(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動化バイオプリンターであって、該自動化バイオプリンターが、
ａ．２つ以上のカートリッジキャリアと前記各カートリッジキャリアに保持された各カートリッジの内容物を分注するための堆積用オリフィス部を含むプリンターヘッドであって、前記各カートリッジキャリアに保持された各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含み、前記各カートリッジキャリアは更に、各カートリッジの内容物を分注して特定の三次元形状を生成するために、各カートリッジキャリアを受け面に対して垂直に作動するカートリッジキャリア作動手段であって、他のカートリッジキャリア作動手段から独立して作動するカートリッジキャリア作動手段を含む、プリンターヘッド；
ｂ．カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；および
ｃ．三次元較正システムを含む較正手段であって、該三次元較正システムが、
堆積用オリフィス部の位置を決定するために受け面に固定されたセンサー；および
受け面の位置を決定するためにプリンターヘッドに固定されたセンサーを含む、
少なくとも２つのレーザーアラインメント
を含み、
それによって、該三次元較正システムが、堆積用オリフィス部と受け面との間の距離を含む印刷高さを計算する、較正手段、
ｄ．カートリッジキャリア作動手段とは独立して作動し、ｘ軸及び／又はｙ軸におけるプリンターヘッドの位置を作動するプリンターヘッド作動手段；
を含み、
前記カートリッジキャリア作動手段が前記カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける方向がｚ軸の方向である、
自動化バイオプリンター。
【請求項２】
三次元較正システムが、バイオプリンティングプロセス前および間に受け面のｘ、ｙ、ｚ座標を自動的に決定するための手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載の自動化バイオプリンター。
【請求項３】
三次元較正システムが、バイオプリンティングプロセス前および間に堆積用オリフィス部のｘ、ｙ、ｚ座標を自動的に決定するための手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載の自動化バイオプリンター。
【請求項４】
三次元較正システムが、カートリッジの分注された内容物の印刷高さをモニタリングすることを特徴とする、請求項１に記載の自動化バイオプリンター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年７月３１日に出願の米国仮特許出願第６１／８６０，６４４号の利益を主張し、その内容は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
医療産業は、多くの切迫した問題に直面している。２０１３年６月時点で、臓器移植を必要としている、全米臓器配分ネットワーク（ＵＮＯＳ）によって登録されたおよそ１１８，０００人の患者が存在した。２０１３年１月から３月の間に、６，８９１のみの移植が行われた。毎年、移植が行われる件数よりも多い患者が、ＵＮＯＳリストに加えられ、その結果、移植を待つ患者の数の純増加をもたらしている。例えば、２０１１年時点で、１５，０００人以上が、移植肝  ／肝臓移植を必要としている人として登録されていたが、その年にわずか約５，８００の肝臓移植が行われただけであった。２０１０年には、肝臓の平均待ち時間は、１２か月を超えていた。
【０００３】
さらに、新しい医薬化合物の研究開発費は、およそ１８億ドルである。Ｐａｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｈｏｗ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｒ＆Ｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ：  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ’ｓ  ｇｒａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９（３）：２０３−２１４を参照。創薬は、薬物が発見される及び／又は設計されるプロセスである。創薬のプロセスは、一般に少なくとも次の工程を含んでいる：治療上の有効性に関する、候補の識別、合成、特徴づけ、スクリーニング、およびアッセイ。技術の進歩および生物系の理解にもかかわらず、創薬はまだ、新しい治療上の発見率が低い、長期の、高価で、非効率的なプロセスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
組織および臓器の緊急の必要性を軽減するための再生医療および組織工学のテクノロジーの適用を促進するツールおよび技術が必要とされている。また、維持不可能な研究開発コストを負担せずに、革新的で、コスト効率の良い新薬の数および質を大幅に増加させるツールおよび技術が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、速度、精度、およびスケーラビリティの向上を可能にする組織および臓器を作製するための、デバイス、システム、および方法に対する改善について記述している。具体的には、デバイス、システム、および方法は、限定されないが、物質の空間定位の制御を維持しながらの生産のスケーラビリティの改善、堆積装置（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）の三次元較正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の改善、および作製プロセスの重大な妨害のない複数の別々の物質の利用の改善を含む、他の利点について記述した。
【０００６】
一態様では、本明細書において自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、１つ以上のカートリッジを含むプリンターヘッドであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含み、および該プリンターヘッドが、各カートリッジのために、カートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段、および堆積用オリフィス部（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｒｉｆｉｃｅ）を含む、プリンターヘッド；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；および三次元較正システムを含む較正手段であって、該三次元較正システムが、少なくとも２つのレーザー、堆積用オリフィス部の位置を決定するために受け面に固定されたセンサー、および受け面の位置を決定するためにプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムが、堆積用オリフィス部と受け面との間の距離を含む印刷高さを計算する、較正手段、を含み、それによって、１つ以上のカートリッジを手動で交換するために、あるいはプリンターヘッドの位置決め又はカートリッジの１つ以上の位置決めを手動で調節するために、バイオプリンターを止めることなく、構築物がバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、三次元較正システムは、受け面の立体図（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｍａｐ）を作成する。幾つかの実施形態では、三次元較正システムは、堆積用オリフィス部の立体図を作成する。幾つかの実施形態では、三次元較正システムは、カートリッジの内容物の堆積（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）中に印刷高さをモニタリングする。幾つかの実施形態では、自動化バイオプリンターは、少なくとも１つの型（ｄｉｅ）をさらに含み、各型は、各々が特定の三次元形状を有している、並列した且つあるパターンで配された複数の構築物の同時堆積、特定の三次元形状を有している単一の構築物の堆積、およびその組み合わせを制御する。幾つかの実施形態では、自動化バイオプリンターは、特定の三次元形状を有している１つ以上の構築物の堆積を制御するための１つ以上の多軸ノズルをさらに含み、ここで、多軸ノズルの各々は、少なくとも２つの異なる材料のための少なくとも２つの独立した入力、およびコア層とマントル層、および随意にコア層とマントル層との間の１つ以上の中間層を有する多軸チューブの調製のための少なくとも２つの独立した出力を備える２重の又はより大きな同心の流動能力（ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を有し、２つの隣接する層は、互いに対して異なる材料の組成を有しており、および該材料は、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される。さらなる実施形態では、１つ以上の多軸ノズルの各々は、少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの異なる材料の各々の流れを独立して調整する手段をさらに含む。またさらなる実施形態では、少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの異なる材料の各々の流れを独立して調整する手段は、連続押出またはスパッタ押出（ｓｐｕｔｔｅｒ  ｅｘｔ��ｕｓｉｏｎ）を可能にする。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの異なる材料の１つは、１つ以上の空隙を作り出すためにバイオプリント後に除去される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジは、カートリッジの温度を調節する及び／又は維持するための手段をさらに含む。
【０００７】
別の態様では、本明細書において自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、少なくとも３つのカートリッジを含む、プリンターヘッドであって、ここで（ｉ）少なくとも１つのカートリッジが、バイオインクを含有しているキャピラリーチューブを含み、（ｉｉ）少なくとも１つのカートリッジが、バイオインクを含有しているニードルを含み、（ｉｉｉ）少なくとも１つのカートリッジが、インクジェットプリンティングのために構成され、および（ｉｖ）各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含む、プリンターヘッド；およびカートリッジの分注された内容物を受けるための受け面、を含み、それによって、１つ以上のカートリッジを手動で交換するために、あるいはプリンターヘッドの位置決め又はカートリッジの１つ以上の位置決めを手動で調節するために、バイオプリンターを止めることなく、構築物がバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、ニードルは、バイオインクリザーバーと連通しており、バイオインク堆積は、空気圧の変位（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によって行われ、およびバイオインクは、液体または半固形の組成物である。幾つかの実施形態では、キャピラリーチューブは、容積流量機構（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を介してバイオインクを堆積させ、バイオインクは、固形または半固形の組成物である。幾つかの実施形態では、自動化バイオプリンターは、三次元較正システムを含む較正手段をさらに含み、該三次元較正システムは、少なくとも２つのレーザー、堆積用オリフィス部の位置を決定するために受け面に固定されたセンサー、および受け面の位置を決定するためにプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムは、堆積用オリフィス部と受け面との間の距離を含む印刷高さを計算する。幾つかの実施形態では、自動化バイオプリンターは、少なくとも１つの型をさらに含み、各型は、各々が特定の三次元形状を有している、並列した且つあるパターンで配された複数の構築物の同時堆積、特定の三次元形状を有している単一の構築物の堆積、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、自動化バイオプリンターは、特定の三次元形状を有している１つ以上の構築物の堆積を制御するための１つ以上の多軸ノズルをさらに含み、ここで、多軸ノズルの各々は、少なくとも２つの異なる材料のための少なくとも２つの独立した入力、およびコア層とマントル層、および随意にコア層とマントル層との間の１つ以上の中間層を有する多軸チューブの調製のための少なくとも２つの独立した出力を備える２重の又はより大きな同心の流動能力を有し、２つの隣接する層は、互いに対して異なる材料の組成を有しており、および該材料は、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジは、カートリッジの温度を調節する及び／又は維持するための手段をさらに含む。
【０００８】
別の態様では、本明細書において自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、少なくとも１つの型をさらに含み、各型は、各々が特定の三次元形状を有している、並列した且つあるパターンで配された複数の構築物の同時堆積、特定の三次元パターンの形状を有している単一の構築物の堆積、またはその組み合わせを含み、それによって、単一の構築物または複数の構築物は、バイオプリンターの１つ以上の構成要素を手動で交換するために、あるいはその位置決めを手動で調節するためにバイオプリンターを止めることなく、バイオプリントされる。幾つかの実施形態では、型は、恒久的に固定される。幾つかの実施形態では、型は、可逆的に固定される。幾つかの実施形態では、型は、並列した且つあるパターンで配された２−３８４の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、バイオインク、支持材、またはその組み合わせの均一層を含有するための１つ以上のチャンバーに接続される。幾つかの実施形態では、型は、並列した複数の材料の同時堆積を制御する。さらなる実施形態では、型は、各材料のための入力ポートを含む。幾つかの実施形態では、複数の構築物中の各構築物は、同じ三次元形状を有している。幾つかの実施形態では、複数の構築物中の構築物の各々は、単一の構築物を形成するために互いに接触している。
【０００９】
別の態様では、本明細書において自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、特定の三次元形状を有している１つ以上の構築物の堆積を制御するための１つ以上の多軸ノズルを含み、ここで、多軸ノズルの各々は、少なくとも２つの異なる材料のための少なくとも２つの独立した入力、およびコア層とマントル層、および随意にコア層とマントル層との間の１つ以上の中間層を有する多軸チューブの調製のための少なくとも２つの独立した出力を備える２重の又はより大きな同心の流動能力を有し、２つの隣接する層は、互いに対して異なる材料の組成を有しており、および該材料は、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択され、それによって、１つ以上の構築物は、バイオプリンターの１つ以上の構成要素を手動で交換するために、あるいはその位置決めを手動で調節するためにバイオプリンターを止めることなく、バイオプリントされる。幾つかの実施形態では、１つ以上の多軸ノズルの各々は、少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの異なる材料の各々の流れを独立して調整するための手段をさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの異なる材料の各々の流れを独立して調整する手段は、連続押出またはスパッタ押出を可能にする。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの異なる材料の１つは、１つ以上の空隙を作り出すためにバイオプリント後に除去される。幾つかの実施形態では、多軸ノズルの１つ以上は、同軸ノズルである。幾つかの実施形態では、多軸ノズルの１つ以上は、三軸ノズルである。
【００１０】
別の態様では、本明細書においてバイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドであって、各プリンターヘッドが、複数のカートリッジを受ける且つ保持するための、カートリッジキャリアを含み、該カートリッジキャリアが、選択されたカートリッジを駆動経路と並べるために回転可能であり、各カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、１つ以上のプリンターヘッド；選択されたカートリッジの内容物を分注するための駆動手段；選択されたカートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；選択されたカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、受け面に対して１つ以上のプリンターヘッドを位置決めするための作動手段；および１）選択されたカートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面の位置を決定するための較正手段、を含む。幾つかの実施形態では、駆動手段は、カートリッジの内容物を分注するために、正の変位（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、空気圧の変位、水圧の変位、音響共鳴、またはそれらの組み合わせを利用する。幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、２−１０のカートリッジを受ける且つ保持する。幾つかの実施形態では、各プリンターヘッドは、各カートリッジのための堆積用オリフィス部を含む。幾つかの実施形態では、各プリンターヘッドは、複数のカートリッジのための共通の堆積用オリフィス部を含む。幾つかの実施形態では、複数のカートリッジは、バイオプリンターの分注路を浄化するために洗浄カートリッジを含む。幾つかの実施形態では、受け面は、１つ以上のプリンターヘッドに対して移動され、複数のカートリッジの分注された内容物中に特定の三次元形状が生成される。幾つかの実施形態では、カートリッジの少なくとも１つは、内容物の遠隔リザーバーに接続される。幾つかの実施形態では、カートリッジの少なくとも１つは、使い捨ての、一回用のカートリッジである。幾つかの実施形態では、較正手段は、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。さらなる実施形態では、較正手段は、材料の堆積の間に印刷高さをモニタリングする。幾つかの実施形態では、較正手段は、三角測量センサー、超音波距離を感知するプローブ、およびデジタルカメラから選択される、１つ以上のセンサーを利用する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、哺乳動物細胞を含む。
【００１１】
別の態様では、本明細書においてバイオプリンター用のカートリッジキャリアが開示され、該カートリッジキャリアは、バイオプリンターの位置決め可能なプリンターヘッドに付けられ、複数のカートリッジを受ける且つ保持するように適応され、各カートリッジは、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含み、該カートリッジキャリアは、選択されたカートリッジをバイオプリンターの駆動経路と並ぶように回転可能にされ、その結果、駆動機構が、前記内容物を分注するために、選択されたカートリッジと係合する。幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、２−１０のカートリッジを受ける且つ保持するように適合される。
【００１２】
別の態様では、本明細書において自動化バイオプリンター用の三次元較正システムが開示され、該三次元較正システムは、バイオプリンターの堆積用オリフィス部の位置を決定するためのバイオプリンターの受け面に固定されたセンサー；および受け面に関連する印刷目的表面の位置を決定するためのバイオプリンターのプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムは、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。幾つかの実施形態では、センサーは、三角測量センサー、超音波距離を感知するプローブ、およびデジタルカメラから選択される。
【００１３】
別の態様では、本明細書においてバイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、カートリッジを受ける且つ保持するための手段を含むプリンターヘッドであって、該カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、プリンターヘッド；カートリッジの内容物を分注するための駆動手段；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；受け面に対するプリンターヘッドの位置決めするための作動手段；および並列した複数の構築物の同時堆積を制御するための型であって、各構築物が、特定の三次元形状を有している、型を含む。幾つかの実施形態では、駆動手段は、駆動手段は、カートリッジの内容物を分注するために、正の変位、空気圧の変位、水圧の変位、音響共鳴、またはそれらの組み合わせを利用する。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、カートリッジ用の堆積用オリフィス部を含む。幾つかの実施形態では、受け面は、１つ以上のプリンターヘッドに対して移動され、カートリッジの分注された内容物中に特定の三次元形状が生成される。幾つかの実施形態では、カートリッジは、内容物の遠隔リザーバーに接続される。幾つかの実施形態では、カートリッジは、使い捨ての、一回用のカートリッジである。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、１）カートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面、の位置を決定するための較正手段をさらに含む。さらなる実施形態では、較正手段は、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。またさらなる実施形態では、較正手段は、材料の堆積の間に印刷高さをモニタリングする。さらなる実施形態では、較正手段は、三角測量センサー、超音波距離を感知するプローブ、およびデジタルカメラから選択される、１つ以上のセンサーを利用する。幾つかの実施形態では、型は、恒久的に固定される。幾つかの実施形態では、型は、可逆的に固定される。幾つかの実施形態では、型は、並列した２−３８４の構築物の同時堆積を制御する。さらなる実施形態では、型は、並列した９６の構築物の同時堆積を制御する。またさらなる実施形態では、型は、並列した２４の構築物の同時堆積を制御する。またさらなる実施形態では、型は、並列した１２の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、バイオインクまたは支持材の均一層を含有するためにチャンバーに接続される。幾つかの実施形態では、型は、並列した複数の材料の同時堆積を制御する。さらなる実施形態では、型は、各材料のための入力ポートを含む。幾つかの実施形態では、複数の構築物中の各構築物は、同じ三次元形状を有している。幾つかの実施形態では、バイオインクは、哺乳動物細胞を含む。
【００１４】
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載されるバイオプリンターによって作り上げられた組織構築物が開示される。
【００１５】
別の態様では、本明細書において、バイオプリンターから堆積された（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）材料を制御するための型が開示され、該型は、バイオプリンターから堆積されたバイオインクまたは支持材を受けるための１つ以上の入力ポート；および複数の出力用モールド（ｏｕｔｐｕｔ  ｍｏｌｄｓ）を含み、各出力用モールドは、バイオインクまたは支持材を形作るための各入力ポートに関連するウェルを含み、それによって、型は、並列した複数の構築物の同時堆積が可能となり、各構築物は、特定の三次元形状を有している。幾つかの実施形態では、型は、並列した２−３８４の構築物の同時堆積を制御する。さらなる実施形態では、型は、並列した９６の構築物の同時堆積を制御する。またさらなる実施形態では、型は、並列した２４の構築物の同時堆積を制御する。またさらなる実施形態では、型は、並列した１２の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、バイオインクまたは支持材の均一層を含有するためのチャンバーに接続され、該チャンバーは、型とバイオプリンターの駆動機構との間に位置付けられる。幾つかの実施形態では、型は、並列した複数の材料の同時堆積を制御する。
【００１６】
別の態様では、本明細書において、１つ以上の三次元のバイオプリントされた組織を所望の幾何学的形状へと形作るように打ち抜く（ｓｔａｍｐｉｎｇ）または切断するための１つ以上のモールドを含む型が開示される。
【００１７】
別の態様では、本明細書においてプリンターヘッドが開示され、該プリンターヘッドは、複数のカートリッジであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含む、複数のカートリッジ；各カートリッジに関連する堆積用オリフィス部の位置を決定するための較正手段；および各カートリッジのための、カートリッジを駆動経路と並べる、カートリッジを受ける且つ保持するための手段；カートリッジの内容物を分注する駆動手段であって、他の駆動手段から独立して作動する作動手段；およびカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段を含み、但し、プリンターヘッドがバイオプリンター用のものであることを条件とする。様々な実施形態では、各駆動手段は、カートリッジの内容物を分注するために、駆動手段は、カートリッジの内容物を分注するために、正の変位、空気圧の変位、水圧の変位、音響共鳴、またはそれらの組み合わせを利用する。
【００１８】
別の態様では、本明細書においてバイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するためのカートリッジキャリアを含むプリンターヘッドであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含み、該プリンターヘッドが、各カートリッジのために、カートリッジを駆動経路と並べる、カートリッジを受ける且つ保持するための手段、カートリッジの内容物を分注する駆動手段であって、他の駆動手段から独立して作動する作動手段、およびカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段を含む、プリンターヘッド；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；および１）各カートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面、の位置を決定するための較正手段、を含む。様々な実施形態では、各駆動手段は、カートリッジの内容物を分注するために、駆動手段は、カートリッジの内容物を分注するために、正の変位、空気圧の変位、水圧の変位、音響共鳴、またはそれらの組み合わせを利用する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】水平位置で取り付けられたレーザー距離センサーの限定しない例を例証する。
【図２】キャピラリーまでの範囲を検出する垂直位置で取り付けられたレーザー距離センサーの限定しない例を例証する。
【図３】ワイヤーを備えるキャピラリーまでの範囲を検出する水平位置でのレーザー距離センサーの限定しない例を例証する。
【図４】二重センサーを備える完全に自動化した較正の構成の限定しない概略図の例を例証し、この場合、印字面に取り付けられた先端三角測量センサー（ｔｉｐ  ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｏｒ）およびポンプヘッドに取り付けられた地表距離センサーを概略図で描写し、ここで、２つのセンサーからの情報は、バイオプリンティングプロセスを自動化するために使用される。
【図５】バイオプリントされた組織構築物の二次元表示の限定しない例を例証する。
【図６】５１０μｍのニードルを備えるシリンジに接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）のバイオプリンターを使用してＰＦ−１２７の連続堆積によって生成された三次元構築物の限定しない例を例証し、この場合、ピラミッド形の構築物を例証する。
【図７】５１０μｍのニードルを備えるシリンジに接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）のバイオプリンターを使用してＰＦ−１２７の連続堆積によって生成された三次元構築物の限定しない例を例証し、この場合、立方体状（左）および中空立方体状（右）の構築物を例証する。
【図８−１】堆積機構に固定された２部の型の限定しない概略図の例を例証し、この場合、並列した複数の構築物の堆積を促進するための堆積された材料の幾何学的形状を制御する型を例証する。
【図８−２】図８−１の２部の型の限定しない概略図の例を例証し、この場合、バイオインクの均一層を形成する細胞懸濁液を充填されたチャンバーに付けられた型を概略図で描写し、これは、型によって押し出され、隣接した、中空の、円筒状の構造体を形成する。
【図９−１】懸濁液および互換性のあるカートリッジからの細胞濃度を増加させるために、バイオインクを含有しているカートリッジを回転させるように意図された遠心装置の限定しない概略図の例を例証し、この場合、（ａ）遠心装置の斜視図；（ｂ）互換性のあるカートリッジの透視図；および（ｃ）互換性のあるカートリッジのＡ−Ａに沿った概略図が示される。
【図９−２】押出し装置上に載せられたカートリッジの限定しない概略図の例を例証する。
【図９−３】カートリッジに設置された型の限定しない例を例証すし、この型によって押し出されたバイオインクが、６つの隣接した、中空の、円筒状の構造体を形成し、この場合、（ａ）設置された型を備えるカートリッジの斜視図；（ｂ）設置された型を備えるカートリッジのＢ−Ｂに沿った概要図；および（ｃ）型自体の３つの異なる斜視図が示される。
【図１０】２材料の押出しプレート、または標準の２４ウェルのプレートと互換性のあるモールド蓋の限定しない概略図の例を例証する、
【図１１】図１０の押出しプレートの限定しない概略図の例を例証し、この場合、個々の幾何学的モールドを概略図で描写し、その各々は、標準の２４ウェルのプレートに材料を堆積させるように適合され、およびチャネルは、各々の幾何学的モールドおよび材料入力ポートに接続される。
【図１２】図１０のモールド蓋の限定しない概略図の例を例証し、この場合、個々の幾何学的モールドを概略図で描写し、その各々は、２つの別々の材料を特定の幾何学的形状へと堆積させるように適合されている。
【図１３】複数のプリント用カートリッジを含む２つのプリンターヘッドを備えるバイオプリンターの限定しない例を例証し、各カートリッジは、堆積のための別々の材料を含有し、この場合、各プリンターヘッドは、各カートリッジのための別々の堆積チップ（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｉｐ）を利用する。
【図１４】複数のプリント用カートリッジを含む２つのプリンターヘッドを備えるバイオプリンターの限定しない例を例証し、各カートリッジは、堆積のための別々の材料を含有し、この場合、各プリンターヘッドは、複数のカートリッジのための共通の堆積チップを利用する。
【図１５】２つのプリンターヘッドを備えるバイオプリンターの限定しない例を例証し、２つのプリンターヘッドの１つは、単一の容器の形態で遠隔リザーバーに接続され、この場合、プリンターヘッドは。単一の堆積チップを利用する。
【図１６】プラスチックシリンジの形態での、使い捨ての、一回用のバイオインクカートリッジの限定しない例を例証し、この場合、分解図が示される。
【図１７】インクジェットヘッドの一部として構成されたカートリッジの限定しない例を例証し、この場合、分解図において、インクジェットヘッドは、シリンジプランジャーを備えるシリンジ本体、シリンジアダプター、インクジェットヘッド用の支持部、高精度の分注チップ（ｄｉｓｐｅｎｓｅ  ｔｉｐ）に連結されたインクジェットバルブ、シリンジアダプターとインクジェットバルブとの間の結合要素（ｕｎｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、およびインクジェットバルブホルダーを含む。
【図１８】２つのプリンターヘッドを備えるバイオプリンターの限定しない例を例証し、この場合、各プリントヘッドは、リザーバーからバイオインクを受ける。
【図１９】バイオプリンターに関連してＵＶ光源に架橋性の材料をさらすための典型的なパラメーターを描写する限定しない概略図を例証する。
【図２０】ＵＶモジュールを含むＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）のバイオプリンターの限定しない例を例証し、この場合、プリンターヘッドは、キャピラリーがＵＶモジュールに部分的に導入されるように位置付けられる。
【図２１】ＵＶモジュールを含むＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）のバイオプリンターの限定しない例を例証し、この場合、プリンターヘッドは、キャピラリーがＵＶモジュールに全体的に導入されるように位置付けられる。
【図２２】限定しない典型的なプリンターヘッドを例証し、この場合、４つのカートリッジを備えるプリンターヘッドを例証し、ここで、各カートリッジは、それ自体の堆積チップを含み、他のカートリッジに対する独立したＺ軸（例えば、垂直）運動の他に、カートリッジの内容物を分注するための独立駆動機構も有している。
【図２３ａ】独立したＺ軸運動を有するプリンターヘッドの限定しない例を例証し、この場合、プリンターヘッドは、印刷目的表面に対する付属のカートリッジの位置を調節するためのＺ軸位置決め機構および付属のカートリッジの内容物を分注するための駆動機構を有している。
【図２３ｂ】図２３ａで示されるプリンターヘッド用の印刷目的表面に対する付属のカートリッジの位置を調節するためのＺ軸位置決め機構の限定しない例を例証する。
【図２４ａ】カートリッジなおよび分注チップのない、図２３ａおよび図２３ｂの限定しない例を例証する。
【図２４ｂ】図２３ａおよび図２３ｂの限定しない例を例証し、この場合、カスタム流動ステージ（ｃｕｓｔｏｍ  ｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｔａｇｅ）および高精密リニアステージ（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｔａｇｅ）が示される。
【図２５】図２３ｂのＺ軸位置決め機構の限定しない例を例証し、この場合、取付プレートが、光遮断センサー（ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ  ｓｅｎｓｏｒ）およびカスタムセンサーブラケット（ｃｕｓｔｏｍ  ｓｅｎｓｏｒ  ｂｒａｃｋｅｔ）とともに示される。
【図２６】図２２のプリンターヘッドを備えるバイオプリンターの限定しない例を例証する。
【図２７】シリンジ温度を制御するための手段を含むプリンターヘッドの限定しない例を例証し、この例において、（ａ）プリンターヘッドは、シリンジのまわりの熱交換ジャケットとともに示され、（ｂ）シリンジのまわりの熱交換ジャケットは、プリントヘッドがない状態で示され、および（ｃ）シリンジのまわりの熱交換ジャケットの概略図が示される。
【図２８】同軸ノズルによる押出の限定しない例を例証し、この例において、マントル層の同時の連続押出でのコア層のスパッタ押出は、区画された同軸チューブにつながり、これは、続いて、球状の「オルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）」を形成するために区画間で切断される。
【図２９】同軸ノズル用の仕様の限定しない例を例証する。
【図３０】同軸ノズルから押し出された細胞を含有しているコア層および無細胞のマントル層を有する同軸チューブの限定しない例を例証し、この場合、断面の組織構造は、コンパクトな細胞コア構造を例証する。
【図３１】５０：５０の正常なヒト肺繊維芽細胞：ヒト肺性内皮細胞を使用する６日齢のバイオプリントされた脈管（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｖｅｓｓｅｌ）の限定しない例を例証し、この例において、脈管のＣＤ３１染色した断面の２つの別々の図が、脈管の内腔への略すべての内皮細胞の移動を示す。すべてのスケールバーは、２００ミクロンを表わす。
【図３２】Ｉ−バイオインクを使用する同軸構造の限定しない例を例証し、この場合、埋め込まれた管状構造の組織構造および周囲のヒドロゲルが観察される。
【図３３】Ｉ−バイオインクで作られたパッチの限定しない例を例証し、この場合、組織構造は、Ｈ＆Ｅ染色を使用して示される。
【図３４】バイオプリンティング構築物の限定しない例を例証し、その幾つかは、（より暗い陰影で示される）Ｉ−バイオインクを含み、この場合、（ａ）球体あるいはシリンダーが示され、（ｂ）同軸シリンダーが示され、（ｃ）同軸球体が示され、および（ｄ）Ｉ−バイオインクおよび正常なバイオインク（免疫調節細胞なしでのバイオインク）に由来する複雑な構造体が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、再生医療、組織／臓器エンジニアリング、生物学的および医学的研究、および創薬分野に関する。より具体的には、本発明は、組織および臓器を作製するための改善されたデバイス、およびそのようなデバイスを較正する且つ使用するためのシステムおよび方法、および本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法によって作製される組織および臓器に関する。例として、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法は、並列した複数の構築物をバイオプリントすることを可能にするバイオプリンターに付けられた型およびモールド装置の使用によって材料の空間的位置決めの精度を維持しながら、生産のスケーラビリティに対する著しい改善を提示する。さらに例として、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法は、材料の堆積用オリフィス部および印字面上の堆積用オリフィス部の高さを含む印刷目的表面の相対位置を急速且つ正確に決定するために、センサーの使用によって堆積装置の三次元較正に対して著しい改善を提示する。またさらなる例として、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法は、切換え動作を行わずにプリント用カートリッジを交換するための手段の使用、および使い捨ての、一回用のプリント用カートリッジの導入による、複数の別々の材料での組織作製に対する著しい改善を提示する。
【００２１】
本明細書には、特定の実施形態において、自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、１つ以上のカートリッジを含むプリンターヘッドであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含み、該プリンターヘッドが、各カートリッジのために、カートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段を含む、プリンターヘッド；および堆積用オリフィス部を含む、プリンターヘッド；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；および三次元較正システムを含む較正手段であって、該三次元較正システムが、少なくとも２つのレーザー、堆積用オリフィス部の位置を決定するために受け面に固定されたセンサー、および受け面の位置を決定するためにプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムが、堆積用オリフィス部と受け面との間の距離を含む印刷高さを計算する、較正手段、を含み、それによって、１つ以上のカートリッジを手動で交換するために、あるいはプリンターヘッドの位置決め又はカートリッジの１つ以上の位置決めを手動で調節するために、バイオプリンターを止めることなく、構築物がバイオプリントされる。
【００２２】
また本明細書には、特定の実施形態において、自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、少なくとも３つのカートリッジを含む、プリンターヘッドであって、ここで（ｉ）少なくとも１つのカートリッジが、バイオインクを含有しているキャピラリーチューブを含み、（ｉｉ）少なくとも１つのカートリッジが、バイオインクを含有しているニードルを含み、（ｉｉｉ）少なくとも１つのカートリッジが、インクジェットプリンティングのために構成され、および（ｉｖ）各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含む、プリンターヘッド；およびカートリッジの分注された内容物を受けるための受け面、を含み、それによって、１つ以上のカートリッジを手動で交換するために、あるいはプリンターヘッドの位置決め又はカートリッジの１つ以上の位置決めを手動で調節するために、バイオプリンターを止めることなく、構築物がバイオプリントされる。
【００２３】
また本明細書には、特定の実施形態において、自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、少なくとも１つの型をさらに含み、各型は、各々が特定の三次元形状を有している、並列した且つあるパターンで配された複数の構築物の同時堆積、特定の三次元パターンの形状を有している単一の構築物の堆積、またはその組み合わせを含み、それによって、単一の構築物または複数の構築物は、バイオプリンターの１つ以上の構成要素を手動で交換するために、あるいはその位置決めを手動で調節するためにバイオプリンターを止めることなく、バイオプリントされる。
【００２４】
また本明細書には、特定の実施形態において、自動化バイオプリンターが開示され、該自動化バイオプリンターは、特定の三次元形状を有している１つ以上の構築物の堆積を制御するための１つ以上の多軸ノズルを含み、ここで、多軸ノズルの各々は、少なくとも２つの異なる材料のための少なくとも２つの独立した入力、およびコア層とマントル層、および随意にコア層とマントル層との間の１つ以上の中間層を有する多軸チューブの調製のための少なくとも２つの独立した出力を備える２重の又はより大きな同心の流動能力を有し、２つの隣接する層は、互いに対して異なる材料の組成を有しており、および該材料は、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択され、それによって、１つ以上の構築物は、バイオプリンターの１つ以上の構成要素を手動で交換するために、あるいはその位置決めを手動で調節するために、バイオプリンターを止めることなく、バイオプリントされる。
【００２５】
また本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドであって、各プリンターヘッドが、複数のカートリッジを受ける且つ保持するための、カートリッジキャリアを含み、該カートリッジキャリアが、選択されたカートリッジを駆動経路と並べるために回転可能であり、各カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、プリンターヘッド；選択されたカートリッジの内容物を分注するための駆動手段；選択されたカートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；選択されたカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、受け面に対して１つ以上のプリンターヘッドを位置決めするための作動手段；および１）選択されたカートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面の位置を決定するための較正手段、を含む。
【００２６】
また本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンター用のカートリッジキャリアが開示され、該カートリッジキャリアは、バイオプリンターの位置決め可能なプリンターヘッドに付けられ、複数のカートリッジを受ける且つ保持するように適応され、各カートリッジは、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含み、該カートリッジキャリアは、選択されたカートリッジをバイオプリンターの駆動経路と並ぶように回転可能にされ、その結果、駆動機構が、前記内容物を分注するために、選択されたカートリッジと係合する。
【００２７】
また本明細書には、特定の実施形態において、自動化バイオプリンター用の三次元較正システムが開示され、該三次元較正システムは、バイオプリンターの堆積用オリフィス部の位置を決定するためのバイオプリンターの受け面に固定されたセンサー；および受け面に関連する印刷目的表面の位置を決定するためのバイオプリンターのプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムは、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。
【００２８】
また本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、カートリッジを受ける且つ保持するための手段を含むプリンターヘッドであって、該カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、プリンターヘッド；カートリッジの内容物を分注するための駆動手段；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；受け面に対するプリンターヘッドの位置決めするための作動手段；および並列した複数の構築物の同時堆積を制御するための型であって、各構築物が、特定の三次元形状を有している、型を含む。
【００２９】
また本明細書には、特定の実施形態において、本明細書に記載されるバイオプリンターによって作製された組織構築物が開示される。
【００３０】
また本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターから堆積された材料を制御するための型が開示され、該型は、バイオプリンターから堆積されたバイオインクまたは支持材を受けるための１つ以上の入力ポート；および複数の出力用モールドを含み、各出力用モールドは、バイオインクまたは支持材を形作るための各入力ポートに関連するウェルを含み、それによって、型は、並列した複数の構築物の同時堆積が可能となり、各構築物は、特定の三次元形状を有している。
【００３１】
また本明細書には、特定の実施形態において、プリンターヘッドが開示され、該プリンターヘッドは、複数のカートリッジであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含む、複数のカートリッジ；各カートリッジに関連する堆積用オリフィス部の位置を決定するための較正手段；および各カートリッジのために、カートリッジを駆動経路と並べる、カートリッジを受ける且つ保持するための手段、カートリッジの内容物を分注する駆動手段であって、他の駆動手段から独立して作動する作動手段、およびカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段を含み、但し、プリンターヘッドがバイオプリンター用のものであることを条件とする。
【００３２】
また本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターが開示され、該バイオプリンターは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するためのカートリッジキャリアを含むプリンターヘッドであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含み、該プリンターヘッドが、各カートリッジのために、カートリッジを駆動経路と並べる、カートリッジを受ける且つ保持するための手段、カートリッジの内容物を分注する駆動手段であって、他の駆動手段から独立して作動する作動手段、およびカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段を含む、プリンターヘッド；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；および１）各カートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面、の位置を決定するための較正手段、を含む。
【００３３】
特定の定義
他に特段の定義のない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有している。本明細書で言及される、すべての公報、特許出願、特許、および他の引用文献は、その全体が引用によって組み込まれる。
【００３４】
本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸、及び／又は本開示を読むことで当業者に明らかになるであろう本明細書に記載されるタイプの組成物などを含む。本明細書の「または」へのあらゆる言及は、特に他に明記のない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「同種移植片」は、レシピエントと同じ種の遺伝学的に異なるメンバーに由来する臓器または組織を意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固形、または固形の組成物を意味する。バイオインクは、高細胞密度、または天然様の細胞密度を有している。幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞から本質的に成る。幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞溶液、細胞集合体、細胞を含むゲル、多細胞体、または組織を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、支持材をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生体力学的特性を提供する非細胞性物質をさらに含む。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「バイオプリンティング」は、自動化の、コンピューター支援の、三次元のプロトタイピングデバイス（例えば、バイオプリンター）と互換性のある方法によって、細胞（例えば、細胞溶液、細胞を含むゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮液、多細胞集合体、多細胞体など）の三次元の、正確な堆積を利用することを意味する。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「カートリッジ」は、バイオインクまたは支持材を受ける（且つ保持する）ことができるあらゆる対象を意味する。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「コンピューターモジュール」は、より大きなコンピューターシステムと対話するソフトウェアコンポーネント（コードのセクションを含む）を意味する。幾つかの実施形態では、ソフトウェアモジュール（またはプログラムモジュール）は、ファイルの形態であり、典型的により大きなソフトウェアシステム内の特定のタスクを扱う。幾つかの実施形態では、モジュールは、１つ以上のソフトウェアシステムに含まれる。他の実施形態では、モジュールは、１つ以上のソフトウェアシステムへと１つ以上の他のモジュールとシームレスに統合される。コンピューターモジュールは、随意に、コードの独立型のセクション、または随意に、別々に識別可能ではないコードである。コンピューターモジュールの重要な特徴は、エンドユーザーが、識別された機能を行うためにコンピューターを使用することを可能にするということである。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「移植可能な」は、生体適合性であること、および一時的に又は略恒久的にのいずれかで、生体へと挿入される、移植される、または付けられることが可能であることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「臓器」は、共通機能を働かせるために構造単位へと接合された組織の集合体を意味する。臓器の例は、限定されないが、皮膚、汗腺、脂線、乳腺、骨、脳、視床下部、下垂体、松果体、心臓、血管、喉頭、気管、気管支、肺、リンパ管、唾液腺、粘液腺、食道、胃、胆嚢、肝臓、膵臓、小腸、大腸、結腸、尿道、腎臓、副腎、導管、尿管、膀胱、ファロピー管、子宮、卵巣、精巣、前立腺、甲状腺、副甲状腺、マイボーム腺、耳下腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺、胸腺、およびひ臓を含む。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「患者」は、任意の個体を意味する。該用語は、「被験体」、「レシピエント」、および「ドナー」と交換可能である。該用語はどれも、医療専門家（例えば、医師、看護婦、ナース−プラクティショナー、医師助手、看護助手、ホスピスワーカー、ソーシャルワーカー、治験担当者など）または科学研究者の監督（常に又はそれ以外）必要とするとして解釈されるべきでない。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞を意味する。幹細胞は、限定されないが、全能性細胞、多能性細胞、分化多能性細胞、少能性細胞、分化単能細胞、および前駆細胞を含む。幹細胞は、随意に、胚性幹細胞、周産期幹細胞、成体幹細胞、羊膜幹細胞、および人工多能性幹細胞である。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「組織」は、細胞の集合体を意味する。組織の例は、限定されないが、結合組織（例えば、疎性結合組織、強靭結合組織、弾性組織、網様結合組織、および脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋および心筋）、性尿器組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織、および上皮組織（例えば、単層上皮および重層上皮）、内胚葉由来組織、中胚葉由来組織、および外胚葉由来組織を含む。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「異種移植片」は、レシピエントとは異なる種に由来する臓器または組織を意味する。
【００４６】
臓器移植の現在の方法
現在、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）臓器合成のための確実な方法はない。臓器は、（例えば、腎臓と肝臓の供与のための）生体ドナー、（例えば、肺と心臓の供与のための）死亡したドナー、および少数の事例で、動物（例えば、豚の心臓弁）に由来するだけである。したがって、臓器移植を必要とする患者は、ドナー臓器が入手可能になるのを待たなければならない。これは結果として入手可能な臓器の不足につながっている。さらに、生体から採取された臓器への依存は、移植拒絶反応の可能性を増加させる。
【００４７】
移植拒絶反応
幾つかの例では、臓器移植を受ける患者は、超急性拒絶反応を被る。本明細書で使用されるように、「超急性拒絶反応」は、レシピエントが有するドナー臓器に対する先在する抗体から結果的に生じる補体媒介性の免疫反応を意味する。超急性拒絶反応は、数分以内に生じ、血液凝集を特徴とする。移植臓器が直ちに除去されない場合、患者は敗血症になりかねない。レシピエントが最初に免疫抑制薬を投与されない限り、異種移植片は、超急性拒絶反応をもたらすだろう。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、抗原を含まず、それ故、レシピエントのどんな抗体によっても認識することができない。
【００４８】
特定の例では、臓器移植を受ける患者は、急性拒絶を被る。本明細書で使用されるように、「急性拒絶」は、移植の約１週間後から約１年後に始まる免疫反応を意味する。急性拒絶は、ドナー臓器上の外来ＨＬＡ分子の存在から結果的に生じる。特定の例では、ＡＰＣは、外来ＨＬＡを認識し、ヘルパーＴ細胞を活性化する。特定の例では、ヘルパーＴ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージを活性化する。特定の例では、細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージの存在は、結果的に、外来ＨＬＡによる細胞の死、およびそれ故、移植臓器の損傷（または死）をもたらす。急性拒絶は、腎臓移植の約６０−７５％、および肝臓移植の５０−６０％で生じる。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、ＨＬＡを含まず、それ故、ヘルパーＴ細胞の活性化を結果的にもたらさない。
【００４９】
特定の例では、臓器移植を受ける患者は、慢性拒絶反応を被る。本明細書で使用されるように、「慢性拒絶反応」は、移植組織に対する慢性の炎症反応および免疫反応から結果的に生じる移植拒絶反応を意味する。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、抗原また外来ＨＬＡを含まず、それ故、炎症反応または免疫反応を引き起こさないだろう。
【００５０】
特定の例では、臓器移植を受ける患者は、慢性同種移植片血管症（ＣＡＶ）を被る。
本明細書で使用されるように、「慢性同種移植片血管症」は、移植臓器の内部血管の繊維症から結果的に生じる移植臓器の機能の損失を意味する。特定の例では、ＣＡＶは、移植臓器に対する長期的な免疫反応の結果である。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、抗原また外来ＨＬＡを含まず、それ故、免疫反応を結果としてもたらすことはないだろう。
【００５１】
移植拒絶反応を回避するために、臓器のレシピエントは免疫抑制薬を投与される。免疫抑制薬は、限定されないが、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾンおよびヒドロコルチゾン）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）、反増殖性薬剤（例えば、アザチオプリンおよびミコフェノール酸）、免疫系の特定成分に対する抗体（例えば、バシリキシマブ  、ダクリズマブ  、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、および抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）およびｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムスおよびエベロリムス））を含む。しかしながら、免疫抑制薬は、限定されないが、感染感受性（例えば、ニューモシスティスカリニ肺炎（ＰＣＰ）、サイトメガロウイルス肺炎（ＣＭＶ）、単純性疱疹ウイルスおよび帯状疱疹ウイルスによる感染）、および悪性細胞の蔓延、高血圧、脂質異常症、高血糖症、消化性潰瘍、肝臓および腎臓の損傷、およぶ他の薬との相互作用を含む、幾つかのマイナスの副作用を有する。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、免疫反応結果としてもたらすことはなく、それ故、免疫抑制薬の投与を必要としない。
【００５２】
感染
特定の例では、ドナー臓器は、感染因子によって感染され得る。感染した臓器の移植後に、感染因子は、ドナーの全体にわたって広がり得る（部分的に免疫抑制薬の使用が原因）。限定しない例として、レシピエントは、移植臓器から、ＨＩＶ、西ナイルウイルス、狂犬病、Ｃ型肝炎、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、結核、シャガス病、およびクロイツフェルト−ヤコブ病に感染してきた。そのような感染は稀ではあるが、それらは、それでも生じる場合があり、死亡したドナーに対する社会歴は、それらが最近親者に必ず由来するために多くの場合不正確であるか、セロコンバージョンが生じていない場合、血清検査は偽陰性の結果をもたらし得るか、あるいは血清検査はまた、輸血後の血液希釈が原因で偽陰性をもたらし得る。さらに、採取される臓器が生存可能な時間が限られているために、多くの珍しい感染因子はスクリーニングされない。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、感染因子を含まないだろう。
【００５３】
ドナーの合併症
生体ドナーは、臓器の提供の結果として合併症も被り得る。これらの合併症は、院内感染、麻酔へのアレルギー反応、および手術ミスを含む。さらに、臓器ドナーは、いつの日か、提供した臓器を必要とするかもしれない。例えば、腎臓ドナーの残りの腎臓または肝臓ドナーの残りの葉は、損傷されるかもしれない。幾つかの実施形態では、新たに作製された組織また臓器は、ドナー臓器の必要性をなくし、それ故、ドナーへのマイナスの副作用を回避するだろう。
【００５４】
入手可能な臓器の不足およびドナー臓器移植に後続し得るすべての合併症を考慮すると、組織および臓器の新規作製の方法が必要とされている。
【００５５】
組織工学
組織工学は、臓器または組織の増大、修復、または置換によって組織機能を回復、維持、または改善する生物学的代替物の開発に向けたエンジニアリングおよびライフサイエンスの法則を適用する且つ組み合わせる学際的分野である。典型的な組織工学への基礎的アプローチは、生細胞を生体適合性および最終的に生物分解性の環境（例えば、スキャフォールド）へと播種し（ｓｅｅｄ）、その後、始原細胞集団がさらに拡大して成熟し、移植後に標的組織を生成するように、バイオリアクター中でのこの構築物を培養することである。生物学的細胞間マトリックス（ＥＣＭ）を模倣する適切なスキャフォールドにより、発達中の組織は、インビトロおよびインビボでの成熟後に所望の臓器の形態および機能の両方を採用し得る。しかしながら、天然組織様の構造を有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたる細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、結果的に、機械的性質が乏しい及び／又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされ得る。さらなる困難は、スキャフォールドの生物分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試されてきた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、幾つかの制限を受ける：
・  各層が異なる細胞タイプを含む多層構造などの、複雑な幾何学的形状は、天然組織様の結果を再生可能な方法で達成するために、特定の構造内の細胞タイプの確定的な、高分解性の配置を必要とし得る。
・  尺度および幾何学的形状は、拡散及び／又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
・  組織の生存度は、拡散を限定する且つ栄養素への細胞のアクセスを制限する閉込め材料（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）によって損なわれ得る。
【００５６】
本明細書には、特定の実施形態において、三次元の組織構築物を生成するデバイス、システム、および方法が開示される。本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、以下の三相プロセスを利用する：（ｉ）前処理、またはバイオインク調製、（ｉｉ）処理、即ち、バイオプリンターによるバイオペーパー（ｂｉｏ−ｐａｐｅｒ）へのバイオインク粒子の実際の自動化送達／プリンティング、および（ｉｉｉ）後処理、即ち、バイオリアクター中のプリントされた構築物の成熟／インキュベーション。最終的な構造体形成は、バイオインク粒子の融合によって後処理中に起こる。本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、以下の利点を有する：
・  それらは、細胞を含む組織及び／又は臓器を生成することができる。
・  それらは、発生生物学の原則を利用することによって天然組織を形成するプロセスの環境条件を模倣する。
・  それらは、幅広い一連の複雑なトポロジー（例えば、多層構造、繰り返しの幾何学模様、セグメント、シート、チューブ、嚢など）を達成することができる。
・  それらは、製造の自動化手段と互換性があり、スケーラブルである。
【００５７】
バイオプリンティングは、組織修復、組織増大、組織置換、および臓器置換に有用である細胞を含む移植可能な組織を生成する改善された方法を可能にする。さらに、バイオプリンティングは、インビトロアッセイに有用なものを含むマイクロスケールの組織アナログを生成する改善された方法を可能にする。
【００５８】
バイオプリンティング
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するための、デバイス、システム、および方法が開示される。幾つかの実施形態では、デバイスは、バイオプリンターである。幾つかの実施形態では、方法は、バイオプリンティング技術の使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法の使用によって作製された組織および臓器は、バイオプリントされる。
【００５９】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた細胞の構築物、組織、および臓器は、三次元の送達デバイス（例えば、バイオプリンター）による、生体適合性表面（例えば、ヒドロゲル及び／又は多孔質膜から構成される）上への、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮液、多細胞体（例えば、シリンダー、スフェロイド、リボンなど）、および支持材を含む細胞の、三次元の、自動化した、コンピューター支援の堆積に基づいた、迅速なプロトタイピング技術を利用する方法で作られる。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態では、組織及び／又は臓器に言及するために使用されるときの、用語「操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮液、多細胞集合体、およびそれらの層が、コンピューターコードに従ってコンピューター支援のデバイス（例えば、バイオプリンター）によって三次元構造を形成するように位置付けられることを意味する。さらなる実施形態では、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。またさらなる実施形態では、三次元の組織構造は、初期の形態形成における自己集合現象に類似した細胞または多細胞体のプリンティング後の融合によって形成される。
【００６０】
多くの方法が、手動配置を含む三次元構造を生成するために、細胞、多細胞集合体、及び／又はそれらの層を生体適合性の表面上に配するのに利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機械による位置決めには利点がある。この技術による細胞または多細胞体の送達の利点は、細胞、多細胞集合体及び／又は様々な組成物を有するそれらの層の、計画された又は予め決められた配向またはパターンを示す構築物をもたらすために、細胞または多細胞体の、急速で、正確で、且つ再生可能な配置を含む。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながら、確かな高い細胞密度を含むことである。
【００６１】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、連続している及び／又は略連続している。連続的なバイオプリンティング方法の限定しない例は、バイオインクのリザーバーに接続された分注チップ（例えば、シリンジ、キャピラリーチューブなど）を介してバイオプリンターからバイオインクを分注することである。さらに限定しない実施形態では、連続的なバイオプリンティング方法は、機能ユニットの繰り返しのパターンでバイオインクを分注することである。様々な実施形態では、繰り返しの機能ユニットは、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的形状を含む、任意の適切な幾何学的形状を有する。さらなる実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットの繰り返しのパターンは、層を含み、複数の層は、隣接してバイオプリントされて（例えば、積み重ねられて）、操作した組織または臓器を形成する。様々な実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の層は、隣接してバイオプリントされて（例えば、積み重ねられて）、操作した組織または臓器を形成する。
【００６２】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、モザイク状のパターンで繰り返す。「モザイク状のパターン」は、重なりや間隙で平面を満たさない図の平面である。連続的及び／又はモザイク式のバイオプリンティングの利点は、バイオプリントされた組織の生成の増加を含み得る。生成の増加は、生成の規模の増加、複雑性の増加、あるいは時間またはコストの減少を達成することを含み得る。別の限定しない潜在的な利点は、三次元構築物のバイオプリンティングを完了する必要のある較正事象の数を減らすことができることである。連続的なバイオプリンティングはまた、随意にシリンジ機構を使用して、バイオインクの大きなリザーバーからのより大きな組織のプリンティングを促進する。
【００６３】
連続的なバイオプリンティングでの方法には、随意に、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立して又は互いに対して、最適化する及び／又は平衡化することを伴う。一例では、堆積のためのバイオプリンターヘッドの速度は、３ｍｍ／ｓであり、分注の高さは、第１層に対しては０．５ｍｍであり、各々の続く層に対しては０．４ｍｍ増加した。幾つかの実施形態では、分注の高さは、バイオプリンターの分注チップの直径とほぼ等しい。限定することなく、適切及び／又は最適な分注の距離によって、結果的に材料が分注ニードルにぴったり付く（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）または接着することはない。様々な実施形態では、バイオプリンターの分注チップは、約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の内径を有し、それらにおけるインクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）を含む。様々な実施形態では、バイオプリンターのバイオインクリザーバーは、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００立方センチメートル、またはそれ以上の容積を有し、それらにおけるインクリメントを含む。ポンプ速度は、システムにおける残留圧力の上昇が低いときに、適切及び／又は最適であり得る。好都合なポンプ速度は、リザーバーと分注ニードルの横断面積間の比率に依存し得、より大きな比率は、より低いポンプ速度を必要とする。幾つかの実施形態では、適切な及び／又は最適なプリント速度によって、物質の機械的結着性に影響を与えることなく、一様な線の堆積が可能となる。
【００６４】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、コア層、マントル層、および随意に、コア層とマントル層との間の１つ以上の中間層を含む多軸チューブである。幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、三軸チューブである。
【００６５】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、同軸チューブである。特定の実施形態では、同軸チューブは、コア層（内部層）およびマントル層（外側層）を含む。特定の実施形態では、コア層のバイオインクは、マントル層のバイオインクとは異なり、結果として生じた同軸チューブは、二層形態を有するシリンダーである。特定の実施形態では、コア層のバイオインクは、非細胞性成分のみを含み、バイオプリンティング後に除去され得、および結果として生じた同軸チューブは、中空シリンダーである。他の実施形態では、コア層は、「スパッタコアフィード（ｓｐｕｔｔｅｒ  ｃｏｒｅ  ｆｅｅｄ）」パターンで非連続的にバイオプリントされ、一方で、マントル層は、連続的にバイオプリントされる（図２８を参照）。マントル層の同時の連続押出でのコア層のスパッタ押出は、区画された同軸チューブを作成する。続く区画された同軸チューブの操作によって、結果的にマントル層は、コア層が存在しない領域に沿ってそれ自体が崩壊する。これらの崩壊した領域で各セグメントを切断することによって、別々のマントル構造およびコア構造を有する球状の球体、またはオルガノイドが作り出される。
【００６６】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、非連続的及び／又は略非連続的である。非連続的なバイオプリンティング方法の限定しない例は、インクジェットヘッドの一部として構成されたカートリッジを介してバイオプリンターからバイオインクを分注することである。幾つかの実施形態では、インクジェットヘッドは、高精度の分注チップ、およびシリンジポンプに密に連結されたインクジェットのソレノイドバルブを含む。幾つかの実施形態では、分注容積は、シリンジ圧力、バルブ作動時間、または高精度の分注チップ、あるいはその任意の組み合わせによって制御される。幾つかの実施形態では、分注容積は、シリンジ圧力、バルブ作動時間、および高精度の分注チップによって制御される。様々な実施形態では、インクジェットの分注容積は、液滴当たり、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ピコリッター、あるいはそれ以上であり、それらにおけるインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、バルクでの分注（ｂｕｌｋ  ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）は、外付けの加圧リザーバーを使用することによって行われる。
【００６７】
本明細書に開示される本発明は、ビジネス方法を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるデバイスおよび方法の速度およびスケーラビリティは、操作した組織及び／又は臓器の生成のための産業設備及び／又は商業設備を設計、構築、および操作するために利用される。さらなる実施形態では、操作した組織及び／又は臓器は、例えば、組織損傷、組織疾患、及び／又は臓器機能不全の医療処置のための材料、ツール、およびキット、またはサービスとして生物学的アッセイ及び／又は薬物スクリーニンングを行うための材料、ツール、およびキットとして、生成、保存、分配され、市場に出され、広告され、および販売される。
【００６８】
バイオプリンター
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、バイオプリンティングプロセスを自動化する任意の機器である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するためのカートリッジキャリアを含むプリンターヘッドであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含み、該プリンターヘッドが、各カートリッジのために、カートリッジを駆動経路と並べる、カートリッジを受ける且つ保持するための手段、カートリッジの内容物を分注する駆動手段であって、他の駆動手段から独立して作動する作動手段、およびカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段を含む、プリンターヘッド；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；および１）各カートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面、の位置を決定するための較正手段、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッド（プリントヘッドとも呼ばれる）であって、プリンターヘッドが、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含み、前記カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、プリンターヘッド；少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段；および少なくとも１つのカートリッジの内容物を分注するための手段、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドであって、各プリンターヘッドが、複数のカートリッジを受ける且つ保持するための、カートリッジキャリアを含み、該カートリッジキャリアが、選択されたカートリッジを駆動経路と並べるために回転可能であり、各カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、プリンターヘッド；選択されたカートリッジの内容物を分注するための駆動手段；選択されたカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、受け面に対して１つ以上のプリンターヘッドを位置決めするための作動手段；および１）選択されたカートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面の位置を決定するための較正手段、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、カートリッジを受ける且つ保持するための手段を含むプリンターヘッドであって、該カートリッジが、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む、プリンターヘッド；カートリッジの内容物を分注するための駆動手段；カートリッジの分注された内容物を受けるための受け面；受け面に対するプリンターヘッドの位置決めするための作動手段；および並列した複数の構築物の同時堆積を制御するための型であって、各構築物が、特定の三次元形状を有している、型、を含む。
【００６９】
様々な実施形態では、バイオプリンターは、二次元または三次元で予め決められた幾何学的形状（例えば、位置、パターンなど）のバイオインク及び／又は支持材を分注する。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、バイオプリントされた材料を受けるのに適したプリンターステージ（ｐｒｉｎｔｅｒ  ｓｔａｇｅ）または受け面に対してプリンターヘッドを移動させることによって、特定の幾何学的形状を達成する。他の実施形態では、バイオプリンターは、プリンターヘッドに対してプリンターステージまたは受け面を移動させることによって、特定の幾何学的形状を達成する。さらなる実施形態では、バイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドに対して受け面を移動させることによって、特定の三次元形状を達成する。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、バイオプリントされた材料を受けるのに適したプリンターステージまたは受け面に対してプリンターヘッドを移動させることによって、およびプリンターヘッドに対してプリンターステージまたは受け面を移動させることによって、特定の幾何学的形状を達成する。特定の実施形態では、バイオプリンターは、無菌環境で維持される。
【００７０】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含む。さらなる実施形態では、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、各カートリッジ用の堆積用オリフィス部を含む。幾つかの実施形態では、カートリッジは、内容物の遠隔リザーバーに接続される。幾つかの実施形態では、カートリッジは、使い捨ての、一回用のカートリッジである。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、１つを超えるカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、磁気引力、コレットチャックグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、コレットチャックグリップである。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、受け面に対するプリンターヘッドのＺ軸位置決めのための独立した作動手段を含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、プリンターヘッド、カートリッジ、及び／又は堆積用オリフィス部の温度を調節する及び／又は維持するための手段をさらに含む。さらなる実施形態では、プリンターヘッドは、冷却剤流を可能にするためにカートリッジのまわりに熱交換器ジャケットを含み、ここで、外付けデバイスは、プリンターヘッドに対する冷却剤の温度および流れを調整する。他の実施形態では、プリンターヘッドは、加熱した液体流を可能にするためにカートリッジのまわりに熱交換器ジャケットを含み、ここで、外付けデバイスは、プリンターヘッドに対する加熱した液体の温度および流れを調整する。
【００７１】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含み、ここで、各プリンターヘッドは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するためのカートリッジキャリアを含む。さらなる実施形態では、カートリッジキャリアは、任意の適切な数のカートリッジを受ける且つ保持する。様々な実施形態では、カートリッジキャリアは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のカートリッジを適切に受ける且つ保持する。幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、約２乃至約１０のカートリッジを受ける且つ保持する。さらなる実施形態では、各プリンターヘッドは、各カートリッジのための堆積用オリフィス部を含む。他の実施形態では、各プリンターヘッドは、複数のカートリッジのための共通の堆積用オリフィス部を含む。幾つかの実施形態では、複数のカートリッジは、バイオプリンターの分注路を浄化するために洗浄カートリッジを含む。特定の実施形態では、バイオプリンターは、使用済みの洗浄媒体が保存される場所を提供するために、対応する洗浄ステーションをさらに含む。幾つかの実施形態では、カートリッジの少なくとも１つは、内容物の遠隔リザーバーに接続される。幾つかの実施形態では、カートリッジの少なくとも１つは、使い捨ての、一回用のカートリッジである。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、受け面に対するプリンターヘッドのＺ軸位置決めのための独立した作動手段を含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、プリンターヘッド、カートリッジ、及び／又は堆積用オリフィス部の温度を調節する及び／又は維持するための手段をさらに含む。
【００７２】
図１３を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、２つのプリンターヘッドを有し、その各々は、付属のカートリッジの各々のための堆積用オリフィス部を含む。
【００７３】
図１４を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、２つのプリンターヘッドを有し、その各々は、付属の複数のカートリッジのための共通の堆積用オリフィス部を含む。
【００７４】
図１５を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、２つのプリンターヘッドを有し、材料の遠隔リザーバーは、２つのプリンターヘッドの１つに接続される。リザーバーの使用は、随意に、電子的、空気圧的、または機械的なシグナル伝達によって制御される。
【００７５】
図１８を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、２つのプリンターヘッドを有し、その各々は、内部のリザーバーシステムに接続される。
【００７６】
図２６を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、４つのカートリッジを備える１つのプリンターヘッドを有する。各カートリッジは、他のカートリッジに対する独立したＺ軸運動を有している。各カートリッジはまた、それ自体の堆積用オリフィス部に関連している。特定のさらなる実施形態では、一度に１つのカートリッジのみが、バイオプリントされた材料を受けるのに適したプリンターステージまたは受け面と対話するために下げられる（ｌｏｗｅｒｅｄ）。他のさらなる実施形態では、１つ以上のカートリッジが、バイオプリントされた材料を受けるのに適したプリンターステージまたは受け面と対話するために下げられる。
【００７７】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、レーザーアラインメント、光学的アラインメント、機械的アラインメント、圧電的アラインメント、磁気アラインメント、電界、キャパシタンスアラインメント、超音波アラインメント、画像ベースのアラインメント、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、レーザーアラインメントである。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、画像ベースのアラインメントである。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジの位置を較正するための手段は、レーザーアラインメントと画像ベースのアラインメントの組み合わせである。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１）選択されたカートリッジに関連する堆積用オリフィス部、および２）受け面に支持された印刷目的表面の位置を決定するための較正手段を含む。さらなる実施形態では、較正手段は、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。またさらなる実施形態では、較正手段は、材料の堆積の間に印刷高さをモニタリングする。幾つかの実施形態では、較正手段は、三角測量センサー、超音波距離を感知するプローブ、およびデジタルカメラから選択される、１つ以上のセンサーを利用する。幾つかの実施形態では、較正手段は、自動化バイオプリンター用の三次元較正システムである。様々な実施形態では、三次元較正システムは、バイオプリンターの堆積用オリフィス部の位置を決定するためにバイオプリンターの受け面に固定されたセンサー；および受け面に関連する印刷目的表面の位置を決定するためのバイオプリンターのプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムは、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。幾つかの実施形態では、センサーは、三角測量センサー、超音波距離を感知するプローブ、およびデジタルカメラから選択される。
【００７９】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、少なくとも１つのカートリッジの内容物を分注するための手段を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジの内容物を分注するための手段は、ピストンの適用、圧力の適用、圧縮ガスの適用、水圧の適用、またはそれらの組み合わせの適用である。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのカートリッジの内容物を分注するための手段は、ピストンの適用である。幾つかの実施形態では、ピストンの直径は、カートリッジの直径未満である。
【００８０】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、選択されたカートリッジの内容物を分注するための駆動手段を含む。幾つかの実施形態では、選択されたカートリッジの内容物を分注するための駆動手段は、正の変位、空気圧の変位、水圧の変位、音響共鳴、またはそれらの組み合わせを利用する。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、選択されたカートリッジの内容物を分注するためのそれ自体の独立した駆動手段を有する。
【００８１】
図２３ａ、２４ａ、および２４ｂを参照すると、特定の実施形態では、カートリッジの内容物を分注するための駆動手段は、２重のリニアガイドレール、ステッパーモーター、および一体化した主ねじとモーターシャフトを含む、駆動機構である。この具体的な実施形態では、駆動機構は、印刷目的表面に対する付属のカートリッジの位置を調節するためのＺ軸位置決め機構に付けられる。
【００８２】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、受け面をさらに含む。さらなる実施形態では、受け面は、バイオプリンターがバイオインク及び／又は支持材を分注する、非細胞毒性の表面である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、プリンターステージをさらに含む。さらなる実施形態では、受け面は、プリンターステージの表面である。他の実施形態では、受け面は、プリンターステージとは別の構成要素であるが、ステージに付けられるか、または支持される。幾つかの実施形態では、受け面は、水平であるか、または略水平である。幾つかの実施形態では、表面は、滑らかであるか、または略滑らかである。他の実施形態では、表面は、略水平且つ略滑らかである。またさらなる実施形態では、受け面は、バイオプリントされた構造体の形、サイズ、構成、または幾何学的形状に合うように特別に設計される。またさらなる実施形態では、受け面は、バイオプリントされた構築物の形、サイズ、構成、または幾何学的形状を制御するか又はそれに影響を与える。幾つかの実施形態では、受け面は、１つ以上のプリンターヘッドに対して移動され、１つのカートリッジまたは複数のカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状が生成される。幾つかの実施形態では、受け面は、標準のアッセイプレートである。幾つかの実施形態では、受け面は、２４ウェルのトランスウェルキャリアに適合されたトランスウェルインサートである。
【００８３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、受け面に対してプリンターヘッドを位置決めするための作動手段を含む。他の実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、選択されたカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、受け面に対して１つ以上のプリンターヘッドを位置決めするための作動手段を含む。幾つかの実施形態では、作動手段は、ボールまたは主ねじを含む。幾つかの実施形態では、作動手段は、光学エンコーダーを含む。幾つかの実施形態では、作動手段は、プリンターヘッドが受け面と不意に接触することを防ぐためのブレーキ機構を含む。他の実施形態では、作動手段は、プリンターヘッドが受け面と不意に接触することを防ぐためのブレーキ機構を含まない。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドは、印刷目的表面に対するカートリッジの位置を調節するためにＺ軸位置決めするための、それ自体の独立した作動手段を有している。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、第２のＸ軸及び／又はＹ軸の位置決め機構をさらに含む。
【００８４】
図２３ａ、２３ｂ、および２５を参照すると、特定の実施形態では、プリンターヘッドは、印刷目的表面に対するカートリッジの位置を調節するためにＺ軸を位置決めするための、それ自体の独立した作動手段を有している。
【００８５】
図２２を参照すると、特定の実施形態では、プリンターヘッドは、４つの独立したカートリッジを含み、その各々は、他のカートリッジに対する独立したＺ軸運動のためのそれ自体のＺ軸位置決め機構を有する。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、各々が特定の三次元形状を有している、並列した且つあるパターンで配された複数の構築物の同時堆積；特定の三次元形状を有している単一の構築物の堆積、またはその組み合わせ、を制御するための型を含む。さらなる実施形態では、型は、恒久的に固定される。他の実施形態では、型は、可逆的に固定される。幾つかの実施形態では、型は、並列した任意の適切な数の構築物の同時堆積を制御する。様々な実施形態では、型は、並列した約２、６、１２、２４、４８、６４、９６、３８４、１５３６、３４５６、または９６００の構築物の同時堆積を適切に制御する。幾つかの実施形態では、型は、並列した約２乃至約３８４の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、標準のアッセイプレートに相補となるように構成される。幾つかの実施形態では、複数の構築物中の各構築物は、同じ三次元形状を有している。他の実施形態では、複数の構成物は、同じ三次元形状を有さない。三次元形状の限定しない例は、シリンダー、中空シリンダー、多角形、シート、および円である。幾つかの実施形態では、型は、並列した複数の材料の同時堆積を制御する。さらなる実施形態では、型は、各材料のための入力ポートを含む。幾つかの実施形態では、型は、バイオインクまたは支持材の均一層を含有するためにチャンバーに接続される。幾つかの実施形態では、複数の構築物中の構築物の各々は、単一の構築物を形成するために互いに接触している。
【００８７】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上の三次元のバイオプリントされた組織を所望の幾何学的形状へと形作るように打ち抜く又は切断するための１つ以上のモールドを含む型を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、所望の幾何学的形状への１つ以上の三次元のバイオプリントされた組織の押出のための同軸または三軸のノズルを含む。幾何学的形状の限定しない例は、シリンダー、中空シリンダー、多角形、シート、および球体である。幾つかの実施形態では、シリンダーの外径は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｍ、あるいはそれ以上であり、それらにおけるインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、シリンダーの外径は、２５０μｍまたは５００μｍである。さらなる実施形態では、同軸ノズルは、少なくとも２つの異なる材料のための少なくとも２つの独立した入力、およびコア層とマントル層を有する同軸チューブの調製のための少なくとも２つの独立した出力を備える２重の流動能力を有し、コア層とマントル層は、互いに対して異なる材料の組成を有している。まださらなる実施形態では、１つ以上の同軸ノズルの各々は、少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの異なる材料の各々の流れを独立して調整するための手段をさらに含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの異なる材料の各々の流れを独立して調整する手段は、連続押出またはスパッタ押出を可能にする。
【００８８】
図８−１および８−２を参照すると、特定の実施形態では、２部の型は、バイオインクの均一層を含有するためのチャンバーに接続される。このチャンバーは、取外し可能な蓋および調整可能な底プレートを含む。チャンバー内のバイオインクの均一層を得るために、チャンバーは、細胞懸濁液で満たされ、遠心分離にかけられる。蓋および上清が除去された後、チャンバーは、逆さまにされて、押出機構に恒久的に又は一時的にのいずれかで付けられる。この押出機構は、調整可能な底プレートを型へと押し、バイオインクを２部の型に追い込む。２部の型は、Ｃ形のモールドを備える第１型およびＣ形のバイオインクを圧縮する第２型を含み、バイオインクが第２型を出ると、隣接した、中空の円筒状の構造体を形成する。
【００８９】
図９−３を参照すると、６つの中空チューブを同時に作り出すモールドを備える型は、カートリッジ上に設置される。他の実施形態では、型は、１つ以上のチューブを同じ又は異なる形状で押し出すためのモールドを有する。幾つかの実施形態では、カートリッジは、細胞濃度を増加させるために、型の設置前に前処理される。図９−１に示されるものなどの遠心装置は、一端で取外し可能なプラグおよび他端で自己シール性の（ｓｅｌｆ−ｓｅａｌｉｎｇ）ポートを有しているカートリッジとともに使用される。自己シール性のポートは、バイオインク懸濁液の進入および後の上清の除去を提供する。カートリッジは、漏出を防ぐためのシールを備えるピストンを含む。一度型がバイオインクを含有しているカートリッジ上に設置されると、カートリッジは、本明細書に開示されるバイオプリンターまたは押出デバイスに付けられ得る（図９−２を参照）。
【００９０】
図１０、１１、および１２を参照すると、特定の実施形態では、型は、２４ウェルのプレートに対して互換性のある、押出プレート、またはモールド蓋となるように構成される。型は、材料＃１および＃２のための２４の個々の幾何学的モールドおよび入力ポートを有する。一般に、そのような幾何学的モールドは、単一の幾何学的形状または幾何学的形状の混合をもたらすことができる。この具体的な実施形態では、２４の個々の幾何学的モールドはすべて、受け面の２４ウェルすべてに対して同じ幾何学的形状をもたらすだろう。材料は、一度入力ポートを通って注入されると、受け面として機能する、標準の２４ウェルのアッセイプレートのそれぞれの個々のウェルへの材料の堆積または押出の位置および幾何学的形状を制御する幾何学的モールドの形態で、予め決められた経路を通って流れる。このように、材料は、単一のウェルへと、同時に複数のウェルへと、または同時にすべてのウェルへと堆積されるか又は押し出される。この具体的な実施形態では、個々のウェルにおいて結果として生じた組織は、随意に、１つ又は２つの材料からなる。
【００９１】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、温度を調節するための手段をさらに含む。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、周囲温度を調節する及び／又は維持する。他の様々な実施形態では、温度を調節するための手段は、限定しない例として、プリントヘッド、カートリッジ、カートリッジの内容物（例えば、バイオインク、支持材など）、プリンターステージ、および受け面の温度を調節する及び／又は維持する。
【００９２】
幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、加熱要素である。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、ヒーターである。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、放射暖房器、対流ヒーター、導電ヒーター、ファンヒーター、熱交換器、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、冷却要素である。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、冷却剤の容器、冷却液、氷、またはその組み合わせである。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、放射冷却器、対流冷却器、導電クーラー、ファンクーラー、またはそれらの組み合わせである。
【００９３】
様々な実施形態では、温度を調節するための手段は、約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０℃に温度を調節し、それらにおけるインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、温度は、約４０℃から約９０℃に調節される。幾つかの実施形態では、温度は、約３７℃から約９０℃に調節される。他の実施形態では、温度は、約０℃から約１０℃に調節される。
【００９４】
幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、堆積チップ及び／又はカートリッジの一部またはすべての温度を調節する。幾つかの実施形態では、温度を調節するための手段は、プリンターヘッド上に置かれる。さらなる実施形態では、温度を調節するための手段は、温度調節された液体の流れを可能にするためのカートリッジの少なくとも一部のまわりに置かれる熱交換器ジャケットであり、ここで、外付けデバイスは、温度および温度調節された液体のプリンターヘッドへの流れを調整する。幾つかの実施形態では、温度調節された液体の温度範囲は、４℃乃至４０℃である。幾つかの実施形態では、冷却デバイスまたは加熱デバイスは、プリンターヘッド上には置かれず、プリンターヘッドは、バイオプリンター内の冷却デバイスまたは加熱デバイスの位置に移動されなければならない。
【００９５】
図２７を参照すると、特定の実施形態では、プリンターヘッドは、シリンジのまわりに置かれた熱交換器ジャケットを含み、ここで、外付けデバイスは、プリンターヘッドに対する冷却剤の温度および流れを調整する。外側ジャケットは、ＰＥＴで作られている。
冷却剤は、最大２７ｐｓｉでジャケットに流れ込む。冷却剤は、約１ａｔｍでジャケットから流れ出る。
【００９６】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、プリンターステージ；受け面、堆積用オリフィス部、バイオインク、支持材、またはプリントされた構築物の１つ以上に、湿潤剤を適用するための手段をさらに含む。幾つかの実施形態では、湿潤剤を適用するための手段は、液体を適用する任意の適切な方法（例えば噴霧器、ピペット、インクジェットなど）である。幾つかの実施形態では、湿潤剤は、水、組織培養培地、緩衝化した食塩水、血清、またはそれらの組み合わせである。さらなる実施形態では、湿潤剤は、バイオインクまたは支持材がバイオプリンターによって分注された後に適用される。幾つかの実施形態では、湿潤剤は、バイオインクまたは支持材がバイオプリンターによって分注されると同時に又は略同時に適用される。幾つかの実施形態では、湿潤剤は、バイオインクまたは支持材がバイオプリンターによって分注される前に適用される。
【００９７】
プリンターヘッド
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッド（プリントヘッドとも呼ばれる）を含む。さらなる実施形態では、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。またさらなる実施形態では、プリンターヘッドは、少なくとも１つのカートリッジをバイオプリンターに付ける。
【００９８】
少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための多くの手段は、適切である。少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための適切な手段は、少なくとも１つのカートリッジをバイオプリンターに確実に、正確に、および安全に付ける手段を含む。様々な実施形態では、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、限定しない例として、磁気引力、コレットチャックグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせである。
【００９９】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、１つのカートリッジを受ける且つ保持する。様々な他の実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のカートリッジを同時に受ける且つ保持する。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、受けられる且つ保持される複数のカートリッジの中からバイオプリンティングに利用されるカートリッジを選択するための手段をさらに含む。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、１つ以上のカートリッジの容量を超えてバイオインク及び／又は支持材を含有するためのリザーバーをさらに含む（またはそれと流体連通している）。さらなる実施形態では、リザーバーは、分注オリフィス部を介する分注のためにバイオインク及び／又は支持材を１つ以上のカートリッジに供給する。リザーバーを含むプリンターヘッド構成は、特に、連続的または略連続的なバイオプリンティングの適用に有用である。本明細書に開示されるリザーバーには多くの量が適している。様々な実施形態では、リザーバーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍｌまたはそれ以上の内容積を有し、それらにおけるインクリメントを含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングには、細胞タイプ、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、堆積順序、堆積位置、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立して又は互いに対して構成するためのコンピューターを使用することを伴う。さらなる実施形態では、コンピューターコードは、プリンターヘッド高さを受け面の上に構成するために、プリンターヘッドの位置決めを指定する。さらなる実施形態では、コンピューターコードは、バイオインク及び／又は支持材に対する分注特性を構成するために、プリンターヘッドの運動の方向および速度を指定する。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、独立したＺ軸位置決め機構に接続される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、プリンターヘッド、付属のカートリッジ、及び／又は堆積用オリフィス部の温度を調節する及び／又は維持するための独立した手段に接続される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるプリンターヘッドは、プリンターヘッド、付属のカートリッジ、及び／又は堆積用オリフィス部の温度を調節する及び／又は維持するための独立したＺ軸位置決め機構および独立した手段に接続される。
【０１０３】
図２２を参照すると、特定の実施形態では、プリンターヘッドは、４つの独立したプリント用カートリッジを含み、その各々は、それ自体の堆積チップを有し、カートリッジの内容物を分注するための独立した駆動機構に付けられる。各カートリッジはまた、それ自体のＺ軸位置決め機構を介して他の３つのカートリッジに対して独立したＺ軸運動を有している。各カートリッジがシリンジニードルに関連して図２２に示されるが、各カートリッジは、独立して、シリンジニードル、キャピラリーチューブ、またはインクジェットチップ（ｉｎｋｊｅｔ  ｔｉｐ）から選択される堆積チップを有する。特定の実施形態では、一度に１つのカートリッジのみが、バイオプリントされた材料を受けるのに適したプリンターステージまたは受け面と対話するために下げられる。他のさらなる実施形態では、１つ以上のカートリッジが、バイオプリントされた材料を受けるのに適したプリンターステージまたは受け面と対話するために下げられる。随意に、各カートリッジは、カートリッジ、堆積用オリフィス部、または内容物の温度を調節する及び／又は維持するための独立した手段を有する。特定の実施形態では、１つ以上のカートリッジは、バイオプリンター上に置かれたゲルヒーターおよびクーラーに達することができる。さらなる実施形態では、２つの右端または２つの左端のいずれかの２つのカートリッジのみが、バイオプリンター上に置かれたゲルヒーターおよびクーラーに達することができる。
【０１０４】
図２６を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、図２２に記載されるようなプリンターヘッドを含む。このバイオプリンターは、受け面としての１つ又は２つの多重ウェルプレートまたはペトリ皿の使用を可能にする。このバイオプリンターはまた、受け面に支持された各堆積用オリフィス部および各印刷目的表面の位置を決定するための較正手段を含む。随意に、バイオプリンターは、バイオプリンターの性能を向上させるために、第２のＸ軸及び／又はＹ軸の位置決め機構をさらに含み得る。
【０１０５】
図２３ａ、２３ｂ、２４ａ、２４ｂ、および２５を参照すると、特定の実施形態では、プリンターヘッドは、カスタム流動ステージおよび高精密リニアステージを有する。プリンターヘッドは、高い精度および分解能の印刷目的表面に対する付属のカートリッジの位置を迅速に調節するために、付属のＺ軸位置決め機構の使用によるバイオプリンター内の他の構成要素に対する独立したＺ軸運動を有している。位置決め機構は、主ねじおよび光学エンコーダーを含む。さらに、プリンターヘッドは、付属のカートリッジの内容物を分注するために、駆動機構に付けられる。この具体的な実施形態では、プリンターヘッドは、一体化した位置決め機構および駆動機構に接続される。この具体的な位置決め機構はまた、プリンターヘッドが受け面と不意に接触することを防ぐためのブレーキ機構を含まない。ハイブリッドのリニアアクチュエーターは、キャリッジアセンブリに付けられたプランジャーを駆動させる（図２４ｂを参照）。主ねじピッチおよびモーター仕様は、速度および精度に関して最適化される。キャリッジアセンブリは、リニアガイドシステムに取り付けられ（図２５を参照）、これは、リニアステージに付けられたカスタムセンサーブラケット、光遮断センサー、および取付プレートに統合された光フラグ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌａｇ）を含んでいる。
【０１０６】
カートリッジキャリア
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、１つ以上のプリンターヘッドを含む。さらなる実施形態では、プリンターヘッドは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するためのカートリッジキャリアであって、各カートリッジが、バイオインク、支持材、およびその組み合わせから選択される内容物を含む、カートリッジキャリア；および各カートリッジのために、カートリッジを駆動経路と並べる、カートリッジを受ける且つ保持するための手段；カートリッジの内容物を分注する駆動手段であって、他の駆動手段から独立して作動する作動手段；およびカートリッジの分注された内容物において特定の三次元形状を生成するために、カートリッジを受け面に対して垂直に位置付ける、作動手段であって、他の作動手段から独立して作動する作動手段、を含む。他の実施形態では、プリンターヘッドは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するためのカートリッジキャリアを含み、該カートリッジキャリアは、選択されたカートリッジを駆動経路と並べるために回転可能である。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、バイオプリンターの位置決め可能なプリンターヘッドに付けられ、複数のカートリッジを受ける且つ保持するように適応される。さらなる実施形態では、カートリッジキャリアは、選択されたカートリッジをバイオプリンターの駆動経路と並ぶように回転可能であり、その結果、駆動機構は、内容物を分注するために、選択されたカートリッジと係合する。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、各カートリッジは、バイオインクおよび支持材の１つ以上から選択される内容物を含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、複数のカートリッジを受ける且つ保持するように適合される。様々な実施形態では、カートリッジキャリアは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のカートリッジを受ける且つ保持するように適合される。幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、約２乃至約１０のカートリッジを受ける且つ保持するように適合される。幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、４つのカートリッジを受ける且つ保持するように適合される。
【０１１０】
少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための多くの手段は、適切である。少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための適切な手段は、少なくとも１つのカートリッジをバイオプリンターに確実に、正確に、および安全に付ける手段を含む。様々な実施形態では、少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段は、限定しない例として、磁気引力、コレットチャックグリップ、フェルール、ナット、バレルアダプター、またはそれらの組み合わせである。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、カートリッジキャリアは、円筒状である。
【０１１２】
型
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、並列した複数の構築物の同時堆積を制御するための型を含み、各構築物は、特定の三次元形状を有している。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、型は、バイオプリンターから堆積されたバイオインクまたは支持材を受けるための１つ以上の入力ポート；および複数の出力用モールドを含み、各出力用モールドは、バイオインクまたは支持材を形作るための各入力ポートに関連するウェルを含み、それによって、型は、並列した複数の構築物の同時堆積が可能となり、各構築物は、特定の三次元形状を有している。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、型は、恒久的に固定される。他の実施形態では、型は、可逆的に固定される。幾つかの実施形態では、複数の構築物中の各構築物は、同じ三次元形状を有している。幾つかの実施形態では、複数の構築物は、均質の幾何学的形状である。他の実施形態では、複数の構築物は、異質の幾何学的形状である。幾つかの実施形態では、複数の構築物は、標準のアッセイプレートへとバイオプリントされる。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、型は、並列した２−３８４の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、並列した９６の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、並列した２４の構築物の同時堆積を制御する。幾つかの実施形態では、型は、並列した１２の構築物の同時堆積を制御する。様々な実施形態では、型は、並列した約２、４、６、８、１２、２４、３６、４８、９６、または３８４の構築物の同時堆積を制御する。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、型は、バイオインクまたは支持材の均一層を含有するためのチャンバーに接続され、該チャンバーは、型とバイオプリンターの駆動機構との間に位置付けられる。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、型は、並列した複数の材料の同時堆積を制御する。さらなる実施形態では、型は、各材料のための入力ポートを含む。
【０１１８】
多軸ノズル
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、所望の幾何学的形状への１つ以上の三次元のバイオプリントされた組織の押出のための１つ以上の多軸ノズルを含む。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、１つ以上の多軸ノズルは、ノズルを通るバイオインクが具体的な幾何学的形状へと形作られるような１つ以上の具体的に形作られたノズルである。幾何学的形状の限定しない例は、シリンダー、中空シリンダー、多角形、シート、および球体である。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、１つ以上の同軸ノズルを有する。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、１つ以上の三軸ノズルを有する。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、１つ以上の同軸ノズルまたは三軸ノズルを有する。
【０１２０】
多軸ノズルは、コア層（内部層）、マントル層（外側層）、および随意に、コア層とマントル層との間の１つ以上の中間層から成る多層形態を備える多軸チューブを調製するために２重の又はより大きな同心の流動能力を有する。ノズルの寸法は、設計修正に基づいて異なる。
【０１２１】
ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの外径は、０．５乃至４ｍｍである。ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの外径は、０．５乃至３ｍｍである。ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの外径は、０．５乃至２ｍｍである。ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの外径は、１乃至４ｍｍである。ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの外径は、２乃至４ｍｍである。ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの外径は、３乃至４ｍｍである。
【０１２２】
同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．１乃至１．５ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．１乃至１．３ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．１乃至１．０ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．１乃至０．８ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．１乃至０．６ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．１乃至０．４ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．６乃至１．５ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．６乃至１．３ｍｍである。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、ノズルの内径は、０．６乃至１．０ｍｍである。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、多軸ノズルは、同軸チューブを調製するために少なくとも２つの独立した出力を通る少なくとも２つの独立した材料の各々の流れを独立して調整するための手段をさらに含み、ここで、任意の２つの隣接層は、互いに対して異なる材料の組成を有している。様々な実施形態では、ノズルを通る押出の流量は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＬ／分、またはそれ以上であり、それらにおけるインクリメントを含む。
【０１２４】
同軸ノズルの幾つかの実施形態では、内部層のバイオインクの流速は、外側層のバイオインクの流速と同等である。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、内部層のバイオインクの流速は、外側層のバイオインクの流速とは異なる。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、内部層のバイオインクの流速は、外側層のバイオインクの流速より５０％速い。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、内部層のバイオインクの流速は、外側層のバイオインクの流速より２倍速い。幾つかの実施形態では、該層のいずれか１つの流速は、隣接層より遅い。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、多軸ノズルは、連続押出及び／又はスパッタ押出が可能である。同軸ノズルの幾つかの実施形態では、コア層は、マントル層が連続押出によって調製されると、スパッタ押出によって調製される。同軸ノズルの他の実施形態では、コア層は、マントル層がスパッタ押出によって調製されると、連続押出によって調製される。
【０１２６】
球体およびシリンダー（例えば、図３４ａ）は、本明細書に記載される方法を使用する基本的な幾何学的形状を表わす。バイオプリントされた構造体の様々な実施形態では、（図３４ａで暗い陰影で示される）Ｉ−バイオインクは、唯一の成分であるか、正常なバイオインク（即ち、免疫調節細胞なしでのバイオインク）での勾配にあるか、またはともに存在しない。同軸または三軸の押出ノズルは、円筒状（例えば、図３４ｂ：Ｉ−バイオインクはコア層またはマントル層に置かれる）または球状の性質（例えば、図３４ｃ：Ｉ−バイオインクはコア層またはマントル層に置かれる）を有する多積層構造を促進する。三軸堆積は、断面図で見たときに、さらなる対称的に位置する（ｎｅｓｔｌｅｄ）シリンダーを含んでいる（図示せず）。これらの幾何学的形状は、生体材料を含む又は含まない、インビトロおよび組織様細胞の密度で組織機能の程度を再現する目的で、はるかに大きい且つより複雑な構造体を構築するために利用される可変構築ブロックを表わす。したがって、基本的な構築ブロックを利用する幾つかの代表的な集合体が、図３４ｄに示される：（Ａ）チューブ状の構築物でのパターン化の例、（Ｂ）球体から生成されたパッチであって、球状のバイオインクの分解能に対する精度に応じてパターン化は異なり得る、（Ｃ）パッチおよびチューブ状の構築物における勾配Ｉ−バイオインクシリンダーの使用、および（Ｄ）単純なパターンのパッチにおける均質なＩ−バイオインクおよび正常なバイオインクのシリンダーの使用。
【０１２７】
カートリッジ
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターに付けられたカートリッジは、バイオインクまたは支持材を含む。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、具体的な細胞の構築物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持材を分注する。複雑な組織構築物を作製するために、バイオプリンターは、バイオインクまたは支持材を正確な速度且つ均一量で堆積させる。したがって、（ａ）滑らか又は略滑らかな分注オリフィス部、および（ｂ）滑らか又は略滑らかな内表面を備えたカートリッジが必要とされている。本明細書で使用されるように、「カートリッジ」は、バイオインク及び／又は支持材を受ける（且つ保持する）ことができる対象を意味する。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるカートリッジは、バイオインクを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるカートリッジは、支持材を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるカートリッジは、バイオインクと支持材の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるカートリッジは、哺乳動物細胞を含むバイオインクを含む。
【０１２９】
本明細書には、特定の実施形態において、少なくとも１つの分注オリフィス部を含む、本明細書に開示されるバイオプリンターとの使用のためのカートリッジが開示さる。幾つかの実施形態では、カートリッジは、１つの分注オリフィス部を含む。様々な他の実施形態では、カートリッジは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の分注オリフィス部を含む。さらなる実施形態では、分注オリフィス部の縁は、滑らか又は略滑らかである。
【０１３０】
本明細書に開示される分注オリフィス部には、多くの形状が適している。様々な実施形態では、分注オリフィス部に適した形状は、限定しない例として、円形、卵形、三角形、正方形、長方形で、多角形、不規則な形状を含む。幾つかの実施形態では、分注オリフィス部は、円形である。他の実施形態では、分注オリフィス部は、正方形である。また他の実施形態では、分注オリフィス部は、卵形、長楕円形、または長方形であり、リボン状の形態での固形または半固形のバイオインク及び／又は支持材を分注する。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、カートリッジの内表面は、滑らか又は略滑らかである。幾つかの実施形態では、カートリッジは、較正を促進するために剛構造で構成される。幾つかの実施形態では、カートリッジの壁は、細胞の堆積に抵抗する物質で構成される。幾つかの実施形態では、カートリッジは、生体適合性である物質で構成される。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、カートリッジは、使い捨ての、一回用のカートリッジである。使い捨ての、一回用のカートリッジは、最終的にカートリッジを駆動経路と並べるバイオプリンター上でカートリッジを受ける且つ保持するための適切な手段へと設置される。カートリッジは、好ましくは、合理化された製造プロセスにおいて充填され、容易にバイオプリンターのプリントヘッドへと設置され、それから取り外されられる。幾つかの実施形態では、カートリッジは、プラスチックシリンジである。
【０１３３】
図１６を参照すると、特定の実施形態では、使い捨ての、一回用のカートリッジは、分注オリフィス部としてシリンジニードルとともに本明細書で示される、プラスチックシリンジである。
【０１３４】
多くのタイプのカートリッジは、本明細書に開示されるバイオプリンターとの使用、およびそれを使用する方法に適している。幾つかの実施形態では、カートリッジは、半固形または固形のバイオインクまたは支持材を１つ以上の分注オリフィス部に通して押し出すことを伴うバイオプリンティングと互換性がある。幾つかの実施形態では、カートリッジは、液体または半固形の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を１つ以上の分注オリフィス部に通して分注することを伴うバイオプリンティングと互換性がある。幾つかの実施形態では、カートリッジは、非連続的なバイオプリンティングと互換性がある。幾つかの実施形態では、カートリッジは、連続的及び／又は略連続的なバイオプリンティングと互換性がある。幾つかの実施形態では、カートリッジは、内容物の遠隔リザーバーに接続される。遠隔リザーバーは、広範囲の量を適切に含有する。様々な実施形態では、遠隔リザーバーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬ、またはそれ以上の内容物を適切に含有する。様々なさらなる実施形態では、遠隔リザーバーは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＬ、またはそれ以上の内容物を適切に含有する。またさらなる実施形態では、遠隔リザーバーは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＬ、またはそれ以上の内容物を適切に含有する。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、カートリッジは、キャピラリーチューブまたはマイクロピペットである。幾つかの実施形態では、カートリッジは、シリンジまたはニードル、あるいはその組み合わせである。略円形か円筒状のカートリッジには、多くの内径が適している。様々な実施形態では、適切な内径は、限定しない例として、１、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｍ、またはそれ以上を含み、それらにおけるインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、適切な内径は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍｍ、またはそれ以上を含み、それらにおけるインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、カートリッジは、約１μｍ乃至約１０００μｍの内径を有している。特定の実施形態では、カートリッジは、約５００μｍの内径を有している。別の特定の実施形態では、カートリッジは、約２５０μｍの内径を有している。本明細書に開示されるカートリッジには、多くの内容積が適している。様々な実施形態では、適切な内容積は、限定しない例として、１、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｌ、またはそれ以上を含み、それらにおけるインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、適切な内容積は、限定しない例として、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｌ、またはそれ以上を含み、それらにおけるインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、カートリッジは、約１μｌ乃至約５０μｌの容積を有している。特定の実施形態では、カートリッジは、約５μｌの容積を有している。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、カートリッジは、米国特許第７，０５１，６５４号に記載されるものなどの受け面上へのバイオインク及び／又は支持材のインクジェットプリンティングと互換性がある。さらなる実施形態では、カートリッジは、本明細書に記載されるコンピューターコードの管理下で、電位開口型のノズルまたはニードルの形態での分注オリフィス部を含む。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、インクジェットプリンティングは、専門の高速インク・ジェットソレノイドバルブに密に連結されたシリンジポンプを必要とする。幾つかの実施形態では、分注容積は、シリンジ圧力、バルブ作動時間および高精度の分注チップによって制御される。幾つかの実施形態では、高精度の分注制御は、２ステージの電子バルブによって制御され、ここで、高圧パルスが続き、その後低圧ホールド電流が後続する。さらなる実施形態では、高圧パルスは、１２乃至４０ＶＤＣであり、低圧ホールド電流は、１２乃至２４ＶＤＣである。幾つかの実施形態では、バルブタイミングは、ＴＴＬ制御電圧によって制御される。幾つかの実施形態では、パルスは、０．３５乃至２．０ミリセカンドである。幾つかの実施形態では、シリンジ圧力は、０乃至１２０ｐｓｉｇである。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、カートリッジは、プライミングされる（ｐｒｉｍｅｄ）。幾つかの実施形態では、カートリッジのプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）は、分注、堆積、または押出のプロセスの精度を増加させる。本明細書で使用されるように、「プライミングされる（ｐｒｉｍｅｄ）」は、分注されるべき材料（バイオインクまたは支持材）が分注オリフィス部と接する位置に位置付けられるまで、カートリッジの内容物が、圧縮されて（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）進められる（ａｄｖｅｎｃｉｎｇ）ことによって、分注、堆積、または押出の準備が整えられることを意味する。例えば、図３を参照。幾つかの実施形態では、内容物が、圧縮または略圧縮されているとき、およびカートリッジの分注オリフィス部と物理的に接触しているときに、カートリッジはプライミングされる。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、カートリッジは、その内容物の組成を示すようにマーキングされる。さらなる実施形態では、カートリッジは、含有されているバイオインク及び／又は支持材の組成を示すようにマーキングされる。幾つかの実施形態では、カートリッジの表面は、着色される。幾つかの実施形態では、カートリッジの外側表面は、染色されるか、ペンキで塗られるか、ペンでマーキングされるか、ステッカーによってマーキングされるか、またはそれらの組み合わせである。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、カートリッジの外側表面は、カートリッジの表面の不透明度を増加させるために（例えば、カートリッジの表面から反射されるレーザービームの量を増加させるために）マーキングされる。幾つかの実施形態では、カートリッジの表面は、着色される。幾つかの実施形態では、カートリッジの外側表面は、採点される。本明細書で使用されるように、「採点される（ｓｃｏｒｅｄ）」は、表面の平滑度を低下させるためにカートリッジの表面をマーキングすることを意味する。カートリッジの表面を採点するために、任意の適切な方法が使用される（例えば、酸性物質の適用、腐食性物質の適用、研磨物質の適用など）。幾つかの実施形態では、カートリッジの外側表面は、ペンキで塗られるか、磨かれる（例えば、先端熱加工される）か、エッチングされる（例えば、レーザーエッチングされる）か、ペンでマーキングされるか、ステッカーによってマーキングされるか、またはそれらの組み合わせである。
【０１４１】
グリップ
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターに付けられたカートリッジは、バイオインク及び／又は支持材を含む。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、具体的な細胞構築物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインク及び／又は支持材を分注する。幾つかの実施形態では、バイオインクを含むカートリッジは、使い捨てである。幾つかの実施形態では、カートリッジは、内容物の押出後にバイオプリンターから取り出される。幾つかの実施形態では、新しいカートリッジが、続いて、バイオプリンターに付けられる。
【０１４２】
複雑な構造体を作製するために、本明細書に開示されるバイオプリンターは、適切で反復可能な精度を持って、カートリッジからバイオインク及び／又は支持材を分注する。様々な実施形態では、適切で反復可能な精度は、任意の軸上の±５、１０、２０、３０、４０、または５０μｍの精度を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、約±２０μｍの反復可能な精度で、カートリッジからバイオインク及び／又は支持材を分注する。しかしながら、カートリッジの制御されてない除去および挿入は、結果として、組織構築物に対するプリンターヘッド（およびそれ故カートリッジ）の位置の変更につながりかねず、それによって、新しいカートリッジから堆積された最初のバイオインク粒子の配置の精度は、随意に、前のカートリッジから堆積された最後のバイオインク粒子に対して変化する。したがって、プリンターヘッドにカートリッジを付ける且つ固定するための方法が必要とされ、ここで、付ける且つ固定することによって、プリンターヘッドの位置の変更は最小限で済む。
【０１４３】
本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターにカートリッジを付ける方法が開示され、該方法は、（ａ）バイオプリンターのプリンターヘッドに付けられるコレットチャックにカートリッジを挿入する工程；および（ｂ）コレットチャックの外側のカラーを調節する工程を含み、ここで、挿入する工程および調節する工程によって、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。
【０１４４】
本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンターにカートリッジを付けるためのシステムが開示され、該システムは、カートリッジを受ける且つバイオプリンターのプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段を含み、ここで、カートリッジを受ける且つ固定するための手段の使用によって、プリンターヘッドの位置は実質的に変更されない。幾つかの実施形態では、カートリッジを受ける且つプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、チャックまたはフェルールである。本明細書で使用されるように、「チャック」は、調整可能なあご部から成る保持デバイスを意味する。幾つかの実施形態では、カートリッジを受ける且つプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、コレットである。本明細書で使用されるように、「コレット」は、保持されるべき対象のまわりにカラーを形成し、強いクランピングを働かせる、チャックのサブタイプを意味する。本明細書で使用されるように、「フェルール」は、１つの対象を互いに固定するために使用されるバンド（例えば、金属バンド）を意味する。幾つかの実施形態では、カートリッジを受ける且つプリンターヘッドにカートリッジを固定するための手段は、バレルアダプターである。本明細書で使用されるように、「バレルアダプター」は、１つの対象を互いに固定するために使用されるねじ込みチューブ（ｔｈｒｅａｄｅｄ  ｔｕｂｅ）を意味する。
【０１４５】
ＵＶモジュール
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、紫外線（ＵＶ）光モジュールを含む。さらなる実施形態では、ＵＶモジュールによって、本明細書に開示されるバイオプリンターは、ＵＶ架橋性の材料を自動的に硬化する（ｃｕｒｅ）且つプリントすることができる。幾つかの実施形態では、ＵＶモジュールは、カートリッジの内容物（例えば、ガラスキャピラリーチューブ）をＵＶ光にさらするための光チャンバーを含む。幾つかの実施形態では、ＵＶモジュールは、カートリッジの内容物をその長さに沿って均等にＵＶ光にさらするためのＵＶ光線を含む。幾つかの実施形態では、ＵＶモジュールは、カートリッジの内容物がさらされるＵＶ光の強度を低下させる随意の減衰フィルターを収納するためにスロットを含む。幾つかの実施形態では、ＵＶモジュールは、バイオプリンターに統合される。様々なさらなる実施形態では、ＵＶモジュールは、バイオプリンターに、恒久的に、半恒久的に、または可逆的に付けられる。他の実施形態では、ＵＶモジュールは、バイオプリンターに付けられない。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるＵＶモジュールは、最初に未硬化材料をガラスキャピラリーチューブへと吸引することによって使用される。さらなる実施形態では、ガラスキャピラリーは、その後、光チャンバーへと下げられ、ここで、高電力の光ファイバー光線が、キャピラリーの長さに沿ってＵＶ光源からＵＶ光を伝達する。またさらなる実施形態では、ガラスキャピラリーは、一度硬化される（例えば、架橋される）と、光チャンバーから引き上げられ、材料は、プリントの準備が整う（例えば、押し出される又は堆積されるなど）。カートリッジの内容物が細胞を含むバイオインク及び／又は支持材を含む適用に関して、随意の減衰フィルターが、より低いＵＶ強度を達成するためにキャピラリーと光ガイドとの間に置かれる。
【０１４７】
本明細書に記載されるＵＶモジュールとの使用には、多くのＵＶ光源が適している。ＵＶ光は、１０ｎｍ乃至４００ｎｍの範囲の波長および３ｅＶ乃至１２４ｅＶのエネルギーを有する電磁放射線である。ＵＶ光は、幾つかの場合には、分子中の化学的結合を変更し、化学反応を引き起こし得る。様々な源からのＵＶ光は、多くの適切な波長および多くの適切な関連するエネルギーを有することを特徴とする。以下の表１を参照。
【０１４８】
【表１】
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【０１４９】
幾つかの実施形態では、ＵＶ光の適切な源は、限定しない例として、ＵＶランプ、ＵＶ蛍光ランプ、ＵＶ  ＬＥＤ、ＵＶレーザーなどを含む。ＵＶランプ（例えば、ブラックライト、ブラックライトブルー（ｂｌａｃｋ  ｌｉｇｈｔ  ｂｌｕｅ）、ＢＬＢランプなど）は、長波ＵＶ放射線を放射し、可視光をほとんど放射しない。蛍光性ブラックライトは、典型的に、ＵＶ発光りん光体を使用して作られる。３６８−３７１ｎｍに近い発光ピークに典型的に使用されるりん光体は、ユウロピウムをドープしたホウフッ化ストロンチウム（ＳｒＢ４Ｏ７Ｆ：Ｅｕ２＋）またはユウロピウムをドープしたホウ酸ストロンチウム（ＳｒＢ４Ｏ７：Ｅｕ２＋）のいずれかであり、一方で、およそ３５０−３５３ｎｍのピークをもたらすために使用されるりん光体は、鉛をドープしたケイ酸バリウム（ＢａＳｉ２Ｏ５：Ｐｂ＋）である。蛍光性ブラックライトはまた、典型的に、４００ｎｍを超える略すべての可視光を遮断するウッドガラス（酸化ニッケルをドープしたグラス）を使用して作られる。非常に非効率的に、一般的な白熱バルブのためのエンベロープとして透明ガラスの代わりにウッドガラスを単に使用することによっても、ブラックライトは形成され得る。ＵＶを可視光に変換するためのリン光性のコーティングなしでのＵＶ蛍光ランプは、バルブ内の水銀のピーク発光が原因の２５３．７ｎｍおよび１８５ｎｍの２つのピークを有する紫外線光を放射する。適切なリン光体（リン光性のコーティング）を加えることで、それらは、ＵＶＡまたはＵＶＢを生成するように修正され得る。ＵＶ範囲で光を放射するために、発光ダイオード（ＬＥＤ）が製造され得るが、実用的なＬＥＤアレイは、３６５ｎｍ未満に制限される。ＵＶ範囲で光を放射するために、ＵＶレーザーダイオードおよびＵＶ固体レーザーが製造され得る。直接的なＵＶ発光レーザーダイオードは、３７５ｎｍで利用可能である。ＵＶダイオードレーザーが、フッ化リチウム・ストロンチウム・アルミニウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｓｔｒｏｎｔｉｕｍ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（Ｃｅ：ＬｉＳＡＦ）をドープされたセリウムの結晶を使用して実証されてきた。３７５ｎｍより短い波長が、周波数が２倍または３倍のダイオードポンプ式の固態（ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ）（ＤＰＳＳ）技術を使用する固体モジュール中のダイオードから生成される。利用可能な波長は、２６２、２６６、３４９、３５１、３５５、および３７５ｎｍを含む。
【０１５０】
図１９を参照すると、特定の実施形態では、ＵＶモジュールは、ＵＶランプであるＵＶ光源を含む。さらに本実施形態では、カートリッジは、ガラスキャピラリーチューブを含み、そこにＵＶ架橋性の材料が吸引される。カートリッジは、ＵＶランプから約３インチの距離であるように、ＵＶモジュールの光チャンバー内に位置付けられる。本実施形態中のＵＶランプは、約３６５ｎｍの波長でＵＶ光を放射する。
【０１５１】
図２０を参照すると、特定の実施形態では、バイオプリンターは、プリンターヘッド８００を含み、これはカートリッジ８１０を保持する。本実施形態では、カートリッジ８１０は、バイオプリンターに付けられたＵＶ光モジュール８２０へと部分的に下げられるガラスキャピラリーチューブを含む。ＵＶモジュール８２０は、この場合、ハウジング、カバー、およびカートリッジ８１０の導入を可能にするためのオリフィス部を含む。
【０１５２】
図２１を参照すると、さらなる特定の実施形態では、カートリッジ８１０を保持するプリンターヘッド８００は、ＵＶライトモジュール８２０へと完全に下げられる。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、ＵＶモジュールによって、本明細書に開示されるバイオプリンターは、ＵＶ架橋性の材料を、予め決められた期間ＵＶ光にさらすことによって、自動的に硬化する且つプリントすることができる。ＵＶ光源への暴露の長い持続時間が適切である。本明細書に提供される開示を考慮すると、当業者は、特定のＵＶ架橋性の材料が特定の露光時刻に合わせられることを認識するだろう。幾つかの実施形態では、露光時間は、材料を完全にＵＶ架橋するために選択され、結果として、より多くの固形の構造体をもたらす。他の実施形態では、露光時間は、材料を部分的にＵＶ架橋するために選択され、結果として、より多くの半固形の構造体をもたらす。様々な実施形態では、適切な露光時刻は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０秒、またはそれ以上である。他の様々な実施形態では、適切な露光時刻は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分、またはそれ以上である。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、露光時間は、約５秒から約１５分である。さらなる実施形態では、露光時間は、約１０秒から約１０分である。またさらなる実施形態では、露光時間は、約１５秒から約５分である。幾つかの場合では、露光時間は、ＵＶ架橋性の材料中の細胞の存在に合わせて調節される。
【０１５５】
受け面
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、バイオインク及び／又は支持材の複数の要素、セクション、及び／又は領域を受け面上へと分注する。さらなる実施形態では、分注は、具体的なパターンおよび具体的な位置で生じる。またさらなる実施形態では、バイオプリンターがバイオインク及び／又は支持材を受け面上へと堆積させる位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに翻訳される。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、バイオインク及び／又は支持材の複数の要素、セクション、及び／又は領域の各々は、３００ｍｍ  ｘ  ３００ｍｍ  ｘ  １６０ｍｍ未満の寸法を有している。ほんの一例ではあるが、バイオインクまたは支持材のセクションの寸法は、随意に、７５ｍｍ  ｘ５．０ｍｍ  ｘ  ５．０ｍｍ；０．３ｍｍ  ｘ  ２．５ｍｍ  ｘ  ２．５ｍｍ；１ｍｍ  ｘ  １ｍｍ  ｘ  ５０ｍｍ；または１５０ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ  ｘ  ８０ｍｍである。  一般に小規模の各セクションが原因で、幾つかの場合において、高度の精度が要求され、受け面における微細な欠陥は、結果として、細胞構築物、組織、または臓器の欠陥（および恐らく、不全）につながり得る。したがって、バイオインク及び／又は支持材を受けることができる、略滑らか且つ略水平な受け面、または画定された又は略画定された受け面が必要とされている。
【０１５７】
本明細書には、特定の実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターによって生成される１つ以上の構造体を受けるための受け面が開示される。幾つかの実施形態では、受け面は、水平または略水平である。幾つかの実施形態では、受け面は、滑らか又は略滑らかである。幾つかの実施形態では、受け面は、水平または略水平である。幾つかの実施形態では、受け面は、画定または略画定される。他の実施形態では、受け面は、具体的なバイオプリントされた構造体の形、サイズ、構成、または幾何学的形状に合うように特別に設計される。さらなる実施形態では、受け面は、バイオプリントされた構築物の形、サイズ、構成、または幾何学的形状を制御するか又はそれに影響を与える。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、受け面は、固形材料、半固形材料、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、受け面は、ガラス、コーティングされたガラス、プラスチック、コーティングされたプラスチック、金属、金属合金、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、受け面は、ゲルを含む。幾つかの実施形態では、受け面およびその上の任意のコーティングは、生体適合性である。様々な実施形態では、受け面は、本明細書に開示される支持材及び／又は閉込め材料のいずれかを含む。具体的な実施形態では、受け面は、重合されたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）または重合されたアガロース、重合されたゼラチン、細胞外マトリックス（またはその成分）、コラーゲン、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、受け面は、標準のアッセイプレートである。幾つかの実施形態では、受け面は、２４ウェルのトランスウェルキャリアに適合されたトランスウェルインサートである。
【０１５９】
ソフトウェア
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターに付けられた１つ以上のカートリッジは、バイオインク及び／又は支持材を含む。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、具体的な細胞の構築物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持材を分注する。
【０１６０】
複雑な組織構築物を作製するために、バイオプリンターは、バイオインクまたは支持材を受け面上の正確な位置で（二次元または三次元で）堆積させる。幾つかの実施形態では、バイオプリンターがバイオインク及び／又は支持材を堆積させる位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに翻訳される。さらなる実施形態では、コンピューターコードは、指定されたタスクを行うために書かれた、デジタル処理デバイスの中央処理装置（ＣＰＵ）において実行可能である、一連の命令を含む。幾つかの実施形態では、限定しない例として、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、可変分注オリフィス部の制御、ＵＶ強度、およびＵＶ露光時間を含む、さらなるバイオプリンティングのパラメーターは、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに翻訳される。他の実施形態では、このようなバイオプリンティングのパラメーターは、ユーザー入力によって直接的には定義されないが、本明細書に記載されるコンピューターコードによる他のパラメーターおよび条件に由来する。
【０１６１】
本明細書には、特定の実施形態において、組織構築物、組織、および臓器を作製するための方法が開示され、該方法は、コンピューターモジュールが、所望の組織構築物の視覚表示の入力を受信する工程；コンピューターモジュールが、一連のコマンドを生じさせる工程であって、該コマンドが、視覚表示に基づいており、バイオプリンターによって読取り可能である、工程；コンピューターモジュールが、一連のコマンドをバイオプリンターに提供する工程；およびバイオプリンターが、定義された幾何学的形状を有する構築物を形成するために、コマンドに従ってバイオインク及び／又は支持材を堆積させる工程、を含む。
【０１６２】
非一時的コンピューター可読記憶媒体
幾つかの実施形態では、バイオプリンターがバイオインク及び／又は支持材を堆積させる位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに翻訳される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、非一時的コンピューター可読記憶媒体またはコンピューター可読プログラムコードでコード化された記憶媒体をさらに含む。さらなる実施形態では、コンピューター可読記憶媒体は、バイオプリンター（またはその構成要素）またはバイオプリンターに接続されたコンピューター（またはその構成要素）などのデジタル処理デバイスの有形要素である。またさらなる実施形態では、コンピューター可読記憶媒体は、随意に、デジタル処理デバイスから取外し可能である。幾つかの実施形態では、コンピューター可読記憶媒体は、限定しない例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、ソリッドステートメモリ、磁気ディスク装置、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどを含む。幾つかの場合では、プログラムおよび命令は、記憶媒体上に、恒久的に、略恒久的に、半恒久的に、または非一時的にコード化される。
【０１６３】
コンピューターモジュール
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、ソフトウェア、サーバー、およびデータベースモジュールを含む。幾つかの実施形態では、「コンピューターモジュール」は、より大きなコンピューターシステムと対話するソフトウェアコンポーネント（コードのセクションを含む）である。さらなる実施形態では、ソフトウェアモジュール（またはプログラムモジュール）は、１つ以上のファイルの形式で生じ、典型的に、より大きなソフトウェアシステム内の特定のタスクを扱う。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、モジュールは、１つ以上のソフトウェアシステムに含まれる。他の実施形態では、モジュールは、１つ以上の他のモジュールとともに１つ以上のソフトウェアシステムに統合される。コンピューターモジュールは、随意に、コードの独立型のセクション、または随意に、別々に識別可能ではないコードである。幾つかの実施形態では、モジュールは、単一のアプリケーション中にある。他の実施形態では、モジュールは、複数のアプリケーション中にある。幾つかの実施形態では、モジュールは、１つのマシン上でホストされる。他の実施形態では、モジュールは、複数のマシン上でホストされる。幾つかの実施形態では、モジュールは、１つの位置において複数のマシン上でホストされる。他の実施形態では、モジュールは、１つを超える位置において複数のマシン上でホストされる。本明細書にはさらに、位置および位置決めデータのフォーマット化が記載される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるデータファイルは、限定しない例として、タブ区切り形式（ｔａｂ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｖａｌｕｅｓ）、コンマ区切り形式（ｃｏｍｍａ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｖａｌｕｅｓ）、文字区切り形式（ｃｈａｒａｃｔｅｒ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｖａｌｕｅｓ）、デリミター区切り形式（ｄｅｌｉｍｉｔｅｒ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｖａｌｕｅｓ）、ＸＭＬ、ＪＳＯＮ、ＢＳＯＮ、およびＹＡＭＬを含む、任意の適切なデータ直列化形式（ｄａｔａ  ｓｅｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ）でフォーマット化される。コンピューターモジュールの重要な特徴は、エンドユーザーが、識別された機能を行うためにコンピューターを使用することを可能にするということである。
【０１６５】
グラフィックユーザーインターフェース
幾つかの実施形態では、コンピューターモジュールは、グラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含む。本明細書で使用されるように、「グラフィックユーザーインターフェース」は、アプリケーションの入出力および情報が保存されるヒエラルキーまたは他のデータ構造の写真や絵画による視覚表現およびテキスト表現を使用するユーザー環境を意味する。幾つかの実施形態では、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを含む。さらなる実施形態では、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを介して、二次元ＧＵＩを提示する。他の実施形態では、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを介して、仮想現実環境などの三次元ＧＵＩを提示する。幾つかの実施形態では、ディスプレイスクリーンは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンであり、対話型ＧＵＩを提示する。
【０１６６】
幾つかの実施形態では、ディスプレイスクリーンは、略同じ形状および略等しいサイズの規則的に間隔を置かれたオブジェクトを含むグリッドから本質的に成るＧＵＩを提示する。提示されるオブジェクトは、任意の適切な形状を有する。幾つかの実施形態では、オブジェクトに適切な形状は、限定しない例として、円形、卵形、正方形、長方形、三角形、菱形、多角形、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１６７】
幾つかの実施形態では、ユーザーは、所望の組織構築物の二次元または三次元の視覚表示を形成するために１つ以上のオブジェクトのコンテンツを定義する。例えば、図５を参照。幾つかの実施形態では、オブジェクトのユーザー定義されたコンテンツは、限定しない例として、様々な組成物を有するバイオインクまたは様々な組成物を有する支持材である。幾つかの実施形態では、ユーザーは、細胞の色またはオブジェクトの形状を変更することによって、オブジェクトのコンテンツを定義する。
【０１６８】
バイオインク
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するための、デバイス、システム、および方法が開示される。幾つかの実施形態では、デバイスは、バイオインクを随意に含有する少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための１つ以上のプリンターヘッドを含む。幾つかの実施形態では、方法は、バイオインクの使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるデバイス、システム、および方法の使用によって作製された組織および臓器は、作製時またはその後にバイオインクを含む。
【０１６９】
バイオインクは、高い細胞密度または天然様の細胞密度を有している。様々な実施形態では、バイオインクの細胞密度は、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセント、あるいはそれ以上であり、それらにおけるインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞から本質的に成る。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固形、または固形の組成物を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体または半固形の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を含む。さらなる実施形態では、細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液は、液体または半固形（例えば、粘着性）の担体および複数の細胞を含む。またさらなる実施形態では、担体は、本明細書に記載されるものなどの、適切な細胞栄養素培地（ｃｅｌｌ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｅｄｉａ）である。幾つかの実施形態では、バイオインクは、半固形または固形の多細胞の集合体または多細胞体を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは、１）結果的にバイオインクをもたらすために、予め決められた比率で複数の細胞または細胞集合体を生体適合性の液体またはゲルと混合することによって、および２）所望の細胞密度および粘度を有するバイオインクを生成するために、バイオインクを圧縮することによって生成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）、またはその組み合わせによって達成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、結果的に、押し出し可能である組成物をもたらし、多細胞の集合体または多細胞体の形成を可能にする。幾つかの実施形態では、「押し出し可能（ｅｘｔｒｕｄａｂｌｅ）」は、ノズルまたはオリフィス部（例えば、１つ以上の穴またはチューブ）に（例えば、圧力下で）押し通すことによって形作られることができることを意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、細胞を適切な密度まで成長させることから結果として生じる。バイオインクに必要な細胞密度は、使用されている細胞および生成されている組織または臓器に応じて異なる。幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞は、凝集及び／又は接着される。幾つかの実施形態では、「凝集する」、「凝集した」、および「凝集」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。さらなる実施形態では、該用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、支持材、細胞培養培地、細胞外マトリックス（またはその成分）、細胞接着剤、細胞死抑制剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、押し出し材料、およびそれらの組み合わせを含む。
【０１７１】
細胞
本明細書には、様々な実施形態において、複数の細胞を含む、液体、半固形、または固形の組成物を含むバイオインクが開示される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体または半固形の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイス、システム、および方法を使用する、バイオインクにおける及び組織および臓器の作製における使用には、あらゆる哺乳動物細胞が適している。様々な実施形態では、細胞は、任意の適切な細胞である。さらなる様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法に使用される細胞のタイプは、生成されている細胞構築物、組織、または臓器のタイプに依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つのタイプの細胞を含む（「均質インク（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｎｋ）」とも呼ばれる）。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つを超えるタイプの細胞を含む（「異質インク（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｎｋ）」とも呼ばれる）。
【０１７２】
さらなる実施形態では、細胞は、限定しない例として、収縮細胞または筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋芽細胞）、結合組織細胞（例えば、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および造骨細胞に分化する細胞、軟骨細胞、またはリンパ組織）、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳腺細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、胃腸細胞、肝細胞、膵細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、性尿器細胞、腎臓細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞（例えば、胚細胞、幹細胞、および始原細胞）、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、およびそれらの組み合わせである。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、細胞は、成熟した、分化細胞である。さらなる実施形態では、「分化細胞」は、分離時の、例えば、平滑筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞と一致する組織特異的な表現型を有する細胞であり、ここで、組織特異的な表現型（または表現型を示す可能性のあるもの）は、分離時から使用時まで維持される。他の実施形態では、細胞は、成熟した、非分化細胞である。さらなる実施形態では、「非分化細胞」は、例えば、平滑筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の決定的な組織特異的な特性を有していない、または失くした細胞である。幾つかの実施形態では、非分化細胞は、幹細胞を含む。さらなる実施形態では、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞である。幹細胞は、限定されないが、全能性細胞、多能性細胞、分化多能性細胞、少能性細胞、分化単能細胞、および前駆細胞を含む。幹細胞は、随意に、胚性幹細胞、成体幹細胞、羊膜幹細胞、および人工多能性幹細胞である。また他の実施形態では、細胞は、成熟した、分化細胞と、成熟した、非分化細胞の混合物である。
【０１７４】
幾つかの実施形態では、細胞は、免疫調節細胞である。さらなる実施形態では、免疫調節細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはマクロファージから選択されるか、あるいはその両方の組み合わせである。幾つかの実施形態では、間葉系幹細胞は、骨及び／又は脂肪由来の細胞である。幾つかの実施形態では、マクロファージは、組織及び／又は血液由来の細胞である。幾つかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ２活性化マクロファージである。幾つかの実施形態では、ひ臓、血液、及び／又は他の組織の位置から分離された、Ｍ２活性化マクロファージは、バイオインク混合剤に加えられる。幾つかの実施形態では、中性マクロファージ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）は、バイオインク混合剤に加えられる前にインビトロで活性化される。幾つかの実施形態では、中性マクロファージは、マクロファージのＭ２活性化に必要なサイトカインを組み込むバイオインク混合剤に加えられる。幾つかの実施形態では、中性マクロファージは、マクロファージのＭ２活性化に必要なサイトカインを生成する細胞を含むバイオインク混合剤に加えられる。幾つかの実施形態では、マクロファージとＭＳＣの混合物は、細胞のバイオインク混合剤中で組み合わせられる。幾つかの実施形態では、バイオインクの構造特性を向上させるために、限定されないが、線維芽細胞などの、実質性の支持細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｃｅｌｌｓ）が、バイオインク混合剤に加えられる。本明細書で使用されるように、「Ｉ−バイオインク」は、非免疫調節細胞及び／又は生体材料の支持体（ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ）の考えられ得るが、義務的ではない存在に加えて、本明細書に記載されるような幾らかの割合の免疫調節細胞を含有する、バイオインク混合剤を意味する。幾つかの実施形態では、Ｉ−バイオインクは、（１）実質細胞；および（２）ＭＳＣ、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、Ｉ−バイオインクは、（１）実質細胞；（２）ＭＳＣ、マクロファージ、またはその組み合わせ；および（３）生体材料の支持体を含み、ここで、生体材料の支持体は、本明細書に定義されるような１つ以上の押し出し材料である。幾つかの実施形態では、生体材料の支持体は、ヒドロゲルである。
【０１７５】
細胞培養培地
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、限定しない例として、ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ、オルシーバー液、Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｕｃｋ’ｓ  Ｓａｌｉｎｅ、ダルベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養素Ｆ−１２Ｈａｍ、栄養素混合物Ｆ−１０Ｈａｍ（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０）、培地１９９、最少必須培地イーグル、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ａｍｅｓ’  Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｇｌａｓｃｏｗ最少必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ変法培地、ＮＣＴＣ媒体、Ｓｗｉｍ’ｓ  Ｓ−７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、変更されるか又は補足される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、アルブミン、セレニウム、トランスフェリン、フェチュイン、糖、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【０１７６】
細胞外マトリックス
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞外マトリックスまたはその誘導体の１つ以上の成分をさらに含む。幾つかの実施形態では、「細胞外マトリックス」は、引張強度を提供する及び／又は細胞シグナル伝達を促進するために、細胞によって生成され、細胞から出て細胞外空間に輸送される、タンパク質を含み、ここでタンパク質は、組織を一緒に保持するための支持体として機能し得る。細胞外マトリックス成分の例は、限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナート、エラスチン、およびプロテオグリカンを含む。例えば、多細胞の集合体は、随意に、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含有する。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞の集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられ得る。細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物の源から精製され得るか、または当該技術分野に既知の組み換え法によって生成され得る。代替的に、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体における細胞によって自然分泌され得るか、あるいは細長い細胞体を作るために使用される細胞は、１つ以上のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体及び／又は１つ以上の細胞接着分子または細胞基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびアドへリン）の発現レベルを変えるために、当該技術分野に既知の任意の適切な方法によって遺伝子操作され得る。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞の集合体中の細胞の凝集を促進し得る。例えば、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、細胞ペーストに適切に加えられ得、これは、多細胞の集合体を形成するために使用される。その後、フィブリノゲンは、トロンビンを加えることによってフィブリンに変換され得る。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞接着を促進する薬剤をさらに含む。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞死（例えば、ネクローシス、アポトーシス、またはオートファゴサイトーシス）を阻害する薬剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗アポトーシス剤をさらに含む。細胞死を阻害する薬剤は、限定されないが、小分子、抗体、ペプチド、ペプチ体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞死を阻害する薬剤は、抗ＴＮＦ作用剤、インターロイキンの活性を阻害する薬剤、インターフェロンの活性を阻害する薬剤、ＧＣＳＦ（果粒球コロニー刺激因子）の活性を阻害する薬剤、マクロファージ炎症タンパク質の活性を阻害する薬剤、ＴＧＦ−Ｂ（形質転換増殖因子Ｂ）の活性を阻害する薬剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）の活性を阻害する薬剤、カスパーゼの活性を阻害する薬剤、ＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケードの活性を阻害する薬剤、Ｓｒｃキナーゼの活性を阻害する薬剤、ＪＡＫ（ヤヌス・キナーゼ）の活性を阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗酸化剤を含む。
【０１７９】
押し出し材料
幾つかの実施形態では、バイオインクは、押し出し材料（即ち、バイオインクの押出特性を修正する化合物）をさらに含む。押し出し材料の例は、限定されないが、ゲル、ヒドロゲル（本明細書に記載されるＵＶ架橋性且つ熱可逆性のヒドロゲルを含む）、界面活性ポリオール（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｏｌｙｏｌｓ）（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、細胞外マトリックス成分（およびその誘導体）、コラーゲン、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己集合ナノファイバーを含む。
【０１８０】
時にゼリーと呼ばれる、ゲルは、様々な方法で定義されてきた。例えば、米国薬局方は、ゲルを、液体がしみこんだ小さな無機分子または大きな有機分子のいずれかで構成されている懸濁液から成る半固体系として定義している。ゲルは、単相系または二相系を含む。単相ゲルは、分散した巨大分子と液体との間に明らかな境界が存在しない方法で、液体全体に均一に分布する有機巨大分子から成る。幾つかの単相ゲルは、合成成る分子（例えば、カルボマー）または天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。幾つかの実施形態では、単相ゲルは、一般的に水性であるが、アルコールおよび油を用いても作られる。二相ゲルは、小さな別々の粒子の網目構造から成る。
【０１８１】
ゲルはまた、疎水性または親水性のものとして分類され得る。特定の実施形態では、疎水性ゲルの基剤は、コロイド状シリカ、あるいはアルミニウム石鹸または亜鉛石鹸でゲル化した、ポリエチレンを有する液体パラフィンまたは脂肪油から成る。対照的に、疎水性ゲルの基剤は、通常、適切なゲル化剤（例えば、トラガント、デンプン、セルロース誘導体、カルボキシビニルポリマー、およびケイ酸アルミニウムマグネシウム）でゲル化した、水、グリセロール、またはプロピレングリコールから成る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物またはデバイスのレオロジーは、擬塑性、塑性、揺変性、または膨張性である。
【０１８２】
適切なヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、フィブリン、アルギン酸塩、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来したものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、支持材は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコール・ジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチル・メタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、またそれらの組み合わせから選択される。
【０１８３】
ＵＶ架橋性のヒドロゲル
適切なヒドロゲルは、ポリエチレン（グリコール）ジアクリラートベースの（ＰＥＧ−ＤＡ）ヒドロゲルなどのメタクリル化ヒドロゲルを含み、これらは、ＵＶ光の存在下で架橋するそれらの能力および細胞に対するそれらの不活性のために、細胞生物学において使用される。ＰＥＧ−ＤＡは、重合が、室温で急速に生じ、低いエネルギー入力を必要とするために、組織工学におけるスキャフォールドとして一般に使用され、高水分含有量を有し、弾性であり、および様々な生体分子を含むようにカスタマイズ可能である。
【０１８４】
光重合開始剤  
幾つかの実施形態では、押し出し材料は、光重合開始剤を含み、これは、特定の波長で光を吸収することで重合または重縮合の反応を触媒することができる反応種を生成する分子である。これらの反応は、光重合または放射線硬化とも呼ばれる。光重合開始剤は、典型的に、芳香族基およびカルボニル基の両方を含有しているケトンである。
【０１８５】
２つのタイプの光重合開始剤：カチオン性光重合開始剤およびラジカル光重合開始剤、が存在する。ラジカル光重合開始剤は、水相溶性であり、アクリラート基またはスチレン基を含有している分子に作用する。使用される波長の範囲は、典型的に近ＵＶ（３００ｎｍ−４００ｎｍ）であるが、開始剤化学における最近の進歩は、使用することができる波長の範囲を拡大している。イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９、１８４、および６５１などの生物学において使用される光重合開始剤は、このクラスに分類される。
【０１８６】
本明細書に記載されるバイオインク及び／又は支持材との使用に適した光重合開始剤は、他のイルガキュア種と比較した、水中のその高い溶解度およびその最小の毒性のために、イルガキュア  ２９５９（４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−プロピル）ケトン（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．：Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，  Ｕｔａｈ）である。ＵＶ光の吸収によって、イルガキュア  ２９５９は、２つの主要なラジカルへ分離し、その後、ＰＥＧ−ＤＡのビニル（Ｃ＝Ｃ）基と反応して、重合を開始する。光重合には、三相：光開始、伝搬、および終結、が存在する。第一工程間の反応速度は、光重合開始剤の性質（量子収率、光重合開始剤の効率）および光の強さに依存し、一方で、後の工程（伝搬および終結）は、伝搬および終結のためのビニル結合濃度および速度定数に応じている。
【０１８７】
熱可逆性ゲル
幾つかの実施形態では、ヒドロゲルベースの押し出し材料は、熱可逆性ゲル（熱応答性ゲルまたはサーモゲルとしても知られる）である。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性ヒドロゲルは、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃に、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、および約４０℃であり、それらにおけるインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約２５℃である。幾つかの実施形態では、（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞タイプ、および他の添加剤などを含む）本明細書に記載されるバイオインクは、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃に、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、および約４０℃であり、それらにおけるインクリメントを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約２５℃である。
【０１８８】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンから構成されるポリマーは、水溶液に組み入れられたときに熱可逆性ゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター装置中で維持することができる温度で、液態からゲル状態  まで変化する能力を有している。液態からゲル状態の相転移は、溶液中のポリマー濃度および成分に依存する。
【０１８９】
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーから構成される非イオン性界面活性剤である。他のポロクサマーは、１８８（Ｆ−６８グレード）、２３７（Ｆ−８７グレード）、３３８（Ｆ−１０８グレード）を含む。ポロクサマーの水溶液は、酸、アルカリ、および金属イオンの存在下で安定している。ＰＦ−１２７は、１３，０００の平均モル質量を有する、一般式Ｅ１０６  Ｐ７０  Ｅ１０６の市販のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン３ブロックコポリマーである。このポリマーは、ポリマーのゲル化性を増強する適切な方法によってさらに精製され得る。このポリマーは、およそ７０％のエチレンオキシドを含有しており、これはその親水性を構成している。このポリマーは、一連のポロクサマーＡＢＡ型ブロックコポリマーの１つである。ＰＦ−１２７は、良好な可溶化能力を有し、毒性が低く、それ故、適切な押し出し材料と考えられる。
【０１９０】
幾つかの実施形態では、本明細書に示されるヒドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載される任意の手段によって測定される。例えば、幾つかの実施形態では、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために、ＬＶＤＶ‐ＩＩ＋ＣＰ  Ｃｏｎｅ  Ｐｌａｔｅ  ＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒおよびＣｏｎｅ  Ｓｐｉｎｄｌｅ  ＣＰＥ‐４０が使用される。他の実施形態では、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（スピンドルおよびカップ）の粘度計が使用される。幾つかの実施形態では、本明細書で言及される粘度範囲は、室温で測定される。他の実施形態では、本明細書で言及される粘度範囲は、体温で（例えば、健康なヒトの平均体温で）測定される。
【０１９１】
さらなる実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、約５００乃至１，０００，０００センチポアズ、約７５０乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至４００，０００センチポアズ；約２０００乃至１００，０００センチポアズ；約３０００乃至５０，０００センチポアズ；約４０００乃至２５，０００センチポアズ；約５０００乃至２０，０００センチポアズ；または約６０００乃至１５，０００センチポアズの間の粘度を有していることを特徴とする。
【０１９２】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、連続的なバイオプリンティングに適した細胞および押し出し材料を含む。具体的な実施形態では、バイオインクは、約１５００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７と細胞性物質の混合物は、連続的なバイオプリンティングに適しているかもしれない。そのようなバイオインクは、随意に、４８時間にわたって冷たい（４℃）リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の連続混合により３０％（ｗ／ｖ）までＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７パウダーを溶解することによって調製される。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７はまた、水中で溶解され得る。細胞は、標準の無菌の細胞培養技術を使用して培養且つ膨張される。細胞は、例えば２００ｇでペレットにされ、３０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７中で再懸濁され、およびバイオプリンターに付けられたリザーバーへと吸引され得、そこで、約１０から２５℃のゲル化温度で凝固することが可能となり得る。バイオプリンティング前のバイオインクのゲル化は、随意である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を含むバイオインク含む、バイオインクは、液体として分注され得る。
【０１９３】
様々な実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、適切な粘性及び／又は細胞毒性を有する任意の値になり得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の適切な濃度はまた、バイオプリントされたときにその形状を保存しながら重量を支持することが可能であり得る。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約３０％と約４０％の間、または約３０％と約３５％の間である。
【０１９４】
図６を参照すると、特定の実施形態では、三次元の、ピラミッド形の構築物は、５１０μｍのニードルを備えるシリンジに接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）バイオプリンターを使用して、ＰＦ−１２７の連続堆積によって生成される。
【０１９５】
図７を参照すると、特定の実施形態では、三次元の、立方体状（左）の構築物および中空の立方体状（右）の構築物は、５１０μｍのニードルを備えるシリンジに接続されたＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）バイオプリンターを使用して、ＰＦ−１２７の連続堆積によって生成される。
【０１９６】
幾つかの実施形態では、バイオインクの非細胞性成分（例えば、押し出し材料など）は、使用前に除去される。さらなる実施形態では、非細胞性成分は、例えば、ヒドロゲル、界面活性ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、コラーゲン、または他の生体適合性の天然または合成のポリマーである。またさらなる実施形態では、非細胞性成分は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって除去される。幾つかの実施形態では、一部の非細胞性成分は、使用時に細胞成分に関連付けられたままである。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞間相互作用を増加させるために前処理される。例えば、細胞は、随意に、バイオインクを形作る前に細胞間相互作用を向上させるために遠心分離後に遠心分離チューブの内部でインキュベートされる。
【０１９８】
支持材
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するための、デバイス、システム、および方法が開示される。幾つかの実施形態では、デバイスは、随意に支持材を含有する少なくとも１つのカートリッジを受ける且つ保持するための１つ以上のプリンターヘッドを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、支持材の使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるデバイス、システム、および方法の使用によって作製された組織および臓器は、作製時またはその後に支持材を含む。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、支持材は、細胞が成長するあるいはそれに移動する又は堆積することを除外することができる。幾つかの実施形態では、支持材は、栄養培地に透過性である。
【０２００】
幾つかの実施形態では、支持材の粘度は、変更可能である。幾つかの実施形態では、支持材の粘度は、支持材の温度の修正によって変更される。幾つかの実施形態では、支持材の粘度は、支持材の圧力の修正によって変更される。幾つかの実施形態では、支持材の粘度は、支持材の濃度の修正によって変更される。幾つかの実施形態では、支持材の粘度は、（例えば、化学架橋剤の使用による）架橋、または（例えば、紫外線光暴露を使用する）光架橋によって変更される。
【０２０１】
幾つかの実施形態では、支持材の透過性は、変更可能である。幾つかの実施形態では、支持材の透過性は、支持材の温度または支持材の周囲の温度を変えることによって修正される。幾つかの実施形態では、支持材の透過性は、支持材を、透過性を修正する薬剤と接触させることによって修正される。
【０２０２】
幾つかの実施形態では、支持材の伸展性（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）（即ち、弾性または硬度）は、修正される。幾つかの実施形態では、支持材の伸展性は、支持材の温度または支持材の周囲の温度を変えることによって修正される。幾つかの実施形態では、支持材の伸展性は、支持材を、伸展性を修正する薬剤と接触させることによって修正される。
【０２０３】
本明細書に記載される方法における使用には、多くの支持材が適している。幾つかの実施形態では、ヒドロゲル（本明細書に記載されるＵＶ架橋性且つ熱可逆性のヒドロゲルを含む）は、非堆積性、生体適合性、押し出し可能、バイオプリント可能、非細胞性、および適切な強度の特性を含む、１つ以上の好都合な特性を有する典型的な支持材である。幾つかの実施形態では、適切なヒドロゲルは、天然ポリマーである。一実施形態では、閉込め材料は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で構成される。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、界面活性ポリオール（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、フィブリン、アルギン酸塩、アガロース、キトサン、それらの誘導体または組み合わせに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、閉込め材料は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコール・ジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチル・メタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、またそれらの組み合わせから選択される。
【０２０４】
幾つかの実施形態では、支持材は、バイオプリンター中に存在する前に細胞を含有している。幾つかの実施形態では、支持材は、細胞の懸濁液を含有しているヒドロゲルである。幾つかの実施形態では、支持材は、１つを超える細胞タイプの混合物を含有しているヒドロゲルである。
【０２０５】
支持材の典型的な用途
幾つかの実施形態では、支持材は、生物学的構築物（例えば、細胞構築物、組織、臓器など）を構築するために構築ユニット（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）として使用される。さらなる実施形態では、支持材のユニットは、所望の構築物の細胞性物質（即ち、中間細胞ユニット（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｎｉｔｓ））を欠く領域を画定且つ維持するために使用される。幾つかの実施形態では、支持材は、あらゆる形またはサイズをとることができる。
【０２０６】
例えば、一実施形態によると、（元々はバッファーと水で混合された粉末相にある）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の溶液は、加熱されて、その粘度が減少し、所望の寸法を有するマイクロピペットにおいて（またはピストンの負の変位による所望形状のチャンバーにおいて）取り込まれる。ピペット（またはチャンバー）におけるＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の溶液は、例えば、ピペット（またはチャンバー）の外部上の強制空気によって又はマイクロピペットを冷たい液体を有する容器にはめ込む（ｐｌｕｎｇｉｎｇ）ことによって、室温に冷却され得、その結果、それは、所望形状を有するゲルへと凝固することができる（即ち、支持材）。結果として生じる支持材は、随意に、特定の細胞構築物、組織、または臓器の構築の間にピペットまたはチャンバーから分注される。例えば、図５を参照。
【０２０７】
幾つかの実施形態では、支持材は、バイオプリンティング後に操作した組織または臓器の生存度を増加させるために使用される。さらなる実施形態では、支持材は、閉込め材料（例えば、支持材）の一時的または半恒久的な格子（ｌａｔｔｉｃｅ）によって、組織または臓器と栄養培地との間の直接接触を提供する。幾つかの実施形態では、組織は、多孔質材料またはギャップ材料（ｇａｐｐｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）中に閉じ込められる。組織または臓器の細胞の少なくとも幾つかの、栄養素への直接アクセスは、組織または臓器の生存度を増加させる。
【０２０８】
さらなる実施形態では、本明細書に開示される方法は、操作した組織または臓器の生存度を増加させるための追加および随意の工程を含み、該工程は、１）随意に、凝集した多細胞の集合体を入れる前に閉込め材料（例えば、支持材）の基層を分注する工程；２）随意に、閉込め材料の周囲（ａ  ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ  ｏｆ）を分注する工程；３）画定された幾何学的形状内の組織の細胞をバイオプリントする工程；および４）調剤は、格子、メッシュ、またはグリッドなどの、閉込め材料における間隙を導入するパターンで、新生組織を覆う閉込め材料の細長い本体（ｅｌｏｎｇａｔｅ  ｂｏｄｉｅｓ）（例えば、シリンダー、リボンなど）を分注する工程、を含む。
【０２０９】
幾つかの実施形態では、パターンを覆う間隙は、組織または臓器の表面のまわりで均一に又は略均一に分布される。他の実施形態では、間隙は、不均一に分布され、それによって、組織または臓器の細胞は、栄養素に不均一にさらされる。不均一の実施形態では、栄養素への差次的なアクセスは、随意に、組織または臓器の１つ以上の特性に影響を与えるように活用される。例えば、バイオプリントされた、細胞構築物、組織、または臓器の１つの表面上の細胞を、別の表面上の細胞より速く増殖させることが望ましいかもしれない。幾つかの実施形態では、栄養素への組織または臓器の様々な部分の暴露は、所望のエンドポイントへの組織または臓器の発達に影響を与える様々な時点で変更され得る。
【０２１０】
幾つかの実施形態では、閉込め材料は、限定されないが、バイオプリンティングの直後（例えば、１０分以内）、バイオプリンティング後（例えば１０分後）、細胞が互いに本質的に凝集される前、細胞が互いに本質的に凝集された後、細胞が細胞外マトリックスを生成した後、細胞が細胞外マトリックスを生成する前、使用の直前などを含む、任意の適した時点で除去される。様々な実施形態では、閉込め材料は、任意の適切な方法によって除去される。例えば、幾つかの実施形態では、閉込め材料は、切除されるか、細胞から引き抜かれるか、消化されるか、または溶解される。
【０２１１】
バイオプリンターのカートリッジの位置を較正するための方法およびシステム
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作製するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態では、バイオプリンターに付けられたカートリッジは、バイオインク及び／又は支持材を含む。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、特定の組織構築物を形成するために具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持材を堆積させる。幾つかの実施形態では、バイオインクを含むカートリッジは、使い捨てである。幾つかの実施形態では、カートリッジは、内容物の押出、分注、または堆積後にバイオプリンターから取り出される。幾つかの実施形態では、新しいカートリッジが、バイオプリンターに付けられる。
【０２１２】
複雑な構造体を作製するために、本明細書に開示されるバイオプリンターは、適切で反復可能な精度を持って、カートリッジからバイオインク及び／又は支持材を分注する。様々な実施形態では、適切で反復可能な精度は、任意の軸上の±５、１０、２０、３０、４０、または５０μｍの精度を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオプリンターは、約±２０μｍの反復可能な精度で、カートリッジからバイオインク及び／又は支持材を分注する。しかしながら、幾つかの実施形態では、カートリッジの除去および挿入が原因で、組織構築物に対するプリンターヘッド（したがってカートリッジ）の位置は変わる。したがって、プリンターステージ、受け面、組織、または臓器に対するプリンターヘッド、カートリッジ、および分注オリフィス部の位置を正確に較正する方法が必要とされている。
【０２１３】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、少なくとも１つのレーザーの使用を含む。さらなる実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、第１および第２のレーザーの使用を含む。またさらなる実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、第１および第２のレーザーおよび１つ以上のカメラの使用を含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、少なくとも１つのレーザーおよび少なくとも１つのカメラを含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、少なくともカメラを含む。
【０２１４】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、手動（例えば目視による）較正を含む。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、画像ベースの較正を含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、１つ以上のカメラを含む。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、手動較正およびレーザー較正を含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正する方法は、手動較正、画像ベースの較正、およびレーザー較正を含む。
【０２１７】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置は、１つの軸に沿って較正され、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置は、２つの軸に沿って較正され、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置は、３つの軸に沿って較正され、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、較正は、少なくとも１つのレーザーの使用によってなされる。さらなる実施形態では、較正は、第１および第２のレーザーの使用によってなされる。またさらなる実施形態では、較正は、第１および第２のレーザーの使用および１つ以上のカメラによってなされる。幾つかの実施形態では、較正は、少なくとも１つのカメラの使用によってなされる。
【０２１９】
水平レーザーを使用して較正するための方法
本明細書には、特定の実施形態において、分注オリフィス部を含むプリンターヘッドの位置を較正する方法が開示される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、レーザーを起動して、少なくとも１つの略安定した及び／又は略静止したレーザービームを生成する工程をさらに含み、ここで、前記レーザービームは、地面に水平である。例えば、図１を参照。
【０２２０】
幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも３つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程；（ｂ）Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程；及び／又は（ｃ）Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程、を含み、ここで、各軸は、デカルト座標系における同じ名称の軸に相当する。幾つかの実施形態では、較正は、少なくとも１つのレーザーの使用によってなされる。幾つかの実施形態では、較正は、第１および第２のレーザーの使用によってなされる。幾つかの実施形態では、較正は、少なくとも１つのカメラのさらなる使用によってなされる。
【０２２１】
幾つかの実施形態では、Ｙ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）（ｉ）プリンターヘッドが第１ｙ八分儀座  （ｏｃｔａｎｔ）に位置する、および（ｉｉ）分注オリフィス部がレーザービームの上限より下にあるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；（ｂ）プリンターヘッドをレーザービームの方に移動させて、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られるとすぐに前記移動を止める工程であって、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られる位置が、第１ｙ位置である、工程；（ｃ）プリンターヘッドが第２ｙ八分儀座に位置する、および分注オリフィス部がレーザービームの上限より下にあるように、プリンターヘッドを再び位置付ける工程；（ｄ）プリンターヘッドをレーザービームの方に移動させて、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られるとすぐに前記移動を止める工程であって、レーザービームが遮られる位置が、第２ｙ位置である、工程；および（ｅ）第１ｙ位置と第２ｙ位置との間の中点を算出する工程、を含む。
【０２２２】
幾つかの実施形態では、Ｘ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）（ｉ）第１ｙ位置と第２ｙ位置との間の中点に、および（ｉｉ）レーザーのセンサー閾値（ｓｅｎｓｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の外に、プリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｂ）プリンターヘッドをセンサー閾値の方に移動させて、プリンターヘッドがセンサー閾値に接触するとすぐに前記移動を止める工程、を含み、ここで、プリンターヘッドが、プリンターヘッド幅の半分増加したセンサーと接触する位置は、ｘ位置である。
【０２２３】
幾つかの実施形態では、Ｙ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）レーザービームがプリンターヘッドの片側面の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；（ｂ）レーザービームがプリンターヘッドの反対側の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｃ）各測定の間のレーザー位置に対するプリンターヘッドと測定した距離の中点位置を算出する工程、を含む。
【０２２４】
幾つかの実施形態では、Ｘ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）レーザービームがプリンターヘッドの片側面の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；（ｂ）レーザービームがプリンターヘッドの反対側の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｃ）各測定の間のレーザー位置に対するプリンターヘッドと測定された距離の中点位置を算出する工程、を含む。
【０２２５】
幾つかの実施形態では、Ｚ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）分注オリフィス部がレーザービームの上に位置するように、プリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｂ）プリンターヘッドをレーザービームの方に移動させて、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られるとすぐに前記移動を止める工程であって、レーザービームが遮られる位置がｚ位置である、工程を含む。
【０２２６】
垂直レーザーを使用して較正するための方法
本明細書には、特定の実施形態において、分注オリフィス部を含むプリンターヘッドの位置を較正する方法が開示される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、レーザーを起動して、少なくとも１つの略安定した及び／又は略静止したレーザービームを生成する工程をさらに含み、ここで、前記レーザービームは、地面に垂直である。例えば、図２を参照。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つのカメラの使用をさらに含む。
【０２２７】
幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも３つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。
【０２２８】
幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程；（ｂ）Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程；および（ｃ）Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程、を含み、ここで、各軸は、デカルト座標系における同じ名称の軸に相当する。
【０２２９】
幾つかの実施形態では、Ｙ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）（ｉ）プリンターヘッドが第１ｙ八分儀座  に位置する、および（ｉｉ）分注オリフィス部がレーザーのセンサー閾値の外にあるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；（ｂ）プリンターヘッドをレーザービームの方に移動させて、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られるとすぐに前記移動を止める工程であって、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られる位置が、第１ｙ位置である、工程；（ｃ）プリンターヘッドが第２ｙ八分儀座に位置する、および分注オリフィス部がレーザーのセンサー閾値の外にあるように、プリンターヘッドを再び位置付ける工程；（ｄ）プリンターヘッドをレーザービームの方に移動させて、レーザービームがプリンターヘッドによって遮られるとすぐに前記移動を止める工程であって、レーザービームが遮られる位置が、第２ｙ位置である、工程；および（ｅ）第１ｙ位置と第２ｙ位置との間の中点を算出する工程、を含む。
【０２３０】
幾つかの実施形態では、Ｘ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）（ｉ）第１ｙ位置と第２ｙ位置との間の中点に、および（ｉｉ）レーザーのセンサー閾値の外に、プリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｂ）プリンターヘッドをセンサー閾値の方に移動させて、プリンターヘッドがセンサー閾値に接触するとすぐに前記移動を止める工程、を含み、ここで、プリンターヘッドが、プリンターヘッド幅の半分増加したセンサーと接触する位置は、ｘ位置である。
【０２３１】
幾つかの実施形態では、Ｚ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）分注オリフィス部がレーザーセンサー範囲閾値のすぐ外にあるように、レーザービームの上に位置するようプリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｂ）センサー閾値に達するまでプリンターヘッドを下げる工程であって、ここで、レーザーセンサー閾値に達する位置は、ｚ位置である。幾つかの実施形態では、工程（ａ）および（ｂ）は、プリンターヘッドの複数点で繰り返され、測定された高さはｚ、位置を決定するために平均化される。
【０２３２】
幾つかの実施形態では、Ｚ軸に沿ったプリンターヘッドの位置の較正は、（ａ）レーザービームがプリンターヘッドの底部の１つ以上の地点の正確な位置を測定することができるように、プリンターヘッドを位置付ける工程；および（ｂ）レーザー位置および既知の測定された距離に基づいて、プリンターヘッドの絶対的または平均的位置を算出する工程、を含む。
【０２３３】
垂直および水平レーザーを使用して較正するための方法
本明細書には、特定の実施形態において、分注オリフィス部を含む、バイオプリンターに付けられているプリンターヘッドの位置を較正する方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、該方法は、少なくとも２つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。幾つかの実施形態では、該方法は、少なくとも３つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程を含み、ここで、軸は、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸から選択される。
【０２３４】
幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程；（ｂ）Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程；および（ｃ）Ｚ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正する工程、を含み、ここで、各軸は、デカルト座標系における同じ名称の軸に相当する。
【０２３５】
幾つかの実施形態では、較正は、第１レーザーおよび第２レーザーの使用を含む。幾つかの実施形態では、第１レーザーは垂直レーザーであり、第２レーザーは水平レーザーである。幾つかの実施形態では、較正は、少なくとも１つのカメラの使用をさらに含む。
【０２３６】
レーザーを使用して較正するためのシステム
本明細書には、特定の実施形態において、堆積用オリフィス部を含む、バイオプリンターに付けられているカートリッジの位置を較正するためのシステムが開示され、該システムは、少なくとも１つの軸に沿ってカートリッジの位置を較正するための手段を含み、ここで、軸は、Ｙ軸、Ｘ軸、およびＺ軸から選択される。
【０２３７】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、分注オリフィス部を含む、バイオプリンターに付けられているプリンターヘッドの位置を較正するためのシステムが開示され、該システムは、Ｘ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正するための手段；Ｙ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正するための手段；およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正するための手段、を含む。
【０２３８】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正するためのシステムは、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段を含む。幾つかの実施形態では、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段は、レーザーアラインメント、光学的アラインメント、機械的アラインメント、圧電的アラインメント、磁気アラインメント、電界、キャパシタンスアラインメント、超音波アラインメント、画像ベースのアラインメント、またはそれらの組み合わせである。
【０２３９】
幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正するためのシステムは、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段を含む。幾つかの実施形態では、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段は、レーザーアラインメントである。幾つかの実施形態では、レーザーアラインメントの手段は、少なくとも１つのレーザーを含む。幾つかの実施形態では、レーザーアラインメントの手段は、複数のレーザーを含む。幾つかの実施形態では、プリンターヘッドの位置を較正するためのシステムは、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための追加の手段をさらに含む。幾つかの実施形態では、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸に沿ってプリンターヘッドを較正するための手段は、少なくとも１つのカメラを使用する画像ベースのアラインメントである。
【０２４０】
幾つかの実施形態では、レーザーアラインメントは、それが適切な精度を有していることを意味する。様々な実施形態では、適切な精度は、任意の軸上の±５、１０、２０、３０、４０、または５０μｍの精度を含む。幾つかの実施形態では、レーザーアラインメントの手段は、垂直軸上で±４０μｍまで及び水平軸上で±２０μｍまで正確である。
【０２４１】
幾つかの実施形態では、レーザーパス（ｌａｓｅｒ  ｐａｔｈ）は、レーザー源と測定点との間で遮られない。幾つかの実施形態では、レーザーパスは、反射面または光学レンズの使用によって最大１７９°まで変更される。幾つかの実施形態では、レーザーパスは、９０°変更される。幾つかの実施形態では、水平レーザービームは、反射面を使用する偏光によって垂直パスでの測定に使用される。幾つかの実施形態では、垂直レーザービームは、反射面を使用する偏光によって水平パスでの測定に使用される。
【０２４２】
完全な自動化のための三次元較正システム
本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリンティングプロセス中に堆積用オリフィス部および印刷目的表面のｘ、ｙ、ｚ座標を自動的に決定するための手段を含むバイオプリンターが開示される。バイオプリンティングプロセスの前および間両方のそのような座標の自動化の三次元決定は、生体材料が、適切な位置の対象面で及び対象面分離距離までの最適な分注オリフィス部を使用してプリントされることを確かなもととする。バイオプリンティング作業に前の堆積用オリフィス部と受け面の頻繁な交換には、バイオプリンティングの質を制御する且つ最大限にするために、バイオプリンティングの開始前にこれらの２つの要素の位置の正確な決定が必要とされる。バイオプリンティングプロセスの間の堆積用オリフィス部および印刷対象面の位置の決定は、対象面の動的マッピングを可能にする。バイオプリンティングプロセスの間のそのような位置決定は、表面材料の製品公差または縮みが原因で、表面高さが必要とされるほど均一ではないかもしれず、バイオインクの層上の層が表面上に堆積されると表面高さが連続的に変わるために、重要である。さらに、堆積したバイオインクの各トラックの厚さの動的測定は、随意に、堆積速度、分注オリフィス部／受け面の相対的移動速度および印刷高さ（堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離）などの、バイオプリンティングのパラメーターを調節するためのフィードバックとして使用される。三次元の位置決定は、随意に、特にデジタルカメラ技術を組み込んだ、プリンター堆積のエラーチェック、プレート位置決めのエラーチェック、バイオプリンティング作業の間または後の構築物の縮みなどの構造変化のためのモニタリング、トランスウェルおよび微量定量プレートのための自動化したウェルの中心決定、および自動化した品質管理モニタリングを可能にする。
【０２４３】
本明細書には、特定の実施形態において、自動化バイオプリンター用の三次元較正システムが開示され、該三次元較正システムは、バイオプリンターの堆積用オリフィス部の位置を決定するためのバイオプリンターの受け面に固定されたセンサー；受け面に関連する印刷目的表面の位置を決定するためのバイオプリンターのプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムは、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の距離を含む、印刷高さを計算する。幾つかの実施形態では、三次元較正システムは、少なくとも２つのレーザー、堆積用オリフィス部の位置を決定するために受け面に固定されたセンサー、および受け面の位置を決定するためにプリンターヘッドに固定されたセンサーを含み、それによって、該三次元較正システムは、堆積用オリフィス部と受け面との間の距離を含む印刷高さを計算する。
【０２４４】
幾つかの実施形態では、センサーは、三角測量センサー、超音波距離を感知するプローブ、およびデジタルカメラから選択される。
【０２４５】
幾つかの実施形態では、三次元較正システムは、適切な精度を有する。様々な実施形態では、適切な精度は、任意の軸上の±５、１０、２０、３０、４０、または５０μｍの精度を含む。
【０２４６】
図４を参照すると、特定の実施形態では、三角測量センサーを備える三次元較正システムが描写されている。図４の左側は、三角測量センサーを感知するチップの上に保持された付属のキャピラリーを備えるプリンターヘッドを示す。キャピラリーチップ（堆積用オリフィス部）およびセンサービームの相対位置は、距離対位置のデータファイルを生成するために変更され、該データファイルから、キャピラリー中心Ｘ、Ｙ座標および平均チップ高さの両方が、自動的に決定され得る。図４の右側は、印刷目的表面の上に保持された付属のキャピラリーを備える後の時点でのプリントヘッドを示す。三角測量センサービームを感知する表面および印刷目的表面の相対位置は、距離対位置のデータファイルを生成するために変更され、該データファイルから、印字面の表面図が構築され得る。これらの２つのセンサーから得られた情報は、組み合わせられ、バイオプリンティングのプロセスを自動化するために使用され得、材料の堆積は、堆積用オリフィス部と印刷目的表面との間の最適の分離で生じる。この分離は、上に記載されるように記録された情報を使用して、バイオプリンティングのプロセスの全体にわたる表面高さの変更のために修正するように調節され得る。
【実施例】
【０２４７】
以下の具体的な実施例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、いかなる方法でも本開示の残存部分を限定するものとして解釈されるべきではない。さらなる精査なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその十分な程度まで利用することができると考えられる。
【０２４８】
実施例１：ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダー
細胞培養
平滑筋細胞：主要なヒト大動脈の平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）を、３７℃および５％のＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（すべてＳｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから）を補足した、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中で維持し、膨張させた。継代４と８との間のＨＡＳＭＣのコンフルエントな（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養液を、すべての研究に使用した。
【０２４９】
内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡから）を補足した、Ｍｅｄｉｕｍ  ２００中で維持し、膨張させた。細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で、ゼラチン（ブタの血清から；Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）でコーティングされた組織培養処理したフラスコ上で増殖させた。継代４と８との間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養液を、すべての研究に使用した。
【０２５０】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールド
２％  ｗ／ｖのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の調製：１ｇの低融点ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、５０ｍｌのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中に溶解した。簡潔には、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶解されるまで、ＤＰＢＳおよびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、一定の撹拌を行いながら、ホットプレート上で８５℃に加熱した。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、２５分間１２５℃で蒸気滅菌によって滅菌した。温度が６６．５℃を超えて維持される限り、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は、液相に残った。この温度より下で、相転移が生じ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘度が増加し、およびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）は固体ゲルを形成する。
【０２５１】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドの調製：ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に適合するテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作り上げた。簡潔には、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用して予め滅菌し、４５分間モールドをＵＶ光にさらした。滅菌したモールドを、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）の上に置き、しっかりと固定した。この組み合わせ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を、垂直に維持し、４５ｍｌの予め暖めた、無菌の２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿との間の空間に注いだ。その後、組み合わせを、１時間室温で水平に置き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を完全にゲル化させた。ゲル化後、テフロン（登録商標）のプリントを除去し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培養培地を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドに加えた。
【０２５２】
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダー
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダーの作製：混合した細胞シリンダーを準備するために、ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを、個別に集め、その後、予め決められた比率で混合した。簡潔には、培養培地を、コンフルエントな培養フラスコから除去し、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の増殖領域）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培養培地を、フラスコに加えた（トリプシン容量に対して２Ｘの容量）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培養培地中で再懸濁し、血球計を使用して数えた。適切な容量のＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを混合し、（総細胞数の％として）５、７．５、１０、１２．５、および１５％のＨＡＥＣを含有している、混合した細胞懸濁液を産出した。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培養培地中で再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアルに移し、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃且つ５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞間接着を開始することが可能となる。インキュベーション後、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培養培地中で再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブの内部に入れられた０．５ｍｌのマイクロチューブへと移し、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、非常に密でコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを作り出すために、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．０ｍｍ、ＩＤ  ０．５ｍｍ、Ｌ  ７５ｍｍ；  Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｂｒｏｏｍａｌｌ，  ＰＡ）へと移した。キャピラリーの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ２で、ＨＡＳＭＣ培養培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから、（ＨＡＳＭＣ培養培地で覆った）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドの溝へと堆積させた。細胞シリンダーを、２４時間および４８時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０２５３】
実施例２：多層の血管チューブ
細胞培養
平滑筋細胞：主要なヒト大動脈の平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ）を、３７℃および５％のＣＯ２で、  １０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡから）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、および３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（すべてＳｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから）を補足した、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持し、膨張させた。継代４と８との間のＨＡＳＭＣのコンフルエントな培養液を、すべての研究に使用した。
【０２５４】
内皮細胞：主要なヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡから）を補足した、Ｍｅｄｉｕｍ  ２００中で維持し、膨張させた。細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で、ゼラチン（ブタの血清から）でコーティングされた組織培養処理したフラスコ上で増殖させた。継代４と８との間のＨＡＥＣのコンフルエントな培養液を、すべての研究に使用した。
【０２５５】
線維芽細胞：主要なヒト皮膚の線維芽細胞（ＨＤＦ）を、３７℃および５％のＣＯ２で、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡから）を補足した、Ｍｅｄｉｕｍ  １０６中で維持し、膨張させた。継代４と８との間のＨＤＦのコンフルエントな培養液を、すべての研究に使用した。
【０２５６】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の溶液およびモールド
２％および４％（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の調製：（それぞれ、２％または４％に対する）１ｇまたは２ｇの低融点ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＭＰ）を、５０ｍｌのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中に溶解した。簡潔には、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶解されるまで、ＤＰＢＳおよびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、一定の撹拌を行いながら、ホットプレート上で８５℃に加熱した。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、２５分間１２５℃で蒸気滅菌によって滅菌した。温度が６６．５℃を超えて維持される限り、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は、液相に残る。この温度より下で、相転移が生じ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘度が増加し、およびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）は固体ゲルを形成する。
【０２５７】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドの調製：ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、１０ｃｍのペトリ皿に適合するテフロン（登録商標）のモールドを使用して、細胞シリンダーのインキュベーションのために作り上げた。簡潔には、テフロン（登録商標）のモールドを、７０％のエタノール溶液を使用して予め滅菌し、４５分間モールドをＵＶ光にさらした。滅菌したモールドを、１０ｃｍのペトリ皿の上に置き、しっかりと固定した。この組み合わせ（テフロン（登録商標）のモールド＋ペトリ皿）を、垂直に維持し、４５ｍｌの予め暖めた、無菌の２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、テフロン（登録商標）のモールドとペトリ皿との間の空間に注いだ。その後、組み合わせを、１時間室温で水平に置き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を完全にゲル化させた。ゲル化後、テフロン（登録商標）のプリントを除去し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドを、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダーをインキュベートするために、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培養培地を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドに加えらるか、あるいはＨＤＦ細胞シリンダーをインキュベートするために、１７．５ｍｌのＨＤＦ培養培地を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドに加えた。
【０２５８】
細胞シリンダー
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダーの作製：混合した細胞シリンダーを準備するために、ＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを、個別に集め、その後、予め決められた比率で混合した。簡潔には、培養培地を、コンフルエントな培養フラスコから除去し、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の増殖領域）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＨＡＳＭＣを０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培養培地を、フラスコに加えた（トリプシン容量に対して２Ｘの容量）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培養培地中で再懸濁し、血球計を使用して数えた。適切な容量のＨＡＳＭＣおよびＨＡＥＣを混合し、（総細胞数の％として）１５％のＨＡＥＣおよび残りの８５％のＨＡＳＭＣを含有している、混合した細胞懸濁液を産出した。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＡＳＭＣ培養培地中で再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアルに移し、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃且つ５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞間接着を開始することが可能となる。インキュベーション後、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＡＳＭＣ培養培地中で再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブの内部に入れられた０．５ｍｌのマイクロチューブへと移し、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、非常に密でコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを作り出すために、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．０ｍｍ、ＩＤ  ０．５ｍｍ、Ｌ  ７５ｍｍ）へと移した。キャピラリーの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ２で、ＨＡＳＭＣ培養培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから、（ＨＡＳＭＣ培養培地で覆った）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドの溝へと堆積させた。細胞シリンダーを、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０２５９】
ＨＤＦ細胞シリンダーの作製：ＨＤＦシリンダーを、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダーを調製する方法に類似した方法を使用して調製した。簡潔には、培地を、コンフルエントなＨＤＦ培養フラスコから除去し、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の増殖領域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の増殖領域）の存在下でインキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。インキュベーション後、ＨＤＦ培養培地をフラスコに加えた（トリプシン容量に対して２Ｘの容量）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＨＤＦ培養培地中で再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアルに移し、その後、７５分間１５０ｒｐｍで、および３７℃且つ５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＨＤＦ培養培地中で再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確かなものとした。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離チューブの内部に入れられた０．５ｍｌのマイクロチューブへと移し、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、非常に密でコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを作り出すために、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．０ｍｍ、ＩＤ  ０．５ｍｍ、Ｌ  ７５ｍｍ）へと移した。キャピラリーの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ２で、ＨＤＦ培養培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーチューブから、（ＨＤＦ培養培地で覆った）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のモールドの溝へと堆積させた。細胞シリンダーを、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０２６０】
多層の血管チューブの作製
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレートの調製：ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレートを、１０ｍｌの予め暖めた（＞４０℃）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（２％のｗ／ｖ）を１０ｃｍのペトリ皿に分注することによって作り上げた。分注直後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、ペトリ皿のベース全体を覆い、均一層を形成するように、均一に広げた。ペトリ皿を、２０分間室温でインキュベートして、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を完全にゲル化させた。
【０２６１】
多層の血管チューブ：ＨＤＦの外側層およびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣの内部層から成る血管チューブを、ＨＤＦシリンダー、およびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダーを利用して作り上げた。図５に示されるような幾何学的配置を利用した。簡潔には、２４時間のインキュベーション期間の終わりに、成熟したＨＤＦおよびＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣのシリンダーを、吸収してキャピラリーチューブへと戻し、さらに使用するまで適切な培地に入れた。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のロッド（ｒｏｄｓ）から成る支柱構造体を、以下のように調製した：予め暖めた２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、キャピラリーチューブ（Ｌ＝５０ｍｍ）へと吸引し、冷たいＰＢＳ溶液（４℃）中で急速に冷却した。５ｃｍ長のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを、ゲル化した、（プランジャーを使用して）キャピラリーから堆積させ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のベースプレート上にまっすぐに置いた。第２のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを、第１のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーに隣接させ、１０のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーが堆積されて、第１層を形成するまで、そのプロセスを繰り返した。この時点で、２０μｌのＰＢＳを、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーの上に分注させて、それらを湿らせ続けた。さらなる６のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを、図５（層２）に示されるような位置で層１の上に堆積させた。その後、３つのＨＤＦシリンダーを、位置４、５、および６で堆積させて、層２を完成させた。各ＨＤＦシリンダーを分注した後に、４０μｌのＨＤＦ培養培地を、堆積させたシリンダーの上に分注して、続くシリンダーの堆積を助け、および細胞シリンダーの脱水を防いだ。層３に対する次のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを堆積させ、その後、位置３および６でＨＤＦシリンダーが続いた。ＨＤＦ培養培地で構造体を再び湿らせた後、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合したシリンダーを、位置４および５に置いた。続いて、４０μｌのＨＡＳＭＣ培養培地および４０μｌのＨＤＦ培養培地を、細胞シリンダーの上で分注した。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを位置１および７で、ＨＤＦシリンダーを位置２および６で、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合したシリンダーを位置３および５で、および最後に４％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダーを位置４で堆積させることによって、層４を完成させた。同様に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のシリンダー、その後、ＨＤＦシリンダー、および最後にＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣシリンダーを、図５に示される位置に置くことによって、層５、６、および７を完成させた。一度構築物全体が完成すると、０．５ｍｌの暖かいＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、構築物の各端部上に分注し、５分間室温でゲル化させた。そのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）のゲル化後、３０ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、（構築物全体が完全に堆積したことを確かなものにするために）ペトリ皿に加えた。構築物を、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートして、細胞シリンダー間の融合を可能にした。
【０２６２】
２４時間の終わりに、周囲のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の支柱構造体を、融合した多層の血管チューブから除去した。
【０２６３】
実施例３：バイオプリンター
バイオプリンターを組み立てた。バイオプリンターは、カートリッジを保持するためのコレットチャックグリップ、およびカートリッジの内容物を分注するためのピストンを有しているプリンターヘッドを含んだ。使用されるカートリッジは、７５−８５ｍｍの長さを有しているガラスミクロキャピラリーチューブであった。新しいキャピラリーチューブを、バイオインクまたは支持材が必要とされる度に充填した。
【０２６４】
構造体をプリントするために、±２０μｍの分注位置繰返し精度を、印刷プロセスの間に、即ち、新しいキャピラリーがプリンターヘッドに充填されたときに、必要とした。ｘ、ｙ、およびｚ方向での同じ地点に対する充填されたすべてのキャピラリーの繰返し精度を維持するために、バイオプリンターは、ミクロキャピラリーチューブの位置を較正するためのレーザー較正システムを含んだ。レーザー較正システムは、共通参照位置に対するすべてのキャピラリーチップの位置を較正した。すべてのプリンティングを、この参照位置に対して移動させた。
【０２６５】
すべての３つの軸（ｘ、ｙ、およびｚ軸）を、単一のレーザー距離測定センサーの使用によって較正した。システムは、レーザーセンサーおよびレーザービームから構成された。センサー閾値（ｓｅｎｓｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）は、レーザーセンサーの最大感知距離であった。予め決められた閾値よりさらに遠く離れた信号をすべて無視するように、センサーを構成した。センサーは、対象（キャピラリーチップ）への距離を決定するために三角測量を使用した。レーザーセンサーを、垂直に上に向けられた（ａｉｍｅｄ  ｖｅｒｔｉｃａｌｌｙ  ｕｐ）（＋Ｚ軸）ビームとともに配向した。
【０２６６】
垂直レーザー較正
Ｘ軸における較正に関して：キャピラリーチップを、レーザービームの左側（−ｘ）に、レーザーセンサーの範囲内に移動させた。センサーがキャピラリー縁部を検知するまで、キャピラリーを＋ｘ方向に移動させ、この位置を記録した。上記の工程を、反対側から繰り返した（即ち、チップを、レーザービームの右（＋ｘ）に位置付け、センサーがキャピラリー縁部を検知するまで、−ｘ方向に移動させた）。両方の工程からの位置を、キャピラリーの中点を算出するために平均化した。随意に、上記のプロセスを、異なるｙ位置のために繰り返し、算出した中点を平均化した。
【０２６７】
Ｙ軸における較正に関して：（Ｘ軸に対する）上記の手順を、Ｙ軸に対しても繰り返した。
【０２６８】
Ｚ軸における較正に関して：センサービームがキャピラリーの底面に当たるように、キャピラリーチップをセンサービームの上に移動させ、チップはセンサー範囲閾値のすぐ外にあった。センサー閾値に達するまで、キャピラリーを下げ、その位置をｚ位置として記録した。随意に、上記の工程を、キャピラリーチップ曲面上の複数点で繰り返し、測定した高さを平均化した。
【０２６９】
水平レーザー較正
Ｙ軸における較正に関して：チップがレーザービーム高さの真下になるように、キャピラリーを移動させ、キャピラリーを片側面に（ｙ方向に）に向けた。キャピラリーを、レーザーに向かうｙ方向に移動させた。レーザーセンサーがキャピラリーから反射したビームを検知したときに、キャピラリーを止め、この位置を記録した。上記の工程を、キャピラリーがレーザーの反対側に向かうとともに繰り返し、−ｙ方向に移動させた。上記の工程からの中点を、ｙ位置として記録した。
【０２７０】
Ｘ軸における較正に関して：Ｙ軸における較正の結果を使用して、レーザーがキャピラリーの中心にくるように、Ｙ軸を移動させた。キャピラリーを、センサー閾値を超えて移動させ、センサーに向けて移動させた。キャピラリーがセンサー閾値を越えて、センサー出力が変化するとすぐに、キャピラリーを止めた。この位置に加えて、（ｙ較正からの）キャピラリー幅１／２を、ｘ位置として記録した。
【０２７１】
Ｚ軸における較正に関して：レーザービームがなくなるまで、キャピラリーを、ｘ位置から上に移動させた。キャピラリーチップを、レーザービームの方へ下に移動させて、（Ｙ軸に対するプロセスと同じプロセスを使用して）レーザービームが遮られるとすぐに止めた。この位置を、ｚ位置として記録した。
【０２７２】
キャピラリーのプライミング
キャピラリーからのプリンティング前に、キャピラリーの内部のバイオインクまたは支持材を、まさにその先端でプライミングを始めるように、プライミングした。キャピラリーをプライミングするために、較正レーザーを使用した。キャピラリーチップを、レーザービームの真上に移動させ、レーザービームをＹ軸の中心にくるようにした。チップは、レーザービームの２０−１００μｍ上にあった。バイオインクまたは支持材がキャピラリーチップから分注し始め、レーザービームを遮るまで、プリンターヘッドにおける分注ピストンを押し下げた。ピストンを逆方向に駆動させる（２０−１００μｍ）ことによって、分注されたバイオインクまたは支持材を、吸引してキャピラリーチューブへと戻した。その後、キャピラリーをプライミングして、分注の準備を整えた。
【０２７３】
ＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）のキャピラリー洗浄
ＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）を、支持材として使用した。キャピラリーチューブの外側表面にくっつく余分なＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を除去するために、および余分なＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が印刷精度に影響を及ぼさないように、余分なＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）を除去した。ワイピング（ｗｉｐｉｎｇ）の特徴を、バルクの（ｂｕｌｋ）ＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）の容器に統合した。バルクのＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）の容器を、隔壁を付けるためのオープンキャップを備える標準の医療用バイアルに適合させた。１−２ｍｍの厚さのシリコンの中心に横断線（ｃｒｏｓｓ  ｃｕｔ）を有するように、隔壁を構成した。隔壁を通ってバルクのＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）の容器にキャピラリーを浸し、ＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）を吸引することによって、余分なＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）を、容器を出るとキャピラリーから拭き取り、バルクの容器に残した。
【０２７４】
血管構造のプリンティング
バイオプリンターおよびカートリッジを、上記のように組み立てた。バイオプリンターは、バイオプリンターによって生成された構造体を受けるためのペトリ皿を有しているステージを有した。ペトリ皿を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングした。
【０２７５】
血管構造の二次元表示（例えば、図５を参照）を、ユーザーによって、バイオプリンターに接続されたコンピューターへとソフトウェアプログラムに入力した。血管構造の二次元表示は、血管構造の空隙を画定し、血管構造を囲む、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダー、ＨＤＦシリンダーのロッド、およびＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）のロッドから成った。ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣ混合した細胞シリンダーおよびＨＤＦ細胞シリンダーを、実施例１でのように調製し、プリンターヘッドのコレットチャックの中への挿入のためにキャピラリーチューブへと吸引した。代替的に、キャピラリーチューブを、プリンターヘッドに充填し、バルクのＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）の容器に浸し、ＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）をキャピラリーチューブへと吸引した。キャピラリーチューブを、垂直レーザー較正システムを使用して較正した。
【０２７６】
ソフトウェアプログラムからのコマンドがバイオプリンターに提供されたときに、バイオプリンターは、予め決められた位置で、ペトリ皿上へと、ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣのロッド、ＨＤＦロッドおよびＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）のロッドを交互にして、三次元構造をプリントするだろう。実施例２を参照。各ロッドを、ペトリ皿に置いた後に、少量の培養培地で湿らせた。一度構築物全体が完成すると、暖かいＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）を、構築物の各端部上に分注し、室温でゲル化させ、細胞培養培地をペトリ皿に加えて、構築物全体を堆積させた。その後、構築物を、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートして、細胞シリンダー間の融合を可能にした。インキュベーション時間の終わりに、周囲のＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）の支持構造体を、融合した多層の血管チューブから除去した。
【０２７７】
実施例４：ＵＶ架橋したＰＥＧ−ＤＡのバイオプリンティング
水中の１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−ＤＡ（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．：Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，  Ｕｔａｈ）の溶液は、硬化剤（０．１％のｗ／ｖ  ＰＥＧｃｕｒｅ  Ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｏｒ）（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．：Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，  Ｕｔａｈ）と混合される。結果として生じた溶液は、バイオプリンターにおけるバイアルチャンバー中で光から遠ざけられる。その後、この溶液は、押出法を介して３００μｍまたは５００μｍのサイズのガラスキャピラリーを使用して吸引され、少なくとも３分間ＵＶ光（波長３６５ｎｍ、強度１５，０００−２０，０００μＷ／ｃｍ２）にさらされ、架橋を介する重合を生じさせる。架橋は、液体ヒドロゲルを半固形の構造体に変換する。半固形ヒドロゲルは、細胞の有無に関係なくバイオプリント可能であり、シート、嚢、チューブ、導管、シリンダー、組織、臓器などの、幾何学的に複雑な構造体を作るために使用される。  
【０２７８】
細胞との架橋したＰＥＧ−ＤＡ
各種用途において、ＰＥＧ−ＤＡは、細胞、タンパク質、または他の生体試料を、バイオプリンターから押し出される前にカプセル化するために使用される。細胞を含むＵＶ架橋性の材料（例えば、ＰＥＧ−ＤＡなど）がバイオプリントされる用途において、減衰フィルターは、ＵＶ光強度の低下を達成するために、ＵＶモジュールに加えられる。１つの用途において、ＰＥＧ−ＤＡは、完全な架橋にとっては最適でない強度及び／又は露光時間でＵＶ光にさらされる。特定の場合では、哺乳動物細胞を含むＰＥＧ−ＤＡを、８００ｍＷ／ｃｍ２の強度でＵＶ光に、およびＰＥＧ−ＤＡ材料から２インチ離れた距離でＵＶ源にさらした。架橋度は、随意に、ＵＶ架橋性の材料および光重合開始剤の組成を変更することによって制御される。表２を参照。
【０２７９】
【表２】
0006842918.tif 000003
【０２８０】
その後、バイオプリンターは、細胞がＰＥＧ−ＤＡによって部分的にあるいは完全にカプセル化される構造においてＰＥＧ−ＤＡおよび細胞の連続する層をプリントする。最後に、細胞を囲むＰＥＧ−ＤＡの完全な架橋を促進するために、構造体全体は、さらにＵＶにさらされる。この手順は、随意に、他のタイプの生体試料を液体または半固形の状態のいずれかでカプセル化するために使用される。
【０２８１】
細胞のない架橋したＰＥＧ−ＤＡ
別の用途において、ＰＥＧ−ＤＡは、細胞および他の材料がバイオプリントされるスキャフォールドの基礎として使用される。予め決められたＰＥＧ−ＤＡ構造体が、ＵＶ光への暴露とともに機械成形によって作られる。例えば、ＰＥＧ−ＤＡは、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＬバッファー中に溶解され、１：２５０の希釈率で５％のイルガキュア２９５９を使用して架橋される。８００ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する長波ＵＶ光（即ち３６５ｎｍ）は、５分間の暴露で完全な架橋を達成するために利用される。予め形作られたＰＥＧ−ＤＡ構造体は、バイオプリンターに置かれ、細胞および他の材料は、構造体上にプリントされる。細胞は、一度プリントされると、融合することができ、ＰＥＧ−ＤＡスキャフォールドが、続いて取り外される。この技術は、膀胱などの臓器の形状および他の複雑な形状で細胞構造を生成することができる。
【０２８２】
実施例５：ＵＶ架橋したメタクリル化ヒドロゲルのバイオプリンティング
架橋したメタクリル化ヒドロゲルは、以下のパラメーターを使用して、ＵＶモジュールを含むＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ（商標）Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒからバイオプリントされる：
・  ヒドロゲル濃度：５％
・  イルガキュア２９５９濃度：０．５％
・  ＵＶ強度：１．５０Ｗ／ｃｍ２
・  ＵＶ露光時間：１５秒
・  分注高さ：０．５ｍｍ（５００μｍのキャピラリーを使用する１ｘＤ）
【０２８３】
随意に、より長い露光時間が、より低いＵＶ強度と組み合わせて使用される。幾つかのメタクリル化ヒドロゲルが、吸引量よりもおよそ４０％長いバイオプリント可能な長さに拡張するために、可変ポンプ速度の分注コマンドが、実際のロボット軸（ｒｏｂｏｔ  ａｘｅｓ）の動作よりも低い速度で、分注ポンプからより短い長さの材料を分注するように構成される。２ｍｍ／秒で＋Ｙ軸における５０ｍｍ長片のメタクリル化ヒドロゲルをプリントする。吸引する材料の正確な量および５０ｍｍのライン（ｌｉｎｅ）に帰着する対応するポンプ速度を測定するために、以下の計算を行う：
・  吸引するメタクリル化ヒドロゲルの量を計算する：５０ｍｍ／１．４＝３５．７１ｍｍ
・  ポンプ速度を計算する：２ｍｍ／秒／１．４＝１．４３ｍｍ／秒
【０２８４】
バイオプリンターのソフトウェアスクリプトコマンドは、以下のように構成される：
・  ３５．７１ｍｍの液体を吸引し、その後、１５秒間ＵＶ露光チャンバーへと移動させる。
・  ゲルのキャピラリーを分注高さ０．５ｍｍでゼロ点に移動させる。
・  ２ｍｍ／秒の速度でＹ軸においてロボットを５０ｍｍ移動させ、１．４３ｍｍ／秒の速度でゲルの分注ポンプを３５．７１ｍｍ移動させる。ゲルのポンプおよびＹ軸は、同時に止まるはずであり、５０ｍｍのラインに帰着する。
【０２８５】
実施例６：同軸ノズル−変動する流速
ノズル修正は、細胞タイプ、材料、及び／又は細胞の混合物の空間的分配を可能にする。この実験は、容積測定の流出量の不一致（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｏｕｔｆｌｏｗ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が原因のマントルコアの混合を最小化するための最適条件を評価するために、様々な流速でノズルを通って押し出された与えられた粘度のモデル化合物の使用を調査する。ノズル用の仕様は以下の通りであった：コア層のバイオインクの流動用ノズルの内径：１５０μｍ；マントル層のバイオインクの流動用ノズルの内径：５００μｍ；ノズルの外径：８００μｍ（図２９を参照）。材料は、最初、青に染色された３０％のＰ−Ｆ１２７および明瞭な３０％のＰ−Ｆ１２７であった。その後、青色の迅速な拡散の正規化のために、Ｐ−Ｆ１２７に類似した粘度を有する不透明な粘着性のタンパク様物質を利用した。評価は、適切なマントル／コア形成のために肉眼によって、評価を質的に決定した。結果を以下に示す。より高い流速は、流動不安定性を引き起こし、それ故、この実験のノズルおよびバイオインクのための持続可能な流動の上限と考えられるべきである。
【０２８６】
【表３】
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【０２８７】
フォローアップ実験を、マントル材料として１％のアルギン酸塩とともに行い、モデル細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）はコア層を含んだ。流速を、最初の実験から測定した。予測されたバルクの形態学的結果（Ｈ＆Ｅ染色）は、図３０に示され、これは、コンパクトな細胞コアが押出後に無傷なままであることを示唆している。
【０２８８】
実験の両方のセットは、同軸ノズルを使用する複雑な二層構造の生成の実現可能性を実証している。マントルおよびコアに対する体積流量の変動は、押し出された成分の形態学的結果に影響を与えたがマントル流のおよそ２倍のコア流の利用は、安定した構造体をもたらした。
【０２８９】
実施例７：同軸ノズル−脈管のプリンティング
同軸ノズルの機能性（ノズル用の仕様：コア層のバイオインクの流動用のノズルの内径：５１４μｍ；マントル層のバイオインクの流動用のノズルの内径：８１９μｍ；ノズルの外径：３２００μｍ）を、非細胞性物質のみのシステム上で試験した。アルギン酸塩とゼラチンの混合物を、中心を通って押し出されたＮｏｖｏｇｅｌを含有している塩化カルシウムのまわりで外側ノズルに通して押し出した。中心の塩化カルシウムの存在は、外側シェルを架橋するのに十分であった。Ｎｏｖｏｇｅｌを、シリンジおよびニードルの手動での使用によってＰＢＳと洗い出した。細胞／アルギン酸塩／ゼラチンの混合物は、一度非細胞性物質のみのシステムにおいて確証されると、中空チューブ（内径８２０μｍ、外径２３００μｍ）を作成するために押し出された。押し出された細胞／材料のチューブを、開存性を確立するために洗い流し、その後、６つの５０ｍｍのチューブへと分けた。チューブを、静的条件および流動条件両方の下で培養した。
【０２９０】
続く実験において、５０：５０の正常なヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）：ヒト肺性の内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）のバイオインクを、脈管のプリンティングに利用した。強い酸素勾配（脈管外で高い／脈管内で低い）の作成が、以前に見られた望ましくない影響を逆転させ、そこで、ＨＰＡＥＣが、標準の条件付きプロトコル下で脈管の反管腔側の（ａｂｌｕｍｉｎａ）表面に自動的に移動すると仮定された。ＦＣ４０（酸素担体）を、バイオリアクター中で高い酸素の反管腔側の区画を生成するために、通気した培地とともに利用した。前述の組成の２つの（６ｘ１）脈管を、プリントし、５日間高い反管腔側の酸素条件下で調整した。５日目に、脈管を、組織学的分析のために固定し与えた。
【０２９１】
高い反管腔側の酸素勾配に応じたＨＡＰＥＣの結果として生じた区画化は、図３１で見られる。そのような勾配がない状態で、ＨＰＡＥＣの選好（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）が、脈管の反管腔側の表面に移動する及びそれをコロニー形成することであることを示す以前の結果（本明細書では示されず）と比較して、ＣＤ３１染色は、脈管の内腔へのＨＰＡＥＣの大量移動を明確に示した。
【０２９２】
これらの結果は、酸素勾配法が、内部区画へと、または（逆勾配を使用する際に）外部区画へと細胞を移動させるこの特定の細胞タイプ（ＨＰＡＥＣ）に利用され得ることを示唆している。具体的な区画への細胞を追い込む技術は、チューブ状要素または球状要素だけでなく、他の幾何学的構造にも利用され得る。
【０２９３】
実施例８：同軸ノズル−Ｉ−バイオインクでのバイオプリンティング
実験１：
７０％の正常なヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）：２０％の気管支平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）：１０％のヒトの脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）から成る細胞の混合物を用いて、５００μｍの直径のバイオプリントされた脈管を生成し、凝集、表面平滑度（適切な内部のバイオインク融合の徴候）、短縮（収縮）、および標準のバイオプリンティングのプロトコルによって管状構造を形成する能力（相互バイオインク融合の徴候）に関して、１２時間目に質的に評価した。評価後、脈管を、生体活性ヒドロゲルに埋め込み、脈動流で灌流した。バイオリアクター上での時間に続いて、脈管が埋め込まれたヒドロゲルを、組織学的検査に送り、これは、予測された細胞質および形態を実証した。
【０２９４】
質的評価は、ＡＤＳＣを含んでいなかった同様のバイオインク混合剤との識別可能な違いを示さなかった。バイオインクの表面特徴は、滑らか且つ不透明であった。バイオインクシリンダーは、扱われたときに、優れた凝集を有する弾性を示した。収縮（短縮）は、およそ５０％であり、これは、円筒形状で生成されたバイオインクと一致していた。３つのバイオプリントされた脈管（ＩＤ  ５００μｍ／ＯＤ  １５００μｍ）を融合し、１２時間目に開存性になった（即ち、開いており、閉塞されていない）。２つの典型的な脈管を、３日間バイオリアクター上のヒドロゲル中で調整した。組織学的評価は、以前のＭＳＣを含んでいない検体との適合性を示した。埋め込まれた管状構造の組織構造および周囲のヒドロゲルの例は、図３２に示される。
【０２９５】
実験２：
２つの細胞混合剤［５０％の正常なヒトの肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）：４０％のヒトの肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）：１０％のヒトの脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）；５０％の正常なヒトの肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）：４５％のヒトの肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）：５％のヒトの脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）］を用いて、５００μｍの直径のバイオプリントされた脈管を生成し、凝集、表面平滑度（適切な内部のバイオインク融合の徴候）、短縮（収縮）、および標準のバイオプリンティングのプロトコルによって管状構造を形成する能力（相互バイオインク融合の徴候）に関して、１２時間目に質的に評価した。典型的なサンプルを、バイオリアクター中で灌流した。これらの群からのサンプルを、形態（Ｈ＆Ｅ）、アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）、増殖（ｋｉ６７）、平滑筋細胞アクチン、内皮マーカー（ＣＤ３１）、線維芽細胞マーカー（ＴＥ７）、および細胞外マトリックス堆積（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）のための染色を用いる組織構造のために提出した。
【０２９６】
質的評価は、ＡＤＳＣを含んでいなかった同様のバイオインク混合剤との識別可能な違いを示さなかった。バイオインクの表面特徴は、滑らか且つ不透明であった。バイオインクシリンダーは、扱われたときに、優れた凝集を有する弾性を示した。収縮（短縮）は、およそ５０％であり、これは、円筒形状で生成されたバイオインクと一致していた。最後に、４つのバイオプリントされた脈管（ＩＤ  ５００μｍ／ＯＤ  １５００μｍ）を融合し、１２時間目に開存性になった（即ち、開いており、閉塞されていない）。バイオリアクターに充填された２つの脈管は、それらの例外的な質によって、５０％のＮＨＬＦ：４５％のＨＰＡＥＣ：５％のＡＤＳＣの群からのものであった。脈動流での調整は、９日間生じ、脈管を、上に記載されるように組織学的に分析した。結果として生じる組織構造は、免疫調節細胞なしでバイオインクから生成された対照構築物との質的な違いを示さなかった。
【０２９７】
実験３：
７５％のヒトの脂肪由来の間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）：２５％のヒトの動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）から成る細胞混合物を用いて、５００μｍの直径のバイオプリントされた脈管を生成し、凝集、表面平滑度（適切な内部のバイオインク融合の徴候）、および短縮（収縮）に関して、１２時間目に質的に評価した。同じこの細胞混合物をまた、標準のバイオプリンティングのプロトコルによってパッチ構造（５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ）を形成する能力（相互バイオインク融合の徴候）に関して評価した。これらの群からのサンプルを、形態（Ｈ＆Ｅ）＆アポプトーシス（ＴＵＮＥＬ）のための染色を用いる組織構造のために提出した。
【０２９８】
質的評価は、ＡＤＳＣを含んでいなかった同様のバイオインク混合剤との識別可能な違いを示さなかった。バイオインクの表面特徴は、滑らか且つ不透明であった。バイオインクシリンダーは、扱われたときに、優れた凝集を有する弾性を示した。収縮（短縮）は、およそ５０％であり、これは、円筒形状で生成されたバイオインクと一致していた。最後に、４つのバイオプリントされたパッチ（５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ）を融合し、１２時間目に開存性になった（即ち、開いており、閉塞されていない）。パッチを、２日後に組織構造のために提出した。パッチの例は、図３３に示される。
【０２９９】
本発明は、その具体的な実施形態に関連して記載されているが、創造性のある方法論によってさらなる修正が可能であることが理解されるだろう。本特許出願は、一般に、本発明の原則に従う、および本発明が属する当該技術分野内の既知の又は慣例的な習慣内に当てはまるように、および添付の特許請求の範囲内で明記される前に及びその通りに本明細書の重要な特徴に適用されるように、本開示からの逸脱を含んで、本発明のあらゆる変更、使用、または適応を包含するように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２ａ）】
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【図３２ｂ）】
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【図３３】
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【図３４】
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