(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組み換え微生物から製品を生産するための多段階発酵バイオプロセスであって：
製品を生産するための遺伝子組み換え微生物を提供することと；
提供された前記遺伝子組み換え微生物を、増殖期の培地で育てることであり、
前記遺伝子組み換え微生物は、
ｉ  前記製品の生合成のための少なくとも１つの生産酵素を含む生産経路と、
ｉｉ  合成代謝調節弁が誘導された時に、ＧＭＯ内の複数の代謝経路を通るフ
ラックスを削減または排除するための１つ以上の前記合成代謝調節弁と
、を含み、
前記１つ以上の合成代謝調節弁が、
ａ）酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングする少なくとも
１つのサイレンシングＳＭＶと、
ｂ）酵素のタンパク質分解を制御する少なくとも１つのタンパク質分解ＳＭＶ
と、を含む、ことと；
生産的な固定相に移行することであって、前記生産経路または前記１つ以上の合成代謝調節弁を欠く微生物と比較して、遺伝子組み換え微生物の成長が遅くなるか停止して製品の生産が促進され、前記１つ以上の合成代謝調節弁を誘導することにより、前記生産的な固定相に移行することと；
前記製品を生産することと、
を含む多段階発酵バイオプロセス。
【請求項２】
前記製品が、アミノ酸、酢酸、アセトイン、アセトン、アクリル、リンゴ酸塩、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ブチレート、イソブチレート、２−ＯＨ−イソブチレート、３−ＯＨ−ブチレート、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、ピルビン酸、イタコネート、レブリン酸、グルカレート、グルタル酸、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、縮合アルコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、ギ酸塩、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸、マレイン酸、及びポリヒドロキシ酪酸、からなる群から選択される、
請求項１に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項３】
前記サイレンシング代謝調節弁によってサイレンシングされる前記酵素と、前記タンパク質分解合成代謝調節弁によるタンパク質分解を受ける前記酵素が、それぞれ、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｄｐ、ｚｗｆ、及びｕｄｈＡ、からなる群から選択された遺伝子によってエンコードされ、あるいは、
前記サイレンシング代謝調節弁は、遺伝子発現とガイドＲＮＡ遺伝子の配列を含むＣＡＳＣＡＤＥプラスミドの発現とのＣＲＩＳＰＲ干渉によって特徴付けられ、あるいは、
前記タンパク質分解合成代謝調節弁は、Ｎ末端またはＣ末端タグに機能的に連結されたタンパク質分解酵素の発現によって特徴付けられ、制御されたタンパク質分解は、合成代謝弁の誘導時にＮ末端またはＣ末端タグを含む酵素に対して選択的である、
請求項１に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項４】
製品を生産するための遺伝子組み換え微生物を提供するステップは、
複数の異なる遺伝子組み換え微生物の提供することであり、
それぞれの遺伝子組み換え微生物は、
ｉ  前記製品の生合成のための少なくとも１つの生産酵素を含む生産経路と、
ｉｉ  合成代謝調節弁が誘導された時に、前記遺伝子組み換え微生物内の複数の代
謝経路を通るフラックスを削減または排除するための１つ以上の合成代謝調節弁と、を含み、
前記１つ以上の合成代謝調節弁が、
ａ）酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングするサイレンシン
グＳＭＶと、
ｂ）酵素のタンパク質分解を制御するタンパク質分解ＳＭＶと、を含み、
前記複数の遺伝子組み換え微生物のそれぞれは、１つ以上の生産酵素、サイレ
ンシングされる前記酵素、あるいはタンパク質分解される前記酵素によって、その
中で区別される、ことと；
増殖期にある培地で前記複数の遺伝子組み換え微生物のそれぞれを独立して増殖させることと；
前記生産経路または前記１つ以上の合成代謝調節弁を欠く微生物と比較して、遺伝子組み換え微生物の成長が遅くなるか停止して製品の生産が促進される、生産的な固定相に移行することであって、前記合成代謝調節弁を誘導することにより、前記生産的な固定相に移行することと；
前記製品を生産することと、
一定期間後、前記複数の遺伝子組み換え微生物のそれぞれについて、生産段階で生産された製品のレベルを測定することと；
生産された製品のレベルに基づいて、発酵プロセスに提供される遺伝子組み換え微生物を選択することと；を含む
請求項１に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項５】
前記製品はアラニンであり、
前記生産酵素または前記生産酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結された遺伝子のプロモーター配列は、前記遺伝子組み換え微生物が由来する種に対して異種であり、
アラニン生産の異種酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）、アラニンエクスポーター（ａｌａＥ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＮ）、またはそれらの組み合わせの１つである、
請求項１に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項６】
前記製品はメバロン酸塩または３−ＨＰであり、
前記生産酵素または前記生産酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結された遺伝子のプロモーター配列は、前記遺伝子組み換え微生物が由来する種に対して異種であり、
メバロン酸塩または３−ＨＰ生産の異種酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性３-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、またはそれらの組み合わせの１つである、
請求項１に記載の多段階発酵バイオプロセス。
【請求項７】
遺伝子組み換え微生物株であって、
ｉ  製品の生合成のための少なくとも１つの生産酵素を含む生産経路と；
ｉｉ  １つ以上の合成代謝調節弁が誘導された場合に、遺伝子組み換え微生物内の複数の代謝経路を通るフラックスを低減または排除できる前記１つ以上の合成代謝調節弁の組み合わせであり、
前記１つ以上の合成代謝調節弁が、
ａ）酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングする少なくとも１
つのサイレンシングＳＭＶと、
ｂ）酵素のタンパク質分解を制御するタンパク質分解ＳＭＶと、を含み、
前記１つ以上の合成代謝調節弁の誘導により、遺伝子組み換え微生物の成長が遅くなるか停止して製品の生産が促進され、
前記サイレンシング代謝調節弁によってサイレンシングされる前記酵素と、前記タンパク質分解合成代謝調節弁によるタンパク質分解を受ける前記酵素が、それぞれ、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｄｐ、ｚｗｆ、及びｕｄｈＡ、からなる群から選択された遺伝子によってエンコードされる、
遺伝子組み換え微生物株。
【請求項８】
前記製品はアラニンであり、
前記生産経路の前記酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）、アラニンエクスポーター（ａｌａＥ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＮ）、またはそれらの組み合わせの１つであり、
前記合成代謝調節弁は、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ１、またはｇｌｔＡ２の遺伝子発現のサイレンシングと、ｆａｂＩまたはｕｄｈＡの制御されたタンパク質分解の組み合わせを含む、
請求項７に記載の遺伝子組み換え微生物株。
【請求項９】
前記製品はメバロン酸塩または３−ＨＰであり、
前記生産経路の前記酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性３-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、またはそれらの組み合わせの１つであり、
前記合成代謝調節弁は、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ１、またはｇｌｔＡ２の遺伝子発現のサイレンシングと、ｆａｂＩまたはｕｄｈＡの制御されたタンパク質分解の組み合わせを含む、
請求項７に記載の遺伝子組み換え微生物株。
【請求項１０】
複数の約50から約500の遺伝子組み換え微生物株であり、
複数の遺伝的に改変された微生物のそれぞれは、生産酵素、サイレンシングされる酵素、またはタンパク質分解される酵素のうちの１つ以上によって区別される、
請求項７に記載の遺伝子組み換え微生物株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロバストな動的な代謝コントロールの為の組成物及び方法に関する。
【０００２】
相互参照
本願は、２０１７年２月２１日出願の米国仮出願第６２／４６１，４３６号の利益を請求し、此の出願は其の全体が参照に依って本願に組み込まれる。
【０００３】
連邦出資の研究についての陳述
本発明は、夫々ＤＯＤ／ＤＡＲＰＡ、ＮＡＶＹ／ＯＮＲ、及びＮＳＦに依って授与された連邦補助金第ＨＲ００１１−１４−Ｃ−００７５、１２０４３９５６、及び１４４５７２６号に依る政府の援助に依って成された。政府は本発明に何らかの権利を有する。
【０００４】
配列表の参照
本願は配列表を含有し、此れはＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、其の全体が参照に依って此処で組み込まれる。２０１８年２月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは５２２４０＿７０２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、サイズが８１，６９７バイトである。
【背景技術】
【０００５】
バイオ医薬品及び低分子治療薬からスペシャリティー、バルク、及びコモディティーケミカル迄のあらゆる物、並びに次世代バイオ燃料をさえも生産する為のバイオテクノロジーに基づく発酵プロセスが、首尾良く開発されて来た。発酵科学及び合成生物学並びに代謝及び酵素工学の分野に於けるテクノロジー開発が原因で、此れ等のプロセスは近年に於いて急速な進歩をして来た。此れ等の実質的な進展にも関わらず、合理的で指向的な工学アプローチの最も首尾良い例も又、多数の且つ多くの場合に長長しい試行錯誤のサイクルに大いに依拠して来た。本開示は、同時に問題の複雑さ（及び然るべき設計領域のサイズ）を縮減し乍ら、環境条件に対する代謝応答をも又最小化する戦略を提供し、操作された株のロバスト性及びスケーラブル性を増大させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
部分的には、本開示は、生産微生物株の迅速な開発を可能にする高スループットな工学プラットホームを提供する。
【０００７】
１つの態様に於いて、本開示は産物を生成する為の細胞を提供し、細胞は：代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減の為の異種的なポリヌクレオチド（酵素の発現のコントロールされた縮減は細胞の静止期を誘導する）と；産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の異種的な生産ポリヌクレオチドと；を含み、酵素を欠く細胞と比較して、静止期の間の産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。
【０００８】
幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは代謝経路のフラックスを縮減する。幾つかの実施形態に於いて、酵素はエノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、生産酵素はＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ、アラニン排出輸送体、及びＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、環境条件の変化は、細胞に接触する培養培地の糖の濃度を増大又は減少させる事を含む。幾つかの実施形態に於いて、糖はグルコースである。幾つかの実施形態に於いて、環境条件の変化は、細胞に接触する培養培地の酸素供給を増大又は減少させる事を含む。幾つかの実施形態に於いて、産物は３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。
【０００９】
幾つかの実施形態に於いて、産物はアミノ酸を含む。幾つかの態様に於いて、アミノ酸はアラニンを含む。幾つかの態様に於いて、細胞は培養に依って増殖させられ、培養に依るアラニンの生産の速度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの態様に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの態様に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの態様に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．６ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの態様に於いて、培養は少なくとも８０ｇ／Ｌのアラニンを生産する。幾つかの態様に於いて、培養は少なくとも１００ｇ／Ｌのアラニンを生産する。幾つかの態様に於いて、培養は少なくとも１２０ｇ／Ｌのアラニンを生産する。幾つかの態様に於いて、培養は少なくとも１４０ｇ／Ｌのアラニンを生産する。幾つかの態様に於いて、生産ポリヌクレオチドはアラニン排出輸送体をコードする。幾つかの態様に於いて、アラニン排出輸送体はａｌａＥである。
【００１０】
幾つかの実施形態に於いて、産物はメバロン酸を含む。幾つかの実施形態に於いて、細胞は培養に依って増殖させられ、培養に依るメバロン酸の生産の速度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも１．２ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも１．２５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの態様に於いて、細胞は培養に依って増殖させられ、培養は少なくとも５０ｇ／Ｌのメバロン酸を生産する。幾つかの実施形態に於いて、培養は少なくとも７０ｇ／Ｌのメバロン酸を生産する。幾つかの実施形態に於いて、培養は少なくとも９０ｇ／Ｌのメバロン酸を生産する。幾つかの実施形態に於いて、培養は少なくとも９５ｇ／Ｌのメバロン酸を生産する。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは：酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される。
【００１１】
幾つかの態様に於いて、異種的なポリヌクレオチドはサイレンシングポリヌクレオチドを含み、サイレンシングポリヌクレオチドは、酵素をコードする遺伝子のプロモーターを認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかの態様に於いて、異種的なポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、ＣＲＩＳＰＲ酵素はｇＲＮＡに結合した時にプロモーター配列に特異的に結合する。幾つかの態様に於いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒的に不活性である。幾つかの態様に於いて、異種的なポリヌクレオチドは分解ポリヌクレオチドを含み、分解ポリヌクレオチドは分解タグをコードする配列を含み、分解タグは酵素の分解を媒介する。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、生産ポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００１２】
別の態様に於いては、方法が本願に於いて開示され：細胞の複数の株を独立して培養する事（各株は、（ｉ）代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の異種的なポリヌクレオチド（酵素の発現のコントロールされた縮減は、細胞の静止期を誘導する）と；（ｉｉ）産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の異種的な生産ポリヌクレオチドと；を含み、複数の株の各株は、異種的なポリヌクレオチド又は異種的な生産ポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列が別の株とは異なる）と；複数の株を静止期迄増殖させる事と；複数の株から或る株を選択する事（静止期の間に選択された株に依って生産される産物のレベルに基づく）とを含む。
【００１３】
幾つかの実施形態に於いて、方法は、産物のレベルを決定する事を含む。幾つかの実施形態に於いて、方法は、選択された株を増殖させる事を含む。幾つかの実施形態に於いて、選択された株はバイオリアクターに依って増殖させられる。幾つかの実施形態に於いて、選択された株を含む培養培地は少なくとも５００ｍｌの体積を有する。幾つかの実施形態に於いて、培養培地は少なくとも１Ｌの体積を有する。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは：酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、複数の株の第１及び第２の株はサイレンシングポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態に於いて、サイレンシングポリヌクレオチドは、酵素をコードする遺伝子のプロモーター配列を認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかの実施形態に於いて、ｇＲＮＡ配列は第１及び第２の株間で異なる。幾つかの実施形態に於いて、複数の株の第１及び第２の株は分解ポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態に於いて、分解ポリヌクレオチドは第１及び第２の株間で異なる。幾つかの実施形態に於いて、酵素はエノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、生産酵素はＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ、アラニン排出輸送体、及びＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、産物はメバロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、及びアミノ酸から成る群から選択される。
【００１４】
幾つかの実施形態に於いて、産物はアミノ酸であり、アミノ酸はアラニンである。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して、選択された株の細胞、静止期の間の産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。幾つかの実施形態に於いて、環境条件の変化は、細胞に接触する培養培地の糖の濃度の変化を含む。幾つかの実施形態に於いて、環境条件の変化は、細胞に接触する培養培地の酸素供給の変化を含む。
【００１５】
別の態様に於いては、細胞性の産物を生成する為の方法が本願に於いて開示され：培養培地に依って異種的な細胞を培養する事を含み、異種的な細胞は：（ｉ）代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の異種的なポリヌクレオチド（酵素の発現のコントロールされた縮減は細胞の静止期を誘導する）と；（ｉｉ）産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の異種的な生産ポリヌクレオチドと；を含み、酵素を欠く細胞と比較して、静止期の間の産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。
【００１６】
１つの実施形態に於いて、方法は環境条件を変化させる事を更に含む。１つの実施形態に於いて、環境条件は培養培地の糖の濃度を含み、環境条件を変化させる事は濃度を増大又は減少させる事を含む。幾つかの実施形態に於いて、糖はグルコースである。幾つかの実施形態に於いて、環境条件は培養培地の酸素濃度を含み、環境条件を変化させる事は酸素濃度を増大又は減少させる事を含む。幾つかの実施形態に於いて、培養する事は、バイオリアクターに依って実施される。幾つかの実施形態に於いて、培養培地は少なくとも５００ｍｌの体積を有する。幾つかの実施形態に於いて、培養培地は少なくとも１Ｌの体積を有する。幾つかの実施形態に於いて、産物は３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。幾つかの実施形態に於いて、産物はアミノ酸を含む。幾つかの実施形態に於いて、アミノ酸はアラニンを含む。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．６ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、生産ポリヌクレオチドはアラニン排出輸送体をコードする。幾つかの実施形態に於いて、アラニン排出輸送体はａｌａＥである。
【００１７】
幾つかの実施形態に於いて、産物はメバロン酸を含む。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも１．２ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、メバロン酸の生産の速度は少なくとも１．２５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは：酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドはサイレンシングポリヌクレオチドを含み、サイレンシングポリヌクレオチドは、酵素をコードする遺伝子のプロモーター配列を認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡに結合した時にプロモーター配列に特異的に結合する。幾つかの実施形態に於いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒的に不活性である。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは分解ポリヌクレオチドを含み、分解ポリヌクレオチドは分解タグをコードする配列を含み、分解タグは酵素の分解を媒介する。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、生産ポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００１８】
別の態様に於いては、アラニンの生産の為の細胞が本願に於いて開示され、細胞は：（ｉ）代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減の為の異種的なポリヌクレオチド（酵素はエノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される）と；（ｉｉ）アラニン排出輸送体（アラニン排出輸送体は、野生型細胞と比較して増大したレベルで発現される）とを含む。
【００１９】
幾つかの実施形態に於いて、アラニン排出輸送体はａｌａＥ遺伝子に依ってコードされる。幾つかの実施形態に於いて、酵素の発現のコントロールされた縮減は細胞の静止期を誘導する。幾つかの実施形態に於いて、細胞は、アラニンの生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大の為の異種的な生産ポリヌクレオチドを更に含む。幾つかの実施形態に於いて、生産酵素はＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは：酵素をコードする遺伝子の転写抑制を媒介する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドはサイレンシングポリヌクレオチドを含み、サイレンシングポリヌクレオチドは、酵素をコードする遺伝子のプロモーター配列を認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかの実施形態に於いて、ポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ酵素を更にコードし、ＣＲＩＳＰＲ酵素はｇＲＮＡに結合した時にプロモーター配列に特異的に結合する。幾つかの実施形態に於いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒的に不活性である。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは分解ポリヌクレオチドを含み、分解ポリヌクレオチドは分解タグをコードする配列を含み、分解タグは酵素の分解を媒介する。幾つかの実施形態に於いて、ポリヌクレオチドは細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、生産ポリヌクレオチドは細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００２０】
幾つかの実施形態に於いて、培養は細胞を含む。幾つかの実施形態に於いて、培養に依るアラニンの生産の速度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、培養に依るアラニンの生産の速度は少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、培養に依るアラニンの生産の速度は少なくとも１．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、培養に依るアラニンの生産の速度は少なくとも１．６ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、培養は少なくとも１００ｇ／Ｌのアラニンを生産する。幾つかの実施形態に於いて、培養は少なくとも１２０ｇ／Ｌのアラニンを生産する。幾つかの実施形態に於いて、培養は少なくとも１４０ｇ／Ｌのアラニンを生産する。
【００２１】
幾つかの態様に於いては、アラニンの生産の方法が本願に於いて開示され、（ｉ）代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減の為の異種的なポリヌクレオチド（酵素はエノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される）と；（ｉｉ）アラニン排出輸送体（アラニン排出輸送体は、野生型細胞と比較して増大したレベルで発現される）とを含む細胞を、培養培地に依って増殖させる事を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態に於いて、酵素の発現のコントロールされた縮減は細胞の静止期を誘導する。幾つかの実施形態に於いて、方法は、静止期の間の培養培地の酸素供給レベル又は糖濃度を減少させる事を更に含み、異種的なポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して、細胞性の産物の生産の速度は減少させる事に対して応答してより縮減されない。幾つかの実施形態に於いて、糖はグルコースである。幾つかの実施形態に於いて、アラニン排出輸送体はａｌａＥ遺伝子に依ってコードされる。幾つかの実施形態に於いて、細胞は、アラニンの生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大の為の異種的な生産ポリヌクレオチドを更に含む。幾つかの実施形態に於いて、生産酵素は：ＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは：酵素をコードする遺伝子の転写抑制を媒介する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドはサイレンシングポリヌクレオチドを含み、サイレンシングポリヌクレオチドは、酵素をコードする遺伝子のプロモーター配列を認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、ＣＲＩＳＰＲ酵素はｇＲＮＡに結合した時にプロモーター配列に特異的に結合する。幾つかの実施形態に於いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒的に不活性である。幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドは分解ポリヌクレオチドを含み、分解ポリヌクレオチドは分解タグをコードする配列を含み、分解タグは酵素の分解を媒介する。
【００２３】
幾つかの実施形態に於いて、異種的なポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、生産ポリヌクレオチドは細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかの実施形態に於いて、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．５ｇ／Ｌ／時間である。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生産の速度は少なくとも１．６ｇ／Ｌ／時間である。
【００２４】
参照に依る組み込み
本明細書に於いて挙げられている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照に依って組み込まれる事を具体的に且つ個々に指示される場合と同じ程度に、参照に依って本願に組み込まれる。
【００２５】
本発明の新規の特徴は添付の請求項に正確に提示されている。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を提示する次の詳細な記載、及び付随する図面の参照に依って得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａは２段階発酵に於ける動的な代謝コントロールの概観を図示している。図１Ｂは株及びバイオプロセス最適化を図示している。
【図２Ａ】乃至
【図２Ｄ】Ｅ．ｃｏｌｉに於ける２段階の合成的な代謝調節弁（ＳＭＶ）の実装の例を図示している。
【図３Ａ】乃至
【図３Ｋ】２段階の動的コントロールを利用するＥ．ｃｏｌｉに於けるアラニン生産の例を図示している。
【図４Ａ】乃至
【図４Ｆ】２段階及び増殖連動型アプローチ間の例のロバスト性比較を図示している。
【図５Ａ】乃至
【図５Ｊ】マイクロ発酵及び１Ｌ発酵に依る「調節弁」及び増殖連動型アラニン生産の例の比較を図示している。
【図６Ａ】乃至
【図６Ｈ】２段階の動的コントロールを利用するＥ．ｃｏｌｉに於けるメバロン酸生産の例を図示している。
【図７】燐酸欠乏プロモーターキャラクタリゼーションの例を図示している。
【図８】インスレーター付き燐酸欠乏プロモーターキャラクタリゼーションの例を図示している。
【図９】インスレーター付き恒常的プロモーターキャラクタリゼーションの例を図示している。
【図１０】２段階発酵に於ける最適な３−ＨＰフラックスの為の代謝モデル化結果の例を図示している。
【図１１】染色体改変の例を図示している。
【図１２】１ＬのＦＧＭ１０最少培地発酵に於ける出発ホスト株の平均最大増殖速度の例を図示している。ｎ＝２。
【図１３Ａ】乃至
【図１３Ｅ】１Ｌの標準的な最少培地発酵に於いて出発ホスト株の増殖期の間に利用されるグルコースの分配の例を図示している。
【図１４】ｐＣＡＳＣＡＤＥ−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド構築スキームを図示している。
【図１５Ａ】乃至
【図１５Ｂ】ｐＣＡＳＣＡＤＥ構築スキームを図示している。
【図１６Ａ】乃至
【図１６Ｃ】マイクロ発酵プロセスの概観を図示している。
【図１７】異なるインスレーター付き燐酸プロモーターをＤＬＦ＿００２５株に用いたＬ−アラニン生産の為のマイクロ発酵を図示している。
【図１８】ｇａｐＮ／ｇａｐＡ株に依るＬ−アラニン生産のヒートマップを図示している。
【図１９Ａ】乃至
【図１９Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２０Ａ】乃至
【図２０Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２１Ａ】乃至
【図２１Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２２Ａ】乃至
【図２２Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２３Ａ】乃至
【図２３Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２４Ａ】乃至
【図２４Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２５Ａ】乃至
【図２５Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２６Ａ】乃至
【図２６Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２７Ａ】乃至
【図２７Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２８Ａ】乃至
【図２８Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図２９Ａ】乃至
【図２９Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図３０Ａ】乃至
【図３０Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図３１Ａ】乃至
【図３１Ｄ】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された４つの株について図示している。
【図３２】マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産を、ロバスト性について評価された１つの株について図示している。
【図３３Ａ】乃至
【図３３Ｂ】本文書に於いて評価した１Ｌスケールの全ての調節弁及び増殖連動型株の増殖プロファイルを図示している。
【図３４】文献からの最も高いメバロン酸力価を有する株及び此の仕事に於いて評価したメバロン酸株１について、比生産性（ＳＰ）比較を図示している。
【図３５】ＭＳ測定からのアラニン標準曲線を図示している。トリプリケートの標準的な測定からの質量分析応答の平均及び標準偏差をプロットした。
【図３６Ａ】乃至
【図３６Ｂ】ＲＩ測定からのグルコース及びエタノール標準曲線を図示している。
【図３７】ＴＵＶ測定からの３−ヒドロキシプロピオン酸標準曲線を図示している。
【図３８Ａ】乃至
【図３８Ｄ】Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、メバロン酸、及びメバロノラクトンのＴＵＶ標準曲線を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
文脈が明瞭に別様に命じていない限り、明細書及び請求項に於いて用いられる単数形「a」、「an」、及び「the」は複数の指示物を包含する。其れ故に、例えば、「発現ベクター」と言う事は、単一の発現ベクター、及び同じ（例えば同じオペロン）か又は異なるか何方かの複数の発現ベクターを包含する；「微生物」と言う事は、単一の微生物及び複数の微生物を包含する；並びに同類である。
【００２８】
本願に於いて用いられる「縮減された酵素活性」、「酵素活性を縮減する事」、及び同類が意味する事は、微生物細胞の又は単離された酵素が、同じ生物種の同等の細胞又は其の天然酵素に於いて測定される物よりも低いレベルの活性を見せると言う事を指示する事である。詰まり、其の酵素の公知の標準的な条件に於ける指示されている基質（単数又は複数）から指示されている産物（単数又は複数）への酵素的変換は、標準的な所定の条件に於ける天然（非改変）酵素に依る同じ生化学的変換の酵素活性よりも、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、又は少なくとも９０パーセント少ない。此の用語は其の酵素活性の除去をも又包含し得る。酵素の縮減された酵素活性を有する細胞は、当分野に於いて公知の何れかの方法を用いて同定され得る。例えば、縮減された酵素活性を有する細胞を同定する為に、酵素活性アッセイが用いられ得る。例えば、「酵素命名法（Enzyme Nomenclature）」，アカデミック・プレス社（Academic Press, Inc.），ニューヨーク，２００７年を見よ。
【００２９】
本願に於いて用いられる用語「異種的なＤＮＡ」、「異種的な核酸配列」、及び同類は、次の少なくとも１つが真である核酸配列を言う：（ａ）所与のホスト微生物にとって外来性の（即ち、其れに天然に見出されない）核酸の配列；（ｂ）配列は所与のホスト微生物に天然に見出され得るが、不自然な（例えば、予期されるよりも多大な）量である；又は（ｃ）核酸の配列が、天然に於いて互いに対して同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含む。例えば、場合（ｃ）に関して、組み換え的に生産される異種的な核酸配列は、遺伝子発現を駆動する非天然のプロモーター等の新たな機能核酸を作る様に配列された無関係な遺伝子同士からの２つ以上の配列を有するであろう。
【００３０】
本願に於いて用いられる用語「合成的な代謝調節弁」及び同類は、代謝フラックスを変改する為の、コントロールされた蛋白質分解、遺伝子サイレンシング、又は蛋白質分解及び遺伝子サイレンシング両方の組み合わせ何方かの使用を言う。
【００３１】
後者の用語が当分野に於いて一般的に用いられる通り、用語「異種的」は用語「外因性」を包含する事を意図されている。異種的な核酸配列の導入に先立つホスト微生物のゲノムを参照すると、酵素をコードする核酸配列は異種的である（異種的な核酸配列が其のゲノムに導入されるか否かに関わらない）。
【００３２】
本願に於いて用いられる用語「遺伝子破壊」又は其の文法的な均等物（且つ「酵素機能を破壊する事」、「酵素機能の破壊」、及び同類を包含する）は、其の様に改変されていない微生物細胞の又は其れからのポリペプチド活性と比較して縮減されたポリペプチド活性を有する様にコードされる遺伝子産物を返す、微生物の遺伝子改変を意味する事を意図される。例えば、遺伝子改変は、遺伝子全体の欠失、転写若しくは翻訳に要求される制御配列の欠失若しくは他の改変、短縮型の遺伝子産物（例えば酵素）を齎す遺伝子の部分の欠失、又はコードされる遺伝子産物の活性を縮減する種々の変異戦略の何れか（検出可能な活性レベル無し迄活性を縮減する事を包含する）であり得る。破壊は、酵素をコードする核酸配列の全て又は一部の欠失を幅広く包含し得、他の型の遺伝子改変、例えば、終止コドンの導入、フレームシフト変異、遺伝子の部分の導入又は取り除き、並びに分解シグナルの導入、ｍＲＮＡ転写レベル及び／又は安定性を左右する遺伝子改変、並びに酵素をコードする遺伝子の上流のプロモーター又はリプレッサーを変改する事をも又包含するが、此れ等に限定されない。
【００３３】
本願に於いて用いられるバイオプロダクション又は発酵は好気的、微好気的、又は嫌気的であり得る。
【００３４】
請求項を包含する本願に於いて、遺伝子産物、例えば酵素の遺伝子改変と言われる時には、遺伝子改変は、述べられている遺伝子産物、例えば酵素を通常コードする遺伝子等の又は其れを包含する核酸配列についてである事が理解される。
【００３５】
本願に於いて用いられる用語「代謝フラックス」及び同類は、産物及び／又は副産物形成の変化に至る代謝の変化を言い、所与の基質からの生産速度、生産力価、及び生産収量を包含する。
【００３６】
生物種及び他の生物系統的な識別は、微生物学の業者に公知の分類に従う。
【００３７】
本願に於いては、酵素はユニバーサル・プロテイン・リソース（Universal Protein Resource）（Ｕｎｉｐｒｏｔ）識別番号を参照して挙げられており、此れは当業者には周知であろう（ＵｎｉｐｒｏｔはＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアムに依って維持されており且つ利用可能である）。
【００３８】
本願に記載される方法及びステップが、何らかの順序で特定の事象同士が起こる事を指示している時には、当業者は、特定のステップ同士の並びが改変され得ると言う事と、斯かる改変が本発明の変形に従うと言う事とを認識するであろう。加えて、特定のステップ同士は、逐次的に実施され得るのは勿論、可能な時には並行したプロセスに依って同時に実施され得る。
【００３９】
略語の意味は次の通りである：「Ｃ」は其の慣用法から明瞭である通りセルシウス又はセルシウス度を意味し、ＤＣＷは乾燥細胞重量を意味し、「ｓ」は秒（単数又は複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数又は複数）を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」、又は「ｈｒｓ」は時間（単数又は複数）を意味し、「ｐｓｉ」はポンド毎平方インチを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日（単数又は複数）を意味し、「μＬ」又は「ｕＬ」又は「ｕｌ」はマイクロリットル（単数又は複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数又は複数）を意味し、「Ｌ」はリットル（単数又は複数）を意味し、「ｍｍ」はミリメートル（単数又は複数）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモーラーを意味し、「μＭ」又は「ｕＭ」はマイクロモーラーを意味し、「Ｍ」はモーラーを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数又は複数）を意味し、「μｍｏｌ」又は「ｕＭｏｌ」はマイクロモル（単数又は複数）を意味し、「ｇ」はグラム（単数又は複数）を意味し、「μｇ」又は「ｕｇ」はマイクログラム（単数又は複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（単数又は複数）を意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの光子波長に於いて測定される光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対（単数又は複数）を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対（単数又は複数）を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「ａＴｃ」はアンヒドロテトラサイクリンを意味し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味し、「ｒｐｍ」は回転毎分を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。
【００４０】
概観
生産微生物株の迅速な最適化を可能にする高スループットな代謝工学プラットホームが本願に於いて提供される。プラットホームは活性な代謝ネットワークの動的な最小化に依拠しており、此れは現行のインビボ及びインビトロのバイオプロダクションアプローチの間のギャップを橋渡しする。動的な代謝ネットワーク最小化は、必須の中央代謝の複数の酵素の活性を縮減する為にＣＲＩＳＰＲ干渉及びコントロールされた蛋白質分解の組み合わせを用いて成し遂げられ得る。最小化は、標準化された２段階バイオプロセスの文脈に於いて実装され得る。此のアプローチは、大いに縮減された複雑さを有する設計領域のみならず、増大した代謝フラックス及び生産速度、並びに環境条件に対してロバストである株をも又、齎し得る。ロバスト性は、高スループットな小スケールスクリーニング又は「マイクロ発酵」から完全計装化バイオリアクターへの予測可能なスケーラブル性に至り得る。合成生物学の急速に増大して行くスループット及び減少して行くコストを真に活用する為には、予測性がある高スループットなアプローチが代謝工学プログラムにとって決定的であり得る。本願に於いて提供される例は、此のアプローチの原理証明を普通の産業微生物：Ｅ．ｃｏｌｉに依って実証したのみならず、２つの重要な産業ケミカル：アラニン及びメバロン酸を商業的に意味がある速度、力価（夫々１４７ｇ／Ｌ及び９７ｇ／Ｌ）、及び収量で生産するＥ．ｃｏｌｉ株の迅速な最適化に依って此のアプローチを検証した。
【００４１】
高スループットな様式のケミカル生産の為の微生物を迅速に最適化する為のシステム及び方法も又本願に於いて提供される。
【００４２】
ケミカル生産の為の開示されるプラットホーム及び／又は方法に用いられ得る微生物も又、本願に於いて提供される。
【００４３】
合成的な代謝調節弁（ＳＭＶ）
本開示は、次の１つ以上又は組み合わせを含む合成的な代謝調節弁（ＳＭＶ）の構築を記載する：コントロールされた遺伝子サイレンシング及びコントロールされた蛋白質分解。遺伝子サイレンシング及びコントロールされた蛋白質分解の為の幾つかの方法論を当業者が知っていると言う事は了解される。
【００４４】
ＳＭＶを利用するプラットホーム微生物株の開発は、増殖を産物形成から切り離し得る。此れ等の株は代謝経路の動的コントロールを可能にし、変改された時に微生物増殖への負の効果を有する物を包含する。代謝の動的コントロールは、転写サイレンシング及びコントロールされた酵素蛋白質分解を包含するが此れ等に限定されない方法論の組み合わせに依って成し遂げられる。此れ等の微生物株は多段階バイオプロセスに利用され、少なくとも２つの段階、微生物が増殖させられ且つ代謝が微生物増殖にとって最適化され得る第１の段階と、増殖がゆっくりに又は終止させられ得、且つ代謝の動的な変化が成されてケミカル又は燃料等の所望の産物の生産を改善し得る少なくとも１つの他の段階とを包摂する。段階間の増殖している培養の遷移と代謝フラックスの操作とは、人工ケミカル誘導因子に依って又は好ましくは鍵と成る制限栄養素のレベルをコントロールする事に依ってコントロールされ得る。加えて、１つ以上のケミカル又は燃料産物の生合成の為の代謝経路を提供する為の遺伝子改変が成され得る。グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、マンノース、及びラクトース等の糖、オイル、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、並びにホルムアルデヒドを包含するが此れ等に限定されない、種々の炭素フィードストックの利用を可能にする為の遺伝子改変も又成され得る。
【００４５】
此のアプローチは生産期の間の代謝フラックス及び生理学的要求のより単純なモデルを許し、増殖している細胞を静止期生体触媒へと換える。此れ等の合成的な代謝調節弁は、必須遺伝子をオフにし、炭素、電子、及びエネルギーフラックスを産物形成へと方向転換する為に、多段階発酵プロセスに於いて用いられ得る。次の１つ以上は此れ等の合成的な調節弁を可能にする：２）誘導性の酵素分解及び３）静止又は非分裂細胞状態を誘導する為の栄養素制限との組み合わせで、１）転写遺伝子サイレンシング又は抑制テクノロジー。ＳＭＶは何れかの経路及び微生物ホストへと一般化可能である。此れ等の合成的な代謝調節弁は、全細胞触媒作用に依って生産され得る再生可能なケミカル及び燃料並びに何れかの産物の生産に有用な、新規の迅速な代謝工学戦略を許す。
【００４６】
種々のケースでは、１つのＳＭＶは１つの遺伝子（又は其の蛋白質産物）の操作を言い得る。操作は遺伝子のコントロールされたサイレンシング及び／又は其の蛋白質産物のコントロールされた分解であり得る。特定のケースでは、ＳＭＶの組み合わせが収量、速度、及び／又はロバスト性の改善された生産に至り得、此れは２つの遺伝子（又は其れ等の蛋白質産物）の操作を包含する。幾つかのケースでは、操作された微生物は少なくとも１つのＳＭＶを含む。幾つかのケースでは、操作された微生物は１つよりも多くのＳＭＶを含む。幾つかのケースでは、操作された微生物は２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０個、又はより多くのＳＭＶを含む。
【００４７】
バイオプロダクションの為の方法及びシステム
本願に於いては、バイオ医薬品及び低分子治療薬からスペシャリティー、バルク、及びコモディティーケミカル、並びにバイオ燃料迄の分子のロバストな大スケール生産の為の方法又はシステムが提供される。本願に於いて提供される方法又はシステムは、限定された一連の代謝酵素を含む操作された微生物を用いる事を含む。幾つかの実施形態に於いて、操作された微生物は、縮減されたレベル又は活性を有する少なくとも１つの代謝酵素を含む。幾つかの実施形態に於いて、操作された微生物は、縮減されたレベル又は活性を有する２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０個、又はより多くの代謝酵素を含む。本願に於いて提供される方法及びシステムは環境条件に対する代謝応答を縮減し得、小スケール（例えばｍｇｓ）生産から大スケール（例えばｋｇｓ）生産へと容易に移入され得る。本願に於いて提供される方法及びシステムは、小スケール（例えばｍｇｓ）から大スケール（例えばｋｇｓ）生産への移行に関連する時間及びコストを縮減し得る。
【００４８】
遺伝子改変微生物は本開示の範囲内であり、微生物は、マロニルＣｏＡ、ピルビン酸、オキサロ酢酸、エリトロース−４−燐酸、キシルロース−５−燐酸、アルファ−ケトグルタル酸、及びクエン酸を包含するが此れ等に限定されない何れかの鍵と成る代謝中間体に由来する産物を、０．０５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒ、０．ｌｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．２ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．４ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大、又は０．５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒよりも多大な速度から選択される具体的な速度で生産する事が出来る。
【００４９】
種々の実施形態に於いて、本発明は、水系培地中の炭素源と遺伝子改変微生物とを含む培養システムを包含し、前記遺伝子改変生物は、０．０５ｇＤＣＷ／Ｌよりも多大、０．１ｇＤＣＷ／Ｌ、１ｇＤＣＷ／Ｌよりも多大、５ｇＤＣＷ／Ｌよりも多大、１０ｇＤＣＷ／Ｌよりも多大、１５ｇＤＣＷ／Ｌよりも多大、又は２０ｇＤＣＷ／Ｌよりも多大から選択される量で存在し、例えば、此の時に、水系培地の体積は５ｍＬよりも多大、１００ｍＬよりも多大、０．５Ｌよりも多大、１Ｌよりも多大、２Ｌよりも多大、１０Ｌよりも多大、２５０Ｌよりも多大、１０００Ｌよりも多大、１０，０００Ｌよりも多大、５０，０００Ｌよりも多大、１００，０００Ｌよりも多大、又は２００，０００Ｌよりも多大から選択され、例えば、此の時に、水系培地の体積は２５０Ｌよりも多大であり且つスチールベッセル内に含有される。
【００５０】
炭素源
本発明に於いて組み換え体微生物に用いられるバイオプロダクション培地は、増殖及び生産段階両方の為の好適な炭素源又は基質を含有しなければ成らない。好適な基質は、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、オイル、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、及びグリセロールを包含し得るが、此れ等に限定されない。上で挙げられている炭素基質及び其れ等の混合物の全ては本発明に於いて炭素源（単数又は複数）として好適である事が企図される。
【００５１】
微生物
本願に於いて記載及び請求される特徴は、１つ以上の天然の、導入された、又は強化された産物バイオプロダクション経路をも又含む、本願のリストから選択される微生物又は別の好適な微生物に依って提供され得る。其れ故に、幾つかの実施形態に於いて、微生物（単数又は複数）は内在性の産物生産経路（幾つかの斯かる実施形態では、此れは強化され得る）を含むが、他の実施形態に於いては、微生物は内在性の産物生産経路を含まない。
【００５２】
例は、特定の細菌及び真菌微生物の具体的な改変及び評価を記載している。本発明の範囲は、斯かる生物種には限定されず、広範な好適な微生物に一般的に応用可能である事が意味されている。
【００５３】
バイオプロダクションの為の好適なホスト細胞又はホスト微生物は原核又は真核何方かであり得る。好適なホスト細胞又はホスト微生物は、細菌、例えばシトロバクター、エンテロバクター、クロストリジウム、クレブシエラ、エアロバクター、ラクトバシラス、アスペルギルス、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、ジゴサッカロマイセス、ピチア、クルイベロマイセス、カンジダ、ハンゼヌラ、デバリオマイセス、ムコール、トルロプシス、メチロバクター、エシェリキア、サルモネラ、バシラス、ストレプトマイセス、及びシュードモナスであり得る。幾つかの実施形態に於いて、ホスト細胞又は操作された細胞はＥ．ｃｏｌｉである。幾つかの実施形態に於いて、ホスト細胞又は操作された細胞はＳ．セレビシエである。
【００５４】
特定の態様に於いては、本願に於いては、産物の生合成の為の少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、複数の代謝経路のフラックスをコントロール可能に縮減又は除去する為の複数の合成的な代謝調節弁の組み合わせと：を含む様に遺伝子改変された微生物が提供される。幾つかの実施形態に於いて、複数の合成的な代謝調節弁の夫々は、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現のコントロールされたサイレンシング又は（ｉｉ）少なくとも１つの蛋白質のコントロールされた蛋白質分解型の不活性化の為の、１つ以上の遺伝子を含む。幾つかの実施形態に於いて、産物の生合成の速度は栄養素の欠乏に依って生産的な静止期に於いて増大し、栄養素の欠乏は複数の合成的な代謝調節弁を誘導する。幾つかのケースでは、遺伝子発現のコントロールされたサイレンシングはＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲ干渉、又は転写抑制に依って成し遂げられる。幾つかのケースでは、コントロールされた蛋白質分解型の不活性化は、特異的プロテアーゼに依る蛋白質切断又は特異的ペプチドタグに依る標的化された分解に依って成し遂げられる。幾つかのケースでは、栄養素は燐酸、窒素、硫黄、マグネシウム、又は其れ等の組み合わせである。
【００５５】
特定の態様に於いては、遺伝子改変微生物が本願に於いて提供され：次の代謝物質の１つからの産物の生合成の為の少なくとも１つの酵素を含む生産経路と：ピルビン酸、アセト乳酸、アセチルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ、又はマロニルＣｏＡ；複数の合成的な代謝調節弁の組み合わせとを含み、複数の合成的な代謝調節弁の夫々は、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ、又はｕｄｈＡ遺伝子の１つを、（ｉ）前記ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ、若しくはｕｄｈＡ遺伝子の対応する１つの遺伝子発現のコントロールされたサイレンシング又は（ｉｉ）前記ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ、若しくはｕｄｈＡ遺伝子の対応する１つに依ってコードされる蛋白質のコントロールされた蛋白質分解型の不活性化の為に含む。幾つかの実施形態に於いて、産物の生合成の速度は栄養素の欠乏に依って生産的な静止期に於いて増大し、栄養素の欠乏は複数の合成的な代謝調節弁を誘導する。幾つかの実施形態に於いて、産物はアラニン又は其れの誘導体である。幾つかの実施形態に於いて、産物はメバロン酸又は其れの誘導体である。幾つかの実施形態に於いて、産物はマロン酸又は其れの誘導体である。幾つかの実施形態に於いて、栄養素は燐酸、窒素、硫黄、マグネシウム、又は其れ等の組み合わせである。
【００５６】
特定の態様に於いては、ピルビン酸からアラニンを生産する為の生産経路と；複数の合成的な代謝調節弁の組み合わせとを含む遺伝子改変微生物が本願に於いて提供され、複数の合成的な代謝調節弁の夫々は、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ、又はｕｄｈＡ遺伝子の１つを、（ｉ）前記ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ、若しくはｕｄｈＡ遺伝子の対応する１つの遺伝子発現のコントロールされたサイレンシング又は（ｉｉ）前記ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、ｌｐｄ、ｚｗｆ、若しくはｕｄｈＡ遺伝子の１つに依ってコードされる蛋白質のコントロールされた蛋白質分解型の不活性化の為に含む。幾つかの実施形態に於いて、アラニンの生合成の速度は栄養素の欠乏に依って生産的な静止期に於いて増大し、栄養素の欠乏は複数の合成的な代謝調節弁を誘導する。幾つかの実施形態に於いて、栄養素は燐酸、窒素、硫黄、マグネシウム、又は其れ等の組み合わせである。
【００５７】
幾つかのケースでは、遺伝子改変微生物は異種的な細胞である。幾つかのケースでは、産物を生成する為の異種的な細胞が本願に於いて提供される。幾つかのケースでは、異種的な細胞は、代謝経路に於いて作用する調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の操作された調節弁ポリヌクレオチドを含む。特定のケースでは、調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減は代謝経路のフラックスを縮減し、調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減は、異種的な細胞の静止期を誘導する。幾つかのケースでは、異種的な細胞は、産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の操作された生産ポリヌクレオチドを更に含む。幾つかの状況では、異種的な細胞は、代謝経路に於いて作用する調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の操作された調節弁ポリヌクレオチドを含み、調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減を欠く細胞と比較して、静止期の間の産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。
【００５８】
幾つかのケースでは、産物を生成する為の異種的な細胞が本願に於いて提供され、前記細胞は：代謝経路に於いて作用する調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の操作された調節弁ポリヌクレオチド（前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減は前記代謝経路のフラックスを縮減し、前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減は前記細胞の静止期を誘導する）と；前記産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の操作された生産ポリヌクレオチドと；を含み、前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減を欠く細胞と比較して、前記静止期の間の前記産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。
【００５９】
幾つかのケースでは、調節弁酵素の縮減された発現又は活性を含む細胞が本願に於いて提供され、調節弁酵素は、エノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ（ｆａｂＩ）、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ）、ＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）、及び其れ等の組み合わせから成る群から選択される酵素を含む。
【００６０】
幾つかのケースでは、生産酵素を含む細胞が本願に於いて提供され、生産酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）、アラニン排出輸送体（ａｌａＥ）、ＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＮ）、及び其れ等の組み合わせから成る群から選択される酵素を含む。
【００６１】
環境条件
環境条件は培地及び培養条件を含み得る。生産に影響し得る環境因子は温度、ｐＨ、酸性度、エタノール、亜硫酸、及び利用可能な栄養素量であり得る。
【００６２】
例えば本願に於いて開示される型の１つから選択される適切な炭素源に加えて、バイオプロダクション培地は、本開示に依る培養の増殖とケミカル産物バイオプロダクションに必要な酵素経路の促進とに好適な、当業者に公知の好適なミネラル、塩、補因子、緩衝液、及び他の構成成分を含有し得る。本発明の別の態様は、本発明の遺伝子改変微生物及び任意に補助栄養素を含む培地及び培養条件に関する。
【００６３】
典型的には、細胞は、適切な培地に依って約２５℃から約４０℃の範囲の温度、好熱性微生物では最高で７０℃に於いて増殖させられる。好適な増殖培地は当分野に於いては良くキャラクタリゼーションされており、公知である。
【００６４】
バイオプロダクションの為の好適なｐＨ範囲はｐＨ２．０からｐＨ１０．０の間であり、此処で、初期条件では、ｐＨ６．０からｐＨ８．０が典型的なｐＨ範囲である。然し乍ら、具体的な実施形態の実際の培養条件は、此れ等のｐＨ範囲に依って限定される事を意味していない。
【００６５】
バイオプロダクションは好気的、微好気的、又は嫌気的条件に於いて撹拌有り又は無しで実施され得る。
【００６６】
幾つかのケースでは、環境条件の変化は、細胞に接触する培養培地の糖濃度の変化を含む。幾つかのケースでは、培養培地の糖濃度の変化は糖濃度の増大である。幾つかの他のケースでは、糖濃度の変化は糖濃度の減少である。幾つかの状況では、糖濃度の増大は、培養培地の元々の糖濃度と比較して、１％から２％、２％から３％、３％から４％、４％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から８０％、８０％から９０％、又は９０％から１００％多い糖である。幾つかの状況では、糖濃度の減少は、培養培地の元々の糖濃度と比較して、１％から２％、２％から３％、３％から４％、４％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から８０％、８０％から９０％、又は９０％から１００％少ない糖である。
【００６７】
幾つかのケースでは、環境条件の変化は、細胞に接触する培養培地の酸素供給の変化を含む。幾つかのケースでは、培養培地の酸素供給の変化は酸素供給の増大である。幾つかの他のケースでは、培養培地の酸素供給の変化は酸素供給の減少である。幾つかの状況では、酸素供給の増大は、培養培地に追加された酸素の元々の量よりも１％から２％、２％から３％、３％から４％、４％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から８０％、８０％から９０％、又は９０％から１００％多い酸素の追加である。幾つかの状況では、酸素供給の減少は、培養培地に追加された酸素の元々の量よりも１％から２％、２％から３％、３％から４％、４％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、６０％から７０％、７０％から８０％、８０％から９０％、又は９０％から１００％少ない酸素の追加である。
【００６８】
バイオプロダクション反応器及びシステム
本発明に従う方法及び／又は組成物を利用する発酵システムも又、本発明の範囲内である。
【００６９】
本願に於いて記載及び／又は参照される組み換え体微生物の何れかは、微生物が商業的に実行可能な工程に依って炭素源を産物に変換する産業バイオプロダクションシステムに導入され得る。バイオプロダクションシステムは、組み換え体微生物を増殖させる事と、基質分子の或る部分から選択されたケミカル産物への所望の変換を得る為に好適な時間に渡って好適な温度範囲（及び反応が好気的又は微好気的である場合には溶存酸素濃度範囲）内にバイオプロダクションシステムを維持する事とに好適な、炭素源基質及びバイオプロダクション培地を有するバイオリアクターベッセルへの斯かる組み換え体微生物の導入を包含する。バイオプロダクションは、好気的、微好気的、又は嫌気的条件に於いて撹拌有り又は無しで実施され得る。産業バイオプロダクションシステム及び其れ等の工程は化学工学及びバイオプロセス工学の業者には周知である。一般的に、バイオプロダクション培地に依って生産される産物の量は、当分野に於いて公知の数々の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、又はＧＣ／質量分析（ＭＳ）を用いて決定され得る。
【００７０】
遺伝子改変、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列
本開示の実施形態はホスト微生物への発現ベクターの導入から齎され得、発現ベクターは、ホスト微生物に通常見出される又はされない酵素をコードする核酸配列を含有する。
【００７１】
ホスト細胞を遺伝子改変する能力は何れかの遺伝子改変（組み換え体）微生物の生産に必須である。遺伝子移入テクノロジーのモードは、エレクトロポレーション、接合、トランスダクション、又は自然形質転換に依ってであり得る。幅広い範囲のホスト接合性プラスミド及び薬剤耐性マーカーが利用可能である。クローニングベクターは、其のホストに於いて機能し得る抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて、ホスト生物に適合される。本願に於いて開示される通り、遺伝子改変（組み換え体）微生物は、其のゲノムＤＮＡの改変を包含するプラスミド導入に依る以外の改変をも又含み得る。
【００７２】
より一般的には、コントロール配列と適合する条件に於いて、Ｅ．ｃｏｌｉ等の微生物に於けるコード配列の発現を指令する１つ以上の（幾つかの）コントロール配列に動作可能に繋げられた酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、核酸構築物が調製され得る。単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供する様に操作され得る。ベクターへの其の挿入に先立つポリヌクレオチドの配列の操作は、発現ベクターに依存して望ましいか又は必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチド配列を改変する為の技術は当分野に於いては良く確立されている。
【００７３】
コントロール配列は、適切なプロモーター配列、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の為にホスト細胞に依って認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写コントロール配列を含有し得る。プロモーターは、選ばれたホスト細胞に於いて転写活性を示す何れかのヌクレオチド配列であり得、変異体、短縮型、及びハイブリッドプロモーターを包含し、ホスト細胞に対して同種的又は異種的何方かの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。組み換え体ＤＮＡプロモーター配列を改変及び利用する為の技術は当分野に於いては良く確立されている。
【００７４】
本発明の種々の実施形態では、遺伝子操作は、種々の遺伝子操作を包含する様に記載され得、夫々の経路の何れかに同定された酵素の制御、故に究極的な活性、又は酵素の酵素活性を変化させる事を指向した物を包含する。斯かる遺伝子改変は、選択及び／若しくは同定された培養条件に於ける酵素活性及び／若しくは選択性の変化を齎す転写、翻訳、及び翻訳後の修飾を、並びに／又は例えば産物生産に関する酵素のコピー数及び／若しくは変異体を増大させる為の追加の核酸配列の提供を指向し得る。斯かる遺伝子改変を達成する為の具体的な方法論及びアプローチは当業者に周知である。
【００７５】
種々の実施形態に於いて、より効率的に機能する為に、微生物は１つ以上の遺伝子欠失を含み得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＩｄｈＡ）、燐酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸蟻酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）、メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、ｃｌｐＸＰプロテアーゼ特異性強化因子（ｓｓｐＢ）、ＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼ（Ｉｏｎ）、外膜プロテアーゼ（ｏｍｐＴ）、ａｒｃＡ転写二重制御因子（ａｒｃＡ）、及びｉｃｌＲ転写制御因子（ｉｃｌＲ）をコードする遺伝子が破壊され得、欠失を包含する。欠失を包含する斯かる遺伝子破壊は限定する事を意味せず、種々の実施形態に於いて種々の組み合わせで実装され得る。遺伝子欠失は当分野に於いて周知の多数の戦略に依って成し遂げられ得、外来性のＤＮＡをホスト染色体に組み込む為の方法も同様である。
【００７６】
種々の実施形態に於いては、より効率的に機能する為に、微生物は１つ以上の合成的な代謝調節弁を含み得、コントロールされた蛋白質分解、発現サイレンシング、又はコントロールされた蛋白質分解及び発現サイレンシング両方の組み合わせの為に標的化された酵素から構成される。幾つかの実施形態に於いて、微生物は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０個、又はより多くの合成的な代謝調節弁を含み得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの１つの遺伝子に依ってコードされる１つの酵素又は多数の遺伝子に依ってコードされる多数の酵素の組み合わせが、代謝を変改する及び産物形成を改善する為の合成的な代謝調節弁として設計され得る。Ｅ．ｃｏｌｉの代表的な遺伝子は次を包含し得るが、此れ等に限定されない：ｆａｂｌ、ｚｗｆ  ｇｌｔＡ、ｐｐｃ、ｕｄｈＡ、Ｉｐｄ、ｓｕｃＤ、ａｃｅＡ、ｐｆｋＡ、Ｉｏｎ、ｒｐｏＳ、ｔｋｔＡ、又はｔｋｔＢ。如何にして追加の微生物生物種に於ける此れ等の遺伝子及び／又は他の遺伝子のホモログを同定するかが当業者には周知であると言う事は了解される。
【００７７】
本願に於いて提供される全ての核酸及びアミノ酸配列については、其の種々の実施形態に於いて、此れ等の配列の保存的に改変されたバリアントが包含され、本発明の範囲内であると言う事は了解される。良く当業者の技能の内である保存的に改変されたバリアントとより大掛りに変えられた配列とを包含し得る、機能的に同等な核酸及びアミノ酸配列（機能的なバリアント）、並びに此れ等を含む微生物も又本発明の種々の実施形態の範囲内であり、斯かる配列及び／又は微生物を含む方法及びシステムも同様である。
【００７８】
従って、上の種々の節に記載されている本開示の幾つかの組成物、方法、及びシステムは、遺伝子改変微生物を提供する事を含み、此れは、中心的な中間体から所望の産物を作る為の生産経路を、フラックスを再分配する為の合成的な代謝調節弁との組み合わせで両方含む。
【００７９】
本発明の態様は、選択された炭素源を選択された産物に変換する際の微生物の総体的な有効性を改善する為の複数の遺伝子改変の提供にも又関する。遺伝子改変のより基本的な組み合わせよりも比生産性、体積当りの生産性、力価、及び収量を実質的に増大させる為の具体的な組み合わせが、例えば実施例に於いて示されている。上に記載されている遺伝子改変に加えて、種々の実施形態に於いては、産物の生産に消費され得る補因子ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨのプール及び利用可能な量を増大させる為の遺伝子改変も又提供され、合成的な代謝調節弁を包含する。
【００８０】
より一般的に、且つ遺伝子改変の為に選択される微生物の具体的な代謝経路に依存して、遺伝子改変の何れかの部分群が作成されて、酢酸、アセトイン、アセトン、アクリル、マレイン酸、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、他の酢酸エステル、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、酪酸、イソ酪酸、２−ＯＨ−イソ酪酸、３−ＯＨ酪酸、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、ピルビン酸、イタコン酸、レブリン酸、グルカル酸、グルタル酸、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコール、及び１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、蟻酸、フマル酸、プロピオン酸、琥珀酸、吉草酸、マレイン酸、及びポリヒドロキシ酪酸から成る群から選択される所望の発酵産物以外の発酵産物（単数又は複数）の細胞性の生産を減少させ得る。遺伝子欠失は本願に於いて一般的に開示される通り成され得る。且つ、所望の産物以外の選択された発酵産物の所望の減少した細胞性の生産を達成する為には、他のアプローチも又用いられ得る。
【００８１】
ＶＩ．Ａ遺伝子サイレンシング
具体的には、本発明は、コントロールされた多段階発酵プロセスに於ける代謝フラックスのコントロールを可能にする事を助ける為の、コントロールされた遺伝子サイレンシングの使用を記載する。コントロールされた遺伝子サイレンシングの為の当分野に於いて公知の幾つかの方法論があり、ｍＲＮＡサイレンシング又はＲＮＡ干渉、転写リプレッサーに依るサイレンシング、及びＣＲＩＳＰＲ干渉を包含するが、此れ等に限定されない。
【００８２】
幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドは、前記調節弁酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；前記調節弁酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチド；及び其れ等の組み合わせから成る群から選択される、ポリヌクレオチドを含む。
【００８３】
幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドはサイレンシングポリヌクレオチドを含み、前記サイレンシングポリヌクレオチドは、前記調節弁酵素をコードする遺伝子のプロモーターを認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。
【００８４】
幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ酵素を更にコードし、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は前記ｇＲＮＡに結合した時に前記プロモーター配列に特異的に結合する。幾つかのケースでは、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒的に不活性である。
【００８５】
幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドは分解ポリヌクレオチドを含み、前記分解ポリヌクレオチドは分解タグをコードする配列を含み、前記分解タグは前記調節弁酵素の分解を媒介する。幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。幾つかのケースでは、生産ポリヌクレオチドの発現は細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される。特定のケースでは、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００８６】
コントロールされた蛋白質分解
具体的には、本開示は、コントロールされた多段階発酵プロセスに於ける代謝フラックスのコントロールを可能にする事を助ける為の、コントロールされた蛋白質の分解又は蛋白質分解の使用を記載する。コントロールされた蛋白質の分解の為の当分野に於いて公知の幾つかの方法論があり、特異的プロテアーゼに依る標的化された蛋白質切断と、特異的ペプチドタグに依る分解への蛋白質のコントロールされた標的化とを包含するが、此れ等に限定されない。コントロールされた蛋白質の分解の為のＥ．ｃｏｌｉのｃｌｐＸＰプロテアーゼの使用の為のシステムが用いられ得る。此の方法論はＤＡＳ４（又はＤＡＳ＋４）タグ等の特異的なＣ末端ペプチドタグを追加する事に依拠している。此のタグを有する蛋白質は、特異性強化シャペロンｓｓｐＢが発現される迄はｃｌｐＸＰプロテアーゼに依って分解されない。ｓｓｐＢはｃｌｐＸＰプロテアーゼに依るＤＡＳ４タグ付き蛋白質の分解を誘導する。加えて、多数の部位特異的プロテアーゼシステムが当分野に於いて周知である。蛋白質は、所与のプロテアーゼの特異的な標的部位を含有する様に操作され得、其れから、プロテアーゼのコントロールされた発現後に切断され得る。幾つかの実施形態に於いて、切断は蛋白質不活性化又は分解に至ると予期され得る。例えば、ｃｌｐＳ依存性のｃｌｐＡＰ分解を可能にする様に、Ｎ末端配列が関心の蛋白質に追加され得る。加えて、更に、此の配列は追加のＮ末端配列に依って標識され得、此れが例えばＵＬＰヒドロラーゼに依ってコントロール可能に切断され得る。此れはヒドロラーゼ発現に依存するコントロールされたＮ末端則分解を許す。故に、コントロールされた蛋白質分解の為に、Ｎ末端又はＣ末端何方かに於いて蛋白質をタグ付けする事が可能である。
【００８７】
Ｎ末端対Ｃ末端タグを用いる好ましさは、分解のコントロールされた始まりに先立って、何方かのタグが蛋白質機能を左右するかどうかに大きく依存するであろう。本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに於いて、コントロールされた多段階発酵プロセスに於ける代謝フラックスのコントロールを可能にする事を助ける為の、コントロールされた蛋白質の分解又は蛋白質分解の使用を記載する。広範なグラム陰性及びグラム陽性細菌、酵母、並びに古細菌をさえも包含する他の微生物ホストに於けるコントロールされた蛋白質の分解の為の、当分野に於いて公知の幾つかの方法論がある。具体的には、コントロールされた蛋白質分解の為のシステムが天然の微生物ホストから移入され得、非天然のホストに用いられ得る。
【００８８】
合成的な代謝調節弁コントロール
具体的には、本開示は、多段階発酵プロセスに於いて代謝フラックスをコントロールする為の合成的な代謝調節弁の使用を記載する。発現を誘導する為の当分野に於いて公知の多数の方法論があり、此れ等は多段階発酵に於ける段階間の遷移に於いて用いられ得る。此れ等は、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシド）、アラビノース、ラフィノース、トリプトファン、及び多数の他の物を包含する人工ケミカル誘導因子を包含するが、此れ等に限定されない。多段階発酵プロセスに於ける増殖及び生産期の間の遷移をコントロールする為に、此れ等の周知の誘導因子の使用を遺伝子発現サイレンシングのコントロール及び／又はコントロールされた蛋白質分解に繋げるシステムが、遺伝子改変微生物システムに一体化され得る。
【００８９】
加えて、増殖の間に消費される１つ以上の制限栄養素の欠乏に依って、多段階発酵に於ける増殖及び生産の間の遷移をコントロールする事が望ましくあり得る。制限栄養素は：燐酸、窒素、硫黄、及びマグネシウムを包含し得るが、此れ等に限定されない。此れ等の栄養素制限に応答する天然の遺伝子発現システムは、遺伝子発現サイレンシングのコントロール及び／又はコントロールされた蛋白質分解を多段階発酵プロセスに於ける増殖及び生産期の間の遷移に動作可能に繋げる様に用いられ得る。
【００９０】
産物
幾つかの実施形態に於いて、産物を生産する為の微生物又は細胞が本願に於いて提供される。幾つかのケースでは、産物は３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。幾つかのケースでは、産物はアミノ酸を含む。幾つかのケースでは、アミノ酸はアラニンを含む。幾つかのケースでは、アラニンはＬ−アラニンである。幾つかのケースでは、アラニンはＤ−アラニンである。幾つかのケースでは、アラニンの生産の速度は少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、６．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、７．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、８．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、９．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ／ｈｒである。
【００９１】
幾つかのケースでは、２４時間後のアラニン力価は０から０．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌから１．５ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌから２ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌから２．５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌから３ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌから３．５ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌから４ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌから４．５ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌから５ｇ／Ｌ、又は５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌであり得る。ＳＭＶに依ってオファーされるアラニン生産のダイナミックレンジは、単に（プロモーターを変化させる事に依って）生産経路酵素の発現レベルを変改する事に依ってオファーされる物と比較して最高で４倍の増大であり得る。幾つかのケースでは、ＳＭＶに依ってオファーされるアラニン生産のダイナミックレンジは、単に生産経路酵素の発現レベルを変改する事に依ってオファーされる物と比較して最高で２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍の増大であり得る。
【００９２】
幾つかのケースでは、微生物の生産ポリヌクレオチドはアラニン排出輸送体をコードする。幾つかのケースでは、アラニン排出輸送体はａｌａＥである。
【００９３】
幾つかのケースでは、産物はメバロン酸を含む。幾つかのケースでは、メバロン酸の生産の速度は少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、６．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、７．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、８．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、９．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ／ｈｒである。
【００９４】
方法
操作された微生物に依って大スケールで産物を生産する為の方法が本願に於いて提供される。高スループットな様式の産物の大スケール生産の為に微生物を操作する為の方法も又本願に於いて提供される。
【００９５】
幾つかのケースでは、方法が本願に於いて提供され：細胞の複数の株を培養する事（前記複数の株の各株は、（ｉ）代謝経路に於いて作用する調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の操作された調節弁ポリヌクレオチド（前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減は前記代謝経路のフラックスを縮減する）と；（ｉｉ）前記産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の操作された生産ポリヌクレオチドと；を含み、前記複数の株の各株は、前記操作された調節弁ポリヌクレオチド又は前記操作された生産ポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列が別の株とは異なる）と；前記複数の株の夫々に依って生成される前記産物のレベルを測定する事と；前記産物の前記レベルに基づいて或る株を選択する事とを含む。幾つかの実施形態に於いて、方法は、前記選択された株をバイオリアクターに依って増殖させる事を更に含む。幾つかの実施形態に於いて、前記選択された株を含む培養培地は、少なくとも１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌ、５００ｍｌ、６００ｍｌ、７００ｍｌ、８００ｍｌ、９００ｍｌ、又は少なくとも１０００ｍｌの体積を有する。幾つかの実施形態に於いて、培養培地は少なくとも１Ｌの体積を有する。
【００９６】
幾つかの実施形態に於いて、調節弁ポリヌクレオチドは：前記調節弁酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；前記調節弁酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチド；及び其れ等の組み合わせから成る群から選択されるポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態に於いて、前記複数の株の第１及び第２の株はサイレンシングポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態に於いて、サイレンシングポリヌクレオチドは、前記調節弁酵素をコードする遺伝子のプロモーターを認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかの実施形態に於いて、ｇＲＮＡ配列は前記第１及び第２の株間で異なる。幾つかの実施形態に於いて、前記ｇＲＮＡに依って認識されるプロモーターは前記第１及び第２の株間で異なる。幾つかの実施形態に於いて、第１の株は前記サイレンシングポリヌクレオチド及び前記分解ポリヌクレオチドを含み、第２の株は、前記サイレンシングポリヌクレオチドを含むが、前記分解ポリヌクレオチドを含まない。幾つかの実施形態に於いて、産物のレベルは前記第２の株に於いて前記第１の株よりも多大である。幾つかの実施形態に於いて、産物のレベルは前記第１の株に於いて前記第２の株よりも多大である。幾つかの実施形態に於いて、調節弁酵素は、エノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ（ｆａｂＩ）、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ）、ＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）、及び其れ等の組み合わせから成る群から選択される酵素を含む。幾つかの実施形態に於いて、生産酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）、アラニン排出輸送体（ａｌａＥ）、ＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＮ）、及び其れ等の組み合わせから成る群から選択される酵素を含む。
【００９７】
幾つかの実施形態に於いて、産物は、メバロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アミノ酸、及び其れ等の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態に於いて、アミノ酸はアラニンである。幾つかの実施形態に於いて、アラニンはＬ−アラニンである。幾つかの実施形態に於いて、アラニンはＤ−アラニンである。
【００９８】
幾つかの実施形態に於いて、前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減を欠く細胞と比較して、前記静止期の間の産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。
【００９９】
幾つかの実施形態に於いて、環境条件の変化は、前記細胞に接触する培養培地の糖濃度の変化を含む。
【０１００】
幾つかの実施形態に於いて、環境条件の変化は、前記細胞に接触する培養培地の酸素供給の変化を含む。
【０１０１】
幾つかのケースでは、細胞性の産物を生成する方法が本願に於いて提供され：培養培地に依って異種的な細胞を培養する事を含み、前記異種的な細胞は：（ｉ）代謝経路に於いて作用する調節弁酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の操作された調節弁ポリヌクレオチド（前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減は前記代謝経路のフラックスを縮減し、前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減は前記細胞の静止期を誘導する）と；（ｉｉ）前記産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の操作された生産ポリヌクレオチドと；を含み、前記調節弁酵素の発現の前記コントロールされた縮減を欠く細胞と比較して、前記静止期の間の前記産物の生産の速度は環境条件の変化に応答してより縮減されない。幾つかの実施形態に於いて、方法は、前記環境条件を変化させる事を更に含む。幾つかの実施形態に於いて、環境条件は前記培養培地の糖濃度を含み、前記環境条件を変化させる事は、前記糖濃度を増大又は減少させる事を含む。幾つかのケースでは、前記糖はグルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、マンニトール、又は其れ等の組み合わせである。幾つかのケースでは、前記糖はグルコースである。幾つかのケースでは、環境条件は前記培養培地の酸素濃度を含み、前記環境条件を変化させる事は、前記酸素濃度を増大又は減少させる事を含む。幾つかのケースでは、前記培養する事は、バイオリアクターに依って実施される。
【０１０２】
幾つかのケースでは、前記培養培地は少なくとも１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌ、５００ｍｌ、６００ｍｌ、７００ｍｌ、８００ｍｌ、９００ｍｌ、又は少なくとも１０００の体積を有する。幾つかのケースでは、前記培養培地は少なくとも１Ｌの体積を有する。幾つかのケースでは、前記産物は３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。幾つかのケースでは、前記産物はアミノ酸を含む。幾つかのケースでは、前記アミノ酸はアラニンを含む。
【０１０３】
幾つかのケースでは、前記アラニンの生産の速度は、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、６．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、７．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、８．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、９．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ／ｈｒである。幾つかのケースでは、前記生産ポリヌクレオチドはアラニン排出輸送体をコードする。幾つかのケースでは、前記アラニン排出輸送体はａｌａＥである。幾つかのケースでは、前記培養する事は、２０時間よりも少し、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、又は１００時間よりも少しに渡って起こる。幾つかのケースでは、前記培養する事は、１０時間よりも少し、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、又は４５時間よりも少しに渡って起こる。幾つかのケースでは、前記培養する事は３０時間よりも少しに渡って起こる。
【０１０４】
幾つかのケースでは、前記産物はメバロン酸を含む。幾つかのケースでは、前記メバロン酸の生産の速度は、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．１ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．３ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．７ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．８ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．９ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、５．５ｇ／Ｌ／ｈｒ、６．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、７．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、８．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、９．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ／ｈｒである。幾つかのケースでは、前記培養する事は、２０時間よりも少し、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、又は１００時間よりも少しに渡って起こる。幾つかのケースでは、前記培養する事は８０時間よりも少しに渡って起こる。
【０１０５】
幾つかの実施形態に於いて、調節弁ポリヌクレオチドは：前記調節弁酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；前記調節弁酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチド；及び其れ等の組み合わせから成る群から選択されるポリヌクレオチドを含む。幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドはサイレンシングポリヌクレオチドを含み、前記サイレンシングポリヌクレオチドは、前記調節弁酵素をコードする遺伝子のプロモーターを認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ酵素を更にコードし、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は前記ｇＲＮＡに結合した時に前記プロモーター配列に特異的に結合する。幾つかのケースでは、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒的に不活性である。幾つかのケースでは、調節弁ポリヌクレオチドは分解ポリヌクレオチドを含み、前記分解ポリヌクレオチドは分解タグをコードする配列を含み、前記分解タグは前記調節弁酵素の分解を媒介する。幾つかのケースでは、前記調節弁ポリヌクレオチドの発現は燐酸に依って制御される。幾つかのケースでは、前記生産ポリヌクレオチドの発現は燐酸に依って制御される。幾つかのケースでは、前記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【０１０６】
バイオプロダクションの最適化
バイオ医薬品及び低分子治療薬からスペシャリティー、バルク、及びコモディティーケミカル迄のあらゆる物、並びに次世代バイオ燃料をさえも生産する為のバイオテクノロジーに基づく発酵プロセスが首尾良く開発されて来た１〜３。多数のテクノロジー開発が原因で、此れ等のプロセスは近年に於いて急速な進歩をして来た４，５。合成生物学を用いて新たな分子を生産する事は曽て無く容易である。此れ等の進展にも関わらず、分子を概念実証（ＰＯＣ）から商業的に意味があるレベルに迄持って行く事には深刻な課題が残っている。株最適化、又は「ｍｇ」から「ｋｇ」へのハードルを克服する事は、バイオプロセスの首尾良い商業化にとって鍵と成る障害のまま残っている。通例、ＰＯＣの実証後には、首尾良いバイオプロセス開発は微生物株及び発酵最適化両方の長長しい繰り返しを要求する６〜８（図１Ｂ）。多くの場合に、此れ等の最適化作業は関心の産物又はホスト株に特異的である。部分的には、操作された微生物株の意味ある標準化された最適化を高スループットな様式で実施する為の幅広く有用なツールの欠如が原因で、合成生物学のスループットは代謝工学の物を追い越してしまっている９。
【０１０７】
株最適化とＰＯＣレベルの先へ展開する事とには多数の課題があり、取り分け、予想される設計領域のサイズ及び複雑さである。電気回路モデルが適用可能なより単純な遺伝子回路とは対照的に１０〜１２、代謝ネットワークは高度に相互接続されている。各代謝物質及び／又は酵素は果てしない他の物と相互作用し得る。此の組み合わせの複雑さは巨大な予想される設計領域を齎し、此れは、標準化された設計原理の開発に要求される種類の系統的な実験法の手には負えない（補足資料表１）。新たな高スループットなＤＮＡアセンブリ及び微生物株構築法に至ったＤＮＡを読み書きする事の劇的な進展及び減少したコストにも関わらず、斯かる大きい設計領域に対処する事に於ける課題は引き続いている１３〜１６。多くの場合に、株操作を使用する新たな合成生物学テクノロジーが、容易にスクリーニング又は選択される表現型に依って実証されると言う事は意外ではない１３，１７〜１９。此れ等の殆どは、限定された一連の経路特異的な酵素を最適化する事への専念に限定されている。
【０１０８】
此の課題の複雑さを克服する為の１つのアプローチはバイオプロダクションの為のインビトロシステムの使用であり、此れは限定された一連の代謝酵素を含む。然し乍ら、此れ等のアプローチは、補因子リサイクル及びエネルギー生成を包含するインビボシステムの鍵と成る利点を複製する事に課題を有する２０，２１。此の複雑さに取り組む為の別のアプローチは、株評価の為のより高速のスクリーニング方法を開発する事である２２。然し乍ら、増大したスループット単独は、予想される設計領域の完全な複雑さを決して評価し得ない。加えて、多くの場合に、高スループット研究から得られる結果は同じ微生物に於いてさえも異なる環境に当て嵌まらない２０，２３，２４。小スケールスクリーニングは直ちにはより大スケールの生産プロセスに当て嵌まらず、株最適化の上に、プロセス最適化の繰り返しに至る（図１Ｂ）。此れは、代謝が高度に制御されており、環境条件の変化に対して場合に依っては劇的に応答し得るからである２５，２０，２６〜２８。従来的には、環境的なロバスト性の欠如が、発酵に基づくプロセスのスケールアップを困難にする１つの因子である。此の問題は、スループットの控えめな改善のみをオファーするスケールダウンの為の特別な複雑なマイクロリアクターシステムの開発に至った２０，２９〜３１。
【０１０９】
「ｍｇｓ」から「ｋｇｓ」に移行する時間及びコストを大いに縮減する為の、幅広く応用可能な迅速でロバストなアプローチの有意な必要が残っている。理想的には、アプローチは、複数の産物及び生産ホストが適用可能であるべきである。真にスケーラブルな標準化された発酵プロセスの使用を可能にする一般化可能な高スループットな株最適化アプローチの開発が本願に於いて提供される。図１Ｂパネルｂに略示されている此のアプローチは、活性な代謝ネットワークの動的な最小化を使用し３２、此れはインビボの生合成の利益を維持し乍ら、インビトロアプローチに共通のより小さい設計領域の利益を組み合わせる２０。我々は、生産に要求される最小限の代謝ネットワークを単離し、此れに専念し得る。合成的な代謝調節弁（ＳＭＶ）３２，３３の組み合わせを利用して（図２Ａ〜Ｄ）、我々は代謝ネットワークを動的に最小化し、標準化された２段階発酵プロセスの文脈に於いて代謝フラックスを方向転換し得る２０。
【０１１０】
此のアプローチは問題の複雑さ及び然るべき設計領域のサイズを縮減し得、最適化を大いにスピードアップする。種々の実施形態に於いては、動的な代謝ネットワーク最小化が、生産経路改変単独に依って達成可能な物よりも経路フラックスを改善し得ると言う事が本願に於いて実証される（図３Ａ〜Ｋ及び６Ａ〜Ｈ）。同時に、我々は、動的なネットワーク最小化が環境条件に対する代謝応答を縮減し、此れが、操作された株のロバスト性及びスケーラブル性を増大させる（図３Ａ〜Ｋ及び５Ａ〜Ｊ）事を実証する。
【実施例】
【０１１１】
Ｅ．ｃｏｌｉに於ける２段階の合成的な代謝調節弁
第１に、我々は、改善された合成的な代謝調節弁（ＳＭＶ）をＥ．ｃｏｌｉに於いて開発した。此れ等は２段階プロセスに於ける蛋白質レベルの動的な縮減を可能にする。此れ等のＳＭＶは、鍵と成る代謝酵素のレベルを縮減する（又は鍵と成る代謝酵素の酵素活性を縮減する）為に用いられ得、コントロールされた蛋白質分解若しくはＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子サイレンシング、又は組み合わせの蛋白質分解及びサイレンシング両方に依拠する（図２Ａ〜Ｄ）３２〜３５。細胞増殖及び動的な代謝コントロールは、燐酸欠乏を環境トリガーとして用いて実装され得る。最少培地の最も割高な構成成分の１つとして、燐酸はトリガーとして理想的な候補であり得る。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉに於いて燐酸欠乏に依って誘導される静止期は、保持された解糖系取り込み及び増大した蛋白質発現を有する３１，３６。燐酸に対して応答する多数のプロモーターシステムが、Ｅ．ｃｏｌｉ、及びＳ．セレビシエを包含する他の微生物に於いて良くキャラクタリゼーションされている３７。燐酸応答性プロモーターバリアントを評価し（補足資料第１節）、爾後に２段階のコントロールに用いた。
【０１１２】
両方とも以前に実証されている通り、誘導された遺伝子サイレンシングの為に天然のＩ−Ｅ型Ｃａｓｃａｄｅ−ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＳＭＶをＥ．ｃｏｌｉに実装し乍ら３４，３８、Ｃ末端デグロンタグを標的蛋白質に組み込む事に依って、コントロールされた蛋白質分解を誘導した６３，３３（図２Ａ）。此れ等のシステムを、最小限の副産物形成並びに高いバイオマス収量及び増殖速度の為に初期操作されたホスト株に導入した（Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＬＦ＿００２５、補足資料第３節）２４，２７，２８，３９。図２Ａ〜Ｄが実証している通り、最少培地の燐酸欠乏に依ってＧＦＰｕｖを「オン」に、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光蛋白質を「オフ」にする事に依って例証される通り、此のアプローチを用いて、蛋白質レベルを２段階プロセスに於いてコントロールし得る。蛋白質分解との遺伝子サイレンシングの組み合わせは、蛋白質の分解の最も大きい速度を齎す（図２Ｃ〜Ｄ）。減衰速度への遺伝子サイレンシング及び蛋白質分解の具体的なインパクトは、蓋然的には、ホスト、標的遺伝子／酵素、並びに其の具体的な天然のターンオーバー速度及び発現レベルに依存して変わるであろう４０，４１。
【０１１３】
代謝ネットワーク最小化は改善されたフラックスに至る
２段階プロセスに於ける蛋白質レベルの動的コントロールの首尾良い実証に依って、我々は、単独及び組み合わせの鍵と成る中央代謝酵素のコントロールされた縮減に依るＥ．ｃｏｌｉの代謝フラックスの動的コントロールを検討する事に転じた。ネットワーク内の熱力学的に有利な「初発」反応のフラックスを縮減する事は、ネットワーク代謝物質プールの増大（補足資料第５節）、及び結果として経路フラックスの変化に至る事が予期される。中央代謝経路の鍵と成る初発ステップの酵素を同定し、初期のＳＭＶ標的として選び、アラニンを初期の試験産物として選んだ（図３Ａ〜Ｋ）。ＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ＊）を含むアラニン生産の為の一連の株をを構築した（図３Ａ）４２。蛋白質分解若しくは遺伝子サイレンシング又は組み合わせて両方を誘導する為の改変何方かに依って、中央代謝酵素のＳＭＶの複数の組み合わせを有するバリアントを作った（補足資料第３節）。一緒に成って、２段階プロセスに於いて評価したＳＭＶを有する一連の株は「調節弁」株として識別される。標準化された２段階の９６ウェルプレートに基づくマイクロ発酵に於けるアラニン生産について、アラニン「調節弁」株のパネル（合計〜５００株）を評価した（補足資料第７節）。２４時間の生産後のアラニン力価が図３Ｂ〜Ｃに依って与えられている。手短には、２４時間後のアラニン力価は〜０ｇ／Ｌから〜４．７ｇ／Ｌ迄の範囲であり、予期される通り、ＳＭＶの数及び組み合わせについて有意に変わった；ＳＭＶ無し及びアラニン経路単独に依るコントロールと比較した時に、殆どのＳＭＶ組み合わせは改善された性能に至る。幾つかのケースでは、２４時間後のアラニン力価は、０から０．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌから１．５ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌから２ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌから２．５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌから３ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌから３．５ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌから４ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌから４．５ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌから５ｇ／Ｌ、又は５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌであり得る。ＳＭＶに依ってオファーされるアラニン生産のダイナミックレンジは、単に（プロモーターを変化させる事に依って）生産経路酵素の発現レベルを変改する事に依ってオファーされる物と比較して最高で４倍の増大であり得る（補足資料第７節）。幾つかのケースでは、ＳＭＶに依ってオファーされるアラニン生産のダイナミックレンジは、単に生産経路酵素の発現レベルを変改する事に依ってオファーされる物と比較して最高で２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍の増大であり得る。重要な事に、単独及び／又は組み合わせの蛋白質分解又はサイレンシングの使用は、生産への有意なインパクトを有し、各酵素について、ＳＭＶを用いる活性のファインチューニングが決定的である事を指示した。其れから、マイクロ発酵からの最も良好な実施株の１つを１０ｇｄｃｗ／Ｌのバイオマスに依る最少培地の２段階の１Ｌ発酵に依って評価した（図３Ｆ）。此れは、４８時間の生産後に０．８ｇ／ｇの収量で８０ｇ／Ｌの１００％Ｌ−アラニンを齎した。アラニン排出輸送体（Ｅ．ｃｏｌｉのａｌａＥ遺伝子に依ってコードされる４３）を過剰発現する事に依る此の株の更なる操作は、２７時間の生産後に理論収量〜１ｇ／ｇの誤差以内の収量で１４７ｇ／Ｌの１００％Ｌ−アラニンを齎した（図３Ｇ）。
【０１１４】
マイクロ発酵ロバスト性
中心的な仮説は、生産段階に於ける代謝を規制する事に依って、株性能が改善され得るのみならず、環境（プロセス）条件に対してよりロバストであるであろうと言う事であった。単純に表現すると、最小化された代謝ネットワークに依って炭素フローが規制され、最早此れは環境に対する細胞応答に依って適応し得ない。此の仮説を試験する為に、株を異なる「マイクロ発酵」プロセス条件に於いて評価した。グルコース濃度及び酸素移動速度（従来的な発酵に於いて株性能にインパクトを及ぼす、鍵と成るプロセス変数２６）を変え（図３Ｄ、補足資料第８節）、アラニン生産を測定した。環境的なロバスト性を定量する為に、ロバスト性スコア（ＲＳ）を開発した。より大きいＲＳスコアはよりロバストな株を指示する。相対標準偏差（ＲＳＤ）はロバスト性の１つの指標であるが、我々は、全てのプロセス条件に於いて株が有する最大偏差（ＭａｘＤｅｖ）をも又組み込むロバスト性のより厳密な尺度を組み込む事を欲した（ＲＳ、式（１））。
【数１】
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【０１１５】
４８個のアラニン「調節弁」株の部分集合のロバスト性スコアが図３Ｅに依って与えられている。此れ等の実験研究からの結果は補足資料第８節に於いて表にしている。ロバスト性のＲＳ＞０．６のカットオフを用いるカイ２分析を用いて、プロセスロバスト性に統計的に寄与する鍵と成るＳＭＶを同定した。ｆａｂＩの蛋白質分解型の分解はロバスト性への主要な寄与因子であり（カイ２＝１３．８５、Ｐ値＜０．００１）、結果として、ｆａｂＩの蛋白質分解型の分解を有する「調節弁」株を更なる研究に用いた。加えて、ｇｌｔＡの蛋白質分解型の分解並びに／又はｆａｂＩ及びｇｌｔＡの蛋白質分解型の分解の組み合わせを有する「調節弁」株も又、大きいＰ値ではあるが、ロバスト性の有意な寄与因子である事が見出された。
【０１１６】
従来的な増殖連動型株と比較した２段階「調節弁」株
ＳＭＶに依って可能にされる２段階アプローチをより従来的な増殖連動型プロセスと比較する為に、我々は、アラニンの増殖連動型生産が可能な、恒常的に発現されるアラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ＊）を有する５つの株を構築した。此れ等の増殖連動型株は、ａｌｄ＊発現を駆動する為に用いたプロモーターの強さが変わるが４４（補足資料第２節）、依然として同じ共通の調節弁無しのコントロールホスト株を利用した。図５は、マイクロタイター（図５Ａ〜Ｄ）及び１Ｌ（図５Ｅ〜Ｊ）スケールに於いて従来的な発酵の「増殖連動型（ＧＡ）」株と比較した２段階プロセスに於ける「調節弁」株の直接的比較の結果を例示している。マイクロ発酵では、２段階「調節弁」株は力価及びプロセスロバスト性についてＧＡ株を凌いだ。変えられたプロセス条件に依る１Ｌ発酵に於いて、マイクロ発酵分析からの最もロバストなＧＡ株（最も高い生産レベルをも又有する）をロバストな「調節弁」株と比較した。マイクロ発酵からの結果と一貫して、「調節弁」株は評価した全てのプロセス条件に於いて一貫した性能を示した（図５Ｅ）。此処で、ＧＡ株はプロセスに依存する有意な性能変動性を有した。我々は、「マイクロ」及び１Ｌスケール発酵両方に於いて「調節弁」株について観察された増大した環境ロバスト性が、予測可能なスケールアップに至るであろうと言う仮説を立てた。此処では、高スループットなマイクロ発酵に於ける改善された性能を有する株は、コントロールされたバイオリアクターに於ける改善された性能を確実に有するであろう。システムのスケーラブル性を評価する為に、マイクロ発酵に於いて統計的に区別される性能（Ｐ値＜０．００１）を有する「調節弁」アラニン株を、標準化された２段階の１Ｌ発酵に於いて評価し、全てのＧＡ株と比較した。「マイクロ発酵」に於いて観察された統計的に異なる性能は、２段階「調節弁」株については１Ｌ発酵へと予測可能にスケーリングした。此れは、マイクロ発酵と１Ｌ性能との間の相関が観察されなかったＧＡ株に依って得られた結果とは対照的である（図５Ｇ〜Ｈ）。
【０１１７】
産物の融通性
１Ｌの完全計装化発酵へのアラニン株の首尾良い予測可能なスケールアップに依って、我々は、テクノロジープラットホームを追加の産物：メバロン酸について検証する事へと展開した。此の目的には、メバロン酸生合成の為に追加の動的な生産経路を構築した（図６Ａ）。３つの酵素機能をコードする一連の２遺伝子生産経路プラスミドはメバロン酸生産の為に構築し、二機能性アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを夫々コードするＥ．フェカリスのｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子から成った。変異体ｍｖａＳ遺伝子の、より高い活性を有するｍｖａＳ（Ａ１１０Ｇ）を用いた４５，４６。生産プラスミドをコントロール株に於けるメバロン酸生産について初期評価した（図６Ｂ）。其れから、最も良好な生産プラスミドを種々の操作された「調節弁」株に導入し、マイクロ発酵に依って評価した（図６Ｃ）。其れから、統計的に区別される株の部分集合を１Ｌ発酵に依って評価して、スケーラブル性を評価した（図６Ｄ）。此れは、アラニンのケースと同様に予測性があった。幾つかのケースでは、実施株は、７８ｈｒｓの生産に依って０．４６ｇ／ｇの収量（理論収量の８４％）で９７ｇ／Ｌと言う、意味がある力価及び収量を生産した（図６Ｅ）。此のメバロン酸株の比生産性は、最も良好な以前に報告された結果よりも４倍超高い４７（補足資料第９節）。
【０１１８】
考察
歴史的に、低分子の生産を代謝的に操作する為の最も首尾良い作業の幾つかは、嫌気的代謝の力を借りて、産物形成を増殖と連結させている。此れは、エタノール、琥珀酸、乳酸、及びイソブタノールを包含する多くの産物を生産する為の産業株の古典的な設計及びセレクションを許した。此れは、進化及びセレクションの力を借りて、操作されたネットワークに於ける最適な代謝フラックスに達している４８，４９。増殖連動型生産は嫌気的代謝に厳密に繋げられてはいないが、増殖連動は、合成生物学を用いて作られ得る異なる分子の数及び多様性を大いに限定する。一般的なロバストでアクセスし易い非増殖連動型プラットホームは、膨大な数の産物の最適化及びスケールアップを大いに単純化するであろう。
【０１１９】
生産改善の為に環境トリガーに対する天然の代謝応答に依拠して来た殆どの既存の２段階プロセスとは対照的に、我々は、必須の代謝ネットワークを積極的に最小化し、代謝物質を関心の産物へと方向転換すると言う次のステップに進んだ。此の仕事に於ける標的化された必須の中央代謝経路の多くは、従来的には操作戦略にとってのオフリミットであった。何故なら、必須酵素を欠失させる事は従来的な発酵に於ける増殖及び増殖連動型生産とは相容れないからである。動的に最小化された代謝ネットワークは、環境変数に対する強化されたロバスト性をも又齎し、高スループットな小スケール研究からより大きい計装化発酵への忠実なトランスレーションを可能にする。当分野に於ける現行のパラダイムは、強化されたプロセスコントロールの為の小スケールのカスタム設計されたマイクロリアクターを開発する事に依って、然るべき株評価のスループットを改善する事である。対照的に、我々のアプローチは新たな方向への展開であり、プロセス変化に対してより感受性でない様に微生物代謝を操作する事を使用し、高スループットな実験法を単純化する。
【０１２０】
ロバスト性の他に、特に生産経路発現レベル単独を変改する事と比較した時に、我々は、最小限の代謝ネットワークの必須酵素への組み合わせの改変が生産の有意な改善に至り得る事を実証した。性能の此れ等の大きい変動は、鍵と成る中央代謝ノードの限定された部分集合の変化が原因であり、蓋然的には変改された代謝物質レベルを齎す。酵素レベルを動的にコントロールする為の以前のアプローチと比較して、我々は、遺伝子サイレンシング及び蛋白質分解の組み合わせに依る蛋白質レベルのファインチューニングについて、改善されたポテンシャルを実証している５０。静止期細胞は細胞分裂に依って既存の蛋白質を希釈し得ないので、此の二重のアプローチは意味を成す。当然の事乍ら、何れかの所与の酵素のレベルの特異的コントロールは天然のターンオーバーメカニズムにも又依存するであろう。一緒に成った遺伝子サイレンシング及び蛋白質分解両方の組み合わせは改善された性能を必ずしも齎す訳ではない、即ち「過ぎたるは猶及ばざるが如し」と言う事は、一見尚も意外であり得る。此れ等の結果を説明する為には、将来的な作業が必要とされ得る。此れ等は、より大きいネットワークに於いて最小限のフラックスを維持すると言う要件が原因か、又は最小限のネットワークの一部ではないが依然としてネットワーク活性に影響する鍵と成る制御代謝物質のレベルの変化の帰結か、何方かであり得る。
【０１２１】
実証されているアプローチは殆どのバイオプロダクションプロセスに共通の多くの問題に対処し得るが、多くの産物特異的な課題が残っている。産物又は経路代謝物質の毒性は力価又は生産速度を限定し得る。低い力価に於いて最適であり得る最小限のネットワークは、高まった力価に於いては最適ではあり得ない。加えて、多くの場合に、改善された酵素の操作は多くの「ｍｇ」から「ｋｇ」へのプロジェクトに於ける課題である。
【０１２２】
此のアプローチを他の微生物ホストに適応する事の実現可能性が予期される。新たなホストの鍵と成る要件は、迅速でロバストな増殖期、蛋白質レベルの動的コントロールを操作する能力、及び代謝的に活性な静止期を包含する。多数の微生物は、生産的な静止期代謝の為の良くキャラクタリゼーションされた栄養素トリガーを有し３６、例えばラルストニア種、ヤロウィア種、及び他の物に於いては窒素制限である５１，５２。此れ等の要件が天然に満たされない時でさえも、其れ等はＳ．セレビシエ又は他の微生物等のホスト内へと操作され得、予想される各ホストは固有の課題と対応する解決策とを提出する。
【０１２３】
将来的な作業は、より複雑な生産経路を有する分子について此のプラットホームを応用する事を狙いとし得る。此のアプローチは、ＰＯＣレベルの先へ展開する事を願い、産業的により然るべき速度、力価、及び収量で問題に立ち向かい始めている代謝工学者及び合成生物学者に、迅速な最適化の為の御し易いルートをオファーし得る。
【０１２４】
方法
試薬及び培地
別様に述べられていない限り、全ての材料及び試薬は可能な最も高いグレードであり、シグマアルドリッチ・コーポレーション（Sigma-Aldrich Corporation）（セントルイス，ＭＯ）から購入した。Ｃ１３標識されたアラニン（２，３−１３Ｃ２，９９％）（品＃ＣＬＭ−２７３４−ＰＫ）はケンブリッジアイソトープラボラトリーズ・インク（Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）（テュークスベリー，ＭＡ）から購入した。通例の株及びプラスミドの増殖及び構築にはルリアブロスを用いた。抗生物質の使用濃度は次の通りであった：アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（３５μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３５μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジン（１００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（１５０μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（５μｇ／ｍＬ）。低塩のルリアブロス（レノックス処方）を用いてゼオシン、ブラストサイジン、及びピューロマイシン耐性クローンについてセレクションした。加えて、ピューロマイシンセレクションでは、燐酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）を５０ｍＭの終濃度迄、ＬＢレノックスに追加した。ストック溶液を包含する培地処方は補足資料第７節に記載されている。
【０１２５】
Ｅ．ｃｏｌｉ株構築
株構築及び確認に用いたオリゴヌクレオチド及び合成線状ＤＮＡ（Ｇｂｌｏｃｋｓ（商標））は全て補足資料第３節に於いて与えられており、其れ等はインテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）（ＩＤＴ，コーラルビル，ＩＡ）から得た。株ＢＷ２５１１３はイェール大学遺伝子ストックセンター（ＣＧＳＣ，http://cgsc.biology.yale.edu/）から得た。株ＢＷａｐｌｄｆはジョージ・チェン（George Chen）（清華大学）からの厚意に依り供与された６２。染色体改変は、抗生物質耐性カセットを保有するＣ末端ＤＡＳ＋４タグのケースでは直接的な抗生物質カセットインテグレーションに依って、又は厳密にリ（Li）等のプロトコール６４を踏襲した痕跡無しのｔｅｔ−ｓａｃＢセレクション及びカウンターセレクションに依って何方かで、標準的な組み換え工学方法論６３を用いて成された。組み換え工学プラスミドｐＳＩＭ５及びｔｅｔ−ｓａｃＢセレクション／カウンターセレクションマーカーカセットはドナルド・コート（Donald Court）（ＮＣＩ，https://redrecombineering.ncifcrf.gov/court-lab.html）からの厚意に依り供与された。手短には、〜５０ｂｐの相同性フランキング配列を供給する適切なオリゴを用いて、Ｅｃｏｎｏｔａｑ（ルシジェン・コーポレーション（Lucigen Corporation），ミドルトン，ＷＩ）を製造者の説明書に従って用いて、９４℃に於ける初期の１０分の変性、次に３５サイクルの９４℃１５秒、５２℃１５秒、及び７２℃５分に依って、ｔｅｔ−ｓａｃＢセレクション／カウンターセレクションカセットを増幅した。ｔｅｔ−ｓａｃＢカセットの「キュアリング」又は直接的インテグレーション（抗生物質マーカーが存在する時）に用いられるカセットは、ＩＤＴからｇＢｌｏｃｋｓとして得た。ｓｓｐＢ遺伝子欠失のケースでは、カナマイシン耐性に依って置き換えられたオープンリーディングフレーム欠失をＫｅｉｏコレクション株ＪＷ３１９７−１から増幅し６５、標準的な方法論を用いて適切なバックグラウンド株に移動した。カナマイシン耐性カセットはｐＣＰ２０プラスミドを用いてキュアリングされ、ｆｒｔ痕跡を残した６３，６５。染色体改変は、ＰＣＲ増幅及びシーケンシング（イートンバイオサイエンス・インク（Eton Bioscience Inc.））に依って確認し、領域全体をフランキングする一対のオリゴヌクレオチド、又はＤＡＳ＋４タグ挿入のケースでは挿入の５’のオリゴ及び耐性カセットの内部の物を何方か用いた。
【０１２６】
Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド構築
ＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイの設計及び構築に用いたプライマーは補足資料第６節に挙げた。遺伝子サイレンシングガイドアレイは一連のｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドから発現した。ｐＣＡＳＣＡＤＥ−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドは、ｐｃｒＲＮＡ．Ｔｅｔ７３のｐＴｅｔプロモーターをインスレーター付きの低燐酸に依って誘導されるｕｇｐＢプロモーター７４に取り替える事に依って調製した。全ての遺伝子のプロモーター配列はＥｃｏＣｙｃデータベースから得た（https://ecocyc.org/）。ＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイを設計する為に、関心のプロモーターの−３５又は−１０ボックスの近くのＣＡＳＣＡＤＥのＰＡＭ部位を同定し、ＰＡＭ部位の３’末端の３０ｂｐをガイド配列として選択し、製造者のプロトコールを踏襲してＱ５部位特異的変異導入（ニュー・イングランド・バイオラボ・インク（New England Biolabs Inc.），ＭＡ）を用いてｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドにクローニングした。５％ｖ／ｖのＤＭＳＯをＱ５ＰＣＲ反応に追加したと言う変更を有した。ＰＣＲサイクルは次の通りであった：増幅は、３０秒の９８℃に於ける初期の変性ステップ、次に２５サイクルの９８℃１０秒、７２℃３０秒、及び７２℃１．５ｍｉｎ（伸長速度は３０秒／ｋｂであった）に於けるサイクル運転、其れから７２℃に於ける２ｍｉｎの最終伸長を使用した。ＰＣＲ混合物の２μＬを１０μＬのＫＬＤ反応に用い、此れは室温で１時間に渡って進行した。此れの後に、１μＬのＫＬＤ混合物をエレクトロポレーションに用いた。
【０１２７】
ｐＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイプラスミドは、より小さい各ガイドプラスミドの相補的な半分ずつをＰＣＲに依って逐次的に増幅する事、次に爾後のＤＮＡアセンブリに依って調製した。ｐＣＡＳＣＡＤＥ−ｃｏｎｔｒｏｌベクターを鋳型として用いた。２つ以上のガイドのアレイを有するｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドはＱ５ハイフィデリティー２×マスターミックス（ニュー・イングランド・バイオラボ・インク（New England Biolabs Inc.），ＭＡ）を用いて調製した。ＰＣＲサイクルは次の通りであった：増幅は、３０秒の９８℃に於ける初期の変性ステップ、次に３５サイクルの９８℃１０秒、６６℃３０秒、及び７２℃４５秒（伸長速度は３０秒／ｋｂであった）に於けるサイクル運転、其れから７２℃に於ける２ｍｉｎの最終伸長を使用した。ＰＣＲ産物はゲル抽出に依って精製し、２０μＬの超純水を用いて５０μＬのＰＣＲ反応精製を溶出した。溶出した各ＰＣＲ産物の１μＬを１０μＬのギブソンアセンブリ（ニュー・イングランド・バイオラボ・インク（New England Biolabs Inc.），ＭＡ）に用い、此れは１５ｍｉｎの５０℃に於けるインキュベーションに依って完了した。１μＬのギブソンアセンブリミックスをエレクトロポレーションに用いた。
【０１２８】
生産経路酵素は低燐酸誘導性プロモーターに依って高コピープラスミドから発現した。生産経路遺伝子配列はＩＤＴウェブサイトからのコドン最適化ツールを用いてコドン最適化し、各経路について、燐酸化されたＧ−ｂｌｏｃｋｓ（商標）をＩＤＴから設計及び購入した。製造者のプロトコールを踏襲してＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉＤＮＡアセンブリマスターミックスを用いてプラスミドをアセンブリした（ニュー・イングランド・バイオラボ・インク（New England Biolabs Inc.），ＭＡ）。ｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−Ｋａｎ（ルシジェン・コーポレーション（Lucigen Corporation），ＷＩ）を全ての経路プラスミドのバックボーンとして用いた。全てのプラスミド配列はＤＮＡシーケンシング（イートンバイオサイエンス・インク（Eton Bioscience Inc.），ＮＣ）に依って確認し、アドジーン（Addgene）に寄託した。
【０１２９】
Ｅ．ｃｏｌｉのＢｉｏＬｅｃｔｏｒ
各株のシングルコロニーを適切な抗生物質を有する５ｍＬのＬＢに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで９時間に渡って又はＯＤ６００が＞２に達する迄培養した。培養の５００μＬを適切な抗生物質を有する１０ｍＬのＳＭ１０培地に接種し、スクエア振盪フラスコ（ＣＡＴ＃：２５−２１２，ジェネシー・サイエンティフィク・インク（Genesee Scientific, Inc.），サンディエゴ，ＣＡ）に依って３７℃、２２０ｒｐｍで１６時間に渡って培養した。細胞を遠心に依ってペレット化し、ＦＧＭ３培地を用いて培養密度をＯＤ６００＝５に正規化した。増殖及び蛍光測定は、高物質移動ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（ＣＡＴ＃：ＭＴＰ−４８−Ｂ，エムツーピーラブス・ゲーエムベーハー（m2p-labs GmbH），独国）を用いてＢｉｏｌｅｃｔｏｒ（エムツーピーラブス・ゲーエムベーハー（m2p-labs GmbH），ベスヴァイラー，独国）に依って得た。ＯＤ正規化した培養の４０μＬを適切な抗生物質を有する７６０μＬのＦＧＭ３培地に接種した。Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ設定は次の通りであった：ＲＦＰゲイン＝１００、ＧＦＰゲイン＝２０、バイオマスゲイン＝２０、振盪スピード＝１３００ｒｐｍ、温度＝３７℃、湿度＝８５％。あらゆる株はトリプリケートで分析した。
【０１３０】
Ｅ．ｃｏｌｉマイクロ発酵
プラスミドはエレクトロポレーションに依ってホスト株に形質転換した。製造者のプロトコールを踏襲してＥＣＭ６３０高スループットエレクトロポレーションシステム（ハーバードアパラタス・インク（Harvard Apparatus, Inc.），ホリストン，ＭＡ）を用いるか、又は個々のエレクトロポレーションキュベットを用いた。等体積の無菌２０％グリセロールを追加する事に依って、各形質転換プレートについてグリセロールストックを調製し、３μＬを用いて、適切な抗生物質を有する１５０μＬのＳＭ１０＋＋培地に一晩培養を接種した。プレートをサンドイッチカバー（モデル＃ＣＲ１５９６。エンザイスクリーン・ビーブイ（EnzyScreen BV），ハールレム，オランダから得た）に依ってカバーした。此れ等のカバーは、インキュベーションの間の最小限の蒸発損失を保証した。別様に述べられていない限り、９６ウェルプレートは３７℃、４００ｒｐｍで１６時間に渡って培養した。シェーカー軌道は２５ｍｍである。必要とされる物質移動係数を得、充分な培養酸素供給を可能にする為には、軌道及び最小限の振盪スピードの此の組み合わせが要求される。
【０１３１】
１６時間の増殖後に、細胞を遠心に依ってペレット化し、過剰な培地を取り除き、細胞を１５０μＬのＦＧＭ３洗浄溶液に再懸濁した。爾後に、細胞をもう一度ペレット化し、再び過剰な培地を取り除き、ペレットを適切な抗生物質を含有する５０μＬの燐酸無しＦＧＭ３培地に再懸濁した。標準的な平底９６ウェルプレートを用いるＯＤ６００測定の為に、再懸濁した培養の５μＬを１９５μＬの水に追加した。１５０μＬの総体積で標準的な９６ウェルプレートを用いて、適切な抗生物質を含有する燐酸無しＦＧＭ３培地を用いて、生産のＯＤ６００をＯＤ６００＝１に正規化した。プレートをサンドイッチカバー（モデル＃ＣＲ１５９６。エンザイスクリーン・ビーブイ（EnzyScreen BV），ハールレム，オランダから得た）に依ってカバーし、９６ウェルプレート培養を３７℃、４００ｒｐｍで２４時間に渡ってインキュベーションした。２４時間の生産後に、各ウェルからの全てのサンプルを遠心に依ってペレット化し、爾後の分析的な測定の為に上清を収集した。トリプリケートのマイクロ発酵を各株について実施した。
【０１３２】
増殖連動型アラニンマイクロ発酵の為に、グリセロールストック調製及びＳＭ１０＋＋に依る１６時間の一晩培養は上に記載されている通り進行した。ＳＭ１０＋＋培地に依る１６時間の増殖後に、一晩培養の５μＬを、適切な抗生物質を含有する４０ｍＭ燐酸を有する１５０μＬのＦＧＭ３に接種した。プレートをサンドイッチカバー（モデル＃ＣＲ１５９６。エンザイスクリーン・ビーブイ（EnzyScreen BV），ハールレム，オランダから得た）に依ってカバーし、９６ウェルプレート培養を３７℃、４００ｒｐｍで２４時間に渡ってインキュベーションした。２４時間の生産後に、ＯＤ６００を記録し、其れから、各ウェルからの全てのサンプルを遠心に依ってペレット化し、爾後の分析的な測定の為に上清を収集した。トリプリケートのマイクロ発酵を各株について実施した。
【０１３３】
マイクロ発酵のロバスト性評価は補足資料第８節に記載されている通り執り行った。
【０１３４】
１Ｌ発酵シード
形質転換プレートからのシングルコロニーを適切な抗生物質を有する５ｍＬのＬＢに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで１６時間に渡って培養した。ＬＢ培養の５００μＬをスクエア振盪フラスコ（ＣＡＴ＃：２５−２１４，ジェネシー・サイエンティフィク・インク（Genesee Scientific, Inc.），サンディエゴ，ＣＡ）中の適切な抗生物質を有する５０ｍＬのＳＭ１０培地に接種し、培養を３７℃に於いて２２０ｒｐｍの振盪スピードで２４時間に渡ってインキュベーションした。此の時に、ＯＤ６００は通常は３及び１０の間である。培養を４０００ｒｐｍに於ける１５ｍｉｎの遠心に依って収穫し、上清を捨て、ＳＭ１０培地を用いて細胞培養をＯＤ６００＝１０に正規化した。１Ｌ発酵シードでは、正規化されたＯＤ６００＝１０培養の６ｍＬをクライオバイアル中の１．５ｍＬの５０％グリセロールに追加し、−８０℃で保存した。
【０１３５】
１Ｌ発酵
インフォース−ＨＴ（Infors-HT）のＭｕｌｔｉｆｏｒｓ（ローレル，ＭＤ，米国）パラレルバイオリアクターシステムを用いて、１Ｌ発酵を実施した。空気、酸素、及び窒素ガスの為に配設された３つのガス接続マスフローコントローラーを包含した。用いたベッセルは１４００ｍＬの総体積及び最高で１Ｌの使用体積を有した。オンラインのｐＨ及びｐＯ２モニタリング及びコントロールはハミルトン・カンパニー（Hamilton company）プローブに依って成し遂げられた。オフガス分析は多重Ｂｌｕｅ−ｉｎ−Ｏｎｅブルーセンス・ガスアナライザー（ブルーセンス・コーポレーション（BlueSens Corporation），ノースブルック，ＩＬ，米国）に依って成し遂げられた。培養密度は２２５ｍｍのオプテックＯＤプローブ（オプテックダヌラット・インク（optek-Danulat Inc.），ジャーマンタウン，ＷＩ，米国）を用いて継続的にモニタリングした。用いたシステムはＩｒｉｓＶ６．０コマンド及びコントロールソフトウェアを実行し、Ｓｅｇ−ｆｌｏｗ自動サンプリングシステム（フローナミクス・アナリティカルインストゥルメンツ・インク（Flownamics Analytical Instruments, Inc.），ロデオ，ＣＡ，米国）と一体化しており、ＦＩＳＰセルフリーサンプリングプローブ、Ｓｅｇｍｏｄ４８００、及びＦｌｏｗＦｒａｃｔｉｏｎ９６ウェルプレートフラクションコレクターを包含した。
【０１３６】
〜１０ｇｃｄｗ／Ｌバイオマスに依る標準化された２段階プロセスでは、Ｅ．ｃｏｌｉバイオマス終濃度〜１０ｇｃｄｗ／Ｌを標的化する為の十分な燐酸を有する８００ｍＬのＦＧＭ１０培地を槽に充填した。抗生物質を適切に追加した。凍結シードバイアルを氷上で融解し、シード培養の７．５ｍＬを用いて槽に接種した。接種後に、５Ｍ水酸化アンモニウム及び１Ｍ塩酸を滴定剤として用いて、槽を３７℃且つｐＨ６．８にコントロールした。図３Ｇの発酵の実行には１０Ｍ水酸化アンモニウムを用いた。次の酸素コントロールスキームを用いて、所望の溶存酸素設定点を維持した。第１に、ガス流量を最小値の０．３Ｌ／ｍｉｎの空気から０．８Ｌ／ｍｉｎの空気迄増大させ、爾後に、より多くの通気が必要とされる場合には、撹拌を最小値の３００ｒｐｍから最大値の１０００ｒｐｍ迄増大させた。最後に、設定点を達成する為により多くの酸素が要求される場合には、一体化されたマスフローコントローラーを用いる酸素補給を包含した。出発グルコース濃度は２５ｇ／Ｌであった。一度撹拌が８００ｒｐｍに達したら、一定した無菌濾過済み濃縮グルコースフィード（５００ｇ／Ｌ）を所定の速度、即ち２ｇ／ｈで槽に追加した。フィード速度又は溶存酸素含量がロバスト性研究の為に変えられる事を必要としたケースでは、変化は細胞が静止期に進入した後で成された。発酵の実行は静止期への進入後に最高で〜５０時間に渡って伸ばし、３時間毎にサンプルを自動的に抜き出した。サンプルは爾後の分析的な測定の為に保管した。
【０１３７】
増殖連動型発酵プロセスのケースでは、槽に４０ｍＭ燐酸を有する８００ｍＬのＦＧＭ１０培地を充填した。此れは多大に過剰であり、燐酸欠乏が増殖連動型発酵プロセスでは発生しないと言う事を保証した。抗生物質を適切に追加した。凍結シードバイアルを氷上で融解し、シード培養の７．５ｍＬを用いて槽に接種した。接種後に、５Ｍ水酸化アンモニウム及び１Ｍ塩酸を滴定剤として用いて、槽を３７℃且つｐＨ６．８にコントロールした。次の酸素コントロールスキームを用いて、所望の溶存酸素設定点を維持した。第１に、ガス流量を最小値の０．３Ｌ／ｍｉｎの空気から０．８Ｌ／ｍｉｎの空気迄増大させ、爾後に、より多くの通気が必要とされる場合には、撹拌を最小値の３００ｒｐｍから最大値の１０００ｒｐｍ迄増大させた。最後に、設定点を達成する為により多くの酸素が要求される場合には、一体化されたマスフローコントローラーを用いる酸素補給を包含した。出発グルコース濃度は２５ｇ／Ｌであった。一度撹拌が８００ｒｐｍに達したら、一定した無菌濾過済み濃縮グルコースフィード（５００ｇ／Ｌ）を所定の速度、即ち２ｇ／ｈで槽に追加した。フィード速度及び溶存酸素濃度を始めに所望の値に設定し、発酵プロセスの間は維持した。発酵の実行は最高で〜５０時間に渡って続け、３時間毎にサンプルを自動的に抜き出した。サンプルは爾後の分析的な分析の為に保管した。
【０１３８】
分析方法
定量した全ての化合物のサンプル標準曲線が補足資料第１０節に示されている。
【０１３９】
グルコース及びエタノール定量：ウォーターズ２４１４屈折率（ＲＩ）検出器と一体化したＡｃｑｕｉｔｙ−ＨクラスＵＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション（Waters Corporation），ミルフォード，ＭＡ，米国）を用いて、グルコース及びエタノール濃度の同時定量の為に、ＵＰＬＣ−ＲＩ法を開発した。クロマトグラフィー分離はバイオラッドＦａｓｔＡｃｉｄ分析ＨＰＬＣカラム（１００×７．８ｍｍ，９μｍ粒径；ＣＡＴ＃：＃１２５０１００，バイオラッドラボラトリーズ・インク（Bio-Rad Laboratories, Inc.），ハーキュリーズ，ＣＡ）を用いて６５℃に於いて実施した。５ｍＭ硫酸を溶離液として用いた。イソクラティック溶出は次の通りであった：０〜０．１ｍｉｎ，流量を０．４ｍＬ／ｍｉｎから０．４２ｍＬ／ｍｉｎ迄増大、０．１〜１２ｍｉｎ，０．４８ｍＬ／ｍｉｎの流量。サンプル注入体積は１０μＬであった。ＵＰＬＣ法開発は分析成分の標準的なストック水溶液を用いて行った。ピーク積分及び更なる分析はＭａｓｓＬｙｎｘ−ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。用いた直線範囲はグルコースでは１〜１０ｇ／Ｌであり、エタノールでは１〜２０ｇ／Ｌであった。必要に応じて、正しい直線範囲内である様にサンプルを希釈した。希釈は超純水を用いて実施した。
【０１４０】
アラニン定量：逆相ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法をアラニンについて開発した。クロマトグラフィー分離はレステックウルトラＡＱ−Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｉ．ｄ．，３μｍ；ＣＡＴ＃：９１７８３６２，レステックコーポレーション（Restek Corporation），ベルフォンテ，ＰＡ）を用いて７０℃に於いて実施した。次の溶離液を用いた：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．２％蟻酸、及び０．０５％アンモニウム（ｖ／ｖ）；溶媒Ｂ：ＭｅＯＨ、０．２％蟻酸、及び０．０５％アンモニウム（ｖ／ｖ）。勾配溶出は次の通りであった：０〜０．１ｍｉｎ，イソクラティックな５％Ｂ、流量を０．６５ｍＬ／ｍｉｎから０．７５ｍＬ／ｍｉｎ迄増大；０．１〜０．３ｍｉｎ，０．７５ｍＬ／ｍｉｎで５％から９５％Ｂ迄直線的；０．３〜０．９ｍｉｎ，０．７５ｍＬ／ｍｉｎでイソクラティックな９５％Ｂ；及び０．９〜１．２ｍｉｎ，０．７５ｍＬ／ｍｉｎで９５％から５％Ｂ迄直線的；１．２〜１．３ｍｉｎ，０．７５ｍＬ／ｍｉｎでイソクラティックな５％Ｂ。サンプル注入体積は５μＬであった。ＵＰＬＣ法開発は分析成分の標準的なストック水溶液を用いて行った。分離はＸｅｖｏ（商標）ＴＱＤ質量分析計と一体化したＡｃｑｕｉｔｙ−ＨクラスＵＰＬＣを用いて実施した（ウォーターズコーポレーション（Waters Corporation），ミルフォード，ＭＡ，米国）。ＭＲＭトランジションを包含するＭＳ／ＭＳパラメータは各分析成分についてチューニングした。表２２に挙げられている。アラニン（２，３−１３Ｃ２，９９％）をアラニンの内部標準として５ｍｇ／Ｌの濃度で用いた。ピーク積分及び更なる分析はＭａｓｓＬｙｎｘ−ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。アラニンの直線範囲は１〜１００ｍｇ／Ｌであった。必要に応じて、正しい直線範囲内である様にサンプルを希釈した。希釈は超純水を用いて実施し、１０倍の最終希釈は溶媒Ａを用いて実施し、５ｍｇ／ＬのＣ１３アラニン（２，３−１３Ｃ２，９９％）を有した。
【０１４１】
メバロン酸定量：メバロン酸及びメバロノラクトンの同時定量の為に、逆相ＵＰＬＣ−ＴＵＶ法を開発した。クロマトグラフィー分離はレステックウルトラＡＱ−Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｉ．ｄ．，３μｍ；ＣＡＴ＃：９１７８３６２，レステックコーポレーション（Restek Corporation），ベルフォンテ，ＰＡ）を用いて３０℃に於いて実施した。２０ｍＭ燐酸を溶離液として用いた。イソクラティック溶出は次の通りであった：１ｍＬ／ｍｉｎに於ける０〜３ｍｉｎのイソクラティック。サンプル注入体積は１０μＬであった。吸光度を２１０ｎｍでモニタリングした。ＵＰＬＣ法開発は分析成分の標準的なストック水溶液を用いて行った。分離はＡｃｑｕｉｔｙ−ＨクラスＵＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション（Waters Corporation），ミルフォード，ＭＡ，米国）を用いて実施した。ピーク積分及び更なる分析はＭａｓｓＬｙｎｘ−ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。メバロン酸及びメバロノラクトンの直線範囲は０．０１〜０．１ｇ／Ｌであった。必要に応じて、正しい直線範囲内である様にサンプルを希釈した。２０ｍＭ燐酸に依って希釈したメバロン酸は自発的にメバロノラクトンに変換するであろう８０。其れ故に、メバロン酸及びメバロノラクトン両方の定量が発酵サンプルに必要であった。メバロン酸及びメバロノラクトンの標準は毎回新しく調製し、即座にＵＰＬＣに流した。希釈は超純水を用いて実施し、１０倍の最終希釈は2０ｍＭ燐酸を用いて実施した。
【０１４２】
アラニン立体異性体定量：Ｌ−／Ｄ−アラニンの同時定量及び区別の為に逆相ＵＰＬＣ−ＴＵＶ法を開発した。クロマトグラフィー分離はＣｈｉｒｅｘ３１２６（Ｄ）−ペニシラミンカラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ；フェノメネックス・インク（Phenomenex Inc.），トーランス，ＣＡ）を用いて５０℃に於いて実施した。２ｍＭ硫酸銅を溶離液として用いた。イソクラティック溶出は次の通りであった：０．７５ｍＬ／ｍｉｎに於いて０〜１０ｍｉｎ。サンプル注入体積は１０μＬであった。吸光度を２５４ｎｍでモニタリングした。ＵＰＬＣ法開発は分析成分の標準的なストック水溶液を用いて行った。分離はＡｃｑｕｉｔｙ−ＨクラスＵＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション（Waters Corporation），ミルフォード，ＭＡ，米国）を用いて実施した。ピーク積分及び更なる分析はＭａｓｓＬｙｎｘ−ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。Ｌ−／Ｄ−アラニンの直線範囲は０．１〜１ｇ／Ｌであった。必要に応じて、正しい直線範囲内である様にサンプルを希釈した。希釈は超純水を用いて実施した。
【０１４３】
補足資料
【表１】
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【０１４４】
第１節：燐酸プロモーター
燐酸プロモーター配列はＰｈｏＢに依って制御されるプロモーターのＥｃｏＣｙｃデータベース８１から得た（https://ecocyc.org/，表２）。我々は、燐酸欠乏に対して応答する事が以前にキャラクタリゼーションされたプロモーターの相対的強さのみならず、加えて、燐酸リッチな条件に於ける相対的な漏れ易さを評価しようとした。此の狙いの為に、我々は一連の蛍光レポータープラスミドを構築した。我々はｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−Ｋａｎ（ルシジェン・コーポレーション（Lucigen Corporation），ＷＩ）バックボーン上の一連の１２個の燐酸依存性プロモーターの後ろに紫外励起可能なＧＦＰｕｖ遺伝子をクローニングした。此れ等のレポーター株をエムツーピーラブス・ゲーエムベーハー（m2p-labs GmbH）Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ（商標）に依って２段階マイクロ発酵プロトコールで評価した。結果は図７に例示されている。発現カセットが染色体インテグレーションされる時の高レベルの緊密にコントロールされた発現の為に、又はガイドアレイの誘導性の発現の為に、多くの場合にはｕｇｐＢ遺伝子プロモーターを選んだ。
【０１４５】
インスレーター８２を燐酸プロモーターの部分集合の５’及び３’末端両方に追加して（表３）、異なる配列文脈に於ける一貫した性能を助けた。リードスルー転写を縮減する為に、固有のターミネーターを各インスレーター付きプロモーターの５’末端に追加した。ターミネーター配列はhttp://parts.igem.org/Terminators/Catalogからであった。ＧＦＰｕｖ発現を用いて、エムツーピーラブス・ゲーエムベーハー（m2p-labs GmbH）Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ（商標）に依って、インスレーター付き燐酸プロモーターを類似にキャラクタリゼーションした（図８）。
【０１４６】
【表２】
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【表３】
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【０１４７】
【表４】
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【表５】
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【０１４８】
第２節：恒常的プロモーター
色々な強さの一連のインスレーター付き恒常的プロモーターが恒常的発現に用いられ、デイビス（Davis）等から直接的に取られ、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣ、ｐｒｏＤプロモーター８２及びＨＣＥｐプロモーター８３を包含した。インスレーターをＨＣＥｐプロモーターの５’及び３’に追加した。インスレーター付き燐酸プロモーターと類似に、固有のターミネーターを恒常的プロモーターの５’末端に追加した。此れ等は、増殖連動型生産株に依る恒常的な経路発現を駆動する為に、及び恒常的な異種的な遺伝子発現が適切である株改変を成す為に用いた。此れ等のプロモーター配列は下の表４に依って与えられており、プロモーターはＧＦＰｕｖ発現を用いてキャラクタリゼーションされている（図９）。
【０１４９】
【表６】
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【表７】
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【０１５０】
第３節：染色体改変されたホスト株
図１１は各染色体改変を図示している。本研究に利用及び／又は構築した株は表５に挙げられている。表６及び７は株構築及び／又は確認に用いたオリゴヌクレオチド及び合成ＤＮＡ配列を挙げている。図１２及び図１３Ａ〜Ｅは１Ｌ発酵に於けるコントロール株について増殖速度及び増殖の間のグルコース分配を示している。
【０１５１】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１５２】
【表１１】
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【表１２】
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【０１５３】
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【０１５４】
第４節：蛋白質レベルの動的コントロール．
蛍光蛋白質及びサイレンシングガイドを発現するプラスミドを、表８に挙げられている対応するホスト株に形質転換した。株をエムツーピーラブス・ゲーエムベーハー（m2p-labs GmbH）Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ（商標）に依ってトリプリケートで評価した。此れは、ＧＦＰｕｖ及びｍＣｈｅｒｒｙレベルを包含する蛍光とバイオマスレベルとを同時に測定する。
【表２４】
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【０１５５】
ＯＤ６００読取り値は下の式を用いて補正し、此処でＯＤ６００はオフライン測定を言い、ＯＤ６００＊はＢｉｏｌｅｃｔｏｒバイオマス読取り値を言い、ｔ０は始点を指示し、ｔｆは終点を指示する。
【数２】
0006878607.tif 000027
【０１５６】
第５節：代謝コントロール
平衡に近い反応
平衡に近い反応の代謝物質プールへの調節弁のインパクトを、Ｇ６Ｐノードを例として用いて例示する。略語：Ｇｌｕｃ，グルコース；Ｇ６Ｐ，グルコース６燐酸；Ｆ６Ｐ，フルクトース６燐酸；６ＰＧｌ，グルコノラクトン６燐酸。
【０１５７】
調節弁無しのＧ６Ｐノード
【数３】
0006878607.tif 000028
【０１５８】
調節弁有りのＧ６Ｐノード
ｚｗｆ調節弁が作動中である時に、Ｊ３≒０。
【数４】
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【０１５９】
調節弁のインパクト
【数５】
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平衡に近いので、［６ＰＧｌ］＞［Ｇ６Ｐ］
【数６】
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平衡に近い熱力学的に有利な反応のネットワークからの取り除きは、増大した代謝物質プールを齎すであろう。
【０１６０】
第６節：遺伝子サイレンシングアレイ＆経路発現構築物
ＣＡＳＣＡＤＥガイド及びガイドアレイの設計及び構築は下で図１４及び図１５Ａ〜Ｂに例示されている。ｐＣＡＳＣＡＤＥ−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドは、ｐｃｒＲＮＡ．Ｔｅｔ８８のｐＴｅｔプロモーターをインスレーター付きの低燐酸に依って誘導されるｕｇｐＢプロモーター８２に取り替える事に依って調製した。２つのプロモーターがｇｌｔＡ遺伝子を制御する事を担っており、両方のプロモーターについてｓｇＲＮＡを設計し、ガイドｇｌｔＡ１（Ｇ１）及びｇｌｔＡ２（Ｇ２）を齎した８９。４つのプロモーターがｇａｐＡ遺伝子を制御する事を担っており、第１のプロモーターについてｓｇＲＮＡを設計した。何故なら、指数増殖期の間には、ｇａｐＡのｍＲＮＡは高度に効率的なｇａｐＡのＰ１プロモーターに於いて主に開始し、静止期の間には、他の３つのｇａｐＡプロモーターと比較して高い儘残ったからである９０。ｌｐｄ制御にはｌｐｄ遺伝子の上流の複数のプロモーターが使用されており（https://ecocyc.org/gene?orgid=ECOLI&id=EG10543#tab=showAll）、其れ故に、ｌｐｄのみの固有の有効なｓｇＲＮＡの設計は可能ではなかった。ｆａｂＩ、ｕｄｈＡ、及びｚｗｆのプロモーター配列はＥｃｏＣｙｃデータベース（https://ecocyc.org/）から得た。ＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイを設計する為に、関心のプロモーターの−３５又は−１０ボックスの近くのＣＡＳＣＡＤＥのＰＡＭ部位を同定し、ＰＡＭ部位の３’末端の３０ｂｐをガイド配列として選択し、製造者のプロトコールを踏襲してＱ５部位特異的変異導入（ニュー・イングランド・バイオラボ・インク（New England Biolabs Inc.），ＭＡ）を用いてｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドにクローニングした。５％ｖ／ｖＤＭＳＯをＱ５ＰＣＲ反応に追加したと言う変更を有した。ｐＣＡＳＣＡＤＥ−ｃｏｎｔｒｏｌベクターを鋳型として用いた。図１５Ａ〜Ｂに例示されている通り、２つ以上のガイドのアレイを有するｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドを調製した。ｐＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイプラスミドは、より小さい各ガイドプラスミドの相補的な半分ずつをＰＣＲに依って逐次的に増幅する事、次に爾後のＤＮＡアセンブリに依って調製した。表９は、ｓｇＲＮＡガイド配列及び其れ等を構築する為に用いたプライマーを挙げている。全てのｐＣＡＳＣＡＤＥサイレンシングプラスミドは下の表１０に挙げられており、アドジーン（Addgene）に於いて利用可能である。
【０１６１】
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【０１６２】
【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【０１６３】
第７節：２段階マイクロ発酵
Ｅ．ｃｏｌｉ培地ストック溶液
・  １０×濃縮アンモニウム−クエン酸３０塩（１Ｌ）、３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１．５ｇのクエン酸を掻き混ぜ乍ら水中で混合し、１０ＭのＮａＯＨに依ってｐＨを７．５に合わせる。オートクレーブし、室温（ＲＴ）で保存する。
・  １０×濃縮アンモニウム−クエン酸９０塩（１Ｌ）、９０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｇのクエン酸を掻き混ぜ乍ら水中で混合し、１０ＭのＮａＯＨに依ってｐＨを７．５に合わせる。オートクレーブし、ＲＴで保存する。
・  １Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸カリウム（ＭＯＰＳ）、５０％ＫＯＨに依ってｐＨ７．４に合わせる。濾過滅菌し（０．２μｍ）、ＲＴで保存する。
・  ０．５Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８．２４８．５ｍＬの１．０ＭのＫ２ＨＰＯ４及び２５１．５ｍＬの１．０ＭのＫＨ２ＰＯ４を混合し、超純水に依って１０００ｍＬの終体積に合わせる。濾過滅菌し（０．２μｍ）、ＲＴで保存する。
・  ２ＭのＭｇＳＯ４及び１０ｍＭのＣａＳＯ４溶液、濾過滅菌し（０．２μｍ）、ＲＴで保存する。
・  チアミンＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液、濾過滅菌し（０．２μｍ）、４℃で保存する。
・  グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液、熱し乍ら掻き混ぜて溶解する。冷却し、濾過滅菌し（０．２μｍ）、ＲＴで保存する。
・  １００ｇ／Ｌ酵母エキス、オートクレーブし、ＲＴで保存する。
・  １００ｇ／Ｌカザミノ酸、オートクレーブし、ＲＴで保存する。
・  ５００×微量金属ストック：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４、０．６ｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５．０ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．６ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＨ３ＢＯ３、及び０．３ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏを含有する１０００ｍＬの水中のミクロ栄養素の溶液を調製する。濾過滅菌し（０．２μｍ）、ＲＴで暗所に保存する。
・  培地を調製する前に毎回、水中の４０ｍＭ硫酸第二鉄七水和物の新しい溶液を調製し、濾過滅菌する（０．２μｍ）。
【０１６４】
培地構成成分
沈殿を最小化する為に書かれている順番で次表に基づくストック溶液を無菌的に混合する事に依って、最終的な使用培地を調製し、其れから濾過滅菌する（０．２μｍフィルターに依る）。
【０１６５】
【表４３】
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【０１６６】
【表４４】
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【０１６７】
マイクロ発酵
マイクロ発酵プロトコールの概観が図１６Ａ〜Ｃに例示されている。株は９６ウェルプレートマイクロ発酵に於ける生産について評価し、２４時間の生産段階の為に、細胞を対数期中期迄初期増殖させ、収穫し、洗浄し、再懸濁し、燐酸不含生産培地に依ってＯＤ６００＝１に正規化した。マイクロ発酵の成功は：（１）指数期に全ての株を収穫する事に依って株を同調させる事と；（２）回分の糖を低く保ち得乍ら有意な予想される産物蓄積を可能にする様な、低いバイオマスレベルの使用と；（３）充分な混合及び通気を供給し乍ら蒸発損失を最小化する為の方法とを要求した。最後の要件に対処する為に、ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ（商標）からの商業的に利用可能なマイクロプレートサンドイッチカバー及びクランプを用いた。此れ等は、蒸発損失を大いに縮減し乍ら、４００ｒｐｍで動作する標準的な２５ｍｍオービタルシェーカーに於いて高いレベルの混合及び通気を可能にする９２〜９３。異なるインスレーター付き燐酸プロモーターに依るアラニン生産のマイクロ発酵結果が図１７に示されている。ｇａｐＡ及びｇａｐＮ遺伝子変改を有する評価した株のマイクロ発酵結果が図１８に依って与えられている。
【０１６８】
第８節：マイクロ発酵のロバスト性評価
マイクロ発酵の酸素ロバスト性研究の間に、生産培養体積を変えて、以前に報告された通り且つ下で表１４に挙げられている通り、所望の酸素移動速度（ＯＴＲ）値を達成した（http://www.enzyscreen.com/oxygen_transfer_rates.htm）９２〜９３。生産段階の間の回分グルコースレベルを変改して、グルコースに対するロバスト性を評価した。マイクロ発酵スケールのロバスト性実験に利用した株は表１５に挙げられている。マイクロ発酵のロバスト性研究からの結果は、図１９Ａ〜Ｄ、図２０Ａ〜Ｄ、図２１Ａ〜Ｄ、図２２Ａ〜Ｄ、図２３Ａ〜Ｄ、図２４Ａ〜Ｄ、図２５Ａ〜Ｄ、図２６Ａ〜Ｄ、図２７Ａ〜Ｄ、図２８Ａ〜Ｄ、図２９Ａ〜Ｄ、図３０Ａ〜Ｄ、図３１Ａ〜Ｄ、及び図３２に与えられている。
【０１６９】
【表４５】
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【０１７０】
【表４６】
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【表４７】
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【０１７１】
第９節：標準化された２段階発酵
燐酸を制限した標準化された２段階発酵プロトコールを、全ての調節弁株の評価に利用した。此のプロトコールは高度に再現可能な増殖段階結果を生み、異なる産物を作る株同士でさえも、最小限の株から株への変動性を有する。異なる株に依る異なるフィード速度及び塩基利用の結果として、生産段階の間には、より有意な変動性が観察された。図３３Ａは、本研究に於いて実施した１Ｌ発酵の１０ｇ・ｃｄｗ／Ｌバイオマスレベルに依る全ての調節弁株の増殖曲線を与えている。此の一貫性は、図３３Ｂに依って与えられている増殖連動型生産株のより変動的な増殖とは対照的である。
【０１７２】
【表４８】
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【０１７３】
第１０節：分析法
【表４９】
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【０１７４】
図面の詳細な説明
図１Ａ：２段階発酵に於ける動的な代謝コントロールの概観。代謝工学は、所望の産物への代謝経路をホストの既存の代謝ネットワークに対して最適化する事を使用し、フィードストックを所望の産物に変換する。塗り潰された丸は代謝物質を指示し、線は酵素反応を指示する。多くの場合に、代謝工学に於ける従来的な最適化は、３つの鍵と成るステップ（ａ）望まれない副産物に至る物を包含する競合する非必須の代謝経路の欠失、及びフィードストック分子を産物に変換する経路の酵素の過剰発現（より太い線に依って指示されている）と、予想上は（ｂ）生産を更に増大させる為に必須の代謝の酵素を減弱させる事（橙色の線に依って指示されている）とを使用する。此のプロセスを繰り返して、収量を所望の産物に最適化する（円グラフ）。対照的に、動的な代謝ネットワーク最小化を用いて、普通に用いられる２段階発酵プロセスのポテンシャルを完全に解き放ち得る（ｃ〜ｄ）。此れ等のプロセスの第１の段階に於いては（ｃ）バイオマス増殖及び収量を最適化し乍ら、第２の段階に於いては（ｄ）産物形成を最適化する。此れは、バイオマスレベルが蓄積し、制限栄養素（此のケースでは無機燐酸）を消費し、此れが欠乏した時に生産的な静止期への進入をトリガーする２段階プロセス（ｅ）に良く適している。ＣＲＩＳＰＲｉに基づく遺伝子サイレンシング及び／又はコントロールされた蛋白質分解を利用する合成的な代謝調節弁を用いて（ｆ及びｇ）生産段階への遷移に依って該当する代謝ネットワークを大いに縮減し得、（ｆ）サイレンシングガイドのアレイが誘導され、ＣＡＳＣＡＤＥ複合体に依って個々のガイドへとプロセシングされ、関心の複数の遺伝子（ＧＯＩ）をサイレンシング標的化する為に用いられ得る。（ｇ）Ｃ末端ＤＡＤ＋４タグが染色体改変に依って関心の酵素（ＥＯＩ）に追加される場合には、其れ等は誘導性のｓｓｐＢシャペロンの存在下に於いてｃｌｐＸＰプロテアーゼに依って誘導的に分解され得る。（ｈ）誘導性の蛋白質分解及びＣＲＩＳＰＲｉサイレンシングに依る２段階の動的コントロールを用いるＥ．ｃｏｌｉの蛋白質レベルの動的コントロール。細胞が増殖すると、燐酸が欠乏し、細胞はｍＣｈｅｒｒｙを「オフにし」、ＧＦＰｕｖを「オンにする」。網掛けエリアは平均からの１標準偏差を表す。ｎ＝３。（ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙ分解への単独及び組み合わせの蛋白質分解及び遺伝子サイレンシングの相対的なインパクトと、（ｊ）減衰速度。
【０１７５】
図１Ｂ：株及びバイオプロセス最適化。（ａ）多くの場合に、代謝工学に於ける株及びプロセス最適化の為の従来のアプローチは、競合する非必須の代謝経路の欠失と経路酵素の過剰発現とを使用する（塗り潰された丸：代謝物質；線：酵素反応。緑は生産経路を指示した）。（ａ−ｉ）株バリアントはスクリーニングスケールで評価され（マイクロタイタープレート、振盪フラスコ等）、（ａ−ｉｉ）最も良好な株を、より大スケールの計装化バイオリアクターに依って評価する。多数の設計−組立−試験サイクル（ａ−ｖｉ〜ｖｉｉ）を用いて、生産株及びプロセス両方を繰り返し最適化する。多くの場合に決定的な環境（プロセス）変数の最適化を包含する（ａ−ｖｉｉ）。（ａ−ｉｉｉ）最も良好な実施株及び関連する最適化されたプロセス条件を、産業的に然るべきレベルへとスケーリングする。（ｂ）２段階の動的な代謝コントロールを用いる迅速な株及びバイオプロセス最適化。細胞の代謝ネットワークは産物形成に必須のステップのみへと動的に最小化される。此れは標準化された２段階バイオプロセス（ｃ）に依って成し遂げられ、此処では、バイオマスを蓄積する増殖段階の次に、最小限の代謝ネットワークのみに依る生産段階がある。マクロ栄養素の限定は、細胞性の代謝を増殖から生産に「切り換える」為に用いられ得る。アプローチは、スクリーニングの為の予想される株バリアントのより小さい部分集合を齎す（ｂ−ｉ）。代謝ネットワーク最小化は、然るべき代謝物質レベル（ｄ）及び其れ故に生産レベルを増大させる事を助け、其れは、プロセスロバスト性（ｅ）並びに結果としてプロセス及び株スケーラブル性（ｆ）をも又強化する。スクリーニングから同定された最も良好な生産者を、（ｂ−ｉｉ）より大きい計装化バイオリアクター及び（ｂ−ｉｉｉ）爾後に産業的に然るべきレベルへと予測可能且つ迅速にスケーリングする。必要とされる場合には、改善をガイドする為に、限定された設計−組立−試験サイクル（ｂ−ｉｖ）を組み込む。株評価の為には、全てのスケールに於いて、産物非依存的な標準化されたプロトコールが踏襲され、集約的なプロセス最適化の必要を除去する。
【０１７６】
図２Ａ〜Ｄ：Ｅ．ｃｏｌｉに於ける２段階の合成的な代謝調節弁（ＳＭＶ）の実装。図２Ａは、ＣＲＩＳＰＲｉに基づく遺伝子サイレンシング及び／又はコントロールされた蛋白質分解を利用するＳＭＶが構築されたと言う事を図示している。（上）サイレンシング：誘導性のサイレンシングガイドＲＮＡのアレイ（ｉ）を用いて、関心の複数の遺伝子（ＧＯＩ）の発現をサイレンシングし得る。此の時には天然のＥ．ｃｏｌｉのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ機構が発現され、此れがガイドアレイを個々のガイド（ｉｉ）へとプロセシングし得る。（下）蛋白質分解：Ｃ末端ＤＡＳ＋４タグが関心の酵素（ＥＯＩ）に追加される時に（染色体改変に依る）、ｓｓｐＢシャペロンのコントロールされた誘導（ｉｉｉ）に依って、其れ等はｃｌｐＸＰプロテアーゼに依って分解され得る（ｉｖ）。図２Ｂは、誘導性の蛋白質分解及びＣＲＩＳＰＲｉサイレンシングを用いるＥ．ｃｏｌｉの蛋白質レベルの動的コントロールを図示している。細胞が増殖すると、燐酸が欠乏し、細胞はｍＣｈｅｒｒｙを「オフにし」、ＧＦＰｕｖを「オンにする」。網掛けエリアは平均からの１標準偏差を表す。ｒ．ｆ．ｕ，相対蛍光単位。図２Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ分解への単独及び組み合わせの蛋白質分解及び遺伝子サイレンシングの相対的なインパクトを図示している。ｎ．ｆ．ｕ．，正規化された蛍光単位（最大蛍光に対して正規化）。図２Ｄは、観察されたｍＣｈｅｒｒｙ蛍光減衰速度（時間当り）への単独及び組み合わせの蛋白質分解及び遺伝子サイレンシングの相対的なインパクトを図示している。
【０１７７】
図３Ａ〜Ｋ：２段階の動的コントロールを利用するＥ．ｃｏｌｉに依るアラニン生産。図３Ａは株バリアント設計を図示している。中央代謝の主要な経路が示されており：解糖系、ペントース燐酸経路、クエン酸サイクル（ＴＣＡ）、脂肪酸生合成、及び可溶性トランスヒドロゲナーゼを包含する。中央代謝のフラックスを縮減する為に「オフにされる」鍵と成る調節弁候補酵素／遺伝子は：グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ−「Ｚ」）、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ−「Ｌ」）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ−「Ｇ」）、エノイルＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ−「Ｆ」）、及び可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ−「Ｕ」）を包含し得る。重要な事に、ｆａｂＩの動的な除去は細胞内マロニルＣｏＡプール及びマロニルＣｏＡフラックスを増大させる事が以前に実証されている５５。動的に「オンにされる」酵素は、関心の産物、此のケースではアラニンを生産する為の代謝経路を包含し得る。具体的な経路酵素はＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ＊）及びアラニン排出輸送体（ａｌａＥ）を包含する。加えて、アラニン生産経路はＮＡＤＰＨを補因子として利用するので、Ｓ．ミュータンスのｇａｐＮ遺伝子５６に依ってコードされるＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼを、単独で、及び天然のｇａｐＡ−「Ａ」遺伝子（ＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をオフにする事との組み合わせでオンにした。略語：ＰＴＳ−グルコースホスホトランスフェラーゼ輸送システム、Ｐ−燐酸、ＢＰ−ビス燐酸、ＯＡＡ−オキサロ酢酸、ＤＨＡＰ−ジヒドロキシアセトン燐酸、ＧＡ３Ｐ−グリセルアルデヒド３リン酸、１，３−ＢＰＧ−１，３ビスホスホグリセリン酸、３−ＰＧ−３−ホスホグリセリン酸、２−ＰＧ−２−ホスホグリセリン酸、ＰＥＰ−ホスホエノールピルビン酸、ＭＳＡ−マロン酸セミアルデヒド、ＡＣＰ−アシルキャリア蛋白質、Ｒｕ−リブロース、Ｘｕ−キシルロース、Ｅ−エリトロース、Ｒｉ−リボース、Ｓ−セドヘプツロース。遺伝子サイレンシング単独、蛋白質分解単独、又は両方の組み合わせの何方かに依って、調節弁遺伝子／酵素の全ての組み合わせの動的コントロールの為のＳＭＶに依って株を操作した。此れ等の株を標準化されたマイクロ発酵に於けるアラニン生産について評価した。図３Ｂは、２段階マイクロ発酵に於いて調べた全ての調節弁株について平均アラニン力価（黒）の順位プロットを図示しており、灰色エリアは標準偏差を表す。コントロール株のアラニン生産は赤で色付けした。図３Ｃは、０ｇ／Ｌ（紫）から５ｇ／Ｌ（赤）迄の、異なる蛋白質分解及びサイレンシングの組み合わせに応答した２段階生産の平均アラニン力価を図示している。図３Ｄは、単一の「調節弁」アラニン株（ｇｌｔＡ１のサイレンシング（「Ｇ１」）、ｆａｂＩ及びｕｄｈＡの蛋白質分解（「ＦＵ」））について、評価された異なる酸素移動速度（ＯＴＲ）及びグルコース濃度に対して応答した平均アラニン力価を図示している。此の表面の結果を用いて株特異的なロバスト性スコア（ＲＳ）を計算した（本文を参照）。此の株は最も高いＲＳスコアを有する。図３Ｅは、複数のプロセス条件に於いて評価された４８個の「調節弁」株の部分集合について、ロバスト性スコアのヒートマップを図示している。図３Ｆは、マイクロ発酵（ｆａｂＩ−ｇｌｔＡ１−ｇｌｔＡ２のサイレンシング（「ＦＧ１Ｇ２」）、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ、及びｕｄｈＡの蛋白質分解（「ＦＧＵ」））から１Ｌバイオリアクターへの最も良好な生産株の１つのスケールアップが、４８ｈｒｓの生産後に０．８ｇ／ｇの収量で８０ｇ／Ｌの力価を齎す事を図示している。図３Ｇは、此の株に於けるａｌａＥアラニン排出輸送体の過剰発現（パネルｆ）が有意に改善された生産を齎し、２７ｈｒｓの生産に依って〜１ｇ／ｇの収量で１４７ｇ／Ｌに達する事を図示している（追加の詳細は補足資料第３節を参照）。図３Ｈはマイクロ発酵に於けるロバスト性評価の為に選択された株を図示している。図３Ｉは最もロバストな「調節弁」アラニン株のロバスト性及び力価を図示している（サイレンシング＿ｇｌｔＡｌ、蛋白質分解＿ＦＵ）。下面は、評価した全てのプロセス条件のメディアンに対して正規化されたアラニン力価のヒートマップを示しており、上面は、全てのプロセス条件に於けるアラニン力価を示している。同じカラースケール（ｇ／Ｌに依るアラニン力価）を両方のパネルに用いた。図３Ｊは選択された株のＲＳ３スコアを図示している。図３Ｋは、評価した全ての条件についてプロセス再現性ヒートマップを図示している。同じグレースケールを図３Ｊ及び図３Ｋに用いた。
【０１７８】
図４Ａ〜Ｆ：２段階及び増殖連動型アプローチの間のロバスト性比較。図４Ａは、評価した全てのアラニン株についてＲＳ３スコアの順位を図示しており、赤いバーは調節弁アラニン株を指示しており、青いバーは増殖連動型（ＧＡ）アラニン株を指示している。図４Ｂは、蛋白質分解「Ｆ」調節弁を有する「調節弁」アラニン株及び増殖連動型アラニン株について平均ＲＳ３スコアを図示している。図４Ｃは、評価した全ての条件のマイクロ発酵に於ける代表的な「調節弁」アラニン（蛋白質分解＿ＦＧＵ、サイレンシング＿ｇｌｔＡ１）及び増殖連動型アラニン株について最大力価プロットを図示している。図４Ｄは、評価した全ての条件に於ける増殖連動型アラニン株のプロセス再現性を図示している。図４Ｅは、代表的なロバストな「調節弁」アラニンについてロバスト性及び力価を図示している（蛋白質分解＿ＦＧＵ、サイレンシング＿ｇｌｔＡ１）。図４ＦはＧＡ２株についてロバスト性及び力価を図示している。下面，評価した全てのプロセス条件のメディアンに対して正規化されたアラニン力価のヒートマップ、上面，全てのプロセス条件に於けるアラニン力価。同じカラースケール（ｇ／Ｌに依るアラニン力価）を両方のパネルに用いた。
【０１７９】
図５Ａ〜Ｊ：マイクロ発酵（図５Ａ〜Ｄ）及び１Ｌ発酵（図５Ｅ〜Ｊ）に於ける「調節弁」及び増殖連動型アラニン生産の比較。ロバスト性分析に用いた全ての株の平均アラニン力価（図５Ａ）及びロバスト性スコア（図５Ｂ）。選択された「調節弁」（図５Ｃ）及び増殖連動型（図５Ｄ）アラニン株の異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答した平均アラニン力価。（図５Ｂ）に置いてアステリスクに依って標識されている株を此の分析に用いた。此れ等の２つの株を１Ｌ性能比較の為に選択した。図５Ｅ及び図５Ｆは評価した１Ｌ性能指標を図示しており、平均比生産性（ＳＰ，ｇ／ｇｄｃｗ−ｈ）、平均グルコース取り込み速度（ＧＵＲ，ｇ／ｇｃｄｗ−ｈ）、最大力価（ｇ／Ｌ）、及び最大収量（ｇ／ｇ）を包含する。図５Ｇ及び図５ＨはμＬから１Ｌへのスケーラブル性を図示している。１Ｌデータを５０時間の生産の間の最大力価に対して標準化した。グルコース欠乏を回避する為に充分なフィードを増殖連動型株に用いた。図５Ｉ及び図５Ｊは、夫々スケーラブル性プロット図５Ｇ及び図５Ｈに用いた全ての株について１Ｌ生産プロファイルを図示しており、より暗色の記号は増殖曲線を表し、より明色の記号は生産曲線を表し、図５Ｇ又は図５Ｈに於いて記号の形は同じ株をコードする。
【０１８０】
図６Ａ〜Ｅ：２段階の動的コントロールを利用するＥ．ｃｏｌｉのメバロン酸生産。図６Ａはメバロン酸生産の為の代謝経路及びＳＭＶを図示している。図６Ｂは、コントロール株に於いて、変えられたプロモーターの組み合わせを有する幾つかの生産経路プラスミドバリアントを用いるメバロン酸生産を図示している。図６Ｃは、メバロン酸を生産する「調節弁」株の部分集合のマイクロ発酵結果を図示しており、蛋白質分解型及びサイレンシングＳＭＶの組み合わせと併せて図６Ｂからの最も良好な生産経路を用いている。図６Ｄは、１Ｌスケールで評価したメバロン酸株の部分集合について、μＬから１Ｌへのスケーラブル性を図示している。μＬデータはｎ＝３、１Ｌデータはｎ＝１。５０時間の生産時間の間の最大力価を相関に用いた。図６Ｅは、１Ｌバイオリアクターに於ける図６Ｄからの最も良好なメバロン酸株の生産を図示している（ｆａｂＩ−ｇｌｔＡ１−ｇｌｔＡ２のサイレンシング（「ＦＧ１Ｇ２」）、ｆａｂＩ及びｕｄｈＡの蛋白質分解（「ＦＵ」））。７８ｈｒｓの生産に依って９７ｇ／Ｌの力価が観察された。生産段階の間の収量は０．４６ｇ／ｇに達した（理論収量の８４％）（追加の詳細は補足資料第９節を参照）。図６Ｆは、３−ＨＰを生産する株の部分集合のマイクロ発酵結果を図示している。図６Ｇは、１Ｌスケールに於いて評価した３−ＨＰ株の部分集合についてμＬから１Ｌへのスケーラブル性を図示している（補足資料表Ｓ２１及びＳ２２）。図６Ｈは、１Ｌシステムに於ける最も良好な３−ＨＰ株の生産性能を図示している。四角，３−ＨＰ／メバロン酸力価；丸，ＯＤ６００。最も高い生産者に於いて、生産段階の間の収量は、メバロン酸では０．４６ｇ／ｇ、３−ＨＰでは０．６３ｇ／ｇに達した。
【０１８１】
図７：燐酸欠乏プロモーターキャラクタリゼーション。一連のＧＦＰレポーターベクターを構築して、１２個の以前に同定された燐酸制御型プロモーターの発現レベルを評価した。燐酸を制限した最少培地を用いる標準化されたプロトコールを用いて、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ（商標）に依って、ＧＦＰ発現について株を連続的に評価した。バイオマスレベルがピークに達した後に（明瞭性の為、示していない）、ＧＦＰ発現が始まる。重要な事に、現行の一連のプロモーターは広範囲の発現レベルを可能にする。
【０１８２】
図８：インスレーター付き燐酸欠乏プロモーターキャラクタリゼーション。一連のＧＦＰレポーターベクターを構築して、ＦＧＭ３培地に於ける５つのインスレーター付き燐酸制御型プロモーターの発現レベルを評価した。燐酸を制限した最少培地を用いる標準化されたプロトコールを用いて、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ（商標）に依って、ＧＦＰ発現について株を連続的に評価した。バイオマスレベルがピークに達した後に（明瞭性の為、示していない）、ＧＦＰ発現が始まる。重要な事に、現行の一連のプロモーターは広範囲の発現レベルを可能にする。
【０１８３】
図９：インスレーター付き恒常的プロモーターキャラクタリゼーション。一連のＧＦＰレポーターベクターを構築して、４０ｍＭ燐酸培地に依って、ＦＧＭ３に於ける５つのインスレーター付き恒常的プロモーターの発現レベルを評価した。網掛けエリアは標準偏差を表す。ｎ＝３。株をＢｉｏｌｅｃｔｏｒ（商標）に依ってＧＦＰ発現について連続的に評価した。ＧＦＰ発現はプロモーターｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、及びｐｒｏＤでのみ観察された。
【０１８４】
図１０：２段階発酵に於ける最適な３−ＨＰフラックスの代謝モデル化結果。左：バイオマス生産を目的関数として用いた、増殖段階の間の最適化されたフラックス。右：３−ＨＰ生産を目的関数として用いた、３−ＨＰ生産段階の間の最適化されたフラックス（バイオマス生産は０に設定した）。フラックスは、利用されるグルコースの１００モル当りの所与の反応のフラックスの相対的な比又はモルとして挙げられている。
【０１８５】
図１１：染色体改変。
【０１８６】
図１２：１ＬのＦＧＭ１０最少培地発酵に於ける出発ホスト株の平均最大増殖速度。ｎ＝２。
【０１８７】
図１３Ａ〜Ｅ：１Ｌの標準的な最少培地発酵に於いて出発ホスト株の増殖期の間に利用されるグルコースの分配。指数期中期〜後期に於いて「生産」が始まるので、ＤＬＦ＿００２５については指数増殖期中期及び増殖期終期の結果が与えられている。結果はデュプリケートの発酵の平均である。図１３Ａ，ＢＷ２５１１３；図１３Ｂ，ＢＷａｐｌｄｆ；図１３Ｃ，ＤＬＦ＿０００１；図１３Ｄ，指数中期のＤＬＦ＿００２５；図１３Ｅ，増殖期の終わりのＤＬＦ＿００２５。単位はグラムグルコースであった。
【０１８８】
図１４：ｐＣＡＳＣＡＤＥ−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド構築スキーム。
【０１８９】
図１５Ａ〜Ｂ：ｐＣＡＳＣＡＤＥ構築スキーム。図１５Ａ，単一のｓｇＲＮＡクローニング；図１５Ｂ，２個のｓｇＲＮＡ。
【０１９０】
図１６Ａ〜Ｃ：マイクロ発酵プロセス概観。（Ａ）高スループットなマイクロ発酵プロトコールの概観。フリーザーストック（代替的には、コロニーが用いられ得る）を用いて、９６ウェルプレートのＳＭ１０＋＋に接種する。培養を１６時間に渡って一晩増殖させ、遠心に依って収穫し、燐酸無し培地に依って洗浄し、燐酸無し培地に標的バイオマスレベルで再懸濁する（ＯＤ６００ｎｍ＝１．０）。ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ（商標）カバー及びクランプを用いて蒸発を縮減し、高い酸素移動速度を可能にする。プロトコールはテカングループ・リミテッド（Tecan Group Ltd.）Ｅｖｏリキッドハンドラーに依って実装されている。（Ｂ）９６ウェルプレート培養に依る代表的な一晩増殖。一晩培養のＯＤ６００の分布をプロットした。（Ｃ）テカングループ・リミテッド（Tecan Group Ltd.）Ｅｖｏリキッドハンドラーを用いる正規化後の代表的なＯＤ６００分布。
【０１９１】
図１７：異なるインスレーター付き燐酸プロモーターをＤＬＦ＿００２５株に用いるＬ−アラニン生産の為のマイクロ発酵。
【０１９２】
図１８：ｇａｐＮ／ｇａｐＡ株に依るＬ−アラニン生産のヒートマップ。
【０１９３】
図１９Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０１９４】
図２０Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０１９５】
図２１Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０１９６】
図２２Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０１９７】
図２３Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０１９８】
図２４Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０１９９】
図２５Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２００】
図２６Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０１】
図２７Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０２】
図２８Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０３】
図２９Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０４】
図３０Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０５】
図３１Ａ〜Ｄ：ロバスト性について評価された４つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０６】
図３２：ロバスト性について評価された１つの株の、マイクロ発酵に於ける異なるＯＴＲ及びグルコース濃度に対して応答したアラニン生産。
【０２０７】
図３３Ａ〜Ｂ：本文書に於いて評価した１Ｌスケールの全ての（図３３Ａ）調節弁及び（図３３Ｂ）増殖連動型株の増殖プロファイル。ラグタイムの何れかの変動を考慮して、増殖曲線を同調させた。調節弁株の増殖曲線は同じ指数中期時点に同調させた。増殖連動型株の増殖曲線は同じテイクオフポイントに同調させた。
【０２０８】
図３４：文献からの最も高いメバロン酸力価を有する株及び此の仕事に於いて評価したメバロン酸株１の比生産性（ＳＰ）比較。
【０２０９】
図３５：ＭＳ測定からのアラニン標準曲線。トリプリケートの標準的な測定からの質量分析応答の平均及び標準偏差をプロットした。
【０２１０】
図３６Ａ〜Ｂ：ＲＩ測定からのグルコース（図３６Ａ）及びエタノール（図３６Ｂ）標準曲線。トリプリケートの標準的な測定からのピーク面積の平均及び標準偏差をプロットした。
【０２１１】
図３７：ＴＵＶ測定からの３−ヒドロキシプロピオン酸標準曲線。デュプリケートの標準的な測定からのピーク面積の平均及び標準偏差をプロットした。
【０２１２】
図３８Ａ〜Ｄ：（図３８Ａ）Ｌ−アラニン、（図３８Ｂ）Ｄ−アラニン、（図３８Ｃ）メバロン酸、及び（図３８Ｄ）メバロノラクトンのＴＵＶ標準曲線。トリプリケートの標準的な測定からのピーク面積の平均及び標準偏差をプロットした。
【０２１３】
参照
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１４．  チャーチ（Church），Ｇ．Ｍ．；エロヴィッツ（Elowitz），Ｍ．Ｂ．；スモルケ（Smolke），Ｃ．Ｄ．； フォークト（Voigt），Ｃ．Ａ．；ワイス（Weiss），Ｒ．著，「合成生物学のポテンシャルを引き出す（Realizing the potential of synthetic biology）」ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー（Nature Reviews Molecular Cell Biology）２０１４年，１５（４），２８９−９４．
１５．  トマス（Thomas），Ｓ．；メイナード（Maynard），Ｎ．Ｄ．；ギル（Gill），Ｊ．著，「ギブソンアセンブリ（登録商標）を用いるＤＮＡライブラリー構築（DNA library construction using Gibson Assembly[reg]）」ネイチャー・メソッズ（Nature Methods）２０１５年，１２（１１）．
１６．  グッドウィン（Goodwin），Ｓ．；マクファーソン（McPherson），Ｊ．Ｄ．；マッコンビー（McCombie），Ｗ．Ｒ．著，「時代の到来：次世代シーケンシングテクノロジーの１０年（Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies）」ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Nature Reviews Genetics）２０１６年，１７（６），３３３−５１．
１７．  リンチ（Lynch），Ｍ．Ｄ．；ヴァルネッケ（Warnecke），Ｔ．；ギル（Gill），Ｒ．Ｔ．著，「ＳＣＡＬＥｓ：ライブラリー濃縮のマルチスケール分析（SCALEs: multiscale analysis of library enrichment）」ネイチャー・メソッズ（Nature Methods）２００７年，４（１），８７−９３．
１８．  ゼイトゥーン（Zeitoun），Ｒ．Ｉ．；ガルスト（Garst），Ａ．Ｄ．；デゲン（Degen），Ｇ．Ｄ．；パインズ（Pines），Ｇ．；マンセル（Mansell），Ｔ．Ｊ．；グリーブス（Glebes），Ｔ．Ｙ．；ボイル（Boyle），Ｎ．Ｒ．；ギル（Gill），Ｒ．Ｔ．著，「操作された細胞集団に於ける組み合わせのゲノム変異の多重トラッキング（Multiplexed tracking of combinatorial genomic mutations in engineered cell populations）」ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２０１５年，３３（６），６３１−７．
１９．  クルーク（Crook），Ｎ．；アバテマルコ（Abatemarco），Ｊ．；サン（Sun），Ｊ．；ワグナー（Wagner），Ｊ．Ｍ．；シュミッツ（Schmitz），Ａ．；アルパー（Alper），Ｈ．Ｓ．著，「酵母の遺伝子及び経路のインビボ連続進化（In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast）」ネイチャー・コミュニケーションズ（Nature Communications）２０１６年，７，１３０５１．
２０．  バーグ（Burg），Ｊ．Ｍ．，リード（Reed），ＢＪ．，イェー（Ye），Ｚ．，クーパー（Cooper），Ｃ．Ｂ．，モレブ（Moreb），Ｅ．Ａ．，及びリンチ（Lynch），Ｍ．Ｄ著，「大スケールバイオプロセスの競争力：２段階発酵に於ける動的な代謝コントロールのポテンシャル（Large-Scale Bioprocess Competitiveness: The Potential of Dynamic Metabolic Control in Two-Stage Fermentations）」カレント・オピニオンズ・イン・ケミカルエンジニアリング（Current Opinions in Chemical Engineering）２０１６年，（査読中）．
２１．  ツァン（Zhang），Ｙ．Ｈ．著，「合成的なインビトロバイオシステムに依るバイオ燃料及びバイオケミカルの生産：機会及び課題（Production of biofuels and biochemicals by in vitro synthetic biosystems: Opportunities and challenges）」バイオテクノロジー・アドバンシズ（Biotechnology Advances）２０１５年，３３（７），１４６７−８３．
２２．  ディートリヒ（Dietrich），Ｊ．Ａ．；マッキー（McKee），Ａ．Ｅ．；キースリング（Keasling），Ｊ．Ｄ．著，「高スループット代謝工学：低分子スクリーニング及びセレクションの進展（High-throughput metabolic engineering: advances in small-molecule screening and selection）」アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annual Review of Biochemistry）２０１０年，７９，５６３−９０．
２３．  フォルメンティ（Formenti），Ｌ．Ｒ．；ノルガード（Norregaard），Ａ．；ボリック（Bolic），Ａ．；ヘルナンデス（Hernandez），Ｄ．Ｑ．；ハーゲマン（Hagemann），Ｔ．；ヘインズ（Heins），Ａ．Ｌ．；ラーション（Larsson），Ｈ．； ミアーズ（Mears），Ｌ．；マウリシオ・イグレシアス（Mauricio-Iglesias），Ｍ．；クルーネ（Kruhne），Ｕ．；ゲルネイ（Gernaey），Ｋ．Ｖ．著，「産業発酵テクノロジー研究の課題（Challenges in industrial fermentation technology research）」バイオテクノロジー・ジャーナル（Biotechnology Journal）２０１４年，９（６），７２７−３８．
２４．  レバノン（Levanon），Ｓ．Ｓ．；サン（San），Ｋ．Ｙ．；ベネット（Bennett），Ｇ．Ｎ．著，「大腸菌ＡｒｃＡ及びＦＮＲ制御システム及び代謝応答への酸素の効果（Effect of oxygen on the Escherichia coli ArcA and FNR regulation systems and metabolic responses）」バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）２００５年，８９（５），５５６−６４．
２５．  ローグ（Logue），Ｊ．Ｂ．；フィンドレー（Findlay），Ｓ．Ｅ．；コンテ（Comte），Ｊ．著，「エディトリアル：環境変化に対する微生物応答（Editorial: Microbial Responses to Environmental Changes）」フロンティアズ・イン・マイクロバイオロジー（Frontiers in Microbiology）２０１５年，６，１３６４．
２６．  ガルシア・オチョア（Garcia-Ochoa），Ｆ．；ゴメス（Gomez），Ｅ．著，「微生物プロセスに於けるバイオリアクタースケールアップ及び酸素移動速度：概観（Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: an overview）」バイオテクノロジー・アドバンシズ（Biotechnology Advances）２００９年，２７（２），１５３−７６．
２７．  ウェーゲマン（Waegeman），Ｈ．；ボープレ（Beauprez），Ｊ．；モエンス（Moens），Ｈ．；メルテンス（Maertens），Ｊ．；デ・メイ（De Mey），Ｍ．；フルキエ・モレノ（Foulquie-Moreno），Ｍ．Ｒ．；ヘイネン（Heijnen），Ｊ．Ｊ．；シャルリエ（Charlier），Ｄ．；ソーテールト（Soetaert），Ｗ．著，「大腸菌Ｋ１２のバイオマス形成及び代謝フラックスへのｉｃｌＲ及びａｒｃＡノックアウトの効果、並びに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の代謝を理解する上での其の意味合い（Effect of iclR and arcA knockouts on biomass formation and metabolic fluxes in Escherichia coli K12 and its implications on understanding the metabolism of Escherichia coli BL21 (DE3)）」ＢＭＣマイクロバイオロジー（BMC Microbiology）２０１１年，１１，７０．
２８．  ウェーゲマン（Waegeman），Ｈ．；メルテンス（Maertens），Ｊ．；ボープレ（Beauprez），Ｊ．；デ・メイ（De Mey），Ｍ．；ソーテールト（Soetaert），Ｗ．著，「大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の生理学及び代謝フラックスへのｉｃｌＲ及びａｒｃＡ欠失の効果（Effect of iclR and arcA deletions on physiology and metabolic fluxes in Escherichia coli BL21 (DE3)）」バイオテクノロジー・レターズ（Biotechnology Letters）２０１２年，３４（２），３２９−３７．
２９．  ヘメリッヒ（Hemmerich），Ｊ．；アデランタード（Adelantado），Ｎ．；バリゴン（Barrigon），Ｊ．Ｍ．；ポンテ（Ponte），Ｘ．；ホルマン（Hormann），Ａ．；フェレール（Ferrer），Ｐ．；ケンジー（Kensy），Ｆ．；ヴァレーロ（Valero），Ｆ．著，「マイクロバイオリアクター及びラボスケール撹拌槽バイオリアクターシステムに於ける流加戦略の網羅的なクローンスクリーニング及び評価：リゾプス・オリゼリパーゼを生産するピキア・パストリスへの応用（Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase）」マイクロバイアル・セル・ファクトリーズ（Microbial Cell Factories）２０１４年，１３（１），３６．
３０．  ラミレス・バルガス（Ramirez-Vargas），Ｒ．；ヴィタル・ジャコメ（Vital-Jacome），Ｍ．；カマーチョ・ペレス（Camacho-Perez），Ｅ．；ハバード（Hubbard），Ｌ．；タラソ（Thalasso），Ｆ．著，「２４ウェルマイクロバイオリアクターシステムに於ける酸素移動のキャラクタリゼーション及び予想される呼吸計測応用（Characterization of oxygen transfer in a 24-well microbioreactor system and potential respirometric applications）」ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Journal of Biotechnology）２０１４年，１８６，５８−６５．
３１．  フーバー（Huber），Ｒ．；ロス（Roth），Ｓ．；ラーメン（Rahmen），Ｎ．；ブフス（Buchs），Ｊ．著，「高スループットな実験法を利用して、燐酸制限に依るＥ．ｃｏｌｉのＴ７発現システムの比生産性を強化する（Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E.coli T7 expression system by phosphate limitation）」ＢＭＣバイオテクノロジー（BMC biotechnology）２０１１年，１１，２２．
３２．  リンチ（Lynch），Ｍ．Ｄ．著，「新たなテリトリーへ：必須の代謝ネットワークの操作に依る改善された微生物合成（Into new territory: improved microbial synthesis through engineering of the essential metabolic network）」カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Current Opinion in Biotechnology）２０１６年，３８，１０６−１１．
３３．  マッギネス（McGinness），Ｋ．Ｅ．；ベイカー（Baker），Ｔ．Ａ．；ザウアー（Sauer），Ｒ．Ｔ．著，「コントロール可能な蛋白質の分解を操作する（Engineering controllable protein degradation）」モレキュラー・セル（Molecular Cell）２００６年，２２（５），７０１−７．
３４．  リュオ（Luo），Ｍ．Ｌ．；ムリス（Mullis），Ａ．Ｓ．；リーネイ（Leenay），Ｒ．Ｔ．； バイゼル（Beisel），Ｃ．Ｌ．著，「プログラム可能な遺伝子抑制の為に内在性Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用途変更する（Repurposing endogenous type I CRISPR-Cas systems for programmable gene repression）」ニュクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic acids research）２０１５年，４３（１），６７４−８１．
３５．  チー（Qi），Ｌ．Ｓ．；ラーソン（Larson），Ｍ．Ｈ．；ギルバート（Gilbert），Ｌ．Ａ．；ダウドナ（Doudna），Ｊ．Ａ．； ワイスマン（Weissman），Ｊ．Ｓ．；アーキン（Arkin），Ａ．Ｐ．；リム（Lim），Ｗ．Ａ．著，「遺伝子発現の配列特異的コントロールの為のＲＮＡに依ってガイドされるプラットホームとしてＣＲＩＳＰＲを用途変更する（Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression）」セル（Cell）２０１３年，１５２（５），１１７３−８３．
３６．  チュブコフ（Chubukov），Ｖ．；ザウアー（Sauer），Ｕ．著，「バシラス・サチリス及び大腸菌の静止期代謝の環境依存性（Environmental dependence of stationary-phase metabolism in Bacillus subtilis and Escherichia coli）」アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and environmental microbiology）２０１４年，８０（９），２９０１−９．
３７．  サントス・ベネイト（Santos-Beneit），Ｆ．著，「Ｐｈｏレギュロン：細菌の巨大な制御ネットワーク（The Pho regulon: a huge regulatory network in bacteria）」フロンティアズ・イン・マイクロバイオロジー（Frontiers in Microbiology）２０１５年，６，４０２．
３８．  ブラウンズ（Brouns），Ｓ．Ｊ．；ジョア（Jore），Ｍ．Ｍ．；ラングレン（Lundgren），Ｍ．；ウェストラ（Westra），Ｅ．Ｒ．；スライクハイス（Slijkhuis），Ｒ．Ｊ．；スナイデルス（Snijders），Ａ．Ｐ．；ディックマン（Dickman），Ｍ．Ｊ．；マカロワ（Makarova），Ｋ．Ｓ．；クーニン（Koonin），Ｅ．Ｖ．；ファンデルウースト（van der Oost），Ｊ．著，「短鎖ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡは原核生物の抗ウイルス防御をガイドする（Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes）」サイエンス（Science）２００８年，３２１（５８９１），９６０−４．
３９．  ジャン（Jian），Ｊ．；ツァン（Zhang），Ｓ．Ｑ．；シー（Shi），Ｚ．Ｙ．；ワン（Wang），Ｗ．；チェン（Chen），Ｇ．Ｑ．；ウー（Wu），Ｑ．著，「欠損した混合酸発酵経路を有する大腸菌変異体に依るポリヒドロキシアルカン酸の生産（Production of polyhydroxyalkanoates by Escherichia coli mutants with defected mixed acid fermentation pathways）」アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）２０１０年，８７（６），２２４７−５６．
４０．  グリューネンフェルダー（Grunenfelder），Ｂ．；ルンメル（Rummel），Ｇ．；ボラドスキー（Vohradsky），Ｊ．；ローダー（Roder），Ｄ．；ランゲン（Langen），Ｈ．；ジェナル（Jenal），Ｕ．著，「細菌細胞周期のプロテオーム分析（Proteomic analysis of the bacterial cell cycle）」米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）２００１年，９８（８），４６８１−６．
４１．  ヒンチェ（Hintsche），Ｍ．；クランプ（Klumpp），Ｓ．著，「増殖速度依存的な遺伝子発現の希釈及び理論的記述（Dilution and the theoretical description of growth-rate dependent gene expression）」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・エンジニアリング（Journal of Biological Engineering）２０１３年，７（１），２２．
４２．  レルヒナー（Lerchner），Ａ．；ヤラシュ（Jarasch），Ａ．；スケラ（Skerra），Ａ．著，「新規の補因子特異性の為のバシラス・サチリスのアラニンデヒドロゲナーゼの操作（Engineering of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis for novel cofactor specificity）」バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Biochemistry）２０１６年，６３（５），６１６−６２４．
４３．  ホリ（Hori），Ｈ．；ヨネヤマ（Yoneyama），Ｈ．；トベ（Tobe），Ｒ．；アンドー（Ando），Ｔ．；イソガイ（Isogai），Ｅ．；カツマタ（Katsumata），Ｒ．著，「大腸菌の新規遺伝子ｙｇａＷ（ａｌａＥ）に依ってコードされる誘導性Ｌ−アラニン排出輸送体（Inducible L-alanine exporter encoded by the novel gene ygaW (alaE) in Escherichia coli）」アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and environmental microbiology）２０１１年，７７（１２），４０２７−３４．
４４．  デイビス（Davis），Ｊ．Ｈ．；ルビン（Rubin），Ａ．Ｊ．；ザウアー（Sauer），Ｒ．Ｔ．著，「一連のインスレーター付き細菌プロモーターの設計、構築、及びキャラクタリゼーション（Design, construction and characterization of a set of insulated bacterial promoters）」ニュクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic acids research）２０１１年，３９（３），１１３１−４１．
４５．  ヘドゥル（Hedl），Ｍ．；サザーリン（Sutherlin），Ａ．；ワイルディング（Wilding），Ｅ．Ｉ．；マッツーラ（Mazzulla），Ｍ．；マクデヴィット（McDevitt），Ｄ．；レーン（Lane），Ｐ．；ベルクナー（Burgner），Ｊ．Ｗ．，２ｎｄ；レーンボイター（Lehnbeuter），Ｋ．Ｒ．；シュタウファッヒャー（Stauffacher），Ｃ．Ｖ．；グウィン（Gwynn），Ｍ．Ｎ．；ロドウェル（Rodwell），Ｖ．Ｗ．著，「イソペンテニル二燐酸生合成の二重機能蛋白質エンテロコッカス・フェカーリスアセトアセチル補酵素Ａチオラーゼ／３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（Enterococcus faecalis acetoacetyl-coenzyme A thiolase/3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a dual-function protein of isopentenyl diphosphate biosynthesis）」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）２００２年，１８４（８），２１１６−２２．
４６．  ストゥシー（Steussy），Ｃ．Ｎ．；ロビソン（Robison），Ａ．Ｄ．；テトリック（Tetrick），Ａ．Ｍ．；ナイト（Knight），Ｊ．Ｔ．；ロドウェル（Rodwell），Ｖ．Ｗ．；シュタウファッヒャー（Stauffacher），Ｃ．Ｖ．；サザーリン（Sutherlin），Ａ．Ｌ．著，「酵素活性の構造的制限：ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼのケース（A structural limitation on enzyme activity: the case of HMG-CoA synthase）」バイオケミストリー（Biochemistry）２００６年，４５（４８），１４４０７−１４．
４７．  シャオン（Xiong），Ｍ．；シュナイダーマン（Schneiderman），Ｄ．Ｋ．；ベイツ（Bates），Ｆ．Ｓ．；ヒルマイヤー（Hillmyer），Ｍ．Ａ．；ツァン（Zhang），Ｋ．著，「糖からの機械的にチューニング可能なブロックポリマーのスケーラブルな生産（Scalable production of mechanically tunable block polymers from sugar）」米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）２０１４年，１１１（２３），８３５７−６２．
４８．  オッターシュテット（Otterstedt），Ｋ．； ラーション（Larsson），Ｃ．；ビル（Bill），Ｒ．Ｍ．；シュタールベルク（Stahlberg），Ａ．；ボレス（Boles），Ｅ．；ホーマン（Hohmann），Ｓ．；グスタフソン（Gustafsson），Ｌ．著，「酵母サッカロマイセス・セレビシエの代謝モードを切り換える（Switching the mode of metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae）」ＥＭＢＯリポーツ（EMBO Reports）２００４年，５（５），５３２−７．
４９．  フブマン（Hubmann），Ｇ．；ギルーエ（Guillouet），Ｓ．； ネフォークト（Nevoigt），Ｅ．著，「サッカロマイセス・セレビシエに依るグリセロール形成の持続可能な縮減の為のＧｐｄ１及びＧｐｄ２のファインチューニング（Gpd1 and Gpd2 fine-tuning for sustainable reduction of glycerol formation in Saccharomyces cerevisiae）」アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and environmental microbiology）２０１１年，７７（１７），５８５７−６７．
５０．  ラスカリス（Lascaris），Ｒ．；ブッセマーカー（Bussemaker），Ｈ．Ｊ．；ブールスマ（Boorsma），Ａ．；パイパー（Piper），Ｍ．；ファンデルスペック（van der Spek），Ｈ．；グリベル（Grivell），Ｌ．；ブロム（Blom），Ｊ．著，「グルコースに依って増殖したサッカロマイセス・セレビシエに於けるＨａｐ４ｐ過剰発現は、細胞が新規の代謝状態に進入する事を誘導する（Hap4p overexpression in glucose-grown Saccharomyces cerevisiae induces cells to enter a novel metabolic state）」ゲノム・バイオロジー（Genome Biology）２００３年，４（１），Ｒ３．
５１．  ミッタル（Mittal），Ｎ．；バブー（Babu），Ｍ．Ｍ．；ロイ（Roy），Ｎ．著，「ミトコンドリア電子伝達系の効率は長寿命のｍｒｇ１９サッカロマイセス・セレビシエに於いて増大している（The efficiency of mitochondrial electron transport chain is increased in the long-lived mrg19 Saccharomyces cerevisiae）」エイジング・セル（Aging Cell）２００９年，８（６），６４３−５３．
５２．  トマス（Thomas），Ｍ．Ｒ．；オシア（O'Shea），Ｅ．Ｋ．著，「細胞内の燐酸緩衝液は細胞外燐酸レベルの一過的揺らぎを遮る（An intracellular phosphate buffer filters transient fluctuations in extracellular phosphate levels）」米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）２００５年，１０２（２７），９５６５−７０．
５３．  グレイ（Gray），Ｊ．Ｖ．；ペツコ（Petsko），Ｇ．Ａ．；ジョンストン（Johnston），Ｇ．Ｃ．；リンゲ（Ringe），Ｄ．；シンガー（Singer），Ｒ．Ａ．；ヴェルナー・ウォッシュバーン（Werner-Washburne），Ｍ．著，「眠れる森の美女：サッカロマイセス・セレビシエの休眠（"Sleeping beauty": quiescence in Saccharomyces cerevisiae）」マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラーバイオロジー・レビューズ（Microbiology and Molecular Biology Reviews）２００４，６８（２），１８７−２０６．
５４．  グリリー（Grilly），Ｃ．；ストリッカー（Stricker），Ｊ．；パン（Pang），Ｗ．Ｌ．；ベネット（Bennett），Ｍ．Ｒ．；ヘイスティ（Hasty），Ｊ．著，「サッカロマイセス・セレビシエの蛋白質の分解をチューニングする為の合成的な遺伝子ネットワーク（A synthetic gene network for tuning protein degradation in Saccharomyces cerevisiae）」モレキュラー・システムス・バイオロジー（Molecular Systems Biology）２００７年，３，１２７．
５５．  オース（Orth），Ｊ．Ｄ．；ティエール（Thiele），Ｉ．；パルソン（Palsson），Ｂ．Ｏ．著，「フラックスバランス分析とは何か？（What is flux balance analysis?）」ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２０１０年，２８（３），２４５−８．
５６．  イム（Yim），Ｈ．；ハセルベック（Haselbeck），Ｒ．；ニウ（Niu），Ｗ．；プホル・バックスレー（Pujol-Baxley），Ｃ．；バーガード（Burgard），Ａ．；ボルト（Boldt），Ｊ．；カンドゥリナ（Khandurina），Ｊ．；トラウィック（Trawick），Ｊ．Ｄ．；オスターハウト（Osterhout），Ｒ．Ｅ．；シュテファン（Stephen），Ｒ．；エスタディリャ（Estadilla），Ｊ．；テイサン（Teisan），Ｓ．；シュレイヤー（Schreyer），Ｈ．Ｂ．；アンドレ（Andrae），Ｓ．；ヤン（Yang），Ｔ．Ｈ．；リー（Lee），Ｓ．Ｙ．；バーク（Burk），Ｍ．Ｊ．；バンディエン（Van Dien），Ｓ．著，「１，４−ブタンジオールの直接的生産の為の大腸菌の代謝工学（Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1,4-butanediol）」ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（Nature Chemical Biology）２０１１年，７（７），４４５−５２．
５７．  グプタ（Gupta），Ａ．；ライツマン（Reizman），Ｉ．Ｍ．；ライシュ（Reisch），Ｃ．Ｒ．；プラザー（Prather），Ｋ．Ｌ．著，「経路非依存的なクオラムセンシング回路を用いる操作された細菌の代謝フラックスの動的制御（Dynamic regulation of metabolic flux in engineered bacteria using a pathway-independent quorum-sensing circuit）」ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature biotechnology）２０１７年，３５（３），２７３−２７９．
５８．  ワン（Wang），Ｊ．；ユー（Yu），Ｈ．Ｑ．著，「回分培養に於けるラルストニア・ユートロファＡＴＣＣ１７６９９に依るポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）及び細胞外ポリマー性物質（ＥＰＳ）の生合成（Biosynthesis of polyhydroxybutyrate (PHB) and extracellular polymeric substances (EPS) by Ralstonia eutropha ATCC 17699 in batch cultures）」アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）２００７年，７５（４），８７１−８．
５９．  シュー（Xu），Ｐ．；チャオ（Qiao），Ｋ．；アーン（Ahn），Ｗ．Ｓ．；ステファノプロス（Stephanopoulos），Ｇ．著，「ドロップイン輸送用燃料及びオレオケミカルの合成の為のプラットホームとしてヤロウィア・リポリティカを操作する（Engineering Yarrowia lipolytica as a platform for synthesis of drop-in transportation fuels and oleochemicals）」米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）２０１６年，１１３（３９），１０８４８−５３．
６０．  リンチ（Lynch），Ｍ．Ｄ．；ヴァルネッケ（Warnecke），Ｔ．；ギル（Gill），Ｒ．Ｔ．著「３−ヒドロキシプロピオン酸及び他の産物を生産する為の方法（Method for Producing 3-Hydroxypropionic Acid and Other Products）」２０１１年９月８日．
６１．  チャオ（Qiao），Ｋ．；ワシレンコ（Wasylenko），Ｔ．Ｍ．；ジョウ（Zhou），Ｋ．；シュー（Xu），Ｐ．；ステファノプロス（Stephanopoulos），Ｇ．著，「ヤロウィア・リポリティカの脂質生産は、サイトゾルレドックス代謝を操作する事に依って最大化される（Lipid production in Yarrowia lipolytica is maximized by engineering cytosolic redox metabolism）」ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２０１７年．
６２．  ジャン（Jian），Ｊ．；ツァン（Zhang），Ｓ．Ｑ．； シー（Shi），Ｚ．Ｙ．；ワン（Wang），Ｗ．；チェン（Chen），Ｇ．Ｑ．；ウー（Wu），Ｑ．著，「欠損した混合酸発酵経路を有する大腸菌変異体に依るポリヒドロキシアルカン酸の生産 （Production of polyhydroxyalkanoates by Escherichia coli mutants with defected mixed acid fermentation pathways）」アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）２０１０年，８７（６），２２４７−５６．
６３．  シャラン（Sharan），Ｓ．Ｋ．；トマソン（Thomason），Ｌ．Ｃ．；クズネツォフ（Kuznetsov），Ｓ．Ｇ．；コート（Court），Ｄ．Ｌ．著，「組み換え工学：遺伝子工学の相同組み換えに基づく方法（Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering）」ネイチャー・プロトコールズ（Nature Protocols）２００９年，４（２），２０６−２３．
６４．  リ（Li），Ｘ．Ｔ．；トマソン（Thomason），Ｌ．Ｃ．； サヴィツケ（Sawitzke），Ｊ．Ａ．； コスタンティーノ（Costantino），Ｎ．； コート（Court），Ｄ．Ｌ．著，「ｔｅｔＡ−ｓａｃＢカセットを用いるポジティブ及びネガティブセレクション：大腸菌の組み換え工学及びＰ１トランスダクション（Positive and negative selection using the tetA-sacB cassette: recombineering and P1 transduction in Escherichia coli）」ニュクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic acids research）２０１３年，４１（２２），ｅ２０４．
６５．  ババ（Baba），Ｔ．；アラ（Ara），Ｔ．；ハセガワ（Hasegawa），Ｍ．；タカイ（Takai），Ｙ．；オクムラ（Okumura），Ｙ．；ババ（Baba），Ｍ．；ダツェンコ（Datsenko），Ｋ．Ａ．；トミタ（Tomita），Ｍ．；ワナー（Wanner），Ｂ．Ｌ．；モリ（Mori），Ｈ．著，「大腸菌Ｋ−１２のインフレームの単一遺伝子ノックアウト変異体の構築：Ｋｅｉｏコレクション（Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection）」モレキュラー・システムズ・バイオロジー（Molecular systems biology）２００６年，２，２００６０００８．
６６．  ファンダイケン（van Dijken），Ｊ．Ｐ．；バウアー（Bauer），Ｊ．；ブランビラ（Brambilla），Ｌ．；ドゥボック（Duboc），Ｐ．；フランソワ（Francois），Ｊ．Ｍ．；ガンセド（Gancedo），Ｃ．；ジュゼッピン（Giuseppin），Ｍ．Ｌ．Ｆ．；ヘイネン（Heijnen），Ｊ．Ｊ．； ホーア（Hoare），Ｍ．；ランゲ（Lange），Ｈ．Ｃ．；マッデン（Madden），Ｅ．Ａ．；ニーダーベルガー（Niederberger），Ｐ．；ニールセン（Nielsen），Ｊ．；パルー（Parrou），Ｊ．Ｌ．；ペティット（Petit），Ｔ．；ポロ（Porro），Ｄ．；ロイス（Reuss），Ｍ．；ヴァンリエル（van Riel），Ｎ．；リッツィ（Rizzi），Ｍ．；スティンスマ（Steensma），Ｈ．Ｙ．；ヴェリップス（Verrips），Ｃ．Ｔ．；ヴィンデロウ（Vindeloev），Ｊ．； プロンク（Pronk），Ｊ．Ｔ．著，「４つのサッカロマイセス・セレビシエ株の生理学的及び遺伝学的特性の施設間比較（An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains）」エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー（Enzyme and Microbial Technology）２０００，２６（９−１０），７０６−７１４．
６７．  オッターシュテット（Otterstedt），Ｋ．； ラーション（Larsson），Ｃ．；ビル（Bill），Ｒ．Ｍ．； シュタールベルク（Stahlberg），Ａ．； ボレス（Boles），Ｅ．； ホーマン（Hohmann），Ｓ．；グスタフソン（Gustafsson），Ｌ．著，「酵母サッカロマイセス・セレビシエの代謝モードを切り換える（Switching the mode of metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae）」ＥＭＢＯリポーツ（EMBO Reports）２００４年，５（５），５３２−７．
６８．  ヴィツォルケ（Wieczorke），Ｒ．；クランペ（Krampe），Ｓ．；ワイエルシュタール（Weierstall），Ｔ．；フライデル（Freidel），Ｋ．；ホレンベルク（Hollenberg），Ｃ．Ｐ．；ボレス（Boles），Ｅ．著，「サッカロマイセス・セレビシエのヘキソースの取り込みをブロックする為には少なくとも２０個の輸送体遺伝子の同時ノックアウトが要求される（Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae）」ＦＥＢＳレターズ（FEBS Letters）１９９９年，４６４（３），１２３−１２８．
６９．  ギーツ（Gietz），Ｒ．Ｄ．；シストル（Schiestl），Ｒ．Ｈ．著，「ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ法を用いる高効率の酵母形質転換（High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method）」ネイチャー・プロトコールズ（Nature Protocols）２００７年，２（１），３１−４．
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【０２１４】
本発明の好ましい実施形態を本願に於いて示し記載したが、斯かる実施形態が例としてのみ提供されていると言う事は当業者には明白であろう。本発明から外れる事無しに、当業者には多数の変形、変化、及び置換がすぐに想到されるであろう。本発明を実現する上で、本願に記載されている本発明の実施形態の種々の代替が採用され得ると言う事は理解されるべきである。次の請求項が本発明の範囲を定めると言う事と、此れ等の請求項の範囲内の方法及び構造並びに其れ等の均等物が其れに依ってカバーされると言う事とが意図されている。
〔付記１〕
産物を生成する為の細胞であって、
前記細胞が：
代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減の為の異種的なポリヌクレオチド（前記酵素の発現の前記コントロールされた縮減は、前記細胞の静止期を誘導する）と；
前記産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の異種的な生産ポリヌクレオチドと；
を含み、
前記酵素を欠く細胞と比較して、前記静止期の間の前記産物の生産の速度が、環境条件の変化に応答してより縮減されない、
産物を生成する為の細胞。
〔付記２〕
前記異種的なポリヌクレオチドが前記代謝経路のフラックスを縮減する、付記１に記載の細胞。
〔付記３〕
前記酵素がエノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される、付記１又は２に記載の細胞。
〔付記４〕
前記生産酵素がＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ、アラニン排出輸送体、及びＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される、付記１〜３の何れか１項に記載の細胞。
〔付記５〕
環境条件の前記変化が、前記細胞に接触する培養培地の糖の濃度を増大又は減少させる事を含む、付記１〜４の何れか１項に記載の細胞。
〔付記６〕
前記糖がグルコースである、付記５に記載の細胞。
〔付記７〕
環境条件の前記変化が、前記細胞に接触する培養培地の酸素供給を増大又は減少させる事を含む、付記１〜６の何れか１項に記載の細胞。
〔付記８〕
前記産物が３−ヒドロキシプロピオン酸を含む、付記１〜７の何れか１項に記載の細胞。
〔付記９〕
前記産物がアミノ酸を含む、付記１〜７の何れか１項に記載の細胞。
〔付記１０〕
前記アミノ酸がアラニンを含む、付記９に記載の細胞。
〔付記１１〕
前記細胞が培養に依って増殖させられ、前記培養に依る前記アラニンの生産の速度が少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である、付記１０に記載の細胞。
〔付記１２〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である、付記１１に記載の細胞。
〔付記１３〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも１．５ｇ／Ｌ／時間である、付記１１に記載の細胞。
〔付記１４〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも１．６ｇ／Ｌ／時間である、付記１１に記載の細胞。
〔付記１５〕
前記細胞が培養に依って増殖させられ、前記培養が少なくとも８０ｇ／Ｌの前記アラニンを生産する、付記１０に記載の細胞。
〔付記１６〕
前記培養が少なくとも１００ｇ／Ｌの前記アラニンを生産する、付記１５に記載の細胞。
〔付記１７〕
前記培養が少なくとも１２０ｇ／Ｌの前記アラニンを生産する、付記１５に記載の細胞。
〔付記１８〕
前記培養が少なくとも１４０ｇ／Ｌの前記アラニンを生産する、付記１５に記載の細胞。
〔付記１９〕
前記生産ポリヌクレオチドがアラニン排出輸送体をコードする、付記９〜１８の何れか１項に記載の細胞。
〔付記２０〕
前記アラニン排出輸送体がａｌａＥである、付記１９に記載の細胞。
〔付記２１〕
前記産物がメバロン酸を含む、付記１〜７の何れか１項に記載の細胞。
〔付記２２〕
前記細胞が培養に依って増殖させられ、前記培養に依る前記メバロン酸の生産の速度が少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である、付記２１に記載の細胞。
〔付記２３〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である、付記２２に記載の細胞。
〔付記２４〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも１．２ｇ／Ｌ／時間である、付記２２に記載の細胞。
〔付記２５〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも１．２５ｇ／Ｌ／時間である、付記２２に記載の細胞。
〔付記２６〕
前記細胞が培養に依って増殖させられ、前記培養が少なくとも５０ｇ／Ｌの前記メバロン酸を生産する、付記２１に記載の細胞。
〔付記２７〕
前記培養が少なくとも７０ｇ／Ｌの前記メバロン酸を生産する、付記２６に記載の細胞。
〔付記２８〕
前記培養が少なくとも９０ｇ／Ｌの前記メバロン酸を生産する、付記２６に記載の細胞。
〔付記２９〕
前記培養が少なくとも９５ｇ／Ｌの前記メバロン酸を生産する、付記２６に記載の細胞。
〔付記３０〕
前記異種的なポリヌクレオチドが：前記酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び前記酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される、付記１〜２９の何れか１項に記載の細胞。
〔付記３１〕
前記異種的なポリヌクレオチドがサイレンシングポリヌクレオチドを含み、前記サイレンシングポリヌクレオチドが、前記酵素をコードする遺伝子のプロモーターを認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、付記３０に記載の細胞。
〔付記３２〕
前記異種的なポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が前記ｇＲＮＡに結合した時に前記プロモーター配列に特異的に結合する、付記３１に記載の細胞。
〔付記３３〕
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が触媒的に不活性である、付記３２に記載の細胞。
〔付記３４〕
前記異種的なポリヌクレオチドが分解ポリヌクレオチドを含み、前記分解ポリヌクレオチドが分解タグをコードする配列を含み、前記分解タグが前記酵素の分解を媒介する、付記３０に記載の細胞。
〔付記３５〕
前記異種的なポリヌクレオチドの発現が前記細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される、付記１〜３４の何れか１項に記載の細胞。
〔付記３６〕
前記生産ポリヌクレオチドの発現が前記細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される、付記１〜３４の何れか１項に記載の細胞。
〔付記３７〕
前記細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、付記１〜３６の何れか１項に記載の細胞。
〔付記３８〕
細胞の複数の株を独立して培養する事（各株は、（ｉ）代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の異種的なポリヌクレオチド（前記酵素の発現の前記コントロールされた縮減は、前記細胞の静止期を誘導する）と；（ｉｉ）前記産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の異種的な生産ポリヌクレオチドと；を含み、前記複数の株の各株は、前記異種的なポリヌクレオチド又は前記異種的な生産ポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列が別の株とは異なる）と；
前記複数の株を静止期迄増殖させる事と；
前記複数の株から或る株を選択する事（前記静止期の間に前記選択された株に依って生産される前記産物のレベルに基づく）と、
を含む方法。
〔付記３９〕
前記産物の前記レベルを決定する事を更に含む、付記３８に記載の方法。
〔付記４０〕
前記選択された株を増殖させる事を更に含む、付記３８に記載の方法。
〔付記４１〕
前記選択された株がバイオリアクターに依って増殖させられる、付記４０に記載の方法。
〔付記４２〕
前記選択された株を含む培養培地が少なくとも５００ｍｌの体積を有する、付記４１に記載の方法。
〔付記４３〕
前記培養培地が少なくとも１Ｌの体積を有する、付記４２に記載の方法。
〔付記４４〕
前記異種的なポリヌクレオチドが：前記酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び前記酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される、付記３８〜４３の何れか１項に記載の方法。
〔付記４５〕
前記複数の株の第１及び第２の株がサイレンシングポリヌクレオチドを含む、付記４４に記載の方法。
〔付記４６〕
前記サイレンシングポリヌクレオチドが、前記酵素をコードする遺伝子のプロモーター配列を認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、付記４５に記載の方法。
〔付記４７〕
前記ｇＲＮＡ配列が前記第１及び第２の株間で異なる、付記４６に記載の方法。
〔付記４８〕
前記複数の株の第１及び第２の株が分解ポリヌクレオチドを含む、付記４４に記載の方法。
〔付記４９〕
前記分解ポリヌクレオチドの配列が前記第１及び第２の株間で異なる、付記４８に記載の方法。
〔付記５０〕
前記酵素がエノイルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、及びＮＡＤＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される、付記３８〜４９の何れか１項に記載の方法。
〔付記５１〕
前記生産酵素がＮＡＤＰＨ依存性アラニンデヒドロゲナーゼ、アラニン排出輸送体、及びＮＡＤＰＨ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼから成る群から選択される、付記３８〜５０の何れか１項に記載の方法。
〔付記５２〕
前記産物がメバロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、及びアミノ酸から成る群から選択される、付記３８〜５１の何れか１項に記載の方法。
〔付記５３〕
前記産物がアミノ酸であり、前記アミノ酸がアラニンである、付記５２に記載の方法。
〔付記５４〕
前記異種的なポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して、前記選択された株の細胞に於いては、前記静止期の間の前記産物の生産の速度が環境条件の変化に応答してより縮減されない、付記３８〜５３の何れか１項に記載の方法。
〔付記５５〕
環境条件の前記変化が、前記細胞に接触する培養培地の糖の濃度の変化を含む、付記５４に記載の方法。
〔付記５６〕
環境条件の前記変化が、前記細胞に接触する培養培地の酸素供給の変化を含む、付記５４に記載の方法。
〔付記５７〕
細胞性の産物を生成する方法であって：
培養培地に依って異種的な細胞を培養する事を含み、前記異種的な細胞が：（ｉ）代謝経路の酵素の発現のコントロールされた縮減を媒介する為の異種的なポリヌクレオチド（前記酵素の発現の前記コントロールされた縮減は、前記細胞の静止期を誘導する）と；（ｉｉ）前記産物の生成の為の生産酵素の発現のコントロールされた増大を媒介する為の異種的な生産ポリヌクレオチドと；を含み、
前記酵素を欠く細胞と比較して、前記静止期の間の前記産物の生産の速度が環境条件の変化に応答してより縮減されない、
細胞性の産物を生成する方法。
〔付記５８〕
前記環境条件を変化させる事を更に含む、付記５７に記載の方法。
〔付記５９〕
前記環境条件が前記培養培地の糖の濃度を含み、前記環境条件を変化させる事が前記濃度を増大又は減少させる事を含む、付記５８に記載の方法。
〔付記６０〕
前記糖がグルコースである、付記５９に記載の方法。
〔付記６１〕
前記環境条件が前記培養培地の酸素濃度を含み、前記環境条件を変化させる事が前記酸素濃度を増大又は減少させる事を含む、付記５８に記載の方法。
〔付記６２〕
前記培養する事が、バイオリアクターに依って実施される、付記５７に記載の方法。
〔付記６３〕
前記培養培地が少なくとも５００ｍｌの体積を有する、付記６２に記載の方法。
〔付記６４〕
前記培養培地が少なくとも１Ｌの体積を有する、付記５２に記載の方法。
〔付記６５〕
前記産物が３−ヒドロキシプロピオン酸を含む、付記５７〜６４の何れか１項に記載の方法。
〔付記６６〕
前記産物がアミノ酸を含む、付記５７〜６４の何れか１項に記載の方法。
〔付記６７〕
前記アミノ酸がアラニンを含む、付記６６に記載の方法。
〔付記６８〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である、付記６７に記載の方法。
〔付記６９〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である、付記６７に記載の方法。
〔付記７０〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも１．５ｇ／Ｌ／時間である、付記６７に記載の方法。
〔付記７１〕
前記アラニンの生産の前記速度が少なくとも１．６ｇ／Ｌ／時間である、付記６７に記載の方法。
〔付記７２〕
前記生産ポリヌクレオチドがアラニン排出輸送体をコードする、付記６７〜７１の何れか１項に記載の方法。
〔付記７３〕
前記アラニン排出輸送体がａｌａＥである、付記７２に記載の方法。
〔付記７４〕
前記産物がメバロン酸を含む、付記５７〜６４の何れか１項に記載の方法。
〔付記７５〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも０．５ｇ／Ｌ／時間である、付記７４に記載の方法。
〔付記７６〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも１．０ｇ／Ｌ／時間である、付記７４に記載の方法。
〔付記７７〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも１．２ｇ／Ｌ／時間である、付記７４に記載の方法。
〔付記７８〕
前記メバロン酸の生産の前記速度が少なくとも１．２５ｇ／Ｌ／時間である、付記７４に記載の方法。
〔付記７９〕
前記異種的なポリヌクレオチドが：前記酵素をコードする遺伝子の転写を抑制する為のサイレンシングポリヌクレオチド；及び前記酵素の細胞性の分解を媒介する為の分解ポリヌクレオチドから成る群から選択される、付記５７〜７８の何れか１項に記載の方法。
〔付記８０〕
前記異種的なポリヌクレオチドがサイレンシングポリヌクレオチドを含み、前記サイレンシングポリヌクレオチドが、前記酵素をコードする遺伝子のプロモーター配列を認識するｇＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、付記７９に記載の方法。
〔付記８１〕
前記異種的なポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が前記ｇＲＮＡに結合した時に前記プロモーター配列に特異的に結合する、付記８０に記載の方法。
〔付記８２〕
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が触媒的に不活性である、付記８１に記載の方法。
〔付記８３〕
前記異種的なポリヌクレオチドが分解ポリヌクレオチドを含み、前記分解ポリヌクレオチドが分解タグをコードする配列を含み、前記分解タグが前記酵素の分解を媒介する、付記７９に記載の方法。
〔付記８４〕
前記異種的なポリヌクレオチドの発現が前記細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される、付記５７〜８３の何れか１項に記載の方法。
〔付記８５〕
前記生産ポリヌクレオチドの発現が前記細胞中の利用可能な燐酸量に依って制御される、付記５７〜８３の何れか１項に記載の方法。
〔付記８６〕
前記細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、付記５７〜８５の何れか１項に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
0006878607.tif 000174
【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
0006878607.tif 000178
【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【配列表】
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