(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロセッサ;及び
命令を記憶するメモリ
を含むマイクロサテライト不安定性を決定するためのシステムであって、命令は、プロセッサによって実行されると、プロセッサに、
目的の試料のゲノム配列データにアクセスする工程であって、目的の試料は、マッチする正常試料が利用不可能な腫瘍試料由来であり、配列データは、複数のマイクロサテライト領域に関するヌクレオチド同一性情報を含む、工程;
目的の試料に関する試料情報を受け取る工程;
試料情報に基づいて、複数の参照試料データセットから、関連する参照試料データセットを選択する工程であって、関連する参照試料データセットは、複数のマイクロサテライト領域についてのヌクレオチド同一性情報及び複数の個体から生成される、マッチしない正常コホートである、工程;
目的の試料からの配列データを、関連する参照試料データセットと比較することに基づいて、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を分類する工程;及び
分類に基づいて、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を代表する指示を提供する工程
を行わせる、システム。
【請求項２】
試料情報が、目的の試料の起源の情報を含み、複数の参照試料データセットが、起源に基づいて互いに異なり、関連する参照試料データセットが、目的の試料の起源の情報と、関連する参照試料データセットの起源との間のマッチに基づいて選択される、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
関連する参照試料データセットが、複数の個体由来のFFPE試料から生成され、目的の試料が、FFPE試料である、請求項1又は2に記載のシステム。
【請求項４】
関連する参照試料データセットが、複数の個体由来の新しい凍結した試料から生成され、目的の試料が、新しい凍結した試料である、請求項1又は2に記載のシステム。
【請求項５】
関連する参照試料データセットが、複数の個体由来の細胞株から生成され、目的の試料が、細胞株である、請求項1又は2に記載のシステム。
【請求項６】
試料情報が、組織タイプの情報を含み、複数の参照試料データセットが、組織タイプに基づいて互いに異なっており、関連する参照試料データセットが、前記組織タイプの情報と、関連する参照試料データセットの組織タイプとのマッチに基づいて更に選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
試料情報が、配列データを生成するのに使用されたシーケンシングパネル情報を含み、複数の参照試料データセットが、参照試料データセットを生成するのに使用されたシーケンシングパネルに基づいて互いに異なっており、関連する参照試料データセットが、前記シーケンシングパネル情報と、関連する参照試料データセットを生成するのに使用されたシーケンシングパネルとの間のマッチに基づいて更に選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
関連する参照試料データセットが、複数の個体由来のプールしたデータセットである、請求項1から7のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
マッチしない正常コホートが、万能なマッチする試料である、請求項1から8のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
複数のマイクロサテライト領域の個々のマイクロサテライト領域に関する、シーケンシング深さに基づく、品質測定基準を使用して、関連する参照試料データセットに関する、個々のマイクロサテライト領域を選択することを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
目的の試料中のマイクロサテライト不安定性を検出するための、コンピューターにより実施される方法であって、
目的の試料の配列データを提供する工程であって、目的の試料は、マッチする正常試料が利用不可能な腫瘍試料由来であり、配列データは、複数のマイクロサテライト領域に関するヌクレオチド同一性情報を含む、工程;
目的の試料に関する試料情報を提供する工程;
試料情報に基づいて、複数の参照試料データセットから、関連する参照試料データセットを選択する工程であって、関連する参照試料データセットは、複数のマイクロサテライト領域のヌクレオチド同一性情報及び複数の個体から生成される、マッチしない正常コホートである、工程;及び
目的の試料からの配列データを、関連する参照試料データセットと、コンピューターによる実施によって比較することに基づいて、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を評価する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
マッチしない正常コホートが、万能なマッチする試料である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
複数のマイクロサテライト領域の個々のマイクロサテライト領域に関する、シーケンシング深さに基づく、品質測定基準を使用して、関連する参照試料データセットに関する、個々のマイクロサテライト領域を選択することを含む、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1から10のいずれか一項に記載のシステムを使用する、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
目的の試料中のマイクロサテライト不安定性を検出するため、及び/又は目的の試料におけるマイクロサテライト不安定性のタイプを決定するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のシステムの使用であって、試料は、マッチする正常試料が利用不可能な腫瘍試料由来である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示があらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる2017年11月16日付けで出願された「MICROSATELLITE INSTABILITY ASSESSMENT TECHNIQUES」という表題の米国仮出願第62/587,350号の優先権と利益を主張する。本出願はまた、その開示があらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる2018年4月3日付けで出願された「MICROSATELLITE INSTABILITY ASSESSMENT TECHNIQUES WITH REDUCED BIAS」という表題の米国仮出願第62/652,151号の優先権と利益も主張する。
【０００２】
本発明の開示は、一般的に、配列データ等の生物学的試料から獲得したデータの分野に関する。より詳細には、本開示は、マッチする正常試料(matched normal samples)の存在から独立した生物学的試料の配列データの分析を介してマイクロサテライト不安定性を評価するための技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子シーケンシングは、遺伝学的調査のますます重要な分野になりつつあり、将来的には診断や他の用途での使用が見込まれている。遺伝子配列データは、他の用途のなかでも特に、特定の臨床転帰に関連する遺伝子突然変異、改変、バリアント、又は多形を同定するのに使用することができる。例えば、特定の遺伝学的バリアントは、正又は負の疾患の転帰に関連する可能性がある。更に、経時的な、又はマッチする正常試料に対する対象の遺伝学的変化は、臨床的に有用な情報を提供する可能性がある。しかしながら、マッチする正常試料は、どの対象でも入手できるとは限らない可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公報第2007/0166705号
【特許文献２】米国特許公報第2006/0188901号
【特許文献３】米国特許公報第2006/0240439号
【特許文献４】米国特許公報第2006/0281109号
【特許文献５】米国特許公報第2005/0100900号
【特許文献６】米国特許第7,057,026号
【特許文献７】WO05/065814
【特許文献８】WO06/064199
【特許文献９】WO07/010,251
【特許文献１０】米国特許第6,969,488号
【特許文献１１】米国特許第6,172,218号
【特許文献１２】米国特許第6,306,597号
【特許文献１３】米国特許第7,001,792号
【特許文献１４】US2009/0026082A1
【特許文献１５】US2009/0127589A1
【特許文献１６】US2010/0137143A1
【特許文献１７】US2010/0282617A1
【特許文献１８】米国特許第7,329,860号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Soni及びMeller、Clin. Chem. 53、1996〜2001(2007)
【非特許文献２】Healy、Nanomed. 2、459〜481(2007)
【非特許文献３】Cockroftら、J. Am. Chem. Soc. 130、818〜820(2008)
【非特許文献４】Leveneら、Science 299、682〜686(2003)
【非特許文献５】Lundquistら、Opt. Lett.33、1026〜1028(2008)
【非特許文献６】Korlachら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA105、1176〜1181(2008)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の開示は、目的の試料からの配列データを使用した、マイクロサテライト不安定性の検出及び特徴付けのための改善された技術を提供する。マイクロサテライト不安定性とは、本明細書で提供されるように、ゲノムにわたり存在する短いタンデム反復配列(例えば長さが1から6個の塩基対)であるマイクロサテライト反復領域中の核酸複製エラーの存在を指し得る。マイクロサテライトの反復はゲノムの非翻訳領域で生じ得るが、マイクロサテライトはコード領域中に存在する場合もある。DNA複製中、マイクロサテライト不安定性を有する細胞はDNA複製エラーを修復できず、それにより、複製された娘鎖でフレームシフト突然変異を引き起こす可能性がある。
【０００７】
マイクロサテライト不安定性の存在は、特定の臨床症状に関連する可能性がある。例えば、マイクロサテライト不安定性は、MLH1、PMS2、MSH2及びMSH6等のミスマッチ修復遺伝子の生殖細胞系突然変異に基づく、リンチ症候群と呼ばれる遺伝性がん症候群の顕著な特徴である。マイクロサテライト不安定性のステータスは、典型的には、結腸直腸腫瘍や子宮内膜腫瘍等のがんタイプにおける良好な生存に関する独立した予後因子として、臨床実験室で評価される。更に、高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI-H)の指定を有するか又はミスマッチ修復欠損(dMMR)である固形腫瘍を有する患者の場合、ニボルマブ又はペンブロリズマブを投与する特定の処置プロトコール又は処置選択肢を開始させることができる。更に、本明細書で決定されるようなマイクロサテライト不安定性スコアに対してマイクロサテライト安定の指定を有する固形腫瘍を有する患者の場合、処置選択肢は、ペンブロリズマブを投与しないことであり得る。別の実施態様において、MSIのタイプ分類(高頻度、低頻度、安定)は、患者がアジュバント5-フルオロウラシル(5-FU)化学療法によって利益を得る可能性があるかどうかを決定するのに使用することができる。結腸直腸がん患者の場合、アジュバント5-フルオロウラシル(5-FU)化学療法は、MSI-H患者に限定的な利益しか提供しない可能性がある。それゆえに、MSI-Hの指定は、アジュバント5-フルオロウラシル(5-FU)化学療法の中断又は禁忌を引き起こす可能性がある。その代わりにこのような患者は、ホリニン酸、5-FU及びオキサリプラチンが与えられる場合がある。別の例において、患者のMSIタイプは、免疫療法が提供されるのか、又は化学療法が提供されるのかを決定するのに使用することができる。
【０００８】
したがって、本明細書で提供されるように、目的の試料の配列データを分析して、目的の試料中のマイクロサテライト不安定性の存在、非存在、及び/又は程度を決定することができる。マイクロサテライト不安定性が評価された目的の試料は、MSI-H、低頻度マイクロサテライト不安定性(MSI-L)、又はマイクロサテライト安定(MSS)と指示することができる。目的の試料は、腫瘍試料であってもよく、マイクロサテライト不安定性又は安定性の指定は、追加の臨床情報を提供することができる。したがって本発明の技術は、がん患者の診断、予後、及び/又は処置プロトコールの一部として、又はそれと共に使用することができる。
【０００９】
特定の実施態様において、本発明の技術は、マッチする正常組織試料を有さない目的の試料の評価を可能にする。本明細書で提供されるように、目的の試料ごとに仮定のマッチする正常試料を代表する参照試料データセットを生成することができる。参照試料データセットは、万能なマッチする正常試料として機能し得る。参照試料データセットは、複数の個体の正常組織の配列データから生成される。腫瘍試料を試験する場合、適切な参照試料データセットは、組織タイプ、試料の起源、及び他の要因に基づき選択することができる。
【００１０】
特定の実施態様において、試料を提供する個体の民族学的バックグラウンドから独立して目的の試料に適用できる万能なマッチする正常試料を生成するために、多民族学的な複数の個体(すなわち、複数の異なる民族学的バックグラウンドを有する個体等)の試料から形成された参照試料データセットは、民族学的グループ間で相対的により高いレベルの変動性を有するマイクロサテライト部位に関して評価することができる。このような部位は、参照試料データセット中で消去又はマスクしてもよく、したがって、目的の試料を代表する総合的なマイクロサテライト不安定性スコアを生成するのに使用される分析から、これらの高度に変動しやすい部位を消去してもよい。この方式であれば、マイクロサテライト不安定性の結果としてではなく民族学的グループ間での変動性により正常試料において変動しやすい部位は、マイクロサテライト不安定性スコアに、誤りの可能性がある結果を導入しない。したがって、本発明の技術は、マッチする正常試料がない試料の、試料の民族学的バックグラウンドから独立したより正確なマイクロサテライト不安定性の評価を提供する。一例において、本発明の技術は、民族学的バックグラウンドの同定情報が存在しない試料に関するマイクロサテライト不安定性を評価するのに使用することができる。別の例において、仮定のマッチする正常なものとして使用される参照試料データセットは、民族学的に変動しやすいマイクロサテライト領域がデータセットから除外されて生成されることから、一般的に様々な試料に適用することができ、したがって目的の試料を提供する個体の民族学的バックグラウンドに基づき、追加の処理工程又は適切な参照試料の選択を行うことが不要になる。
【００１１】
一実施態様において、コンピューターにより実施されるマイクロサテライト不安定性を処理する方法であって、それぞれの個体に対応する複数の参照生物学的試料から、参照配列データを獲得する工程であって、各参照生物学的試料は、複数の民族学的グループのうち1つに関連し、参照配列データは、複数のマイクロサテライト領域に関するヌクレオチド同一性情報を含む、工程;マイクロプロセッサを使用して参照配列データを分析して、複数の参照生物学的試料につき複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布を生成する工程;マイクロプロセッサを使用して、複数の参照生物学的試料につき複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布の民族学的グループの変動性を決定する工程であって、民族学的グループの変動性は、各民族学的グループに関連する参照配列データを複数の民族学的グループの他の民族学的グループに対して評価することに基づく、工程;民族学的グループの変動性が閾値未満の分布を有する複数のマイクロサテライト領域の民族学的に偏っていないマイクロサテライト領域を決定する工程;マイクロプロセッサを使用して、決定された複数のマイクロサテライト領域の民族学的に偏っていないマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布から、参照試料データセットを生成する工程;マイクロプロセッサを使用して、目的の試料からの配列データと参照試料データセットとの比較に基づいて、個体由来の目的の試料にマッチする正常試料を使用せずに、マイクロサテライト不安定性を決定する工程であって、目的の試料は、個体の腫瘍試料由来である、工程;及び決定されたマイクロサテライト不安定性に基づいて、処置選択肢に関する情報をアウトプットする工程を含む方法が提供される。
【００１２】
別の実施態様において、コンピューターにより実施される方法であって、マイクロプロセッサを使用して、それぞれの個体に対応する複数の参照生物学的試料から、ゲノム参照配列データを獲得する工程;参照配列データを分析して、複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける配列の分布を生成する工程;複数の参照生物学的試料につき複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布の民族学的グループの変動性を決定する工程であって、民族学的グループの変動性は、ゲノム配列の差を含む、工程;複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける民族学的グループの変動性に基づいて、複数のマイクロサテライト領域の民族学的に偏ったマイクロサテライト領域を同定する工程;及び複数の参照生物学的試料の参照配列データから、民族学的に偏ったマイクロサテライト領域を除去又は除外することによって、参照試料データセットを生成する工程を含む、方法が提供される。
【００１３】
一実施態様において、それぞれの個体に対応する複数の参照生物学的試料から、参照配列データを獲得する工程であって、参照配列データは、複数のマイクロサテライト領域に関するヌクレオチド同一性情報を含む、工程;参照配列データを分析して、複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布を生成する工程;複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布から参照試料データセットを生成する工程;及び目的の試料からの配列データを参照試料データセットと比較することに基づいて、マイクロサテライト不安定性を評価する命令を提供する工程であって、目的の試料は、個体の腫瘍試料由来であり、個体由来の目的の試料にマッチする正常試料は利用可能ではない、工程を含む方法が提供される。
【００１４】
別の実施態様において、プロセッサ;及び命令を記憶するメモリを含むシステムであって、命令は、プロセッサによって実行されると、プロセッサに、目的の試料のゲノム配列データにアクセスする工程であって、配列データは、複数のマイクロサテライト領域に関するヌクレオチド同一性情報を含む、工程;目的の試料に関する試料情報を受け取る工程;試料情報に基づいて、複数の参照試料データセットから、関連する参照試料データセットを選択する工程であって、参照試料データセットのそれぞれは、複数のマイクロサテライト領域のヌクレオチド同一性情報及び複数の個体から生成される、工程;目的の試料からの配列データと関連する参照試料データセットとの比較に基づいて、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を分類する工程;及び分類に基づいて、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を表す指示を提供する工程を行わせる、システムが提供される。
【００１５】
別の実施態様において、プロセッサ;及び命令を記憶するメモリを含むシステムであって、命令は、プロセッサによって実行されると、プロセッサに、目的の試料の配列データにアクセスする工程であって、目的の試料は、マッチする正常試料が利用不可能な腫瘍試料由来であり、配列データは、複数のマイクロサテライト領域に関するヌクレオチド同一性情報を含む、工程;目的の試料のマッチする試料情報を受け取る工程;並びにマッチする試料情報が、目的の試料にマッチする正常組織試料の非存在を示す場合、第1のマイクロサテライト分析技術に従って配列データを分析して、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を示す第1の出力を生成する工程;及びマッチする試料情報が、目的の試料にマッチする正常組織試料の存在を示す場合、第2のマイクロサテライト分析技術に従って配列データを分析して、目的の試料のマイクロサテライト不安定性を示す第2の出力を生成する工程を行わせる、システムが提供される。
【００１６】
別の実施態様において、腫瘍試料の腫瘍配列データを獲得するように設計されたシーケンシングデバイスが提供される。デバイスは、記憶された実行可能なアプリケーション命令を含むメモリデバイス;及びメモリデバイスに記憶されたアプリケーション命令を実行するように設計されたプロセッサを含む。アプリケーション命令は、プロセッサに、シーケンシングデバイスから腫瘍配列データを受け取る工程;腫瘍配列データ中の複数のマイクロサテライト領域の分布を同定する工程;腫瘍試料が、マッチする正常試料に関連しないことを決定する工程;参照配列データにアクセスする工程;腫瘍試料の分布の参照試料データセットの参照分布との比較に基づいて、腫瘍試料のマイクロサテライト不安定性のタイプを決定する工程;及び腫瘍試料が高頻度マイクロサテライト不安定性のタイプであるという決定に基づいて、処置選択肢の指示を提供する工程を行わせる命令を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の技術によるマイクロサテライト不安定性の概略図である。
【図２】本発明の技術に従って配列データを獲得するように設計されたシーケンシングデバイスのブロック図である。
【図３】本発明の技術に従って試料のマイクロサテライト不安定性を評価する方法の流れ図である。
【図４】本発明の技術に従ってマッチする又はマッチしない(matched or unmatched)目的の試料におけるマイクロサテライト不安定性を評価するためのワークフローの流れ図である。
【図５Ａ】結腸直腸腫瘍組織及びマッチする正常試料の配列データから抽出されたマイクロサテライト領域にマッピングされた配列リードの例の概略図である。
【図５Ｂ】上のパネルは、高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI-H)試料のマッピングされたリードを示し、下のパネルは、MSI-H試料における腫瘍及び正常試料の両方の反復単位長の分布を示す図である。
【図５Ｃ】上のパネルは、マイクロサテライト安定(MSS)試料のマッピングされたリードを示し、下のパネルは、MSS試料における腫瘍及び正常試料の両方の反復単位長の分布を示す図である。
【図５Ｄ】明細書参照。
【図５Ｅ】明細書参照。
【図６】腫瘍のみの試料(y軸)及び腫瘍/正常の対(x軸)の単一のマイクロサテライト部位の予測精度を示す図である。
【図７Ａ】腫瘍/正常の対に基づくマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図７Ｂ】腫瘍/正常の対のROC曲線である。
【図７Ｃ】腫瘍のみの試料に基づくマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図７Ｄ】腫瘍のみの試料のROC曲線である。
【図７Ｅ】MSS試料と比較して非同義の腫瘍変異負荷(TMB)がより高いMSI-H試料を示すボックスプロットである。
【図８Ａ】腫瘍試料の一部にマッチする58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、様々な組織タイプからの232個の腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットであり、赤色の丸で囲まれた部分は、MSI-PCRに基づきMSSとしての以前の特徴付けによるMSI-Hステータスに関する偽陽性を示す。
【図８Ｂ】58個のマッチする正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、116個の結腸直腸がんのマッチする腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図９】58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、4つの異なる民族学的グループ(アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)のうちの1つに関連する個体由来の試料を含む140個の正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図１０】民族学的な変動性に基づいて参照試料データセットから偏りを除去する方法の流れ図である。
【図１１Ａ】参照試料データセットにおける民族学的な変動性を評価するのに使用される140個の試料における民族性の分布を示す。
【図１１Ｂ】計算されたデルタジェンセン-シャノン距離を使用して参照試料データセット中の相対的に高い民族学的な変動性を有するマイクロサテライト領域を同定する実施例の技術からの結果を示す図である。
【図１２】分析前に参照試料データセットから除外された相対的に高い民族学的な変動性を有する同定されたマイクロサテライト領域を有する58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、4つの異なる民族学的グループ(アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)のうちの1つに関連する個体由来の試料を含む140個の正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図１３】除外後の58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、様々な組織タイプからの232個の腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットであり、赤色の丸は偽陽性の可能性を意味する。
【図１４】相対的に高い民族学的な変動性を有する同定されたマイクロサテライト領域の除外前及び除外後の参照試料データセットとして58個のマッチしない細胞株試料を使用した、4つの異なる民族学的グループ(アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)のうちの1つに関連する正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図１５】マッチしない細胞株試料の参照データセットの民族学的多様性の、正常/結腸直腸がん参照試料データセットとの比較を示す図である。
【図１６Ａ】相対的に高い民族学的な変動性を有する同定されたマイクロサテライト領域の除外後の参照試料データセットとしてマッチしない細胞株試料を使用した、様々な組織タイプからの232個の腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図１６Ｂ】図16Aの結果の感度及び特異度を示す図である。
【図１７】78個の結腸直腸がん試料の元の試行と反復試行の比較を示す図である。
【図１８】様々な試料を用いた参照試料データセットのMSIスコアの結果の相関を示す図である。
【図１９】様々な試料を用いた参照試料データセットのMSIスコアの結果の相関を示す図である。
【図２０】細胞株の異なるタイトレーションレベルに対するMSIスコアを示す図である。
【図２１】4個のMSI-H細胞株を含む46個の細胞株試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【図２２】本開示の実施態様に従ってマイクロサテライト分析技術を使用した、Lovo細胞のタイトレーションしたレベルの検出の限界を示す図である。
【図２３】本開示の実施態様に従ってマイクロサテライト分析技術を使用した、SW48細胞のタイトレーションしたレベルの検出の限界を示す図である。
【図２４】本開示の実施態様に従って改善されたより厳格なマイクロサテライト分析技術を使用した、Lovo細胞のタイトレーションしたレベルの検出の限界を示す図である。
【図２５】本開示の実施態様に従って改善されたより厳格なマイクロサテライト分析技術を使用した、SW48細胞のタイトレーションしたレベルの検出の限界を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
腫瘍試料のマイクロサテライト不安定性を評価することは、可能性がある予後又は処置選択肢に関する情報を患者に提供することを可能にする。しかしながら、臨床条件において、正常組織のマッチングは、目的の試料に対して必ずしも入手可能とは限らない。例えば、臨床試験、病理学のアーカイブ、及び旧世代のバイオバンク由来のヒト材料を用いて分析を行う場合、マッチする正常試料は、過去の研究では入手不可能であることが多い。これらの場合、マッチする正常試料を有さない腫瘍組織からマイクロサテライト不安定性を同定及び/又は評価する必要がある。更に、生物学的試料として同じ個体から採取したマッチする正常試料を使用することは、ある種の問題がある。例えば、試料収集におけるばらつき(試料の品質、選択される組織部位)は、参照試料が正常組織を真に代表していないことを意味する可能性がある。加えて、全ての試験試料が、入手可能なマッチする組織又はシーケンシングにとって十分に高い品質を有するマッチする組織を有するとは限らない。更に依然として、所与の評価のための目的の試料は、様々な民族学的バックグラウンドを有する個体によって提供される可能性がある。このような多様性は、世界中の人々にわたり処置プロトコールの作用を示す研究において望ましいことが多い。
【００１９】
マイクロサテライト不安定性は、典型的には、特定のマイクロサテライトのPCR(MSI-PCR)(例えば、n=5又は10個のマーカーを使用して)、続いてPCRを介したフラグメント長さの分析、及びPCRアンプリコンを分離するためのキャピラリー電気泳動によって検出される。MSI-PCRを用いて、それぞれ個々のマーカーは、どのように腫瘍マーカーがマッチする正常マーカーからシフトするかを比較することによって評価される。すなわち不安定性は、正常試料と腫瘍試料との間の増幅した対立遺伝子の特徴における変化によって検出される。腫瘍試料中の30%より多くのマイクロサテライトが、そのマッチする正常試料と比較してシフトしている場合、その腫瘍試料は、高頻度MSIとして類別される。マイクロサテライトの10〜20%がシフトしている場合、その腫瘍試料は、低頻度MSIとして類別される。マイクロサテライトがマッチする正常試料と比べてシフトしていない場合、その腫瘍試料は、マイクロサテライト安定として類別される。
【００２０】
別の例において、免疫組織化学的分析(IHC)は、ミスマッチ修復欠損の同定を介してマイクロサテライト不安定性を有する試料を同定するのに使用することができる。しかしながら、ミスマッチ修復IHCとマイクロサテライト不安定性は、マイクロサテライト不安定性表現型(POLE)を示す試料中に他の機能喪失型遺伝子が生じるため、必ずしも相関するとは限らない。他の機能喪失型遺伝子に起因するマイクロサテライト不安定性を示す試料は、IHCを使用してミスマッチ修復遺伝子に関してスクリーニングする場合、同定されないと予想される。更に、ミスマッチ修復遺伝子MSH6中の突然変異は、腫瘍中で、より弱いマイクロサテライト不安定性をもたらすか又はマイクロサテライト不安定性をもたらさない傾向がある。このようなMSH6のケースは、マイクロサテライト不安定性試験で見逃される可能性があるが、MSH6突然変異スクリーニングによって検出可能な場合がある。一般的に、IHCは、タンパク質の短縮化又は分解を引き起こす突然変異に関するスクリーニングにおいて信頼できる。しかしながらIHCは、一般的にミスセンス変異の結果生じる突然変異タンパク質と、野生型ポリペプチドとを区別できない。MSI-PCR及び他のマイクロサテライト不安定性の評価技術は、腫瘍DNAをマッチする正常試料と比較することを必要とする。更に、少数の評価されたマーカーが、試験の感度に影響を与える可能性がある。
【００２１】
目的の試料からの配列データを使用するマイクロサテライト不安定性を決定するための技術が本明細書で提供される。この技術は、目的の試料に関するマッチする正常試料が入手不可能であったとしても、仮定のマッチする正常試料として機能する参照試料データセットに対して試料を分析することを含み得る。参照試料データセットは、マッチしない正常コホートからの配列データ(すなわち、目的の試料を生成した個体と異なる個体由来の配列データ)から生成することができる。マッチしない正常コホートは、目的の試料に関する万能なマッチする正常コホートとして機能し得る。配列データは、あらゆる好適な数のマイクロサテライトマーカーに関して評価することができる。開示された技術は、試験試料を得る個体由来のマッチする正常試料の存在に頼ることなく使用できる参照試料データセットを提供する。開示された技術はまた、コホートにおける民族学的バックグラウンドの変動性の結果として、マッチしないコホートの正常試料間で高い変動性を有するマイクロサテライト領域に関してスクリーニングされる参照試料データセットも提供する。この方式で、参照試料データセットは、目的の試料を提供する個体の民族学的バックグラウンドに関係なく、あらゆる目的の試料に対する仮定のマッチする正常試料として役立つ。この方式で、試料中のマイクロサテライト不安定性の同定を介した試料の評価は、他の技術に比べて、例えばマッチする正常なものがない試料等の多種多様な試料にも拡張することができる。更に、万能なマッチする正常なものを使用することによって、分析における腫瘍/正常試料のミスマッチによる使用者のエラーの可能性も低減される。すなわち、万能な正常試料は、多くの様々な腫瘍試料にとって同じ試料であるため、そのマッチする正常試料への腫瘍試料の誤った割り当てが起こる可能性が低減される。
【００２２】
したがって、開示された技術は、マッチする試料を使用することなく、より正確なマイクロサテライト評価を容易にする。万能な又は代表的なマッチしない正常試料は、マッチしない参照生物学的試料のセット又はコホートを使用して生成される。代表的なマッチしない正常試料情報は、個体の腫瘍試料をそれと比較できる正常試料として役立つ可能性があるバーチャルな参照を代表する。代表的なマッチしない正常試料情報は、マッチしない正常試料情報が生成されるコホートにおける民族学的バックグラウンドの変動性の結果として、相対的に低い変動性(例えば、予め定義された閾値より低い)を有するマイクロサテライト領域のセットを代表する。
【００２３】
それを受けて、図1は、修復されていない複製エラーによって引き起こされる異なる対立遺伝子を有する領域として表されたマイクロサテライト不安定性の概略図である。例えば、複製中のポリメラーゼの目減りの結果として、親鎖(一例として、鎖12aとして示される)は、N(n)個の配列を有するマイクロサテライト領域14(式中nは、反復モチーフ16の数である)を有していてもよく、一方で娘鎖は、マイクロサテライト領域において異なる長さの対立遺伝子をもたらすエラーの性質に応じて、例えば鎖12bの場合のようにN(n+1)個の配列、又は例えば鎖12cの場合のようにN(n-1)個の配列を有していてもよい。本明細書で提供されるように、マイクロサテライト不安定性の評価は、目的の試料の対立遺伝子分布と、入手可能な場合、マッチする正常試料の対立遺伝子分布との間に、又は代表的なマッチしない正常試料との間に相違があるかどうかを決定することができる。示した通り、鎖12の分布はマイクロサテライト領域14の変動性に基づいて変動する。
【００２４】
図2は、マイクロサテライト不安定性を評価するのに使用される配列データ(例えば、目的の試料の配列データ、マッチしないコホートの配列データ)を獲得するための、図1と共に使用できるシーケンシングデバイス60の概略図である。シーケンシングデバイス60は、あらゆるシーケンシング技術、例えば、これらの開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許公報第2007/0166705号;同第2006/0188901号;同第2006/0240439号;同第2006/0281109号;同第2005/0100900号;米国特許第7,057,026号;WO05/065814;WO06/064199;WO07/010,251に記載される合成によるシーケンシング(sequencing-by-synthesis)方法を取り入れた技術に従って実施することができる。代替として、ライゲーションによるシーケンシング技術は、シーケンシングデバイス60で使用することができる。このような技術は、オリゴヌクレオチドを取り込み、このようなオリゴヌクレオチドの取り込みを同定するのにDNAリガーゼを使用しており、これは、米国特許第6,969,488号;同第6,172,218号;及び同第6,306,597号に記載されている。これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。一部の実施態様は、標的核酸鎖、又はエキソヌクレアーゼによって標的核酸から除去されたヌクレオチドがナノ細孔を通過することによるナノ細孔シーケンシングを利用することができる。標的核酸又はヌクレオチドがナノ細孔を通過するとき、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって各タイプの塩基を同定することができる(米国特許第7,001,792号;Soni及びMeller、Clin. Chem. 53、1996〜2001(2007);Healy、Nanomed. 2、459〜481(2007);及びCockroftら、J. Am. Chem. Soc. 130、818〜820(2008)、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる)。更に他の実施態様は、伸長生成物にヌクレオチドが取り込まれるときに放出されたプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、Ion Torrent社(Guilford、CT、ThermoFisher社の子会社であるLife Technologies社)から市販されている電気検出器及び関連技術、又はこれらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられるUS2009/0026082A1;US2009/0127589A1;US2010/0137143A1;又はUS2010/0282617A1に記載されるシーケンシング方法及びシステムを使用することができる。特定の実施態様は、DNAポリメラーゼ活性をリアルタイムでモニターすることに関する方法を利用することができる。ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォアと結合したポリメラーゼとγ-ホスフェートで標識されたヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)相互作用を介して、又は例えば、それらの開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられるLeveneら、Science 299、682〜686(2003);Lundquistら、Opt. Lett.33、1026〜1028(2008);Korlachら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA105、1176〜1181(2008)に記載されるようなゼロモード導波管を用いて検出することができる。他の好適な代替技術としては、例えば、蛍光インサイチュシーケンシング(FISSEQ:fluorescent in situ sequencing)、及び大規模並列シグネチャーシーケンシング(MPSS:Massively Parallel Signature Sequencing)が挙げられる。特定の実施態様において、シーケンシングデバイス16は、Illumina(La Jolla, CA)からのHiSeq、MiSeq、又はHiScanSQであってもよい。
【００２５】
図示された実施態様において、シーケンシングデバイス60は、別の試料処理デバイス62及び関連する分析デバイス64を含む。しかしながら、述べたように、これらは、単一のデバイスとして実装してもよい。更に、分析デバイス64は、試料処理デバイス62に対してローカルであってもよいし、又はそれとネットワーク化されていてもよい。図示された実施態様において、生物学的試料は、配列データを生成するために画像化される試料スライド70として、試料処理デバイス62にローディングされてもよい。例えば、生物学的試料と相互作用する試薬は、画像化モジュール72によって生成される励起ビームに応答して、特定の波長で蛍光を発し、それによって画像化のための放射線を返送する。例えば、蛍光成分は、その成分の相補的な分子にハイブリダイズする、又はポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドに取り込まれる蛍光タグを有するヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光タグを有する核酸によって生成することができる。当業者であれば理解していると予想されるように、試料の色素が励起される波長及びそれらが蛍光を発する波長は、具体的な色素の吸収及び放出スペクトルによって決まると予想される。このような返送された放射線は、指向性光学を介して後方に伝搬が可能である。この後方へのビームは、一般的に、画像化モジュール72の検出光学に指向させることができる。
【００２６】
画像化モジュール検出光学は、あらゆる好適な技術に基づいていてもよく、例えば、デバイス中の配置に影響を与える光子に基づきピクセル化された画像データを生成する電荷結合素子(CCD)センサーであり得る。しかしながら、様々な他の検出器のいずれかを使用してもよいことが理解されると予想され、そのような、検出器としては、これらに限定されないが、時間遅延積分(TDI)動作のために設計された検出器アレイ、相補型金属酸化膜半導体(CMOS)検出器、アバランシェフォトダイオード(APD)検出器、ガイガーモード光子計数器、又は他のあらゆる好適な検出器等が挙げられる。TDIモード検出は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,329,860号に記載されたようなラインスキャニングと組み合わせてもよい。他の有用な検出器は、例えば、本明細書において様々な核酸シーケンシング手法の文脈でこれまでに提供された参考文献に記載されている。
【００２７】
画像化モジュール72は、例えばプロセッサ74(例えば、マイクロプロセッサ)を介して、プロセッサによって制御されてもよく、試料を受け取るデバイス18は、I/Oコントロール76、内部バス78、不揮発性メモリ80、RAM82及び他のあらゆるメモリ構造を含んでいてもよく、このようなメモリは、実行可能命令を記憶できるようになっており、更にデバイス18は、図2に関して記載されたものに類似していてもよい他の好適なハードウェア構成要素を含んでいてもよい。更に、関連するコンピューター20はまた、プロセッサ84、I/Oコントロール86、通信モジュール94、並びにRAM88及び不揮発性メモリ90を含むメモリアーキテクチャーを含んでいてもよく、このようなメモリアーキテクチャーは、実行可能命令92を記憶できるようになっている。ハードウェア構成要素は、内部バス94によってリンクされていてもよく、これが更にディスプレイ96にリンクされていてもよい。シーケンシングデバイスがオールインワンデバイスとして実施される実施態様では、特定の冗長なハードウェアエレメントを省略してもよい。
【００２８】
図3は、マイクロサテライト不安定性を評価する方法100の流れ図である。方法100の工程は、示した通り、使用者及び/又は供給者によって行うことができる。例えば、使用者は、シーケンシングデバイスの最終使用者、例えばシーケンシングデバイスの所有者、シーケンシングデバイスの契約者、シーケンシングデバイスの使用者であってもよい。使用者は、1つ又は複数の試料においてマイクロサテライト不安定性を同定することに関心がある使用者であってもよい。供給者は、本明細書で提供される万能なマッチする正常参照配列の供給者であってもよい。更に、特定の実施態様において、使用者及び供給者は、同じ実体であってもよい。すなわち、マイクロサテライトの評価は、万能なマッチする正常参照配列の供給者によって行うことができる。
【００２９】
工程102で、目的の試料を獲得し、工程104で、シーケンシングのための試料の調製を行う。試料の調製は、試料のタイプ(例えば、液体試料、固体試料、FFPE試料、血漿試料)に基づいていてもよい。配列データは、工程106で、本明細書で提供されるシーケンシングデバイス60を使用して獲得してもよい。他の実施態様において、事前に獲得された配列データにアクセスしてもよい。本明細書で提供される生物学的試料の配列データ(すなわち、目的の試料、代表的なマッチしない正常試料、マッチする正常試料)は、生データ、ヌクレオチド同一性を提供する塩基のコールデータ、又は一次若しくは二次分析(配列アライメントマップ、バイナリーアライメントマップ)を経たデータの形態であってもよいことが理解されるものとする。
【００３０】
分析デバイスは、ディスプレイ96を介して、使用者が本明細書で提供されるマイクロサテライト不安定性の評価技術を使用したシーケンシング反応に関する情報を入力しやすくするグラフィカルユーザーインターフェースを提供することができる。例えば、使用者は、シーケンシング試行における各試料の名称又は同定、試料の起源(すなわち、FFPE試料、新しい凍結した試料、細胞株から調製された核酸)、配列データを獲得するのに使用されるシーケンシングパネル(すなわち、シーケンシングプローブのセット)、及び目的の試料の組織タイプに関する入力を提供することができる。また使用者は、マッチする正常試料が入手可能かどうかに関する入力を提供することもできる。
【００３１】
本発明の技術は、工程108で、マッチする正常試料からの配列データがなくても、生物学的試料(例えば、腫瘍試料)におけるマイクロサテライト不安定性の検出又は評価を容易にする。したがって、方法100は、工程110で、正常コホートからの配列データを獲得する。特定の実施態様において、生成及び記憶の後、複数の試料のコホートから生成した万能な又は代表的な正常試料の配列データは、異なる及び/又は後続のタイムポイントで、複数の目的の試料の分析に使用される。使用者は、目的の試料の特徴と最も厳密にアライメントされたコホートに基づいて、記憶されたファイルにアクセスすることができる。それを受けて、複数の異なる正常コホートの配列データセット112を獲得してもよい。異なる正常コホートの配列データセット112は、異なる試料のタイプ(正常FFPE試料、新しい凍結した試料、細胞株から調製された核酸)、シーケンシングパネル、組織タイプ等を代表していてもよい。正常コホートの配列データ112を好適なサイズのコホート(少なくとも10個体、少なくとも20個体、少なくとも50個体)から獲得して、検査された各マイクロサテライト領域につき十分な数の使用に適した配列を提供することもできる。各コホートにおける個体(又は異なる個体を代表する試料)は、正常コホートの配列データ(すなわち、代表的な正常試料の配列データ)を獲得するのに使用できる正常細胞又は組織からの試料を提供することができる。コホートは、目的の試料にマッチしない個体、すなわち異なる個体を代表する。
【００３２】
一実施態様において、代表的なマッチしない正常試料の配列データは、一度生成されたら、特定の試料の調製技術に固定される。すなわち、代表的なマッチしない正常試料の配列データは、データを生成した試料のタイプに関連する。異なる代表的なマッチしない正常試料の配列データセットを、FFPE試料、細胞株、新しい凍結したもの等につき生成してもよい。更に、代表的なマッチしない正常試料の配列データセットを供給者により記憶し、工程116で分析パッケージの一部として使用者に送ってもよい。また分析パッケージは、マイクロサテライト不安定性分析が供給者によって洗練される場合、リモートサーバーからアップデートを受け取ることも可能であり得る。
【００３３】
一実施態様において、正常コホートの配列データは、複数の個体由来の配列データを含んでいてもよい。それぞれ個々の配列は、それぞれ個々のマイクロサテライト領域における特定の品質測定基準(例えばシーケンシングの深さ)に従って評価することができる。例えば、それぞれ個々の配列の配列データは、個々のマイクロサテライト領域において少なくとも予め決定された数の(例えば、20個の)シーケンシングリードがある場合にのみ使用することができる。したがって、それぞれ個々の配列は、利用可能なシーケンシング深さに応じて、マイクロサテライト領域のサブセットで通過することができ、それ以外では通過できないこともある。通過する領域は、更なる分析に使用され、一方で通過できない領域は、マスクされるか又は使用されない。品質評価の後、コホートの個々の配列をプールして、各マイクロサテライト領域で分布を生成することもできる。プールした正常コホートの分布は、仮定のマッチする正常試料を代表する参照試料データセットとして役立つ。
【００３４】
分析は、工程120でマイクロサテライト不安定性スコアを生成するのに使用することができる。マイクロサテライト不安定性スコアは、目的の試料と参照試料データセットとの間の各マイクロサテライト領域における分布間の距離(すなわち、統計距離、ジェンセン-シャノン距離)の比較に基づいていてもよい。一実施態様において、マイクロサテライト不安定性スコアは、閾値を超える距離を有するマイクロサテライト領域の数に基づいており、この場合、距離が大きければ大きい程、参照試料データセットからの相違がより大きいことを示し、マイクロサテライト領域の総数に対して正のスコアを有することに関連する。正のスコアを有する予め決定された数値(例えば、5%)より大きいパーセンテージを有する試料は、マイクロサテライト不安定性を有するとして分類することができ、一方で予め決定された数値より低いパーセンテージを有する試料は、マイクロサテライト安定として分類することができる。更に、マイクロサテライト不安定性は、パーセンテージに基づいて高頻度又は低頻度と指定される場合もある。
【００３５】
マイクロサテライト不安定性の評価は、処置プロトコールを決定するための入力として臨床医に提供することができる。近年、免疫チェックポイント阻害剤は、様々ながんタイプの処置において大いに有望であることが示されてきたが、患者のごく一部しか、このタイプの免疫療法に応答しない。定量的免疫組織化学(IHC)によって測定されたPD-L1タンパク質発現は、一部の免疫チェックポイント阻害剤のためのFDA承認済みのコンパニオン診断又は補助的アッセイである。ペンブロリズマブ(KEYTRUDA、Merck & Co.社)は、高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI-H)又はミスマッチ修復欠損(dMMR)を有する固形腫瘍を有する患者に提供することができる。
【００３６】
図4は、例証的な腫瘍試料150の目的の試料の例証的なワークフローを示す。マッチする正常試料154が入手可能な場合、ワークフローは、腫瘍試料の配列データ158の配列分析156及び正常試料の配列データ162の配列分析160に進む。配列データは、BAMファイル、塩基のコールデータ、画像データ等の形態であってもよい。配列分析は、マッチする正常試料のデータを比較の基礎として使用するマイクロサテライト不安定性分析技術を介していてもよい(ブロック164)。マッチする正常試料が入手可能ではない場合、ワークフローは、適切なマッチしない正常コホートからの参照試料データセットを使用する本明細書で提供されるマイクロサテライト不安定性の分析技術を介した分析に進む(ブロック166)。どちらの技術も、マイクロサテライト不安定性スコア、すなわち腫瘍のみのマイクロサテライト不安定性スコア168又は腫瘍/正常のマイクロサテライト不安定性スコア170のいずれかを生じる。更に、マッチする試料の場合、それでもなお目的の試料をマッチしない分析にフィードして、その結果を、品質目的でマッチする分析と比較してもよい。
【００３７】
具体的な実施態様において、固形腫瘍に関連する170種の遺伝子を網羅するシーケンシングパネルを提供した。パネルは、一塩基変異、インデル、増幅、スプライスバリアント及び融合等の突然変異の変化を捕獲するように設計されていることから、このパネルを、単一のシーケンシング試行で同じFFPE腫瘍試料由来のDNA及びRNAバリアントの両方を標的化するように設計した。103個のマイクロサテライト遺伝子座を評価するパネルの性能を、53個の結腸がん試料(MSI-PCRによって決定された、28個のMSI-H及び25個のMSS)を使用して評価したところ、パネルが、マイクロサテライト不安定性ステータスに関してマッチする腫瘍/正常の対と100%の一致を達成したことが示された。加えて、マイクロサテライト不安定性分析は、MSI-PCRと98%の一致しか達成していないマッチしない腫瘍試料にも使用することができる。更に、MSI-H試料は、この結腸試料のコホートにおいて、MSS試料と比較してより有意に高い腫瘍変異負荷を有していた。まとめると、マイクロサテライト標的化パネルは、FFPE腫瘍試料からマイクロサテライト不安定性ステータスを正確に決定することができる。図5、図6、及び図7A〜図7Eは、実験結果を示す。
【００３８】
各マイクロサテライト遺伝子座につき、マイクロサテライト反復のフランキング配列を固定して、領域にマッピングされたリードによって支持される反復単位の数を決定した。その後、反復単位長分布は、各部位のマイクロサテライト不安定性ステータスを決定する。不安定なマイクロサテライト部位の数を評価した全部位の数で割ることによって、最終的なマイクロサテライト不安定性スコアを計算した。図5Aは、バイナリーアライメントマップファイルから抽出されたマイクロサテライト領域にマッピングされたリードを示す。図5Bにおいて、上のパネルは、高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI-H)試料のマッピングされたリードを示し、下のパネルは、MSI-H試料における腫瘍及び正常試料の両方の反復単位長の分布を示す。図5Cにおいて、上のパネルは、マイクロサテライト安定(MSS)試料のマッピングされたリードを示し、下のパネルは、MSS試料における腫瘍及び正常試料の両方の反復単位長の分布を示す。図6は、シーケンシングパネルの103個の部位のそれぞれに対する単一のマイクロサテライト領域の予測値を示す。単一の部位は、完全なパネルに比べてそれほど正確ではなかった。本明細書で提供されるように、本発明の技術でマイクロサテライト不安定性スコアを生成するのに使用されるマイクロサテライト部位又はマイクロサテライト領域の数は、1個若しくはそれより多く、5個若しくはそれより多く、50個若しくはそれより多く、又は100個若しくはそれより多くであり得る。特定の実施態様において、本発明の技術は、マイクロサテライト不安定性スコアを生成するための分析において、1〜20、5〜20、5〜50、10〜20、10〜50、又は50〜100個のマイクロサテライト部位を分析することができる。
【００３９】
示された通り、目的の試料から参照試料データセットまでのジェンセン-シャノン距離を決定した。参照試料の全ての対になった組合せにつき、参照ジェンセン-シャノン距離d1を以下のように計算した(BL_n、n=1..N):
BL_n1=Pr[X=x]
BL_n2=Pr[X=x]
JS1=0.5×(合計(BL_n1×log(BL_n1/m1))+合計(BL_n1×log(BL_n1/m1)))
m1=0.5×(BL_n1+BL_n2)
d1=sqrt(JS1)。
【００４０】
目的の試料(T)から参照データセットの各試料までの試験ジェンセン-シャノン距離d2を以下のように計算した:
BL_n=Pr[X=x]
T=Pr[X=x]
JS2=0.5×(合計(BL_n×log(BL_n/m2))+合計(T×log(T/m2)))
m2=0.5×(BL1+T)
d2=sqrt(JS2)。
【００４１】
2つのジェンセン-シャノン距離分布間の比較を片側t検定を介して行ったところ、FDR<0.05及びd2-d1>0.1の場合、d1<d2であることが確立された。
【００４２】
図7Aは、腫瘍/正常の対に基づくマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。図7Bは、腫瘍/正常の対のROC曲線である。図7Cは、腫瘍のみの試料に基づくマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。図7Dは、腫瘍のみの試料のROC曲線である。図7Eは、MSS試料と比較して非同義の腫瘍変異負荷(TMB)がより高いMSI-H試料を示すボックスプロットである。
【００４３】
図8Aは、腫瘍試料の一部にマッチする58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、様々な組織タイプからの232個の腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを、以下のMSI-H及びMSS CRC試料のマッチする正常試料から生成した。これらの試料は、マッチする腫瘍の正常な対:n=140と92対を含んでおり、それと共にMSI-PCRの結果を示した:
MSI-H腫瘍:n=35(32個のCRC及び3個のUCEC)
MSS腫瘍:n=57(26個のCRC及び31個のUCEC)
総試験試料(92個の腫瘍+140個の正常=232個の試料)。
【００４４】
試料を、MSI-PCRに基づいてMSI-H(n=35)、MSS(n=54)腫瘍、又は正常(n=140)として特徴付けた。マイクロサテライト不安定性スコアを、本明細書で提供されるようにして決定した。結果を全体的にMSI-PCRの結果とアライメントしたが、赤色の丸で囲まれた部分は、MSIカットオフスコアに基づき、MSI-Hに関して偽陽性を示す。
【００４５】
図8Bは、図8Aの58個のマッチする正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、58個の結腸直腸がんのマッチする腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットであり、安定と同定されたMSIスコアのより厳格なグループ分けを示す。
【００４６】
図9は、140個の正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットであり、これにより、図8Aの58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用して、個体由来の試料が、それらの関連する民族学的グループ(アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)に分けられる。示した通り、マイクロサテライト不安定性スコアは、民族学的グループ間で変動し、これは、参照試料データセットに民族学的な偏りが存在する可能性を示す。
【００４７】
図10は、民族学的な変動性に基づいて参照試料データセットから偏りを除去する方法200の流れ図である。工程202において、参照試料の配列データは、例えば本明細書で提供されるシーケンシングデバイス60を使用して、複数の個体のコホートの参照試料から獲得することができる。複数の個体は、特定の民族学的バックグラウンド(例えば、非限定的な例において、アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)と関連する可能性がある。この関連は、一例において、自己報告に基づいていてもよい。他の実施態様において、事前に獲得された参照試料の配列データにアクセスすることができる。工程204において、参照配列データを分析して、複数の目的のマイクロサテライト領域のそれぞれにおいて分布を生成する。最初の品質管理工程において、リードカバー率が不十分な(例えば、特定のマイクロサテライト領域のリードが20個より少ない)個々の参照試料からの個々のマイクロサテライト領域のデータは、参照試料の配列データから除外することができる(例えば、更なる分析工程で、削除される、マスクされる、又はそれ以外の方法で考察対象外であると示される)。
【００４８】
工程206において、複数の参照生物学的試料につき複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける分布の民族学的グループの変動性(例えば、対立遺伝子分布)が決定される。例えば、民族学的バックグラウンド情報が入手可能な個々の参照試料の配列(例えば、10個の配列、20個の配列、又はそれより多く)のそれぞれにつき、配列データは、分析のためのコホートにおいて代表される民族学的グループのうち1つにグループ分けされる。コホートは、コホート中で全体的に均一に分布していてもよいし又は不均一に分布していてもよい、所望の数の民族学的グループからの試料の有利なミックスを提供するように選択することができることが理解されるものとする。民族学的な変動性は、第1の民族学的グループに関連する試料のグループの配列データの第1の分布と、それに対する第2の民族学的グループに関連する試料のグループの配列データの第2の分布との変動性を含み得る。分布は、配列データが入手可能な(例えば、何らかの品質評価の後に)それぞれ個々のマイクロサテライト領域における2つ又はそれより多くの民族学的グループ間の変動性が評価されるように、領域ごとの分布であってもよい。一実施態様において、十分なカバー率の第1の品質評価の後、条件を満たす試料が少数であることに基づいて、特定の個々のマイクロサテライト領域が、民族学的な変動性評価の条件を満たさない可能性がある。すなわち、本方法は、変動性評価の条件を満たすために、民族学的グループ1つ当たり試料のカットオフ(例えば、十分な品質を有する、又は十分なリードカバー率を有する個々の試料が5又はそれより多くであること)を含んでいてもよい。
【００４９】
工程208において、複数のマイクロサテライト領域の民族学的に偏った及び/又は偏っていないマイクロサテライト領域は、それぞれ個々の民族学的グループに分けられた参照試料のグループにつき、複数のマイクロサテライト領域のそれぞれにおける民族学的変動性に基づいて、同定される。一実施態様において、特定の民族学的グループ内の特定のマイクロサテライト領域ごとのマイクロサテライト領域の配列データ分布の変動性の基準が決定される。次いでこの変動性は、別の民族学的グループの変動性と比較される。次いでこの変動性は、別の民族学的グループの変動性と比較される。民族学的グループ間の変動性において相対的に大きい差を有するマイクロサテライト領域は、その領域にとって固有の民族学的な変動性の指標となり得る。変動性は、あらゆる好適な方法、例えば、範囲、平均、分散及び/若しくは標準偏差によって、又は本明細書で提供されるジェンセン-シャノン距離によって評価することができる。各マイクロサテライト領域にこの分析を行った後、閾値を超える変動性の測定基準を有する領域は、高い民族学的な偏り又は変動性を有するとして同定することができ、一方で閾値未満の変動性の測定基準を有する領域は、低い又は許容できる民族学的な偏り又は変動性を有するとして同定することができる。工程210において、参照試料データセットは、複数の参照生物学的試料の参照配列データから、民族学的に偏ったマイクロサテライト領域を除去/除外することによって、参照配列データから生成される。方法200の結果として、例えば、シーケンシングされたマイクロサテライト領域の部分が民族学的な偏りの同定のために更なる分析から排除された参照試料データセットが生成される。残りのマイクロサテライト領域は、民族学的バックグラウンドに関する偏りの影響を受けにくい。したがって、参照試料データセットは、よりロバストで、偏りと無関係になり、より正確に多様な目的の試料に対する仮定のマッチする正常試料として役立つ。
【００５０】
図11Aは、参照試料データセットにおける民族学的な変動性を評価するのに使用される140個の試料における民族性の分布を示す。図11Bは、計算されたデルタジェンセン-シャノン距離を使用して参照試料データセット中の相対的に高い民族学的な変動性を有するマイクロサテライト領域を同定する実施例の技術からの結果を示す。デルタジェンセン-シャノン距離を以下のようにして決定した:
ΔJSD=平均(JSDbetween)-平均(JSDwithin)
各マイクロサテライト領域のデルタジェンセン-シャノン距離は、2つのグループ間の平均ジェンセン-シャノン距離及びグループ内の平均ジェンセン-シャノン距離の基準である。3又はそれより多くのグループ間の対としての比較を行ってもよい。この技術は、175個の部位(マイクロサテライト領域)を、各民族性グループの最小5個の試料につき少なくとも20個の支持リードで評価した。この分析に基づいて、3つの民族性グループ間の対としての比較に基づいて≧0.1のΔJSDを有する44個の部位を、高い民族学的な変動性を有するとして同定した。これらの部位を、参照試料データセットを生成するのに使用された配列データから除外した(例えば、消去又はマスクした)。
【００５１】
図12は、分析前に参照試料データセットから除外された相対的に高い民族学的な変動性を有する同定されたマイクロサテライト領域を有する58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、4つの異なる民族学的グループ(アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)のうちの1つに関連する個体由来の試料を含む140個の正常試料マイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。同じ分析を示すが同定されたマイクロサテライト領域からの除外を行わなかった図9と比較して、MSIスコアは、特定の民族学的グループについてより圧縮されており、これは、相対的に高い民族学的な変動性の領域からの除外の作用を示す。
【００５２】
図13は、除外後の58個の正常試料/結腸直腸がん参照試料データセットを使用した、様々な組織タイプからの232個の腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットであり、赤色の丸は偽陽性の可能性を意味する。MSI-H試料は、除外後、全体的に損なわれていないMSIスコアを有し、一方で正常な/MSS試料は、より低いMSIスコアを有する。図14は、相対的に高い民族学的な変動性を有する同定されたマイクロサテライト領域の除外前及び除外後の参照試料データセットとして58個のマッチしない細胞株試料を使用した、4つの異なる民族学的グループ(アフリカ人、南米人、東アジア人、及び欧州人)のうちの1つに関連する正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。58個のマッチしない細胞株には、10個のIHW及び48個のコーリエル株が含まれ、以下の民族学的グループ分布を有していた:
P_AFR(n=22)(アフリカ人)
P_AMR(n=25)(南米人)
P_EUR(n=8)(欧州人)
P_EAS(n=3)(東アジア人)。
【００５３】
図15は、マッチしない細胞株試料の参照データセットの民族学的多様性の、正常/結腸直腸がん参照試料データセットとの比較である。細胞株の参照試料は、FFPE試料と遺伝子型を共有していないが、CRC腫瘍試料の一部とマッチしていた。細胞株の参照試料データセットは、真のマッチしない試料を表す。更に、細胞株の参照試料データセットは、全般的に、元のベースライン又はFFPE試料と異なる民族性の組成を表す。
【００５４】
図16Aは、相対的に高い民族学的な変動性を有する同定されたマイクロサテライト領域の除外後の参照試料データセットとしてマッチしない細胞株試料を使用した、様々な組織タイプからの232個の腫瘍/正常試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。図16Bは、図16Aの結果の感度及び特異度を示す。
【００５５】
図17は、78個の結腸直腸がん試料の元の試行と反復試行の比較である。
【００５６】
図18〜図19は、様々な試料を用いた参照試料データセットのMSIスコアの結果の相関を示す。ランダムな10、20、30、40、50個のベースライン試料(現状の232個の試験セットとオーバーラップしない71個の試料(58個の細胞株+13個のFFPE正常)からランダムに選択された)を用いて、性能を試験した。
【００５７】
図20は、細胞株の異なるタイトレーションレベルに対するMSIスコアを示し、図21は、4個のMSI-H細胞株を含む46個の細胞株試料のマイクロサテライト不安定性スコアのボックスプロットである。
【００５８】
結果は、44個の民族性に特異的な/偏った部位をブロックすることで性能が改善されたことを示した。更に、参照試料データセットは、試料のタイプ/民族性に制約される必要がない。性能は、参照試料データセット中、n≧30の試料でロバストであった。
【００５９】
利用可能なマイクロサテライト部位のサブセットを利用可能な部位から選択して、より高感度の検出限界を開発することができる。MSI部位選択における厳格さは、検出の限界を改善する可能性がある。図22は、マイクロサテライト安定性を有する細胞株に対してタイトレーションした様々なLovo細胞のタイトレーションレベルに対する細胞株タイトレーション及び関連するMSIスコアの検出限界を示す。図23は、マイクロサテライト安定性を有する細胞株に対してタイトレーションした様々なSW48細胞のタイトレーションレベルに対する細胞株タイトレーション及び関連するMSIスコアの検出限界を示す。安定な細胞における細胞株タイトレーションのモデルは、腫瘍試料中の他の細胞型と混合された腫瘍細胞の存在をモデル化している。図示されたタイトレーションとMSI検出の損失との相関は、100+マイクロサテライト部位の分布の分析に基づいており、試料のシーケンシング深さによって制限される。図示された検出限界における2.5%又は5%のタイトレーションは固体試料にとって許容できるものであるが、血漿(例えば、血漿中のDNA死細胞片)におけるマイクロサテライト不安定性の検出は、精度に関してより低い検出限界を含む場合がある。
【００６０】
しかしながら、特定の実施態様において、入手可能なマイクロサテライト部位の品質分析は、改善された検出限界を達成するために、より高い品質又はより低い変動性を有する部位のサブセットの選択を容易にする可能性がある。考えられる様々なDNA抽出方法、ベースライン、シーケンシング深さを用いる場合、マイクロサテライト部位の品質は、試料のタイプ(例えば、固体又はFPEに対して液体)に基づいて変化する場合がある。図24は、マイクロサテライト安定性を有する細胞株に対してタイトレーションしたLovo細胞の改善された検出限界を示す。図25は、マイクロサテライト安定性を有する細胞株に対してタイトレーションしたSW48細胞の改善された検出限界を示す。図24〜図25は、130個の入手可能な部位から、図示された実施例16におけるより高い品質のマイクロサテライト部位のサブセットのみを使用した分析を表す。参照データセットの部位を、参照配列データ中で評価されたそれぞれ個々の部位における最も低いデルタ分布として選択した。したがって、特定の実施態様において、例えば、デルタ分布のランク付けを使用し、最も低い分布を有する部位を選択することで、MSI部位をより高い品質の部位のサブセットに限定することによって、検出限界が5倍改善される。
【００６１】
更に、MSI部位のサブセットの選択は、1つ又は複数の使用者の入力及び/又は試料のタイプに基づいていてもよい。固体試料等の試料の場合、全ての又はほとんどの入手可能なMSI部位を使用して達成される検出限界は、十分であり得る。したがって、固体試料の指示は、試料が血漿又は液体試料であるという使用者の入力の場合より大きい入手可能なMSI部位のサブセットを使用して、本明細書で提供される分析を開始させることができる。更に、使用者は、シーケンシング又は分析デバイスに厳格さ又は検出限界の設定の入力が可能な場合がある。
【００６２】
開示された実施態様の技術的な作用としては、マッチしない目的の試料に関して改善されたより正確なマイクロサテライト不安定性の評価が挙げられる。追加の技術的な作用としては、腫瘍のみの試料の分析のための仮定のマッチする正常試料として役立つ参照試料データセット生成の改善が挙げられる。マッチしない目的の試料のマイクロサテライト不安定性スコアを決定するのに使用される改善された参照試料データセットは、高い民族間の変動性を有する部位が(例えば、マスキング又は消去を介して)排除される。この方式において、参照試料データセットは、マッチしない目的の試料に関連する個体の民族学的バックグラウンドから独立して、仮定のマッチする試料として使用することができ、マイクロサテライト不安定性の評価のためのよりロバストな技術が提供される。
【００６３】
本開示の特定の特徴のみを本明細書で例示し説明したが、当業者であれば多くの改変及び変更を思いつくと予想される。それゆえに、添付の特許請求の範囲は、このような全ての改変及び変更を本開示の真の本質の範囲内にあるものとして網羅することが意図されていることが理解されるものとする。
【符号の説明】
【００６４】
12a、12b、12c  鎖
14  マイクロサテライト領域
60  シーケンシングデバイス
62  試料処理デバイス
64  分析デバイス
70  試料スライド
72  画像化モジュール
74  プロセッサ
76  I/Oコントロール
78  内部バス
80  不揮発性メモリ
82  RAM
84  プロセッサ
86  I/Oコントロール
88  RAM
90  不揮発性メモリ
92  実行可能命令
94  内部バス、通信モジュール
96  ディスプレイ
100  マイクロサテライト不安定性を評価する方法
102、104、106、108、110、116、120  工程
112  配列データセット
150  腫瘍試料
154  正常試料
156  配列分析
158  腫瘍試料の配列データ
160  配列分析
162  正常試料の配列データ
164、166  マイクロサテライト不安定性分析技術
168  腫瘍のみのマイクロサテライト不安定性スコア
170  腫瘍/正常のマイクロサテライト不安定性スコア
200  方法
202、204、206、208、210  工程
【図１】
0006955035.tif 000002
【図２】
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【図３】
0006955035.tif 000004
【図４】
0006955035.tif 000005
【図５Ａ】
0006955035.tif 000006
【図５Ｂ】
0006955035.tif 000007
【図５Ｃ】
0006955035.tif 000008
【図５Ｄ】
0006955035.tif 000009
【図５Ｅ】
0006955035.tif 000010
【図６】
0006955035.tif 000011
【図７Ａ】
0006955035.tif 000012
【図７Ｂ】
0006955035.tif 000013
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0006955035.tif 000015
【図７Ｅ】
0006955035.tif 000016
【図８Ａ】
0006955035.tif 000017
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
0006955035.tif 000020
【図１１Ａ】
0006955035.tif 000021
【図１１Ｂ】
0006955035.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006955035.tif 000026
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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