(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染を治療するキメラ抗原受容体Ｎ６−ＣＡＲであって、
Ｎ末端からＣ末端へシグナルペプチド、一本鎖抗体ｓｃＦｖ、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ、白血球抗原分化群分子膜貫通領域ＣＤ２８−ＴＭおよびその細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、４−１ＢＢ、および白血球抗原分化群３のζ鎖ＣＤ３を順次連結することで得られるものであり、得られたキメラ抗原受容体のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示され、
前記一本鎖抗体ｓｃＦｖが、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０を認識可能であり、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０に対する抗体の軽鎖、重鎖可変領域を直列することで得られるものであり、ＣＡＲ分子全体の細胞外結合ドメインとして、そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されることを特徴とするＨＩＶ感染を治療するキメラ抗原受容体Ｎ６−ＣＡＲ。
【請求項２】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする遺伝子であって、
その塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されることを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする遺伝子。
【請求項３】
塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるキメラ抗原受容体のコード遺伝子を含有しかつ発現し得る発現ベクターであって、
前記ベクターは、ＰＴＫ８８１ベクターを骨格とし、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置き換えた後に改造されたＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６ベクターであり、その塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されることを特徴とする塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるキメラ抗原受容体のコード遺伝子を含有しかつ発現し得る発現ベクター。
【請求項４】
遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球であって、
請求項３に記載のＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして得られたレンチウイルスベクター形質導入ＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、これにより得られたキメラ抗原受容体を発現し得る遺伝子操作したＴ−リンパ球であることを特徴とする遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の調製方法であって、
（１）末梢血からＰＢＭＣを分離した後に磁気ビーズを用いてポジティブセレクションによりＣＤ８＋Ｔ細胞が得られ、そしてａｎｔｉ−ＣＤ３／２８磁気ビーズ（細胞と磁気ビーズとの比は１：３）により１２時間刺激し、次いでＮ６−ＣＡＲ分子を組み換えたレンチウイルスを加えて４時間感染させた後に補液し（ＭＯＩ＝５）、ウイルス感染後３日目から細胞を計数し、細胞状態および増殖状況に応じて培地を流加し、細胞濃度を０．６×１０６／ｍｌに調整し、そしてＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を補充し、輸注した細胞数を満たすまで細胞をさらに増幅させる調製方法。
【請求項６】
Ｎ６−ＣＡＲで遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の使用であって、  前記Ｎ６−ＣＡＲで遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球が抗ＨＩＶ感染の生細胞薬の調製に応用されることを特徴とする請求項１に記載のＮ６−ＣＡＲで遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性疾患の免疫療法の技術分野に関し、より詳しくは、ＨＩＶ感染を治療するキメラ抗原受容体の組換え遺伝子構築およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイズは、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  １、ＨＩＶ−１）感染によって生じ、人類の生命を重大に脅かす伝染性疾患であり、世界保健機関の最新の統計によると、発見以来２０１４年末まで３９００万人以上が死亡してしまい、いまだに世界中に３７００万人のＨＩＶ感染者がいる。中国のＨＩＶ感染者の数は年々増加しており、患者の総数が既に１００万人を超えた。現時点で有効なワクチンはなく、既存の薬で完治させることはできない。
【０００３】
高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）は、歴史的に見てＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療の転換点となり、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの発症率および死亡率を大幅に減少させ、患者の寿命を大幅に延ばし、さらにＨＩＶ感染を減少させる。しかしながら、１）患者が生涯にわたって薬を服用しなければならないことに起因する高価な支出、２）重篤な毒性および副作用、３）耐性株の出現、４）さらに重要なことに、薬剤が複製中のウイルスのみに対して有効であるが、感染の初期段階でＨＩＶによって確立された潜伏性ウイルス「リザーバー」（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）には無効であるという主な要因で、ｃＡＲＴがウイルスを完全に排除できないことといった多くの課題もある。抗レトロウイルス治療が中断されると、ウイルスリザーバー内の組み込み前ウイルスが再活性化され、ほとんど全ての患者体内のウイルス血症は急速に再発する。
【０００４】
伝播および繁殖におけるエイズウイルスの高変異性が原因で過去において有効なエイズ治療薬が無効になり、そのため、複数の抗ウイルス薬を組み合わせて高活性抗レトロウイルス療法を行う「カクテル療法」が後で開発されたが、カクテル療法にも限界がある。現在エイズ研究に関する国際的なフロンティアおよびホットスポットを踏まえて、研究者らは一般に、感染の極初期の段階でＨＩＶが体内に隠されたウイルス「リザーバー」、すなわち静止期メモリーＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｒｅｓｔｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ４＋Ｔ）を確立することが、ＨＩＶが治癒に至らない主な要因となると考えている。
【０００５】
エイズの治癒における主要な課題の１つは、体の免疫系によって自ら認識および排除（ｓｈｏｃｋ  ａｎｄ  ｋｉｌｌ）されるように潜伏性のＨＩＶをどのように再活性化できるかということである。同時に、研究から、ｃＡＲＴ治療を受けている感染者体内でさえ、不可逆的な免疫損傷、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数減少および機能的欠陥があることを見出した。これは、抗レトロウイルス療法によって再構築された免疫系がこれらの活性化された細胞を効果的に排除できず、体のＨＩＶ特異的免疫応答を共同で増強することによってＨＩＶリザーバーに対する排除効果を増強する必要があることを示唆している。したがって、ＨＩＶ潜伏性ウイルス「リザーバー」の形成および活性化戦略、ならびに体の免疫機能の再構築に対する探究は、全て、ＨＩＶを治癒する時代への非常に重要な研究方向である。
【０００６】
近年、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）腫瘍免疫療法技術に基づき、腫瘍細胞を殺すための新しい方法を生み出した。その高い親和性およびＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）非依存性などの優勢を持つ、特に２つのＣＤ２８および４−１ＢＢ、ＣＤ３ζのカップリングによって形成される第３世代ＣＡＲがＴ細胞の殺腫瘍能力を増強し、そして体内での生存期間を延ばすことができるため、これにより白血病やリンパ腫などの腫瘍免疫療法において有望な結果をもたらしている。実際には、早くも１９９４年には、Ｒｏｂｅｒｔｓらは、感染細胞表面のｇｐ１２０と結合するための一本鎖抗体としてＣＤ４配列を選択し、ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＨＩＶ感染の治療を試みたが、感染細胞を部分的に殺す機能があり、長年の努力の末に失敗に終わった。その要因としては以下が挙げられる。１．レトロウイルスベクターによる形質導入効率が比較的低く、十分な輸注可能ＣＡＲ−Ｔ細胞を得るために行われている過剰な体外増幅は輸注後の細胞死およびＣＡＲ分子の喪失を招く。２．ＣＡＲ分子設計それ自体に欠陥が存在し、ＣＤ４ドメインは、ＣＤ４分子のＨＩＶ感染細胞またはウイルス感染細胞での発現ダウンレギュレートにより、形質導入されたＣＴＬｓがＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷を免れることを引き起こす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の従来技術の欠点を解消するために、本発明は、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０を認識できる新規な一本鎖抗体ｓｃＦｖおよび当該一本鎖抗体からなるＮ６−ＣＡＲ分子と称されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記のＮ６−ＣＡＲを発現し得る発現ベクター、およびＮ６−ＣＡＲベクターで遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、Ｎ６−ＣＡＲ分子で修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の抗ＨＩＶ感染薬調製における用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決手段によって実現される。
【００１１】
本発明は、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０を認識可能であり、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０に対する抗体の軽鎖、重鎖可変領域を直列することで得られるものであり、ＣＡＲ分子全体の細胞外結合ドメインとして、そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示される一本鎖抗体ｓｃＦｖを提供する。
【００１２】
本発明は、上記の一本鎖抗体ｓｃＦｖをコードするコード遺伝子をも提供し、該遺伝子の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示される。
【００１３】
また、本発明は、ＨＩＶ感染を治療するキメラ抗原受容体を提供し、該キメラ抗原受容体は、Ｎ末端からＣ末端へシグナルペプチド、本発明に係る一本鎖抗体ｓｃＦｖ、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ、白血球抗原分化群分子膜貫通領域ＣＤ２８−ＴＭおよび細胞内ドメインＩＣＤ、４−１ＢＢ、および白血球抗原分化群３のζ鎖ＣＤ３を順次スプライシングすることで得られるものであり、得られたキメラ抗原受容体のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示される。
【００１４】
本発明は、上記のキメラ抗原受容体Ｎ６−ＣＡＲをコードするコード遺伝子を同時に提供し、該遺伝子の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示される。
【００１５】
本発明は、塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるキメラ抗原受容体Ｎ６−ＣＡＲのコード遺伝子を含有しかつ発現し得る発現ベクターを提供し、前記ベクターは、ＰＴＫ８８１ベクターを骨格とし、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置き換えた後に改造されたＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６ベクターであり、その塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示される。
【００１６】
本発明は、遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球を提供し、ＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして得られたレンチウイルスベクター形質導入ＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、これにより得られたキメラ抗原受容体を発現し得る遺伝子操作したＴ−リンパ球である。Ｎ６−ＣＡＲで改造されたＣＤ８＋細胞のｇｐ１２０細胞株の発現に対する殺傷効果はより顕著である。
【００１７】
さらに、前記遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球は、（１）末梢血からＰＢＭＣを分離した後に磁気ビーズを用いてポジティブセレクションによりＣＤ８＋Ｔ細胞が得られ、そしてａｎｔｉ−ＣＤ３／２８磁気ビーズ（細胞と磁気ビーズとの比は１：３）により１２時間刺激し、次いでＮ６−ＣＡＲ分子を組み換えたレンチウイルスを加えて４時間感染させた後に補液し（ＭＯＩ＝５）、ウイルス感染後３日目から細胞を計数し、細胞状態および増殖状況に応じて培地を流加し、細胞濃度を０．６×１０６／ｍｌに調整し、そしてＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を補充し、輸注した細胞数を満たすまで細胞をさらに増幅させるという方法により調製される。
【００１８】
本発明は、上記のＮ６−ＣＡＲで遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の用途を同時に提供し、前記Ｎ６−ＣＡＲで遺伝子修飾されたＣＤ８＋Ｔリンパ球が抗ＨＩＶ感染の生細胞薬の調製に応用される。
【発明の効果】
【００１９】
（１）本発明では、初期設計の欠点を解消し、ウイルスタンパク質Ｇｐ１２０に高度に特異的に結合できる広域中和抗体をｓｃＦｖとして使用し、９８％のＨＩＶ−１のウイルス株に結合して該ＣＡＲ−Ｔ細胞の広域スペクトルを拡大させることができる。（２）本発明では、ＳＩＮ（Ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）構造を有するＰＴＫプラスミドを用いてレンチウイルスベクターを生産し、安全性を高めると同時に、二重刺激分子を含むようにＣＡＲ分子細胞内を改造してＮ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞の増幅および生存特性を増強し、臨床的有効性および安全性を高める。（３）本発明におけるキメラ抗原受容体を発現し得る遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、体外実験でも体内実験でもＨＩＶウイルスを阻害および殺傷するのに有意な活性を示し、抗ＨＩＶ感染薬を調製するための活性成分として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明により構築された抗ＨＩＶ感染のキメラ抗原受容体の概略構造図である。
【図２】図２は、本発明により構築されたＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６レンチウイルスベクターの概略構造図である。
【図３】図３は、本発明において形質導入されたＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＮ６−ＣＡＲの発現レベル（Ａ）およびその刺激後の機能的増殖能（Ｂ）検出である。
【図４】図４は、本発明においてＮ６−ＣＡＲで形質導入されたＣＤ８＋Ｔリンパ球が体外でＨＩＶ感染細胞活性を死滅させる検出である。
【図５】図５は、共培養条件下では、本発明においてＮ６−ＣＡＲで形質導入されたＣＤ８＋Ｔリンパ球がウイルス活性を阻害する検出である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明においてＮ６−ＣＡＲで形質導入されたＣＤ８＋Ｔリンパ球がヒト化マウス体内のＨＩＶ感染細胞活性を死滅させる検出である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明においてＮ６−ＣＡＲで形質導入されたＣＤ８＋Ｔリンパ球がヒト化マウス体内のＨＩＶ感染細胞活性を死滅させる検出である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実例を挙げて本発明のいくつかの実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。本発明に開示されている内容を材料、方法および反応条件から同時に改良し、これらの改良は、全て本発明の精神および範囲内に含まれる。
【００２２】
実施例１
本発明は、ＨＩＶ感染を治療するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組換え遺伝子およびその構築方法を提供し、具体的なスプライシング方法は、シグナルペプチド、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０を認識可能な一本鎖抗体ｓｃＦｖ、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ、白血球抗原分化群分子膜貫通領域ＣＤ２８−ＴＭ＋ＩＣＤ、４−１ＢＢ、およびＣＤ３（白血球抗原分化群分子３）のζ鎖を順次スプライシングすることで、最後にＨＩＶを治療できる完全なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子が得られ、そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示され、その構造を図１に示し、該キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示される。
【００２３】
ＨＩＶ感染を治療するキメラ抗原受容体由来の一本鎖抗体ｓｃＦｖのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、該一本鎖抗体ｓｃＦｖは、ＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０に対する抗体の軽鎖、重鎖可変領域を直列することで得られるものであり、そのコード遺伝子の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示される。
【００２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を例として本発明のＣＡＲ分子の構造設計について詳細に紹介する。ＣＡＲ分子の窒素末端配列はＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０を特異的に認識できるＣＡＲ由来のｓｃＦｖ配列であり、ＣＡＲ分子の炭素末端配列は第３世代ＣＡＲの構造をもとに、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ、ＣＤ２８ＴＭ＋ＩＣＤ、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを直列することで構成され、ＣＤ２８分子の膜貫通ドメインによってｓｃＦｖおよび細胞内シグナル分子が連結されている。かかる構造により、各セグメントは、以下の機能を果たすことができる。シグナルペプチドはＣＡＲを細胞外に分泌でき、ＣＤ２８ＴＭ＋ＩＣＤは本発明のＣＡＲを細胞膜にアンカー結合させ、ｓｃＦｖはＨＩＶウイルス感染細胞表面のｇｐ１２０を特異的に認識し、ＣＤ３ζは細胞内シグナル活性化配列であり、ｓｃＦｖが抗原に結合した後にＣＤ３ζがシグナルを活性化し、リンパ球に殺傷活性を発揮させる。
【００２５】
実施例２：ＣＡＲ分子の組換えによるＰＴＫ−ＥＦ−１α−Ｎ６プラスミド発現ベクターの構築
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示される配列でＣＡＲを合成し、全長ＣＡＲのコード遺伝子をシームレス組換えクローニング技術に基づいて目的発現ベクターに挿入する（図２参照）。数回の実験を重ねた結果、好ましいプラスミドベクターとして、ＰＴＫ８８１ベクターを骨格とし、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置き換えた後に改造されたＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６ベクター（その塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示される）であり、最終的にＣＡＲ遺伝子が挿入されＣＡＲを発現し得る組換えプラスミドＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６ベクターが得られ、その塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示される。
【００２６】
ウイルスを次の手順でパッケージングする。
１）ＤＭＥＭ培養液１６ｍｌの入った２本の遠心チューブのうち、一方のチューブにＰＥＩ９６０μｇを加え、他方のチューブにプレミックスＰＴＫ８８１ベクタープラスミド３２０μｇを加え、ボルテックスで振とうし、そして室温で１０分間平衡化する。
２）１０ｍｌピペットを用いてＰＥＩを混合した培地を膨らませ、プラスミドを混合した培地を一滴ずつＰＥＩに加え、そして室温で３０分間インキュベートする。
３）Ｔ１７５フラスコにウシ胎児血清３ｍｌを加え、ＰＥＩと混合したＰＴＫ−ＥＦ１α−Ｎ６ベクタープラスミドをその中に加え、次に多層細胞培養フラスコ内の培地をＴ１７５フラスコに注ぎ、上下左右逆さまにプラスミドと均一に混合し、最後にＴ１７５フラスコ内の培地を多層細胞培養フラスコに逆さまに注ぐ。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにて３日間培養し、上清を回収する。回収した上清を４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で３０ｍｉｎ遠心分離して２９３Ｔ細胞破片を除去する。
４）レンチウイルス液上清を０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過し、２５０ｍｌ遠心分離ボトルに分注し、４℃、３００００ｇで２．５時間遠心分離し、遠心分離した後に遠心分離ボトルをバイオセーフティキャビネットに注意深く移し、真空ポンプで上清を取り除き、沈殿物を残し、Ｔ細胞培地を５００μｌ／遠心分離ボトルで加え、沈殿物をガンで吹き飛ばして均一に混合すれば、Ｎ６−ＣＡＲ分子を含有するレンチウイルスベクターが得られ、直ちに使用するかまたは分注した後に−８０℃で保存する。
【００２７】
実施例３：キメラ抗原受容体を発現し得るＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）の調製
ステップ１：患者のＰＢＭＣ細胞の分離
（１）ヒト末梢血試料６０〜８０ｍｌを採取し、採取しながら揺れて末梢血を抗凝固剤と十分に混合させる。
（２）末梢血を５０ｍｌ遠心チューブに移し、ＤＰＢＳ緩衝液を用いて１：１で末梢血を希釈し、均一に混合する。希釈した血液試料を室温でヒトリンパ球分離液の入った１５ｍｌ遠心チューブにゆっくり加える。方法は次のとおりである。１０ｍｌピペットで血液試料を吸引し、分離液の液面より上方０．５ｃｍの位置まで伸び、血液試料が自然に滑り落ちて分離液の表面に広げられ、次いで液面を破壊しないように注意しながら血液試料を軽く加える。
（３）平衡化して３０ｍｉｎ遠心分離し、ゆっくりと加速させたり減速させたりする。
（４）遠心分離終了後、遠心チューブ内で、下から赤血球層、顆粒細胞層、Ｆｉｃｏｌｌ層、単核細胞層および血漿層の順に明らかに層が分離する。血漿層を白膜層から約５ｍｍの位置まで吸引して捨てる。赤血球層以上の全ての液体を遠心チューブに慎重に吸引し、ＰＢＳで希釈し、細胞懸濁液との体積比を１：３より大きくし、均一に混合する。
（５）（１６００ｒ／ｍｉｎ）で５ｍｉｎ遠心分離し、細胞をＰＢＳで再懸濁して均一に混合し、少量の細胞を取って計数する。
（６）３００ｇ（１２００ｒ／ｍｉｎ）で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を無菌検出に送る。
【００２８】
ステップ２：ＣＤ８＋Ｔ細胞の選別
（１）ステップ１のＰＢＭＣ細胞を、３０ｍｌの生理食塩水で再懸濁した後にサンプリングし計数し（サンプリング終了後、５０ｍｌまで補加して均一に混合し、５００ｇ、１０ｍｉｎ、１８℃、急速に加速させたり減速させたりして遠心分離し、上清を除去する）、計数した後に１０７／８０μＬでｂｕｆｆｅｒを加えて均一に混合し（上清が完全に除去されない場合、ｂｕｆｆｅｒを加えないことが好ましい）、１０７／２０μＬでＣＤ８  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを加えて再懸濁し、４〜８℃で１５ｍｉｎインキュベートする。
（２）インキュベート終了後、１０７個当たり１〜２ｍｌでｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を洗浄し、５００ｇ、１０ｍｉｎで遠心分離する。
（３）５００μＬのｂｕｆｆｅｒで１０８個もある細胞を再懸濁する（細胞数が多い場合、ｂｕｆｆｅｒの使用量も多くなる）。
（４）ミルテニー専用ＬＳカラムを磁気スタンドに置き、３ｍｌのｂｕｆｆｅｒでＬＳカラムをすすいだ後、細胞再懸濁液をＬＳカラムに加え、流れ終わらせる。３ｍｌのｂｕｆｆｅｒでＬＳカラムを３回洗浄し、毎回流れ終わらせる必要がある。ＬＳカラムを磁気スタンドから取り外し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒをＬＳカラムに加え、ピストンで標識された細胞を洗い流す（標識された細胞がいずれも洗い流されることを確保するために２回すすぐ）。
（５）ＣＤ８＋Ｔ細胞を洗い流した後、生理食塩水で３０ｍｌに再懸濁し、サンプリングし計数し、５００ｇ、１０ｍｉｎ、１８℃で遠心分離し、細胞沈殿物が得られると、培養に用いることができる。
【００２９】
ステップ３：ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
（１）ステップ２のＣＤ８＋Ｔ細胞を計数し、２×１０６／ｍｌの密度で培養フラスコに加え、均一に混合してＣＯ２インキュベーターに入れて２時間培養する。
（２）培養フラスコを取り出し、軽く揺れ、底部に沈殿した懸濁細胞を浮遊させ、ピペットで培地を吸引して遠心チューブに移し、少量の培地で培養フラスコを洗浄して懸濁細胞を全て収集し、均一に混合して計数する。
（３）細胞計数に応じて細胞濃度を調整し、１．２×１０６／ｍｌの濃度で培養フラスコに接種し（１００〜１２０ｍｌ  ｉｎ  ａ  Ｔ１５０、５０〜６０ｍｌ  ｉｎ  ａ  Ｔ７５、１５〜２９ｍｌ  ｉｎ  ａ  Ｔ２５）、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを加え、細胞と磁気ビーズとの比は１：３で（加える前に磁気ビーズを培地で３回洗浄し、保存液を除去する）、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を加え、均一に混合してＣＯ２インキュベーターに入れて培養し、細胞を収集する。
【００３０】
ステップ４：ＣＤ８＋Ｔ細胞をＮ６−ＣＡＲ分子で形質導入することによるＣＡＲ−Ｔ細胞の調製
磁気ビーズを１２時間加えた後、ステップ３での生長状態が良好なＣＤ８＋Ｔ細胞懸濁液を、遠心チューブに適量入れて３００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、１×１０６／ｍｌ細胞の割合でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ウイルスベクターを加え、また最終濃度が４μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅを加え、均一に混合する。細胞懸濁液を３７℃で少量インキュベートする。４時間インキュベートした後にＴ細胞完全培地を適量流加して培養する。細胞培養３日目に、細胞を計数しかつ細胞状態および増殖状況に応じて培地を流加し、細胞濃度を０．６×１０６／ｍｌに調整し、そしてＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を補充する。細胞培養５日目に、細胞を均一に混合して遠心チューブに移し、磁気ビーズを磁気スタンドから取り外し、細胞を計数しかつ培地を流加し、かつＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を補充し、細胞密度を０．６×１０６／ｍＬに調整して培養を続ける。ｓｃＦｖの発現をフローサイトメトリーで検出すると同時に、一部のＣＤ８＋Ｔリンパ球をｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体により刺激して連続継代することにより、ａｎｔｉ−ｇｐ１２０でＣＡＲが形質導入されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の自己増幅能を確定し、結果を図３に示す。
【００３１】
結果から、Ａｎｔｉ−ｇｐ１２０でＣＡＲウイルスが形質導入された細胞培養５日目後に、４０％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＡＲ分子を発現し、抗体ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙがＣＤ８＋Ｔ細胞発現ＣＡＲ分子に特異的に結合すると、細胞増殖を効果的かつ用量依存的に活性化でき、継代数が増加するにつれて、ＣＡＲ分子陽性細胞種群の割合も徐々に増加することが明らかになる。
【００３２】
実施例４：ＣＡＲ−Ｔ細胞が体外でＨＩＶ感染細胞活性を死滅させる検出
Ｎ６−ＣＡＲの機能をさらに検出するために、Ｎ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞をＨＩＶ−１に感染した２つの細胞株Ｈ９−ＮＬ４−３およびＨ９−ＮＤＫとそれぞれ混合して培養し、Ｕ底タイプの９６ウェルプレートで細胞殺傷実験を行う。まずＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭでＨＩＶ感染細胞株Ｈ９および陰性対照細胞を標識し、１００μｌ（標的細胞含有数１０４）を９６ウェルプレートに取り、勾配希釈されたＣＡＲ−Ｔ細胞１００μｌを対応する９６ウェルプレートに加え、有効標的比は５：１から１０：１の範囲であるように確保し、最終容量が１ウェルあたり２００μｌである。室温、２００ｇで３０分間遠心分離し、３７℃で２〜３時間インキュベートする。遠心分離して上清を取って蛍光を測定し、溶解の割合を計算することでＨＩＶ感染細胞に対するＮ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を判断し、実験結果を図４に示す。
【００３３】
結果から、５：１から１０：１の有効標的比区間範囲内で、Ｎ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞が用量依存的に２つの毒株ＨＩＶ感染標的細胞株を有意に死滅させるが、対照標的細胞に有意な殺傷効果がなく、Ｎ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的細胞に対する殺傷作用がＨＩＶ−ｇｐ１２０特異的であることを示していることが明らかになる。
【００３４】
実施例５：共培養条件下ではＣＡＲ−Ｔ細胞が体外でウイルス複製活性を阻害する検出
野生型ＨＩＶ−１感染の初世代ＣＤ４＋Ｔ細胞の排除におけるＮ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性をさらに実証するために、野生型ＨＩＶ−１ＮＬ４−３−ＥＧＦＰおよびＮＤＫ−ＥＧＥＰの２つの毒株を用いてそれぞれ健康なヒトの血液試料から分離したＣＤ４＋Ｔリンパ球に感染し、感染３時間後に血液を交換する。感染後８日目に、該細胞をＮ６−ＣＡＲで改造された同源ＣＤ８＋Ｔリンパ球と１：４の割合で混合し、２４ウェルプレートで細胞殺傷実験を行う。標的細胞数が１０６／ウェルであり、ＲＭＰＩ１６４０完全培地容量が５００μｌ／ウェルである。４８時間後、フローサイトメトリーによりＥＧＦＰ＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球の割合を検出し、Ｎ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷効果を検証し、実験結果を図５に示す。
【００３５】
結果から、ＣＡＲ分子で改造されていないＣＤ８＋Ｔ細胞群を参照とし、Ｎ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞群が９９．５％のＨＩＶ−１感染細胞を排除でき、殺傷効果が顕著であり、そしてＮ６−ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性および効率性を十分に示すことが明らかになる。
【００３６】
実施例６：ＣＡＲ−Ｔリンパ球が体内でＨＩＶウイルス感染細胞活性を死滅させる検出
Ａｎｔｉ−ｇｐ１２０  ＣＡＲ−Ｔリンパ球が体内でＨＩＶ感染細胞を排除できるか否かをさらに実証するために、蛍光遺伝子付きのＮＬ４−３−ＥＧＦＰウイルス（１ｘ１０６ｐｇ  ｐ２４／ｍｏｕｓｅ）をヒト化マウスＢＬＴ体内に静脈内注射し、マウスに感染すると同時に、健康なボランティアからＰＢＭＣを分離し、次いでＣＤ８＋Ｔ細胞を分離し、Ｎ６−ＣＡＲレンチウイルスで形質導入し、１０日間体外増幅した後に、計数し、そして５００μｌのＰＢＳで再懸濁し、１×１０７ＣＤ８＋Ｔ／ｋｇの用量で静脈内輸注する。２週間後、脾臓をマウス体内から収集し、包埋剤に入れて凍結切片を作製する。２０枚を超える厚さ１０μｍの凍結切片を作製し、蛍光共焦点顕微鏡下で写真を撮影し、写真をＶｅｌｏｃｉｔｙ５．０ソフトウェアで定量化し分析する（図６Ａ）。同時に、収集した脾臓細胞の一部から単細胞懸濁液を調製し、５×１０６個の細胞にＤＮＡｚｏｌを加えてゲノムＤＮＡを抽出し、Ｎｅｓｔｅｄ−ＱＰＣＲによってプロウイルスのコピー数を定量化して体内の全ＨＩＶ感染細胞数を推定する（図６Ｂ）。
【００３７】
結果から、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受けなかった対照群と比較して、ウイルスタンパク質発現レベルおよびウイルスゲノムレベルのそれぞれが９７．１％を有意に減少したことを示し、ＣＡＲ−Ｔ細胞が体内でＨＩＶ感染細胞を効果的に溶解および排除できることが実証され、ＣＡＲ−Ｔ細胞のヒト臨床実験のために理論的基礎を提供することが明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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