルドラーゼＡ（ｔａｌＡ）、トラスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（ｐｒｓ）、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｉｓＧ）、ヒスチジン生合成二機能性タンパク質ＨｉｓＩＥ（ｈｉｓＩ）、１−（５−ホスホリボシル）−５−［（５−ホスホリボシルアミノ）メチリデンアミノ］イミダゾール−４−カルボキサミドイソメラーゼ（ｈｉｓＡ）、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼサブユニットＨｉｓＨ（ｈｉｓＨ）、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼサブユニットＨｉｓＦ（ｈｉｓＦ）、ヒスチジン生合成二機能性タンパク質ＨｉｓＢ（ｈｉｓＢ）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ｈｉｓＣ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（ａｒｏＢ）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼ２（ａｒｏＬ）、シキミ酸キナーゼ１（ａｒｏＫ）、３−ホスホシキミ酸１−カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ａｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）、Ｐタンパク質（ｐｈｅＡ）、Ｔタンパク質（ｔｙｒＡ）、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＧ）、ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＨ）、ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ｙｄｉＢ）、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼアイソザイム１（ｐｆｋＡ）、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼアイソザイム２（ｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼクラス２（ｆｂａＡ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼクラス１（ｆｂａＢ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉＡ）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＦ）、ピルビン酸キナーゼＩＩ（ｐｙｋＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ（ｇａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）、２，３−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＡ）、２，３−ビスホスホグリセリン酸非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＭ／ｙｉｂＯ）、高可能性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｙｔｊＣ／ｇｐｍＢ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）、ホスホセリンホスファターゼ（ｓｅｒＢ）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ１（ｓｄａＡ）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ２（ｓｄａＢ）、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ・異化作用性（ｔｄｃＢ）、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ・生合成性（ｉｌｖＡ）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（ｔｄｃＧ）、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）、システインシンターゼＡ（ｃｙｓＫ）、システインシンターゼＢ（ｃｙｓＭ）、ベータ−シスタチオナーゼ（ｍａｌＹ）、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ｍｅｔＣ）、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＥ）、メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）、Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ｍｅｔＫ）、シスタチオニンガンマ−シンターゼ（ｍｅｔＢ）、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、５’−メチルチオアデノシン／Ｓ−アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼ（ｍｔｎＮ）、Ｓ−リボシルホモシステインリアーゼ（ｌｕｘＳ）、シスタチオンベータリアーゼ、シスタチオンガンマリアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｉｔａＥ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ小サブユニット（ｌｅｕＤ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット（ｌｅｕＣ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ）、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ・生合成性（ｉｌｖＡ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム３大サブユニット（ｉｌｖＩ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム３小サブユニット（ｉｌｖＨ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム１小サブユニット（ｉｌｖＮ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム２小サブユニット（ｉｌｖＭ）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１（ｔｈｒＡ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ２（ｍｅｔＬ）、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ）、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａＡ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１（ｔｈｒＡ）、二機能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ２（ｍｅｔＬ）、リジン感受性アスパルトキナーゼ３（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、２−ケト−３−デオキシ−ガラクトン酸アルドラーゼ（ｙａｇＥ）、４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−ジカルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、スクシニル−ジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）、推定的リアーゼ（ｙｊｈＨ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、アコニット酸ヒドラターゼＢ（ａｃｎＢ）、アコニット酸ヒドラターゼＡ（ａｃｎＡ）、特徴づけられていない推定的アコニット酸ヒドラターゼ（ｙｂｈＪ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａＡ）、グルタミン酸シンターゼ［ＮＡＤＰＨ］長鎖（ｇｌｔＢ）、グルタミン酸シンターゼ［ＮＡＤＰＨ］短鎖（ｇｌｔＤ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＡ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ａｒｇＢ）、Ｎ−アセチル−ガンマ−グルタミル−リン酸レダクターゼ（ａｒｇＣ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（ａｒｇＥ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼＦ鎖（ａｒｇＦ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼＩ鎖（ａｒｇＩ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）、グルタミン酸５−キナーゼ（ｐｒｏＢ）、ガンマ−グルタミルリン酸レダクターゼ（ｐｒｏＡ）、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ（ｐｒｏＣ）、オルニチンシクロデアミナーゼ、ロイシン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｌｅｕＳ）、グルタミン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｇｌｎＳ）、セリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｓｅｒＳ）、グリシン−ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｇｌｙＳ）、グリシン−ｔＲＮＡリガーゼアルファサブユニット（ｇｌｙＱ）、チロシン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｙｒＳ）、スレオニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｈｒＳ）、フェニルアラニン−ｔＲＮＡリガーゼアルファサブユニット（ｐｈｅＳ）、フェニルアラニン−ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｐｈｅＴ）、アルギニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｒｇＳ）、ヒスチジン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｈｉｓＳ）、バリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｖａｌＳ）、アラニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｌａＳ）、イソロイシン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｉｌｅＳ）、プロリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｐｒｏＳ）、システイン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｃｙｓＳ）、アスパラギン−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｓｎＳ）、アスパラギン酸−ｔＲＮＡリガーゼ（ａｓｐＳ）、グルタミン酸−ｔＲＮＡリガーゼ（ｇｌｔＸ）、トリプトファン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｒｐＳ）、グリシン−ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｇｌｙＳ）、メチオニン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｍｅｔＧ）、リジン−ｔＲＮＡリガーゼ（ｌｙｓＳ）からなる群から選択される。アミノ酸産生に必須の好ましい酵素は、ｔｋｔＡ、ｒｐｅ、ｐｒｓ、ａｒｏＫ、ｔｙｒＢ、ａｒｏＨ、ｆｂａＡ、ｇａｐＡ、ｐｇｋ、ｅｎｏ、ｔｄｃＧ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＫ、ｇｌｙＡ、ａｓｄ、ｄａｐＡ／Ｂ／Ｄ／Ｅ／Ｆ、ａｒｇＣ、ｐｒｏＣ、ｌｅｕＳ、ｇｌｎＳ、ｓｅｒＳ、ｇｌｙＳ／Ｑ、ｔｙｒＳ、ｔｈｒＳ、ｐｈｅＳ／Ｔ、ａｒｇＳ、ｈｉｓＳ、ｖａｌＳ、ａｌａＳ、ｉｌｅＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｓｎＳ、ａｓｐＳ、ｇｌｔＸ、ｔｒｐＳ、ｇｌｙＳ、ｍｅｔＧ、ｌｙｓＳであり、より好ましいのは、ａｓｄ、ｇｌｙＡ、ｌｅｕＳ、ｇｌｎＳ、ｓｅｒＳ、ｇｌｙＳ／Ｑ、ｔｙｒＳ、ｔｈｒＳ、ｐｈｅＳ／Ｔ、ａｒｇＳ、ｈｉｓＳ、ｖａｌＳ、ａｌａＳ、ｉｌｅＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｓｎＳ、ａｓｐＳ、ｇｌｔＸ、ｔｒｐＳ、ｇｌｙＳ、ｍｅｔＧ、ｌｙｓＳであり、最も好ましいのは、ａｓｄである。
【０１４４】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションをさらに含む。内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションは、ＲＮＡ温度センサー領域内の欠失、挿入又は置換であり得る。欠失又は挿入は、通常は、１つ又はいくつか、好ましくは約３０−約１００の間のヌクレオチド、より好ましくは約４０−約６０の間のヌクレオチドの欠失又は挿入を含む。置換は、通常は、１つ又はいくつか、好ましくは約３−約３０の間のヌクレオチド、より好ましくは約３−約１５の間のヌクレオチドの置換を含む。好ましくは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内の欠失、好ましくは約３０−約１００の間のヌクレオチドの、より好ましくは約４０−約６０の間のヌクレオチドの欠失である。内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質、及びＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域は、通常、組換え弱毒化グラム陰性菌株に含まれる内在性毒性プラスミド上に位置する。ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質は、好ましくは、ＶｉｒＦ、ＬｃｒＦ、ＭｘｉＥ、ＥｘｓＡ、ＰｅｒＡ、ＨｒｐＸ、ＨｒｐＢ、ＧａｄＸ、ＨｉｌＣ、ＨｉｌＤ及びＩｎｖＦからなる群から選択される。より好ましくは、ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＶｉｒＦ及びＬｃｒＦからなる群から選択される。一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）であり、ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＶｉｒＦである。
【０１４５】
好ましくは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流の、ＲＮＡヘアピン、好ましくはＨａｉｒｐｉｎ  Ｉに干渉するモジュレーションを含む。より好ましくは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内のモジュレーションは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流の、ＲＮＡヘアピン構造又はその一部、好ましくはｈａｉｒｐｉｎ  Ｉの一部を除去する欠失を含む。ＲＮＡヘアピン構造又はその一部を除去する欠失は、通常は約３０−約１００の間のヌクレオチドの、好ましくは約４０−約６０の間のヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、エルシニア・エンテロコリティカであり、欠失は、ｖｉｒＦのコード配列の上流の−１１１位−−５７位（ここで、−１は、ｖｉｒＦコード配列のＡＴＧ開始コドンのＡの１塩基上流である）のヌクレオチドの欠失を含む。
【０１４６】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属及びシュードモナス属からなる群から選択される。一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、エルシニア属及びサルモネラ属からなる群から選択される。好ましくは、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、エルシニア属株、より好ましくはエルシニア・エンテロコリティカ株である。最も好ましいのは、Ｙ．エンテロコリティカＥ４０（Ｏ：９、生物型２）１９、又は２０に記載されているようなＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０（別名Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０）のような、そのアンピシリン感受性派生物である。２０に記載されているようなＹ．エンテロコリティカＥ４０及びその派生物Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０は、１５、１７、２１に記載されているようなＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＥ４０及びその派生物Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０と同一である。また、好ましくは、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、サルモネラ属株、より好ましくはサルモネラ菌株である。最も好ましいのは、ｔｈｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＴＣ  １３３４７）によって記載されているようなネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ１３４４である。
【０１４７】
本発明の一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、シデロホアを産生しない、例えば、シデロホアの産生が不十分である株、好ましくは、シデロホアを産生しない、例えば、何れのシデロホアの産生も不十分である株である。そのような株は、例えば、１５、１７、２０、２１に記載されているようなＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０であり、これは、エルシニアバクチンを産生せず、好ましい。
【０１４８】
本発明の一実施態様では、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌エフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片、好ましくは、真核細胞に対して毒性である細菌エフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含む。本発明の一実施態様では、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含む細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質であって、該Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片がシャペロン結合部位を含み得る、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質である。シャペロン結合部位を含む、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、本発明の送達シグナルとして特に有用である。好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＳｓｐＨ１、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＸｏｐＤ、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＢＳ３、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。より好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、これらのうち最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、特に、ＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片である。
【０１４９】
同じく好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。同じくより好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、これらのうち同じく最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ及びＹｏｐＴからなる群から選択され、特に、ＳｏｐＥ、ＳｔｅＡ、若しくはＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片、より特にＳｔｅＡ若しくはＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片、最も特にＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片である。
【０１５０】
一部の実施態様では、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌エフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含むヌクレオチド配列によりコードされ、そのＮ末端断片は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質の少なくとも最初の１０、好ましくは少なくとも最初の２０、より好ましくは少なくとも最初の１００アミノ酸を含む断片を含む。
【０１５１】
一部の実施態様では、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含むヌクレオチド配列によりコードされ、前記細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、シャペロン結合部位を含む。
【０１５２】
シャペロン結合部位を含む、好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、シャペロン結合部位とＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれのＮ末端断片との次の組合せを含む：ＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ−ＳｏｐＥ、ＳｉｃＰ−ＳｐｔＰ、ＳｙｃＴ−ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ−ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ−ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ−ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ−ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ−ＥｓｐＦ、ＳｙｃＤ−ＹｏｐＢ、ＳｙｃＤ−ＹｏｐＤ。より好ましいのは、ＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ−ＳｏｐＥ、ＳｙｃＴ−ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ−ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ−ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ−ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ−ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ−ＥｓｐＦである。最も好ましいのは、ＳｙｃＥシャペロン結合部位を含む、ＹｏｐＥ若しくはそのＮ末端断片、例えば、本明細書ではＹｏｐＥ１−１３８と表記され、配列番号２で示されるような、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端１３８アミノ酸を含有する、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片であるか、又はＩｎｖＢシャペロン結合部位を含む、ＳｏｐＥ若しくはそのＮ末端断片、例えば、本明細書ではＳｏｐＥ１−８１若しくはＳｏｐＥ１−１０５とそれぞれと表記され、配列番号６及び７で示されるような、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端８１又は１０５アミノ酸を含有する、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片である。
【０１５３】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株はエルシニア属株であり、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はＮ末端部、好ましくは、Ｙ．エンテロコリティカＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部を含む。好ましくは、ＳｙｃＥ結合部位は、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部内に含まれる。これに関連して、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端１２、１６、１８、５２、５３、８０又は１３８アミノ酸を含み得る２２−２４。最も好ましいのは、例えば、本明細書ではＹｏｐＥ１−１３８と表記され、配列番号２で示される、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ及びＷｏｌｆ−Ｗａｔｚ２５に記載されているような、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端１３８アミノ酸を含有するＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片である。
【０１５４】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株はサルモネラ属株であり、ヌクレオチド配列によりコードされている細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部、好ましくは、サルモネラ菌ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部を含む。好ましくは、シャペロン結合部位は、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部内に含まれる。これに関連して、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端８１又は１０５アミノ酸を含み得る。最も好ましいのは、例えば配列番号７に記載されているような、完全長ＳｔｅＡ（配列番号５）、及びエフェクタータンパク質のＮ末端１０５アミノ酸を含有するＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片である。
【０１５５】
当業者は、タンパク質を送達することができるエフェクタータンパク質のポリペプチド配列を同定する方法に精通している。例えば、１つのそのような方法は、Ｓｏｒｙ等１９により記載されている。簡単に述べると、例えばＹｏｐタンパク質の様々な部分からの、ポリペプチド配列を、百日咳菌シクロリジンのカルモジュリン活性化アデニル酸シクラーゼドメイン（又はＣｙａ）等のレポーター酵素に、インフレームで融合させることができる。真核細胞のサイトゾルへのＹｏｐ−Ｃｙａハイブリッドタンパク質の送達は、ｃＡＭＰの蓄積につながる感染真核細胞におけるシクラーゼ活性の出現により示される。そのような手法を用いることにより、当業者は、タンパク質を送達することができる最小配列要件、すなわち、最も短い長さの連続アミノ酸配列を、必要に応じて決定することができる。例えば１９を参照されたい。したがって、本発明の好ましい送達シグナルは、少なくとも、タンパク質を送達することができるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質のアミノ酸の最小配列からなる。
【０１５６】
一実施態様では、本発明は、少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が不十分である、より好ましくは、真核細胞に対して毒性である少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が不十分である、よりいっそう好ましくは、少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生が不十分である、最も好ましくは、真核細胞に対して毒性である少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生が不十分である、組換え弱毒化グラム陰性菌株を提供する。一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、真核細胞に対して毒性である少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、よりいっそう好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、より特に少なくとも６つ、最も特に全ての細菌エフェクタータンパク質の生産が不十分である。一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、結果として得られる組換え弱毒化グラム陰性菌株が、非弱毒化グラム陰性菌野生型株と比較して、すなわち、細菌エフェクタータンパク質を正常に産生するグラム陰性菌野生型株と比較して、少ない細菌エフェクタータンパク質を産生する若しくは少ない程度に細菌エフェクタータンパク質を産生する、又は、結果として得られる組換え弱毒化グラム陰性菌株が、真核細胞に対して毒性である何れの機能性細菌エフェクタータンパク質も、もはや産生しない真核細胞に対して毒性である少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、よりいっそう好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、より特に少なくとも６つ、最も特に全ての機能性細菌エフェクタータンパク質の生産が不十分である。
【０１５７】
本発明によれば、そのような突然変異型グラム陰性菌株、すなわち、少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が不十分である、例えば、真核細胞に対して毒性である少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の生産が不十分である、そのような組換え弱毒化グラム陰性菌株、例えば、そのような突然変異型エルシニア属株は、エフェクターをコードしている少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの突然変異を導入することにより生じさせることができる。好ましくは、エフェクターをコードしているそのような遺伝子としては、エルシニア属株について言えば、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ及びＹｏｐＴが挙げられる。好ましくは、エフェクターをコードしているそのような遺伝子としては、サルモネラ属株について言えば、ＡｖｒＡ、ＣｉｇＲ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＰｉｐＢ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＡ、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＰｉｐＢ２、ＳｉｆＡ、ＳｏｐＤ２、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｐｖＤ、ＳｒｆＪ、ＳｐｔＰが挙げられる。最も好ましくは、エフェクターをコードしている全ての遺伝子が欠失している。当業者は、任意の数の標準技術を用いて、これらのＴ３ＳＳエフェクター遺伝子の変異を生じさせることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等は、一般にそのような技術を説明している。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等２６を参照されたい。
【０１５８】
本発明によれば、エフェクターをコードする遺伝子のプロモーター領域において、そのようなエフェクター遺伝子の発現を消失させるように変異を生じさせることができる。
エフェクターをコードしている遺伝子のコード領域において、コードされているエフェクタータンパク質の触媒活性を消失させるような変異を生じさせることもできる。エフェクタータンパク質の「触媒活性」は、エフェクタータンパク質の抗標的細胞機能、すなわち毒性を通常は意味する。そのような活性は、エフェクタータンパク質の触媒ドメインにおける触媒モチーフにより支配される。エフェクタータンパク質の触媒ドメイン及び／又は触媒モチーフを同定する手法は、当業者に周知である。例えば、２７、２８を参照されたい。
【０１５９】
したがって、本発明の１つの好ましい変異は、全触媒ドメインの欠失である。別の好ましい変異は、エフェクターをコードしている遺伝子のフレームシフト変異であり、したがって、触媒ドメインは、そのような「フレームシフトした」遺伝子から発現されるタンパク質産物中に存在しない。最も好ましい変異は、エフェクタータンパク質の全コード領域の欠失を伴う変異である。他の変異、例えば、エフェクタータンパク質の触媒モチーフにおいて生じて所与のエフェクタータンパク質の触媒活性の破壊につながる小欠失又は塩基対置換も、本発明により企図されている。
【０１６０】
機能性細菌エフェクタータンパク質の遺伝子において生じる変異を多数の方法により特定の株に導入することができる。１つのそのような方法は、変異配列をアレル交換により株に導入することができる「自殺」ベクターへの変異遺伝子のクローニングを含む。そのような「自殺」ベクターの例は、２９により記載されている。
【０１６１】
このようにして、複数の遺伝子において生じる変異をグラム陰性菌株にうまく導入して、多重突然変異株、例えば、六重突然変異型組換え株を生じさせることができる。これらの変異配列を導入する順序は重要でない。一部の環境下では、エフェクター遺伝子の全てではなく一部のみを変異させることが所望されることもある。したがって、本発明は、六重突然変異型エルシニア以外の多重突然変異型エルシニア、例えば、二重突然変異型、三重突然変異型、四重突然変異型及び五十突然変異型株をさらに企図している。タンパク質を送達するために、本突然変異株の分泌及び移行系は、インタクトである必要がある。
【０１６２】
本発明の好ましい組換え弱毒化グラム陰性菌株は、エフェクターをコードする全ての遺伝子が、結果として得られるエルシニア属が何れの機能性エフェクタータンパク質ももはや産生しないように突然変異した、六重突然変異型エルシニア属株である。そのような六重突然変異型エルシニア属株は、Ｙ．エンテロコリティカについてはΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔと表記される。例として、そのような六重突然変異株をＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０株から産生させて、好ましいＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ（本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ又はＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ）を生じさせることができる。エルシニアバクチンの産生が不十分であるＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔは、ＷＯ０２０７７２４９に記載されており、特許手続きを目的とした微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に２００１年９月２４日に寄託され、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１０１３を与えられた。
【０１６３】
より好ましいのは、内在性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＨａｉｒｐｉｎ  Ｉの欠失等の、ＲＮＡヘアピン構造又はその一部を除去する内在性毒性プラスミドｐＹＶにおける欠失（ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ）を含むＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ、例えば、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ（別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ）である。同様に好ましいのは、ａｓｄをコードする染色体遺伝子の欠失、及びプロモーターに作用可能に連結されているａｓｄをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む内在性毒性プラスミドｐＹＶ（ｐＹＶ−ａｓｄ）を含むＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ、例えば、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ（本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ）である。特に好ましいのは、上記の両方の修飾を含むＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹＶ−ａｓｄ（本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹＶ−ａｓｄ）である。特に好ましい株は、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ（別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ）、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ（本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ）又はＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹＶ−ａｓｄ（本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹＶ−ａｓｄ）であり、これらは、Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカ株の場合のように、シデロホアの産生が不十分である、好ましくは、シデロホアを産生しない、例えば、何れのシデロホアの産生も不十分である。したがって、同様に特に好ましい株は、Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ（別名Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ）、Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ  本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ）又はＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹＶ−ａｓｄ（本明細書での別名Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹ���−ａｓｄ）である。
【０１６４】
グラム陰性菌株を形質転換するために本発明に従って使用することができるベクターのようなヌクレオチド分子は、当業者に公知であるように、使用されるグラム陰性菌株に依存し得る。本発明に従って使用することができるヌクレオチド分子は、発現ベクター（内在性毒性プラスミドの合成バージョン又は別様に生成された修飾バージョンを含む）、染色体又は毒性プラスミド挿入用のベクター、及び例えば染色体又は毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片等の、ヌクレオチド配列を含む。例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株において有用である、発現ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＢａｄ、ｐＡＣＹＣ、ｐＵＣＰ２０及びｐＥＴプラスミドである。例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において有用である、染色体又は毒性プラスミド挿入用のベクターは、例えば、ｐＫＮＧ１０１である。染色体又は毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片は、例えばラムダレッド遺伝子操作のような、例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において使用される方法を意味する。染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクター又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片は、例えば、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、組換え弱毒化グラム陰性菌株の内在性プロモーターに作用可能に連結されるように、本発明のヌクレオチド配列を挿入することができる。したがって、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクター又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片が使用される場合、内在性プロモーターは、内在性細菌ＤＮＡ（染色体又はプラスミドＤＮＡ）上にコードされていることがあり、それぞれのヌクレオチド配列のみが、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用の操作ベクター又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片により提供されることになる。或いは、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクター、又は例えば染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のヌクレオチド配列等のヌクレオチド分子が使用される場合、内在性プロモーター、及び細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、内在性細菌ＤＮＡ（染色体又はプラスミドＤＮＡ）上にコードされていることがあり、例えば異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列等のヌクレオチド分子のみが、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクターにより、又は例えば染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のヌクレオチド配列等のヌクレオチド分子により、提供されることになる。したがって、プロモーターは、必ずしも、組換え弱毒化グラム陰性菌株の形質転換に使用されるベクターに含まれている必要がなく、すなわち、本発明の組換え弱毒化グラム陰性菌株は、プロモーターを含まないベクターで形質転換されることもある。
【０１６５】
好ましい実施態様では、ヌクレオチド分子、例えば、本発明のベクターは、５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のヌクレオチド配列、
前記第１のヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列
を含む。
【０１６６】
エルシニア属用の好ましいベクター、例えば、好ましい発現ベクターは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２からなる群から選択される。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０からのＹｏｐＥ及びＳｙｃＥ用の内在性プロモーターを含有するＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ１−１３８断片をｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることにより構築した。さらなる修飾は、消化、クレノウ断片処理及び再ライゲーションによるｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去を含む。さらに、ＹｏｐＥ１−１３８の３’末端に、次の切断部位を加えた：ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＢｓｔＢＩ−（ＨｉｎｄＩＩＩ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１は、ｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーターの下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。同じく好ましいのは、Ｔ３ＳＳシグナル配列への融合体としての、異種タンパク質をコードする内在性エルシニア属毒性プラスミドｐＹＶの修飾バージョンの使用である。サルモネラ属用の好ましいベクター、例えば、好ましい発現ベクターは、ｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９からなる群から選択される。対応する内在性プロモーターとＳｔｅＡ１−２０断片（ｐＳｉ＿２６６）、完全長ＳｔｅＡ配列（ｐＳｉ＿２６７）、ＳｏｐＥ１−８１断片（ｐＳｉ＿２６８）又はＳｏｐＥ１−１０５断片（ｐＳｉ＿２６９）とを含むプラスミドｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９を、サルモネラ菌ＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。
【０１６７】
ヌクレオチド分子、例えば、本発明のベクターは、他の配列エレメント、例えば、３’終止配列（終止コドン及びポリＡ配列を含む）を含むこともあり、又は本ベクターを受け取った形質転換体の選択を可能にする薬物耐性を付与する遺伝子を含むこともある。ヌクレオチド分子、例えば、本発明のベクターを多数の公知の方法により組換え弱毒化グラム陰性菌株内に形質転換することができる。本発明では、ベクターを導入するための形質転換方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介形質転換、接合伝達、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なエレクトロポレーション手順によりヌクレオチド分子、例えば、ベクターを第１の菌株内に形質転換することができる。その後、「可動化」とも呼ばれる方法である接合伝達によりそのようなヌクレオチド分子、例えば、ベクターを第１の菌株から所望の株内に移入することができる。形質転換体（すなわち、ベクターを取り込んだグラム陰性菌株）は、例えば抗生物質で、選択することができる。これらの技術は、当該技術分野で周知である。例えば、［１６］を参照されたい。
【０１６８】
本発明に従って、本発明の組換え弱毒化グラム陰性菌株の細菌エフェクタータンパク質に作用可能に連結されているプロモーターは、それぞれの株若しくは匹敵する菌株のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の天然プロモーターであってもよく、又は例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属若しくはシュードモナス属において有用である発現ベクターに使用されるプロモーター、例えば、ｐＵＣ及びｐＢａｄであってもよい。そのようなプロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｐｌａｃプロモーター、又はアラビノース誘導性Ａｒａ−ｂａｄプロモーターである。
【０１６９】
組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、エルシニア属ビルロン遺伝子からのものであり得る。「エルシニア属ビルロン遺伝子」は、エルシニア属ｐＹＶプラスミド上の遺伝子であって、その発現が温度によっても、標的細胞との接触によっても調節される遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、分泌機構のエレメントをコードする遺伝子（Ｙｓｃ遺伝子）、トランスロケーターをコードする遺伝子（ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ及びＬｃｒＶ）、調節エレメントをコードする遺伝子（ＹｏｐＮ、ＴｙｅＡ及びＬｃｒＧ）、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子（ＳｙｃＤ、ＳｙｃＥ、ＳｙｃＨ、ＳｙｃＮ、ＳｙｃＯ及びＳｙｃＴ）及びエフェクターをコードする遺伝子（ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ及びＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ）、並びにＶｉｒＦ及びＹａｄＡのような、他のｐＹＶにコードされているタンパク質を含む。
【０１７０】
本発明の好ましい実施態様では、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能性エフェクターをコードしている遺伝子の天然プロモーターである。組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ及びＹｏｐＰ／ＹｏｐＪの何れか１つから選択される。より好ましくは、プロモーターは、ＹｏｐＥ又はＳｙｃＥからのものである。最も好ましいのは、ＹｏｐＥプロモーターである。
【０１７１】
組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、ＳｐｉＩ若しくはＳｐｉＩＩ病原性アイランドからのものであってもよく、又は他の場所にコードされているエフェクタータンパク質からのものであってもよい。そのような遺伝子は、分泌機構のエレメントをコードする遺伝子、トランスロケーターをコードする遺伝子、調節エレメントをコードする遺伝子、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子、及びエフェクターをコードする遺伝子、並びにＳＰＩ−１又はＳＰＩ−２によりコードされている他のタンパク質を含む。本発明の好ましい実施態様では、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能性エフェクターをコードしている遺伝子の天然プロモーターである。組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、エフェクタータンパク質の何れか１つからのものであり得る。より好ましくは、プロモーターは、ＳｏｐＥ、ＩｎｖＢ又はＳｔｅＡからのものである。
【０１７２】
一部の実施態様では、プロモーターは、好ましい、例えばアラビノース誘導性プロモーターのような、人工誘導性プロモーターである。この場合、通常、アラビノースは、細菌に提供され、次いで、送達されるタンパク質の細菌発現を誘導することになる。
【０１７３】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列を含む。プロテアーゼ切断部位は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端とインフレームで融合している異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子上の、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の間に通常は位置する。機能的且つ一般に適用可能な切断部位の生成は、移行後の送達シグナルの切除を可能にする。送達シグナルは、標的細胞内に移行されるタンパク質の正しい位置及び／又は機能を妨害し得るので、送達シグナルと目的のタンパク質の間にプロテアーゼ切断部位を導入することにより大部分の天然タンパク質が真核細胞内に送達される。好ましくは、プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼ又はその触媒ドメインにより切断されるアミノ酸モチーフ、より好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼにより切断されるアミノ酸モチーフである。同じく好ましいプロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、脱ユビキチン化酵素と呼ばれるユビキチンプロセシングプロテアーゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼ又はその触媒ドメインにより切断される、アミノ酸モチーフである。最も好ましいのは、ＴＥＶプロテアーゼにより、又はユビキチンプロセシングプロテアーゼにより切断される、アミノ酸モチーフである。
【０１７４】
したがって、本発明のさらなる実施態様では、異種タンパク質は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルからプロテアーゼにより切断される。好ましい切断方法は、
ａ）プロテアーゼが、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質としてのプロテアーゼとの融合タンパク質を発現する本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株により真核細胞に移行される方法、又は
ｂ）プロテアーゼが、真核細胞において構成的に若しくは一過性に発現される方法
である。
【０１７５】
通常、真核細胞に所望のタンパク質を送達するために使用される組換え弱毒化グラム陰性菌株と、真核細胞にプロテアーゼを移行させる組換え弱毒化グラム陰性菌株は、異なる。
【０１７６】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、標識分子をコードするさらなるヌクレオチド配列を含むか、又は標識分子の受容部位を含む。標識分子をコードするさらなるヌクレオチド配列、又は標識分子の受容部位は、通常、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端と又は３’末端と融合している。好ましい標識分子、又は標識分子の受容部位は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、クマリン、クマリンリガーゼ受容部位、レゾルフィン、レゾルフィンリガーゼ受容部位、ＦｌＡｓＨ／ＲｅＡｓＨ色素（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用されているシータシステインモチーフからなる群から選択される。最も好ましいのは、レゾルフィン及びレゾルフィンリガーゼ受容部位又はＥＧＦＰである。標識分子、又は標識分子の受容部位を使用すると、標識分子が目的の異種タンパク質に結合することになり、次いで、真核細胞内等に送達されることになり、例えば細胞のライブ顕微鏡観察により、タンパク質の追跡が可能になる。
【０１７７】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、ペプチドタグをコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。ペプチドタグをコードするさらなるヌクレオチド配列は、通常、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端と又は３’末端と融合している。好ましいペプチドタグは、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ若しくはＶ５タグからなる群から選択されるか、又はこれらの群外の２つ以上のタグの組合せである。最も好ましいのは、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、及び組み合わせたＭｙｃタグとＦｌａｇタグである。ペプチドタグを使用すると、例えば、抗タグ抗体を使用する免疫蛍光法又はウェスタンブロット法により、タグ付タンパク質の追跡が可能になる。さらに、ペプチドタグを使用することにより、培養上清への分泌後又は真核細胞への移行後に、どちらの場合も対応するタグに合う精製法（例えば、Ｈｉｓタグと共に使用されている金属キレートアフィニティー精製、又はＦｌａｇタブと共に使用されている抗Ｆｌａｇ抗体ベースの精製）を使用して、所望のタンパク質のアフィニティー精製が可能になる。
【０１７８】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、核内移行シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。さらなるヌクレオチド配列が核内移行シグナル（ＮＬＳ）をコードする場合、核内移行シグナル（ＮＬＳ）をコードする前記さらなるヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端と又は３’末端と通常は融合している。好ましいＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ及びその誘導体３０並びに他のウイルスＮＬＳからなる群から選択される。最も好ましいのは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ及びその誘導体である。
【０１７９】
本発明の一実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、多重クローニング部位を含む。多重クローニング部位は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端に、及び／又は異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端に、通常は位置する。１つ又は１つより多くの多重クローニング部位がベクターに含まれることもある。好ましい多重クローニング部位は、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩからなる制限酵素の群から選択される。最も好ましいのは、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩである。
【０１８０】
本発明の組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現される融合したタンパク質は、「融合タンパク質」又は「ハイブリッドタンパク質」、すなわち、送達シグナルと異種タンパク異質の融合したタンパク質又はハイブリッドとも呼ばれる。融合タンパク質は、例えば、送達シグナル及び２つ以上の異なる異種タンパク質を含むこともできる。
【０１８１】
本発明は、対象のがんを治療する、例えば、悪性固形腫瘍を治療する方法であって、本明細書中の上段に記載の異種タンパク質をがん細胞内に、例えば、悪性固形腫瘍の細胞に送達することを含む方法を企図している。タンパク質を、組換え弱毒化グラム陰性菌株を対象に投与するのと同時にがん細胞内に、例えば悪性固形腫瘍の細胞に送達してもよく、すなわち移行させてもよく、又は後程、例えば、組換え弱毒化グラム陰性菌株ががん細胞に、例えば悪性固形腫瘍部位に達した後、及び／又はがん細胞、例えば悪性固形腫瘍部位に達し、上で説明したように複製された後、がん細胞内に、例えば、悪性固形腫瘍の細胞に送達してもよい、すなわち移行させてもよい。送達する時は、例えば、組換え弱毒化グラム陰性菌株において異種タンパク質を発現させるために使用されるプロモーターにより、制御することができる。第１の場合、細菌エフェクタータンパク質の構成的プロモーター、又はより好ましい内在性プロモーターのどちらかが、異種タンパク質を駆動し得る。遅延タンパク質送達の場合、アラビノース誘導性プロモーターのような人工的に誘導可能なプロモーターが、異種タンパク質を駆動し得る。この場合、細菌が所望の部位に達し、蓄積したら、アラビノースを対象に投与することになる。すると、アラビノースは、送達されたタンパク質の細菌発現を誘導することになる。
【０１８２】
したがって、一実施態様では、がんを治療する方法は、
ｉ）本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株を培養すること、
ｉｉ）がん細胞をｉ）の組換え弱毒化グラム陰性菌株と接触させること（ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が、組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現され、がん細胞内に移行される）により前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を対象に投与すること、及び任意選択的に、
ｉｉｉ）異種タンパク質ががん細胞内の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルから切断されるように融合タンパク質を切断すること
を含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、対象を治療するのに十分である量で投与される。
【０１８３】
異種タンパク質を送達するためのがん細胞は、通常、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、中枢神経系がんからなる群から選択される非固形腫瘍と、これらに限定されるものではないが、肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、口唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺又は肺等の様々な組織型から生じ得る異常な細胞塊を含み、したがって、悪性固形肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、口唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺又は肺腫瘍を含む、悪性固形腫瘍とから選択される、がんからのがん細胞である。好ましくは、異種タンパク質を送達するためのがん細胞は、悪性固形腫瘍である。
【０１８４】
したがって、１つの好ましい実施態様では、がんは、悪性固形腫瘍であり、方法ｒは、
ｉ）本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株を培養すること、
ｉｉ）悪性固形腫瘍の細胞をｉ）の組換え弱毒化グラム陰性菌株と接触させること（ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が、組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現され、悪性固形腫瘍の細胞内に移行される）により前記組換え弱毒化グラム陰性菌株を対象に投与すること、及び任意選択的に、
ｉｉｉ）異種タンパク質が悪性固形腫瘍細胞内の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルから切断されるように融合タンパク質を切断すること
を含み、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、前記対象を治療するために十分である量で投与される。
【０１８５】
一部の実施態様では、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質とを各々が含む少なくとも２つの融合タンパク質が、組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現され、本発明の方法により真核細胞、例えば、がん細胞に移行される。
【０１８６】
組換え弱毒化グラム陰性菌株を、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＦＤＡ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）、第８章：Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）に従って、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が発現されるように培養することができる。好ましくは、組換え弱毒化グラム陰性菌株をブレインハートインフュージョン培地で、例えば２８℃で培養することができる。Ｔ３ＳＳ及び例えばＹｏｐＥ／ＳｙｃＥプロモーター依存性遺伝子の発現の誘導のために、細菌を３７℃で増殖させることができる。
【０１８７】
一実施態様では、第１の組換え弱毒化グラム陰性菌株が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと第１の異種タンパク質とを含む第１の融合タンパク質を発現し、第２の組換え弱毒化グラム陰性菌株が、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと第２の異種タンパク質とを含む第２の融合タンパク質を発現する、ｉ）の２つの組換え弱毒化グラム陰性菌株と、がん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の細胞を接触させ、これにより、第１及び第２の融合タンパク質を悪性固形腫瘍の細胞に移行させる。この実施態様は、例えば、２つの異なるハイブリッドタンパク質をそれらの機能的相互作用に取り組むために単一細胞に送達するための有効な方法として、がん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の細胞の２つの菌株による同時感染を提供するものであった。
【０１８８】
当業者は、多数のアッセイを使用して、融合タンパク質の送達が成功したかどうかを判定することができる。例えば、融合したタグ（Ｍｙｃタグのような）を認識する抗体を使用する免疫蛍光法により、融合タンパク質を検出してもよい。その判定は、送達されることになるタンパク質の酵素的活性、例えば１９により記載されているアッセイに基づくこともある。
【０１８９】
本発明は、好適な薬学的に許容される担体を任意選択的に含む、本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株を含む、薬学的組成物も提供する。したがって、本発明は、対象のがん、例えば悪性固形腫瘍、を治療する方法において使用するための、本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株を含む薬学的組成物も提供する。
【０１９０】
組換え弱毒化グラム陰性菌株を、薬学的組成物として対象を治療するのに十分である量での適便且つ有効な投与のために、好適な薬学的に許容される担体と配合することができる。投与されることになる組換え弱毒化グラム陰性菌株の又は薬学的組成物の単位投与形態は、例えば、組換え弱毒化グラム陰性菌株を１ｍｌ当り細菌約１０５−約１０９個、好ましくは１ｍｌ当り細菌約１０６−約１０８個、より好ましくは１ｍｌ当り細菌約１０７−１０８個、最も好ましくは１ｍｌ当り細菌約１０８個の量で含有することができる。
【０１９１】
本明細書では同義で使用される「対象を治療するのに有効である量」又は「有効量」とは、正しい医学的判断の範囲内で、治療すべき状態を有意に正に修飾するのに十分な多さの、しかし重篤な副作用を回避するのに十分な少なさの細菌（一又は複数）の（妥当なリスク／ベネフィット比での）量を意味する。細菌の有効量は、達成すべき特定の目標、治療を受ける対象の年齢及び健康状態、治療期間、併用治療の性質、及び用いられる具体的な細菌によって変わることになる。したがって、細菌の有効量は、所望の効果をもたらすことになる最少量であるあろう。通常、体表１ｍ２当り細菌約１０５個−約１０９個、例えば、約１０５個−約１０９個、好ましくは、体表１ｍ２当り細菌約１０６個−約１０８個、例えば、約１０６個−約１０８個、より好ましくは、体表１ｍ２当り細菌約１０７個−約１０８個、例えば、約１０７個−約１０８個、最も好ましくは体表１ｍ２当り細菌１０８個、例えば、１０８個量が、対象に投与される。
【０１９２】
がん、例えば、悪性固形腫瘍を治療するために対象に、例えばヒトに、投与される組換え弱毒化グラム陰性菌株の単一用量は、通常、全組換え弱毒化グラム陰性菌株の細菌約１０４個−約１０１０個、例えば、体表１ｍ２当り細菌約１０４個−体表１ｍ２当り細菌約１０１０個、好ましくは、細菌約１０５個−約１０９個、例えば、体表１ｍ２当り細菌約１０５個−約１０９個、より好ましくは、細菌約１０６個−約１０８個、例えば、体表１ｍ２当り細菌約１０６個−約１０８個、より一相好ましくは、細菌約１０７個−約１０８個、例えば、体表１ｍ２当り細菌約１０７個−約１０８個、最も好ましくは、細菌１０８個、例えば、体表１ｍ２当り細菌１０８個である。
【０１９３】
薬学的担体として役立ち得る物質の例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク、ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；炭酸カルシウム；植物油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びカカオ脂；ポリオール、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸；発熱物質不含水；等張食塩水；クランベリー抽出物及びリン酸バッファー溶液；脱脂粉乳；並びに例えばビタミンＣ、エストロゲン及びエキナセア等の、薬学的製剤に使用される他の非毒性適合性物質である。湿潤剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、並びに着色剤、香味剤、潤滑剤、賦形剤、錠剤形成剤、安定剤、抗酸化物質及び防腐剤も存在することもある。
【０１９４】
対象への組換え弱毒化グラム陰性菌株の投与方法は、静脈内、腫瘍内、腹腔内及び経口投与からなる群から選択することができる。本発明は、何れの特定の適用方法に限定されることを意図したものではないが、細菌又は薬学的組成物の静脈内又は腫瘍内投与が好ましい。
【０１９５】
投与経路に依存して、細菌を含む活性成分を、前記生物を不活性にし得る酵素、酸及び他の自然条件の作用から前記生物を保護するための材料で、コーティングする必要があることもある。非経口投与以外により細菌を投与するために、不活性化を防止するための材料によりそれらをコーティングすべきであり、又はそのような材料と共にそれらを投与すべきである。例えば、細菌を酵素阻害剤と又はリポソームで共投与してもよい。酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）及びトラジロールを含む。リポソームは、水中油中水型Ｐ４０エマルジョン、並びにラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）等の細菌又はそれらの副産物を宿主対象の内部標的に輸送する従来の特別設計リポソームを含む。１つの細菌を単独で投与してもよく、又は第２の異なる細菌と共に投与してもよい。任意の数の異なる細菌を共に投与することができる。「と共に」とは、一緒に、実質的に同時に、又は逐次的に、を意味する。組成物を、例えば、本発明の細菌若しくは薬学的組成物を含むフリーズドライカプセル等の、錠剤、ピル若しくはカプセルの形態で投与してもよく、又はＤＭＳＯ若しくはグリセロールを含有する本発明の細菌若しくは薬学的組成物の凍結溶液として投与してもよい。別の好ましい適用形態は、本発明の細菌又は薬学的組成物の凍結乾燥カプセルの製剤である。さらに別の好ましい適用形態は、本発明の細菌又は薬学的組成物の熱乾燥カプセルの製剤である。
【０１９６】
投与すべき組換え弱毒化グラム陰性菌株又は薬学的組成物を注射により投与することができる。注射剤用に好適な形態は、モノセプティック又は滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合、形態は、モノセプティック又は無菌でなければならず、容易な注入性が存在する程度に流動性でなければならない。形態は、製造及び保管条件下で安定していなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒であることができる。適正な流動体は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合は必要粒径の維持により、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン、の組成物における使用によりもたらすことができる。
【０１９７】
本発明の一部の実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、対象にシデロホアと共投与される。これらの実施態様は好ましい。共投与することができるシデロホアは、ヒドロキサム酸型シデロホア、カテコール酸型シデロホア、及び混合配位子型シデロホアを含む、シデロホアである。好ましいシデロホアは、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢ、デスフェロキサミンＢ、ＤＦＯ−Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢ又はデスフェラルとしても公知）、デスフェリオキサミンＥ、デフェラシロクス（エクジェイド、デシロクス、デフリジェット、デシファー）及びデフェリプロン（フェリプロックス）であり、より好ましいのはデフェロキサミンである。デフェロキサミンは、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ）により産生された細菌シデロホアであり、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ（スイス）から市販されている。
【０１９８】
シデロホアとの共投与は、組換え弱毒化グラム陰性菌株の投与前であってもよく、投与と同時であってもよく、又は投与後であってもよい。好ましくは、シデロホアは、組換え弱毒化グラム陰性菌株の投与前に投与され、より好ましくは、対象への組換え弱毒化グラム陰性菌株の投与の少なくとも１時間、好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、特に少なくとも２４時間前に投与される。特定の実施態様では、対象は、細菌の増殖を可能にするために、組換え弱毒化グラム陰性菌株による感染の２４時間前にデフェロキサミンで前治療される。通常、シデロホアは、体重１ｋｇ当り約０．５×１０−５Ｍｏｌ−約１×１０−３Ｍｏｌ、より好ましくは、約１×１０−５Ｍｏｌ−約１×１０−４Ｍｏｌ、好ましくは約３．５×１０−５Ｍｏｌ−約１．１×１０−４Ｍｏｌの単一用量で共投与される。通常、デスフェロキサミンは、体重１ｋｇ当り約２０ｍｇ−約６０ｍｇ、好ましくは約２０ｍｇ−約６０ｍｇの単一用量で共投与される。
【０１９９】
本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株又は薬学的組成物の投与の投与レジメンは、当業者には公知であるように、達成すべき特定の目標、治療を受ける対象の年齢及び健康状態、治療期間、併用治療の性質並びに用いられる具体的な細菌によって変わることになる。組換え弱毒化グラム陰性菌株は、通常、１−２０日毎に、好ましくは１−１０日毎に、より好ましくは１−７日毎に単一用量からなる投与レジメンに従って、単一用量からなる投与レジメンに従って、対象に投与される。投与の期間は、通常は約２０−約６０日、好ましくは約３０−４０日である。或いは、投与の期間は、通常約８−約３２週間、好ましくは約８−約２４週間、より好ましくは約１２−約１６週間である。
【０２００】
さらなる実施態様では、本発明は、好ましくはヒトの、がん、例えば、悪性固形腫瘍などを治療するためのキットを提供する。そのようなキットは、一般に、本明細書に記載の組換え弱毒化グラム陰性菌株又は薬学的組成物とキットを使用するための説示とを含むことになる。一部の実施態様では、キットは、各々の容器が、本明細書に記載の方法において使用されることになる別々の要素の１つを含む、一又は複数の容器、例えばバイアル、チューブなどの受入れるように区画化されている、キャリア、パッケージ又は容器を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、及び試験管が挙げられる。他の実施態様では、容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されたものである。
【実施例】
【０２０１】
実施例１：
Ａ）材料及び方法
菌株及び増殖条件。この研究で使用した株を図３Ａ−Ｍに列挙する。プラスミド精製及びクローニングに使用した大腸菌Ｔｏｐ１０、及び接合伝達に使用した大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ、並びにｐＫＮＧ１０１を伝播するために使用した大腸菌ＢＷ１９６１０３１を、ＬＢ寒天プレート上及びＬＢ培地中、３７℃で常套的に増殖させた。アンピシリンを２００μｇ／ｍｌ（エルシニア属）又は１００μｇ／ｍｌ（大腸菌）で使用して、発現ベクターについて選択した。ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用して、自殺ベクターについて選択した。Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０（Ｏ：９、生物型２）２０、非アンピシリン耐性Ｅ４０派生物１９及びそれに由来する株をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ：Ｄｉｆｃｏ）上で、室温で常套的に増殖させた。Ｙ．エンテロコリティカ株に、ナリジクス酸酸（３５μｇ／ｍｌ）を添加し、全てのＹ．エンテロコリティカａｓｄ株に、さらに、１００μｇ／ｍｌのメソ−２，６−ジアミノピメリン酸（ｍＤＡＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した。サルモネラ菌ＳＬ１３４４をＬＢ寒天プレート上及びＬＢ培地中、３７℃で常套的に増殖させた。アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用して、サルモネラ菌における発現ベクターについて選択した。
【０２０２】
Ｙ．エンテロコリティカの遺伝子操作。Ｙ．エンテロコリティカの遺伝子操作は、記載されている３２、３３。簡単に述べると、精製ｐＹＶ４０プラスミド又はゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、２断片オーバーラップＰＣＲにより、ｐＹＶプラスミド内又は染色体上の遺伝子の修飾又は欠失のための変異誘発物を構築して、それぞれの遺伝子の欠失又は修飾部分の両側に２００−２５０ｂｐの隣接配列をもたらした。得られた断片を大腸菌ＢＷ１０６１０３１におけるｐＫＮＧ１０１２９にクローニングした。配列が検証されているプラスミドを大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ内に形質転換し、そこからプラスミドを対応するＹ．エンテロコリティカ株内に移動させた。組込み型ベクターを保有する突然変異株を選択圧なしで数世代増殖させた。次いで、スクロースを使用して、ベクターを失ってしまったクローンについて選択した。最後に、突然変異株をコロニーＰＣＲにより同定した。特定の変異誘発物（ｐＳｉ＿４０８、ｐＳｉ＿４１９）を表ＩＩＩに収載する。
【０２０３】
プラスミドの構築。プラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ２又はｐＢａｄ＿Ｓｉ１（図２）を、ＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸（配列番号２）を有する融合タンパク質のクローニングに使用した。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０からのＹｏｐＥ及びＳｙｃＥ用の内在性プロモーターを含有するＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ１−１３８断片をｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることにより構築した。さらなる修飾は、消化、クレノウ断片処理及び再ライゲーションによるｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去を含む。二方向転写ターミネーター（ＢＢａ＿Ｂ１００６；ｉＧＥＭ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）を、ＫｐｎＩ切断及びクレノウ処理（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）又はＢｇｌＩＩ切断部位（ｐＢａｄ＿Ｓｉ１）にクローニングした。さらに、ＹｏｐＥ１−１３８の３’末端に、次の切断部位を加えた：ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＢｓｔＢＩ−（ＨｉｎｄＩＩＩ）（図２Ｂ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１は、ｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーターの下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。対応する内在性プロモーターとＳｔｅＡ１−２０断片（ｐＳｉ＿２６６）、完全長ＳｔｅＡ配列（ｐＳｉ＿２６７）、ＳｏｐＥ１−８１断片（ｐＳｉ＿２６８）又はＳｏｐＥ１−１０５断片（ｐＳｉ＿２６９）とを含むプラスミドｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９を、サルモネラ菌ＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。
【０２０４】
完全長遺伝子又はそれらの断片を、下の表Ｉに収載されている特定のプライマーで増幅し、ＹｏｐＥ１−１３８との融合体としてプラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ２に、又はｚ−ＢＩＭ（配列番号１６）の場合はｐＢａｄ＿Ｓｉ１にクローニングした（下の表ＩＩを参照されたい）。ＳｔｅＡ又はＳｏｐＥとの融合のために、合成ＤＮＡ構築物をＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩにより切断し、ｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８又はｐＳｉ＿２６９にそれぞれクローニングした。細菌種の遺伝子の場合、精製ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した（フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、サルモネラ菌亜種ネズミチフス菌ＳＬ１３４４、バルトネラ・ヘレンセラ菌ＡＴＣＣ  ４９８８２）。ヒト遺伝子については、別段の記述がない場合、汎用ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し（図３Ａ−Ｍ）、ゼブラフィッシュ遺伝子をｃＤＮＡライブラリー（Ｍ．Ａｆｆｏｌｔｅｒからの親切な寄贈品）から増幅した。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌Ｔｏｐ１０にクローニングした。シークエンシング済みプラスミドを、標準的な大腸菌エレクトロポレーションの場合と同様の設定を使用して所望のＹ．エンテロコリティカ又はサルモネラ菌株にエレクトロポレーションした。
表Ｉ（プライマーＮｒ．Ｓｉ＿：配列）
配列番号５１：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿２８５
CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG
配列番号５２：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿２８６
GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
配列番号５３：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿２８７
CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG
配列番号５４：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿２８８
GTTAAAGCTTttcgaatctagactcgagCGTGGCGAACTGGTC
配列番号５５：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿３８７
CGTAtctagaATGGACTGTGAGGTCAACAA
配列番号５６：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿３９１
CGTAtctagaGGCAACCGCAGCA
配列番号５７：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿３８９
GTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTg
配列番号５８：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４３６
CGTAtctagaATGCCCCGCCCC
配列番号５９：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４３７
GTTAAAGCTTCTACCCACCGTACTCGTCAAT
配列番号６０：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４３８
CGTAtctagaATGTCTGACACGTCCAGAGAG
配列番号６１：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４３９
GTTAAAGCTTTCATCTTCTTCGCAGGAAAAAG
配列番号６２：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４６３
CAGTctcgaggaaagcttgtttaaggggc
配列番号６３：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４６４
cagtTTCGAAttagcgacggcgacg
配列番号６４：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４７６
GTTAAAGCTTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
配列番号６５：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４９４
CGTAtctagaATGGCCGAGCCTTG
配列番号６６：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿４９５
GTTAAAGCTTttaTTGAAGATTTGTGGCTCC
配列番号６７：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５０４
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTATGCCCCGCCCC
配列番号６８：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５０５
GTTAAAGCTTCCCACCGTACTCGTCAATtc
配列番号６９：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５０８
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTATGGCCGAGCCTTG
配列番号７０：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５０９
GTTAAAGCTTTTGAAGATTTGTGGCTCCc
配列番号７１：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５１１
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGTGAGCAAGGGCGAG
配列番号７２：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５１２
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTCCGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTTGTGAGCAAGGGCGAG
配列番号７３：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５１３
GTTAAAGCTTttAAACTTTACGTTTTTTTTTCGGCGGCTTGTACAGCTCGTCCAT
配列番号７４：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５１５
CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG
配列番号７５：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６７７
TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCGCCATCTGGCCCAAATTGGTGATGAAATGGATCATTAAGCTTGGAGTA
配列番号７６：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６７８
TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGGGCCAGATGGCGGGCAATATTATGAATAATTTCTTCGAATAGTAA
配列番号７７：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６８２
TTACTACTCGAGAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGCCGCATTGGTGATGAACTGGATAGCTAAGCTTGGAGTA
配列番号７８：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６８３
TACTCCAAGCTTAGCTATCCAGTTCATCACCAATGCGGCGCAGACATTCGCTCAGTTTTTTCTCGAGTAGTAA
配列番号７９：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５８０
catgccatggatttatggtcatagatatgacctc
配列番号８０：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６１２
CGGGGTACCatgaggtagcttatttcctgataaag
配列番号８１：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６１３
CGGGGTACCataattgtccaaatagttatggtagc
配列番号８２：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６１４
catgccatggCGGCAAGGCTCCTC
配列番号８３：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６１５
cggggtaccTTTATTTGTCAACACTGCCC
配列番号８４：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿６１６
cggggtaccTGCGGGGTCTTTACTCG
配列番号８５：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５８５
CAGTctcgagATGCAGATCTTCGTCAAGAC
配列番号８６：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５８６
GTTAAAGCTTgctagcttcgaaACCACCACGTAGACGTAAGAC
配列番号８７：プライマーＮｏ．：Ｓｉ＿５８８
cagtTTCGAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG
配列番号８８：プライマーＮｏ．７３３
TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCG
配列番号８９：プライマーＮｏ．７３５
TACTCCTTCGAATTAATGATCCATTTCATCACCAATTTG
配列番号９０：プライマーＮｏ．７３６
TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCG
配列番号９１：プライマーＮｏ．７３８
TACTCCTTCGAATTAGCTATCCAGTTCATCACCAATG
配列番号９２：プライマーＮｏ．７３４
TACTCCTTCGAAGGCACCATGATCCATTTCATCACCAATTTGG
配列番号９３：プライマーＮｏ．７２５：
TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCC
配列番号９４：プライマーＮｏ．７２６：
TACTCCAAGCTTACGGTTGAATATTATGATCCATTTCATCACCAATTTGG
配列番号９５：プライマーＮｏ．７２７：
TTACTATTCGAAGCCGGTGGTGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCC
配列番号９６：プライマーＮｏ．７２８：
TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCA
配列番号９７：プライマーＮｏ．７３７：
TACTCCTTCGAAGGCACCGCTATCCAGTTCATCACCAATG
配列番号101: プライマーＮｏ．８６９：
gatcgtcgacTTAAGTTCAATGGAGCGTTTAATATC
配列番号１０２：プライマーＮｏ．８７０：
ctttgactggcgagaaacgcTCTTAACATGAGGCTGAGCTC
配列番号１０３：プライマーＮｏ．８７１：
GAGCTCAGCCTCATGTTAAGAgcgtttctcgccagtcaaag
配列番号１０４：プライマーＮｏ．８７２：
gatagcccccgagcctgtGCACTTTGTCATTAACCTCAGC
配列番号１０５：プライマーＮｏ．８７３：
GCTGAGGTTAATGACAAAGTGCacaggctcgggggctatc
配列番号１０６：プライマーＮｏ．８７４：
catgtctagaCCCTCAGCATAATAACGACTC
配列番号１０７：プライマーＮｏ．６００：
catgacatgtTGGCGTTTCTCGCC
配列番号１０８：プライマーＮｏ．６０１：
catgacatgtATTAACCTCAGCCCTGACTATAAG
配列番号１１９：プライマーＮｏ．１０１０：
cacatgtctagaCAACCGTTTCCGAAAGGTGATCTG
配列番号１２０：プライマーＮｏ．１０１２：
atccCAagctTATTGGCGTTGGGTGGTAAAAATTTTG
配列番号１２１：プライマーＮｏ．１０２１：
cacatgtctagaATGACCGCCGAACAACGC
配列番号１２２：プライマーＮｏ．１０２２：
catgaagcttaCGGACCCGGATTTTGGCTC
＞配列番号１２３：プライマーＮｏ．１０２３：
catgaagcttaCGGTTCTTCTTGAATAAAAATTTGAATG
配列番号１２４：プライマーＮｏ．１０２４：
catgaagcttaTTGCAGCACTTTCGGCCAATTT
配列番号１２５：プライマーＮｏ．１０２５：
cacatgtctagaATGAGCATTGTGTGTAGCGC
配列番号１２６：プライマーＮｏ．１０２６：
catgaagcttaGCTTTCATCCACGGCCGG
配列番号１２７：プライマーＮｏ．１０２７：
catgaagcttaATTACCGGTTTGGCGCAGC
0006976351.tif 000002
0006976351.tif 000003
0006976351.tif 000004
0006976351.tif 000005
【０２０５】
Ｙｏｐ分泌。培養をＢＨＩ−Ｏｘ中３７℃（分泌許容条件）３４に変えることにより、Ｙｏｐレギュロンの導入を果たした。炭素源グルコース（４ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２０６】
細胞と上清画分を２０  ８００ｇで１０分間、４℃での遠心分離により分離した。細胞ペレットを全細胞画分と見なした。最終１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を用いて、１時間、４℃で、上清中のタンパク質を沈殿させた。遠心分離（１５分間、２０，８００ｇ）及び上清の除去後、得られたペレットを氷冷アセトンで一晩洗浄した。試料を再び遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを空気乾燥させ、１×ＳＤＳローディング色素に再懸濁させた。
【０２０７】
分泌されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析し、各場合、細菌３×１０８個により分泌されたタンパク質をレーン毎にローディングした。１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、イムノブロット法による特定の分泌タンパク質の検出を行った。全細胞内のタンパク質を検出するために、別段の記述がない場合、細菌２×１０８個をレーン毎にローディングし、イムノブロット法による検出前に１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてタンパク質を分離した。
【０２０８】
ＹｏｐＥに対するラットモノクローナル抗体（ＭＩＰＡ１９３−１３Ａ９；１：１０００、３５）を使用して、イムノブロッティングを行った。バックグラウンド染色を低減させるために、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに対する抗血清を一晩に２回、予備吸着させた。ラット抗体に対する二次抗体であって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５０００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ）にコンジュゲートさせた二次抗体を用いて検出を行い、その後、ＥＣＬ化学発光基質（ＬｕｍｉＧｌｏ，ＫＰＭ）で現像した。
【０２０９】
細胞培養及び感染。１０％ＦＣＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ｃＤＭＥＭ）を補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＨｅＬａ  Ｃｃｌ２及びＢ１６Ｆ１０細胞を培養した。１０％ＦＣＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０で４Ｔ１細胞を培養した。添加剤を加えたＢＨＩでＹ．エンテロコリティカを一晩、室温で増殖させ、新たなＢＨＩで希釈して０．２のＯＤ６００にし、２時間、室温で増殖させた後、さらに３０分間、又はＥＧＦＰの送達の場合は１時間、３７℃水浴振盪機への温度シフトを行った。最後に、細菌を遠心分離（６０００ｒｃｆ、３０秒）により回収し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭで１回洗浄した。最後に、細菌を遠心分離（６０００ｒｃｆ、３０秒）により収集し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭで１回洗浄した。９６ウェルプレートに（免疫蛍光法のために）又は６ウェルプレートに（ウェスタンブロット法のために）播種した細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、示されている感染多重度で感染させた。細菌を添加した後、プレートを１分間、１７５０ｒｐｍで遠心分離し、示されている期間、３７℃で置いておいた。細胞外細菌を、示されている場合にはゲンタマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）により殺滅した。免疫蛍光分析の場合、感染アッセイを４％ＰＦＡ固定により停止した。ウェスタンブロット分析のために、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓａｆｅ溶解バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して細胞を溶解した。氷上でのインキュベーション後、細胞を遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により全タンパク質含有量について分析した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、そして抗アクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗Ｂｉｄ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗カスパーゼ３  ｐ１７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗Ｉｎｋ４Ｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体を使用するウェスタンブロッティングを行った。
【０２１０】
感染細胞からのＴ３ＳＳ移行タンパク質のウェスタンブロッティング。６ウェルプレート内のＨｅＬａ細胞を、感染多重度１００で、上で説明したように感染させた。ＴＥＶプロテアーゼ移行性Ｙ．エンテロコリティカ株を用いる同時感染の場合、株のＯＤ６００を設定し、２つの細胞懸濁液をチューブの中で（別段の指示がない限り）１：１で混合した後、細胞に添加した。感染の最後に、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、小量の氷冷ＰＢＳ中にかき取ることにより回収した。遠心分離（１６０００ｒｃｆ、５分、４℃）後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ）を補充した０．００２％ジギトニンにペレットを溶解した。溶解したペレット氷上で５分間インキュベートし、次いで、遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を回収し、全タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により分析した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、そして抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、９Ｅ１１）又は抗Ｉｎｋ４Ｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用するウェスタンブロット法を行った。
【０２１１】
自動顕微鏡観察及び画像分析。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて画像を自動で取得した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を使用して抗Ｍｙｃ染色強度の定量を行った。核領域及び細菌を含有する領域を除く細胞内の領域を手動で選択し（４０画素のエリアを有する円）、平均強度を記録した。
【０２１２】
Ｂ１６−Ｆ１０及び４Ｔ１同種移植マウスモデルにおける体内分布
全ての動物実験は、認可されたものであり（ｌｉｃｅｎｓｅ  １９０８；Ｋａｎｔｏｎａｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ  Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔ）、地域のガイドライン（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ−Ｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇ；Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔ）及びスイス動物保護法（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ−Ｇｅｓｅｔｚ）に従って行った。６週齢Ｃ５７Ｂｌ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓから取り寄せた。少なくとも１週間の馴化後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、１０ｕｌ  Ｂ１６−Ｆ１０又は４Ｔ１細胞（細胞１×１０５−１×１０６個）をＣ５７Ｂｌ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスの側副部にそれぞれ皮下注射した。この実験を通して、マウスの行動及び身体的外見についてのスコアを付け、体表温度並びに体重を測定した。
【０２１３】
腫瘍が発生したら、マウスに８ｍｇ／ｍｌ  デスフェラル溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射により投与した。翌日、マウスを尾静脈への注射によりＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０又はＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０ΔＨＯＰＥＭＴ（細菌２×１０５、１×１０６又は１×１０７個）に感染させた。マウスに静脈内投与した種菌を希釈平板法により検証した。一部の実験では、腫瘍進行をデジタルノギスでの腫瘍長及び幅の毎日の測定により追跡した。腫瘍体積を０．５３２×長さ×幅２として決定した。注射後のそれぞれの日に、マウスをＣＯ２吸入により屠殺した。直ちに心臓からの吸引により血液試料を単離した。肝臓、脾臓、肺及び腫瘍を単離し、それらの重量を判定した。臓器及び腫瘍をホモジナイズした。ナリジクス酸（３５ｕｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレート上への段階希釈物のスポッティングにより、各試料におけるＣＦＵを判定した。
【０２１４】
直接的Ｉ型インターフェロン活性化アッセイ。多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下で分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又は分泌型Ｌｕｃｉａルシフェラーゼを安定的に発現する、マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞、マウスＲＡＷ２６４．７野生型又はＭＡＶＳノックアウトマクロファージを、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した（Ｂ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ、ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ、ＲＡＷ−Ｌｕｃｉａ  ＩＳＧ及びＲＡＷ−Ｌｕｃｉａ  ＩＳＧ−ＫＯ−ＭＡＶＳ）。増殖条件及びＩ型ＩＦＮアッセイは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎにより提供されたプロトコールから適応させた。簡単に述べると、１ウェル当り１５０μｌの試験培地（Ｂ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞についてはＲＰＭＩ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ；ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ、ＲＡＷ−Ｌｕｃｉａ及びＲＡＷ−Ｌｕｃｉａ  ＫＯ−ＭＡＶＳ  ＩＳＧ細胞についてはＤＭＥＭ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ）中、１２’５００個のＢ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞又は３０’０００個のＲＡＷ−Ｂｌｕｅ、ＲＡＷ−Ｌｕｃｉａ若しくはＲＡＷ−Ｌｕｃｉａ  ＫＯ−ＭＡＶＳ  ＩＳＧ細胞を、平底９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ又はＣｏｒｎｉｎｇ）に播種した。翌日、所望の感染多重度（ＭＯＩ、試験培地で希釈したもの）の１ウェル当り１５μｌを添加することにより、評価すべき菌株に細胞を感染させた。２時間のインキュベーション（３７℃及び５％ＣＯ２）後、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を含有する試験培地を添加することにより細菌を殺滅した。インキュベーションを２０−２４時間継続した。ＳＥＡＰ及びルシフェラーゼの検出は、それぞれ、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）及びＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ（商標）プロトコール（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に従った。ＳＥＡＰ検出について：２０μｌの細胞上清を１８０μｌの検出試薬（ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と共にインキュベートした。プレートを３７℃でインキュベートし、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して６５０ｎｍでのＯＤを読み取ることにより、ＳＥＡＰ活性を測定した。ポリティブコントロールとして、試験培地でそれぞれの濃度に希釈したマウスＩＦＮガンマ（ストック：１’０００’０００Ｕ／ｍｌ）を使用した。ルシフェラーゼ検出について：不透明プレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において２０μｌの細胞上清に５０μｌの検出試薬（ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加した。直ちに、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して発光を測定した。
【０２１５】
間接的Ｉ型インターフェロン活性化アッセイ。マウスＢ１６Ｆ１０又は４Ｔ１細胞を、上で説明したように、評価すべき菌株の示した感染多重度（ＭＯＩ）を用いて合計４時間、感染させた。次いで、細胞上清を、Ｉ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下で分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定的に発現するマウスＢ１６Ｆメラノーマ細胞上に移した（前記プロモーターは多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含む；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した、Ｂ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞）。増殖条件及びＩ型ＩＦＮアッセイは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎにより提供されたプロトコールから適応させた。簡単に述べると、１ウェル当り１５０μｌの試験培地（ＲＰＭＩ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ）中、１２’５００個のＢ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞を、平底９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に播種した。翌日、全培地を除去し、事前に感染させたＢ１６Ｆ１０又は４Ｔ１の１００ｕｌの細胞上清を添加した。プレートを２０−２４時間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。ＳＥＡＰの検出は、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）プロトコール（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に従った。２０μｌの細胞上清を１８０μｌの検出試薬（ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と共にインキュベートした。プレートを３７℃でインキュベートし、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して６５０ｎｍでのＯＤを読み取ることにより、ＳＥＡＰ活性を測定した。
【０２１６】
腫瘍内治療時のＢ１６Ｆ１０腫瘍同種移植マウスモデルにおける腫瘍進行の研究。全ての動物実験は、関係当局により認可されたものであり、地域のガイドライン及び動物保護法に従って行った。５−７週齢雌Ｃ５７Ｂ１／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から取り寄せた。少なくとも１週間の馴化後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中の１×１０６個のＢ１６−Ｆ１０細胞をマウスの右側腹部に皮下注射した。定期的な間隔で、マウスを行動及び身体的外見についてモニターし、体重を測定した。
【０２１７】
腫瘍が６０−１３０ｍｍ３の体積に達したら（０日目と定義した）処置を開始した。０、１、２、３、６及び９日目にイソフルラン麻酔下での腫瘍内注射（１投与当り５０ｕｌ  ＰＢＳ中の細菌７．５×１０７個）により、評価すべき細菌をマウスに投与した。マウスに腫瘍内投与した種菌を希釈平板法により検証した。コントロールとして、内毒素不含ＰＢＳのみをマウスに注射した。最終細菌治療（８日目）の２４時間前に、８ｍｇ／ｍｌのデスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射によってマウスに投与した。デジタルノギスでの腫瘍長及び幅の測定により、腫瘍進行を追跡した。腫瘍体積を０．５×長さ×幅２として決定した。１５００ｍｍ３を超える腫瘍体積を、人道的エンドポイントと定義した。
【０２１８】
腫瘍内治療時のＥＭＴ−６腫瘍同種移植マウスモデルにおける腫瘍進行及び再投与の研究。全ての動物実験は、関係当局により認可されたものであり、地域のガイドライン及び動物保護法に従って行った。５−７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から取り寄せた。少なくとも１週間の馴化後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１×１０６個のＥＭＴ−６細胞をマウスの右側腹部に皮下注射した。定期的な間隔で、マウスを行動及び身体的外見についてモニターし、体重を測定した。
【０２１９】
腫瘍が６０−１３０ｍｍ３の体積に達したら（０日目と定義した）処置を開始した。０、１、５、６、１０及び１１日目にイソフルラン麻酔下での腫瘍内注射（１投与当り５０ｕｌ  ＰＢＳ中、細菌７．５×１０７個）により、評価すべき細菌をマウスに投与した。マウスに腫瘍内投与した種菌を希釈平板法により検証した。コントロールとして、内毒素不含ＰＢＳのみをマウスに注射した。最終細菌治療（１０日目）の２４時間前に、８ｍｇ／ｍｌのデスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射によってマウスに投与した。デジタルノギスでの腫瘍長及び幅の測定により、腫瘍進行を追跡した。腫瘍体積を０．５×長さ×幅２として決定した。１５００ｍｍ３を超える腫瘍体積を、人道的エンドポイントと定義した。治療開始後５４日目に完全腫瘍退縮を示したマウスを、イソフルランを使用して麻酔し、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１×１０６個のＥＭＴ−６細胞を、初回腫瘍細胞注射に対して対側（左側）の側腹部に皮下注射した。コントロール群として、過去にＥＭＴ−６細胞の移植を受けたことがないナイーブマウスを含めた。デジタルノギスでの腫瘍長及び幅の測定により、腫瘍進行を追跡した。腫瘍体積を０．５×長さ×幅２として決定した。１５００ｍｍ３を超える腫瘍体積を、人道的エンドポイントと定義した。
【０２２０】
静脈内治療時のＥＭＴ−６腫瘍同種移植マウスモデルにおける腫瘍進行の研究。全ての動物実験は、関係当局により認可されたものであり、地域のガイドライン及び動物保護法に従って行った。５−６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から取り寄せた。少なくとも１週間の馴化後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１×１０６個のＥＭＴ−６細胞をマウスの右側腹部に皮下注射した。定期的な間隔で、マウスを行動及び身体的外見についてモニターし、体重を測定した。
【０２２１】
腫瘍が８０−２５０ｍｍ３の体積に達したら（０日目と定義した）マウスを治療群に無作為化した。無作為化（Ｄ−１）の２４時間前に、８ｍｇ／ｍｌのデスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射によりマウスに投与した。０日目にイソフルラン麻酔下での静脈内注射（１投与当り１００ｕｌ  ＰＢＳ中の細菌５×１０６個）により、評価すべき細菌をマウスに投与した。マウスに静脈内投与した種菌を希釈平板法により検証した。コントロールとして、内毒素不含ＰＢＳのみをマウスに注射した。デジタルノギスでの腫瘍長及び幅の測定により、腫瘍進行を追跡した。腫瘍体積を０．５×長さ×幅２として決定した。１５００ｍｍ３を超える腫瘍体積を、人道的エンドポイントと定義した。
【０２２２】
腫瘍細胞単離物感染時のＩＦＮβ分泌の測定。全ての動物実験は、認可されたものであり（ｌｉｃｅｎｓｅ  １９０８；Ｋａｎｔｏｎａｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ  Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔ）、地域のガイドライン（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ−Ｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇ；Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔ）及びスイス動物保護法（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ−Ｇｅｓｅｔｚ）に従って行った。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｍｖｏｅｒ  Ｌａｂｓから取り寄せた。少なくとも１週間の馴化後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、１００ｕｌ  ＥＭＴ−６細胞（細胞１×１０６個）をマウスの側副部に皮下注射した。この実験を通して、マウスの行動及び身体的外見についてのスコアを付け、体表温度及び体重を測定した。デジタルノギスでの腫瘍長及び幅の測定により、腫瘍進行を追跡した。腫瘍体積を０．５×長さ×幅２として決定した。アッセイ当日、腫瘍を単離し、１−２ｍｍの小片に切断し、１−１．５時間消化し、７０μｍナイロンメッシュに通して単一細胞懸濁液を得た。この粗細胞単離物の細胞数を判定し、１ウェル当り細胞３００’０００個を平板２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内の増殖培地（ＤＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン＋非必須アミノ酸＋１０％ＦＣＳ）に播種した。３７℃及び５％ＣＯ２で１時間のインキュベーション後、１ウェル当り１００μｌの細菌（増殖培地で希釈して、異なる感染多重度）の滴定を加えることにより、評価すべき菌株に細胞を感染させた。１時間のインキュベーション（３７℃及び５％ＣＯ２）後、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を含有する増殖培地を添加することにより細菌を殺滅した。インキュベーションをさらに３時間継続した。プレートを遠心分離して全ての細胞をウェルの底に集め、上清を、ＩＦＮβ濃度について、ＬｕｍｉＫｉｎｅ（商標）ＸｐｒｅｓｓマウスＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により、製造業者の説明書に従って分析した。
【０２２３】
Ｂ）結果
ＹｏｐＥ融合タンパク質の３型分泌に基づくタンパク質送達系
Ｙ．エンテロコリティカＴ３ＳＳエフェクターＹｏｐＥ（配列番号１）のまさにＮ末端は、異種タンパク質を移行させるのに十分な分泌シグナルを有する２２が、そのシャペロン（ＳｙｃＥ）についてはシャペロン結合部位（ＣＢＳ）を含まない３６。本発明者らは、ＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸（配列番号２）を選択して、送達すべきタンパク質と融合させた。このＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸は、他の異種Ｔ３Ｓ基質の移行について最良の結果をもたらすことが証明されていた２４からであった。ＹｏｐＥのこれらのＮ末端１３８アミノ酸はＣＢＳを含有するので、本発明者らは、さらに、ＳｙｃＥを共発現させることを決めた。精製Ｙ．エンテロコリティカｐＹＶ４０毒性プラスミドからクローニングしたＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ１−１３８断片は、ＹｏｐＥの及びそのシャペロンＳｙｃＥの内在性プロモーターを含有する（図２）。したがって、ＳｙｃＥと任意のＹｏｐＥ１−１３８の融合タンパク質は、室温での増殖から３７℃への急速な温度シフトにより誘導される。３７℃での培養時間は、細菌内に存在する融合タンパク質量に影響を与えることになる。多重クローニング部位（ＭＣＳ）をＹｏｐＥ１−１３８の３’末端に付加させ（図２Ｂ）、その後、Ｍｙｃ及び６×Ｈｉｓタグ及び終止コドンを付加させた。
【０２２４】
バックグラウンド株を注意深く選択した。先ず、内在性エフェクターの移行を制限するために、本発明者らは、公知のエフェクター、Ｙｏｐ  Ｈ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ及びＴの全てが欠失したＹ．エンテロコリティカ株（名称ＨＯＰＥＭＴ）３７を使用した。加えて、本発明者らは、外来メソ−２，６−ジアミノピメリン酸の非存在下では増殖することができない栄養要求突然変異株３８を時には使用した。この株のアスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失したものであり（Δａｓｄ）、Ｓｗｉｓｓ  ｓａｆｅｔｙ  ａｇｅｎｃｙによりバイオセーフティレベル１に分類されている（Ａ０１００８８／２に対する補正）。加えて、本発明者らは、バックグラウンド株のより大規模な選択をもたらすために接着タンパク質ＹａｄＡ及び／又はＩｎｖＡを欠失させた。ｙａｄＡ又はｙａｄＡ／ｉｎｖＡ株を使用は、誘導されるバックグラウンドシグナルを低減させるが３９が、送達されるタンパク質量も同様に影響を受ける４０。
【０２２５】
真核細胞への融合タンパク質の移行後のＹｏｐＥ１−１３８付属物の除去
ＹｏｐＥ１−１３８断片は、細菌送達に大いに役立つものであるが、融合タンパク質の機能及び／又は局在化を妨げる可能性がある。したがって、タンパク質送達後にそれを除去することが最適であるだろう。この目的のために、本発明者らは、ＹｏｐＥ１−１３８と融合パートナー（転写制御因子ＥＴ１−Ｍｙｃ（配列番号９及び１１）４４及びヒトＩＮＫ４Ｃ（配列番号８及び配列番号１０））との間に２つのＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）４１−４３を導入した。提供する方法の優位性を保持するために、本発明者らは、別のＹ．エンテロコリティカ株においてＴＥＶプロテアーゼ（Ｓ２１９Ｖバリアント；４５）をＹｏｐＥ１−１３８（配列番号１２）とさらに融合した。ＨｅＬａ細胞を一度に両方の株に感染させた。タンパク質の移行画分のみの分析を可能にするために、感染ＨｅＬａ細胞を、感染の２時間後に、細菌を溶解しないことが公知であるジギトニンを用いて溶解した（４６；）。ウェスタンブロット分析は、細胞が対応する株に感染した場合にのみ、ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−Ｍｙｃの存在を明示した。この細胞溶解物を精製ＴＥＶプロテアーゼで一晩消化すると、シフトしたバンドを観察することができた。このバンドは、ＴＥＶ切断部位のＮ末端に残存物がある、ＥＴ１−Ｍｙｃ又はＦｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃに対応し、この残存物は、１つのセリンのみの可能性が最も高い。ＴＥＶプロテアーゼを送達する株に細胞を同時感染させると、同じ切断ＥＴ１−Ｍｙｃ又はＦｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ断片が目に見えるようになった。これは、Ｔ３ＳＳを介して送達されたＴＥＶプロテアーゼが機能性であること、及び単一細胞が両方の菌株に感染したことを示す。切断は完全なものではないが、移行したタンパク質の大多数が、感染の２時間後に既に切断され、精製ＴＥＶプロテアーゼで一晩消化しても、より高い切断率は得られなかった。報告されているように、ＴＥＶプロテアーゼ依存性切断は、融合タンパク質次第で最適化を必要とする可能性がある４７、４８。したがって、移行後のＹｏｐＥ１−１３８付属物のＴＥＶプロテアーゼ依存性除去は、アミノ酸組成をＮ末端アミノ酸１つだけしか変化させずに、ほとんどの天然異種タンパク質のＴ３ＳＳタンパク質送達をもたらす初めてのものである。
【０２２６】
ＹｏｐＥ断片のＴＥＶプロテアーゼ依存性切断の代替の手法は、目的の融合タンパク質にユビキチンを組み込むことに存した。実際、ユビキチンは、そのＣ末端で、内在性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）群により、プロセシングされる。切断はユビキチンのまさにＣ末端（Ｇ７６の後ろ）で起こるはずであるので、目的のタンパク質には追加のアミノ酸配列がないはずである。この方法を、ＹｏｐＥ１−１３８−ユビキチン−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ融合タンパク質を用いて試験した。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを発現する細菌に感染させたコントロール細胞では、融合タンパク質の効率的移行を示す、ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓに対応するバンドが見られた。ＹｏｐＥ１−１３８−ユビキチン−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを発現する細菌に細胞を１時間感染させたとき、Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓのサイズに対応する追加のバンドが目に見えた。これは、融合タンパク質の一部が切断されたことが示す。この結果は、融合タンパク質へのユビキチンの導入により、外来プロテアーゼを必要とすることなくＹｏｐＥ１−１３８断片を切り離すことが可能になることを示す。
【０２２７】
真核細胞に対する毒性活性を有する細菌エフェクタータンパク質の欠失／変異による弱毒化
Ｙ．エンテロコリティカの場合、毒性は、「エルシニア属外部タンパク質」（Ｙｏｐ）と呼ばれる６つの内在性エフェクタータンパク質、詳細には、ＹｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ（ＭＲＳ４０  ｐＩＭＬ４２１［ｙｏｐＨΔ１−３５２、ｙｏｐＯΔ６５−５５８、ｙｏｐＰ２３、ｙｏｐＥ２１、ｙｏｐＭ２３、ｙｏｐＴ１３５］）の欠失により低減される３７。これらのＹｏｐは、約７０ｋｂｐサイズのプラスミドである、「エルシニア属毒性プラスミド」（ｐＹＶ）上にコードされており、プラスミド上には、完全３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）はもちろん他の毒性プレーヤーもコードされている（図４）。ＹｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ及びＴは、免疫系を調節し弱めるために細菌３型分泌系により宿主細胞に送達される６つのエフェクタータンパク質である。各Ｙｏｐは、宿主細胞において特異的生化学的活性を有する。ＹｏｐＴは、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅのＣ末端システインを切り離し、かくて、ＧＴＰａｓｅを膜に固定化するイソプレニル基を除去する。誤った局在化に起因するＲｈｏのこの活性化により、マクロファージ及び好中球のような免疫細胞による食作用が回避される４９。同じ経路で、ＹｏｐＥは、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅに対してＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）として作用して、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅを不活性化する。この結果、免疫細胞による食作用が減少し、ＩＬ−１ベータ放出が阻害されることになる４９。さらに、ＹｏｐＯは、グアニジンヌクレオチド解離阻害因子（ＧＤＩ）として作用して、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅを不活性化する。ＹｏｐＯは、アクチン細胞骨格に対してまだ定義されていない方法で作用する、セリン／スレオニンキナーゼドメインを有する４９。ＹｏｐＨは、接着斑キナーゼ（Ｆａｋ）のような接着斑タンパク質、パキシリン等に対して作用し、かくてマクロファージ及び好中球による食作用を強力に防止する、チロシンホスファターゼである４９。ＹｏｐＰは、偽結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）ではＹｏｐＪと称するものであり、免疫細胞におけるＭＡＰＫ／ＮＦｋＢ経路を不活性化して、これらの細菌の存在による刺激を受けた免疫細胞からのＴＮＦａ及びＩＬ−８放出を防止することが判明した。さらに、ＹｏｐＰは、免疫細胞においてアポトーシスを誘導することが判明しており、これは、ＭＡＰＫ経路における効果に関係がある可能性があり、これは活性化状態で細胞をアポトーシスから保護する４９。ＹｏｐＭの役割は、まだ完全に明らかになってはいないが、ＹｏｐＭは、リボソームＳ６キナーゼ１（ＲＳＫ１）及びプロテインキナーゼＣ様２（ＰＲＫ２）に関連して見出された。ＹｏｐＭは、ＲＳＫ１のリン酸化を刺激し、かくて、例えば細胞周期進行のような、下流の標的に作用するように思われる４９。これらのＹｏｐのうちの１つ又はいくつかを欠失させることにより、免疫系に対する細菌の防御機構に劇的な影響を与えられる５０。それぞれのｙｏｐの変異を、それぞれの領域に関してＰＣＲにより確認し、またインビトロ分泌アッセイにより確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によるインビトロでの分泌の分析により、完全長ＹｏｐＨ、Ｏ、Ｍ及びＹｏｐＥの非存在が確認さ���た。
【０２２８】
さらに、ａｓｄ（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）が欠失しているＹ．エンテロコリティカ株を構築した。ａｓｄの変異は、メソ−ジアミノピメリン酸を加えなくても、増殖能力の完全喪失をもたらす。これにより、それぞれのプラスミド上のａｓｄの存在に基づいて抗生物質不使用のプラスミド維持系の生成が可能になる。同様の方法で、他の栄養要求突然変異株を使用することができるだろう。
【０２２９】
増強アポトーシス促進性細菌の生成
送達又はアポトーシス促進性タンパク質を最適化するために、様々なアポトーシス促進性タンパク質で形質転換された株が表ＩＶの通りに生成されている。
0006976351.tif 000006
【０２３０】
シグナル伝達に必要な必須ドメイン（例えば、ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン（配列番号１９））に送達されるタンパク質の短縮は、細胞殺滅効率を増加させることができる（図５）。理論に縛られることは望まないが、有効性のこの増加は、送達されるタンパク質のより小さいサイズに起因するタンパク質産生量の増加及びＴ３ＳＳによる後続の送達量の増加に関係する可能性が高い。ＹｏｐＥ部分とｔＢＩＤのＢＨ３ドメインの間へのリンカー（配列番号２３）の導入は、さらなるアミノ酸４個分ＢＨ３ドメイン（配列番号２２）を伸長するばかりでなく、有効性を低下させた（図５）。
【０２３１】
加えて、そのような必須ドメイン（例えば、ｔ−ＢＩＤのＢＨ３ドメイン（配列番号２７））のリピート又はそれらの必須ドメイン（例えば、ｔ−ＢＩＤのＢＨ３ドメインとＢＡＸのＢＨ３ドメイン（配列番号２４及び２８））の組合せを有する合成輸送基質を生成した。驚くべきことに、同じ又は異なるＢＨ３ドメインのタンデムリピートは、がん性細胞株（４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０細胞を含む）に対するアポトーシス誘導増強をもたらすことが判明した（図５）。真核細胞１個当りのそのような細胞の５０％を殺滅するために必要とされる細菌数（感染多重度）を指すＩＣ５０（半最大阻害濃度）は、単一ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインと比較してｔＢＩＤ  ＢＨ３のタンデムリピートの送達時に減少することが判明した（図５）。タンパク質サイズは、ｔＢＩＤの第２のＢＨ３ドメインとしての融合により増加されるので、この研究結果は、驚くべきものであった。このために、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３（配列番号１９及び２５）と比較してＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）の発現と送達レベル減少が予想され、最大で同等レベルに達する可能性があった。細胞殺滅活性の増加を達成するために、融合ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインは、真核細胞へのＴ３ＳＳによる送達時に一緒に同時に作用しなければならない。ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２構築物中の１つのｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインしか機能しない場合、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３を用いた場合とせいぜい同じ効率しか期待できないだろう。
【０２３２】
インビボ研究のためにＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）の遺伝的安定性を増加させるために、本発明者らは、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）をエルシニア属毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に、（変異誘発プラスミドｐＳＩ＿４０８及びｐＳＩ＿４１９を使用して）天然ＹｏｐＥプロモーターのもとで、相同組替えによりクローニングした。そのような変異誘発物質は、組込みが起こるそれぞれの遺伝子の部位に応じて２００−２５０ｂｐの配列が両側に隣接している、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する。これらのプラスミドを大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ内に形質転換し、そこからプラスミドを対応するＹ．エンテロコリティカ株内に移動させた。組込み型ベクターを保有する突然変異株を選択圧なしで数世代増殖させた。次いで、スクロースを使用して、ベクターを失ってしまったクローンについて選択した。最後に、突然変異株をコロニーＰＣＲにより同定した。Ｔ３ＳＳによる輸送のための内在性タンパク質（「エルシニア属外部タンパク質」、Ｙｏｐ、と呼ばれる）は、エルシニア属毒性プラスミド（ｐＹＶ）という名称の、Ｙ．エンテロコリティカのこの７０ｋｂプラスミド上にコードされており、このプラスミドは、Ｔ３ＳＳ装置をさらにコードする。
【０２３３】
エルシニア毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に、天然ＹｏｐＥプロモーターのもとで、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）（配列番号１９及び２５）又はＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）をコードする、エルシニア属株を、がん性細胞（４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０細胞を含む）においてアポトーシスを誘導する能力について評価した（図６）。真核細胞１個当りのそのような細胞の５０％を殺滅するために必要とされる細菌数（感染多重度）を指すＩＣ５０（半最大阻害濃度）は、単一ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインと比較してｔＢＩＤ  ＢＨ３のタンデムリピートの送達時に、両方のタンパク質が、エルシニア属毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に、天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでコードされている場合、減少することが判明した（図６）。これは、これらのタンパク質の発現プラスミド媒介送達からの研究結果（図５）と一致する。重ねて、タンパク質サイズは、ｔＢＩＤの第２のＢＨ３ドメインの融合により増加されるので、この研究結果は、驚くべきものであった。このために、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３（配列番号１９及び２５）と比較してＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）の発現と送達レベル減少が予想され、最大で同等レベルに達する可能性があった。細胞殺滅活性の増加を達成するために、融合ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインは、真核細胞へのＴ３ＳＳによる送達時に一緒に同時に作用しなければならない。ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２構築物中の１つのｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインしか機能しない場合、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３を用いた場合とせいぜい同じ効率しか期待できないだろう。さらに、エルシニア毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）をコードするエルシニア株を、がん性細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの能力について、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２の発現ブラスミド（ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡに基づく）由来送達と比較した。ｐＹＶ（１−６コピーと報告される）と比較して高い、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのコピー数（２０−２５コピー）と一致して、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）のｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡに基づく送達は、４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０細胞のＩＣ５０値をわずかに低下させる結果となった（図６）。
【０２３４】
メラノーマのマウスモデルにおける体内分布研究
腫瘍特異的ビヒクルとしての、Ｔ３ＳＳエフェクターのような重要な毒性決定因子の変異を有するグラム陰性菌を検証するために、十分に確証されているＢ１６Ｆ１０メラノーマモデル（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５）を使用するマウス同種移植腫瘍研究を行った。皮下腫瘍がある特定のサイズ（約１００−２００ｍｍ３）に達したら、マウスを２×１０５ｃｆｕのＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０又はＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔに静脈内感染させた。細菌増殖を可能にするために、感染の２４時間前にマウスをデフェロキサミンで前治療した。ｗｔ  Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０株に感染したマウスは、身体的外見及び行動について高いスコアが付き（図４７−４８）、感染の最初の４８時間にわたって有意な体重減少を示し（図４９）、これに促されて、本発明者らは、この群のマウス全てを既に感染後２日目に屠殺した。対照的に、Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ株に感染したマウスは、感染後４日目でも、有意な体重減少を示さず、身体的外見及び行動について正常なスコアが付与された（図４７−４９）。ｗｔ株（Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０）に感染したマウスでは、評価した全ての臓器において、及びさらには血液中で、生きている細菌が検出された（図５１）。悪性固形腫瘍内に存在するｗｔ細菌が認められたが、同程度に多い又はそれ以上に多い数が他の臓器において認められ、脾臓内が最も多かった（図５１）。際だって対照的に、Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔに感染したマウスでは、生きている細菌は、感染後１日目に主として悪性固形腫瘍内で認められ、少ない細菌数が脾臓、肝臓及び肺で観察された。特に、感染後４日目に、悪性固形腫瘍内の細菌数は、数桁増加した（腫瘍組織１ｇ当り１０８ｃｆｕ超に達した）が、評価した全ての他の臓器では、細菌数が検出限界未満に低下した（図５０）。したがって、Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔは、感染後４日目に、脾臓又は肝臓と比較して（検出限界に対して割当量を計算して）悪性固形腫瘍部位で約（最小限）１００万倍の割当量で蓄積した。
【０２３５】
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担持マウスの外側尾静脈への静脈内投与後５又は８日目に、固形腫瘍１グラム当り、同様の多数の細菌が、Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ、Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤ又はＹ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤについて測定された（図２６）。これらにより、Ｔ３ＳＳ制御に影響を与える異種タンパク質カーゴ及びさらなる突然変異（ＶｉｒＦ）が、マウスモデルにおいて固形腫瘍の細菌定着に影響を及ぼさないことが検証される。
【０２３６】
これらの結果は、悪性固形腫瘍を特異的に標的とする細菌ビヒクルを生成するために、重要な毒性決定因子の変異により弱毒化するこの戦略を認証するものであった。
【０２３７】
細菌投与後１４日目までのインビトロでの腫瘍特異的増殖の検証
遺伝子修飾Ｙ．エンテロコリティカによる腫瘍定着実験を同系マウス同種移植モデル（４Ｔ１乳がんモデル）において繰り返し、細菌の定着を２週間にわたって追跡した。このとき、マウスを１×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔに感染させた。感染後まだ間もない頃にＢ１６Ｆ１０モデルと同様の結果を得たが、本発明者らは、腫瘍定着が、感染後８日目に、そして１４日目まで一貫して認められることをさらに明らかにすることができた（図７）。さらに、この定着は非常に特異的であり、評価した他の全ての臓器においてほんの少数の細菌しか検出されなかった（図８）。これらの研究結果は、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔが、腫瘍の持続的定着を確立することによって、免疫系によるクリアランスを防止することができることを示す。
【０２３８】
腫瘍進行を遅らせる点でのＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴの有効性
インビボで腫瘍細胞に送達されるＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２の影響を評価するために、本発明者らは、４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて研究を行った。本発明者らは、エルシニア属毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ株を評価し、それを、ＶｉｒＦの上流のｈａｉｒｐｉｎ  Ｉ領域の欠失によりさらに最適化して送達されるタンパク質量を増加させることを目標とした。腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら、ＰＢＳ又は１×１０７のＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ｖｉｒＦ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２をマウスに静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義した。その後数日（細菌の静脈内注射後０日目から９日目まで）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍サイズの一切の初期均質性を補償するために、腫瘍体積を０日目の腫瘍体積に対して正規化した。Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２での治療は、腫瘍体積進行に対する影響を示し、細菌投与後８、９及び１０日目に統計的に有意な腫瘍低減があった（図９）。重要なこととして、単独でのＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴは、４Ｔ１マウスがんモデルにおいて腫瘍進行に影響を与えないことが判明した（図１０）。これらの実験結果は、そのような細菌及びそれらのＴ３ＳＳを腫瘍進行の妨害に用いることができることに光を当てるものである。
【０２３９】
ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の上流のＲＮＡ温度センサー領域内に欠失を有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ
ほとんどの公知エルシニア属毒性遺伝子は、真核生物宿主外では発現されず、宿主環境への侵入後にしか誘導されない。これらの毒性遺伝子の発現は、宿主への侵入に関連する温度の急上昇により誘導される。特に、Ｔ３ＳＳ及びそのエフェクタータンパク質（Ｙｏｐ）のような、ｐＹＶにコードされた毒性因子は、このように制御される。室温（２０−２５℃）では、Ｔ３ＳＳの制御、Ｔ３ＳＳ形成に必要な遺伝子それ自体、及び送達されたエフェクターは、発現されず、そのような温度が３７℃に上昇された時のみ、発現が誘導される。ｐＹＶにコードされた毒性遺伝子（ｙａｄＡ及びＴ３ＳＳ関連遺伝子）の大多数の発現は、温度により誘導され、Ｙ．エンテロコリティカではＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質ＶｉｒＦ（他のエルシニア属種ではＬｃｒＦ）を必要とする。ＬｃｒＦの発現の温度制御は、より高温でのｍＲＮＡ内のＲＮＡステム−ループの融解によって起こると考えられ、融解されない場合にはリボソーム結合部位を封鎖し、かくて翻訳を防止する５１。対照的に、Ｙ．エンテロコリティカの場合、ＶｉｒＦの転写が、主として、温度に依存することが証明されている５２。つい最近の研究はより複雑な状況を示し、ＹｍｏＡと呼ばれる熱不安定性制御因子の関与を示唆するが５１、一方、ＬｃｒＦの上流のＲＮＡ温度センサーが、ＬｃｒＦの温度制御、したがって温度依存性毒性遺伝子の主な原因であることが判明した。
【０２４０】
天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでｐＹＶから発現される異種カーゴの分泌レベルを増加させるために、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカにおけるＶｉｒＦの上流のこれらのＲＮＡヘアピン構造の１つを欠失させることを目標とした。そのようなＲＮＡステム−ループの重要性は、Ｙ．エンテロコリティカでは明確に示されておらず、温度誘導は、どちらかと言えば転写の変化によるものとされたが、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカＶｉｒＦの上流のｈａｉｒｐｉｎ  Ｉ５１を同定することができた。そこで、相同組換えにより、本発明者らは、ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉの一部（５１におけるような−１１１から−５７まで）を除去し、ｐＹＶにコードされたＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）又はＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２タンパク質（配列番号３８）（各々、ＹｏｐＥの天然部位におけるもの）の分泌能をインビトロ分泌アッセイで評価した（図１１）。驚くべきことに、Ｙ．エンテロコリティカにおけるＶｉｒＦの上流のヘアピン領域Ｉの一部の欠失は、インビトロで異種タンパク質の分泌を増加させた（図１１Ａ及びＢ）。これは、ＶｉｒＦの転写が温度制御の主要駆動因子であると考えられたＹ．エンテロコリティカに関する以前の報告５２とは対照的である。
【０２４１】
Ｔ３ＳＳの発現及びＴ３ＳＳによるタンパク質の送達を人工的に誘導することができるように、本発明者らは、別の株においてｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡから公知であるようなアラビノース誘導性プロモーターによってｐＹＶ上のＶｉｒＦの内在性プロモーターを置換した。ＶｉｒＦのプロモーターを置換することに加えて、本発明者らは、上流に（逆方向に）全長ａｒａＣ遺伝子を導入した。次いで、本発明者らは、インビトロ分泌アッセイにおいて、アラビノースの非存在又は存在下で、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２７）（ｐＹＶにコードされており、ＹｏｐＥの天然部位にある）の分泌能を評価した（図１１Ａ）。アラビノースの付加時にのみ、異種タンパク質は、Ｔ３ＳＳにより分泌されることが判明した。これは、アラビノースによるＦｉｒＦの発現の制御と一致する。
【０２４２】
異種カーゴの安定性増大を有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ（インビトロ及びインビボ）
Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔは、本発明者らのマウス実験で固形腫瘍を標的とする非常に特異的な株であることが明らかになり、その一方で、細胞傷害性タンパク質のＴ３ＳＳ依存性送達はがん細胞に関する細胞培養で効果的であることが判明した。これら２つの形質を併用するために、数日又はさらには数週間にわたってインビボで細胞傷害性カーゴを安定的にコードするように固形腫瘍定着細菌を最適に操作する必要がある。制御要件のため、細菌内に外来プラスミドを維持するための古典的抗生物質耐性の使用は、不利である。それ故、マウス同種移植研究において、本発明者らは、抗生物質耐性のないプラスミド維持系を評価した。この系は、必須遺伝子（例えば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ａｓｄ）の染色体欠失、及び細菌増殖を維持するための異種プラスミド上の同遺伝子のコーディングに基づく。プラスミド維持のためのａｓｄ欠失の補完は以前に明らかにされている５３が、再現性及び数日にわたっての持続性の相違が報告されている５４。本発明者らは、この系をＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔにおいての使用に適応させ、そこで、本発明者らは、染色体にコードされたａｓｄをさらに欠失させ（その結果、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄを得）、次いで、中等度コピー数のプラスミドｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ上においてａｓｄを戻した（ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄ）。ａｓｄ遺伝子をＹ．エンテロコリティカ８０８１からクローニングし、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＰｃｉＩ部位にその内在性プロモーター及び転写ターミネーターと共にそれぞれ順方向及び逆方向に挿入した。得られた株Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄ（順又は逆ａｓｄ方向）の増殖挙動を培養フラスコにおいてインビトロ（ＢＨＩ培地）でｗｔ及び親Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ株と比較した（図１２）。両方の方向で、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄは、ａｓｄの欠失時に観察された表現型を回復させた（図１２）。対照的に、Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウスモデル及び４Ｔ１モデルでは、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄが十分に固形腫瘍に定着しないことを見出し（図１３及び１４）、単離した少数のコロニーから本発明者らはｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄプラスミドを回収することができなかった。さらに、Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウスモデルから単離したコロニーを、アンピシリン耐性をコードするｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄプラスミドの存在に有利になるアンピシリン含有プレート上で、増殖について検証した。静脈内注射後４日目に、単離したコロニーのわずかな割合しかアンピシリン耐性を示さなかった（図１３）。これは、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄの欠損を示す可能性があったが、アンピシリン耐性遺伝子のみの欠損に、又はアンピシリンによる殺滅を回避するのに十分迅速なアンピシリン耐性遺伝子の発現の再始動の困難に関連する可能性もあった。いずれにせ��、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマウスモデル及び４Ｔ１モデルにおいて観察されたエンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ＋ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ａｓｄでの腫瘍定着は、固形腫瘍内の細菌数の急減を示し、これは、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔとは対照的である。このように、染色体ａｓｄの欠失及びｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡに対する補完は、インビボでの細菌の適応度の大幅な低下をもたらす。この観察は、バランスの取れていないａｓｄレベルによる生存率低下に関する報告５４と一致する。
【０２４３】
Ｔ３ＳＳによる輸送のための内在性タンパク質（「エルシニア属外部タンパク質」、Ｙｏｐと呼ばれる）は、Ｙ．エンテロコリティカにより７０ｋｂプラスミド上にコードされている。エルシニア属毒性プラスミド（ｐＹＶ）という名のこのプラスミドは、Ｔ３ＳＳ装置をさらにコードする。本発明者らは、４Ｔ１マウス同種移植モデルにおけるｐＹＶプラスミドの安定性を評価した。本発明者らは、マウス感染後９又は１０日目に回収した株からのｐＹＶの単離に成功した（図１５）。本発明者らは、インビボで固形腫瘍において８日増殖させた後に単離した菌株のＴ３ＳＳの存在及び機能性を確認する試験をさらに行った。その結果として、本発明者らは、ｐＹＶを、インビボでの送達のための異種カーゴをコードするのに最適なベクターと考える。とは言え、本発明者らは、マウスにおける４Ｔ１腫瘍において９−１０日間増殖させた後、ｐＹＶプラスミを有する細菌コロニーの割合が不均質であることを認めた（図１５）。ｐＹＶの固有の不安定性に加えて、株Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔは、インビボで、毒性を増加させるＹｏｐの選択的優位性を失った。
【０２４４】
ｐＹＶを安定させ、ひいてはｐＹＶ上にコードされた異種カーゴを安定させるために、本発明者らは、ｐＹＶ上のＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔにおける使用に「ａｓｄ」系を適応させた。本発明者らは、染色体にコードされたａｓｄを欠失させ（その結果、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄを得）、次いで、ｐＹＶ上にａｓｄを戻した（ｐＹＶ−ａｓｄと呼ぶ）。ａｓｄ遺伝子をＹ．エンテロコリティカ８０８１（Ｙ．エンテロコリティカ亜種エンテロコリティカ８０８１；ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００８８００．１）からクローニングし、相同組換えによりｐＹＶ上に（ＳｙｃＯの前の天然挿入領域内に）その内因性プロモーター及び転写ターミネーターと共に挿入した。得られた株Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ＋ｐＹＶの増殖挙動を、培養フラスコにおいてインビトロ（ＢＨＩ培地）でｗｔ及び親Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ  Δａｓｄ株と比較した（図１２）。ｐＹＶ−ａｓｄは、ａｓｄの欠失時に観察された表現型を回復させることができた（図１２）が、この回復は完全でなく、インビトロでわずかな増殖低減を観察することができた。対照的に、インビボでのシンジェニック４Ｔ１マウスがんモデルでは、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ＋ｐＹＶ−ａｓｄが十分に固形腫瘍に定着することが認めた（図１６）。際だったこととして、注射後９−１０日目に固形腫瘍から単離したコロニーは全て、ｐＹＶプラスミドを依然として含有すること（亜ヒ酸塩含有増殖プレートでの選択；亜ヒ酸塩耐性は、ｐＹＶ上のａｒｓＲＢＣ遺伝子の存在に関連している５５）が判明した（図１５）。したがって、驚くべきことに、ｐＹＶ−ａｓｄは、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔ  Δａｓｄ株バックグラウンドで数日及び数週間にわたって定着菌により固形腫瘍において発現される異種タンパク質をコードするためのインビボ安定性ベクターであることが明らかになった。
【０２４５】
腫瘍進行を遅らせる点、及び変化するＶｉｒＦ活性に対する影響、並びに安定性を増大させる点でのＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴの有効性
４Ｔ１細胞（図９及び１０）と同様の実験を、ＥＭＴ６乳がんマウスモデルにおいて行い、この実験では、野生型Ｂａｌｂ／ＣマウスにＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植し、腫瘍が約８０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら細菌の単回静脈内投与で治療した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義し、全てのマウスにｄ０の前日にデスフェラールの腹腔内注射を施した。Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴでの治療は、生理食塩水と比較して腫瘍進行に影響を与えなかった。Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２は、腫瘍進行に対してわずかな影響を与え、これが、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２の使用により強化された（図４５）。これらの研究結果は、そのような細菌及びそれらのＴ３ＳＳを腫瘍進行への干渉に利用することができること、並びにＶｉｒＦ活性の操作を、インビボでの投与時の細菌Ｔ３ＳＳ活性の調節に使用することができることに光を当てるものである。さらに、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ΔＨａｉｒｐｉｎＩ−ＶｉｒＦ  Δａｓｄ  ｐＹＶ−ａｓｄ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２の使用は、腫瘍進行に対する影響をさらに強化した（図４５）。このことにより、全身投与時の遺伝子安定性増大の利点が強調される。
【０２４６】
Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導のための細菌Ｔ３ＳＳを介したＲＩＧ−１様受容体経路誘発タンパク質の送達
サイトゾル核酸は、サイトゾル中の病原体由来ＲＮＡを検出するＲＩＧ−１様受容体（ＲＬＲ）ファミリーメンバーのような受容体により感知される５６。ＲＩＧ−１及びＭＡＤ５は、２つのＮ末端ＣＡＲＤドメインと特定の核酸を感知する中心（ＤｅｘＤ／Ｈ）ヘリカーゼドメインとからなる５６。刺激性ＲＮＡへの結合は、オリゴマーを形成するための５６（及びＭＤＡ５の場合はフィラメント形成への５６）非固着Ｋ６３連結ユビキチン鎖とのその後の会合のためにそのＣＡＲＤを遊離するＲＩＧ−Ｉ（及びＭＡＤ５）の構造再構成を誘導する。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５のオリゴマー化したＣＡＲＤドメインは、ＭＡＶＳのＣＡＲＤドメインと相互作用する。この相互作用は、ＭＡＶＳの単一のＣＡＲＤドメインの重合を促進し、これが下流のシグナル伝達を誘導し、最終的にはＩ型ＩＦＮ遺伝子の誘導に至る５６。
【０２４７】
本発明者らは、Ｔ３ＳＳ、特にＹｏｐＥ１−１３８による送達のためのＮ末端細菌分泌シグナルと融合したヒト又はマウス由来のＲＩＧ−１の２つのＮ末端ドメイン（配列番号３７及び３８）を発現する菌株を生成した。融合タンパク質ＹｏｐＥ１−１３８−ＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２の送達を、標準的なインビトロ分泌アッセイにより評価し、送達されたタンパク質の機能性を、レポーター細胞株でＩ型ＩＦＮ誘導について評価した。Ｉ型ＩＦＮ刺激のためのマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマレポーター細胞は、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく。ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−ＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２タンパク質を移行させる菌株の様々な量（感染多重度）に、レポーター細胞を感染させた。ＲＩＧ−１のマウス及びヒトＮ末端ＣＡＲＤドメインは、レポーター細胞株において用量依存性Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導することを示した（図１７）が、細菌バックグラウンド株（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ）は、そのような応答を誘導することができなかった（図１７）。ヒト及びマウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインは、マウスレポーター細胞株において同様のＩ型ＩＦＮ応答を誘導した（図１７）。これは、高い配列同一性（７６％）及び類似性（８８．５％）と一致する。
【０２４８】
このように、細菌のＮ末端分泌シグナルとの融合は、細菌により発現されるヒト及びマウスＹｏｐＥ１−１３８−ＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２タンパク質の送達成功につながり、真核細胞内のＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインのフォールディング及び機能を妨げなかった。このことは、ＹｏｐＥ融合ＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメインが、それら自体を多量体化すること、及びＭＡＶＳの多量体化を誘導することが依然としてできることを含意し、これは驚くべきことである。
【０２４９】
このＢ１６Ｆ１０  Ｉ型ＩＦＮレポーター細胞株を使用するさらなる実験において、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカ  ΔＨＯＰＥＭＴを、ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）上にＹｏｐＥ１−１３８−ＭｙｃＨｉｓ又はＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＲｉｇ１  ＣＡＲＤ２をコードしているＹ．エンテロコリティカ  ΔＨＯＰＥＭＴと比較した。この場合もやはり、ヒトＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインの送達は、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導したが、Ｙ．エンテロコリティカ  ΔＨＯＰＥＭＴも、Ｙ．エンテロコリティカ  ΔＨＯＰＥＭＴ送達ＹｏｐＥ１−１３８−ＭｙｃＨｉｓも、Ｉ型ＩＦＮ応答に対して影響を与えなかった（図１８）。同じアッセイにおいて、本発明者らは、細菌送達ＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインのＩ型ＩＦＮ誘導能を、ポジティブコントロール、マウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）と比較した。非常に驚くべきことに、ＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインの細菌送達は、Ｉ型ＩＦＮ誘導についてのポジティブコントロール、ＩＦＮγにより得られる応答と同様のレポーター細胞株の最大応答を誘導することができた（図１８及び１９）。
【０２５０】
さらなる実験では、本発明者らは、４Ｔ１マウス乳がん細胞又はｗｔ  Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を感染させ、ＩＦＮを含有する可能性がある上清を、４時間後、Ｂ１６Ｆ１０  Ｉ型ＩＦＮレポーター細胞株上に移した。このように、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴを、内在性毒性プラスミド（ｐＹＶ）上にＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲｉｇ１  ＣＡＲＤ２をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴと比較した。ｐＹＶにコードされたマウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインの送達は、用量依存性Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導したが、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴは、ｗｔ  Ｂ１６Ｆ１０（図２０）においても、４Ｔ１細胞（図２１）においても、Ｉ型ＩＦＮ応答に影響を与えなかった。
【０２５１】
さらなる実験では、異なる長さのマウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤからなるいくつかのバージョンを、それらのＩ型ＩＦＮ応答誘導能について評価した。ＲＩＧ−１のＣＡＲＤドメインは、アミノ酸１−１７２（マウス配列、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｎｒ．Ｑ６Ｑ８９９）によりコードされると予測される。本発明者らは、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマＩＦＮレポーター細胞で及びＲＡＷマクロファージＩＦＮレポーター細胞で、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２９、及びＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８を評価した（図２７−２８）。ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２２９及びＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８は、同様に活性と判明した。
【０２５２】
後続の実験で、本発明者らは、細菌により送達されるＭＤＡ５の能力を評価した。本発明者らは、異なる長さのマウスＭＤＡ５  ＣＡＲＤからなるいくつかのバージョンをクローニングし、それらを、Ｂ１６Ｆ１０  ＩＦＮレポーター細胞でのそれらのＩ型ＩＦＮ応答誘導能について評価した。ＭＤＡ５のＣＡＲＤドメインは、アミノ酸１−１９０（マウス配列、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｎｒ．Ｑ８Ｒ５Ｆ７）によりコードされると予測される。本発明者らは、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマＩＦＮレポーター細胞で、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＭＤＡ５  ＣＡＲＤドメイン１−２９４及びＹｏｐＥ１−１３８−マウスＭＤＡ５  ＣＡＲＤドメイン１−２３１を評価した。全ての変異体は、活性と判明した（図２９）。驚くべきことに、送達されたＭＤＡ  ＣＡＲＤの活性は、ＲＩＧ−１  ＣＡＲＤの場合より、これらのタンパク質が、非常に類似した生物学的機能、及び２つのＮ末端ＣＡＲＤドメインと特定のヌクレオチドを感知する中心（ＤｅｘＤ／Ｈ）ヘリカーゼドメインとからなるタンパク質構造を共有する５６にもかかわらず、はるかに低いことが判明した。
【０２５３】
Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導のための細菌Ｔ３ＳＳを介したｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路誘発タンパク質の送達
ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路において、サイトゾル二本鎖ＤＮＡは、酵素サイクリックＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）と結合することにより検出される。ｄｓＤＮＡが結合すると、ｃＧＡＳは、活性化され、サイクリックＣＤＮ二次メッセンジャーであるサイクリックＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）を産生する。次いで、ｃＧＡＭＰは、小胞体受容体タンパク質ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）と直接結合する。ｃＧＡＭＰが結合すると、ＳＴＩＮＧは、活性化され、シグナル伝達経路を誘導して、Ｉ型ＩＦＮ及び他の同時制御遺伝子の転写に至る５７。ヒトｃＧＡＳは、２’，３’ｃＧＡＭＰ（２’−５’及び３’−５’ホスホジエステル結合を含有する）を産生するが、他のＣＤＮは、マウス又はヒトＳＴＩＮＧを様々なレベルで誘導することが証明されている。これは、３’，３’ｃＧＡＭＰ（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）ＤｎｃＶ若しくは一部の真核生物ｃＧＡＳにより産生される）、サイクリックジＡＭＰ（例えば、様々なグラム陽性種のＣｄａＡ若しくはＤｉｓＡにより産生される）又はサイクリックジＧＭＰ（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＷｓｐＲにより産生される）を含む５７、５８。ｗｔヒトＳＴＩＮＧ（及びマウスＳＴＩＮＧ）は、２’，３’ｃＧＡＭＰ、３’，３’ｃＧＡＭＰ、サイクリックジＡＭＰ及びサイクリックジＧＭＰを認識するが、いくつかの天然ヒトＳＴＩＮＧ変異体は、これらのアゴニストに対して異なった応答をする５９。
【０２５４】
細菌によるタンパク質の送達時にＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路を活性化するために、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカにより発現されＴ３ＳＳを介して送達されるサイクリックジＧＭＰを産生する緑膿菌ＷｓｐＲをクローニングした。ＷｓｐＲの活性を増大させるために、そのＧＧＤＥＦドメイン（ジグアニル酸シクラーゼドメイン）のみを使用し、上流のストークドメインを酵母からのＧＣＮ４のロイシンジッパーモチーフで置換した。ＷｓｐＲの二量体化がその活性に必要であることは公知であり、ＧＣＮ４のロイシンジッパーが、平行コイルドコイルを形成すること、ひいては強力な二量体化モジュールとして役立つことは証明されている。ＧＣＮ４モチーフを、ＧＧＤＥＦとヘリカルストークの間に天然リンカーを含むＷｓｐＲのＧＧＤＥＦドメインと融合させて、野生型ＷｓｐＲに匹敵する内部ドメイン柔軟性を可能にした６０。
【０２５５】
融合タンパク質ＹｏｐＥ１−１３８−ＧＣＮ４ロイシンジッパー−ＷｓｐＲ  ＧＧＤＥＦドメイン（簡潔に、ＹｏｐＥ１−１３８−ＷｓｐＲ）（配列番号３９）の送達を、レポーター細胞株でＩ型ＩＦＮ誘導について評価した。Ｉ型ＩＦＮ刺激のためのマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマレポーター細胞は、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく。ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−ＷｓｐＲタンパク質を移行させる菌株の様々な量（感染多重度）に、レポーター細胞を感染させた。ＧＣＮ４ロイシンジッパーモチーフと融合した緑膿菌ＷｓｐＲ  ＧＧＤＥＦドメインは、レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ応答を用量依存的に誘導することを示した（図２２）が、細菌バックグラウンド株（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ）は、そのような応答を誘導することができなかった（図２２）。
【０２５６】
このように、細菌のＮ末端分泌シグナルとの融合は、細菌により発現されるＹｏｐＥ１−１３８−ＧＣＮ４  ロイシンジッパー（酵母）−ＷｓｐＲ  ＧＧＤＥＦ（緑膿菌）タンパク質の送達成功につながり、真核細胞内のこの３要素タンパク質のフォールディング及び機能を妨げなかった。このことは、ＹｏｐＥ融合ＧＣＮ４ロイシンジッパー−ＷｓｐＲ  ＧＧＤＥＦが、依然として二量体化することができ、ひいては活性ＧＧＤＥＦドメインをもたらすことができることを含意し、これは驚くべきことである。
【０２５７】
さらなる実験のために、本発明者らは、外部刺激の非存在下で細菌による発現及び移行について活性であると報告されている、コレラ菌ＤｎｃＶ（３’，３’ｃＧＡＭＰを産生する）５７、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＤｉｓＡ様タンパク質（サイクリックジＡＭＰを産生する）６１及び真核生物イソギンチャク（ネマトステラ・ベクテンシス（Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａ  ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ））ｃＧＡＳ（３’，３’ｃＧＡＭＰを産生する）５７をクローニングした。ＤｉｓＡ型シクラーゼは、通常は八量体を形成し６１、これは、Ｎ末端ＹｏｐＥ融合及び細菌送達に適合しない可能性があった。セレウス菌ＤｉｓＡ様（ＰＤＢコード２ｆｂ５）は、古典的ＤｉｓＡタンパク質のジアデニル酸シクラーゼ（ＤＡＣ）ドメインとの構造類似性に基づいて同定された６１が、興味深いことに、これは、多量体化に必要とされる他のＤｉｓＡタンパク質から公知の全てのヘリックスを欠いている。それ故、本発明者らは、セレウス菌からの、おそらく単量体である活性ＤｉｓＡ様タンパク質（ＰＤＢコード２ｆｂ５；残基７６−２０５）を利用することを決めた。
【０２５８】
融合タンパク質ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ（配列番号４１）、ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質（配列番号４２）及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ（配列番号４３）の送達を、レポーター細胞株でＩ型ＩＦＮ誘導について評価した。Ｉ型ＩＦＮ刺激のためのマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマレポーター細胞は、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく。ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳを移行させる菌株の様々な量（感染多重度）に、レポーター細胞を感染させた。ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ全てが、レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ応答を用量依存的に誘導することを示した（図２３）が、細菌バックグラウンド株（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ）又はＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ送達ＹｏｐＥ１−１３８−ＭｙｃＨｉｓは、そのような応答を誘導することができなかった（図２３）。３’，３’ｃＧＡＭＰ産生イソギンチャク（ネマトステラ・ベクテンシス）ｃＧＡＳは、最も高い活性を示したが、コレラ菌ＤｎｃＶ（３’，３’ｃＧＡＭＰを産生する）及びセレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質（サイクリックジＡＭＰを産生する）は、Ｉ型ＩＦＮ応答を同様に活性化することが判明した。
【０２５９】
このように、細菌のＮ末端分泌シグナルとの融合は、細菌により発現されるＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳタンパク質の送達成功につながり、真核細胞内のこれらのタンパク質のフォールディング及び機能を妨げず、このようなことは予測され得なかった。
【０２６０】
或いは、ＲＬＲ又はｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達の下流の中心転写因子である６２、マウスＩＲＦ３を、細菌による発現及び輸送のためにクローニングした。活性化の非存在下では、ＩＲＦ−３は、細胞質内に潜在立体構造で存在する。ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５又はＳＴＩＮＧのような上流受容体の活性化時にのみ、ＩＲＦ−３は、ＴＢＫ１及びＩＫＫεによってリン酸化され、ひいては活性化される。ＩＲＦ−３のリン酸化は、二量体化、核への移行、及び共活性化因子との会合に至る６２。ＩＲＦ３の構成的活性バージョンを獲得するために、本発明者らは、最も重要なリン酸化部位の１つ（マウスＩＲＦ３におけるＳｅｒ３９７）をＡｓｐにより置換した６２。
【０２６１】
融合タンパク質ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＩＲＦ３  Ｓｅｒ３９７Ａｓｐ（配列番号４０）の送達を、周囲液へのタンパク質分泌を人工的に誘導するインビトロ分泌アッセイで、評価した。ＴＣＡに基づくタンパク質沈殿の後、抗ＹｏｐＥ抗体でのウェスタンブロット分析を使用して、分泌されたタンパク質量を判定した（図２４）。ＹｏｐＥ１−１３８−マウスｔＢＩＤ  ＢＨ３をコードするΔＨＯＰＥＭＴ株は、分泌画分に関する強いバンドを（１５−２０ｋＤａで）もたらした一方で、より小さい程度にだが、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＩＲＦ３  Ｓｅｒ３９７Ａｓｐ（５０−７５Ｄａにおけるもの）も分泌されることが判明した（図２４）。全細菌細胞画分分析は、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスｔＢＩＤ  ＢＨ３及びＹｏｐＥ１−１３８−マウスＩＲＦ３  Ｓｅｒ３９７Ａｓｐの発現レベルが同等であるが、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＩＲＦ３  Ｓｅｒ３９７Ａｓｐは分解バンドパターンを示すことを明示した（図２４）。
【０２６２】
免疫細胞におけるＩ型ＩＦＮ応答の誘導のための細菌Ｔ３ＳＳを介したｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ及びＲＩＧ−１様受容体経路誘発タンパク質の送達。
融合タンパク質ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２、ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳの送達を、免疫レポーター細胞株でＩ型ＩＦＮ誘導について評価した。Ｉ型ＩＦＮ刺激のためのマウスＲＡＷ２６４．７マクロファージレポーター細胞は、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく。ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２、ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、ＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳを移行させる菌株の様々な量（感染多重度）に、レポーター細胞を感染させた。ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２、ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ、及びＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ全てが、この免疫レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ応答を用量依存的に誘導することを示した（図２５）が、細菌バックグラウンド株（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ）は、そのような応答を誘導することができなかった（図２５）。ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤ２が最も高い活性を示し、これに、３’，３’ｃＧＡＭＰ産生イソギンチャク（ネマトステラ・ベクテンシス）ｃＧＡＳ及びコレラ菌ＤｎｃＶ（３’，３’ｃＧＡＭＰを産生する）が続いた。セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質（サイクリックジＡＭＰを産生する）は、Ｉ型ＩＦＮ応答を弱くしか活性化しないことが判明した。
【０２６３】
さらなる実験のために、本発明者らは、ヒトｃＧＡＳアミノ酸１６１−５２２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｎｒ．Ｑ８Ｎ８８４及び配列番号１１５；２’，３’ｃＧＡＭＰを産生する）５７を細菌による発現及び移行のためにクローニングした。Ｉ型ＩＦＮ刺激のためのマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ及びマウスＲＡＷマクロファージレポーター細胞は、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく。ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２を移行させ、レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ応答の用量依存的誘導を示した菌株の、並びにｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ６０−４２２、ＹｏｐＥ１−１３８−リステリア属ＣｄａＡ１０１−２７３、ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ又はＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質を移行させる菌株の、様々な量（感染多重度）に、レポーター細胞を感染させた（図３２−３３）。最も強い活性がＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ１６１−５２２で観察され、これにＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ６０−４２２が続いた。興味深いことに、短いイソギンチャクｃＧＡＳ６０−４２２変異体のほうが、わずかに活性が高かった。ＹｏｐＥ１−１３８−リステリア属ＣｄａＡ１０１−２７３、ＹｏｐＥ１−１３８−コレラ菌ＤｎｃＶ又はＹｏｐＥ１−１３８−セレウス菌ＤｉｓＡ様タンパク質も、ｃＧＡＳタンパク質より小さい程度にだが、用量依存性ＩＦＮ活性化を示した（図３２−３３）。
【０２６４】
Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導のための細菌Ｔ３ＳＳを介したＭＡＶＳの送達
サイトゾル核酸は、サイトゾル中の病原体由来ＲＮＡを検出するＲＩＧ−１様受容体（ＲＬＲ）ファミリーメンバーのような受容体により検知される５６。ＲＩＧ−１及びＭＡＤ５は、２つのＮ末端ＣＡＲＤドメインと特定の核酸を検知する中心（ＤｅｘＤ／Ｈ）ヘリカーゼドメインとからなる５６。刺激性ＲＮＡとの結合は、オリゴマーを形成するための５６（及びＭＤＡ５の場合はフィラメント形成への５６）非固着Ｋ６３連結ユビキチン鎖とのその後の会合のためにそのＣＡＲＤを遊離するＲＩＧ−Ｉ（及びＭＡＤ５）の構造再構成を誘導する。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５のオリゴマー化したＣＡＲＤドメインは、ＭＡＶＳのＣＡＲＤドメインと相互作用する。この相互作用は、ＭＡＶＳの単一のＣＡＲＤドメインの重合を促進し、これが下流のシグナル伝達を誘導し、最終的にＩ型ＩＦＮ遺伝子の誘導に至る５６。
【０２６５】
本発明者らは、Ｔ３ＳＳ、特に、ＹｏｐＥ１−１３８による送達のためのＮ末端細菌分泌シグナルと融合したヒト由来のＭＡＶＳのＮ末端をＣＡＲＤドメイン発現する菌株（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに基づく）を生成した。融合タンパク質ＹｏｐＥ１−１３８−ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤの送達を、標準的なインビトロ分泌アッセイにより評価し、送達されたタンパク質の機能性を、レポーター細胞株でＩ型ＩＦＮ誘導について評価した。Ｉ型ＩＦＮ刺激のためのマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ又はマウスＲＡＷマクロファージレポーター細胞は、多量体ＩＳＲＥにより増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターを含むＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの調節下にある分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく。ｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）から発現し、ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤタンパク質を移行させるＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴの様々な量（感染多重度）に、レポーター細胞を感染させた。ＭＡＶＳのマウスＮ末端ＣＡＲＤドメインは、レポーター細胞株においてＩ型ＩＦＮ応答を用量依存的に誘導することを示した（図３０−３１）が、細菌バックグラウンド株（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ）は、そのような応答を誘導することができなかった（図３０−３１）。ヒトｃＧＡＳ及びマウスＲＩＧ−１  ＣＡＲＤドメインは、マウスレポーター細胞株において同様にＩ型ＩＦＮ応答を誘導し（図３０−３１）、ＲＩＧ−１が最も高い活性化能を示し、これにＭＡＶＳ及びｃＧＡＳが続いた。
【０２６６】
このように、細菌のＮ末端分泌シグナルとの融合は、細菌により発現されるヒトＹｏｐＥ１−１３８−ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤタンパク質の送達成功につながり、真核細胞内のＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメインのフォールディング及び機能を妨げなかった。このことは、ＹｏｐＥ融合ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメインが、それら自体を多量体化すること、及びＭＡＶＳの多量体化を誘導することが依然としてできることを含意し、これは驚くべきことである。よりいっそう驚くべきことに、ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ単独ではＩＦＮ下流シグナル伝達を誘導することができないことが証明されていたが６４、本発明者らは、Ｉ型ＩＦＮ経路を強く活性化するＹｏｐＥ融合ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメインを見つけた。
【０２６７】
さらに、ＭＡＶＳのＣ末端膜貫通ドメインは、ＤＮＡトランスフェクション時のＭＡＶＳ機能に必須であることが証明されており、単独でのＭＡＶＳ  ＣＡＲＤドメインは、トランスフェクトされたＤＮＡ構築物から発現されたとき、不活性であることが証明されていた６６。さらに加えて、トランスフェクトされたＤＮＡから又は精製タンパク質として発現されたときにＩ型ＩＦＮ応答を活性化する能力がある６４、６６、膜貫通領域と融合したＭＡＶＳ  ＣＡＲＤは、凝集及びひいては活性化を開始させる６４内在性ＭＡＶＳに依存することが明らかになった。本発明者らは、ＭＡＶＳ  ＫＯ細胞株を使用することにより（図５２）、細菌により送達されるＹｏｐＥ融合ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤが、ミトコンドリア上に存在する内在性ＭＡＶＳなしに活性であることを明らかにすることができた。ＹｏｐＥ融合ＭＡＶＳ  ＣＡＲＤが、膜貫通ドメインなしに、さらには内在性ＭＡＶＳなしに、下流パートナーを多量体化及び活性化することができることは、驚くべきことである。
【０２６８】
インビトロでのＩ型ＩＦＮ応答の誘導についての小分子ＳＴＩＮＧアゴニストに対する評価
サイクリックジヌクレオチドは、下流のＩ型ＩＦＮシグナル伝達誘導に至るＳＴＩＮＧ経路の周知アゴニストである。ＳＴＩＮＧアゴニストは、文献５９に記載されており、主として免疫細胞に作用し、樹状細胞に対して最も高い活性を示すことが判明している５９。対照的に、ＲＬＲシグナル伝達は、より遍在的に発現されることが判明した６３。それ故、本発明者らは、免疫細胞（ＲＡＷマクロファージＩＦＮレポーター細胞）及び非免疫細胞（Ｂ１６Ｆ１メラノーマＩＦＮレポーター細胞）上で、インターフェロン誘導能について、サイクリックジヌクレオチド生成酵素（ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ及びＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ）を送達するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ細菌、又はＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８を送達する細菌を、小分子ＳＴＩＮＧアゴニスト２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ、Ｒｐ）（Ａｄｕｒｏ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＡＤＵ−Ｓ１００に類似）と比較した。免疫細胞で、同様の活性化能が、小分子ＳＴＩＮＧアゴニスト２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）、及びタンパク質（ＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ、ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳ又はＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８）を送達する３つ全ての被験菌株について観察されたが、タンパク質を送達しないＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ細菌は、非常に弱い活性化能を示した（図３４−３７）。非免疫細胞（がん細胞、メラノーマ）では、細菌により送達されるＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２１８、細菌により送達されるＹｏｐＥ１−１３８−イソギンチャクｃＧＡＳ及びＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳは、同様によく働き、ほとんどが小分子ＳＴＩＮＧアゴニストより優れており、これは、ＳＴＩＮＧと比較してＲＬＲのより偏在的な存在を強調した（図３４−３７）。
【０２６９】
細菌により送達されるＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン又はＭＡＶＳ  ＣＡＲＤの厳格なＴ３ＳＳ依存性
厳密なＴ３ＳＳ依存性輸送を証明するために、真核細胞膜への移行孔を形成するＴ３ＳＳタンパク質の１つを欠失させた（ＹｏｐＢ）。そのようなｙｏｐＢ欠失細菌（Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ−ｙｏｐＢと呼ばれる）についてのＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６又はＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００発現能をＲＡＷマクロファージＩＦＮレポーター細胞株で評価し、同じくＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６又はＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００を発現する、ｙｏｐＢ発現Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ細菌と比較した（図３８）。ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６又はＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００を発現するｙｏｐＢ−野生型細菌は、Ｉ型ＩＦＮ応答の用量依存性活性化を示したが、同じタンパク質を発現するｙｏｐＢ欠失株は、そのような応答を、送達されるタンパク質を発現しないバックグラウンド非細菌株により誘導されるバックグラウンドレベルより高く誘導することができなかった（図３８）。これにより、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６又はＹｏｐＥ１−１３８−ヒトＭＡＶＳ  ＣＡＲＤ１−１００は両方とも、Ｔ３ＳＳニードルを通って標的真核細胞に輸送されることが検証される。
【０２７０】
粗腫瘍単離物におけるＩ型ＩＦＮ応答の誘導
Ｉ型ＩＦＮ応答を腫瘍微小環境内で開始させることができることを検証するために、本発明者らは、エクスビボで菌株に感染させた粗腫瘍単離物に関する分析を行い、続いてインターフェロンベータを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、腫瘍が    の体積に達したときに屠殺した。腫瘍をすりつぶし、消化し、２４ウェルプレートに単一細胞懸濁液として播種した。２つの異なる腫瘍からのそのような細胞を、未感染で放置した（図３９中の破線）か、又はＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、若しくはｐＢａｄＭｙｃＨｉｓＡ由来プラスミド上にＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴに感染させた。インターフェロンベータを用いるＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ刺激を評価し、これは、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴが、インターフェロンベータ分泌を誘導することができないが、ＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６をコードしているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴによる感染が、２つの異なる腫瘍の粗腫瘍単離物による用量依存性インターフェロンベータ分泌をもたらすことを示した（図３９）。これにより、細菌により送達されるＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメインは、がん細胞、免疫細胞及び腫瘍微小環境内の他の全ての細胞からなる混合細胞集団においてインターフェロン産生を誘導することができることが検証される。
【０２７１】
腫瘍進行を遅らせる点でのＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ送達ＲＩＧ１  ＣＡＲＤ又はｃＧＡＳの有効性
インビボで腫瘍細胞に送達されるＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６及びＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳの影響を評価するために、本発明者らは、ＥＭＴ６乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて研究を行った。腫瘍が約６０−１３０ｍｍ３のサイズに達したら、ＰＢＳ（図４０）又は７．５×１０７  Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＹｏｐＥ１−１３８マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６若しくはＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＹｏｐＥ１−１３８ヒトｃＧＡＳをマウスに腫瘍内（ｉｔ）注射した。細菌の初回腫瘍内注射の日を０日目と定義した。ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０及びｄ１１に、マウスに腫瘍内注射した。その後数日にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。Ｙ．エンテロコリティカ単独での治療は、腫瘍体積進行に対する影響を示し、４／１４匹のマウスが完全腫瘍退縮を示した（図４１）。Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導するタンパク質であって、ＲＩＧ１  ＣＡＲＤＳ又はｃＧＡＳであるタンパク質を送達するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴは、腫瘍進行に対してより顕著な影響をもたらし、８／１４（ＲＩＧ１  ＣＡＲＤ）又は８／１５（ｃＧＡＳ）匹のマウス各々が完全且つ永続的腫瘍退縮を示すことが判明した（図４２−４３）。これらの研究結果は、そのような細菌及びそれらのＴ３ＳＳを、腫瘍進行への有意な干渉に利用することができること、及びＩ型ＩＦＮ誘導タンパク質の送達が、原発性腫瘍の退縮を誘導するのによく適していることに光を当てるものである。
【０２７２】
完全に腫瘍が退縮したマウスを、初回腫瘍同種移植後６５日目までさらに観察し、その後、６５日目に、対側側腹部にＥＭＴ６乳がん細胞を再投与して、これらのがん細胞に対する免疫介在性記憶及び全身作用を評価した。この再投与研究では、さらなる治療を投与せず、マウスを対側側腹部における腫瘍進行について単に観察し、ナイーブマウス（年齢等の全ての他のパラメータは同一であるがＥＭＴ６乳がん細胞への以前の曝露がないマウス）と比較した。ナイーブマウスでは、皮下に同種移植された腫瘍細胞により腫瘍増殖が生じる結果となったが、反対側の側腹部におけるＥＭＴ６腫瘍が以前に処置され完全に退縮した全てのマウスは、腫瘍増殖から保護されることが判明した（図４４）。注目すべきこととして、細菌治療により誘導された以前の完全退縮を対側側腹部に有するマウスの腫瘍は、数日間、増殖を開始し、＞１００ｍｍ３までの体積に達し（２回目の移植後およそ１０日目にピーク体積を有する）、その後、縮小に至った（図４４）。この遅延期間は、十分に開始される前に数日を要する適応免疫系応答を示し得る。
【０２７３】
インビボで腫瘍細胞に送達されるＹｏｐＥ１−１３８−マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６及びＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳの影響をさらに評価するためのさらなる実験において、本発明者らは、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマがん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて研究を行った。腫瘍が約７５ｍｍ３のサイズに達したら、ＰＢＳ又は７．５×１０７  Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＹｏｐＥ１−１３８マウスＲＩＧ１  ＣＡＲＤドメイン１−２４６若しくはＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＹｏｐＥ１−１３８ヒトｃＧＡＳをマウスに腫瘍内（ｉｔ）注射した。細菌の初回腫瘍内注射の日を０日目と定義した。ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６及びｄ９に、マウスに腫瘍内注射した。その後数日にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。Ｙ．エンテロコリティカ単独での治療は、腫瘍体積進行に対する影響を示し、１／１５匹のマウスが完全腫瘍退縮を示した（図４６）。Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導するタンパク質であって、ＲＩＧ１  ＣＡＲＤＳ又はｃＧＡＳであるタンパク質を送達するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴは、腫瘍進行に対して非常に顕著な影響をもたらし、５／１５（ＲＩＧ１  ＣＡＲＤ）又は８／１５（ｃＧＡＳ）匹のマウス各々が完全且つ永続的腫瘍退縮を示すことが判明した（図４６）。これらの研究結果は、そのような細菌及びそれらのＴ３ＳＳを、腫瘍進行への非常に有意な干渉に利用することができること、及びＩ型ＩＦＮ誘導タンパク質の送達が、原発性腫瘍の退縮を誘導するのによく適していることに光を当てるものである。注目すべきこととして、特に、ＹｏｐＥ１−１３８−ヒトｃＧＡＳを送達する細菌の場合、ＰＢＳ治療コントロールと比較して、Ｉ型ＩＦＮ誘導ｃＧＡＳタンパク質の細胞内送達により誘導される腫瘍への白血球流入によって誘導され得る腫瘍体積の増加（偽性進行）が初回投与直後に観察された。
【０２７４】
参考文献リスト
1  Hayes, C. S., Aoki, S. K. & Low, D. A. Bacterial contact-dependent delivery systems. Annu Rev Genet 44, 71-90, doi:10.1146/annurev.genet.42.110807.091449 (2010).
2  Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol 4, 811-825, doi:nrmicro1526 [pii]10.1038/nrmicro1526 (2006).
3  Blanco-Toribio, A., Muyldermans, S., Frankel, G. & Fernandez, L. A. Direct injection of functional single-domain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One 5, e15227, doi:10.1371/journal.pone.0015227 (2010).
4  Bichsel, C. et al. Direct reprogramming of fibroblasts to myocytes via bacterial injection of MyoD protein. Cell Reprogram 15, 117-125, doi:10.1089/cell.2012.0058 (2013).
5  Bichsel, C. et al. Bacterial delivery of nuclear proteins into pluripotent and differentiated cells. PLoS One 6, e16465, doi:10.1371/journal.pone.0016465 (2011).
6  Chamekh, M. et al. Delivery of biologically active anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-1ra in vivo by the Shigella type III secretion apparatus. J Immunol 180, 4292-4298 (2008).
7  Skurnik, M. & Wolf-Watz, H. Analysis of the yopA gene encoding the Yop1 virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol 3, 517-529 (1989).
8  Isberg, R. R., Voorhis, D. L. & Falkow, S. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50, 769-778 (1987).
9  Mota, L. J. & Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Ann Med 37, 234-249, doi:R673752030212825 [pii]10.1080/07853890510037329 (2005).
10  Trosky, J. E., Liverman, A. D. & Orth, K. Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557-565, doi:10.1111/j.1462-5822.2007.01109.x (2008).
11  Brenner, D. & Mak, T. W. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol 21, 871-877, doi:S0955-0674(09)00160-4 [pii]10.1016/j.ceb.2009.09.004 (2009).
12  Chalah, A. & Khosravi-Far, R. The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol 615, 25-45, doi:10.1007/978-1-4020-6554-5_3 (2008).
13  Fuchs, Y. & Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell 147, 742-758, doi:S0092-8674(11)01283-9 [pii]10.1016/j.cell.2011.10.033 (2011).
14  Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif 80, 283-293, doi:S1046-5928(11)00203-8 [pii]10.1016/j.pep.2011.08.005 (2011).
15  Howard, S. L. et al. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. J Bacteriol 188, 3645-3653, doi:10.1128/JB.188.10.3645-3653.2006 (2006).
16  Thomson, N. R. et al. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS Genet 2, e206, doi:10.1371/journal.pgen.0020206 (2006).
17  Pelludat, C., Hogardt, M. & Heesemann, J. Transfer of the core region genes of the Yersinia enterocolitica WA-C serotype O:8 high-pathogenicity island to Y. enterocolitica MRS40, a strain with low levels of pathogenicity, confers a yersiniabactin biosynthesis phenotype and enhanced mouse virulence. Infect Immun 70, 1832-1841 (2002).
18  Mulder, B., Michiels, T., Simonet, M., Sory, M. P. & Cornelis, G. Identification of additional virulence determinants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227. Infect Immun 57, 2534-2541 (1989).
19  Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol 14, 583-594 (1994).
20  Sarker, M. R., Neyt, C., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacteriol 180, 1207-1214 (1998).
21  Neubauer, H., Aleksic, S., Hensel, A., Finke, E. J. & Meyer, H. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int J Med Microbiol 290, 61-64, doi:10.1016/S1438-4221(00)80107-1 (2000).
22  Feldman, M. F., Muller, S., Wuest, E. & Cornelis, G. R. SycE allows secretion of YopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol 46, 1183-1197, doi:3241 [pii] (2002).
23  Ramamurthi, K. S. & Schneewind, O. A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacteriol 187, 707-715, doi:10.1128/JB.187.2.707-715.2005 (2005).
24  Wolke, S., Ackermann, N. & Heesemann, J. The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol 13, 1339-1357, doi:10.1111/j.1462-5822.2011.01623.x (2011).
25  Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression. J Bacteriol 172, 1547-1555 (1990).
26  Sambrook, J.    (ed David W. Russell) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 2001).
27  Alto, N. M. & Dixon, J. E. Analysis of Rho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. Methods Enzymol 439, 131-143, doi:S0076-6879(07)00410-7 [pii]10.1016/S0076-6879(07)00410-7 (2008).
28  Alto, N. M. et al. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell 124, 133-145, doi:S0092-8674(05)01229-8 [pii]10.1016/j.cell.2005.10.031 (2006).
29  Kaniga, K., Delor, I. & Cornelis, G. R. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. Gene 109, 137-141, doi:0378-1119(91)90599-7 [pii] (1991).
30  Yoneda, Y. et al. A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res 201, 313-320 (1992).
31  Metcalf, W. W., Jiang, W. & Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138, 1-7 (1994).
32  Diepold, A. et al. Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome. Embo J 29, 1928-1940, doi:emboj201084 [pii]10.1038/emboj.2010.84 (2010).
33  Iriarte, M., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on expression of virulence factors. Infect Immun 63, 1840-1847 (1995).
34  Cornelis, G., Vanootegem, J. C. & Sluiters, C. Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367-379, doi:0882-4010(87)90078-7 [pii] (1987).
35  Grosdent, N., Maridonneau-Parini, I., Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. Infect Immun 70, 4165-4176 (2002).
36  Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornelis, G. R. Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. J Bacteriol 182, 4811-4821 (2000).
37  Iriarte, M. & Cornelis, G. R. YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29, 915-929 (1998).
38  Kudryashev, M. et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. Elife 2, e00792, doi:10.7554/eLife.0079200792 [pii] (2013).
39  Schulte, R. et al. Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rel p65-p65 homodimers. FASEB J 14, 1471-1484 (2000).
40  Mota, L. J., Journet, L., Sorg, I., Agrain, C. & Cornelis, G. R. Bacterial injectisomes: needle length does matter. Science 307, 1278, doi:307/5713/1278 [pii]10.1126/science.1107679 (2005).
41  Carrington, J. C. & Dougherty, W. G. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 3391-3395 (1988).
42  Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D. & Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun 294, 949-955, doi:10.1016/S0006-291X(02)00574-0S0006-291X(02)00574-0 [pii] (2002).
43  Liang, H., Gao, H., Maynard, C. A. & Powell, W. A. Expression of a self-processing, pathogen resistance-enhancing gene construct in Arabidopsis. Biotechnol Lett 27, 435-442, doi:10.1007/s10529-005-1884-9 (2005).
44  Weber, W. et al. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol 20, 901-907, doi:10.1038/nbt731nbt731 [pii] (2002).
45  Kapust, R. B. et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng 14, 993-1000 (2001).
46  Lee, V. T., Anderson, D. M. & Schneewind, O. Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol of HeLa cells: one-step translocation of YopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol 28, 593-601 (1998).
47  Gray, D. C., Mahrus, S. & Wells, J. A. Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646, doi:S0092-8674(10)00783-X [pii]10.1016/j.cell.2010.07.014 (2010).
48  Henrichs, T. et al. Target-directed proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4246-4251, doi:102/12/4246 [pii]10.1073/pnas.0408520102 (2005).
49  Aepfelbacher, M., Trasak, C. & Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost 98, 521-529 (2007).
50  Trulzsch, K., Sporleder, T., Igwe, E. I., Russmann, H. & Heesemann, J. Contribution of the major secreted yops of Yersinia enterocolitica O:8 to pathogenicity in the mouse infection model. Infect Immun 72, 5227-5234, doi:10.1128/IAI.72.9.5227-5234.2004 (2004).
51  Bohme, K. et al. Concerted actions of a thermo-labile regulator and a unique intergenic RNA thermosensor control Yersinia virulence. PLoS Pathog 8, e1002518, doi:10.1371/journal.ppat.1002518 (2012).
52  Rohde, J. R., Luan, X. S., Rohde, H., Fox, J. M. & Minnich, S. A. The Yersinia enterocolitica pYV virulence plasmid contains multiple intrinsic DNA bends which melt at 37 degrees C. J Bacteriol 181, 4198-4204 (1999).
53  Curtiss, R., 3rd, Galan, J. E., Nakayama, K. & Kelly, S. M. Stabilization of recombinant avirulent vaccine strains in vivo. Res Microbiol 141, 797-805 (1990).
54  Spreng, S. & Viret, J. F. Plasmid maintenance systems suitable for GMO-based bacterial vaccines. Vaccine 23, 2060-2065, doi:10.1016/j.vaccine.2005.01.009 (2005).
55  Neyt, C., Iriarte, M., Thi, V. H. & Cornelis, G. R. Virulence and arsenic resistance in Yersiniae. J Bacteriol 179, 612-619 (1997).
56  Wu, J. & Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annu Rev Immunol 32, 461-488, doi:10.1146/annurev-immunol-032713-120156 (2014).
57  Kranzusch, P. J. et al. Ancient Origin of cGAS-STING Reveals Mechanism of Universal 2',3' cGAMP Signaling. Mol Cell 59, 891-903, doi:10.1016/j.molcel.2015.07.022 (2015).
58  Commichau, F. M., Dickmanns, A., Gundlach, J., Ficner, R. & Stulke, J. A jack of all trades: the multiple roles of the unique essential second messenger cyclic di-AMP. Mol Microbiol 97, 189-204, doi:10.1111/mmi.13026 (2015).
59  Corrales, L. et al. Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity. Cell Rep 11, 1018-1030, doi:10.1016/j.celrep.2015.04.031 (2015).
60  De, N., Navarro, M. V., Raghavan, R. V. & Sondermann, H. Determinants for the activation and autoinhibition of the diguanylate cyclase response regulator WspR. J Mol Biol 393, 619-633, doi:10.1016/j.jmb.2009.08.030 (2009).
61  Witte, G., Hartung, S., Buttner, K. & Hopfner, K. P. Structural biochemistry of a bacterial checkpoint protein reveals diadenylate cyclase activity regulated by DNA recombination intermediates. Mol Cell 30, 167-178, doi:10.1016/j.molcel.2008.02.020 (2008).
62  Panne, D., McWhirter, S. M., Maniatis, T. & Harrison, S. C. Interferon regulatory factor 3 is regulated by a dual phosphorylation-dependent switch. J Biol Chem 282, 22816-22822, doi:10.1074/jbc.M703019200 (2007).
63  Engel, C., G. Brugmann, S. Lambing, L.H. Muhlenbeck, S. Marx, C. Hagen, D. Horvath, M. Goldeck, J. Ludwig, A.M. Herzner, J.W. Drijfhout, D. Wenzel, C. Coch, T. Tuting, M. Schlee, V. Hornung, G. Hartmann, and J.G. Van den Boorn. 2017. RIG-I Resists Hypoxia-Induced Immunosuppression and Dedifferentiation. Cancer Immunol Res. 5:455-467.
64  Hou, F., L. Sun, H. Zheng, B. Skaug, Q.X. Jiang, and Z.J. Chen. 2011. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146:448-461.
65  Kranzusch, P.J., A.S. Lee, J.M. Berger, and J.A. Doudna. 2013. Structure of human cGAS reveals a conserved family of second-messenger enzymes in innate immunity. Cell Rep. 3:1362-1368.
66  Seth, R.B., L. Sun, C.K. Ea, and Z.J. Chen. 2005. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122:669-682.
【図１】
0006976351.tif 000007
【図２Ａ−Ｂ】
0006976351.tif 000008
【図３Ａ】
0006976351.tif 000009
【図３Ｂ】
0006976351.tif 000010
【図３Ｃ】
0006976351.tif 000011
【図３Ｄ】
0006976351.tif 000012
【図３Ｅ】
0006976351.tif 000013
【図３Ｆ】
0006976351.tif 000014
【図３Ｇ】
0006976351.tif 000015
【図３Ｈ】
0006976351.tif 000016
【図３Ｉ】
0006976351.tif 000017
【図３Ｊ】
0006976351.tif 000018
【図３Ｋ】
0006976351.tif 000019
【図３Ｌ】
0006976351.tif 000020
【図３Ｍ】
0006976351.tif 000021
【図３Ｎ】
0006976351.tif 000022
【図３Ｏ】
0006976351.tif 000023
【図３Ｐ】
0006976351.tif 000024
【図３Ｑ】
0006976351.tif 000025
【図４】
0006976351.tif 000026
【図５】
0006976351.tif 000027
【図６】
0006976351.tif 000028
【図７】
0006976351.tif 000029
【図８】
0006976351.tif 000030
【図９】
0006976351.tif 000031
【図１０】
0006976351.tif 000032
【図１１】
0006976351.tif 000033
【図１２】
0006976351.tif 000034
【図１３】
0006976351.tif 000035
【図１４】
0006976351.tif 000036
【図１５】
0006976351.tif 000037
【図１６】
0006976351.tif 000038
【図１７】
0006976351.tif 000039
【図１８】
0006976351.tif 000040
【図１９】
0006976351.tif 000041
【図２０】
0006976351.tif 000042
【図２１】
0006976351.tif 000043
【図２２】
0006976351.tif 000044
【図２３】
0006976351.tif 000045
【図２４】
0006976351.tif 000046
【図２５】
0006976351.tif 000047
【図２６】
0006976351.tif 000048
【図２７】
0006976351.tif 000049
【図２８】
0006976351.tif 000050
【図２９】
0006976351.tif 000051
【図３０】
0006976351.tif 000052
【図３１】
0006976351.tif 000053
【図３２】
0006976351.tif 000054
【図３３】
0006976351.tif 000055
【図３４】
0006976351.tif 000056
【図３５】
0006976351.tif 000057
【図３６】
0006976351.tif 000058
【図３７】
0006976351.tif 000059
【図３８】
0006976351.tif 000060
【図３９】
0006976351.tif 000061
【図４０】
0006976351.tif 000062
【図４１】
0006976351.tif 000063
【図４２】
0006976351.tif 000064
【図４３】
0006976351.tif 000065
【図４４】
0006976351.tif 000066
【図４５】
0006976351.tif 000067
【図４６】
0006976351.tif 000068
【図４７】
0006976351.tif 000069
【図４８】
0006976351.tif 000070
【図４９】
0006976351.tif 000071
【図５０】
0006976351.tif 000072
【図５１】
0006976351.tif 000073
【図５２】
0006976351.tif 000074
【配列表】
0006976351000001.app