(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列における６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列における６３７番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるＢＲＡＦ変異タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物であって、
胚発生段階で脳体細胞においてＢＲＡＦ変異タンパク質の発現を誘導することにより非ヒト動物において神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんを誘導するためのものである、組成物。
【請求項２】
ＢＲＡＦ変異タンパク質をコードする核酸分子が、配列番号２のヌクレオチド配列における１７９９番目のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列、または配列番号４のヌクレオチド配列における１９１０番目のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものではない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導されている、ヒトを除いた動物であって、
前記動物は、配列番号１のアミノ酸配列における６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列における６３７番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるＢＲＡＦ変異タンパク質を脳体細胞で発現する形質転換動物であり、
神経節膠腫またはてんかんが、動物の胚発生段階でＢＲＡＦ変異タンパク質の発現を誘導することによりもたらされる、動物。
【請求項５】
前記動物は、ヒトを除いた哺乳類または齧歯類である、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された、請求項４に記載のヒトを除いた動物。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列における６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列における６３７番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるＢＲＡＦ変異タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えベクターを製造する工程であって、前記核酸分子がＣｒｅリコンビナーゼ依存的ＬｏｘＰ配列に連結されＣｒｅリコンビナーゼ依存的にＢＲＡＦ変異タンパク質を発現する、工程；
前記組換えベクターを導入することによりＢＲＡＦ変異タンパク質をコードする核酸分子を含む動物の胚を製造する工程；
前記胚を妊娠した動物を製造する工程；および
胚発生段階で胚の側脳室にＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸分子を含むベクターを注入することによりＢＲＡＦ変異タンパク質を発現させる工程
を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導されたヒトを除いた動物を製造する方法。
【請求項７】
ＢＲＡＦ変異タンパク質の発現が、胚期中、大脳皮質層（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｌａｙｅｒ）が形成される期間に誘導される、請求項６に記載のてんかんが誘導された動物を製造する方法。
【請求項８】
請求項４に記載の動物に候補物質を投与した後、神経節膠腫またはてんかん軽減の有無を判定する工程を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんの動物モデルとしての、請求項４に記載の動物。
【請求項１０】
ＢＲＡＦ変異による神経細胞の枝突起の配列異常または皮質異常積層の罹患という特徴を有する、請求項４に記載の動物。
【請求項１１】
神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんの動物モデルとしての、請求項４に記載の動物の使用。
【請求項１２】
星状膠細胞または希突起膠細胞が正常ＢＲＡＦタンパク質を発現しているマウスの脳組織に比べて増加しているという特徴を有する、請求項４に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経節膠腫のバイオマーカーを用いた神経節膠腫の診断および治療用途に関し、具体的には、ＢＲＡＦ変異タンパク質および核酸分子、前記タンパク質または核酸分子を検出できる製剤を含む神経節膠腫診断用組成物、前記ＢＲＡＦ突然変異核酸分子で形質転換された神経節膠腫が誘導された動物、およびＢＲＡＦ突然変異タンパク質の活性阻害剤を含む神経節膠腫の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）神経細胞の一部が発作的に短時間に過度な電気を発生させててんかん発作（ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ）が繰り返し発生する慢性化された疾患群であって、神経生物学的、精神的、認知的、社会的変化を伴う深刻な神経疾患である。
【０００３】
てんかんは、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）および脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）に次ぐ３番目に一般的な神経系疾患で、全世界人口の約０．５％〜２％がてんかんに悩まされている。また、全世界的には毎年１０万人あたり４５人程度の新たな患者が発生しており、韓国の場合、約３０〜４０万人のてんかん患者がいると推定され、毎年２万人程度の新たなてんかん患者が発生すると報告されている。また、全体てんかんの７０％が小児青少年の年齢から始まり、特に幼児期に発病率が高いことが知られている。発病率と有病率は生後１年以内で最も高くなってから急減し、６０歳以上の老年層で再び急増するＵ字形態を示し、一生発作を経験する有病率は１０〜１５％にのぼる。
【０００４】
てんかんのうち、現在まで開発された抗てんかん薬物に反応しないてんかんを難治性てんかん（ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）といい、全体てんかんの約４０％を占めている。
【０００５】
てんかんの原因疾患としては、大脳皮質形成異常（Ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、ＭＣＤ）、神経節膠腫（ｇａｎｇｌｉｏｇｌｉｏｍａ、ＧＧ）および海馬硬化症（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＨＳ）、またはスタージウェーバー症候群（Ｓｔｕｒｇｅ  ｗｅｂｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＷＳ）などが知られている。
【０００６】
神経節膠腫は、薬物治療に反応しない難治性てんかんの重要な原因の一つで、腫瘍に起因する小児難治性てんかんの約８０％を占めている。これは、中枢神経系の神経細胞腫瘍のうち最も一般的であり、神経細胞および膠細胞ともに異形成を伴う陽性腫瘍である。大部分小児で発生し、その８０％に近い患者で繰り返されるてんかんを主要症状として伴う。外科的切除は患者の発作回数を減少させるが、一部の患者群でてんかん発作が持続する問題点があり、発病年齢が低く、腫瘍の位置が深部にあって手術的治療が難しい場合がある。特に神経節膠腫の分子遺伝学的原因が明らかにされていないことから、新規かつ効果的な神経節膠腫の治療法の開発が難しいのが現状である。
【０００７】
過去の研究を通して神経節膠腫に特異的な体性突然変異を推測してきたが、未だに当該突然変異と神経節膠腫の発病に関する明確な因果性が裏付けられておらず、まだこのような体性突然変異が実際にてんかんを誘発するか、そしてこれに関連する生物学的な機序は何かが確認されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、てんかんを診断するためのバイオマーカーとして、ＢＲＡＦ変異タンパク質および核酸分子を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、ＢＲＡＦ変異タンパク質および核酸分子を検出できる製剤を含むてんかん診断用組成物、診断キットおよび診断方法に関する。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、ＢＲＡＦ突然変異核酸分子で形質転換されたてんかんが誘導された動物、および前記動物を用いたてんかんまたは神経節膠腫の治療薬物のスクリーニング用組成物およびスクリーニング方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、ＢＲＡＦ突然変異タンパク質の活性阻害剤を含むてんかんおよび神経節膠腫の予防または治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、神経節膠腫手術患者の脳組織試料（ｂｒａｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ）に対して、全体エクソーム塩基配列分析手法を用いて神経節膠腫の脳病変特異的体性突然変異を発掘し、このような脳体細胞突然変異を発現する動物モデルを作製して、前記作製した動物モデルにＢＲＡＦ変異タンパク質の活性阻害剤を投与する場合、てんかんを顕著に治療する効果があることを確認して、本発明を完成した。
【００１３】
上記の目的を達成するための一つの様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなる変異タンパク質、または
配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる変異核酸分子を検出できる製剤を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん診断用組成物に関する。
【００１４】
もう一つの様態として、本発明は、てんかん診断に必要な情報を提供するために、患者の試料から、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子を検出する方法に関する。
【００１５】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物に関する。
【００１６】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む、組換えベクターに関する。もう一つの様態として、本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターが導入された細胞に関する。
【００１７】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターが導入された動物または動物の胚に関する。
【００１８】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む、組換えベクターで形質転換されて、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物に関する。
【００１９】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターを製造する工程；
前記ベクターをマウスに形質転換する工程を含む神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物を製造する方法に関する。
【００２０】
もう一つの様態として、本発明は、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物にてんかん治療候補物質を投与した後、てんかん軽減の有無を確認する工程を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００２１】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列中の６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸を含むタンパク質の活性阻害剤を含む神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物に関する。
【００２２】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００２３】
本発明は、神経節膠腫の脳病変特異的体性突然変異を用いて、難治性てんかん、例えば、神経節膠腫（ＧＧ）による難治性てんかんの診断バイオマーカーに関する。
【００２４】
本発明は、てんかんを診断するためのバイオマーカーおよびその使用に関する。より具体的には、本発明は、塩基配列の変異が起こったＢＲＡＦ遺伝子、または塩基配列の変異によってアミノ酸配列の変異が起こったＢＲＡＦタンパク質に関する。また、本発明は、前記遺伝子またはタンパク質を検出できる製剤を含むてんかん診断用組成物およびキットに関する。さらに、本発明は、てんかん診断に必要な情報を提供するために、患者の試料からてんかん診断用バイオマーカーである前記遺伝子およびタンパク質を検出する方法に関する。
【００２５】
本発明において、用語「てんかん」とは、神経細胞の一部が短時間に過度な電気を発生させて発作が繰り返し発生する慢性化された疾患を意味する。本発明において、前記てんかんは、難治性てんかんを含むことができ、前記てんかんは、神経節膠腫（ＧＧ）による難治性てんかんであってもよい。
【００２６】
本発明者らは、既存の癌共用データ資料の分析に基づいて小児低等級病期の脳腫瘍が成人の脳腫瘍とは異なり難治性てんかんを伴う比率が高いことの相関関係に基づいて、低等級病期の神経膠腫を有する小児患者のうち、既存の抗てんかん剤治療に薬効のない難治性てんかんを伴っている神経節膠腫（ｇａｎｇｌｉｏｇｌｉｏｍａ、ＧＧ）患者の手術後、脳組織試料を分析した結果、配列番号１のアミノ酸から構成されたＢＲＡＦタンパク質の６００番目のアミノ酸であるバリンがグルタミン酸に置換されたＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（以下、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）脳体細胞突然変異が特異的に存在することを確認し、前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅアミノ酸および前記アミノ酸をコードする遺伝子を、脳腫瘍由来の小児難治性てんかんを診断するためのバイオマーカーパネルとして活用できることを確認した。
【００２７】
前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異は、患者の血液からは発見されておらず、脳組織試料で特異的に発見された。また、神経節膠腫患者群における遺伝変異率は３０〜７０％の比率で存在し、各患者内で存在する正常アレルに対する突然変異遺伝子の比率は５％〜３５％の比率で存在していることを確認した（表３）。
【００２８】
実験に用いた腫瘍は陽性腫瘍であって、その突然変異細胞の複製数が少ないため、全長エクソーム塩基配列分析法で確認した結果、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を除いて他のいかなる突然変異は発見されなかった。つまり、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ単一突然変異のみが神経節膠腫と関連があることを確認し、よって、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが神経節膠腫患者から現れる表現型と極めて強い相関関係があることを確認した（実施例２）。
【００２９】
本発明の難治性てんかんは、神経節膠腫によるものであってもよいし、具体的には、神経節膠腫は、脳体細胞突然変異関連神経節膠腫であってもよいし、好ましくは、前記脳体細胞突然変異は、脳体細胞ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００３０】
本発明において、用語「脳体細胞突然変異」とは、野生型の遺伝子における１つ以上の位置で塩基配列の変異が起こったことを意味する。例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはこれらの遺伝子に相応するタンパク質のアミノ酸変異であってもよい。
【００３１】
前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものでなくてもよく、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が、膠細胞ではない、神経細胞で発現して発生するものであってもよいし、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が胚発生段階の神経細胞で発現して発生するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００３２】
前記胚発生段階は、嚢胚期までの時期を意味することができ、具体的には、器官が形成される前の時期を意味することができる。
【００３３】
ＢＲＡＦ遺伝子またはタンパク質は、細胞膜から核に細胞分裂のシグナルを伝達する役割を果たすタンパク質リン酸化酵素（キナーゼ）として知られており、ＭＥＫ  ｋｉｎａｓｅとＥＲＫ  ｋｉｎａｓｅをリン酸化してＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅシグナルを伝達する機能をする。ヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列は配列番号１に記載されており、前記配列番号１のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはＮＰ＿００４３２４．２であり、前記配列番号１をコードする塩基配列は配列番号２に記載されており、前記配列番号２のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはＮＭ＿００４３３３．４である。前記ヒトに対応するマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＢＲＡＦのアミノ酸配列は配列番号３に記載されており、前記配列番号３のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはＮＰ＿６４７４５５．３であり、前記配列番号３をコードする塩基配列は配列番号４に記載されており、前記配列番号４のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはＮＭ＿１３９２９４．５である。
【００３４】
本発明において、脳体細胞突然変異の好ましい例は、野生型のヒトＢＲＡＦ遺伝子である配列番号１のアミノ酸配列に変異が起こったものを意味する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）を意味することができる。他の例として、本発明において、脳体細胞突然変異は、野生型のＢＲＡＦタンパク質をコードする塩基配列である配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子であってもよい。
【００３５】
前記ヒトＢＲＡＦに対応するマウスＢＲＡＦの突然変異は、配列番号３のアミノ酸配列における、６３７番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質（ＢＲＡＦ  Ｖ６３７Ｅ）を意味することができ、前記配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列である配列番号４のヌクレオチド配列における、１９１０番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子であってもよい。
【００３６】
本発明の一実施例において、ＢＲＡＦの突然変異を発現するマウスを作製するために、配列番号３のアミノ酸配列における、６３７番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質（ＢＲＡＦ  Ｖ６３７Ｅ）、または前記配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列である配列番号４のヌクレオチド配列における、１９１０番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子を使用した。
【００３７】
ただし、慣用的にヒトＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと同様に、マウスＢＲＡＦ  Ｖ６３７ＥをＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと表示するので、本明細書では、マウスＢＲＡＦ  Ｖ６３７Ｅ突然変異を発現するマウスに対してＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと記載した。
【００３８】
また、変異タンパク質は、分子の活性を全体的に変更させない範囲内で追加的な変異を含むことができる。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸の交換は、当該分野で公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９）。場合によって、前記ＢＲＡＦ変異タンパク質は、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
【００３９】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなる変異タンパク質、または
配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる変異核酸分子を検出できる製剤を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん診断用組成物に関する。
【００４０】
本願において、用語、「診断」とは、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん発病の有無または発病の可能性を確認することである。
【００４１】
本発明の一実施例では、腫瘍由来性てんかん患者モデルを動物モデルで正確に反映するために好適なモデル疾患として、てんかん関連腫瘍のうち小児で最も大きな原因と知られている神経節膠腫を選定して、これらの手術後、脳組織と血液サンプルを採取し、前記脳組織サンプルでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を特異的に確認（実施例１および２）して、前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異がてんかんの診断マーカーとして使用可能であり、好ましくは、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんの診断マーカーとして使用可能であることを確認した。
【００４２】
本発明において、「遺伝子を検出できる製剤」は、患者の試料内でＢＲＡＦ変異遺伝子を検出するために使用できる物質を意味する。具体的な一例として、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる遺伝子に相補的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プローブ（ｐｒｏｂｅ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｎｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）などであってもよい。前記プライマー、プローブまたはアンチセンス核酸は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列に特異的なで結合し、他の核酸物質の塩基配列には特異的結合をしないことが好ましい。
【００４３】
この時、相補的に結合するというのは、所定のハイブリダイゼーションまたはアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）条件、好ましくは、生理学的条件下でアンチセンス核酸がＢＲＡＦ突然変異遺伝子ターゲットに選択的にハイブリダイゼーションする程度に十分に相補的であることを意味し、実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）および完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）であることをすべて含む意味を有し、好ましくは、完全に相補的であることを意味する。
【００４４】
一例として、本願のＢＲＡＦ変異遺伝子バイオマーカーを検出するのに使用される製剤は、アンチセンス核酸であってもよい。
【００４５】
用語、「アンチセンス核酸」は、ターゲットとするＢＲＡＦ変異遺伝子に対する相補的な配列を有していて、ＢＲＡＦ変異遺伝子と二量体を形成できる核酸ベースの分子を意味し、本願のＢＲＡＦ変異遺伝子バイオマーカーを検出するのに使用できる。
【００４６】
他の例として、本願のＢＲＡＦ変異遺伝子バイオマーカーを検出するのに使用される製剤は、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）対またはプローブ（ｐｒｏｂｅ）であり、本願明細書にてＢＲＡＦ変異遺伝子の塩基配列が明らかにされているので、当業者は、前記配列に基づいてこれら遺伝子の特定領域を特異的に増幅するプライマーまたはプローブをデザインすることができる。
【００４７】
用語「プライマー」とは、短い自由３末端水酸化基（ｆｒｅｅ  ３’ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列で相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）を形成することができ、テンプレート鎖コピーのための開始地点として機能する７個〜５０個の核酸配列を意味する。プライマーは通常合成するが、自然に生成された核酸で用いることもできる。プライマーの配列は、必ずしも鋳型の配列と正確に同一である必要はなく、十分に相補的であるので、鋳型とハイブリダイゼーションできれば良い。好ましくは、本発明のプライマーは、ＢＲＡＦ変異遺伝子を増幅できるプライマーであってもよい。
【００４８】
他の例として、本願のＢＲＡＦ変異遺伝子バイオマーカーを検出するのに使用される製剤は、プローブであってもよい。用語、「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合をなし得る、短くて数塩基から長くて数百塩基に相当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベリング（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されていて、特定のｍＲＮＡの存在の有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で作製できる。
【００４９】
本発明では、ＢＲＡＦ遺伝変異と相補的なプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施して、ハイブリダイゼーションの有無により診断することができる。適度なプローブの選択およびハイブリダイゼーション条件は、当業界で公知のものに基づいて変形することができる。
【００５０】
本発明において、「タンパク質を検出できる製剤」は、患者の試料内でＢＲＡＦ変異タンパク質を検出するために使用できる物質を意味する。好ましくは、前記ＢＲＡＦ変異タンパク質をターゲット（ｔａｒｇｅｔ）とする特定の化合物または合成物質であってもよい。具体的な一例として、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的な抗体またはアプタマーであってもよい。好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。
【００５１】
用語「抗体」とは、当該分野で公知の用語であって、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は、本発明のマーカーであるＢＲＡＦ変異タンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、このような抗体は、ＢＲＡＦ変異遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）して前記ＢＲＡＦ変異遺伝子によってコードされるＢＲＡＦ変異タンパク質を得て、得られたＢＲＡＦ変異タンパク質から通常の方法によって製造できる。これには前記ＢＲＡＦ変異タンパク質から作られる部分ペプチドも含まれ、本発明の部分ペプチドとしては、少なくとも７個のアミノ酸、好ましくは９個のアミノ酸、さらに好ましくは１２個以上のアミノ酸を含む。本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗原結合性を有するものであれば、その一部も本発明の抗体に含まれ、すべての免疫グロブリン抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
【００５２】
本発明のてんかん診断バイオマーカーの検出に使用される抗体は、２個の全体長さの軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）および２個の全体長さの重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００５３】
また、本発明は、ＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質を検出できる製剤を含むてんかん診断用組成物は、キットの形態で実現されて提供される。
【００５４】
本発明のキットは、てんかん診断バイオマーカーであるＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質を検出することができる。本発明のキットには、ＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質を検出するためのプライマー、プローブ、アンチセンス核酸、または選択的にＢＲＡＦ変異タンパク質を認知する抗体だけでなく、分析方法に適した１種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置が含まれる。
【００５５】
具体的な一例として、本発明において、ＢＲＡＦ変異遺伝子を検出するためのキットは、ＤＮＡチップ（ｃｈｉｐ）を行うために必要な必須要素を含むてんかん診断用キットであってもよい。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡがプローブに付着している基板、蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、定量対照群遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡを含むことができる。さらに、ＢＲＡＦ変異遺伝子を検出するためのキットは、ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットであってもよい。ＰＣＲキットは、ＢＲＡＦ変異遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマー対以外にも、テストチューブまたは他の適切なコンテナ（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼのような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ−水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。また、定量対照群として使用される遺伝子に特異的なプライマー対を含むことができる。
【００５６】
他の具体的な一例として、本発明において、ＢＲＡＦ変異タンパク質を検出するためのキットは、抗体の免疫学的検出のために、基質、適度な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された二次抗体、発色基質などを含むことができる。前記基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレートおよびガラスからなるスライドガラスなどが使用可能であり、発色酵素は、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカラインホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が使用可能であり、蛍光物質は、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが使用可能であり、発色基質液は、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））またはＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）が使用可能である。
【００５７】
本発明は、てんかん診断に必要な情報を提供するために、患者の試料から、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子を検出する方法に関する。
【００５８】
前記核酸分子を検出する方法は、患者の試料から核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸の塩基配列を決定する工程とを含むものであってもよい。
【００５９】
前記試料は、患者の脳組織試料であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００６０】
本発明を実施するための一つの様態として、てんかん診断に必要な情報を提供するために、患者の試料からＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質を検出する方法を提供する。
【００６１】
より具体的には、ＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質を検出する方法で行うことができ、患者の試料からゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）ＤＮＡまたは総タンパク質（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の分離は、公知の工程を利用して行うことができる。
【００６２】
本発明において、用語「患者の試料」とは、ＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質を検出できる組織、細胞のような試料などを含む。好ましくは、脳組織であってもよいが、これに制限されない。
【００６３】
好ましくは、患者の試料からＢＲＡＦ変異遺伝子を検出する方法は、患者の試料から核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸の塩基配列を決定する工程とを含む方法で行われる。
【００６４】
具体的には、前記核酸を増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ、ホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）ＰＣＲ、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ、ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）ＰＣＲ、リアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ＰＣＲ：ＤＤ−ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ）、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ポリメラーゼ連鎖反応、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、復旧連鎖反応、転写媒介増幅、自己保持塩基配列複製またはターゲット塩基配列の選択的増幅反応によって行われる。
【００６５】
また、前記増幅された核酸の塩基配列を決定する工程は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング、マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）シーケンシング、ショットガン（Ｓｈｏｔｇｕｎ）シーケンシング、パイロシーケンシング、マイクロアレイによるハイブリダイゼーション、アレル特異的なＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ダイナミックアレルハイブリダイゼーション手法（ｄｙｎａｍｉｃ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＤＡＳＨ）、ＰＣＲ伸長分析、ＴａｑＭａｎ法、自動塩基配列分析、または次世代シーケンシングによって行われる。次世代シーケンシングは、当業界で広く使用される塩基配列分析システムを用いて行われ、例えば、Ｒｏｃｈｅ社の４５４  ＧＳ  ＦＬＸ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＯＬｉｄ  Ｐｌａｔｆｏｒｍなどを用いることができる。
【００６６】
他の例として、患者の試料からＢＲＡＦ変異タンパク質を検出する方法は、当該アミノ酸変異を特異的に検出する抗体を用いたウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免役電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがあるが、これに制限されるわけではない。前記分析方法により、ＢＲＡＦ変異タンパク質とこれに対する抗体との間の抗原−抗体複合体を確認することができ、ＢＲＡＦ変異タンパク質とこれに対する抗体との間の抗原−抗体複合体を判断して、てんかんを診断することができる。
【００６７】
本願において、「抗原−抗体複合体」とは、ＢＲＡＦ変異タンパク質とこれに特異的な抗体との結合物を意味し、抗原−抗体複合体の形成の有無は、検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌ）のシグナルにより測定可能である。このような検出ラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス（ｒｅｄｏｘ）分子および放射線同位元素からなるグループの中から選択することができ、必ずしもこれに制限されるわけではない。
【００６８】
一具体例として、ＢＲＡＦ変異タンパク質とこれに対する抗体との間の抗原−抗体複合体の測定は、ＥＬＩＳＡ法を利用するものである。また、好ましくは、ＢＲＡＦ変異タンパク質に対する１つ以上の抗体が基板上の定められた位置に配列されて高密度で固定化されているタンパク質チップを用いることである。タンパク質チップを用いて試料を分析する方法は、試料からタンパク質を分離し、分離したタンパク質をタンパク質チップとハイブリダイゼーションさせて抗原−抗体複合体を形成させ、これを読み取って、タンパク質の存在を確認して、てんかん発病の有無を確認することができる。
【００６９】
好ましくは、患者の試料からＢＲＡＦ変異タンパク質を検出する方法は、患者の試料から全体タンパク質を分離する工程；分離したタンパク質のアミノ酸配列を分析して参照配列（リファレンスシーケンス）と比較する工程を含む方法で行われる。また、好ましくは、ＢＲＡＦ遺伝変異によって増加したＢＲＡＦタンパク質の活性化を測定する方法で行われる。前記検出方法により、ＢＲＡＦ変異遺伝子またはＢＲＡＦ変異タンパク質が検出される場合、てんかんと診断することができる。
【００７０】
本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子を含む、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ組換えベクターに関する。
【００７１】
本発明の一実施例では、公知のｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ方法を利用して、配列番号４に記載の塩基配列中における１９１０番目のチミンがアデニンに置換された遺伝子を増幅し、これをＣｒｅリコンビナーゼ依存的ｌｏｘＰ配列に連結した後、マウス胚細胞に入れて相同性組換え方式でＣｒｅ依存的ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅタンパク質を発現する条件的突然変異形質転換マウスを作製し、前記作製されたマウスとｔｄＴｏｍａｔｏマウスとを交配して得られたマウスの妊娠１４日（Ｅ１４）になった時に、子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｈｏｒｎ）が露出して個々の胚（ｅｍｂｒｙｏ）の側脳室（Ｌａｔｅｒａｌ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）にＣｒｅリコンビナーゼを注入（子宮内遺伝子導入）してＣｒｅリコンビナーゼによりＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を発現するてんかんが誘導されたマウスを作製した。
【００７２】
前記マウスは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中における６３７番目のバリンがグルタミン酸に置換されたＢＲＡＦ  Ｖ６３７Ｅタンパク質を発現するか、前記マウスは、配列番号４に記載の塩基配列中における１９１０番目のチミンがアデニンに置換された遺伝子を発現することができる。
【００７３】
ただし、慣用的にヒトＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと同様に、マウスＢＲＡＦ  Ｖ６３７ＥをＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと表示するので、本発明では、マウスＢＲＡＦ  Ｖ６３７ＥをＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと記載した。
【００７４】
前記製造した組換えベクターは、哺乳類または齧歯類で発現可能なベクターであってもよい。
【００７５】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物に関する。
【００７６】
前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物は、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんで特異的に発見される突然変異タンパク質である前記配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を含む特徴がある。前記配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列によってコードされるものであってもよい。
【００７７】
本願において、用語、「誘導」とは、正常状態から病理状態に変化を誘発することを意味する。本発明の目的上、誘導は、てんかんが発病しない状態からてんかんが発病する状態に変化することである。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を含む組成物を注入しててんかんを誘発することであってもよい。また、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９こ９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む塩基配列からなる遺伝子を含む組成物を注入しててんかんを誘発することであってもよいが、これに制限されず、アミノ酸配列が変異された配列番号１のタンパク質、または遺伝子配列が変異された配列番号２の遺伝子を注入しててんかんを誘発することであってもよい。
【００７８】
前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものではなくてもよく、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が膠細胞ではない、神経細胞で発現して発生するものであってもよいし、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が胚発生段階の神経細胞で発現して発生するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００７９】
前記胚発生段階は、嚢胚期までの時期を意味することができ、具体的には、器官が形成される前の時期を意味することができる。
【００８０】
本発明の一実施例において、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、膠細胞起源のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異とは無関係であり、神経細胞で発生するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異がてんかん発生機序に重要な役割を果たすことを確認し、膠細胞でのみＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が発生する場合には、膠細胞増殖能と陽性腫瘍が増加することを確認した。前記結果を通して、本発明の前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、神経細胞で発生するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異によって発生するが、膠細胞で発生するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異は、本発明の前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんを誘導するのではなく、細胞の増殖を誘導することが分かった（実施例６）。
【００８１】
本発明の一実施例において、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、成人期に発現したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異により誘導されるのではなく、器官発生期前の胚発生段階で発現したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異により誘導されることを確認した（実施例５）。
【００８２】
また、本発明の一実施例において、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路により誘導されるのではないことを確認した（実施例９）。
【００８３】
本発明は、前記配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む、組換えベクターであってもよい。
【００８４】
本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターが導入された細胞に関する。前記細胞は、脳細胞であってもよい。
【００８５】
本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターが導入された胚に関する。
【００８６】
前記胚は、ヒトを除いた哺乳類または齧歯類であってもよく、前記胚は、脳の形成または発達段階にある胚であってもよい。
【００８７】
本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む、組換えベクターで形質転換されて、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された、ヒトを除いた動物に関する。
【００８８】
本発明は、前記組換えベクターによる形質転換動物に関する。
【００８９】
本発明において、用語、「形質転換動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」とは、細胞内のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅタンパク質の活性が正常細胞に比べて増加するように形質の変形が誘導された動物を意味し、アミノ酸配列が変異されたＢＲＡＦタンパク質を発現するベクターを細胞内流入することによって形質転換を誘導することができる。てんかんが発生した前記形質転換動物は、てんかん動物モデルとして効果的に使用できる。
【００９０】
前記動物は、ヒトを除いた哺乳類または齧歯類であってもよく、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導されたものであってもよい。
【００９１】
本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターを製造する工程；
前記ベクターをマウスに形質転換する工程を含む神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物を製造する方法に関する。
【００９２】
前記組換えベクターを導入する方法は、特に制限されない。例えば、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎまたはｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）などの方法によりベクターが細胞内に挿入される。細胞内に挿入されたベクターは、細胞内で遺伝子発現が持続的に起こってアミノ酸配列が変異されたＢＲＡＦタンパク質を生成することができる。
【００９３】
前記組換えベクターは、胚期中、大脳皮質層（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｌａｙｅｒ）が形成される期間に胚の脳に導入されるものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００９４】
本発明の具体的な一実施例では、配列番号４に記載の塩基配列中におけるＣｒｅ依存的に１９１０番目のチミンがアデニンに置換された遺伝子を発現できる条件的突然変異形質転換マウスを作製し、これにＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミドをマウスの子宮内遺伝子導入しててんかんが誘導されたマウス動物モデルを製造した。
【００９５】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列中の６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸をコードする塩基配列を含む組換えベクターで形質転換されたてんかんが誘導された動物に関する。前記動物は、ヒトを除いた哺乳類または齧歯類であってもよい。
【００９６】
本発明において、「動物モデル（ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ）」または「疾患モデル（ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌ）」は、ヒトの疾病と類似の特定疾患を有していて病因を究明し、病態を確認できる研究対象となり得るモデルになる動物を意味する。動物モデルとして用いるための動物は、ヒトにおけるような効果を予測することができ、容易に作ることができ、再現性がある。また、ヒトの疾病の病因と同一であるか、類似して進行しなければならない。したがって、ヒトのような哺乳類脊椎動物でかつ、臓器などの体内構造、免疫体系、体温などが類似し、高血圧、癌、免疫欠乏などの疾患を病む動物が動物モデルとして適合する。このような動物は、好ましくは、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、ラビット、マウス、ラット、ギニーピッグ、ハムスターなどの哺乳類であり、より好ましくは、マウス、ラット、ギニーピッグ、ハムスターなどの齧歯類である。
【００９７】
本発明の一実施例において、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが神経節膠腫患者から現れる表現型と極めて強い相関関係があることを確認して、これに基づいて、動物モデルでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異に正常ＢＲＡＦ遺伝子が置換される場合、動物モデルでてんかんの表現型が現れるかを確認した（実施例４）。
【００９８】
本発明の一実施例において、前記ＢＲＡＦ遺伝子置換モデルでてんかんの表現型が現れるかを確認するに先立って、患者組織を神経細胞に特異的なマーカーと膠細胞に特異的なマーカーでそれぞれ染色して、特定組織型の細胞だけをレーザーキャプチャー顕微鏡解剖という方法を利用して分離して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の存在の有無を確認することにより、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が神経細胞、および膠細胞系の細胞株ともに起源することを確認することができた（図２Ａ、および図２Ｂ）。前記結果を通して、神経細胞および膠細胞ともの共通した先祖から前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が発生したことを推論することができた（実施例３）。
【００９９】
本発明の一実施例において、前記製造したマウス動物モデルにおいて、１４日（Ｅ１４）の胚マウスの側脳室にＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミドを電気穿孔した胚を誕生させた後、生後３週後からビデオ脳電図（Ｖｉｄｅｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｐｈｙ、ｖｉｄｅｏ−ＥＥＧ）監視を施した結果、本発明の塩基配列変異が起こった変異遺伝子を挿入したプラスミドを注入したマウスからてんかん波を伴う自発発作を確認した（図３Ｂ、および３Ｃ）。さらに、動物モデルマウスの脳を切断して多チャンネル電極分析装備を用いて組織の活性度を測定した結果、対照群とは異なり、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する脳組織でてんかんに特徴的な、自発的活動波と様々なチャンネルで同時に一時的に短い周期の高振幅のエネルギーが放出されてなるｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｂｕｒｓｔ  ｆｉｒｉｎｇ（図３Ｃ）が現れることを確認した（実施例４）。
【０１００】
本発明の一実施例において、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を電気穿孔で誘導した大脳領域のＧＦＰ陽性細胞の場合、神経節膠腫で特徴的に現れている神経細胞の異形成が伴っているが、これには細胞の大きさが大きくなり（図５のＡ）、細胞の形状がゆがんでおり（図５のＢ）、細胞の形状および神経細胞の枝の配列が正常神経細胞とは異なり任意の方向に配列されている（図５のＣ）ことを確認した。
【０１０１】
また、本発明の一実施例において、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を有する神経原性細胞の娘細胞を追跡するために、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｘｅｄ  ｔｄＴｏｍａｔｏマウスと交配して、再びＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド遺伝子を子宮内遺伝子導入という方法を利用して製造して（図６Ａ）、その娘細胞を追跡した結果、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する神経原性細胞から、膠細胞系関連星状膠細胞または希突起膠細胞が正常脳組織に比べて有意に増加（図６Ｂ）したことを確認した（実施例５）。
【０１０２】
前記結果を通して、本発明の方法で製造したマウスは、神経節膠腫の特徴である神経細胞の異形成と膠細胞の数的増加が観察されるので、神経節膠腫疾患が誘導された動物モデルとして適合することが分かった。
【０１０３】
本発明のてんかん動物モデルは、遺伝子機能に関する研究、てんかんの分子的機序および新規抗てんかん剤探索などの研究に効果的に使用することができる。
【０１０４】
本発明は、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物にてんかん治療候補物質を投与した後、てんかん軽減の有無を確認する工程を含むてんかん治療剤のスクリーニング方法に関する。
【０１０５】
前記てんかんが誘導された動物にてんかん治療候補物質を投与した後、てんかん症状を間接的または直接的に軽減させる物質は、てんかん治療剤として選択することができる。つまり、てんかん治療候補物質の不在下でてんかん症状を測定し、てんかん治療候補物質の存在下でてんかん症状を測定して両者を比較した後、てんかん治療候補物質が存在する時のてんかん症状が、てんかん治療候補物質の不在時の症状より軽減させる物質をてんかん治療剤として予測することができるのである。
【０１０６】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列中の６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸を含むタンパク質の活性阻害剤を含む神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物に関する。
【０１０７】
本発明による前記配列番号１のアミノ酸配列中の６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸を含むタンパク質の活性阻害剤の具体的な例は、ベムラフェニブ（Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）またはその塩、およびダブラフェニブ（Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）またはその塩からなる群より選択される１種以上を含むことができる。
【０１０８】
前記阻害剤は、ＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂまたはＤａｂｒａｆｅｎｉｂであってもよいし、前記Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂは、ＰＬＸ４０３２、ＰＬＸ４７２０、またはＺｅｌｂｏｒａｆとも呼ばれる。
【０１０９】
本発明の一実施例において、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を細胞に導入する場合、ＢＲＡＦタンパク質が過活性化されるので、難治性てんかんが誘発されうることを確認し、前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅタンパク質の活性阻害剤を投与する場合、神経節膠腫（ＧＧ）による難治性てんかんの予防、改善または治療と、これら難治性てんかんの原因疾患である神経節膠腫（ＧＧ）の予防、改善または治療効果があることを、発作の減少の有無で確認した（実施例８）。
【０１１０】
本発明は、難治性てんかんの予防、改善または治療とこれら難治性てんかんの原因疾患である神経節膠腫（ＧＧ）の予防、改善または治療用組成物、キット、または方法を提供することである。好ましくは、前記難治性てんかんは、脳体細胞突然変異関連難治性てんかんに関する予防、治療および／または改善用途に関する。
【０１１１】
前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものではなくてもよく、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が、膠細胞ではない、神経細胞で発現して発生するものであってもよいし、前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が胚発生段階の神経細胞で発現して発生するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【０１１２】
前記胚発生段階は、嚢胚期までの時期を意味することができ、具体的には、器官が形成される前の時期を意味することができる。
【０１１３】
前記阻害剤を含む組成物は、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんによって発生する発作を減少することを特徴とすることができる。
【０１１４】
本発明において、前記阻害剤は、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、またはＤａｂｒａｆｅｎｉｂであってもよく、前記阻害剤は、前記化合物の誘導体または類似体および薬学的に許容可能な塩または水和物をすべて含むことができる。
【０１１５】
前記薬学的に許容可能な塩または水和物は、無機酸または有機酸から誘導された塩または水和物であってもよく、一例として、塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸であってもよいが、これに制限されない。前記水和物は、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂが水分子と結合して形成されたものを意味することができる。
【０１１６】
本発明において、「治療」は、症状の軽減または改善、疾患の範囲の減少、疾患進行の遅延または緩和、疾患状態の改善、軽減または安定化、部分的または完全な回復、生存の延長その他の良い治療結果などをすべて含む意味で使用できる。
【０１１７】
前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんに関連する症状は、脳の発達過程で神経細胞が適切な脳の地域への移動に失敗することで現れるもので、自発発作、行動発作、脳波発作および大脳で異常な神経細胞の発生などを例示することができる。
【０１１８】
したがって、本発明における治療は、このような神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん患者に対して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅタンパク質活性阻害剤、例えば、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂを投与することによって、自発発作、行動発作または脳波発作が現れる回数を顕著に軽減させ、大脳で異常な神経細胞の活性または異常シグナルを低減することを意味することができる。
【０１１９】
本発明の薬学組成物の使用態様および使用方法により、ＢＲＡＦタンパク質活性阻害剤の有効量は、当業者の選択に応じて適切に調節して使用可能である。
【０１２０】
一例として、前記薬学組成物は、ＢＲＡＦタンパク質活性阻害剤を、全体組成物の総重量に対して０．１〜１０重量％、さらに好ましくは０．５〜５重量％の量で含むことができる。
【０１２１】
前記ＢＲＡＦタンパク質活性阻害剤は、前記薬学組成物内に単独で含まれ、またはその他薬理学的に許容可能な添加剤を追加的に含むことができる。前記薬学的に許容可能な添加剤は、製剤する時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含み、また、薬学的に許容される賦形剤としては、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを含むが、これに限定されるものではない。つまり、本発明の薬学組成物に添加される薬学的に許容可能な添加剤は、使用目的に応じて通常の技術者が困難なく選定することができ、その添加量は本発明の目的および効果を損なわない範囲内で選択可能である。
【０１２２】
本発明の薬学組成物の患者に対する好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間に応じて異なるが、通常の技術者によって適切に選択可能である。しかし、好ましい効果のために、本発明の抽出物は、１日、１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１５０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ投与するのが良い。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。したがって、前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２３】
本発明の組成物は、ネズミ、ハツカネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与される。投与のすべての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与可能である。
【０１２４】
本発明は、他の様態として、ＢＲＡＦタンパク質活性阻害剤、例えば、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂまたはその塩を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんの予防または改善用食品組成物に関する。
【０１２５】
前記食品組成物は、通常の他の食品組成物の成分と共に使用可能であり、通常の方法により適切に使用可能である。ＢＲＡＦタンパク質活性阻害剤は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて好適に決定可能である。一般に、食品用組成物の製造時には、有効成分の原料に対して０．０１〜１０重量部、好ましくは０．０５〜１重量部の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であってもよい。
【０１２６】
前記食品組成物は、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんの予防または改善のための目的で健康食品に含有されてもよいし、その種類には特別な制限はない。前記物質を添加可能な食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品をすべて含むことができる。前記のほか、本発明の前記食品組成物は、食品学的に許容可能な添加剤を追加的に含むことができる。このような添加剤の比率は大して重要でないものの、本発明の組成物１００重量部あたり、０．０１〜０．１重量部の範囲から選択されることが一般的である。
【発明の効果】
【０１２７】
本発明は、てんかんのバイオマーカー、てんかん診断用組成物、てんかんが誘導された動物、およびてんかん予防または治療用組成物に関し、具体的には、ＢＲＡＦ突然変異タンパク質および核酸分子、前記タンパク質または核酸分子を検出できる製剤を含むてんかん診断用組成物、前記ＢＲＡＦ突然変異核酸分子で形質転換されたてんかんが誘導された動物、およびＢＲＡＦ突然変異タンパク質の活性阻害剤を含むてんかんの予防または治療用組成物に関するものであり、本発明のＢＲＡＦ突然変異タンパク質の活性阻害剤を含むてんかん予防または治療用組成物を用いて神経節膠腫またはこれによるてんかんを予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１Ａ】図１Ａは、小児の低病期脳腫瘍ではＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが統計的有意性を有して著しく多く存在していることを確認した図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、神経節膠腫患者（ＧＧ２２１）の頭部磁気共鳴映像所見（左側）と矢印の当該病変を手術中に確認した病理組織所見（右側）を確認した図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、神経節膠腫患者（ＧＧ５７、ＧＧ１６３、ＧＧ２２１、ＧＧ２３１、ＧＧ２４９、およびＧＧ３８１）の手術前の頭部磁気共鳴映像所見を確認した図である。
【図２Ａ】図２Ａは、レーザーキャプチャー顕微鏡解剖方法を利用した神経細胞と膠細胞でのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の存在の有無に関する実験の方法を図式化した図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、レーザーキャプチャー顕微鏡解剖方法を利用して神経細胞（左側）と膠細胞（右側）でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の存在の有無を確認した図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の一実施例により作製したマウスがＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異遺伝子を発現していることを確認した図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の一実施例によりＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異遺伝子を挿入したプラスミドを注入したマウスでてんかん波を伴う自発発作が発生したことを確認した図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスから得られた脳組織でてんかんに特徴的な病理的特徴を確認した図である。
【図４】図４は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスで自発的活動波と様々なチャンネルで同時に一時的に短い周期の高振幅のエネルギーが放出されてなる同期バースト発火（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｂｕｒｓｔ  ｆｉｒｉｎｇ）が現れることを確認した図である。
【図５】図５は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスで神経節膠腫で特徴的に現れている神経細胞の異形成が伴っていることを確認した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を有する神経原性細胞の娘細胞を追跡するためにｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｘｅｄ  ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを交配する過程を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する神経原性細胞で膠細胞系関連星状膠細胞または希突起膠細胞が正常脳組織に比べて有意に増加したことを確認した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、前記図６Ｂの組織写真を高倍率で拡大して再撮影した図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実際の患者組織で免疫組織化学染色方法によりＣＤ３４の発現が増加したことを確認した図である。
【図７】図７は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスでＣＤ３４の発現量が増加することを確認した図である。
【図８】図８は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスでＣＤ３４マーカーが増加することを示す免疫蛍光染色所見（左側）と免疫組織化学染色（右側）所見を示す図である。
【図９】図９は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスで皮質の異常積層を観察した図である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例の方法でマウスモデルを作製した時、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する脳組織が正常脳組織とは異なり上側と下側にわたって分布が異なり、皮質異形成を示すことを確認した図である。図１０の下の図では、このような観察を拡大して示し、全体神経細胞の量には変化がないことを確認した。
【図１１】図１１は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を膠細胞でのみ発現するマウスでてんかんの行動様式は現れず、ただし、膠細胞系の細胞の数が増加することを確認した図である。
【図１２】図１２は、成体マウスにおけるタモキシフェンを用いて誘導可能なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウスの作製方法を示す図である。
【図１３】図１３は、成体マウスにおけるウイルスを用いて誘導可能なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウスの作製方法を示す図である。
【図１４】図１４は、成体マウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異誘導した場合における細胞学的異常様相を確認した図である。
【図１５】図１５は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤の持続的脳室内注入（ｃＩＣＶ、ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）による発作の減少をビデオモニタリング脳波分析を通した発作棘波の測定を利用して確認した図である。ＰＯＤ（ｐｏｓｔ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｄａｙ）は、手術後の日を意味し、ｉｃｔａｌｓｅｉｚｕｒｅは、てんかん発作を意味する。
【図１６】図１６は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤の持続的脳室内注入による発作の減少をビデオモニタリング脳波分析を通した発作間棘波（Ｉｎｔｅｒｉｃｔａｌ  ｓｐｉｋｅ）と電気生理学的発作棘波（Ｅｌｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ）の測定を利用して確認した図である。
【図１７】図１７は、本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤の一時的脳室内注入（ａＩＣＶ、ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と経口投薬（ＰＯ、ｐｅｒ  ｏｒａｌ）を通してビデオモニタリング脳波分析で発作の減少が現れないことを確認した図である。
【図１８】本発明の一実施例により作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスでｍＴＯＲシグナリング経路の活性化の有無を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
本発明は以下の態様にも関する。
［１］  配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物。
［２］  前記配列における６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列によってコードされるものである、上記［１］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物。
［３］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものではない、上記［１］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物。
［４］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が神経細胞で発現して発生するものである、上記［１］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物。
［５］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が胚発生段階の神経細胞で発現して発生するものである、上記［１］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん誘導用組成物。
［６］  配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む、組換えベクター。
［７］  配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターが導入された、細胞。
［８］  配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターが導入された、ヒトを除いた動物の胚。
［９］  配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む、組換えベクターで形質転換されて、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された、ヒトを除いた動物。
［１０］  前記動物は、ヒトを除いた哺乳類または齧歯類である、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された、上記［９］に記載のヒトを除いた動物。
［１１］  配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含む核酸分子を含む組換えベクターを製造する工程；
前記ベクターをマウスに形質転換する工程を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物を製造する方法。
［１２］  前記組換えベクターは、胚期中、大脳皮質層（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｌａｙｅｒ）が形成される期間に胚の脳に導入されるものである、上記［１１］に記載のてんかんが誘導された動物を製造する方法。
［１３］  上記［１１］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんが誘導された動物にてんかん治療候補物質を投与した後、てんかん軽減の有無を確認する工程を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん治療剤のスクリーニング方法。
［１４］  配列番号１のアミノ酸配列中の６００番目のバリンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸を含むタンパク質の活性阻害剤を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物。
［１５］  前記阻害剤は、ベムラフェニブ（Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）またはその塩、およびダブラフェニブ（Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）またはその塩からなる群より選択される１種以上を含むものである、上記［１４］に記載のてんかん予防または治療用組成物。
［１６］  前記タンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列によってコードされるものである、上記［１４］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物。
［１７］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものではない、上記［１４］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物。
［１８］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が神経細胞で発現して発生するものである、上記［１４］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物。
［１９］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が胚発生段階の神経細胞で発現して発生するものである、上記［１４］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物。
［２０］  前記組成物は、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんによって発生する発作を減少することを特徴とする、上記［１４］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん予防または治療用組成物。
［２１］  配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなる変異タンパク質、または
配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる変異核酸分子
を検出できる製剤を含む、神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん診断用組成物。
［２２］  前記神経節膠腫は、脳体細胞突然変異によるものである、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２３］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、ｍＴＯＲシグナリング経路の活性化によって発生するものではない、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２４］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が神経細胞で発現して発生するものである、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２５］  前記神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかんは、前記変異タンパク質または前記変異核酸分子が胚発生段階の神経細胞で発現して発生するものである、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２６］  前記タンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列によってコードされるものである、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２７］  前記核酸分子を検出できる製剤は、前記ヌクレオチド配列に相補的なプライマー、プローブ、またはアンチセンス核酸である、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２８］  前記タンパク質を検出できる製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体またはアプタマーである、上記［２１］に記載のてんかん診断用組成物。
［２９］  前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、上記［２８］に記載の神経節膠腫または神経節膠腫によるてんかん診断用組成物。
［３０］  てんかん診断に必要な情報を提供するために、患者の試料から、
配列番号１のアミノ酸配列における、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換された変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質、または
配列番号２のヌクレオチド配列における、１７９９番目のチミンがアデニンに置換された変異を含むヌクレオチド配列からなる核酸分子
を検出する方法。
［３１］  前記試料は、患者の脳組織試料である、上記［３０］に記載の方法。
［３２］  前記核酸分子を検出する方法は、
患者の試料から核酸を増幅する工程、および
前記増幅された核酸の塩基配列を決定する工程
を含むものである、上記［３０］に記載の方法。
［３３］  前記核酸を増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ、ホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）ＰＣＲ、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ、ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）ＰＣＲ、リアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ＰＣＲ：ＤＤ−ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ）、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ポリメラーゼ連鎖反応、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、復旧連鎖反応、転写媒介増幅、自己保持塩基配列複製またはターゲット塩基配列の選択的増幅反応によって行われるものである、上記［３２］に記載の方法。
［３４］  前記増幅された核酸の塩基配列を決定する工程は、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング、マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）シーケンシング、ショットガン（Ｓｈｏｔｇｕｎ）シーケンシング、パイロシーケンシング、マイクロアレイによるハイブリダイゼーション、アレル特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーション手法（ｄｙｎａｍｉｃ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＤＡＳＨ）、ＰＣＲ伸長分析、ＴａｑＭａｎ法、または自動塩基配列分析によって行われるものである、上記［３２］に記載の方法。
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１３０】
実施例１．遺伝体共用データ分析を通した遺伝体範囲プロファイリング
小児の低病期神経膠腫は、一般成人の脳腫瘍と臨床様相が大いに異なるが、特にこれらの患者群でてんかんが伴う比率が高いことが知られている。小児低病期神経膠腫（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａ）でなぜ高い頻度でてんかんが発生するかを確認するために、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）、ＰｅＣａｎ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｔａ  Ｐｏｒｔａｌ）のような遺伝体共用データを分析して、成人と小児の脳腫瘍で区分される突然変異遺伝子タイプを分類した。
【０１３１】
その結果、図１に示されるように、成人の脳腫瘍ではＩＤＨ１、およびＴＰ５３のような遺伝子の突然変異が顕著に多く存在したが、小児の低病期脳腫瘍ではＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が統計的有意性を有して顕著に多く存在した。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
実施例２．全体エクソームシーケンシングを利用したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の確認
２−１．５人の患者から全体エクソームシーケンシングでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異候補群の確認
腫瘍由来性てんかん患者モデルを動物モデルで正確に反映するために、小児でてんかん関連腫瘍を起こす最も大きな原因として知られている神経節膠腫を選定して前記神経節膠腫で存在する遺伝子突然変異を選別するために、神経節膠腫患者５人（ＧＧ２９、ＧＧ３０、ＧＧ２２１、ＧＧ２３１、およびＧＧ２４９と命名）の手術後、脳組織と血液サンプルを採取した。
【０１３４】
神経節膠腫患者の脳組織試料で全体エクソームシーケンシング（ｄｅｅｐ  ｗｈｏｌｅ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ｒｅａｄ  ｄｅｐｔｈ  ６３０−６７２）を行い、全体エクソームシーケンシングのＳｔｒｅｌｋａとＭｕｔｅｃｔの２つのアルゴリズムで同時に発見される候補突然変異であるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを選別した。
【０１３５】
具体的には、全体エクソームシーケンシングデータ取得（ｗｈｏｌｅ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために、製造会社が提供するＡｇｉｌｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  ５０Ｍｂ  ｋｉｔ）を用いてシーケンシングライブラリーを作製した。前記作製したシーケンシングライブラリーをＨｉｓｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングを行い、分析の正確性を高めるために、一般的なシーケンシングデプス（ｄｅｐｔｈ）の５倍のデプス（〜５００ｘ）でシーケンシングを行った。
【０１３６】
前記シーケンシング後に出たデータは、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇａｔｋ／）を用いて分析できる形態のファイル（ｂａｍ  ｆｉｌｅ）に変換して保存した。
【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
その結果、表２に示されるように、神経節膠腫５人の患者のうち３人の患者から共通してＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が存在することを確認することができ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異以外に他の遺伝子の突然変異は観察されなかった。前記神経節膠腫から確認したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異は、配列番号２のヒト遺伝子ＢＲＡＦ遺伝子の１７９９チミンがアデニンに置換された突然変異であり、これは、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質の６００番バリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された突然変異である。
【０１３９】
２−２．拡大患者群からＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の確認
実施例２−１で神経節膠腫５人の患者で存在すると確認したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅが他の患者群でも存在するかを確認するために、患者群を拡大して全体１２人の患者（実施例２−１で確認した患者５人（ＧＧ２９、ＧＧ３０、ＧＧ２２１、ＧＧ２３１、およびＧＧ２４９を含む）で存在する遺伝子突然変異を調べた（表３）。
【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異は、患者の血液からは発見されず、脳組織試料で特異的に発見された。
【０１４２】
その結果、表３から確認できるように、全体１２の神経節膠腫患者群のうち６人の患者からＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が存在することを確認することができ（遺伝変異率は５０％の比率）、各患者内で存在するＢＲＡＦ正常アレル対比、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異アレルの比率は約７〜３０％であったことを確認することができた。
【０１４３】
２−３．患者試料採取およびゲノムＤＮＡ抽出
実施例２−２で用いた神経節膠腫（Ｇａｎｇｌｉｏｇｌｉｏｍａ、ＧＧ）による難治性てんかん患者１２人に対して、当該患者全員の同意の下、患者の脳組織（１〜２ｇ）、唾液（１〜２ｍＬ）、血液（約５ｍＬ）、凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋された脳組織を得た（セブランス病院小児神経外科および小児神経科）。下記のキットを製造会社のプロトコルを用いて患者の脳組織、血液、唾液、凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋脳組織のゲノムＤＮＡを分離した：
脳組織：Ｑｉａｍｐ  ｍｉｎｉ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）、血液：Ｆｌｅｘｉｇｅｎｅ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）、唾液：ｐｒｅｐＩＴ２Ｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＤＮＡｇｅｎｏｔｅｋ、ＵＳＡ）、凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋脳組織：Ｑｉａｍｐ  ｍｉｎｉ  ＦＦＰＥ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）。
【０１４４】
２−４．神経節膠腫特異的な遺伝子突然変異の配列分析
神経節膠腫患者にＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が存在するか否かを追加的に確認するために、実施例２−２で確認した１２人の患者のうち、実施例２−１で確認した患者５人を除いた残りの７人の患者に対して、リード深さが１００−１７，７００となるようにハイブリッドキャプチャーシーケンシングを下記の方法で行った。
【０１４５】
前記７人の神経節膠腫患者に対して、実施例２−３と同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出し、これについてハイブリッドキャプチャー塩基配列分析を行った。前記ハイブリッドキャプチャー塩基配列分析のために、ＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｔｏｏｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＢＲＡＦ遺伝子特異的なｐｒｏｂｅを作製した。製造会社が提供するＡｇｉｌｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを用いてシーケンシングライブラリーを作製した。前記作製したシーケンシングライブラリーに対して、Ｈｉｓｅｑ２５００（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて中央リード深さが５００ｘとなるようにシーケンシングを行った。前記シーケンシング後に出たデータは、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇａｔｋ／）を用いて分析できる形態のファイル（ｂａｍ  ｆｉｌｅ）で作った。
【０１４６】
脳組織特異的なｄｅ  ｎｏｖｏ体性突然変異を探すために、血液、および脳組織の遺伝子シーケンシング結果のうち、ＳｔｒｅｌｋａとＭｕｔｅｃｔの２つのアルゴリズムで同時に発見される体性突然変異を選び出した。また、ハイブリッドキャプチャーシーケンシング結果からすべて発見された遺伝変異のうち、深さ１００以上のｍｕｔａｔｅｄ  ｃａｌｌ３つ以上（ｍａｐｐｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ３０以上）の選別基準を満足する遺伝変異のみを疾患関連遺伝子候補に選定した。
【０１４７】
前記シーケンシング過程で発生するエラーを確実に除去するために、遺伝変異率が１％以上の場合のみ陽性と見なし、血液、および脳組織のゲノムＤＮＡからハイブリッドキャプチャーエクソーム塩基配列分析を行った時、すべて変異が現れた場合にのみ、これを陽性と見なして、当該変異を真性突然変異として選択した。
【０１４８】
その結果、下記表４に示されるように、遺伝変異陽性患者（遺伝変異率が１％以上）の唾液と血液（対照群）ではＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が発見されなかった（陰性）。しかし、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異は、３人の患者（ＧＧ２２１、ＧＧ２３１、ＧＧ２４９ではＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が繰り返し検出され、ＢＲＡＦ正常アレル対比、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異アレルの比率は７％〜３０％であった。
【０１４９】
【表４】
0006941688.tif 000006
【０１５０】
実施例３．レーザーキャプチャー細胞剥離法を利用したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の細胞特異的存在の確認
患者の治療に用いるためには、適切なモデル生命体の原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）を作製しなければならないが、前記モデル生命体の原型を作製するに先立って、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が正確に神経細胞に存在するか、または膠細胞系の細胞株で存在するか否かを確認する必要があり、下記の実験を行った。
【０１５１】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が正確に神経細胞に存在するか、または膠細胞系の細胞株で存在するか否かを確認するために、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が確認されたＧＧ２２１、ＧＧ２３１患者組織を神経細胞に特異的なマーカーと膠細胞に特異的なマーカーとしてそれぞれ免疫蛍光染色方法を利用して染色した後、特定組織型の細胞のみをレーザーキャプチャー顕微鏡解剖という方法を利用して分離して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の存在の有無を確認した。
【０１５２】
実施例２で用いた神経節膠腫患者の組織中、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が確認された外科的組織塊（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｌｏｃｋ）（ＧＧ２２１、ＧＧ２３１患者組織）を新たに準備したｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ＰＢ）下の４％（ｗ／ｖ）ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（固定）、２０％（ｗ／ｖ）ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｕｃｒｏｓｅ（凍結防止（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔ））、１０％（ｗ／ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢ下の７．５％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎで一晩培養して、ｇｅｌａｔｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ組織塊を作って、−８０℃で保管した。
【０１５３】
前記作製したｇｅｌａｔｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ組織塊を−５０℃の２−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｅｓに急速に浸漬して、ｇｅｌａｔｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ組織塊を急速に凍結させ、−２０℃下の環境で凍結組織切片機（Ｌｅｉｃａ）を用いて１０ｕｍ厚さの凍結切片（Ｃｒｙｏｓｔａｔ−ｃｕｔ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を作り、前記凍結切片をガラススライド（ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）上に置き、常温で１時間ＰＢＳ−ＧＴ（０．２％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎおよび０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｉｎ  ＰＢＳ）で遮断（ｂｌｏｃｋ）し、下記の抗体で染色（ｓｔａｉｎ）した：ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＮｅｕＮ（１：２００、＃ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ２（Ｏｌｉｇ２）（１：５００、ＡＢ９６１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。３回のＰＢＳ洗浄後、組織スライドは次の二次抗体で染色した：マウスに対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ）（１：２００ｄｉｌｕｔｉｏｎ；Ａ２１４２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはウサギに対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｒａｂｂｉｔ）（１：２００ｄｉｌｕｔｉｏｎ；Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐ３６９３１、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に含まれているＤＡＰＩは核染色に使用した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ３０００Ｂ倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて蛍光イメージを得た。染色した組織中、ＰＡＬＭ  ＭｉｃｒｏＢｅａｍ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡を用いて、ＮｅｕＮ陽性でかつＯｌｉｇ２陰性、逆にＮｅｕＮ陰性でかつＯｌｉｇ２陽性の細胞のみを約５０個程度を引き離して、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔでｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのみを抽出した後、表５のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、増幅されたＰＣＲ産物はＭＥＧＡｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて精製した後、ＢｉｏＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＳａｎｇｅｒシーケンシングを行った。
【０１５４】
【表５】
0006941688.tif 000007
【０１５５】
その結果、図２Ｂから確認できるように、神経細胞（図２Ｂの左側）および膠細胞（図２Ｂの右側）の２種類の互いに異なる細胞でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異（ＢＲＡＦ  Ｃｈｒ７：１４０４５３１３６  ｆｏｒ  ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ突然変異）が存在することを確認することができた。
【０１５６】
図２Ｂのように、互いに異なる２つの細胞である神経細胞および膠細胞で同一の突然変異が存在することにより、神経細胞および膠細胞ともの共通した先祖の細胞から前記突然変異が発生したことを類推することができた。
【０１５７】
実施例４．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を発現するマウスからてんかん患者の表現型の確認
４−１．動物モデルマウスから自発発作の確認
実施例１〜３で確認したてんかん患者に現れるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を、発現可能なｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｘｅｄ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅマウスを作製し、前記マウスをｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｘｅｄ  ｔｄＴｏｍａｔｏマウスと交配して、胚期１４日となるｔｉｍｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔを作製した後、Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド遺伝子を子宮内電気穿孔法で導入して、神経節膠腫患者の状況と類似の動物モデルを作製した。
【０１５８】
具体的には、本発明の一実施例では、公知のｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ方法を利用して、配列番号４に記載の塩基配列中、１９１０番目のチミンがアデニンに置換された遺伝子を増幅し、これをＣｒｅ依存的ＬｏｘＰ配列に入れた産物をマウス胚に注入してＣｒｅ依存的条件の突然変異に置換された形質転換マウスを作製し、前記作製されたマウスとｔｄＴｏｍａｔｏマウスとを交配して得られたマウスの妊娠１４日（Ｅ１４）になった時に子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｈｏｒｎ）が露出して、個々の胚（ｅｍｂｒｙｏ）の側脳室（Ｌａｔｅｒａｌ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）にＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド２〜３ｕｇと結合したＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（Ｆ７２５２、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２ｕｇ／ｍｌをｐｕｌｌｅｄ毛細管（ｐｕｌｌｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ）を用いて注入した。Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド（ｐＣＡＧ−Ｃｒｅ−ＩＲＥＳ２−ＧＦＰ、ａｄｄｇｅｎｅ、＃２６６４６）は胚の頭に９００ｍｓの間隔に１００ｍｓの５番電気パルスであるＥＣＭ８３０  ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢＴＸ−ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）で５０Ｖを放電して電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）した。
【０１５９】
前記Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド電気穿孔したマウス胎児の脳組織を引き離して、表６のプライマーおよびｉ−Ｔａｑ  ＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、＃２５０２１）を用いてｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＰＣＲを施した。
【０１６０】
【表６】
0006941688.tif 000008
【０１６１】
その結果、図３Ａに示されるように、作製したマウスはＢＲＡＦ  Ｖ６３７Ｅ突然変異遺伝子を発現していることを確認することができた（マウスＢＲＡＦ  Ｖ６３７Ｅ突然変異であるが、慣用的にヒトＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと同様に、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと表示するので、以下、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅと記載する）。
【０１６２】
作製したモデルマウスの脳で実際に電気生理学的にてんかん波が現れるかを確認するために、前記Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミドを電気穿孔したマウス胎児を誕生させた後、生後３週後からビデオ脳電図（Ｖｉｄｅｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｐｈｙ、ｖｉｄｅｏ−ＥＥＧ）検査を行った。発作波を電気的なシグナルで分析するために、生後３週後からビデオ脳電図監視を行った。胎児を母と分離した後、１日に１２時間、ビデオ監視により緊張間代発作が始まるかを確認した。その後、発作を示すネズミを１日６時間、２日以上ビデオ−脳電図監視を行って、てんかん波を示す自発発作について調べた。
【０１６３】
発作間棘波と非痙攣性脳波発作の頻度を測定するために、１０〜１２時間程度撮影したビデオ脳電図データを用い、このデータから１時間間隔で１分のデータを抽出して分析した。
【０１６４】
発作間棘波と非痙攣性脳波発作の頻度はネズミの遺伝型を知らない観察者が計測した。発作間棘波は２００ｍｓ以下のてんかん形状の波が一定間隔で現れ、背景脳波に比べて２倍以上の振幅を有する場合と定義し、非痙攣性脳波発作は少なくとも２個以上の連結された棘徐波（１〜４Ｈｚ）が背景脳波に比べて２倍以上の振幅で現れ、４個の電極ですべて観察される場合と定義した。
【０１６５】
具体的には、前記マウスが授乳を止めた後（＞３ｗｅｅｋｓ）、Ｖｉｄｅｏ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇのみによって発作（Ｓｅｉｚｕｒｅ）発生の有無を確認した後、脳電図測定のために、電極を植え込む手術を進行させた。電極は硬脳膜上層（ｅｐｉｄｕｒａｌ  ｌａｙｅｒ）に位置させ、天井点（Ｂｒｅｇｍａ）を基準として、前頭葉部位に２個（ＡＰ＋２．８ｍｍ、ＭＬ±１．５ｍｍ）、側頭葉部位に２個（ＡＰ−２．４ｍｍ、ＭＬ±２．４ｍｍ）、小脳部位に１個を植え込んで、計５個の電極を植え込んだ。４日間の回復期間をもった後、夕方６時から明け方２時の時間に、マウスあたり２〜５日間（１日６時間）脳電図測定を行った。脳電図シグナルはａｍｐｌｉｆｉｅｒ（ＧＲＡＳＳ  ｍｏｄｅｌ９  ＥＥＧ／Ｐｏｌｙｓｏｍｎｏｇｒａｐｈ、ＧＲＡＳＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）によって増幅され、ｐＣＬＡＭＰ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）またはＲＨＤ２０００  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ、ｂｏａｒｄ（Ｉｎｔａｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｉｅｓ、ＵＳＡ）およびＭＡＴＬＡＢ  ＥＥＧＬＡＢ（ｈｔｔｐ：／／ｓｃｃｎ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｅｅｇｌａｂ）を用いて前記シグナルを分析した。
【０１６６】
その結果、図３Ｂに示されるように、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異遺伝子を発現するマウスの９０％以上がてんかん波を伴う自発発作を示し、てんかん波は高い振幅の高周波、高い振幅の棘徐波、低振幅の高周波を示した。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異遺伝子を発現するネズミからは発作間棘波も現れることを確認することができた。このような自発発作を示すマウスは、緊張期、間代期、ポスト発作期からなる全身緊張−間代性発作を示し、これは、神経節膠腫患者で発生する症状と類似していた。また、前記マウスの緊張脳波は低電圧、高周波の同調した多周波を示し、間代期の脳波は高電圧の一定の形態を示し、ポスト発作期は同調した減衰振幅を示すことを確認した。これとは異なり、野生型ＢＲＡＦタンパク質を発現するマウスは自発発作やてんかん波を示さなかった。
【０１６７】
したがって、前記結果に基づいて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異遺伝子を挿入したプラスミドを注入したマウスでてんかん波を伴った自発発作が発生したことが分かった。
【０１６８】
４−２．動物モデルマウスから神経細胞過活性の確認
実施例４−１で作製したモデルマウスに現れるてんかん波を電気生理学的に分析するために、下記の方法で実験を行った。
【０１６９】
具体的には、実施例４−１で作製したモデルマウスをｖｉｂｒａｔｏｍｅでマウス脳皮質スライスを得た後、人工脳脊髄液溶液で自発的活動電位を測定した。人工脳脊髄液の組成は次の通りである：ｉｎ  ｍＭ、１２４ＮａＣｌ、２６ＮａＨＣＯ３、３ＫＣｌ、１．２５ＫＨ２ＰＯ４、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＳＯ４、および１０Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ。前記マウス脳皮質スライスを脳多チャンネル電極記録装置（ＭＥＤ６４  ｐｒｏｂｅ、＃Ｐ５１５Ａ、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ  Ａｌｐｈａ−Ｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に載せて、スライド固定台（Ｓｌｉｃｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｋｉｔ、ＳＨＤ−２２ＣＫＩＴ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて支持した後、１５分間２ｍＬ／分の速度で人工脳脊髄液を流しながら、３７℃／５％ＣＯ２条件下で発生するてんかん波を測定した。ＳｐｉｋｅｓはＭｏｂｉｕｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。
【０１７０】
その結果は図３Ｃおよび図４に示されている。
【０１７１】
図３Ｃの左側によれば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を誘導する場合、９０％に近いマウスでてんかん発作が起こり、図３Ｃの真ん中によれば、図３Ｃで発作を起こすマウスの場合、平均６週〜７週頃からてんかん表現型を見せ始めた。
【０１７２】
図３Ｃの右側によれば、図３Ｃで発作を起こすＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異型マウスの個々の発作が始まる時期を確認することができた。
【０１７３】
図４によれば、対照群とは異なり、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する脳組織でてんかんに特徴的な、自発的活動波と様々なチャンネルで同時に一時的に短い周期の高振幅のエネルギーが放出されてなるｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｂｕｒｓｔ  ｆｉｒｉｎｇが現れることを確認した。
【０１７４】
したがって、前記結果を通して、対照群の野生型ＢＲＡＦタンパク質を発現するマウスから得られた脳組織とは異なり、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質を発現するマウスから得られた脳組織でてんかんに特徴的な、自発的活動波と様々なチャンネルで同時に一時的に短い周期の高振幅のエネルギーが放出されてなるｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｂｕｒｓｔ  ｆｉｒｉｎｇが現れることを確認することができた。これを通して、実施例４−１で作製したモデルマウスで神経細胞が過活性化されたことが分かった。
【０１７５】
実施例５：ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を発現するマウスのてんかん関連腫瘍特異性の確認
５−１．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異動物モデルマウスの免疫蛍光染色法
実施例４−１で作製した動物モデルマウスの脳組織に対して、実施例３と同様の方法で実験を行ってｇｅｌａｔｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ組織塊を作り、これを−８０℃で保管した。
【０１７６】
実施例３と同様の方法でｇｅｌａｔｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ組織塊を凍結切片にし、これをガラススライド上に載せて、下記の抗体で染色した：ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＮｅｕＮ（１：２００、＃ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）（１：５００、＃ｚ０３３４、ＤＡＫＯ）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ２（Ｏｌｉｇ２）（１：５００、ＡＢ９６１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｓ１００  ｂｅｔａ（１：５００、ａｂ５２６４２、Ａｂｃａｍ）、ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ３４（１：５００、ａｂ８１２８９、Ａｂｃａｍ）、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ６７（ＧＡＤ６７）（１：５００、＃ＭＡＢ５４０６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ（ＰＶ）（１：５００、＃ＭＡＢ１５７２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１（ＶＧＬＵＴ１）（１：５００、＃１３５  ３０３、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ＧＡＢＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＶＧＡＴ）（１：５００、＃１３５  ００２、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＧＦＰ（１：５００、＃Ａｂ１２１８、Ａｂｃａｍ）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＧＦＰ（１：５００、＃Ａｂ２９０、Ａｂｃａｍ）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＲＥＳＴ（１：２００、ＩＨＣ−００１４１、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＵＸ１（１：４００、ＳＣ１３０２４、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）。３回のＰＢＳ洗浄後、組織スライドは次の二次抗体で染色した：Ａｌｅｘａ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：５００、＃Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡｌｅｘａ  ５５５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：５００、＃２１４２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐ３６９３１、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に含まれているＤＡＰＩは核染色に使用した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ３０００Ｂ倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）やＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡を用いてイメージを得た。ＮｅｕＮに陽性の細胞数は１０ｘ対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｓ）を用いて測定した；ニューロンが豊富な地域（ｒｅｇｉｏｎ）内で１つの試料（ｓｕｂｊｅｃｔ）あたり４〜５フィールドを得て、地域あたり１００個以上の細胞を記録した。ＤＡＰＩ−陽性細胞の数は���体細胞数を示す。ニューロン細胞の大きさは、ＮｅｕＮ陽性細胞でＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅの自動化されたカウンティングプロトコル（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｏｆ  ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて測定した。神経細胞のｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙとａｓｐｅｃｔ  ｒａｔｉｏおよび枝突起の皮質面に対する角度は、ＩｍａｇｅＪで自動的に計算した値を参照した。
【０１７７】
５−２．免疫蛍光染色した組織の定量分析を通した神経細胞異形成の確認
実施例５−１と同様の方法で免疫蛍光染色した結果は図５に示されている。
【０１７８】
その結果、図５から確認できるように、実施例４と同様の方法でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を電気穿孔で誘導した大脳領域のＧＦＰ陽性細胞の場合、神経節膠腫で特徴的に現れている神経細胞の異形成が伴っていることを確認することができ（図５のＡ）、前記ＧＦＰ陽性細胞の場合、細胞の大きさが大きくなり、細胞の形状が歪んでおり（図５のＢ）、細胞の形状および神経細胞の枝の配列が正常神経細胞とは異なり任意の方向に配列されている（図５のＣ）ことを確認することができた。
【０１７９】
５−３．免疫蛍光染色した組織の定量分析を通した膠細胞増殖の増加の確認
実施例４−１と同様の方法を用いて作製した動物モデルマウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する神経原性細胞から分化して出た娘細胞を追跡するために、実施例４−１と同様の方法を用いてＣｒｅリコンビナーゼに依存的なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅタンパク質を発現する遺伝子に置換された形質転換マウスをｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を生成可能なマウスを交配してマウスを得て、前記マウスに対してＣｒｅリコンビナーゼを子宮内電気穿孔法で導入して前記マウスに由来するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する神経原性細胞から分化して出る娘細胞をｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光色で追跡した。
【０１８０】
その結果、図６Ｂから確認できるように、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する神経原性細胞から分化して出た娘細胞は、膠細胞系関連星状膠細胞（図６Ｂの左の図）または希突起膠細胞（図６Ｂの右の図）がＢＲＡＦ正常遺伝子を発現するマウスの脳組織に比べて有意に増加していた。
【０１８１】
実施例５−２および５−３の結果をまとめてみれば、実施例４で作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が神経細胞の異形成と膠細胞の数的増加が共に伴っている神経節膠腫疾患をよく反映している動物モデルであることが分かる。
【０１８２】
５−４．免疫蛍光染色した組織の定量分析を通したＣＤ３４マーカーの確認
神経節膠腫は腫瘍組織で病理学的にＣＤ３４の発現量が増加する特徴があることが従来知られているので、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織で実施例５−１と同様の方法で免疫蛍光染色を行って、ＣＤ３４マーカーの発現量を確認した。
【０１８３】
その結果、図７に示されるように、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織でも、対照群とは異なり、ＣＤ３４の発現が２．２倍増加することを確認することができた。
【０１８４】
また、神経節膠腫の特徴を追加的に確認するために、病理学的に神経節膠腫の診断時に使用するヘマトキシリン−エオシンおよびＤＡＢ免疫組織化学染色を用いて、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織を染色した。
【０１８５】
具体的には、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウスの心臓を通してホルマリン（Ｓｉｇｍａ、＃ＨＴ５０１１２８）を注入して固定させた後、パラフィン包埋器（Ｌｅｉｃａ  ＴＰ１０２０）に１日以上パラフィンを浸透させてホルマリン固定パラフィン包埋マウス脳組織を得た。前記ホルマリン固定パラフィン包埋マウス脳組織をｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２１３５）を用いて４ｕｍ厚さに切断後、スライドを一般的なヘマトキシリン−エオシン染色をした。ＣＤ３４の免疫組織化学染色のためには、スライドを先にｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅを用いて抗原の回収をし、漸進的な濃度のアルコールを用いて脱水させた後、３％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ６５２０）を用いて内在的なｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を除去した。この後、組織をブロッキング溶液のＰＢＳ−ＧＴ（ＰＢＳ下の０．２％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎおよび０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いてブロッキングした後、ａｎｔｉ−ＣＤ３４  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５００、ａｂ８１２８９、Ａｂｃａｍ）を用いて常温に保管した。３回のＰＢＳ洗浄後、二次抗体を用いて染色した後、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（ＤＡＢ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて組織内抗原結合部位を可視化した。イメージ強度による偏向を排除するために、正常およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウス組織とも同じ時間反応させ、ヘマトキシリンで背景染色を行った。
【０１８６】
その結果、図８の右の図に示されるように、正常組織では染色されていなかったＣＤ３４の発現がＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウス脳組織で突然変異が発生した地域を中心として目立って発現することを確認することができた。
【０１８７】
前記図７〜図８の結果をまとめて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ体性遺伝体突然変異を有するマウス脳組織では、正常遺伝子を有するマウス脳組織と比較して顕著にＣＤ３４の発現が増加し、このようなパターンは、特に子宮内電気穿孔により突然変異が誘導された神経細胞および組織に沿って特徴的に現れることが分かった。
【０１８８】
５−５．免疫蛍光染色した組織の定量分析を通した皮質異常積層の確認
神経節膠腫は、腫瘍組織で局所皮質異形成症が伴ったり皮質の形成異常の一環で皮質異常積層（Ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｄｙｓｌａｍｉｎａｔｉｏｎ）が観察される場合が多いと知られているので、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織でも類似の様相が現れるかを確認するために、実施例５−４と同様の方法で、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織を固定および準備した後、実施例５−１と同様の方法で皮質の層を区分して確認できるＣｕｘ１マーカーを通して染色を行った。
【０１８９】
その結果、図９に示されるように、正常遺伝子を有するマウス脳組織とは異なり、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ体性遺伝体突然変異を有するマウス脳組織ではＣｕｘ１マーカーが皮質の上端部だけでなく、下端部でも強く観察されていることを確認することができた。特に、Ｃｕｘ１陽性の神経細胞の分布は、正常群とは異なり、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異があるマウスで統計的に有意に負の相関関係を有していることを確認して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ体性遺伝体突然変異を有するマウス脳組織皮質の異常積層が明確に現れることが分かった。
【０１９０】
また、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織を、実施例５−１と同様の方法で免疫組織蛍光分析して、ＮｅｕＮおよびｔｄＴｏｍａｔｏ同時陽性である細胞の分布を確認した時、図１０の上段から確認できるように、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有するマウス脳組織に由来する細胞が正常に分布していない皮質下端部の層でもＮｅｕＮ陽性でかつｔｄＴｏｍａｔｏ陽性である神経細胞が有意に相当量分布（ｒ＝−０．１１２２、ｐ＜０．０００１）を確認することができた。
【０１９１】
しかし、実施例５−３で示した膠細胞に現れた増殖症が神経細胞でも同時に罹患されていないということを、図１０の下端を通して分かった。つまり、神経細胞では細胞の増殖なしに皮質内の位置異常のみが現れていた。
【０１９２】
５−６．結果のまとめ“Ｇ要約
実施例５−２、５−３、５−４、５−５の結果を通して、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウス組織は、神経節膠腫を含む小児低病期神経膠腫のうち、てんかんを伴う頻度が高い腫瘍の所見を非常に類似して反映することを確認することができた。このような所見には、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異による神経細胞の異形成、膠細胞増殖症、神経細胞の枝突起の配列異常、ＣＤ３４陽性所見、および皮質異常積層の罹患などがある。
【０１９３】
実施例６．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の空間的取得による表現型
小児のてんかん関連腫瘍および小児低病期神経膠腫、および実施例３および５−２で説明したように、本発明で提示した動物モデルマウスの場合、膠細胞にもＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が存在しているため、神経細胞または膠細胞由来の突然変異のうちどの突然変異がてんかんを誘発するのに重要な役割を果たすかを確認する必要がある。
【０１９４】
このために、実施例４−１と類似の方法で神経節膠腫患者で発見されるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異をＣｒｅ依存的に発現できるマウスを作製し、前記マウスの出生後１日目にＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミドを電気穿孔した後、約９０日程度行動を追跡観察した。
【０１９５】
具体的には、皮質神経系の分化は、Ｅ１４日には神経細胞が、出生後には膠細胞の分化が活発に行われるため、Ｃｒｅ依存的な遺伝子発現が可能な胚を妊娠した母マウスの妊娠１４日目にＣｒｅプラスミドを注入すれば、突然変異が神経細胞と膠細胞で発生し、マウスが出生後１日目になる時期にＣｒｅプラスミドを注入すれば、突然変異が膠細胞に発生するので、前記事実を利用して膠細胞でのみＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を発生させるために、実施例４−１と同様にマウスを作製するが、Ｃｒｅ依存的な遺伝子発現が可能なマウスが出生後１日目になる時期にＣｒｅプラスミドを注入した。
【０１９６】
その結果、図１１のＢに示されたように、膠細胞でのみＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を発生させるように作製したマウス（ＧＦＡＰ、およびＯＬＩＧ２が膠細胞確認マーカー）では発作が全く発生しないことを確認することができた。
【０１９７】
また、前記膠細胞でのみＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を発生させるように作製したマウスでも、膠細胞増殖症が起こるかを確認するために、実施例５−３と同様に実験を行った結果、図１１のＣに示されるように、膠細胞増殖症は継続して有意に現れていることを確認することができた。
【０１９８】
したがって、前記結果をまとめて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ体性遺伝体突然変異によるてんかんの発達は、膠細胞に起源する突然変異とは無関係であり、神経細胞で発生するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異がてんかん発生機序に重要な役割を果たすことが分かり、また、膠細胞でのみＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が発生する陽性腫瘍の増殖が増加することが分かった。
【０１９９】
実施例７：ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の時間的な取得による表現型
てんかん関連腫瘍の場合、小児で高い比率で発見されるため、患者の力学的な情報のように、本発明のマウスモデルでも幼い時期のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の取得と成体マウスでの突然変異の取得において表現型的な差があるか否かを下記の方法で確認した。
【０２００】
７−１．成体マウスにおけるタモキシフェンを用いて誘導可能なＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異
動物モデルマウス上でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の発生時期を変化させるために、下記の方法を使用した。
【０２０１】
実施例４−１と同様の方法でｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｘｅｄ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅマウスのｔｉｍｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔを作り、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド遺伝子を子宮内遺伝子導入させた後、生後３０日後からタモキシフェンを腹腔内注射してＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ体性遺伝体突然変異をモデルマウスの脳で適切に誘導した。タモキシフェンを出生後３０日後から処理し始め、約３０日間マウスの行動を追跡観察した。
【０２０２】
具体的には、子宮内遺伝子の導入は、Ｔｉｍｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔ１４日（Ｅ１４）の子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｈｏｒｎ）が露出し、個々の胚（ｅｍｂｒｙｏ）の側脳室（ｌａｔｅｒａｌ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）にＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド２〜３ｕｇと結合したＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（Ｆ７２５２、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２ｕｇ／ｍｌをｐｕｌｌｅｄ毛細管（ｐｕｌｌｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ）を用いて注入した。プラスミドは、胚の頭に９００ｍｓの間隔に１００ｍｓの５番電気パルスであるＥＣＭ８３０ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢＴＸ−ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）で５０Ｖを放電して電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）した。また、タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ５６４８）は、コーン油（Ｓｉｇｍａ、Ｃ８２６７）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、３７℃で１日遮光して保管し、正常マウスおよび突然変異マウスともに対して１００ｕｇ／ｇタモキシフェンを腹腔内注射し、５日連続して１日に１回ずつ処理し、直後の１週間は休薬期間をもった後、再び５日連続して処理した。タモキシフェンの処理が終わってから、マウスは行動観察をし始め、タモキシフェンを含まないコーン油のみ処理したマウスや正常マウスにタモキシフェンを処理したマウスを対照群として用いて行動を比較した。前記実験過程の概略的流れは図１２に示されている。
【０２０３】
その結果、図１２の右のグラフから確認できるように、生後３０日後、成体マウスの神経細胞にＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を誘導した場合には、マウスが発作行動を示さなかった。
【０２０４】
７−２．ウイルスを用いたＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異成体マウス
動物モデルマウス上でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の発生時期を変化させるために、ウイルスを用いてＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異成体マウスを下記の方法で作製した。
【０２０５】
具体的には、出生後３０日後のマウスを麻酔させ、定位手術装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）に頭を固定させ、約１ｍｍの直径を有する孔を脳骨に歯科用ドリルで作った。０．５ｕＬのＡＡＶ９．ＣａｍＫＩＩ．ＨＩ．ｅＧＦＰ−Ｃｒｅ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（Ｐｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；ｔｉｔｅｒ  ６．５４ｘ１０１３  ＧＣｍｌ−１）をｇｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅを用いてｓｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｃｏｒｔｅｘ（ＡＰ：−０．５；ＭＬ：−２．０〜−２．５；ＤＶ：−０．５）に遅い速度で注入した（１ｎＬ  ｐｅｒ  ｓｅｃ）。２週経過後、ウイルスを注入したマウスの行動を観察し、脳波を測定し始めた。観察が終わってからは、脳を実施例５−１と同様の方法でｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで凍結組織スライドを２０ｕｍの厚さに準備し、顕微鏡で観察して、ウイルスを通して注入した蛍光レポータータンパク質がよく発現しいるか否かを再確認した。
【０２０６】
その結果、図１３から確認できるように、実施例７−１でタモキシフェンを用いて成体マウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を誘導したのと同様に、ウイルスを用いて突然変異を誘導したマウスの場合にも発作は現れなかった。
【０２０７】
７−３．成体マウスにおけるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異誘導による細胞学的異常様相の確認
実施例７−２、および７−３の方法と同様に、成体マウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ体性遺伝体突然変異を誘導した後、実施例５−２と同様の方法で神経細胞の異形成の有無を確認した。
【０２０８】
その結果、図１４から確認できるように、成体マウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を誘導（ＢＲＡＦＷＴ／ＬＳＬ−Ｖ６００Ｅ）する場合、実施例４−１と同様の方法で作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウスの場合と同様に、正常ＢＲＡＦ遺伝子を有しているマウス（ＢＲＡＦＷＴ／ＷＴ）と比較して、細胞の大きさ（図１４のＡ）、細胞のｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ、ａｓｐｅｃｔ  ｒａｔｉｏ（図１４のＢ）および枝突起の皮質表面に対する角度（図１４のＣ）などが正常ＢＲＡＦ遺伝子を有しているマウスと大きな差はなかった（神経細胞の異形成存在せず）。
【０２０９】
また、タモキシフェンを用いて成体マウスでＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を誘導した場合にも、正常ＢＲＡＦ遺伝子を有しているマウスと比較して、細胞の大きさ、細胞のｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ、ａｓｐｅｃｔ  ｒａｔｉｏおよび枝突起の皮質表面に対する角度などが正常ＢＲＡＦ遺伝子を有しているマウスと大きな差はなかった（図１４のＤ）（神経細胞の異形成存在せず）。
【０２１０】
前記結果を通して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が胚発生段階の神経細胞でのみ発生した時、神経細胞の異形成を誘導しててんかんを起こすことが分かった。
【０２１１】
実施例８．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤の注入による発作減少の確認
実施例４−１と同様の方法で作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウスに発生する発作の頻度を低減するために、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤を処理し、その効果を確認した。
【０２１２】
具体的には、実施例４−１と同様の方法で作製したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異マウスの脳組織に長期間ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異タンパク質特異的活性阻害剤（Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）を注入した。Ｚｏｌｅｔｉｌ（０．０１ｍｇ／ｋｇ）とｒｏｍｐｕｎ（０．２ｍｇ／ｋｇ）を混合した溶液を腹腔内注入方式で全身麻酔し、ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｃａｎｎｕｌａ（ＡＬＺＥＴ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｋｉｔ３）が連結されたｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ（ＡＬＺＥＴ  ｐｕｍｐｓ  ２００４  ｏｒ  ２００６、ＡＬＺＥＴ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐｓ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）にｖｅｈｉｃｌｅ（ＤＷ上の５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）または５００ｕｍ  ＰＬＸ４０３２（Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）（Ｖ−２８００、ＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を右脳室空間（ＡＰ：−０．６；ＭＬ：−１．０；ＤＶ：−２．０）に持続的脳室内注入（ｃＩＣＶ、ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。脳波を追跡するために、４つのＥＥＧ  ｐｒｏｂｅｓ（ｌｅｆｔ／ｒｉｇｈｔ  ｆｒｏｎｔａｌ  ｌｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｌｅｆｔ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂｅｓ、ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ａｓ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を実施例４−１と同様の方法で動物モデルマウスの頭に挿入した後、脳波シグナルを得て、５〜６週経過後、マウスをｓａｃｒｉｆｉｃｅし、脳を取り出して後の研究に用い、この時、ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ内の半透過性膜が縮小しているか否かを再確認した。薬物注入は４週〜６週まで実施し、この時点でマウスの脳波を追跡記録した。
【０２１３】
その結果を図１５〜図１７に示した。
【０２１４】
図１５によれば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤を投入したマウスの場合、発作行動（ｉｃｔａ  ｓｅｉｚｕｒｅ）が約４倍減少することを確認することができ（図１５のＢ）、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤を６週間処理した時にも発作が減少し続けていることを電気生理学的に確認することができた（図１５のＣ）。
【０２１５】
図１６によれば、電気生理学的発作（ｅｌｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ）が２倍〜３倍減少し（図１６の真ん中）、発作間棘波（Ｉｎｔｅｒｉｃｔａｌ  ｓｐｉｋｅ）が１．３倍〜１．５倍減少することを確認することができた。
【０２１６】
また、図１７によれば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ特異的阻害剤を一時的に脳室に注入（ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（３回／ｄａｙ、５ｕＬを８分間注入）（図１７の左側）したり、経口投薬（ＰＯ、ｐｅｒ  ｏｒａｌ）（図１７の右側）をした場合、発作頻度が減少しないことを確認することができた。
【０２１７】
実施例９．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異による発作関連機序
ｍＴＯＲシグナリング経路の異常な活性はてんかん発作を誘導すると知られており、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異はＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫのＭＡＰＫシグナリング経路を活性化させることが知られている。一方、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異が活性化させることが知られているＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫのＭＡＰＫシグナリング経路はｍＴＯＲシグナリング経路と互いにｃｒｏｓｓｔａｌｋして、ｍＴＯＲシグナリング経路を活性化することが知られており、神経節膠腫患者の組織でｍＴＯＲシグナリング経路に関連するタンパク質の発現が増加していることが報告された。したがって、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異によりｍＴＯＲシグナリング経路が活性化されててんかん発作が発生するか否かを確認するために、下記の実験を行った。
【０２１８】
具体的には、実施例４−１と同様の方法で作製した動物モデルマウスに対して、ｍＴＯＲ特異的阻害剤のラパマイシンを腹腔内注射で注入した後、その変化を確認した。ラパマイシン（ＬＣ  Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）は１００％エタノールに２０ｍｇ／ｍｌに希釈して原液を作った後、−２０℃で保管した。ラパマイシンを動物モデルマウスに注射する前に、ラパマイシン原液を５％（ｗ／ｖ）ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ４００と５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０に希釈して１ｍｇ／ｍＬラパマイシンと４％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を作った。作られた溶液を腹腔内注射法で１〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間投与した（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ腹腔注射、２週間）。
【０２１９】
その結果、図１８に示されるように、ラパマイシンの投与にもかかわらず、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異動物モデルマウスのてんかん発作頻度は減少せず、ｍＴＯＲ下位経路にあるＳ６タンパク質のリン酸化も、正常マウス組織に比べてＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異動物モデルマウス組織が大きな差を示さなかった。
【図１Ａ】
0006941688.tif 000009
【図１Ｂ】
0006941688.tif 000010
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0006941688.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006941688.tif 000020
【図６Ｃ】
0006941688.tif 000021
【図６Ｄ】
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【図７】
0006941688.tif 000023
【図８】
0006941688.tif 000024
【図９】
0006941688.tif 000025
【図１０】
0006941688.tif 000026
【図１１】
0006941688.tif 000027
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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