(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含む前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドに特異的に結合することができる単離された単一ドメイン抗体であって、
ここで、前記単一ドメイン抗体は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を含むＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の配列を含むＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の配列を含むＣＤＲ３
を含む、
単離された単一ドメイン抗体。
【請求項２】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項３】
前記単一ドメイン抗体は三重特異性タンパク質の一部である、請求項２に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項４】
前記三重特異性タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の前記単一ドメイン抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載の前記ポリヌクレオチドを含む単離されたベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の前記ベクターで形質転換された、単離された宿主細胞。
【請求項８】
（ｉ）請求項１に記載の前記単一ドメイン抗体および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年１１月２３日に出願された、米国仮特許出願第６２／４２６，０８６号の利益を主張するものであり、該文献はその全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１７年１１月２２日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７−７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１４８，６５０バイトのサイズである。
【０００３】
引用による組み込み
本明細書に言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、及びそれら全体において明記されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
本開示は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の発現に関連する他の兆候を診断及び処置するために使用することができる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合タンパク質を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
１つの実施形態において、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＸ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＤＸ７ＹＧＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）に記載される通りであり、幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は以下の式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり；ｒ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり；及び、ｒ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり；ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４は、上記のタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載されるアミノ酸配列に少なくとも８０パーセント同一であるように選択されたフレームワーク残基である。幾つかの実施形態において、Ｘ１はプロリンである。幾つかの実施形態では、Ｘ２はヒスチジンである。幾つかの実施形態において、Ｘ３はアスパラギン酸である。幾つかの実施形態では、Ｘ４はリジンである。幾つかの実施形態では、Ｘ５はグルタミンである。幾つかの実施形態では、Ｘ６はチロシンである。幾つかの実施形態では、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、Ｘ１はプロリンである。幾つかの実施形態では、Ｘ５はグルタミンである。幾つかの実施形態では、Ｘ６はチロシンである。幾つかの実施形態において、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質はさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもカニクイザル前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、ｒ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を��む。幾つかの実施形態において、ｒ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含む。幾つかの実施形態では、ｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含む。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載される配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質を提供し、ここで、アミノ酸位置３１、３３、５０、５５、５６、６２、及び９７から選択された１つ以上のアミノ酸残基が置換される。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は、位置３１、３３、５０、５５、５６、６２、及び９７以外のアミノ酸位置で１つ以上の追加の置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置３１で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置３３で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置５０で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置５５で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置５６で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置６２で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は位置９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質はアミノ酸位置５５と９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、結合タンパク質はアミノ酸位置３３と９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質はアミノ酸位置３３、５０、及び、９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもカニクイザル前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、結合タンパク質はアミノ酸位置３１、３３、５０、及び、９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質はアミノ酸位置３３、５０、５５、及び、９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、結合タンパク質はアミノ酸位置３３、５０、５６、及び、９７で置換を含む。幾つかの実施形態において、はアミノ酸位置３３、５０、６２、及び、９７で置換を含む。
【０００７】
さらなる実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質を提供し、ここで、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で記載される配列を含む。１つの実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質を提供し、ここで、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で記載される配列を含む。追加の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質を提供し、ここで、ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で記載される配列を含む。１つの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載される配列に少なくとも８０％同一の配列を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質が提供される。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質が提供され、ここで、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対して少なくとも８０％の同一性を有し、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に対して少なくとも８５％の同一性を有し、ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
【０００８】
別の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む前立腺特異的膜抗原結合タンパク質を提供し、ここで、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で記載される配列を含み、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で記載される配列を含み、ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で記載される配列を含む。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ヒト前立腺特異的膜抗原とカニクイザル前立腺特異的膜抗原の１つあるいは両方に結合する。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は、同等の結合親和性で、ヒト前立腺特異的膜抗原とカニクイザル前立腺特異的膜抗原に結合する。幾つかの実施形態において、結合タンパク質は、カニクイザル前立腺特異的膜抗原よりも高い結合親和性でヒト前立腺特異的膜抗原に結合する。
【０００９】
別の実施形態は、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施形態は、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の実施形態では、ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。別の実施形態では、（ｉ）本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質、本開示に係るポリヌクレオチド、本開示に係るベクター、又は本開示に係る宿主細胞、及び、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。別の実施形態は、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質の生成のプロセスを提供し、上記プロセスは、ＰＳＭＡ結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示に係るＰＳＭＡアルブミン結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収及び精製する工程とを含む。１つの実施形態では、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を被験体へ投与する工程を含む、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、又は宿主対移植片病の処置又は改善のための方法が提供される。幾つかの実施形態では、被験体はヒトである。幾つかの実施形態において、方法はさらに、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を含む。
【００１０】
１つの実施形態は、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質を提供する。さらなる実施形態は、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を含む抗体を提供する。１つの実施形態において、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を含む、多特異性抗体、二重特異性抗体、ｓｄＡｂ、可変重鎖ドメイン、ペプチド、又はリガンドが提供される。１つの実施形態では、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を含む抗体が提供され、ここで、上記抗体は単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、単一ドメイン抗体はＩｇＧの重鎖可変領域に由来する。さらなる実施形態は、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を含む、多特異性結合タンパク質又は抗体を提供する。１つの実施形態では、本開示に係る多特異性抗体を被験体へ投与する工程を含む、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、又は宿主対移植片病の処置又は改善のための方法が提供される。さらなる実施形態では、本開示に係る多特異性抗体を被験体へ投与する工程を含む、前立腺疾病の処置又は改善のための方法が提供される。別の実施形態は、上記の実施形態のいずれかに係るＰＳＭＡ結合タンパク質を被験体へ投与する工程を含む、前立腺疾病の処置又は改善のための方法を提供する。さらなる実施形態では、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を被験体へ投与する工程を含む、前立腺疾病の処置又は改善のための方法を提供する。
【００１１】
幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、以下の任意の組み合わせを含む：（ｉ）Ｘ１はプロリンである；（ｉｉ）Ｘ２はヒスチジンである；（ｉｉｉ）Ｘ３はアスパラギン酸である；（ｉｖ）Ｘ４はリジンである；（ｖ）Ｘ５はグルタミンである；（ｖｉ）Ｘ６はチロシンである；及び、（ｖｉｉ）Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、上記の実施形態の前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合は、以下の任意の組み合わせを含む：（ｉ）Ｘ１はプロリンである；ここで、Ｘ５はグルタミンである；（ｉｉ）Ｘ６はチロシンである；ここで、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである；（ｉｉｉ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである；（ｉｖ）Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである；（ｖ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ７はセリンである；（ｖｉ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである；（ｖｉｉ）Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである（ｖｉｉｉ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ７はセリンである；（ｉｘ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンであり、Ｘ７はセリンである；及び、（ｘ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである。場合によっては、上記の実施形態の前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載される配列を有する結合タンパク質のよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。場合によっては、上記の実施形態の前立腺特異的膜抗原結合タンパク質はさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載される配列を有する結合タンパク質のよりもカニクイザル前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、以下の任意の組み合わせを含む：（ｉ）位置３１での置換；（ｉｉ）位置５０での置換；（ｉｉｉ）位置５５での置換；位置５６での置換；（ｉｖ）位置６２での置換；（ｖ）位置９７での置換；（ｖｉ）位置５５及び９７での置換；（ｖｉｉ）位置３３及び９７での置換；（ｖｉｉｉ）３３、５０、及び９７の置換；（ｉｘ）位置３１、３３、５０、及び９７での置換；（ｘ）位置３３、５０、５５、及び９７での置換；（ｘｉ）位置３３、５０、５６、及び９７での置換；ならびに、（ｘｉｉｉ）位置３３、５０、６２、及び９７での置換。場合によっては、上記の実施形態の前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。場合によっては、上記の実施形態の前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は��らに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載される配列を有する結合タンパク質のよりもカニクイザル前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。
【００１２】
１つの実施形態は、前立腺癌の処置又は改善のための方法を提供し、上記方法は、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＰＳＭＡ結合タンパク質の被験体への投与を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＸ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＤＸ７ＹＧＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）に記載される通りである。
【００１３】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記単一ドメイン抗体は三重特異性抗体の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の新規な特徴はとりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】典型的なＰＭＳＡ標的三重特異性の抗原結合タンパク質の略図であり、タンパク質は抗ＣＤ３ε単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と抗ＨＳＡ可変重鎖領域を含む不変のコア要素と、ＶＨ、ｓｃＦｖ、非Ｉｇバインダー、あるいはリガンドであり得るＰＭＳＡ結合ドメインとを有する。
【図２Ａ】ヒト前立腺癌細胞を殺すようにＴ細胞を誘発するためのＣＤ３に対する様々な親和性と例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子）の能力を比較する。図２Ａは、前立腺癌モデルＬＮＣａＰにおける様々なＰＭＳＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子による死滅を示す。
【図２Ｂ】ヒト前立腺癌細胞を殺すようにＴ細胞を誘発するためのＣＤ３に対する様々な親和性と例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子）の能力を比較する。図２Ｂは、前立腺癌モデル２２Ｒｖ１における様々なＰＭＳＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子による死滅を示す。
【図２Ｃ】ＬＮＣａＰと２２Ｒｖ１の前立腺癌モデルにおけるＰＭＳＡ標的化ＴｒｉＴＡＣのＥＣ５０値を示す。
【図３】３週間にわたる静脈内投与（１００μｇ／ｋｇ）後のカニクイザル中のＰＭＳＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ２３６の血清中濃度を示す。
【図４】３週間にわたる静脈内投与（１００μｇ／ｋｇ）後のカニクイザル中の異なるＣＤ３親和性を有するＰＭＳＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の血清中濃度を示す。
【図５Ａ】ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを殺すようにＴ細胞を誘発するためのＰＳＭＡに対する様々な親和性とＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の能力を比較する。図５Ａは、陽性対照としてのＰＳＭＡ標的化ＢｉＴＥを用いる、ヒト血清アルブミンがない状態で実施された実験を示す。
【図５Ｂ】ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを殺すようにＴ細胞を誘発するためのＰＳＭＡに対する様々な親和性とＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の能力を比較する。図５Ｂは、陽性対照としてのＰＳＭＡ標的化ＢｉＴＥを用いる、ヒト血清アルブミンの存在下で実施された実験を示す。
【図５Ｃ】ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを殺すようにＴ細胞を誘発するためのＰＳＭＡに対する様々な親和性とＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の能力を比較する。図５Ｃは、ＬＮＣａＰ前立腺癌モデルにおいて陽性対照としてのＰＳＭＡ標的化ＢｉＴＥを用いる、ＨＳＡの存在下又は不在下でのＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣに対するＥＣ５０値を示す。
【図６】マウス異種移植片実験においてヒト前立腺癌細胞の腫瘍成長を阻害するためにＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の能力を実証する。
【図７Ａ】標的タンパク質を発現する／しない標的細胞株を用いて細胞致死アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を例証する。図７Ａは、ＬＮＣａＰ、ＫＭＳ１２ＢＭ、及びＯＶＣＡＲ８の細胞株におけるＥＧＦＲとＰＳＭＡの発現を示す。
【図７Ｂ】標的タンパク質を発現する／しない標的細胞株を用いて細胞致死アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を例証する。図７Ｂは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、及び陰性対照ＴｒｉＴＡＣｓによるＬＮＣａＰ腫瘍細胞の死滅を示す。
【図７Ｃ】標的タンパク質を発現する／しない標的細胞株を用いて細胞致死アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を例証する。図７Ｃは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、及び陰性対照ＴｒｉＴＡＣｓによるＫＭＳ１２ＢＭ腫瘍細胞の死滅を示す。
【図７Ｄ】標的タンパク質を発現する／しない標的細胞株を用いて細胞致死アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を例証する。図７Ｄは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、及び陰性対照ＴｒｉＴＡＣｓによるＯＶＣＡＲ８細胞の死滅を示す。
【図８Ａ】ＴｒｉＴＡＣ活性に対する、３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでのプレインキュベーションの影響を描く。図８Ａは３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでのプレインキュベーションの後のＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ２３５活性を示す。
【図８Ｂ】ＴｒｉＴＡＣ活性に対する、３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでのプレインキュベーションの影響を描く。図８Ｂは３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでプレインキュベーションの後にＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３５９活性を示す。
【図８Ｃ】ＴｒｉＴＡＣ活性に対する、３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでのプレインキュベーションの影響を描く。図８Ｃは３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでプレインキュベーションの後にＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６０活性を示す。
【図８Ｄ】ＴｒｉＴＡＣ活性に対する、３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでのプレインキュベーションの影響を描く。図８Ｄは３７°Ｃ及び凍結／融解のサイクルでプレインキュベーションの後にＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６１活性を示す。
【図９Ａ】Ｔ細胞依存性細胞の細胞毒性アッセイ（ＴＤＣＣ）における再指示された（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞死滅での本開示のＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の活性を描く。図９Ａは、ＬＮＣａＰ細胞を殺す際に、カニクイザルドナーＧ３２２からのカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を再指示する際のＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の影響を示す。
【図９Ｂ】Ｔ細胞依存性細胞の細胞毒性アッセイ（ＴＤＣＣ）における再指示された（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞死滅での本開示のＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の活性を描く。図９Ｂは、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞を殺すためにカニクイザルドナーＤ１７３から、カニクイザルＰＢＭＣを再指示する際のＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の影響を示す。
【図１０】Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の発現に対する本開示のＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の影響を描く。
【図１１】ＰＳＭＡ発現標的細胞の存在下でＴ細胞増殖を刺激するために本開示のＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の能力を描く。
【図１２】ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子ＰＳＭＡ  Ｚ２  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）によるＬｎＣａＰ細胞を殺す再指示されたＴ細胞を描く。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くの変更、変化、及び置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、及び構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【００１６】
特定の定義
本明細書で使用される用語は、特定のケースだけを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「とともに（ｗｉｔｈ）」、又はその変形が、詳細な記載及び／又は請求項のいずれかで使用される程度まで、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に類似した方法で含まれるように意図される。
【００１７】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、例えば、測定システムの制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、任意の値での実践につき１又は１を超える標準偏差を意味し得る。特定の値が本出願と請求項に記載されている場合、特段の定めのない限り、「約」との用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味するものであると仮定されなければならない。
【００１８】
用語「個体」、「患者」、又は「被験体」は互換的に使用される。どの用語も、保健従事者（例えば、医師、正看護婦、ナース−プラクティショナー、医師助手、用務係、又はホスピス職員）の監督（例えば、持続的又は断続的）によって特徴付けられた状態を要求せず、又はそれに限定されない。
【００１９】
用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基（又は領域）は、本明細書に定義されるようなＣＤＲ又は超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基を指す。「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なり、その特定の抗原について各々の特定の抗体の結合と特異性で使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、β−シート構造を接続する、場合によってはβ−シート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続された、β−シート構造を採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。「Ｋａｂａｔでのような可変ドメイン残基のナンバリング」あるいは「Ｋａｂａｔでのようなアミノ酸位置のナンバリング」、及びその変更形態は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインあるいは軽鎖可変ドメインのために使用される番号づけ方式を参照する。このナンバリングシステムを使用して、実際の直線のアミノ酸配列は、可変性ドメインのＦＲ又はＣＤＲの省略、又はそれらへの挿入に対応する、より少数の又は付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに係る残基５２ａ）を、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングを行った配列を有する抗体の配列の相同領域にある列によって、与えられた抗体について測定され得る。本開示のＣＤＲはＫａｂａｔの番号付けの慣習に必ず対応するということを意図するものではない。
【００２１】
本明細書で使用されるように、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」との用語は、配列を位置合わせし、ギャップを導入して、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成した後に、かつ、配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換を考慮せずに、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野内の様々な方法で、例えば、ＥＭＢＯＳＳ  ＭＡＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＷＡＴＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＳＴＲＥＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＮＥＥＤＬＥ、ＥＭＢＯＳＳ  ＬＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２１−２５（Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，６ｔｈ  ｅｄ．１９８０）に記載されるように、その通常の意味で使用される。簡潔に、この用語は、薬物消失の時間経過の定量的測度を包含することを意味している。薬物濃度は通常、消失プロセスの飽和に必要なものに匹敵しないため、大抵の薬剤の消失は急激的なものである（すなわち、一次速度論に従う）。急激なプロセスの速度は、時間の単位当たりの分数変化率を表すその速度定数ｋにより、又は、処理の５０％の完了に必要な時間であるその半減期ｔ１／２によって表され得る。これらの２つの定数の単位は、それぞれ時間−１及び時間である。一次反応速度定数及び反応の半減期は単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、適宜交換され得る。一次消失キネティクスは、薬物の一定の画分が時間単位ごとに消失されることを命令するため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初期分布段階後（すなわち、薬物吸収と分布が完了した後）の全ての時間で直線状である。薬物消失の半減期は、そのようなグラフから正確に判定され得る。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「結合親和性」は、結合標的に対する本開示に記載されたタンパク質の親和性を指し、「Ｋｄ」値を数的に使用して表現される。２つ以上のタンパク質が、その結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、その結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。２つ以上のタンパク質が単一の結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、上記の単一結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。タンパク質が同等の結合親和性で２つ以上の標的に結合すると示されている場合、２つ以上の標的に対する上記タンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。一般に、高いＫｄ値は弱い結合に対応する。幾つかの実施形態では、「Ｋｄ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を使用して放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）又は表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。ある実施形態では、「ｏｎ−ｒａｔｅ」あるいは「会合速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ又はａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」あるいは「ｋｏｎ」、及び「オフ率」あるいは「解離速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）又は（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」、又は「ｋｏｆｆ」もＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を使用して、表面プラズモン共鳴技術で決定される。さらなる実施形態では、「Ｋｄ」、「ｋｏｎ」、及び「ｋｏｆｆ」は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムズ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定される。ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムズを使用して、結合親和性を測定する例示的な方法では、リガンド、例えば、ビオチン化されたヒト又はカニクイザルのＰＳＭＡは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ストレプトアビジンキャピラリーセンサー先端表面に固定され、その後、約２０−５０μｇ／ｍｌのヒト又はカニクイザルのＰＳＭＡタンパク質を使用してメーカーの説明書に従ってが活性化される。ＰＢＳ／カゼインの溶液も遮断薬として導入される。関連反応速度測定については、ＰＳＭＡ結合タンパク質変異体は、約１０μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌまでの濃度で導入される。完全解離は、陰性対照の結合タンパク質を含まないアッセイ緩衝液の場合に観察される。その後、結合反応の動力学的パラメーターは、適切なツール、例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウェアを使用して決定される。
【００２４】
ＰＳＭＡ結合タンパク質、医薬組成物、同様に、ＰＳＭＡ結合タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞が本明細書で提供される。さらに、疾患、疾病、及び障害の予防及び／又は処置において、開示されたＰＳＭＡ結合タンパク質を使用する方法も提供される。ＰＳＭＡ結合タンパク質はＰＳＭＡに特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＣＤ３結合ドメインなどの追加のドメインを含む。
【００２５】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）及び前立腺の疾病におけるその役割
前立腺特異的膜抗原結合タンパク質が本明細書で企図される。グルタミン酸塩カルボキシペプチダーゼＩＩとしても知られている前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｎ−アセチル−α−連結した酸性ジペプチターゼＩ［Ｎａａｌａｄａｓｅ（ＮＬＰ）Ｉ］、あるいは、葉酸ヒドロラーゼは、前立腺癌細胞と非前立腺固形腫瘍血管新生では高度に発現し、健康な前立腺、腎臓、肝臓、小腸、小腸、唾液腺、十二指腸の粘膜、近位尿細管、及び脳を含む他の組織ではより低いレベルで発言する事がわかっている７５０残基のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＳＭＡは、単核の亜鉛活性部位を有するカルボキシペプチダーゼ（例えばカルボキシペプチダーゼＡ）、及び、二核の亜鉛活性部位を有するカルボキシ−及びアミノペプチダーゼを含む、亜鉛依存性エキソペプチダーゼのスーパーファミリーのメンバーである［例えば、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、ペプチダーゼＴ及びＶ（ＰｅｐＴ及びＰｅｐＶ）、ストレプトマイセス−グリセウスアミノペプチダーゼ（Ｓｇａｐ）、及びエロモナスプロテオリチカアミノペプチダーゼ（ＡＡＰ）］。これらの溶解可能な単一ドメイン（例えばＡＡＰ）、あるいは二重ドメイン（例えばＣＰＧ２）亜鉛依存性エキソペプチダーゼを有する限定された相同領域に加えて、ＰＳＭＡの全配列は少なくとも４つの他のヒトタンパク質に相同である：ＮＬＤＬ（回腸で発現；３５％の同一性）、ＮＬＤ２（卵巣、睾丸、及び脳で発現；６７％の同一性）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）１（ＴｆＲ１；ほとんどの細胞型で発現；２６％の同一性）、及びＴｆＲ２（肝臓で優勢的に発現；２８％の同一性）。
【００２６】
ＰＳＭＡの結晶構造は３つのＴｆＲ１ドメインと類似する３つのドメイン：プロテアーゼドメイン、頂端ドメイン（ａｐｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）、及び螺旋ドメインを含む各ポリペプチド鎖を有する対称的な二量体を含むことが示されている。３つのドメイン間の界面の大きな空洞（〜１，１００Å２）は、二核の亜鉛部位と、優勢的に極性の残基（７０の残留物の６６％）を含む。２つの亜鉛イオンについての観察と、ＰＳＭＡオルソログとホモログの中のキャビティ成形残基の多くの保存は、有力な基質結合部位として空洞を同定する。
【００２７】
典型的には、ＰＳＭＡ発現は、前立腺疾患の進行と転移とともに増加することがわかっている。ＰＳＭＡの発現は前立腺癌で、とりわけ、分化が不十分な転移性及びホルモン難治性の細胞腫で増大する。ＰＳＭＡは、正常組織から血管中に限定されないが、腎細胞細胞腫と結腸細胞腫を含む特定の悪性病変の及び腫瘍周囲及び腫瘍内の領域中の毛細管の内皮細胞でも発現される。加えて、ＰＳＭＡは腫瘍血管新生に関連することが報告されている。ＰＳＭＡは結腸、乳房、膀胱、膵臓、腎臓、及び黒色腫の細胞腫中の腫瘍関連血管新生の内皮細胞で発現されることが実証されている。
【００２８】
腫瘍マーカーとしての役割に加えて、ＰＳＭＡは二核の亜鉛部位を含んでおり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼとして活性であり、ペプチド又は小分子からのα−又はγ−結合グルタミン酸塩の加水分解を触媒する。その基質は必須栄養素であるポリ−γ−グルタミン酸化葉酸と、抗癌剤メトトレキサートのポリ−γ−グルタミン酸化の形態とを含み、この場合、切断により効果的ではなくなる。ＰＳＭＡの酵素活性は、プロドラッグのデザインのために利用することができ、薬物の不活性なグルタミン酸化形態は選択的に切断され、それによって、ＰＳＭＡを発現する細胞でのみ活性化される。ＰＳＭＡはさらに、豊富な神経ペプチドＮ−アセチル−ｌ−アスパルチル−ｌ−グルタミン酸塩（α−ＮＡＡＧ）を切断して不活性化し、これは、ＮＭＤＡイオンチャネル型受容体の阻害剤であり、かつ、ＩＩ型代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ３のアゴニストである。α−ＮＡＡＧによるグルタミン酸作動性神経伝達のレギュレーションの破壊は、統合失調症、発作性疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症に関与している。したがって、ＰＳＭＡの阻害は、グルタミン酸塩を減少させ、及びα−ＮＡＡＧを増加させることにより潜在的に神経保護を与える。例えば、ｎＭ以下の阻害剤２−（ホスホノメチル）ペンタン二酸は、細胞培養、及び／又は、血流不全、糖尿病性神経障害、薬物乱用、慢性疼痛、及び筋萎縮性側索硬化症の動物モデルにおいて神経保護を提供することがわかっている。
【００２９】
前立腺癌は、最も一般的なタイプの癌であり、アメリカ人男性の癌による主要な死因の１つである。高齢者の人口の増加と早期診断のきっかけとなるこの疾患に対する意識の高まりの結果、前立腺癌と診察された人の数は着実に増えている。前立腺癌を進行させる人の寿命リスクは、白人で約５人に１人、アフリカ系アメリカ人で６人に１人である。リスクの高いグループは、前立腺癌の陽性の家系又はアフリカ系アメリカ人のグループでによって表わされる。生涯にわたって、前立腺癌と診察された人の３分の２以上がその病気で死ぬ。さらに、前立腺癌では死なない多くの患者は、疼痛、出血、及び尿路閉塞などの症状を改善するために継続的な処置を必要とする。したがって、前立腺癌はさらに、苦痛と健康管理の出費の増加の主要な原因を表わす。前立腺癌が局在化され、患者の平均寿命が１０年以上である場合、前立腺全摘出術はその病気の根絶のために最良の機会を与える。歴史上、この手術の欠点は、ほとんどの癌が、検知される時までに手術の限界を越えて広がっていたということである。塊の高悪性度の腫瘍を抱える患者は前立腺全摘出術による処置が成功に終わる見込みは少ない。放射線治療も前立腺全摘出術の代わりとして広く使用されている。放射線治療によって一般に処置される患者は、高齢であまり健康ではなく、グレードの高い臨床的に進行した腫瘍を抱えている人々である。とりわけ好ましい処置は、放射線場が処置される組織の量に一致するように設計されている、３次元の共焦点放射線療法を含む外部光線療法；超音波ガイダンスを使用して放射性化合物のシードが注入される、組織内照射；及び、外部光線療法と組織内照射の組み合わせである。局所的に進行性の疾患を抱える患者の処置については、前立腺全摘出術あるいは放射線治療の前又は後に、ホルモン療法が利用されている。ホルモン療法は播種性の前立腺癌を抱える人を処置するための主要な形態である。睾丸摘出は血清テストステロン濃度を減少させるが、エストロゲン処置は同様に有益である。エストロゲンからのジエチルスチルベストロールは、心臓血管毒性を引き起こすという欠点を抱える別の有用なホルモン療法である。ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストが投与されると、テストステロン濃度は最終的に減少する。フルタミドと他の非ステロイド性の抗アンドロゲン薬剤は、その細胞内受容体へのテストステロンの結合を阻む。その結果、それは、テストステロンの効果を遮断し、血清テストステロン濃度を増加させて、患者の性的能力を維持する−−前立腺全摘出術と放射線処理の後の重大な問題。細胞毒性化学療法は、前立腺癌を処置する際には大部分が効果がない。その毒性が原因でこの治療は高齢の患者には適さない。加えて、前立腺癌は細胞毒性薬に対する耐性が比較的強い。再発性又は進行性の疾患も抗アンドロゲン治療で処置される。不運なことに、ほとんどすべての腫瘍がホルモン耐性を有するようになり、任意の有効な治療がない状態で急速に進行する。これに応じて、患者の正常組織に圧倒的に毒性ではなく、前立腺癌細胞を選択的に除去するのに効果的な前立腺癌のための有効な治療が必要とされている。本開示は、特定の実施形態において、前立腺癌を処置するのに役立つＰＳＭＡ結合タンパク質を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を使用する免疫療法によって前立腺癌を処置する方法を提供する。
【００３０】
さらに、前立腺特異的膜抗原スクリーニング方法は多くの偽陽性に関連することから、前立腺癌を診断するのは困難である。これに応じて、幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を使用して、前立腺癌を検知する改良された方法を提供する。
【００３１】
ＰＳＭＡ結合タンパク質
特定の実施形態において、ＰＳＭＡタンパク質に結合する、抗ＰＳＭＡ抗体又は抗体変異体などの結合タンパク質が本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、ＰＳＭＡタンパク質は多量体である。ＰＳＭＡタンパク質多量体は、本明細書で使用されるように、少なくとも２つのＰＳＭＡタンパク質あるいはその断片のタンパク質複合体である。ＰＳＭＡタンパク質多量体は、完全長のＰＳＭＡタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、組み換えの溶解可能なＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸４４−７５０））、及び、（つまり、ＰＳＭＡの二量体及び／又は高次の多量体の形成に必要なタンパク質ドメインを保持する）多量体を形成する前述の断片の様々な組み合わせから構成され得る。幾つかの実施形態において、多量体を形成するＰＳＭＡタンパク質の少なくとも１つは、組み換えの溶解可能なＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）ポリペプチドである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡタンパク質多量体は、組み換えの溶解可能なＰＳＭＡタンパク質から形成されたものなどの二量体である。幾つかの実施形態において、ｒｓＰＳＭＡはホモダイマーである。いかなる特定の理論によっても束縛されることなく、本明細書で言及されるＰＳＭＡタンパク質多量体は、固有立体配座を取ると信じられており、好ましくは、そのような立体配座を持つと信じられている。ＰＳＭＡタンパク質は、特定の実施形態では、ＰＳＭＡタンパク質多量体を形成するために一緒に非共有結合される。例えば、ＰＳＭＡタンパク質が非変性条件下で二量体を形成するために非共有結合することが分かっている。ＰＳＭＡタンパク質多量体はＰＳＭＡの活性を保持することができ、好ましくはＰＳＭＡの活性を保持する。ＰＳＭＡタンパク質の活性は、特定の実施形態では、葉酸ヒドロラーゼ活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ活性、及びγ−グルタミルヒドロラーゼ活性などの酵素活性である。多量体のＰＳＭＡ活性を試験するための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ：  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｌ．  Ｗ．  Ｋ．  Ｃｈｕｎｇ，  Ｗ．  Ｂ．  Ｉｓａａｃｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｗ．  Ｓｉｍｏｎｓ  （ｅｄｓ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  ２０００，  ｐｐ．  ３０７−３２６によって精査される）。
【００３２】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡタンパク質あるいはＰＳＭＡタンパク質多量体と結合する本開示の結合タンパク質は、ＰＳＭＡタンパク質あるいはＰＳＭＡタンパク質多量体の酵素活性を調節する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸ヒドロラーゼ活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、γ−グルタミルヒドロラーゼ活性、あるいはこれらの組み合わせなどの少なくとも１つの酵素活性を阻害する。他の実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸ヒドロラーゼ活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、γ−グルタミルヒドロラーゼ活性、あるいはこれらの組み合わせなどの少なくとも１つの酵素活性を増強する。
【００３３】
本明細書で使用されるように、用語「抗体変異体」は、本明細書に記載される抗体の変異体及び誘導体を指す。ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡ抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の結合親和性及び／又は他の生体特性を改善するために企図される。アミノ酸変異体を調製する例示的な方法は、限定されないが、抗体をコードするヌクレオチド配列へ、あるいはペプチド合成によって、適切な修飾を導入することを含む。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入及び／又はの置換を含む。
【００３４】
最終構築物に到達するために、あらゆる欠失、挿入、及び置換の組み合わせをつくることができるが、ただし、最終構築物は所望の特徴（例えば、抗原−結合）を有する。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象部位はＣＤＲとフレームワーク領域を含む。そのような置換の例が以下に記載される。アミノ酸置換は、所望の抗体に導入されてもよく、所望の活性（例えば、保持された／改善された抗原結合、減少した免疫原性、あるいは改善された抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ））についてスクリーニングされた生成物へ導入されてもよい。保守的及び非保存的なアミノ酸置換は抗体変異体の調製について企図される。
【００３５】
変異体抗ＰＳＭＡ抗体を作成する置換の別の例では、親抗体の１つ以上超可変領域残基が置換されている。概して、変異体は、親抗体と比較して、所望の特性の改善、例えば、親和性の増加、親和性の減少、免疫原性の減少、ｐＨ依存性の結合の増加に基づいて、選択される。例えば、親和性成熟変異体抗体は、例えば、本明細書に記載される技術や当該技術分野で知られている技術などのファージディスプレーベースの親和性成熟技術を用いて、生成可能である。
【００３６】
置換は、変異体を生成するために親抗ＰＳＭＡ抗体の超可変領域（ＨＶＲ）で行うことができ、変異体は結合親和性に基づき、つまり、親和性成熟によって選択される。親和性成熟の幾つかの実施形態において、多様性は、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、あるいはオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発）のいずれかによって成熟について選択されたバリアブル遺伝子へ導入される。その後、第２のライブラリが作成される。その後、ライブラリは所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法はＨＶＲ方向アプローチを含み、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、ある時点で４−６の残基）が無作為化される。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニン走査突然変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定されることがある。置換は、親抗体配列内の１、２、３又はそれ以上の部位にあり得る。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡに特異的な、ラクダ科の動物由来のｓｄＡｂの重鎖変数ドメイン（ＶＨ）、可変ドメイン（ＶＨＨ）、ペプチド、リガンド、又は少分子実態などの単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質のＰＳＭＡ結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含むＰＳＭＡに結合する任意のドメインである。特定の実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はペプチドである。さらなる実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は小分子である。
【００３８】
一般に、単一ドメイン抗体との用語は、その最も広い意味で本明細書で使用されるように、特定の生体源あるいは特定の調製方法に限定されないことに着目されたい。例えば、幾つかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、（１）自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインの隔離；（２）自然発生のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現；（３）自然発生のＶＨＨドメインの「ヒト化」、あるいはそのようなヒト化されたＶＨＨドメインをコードする核酸の発現；（４）任意の動物種に由来する、及び、とりわけ人間などからの哺乳動物の種からの自然発生のＶＨドメインの「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」、あるいは、そのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現；（５）「ドメイン抗体」又は「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、あるいはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現；（６）タンパク質、ポリペプチド、あるいは他のアミノ酸配列を調製するための合成技術又は半合成技術の使用；（７）当該技術分野で知られている技術を使用して単一ドメイン抗体をコードする核酸の調製と、その後の、得られる核酸の発現；及び／又は、（８）前述の１つ以上の任意の組み合わせ、によって、得られる。
【００３９】
１つの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＰＳＭＡに対して向けられた自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、そのようなＶＨＨ配列は通常、ＰＳＭＡ（つまり、上げるために、１つの、ＰＳＭＡに対して方向付けられた免疫応答及び／又は重鎖抗体）を有するラクダ科の動物の種を適切に免疫することにより、ラクダ科の動物由来の適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、又はＢ細胞のサンプル）を得ることにより、及び、当該技術分野で知られているあらゆる適切な技術を用いて上記サンプルから始まるＰＳＭＡに対して向けられたＶＨＨ配列を生成することにより、生成又は入手可能である。
【００４０】
別の実施形態において、ＰＳＭＡに対するそのような自然発生のＶＨＨドメインは、ラクダ科の動物のＶＨＨ配列の未処理のライブラリから、例えば、ＰＳＭＡ、あるいは、当該技術分野で知られている少なくとも１つのスクリーニング技術を用いて、その少なくとも１つの部分、断片、抗原決定基、あるいはエピトープを使用してそのようなライブラリをスクリーニングすることによって、得られる。そのようなライブラリ及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載される。代替的に、未処理のＶＨＨライブラリに由来する改善された合成又は半合成のライブラリが使用される。例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるような  無作為の突然変異誘発及び／又はＣＤＲシャッフリングなどの技術によって、未処理のＶＨＨライブラリから得られたＶＨＨライブラリなどである。
【００４１】
さらなる実施形態において、ＰＳＭＡに対して方向付けられたＶＨＨ配列を得るためのさらに別の技術は、当該技術分野で知られているあらゆる適切な技術を使用して、（つまり、１つの、ＰＳＭＡに対して方向付けられた免疫応答及び／又は重鎖抗体を産生するために）重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫すること、上記トランスジェニック哺乳動物から適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及び、上記サンプルから開始して、ＰＳＭＡに対して方向付けられたＶＨＨ配列を生成することを含む。例えば、この目的のために、重鎖抗体発現ラット又はマウス、及びＷＯ０２／０８５９４５とＷＯ０４／０４９７９４に記載されるような方法と技術を使用することができる。
【００４２】
幾つかの実施形態において、単一ドメインＰＳＭＡ抗体は、本明細書に記載されるように、自然発生のＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化している」、つまり、上記自然発生のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中（及び、とりわけ、フレームワーク配列内）の１つ以上のアミノ酸残基を、（例えば、上に示すような）ヒト由来の従来の４−鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上に置き換えることによって、アミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む。これは、例えば、さらに以下の記載に基づいて、当業者に明らかな当該技術分野で知られているやり方で実施可能である。再度、本開示のそのようなヒト化された抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体がそれ自体で知られている任意の適切なやり方で得られ（つまり、上のポイント（１）−（８）で示されたように）、従って、出発物質として自然発生のＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密には限定されない。幾つかのさらなる実施形態では、単一ドメインＰＳＭＡ抗体は、本明細書に記載されるように、自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」、つまり、従来の４−鎖抗体からの自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上に置き換えることによって、アミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む。そのような「ラクダ化」置換は好ましくは、ＶＨ−ＶＬ界面及び／又はいわゆるラクダ科に顕著な残基を形成するか、ならびに／あるいは、そこに存在する、アミノ酸位置に挿入される（例えば、ＷＯ  ９４／０４６７８とＤａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  （１９９４と１９９６）を参照）。好ましくは、ラクダ化単一ドメインを生成又は設計するための出発物質又は出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかしながら、特定の実施形態では、本開示のそのようなラクダ化抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体、当該技術分野で知られているやり方（つまり、上のポイント（１）−（８）で示されように）で得られ、したがって、出発物質としての自然発生のＶＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密には限定されないということに注意されたい。例えば、本明細書にさらに記載されるように、「ヒト化」及び「ラクダ化」の両方は、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供し、及び、その後、新しいヌクレオチド配列が「ヒト化」又は「ラクダ化」単一ドメイン抗体をそれぞれコードするようなやり方で提供されたヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変えることによって、実行される。その後、この核酸は、本開示の所望の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体を提供するために発現可能である。代替的に、他の実施形態では、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づいて、本開示の所望のヒト化又はラクダ化抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体のそれぞれのアミノ酸配列が設計され、その後、ペプチド合成の既知の技術を用いてデノボ合成される。幾���かの実施形態において、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインのアミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列にそれぞれ基づいて、本開示の所望のヒト化又はラクダ化抗ＰＳＭＡ短鎖抗体のそれぞれをコードするヌクレオチド配列が設計され、その後、核酸合成の既知の技術を用いてデノボ合成され、その後、本開示の所望の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体を得るために、このように得られた核酸を、既知の発現技術を用いて発現させる。
【００４３】
自然発生のＶＨ配列又はＶＨＨ配列から開始して、本開示の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体及び／又はこの抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体をコードする核酸を得るための他の適切な方法及び技術は、本開示の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体あるいはこれをコードするヌクレオチド配列又は核酸を提供するために、適切なやり方で、例えば、１つ以上の自然発生のＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）配列及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）配列など）、１つ以上の自然発生のＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列あるいはＣＤＲ配列など）、及び／又は、１つ以上の合成又は半合成の配列を組み合わせることを含む。
【００４４】
実施形態によっては、ＰＳＭＡ結合タンパク質はかなり小さく、実施形態によっては、わずか２５ｋＤ、わずか２０ｋＤ、わずか１５ｋＤ、又はわずか１０ｋＤであることが企図される。特定の例において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ペプチド又は小分子の実体である場合に５ｋＤ以下である。
【００４５】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、重鎖可変相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、重鎖可変ＣＤＲ３、軽鎖可変ＣＤＲ１、軽鎖可変ＣＤＲ２、及び軽鎖可変ＣＤＲ３を含む抗ＰＳＭＡ特異的抗体を含む。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、あるいは抗原結合フラグメントからのドメインを含む、ＰＳＭＡに結合する任意のドメインを含み、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、ならびに１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体である。幾つかの例では、ＰＳＭＡ結合タンパク質が本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＰＳＭＡ結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒト又はヒト化残基を含めることが、ＰＳＭＡ結合タンパク質のＰＳＭＡ結合ドメインに有益なことがある。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、重鎖可変ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、及び重鎖可変ＣＤＲ３を含む、抗ＰＳＭＡ特異的結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、重鎖可変ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、及び重鎖可変ＣＤＲ３を含む、抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体である。
【００４６】
幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４によって表わされるように、３つの相補性決定領域／配列によって中断された４つのフレームワーク領域／配列（ｆ１−ｆ４）で構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、式中、ｒ１、ｒ２、及びｒ３はそれぞれ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質のフレームワーク残基は、例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１のアミノ酸残基と、相補性決定領域、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６のアミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、フレームワーク残基と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で記載されるアミノ酸配列を含み、（ａ）ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で記載されるアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含み、（ｂ）ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で記載される配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含み、及び、（ｃ）ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で記載される配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００４７】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、フレームワーク残基と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で記載されるアミノ酸配列を含み、（ａ）ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で記載されるアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含み、（ｂ）ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で記載される配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含み、及び、（ｃ）ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で記載される配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００４８】
ＰＳＭＡ結合タンパク質のＣＤＲ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で記載されるアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含む実施形態において、そのような置換は例えば、プロリン、ヒスチジンを含む。ＰＳＭＡ結合タンパク質のＣＤＲ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で記載されるアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含む実施形態において、そのような置換は例えば、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、チロシンを含む。
【００４９】
ＰＳＭＡ結合タンパク質のＣＤＲ３が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で記載されるアミノ酸配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８中に１つ、２つ、３つ、あるいは４つのアミノ酸置換を有する変異体を含む実施形態において、そのような置換は例えば、セリンを含む。
【００５０】
幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４を含み、式中、ｒ１、ｒ２、及びｒ３はそれぞれ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基であり、ｒ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含み、ｒ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含み、及び、ｒ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は以下の式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４を含む単一ドメイン抗体であり、式中、ｒ１、ｒ２、及びｒ３はそれぞれ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基であり、ｒ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であり、ｒ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であり、及び、ｒ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５である。
【００５１】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載される通りである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載される通りである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載される通りである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りである。
【００５２】
幾つかの実施形態において、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及びＸ７は、グルタミン酸、プロリン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン酸、グリシン、リジン、トレオニン、グルタミン、及びチロシンから独立して選択される。幾つかの実施形態において、Ｘ１はプロリンである。幾つかの実施形態では、Ｘ２はヒスチジンである。幾つかの実施形態において、Ｘ３はアスパラギン酸である。幾つかの実施形態では、Ｘ４はリジンである。幾つかの実施形態では、Ｘ５はグルタミンである。幾つかの実施形態では、Ｘ６はチロシンである。幾つかの実施形態では、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。
【００５３】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ１はプロリンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ５はグルタミンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ６はチロシンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ４はセリンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はセリンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ１はピロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンであり、Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）に記載される通りであり、（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）に記載される通りであり、及び、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＤＸ７ＹＧＹ）に記載される通りであり、ここで、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである。
【００５４】
本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はトレオニンであり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はトレオニンであり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はセリンであり、Ｘ３はトレオニンであり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はセリンであり、Ｘ３はトレオニンであり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はグリシンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はセリンであり、Ｘ３はトレオニンであり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はグリシンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はセリンであり、Ｘ３はトレオニンであり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はグリシンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はグルタミンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はセリンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸であり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はトレオニンであり、Ｘ６はチロシンであり、及び、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むことがあり、ここで、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ７はセリンである。例示的なフレームワーク配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５−１６８として開示される。
【００５５】
幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、以下の任意の組み合わせを含む：（ｉ）Ｘ１はプロリンである；（ｉｉ）Ｘ２はヒスチジンである；（ｉｉｉ）Ｘ３はアスパラギン酸である；（ｉｖ）Ｘ４はリジンである；（ｖ）Ｘ５はグルタミンである；（ｖｉ）Ｘ６はチロシンである；及び、（ｖｉｉ）Ｘ７はセリンである。幾つかの実施形態において、上記の実施形態の前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載される配列を有する結合タンパク質のものよりもヒト前立腺特異的膜抗原に対する高い親和性を有する。幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合は、以下の任意の組み合わせを含む：（ｉ）Ｘ１はプロリンである；ここで、Ｘ５はグルタミンである；（ｉｉ）Ｘ６はチロシンである；ここで、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである；（ｉｉｉ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである；（ｉｖ）Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである；（ｖ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ７はセリンである；（ｖｉ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ４はリジンであり、Ｘ７はセリンである；（ｖｉｉ）Ｘ１はプロリンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである（ｖｉｉｉ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ５はグルタミンであり、Ｘ７はセリンである；（ｉｘ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンであり、Ｘ７はセリンである；及び、（ｘ）Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はアスパラギン酸であり、Ｘ７はセリンである。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される通りのアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される通りのアミノ酸配列を有し、ここで、１つ以上のアミノ酸位置が置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置１９、８６、８７、及び１０６の１つ以上が置換される。アミノ酸位置１９、８６、８７、及び１０６の例示的な置換は、限定されないが、Ｔ１９Ｒ、Ｋ８６Ｒ、Ｐ８７Ａ、及びＱ１０６Ｌを含む。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３１、３３、５０、５５、５６、６２、及び９７の１つ以上が置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３１はＥ３１Ｐとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３はＳ３３Ｈとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置５０はＴ５０Ｄとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置５５はＧ５５Ｋとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置５６はＴ５６Ｑとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置６２はＳ６２Ｙとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置９７はＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３はＳ３３Ｈとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３１でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置５０及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３１、５０、及び９７はそれぞれ、Ｅ３１Ｐ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置５０及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３、５０、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置５０、５５、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３、５０、５５、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、Ｇ５５Ｋ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置３１、５０、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３１、３３、５０、及び９７はそれぞれ、Ｅ３１Ｐ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は���位置５０、５６、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３、５０、５６、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、Ｔ５６Ｑ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置５０、６２、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３、５０、６２、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、Ｓ６２Ｙ、及びＧ９７Ｓとして置換される。
【００５７】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載される通りのアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載される通りのアミノ酸配列を有し、ここで、１つ以上のアミノ酸位置が置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３１、３３、５０、５５、５６、６２、及び９７の１つ以上が置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３１はＥ３１Ｐとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３３はＳ３３Ｈとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置５０はＴ５０Ｄとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置５５はＧ５５Ｋとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置５６はＴ５６Ｑとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置６２はＳ６２Ｙとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置９７はＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３３はＳ３３Ｈとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３１でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の置換は、位置５０及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３１、５０、及び９７はそれぞれ、Ｅ３１Ｐ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の置換は、位置９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３３及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の置換は、位置５０及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３３、５０、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の置換は、位置５０、５５、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３３、５０、５５、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、Ｇ５５Ｋ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の置換は、位置３１、５０、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３１、３３、５０、及び９７はそれぞれ、Ｅ３１Ｐ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓとして置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の置換は、位置５０、５６、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸位置３３、５０、５６、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、Ｔ５６Ｑ、及びＧ９７Ｓと���て置換される。幾つかの実施形態において、位置３３でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換は、位置５０、６２、及び９７での置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３、５０、６２、及び９７はそれぞれ、Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、Ｓ６２Ｙ、及びＧ９７Ｓとして置換される。
【００５８】
幾つかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原結合タンパク質は、以下の任意の組み合わせを含む：（ｉ）位置３１での置換；（ｉｉ）位置５０での置換；（ｉｉｉ）位置５５での置換；位置５６での置換；（ｉｖ）位置６２での置換；（ｖ）位置９７での置換；（ｖｉ）位置５５及び９７での置換；（ｖｉｉ）位置３３及び９７での置換；（ｖｉｉｉ）３３、５０、及び９７の置換；（ｉｘ）位置３１、３３、５０、及び９７での置換；（ｘ）位置３３、５０、５５、及び９７での置換；（ｘｉ）位置３３、５０、５６、及び９７での置換；ならびに、（ｘｉｉｉ）位置３３、５０、６２、及び９７での置換。
【００５９】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ヒトとカニクイザルのＰＳＭＡと交差反応する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はヒトＰＳＭＡに特異的である。様々な実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一である。
【００６０】
様々な実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一である。
【００６１】
様々な実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質の相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一である。
【００６２】
様々な実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質の相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一である。
【００６３】
様々な実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質の相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一である。
【００６４】
ヒト化及び親和性の成熟
治療用途のための結合タンパク質の設計において、例えば、標的の機能的活性を調節するタンパク質、及び／又は、より高い特異性を持つ結合タンパク質、及び／又は特定の細胞又は組織環境においてより生物利用可能で、安定し、又は可溶性である結合タンパク質などの改善された結合タンパク質を作成することが望ましい。
【００６５】
本開示に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡである標的結合ドメインに対する結合親和性の改善を示す。本開示は、ヒト及びカニクイザルのＰＳＭＡの何れか又は両方に対する高い結合親和性をもたらす、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質の相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるアミノ酸置換を同定する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は抗体である。特定の実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はヒト化抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ又はＣＤＲの部分が非ヒト抗体由来であり、フレームワーク領域又はフレームワーク領域の部分がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。随意に、ヒト化抗体はヒト定常領域の少なくとも一部も含む。幾つかの実施形態において、選択されたフレームワーク残基は、例えば、抗体の得意性、親和性、又はｐＨ依存性を修復する又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲが由来する抗体）からの対応する残基で置換される。ヒト化のために使用可能なヒトフレームワーク領域は、限定されないが、最良適合法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６，  １９９３）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９：４２８５，  １９９２；  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５１：２６２３，  １９９３）；ヒト成熟（身体的に突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３：１６１９−１６３３，  ２００８）；及びスクリーニングフレームワークライブラリに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１０６７８−１０６８４，  １９９７；  ａｎｄ  Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２２６１１−２２６１８，  １９９６））を含む。故に、１つの態様において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は含む、ヒト化又はヒト抗体、或いは抗体フラグメントを含む。１つの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化又はヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、及び／又は、本明細書に記載されるヒト化又はヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含み、例えばヒト化又はヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、１つ以上の、例えば３つ全てのＬＣ  ＣＤＲと、１つ以上の、例えば３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含む。幾つかの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、ＰＳＭＡに特異的なヒト化又はヒト軽鎖可変領域を含み、ここでＰＳＭＡに特異的な軽鎖可変領域はヒ��軽鎖フレームワーク領域中のヒト又は非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例において、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例において、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。幾つかの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＰＳＭＡ結合ドメインは、ＰＳＭＡに特異的なヒト化又はヒト重鎖可変領域を含み、ＰＳＭＡに特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域中のヒト又は非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。特定の例において、重鎖及び／又は軽鎖の相補性決定領域は、例えば７Ｅ１１、ＥＰＲ６２５３、１０７．１Ａ４、ＧＣＰ−０５、ＥＰ３２５３、ＢＶ９、ＳＰ２９、ヒトＰＳＭＡ／ＦＯＬＨ１／ＮＡＡＬＡＤａｓｅ  Ｉ抗体などの既知の抗ＰＳＭＡ抗体に由来する。
【００６６】
本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、標的結合ドメインに対するその結合親和性を増大させるために成熟される親和性である。上述のＣＤＲの１つ以上を含む、抗ＰＳＭＡ抗体などの本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質の親和性を改善することが望まれる場合、親和性が改善されたそのような抗体は、多数の成熟プロトコル、限定されないが、ＣＤＲの維持、鎖のシャフリング、大腸菌の突然変異菌株の使用、ＤＮＡシャフリング、ファージディスプレイ、及び生殖（ｓｅｘｕａｌ）によって得られる場合がある。親和性成熟の上方の例示的な方法は、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １６，  ５３５−５３９，  １９９８）によって議論されている。故に、前述の段落で議論されたＰＳＭＡ結合タンパク質変異体に加えて、本開示は更に、標的、即ちＰＳＭＡに対する結合タンパク質の親和性を改善する配列変異体を提供する。特定の実施形態において、そのような配列変異体は、ＰＳＭＡ結合タンパク質配列内の１つ以上の半保存的又は保存的置換を含み、そのような置換は、結合タンパク質の望ましい活性に有意に影響を与えないことが好ましい。置換は自然に発生する、又は、例えば突然変異生成（例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５３：６５５１）を使用して導入されてもよい。例えば、アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンは頻繁に、互いに置換されてもよい（脂肪族側鎖を持つアミノ酸）。これら起こり得る置換において、典型的にはグリシン及びアラニンが、比較的短い側鎖を持つことから互いの置換に使用され、バリン、ロイシン、及びイソロイシンは、疎水性である、より大きな脂肪族側鎖を持つことから互いの置換に使用される。互いに頻繁に置換され得る他のアミノ酸は、限定されないが：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を持つアミノ酸）；リジン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を持つアミノ酸）；アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩（酸性側鎖を持つアミノ酸）；アスパラギン、及びグルタミン（アミド側鎖を持つアミノ酸）；並びにシステイン、及びメチオニン（硫黄含有側鎖を持つアミノ酸）を含む。
【００６７】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、組み合わせライブラリをスクリーニングすることにより、例えば、ファージディスプレイライブラリを生成すること、且つ望ましい結合特徴を持つ抗体に対してそのようなライブラリをスクリーニングすることにより、単離される。更に、その結合標的に対するＰＳＭＡ結合タンパク質の結合親和性は、特定のＰＳＭＡアルブミン結合タンパク質中の特定の消失半減期を標的とするように選択され得る。故に、幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はその結合標的に対して高い結合親和性を有する。他の実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はその結合標的に対して中程度の結合親和性を有する。また他の実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はその結合標的に対して低い又は中程度の結合親和性を有する。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高い）の、１０ｎＭ〜１００ｎＭの間（中程度）の、及び１００ｎＭを超える（低い）Ｋｄを含む。ＰＳＭＡに結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に表示された；溶液中などの、結合タンパク質自体の、又はＰＳＭＡに結合するそのＰＳＭＡ結合ドメインの能力によって、決定することができる。ＰＳＭＡに対する本開示のタンパク質の結合活性も、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えばＰＳＭＡ）、或いは前記結合タンパク質自体又はそのＰＳＭＡ結合ドメインを固定することによって分析され得る。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質自体又はそのＰＳＭＡ結合ドメインと、標的リガンド（ＰＳＭＡなど）との結合は、例えば結合動力学アッセイによって決定することができる。結合動力学アッセイは、特定の実施形態において、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムを使用して行なわれる。そのような実施形態において、第１の工程は、最適な装填密度でバイオセンサ（例えばストレプトアビジンバイオセンサ）の表面上へとリガンド（例えばビオチン化ＰＳＭＡ）を固定する工程であって、その後、結合していないリガンドを取り除くためのアッセイバッファーにより洗浄し、その後、分析物、即ちＰＳＭＡ結合タンパク質自体、又はリガンドを有するそのＰＳＭＡ結合ドメインを会合し、その後、分析物を含まないバッファーにバイオセンサをさらし、その結果、リガンドからのＰＳＭＡ結合タンパク質自体又はそのＰＳＭＡ結合ドメインの解離をもたらす、工程を含む。ＢＳＡ、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＥＧ、ゼラチンなどの適切な遮断薬は、バイオセンサ上の非特異的結合部位を遮断するために使用される。結合動力学データは後に、ＰＳＭＡ結合タンパク質自体又はそのＰＳＭＡ結合ドメインとリガンドとの結合相互作用に対する会合及び解離速度定数を決定するのに適切なソフトウェア（例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ  Ｏｃｔｅｔのソフトウェア）を使用して、分析される。
【００６８】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＰＳＭＡに結合する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＰＳＭＡに結合する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＰＳＭＡと、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＰＳＭＡとに結合する。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約４５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約４００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約３５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約３００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約１５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約９０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．２ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．３ｎＭ〜約７０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．４ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．５ｎＭ〜約３０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．６ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．７ｎＭ〜約８ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．８ｎＭ〜約６ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．９ｎＭ〜約４ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約１ｎＭ〜約２ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、同等の結合親和性（Ｋｄ）を備えたヒト及びカニクイザルのＰＳＭＡに結合する。
【００６９】
幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に述べられるような配列を含み、約１０ｎＭ〜約２０ｎＭのｈＫｄを有する。幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３１においてグルタミン酸からプロリンへの突然変異を含み、約５ｎＭ〜約１０ｎＭのｈＫｄを有する。幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置５６においてトレオニンからグルタミンへの突然変異を含み、約１ｎＭ〜約７ｎＭのｈＫｄを有する。幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置５５においてグリシンからリジンへの突然変異を含み、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのｈＫｄを有する。幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３においてセリンからヒスチジンへの突然変異、アミノ酸位置５０においてトレオニンからアスパラギン酸への突然変異、及びアミノ酸位置９７においてグリシンからセリンへの置換を含み、約５ｎＭ〜約１０ｎＭのｈＫｄを有する。幾つかの実施形態において、本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置３３においてセリンからヒスチジンへの突然変異、及びアミノ酸位置９７においてグリシンからセリンへの置換を含み、約０．０５ｎＭ〜約２ｎＭのｈＫｄを有する。故に、様々な実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に述べられるような配列と比較して１つ以上の置換を含むＰＳＭＡ結合タンパク質は、置換のないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含むタンパク質よりも１．５〜約３００倍高いヒトＰＳＭＡに対する結合親和性を持つ。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換がＥ３１Ｐを含むと、結合親和性は約１．５〜約３倍高く；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換がＴ５６Ｑを含むと、約２〜約１５倍高く；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換がＧ５５Ｋを含むと、約３〜約３０倍高く；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換がＳ３３Ｈ  Ｔ５０Ｄ  Ｇ９７Ｓを含むと、約２〜約３倍高く；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の置換がＳ３３Ｈ  Ｇ９７Ｓを含むと、約５〜約３００倍高い。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の１つ以上アミノ酸置換は、上述のように、ヒト及びカニクイザル両方のＰＳＭＡ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸置換Ｓ３３Ｈ及びＧ９７Ｓを含む本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質に対する結合親和性の増強をもたらし、置換のないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含むタンパク質と比較して、ヒト及びカニクイザルＰＳＭＡに対する親和性が増大したことを示す。そのような二重親和性増強の更なる例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸置換Ｓ３３Ｈ、Ｔ５０Ｄ、及びＧ９７Ｓを含むＰＳＭＡ結合タンパク質の場合に見られる。幾つかの実施形態において、前述のＰＳＭＡ結合タンパク質の何れか（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１−３２の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体）は、精製の容易さのためにタグ付けされる親和性ペプチドである。幾つかの実施形態において、親和性ペプチドタグは、６ｈｉｓとも称される、６つの連続するヒスチジン残基である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）。
【００７０】
本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質、例えば抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体の結合親和性も、相対語において、或いは、ＰＳＭＡにも特異的に結合する第２の結合タンパク質（例えば、「第２のＰＳＭＡ特異的抗体」とも本明細書で称される、ＰＳＭＡに特異的である第２の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体）の結合親和性と比較して、記載され得る。幾つかの実施形態において、第２のＰＳＭＡ特異的抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１−３２に定められる結合タンパク質などの、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質変異体の何れかである。従って、本開示の特定の実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の結合タンパク質よりも高い親和性、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の結合タンパク質のＫｄよりも低いＫｄを持つ、ヒトＰＳＭＡ及び／又はカニクイザルＰＳＭＡに結合する、抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体に関連する。本開示の更なる実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の結合タンパク質よりも高い親和性、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の結合タンパク質のＫｄよりも低いＫｄによりヒトＰＳＭＡ及び／又はカニクイザルＰＳＭＡに結合する抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体に関係がある。
【００７１】
ＣＤ３結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体によって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣの文脈で表示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。Ｔ細胞受容体複合体を含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、Ｔ細胞受容体複合体のα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と共に会合する。固定された抗ＣＤ３抗体などによるＴ細胞上でのＣＤ３のクラスター形成は、Ｔ細胞受容体の結合と同様であるがそのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化を引き起こす。
【００７２】
１つの態様において、本開示に係るＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質が、本明細書に記載される。幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを更に含む。幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを更に含む。幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインを更に含む。幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを更に含む。更なる実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合するドメインを更に含む。幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＴＣＲのα鎖に特異的に結合するドメインを更に含む。幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖に特異的に結合するドメインを更に含む。
【００７３】
幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は更に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのバルク血清タンパク質に特異的に結合するドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１４６からなる群から選択された配列を含む。
【００７４】
幾つかの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子又はＰＳＭＡ三重特異性分子或いは三重特異性分子とも本明細書で称される、ＰＳＭＡ標的化三重特異性抗原結合タンパク質である。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。例によっては、多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。
【００７６】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に結合するドメインを含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はＣＤ３結合抗体の抗原結合フラグメント、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、並びに１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体からのドメインが含まれるがこれらに限定されない。幾つかの例において、本明細書に記載される単一ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが、ＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトに使用するために、抗体又は抗体フラグメントのＰＳＭＡ結合ドメインからのヒト又はヒト化残基を含めることが、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益な場合がある。
【００７７】
故に、１つの態様において、ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒト化又はヒト抗体、或いは抗体フラグメント、もしくはマウスの抗体又は抗体フラグメントを含む。１つの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば３つすべて）の軽鎖相補性決定領域、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、及び／又は、本明細書に記載されるヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば３つすべて）の重鎖相補性決定領域、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、１つ以上の、例えば３つ全てのＬＣ  ＣＤＲ、及び１つ以上の、例えば３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含む。
【００７８】
幾つかの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化又はヒト軽鎖可変領域を含み、ここでＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域中のヒト又は非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例において、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例において、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【００７９】
幾つかの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化又はヒト重鎖可変領域を含み、ここでＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域中のヒト又は非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
【００８０】
特定の例において、重鎖及び／又は軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、ＴＲ−６６、又はＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、及びＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
【００８１】
１つの実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用されるように、「単鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを指し、軽鎖と重鎖の可変領域は、短い適合性の（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）ポリペプチドリンカーによって連続的に結合され、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、及びｓｃＦｖはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。一実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは以下を含む：本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、又は３つの修飾（例えば置換）を含むが、多くとも３０、２０、又は１０の修飾（例えば置換）しか含まないアミノ酸配列、或いは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域；及び／又は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、又は３つの修飾（例えば置換）を含むが、多くとも３０、２０、又は１０の修飾（例えば置換）しか含まないアミノ酸配列、或いは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域。１つの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーによって本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域、或いは重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域。
【００８２】
幾つかの例において、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖは既知の方法に従って調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、適合性のポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨとＶＬの領域を一緒に結合することにより、生成可能である。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を備えるｓｃＦｖリンカー（例えばＳｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。従って、幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＣＤ３結合部位を形成するために、ＶＨ又はＶＬのドメインが他の可変ドメインと分子間で会合することができるような長さである。特定の実施形態において、こうしたｓｃＦｖリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のアミノ酸残基からなる。故に、特定の例において、ｓｃＦｖリンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。幾つかの実施形態において、これらｓｃＦｖリンカーは、約３から約１５、例えば８、９、又は１０の連続的なアミノ酸残基からなる。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸組成に関して、適合性を与え、可変ドメインに干渉せず、同様に、機能的なＣＤ３結合部位を形成するために２つの可変ドメインを接合するための鎖間フォールディングを可能にしないペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリンの残基を含むｓｃＦｖリンカーは一般的にプロテアーゼ耐性を与える。幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖ中のリンカーはグリシンとセリンの残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ３結合とｓｃＦｖの産生収率を改善するためのファージディスプレイ方法によって最適化可能である。ｓｃＦｖ中の可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを結合するのに適切なペプチドｓｃＦｖリンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）、又は（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。１つの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）、又は（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）であり得る。リンカー長さの変動は活性を保持又は増強し、活性研究で優れた有効性をもたらすこともある。
【００８３】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＫＤを持つＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する親和性を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＫＤを持つ、ＣＤ３ε、γ、或いはδに対する親和性を有する。更なる実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性、つまり、約１００ｎＭ以上を有する。
【００８４】
ＣＤ３に結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に表示された；溶液中などの、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質自体又はＣＤ３結合に結合するそのＣＤ３結合ドメインの能力によって、決定することができる。ＣＤ３に対する本開示のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質自体又はそのＣＤ３結合ドメインの結合活性は、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）又はＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質自体或いはそのＣＤ３結合ドメインを固定することにより分析可能である。薬剤は、所定の温度で一定の期間インキュベートされた適切なバッファーと結合パートナーに加えることができる。未結合材料を取り除くために洗浄した後、結合タンパク質は、例えば、ＳＤＳ、高いｐＨのバッファーなどで放出可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析可能である。
【００８５】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−８８）及びそのサブ配列を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−１２２）に対して少なくとも７０％−９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−１２２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−１２２）の少なくとも一部を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−１２２）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。
【００８６】
特定の実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、及び５６−６７を含む重鎖ＣＤＲ１を有するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、及び６８−７７を含む重鎖ＣＤＲ２を有するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、及び７８−８７を含む重鎖ＣＤＲ３を有するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、及び８８−１００を含む軽鎖ＣＤＲ１を有するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、及び１０１−１１３を含む軽鎖ＣＤＲ２を有するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、及び１１４−１２０を含む軽鎖ＣＤＲ３を有するｓｃＦｖを含む。
【００８７】
ＣＤ３に結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に表示された；溶液中などの、ＰＳＭＡ結合タンパク質自体又はＣＤ３結合に結合するそのＣＤ３結合ドメインを含む多特異性タンパク質の能力によって、決定することができる。ＣＤ３に対して本開示に係る、ＰＳＭＡ結合タンパク質自体又はそのＣＤ３結合ドメインを含む多特異性タンパク質の結合活性は、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）、又は前記多特異性タンパク質自体、或いはそのＣＤ３結合ドメインを固定することによりアッセイすることができる。ＣＤ３に結合するための、ＰＳＭＡ結合タンパク質自体又はそのＣＤ３結合ドメインを含む多特異性タンパク質の結合活性は、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）、又は前記多特異性タンパク質自体、或いはそのＰＳＭＡ３結合ドメインを固定することにより決定することができる。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質間と標的リガンド（ＣＤ３など）との結合は、例えば結合動力学アッセイによって決定することができる。結合動力学アッセイは、特定の実施形態において、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムを使用して行なわれる。そのような実施形態において、第１の工程は、最適な装填密度でバイオセンサ（例えばストレプトアビジンバイオセンサ）の表面上へとリガンド（例えばビオチン化ＣＤ３）を固定する工程であって、その後、結合していないリガンドを取り除くためにアッセイバッファーにより洗浄し；その後、分析物、例えば、リガンドを有するＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質を会合し；その後、分析物を含まないバッファーにバイオセンサをさらし、その結果、リガンドからのＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質の解離をもたらす、工程を含む。ＢＳＡ、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＥＧ、ゼラチンなどの適切な遮断薬は、動力学アッセイ中に、バイオセンサ上の非特異的結合部位を遮断するために使用される。結合動力学データは後に、ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質とリガンドとの結合相互作用に対する会合及び解離速度定数を決定するのに適切なソフトウェア（例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ  Ｏｃｔｅｔのソフトウェア）を使用して、分析される。
【００８８】
１つの態様において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメイン（Ａ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合するドメイン（Ｂ）、及びＰＳＭＡに特異的に結合するドメイン（Ｃ）を含む。ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質中の３つのドメインは任意の順序で配置される。故に、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のドメイン順序は以下のとおり企図される：
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、又は
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ。
【００８９】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。
【００９０】
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は中間ドメインとしてＨＳＡ結合ドメインを有し、それによりドメイン順序は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ又はＨ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨである。ＨＳＡ結合ドメインが中間ドメインであるそのような実施形態において、ＣＤ３及びＰＳＭＡ結合ドメインは、それぞれの標的に結合するための追加の適合性を与えられることが、企図される。
【００９１】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７−１５６）及びそのサブ配列を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７−１５６）に対して少なくとも７０％−９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７−１５６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７−１５６）の少なくとも一部を含む配列を有する。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７−１５６）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０における配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７−１５６）に記載されるような１つ以上のＣＤＲを含む。
【００９２】
本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員することによりＰＳＭＡを発現する細胞の特異的な標的化を可能にするように設計される。これは、単独の抗原に向けられた完全長の抗体を使用し且つ細胞傷害性Ｔ細胞を直接動員することができないＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）と比較して、有効性を改善する。対照的に、これら細胞上で特異的に発現されたＣＤ３分子を結合することにより、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、非常に特異的な様式で細胞傷害性Ｔ細胞を、ＰＳＭＡを発現する細胞と架橋することができ、それによって、Ｔ細胞の細胞毒性の可能性を標的細胞へ向けることができる。本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、ＴＣＲの一部を形成する、表面発現されたＣＤ３タンパク質に結合することによって細胞傷害性Ｔ細胞と結合する。特定の細胞の表面上で発現されたＣＤ３及びＰＳＭＡへの様々なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の同時結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、特定のＰＳＭＡ発現細胞の後の溶解を媒介する。故に、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は強力で、特異的で、且つ効率的な標的細胞死滅を表示するように企図される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、病原性細胞（例えばＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞）を排除するために細胞傷害性Ｔ細胞により死滅する標的細胞を刺激する。そのような実施形態の幾つかにおいて、細胞は選択的に排除され、それにより毒性の副作用の可能性が減少する。
【００９３】
本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、従来のモノクローナル抗体及び他の小さな二重特異性の分子を上回る、更なる治療上の利点を与える。一般に、組換えタンパク質医薬品の有効性は、タンパク質自体の内因性の薬物動態学に極度に依存する。こうした利点の一つは、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質が、ＨＳＡに特異的なドメインなどの半減期拡張ドメインを持っていることにより、薬物動態学的消失半減期を延長させたことである。この点で、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、幾つかの実施形態において、約２、３、約５、約７、約１０、又は約１４日の延長された血清消失半減期を有する。このことは、消失半減期が比較的非常に短いＢｉＴＥ又はＤＡＲＴの分子などの他の結合タンパク質とは対照的である。例えば、ＢｉＴＥのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合分子は、消失半減期が短いため持続点滴（静脈内）による薬物送達を必要とする。ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のより長い内因性の半減時間は、この問題を解決し、それにより低用量の医薬製剤、定期的な投与の減少、及び／又は新規な医薬組成物などの治療可能性を増加させる。
【００９４】
本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質はまた、組織への浸透と組織への分布を強化するための最適なサイズを有する。サイズが大きければ、標的組織中でのタンパク質の浸透又は分布が制限されるか或いは妨げられる。本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、組織への浸透と分布を増強する小さなサイズを有することによりこれを回避する。従って、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、幾つかの実施形態において、約５０ｋＤ−約８０ｋＤ、約５０ｋＤ−約７５ｋＤ、約５０ｋＤ−約７０ｋＤ、又は約５０ｋＤ−約６５ｋＤのサイズを有する。故に、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のサイズは、約１５０ｋＤであるＩｇＧ抗体よりも、及び、約５５ｋＤであるが延長された半減期ではなく、且つ故に腎臓で即座に排除されるＢｉＴＥ及びＤＡＲＴ二重特異性抗体分子よりも、都合が良い。
【００９５】
更なる実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、増強された組織への浸透と分布に最適なサイズを有する。これら実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は可能な限り小さくなるように構築され、その一方で、その標的に対する特異性を保持する。従って、これら実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、約２０ｋＤ−約４０ｋＤ、約２５ｋＤ−約３５ｋＤ、約４０ｋＤまで、約４５ｋＤまで、約５０ｋＤまで、約５５ｋＤまで、約６０ｋＤまで、約６５ｋＤまでのサイズを有する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、約５０ｋＤ、４９ｋＤ、４８ｋＤ、４７ｋＤ、４６ｋＤ、４５ｋＤ、４４ｋＤ、４３ｋＤ、４２ｋＤ、４１ｋＤ、４０ｋＤ、約３９ｋＤ、約３８ｋＤ、約３７ｋＤ、約３６ｋＤ、約３５ｋＤ、約３４ｋＤ、約３３ｋＤ、約３２ｋＤ、約３１ｋＤ、約３０ｋＤ、約２９ｋＤ、約２８ｋＤ、約２７ｋＤ、約２６ｋＤ、約２５ｋＤ、約２４ｋＤ、約２３ｋＤ、約２２ｋＤ、約２１ｋＤ、又は約２０ｋＤのサイズを有する。小さなサイズに対する典型的な手法は、ドメインの各々について単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントを使用することによる。例えば、特定のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、ＰＳＭＡに対して抗ＣＤ３  ｓｄＡｂ、抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂ、及びｓｄＡｂを有する。これは、４０ｋＤ未満までに典型的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のサイズを減少させる。故に、幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のドメインは全て単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントである。他の実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、ＨＳＡ及び／又はＰＳＭＡのための小分子実体（ＳＭＥ）バインダーを含む。ＳＭＥバインダーは、平均して約５００〜２０００Ｄａのサイズの小分子であり、ソルターゼ連結反応或いは共役などの既知の方法によってＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質に結合される。これらの例において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のドメインの１つは、ソルターゼ認識配列、例えば、ＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）である。ソルターゼ認識配列を備えたＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質にＳＭＥバインダーを結合させるために、タンパク質はソルターゼとＳＭＥバインダーでインキュベートされ、それによってソルターゼがＳＭＥバインダーを認識配列に結合させる。既知のＳＭＥバインダーは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するＭＩＰ−１０７２とＭＩＰ−１０９５を含む。また他の実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のＰＳＭＡに結合するドメインは、ＰＳＭＡに結合するためのノッチンペプチドを含む。ノッチンは、システインノット足場を備えたジスルフィド安定化ペプチドであり、約３．５ｋＤの平均サイズを有する。ノッチンは、ＰＳＭＡなどの特定の腫瘍分子への結合について企図されてきた。更なる実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のＰＳＭＡに結合するドメインは、天然ＰＳＭＡリガン���を含む。
【００９６】
本明細書に記載される三ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の別の特徴は、それらがドメインの適合性の結合を備えた単一のポリペプチドの設計であるということである。これにより、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の容易な産生と製造が可能になる。なぜなら、これらはベクターに容易に組み入れられる単一のｃＤＮＡ分子によってコード可能であるためである。更に、本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質が単量体の単一のポリペプチド鎖であるので、鎖の対形成の問題がなく、二量体化のための要件もない。本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質は、Ｆｃ−γ免疫グロブリンドメインを備えた二重特異性タンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低下している。
【００９７】
本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質において、ドメインは内部リンカーＬ１とＬ２によって結合され、ここで、Ｌ１は、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の第１と第２のドメインに結合し、Ｌ２はＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の第２と第３のドメインに結合する。リンカーＬ１とＬ２は最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有する。幾つかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は同じ長さとアミノ酸組成を有する。他の実施形態において、Ｌ１とＬ２は異なる。特定の実施形態において、内部リンカーＬ１及び／又はＬ２は「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、或いは１２のアミノ酸残基からなる。故に、特定の例において、内部リンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、内部リンカーはペプチド結合である。特定の実施形態において、内部リンカーＬ１及び／又はＬ２は「長い」、つまり、１５、２０、或いは２５のアミノ酸残基からなる。幾つかの実施形態において、これら内部リンカーは約３〜約１５まで、例えば、８、９、或いは１０の連続したアミノ酸残基からなる。内部リンカーＬ１とＬ２のアミノ酸組成に関して、ペプチドは、ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質に対して適合性を与え、結合ドメインに干渉せず、同様にプロテアーゼからの切断に抵抗しない特性と共に選択される。例えば、グリシンとセリンの残基は一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。ＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質中のドメインの結合に適切な内部リンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）、或いは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）が挙げられ、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。１つの実施形態において、内部リンカーＬ１及び／又はＬ２は、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）、或いは（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）である。
【００９８】
ＰＳＭＡ結合タンパク質修飾
本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによってコードされるものではないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合され、又は、（ｉｉｉ）追加のアミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、或いは免疫原ドメインを遮断するための及び／又はタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合される、誘導体又はアナログを包含する。
【００９９】
典型的な修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解性の加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の付加、及びユビキチン化を含む。
【０１００】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル終端を含む、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質のあらゆる場所で行われる。ＰＳＭＡ結合タンパク質の修飾に役立つ特定の共通したペプチド修飾は、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化、ガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合修飾によるポリペプチド中のアミノ基又はカルボキシル基の遮断、或いはその両方、及びＡＤＰリボシル化を含む。
【０１０１】
ＰＳＭＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
【０１０２】
ポリヌクレオチド分子は、適切なプロモーターに動作可能に結合される抗ＰＳＭＡ結合タンパク質をコードする遺伝子及び随意に適切な転写ターミネーターを組み合わせること、及び、細菌又は例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系にそれを発現させることなど、既知の方法によって構築される。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、更なる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組換えベクターは既知の方法によって構築可能である。特定の望ましいベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、及びコスミドを含んでいる。
【０１０４】
様々な発現ベクター／宿主系は、記載されたＰＳＭＡ結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つそれを発現するために利用されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）  ２８５（１）：１１１−２７）、哺乳動物細胞中の発現用のｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＩＣＨＩＡＰＩＮＫ（商標）酵母発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＡＣＵＶＡＮＣＥ（商標）バキュロウィルス発現系（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）である。
【０１０５】
故に、本明細書に記載されるようなＰＳＭＡアルブミン結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、上記のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞へ導入し、且つ、タンパク質ドメインが発現し、単離され、随意に更に精製され得る条件下で上記宿主細胞を培養することにより、生成される。
【０１０６】
ＰＳＭＡ結合タンパク質の産生
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質の産生のプロセスが本明細書に開示される。幾つかの実施形態において、上記プロセスは、ＰＳＭＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主を、ＰＳＭＡ結合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、及び培養物から生成されたタンパク質を回収且つ精製することを含む。
【０１０７】
更なる実施形態において、基準結合化合物と比較して、ＰＳＭＡ結合タンパク質、及び／又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の、１つ以上の特性、例えば親和性、安定性、耐熱性、交差反応性などを改善することを対象とされたプロセスが提供される。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質又は基準結合化合物の異なるドメイン又はアミノ酸セグメントに対応する複数の単置換ライブラリが提供され、それにより単置換ライブラリの各メンバーが、その対応するドメイン又はアミノ酸セグメントにおける単一のアミノ酸変化のみをコードする。典型的には、これにより、大きなタンパク質又はタンパク結合部位の起こり得る全ての置換を、少数の小さなライブラリで探索することが可能となる。幾つかの実施形態において、複数のドメインは、ＰＳＭＡ結合タンパク質又は基準結合化合物のアミノ酸のコンティグ配列を形成する或いは網羅する。様々な単置換ライブラリのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの他の単置換ライブラリのヌクレオチド配列と重複する。幾つかの実施形態において、全てのメンバーが隣接するドメインをコードするそれぞれの単置換ライブラリの全てのメンバーに重複するように、複数の単置換ライブラリが設計される。
【０１０８】
こうした単置換ライブラリから発現された結合化合物は、各ライブラリ中で変異体の部分集合を得るために別々に選択され、該変異体は、基準結合化合物と少なくとも同じぐらい優れた特性を有し、且つ結果として生じたライブラリはサイズが減少している。一般的に、結合化合物の選択されたセットをコードする核酸の数は、元々の単置換ライブラリのメンバーをコードする核酸の数よりも少ない。こうした特性としては、限定されないが、標的化合物への親和性、熱、高い又は低いｐＨ、酵素分解、他のタンパク質に対する交差反応性など、様々な条件に対する安定性が挙げられる。それぞれの単置換ライブラリから選択された化合物は、「前候補化合物」又は「前候補タンパク質」と本明細書では互換的に呼ばれている。別々の単置換ライブラリからの前候補化合物をコードする核酸配列は、ＰＣＲベースの遺伝子シャッフリング技術を使用してＰＣＲ中でシャッフルされることで、シャッフルされたライブラリを生成する。
【０１０９】
スクリーニングプロセスの典型的なワークフローが本明細書に記載される。前候補化合物のライブラリは単置換ライブラリから生成され、標的タンパク質への結合のために選択され、その後、前候補ライブラリはシャッフルされることで候補化合物をコードする核酸のライブラリを生成し、これは次に、ファージミド発現系などの便利な発現ベクターへとクローン化される。その後、ファージ発現候補化合物は、標的分子への結合親和性などの望ましい特性を改善するために１ラウンド以上の選択を受ける。標的分子は吸着されることもあれば、そうでなければウェル又は他の反応容器の表面へ付けられることもあり、或いは、標的分子はビオチンなどの結合部分で誘導体化されてもよく、これは、候補結合化合物でのインキュベーション後、洗浄のために、磁気ビーズなどのビーズに結合されたストレプトアビジンなどの相補的部分で捕えられることもある。典型的な選択レジメンにおいて、標的分子からの非常に低い解離速度の候補化合物だけが選択されるように、候補結合化合物は洗浄工程を受ける。そのような実施形態に対して典型的な洗浄時間は、約１０分、約１５分、約２０分、約２０分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間；又は他の実施形態において約２４時間；又は他の実施形態において約４８時間；又は他の実施形態において約７２時間である。選択後の単離されたクローンは、増幅され、及び選択の追加のサイクルにさらされ、或いは、例えば配列決定によって、及び、例えばＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合（ＳＰＲ）、バイオ層干渉法（例えば、ＯＣＴＥＴＲ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）などにより結合親和性の比較測定を行うことによって、分析される。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、上記プロセスは、基準ＰＳＭＡ結合タンパク質と比較して、結合親和性が改善され且つ結合タンパク質の選択されたセットに対する交差反応性が改善された１つ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質を同定するために実施される。幾つかの実施形態において、基準結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で述べられるアミノ酸配列を持つタンパク質である。幾つかの実施形態において、基準結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で述べられるアミノ酸配列を持つタンパク質である。特定の実施形態において、単置換ライブラリは、フレームワーク領域とＣＤＲ中にコドンを含む、基準ＰＳＭＡ結合タンパク質のＶＨ領域中のコドンを変えることにより調製される。別の実施形態において、コドンが変えられる位置は、基準ＰＳＭＡ結合タンパク質の重鎖のＣＤＲ、或いは、単独でＣＤＲ１、単独でＣＤＲ２、単独でＣＤＲ３、又はそれらの対などのＣＤＲのサブセットを含む。別の実施形態において、コドンが変えられる位置は、単にフレームワーク領域で生じる。幾つかの実施形態において、ライブラリは、１０〜１１１の範囲で番号付けられるＶＨのフレームワーク領域単独における、基準ＰＳＭＡ結合タンパク質からの単一のコドン変化のみを含む。別の実施形態において、コドンが変えられる位置は、基準ＰＳＭＡ結合タンパク質の重鎖のＣＤＲ３、或いはそのようなＣＤＲ３のサブセットを含む。別の実施形態において、ＶＨコード領域のコドンが変えられる位置の数は、最大８０の位置がフレームワーク領域にあるように、１０〜１１１の範囲にある。単置換ライブラリの調製後、上に概説されるように、以下の工程が行われる：（ａ）前候補タンパク質として個々の単置換ライブラリの各メンバーを別々に発現する工程；（ｂ）元々の結合標的［例えば、望ましい交差反応標的］とは異なる、又は異ならないこともある結合パートナーに結合する前候補タンパク質をコードする、個々の単置換ライブラリのメンバーを選択する工程；（ｃ）シャッフルされた組み合わせライブラリを生成するためにＰＣＲで選択されたライブラリのメンバーをシャッフルする工程；（ｄ）候補ＰＳＭＡ結合タンパク質としてシャッフルされたライブラリのメンバーを発現する工程；及び（ｅ）元々の結合パートナーと結合する候補ＰＳＭＡ結合タンパク質についてシャッフルされたライブラリのメンバーを１回以上選択する工程、及び可能であれば（ｆ）望ましい交差反応標的と結合するために候補タンパク質を更に選択する工程であって、それにより、元々のリガンドに対する親和性を失うことなく基準ＰＳＭＡ結合タンパク質に対する１つ以上の物質の交差反応性を増強した、核酸でコードされたＰＳＭＡ結合タンパク質を提供する工程。追加の実施形態において、前記方法は、工程（ｆ）を、望ましくない交差反応性化合物に結合する候補ＰＳＭＡ結合タンパク質のサブセットから候補結合化合物を１回以上枯渇させる工程と置き換えることにより、選択された交差反応性物質又は化合物或いはエピトープに対する反応性が減少した、ＰＳＭＡ結合タンパク質を得るために実施され得る。
【０１１１】
医薬組成物
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質、ＰＳＭＡ結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、或いはこのベクター及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体によって形質転換された宿主細胞を含む、医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」としては、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ、投与される患者にとって毒性ではない任意の担体が挙げられる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。こうした担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な投与量で被験体に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物は、保存剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを更に含み得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含によって保証され得る。
【０１１２】
医薬組成物の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質はナノ粒子に封入される。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、又はナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はリポソームに結合する。幾つかの例において、ＰＳＭＡ結合タンパク質はリポソームの表面に共役される。幾つかの例において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、リポソームのシェル内に封入される。幾つかの例において、リポソームはカチオン性リポソームである。
【０１１３】
本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質は、薬物としての使用のために企図されている。投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、又は皮内の投与によって達成される。幾つかの実施形態において、投与経路は、治療の種類と、医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医と他の臨床的因子によって決定される。任意の１人の患者のための用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間と投与経路、治療の種類、健康状態、及び同時に投与されている他の薬物を含む多くの因子に依存する。「有効量」は、こうした病状の減少又は緩解をもたらす、疾患の経過と重症度に影響を与えるのに十分な有効成分の量を指し、既知の方法を使用して決定されることもある。
【０１１４】
処置の方法
幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質、又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の投与を含む、必要とする個体の免疫系を刺激するための方法及び使用も提供される。幾つかの例において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質の投与は、標的抗原を発現する細胞への細胞毒性を引き起こす、及び／又は持続させる。幾つかの例において、細胞は、癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性のＴ又はＢ細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク、或いは繊維症の組織である。
【０１１５】
ＰＳＭＡ結合タンパク質、又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質を個体に投与する工程を含む、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病の処置のための方法と使用も、本明細書で提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病としては、限定されないが、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫性疾患、移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、又は線維症が挙げられる。他の実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、又は宿主対移植片疾患である。１つの実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は癌である。１つの例において、癌は血液の癌である。別の例において、癌は前立腺癌である。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、前立腺癌は、進行した段階の前立腺癌である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、薬物耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、抗アンドロゲン薬物に耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は転移性である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は転移性であり、薬剤耐性がある（例えば抗アンドロゲン薬物耐性）。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、去勢抵抗性である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、転移性且つ去勢抵抗性である。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、エンザルタミドに耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、エンザルタミド及びアビラテロンに耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、エンザルタミド、アビラテロン、及びビカルタミドに耐性がある。幾つかの実施形態において、前立腺癌は、ドセタキセルに耐性がある。これら実施形態の幾つかにおいて、前立腺癌は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、及びドセタキセルに耐性がある。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の投与は、前立腺癌細胞増殖を阻害し；前立腺癌細胞移動を阻害し；前立腺癌細胞侵入を阻害し；前立腺癌の症状を改善し；前立腺癌腫瘍のサイズを減少し；前立腺癌腫瘍の数を減少し；前立腺癌細胞の数を減少し；前立腺癌細胞の壊死、突出（ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ）、腫瘍症、アポトーシス、自食作用、又は他の細胞死を誘導し；又は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物の治療効果を向上させる。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌細胞増殖を阻害する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌細胞移動を阻害する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌細胞侵入を阻害する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌の症状を改善する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌腫瘍のサイズを減少する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌腫瘍の数を減少する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌細胞の数を減少する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載される抗ＰＳＭＡの単一ドメイン抗体又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を投与することにより前立腺癌細胞の壊死、突出、腫瘍症、アポトーシス、自食作用、又は他の細胞死を誘導する工程を含む。
【０１１９】
本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、「処置」、「処置すること」、或いは「処置された」とは、望ましくない生理的な疾病、障害、又は疾患を遅らせる（減らす）こと、或いは、有益な又は望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な又は望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、又は疾患の程度の減少；疾病、障害、又は疾患の状態の安定化（つまり、悪化しないこと）；疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせること、又は進行を遅らせること；疾病、障害、又は疾患の状態の改善；及び、検出可能であれ検出不可能であれ、或いは疾病、障害、又は疾患の亢進であれ改善であれ、緩解（部分的でも全体でも）が挙げられる。処置は、過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置は更に、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態において、「処置」、「処置すること」、又は「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患のための遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせるか、或いはその重症度を低下させることである。
【０１２０】
本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質、又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、特定の疾患、障害、又は疾病を処置するための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤としては、限定されないが、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｘ線、及び／又は、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの指示された送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、及び他の免疫療法に関する治療が挙げられる。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質、又は本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、下痢止め薬、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、及び／又は非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質、又は本明細書に記載されるようなＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、手術の前、間、又は後に投与される。本発明の別の実施形態に従い、診断、予後、又はモニタリングのために前立腺癌を検出するためのキットが提供される。キットは、前述のＰＳＭＡ結合タンパク質（例えば、標識された抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメント）、及び標識を検出するための１つ以上の化合物を含む。幾つかの実施形態において、標識は、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、及び発色団標識から成る群から選択される。
【０１２１】
更なる実施形態は、凍結乾燥形態で包装される、或いは水性媒体に包装される、抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合性フラグメントなどの上記結合タンパク質の１つ以上を提供する。本開示の他の態様において、サンプル中のＰＳＭＡ、又はＰＳＭＡを発現する細胞を検出するための方法が提供される。そのような方法は、抗体又はその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間の複合体形成を可能にするのに十分な時間にわたって、ＰＳＭＡの細胞外のドメインに特異的に結合する前述のＰＳＭＡ結合タンパク質（抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントなど）の何れかにサンプルを接触させる工程、及びＰＳＭＡ抗体複合体又はＰＳＭＡ抗原結合フラグメント複合体を検出する工程を含む。幾つかの実施形態において、サンプル中の複合体の存在は、ＰＳＭＡのサンプル又はＰＳＭＡを発現する細胞中の存在を示す。他の態様において、本開示は、被験体におけるＰＳＭＡ媒介性疾患を診断するための他の方法を提供する。そのような方法は、前立腺に特異的な膜抗原の細胞外ドメインに特異的に結合するある量の前述のＰＳＭＡ結合タンパク質（抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントなど）の何れかを、ＰＳＭＡ媒介性疾患を抱える疑いのある或いは以前にそのように診断された被験体に投与する工程を含む。前記方法はまた、抗体又はその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間の複合体の形成を可能にする工程、及び、標的エピトープに対するＰＳＭＡ抗体複合体又はＰＳＭＡ抗原結合フラグメント抗体複合体の形成を検出する工程を含む。前立腺癌を抱える疑いのある或いは以前にそのように診断された被験体における複合体の存在は、ＰＳＭＡ媒介性疾患の存在を示す。
【０１２２】
前記方法の特定の実施形態において、ＰＳＭＡ媒介性疾患は前立腺癌である。他の実施形態において、ＰＳＭＡ媒介性疾患は、移行上皮癌を含む膀胱癌；膵管癌腫を含む膵臓癌；非小細胞肺癌を含む肺癌；従来の腎細胞癌を含む腎臓癌；軟部組織肉腫を含む肉腫；乳房細胞腫を含む乳癌；多形神経膠芽腫を含む脳癌；神経内分泌膵癌；結腸癌腫を含む結腸癌；睾丸胎生期腫瘍を含む精巣癌；及び悪性黒色腫を含む黒色腫から成る群から選択されるものなどの、非前立腺癌である。
【０１２３】
前記方法の幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合タンパク質（抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントなど）は、標識される前記方法の他の実施形態において、二次抗体は、一次抗体又はその抗原結合フラグメントを検出するために投与される。本開示の更なる態様において、ＰＳＭＡ媒介性疾患を有する被験体の予後を評価するための方法が提供される。そのような方法は、有効な量の前述のＰＳＭＡ結合タンパク質（抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合性フラグメントなど）の何れかを、ＰＳＭＡ媒介性疾患を抱える疑いのある又は以前にそのように診断された被験体に投与する工程、抗体又はその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間の複合体の形成を可能にする工程、及び標的エピトープに対する複合体の形成を検出する工程を含む。ＰＳＭＡ媒介性疾患を抱える疑いのある又は以前にそのように診断された被験体における複合体の量は、予後を示す。
【０１２４】
本開示の別の態様において、ＰＳＭＡ媒介性疾患を有する被験体の処置の有効性を評価するための方法が提供される。そのような方法は、有効な量の前述のＰＳＭＡ結合タンパク質、例えば抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体又はその抗原結合性フラグメントなどの何れかを、ＰＳＭＡ媒介性疾患を抱える又は以前にそのように診断された被験体に投与する工程、抗体又はその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間の複合体の形成を可能にする工程、及び標的エピトープに対する複合体の形成を検出する工程を含む。ＰＳＭＡ媒介性疾患を抱える疑いのある又は以前にそのように診断された被験体における複合体の量は、処置の有効性を示す。前記の特定の実施形態において、ＰＳＭＡ媒介性疾患は前立腺癌である。他の実施形態において、ＰＳＭＡ媒介性疾患は非前立腺癌である。それらの実施形態において、非前立腺癌は好ましくは、移行上皮癌を含む膀胱癌；膵管癌腫を含む膵臓癌；非小細胞肺癌を含む肺癌；従来の腎細胞癌を含む腎臓癌；軟部組織肉腫を含む肉腫；乳房細胞腫を含む乳癌；多形神経膠芽腫を含む脳癌；神経内分泌膵癌；結腸癌腫を含む結腸癌；睾丸胎生期腫瘍を含む精巣癌；及び悪性黒色腫を含む黒色腫から成る群から選択される。また別の実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは標識される。更なる実施形態において、二次抗体は、一次抗体又はその抗原結合フラグメントを検出するために投与される。
【０１２５】
本開示のまた別の態様に従い、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。そのような方法は、ＰＳＭＡを発現する細胞を、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害するのに有効なＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合するある量の前述の抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つと接触させる工程を含む。
【実施例】
【０１２６】
下記の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、記載された実施形態を更に例示する。
【０１２７】
実施例１：親の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体と同等の又は改善された結合特性を有する、抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体変異体の生成
親の抗ＰＳＭＡファージの特徴づけ
ＰＳＭＡ抗原への親の抗ＰＳＭＡファージの特異的結合を判定した（表１）。
【０１２８】
ｃｙｎｏ  ＰＳＭＡ上で選択された単置換ＰＳＭＡ  ｓｄＡｂファージライブラリ
３つのＣＤＲドメインの各々に対して単置換ライブラリを提供した。単置換ライブラリをカニクイザルＰＳＭＡに結合し、その後、３０分間バッファー中で洗浄した。０分及び３０分で結合されたファージを取り出し、計数した。バッファー中で３０分間の洗浄を用いて選択されたファージを使用して、２つの独立した組み合わせのファージライブラリを作成した。
【０１２９】
組み合わせの抗ＰＳＭＡライブラリ
カニクイザルＰＳＭＡを、３回の選択の選択標的として使用した。３回の選択のための２つの独立したライブラリからの組み合わせのファージの結合の後、ウェルを２〜４時間洗浄した。３回目の選択からのＩｎｓｅｒｔｓ  ＰＣＲｅｄを、ｐ３４発現ベクターへとサブクローン化した。９６個のクローンを選び、ＤＮＡを精製し、配列決定し、Ｅｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトした。
【０１３０】
ｈｕＰＳＭＡ上で選択された単置換ＰＳＭＡ  ｓｄＡｂファージライブラリ
３つのＣＤＲドメインの各々に対して単置換ライブラリを提供した。単置換ライブラリをヒトＰＳＭＡに結合し、その後、３０μｇ／ｍｌのｈ  ＰＳＭＡ−Ｆｃを含むバッファー中で２４時間洗浄した。０時間及び２４時間で結合されたファージを取り出し、計数した。２４時間の競合的な洗浄を用いて選択されたファージを使用して、組み合わせのファージライブラリを作成した。
【０１３１】
組み合わせの抗ＰＳＭＡライブラリ
ヒトＰＳＭＡを、３回の選択の選択標的として使用した。３回の結合のための組み合わせのファージの結合の後、３０μｇ／ｍｌ〜８５０μｇ／ｍｌのヒトＰＳＭＡ−Ｆｃを含むバッファー中でウェルを洗浄した。３回目の選択からのＩｎｓｅｒｔｓ  ＰＣＲｅｄを、ｐ３４発現ベクターへとサブクローン化した。９６個のクローンを選び、ＤＮＡを精製し、配列決定し、Ｅｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトした。
【０１３２】
結合親和性の測定
上清を使用し、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムを用いてヒト及びカニクイザルのＰＳＭＡに対するＫｄ、ｋｏｎ、及びｋｏｆｆ（又はｋｄｉｓ）を評価した。様々なクローンを、親のｓｄＡｂと同様に強健な産生、凝集、及び安定性プロファイルと比較して、その結合親和性、及びヒトＰＳＭＡとの相互作用に対する会合及び解離速度定数に基づいて、更なる特徴づけ（表１）のために選択した。親のｓｄＡｂを表１の抗ＰＳＭＡ  ｗｔ  ｓｄＡｂ．６ｈｉｓとして列挙する。
【０１３３】
【表１】
0006812551.tif 000002
【０１３４】
実施例２：例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性抗原結合分子の結合活性と細胞毒性活性を評価する方法
【０１３５】
タンパク質産生
三重特異性分子の配列を、リーダー配列が先行し、６ｘヒスチジンタグ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  Ｔａｇ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）が後続する、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ  ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ２９３培地中の０．２−８ｘ１ｅ６細胞／ｍｌでＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）中の懸濁液において維持した。精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６３５）プロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３細胞へトランスフェクトし、トランスフェクション後４−６日間維持した。調整培地を、親和性及び脱塩クロマトグラフィーによって部分的に精製した。続いて、三重特異性タンパク質を、イオン交換によって磨き、又は代替的に、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａの遠心濾過ユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００のサイズ排除培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、賦形剤を含有している中性バッファー中に溶解した。フラクションプール（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｐｏｏｌｉｎｇ）及び最終的な純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析的なＳＥＣによって評価した。
【０１３６】
親和性測定
【０１３７】
全ての結合ドメイン分子の親和性を、Ｏｃｔｅｔの機器を使用したバイオレイヤー干渉法によって測定した。
【０１３８】
ＰＳＭＡ親和性を、１２０秒間ヒトＰＳＭＡ−Ｆｃタンパク質（１００ｎＭ）を抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃバイオセンサ上に充填することによって測定し、続いて、６０秒のベースラインで測定し、その後、１８０秒間三重特異性分子の希釈系列においてセンサー先端部をインキュベートすることによって会合を測定し、続いて、５０秒間解離した。ＥＧＦＲ及びＣＤ３の親和性を、１２０秒間、ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質又はヒトＣＤ３−Ｆｌａｇ−Ｆｃタンパク質をそれぞれ（１００ｎＭ）、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃバイオセンサ上に充填することによって測定し、続いて、６０秒のベースラインで測定し、その後、１８０秒間三重特異性分子の希釈系列においてセンサー先端部をインキュベートすることによって会合を測定し、続いて、３００秒間解離した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性を、ビオチン化アルブミンをストレプトアビジンバイオセンサ上に充填することによって測定し、その後、ＣＤ３親和性測定と同じ動態パラメーターに従って測定した。全ての工程を、リン酸緩衝食塩水中の０．２５％のカゼインにおいて３０℃で実行した。
【０１３９】
細胞毒性アッセイ
【０１４０】
ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイを使用して、腫瘍細胞を死滅させるようＴ細胞を導く三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２０：５１９−２７）。このアッセイにおいて、Ｔ細胞及び標的癌細胞株の細胞を、３８４ウェルのプレートにおいて１０：１の比率で一緒に混合し、様々な量のＴ細胞エンゲージャーを加える。４８時間後、Ｔ細胞を洗浄し、Ｔ細胞によって死滅されなかったプレート標的細胞に結合されたままにする。残りの生細胞を定量化するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する。場合によっては、標的細胞を操作してルシフェラーゼを発現させる。これらの場合、標的細胞の生存率を、ＳＴＥＡＤＹＧＬＯ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた発光ルシフェラーゼアッセイの実行により評価し、ここで生存率はルシフェラーゼ活性の量に直接比例する。
【０１４１】
安定性アッセイ
【０１４２】
三重特異性結合タンパク質の安定性を、非ヒト霊長類血清の存在下において低濃度で評価した。ＴｒｉＴＡＣを、カニクイザル血清（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）中で３３μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃で２時間インキュベートするか、或いは５回の凍結／解凍サイクルにさらした。処置の後、サンプルを、細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイで評価し、それらの残存活性を未処置の貯蔵液と比較した。
【０１４３】
異種移植片アッセイ
【０１４４】
三重特異性結合タンパク質のインビボの効果を、異種移植片実験（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｔａｉｃａｎｇ）で評価した。一般的なガンマ鎖を欠くＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＮＣＧ，  Ｍｏｄｅｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を、５ｅ６  ２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞と、健康なヒトドナーから単離された５ｅ６の休止ヒトＴ細胞との混合物で０日目に播種した。マウスを３つの群へと無作為化し、ビヒクル、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３２４、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＢｉＴＥにより処置した。静脈内のボーラス注入を介して１０日間毎日、処置を施した。病的状態及び死亡率について動物を毎日確認した。カリパスを用いて腫瘍体積を週に２回判定した。研究を３０日後に終了した。
【０１４５】
ＰＫアッセイ
【０１４６】
この研究の目的は、静脈内注射後の三重特異性結合タンパク質の単回投与の薬物動態学を評価することであった。１つの群につき２匹の実験的にナイーブなカニクイザル（オス１匹とメス２匹）に、およそ１分間にわたる遅いＩＶボーラス注入を介して化合物を投与した。投与後、ケージ側面観察を毎日１回行い、体重を毎週記録した。血液サンプルを集め、投与後２１日間にわたり薬物動態学的分析のための血清へと処理した。
【０１４７】
被験物質の濃度を、エレクトロルミネセンスの読み出し（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）によりサル血清から判定した。固定された組換え型ＣＤ３を含む９６ウェルプレートを使用して分析物を捉えた。製造者の指示に従い、ＭＳＤリーダー上でスルホタグを付けた（ｓｕｌｆｏ−ｔａｇｇｅｄ）組換え型ＰＳＭＡにより検出を行った。
【０１４８】
実施例３：例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性分子の特性に対するＣＤ３親和性の影響の評価
異なるＣＤ３結合ドメインを有するＰＳＭＡ標的化三重特異性分子を調べて、ＣＤ３親和性を変える効果を実証した。例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性分子を図１に示す。表２は、３つの結合パートナー（ＰＳＭＡ、ＣＤ３、ＨＳＡ）に対する各分子の親和性を列挙する。Ｏｃｔｅｔ器機（Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）を使用したバイオ層インターフェロメトリーによって親和性を測定した。ＣＤ３親和性の減少は、Ｔ細胞媒介性細胞毒性の観点で効力の損失に繋がる（図２Ａ−Ｃ）。これら三重特異性分子の薬物動態学的特性をカニクイザルにおいて評価した。ＣＤ３様のＴｒｉＴＡＣ  Ｃ２３６に対して高親和性を有する分子には、およそ９０時間の末端半減期がある（図３）。Ｔ細胞上でＣＤ３に結合する能力の改変にもかかわらず、図４に示される異なるＣＤ３親和性を有する２つの分子の末端半減期は、非常に類似している。しかし、ＣＤ３親和性の減少は、より大きな体積の分布に繋がると考えられ、これはＴ細胞による三重特異性分子の隔離の減少と一貫している。研究期間中に、有害な臨床観察、又は注記された体重変化はなかった。
【０１４９】
【表２】
0006812551.tif 000003
【０１５０】
実施例４：例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性分子の特性に対するＰＳＭＡ親和性の影響の評価
異なるＰＳＭＡ結合ドメインを有するＰＳＭＡ標的化三重特異性分子を調べて、ＰＳＭＡ親和性を変える効果を実証した。表３は、３つの結合パートナー（ＰＳＭＡ、ＣＤ３、ＨＳＡ）に対する各分子の親和性を列挙する。ＰＳＭＡ親和性の減少は、Ｔ細胞媒介性細胞毒性の観点で効力の損失に繋がる（図５Ａ−Ｃ）。
【０１５１】
【表３】
0006812551.tif 000004
【０１５２】
実施例５：例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性分子のインビボの効果
例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性分子Ｃ３２４を、マウスにおける腫瘍の増殖を阻害する能力について評価した。この実験のために、ヒトＴ細胞で再構成された免疫無防備状態のマウスの皮下に、ＰＳＭＡ発現ヒト前立腺腫瘍細胞（２２Ｒｖ１）を播種し、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ標的化ＢｉＴＥ又はＴｒｉＴＡＣ分子の何れかを静脈内投与することで１０日間毎日処置した。腫瘍増殖を３０の間測定した。実験期間にわたり、三重特異性分子は、ＢｉＴＥ分子に匹敵する効果を持つ腫瘍増殖を阻害することができた（図６）。
【０１５３】
実施例６：例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性分子の特異性
ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を評価するために、腫瘍細胞を死滅させるためにＴ細胞を誘導するそれらの能力を、ＰＳＭＡに対して陰性である腫瘍細胞で試験した（図７Ａ）。ＥＧＦＲ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子は陽性対照として機能し、ＧＦＰ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子は陰性対照として機能した。異なるＰＳＭＡ結合ドメインを有する３つ全てのＴｒｉＴＡＣは、ＰＳＭＡ陽性細胞株ＬＮＣａＰに対して予想された活性を示したが（図７Ｂ）、ＰＳＭＡ陰性腫瘍細胞株ＫＭＳ１２ＢＭ及びＯＶＣＡＲ８のＥＣ５０には到達しなかった（図７Ｃ及び７Ｄ）。ＥＣ５０を表４にまとめる。非常に高いＴｒｉＴＡＣ濃度（＞１ｎＭ）において、幾つかの制限されたオフターゲット細胞死滅をＴｒｉＴＡＣｓ  Ｃ３６２及びＣ３６３に対して観察できたが、Ｃ３６４は試験条件の何れかにおいて有意な細胞死滅を示さなかった。
【０１５４】
【表４】
0006812551.tif 000005
【０１５５】
実施例７：ストレステスト及びタンパク質安定性
４つのＰＳＭＡ標的化三重特異性分子を、低濃度（３３．３μｇ／ｍｌ）でカニクイザル血清において４８時間インキュベートするか、或いは、カニクイザル血清において５回の凍結と解凍のサイクルにさらした。処置後、ＴｒｉＴＡＣ分子の生物活性を、細胞死滅アッセイにおいて分析し、未処置のサンプル（「陽性対照」、図８Ａ−Ｄ）と比較した。全ての分子は、それらの細胞死滅活性の大部分を維持した。ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６２には最もストレス耐性があり、ここで試験した条件下で活性を損失しないと考えられた。
【０１５６】
実施例８：異種移植片腫瘍モデル
例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質を異種移植片モデルにおいて評価する。
【０１５７】
オスの免疫欠損ＮＣＧマウスの右背中側の側腹部の皮下に、５×１０６  ２２Ｒｖ１細胞を播種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達すると、動物を３つの処置群へと割り当てる。群２と３（各々８匹の動物）に、１．５×１０７の活性化したヒトＴ細胞を腹腔内注入する。３日後、群３の動物を引き続き、５０μｇの本開示の例示的なＰＳＭＡ標的化三重特異性抗原結合タンパク質（ｑｄｘ９ｄ）の合計９回の静脈内投与で処置する。群１と２をビヒクルのみで処置する。体重と腫瘍体積を３０日間測定する。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質で処置されたマウスにおける腫瘍増殖が、それぞれのビヒクルで処置した対照群における腫瘍増殖と比較して大幅に減少することが予想される。
【０１５８】
実施例９：前立腺癌患者への例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合性のタンパク質の投与に対する概念実証臨床試験プロトコル
これは、前立腺癌に対する処置としての実施例１のＰＳＭＡ標的化抗原結合タンパク質を試験するための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。
【０１５９】
試験転帰：
【０１６０】
第１：以前の実施例のＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の最大耐量
【０１６１】
第２：以前の実施例のＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質のインビボでの反応が臨床反応に関連するかどうかを判定すること。
【０１６２】
第Ｉ相
【０１６３】
最大耐用量（ＭＴＤ）は、試験の第Ｉ相のセクションで判定される。
１．１  最大耐用量（ＭＴＤ）は、試験の第Ｉ相のセクションで判定される。
１．２  適格基準を満たす患者は、以前の実施例のＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の試験にエントリーする。
１．３  目標は、参加者の重度の又は対処不可能な副作用なしに安全に投与可能な以前の実施例のＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の最大投与量を同定することである。与えられる投与量は、先の試験に登録された参加者の数及び投与量に対してどれほど十分に耐性があるかに依存する。全ての参加者が同じ投与量を受けるとは限らない。
【０１６４】
第ＩＩ相
２．１  続く第ＩＩ相のセクションでは、以前の実施例のＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の治療薬による治療の結果が少なくとも２０％の反応率となるかどうかを判定することを目標として、ＭＴＤにて処置が行われる。
第ＩＩ相に対する一次転帰  −−−  以前の実施例のＰＳＭＡ標的化三重特異性タンパク質の治療の結果、患者の少なくとも２０％が、臨床反応（爆発的な反応、わずかな反応、部分的な反応、又は完全な反応）を達成するかどうかを判定する
【０１６５】
適格性：
２００１年〜２００７年までの、現行のＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎに従い組織学的に確認された、新たに診断された侵襲性の前立腺癌。
疾患のあらゆる段階。
ドセタセル及びプレドニゾンでの処置（＋／−手術）。
年齢≧１８歳
カルノフスキーパフォーマンス状況≧５０％又はＥＣＯＧパフォーマンスステータス０−２
平均寿命≧６週間
【０１６６】
実施例１０：ＰＳＭＡ発現細胞株及び異なるドナーのＴ細胞を使用する再指示されたＴ細胞死滅アッセイにおける例示的なＰＳＭＡ抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子）の活性
この研究を行い、例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の活性がＬＮＣａＰ細胞又は単細胞ドナーに限定されないことを実証した。
【０１６７】
再指示されたＴ細胞死滅アッセイを、４つの異なるドナーのＴ細胞、及びヒトＰＳＭＡ発現前立腺癌細胞株ＶＣａＰ、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡＰＣａ２ｂ、及び２２Ｒｖ１を使用して実行した。１つの例外を除いて、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、表５に示されるように、０．２〜１．５ｐＭのＥＣ５０値を持つ全てのドナーのＴ細胞からのＴ細胞を使用して、これら癌細胞株の死滅を導くことができた。前立腺癌細胞株２２  Ｒｖ１及びドナー２４では、死滅はほとんど又は全く観察されなかった（図示せず）。ドナー２４はまた、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞株のおよそ５０％の死滅しか結果としてもたらさなかった一方、他の３つのドナーからのＴ細胞は結果としてこの細胞株ほぼ完全な死滅をもたらした（図示せず）。対照アッセイは、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質による死滅がＰＳＭＡ特異性であったことを実証した。ＰＳＭＡ発現細胞をＰＳＭＡの代わりに対照の三重特異性タンパク質標的化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で処置した時、死滅は観察されなかった（図示せず）。同様に、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、表５にも示されるＰＳＭＡ発現、ＮＣＩ−１５６３、及びＨＣＴ１１６を欠く細胞株により不活性であった。
【０１６８】
【表５】
0006812551.tif 000006
【０１６９】
実施例１１：再指示されたＴ細胞死滅アッセイにおける例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子）によるサイトカイン発現の刺激
この研究を行い、活性化Ｔ細胞によるアッセイ培地へのサイトカインの分泌を測定することにより、再指示されたＴ細胞死滅アッセイ中に、例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質によるＴ細胞の活性化を実証した。
【０１７０】
実施例９で上述されるような、再指示されたＴ細胞死滅アッセイから集めた条件培地を、サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγの発現について分析した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用してサイトカインを測定した。ＰＳＭＡ抗原結合タンパク質の滴定を、４つの異なるドナー及び４つのＰＳＭＡ発現細胞株、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＭＤＡＰＣａ２ｂ、及び２２Ｒｖ１からのＴ細胞に加えた結果、ＴＮＦαのレベルが増加した。条件培地におけるＴＮＦα発現及びＩＦＮγ発現のレベルに対する結果を、表６と７それぞれに示す。これらサイトカインのＰＳＭＡ抗原結合タンパク質により誘導された発現に対するＥＣ５０値は、３〜１５ｐＭの範囲に及んだ。サイトカインレベルの増加は、ＧＦＰを標的とする対照の三重特異性タンパク質では観察されなかった。同様に、ＰＳＭＡ発現、ＨＣＴ１１６、及びＮＣＩ−Ｈ１５６３を欠く２つの細胞株でアッセイを行ったとき、ＰＳＭＡ  ＨＴＳ  ＴｒｉＴＡＣはＴＮＦα又はＩＦＮγの発現も増大させなかった。
【０１７１】
【表６】
0006812551.tif 000007
【０１７２】
【表７】
0006812551.tif 000008
【０１７３】
実施例１２：カニクイザルからのＴ細胞を使用する再指示されたＴ細胞死滅アッセイ（ＴＤＣＣ）の例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ）の活性
この研究を行い、ＰＳＭＡ発現細胞株を死滅させるようカニクイザルのＴ細胞を導く例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の能力を試験した。
【０１７４】
ＴＤＣＣアッセイを、カニクイザルの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用してセットアップした。Ｃｙｎｏ  ＰＢＭＣを１０：１の比率でＬＮＣａＰ細胞に加えた。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、１１ｐＭのＥＣ５０値を有するｃｙｎｏ  ＰＢＭＣによりＬＮＣａＰの死滅を再び導いたことが観察された。結果を図９Ａに示す。これらの結果を確かめるために、第２の細胞株を使用し、ＭＤＡＰＣａ２ｂ、及び第２のカニクイザルドナーからのＰＢＭＣを試験した。標的細胞の再指示された死滅を、２．２ｐＭのＥＣ５０値で観察した。結果を図９Ｂに示す。死滅は、ＧＦＰを標的とする陰性対照の三重特異性タンパク質では観察されなかったため、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＳＭＡ群に特異的であった。これらのデータは、ＰＳＭＡ抗原結合三重特異性タンパク質が、カニクイザルＴ細胞にヒトＰＳＭＡを発現する標的細胞を死滅させるよう導くことができることを実証する。
【０１７５】
実施例１３：例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子）による再指示されたＴ細胞死滅アッセイにおけるＴ細胞活性化のマーカーの発現
この研究を行い、例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質がＴ細胞に標的細胞を死滅させるよう導いたときにＴ細胞が活性化されたかどうかを評価した。
【０１７６】
上記実施例に記載される再指示されたＴ細胞死滅アッセイに対する条件を使用してアッセイをセットアップした。フローサイトメトリーを使用してＴ細胞の表面上のＣＤ２５及びＣＤ６９の発現を測定することによりＴ細胞活性化を評価した。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質を、精製されたヒトＴ細胞及び前立腺癌細胞株ＶＣａＰの１０：１混合物に加えた。増大する量のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の添加後、図１０に示されるように、ＣＤ６９の発現及びＣＤ２５の発現の増加を観察した。ＥＣ５０値は、ＣＤ６９では０．３ｐＭ、及びＣＤ２５では０．２ｐＭであった。ＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質を、陰性対照としてこれらのアッセイに含めて、図１０に示されるように、ＧＦＰ標的化三重特異性タンパク質ではＣＤ６９又はＣＤ２５の発現の増加はほとんど又は全く観察されなかった。
【０１７７】
実施例１４：ＰＳＭＡ発現標的細胞の存在下における例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子）によるＴ細胞増殖の刺激
この研究を追加の方法として使用し、Ｔ細胞が標的細胞を死滅させるよう再び導かれたときに例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質はＴ細胞を活性化することができたことを実証した。
【０１７８】
上述のようにＬＮＣａＰ標的細胞を使用した再指示されたＴ細胞死滅アッセイの条件を使用し、７２時間で存在するＴ細胞の数を測定して、Ｔ細胞増殖アッセイをセットアップした。例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、０．５ｐＭのＥＣ５０値での増殖を刺激した。陰性対照として、ＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質をこのアッセイに含め、このタンパク質では増殖の増加は観察されなかった。Ｔ細胞増殖アッセイに対する結果を図１１に示す。
【０１７９】
実施例１５：例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡ標的化ＴｒｉＴＡＣ分子Ｚ２）によるＬＮＣａＰ細胞の再指示されたＴ細胞死滅。
この研究を行い、Ｔ細胞にＬＮＣａＰ細胞株を死滅させるよう再び導く、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５６で述べられるような配列を持つ例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の能力を試験した。
【０１８０】
ＴＤＣＣアッセイを上記実施例に記載されるようにセットアップして、図１２に示されるように、ＰＳＭＡ  Ｚ２  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）タンパク質は０．８ｐＭのＥＣ５０値により死滅を導いた。
【０１８１】
【表８−１】
0006812551.tif 000009
【０１８２】
【表８−２】
0006812551.tif 000010
【０１８３】
【表８−３】
0006812551.tif 000011
【０１８４】
【表９−１】
0006812551.tif 000012
【０１８５】
【表９−２】
0006812551.tif 000013
【０１８６】
【表９−３】
0006812551.tif 000014
【０１８７】
【表９−４】
0006812551.tif 000015
【０１８８】
【表９−５】
0006812551.tif 000016
【０１８９】
【表１０−１】
0006812551.tif 000017
【０１９０】
【表１０−２】
0006812551.tif 000018
【０１９１】
【表１１−１】
0006812551.tif 000019
【０１９２】
【表１１−２】
0006812551.tif 000020
【０１９３】
【表１１−３】
0006812551.tif 000021
【０１９４】
【表１２】
0006812551.tif 000022
【図１】
0006812551.tif 000023
【図２Ａ】
0006812551.tif 000024
【図２Ｂ】
0006812551.tif 000025
【図２Ｃ】
0006812551.tif 000026
【図３】
0006812551.tif 000027
【図４】
0006812551.tif 000028
【図５Ａ】
0006812551.tif 000029
【図５Ｂ】
0006812551.tif 000030
【図５Ｃ】
0006812551.tif 000031
【図６】
0006812551.tif 000032
【図７Ａ】
0006812551.tif 000033
【図７Ｂ】
0006812551.tif 000034
【図７Ｃ】
0006812551.tif 000035
【図７Ｄ】
0006812551.tif 000036
【図８Ａ】
0006812551.tif 000037
【図８Ｂ】
0006812551.tif 000038
【図８Ｃ】
0006812551.tif 000039
【図８Ｄ】
0006812551.tif 000040
【図９Ａ】
0006812551.tif 000041
【図９Ｂ】
0006812551.tif 000042
【図１０】
0006812551.tif 000043
【図１１】
0006812551.tif 000044
【図１２】
0006812551.tif 000045
【配列表】
0006812551000001.app