(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれるＤＮＡおよびＲＮＡ由来の標的ポリヌクレオチドを同時に濃縮する方法であって、該方法が、以下：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態の両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること；
ｂ）第１標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｃ）該ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成すること；
ｄ）該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと；
ｅ）第２標的特異的プライマーを、二本鎖ＤＮＡに由来する変性したＤＮＡおよびｃ）で形成した二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに由来する変性したＤＮＡにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｆ）ハイブリダイズした第２標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長して第２プライマー伸長産物を形成すること；
ｇ）該試料を、５’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該５’オーバーハングは、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｈ）該アダプターを該第１および第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること；
ｉ）該アダプターの一方の鎖を該第１および第２プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること；
ｊ）第３標的特異的プライマーを該第１および第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第３標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；ならびに
ｋ）該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
該アダプターのより短い鎖の長さが、該５’オーバーハングの長さの１．５倍より短いかまたは１．５倍に等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アダプターが、３’末端において伸長ブロックを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該伸長ブロックが、３’または２’ホスフェート基である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該第１および第２標的特異的プライマーの少なくとも一方が、バーコードを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該バーコードが、ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）および試料バーコード（ＳＩＤ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｋ）における増幅が、デジタルドロップレットＰＣＲを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態の両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること；
ｂ）第１標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｃ）該ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成すること；
ｄ）該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと；
ｅ）第２標的特異的プライマーを、二本鎖ＤＮＡに由来する変性したＤＮＡおよびｃ）で形成した二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに由来する変性したＤＮＡにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｆ）該ハイブリダイズした第２標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して第２プライマー伸長産物を形成すること；
ｇ）該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｈ）該アダプターを該第１および第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること；
ｉ）該アダプターの一方の鎖を該第１および第２プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること；
ｊ）第３標的特異的プライマーを該第１プライマー伸長産物に、第４プライマーを該第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第３および第４標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；ならびに
ｋ）該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること；
を含む、前記方法。
【請求項９】
該第１および第２標的特異的プライマーが、ユニーク分子バーコードを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料からの標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること；
ｂ）第１標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み；
ｃ）該ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成すること；
ｄ）該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと；
ｅ）第２標的特異的プライマーを、二本鎖ＤＮＡに由来する変性したＤＮＡおよびｃ）で形成した二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに由来する変性したＤＮＡにハイブリダイズさせること；
ｆ）該ハイブリダイズした第２標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して第２プライマー伸長産物を形成すること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み；
ｇ）該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該第１および第２標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｈ）該アダプターを該第１および第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること；
ｉ）該アダプターの一方の鎖を該第１および第２プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること；
ｊ）第３標的特異的プライマーを該第１プライマー伸長産物に、第４標的特異的プライマーを該第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第３および第４標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；
ｋ）該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること；ならびに
ｌ）工程ｋ）からの該増幅されたライゲーション産物を配列決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ユニバーサルプライマーが、配列決定プライマーとして用いられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該第３および第４標的特異的プライマーが、さらに配列決定プライマー結合部位を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該アダプターが、さらに配列決定プライマー結合部位を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該アダプターが、さらにバーコードを含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該バーコードが、試料同定バーコードである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料からのＤＮＡおよびＲＮＡ標的を同時に濃縮するためのキットであって、以下：標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第１標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含む第２標的特異的プライマー、第２プライマー伸長産物を形成するためのＤＮＡポリメラーゼ；より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター（ここで、該より長い鎖は、該第１および第２標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む）；を含む、前記キット。
【請求項１７】
さらに、ユニバーサルプライマーならびにＤＮＡライゲーションおよびＤＮＡ増幅のための試薬を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
さらに、該濃縮されたＤＮＡおよびＲＮＡ標的を配列決定するための試薬を含む、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
試料からのＤＮＡおよびＲＮＡ標的を同時に濃縮するための反応混合物であって、以下：標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第１標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含む第２標的特異的プライマー、第２プライマー伸長産物を形成するためのＤＮＡポリメラーゼ；より長い鎖およびより短い鎖を含む該アダプターを含み、該より長い鎖が、該第１および第２標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖が、ユニバーサルプライミング部位を含む、前記反応混合物。
【請求項２０】
試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること；
ｂ）第１標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域を含み；
ｃ）該ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成すること；
ｄ）該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと；
ｅ）第２標的特異的プライマーを、二本鎖ＤＮＡに由来する変性したＤＮＡおよびｃ）で形成した二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに由来する変性したＤＮＡにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｆ）第３標的特異的プライマーを該第１プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｇ）該ハイブリダイズした第２および第３標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して第２および第３プライマー伸長産物を形成すること；
ｈ）該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｉ）該アダプターを該第２および第３プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること；
ｊ）該アダプターの一方の鎖を該第２および第３プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること；
ｋ）第４標的特異的プライマーを該第２プライマー伸長産物に、第５プライマーを該第３プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第４および第５標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；ならびに
ｌ）該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列決定の分野に関する。より詳細には、本発明は、配列決定のための稀な核酸標的の濃縮の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
高スループット配列決定のための試料調製は、典型的には、試料中の標的配列を含有する核酸の非標的核酸に対する比率を増大させる濃縮工程を含む。当該技術で既知の配列ベースの濃縮技法は、ハイブリッド捕捉、ＰＣＲ増幅、プライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）を含む。プライマーベースの標的濃縮法は、１ラウンド以上のコピー鎖の合成を含む。ＤＮＡ配列決定の一部の臨床適用は、非常に稀な標的、例えば癌の血液中に存在する無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出することを目的としている。変異により識別される腫瘍ＤＮＡは、典型的な血液試料１ｍＬあたり数コピーもの低い濃度で存在する（ｃａｐｐペーパー）。患者からの可能な限り少ない試料材料を利用してそのような稀な標的配列を確実に検出する必要性が、存在する。
【発明の概要】
【０００３】
一態様において、本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であり、その方法は、以下の工程を含む：標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し；第１標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに相補的な領域を含み；ハイブリダイズした標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長してプライマー伸長産物を形成し；試料を５’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、５’オーバーハングは、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；アダプターをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ；アダプターの一方の鎖をプライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し；第２標的特異的プライマーをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第２標的特異的プライマーは標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズするプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。ある態様において、プライマーアニーリングおよび伸長工程またはプライマーアニーリングおよび増幅工程は、同時に実施される。ある態様において、その方法は、さらに標的特異的プライマーまたはアダプターを除去する精製工程を含む。精製は、酵素消化、サイズ排除ベースの精製および親和性ベースの精製から選択されることができる。
【０００４】
ある態様において、増幅は、ホットスタート能力を有するＤＮＡポリメラーゼによる。
【０００５】
ある態様において、アダプターのより短い鎖の長さは、５’オーバーハングの長さの１．５倍より短いかまたは１．５倍に等しい。ある態様において、アダプターは、３’末端において伸長ブロックを含む。ブロックは、３’または２’ホスフェート基を含むことができる。
【０００６】
ある態様において、増幅は、サブサイクリング（ｓｕｂｃｙｃｌｉｎｇ）熱サイクルプロファイルを含む。
【０００７】
ある態様において、第１および第２標的特異的プライマーの少なくとも一方は、バーコード、例えばユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）および試料バーコード（ＳＩＤ）を含む。
【０００８】
ある態様において、工程ｈ）における増幅は、デジタルドロップレット（ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ）ＰＣＲを含む。
【０００９】
より詳細には、本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む：
ａ）標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し；
ｂ）第１標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｃ）ハイブリダイズした標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長してプライマー伸長産物を形成し；
ｄ）試料を５’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、５’オーバーハングは、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｅ）アダプターをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ；
ｆ）アダプターの一方の鎖をプライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し；
ｇ）第２標的特異的プライマーをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第２標的特異的プライマーは標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；
ｈ）ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
【００１０】
工程ｂ）およびｃ）は、同時に実施されることができる。工程ｇ）およびｈ）は、同時に実施される。その方法は、さらに工程ｃ）の後に標的特異的プライマーを除去する精製工程を含むことができる。精製工程は、工程ｅ）の後にアダプターを除去するために用いられることもできる。精製は、酵素消化、サイズ排除ベースの精製および親和性ベースの精製から選択されることができる。工程ｈ）における増幅は、ホットスタート能力を有するＤＮＡポリメラーゼにより実行されることができる。
【００１１】
アダプターのより短い鎖の長さは、５’オーバーハングの長さの１．５倍より短いかまたは１．５倍に等しいことができる。アダプターは、３’末端において伸長ブロックを含むことができ、それは、好ましくは３’または２’ホスフェート基である。
【００１２】
増幅工程ｈ）は、サブサイクリング熱サイクルプロファイルを含むことができる。第１および第２標的特異的プライマーの少なくとも一方は、バーコードを含むことができ、それは、ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）または試料バーコード（ＳＩＤ）であることができる。工程ｈ）は、デジタルドロップレットＰＣＲとして実施されることができる。
【００１３】
本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法も提供し、その方法は、以下の工程を含む：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態の両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し；
ｂ）第１標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｃ）ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；
ｄ）試料を二本鎖核酸変性条件下に置き；
ｅ）第２標的特異的プライマーを変性したＤＮＡにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｆ）ハイブリダイズした第２標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して第２プライマー伸長産物を形成し；
ｇ）試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｈ）アダプターを第１および第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ；
ｉ）アダプターの一方の鎖を第１および第２プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し；
ｊ）第３標的特異的プライマーを第１プライマー伸長産物に、第４プライマーを第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第３および第４標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；そして
ｋ）ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
【００１４】
第１および第２標的特異的プライマーは、ユニーク分子バーコードを含むことができる。第１標的特異的プライマーは、第２標的特異的プライマーと同じであることができる。あるいは、第１標的特異的プライマーは第２標的特異的プライマーと異なることができるが、同じ遺伝子を標的とする。第３標的特異的プライマーは、第４標的特異的プライマーと同じであることができる。特定の態様において、第１標的特異的プライマーは、第２標的特異的プライマーと同じであるが、第３標的特異的プライマーは、第４標的特異的プライマーと異なる。
【００１５】
その方法は、さらに、工程ｃ）の後にＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを除去する工程を含むことができる。その方法は、さらに、試料を工程ｇ）においてアダプターと接触させる前に試料から未使用のプライマーを除去する工程または工程ｋ）における増幅の前に試料から未使用のプライマーを除去する工程を含むこともできる。その方法は、工程ｃ）およびｆ）の後に一本鎖核酸を除去する工程を含むこともできる。工程ｆ）におけるＤＮＡポリメラーゼは、ホットスタート能力を有する熱安定性ポリメラーゼであることができる。
【００１６】
本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法も含み、その方法は、以下の工程を含む：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し；
ｂ）第１標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み；
ｃ）ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；
ｄ）試料を二本鎖核酸変性条件下に置き；
ｅ）第２標的特異的プライマーを変性したＤＮＡにハイブリダイズさせ；
ｆ）ハイブリダイズした第２標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して第２プライマー伸長産物を形成し、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み；
ｇ）試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、第１および第２標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｈ）アダプターを第１および第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ；
ｉ）アダプターの一方の鎖を第１および第２プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し；
ｊ）第３標的特異的プライマーを第１プライマー伸長産物に、第４標的特異的プライマーを第２プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第３および第４標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；
ｋ）ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅し；
ｌ）工程ｋ）からの増幅されたライゲーション産物を配列決定する。
【００１７】
ユニバーサルプライマーは、配列決定プライマーとして用いられることができる。あるいは、第３および第４標的特異的プライマーは、さらに配列決定プライマー結合部位を含む。さらにその代わりに、アダプターは、さらに配列決定プライマー結合部位を含む。アダプターは、バーコードを含むこともでき、それは、試料同定バーコードであることができる。
【００１８】
特定の態様において、ユニバーサルプライマーが配列決定プライマーとしても用いられる場合、試料中の遺伝子融合が、検出されることができる。この場合、試料からの標的ポリヌクレオチドは、第１および第２標的特異的プライマーは同じであるが第３および第４標的特異的プライマーは異なるような方式で処理および配列決定される。
【００１９】
本発明は、さらに、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法を含み、その方法は、以下の工程を含む：
ａ）一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ形態両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し；
ｂ）第１標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域を含み；
ｃ）ハイブリダイズした第１標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、ＲＮＡ鎖および第１プライマー伸長産物を含む二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；
ｄ）試料を二本鎖核酸変性条件下に置き；
ｅ）第２標的特異的プライマーを変性したＤＮＡにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｆ）第３標的特異的プライマーを第１プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み；
ｇ）ハイブリダイズした第２および第３標的特異的プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して第２および第３プライマー伸長産物を形成し；
ｈ）試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み；
ｉ）アダプターを第２および第３プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ；
ｊ）アダプターの一方の鎖を第２および第３プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し；
ｋ）第４標的特異的プライマーを第２プライマー伸長産物に、第５プライマーを第３プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第４および第５標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み；そして
ｌ）ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
【００２０】
本発明は、以下のものを含む、試料からのＤＮＡおよびＲＮＡ標的を同時に濃縮するためのキットも提供する：標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第１標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第２標的特異的プライマー、第２プライマー伸長産物を形成するためのＤＮＡポリメラーゼ；より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター（ここで、より長い鎖は、第１および第２標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む）；ならびに場合によりユニバーサルプライマーならびにＤＮＡライゲーションおよびＤＮＡ増幅のための試薬。キットは、さらに濃縮されたＤＮＡおよびＲＮＡ標的を配列決定するための試薬を含むことができる。
【００２１】
本発明は、以下のものを含む、試料からのＤＮＡおよびＲＮＡ標的を同時に濃縮するための反応混合物も提供する：標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第１標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第２標的特異的プライマー、第２プライマー伸長産物を形成するためのＤＮＡポリメラーゼ；より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター（ここで、より長い鎖は、第１および第２標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の作業の流れの概要の図である。
【図２】図２は、ＤＮＡおよびＲＮＡの同時濃縮を含む本発明の作業の流れの図である。
【図３】図３は、その方法をＲＮＡ標的に適用した結果を図説している。
【図４】図４は、図２の方法を図説する模式的な流れの図である。
【図５】図５は、本開示に従う方法の一態様の模式的表現であり、ここで、第２プライマー伸長工程およびユニバーサルプライマー増幅工程は、組み合わせられて単一の工程になっている。
【図６】図６は、プライマー伸長産物にライゲーションされたアダプターの模式的図説である。
【図７】図７は、図６のアダプターの態様の一本鎖オーバーハング領域を強調する詳細な図である。
【図８】図８は、本開示に従う方法の第１プライマー伸長反応に適用された際のサブサイクリングの標的的中（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）パーセントへの影響を図説する棒グラフである。
【図９】図９は、その中に組み込まれたＵＩＤおよびＭＩＤ両方を有するプライマーを含む本開示に従う方法の一態様の模式的表現である。
【図１０】図１０は、本開示に従う方法の一態様の模式的表現であり、ここで、その方法は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）と共に使用するために改変されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
別途定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第４版 Cold Spring Harbor Lab Press (2012)を参照。
【００２４】
以下の定義は、本開示の理解を促進するために提供されている。
用語“バーコード”は、検出および同定されることができる核酸配列を指す。バーコードは、一般に２以上かつ約５０までのヌクレオチド長であることができる。バーコードは、集団中の他のバーコードと少なくとも最低限の数の違いを有するように設計されている。バーコードは、試料中のそれぞれの分子に独特であることができ、または試料に独特であり試料中の多数の分子により共有されることができる。
【００２５】
用語“多重識別子”、“ＭＩＤ”または“試料バーコード”は、試料または試料の源を同定するバーコードを指す。従って、単一の源または試料からの全てまたは実質的に全てのＭＩＤでバーコードを付けられたポリヌクレオチドは、同じ配列のＭＩＤを共有すると考えられ；一方で異なる源または試料からの全てまたは実質的に全て（例えば少なくとも９０％または９９％）のＭＩＤでバーコードを付けられたポリヌクレオチドは、異なるＭＩＤバーコード配列を有するであろう。異なるＭＩＤを有する異なる源からのポリヌクレオチドは、ＭＩＤバーコード中にコードされた試料情報を維持しながら並行して混合および配列決定されることができる。
【００２６】
用語“ユニーク分子識別子”または“ＵＩＤ”は、それが結合しているポリヌクレオチドを同定するバーコードを指す。典型的には、ＵＩＤでバーコードを付けられたポリヌクレオチドの混合物中の全てまたは実質的に全て（例えば少なくとも９０％または９９％）のＵＩＤバーコードは、独特である。
【００２７】
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態両方のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。別途限定されない限り、その用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然存在ヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列ならびに明示的に示された配列も、暗に包含する。
【００２８】
用語“ポリメラーゼ”は、ポリヌクレオチドの鋳型に方向付けられる合成を実施する酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、原核生物Ｐｏｌ  Ｉ、Ｐｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＶおよびＰｏｌ  Ｖ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼおよび逆転写酵素を含む。用語“熱安定性ポリメラーゼ”は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、その後のポリヌクレオチド伸長反応を達成するために十分な活性を保持しており、二本鎖核酸の変性を達成するために必要な時間の間高温に晒された際に不可逆的に変性した（不活性化された）状態にならない酵素を指す。ある態様において、以下の熱安定性ポリメラーゼが、用いられることができる：サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｖｅｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ７２１０１）、パイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１２９８３、ＢＡＡ０２３６２）、パイロコッカス・ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉｉ）、パイロコッカスＧＢ−Ｄ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６７１３１）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤＩ（ＫＯＤ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＤ１７５５５３、ＢＡＡ０６１４２；サーモコッカス属の種ＫＯＤ株（Ｐｆｘ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＥ６８７３８））、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）（Ｔｇｏ、Ｐｄｂ：４６９９８０６）、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌａｔａｒｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ００２７５４、Ｐ２６８１１）、アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８１１０９）、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：０２９７５３）、パイロバキュラム・アエロピュルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ６３９５２）、ピュロディクティウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０７５７９、ＢＡＡ０７５８０）、サーモコッカス９度Ｎｍ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ９  ｄｅｇｒｅｅ  Ｎｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８８７６９、Ｑ５６３６６）、サーモコッカス・フミコーランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９３７３８、Ｐ７４９１８）、サーモコッカス・ヒドロサーマリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１８５５５）、サーモコッカス属の種ＧＥ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８５０）、サーモコッカス属の種ＪＤＦ−３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ１３５４５６；ＷＯ０１３２８８７）、サーモコッカス属の種ＴＹ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７３４７５）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ７７９１６）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎ��：ＣＡＣ１２８４９）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ  １４３７７６）、パイロコッカス属の種ＧＥ２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９０８８７）、パイロコッカス属の種ＳＴ７００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ  １２８４７）、サーモコッカス・パシフィカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ４１１３１２．１）、サーモコッカス・ジリジイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３３６６８９０）、サーモコッカス・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、サーモコッカス・バロシイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉｉ）、サーモコッカス・セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５０．１）、サーモコッカス・プロファンダス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｅ１４１３７）、サーモコッカス・サイクリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５７．１）、サーモコッカス・チオレドゥセンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモコッカス・オヌリネウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ）ＮＡ１、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ）、スルフォロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロバキュラム・カリジフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）、パイロバキュラム・イスランディクム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ２７８１５）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｑ５８２９５）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の種ＴＯＫ、デスルフロコッカス属、ピュロロブス属（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、パイロディクティウム属（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、スタフィロテルムス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）、バルカニサエタ属（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔｔａ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ５２０２５）および他の古細菌Ｂポリメラーゼ、例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ６２７１２、Ｐ９５６９０１、ＢＡＡＡ０７５７９））、好熱細菌サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）の種（例えば、フラバス（ｆｌａｖｕｓ）、ルベル（ｒｕｂｅｒ）、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクテウス（ｌａｃｔｅｕｓ）、ルーベンス（ｒｕｂｅｎｓ）、アクウァーティクス（ａｑｕａｔｉｃｕｓ））、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、メタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、サーモコッカス属の種９度Ｎ−７、Ｔ４、Ｔ７、ｐｈｉ２９、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．アビシ、Ｔ．ゴルゴナリウス（Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｔ．ジリギ（Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ）、Ｔ属の種ＧＴ、Ｐ属の種ＧＢ−Ｄ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｔ．ゴルゴナリウス、Ｔ．ジリギ、Ｔ．リトラリスおよびサーモコッカス属の種９Ｎ−７ポリメラーゼ。ある場合には、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）ポリメラーゼは、改変された天然存在タイプＡポリメラーゼであることができる。本発明のさらなる態様は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ））または増幅反応における改変されたタイプＡポリメラーゼがメイオサーマス属（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）またはサーモミクロビウム属（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）のあらゆる種から選択されることができる方法に関する。本発明の別の態様は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ）または増幅反応におけるポリメラーゼがサーマス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）またはサーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから単離されることができる方法に関係する。本発明のさらなる態様は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ）または増幅反応における改変されたタイプＡポリメラーゼがバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スファエロバクター・サーモフィラス（Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ディクチオグロムス・サーモフィラム（Ｄｉｃｔｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）または大腸菌から単離されることができる方法を包含する。別の態様において、本発明は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ）または増幅反応における改変されたタイプＡポリメラーゼが変異体Ｔａｑ−Ｅ５０７Ｋポリメラーゼであることができる方法に関する。本発明の別の態様は、一般に、熱安定性ポリメラーゼが標的核酸の増幅を達成するために用いられることができる方法に関係する。
【００２９】
用語“プライマー”は、一本鎖鋳型核酸分子の特定の領域に結合してポリメラーゼに媒介される酵素反応による核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは、約１００ヌクレオチド未満を含み、好ましくは約３０ヌクレオチド未満を含む。標的特異的プライマーは、ハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーション条件は、約４０℃〜約７０℃の温度での等温増幅緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、２５℃においてｐＨ８．８）中でのハイブリダイゼーションを含むことができるが、それに限定されない。標的結合領域に加えて、プライマーは、典型的には５’部分において追加の領域を有することができる。追加の領域は、ユニバーサルプライマー結合部位またはバーコードを含むことができる。
【００３０】
用語“ユニバーサルプライマー”は、ユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズすることができるプライマーを指す。ユニバーサルプライマー結合部位は、典型的には標的配列に非標的特異的様式で付加される天然または人工配列であることができる。
【００３１】
用語“試料”は、核酸分子を含む、典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡを含むあらゆる生物学的試料を指す。試料は、組織、細胞もしくはそれらの抽出物であることができ、または核酸分子の精製された試料であることができる。用語“試料”の使用は、試料中に存在する核酸分子中の標的配列の存在を必ずしも暗示しない。
【００３２】
用語“試料”は、標的核酸を含有するかまたは含有すると仮定されるあらゆる組成物を指す。これは、個体から分離された組織または流体の試料、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官および腫瘍、ならびに個体から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物の試料（ホルマリン固定されパラフィン包理された組織（ＦＦＰＥＴ）を含む）およびそれらから単離された核酸を含む。試料は、無細胞材料、例えば無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分も含むことができる。
【００３３】
核酸配列決定は、臨床診療へと急速に拡大している。現行の配列決定技術は、単分子配列決定を利用し、極めて稀な標的の検出を可能にする。核酸配列決定の臨床適用の中には、“液体生検”、例えば伝統的な侵襲的生検のかわりに血液試料を用いる悪性腫瘍の検出およびモニタリングがある。腫瘍ＤＮＡは、単一ヌクレオチドのバリエーションまたは短い配列のバリエーションならびに遺伝子融合を含め、変異の存在により識別される。Newman, A., et al., (2014) An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage, Nature Medicine doi:10.1038/nm.3519およびF. Mertens, et al. (2015) The emerging complexity of gene fusions in cancer, Nat. Rev. Cancer 15:371を参照。
【００３４】
これらの難題および他の難題は、本開示に従う単一プローブプライマー伸長による標的濃縮に関する方法により克服されることができる。一側面において、本開示は、単一プローブプライマー伸長ベースの濃縮のための一般的なアプローチならびにそれに関する向上の両方を記載する。本明細書で記載される向上は、代替の精製法、作業の流れの改変（例えば代替の酵素、全工程の数の低減、向上した熱サイクルプロファイル）、代替のアダプター設計、ならびに開示される方法をＲＮＡおよびＤＮＡの同時濃縮ならびにデジタルドロップレットＰＣＲの両方に適用することを可能にするための変更を含むが、それらに限定されない。
【００３５】
一態様において、本発明は、以下の工程を含む、標的配列を増幅する方法である：標的核酸をプライマーおよびポリメラーゼと接触させ、ここで、プライマーは、標的結合部位およびユニーク分子同定タグ（ＵＩＤ）を含み；ポリメラーゼ伸長反応および終結を実施して一本鎖プライマー伸長産物を作製し；アダプターを一本鎖プライマー伸長産物のそれぞれの末端にライゲーションしてライゲーション産物を作製し、ここで、アダプターは、少なくとも１個のユニバーサルプライミング部位を含み；増幅反応中のライゲーション産物を、少なくとも１個のユニバーサルプライミング部位への少なくとも１個のプライマーの結合を利用する増幅反応においてライゲーション産物を増幅して増幅された標的配列を作製する。ある態様において、プライマーおよびアダプターの少なくとも１つは、相互に適合性のユニバーサルライゲーション部位を含む。ある態様において、標的結合部位は、予め設計された標的特異的配列である。ある態様において、標的結合部位は、ランダム配列である。ある態様において、終結は、温度シフト、特異的酵素阻害剤の添加、キレート剤の添加、ウリジン含有塩基の組み込みとその後のウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼによる処理からなるリストから選択される方法により達成される。ある態様において、少なくとも１種類のアダプターは、バーコードを含む。バーコードは、多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）であることができる。増幅は、線形増幅または指数関数的増幅であることができる。ある態様において、方法は、さらにプライマー伸長およびライゲーションの少なくとも一方の後に精製工程を含む。
【００３６】
他の態様において、本発明は、以下のものを含む、標的配列を増幅するためのキットである：標的結合部位、ユニーク分子同定タグ（ＵＩＤ）およびユニバーサルライゲーション部位を含むプライマー；少なくとも１つのユニバーサルプライミング部位、多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）およびユニバーサルライゲーション部位を含む少なくとも１種類のアダプター。ある態様において、キットは、異なるユニバーサルプライミング部位を有する２種類のアダプターを含むが、一方のアダプターのみがユニバーサルライゲーション部位およびＭＩＤを含む。ある態様において、キットは、さらに以下の１以上を含む：核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびユニバーサルプライマー。
【００３７】
個々の分子の検出は、典型的には分子バーコード、例えば米国特許第７，３９３，６６５号、第８，１６８，３８５号、第８，４８１，２９２号、第８，６８５，６７８号および第８，７２２，３６８号において記載されている分子バーコードを必要とする。ユニーク分子バーコードは、典型的にはインビトロ操作の最も早い工程の間に患者の試料中のそれぞれの分子に付加される短い人工配列である。バーコードは、分子およびその子孫に印を付ける。ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）は、多数の用途を有する。バーコードは、試料中のそれぞれの個々の核酸分子を追跡して、例えば生検を用いずに癌を検出およびモニターするために患者の血液中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子の存在および量を評価することを可能にする(Newman, A., et al., (2014) An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage, Nature Medicine doi:10.1038/nm.3519)。
【００３８】
ユニーク分子バーコードは、配列決定エラーの修正のために用いられることもできる。単一の標的分子の全子孫は、同じバーコードで印を付けられており、バーコードを付けられたファミリーを形成する。バーコードを付けられたファミリーの全てのメンバーにより共有されているわけではない配列におけるバリエーションは、人為産物であり真の変異ではないものとして破棄される。ファミリー全体が元の試料中の単一の分子に相当するため、バーコードは、位置的重複排除および標的定量化のために用いられることもできる(Newman, A., et al., (2016) Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA, Nature Biotechnology 34:547)。
【００３９】
ある態様において、本発明は、配列決定のためのバーコードを付けられた核酸分子のライブラリーである。ある態様において、本発明は、核酸分子のバーコードを付けられたライブラリーの作製により核酸を配列決定する方法である。
【００４０】
本発明は、核酸配列決定により試料中の標的核酸を検出することを含む。試料中の全ての核酸を含む多数の核酸が、本明細書で記載される方法および組成物を用いて検出されることができる。ある態様において、試料は、対象または患者から得られる。ある態様において、試料は、対象または患者から例えば生検により得られた固形組織または固形腫瘍の断片を含むことができる。試料は、体液（例えば尿、痰、血清、血漿またはリンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹腔液、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液または糞便試料）を含むこともできる。試料は、正常または腫瘍細胞が存在し得る全血または血液画分を含むことができる。ある態様において、試料、特に液体試料は、無細胞材料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡを含む無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。ある態様において、試料は、無細胞試料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞血液由来の試料である。他の態様において、試料は、培養物中の細胞由来または培養物中に存在する感染性因子由来の核酸を含有する、または含有することが疑われる培養された試料、例えば培養物または培養上清である。ある態様において、感染性因子は、細菌、原生動物、ウイルスまたはマイコプラズマである。
【００４１】
標的核酸は、試料中に存在し得る対象の核酸である。ある態様において、標的核酸は、標的特異的プライマーがハイブリダイズする遺伝子もしくは遺伝子断片または転写産物もしくは転写産物の一部である。ある態様において、多数の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子間領域および遺伝子転写産物が、標的核酸を構成する。ある態様において、標的核酸は、遺伝的バリアント、例えば多型（一塩基多型またはバリアント（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む）または結果として例えば遺伝子融合をもたらす遺伝的再編成を含有する。ある態様において、標的核酸は、バイオマーカー、すなわちそのバリアントが疾患または病気と関係している遺伝子を含む。他の態様において、標的核酸は、特定の生物に特徴的であり、その生物の同定を助け、または病原性生物の特徴（例えば薬剤感受性または薬剤耐性）である。さらに他の態様において、標的核酸は、ヒトの対象の独特の特徴であり、例えば対象の独特のＨＬＡまたはＫＩＲ遺伝子型を定めるＨＬＡまたはＫＩＲ配列の組み合わせである。
【００４２】
ある態様において、標的核酸は、天然に一本鎖形態で存在する（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ；または一本鎖ウイルスＤＮＡ）。他の態様において、標的核酸は、天然に二本鎖形態で存在する。当業者は、本発明の方法がＲＮＡおよびＤＮＡ形態両方の標的核酸に関して同時に濃縮することができ、試料中に一方または両方の形態どちらで存在していても有効であることを認識しているであろう。より長い標的核酸は、断片化されることができる。ある態様において、標的核酸は、自然に断片化されている（例えば、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または化学分解されたＤＮＡ、例えば保存された試料中に見られるＤＮＡ）。
【００４３】
本発明は、プライマー伸長産物の末端にライゲーションされる１つのアダプター分子の使用を含む。ある態様において、部分的に一本鎖のアダプターは、一本鎖プライマー伸長産物にハイブリダイズさせられて一方の鎖にニックを有する部分的に二本鎖の分子を作り出す。ニックを有する鎖のライゲーションは、当該技術で周知である(Green M., and Sambrook, J., Molecular Cloning, 2012 CSHL Press参照)。
【００４４】
ある態様において、アダプター分子は、インビトロで合成された人工配列である。他の態様において、アダプター分子は、インビトロで合成された天然存在配列である。さらに他の態様において、アダプター分子は、単離された天然存在分子または単離された非天然存在分子である。
【００４５】
ある態様において、アダプターは、１以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合された（多重化された）場合に試料の源を同定するために用いられる多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）であることができる。バーコードは、それぞれの元の分子およびその子孫を同定するために用いられるユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）の役目を果たすこともできる。バーコードは、ＵＩＤおよびＭＩＤの組み合わせであることもできる。ある態様において、単一のバーコードが、ＵＩＤおよびＭＩＤ両方として用いられる。ある態様において、それぞれのバーコードは、予め定められた配列を含む。他の態様において、バーコードは、ランダム配列を含む。
【００４６】
ある態様において、本発明の方法により生成された増幅された分子は、少なくとも１つの、ある態様において少なくとも２つのバーコードを含む。少なくとも１つのバーコードは、ＵＩＤであり、少なくとも２つのバーコードは、ＵＩＤおよびＭＩＤを含む。本発明のある態様において、バーコードは、それぞれが同一のバーコードの異なる対を有する９６〜３８４種類の異なるアダプターがヒトゲノム試料に付加されるように、約４〜２０塩基長である。当業者は、バーコードの数は試料の複雑さ（すなわち予想される独特の標的分子の数）に依存することを理解していると考えられ、それぞれの実験に関して適切な数のバーコードを作製することができるであろう。
【００４７】
ある態様において、本発明は、標的特異的プライマーを利用する。標的特異的プライマーは、標的に相補的である少なくとも一部を含む。追加の配列が存在する場合、それらは、典型的にはプライマーの５’部分中である。ある態様において、同じプライマーまたは標的特異的プライマーの対が、標的のＲＮＡおよびＤＮＡ版のために用いられることができる。他の態様において、１つの標的特異的プライマーのみが共有されており、第２標的特異的プライマーは異なる。さらに他の態様において、標的特異的プライマーは、異なる遺伝子に特異的であり、例えば第２標的特異的プライマーは、遺伝子融合パートナーに特異的である。さらに他の態様において、ＤＮＡに関して用いられるプライマーは、ＲＮＡ標的に関して用いられるプライマーとは異なる遺伝子または座位を標的とする。
【００４８】
アダプターは、さらに少なくとも１つのユニバーサルプライマーに関するプライマー結合部位を含む。当業者は、二本鎖アダプター配列は一方の鎖上にプライマー結合部位を有し、他方の鎖上にプライマーと同一の配列を有するであろうことを認識しているであろう。当業者は、一本鎖プライマー（例えば標的特異的プライマー）はプライマーと同一の５’配列を有し、それが相補鎖中のプライマー結合部位中にコピーされるであろうことも、認識しているであろう。
【００４９】
ある態様において、本発明は、増幅工程を含む。この工程は、線形または指数関数的増幅、例えばＰＣＲを含むことができる。増幅は、等温であることができ、または熱サイクルを含むことができる。ある態様において、増幅は、指数関数的であり、ＰＣＲを含む。ユニバーサルプライマーが、用いられ、すなわち、一対のプライマーが、試料中の全ての標的配列上に存在するアダプター中の結合部位にハイブリダイズする。同じアダプターを有するライブラリー中の全ての分子が、同じプライマーのセットを用いて増幅されることができる。ユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲは配列バイアスを低減してきたため、増幅サイクルの数は、制限される必要がない。ユニバーサルプライマーが用いられる増幅サイクルの数は、少ないことができるが、その後の工程に必要とされる生成物の量に応じて１０、２０または約３０以上もの多いサイクル数であることもできる。
【００５０】
標的核酸から生成されるアンプリコンは、核酸配列決定を施されることができる。配列決定は、当該技術で既知のあらゆる方法により実施されることができる。高スループット単分子配列決定が、特に好都合である。そのような技術の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａカリフォルニア州サンディエゴ）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、ＳＭＲＴを利用するＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州メンローパーク）またはナノポア技術を利用するプラットフォーム、例えばＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）またはＲｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州サンタクララ）により製造されたプラットフォームおよび合成による配列決定を含むかまたは含まないあらゆる他の現在存在するかまたは将来のＤＮＡ配列決定技術を含む。配列決定工程は、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを利用することができる。これらのプライマーに関する結合部位は、増幅工程において用いられる増幅プライマーの５’部分中に導入されることができる。プライマー部位がバーコードを付けられた分子のライブラリー中に存在しない場合、そのような結合部位を導入する追加の短い増幅工程が、実施されることができる。
【００５１】
ある態様において、配列決定工程は、配列分析を含む。ある態様において、分析は、配列の整列の工程を含む。ある態様において、整列は、複数の配列、例えば同じバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定するために用いられる。ある態様において、バーコード（ＵＩＤ）は、全てが同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために用いられる。他の態様において、バーコード（ＵＩＤ）は、人為産物、すなわち同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する一部の配列中に存在するが全ての配列中に存在するわけではないバリエーションを排除するために用いられる。ＰＣＲエラーまたは配列決定エラーの結果として生じるそのような人為産物は、排除されることができる。
【００５２】
ある態様において、試料中のそれぞれの配列の数は、試料中のそれぞれのバーコード（ＵＩＤ）を有する配列の相対的な数を定量化することにより定量化されることができる。それぞれのＵＩＤは、元の試料中の単一の分子に相当し、それぞれの配列バリアントと関係している異なるＵＩＤの計数は、元の試料中のそれぞれの配列の割合を決定することができる。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列の読みの数を決定することができるであろう。ある態様において、関連する数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤあたりの読み（“配列深度”）である。ある態様において、所望の深度は、ＵＩＤあたり５〜５０回の読みである。
【００５３】
同じ試料からのＲＮＡおよびＤＮＡ物質の同時分析は、診療所において実質的有用性を有する。多くのタイプの試料に関して、核酸の量および質は、限られており、それは、特定の標的の検出を困難にする。ＤＮＡおよびＲＮＡ両方の使用は、利用可能な標的の量を最大化する一方でそれぞれのタイプの核酸の独特の特性も利用する。例えば、ＤＮＡは、一塩基バリアント（ＳＮＶ）およびコピー数バリエーション（ＣＮＶ）を含む変異に関する情報を保持している。加えて、ＤＮＡ由来の情報は、定量的であることができ、すなわち腫瘍試料中の変異のタイプだけでなく変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）も反映することができる。対照的に、変動する発現レベルがゲノム中の変異負荷を不明瞭にするため、ＲＮＡは、変異に関する定性的情報を提供する。同時に、遺伝子転写は、稀な変異事象からの信号を増幅し、それを検出するのをより容易にする。ＲＮＡの分析は、両方の融合パートナーからの野生型ＤＮＡ配列の背景において遺伝子融合を検出するために特に有用である。
【００５４】
ある態様において、本発明は、専らＲＮＡに適用されるプライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）の方法を含む。一般的に記載すると、その方法は、ＲＮＡ分子の逆転写とその後のプライマー伸長標的濃縮を含む。プライマー伸長標的濃縮の例は、以前に２０１６年６月１日に出願された米国仮出願一連番号６２／３４４，３３０、２０１６年７月１２日に出願された米国仮出願一連番号６２／３６１，４２６および２０１６年８月４日に出願された米国出願一連番号１５／２２８，８０６において本発明者らにより記載されている。
【００５５】
ある態様において、本発明は、ＲＮＡおよびＤＮＡの未分離の混合物に適用されるプライマー伸長標的濃縮の方法を含む。ある態様において、混合物は、総ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ、すなわち試料から最低限の処理で分離された核酸を含む。一般的に記載すると、その方法は、ＤＮＡ分子が受動的に存在する一方でのＲＮＡ分子の逆転写とその後のゲノムＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子両方に適用されるプライマー伸長標的濃縮を含む。
ある態様において、本発明は、中間の精製工程を含む。ある態様において、未使用のＤＮＡおよびＲＮＡ一本鎖は、エキソヌクレアーゼにより除去される。ある態様において、未使用のプライマーおよびアダプターは、例えばゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーから選択されるサイズ選択法により除去される。ある態様において、サイズ選択は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（カリフォルニア州ブレア）からの固相可逆固定化（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＰＲＩ）技術を用いて実施されることができる。
【００５６】
ある態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。ある態様において、プライマー伸長工程を実施する同じポリメラーゼが、ＰＣＲ増幅において用いられることができる。ある態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、ホットスタート能力を有する。ホットスタート能力は、抗体相互作用、化学修飾またはアプタマー相互作用から選択される機序による周囲温度におけるポリメラーゼの阻害を含む。
【００５７】
本発明は、図１〜２においてより詳細に表されている。図１は、本発明の典型的な作業の流れを描写している。総核酸が、試料から単離される。第１工程において、ＲＮＡは、逆転写を施され、一方でＤＮＡは、二本鎖のままである。ＲＮＡがＲＮアーゼＨにより除去された後、ｃＤＮＡ鎖のみが残る。変性後、プライマー伸長が、ＤＮＡ標的上で行われることができる。次に、ＤＮＡ由来およびＲＮＡ由来のプライマー伸長産物両方が、プライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）手順および配列決定を施される。
【００５８】
図２は、ＰＥＴＥ工程が詳細に示されている本発明の典型的な作業の流れを描写している。まず、逆転写工程が、ＲＮＡ鎖からｃＤＮＡを生成する。次に、ＵＩＤを有する標的特異的プライマーが、ｃＤＮＡ鎖および変性したゲノムＤＮＡ鎖の両方にアニーリングする。部分的に一本鎖のアダプターは、ＭＩＤ、ユニバーサルプライマー部位および試料中に存在する標的特異的プライマーの５’部分にアニーリングすることができる配列を有する。結果として生じる複合体の一方の鎖は、リガーゼにより塞がれることができるニックを含有する。第２標的特異的プライマーは、第２ユニバーサルプライミング部位を導入するために用いられる。プライマー伸長産物は、ユニバーサルプライマーを用いて増幅されることができる。
【００５９】
ここで図４に移って、単一プローブプライマー伸長による標的濃縮に関する方法１００は、プライマーハイブリダイゼーションに関する工程１０２を含み、ここで、第１プライマーが、試料中に存在する核酸にハイブリダイズさせられる。一側面において、第１プライマーは、標的特異的プライマーである。標的特異的プライマーの一例は、対象の遺伝子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）に、またはその付近（例えばその上流またはそれに対して５’側）にハイブリダイズするように設計された遺伝子特異的プライマーである。試料中の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその組み合わせであることができる。プライマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、修飾核酸（例えばビオチン化、ロックド核酸、イノシン類、Ｓｅｅｌａ塩基等）または当該技術で既知の他の核酸類似体からなるオリゴヌクレオチドプライマーであることができる。
【００６０】
引き続き図４を参照して、工程１０２の後、ポリメラーゼによるプライマー伸長の工程１０４が行われる。一側面において、第１プライマーの核酸鋳型へのハイブリダイゼーションの後、第１プライマーは、ポリメラーゼにより伸長され、それにより核酸鋳型の逆相補配列を含む３’領域を含む第１プライマー伸長産物を生成する。本明細書で記載されるように、工程１０２および工程１０４は、場合により同時に実施され、一方で他の態様において、工程１０２および工程１０４は、別々に（例えば順次）実施される。従って、開示される方法のある態様において、工程１０２および工程１０４は、組み合わせられて単一の工程１０２’になる。
【００６１】
方法１００は、さらに工程１０４（または工程１０２’）において合成された第１プライマー伸長産物の長さを制御するための伸長停止の工程１０６を含む。注目すべきことに、第１プライマー伸長産物の長さは、工程１０４において添加されたポリメラーゼの不活性化のような技法により能動的に、または例えば制限反応物質の消費により反応が完了に向かうことを可能にすることによるかもしくは方法１００の工程を実施する前の核酸鋳型の断片化により受動的に制御されることができる。
【００６２】
一側面において、方法１００は、さらに１以上の精製工程を含むことができる。図説されている態様において、方法１００は、第１プライマー伸長工程１０４および伸長停止工程１０６の後に第１精製工程１０８（すなわち精製１）を含む。工程１０８は、反応構成要素、例えば未使用のプライマー分子、プライマー伸長産物を作製するために用いられた鋳型核酸分子等からの第１プライマー伸長産物の精製に関するあらゆる適切な方法を含むことができる。ある態様において、工程１０８は、酵素消化、サイズ排除ベースの精製、親和性ベースの精製等またはそれらの組み合わせを含む。
【００６３】
方法１００は、さらにアダプターライゲーションの工程１１０を含む。アダプターは、ホモポリマー尾部、ユニバーサルプライミング部位、試料識別子もしくは分子識別子（ＭＩＤ）、ユニーク識別子（ＵＩＤ）またはバーコード等およびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されないあらゆる適切な組成を有することができる。本明細書で記載されるように、アダプターをライゲーションする正確な方式は、アダプターがプライマー伸長産物と会合した状態になり下記のその後の工程を可能にする限り、重要ではない。一側面において、ユニバーサルプライミング部位を有するアダプターは、当該技術で利用可能なあらゆる一本鎖ライゲーション法により、第１プライマー伸長産物の一方または両方の末端に付加されることができる。
【００６４】
方法１００は、さらに任意の第２プライマー伸長工程１１２を含むことができる。例えば、遊離の３’末端を有するライゲーションされたアダプターは、ポリメラーゼにより第１プライマー伸長産物の５’末端に向かって伸長されて二本鎖核酸生成物を作り出すことができる。第１標的特異的プライマーと比較して逆方向の第２標的特異的プライマーも、用いられることができる（図５）。その後、方法１００は、アダプターライゲーション工程１１０および場合により第２プライマー伸長工程１１２の後に第２精製工程１１４（すなわち精製２）を含むことができる。第２精製工程１１４は、反応構成要素、例えば未使用のアダプター分子等の除去に有用であることができる。従って、工程１１０のライゲーションしなかったアダプターおよび副産物は、アダプターにライゲーションした第１（または第２）伸長産物からあらゆる適切な精製法により分離される。
【００６５】
方法１００は、さらに増幅の工程１１６を含む。工程１１６は、線形または指数関数的増幅（例えばＰＣＲ）を含むことができる。一般に、工程１１６は、第１（または第２）のアダプターがライゲーションしたプライマー伸長産物の増幅を含む。ある態様において、プライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位が導入されている一方または両方の鎖の合成を支援することができるユニバーサルプライマーである（すなわち、二本鎖核酸の上および下の鎖両方が増幅反応の鋳型に相当する）。
【００６６】
増幅の工程１１６の後、方法１００は、配列決定の工程１１８を含むことができる。工程１１６は、方法１００の１以上の産物の核酸配列を決定するためのあらゆる方法を含むことができる。工程１１６は、さらに配列アラインメント、配列バリエーションの同定、独特のプライマー伸長産物の計数等またはそれらの組み合わせを含むことができる。ある態様において、追加の精製工程が、配列決定１１８の前に実施される。
【実施例】
【００６７】
実施例１．既知の融合標的の検出
この実施例において、アッセイの感度が、５つの臨床的に関連する融合遺伝子を発現することが知られている３つの細胞株を用いて評価された。２４のＡＬＫ、１１のＲＥＴおよび１５のＲＯＳ１を含むＲＮＡ融合パネルを標的とするプライマー（プローブ）のセットが、設計された（表１）。
【００６８】
【表１−１】
0006970205.tif 000002
【００６９】
【表１−２】
0006970205.tif 000003
【００７０】
パネルは、逆転写に関して１０のプローブおよび第２伸長工程に関して４２のプローブを用いて合計で６１の標的（４９の融合、１０の野生型遺伝子および２のハウスキーピング遺伝子）をカバーしている。ＲＮＡ  ＰＥＴＥの作業の流れ（図１および２）を用いて作製されたライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器上で配列決定された。元の細胞株中に存在することが報告された５つの融合の全てが、検出された。（ユニーク分子ＩＤの計数に基づいて計算された）それぞれの融合癌遺伝子の重複排除された深度は、細胞株におけるそれらの発現レベルと相関していた。
【００７１】
この実験（逆転写工程）において、試料核酸は、プライマーと混合され、４０℃でインキュベートされた。反応は、製造業者の説明書に従ってさらにｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮアーゼ阻害剤およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を含んでいた。試料中のプライマー伸長産物は、ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア）を用いて精製された。アダプターが、Ｔ７リガーゼを２５℃において５分間用いてライゲーションされた。試料中のライゲーション産物は、ＡＭＰｕｒｅビーズを用いて精製された。ＤＮＡプライマー伸長は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って硫酸アンモニウムの存在下で用いて実施された。伸長は、サーモサイクラー中で１５サイクル実施された。試料中のプライマー伸長産物は、ＡＭＰｕｒｅビーズを用いて精製された。
【００７２】
最終的なＰＥＴＥ生成物は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いてユニバーサルプライマーで２８サイクルのＰＣＲにより増幅された。増幅産物は、ＡＭＰｕｒｅビーズを用いて精製された。成功したＲＮＡ  ＰＥＴＥの結果が、図３において示されている。
【００７３】
実施例２：ＳＰＲＩビーズクリーンアップに関するエキソヌクレアーゼＩの代用
エキソヌクレアーゼＩは、一本鎖ＤＮＡからの３’→５’方向でのヌクレオチドの除去を触媒する酵素である。本開示の文脈において、エキソヌクレアーゼＩ処理工程は、下流の作業の流れのための調製において過剰な一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを分解するための精製工程として含まれることができる。一側面において、エキソヌクレアーゼＩ処理は、代替の精製工程（例えば図４の工程１０８）に加えて、またはその代わりに用いられる。代替の精製法の例は、固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）ビーズベースの精製法、カラムベースのクリーンアップ法、エタノール沈殿法等を含むことができる。第１プライマー伸長工程（例えば図４の工程１０４）後およびアダプターライゲーション工程（例えば図４の工程１１０）前の過剰なプライマーオリゴヌクレオチドの除去のためのエキソヌクレアーゼＩの使用は、過剰なプライマーオリゴヌクレオチドの除去に関してＳＰＲＩビーズ精製と比較した場合に類似の結果を示すことが実証されている。さらに、エキソヌクレアーゼＩの使用は、ＳＰＲＩビーズ精製工程に頼る作業の流れと比較した場合に実施時間の全体的な長さを低減することにより本開示の方法を単純化することができる。
【００７４】
実施例３：単一の反応工程におけるＰＥ２およびユニバーサルプライマー増幅の組み合わせ
ある態様において、本開示に従う方法は、第２標的特異的プライマー伸長工程と連続的にそれに続くユニバーサルプライマー増幅工程を含む。図４および５において図説されているように、アダプターライゲーション工程１１０および関係する反応精製工程の後、方法は、標的特異的プライマーを用いる第２プライマー伸長工程１１２およびユニバーサルプライマーを用いる増幅工程１１６を含むことができる。第２プライマー伸長工程１１２および増幅工程１１６は、組み合わせられて単一の工程１１２’になることができる（例えば、２つの工程は、中間のクリーンアップ工程、異なる反応条件等またはそれらの組み合わせを必要とすることなく単一の反応容器中で実施されることができる）。組み合わせられた工程１１２’が実施される場合、第２精製工程１１４は、方法１００の工程１１２および工程１１４の間の中間工程として省略されることができる。図５は、さらに組み合わせられた工程１１２’を含む図３の方法１００の一態様の工程を模式的に図説している。図４および５において図説されている組み合わせられたアプローチを用いて、逆方向標的特異的プライマーはユニバーサルプライマーと組み合わせられることができ、順次のプライマー伸長および増幅工程を含む方法と比較可能な結果を有することが、実証された。プライマー伸長およびユニバーサル増幅の組み合わせられた工程の１つの利点は、低減した総工程数による単純化された作業の流れに加えた全体の作業の流れの時間における低減である。プライマー伸長およびユニバーサル増幅の組み合わせられた工程に関する熱サイクルプロファイルの一例が、表２において示されている。
【００７５】
【表２】
0006970205.tif 000004
【００７６】
実施例４：“ホットスタート”能力を有する熱安定性ポリメラーゼの使用
本開示に従って、熱的に不安定なポリメラーゼ（例えばＢｓｔポリメラーゼ）が、第１プライマー伸長工程（例えば図４の工程１０４）において用いられる。熱的に不安定なポリメラーゼを用いる場合、ポリメラーゼを反応混合物に変性後のプライマーハイブリダイゼーション工程（例えば図４の工程１０２）の間に添加することが有用であり得る。他の態様において、熱的に安定なポリメラーゼが、熱的に不安定なポリメラーゼの代わりに用いられる。熱的に安定なポリメラーゼの使用は、ポリメラーゼを増幅または伸長反応混合物に所与の標的核酸二重鎖の変性の前に添加することを可能にすることが実証されている。
【００７７】
実施例５：アダプターの改変
本明細書で記載される際、アダプターは、図２において示されており、図６および図７においてより詳細に示されているように、二本鎖領域およびライゲーション部位に相補的な一本鎖オーバーハングを含むことができる。組成物は、５’標的特異的プライマー領域２０２および３’伸長領域２０４を有するプライマー伸長産物２００を含む。組成物は、さらに二本鎖領域２０８および一本鎖３’オーバーハング２１０を有する第１アダプター２０６ならびに二本鎖領域２１４および一本鎖５’オーバーハング２１６を有する第２アダプター２１２を含む。第２アダプター２１２の一本鎖５’オーバーハング２１６の標的特異的プライマー領域２０２の５’末端へのアニーリングは、結果として第２アダプター２１２の二本鎖領域２１４およびプライマー領域２０２の５’末端の間のギャップ２１８をもたらす。ギャップ２１８がニックである場合（すなわち、プライマー領域２０２の５’末端および隣接する二本鎖領域２１４の３’末端の間にはゼロヌクレオチド間隔が存在する）、その２つの鎖は、ギャップ２１８においてＤＮＡリガーゼもしくは別の酵素、またはプライマー領域２０２の３’−ＯＨおよび第２アダプター２１２の５’ホスフェートの間の反応を触媒することができる非酵素的試薬によりライゲーションされることができる。第１アダプター２０６は、同様に伸長された領域２０４の３’末端にアニーリングし、（例えばニック修復により）ライゲーションされることができる。
【００７８】
本開示によれば、アダプターの二本鎖部分のヌクレオチドにおける全体の長さの減少は下流の増幅反応における望まれない副産物（例えばプライマーダイマー）の形成を低減することができるという発見がなされている。図７においてさらに図説されているように、汎用アダプター２１２ａは、二本鎖領域２１４ａおよびプライマー領域２０２の５’末端にアニーリングするように設計されている一本鎖５’オーバーハング２１６ａを含む。二本鎖領域２１４ａは、［Ｎ］ｉの全ヌクレオチド長を有し、ここでＮは、アダプターヌクレオチドであり、ｉは、二本鎖領域２１４ａ中のヌクレオチドの数を表す整数である。類似の設計が、一本鎖領域２１０および二本鎖領域２０８を有するアダプター２０６に関して用いられる。
【００７９】
引き続き図７を参照して、二本鎖領域２１４ｂおよび一本鎖５’オーバーハング２１６ｂを有するアダプター２１２ｂは、Ｎ＝１０であるアダプター２１２ａの一態様を図説している。二本鎖領域２１４ｃおよび一本鎖５’オーバーハング２１６ｃを有するアダプター２１２ｃは、Ｎ＝１５であるアダプター２０６ａの一態様を図説している。本開示によれば、アダプター２１２ｂは、一般に、本明細書で開示される方法における使用に関してアダプター２１２ｃよりも優先的に選択されるであろう。一側面において、プライマー伸長産物へのライゲーションのためのアダプターは、１０ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、８ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、４ヌクレオチド未満、３ヌクレオチド未満、２ヌクレオチド未満または１ヌクレオチド未満の二本鎖領域を有する。類似の考えが、一本鎖領域２１０および二本鎖領域２０８を有するアダプター２０６に関して用いられる。
【００８０】
別の側面において、アダプターの３’末端のホスフェート基（または別の同様のブロック基）によるブロックは下流の増幅反応において望ましくない副産物（例えばプライマーダイマー）の形成を低減することができるという発見が、なされている。さらに、エキソヌクレアーゼＩ精製工程およびライゲーション反応工程は、３’ホスフェートブロックがアダプターの一本鎖オーバーハングの設計中に含まれる場合、組み合わせられて単一の反応工程になることができることが、実証された。例えば、図４中の方法１００の工程１０８（エキソヌクレアーゼＩ処理を含む）および工程１１０は、組み合わせられて単一の工程１０８’になることができる。さらに別の側面において、エキソヌクレアーゼＩの熱不活性化はエキソヌクレアーゼ処理がアダプターライゲーションの前に実施される場合、必要とされないことが、実証された。例えば、図４中の方法１００の場合、精製工程１０８およびアダプターライゲーション工程１１０の間におけるエキソヌクレアーゼＩの熱不活性化を省略することが、有用である可能性がある。
【００８１】
実施例６：サブサイクリング
サブサイクリングは、異なるアニーリング温度を有する一連のサイクルの組み合わせを含むＰＣＲに関する熱サイクルの改変された方法である。一側面において、サブサイクリングは、多重ＰＣＲ法の間にある標的配列の増幅が別の標的配列の増幅を上回るような偏りを制限するために用いられることができる(例えば、Guido N. et al., 2016. PLoS ONE 11(6): e0156478; Liu Q. et al., 1998. Biotechniques 25(6):1022-8参照)。本開示に従う第１プライマー伸長反応において実施された場合、サブサイクリングは、標的的中率（図８）および均一性を向上させることが示されている。標的的中率は、第１プライマー、インサート配列および逆方向標的特異的プライマーを配列決定の読みの長さがそれらをカバーする場合に含む、予想される標的にマッチするクオリティフィルタリングされた読みのパーセントとして定義される。第１プライミング事象および第２プライミング事象に関するサブサイクリング熱サイクルプログラムの例が、それぞれ表３および４において示されている。データの均一性は、平均の０．５倍〜２．０倍に入る標的の百分率を同定することにより決定された。１８１の異なる標的の中で、１３０の標的（７１．８％）は、平均の０．５倍〜２．０倍の標準化された深度を有していた。アンプリコンのＧＣ含有率の関数として測定された場合、１８１の異なる標的の中で、１４６の標的（８０．７％）が、平均の０．５倍〜２．０倍の標準化された深度を有していた。
【００８２】
【表３】
0006970205.tif 000005
【００８３】
【表４】
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【００８４】
表３において、サブサイクリングは、工程４および５において含まれており、一方で表４において、サブサイクリングは、工程５および６において含まれている。注目すべきことに、表４は、工程５および６の反復が工程２〜７の反復内に入れ子になっている熱サイクルプロファイルを示している。例えば、工程２〜７の単一のサイクルは、以下の工程の配列を順に含むであろう：２、３、４、５、６、５、６、５、６、５、６、７。
【００８５】
実施例７：完全なユニバーサルアダプターを有する遺伝子特異的プライマー
一側面において、ユニバーサルアダプター、インデックス（ＭＩＤ）配列またはそれらの組み合わせを有する遺伝子特異的プライマー（Ｇｅｎｅ  Ｓｐ．１、ＵＩＤ、ＭＩＤ、ユニバーサルプライマーＡ）を生成することが、有用であり得る。図９を参照して、ＵＩＤおよびＭＩＤの一方または両方を有するプライマーの使用は、本開示に従う方法の第１プライマー伸長工程の間の第１プライマー伸長産物のインデックス化を可能にし、それにより偽陽性の結果をもたらし得る下流の相互混入の可能性を低減する。
【００８６】
実施例８（仮想例）：プライマー伸長標的濃縮のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）への適用。
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、水−油エマルジョン液滴技術に基づくデジタルＰＣＲを実施するための方法である。試料は、数千個の液滴中に分画され、鋳型分子のＰＣＲ増幅が、それぞれの個々の液滴中で行われる。図１０を参照して、本開示に従う方法は、ｄｄＰＣＲへの適用に適合させられることができる。一側面において、ｄｄＰＣＲに有用なプライマー（例えば逆方向プライマーおよびユニバーサルプライマー）は、第１プライマー伸長産物およびエキソヌクレアーゼＩと組み合わせられることができる。注目すべきことに、本開示に従うプライマー伸長による標的濃縮は、次世代配列決定に関する高度に多重化されたアンプリコン生成に関する能力を有する。さらに、その方法は、標的特異的Ｔａｑｍａｎプローブと共にｄｄＰＣＲにおいて用いられた場合、標的核酸の計数を可能にするために適用されることができる。
【００８７】
本発明は特定の実施例への参照により詳細に記載されてきたが、当業者には、様々な改変が本発明の範囲内でなされることができることは、明らかであろう。従って、本発明の範囲は、本明細書で記載された実施例によってではなく下記で提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【符号の説明】
【００８８】
１００  方法
１０２  プライマーハイブリダイゼーションに関する工程
１０２’  工程
１０４  プライマー伸長の工程
１０６  伸長停止の工程
１０８  第１精製工程
１０８’  工程
１１０  アダプターライゲーション工程
１１２  第２プライマー伸長工程
１１２’  工程
１１４  第２精製工程
１１６  増幅の工程
１１８  配列決定の工程
２００  プライマー伸長産物
２０２  ５’標的特異的プライマー領域
２０４  ３’伸長領域
２０６  第１アダプター
２０８  二本鎖領域
２１０  一本鎖３’オーバーハング
２１２  第２アダプター
２１２ａ  一般的アダプター
２１２ｂ  アダプター
２１４  二本鎖領域
２１４ａ  二本鎖領域
２１４ｂ  二本鎖領域
２１４ｃ  二本鎖領域
２１６  一本鎖５’オーバーハング
２１６ａ  一本鎖５’オーバーハング
２１６ｂ  一本鎖５’オーバーハング
２１６ｃ  一本鎖５’オーバーハング
２１８  ギャップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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