(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチド担体が、以下の（１）、（２）、（３）のポリペプチド担体から選択される、上記核酸分子：
（１）ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体：これは、以下の点（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）を含む違いによって、カグラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質）と相違する；
（１ａ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている点、
（１ｂ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基、及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基が、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープで置換されている点、及び
（１ｃ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端におけるＸ個のアミノ酸残基が除去され又は検出されず、ここでＸは１以上４０以下の整数である点；
（２）ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体：これは、以下の点（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）を含む違いによって、テントコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質）と相違する；
（２ａ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている点、
（２ｂ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基、位置５４〜７３のアミノ酸残基、及び／又は位置１２４〜１４４のアミノ酸残基が、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープで置換されている点；及び
（２ｃ）ＴＢＨＢｃＡｇのＣ末端におけるＸ個のアミノ酸残基が除去され又は検出されず、ここでＸは１以上３５以下の整数である点；並びに
（３）ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体：これは、以下の点（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）を含む違いによって、キクガシラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質）と相違する；
（３ａ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている点、
（３ｂ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基、及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基が、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープで置換されている点、及び
（３ｃ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端におけるＸ個のアミノ酸残基が除去され又は検出されず、ここでＸは１以上４０以下の整数である点；
ここで前記核酸分子が、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するために用いられ、前記標的ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、除去される前記１個若しくは複数個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、又は前記ペプチドリンカーをコードする前記ヌクレオチド配列内に、又はその末端に挿入される。
【請求項２】
前記ポリペプチド担体が、以下の（１）、（２）又は（３）である、請求項１に記載の核酸分子：
（１）前記ポリペプチド担体が、前記ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、前記核酸分子が以下の（（ｉ）〜（ｘｉ）の一つ又は複数の特徴を有する：
（ｉ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｉｉ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３、位置７８〜８２、位置７８〜８１、又は位置７８〜８０のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている；
（ｉｉｉ）ペプチドリンカーは可動性ペプチドリンカーである；
（ｉｖ）ヒトＴ細胞エピトープがＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープである：
（ｖ）ヒトＴ細胞エピトープが、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープから選択される；
（ｖｉ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８７、８８及び８９に示されているヒトＴ細胞エピトープで置換されている；
（ｖｉｉ）制限酵素切断部位が、除去されるＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３の１個又は複数個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に導入されている；
（ｖｉｉｉ）制限酵素切断部位が、前記ペプチドリンカーをコードする前記ヌクレオチド配列内に、及び／又はその末端の一方若しくは両方に導入されている；
（ｉｘ）前記ポリペプチド担体が、配列番号７５又は７８に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｘ）前記核酸分子が配列番号８１又は８４に示される核酸配列を含む：並びに
（ｘｉ）前記ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている：或いは
（２）  前記ポリペプチド担体が、前記ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、前記核酸分子が以下の（ｉ）〜（ｘｉ）の一つ又は複数の特徴を有する：
（ｉ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｉｉ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４、位置８０〜８３、又は位置８０〜８２のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている；
（ｉｉｉ）ペプチドリンカーは可動性ペプチドリンカーである；
（ｉｖ）ヒトＴ細胞エピトープがＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープである：
（ｖ）ヒトＴ細胞エピトープが、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープから選択される；
（ｖｉ）前記ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５４〜７３及び１２４〜１４４の前記アミノ酸残基は、それぞれ配列番号８７、８８及び８９に示されているヒトＴ細胞エピトープで置換されている：
（Ｖｉｉ）制限酵素切断部位が、除去されるＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４の１個又は複数個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に導入されている；
（ｖｉｉｉ）制限酵素切断部位が、前記ペプチドリンカーをコードする前記ヌクレオチド配列内に、及び／又はその末端の一方若しくは両方に導入されている；
（ｉｘ）前記ポリペプチド担体が、配列番号７６又は７９に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｘ）前記核酸分子が配列番号８２又は８５に示される核酸配列を含む：並びに
（ｘｉ）前記ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個、２個、３個、４個、又は５個のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている：或いは、
（３）前記ポリペプチド担体が、前記ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、前記核酸分子が以下の（ｉ）〜（ｘｉ）の一つ又は複数の特徴を有する：
（ｉ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる：
（ｉｉ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３、位置７８〜８２、位置７８〜８１、又は位置７８〜８０のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている；
（ｉｉｉ）ペプチドリンカーは可動性ペプチドリンカーである；
（ｉｖ）ヒトＴ細胞エピトープがＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープである：
（ｖ）ヒトＴ細胞エピトープが、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープから選択される；
（ｖｉ）前記ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８７、８８及び８９に示されているヒトＴ細胞エピトープで置換されている；
（ｖｉｉ）制限酵素切断部位が、除去されるＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３の１個又は複数個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に導入されている；
（ｖｉｉｉ）制限酵素切断部位が、前記ペプチドリンカーをコードする前記ヌクレオチド配列内に、及び／又はその末端の一方若しくは両方に導入されている；
（ｉｘ）前記ポリペプチド担体が、配列番号７７又は８０に示されるアミノ酸配列からなる；
（ｘ）前記核酸分子が、配列番号８３又は８６に示されるヌクレオチド配列を含む；並びに
（ｘｉ）前記ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基が除去され、若しくはペプチドリンカーで置換されている。
【請求項３】
前記核酸分子が、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記標的ポリペプチドが、前記ポリペプチド担体に対して異種性であり、且つ前記標的ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、除去される前記１個若しくは複数個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いは前記ペプチドリンカーをコードする前記ヌクレオチド配列内に、又はその末端に挿入される、
請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
標的ポリペプチドがエピトープペプチドである、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記エピトープペプチドが、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の一つの特徴を有する、請求項４に記載の核酸分子：
（ｉ）前記エピトープペプチドが、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ、又はＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質のエピトープ又はヒトＰＤ−Ｌ１のエピトープを含み、
（ｉｉ）前記エピトープペプチドが、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、並びに
（ｉｉｉ）前記エピトープペプチドが、配列番号２０〜２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列からなる。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
（１）組換えタンパク質をコードする核酸分子を得るように、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、請求項１又は２に記載の核酸分子へ挿入するステップであって、前記標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記除去される１個若しくは複数のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いは前記ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端に挿入される、上記ステップ；及び
（２）ステップ（１）における前記組換えタンパク質をコードする核酸分子を発現させて、前記組換えタンパク質を産生するステップ
を含む、標的ポリペプチドを提示するための方法。
【請求項９】
前記標的ポリペプチドが、エピトープペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記エピトープペプチドが、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のうちの一つの特徴を有する、請求項９に記載の方法：
（ｉ）エピトープペプチドが、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ、又はＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質のエピトープ、又はヒトＰＤ−Ｌ１のエピトープを含み、
（ｉｉ）前記エピトープペプチドが、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸、又はＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、及び
（ｉｉｉ）前記エピトープポリペプチドが、配列番号２０〜２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列からなる。
【請求項１１】
ポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む、組換えタンパク質であって、前記ポリペプチド担体が、請求項１又は２に定義されている通りであり、かつ前記標的ポリペプチドが、除去される前記１個若しくは複数個のアミノ酸残基の位置に挿入され、或いは前記ペプチドリンカー内に、又はその末端に挿入される、上記組換えタンパク質。
【請求項１２】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の一つ又は複数の特徴を有する、請求項１１に記載の組換えタンパク質：
（ｉ）前記ポリペプチド担体が、配列番号７５〜８０から選択されるアミノ酸配列からなり；
（ｉｉ）前記標的ポリペプチドが、エピトープペプチドであり、；及び
（ｉｉｉ）前記組換えタンパク質が、配列番号９０〜９６から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【請求項１３】
前記エピトープペプチドが、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質のエピトープ、若しくはヒトＰＤ−Ｌ１のエピトープを含み、又は、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸、ＨＩＶＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸、若しくはヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み；又は、配列番号２０〜２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含み、又はそれからなる、ウイルス様粒子。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、又は請求項１４に記載のウイルス様粒子、及び１つ又は複数の薬学的に許容される媒体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物がワクチンであり、及び／又は前記薬学的に許容される媒体又は賦形剤がアジュバントである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記標的ポリペプチドが、ＨＢＶ由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである、必要としている患者における、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患の予防又は処置における使用のための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、或いは請求項１４に記載のウイルス様粒子、或いは請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
以下の（ｉ）〜（ｖ）の一つ又は複数を特徴として有する、請求項１７に記載の使用のための組換えタンパク質、又はウイルス様粒子又は医薬組成物：
（ｉ）ＨＢＶ感染に関連した疾患がＢ型肝炎であり；
（ｉｉ）前記エピトープペプチドが、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープを含み；
（ｉｉｉ）前記エピトープペプチドが、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸を含み、
（ｉｖ）前記標的ポリペプチドが、配列番号２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列からなり；及び
（ｖ）前記組換えタンパク質が、配列番号９０〜９６から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【請求項１９】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載のポリヌクレオチド又は請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を調製するための方法であって、前記組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記組換えタンパク質を発現させるのに適した条件下で培養する工程、及び前記組換えタンパク質を回収する工程を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変ワクチン、分子ウイルス学、及び免疫学の分野に関する。加えて、本発明は、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置の分野に関する。特に、本発明は、ポリペプチド担体（ペプチド担体）をコードするヌクレオチド配列を含み、且つ標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入のために用いられる核酸分子に関する。特に、本発明の核酸分子が、それに挿入された標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し、且つ組換えタンパク質として発現した後、ポリペプチド担体が、標的ポリペプチド（例えば、標的抗原、又は抗原における標的エピトープ）を提示することができ、及び／又は組換えタンパク質が、ウイルス様粒子を形成して、標的ポリペプチドを提示することができる。加えて、本発明はさらに、ポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質に関する。さらに、本発明はさらに、核酸分子及び組換えタンパク質の使用に関する。加えて、本発明は具体的には、本発明のポリペプチド担体及びＨＢＶ由来のエピトープを含む組換えタンパク質を含む、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を予防し、緩和し、又は処置するのに有用なワクチン又は医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、感染性疾患と闘うための効果的な手段である。適用可能な人に応じて、ワクチンは予防ワクチン及び治療ワクチンに分けることができる。予防ワクチンは、主に、ウイルス感染を予防するために用いられ、それには、弱毒ワクチン、不活性化ワクチン、及び遺伝子改変ワクチンが含まれ、それらは、主に、生物体において中和抗体を誘導することにより、ウイルス感染から生物体を保護する。治療ワクチンは、主として、持続性ウイルス感染及び腫瘍などの疾患を処置するために用いられる。これらの疾患において、患者は、一般的に、標的抗原に免疫寛容であり、したがって、研究者は、生物体において標的抗原に対する効果的な免疫応答の発生を誘導するためにいくつかの形のワクチンを試みている。治療ワクチンには、主に、核酸ワクチン、ウイルスベクターワクチン、遺伝子改変ワクチンなどが含まれる。それらの中では、遺伝子改変ワクチンが、著しい利点を有する。
【０００３】
市販されている遺伝子改変ワクチンには、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチン、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン、及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ワクチンが含まれ、それらの全ては、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形をとる。ウイルス様粒子は、特定のウイルスの１つ又は複数の構造タンパク質により形成される中空粒子を指し、それは、ウイルス核酸を含まず、自己複製することができないが、形態及び構造に関して真のビリオンと同じか、又は類似している。ウイルス様粒子は、以下の利点、すなわち、強い免疫原性、高い安全性、容易には不活性化されないこと、及び外因性ペプチド断片を提示して、生物体においてその外因性ペプチド断片に対する特異的免疫応答を誘導し得ることを有し、それゆえに、ワクチンの分野において重要な利用価値を有する。
【０００４】
現在、世界中で、約２０億人の人がＨＢＶに感染しており、それらのうちの約３億５千万人が、慢性ＨＢＶ感染を有し、これらの感染した人が、ＨＢＶ感染に関連した肝臓疾患で最終的に死亡するリスクは、１５％〜２５％に達し得る。世界中で毎年、１００万人を超える人が、Ｂ型肝炎により引き起こされる末期肝臓疾患で死亡している。中国は、ＨＢＶ感染に激しく冒されている地域であり、現在、Ｂ型肝炎を有する約９３００万の人がいる。ここ数年、症例報告システムの継続的改善で、Ｂ型肝炎関連疾患の発生率及び死亡率は、減少するどころか、増加している。
【０００５】
現在、慢性ＨＢＶ感染を処置するための薬剤は、主に、２つのクラス、すなわち、インターフェロン及びヌクレオシド／ヌクレオチド類似体（ＮＡ）に分けることができる。慢性ＨＢＶ感染を処置することの最終目標は、重度の肝炎（肝不全）、肝硬変、及び肝臓癌などの末期肝臓疾患の発生を防止することであり、最善の臨床的エンドポイントは、患者が、Ｂ型肝炎表面抗原の血清学的陰性転換又は血清学的転換に達する、すなわち、ＨＢＶを完全に排除することを可能にすることである。しかしながら、その目標に達することができる既存の薬剤は非常に限られた数しかない。したがって、慢性ＨＢＶ感染を有する患者について、ウイルスをより効果的に排除することができ、特に、ＨＢｓＡｇを効果的に排除することができ、又はＨＢｓＡｇレベルを大いに減少させることができる新規の独創的な治療薬及び方法を開発することが緊急且つ必要であり、治療ワクチンを開発することは可能性のある方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願の発明者らは、３つのコウモリ由来のＢ型肝炎ウイルスコア抗原（すなわち、カグラコウモリ（ｒｏｕｎｄｌｅａｆ  ｂａｔ）ＨＢＶ（ＲＢＨＢＶ）コア抗原（ＲＢＨＢｃＡｇ）；テントコウモリ（ｔｅｎｔ−ｍａｋｉｎｇ  ｂａｔ）ＨＢＶ（ＴＢＨＢＶ）コア抗原（ＴＢＨＢｃＡｇ）；及びキクガシラコウモリ（ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ  ｂａｔ）ＨＢＶ（ＨＢＨＢＶ）コア抗原（ＨＢＨＢｃＡｇ））に基づいて、標的ポリペプチドを提示するための新規なポリペプチド担体（ペプチド担体）の類を開発した。したがって、本発明は、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、それに挿入された標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有することができ、ポリペプチド担体及び標的ポリペプチド（例えば、標的抗原、又は抗原における標的エピトープ）を含む組換えタンパク質として発現することができる。さらに、産生された組換えタンパク質は、ＶＬＰを効果的に形成することができ、ＶＬＰの表面上にそれに挿入された標的ポリペプチドを提示することができ、その結果、標的ポリペプチドが生物体における免疫系により効果的に認識され、それにより、生物体において、標的ポリペプチドに対する特異的免疫応答の発生を誘導することができる。したがって、本発明のポリペプチド担体は、標的ポリペプチド、例えば、標的抗原由来のペプチド断片（例えば、エピトープ）を提示するためのワクチンのための担体として用いることができ、本発明のポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質は、生物体において標的ポリペプチドに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチンとして用いることができる。
【０００７】
さらに、本出願の発明者らはまた、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端が、リシン豊富な領域であり、ＶＬＰのアセンブリーに必要ではないことを見出した。したがって、本発明のポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端を含まなくてもよい。例えば、本発明のＲＢＨＢｃＡｇ担体は、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１４５〜１８９のアミノ酸が部分的に、又は完全に除去され得（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１５０〜１８９のアミノ酸が除去され得る）、本発明のＴＢＨＢｃＡｇ担体は、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１４９〜１８８のアミノ酸が部分的に、又は完全に除去され得（例えば、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１５４〜１８８のアミノ酸が除去され得る）、本発明のＨＢＨＢｃＡｇ担体は、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１４５〜１８９のアミノ酸が部分的に、又は完全に除去され得る（例えば、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１５０〜１８９のアミノ酸が除去され得る）。
【０００８】
さらに、本出願の発明者らはまた、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列の一部が、ＶＬＰのアセンブリーに影響を与えることなく、ヒトＴ細胞エピトープによって置換され得ることも見出した。したがって、本発明のポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質に対する人体の免疫応答を増強するために、本出願の発明者らは、ポリペプチド担体のアミノ酸配列の一部をヒトＴ細胞エピトープで置換し、こうして最適化されたポリペプチド担体（すなわち、ヒトＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体）を得ることによって、本発明のポリペプチド担体をさらに改変した。例えば、本出願の発明者らは、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１８〜２７、５０〜６９、及び／又は１２０〜１４０のアミノ酸残基が、ＶＬＰのアセンブリーに影響を与えることなく、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性エピトープ）によって置換され得ること見出した。ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質は類似の特性を有する。したがって、ポリペプチド担体ＲＢＨＢｃＡｇ、ＴＢＨＢｃＡｇ及びＨＢＨＢｃＡｇを対応させて改変して、ヒトＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ及びＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔを得ることができる。
【０００９】
加えて、本出願の発明者らはまた、驚くべきことに、本発明のポリペプチド担体が、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の抗原エピトープ（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ）を提示するのに特に適しており、既存のＢ型肝炎ワクチン（例えば、同じエピトープを含み、且つポリペプチド担体としてヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇを用いることにより構築されたワクチン）の効力より有意に高い効力で、対象においてＨＢｓＡｇを排除するための非常に強く且つ特異的な免疫応答を誘導し得ることを見出した。したがって、本発明はさらに、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の抗原エピトープを提示するのに特に適したポリペプチド担体を提供する。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列又はそのバリアントを含む核酸分子であって、前記バリアントが、ヌクレオチド配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の同一性を有し、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力があり、前記ポリペプチド担体が以下から選択される、核酸分子を提供する。
（１）ＲＢＨＢｃＡｇ担体：これは、以下の点（ａ）、（ｂ）を含む違いによって、カグラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質；例えば、それのアミノ酸配列は配列番号１に示される）とは相違する。すなわち、（ａ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基；例えば、位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、又は位置７８〜８０のアミノ酸残基）が除去され、若しくはリンカー（例えば、可動性リンカー；例えば、配列番号４３に示されたリンカー）で置換されている点、及び（ｂ）任意に、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基）が除去されている点である。
（２）ＴＢＨＢｃＡｇ担体：これは、以下の点（ａ）、（ｂ）を含む違いによって、テントコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質；例えば、それのアミノ酸配列は配列番号２に示される）とは相違する。すなわち、（ａ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸残基；例えば、位置８０〜８４のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、又は位置８０〜８２のアミノ酸残基）が除去され、若しくはリンカー（例えば、可動性リンカー；例えば、配列番号４３に示されたリンカー）で置換されている点、及び（ｂ）任意に、ＴＢＨＢｃＡｇのＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、又は３０〜３５個のアミノ酸残基）が除去されている点である。
（３）ＨＢＨＢｃＡｇ担体：これは、以下の点（ａ）、（ｂ）を含む違いによって、キクガシラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質；例えば、それのアミノ酸配列は配列番号３に示される）とは相違する。すなわち、（ａ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基；例えば、位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、又は位置７８〜８０のアミノ酸残基）が除去され、若しくはリンカー（例えば、可動性リンカー；例えば、配列番号４３に示されたリンカー）で置換されている点、及び（ｂ）任意に、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基）が除去されている点である。
【００１１】
ＲＢＨＢｃＡｇ担体
好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質は、野生型ＲＢＨＢｃＡｇである。好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。
好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇ担体とＲＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点が含まれる。すなわち、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカーで置換されている点である。例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、位置７８〜８０のアミノ酸残基、位置７８〜７９のアミノ酸残基、位置７９〜８３のアミノ酸残基、位置７９〜８２のアミノ酸残基、位置７９〜８１のアミノ酸残基、位置７９〜８０のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、位置８０〜８２のアミノ酸残基、位置８０〜８１のアミノ酸残基、位置８１〜８３のアミノ酸残基、位置８１〜８２のアミノ酸残基、位置８２〜８３のアミノ酸残基、位置７８のアミノ酸残基、位置７９のアミノ酸残基、位置８０のアミノ酸残基、位置８１のアミノ酸残基、位置８２のアミノ酸残基、又は位置８３のアミノ酸残基が除去され得るか、又はリンカーで置換され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、可動性リンカーである。そのような可動性リンカーは、当業者に周知であり、例えば、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＳＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）である。
【００１２】
好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇ担体とＲＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点（１）、（２）が含まれる。すなわち、（１）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか、又は上記で定義されているようなリンカーで置換されている点；及び（２）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基が除去されている点である。好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基が除去されている。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、又は４０個のアミノ酸残基が除去されている。
【００１３】
ＴＢＨＢｃＡｇ担体
好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質は野生型ＴＢＨＢｃＡｇである。好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇ担体とＴＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点が含まれる。すなわち、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個又は複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、又は５個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカーで置換されている点である。例えば、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、位置８０〜８２のアミノ酸残基、位置８０〜８１のアミノ酸残基、位置８１〜８４のアミノ酸残基、位置８１〜８３のアミノ酸残基、位置８１〜８２のアミノ酸残基、位置８２〜８４のアミノ酸残基、位置８２〜８３のアミノ酸残基、位置８３〜８４のアミノ酸残基、位置８０のアミノ酸残基、位置８１のアミノ酸残基、位置８２のアミノ酸残基、位置８３のアミノ酸残基、又は位置８４のアミノ酸残基が除去され得るか、又はリンカーで置換され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、可動性リンカーである。そのような可動性リンカーは、当業者に周知であり、例えば、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＳＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）である。
【００１４】
好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇ担体とＴＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点（１）、（２）が含まれる。すなわち、（１）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個又は複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、又は５個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか、又は上記で定義されているようなリンカーで置換されている点；及び（２）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基が除去されている点である。好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、又は３０〜３５個のアミノ酸残基が除去されている。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、又は３５個のアミノ酸残基が除去されている。
【００１５】
ＨＢＨＢｃＡｇ担体
好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質は、野生型ＨＢＨＢｃＡｇである。好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、配列番号３に示されている。
好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇ担体とＨＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点が含まれる。すなわち、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカーで置換されている点である。例えば、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、位置７８〜８０のアミノ酸残基、位置７８〜７９のアミノ酸残基、位置７９〜８３のアミノ酸残基、位置７９〜８２のアミノ酸残基、位置７９〜８１のアミノ酸残基、位置７９〜８０のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、位置８０〜８２のアミノ酸残基、位置８０〜８１のアミノ酸残基、位置８１〜８３のアミノ酸残基、位置８１〜８２のアミノ酸残基、位置８２〜８３のアミノ酸残基、位置７８のアミノ酸残基、位置７９のアミノ酸残基、位置８０のアミノ酸残基、位置８１のアミノ酸残基、位置８２のアミノ酸残基、又は位置８３のアミノ酸残基が除去され得るか、又はリンカーで置換され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、可動性リンカーである。そのような可動性リンカーは、当業者に周知であり、例えば、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＳＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）である。
【００１６】
好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇ担体とＨＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点（１）、（２）が含まれる。すなわち、（１）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか、又は上記で定義されているようなリンカーで置換されている点；及び（２）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基が除去されている点である。好ましい実施形態では、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基が除去されている。例えば、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、又は４０個のアミノ酸残基が除去されている。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はまたＴ細胞エピトープも担持する。特定の好ましい実施形態では、Ｔ細胞エピトープはヒトＴ細胞エピトープである。特定の好ましい実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及びＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープから選択される。特定の好ましい実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープは配列番号８７に示されている。特定の好ましい実施形態では、ＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープは配列番号８８又は８９に示されている。
【００１８】
特定の好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はヒトＴ細胞エピトープを担持し、以下から選択される。
（１）ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体：これは、以下の点（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）を含む違いによって、カグラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質；例えば、それのアミノ酸配列は配列番号１に示されている）とは相違する：
（１ａ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のアミノ酸残基；例えば、位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、若しくは位置７８〜８０のアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカー（例えば、可動性リンカー；例えば、配列番号４３に示されているリンカー）で置換されている点；
（１ｂ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基がそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている点；並びに
（１ｃ）任意に、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基）が除去されている点。
（２）ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体：これは、以下の点（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）を含む違いによって、テントコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質；例えば、それのアミノ酸配列は配列番号２に示されている）とは相違する：
（２ａ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸残基；例えば、位置８０〜８４のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、若しくは位置８０〜８２のアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカー（例えば、可動性リンカー；例えば、配列番号４３に示されているリンカー）で置換されている点；
（２ｂ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５４〜７３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２４〜１４４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている点；並びに
（２ｃ）任意に、ＴＢＨＢｃＡｇのＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、又は３０〜３５個のアミノ酸残基）が除去されている点。そして
（３）ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体：これは、以下の点（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）を含む違いによって、キクガシラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質；例えば、それのアミノ酸配列は配列番号３に示されている）とは相違する：
（３ａ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のアミノ酸残基；例えば、位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、若しくは位置７８〜８０のアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカー（例えば、可動性リンカー；例えば、配列番号４３に示されているリンカー）で置換されている点；
（３ｂ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が、それぞれが独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている点；並びに
（３ｃ）任意に、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基）が除去されている点。
【００１９】
ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体
好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質は野生型ＲＢＨＢｃＡｇである。好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。
好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体とＲＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには以下の点（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）が含まれる。すなわち、（ｉ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のアミノ酸残基）が除去されているか、又はリンカーで置換されている点、（ｉｉ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている点、並びに（ｉｉｉ）任意に、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基）が除去されている点である。
【００２０】
違い（ｉ）について
特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸残基、位置７８〜８１のアミノ酸残基、位置７８〜８０のアミノ酸残基、位置７８〜７９のアミノ酸残基、位置７９〜８３のアミノ酸残基、位置７９〜８２のアミノ酸残基、位置７９〜８１のアミノ酸残基、位置７９〜８０のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、位置８０〜８２のアミノ酸残基、位置８０〜８１のアミノ酸残基、位置８１〜８３のアミノ酸残基、位置８１〜８２のアミノ酸残基、位置８２〜８３のアミノ酸残基、位置７８のアミノ酸残基、位置７９のアミノ酸残基、位置８０のアミノ酸残基、位置８１のアミノ酸残基、位置８２のアミノ酸残基、又は位置８３のアミノ酸残基が除去され得るか、又はリンカーで置換され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、可動性リンカーである。そのような可動性リンカーは、当業者に周知であり、例えばＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＳＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）がある。
【００２１】
違い（ｉｉ）について
特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、２１〜２２、２２〜２７、２２〜２６、２２〜２５、２２〜２４、２２〜２３、２３〜２７、２３〜２６、２３〜２５、２３〜２４、２４〜２７、２４〜２６、２４〜２５、２５〜２７、２５〜２６、２６〜２７、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８のアミノ酸残基が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ；例えば、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００２２】
特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５０〜６９、５０〜６８、５０〜６７、５０〜６６、５０〜６５、５０〜６４、５０〜６３、５０〜６２、５０〜６１、５０〜６０、５０〜５９、５０〜５８、５０〜５７、５０〜５６、５０〜５５、５０〜５４、５０〜５３、５０〜５２、５０〜５１、５１〜６９、５１〜６８、５１〜６７、５１〜６６、５１〜６５、５１〜６４、５１〜６３、５１〜６２、５１〜６１、５１〜６０、５１〜５９、５１〜５８、５１〜５７、５１〜５６、５１〜５５、５１〜５４、５１〜５３、５１〜５２、５２〜６９、５２〜６８、５２〜６７、５２〜６６、５２〜６５、５２〜６４、５２〜６３、５２〜６２、５２〜６１、５２〜６０、５２〜５９、５２〜５８、５２〜５７、５２〜５６、５２〜５５、５２〜５４、５２〜５３、５３〜６９、５３〜６８、５３〜６７、５３〜６６、５３〜６５、５３〜６４、５３〜６３、５３〜６２、５３〜６１、５３〜６０、５３〜５９、５３〜５８、５３〜５７、５３〜５６、５３〜５５、５３〜５４、５４〜６９、５４〜６８、５４〜６７、５４〜６６、５４〜６５、５４〜６４、５４〜６３、５４〜６２、５４〜６１、５４〜６０、５４〜５９、５４〜５８、５４〜５７、５４〜５６、５４〜５７、５４〜５６、５４〜５５、５５〜６９、５５〜６８、５５〜６７、５５〜６６、５５〜６５、５５〜６４、５５〜６３、５５〜６２、５５〜６１、５５〜６０、５５〜５９、５５〜５８、５５〜５７、５５〜５６、５６〜６９、５６〜６８、５６〜６７、５６〜６６、５６〜６５、５６〜６４、５６〜６３、５６〜６２、５６〜６１、５６〜６０、５６〜５９、５６〜５８、５６〜５７、５７〜６９、５７〜６８、５７〜６７、５７〜６６、５７〜６５、５７〜６４、５７〜６３、５７〜６２、５７〜６１、５７〜６０、５７〜５９、５７〜５８、５８〜６９、５８〜６８、５８〜６７、５８〜６６、５８〜６５、５８〜６４、５８〜６３、５８〜６２、５８〜６１、５８〜６０、５８〜５９、５９〜６９、５９〜６８、５９〜６７、５９〜６６、５９〜６５、５９〜６４、５９〜６３、５９〜６２、５９〜６１、５９〜６０、６０〜６９、６０〜６８、６０〜６７、６０〜６６、６０〜６５、６０〜６４、６０〜６３、６０〜６２、６０〜６１、６１〜６９、６１〜６８、６１〜６７、６１〜６６、６１〜６５、６１〜６４、６１〜６３、６１〜６２、６２〜６９、６２〜６８、６２〜６７、６２〜６６、６２〜６５、６２〜６４、６２〜６３、６３〜６９、６３〜６８、６３〜６７、６３〜６６、６３〜６５、６３〜６４、６４〜６９、６４〜６８、６４〜６７、６４〜６６、６４〜６５、６５〜６９、６５〜６８、６５〜６７��６５〜６６、６６〜６９、６６〜６８、６６〜６７、６７〜６９、６７〜６８、６８〜６９、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１又は５０のアミノ酸残基が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００２３】
特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２１個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１２０〜１４０、１２０〜１３９、１２０〜１３８、１２０〜１３７、１２０〜１３６、１２０〜１３５、１２０〜１３４、１２０〜１３３、１２０〜１３２、１２０〜１３１、１２０〜１３０、１２０〜１２９、１２０〜１２８、１２０〜１２７、１２０〜１２６、１２０〜１２５、１２０〜１２４、１２０〜１２３、１２０〜１２２、１２０〜１２１、１２１〜１４０、１２１〜１３９、１２１〜１３８、１２１〜１３７、１２１〜１３６、１２１〜１３５、１２１〜１３４、１２１〜１３３、１２１〜１３２、１２１〜１３１、１２１〜１３０、１２１〜１２９、１２１〜１２８、１２１〜１２７、１２１〜１２６、１２１〜１２５、１２１〜１２４、１２１〜１２３、１２１〜１２２、１２２〜１４０、１２２〜１３９、１２２〜１３８、１２２〜１３７、１２２〜１３６、１２２〜１３５、１２２〜１３４、１２２〜１３３、１２２〜１３２、１２２〜１３１、１２２〜１３０、１２２〜１２９、１２２〜１２８、１２２〜１２７、１２２〜１２６、１２２〜１２５、１２２〜１２４、１２２〜１２３、１２３〜１４０、１２３〜１３９、１２３〜１３８、１２３〜１３７、１２３〜１３６、１２３〜１３５、１２３〜１３４、１２３〜１３３、１２３〜１３２、１２３〜１３１、１２３〜１３０、１２３〜１２９、１２３〜１２８、１２３〜１２７、１２３〜１２６、１２３〜１２５、１２３〜１２４、１２４〜１４０、１２４〜１３９、１２４〜１３８、１２４〜１３７、１２４〜１３６、１２４〜１３５、１２４〜１３４、１２４〜１３３、１２４〜１３２、１２４〜１３１、１２４〜１３０、１２４〜１２９、１２４〜１２８、１２４〜１２７、１２４〜１２６、１２４〜１２５、１２５〜１４０、１２５〜１３９、１２５〜１３８、１２５〜１３７、１２５〜１３６、１２５〜１３５、１２５〜１３４、１２５〜１３３、１２５〜１３２、１２５〜１３１、１２５〜１３０、１２５〜１２９、１２５〜１２８、１２５〜１２７、１２６〜１４０、１２６〜１３９、１２６〜１３８、１２６〜１３７、１２６〜１３６、１２６〜１３５、１２６〜１３４、１２６〜１３３、１２６〜１３２、１２６〜１３１、１２６〜１３０、１２６〜１２９、１２６〜１２８、１２６〜１２７、１２７〜１４０、１２７〜１３９、１２７〜１３８、１２７〜１３７、１２７〜１３６、１２７〜１３５、１２７〜１３４、１２７〜１３３、１２７〜１３２、１２７〜１３１、１２７〜１３０、１２７〜１２９、１２７〜１２８、１２８〜１４０、１２８〜１３９、１２８〜１３９、１２８〜１３７、１２８〜１３６、１２８〜１３５、１２８〜１３４、��２８〜１３３、１２８〜１３２、１２８〜１３１、１２８〜１３０、１２８〜１２９、１２９〜１４０、１２９〜１３９、１２９〜１３８、１２９〜１３７、１２９〜１３６、１２９〜１３５、１２９〜１３４、１２９〜１３３、１２９〜１３２、１２９〜１３１、１２９〜１３０、１３０〜１４０、１３０〜１３９、１３０〜１３８、１３０〜１３７、１３０〜１３６、１３０〜１３５、１３０〜１３４、１３０〜１３３、１３０〜１３２、１３０〜１３１、１３１〜１４０、１３１〜１３９、１３１〜１３８、１３１〜１３７、１３１〜１３６、１３１〜１３５、１３１〜１３４、１３１〜１３３、１３１〜１３２、１３２〜１４０、１３２〜１３９、１３２〜１３８、１３２〜１３７、１３２〜１３６、１３２〜１３５、１３２〜１３４、１３２〜１３３、１３３〜１４０、１３３〜１３９、１３３〜１３８、１３３〜１３７、１３３〜１３６、１３３〜１３５、１３３〜１３４、１３４〜１４０、１３４〜１３９、１３４〜１３８、１３４〜１３７、１３４〜１３６、１３４〜１３５、１３５〜１４０、１３５〜１３９、１３５〜１３８、１３５〜１３７、１３５〜１３６、１３６〜１４０、１３６〜１３９、１３６〜１３８、１３６〜１３７、１３７〜１４０、１３７〜１３９、１３７〜１３８、１３８〜１４０、１３８〜１３９、１３９〜１４０、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１又は１２０のアミノ酸残基が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば、配列番号８７〜８９に示されるヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００２４】
特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体は、上記の３つの置換のうちのいずれか１つ又は２つを含む。特定の好ましい実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体は上記の３つの置換を含む（そのようなポリペプチド担体はまた、以下ではＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体とも呼ばれる）。例えば、特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７及び５０〜６９のアミノ酸残基はそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７位及び１２０〜１４０のアミノ酸残基はそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態において、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基はそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は全てヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８７、８８及び８９に示されているヒトＴ細胞エピトープで置換されている。
【００２５】
違い（ｉｉｉ）について
違い（ｉｉｉ）は必要ではない。言い換えれば、ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体において、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端欠失はあってもなくてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体において、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端欠失はない。特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基は除去されている。特定の例示的な実施形態では、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、又は３５〜４０個のアミノ酸残基は除去されている。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、又は４０個のアミノ酸残基は除去されている。
【００２６】
ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体
好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質は野生型ＴＢＨＢｃＡｇである。好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示されている。
好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体とＴＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いは以下の点（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）が含まれる。すなわち、（ｉ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、若しくは５個の連続したアミノ酸残基）は除去されているか又はリンカーで置換されている点、（ｉｉ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５４〜７３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２４〜１４４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている点、並びに（ｉｉｉ）任意に、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、又は３０〜３５個のアミノ酸残基）が除去されている点である。
【００２７】
違い（ｉ）について
特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、位置８０〜８２のアミノ酸残基、位置８０〜８１のアミノ酸残基、位置８１〜８４のアミノ酸残基、位置８１〜８３のアミノ酸残基、位置８１〜８２のアミノ酸残基、位置８２〜８４のアミノ酸残基、位置８２〜８３のアミノ酸残基、位置８３〜８４のアミノ酸残基、位置８０のアミノ酸残基、位置８１のアミノ酸残基、位置８２のアミノ酸残基、位置８３のアミノ酸残基、又は位置８４のアミノ酸残基が除去され得るか、又はリンカーで置換され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、可動性リンカーである。そのような可動性リンカーは、当業者に周知であり、例えば、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＳＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）である。
【００２８】
違い（ｉｉ）について
特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、２１〜２２、２２〜２７、２２〜２６、２２〜２５、２２〜２４、２２〜２３、２３〜２７、２３〜２６、２３〜２５、２３〜２４、２４〜２７、２４〜２６、２４〜２５、２５〜２７、２５〜２６、２６〜２７、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８のアミノ酸残基がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ；例えば、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００２９】
特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５４〜７３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５４〜７３、５４〜７２、５４〜７１、５４〜７０、５４〜６９、５４〜６８、５４〜６７、５４〜６６、５４〜６５、５４〜６４、５４〜６３、５４〜６２、５４〜６１、５４〜６０、５４〜５９、５４〜５８、５４〜５７、５４〜５６、５４〜５５、５５〜７３、５５〜７２、５５〜７１、５５〜７０、５５〜６９、５５〜６８、５５〜６７、５５〜６６、５５〜６５、５５〜６４、５５〜６３、５５〜６２、５５〜６１、５５〜６０、５５〜５９、５５〜５８、５５〜５７、５５〜５６、５６〜７３、５６〜７２、５６〜７１、５６〜７０、５６〜６９、５６〜６８、５６〜６７、５６〜６６、５６〜６５、５６〜６４、５６〜６３、５６〜６２、５６〜６１、５６〜６０、５６〜５９、５６〜５８、５６〜５７、５７〜７３、５７〜７２、５７〜７１、５７〜７０、５７〜６９、５７〜６８、５７〜６７、５７〜６６、５７〜６５、５７〜６４、５７〜６３、５７〜６２、５７〜６１、５７〜６０、５７〜５９、５７〜５８、５８〜７３、５８〜７２、５８〜７１、５８〜７０、５８〜６９、５８〜６８、５８〜６７、５８〜６６、５８〜６５、５８〜６４、５８〜６３、５８〜６２、５８〜６１、５８〜６０、５８〜５９、５９〜７３、５９〜７２、５９〜７１、５９〜７０、５９〜６９、５９〜６８、５９〜６７、５９〜６６、５９〜６５、５９〜６４、５９〜６３、５９〜６２、５９〜６１、５９〜６０、６０〜７３、６０〜７２、６０〜７１、６０〜７０、６０〜６９、６０〜６８、６０〜６７、６０〜６６、６０〜６５、６０〜６４、６０〜６３、６０〜６２、６０〜６１、６１〜７３、６１〜７２、６１〜７１、６１〜７０、６１〜６９、６１〜６８、６１〜６７、６１〜６６、６１〜６５、６１〜６４、６１〜６３、６１〜６２、６２〜７３、６２〜７２、６２〜７１、６２〜７０、６２〜６９、６２〜６８、６２〜６７、６２〜６６、６２〜６５、６２〜６４、６２〜６３、６３〜７３、６３〜７２、６３〜７１、６３〜７０、６３〜６９、６３〜６８、６３〜６７、６３〜６６、６３〜６５、６３〜６４、６４〜７３、６４〜７２、６４〜７１、６４〜７０、６４〜６９、６４〜６８、６４〜６７、６４〜６６、６４〜６５、６５〜７３、６５〜７２、６５〜７１、６５〜７０、６５〜６９、６５〜６８、６５〜６７、６５〜６６、６６〜７３、６６〜７２、６６〜７１、６６〜７０、６６〜６９、６６〜６８、６６〜６７、６７〜７３、６７〜７２、６７〜７１、６７〜７０、６７〜６９、６７〜６８、６８〜７３、６８〜７２、６８〜７１、６８〜７０、６８〜６９、６９〜７３、６９〜７２、６９〜７１、６９〜７０、７０〜７３、７０〜７２、７０〜７１、７１〜��３、７１〜７２、７２〜７３、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５又は５４のアミノ酸残基がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００３０】
特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１２４〜１４４のアミノ酸残基のうち１個又は複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個若しくは２１個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ若しくはＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１２４〜１４４、１２４〜１４３、１２４〜１４２、１２４〜１４１、１２４〜１４０、１２４〜１３９、１２４〜１３８、１２４〜１３７、１２４〜１３６、１２４〜１３５、１２４〜１３４、１２４〜１３３、１２４〜１３２、１２４〜１３１、１２４〜１３０、１２４〜１２９、１２４〜１２８、１２４〜１２７、１２４〜１２６、１２４〜１２５、１２５〜１４４、１２５〜１４３、１２５〜１４２、１２５〜１４１、１２５〜１４０、１２５〜１３９、１２５〜１３８、１２５〜１３７、１２５〜１３６、１２５〜１３５、１２５〜１３４、１２５〜１３３、１２５〜１３２、１２５〜１３１、１２５〜１３０、１２５〜１２９、１２５〜１２８、１２５〜１２７、１２５〜１２６、１２６〜１４４、１２６〜１４３、１２６〜１４２、１２６〜１４１、１２６〜１４０、１２６〜１３９、１２６〜１３８、１２６〜１３７、１２６〜１３６、１２６〜１３５、１２６〜１３４、１２６〜１３３、１２６〜１３２、１２６〜１３１、１２６〜１３０、１２６〜１２９、１２６〜１２８、１２６〜１２７、１２７〜１４４、１２７〜１４３、１２７〜１４２、１２７〜１４１、１２７〜１４０、１２７〜１３９、１２７〜１３８、１２７〜１３７、１２７〜１３６、１２７〜１３５、１２７〜１３４、１２７〜１３３、１２７〜１３２、１２７〜１３１、１２７〜１３０、１２７〜１２９、１２７〜１２８、１２８〜１４４、１２８〜１４３、１２８〜１４２、１２８〜１４１、１２８〜１４０、１２８〜１３９、１２８〜１３８、１２８〜１３７、１２８〜１３６、１２８〜１３５、１２８〜１３４、１２８〜１３３、１２８〜１３２、１２８〜１３１、１２８〜１３０、１２８〜１２９、１２９〜１４４、１２９〜１４３、１２９〜１４２、１２９〜１４１、１２９〜１４０、１２９〜１３９、１２９〜１３８、１２９〜１３７、１２９〜１３６、１２９〜１３５、１２９〜１３４、１２９〜１３３、１２９〜１３２、１２９〜１３１、１２９〜１３０、１３０〜１４４、１３０〜１４３、１３０〜１４２、１３０〜１４１、１３０〜１４０、１３０〜１３９、１３０〜１３８、１３０〜１３７、１３０〜１３６、１３０〜１３５、１３０〜１３４、１３０〜１３３、１３０〜１３２、１３０〜１３１、１３１〜１４４、１３１〜１４３、１３１〜１４２、１３１〜１４１、１３１〜１４０、１３１〜１３９、１３１〜１３８、１３１〜１３７、１３１〜１３６、１３１〜１３５、１３１〜１３４、１３１〜１３３、１３１〜１３２、１３２〜１４４、１３２〜１４３、１３２〜１４２、１３２〜１４１、１３２〜１４０、１３２〜１３９、１３２〜１３８、１３２〜１３��、１３２〜１３６、１３２〜１３５、１３２〜１３４、１３２〜１３３、１３３〜１４４、１３３〜１４３、１３３〜１４２、１３３〜１４１、１３３〜１４０、１３３〜１３９、１３３〜１３８、１３３〜１３７、１３３〜１３６、１３３〜１３５、１３３〜１３４、１３４〜１４４、１３４〜１４３、１３４〜１４２、１３４〜１４１、１３４〜１４０、１３４〜１３９、１３４〜１３８、１３４〜１３７、１３４〜１３６、１３４〜１３５、１３５〜１４４、１３５〜１４３、１３５〜１４２、１３５〜１４１、１３５〜１４０、１３５〜１３９、１３５〜１３８、１３５〜１３７、１３５〜１３６、１３６〜１４４、１３６〜１４３、１３６〜１４２、１３６〜１４１、１３６〜１４０、１３６〜１３９、１３６〜１３８、１３６〜１３７、１３７〜１４４、１３７〜１４３、１３７〜１４２、１３７〜１４１、１３７〜１４０、１３７〜１３９、１３７〜１３８、１３８〜１４４、１３８〜１４３、１３８〜１４２、１３８〜１４１、１３８〜１４０、１３８〜１３９、１３９〜１４４、１３９〜１４３、１３９〜１４２、１３９〜１４１、１３９〜１４０、１４０〜１４４、１４０〜１４３、１４０〜１４２、１４０〜１４１、１４１〜１４４、１４１〜１４３、１４１〜１４２、１４２〜１４４、１４２〜１４３、１４３〜１４４、１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５又は１２４のアミノ酸残基が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ若しくはＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００３１】
特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体は、上記の３つの置換のうちのいずれか１つ又は２つを含む。特定の好ましい実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体は上記の３つの置換を含む（そのようなポリペプチド担体は以下ではＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体とも呼ばれる）。例えば、特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７及び５４〜７３のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７及び１２４〜１４４のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５４〜７３及び１２４〜１４４のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５４〜７３及び１２４〜１４４のアミノ酸残基は全て、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５４〜７３及び１２４〜１４４のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８７、８８及び８９に示されているヒトＴ細胞エピトープで置換されている。
【００３２】
違い（ｉｉｉ）について
違い（ｉｉｉ）は必要ではない。言い換えれば、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体において、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端欠失があってもなくてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体において、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端欠失はない。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基が除去されている。特定の例示的な実施形態では、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、又は３０〜３５個のアミノ酸残基が除去されている。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個又は３５個のアミノ酸残基が除去されている。
【００３３】
ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体
好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質は野生型ＨＢＨＢｃＡｇである。好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３に示されている。
好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体とＨＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには以下の点（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）が含まれる。すなわち、（ｉ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個の連続したアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸残基）が除去されているか又はリンカーで置換されている点、（ｉｉ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２０〜１４０のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ若しくはＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている点、並びに（ｉｉｉ）任意に、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基（例えば、１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個又は３５〜４０個のアミノ酸残基）が除去されている点である。
【００３４】
違い（ｉ）について
特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基、位置７８〜８２のアミノ酸、位置７８〜８１のアミノ酸残基、位置７８〜８０のアミノ酸残基、位置７８〜７９のアミノ酸残基、位置７９〜８３のアミノ酸残基、位置７９〜８２のアミノ酸残基、位置７９〜８１のアミノ酸残基、位置７９〜８０のアミノ酸残基、位置８０〜８３のアミノ酸残基、位置８０〜８２のアミノ酸残基、位置８０〜８１のアミノ酸残基、位置８１〜８３のアミノ酸残基、位置８１〜８２のアミノ酸残基、位置８２〜８３のアミノ酸残基、位置７８のアミノ酸残基、位置７９のアミノ酸残基、位置８０のアミノ酸残基、位置８１のアミノ酸残基、位置８２のアミノ酸残基、又は位置８３のアミノ酸残基が除去され得るか、又はリンカーで置換され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、可動性リンカーである。そのような可動性リンカーは、当業者に周知であり、例えば、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＳＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）である。
【００３５】
違い（ｉｉ）について
特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸残基）は、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、２１〜２２、２２〜２７、２２〜２６、２２〜２５、２２〜２４、２２〜２３、２３〜２７、２３〜２６、２３〜２５、２３〜２４、２４〜２７、２４〜２６、２４〜２５、２５〜２７、２５〜２６、２６〜２７、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８のアミノ酸残基がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００３６】
特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸残基）がヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５０〜６９、５０〜６８、５０〜６７、５０〜６６、５０〜６５、５０〜６４、５０〜６３、５０〜６２、５０〜６１、５０〜６０、５０〜５９、５０〜５８、５０〜５７、５０〜５６、５０〜５５、５０〜５４、５０〜５３、５０〜５２、５０〜５１、５１〜６９、５１〜６８、５１〜６７、５１〜６６、５１〜６５、５１〜６４、５１〜６３、５１〜６２、５１〜６１、５１〜６０、５１〜５９、５１〜５８、５１〜５７、５１〜５６。５１〜５５、５１〜５４、５１〜５３、５１〜５２、５２〜６９、５２〜６８、５２〜６７、５２〜６６、５２〜６５、５２〜６４、５２〜６３、５２〜６２、５２〜６１、５２〜６０、５２〜５９、５２〜５８、５２〜５７、５２〜５６、５２〜５５、５２〜５４、５２〜５３、５３〜６９、５３〜６８、５３〜６７、５３〜６６、５３〜６５、５３〜６４、５３〜６３、５３〜６２、５３〜６１、５３〜６０、５３〜５９、５３〜５８、５３〜５７、５３〜５６、５３〜５５、５３〜５４、５４〜６９、５４〜６８、５４〜６７、５４〜６６、５４〜６５、５４〜６４、５４〜６３、５４〜６２、５４〜６１、５４〜６０、５４〜５９、５４〜５８、５４〜５７、５４〜５６、５４〜５７、５４〜５６、５４〜５５、５５〜６９、５５〜６８、５５〜６７、５５〜６６、５５〜６５、５５〜６４、５５〜６３、５５〜６２、５５〜６１、５５〜６０、５５〜５９、５５〜５８、５５〜５７、５５〜５６、５６〜６９、５６〜６８、５６〜６７、５６〜６６、５６〜６５、５６〜６４、５６〜６３、５６〜６２、５６〜６１、５６〜６０、５６〜５９、５６〜５８、５６〜５７、５７〜６９、５７〜６８、５７〜６７、５７〜６６、５７〜６５、５７〜６４、５７〜６３、５７〜６２、５７〜６１、５７〜６０、５７〜５９、５７〜５８、５８〜６９、５８〜６８、５８〜６７、５８〜６６、５８〜６５、５８〜６４、５８〜６３、５８〜６２、５８〜６１、５８〜６０、５８〜５９、５９〜６９、５９〜６８、５９〜６７、５９〜６６、５９〜６５、５９〜６４、５９〜６３、５９〜６２、５９〜６１、５９〜６０、６０〜６９、６０〜６８、６０〜６７、６０〜６６、６０〜６５、６０〜６４、６０〜６３、６０〜６２、６０〜６１、６１〜６９、６１〜６８、６１〜６７、６１〜６６、６１〜６５、６１〜６４、６１〜６３、６１〜６２、６２〜６９、６２〜６８、６２〜６７、６２〜６６、６２〜６５、６２〜６４、６２〜６３、６３〜６９、６３〜６８、６３〜６７、６３〜６６、６３〜６５、６３〜６４、６４〜６９、６４〜６８、６４〜６７、６４〜６６、６４〜６５、６５〜６９、６５〜６８、６５〜６７��６５〜６６、６６〜６９、６６〜６８、６６〜６７、６７〜６９、６７〜６８、６８〜６９、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１又は５０のアミノ酸残基が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００３７】
特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２１個のアミノ酸残基）が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１２０〜１４０、１２０〜１３９、１２０〜１３８、１２０〜１３７、１２０〜１３６、１２０〜１３５、１２０〜１３４、１２０〜１３３、１２０〜１３２、１２０〜１３１、１２０〜１３０、１２０〜１２９、１２０〜１２８、１２０〜１２７、１２０〜１２６、１２０〜１２５、１２０〜１２４、１２０〜１２３、１２０〜１２２、１２０〜１２１、１２１〜１４０、１２１〜１３９、１２１〜１３８、１２１〜１３７、１２１〜１３６、１２１〜１３５、１２１〜１３４、１２１〜１３３、１２１〜１３２、１２１〜１３１、１２１〜１３０、１２１〜１２９、１２１〜１２８、１２１〜１２７、１２１〜１２６、１２１〜１２５、１２１〜１２４、１２１〜１２３、１２１〜１２２、１２２〜１４０、１２２〜１３９、１２２〜１３８、１２２〜１３７、１２２〜１３６、１２２〜１３５、１２２〜１３４、１２２〜１３３、１２２〜１３２、１２２〜１３１、１２２〜１３０、１２２〜１２９、１２２〜１２８、１２２〜１２７、１２２〜１２６、１２２〜１２５、１２２〜１２４、１２２〜１２３、１２３〜１４０、１２３〜１３９、１２３〜１３８、１２３〜１３７、１２３〜１３６、１２３〜１３５、１２３〜１３４、１２３〜１３３、１２３〜１３２、１２３〜１３１、１２３〜１３０、１２３〜１２９、１２３〜１２８、１２３〜１２７、１２３〜１２６、１２３〜１２５、１２３〜１２４、１２４〜１４０、１２４〜１３９、１２４〜１３８、１２４〜１３７、１２４〜１３６、１２４〜１３５、１２４〜１３４、１２４〜１３３、１２４〜１３２、１２４〜１３１、１２４〜１３０、１２４〜１２９、１２４〜１２８、１２４〜１２７、１２４〜１２６、１２４〜１２５、１２５〜１４０、１２５〜１３９、１２５〜１３８、１２５〜１３７、１２５〜１３６、１２５〜１３５、１２５〜１３４、１２５〜１３３、１２５〜１３２、１２５〜１３１、１２５〜１３０、１２５〜１２９、１２５〜１２８、１２５〜１２７、１２６〜１４０、１２６〜１３９、１２６〜１３８、１２６〜１３７、１２６〜１３６、１２６〜１３５、１２６〜１３４、１２６〜１３３、１２６〜１３２、１２６〜１３１、１２６〜１３０、１２６〜１２９、１２６〜１２８、１２６〜１２７、１２７〜１４０、１２７〜１３９、１２７〜１３８、１２７〜１３７、１２７〜１３６、１２７〜１３５、１２７〜１３４、１２７〜１３３、１２７〜１３２、１２７〜１３１、１２７〜１３０、１２７〜１２９、１２７〜１２８、１２８〜１４０、１２８〜１３９、１２８〜１３９、１２８〜１３７、１２８〜１３６、１２８〜１３５、１２８〜１３４��１２８〜１３３、１２８〜１３２、１２８〜１３１、１２８〜１３０、１２８〜１２９、１２９〜１４０、１２９〜１３９、１２９〜１３８、１２９〜１３７、１２９〜１３６、１２９〜１３５、１２９〜１３４、１２９〜１３３、１２９〜１３２、１２９〜１３１、１２９〜１３０、１３０〜１４０、１３０〜１３９、１３０〜１３８、１３０〜１３７、１３０〜１３６、１３０〜１３５、１３０〜１３４、１３０〜１３３、１３０〜１３２、１３０〜１３１、１３１〜１４０、１３１〜１３９、１３１〜１３８、１３１〜１３７、１３１〜１３６、１３１〜１３５、１３１〜１３４、１３１〜１３３、１３１〜１３２、１３２〜１４０、１３２〜１３９、１３２〜１３８、１３２〜１３７、１３２〜１３６、１３２〜１３５、１３２〜１３４、１３２〜１３３、１３３〜１４０、１３３〜１３９、１３３〜１３８、１３３〜１３７、１３３〜１３６、１３３〜１３５、１３３〜１３４、１３４〜１４０、１３４〜１３９、１３４〜１３８、１３４〜１３７、１３４〜１３６、１３４〜１３５、１３５〜１４０、１３５〜１３９、１３５〜１３８、１３５〜１３７、１３５〜１３６、１３６〜１４０、１３６〜１３９、１３６〜１３８、１３６〜１３７、１３７〜１４０、１３７〜１３９、１３７〜１３８、１３８〜１４０、１３８〜１３９、１３９〜１４０、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１又は１２０のアミノ酸残基が、ヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ、例えば、配列番号８７〜８９に示されているヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。
【００３８】
特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体は、上記の３つの置換のうちのいずれか１つ又は２つを含む。特定の好ましい実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体は上記の３つの置換を含む（そのようなポリペプチド担体は、以下ではＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体とも呼ばれる）。例えば、特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７及び５０〜６９のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は、それぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は全てヒトＴ細胞エピトープ（例えば、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープ）で置換されている。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７、５０〜６９及び１２０〜１４０のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号８７、８８及び８９に示されているヒトＴ細胞エピトープで置換されている。
【００３９】
違い（ｉｉｉ）について
違い（ｉｉｉ）は必要ではない。言い換えれば、ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体において、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端欠失はあってもなくてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体においてＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端欠失はない。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基が除去されている。特定の例示的な実施形態では、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個又は３５〜４０個のアミノ酸残基が除去されている。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個又は４０個のアミノ酸残基が除去されている。
【００４０】
当業者に知られているように、制限酵素切断部位の導入は、特に有利である。したがって、好ましい実施形態では、本発明の核酸分子において、制限酵素切断部位は、除去される１個又は複数個のアミノ酸残基（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端おける位置７８〜８３のアミノ酸残基、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基）をコードするヌクレオチドの位置に導入される。好ましい実施形態では、本発明の核酸分子において、制限酵素切断部位は、リンカーをコードするヌクレオチド配列内に及び／又はその末端の一方若しくは両方に導入される。好ましい実施形態では、１つ又は複数の制限酵素切断部位は、本発明の核酸分子内に及び／又はその末端の一方若しくは両方に導入される。様々な制限酵素切断部位が、当業者に知られており、それらには、非限定的に、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｈｐａ  ＩＩ、Ｍｂｏ  Ｉ、及びＭｂｏ  ＩＩなどの制限酵素により認識される酵素切断部位が含まれる。
好ましい実施形態では、バリアントは、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【００４１】
好ましい実施形態では、バリアントは、ストリンジェントな条件下でポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。好ましい実施形態では、バリアントは、高ストリンジェントな条件下でポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。
好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、配列番号４〜９及び７５〜８０から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号１２〜１７及び８１〜８６から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
好ましい実施形態では、核酸分子は、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入のために用いられる。例えば、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、除去される１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端おける位置７８〜８３のアミノ酸残基、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基）をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いはリンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端の一方に若しくは両方に挿入される。好ましい実施形態では、インフレーム様式で、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列に挿入される。好ましい実施形態では、制限酵素切断部位によって、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列に挿入される。
【００４３】
好ましい実施形態では、核酸分子はさらに、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該標的ポリペプチドはポリペプチド担体に対して異種性であり、且つ該標的ポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列が、除去される１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端おける位置７８〜８３のアミノ酸残基、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基）をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いはリンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端の一方に若しくは両方に挿入される。好ましい実施形態では、インフレーム様式で、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列に挿入される。好ましい実施形態では、制限酵素切断部位によって、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列に挿入される。
【００４４】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、抗原、又は抗原性エピトープを含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、エピトープペプチド、例えば、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。
【００４５】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ、又はＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ））を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＴＢＨＢｃＡｇ担体又はＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ））を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＨＢＨＢｃＡｇ担体又はＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ））を含み、又はそれである。
【００４６】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇタンパク質、又は前記ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤから選択される。好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープは、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸である。
【００４７】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質、又は前記ＧＰ１２０タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、又はそれである。
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２０〜２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号２３〜４０、６９〜７４及び９０〜９６から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、又はそれからなる。
【００４８】
別の態様では、本発明は、上記で定義されているような本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
標的ポリヌクレオチドの挿入のためのベクター（例えば、本発明の核酸分子）は、当技術分野において周知であり、非限定的に、クローニングベクター及び発現ベクターが含まれる。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、真核生物の発現ベクター又は原核生物の発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、又はファージなどである。
別の態様では、本発明はさらに、核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞には、非限定的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの原核細胞、並びに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞が含まれる。本発明の宿主細胞はまた、２９３Ｔ細胞などの細胞系でもあり得る。
【００４９】
別の態様では、本発明は、以下の工程を含む、標的ポリペプチドを提示するための方法に関する：
（１）組換えタンパク質をコードする核酸分子を得るために、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本発明の核酸分子に（特に、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列に）挿入する工程；及び
（２）工程（１）における組換えタンパク質をコードする核酸分子を発現させて、組換えタンパク質を産生する工程。
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ポリペプチド担体に対して異種性である。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、除去される１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端おける位置７８〜８３のアミノ酸残基、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基）をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いはリンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端の一方若しくは両方に挿入される。好ましい実施形態では、インフレーム様式で、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列内に挿入される。好ましい実施形態では、制限酵素切断部位によって、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列内に挿入される。
【００５０】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、抗原、又は抗原性エピトープを含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、エピトープペプチド、例えば、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。
【００５１】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ、又はＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＴＢＨＢｃＡｇ担体又はＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＨＢＨＢｃＡｇ担体又はＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。
【００５２】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇタンパク質、又は前記ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープは、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸である。
【００５３】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質、又は前記ＧＰ１２０タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、又はそれである。
【００５４】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２０〜２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２３〜４０、６９〜７４及び９０〜９６から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、又はそれからなる。
【００５５】
別の態様では、本発明は、ポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質に関し、ポリペプチド担体は、上記で定義されているのと同じ意味を有し、標的ポリペプチドが、ポリペプチド担体に挿入されている。
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、除去される１個若しくは複数個のアミノ酸残基（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端おける位置７８〜８３のアミノ酸残基、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基）の位置に挿入され、或いは、リンカー内に、又はその末端の一方若しくは両方に挿入される。
【００５６】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、抗原、又は抗原性エピトープを含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、エピトープペプチド、例えば、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ、又はＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
【００５７】
好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＴＢＨＢｃＡｇ担体又はＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＨＢＨＢｃＡｇ担体又はＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＩＶ、ＰＤＬ１又はＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。
【００５８】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇタンパク質、又は前記ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤから選択される。好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープは、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸である。
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質、又はＧＰ１２０タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、又はそれである。
【００５９】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２０〜２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、配列番号４〜９及び７５〜８０から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２３〜４０、６９〜７４及び９０〜９６から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００６０】
別の態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含み、又はそれからなるウイルス様粒子に関する。
別の態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、又は本発明のウイルス様粒子、及び任意に、１つ又は複数の薬学的に許容される媒体又は賦形剤（例えば、アジュバント）を含む医薬組成物（例えば、ワクチン）に関する。好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質、又は本発明のウイルス様粒子は、医薬組成物中に有効量で存在する。例えば、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患（例えば、Ｂ型肝炎）の予防又は処置に有効な量で、組換えタンパク質又はウイルス様粒子を含み得る。
【００６１】
別の態様では、本発明は、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を予防又は処置するための方法であって、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含み、標的ポリペプチドがＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ、又はＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
【００６２】
好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＴＢＨＢｃＡｇ担体又はＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＨＢＨＢｃＡｇ担体又はＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。
【００６３】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇタンパク質、又は前記ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープは、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸である。
【００６４】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号３５〜４０、６９〜７４及び９０〜９６から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物は、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を予防又は処置するのに有効な量で投与される。
【００６５】
別の態様では、本発明は、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を予防又は処置するための薬物の製造における組換えタンパク質又はウイルス様粒子の使用に関し、標的ポリペプチドが、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ、又はＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
【００６６】
好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＴＢＨＢｃＡｇ担体又はＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＨＢＨＢｃＡｇ担体又はＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。
【００６７】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇタンパク質、又はＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープは、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸である。
【００６８】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号３５〜４０、６９〜７４及び９０〜９６から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００６９】
別の態様では、本発明は、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患（例えば、Ｂ型肝炎）の予防又は処置における使用のための、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物に関し、標的ポリペプチドが、ＨＢＶ（特にヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＢＶ（特にヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ、又はＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
【００７０】
好ましい実施形態では、ポリペプチド担体は、ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＴＢＨＢｃＡｇ担体又はＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特に、ヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ポリペプチド担体はＨＢＨＢｃＡｇ担体又はＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体であり、エピトープペプチドは、ＨＢＶ（特にヒトＨＢＶ）由来の抗原性エピトープ、例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含み、又はそれである。
【００７１】
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇタンパク質、又はＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。好ましい実施形態では、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。好ましい実施形態では、ＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープは、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸である。
好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２２及び６０〜６２から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号３５〜４０、６９〜７４及び９０〜９６から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００７２】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染、又はＨＩＶ感染に関連した疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を予防又は処置するための方法であって、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含み、標的ポリペプチドがＨＩＶの抗原性エピトープを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質、又はＧＰ１２０タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
【００７３】
好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２０に示されたアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２３〜２８から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物は、ＨＩＶ感染、又はＨＩＶ感染に関連した疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を予防又は処置するのに有効な量で投与される。
【００７４】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染、又はＨＩＶ感染に関連した疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を予防又は処置するための薬物の製造における本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子の使用に関し、標的ポリペプチドが、ＨＩＶ由来の抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質、又はＧＰ１２０タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれらから選択される。
好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２０に示されたアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２３〜２８から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００７５】
別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染、又はＨＩＶ感染に関連した疾患（例えば、ＡＩＤＳ）の予防又は処置における使用のための、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物に関し、標的ポリペプチドが、ＨＩＶ由来の抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質、又はＧＰ１２０タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２０に示されたアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２３〜２８から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００７６】
別の態様では、本発明は、癌（例えば、非小細胞肺癌）を予防又は処置するための方法であって、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含み、標的ポリペプチドがヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の抗原性エピトープを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２１に示されたアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２９〜３４から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物は、癌（例えば、非小細胞肺癌）を予防又は処置するのに有効な量で投与される。
【００７７】
別の態様では、本発明は、癌（例えば、非小細胞肺癌）を予防又は処置するための薬物の製造における組換えタンパク質又はウイルス様粒子の使用に関し、標的ポリペプチドが、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２１に示されたアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２９〜３４から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００７８】
別の態様では、本発明は、癌（例えば、非小細胞肺癌）の予防又は処置における使用のための、組換えタンパク質又はウイルス様粒子又は医薬組成物に関し、標的ポリペプチドが、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質のエピトープ（例えば、直線状エピトープ）を含むエピトープペプチドを含み、又はそれである。
好ましい実施形態では、エピトープペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含み、又はそれである。好ましい実施形態では、標的ポリペプチドは、配列番号２１に示されたアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２９〜３４から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【００７９】
別の態様では、本発明は、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
標的ポリヌクレオチド（例えば、本発明の核酸分子）の挿入のためのベクターは、当技術分野において周知であり、非限定的に、クローニングベクター及び発現ベクターが含まれる。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、真核生物の発現ベクター又は原核生物の発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、又はファージなどである。
【００８０】
別の態様では、本発明はさらに、ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞には、非限定的に、大腸菌細胞などの原核細胞、並びに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び（例えば哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞などの）動物細胞などの真核細胞が含まれる。本発明の宿主細胞はまた、２９３Ｔ細胞などの細胞系でもあり得る。
【００８１】
別の態様では、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を、組換えタンパク質を発現させるのに適した条件下で培養する工程、及び組換えタンパク質を回収する工程を含む、組換えタンパク質を調製する方法に関する。
【００８２】
本発明における関連用語の定義及び説明
本発明において、他に規定がない限り、本明細書で用いられる科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解されているような意味をもつ。さらに、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験操作ステップは、対応する分野で広く用いられる日常的ステップである。加えて、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義及び説明が以下のように提供される。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、用語「カグラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇ）」及び「ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質」は、カグラコウモリＨＢＶ（ＲＢＨＢＶ）由来のコア抗原タンパク質を指し、それは、当業者に周知である（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＫＣ７９０３７３．１を参照）。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列が言及される時、それは、配列番号１に示された配列を参照することにより記載される。例えば、句「ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基」は、配列番号１に示されたポリペプチドの位置７８〜８３のアミノ酸残基を指す。しかしながら、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）又はバリエーション（非制限的に、置換、欠失、及び／又は付加を含む。例えば、異なる遺伝子型又は遺伝子サブタイプのＲＢＨＢｃＡｇタンパク質）が、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列に天然で存在し、又はそれに、その生物学的性質に影響することなく、人工的に導入され得ることを、当業者は理解している。したがって、本発明において、用語「ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質」は、配列番号１に示された配列、及びそれの天然又は人工的バリアントを含む、全てのそのような配列を含むことを意図する。加えて、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の配列断片が記載される時、それらは、配列番号１の配列断片だけでなく、それの天然又は人工的バリアントの対応する配列断片も含む。例えば、句「ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基」は、配列番号１の位置７８〜８３のアミノ酸残基、及びそれのバリアント（天然又は人工的バリアント）の対応する断片を含む。本発明によれば、句「対応する配列断片」又は「対応する断片」は、その配列が最適化アラインメントに供された時、すなわち、その配列が最高パーセンテージの同一性を得るようにアラインメントされた時の配列の同等の位置に位置する断片を指す。
【００８５】
本明細書で用いられる場合、用語「野生型ＲＢＨＢｃＡｇ」は、カグラコウモリＨＢＶにおける天然で存在するコア抗原タンパク質を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「ＲＢＨＢｃＡｇ担体又はＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体」は、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質に由来したポリペプチド担体を指す。上記で詳細に記載されているように、ＲＢＨＢｃＡｇ担体とＲＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点（ａ）、（ｂ）が含まれる。すなわち、（ａ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個のアミノ酸残基が除去されているか、又はリンカーで置換されている点、及び（ｂ）任意に、１〜４０個のアミノ酸残基がＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端において除去されている点である。ＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体とＲＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには以下の点（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が含まれる。すなわち、（ａ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が除去されているか、又はリンカーで置換されている点；（ｂ）ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基がそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープで置換されている点；並びに（ｃ）任意に、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基が除去されている点である。
【００８６】
本明細書で用いられる場合、用語「テントコウモリＨＢＶコア抗原（ＴＢＨＢｃＡｇ）」及び「ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質」は、テントコウモリＨＢＶ（ＴＢＨＢＶ）由来のコア抗原タンパク質を指し、それは、当業者に周知である（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＫＣ７９０３７８．１を参照）。
本明細書で用いられる場合、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列が言及される時、それは、配列番号２に示された配列を参照することにより記載される。例えば、句「ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基」は、配列番号２に示されたポリペプチドの位置８０〜８４のアミノ酸残基を指す。しかしながら、突然変異又はバリエーション（非限定的に、置換、欠失、及び／又は付加を含む。例えば、異なる遺伝子型又は遺伝子サブタイプのＴＢＨＢｃＡｇタンパク質）が、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列に天然で存在し、又はそれに、その生物学的性質に影響することなく、人工的に導入され得ることを、当業者は理解している。したがって、本発明において、用語「ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質」は、配列番号２に示された配列、及びそれの天然又は人工的バリアントを含む、全てのそのような配列を含むことを意図する。加えて、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の配列断片が記載される時、それらは、配列番号２の配列断片だけでなく、それの天然又は人工的バリアントの対応する配列断片も含む。例えば、句「ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基」は、配列番号２の位置８０〜８４のアミノ酸残基、及びそれのバリアント（天然又は人工的バリアント）の対応する断片を含む。本発明によれば、句「対応する配列断片」又は「対応する断片」は、その配列が最適化アラインメントに供された時、すなわち、その配列が最高パーセンテージの同一性を得るようにアラインメントされた時の配列の同等の位置に位置する断片を指す。
【００８７】
本明細書で用いられる場合、用語「野生型ＴＢＨＢｃＡｇ」は、テントコウモリＨＢＶにおける天然で存在するコア抗原タンパク質を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「ＴＢＨＢｃＡｇ担体」又は「ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体」は、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質由来のポリペプチド担体を指す。上記で詳細に記載されているように、ＴＢＨＢｃＡｇ担体とＴＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点（ａ）、（ｂ）が含まれる。すわなち、（ａ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個又は複数個のアミノ酸残基が除去されているか、又はリンカーで置換されている点、及び（ｂ）任意に、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基が除去されている点である。ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体とＴＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには以下の点（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が含まれる。すなわち、（ａ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置８０〜８４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基が除去されているか、又はリンカーで置換されている点、（ｂ）ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５４〜７３のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２４〜１４４のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基がそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープで置換されている点、並びに（ｃ）任意に、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜３５個のアミノ酸残基が除去されている点である。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、用語「キクガシラコウモリＨＢＶコア抗原タンパク質（ＨＢＨＢｃＡｇ）」及び「ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質」は、キクガシラコウモリＨＢＶ（ＨＢＨＢＶ）由来のコア抗原タンパク質を指し、それは、当業者に周知である（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＫＣ７９０３７７．１を参照）。
本明細書で用いられる場合、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列が言及される時、それは、配列番号３に示された配列を参照することにより記載される。例えば、句「ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基」は、配列番号３に示されたポリペプチドの位置７８〜８３のアミノ酸残基を指す。しかしながら、突然変異又はバリエーション（非限定的に、置換、欠失、及び／又は付加が含まれる。例えば、異なる遺伝子型又は遺伝子サブタイプのＨＢＨＢｃＡｇタンパク質）が、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列に天然で存在し、又はそれに、その生物学的性質に影響することなく、人工的に導入され得ることを、当業者は理解している。したがって、本発明において、用語「ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質」は、配列番号３に示された配列、及びそれの天然又は人工的バリアントを含む、全てのそのような配列を含むことを意図する。加えて、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の配列断片が記載される時、それらは、配列番号３の配列断片だけでなく、それの天然又は人工的バリアントの対応する配列断片も含む。例えば、句「ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基」は、配列番号３の位置７８〜８３のアミノ酸残基、及びそれのバリアント（天然又は人工的バリアント）の対応する断片を含む。本発明によれば、句「対応する配列断片」又は「対応する断片」は、その配列が最適化アラインメントに供された時、すなわち、その配列が最高パーセンテージの同一性を得るようにアラインメントされた時の配列の同等の位置に位置する断片を指す。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、用語「野生型ＨＢＨＢｃＡｇ」は、キクガシラコウモリＨＢＶにおける天然で存在するコア抗原タンパク質を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「ＨＢＨＢｃＡｇ担体」又は「ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体」は、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質由来のポリペプチド担体を指す。上記で詳細に記載されているように、ＨＢＨＢｃＡｇ担体と又はＨＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには、以下の点（ａ）、（ｂ）が含まれる。すなわち、（ａ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個のアミノ酸残基が除去されているか、又はリンカーで置換されている点、及び（ｂ）任意に、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基が除去されている点である。ＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ担体とＨＢＨＢｃＡｇタンパク質との間の違いには以下の点（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が含まれる。すわなち、（ａ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置７８〜８３のアミノ酸残基のうち１個又は複数個のアミノ酸残基が除去されているか、又はリンカーで置換されている点、（ｂ）ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端における位置１８〜２７のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基、位置５０〜６９のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基及び／又は位置１２０〜１４０のアミノ酸残基のうち１個若しくは複数個のアミノ酸残基がそれぞれ独立してヒトＴ細胞エピトープで置換されている点、並びに（ｃ）任意に、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端における１〜４０個のアミノ酸残基が除去されている点である。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒトＨＢＶ  ＨＢｃＡｇ」及び「Ｈｕ−ＨＢｃＡｇ」は、ヒトＢ型肝炎ウイルスのコア抗原タンパク質を指し、それは、当業者に周知である（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＡＡＯ６３５１７．１を参照）。本明細書で用いられる場合、ヒトＨＢＶ  ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列が言及される時、それは、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＡＡＯ６３５１７．１に示された配列により記載される。
本明細書で用いられる場合、用語「ヒトＨＢＶ  ＨＢｓＡｇ」及び「Ｈｕ−ＨＢｓＡｇ」は、ヒトＢ型肝炎ウイルスの表面抗原タンパク質を指し、それは、当業者に周知である（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＡＡＦ２４７２９．１を参照）。
【００９１】
本明細書で用いられる場合、ヒトＨＢＶ  ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列が言及される時、それは、配列番号４４（すなわち、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＡＡＦ２４７２９．１）に示された配列を参照することにより記載される。例えば、句「ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸残基」は、配列番号４４に示されたポリペプチドの位置１１３〜１３５のアミノ酸残基を指す。しかしながら、突然変異又はバリエーション（非限定的に、置換、欠失、及び／又は付加が含まれる。例えば、異なる遺伝子型又は遺伝子サブタイプのＨＢｓＡｇタンパク質）が、ＨＢｓＡｇタンパク質のアミノ酸配列に天然で存在し、又はそれに、その生物学的性質に影響することなく、人工的に導入され得ることを、当業者は理解している。したがって、本発明において、用語「ＨＢｓＡｇタンパク質」は、配列番号４４に示された配列、及びそれの天然又は人工的バリアントを含む、全てのそのような配列を含むことを意図する。加えて、ＨＢｓＡｇタンパク質の配列断片が記載される時、それらは、配列番号４４の配列断片だけでなく、それの天然又は人工的バリアントの対応する配列断片も含む。例えば、句「ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸残基」は、配列番号４４の位置１１３〜１３５のアミノ酸残基、及びそれのバリアント（天然又は人工的バリアント）の対応する断片を含む。本発明によれば、句「対応する配列断片」又は「対応する断片」は、その配列が最適化アラインメントに供された時、すなわち、その配列が最高パーセンテージの同一性を得るようにアラインメントされた時の配列の同等の位置に位置する断片を指す。
【００９２】
本明細書で用いられる場合、句「Ｘタンパク質のＣ末端において除去されたＹ個のアミノ酸残基」とは、Ｘタンパク質のＣ末端における最後のＹ個のアミノ酸残基が完全に除去されていることを意味する。例えば、句「ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端において除去された１〜４０個のアミノ酸残基」は、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端において最後の１〜４０個のアミノ酸残基が完全に除去されていることを意味する。
本明細書で用いられる場合、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間、又は２つの核酸間の一致の程度を指す。比較のための２つの配列が、特定の部位において同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが、特定の部位においてアデニンを有し、又は２つのポリペプチドのそれぞれが、特定の部位においてリシンを有する）場合、その２つの分子はその部位において同一である。２つの配列間でのパーセント同一性は、比較のための部位の総数で割った、２つの配列によって共有される同一部位の数×１００という関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位のうちの６個が一致している場合には、これらの２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６個の部位のうち３個が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、最大同一性を生じ得る様式で行われる。そのようなアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３、１９７０）に基づいているＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムを用いることにより行うことができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へ組み込まれている、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ，、４：１１〜１７（１９８８））を用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスか又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムへ組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））により決定することができる。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドの生物学的活性に不利に影響しないであろう、又は変化させないであろうアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの当技術分野において知られた標準技術により導入され得る。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、対応するアミノ酸残基と物理的又は機能的に類似した（例えば、類似したサイズ、形、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的性質などを有する）残基と置換される置換が挙げられる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐型側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換される。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０〜１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９〜８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２〜４１７（１９９７）を参照。（それらを参照により本明細書に援用する））。
【００９４】
本明細書で用いられる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、特定の条件（例えば、適切な温度、イオン強度など）下で、相補的塩基対形成の原理に基づいて、相補的配列を有する２つの一本鎖核酸分子をアニールすることにより、二本鎖核酸を形成する過程を指す。核酸ハイブリダイゼーションは、塩基対形成のための相補的配列を有する限り、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、加えて、ＤＮＡ−ＲＮＡ間又はＲＮＡ−ＲＮＡ間で起こり得る。核酸ハイブリダイゼーションのさらなる詳細な説明に関して、例えば、Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  Ｏら、（１９９９）“Ｃｕｓｔｏｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５〜３４８；Ｅｚａｋｉ  Ｔら、１９８９、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｗｅｌｌｓ  ａｓ  ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｗｈｉｃｈ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ａｒｅ  Ｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ  ａｍｏｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｔｒａｉｎｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ２９（３）：２２４〜２２９；及びＨｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｃら、１９９８．ＰＣＲ  ３：ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、３巻  Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照してください。
【００９５】
核酸ハイブリダイゼーションの特異性を保証するために、ストリンジェントな条件又は高ストリンジェントな条件が一般的に用いられる。ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件は、分子生物学の分野においてよく知られている。例えば、ストリンジェントな条件は、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて約５０〜６５℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回又は複数回の洗浄を指し得る。高ストリンジェントな条件は、約４５℃、６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、続いて約６８℃、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回又は複数回の洗浄を指し得る。当業者により知られた他のストリンジェントな条件又は高ストリンジェントな条件に関して、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６．３．１〜６．３．６及び２．１０．３ページを参照してください。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、用語「リンカー」は、２つの分子（例えば、タンパク質）を連結するための短いペプチドを指す。そのようなリンカーは当業者に周知であり、非限定的に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ、及び（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）３などの可動性リンカーを含む。
本発明において、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同じ意味をもち、互換的に用いることができる。さらに、本発明において、アミノ酸は、一般的に、１文字コード及び３文字コードとして表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａとして表され得る。
【００９７】
本明細書で用いられる場合、用語「制限酵素切断部位」は、制限酵素によって認識される酵素切断部位を指す。そのような制限酵素切断部位は、当業者に周知であり、非限定的に、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｈｐａ  ＩＩ、Ｍｂｏ  Ｉ、及びＭｂｏ  ＩＩなどの制限酵素により認識される酵素切断部位が含まれる。
本明細書で用いられる場合、用語「抗原性エピトープ」、「抗原エピトープ」、及び「エピトープ」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部分を指す。「エピトープ」はまた、当技術分野において、「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープ又は抗原決定基は、一般的に、アミノ酸、糖質、又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、且つ一般的に、特定の３Ｄ構造特性及び特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは一般的に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、又は１５個の連続した、又は不連続なアミノ酸を、その固有の立体構造で含み、それは「直線状」又は「立体構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）」であり得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照。直線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間の全ての相互作用部位は、そのタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体構造的エピトープにおいて、相互作用部位は、そのタンパク質のアミノ酸残基によって互いに離間している。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されるエピトープを指す。したがって、ヒトＴ細胞エピトープは、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されるエピトープを指す。当業者には一般に理解されているように、ＴＣＲは一般的に立体構造的エピトープを認識しないが、連続したアミノ酸残基（例えば、約１０〜２０個のアミノ酸の小型ポリペプチド）からなる直線状エピトープのみを認識する。さらに、そのようなエピトープは、それがＴＣＲによって認識され得るようにＭＨＣ分子と結合する必要がある。したがって、結合したＭＨＣ分子の種類に応じて、ヒトＴ細胞エピトープは、それぞれＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープに分類することができる。これに関連して、例示的なＭＨＣ  Ｉ拘束性ヒトＴ細胞エピトープは、配列番号８７に示され（Ｚｈａｎｇ  Ｈ  Ｐ，Ｙａｎ  Ｈ  Ｐ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ  Ｈら，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｈｕａ  ｙｕ  ｆａｎｇ  ｙｉ  ｘｕｅ  ｚａ  ｚｈｉ［Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ］，２００９，４３（８）：６９０−６９４を参照）；例示的なＭＨＣ  ＩＩ拘束性ヒトＴ細胞エピトープは、配列番号８８〜８９に示されている（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｆｅｂ  １；１６４（３）：１６２５−３３及びＰｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５巻，１６１０−１６１４ページ，Ｍａｒｃｈ  １９８８を参照）。しかしながら、直線状エピトープは空間的構造、立体配置及び立体構造に無関係であるので、当業者はまた本発明を実施するために他のヒトＴ細胞エピトープも選択できることは容易に理解されるであろう。本発明は、特定のヒトＴ細胞エピトープによって限定されない。
【００９９】
本明細書で用いられる場合、用語「ＨＢｓＡｇエピトープ」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合し得るＨＢｓＡｇ上の部分を指す。ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇの構造及び機能は十分に研究されている。さらに、多くの論文が、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇ上のエピトープを報告している。例えば、ＷＯ９７／３９０２９  Ａ２；ＷＯ８５／０４１０３  Ａ１；Ｘｉａｏｘｉｎｇ  Ｑｉｕら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９６、１５６巻、３３５０〜３３５６ページ；ＷＯ２０１３／１８５５５８  Ａ１などを参照。
【０１００】
本明細書で用いられる場合、用語「エピトープペプチド」は、エピトープを形成し、又はエピトープとして作用することができる、抗原上のペプチド断片を指す。いくつかの条件下で、単独でのエピトープペプチドに、そのエピトープに対する抗体が特異的に認識／結合し得る。いくつかの他の条件下で、エピトープペプチドは、エピトープペプチドが抗体により特異的に認識されるのを促進するために、ポリペプチド担体に融合しなければならない。エピトープペプチド内に含まれるエピトープは、直線状エピトープ又は立体構造的エピトープであり得る。エピトープペプチドが直線状エピトープを含む場合、それは、抗体においてエピトープを形成する連続したアミノ酸セグメント（すなわち、ペプチド断片）を含み、又はそれであり得る。エピトープペプチドが立体構造的エピトープを含む場合、それは、立体構造的エピトープに関与する全てのアミノ酸残基を包含する連続したアミノ酸セグメント（すなわち、ペプチド断片）を含み、又はそれであり得る。本発明のいくつかの実施形態では、エピトープペプチドは、好ましくは、５００個以下のアミノ酸残基の長さ、例えば、４００個以下のアミノ酸残基の長さ、３００個以下のアミノ酸残基の長さ、２００個以下のアミノ酸残基の長さ、１００個以下のアミノ酸残基の長さ、９０個以下のアミノ酸残基の長さ、８０個以下のアミノ酸残基の長さ、７０個以下のアミノ酸残基の長さ、６０個以下のアミノ酸残基の長さ、５０個以下のアミノ酸残基の長さ、４０個以下のアミノ酸残基の長さ、３０個以下のアミノ酸残基の長さ、又は２５個以下のアミノ酸残基の長さを有する。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド担体」は、エピトープペプチドの担体として作用し得る、すなわち、エピトープペプチドが提示され得、それにしたがって、抗体又は免疫系により認識され得るように、その中の特定の位置（例えば、そのタンパク質内、又はそのタンパク質のＮ末端若しくはＣ末端）に挿入されたエピトープペプチドを有し得る、そのような担体タンパク質を指す。そのような担体タンパク質は、以前の論文において報告されており、それには、例えば、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質（エピトープペプチドが、そのタンパク質の位置１３０のアミノ酸と位置１３１のアミノ酸の間、又は位置４２６のアミノ酸と位置４２７のアミノ酸の間で挿入され得る；Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ，Ｋ．ら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｃａｐｓｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｏｏｐｓ  ［Ｊ］  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、２００１、８２：２７９９〜２８０４；Ｖａｒｓａｎｉ，Ａ．ら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６（ＨＰＶ−１６）  Ｌ１  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌ２  ｍｉｎｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＨＰＶ−６  ａｎｄ  ＨＰＶ−１６  ［Ｊ］  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００３、７７：８３８６〜８３９３参照）、ＣＲＭ１９７タンパク質（エピトープペプチドが、そのタンパク質又はそれの断片のＮ末端又はＣ末端に連結され得る）などが挙げられる。上記で論じられているように、本発明は、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の抗原性エピトープ（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープ）を含むエピトープペプチドを提示するのに特に適している、標的ポリペプチドを提示するためのポリペプチド担体の新しい類を提供する。本発明の実施形態において、リンカー（例えば、可動性又は剛性リンカー）が、エピトープペプチドとポリペプチド担体との間に、それらのフォールディングをそれぞれ、促進するために用いられ得る。
【０１０２】
本明細書で用いられる場合、用語「組換えタンパク質」は、記載されたそのタンパク質が天然に存在するタンパク質ではないことを意味するのみであり、そのタンパク質を産生又は取得する手段を制限することを意図しない。本発明の組換えタンパク質は、任意の既知の方法により産生され得、非限定的に、遺伝子工学方法及び人工的合成方法が含まれる。
本明細書で用いられる場合、用語「ウイルス様粒子」は、ウイルス核酸を含まず、自己複製することができないが、形態及び構造に関して真のビリオンと同じ、又は類似している、特定のウイルスの１つ又は複数の構造タンパク質によって形成される中空粒子を指す。
【０１０３】
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」は、対象及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合性である担体及び／又は賦形剤を指し、それは、当技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲによる編集、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５参照）、それには、非限定的に、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が含まれる。例えば、ｐＨ調整剤には、非限定的に、リン酸緩衝液が含まれ、界面活性剤には、非限定的に、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０）が含まれ、及び、イオン強度増強剤には、非限定的に、ＮａＣｌが含まれる。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、用語「アジュバント」は、それが、抗原と共に生物体へ送達され、又は前もって生物体へ送達される場合、生物体において抗原に対する免疫応答を増強し、又は免疫応答の型を変化させることができる、非特異的免疫賦活剤を指す。様々なアジュバントがあり、それには、非限定的に、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカインなどが含まれる。フロイントアジュバントは、動物実験において、現在、最も一般的に用いられるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、より一般的には、臨床試験に用いられる。
【０１０５】
本明細書で用いられる場合、用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を指し、大腸菌（株）には、非限定的に、市場で入手できる、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）が含まれる。
本明細書で用いられる場合、用語「ベクター」は、それに挿入されるポリヌクレオチドを有し得る核酸媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指す。ベクターが、それに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより宿主細胞において発現する、輸送される遺伝子材料エレメントを有し得る。ベクターは当業者に周知であり、非限定的に、プラスミド、ファージ、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ、及び動物ウイルスが含まれる。ベクターとして用いることができる動物ウイルスには、非限定的に、（レンチウイルスを含む）レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、発現を制御するための複数のエレメントを含み得、非限定的に、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が含まれる。加えて、ベクターは、複製開始点を含み得る。
【０１０６】
本明細書で用いられる場合、用語「宿主細胞」は、ベクターを導入し得る細胞を指し、非限定的に、大腸菌又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核細胞、酵母細胞又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞又はＳｆ９などの昆虫細胞、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、又はヒト細胞などの動物細胞が含まれる。
本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒトなどの霊長類哺乳動物を指す。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、所望の効果を達成し、又は少なくとも部分的に達成するのに十分である量を指す。例えば、疾患（例えば、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患）を予防するための有効量は、その疾患（例えば、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ感染に関連した疾患）の発生を予防し、抑制し、又は遅らせるのに十分である量を指す；治療的有効量は、疾患及びその疾患を有する患者におけるそれの合併症を治癒し、又は少なくとも部分的に抑制するのに十分である量を指す。そのような有効量の決定は、完全に、当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用に有効な量は、処置されるべき疾患の重症度、患者における免疫系の一般的な状態、年齢、体重、及び性別などの患者の一般的な状態、薬剤の投与経路、同時に用いられる追加の治療などに依存する。
【発明の効果】
【０１０８】
本発明の技術的解決策は、先行技術に優る、以下の有益な効果を有する。
（１）本発明は、幅広い適用性を有し、様々な標的ポリペプチド（例えば、抗原エピトープ／抗原ペプチド断片）を効率的に提示して、宿主において標的ポリペプチドに対する特異的免疫応答の発生を誘導するために用いることができる、新規なポリペプチド担体を提供する。そのような標的ポリペプチド（例えば、抗原性エピトープ／抗原ペプチド断片）には、非限定的に、ＨＩＶ由来の抗原性エピトープ／抗原ペプチド断片（例えば、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質由来の抗原性エピトープ／抗原ペプチド断片；例えば、ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸を含むポリペプチド）、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の抗原性エピトープ／抗原ペプチド断片（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸を含むポリペプチド）、及びヒトＨＢＶ由来の抗原性エピトープ／抗原ペプチド断片（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇタンパク質の抗原性エピトープ／抗原ペプチド断片；例えば、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸を含むポリペプチド）が含まれる。
【０１０９】
（２）本発明のポリペプチド担体は、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の抗原エピトープ（例えば、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇにおけるエピトープ）を提示するのに特に適しており、既存のＢ型肝炎ワクチン（例えば、同じエピトープを含み、且つポリペプチド担体としてヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇを用いることにより構築されたワクチン）の効力より有意に良好な効力で、対象においてＨＢｓＡｇを排除するために、非常に強く、且つ特異的な免疫応答を誘導することができる。
【０１１０】
（３）本発明のヒトＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体は、人体における免疫応答の増強、例えば、ヒト免疫細胞によるＩＦＮγの分泌促進などを誘導することができ、特に有利である。
【０１１１】
本発明の実施形態は、以下の図面及び実施例を参照することにより詳細に例証されている。しかしながら、以下の図面及び実施例は、本発明の保護範囲を限定するためではなく、本発明を例証するためだけに用いられていることが当業者によって理解される。以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な説明により、本発明の様々な目的及び有利な態様が当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、組換えタンパク質が、標的ポリペプチド（標的抗原ペプチド断片）を本発明のＲＢＨＢｃＡｇ担体、ＴＢＨＢｃＡｇ担体、及びＨＢＨＢｃＡｇ担体へ挿入することにより構築される、クローニングソリューションのスキームである。
【図２】図２は、例２で構築された１８の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、及びその組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）結果を示す図である。
【図３】図３は、例２で構築された１８の組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子でＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した後の、マウス血清中の組換えタンパク質における標的ポリペプチドに対する抗体の力価の経時変化を示す図である。縦軸：抗体価（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒ）（ｌｏｇ１０）；横軸：時間（週）。  図３Ａでは、用いられた標的ポリペプチドは配列番号２０であり、抗ＧＰ１２０抗体の力価を測定した。  図３Ｂでは、用いられた標的ポリペプチドは配列番号２１であり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の力価を測定した。  図３Ｃでは、用いられた標的ポリペプチドは配列番号２２であり、抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価を測定した。
【０１１３】
【図４】図４は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図４Ａ）及びＨＢＶトランスジェニック雌マウス（図４Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの経時変化を示す図である。縦軸：ＨＢｓＡｇレベル（ＩＵ／ｍｌ）；横軸：時間（週）。矢印は、マウスへのウイルス様粒子の投与の時点を示す。
【図５】図５は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウスを処置した後の、マウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルの経時変化を示す図である。縦軸：ＨＢＶ  ＤＮＡレベル（Ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍｌ）；横軸：時間（週）。矢印は、マウスへのウイルス様粒子の投与の時点を示す。
【０１１４】
【図６】図６は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図６Ａ）及びＨＢＶトランスジェニック雌マウス（図６Ｂ）を処置した後の、マウス血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価の経時変化を示す図である。縦軸：抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価；横軸：時間（週）。
【図７】図７は、例５で構築された６つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子のＴＥＭ結果を示す図である。
【０１１５】
【図８】図８は、８つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子で、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化してから３週間後の、マウス血清中の、対応する標的ポリペプチド（配列番号６０、２２、６１、及び６２）に対する抗体の力価を示す図である。ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号６０）を使用して、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６０及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６０で免疫化したマウスの血清中の抗体価を測定した。ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号２２）を使用して、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２２で免疫化したマウスの血清中の抗体価を測定した。ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号６１）を使用して、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６１及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６１で免疫化したマウスの血清中の抗体価を測定した。そして、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号６２）を使用して、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６２及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６２で免疫化したマウスの血清中の抗体価を測定した。結果は、８つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子全てが良好な免疫原性を有し、マウスにおいて標的抗原に特異的に結合する高力価の抗体の産生を誘導し得ることを示している。
【０１１６】
【図９】図９は、４つの組換えタンパク質（配列番号３６、６９、７０、及び７１）により形成されたウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図９Ａ）及び雌マウス（図９Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの変化を示す図である。縦軸：ＨＢｓＡｇレベル（ＩＵ／ｍｌ）；横軸：時間（週）。
【０１１７】
【図１０】図１０は、標的ポリペプチド（標的抗原ペプチド断片）を、本発明のＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体及びＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体に挿入することによって、組換えタンパク質を構築したクローニングソリューションのスキームである。
【図１１】図１１は、例７で構築した２つの組換えタンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、並びに前記組換え体タンパク質によって形成されたウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）結果を示す。
【０１１８】
【図１２】図１２は、例７の組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２によって形成されたウイルス様粒子、並びに例２の組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２によって形成されたウイルス様粒子でそれぞれ、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した後の、マウス血清中の組換えタンパク質中の標的ポリペプチドＨＢｓＡｇに対する抗体の力価の経時変化を示す図である。縦軸：抗ＨＢｓＡｇ抗体価（ｌｏｇ１０）；横軸：時間（週）。矢印は、マウスへのウイルス様粒子の投与（ワクチン接種）の時点を示す。結果は、４つ全てのウイルス様粒子が良好な免疫原性を有し、マウスにおいて標的抗原ＨＢｓＡｇに特異的に結合する高力価の抗体を誘導し得ることを示す。
【０１１９】
【図１３】図１３は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する２つの異なるウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図１３Ａ）及び雌マウス（図１３Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの経時的変化を示す図である。縦軸：ＨＢｓＡｇレベル（ＩＵ／ｍｌ）；横軸：時間（週）。矢印は、マウスへのウイルス様粒子の投与（ワクチン接種）の時点を示す。結果は、ＨＢＶトランスジェニックマウスに投与した後、両方のウイルス様粒子がマウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの低下を引き起こすことができ、２つのＶＬＰが匹敵する効果を示すことを示す。
【０１２０】
【図１４】図１４は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する２つのウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図１４Ａ）及び雌マウス（図１４Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルの経時変化を示す。縦軸：ＨＢＶ  ＤＮＡレベル（Ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍｌ）；横軸：時間（週）。矢印は、マウスへのウイルス様粒子の投与（ワクチン接種）の時点を示す。結果は、ＨＢＶトランスジェニックマウスに投与した後、両方のウイルス様粒子がマウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡのレベルの低下を引き起こすことができ、２つのＶＬＰが匹敵する効果を示すことを示す。
【０１２１】
【図１５】図１５は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する２つのウイルス様粒子で、ＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図１５Ａ）及び雌マウス（図１５Ｂ）を処置した後の、マウス血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価の経時変化を示す。縦軸：抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価；横軸：時間（週）。結果は、ＨＢＶトランスジェニックマウスに投与した後、両方のウイルス様粒子がマウスにおいて高力価の抗ＨＢｓＡｇ抗体を誘導し得、２つのＶＬＰが匹敵する効果を示すことを示す。
【０１２２】
【図１６】図１６は、ウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２又はウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２と共に、Ｂ型肝炎患者から得た全血試料をインキュベートした後の、全血試料中に分泌されたＩＦＮγのレベルを示す。結果は、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２と共にインキュベートした全血試料中のＩＦＮγのレベルが、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２（ｐ＝０．００２１）又はＰＢＳ（ｐ＝０．００３７）と共にインキュベートした全血試料中のそれよりも有意に高いことを示す。
【０１２３】
【図１７】図１７は、精製した組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、及び前記組換えタンパク質によって形成されたウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡の結果を示す。
【０１２４】
配列情報
本発明に関与する配列（配列番号１〜４４及び７５〜９６）の部分に関する情報を、以下の表１に提供する。
【表１−１】
0006955020.tif 000002
【表１−２】
0006955020.tif 000003
【表１−３】
0006955020.tif 000004
【表１−４】
0006955020.tif 000005
【表１−５】
0006955020.tif 000006
【表１−６】
0006955020.tif 000007
【表１−７】
0006955020.tif 000008
【０１２５】
本発明を実施するための特定の態様
本発明は、以下の例を参照することにより例証される（それは、本発明の保護範囲を限定することではなく、本発明を説明することを意図する）。
他に指示がない限り、本発明に用いられる分子生物学的実験方法及び免疫学的アッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に記載されているような方法に実質的に従って実行される。制限酵素は、その製品の製造者により推奨される条件下で用いられる。例は、本発明を例証するために用いられるが、本発明の保護範囲を限定することを意図しないことを当業者は理解している。
【実施例】
【０１２６】
例１．  ポリペプチド担体をコードするプラスミドの構築
本例では、ポリペプチド担体をコードするプラスミドを構築した。
１．１  ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列の調製
３つのコウモリ由来ＨＢＶコア抗原（すなわち、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質）に基づいて、以下のポリペプチド担体を設計した。
ＲＢＨＢｃＡｇ１８９担体：これは、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置７８〜８１のアミノ酸残基が配列番号４３に示されているリンカーで置換されている点で、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質（配列番号１）とは異なる。ＲＢＨＢｃＡｇ１８９担体のアミノ酸配列は配列番号４に示されており、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９担体のヌクレオチド配列は配列番号１２に示されている。
【０１２７】
ＴＢＨＢｃＡｇ１８８担体：これは、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置８０〜８３のアミノ酸残基が配列番号４３に示されているリンカーで置換されている点で、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質（配列番号２）とは異なる。ＴＢＨＢｃＡｇ１８８担体のアミノ酸配列は配列番号６に示されており、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８担体のヌクレオチド配列は配列番号１４に示されている。
【０１２８】
ＨＢＨＢｃＡｇ１８９担体：これは、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置７８〜８１のアミノ酸残基が配列番号４３に示されたリンカーで置換されている点で、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質（配列番号３）とは異なる。ＨＢＨＢｃＡｇ１８９担体のアミノ酸配列は配列番号８に示されており、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９担体のヌクレオチド配列は配列番号１６に示されている。
【０１２９】
加えて、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇタンパク質に基づいて、ＨＢｃＡｇ１８３担体もまた、対照として設計された。ＨＢｃＡｇ１８３担体は、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇタンパク質の位置７９〜８１のアミノ酸残基が配列番号４３に示されているリンカーで置換されている点で、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇタンパク質とは異なる。ＨＢｃＡｇ１８３担体のアミノ酸配列は配列番号１０に示されており、ＨＢｃＡｇ１８３担体のヌクレオチド配列は配列番号１８に示されている。
前記４つの担体のヌクレオチド配列に関して、それらの全遺伝子合成は、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄにより実施された。
【０１３０】
１．２  ポリペプチド担体をコードするプラスミドの調製
合成されたヌクレオチド配列を鋳型として用い、且つ表２におけるプライマーを用いることにより、前記４つの担体の完全長遺伝子及び切り詰め型（すなわち、Ｃ末端で切り詰められた遺伝子断片）を、ＰＣＲによりそれぞれ増幅した。８つのＰＣＲ産物が得られた。すなわち、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９担体をコードする遺伝子（配列番号１２；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号４である）、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９担体をコードする遺伝子（配列番号１３；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号５である）、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８担体をコードする遺伝子（配列番号１４；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号６である）、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３をコードする遺伝子（配列番号１５；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号７である）、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９担体をコードする遺伝子（配列番号１６；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号８である）、ＨＢＨＢｃＡｇ１４９担体をコードする遺伝子（配列番号１７；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号９である）、ＨＢｃＡｇ１８３担体をコードする遺伝子（配列番号１８；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号１０である）、及びＨＢｃＡｇ１４９担体をコードする遺伝子（配列番号１９；それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号１１である）である。
【０１３１】
ｐＴＯ−Ｔ７ベクター（Ｌｕｏ  Ｗｅｎｘｉｎ、Ｚｈａｎｇ  Ｊｕｎ、Ｙａｎｇ  Ｈａｉｊｉｅら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ）［Ｊ］、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６（５）：５７８〜５８１）を、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる二重酵素消化に供して、直線状ベクターを得た。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリークローニング方法（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ）により、得られた８つのＰＣＲ産物を、直線状ベクターにライゲーションし、ＤＨ５ａコンピテント細菌を形質転換させた。形質転換された細菌をプレート上に広げて培養し、その後、モノクローナルコロニーを選択し、プラスミドを抽出し、配列決定した。ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列を含む８つのプラスミドが得られたことを、配列決定によって確認した。
【０１３２】
ＰＣＲに関与したプライマーを表２に示す。
【表２】
0006955020.tif 000009
【０１３３】
例２．  組換えタンパク質の調製
本例では、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、例１で構築されたプラスミドに挿入し、標的ポリペプチド及びポリペプチド担体を含む組換えタンパク質を得た。組換えタンパク質が、標的ポリペプチド（標的抗原ペプチド断片）を本発明のＲＢＨＢｃＡｇ担体、ＴＢＨＢｃＡｇ担体、及びＨＢＨＢｃＡｇ担体に挿入することにより構築された、クローニングソリューションのスキームを図１に示す。
【０１３４】
２．１  標的ポリペプチド及びポリペプチド担体を含む組換えタンパク質の発現プラスミドの構築
本例では、３つの標的ポリペプチドを用いて、ペプチド断片を提示することについての本発明のポリペプチド担体の多能性を検証した。前記３つの標的ポリペプチドとは、ポリペプチドＨＩＶ−ＧＰ１２０−ａａ３６１−３７５（すなわち、ＨＩＶ  ＧＰ１２０タンパク質の位置３６１〜３７５のアミノ酸、それのアミノ酸配列は配列番号２０に示されている）、ポリペプチドｈＰＤＬ１−ａａ１４７−１６０（すなわち、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の位置１４７〜１６０のアミノ酸、それのアミノ酸配列は配列番号２１に示されている）、及びポリペプチドＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５（すなわち、ヒトＨＢＶ由来のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の位置１１３〜１３５のアミノ酸、それのアミノ酸配列は配列番号２２に示されている）である。
【０１３５】
（表３に示されているような）前記３つの標的ポリペプチドをコードするセンス配列及びアンチセンス配列を、直接、合成して、付着末端を有し且つ標的ポリペプチドをコードする遺伝子断片を得るようにアニールした。
【表３】
0006955020.tif 000010
例１で得られた６つのプラスミド（ＲＢＨＢｃＡｇ１８９、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９）を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによる二重酵素消化に供し、６つの直線状ベクターを得た。その後、上記で調製したような、付着末端を有し且つ標的ポリペプチドをコードする３つの遺伝子断片を、直線状ベクターにライゲーションして、組換えタンパク質をコードする発現プラスミドを得た（合計１８個、すなわち、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２０、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２０、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−ＳＥＱ２０、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２０、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２０、ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２０、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２１、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２１、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−ＳＥＱ２１、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２１、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２１、ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２１、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２２、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２、及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２である）。
【０１３６】
２．２  組換えタンパク質の発現、精製、及びアセンブリー
前のステップで構築された１８の発現プラスミドを用いて、同じ方法により、発現プラスミドによりコードされる組換えタンパク質を発現させ、精製した。ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱＸ（ＳＥＱＸはＳＥＱ２０、ＳＥＱ２１又はＳＥＱ２２を表す）を例として使用して、組換えタンパク質の発現及び精製について説明する。
（２．２．１）  組換えタンパク質を発現させるための細菌株の調製：２．１で得られた発現プラスミドＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱＸにより、発現細菌株を得るように、大腸菌株ＥＲ２５６６を形質転換させた。
（２．２．２）  組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱＸの発現：発現細菌株を５００ｍＬ三角フラスコに播種し、ＯＤが約１．０になるまで振盪台上で、３７℃にて培養し、後で、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、０．５ｍＭの最終濃度で添加し、２５℃で６時間、発現をさらに行なった。
【０１３７】
（２．２．３）  組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱＸの精製：
（２．２．３．１）  細菌の超音波破壊：２．２．２における細菌を、遠心分離により収集し、超音波破壊に供した。超音波処理緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ６．０）＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ。
（２．２．３．２）  組換えタンパク質の一次精製：超音波破壊後に得られた混合物を、６５℃の水浴中で３０分間、インキュベートし、その後、上清を遠心分離により収集した。飽和硫酸アンモニウムを上清に１：１の体積比で加え、沈殿物を遠心分離により収集した。一次精製された組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱＸを得るために、適切な体積の緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えて、沈殿物を再懸濁した。
（２．２．３．３）  クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製：製造者の使用説明書に従って、２．２．３．２で得られたタンパク質を、精製組換えタンパク質を得るために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（ＧＥ）分子ふるいカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。精製された標的タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、組換えタンパク質により形成されたＶＬＰが、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察された。
【０１３８】
図２は、構築された１８の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、及びその組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子のＴＥＭ結果を示す。結果は、得られた１８の組換えタンパク質の全てが、８５％より上の純度を有し、約３０ｎｍの直径を有するウイルス様粒子にアセンブリーされ得ることを示している。これらの結果は、本発明において構築されたポリペプチド担体が幅広い多能性を有し、様々な標的ポリペプチドを提示するために用いることができ、ＶＬＰを形成し得ることを示している。
【０１３９】
例３．  ウイルス様粒子の免疫原性に関する評価
本例では、本発明者らは、例２で調製した組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子の免疫原性を検証した。全てのそのようなウイルス様粒子は、生物体において標的抗原に特異的に結合する抗体の産生を誘導することができる。
【０１４０】
３．１  マウスの免疫化
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、例２で調製された１８のウイルス様粒子でそれぞれ免疫化した。免疫化過程は以下の通りであった。すなわち、用いた免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は３ｕｇ／用量であり、免疫化を、後肢の外側大腿部における筋肉内注射により実施し、免疫手順は、一次免疫＋２週間後の追加免疫であった（すなわち、合計２回）。
【０１４１】
３．２  血清中の標的抗原に特異的に結合する抗体の力価の検出
３．２．１  反応プレートの調製
反応プレートをコーティングするための抗原は、前記３つの標的ポリペプチドに対応する標的抗原、すなわち、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入、カタログＮｏ．１１２３３−Ｖ０８Ｈ）、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入）、及びＣＨＯ細胞において組換えにより発現したヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙから購入）であった。
【０１４２】
３つの組換えタンパク質を、それぞれ、ｐＨ９．６  ５０ｍＭ  ＣＢ緩衝液（５０ｍＭの最終濃度、ｐＨ＝９．６でのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液）で、２μｇ／ｍＬの最終濃度で、希釈し、コーティング溶液を得た。９６ウェル  ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μＬコーティング溶液を加え、ウェルを２〜８℃で１６〜２４時間、コーティングし、その後さらに、３７℃で２時間、コーティングした。その後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、ウェルを１回、洗浄した；その後、２００μＬブロッキング溶液（２０％仔ウシ血清及び１％カゼインを含有する、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液、ｐＨ＝７．４）を各ウェルに加え、ウェルを３７℃で２時間、ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨てた。その後、ＥＬＩＳＡプレートを乾燥させ、アルミホイルバッグ中にパッケージングし、それをさらなる使用のために２〜８℃で保存した。
【０１４３】
３．２．２  血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体価のＥＬＩＳＡ検出
血清試料の収集：０週間目、２週間目、及び４週間目に、マウスの眼窩から血液を収集し、血清を分離して、検出まで−２０℃で凍結保存した。
試料希釈：マウス血清を、２０％新生仔ウシ血清を含有するＰＢＳ溶液で、７つの希釈勾配、すなわち、１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２５００、１：６２５００、１：３１２５００、及び１：１５６２５００にて希釈した。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡ検出：コーティングしたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μＬ希釈血清試料を加え、３７℃で３０分間、インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回、洗浄した。洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μＬ  ＧＡＭ−ＨＲＰ反応溶液を加え、３７℃で３０分間、インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回、洗浄した。洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、５０μＬ  ＴＭＢ発色剤（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙから提供された）を加え、３７℃で１５分間、インキュベートした。インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、５０μＬ停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙから提供された）を加え、各ウェルについてＯＤ４５０／６３０値をＥＬＩＳＡ計器により読み取った。
【０１４５】
抗体価の計算：読み取り値が０．２〜２．０内にある試料を分析した；希釈倍率と読み取り値で回帰曲線をプロットし、読み取り値がバックグラウンド値の２倍である試料の希釈倍率を計算した；そして、試料の希釈倍率を、血清中の特異的抗体の力価として用いた。
【０１４６】
図３は、１８の組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子でＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した後のマウス血清中の標的抗原に対する抗体の力価の経時変化それぞれを示している。図３Ａ：用いられた標的ポリペプチドは配列番号２０であり、抗ＧＰ１２０抗体の力価を測定した；図３Ｂ：用いられた標的ポリペプチドは配列番号２１であり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の力価を測定した；図３Ｃ：用いられた標的ポリペプチドは配列番号２２であり、抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価を測定した。結果は、１８の組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子の全てが、良好な免疫原性を有し、マウスにおいて標的抗原に特異的に結合する高力価の抗体の産生を誘導し得ることを示している。
【０１４７】
例４．  ＨＢｓＡｇエピトープ（配列番号２２）を提示するウイルス様粒子の抗ＨＢＶ治療効果に関する評価
本例では、本発明者らは、異なるポリペプチド担体に基づいて構築された、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示するウイルス様粒子の抗ＨＢＶ治療効果を評価した。
【０１４８】
４．１  マウスの免疫化
例１〜２に記載された方法に従って、ＨＢｓＡｇエピトープ（配列番号２２）を提示し、且つヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇに基づいて構築された、２つの組換えタンパク質（すなわち、ＨＢｃＡｇ１８３−ＳＥＱ２２（それのアミノ酸配列は配列番号４１に示されている）；及びＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２（それのアミノ酸配列は配列番号４２に示されている））を調製し、その２つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子を調製した。
【０１４９】
後で、例２で調製されたＨＢｓＡｇエピトープ（配列番号２２）を提示する５つのウイルス様粒子、及び本例で調製された２つのウイルス様粒子を、ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおいて抗ＨＢＶ治療効果について評価した。
免疫化方法は、以下の通りであった。すなわち、用いられる免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は１２μｇ／用量であり、免疫化を、後肢の外側大腿部における筋肉内注射により実施した；免疫手順は、０週間目、２週間目、３週間目、４週間目、５週間目、及び６週間目での免疫化であった（すなわち、合計６回）。
【０１５０】
４．２  血清中の抗体価及びウイルス学的指標の検出
例３．２に記載されているような方法に従って、血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体価を測定し、マウス血清中のウイルス学的指標（すなわち、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベル）を測定した。
【０１５１】
４．３  組換えタンパク質の治療効果の分析
検出結果は、図４〜６に示されている。図４は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図４Ａ）及び雌マウス（図４Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの経時変化を示す。図５は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウスを処置した後の、マウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルの経時変化を示す。図６は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図６Ａ）及び雌マウス（図６Ｂ）を処置した後の、マウス血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価の経時変化を示す。
【０１５２】
結果は、ＶＬＰでの免疫療法を受ける群において、抗ＨＢｓＡｇ抗体が、免疫化後、マウス血清において検出され、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルが、マウス血清中で異なる程度まで減少したことを示している。比較すると、（ＶＬＰで免疫化されなかった）対照マウスの血清中に抗ＨＢｓＡｇ抗体は産生されず、血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルの減少は観察されなかった。
【０１５３】
これらの結果は、コウモリＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に基づいて構築された、６つのポリペプチド担体全てが、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープペプチド（例えば、ＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５）を効果的に提示するために用いることができ、ＶＬＰを形成することができ、生物体において高力価の抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を誘導し、それにより、マウスにおいてＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルを抑制する（すなわち、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇは有意に減少した）ことを示している。加えて、図４〜６における実験データはまた、本発明のポリペプチド担体（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３）に基づいたウイルス様粒子が、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇに基づいて構築されたウイルス様粒子よりも良好な、特に有意な抗ＨＢＶ治療効果を生じることを示している。
【０１５４】
したがって、本例における実験結果は以下を示している：（１）本発明のポリペプチド担体は、ＶＬＰを形成することができ、様々な標的ポリペプチドを提示するのに適しており、生物体において標的ポリペプチドに対する高力価の抗体の産生を誘導することができる；（２）本発明のポリペプチド担体は、ヒトＨＢＶのエピトープ（例えば、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇのエピトープ）を提示するのに特に適しており、生物体においてＨＢｓＡｇに対する高力価の抗体の産生を誘導することができ、インビボで、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルを、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇに基づいて構築されたポリペプチド担体の効力より良好な効力で、排除又は抑制することができる。このように、本発明によるヒトＨＢＶエピトープを提示する組換えタンパク質は、ＨＢＶ感染を処置することにおいて可能性があり、効果的で、特異的で、且つ治療的な抗ＨＢＶ免疫化を誘導するのに特に適している。
【０１５５】
例５．  異なるＨＢＶ遺伝子型由来のＨＢｓＡｇのエピトープを提示するウイルス様粒子の調製及び評価
例２〜４に用いられたＨＢｓＡｇエピトープ（配列番号２２）は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来であった。様々なＨＢＶ遺伝子型に対する本発明のポリペプチド担体の幅広い多能性を確認するために、本発明者らはまた、例示的なポリペプチド担体としてＲＢＨＢｃＡｇ１４９及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３を用いて、異なるＨＢＶ遺伝子型（遺伝子型Ａ、Ｃ、及びＤ）由来のＨＢｓＡｇのエピトープを提示する組換えタンパク質を構築し、その構築された組換えタンパク質の、ウイルス様粒子にアセンブリーされる能力、産生されたウイルス様粒子の免疫原性、及びＨＢＶ感染に対するそれらの治療効果を評価した。
【０１５６】
５．１  標的ポリペプチド及びポリペプチド担体を含む組換えタンパク質をコードする発現プラスミドの構築
本例では、例２〜４に用いられたＨＢｓＡｇエピトープ（ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来、配列番号２２）に加えて、標的ポリペプチドはさらに、ＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５−Ａ、ＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５−Ｃ、及びＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５−Ｄと名付けられた、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｃ、及びＤ由来のＨＢｓＡｇエピトープ（位置１１３〜１３５のアミノ酸）を含み、それらの配列（配列番号６０〜６２）は表４に示されている。
【表４】
0006955020.tif 000011
【０１５７】
前記３つの標的ポリペプチドをコードするセンス配列及びアンチセンス配列（表５に示されている）を直接、合成し、アニールして、付着末端を有し且つ標的ポリペプチドをコードする遺伝子断片を得た。
【表５】
0006955020.tif 000012
【０１５８】
例２で記載されているように、上記で調製されたような、付着末端を有し且つ標的ポリペプチドをコードする３つの遺伝子断片を、組換えタンパク質をコードする発現プラスミド（合計６個：ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６０、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６１、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６２、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６０、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６１、及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６２）を得るために、直線状ベクターＲＢＨＢｃＡｇ１４９及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３、それぞれにライゲーションした。その発現プラスミドによりコードされる組換えタンパク質のアミノ酸配列は表６に示されている。
【表６】
0006955020.tif 000013
【０１５９】
５．２  組換えタンパク質の発現、精製及びアセンブリー
例２に記載されているように、前のステップで構築された６つの発現プラスミドを用いることにより、その発現プラスミドによりコードされる組換えタンパク質を発現させ、精製した。後で、その組換えタンパク質により形成されたＶＬＰが、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察された。
図７は、構築された６つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子のＴＥＭ結果を示す。結果は、得られた６つの組換えタンパク質の全てが、約３０ｎｍの直径を有するウイルス様粒子にアセンブリーされ得ることを示している。これらの結果は、本発明において構築されたポリペプチド担体が幅広い多能性を有し、様々なＨＢＶ遺伝子型由来のエピトープペプチド（例えば、ＨＢｓＡｇタンパク質のａａ１１３−１３５）を提示するために用いることができ、ＶＬＰを良好に形成し得ることを示している。
【０１６０】
５．３  ウイルス様粒子の免疫原性の評価
例３に記載された方法を用いることにより、上記で構築された６つの組換えタンパク質及び例２における組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２２により形成されたウイルス様粒子を、それらの免疫原性について評価した。実験結果は図８に示されている。
【０１６１】
図８は、８つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子でＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化してから３週間後の、マウス血清中の、対応する標的ポリペプチド（配列番号６０、２２、６１、及び６２）に対する抗体の力価を示す。その場合、ＨＢＶ遺伝子型Ａ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号６０）が、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６０及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６０で免疫化されたマウスの血清中の抗体価を測定するために用いられ、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号２２）が、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２２で免疫化されたマウスの血清中の抗体価を測定するために用いられ、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号６１）が、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６１及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６１で免疫化されたマウスの血清中の抗体価を測定するために用いられ、及び、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ由来のＨＢｓＡｇタンパク質のエピトープペプチド（配列番号６２）が、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６２及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６２で免疫化されたマウスの血清中の抗体価を測定するために用いられた。結果は、８つの組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子が良好な免疫原性を有し、マウスにおいて標的エピトープに特異的に結合する高力価の抗体の産生を誘導し得ることを示している。
【０１６２】
５．４  ウイルス様粒子の抗ＨＢＶ治療効果に関する評価
例４に記載されているような方法を用いることにより、４つの組換えタンパク質（配列番号３６、６９、７０、及び７１）により形成されたウイルス様粒子を、抗ＨＢＶ治療効果について評価した。実験結果は図９に示されている。
【０１６３】
図９は、上記の構築された４つの組換えタンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６０、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６１、及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６２；それらの配列は、それぞれ、配列番号３６、６９、７０、及び７１である）により形成されたウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図９Ａ）及び雌マウス（図９Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの経時変化を示す。縦軸：ＨＢｓＡｇレベル（ＩＵ／ｍｌ）；横軸：時間（週）。結果は、ＶＬＰでの免疫療法を受けたマウスにおいて、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルが、免疫化後、有意に減少したことを示す。
【０１６４】
これらの実験結果は、本発明のポリペプチド担体（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９及びＴＢＨＢｃＡｇ１５３）が、異なる遺伝子型（例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）のヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープペプチド（例えば、ＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５）を効果的に提示するために用いられ得ることを示している。本発明のポリペプチド担体及びＨＢｓＡｇのエピトープペプチドに基づいて構築された組換えタンパク質は、ＶＬＰを形成することができ、生物体において高力価の抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を誘導して、それにより、マウスにおいてＨＢｓＡｇレベルを抑制することができる（すなわち、ＨＢｓＡｇレベルは有意に減少した）。これは、本発明のポリペプチド担体及びＨＢｓＡｇのエピトープペプチドを含む組換えタンパク質が、様々なＨＢＶ遺伝子型による感染を予防及び処置するために用いることができ、したがって、新しい抗ＨＢＶワクチン及び薬物の開発に用いられ得ることを示している。
【０１６５】
例６．  Ｔ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体をコードするプラスミドの構築
この例では、Ｔ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体をコードするプラスミドが構築される。
６．１  Ｔ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列の調製
３つのコウモリ由来ＨＢＶコア抗原（すなわち、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質、及びＨＢＨＢｃＡｇタンパク質）に基づいて、以下のポリペプチド担体を設計した。
【０１６６】
ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体：これは、以下の点で、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質（配列番号１）とは異なる。すわなち、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置７８〜８１のアミノ酸残基が配列番号４３に示されているリンカーで置換されている点、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１８〜２７のアミノ酸残基が配列番号８７に示されている配列で置換されている点、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置５０〜６９のアミノ酸残基が配列番号８８に示されている配列で置換されている点、及び、ＲＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１２０〜１４０のアミノ酸残基が配列番号８９に示されている配列で置換されている点である。ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体のアミノ酸配列は配列番号７５に示されており、そのヌクレオチド配列は配列番号８１に示されている。
【０１６７】
ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３担体：これは、以下の点で、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質（配列番号２）とは異なる。すなわち、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置８０〜８３のアミノ酸残基が配列番号４３に示されているリンカーで置換されている点、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１８〜２７のアミノ酸残基が配列番号８７に示されている配列で置換されている点、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置５４〜７３のアミノ酸残基が配列番号８８に示されている配列で置換されている点、ＴＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１２４〜１４４のアミノ酸残基が配列番号８９に示されている配列で置換されている点である。ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３担体のアミノ酸配列は配列番号７６に示されており、そのヌクレオチド配列は配列番号８２に示されている。
【０１６８】
ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体：これは、以下の点で、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質（配列番号３）とは異なる。すなわち、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置７８〜８１のアミノ酸残基が配列番号４３に示されているリンカーで置換されている点、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１８〜２７のアミノ酸残基が配列番号８７に示されている配列で置換されている点、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置５０〜６９のアミノ酸残基が配列番号８８に示されている配列で置換されている点、ＨＢＨＢｃＡｇタンパク質の位置１２０〜１４０のアミノ酸残基が配列番号８９に示されている配列で置換されている点である。ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体のアミノ酸配列は、配列番号７７に示されており、そのヌクレオチド配列は配列番号８３に示されている。
前記３つの担体のヌクレオチド配列に関して、それらの全遺伝子合成はＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．Ｌｔｄによって行われた。
【０１６９】
６．２  ポリペプチド担体をコードするプラスミドの調製
合成されたヌクレオチド配列（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体）を鋳型として使用し、配列番号４５〜４７に示されているプライマーを使用することにより、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体の完全長遺伝子及びその切り詰め型（すなわち、Ｃ末端で切り詰められた遺伝子断片）をＰＣＲによって増幅した。２つのＰＣＲ産物、すなわちＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体をコードする遺伝子（配列番号８１；それによってコードされるアミノ酸配列は配列番号７５である）、及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３担体をコードする遺伝子（配列番号８４；それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号７８である）が得られた。
【０１７０】
同様の方法により、以下のＰＣＲ産物が得られる。すなわち、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３担体をコードする遺伝子（配列番号８２；それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号７６である）、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体をコードする遺伝子（配列番号８３；それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号７７である）、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３担体をコードする遺伝子（配列番号８５；それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号７９である）、及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３担体をコードする遺伝子（配列番号８６；それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号８０である）である。
【０１７１】
ｐＴＯ−Ｔ７ベクター（Ｌｕｏ  Ｗｅｎｘｉｎ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊｕｎ，  Ｙａｎｇ  Ｈａｉｊｉｅら，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ［Ｊ］，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０００，  １６（５）：５７８−５８１）をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって二重酵素消化し、直線状ベクターを得た。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリークローニング法（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ）により、得られたＰＣＲ産物を直線状ベクターにライゲーションし、ＤＨ５ａコンピテント細菌を形質転換させた。形質転換した細菌をプレート上に広げて培養し、次いでモノクローナルコロニーを選択し、プラスミドを抽出し、そして配列決定した。配列決定により、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列を含む６つのプラスミドが得られたことを確認した。
【０１７２】
例７．  組換えタンパク質の調製
本例では、例６で構築したプラスミドに標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入し、標的ポリペプチド及びポリペプチド担体を含む組換えタンパク質を得た。本発明のＲＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体、ＴＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体及びＨＢＨＢｃＡｇ−Ｔ３担体に標的ポリペプチド（標的抗原ペプチド断片）を挿入して組換えタンパク質を構築した、クローニングソリューションのスキームを図１０に示す。
【０１７３】
７．１  標的ポリペプチド及びポリペプチド担体を含む組換えタンパク質をコードする発現プラスミドの構築
本例では、本発明のヒトＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体を用いて、標的ポリペプチドを提示できることが確認された。使用される例示的な標的ポリペプチドは、ＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５である（すなわち、ヒトＨＢＶ由来のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の位置１１３−１３５のアミノ酸残基であり、そのアミノ酸配列は配列番号２２に示されている）。
【０１７４】
例２に記載したようにして、付着末端を有し且つ標的ポリペプチドＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５をコードする遺伝子断片を調製した。例６で得たプラスミドＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによって二重酵素消化に供して、２つの直線状ベクトルを得た。次に、上記で調製した付着末端を有し且つ標的ポリペプチドをコードする遺伝子断片をそれぞれの直線状ベクターにそれぞれライゲーションして、以下の組換えタンパク質をコードする発現プラスミドを得た。すなわち、ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９０）及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９１）である。
【０１７５】
同様の方法により、以下の組換えタンパク質をコードする発現プラスミドを得た。すなわち、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９２）、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９３）、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９４）及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９５）である。
【０１７６】
７．２  組換えタンパク質の発現、精製及びアセンブリー
上記で調製した発現プラスミドによってコードされる組換えタンパク質を、例２．２に記載の方法によって発現させ及び精製して、ＶＬＰをアセンブリーするために使用した。
図１１は、構築した２つの組換えタンパク質（ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、並びに組換えタンパク質によって形成されたウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）結果を示す。結果は、得られた両方の組換えタンパク質が８５％を超える純度を有し、約３０ｎｍの直径のウイルス様粒子にアセンブリーされ得ることを示した。
【０１７７】
さらに、上記の方法によって、組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２、及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２もまた、良好に形成されたウイルス様粒子にアセンブリーされ得ることが確認できた。
これらの結果は、本発明によって構築されたＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体を、標的ポリペプチドを提示するために使用でき、ＶＬＰを形成し得ることを示す。
【０１７８】
例８．  ウイルス様粒子の免疫原性の評価
本例では、本発明者らは、例７で調製した組換えタンパク質によって形成されたウイルス様粒子の免疫原性を検証した。このようなウイルス様粒子は全て、生物体において標的抗原に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る。
【０１７９】
８．１  マウスの免疫化
例７で調製した２つのウイルス様粒子（ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２）並びに例２で調製した２つのウイルス様粒子（ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２）でＢＡＬＢ／Ｃマウスをそれぞれ免疫化した。免疫化プロセスは以下の通りであった。すなわち、使用した免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は３μｇ／用量であり、免疫化は後肢の外側大腿部における筋肉内注射により行い、免疫手順は０、２、３、４、５及び６週に各１回、合計６回の免疫化であった。
【０１８０】
８．２  血清中の標的抗原に特異的に結合する抗体の力価の検出
８．２．１  反応プレートの調製
反応プレートをコーティングするための抗原は、標的ポリペプチドＳＥＱ２２に対応する標的抗原、すなわちＣＨＯ細胞中で組換えにより発現されたヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙから購入）であった。
【０１８１】
ＨＢｓＡｇタンパク質をｐＨ９．６の５０ｍＭ  ＣＢ緩衝液（最終濃度５０ｍＭ、ｐＨ＝９．６のＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液）で、最終濃度２μｇ／ｍＬに希釈して、コーティング溶液を得た。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μＬのコーティング溶液を添加し、ウェルを２〜８℃で１６〜２４時間コーティングし、次に、３７℃で２時間さらにコーティングした。その後、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてウェルを１回洗浄した。次に、２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔ウシ血清及び１％カゼインを含有する２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ＝７．４）を各ウェルに添加し、ウェルを３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨てた。その後、ＥＬＩＳＡプレートを乾燥させ、アルミニウムホイルバッグ中にパッケージングし、さらなる使用のために２〜８℃で貯蔵した。
【０１８２】
８．２．２  血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体価のＥＬＩＳＡによる検出
血清試料の採取：０、２、３、４、５、６及び７週目にマウスの眼窩から血液を採取し、血清を分離し、検出まで−２０℃で凍結保存した。
試料希釈：マウス血清を２０％の新生仔ウシ血清を含有するＰＢＳ溶液で７つの希釈勾配、すなわち、１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２５００、１：６２５００、１：３１２５００、及び１：１５６２５００で希釈した。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡ検出：コーティングしたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μＬの希釈した血清試料を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μＬのＧＡＭ−ＨＲＰ反応溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、５０μＬのＴＭＢ発色剤（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙにより提供された）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙにより提供された）を添加し、各ウェルのＯＤ４５０／６３０値をＥＬＩＳＡ機器により読み取った。
【０１８４】
抗体価の計算：読み取り値が０．２〜２．０の範囲内にある試料を分析した。回帰曲線を希釈倍率及び読み取り値でプロットし、読み取り値がバックグラウンド値の２倍である試料の希釈倍率を計算した。試料の希釈倍率を血清中の特異的抗体の力価として用いた。
【０１８５】
図１２は、４つの組換えタンパク質によって形成されたウイルス様粒子でＢＡＬＢ／Ｃマウスをそれぞれ免疫化した後の、マウス血清中の標的抗原ＨＢｓＡｇに対する抗体の力価の経時変化を示す。結果は、４つの組換えタンパク質によって形成された全てのウイルス様粒子が良好な免疫原性を有し、マウスにおいて標的抗原ＨＢｓＡｇに特異的に結合する高力価抗体の産生を誘導し得ることを示す。加えて、結果は、マウスにおける例７で調製されたウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２の免疫原性が、例２で調製されたウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２の免疫原性に匹敵することを示す。
【０１８６】
同様の方法により、ウイルス様粒子ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２が良好な免疫原性を有することが確認された。
結果は、本発明のＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体が標的ポリペプチドを提示するのに適しており、ＶＬＰを形成でき、及びＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質によって形成されたウイルス様粒子は、生物体において標的ポリペプチドに特異的に結合する高力価抗体の産生を誘導することができることを示す。
【０１８７】
例９．  ＨＢｓＡｇエピトープ（配列番号２２）を提示するウイルス様粒子の抗ＨＢＶ治療効果の評価
本例では、本発明者らは、異なるポリペプチド担体に基づいて構築された、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示するウイルス様粒子の抗ＨＢＶ治療効果を評価した。
【０１８８】
９．１  マウスの免疫化
例４に記載したように、実施例７で調製したウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及び例２で調製したウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２（ＨＢｓＡｇのエピトープ（配列番号２２）を提示する２つのウイルス様粒子）を、ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおける抗ＨＢＶ治療効果について評価した。
免疫化方法は以下の通りであった。すなわち、使用した免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は１２μｇ／用量であり、免疫化は後肢の外側大腿部における筋肉内注射により行い、免疫手順は、０週、２週、３週、４週、５週、及び６週目に各１回、合計６回免疫化することによって行なった。
【０１８９】
９．２  血清中の抗体価とウイルス学的指標の検出
例３．２に記載の方法に従って、血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体価を測定し、マウス血清中のウイルス学的指標（すなわち、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベル）を測定した。
【０１９０】
９．３  組換えタンパク質の治療効果の分析
検出結果を図１３〜１５に示す。図１３は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図１３Ａ）及び雌マウス（図１３Ｂ）処置した後の、マウス血清中のＨＢｓＡｇレベルの経時変化を示す。図１４は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図１４Ａ）及び雌マウス（図１４Ｂ）を処置した後の、マウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡレベルの経時変化を示す。図１５は、同じエピトープペプチド（配列番号２２）を提示する異なるウイルス様粒子でＨＢＶトランスジェニック雄マウス（図１５Ａ）及び雌マウス（図１５Ｂ）を処置した後の、マウス血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価の経時変化を示す図である。
【０１９１】
結果は、ウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２又はウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２を用いた免疫療法を受けている群において、免疫化後に、有意なレベルの抗ＨＢｓＡｇ抗体がマウス血清中で検出され、マウス血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルは有意に減少し、２つのウイルス様粒子の有効性は同程度であったことを示す。対照的に、対照マウス（ＶＬＰで免疫化されていない）の血清中に抗ＨＢｓＡｇ抗体は産生されず、血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルの減少は観察されなかった。
【０１９２】
同様の方法により、ウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２、及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２が良好な免疫原性を有することが確認された。
これらの結果は、コウモリＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に基づいて構築された、Ｔ細胞エピトープを担持する全てのポリペプチド担体が、ヒトＨＢＶ由来のＨＢｓＡｇのエピトープペプチド（例えばＨＢｓＡｇ−ａａ１１３−１３５）を効果的に提示するために使用でき、ＶＬＰを形成することができ、宿主における高力価の抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を誘導することができ、それにより、マウスにおけるＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルを抑制する（すなわち、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇは有意に減少した）ことを示す。さらに、図１３〜１５の実験データはまた、ウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２が同等の抗ＨＢＶ治療効果を有していたことを示す。例４の図４〜６の実験結果と組み合わせると、本発明のＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体に基づくウイルス様粒子（例えば、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３）は、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇに基づいて構築されたウイルス様粒子よりも優れた、特に顕著な抗ＨＢＶ治療効果を有することを知ることができる。
【０１９３】
したがって、本例の実験結果は以下のことを示す。すなわち、（１）本発明のＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体はＶＬＰを形成することができ、標的ポリペプチドを提示するのに適しており、そして生物体において標的ポリペプチドに対する高力価抗体の産生を誘導することができ、（２）本発明のＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体は、ヒトＨＢＶのエピトープ（例えば、ヒトＨＢＶのＨＢｓＡｇのエピトープ）を提示するのに特に適しており、生物体においてＨＢｓＡｇに対する高力価抗体の産生を誘導することができ、そして、ヒトＨＢＶのＨＢｃＡｇに基づいて構築されたポリペプチド担体の有効性よりも優れた有効性で、インビボでＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルを除去又は抑制できることである。したがって、本発明によるヒトＨＢＶエピトープを提示する組換えタンパク質は、ＨＢＶ感染を処置する潜在性を有し、そして効果的、特異的及び治療的抗ＨＢＶ免疫化を誘導するために特に適している。
【０１９４】
例１０．  Ｔ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体に基づくウイルス様粒子の、免疫細胞を刺激してＩＦＮγを分泌させる能力の評価
本例では、本発明者らは、Ｔ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体に基づくウイルス様粒子の、免疫細胞を刺激してＩＦＮγを分泌させる能力を評価した。手短に言えば、例７で調製したウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及び例２で調製したウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２を、それぞれＢ型肝炎患者から得た全血試料と共にインキュベートし、次に、Ｂ型肝炎患者の全血試料中の免疫細胞を刺激して、ＩＦＮγを分泌させるウイルス様粒子の能力を評価するために、全血試料中のＩＦＮγのレベルを検出した。
【０１９５】
１０．１  ウイルス様粒子と全血試料の共培養
全血試料をＢ型肝炎患者（２６）から採取し、３本の１．５ｍＬ  ＥＰチューブ（５００μＬ／チューブ）に分注し、それぞれウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２及びＰＢＳ（ネガティブ対照として使用、トキソイドなし）と３７℃で２４時間（２μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度で）インキュベートした。インキュベーション後、全血試料を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を次の試験のために収集した。
【０１９６】
１０．２  ＩＦＮγの検出
製造者の使用説明書に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入したヒトサイトカインアッセイキットであるＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  ＭＡＰ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｏｒｔｆｏｌｉｏを使用して、上清試料中のＩＦＮγレベルを測定した。結果を図１６に示す。
【０１９７】
図１６は、Ｂ型肝炎患者から得られた全血試料を、ウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２又はウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２と共にインキュベートした後の全血試料中に分泌されたＩＦＮγのレベルを示す図である。結果は、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２と共にインキュベートした全血試料中のＩＦＮγのレベルが、ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２（ｐ＝０．００２１）又はＰＢＳ（ｐ＝０．００３７）と共にインキュベートした全血試料中の当該レベルよりも有意に高いことを示している。
【０１９８】
同様の方法で、ウイルス様粒子ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３−ＳＥＱ２２、ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２及びＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２もまた、Ｂ型肝炎患者から得られた全血試料中にて免疫細胞によるＩＦＮγの分泌を刺激し得ることを確認することができた。
【０１９９】
これらの結果は、本発明のヒトＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体及びそれに基づいて構築された組換えタンパク質／ウイルス様粒子は、ヒト免疫細胞によるＩＦＮγの分泌を刺激することができ、したがって、ポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質／ウイルス様粒子に対する人体の免疫応答を増強できることを示す。本発明のヒトＴ細胞エピトープを担持するポリペプチド担体は、ヒトＴ細胞の応答を増強する上で大きな利点を有する。
【０２００】
例１１．  リンカーのないポリペプチド担体に基づいて構築された組換えタンパク質の調製、発現、精製及びアセンブリー
本例では、本発明者らは、標的ポリペプチドと、リンカーを含まないポリペプチド担体とを含む組換えタンパク質を得るために、リンカーを含まないポリペプチド担体を用いて、標的ポリペプチドを提示させた。さらに、本発明者らはまた、得られた組換えタンパク質の、ＶＬＰにアセンブリーされる能力についても研究した。
【０２０１】
手短に言えば、例７で得られた組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２をコードする発現プラスミドに基づいて、組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２（配列番号９６に示されるアミノ酸配列を有する）を発現する発現プラスミドを構築した。ここで、組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２は、組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２とは、標的ポリペプチドＳＥＱ２２の両端に位置する可動性リンカーが除去されている点で異なる。組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２をコードする発現プラスミドの構築方法は以下の通りである。
【０２０２】
組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２をコードする発現プラスミドを鋳型として使用して、第１のプライマー対ＲＢｃ１４９ｎＦ１（配列番号９７）及びＲＢｃ１４９ｎＲ１（配列番号９８）を使用してＰＣＲを行ない、第１の増幅生成物を得、そして第２のプライマー対ＲＢｃ１４９ｎＦ２（配列番号９９）及びＲＢｃ１４９ｎＲ２（配列番号１００）を使用してＰＣＲを行い、第２の増幅生成物を得る。続いて、第１の増幅生成物と第２の増幅生成物を鋳型として一緒に使用して、プライマーＲＢｃ１４９ｎＦ１（配列番号９７）及びＲＢｃ１４９ｎＲ２（配列番号１００）を使用して、ＰＣＲを行い、第３の増幅生成物、すなわち組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２をコードする核酸断片を得る。
【表７】
0006955020.tif 000014
【０２０３】
ｐＴＯ−Ｔ７ベクターを、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより二重酵素消化して、直線状ベクターを得た。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリークローニング法（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ）により、得られた第３の増幅生成物を直線状ベクターにライゲーションし、ＥＲ２５６６コンピテント細菌を形質転換させた。形質転換した細菌をプレート上に広げて培養し、次にモノクローナルコロニーを選択し、プラスミドを抽出し、配列決定した。配列決定により、組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２をコードするヌクレオチド断片を有する発現プラスミドが得られることを確認した。
【０２０４】
続いて、例２の２．２節に記載の方法に従って、組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２を発現させ、精製し、精製した組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、組換えタンパク質により形成されたＶＬＰを、透過型電子顕微鏡により観察した。実験結果を図１７に示した。
【０２０５】
図１７は、精製した組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果及び組換えタンパク質から形成されたウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡観察結果を示す。結果は、得られた組換えタンパク質が８５％を超える純度を有し、約３０ｎｍの直径を有するウイルス様粒子にアセンブリーされ得ることを示している。これらの結果は、標的ポリペプチドを提示させるために、本発明によって構築されたリンカーを含まないポリペプチド担体を使用することができ、ＶＬＰを形成することができることを示す。
【０２０６】
本発明の実施形態を詳細に説明してきたが、当業者であれば、開示した全ての教示に従って詳細を修正及び改変することができ、これらの変更は全て本発明の保護範囲に入ることを理解するであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって定義される。
【配列表フリーテキスト】
【０２０７】
配列番号４：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１８９担体
配列番号５：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１４９担体
配列番号６：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１８８担体
配列番号７：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１５３担体
配列番号８：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１８９担体
配列番号９：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１４９担体
配列番号１０：＜２２３＞ＨＢｃＡｇ１８３担体
配列番号１１：＜２２３＞ＨＢｃＡｇ１４９担体
配列番号１２：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１８９担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１３：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１４９担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１４：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１８８担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１５：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１５３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１６：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１８９担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１７：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１４９担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１８：＜２２３＞ＨＢｃＡｇ１８３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号１９：＜２２３＞ＨＢｃＡｇ１４９担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号２３：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２０
配列番号２４：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２０
配列番号２５：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−ＳＥＱ２０
配列番号２６：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２０
配列番号２７：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２０
配列番号２８：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２０
配列番号２９：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２１
配列番号３０：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２１
配列番号３１：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−ＳＥＱ２１
配列番号３２：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２１
配列番号３３：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２１
配列番号３４：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２１
配列番号３５：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２
配列番号３６：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２
配列番号３７：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−ＳＥＱ２２
配列番号３８：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ２２
配列番号３９：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−ＳＥＱ２２
配列番号４０：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２
配列番号４１：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢｃＡｇ１８３−ＳＥＱ２２
配列番号４２：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ２２
配列番号４３：＜２２３＞リンカー
配列番号４５〜５９、６３〜６８：＜２２３＞プライマー
配列番号６９：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６０
配列番号７０：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６１
配列番号７１：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−ＳＥＱ６２
配列番号７２：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６０
配列番号７３：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６１
配列番号７４：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−ＳＥＱ６２
配列番号７５：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体
配列番号７６：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３担体
配列番号７７：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体
配列番号７８：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３担体
配列番号７９：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３担体
配列番号８０：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３担体
配列番号８１：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号８２：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号８３：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号８４：＜２２３＞ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号８５：＜２２３＞ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号８６：＜２２３＞ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号９０：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９１：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９２：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１８８−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９３：＜２２３＞組換えタンパク質ＴＢＨＢｃＡｇ１５３−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９４：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１８９−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９５：＜２２３＞組換えタンパク質ＨＢＨＢｃＡｇ１４９−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９６：＜２２３＞組換えタンパク質ＲＢＨＢｃＡｇ１４９ｎ−Ｔ３−ＳＥＱ２２
配列番号９７〜１００：＜２２３＞プライマー
【図１】
0006955020.tif 000015
【図２】
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【図３】
0006955020.tif 000017
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006955020.tif 000021
【図８】
0006955020.tif 000022
【図９】
0006955020.tif 000023
【図１０】
0006955020.tif 000024
【図１１】
0006955020.tif 000025
【図１２】
0006955020.tif 000026
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006955020.tif 000029
【図１６】
0006955020.tif 000030
【図１７】
0006955020.tif 000031
【配列表】
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