(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含む、温度センサー用組成物。
【請求項２】
前記二重鎖がある特定の温度で一本鎖に変性され、前記DNAザイム鎖が前記DNAザイム補因子に結合する、請求項1に記載の温度センサー用組成物。
【請求項３】
前記二重鎖が、ある特定の温度で不可逆的に変性される、請求項2に記載の温度センサー用組成物。
【請求項４】
前記DNAザイム鎖が、G四重鎖構造を含む、請求項1に記載の温度センサー用組成物。
【請求項５】
前記酸化グラフェンが、ポリエチレングリコールで官能化されている(PEG-GO)、請求項1に記載の温度センサー用組成物。
【請求項６】
比色試薬をさらに含む、請求項1に記載の温度センサー用組成物。
【請求項７】
前記比色試薬が、ABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))、OPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)、DAB(ジアミノベンジジン)、AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、AmplexRed、ホモバニリン酸、及び1種以上のペルオキシドからなる群から選択される1種以上の試薬を含む、請求項6に記載の温度センサー用組成物。
【請求項８】
前記DNAザイム補因子がヘミンである、請求項1に記載の温度センサー用組成物。
【請求項９】
前記PNA鎖の長さを調節することによって目標温度を制御する、請求項1に記載の温度センサー用組成物。
【請求項１０】
DNAザイム鎖及びPNA鎖を混合することによって、前記DNAザイム鎖及び前記PNA鎖が相補的に結合した二重鎖を含有する混合物を得るステップ、
前記混合物に酸化グラフェンを添加するステップ、及び
前記混合物を加熱しながら前記混合物の色の変化を観察するステップ
を含む、温度検出方法。
【請求項１１】
DNAザイム補因子を前記混合物に添加するステップをさらに含む、請求項10に記載の温度検出方法。
【請求項１２】
前記酸化グラフェンが、ポリエチレングリコールで官能化されている(PEG-GO)、請求項10に記載の温度検出方法。
【請求項１３】
前記PNA鎖の長さを調節することによって目標温度を制御する、請求項10に記載の温度検出方法。
【請求項１４】
酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含む組成物を含む、温度センサー用キット。
【請求項１５】
比色試薬をさらに含む、請求項14に記載の温度センサー用キット。
【請求項１６】
前記酸化グラフェンが、ポリエチレングリコールで官能化されている(PEG-GO)、請求項14に記載の温度センサー用キット。
【請求項１７】
前記PNA鎖の長さを調節することによって目標温度を制御する、請求項14に記載の温度センサー用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化グラフェン、DNAザイム及びPNAを含む温度センサー用組成物並びにそれを使用する温度検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度は、科学技術のほとんどの分野における基本的パラメーターである。従来、多くの温度センサーは、温度応答性材料、例えば生体分子(非特許文献1、Bu et al., 2018. DNA nanostructure-based fluorescence thermometer with silver nanoclusters. Nanotechnology 29(29), 295501;非特許文献2、Donner et al., 2012. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Lett 12(4), 2107-2111)、ポリマー(非特許文献3、Hu et al., 2015. Intracellular cascade FRET for temperature imaging of living cells with polymeric ratiometric fluorescent thermometers. ACS Appl Mater Interfaces 7(2018), 15551-15560)、ヒドロゲル(非特許文献4、Yamamoto et al., 2017. Efficient Skin Temperature Sensor and Stable Gel-Less Sticky ECG Sensor for a Wearable Flexible Healthcare Patch. Adv Healthc Mater 6(17))、有機小分子(非特許文献5、Boles et al., 2003. Quantification of mitochondrial DNA heteroplasmy by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Clin Chem 49(1), 198-200)、及びナノ材料(非特許文献6、Freddi et al., 2013. A molecular thermometer for nanoparticles for optical hyperthermia. Nano Lett 13(5), 2004-2010)をベースにして確立されてきた。
【０００３】
これらの材料の中で、DNAをベースにしたナノ構造は、そのプログラム可能性、高温分解能、及び高速応答により、温度を検出するのに最も価値のあるツールの1つである。DNA二重鎖の塩基間の水素結合は、「DNA融解」と呼ばれるプロセスにより、高温で破断される。DNAの融解動態は温度の上昇に相関するので、融解したDNAの部分は温度インジケーターとして作用する。そのようなサーモセンサーの検出可能な温度範囲は、DNA構造の融解温度(Tm)によって決定される。例えば、ステムループ構造を形成するように設計された分子指標(MB)は、温度応答性ヘアピン開口を介して作用する代表的なDNAナノサーモセンサーである(非特許文献7、Jonstrup et al., 2013. DNA hairpins as temperature switches, thermometers and ionic detectors. Sensors (Basel) 13(5), 5937-5944)。
【０００４】
ほとんどのDNAサーモセンサーは蛍光法をベースにし、DNA構造に結合された蛍光染料間の蛍光共鳴エネルギー移動現象を利用する。事実、温度測定のための肉眼比色手法は、実用的な分野、例えば健康診断及び食品安全性における、その技術的な簡便性及び適用可能性にも関わらず、ほとんど開発されていない。グアニン(G)リッチDNAザイム(Dz)は、様々な生物学的用途に最も有用なDNAの1種である。グアニン(G)リッチDNAザイム(Dz)は、G(グアニン)四重鎖構造を採用し、ヘミンの存在下でペルオキシダーゼ様活性を示す。この触媒DNA分子は、その熱安定性、官能化の容易さ、及び費用有効性により、ペルオキシダーゼの代わりに数多くの比色検出システムで広く利用されてきた。
【０００５】
したがって本発明者らは、実用的な分野、例えば健康診断及び食品安全性において容易に適用することができる、ペプチド核酸(PNA)、DNAザイム(Dz)、及びPEG化酸化グラフェン(PEG-GO)を使用して肉眼で読み取ることができる温度センサーを開発した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bu et al., 2018. DNA nanostructure-based fluorescence thermometer with silver nanoclusters. Nanotechnology 29(29), 295501
【非特許文献２】Donner et al., 2012. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Lett 12(4), 2107-2111)
【非特許文献３】Hu et al., 2015. Intracellular cascade FRET for temperature imaging of living cells with polymeric ratiometric fluorescent thermometers. ACS Appl Mater Interfaces 7(2018), 15551-15560
【非特許文献４】Yamamoto et al., 2017. Efficient Skin Temperature Sensor and Stable Gel-Less Sticky ECG Sensor for a Wearable Flexible Healthcare Patch. Adv Healthc Mater 6(17)
【非特許文献５】Boles et al., 2003. Quantification of mitochondrial DNA heteroplasmy by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Clin Chem 49(1), 198-200
【非特許文献６】Freddi et al., 2013. A molecular thermometer for nanoparticles for optical hyperthermia. Nano Lett 13(5), 2004-2010
【非特許文献７】Jonstrup et al., 2013. DNA hairpins as temperature switches, thermometers and ionic detectors. Sensors (Basel) 13(5), 5937-5944
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含み、肉眼比色測定及び温度リコール(temperature recall)を可能にする、温度センサー用組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、肉眼比色測定を可能にする温度センサー用組成物を使用する、温度検出方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、肉眼比色測定を可能にする温度センサー用組成物を含む、温度センサー用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の態様では、本発明は、酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含む、温度センサー用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様では、本発明は、下記のステップ:
DNAザイム鎖及びPNA鎖を混合することによって、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した、二重鎖を含有する混合物を得るステップ、
混合物に酸化グラフェンを添加するステップ、並びに
混合物を加熱しながら混合物の色の変化を観察するステップ
を含む、温度検出方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様では、本発明は、酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含む温度センサー用組成物を含む、温度センサー用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による温度センサー用組成物、温度検出方法、及び温度センサー用キットにおいて、DNAザイム/PNA二重鎖が、ある特定の温度で解離する場合、酸化グラフェンは、優れた選択性及び不可逆性でPNAを吸着し、したがって温度のリコールが可能になり、必要な時に遅延発色させることができる。さらに、目標温度は、比色試薬の色の変化を通して肉眼で容易にかつ素早く検出することができ、サーモセンサーは、技術的に簡便で適用するのが容易であり、したがって様々な生物学的用途において使用することができる。さらに、様々な長さのPNAプローブの組合せを使用するバーコード(オン/オフ)システムとして使用することができ、したがって、多様な温度範囲を検出するのに広く適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】PNA及びPEG-GOを含む温度センサー用組成物を使用する、温度検出方法の概略的なメカニズムを示す図である。
【図２ａ】図2aは、Dz鎖及びその相補的PNA鎖の配列を示す図である。
【図２ｂ】図2bは、比較例2のDz補因子、実施例1の発色試薬、及び陰性対照ペルオキシドの存在下で色の変化を観察した結果を示す図である。
【図２ｃ】図2cは、比較例2のDz補因子、実施例1の発色試薬、及び陰性対照ペルオキシドの存在下での、420nmでの時間依存性吸光度及び30分での吸収スペクトルを示す図である。
【図２ｄ】図2dは、比較例2のDz補因子、実施例1の発色試薬、及び陰性対照ペルオキシドの存在下での、420nmでの時間依存性吸光度及び30分での吸収スペクトルを示す図である。
【図３】5×PBS溶液中の、比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOの分散性を示す写真である。
【図４ａ】図4aは、DNA鎖(D18)及びPNA鎖(P18)を比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOと混合した場合の、クエンチ現象を観察した結果を示すグラフである。
【図４ｂ】図4bは、DNA鎖(D18)及びPNA鎖(P18)を比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOと混合した場合の、クエンチ現象を観察した結果を示すグラフである。
【図４ｃ】図4cは、DNA鎖(D18)及びPNA鎖(P18)を比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOと混合した場合の、クエンチ現象を観察した結果を示すグラフである。
【図４ｄ】図4dは、DNA鎖(D18)及びPNA鎖(P18)を比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOと混合した場合の、クエンチ現象を観察した結果を示すグラフである。
【図４ｅ】図4eは、DNA鎖(D18)及びPNA鎖(P18)を比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOと混合した場合の、クエンチ現象を観察した結果を示すグラフである。
【図４ｆ】図4fは、DNA鎖(D18)及びPNA鎖(P18)を比較例1のGO-COOH及び調製例のPEG-GOと混合した場合の、クエンチ現象を観察した結果を示すグラフである。
【図５ａ】図5aは、加熱によって解離した(実施例2)又は加熱せずに室温で保存した(比較例3)Dz/P18二重鎖を、様々なPEG-GOと混合した場合の、蛍光強度及び吸光度を示すグラフである。
【図５ｂ】図5bは、加熱によって解離した(実施例2)又は加熱せずに室温で保存した(比較例3)Dz/P18二重鎖を、様々なPEG-GOと混合した場合の、蛍光強度及び吸光度を示すグラフである。
【図５ｃ】図5cは、加熱によって解離した(実施例2)又は加熱せずに室温で保存した(比較例3)Dz/P18二重鎖を、様々なPEG-GOと混合した場合の、蛍光強度及び吸光度を示すグラフである。
【図５ｄ】図5dは、加熱によって解離した(実施例2)又は加熱せずに室温で保存した(比較例3)Dz/P18二重鎖を、様々なPEG-GOと混合した場合の、蛍光強度及び吸光度を示すグラフである。
【図６ａ】図6aは、実施例2の生成物を、50℃〜80℃の温度範囲で加熱することによって、蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示すグラフである。
【図６ｂ】図6bは、実施例2の生成物を、50℃〜80℃の温度範囲で加熱することによって、蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示すグラフである。
【図６ｃ】図6cは、実施例2の生成物を、50℃〜80℃の温度範囲で加熱することによって、蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示すグラフである。
【図６ｄ】図6dは、実施例2の生成物を、50℃〜80℃の温度範囲で加熱することによって、蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示すグラフである。
【図７ａ】図7aは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のための、実施例1、実施例3、及び実施例4の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図７ｂ】図7bは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のための、実施例1、実施例3、及び実施例4の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図７ｃ】図7cは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のための、実施例1、実施例3、及び実施例4の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図７ｄ】図7dは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のための、実施例1、実施例3、及び実施例4の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図７ｅ】図7eは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のための、実施例1、実施例3、及び実施例4の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図８】目標温度、40℃、60℃、及び80℃で5分間維持された、並びに室温又は4℃で一晩保存された、実施例の生成物の相対的吸光度値を示すグラフである。H2O2を、保存後に添加し又は保存せずにすぐに添加した。
【図９ａ】図9aは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のために実施例3〜実施例6の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図９ｂ】図9bは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のために実施例3〜実施例6の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図９ｃ】図9cは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のために実施例3〜実施例6の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【図９ｄ】図9dは、塩基対の数による温度センサーの比色確認のために実施例3〜実施例6の生成物の蛍光強度及び吸光度を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に記載する。
【００１６】
本発明の実施形態は、様々なその他の形に修正することができ、本発明の範囲は、以下に記載される実施形態に限定されない。この分野に関する平均的知識を有する当業者によって、本発明の実施形態は本発明をより正確に説明するために与えられたことが、十分理解される。さらに、本明細書の全体を通した要素の「包含(inclusion)」は、その他の要素を排除するものではなく、他に特に指示されない限り、その他の要素を含んでいてもよい。
【００１７】
上述のように、過去には、生体分子、有機小分子、ナノ材料などを使用する多くの温度センサーが確立されてきたが、温度測定のための肉眼比色手法はほとんど開発されておらず、実際的応用、例えば健康診断及び食品安全性において制約がある。
【００１８】
したがって上記問題を解決するために、本発明者らは、ペプチド核酸(PNA)、DNAザイム(Dz)、及び酸化グラフェンを使用して、肉眼で特定することができ且つ実用的な分野、例えば健康診断及び食品安全性において容易に適用することができる、温度センサーを開発した。
【００１９】
本発明者らは、ペプチド核酸(PNA)及びPEG化酸化グラフェン(PEG-GO)を使用した、GリッチDzベースの比色温度センサーを確立した。酸化グラフェン(GO)、グラフェンの水分散性形態は、様々な酸素含有基を収容する二次元炭素シートである。これらの表面基は、ポリエチレングリコール(PEG)で容易に官能化することができ、高いバイオアベイラビリティ及び分散性をGOに与える。GOは、様々な生物学的用途に、例えばバイオセンサー、及び薬物送達システムにおいて、数十年にわたり利用されてきた。数多くのバイオセンサーでは、GOは一般に、二重鎖形態よりも一本鎖核酸に対して優先的な親和性を示しており、効率的な蛍光クエンチ能を示す。ペプチド核酸(PNA)、合成DNA模倣体は、現在のところ、GOベースのセンサーで使用するのに非常な関心が持たれている。DNAと比較すると、無電荷のPNAは、相補的DNA又はRNAに結合したときに、GOに対する優れた結合親和性と、改善された熱安定性とを示す。したがって本発明者らは、温度依存的手法でDzの触媒活性を制御するためにPNAとPEG-GOとの組合せを利用し、比色熱可視化を可能にした。
【００２０】
本発明による温度センサーに関するメカニズムは、GリッチDzを有する熱感受性ワトソン・クリック型塩基対合、及び触媒活性を持つDzのG四重鎖立体構造に依拠する。温度によるDz活性を制御するために、本発明者らは、CリッチPNAプローブを用いてDz鎖とハイブリダイズし、PNAプローブのスカベンジャーとしてのPEG-GOを用いた。本発明による温度センサー用組成物の例として、温度センサーは、アニールされたDz/PNA二重鎖とPEG-GOとを、ヘミン及び2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS))を含有する1×Dz緩衝剤中で、混合することによって調製した。この時、DzのG四重鎖フォールディングは、相補的PNAとの強力なワトソン・クリック塩基対合によって完全に遮断され、Dz活性の阻害がもたらされた。二重鎖は、温度を上昇させることによって変性し、その後、PEG-GOによる選択的PNA捕捉がなされ、DzをG四重鎖構造にフォールドさせた。PEG-GOへのPNAの吸着が不可逆的に生じ;したがって活性Dzの量は、温度が、元の低いベースラインに戻った後でも、目標温度でのDz/PNAの変性の比に従って定量的に決定することができた。その結果、G四重鎖DzはDz補因子と組み合わされ、反応を触媒して、ペルオキシドの後添加により比色試薬を生成した(図1)。
【００２１】
本発明の態様において、本発明は、酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含む、温度センサー用組成物を提供する。
【００２２】
本発明で使用されるPNA(ペプチド核酸)という用語は、DNAの糖リン酸骨格の、ペプチドコンジュゲートによる置換体を含み、DNA主鎖構造の負電荷を示さない中性構造を有することができる。
【００２３】
本発明で使用されるDNAザイム(Dz)という用語は、一般に、酵素活性を有する核酸分子を指す。例えば、DNAザイムはペルオキシダーゼ活性を有することができる。さらにDNAザイムは、デオキシリボザイム、DNA酵素、DNAザイム、触媒DNA、DNAをベースにした酵素を含む用語とすることができ、リボヌクレアーゼ及びRNAリガーゼとすることもできる。DNAザイムは、化学反応、例えばDNAリン酸化、DNAアデニル化、DNA脱グリコシル化、ポルフィリンメタル化、チミンダイマー光復帰（photoreversion）、及びDNA切断を可能にしてもよい。
【００２４】
DNAザイムはDNAザイム配列を含んでいてもよく、DNAザイム配列は、DNAザイムとして機能することが可能な核酸構成体を形成することができる、配列を指す。例えば、核酸四重鎖構造を形成することが可能な配列、及び一実施形態ではG四重鎖を形成することが可能な配列とすることができる。
【００２５】
さらに、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖の長さは、例えば、5〜50ヌクレオチド、5〜40ヌクレオチド、5〜30ヌクレオチド、5〜25ヌクレオチド、6〜20ヌクレオチド、及び9〜18ヌクレオチドとすることができるが、必ずしもこれらに限定するものではない。DNAザイム鎖の少なくとも一部は、PNA鎖の少なくとも一部に相補的にすることができる。
【００２６】
本発明の実施形態では、図7aに示されるように、DNAザイム配列は、5'-GGG TAG GGC GGG TTG GGA-3'(配列番号:1)とすることができる。これに加え、G四重鎖を形成できる場合は、限定することなく本発明に含まれる。
【００２７】
一実施形態において、5'-GTGGGGCATTGTGGGTGGGTGTGG-3'(配列番号:5)、5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'(配列番号:6)、5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'(配列番号:7)、又は5'-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'(配列番号:8)を含むDNAザイム配列を、5'-GGG TAG GGC GGG TTG GGA-3'(配列番号:1)の代わりに使用することができる。
【００２８】
本発明の別の態様では、二重鎖を、ある特定の温度で一本鎖に変性させることができ、したがってDNAザイム鎖はDNAザイム補因子に結合することができる。
【００２９】
本発明の一態様では、DNAザイム補因子は、DNAザイムの配列と一緒にDNAザイムとして機能させるのに使用することができる限り、限定することなく本発明に含まれると理解することができる。本発明の実施形態では、DNAザイムは、ペルオキシダーゼ活性を示すものとすることができ、DNAザイム補因子をヘミンとすることができる。
【００３０】
この時、二重鎖は、ある特定の温度で一本鎖に不可逆的に変性され、DNAザイム鎖はDNAザイム補因子に結合することができる。目標温度は、時間が経過し又は温度が変化する場合であっても記憶することができ、したがって目標温度は、比色試薬を添加することによって検出され得る。
【００３１】
本発明の別の態様では、酸化グラフェンは、ポリエチレングリコール(PEG)官能化酸化グラフェン(PEG-GO)とすることができる。ポリエチレングリコールで酸化グラフェンを官能化することによってPEG-GOを調製するステップは、カルボキシル化を含むことができる。さらに、ポリエチレングリコールで酸化グラフェンを官能化することによってPEG-GOを調製するステップは、PEG化(ポリエチレングリコール化)を含むことができる。
【００３２】
本発明の態様では、酸化グラフェンは、単層シート形態の形であることができるが、必ずしもこれに限定するものではない。例えば、単層シートの形をとる酸化グラフェンは、単層シートの形をとらない酸化グラフェンに比べて同じ質量で広い表面積を有し、したがって大量の核酸プローブを吸着することができる。
【００３３】
本発明の態様では、酸化グラフェンは、約10nm〜約1μmのサイズを有する粒子の形態であり得るが、常にそれらに限定するものではない。例えば、酸化グラフェン粒子のサイズは、約10nm〜約1μm、約10nm〜約700nm、約10nm〜約500nm、約10nm〜約400nm、約10nm〜約300nm、約10nm〜約200nm、約10nm〜約100nm、約10nm〜約50nm、約50nm〜約1μm、約100nm〜約1μm、約200nm〜約1μm、約300nm〜約1μm、約400nm〜約1μm、約500nm〜約1μm、約700nm〜約1μm、約200nm〜約300nm、又は約400nm以下とすることができるが、これらに常に限定されるものではない。
【００３４】
本発明の別の態様では、組成物は、比色試薬をさらに含むことができ、比色試薬は、DNAザイム活性により比色を示すことが可能である限り、限定することなく本発明の組成物に含めることができる。例えば、比色試薬は、ABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))、OPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)、DAB(ジアミノベンジジン)、AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、AmplexRed、又はホモバニリン酸とすることができる。さらに、比色試薬は1種以上のペルオキシドを含むことができる。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明は特定の理論に限定されないが、DNAザイムはペルオキシダーゼ活性を示す。DNAザイムは、ABTS、OPD、DAB、AEC、TMB、AmplexRed、及びホモバニリン酸からなる群から選択される1つ以上と少なくとも1種のペルオキシドの一連の酸化還元プロセスを通して、ABTS、OPD、DAB、AEC、TMB、AmplexRed、及びホモバニリン酸からなる群から選択される1つ以上から比色を検出することができる。
【００３６】
本発明の別の態様では、温度センサー用組成物は、PNA鎖の長さを調節することによって目標温度を制御することができる。
【００３７】
本発明の別の態様では、本発明は、下記のステップ:
DNAザイム鎖及びPNA鎖を混合することによって、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖を含有する混合物を得るステップ、
混合物に酸化グラフェンを添加するステップ、並びに
混合物を加熱しながら混合物の色の変化を観察するステップ
を含む、温度検出方法を提供する。
【００３８】
以下、温度検出方法について、ステップごとに詳細に記載する。
【００３９】
DNAザイム鎖及びPNA鎖を混合することによって、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖を含有する混合物を得るステップは、DNAザイム鎖及びPNA鎖をアニールし、ゆっくり冷却することによって、実現することができる。以下に記載される実施例では、二重鎖は、DNAザイム鎖及びPNA鎖を95℃で5分間アニールし、水中でゆっくり冷却することによって調製したが、条件は、DNAザイム鎖及びPNA鎖の長さ並びにヌクレオチドのタイプに応じて様々であってもよい。
【００４０】
酸化グラフェンを混合物に添加するステップは、酸化グラフェン(GO)を、得られた混合物に添加することと理解することができる。酸化グラフェンは、ポリエチレングリコール(PEG)官能化酸化グラフェン(PEG-GO)とすることができる。ポリエチレングリコールで酸化グラフェンを官能化することによってPEG-GOを調製するステップは、カルボキシル化を含むことができる。さらに、ポリエチレングリコールで酸化グラフェンを官能化することによってPEG-GOを調製するステップは、PEG化(ポリエチレングリコール化)を含むことができる。
【００４１】
混合物を加熱しながら混合物の色の変化を観察するステップは、混合物を加熱している間に混合物の色が変化する瞬間を観察する、又は色が変化するまで混合物を加熱するプロセスを含むことができる。ステップは、混合物にDNAザイム補因子を添加するステップをさらに含むことができる。この時、二重鎖は、ある特定の温度で一本鎖に変性させることができ、したがってDNAザイム鎖はDNAザイム補因子に結合することができる。DNAザイム補因子は、DNAザイムの配列と一緒にDNAザイムとして機能するよう使用することができる限り、限定することなく本発明に含まれると理解することができる。本発明の実施形態において、DNAザイムは、ペルオキシダーゼ活性を示すものとすることができ、DNAザイム補因子はヘミンとすることができる。
【００４２】
組成物は、比色試薬をさらに含むことができ、比色試薬は、DNAザイム活性により比色を示すことが可能である限り、限定することなく本発明の組成物に含めることができる。例えば、比色試薬は、ABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))、OPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)、DAB(ジアミノベンジジン)、AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、AmplexRed、又はホモバニリン酸とすることができる。さらに、比色試薬は1種以上のペルオキシドを含むことができる。
【００４３】
温度検出方法は、PNA鎖の長さを調節することによって目標温度を制御することができる。PNA鎖の長さを調節することは、PNA鎖とDNAザイム鎖との間の水素結合の数を制御することによって、二重鎖が変性する温度を制御することを意味し得る。このことは、アデニン(A)及びチミン(T)の結合の数、又はグアニン(G)及びチミン(C)の結合の数を制御することによって、二重鎖が変性する温度を制御することを含んでいてもよい。以下に記載される実施例において、実験は、9merPNA(P9)3'-TC CCG CCC A-5'(配列番号:2)、12merPNA(P12)3'-ATC CCG CCC AAC-5'(配列番号:3)、18merPNA(P18)3'-CCC ATC CCG CCC AAC CCT-5'(配列番号:4)、11merPNA(P11)3'-ATC CCG CCC AA-5'(配列番号:9)、及び10merPNA(P10)3'-ATC CCG CCC A-5'(配列番号:10)を使用するPNA鎖の長さの制御を通した、目標温度の制御に関して行なった。以下に記載される実施例6では、PNA鎖の長さが増大するにつれ、色が増大し始める温度が上昇することが確認された。
【００４４】
本発明の別の態様では、本発明は、酸化グラフェン、DNAザイム鎖及びPNA鎖が相補的に結合した二重鎖、並びにDNAザイム補因子を含む組成物を含む、温度センサー用キットを提供する。
【００４５】
キットは、比色試薬をさらに含むことができ、比色試薬は、DNAザイム活性による比色を示すことが可能である限り、限定することなく本発明のキットに含めることができる。例えば、比色試薬は、ABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))、OPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)、DAB(ジアミノベンジジン)、AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、AmplexRed、又はホモバニリン酸とすることができる。さらに、比色試薬は1種以上のペルオキシドを含むことができる。
【００４６】
グラフェンオキシドは、ポリエチレングリコール(PEG)-官能化酸化グラフェン(PEG-GO)とすることができる。ポリエチレングリコールで酸化グラフェンを官能化することによってPEG-GOを調製するステップは、カルボキシル化を含むことができる。さらに、ポリエチレングリコールで酸化グラフェンを官能化することによってPEG-GOを調製するステップは、PEG化(ポリエチレングリコール化)を含むことができる。
【００４７】
本発明の別の態様では、キットは、PNA鎖の長さを調節することによって目標温度を制御することができる。
【００４８】
以下、本発明について、下記の実施例により詳細に記載する。
【００４９】
しかし、下記の実施例及び実験例は、本発明を単に例示するためのものであり、本発明の内容はこれらに限定されない。
【００５０】
DNA鎖は、Genotech(Daejon、韓国)から購入した。
【００５１】
PNA鎖は、Panagene(Daejon、韓国)から購入した。
【００５２】
ヘミン、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾジアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、クロロ酢酸、及びGOは、Sigma-Aldrich(MO、USA)から購入した。
【００５３】
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)は、ThermoFisher Scientific(OK、USA)から購入した。
【００５４】
アミン官能化メトキシポリエチレングリコール(mPEG-NH2、分子量:2000Da)は、NANOCS(Boston、MA、USA)から購入した。
【００５５】
Amicon Ultra 0.5mL遠心分離フィルターは、Merck Millipore(Darmstadt、ドイツ)から購入した。
【００５６】
温度制御は、サーモサイクラー(Bio-Rad、USA)を使用して行った。
【００５７】
吸光度及び蛍光は、Citation 5マルチモードリーダー(Biotek、USA)を使用して測定した。
【００５８】
[調製例1]
GOのPEG修飾によるPEG-GOの調製
カルボキシル化のために、0.2mg/mLのGOを、2mg/mLのクロロ酢酸を含有する4M NaOH溶液で調製した。混合物を、75分間、浴超音波処理し、15000rpmで30分間の遠心分離により2回、精製した。カルボキシル化GOを、脱イオン(DI)水に対して1週間、透析した。その結果、GO-COOHが得られた。
【００５９】
PEG化のため、1.5mLのカルボキシル化GO(1mg/mL)を、4μmolのmPEG-NH2(アミン官能化メトキシポリエチレングリコール、分子量:2000Da、NANOCS(Boston、MA、USA)から購入)と混合し、5分間、浴超音波処理した。その後、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)を、5mMの濃度まで添加し、溶液をさらに30分間、浴超音波処理した。濃度をさらに高めるために、より多くのEDCを、12時間にわたり振盪させながら添加した。製作されたPEG-GOを、50k遠心分離フィルターユニットを使用して、10000rpmで15分間、脱イオン水で精製した。洗浄ステップを5回繰り返した。その結果、PEG-GO(ポリエチレングリコール官能化酸化グラフェン)が調製された。
【００６０】
[実施例1]
本発明者らは、18merGリッチDz鎖、及びその完全に相補的に配列されたFAM標識PNA鎖(P18)を調製した(図2a)。Dz/P18二重鎖は、Dz及びP18を95℃で5分間アニールし、水中でゆっくり冷却することによって調製した。
【００６１】
[実施例2]
実施例1のDz/P18二重鎖500nMを、ヘミン及びABTSを含有する1×Dz緩衝剤中のPEG-GOを用いて調製した。次いで試料を、95℃で5分間適用して、PNAからのDzを完全に変性させた。
【００６２】
[実施例3]
本発明者らは、9merGリッチDz鎖、及びその完全に相補的に配列したFAM標識PNA鎖(P9)を調製した。Dz/P9二重鎖は、Dz及びP9を95℃で5分間アニールし、水中でゆっくり冷却することによって調製した。
【００６３】
[実施例4]
本発明者らは、12merGリッチDz鎖、及びその完全に相補的に配列したFAM表閾PNA鎖(P12)を、調製した。Dz/P12二重鎖は、Dz及びP12を95℃で5分間アニールし、水中でゆっくり冷却することによって調製した。
【００６４】
[実施例5]
本発明者らは、10merGリッチDz鎖と、その完全に相補的に配列したFAM標識PNA鎖(P10)を、調製した。Dz/P10二重鎖は、Dz及びP10を95℃で5分間アニールし、水中でゆっくり冷却することによって調製した。
【００６５】
[実施例6]
本発明者らは、11merGリッチDz鎖、及びその完全に相補的に配列したFAM標識PNA鎖(P11)を、調製した。Dz/P11二重鎖は、Dz及びP11を95℃で5分間アニールし、水中でゆっくり冷却することによって調製した。
【００６６】
[比較例1]
GO(Sigma-Aldrich(MO、USA)から購入)のカルボキシル化のため、0.2mg/mLのGOを、2mg/mLのクロロ酢酸を含有する4M NaOH溶液中に調製した。混合物を、75分間、浴超音波処理し、15000rpmで30分間、遠心分離によって2回、精製した。カルボキシル化GOを、脱イオン(DI)水に対して1週間透析した。その結果、GO-COOHが得られた。
【００６７】
[比較例2]
相補的PNAのない18merフリーDzを、調製した(図2a)。
【００６８】
[比較例3]
実施例1のDz/P18二重鎖500nMを、ヘミン及びABTSを含有する1×Dz緩衝剤中のPEG-GOを用いて調製し、次いでこれを、加熱せずに室温で保存した。
【００６９】
[実験例1]
PEG-GOの分散性の向上の確認
調製例1で合成されたPEG-GOの分散性を確認するために、調製例1のPEG-GO及び比較例1のGO-COOHを調製した。結果を図3に示す。
【００７０】
まず、調製例1のPEG-GO及び比較例1のGO-COOH、高塩分緩衝剤(5×PBS)に添加して、溶液相中に凝集が生じたか否かを確認した。その結果、調製例1のPEG-GOは、高塩分緩衝剤(5×PBS)中で向上した分散性を示し、一方、比較例1のGO-COOHは凝集し、緩衝剤中で肉眼で観察された(図3)。上記結果から、PEG化は、塩分に富む水性溶液中でGOの分散性を向上させることが確認された。
【００７１】
[実験例2]
PNAに関するPEG-GOの選択性の確認
PNAに関するPEG-GOの選択性を確認するために、調製例1のPEG-GO、比較例1のGO-COOH、FAM標識18merPNA鎖(P18)、及びP18と同じ配列を持つDNA鎖(D18)を、調製した。結果を図4a〜4fに示す。
【００７２】
P18及びD18の各100nMを、1×Dz緩衝剤中に調製し、様々な濃度(0〜16μg/ml)の調製例1のPEG-GO及び比較例1のGO-COOHと混合した。その結果、P18は、比較例1のGO-COOHの存在下、D18よりも高いクエンチ効率を示した(図4a)。調製例1のPEG-GOは、比較例1のGO-COOHの場合に比べ、D18とP18との間でのクエンチ効率の差を増大させた(図4d)。P18に比べ、D18の強度をクエンチ処理するのに、比較例1のGO-COOHは2倍しか必要とされず、それに対して、P18に対してよりもD18に対しては、調製例1のPEG-GOは4倍必要とされた。上記の結果から、調製例1のPEG-GOは、比較例1のGO-COOHと比べてPNAに対して優れた選択性を有することが確認された。PNAの完全吸着に最適なPEG-GOの量は、4μg/mLであることも確認された。
【００７３】
実験例2で確認された、PNAの完全吸着に最適なPEG-GOの量(4μg/mL)で、D18とP18との間での、調製例1のPEG-GOの相対蛍光値の差は、初期値が66%であり(図4b)、一方、比較例1のGO-COOHの場合の差は、32%であった(2μg/mL;図4e)。さらに、調製例1のPEG-GOの存在下、D18のクエンチ現象は、比較例1のGO-COOHの存在下の場合よりも短い時間で安定化された(図4c及びf)。これらの結果は、水の障壁を提供することによって、GO表面への高親水性DNAの接近を、PEG修飾が選択的に破壊することを示唆した。
【００７４】
[実験例3]
PNAによるDz活性の阻害の確認
PNAによるDz活性の阻害を確認するために、実施例1のDz/P18二重鎖及び比較例2のPNAなしのフリーDzを調製した。次いでこれらを、DNAザイム補因子としてのヘミン並びに比色試薬としての2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)及びH2O2を含有する1×Dz緩衝剤に添加した。さらに、陰性対照として、ヘミン、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、及びH2O2を含有する1×Dz緩衝剤のみを調製した。結果を、図2a〜2dに示す。
【００７５】
3-1.  肉眼での色の変化の観察
ヘミン、ABTS、及びH2O2を含有する1×Dz緩衝剤中で、比較例2のPNAのないフリーDzは、ヘミンと共にG四重鎖構造にフォールディングすることにより、緑色ABTSを生成することができた。しかし同じ条件下で、実施例1のDz/P18二重鎖は、陰性対照と同様に色の変化をほとんど示さなかった(図2b)。これらの結果は、DzとのPNAハイブリダイゼーションが、DzのG四重鎖構造の形成を阻害し、Dz活性を首尾良く止めることを示した。
【００７６】
3-2.  比色法による色の変化の測定
実施例1のDz/P18二重鎖、比較例2のPNAのないフリーDz、及び陰性対照の間の、明らかな色の差は、マイクロプレートリーダーを使用して、A420での分光光度法により確認された。その結果、実施例1のDz/P18二重鎖及び陰性対照のA420値は、ほとんど変化せず、それに対して比較例2のPNAのないフリーDzのA420は、数分以内で劇的に増大した(図2c及びd)。これらの結果は、DzによるPNAハイブリダイゼーションが、DzのG四重鎖構造の形成を阻害し、Dz活性を首尾良く止めることを示した。
【００７７】
[実験例4]
PEG-GOの濃度による温度センサーの比色の確認
実施例2のDz/P18二重鎖及び比較例3のDz/P18二重鎖を、本発明による温度センサーに使用されることになるPEG-GOの量が最適化されるように調製し、蛍光強度及び吸光度を測定した。結果を、図5a〜5dに示す。
【００７８】
4-1.  蛍光強度による色の変化の測定
図5aに示されるように、実施例2の加熱したDz/P18相対蛍光強度は、PEG-GOの量が増加するにつれて減少し、それに対して、加熱なしの比較例3のDz/P18の相対蛍光強度は、PEG-GOの濃度の増加に応じて、少量の変化を示した。クエンチ現象におけるこの差は、Dz/P18の変性後に一本鎖P18を捕捉することにより、PEG-GOが、PNAに有効なスカベンジャーとして働くことができることを示した。40μg/mLよりも高い濃度のPEG-GOが使用された場合、実施例2の加熱したDz/P18は、95%以上のクエンチ効率を示した(図5b)。
【００７９】
4-2.  比色方法による色の変化の測定
本発明者らは、PEG-GOへのPNA吸着後、G四重鎖構造へのDzのフォールディングを検証するために、同じ混合物中にH2O2を単に添加することにより、追加の比色アッセイを行った。
【００８０】
図5cに示されるように、実施例2の加熱したDz/P18のA420は、PEG-GOの濃度が増加するにつれて増大し、それに対して比較例3のDz/P18のA420は、0.3よりも下の小さい値で維持された。したがってPEG-GOは、高温で、変性したP18を選択的に捕捉し、DzとP18との間での再ハイブリダイゼーションを防止することが確認された。フリーDzは、G四重鎖構造にフォールドすることができ、ヘミンの存在下で触媒反応により色の変化を引き起こすことが可能になった。
【００８１】
[実験例5]
温度による温度センサーの比色の確認
PEG-GOによる高分解能温度検出では、本発明者らは、2℃の間隔で50℃〜80℃に及ぶ温度を適用した後に、ヘミン及びABTSの存在下で、PEG-GOを有するDz/P18の比色及び蛍光シグナルの両方を観察した。結果を、図6a〜6dに示す。
【００８２】
緩衝溶液中のPEG-GO及びDz/P18を目標温度に加熱し、H2O2を添加し、温度の上昇に従い濃緑色への色の変化を肉眼で観察した(図6a)。温度が上昇するにつれ、より多くのDz/P18の変性が生じ、その結果、触媒活性を再び得たフリーDzが増加するにつれ、ヘミンに結合してABTSの酸化反応を触媒した。
【００８３】
温度上昇による、より濃い色への変化も、A420及び蛍光強度を測定することによって定量的に測定した。結果を図6b及び6cに示す。
【００８４】
その結果、吸光度のグラフは、DNA融解曲線に類似したS字形を示した。この温度範囲では、同じ溶液の蛍光強度は温度が上昇するにつれ減少し、PEG-GOへのP18の選択的吸着の後にDz/P18の温度依存的変性が続くことを示した。実験例5で観察された蛍光強度及び吸光度のこの反対の傾向は、Dz触媒された発色が、Dz/P18の温度依存的変性及びフリーDzの活性化を直接反映することを示した。特に、60℃〜74℃の範囲では、温度が上昇するにつれ吸光度と蛍光値の両方で大きな差があり、温度の高分解能検出が可能になった。したがって温度は、目に見える色の変化によって並びに吸光度の定量的測定によって区別できることが確認された。
【００８５】
[実験例6]
塩基対合の数による温度センサーの比色の確認-1
PNA鎖の長さを変えることによって、Dz/PNAの熱安定性を制御することができる。したがって、実施例1のDz/P18二重鎖、実施例3のDz/P9二重鎖、及び実施例4のDz/P12二重鎖を調製し、次いで20〜80℃の広い温度範囲にわたる温度依存的発色実験を行なった。実施例1のDz/P18二重鎖、実施例3のDz/P9二重鎖、又は実施例4のDz/P12二重鎖を、ヘミン及びABTSを含有する1×Dz緩衝液中でPEG-GOと混合し、混合物を、5分間にわたり10℃の間隔でインキュベートした。H2O2を混合物に添加後、色の変化が観察された。結果を図7a〜7eに示す。
【００８６】
6-1.  肉眼による色の変化の観察
最初に、温度検出の前に、実施例1のDz/P18二重鎖、実施例3のDz/P9二重鎖、及び実施例4のDz/P12二重鎖の全ては、4℃で無色を示した。このことにより、Dz活性はPNAにより阻害されることが確認された(図7a)。H2O2が混合物に添加されると、温度が上昇するにつれて緑色が徐々に観察された(図7b）。実施例1のDz/P18二重鎖、実施例3のDz/P9二重鎖、及び実施例4のDz/P12二重鎖は、それぞれ20℃、40℃、及び60℃で目に見える色の変化を示した。
【００８７】
6-2.  比色方法による色の変化の測定
実施例1のDz/P18二重鎖では、相対的A420は、60〜80℃の範囲の劇的な増大を示し(図7c)、これは図6bに示されるデータと一致していた。PNAプローブの長さを短くすると、吸光度曲線は、温度軸に沿って左にシフトした。上記の結果から、PNAプローブの長さが短くなるほど、変性が生じる温度は低下し、色の変化は、より低い温度で出現することが確認された。
【００８８】
6-3.  蛍光強度による色の変化の測定
実施例1、実施例3、及び実施例4の3つのDz/PNA構成体の蛍光曲線は、同じ温度範囲でそれぞれ対応する吸光度に関して逆の傾向を示した(図7d)。これはPNA長さ依存的吸光度曲線のシフトが、各Dz/PNA対の熱安定性に依存することを示した。
【００８９】
上記実験から、本発明者らは、Dz/PNAの熱安定性を調節することによって、検出可能な温度範囲を確立した。図7eに示されるように、温度依存的な色の変化は、様々な長さのPNAプローブの組合せを使用することにより、バーコード(オン/オフ)システムとして評価することができた。
【００９０】
[実験例7]
温度リコール機能の確認
本発明者らは、温度センサーが目標温度で適用された後に、検出結果の視覚化を遅延させることにより、温度リコール機能を実証した。
【００９１】
ほとんどのDNA温度センサーは一般に、測定を分析時の温度に制限するが、それはDNAの融解動態が温度に応じて可逆的だからである。しかし、本発明による温度センサーは温度リコール機能を有するので、実験は、このことを確認するために実施した。本発明者らは、センサーを使用して温度を記録するために、3つの目標点、即ち40℃、60℃、及び80℃を選択する。実施例1、実施例3、及び実施例4のDz/PNA構成体、PEG-GO、ヘミン、並びにABTSを含有する各混合物を、目標温度で5分間維持し、室温又は4℃で一晩保存した。H2O2をすぐに添加する対照群と比較して、両方の一晩保存した群は、保存条件とは無関係に、H2O2を添加した後に同じ緑色を示した(図8)。
【００９２】
PEG-GOへのPNAの吸着及びその後に続くDz活性化は不可逆的であるので、目標温度での活性Dzの比は、本発明によるシステムで記録することができた。これらの結果は、本発明による温度検出システムが目標温度を記憶することができ、後の測定時点でH2O2の添加後に認識可能なバーコードで分析できることを示唆した。
【００９３】
目標温度でのPEG-GOへの不可逆的PNA捕捉は、温度のリコールを可能にし、これは典型的なDNAサーモセンターとは異なって必要な時に遅延発色を可能にした。本発明による視覚的サーモセンサーは、技術的に簡便であり、容易に適用し使用することができる。さらに、本発明によるシステムは多様であり、Dz/PNAの融解温度に基づいてPNAプローブを再設計することにより、多様な温度範囲の検出に広く適用することができた。種々のPNAプローブを組み合せた使用は、より正確な温度検出のためにバーコード結果を提供した。
【００９４】
上述のように、本発明について、好ましい調製例、実施例、及び実験例を通して詳細に記載してきたが、本発明の範囲は特定の例に限定するものではなく、添付される特許請求の範囲によって解釈されるべきである。さらに、当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの修正例及び変形例が可能であることが理解されるべきである。
【００９５】
[実験例8]
塩基対合の数による温度センサーの比色の確認-2
実世界での適用例におけるこのシステムの実現可能性を調査するために、本発明者らは、体温範囲内における2℃の間隔での温度測定実験の反復を試みた。本発明者らは、9〜12塩基の4つのPNAプローブ、即ちP9、P10、P11、及びP12の組を利用して、目標温度付近での検出精度を向上させた(図9a)。PNA鎖の長さを変えることによって、Dz/PNAの熱安定性を制御することができる。したがって、実施例4のDz/P12二重鎖、実施例6のDz/P11二重鎖、実施例5のDz/P10二重鎖、及び実施例3のDz/P19二重鎖を調製し、次いで、20〜60℃の広い温度範囲にわたる温度依存的発色実験を行なった。結果を図9a〜9dに示す。
【００９６】
8-1.  比色方法による色の変化の測定
Dz/P10及びDz/P11に関し、相対的A420は、30℃〜40℃及び40℃〜50℃のそれぞれの温度範囲で劇的な増大を示し、これらは、Dz/P9及びDz/P12の確立された曲線の間に位置決めされた(図9b)。34℃〜40℃の目標範囲にわたり、Dz/P10及びDz/P11は、A420値が徐々に増加することを示し、一方、Dz/P9及びDz/P12は、それぞれ最大及び最小基準として作用した。
【００９７】
8-2.  肉眼及びスマートフォンのアプリケーションによる色の変化の観察
肉眼によりほとんど区別できない、それぞれの微細な色の変化は、スマートフォンのアプリケーションを用いることによって定量化することができた(図9c及びd)。さらに、4つのDz/PNAの積分強度は、単一のDz/PNAよりも正確な温度情報を提供した。これらのデータは、このシステムの温度分解能を、PNAプローブと適正な長さとを組み合せることによって、及びスマートフォンを使用することによって、向上させることができることを実証した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
0006970798.tif 000006
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
0006970798.tif 000031
【配列表】
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