(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）遺伝子およびＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）遺伝子発現を同時に抑制する核酸分子であって、
前記核酸分子は、配列番号１および２；配列番号３および４；配列番号５および６；配列番号７および８；配列番号９および１０；配列番号１１および１２；配列番号１３および１４；配列番号１５および１６；または配列番号１７および１８；の塩基配列を含み、
前記配列番号１は配列番号２と、配列番号３は配列番号４と、配列番号５は配列番号６と、配列番号７は配列番号８と、配列番号９は配列番号１０と、配列番号１１は配列番号１２と、配列番号１３は配列番号１４と、配列番号１５は配列番号１６と、配列番号１７は配列番号１８と部分的に相補的に結合を成している二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ｓｉＲＮＡまたは一本鎖ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であることを特徴とする、核酸分子。
【請求項２】
前記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７にて表示される塩基配列は、ＲＮＡ干渉によってｍＴＯＲ遺伝子発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８で表示される塩基配列は、ＲＮＡ干渉によってＳＴＡＴ３遺伝子発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子は、配列番号２０または配列番号２１の塩基配列で表されるｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１の核酸分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項５の組換え発現ベクターを導入した組換え微生物。
【請求項７】
請求項１の核酸分子を有効成分として含む、抗がん用薬学的組成物。
【請求項８】
前記核酸分子は、抗がん剤をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の抗がん用薬学的組成物。
【請求項９】
前記抗がん剤は、シスプラチン、パクリタキセル、５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノールビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ビンデンシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェンおよびタキソールからなる群から選択された１種以上の抗がん剤であることを特徴とする請求項８に記載の抗がん用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＴＯＲ遺伝子およびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子と、これを含む抗癌用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界的に最も多い死亡者を出す疾病の一つで、革新的な癌治療剤の開発は、これに対する治療時に発生する医療費を節減できると同時に高付加価値を創り出すことができる。また、２００８年度の統計によれば、既存の抗がん剤耐性を克服できる分子治療剤は、主要７カ国（ＵＳ、Ｊａｐａｎ、Ｆｒａｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｉｔａｌｙ、Ｓｐａｉｎ、ＵＫ）で＄１７．５ｂｉｌｌｉｏｎを占め、２０１８年度の場合、約＄４５ｂｉｌｌｉｏｎ程度のｍａｒｋｅｔ  ｓｉｚｅを占め、２００８年比で９．５％の成長率を示すものと予測されている。癌の治療は、手術、放射線治療、化学療法、生物学的治療に区分されるが、この中で化学療法は、化学物質で癌細胞の増殖を抑制し殺す治療法であり、抗癌剤によって現れる毒性は、相当部分正常細胞でも現れるため、一定程度の毒性を示し、抗癌剤の効果が現れるものの、一定期間使用後には効果が喪失する耐性が発生するので、癌細胞に選択的に作用して耐性が現れない抗癌剤の開発が切に望まれる（癌征服の現住所Ｂｉｏｗａｖｅ  ２００４．６（１９））。近年、癌に対する分子遺伝情報の確保により癌の分子的特性を標的にした新しい抗癌剤の開発が進行されており、癌細胞だけが持っている特徴的な分子的標的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ）をねらう抗癌剤は、薬剤の耐性が現れないとの報告もある。
【０００３】
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病治療のための治療剤の開発および標的検証における重要な道具である。干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」という）は、その役割が発見された以後、多様な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）で、配列特異的ｍＲＮＡに作用することが明らかになった（非特許文献１）。ＲＮＡｉは、２１〜２５個のヌクレオチドの大きさの二本鎖構造を有する小さな干渉リボ核酸、短干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下ｓｉＲＮＡという）が、相補配列を有する転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に特異的に結合して、該転写体を分解することによって、特定の蛋白質の発現を抑制する現象である。細胞内では、ＲＮＡ二本鎖がＤｉｃｅｒと呼ばれるエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によりプロセッシングされ、２１〜２３個の二本鎖（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ、ｂｐ）のｓｉＲＮＡへと変換され、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と結合してガイド（アンチセンス）鎖が、標的ｍＲＮＡを認識して分解する過程を通じて標的遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（非特許文献２）。ベルトラン（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究グループによれば、同じ標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡがアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べて生体内／外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果が優れて、該当効果が長く持続される効果があることが明らかになった（非特許文献３）。ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ技術基盤の治療剤市場は、今後、世界市場規模が、２０２０年頃には計１２兆ウォン以上を形成するものと分析されており、当該技術を適用できる対象が大幅に拡大され、従来の抗体、化合物基盤の医薬品では治療し難い疾病を治療できる次世代の遺伝子治療技術として評価されている。また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、標的ｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するため、従来の抗体基盤の医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）が、特定の蛋白質標的に最適化されるまでの長い間、開発期間と開発コストがかかることに対し、適用できる対象が画期的に拡大され得、開発期間が短縮され、かつ医薬化が不可能な標的物質を含むすべての蛋白質標的に対して最適化されたリード化合物を開発することができるという利点がある（非特許文献４）。これに、最近、このリボ核酸媒介干渉現象が既存の化学合成医薬開発にて発生する問題への解決策を提示し、かつ転写体レベルで特定蛋白質の発現を選択的に抑制し、様々な疾病の治療剤、特に腫瘍治療剤の開発に利用しようとする研究が進められている。また、ｓｉＲＮＡ治療剤は、既存の抗癌剤とは異なり、標的が明確なため、副作用の予測が可能であるという長所があるが、これらの標的特異性は、様々な遺伝子の問題によって発生する病気である腫瘍の場合には、むしろ、これらの標的特異性は、治療効果が高くない原因にもなる。
【０００４】
ｍＴＯＲ（哺乳類のラパマイシン標的；ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、サイトカイン−刺激細胞増殖、細胞周期の位相、Ｇ１期を調節するいくつかの重要な蛋白質のためのｍＲＮＡの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）誘導転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を含む、様々な信号変換経路において重要な酵素である。ｍＴＯＲの阻害は、細胞周期のＧ１期からＳ期までの進行の抑制を引き起こす。ｍＴＯＲ阻害剤は、免疫抑制、抗増殖および抗癌活性を示すので、これらの疾患の治療のためにｍＴＯＲが標的とされている（非特許文献５）。また、ｍＴＯＲは、自己消化（ａｕｔｏｐｈａｇｅ）調節に重要な因子であって、自己消化経路を調節するｍＴＯＲを標的として、様々な疾患、例えば、癌、神経変性疾患、心臓疾患、老化、免疫疾患、感染症疾患、クローン病などを治療することができる（非特許文献６）。
【０００５】
ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）は、細胞の外部の様々な成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の信号を核に伝達して転写を促進する転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）であり、細胞内不活性状態で転写活性ドメイン（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）のチロシン残基がリン酸化されて活性化されると、核内に流入される（非特許文献７）。リン酸化されたＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）は、核のＤＮＡと結合して細胞の成長（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）と分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）などの腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）に関連する広範囲な標的遺伝子の発現を誘導し、固形癌および血液癌患者の約７０％から常時活性化している（非特許文献８）。しかし、ＳＴＡＴ３のような転写因子は、蛋白の３次構造により、活性を阻害できる標的を見つけるのが困難なため、伝統的な合成新薬開発の分野において、乱開発（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）とされてきた（非特許文献９）。したがって、ＳＴＡＴ３の発現を阻害できるｓｉＲＮＡ治療剤及びこれの伝達技術に対する市場の需要は、非常に高い状況である。
【０００６】
すなわち、Ｓｔａｔ３およびｍＴＯＲは、発現の程度に応じて肺癌、前立腺癌、頭頸部癌などにおいて、予後が決定づけられる主要な癌関連の遺伝子であって、抗癌剤開発の標的となっているものの、細胞質に存在するので、今まで多く用いられていた抗体の治療薬では接近が不可能であり、また、薬物で伝達するには全身性副作用が予想され、これらを抑制するための新薬開発が難しいのが実情である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、「Ｓｉｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２００５，Ｖｏｌ．８３、ｐ．７６４−７７３
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、「ＮＵＣＬＥＩＣ−ＡＣＩＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＣＥＮＴ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」２００２、１、ｐ．５０３−５１４
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、２００２、Ｖｏｌ．２９６、ｐ．１０００−１００４
【非特許文献４】ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ」、２００６、Ｖｏｌ．１３、No.４、ｐ．６６４−６７０
【非特許文献５】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ、２００５、Ｖｏｌ．１６、ｐ．３１７−３２３
【非特許文献６】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７：７６７−７７７；  Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１０６９−１０７５、２００８
【非特許文献７】Ｊａｋ−Ｓｔａｔ、「ＳＴＡＴ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｈａｖｅ  ａｌｌ  ｒｏａｄｓ  ｂｅｅｎ  ｅｘｐｌｏｒｅｄ」、２０１３、１；２（１）：ｅ２２８８２
【非特許文献８】Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ。ＢｉｏＭｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ。２０１３；２０１３：４２１８２１
【非特許文献９】Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＳＴＡＴ３  ａｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  。Ｃａｎｃｅｒｓ。２０１４；１６；６（２）：９２６−５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ｍＴＯＲ遺伝子およびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を同時に抑制する核酸を提供するものであって、本発明では、ｓｉＲＮＡの標的特異性に起因する治療効果が高くない欠点を克服するために、癌に関連するｍＴＯＲ遺伝子およびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を同時に抑制するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを作製し、これらの抗癌活性と抗癌剤との相乗的な抗癌活性を確認することによって、これを癌の予防または治療用薬学的組成物として用いることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記組換え発現ベクターを導入した組換え微生物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記核酸分子を有効成分として含む、抗癌用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、薬学的に有効な量の請求項１の核酸分子を個体に投与する段階を含む、癌の予防と治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、本願発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、センス鎖は、ｍＴＯＲ遺伝子の発現を抑制し、アンチセンス鎖は、ＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制し、それぞれのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを別々に処理しなくても二つの遺伝子を同時に抑制することができる。これにより、癌細胞の死滅を促進し、抗癌剤との併用処理において、癌細胞の死滅を相乗的に向上させる効果があり、局所的に伝達が可能で、選択性に優れているので、様々な癌の種類に抗癌用組成物または抗癌サプリメントとして有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡ配列をループ配列と共に一本鎖に含まれるｓｈＲＮＡを、細胞内で発現するためのベクターのマップを示す図である。
【図２】本発明の二重標的の二本鎖ｓｉＲＮＡによるｍＴＯＲまたはＳＴＡＴ３遺伝子の発現抑制効果を確認した図である。
【図３】ｍＴＯＲ遺伝子およびＳＴＡＴ３遺伝子の発現が相互影響を及ぼすのかを確認するために、ｍＴＯＲ遺伝子またはＳＴＡＴ３遺伝子のｓｉＲＮＡをそれぞれまたは一緒に処理してｍＴＯＲとＳＴＡＴ3の発現量を確認した図である（ｎｃ２は、対照群ｓｉＲＮＡ；ｓｉｍＴＯＲは、ｍＴＯＲのみを標的化するｓｉＲＮＡ；ｓｉＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴ３のみを標的化するｓｉＲＮＡ；ｓｉｍＴＯＲ＆ＳＴＡＴ３は、ｍＴＯＲ標的化ｓｉＲＮＡおよびＳＴＡＴ３標的化ｓｉＲＮＡ併用処理）。
【図４】本発明の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したときのヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞の細胞生存率を確認した図である。
【図５】シスプラチン処理後、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したときのヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞の細胞生存率を確認した図である。
【図６】パクリタキセル処理後、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したときのヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞の細胞生存率を確認した図である。
【図７】５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）処理後、本発明の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したときのヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞の細胞生存率を確認した図である。
【図８】配列番号２０のＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡループｓｈＲＮＡ配列または配列番号２１のＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧループｓｈＲＮＡを含むベクターによるｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３の発現量をｓｈＲＮＡのＤＮＡ量に応じて確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を同時に抑制する核酸分子を提供する。
【００１７】
前記核酸分子は、配列番号１および２；配列番号３および４；配列番号５および６；配列番号７および８；配列番号９および１０；配列番号１１および１２；配列番号１３および１４；配列番号１５および１６；または配列番号１７および１８；の塩基配列を含むことができる。
【００１８】
一実施例において、前記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７で表示される塩基配列は、ＲＮＡ干渉によりｍＴＯＲ遺伝子発現を抑制し、前記配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８で表示される塩基配列は、ＲＮＡ干渉によりＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制することができ、本発明の核酸分子は、ｍＴＯＲ遺伝子とＳＴＡＴ３遺伝子の発現を同時に抑制することができる。
【００１９】
一実施例において、前記配列番号１は配列番号２と、配列番号３は配列番号４と、配列番号５は配列番号６と、配列番号７は配列番号８と、配列番号９は配列番号１０と、配列番号１１は配列番号１２と、配列番号１３は配列番号１４と、配列番号１５は配列番号１６と、配列番号１７は配列番号１８と部分的に相補的結合を成している二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）ｓｉＲＮＡをなすように作製し、二本鎖ｓｉＲＮＡがそれぞれｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子を標的化して発現を抑制することを確認することによって、二重標的ｓｉＲＮＡセットであることを確認した。
【００２０】
本発明において、ｍＴＯＲまたはＳＴＡＴ３を標的とするｓｉＲＮＡは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のｍＴＯＲ遺伝子またはＳＴＡＴ３遺伝子の一部と１００％相補的な配列を有し、ｍＴＯＲ遺伝子またはＳＴＡＴ３遺伝子のｍＲＮＡを分解したり、翻訳を抑制することができる。
【００２１】
本発明にて用いられる用語、「発現抑制」とは、標的遺伝子の発現または翻訳の低下を惹起することを意味し、好ましくは、これにより標的遺伝子の発現が検出不可能になり、無意味なレベルで存在することを意味する。
【００２２】
本発明にて用いられる用語、「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」とは、特定のｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を通じてＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象を誘導することができる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。一般的に、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖で構成されるが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７の塩基配列で表示されるｓｉＲＮＡ（ｍＴＯＲ遺伝子のアンチセンス鎖）であり、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（ＳＴＡＴ３遺伝子のアンチセンス鎖）であるので、二本鎖ｓｉＲＮＡがそれぞれ同時にｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制することができるので、効率的な遺伝子ノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）法として、または、遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）法として提供される。
【００２３】
一実施例において、セット１の配列番号１および２のｓｉＲＮＡは、２１ｍｅｒのうち１７ｍｅｒが、セット２の配列番号３および４のｓｉＲＮＡは、２０ｍｅｒのうち１６ｍｅｒが、セット３の配列番号５および６のｓｉＲＮＡは１９ｍｅｒのうち１５ｍｅｒが、セット４の配列番号７および８のｓｉＲＮＡは１８ｍｅｒのうち１４ｍｅｒが、セット５の配列番号９および１０のｓｉＲＮＡは１７ｍｅｒのうち１６ｍｅｒが相補的に結合する。また、セット６の配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡは、２０ｍｅｒのうち１７ｍｅｒが、セット７の配列番号１３および１４のｓｉＲＮＡは、１９ｍｅｒのうち１６ｍｅｒが、セット８の配列番号１５および１６のｓｉＲＮＡは、１８ｍｅｒのうち１５ｍｅｒが、セット９の配列番号１７および１８のｓｉＲＮＡは、１７ｍｅｒのうち１５ｍｅｒが相補的に結合する。
【００２４】
前記塩基配列の変異体が、本発明の範囲内に含まれる。本発明のｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子発現を同時に抑制する核酸分子は、これを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、核酸分子の一部の塩基配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により変形されたが、核酸分子と機能的に同様の作用をすることができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。具体的には、前記遺伝子は、配列番号１〜１８の塩基配列とそれぞれ７０％以上、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。核酸分子の「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域とを比較することにより確認され、比較領域における核酸分子の配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（つまり、ギャップ）を含むことができる。
【００２５】
また、本発明は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００２６】
本発明にてｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡが伝達された細胞において適宜転写されるようにするためにはこれを含むｓｈＲＮＡ、特に、配列番号１〜１８の塩基配列が一部変形されたｓｈＲＮＡを少なくともプロモーターに作動可能に連結されるのが好ましい。前記プロモーターは、真核細胞において機能することができるプロモーターであれば如何なるものでも差し支えない。ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの効率的な転写のために必要に応じてリーダー配列、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサー、上流活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子をはじめとする調節配列をさらに含むこともできる。前記ｓｈＲＮＡは、配列番号２０または配列番号２１の塩基配列で表示されることができる。
【００２７】
本発明の用語「ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）」とは、一本鎖ＲＮＡにおいて部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、３’領域に二本鎖構造を有するヘアピンと同様の構造を形成し、細胞内で発現された後、細胞内に存在するＲＮａｓｅの一種であるｄｉｃｅｒによって切断され、ｓｉＲＮＡに変換することができるＲＮＡを意味するが、前記二本鎖構造の長さは、特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。本発明において、前記ｓｈＲＮＡは、ベクターに含まれることができる。
【００２８】
本明細書において、用語「ベクター」は、宿主細胞において目的とする遺伝子を発現させるための手段として、プラスミドベクター；ファージミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ−随伴ウイルスベクターなどのようなウイルスベクターなどを含むことができる。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のベクターにおいて遺伝子は、プロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）されている。
【００３０】
本発明において、用語「作動的に結合された」とは、遺伝子発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の遺伝子配列間との機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の遺伝子配列の転写および／または解読を調節することになる。
【００３１】
本発明のベクターシステムは、当業界に公知の様々な方法により構築されることができ、これに対する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ。（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに開示されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００３２】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築することができる。本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびＴ７プロモーターなど）、解読開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むのが一般的である。宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ．（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８：１０１８−１０２４）、そしてファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ、Ｄ．（１９８０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１４：３９９−４４５）を調節部位として用いることができる。
【００３３】
一方、本発明に用いることができるベクターは、当業界でよく用いられているプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９等）、ファージミド（例えば、ｐＣｏｍｂ３Ｘ）、ファージまたはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製することができる。
【００３４】
なお、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶ  ＴＫプロモーター）が用いられることができ、転写終結配列として、ポリアデニル化配列を、一般的に有する。
【００３５】
本発明のベクターは、タンパク質の精製を容易にするために、必要に応じて他の配列と融合されることもでき、融合される配列は、いわゆる、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ  ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）および６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などが用いられることができるが、これに限定されるものでない。また、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界で通常的に用いられる抗生物質耐性遺伝子を含むことができ、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ケネチシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００３６】
また、本発明は、前記組換え発現ベクターを導入した組換え微生物を提供する。
【００３７】
本発明のベクターを安定、かつ連続的にクローニングおよび発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知された如何なる宿主細胞も用いることができ、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリスおよびバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むが、これに制限されるものではない。前記宿主細胞は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉであり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５３７、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨシリーズ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１である。
【００３８】
本発明のベクターを宿主細胞内に運ぶ方法は、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ、ＳＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０−２１１４）は、ハナハンの方法（Ｃｏｈｅｎ、ＳＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０−２１１４；およびＨａｎａｈａｎ、Ｄ．（１９８３）、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６：５５７−５８０）、および電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ、ＷＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：６１２７−６１４５）などにより実施することができる。
【００３９】
また、本発明は、前記核酸分子を有効成分として含む、抗がん用薬学的組成物を提供する。
【００４０】
前記核酸分子は、抗がん剤をさらに含むことができ、例えば、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アムプリゲン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングシネート、アサリー、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、バチルス・カルメット−グエリン（ＢＣＧ）、Ｂａｋｅｒのアンチホル、ベタ−２−ジオキシチオグアノシン、ビサントレンＨＣｌ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ  ７７３Ｕ８２、ＢＷ  ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ  ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、クロロキノキサリン−スルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウム・パルブム、ＣＰＴ−１１、クリスナトル、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレエート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、デアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンハイドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ジデムニンＢ、ジジエチルジチオカルバメート、ジクリコアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エキノマイシン、エダトレキセート、エセルホシン、エフロルニチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エタニダゾール、エチオホス、エトポシド、ファドラアゾール、ファザラビン、ペンレチニド、フィルグラスチム、フィナステライド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５’−フルオロウラシル、ＦｌｕｏｓｏｌＴＭ、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセタミド、ホモハリントニン、硝酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣｌ、イフォスファミド、４−イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミソール、リポソーマルダウオルビシン、リポソーム被包性ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６−メルカプトプリン、メスナ、バチルス・カルメット−グエリンのメタノール抽出物、メトトレキサート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、ミトマイシン−Ｃ、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、単核細胞／大食細胞コロニ−刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルジノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジン注射、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、塩酸トリフルオペラジン、トリフルリジン、トリメトレキセート、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ  ８６４、ゾルビシン、サイトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、タキソール及びこれらの混合物を含むことができる。好ましくはシスプラチン、パクリタキセル、５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェンおよびタキソールであり、より好ましくは、シスプラチン、パクリタキセルまたは５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）であるが、本発明の核酸分子と併用して処理し、抗がん効果に相乗効果が奏されるように目的を達成するためなら、これに制限されるものでない。
【００４１】
前記癌は、大腸癌、乳癌、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部癌、悪性黒色腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、胃癌、肺癌、膵臓癌、非小細胞性肺癌、肝臓癌、食道癌、小腸癌、肛門付近がん、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、骨癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色種、内分泌腺癌、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ；ＣＮＳ）腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、多形膠芽細胞腫と下垂体腫瘍からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。
【００４２】
本発明の薬学的組成物には、単一のドメイン抗体に加えて、サプリメント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことができる。前記サプリメントは、当該技術分野で知られているものであれば、何ら制限なく使用することができるが、例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全サプリメントまたは不完全サプリメントをさらに含み、その効果を増加させることができる。
【００４３】
本発明に係る薬学的組成物は、有効成分を薬学的に許容された担体に混入させた形態で製造することができる。ここで、薬学的に許容された担体は、製薬分野で通常用いられる担体、賦形剤、および希釈剤を含む。本発明の薬学的組成物に利用できる薬学的に許容された担体は、これらに限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油を挙げることができる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。
【００４５】
製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、有効成分に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般的に使用される希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水溶性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラノリン脂、グリセロールゼラチンなどが使用されることができる。
【００４６】
本発明に係る薬学的組成物は、個体にさまざまな経路で投与することができる。投与のあらゆる方式が想定されるが、例えば、経口、静脈、筋肉、皮下、腹腔内注射によって投与することができる。
【００４７】
本発明による薬学的組成物の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体の状態などを考慮して選択される。前記薬学的組成物の中、含まれるシングルドメイン抗体の濃度は、対象に応じて多様に選択することができることは自明であり、好ましくは薬学的組成物に０．０１〜５０００μｇ／ｍｌの濃度で含まれるものである。その濃度が０．０１μｇ／ｍｌの未満の場合には、薬学活性が示されないこともあり、５，０００μｇ／ｍｌを超える場合には、人体に毒性を示すことができる。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、癌およびその合併症の予防または治療に用いられることができ、抗がんサプリメントとしても使用することができる。
【００４９】
また、本発明は、薬学的に有効な量の請求項１の核酸分子を個体に投与する段階を含む、癌の予防および治療方法を提供する。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、治療的有効量または薬学的に有効な量で投与する。用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類および重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物への感度、投与時間、投与経路、および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。
【００５１】
下記の実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであって、これにより本発明が限定されるものではない。
【００５２】
実施例１．二重標的ｓｉＲＮＡ作製
ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３）及びｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を同時に抑制することができる二重標的ｓｉＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）を下記の表１の配列で作製した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）。
【００５３】
【表１】
0006962600.tif 000002
【００５４】
前記セット１の配列番号１および２のｓｉＲＮＡは、２１ｍｅｒのうち１７ｍｅｒが、セット２の配列番号３および４のｓｉＲＮＡは、２０ｍｅｒのうち１６ｍｅｒが、セット３の配列番号５および６のｓｉＲＮＡは、１９ｍｅｒのうち１５ｍｅｒが、セット４の配列番号７および８のｓｉＲＮＡは、１８ｍｅｒのうち１４ｍｅｒが、セット５の配列番号９および１０のｓｉＲＮＡは、１７ｍｅｒのうち１６ｍｅｒが相補的に結合する。また、セット６の配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡは、２０ｍｅｒのうち１７ｍｅｒが、セット７の配列番号１３および１４のｓｉＲＮＡは、１９ｍｅｒのうち１６ｍｅｒが、セット８の配列番号１５および１６のｓｉＲＮＡは、１８ｍｅｒのうち１５ｍｅｒが、セット９の配列番号１７および１８のｓｉＲＮＡは、１７ｍｅｒのうち１４ｍｅｒが相補的に結合する。
【００５５】
具体的には、各セットの二つの序列がｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ形態で細胞内に入った後は、各セットのａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿ｍＴＯＲのｓｉＲＮＡがｍＴＯＲ  ｍＲＮＡ（ｇｉ｜２０６７２５５５０｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００４９５８．３｜Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）（ＭＴＯＲ）、ｍＲＮＡ）の標的部位に相補的に結合する。
【００５６】
また、各セットのａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿ＳＴＡＴ３のｓｉＲＮＡがＳＴＡＴ  ｍＲＮＡ（ｇｉ｜４７０８０１０４｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿１３９２７６．２｜Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３（ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＴＡＴ３）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １、ｍＲＮＡ）の標的部位に相補的に結合してｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子発現を減少させる。
【００５７】
実施例２．二重標的ｓｉＲＮＡを含むｓｈＲＮＡを発現する組み換え発現ベクターの作製
前記実施例１にて作製したセット１の配列番号１および２の二重標的ｓｉＲＮＡを細胞内で発現するために、前記ｓｉＲＮＡ二本鎖配列とループ配列（ＵＵＧＧＡＵＣＣＡＡループｓｈＲＮＡおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧループｓｈＲＮＡ）を含むｓｈＲＮＡをコードする核酸分子を作製した（各核酸分子の配列は、それぞれ表２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０および２１に示す）。各核酸分子をｐＥ３．１ベクター（図１）の制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶ切断位置にＵ７プロモーター（配列番号１９）の後に来るように配置して、ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を標的とする二重標的ｓｉＲＮＡを含む２種のｓｈＲＮＡを細胞内で発現することができる組換え発現ベクターを作製した（各ｓｈＲＮＡの配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６および２７に示す）。
【００５８】
【表２】
0006962600.tif 000003
【００５９】
実験例１．二重標的ｓｉＲＮＡのｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子発現抑制効果を確認
１２−ウェルプレートにＨｅｌａ細胞を分注した後、細胞ｃｏｎｆｌｕｅｎｔが５０％になるまで、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）が添加されたＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。その後、前記細胞に、前記実施例１にて作製した二重標的ｓｉＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でトランスフェクションしてＢｃｌ１、ＢＩ１、ＡＲ、ｍＴＯＲ、およびＳＴＡＴ３を同時にノックダウンした。トランスフェクション４８時間後、細胞を破砕してＧｅｎｅＪＥＴ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡを鋳型として用い、ＲｅｖｏＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ＰｒｅＭｉｘ（ｉＮｔＲＯＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）で逆転写反応を行った。逆転写されたｃＤＮＡを２５〜２００ｎｇ含有した試料２０μｌとＡｍｐＯＮＥ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧｅｎｅＡｌｌ）およびＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｍＴＯＲ（Ｈｓ００２３４５２２＿ｍ１）、ＳＴＡＴ３（Ｈｓ０１０４７５８０＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）に対し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍおよびＱＳ３  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて反応を行った。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ反応条件は、［５０℃で２分、９５℃で１０分、および９５℃で１５秒および６０℃で６０秒の二段階のサイクル］を全４０サイクル行った。すべての反応は３回ずつ繰り返し実行され、それらの平均値を求めた。このようにして得られた結果は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ値に対して正規化した。
【００６０】
その結果、セット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡによってｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３は、対照群と比較して、残余発現が約２０〜４０％であることが確認され、二重標的ｓｉＲＮＡが両遺伝子共に発現抑制することが分かった（図２）。
【００６１】
実験例２．ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３の遺伝子相互発現の影響性を確認
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９に前記実験例１と同様に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を利用して、下記表３のｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ（ｂｉｏｎｅｅｒ、１０５８９０６）（配列番号２２および２３）、ＳＴＡＴ３  ｓｉＲＮＡ（ｂｉｏｎｅｅｒ、１１４５６５８）（配列番号２４および２５）またはｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡとＳＴＡＴ３  ｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、前記実験例１と同様にＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）を利用して、ｍＴＯＲとＳＴＡＴ３遺伝子発現の減少割合を確認した。
【００６２】
【表３】
0006962600.tif 000004
【００６３】
【表４】
0006962600.tif 000005
【００６４】
その結果、それぞれのｓｉＲＮＡによりｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３発現が減少しており、この結果を両ｓｉＲＮＡと同時に処理した場合と比較した結果、ｍＴＯＲ遺伝子およびＳＴＡＴ３遺伝子の発現は、相互間に影響を与えなかった（図３及び表４）。
【００６５】
実験例３．二重標的ｓｉＲＮＡによる癌細胞死滅効果を確認
本発明のセット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡによる癌細胞の死滅効果を確認するために、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに５×１０３ｃｅｌｌ／ウェルで分注した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００で二重標的ｓｉＲＮＡ（ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時にノックダウン）をそれぞれ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、さらに２４時間後に５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｔｄ．）を細胞に処理し、４時間インキュベーションした。その後、培地を除去し、可溶化溶液（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１５０μｌを処理し、３７℃で４時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定し、下記数式を用いて、細胞の生存率を計算した。
【００６６】
【数１】
0006962600.tif 000006
【００６７】
その結果、本発明のセット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したとき、細胞生存率が対照群と比較して有意に減少したことを確認した。したがって、本発明のセット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡは、効果的に癌細胞が死滅したことを確認した（図４）。
【００６８】
実験例４．二重標的ｓｉＲＮＡと抗がん剤併用処理による癌細胞死滅効果を確認
４−１．シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）との併用処理
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに５×１０３ｃｅｌｌ  ／ウェルで分注した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００で二重標的ｓｉＲＮＡ（ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時にノックダウン）をそれぞれ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、シスプラチン５μＭを処理し、１０時間インキュベーションした。その後、前記実験例３と同様にＭＴＴ反応を行い、これの吸光度を５７０ｎｍで測定し、細胞生存率を計算した。
【００６９】
その結果、シスプラチンと併用処理し、本発明のセット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したとき、細胞生存率が約５０〜７０％まで減少し、対照群と比較して有意な相違を示すことが確認された。したがって、抗がん剤との併用処理においても両遺伝子を同時に抑制したとき、細胞死滅効果が著しく向上したことが確認された（図５）。
【００７０】
４−２．パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）との併用処理
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに５×１０３ｃｅｌｌ  ／ウェルで分注した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００で二重標的ｓｉＲＮＡ（ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時にノックダウン）をそれぞれ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、パクリタキセル５μＭを処理し、１０時間インキュベーションした。その後、前記実験例３と同様にＭＴＴ反応を行い、これの吸光度を５７０ｎｍで測定し、細胞生存率を計算した。
【００７１】
その結果、パクリタキセルと併用処理し、本発明のセット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したとき、細胞生存率が約３０〜５０％まで減少し、対照群と比較して有意な相違を示すことが確認された。したがって、抗がん剤との併用処理でも両遺伝子を同時に抑制したとき、細胞死滅効果が著しく向上することが確認された（図６）。
【００７２】
４−３．５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）との併用処理
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに５×１０３ｃｅｌｌ  ／ウェルで分注した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００で二重標的ｓｉＲＮＡ（ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時にノックダウン）をそれぞれ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、５−フルオロウラシル１μＭを処理し、１０時間インキュベーションした。その後、前記実験例３と同様にＭＴＴ反応を行い、これの吸光度を５７０ｎｍで測定し、細胞生存率を計算した。
【００７３】
その結果、５−フルオロウラシルと併用処理し、本発明のセット１−９の二重標的ｓｉＲＮＡでｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３を同時に抑制したとき、細胞生存率が約３０％まで減少し、対照群と比較して有意な相違を示すことが確認された。したがって、抗がん剤との併用処理でも両遺伝子を同時に抑制したとき、細胞死滅効果が著しく向上することを確認した（図７）。
【００７４】
実験例５．二重標的ｓｉＲＮＡを含むｓｈＲＮＡのｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３の抑制効果
前記実施例２にて作製した配列番号２０のＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡループｓｈＲＮＡ配列または配列番号２１のＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧループｓｈＲＮＡを含むベクターをＡ５４９細胞にそれぞれ０、１、および２μｇずつｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を利用してトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、実験例１に記載されたＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ分析方法を利用して、ｍＴＯＲおよびＳＴＡＴ３遺伝子発現の減少程度を確認した。
【００７５】
その結果、ｍＴＯＲ、およびＳＴＡＴ３発現は、本願発明の二重標的ｓｉＲＮＡを含む２種のｓｈＲＮＡの両方で減少しており、ｓｈＲＮＡのＤＮＡ量に比例して、２０％程度まで減少する傾向を示した（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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