(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体。
【化１】
0006811435.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＫＧＦはケラチノサイト  グロース  ファクターの略であり、皮膚の角質層に存在する表皮細胞の増殖因子である。このＫＧＦはヒト型ではＦＧＦ−７と同一である。ＫＧＦは表皮細胞に存在するＫＧＦ受容体に反応してシグナル伝達により細胞増殖シグナルが伝達され、表皮細胞の増殖につながる。
【０００３】
このＫＧＦ受容体は表皮細胞の他にも、毛髪細胞にも存在している。ＫＧＦ受容体の活性化は皮膚では表皮細胞の活性化と細胞分裂を促すことから、火傷や皮膚疾患の際に利用される。頭髪に対しては毛母細胞の増殖を刺激することから育毛作用が期待される。
【０００４】
このＫＧＦ受容体はＥＧＦ受容体とは異なり、ＥＧＦにより活性化される皮膚癌の抑制に関係することから医薬品の開発に利用されて研究されている。例えば、ビトロネクチン：ケラチノサイト成長因子キメラの発明では癌細胞の遊走を阻害する働きが報告されている。（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
また、例えば、皮膚に対する化粧料としてイチョウ、ユキノシタ、コウスイハッカ、タチジャコウソウ、及びオドリコソウより選ばれる１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするケラチノサイト増殖因子産生促進剤の発明がある（例えば、特許文献２参照）。このようにＫＧＦ受容体の結合体や活性化の研究は実施されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５８４３１７５号
【特許文献２】特開２００９−１８５００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、既存の植物エキスによるＫＧＦ受容体に対する活性化作用及び表皮細胞増殖作用は著しく軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題がある。一方、化学合成された物質では安全性に問題があり、その利用が限られている。
【０００８】
そこで、副作用が弱く優れたＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈する天然由来の物質が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）示されるＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体に関するものである。
【００１０】
【化１】
0006811435.tif 000002
【発明の効果】
【００１１】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１２】
請求項１に記載のポリフェノール誘導体によれば、副作用が少ない、かつ、優れたＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈する天然由来の物質が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１４】
ＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体とは以下の式（１）で示される構造からなる。
【００１５】
【化２】
0006811435.tif 000003
【００１６】
ここに示したポリフェノール誘導体はヒト細胞の細胞膜に存在するＫＧＦ受容体を活性化する。ＫＧＦはケラチノサイト  グロース  ファクターまたはケラチノサイト増殖因子といわれるタンパク性の成長因子であり、ＦＧＦ−７と同一である。また、ＫＧＦ受容体はケラチノサイト  グロース  ファクター受容体のことであり、ＦＧＦ−７受容体と同一である。このＫＧＦ受容体はヒト皮膚の角化細胞、毛母細胞の他、各種細胞の存在しており、皮膚、骨、毛髪などの成長に関与している。
【００１７】
すなわち、ここで示すポリフェノール誘導体はリガンドであるＫＧＦとＫＧＦ受容体との結合の際、その結合の結合定数であるｋｍ値を低下させる。これにより反応性が高まるというハイパーセンシティビディを引き起こす。かつ、ポリフェノール誘導体は結合最大値であるＶｍａｘも増大することから、結合中心と受容体周辺のサポート部分の両者を活性化する。さらに、このポリフェノール誘導体は皮膚の表皮細胞を増殖させる。
【００１８】
このポリフェノール誘導体は式（１）で示すように、カフェ酸、トリヒドロキシジメチルベンゼン、プレニル基、アスパラギン酸から構成されている。分子式はＣ３４Ｈ４０Ｎ１Ｏ１０であり、炭素３４個、水素４０個、窒素１個及び酸素１０個から構成されている。
【００１９】
このポリフェノール誘導体はカフェ酸、トリヒドロキシジメチルベンゼン、プレニル化合物及びアスパラギン酸を原料として有機化学的に合成することができ、標準品として構造解析の目的で利用できる。また、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、セファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、イオン交換担体ＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体ＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）により精製され、純度９６％以上の精製品を得ることができる。
【００２０】
このポリフェノール誘導体の構造は核磁気共鳴装置（例えば、ブルカー製ＮＭＲ）により、ＣＤＣＬ３中における１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲの解析を行うことにより解析される。この構造は５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲ解析により、１．２５、１．３３、１．５１、１．５６、１．７１、１．８２、１．８７、２．０１、２．５２、２．８５、２．９５、３．０２、３．１９、３．８８、３．９６、４．９１、４．９３、５．３２、５．５１、５．８８及び８．１８ｐｐｍにピークが認められる。
【００２１】
さらに、ＣＤＣＬ３中１３Ｃ−ＮＭＲの解析により、１３．８、１８．５、２１．３、２１．４、２３．８、２８．６、２９．０、２９．２、３０．９、３１．０、４３．５、５０．１、５４．４、７５．５、８４．４、８４．８、８６．０、９０．０、９２．０、１０２．３、１０３．３、１１１．７、１１４．９、１３０．７、１３３．７、１３６．１、１３７．１、１４８．６、１５５．９、１６５．７、１６９．５、１７０．０、１７９．７及び２０５．１ｐｐｍにピークが認められる。
【００２２】
このポリフェノール誘導体はフェノール性の水酸基を有することから抗酸化作用を発揮してＫＧＦ受容体の酸化を防止し、ＫＧＦ受容体を維持することにより、ＫＧＦ受容体を活性化する。
【００２３】
構成成分であるカフェ酸、トリヒドロキシジメチルベンゼン、プレニル基、アスパラギン酸はいずれも自然界に存在する天然物である。これらの構成成分の比率は１：１：１：１である。また、このポリフェノール誘導体は天然物由来であるため、その安全性は高い。
【００２４】
このうち、カフェ酸はフェニルプロパノイド系のポリフェノールであり、コーヒー酸とも称され、抗酸化作用に優れた天然物である。トリヒドロキシジメチルベンゼンは抗酸化作用に優れたフェノール性天然物である。プレニル基はカロチノイドやテルペノイドの生合成に必要な反応基であり、複数の二重結合が電子を豊富に共有することから反応性の高い天然物である。アスパラギン酸は天然のアミノ酸であり、ここでは、Ｌ型である。
【００２５】
ここで示すポリフェノール誘導体は過剰量を摂取した際には生体内で分解され、排泄されることから安全性が高い。また、体内や環境中での蓄積性は認められず、環境への安全性も高い。
【００２６】
ここで示したポリフェノール誘導体はカフェ酸のカルボキシル基はトリヒドロキシジメチルベンゼンのフェノール性水酸基とエステル結合している。トリヒドロキシジメチルベンゼンの水酸基はプレニル基の水酸基を介して結合している。プレニル基はアスパラギン酸のカルボキシル基とエステル結合している。アスパラギン酸のカルボキシル基とプレニル基がエステル結合している。プレニル基とアスパラギン酸は環状構造を呈する。
【００２７】
このプレニル基とアスパラギン酸からなる環状構造は疎水性を呈して細胞膜内に挿入されて細胞表明に結合する。この細胞膜との結合により表皮細胞の細胞膜が安定化されて増殖しやすい環境を作り出す。
【００２８】
また、アスパラギン酸の酸素部位はＫＧＦ受容体とＫＧＦとの結合に関する活性中心に働き、ＫＧＦ受容体のｋｍ値を低下させ、Ｖｍａｘを増加させることによりＫＧＦ受容体を活性化する。
【００２９】
さらに、このポリフェノール誘導体は皮膚では表皮細胞の他に、線維芽細胞の細胞膜にも反応して細胞膜を維持して線維芽細胞の機能を向上させる。また、コラーゲンやエラスチンの産生を増加させる。
【００３０】
また、このポリフェノール誘導体は皮膚のメラニン細胞にも反応して抗酸化作用を発揮してメラニンの産生を抑制する。すなわち、チロシンの酸化反応を抑制してメラニン産生を抑制する。
【００３１】
このポリフェノール誘導体の製造方法としては有機化学的に合成する方法があり、その他に植物、野菜類、藻類や動物から抽出する方法、また、植物などを発酵して得ることが可能である。
【００３２】
このうち、発酵法により植物から製造されることは安全性が高く、製造効率が高いことから好ましい。発酵に用いられる植物としてはポリフェノール、アミノ酸、有機酸を豊富に含有している米、米胚芽、緑茶、緑豆などの豆類、ラベンダーなどのハーブ類、ベルガモットやミカンなどの柑橘類が適している。特に、オリザノールなどのポリフェノールを豊富に含む有色の古代米や米胚芽が原料として好ましい。
【００３３】
たとえば、このポリフェノール誘導体の製造方法としては古代米と米胚芽をサッカロミセスや麹菌を添加して発酵させる方法がある。特に、サッカロミセスはパン酵母などの有用な微生物であり、発酵法も安定していることから好ましい。
【００３４】
一例として清浄な発酵タンクに古代米と米胚芽を添加し、サッカロミセスにより好気下で発酵させ、得られた発酵物を精製する製造工程について説明する。この製造方法は天然物のみを使用し、化学合成された有機溶媒や触媒などを使用しないことから、安全性が高く、また、地球環境や作業環境にも適した製造方法である。
【００３５】
原料となる古代米は有色の米であり、日本古来より日本に自生していた米の原種である。学名Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａであり、アントシアニンを含有していることから、赤米、黒米と称される。用いる古代米は日本由来が品質の点で好ましい。特に、幸福米穀株式会社（大阪府）で提供される米胚芽は品質が高いことから好ましい。
【００３６】
用いる米胚芽は米の胚芽部分のことであり、胚芽とは米の胚の部分であり、成長して芽になる部分を示す。この胚芽にはビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質が含有されており、特に、植物の成長因子が大量に含有されている。
【００３７】
古代米と米胚芽は使用に際して、株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で粉砕される。この粉砕により発酵の工程が効率的に進行しやすいことから好ましい。
【００３８】
発酵に用いるサッカロミセスは別名パン酵母とも称され、菌類、真正菌類に分類され、学名Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。食用パンの製造に用いられる有用微生物である。産地は日本、アジア、南米などの産地があるが日本産のサッカロミセスは品質が高いことから好ましい。特に、オリエンタル酵母工業株式会社製のドライイーストは発酵性が高く、品質が均一であり、使用実績が多いことから好ましい。
【００３９】
前記の発酵に関するそれぞれの添加量は、古代米１重量に対し、米胚芽０．１〜１．３倍重量、サッカロミセス０．００１〜０．０３重量が好ましい。サッカロミセスは発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００４０】
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。また、この発酵は、３５〜４３℃に加温され、発酵は２日間から８日間行われる。発酵は撹拌しながら実施することにより通気性が高まる。
【００４１】
発酵後、９５℃程度の加温によりサッカロミセスが死滅し、発酵が停止される。この発酵の工程によって目的とするポリフェノール誘導体が製造される。
【００４２】
前記の発酵により生成された発酵物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。また、得られた発酵物を超音波破砕処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。
【００４３】
前記の発酵物を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることは好ましい。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００４４】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００４５】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００４６】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００４７】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００４８】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（ＨＰ−２０型またはＨＰ２１型、三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００４９】
これらのうち、ダイヤイオンＨＰ−２０型、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００５０】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３５倍量が好ましく、４〜２５倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から５〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００５１】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００５２】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００５３】
ダイヤイオンＨＰ−２０型及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００５４】
また、活性を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００５５】
また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られる活性部分が油の中で安定に維持することから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。
【００５６】
医薬品として注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【００５７】
経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。
【００５８】
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の素材を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００５９】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００６０】
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００６１】
食品製剤として皮膚細胞の増殖性を利用とした美容食品などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００６２】
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、表皮細胞増殖作用を介した皮膚の健康を維持する目的として、飼料やサプリメントとして利用される。
【００６３】
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができ、ＫＧＦ受容体活性化を介した表皮細胞増殖作用を促進する化粧料となる。化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。
【００６４】
また、植物活性化剤として植物のＫＧＦ類似受容体を介した細胞増殖作用機序により植物を元気にさせる用途にも使用できる。豆類、穀物、米類、根菜類や花にも使用でき、植物のＫＧＦ類似受容体を活性化させて収穫高や品質を高め、植物の生育と寿命を高める。切り花の保持にも利用できる。
【００６５】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００６６】
国産の古代米及び米胚芽をいずれも幸福米穀株式会社（大阪府）より購入して用いた。それぞれの１ｋｇをミキサー（二軸型破砕機ＮＳ、株式会社新居浜鐵工所製）により粉砕した。
【００６７】
この古代米及び米胚芽の粉砕物をオートクレーブ（トミー精巧製、ＳＲ−２４０）に入れて１２１℃で滅菌した。
【００６８】
滅菌した古代米及び米胚芽の粉砕物を清浄な発酵タンク（大脇エンジニア製、１５０ｋｇ容量）に入れた。これに水道水８Ｌを添加した。
【００６９】
これとは別にオリエンタル酵母工業株式会社製のドライイースト（ＵＳイースト）をオートクレーブ滅菌した水道水に懸濁して３７℃で１日間発酵させて前培養液とした。
【００７０】
上記の古代米及び米胚芽懸濁液７ｋｇに前記の前培養液０．０５ｋｇを添加して３８℃から３９℃の発酵タンクで撹拌させながら、３日間発酵させた。発酵の程度はポリフェノール誘導体の分析、気泡の発生及び発酵液の色の変化などで観察した。３日間の発酵後、発酵液を９５℃の加温槽に入れて２０分間煮沸滅菌させた。これを冷却後、ろ過し、ろ液として５．８Ｌを得た。これをポリフェノール誘導体含有発酵エキスとした。これを以下の精製をするまで冷暗所保管した。
【００７１】
前述のポリフェノール誘導体含有エキスの５Ｌに５％エタノール含有精製水３Ｌを添加した。これを濾紙により濾過し、濾液をダイヤイオンＨＰ−２０型（三菱化学製）２００ｇを５％エタノール液に懸濁・充填したカラムに供した。
【００７２】
これに１０％エタノール液の３Ｌを添加して清浄し、さらに、２０％エタノール液を２Ｌ添加して洗浄した。この後、７５％エタノールを供して目的とするポリフェノール誘導体を溶出させた。精製されたポリフェノール誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。この精製工程を３回繰り返した。３回目の水溶液を減圧乾燥後、乾燥させ、粉末とし、これを検体１とした。
【００７３】
以下にポリフェノール誘導体の同定試験について説明する。
（試験例１）
【００７４】
上記のように得られた実施例１のポリフェノール誘導体である検体１を核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製）で解析した。
【００７５】
その結果、ＣＤＣＬ３中における５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲ解析により、１．２５、１．３３、１．５１、１．５６、１．７１、１．８２、１．８７、２．０１、２．５２、２．８５、２．９５、３．０２、３．１９、３．８８、３．９６、４．９１、４．９３、５．３２、５．５１、５．８８及び８．１８ｐｐｍにピークが認められた。
【００７６】
さらに、ＣＤＣＬ３中１３Ｃ−ＮＭＲの解析により、１３．８、１８．５、２１．３、２１．４、２３．８、２８．６、２９．０、２９．２、３０．９、３１．０、４３．５、５０．１、５４．４、７５．５、８４．４、８４．８、８６．０、９０．０、９２．０、１０２．３、１０３．３、１１１．７、１１４．９、１３０．７、１３３．７、１３６．１、１３７．１、１４８．６、１５５．９、１６５．７、１６９．５、１７０．０、１７９．７及び２０５．１ｐｐｍにピークが認められた。
【００７７】
以下に、１３Ｃ−ＮＭＲの解析結果のチャートを示した。（横軸単位はｐｐｍ、縦軸単位はピーク強度を示す。）
0006811435.tif 000004
【００７８】
つまり、実施例１の検体１は有機化学的に合成し精製された標準品と同一の分析結果を示した。目的とするポリフェノール誘導体と同定された。すなわち、カフェ酸、トリヒドロキシジメチルベンゼン、プレニル基、アスパラギン酸からなり、これらの構成成分の比率は１：１：１：１であった。
【００７９】
また、式（１）で示す構造体と同一の構造であった。また、高速液体クロマトグラフィーにより単一ピークを示す目的とするポリフェノール誘導体が同定され、その純度は９８．８％であった。
【００８０】
以下に、ＫＧＦ受容体活性化を介した表皮細胞増殖作用の確認試験について述べる。すなわち、ヒト皮膚表皮細胞を用いてＫＧＦ受容体活性化作用及び表皮細胞増殖作用の評価を実施した。なお、この試験方法は生化学的及び分子生物学的に有効成分の働きを検証できる再現性のある常法であり、試験成績も豊富であり、信頼性も高い方法である。
（試験例２）
【００８１】
タカラバイオ株式会社より購入したヒト皮膚表皮細胞（正常ヒト表皮角化細胞（成人、単一ドナー）：Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）をヒト由来表皮細胞として用いた。培養液としては専用の培養液を購入して用いた。予め培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。検体１の１ｍｇ／ｍＬの溶液を培養液に溶解して添加した。溶媒対照として培養液のみを用いた。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。
【００８２】
これを４８時間培養した。生細胞数をトリパンブルー色素法により顕微鏡下で計数した。さらに、細胞を０．０５％トリプシン溶液にて剥離して遠心分離後、細胞部分をＰＢＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を超音波破砕して細胞破砕液を調製した。
【００８３】
この細胞破砕液の細胞膜部分を超遠心分離装置（ＨＩＴＡＣＨＩ製）により分離した。この細胞膜に認められるＫＧＦ受容体の反応性をＫＧＦをリガンドとしたリガンド受容体結合試験により測定した。
【００８４】
測定にはＢＩＡ（ＧＥ社製、Ｔ２００型）を用いた。ＢＩＡとはＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓのことである。つまり、生物物理学的相互作用解析法であり、生体内での分子間相互作用を測定する方法である。なお、リガンドとしたヒト由来ＫＧＦ（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ製、品番ＨＺ−１１００、純度９５％以上）をコスモバイオ株式会社より購入して用いた。
【００８５】
その結果、検体１の１ｍｇ／ｍＬを添加した表皮細胞群は溶媒対照群に比して平均値として１４３％に増加した。また、検体１を添加した表皮細胞の細胞膜分画を用いた調べたＫＧＦ受容体のｋｍ値は溶媒対照群に比して平均値として４９％に減少し、一方、Ｖｍａｘは２１１％に増加した。このｋｍ値が減少するということは低濃度でもＫＧＦとＫＧＦ受容体が結合することを示している。Ｖｍａｘは最大結合数であり、このＶｍａｘが高いことは結合の最大値が高いことであり、結合が促進されていた。
【００８６】
これらの結果から、検体１はＫＧＦ受容体を活性化して表皮細胞増殖作用を発揮したことになる。
【００８７】
以下にヒト頭髪由来毛乳頭細胞の増殖性について述べる。皮膚表皮細胞の他にもＫＧＦ受容体が認められる毛乳頭細胞への効果を評価した。なお、この試験方法は生化学的及び分子生物学的に有効成分の働きを検証できる再現性のある常法であり、試験成績も豊富であり、信頼性も高い方法である。
（試験例３）
【００８８】
コスモバイオ株式会社から購入したヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌｓ、コード番号Ｃ−１２０７１）を専用培養液（コスモバイオ株式会社製、毛乳頭細胞基本培地（フェノールレッド不含）、コード番号Ｃ−２６５０５）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。
【００８９】
ここに、前記の実施例１で得られた検体１を１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。溶媒対照として上記の培養液のみを用いた。
【００９０】
培養終了後、毛乳頭細胞数を顕微鏡的に計数した。さらに、上記と同様の方法により毛乳頭細胞の細胞膜部分のＫＧＦ受容体を測定した。
【００９１】
その結果、検体１の１ｍｇ／ｍｌ添加により毛乳頭細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１２８％に増加した。また、検体１を添加した毛乳頭細胞の細胞膜分画を用いた調べたＫＧＦ受容体のｋｍ値は溶媒対照群に比して平均値として５９％に減少し、一方、Ｖｍａｘは１７７％に増加した。検体１はＫＧＦ受容体とＫＧＦの結合性を高めた。
【００９２】
一方、安全性試験の一環として人工皮膚であるＥｐｉＳｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）を用いた皮膚刺激性実験では、検体１の添加により刺激性は認められず、安全性が確認された。なお、この方法は細胞を用いる皮膚刺激性試験評価法として動物を使用しない方法として確立されている。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明で得られるポリフェノール誘導体はＫＧＦ受容体の活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を示し、かつ、副作用が少ないことから、国民のＱＯＬを改善し、美容作用を介して健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。
【００９４】
本発明で得られるポリフェノール誘導体はＫＧＦ受容体の活性化作用を介した毛母細胞増殖作用により育毛剤に利用できる。
【００９５】
本発明で得られるポリフェノール誘導体は食品としても利用できることから、表皮細胞増殖作用や育毛作用の点で化粧品や食品業界の発展に寄与する。
【要約】
【課題】  ＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体。
【解決手段】  ＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体はカフェ酸、トリヒドロキシジメチルベンゼン、プレニル基、アスパラギン酸から構成されている。分子式はＣ３４Ｈ４０Ｎ１Ｏ１０であり、炭素３４個、水素４０個、窒素１個及び酸素１０個から構成されている。ＫＧＦ受容体の活性化を介した表皮細胞増殖作用及び毛乳頭細胞の増殖作用を示した。また、ＫＧＦ受容体のｋｍ値を低下させ、Ｖｍａｘを増加させた。このＫＧＦ受容体活性化作用を介した表皮細胞増殖作用を呈するポリフェノール誘導体は美容効果と育毛効果を期待した化粧料に利用される。
【選択図】      なし