(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質;並びに
増幅可能な選択マーカー
をコードする核酸配列を含むレトロウイルスパッケージング細胞であって、前記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルスパッケージング細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である、前記レトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項２】
前記増幅可能な選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又はグルタミンシンテターゼ(GS)である、請求項1に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項３】
前記増幅可能な選択マーカーがDHFRであり、DHFRをコードする前記核酸配列を含む前記発現構築物が配列番号1の核酸配列を含む、請求項2に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項４】
ユニットが、選択マーカーをコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項５】
ユニットが、補助遺伝子revをコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項６】
gag及びpolタンパク質、envタンパク質又は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質をコードする核酸配列、あるいは補助遺伝子revの核酸配列が、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス又はフォーミーレトロウイルスから選択されるレトロウイルスに由来する、請求項1から5のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項７】
発現構築物の1つ以上がCMVプロモーターを含み、好ましくはCMVプロモーターが少なくとも1つのTetオペロンを付加的に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項８】
インスレーターを付加的に含み、好ましくはインスレーターが発現構築物のそれぞれの間に存在する、請求項1から7のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項９】
細胞が哺乳動物細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞がHEK 293Tである、請求項1から8のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項１０】
ユニットが、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項１１】
個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質;
増幅可能な選択マーカー;並びに
レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノム
をコードする核酸配列を含むレトロウイルス産生細胞であって、前記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である、前記レトロウイルス産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロウイルスベクター産生に必要とされる遺伝子を含む核酸ベクター及びそれらの使用に関する。また、本明細書に記載の核酸ベクターを含むレトロウイルスパッケージング/産生細胞株を作製する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法では、遺伝物質が処置を必要とする対象の内在細胞に送達される。この遺伝物質は、対象に新規な遺伝子を導入するか、既存の遺伝子の付加的なコピーを導入するか、又は対象に存在する遺伝子の異なる対立遺伝子若しくは変異体を導入し得る。遺伝子療法において使用するために有効な遺伝子送達法としてウイルスベクター系が提案されている(Verma and Somia (1997) Nature 389: 239-242)。
【０００３】
特に、これらのウイルスベクターはレトロウイルス科のメンバーに基づき、これは宿主のゲノムへそれらの遺伝子ペイロードを組み込むそれらの能力によるものである。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノムのパッケージング及び送達に必要とされる必須タンパク質を維持するが、それらの疾患の原因となるものを含む必須でない補助的タンパク質が除去されるよう設計される。レトロウイルスベクターの例としては、レンチウイルスベクター、例えば、非増殖細胞に組み込むことができるために広く使用されている1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)に基づくものが挙げられる。
【０００４】
現在、大部分のウイルスベクターは、宿主細胞株へのウイルス遺伝子の一過性の同時トランスフェクションにより産生される。ウイルス遺伝子は、ウイルス遺伝子がプラスミドに留まり、ゲノム内に組み込まれないため、限定された期間だけ宿主細胞内に存在する細菌プラスミドを用いて導入される。よって、一過性にトランスフェクトされた遺伝物質は、細胞分裂中に次世代に継代されない。
【０００５】
一過性トランスフェクションに関連して、バッチごとの変動、高コストのトランスフェクション試薬及び品質管理の維持の難しさなどのいくつかの欠点がある(Seguraら(2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(7): 987-1011を参照されたい)。トランスフェクションのプロセス自体も労働集約的であり、スケールアップが困難である。また、ベクター調製中に持ち越されるプラスミド不純物を除去するという困難な作業もある(Pichlmairら(2007) J. Virol. 81(2): 539-47を参照されたい)。
【０００６】
一過性トランスフェクションに関連付けられる問題に取り組むために、レトロウイルスベクター産生を簡単にするためのレトロウイルスパッケージング及び産生細胞株の開発が望まれている。
【０００７】
パッケージング細胞株は、レトロウイルスベクターをパッケージングすることができる細胞株をプラスミド(個々のプラスミドは、レトロウイルスパッケージング遺伝子及び固有の真核生物選択マーカーを保持する)でトランスフェクトすることにより生成されている。レトロウイルスパッケージング遺伝子は、パッケージング細胞株のゲノムに組み込まれ、安定にトランスフェクトされると記載されている。過去20年間に、レトロウイルスベクター用の安定なパッケージング及び産生細胞株を生成するために様々な試みがなされてきた。
【０００８】
レトロウイルスベクター成分の宿主細胞ゲノムへの組込みを介して産生されるパッケージング及び産生細胞株には報告されている多数の問題がある。第一に、レトロウイルスベクター成分の連続的導入は労力がかかり、融通が利かないものであり得る。また、宿主細胞ゲノムに組み込まれる場合、組込み部位が予測できないために、レトロウイルスベクター成分の遺伝的及び/又は転写的不安定性という問題もある(Niら(2005) J. Gene Med. 7: 818-834)。
【０００９】
また、産生細胞株の懸濁適応及びスケールアップの際に、ウイルスベクター生産性の有意な低下が報告されている(Farsonら(2001) Hum. Gene Ther. 12: 981-997; Guyら(2013) Hum. Gene Ther. Methods. 24(2): 125-39)。
【００１０】
また、バイオ医薬品業界内では、高力価の組換えタンパク質を確実に提供するトランスフェクトされた細胞株を産生する試みも行われている。このようなプロセスは、典型的には、トランスフェクトされた細胞をスクリーニングして、最適な増殖と組換えタンパク質の産生を有する細胞株を同定することを伴う(例えば、Wurm, 2004, Nature Biotechnology 22, 1393-1398を参照されたい)。
【００１１】
公知の方法は、対象とする組換え遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれ、増幅された、安定にトランスフェクトされた細胞株を選択し、それにより細胞株は対象とする組換え遺伝子の増幅したコピー数を含むことを含む。これは、公知の毒性薬物によって阻害される増幅可能な選択マーカー遺伝子とともに対象とする組換え遺伝子を宿主細胞に同時トランスフェクトすることによって行われる。次に、例えば、毒性薬物を含有する培地中でトランスフェクトされた細胞を培養することにより、安定にトランスフェクトされた細胞は、増加濃度の公知の毒性薬物に供される。このようにして、遺伝子増幅により増幅可能な選択マーカー遺伝子のコピー数を増加させ、その結果、増幅可能な選択マーカーの発現レベルが増加し、それにより毒性薬物に対する耐性を付与するトランスフェクト細胞の集団を選択し得る。遺伝子増幅のプロセスが増幅可能な選択マーカー及び周囲のDNA配列の増幅をもたらすため、対象とする組換え遺伝子が宿主細胞ゲノム内の増幅可能な選択マーカーをコードする遺伝子に隣接して組み込まれる場合において、増幅可能な選択マーカーをコードする配列とともに、対象とする組換え遺伝子をコードする核酸配列を同時に増幅することが可能である。このプロセスは、増幅可能な選択マーカー遺伝子及び対象とする組換え遺伝子の宿主細胞ゲノムへのインビボ連結及び組込みに依存している(Kaufmanら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1750-1759)。
【００１２】
レトロウイルスベクター産生のために安定にトランスフェクトされたパッケージング及び産生細胞株を得るために現在利用可能な方法は、宿主細胞ゲノムへのレトロウイルス遺伝子の連続的組込みを必要とし、各組込み事象の部位は無作為であり、予測不可能であることを考慮すると、レトロウイルス遺伝子が増幅された細胞株を取得するために、すべてのレトロウイルス遺伝子が、増幅可能な選択マーカー遺伝子の近傍に組み込まれた細胞株を得ることは非常に困難であろう。したがって、高力価のウイルスベクターを産生する細胞株を選択するために、増幅可能な選択マーカーを使用して確立された選択手法を使用することは実際的ではないだろうことが想定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、既存の方法に関連付けられる欠点の1つ以上を克服する、安定なレトロウイルスパッケージング及び産生細胞株を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、レトロウイルスベクター産生に必須であるレトロウイルス遺伝子、及び増幅可能な選択マーカー遺伝子を含む、非哺乳動物複製起点と少なくとも25キロベース(kb)のDNA、例えば細菌人工染色体を保持する能力を含む核酸ベクターの使用を伴う、レトロウイルスパッケージング及び産生細胞株を作製する新規な方法を開発した。これは、一過性トランスフェクション法に関連付けられる問題を改善するための、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子の産生に必要とされるレトロウイルス遺伝子の発現を可能にする。さらに、すべての必須レトロウイルス遺伝子及び増幅可能な選択マーカー遺伝子が、単一の核酸ベクターで宿主細胞にトランスフェクトされるため、核酸ベクターは単一の遺伝子座で宿主ゲノムに組み込まれる。これは、宿主ゲノム内の異なる遺伝子座にレトロウイルス遺伝子の組込みを引き起こす連続的なトランスフェクションに関連付けられる問題、及び増幅可能な選択マーカーを使用して上記細胞内のレトロウイルス遺伝子を増幅することに関連付けられる問題を改善する。
【００１５】
非哺乳動物複製起点を含み、及び少なくとも25kbのDNA(すなわち、大型DNA構築物)を保持する能力を有する核酸ベクターの使用にはいくつかの利点がある。第一に、ベクターは、哺乳動物宿主細胞ではなく、非哺乳動物細胞(例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞)でまず操作することができ(例えば、細菌人工染色体は大腸菌でまず操作することができる)、これは使用をはるかに容易にする。一度、核酸ベクターが調製されると、それを哺乳動物宿主細胞に導入することができ、核酸ベクターが内在性染色体に組み込まれた任意の哺乳動物細胞を、安定な細胞株を単離するために選択することができる。
【００１６】
また、レトロウイルス核酸の哺乳動物宿主細胞への導入は単一ステップで起こり、これは選択圧及びサイレンシング時間枠を低減する助けとなる。これは、潜在的パッケージング及び産生細胞のより速いスクリーニングを可能にし、1つのベクターが使用されるだけであるため、複数のプラスミドベクターを使用する従来の方法よりも材料のコストが削減される。特に、現在の系の使用は、プラスミドコスト、必要とされるトランスフェクション試薬(例えば、ポリエチレンイミン[PEI])を節約し、必要とされるベンゾナーゼ処理の量を減少させ(レンチウイルス回収物中のDNAの量が少なくなり、したがって、下流処理工程で余分なものを除去するために必要なベンゾナーゼが少なくなる)及び試験コストを削減すること(レンチウイルス産物中の残留プラスミドを試験する必要がなくなる)により製造コストを削減する。
【００１７】
さらに、レトロウイルス産生(移入ベクターを用いる又は用いない)に必須のレトロウイルス遺伝子及び増幅可能な選択マーカー遺伝子は、ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入された場合に、レトロウイルス遺伝子及び増幅可能な選択マーカー遺伝子のすべてが哺乳動物宿主細胞ゲノム内の1つの遺伝子座で組み込まれるように核酸ベクター内に存在する。これは、レトロウイルス遺伝子が宿主細胞ゲノム内に無作為に異なる遺伝子座で組み込まれた場合に起こり得る遺伝子サイレンシングなどの問題が克服することができる。これはまた、高力価のレトロウイルスベクター粒子を有するパッケージング又は産生細胞を産生する手法を提供し、レトロウイルス遺伝子の増幅は、レトロウイルス遺伝子の増幅可能な選択マーカーへのインビボ連結に依存しない。
【００１８】
したがって、本発明の第1の態様によれば、
個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;並びに
増幅可能な選択マーカー;
をコードする核酸配列を含むレトロウイルスパッケージング細胞が提供され、上記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルスパッケージング細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、
個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;
増幅可能な選択マーカー;並びに
レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノム
をコードする核酸配列を含むレトロウイルス産生細胞が提供され、上記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である。
【００２０】
本発明の代替の態様において、非哺乳動物複製起点及び少なくとも25キロベース(kb)のDNAを保持する能力を含む核酸ベクターが提供され、上記核酸ベクターは、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;並びに
増幅可能な選択マーカー
をコードする核酸配列を含むことを特徴とし、核酸配列のそれぞれは、核酸ベクター内の個々の発現構築物として配置されている。
【００２１】
本発明のなおさらなる態様において、安定なレトロウイルスパッケージング細胞株を産生する方法であって、
(a)本明細書において定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;及び
(c)上記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ
を含む方法が提供される。
【００２２】
本発明の代替の態様において、本明細書に記載される方法によって得られるレトロウイルスパッケージング細胞が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様において、安定なレトロウイルス産生細胞株を産生する方法であって、
(a)本明細書において定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;及び
(c)上記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ
を含む方法が提供される。
【００２４】
本発明のなおさらなる態様において、本明細書に定義される方法によって得られるレトロウイルス産生細胞が提供される。
【００２５】
本発明の代替の態様において、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を産生する方法であって、
(a)本明細書において定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;
(c)上記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ;及び
(d)複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下で、ステップ(c)で選択された哺乳動物宿主細胞をさらに培養するステップ
を含む方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、本明細書に定義される方法によって得られる複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】BACpack-WTGP-277delU5及びBACpack-SYNGP-277delU5の構築に関する段階的ガイドを示す図である。
【図２】安定なポリクローナルプールの選択を示す図である。HEK293T付着細胞は、リン酸カルシウムを用いてBACpackWTGagPol-トランスファーでトランスフェクトされた。安定なプールが2週間のゼオシン選択後に生成された。安定なトランスフェクタントがウイルスを生成することができたかどうか調べるために、安定なポリプールにドキシサイクリンで48時間誘導を行った。誘導48時間後にウイルス上清を採取し、0.22μmフィルターで濾過し、HEK293T細胞を形質導入することにより力価を測定した。GFP陽性形質導入細胞を用いて形質導入単位/ml(TU/mL)を計算した。
【図３】安定なトランスフェクション懸濁クローンの生成を示す図である。HEK293 6E細胞は、293フェクチン試薬を用いて、BACpackWTGagPol-トランスファーでトランスフェクトされた。安定なプールが2週間のゼオシン選択後に生成された。これらの安定なプールを96ウェルプレートでの限界希釈によりクローニングして単細胞クローンを得、これを続いて拡大培養した。接着培地(DMEM+FBS)とその後の懸濁適応(FreeStyle培地)で得られた最良のクローン1、14、15及び16の蛍光顕微鏡により検出されたGFP。
【図４】懸濁クローンにおけるレンチウイルスの誘導を示す図である。安定なHEK6Eトランスフェクタントがウイルスを生成することができたかどうか調べるために、20mlの安定な懸濁クローンにドキシサイクリン(2μg/ml)で48時間誘導を行った。誘導48時間後にウイルス上清を採取し、0.45μmフィルターで濾過し、HEK293T細胞を形質導入することにより力価を測定した。GFP陽性形質導入細胞を用いて形質導入単位/ml(TU/mL)を算出した。
【図５】実施例4に従って産生されたクローンのベクター力価を示す図である。結果は、クローン1及び16のベクター力価が、5代〜21代の間に中等度に増加したことを示す。
【図６】BACpack-WTGP-DHFR-277delU5及びBACpack-SYNGP-DHFR-277delU5の構築に関する段階的なガイドを示す図である。
【図７−１】dhfr遺伝子を含む発現構築物の核酸配列を示す図である。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−１の続きである。
【図８−１】BAC2.0 GSの構築に関する段階的なガイドを示す図である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図８−３】図８−１の続きである。
【図８−４】図８−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、参照よりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００２９】
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」又は「からなる」を包含し、例えば、Xを「含む」組成物は、排他的にXからなってよく、又は何かをさらに含んでもよく、例えば、X+Yであってよい。
【００３０】
用語「から本質的になる」は、特徴の範囲を特定の材料又はステップ及び請求項に係る特徴の基本的な特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【００３１】
用語「からなる」は、いずれの付加的な成分(複数可)の存在も排除する。
【００３２】
数値xに関して用語「約」は、例えば、x±10%、5%、2%又は1%を意味する。
【００３３】
用語「ベクター」又は「核酸ベクター」は、外来の(すなわち、外因性の)遺伝物質を別の細胞に人為的に運搬し、そこでそれが複製及び/又は発現され得るビヒクルを指す。ベクターの例としては、非哺乳動物核酸ベクター、例えば、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1由来人工染色体(PAC)、コスミド又はフォスミドが挙げられる。宿主細胞ゲノムへの組込みとの関連で本明細書において使用される用語「核酸ベクター」とは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた核酸ベクターに由来するDNAを指す。
【００３４】
ベクターの他の例としては、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス及びレンチウイルスベクターが挙げられ、これらは本出願で特に注目される。レンチウイルスベクター、例えば、1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)に基づくものは、非増殖細胞に組み込むことができるため、広く使用されている。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを別個の部分に分割することにより、例えば、別個のプラスミドに配置することにより、複製欠陥とすることができる。例えば、Salk Institute for Biological Studiesにより開発された、いわゆる第一世代のレンチウイルスベクターは、パッケージング発現カセット、エンベロープ発現カセット及び移入ベクター発現カセットからなる3つのプラスミド発現系として構築された。「パッケージングプラスミド」は、全gag-pol配列、調節(tat及びrev)配列及び補助(vif、vpr、vpu、nef)配列を含有する。「エンベローププラスミド」は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下に、天然HIV-1エンベロープタンパク質の代わりに水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVg)を保持する。第三のプラスミド(「移入プラスミド」又は「移入ベクター」)は、宿主細胞内で導入遺伝子を発現させるため、長い末端反復(LTR)、導入遺伝子、カプセル封入配列(ψ)、Rev応答エレメント(RRE)配列及びCMVプロモーターを有する。
【００３５】
第二のレンチウイルスベクター世代は、病原性配列vpr、vif、vpu及びnefの欠失を特徴とした。パッケージングベクターはgag、pol、tat及びrev遺伝子に減らされ、したがって、系の安全性が高まった。
【００３６】
レンチウイルス系を改良するために、パッケージング構築物からtat遺伝子を除去し、ベクターカセットからLTRを不活化し、したがって、挿入突然変異誘発効果に関する問題を軽減することによって、第三世代のベクターが設計された。
【００３７】
様々なレンチウイルス世代が以下の参照文献に記載されている:第一世代:Naldiniら(1996) Science 272(5259): 263-7;第二世代:Zuffereyら(1997) Nat. Biotechnol. 15(9): 871-5;第三世代:Dullら(1998) J. Virol. 72(11): 8463-7、これらはすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。レンチウイルスベクターの開発についての総説は、Sakumaら(2012) Biochem. J. 443(3): 603-18及びPicanco-Castro(2008) Exp. Opin. Therap. Patents 18(5):525-539に見出すことができる。
【００３８】
用語「非哺乳動物複製起点」は、複製が開始され、及び、非哺乳動物起源に由来する核酸配列を指す。これは、本発明の核酸ベクターが安定に複製すること、及び宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である場合を除いて、それが宿主細胞後代に伝達されるように適切な宿主細胞(例えば、細菌又は酵母細胞などの微生物細胞)内で内在性染色体とともに分離することを可能とする。哺乳動物宿主細胞において、非哺乳動物複製起点を有する核酸ベクターは、哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれるか又は哺乳動物宿主細胞複製時に喪失する。例えば、細菌人工染色体(BAC)、P1由来人工染色体(PAC)、コスミド又はフォスミドなどの、非哺乳動物複製起点を有する核酸ベクターは、細菌細胞(例えば、大腸菌)内で安定に複製し、内在性染色体とともに分離することがきるが、しかしながら、それらが哺乳動物宿主細胞に導入された場合、BAC、PAC、コスミド又はフォスミドは哺乳動物宿主細胞複製時に組み込まれるか又は喪失する。酵母人工染色体(YAC)は、酵母細胞内で安定に複製し、内在性染色体とともに分離することがきるが、しかしながら、それらが哺乳動物宿主細胞に導入された場合、YACは哺乳動物宿主細胞複製時に組み込まれるか又は喪失する。したがって、この文脈では、本発明の核酸ベクターは、レトロウイルス産生用の安定な細胞株を生成するために哺乳動物宿主細胞に容易に移入できるDNAのリザーバーとして(すなわち、レトロウイルス産生に必須の遺伝子のために)作用する。非哺乳動物複製起点の例としては、細菌複製起点、例えば、oriC、oriV若しくはoriS、又は自律複製配列(ARSエレメント)としても知られる酵母複製起点が挙げられる。
【００３９】
本発明の核酸ベクターは、非哺乳動物複製起点を含み、及び少なくとも25キロベース(kb)のDNAを保持することができる。一実施形態では、核酸ベクターは、少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340又は350kbのDNAを保持する能力を有する。「保持する能力」への言及はその通常の意味を有し、核酸ベクターの挿入サイズの上限が請求項に係るサイズ以上(すなわち、25kb以上のDNA)であることを含意すると理解される。
【００４０】
本発明の目的は、単一の構築物(すなわち、核酸ベクター)にレトロウイルスパッケージング及び増幅可能な選択マーカー遺伝子に必須の遺伝子を含めることである。したがって、本発明の核酸ベクターは、大きなDNA挿入物を保持することができなければならない。疑念を避けるため、「核酸ベクター」又は「人工染色体」への言及は、天然細菌プラスミド(例えば、一過性トランスフェクション法で現在使用されているプラスミド)は、少なくとも25kbのDNAを保持することができないため、これらを指さないものと理解される。プラスミドが含有し得る最大サイズの挿入物は約15kbである。このような核酸ベクターはまた、一般に5〜11kbの最大挿入物を保持するにすぎないバクテリオファージも指さない。したがって、一実施形態では、本発明の核酸ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ又はエピソームではない。
【００４１】
用語「内在性染色体」(又は宿主細胞ゲノム)は、細菌人工染色体などの外因性核酸ベクターの生成又は導入の前に宿主細胞に見られるゲノム染色体を指す。
【００４２】
用語「トランスフェクション」、「形質転換」及び「形質導入」は、本明細書において使用する場合、標的細胞(すなわち、宿主細胞)への非哺乳動物又はウイルスベクターの挿入を記載するために使用され得る。ベクターの挿入は、通常、細菌細胞については形質転換及び真核細胞についてはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入はまた形質導入とも呼ばれ得る。当業者は、限定されないが、物理的方法(例えば、エレクトロポレーション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、遺伝子銃又は粒子衝撃)、化学試薬(例えば、リン酸カルシウム、高分岐有機化合物又はカチオン性ポリマー)又はカチオン性脂質(例えば、リポフェクション)の使用を含む一般的に使用される種々の非ウイルストランスフェクション法を知っているであろう。多数のトランスフェクション法は、プラスミドDNAの溶液と細胞との接触を必要とし、次にこれらを増殖させ、マーカー遺伝子発現に関して選択する。
【００４３】
用語「プロモーター」は、遺伝子発現を駆動する配列を指す。高レベルの発現を駆動するために、非レトロウイルス高効率プロモーターなどの高効率プロモーターを使用することが有益であり得る。適切なプロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、又はヒト延長因子1アルファ(pEF)プロモーターなどのプロモーターが挙げられる。
【００４４】
Tetオペロン(テトラサイクリン制御性転写活性化)は誘導性遺伝子発現の方法で使用してよく、ここで転写は、抗生物質テトラサイクリン又はその誘導体の1つ(例えば、ドキシサイクリン)の存在下で可逆的にオン又はオフされる。本来、Ptetプロモーターは、リプレッサーTetRとテトラサイクリン抗生物質を細胞外へくみ出すタンパク質TetAを発現する。本発明において、Tetオペロンは存在してもしなくてもよく、例えば、一実施形態では、Tetオペロンはプロモーター内に存在し得る。
【００４５】
用語「ポリAシグナル」は、例えば、導入遺伝子の3'側に配置された、宿主因子が転写の際に新生mRNAの末端にポリアデノシン(ポリA)テールを付加することを可能とするポリアデニル化シグナル配列を指す。このポリAテールは、mRNAを酵素分解から保護し、また翻訳を補助する、最大300のアデノシンリボヌクレオチドのストレッチである。したがって、本発明の核酸ベクターは、ヒトベータグロビン又はウサギベータグロビンポリAシグナル、シミアンウイルス40(SV40)前期又は後期ポリAシグナル、ヒトインスリンポリAシグナル、又はウシ成長ホルモンポリAシグナルなどのポリAシグナル配列を含み得る。一実施形態では、ポリAシグナル配列は、ヒトベータグロビンポリAシグナルである。
【００４６】
用語「イントロン配列」は、RNAスプライシングにより最終遺伝子産物から除去されるヌクレオチド配列を指す。エンハンサー/プロモーター領域の下流及びcDNA挿入物の上流でのイントロンの使用は、遺伝子発現のレベルを増強することが示されている。発現の増強は特定のcDNA挿入物に依存する。したがって、本発明の核酸ベクターは、ヒトベータグロビンイントロン、ウサギベータグロビンイントロンII又はキメラヒトベータグロビン-免疫グロブリンイントロンなどのイントロンを含み得る。一実施形態では、イントロンは、ヒトベータグロビンイントロン及び/又はウサギベータグロビンイントロンIIである。
【００４７】
用語「パッケージング細胞株」は、gag及びpolタンパク質並びにエンベロープ糖タンパク質遺伝子が安定に挿入された細胞株を指す。あるいは、用語「産生細胞株」は、上記のLTR配列間の対象とする導入遺伝子を含有する「移入ベクター」成分(一過性トランスフェクション法において使用した場合)が安定に挿入されたパッケージング細胞株を指す。本明細書に記載の核酸ベクターは、パッケージング細胞株(すなわち、少なくともgag、pol及びenv遺伝子が核酸ベクターに存在し、宿主細胞に組み込まれる場合)又は産生細胞株(すなわち、核酸ベクターが、gag、pol及びenv遺伝子とともに宿主細胞に組み込まれる移入ベクター成分を付加的に含む場合)を生成するために使用可能であることが当業者には理解される。
【００４８】
用語「安定にトランスフェクトされる」は、導入されたレトロウイルス遺伝子をそれらの後代(すなわち、娘細胞)に受け渡すことができる細胞株を意味し、これはトランスフェクトされたDNAが内在性染色体に組み込まれたためかまた外因性染色体の安定な継承を介したものである。
【００４９】
用語「発現構築物」及び「発現カセット」は、互換的に使用され、本明細書において使用される場合、1つ以上の組み込まれたポリヌクレオチドの発現を駆動することができる機能的発現ユニットを指す。このようなカセットは、通常、ポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドの転写及び翻訳に必要な成分を含む。例えば、カセットは、プロモーター、翻訳開始配列シグナル、転写ターミネーター(例えば、ポリA配列)及び/又は自己切断ペプチド配列(例えば、P2A配列)を含む核酸配列(すなわち、組換えDNA)を含み得る。一実施形態では、個々の発現カセットは、プロモーター及び/又は転写ターミネーターを含む。一実施形態では、個々の発現カセットは、ともに単一のプロモーターから転写されるIRESによって分離された2つの遺伝子を含む。構築物はまた、ポリヌクレオチドの転写及び翻訳のより大きな制御を増強又は提供し得る、当該技術分野において公知である他の付加的な成分を含有し得る。一実施形態では、追加の成分は、SV40ゲノム由来の任意の核酸配列であり得る。
【００５０】
核酸ベクター
本発明の一態様によれば、非哺乳動物複製起点及び少なくとも25キロベース(kb)のDNAを保持する能力を含む核酸ベクターが提供され、上記核酸ベクターは、
gag及びpolタンパク質、
envタンパク質又はその機能的置換体、並びに
増幅可能な選択マーカー
をコードする核酸配列を含むことを特徴とし、核酸配列のそれぞれは、核酸ベクター内の個々の発現構築物として配置されている。
【００５１】
レトロウイルスベクター粒子を生成するための現在の方法は、宿主細胞へのレトロウイルス遺伝子の一過性トランスフェクションを伴う。しかしながら、コスト及び労力がかかり、スケールアップが難しいことから、この方法には多くの欠点が関連付けられてきた。1つの解決策は、一過性トランスフェクションに関連付けられる問題を回避するために、レトロウイルスパッケージング遺伝子を安定に組み込むパッケージング細胞株を操作することである。
【００５２】
本発明者らは、本明細書に記載の核酸ベクターが、レトロウイルスベクター産生法に関連付けられる以前の欠点を改善するレトロウイルスパッケージング又は産生細胞株を生成するために使用することができることを見出した。例えば、レトロウイルスパッケージング細胞株を生成する公知の方法は、それぞれのレトロウイルス遺伝子が導入された後に複数回の選択を伴う。この過程には最大6か月かかり、極めて労働集約的である。長期に労力を要するプロセスの後にパッケージング細胞株が得られた後でさえ、パッケージング細胞株の懸濁適応及びスケールアップ中にウイルスベクターの生産性が有意に低下するという報告がある。
【００５３】
核酸ベクターにすべてのレトロウイルス遺伝子を含めることにより、次に、レトロウイルス遺伝子は1つの単一ステップで哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に挿入することができる。したがって、核酸ベクターの使用は、本明細書で提案されるように、選択圧を小さくし、サイレンシング時間枠を短縮し、及び、潜在的パッケージング細胞のより迅速なスクリーニングを可能とする。
【００５４】
さらに、核酸ベクターのレトロウイルス遺伝子は、すべてが哺乳動物宿主細胞の内在性染色体の単一の遺伝子座に組み込まれ、これにより個々のレトロウイルス遺伝子がサイレントとなるリスクが減り、すべてのレトロウイルス遺伝子が一様に発現されるだろう。
【００５５】
宿主細胞のゲノム内の単一遺伝子座での組込みにより、増幅可能な選択マーカー遺伝子を使用してレトロウイルス遺伝子を増幅する手法が可能になり、レトロウイルス遺伝子の増幅は、レトロウイルス遺伝子が単一の遺伝子座に組み込まれていない場合に必要な、レトロウイルス遺伝子の増幅可能な選択マーカーへのインビボ連結に依存しない。
【００５６】
したがって、本明細書に記載の核酸ベクターを使用することにより、増幅されたレトロウイルス遺伝子を有するパッケージング細胞又は産生細胞を選択して、レトロウイルスベクター粒子の力価を改善することが可能である。
【００５７】
一実施形態では、核酸ベクターは、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を付加的に含む。この核酸配列が転写された場合、細胞によって産生されたレトロウイルスベクター粒子内でキャプシド形成され、したがって、レトロウイルスベクター粒子のゲノムとして機能する。レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列は、通常、一過性トランスフェクション法に使用される「移入ベクター」に含まれることが理解される。移入ベクタープラスミドは、一般的に、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター(例えば、SV40)(及び場合により、ポリアデニル化シグナル、さらに場合により導入遺伝子の転写及び発現を制御/増強させるための核酸配列)及び2つのLTR配列:3'LTR(自己不活性化(すなわち、SIN)3'-LTRであってもなくてもよい)と5'LTR(U5領域を含んでも含まなくてもよい)の間にキャプシド形成配列(ψ)を含有する。したがって、一実施形態では、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムは、2つのLTR間にコードされる1つ以上の導入遺伝子を含む。
【００５８】
一実施形態では、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列(すなわち、移入ベクターの成分)の複数のコピーが核酸ベクターに含まれる。移入ベクターの複数コピーは、より高いウイルスベクター力価をもたらすと予想される。例えば、核酸ベクターは、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列(すなわち、移入ベクター)の2以上、例えば、3、4、5、6、7、8、9又は10以上のコピーを含み得る。
【００５９】
一実施形態では、核酸ベクターは、1つ又は複数の組換え部位を含有する。これは、標的配列がリコンビナーゼ酵素の存在下で部位特異的な手法で哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれることを可能とする。リコンビナーゼ酵素は、2つの組換え部位の間の組換え反応を触媒する。
【００６０】
多数のタイプの部位特異的組換え系が当該技術分野において公知であり、任意の適切な組換え系が本発明で使用され得る。例えば、一実施形態では、組換え部位(複数可)は、ラムダファージのint/att系、バクテリオファージP1のCre/lox系、酵母のFLP/FRT系、ファージMuのGin/gixリコンビナーゼ系、Cinリコンビナーゼ系、大腸菌のPinリコンビナーゼ系及びpSR1プラスミドのR/RS系、又はそれらの任意の組合せから選択されるか、又はそれらに由来する。さらなる実施形態では、組換え部位は、att部位(例えば、ラムダファージ由来)であり、このatt部位は、ラムダインテグラーゼの存在下で部位指定組込みを可能とする。「ラムダインテグラーゼ」への言及には、int/att系となお適合する突然変異インテグラーゼ、例えば、WO2002/097059に記載の修飾されたラムダインテグラーゼについての言及が含まれることが理解される。
【００６１】
一実施形態では、核酸ベクターは、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1由来人工染色体(PAC)、フォスミド又はコスミドから選択される。さらなる実施形態では、核酸ベクターは、細菌人工染色体(BAC)である。
【００６２】
細菌人工染色体
用語「細菌人工染色体」又は「BAC」は、大きな外因性DNA挿入物を保持することができる細菌プラスミド由来のDNA構築物を指す。それらは、通常、最大およそ350kbのDNA挿入物を保持することができる。BACは、細菌の細胞分裂後にプラスミドの一様な分布を促進する分配遺伝子を含有する、十分に特徴付けられた細菌機能的稔性プラスミド(Fプラスミド)から開発された。これは、BACが安定に複製し、内在性細菌ゲノム(例えば、大腸菌)とともに分離することを可能とする。BACは、通常、複製起点(例えば、oriS又はoriV遺伝子)、repE遺伝子(プラスミド複製及びコピー数の調節のため)及び細菌細胞内でのBACの安定な維持を確保する分配遺伝子(例えば、sopA、sopB、parA、parB及び/又はparC)の少なくとも1コピーを含有する。BACは、天然では、環状及びスーパーコイル型であり、これはそれらをYACなどの直鎖人工染色体よりも回収を容易にする。それらはまた、エレクトロポレーションなどの簡単な方法を用い、比較的容易に細菌宿主細胞に導入することができる。
【００６３】
一実施形態では、細菌人工染色体は、oriS遺伝子を含む。一実施形態では、細菌人工染色体は、repE遺伝子を含む。一実施形態では、細菌人工染色体は、分配遺伝子を含む。さらなる実施形態では、分配遺伝子は、sopA、sopB、parA、parB及び/又はparCから選択される。なおさらなる実施形態では、細菌人工染色体は、sopA及びsopB遺伝子を含む。
【００６４】
本発明において使用するためのBACは、例えば、LUCIGEN(商標)(全長骨格配列については、ゲノム受託番号EU101022.1を参照されたい)からのpSMART BACなど、商業ソースから入手され得る。このBACはL-アラビノース「コピーアップ」系を含有し、これはまた、TrfA複製タンパク質の存在下でのみ活性であるoriVミディアムコピー複製起点を含有する。TrfAの遺伝子は、細菌宿主細胞のゲノムのL-アラビノース誘導プロモーターaraC-PBADの制御下に組み込むことできる(Wildら(2002) Genome Res. 12(9): 1434-1444を参照されたい)。L-アラビノースの添加はTrfAの発現を誘導し、TrfAはoriVを活性化し、細胞あたり50コピーまでプラスミドを複製させる。
【００６５】
酵母人工染色体
用語「酵母人工染色体」又は「YAC」は、酵母DNAが細菌プラスミドに組み込まれている染色体を指す。それらは、自律的複製配列(ARS)(すなわち、複製起点)、セントロメア及びテロメアを含有する。BACとは異なり、YACは線状であり、したがって、宿主細胞後代に受け渡される際に、染色体の各末端に、その末端を分解から保護する酵母テロメアを含む。YACは、100〜2000kbであれば、一定範囲のDNA挿入サイズを保持することができる。
【００６６】
P1由来人工染色体
用語「P1由来人工染色体」又は「PAC」は、P1バクテリオファージ及び細菌FプラスミドのDNAに由来するDNA構築物を指す。それらは、通常、最大およそ100〜300kbのDNA挿入物を保持することができ、大腸菌においてクローニングベクターとして使用される。PACは、精製及び細菌宿主細胞への導入が容易など、BACと同様の利点を有する。
【００６７】
コスミド及びフォスミド
用語「コスミド」は、バクテリオファージラムダに由来するcos部位を付加的に含有する細菌プラスミドに由来するDNA構築物を意味する。コスミドは、一般的に、細菌複製起点(例えば、oriV)、選択マーカー、クローニング部位及び少なくとも1つのcos部位を含有する。コスミドは、通常、最大40〜45kbのDNA挿入物を受容することができる。コスミドは、大腸菌細胞感染において標準的な細菌プラスミドよりも効率的であることが示されている。用語「フォスミド」は、細菌Fプラスミドに基づくこと以外はコスミドと同様の非哺乳動物核酸ベクターを指す。特に、それらは、大きなDNA断片のクローニングを可能とするFプラスミド複製起点及び分配機構を使用する。フォスミドは通常、最大40kbのDNA挿入物を受容することができる。
【００６８】
レトロウイルス
レトロウイルスは、擬似二倍体一本鎖RNAゲノムを含有するウイルス科である。それらは、RNAゲノムからDNAを産生する逆転写酵素をコードし、次に、このDNAは、宿主細胞のDNAに挿入され得る。本明細書に記載の本発明は、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を産生するために使用され得る。本発明のレトロウイルスベクター粒子は、任意の適切なレトロウイルスから選択されるか、又はそれに由来するものであり得る。
【００６９】
一実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス又は泡沫レトロウイルス、例えば、レンチウイルス又はガンマレトロウイルス、特に、レンチウイルスに由来するかまたそれらから選択される。さらなる実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV及びVisnaからなる群から選択されるレンチウイルスである。レンチウイルスは非分裂(すなわち、静止)細胞に感染することができ、これにより、レンチウイルスは遺伝子療法にとって魅力的なレトロウイルスベクターとなる。なおさらなる実施形態では、レトロウイルスベクター粒子はHIV-1であるか又はHIV-1に由来する。いくつかのレトロウイルスのゲノム構造を当該技術分野において見出すことができる。例えば、HIV-1の詳細は、NCBI Genbank(ゲノム受託番号AF033819)から見出すことができる。HIV-1は、最も理解されているレトロウイルスの1つであり、したがって、レトロウイルスベクターとしてしばしば使用されている。
【００７０】
レトロウイルス遺伝子
すべてのレトロウイルスに共通する核酸配列は、以下のようにより詳しく説明され得る:
長い末端反復配列(LTR):レトロウイルスゲノムの基本構造は、5'-LTR及び3'-LTRを含み、その間又は内にレトロウイルス産生に必要とされる遺伝子が位置する。LTRは、レトロウイルスの組込み及び転写に必要とされる。それらはまた、レトロウイルス遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列として働くことができる(すなわち、それらがシス作用遺伝子である)。LTRは、U3、R、U5と呼ばれる3つの部分領域から構成され、U3は、RNAの3'末端に固有の配列に由来し;Rは、RNAの両末端で反復する配列に由来し;U5は、RNAの5'末端に固有の配列に由来する。したがって、一実施形態では、核酸ベクターは、5'-及び3'-LTRを付加的に含む。さらなる実施形態では、5'LTRのU5領域を欠失させ、非HIV-1ポリAテールに置き換えることができる(Hanawaら(2002) Mol. Ther. 5(3): 242-51を参照されたい)。
【００７１】
複製可能ウイルスの生成に関する安全性の問題に取り組むために、3'LTRのU3領域中の、TATAボックス並びに転写因子Sp1及びNF-κBの結合部位を含む部分を欠失させることによって自己不活性化(SIN)ベクターが開発された(Miyoshiら(1998) J. Virol. 72(10): 8150-7を参照されたい)。この欠失は、感染細胞における逆転写及び組込みの後に5'LTRに移入され、これにより、LTRの転写の不活性化が起こる。これは、自己不活性化レンチウイルスに基づくベクター系として知られ、本発明に含まれ得る。
【００７２】
ψ:レトロウイルスRNAのキャプシド形成は、レトロウイルスゲノムの5'末端に位置するψ(プサイ)配列により起こる。また、プサイ配列の下流にあってgagコード領域へと延伸する配列が効率的なレトロウイルスベクター産生に関与することもまた当該技術分野において周知である(Cuiら(1999) J. Virol. 73(7): 6171-6176を参照されたい)。一実施形態では、核酸ベクターは、ψ(プサイ)配列を付加的に含む。
【００７３】
プライマー結合部位(PBS):レトロウイルスゲノムは、5'-LTRのU5領域の後に存在するPBSを含有する。この部位は、逆転写の開始に必要とされるtRNAプライマーと結合する。一実施形態では、核酸ベクターは、PBS配列を付加的に含む。
【００７４】
PPT:レトロウイルスゲノムは、レトロウイルスゲノムの3'末端付近に、ポリプリントラクト(PPT)と呼ばれるプリンの短いストレッチを含有する。これらのPPTは、逆転写中にプラス鎖DNA合成のRNAプライマーとして機能する。複雑なレトロウイルス(例えば、HIV-1)は、より中央に位置する第2のPPT(すなわち、セントラルポリプリントラクト(cPPT))を含有し、これはDNA合成の開始の第2の部位を提供する。cPPTをコードするレトロウイルスベクターは、形質導入及び導入遺伝子発現が増強されることが示されている(Barryら(2001) Hum. Gene Ther. 12(9):1103-8を参照されたい)。一実施形態では、核酸ベクターは、3'-PPT配列及び/又はcPPT配列を付加的に含む。
【００７５】
上記の非コード領域のゲノム構造は当業者に周知である。例えば、HIV-1の非コード領域のゲノム構造に関する詳細は、NCBI Genbankからゲノム受託番号AF033819として、又はHIV-1 HXB2(一般的に使用されるHIV-1参照株)ではゲノム受託番号K03455として見出すことができる。一実施形態では、非コード領域は、ゲノム受託番号K03455の、例えば、塩基対454〜1126(R-U5-PBS-Gagの場合)、7622〜8479(RREの場合)又は7769〜8146(RREの場合)、4781〜4898(cPPTの場合)、9015〜9120及び9521〜9719(dNEF-PPT-sinU3-R-U5の場合)から利用可能な配列に由来する。
【００７６】
Gag/pol:gag及びpol遺伝子の発現は、gagとgagpolの間の翻訳フレームシフトに依存する。ともに成熟の際に切断されるポリタンパク質である。レトロウイルスベクターの主要な構造マトリックス、キャプシド、及びヌクレオキャプシドタンパク質はgagによりコードされている。pol遺伝子は、レトロウイルス酵素:i)レトロウイルスRNAゲノムの二本鎖DNAへの逆転写に不可欠な逆転写酵素、ii)レトロウイルスDNAゲノムの宿主細胞染色体への組込みを可能とするインテグラーゼ、及びiii)レトロウイルスの成熟した機能的タンパク質を産生するために合成されたポリタンパク質を切断するプロテアーゼをコードしている。一実施形態では、gag及びpolタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列は、HIV-1 HXB2配列に由来し、この配列は、ゲノム受託番号K03455の、例えば、塩基対790〜5105から利用可能である。
【００７７】
Env:env(「エンベロープ」)遺伝子は、レトロウイルスエンベロープの表面及び膜貫通成分(例えば、HIV-1の糖タンパク質gp120及びgp41)をコードし、レトロウイルス-細胞膜融合に関与する。レトロウイルスベクターの組織向性を拡大するために、本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、別のウイルス由来のエンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。シュードタイピングは、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターの宿主細胞範囲が拡大され得、又はレトロウイルスベクター粒子上の糖タンパク質(GP)を変化させることにより変更され得る(例えば、他のエンベロープウイルスから得られる若しくは他のエンベロープウイルスに由来するGPを使用するか、又は合成/人工GPを使用することによる)プロセスを指す。レトロウイルスベクターのシュードタイピングに最も慣用される糖タンパク質は、広い向性と高いベクター粒子安定性に起因して水疱性口内炎ウイルスGP(VSV)である。しかしながら、他の糖タンパク質がシュードタイピングに使用可能であることが当業者には理解される(参照により全体として本明細書に組み込まれるCroninら(2005) Curr. Gene Ther. 5(4):387-398を参照されたい)。シュードタイピングに使用されるウイルスの選択はまた、いくつかのシュードタイプは組織種選好性を持つことが示されていることから、標的とされる細胞及び/又は器官の種類によっても異なり得る。一実施形態では、envタンパク質の機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質である。
【００７８】
一実施形態では、envタンパク質又はその機能的置換体は、ベジクロウイルス(例えば、水疱性口内炎ウイルス)、リッサウイルス(例えば、狂犬病ウイルス、モコラウイルス)、アレナウイルス(例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV))、アルファウイルス(例えば、ロスリバーウイルス(RRV)、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、フィロウイルス(例えば、レストンエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、ラッサ熱ウイルス)、アルファレトロウイルス(例えば、トリ白血病ウイルス(ALV))、ベータレトロウイルス(例えば、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス(JSRV))、ガンマレトロウイルス(例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(MLV)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、ネコ内在性レトロウイルス(RD114))、デルタレトロウイルス(例えば、ヒトTリンパ球向性ウイルス1(HTLV-1))、スプマウイルス(例えば、ヒト泡沫状ウイルス)、レンチウイルス(例えば、マエディ・ビスナウイルス(MVV))、コロナウイルス(例えば、SARS-CoV)、レスピロウイルス(例えば、センダイウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス(RSV))、ヘパチウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV))、インフルエンザウイルス(例えば、インフルエンザウイルスA)及び核多角体ウイルス(例えば、オートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)多角体病ウイルス(AcMNPV))から選択されるウイルスから得られるか、又はそれらのウイルスに由来する。さらなる実施形態では、envタンパク質又はその機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルスから得られるか又はそのウイルスに由来する。この実施形態では、レトロウイルス粒子がより広い宿主細胞範囲に感染し、野生型エンベロープタンパク質を産生するために組換えの機会を少なくすることを可能とする水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVg)タンパク質が使用され得る。さらなる実施形態では、envタンパク質又はその機能的置換体をコードするレトロウイルス核酸配列は、ゲノム受託番号J02428.1の、例えば、塩基対3071〜4720から利用可能な配列に由来する。
【００７９】
本明細書に記載の構造遺伝子は、すべてのレトロウイルスに共通する。さらなる補助遺伝子は、種々のタイプのレトロウイルスで見出すことができる。例えば、レンチウイルス、例えば、HIV-1は、rev、vif、vpu、vpr、nef及びtatとして知られるさらに6つの補助遺伝子を含む。他のレトロウイルスは、本明細書に記載の遺伝子に類似する補助遺伝子を有することができるが、それらは文献で常に同じ名称で示されているわけではない。Tomonaga and Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt 8):1611-1621などの参照文献に様々なレトロウイルス補助遺伝子が記載されている。
【００８０】
Rev:補助遺伝子rev(「ビリオンの調節因子」」は、Rev応答エレメント(RRE)に結合し、レトロウイルス転写産物の輸送を促進する補助タンパク質をコードする。この遺伝子のタンパク質産物は、Rev応答エレメント(RRE)を含有するレトロウイルスmRNAの断片が核から細胞質へ輸送されることを可能とする。RRE配列は、複雑な折りたたみ構造を形成すると予想される。revのこの特定の役割は、スプライシングステップ及び核輸送ステップの強固な共役を反映する。一実施形態では、核酸ベクターは、RRE配列を含む。さらなる実施形態では、RRE配列は、HIV-1 HXB2配列に由来し、この配列はゲノム受託番号K03455の、例えば、塩基対7622〜8479、又は7769〜8146、特に、塩基対7622〜8479から利用可能である。
【００８１】
RevはRREと結合し、シングルスプライシング(env、vif、vpr及びvpu)又は非スプライシング(gag、pol及びゲノムRNA)ウイルス転写産物の輸送を促進して、遺伝子翻訳及びパッケージングのような下流事象をもたらす(Suhasini and Reddy (2009) Curr. HIV Res. 7(1): 91-100を参照されたい)。一実施形態では、核酸ベクターは、補助遺伝子rev又はその類似遺伝子(すなわち、他のレトロウイルス若しくは機能的に類似の系由来)を付加的に含む。rev遺伝子の包含は、特にRREエレメントもまた輸送される転写産物に含まれる場合に、核から細胞質へのレトロウイルスベクターゲノムのRNA転写産物の効率的輸送を確実にする。さらなる実施形態では、rev遺伝子は、ゲノム受託番号M11840の塩基対970〜1320(すなわち、HIV-1クローン12cDNA、HIVPCV12遺伝子座)と少なくとも60%の配列同一性、例えば、少なくとも70%の配列同一性を含む。代替の実施形態では、rev遺伝子は、ゲノム受託番号K03455.1(すなわち、1型ヒト免疫不全ウイルス、HXB2)の塩基対5970〜6040及び8379〜8653に対して少なくとも60%の配列同一性、例えば、少なくとも70%、80%、90%又は100%の配列同一性を含む。
【００８２】
補助遺伝子は、レトロウイルス複製及び病原性に役割を果たすと考えられ、したがって、多数の現在のウイルスベクター産生系は、これらの遺伝子のいくつかを含まない。例外は、通常存在するrevであり、又はrev/RRE系に類似の系は潜在的に使用される。したがって、一実施形態では、補助遺伝子vpr、vif、vpu、tat及びnef、又は類似の補助遺伝子のうち1つ以上をコードする核酸配列は、上記補助遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムから除かれるか又は機能的補助タンパク質をコードできないように破壊される。さらなる実施形態では、補助遺伝子vpr、vif、vpu、tat及びnef、又は類似の補助遺伝子のうち少なくとも2つ以上、3つ以上、4つ以上、又はすべてが、上記補助遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムから除かれるか又は機能的補助タンパク質をコードできないように破壊される。機能的補助遺伝子の除去は遺伝子全体の除去を必要とせず、その遺伝子の一部の除去又はその遺伝子の破壊で十分であろう。
【００８３】
複製欠陥レトロウイルスベクター粒子をコードする核酸配列は、レトロウイルスベクター粒子が基づくレトロウイルスの野生型遺伝子と同じ、又はそれに由来するものであり得、すなわち、それらの配列は、野生型ウイルスに含まれる配列の遺伝的に又は他には変更されたバージョンであり得ると理解される。したがって、核酸ベクター又は宿主細胞ゲノムに組み込まれるレトロウイルス遺伝子は、野生型遺伝子のコドン最適化バージョンもまた意味し得る。
【００８４】
遺伝子増幅
自然界では、遺伝子増幅は、特にキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の卵子形成など、特にその卵巣における絨毛膜遺伝子の増幅において、いくつかの正常な発達状態を特徴付けるプロセスである(Spraldingら(1980) PNAS, 77: 1096-1100)。遺伝子増幅はまた、腫瘍細胞においても頻繁に起こる現象であり、癌遺伝子の発現の増強を引き起こすことにより、癌遺伝子の活性化において主要な役割を果たす(Albertson D.G. (2006) Trends Genet. 22: 447-455)。
【００８５】
「遺伝子増幅」とは、ゲノムの特定のDNA配列(すなわち、遺伝子)がゲノム内の他の配列に対して不均衡に複製され、増幅されたDNA配列が、このような不均衡な複製前のゲノム最初に存在したよりも高いコピー数で存在するようになるプロセスを指す。遺伝子又は核酸配列に関して本明細書で使用される「増幅された」又は「増幅」とは、遺伝子増幅により宿主細胞株に2つ以上のコピーで存在する遺伝子又は核酸配列を指す。
【００８６】
遺伝子増幅の自然現象は、細胞株によって産生される組換え遺伝子産物の力価を高める方法として、バイオ医薬品業界で活用されている。組換え遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている場合、組換え遺伝子のコピー数、及びそれに伴って発現される組換えタンパク質の量は、組換え遺伝子が、宿主細胞ゲノムに組み込まれた後に増幅された細胞株を選択することにより増加させることができる。
【００８７】
本明細書で使用される「増幅可能な選択マーカー遺伝子」は、適切な増殖条件下でその遺伝子の増幅を可能にする遺伝子を指す。対照的に、本明細書で使用され、以下により詳細に記載される用語「選択可能なマーカー遺伝子」は、増幅を許可しない選択可能なマーカー遺伝子を指す。増幅可能な選択マーカー遺伝子は、発現産物(すなわち、増幅可能な選択マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現)を増加させる増幅により、阻害剤又は必須代謝産物の欠如のいずれかに応答することができる。毒性薬物などの阻害剤が使用される場合、増幅可能な選択マーカーの発現の増加により、阻害剤に対する耐性が付与される。一実施形態では、増幅可能な選択マーカー遺伝子は、栄養要求性宿主を補完することができるものとして特徴付けられ得る。一実施形態では、増幅可能な選択マーカーは、プロモーターの制御下にある。一実施形態では、プロモーターはSV40プロモーターである。
【００８８】
本明細書で使用される用語「選択マーカー遺伝子」とは、挿入遺伝子(例えば、核酸ベクター)を活発に発現する細胞を選択するのに役立つが、増幅を許可しない遺伝子を指す。適切な選択マーカーの例には、抗生物質に対する耐性をコードする酵素(すなわち、抗生物質耐性遺伝子)、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、又はゼオシンが含まれる。適切な選択マーカーの別の例は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)又は青色蛍光タンパク質(BFP)である。
【００８９】
本明細書で使用される「増幅可能な選択マーカー」及び「選択可能なマーカー」は、それぞれ増幅可能な選択マーカー遺伝子及び選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる産物(すなわち、酵素タンパク質)を指す。
【００９０】
遺伝子増幅は、増幅可能な選択マーカー遺伝子を宿主細胞に安定的にトランスフェクトすることにより誘導され得る。安定してトランスフェクトされた宿主細胞は、増幅可能な選択マーカーを阻害することが知られている、増加濃度の毒性薬物に供される。例えば、トランスフェクトされた細胞は、親細胞(すなわち、トランスフェクトされていない細胞)を毒性薬物を含む培地にプレーティングした後、3〜5日以内に細胞の98%を超える死滅を達成する濃度で毒性薬剤を含む培地中で培養され得る。あるいは、トランスフェクトされた細胞は、毒性薬物(例えば、MTX又はMSX)を含有する培地中で、空気中8%COの加湿雰囲気で14〜21日間又は90%超の生存率まで37℃で培養され得る。このような阻害により、増幅可能な選択マーカーの発現レベルが増加し、その結果、使用される濃度の薬物に対する耐性を有する細胞集団を選択することができる。遺伝子増幅を誘導するさらなる方法は、OptiCHO(商標)Express Kitマニュアル(Life Technologies(商標))に記載されている方法など、当業者に公知であろう。
【００９１】
本発明の核酸ベクターは、その中に含まれる発現構築物のすべてが、宿主細胞ゲノム内の単一の遺伝子座に組み込まれることを可能にする。増幅可能な選択マーカー遺伝子の増幅はまた、周囲のDNA配列の増幅を引き起こす。その結果、宿主細胞ゲノムに一緒に組み込まれた核酸ベクターの残りのDNA配列もまた増幅される。このように、本明細書に記載される核酸ベクターを使用することにより、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれたレトロウイルスベクター遺伝子を増幅するプロセスを提供することができ、これは、増幅可能な選択マーカー遺伝子に対して、宿主細胞による複数のレトロウイルスベクター遺伝子のインビボ連結組込みに依存しない。
【００９２】
増幅可能な選択マーカーはそれぞれ、関連する選択剤(すなわち、毒性薬物)を有し、これは、増幅及び選択体制中に細胞培養培地に追加される。異なる増幅可能な選択マーカー/選択剤の組合せは当該技術分野において公知であり、本発明では任意の適切な増幅及び選択体制を使用し得る。適切な増幅可能な選択マーカー/選択剤の組合せには、アデノシンデアミナーゼ/デオキシコホルマイシン、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ/N(ホスホアセチル)-L-アスパラギン酸、ジヒドロ葉酸レダクターゼ/メトトレキサート、グルタミンシンテターゼ/メチオニンスルホキシミン、及び金属チオネイン-1/重金属が含まれる。
【００９３】
一実施形態では、増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)である。DHFRの選択方法は、dhfr遺伝子(すなわち、増幅可能な選択マーカー遺伝子)を含む発現構築物を核酸ベクターに組み込むことにより、核酸ベクターの他の発現構築物にDHFR選択圧を誘導することを伴う。宿主細胞に核酸ベクターをトランスフェクトし、増加濃度のDHFR阻害剤メトトレキサート(MTX)の存在下で増殖させて、宿主ゲノムに組み込まれた外因性dhfr遺伝子、及び同時に核酸ベクターに組み込まれた残りを増幅した細胞を選択する。
【００９４】
遺伝子増幅に使用するためのdhfr遺伝子を含む発現構築物は、当該技術分野において周知であり、例えば、Subramaniら(1981) Mol. Cell. Bio. 2:854-864及びWallsら(1989) Gene 81:139-149に記載されている。
【００９５】
一実施形態では、dhfr遺伝子は、ゲノム受託番号NM_010049.3に対して少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%、80%、90%又は100%の配列同一性を含む。一実施形態では、DHFRは、ゲノム受託番号NP_034179に対して少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%、80%、90%、又は100%の配列同一性を含む。
【００９６】
一実施形態では、DHFRをコードする核酸配列を含む発現構築物は、シミアンウイルス40ゲノムからのポリヌクレオチドの転写及び翻訳に必要な成分をさらに含み得る。
【００９７】
一実施形態では、増幅可能な選択マーカーをコードする核酸配列を含む発現構築物は、Subramaniら(1981) Mol. Cell. Bio. 2:854-864に開示されているpSV2-dhfrに由来する。
【００９８】
さらなる実施形態では、増幅可能な選択マーカーをコードする核酸配列を含む発現構築物の核酸配列は、配列番号1の核酸配列を含む。配列番号1の核酸配列は、図2に記載の通りである。
【００９９】
別の実施形態では、増幅可能な選択マーカーはグルタミンシンテターゼ(GS)である。GSの選択方法は、gs遺伝子を核酸ベクターに組み込むことにより、核酸ベクターの他の発現構築物にGS選択圧力を誘導することを伴う。宿主細胞に核酸ベクターをトランスフェクトし、増加濃度のGS阻害剤メチオニンスルホキシイミン(MSX)の存在下で増殖させて、宿主ゲノムに組み込まれたgs遺伝子、及び同時に核酸ベクターに組み込まれた残りを増幅した細胞を選択する。
【０１００】
遺伝子増幅に使用するためのgs遺伝子を含む発現構築物は、当該技術分野において周知であり、例えば、WO874462及びBebbingtonら(1992) Nature 10:169-175に記載されている。
【０１０１】
このように増幅可能な選択マーカー及び関連する選択剤を使用することにより、選択圧を保有する宿主細胞ゲノムの領域が増幅され、それにより増幅可能な選択マーカー及び核酸ベクターのコピー数が増加する。次に、このようなラウンドの増幅及び選択を介して増殖した細胞株は、レトロウイルスベクター産生の力価についてスクリーニングされ、大量産生での使用に最良のクローンが選択される。
【０１０２】
典型的には、増幅のラウンド数と使用される関連する薬剤の濃度の両方が設定又は固定されない。代わりに、増幅及び選択体制は、産生閾値に達する点まで段階的に厳しくなることが典型的である。タンパク質産生の「プラトー」に近づくまで、観察されるタンパク質産生のレベルは、典型的には、遺伝子コピー数の増加に比例することが観察されている(Bebbington and Hentschel, DNA Cloning Volume III, IRL press, 1987)。
【０１０３】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、増幅可能な選択マーカーに対して陰性である。すなわち、宿主細胞は、内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を含まないということである。例えば、増幅可能な選択マーカーとしてDHFRを使用する場合、CHO DG44又はCHO DUX-B11などのDHFR陰性宿主株を使用することが好ましい。一実施形態では、宿主細胞は、GS陰性宿主株である。一実施形態では、宿主細胞は、内因性gs遺伝子をノックアウトするように改変される。細胞の特定の遺伝子をノックアウトする方法は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するなど、当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、宿主細胞はGS陰性HEK293T細胞である。しかしながら、本発明は、特定の宿主細胞株の選択により限定されない。急速な増殖速度(すなわち、12時間以下の倍加時間)を有し、外因性の増幅可能な選択マーカーを優性マーカーとして使用できるように、同様の又はそれより高い速度で内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅させずに合理的な速度で外因性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅することができる任意の細胞株が、本発明の方法において使用することができる。
【０１０４】
優性マーカー(すなわち、外因性の増幅可能な選択マーカー)で形質導入された細胞株は、増加濃度の選択剤で増殖する細胞の能力が、増幅可能な選択マーカーのコピー数の増加と相関することを決定することにより同定される(これは、サザンブロッティングにより増幅マーカーのコピー数の増加を示すことにより直接的に測定されるか、又はノザンブロッティング、又はqPCRにより増幅マーカーから産生されるmRNA量の増加を示すことにより間接的に測定される。
【０１０５】
宿主細胞が内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を含む場合、核酸ベクターは、増幅可能な選択マーカーに加えて、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含み得る。宿主細胞は、増幅可能な選択マーカー並びに選択マーカーを含む核酸ベクターでトランスフェクトされる。選択可能なマーカーが抗生物質耐性を付与する場合、トランスフェクションされた宿主細胞は、ゼオシン又はハイグロマイシンなどのそれぞれの抗生物質の存在下で増殖する能力について最初に選択される。このようにして、遺伝子増幅を誘導する前に、核酸ベクターで首尾よくトランスフェクトされた宿主細胞を選択することが可能である。次に、MTX又はMSXなどの増加濃度の選択剤で増殖する能力について細胞を選択する。
【０１０６】
したがって、一実施形態では、核酸ベクターは選択マーカー遺伝子を付加的に含む。さらなる実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、ゼオシン、カナマイシン又はピューロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子であり、特にゼオシン(ZeoR)耐性遺伝子である。さらに別の実施形態では、ゼオシン耐性遺伝子は、ストレプトアロテイカス・ヒンダスタンス(Streptoalloteichus hindustans)ble遺伝子に由来し、例えば、塩基対3〜377のゲノム受託番号X52869.1を参照されたい。別の実施形態では、選択マーカーは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【０１０７】
付加的成分
本発明の核酸ベクターは、さらなる付加的成分を含み得る。これらの付加的特徴は、例えば、翻訳のために転写産物を安定化させる、遺伝子発現のレベルを増強する、及び遺伝子転写のオン/オフを切り替える助けをするために使用され得る。
【０１０８】
本発明により産生されるレトロウイルスベクター粒子は、遺伝子療法の方法において使用され得る。したがって、一実施形態では、核酸ベクターは、1つ以上の導入遺伝子を付加的に含む。例えば、標的遺伝子が哺乳動物宿主細胞において正しく発現されない場合、したがって、標的遺伝子の正しいバージョンが導入遺伝子として導入される。換言すると、この導入遺伝子は、標的疾患を処置又は改善するために使用され得る遺伝子産物をコードする治療上活性な遺伝子である。導入遺伝子は、例えば、アンチセンスRNA、リボザイム、タンパク質(例えば、腫瘍抑制タンパク質)、毒素、抗原(抗体、又はヘルパーT細胞又は細胞傷害性T細胞を誘導するために使用され得る)又は抗体(例えば、一本鎖抗体)をコードし得る。導入遺伝子は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにて細胞内で望ましく産生されるポリペプチド又はRNAをコードすることができる。一実施形態では、導入遺伝子はベータグロビンをコードする。導入遺伝子は、別の細胞型若しくは別の種から得られたものであり、又は合成的に調製されたものであり得る。あるいは、導入遺伝子は宿主細胞から得られたものであるが、天然遺伝子に存在する調節領域とは異なる調節領域に機能的に連結されたものであり得る。あるいは、導入遺伝子は、宿主細胞に存在する遺伝子の異なる対立遺伝子又は変異体であり得る。
【０１０９】
導入遺伝子を含有する移入ベクターの複数コピーは、より高いレトロウイルスベクター力価を生じると予想され、したがって、一実施形態では、核酸ベクターは、導入遺伝子の複数コピー、例えば、導入遺伝子の2つ以上、特に、3つ以上のコピーを含む。場合によっては、疾患を処置するために1を超える遺伝子産物が必要とされ、したがって、さらなる実施形態では、核酸ベクターは、2つ以上、例えば、3つ以上、又は4つ以上の異なる導入遺伝子を付加的に含む。
【０１１０】
遺伝子療法の目的は、治療目的で生細胞の遺伝物質を修飾することであり、それは治療効果を達成するために細胞に機能的遺伝子を挿入することを伴う。本明細書に記載の核酸ベクター及び宿主細胞を用いて作製されたレトロウイルスベクターは、標的細胞をトランスフェクトし、潜在的治療対象の遺伝子の発現を誘導するために使用できる。したがって、レトロウイルスベクターは、限定されないが、遺伝的障害、癌、及び特定のウイルス感染を含む状態に罹患している、ヒト対象などの哺乳動物対象の処置のために使用することができる。
【０１１１】
当業者は、核酸配列を適切な制御配列と作動可能に関連付けることができることを理解するだろう。例えば、核酸配列は、転写/翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位(IRES)、プロモーター、及び/又はエンハンサーなどの発現制御エレメントに作動可能に関連付けることができる。
【０１１２】
一実施形態では、核酸ベクターは、転写調節エレメントを付加的に含む。例えば、本明細書に記載のエレメントはいずれも、発現が制御可能なようにプロモーターに作動可能に連結され得る。本明細書で言及されるプロモーターは、構成的に作用し得るか、又は例えば、調節タンパク質の存在下で誘導可能な公知のプロモーターの全体又は一部を含み得る。一実施形態では、プロモーターはウイルスプロモーターである。一実施形態では、核酸ベクターは、高効率プロモーター、例えば、CMVプロモーターを付加的に含む。このプロモーターは、非哺乳動物核酸ベクターにコードされているエレメントの高レベルの発現を促進するという利点を有する。さらなる実施形態では、CMVプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス株AD169に由来する配列を含む。この配列は、ゲノム受託番号X17403の、例えば、塩基対173731〜174404から取得可能である。代替の実施形態では、プロモーターは、シミアンウイルス40由来のSV40後期プロモーターである。本明細書で言及されるプロモーターは、例えば、調節タンパク質の存在下で、構成的に作用し又は誘導し得る、全体又は一部で公知のプロモーターを含み得る。
【０１１３】
一実施形態では、プロモーター(例えば、CMVプロモーター)は、少なくとも1つのTetオペロンを付加的に含む。Tetオペロン系は、核酸ベクター内に含有されるレトロウイルス配列の発現を制御するために使用され得る。簡単には、Tetリプレッサータンパク質は、プロモーターに導入されるTetオペロン部位に結合することにより発現を遮断する。したがって、TetリプレッサーがTetオペロンと結合している場合には、遺伝子発現はない。テトラサイクリン又はドキシサイクリンを添加すると、Tetリプレッサーは隔離されてプロモーター活性を可能とし、したがって、遺伝子発現がオンにされる。Tetオペロン系は、Invitrogeから入手可能なpcDNA(商標)4/TO哺乳動物発現ベクターで使用されるTetオペロンなど、広く入手可能である。
【０１１４】
一実施形態では、核酸ベクターは、テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質(「Tetリプレッサー」又は「TetR」)を付加的に含む。さらなる実施形態では、Tetリプレッサーは、コドンが最適化されている。
【０１１５】
一実施形態では、核酸ベクターは、クロマチンインスレーターなどのインスレーターを付加的に含む。用語「インスレーター」は、プロモーターとエンハンサーの間の相互作用を遮断する遺伝子配列を指す。さらなる実施形態では、インスレーター(例えば、クロマチンインスレーター)は、レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間(すなわち、個々の発現構築物間)に存在する。これは、隣接するレトロウイルス核酸配列間のプロモーター干渉(すなわち、ある転写単位からのプロモーターが隣接する転写単位の発現を障害する場合)を防ぐ助けをする。理論に拘束されるものではないが、これはまた、レトロウイルス配列間の組換えのリスクを最小化して複製能力のあるウイルスを生成するのに役立つと考えられる。
【０１１６】
核酸ベクターにおいて、レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間にインスレーターが存在する場合、これらは核酸ベクター内に個々の発現構築物として配置され得ると理解される。例えば、レトロウイルス核酸配列をコードする各配列は、その固有のプロモーター及び/又はイントロン及び/又はポリAシグナルを有する。
【０１１７】
一実施形態では、クロマチンインスレーターは、ニワトリ(Gallus gallus)HS4インスレーター配列(例えば、ゲノム受託番号U78775.2、塩基対1〜1205参照)と少なくとも90%の配列同一性、例えば、少なくとも95%の配列同一性を有する。
【０１１８】
一実施形態では、核酸ベクターは、ポリAシグナルを付加的に含む。ポリAシグナルの使用は、mRNAを酵素分解から保護し、翻訳を補助するという利点を有する。さらなる実施形態では、ポリAシグナルは、SV40、ウシ成長ホルモン及び/又はヒトベータグロビンから得られるか、又はそれに由来する。一実施形態では、ポリAシグナルは、SV40初期ポリAシグナル(例えば、ゲノム受託番号EF579804.1、マイナス鎖由来の塩基対2668〜2538参照)に由来する。一実施形態では、ポリAシグナルは、ヒトベータグロビンポリAシグナル(例えば、ゲノム受託番号GU324922.1、塩基対3394〜4162参照)に由来する。
【０１１９】
一実施形態では、核酸ベクターは、イントロン配列を付加的に含む。エンハンサー/プロモーター領域の下流及びcDNA挿入物(すなわち、導入遺伝子)の上流でのイントロンの使用は、挿入物の発現レベルを増強することが公知である。さらなる実施形態では、イントロン配列は、ヒトベータグロビンイントロン又はウサギベータグロビンイントロンII配列である。一実施形態では、ヒトベータグロビンイントロンは、ゲノム受託番号KM504957.1(例えば、塩基対476〜1393由来)で使用可能な配列に由来する。一実施形態では、ウサギベータグロビンイントロンIIは、ゲノム受託番号V00882.1(例えば、塩基対718〜1290由来)で利用可能な配列に由来する。
【０１２０】
一実施形態では、核酸ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を付加的に含む。WPREの存在は発現を増強することが示されており、このようにして、高レベルの発現を達成する上で有益である蓋然性が高い。さらなる実施形態では、WPREは、ゲノム受託番号J04514.1(例えば、塩基対1093〜1684由来)で利用可能な配列に由来する。
【０１２１】
一実施形態では、核酸ベクターは、内部リボソーム進入部位(IRES)を付加的に含む。IRESは、5'キャップの下流の5'非翻訳領域(開始複合体のアセンブリに必要とされる)に通常見られる構造化されたRNAエレメントである。IRESは翻訳開始因子によって認識され、キャップ非依存的翻訳を可能とする。さらなる実施形態では、IRESは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)ゲノム(例えば、ゲノム受託番号KF836387.1、塩基対151〜724参照)に由来する。
【０１２２】
一実施形態では、核酸ベクターは、多重クローニング部位(MCS)を付加的に含む。MCSは、核酸ベクター内の、多重制限部位(例えば、10、15又は20部位)を含有する短いDNAセグメントである。これらの部位は、通常、エンドヌクレアーゼが一箇所でのみ切断することを保証するために核酸ベクター内に一度しか見られない。これはレトロウイルス遺伝子が適切なエンドヌクレアーゼ(すなわち、制限酵素)を用いて容易に挿入されることを可能とする。
【０１２３】
構築物は核酸ベクター内に任意の順序で配置され得ることが当業者には理解されるだろう。例示的な実施形態では、核酸ベクターは、以下の挿入物を含む:増幅可能な選択マーカーをコードする核酸配列、gag及びpolタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列、envタンパク質又はその機能的置換体(例えば、VSVg)をコードするレトロウイルス核酸配列、補助遺伝子rev(例えば、コドン最適化rev配列)若しくはその類似遺伝子又は機能的に類似の系をコードするレトロウイルス核酸配列、テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質(TetR)、内部リボソーム進入部位、及び選択マーカー(例えば、ゼオシン耐性選択マーカー)(すなわち、増幅可能な選択マーカー-GagPol-Env-Rev-Tetリプレッサー-IRES-抗生物質耐性マーカー-残りのBAC配列(「BAC骨格」);又は増幅可能な選択マーカー-GagPol-(野生型)VSVg-(コドン最適化)Rev-Tetリプレッサー-IRES-ゼオシン耐性-pSMARTBAC)。さらなる実施形態では、インスレーター(例えば、クロマチンインスレーター)は、増幅可能な選択マーカー、gagpol、env及びrev配列のそれぞれの間に存在する。さらなる実施形態では、プロモーターは、増幅可能な選択マーカー、gagpol、env及びrev配列のそれぞれの前に存在する。なおさらなる実施形態では、移入ベクター配列(すなわち、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を含む)の少なくとも1コピーは、増幅可能な選択マーカー配列の前に存在する。
【０１２４】
一実施形態では、核酸ベクターは、以下の挿入物を含む:プロモーター(例えば、場合によりTetオペロン配列を含むCMVプロモーター)、イントロン(例えば、ヒトベータグロビンイントロン)、増幅可能な選択マーカーをコードする核酸配列、ポリAシグナル(例えば、ヒトベータグロビンポリAシグナル)、インスレーター(例えば、クロマチンインスレーター)、プロモーター(例えば、Tetオペロン配列を場合により含むCMVプロモーター)、イントロン(例えば、ヒトベータグロビンイントロン)、gag及びpolタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列、RREをコードするレトロウイルス核酸、ポリAシグナル(例えば、ヒトベータグロビンポリAシグナル)、インスレーター(例えば、クロマチンインスレーター)、プロモーター(例えば、場合によりTetオペロン配列を含むCMVプロモーター)、イントロン(例えば、ヒトベータグロビンイントロン)、envタンパク質又はその機能的置換体(例えば、VSVg)をコードするレトロウイルス核酸配列、ポリAシグナル(例えば、ヒトベータグロビンポリAシグナル)、インスレーター(例えば、クロマチンインスレーター)、プロモーター(例えば、場合によりTetオペロン配列を含むCMVプロモーター)、補助遺伝子rev若しくはその類似遺伝子又は機能的に類似の系をコードするレトロウイルス核酸配列、ポリAシグナル(例えば、ヒトベータグロビンポリAシグナル)、インスレーター(例えば、クロマチンインスレーター)、プロモーター(例えば、CMVプロモーター)、イントロン(例えば、ウサギベータグロビンイントロン)、テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質(TetR)、内部リボソーム進入部位、選択マーカー(例えば、ゼオシン耐性選択マーカー)、ポリAシグナル及び多重クローニング部位。
【０１２５】
核酸配列は、核酸ベクターに順次導入され得る。これは、必要とされる核酸配列のすべてが核酸ベクターに首尾よく組み込まれることを保証するように、各組込み後の選択を可能とする。あるいは、少なくとも2以上の核酸配列が同時に核酸ベクターに導入される。
【０１２６】
本明細書に記載の付加的な遺伝子は、当該技術分野において公知である標準的な分子クローニング技術により、例えば、制限エンドヌクレアーゼ及び連結技術を用いて、核酸ベクターに導入され得ることが理解されるだろう。さらに、核酸ベクター、特に、BAC、PAC、フォスミド及び/又はコスミドは、エレクトロポレーションなどの標準的技術によって細菌宿主細胞(例えば、大腸菌細胞、特に、大腸菌DH10B株)に導入され得る。
【０１２７】
使用
本発明のさらなる態様によれば、レトロウイルスパッケージング又は産生細胞株の産生における使用のための本明細書に定義される核酸ベクターが提供される。
【０１２８】
本明細書に記載の核酸ベクターは、レトロウイルスベクター産生を大いに簡便にするレトロウイルスパッケージング細胞株を作製するために使用され得る。レトロウイルスベクターのRNAゲノムをコードする核酸配列(導入遺伝子を含む)が核酸ベクターに含まれている場合、これは産生細胞株の作製のために使用されることが理解されるだろう。
【０１２９】
本明細書に記載されるように、一過性トランスフェクションに付随する欠点を克服し、レトロウイルス粒子の力価を減少させるためには、安定なレトロウイルスパッケージング又は産生細胞株を開発することが有用であろう。本明細書に記載の核酸ベクターは、レトロウイルスパッケージングに必要とされる必須遺伝子を含有する大きなDNA挿入物を保持することができ、これは次に哺乳動物宿主細胞の内在性ゲノムに一ステップで組み込まれ、不可欠なレトロウイルス遺伝子の増幅とその後の発現が互いに比例するようにユニットとして増幅され得るので、上記パッケージング又は産生細胞株の調製に使用することができる。
【０１３０】
宿主細胞
本発明のさらなる態様によれば、
個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;並びに
増幅可能な選択マーカー
をコードする核酸配列を含むレトロウイルスパッケージング細胞が提供され、上記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルスパッケージング細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である。
【０１３１】
大きな核酸ベクターにレトロウイルス遺伝子及び増幅可能な選択マーカーのすべてを含めることの利点は、それらがまず、取り扱い及び操作がはるかに容易な微生物細胞(例えば、細菌又は酵母細胞)で調製でき、その後、単一ステップで哺乳動物細胞に組み込まれ得るということである。これは選択圧を和らげ、一度レトロウイルス遺伝子が哺乳動物宿主細胞に組み込まれれば、サイレンシング時間枠を減じる。この方法の特有な特徴は、パッケージング細胞株を作出するために必要とされるレトロウイルス遺伝子のすべてが、内在ゲノム中に無作為に分散するのではなく、ユニットとして内在ゲノム内の単一の遺伝子座に存在するということである。これは、レトロウイルス遺伝子が宿主細胞のゲノムに個別に及び無作為に組み込まれ、一様でないレベルの発現を生じ得る従来の公知の方法に比べて、レトロウイルス遺伝子のすべてが同じ遺伝子座に組み込まれるため、同じレベルで発現するレトロウイルスパッケージング細胞を産生するという利点を有する。
【０１３２】
さらに、必須のレトロウイルスタンパク質(gag、pol、env又はその機能的置換体)をコードする核酸配列を含むすべての発現構築物と同じ核酸ベクター上に増幅可能な選択マーカーを有することによって、発現構築物を一緒に増幅する。
【０１３３】
ユニットは、異なる染色体上の複数の異なる位置で宿主細胞ゲノムに複数回組み込まれ得ることが理解される(ただし、単一の遺伝子座に存在するすべてのコードされた核酸配列を伴う)。したがって、「単一遺伝子座」への言及は、レトロウイルスパッケージング/産生細胞ゲノム内の複数の遺伝子座で核酸配列がすべて一緒に組み込まれる可能性を排除しない。これは、導入遺伝子の発現レベルを高めるために有益であり、潜在的にレトロウイルス力価を改善することができる。qPCRにより、個々のクローンに由来する細胞集団間で、構造挿入物のコピー数を比較することが可能である。
【０１３４】
一実施形態では、レトロウイルスパッケージング細胞は、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を付加的に含む。このような核酸配列はまた、gag及びpolタンパク質、envタンパク質又はその機能的置換体、並びに増幅可能な選択マーカーをコードする核酸配列とともに単一の遺伝子座に組み込まれ得る。
【０１３５】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、
個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;
増幅可能な選択マーカー;並びに
レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノム
をコードする核酸配列を含むレトロウイルス産生細胞が提供され、上記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である。
【０１３６】
一実施形態では、レトロウイルスパッケージング細胞は、哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞は、HEK293細胞、CHO細胞、Jurkat細胞、KS62細胞、PerC6細胞、HeLa細胞又はそれらの誘導体若しくは機能的等価物から選択される。一実施形態では、哺乳動物細胞はCHO-K1又はCHO-K1SVである。なおさらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、HEK293細胞であるか、又はHEK293細胞に由来する。このような細胞は、接着細胞株(すなわち、それらは表面に結合して単層として増殖する)又は懸濁適応/非接着細胞株(すなわち、それらは培養培地中、懸濁状態で増殖する)であり得る。懸濁状態で増殖する細胞は、高密度に増加するため、生物学的製品の生産のために産業界で広く使用されており、接着細胞に比べて生産が容易に拡大される。なおさらなる実施形態では、HEK293細胞は、HEK293T細胞である。用語「HEK293細胞」は、バイオテクノロジーにおいて一般的に使用されるヒト胎児腎293細胞を指す。特に、HEK293T細胞は、様々なレトロウイルスベクターの生成に慣用される。適切な市販の細胞株の他の例としては、T-REX(商標)(Life Technologies)細胞株が含まれる。好ましくは、哺乳動物細胞は、増幅可能な選択マーカーを内在的に発現しない。例えば、増幅可能な選択マーカーがDHFRである場合、dhfr-CHO細胞株などのdhfr-(dhfr陰性)細胞株を使用することが好ましく、あるいは増幅可能な選択マーカーがGSである場合、gs-(gs陰性)細胞株、例えば、GS陰性HEK293Tを生成するためにgs遺伝子をノックアウトするように改変されたHEK293細胞株を使用することが好ましい。細胞の特定の遺伝子をノックアウトする方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する方法がある。
【０１３７】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、増幅可能な選択マーカーに対して陰性である。すなわち、宿主細胞ゲノムは、内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を含まないということである。例えば、増幅可能な選択マーカーとしてDHFRを使用する場合、CHO DG44又はCHO DUX-B11などのDHFR陰性宿主株を使用することが好ましい。一実施形態では、宿主細胞はGS陰性宿主株である。一実施形態において、宿主細胞は、内在性gs遺伝子をノックアウトするように改変される。好ましい実施形態では、宿主細胞はGS陰性HEK293T細胞である。しかしながら、本発明は、特定の宿主細胞株の選択により限定されない。急速な増殖速度(すなわち、12時間以下の倍加時間)を有し、同様の又はそれより高い速度で内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅させずに合理的な速度で増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅することができる任意の細胞株が、本発明の方法において使用することができる。内在性選択マーカー遺伝子が増幅される速度よりも速い速度で増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅する能力を有する細胞株は、増加濃度の選択剤(すなわち、生存するために細胞が増幅可能な選択マーカーを発現することを必要とする化合物)で細胞が増殖する能力が、増幅可能な選択マーカーのコピー数の増加と相関する(これは、直接的に増幅可能なマーカーのコピー数の増加をサザンブロッティングによって実証することによって、又は間接的にノザンブロッティングによって増幅可能なマーカーから生成されるmRNAの量の増加を実証することによって測定され得る)ことを見出すことによって同定される。
【０１３８】
核酸ベクターに関して以上に記載した実施形態はすべて、本発明のレトロウイルスパッケージング/産生細胞にも適用可能であることが理解されるだろう。
【０１３９】
方法
本発明のさらなる態様によれば、安定なレトロウイルスパッケージング細胞株を生成する方法であって、
(a)本明細書に記載される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;及び
(c)上記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ
を含む方法が提供される。
【０１４０】
産生又はパッケージング細胞株が生成されるかどうかは、核酸ベクターがレトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列をそれぞれ含むか又は含まないかに依存する。
【０１４１】
標的遺伝子が抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーとともに内在性染色体に組み込まれる場合、本方法は、レトロウイルス核酸が首尾よく組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択することを付加的に含み得る。したがって、一実施形態では、本方法は、ステップa)の後、哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれたベクターにコードされた核酸配列を有する哺乳動物宿主細胞を培養物内で選択するさらなるステップを含む。
【０１４２】
安定的にトランスフェクトされた宿主細胞は、増幅可能な選択マーカーを阻害することが公知である増加濃度の選択剤(例えば、毒性薬物)に供される。例えば、トランスフェクトされた細胞は、毒性薬物を含有する培地に親細胞(すなわち、トランスフェクトされていない細胞)をプレーティングした後、3〜5日以内に98%を超える細胞の死滅をもたらす濃度で毒性薬剤を含有する培地で培養され得る。あるいは、トランスフェクトされた細胞は、毒性薬物(例えば、MTX又はMSX)を含有する培地で、空気中8%COの加湿雰囲気で撹拌しながら、14〜21日間又は生存率が90%を超えるまで37℃にて培養できる。このような阻害により、増幅可能な選択マーカーの発現レベルが増加し、その結果、使用される濃度で薬物に対する耐性を有する細胞集団を選択することができる。ステップb)及びc)は、選択剤の濃度を段階的に増大させて繰り返され得る。一実施形態では、外因性遺伝子の増幅は、ステップb)及びc)を繰り返すことによって、選択剤の段階的に増大したレベルに対する耐性の選択により達成される。
【０１４３】
遺伝子増幅を誘導する方法は、OptiCHO(商標)Express Kitマニュアル(Life Technologies(商標))に記載されている方法など、当業者に公知であろう。
【０１４４】
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、HEK293細胞、HEK6E、CHO細胞、Jurkat細胞、KS62細胞、PerC6細胞、HeLa細胞又はそれらの誘導体若しくは機能的等価物から選択される。さらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、HEK293細胞であるか、又はHEK293細胞に由来する。このような細胞は、接着細胞株(すなわち、それらは表面に付着して単層として増殖する)又は懸濁適応/非接着細胞株(すなわち、それらは培養培地中、懸濁状態で増殖する)であり得る。なおさらなる実施形態では、HEK293細胞は、HEK293T細胞又はHEK6E細胞である。適切な市販の細胞株の他の例としては、T-REX(商標)(Life Technologies)細胞株が含まれる。
【０１４５】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、増幅可能な選択マーカーに対して陰性である。すなわち、宿主細胞ゲノムは、内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を含まないということである。例えば、増幅可能な選択マーカーとしてDHFRを使用する場合、CHO DG44又はCHO DUX-B11などのDHFR陰性宿主株を使用することが好ましい。一実施形態では、宿主細胞はGS陰性宿主株である。一実施形態では、宿主細胞は、内因性gs遺伝子をノックアウトするように改変される。細胞の特定の遺伝子をノックアウトする方法は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するなど、当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、宿主細胞はGS陰性HEK293T細胞である。
【０１４６】
しかしながら、本発明は、特定の宿主細胞株の選択により限定されない。急速な増殖速度(すなわち、12時間以下の倍加時間)を有し、同様の又はそれより高い速度で内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅させずに合理的な速度で増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅することができる任意の細胞株が、本発明の方法において使用することができる。内在性選択マーカー遺伝子が増幅される速度よりも速い速度で増幅可能な選択マーカー遺伝子を増幅する能力を有する細胞株は、増加濃度の選択剤(すなわち、生存するために細胞が増幅可能な選択マーカーを発現することを必要とする化合物)で細胞が増殖する能力が、増幅可能な選択マーカーのコピー数の増加と相関する(これは、直接的に増幅可能なマーカーのコピー数の増加をサザンブロッティングによって実証することによって、又は間接的にノザンブロッティングによって増幅可能なマーカーから生成されるmRNAの量の増加を実証することによって測定され得る)ことを見出すことによって同定される。
【０１４７】
当業者は、核酸ベクターを宿主細胞に導入することが、当該技術分野において公である適切な方法、例えば、脂質媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、細胞(例えば、マイクロセル)融合、エレクトロポレーション又は微粒子衝撃を用いて実施され得ることを認識するであろう。一実施形態では、核酸ベクターは、エレクトロポレーションにより宿主細胞に導入される。核酸ベクターの導入に使用するための方法の選択は、使用される哺乳動物宿主細胞のタイプに応じて選択され得ることが理解される。
【０１４８】
一度、哺乳動物宿主細胞にあれば、核酸ベクターは、哺乳動物宿主細胞の内在ゲノムに無作為に組み込まれる。したがって、本方法は、核酸ベクターにコードされる核酸が組み込まれた哺乳動物宿主細胞を(例えば、ゼオシン耐性マーカーなどの抗生物質耐性選択マーカーを使用して)選択することを付加的に含む。
【０１４９】
当業者は、例えば、核酸ベクターが天然状態で環状であれば(例えば、BAC、PAC、コスミド又はフォスミド)それを線状化するなど、核酸ベクターの組込みを助長する方法を認識するであろう。核酸ベクターは、内在ゲノム内の選択された部位への組込みをガイドするための、哺乳動物宿主細胞の内在性染色体と相同性を共有する領域を付加的に含み得る。さらに、組換え部位が核酸ベクター上に存在する場合、これらは標的組換えに使用することができる。例えば、核酸ベクターは、Creリコンビナーゼと組み合わせた場合に(すなわち、P1バクテリオファージに由来するCre/lox系を使用する)、標的組込みを可能とするloxP部位を含有し得る。あるいは(又は加えて)、組換え部位は、att部位(例えば、ラムダファージ由来)であり、att部位は、ラムダインテグラーゼの存在下での部位指定組込みを可能とする。これは、レトロウイルス遺伝子が高い及び/又は安定な発現を可能とする内在ゲノム内の遺伝子座に標的化されることを可能とするだろう。
【０１５０】
標的化組込みの他の方法は、当該技術分野において周知である。例えば、選択された染色体遺伝子座での標的組換えを助長するために、ゲノムDNAの標的切断を誘導する方法を使用することができる。これらの方法は、多くの場合、二本鎖切断(DSB)を誘導するための操作された切断系、又は非相同末端結合(NHEJ)若しくは修復鋳型(すなわち、相同性組換え修復(homology directed repair)又はHDR)を用いる修復などの天然プロセスにより切断の修復を誘導するための内在ゲノムのニックの使用を含む。
【０１５１】
切断は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などの特異的ヌクレアーゼの使用を介して、特異的切断をガイドするために操作されたcrRNA/tracr RNA(「シングルガイドRNA」)とともにCRISPR/Cas9系を使用して、及び/又はアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ(例えば、T.サーモフィラス(T. thermophilus)由来、「TtAgo」として知られる、Swartsら(2014) Nature 507(7491): 258-261)を使用して、起こり得る。これらのヌクレアーゼ系の使用を用いた標的切断は、HDR又はNHEJのいずれかにより媒介されるプロセスを用いて、特定の標的位置に核酸を挿入するために活用することができる。したがって、一実施形態では、本方法は、少なくとも1つのヌクレアーゼを用いて、核酸ベクターにコードされる核酸配列を哺乳動物宿主細胞のゲノム(すなわち、内在性染色体)に組み込むことを付加的に含み、上記少なくとも1つのヌクレアーゼは、核酸配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、哺乳動物宿主細胞のゲノムを切断する。さらなる実施形態では、少なくとも1つのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casヌクレアーゼ系及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１５２】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義される方法により得られるレトロウイルスパッケージング又は産生細胞が提供される。
【０１５３】
本明細書に定義される方法を用いて得られる細胞株は、レトロウイルスベクター粒子の力価が改善された細胞株を産生するために使用され得る。
【０１５４】
本明細書で用語「力価」についての言及は、患者細胞などの標的細胞を形質導入できるレトロウイルスベクター又は粒子の有効量を指す。一実施形態では、高力価は、濃縮なく106TU/ml(TU=形質導入単位)を超えるものである。
【０１５５】
本発明のさらなる態様によれば、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
(a)本明細書で定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;
(c)上記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ;及び
(d)複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下で、ステップ(c)で選択された哺乳動物宿主細胞をさらに培養するステップ
を含む方法が提供される。
【０１５６】
ステップb)及びc)は、選択剤の濃度を段階的に増加させて繰り返すことができる。したがって、一実施形態では、外因性遺伝子の増幅は、ステップb)及びc)を繰り返すことにより選択剤の段階的に増加したレベルに対する耐性の選択によって達成される。
【０１５７】
標的遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーで内因性染色体に組み込まれる場合、本方法は、レトロウイルス核酸が上手く組み込まれている哺乳動物宿主細胞を選択することを付加に含み得る。したがって、一実施形態では、本方法は、ステップa)の後、哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれたベクターにコードされた核酸配列を有する哺乳動物宿主細胞を培養物内で選択するさらなるステップを含む。
【０１５８】
以上に記載されるように、一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、HEK293細胞、CHO細胞、Jurkat細胞、KS62細胞、PerC6細胞、HeLa細胞又はそれらの誘導体若しくは機能的等価物から選択される。さらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞はHEK293細胞であるか、又はHEK293細胞に由来する。このような細胞は、接着細胞株(すなわち、それらは表面に付着して単層として増殖する)又は懸濁適応/非接着細胞株(すなわち、それらは培養培地中、懸濁状態で増殖する)であり得る。なおさらなる実施形態では、HEK293細胞は、HEK293T細胞である。適切な市販の細胞株の他の例としては、T REX(商標)(Life Technologies)細胞株が含まれる。
【０１５９】
好ましい実施形態では、宿主細胞は増幅可能な選択マーカーに対して陰性である。つまり、宿主細胞ゲノムは、内在性の増幅可能な選択マーカー遺伝子を含まないということである。例えば、増幅可能な選択マーカーとしてDHFRを用いる場合、CHO DG44又はCHO DUX-B11などのDHFR陰性宿主株を使用することが好ましい。一実施形態では、宿主細胞はGS陰性宿主株である。一実施形態では、宿主細胞は、内在性gs遺伝子をノックアウトするように改変される。細胞の特定の遺伝子をノックアウトする方法は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するなど、当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、宿主細胞はGS陰性HEK293T細胞である。しかしながら、本発明は、特定の宿主細胞株の選択により限定されない。
【０１６０】
本明細書に記載の方法において使用される条件は、使用される宿主細胞に依存するであろうことが当業者により理解されるだろう。典型的な条件、例えば、使用される培養培地又は温度は、当該技術分野において周知である。一実施形態では、培養は、哺乳動物宿主細胞を加湿条件下でインキュベートすることによって実施される。さらなる実施形態では、加湿条件は、トランスフェクト細胞を37℃、5%CO2でインキュベートすることを含む。一実施形態では、培養は、10%(vol/vol)ウシ胎児血清(FBS)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、無血清UltraCULTURE(商標)培地(Lonza、カタログ番号12-725F)、BalanCD HEK293(登録商標)培地(Irvine Scientific、カタログ番号911615)又はFreeStyle(商標)Expression培地(Thermo Fisher、カタログ番号12338-018)から選択される培養培地を用いて実施される。
【０１６１】
適切な培養方法は、当業者に周知である。例えば、細胞は、懸濁液中及び/又は動物成分を含まない条件で培養され得る。一実施形態において、細胞は、10ml(例えば、シェーカーフラスコ)から10L、50L、100L、又はそれ以上(例えば、バイオリアクター)までの任意容量の培養培地中での培養に適している。
【０１６２】
一実施形態では、本方法は、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を単離することを付加的に含む。例えば、一実施形態では、単離は、フィルターを使用することにより実施される。さらなる実施形態では、フィルターは、低タンパク質結合膜(例えば、0.22μm低タンパク質結合膜又は0.45μm低タンパク質結合膜)、例えば、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)又はポリエーテルスルホン(PES)人工膜である。
【０１６３】
一度、哺乳動物宿主細胞にあれば、核酸ベクターに存在するレトロウイルス核酸は、内在ゲノム内の無作為な単一遺伝子座に組み込まれ得る。組込みステップは、以上に記載されるように、例えば、線状化及び/又は共通相同性領域を用いて助長され得る。組換え部位はまた標的化組換えのために使用され得る。
【０１６４】
一度単離されれば、レトロウイルスベクター粒子は、インビボ適用のために濃縮され得る。濃縮方法としては、例えば、超遠心分離、沈降又は陰イオン交換クロマトグラフィーが含まれる。超遠心分離は、小規模でのレトロウイルスベクター濃縮のための迅速法として有用である。あるいは、陰イオン交換クロマトグラフィー(例えば、Mustang Q陰イオン交換膜カートリッジを使用)又は沈降(例えば、PEG 6000を使用)は、大容量のレンチウイルスベクター上清を処理するために特に有用である。
【０１６５】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される方法により得られる複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が提供される。
【０１６６】
ここで、以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１６７】
[実施例1]
構築物ガイド(BAC)
図1は、BACpack-WTGP-277delU5及びBACpack-SYNGP-277delU5の構築に関する段階的なガイドを示す。XbaI及びNheI消化の適合末端のために、レンチウイルスパッケージング遺伝子をpSmart BACベクターに段階的に搭載した。GagPolの付加に際して、野生型GagPol(WTGP)又はコドン最適化GagPolであるSYNGPのいずれかを含有する2つの構築物を作製した。これらをそれぞれBACpack-WTGP及びBACpack-SYNGPと呼称した。次に、移入カセットをこれらの構築物の両方に搭載し、このようにしてBACpackWTGP-277delU5及びBACpackSYNGP-277delU5を生成した。
【０１６８】
[実施例2]
安定なポリクローナルプールの選択
接着細胞株HEK293TをBACpackSYNGP-277delU5又はBACpackWTGP-277delU5でトランスフェクトすることにより、ポリクローナルの安定なトランスフェクタントプールを生成した。次に、成功した組込み事象をゼオシンで選択した。
【０１６９】
これらのポリクローナルプールのレンチウイルスベクター生成能を評価するために、細胞をドキシサイクリン(I)で誘導するか、又は誘導しないままとし(UI)、非トランスフェクトHEK293T細胞と比較した。
【０１７０】
結果は、各トランスフェクション条件から採取したレンチウイルスベクター上清の力価を形質導入単位(TU)/mLで示す。図2の力価測定結果から、BACpackSYNGP-277delU5又はBACpackWTGP-277delU5のいずれかを用いて生成した安定なポリクローナルプールは、現在の一過性トランスフェクション系に匹敵する10e7 TU/mLの領域での濃縮でレンチウイルスベクターを産生する能力があることがわかる。
【０１７１】
結果から、レンチウイルス産生に必要なすべてのパッケージング遺伝子を含有する単一のBACベクターが、適切な力価でレンチウイルスベクターを産生することができる細胞株を生成し得ることが確認される。
【０１７２】
[実施例3]
安定なトランスフェクション懸濁クローンの生成
BAC技術を用いたレンチウイルスベクター産生細胞株を生成する主要な目的は、プラットフォームに新たな進歩を迅速に適用することである。これらの進歩は、特殊細胞株の修飾を含む可能性がある。例えば、接着細胞よりも高密度まで増殖することから、懸濁液細胞において生物学的生成物を産生することにより収量を高めることが業界標準である。しかしながら、現在のレンチウイルスベクター産生系は、接着HEK293T細胞よりも懸濁液細胞において達成するほうが困難な高トランスフェクション率に依存している。トランスフェクション効率は、成功した組込み体を選択するために、安定な細胞株を生成する場合をあまり考慮していないため、BAC構築物は、レンチウイルスベクター産生懸濁液細胞株を生成するための理想的な解決策である。
【０１７３】
以前に実証されたように、BAC構築物は、接着HEK293T細胞からレンチウイルスベクター産生細胞株を生成することができる。BAC構築物の適用性を証明するために、安定なトランスフェクタント細胞株を懸濁液細胞株HEK293 6Eから生成した。HEK293 6E細胞をBAC構築物BACpackWTGP-277delU5でトランスフェクトした後にゼオシンで選択した。この後、クローニングを行ってクローン細胞株を生成した。図3の結果は、安定な細胞株により生成されたGFPシグナルを示す。これは、移入ベクターセグメントにゼオシン耐性と機能的GFP発現カセットの両方が存在していることを示す。
【０１７４】
この結果は、BAC構築物が複数の細胞株から安定なクローンを生成する能力を有することを示唆する。
【０１７５】
[実施例4]
懸濁クローンにおけるレンチウイルスの誘導
安定な懸濁クローンのレンチウイルスベクター産生能を確認するために、クローン1、14、15及び16を2μg/mlドキシサイクリンで誘導し、HEK293T細胞の形質導入によって上清のウイルス力価を測定した。
【０１７６】
図4の結果は、各クローンから採取したレンチウイルスベクター上清の形質導入単位(TU)/mLでの力価を示す。これらの結果は、懸濁液細胞株HEK293 6Eの、BACpackWTGP-277delU5による安定なトランスフェクションによって生成された細胞株は、現在の一過性トランスフェクション系に匹敵する収量でレンチウイルスベクターを産生できることを明らかに示す。
【０１７７】
[実施例5]
クローンのベクター力価
図4に記載されるように、クローン1及び16を継代培養し、誘導を行い、後の時点で力価を測定して、これらの高生産性クローンかのベクター産生が安定であるかどうかを決定した。図5A及び5Bに示されるように、これらのクローンのベクター力価は、おそらくはこの誘導方法に導入された酪酸ナトリウム濃度の増大のために、実際に5代目〜21代目の間に中等度の増加を見せた。
【０１７８】
[実施例6]
構築物ガイド(BAC+DHFR)
図6は、BACpackWTGP-DHFR-277delU5及びBACpackSYNGP-DHFR-277delU5の構築のための段階的なガイドを示す。XbaI及びNheI消化の適合末端のために、レンチウイルスパッケージング遺伝子をpSmart BACベクターに段階的に搭載する。GagPolの付加に際して、野生型GagPol(WTGP)又はコドン最適化GagPolであるSYNGPのいずれかを含有する2つの構築物を作製する。これらをそれぞれBACpack-WTGP及びBACpack-SYNGPと呼称する。次に、DHFRカセット、続く移入カセットをこれらの構築物の両方に搭載し、このようにしてBACpackWTGP-277delU5及びBACpackSYNGP-277delU5を生成する。
【０１７９】
[実施例7]
安定なポリクローナルプールの選択及びMTX溶液によるゲノム増殖
接着細胞株HEK293TをBACpackWTGP-DHFR-277delU5又はBACpackWTGP-DHFR-277delU5でトランスフェクトすることにより、ポリクローナルの安定なトランスフェクタントプールを生成する。次に、成功した組込み事象をゼオシンで選択し、これらのポリクローナルプールのレンチウイルスベクター生成能をドキシサイクリンで誘導した後に評価し、非トランスフェクトHEK293T細胞と比較する。トランスフェクトされた接着細胞を無血清培地に移し、振とう条件下、エルレンマイヤーフラスコ中で増殖させ、細胞を懸濁状態で増殖させる。
【０１８０】
レンチウイルスベクターを産生する懸濁細胞株を生成するために、ポリクローナル安定プールを懸濁状態で増殖するように適合する。これに続いて、細胞を段階的にMTXの濃度を増加させることにより、レトロウイルス遺伝子及び導入遺伝子のゲノム増幅を行う。細胞を100μg/mlのMTXを含む培地に播種し、14〜21日間、又は生存率が90%を超えるまで増殖させた後、MTXの次に高い濃度に供する。レトロウイルス遺伝子の増幅が起こったかどうかを見るために、増幅の各ラウンドの後に、核酸ベクターのコピー数を液滴デジタルPCRによって評価する。レンチウイルスベクターを生成する能力を以前のステップの能力と比較する。
【０１８１】
[実施例8]
構築物ガイド(BAC+GS)
図8は、DHFR発現カセットをGS発現カセットで置き換えることによる、gs選択マーカー遺伝子を含有するLV-BAC構築物を構築するための段階的ガイドを示す。MauBI-MreI断片は、LV-BAC及びpTAR-GS-RFPベクターをそれぞれBAC及びgs配列のための鋳型として用いるオーバーラップPCRによって生成される(図3A及び3B)。ポリメラーゼ産物の平滑末端のため、アンプリコンをpCR(商標)-Blunt II-TOPO(商標)ベクター(図3C)にサブクローニングした後、MauBI-MreI消化されたLV-BAC(図3D)に搭載する。この構築物をBAC2.0_GSと呼称する。
【０１８２】
[実施例9]
GS遺伝子をノックアウトするための哺乳動物細胞の改変
HEK293T細胞にgs遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をトランスフェクトし、トランスフェクトされたプールのZFN活性を確認し、CELL-I又はT7アッセイで測定する。トランスフェクトされたプールから細胞クローンを生成し、最大500個のクローンをスクリーニングして、gs遺伝子のすべてのコピーにおいてフレームシフトインデル(挿入又は削除)を有するクローンを同定する。陽性クローンを拡大し、バンク登録し、遺伝子型を修飾された配列のPCR増幅により確認し、続いて配列決定する。
【０１８３】
[実施例10]
GS陰性HEK293T細胞のトランスフェクション及びMSXを用いた安定なポリクローナルプールの選択
GSノックアウト細胞と親のHEK293T細胞の最大3つのクローンにLV-BAC構築物をトランスフェクトする。上手くいった組込み事象をゼオシンで最初に選択し、GSノックアウトHEK293Tクローンのレンチウイルスベクターを生成する能力をドキシサイクリンでの誘導後に評価し、トランスフェクトされた親HEK293T細胞株と比較する。次に、GS陰性クローンの中で最良のレンチウイルスベクター産生がBAC2.0_GSのトランスフェクション用に選択される。トランスフェクション後、BACの転写活性領域への組込みは、3〜4週間、異なるMSX濃度(0、5、10、25、50μM)の単一ラウンドで選択される。zeocinはまたBAC2.0_GSの組込み事象の選択に使用され、zeocinポリクローナルプールはレンチウイルスベクターを生成するMSX安定なポリクローナルプールの能力のコントロールとして機能する。遺伝子増幅によって、より高いレンチウイルスの生産性を達成することができる。MSXで選択した安定なポリクローナルプールを、増加濃度のMSX(100〜500μM)を含有する培地中で3〜4週間増殖させた後、細胞を拡大し、レンチウイルス生産性を評価する。レンチウイルスベクター産生懸濁液細胞株を生成するために、安定なポリクローナルプールを懸濁液中で増殖するように適合させ、MSXの存在下及び非存在下でのレンチウイルス産生の安定性を評価する。
【０１８４】
本明細書に記載される実施形態は、本発明のすべての態様に適合され得ると理解される。さらに、限定されないが、特許及び特許出願を含め、本明細書に引用されているすべての刊行物は、引用することにより、完全に示されているかのごとく参照により本明細書に組込まれる。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［１］個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;並びに
増幅可能な選択マーカー
をコードする核酸配列を含むレトロウイルスパッケージング細胞であって、前記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルスパッケージング細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である、前記レトロウイルスパッケージング細胞。
［２］前記増幅可能な選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又はグルタミンシンテターゼ(GS)である、［1］に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［３］前記増幅可能な選択マーカーがDHFRであり、DHFRをコードする前記核酸配列を含む前記発現構築物が配列番号1の核酸配列を含む、［2］に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［４］ユニットが、選択マーカーをコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、［1］から［3］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［５］ユニットが、補助遺伝子rev又は機能的に類似した遺伝子若しくは機能的に類似した系をコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、［1］から［4］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［６］gag及びpolタンパク質、envタンパク質又はそれらの機能的置換体をコードする核酸配列、あるいは補助遺伝子rev又は機能的に類似した遺伝子若しくは機能的に類似した系の核酸配列が、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス又はフォーミーレトロウイルスから選択されるレトロウイルスに由来する、［1］から［5］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［７］発現構築物の1つ以上がCMVプロモーターを含み、好ましくはCMVプロモーターが少なくとも1つのTetオペロンを付加的に含む、［1］から［6］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［８］インスレーターを付加的に含み、好ましくはインスレーターが発現構築物のそれぞれの間に存在する、［1］から［7］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［９］細胞が哺乳動物細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞がHEK 293Tである、［1］から［8］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［１０］ユニットが、レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、［1］から［9］のいずれかに記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
［１１］個々の発現構築物として、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;
増幅可能な選択マーカー;並びに
レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノム
をコードする核酸配列を含むレトロウイルス産生細胞であって、前記発現構築物はすべて、ユニットとしてレトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座で一緒に組み込まれており、ユニットのコピー数は2以上である、前記レトロウイルス産生細胞。
［１２］非哺乳動物複製起点及び少なくとも25キロベース(kb)のDNAを保持する能力を含む核酸ベクターであって、前記核酸ベクターは、
gag及びpolタンパク質;
envタンパク質又はその機能的置換体;並びに
増幅可能な選択マーカー
をコードする核酸配列を含むことを特徴とし、核酸配列のそれぞれは、核酸ベクター内の個々の発現構築物として配置されている前記核酸ベクター。
［１３］増幅可能な選択マーカーがDHFR又はGSである、［12］に記載の核酸ベクター。
［１４］増幅可能な選択マーカーがDHFRであり、DHFRをコードする核酸配列を含む発現構築物が配列番号1の核酸配列を含む、［13］に記載の核酸ベクター。
［１５］選択可能マーカーをコードする核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、［12］から［14］のいずれかに記載の核酸ベクター。
［１６］補助遺伝子rev又はそれに類似する遺伝子若しくは機能的に類似した系の核酸配列を含む発現構築物をさらに含む、［12］から［15］のいずれかに記載の核酸ベクター。
［１７］核酸ベクターが、細菌人工染色体、酵母人工染色体、P1由来人工染色体、フォスミド又はコスミド、好ましくは細菌人工染色体から選択される、［12］から［16］のいずれかに記載の核酸ベクター。
［１８］レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を付加的に含む、［12］から［17］のいずれかに記載の核酸ベクター。
［１９］(a)［12］から［18］のいずれかに記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;及び
(c)前記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ
を含む、安定なレトロウイルスパッケージング細胞株を生成する方法。
［２０］(a)［18］に記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含有する培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;及び
(c)前記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ
を含む、安定なレトロウイルス産生細胞株を産生する方法。
［２１］ステップ(b)及び(c)が2回以上繰り返される、［19］又は［20］に記載の方法。
［２２］ステップ(a)の後に、哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれたベクターにコードされた核酸配列を有する哺乳動物宿主細胞を培養物内で選択するステップをさらに含む、［19］から［21］のいずれかに記載の方法。
［２３］前記選択剤が、DHFR阻害剤、好ましくはメトトレキサート(MTX)、又はGS阻害剤、好ましくはメチオニンスルホキシミン(MSX)である、［19］から［22］のいずれかに記載の方法。
［２４］［19］のいずれかに記載の方法、又は［19］に従属する場合の［21］から［23］のいずれかに記載の方法よって得られるレトロウイルスパッケージング細胞。
［２５］［20］に記載の方法、又は［20］に従属する場合の［21］から［23］のいずれかに記載の方法によって得られるレトロウイルス産生細胞。
［２６］(a)［12］から［18］のいずれかに記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物にトランスフェクトするステップ;
(b)不十分なレベルの増幅可能な選択マーカーを発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞の増殖を阻害する濃度の選択剤を含む培地において、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を増殖させるステップ;
(c)前記培地で増殖可能なトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、選択され、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み込まれた、増幅したコピー数の核酸ベクターを含有するステップ;及び
(d)複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下で、ステップ(c)で選択された哺乳動物宿主細胞をさらに培養するステップ
を含む、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を産生する方法。
［２７］複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を単離するステップを付加的に含む、［26］に記載の方法。
［２８］［26］又は［27］に記載の方法によって得られる複製欠陥レトロウイルスベクター粒子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【配列表】
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