(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチドを含むアトピー性皮膚炎抑制用組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１のＮ−末端がアセチル化されたものである、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎抑制用組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは、Ｎ−末端またはＣ−末端に連結された細胞透過性ペプチドをさらに含む、請求項１または２に記載のアトピー性皮膚炎抑制用組成物。
【請求項４】
前記細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴ、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ＶＰ２２、Ｐｅｐ−１、ポリアルギニン（ｐｏｌｙ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙ  Ｌｙｓｉｎｅ）、Ｈｐｈ−１、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、Ｓｉｍ−２、ＬＰＩＮ３、２ＩＬ−１ａおよびｄＮＰ２からなる群より選択されるいずれか一つのペプチドである、請求項３に記載のアトピー性皮膚炎抑制用組成物。
【請求項５】
前記細胞透過性ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３に記載のアトピー性皮膚炎抑制用組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記組成物は、ゲル、ペースト、軟膏、散剤、乳剤およびエアロゾルからなる群より選択される剤形である、請求項６に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚炎症抑制用ペプチドおよびそれを含む皮膚炎症の予防または治療用薬学的組成物および化粧料組成物に関する。
本発明は、保健福祉部からの認可番号ＨＩ１７Ｃ２２７３（新規の抗−網膜変性疾患候補物質の非−臨床試験及び開発）による韓国政府の支援のもと、なされたものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚炎症とは、皮膚上皮内に一連の炎症反応を引き起こす様々な刺激要因により、かゆみ、浮腫、紅斑、剥脱などのような一連の臨床的兆候と症状が誘発される疾患をいい、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅａ）、およびにきび、乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）などが知られている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は、大半は幼児期や小児期に発生して好転と悪化を繰り返し、外部の刺激物質によって発疹と激しいかゆみを伴う慢性炎症性皮膚疾患である。このようなアトピー性皮膚炎の病因論は未だに明らかになっていないが、ＩｇＥ抗体の増加に応じた過感作反応によるか、または細胞媒介性免疫機能の低下により現れるＴリンパ球の機能的欠如のような病理的要因が明らかになることによって、免疫学的な異常が関与する疾患として考えられている。また、アトピー性皮膚炎の大部分を占める外因性アトピー性皮膚炎はＩｇＥと連関した免疫メカニズムによって発生し、特定のアレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）に対する即時型過敏反応よりはＴ細胞異常による遅延性過敏反応が関与していると報告されている。
【０００４】
現在アトピー性皮膚炎などによる皮膚炎症を治療するために、保湿剤と共に、主にステロイド剤（ｓｔｅｒｏｉｄ）や抗ヒスタミン剤（ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅｓ）などが用いられている。しかし、ステロイド剤は、抗炎症作用や免疫抑制作用があるものの、副作用があるためにその使用に制限がある。また、抗ヒスタミン剤は、肥満細胞表面のヒスタミン受容体に結合してヒスタミンの遊離は阻害するものの、各種のアレルギー炎症性メディエータの生成に効果がないためにその使用に制限がある。
【０００５】
一方、肥満細胞からヒスタミンやロイコトリエンなどのような化学的メディエータ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）の放出を阻害する薬物が開発されており、クロモグリク酸（インタール：Ｉｎｔａｌ）やトラニラスト（リザベン：Ｒｉｚａｂｅｎ）などは喘息やアレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎の予防または治療薬として用いられている。しかし、前記のような合成製品は、完全な治療を期待することができず、長期間の使用時にはその効果が落ち、全身性副作用が酷いという短所がある。
【０００６】
そこで、本発明者らは、テトラペプチド（ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）が副作用なしに皮膚炎症を抑制するということを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一つの目的は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを含む皮膚炎症の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを含む皮膚炎症の予防または改善用化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様態は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを提供する。
【００１１】
本発明の一具体例によれば、前記ペプチドは、Ａｒｇがアセチル化されたものであってもよい。
【００１２】
本発明の一具体例によれば、前記ペプチドは、Ｎ−末端またはＣ−末端に連結された細胞透過性ペプチドをさらに含んでもよい。
【００１３】
本発明の一具体例によれば、前記細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴ、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ＶＰ２２、Ｐｅｐ−１、ポリアルギニン（ｐｏｌｙ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙ  Ｌｙｓｉｎｅ）、Ｈｐｈ−１、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、Ｓｉｍ−２、ＬＰＩＮ３、２ＩＬ−１ａおよびｄＮＰ２からなる群より選択されるいずれか一つのペプチドであってもよい。
【００１４】
本発明の一具体例によれば、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００１５】
本発明の一具体例によれば、前記皮膚炎症はアトピー性皮膚炎であってもよい。
【００１６】
本発明の他の様態は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一具体例によれば、前記組成物は、ゲル、ペースト、軟膏、散剤、乳剤およびエアロゾルからなる群より選択される剤形であってもよい。
【００１８】
本発明の一具体例によれば、前記皮膚炎症はアトピー性皮膚炎であってもよい。
【００１９】
本発明のまた他の様態は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００２０】
本発明の一具体例によれば、前記皮膚炎症はアトピー性皮膚炎であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の皮膚炎症抑制用ペプチドおよびそれを含む皮膚炎症の予防または治療用薬学的組成物および化粧料組成物は、アトピー性皮膚炎などによる皮膚炎症の症状を改善する効果に優れるため、皮膚炎症の予防または治療に有用に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】アトピー性皮膚炎の動物モデルの体重変化を示すグラフである。
【図２】アトピー性皮膚炎の動物モデルの耳厚さの変化を示すグラフである。
【図３】アトピー性皮膚炎の動物モデルグループ１〜５の肉眼病理学的検査の結果を示す写真である。
【図４】Ｄａｙ  ０における、アトピー性皮膚炎の動物モデルの肉眼病理学的検査に応じた紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、擦りむき／爛れ（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）、鱗屑／乾燥（ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ）およびトータルスコア（ｔｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ）を示すグラフである。
【図５】Ｄａｙ  ７における、アトピー性皮膚炎の動物モデルの肉眼病理学的検査に応じた紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、擦りむき／爛れ（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）、鱗屑／乾燥（ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ）およびトータルスコアを示すグラフである。
【図６】Ｄａｙ  １４における、アトピー性皮膚炎の動物モデルの肉眼病理学的検査に応じた紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、擦りむき／爛れ（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）、鱗屑／乾燥（ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ）およびトータルスコアを示すグラフである。
【図７】ＥＬＩＳＡ分析に応じた血中ＩｇＥおよびヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）の濃度をアトピー性皮膚炎の動物モデルグループ別に示すグラフである。
【図８】組織病理学的検査の結果に応じた表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）および真皮（ｄｅｒｍｉｓ）のスコア（ｓｃｏｒｅ）をアトピー性皮膚炎の動物モデルグループ別に示すグラフである。
【図９】アトピー性皮膚炎の動物モデルの各グループの表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）および真皮（ｄｅｒｍｉｓ）を示す写真である。
【図１０】アトピーマウス皮膚組織での血管の生成を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す写真である。
【図１１】アトピーマウス皮膚組織での炎症細胞の流入を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す写真である。
【図１２】アトピーマウス皮膚組織での角質化および線維化を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す写真である。
【図１３】アトピーマウス皮膚組織内の血管形成マーカー、炎症細胞およびケラチンに対する免疫組織化学染色の結果を示すグラフである。
【図１４】分析したＡＣＰ−テトラペプチドの細胞透過能を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】テトラペプチドの血管障壁の崩壊による血管壁透過性の抑制効果を示すグラフである。
【図１６】ＶＥＧＦによって損傷したＶＥ−ｃａｄのテトラペプチド処理による回復レベルを示す共焦点レーザ顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）写真である。
【図１７】ＶＥＧＦによって損傷したＶＥ−ｃａｄのテトラペプチド処理による回復レベルを示すグラフである。
【図１８】ＶＥＧＦによって損傷したＺＯ−１のテトラペプチド処理による回復レベルを示す共焦点レーザ顕微鏡写真である。
【図１９】ＶＥＧＦによって損傷したＺＯ−１のテトラペプチド処理による回復レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一様態は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを提供する。
【００２４】
本明細書で用いられる用語、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）によってアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味する。
【００２５】
本発明の一具体例に係るＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるテトラペプチドは、皮膚でのアトピーの原因物質として知られた血中ＩｇＥおよびヒスタミンを減少させ、密着結合関連タンパク質を回復させて血管壁の透過性を抑制できるだけでなく、抗アトピー剤であるプレドニゾロンに比べて千倍以上低い分子比（ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏ）をもって処理しても同一なレベルの効果を得ることができるため、アトピー性皮膚炎などによって発生した皮膚炎症を予防または治療するのに効果的に使用できる。
【００２６】
本発明の一具体例によれば、前記ペプチドは、配列番号１のＮ−末端がアセチル化されたものであってもよい。
【００２７】
本発明の一具体例に係るテトラペプチドは、配列番号１のＮ−末端がアセチル化されることによって、アセチル化されていないテトラペプチドに比べて血液および皮膚での安全性を高める効果を示すため、皮膚炎症の予防または治療効果を長時間持続させることができる。
【００２８】
本発明の一具体例によれば、前記ペプチドは、Ｎ−末端またはＣ−末端に連結された細胞透過性ペプチドをさらに含むことができる。
【００２９】
本明細書で用いられる用語、「Ｎ−末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、ペプチド分子の両端のうちアミノ基（ＮＨ２−）が結合していない状態で残っている末端をいい、一般に、アミノ酸配列の左側末端を意味する。用語、「Ｃ−末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、ペプチド分子の両端のうちカルボキシル基（ＣＯＯＨ−）が結合していない状態で残っている末端をいい、一般に、アミノ酸配列の右側末端を意味する。本発明において、前記細胞透過性ペプチドは、テトラペプチドのアミノ酸のうちＮ−末端アミノ酸であるＡｒｇのＮＨ２−基に連結されることが好ましい。
【００３０】
一方、本明細書で用いられる用語、「細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＰＰ）」は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および／またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）上で運搬対象物質である化学物質、小さい分子、ポリペプチドおよび／または核酸などを細胞内に運搬できる能力を有したペプチドを意味し、細胞透過性ペプチドは、そのものでリン脂質二重膜の細胞膜を通過できるアミノ酸配列を有するペプチドである。本発明の一具体例に係るテトラペプチドは、細胞透過性ペプチド配列をさらに含むことによって、炎症が発生した皮膚表面に使用できる。
【００３１】
本発明の一具体例によれば、前記細胞透過性ペプチドはＴＡＴ、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ＶＰ２２、Ｐｅｐ−１、ポリアルギニン（ｐｏｌｙ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙ  Ｌｙｓｉｎｅ）、Ｈｐｈ−１、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、Ｓｉｍ−２、ＬＰＩＮ３、２ＩＬ−１ａおよびｄＮＰ２からなる群より選択されることができるが、これらに限定されるものではない。また、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが用いられてもよい。
【００３２】
本発明の一具体例によれば、前記皮膚炎症はアトピー性皮膚炎であってもよい。
【００３３】
本発明の他の様態は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる皮膚炎症抑制用ペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３４】
本発明で用いられる用語、「予防」は皮膚炎症の発病を減少させることを意味し、既に発病した皮膚炎症の症状が悪化しないように状態を維持することを含み、本発明で用いられる用語、「治療」は、皮膚炎症の症状が好転するかまたは有益に変更されることを意味する。
【００３５】
本発明の一具体例に係る薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。本発明の一具体例に係る薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、ヒアルロン酸、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の一具体例に係る薬学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２２ｔｈ  ｅｄ．，２０１３）に詳細に記載されている。
【００３６】
本発明の一具体例に係る薬学的組成物は、一つ以上の公知の皮膚炎症に活性を示す物質と共に投与することができる。また、本発明の一具体例に係る薬学的組成物は、皮膚炎症を治療するために、単独、または手術、ホルモン治療、薬物治療および／または生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用できる。
【００３７】
本発明の薬学的組成物は、その剤形の製剤化に必要で、且つ、適切な各種の基剤および／または添加物を含んでもよく、その効果を落とさない範囲内で非イオン界面活性剤、シリコーン重合体、体質顔料、香料、防腐剤、殺菌剤、酸化安定化剤、有機溶媒、イオン性または非イオン性の増粘剤、柔軟化剤、酸化防止剤、フリーラジカル捕捉剤、不透明化剤、安定化剤、エモリエント（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔ）、シリコーン、α−ヒドロキシ酸、消泡剤、保湿剤、ビタミン、昆虫忌避剤、香料、保存剤、界面活性剤、消炎剤、サブスタンスＰ拮抗剤、充填剤、重合体、推進剤、塩基性化または酸性化剤、または着色剤などの公知の化合物をさらに含んで製造されることができる。
【００３８】
本発明の薬学的組成物は、非経口、例えば、経皮投与することができる。
【００３９】
本発明の薬学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、成人を基準に０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は非経口投与時に様々な剤形として投与でき、液相製剤としては懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、多く用いられる単純希釈剤である水、流動パラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。本発明の一具体例によれば、前記組成物は、ゲル、ペースト、軟膏、散剤、乳剤およびエアロゾルからなる群より選択される剤形であってもよい。
【００４１】
本発明のまた他の様態は、前記皮膚炎症抑制用ペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００４２】
本発明の一具体例に係る皮膚炎症抑制用ペプチドを含む化粧料組成物は、例えば、クリーム、水中油（ｏｉｌ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ）、水中シリコーン（ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ）、エマルション、油中水（ｗａｔｅｒ  ｉｎ  ｏｉｌ）、シリコーン中水（ｗａｔｅｒ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ）のエマルション、水／油／水型または水／シリコーン／水型のエマルション、そして油／水／油型またはシリコーン／水／シリコーン型のエマルションのような多数のエマルション、無水の組成物、水性分散液、オイル、ミルク、バルサム（ｂａｌｓａｍｓ）、フォーム、ローション、ジェル、クリームジェル、ヒドロアルコール溶液、ヒドログリコール溶液、塗布剤、石鹸、シャンプー、柔軟剤、セラム（ｓｅｒｕｍ）、多糖類膜、軟膏、ムース、ポマード、パウダー、棒状物質、ペンシル、スプレーのような多数のエマルションのような任意の固体、液体または半固体の製剤が挙げられる。
【００４３】
また、本発明の一具体例に係る皮膚炎症抑制用ペプチドを含む化粧料組成物は、例えば、お絞り、ヒドロゲル、接着用パッチ、非接着用パッチ、マイクロエレクトリックパッチまたは顔マスクのような他種類の固体用具に当該分野の技術者に知られた使用技術を用いて含ませるか、メーキャップファンデーション、例えば、リキッドファンデーションおよびコンパクトファンデーション、メーキャップ除去用ローション、メーキャップ除去用ミルク、コンシーラー、アイシャドウ、リップスティック、リッププロテクター、リップグロスおよびパウダーのような他のメーキャップ生産物に含ませてもよい。
【００４４】
本発明の一具体例に係る皮膚炎症抑制用ペプチドを含む化粧料組成物は、前記ペプチドの経皮吸収を増加させる物質、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾン（ａｚｏｎｅ）（１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン）、アルコール、尿素、エトキシジグリコール、アセトン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含むことができるが、これらに限定されるものではない。さらに、前記ペプチドのより深い浸透のために、イオン泳動、ソノフォレーシス、エレクトロポレーション、マイクロエレクトリックパッチ、機械的圧力、浸透圧勾配、密封治療、マイクロインジェクション、または、例えば、酸素圧力による注射のような圧力方式による無針注射、あるいはこれらの任意の組み合わせのような方式により、治療する局所部位に適用することができる。
【実施例】
【００４５】
以下では一つ以上の具体例について実施例を通じてより詳しく説明する。但し、これらの実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実験方法
１．ペプチドの合成および実験物質
下記の表１の配列番号１〜３のペプチドは、Ｃｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ（上海、中国）においてＦＭＯＣ固相法（ＦＭＯＣ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ）により合成された。合成されたペプチドは、Ｃ１８分析用ＲＰカラム（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ｃａｐｃｅｌｌ  ｐａｋ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）（ＨＰＬＣ−２０ＡＰ、日本）により精製および分析し、質量分析器（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ、日本）を用いて同定した。
【表１】
0006934051.tif 000002
【００４７】
細胞透過性ペプチドとして用いられたＡＣＰ（Ａｖｉｘｇｅｎ’ｓ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、テトラペプチドのＮ−末端に結合して用いた。テトラペプチドとＡＣＰ−テトラペプチドは冷凍保管して以後の実験に供し、陽性対照物質としてはプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を有効成分として含有するソロンド（登録商標）錠（Ｓｏｌｏｎｄｏ  Ｔａｂ．）を用いた。これらの物質は、賦形剤である滅菌注射用水（ＤＡＩＨＡＮ薬品工業（株））に溶かして該当濃度に薄めて用いた。
【００４８】
２．動物モデルの飼育および分配
平均体重（ｇ）が±２０％以内の４週齢のＮｃ／ＮｇａＳｌｃ雌マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ、Ｉｎｃ．）２０匹を温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、換気回数１０〜２０回／ｈｒ、１２時間の照明時間（午前８時に点灯〜午後８時に消灯）および照度１５０〜３００Ｌｕｘに設定した飼育場で適応させた後に実験に供した。適応、投与および観察期間の間ウサギ用ステンレス製の飼育ボックス（Ｗ５００×Ｌ８００×Ｈ５００ｍｍ）で１匹／飼育ボックスとして飼育し、飼料および水は自由に摂取するようにした。
【００４９】
適応期間中に健康であると判定されたマウスの体重を測定し、順位化した体重に応じて各グループの平均体重が最大限に均一に分布するように無作為法で分配した。
【００５０】
３．アトピー性皮膚炎の動物モデルの作製
ＮＣ／Ｎｇａマウスの耳殻部分をカミソリで除毛した後、除毛剤を適量塗布して完全に除毛と、除毛剤をぬぐい取った後、下記の表２のＡＤ誘発試薬１００ｍｇをマイクロピペットチップを用いて耳殻部分に均一に塗布して初回のアトピー性皮膚炎を誘発した。
【００５１】
必要に応じてカミソリで除毛した後、４％  ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットを用いて耳殻部分に均一に塗布し、ドライヤーを用いて冷風で乾燥および約２〜３時間自然乾燥させた後、同一のＡＤ誘発試薬１００ｍｇをマイクロピペットチップを用いて耳殻部分に均一に塗布して２回以後のアトピー性皮膚炎を誘発し、全ての処理は１週間に２回、総３週間に６回の処理で進めてアトピー性皮膚炎の動物モデルを作製した。
【表２】
0006934051.tif 000003
【００５２】
４．アトピー性皮膚炎の動物モデル実験群の設計
実験群は下記の表３のように各々４匹ずつ５個のグループに分け、各グループ別に下記の表３のように処理した。グループ２〜５のマウスは、前記実験方法３．で作製されたアトピー性皮膚炎の動物モデルを使用した。
【表３】
0006934051.tif 000004
【００５３】
実験物質および対照物質はマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ  ｐｉｐｅｔ  ｔｉｐ）を用いて耳殻部分に均一に塗布して処理し、実験物質の投与開始日（Ｄａｙ  ０）から剖検日（Ｄａｙ  １４）まで１回／日、２週間投与した。
【００５４】
５．動物モデルにおけるアトピー性皮膚炎の評価方法
５−１．体重の測定
グループ分離日または実験物質の投与開始日にマウスの体重を測定し、その後には週１回および剖検日に測定した。
【００５５】
５−２．耳厚さの測定および写真撮影
キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて個体別に耳厚さを測定し、耳部位に対する写真撮影を実施した。耳厚さの測定および写真撮影は、実験物質の投与開始日およびその後には１回／週に実施した。
【００５６】
５−３．肉眼病理学的な評価
アトピー性皮膚炎の肉眼病理学的な評価のために、アトピー性皮膚炎の誘発開始０週目から１週間隔で皮膚臨床指数評価（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）を行った。個体別に紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、擦りむき／爛れ（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）および鱗屑／乾燥（ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ）に対し、０（ｎｏｎｅ）、１（ｍｉｌｄ）、２（ｍｏｄｅｒａｔｅ）および３（ｓｅｖｅｒｅ）に記録した後、各項目別の点数の合計を最終等級に定めて評価した。
【００５７】
５−４．ＥＬＩＳＡ分析
剖検当日に腹大静脈から注射器を用いて採血を実施し、血液から分離した血清でＩｇＥおよびヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）に対してＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて分析をした。
【００５８】
５−５．組織病理学的検査
剖検日に組織病理学的検査のために耳を摘出して１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定した。固定された組織は、切り出し、脱水、パラフィン包埋、薄切などの一般的な組織処理過程を経て組織病理学的検査のための検体を作製した後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＆  Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）およびＴＵＮＥＬ  ａｓｓａｙを実施し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５３、Ｊａｐａｎ）を用いて組織病理学的変化を観察した。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＆  Ｅｏｓｉｎ染色スライドを用いた組織病理学的な評価は、病変程度を誘発対照群と比較するために病変の最も激しい部位を選定し、表皮層（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）では肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）、過角化（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）および炎症細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）を評価し、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）では炎症細胞の浸潤を評価した。点数化の基準は０（ｎｏ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ）、１（ｍｉｌｄ）、２（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、３（ｓｅｖｅｒｅ）である（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）。
【００５９】
５−６．免疫組織化学染色に応じたアトピーマウス皮膚組織内の血管形成マーカー、炎症細胞分布およびケラチン分析
アトピーマウス皮膚組織をキシレンに５分ずつ３回、１００％エタノールに２分、９５％エタノールに２分、９０％エタノールに２分、７０％エタノールに２分、Ｄ．Ｗに２分ずつ浸してパラフィン除去と水和（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を実施した。ＰＢＳで洗浄した後、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を処理して細胞透過性を増加させた。ＰＢＳで再洗浄した後、ブロッキング溶液である３％牛血清アルブミンで１時間反応させた。炎症細胞およびケラチン染色の場合、各々Ｆ４／８０（ｓｃ−３７７００９、ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）とサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）（ＮＢ６００−５７９、ＮＯＶＵＳＢＩＯ）抗体と常温で２時間反応させ、ＰＢＳで洗浄した後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ａｂ６７８７、Ａｂｃａｍ）二次抗体を処理して常温で６０分間反応させた。Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎをスライド組織に落とした後、カバースライドで組織を覆い、サンプルを蛍光顕微鏡で観察した。血管形成程度を分析するためにアトピーマウス皮膚組織を血管マーカーであるＦＩＴＣ結合ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４（Ｌ２８９５、ｓｉｇｍａ）で常温で２時間反応させ、ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎをスライド組織に落とした後、カバースライドで組織を覆った後にサンプルを蛍光顕微鏡で観察した。
【００６０】
各々のマーカーで染色されたマウス皮膚組織を蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＤＭｉ１、Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて写真を撮影し、蛍光ｉｎｔｅｎｓｉｔｙをＩｍａｇｅ  Ｊ  プログラム（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて定量的に分析した。
【００６１】
５−７．統計学的分析
本実験の結果に対し、パラメトリック多重比較（ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）あるいはノンパラメトリック多重比較（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）を用いた。パラメトリック多重比較の場合、資料の正規性を仮定し、パラメトリック一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）で検定し、その結果が有意な場合、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔを用いて事後検定を行って実験群間の有意な差を分析した。ノンパラメトリック多重比較の場合、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ’Ｈ−ｔｅｓｔで検定して、その結果が有意な場合、事後分析であるＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて実験群間の有意な差を分析した。
【００６２】
統計学的分析は、Ｐｒｉｓｍ  ５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １８．０Ｋを用いて実施し、ｐ値が０．０５未満である場合、統計学的に有意なものに判定した。
【００６３】
６．ＡＣＰ−テトラペプチドの細胞膜透過実験
ＨｅＬａ細胞を１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でガラスが入っている１２ウェルプレートに接種した後、２４時間培養して細胞をガラスに付着させた。その後、ＡＣＰ−ＦＩＴＣペプチド３μＭおよびＡＣＰ−テトラペプチド−ＦＩＴＣペプチド３、１５、３０μＭをＨｅＬａ細胞に３時間処理した。３時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、３．７％ホルムアルデヒドで２０分間細胞を固定させ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含まれたＰＢＳを処理して細胞透過性を増加させた。その後、３％  ＢＳＡで１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた後、Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）と常温で２時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、Ｃｙ３  二次抗体（Ｃｙ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）を処理して常温で１時間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で１０分間染色した。最後に、ＨｅＬａ細胞が付着されたガラスを取り外してスライドガラス上に載せておき、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＤＭｉ１、Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
【００６４】
７．テトラペプチドの血管障壁の崩壊による血管壁透過性の抑制確認実験
７−１．ＨＵＶＥＣでのＶＥＧＦによる血管障壁の崩壊によって増加した血管壁透過性の抑制確認実験
ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ；ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）を１％  ＦＢＳが添加されたＭ１９９  ｍｅｄｉａで４時間ｓｔａｒｖａｔｉｏｎした後、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒに１×１０５の数字で接種した。本実験で用いられた３種類のテトラペプチドは血清において半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が各々異なるため、アセチル化テトラペプチド、ＡｒｇがＤ−ｆｏｒｍであるテトラペプチドおよび非アセチル化テトラペプチドを血清において２時間培養した後、ＨＵＶＥＣに処理した。各々ペプチドを処理し、３０分後に血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）２０ｎｇ／ｍｌを１時間処理した。Ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒに［１４Ｃ］スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）を０．８ｍＣｉ／ｍｌ濃度で３０分間処理した後、ｌｏｗｅｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔにおいてＬＳＣ（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて放射能数値を測定した。
【００６５】
７−２．ＨＵＶＥＣでのＶＥＧＦによって破壊された密着結合関連タンパク質の回復確認実験
ＨＵＶＥＣを１％  ＦＢＳが添加されたＭ１９９  ｍｅｄｉａで４時間ｓｔａｒｖａｔｉｏｎし、ガラス（ｇｌａｓｓ）が入っている２４ウェルプレートに１×１０５の数字で接種した後、２４時間培養して細胞を付着させた。アセチル化テトラペプチド（ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）と非アセチル化テトラペプチド［ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ（−Ａｃ）］をＨＵＶＥＣに３０分間前処理した後、ＶＥＧＦを２０ｎｇ／ｍｌ濃度で１時間処理した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで２０分間固定させた後、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含まれたＰＢＳを処理して血管透過性を増加させた。３％  ＢＳＡで１時間ブロッキングした後、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）とＺＯ−１（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）抗体を常温で２時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｃｙ３  二次抗体を処理して常温で１時間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩで１０分間染色した。ＨＵＶＥＣが付着されたガラスを取り外してスライドガラス上に載せた後に共焦点顕微鏡で観察した。
【００６６】
実験結果
１．アトピー性皮膚炎の動物モデルからテトラペプチドの効能の確認
１−１．実験群の体重維持の確認
前記実験方法に従ってマウスの体重を測定した結果、全実験期間の間全ての実験群間に統計学的に体重の有意な差は観察されなかった（図１）。
【００６７】
すなわち、前記結果から、テトラペプチドは体重に影響を及ぼさないのを確認した。
【００６８】
１−２．耳厚さ減少効果の確認
実験物質を投与してから０および７日目に全てのアトピー誘発群（グループ２〜グループ５）の耳厚さは正常対照群（グループ１）に比べて有意に厚く（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０１）、実験物質を投与してから１４日目に誘発対照群（グループ２）、テトラペプチド投与群（グループ３）およびＡＣＰ−テトラペプチド投与群（グループ４）の耳厚さはグループ１に比べて有意に厚く（ｐ＜０．００１）、実験物質を投与してから７および１４日目に、グループ３、グループ４およびプレドニゾロン投与群（グループ５）の耳厚さはグループ２に比べて有意に薄かった（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０１）（図２）。前記結果から、テトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドのアトピー性皮膚炎に対する改善効果を確認した。
【００６９】
１−３．肉眼病理学的評価に応じたアトピー性皮膚炎の改善効果の確認
実験物質を投与してから０日（図４）、７日（図５）および１４日（図６）目に全てのアトピー誘発群のｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓおよびトータルスコアレベルはグループ１に比べて有意に高かったが（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）、実験物質を投与してから１４日目にグループ５のｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓスコアレベルはグループ２に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ項目を除いた大部分の項目では正常対照群と有意な差は示さず、トータルスコアの場合、テトラペプチド投与群およびＡＣＰ−テトラペプチド投与群のスコアレベルはプレドニゾロン投与群と類似したレベルであった。前記結果から、テトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドのアトピー性皮膚炎症状に対する改善効果を確認することができた。
【００７０】
１−４．血中ＩｇＥおよびヒスタミン減少効果の確認
グループ２、グループ３およびグループ４のＩｇＥレベルは正常対照群に比べて有意に高く（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０１）、全てのアトピー誘発群のヒスタミンレベルはグループ１に比べて有意に高かったが（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０５）、グループ３、グループ４およびグループ５のＩｇＥおよびヒスタミンレベルはグループ２に比べて有意に低く（ｐ＜０．００１またはｐ＜０．０１）、プレドニゾロン投与群よりも低いレベルを示した（図７）。前記結果から、ＩｇＥおよびヒスタミンの過生成に応じたアトピー性皮膚炎症状に対するテトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドの改善効果を確認した。
【００７１】
１−５．表皮および真皮部位でのアトピー性皮膚炎の減少効果の確認
アトピー性皮膚炎が誘発された動物モデルの病変部位を分析して、テトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドのアトピー性皮膚炎に対する効果を確認した。その結果、表皮の場合、グループ２のスコアレベルはグループ１に比べて有意に高く（ｐ＜０．０１）、グループ３、グループ４およびグループ５のスコアレベルはグループ２に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。真皮の場合、グループ２のスコアレベルはグループ１に比べて有意に高く（ｐ＜０．０１）、グループ３、グループ４およびグループ５のスコアレベルはグループ２に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）（図８および図９）。
【００７２】
すなわち、テトラペプチド投与群およびＡＣＰ−テトラペプチド投与群の表皮および真皮のスコアレベルは誘発対照群に比べて低いレベルを示してテトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドのアトピー性皮膚炎の病変部位組織での改善効果を確認し、特にＡＣＰ−テトラペプチド投与群の場合、全ての項目で正常対照群と類似したレベルのスコアを示すのを確認することによって、ＡＣＰ−テトラペプチドのアトピー性皮膚炎の病変部位の表皮および真皮に対する優れた炎症抑制効果を確認した。
【００７３】
１−６．免疫組織化学染色分析に応じたアトピーマウス皮膚組織内の血管形成マーカー、炎症細胞分布およびケラチン抑制効果の確認
テトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドの生体内の作用メカニズムを糾明するために、アトピーマウス皮膚組織内の血管形成マーカー、炎症細胞分布およびケラチン分析を行った遂行した。
【００７４】
アトピーマウス皮膚組織において血管マーカーであるＩｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４を染色した結果、誘発対照群に比べてテトラペプチド投与群およびＡＣＰ−テトラペプチド投与群の血管形成はプレドニゾロン投与群と類似に低いレベルを示した（図１０）。アトピーマウス皮膚組織において炎症細胞マーカーであるＦ４／８０を染色した結果、誘発対照群に比べてテトラペプチド投与群およびＡＣＰ−テトラペプチド投与群の炎症細胞流入はプレドニゾロン投与群と類似に低いレベルを示した（図１１）。アトピーマウス皮膚組織において角質化および線維化マーカーであるサイトケラチンを染色した結果、誘発対照群に比べてテトラペプチド投与群およびＡＣＰ−テトラペプチド投与群の角質化および線維化がプレドニゾロン投与群と類似に低いレベルを示した（図１２）。前記結果から、テトラペプチドおよびＡＣＰ−テトラペプチドは、アトピー誘発皮膚組織内の血管形成と炎症細胞流入を抑制し、また、角質化および線維化も抑制することによって、アトピー性皮膚炎の病変皮膚組織を治癒できるのを確認した。また、先ほど確認されたテトラペプチドの抗アトピー効果は、プレドニゾロンに比べて千倍以上低い分子比（ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏ）処理量から確認されたため、プレドニゾロン処理群に比べてテトラペプチドの優位性を確認した（図１３）。
【００７５】
２．ＡＣＰ−テトラペプチドの細胞膜透過能の確認
ＡＣＰ−テトラペプチドの細胞膜透過能において、細胞透過性ペプチドであるＡＣＰの効果を確認するために、ＨｅＬａ細胞株においてｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ後、蛍光顕微鏡分析を行った。その結果、ＡＣＰを通じてテトラペプチドが細胞膜において凝集されず濃度依存的に細胞内に伝達されるのを確認した（図１４）。前記結果から、ＡＣＰ−テトラペプチドをアトピー性皮膚炎の病変部位に塗布時、ＡＣＰ−テトラペプチドが皮膚細胞内に効率的に伝達されて、表皮だけでなく真皮までも皮膚炎症を効果的に抑制できるのを確認した。
【００７６】
３．テトラペプチドの血管障壁の崩壊による血管壁透過性の抑制効果の確認
３−１．ＨＵＶＥＣでのＶＥＧＦによって血管障壁の崩壊によって増加した血管壁透過性の抑制効果の確認
テトラペプチドの血管障壁の崩壊（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）によって増加した血管透過性（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）の抑制効果を確認するために、ＨＵＶＥＣにペプチドおよびＶＥＧＦを処理して血管透過度を測定した。その結果、アセチル化テトラペプチド（Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅに表記）、ＡｒｇがＤ−ｆｏｒｍであるテトラペプチド（Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ（Ｄ−ｆｏｒｍ）に表記）および非アセチル化テトラペプチド［Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ（−Ａｃ）に表記］は、ＶＥＧＦを処理していない対照群と類似したレベルの血管透過性の抑制効果を示すのを確認した（図１５）。すなわち、前記結果から、３つの異なる形態のテトラペプチド（アセチル化、Ｄ−ｆｏｒｍのＡｒｇに置換、非アセチル化）の全てをアトピー性皮膚炎に適用できるのを確認した。
【００７７】
３−２．ＨＵＶＥＣでのＶＥＧＦによって破壊された密着結合関連タンパク質の回復効果の確認
細胞結合タンパク質（ｃｅｌｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が血管内皮細胞の細胞と細胞との間に存在してこそ互いに堅固に連結されて血管透過性を抑制することができるため、血管壁での炎症細胞の移動を防ぐことができる。しかし、ＶＥＧＦは、細胞結合タンパク質を損傷させる機能をして血管の透過性を増加させる。
【００７８】
テトラペプチドが密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）関連タンパク質を回復させて血管壁透過性を抑制するかを確認するために、ＨＵＶＥＣにペプチドおよびＶＥＧＦを処理して透過性を測定した。その結果、アセチル化、非アセチル化テトラペプチドは全てＶＥＧＦＲ−２のシグナルを阻むため、ＶＥＧＦによって損傷したＶＥ−ｃａｄ（図１６および図１７）およびＺＯ−１（図１８および図１９）のレベルをＶＥＧＦ非処理対照群と類似したレベルに回復させることによって、その結果、血管透過性を減少させるのを確認した。前記結果から、アセチル化、非アセチル化テトラペプチドの全てをアトピー性皮膚炎に適用できるのを確認した。
【００７９】
今まで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者であれば、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲内で変形した形態に実現できることを理解することができるであろう。したがって、開示された実施例は限定的な観点でなく説明的な観点で考慮しなければならない。本発明の範囲は前述した説明でなく特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異点は本発明に含まれたものとして解釈しなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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