(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）とクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）からなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物であって、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
クロルフェネシンは、下記化１で表される、請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【化１】
0006900067.tif 000010
【請求項３】
クロロキンは、下記化２で表される、請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【化２】
0006900067.tif 000011
【請求項４】
クロロピラジンは、下記化３で表される、請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【化３】
0006900067.tif 000012
【請求項５】
前記クロルフェネシンに代えて、有効成分が、下記化４で表されるクロルフェネシンカルバミン酸エステル（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）である、請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【化４】
0006900067.tif 000013
【請求項６】
癌は、大腸癌、膵臓癌、または胆道癌である、請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌の増殖および転移抑制用薬学的組成物であって、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを有効成分として含む、癌の増殖および転移抑制用薬学的組成物。
【請求項８】
癌は、大腸癌、膵臓癌、または胆道癌である、請求項７に記載の癌の増殖および転移抑制用薬学的組成物。
【請求項９】
クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、抗癌サプリメントであって、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを有効成分として含む、抗癌サプリメント。
【請求項１０】
癌は、大腸癌、膵臓癌、または胆道癌である、請求項９に記載の抗癌サプリメント。
【請求項１１】
クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１以上を含む、癌の予防または改善用食品組成物であって、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを含む、癌の予防または改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療および転移抑制用組成物に関するものであって、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理による抗癌および転移抑制効果に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの体を構成する最小単位を細胞（ｃｅｌｌ）と呼ぶが、正常な細胞は、細胞内の調節機能によって分裂して成長したり、死滅したりして、細胞数のバランスを維持する。ある原因によって細胞が損傷を受けた場合には、治療を受けて正常な細胞としての役割をしたり、回復しなかった場合には、自滅する。しかし、様々な理由により、細胞の遺伝子に変化が起これば、異常に細胞が変化してしまい不完全に成長し、細胞周期が調節されずに細胞分裂をし続けるが、これを癌（ｃａｎｃｅｒ）と定義する。また、癌は、周囲の組織および臓器に侵入し、これらを破壊するだけでなく、他の臓器にまで広まって行く特徴がある。癌による死亡率は、韓国内における死亡原因第１位となっており、毎年その数が増加している。特定の癌の医学的治療には、目覚ましい進歩をなしてきたものの、全ての癌の全体の５年生存率は、過去２０年間で約１０％程度しか改善されていない。癌、または悪性腫瘍は、制御されない方式で速くに転移および成長するので、良いタイミングでこれを検出し、治療することが極度に困難である。
【０００３】
大腸は、小腸の端から始まり、肛門まで続く長いチューブ状の消化器官であって、この部位で発生する癌を大腸癌という。大腸癌は、発生する部位別に大きく結腸癌と直腸癌とに区分される。大腸癌の患者は、一般的に排便習慣の変化、血便や粘液便、太さが細い便、体重の減少、腹部の不快感、疲労、食欲不振などの症状を見せる。大腸癌は、主に肝臓、肺へと転移し、大腸癌患者の約５０％以上から癌転移（ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）が発生する。従来の大腸癌の治療は、外科的な手術と化学療法が行われるが、代表的な標的療法として、「Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）注射剤」が使われている。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂとは、上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）を標的とするモノクローナル抗体であって、大腸癌細胞表面のＥＧＦＲに特異的に結合し、癌細胞の増殖を引き起こすシグナル伝達の過程で、特定の部分を抑制し、癌細胞の全般的な増殖を抑制する。
【０００４】
膵臓癌は、最も致命的な形態の癌の一つである。米国では、毎年４万名以上が膵臓癌の診断を受け、これらの内、５％未満が診断後、５年以上生存する。このような低生存率は、主に、ほとんどの膵臓癌が進行した段階までに診断されないことに起因する。膵臓癌は、通常、初期段階では、症状がないが、後期の段階での症状は、非−特異的で多様なため、早期診断を困難にする。膵臓癌の治療の選択肢は、限られている。手術および放射線治療は、初期段階での膵臓癌に行われることがあるが、進行性または再発性膵臓癌にはあまり効果的ではない。ゲムシタビンの週１回の静脈内投与が有効であることが分かった。これは、１９９８年に米国ＦＤＡによって膵臓癌に承認された。膵臓癌の治療のために最も多く用いられる抗癌剤であるゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）は、シュウ酸（ｏｘａｌａｔｅ）や５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）などの他の薬物と一緒に併用して使用されているが、膵臓癌の患者の有意な生存率の増加には、大きな影響を及ぼしていない。姑息的療法のための標準的な治療法は、単独療法またはＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブとの併用療法で使われるゲムシタビンである。代替オプションとして、５フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカンおよびオキサリプラチンの併用（ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸプロトコルとしても知られている）、またはゲムシタビンとナブ−パクリタキセルの併用があり、後者は、ＭＰＡＣＴ研究でゲムシタビン単独療法に比べて優れた効果を示す（Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；  Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｅｘｏｋｒｉｎｅｓ  Ｐａｎｋｒｅａｓｋａｒｚｉｎｏｍ、２０１３）。米国ＦＤＡは、また、過去に化学療法を受けなかった進行段階の膵臓癌患者に対して、ゲムシタビンと併用して使用するためのキナーゼ阻害剤エルロチニブを承認した。しかし、エルロチニブから誘導される生存期間中央値（ｍｅｄｉａｎ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の利益は、わずか４週間未満であった（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，２５（１５）：１９６０−６（２００７））。
【０００５】
胆管は、肝臓で作られる胆汁を十二指腸に送る管であって、肝臓の中から木の枝が一つの幹に向かって集まるように、徐々に合流し太くなり、肝臓から出る際に、左右の胆管がほとんど合流して一本となる。胆管は、肝臓の中を走る間、肝内胆管と肝臓の外に出てから十二指腸まで続く、肝外胆管に分けられる。  肝外胆管の内、胆汁を一時的に保存して濃縮する袋を胆嚢と呼び、これらの肝内外胆管と胆嚢をあわせて胆道と呼ぶ。胆管は、肝臓から排出される胆汁の通路であって、木の幹のように徐々に太くなり、十二指腸に開口している。  そして、胆汁を１次的に蓄える場所としては、胆嚢がある。胆管癌と胆嚢癌を総称して胆道癌とし、胆道、胆嚢内部を取り囲んでいる上皮細胞に発生する癌である。胆道癌は、診断当時７０−８０％が進行性癌であって、手術は３０〜４０％のみが可能であり、５年生存率は、７％前後に過ぎない治療が難しい難治癌の一つである。現在まで、色んな癌に対する多くの抗癌剤が開発されているにもかかわらず、抗癌剤だけで完治が可能な癌は、少数の癌に過ぎない。その理由は、抗癌剤を使った癌の治療時、抗癌剤に癌細胞が反応しなかったり、初期には効果的に腫瘍が減少するが、治療途中または治療後に、抗癌剤に耐性が生じてしまうからである。したがって、効果的な抗癌の治療のためには、抗癌剤に対する癌細胞の耐性など、抗癌剤に対する抵抗性を克服しなければならない。胆道癌の場合にも、抗癌剤の耐性が早期に頻繁に発生し、抗癌剤の反応率が１５％に過ぎず、術後の再発率が８５％に達するにもかかわらず、手術前と後の補助抗癌剤療法のために用いることができる、効果的な抗癌薬剤が全くない状態である。
【０００６】
悪性腫瘍は、ほとんどの場合、１つの臓器（肺、肝臓、腎臓、胃、大腸、直腸など）で発生した後、最初に発生した原発部位の臓器から他の組織に広まるが、このように原発部位から他の組織に広まることを転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）という。転移は、悪性腫瘍の進行に伴う現象であって、悪性腫瘍細胞が増殖し、癌が進行するにつれて、転移に必要な新たな遺伝形質を獲得した後、血管とリンプ線に浸潤して血液やリンパ管に沿って循環している途中、他の組織に定着した後、増殖する。
【０００７】
現在、癌の治療には手術療法、放射線治療や化学療法などが使用されている。この中で、化学療法は、抗癌剤を用いて癌を治療する方法をいう。今日では、約６０種の様々な抗癌剤が使用されており、最近の癌の発症および癌細胞の特性に関する知識が多く知られるにつれて、新たな抗癌剤の開発に関する研究が活発に進められている。また、現在の治療法は、癌細胞の死滅または除去に焦点を当てており、癌患者の生存率と直接に結びつく、原因である癌細胞の増殖と転移を防止するための薬物の研究が不足しているのが現状である。したがって、癌治療と患者の生存率を高めるためには、抗癌活性と癌細胞の増殖および転移抑制効果を一緒に有する新概念の薬物の開発が切実に望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，２５（１５）：１９６０−６（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の発明者は、クロルフェネシン、クロロキンまたはクロロピラジンが、抗癌効果、および癌細胞の増殖と転移抑制に効果があることを確認し、これらの組み合わせが相乗作用を奏することを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）およびクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌増殖と転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００１２】
また、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、抗癌サプリメントを提供する。
【００１３】
さらに、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１以上を含む癌の予防または改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、癌細胞の増殖および転移を一緒に抑制することを目的とする抗癌組成物に関するものであって、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンを、それぞれまたはいくつかの組み合わせで併用投与することにより、著しく効果的な増殖と転移を抑制することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）の大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の細胞生存率を示すグラフである。
【図２】クロロキン（ＯＣ−２０２）の大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の細胞生存率を示すグラフである。
【図３】クロロピラジン（ＯＣ−２０３）の大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の細胞生存率を示すグラフである。
【図４】クロルフェネシンとクロロキンの併用処理による大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の細胞生存率を示すグラフである。
【図５】クロルフェネシンとクロロピラジンの併用処理による大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の細胞生存率を示すグラフである。
【図６】クロルフェネシン濃度によるＳＷ４８０細胞の移動程度を確認する図である。
【図７】クロルフェネシン濃度によるＳＷ４８０細胞の移動程度を示すグラフである。
【図８】クロルフェネシン濃度によるＨＣＴ１１６細胞の移動程度を確認する図である。
【図９】クロルフェネシン濃度によるＨＣＴ１１６細胞の移動程度を示すグラフである。
【図１０】クロルフェネシン濃度によるＣＴ２６細胞の移動程度を確認する図である。
【図１１】クロルフェネシン濃度によるＣＴ２６細胞の移動程度を示すグラフである。
【図１２】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理によるＳＷ４８０細胞の移動程度を確認する図である。
【図１３】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理によるＳＷ４８０細胞の移動程度を示すグラフである。
【図１４】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理によるＨＣＴ１１６細胞の移動程度を確認する図である。
【図１５】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理によるＨＣＴ１１６細胞の移動程度を示すグラフである。
【図１６】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理によるＣＴ２６細胞の移動程度を確認する図である。
【図１７】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンの単独または併用処理によるＣＴ２６細胞の移動程度を示すグラフである。
【図１８】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度によるＳＷ４８０細胞の移動阻害への相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を確認した図である。
【図１９】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度によるＨＣＴ１１６細胞の移動阻害への相乗作用を確認した図である。
【図２０】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度によるＣＴ２６細胞の移動阻害の相乗作用を確認した図である。
【図２１】クロルフェネシン単独処理によるＨＣＴ１１６細胞の移動抑制効果を創傷治癒アッセイ方法で確認した図である。
【図２２】クロルフェネシン単独処理によるＨＣＴ１１６細胞の移動抑制効果を創傷治癒アッセイで確認した図である。
【図２３】クロルフェネシン単独処理によるＨＣＴ１１６の創傷治癒アッセイ結果を示すグラフである。
【図２４】クロロキン（ＯＣ−２０２）とクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をそれぞれ単独処理によるＨＣＴ１１６細胞の移動抑制効果を創傷治癒アッセイで確認した図である。
【図２５】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理したＨＣＴ１１６細胞の移動抑制効果を創傷治癒アッセイで確認した図である。
【図２６】クロロキンまたはクロロピラジンの単独処理、またはクロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理したＨＣＴ１１６細胞の創傷治癒アッセイ結果を示すグラフである。
【図２７】クロルフェネシン処理濃度によるＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成アッセイ結果を示す図である。
【図２８】クロルフェネシン、クロロキンまたはクロロピラジンの単独処理、またはクロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した濃度によるＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成アッセイ結果を示す図である。
【図２９】クロルフェネシン、クロロキンまたはクロロピラジンの単独処理、またはクロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した濃度によるＣＴ２６細胞のコロニー形成アッセイ結果を示す図である。
【図３０】クロルフェネシン処理濃度による膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３１】クロロキン処理濃度による膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３２】クロロピラジン処理濃度による膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３３】クロルフェネシン５μＭにクロロキンを１μＭ〜５０μＭで併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３４】クロロキン０．５μＭにクロルフェネシンを１μＭ〜５０μＭで併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３５】クロロキン１μＭにクロルフェネシンを１μＭ〜５０μＭで併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３６】クロロキン５μＭにクロルフェネシンを１μＭ〜５０μＭで併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３７】クロルフェネシン５μＭにクロロピラジンを１μＭ〜２５μＭで併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２とＰａｎｃ−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図３８】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンをそれぞれ単独処理したり、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１の移動程度を示す図である。
【図３９】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１で併用処理濃度による細胞の移動阻害への相乗作用を確認した図である。
【図４０】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンをそれぞれ単独処理したり、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１の移動程度を示す図である。
【図４１】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１で併用処理濃度による細胞の移動阻害への相乗作用を確認した図である。
【図４２】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンをそれぞれ単独処理したり、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１の浸潤解析結果を示す図である。
【図４３】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１で併用処理濃度による細胞の浸潤抑制への相乗作用を確認した図である。
【図４４】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンをそれぞれ単独処理したり、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株  ＭＩＡＣａＰａ２の浸潤解析結果を示す図である。
【図４５】クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した膵臓癌細胞株ＭＩＡＣａＰａ２で併用処理濃度による細胞の浸潤抑制への相乗作用を確認した図である。
【図４６】胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９とＳＮＵ３０８のクロルフェネシン濃度による細胞生存率を示すグラフである。
【図４７】胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９とＳＮＵ３０８のクロロキンの濃度による細胞生存率を示すグラフである。
【図４８】胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９とＳＮＵ３０８のクロロピラジンの濃度による細胞生存率を示すグラフである。
【図４９】クロルフェネシンとクロロキンの併用処理濃度による胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９とＳＮＵ３０８細胞生存率を示すグラフである。
【図５０】クロルフェネシンとクロロピラジンの併用処理濃度による胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９とＳＮＵ３０８細胞生存率を示すグラフである。
【図５１】クロルフェネシン濃度による胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９の移動阻害の程度を確認した図である。
【図５２】クロルフェネシン濃度による胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９の移動阻害の程度を確認したグラフである。
【図５３】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンをそれぞれ単独処理したり、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９の移動阻害の程度を確認した図である。
【図５４】クロルフェネシンとクロロキン、またはクロロピラジンを併用処理した胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９で併用処理濃度による細胞の移動阻害への相乗作用を確認した図である。
【図５５】クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンをそれぞれ単独処理したり、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロロピラジンを併用処理した胆道癌細胞ＳＮＵ１０７９の浸潤抑制効果を示す図である。
【図５６】クロルフェネシンとクロロキン、またはクロロピラジンを併用処理した胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９で併用処理濃度による細胞の浸潤抑制への相乗作用を確認した図である。
【図５７】ロルフェネシン細胞毒性の評価結果を示すグラフである。
【図５８】クロルフェネシン処理されるか、処理されていないＣＴ２６細胞およびＨＣＲ１１６細胞の染色画像である。
【図５９】クロルフェネシン処理されるか処理されていないＣＴ２６細胞の単層の染色画像である。
【図６０】癌転移動物モデルから収集した肺の画像および肺に発生したｎｏｄｕｌｅの数を示すグラフである。
【図６１】癌転移動物モデルの体重及び腫瘍の大きさの測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、添付された図面を参照して、本発明の実施例において、本発明を詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の例示として挙げるものであり、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が、本発明の要旨を不要に曖昧にし得ると判断された場合には、その詳細な説明を省略することができ、これにより本発明が限定されるものではない。本発明は、後述する特許請求の範囲の記載およびそれから解釈される均等範疇内で多様な変形および応用が可能である。
【００１７】
また、本明細書にて用いられる用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好適な実施例を適切に表現するために使用される用語であって、これらは、ユーザー、運用者の意図または本発明が属する分野の慣例などによって変わり得る。したがって、本用語の定義は、本明細書全般にわたった内容に基づいてなされるべきである。明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」としたとき、これは特に相反する記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【００１８】
一側面において、本発明は、クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）とクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【００１９】
一実施例において、クロルフェネシンは、下記化１で、クロロキンは下記化２で、およびクロロピラジンは下記化３で、表されることができる。
【００２０】
【化１】
0006900067.tif 000002
【００２１】
【化２】
0006900067.tif 000003
【００２２】
【化３】
0006900067.tif 000004
【００２３】
一実施例において、クロルフェネシンは下記化４で表されるクロルフェネシンカルバミン酸エステル（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）であることができる。
【００２４】
【化４】
0006900067.tif 000005
【００２５】
本発明のクロルフェネシンカルバミン酸エステルは、主に筋肉弛緩剤として使用され、鎮静、不安緩和などの効果および抗真菌、抗菌効果があることが知られている。
【００２６】
一実施例において、本発明の薬学組成物は、クロルフェネシンおよびクロロキン、クロルフェネシンおよびクロロピラジン、クロロキンおよびクロロピラジン、またはクロルフェネシン、クロロキンおよびクロルフェネシン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことができ、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを含むことが相乗的な抗癌効果を奏するので、より好ましい。
【００２７】
一実施例において、本発明の薬学組成物は、クロルフェネシンを５〜５００μＭ、クロロキンを０．５〜２５μＭ、またはクロロピラジンを１〜１００μＭを含むことができ、クロルフェネシンとクロロキンを一緒に含む場合のクロルフェネシン５μＭ（固定濃度）およびクロロキン０．５〜２５μＭを含むことができ、クロルフェネシンクロロピラジンを一緒に含む場合、クロルフェネシン５μＭ（固定濃度）およびクロロピラジン２５〜５０μＭを含むことができる。本発明の一実施例において、本発明のクロルフェネシン、クロロキンおよび／またはクロロピラジンは、細胞実験において前記濃度範囲で、深刻な細胞毒性なく癌細胞の移動および浸潤を抑制した。
【００２８】
一実施例において、前記癌は、脳腫瘍、メラノーマ、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭付近癌、子宮内膜癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ節癌、膀胱癌、胆道癌（胆嚢と胆管癌）、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つ以上とすることができ、大腸癌、膵臓癌、または胆道癌であることがより好ましい。本発明の一実施例において、マウス由来の結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＣＴ２６、ヒト由来の大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト由来の結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＳＷ４８０、ヒト由来の膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株Ｐａｎｃ−１、ヒト由来の膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ヒト由来の膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣＡ２、ヒト由来の胆嚢癌（Ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＳＮＵ３０８およびヒト由来胆管癌（Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＳＮＵ１０７９のクロルフェネシン、クロロキンおよびクロルフェネシンそれぞれの抗癌効果とこれらの組み合わせによる併用処理による抗癌効果を確認した。
【００２９】
本発明は、化学式１〜３で表されるクロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）およびクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）だけでなく、これらの薬学的に許容される塩、これにより製造可能な溶媒和物、水和物、ラセミ体または立体異性体の両方を含む。
【００３０】
本発明の化学式１〜３で表されるクロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）およびクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸などのような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル−置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得る。このような薬学的に無毒な塩類としては、スルファート、ピロスルファート、バイスルファート、サルファイト、バイサルファイト、ニトラート、ホスファート、モノヒドロゲンホスファート、ジヒドロゲンホスファート、メタホスファート、ピロホスファートクロライド、ブロマイド、アイオダイド、フルオライド、アセタート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルマート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、サクシネート、スベラート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン−１、４−ジオエート、ヘキサン−１、６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホナート、トルエンスルホナート、クロロベンゼンスルホナート、キシレンスルホナート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトラート、ラクタート、β−ヒドロキシブチレート、グリコラート、マレート、タートレート、メタンスルホナート、プロパンスルホナート、ナフタリン−１−スルホナート、ナフタリン−２−スルホナートまたはマンデレートを含有する。
【００３１】
本発明による酸付加塩は、通常の方法、例えば、化学式１〜３で表されるクロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）およびクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈澱させて製造することができる。また、この混合物から溶媒や過量の酸を蒸発させて乾燥するか、または析出した塩を吸入ろ過して製造することもできる。
【００３２】
また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物の溶液中に溶解し、非溶解化合物塩をろ過し、余液を蒸発、乾燥させて得る。ここで、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上適切である。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得る。
【００３３】
本発明の薬学的組成物は、有効成分としてクロルフェネシン、クロロキンおよびクロルフェネシンの外に公知された抗癌剤をさらに含むことができ、これらの疾患の治療のために公知された他の治療と併用することができる。他の治療には、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、骨髄移植、幹−細胞代替療法、他の生物学的治療、免疫治療などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明において、用語「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により癌の発生、拡散、および再発を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、本発明のクロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）およびクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩、またはこれを含む組成物の投与により癌細胞の死滅または癌の症状を好転させたり、有益に変更するすべての行為を意味する。本発明が属する技術分野にて通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会などで提示された資料を参照して、本願の組成物が効果のある疾患の正確な基準を知り、改善、向上、および治療の程度を判断することができるものである。
【００３５】
本発明において、有効成分と結合して使用された「治療学的に有効な量」という用語は、対象疾患を予防または治療するのに有効な量を意味し、本発明の組成物の治療的に有効な量は、いくつかの要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって変わり得る。したがって、人体に使用する際の投与量は、安全性および効率性を一緒に考慮して適正量を決定しなければならない。動物実験を通じて決定された有効量から、ヒトに使用する量を推定することも可能である。有効な量を決定する際に考慮されるべきこれらの事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ  ｅｄ。（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；と、ＥＷ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｄ，、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ，（１９９０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記述されている。
【００３６】
本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明にて用いられる用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味し、有効容量水準は、患者の健康状態、癌の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与方法、投与時間、投与経路、および排出割合、治療期間、配合または同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られた要素に基づいて決定することができる。本発明の組成物は、個々の治療薬として投与するか、他の治療薬と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与されることができる。前記した要素をすべて考慮して、副作用なく最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定することができる。
【００３７】
本発明の薬学組成物は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤、または２つ以上の組み合わせを含むことができる。本発明で用いられる用語、「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出する細胞やヒトに毒性がない特性を示すことを意味する。前記担体は、組成物を生体内伝達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ  ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ． に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうちの１成分以上を混合して利用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような、注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００３８】
一実施例において、前記薬学組成物は、経口型製剤、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液および噴霧剤を含む群から選択される１つ以上の製剤であることができ、経口型または注射用製剤がより好ましい。
【００３９】
本発明にて用いられる用語、「投与」とは、任意の適切な方法で、個体または患者に所定の物質を提供することを意味し、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に注射製剤に適用）したり、経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などにより、その範囲が多様である。本発明の組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、所謂、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが一緒に含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。本発明の薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することもできる。好ましい投与方式および製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などである。注射剤は、生理食塩液、リンゲル液などの水性溶剤、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて製造することができ、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、微生物発育を阻止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサル、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレソール、ベンジルアルコールなど）などの薬学的担体を含むことができる。
【００４０】
本発明にて用いられる用語、「個体」とは、前記の癌が発症または発症し得るヒトを含むサル、牛、馬、羊、豚、鶏、七面鳥、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットを含むすべての動物を意味し、本発明の薬学的組成物を個体に投与することにより、前記の疾患を効果的に予防または治療することができる。本発明の薬学的組成物は、従来の治療剤と並行して投与することができる。
【００４１】
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、この時、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダル二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化澱粉、トウモロコシ澱粉、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、でん粉グリコール酸ナトリウム、カルボナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどが使用されることができる。本発明による薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部〜９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
一側面において、本発明は、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンから選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌増殖および転移抑制用薬学的組成物に関するものである。
【００４３】
一実施例において、クロルフェネシンは下記化５で、クロロキンは下記化６で、およびクロロピラジンは下記化７で、表されることができる。
【００４４】
【化５】
0006900067.tif 000006
【００４５】
【化６】
0006900067.tif 000007
【００４６】
【化７】
0006900067.tif 000008
【００４７】
一実施例において、クロルフェネシンは下記化８で表されるクロルフェネシンカルバミン酸エステル （ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）であることができる。
【００４８】
【化８】
0006900067.tif 000009
【００４９】
一実施例において、本発明の薬学組成物は、クロルフェネシンとクロロキン、クロルフェネシンとクロロピラジン、クロロキンおよびクロロピラジン、またはクロルフェネシン、クロロキンおよびクロルフェネシン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことができ、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを含むことが相乗的な転移および浸潤抑制の効果を奏するので、より好ましい。
【００５０】
一実施例において、本発明の薬学組成物は、クロルフェネシンを５〜５００μＭ、クロロキンを０．５〜２５μＭ、またはクロロピラジンを１〜１００μＭを含むことができ、クロルフェネシンとクロロキンを共に含む場合、クロルフェネシン５μＭ（固定濃度）およびクロロキン０．５〜２５μＭを含むことができ、クロルフェネシンとクロロピラジンを共に含む場合、クロルフェネシン５μＭ（固定濃度）およびクロロピラジン２５〜５０μＭを含むことができる。本発明の一実施例において、前記の濃度範囲で深刻な細胞毒性なく癌細胞の移動および浸潤を抑制した。
【００５１】
本発明のクロルフェネシンは、低濃度である０．１μＭ〜１０ｍＭで癌細胞の死滅ではなく、癌細胞の増殖と転移のみを抑制することができる。例えば、本発明の組成物は、１μＭ〜１ｍＭ範囲の低濃度のクロルフェネシンを含むことができる。クロルフェネシンが１μＭ未満の濃度である場合、癌の増殖および転移の抑制効果が１μＭに比べて減少し、１Ｍｍ超過、特に１０ｍＭ以上の濃度では、細胞毒性を示すことができる。
【００５２】
一実施形態において、前記癌は、大腸癌、膵臓癌、または胆道癌とすることができる。本発明の一実施例においては、マウス由来の結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＣＴ２６、ヒト由来の大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト由来の結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＳＷ４８０、ヒト由来の膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株Ｐａｎｃ−１、ヒト由来の膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ヒト由来の膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣＡ２、ヒト由来の胆嚢癌（Ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＳＮＵ３０８およびヒト由来の胆管癌（Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＳＮＵ１０７９に対するクロルフェネシン、クロロキンおよびクロルフェネシンそれぞれの癌細胞転移および浸潤抑制効果と、これらの組み合わせによる併用処理による癌細胞の転移と浸潤抑制効果を確認した。
【００５３】
一側面において、本発明は、クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）およびクロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ）から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、抗癌サプリメントに関するものである。
【００５４】
一実施例において、本発明のクロルフェネシンは、低濃度で癌細胞の死滅ではなく、癌細胞の増殖および転移のみを抑制することができるため、すでに細胞の毒性を有する抗癌剤と併用投与するとき、細胞の毒性を最小限に抑えることができる。例えば、本発明の組成物は、１μＭ〜１ｍＭの範囲の低濃度のクロルフェネシンを含むことができる。クロルフェネシン１μＭ未満の濃度の場合、癌の増殖および転移抑制効果がなく、１Ｍｍ超過、特に１０ｍＭ以上の濃度では、細胞毒性を示すことができる。
【００５５】
一実施例において、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを有効成分として含むことができる。本発明の一実施例においては、マウスからマウス由来の結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＣＴ２６で誘発した腫瘍の大きさおよび転移をクロルフェネシン抗癌剤を併用処理することにより、著しく抑制したことを確認した。
【００５６】
本発明の薬学的組成物に含めることができる抗癌剤の例には、ＤＮＡアルキル化剤（ＤＮＡ  ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）として、メクロエグルタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ：ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ：ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）およびカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）；抗癌性抗生物質（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）として、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ：ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）およびブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）；および植物アルカロイド（ｐｌａｎｔ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ）として、ピンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）およびイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
一側面において、本発明は、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンから選択される１つ以上を含む癌の予防または改善用食品組成物に関するものである。
【００５８】
本発明の組成物を食品組成物として使用する場合には、前記クロルフェネシン、クロロキンまたはクロルフェネシンをそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常の方法に応じて適宜に使用することができる。前記組成物は、有効成分に加えて、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができ、有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に基づいて適宜決定することができる。
【００５９】
本発明にて用いられる用語「栄養補助添加剤」とは、食品に補助的に添加することができる構成要素を意味し、各製剤の健康機能食品を製造するのに添加されるものであって、当業者が適宜選択して使用することができる。栄養補助剤の例としては、数々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤、および充填剤、ペクチン酸とその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などが含まれるが、前記の例により、本発明の食品補助添加剤の種類が制限されるものではない。
【００６０】
本発明の食品組成物には、健康機能食品が含まれることができる。本発明にて用いられる用語「健康機能食品」とは、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液体および丸などの形態で製造および加工した食品をいう。ここで「機能性」とは、人体の構造および機能に対して栄養素を調整したり、生理学的作用などのような保健の用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の健康機能食品は、通常の技術分野で一般的に使用される方法によって製造可能であり、前記製造の際には、通常の技術分野で一般的に添加する原料および成分を添加して製造することができる。また、前記健康機能食品の製剤もまた健康機能食品として認められている製剤であれば、制限なく製造することができる。本発明の食品用組成物は、様々な形の製剤で製造することができ、一般的な薬品とは異なり、食品を原料とし、薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがない利点があり、携帯性に優れ、本発明の健康機能食品は、抗癌剤の効果を増進させるためのサプリメントとして摂取が可能である。
【００６１】
また、本発明の組成物が使用されることができる健康食品の種類には制限がない。なお、本発明のクロルフェネシン、クロロキンまたはクロルフェネシンを活性成分として含む組成物は、当業者の選択に応じて、健康機能食品に含有することができる適切なその他の補助成分と公知の添加剤とを混合して製造することができる。添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、飴類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン配合剤などがあり、本発明による抽出物を主成分とし、製造した汁、茶、ゼリーおよびジュースなどに添加して製造することができる。
【００６２】
一側面において、本発明は、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩を薬学的に有効な量で、癌に罹った個体に投与する段階を含む、癌治療方法に関するものである。
【００６３】
一実施例においては、クロルフェネシンとクロロキン、クロルフェネシンとクロロピラジン、クロロキンとクロロピラジン、またはクロルフェネシン、クロロキンとクロルフェネシン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することができ、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロルフェネシンとクロロピラジンを一緒に投与することが相乗的な抗癌効果をそうするので、より好ましい。
【００６４】
一実施例において、本発明の薬学組成物は、クロルフェネシンを５〜５００μＭ、クロロキンを０．５〜２５μＭ、またはクロロピラジンを１〜１００μＭを含むことができ、クロルフェネシンとクロロキンを共に含む場合、クロルフェネシン５μＭ（固定濃度）およびクロロキン０．５〜２５μＭを含むことができ、クロルフェネシンとクロロピラジンを一緒に含む場合、クロルフェネシン５μＭ（固定濃度）とクロロピラジン２５〜５０μＭを含むことができる。本発明の一実施例においては、前記の濃度範囲で深刻な細胞毒性なく癌細胞の移動および浸潤を抑制した。
【００６５】
一実施例において、前記癌は、脳腫瘍、メラノーマ、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、卵管癌、肛門付近癌、子宮内膜癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ節癌、膀胱癌、胆道癌（胆嚢と胆管癌）、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、  副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫と下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つ以上とすることができ、大腸癌、膵臓癌、または胆道癌であることがより好ましい。
【００６６】
一側面において、本発明は、癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に使用するための、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジンからなる群から選択される１つ以上、または薬学的に許容可能なその塩の用途に関するものである。
【００６７】
下記の実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであって、これにより本発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００６８】
大腸癌に対する抗癌および転移抑制効果の確認
１−１．細胞生存率の確認
１−１−１．単独投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｎｓｉｎ、ＯＣ−２０１と命名）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ、ＯＣ−２０２と命名）と、クロロピラジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅ、ＯＣ−２０３と命名）、それぞれの単独投与が大腸癌細胞の生存率に及ぼす影響を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｔｄ．）により、大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞株に対する細胞の生存率を評価した。それぞれの大腸癌細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種し、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）を、それぞれＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ および１ｍＭで２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの間、前処理した細胞を４時間５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液および中断溶液を追加した後、３０℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、下記式を用いて、細胞生存率を計算した。
（数１）
細胞生存率＝実験群吸光度（５７０ｎｍ）／対照群吸光度（５７０ｎｍ）×１００（％）
【００６９】
その結果、図１〜３で見られるように、ＯＣ−２０１は５００μＭ超過、ＯＣ−２０２は１０ｕＭ超過時、毒性を示し、ＯＣ−２０３は１００ｕＭ以下で毒性が示さないことが分かった。
【００７０】
１−１−２．併用投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）の組み合わせによる併用処理による大腸癌細胞の生存率を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  、Ｌｔｄ．）により、大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞株に対する細胞生存率を評価した。それぞれの大腸癌細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種し、対照群（ＤＭＳＯ処理）、クロルフェネシン５μＭ、クロルフェネシンとクロロキン（５μＭ＋５００ｎＭ、５μＭ＋１μＭ、５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭと５μＭ＋５０μＭ）、またはクロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋１μＭ、５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ、５μＭ＋５０μＭおよび５μＭ＋１００μＭ）をそれぞれ２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの間、処理した細胞を４時間５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴと一緒にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液および中断溶液を追加した後、３０℃で４時間の間、インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、前記（式１）を用いて細胞生存率を計算した。
【００７１】
その結果、クロルフェネシン５μＭにクロロキンを２５μＭ以上、併用処理した場合、大腸癌に毒性を示し（図４）、クロルフェネシン５μＭにクロロピラジンを１００μＭ以下で併用処理した場合、大腸癌に毒性を示さなかった（図５）。
【００７２】
１−２．細胞移動の確認
１−２−１．移動解析（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
１−２−１−１．クロルフェネシン単独投与
癌細胞の転移は、細胞の運動性が前提とされるべき関係にあるので、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）の処理濃度による大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６およびＣＴ２６細胞株の移動を移動解析方法を使用して確認した。具体的には、大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞株を無血清ＲＰＭＩに懸濁した後、ポリカーボネート膜（８．０μＭｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、Ｃｏｓｔａｒ）を有する２４ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーにウェル当たり１ｘ１０５細胞で添加した。ラミニン（１０μｇ／ｍｌ）を下部ウェルに位置させ、それぞれの細胞にクロルフェネシン（ＯＣ−２０１）ＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭおよび２ｍＭでそれぞれ処理した。細胞は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１８時間培養し、移動するようにした。その後、細胞を３０分間ＰＢＳ内で７０％メチルアルコールで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Ｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で固定させた。移動した細胞（膜の下面に付着した細胞）を高出力長（ｘ２０）からランダムに選択されたスコープで計数した。
【００７３】
その結果、ＳＷ４８０細胞株では、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）を２５μＭ以上処理した場合、細胞の移動が著しく減少した（図６および７）。また、ＨＣＴ１１６細胞株では、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）を処理した場合、細胞の移動が減少し、特に２５０μＭ以上処理した場合に著しく減少した（図８および９）。併せて、ＣＴ２６細胞株でもクロルフェネシン（ＯＣ−２０１）を処理した場合、細胞の移動が減少し、特に２５０μＭ以上、処理した場合に著しく減少した（図１０および１１）。
【００７４】
１−２−１−２．併用投与
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をそれぞれ単独処理した場合と、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロロピラジンを併用処理した場合、大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０の移動程度を確認した。
【００７５】
具体的には、大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６、またはＳＷ４８０を対照群（ＤＭＳＯ処理）、クロルフェネシン（５μＭ）、クロロキン（５μＭ、１０μＭまたは２５μＭ）、クロロピラジン（２５μＭまたは５０μＭ）、クロルフェネシンとクロロキン（５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ）、およびクロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋２５μＭ、５μＭ＋５０μＭ）で処理した後、細胞の移動程度を前記実施例と同様の方法で確認した。また、併用処理時、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を、Ｃｏｍｐｕｓｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用してクロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＣＩ）を通じて計算した。
【００７６】
その結果、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をそれぞれ単独処理したものよりもクロルフェネシンとクロロキンまたはクロルフェネシンとクロロピラジンを併用処理したとき、大腸癌細胞株ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０両方の移動が減少することが確認できた（図１２ないし１７）。また、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した場合、相乗作用を示し、特に、クロルフェネシンとクロロキンを併用処理した場合、すべての細胞株から相乗作用が示された（図１８〜２０）。
【００７７】
１−２−２．創傷治癒アッセイ（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）
１−２−２−１．クロルフェネシン単独投与
癌細胞の転移は、細胞の運動性が前提とされるべき関係であるので、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）を単独処理した場合、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の移動程度を、創傷治癒アッセイで確認した。具体的には、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩに添加し、２４時間後、単層で７０〜８０％コンフルエンスに達したときの濃度で２４ウェル組織培養プレートに接種した。ウェルの中央を横切って、新しい２００μＬイエローピペットチップで断層に慎重にゆっくりとスクラッチを出した。結果として生成されたギャップ距離をチップの端の外径と同じにした。スクラッチを出した後、ディッシュを培地に慎重に２回洗浄して分離された細胞を除去した。その後、クロルフェネシン０μＭ（ＤＭＳＯ）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、２５０μＭ、５００μＭまたは１ｍＭを処理し、インキュベーション０時間、８時間、および２４時間後、顕微鏡で確認をし、グラフ化した。
【００７８】
その結果、クロルフェネシン２５μＭ以上処理した場合、大腸癌細胞の移動が減少した（図２１ないし２３）。
【００７９】
１−２−２−２．併用投与
クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をそれぞれ単独処理した場合と  クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）をこれらとそれぞれ併用処理した場合、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の移動程度を確認した。具体的には、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩに添加し、２４時間後、単層で７０〜８０％コンフルエンスに達したときの濃度で２４ウェル組織培養プレートに接種した。ウェルの中央を横切って、新しい２００μＬイエローピペットチップで断層に慎重にゆっくりとスクラッチを出した。結果として生成されたギャップ距離をチップの端の外径と同じにした。スクラッチを出した後、ディッシュを培地に慎重に２回洗浄して分離された細胞を除去した。その後、クロロキン単独処理（５、１０、または２５μＭ）、クロロピラジン単独処理（２５または５０μＭ）、クロルフェネシンとクロロキン併用処理（５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ）、およびクロルフェネシンとクロロピラジン併用処理（５μＭ＋  ２５μＭ、５μＭ＋５０μＭ）した後、０時間、８時間、または２４時間後の細胞の移動程度を前記実施例１−２−２−１と同様の方法で確認した。
【００８０】
その結果、クロロキン（ＯＣ−２０２）とクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をそれぞれ単独処理した場合よりもクロルフェネシンと共に処理した場合、大腸癌細胞の移動が減少したことが示された（図２４ないし２６）。
【００８１】
１−３．非付着増殖解析
１−３−１．クロルフェネシン単独投与
非付着増殖能（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ）は、正常細胞と癌細胞を区分する重要な形質であって、正常細胞が増殖する際に付着（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）を必要とするが、癌細胞は、付着せずに生存し、増殖することができる。すなわち、正常細胞は、細胞が培養プレートに付着していない場合は、増殖することができないが、癌細胞は軟寒天（ｓｏｆｔ  ａｇａｒ）のように、細胞接着がない浮遊状態で増殖可能な特性を利用して、軟寒天コロニー形成アッセイを通じて非付着増殖能を確認した。まず、クロルフェネシン単独投与による大腸癌細胞株の非付着増殖能を確認するために、コロニー形成アッセイ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。具体的には、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６  ３千個を軟寒天と混ぜて６ウェルプレートに分注した後、クロルフェネシン０μＭ（ＤＭＳＯ）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭまたは２ｍＭで処理した。その後、細胞培地を交換するたびにクロルフェネシンも一緒に補充し、細胞分周３週間後に観察した。
【００８２】
その結果、図２７に示すように、クロルフェネシン２５０μＭ以上処理した場合、コロニー形成能が減少することが示された。
【００８３】
１−３−２．併用投与
クロルフェネシンとクロロキン（ＯＣ−２０２）またはクロロピラジン（ＯＣ−２０３）を併用処理した場合、大腸癌細胞株の非付着増殖能が単独処理に比べて抑制するのかを確認するために、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６およびＣＴ２６にそれぞれクロルフェネシン５μＭ、クロロキン１０または２５μＭ、クロロピラジン１０μＭ、クロルフェネシンとクロロキン（５μＭ＋１０μＭまたは５μＭ＋２５μＭ）、クロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭまたは５μＭ＋５０μＭ）を処理してコロニー形成アッセイを行った。
【００８４】
その結果、クロロキンまたはクロロピラジンを、それぞれ単独で処理したものよりもクロルフェネシンとクロロキンを併用処理したとき、コロニー形成が減少した（図２８および２９）。
【実施例２】
【００８５】
膵臓癌に対する効果の確認
２−１．細胞生存率の確認
２−１−１．単独投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）のそれぞれの単独投与が膵臓癌細胞の生存率に及ぼす影響を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、  Ｌｔｄ．）により、膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２およびＰａｎｃ−１に対する細胞生存率を評価した。それぞれの膵臓癌細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種し、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）をＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭおよび１ｍＭ（１０００μＭ）で、クロロキン（ＯＣ−２０２）をＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭ、およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭで、それぞれ２４ｈ  、４８ｈまたは７２ｈの間、前処理した細胞を４時間５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、３０℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、前記（式１）を用いて、細胞生存率を計算した。
【００８６】
その結果、図３０〜３２に見られるように、クロルフェネシンとクロロピラジンの単独群の場合、大容量でも細胞毒性を示さなかったが、クロロキンの場合には５０μＭ以上の濃度で細胞毒性を示した。
【００８７】
２−１−２．併用投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）の組み合わせによる併用処理による膵臓癌細胞の生存率を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、  Ｌｔｄ．）により、膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１、ＭＩＡＰａＣＡ２およびＰａｎｃ−１の細胞生存率を評価した。それぞれの膵臓癌細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種し、対照群（ＤＭＳＯ処理）、クロルフェネシン５μＭ、クロルフェネシンとクロロキン（クロルフェネシン５μＭおよびクロロキン１、５、１０、２５、または５０μＭの併用処理、クロロキン０．５μＭおよびクロルフェネシン１、５、１０、２５、または５０μＭの併用処理、クロロキン１μＭおよびクロルフェネシン１、５、１０、２５または５０μＭの併用処理、またはクロロキン５μＭとクロルフェネシン１、５、１０、２５、または５０μＭの併用処理）、またはクロルフェネシンとクロロピラジン（クロルフェネシン５μＭおよびクロロピラジン１、５、１０、２５または５０μＭの併用処理）を処理した後、それぞれ２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈ後、細胞を４時間５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、３０℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、前記（式１）を用いて細胞生存率を計算した。
【００８８】
その結果、クロルフェネシン５μＭにクロロキンを１μＭ〜５０μＭを併用処理した場合（図３３）、クロロキン０．５μＭにクロルフェネシン１μＭ〜５０μＭを併用処理した場合（図３４）、クロロキン１μＭにクロルフェネシン１μＭ〜５０μＭを併用処理した場合（図３５）、クロロキン５μＭにクロルフェネシン１μＭ〜５０μＭを併用処理した場合（図３６）には、膵臓癌細胞株から７２時間までの深刻な細胞毒性は見られず、クロルフェネシン５μＭにクロロピラジンを１μＭ〜２５μＭまで併用処理した場合（図３７）には、膵臓癌細胞株から２４時間まで深刻な細胞毒性は見られなかった。
【００８９】
２−２．細胞移動解析（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
２−２−１．単独と併用処理との比較
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）をそれぞれ単独処理した場合と、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した場合、膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１およびＡｓｐｃ−  １の移動程度を、前記実施例１−２−１と同様の方法で確認した。具体的には、膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１およびＡｓｐｃ−１に対照群（ＤＭＳＯ）、クロルフェネシン（５μＭ）、クロロキン（５μＭ、１０μＭまたは２５μＭ）、クロロピラジン（２５μＭまたは５０μＭ）、クロルフェネシンおおびクロロキン（５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ）、およびクロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋２５μＭ、５μＭ＋５０μＭ）で処理した後、細胞の移動程度を前記実施例１−２−１と同様の方法で確認した。また、併用処理時、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）をＣｏｍｐｕｓｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＣＩ）を通じて計算した。
【００９０】
その結果、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジン単独投与群ではＰａｎｃ−１細胞の移動が減少し（図３８および３９）、クロルフェネシン５μＭとクロロキンを１０μＭ併用処理した群と、クロルフェネシン５μＭとクロロピラジンを２５μＭ以上併用処理した群から上昇作用を示す（図３９）。また、クロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジン単独投与群からＡｓｐｃ−１細胞株でも、細胞の移動が減少し（図４０および４１）、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理したすべての群から細胞の移動の減少に対して上昇作用を示す（図４１）。
【００９１】
２−３．浸潤解析
本発明のクロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）が、細胞の組織を取り囲んでいる薄い膜に穴を開けたり、細胞の間々を満たしている細胞外基質を分解しながら、他の部位に浸潤して転移する癌細胞の特性を阻害していることを確認するためには、細胞外基質を模写したマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を使用した浸潤解析（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。具体的には、膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１およびＭＩＡＣａＰａ２を無血清ＲＰＭＩに懸濁した後、ポリカーボネート膜（８．０μＭｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、  Ｃｏｓｔａｒ）を有する２４ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーにウェル当たり１ｘ１０５細胞に添加した。マトリゲル（１０μｇ／ｍｌ）を下部ウェルに位置させ、それぞれの細胞に対照群（ＤＭＳＯ）、クロルフェネシン（５μＭ）、クロロキン（５μＭ、１０μＭまたは２５μＭ）、クロロピラジン（２５μＭまたは５０μＭ）、クロルフェネシンとクロロキン（５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ）、およびクロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋２５μＭ、５μＭ＋５０μＭ）で処理した。その後、細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１８時間培養した。その後、細胞を３０分間ＰＢＳ内で７０％メチルアルコールで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Ｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で固定させた。移動した細胞（膜の下面に付着した細胞）を高出力長（ｘ２０）からランダムに選択されたスコープで計数した。また、併用処理時、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）をＣｏｍｐｕｓｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＣＩ）を通じて計算した。
【００９２】
その結果、図４２および４４に示すようにクロルフェネシン、クロロキンおよびクロロピラジン単独投与群からＰａｎｃ−１およびＭＩＡＣａＰａ２の浸潤が抑制されたことを確認することができ、両膵臓癌細胞株からいずれもクロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理による相乗作用を示す（図４３および４５）。
【実施例３】
【００９３】
胆道癌に対する効果を確認
３−１．細胞生存率の確認
３−１−１．単独投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）それぞれの単独投与が胆道癌細胞の生存率に及ぼす影響を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  、Ｌｔｄ．）により、胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９およびＳＮＵ３０８の細胞生存率を評価した。それぞれの胆道癌細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種し、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）をＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭと１ｍＭ（１０００μＭ）であり、およびクロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）を、それぞれＯμＭ（対照群ＤＭＳＯ処理）、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭでそれぞれ２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの間に前処理した細胞を４時間、５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液および中断溶液を追加した後、３０℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、前記（式１）を用いて細胞生存率を計算した。
【００９４】
その結果、図４６ないし４８にて見られるように、クロルフェネシンの場合、１ｍＭ以上の場合、４８時間後に明確な細胞毒性を示し、クロロキンの場合には、ＳＮＵ１０７９細胞株の場合、２４時間では５０μＭ以上の濃度で、４８時間後には２５μＭ以上の濃度で、細胞毒性を示し、ＳＮＵ３０８細胞株の場合、４８時間後には、５０μＭ以上の濃度で細胞毒性を示す。クロロピラジンの単独群の場合、大容量でも細胞毒性を示さなかった。
【００９５】
３−１−２．併用投与による細胞生存率を確認
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）およびクロロピラジン（ＯＣ−２０３）の組み合わせによる併用処理による胆道癌細胞の生存率を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  、Ｌｔｄ．）により、胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９およびＳＮＵ３０８に対する細胞生存率を評価した。それぞれの胆道癌細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種し、対照群（ＤＭＳＯ処理）、クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）５μＭの処理、クロルフェネシンとクロロキン（ＯＣ−２０２  ）併用処理（クロルフェネシン５μＭ＋クロロキン１、５、１０、２５、または５０μＭ併用処理）、またはクロルフェネシンとクロロピラジン（ＯＣ−２０３）併用処理（クロルフェネシン５μＭ＋クロロピラジン１、５、１０、２５、５０、または１００μＭ併用処理）した後、それぞれ２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈ後、細胞を４時間５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、３０℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、前記（式１）を用いて、細胞生存率を計算した。
【００９６】
その結果、クロルフェネシン５μＭとクロロキン５０μＭ以上、併用処理した場合（図４９）およびクロルフェネシン５μＭとクロロピラジン１００μＭを併用処理した場合（図５０）、胆道癌細胞株に細胞毒性を示す。
【００９７】
３−２．細胞移動の確認
３−２−１．クロルフェネシン単独投与
クロルフェネシン（ＯＣ−２０１）の処理濃度による胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９の移動性を移動解析方法を通じて確認した。具体的には、胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９を無血清ＲＰＭＩに懸濁した後、ポリカーボネート膜（８．０μＭｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、Ｃｏｓｔａｒ）を有する２４ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーにウェル当たり１ｘ１０５細胞に添加した。ラミニン（１０μｇ／ｍｌ）を下部ウェルに位置し、クロルフェネシン５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭまたは２ｍＭを処理した。細胞は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１８時間培養して移動するようにした。その後、細胞を３０分間、ＰＢＳ内で７０％メチルアルコールで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜の上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Ｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で固定させた。移動した細胞（膜の下面に付着した細胞）を高出力長（ｘ２０）からランダムに選択されたスコープで計数した。
【００９８】
その結果、クロルフェネシン２５μＭ以上の処理された胆道癌細胞の移動が減少しており、特に、１００μＭ以上の濃度で、細胞の移動の減少が著しく示された（図５１および５２）。
【００９９】
３−２−２．併用投与
クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した場合、胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９の移動性を移動解析方法を通じて確認した。具体的には、胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９に対照群（ＤＭＳＯ）、クロルフェネシン（５μＭ）、クロロキン（５μＭ、１０μＭまたは２５μＭ）、クロロピラジン（２５μＭまたは５０μＭ）、クロルフェネシンとクロロキン（５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ）、およびクロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋２５μＭ、５μＭ＋５０μＭ）を処理した後、細胞の移動程度を前記実施例３−２−１と同様の方法で確認した。また、併用処理時、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を、Ｃｏｍｐｕｓｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＣＩ）を通じて計算した。
【０１００】
その結果、クロルフェネシン５μＭのクロロキンを５μＭまたは１０μＭで併用処理した場合、胆道癌細胞の移動阻害が相乗的に増加した（相乗作用）ことを示した（図５３および５４）。
【０１０１】
３−３．浸潤解析
本発明のクロルフェネシン（ＯＣ−２０１）、クロロキン（ＯＣ−２０２）とクロロピラジン（ＯＣ−２０３）が単独または併用処理時、他の部位に浸潤して転移する癌細胞の特性を阻害していることを確認するため、胆道癌細胞株ＳＮＵ１０７９に対照群（ＤＭＳＯ）、クロルフェネシン（５μＭ）、クロロキン（５μＭ、１０μＭまたは２５μＭ）、クロロピラジン（２５μＭまたは５０μＭ）、クロルフェネシンとクロロキン（５μＭ＋５μＭ、５μＭ＋１０μＭ、５μＭ＋２５μＭ）、およびクロルフェネシンとクロロピラジン（５μＭ＋２５μＭ、５μＭ＋５０μＭ）を処理して、前記実施例２−３に記載された方法で浸潤解析（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。また、併用処理時、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を、Ｃｏｍｐｕｓｙｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＣＩ）を通じて計算した。
【０１０２】
その結果、図５５のように胆道癌細胞の浸潤が抑制されたことを確認することができ、特に、クロルフェネシンとクロロキンを併用処理した場合、相乗作用を示した（図５６）。
【実施例４】
【０１０３】
低濃度における癌の転移抑制効果の確認
４−１．クロルフェネシン大腸癌の転移抑制効果の確認
４−１−１．細胞毒性のない低濃度の決定
細胞毒性のないクロルフェネシン濃度を決定するために、製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｔｄ．）により、細胞生存率を評価した。ＣＴ２６細胞株およびＨＣＴ−１１６細胞株をウェル当たり５×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートに接種した。クロルフェネシン（１００ｐｐｍ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ）を前処理する、または前処理せずに、それから細胞を４時間５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、１５０μＬの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、３０℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、前記（式１）で計算した。図５７から見られるように、ＣＴ２６細胞およびＨＣＴ−１１６細胞いずれも１μＭ〜１ｍＭの濃度範囲で細胞毒性がないことを確認した。
【０１０４】
１μＭのクロルフェネシン濃度は、筋肉弛緩効果を示す濃度以下であり、かつ細胞毒性のない濃度であるので、抗癌活性がない低濃度のクロルフェネシンが癌細胞転移抑制効果を有するのかを評価するための濃度で、以後の実験を行った。
【０１０５】
４−１−１．細胞移動阻害を確認
４−１−１−１．移動解析
ポリカーボネート膜（８．０μＭｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、Ｃｏｓｔａｒ）を有する２４ウェルトランスウェルチャンバーを使用して、細胞の移動を評価した。ＣＴ２６とＨＣＴ１１６大腸癌細胞を無血清ＲＰＭＩに懸濁した後、ウェル当たり１ｘ１０５細胞で上部チャンバーに添加した。ラミニン（１０μｇ／ｍｌ）を下部ウェルに位置させ、細胞が３７℃のＣＯ２インキュベーター内で８時間移動するようにした。細胞を３０分間、ＰＢＳ内で７０％メチルアルコールで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜の上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Ｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で固定させた。移動した細胞（膜の下面に付着した細胞）を高出力長（ｘ２０）からランダムに選択されたスコープで計数した。
【０１０６】
その結果、図５８に示すように、クロルフェネシン低濃度（１μＭ）で処理した場合には、細胞の浸透能力と移動能力が対照群に比べて著しく減少したことが確認できた。
【０１０７】
４−１−１−２．創傷治癒アッセイ
細胞の運動性を測定するために創傷治癒アッセイを実施した。まず、ＣＴ２６大腸癌細胞株を、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩに添加し、２４時間後、単層で７０〜８０％コンフルエンスに達したときの濃度で、２４ウェル組織培養プレートに接種した。ウェルの中央を横切って、新しい２００μＬイエローピペットチップで断層に慎重にゆっくりとスクラッチを出した。結果として生成されたギャップ距離をチップの端の外径と同じにした。スクラッチを出した後、ディッシュを培地に慎重に２回洗浄して分離された細胞を除去した。クロルフェネシン（１μＭ）の存在または不在下で細胞を２４時間インキュベーションした後、顕微鏡で染色された断層の写真を撮影した。
【０１０８】
その結果、図５９から見られるように、クロルフェネシン（１μＭ）処理によってＣＴ２６細胞株の運動性が減ったことを確認することができた。また、これは、癌細胞の死滅が不可能なほどの低濃度でも癌細胞の転移抑制に影響を与え得ることを証明する結果である。
【０１０９】
４−１−２．ｉｎ  ｖｉｖｏ  癌転移抑制の確認
クロルフェネシンによる腫瘍増殖抑制効果を動物実験で確認した。具体的には、６０匹Ｂａｌｂ／ｃ  ｍｉｃｅに１００μＬのＣＴ２６細胞懸濁液（１ｘ１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１回皮下接種し、腫瘍を誘発させて異種移植動物モデル（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ）を製造した。癌細胞接種後、３日後から５週間の間、抗癌剤であるフルオロウラシル（５’ＦＵ）と併用して、または単独でクロルフェネシンを投与した。まず、フルオロウラシルとの併用投与実験群として、１１匹の動物モデルに５週間２５ｍｇ／ｋｇのフルオロウラシル（週５回投与）と、１０ｍｇ／ｋｇのクロルフェネシン（週３回投与）を腹腔内に併用投与した。クロルフェネシン単独投与実験群としては、１０匹の動物モデルに５週間、１０ｍｇ／ｋｇのクロルフェネシンを週３回腹腔投与したり、１４匹の動物モデルに５週間、２０ｍｇ／ｋｇのクロルフェネシンを週５回経口投与した。陰性対照群として１４匹の動物モデルにクロルフェネシンと同容量のＰＢＳを投与し、陽性対照群として１４匹の動物モデルに抗癌剤である、２５ｍｇ／ｋｇのフルオロウラシルを単独で週５回投与した。動物モデルの体重を週１回測定し、腫瘍の大きさを薬物投与日から週１回測定した。６週間後に、動物モデルをエーテルで麻酔した後、腫瘍と肺を収集した。
【０１１０】
その結果、図６０に示すように、対照群に比べてクロルフェネシン処理した群からは、肺への転移がなかったことが確認できた。また、図６１のように、クロルフェネシン処理した群からは対照群に比べて、２０ｍｇ／ｋｇのクロルフェネシン処理した動物から、腫瘍の大きさも小さくなる現象も確認できた。そこで、クロルフェネシンが腫瘍の成長と転移能力の両方を負の調節をすることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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