(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝を罹患している被験体において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別する方法であって、
脂肪肝を罹患している前記被験体から血液サンプルを採取するステップ１と、
前記血液サンプルにおける標的マーカーＧＰ７３を測定するステップ２と、
前記血液サンプルにおける標的マーカーＧＰ７３の含有量とその標準含有量とを比較するステップ３と、
前記血液サンプルにおける標的マーカーＧＰ７３の含有量が前記標準含有量よりも低い場合、前記被験体が単純性脂肪肝を罹患していると鑑別し、前記血液サンプルにおける標的マーカーＧＰ７３の含有量が前記標準含有量よりも高い場合、前記被験体が脂肪性肝炎を罹患していると鑑別するステップ４と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記測定は、化学発光法、酵素結合免疫法及び免疫クロマトグラフィー法からなる群より選択されるいずれか１種の免疫学的方法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学発光法は、磁性粒子化学発光法、電気化学発光法、時間分解化学発光法、標識強化化学発光法及び酵素化学発光法のうちの少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素結合免疫法は、酵素結合免疫吸着法、ドット免疫濾過法、磁性粒子酵素結合免疫法分析、酵素結合免疫蛍光測定法及びプロテインチップ法のうちの少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫クロマトグラフィー法は、アップコンバージョン発光免疫クロマトグラフィー法、ラテックス免疫クロマトグラフィー法、コロイド金免疫クロマトグラフィー法、発光免疫クロマトグラフィー法、量子ドット免疫クロマトグラフィー法のうちの少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記血液サンプルは、血清又は血漿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標準含有量は、カットオフ値８２．２５ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪性肝炎のインビトロ検出に用いられる新しいマーカー及び検出方法に関し、バイオテクノロジー及び体外診断の細分化分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝は、様々な原因に引き起こされ、脂肪が肝細胞内に異常に多く蓄積する病変である。正常なヒト肝臓組織には少量の脂肪があり、その重量が肝臓重量の約４％〜５％であり、脂肪量が５％を超えると軽度脂肪肝になり、１０％を超えると中度脂肪肝になり、２５％を超えると重度脂肪肝になる。脂肪肝は、現在最も一般的な慢性肝疾患の一つであり、先進国と一部の発展途上国で発生率が３０％を超えており、重要な公衆衛生問題となり、人々の健康を深刻に脅かしている。脂肪肝は、単純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変などの主な病理学的段階を含む。脂肪肝の単純性脂肪肝は良性であり、飲食や運動などを調節することにより治ることができ、特定の治療を受ける必要がない。脂肪性肝炎の場合は、適時に治療を受けないと、疾患の進行につれて肝線維症、肝硬変、肝臓がんに進行する恐れがある。脂肪性肝炎から肝線維症、ひいては肝がんへ進行する発症率は、ウイルス性肝炎の発症率に相当することが報告されている。脂肪性肝炎は人々の健康にとって深刻な脅威であり、現在、脂肪肝は、主にＢ超音波、ＣＴ、ＭＲＩなどのイメージング検査によって検出されている。しかし、イメージング検査では、単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を区別できないので、脂肪性肝炎の診断は依然として肝穿刺検査により行われている。しかし、肝穿刺検査は、患者により大きな肉体的及び精神的負担をもたらし、脂肪性肝炎の診断及び日常的な検査に不利である。
【０００３】
ゴルジタンパク質７３（特に指定がない限り、以下ＧＰ７３と略する）は、ゴルジ糖タンパク質であり、２０００年にＫｌａｄｎｅｙらが成人巨細胞性肝炎の病因を研究していたときに発見した新しい膜貫通糖タンパク質であり、ゴルジＩＩ型膜タンパク質（Ｇｏｌｐｈ２）及びゴルジ膜タンパク質Ｉ（Ｇｏｌｍ１）とも呼ばれ、相対分子量が７３０００ｋＤａである。ＧＰ７３は、正常な肝細胞内で発現されないか又は少量発現される。近年の研究により、ＧＰ７３は、肝線維症、肝硬変及び肝がんなどの多くの肝臓疾患では高度に発現され、分泌されて血清に入ることができ、肝がん患者でのＧＰ７３の上昇が最も顕著であるため、肝がんの早期診断に好適なマーカーの一つであり、その感度と特異性がいずれもＡＦＰよりも優れている。
【０００４】
中国特許ＣＮ１０１７３５３１９Ａ（北京熱景生物技術股分有限公司、発明の名称：抗ＧＰ７３タンパク質モノクローナル抗体、その製造方法及び使用）には、抗ゴルジタンパク質ＧＰ７３モノクローナル抗体、ＧＰ７３用いる酵素免疫定量検出キット及び迅速診断キットが開示され、正常な人と肝疾患の患者のＧＰ７３含有量の臨界値は４０ｎｇ／ｍｌであり、良性肝疾患患者と悪性肝疾患患者のＧＰ７３の含有量の臨界値は１００ｎｇ／ｍｌであることが開示されている。
【０００５】
中国特許ＣＮ１０１４０７５４４Ａ（発明の名称：抗ゴルジタンパク質モノクローナル抗体及びその使用）には、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体及びこのモノクローナル抗体を用いる肝がん検査の酵素免疫試薬、免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫組織化学などにおける使用が開示されている。
【０００６】
中国特許第ＣＮ１０４２１５７６１Ａ（発明の名称：血清における抗ＧＰ７３抗体の検出キット）には、肝がん検査に用いられる血清における抗ＧＰ７３抗体を検出する酵素免疫キットが開示されている。
【０００７】
近年、ＧＰ７３及び関連応用研究は、主に肝がんの早期診断分野に集中し、ＧＰ７３に関する特許出願も主にＧＰ７３及びその抗体を用いる肝がん検査の体外診断キットの分野に集中しており、ＧＰ７３を用いる単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別診断に関する研究及び応用についての報告及び関連特許出願がない。本発明者は、数多くの臨床サンプルに対する研究と分析により、を十分に証明した。ＧＰ７３が脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するための優れた血清マーカーであり、脂肪性肝炎の診断及び鑑別には重要な臨床応用価値がある。
【発明の概要】
【０００８】
現在、臨床的には、肝穿刺により脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断しており、患者に巨大な苦痛をもたらしている。従来のイメージング検査技術及び血清学的検査技術により脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断できない問題を解決するために、本発明は、脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するための新しい血清学的標的マーカーＧＰ７３を提供し、さらに脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するためのＧＰ７３検出キット、検出方法及びその判定基準を提供する。
【０００９】
本発明は、脂肪肝患者に対して単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するための新しい血清学的標的マーカーＧＰ７３、及び体外診断用検出サンプルにおけるＧＰ７３含有量の測定方法を提供する。
【００１０】
本発明は、脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するための血清学的体外診断検出キット、体外診断検出キットを用いるＧＰ７３の検出方法及びその判定基準をさらに提供する。
【００１１】
本発明の実施形態において、ＧＰ７３検出方法の原理は、抗原抗体結合反応に基づく免疫学的検出方法の原理であり、好ましくは、化学発光法、酵素結合免疫法、免疫クロマトグラフィー法のいずれか１種を採用する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態において、前記化学発光法は、化学発光法、磁性粒子化学発光法、電気化学発光法、酵素化学発光法、時間分解化学発光法の少なくとも１種である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態において、前記酵素結合免疫法は、酵素結合免疫法、免疫濾過法、プロテインチップ法の少なくとも１種である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫クロマトグラフィー法は、アップコンバージョン発光免疫クロマトグラフィー法、ラテックス免疫クロマトグラフィー法、コロイド金免疫クロマトグラフィー法、発光免疫クロマトグラフィー法、量子ドット免疫クロマトグラフィー法の少なくとも１種。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態において、ＧＰ７３の検出サンプルは、脂肪肝患者の血液サンプルである。前記血液サンプルの検出結果は、脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別診断に用いられる。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態において、ＧＰ７３血清学的体外診断検出キットは、脂肪肝患者に対して単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断する判定カットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）が８２．２５ｎｇ／ｍｌである。
【００１７】
従来技術に比べて、本発明は、脂肪肝患者に対して単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断する新しい血清学的標的マーカーＧＰ７３を提供し、さらに脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するためのＧＰ７３検出方法及びその判定基準を提供することにより、従来のイメージング検査技術及び血清学的検出技術により脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断できない問題が解決され、脂肪性肝炎の診断及び治療に根拠を提供するとともに、検出サンプルが血液サンプルであることにより、脂肪性肝炎の肝穿刺検査による患者の苦痛が大幅に減軽され、脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別に対して重要な臨床診断値及び臨床的意義を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の絶対バイアス図である。
【図２】２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の絶対バイアス図である。
【図３】２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の絶対バイアス図である。
【図４】２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の相対バイアス図である。
【図５】２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の相対バイアス図である。
【図６】２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の相対バイアス図である。
【図７】前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬の検出結果の線形相関性である。
【図８】前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の検出結果の線形相関性である。
【図９】前記２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の検出結果の線形相関性である。
【図１０】ＲＯＣ曲線分析図である。
【図１１】ＧＰ７３検出結果のデータ分布図である。
【図１２】臨床一致性の分析図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、図面及び実施例を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する。本明細書の好ましい実施例は、本発明を解釈するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ使用され、本発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。本明細書の数値範囲については、範囲の上限と下限の間の各中間値も具体的に開示されていることを理解されたい。本明細書での記載値若しくは記載範囲内の中間値、及び他の記載値若しくは前記範囲内の中間値の間の各小さい範囲も、すべて本発明の範囲内に含まれる。これらの小さい範囲の上限と下限は、独立して範囲に含まれたり除外されたりすることができる。
【００２１】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明は、好ましい実験方法、アッセイ、又は試験のみを記載しているが、本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法も、本発明の実験、アッセイ、又は試験において使用することができる。本明細書で言及されるすべての文献は、前記文献に関連する方法又は実験を開示及び説明するために参照により組み込まれる。組み込まれた文献と矛盾する場合は、本明細書の内容が優先される。
【００２２】
本発明において、文脈上特に明確に示されていない限り、用語には単数形と複数形の両方が含まれる。本発明に記載の「少なくとも１つ」又は「少なくとも１種」は、「１つ」又は「１種」を含むだけではなく、「複数個」又は「複数種」も含む。
【００２３】
ＧＰ７３標的マーカー及びＧＰ７３検出方法、判定基準が提供される。抗ＧＰ７３タンパク質抗体を用いて抗原抗体結合反応の免疫学的検出方法（化学発光法、酵素結合免疫法、免疫クロマトグラフィー法を含む）に基づく検出試薬、及び前記方法の改良法の任意方法に基づく定量検出試薬を調製する。前記定量試薬により検出されるサンプルは、脂肪肝患者の血液サンプルであり、血清、血漿、全血のいずれか１種であり得る。前記血液サンプルの検出結果は、脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別診断に用いられる。
【００２４】
本発明のＧＰ７３の測定方法は、試薬の使用を含み、前記試薬に抗体が含まれるが、これに限定されない。前記抗体は、具体的にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片（例えば、抗体における所望の生物学的活性を示す可変領域及び他の部分）を含む。用語「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」とは、高度特異性を有し、単一の抗原決定基（エピトープ）に対する抗体をいう。従って、用語「モノクローナル」とは、同じエピトープに対する抗体を指し、特定の方法により抗体を産生する必要があると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、当分野で知られている任意の技術又は方法により製造できることが理解されるべきである。例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５）、当分野で知られている組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、又は使用ファージ抗体ライブラリーを用い、以下の文献に記載の技術により分離し、組換えの方式でモノクローナル抗体を生産する方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）を含む。
【００２５】
本発明において、「抗体断片」とは、完全抗体と異なる分子を指し、完全抗体の一部を含み、完全抗体が結合する抗原に結合する。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重抗体、線形抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明に記載の試薬は、他の試薬をさらに含む。前記他の試薬の例には、ＡＢＣ希釈液、ＴＭＢ発色液、ＴＭＢ停止液、洗浄液などを含む。いくつかの実施形態において、上記の物質のいずれかは、使用中に互いに接触できる限り、他の物質と独立して異なる容器（例えば、バイアル）に別々に保管されてもよい。上記物質のいずれか２つ以上は混合されて混合物として存在できることが好ましい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、前記他の試薬は、それぞれ乾燥粉末又は溶液（例えば、水溶液の状態）として提供されてもよい。水溶液の状態で存在する場合において、これらの物質の濃度又は含有量は、当業者が異なる需要に応じて簡単に確定することができる。例えば、保存を目的とする場合、前記物質は高濃度で存在することができ、作業状態又は使用状態である場合、例えば、前記高濃度の溶液を希釈することにより濃度を作業濃度に低くすることができる。
【００２８】
本発明において、ＧＰ７３の測定試薬は、さらに脂肪肝を罹患している被験体に対して単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別するための診断剤に調製され得る。前記診断剤は、診断組成物、診断キットの形態であってもよいか、又は単独して存在する複数の試薬の併用などの他の形態であってもよい。
【００２９】
（実施例１）
抗ＧＰ７３タンパク質抗体の製造
抗ＧＰ７３タンパク質抗体は、既存の特許技術を参照して製造されてもよく、市販されている抗ＧＰ７３タンパク質抗体から選択されておもよく、又は既知の技術により製造されてもよい。製造又は選択されたモノクローナル抗体は、脂肪肝患者の血液サンプルにおけるＧＰ７３の正確定量測定及び結果判定に適用できる。
【００３０】
本発明をよりよく説明するために、本発明のいくつかの実施形態に記載の抗ＧＰ７３タンパク質抗体は、北京熱景生物技術股分有限公司の特許技術（「抗ＧＰ７３タンパク質モノクローナル抗体、その製造方法及び使用」ＣＮ１０１７３５３１９  Ｂ）に記載の抗ＧＰ７３タンパク質抗体の製造方法に従って製造された抗ＧＰ７３タンパク質抗体を使用することが好ましい。前記抗ＧＰ７３タンパク質抗体の製造に用いられるハイブリドーマ細胞株（３Ｅ１２株）は、２００８年１１月１１日に保蔵番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．２７４２で中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託されている。
【００３１】
モノクローナル抗体の調製
成年ＢＡＬＢ／ｃマウスにプリスタン又は流動パラフィンを０．３−０．５ｍｌ／匹で腹腔内接種し、７−１０日後、ＰＢＳ又は無血清培地で希釈した３Ｅ１２株のハイブリドーマ細胞株を５×１０５／０．２ｍｌ／匹で腹腔内接種した後、マウスの腹水産生状況を毎日観察し、腹部が顕著に膨張するとき、つまり、手で触ると皮膚のハリ感を感じるときに、約３ｍｌ／匹で腹水を収集し、腹水を２０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離することで細胞成分及び沈殿物を除去し、上清を回収し、組換えｐｒｏｔｅｉｎＧプレパッククロマトグラフィックカラムにより精製し、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体を得た。
【００３２】
（実施例２）
化学発光法用検出試薬の製造
前記化学発光法は、化学発光法、磁性粒子化学発光法、電気化学発光法、酵素化学発光法、時間分解化学発光法及びその改良法の少なくとも１種である。異なる化学発光法の間は、標識粒子及び分離方法のみが異なり、反応原理が同じであり、抗ＧＰ７３タンパク質抗体の濃度を最適化処理することにより、いずれも脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を正確で定量的に検出鑑別することができ、脂肪性肝炎の診断と治療を補助する目的を達成できる。ＧＰ７３化学発光法用検出試薬の製造は、成熟した化学発光法製造技術を採用し、当該技術を最適化することにより優れた検測結果が得られる。
【００３３】
本発明をよりよく説明するために、本発明のいくつかの実施形態において、前記化学発光法は、磁性粒子化学発光法であることが好ましい。磁性粒子化学発光法用検出試薬の製造は、北京熱景生物技術股分有限公司の関連特許技術に従って行うことができる。前記抗体は、実施例１に記載の抗ＧＰ７３タンパク質抗体である。
【００３４】
１．ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬のＧＰ７３分離試薬の調製
前記ＧＰ７３分離試薬は、磁性粒子と抗ＧＰ７３タンパク質抗体とを反応させてリンカーを形成し、一定の濃度で緩衝液を加えることにより製造される。具体的なステップは以下の通りである。
磁気ビーズを均一に混合した後、磁場を印加して上清を除去し、コーティング緩衝液で磁気ビーズを１回洗浄した後、活性化剤（カルボジイミド）を加え、常温で３０分間振盪反応させた後、上清を除去し、コーティング緩衝液及び適量の抗ＧＰ７３タンパク質抗体を加え、常温で３時間振盪し、反応終了後、ブロッキング液を加えて振盪し、最後に洗浄液を加え、洗浄した後、保存液を加え、一晩保存する。
【００３５】
前記コーティング緩衝液は、０．１ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）である。
【００３６】
前記活性化剤カルボジイミドの最終濃度は０．０１−０．１ｇ／ｍｌである。
【００３７】
前記抗ＧＰ７３タンパク質抗体の最適濃度は１０−１００ｕｇ／ｍｇ磁気ビーズである。
【００３８】
コーティング終了後、磁場を印加して上清を捨て、約１０倍体積のブロッキング液を加え、常温で少なくとも１時間振盪する。
【００３９】
前記ブロッキング液の主成分は、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、１−５％ＢＳＡ溶液、０．１％防腐剤であり、ｐＨ７．４である。
【００４０】
ブロッキング終了後、磁場を印加して上清を捨て、約１０倍体積の洗浄液を加えて洗浄する。
【００４１】
前記洗浄液の主成分は、０．０２ＭのＰＢＳ、１００ｎＭ塩化ナトリウム溶液、０．５−１％のツイーン（ＴＷＥＥＮ）−２０溶液である。
【００４２】
洗浄終了後、磁場を加えて上清を捨て、１０倍体積の磁性粒子保存液を正確に加え、抗ＤＣＰモノクローナル抗体の磁性粒子をＧＰ７３分離試薬として保存する。
【００４３】
前記保存液の主成分は、０．０２−０．１ＭのＰＢＳ溶液、１％−５％のＢＳＡ溶液、０．１％の防腐剤、０．５−３％のグリシン溶液であり、ｐＨ７．４である。
【００４４】
２．ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬の製造
前記検出試薬は、アルカリホスファターゼで標識された抗ＧＰ７３タンパク質抗体を一定の濃度で緩衝液に加えて調製される。
【００４５】
本発明をよりよく説明するために、コーティング抗体に対応して、アルカリホスファターゼ標識抗体は、抗ＧＰ７３タンパク質抗体であることが好ましい。この製造方法は、本発明を説明するものに過ぎず、標識抗体の製造及び使用を制限するものではない。
【００４６】
抗ＧＰ７３タンパク質抗体との質量比が１／４〜１／１のアルカリホスファターゼを取り、アルカリホスファターゼ溶液と等体積のＮａＩＯ４（１２．８ｍｇ／ｍｌ、４℃使用時に調製）を加え、４℃、暗所で３０分間反応させた後、アルカリホスファターゼ溶液と等体積のエチレングリコール溶液を加え、４℃、暗所で４５分間反応させ、抗ＧＰ７３タンパク質抗体を加え、さらに混合液の体積の１／４０〜１／１０のＣＢＳ標識緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．６）を加え、４℃、暗所で一晩透析し、最後に硫酸アンモニウム溶液を加え、２時間反応させ、遠心分離し、上清を捨て、沈殿を０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳで溶解した後、４℃、暗所で一晩透析し、その後、等体積のグリセリンを加えて均一に混合した後、−２０℃で保存する。
【００４７】
所定の割合（推奨濃度≧１：１０００）でアルカリホスファターゼで標識された抗ＧＰ７３タンパク質抗体を保存液に加え、均一に混合することで、ＧＰ７３標識抗体を検出試薬として得る。
【００４８】
３．ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬の洗浄液の製造
前記洗浄液の主成分は、０．１ＭのＴｒｉｓ緩衝液、０．１−１％のツイーン溶液、０．１％の防腐剤である。
【００４９】
４．ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬のキャリブレーション溶液の製造
前記ＧＰ７３キャリブレーション溶液は、検査に合格したＧＰ７３抗原をキャリブレーション生産希釈液に加え、凍結乾燥させることにより製造される。
【００５０】
前記キャリブレーション生産希釈液は、１−５％のＢＳＡ溶液、１−５％のトレハロース溶液、１０−５０％の新生児ウシ血清溶液を含む。高抗体価のＧＰ７３抗原凍結乾燥液を最適濃度となるまで段階希釈し、検出した後、凍結乾燥機で凍結乾燥させる。ここで、予備凍結時間は２ｈであり、真空引き時間は１６−２４時間である。
【００５１】
５．ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬の製造
ＧＰ７３分離試薬、ＧＰ７３検出試薬、ＧＰ７３洗浄液、ＧＰ７３基質液をプロセス又は明細書の要求に従ってそれぞれ対応サイズの試薬瓶、又はストリップ試薬の試薬ストリップの対応孔に充填した後、密封する。充填された試薬は、キャリブレーション溶液、消耗材反応タンク、使い捨てサンプリングヘッドなどと共にＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬を構成する。前記試薬は、北京熱景生物技術股分有限公司製のＭＱ６０シリーズ自動免疫分析装置に適用できる。
【００５２】
（実施例３）
ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬（９６人分）の製造
前記酵素結合免疫法は、酵素結合免疫吸着法、ドット免疫濾過法、磁性粒子酵素結合免疫法分析、酵素結合免疫蛍光測定法及びプロテインチップ法の少なくとも１種、又は酵素結合免疫の改良法の少なくとも１種である。異なる酵素結合免疫法の間は、担体のみが異なり、反応原理が同じであり、抗ＧＰ７３タンパク質抗体の濃度を最適化処理することにより、いずれも脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を正確で定量的に検出鑑別することができ、脂肪性肝炎の診断と治療を補助する目的を達成できる。ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬の製造は、成熟した酵素結合免疫法製造技術を採用し、当該技術を最適化することにより優れた検測結果が得られる。
【００５３】
本発明をよりよく説明するために、本発明のいくつかの実施形態において、前記酵素結合免疫法は、酵素結合免疫吸着法であることが好ましい。酵素結合免疫法用検出試薬の製造は、北京熱景生物技術股分有限公司の関連特許技術に従って行うことができる。前記抗体は、実施例１に記載の抗ＧＰ７３タンパク質抗体である。
【００５４】
ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬（９６人分）の組成は、ＧＰ７３標準品５瓶、抗ＧＰ７３タンパク質抗体コーティングプレート（９６ウェル）１枚、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗ＧＰ７３タンパク質抗体１瓶（１０ｍｌ／瓶）、発色液Ａ  １瓶（５ｍｌ／瓶）、発色液Ｂ  １瓶（５ｍｌ／瓶）、停止液１瓶（５ｍｌ／瓶）洗液（２０×濃縮）１瓶（５０ｍｌ／瓶）を含む。
【００５５】
１．ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬の標準品の製造
高抗体価ＧＰ７３抗原を、０、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌの異なる濃度で２％のＢＳＡ溶液に希釈し、最終濃度が０．１％になるまで防腐剤ｐｒｏｃｌｉｎｅ３００を加え、濾過して除菌し、無菌の条件下、０．５ｍｌ／バイアルで１．５ｍｌのバイアルに分注する。４℃で保存する。
【００５６】
２．抗ＧＰ７３タンパク質抗体コーティングプレート（９６ウェル）の製造
ＥＬＩＳＡ用プレートは、１２×８又は８×１２の分割可能なストリップタイプのＥＬＩＳＡ用プレートを採用する。抗ＧＰ７３タンパク質抗体を０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液で１０−５０μｇ／ｍｌに希釈した後、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに加え、一晩吸着させ、洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ溶液、２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ、０．５％ツイーン−２０を含み、ｐＨ７．４）でプレートを洗浄し、１２０μｌ／ウェルのブロッキング液緩衝液（２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴ溶液に希釈）で一晩ブロッキングした後、ブロッキング液を捨て、乾燥させ、抗ＧＰ７３タンパク質抗体コーティングプレート（９６ウェル）を得、アルミホイルバッグで真空密閉包装する。
【００５７】
３．西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗ＧＰ７３タンパク質抗体の製造（全過程は暗所で処理する）。
【００５８】
ＨＲＰを５ｍｇ秤量し、ｄｄＨ２Ｏを２５０μｌ加えて溶解し、ＮａＩＯ４を５ｍｇ秤量し、ｄｄＨ２Ｏを２５０μｌ加えて溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製する。ＨＲＰ溶液にＮａＩＯ４溶液を一滴ずつ滴下し、滴下しながら撹拌し、混合した溶液を４℃で３０分間静置する。５ｍｌエチレングリコールを２５μｌのｄｄＨ２Ｏに溶解したものを前記混合溶液に一滴ずつ滴下し、ＨＲＰ最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるまで滴下しながら撹拌し、室温で３０分間静置する。
【００５９】
抗ＧＰ７３タンパク質抗体の濃度を約５ｍｇ／ｍｌに調整し、抗ＧＰ７３タンパク質抗体とＨＲＰとを１：４で混合し、５０ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中で６時間以上透析し、最初の２時間に緩衝液を１回交換する。
【００６０】
新たに調製した１ｍｇのＮａＢＨ４溶液で反応を停止させ、均一に振った後、４℃で２時間静置し、３０分ごとに振る。
【００６１】
１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）（予め０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４のストック溶液を調製し、必要なｐＨ値に応じて両者を均一に混合してＰＢＳ緩衝液を形成する）で一晩透析し、緩衝液を１回交換する。
【００６２】
ＨＲＰ標識抗ＧＰ７３タンパク質抗体溶液を飽和硫酸アンモニウム溶液で一晩透析した後、限外濾過チューブにより１２０００ｒｐｍで遠心分離し、濃縮された精製ＨＲＰ標識抗ＧＰ７３タンパク質抗体を得る。
【００６３】
ＨＲＰ標識抗ＧＰ７３タンパク質抗体を１０％ウシ胎児血清含有緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ）で適切な作業濃度（推奨希釈濃度≧１：５００）に希釈し、１０ｍｌ／瓶で分注し、４℃で保存する。
【００６４】
４．発色液Ａの調製
リン酸−クエン酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＨ５．０）で３％過酸化水素溶液を調製し、５ｍｌ／瓶で分注する。
【００６５】
５．発色液Ｂの調製
ＴＭＢ（０．１ｍｇ／ｍｌ）メタノール溶液を５ｍｌ／瓶で分注する。
【００６６】
６．停止液の調製
２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を５ｍｌ／瓶で分注する。
【００６７】
７．洗浄液（２０倍濃縮液）
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製された１％ツイーン２０溶液を５０ｍｌ／瓶で分注する。
【００６８】
ＧＰ７３標準品、抗ＧＰ７３タンパク質抗体コーティングプレート、ＨＲＰ標識抗ＧＰ７３タンパク質抗体、発色液Ａ、発色液Ｂ、停止液１瓶、洗浄液（２０×濃縮）を用いて要求に従ってＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬（９６人分）を調製する。
【００６９】
（実施例４）
ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬（９６人分）の使用方法は、以下のステップを含む。
１．洗浄緩衝液の調製：濃縮緩衝液に２０倍の精製水を加えて希釈する。
２．標準品の準備：標準品は、０、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ  の５つの異なる濃度を含む。
３．抗原−抗体反応：抗体コーティングプレートのマイクロウェルにそれぞれ１００μｌのサンプル希釈液を加えた後、異なる濃度の標準品又は測定血清サンプルを１０μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄する。
４．酵素結合反応：各ウェルに１００μｌのＨＲＰ標識抗ＧＰ７３タンパク質抗体溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄する。
５．呈色反応：各ウェルに順に５０μｌの発色液Ａ、５０μｌの発色液Ｂをそれぞれ加え、３７℃で１０分間インキュベートし、さらに各ウェルに５０μｌの停止液を加えて反応を停止させる。
６．比色：ブランク対照ウェルの吸光度でゼロ調整した後、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍでＯＤ平均値を測定し、各ウェルの吸光度を記録し、ダブルウェル標準品ＯＤ値の平均値を計算する。
７．結果計算
１）標準曲線の描画：標準品濃度を横座標、標準品の測定された平均ＯＤ値を縦座標として本測定の標準曲線を描き、標準曲線の回帰係数Ｒ２を計算し、Ｒ２≧０．９８である場合、本実験は有効である
２）測定用サンプル濃度の計算：測定用サンプルのＯＤ値に基づいて標準曲線からＧＰ７３濃度を算出する。
【００７０】
（実施例５）
免疫クロマトグラフィー法は、アップコンバージョン発光免疫クロマトグラフィー法、ラテックス免疫クロマトグラフィー法、コロイド金免疫クロマトグラフィー法、発光免疫クロマトグラフィー法、量子ドット免疫クロマトグラフィー法の少なくとも１種である。
【００７１】
ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の製造
前記免疫クロマトグラフィー法は、アップコンバージョン発光免疫クロマトグラフィー法、ラテックス免疫クロマトグラフィー法、コロイド金免疫クロマトグラフィー法、発光免疫クロマトグラフィー法、量子ドット免疫クロマトグラフィー法又は免疫クロマトグラフィー法の改良法の少なくとも１種である。異なる免疫クロマトグラフィー法の間は、標識粒子のみが異なり、反応原理が同じであり、抗ＧＰ７３タンパク質抗体の濃度を最適化処理することにより、いずれも脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を正確で定量的に検出鑑別することができ、脂肪性肝炎の診断と治療を補助する目的を達成できる。ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の製造は、成熟した免疫クロマトグラフィー法製造技術を採用し、当該技術を最適化することにより優れた検測結果が得られる。
【００７２】
本発明をよりよく説明するために、本発明のいくつかの実施形態において、前期免疫クロマトグラフィー法は、アップコンバージョン発光免疫クロマトグラフィー法であることが好ましい。酵アップコンバージョン発光免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の製造は、北京熱景生物技術股分有限公司の関連特許技術に従って行うことができる。前記抗体は、実施例１に記載の抗ＧＰ７３タンパク質抗体である。
【００７３】
ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の製造
１．コーティング
抗ＧＰ７３タンパク質抗体を２ｍｇ／ｍｌに希釈してＴラインコーティング液とし、ヤギ抗マウスＩｇＧを２ｍｇ／ｍｌに希釈してＣラインコーティング液とし、スプレー機によりＴラインコーティング液及びＣラインコーティング液コーティングをニトロセルロース膜にラインコーティングし、乾燥させ、モノクローナル抗体でコーティングされたフィルムストリップを得る。
【００７４】
２．アップコンバージョン発光粒子（ＵＣＰ）標識抗体
１０ｍｇのＵＣＰ粒子を秤量して三角フラスコに入れ、１０ｍｌ、ｐＨ＝７．２、０．２０ＭのＰＢ溶液を加え、ＵＣＰ粒子懸濁液を調製し、その後、０．５−２ｍｇの抗ＧＰ７３タンパク質抗体を加え、さらに最終濃度が１％となるまで無水グルタルアルデヒドを加え、３７℃で一晩撹拌し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、ＵＣＰ沈殿物に１０ｍｌ、ｐＨ＝７．２、０．２０ＭのＰＢ溶液を加え、均一に混合し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、ＵＣＰ沈殿物を回収する。
【００７５】
３．ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の凍結乾燥コンジュゲートパッドの製造
５０ｍｌ、ｐＨ＝７．２、０．２０ＭのＰＢ溶液でＵＣＰ沈殿物を再懸濁し、ＵＣＰ標識物懸濁液を調製し、１２０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した後、上清を捨て、４５ｍｌの凍結乾燥液（ｐＨ＝７．２０、２０ＭのＰＢ、２％ＢＳＡ、３％スクロース）を加え、ＵＣＰ標識物懸濁液を２−５ｃｍ２／ｍｌでガラス繊維上に加え、１１時間真空凍結乾燥させ、凍結乾燥したコンジュゲートパッドを幅が１ｃｍのストリップにカットし、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の凍結乾燥コンジュゲートパッドを得る。
【００７６】
４．試験紙ストリップの組み立て
順にニトロセルロース膜、吸水紙、コンジュゲートパッド、サンプルパッドをベースプレートに貼り付け、幅が４．０ｍｍの紙ストリップにカットした後、プラスチックカードの底ケースに入れ、プラスチックカードの上ケースでカバーし、圧密し、乾燥剤を加え、密封包装する。
【００７７】
５．サンプル希釈液の調製
サンプル希釈液の成分は、０．２０ＭのＰＢ溶液（ｐＨ＝７．２）及び１％ツイーン２０である。
【００７８】
６．組み立てられたＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬ストリップ及びサンプル希釈液は共同でＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を構成し、北京熱景生物技術股分有限公司のＵＰＴ−３Ａシリーズのアップコンバージョン発光免疫分析装置と共に使用できる。
【００７９】
（実施例６）
ＧＰ７３定量検出サンプルの準備
前記検出サンプルは、いずれも臨床サンプルに由来し、明確な臨床診断の背景（脂肪肝）を有する。
【００８０】
前記臨床的に脂肪肝と診断されたサンプルは合計２００例であり、脂肪性肝炎と診断された肝疾患進行サンプル（脂肪性肝炎に引き起こされる肝線維症サンプル及び肝硬変サンプルを含むが、肝がん患者サンプルを含まない。以下、脂肪性肝炎サンプルと略す）の血清／血漿サンプル６３例、及び単純性脂肪肝と診断された脂肪肝サンプル１３７例を含む。
【００８１】
全血サンプルは、長時間保存されにくいため、長期コホートサンプルを構築して検出分析を行うのに適しておらず、本発明の上記実施例では分析されていないが、本発明に基づいて改良されるＧＰ７３の全血検出に適し、脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するためのＧＰ７３の検出方法及びその判定基準は、本発明の保護範囲内に含まれると見なられるべきである。
【００８２】
（実施例７）
それぞれＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬により臨床的に脂肪肝と診断されたサンプル２００例を検出し、検出結果をそれぞれまとめて分析する。
【００８３】
１．異なる方法の検出結果の分析
ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の検出結果の絶対バイアス、絶対バイアス及び線形相関性を統計分析し、異なる方法の間の偏差状況を判断する。
【００８４】
ａ．絶対バイアス分析
「方法比較及び偏差評価方法ＮＣＣＬＳ  ＥＰ９−Ａ」に規定の方法及び基準に基づいて、全てのサンプルの絶対偏差を計算する。
前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の最大絶対偏差は２０．０８であり、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の平均絶対偏差の４倍、即ち２０．２２よりも小さい。図１は、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の絶対バイアス図である。
【００８５】
前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の最大偏差は２０．９２であり、２００例ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の平均絶対偏差の４倍、即ち２０．１０よりも小さい。図２は、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の絶対バイアス図である。
【００８６】
前記２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の最大絶対偏差は１７．４３であり、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の平均絶対偏差の４倍、即ち１９．０３よりも小さい。図３は、２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の絶対バイアス図である。
【００８７】
上記分析の結果から分かるように、ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の絶対偏差は、いずれもＮＣＣＬＳ  ＥＰ９−Ａに規定の範囲内にあり、この３つの方法の間には顕著な偏差がない。
【００８８】
ｂ．相対バイアス分析
「方法比較及び偏差評価方法ＮＣＣＬＳ  ＥＰ９−Ａ」に規定の方法及び基準に基づいて、全てのサンプルの相対偏差を計算する。  
前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の最大相対偏差は３０．８９％であり、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の平均相対偏差の４倍、即ち３２．３６％よりも小さい。図４は、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果の相対バイアス図である。
【００８９】
前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の最大相対偏差は３３．９１％であり、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の平均相対偏差の４倍、即ち３３．９８％よりも小さい。図５は、２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果相対バイアス図である。
【００９０】
前記２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の最大相対偏差は３０．４８％であり、いずれもＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の平均相対偏差の４倍、即ち３０．５５％よりも小さい。図６は、２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の相対バイアス図である。
【００９１】
上記分析の結果から分かるように、ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果の相対偏差は、いずれもＮＣＣＬＳ  ＥＰ９−Ａに規定の範囲内にあり、この３つの方法の間には顕著な偏差がない。
【００９２】
ｃ．線形相関性の分析
前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬を用いた検出結果は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェアにより相関係数を算出した結果、Ｒ２＝０．９９２７である。図７は、前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬の検出結果の線形相関性である。
【００９３】
前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェアにより相関係数を算出した結果、Ｒ２＝０．９９１６である。図８は、前記２００例のＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の検出結果の線形相関性である。
【００９４】
前記２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬を用いた検出結果は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェアにより相関係数を算出した結果、Ｒ２＝０．９９０４である。図９は、前記２００例のＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の検出結果の線形相関性である。
【００９５】
絶対バイアス分析、絶対バイアス分析及び線形相関性分析の結果から分かるように、ＧＰ７３が脂肪肝サンプルの検出分析に用いられる場合、ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬、ＧＰ７３酵素結合免疫法用検出試薬、ＧＰ７３免疫クロマトグラフィー法用検出試薬の３種の方法は、脂肪肝サンプルに対する検出結果が良好な一致性を有する。
【００９６】
４．検出結果のカットオフ値の設定及び臨床一致性分析
ａ．カットオフ値の設定
ＧＰ７３磁性粒子化学発光法用検出試薬を用いた検出結果を用い、２００例の臨床背景を根拠とし、ＲＯＣ曲線により分析したところ、用于脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別診断におけるＧＰ７３のカットオフ値は８２．２５ｎｇ／ｍｌである。図１０は、ＲＯＣ曲線分析図であり、図１１は、ＧＰ７３検出結果のデータ分析図である。
【００９７】
ｂ．臨床一致性の分析
既知の臨床背景の結果（単純性脂肪肝：１３７例、脂肪性肝炎：６３例）を用いて比較分析し、ＧＰ７３の含有量８２．２５ｎｇ／ｍｌを脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別診断におけるカットオフ値とする場合の検出結果、単純性脂肪肝の一致率はいずれも８６．８６％であり、脂肪性肝炎の一致率はいずれも８５．７１％であり、総一致率は８６．５０％である。図１２は、臨床一致性の分析図である。臨床背景が検出結果と一致しない偏差サンプルは、主に目標値が８２．２５ｎｇ／ｍｌ±２０％の範囲にある。
【００９８】
本発明の実施例の分析から分かるように、血清学的標的マーカーＧＰ７３及びその使用は、脂肪肝患者において単純性脂肪肝と脂肪性肝炎を鑑別診断するための優れた血清学的標的マーカーとして適用でき、ＧＰ７３の含有量８２．２５ｎｇ／ｍｌを脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の鑑別診断におけるカットオフ値である場合、特異性は８６．８６％であり、感度は８５．７１％であるため、異なる検出方法の間の検出結果の一致性は高い。
【００９９】
血清学的標的マーカーＧＰ７３及びその使用は、脂肪肝患者の単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の臨床鑑別診断、単純性脂肪肝と脂肪性肝炎の治療に対する補助に対して、極めて高い臨床応用価値を有する。
【０１００】
上記実施例は、本発明の好ましい実施例であり、上記のように、本発明に対する解釈として理解されるべきであり、本発明を制限するものではなく、他の実施形態が除外されると見なされるべきではなく、様々な他の形態の組み合わせ、修正に使用することができ、本発明の思想の範囲内で変更することができる。本発明の思想及び範囲内で当業者によって行われる修正及び変更はすべて、本発明の添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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