(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド；及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含み、
前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の化学的に変形されたヌクレオシド間のリンケージを有し、そこでは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形されている、
Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つ以上の糖部（Sugar moiety）が化学的変形されたものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項３】
前記糖部が、ヌクレオチド内の５炭糖の２’番位置の−Ｈ基がメトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、
前記糖部が、Ｆ−ＡＮＡに置換されて変形されたものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項４】
前記糖部が、ＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、３’または５’末端にリンカーを介してＧａｌＮＡｃ（N-acetylgalactosamine）が結合されている形態である、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項６】
前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される２種以上の化学的変形を有するものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項７】
２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の５炭糖の２’番位置の−Ｈ基がメトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がＦ−ＡＮＡに置換されて変形されたものである、請求項６に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項８】
２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものである、請求項６に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、ＨＢＶとグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular DNA）を減らすものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１１】
前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１２】
前記薬剤学的に許容可能な担体が、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものである、請求項１１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１３】
前記薬剤学的に許容可能な担体が、キトサンナノ粒子であり、
前記キトサンが、５０〜１９０ｋＤａの分子量を有するものである、請求項１２に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１４】
前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、経口または非経口で個体に投与されるものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１５】
前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に個体に投与されるものである、請求項１に記載のＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎を予防または治療するためのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することにより、Ｂ型肝炎を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus、以下ＨＢＶ）は、現在、全世界で約３億５千万人以上が感染しているほど、ウイルス感染の中で人類に最も多くの弊害を及ぼしている。個体がＨＢＶに感染すると、慢性肝炎、肝硬変、肝臓がんなどの肝疾患が発生することがあり、ひどい場合は、ウイルス性肝疾患により死亡に至る。ＨＢＶはＤＮＡをゲノム（genome）で有しており、これまでに知られているウイルスの中で最も小さいゲノムを有するウイルスの１つである（非特許文献１）。
現在、ＨＢＶ感染を抑制しうるワクチンが開発されて、新規感染率が多く減っているが、発展途上国では依然として感染の実態が深刻な実情であり、ワクチン接種前にＨＢＶに感した患者が多く、社会的に多くの問題を引き起こしている。
ＨＢＶは３．２ｋｂの二本鎖ＤＮＡをゲノムで有しているウイルスであり、ＤＮＡの周りはキャプシド（capsid）タンパク質が取り囲んでおり、外皮（surface）タンパク質がその周辺を覆っている形態で存在する。ＨＢＶは肝細胞に特化されている屈性（tropism）があり、非細胞毒性（non-cytotoxic）の状態で持続的な感染を起こし、宿主範囲が非常に狭くてヒトとチンパンジー以外の動物には感染されないという特徴がある（非特許文献１）。
ＨＢＶは感染後にキャプシドが解体されて遺伝子が核内に移動し、宿主の核内で二本鎖ウイルスＤＮＡがｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular ＤＮＡ）に転換される。ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶ転写の鋳型（template）としてＨＢＶライフサイクル（life cycle）において最も重要な役割を担っている。最近の研究によると、ｃｃｃＤＮＡはヒストン（histone）に巻かれており、これらの様々な変形によって調節されうるという事実が明らかになった（非特許文献２）。ｃｃｃＤＮＡはエピソーム（episome）形態のミニ染色体（minichromosome）としてＨＢＶの全てのＲＮＡを作るだけでなく、現在の治療剤ではこれを取り除くことができないため、慢性感染を引き起こす主な原因として知られている（非特許文献３）。
ｃｃｃＤＮＡから生成されたウイルス核酸（viral RNA）は、コア（core）、表面（surface）、ポリメラーゼ（polymerase）などを作り、細胞質からゲノムＤＮＡへの転換が可能なプレゲノムＲＮＡ（pregenomic RNA）を中心に移入（encapsidation）が行われる。プレゲノムＲＮＡから成功的にＤＮＡ転換まで終えたＨＢＶビリオン（virion）は出芽（budding）される。以後、周辺肝細胞に感染したり、再感染されて着実に増殖することになる（非特許文献３）。
現在使用中のすべてのＢ型肝炎治療剤は核酸誘導体として、プレゲノムＲＮＡがキャプシド内でポリメラーゼによってＤＮＡに転換されるときに、ウイルスの新生ＤＮＡ鎖に割り込んで最終的に合成を終了させる。したがって、この部分を標的とする現在のすべての薬剤は、ＨＢＶポリメラーゼのＲＴ（reverse transcriptase）ドメイン内の活性部位に突然変異が生じると薬剤耐性を誘発するため、長期的な治療の時は、ほとんどこのような薬剤耐性の突然変異によって完全治療が難しい（非特許文献４）。
現在、ＦＤＡの承認を受けた慢性Ｂ型感染の治療剤である核酸類似体には、ラミブジン（lamivudin）、アデホビル（adefovir）、エンテカビル（entecavir）、テルビブジン（telbivudin）、クレブジン（clevudine）及びテノホビル（tenofovir）があり、これらはすべてポリメラーゼ阻害剤であるため、慢性肝炎を完治することはできない。
２０１４年、ＬｕｃｉｆｏｒａらがＩＦＮ−αとリンホトキシンｂ受容体（Lymphotoxin b receptor；ＬＴｂＲ）がＡＰＯＢＥＣ３Ａまたは３Ｂを誘導し、これらが細胞死滅せずにｃｃｃＤＮＡのみを選択的に除去できると報告したが、使用量が多すぎて実際の適用には困難がある（非特許文献５）。
細胞基盤のｃｃｃＤＮＡ分析方法を構築して、８５，０００個の化合物を分析した結果、ＤＳＳ（disubstituted sulfonamides）の２つ（CCC-0975、CCC-0346）がｃｃｃＤＮＡをある程度減らすことができることが発見されたが、薬に開発されるにはまだ効果が不足し、作用メカニズムも知られていない（非特許文献６）。
したがって、ＨＢＶ感染疾患を治療するためには新しい治療法が必要である。本発明者らは、ＨＢＶのゲノムを分析して、グアニン４重合体を成し遂げられる部分を発見し、ＨＢＶ遺伝子の活性を調節してＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを除去する技術を開発した。グアニン４重合体（G-quadruplex）は、４つのグアニン同士の結合を基本とする４本のＤＮＡらせんである（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ganem and Prince N Engl J Med (2004) 350, 1118-1129
【非特許文献２】Pollicino et al. Gastroenterology (2006) 130, 823-837
【非特許文献３】Urban et al. J Hepatol (2010) 52, 282-284
【非特許文献４】Zoulim and Locarnini, Gastroenterology (2009) 137, 1593-1608 e1591-1592
【非特許文献５】Lucifora et al. Science. (2014) Mar 14;343(6176):1221-8
【非特許文献６】Cai et al. Antimicrob Agents Chemother. (2012) Aug;56(8):4277-88
【非特許文献７】Metifiot et al. Nucleic Acids Res. 2014 Nov 10;42(20):12352-66. Epub 2014 Oct 20
【非特許文献８】Remington’s Pharmaceutical Sciences 15th Edition
【非特許文献９】Targeted Gene Silencing Using RGD-Labeled Chitosan Nanoparticles, Hee Dong Han, Clin Cancer Res. 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド；及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチド；からなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が提供される。
また、前記医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、Ｂ型肝炎の治療または予防方法が提供される。
また、ＨＢＶと候補物質とを接触させて、グアニン４重合体を形成するかどうかを確認する段階を含む、Ｂ型肝炎治療剤のスクリーニング方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が提供される。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上のヌクレオシド間のリンケージ（linkage）が化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）またはボラノホスフェート（boranophosphate）に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の糖部（sugar moiety）が化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部は、ヌクレオチド内の５炭糖の２’番位置の−Ｈ基が、メトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（ Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、前記糖部が、Ｆ−ＡＮＡに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部は、ＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、３’または５’末端にリンカーを介してＧａｌＮＡｃ（N-acetylgalactosamine）が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される２種以上の化学的変形を有するものであってもよい。
一部具体例において、２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の５炭糖の２’番位置の−Ｈ基がメトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部が、Ｆ−ＡＮＡに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに３’または５’末端にリンカーを介してＧａｌＮＡｃ（N-acetylgalactosamine）が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶとグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular ＤＮＡ）を減らすものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子であり、前記キトサンは、５０〜１９０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、経口または非経口で個体に投与されるものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に個体に投与されるものであってもよい。
本明細書に記載されたオリゴヌクレオチドは、Ｂ型肝炎の予防及び/または治療、及び治療のための医薬の製造に用いてもよい。
配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、Ｂ型肝炎の治療または予防方法が提供される。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上のヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の糖部が化学的変形されたものであってもよい。  
一部具体例において、前記糖部はヌクレオチド内の５炭糖の２’番位置の−Ｈ基が、メトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、前記糖部が、Ｆ−ＡＮＡに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部は、ＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、３’または５’末端にリンカーを介してＧａｌＮＡｃ（N-acetylgalactosamine）が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される２種以上の化学的変形を有するものであってもよい。
一部具体例において、前記２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の５炭糖の２’番位置の−Ｈ基がメトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がＦ−ＡＮＡに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに３’または５’末端にリンカーを介してＧａｌＮＡｃ（N-acetylgalactosamine）が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶとグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular ＤＮＡ）を減らすものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものであってもよい。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子であり、前記キトサンは、５０〜１９０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、経口または非経口で個体に投与されるものであってもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内または皮下に個体に投与されるものであってもよい。
また、ＨＢＶと候補物質とを接触させ、前記ＨＢＶと候補物質がグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するかどうかを確認する段階を含む、Ｂ型肝炎治療剤のスクリーニング方法が提供される。
一部具体例において、ＨＢＶと候補物質がグアニン４重合体を形成する場合、Ｂ型肝炎治療剤として選定する段階をさらに含んでもよい。
一部具体例において、グアニン４重合体を確認する段階は、ＥＭＳＡ（Electrophoretic mobility shift assay）、円偏光二色性（circular dichroism、ＣＤ）、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance、ＮＭＲ）、またはグアニン４重合体特異抗体を用いた方法を用いてもよいが、これに制限されるものではない。
一部具体例において、前記候補物質は、グアニン（Ｇ）を４つ以上含むものであってもよい。
一部具体例において、前記候補物質は、ＨＢＶのエンハンサーＩＩ部位と結合してグアニン４重合体を形成することにより、ＨＢＶの発現を阻害してもよい。
【発明の効果】
【０００６】
配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、ＨＢＶ（Hepatitis B virus）とグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成してＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular ＤＮＡ）を減少させることより、Ｂ型肝炎の治療、予防、またはＢ型肝炎治療剤のスクリーニングに用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＨＢＶのゲノム解析を通じた配列スクリーニングの模式図及びＤ１−Ｄ９ ＨＢＶ ＤＮＡの部位を模式的に示したものである。
【図２】オリゴヌクレオチド（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ６）がタンパク質の発現阻害[（ａ）及び（ｂ）]及びＨＢＶの複製阻害[（ｃ）]の効果があることを示す。（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＨＢＶ １．２プラスミドのＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの分泌量、（ｃ）は、ＨＢＶ ＤＮＡサザンブロットの結果である。
【図３】オリゴヌクレオチドがウイルス（viral）ｍＲＮＡｓ転写を抑制させる結果を示す。ｐｇ／ｐｒｅＣ ＲＮＡはプレゲノム及びプレコアＲＮＡ（pregenomic and precore RNA）を意味し；ｐｒｅ−Ｓ／Ｓ ＲＮＡは表面ＲＮＡ（surface RNAs）を意味し；ＨＢｘ ＲＮＡはＨＢｘタンパク質を作るＲＮＡを意味する。
【図４】オリゴヌクレオチドがウイルス（viral）表面タンパク質を阻害することを示す。ベータアクチンはローディング対照群であり、Ｌ、Ｍ、Ｓは表面タンパク質の３種類を意味するもので、Ｌは大きいもの、Ｍは中間のもの、Ｓは小さいものを意味する。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサー活性を阻害することを示すルシフェラーゼレポーターの分析結果である。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサーを阻害することを示す。
【図７】オリゴヌクレオチドのＥＭＳＡ（electrophoretic mobility shift assay）の結果を示す。オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶのエンハンサーＩ、ＩＩ配列と結合してグアニン４重合体を形成することを示す。
【図８】オリゴヌクレオチドのＥＭＳＡ（electrophoretic mobility shift assay）の結果を示す。前記オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサーＩＩ部位と部分的にグアニン４重合体を形成することを示す。
【図９】オリゴヌクレオチドのＥＭＳＡ（electrophoretic mobility shift assay）の結果を示す。前記オリゴヌクレオチドが自己の塩基配列を認知してグアニン４重合体の構造を形成することを示す。
【図１０】オリゴヌクレオチドに点突然変異を起こした突然変異ヌクレオチドがグアニン４重合体を形成するかどうかを確認するためのＥＭＳＡの結果である。前記点突然変異されたオリゴヌクレオチドの場合、グアニン４重合体を形成できない。
【図１１】オリゴヌクレオチドのＨＢＶ阻害活性をルシフェラーゼの活性分析で測定した結果である。ＰＳはホスホロチオエート変形されたＤ２、ＯｍｅはＯ−メチル変形されたＤ２、ＰＮＡはＰＮＡ変形されたＤ２、ＰＳ−ＯＭｅはホスホロチオエートとＯ−メチル変形されたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡは、ホスホロチオエートとＬＮＡ変形されたＤ２を示す。
【図１２】（ａ）は、ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞のＨＢＶ感染とウイルスタンパク質分析過程を模式的に示したものである。（ｂ）及び（ｃ）は、変形されたオリゴヌクレオチド処理時のＨＢＶタンパク質発現の解析結果である。ＰＳはホスホロチオエート変形されたＤ２を、ＰＳ−ＯＭｅはホスホロチオエートとＯ−メチル変形されたＤ２を、ＰＳ−ＬＮＡは、ホスホロチオエートとＬＮＡの変形されたＤ２を示す。 Ｄ２の感染（transfection）（Ｄ１、Ｔ.Ｆ）を抗ＨＢＶ効果の陽性対照群として用いた。変形されていないＤ２処理（Ｄ２、Ｔｒ）は、陰性対照群に用いた。 ＬＭＶはラミブジン（lamivudine）である。
【図１３】（ａ）は、ＰＨＨｓ（primary human hepatocytes）のＨＢＶ感染とウイルスタンパク質分析過程を模式的に示したものである。（ｂ）及び（ｃ）は、変形されたオリゴヌクレオチド処理時のＨＢＶタンパク質発現の分析結果である。 ＰＳはホスホロチオエート変形されたＤ２、ＰＳ−ＯＭｅはホスホロチオエートとＯ−メチル変形されたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡはホスホロチオエートとＬＮＡ変形されたＤ２を示す。Ｄ２の感染（transfection）（Ｄ１、Ｔ.Ｆ）を抗ＨＢＶ効果の陽性対照群として用いた。変形されないＤ２処理（Ｄ２）は陰性対照群として用いた。
【図１４】変形されたＤ２の抗ＨＢＶ活性を示すルシフェラーゼの分析結果である。ＰＳはバックボーンがＰＳに変形されたＤ２、ＰＳ−Ｏｍｅ（４、４）はバックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端でそれぞれ４つのヌクレオチドをＯ−メチルに変形させたＤ２、ＰＳ−Ｏｍｅ（５、５）はバックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端でそれぞれ５つのヌクレオチドをＯ−メチルに変形させたＤ２、ＰＳ−Ｏｍｅ（ａｌｌ）はバックボーンがＰＳであり、すべてのヌクレオチドをＯ−メチルに変形させたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡ（２、２）はバックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端でそれぞれ２つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡ（３、３）はバックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端でそれぞれ３つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）はバックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端でそれぞれ４つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡ（５、５）はバックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端からそれぞれ５つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＤ２、及びＰＳ−ＬＮＡ（ａｌｌ）はバックボーンがＰＳであり、すべてのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＤ２を意味する。
【図１５】５８個の変形されたオリゴヌクレオチドのＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢｅＡｇの阻害活性を示したものである。
【図１６】５８個の変形されたオリゴヌクレオチドのＨｅｐＧ２細胞におけるＨＢｓＡｇの阻害活性を示したものである。
【図１７】５８個の変形されたオリゴヌクレオチドのＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞におけるＨＢｅＡｇの阻害活性を示したものである。
【図１８】５８個の変形されたオリゴヌクレオチドのＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞におけるＨＢｓＡｇの阻害活性を示したものである。
【図１９】５８個の変形されたオリゴヌクレオチドのＰＨＨ細胞におけるＨＢｅＡｇの阻害活性を示したものである。
【図２０】５８個の変形されたオリゴヌクレオチドのＰＨＨ細胞におけるＨＢｓＡｇの阻害活性を示したものである。
【図２１】オリゴヌクレオチドがインビボモデルでＨＢＶを阻害することを示す。 （ａ）はインビボ実験スケジュールを模式的に示したものであり、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれウイルスタンパク質であるＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの測定結果である。 （ｂ）及び（ｃ）の最初のバーであるＭｏｃｋは対照マウス（control mouse）であり、２番目はＨＢＶと空ベクターがあるものであり、3番目はＨＢＶ ＤＮＡとＤ２を一緒に入れた実験群を意味する。
【図２２】変形されたオリゴヌクレオチドがインビボモデルに静脈注射したときにＨＢＶを阻害することを示す。（ａ）はインビボ静脈（intravenous、ＩＶ）注射実験スケジュールを模式的に示したものであり、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれウイルスタンパク質であるＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの測定結果である。（ｄ）は、サザンブロットで確認した結果であり、各数字は実験したマウスの番号を示す。ＰＳはバックボーンがホスホロチオエートで変形されたＤ２、ＰＳ−ＯＭｅはバックボーンがＰＳであり、すべてのヌクレオチドをＯ−メチルに変形させたＤ２、ＰＳ−ＬＮＡはバックボーンがＰＳであり、すべてのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＤ２を意味する。
【図２３】変形されたオリゴヌクレオチドをナノ粒子（キトサン）で包んだ後にインビボモデルに静脈注射したときにＨＢＶを阻害することを示す。（ａ）はインビボ静脈（intravenous、ＩＶ）注射実験スケジュールを模式的に示したものであり、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれウイルスタンパク質であるＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの測定結果であり、（ｄ）はサザンブロットで確認した結果である。
【図２４】変形されたオリゴヌクレオチドが最初から処理されたときにＨＢＶを阻害することを示す。（ａ）はＰＨＨにＨＢＶを感染させる手順について模式化して示したものであり、（ｂ）及び（ｃ）は変形されたオリゴヌクレオチドを処理した場合、ｃｃｃＤＮＡを除去する作用が優れたことを確認した結果であり、（ｅ）及び（ｆ）は、リアルタイムＰＣＲで定量的に評価した結果である。
【図２５】変形されたオリゴヌクレオチドが再感染の条件で処理されたときにＨＢＶを阻害することを示す。（ａ）はＰＨＨにＨＢＶを感染させる手順について模式化して示したものであり、（ｂ）及び（ｃ）は変形されたオリゴヌクレオチドを濃度別に処理した結果であり、（ｄ）は一般的なＰＣＲを行った後に電気泳動によりＤＮＡ量の違いを確認した結果である。
【図２６】変形されたオリゴヌクレオチドがＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰでｃｃｃＤＮＡを効率的に認識してグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するかどうかを確認した結果である。（ａ）はＮＴＣＰで感染されて生成されたＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡと変形されたオリゴヌクレオチドを処理したとき、グアニン４重合体を認識するＢＧ４抗体によってＤ２とｃｃｃＤＮＡがグアニン重合体を形成することを確認しており、（ｂ）は、ＢＧ４によるｆｏｃｉの個数を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物を提供する。
下記実施例によると、配列番号１、２または６の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドをＨＢＶ感染の肝臓がん細胞株に処理し、ＨＢＶマウスモデルに注入したとき、ＨＢＶタンパク質の生成が阻害されることを確認した。これにより、配列番号１、２または６の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドがＨＢＶに対する抗ウイルス効果を有することを確認した。したがって、配列番号１、２または６の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列も、ＨＢＶに対する抗ウイルス効果を有する。
別の具体例では、オリゴヌクレオチドの細胞透過を容易にするために、配列番号１、２または６の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをＨＢＶ感染の肝臓がん細胞株及びＨＢＶ感染のマウスモデルに処理した。その結果、ＨＢＶタンパク質の生成が阻害されることを確認し、これにより、前記少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドが化学的変形にもかかわらず、ＨＢＶに対する優れた抗ウイルス効果を有することを確認した。
したがって、配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド；及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチド；からなる群から選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドは、Ｂ型肝炎の治療または予防のための医薬の有効成分として用いられる。
医薬組成物において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上のヌクレオシド間のリンケージ（linkage）が化学的変形されたものであるか、少なくとも１つ以上の糖部（sugar moiety）が化学的変形されたものであってもよい。
具体例において、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）とは、これに制限されるものではないが、約５〜４０個、例えば、１０〜３０個のヌクレオチドからなる重合体である。
ヌクレオチド（nucleotide）は、塩基（base）、５炭糖、リン酸基（ホスフェート）で構成される。前記塩基は、プリン（アデニンまたはグアニン）またはピリミジン（シトシン、チミンまたはウラシル）であってもよい。また、５炭糖は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはこれらの糖の安定化された変形形態であってもよい。
例えば、５炭糖がデオキシリボースである場合、ヌクレオチドは下記式（１）のような構造で表してもよい。
【化１】
0006811338.tif 000002
（１）
前記式（１）において、
Ｂは、塩基（base）を示し、Ｒ１、は−Ｈである。
化学的変形（chemical modification）について、より具体的に説明すると、次の通りである。前記化学的変形されたオリゴヌクレオチドは、自然オリゴヌクレオチドと比較する時、ヌクレオシド間のリンケージ、リボース単位体及び/または自然ヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンなど）を伴う様々な化学的変形（chemical modification）を含んでもよい。変形はオリゴヌクレオチドの合成の間に、または合成の後に発生してもよい。合成の間に、変形された塩基は内部的にまたはそれの末端に組み込まれてもよい。合成の後に、変形は活性基（アミノ変形者を介して、３’または５’ヒドロキシル基を介して、またはリン酸基を介して）を用いて行われてもよい。通常の技術者は、オリゴヌクレオチドの変形方法をよく知っている。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは少なくとも１つ以上のヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたものであってもよい。  
ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されるということは、ヌクレオシドを互いに連結させているリン酸基内の酸素が１つ以上の他の置換基に置換されていることをいう。
一部具体例として、ヌクレオシド間のリンケージに参与しないリン酸基中の酸素が硫黄に置き換えられている核酸分子の安定化された糖ホスフェートバックボーンを「ホスホロチオエートバックボーン」という。前記ホスホロチオエートの他にヌクレオチドのリン酸基は、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートにも置換されてもよいが、これに制限されない。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートバックボーンは、それぞれ下記の式（２）〜（５）に示す。
【化２】
0006811338.tif 000003
（２）
【化３】
0006811338.tif 000004
（３）
【化４】
0006811338.tif 000005
（４）
【化５】
0006811338.tif 000006
（５）
前記式（２）〜（５）において、Ｂは、塩基（base）を示す。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは少なくとも１つ以上の糖部が化学的変形されたものであってもよい。
糖部が化学的変形されたことは、ヌクレオチド内の５炭糖に化学的変形が起きたことをいう。
糖部の化学的変形は、例えば、ヌクレオチド内の５炭糖の２’位置の−Ｈ基が他の置換基に置換されたり、５炭糖の基本構造が変形される場合を含む。
ヌクレオチド内の５炭糖の２’位置の−Ｈ基が他の置換基に置換されている糖部の化学的変形は、下記式（１）の５炭糖の２’の位置であるＲ１、が−Ｈ基以外の置換基に置換されることを意味する。
【化６】
0006811338.tif 000007
（１）
前記式（１）において、
Ｂは、塩基（base）を示し、Ｒ１は、−Ｈである。
一部具体例において、前記糖部はヌクレオチド内の５炭糖の２’位置の−Ｈ基が、これに制限されるものではないが、メトキシエトキシ[２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）；ＭＯＥ]、式（６））、ジメチルアミノオキシエトキシ（[２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２；ＤＭＡＯＥ]、式（７））、ジメチルアミノエチルオキシエチル（[２’−ＯＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２；ＤＭＡＥＯＥ]、式（８））、メトキシ（[２’−ＯＣＨ３；Ｏｍｅ]、式（９））、アミノプロポキシ（[２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２；ＡＰ]、式（１０））またはフッ素（２’−Ｆ、式（１１））に置換されて変形されたり、前記糖部が、Ｆ−ＡＮＡ（２’−Ｆ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、式（１２））に置換されて変形されたものであってもよい。
【化７】
0006811338.tif 000008
（６）
【化８】
0006811338.tif 000009
（７）
【化９】
0006811338.tif 000010
（８）
【化１０】
0006811338.tif 000011
（９）
【化１１】
0006811338.tif 000012
（１０）
【化１２】
0006811338.tif 000013
（１１）
【化１３】
0006811338.tif 000014
（１２）
前記式（６）〜（１２）で、Ｂは、塩基（base）を示す。
一部具体例において、ヌクレオチド内の５炭糖の基本構造が変形されている場合は、これに制限されるものではないが、ヌクレオチド内の５炭糖がＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものを含んでもよい。
ＬＮＡ（locked nucleic acid）は、「ロック核酸」または「バイサイクリックヌクレオシド（bicyclic nucleoside）」とも呼ばれ、ヌクレオチド内の５炭糖の２’位置と４’位置との間の共有ブリッジを含むヌクレオシドを含むことをいう。ＬＮＡは、下記式（１３）で表示される。
【化１４】
0006811338.tif 000015
（１３）
前記式（１３）において、Ｂは、塩基（base）を示す。
ＰＮＡ（peptide nucleic acid）は、「ペプチド核酸」とも呼ばれ、ヌクレオチドの基本骨格に塩基（base）が保有されており、基本骨格のアミド（amide-）部分のアザ（aza-）窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡは、下記式（１４）で表してもよい。
【化１５】
0006811338.tif 000016
（１４）  
前記式（１４）において、Ｂは、塩基（base）を示す。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは３’または５’末端にリンカーを介してＧａｌＮＡｃ（N-acetylgalactosamine）が結合されている形態であってもよい。
これに制限されるものではないが、前記ＧａｌＮＡｃは、オリゴヌクレオチドの末端に連結されたリンカー部分に必要な数だけ、例えば、１個、２個、または３個を導入してもよい。
ＧａｌＮＡｃは、肝臓細胞のアシアロ糖タンパク質（asialoglycoprotein）受容体に結合されるために、肝臓標的化の一部としてＧａｌＮＡｃをオリゴヌクレオチドの末端に結合させて、肝臓特異的な伝達をする技術が開発されている。前記オリゴヌクレオチドは、肝臓特異的な伝達が必要であるため、このような公知のＧａｌＮＡｃ結合技術を活用してオリゴヌクレオチドをさらに化学的変形させてもよい。  
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される２種以上の化学的変形を有するものであってもよい。
前記糖部の化学的変形は、同一または異なってもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは糖部の化学的変形を含み、化学的変形を有するヌクレオシド間のリンケージによって結合してもよい。１つのヌクレオチドの化学的変形は同一のオリゴヌクレオチド内に存在する他のヌクレオチドの化学的変形とは関係ない。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、糖部の化学的変形を含んでもよい。
一部具体例において、化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%または１００%が変形されたものであってもよい。
例えば、２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の５炭糖の２’位置の−Ｈ基がメトキシエチル（ＭＯＥ）、ジメチルアミノオキシエトキシ（ＤＭＡＯＥ）、ジメチルアミノエトキシエチル（ＤＭＡＥＯＥ）、メチル（Ｏｍｅ）、アミノプロポキシ（ＡＰ）またはフッ素（Ｆ）に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がＦ−ＡＮＡに置換されて変形されたものであってもよい。
また別の例において、２種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＰＮＡ（peptide nucleic acid）の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドの５’末端は、１、２、３、４または５つの隣接する化学的変形を含んでもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドの３’末端は、１、２、３、４または５つの隣接する化学的変形を含んでもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、５’末端及び３’末端に１、２、３、４または５つの隣接する化学的変形を含んでもよい。
例えば、下記具体例で見られるように、オリゴヌクレオチドは全体バックボーンがホスホロチオエート（ＰＳ）バックボーンに変形され、オリゴヌクレオチドの５’と３’の両端でそれぞれ４つのヌクレオチドをＯ−メチルに変形させたＰＳ−ＯＭｅ（４、４）；またはオリゴヌクレオチドの５’と３’の両端でそれぞれ５つのヌクレオチドをＯ−メチルに変形させたＰＳ−ＯＭｅ（５、５）であってもよい。
また別の具体例において、オリゴヌクレオチド全体のバックボーンは、ホスホロチオエート（ＰＳ）であり、オリゴヌクレオチドの５’と３’の両端でそれぞれ２つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＰＳ−ＬＮＡ（２、２）；オリゴヌクレオチドの５’と３’の両端でそれぞれ３つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＰＳ−ＬＮＡ（３、３）；オリゴヌクレオチドの５’と３’の両端でそれぞれ４つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＰＳ−ＬＮＡ（４、４）；またはオリゴヌクレオチドの５’と３’の両端でそれぞれ５つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたＰＳ−ＬＮＡ（５、５）であってもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
具体例では、化学的変形を有するオリゴヌクレオチドで配列番号２０〜５７の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドを用いたが、これに制限されるものではない。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドはＨＢＶとグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成してもよい。
ワトソン−クリック（Watson-Crick）モデルに記述されている二重らせんＤＮＡは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と水素結合を介してペアをなす。しかし、フーグスティーン（Hoogsteen）は、グアニンがリッチなところには４つのグアニンが平面的に水素結合して１つのカルテット（quartet）をなして、カルテット３つが垂直に層をなした形を成したが、これをグアニン４重合体（G-quadruplex）と提案した。一般的に、グアニンが多く位置いた遺伝子において、グアニン４重合体の構造に現れると報告された。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶと結合してグアニン４重合体を形成してＨＢＶ活性を阻害することを確認した（実施例３参照）。
前記オリゴヌクレオチドは、細胞、組織のような個体でＨＢＶの発現を抑制するために用いられてもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドを用いて個体に投与するための組成物、すなわち、医薬組成物を製剤化してもよい。前記製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容可能な賦形剤は、活性薬剤の成分（例えば、オリゴヌクレオチド、治療剤など）を除いた物質である。賦形剤は、添加された投与量では効果を示さない。
具体例において、前記オリゴヌクレオチドの中の１つ以上を含むＢ型肝炎の治療または予防用医薬組成物が提供される。
オリゴヌクレオチドは、「抗ウイルス性オリゴヌクレオチド」または「抗ＨＢＶオリゴヌクレオチド」として記述してもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular DNA）を減らすことによってＨＢＶ活性を阻害しうる。
したがって、「抗ウイルス性オリゴヌクレオチド」を含む医薬組成物が提供される。
前記医薬組成物は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドらを含み、生体内（インビボ）で抗ウイルス剤としての使用を妨げない他の物質を含んでもよい。これらの他の物質は制限されず、希釈剤、賦形剤、担体、及び/または他の抗ウイルス性物質を含んでもよい。
具体例において、オリゴヌクレオチドは、様々な医薬組成物で製剤化されてもよい。医薬組成物は、意図された使用に適した形態で製造される。一般的に、これは発熱源（pyrogens）だけでなく、人間または動物に害を及ぼすことができる他の不純物のない組成物の製造を必要とする。例示的な伝達/製剤システムは、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、及び水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子であり、前記キトサンは、５０〜１９０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
組成物または製剤は、本発明に記載された少なくとも１つを含む多数の治療的オリゴヌクレオチドを用いてもよい。例えば、組成物または製剤は、本発明に記載された少なくとも１、２、または３つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを用いてもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは他の治療剤との組み合わせで用いられてもよい。組み合わせはまた、細胞を１つ以上の区別された組成物または製剤と同時に接触させることにより達成できる。選択的に、組み合わせは連続的に投与されてもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは例えば、殺菌水と一般的な食塩水を含む、適切な希釈液と一緒に製剤化することにより、通常の皮下または静脈投与のために製剤化される。
医薬組成物及び製剤は、伝達ビークルを安定化し、標的細胞によって吸収されるように適切な塩及び緩衝液が用いられてもよい。具体例において、医薬組成物は、抑制剤オリゴヌクレオチド（例えば、リポソーム、ナノ粒子、または他の複合体）を含む有効量の伝達ビークルが含まれ、薬学的に許容可能な担体または水性媒質で溶解されるか、または分散される。「薬剤学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」は、動物または人間に投与された場合、有害であるか、アレルギーになるか、または他の副反応を示さない分子または組成物をいう。
用語、「許容可能な担体」は、人間に投与するのに適した医薬のような医薬を製剤化するために用いるのに適した１つ以上の溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌性及び抗真菌性物質、等張性及び吸収遅延物質等を含む。医薬的に活性である物質のためのこのような媒質及び物質の使用は、この技術分野でよく知られている。また、補助的な活性成分が組成物に含まれてもよい。  
医薬組成物の投与、または伝達は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を通してもよい。例えば、投与は、局所または皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、冠状動脈内、硬膜内または静脈内注射、または標的組織（例えば、心臓組織）内への直接注射によってもよい。本発明に開示されたオリゴヌクレオチドの安定性及び/または効力は皮下、皮内、静脈内及び筋肉内を含む便利な投与経路を考慮する。また、本発明に記載されたオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療物質を心臓に伝達するために、冠状循環を隔離するシステムによって投与してもよい。治療物質を心臓及び冠状脈管構造に伝達するための様々なカテーテルシステムは、この技術分野で知られている。
前記オリゴヌクレオチド及び医薬組成物は、キット（kit）、容器（container）、パック（pack）またはディスペンサー（dispenser）に含まれてもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドの中の１つ以上を含む医薬組成物は、細胞、組織、または個体におけるＨＢＶ発現の抑制に有用である。また、組成物または製剤は、非経口、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に投与されてもよい。例として、遊離塩基または薬剤学的に許容可能な塩として、コンジュゲート（conjugate）の溶液は、水でヒドロキシプロピルセルロース（hydroxypropyl cellulose）のような界面活性剤と適切に混合して製造してもよい。また、分散液は、グリセロール（glycerol）、液体ポリエチレングリコール（polyethyleneglycol）、これらの混合物及び油で製造してもよい。
通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防ぐために、一般的に防腐剤を含む。注射用途またはカテーテル（catheter）伝達に適した薬学的形態は、例えば、殺菌水性溶液または分散液及び滅菌注射溶液または分散液の即時製造のための滅菌粉末を含む。一般的に、これらの製剤は滅菌されて、容易な注入性が存在する程度に流動的である。製剤は、製造及び保管条件下で安定である必要があり、細菌及び菌類のような微生物の汚染作用に備えて保管しなければならない。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び植物油を含んでもよい。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌及び抗真菌物質によって行われる。多くの場合では、等張性物質、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが適切である。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物に用いて行ってもよい。
殺菌注射溶液は、適切な量のコンジュゲートを溶媒に望む任意の他の成分（例えば、前記の列挙したもの）と一緒に混合することにより製造してもよい。一般的に、分散液は、様々な殺菌活性成分を基本的な分散媒と望む他の成分、例えば、前に列挙したものを含む殺菌ビークルに混合することにより製造される。殺菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、前記殺菌／ろ過された溶液から任意のさらに要求される成分を加えた活性成分のパウダーを生産する真空乾燥及び凍結乾燥技術を含む。
製剤において、溶液はなるべく投与製剤に適した方法及び治療に効果的な量で投与される。製剤は注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの多様な投薬形態で容易に投与されうる。水溶液においては非経口投与のために、例えば、溶液は一般的に適切に緩衝され、液状希釈液は、まず、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性を作る。これらの水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹膜内投与に使用されてもよい。好ましくは、特に本明細書の観点から、この技術分野の通常の技術を有する者に既に知られている通り、殺菌水性媒体が使用される。例として、単一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解されて１０００ｍｌの皮下注液流体（hypodermoclysis fluid）に添加されるか、または予定された注入部位に注射されてもよい（例えば、非特許文献８のページ１０３５−１０３８及び１５７０−１５８０を参照）。治療を受ける対象の疾患に応じて、容量の一部変化は必然的に生じることになる。投与に対して責任を負う者はどんなことがあっても、個々の対象のための適切な容量を決定するべきである。また、人間への投与において、剤形はＦＤＡの生物学基準事務局によって要求される殺菌性、発熱原性、一般的な安全及び純度の基準を満たしていなければならない。
具体例において、オリゴヌクレオチドを（例えば、本明細書に記述された組成物または製剤の一部として）細胞に伝達する方法、及び対象における疾患の進行を治療、軽減、または予防する方法が提供される。用語、「対象」または「患者」は、人間及び他の霊長類（例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及び馬）、家庭用哺乳類（例えば、犬及び猫）、実験室動物（例えば、マウス、ラット、及びモルモットのようなげっ歯類）及び鳥（例えば、鶏、七面鳥及び家禽類のような家庭用、野生用及び競技用の鳥、アヒル、ガチョウなど）を含むが、これに制限されない任意の脊椎動物を意味する。一部の実施態様において、対象は哺乳類である。
一部具体例において、哺乳類は人間である。
具体例において、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は標的細胞（例えば、哺乳類細胞）とインビトロ（in vitro）またはインビボで接触されてもよい。一部具体例において、前記細胞は肝臓細胞であってもよい。
また、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）と候補物質とを接触させて、前記ＨＢＶと候補物質がグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するかどうかを確認する段階を含む、Ｂ型肝炎治療剤のスクリーニング方法が提供される。
前記スクリーニング方法でＨＢＶと候補物質がグアニン４重合体を形成する場合、前記候補物質がＢ型肝炎に治療効果があると判断してもよい。
具体例において、ＨＢＶと候補物質がグアニン４重合体を形成するかどうかを確認する方法は、ＥＭＳＡ（Electrophoretic mobility shift assay）、円偏光二色性（circular dichroism、ＣＤ）、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance、ＮＭＲ）、またはグアニン４重合体に特異抗体を用いた方法を用いて確認してもよいが、ＤＮＡとタンパク質間に結合するかどうかを確認できる方法であれば、特に制限されるものではない。
前記候補物質は、グアニン（Ｇ）を４つ以上含むものであってもよい。前記候補物質がグアニンを４つ以上含むことにより、グアニン４つの結合を基本として、４本のヘリックスが１つの構造をなすグアニン４重合体を形成しうる。
前記グアニン４重合体は、ＨＢＶのエンハンサーＩＩ部位と候補物質が結合して形成されるものであってもよい。前記エンハンサーＩＩは、配列番号１９の核酸配列を有するものであってもよい。
下記実施例では、配列番号２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサーＩＩ領域と物理的に結合して、部分的にグアニン４重合体を形成することを確認することにより、ＨＢＶのエンハンサーの活性を阻害することを確認した。
一部具体例において、前記候補物質は、配列番号１、２または６の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドであるか、前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも１つの化学的変形（chemical modification）を有するオリゴヌクレオチドであるか、前記オリゴヌクレオチドをすべて含むものであってもよい。
前記オリゴヌクレオチドは、先に述べたすべての内容をそのまま適用してもよい。
一部具体例において、前記Ｂ型肝炎の治療または予防用医薬組成物を経口または非経口で個体に投与されることを含む、Ｂ型肝炎の治療または予防方法が提供される。
臨床的な使用のために、オリゴヌクレオチドは望む治療結果を達成するのに効果的な任意の適切な投与経路を介して単独で投与されるか、医薬組成物に剤形化されてもよい。オリゴヌクレオチドの投与「経路」は、経腸、非経口及び局所投与または吸入を意味する。オリゴヌクレオチドの経腸投与の経路は口腔、胃腸、腸、及び直腸を含む。非経口の経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、脊髄腔内、皮下、局所注入、膣、局所、鼻腔、粘膜及び肺投与を含む。オリゴヌクレオチドの局所投与の経路は、表皮、口腔、及び耳、目及び鼻内へのオリゴヌクレオチドの外部適用を示す。
用語、「予防」とは、医薬組成物を個体に投与して炎症疾患または免疫疾患を抑制させたり、遅延させる全ての行為を意味する。
用語、「治療」とは、医薬組成物をＢ型肝炎の発生が疑われる個体に投与して、肝炎の症状が好転するようにしたり、有利になるようにするすべての行為を意味する。
用語、「改善」は、治療される状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。
本発明は、制限的なものと解釈されるべきではない次の追加例によりさらに説明される。通常の技術者は、本発明の観点で本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施態様に対する色々な変化が可能であり、同様または類似の結果を得ることができると理解するべきである。
他の式で定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法は、本技術分野でよく知られていて、通常使用されるものである。
以下、本発明を実施例を介して詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するだけであり、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：材料及び方法
１−１：細胞培養及び感染（transfection）
人間肝臓がん細胞株（ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Manassas、VA、USA）から提供された。 ｈＮＴＣＰ[ＮＭ_００３０４９．３]のＮＣＢＩ番号を有するｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １０（ナトリウム／胆汁酸共輸送体）またはメンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）が発現可能なプラスミドは、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞株を確立するために、製造社の指示に従って、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いてＨｅｐＧ２細胞に感染（transfection）させた。細胞株は、ＤＭＥＭで培養した。ＤＭＥＭには、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Gibco BRL）を入れ、１％ペニシリンと１％ストレプトマイシンを添加して用いた。ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞を５％ＣＯ２が発生するインキュベーターで３７℃の温度で培養した。初代ヒト肝細胞（Primary human hepatocytes、ＰＨＨｓ）はカトリック大学病院（議政府、京畿道、韓国）の患者組織からＩＲＢの承認を受けて、分離して用いた。一次維持培地（primary maintenance medium）（Gibco BRL、Oregon、USA）にＣＭ４０００（Thermo、Rockford、USA）を入れ、１％ペニシリンと１％ストレプトマイシンを添加してＰＨＨを培養した。
感染（Transfection）は、ガイドラインに従ってリポフェクタミン２０００を用いて、８０％程度の細胞が培養されたときに行った。感染後１５時間が経過したとき、細胞は新しい培地に変えた。細胞、感染後２〜３日目に収穫した。
１−２：ＨＢＶ感染の研究
接種可能なＨＢＶを集めるために、約１００倍に濃縮されたＨｅｐＡＤ３８細胞の培養上澄み液を６％ＰＥＧ８０００と一緒に沈殿させた。２５％ＦＢＳを含むＰＢＳにＨＢＶ粒子を準備した。感染性のあるＨＢＶストックを−８０℃で保管した。ＨＢＶの定量は、点ブロット検定（dot blot assay）を介して計算した。ＨＢＶ感染のために、４％ＰＥＧと２．５％ＤＭＳＯを含むＰＭＭと一緒に、ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞とＰＨＨ細胞を用いた。感染１５時間後、フレッシュＰＭＭで培地を交替した。感染（infection）して７日後に、感染された細胞を収穫した。
１−３：サザンブロット（Southern blot）
サザンブロット（Southern blot）でウイルスＤＮＡを検出した。簡略に言うと、感染して３日後に掻き取って（scrapping）細胞ペレットを収穫した。そして収穫された細胞を冷たいＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０）バッファー １００μｌで溶かした後、２６％ＰＥＧ８０００ バッファーで溶解物にあるＨＢＶコアキャプシド（HBV core capsid）を沈殿させた。その後、ＨＢＶコアキャプシドを０．５％ＳＤＳバッファー（２５０ｍｇプロテイナーゼＫ含有）で、３７℃で３時間分解させた。ＨＢＶ ＤＮＡをフェノールクロロホルム（phenol-chloroform）で抽出し、ＮａＯＡＣとエタノール（ethanol）で沈殿させた。総ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで９０Ｖで３時間電気泳動を通して分離させ、ＸＬニトロセルロースメンブレン（XL nitrocellulose membrane）（GE healthcare）に移した（transfer）。その後、ＨＢＶのＤＮＡを高純度ランダム化ＨＢＶプローブ（highly pure randomized HBV probe）で検出し、ホスホイメージャー（Phospho-imager）を使って相対的なＨＢＶのＤＮＡ複製の水準を定量化した。
１−４：ノーザンブロット（Northern blot）
ノーザンブロット（Northern blot）でＨＢＶのｍＲＮＡを検出した。簡略に言うと、製造社の指示に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて総細胞ＲＮＡを抽出した。２０μｌの総ＲＮＡを１％ホルムアルデヒド（formaldehyde）アガロースゲルで１２０Ｖで３時間電気泳動を通して分離させ、ＸＬニトロセルロースメンブレン（GE healthcare）に１６〜１８時間移した（transfer）。ＨＢＶ特異的ｍＲＮＡ（HBV-specific mRNA）を検出するために、メンブレンを高純度ランダム化ＨＢＶプローブと一緒に混成化（hybridization）させ、ホスホイメージャーを使って相対的なＨＢＶのＤＮＡ複製の水準を定量化した。
１−５：ウエスタンブロット（Western blot）
感染２日後、細胞を収穫してＲＩＰＡ バッファー （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％プロテアーゼ阻害剤カクテル（protease inhibitor cocktail）（Sigma、St.Luis、MO）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に３０分間４℃で溶解させた。タンパク質溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法で分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ポリアクリルアミドゲル（polyacrylamide gel）のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに移した。抗体（Antibody）は１：２０００の割合で用いた。１次抗体（1st antibody）は、抗アクチン（anti-actin）（Sigma）、ＨＢｓＡｇ（Abcam）、ＨＢｃＡｇ（DAKO、USA）を用いた。
１−６：リアルタイム（real-time）ＰＣＲを用いたｒｃＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡの定量分析
ＨＢＶのｒｃＤＮＡを定量するために、ＨＢＶが感染したＰＨＨでＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全体細胞のＤＮＡを抽出した。ｃｃｃＤＮＡを増幅する前に、ＤＮＡをＴ５ ｅｃｏｎｕｃｌｅａｓｅ（NEB）処理した。リアルタイムＰＣＲは、ＤＮＡを２０ｎｇ含むＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（roche）２０μｌ、０．５μｍｏｌ／Ｌの正方向プライマー、０．５μｍｏｌ／Ｌの逆方向プライマー、０．２μｍｏｌ／Ｌの３’−フルオレセイン（fluorescein）（FL）が標示されたプローブ、及び０．４μｍｏｌ／Ｌの５’−Ｒｅｄ６４０（Ｒ６４０）が標示されたプローブを用いた。ｃｃｃＤＮＡの増幅のための正方向と逆方向プライマーは、それぞれ５’−ＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１０）及び５’−ＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号１１）の構造であり、肝臓内のｒｃＤＮＡの増幅は、 ５’−ＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１２）及び５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号１３）をそれぞれ用いた。ＦＲＥＴ混成化プローブは、ｃｃｃＤＮＡの増幅のために、５’−ＧＴＴＣＡＣＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＡＣＧＴ−ＦＬ−３’（配列番号１４）及び５’−Ｒ６４０−ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１５）、ｒｃＤＮＡの増幅のために５’−ＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡ−ＦＬ−３’（配列番号１６）及び５’−Ｒ６４０ ＴＧＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ−３’（配列番号１７）をそれぞれ用いた。ＨＢＶ ＤＮＡの総量の増幅は、記述したように行った：９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で１０秒、５８℃で１０秒、７２℃で１５秒を４５回繰り返した。ｃｃｃＤＮＡの増幅は、次に記述したように行った：９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で１０秒、５８℃で５秒、７２℃で２０秒を４５回繰り返した。ノーマライジングするために、ベータグロビンの遺伝子をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｂ−Ｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｉｔ（Roche）を用いて増幅させた。ＨＢＶモノマー（ｐＨＢＶＥｃｏＲＩ）が含まれたプラスミドを段階希釈したものを定量標準とした。
１−７：ルシフェラーゼレポーター（luciferase reporter）の分析
ＨＢＶエンハンサーの活性を確認するために、エンハンサールシフェラーゼレポーターアッセイを行った。１２ウェルプレートに２×１０５個のＨｅｐＧ２細胞株を用意して、０．５μｇのエンハンサーＬｕｃ（ｐＥｎｈＩ.ＩＩ、ｐＥｎｈＩ.ΔＩＩ、ｐＥｎｈＩＸｐ、ｐＸｐ.ＥｎｈＩＩ、ｐＮＲＥ.ＥｎｈＩＩ、ｐＥｎｈＩＩ/ｃｐ、ｐＥｎｈＩ△Ｘｐ−Ｄ２、ｐＥｎｈＩＸｐ−Ｄ６、ｐＥｎｈＩ△Ｘｐ−Ｄ７、及びｐＥｎｈＩＸｐ−Ｄ８：図５及び図６参照）及び５０ｎＭのＤ２をトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に、細胞を収穫してプロメガ溶解バッファー（promega lysis buffer）に溶解し、その後、エンハンサールシフェラーゼの活性をルシフェラーゼ試薬（Promega、Madison、WI）を用いて測定した。
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１−８：オリゴヌクレオチドの製作
１−８−１：変形されないオリゴヌクレオチドの製作
図１は、ＨＢＶのゲノム分析を通してグアニン４重合体（G-quadruplex）などの特異な構造をなす、抗ウイルスの効果を出せる配列スクリーニングの模式図を示したものである。
本発明に用いたオリゴ化合物Ｄ１−Ｄ９はｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ（Seoul、Korea）またはＢｉｏ Ｂａｓｉｃ（Canada）で合成した。それぞれの詳細な説明は、以下の表２に記載した。
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Ｄ１−Ｄ９は、変形されないオリゴヌクレオチドである。このうち、Ｄ２をＰＳ（Phosphorothioate）、ＯＭｅ（O-Methyl）、ＰＮＡ（Peptide nucleic acid）、ＬＮＡ（locked nucleic acid）、ＰＳ−ＯＭｅ、及びＰＳ−ＬＮＡに変形して用いた。
ＰＳに変形されたオリゴヌクレオチドは、細胞内への透過が容易であり、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）による分解を防げる。ＯＭｅ変形は、ＲＮＡと類似の特徴を有するが、細胞内でヌクレアーゼ（nuclease）の加水分解に対して安定性が増加する特徴がある。また、２重構造のＴｍは１−４℃程度増加する。ＰＮＡは、人為的に作られた重合体であって、ＤＮＡまたはＲＮＡと類似の構造を有し、骨格はペプチド結合によってＮ−（２−アミノエチル）−グリシンが繰り返して連結されている。ＬＮＡに変形されたオリゴヌクレオチドは２’酸素と４’炭素が連結されてロックされた構造であって、混成化する時にＴｍが増加して分解から安定した特徴がある。部分的に変形されたＤ２は、５’末端と３’末端配列に部分的に変形させた。例えば、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）は、全体バックボーンがＰＳであり、５’と３’の両端でそれぞれ４つのヌクレオチドをＬＮＡに変形させたことを意味する。このように、部分的に変形させて製作したＤ２としては、ＰＳ−ＯＭｅ（４、４）、ＰＳ−ＯＭｅ（５、５）、ＰＳ−ＬＮＡ（２、２）、ＰＳ−ＬＮＡ（３、３）（配列番号７６）、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）（ 配列番号７７）、ＰＳ−ＬＮＡ（５、５）などがある。
１−８−２：変形されたオリゴヌクレオチドの製作
抗ウイルス効果の最適化のために、前記１−８−１のＤ２を用いて多様な形態のオリゴヌクレオチドを以下のような命名法を用いて作製した：ＤＮＡは、大文字のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔと命名し、ＲＮＡはａ、ｇ、ｃ、ｔと命名した。ヌクレオチド内の５炭糖の２’位置をＯ−メチルに変形させた場合、核酸の前にｍを付けて、ＬＮＡに変形させた場合は核酸の前にＩを付けた。ＤＮＡバックボーン（backbone）の場合、ホスホロチオエート（phosphorthioate、ＰＳ）となっている場合、中括弧（[]）で表記した。一般ＤＮＡは、中括弧がない形態である。前記命名法については、表３に示した。
前記命名法の規則に基づいて、合計５８個のオリゴヌクレオチドを合成し、表４及び５に示した。本発明では、下記の表４及び５に示されたオリゴヌクレオチドは、順番に配列番号２０〜 配列番号７７で示し、下記の表４及び５で核酸配列に付与された番号はオリゴ変形＃（Oligo modification ＃）を意味する。
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【表４】
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【表５】
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１−９：ＥＭＳＡ（electrophoretic mobility shift assay）
ＨＢＶのエンハンサーＤＮＡは３０ｎｇを使用し、[３２Ｐ]−ガンマ同位元素を用いてラベリングした。Ｄ２は５００ｎｇをグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するのに用いた。ＤＮＡを（Ｄ２、ｐＥｎｈＩ△Ｘｐ、ｐＥｎｈＩ△Ｘｐ−Ｄ２、及びエンハンサーＩ、ＩＩ）バッファー溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）と混合し、熱を加えた後、冷やしてＤＮＡをフォルディングさせた。ＤＮＡ混合物に反応させた後、ＢＧ４抗体（Absolute antibody、United Kingdom）を添加してＤＮＡ−タンパク質結合を介して特異的なグアニン４重合体（G-quadruplex）ＤＮＡを確認した。常温で結合反応した後、ＤＮＡ−ＤＮＡ複合体は６％ポリアクリルアミドゲルを用いて低温で電気泳動を行った。電気泳動した後、ゲルは７０℃の温度で３０分間乾燥させた。結果は、ホスホイメージャーを用いて分析した。
１−１０：マウスに流体力学的な注入（hydrodynamic injection）を用いた実験
流体力学的な注入方法を用いて、６週齢のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にプラスミドＤＮＡ（ＨＢＶ １．２ ２５μｇ、Ｄ２ ２５μｇ及びｂ−ｇａｌ ５μｇ）を伝達した。マウス体重の１０％に該当する体積のＰＢＳを用意してマウスの尾静脈に注射した。変形されたＤ２（５０μｇ）もマウスの尾静脈に注射した。ＤＮＡを含むＰＢＳは注射器を用いて４−６秒間、迅速に静脈に注射した。すべての動物実験は、建国大学の動物管理委員会（Animal Care Committee）によって承認された。
１−１１：細胞のグアニン４重合体を顕微鏡で分析する方法
６ウェルプレートにカバーグラスを底に敷いて細胞を培養した。前記細胞にＨＢＶを感染させて、５００ｎＭの変形されたＤ２を処理した。アセトンで細胞を固定させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いてブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＢＧ４（absolute antibody、Ab00174-1.1）抗体を１：３００の割合で混ぜて、冷蔵室（cold room）で一晩反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、抗マウスアレクサ５６８（Anti-mouse alexa 568）を用いて１時間６ウェルプレートにカバーグラスを底に敷いて細胞を培養した。前記細胞にＨＢＶを感染させて、５００ｎＭの変形されたＤ２を処理した。アセトンで細胞を固定させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いてブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＢＧ４（absolute antibody、Ab00174-1.1）抗体を１：３００の割合で混ぜて、冷蔵室（cold room）で一晩反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、抗マウスアレクサ５６８（Anti-mouse alexa 568）を用いて１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、３０分間ＤＡＰＩで核を染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、カバーガラスをスライドガラスに取り付けた後、乾燥させた。
１−１２：キトサンナノ粒子を用いたインビボ実験
流体力学的な注入方法を用いて、６週齢のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にプラスミドＤＮＡ（ＨＢＶ １．２ ２５μｇ及びｂ−ｇａｌ ５μｇ）を伝達した。マウス体重の１０％に該当する体積のＰＢＳを用意してマウスの尾静脈に注射した。ＤＮＡを含むＰＢＳは注射器を用いて４−６秒間、迅速に静脈に注射した。翌日、キトサンナノ粒子Ｄ２ ８μｇもマウスの尾静脈に注射した。キトサンナノ粒子は、低細胞毒性と免疫原性だけでなく、効率的な生体適合性分子であって、siＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドを効率的に転送できる特徴がある（非特許文献９）。
前記の実験のために用いられたキトサンナノ粒子は、キトサン（ＭＷ ５０−１９０ＫＤａ）とＤ２のイオン的ゲル化（gelation）を基に製造した。ＴＰＰ（０．２５％ｗ／ｖ）とＤ２（１μg/μＬ）を１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液に添加した。室温で連続的な反応が起き、インキュベーション反応が終わった後、４℃で４０分間１３，０００ＲＰＭで遠心分離してペレットを収得した。収得されたペレットはＤＷで３回にわたって洗浄し、使用するまで４℃で保管した。すべての動物実験は、建国大学の動物管理委員会によって承認された。
実施例２：抗ウイルス効果の確認
２−１：抗ウイルス効果を示すオリゴヌクレオチドの確認
Ｄ１〜Ｄ９のオリゴヌクレオチドをＨＢＶと一緒に肝臓がん細胞株に感染させた後、ウイルスタンパク質（ＨＢＳＡｇ及びＨＢｅＡｇ）の生成阻害及び複製阻害によって抗ウイルス効果を判断した。
具体的には、ＨＢＶ １．２プラスミド及びオリゴヌクレオチド（Ｄ１〜Ｄ９は、それぞれ配列番号１〜９）は、ＨｅｐＧ２に感染させた。感染させた後３日間、細胞と上澄み液を培養した。ＨＢＶタンパク質の発現を決定するために、分泌されたＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇを測定した。培養培地のＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇはＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇＥＬＳＩＡキット（Wantai pharm Inc.、Beijing、China）を用いて分析した。ＨＢＶ ＤＮＡはサザンブロットで測定した。
その結果、図２に示すように、Ｄ１、Ｄ２及びＤ６が抗ウイルス効果を示した。
２−２：ＨＢＶ ＲＮＡ発現の阻害
前記実施例２−１で確認したように、Ｄ１、Ｄ２とＤ６オリゴヌクレオチドの中で抗ウイルス効果が最も優れたＤ２オリゴヌクレオチドを用いて、ＨＢＶ ＲＮＡ発現阻害の実験を行った。具体的には、どの段階のＨＢＶライフサイクルがＤ２オリゴヌクレオチドによって阻害されるのかを確認するために、Ｈｕｈ７細胞にＨＢＶ １．２ｍｅｒを感染させた後、ＨＢＶ ｍＲＮＡレベルをノーザンブロットで分析した。
その結果、図３に示すように、Ｄ２オリゴヌクレオチドは用量依存的にＨＢＶ ＲＮＡsを抑制させることを確認した。したがって、Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶ ＲＮＡ発現も阻害することを確認することにより、Ｄ２オリゴヌクレオチドがウイルスのＲＮＡ転写段階に作用して、阻害することを確認した。
２−３：ＨＢＶタンパク質の発現阻害を確認
Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶタンパク質発現を阻害するかどうかを確認するために、Ｈｕｈ７細胞にＨＢＶ １．２ｍｅｒとＤ２オリゴヌクレオチドを感染させた後、ウエスタンブロット分析で表面タンパク質の発現レベルを測定した。
その結果、図４に示すように、Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶのタンパク質の１つである表面タンパク質の発現を濃度依存的に阻害することを確認した。
２−４：ＨＢＶのエンハンサー／プロモーター（enhancer／promoter）活性の阻害
Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶ ｍＲＮＡレベルをどのように減少させるのかを調べるために、ＨＢＶのエンハンサーを用いてルシフェラーゼレポーター分析を行った。
その結果、図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｄ２オリゴヌクレオチド感染によってＨＢＶのエンハンサーＩ、ＩＩ活性が約８０％が阻害されることを確認した。このような事実により、Ｄ２オリゴヌクレオチドはエンハンサーＩ及びＩＩの活性すべてを阻害することを確認した。しかし、エンハンサーＩ（ＥｎｈＩ）、ｐＥｎｈＩ△Ｘｐの上位部位では効果が現れなかった。Ｄ２オリゴヌクレオチド感染によって、ＨＢＶのエンハンサーＩＩ（ＥｎｈＩＩ）は、約４８％阻害されることを確認した。このような事実により、ＨＢＶのエンハンサーＩＩの１７４２Ｇリッチ部位（１７４２〜１７４７の領域）がＤ２オリゴヌクレオチドによるエンハンサー活性の抑制に重要なものであることを確認した。
結果的に図５の結果により、Ｄ２オリゴヌクレオチドがエンハンサーＩとＩＩの活性を減らすことによって、転写段階で抗ウイルス効果を出すという事実を確認した。
Ｄ２オリゴヌクレオチドがどのようにＨＢＶのエンハンサー活性を減少させるかを調べるために、前述したレポータープラスミドを製作した後、レポーター活性を測定した。図６（ａ）のように、表２のＤ２、Ｄ６、Ｄ７及びＤ８の塩基ＧがリッチなＨＢＶモチーフがレポータープラスミドのプロモーター領域に導入された。
その結果、図６（ｂ）に示すように、ｐＥｎｈＩ△Ｘｐルシフェラーゼクローンは何の効果もなかったが、Ｄ２またはＤ６モチーフを含むｐＥｎｈＩ△Ｘｐルシフェラーゼクローンは、ルシフェラーゼ活性を強く阻害することを確認した。
したがって、Ｄ２オリゴヌクレオチドはエンハンサーＩ（ＥｎｈＩ）の上流であるｐＥｎｈＩ△Ｘｐレポーターには全く作用できないが、ここに自己と同じ塩基配列を入れると、強力な阻害効果を発揮することを確認し、Ｄ２オリゴヌクレオチドと同様の塩基配列を有するＤ６オリゴヌクレオチドを入れたレポーターも阻害することを確認した。これはＤ２オリゴヌクレチドが自身の塩基配列を認知して阻害作用をすることを示す結果である。
実施例３：グアニン４重合体（G-quadruplex）構造の形成
３−１：Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサーＩ、ＩＩ部位を認知してグアニン４重合体（G-quadruplex）を形成
Ｄ２オリゴヌクレオチドがエンハンサーＩ、ＩＩの配列とグアニン４重合体を形成するかどうかを確認するために、Ｄ２オリゴヌクレオチド及びＰ３２標示のＨＢＶエンハンサー配列を用いてインビトロＥＭＳＡ（electrophoretic mobility shift assay）を行った（図７ （ａ））。
その結果、ＥＭＳＡを通してＤ２オリゴヌクレオチドがエンハンサーＩ、ＩＩの配列と部分的にグアニン４重合体を形成することを確認した。図７（ｂ）に示すように、グアニン４重合体の形成は、グアニン４重合体に特異的ＢＧ４抗体を用いてバンドのスーパーシフトから確認した。これはホスホルイメージング（phosphorimaging）でゲルを視覚化した結果である。すなわち、図７を通してＤ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサー部位と物理的に結合してグアニン４重合体を形成することによって、ＨＢＶのエンハンサーの活性を阻害することを確認した。
３−２：Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサーＩＩの領域とグアニン４重合体を形成
Ｄ２オリゴヌクレオチドがエンハンサーＩＩ領域とグアニン４重合体を形成するかどうかを確認するために、Ｄ２及びＨＢＶを用いてインビトロＥＭＳＡを行った。
その結果、ＥＭＳＡを通してＤ２オリゴヌクレオチドがエンハンサーＩＩの配列と部分的にグアニン４重合体を形成することを確認した。グアニン４重合体の形成は、グアニン４重合体に特異的ＢＧ４抗体を用いてバンドのスーパーシフトから確認した。図８を通して、Ｄ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶのエンハンサーＩＩ領域を介してグアニン４重合体構造を形成することを確認した。
３−３：Ｄ２オリゴヌクレオチドが自己の塩基配列を有する部位と完全なグアニン４重合体（G-quadruplex）構造を形成
Ｄ２オリゴヌクレオチドが、自己の配列を通してＨＢＶゲノムと完全なグアニン４重合体を形成するかどうかを確認するために、インビトロＥＭＳＡを行った。
その結果、図９に示すように、ＥＭＳＡを通してＤ２オリゴヌクレオチドが自己の配列を介してＨＢＶゲノムと完全なグアニン４重合体を形成することを確認した。グアニン４重合体の形成は、グアニン４重合体に特異的ＢＧ４抗体を用いてバンドのスーパーシフトから確認し、ゲルはホスホルイメージングにより視覚化した。  
図９によれば、Ｄ２オリゴヌクレオチドがエンハンサーＩの部位（ＥｎｈＩ△Ｘｐ）とは結合しないが、ここに自己の塩基配列を入れたもの（ＥｎｈＩ△Ｘｐ−Ｄ２）とは完全なグアニン４重合体構造を形成した。これは、Ｄ２オリゴヌクレオチドが自己の塩基配列を認知してグアニン４重合体の構造を形成し、これがウイルスの阻害に関連することを意味する。
３−４：Ｄ２オリゴヌクレオチドの塩基配列に点突然変異を導入したＤ３オリゴヌクレオチドは、グアニン４重合体の構造を形成できない
図１０に示すように、インビトロＥＭＳＡを通して、Ｄ２オリゴヌクレオチドの塩基配列に点突然変異を導入したＤ３オリゴヌクレオチドは、グアニン４重合体の構造を形成できないことを確認した。具体的には、Ｄ２オリゴヌクレオチド配列の中間部位の保存的なＧＧＧＧＧＧをＧＧＧＴＧＧに点突然変異させたＤ３オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムとグアニン４重合体を形成しなかった。この結果により、Ｄ２オリゴヌクレオチドのＧリッチ部位がグアニン４重合体の形成に非常に重要であることが分かる。
また、図２から分かるように、Ｄ３オリゴヌクレオチドは全くウイルス阻害作用を示さず、図１０に示されたＥＭＳＡの結果であるＤ３オリゴヌクレオチドのグアニン４重合体構造の未形成結果と一緒に見ると、グアニン４重合体構造の形成が抗ウイルス作用の必要条件であることが分かる。
実施例４：ＨＢＶ活性の阻害
４−１：変形されたＤ２オリゴヌクレオチドが細胞を透過してＨＢＶのエンハンサー活性を阻害する
ＨＢＶのエンハンサーＩ、ＩＩのプラスミドをＨｅｐＧ２細胞に感染させた。感染の前に、多数の変形されたＤ２オリゴヌクレオチド（ＰＳ、ＯＰＭｅ、ＰＮＡ、ＬＮＡ ＰＳ−ＯＭｅ、ＰＳ−ＬＮＡ）をＨｅｐＧ２細胞（最終濃度５００ｎＭ）で前処理した。翌日、細胞を５００ｎＭの変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを含む新しい培地（ＤＭＥＭ）で置き換えた。感染後２４時間細胞を培養し、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍを利用して、ルシフェラーゼの活性を分析した。
その結果、図１１に示すように、ＰＳ変形によって優れた細胞透過及びＨＢＶ阻害活性を示すことを確認した。前記結果によると、ＰＳ（phosphorothioate）またはＬＮＡ（locked nucleic acids）にオリゴヌクレオチドのバックボーン骨格を変形させると、オリゴヌクレオチドの透過性を向上させ、結果的に、そのオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を増加させる。
４−２：変形されたＤ２オリゴヌクレオチドがＨＢＶ感染モデルでＨＢＶを阻害する
ＨＢＶ感染モデルでもＤ２オリゴヌクレオチドが阻害効果を示すのかを見るために、ＨＢＶ感染性細胞株であるＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞株にＨＢＶを感染させた後、ＰＳで変形されたＤ２オリゴヌクレオチド（ＰＳ、ＰＳ−ＯＭｅ、ＰＳ−ＬＮＡ）を処理して行った。具体的には、図１２（ａ）のＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞のＨＢＶ感染とウイルスタンパク質の分析過程を模式図に示したように、実験手順は以下の通りである：ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞は、２％ＤＭＳＯと４％ＰＥＧ８０００を含有したＰＭＭ（PHH maintain media、Gibco）で１６〜２０時間培養した２０００ ＨＢＶ細胞あたりゲノム当量（Geq／cell）で感染させた。次に、感染された細胞はＰＢＳ ５００μｌで３回洗浄し、ＰＭＭ（２％ＤＭＳＯ）に維持させた後に７日間培養した。ＨＢＶタンパク質の発現を分析するために、分泌されたＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇを測定した。培養培地内のＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇは、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキット（Wantai Pharm Inc、Beijing、China）を用いて分析した。Ｄ２オリゴヌクレオチドの感染（transfection）（Ｄ１、Ｔ.Ｆ）を抗ＨＢＶ効果の陽性対照群として用いた。変形されないＤ２オリゴヌクレオチド処理（Ｄ２、Ｔｒ）は、陰性対照群として用いた。 ＬＭＶはラミブジンである。
ＨＢＶタンパク質の発現解析の結果、図１２（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ＰＳに変形されたＤ２オリゴヌクレオチド（ＰＳ、ＰＳ−ＯＭｅ、ＰＳ−ＬＮＡ）がＨＢＶ感染性細胞株であるＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰでもＨＢＶを阻害することを確認し、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを処理したときの抗ウイルス効果を確認した。
４−３：変形されたＤ２オリゴヌクレオチドがＰＨＨ（primary human hepatocyte）でＨＢＶを阻害する
ＰＳに変形されたＤ２オリゴヌクレオチドがＰＨＨ（primary human hepatocyte）でＨＢＶを阻害することを確認するために、肝臓手術を受けた人の肝臓組織からＰＨＨを分離した後、ここにＨＢＶを感染させた後に、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を調査した。具体的には、図１３（ａ）のＰＨＨｓのＨＢＶ感染とウイルスタンパク質の分析過程を模式図に示したように、実験手順は以下の通りである：ＰＨＨｓは２％ＤＭＳＯと４％ＰＥＧ８０００を含有したＰＭＭ（PHH maintain media、Gibco）で１６〜２０時間培養した５０００ ＨＢＶ細胞あたりゲノム当量（Geq／cell）で感染させた。次に、感染された細胞はＰＢＳ ５００μｌで３回洗浄し、ＰＭＭ（２％ＤＭＳＯ）に維持させた後に７日間培養した。ＨＢＶタンパク質の発現を分析するために、分泌されたＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇを測定した。培養培地内のＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇは、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキット（Wantai Pharm Inc、Beijing、China）を用いて分析した。変形されないＤ２は陰性対照群として用いた。ＬＭＶはラミブジンである。
ＨＢＶタンパク質の発現解析の結果、図１３に示すように、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドは抗ウイルス効果が優れており、特にＰＳ−ＬＮＡに変形されたＤ２オリゴヌクレオチドが９０％以上のウイルスを阻害する結果を示すことで、最も強力な阻害効果を示した。これらの結果を通じ、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドをヒト細胞に処理したときにも抗ウイルス効果が表示されることを確認した。
４−４：Ｄ２オリゴヌクレオチドの分析
最適の効果を示す変形の形態を見つけるために、Ｄ２オリゴヌクレオチドの末端を３つずつ（３、３）、４つずつ（４、４）、または５つずつ（５、５）を変形した。分析のために、ＨＢＶのエンハンサーＩ、ＩＩの構造体をＨｅｐＧ２細胞に感染させた。感染前に、多数の変形されたＤ２（ＰＳ、ＰＳ−Ｏｍｅ（４、４）、ＰＳ−Ｏｍｅ（５、５）、ＰＳ−Ｏｍｅ（ａｌｌ）、ＰＳ−ＬＮＡ（２、２）、ＰＳ−ＬＮＡ（３、３）、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）、ＰＳ−ＬＮＡ（５、５）、ＰＳ−ＬＮＡ（ａｌｌ））をＨｅｐＧ２細胞（最終濃度５００ｎＭ）で前処理した。翌日、 細胞を５００ｎＭの変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを含む新しい培地（ＤＭＥＭ）で置き換えた。感染２日後に、ルシフェラーゼアッセイシステム（luciferase assay system）（Promega; madison、WI）を用いて、プロトコルに従ってＨＢＶエンハンサーのルシフェラーゼ活性を分析した。
その結果、図１４に示すように、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドは優れた抗ウイルス効果を示した。その中、５’末端と３’末端がすべて４つのＬＮＡに変形されたＰＳ−ＬＮＡ（４、４）が最も強力な抗ウイルス効果を示した。
４−５：ＨｅｐＧ２細胞における変形されたオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果の確認
１−８−２で製作したオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞にＨＢＶと一緒に挿入した。５０ｎＭ濃度の５８個のオリゴヌクレオチドをそれぞれ、ＨＢＶ １μｇと一緒に２ｍｌの培地に入れて、感染させた。翌日、培地を新しい培地（ＤＭＥＭ）に変えた後、７２時間細胞を培養した。以後、培養培地内のＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇをＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキット（Wantai Pharm Inc.、Beijing、China）を用いて分析した。ＨＢｅＡｇに対する結果を図１５に、ＨＢｓＡｇに対する結果を図１６に示した。
その結果、図１５に示すように、多数のオリゴヌクレオチドがＨＢｅＡｇを阻害することが確認できた。特に、ＨｅｐＧ２細胞のＨＢｅＡｇを効果的に減らした物質は９、１７、１８、２０、２１、３４、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、５０、５１、５４、５５、（３、３）、（４、４）であった。
また、図１６では、多数のオリゴヌクレオチドがＨＢｓＡｇを阻害することが確認できた。特に、ＨｅｐＧ２細胞のＨＢｓＡｇを効果的に減らした物質は、９、１０、１８、２０、２１、２４、２８、３４、３７、４０、４１、４４、４８、（３、３）であった。
４−６：ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞での変形されたオリゴヌクレオチドの効果の確認
１−８−２で製作したオリゴヌクレオチドのＨＢＶ感染モデルでの効果を確認するために、ＨＢＶ感染性細胞株であるＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞を用いた。具体的には、ＨＢＶを２％ＤＭＳＯと４％ＰＥＧ８０００を含有したＰＭＭ（PHH maintain media、Gibco）で１６〜２０時間培養した２０００ ＨＢＶ細胞あたりにゲノム当量（Geq／cell）で感染させた。次に、感染された細胞はＰＢＳ ５００μｌで３回洗浄し、ＰＭＭ（２％ＤＭＳＯ）に維持させた後に７日間培養した。感染後３日目から５８個の変形されたオリゴヌクレオチドを毎日処理した。この時、処理濃度は５００ｎＭである。感染後７日目になったとき、分泌されたＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇを測定してＨＢＶタンパク質の発現を分析した。培養培地内のＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇはＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。ＨＢｅＡｇに対する結果を図１７に、ＨＢｓＡｇに対する結果を図１８に示した。
その結果、図１７に示すように、多数のオリゴヌクレオチドがＨＢｅＡｇを阻害することが確認できた。特に、ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞のＨＢｅＡｇを効果的に減らした物質は、８、１７、１８、１９、２０、２１、２７、４０、４４、４７、５５、（３、３）、（４、４）であった。また、図１８のように、ＨＢｓＡｇも多数オリゴヌクレオチドによって阻害されることが確認できた。ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞のＨＢｓＡｇを効果的に減らした物質は、７、８、９、１８、１９、２０、４０、４２、４４、４５、（３、３）、（４、４）であった。
４−７：ＰＨＨ（Primary human hepatocyte）細胞での変形されたオリゴヌクレオチドの効果の確認
１−８−２で製作したオリゴヌクレオチドがＰＨＨ（Primary human hepatocyte）でもＨＢＶを阻害することができるかを確認するために、肝臓手術を受けたヒトの肝臓組織からＰＨＨを分離してＨＢＶを感染させ、５８個の変形されたオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を確認した。具体的には、ＰＨＨｓのＨＢＶ感染とウイルスタンパク質の分析過程は、以下の通りである：ＨＢＶを２％ＤＭＳＯと４％ＰＥＧ８０００を含有したＰＭＭ（PHH maintain media、Gibco）で１６〜２０時間培養した２０００ ＨＢＶ細胞あたりにゲノム当量（Geq／cell）で感染させた。次に、ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰ細胞と同様に、ＰＨＨｓはＰＢＳ ５００μｌで３回洗浄し、ＰＭＭ（２％ＤＭＳＯ）に維持させた後に１１日間培養した。感染後５日目から５８個の変形されたオリゴヌクレオチドを毎日処理し、この時の処理濃度は５００ｎＭにした。感染後１１日目になったとき、ＨＢＶタンパク質発現を分析するために培養培地内ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇを測定した。ＨＢｅＡｇに対する結果を図１９に、ＨＢｓＡｇに対する結果を図２０に示した。
その結果、図１９に示すように、多数のオリゴヌクレオチドがＨＢｅＡｇを阻害することが確認できた。特に、ＰＨＨ細胞のＨＢｅＡｇを効果的に減らした物質は、７、８、１８、１９、２０、５２、（３、３）、（４、４）であった。また、図２０のように、ＨＢｓＡｇも多数のオリゴヌクレオチドによって阻害されることが確認できた。ＰＨＨ細胞のＨＢｓＡｇを効果的に減らした物質は、６、７、８、１５、１６、１８、１９、４２、（３、３）、（４、４）であった。
ＨＢＶタンパク質の発現解析の結果、それぞれの結果に示されたように、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果が優れており、特に、様々な形態のｇａｐ ｍｅｒの中で、ＰＳ−ＬＮＡで部分変形されたＤ２が最も強力な阻害効果を示すことを確認した。特に、（３、３）または（４、４）のようにＧが連続的にある部分が変形されない場合にＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ阻害効果が優れていた。これはオリゴヌクレオチドの合成に必要な単価を下げることができ、部分的または完全に変形されたＤ２オリゴヌクレオチドをヒト細胞に処理したとき、抗ウイルス効果が現れることを確認した。
実施例５：インビボモデル
５−１：Ｄ２オリゴヌクレオチドはマウスのインビボモデルでＨＢＶを阻害する
Ｄ２オリゴヌクレオチドがインビボでも作用するかを見るためにＨＢＶマウスモデルを用いて実験した。実験は、図２１（ａ）に基づいて行った。６週齢の雄マウスを、各グループに用いた。ＰＢＳを対照群として注射した（Ｍｏｃｋ）。流体力学的注射（hydrodynamic injection）の方法で注射された（ＨＩ）ＤＮＡは、以下の通りである：２５μｇ ＨＢＶ １．２ｍｅｒ、２５μｇの空ベクター（empty vector）またはＤ２オリゴヌクレオチド、及び５μｇのｂ−ｇａｌ。ｂ−ｇａｌは、注射対照群として用いた。マウスを犠牲にして血液サンプルを得た。マウス血清は、ＰＢＳで希釈した（ＨＢｅＡｇの場合は１：５０、ＨＢｓＡｇの場合は１：２０００）。ウイルスタンパク質（ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ）は、ＥＬＩＳＡキットで測定した。
その結果、図２１（ｂ）及び（ｃ）に示すように、Ｄ２オリゴヌクレオチドを注射したマウスで強力な抗ウイルス効果を示した。また、図２１（ｄ）に示すように、サザンブロットを利用してＤ２オリゴヌクレオチドを注射したマウスで、ＨＢＶ  ＤＮＡが大幅に減ったことを確認した。
５−２：変形されたＤ２オリゴヌクレオチドをマウスのインビボモデルに静脈注射したとき、ＨＢＶを阻害する
変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを注射したとき、インビボでも作用するかを調べるためにＨＢＶマウスモデルを用いて実験した。インビボ実験は、図２２（ａ）に基づいて行った。６週齢の雄マウスを、各グループに用いた。ＨＢＶのみを注射したものを対照群とした。２５μｇのＨＢＶ １．２ｍｅｒ及び５μｇのｂ−ｇａｌプラスミドが流体力学的注射（hydrodynamic injection）方法で注射された。その次、５０μｇの変形されたＤＮＡ（ＰＳ、ＰＳ−ＯＭｅ及びＰＳ−ＬＮＡ）を３日間静脈内注射した。注射４日後、マウスを犠牲にして血液サンプルを得た。ｂ−ｇａｌは注射対照群として使用した。マウス血清は、ＰＢＳで希釈した（ＨＢｅＡｇの場合は１：５０、ＨＢｓＡｇの場合は１：２０００）。ウイルスタンパク質（ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ）は、ＥＬＩＳＡキットで測定した。
その結果、図２２（ｂ）及び（ｃ）に示すように、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを注射したマウスで抗ウイルス効果を示した。図２２（ｄ）に示すように、サザンブロットで確認したとき、ＨＢＶ ＤＮＡレベルでも抗ウイルス効果が示した。これは、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを注射したとき、マウスの肝臓に伝達されてウイルス阻害作用を示すことを確認した結果である。
５−３：ナノ粒子（キトサン）でＤ２オリゴヌクレオチドを包んだ後、マウスのインビボモデルに静脈注射したとき、ＨＢＶを阻害する
ナノ粒子（キトサン）でＤ２オリゴヌクレオチドを包んだ後に注射したとき、インビボでも作用するかを調べるためにＨＢＶマウスモデルを用いて実験した。ナノ粒子を用いてＤ２オリゴヌクレオチドを包むと効率的に肝臓に転送される。図２３（ａ）に基づいてインビボ実験を行った。６週齢の雄マウスを各グループに用いた。２５μｇのＨＢＶ １．２ｍｅｒ及び５μｇのｂ−ｇａｌプラスミドが流体力学的注射（hydrodynamic injection）方法で注射された。その次、８μｇのナノ粒子Ｄ２をＨＢＶに感染させた後、１回静脈内注射した。注射４日後、マウスを犠牲にして血液サンプルを得た。ｂ−ｇａｌは、注射対照群として用いた。マウス血清はＰＢＳで希釈した（ＨＢｅＡｇの場合は１：５０、ＨＢｓＡｇの場合は１：２０００）。ウイルスタンパク質（ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ）は、ＥＬＩＳＡキットで測定した。
その結果、図２３（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ナノ粒子Ｄ２を注射したマウスで抗ウイルス効果を示した。この時、最初のバーは、ｍｏｃｋ、２番目のバーは、ＨＢＶ、３番目のバーは、ＨＢＶとキトサンナノ粒子Ｄ２、４番目のバーは、ＨＢＶとキトサンナノ粒子Ｄ４を意味する。キトサンナノ粒子Ｄ４はＨＢＶを全く阻害できない陰性対照群として用いた。図２３（ｄ）に示すように、サザンブロットで確認したとき、ＨＢＶ ＤＮＡレベルでも抗ウイルス効果が現れた。これはキトサンナノ粒子Ｄ２を注射したとき、マウスの肝臓に伝達されて、非常に強力なウイルス活性を阻害したことを確認した。
実施例６：ＰＨＨ（primary human hepatocyte）でのＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの阻害
６−１：変形されたＤ２が最初から処理されてＨＢＶを阻害する
Ｄ２オリゴヌクレオチドがＰＨＨでＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを除去するかどうか見るために、ＰＨＨにＨＢＶに感染させて実験した。本実験は、ＨＢＶ感染後の翌日から変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを処理し、この方法は、図２４（ａ）に示すように、ＰＨＨにＨＢＶに感染させる手順について模式化した。このとき、ＩＦＮ−αは陽性対照群として用い、変形されない一般的なＤ２オリゴヌクレオチドを処理した場合は、ＨＢＶを全く阻害できないため、陰性対照群として用いた。図２４（ｄ）及び（ｅ）は、リアルタイムＰＣＲを利用して定量的に行った。
その結果、図２４（ｂ）及び（ｃ）では、ＰＳ−ＬＮＡ（３、３）、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）、ＰＳ−ＬＮＡ（ａｌｌ）に部分変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを処理した場合、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇが減少することを確認した。また、図２４（ｄ）で示すように、ＨＢＶ ｒｃＤＮＡがＰＳ−ＬＮＡ（３、３）、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）、ＰＳ−ＬＮＡ（ａｌｌ）に部分変形されたＤ２オリゴヌクレオチドで効率的に減少することを示した。重要な結果として、ＨＢＶを最終的に治療するためには、ｃｃｃＤＮＡを除去する必要があり、図２４（ｅ）に示すように、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡがＰＳ−ＬＮＡ（３、３）、ＰＳ−ＬＮＡ（４、４）、ＰＳ−ＬＮＡ（ all）に部分変形されたＤ２オリゴヌクレオチドが処理されたときに減少することが分かった。
６−２：変形されたＤ２オリゴヌクレオチドがｃｃｃＤＮＡが十分に生成された場合も、ＨＢＶを阻害する
ＨＢＶ感染後５日間、十分な再感染の条件でもＤ２オリゴヌクレオチドがＰＨＨでＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを除去するかどうか見るために実験を行った。本実験は、ＨＢＶ感染後５日後から変形されたＤ２オリゴヌクレオチド（ＰＳ−ＬＮＡ（ａｌｌ）０．５μＭ、ＰＳ−ＬＮＡ（ａｌｌ）１μＭ）を処理し、この方法は、図２５（ａ）に示すように、ＰＨＨにＨＢＶに感染させる手順について模式化した。この時、ＩＦＮ−αはＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ｒｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡを減らす陽性対照群として用い、変形されない一般的なＤ２オリゴヌクレオチドを処理した場合は、ＨＢＶを全く阻害できないため陰性対照群として用いた。
その結果、図２５（ｂ）及び（ｃ）では、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを濃度別処理した場合、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇが減少することがわかった。図２５（ｄ）は、一般的なＰＣＲを行った後、ＤＮＡ電気泳動でＨＢＶ ＤＮＡとｃｃｃＤＮＡの量の違いを確認した。また、図２５（ｄ）で示すように、ＨＢＶ ｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡが部分変形されたＤ２オリゴヌクレオチドで濃度依存的に減少することを示した。
実施例７：ＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰでＤ２オリゴヌクレオチドとＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡが形成されるグアニン４重合体（G-quadrueplex）の確認
ＰＳ−ＬＮＡに変形されたＤ２オリゴヌクレオチドがＨｅｐＧ２−ＮＴＣＰでＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを効率的に認識し、グアニン４重合体（G-quadruplex）を形成するかどうかを調べるために、ＮＴＣＰにＨＢＶを感染させ、Ｄ２オリゴヌクレオチドを処理して、顕微鏡を用いて見た。本実験は、ＨＢＶ感染後５日目から変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを処理し、７日目に細胞を固定させた。以後、ＢＧ４抗体を用いて、グアニン４重合体（G-quadruplex）を確認できるように赤いシグナルが出てくるように、スライドグラスを製作した。
その結果、図２６（ａ）は、ＮＴＣＰで感染されて生成されたＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡと変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを処理したとき、グアニン４重合体（G-quadruplex）を認識するＢＧ４抗体によってＤ２オリゴヌクレオチドとｃｃｃＤＮＡがグアニン４重合体を形成することを確認した。また、ＨＢｅＡｇレベルがＨＢＶでは正常に発現して、変形されたＤ２を処理した場合には減少する結果を確認することにより、変形されたＤ２オリゴヌクレオチドによる抗ウイルス効果も一緒に検定できた。図２６（ｂ）にまとめたグラフ及び図２６（ａ）の下段にまとめたＢＧ４によるｆｏｃｉ数を見たとき、Ｍｏｃｋの場合は一般的な細胞の条件で約５つの内因性（endogenus）形態のグアニン４重合体のシグナルが確認された。変形されたＤ２オリゴヌクレオチドのみを処理した場合、約６つのシグナルが確認された。 ＨＢＶのみ感染された場合、約７つのシグナルが確認された。何よりも、ＨＢＶと変形されたＤ２オリゴヌクレオチドを処理したとき、約１６個のシグナルが確認された。この結果は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡが変形されたＤ２オリゴヌクレオチドによってグアニン４重合体を形成することを示す結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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