(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列でｉ）３７７番目のアミノ酸がトレオニンに置換、ｉｉ）４９９番目のアミノ酸がイソロイシンに置換、またはｉｉｉ）３７７番目のアミノ酸がトレオニンに置換されて４９９番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された、変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ、請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載のベクターを含み、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記コリネバクテリウム属微生物が、 コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項４に記載の５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階を含む５’−イノシン酸の製造方法。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項６に記載の５’−イノシン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ、これを含む微生物、及びこれを用いた５’−イノシン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質の１つである５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate；以下ＩＭＰ）は、核酸生合成代謝系の中間物質であって、医薬品及び各種医療的利用などの多方面に利用されており、５’−グアニル酸（5'-guanine monophosphate；以下ＧＭＰ）と共に食品調味添加剤または食品用として広く利用されている物質である。ＩＭＰは、それ自体で牛肉の味を出すことが知られており、ＧＭＰと共にグルタミン酸一ナトリウム（monosodium glumtaic acid；以下ＭＳＧ）の風味を強化することが知られて、呈味性核酸系の調味料として脚光を浴びている。
【０００３】
ＩＭＰを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法（非特許文献１など）及びＩＭＰを直接生産する微生物を培養して、培養液内のＩＭＰを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、ＩＭＰを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
【０００４】
一方、自然な状態での酵素は、産業的な活用において要求される活性、安定性、光学異性体に対する基質特異性などにおいて、常に最適の特性を示すものではないため、アミノ酸配列の変異などを介して目的とする用途に適して酵素を改良する様々な試みがなされてきた。その中、酵素の合理的デザイン（rational design）及び位置指定置換変異（site-directed mutagenesis）方法が酵素機能を向上するために適用された例であるが、多くの場合、目的酵素の構造に関する情報が不足したり、構造−機能の相関関係が明確ではなく、効果的に適用できないという欠点がある。このような場合、酵素遺伝子のランダム変異を介して構築された変異酵素ライブラリから目的の形質の酵素をスクリーニングする方向的進化（directed evolution）方法により酵素の改良を試みて活性を改善させると報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献２】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 36, 1511（1972）
【非特許文献２】Pearson et al （1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math （1981）2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 （1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献９】Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008
【非特許文献１０】Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541-545
【非特許文献１１】Nat. Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記微生物発酵を介して直接ＩＭＰを生産する方法で高収率のＩＭＰを生産するために、発明者らは、広範な研究を行い、ＩＭＰ生産能に関与するタンパク質の変異体を発掘することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ及び前記ベクターを含む５’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地で５’−イノシン酸を回収する段階を含む５’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを用いて５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培養すると、高収率の５’−イノシン酸生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。一方、本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本発明で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本発明のカテゴリが制限されることはない。
前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、配列番号２のアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供することにある。具体的には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供し、前記アミノ酸置換は、Ｎ末端から３７７番目のアミノ酸がトレオニンに置換及び４９９番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された群から選択される少なくともいずれか１つを含む。本発明のもう一つの態様は、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸がトレオニンに置換、４９９番目のアミノ酸がイソロイシンに置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを提供することにある。具体的には、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、３７７番目のアミノ酸がトレオニンに置換及び４９９番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された群から選択される少なくともいずれか１つからなるものであってもよい。
【００１１】
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ」は、５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate;IMP）を生産するのに関与するタンパク質を意味する。本発明の目的上、前記用語はイノシン−５’−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）、イノシン酸デヒドロゲナーゼ（Inosinic acid dehydrogenase）、 ＩＭＰＤＨなどと混用して使用してもよい。
【００１２】
本発明で、前記配列番号２は、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列を意味する。具体的には、前記配列番号２は、ｇｕａＢ遺伝子によってコードされる５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質配列である。前記配列番号２のアミノ酸は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。一例として、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）由来であってもよいが、これに制限されず、前記アミノ酸と同様の活性を有する配列は制限なく含まれてもよい。また、配列番号２のアミノ酸配列またはこれと８０％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記アミノ酸は、配列番号２及び前記配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸を含んでもよい。相同性または同一性を有するアミノ酸配列は、１００％同一性を有する配列は除く前記範囲のものであってもよく、または１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。
【００１３】
本明細書において、用語、「変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ」は、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチド、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ変異体などと混用して使用してもよい。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
【００１４】
前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列内のＮ末端から３７７番目の位置及び/または４９９番目の位置での変異を含む。前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであり、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または野生型微生物由来の非変異５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼに比べて弱化された活性を有するものであってもよい。このような変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、前記説明した配列番号２及び/または前記配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸でのＮ末端から３７７番目の位置及び/または４９９番目の位置のアミノ酸が変異されたものを意味する。
【００１５】
具体的には、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸がトレオニン（Threonine）に置換、４９９番目のアミノ酸がイソロイシン（Isoleucine）に置換、または３７７番目のアミノ酸がトレオニン（Threonine）に置換されて４９９番目のアミノ酸がイソロイシン（Isoleucine）に置換されたものであり、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて弱化された５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼの活性を有してもよいが、これに制限されない。
【００１６】
本発明の目的上、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを含む微生物の場合、ＩＭＰ生産量が増加することを特徴とする。これは、野生型コリネバクテリウム属菌株がＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても非常に極微量を生産できるのに対し、本発明の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを通じてＩＭＰ生産量を増加させることに意義がある。
【００１７】
具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列内の３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、かつ４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６、７及び８からなる群から選択される少なくともいずれか１つを含んでもよい。より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸がトレオニン（Threonine）に置換、４９９番目のアミノ酸がイソロイシン（Isoleucine）に置換、または３７７番目のアミノ酸がトレオニン（Threonine）に置換され、かつ４９９番目のアミノ酸がイソロイシン（Isoleucine）に置換された変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６、７及び８からなる群から選択される少なくともいずれか１つを含んでもよい。前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６、７及び８からなる群から選択される少なくともいずれか１つからなるものであってもよい。また、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６、７及び８のアミノ酸配列またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本発明の前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号６、７、８及び前記配列番号６、７、８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、３７７番目または４９９番目のアミノ酸配列に加えて、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００１８】
すなわち、本発明で「特定配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」と記載されている場合でも、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属することは自明である。
【００１９】
前記「保存的置換（conservative substitution）」は、あるアミノ酸を類似の構造的及び/または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換させることを意味する。これらのアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/または両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生しうる。例えば、正に荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；負に荷電された（酸性）アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含む。
【００２０】
したがって、本発明で「変異型（variant）」は、「特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」に加えて１つ以上のアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び/または変形（modification）を含んでもよい。例えば、一部の変異型はＮ末端リーダー配列または膜転移ドメイン（transmembrane domain）のような１つ以上の部分が除去された変異型を含んでもよい。他の変異型は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び/またはＣ末端から一部が除去された変異型を含んでもよい。また、前記変異型は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加を含む他の変形を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳同時に（co-translationally）または翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートしてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートしてもよい。前記用語「変異型」は、変異体、変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異、などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergentなど）が使用されてもよく、変異された意味で使用される用語であれば、これに制限されない。
【００２１】
相同性（homology）と同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されうる。
用語相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）または同一（identical）の配列は、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００２２】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）が使用されて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 （1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 （1990）； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【００２３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含みうる。したがって、発明で使用される用語「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００２４】
また、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその相同性または同一性を有するポリペプチドに翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれることは自明である。例えば、配列番号３、４及び５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列で構成されたものであってもよい。また、公知の遺伝子配列から調製しうるプローブ（Probe）、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件（Stringent condition）下でハイブリッド化（Hybridization）して、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸がトレオニン（Threonine）に置換されるか、または４９９番目のアミノ酸がイソロイシン（Isoleucine）に置換されたアミノ酸配列を含む、変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。
【００２５】
本発明の他の１つの態様は、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（polymer）であって、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖で、より具体的には、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明の５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。本発明で５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｇｕａＢ遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
【００２６】
具体的には、本発明のポリヌクレオチドはコドンの縮退性（degeneracy）により、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われる。配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含んでもよい。例えば、本発明の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であってもよいが、これに制限されるものではない。より具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３、４及び５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列で構成されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２７】
また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化し、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件（ストリンジェントな条件：stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性（homology）または同一性（identity）が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。
ハイブリッド化は、たとえハイブリッド化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
【００２８】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリッド化段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
【００２９】
本発明で変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｇｕａＢ遺伝子であり、これをコードするポリヌクレオチドに関する説明は前述した通りである。
本発明で変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドも、先に説明した通りである。
【００３０】
本明細書で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００３１】
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ4、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
【００３２】
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを使用して、染色体に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内の挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換え（homologous recombination）によって行われることができるが、これに限定されない。前記染色体挿入するかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含むことができる。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子の挿入するかどうかを確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒するマーカーが使用することができる。選択制（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみの生存、または他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。本発明のもう一つの様態として、本発明は、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを含むか、これをコードするポリヌクレオチドを含んで、５’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。具体的には、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ及び/またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換によって製造される微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００３３】
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用される用語、「変異型ポリペプチドを含む微生物」または「変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを含む微生物」とは、自然的に弱いＩＭＰ生産能を有している微生物またはＩＭＰの生産能のない親菌株にＩＭＰの生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、配列番号２のアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを発現する微生物であって、前記アミノ酸置換は、Ｎ末端から３７７番目のアミノ酸がトレオニンに置換及び４９９番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された群から選択される少なくともいずれか１つを含むものであってもよい。また、前記微生物は、配列番号２のアミノ酸配列で３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または３７７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて４９９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００３５】
前記微生物は、変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを発現できる細胞または微生物であって、本発明の目的上、前記宿主細胞または微生物は、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを含み、−５’−イノシン酸を生成することができる微生物であればいずれも可能である。
本発明で、前記５’−イノシン酸を生産する微生物は、５’−イノシン酸を生産する微生物、５’−イノシン酸生産能を有する微生物と混用して使用してもよい。
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定メカニズムが弱化されたり強化された微生物であって、目的とする５’−イノシン酸の生産のために、遺伝的変異が起きたり活性を強化させた微生物であってもよい。本発明の目的上、前記５’−イノシン酸を生産する微生物は、前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを含み、目的とする５’−イノシン酸の生産能が増加したことを特徴とし、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本発明で５’−イノシン酸を生産する微生物または５’−イノシン酸生産能を有する微生物は、５’−イノシン酸生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されたり、５’−イノシン酸分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。例えば、前記微生物は、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ（phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase）をコードするｐｕｒＦの発現が強化されたり、アデニロコハク酸シンテターゼ（adenylosuccinate synthetase）をコードするｐｕｒＡの発現が弱化された微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００３６】
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介して５’−イノシン酸生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇｕａＢの活性を強化させたり弱化させて向上された５’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、本発明の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼまたはこれをコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、向上された５’−イノシン酸生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。前記「向上された５’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」は、形質変化前の親菌株または非変形微生物より、５’−イノシン酸生産能が向上された微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、天然型菌株自体であるか、前記５’−イノシン酸を生産するタンパク質変異体を含まない微生物、または前記変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
【００３７】
本発明において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。
【００３８】
本発明のもう一つの様態として、前記５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法を提供する。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された５’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
【００３９】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油及び脂肪 （例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００４０】
本発明の前記培養段階で生産された５’−イノシン酸を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とする５’−イノシン酸を収集（collect）してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とする５’−イノシン酸を回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された５’−イノシン酸は、精製された形態または５’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい（非特許文献９）。
【００４１】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではなく、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００４２】
実施例１：野生型基盤のＩＭＰ生産株の製作
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても非常に極微量を生産することができる。したがって、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を基にＩＭＰ生産株を製作した。より具体的には、プリン生合成酵素の一番目であるホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするＰｕｒＦの活性を強化させて、５’−イノシン酸の分解経路にあるアデニロコハク酸シンテターゼをコードするＰｕｒＡの活性を弱化させたＩＭＰ生産菌株を製造した。
【００４３】
実施例１−１：ｐｕｒＦ強化菌株の製作
ｐｕｒＦの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まずｐｕｒＦが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにｐｕｒＦ遺伝子をクローニングするために、具体的に、ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として、配列番号９と１０、配列番号１１と１２のプライマーを用いて行い、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長（extension）過程を３０回繰り返した。前記ＰＣＲ反応で獲得した２つのＤＮＡ切片を鋳型として、配列番号９と１２のプライマーを用いて、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長伸長（extension）過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を獲得した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素で切断された（ｐＤＺ（特許文献１及び２））ベクターにクローニングした。前記方法で製作したベクターをｐＤＺ−ｐｕｒＦ−ｇ１ａと命名した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２に組換えベクターであるｐＤＺ−ｐｕｒＦ−ｇ１ａを電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差を経て、選定された菌株でシーケンシングを行い、最終的に変異が導入された菌株を選別し、これはＡＴＣＣ６８７２::ｐｕｒＦ（ｇ１ａ）菌株と命名した。
【００４６】
実施例１−２：ｐｕｒＡ弱化菌株の製作
ｐｕｒＡの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まずｐｕｒＡが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにｐｕｒＡ遺伝子をクローニングするために、具体的に、ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６のプライマーを用いて行い、前記ＰＣＲ産物は、実施例１−１と同様にクローニングを進めて、製作したベクターをｐＤＺ−ｐｕｒＡ−ａ１ｔと命名した。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
実施例１−１で製作されたＡＴＣＣ６８７２::ｐｕｒＦ（ｇ１ａ）の菌株に組換えベクターであるｐＤＺ−ｐｕｒＡ−ａ１ｔを電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再び２次交差を経て選定された菌株でシーケンシングを行い、最終的に変異が導入された菌株を選別した。
最終的に選別された、野生型コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を基にする前記ＩＭＰ生産菌株をＣＪＩ２３３１と命名した。
【００４９】
実施例１−３：ＣＪＩ２３３１の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３１をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表３の通りである。下記のような結果は、ｐｕｒＦ強化及びｐｕｒＡ弱化させた菌株がＩＭＰの生産能を有することを示唆する。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
−種培地：ぶどう糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
−発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ぶどう糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００５２】
実施例２：５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ弱化変異体の製造
ＩＭＰ生産能を向上させる５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ変異を発掘するために、これをコードする遺伝子であるｇｕａＢの変異ライブラリを製作した。
【００５３】
実施例２−１：ｇｕａＢを含むベクターの製作
ｇｕａＢ変異ライブラリを製作するために、まずｇｕａＢを含む組換えベクターを製作した。ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として、配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを用いて行い、前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてＰＣＲ−ｇｕａＢを得た。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
実施例２−２：ｇｕａＢ変異ライブラリの製作
前記実施例２−１で製作したベクターを基にｇｕａＢ変異ライブラリを製作した。ライブラリは、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（clontech DiversifyTMPCR Random Mutagenesis Kit）を用いて製作した。変異が発生しうる条件で、配列番号１９及び配列番号２０をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１０００ｂｐ当たり０〜３つの変異が発生する条件で、９４℃で３０秒予熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で１分３０秒の過程を２５回繰り返して行った。このとき得られたＰＣＲ産物をメガプライマー（５００〜１２５ｎｇ）とし、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で１２分の過程を２５回繰り返した。その後、ＤｐｎＩ処理して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、２変異／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをｐＴＯＰＯ−ｇｕａＢ−ｌｉｂｒａｒｙと命名した。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
実施例２−３：製作したライブラリの評価及び菌株の選別
前記実施例２−２で製作されたｐＴＯＰＯ−ｇｕａＢ−ｌｉｂｒａｒｙを実施例１で製作した菌株ＣＪＩ２３３１に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株から１０，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１からＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１００００までと命名した。
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２%、ｐＨ７．２
確保された１０，０００個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した種培地２００μｌに接種した９６ディープウェルプレートを、マイクロプレート振とう機（Microplate shaker（TAITEC））を用いて３０℃の温度、１２００ｒｐｍで２４時間振とう培養し、種培養液として用いた。加圧殺菌した発酵培地２９０μｌを９６ディープウェルプレートに分注した後、種培養液２０μｌずつ接種し、前記条件と同様に７２時間振とう培養した。
培養液から生産された５’−イノシン酸の生産量を分析するために、培養終了後の培養上澄み液３μlを蒸留水が１９７μlずつ分注された９６ウェルＵＶプレートに移した。次に、マイクロプレートリーダー（Microplate reader）を用いて３０秒間振とうし、２５℃、波長２７０ｎｍで分光光度計で吸光度を測定し、ＣＪＩ２３３１菌株の吸光度と比較して１０％以上増加した吸光度を示す５０個の変異菌株コロニーを選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
選別された５０個の菌株は、前記と同様に吸光度を測定し、５’−イノシン酸の生産量を繰り返して行った。そして、ＣＪＩ２３３１菌株に比べて５’−イノシン酸の生産能が著しく向上されたＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１３３、ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１２０９、 ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）８９２７菌株３種を選別した。
【００５８】
実施例２−４：遺伝子シーケンシングを通じた変異の確認
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号２１と２２のプライマーを用いてＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１３３、ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１２０９、ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）８９２７菌株でＰＣＲを行い、シーケンスを進め、ｇｕａＢ遺伝子を野生型菌株であるＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３１と比較した。
その結果、前記の菌株３種すべてが異なる位置でｇｕａＢ遺伝子変異を含むことを確認した。
具体的には、配列番号２で表われるＧｕａＢアミノ酸配列において、ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１３３菌株は、４９９番目のトレオニンがイソロイシンに置換された変異を、ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１２０９菌株は、３７７番目のアラニンがトレオニンに置換された変異を、ＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）８９２７菌株は、３７７番目のアラニンがトレオニンに置換されて４９９番目のトレオニンがイソロイシンに置換された変異を含んでいることを確認した。したがって、以下の実施例３及び４では、前記の変異がそれぞれコリネバクテリウム属微生物のＩＭＰ生成量に影響を与えるかを確認した。
【００５９】
実施例３：ＣＪＩ２３３１におけるＩＭＰ生産能の確認
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株であるＣＪＩ２３３１に前記実施例２で確認した変異を導入してＩＭＰ生産能を確認した。
【００６０】
実施例３−１：変異が導入された菌株の製作
前記実施例２で確認した変異を導入するために、ターゲット変異を含んでいる逆方向のオリゴヌクレオチドを７５マー（mer）の長さでそれぞれデザインした。
具体的には、配列番号２３または２４のオリゴヌクレオチド３０μｇをＣＪＩ２３３１菌株に電気パルス法（非特許文献１０）で形質転換して、複合液体培地を１ ｍｌ添加し、３０℃で３０分間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。以後、培養液を氷で１０分間インキュベーション（incubation）し、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去して菌体を確保した。その後、４℃の１０％グリセロール溶液を１ｍｌ添加して混合した後、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄み液を除去して菌体を洗浄した。同様に菌体をもう１回洗浄し、４℃の１０％グリセロール溶液を０．１ｍｌ添加して次の形質転換のための菌株を準備した。その後、前記のような電気パルス法で配列番号２３または２４のオリゴヌクレオチドを用いて形質転換する過程を１０回繰り返した後、複合平板培地に塗抹してコロニーを確保した（非特許文献１１）。
前記確保したコロニーの遺伝子配列解析を行った結果、菌株に前記のターゲット変異が導入されたことを確認し、ｇｕａＢ遺伝子にコードされるタンパク質内Ａ３７７Ｔ変異が導入された前記菌株をＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ１、Ｔ４９９Ｉ変異が導入された菌株をＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ２と命名した。
また、Ａ３７７ＴとＴ４９９Ｉ変異の両方を含む変異菌株を製作するためにＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ１菌株に配列番号２４のオリゴヌクレオチド３０μgを形質転換して、前記と同様の方法でコロニーを確保した（非特許文献１１）。確保したコロニーの遺伝子配列解析を行い、ｇｕａＢ遺伝子にコードされるタンパク質内Ａ３３７Ｔ及びＴ４９９Ｉ変異の両方が導入された菌株を選別し、これをＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ１ｍ２と命名した。
【００６１】
【表６】
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【００６２】
実施例３−２：変異が導入された菌株のＩＭＰ生成能の確認
種培地２ｍｌを、直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３１をそれぞれ接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養し、種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表７の通りである。下記結果から分かるように、対照群であるＣＪＩ２３３１菌株に比べて、ｇｕａＢ遺伝子にコードされるタンパク質内Ａ３７７Ｔ変異またはＴ４９９Ｉ変異を有するＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ１またはＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ２菌株の場合、ＩＭＰ濃度がそれぞれ０．４２ｇ／Ｌ（４０％）、０．２１ｇ／Ｌ（２０％）向上されたことを確認した。また、Ａ３７７ＴとＴ４９９Ｉ変異の両方を含んでいるＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ１ｍ２菌株の場合、ＩＭＰ濃度が０．５８ｇ／Ｌ（５０％）向上され、２つの変異を一緒に含んだときにＩＭＰ濃度の向上に最も効果があることを確認した。
【００６３】
【表７】
0006873244.tif 000008
【００６４】
実施例４：ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株におけるＩＭＰ生産能の確認
実施例４−１：ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産株を製作するために、ＡＴＣＣ６８７２をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌと懸濁させた。ここにＵＶ処理して、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、１．７％寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に希釈して塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＩＭＰ生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度ＩＭＰ生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、３,４−ジヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてＩＭＰ生産能の優れたＣＪＩ２３３５を最終選別した。下記の表８にＡＴＣＣ６８７２に比べたＣＪＩ２３３５の耐性程度を比較して示した。
【００６５】
【表８】
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【００６６】
−最小培地：ぶどう糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌをｐＨ７．３になるように添加して用いた。
【００６７】
実施例４−２：ＣＪＩ２３３５の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３５をそれぞれ接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表９の通りである。
【００６８】
【表９】
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【００６９】
実施例４−３：ｇｕａＢ変異を含む挿入ベクターの製作
前記実施例３で選別された変異を菌株に導入するために挿入用ベクターを製作した。ｇｕａＢ変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。前記実施例２で選別されたＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１２０９菌株のｇｕａＢ（Ａ３７７Ｔ）遺伝子及びＣＪＩ２３３１_ｐＴＯＰＯ_ｇｕａＢ（ｍｔ）１３３菌株のｇｕａＢ（Ｔ４９９Ｉ）遺伝子を鋳型とし、配列番号２５と配列番号２６をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、得られた遺伝子断片をそれぞれＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングし、ｐＤＺ−ｇｕａＢ（Ａ３７７Ｔ）とｐＤＺ−ｇｕａＢ（Ｔ４９９Ｉ）を製作した。
【００７０】
【表１０】
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【００７１】
実施例４−４：ＣＪＩ２３３５菌株内変異体の導入及び評価
前記実施例４−１で選別されたＣＪＩ２３３５菌株のｇｕａＢ遺伝子の塩基配列を確認するために、ＣＪＩ２３３５のゲノミックＤＮＡをＰＣＲを介して増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＩ２３３５の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２１と２２のプライマーを用いて、９４℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で２分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、約２．１ｋｂのｇｕａＢを増幅した。また、これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、野生型ＡＴＣＣ６８７２菌株のｇｕａＢ遺伝子と同じ配列と確認され、ｇｕａＢ遺伝子には変異がないことを確認した。
【００７２】
【表１１】
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【００７３】
前記実施例４−３で製作したｐＤＺ−ｇｕａＢ（Ａ３７７Ｔ）、ｐＤＺ−ｇｕａＢ（Ｔ４９９Ｉ）ベクターをＣＪＩ２３３５に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を経て、標的遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的な形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号２１と配列番号２２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することにより菌株内に変異が導入されたことを確認した。具体的には、ｇｕａＢ遺伝子にコードされるタンパク質内にＡ３７７Ｔ変異が導入された前記菌株をＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ１、Ｔ４９９Ｉ変異が導入された菌株をＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ２と命名した。また、Ａ３７７ＴとＴ４９９Ｉ変異の両方を含む変異菌株を製作するために、ＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ１菌株にｐＤＺ−ｇｕａＢ（Ｔ４９９Ｉ）ベクターを形質転換して、前記と同様の方法でコロニーを確保した。確保したコロニーの遺伝子配列解析を行い、ｇｕａＢ遺伝子にコードされるタンパク質内Ａ３３７Ｔ及びＴ４９９Ｉ変異がすべて導入された菌株を選別し、これをＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ１ｍ２と命名した。
下記の表１２に示すように、対照群であるＣＪＩ２３３５菌株に比べてｇｕａＢ遺伝子にコードされるタンパク質内のＡ３７７Ｔ変異またはＴ４９９Ｉ変異を有しているＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ１またはＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ２菌株の場合、ＩＭＰ濃度がそれぞれ２．２ｇ／Ｌ（４０％）、１．０ｇ／Ｌ（１８．５％）向上されたことを確認した。また、Ａ３７７ＴとＴ４９９Ｉ変異の両方を含んでいるＣＪＩ２３３１_ｇｕａＢ_ｍ１ｍ２菌株の場合は、ＩＭＰ濃度が２．７ｇ／Ｌ（５０％）向上され、２つの変異を一緒に含むときに、ＩＭＰ濃度の向上に最も効果があることを確認した。
【００７４】
【表１２】
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【００７５】
前記のような結果は、ＩＭＰ生産能を有する様々なコリネバクテリウム属微生物に、本発明の変異型５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼを導入する場合に、５’−イノシン酸の生産能が大きく向上されることを裏付ける。
前記ＣＪＩ２３３５は、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年６月２２日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２７７８Ｐを与えられた。また。前記製作されたＣＪＩ２３３５_ｇｕａＢ_ｍ１ｍ２菌株は、ＣＪＩ２３４７と呼ばれており、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年６月２２日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２７９Ｐを与えられた。
【００７６】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【配列表】
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