(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ワクチンであって、抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：及びＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する脂質ナノ粒子内に製剤化され、該抗原性ポリペプチドがウイルス抗原であり、該カチオン性脂質がイオン性のカチオン性脂質であり、前記１つ以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、Ｎ１−メチルシュードウリジンを含む少なくとも１つの化学修飾を含む、前記核酸ワクチン。
【請求項２】
前記非カチオン性脂質が中性脂質である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ステロールがコレステロールである、請求項１〜２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項４】
前記ウイルス抗原が、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型またはこれらの組み合わせの株である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記抗原性ポリペプチドが、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ヘマグルチニンタンパク質が、
ａ）頭部ドメイン（ＨＡ１）の一部、
ｂ）細胞質ドメインの一部、及び／または
ｃ）膜貫通ドメインの一部
を含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ウイルス抗原が、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ８からなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記化学修飾が、シュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される化学修飾をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
前記脂質ナノ粒子が
ａ）５０〜２００ｎｍの平均直径、
ｂ）０．４未満の多分散値、または
ｃ）中性ｐＨにおいて中性の正味電荷
を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記オープンリーディングフレーム内のウラシルの少なくとも８０％が化学修飾を有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記オープンリーディングフレーム内のウラシルの１００％が化学修飾を有する、及び／または前記化学修飾がＮ１−メチルシュードウリジンである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号３９４または３９５と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号９４１〜９５０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号９４１〜９５０のいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記核酸が配列番号３９５を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１６】
対象において抗原特異的な免疫応答を誘発する方法に使用するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記方法が、前記ワクチンを有効量で対象に投与し、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む、前記ワクチン。
【請求項１７】
インフルエンザウイルス感染の予防または治療の方法において使用するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記方法は、対象に前記ワクチンを投与することを含む、前記ワクチン。
【請求項１８】
前記ヘマグルチニンタンパク質が、頭部ドメイン（ＨＡ１）、細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインのうち、少なくとも１つの一部のみを含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記ヘマグルチニンタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８である、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記ヘマグルチニンタンパク質が、Ｈ１、Ｈ７及びＨ１０から選択される、請求項１８に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法§１１９に基づいて米国仮出願第６１／９８３，２５０号（２０１４年４月２３日出願）及び同第６２／０８８９９４号（２０１４年１２月８日出願）の利益を主張するものであり、それぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ワクチン、特に核酸ワクチン（ＮＡＶ）の選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物、方法、プロセス、キット及び装置に関する。特に、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン、例えば、ｍＲＮＡワクチンの選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物、方法、プロセス、キット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチン接種は、例えばインフルエンザ、ＡＩＤＳ、肝炎ウイルス感染症、コレラ、マラリア及び結核ならびにその他の多くの疾患の、ウイルス性、細菌性及び／または寄生体疾患を含むがこれらに限定されない、感染症に対する予防的防御を提供する効果的な方法である。例えば、インフルエンザ感染は、米国で年間入院数２００，０００及び死亡数４０，０００を記録する米国第７番目の死因であり、世界全体では年間入院数約３００万〜５００万及び死亡数約３００，０００〜５００，０００の原因となっている。毎年季節性インフルエンザを予防するために数百万人がインフルエンザワクチンを受ける。ワクチン接種は、新型インフルエンザの汎発流行の拡大を迅速に予防することもできる。
【０００４】
典型的なワクチンは、弱毒化または枯死形態の疾患原因因子と類似する作用物質を含有しており、これは細菌、ウイルス、菌類、寄生体または１種以上の毒素などの微生物、及び／または１種以上のタンパク質、例えばこのような微生物の表面タンパク質（すなわち、抗原）であり得る。ワクチン中の抗原または作用物質が身体の免疫系を刺激することにより、免疫系はその作用物質を外部の侵入者と認識して、その物質に対する抗体を形成し、それを破壊して、その記憶を構築することができる。ワクチンで誘発された記憶により、免疫系は後に遭遇するこうした作用物質のいずれからも身体を防御するように迅速に作用することができる。
【０００５】
当該技術分野で使用されるワクチン製造、例えば、抗原ワクチン製造には、抗原の生成、抗原の精製及び不活化、ならびにワクチンの製剤化を含む、いくつかの段階がある。まず、ウイルスを細胞株で培養する、バイオリアクター中で細菌を増殖させる、または細胞培養液、酵母または細菌中でウイルス及び細菌から誘導される組換えタンパク質を製造することにより抗原を生成する。次に組換えタンパク質を精製し、ウイルス及び細菌を不活化した後、アジュバントを用いてワクチンに製剤化する。ワクチン開発の現状技術に伴う時間と費用を大幅に削減することは難題であった。
【０００６】
新規ワクチン開発に対するもう一つの障害は、ウイルス及び細菌などの大部分の感染因子が常時、進化することである。ウイルスは多くの場合、自己の表面タンパク質を変異させて新たな抗原を形成し、ウイルスを含有するワクチンによって免疫された能動免疫系を容易にスキップできるようにする。対照的に、細菌はキータンパク質を捕捉して変異させ、宿主感染防御及び有効な抗生物質の適用を回避する。
【０００７】
例えば、インフルエンザＡ型、Ｂ型及びＣ型ウイルスは、インフルエンザの病因因子である。インフルエンザＡ型及びＢ型ウイルスの主要な外被糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）、またはそのホモログであるインフルエンザＣ型ウイルス中のヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）はウイルスの自然の保持体である。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の急速な進化の結果、新規株が常時出現するため、宿主の適応免疫応答は新たな感染症に対して部分的な防御しか与えられない。従来のワクチンを使用したインフルエンザ及び他の感染症に対する治療及び予防にとって最大の課題は、ワクチンの幅が限られており、密接に関連した亜型に対してしか防御を提供しないことである。加えて、現在の製造プロセスの長さが、汎発流行性状況での適合ワクチンの開発及び製造に対応する迅速性を妨げている。
【０００８】
新規なワクチン、ならびに感染疾患及び感染因子と戦う新たな手法を開発することは大きな関心事である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書は、核酸ワクチン（ＮＡＶ）の選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物、方法、プロセス、キット及び装置について記載する。特に、本明細書は、核酸ワクチン、例えばＲＮＡワクチン及びｍＲＮＡワクチンの選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物、方法、プロセス、キット及び装置について記載する。
【００１０】
本発明は、１種以上の核酸ワクチン（ＮＡＶ）を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明のＮＡＶまたはＮＡＶ組成物は、１種以上の野生型または遺伝子操作型タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）をコードする、１種以上の核酸分子、例えばポリヌクレオチドを含むように設計され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子、例えばポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸分子、例えばポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＮＡＶまたはＮＡＶ組成物は、化学修飾された核酸（例えばＲＮＡポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、そこから抗原が誘導または遺伝子操作される感染因子は、ウイルス、細菌、菌類、原生動物及び／または寄生体を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、細胞、組織または生物の免疫応答を誘導、誘発、増強または始動する方法が提供され、これは前記細胞、組織または生物を本明細書で記載または教示するＲＮＡＶのいずれかと接触させることを含む。
【００１３】
本発明の態様は第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、カチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化された核酸ワクチン（ＮＡＶ）を提供する。いくつかの態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する担体中に製剤化されるＮＡＶを提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、モル比約５０％のカチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール及び約１０％の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、モル比約５５％のカチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール及び約１０％の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はイオン性のカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、モル比５０：３８．５：１０：１．５のカチオン性脂質：ＰＥＧ２０００−ＤＭＧ：ＤＳＰＣを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、５０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１．５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡポリヌクレオチド及び３５〜４５ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは、約２ｍｇ／ｍＬのＲＮＡポリヌクレオチド及び約４０ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、第１の抗原性ポリペプチドは、感染因子から誘導される。いくつかの実施形態では、感染因子は、ウイルス株及び細菌株からなる群のメンバーから選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドは、さらなる抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、さらなるＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１つの化学修飾及びコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは抗原性ポリペプチドをコードする。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原性ポリペプチドは、表６〜１６、表２９〜３０に列挙されたタンパク質、またはそれらの断片から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム及び／または第２のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、それぞれ独立して、表６〜１６、表２９〜３０から選択される抗原性ポリペプチド、またはそれらの断片をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドの各オープンリーディングフレームは、ＲＮＡ配列表２８のいずれか、またはそれらの断片から選択される。
【００１８】
本明細書で提供される実施形態のいずれかで、感染因子はアデノウイルス；単純ヘルペス１型；単純ヘルペス２型；脳炎ウイルス、パピローマウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス；エプスタイン・バールウイルス；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトへルペスウイルス８型；ヒトパピローマウイルス；ＢＫウイルス；ＪＣウイルス；天然痘；ポリオウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；ヒトボカウイルス；パルボウイルスＢ１９；ヒトアストロウイルス；ノーウォークウイルス；コクサッキーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；ポリオウイルス；ライノウイルス；重症急性呼吸器症候群ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；黄熱ウイルス；デングウイルス；ウエストナイルウイルス；風疹ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；インフルエンザウイルス；グアナリトウイルス；フニンウイルス；ラッサウイルス；マチュポウイルス；サビアウイルス；クリミア・コンゴ出血熱ウイルス；エボラウイルス；マールブルグウイルス；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；パラインフルエンザウイルス；呼吸器合胞体ウイルス；ヒトメタニューモウイルス；ヘンドラウイルス；ニパウイルス；狂犬病ウイルス；Ｄ型肝炎；ロタウイルス；オルビウイルス；コルティウイルス；バンナウイルス；ヒトエンテロウイルス；ハンタウイルス；ウエストナイルウイルス；中東呼吸器症候群コロナウイルス；日本脳炎ウイルス；水疱疹ウイルス；及び東部ウマ脳炎からなる群から選択されるウイルス株である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型またはこれらの組み合わせの株である。いくつかの実施形態では、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型の株は、トリ、ブタ、ウマ、イヌ、ヒトまたは非ヒト霊長類と関連する。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードする。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８またはこれらの断片である。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、頭部ドメイン（ＨＡ１）を含まない。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、頭部ドメイン（ＨＡ１）の一部を含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、トランケート型ヘマグルチニンタンパク質である。いくつかの実施形態では、トランケート型ヘマグルチニンタンパク質は、膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片のアミノ酸配列は、表６〜１４に示されたアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、表６〜１４に列挙されたタンパク質またはその断片から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、感染因子は、結核菌（ヒト型結核菌）、クリンダマイシン耐性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フルオロキノロン耐性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、多剤耐性エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、多剤耐性エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、多剤耐性アシネトバクター・バウマニ及びバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＶＲＳＡ））から選択される細菌株である。いくつかの実施形態では、細菌はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶは多価である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、少なくとも１０、１５、２０または５０の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、２〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜５０、５０〜１００または１００〜２００の抗原性ポリペプチドをコードする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは化学修飾を含み、化学修飾は表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、第２の化学修飾を含み、前記第２の化学修飾は表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の化学修飾の組み合わせは、表２５に列挙されたものから選択される。
【００２３】
他の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、５０〜２００ｎｍの平均直径を有するナノ粒子内部に製剤化されるＮＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、中性ｐＨにおいて中性の正味電荷を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含むカチオン性脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される。
【００２４】
他の態様は第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、該オープンリーディングフレーム内のウラシルの少なくとも８０％が化学修飾を有するＮＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム内のウラシルの１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾はウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、カチオン性脂質複合体またはカチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化される。
【００２５】
更に他の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’末端キャップ及び少なくとも１つの化学修飾を有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、カチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化されたＮＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。いくつかの実施形態では、化学修飾は、表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは更に、第２の化学修飾を含み、前記第２の化学修飾は表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の化学修飾の組み合わせは、表２５に列挙されたものから選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する。
【００２７】
いくつかの態様は、ヘマグルチニンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、カチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化されたＮＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、ＨＡ１、ＨＡ７及びＨＡ１０から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、Ｆタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは更に、ノイラミニダーゼタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、インフルエンザＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスまたはそれらの組み合わせの株から誘導される。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ８から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは化学修飾を含み、化学修飾は表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは更に、第２の化学修飾を含み、前記第２の化学修飾は表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の化学修飾の組み合わせは、表２５に列挙されたものから選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１９７〜３９２を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１９７〜３９２と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号９４１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号９４１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号９４６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号９４６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２４を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２４と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２５を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２５と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２６を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２６と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２７を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１０２７と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明の態様は、配列番号１０２７または配列番号１０２６と８０〜９５％の配列同一性を有する核酸を提供する。他の態様は、配列番号３９５を含む核酸を提供する。
【００３２】
更に他の態様は、対象において抗原特異的な免疫応答を誘発する方法を提供し、本方法は本明細書に記載するワクチンのいずれかを有効量で対象に投与して、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答は、Ｂ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答を生じさせる方法は、ワクチンの単回投与を伴う。いくつかの実施形態では、方法は更に、ブースター量のワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ブースター量のワクチンは、２１日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、用量１０ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇのワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象に投与されるワクチンに、用量２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与されるワクチンに、用量１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与されるワクチンに、用量４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節に１００倍高レベルに蓄積する。
【００３４】
態様は、本明細書に記載するワクチンのいずれかを対象に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の予防または治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答は、Ｂ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答を生じさせる方法は、ワクチンの単回投与を伴う。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される。
【００３５】
更に他の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む、対象へのワクチン接種方法を提供し、ここでの該ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、更にアジュバントがワクチンと共製剤化または共投与されない。いくつかの実施形態では、用量１０ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの核酸ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の用量の核酸ワクチンは、２１日目に対象に投与される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、用量４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節に１００倍高レベルに蓄積する。
【００３７】
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、ここでの該ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含まず、アジュバントがワクチンに含まれない。いくつかの実施形態では、安定化要素はヒストンのステムループである。いくつかの実施形態では、安定化要素は、野生型配列と関連するＧＣ含量が低減された核酸配列である。
【００３８】
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含むＮＡＶを提供し、ここでの該ＲＮＡポリヌクレオチドは宿主へのインビボ投与用の製剤中に存在し、ヒト対象に許容される割合で、第１の抗原に対して、血清保護の水準を上回る抗体力価を与える。いくつかの実施形態では、抗体力価は、中和抗体力価である。
【００３９】
第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、該ＲＮＡポリヌクレオチドが宿主へのインビボ投与用の製剤中に存在しており、安定化要素を有するかまたはアジュバントと共に製剤化された、第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体力価よりも長く持続する高い抗体力価を誘発するＮＡＶも提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、１週間以内の単回投与で中和抗体を生じるように製剤化される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫活性化核酸から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ペプチドはプロタミンを含む。
【００４０】
態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有し、該オープンリーディングフレームが第１の抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、該ＲＮＡポリヌクレオチドが宿主へのインビボ投与用の製剤中に存在しており、それによって宿主中の抗原発現レベルが、安定化要素を有するか、またはアジュバントと共に製剤化された、第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンにより生じる抗原発現レベルを有意に上回るＮＡＶを提供する。
【００４１】
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有し、該オープンリーディングフレームが第１の抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、該ワクチンが、同等の抗体力価を得るために非修飾のｍＲＮＡワクチンで必要とされるよりも、少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドを有するＮＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、用量２５〜１００マイクログラム中に存在する。
【００４２】
本発明の態様はまた、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有し、該オープンリーディングフレームが第１の抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド１０ｕｇ〜４００ｕｇと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ヒト対象への送達に合わせて製剤化された１使用単位のワクチンも提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンは更に、カチオン性脂質ナノ粒子を含む。
【００４３】
本発明の態様は、個体または個体集団においてインフルエンザ株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法を提供する。この方法は、前記個体または集団に抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含み、該核酸ワクチンは（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象の筋肉組織を組成物の注射に適した装置と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、投与ステップは、エレクトロポレーションと併用される、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを接触させることを含む。
【００４４】
本発明の態様は、対象にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、有効量の第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの単回用量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇを対象に投与して、対象にワクチン接種することを含む。
【００４５】
態様はヘマグルチニンタンパク質断片をコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含むＮＡＶを提供し、該ヘマグルチニンタンパク質は頭部ドメイン（ＨＡ１）、細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインのうち、少なくとも１つの一部のみを含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８である。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、頭部ドメイン（ＨＡ１）を含まない。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、トランケート型ヘマグルチニンタンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、表６〜１６に示すアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質複合体またはカチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの５’末端キャップ及び少なくとも１つの化学修飾を含む。
【００４７】
態様は、対象の抗原特異的な免疫応答を誘発する方法で使用される、本明細書に記載するワクチンのいずれかも提供する。いくつかの実施形態では、方法は、有効量のワクチンを対象に投与し、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む。
【００４８】
他の態様は、対象の抗原特異的な免疫応答を誘発する方法であって、該方法が有効量のワクチンを対象に投与し、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む方法に使用される薬剤の製造において、本明細書に記載するワクチンいずれかの使用を提供する。
【００４９】
態様はまた、対象にワクチンを投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の予防または治療の方法に使用される本明細書に記載するワクチンのいずれかを提供する。
【００５０】
他の態様は、対象にワクチンを投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の予防または治療の方法に使用される薬剤の製造において、本明細書に記載するワクチンいずれかの使用を提供する。
【００５１】
他の態様は、対象のワクチン接種方法に使用する核酸ワクチンを提供し、該核酸ワクチンが第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、ここでの該ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、更にアジュバントがワクチンと共製剤化または共投与されない。いくつかの実施形態では、方法は更に、対象にワクチンを投与することを含む。
【００５２】
他の態様は、対象のワクチン接種方法に使用される薬剤の製造において、核酸ワクチンの使用を提供し、該核酸ワクチンが第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、ここでの該ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、更にアジュバントがワクチンと共製剤化または共投与されない。いくつかの実施形態では、方法は更に、対象にワクチンを投与することを含む。
【００５３】
本発明の態様は、個体または個体集団においてインフルエンザ株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法に使用される抗原記憶ブースター核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、抗原記憶ブースター核酸ワクチンは、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、更に該方法が、前記個体または集団に抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含む。
【００５４】
他の態様は、個体または個体集団においてインフルエンザ株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法に使用される薬剤の製造において、抗原記憶ブースター核酸ワクチンの使用を提供し、該抗原記憶ブースター核酸ワクチンは、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、更に該方法が、前記個体または集団に抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含む。
【００５５】
他の態様は、対象のワクチン接種方法に使用される核酸ワクチンを提供し、該核酸ワクチンが第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、更に該方法が、有効量の核酸ワクチンの単回用量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇを対象に投与して、対象にワクチン接種することを含む。
【００５６】
他の態様は、対象のワクチン接種方法に使用される薬剤の製造において核酸ワクチンの使用を提供し該核酸ワクチンが第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、更に該方法が、有効量の核酸ワクチンの単回用量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇを対象に投与して、対象にワクチン接種することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶポリヌクレオチドは、抗原としてインフルエンザ株の１つ以上のポリペプチドをコードしても良い。このような抗原としては、本明細書で提示する表に列挙されたポリヌクレオチドによってコードされる抗原が挙げられるが、これらに限定されない。表中、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号またはＧＩ登録番号は、コードされた抗原の完全な、または部分的なＣＤＳを表す。ＮＡＶポリヌクレオチドは、表に列挙された配列のいずれかの領域、または列挙されたｍＲＮＡのコード領域全体を含み得る。ＮＡＶポリヌクレオチドには、ハイブリッド若しくはキメラ領域、または模倣体若しくは変異体を含み得る。
【００５８】
本発明の各種実施形態の詳細を以下の説明で記述する。本発明のその他の特長、目的及び利点は、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００５９】
前述の及び他の目的、特長及び利点は、添付の図面に示されるような本発明の具体的な実施形態に関する以下の説明から明らかとなるであろう。図面では、それぞれの図を通じて同一参照符号は同じ部分を指す。図面は必ずしも縮尺に従っておらず、むしろ本発明の様々な実施形態の原理を図解することに重点が置かれている。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
核酸ワクチンであって、抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、カチオン性脂質約２０〜６０％：
非カチオン性脂質５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：及びＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有するカチオン性脂質ナノ粒子内に製剤化される、前記核酸ワクチン。
（項目２）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含む、項目１に記載のワクチン。
（項目３）
前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される、項目２に記載のワクチン。
（項目４）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：及びＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する、項目２または３に記載のワクチン。
（項目５）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、モル比約５０％のカチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール及び約１０％の非カチオン性脂質を含む、項目２または３に記載のワクチン。
（項目６）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、モル比約５５％のカチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール及び約１０％の非カチオン性脂質を含む、項目２または３に記載のワクチン。
（項目７）
前記カチオン性脂質がイオン性のカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が中性脂質であり、前記ステロールがコレステロールである、項目２に記載のワクチン。
（項目８）
前記オープンリーディングフレームがコドン最適化されている、項目１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目９）
前記抗原性ポリペプチドが感染因子から誘導される、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１０）
前記感染因子が、ウイルス株及び細菌株からなる群のメンバーから選択される、項目９に記載のワクチン。
（項目１１）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドが、更に抗原性ポリペプチドをコードする、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１２）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含む、項目１〜８に記載のワクチン。
（項目１３）
前記抗原性ポリペプチドが、表６〜１４、表２９〜３０に列挙されたタンパク質、またはその抗原性断片から選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１４）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームが表６〜１１、表２２〜２３から選択される抗原性ポリペプチド、またはその抗原性断片をコードする、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１５）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームが、それぞれ表２８のＲＮＡ配列のいずれか、またはその抗原性断片から選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１６）
前記感染因子が、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型またはこれらの組み合わせの株である、項目９〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１７）
前記インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型の株が、鳥類、ブタ、ウマ、イヌ、ヒトまたは非ヒト霊長類と関連する、項目１６に記載のワクチン。
（項目１８）
前記抗原性ポリペプチドが、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードする、項目１〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１９）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、またはこれらの断片である、項目１８に記載のワクチン。
（項目２０）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、頭部ドメイン（ＨＡ１）を含まない、項目１８または１９に記載のワクチン。
（項目２１）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、頭部ドメイン（ＨＡ１）の一部を含む、項目１８または１９に記載のワクチン。
（項目２２）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、細胞質ドメインを含まない、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２３）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、細胞質ドメインの一部を含む、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２４）
前記ヘマグルチニンタンパク質がトランケート型である、項目１８〜２３のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２５）
前記トランケート型ヘマグルチニンタンパク質が、膜貫通ドメインの一部を含む、項目１８〜２３のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２６）
前記ヘマグルチニンタンパク質またはその断片のアミノ酸配列が、表１４〜１６に示すアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を備える、項目１８〜２５のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２７）
前記ウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ８からなる群から選択される、項目１８に記載のワクチン。
（項目２８）
前記抗原性ポリペプチドが、表６〜１２に列挙されたタンパク質またはそれらの断片から選択される、項目１８に記載のワクチン。
（項目２９）
前記核酸ワクチンが多価である、項目１〜２８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３０）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗原性ポリペプチドをコードする、請求
項２９に記載のワクチン。
（項目３１）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームが、少なくとも１０、１５、２０または５０の抗原性ポリペプチドをコードする、項目２９に記載のワクチン。
（項目３２）
前記１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームが、２〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜５０、５０〜１００または１００〜２００の抗原性ポリペプチドをコードする、項目２９に記載のワクチン。
（項目３３）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが化学修飾を含み、及び前記化学修飾が表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される、項目１〜３２のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３４）
前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される、項目３３に記載のワクチン。
（項目３５）
第２の化学修飾を更に含み、前記第２の化学修飾が、表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される、項目３４に記載のワクチン。
（項目３６）
第１及び第２の化学修飾の前記組み合わせが、表２５に列挙されたものから選択される、項目３５に記載のワクチン。
（項目３７）
核酸ワクチンであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、ナノ粒子内部に製剤化され、該ナノ粒子が５０〜２００ｎｍの平均直径を有する、前記ワクチン。
（項目３８）
前記ナノ粒子が０．４未満の多分散値を有する、項目３７に記載のワクチン。
（項目３９）
前記ナノ粒子の実効電荷が中性ｐＨにおいて中性の正味電荷を有する、項目３７に記載のワクチン。
（項目４０）
前記ナノ粒子が８０〜１００ｎｍの平均直径を有する、項目３７に記載のワクチン。
（項目４１）
前記ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含むカチオン性脂質ナノ粒子である、項目３７に記載のワクチン。
（項目４２）
前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される、項目４１に記載のワクチン。
（項目４３）
核酸ワクチンであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、該オープンリーディングフレーム内のウラシルの少なくとも８０％が化学修飾を有する、前記ワクチン。
（項目４４）
前記オープンリーディングフレーム内のウラシルの１００％が化学修飾を有する、項目４３に記載のワクチン。
（項目４５）
前記化学修飾がウラシルの５位にある、項目４３または４４に記載のワクチン。
（項目４６）
前記化学修飾がＮ１−メチルシュードウリジンである、項目４３〜４４のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目４７）
カチオン性脂質複合体またはカチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化される、項目４３〜４６のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目４８）
核酸ワクチンであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’末端キャップ及び少なくとも１つの化学修飾を有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、カチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化される、前記ワクチン。
（項目４９）
前記５’末端キャップが７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである、項目４８に記載のワクチン。
（項目５０）
前記化学修飾が、表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される、項目４８〜４９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目５１）
前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される、項目５０に記載のワクチン。
（項目５２）
第２の化学修飾を更に含み、前記第２の化学修飾が、表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される、項目５０に記載のワクチン。
（項目５３）
第１及び第２の化学修飾の前記組み合わせが、表２５に列挙されたものから選択される、項目５２に記載のワクチン。
（項目５４）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含む、項目４８に記載のワクチン。
（項目５５）
前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される、項目５４に記載のワクチン。
（項目５６）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：及びＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する、項目５４または５５に記載のワクチン。
（項目５７）
核酸ワクチンであって、ヘマグルチニンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、カチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化される、前記ワクチン。
（項目５８）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、ＨＡ１、ＨＡ７及びＨＡ１０から選択される、項目５７に記載のワクチン。
（項目５９）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドがＦタンパク質をコードしない、項目５７または５８に記載のワクチン。
（項目６０）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが更にノイラミニダーゼタンパク質をコードする、項目５７〜５９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目６１）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、インフルエンザＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスまたはそれらの組み合わせの株から誘導される、項目５７〜６０のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目６２）
前記インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ８から選択される、項目６１に記載のワクチン。
（項目６３）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが化学修飾を含み、及び該化学修飾が表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される、項目５７〜６２のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目６４）
前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される、項目６３に記載のワクチン。
（項目６５）
第２の化学修飾を更に含み、前記第２の化学修飾が、表２２及び２３に列挙されたもののいずれかから選択される、項目６３に記載のワクチン。
（項目６６）
第１及び第２の化学修飾の前記組み合わせが、表２５に列挙されたものから選択される、項目６５に記載のワクチン。
（項目６７）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び非カチオン性脂質を含む、項目５７に記載のワクチン。
（項目６８）
前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群から選択される、項目６７に記載のワクチン。
（項目６９）
前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質約２０〜６０％：非カチオン性脂質約５〜２５％：ステロール約２５〜５５％：及びＰＥＧ修飾脂質約０．５〜１５％のモル比を有する、項目６７または６８に記載のワクチン。
（項目７０）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが配列２４５９〜２６２１を含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７１）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２４５９〜２６２１と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７２）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２２５４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７３）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２２５４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７４）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２２５９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７５）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２２５９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７６）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２１９２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７７）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２１９２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７８）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２２００と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７９）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２２００のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８０）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが配列番号２０４６を含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８１）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２０４６と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８２）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが配列番号２１１９を含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８３）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２１１９と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８４）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが配列番号２０５４を含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８５）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２０５４と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８６）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが配列番号２１２７を含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８７）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２１２７と８０〜９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項目５７〜６９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８８）
配列番号２１２７または配列番号２０５４と８０〜９５％の配列同一性を含む核酸。
（項目８９）
配列番号２６２４を含む核酸。
（項目９０）
対象において抗原特異的な免疫応答を誘発する方法であって、項目１〜８９のいずれか１項に記載のワクチンを有効量で対象に投与して、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む、前記方法。
（項目９１）
前記抗原特異的な免疫応答が、Ｔ細胞応答を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記抗原特異的な免疫応答が、Ｂ細胞応答を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９３）
抗原特異的な免疫応答を生じさせる前記方法が、ワクチンの単回投与を伴う、項目９０に記載の方法。
（項目９４）
ブースター量のワクチンを投与することを更に含む、項目９０に記載の方法。
（項目９５）
前記ワクチンが、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される、項目９０に記載の方法。
（項目９６）
対象において抗原特異的な免疫応答を誘発する方法に使用するための項目１〜８９のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記方法が、前記ワクチンを有効量で対象に投与し、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む、前記ワクチン。
（項目９７）
対象において抗原特異的な免疫応答を誘発する方法において使用するための薬剤の製造における項目１〜８９のいずれか１項に記載のワクチンの使用であって、前記方法は、前記ワクチンを有効量で対象に投与し、抗原特異的な免疫応答を生じさせることを含む、前記使用。
（項目９８）
項目５７〜８９のいずれか１項に記載のワクチンを対象に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の予防または治療方法。
（項目９９）
前記抗原特異的な免疫応答が、Ｔ細胞応答を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記抗原特異的な免疫応答が、Ｂ細胞応答を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
抗原特異的な免疫応答を生じさせる前記方法が、ワクチンの単回投与を伴う、項目９８に記載の方法。
（項目１０２）
前記ワクチンが、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される、項目９８に記載の方法。
（項目１０３）
インフルエンザウイルス感染の予防または治療の方法において使用するための項目５７〜８９のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記方法は、対象に前記ワクチンを投与することを含む、前記ワクチン。
（項目１０４）
インフルエンザウイルス感染の予防または治療の方法において使用するための薬剤の製造における、項目５７〜８９のいずれか１項に記載のワクチンの使用であって、前記方法は、対象に前記ワクチンを投与することを含む、前記使用。
（項目１０５）
第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む、対象へのワクチン接種方法であって、該ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化要素を含まず、更にアジュバントがワクチンと共製剤化または共投与されない、前記方法。
（項目１０６）
用量１０ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの核酸ワクチンが前記対象に投与される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記核酸が、皮内注射または筋肉注射によって前記対象に投与される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記核酸が、０日目に前記対象に投与される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
第２の用量の前記核酸ワクチンが、２１日目に前記対象に投与される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記対象に投与される前記核酸ワクチンに、用量２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる、項目１０５に記載の方法。
（項目１１１）
前記対象に投与される前記核酸ワクチンに、用量１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる、項目１０５に記載の方法。
（項目１１２）
前記対象に投与される前記核酸ワクチンに、用量４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる、項目１０５に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節において１００倍高レベルに蓄積する、項目１０５に記載の方法。
（項目１１４）
対象へのワクチン接種方法に使用するための核酸ワクチンであって、前記核酸ワクチンが、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化要素を含まず、更にアジュバントがワクチンと共製剤化または共投与されない、前記核酸ワクチン。
（項目１１５）
対象へのワクチン接種方法に使用するための薬剤の製造における、核酸ワクチンの使用であって、前記核酸ワクチンが、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化要素を含まず、更にアジュバントがワクチンと共製剤化または共投与されない、前記使用。
（項目１１６）
個体または個体集団においてインフルエンザ株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法であって、前記個体または集団に、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含む、前記方法。
（項目１１７）
前記ワクチンが、筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して、前記個体に投与される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記投与ステップが、前記対象の筋肉組織を前記組成物の注射に適した装置と接触させることを含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記投与ステップが、エレクトロポレーションと併用して、筋肉組織を前記組成物の注射に適した装置と接触させることを含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
個体または個体集団においてインフルエンザ株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法に使用するための抗原記憶ブースター核酸ワクチンであって、前記抗原記憶ブースター核酸ワクチンが、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、更に前記方法が、前記個体または集団に前記抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含む、前記抗原記憶ブースター核酸ワクチン。
（項目１２１）
個体または個体集団においてインフルエンザ株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法に使用するための薬剤の製造における、抗原記憶ブースター核酸ワクチンの使用であって、前記抗原記憶ブースター核酸ワクチンが、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾及び２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、更に前記方法が、前記個体または集団に前記抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含む、前記使用。
（項目１２２）
対象へのワクチン接種方法に使用するための核酸ワクチンであって、前記核酸ワクチンが第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、更に前記方法が、前記核酸ワクチンの単回用量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇを有効量で前記対象に投与して、前記対象にワクチン接種することを含む、前記核酸ワクチン。
（項目１２３）
対象へのワクチン接種方法に使用するための薬剤の製造における、核酸ワクチンの使用であって、前記核酸ワクチンが第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、更に前記方法が、前記核酸ワクチンの単回用量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇを有効量で前記対象に投与して、前記対象にワクチン接種することを含む、前記使用。
（項目１２４）
核酸ワクチンであって、ヘマグルチニンタンパク質断片をコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記ヘマグルチニンタンパク質が、頭部ドメイン（ＨＡ１）、細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインのうち、少なくとも１つの一部のみを含む、前記核酸ワクチン。
（項目１２５）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８である、項目１２４に記載のワクチン。
（項目１２６）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、頭部ドメイン（ＨＡ１）を含まない、項目１２４に記載のワクチン。
（項目１２７）
前記ヘマグルチニンタンパク質が、細胞質ドメインを含まない、項目１２４に記載のワクチン。
（項目１２８）
前記トランケート型ヘマグルチニンタンパク質が、膜貫通ドメインを含まない、項目１２４〜１２７のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１２９）
前記ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列が、１４〜１６に示すアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を備える、項目１２４〜１２８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１３０）
前記ワクチンがカチオン性脂質複合体またはカチオン性脂質ナノ粒子内部に製剤化される、項目１２４〜１２９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１３１）
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’末端キャップ及び少なくとも１つの化学修飾を含む、項目１２４〜１３０のいずれか１項に記載のワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】ポリヌクレオチド構築物の概略図である。図１Ａは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、共通所有の同時係属中である米国特許出願第１３／７９１，９２２号（２０１３年３月９日出願）に教示されるポリヌクレオチド構築物の概略図である。図１Ｂは、直鎖状ポリヌクレオチド構築物の概略図である。
【図１Ｂ】ポリヌクレオチド構築物の概略図である。図１Ａは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、共通所有の同時係属中である米国特許出願第１３／７９１，９２２号（２０１３年３月９日出願）に教示されるポリヌクレオチド構築物の概略図である。図１Ｂは、直鎖状ポリヌクレオチド構築物の概略図である。
【図２】本発明の一連のキメラポリヌクレオチドの概略図である。
【図３】一連のキメラポリヌクレオチドの概略図であり、位置修飾の種々のパターンを示し、かつｍＲＮＡポリヌクレオチドの各領域と類似する領域を示す。
【図４】一連のキメラポリヌクレオチドの概略図であり、式Ｉに基づく位置修飾の種々のパターンを示す。
【図５】一連のキメラポリヌクレオチドの概略図であり、式Ｉに基づく位置修飾の種々のパターンを示し、ブロック化または構造化された３’末端を更に示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、本発明の環状構築物の概略図である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、本発明の環状構築物の概略図である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、本発明の環状構築物の概略図である。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、本発明の環状構築物の概略図である。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、本発明の環状構築物の概略図である。図８Ａは少なくとも１つのセンサー領域及びスペーサー領域を含む環状構築物を示す。図８Ｂは非コード環状構築物を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、本発明の環状構築物の概略図である。図８Ａは少なくとも１つのセンサー領域及びスペーサー領域を含む環状構築物を示す。図８Ｂは非コード環状構築物を示す。
【図９】本発明の非コード環状構築物の概略図である。
【図１０】タンパク質及び非修飾ｍＲＮＡワクチンと比較した、化学修飾ｍＲＮＡインフルエンザワクチンのＨＡ中和力価を示す。
【図１１】Ｈ１Ｎ１ウイルスのヘマグルチニンタンパク質をコードするｍＲＮＡを異なる用量及び製剤でワクチン接種した後のマウスにおけるヘマグルチニン阻害力価を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ワクチン接種及びインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる負荷後のマウスの生存率を示す。図１２Ａは、負荷後１週での生存率を示す。図１２Ｂは、負荷後２週での生存率を示す。図１２Ｃは、負荷後３週での生存率を示す。図１２Ｄは、負荷後４週での生存率を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ワクチン接種及びインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる負荷後のマウスの生存率を示す。図１２Ａは、負荷後１週での生存率を示す。図１２Ｂは、負荷後２週での生存率を示す。図１２Ｃは、負荷後３週での生存率を示す。図１２Ｄは、負荷後４週での生存率を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ワクチン接種及びインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる負荷後のマウスの生存率を示す。図１２Ａは、負荷後１週での生存率を示す。図１２Ｂは、負荷後２週での生存率を示す。図１２Ｃは、負荷後３週での生存率を示す。図１２Ｄは、負荷後４週での生存率を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ワクチン接種及びインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる負荷後のマウスの生存率を示す。図１２Ａは、負荷後１週での生存率を示す。図１２Ｂは、負荷後２週での生存率を示す。図１２Ｃは、負荷後３週での生存率を示す。図１２Ｄは、負荷後４週での生存率を示す。
【図１３】ワクチン接種及びインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる負荷後のマウスの平均ヘマグルチニン阻害力価を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞のＩＦＮγサイトカイン応答を示す。図１４ＡはＨ１タンパク質／ペプチドによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。図１４ＢはＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。図１４ＣはＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞のＩＦＮγサイトカイン応答を示す。図１４ＡはＨ１タンパク質／ペプチドによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。図１４ＢはＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。図１４ＣはＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞のＩＦＮγサイトカイン応答を示す。図１４ＡはＨ１タンパク質／ペプチドによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。図１４ＢはＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。図１４ＣはＰＭＡ＋イオノマイシンによる刺激時のＩＦＮγ産生を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５ＤＨ１及びＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激後のＩｇＧ産生を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５ＤＨ１及びＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激後のＩｇＧ産生を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５ＤＨ１及びＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激後のＩｇＧ産生を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５ＤＨ１及びＨ７タンパク質／ペプチドによる刺激後のＩｇＧ産生を示す。
【図１６】Ｈ１０Ｎ８／Ｎ１−メチルシュードウリジン／Ｃ０製剤ＭＣ３ワクチンを指定用量で投与した後の、Ｈ１０に対するヘマグルチニン阻害力価（ＨＡＩ）を示すグラフである。
【図１７】Ｈ１０Ｎ８／Ｎ１−メチルシュードウリジン／Ｃ１製剤ＭＣ３ワクチンを指定用量で投与した後の、Ｈ１０に対するヘマグルチニン阻害力価（ＨＡＩ）を示すグラフである。
【図１８】１０μｇ／用量でＨ７Ｎ９／Ｃ０製剤を投与した後の、Ｈ７に対するヘマグルチニン阻害力価（ＨＡＩ）をＨ７Ｎ９／Ｃ１製剤の場合と比較したグラフである。
【図１９】指定された製剤及び用量の投与前及び投与後の種々の時点でカニクイザルから採取した血清サンプル中の平均ヘマグルチニン阻害力価（ＨＡＩ）のグラフである。
【図２０】単一の予防接種を受けた２１日後に負荷されたフェレットのＨ７Ｎ９ウイルス負荷を示すグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜２１Ｄは、Ｈ７Ｎ９をコードする単回用量のｍＲＮＡ  ＮＡＶの投与後、致死量の負荷をされたマウスのマウス生存及びＨＡＩ力価を示す。図２１Ａは負荷後７日目の生存を示す。図２１Ｂは負荷後２１日目の生存を示す。図２１Ｃは負荷後８４日目の生存を示す。図２１ＤはＨＡＩ力価を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜２１Ｄは、Ｈ７Ｎ９をコードする単回用量のｍＲＮＡ  ＮＡＶの投与後、致死量の負荷をされたマウスのマウス生存及びＨＡＩ力価を示す。図２１Ａは負荷後７日目の生存を示す。図２１Ｂは負荷後２１日目の生存を示す。図２１Ｃは負荷後８４日目の生存を示す。図２１ＤはＨＡＩ力価を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｄは、Ｈ７Ｎ９をコードする単回用量のｍＲＮＡ  ＮＡＶの投与後、致死量の負荷をされたマウスのマウス生存及びＨＡＩ力価を示す。図２１Ａは負荷後７日目の生存を示す。図２１Ｂは負荷後２１日目の生存を示す。図２１Ｃは負荷後８４日目の生存を示す。図２１ＤはＨＡＩ力価を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｄは、Ｈ７Ｎ９をコードする単回用量のｍＲＮＡ  ＮＡＶの投与後、致死量の負荷をされたマウスのマウス生存及びＨＡＩ力価を示す。図２１Ａは負荷後７日目の生存を示す。図２１Ｂは負荷後２１日目の生存を示す。図２１Ｃは負荷後８４日目の生存を示す。図２１ＤはＨＡＩ力価を示す。
【図２２−１】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−５】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−６】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−７】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−８】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−９】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１０】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１１】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１２】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１３】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１４】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１５】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１６】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１７】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１８】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−１９】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２０】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２１】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２２】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２３】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２４】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２５】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２６】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２７】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２８】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−２９】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３０】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３１】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３２】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３３】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３４】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３５】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３６】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３７】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３８】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−３９】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４０】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４１】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４２】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４３】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４４】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４５】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４６】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４７】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４８】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−４９】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−５０】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２２−５１】コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。配列は、上から下に、配列番号１０２０、８、１３、７、９８、９９、１００、９６、８９、９２、２４、２９、９０、５７、４２、２７、７８、７４、９５、３０、３１、３２、２５、３９、３８、３５、３６、３７、８２、９１、８３、１０４、９３、９４、１７８、１３３、１３４、１３２、１３５、１３６、１７３、１７５、１７４、７３、７０、３３、３４、４１、４０、７６、７５、７２、７９、８０、８６、１０５、７７、１１、１２、４、１６４、１５０、１５１、１７１、１５２、１６５、１２１、１６６、１６７、１５６、１５７、１６８、１４３、１６９、１４４、１４５、１２２、１１３、１１７、１１９、１３８、１３７、１４６、１４７、１４８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、６２、１２９、１３０、１４１、１２３、１２４、１７６、１２５、１８２、１８３、１７９、１８０、１８４、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１７７、１４０、４９、４７、４８、９７、５０、５１、１９１、１９５、１９６、１２８、１３１、１７０、１１１、１１２、１１８、１０８、１２０、１０９、１０７、２６、１０６、５２、５３、２８、１９２、４５、４６、６、４４、４３、１２６、１９、２１、２０、５９、５４、７１、１０２、１０、１０１、２、５８、２３、５５、５、２２、１０３、１５３、１５４、１５５、１７２、１４２、１１４、１１５、１１６、１２７、１４９、１６３、１３９、１９４、１１０、１７、８１、３、８５、８７、８８、８４、６１、６０、１、９、１４、１５、１６、６４、６３、６６、６５、６７、６８、６９、１８および５６に対応する。
【図２３−１】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−２】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−３】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−４】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−５】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−６】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−７】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−８】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−９】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−１０】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−１１】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−１２】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−１３】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２３−１４】図２３（配列番号１０２１、９６７〜１０１９）は、コンセンサス配列に対する、インフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株に由来するヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボを問わず、細胞内部の目的とするペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）の設計、合成及び送達を可能にし、それによって細胞、組織または器官にとって、更に最終的には生物にとって有益である生理学的成果を得ることは、治療的、診断的薬剤の分野及びバイオアッセイの分野での大きな関心事である。１つの有益な成果は、核酸の細胞内翻訳及び少なくとも１つのコードされた目的ペプチドまたはポリペプチドの産生をもたらすことである。
【００６２】
ワクチン接種を目的とした、抗原（例えば、感染性微生物から誘導される抗原）をコードする核酸、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）の設計、合成及び送達を可能にすることは特に関心が高い。
【００６３】
本明細書では、核酸ワクチン（ＮＡＶ）の選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法を記載する。該ＮＡＶの少なくとも１つの成分は核酸分子、例えばポリヌクレオチドである。特に、本明細書では、核酸ワクチン（ＮＡＶ）の少なくとも１つの成分がポリヌクレオチドであるＮＡＶの選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法を記載する。特に、本明細書では、核酸ワクチン（ＮＡＶ）の少なくとも１つの成分が、抗原、例えば伝染性微生物から誘導される抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドである、ＮＡＶの選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法を記載する。ある特定の実施形態では、本発明は、リボ核酸ワクチン（ＲＮＡＶ）の少なくとも１つの成分が、抗原、例えば伝染性微生物から誘導される抗原をコードするリボ核酸分子、例えばｍＲＮＡである、ＲＮＡＶの選択、設計、調製、製造、製剤化及び／または使用のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法に関する。よって本発明は、部分的には、ワクチンまたはワクチンの成分として機能できるポリペプチド、特にインビトロ転写（ＩＶＴ）ポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド及び／または環状ポリヌクレオチドに関する。
【００６４】
本明細書に記載するＮＡＶを選択、設計及び／または利用するためのシステム、プロセス、装置及びキットも提供する。
【００６５】
本発明によれば、このポリヌクレオチドは、当該技術の他のポリヌクレオチド分子の欠陥を回避できるか、またはそれを上回る改善をもたらし得る。
【００６６】
ｍＲＮＡワクチン及び自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンの製造が試行されてきたにもかかわらず、このようなＲＮＡワクチンの治療的有効性はまだ十分に確立されていない。実に驚くべきことに、本発明者らは、中和能力を有する抗原産生及び機能性抗体産生の亢進を含む、著しく増強された、また多くの面で相乗的な免疫応答をもたらす種類の、ｍＲＮＡワクチンの生体内への送達のための製剤を見出した。他の種類の脂質系製剤で使用されるｍＲＮＡ用量と比較して、著しく低用量のｍＲＮＡが投与された場合でも、これらの結果が達成される。本発明の製剤は、予防的及び治療的な薬剤としての機能性ｍＲＮＡワクチンの有効性を確立するのに十分である予想外に有意な生体免疫応答を示した。
【００６７】
本発明は、いくつかの態様において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、化学修飾されたｍＲＮＡワクチン及び非修飾のｍＲＮＡワクチンを含めて、ｍＲＮＡワクチンの効果を著しく増強するという驚くべき知見を包含する。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンの有効性を、いくつかの異なったウイルス抗原を使用して、かつ多種多様な動物モデルにてインビボで試験した。本明細書で提示する結果は、他の脂質系担体で製剤化された他のｍＲＮＡワクチンならびにタンパク質抗原よりも予想外に優れた、ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンの有効性を示している。
【００６８】
増強された免疫応答を提供することに加えて、本発明の製剤は単回用量の抗原を用いた後、試験された他のｍＲＮＡワクチンまたはタンパク質ベースのワクチンよりも急速な免疫応答を引き起こす。本明細書に記載する試験では、マウスの静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）にワクチン接種した後、致死量のウイルスに曝露した。ワクチン接種された動物は全て致死量にも生存したのに加え、タンパク質抗原及び他の脂質系製剤（リポプレックス）と比較して、著しく強い初期の免疫応答（ウイルス中和アッセイ及びＨＡ阻害（ＨＡＩ）による抗ウイルス活性）が観察された。データによれば、ｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を受けている２群の動物（ＩＤまたはＩＭ）は、ワクチン接種後１週という早い段階でそれぞれ６０及び１１４という、４０を超えるＨＡＩ力価を示した。４０超のＨＡＩ力価は、インフルエンザの致死攻撃からの防御に十分であると見なされる。特にワクチン接種後１週、更には３週の時点でも引き続き４０未満の無効なＨＡＩ力価を示したタンパク質抗原及び他の脂質担体（リポプレックス）で製剤化されたｍＲＮＡワクチンに見られた応答と比較した場合、この急速な反応は予想外であった。
【００６９】
本発明の製剤は、それ以降の各時点（３週及び５週）でも、それぞれタンパク質抗原の場合よりも引き続き有意に強い治療応答をもたらした。事実、ＩＶ経路により投与された、化学修飾されていない、及び化学修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤はいずれも、タンパク質抗原と比較して増強したＨＡＩ力価を有した。ＩＭまたはＩＤ投与によりｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を受けている動物は全て、１週及び３週の時点でも４０未満のＨＡＩ力価を引き続き示したタンパク質抗原と比較して、３週目までに４０超のＨＡＩ活性を示した。５週目までに、ＩＤ経路により投与されたｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、同時点のタンパク質抗原のＨＡＩ力価が約４００であったのに対して、驚くべきことに１０，０００超のＨＡＩ活性を有した。ｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を受けているマウスは、マイクロ中和アッセイによって７９〜２５０（ＩＭ）及び２５０（ＩＤ）の中和活性も示した。対して、同時点でのタンパク質抗原の中和活性は検出不能であった。ワクチン接種後、５週目までに、６つのＬＮＰ製剤化群のうち５つは、７８９〜２４８９２の高い中和活性を示した。対照的に、タンパク質抗原を用いてワクチン接種されたマウスは、５匹のマウスのうち３匹のみ中和活性を示し、その範囲は７９〜２５０に留まった。
【００７０】
本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、別の脂質担体（リポプレックス）で製剤化されたｍＲＮＡワクチンの場合よりも、定量的及び定性的に良好な免疫応答も生成した。５週目に、ｍＲＮＡ−リポプレックスワクチンは、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤により達成された値（６３５〜１０，１５２のＨＡＩ力価）と比較して、１９７のＨＡＩ力価を示した。他のどの時点でも、ｍＲＮＡ−リポプレックスワクチンの全てにおいて、ＨＡＩ力価はどれも４０超の臨界レベルに達しなかった。加えて、ｍＲＮＡ−リポプレックスワクチンは、ワクチン接種の５週間後になっても、マイクロ中和活性に関して検出可能な中和活性に至らなかった。
【００７１】
本明細書に記載するデータは、本発明の製剤が既存のタンパク質抗原ワクチン及びｍＲＮＡワクチン製剤のいずれよりも、予想外に著しい改善をもたらしたことを示している。インフルエンザ致死攻撃からの１００％生存をもたらした、１週間後の迅速な防御抗体力価の発現、及び高い抗体力価（すなわち、非修飾ｍＲＮＡの５０倍、タンパク質ワクチンの２０倍）が改善点として挙げられる。
【００７２】
加えて、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、ｍＲＮＡの用量が他の脂質製剤の場合より著しく低い際にも、他の脂質製剤よりも優れていた。例えば、上記のデータは、ｍＲＮＡ−リポプレックス製剤では８０μｇのｍＲＮＡであるのに対して、ｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤では１０μｇのｍＲＮＡを使用して得たものであった。
【００７３】
本発明の製剤は、非ヒト霊長類を含む、いくつかの非齧歯類動物モデルでも強い有効性を示した。カニクイザル及びフェレットへのワクチン接種において高い有効性が観察された。カニクイザルに種々の用量のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤（５０μｇ／用量、２００μｇ／用量、４００μｇ／用量）をワクチン接種した。実に驚くべきことに、１回のワクチン接種後ちょうど７日目にウイルスに曝露したフェレットの肺において、本発明のワクチン製剤は全ての用量で有意に減少したウイルス力価が測定された。ＨＡＩ及びマイクロ中和により測定したとき、抗体力価の統計的に有意な増加が、ワクチン接種後７日目という早期に検出され、更にこれは研究実施期間（８４日）を通じて検出された。大部分の動物において、１回のワクチン接種で全てのウイルスを排除することができた。
【００７４】
本明細書に記載する試験で使用されたＬＮＰは、動物モデル、ならびにヒトにおいても各種のｓｉＲＮＡの送達に以前より使用されていた。ＬＮＰ製剤のｓｉＲＮＡ送達と関連してなされた観察から見て、ＬＮＰがワクチンに有用であるという事実は実に驚くべきことである。ＬＮＰ製剤化ｓｉＲＮＡの治療的送達は、一過性のＩｇＭ応答と関連した望ましくない炎症反応の原因となり、通常は抗原産生の低下及び損なわれた免疫応答に繋がることが観察されている。ｓｉＲＮＡについて観察された所見とは対照的に、本発明のＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤は、一過性のＩｇＭ応答よりむしろ、予防的及び治療的な方法に十分であるＩｇＧレベルの増強を生み出すことを本明細書に示す。
【００７５】
Ｉ．核酸ワクチン（ＮＡＶ）
本発明の核酸ワクチン（ＮＡＶ）は、１つ以上の野生型または遺伝子操作抗原をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチド構築物を含む。例示的なポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチド構築物は、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを含む。例示的態様において、本発明のポリヌクレオチド、例えば抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を含んでも良い。
【００７６】
本発明のＮＡＶ組成物は、寛容化剤またはアジュバントを含むが、それらに限定されない他の成分を含んでも良い。
【００７７】
寛容化剤または組成物
自己免疫媒介性の副作用が発生する場合、抗原特異的な寛容性を誘発するため、ｍＲＮＡの寛容化及び／または例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ６１／８９２，５５６（２０１３年１０月１８日出願）及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６１１０４（２０１４年１０月１７日出願）などに教示されたいずれかのようなものをＮＡＶと共投与する。
【００７８】
アジュバント
アジュバントまたは免疫増強剤を１つ以上のＮＡＶと共に、または組み合わせて投与しても良い。
【００７９】
一実施形態では、アジュバントは、感染の存在に応じて、一次Ｔ細胞及び／またはＢ細胞及び／またはＮＫ細胞に対する共シグナルとして作用する。
【００８０】
アジュバントの利点は、抗原の免疫原性の増強、免疫応答性の調節、免疫付与の成功に必要とされる抗原量の減少、必要とされるブースター免疫の頻度の減少、及び高齢者及び免疫不全のワクチン接種者での免疫応答の改善を含む。アジュバントは、筋肉内、皮下、ＩＶまたは皮内注射など、経路を問わず共投与することができる。
【００８１】
本発明で有用なアジュバントは天然物または合成物を含み得るが、これらに限定されない。アジュバントは有機であっても無機であっても良い。
【００８２】
アジュバントは、（１）無機塩類、例えば水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムのゲル；（２）オイルエマルジョン及び界面活性剤系の製剤、例えば、マイクロ流体化洗剤で安定化した水中油型エマルジョン、精製サポニン、水中油型エマルジョン、安定化した油中水型乳エマルジョンを含むエマルジョン；（３）粒子状アジュバント、例えば、ビロゾーム（インフルエンザヘマグルチニンを組み込んでいるユニラメラリポソームビヒクル）、サポニン及び脂質の構造複合体、ポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧ）；（４）微生物誘導体；（５）内因性ヒト免疫調節薬；及び／または（６）金粒子などの不活性ビヒクル；（７）微生物由来アジュバント；（８）張力活性化合物；（９）炭水化物類；またはこれらの組み合わせのいずれかの種類から選択して良い。
【００８３】
ＤＮＡ核酸ワクチン（ＤＮＡ）用のアジュバントは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＫｏｂｉｙａｍａらのＶａｃｃｉｎｅｓ，２０１３，１（３），２７８−２９２に開示されている。Ｋｏｂｉｙａｍａによって開示されたアジュバントのいずれをも、本発明のＲＮＡＶで使用しても良い。
【００８４】
本発明のＲＮＡＶで利用できる他のアジュバントは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ウェブ上のワクチンアジュバントデータベース、Ｖａｘｊｏ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｏｌｉｎｅｔ．ｏｒｇ／ｖａｘｊｏ／）に列挙されたもの、及びＳａｙｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２巻（２０１２），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８３１４８６，１３ページに記載されたもののいずれかを含む。
【００８５】
適切なアジュバントの選択は、当業者に明らかであろう。具体的なアジュバントとして、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体ＪＶＲＳ−１００、水酸化アルミニウムワクチンアジュバント、リン酸アルミニウムワクチンアジュバント、硫酸カリウムアルミニウムアジュバント、アルヒドロゲル、ＩＳＣＯＭ（商標）、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＣｐＧ  ＤＮＡワクチンアジュバント、コレラ毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、リポソーム、サポニンワクチンアジュバント、ＤＤＡアジュバント、スクアレン系アジュバント、Ｅｔｘ  Ｂサブユニットアジュバント、ＩＬ−１２ワクチンアジュバント、ＬＴＫ６３ワクチン突然変異アジュバント、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバント、Ｒｉｂｉワクチンアジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０アジュバント、コリネバクテリウム由来Ｐ４０ワクチンアジュバント、ＭＰＬ（商標）アジュバント、ＡＳ０４、ＡＳ０２、リポ多糖体ワクチンアジュバント、ムラミルジペプチドアジュバント、ＣＲＬ１００５、死菌コリネバクテリウムパルヴムワクチンアジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１、百日咳菌成分ワクチンアジュバント、カチオン性リポソームワクチンアジュバント、アダマンチルアミドジペプチドワクチンアジュバント、Ａｒｌａｃｅｌ  Ａ、ＶＳＡ−３アジュバント、アルミニウムワクチンアジュバント、Ｐｏｌｙｇｅｎワクチンアジュバント、Ａｄｊｕｍｅｒ（商標）、藻類グルカン、Ｂａｙ  Ｒ１００５、Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（登録商標）、ステアリルチロシン、Ｓｐｅｃｏｌ、アルガムリン、Ａｖｒｉｄｉｎｅ（登録商標）、リン酸カルシウムゲル、ＣＴＡ１−ＤＤ遺伝子融合タンパク質、ＤＯＣ／Ａｌｕｍ複合体、ガンマイヌリン、ゲルブアジュバント、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、組換えｈＩＦＮ−γ／インターフェロン−ｇ、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−７、Ｓｃｌａｖｏペプチド、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ  ＬＶ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ  ＨＰＡ、Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ、ＭＦ５９、ＭＴＰ−ＰＥリポソーム、ムラメチド、ムラパルミチン、Ｄ−ムラパルミチン、ＮＡＧＯ、非イオン性界面活性剤ビシクル、ＰＭＭＡ、プロテインコレステロール、ＱＳ−２１、ＳＰＴ（抗原製剤）、ナノエマルジョンワクチンアジュバント、ＡＳ０３、Ｑｕｉｌ−Ａワクチンアジュバント、ＲＣ５２９ワクチンアジュバント、ＬＴＲ１９２Ｇワクチンアジュバント、大腸菌易熱性毒素、ＬＴ、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩.アジュバント、リン酸カルシウムワクチンアジュバント、Ｓｅｐｐｉｃモンタナイド不完全アジュバント、イミキモド、レシキモド、ＡＦ０３、フラジェリン、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、Ａｂｉｓｃｏ−１００ワクチンアジュバント、アルブミン−ヘパリン微小粒子ワクチンアジュバント、ＡＳ−２ワクチンアジュバント、Ｂ７−２ワクチンアジュバント、ＤＨＥＡワクチンアジュバント、共刺激分子に対する抗体を含有する免疫リポゾーム、ＳＡＦ−１、センダイプロテオリポソーム、センダイ含有脂質マトリックス、トレオニルムラミルジペプチド（ＴＭＤＰ）、Ｔｙ粒子ワクチンアジュバント、ブピバカインワクチンアジュバント、ＤＬ−ＰＧＬ（ポリエステルポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド））ワクチンアジュバント、ＩＬ−１５ワクチンアジュバント、ＬＴＫ７２ワクチンアジュバント、ＭＰＬ−ＳＥワクチンアジュバント、コレラ毒素ｍＣＴ−Ｅ１１２Ｋの非毒性突然変異Ｅ１１２Ｋ及び／またはＭａｔｒｉｘ−Ｓが挙げられる。
【００８６】
本発明のＮＡＶと共投与できる他のアジュバントとして、インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＣＣＬ２１のようなケモカイン、エオタキシン、ＨＭＧＢ１、ＳＡ１００−８α、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、グラニュライシン、ラクトフェリン、オボアルブミン、ＣＤ−４０Ｌ、ＣＤ２８アゴニスト、ＰＤ−１、可溶性ＰＤ−１、Ｌ１若しくはＬ２、またはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７及びＩＬ−１８などのインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントは、例えば、ポリシストロニックなどの同様にコードされたポリヌクレオチドで、またはアジュバント及び抗原をコードする別のｍＲＮＡとしてＮＡＶと共に投与しても良い。
【００８７】
価数
本発明のＮＡＶはその価数において様々であり得る。価数とは、ＮＡＶまたはＮＡＶポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）またはポリペプチド中の抗原成分数を指す。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは一価である。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは二価である。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは三価である。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは多価である。多価ワクチンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の抗原または抗原性部分（例えば、抗原ペプチドなど）を含み得る。ＮＡＶの抗原成分は、単一のポリヌクレオチドにあっても、または別々のポリヌクレオチドにあっても良い。
【００８８】
治療剤
本発明のＮＡＶは、治療剤または予防剤として使用することができる。ＮＡＶは薬剤に使用するため、及び／または免疫エフェクター細胞のプライミング、例えば、ＰＢＭＣをエクスビボで刺激／トランスフェクトし、その活性細胞を再注入するために提供する。例えば、本明細書に記載するＮＡＶは対象に投与することができ、そのときポリヌクレオチドはインビボで翻訳されて抗原を産生する。ヒト及びその他の哺乳動物の疾患または病態の診断、治療または予防のための組成物、方法、キット及び試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ＮＡＶ、ＮＡＶ含有細胞、または前記ＮＡＶに含まれるポリヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドを含む。
【００８９】
本明細書では、本明細書に記載するＮＡＶのポリヌクレオチドを使用して、細胞、組織または生物におけるポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳を誘導する方法を提供する。このような翻訳はインビボ、エクスビボ、培養液内、インビトロで行われ得る。目的とするポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）をコードする少なくとも１つの翻訳可能な領域を有するポリヌクレオチドを含むＮＡＶを含有する有効量の組成物と、細胞、組織または生物を接触させる。
【００９０】
ＮＡＶ組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特徴（例えば、サイズ及び修飾ヌクレオシドの程度）及びＮＡＶのその他の成分の物理的特徴、ならびにその他の決定要因に基づいて定められる。一般にＮＡＶ組成物の有効量は、細胞中での抗原産生機能としての免疫応答の誘導または増強を、好ましくは同じ抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的にもたらす。増加した抗原産生は、細胞の増加したトランスフェクション（すなわち、ＮＡＶでトランスフェクトされる細胞のパーセント）、ポリヌクレオチドからの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解（例えば、修飾ポリヌクレオチドからの増加したタンパク質翻訳期間などで示される）、または変化した宿主細胞の自然免疫応答により示され得る。
【００９１】
本発明の態様は、ポリペプチド抗原のインビボ翻訳を誘導することを、それを必要とする哺乳動物対象において行う方法に関する。その場合に、少なくとも１つの構造修飾または化学修飾、及びポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）をコードする翻訳可能な領域を有するポリヌクレオチドを含むＮＡＶ組成物の有効量を、本明細書に記載する送達方法を使用して対象に投与する。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが細胞内で翻訳されるような量及びその他の条件下で提供される。ポリヌクレオチドが局在化される細胞または細胞が存在する組織を標的として、ＮＡＶを１回または複数回投与することができる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、投与されたポリヌクレオチドを含むＮＡＶは、ポリペプチドが翻訳される細胞、組織または生物内に実質的に存在しない機能的な免疫系関連の活性を与える１つ以上のポリペプチドの産生を誘導する。例えば、存在しない機能的活性は、酵素的、構造的、または遺伝子調節的な性質であり得る。関連した実施形態では、投与されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドが翻訳される細胞内に存在するが、実質的に欠損した免疫系に関連した機能的な活性を（例えば、相乗的に）増加させる１つ以上のポリペプチドの産生を誘導する。
【００９３】
加えて、ポリペプチドは、細胞内、細胞表面に存在する生物学的部分、または細胞から分泌された生物学的部分の活性を直接または間接的に中和する。中和される生物学的部分の例は、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素及び破傷風菌毒素などのタンパク質毒素、またはボツリヌス、コレラ及びジフテリア毒などの小分子毒素を含む。加えて、中和される生体分子は、細胞毒性または細胞増殖抑制性の活性などの望ましくない活性を呈する内因性タンパク質であっても良い。
【００９４】
本明細書に記載するタンパク質は、細胞内、潜在的には細胞質または核などの特異的な区画内での局在化のために操作することができ、あるいは細胞からの分泌または細胞の形質膜への輸送のために操作される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明によるＮＡＶのポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、寄生性感染症または細菌感染症を含むが、これらに限定されない様々な疾患、障害及び／または病態のいずれをも治療するために用い得る。
【００９６】
治療剤を投与できる対象は、疾患、障害または有害症状を有する、またはそれらの発症リスクを有し得る。この基準に基づいて対象を特定、診断及び分類する方法が提供され、これには臨床診断、バイオマーカーレベル、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）及び当該技術分野で既知のその他の方法を含み得る。
【００９７】
薬剤は、同時に、例えば単位用量で併用（例えば、両方の薬剤の同時送達を行う）にて投与することができる。薬剤は、指定された時間間隔、例えば限定されないが、数分、数時間、数日または数週の間隔で投与することもできる。一般に薬剤は対象内で同時に生物学的利用可能、例えば検出可能であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、ほぼ同時に投与しても良く、例えば２単位用量を同時に投与するか、または２つの薬剤を合計した単位用量で投与しても良い。他の実施形態では、薬剤は、別々の単位用量で送達されても良い。薬剤はどの順序で投与しても、２つ以上の薬剤を含む１つ以上の製剤として投与されても良い。好ましい実施形態では、薬剤のいずれか、例えば第１の薬剤の少なくとも１回の投与が、他の薬剤、例えば第２の薬剤の数分、１、２、３若しくは４時間以内、または更には１若しくは２日以内に行われても良い。いくつかの実施形態では、併用によって、相乗的な結果、例えば相加的な結果を超える、例えば相加的な結果よりも少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００％上回る結果を達成することができる。
【００９８】
免疫応答の調節
免疫応答の活性化
本発明によれば、本明細書で開示するポリヌクレオチド、例えばＲＮＡポリヌクレオチドを含むＮＡＶは、単一の組成物としてワクチンとして作用することができる。本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、生物、例えば動生物、例えば哺乳類生物（例えばヒト）の免疫を刺激、誘発、発生または改善する組成物、例えば物質または製剤を指す。好ましくは、ワクチンは、予防的及び／または治療的な免疫を含む、生物の１つ以上の疾患または障害に対する免疫を付与する。例示的なワクチンは、感染因子、例えば、疾患原因微生物と類似している１つ以上の薬剤を含み、例えば、生存、弱毒化、修飾、弱化、または死滅形態の疾患原因微生物から、またはそれから誘導される抗原成分の組合せを含む抗原から作製することができる。例示的実施形態では、ワクチンは、いかなる疾患または障害も誘発せずに、生物内の免疫を刺激、誘導、発症または改善するか、あるいは生物内で感染を引き起こすか、またはそれを模倣する。ワクチンは抗原を対象の組織、細胞外空間または細胞に誘導して免疫応答を誘発し、それによって対象を特定の疾患または病原性感染症から防御する。本発明のポリヌクレオチドは抗原をコードすることができ、ポリヌクレオチドが細胞内で発現するときに、所望の免疫応答を達成する。
【００９９】
ＮＡＶは、能動免疫スキームの一環として健常な個体に予防的または治療的に投与されても、潜伏期間中または発症後の活動性感染中の感染初期に投与されても良い。
【０１００】
本発明のＮＡＶは、抗生物質及び抗ウイルス薬が受動免疫を誘発できなかった場合などの、標準的な第１選択治療後の第２選択治療として投与されても良い。この点に関して、本発明のＮＡＶは、第１選択治療に対して耐性が生じ、疾患が持続して慢性疾患を誘発している場合に有用である。
【０１０１】
ＮＡＶは、ＭＲＳＡまたはクロストリジウム感染症などの潜伏細菌感染症に対する治療レジメンの一環として投与されても良い。この実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドを投与して、最終的に細菌周囲の防御壁を除去または改変するタンパク質を産生し、抗生物質治療に対して細菌を作用させやすくする。
【０１０２】
一実施形態では、１つまたは複数の汎用のまたは患者特異的な抗生物質耐性の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを患者に投与する（例えばＮＤＭ−１）。次にポリヌクレオチドを翻訳し、インビボで酵素を産生する。この酵素の産生により、抗生物質耐性を中和し、再度利用可能な抗生物質によるクリアランスに対して細菌を作用させやすくする分泌酵素及び／または細胞内酵素に対する抗体媒介性の免疫応答を上昇させることができる。広範にわたる抗生物質耐性遺伝子の突然変異体及び変異体を考慮すると、患者を宿主とする具体的な細菌遺伝子を配列決定し、感染患者に特異的な変異体と正確に一致するワクチンを設計することが可能になる。
【０１０３】
ワクチン内でのＲＮＡの使用またはワクチンとしてのＲＮＡの使用は、免疫応答を生成する際の安全性、実現可能性、適用性及び効果の点で、細胞へのＤＮＡの組み込みを伴う従来の遺伝子ワクチン接種の欠点を克服する。ＲＮＡはより容易に分解されるため、ＲＮＡ分子はＤＮＡワクチンよりも著しく安全であると考えられる。生物から迅速に排除され、ゲノムに統合される可能性がなく、制御不能な方法で細胞の遺伝子発現に影響を及ぼすことがない。ＲＮＡワクチンによって自己免疫性疾患の発生または抗ＤＮＡ抗体の産生のような重度の副作用を引き起こす可能性も低い（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１０），２０１０巻，記事番号６２３６８７）。ＲＮＡを用いたトランスフェクションには、細胞の細胞質への挿入しか必要とせず、核への挿入よりも達成が容易である。しかしながら、ＲＮＡは、細胞の細胞質内でのＲＮアーゼ分解及びその他の自然分解を受けやすい。
【０１０４】
ＲＮＡワクチンの安定性及び貯蔵寿命を増加させる種々の方法が試行されている。Ｖｏｎ  Ｄｅｒ  ＭｕｌｂｅらのＵＳ２００５／００３２７３０は、ｍＲＮＡ分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を増加させることによる、ｍＲＮＡワクチン組成物の安定性改善について開示している。ＦｅｌｇｎｅｒらのＵＳ５５８０８５９は、ｍＲＮＡに結合して安定性を調節する調節タンパク質に対するポリヌクレオチド配列コードの組み込みについて教示している。理論に束縛されるものではないが、本発明のポリヌクレオチドワクチン（ＮＡＶ）は、少なくとも部分的に構築物設計の特異性、純度及び選択性に起因して、改善された安定性及び治療有効性をもたらすと考えられる。
【０１０５】
加えて、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドに導入されたとき、ある特定の修飾ヌクレオシドまたはこれらの組み合わせは、自然免疫応答を活性化する。このような活性化分子は、ポリペプチド及び／またはその他のワクチンと組み合わせるときのアジュバントとして有用である。ある特定の実施形態では、活性化分子は、ワクチンとして有用なポリペプチド配列をコードする翻訳可能な領域を含み、それによって自己アジュバントとしての能力を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドを、感染因子によって生じる疾患及び身体障害の予防、治療及び診断に使用することができる。本発明のポリヌクレオチドは、目的とする少なくとも１つのポリペプチド（抗原）をコードでき、個体に付与すると、免疫系を刺激して疾患原因物質に対して防御することができる。非限定的な例として、抗原及び／または感染因子と結合して中和する能力を有する１つ以上のポリヌクレオチドを提供することによって、抗原または感染因子からの生物学的活性及び／または効果を阻害及び／または無効化することができる。
【０１０７】
非限定的な例として、免疫原をコードするポリヌクレオチドを、複数の自然応答経路を誘発するために細胞に送達することができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７７号及び米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７７６３９号を参照）。他の非限定的な例として、免疫原をコードする本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドは、脊椎動物に免疫を生じさせるのに十分な用量で脊椎動物に送達され得る（それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７２号及び同ＷＯ２０１２００６３６９号ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１４９３７５号及び同ＵＳ２０１３０１７７６４０号を参照）。
【０１０８】
ポリヌクレオチドワクチンが治療できる感染症の非限定的な一覧は、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）などのウイルス性感染症、ＨＩＶの結果生じる抗酸菌感染症、ＡＩＤＳ関連悪液質、ＡＩＤＳ関連サイトメガロウイルス感染症、ＨＩＶ関連腎症、リポジストロフィー、ＡＩＤ関連クリプトコッカス髄膜炎、ＡＩＤＳ関連好中球減少症、ニューモシスチス肺炎（カリニ肺炎）、ＡＩＤ関連トキソプラズマ症、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、またはＥ型肝炎、ヘルペス、帯状ヘルペス（水痘）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱その他（フラビウイルス）、インフルエンザ（インフルエンザウイルス）、出血感染疾患（マールブルグまたはエボラウイルス）、在郷軍人病（レジオネラ）などの細菌性感染症、胃潰瘍（ヘリコバクター）、コレラ（ビブリオ）、大腸菌感染症、ブドウ球菌感染症、サルモネラ感染症または連鎖球菌性感染症、破傷風（破傷風菌）、原生動物感染症（マラリア、眠り病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、すなわちプラズモディウム、トリパノゾーム、ライシェマニア及びトキソプラズマを原因とする感染症）、ジフテリア、ハンセン病、麻疹、百日咳、狂犬病、破傷風、結核、腸チフス、水痘、アメーバ症などの下痢性感染症、クロストリジウム・ディフィシル関連の下痢（ＣＤＡＤ）、クリプトスポリジウム症、ランブル鞭毛虫症、サイクロスポーラ症及びロタウイルス胃腸炎、日本脳炎のような脳炎、西部ウマ脳炎及びダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）、カンジダ症、爪真菌症、頭部白癬／頭皮白癬、躯幹白癬／体白癬、股部白癬／陰金、スポロトリクム症及び足白癬／ミズムシなどの菌類の皮膚病、ヘモフィルス属インフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）などの髄膜炎、髄膜炎、ウイルス性、髄膜炎菌性感染症及び肺炎球菌感染症、アルゼンチン出血熱などの顧みられない熱帯病、リーシュマニア症、線虫／回虫感染症、ロス川ウイルス感染症及びウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）疾患、トリコモナス症などの非ＨＩＶ性感染症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、性行為感染クラミジア疾患、軟性下疳及び梅毒、蜂巣炎などの非敗血性細菌感染症、ライム病、ＭＲＳＡ感染症、プソイドモナス、ブドウ球菌感染症、ブトヌーズ熱、レプトスピラ症、リウマチ熱、ボツリヌス症、リケッチア症及び乳様突起炎、嚢虫症などの寄生体感染症、エキノコックス症、ジストマ症／吸虫感染症、旋毛虫症、バベシア症、ウシバエ症、裂頭条虫症及びトリパノソーマ症、アデノウイルス感染症などの呼吸器感染症、アスペルギルス症、トリ（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザ、インフルエンザ、ＲＳＶ感染症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、副鼻腔炎、レジオネラ症、コクシジオイデス症及びブタ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザ、菌血症などの敗血症、敗血症／敗血症性ショック、早産児の敗血症、膣感染症（細菌性）などの尿路感染症、膣感染症（菌類）及び淋菌感染症、パルボウイルスＢ１９感染症などのウイルス性皮膚炎、疣贅、性器へルペス、口腔顔面ヘルペス、帯状疱疹、内耳感染症、胎児サイトメガロウイルス症候群、ブルセラ症（ブルセラ属）など食品由来疾病、ウェルシュ菌（イプシロン毒素）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（大腸菌）、サルモネラ症（サルモネラ種）、細菌性赤痢（赤痢菌）、ビブリオ症及びリステリア症バイオテロリズム及びエボラ出血熱などの潜在的流行性疾患、ラッサ熱、マールブルグ出血熱、ペスト、炭疽ニパウイルスス病、ハンタウイルス、天然痘、馬鼻疽（鼻疽菌）、オウム病（オウム病クラミジア）、Ｑ熱（コクシエラバーネッティイ）、野兎病（野兎病菌）、風疹、流行性耳下腺炎及びポリオを含む。
【０１０９】
本発明のＮＡＶは、感染症の罹患率または未達成な医学的要求の程度若しくは水準に応じて、様々な場で利用することができる。非限定的な例として、本発明のＮＡＶを利用して、インフルエンザ感染症、すなわちインフルエンザウイルス感染と関連した疾患及び病態（季節性及び汎発流行性）を治療及び／または予防することができる。
【０１１０】
インフルエンザ感染症の症状は、呼吸不全へと進行する乾性咳、発熱、悪寒、筋痛及び二次性細菌感染症（例えば、ＭＲＳＡ）の危険性を含む。季節性インフルエンザは遍在性であり、３つの主要な株（Ａ［Ｈ１Ｎ１］、Ａ［Ｈ３Ｎ２］及びＢ）を含み、年次ワクチンの対象となる。汎発流行性インフルエンザは、トリとブタ間でのインフルエンザ株の抗原シフトならびに移行を可能にする、ウイルス固有の再集合能力に起因して発生する。東南アジアに生じている懸念の一つが、いくつかの新規株に関する汎発流行の可能性である。このような汎発流行性のアウトブレイクは、有効な治療がほとんどなく死亡率が高い。抗ウイルス薬は症状緩和のみを提供し、最初の４８時間以内に与えなければならない。
【０１１１】
本発明のＮＡＶは、非常に高い抗体力価を生成し、市販の抗ウイルス薬よりも早期に反応をもたらし、臨界期である４８時間後に投与されても有効性を持続できるという点で優れた特性を有する。
【０１１２】
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ｍＲＮＡポリヌクレオチドである本発明のＮＡＶは、ＮＡＶが自然細胞機構を取り込むときの翻訳時に適切なタンパク質のコンホメーションを生じるように適切に設計されると想定している。エクスビボで製造され、不必要な細胞応答を誘発し得る従来のワクチンとは異なり、ＮＡＶはより自然な様式で細胞系に提示される。この優れた効果が加わることで、ＮＡＶの遮断または輸送に役立ち得る製剤を利用する必要をなくし得る。
【０１１３】
本発明によるＮＡＶは、感染予防だけではなく、インフルエンザの伝播も制限できる適合性のある活性ワクチンである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶを使用すると、ＮＡＶベースのワクチンの非常に迅速な製造プロセスによって、新規株の出現に対応することにより汎発流行性インフルエンザを予防することができる。いくつかの実施形態では、新興株（例えば、Ｈ１０Ｎ８）を含むインフルエンザのアウトブレイクに対処するまたはそれを予防的に回避するための新たなＮＡＶを、抗原同定時点からワクチン提供まで、６週間未満で製造することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、単一の抗原をコードするＮＡＶポリヌクレオチドの１回の注射で、インフルエンザシーズン全期にわたって防御を実現することができる。
【０１１６】
本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドは、自己複製ＲＮＡではない。自己複製ＲＮＡは、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１１０３００２０５号ならびに国際公開第ＷＯ２０１１００５７９９号及び同ＷＯ２０１３０５５９０５号に記載されている。
【０１１７】
一実施形態では、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドは、両親媒性及び／または免疫原性の両親媒性ペプチドをコードしても良い。
【０１１８】
一実施形態では、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドの製剤は、両親媒性及び／または免疫原性の両親媒性ペプチドを更に含んでいて良い。非限定的な例として、両親媒性及び／または免疫原性の両親媒性ペプチドを含むポリヌクレオチドは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１１０２５０２３７号ならびに国際公開第ＷＯ２０１０００９２７７号及び同第ＷＯ２０１０００９０６５号の記載のように製剤化することができる。
【０１１９】
一実施形態では、本発明のＮＡＶのポリペプチドは免疫刺激性であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、ポジティブセンス鎖またはネガティブセンス鎖のＲＮＡウイルスゲノムの全体または一部をコードしていても良い（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９２５６９号及び米国公開第ＵＳ２０１２０１７７７０１を参照）。別の非限定的な例として、本発明の免疫刺激性ポリヌクレオチドは、本明細書に記載された及び／または当該技術分野で既知である投与のための賦形剤と共に製剤化されていて良い（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０６８２９５及び米国公開第ＵＳ２０１２０２１３８１２号を参照）。ポリヌクレオチドは、免疫応答を促進するサイトカイン、例えばモノカイン、リンフォカイン、インターロイキンまたはケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＬＴ−αまたはｈＧＨなどの増殖因子をコードする配列領域を更に含んでいて良い。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書に記載する方法によって製剤化されるワクチンの応答は、治療効果を誘発する各種化合物を添加することにより増強することができる。非限定的な例として、ワクチン製剤は、ＭＨＣ  ＩＩ結合ペプチドまたはＭＨＣ  ＩＩペプチド結合ペプチドと類似した配列を有するペプチドを含んでいて良い（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０２７３６５号、同ＷＯ２０１１０３１２９８号及び米国公開第ＵＳ２０１２００７０４９３号、同ＵＳ２０１１０１１０９６５号を参照）。別の例として、ワクチン製剤は、対象でのニコチン残基に対する抗体応答を生成できる修飾されたニコチン性化合物を含んでいて良い（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０６１７１７号及び米国公開第ＵＳ２０１２０１１４６７７号を参照）。
【０１２１】
一実施形態では、細胞、組織または対象に付与される、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドの有効量は、免疫予防に十分であり得る。
【０１２２】
一実施形態では、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドを他の予防的または治療的化合物と共に投与しても良い。非限定的な例として、予防的または治療的化合物は、アジュバントまたはブースターであり得る。本発明で使用される場合、ワクチンなどの予防組成物を参照するとき、「ブースター」という用語は、予防組成物の追加投与を指す。ブースター（すなわちブースターワクチン）は、予防組成物のより早い投与の後に与えることができる。予防組成物の最初の投与からブースター投与までの期間は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、１８か月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年または９９年以上であり得るが、これらに限定されない。
【０１２３】
一実施形態では、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドは、生ワクチンの投与と同様に鼻腔内に投与しても良い。別の態様では、ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内または皮内に投与しても良い。
【０１２４】
一実施形態では、本発明のＮＡＶを使用して、既知または未知であり得る新興の脅威または遺伝子操作による脅威に対して防御すること、及び／またはその伝播を予防することができる。
【０１２５】
別の実施形態では、ＮＡＶは、本明細書に記載の方法によって製剤化することができる。一態様では、製剤は、複数の疾患、障害または病態に対して、治療的及び／または予防的効果を与えることができるＮＡＶまたはポリヌクレオチドを含んでも良い。非限定的な例として、製剤は、限定されないがウイルスタンパク質、寄生体タンパク質または細菌タンパク質などの感染因子からのタンパク質を含む抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでも良い。
【０１２６】
加えて、本発明のＮＡＶ抗体は、多くの適用範囲の研究、例えば、限定されないが細胞内及び細胞外タンパク質、タンパク質相互作用、シグナル経路ならびに細胞生物学の特定と位置決定のために使用しても良い。
【０１２７】
別の実施形態では、ＮＡＶを使用して、例えば限定されないが高病原性トリインフルエンザウイルス（例えば、限定されないがＨ５Ｎ１亜型）感染症及びヒトインフルエンザウイルス（例えば、限定されないがＨ１Ｎ１亜型及びＨ３Ｎ２亜型）感染症などのインフルエンザウイルス感染症の危険性を緩和する、またはその感染を抑制することができる。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８４７０７７１号に記載されたタンパク質配列のいずれかをコードできる、本明細書に記載するポリヌクレオチドは、インフルエンザ感染症の治療に、またはその危険性を緩和するために使用しても良い。
【０１２８】
一実施形態では、ＮＡＶは、ワクチンとして、または寄生体によって生じるタンパク質に対する免疫応答を調節するために使用しても良い。Ｂｅｒｇｍａｎｎ−Ｌｅｉｔｎｅｒらは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８４７０５６０号にて、マラリア原生動物のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）に対するＤＮＡワクチンについて記載している。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、Ｃ３ｄのＣＲ２結合モチーフをコードしても良く、これをワクチンまたは治療に使用して、マラリア原生動物のＣＳＰに対して免疫系を調節することができる。
【０１２９】
一実施形態では、ＮＡＶをワクチンとして使用しても良く、このワクチンがより高い免疫応答を誘発できるアジュバントを更に含んでも良い。非限定的な例として、アジュバントは、ヒト小児集団でより高い免疫応答を誘発できるサブミクロンの水中油型エマルジョンであり得る（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１２００２７８１３号及び米国特許第ＵＳ８５０６９６６号に記載のアジュバント化ワクチンを参照）。
【０１３０】
ＩＩ．感染因子及び抗原
本発明のＮＡＶを使用して、感染因子、例えば微生物との接触により生じる感染症を予防、治療または治癒することができる。感染因子は、細菌、ウイルス、菌類、原生動物及び寄生体を含む。
【０１３１】
Ａ．感染管理
一実施形態では、抗微生物ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むＮＡＶを投与することにより、対象の微生物感染症（例えば、細菌感染症）及び／または微生物若しくはウイルス感染に伴う疾患、障害若しくは病態、またはそれらの症状を治療または予防する方法を提供する。投与は、抗微生物剤（例えば、抗細菌剤）、例えば、本明細書に記載する抗微生物ポリペプチドまたは小分子抗微生物性化合物と組み合わせても良い。抗微生物剤には、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原生動物剤、抗寄生体剤及び抗プリオン剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
細菌感染症に伴う病態
本発明のＮＡＶを使用して治療できる、細菌感染症に伴い得る疾患、障害または病態は、以下のうち１つ以上を含むが、それらに限定されない：膿瘍、アクチノミセス症、急性前立腺炎、エロモナスハイドロフィラ感染症、一年生ライグラス中毒、炭疽症、細菌性紫斑、菌血症、細菌性胃腸炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性腟症、細菌関連性の皮膚病態、バルトネラ症、ＢＣＧ腫瘍、ボトリオミセス症、ボツリヌス症、ブラジル紫斑熱、ブロディ膿瘍、ブルセラ症、ブルーリ潰瘍、カンピロバクター感染症、カリエス、カリオン病、ネコひっかき病、蜂巣炎、クラミジア感染症、コレラ、慢性細菌性前立腺炎、慢性再発性多焦点骨髄炎、クロストリジウム壊死性腸炎、歯周−歯内混合型病変、接触伝染性牛肺疫、ジフテリア、ジフテリア口内炎、エールリヒア症、丹毒、喉頭蓋炎、丹毒、フィッツ・ヒュー・カーティス症候群、蚤媒介性斑点熱、腐蹄症（伝染性足皮膚炎）、ガレー硬化性骨髄炎、淋病、鼠径部肉腫、ヒト顆粒球のアナプラズマ症、ヒト単球向性エールリヒア症、百日咳、膿痂疹、後期先天性の梅毒性眼疾患、レジオネラ症、レミエール症候群、癩（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ節炎、類鼻疽、髄膜炎菌性疾患、髄膜炎菌性敗血症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（ＭＡＩ）症、マイコプラズマ肺炎、壊死性筋膜炎、ノカルジア症、水癌（水癌または壊疽性口内炎）、臍炎、眼窩蜂巣炎、骨髄炎、脾摘出後重症感染症（ＯＰＳＩ）、羊ブルセラ症、パスツレラ症、眼窩周囲蜂巣炎、百日咳（百日咳）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、ポット病、直腸炎、シュードモナス感染症、オウム病、膿血症、化膿性筋炎、Ｑ熱、回帰熱（回帰熱）、リウマチ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、リケッチア症、サルモネラ症、猩紅熱、敗血症、セラチア感染症、細菌性赤痢、南部マダニ発疹病、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、連鎖球菌性咽頭炎、プール肉芽腫、ブタブルセラ症、梅毒、梅毒性大動脈炎、破傷風、毒性ショック症候群（ＴＳＳ）、トラコーマ、塹壕熱、熱帯潰瘍、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、尿路性器結核症、尿路感染症、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染症、ウォーターハウス・フリードリヒセン症候群、仮性結核（エルシニア）疾患及びエルシニア症。
【０１３３】
細菌病原体
本明細書に記載する細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。細菌病原体には、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、ヤギ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸管毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒａｌｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｅｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｓ．）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓ��）、斑点熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｅｎｓ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、及びエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
細菌病原体は、耐性菌感染症を引き起こす細菌病原体、例えば、クリンダマイシン耐性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フルオロキノロン耐性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、多剤耐性エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、多剤耐性エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、多剤耐性アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、及びバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＶＲＳＡ）も含み得る。
【０１３５】
抗生物質併用
一実施形態では、本発明のＮＡＶ、例えば、本発明の１つ以上の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＮＡＶは、１種以上の抗生物質と共に投与しても良い。
【０１３６】
抗細菌剤
抗細菌剤としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：アミノグリコシド（例えば、アミカシン（ＡＭＩＫＩＮ（登録商標））、ゲンタミシン（ＧＡＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、カナマイシン（ＫＡＮＴＲＥＸ（登録商標））、ネオマイシン（ＭＹＣＩＦＲＡＤＩＮ（登録商標））、ネチルミシン（ＮＥＴＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、トブラマイシン（ＮＥＢＣＩＮ（登録商標））、パロモマイシン（ＨＵＭＡＴＩＮ（登録商標）））、アンサマイシン（例えば、ゲルタナマイシン、ヘルビマイシン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ（ＬＯＲＡＢＩＤ（登録商標））、カルバペネム（例えば、エルタペネム（ＩＮＶＡＮＺ（登録商標））、ドリペネム（ＤＯＲＩＢＡＸ（登録商標））、イミペネム／シラスタチン（ＰＲＩＭＡＸＩＮ（登録商標））、メロペネム（ＭＥＲＲＥＭ（登録商標））、セファロスポリン（第１世代）（例えば、セファドロキシル（ＤＵＲＩＣＥＦ（登録商標））、セファゾリン（ＡＮＣＥＦ（登録商標））、セファロチンまたはセファロシン（ＫＥＦＬＩＮ（登録商標））、セファレキシン（ＫＥＦＬＥＸ（登録商標））、セファロスポリン（第２世代）（例えば、セファクロル（ＣＥＣＬＯＲ（登録商標））、セファマンドール（ＭＡＮＤＯＬ（登録商標））、セフォキシチン（ＭＥＦＯＸＩＮ（登録商標））、セフプロジル（ＣＥＦＺＩＬ（登録商標））、セフロキシム（ＣＥＦＴＩＮ（登録商標）、ＺＩＮＮＡＴ（登録商標）））、セファロスポリン（第３世代）（例えば、セフィキシム（ＳＵＰＲＡＸ（登録商標））、セフジニル（ＯＭＮＩＣＥＦ（登録商標）、ＣＥＦＤＩＥＬ（登録商標））、セフジトレン（ＳＰＥＣＴＲＡＣＥＦ（登録商標））、セフォペラゾン（ＣＥＦＯＢＩＤ（登録商標））、セフォタキシム（ＣＬＡＦＯＲＡＮ（登録商標））、セフポドキシム（ＶＡＮＴＩＮ（登録商標））、セフタジム（ＦＯＲＴＡＺ（登録商標））、セフチブテン（ＣＥＤＡＸ（登録商標））、セフチゾキシム（ＣＥＦＩＺＯＸ（登録商標））、セフトリアキソン（ＲＯＣＥＰＨＩＮ（登録商標）））、セファロスポリン（第４世代）（例えば、セフェピム（ＭＡＸＩＰＩＭＥ（登録商標）））、セファロスポリン（第５世代）（例えば、セフトビプロール（ＺＥＦＴＥＲＡ（登録商標）））、グリコペプチド（例えば、テイコプラニン（ＴＡＲＧＯＣＩＤ（登録商標））、バンコマイシン（ＶＡＮＣＯＣＩＮ（登録商標））、テラバンシン（ＶＩＢＡＴＩＶ（登録商標））、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン（ＣＬＥＯＣＩＮ（登録商標））、リンコマイシン（ＬＩＮＣＯＣＩＮ（登録商標）））、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン（ＣＵＢＩＣＩＮ（登録商標））、マクロリド（例えば、アジスロマイシン（ＺＩＴＨＲＯＭＡＸ（登録商標）、ＳＵＭＡＭＥＤ（登録商標）、ＺＩＴＲＯＣＩＮ（登録商標））、クラリスロマイシン（ＢＩＡＸＩＮ（登録商標））、ジリスロマイシン（ＤＹＮＡＢＡＣ（登録商標））、エリスロマイシン（ＥＲＹＴＨＯＣＩＮ（登録商標）、ＥＲＹＴＨＲＯＰＥＤ（登録商標））、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン（ＴＡＯ（登録商標））、テリスロマイシン（ＫＥＴＥＫ（登録商標））、スペクチノマイシン（ＴＲＯＢＩＣＩＮ（登録商標））、モノバクタムス（例えば、アズトレナム（ＡＺＡＣＴＡＭ（登録商標））、ニトロフラン（例えば、フラゾリドン（ＦＵＲＯＸＯＮＥ（登録商標）、ニトロフラントイン（ＭＡＣＲＯＤＡＮＴＩＮ（登録商標））、ＭＡＣＲＯＢＩＤ（登録商標））、ペニシリン（例えば、アモキシシリン（ＮＯＶＡＭＯＸ（登録商標）、ＡＭＯＸＩＬ（登録商標））、アンピシリン（ＰＲＩＮＣＩＰＥＮ（登録商標））、アゾロシリン、カルベニシリン（ＧＥＯＣＩＬＬＩＮ（登録商標））、クロキサシリン（ＴＥＧＯＰＥＮ（登録商標））、ジクロキサシリン（ＤＹＮＡＰＥＮ（登録商標））、フルクロキサシリン（ＦＬＯＸＡＰＥＮ（登録商標））、メズロシリン（ＭＥＺＬＩＮ（登録商標））、メチシリン（ＳＴＡＰＨＣＩＬＬＩＮ（登録商標））、ナフシリン（ＵＮＩＰＥＮ（登録商標））、オキサシリン（ＰＲＯＳＴＡＰＨＬＩＮ（登録商標））、ペニシリンＧ（ＰＥＮＴＩＤＳ（登録商標））、ペニシリンＶ（ＰＥＮ−ＶＥＥ−Ｋ（登録商標））、ピペラシリン（ＰＩＰＲＡＣＩＬ（登録商標））、テモシリン（ＮＥＧＡＢＡＮ（登録商標））、チカルシリン（ＴＩＣＡＲ（登録商標）））、ペニシリン併用剤（例えば、アモキシシリン／カルブラネート（ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（登録商標））、アンピシリン／スルバクタム（ＵＮＡＳＹＮ（登録商標））、ピペラシリン／タゾバクタム（ＺＯＳＹＮ（登録商標））、チカルシリン／クラブラネート（ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）））、ポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン（ＣＯＬＹ−ＭＹＣＩＮ−Ｓ（登録商標））、ポリミキシンＢ、キノロン（例えば、シプロフロキサシン（ＣＩＰＲＯ（登録商標）、ＣＩＰＲＯＸＩＮ（登録商標）、ＣＩＰＲＯＢＡＹ（登録商標））、エノキサシン（ＰＥＮＥＴＲＥＸ（登録商標））、ガチフロキサシン（ＴＥＱＵＩＮ（登録商標））、レボフロキサシン（ＬＥＶＡＱＵＩＮ（登録商標））、ロメフロキサシン（ＭＡＸＡＱＵＩＮ（登録商標））、モキシフロキサシン（ＡＶＥＬＯＸ（登録商標））、ナリジクス酸（ＮＥＧＧＲＡＭ（登録商標））、ノルフロキサシン（ＮＯＲＯＸＩＮ（登録商標））、オフロキサシン（ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）、ＯＣＵＦＬＯＸ（登録商標））、トロバフロキサシン（ＴＲＯＶＡＮ（登録商標））、グレパフロキサシン（ＲＡＸＡＲ（登録商標））、スパルフロキサシン（ＺＡＧＡＭ（登録商標））、テマフロキサシン（ＯＭＮＩＦＬＯＸ（登録商標））、スルホンアミド（例えば、マフェニド（ＳＵＬＦＡＭＹＬＯＮ（登録商標））、スルホンアミドクリソイジン（ＰＲＯＮＴＯＳＩＬ（登録商標））、スルファセタミド（ＳＵＬＡＭＹＤ（登録商標）、ＢＬＥＰＨ−１０（登録商標））、スルファジアジン（ＭＩＣＲＯ−ＳＵＬＦＯＮ（登録商標））、スルファジアジン銀（ＳＩＬＶＡＤＥＮＥ（登録商標））、スルファメチゾール（ＴＨＩＯＳＵＬＦＩＬ  ＦＯＲＴＥ（登録商標））、スルファメトキサゾール（ＧＡＮＴＡＮＯＬ（登録商標））、スルファニリミド、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標））、スルフィソキサゾール（ＧＡＮＴＲＩＳＩＮ（登録商標））、トリメトプリム（ＰＲＯＬＯＰＲＩＭ（登録商標）、Ｔ���ＩＭＰＥＸ（登録商標））、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コ−トリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）（ＢＡＣＴＲＩＭ（登録商標）、ＳＥＰＴＲＡ（登録商標））、テトラサイクリン（例えば、デメクロサイクリン（ＤＥＣＬＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、ドキシサイクリン（ＶＩＢＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ミノサイクリン（ＭＩＮＯＣＩＮ（登録商標））、オキシテトラサイクリン（ＴＥＲＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、テトラサイクリン（ＳＵＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＡＣＨＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標）Ｖ、ＳＴＥＣＬＩＮ（登録商標））、マイコバクテリアに対する薬剤（例えば、クロファジミン（ＬＡＭＰＲＥＮＥ（登録商標））、ダプソン（ＡＶＬＯＳＵＬＦＯＮ（登録商標））、カプレオマイシン（ＣＡＰＡＳＴＡＴ（登録商標））、シクロセリン（ＳＥＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、エタムブトール（ＭＹＡＭＢＵＴＯＬ（登録商標））、エチオナミド（ＴＲＥＣＡＴＯＲ（登録商標））、イソニアジド（Ｉ．Ｎ．Ｈ．（登録商標））、ピラジナミド（ＡＬＤＩＮＡＭＩＤＥ（登録商標））、リファンピン（ＲＩＦＡＤＩＮ（登録商標）、ＲＩＭＡＣＴＡＮＥ（登録商標））、リファブチン（ＭＹＣＯＢＵＴＩＮ（登録商標））、リファペンチン（ＰＲＩＦＴＩＮ（登録商標））、ストレプトマイシン）、ならびにその他（例えば、アルスフェナミン（ＳＡＬＶＡＲＳＡＮ（登録商標））、クロラムフェニコール（ＣＨＬＯＲＯＭＹＣＥＴＩＮ（登録商標））、ホスホマイシン（ＭＯＮＵＲＯＬ（登録商標））、フシジン酸（ＦＵＣＩＤＩＮ）（登録商標））、リネゾリド（ＺＹＶＯＸ（登録商標））、メトロニダゾール（ＦＬＡＧＹＬ（登録商標））、ムピロシン（ＢＡＣＴＲＯＢＡＮ（登録商標））、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン（ＳＹＮＥＲＣＩＤ（登録商標））、リファキシミン（ＸＩＦＡＸＡＮ（登録商標））、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ＴＩＧＡＣＹＬ（登録商標））、チニダゾール（ＴＩＮＤＡＭＡＸ（登録商標））、ＦＡＳＩＧＹＮ（登録商標））。
【０１３７】
ウイルス感染に伴う病態
別の実施形態では、抗ウイルスポリペプチド、例えば、抗ウイルス剤と組み合わせた本明細書に記載の抗ウイルスポリペプチド、例えば、本明細書に記載の抗ウイルスポリペプチドまたは小分子抗ウイルス剤をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むＲＮＡＶを投与することにより、対象のウイルス感染症、及び／またはウイルス感染に伴う疾患、障害、若しくは病態、またはその症状を治療または予防する方法が提供される。
【０１３８】
本発明のＮＡＶを用いて治療できるウイルス感染に伴う疾患、障害、若しくは病態として、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、小児胃腸炎、コクサッキーウイルス感染症、伝染性単核症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、一次ＨＳＶ−１感染（例えば、小児の歯肉口内炎、成人の扁桃炎及び咽頭炎、角結膜炎）、潜在性ＨＳＶ−１感染（例えば、口唇ヘルペス及び単純疱疹）、一次ＨＳＶ−２感染、潜在性ＨＳＶ−２感染、無菌性髄膜炎、伝染性単核症、巨細胞性封入体病、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性滲出性リンパ腫、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、ライ症候群、麻疹、感染後脳脊髄炎、流行性耳下腺炎、上皮過形成性病変（例えば、尋常性、扁平、足底及び肛門性器疣贅、喉頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症）、子宮頸癌、扁平上皮癌、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、ポリオ、狂犬病、細気管支炎、肺炎、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重症細気管支炎、風疹、先天性風疹、水痘、及び帯状疱疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
ウイルス病原体
ウイルス性感染因子の例として、アデノウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、脳炎ウイルス、パピローマウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）インフルエンザウイルスＡ型若しくはＢ型、グアナリトウイルス、ジュニウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、ハンタウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、チクングンヤ熱ウイルスまたはバンナウイルス挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
ウイルス病原体には、耐性ウイルス感染症の原因となるウイルスも含み得る。
【０１４１】
抗ウイルス剤
例示的な抗ウイルス剤として、限定はされないが、以下のものが挙げられる：アバカビル（ＺＩＡＧＥＮ（登録商標））、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン（ｔｒｉｚｉｖｉｒ（登録商標））、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）またはアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＣＹＣＬＯＶＩＲ（登録商標）、ＨＥＲＰＥＸ（登録商標）、ＡＣＩＶＩＲ（登録商標）、ＡＣＩＶＩＲＡＸ（登録商標）、ＺＯＶＩＲＡＸ（登録商標）、ＺＯＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（Ｐｒｅｖｅｏｎ（登録商標）、Ｈｅｐｓｅｒａ（登録商標））、アマンタジン（ＳＹＭＭＥＴＲＥＬ（登録商標））、アンプレナビル（ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標））、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル（ＲＥＹＡＴＡＺ（登録商標））、ボセプレビル、シドフォビル、ダルナビル（ＰＲＥＺＩＳＴＡ（登録商標））、デラビルジン（ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標））、ジダノシン（ＶＩＤＥＸ（登録商標））、ドコサノール（ＡＢＲＥＶＡ（登録商標））、エドクスジン、エファビレンツ（ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）、ＳＴＯＣＲＩＮ（登録商標））、エムトリシタビン（ＥＭＴＲＩＶＡ（登録商標））、エムトリシタビン／テノフォビル／エファビレンツ（ＡＴＲＩＰＬＡ（登録商標））、エンフビルチド（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標）、ＥＮＮＡＶＩＲ（登録商標））、ファムシクロビル（ＦＡＭＶＩＲ（登録商標））、フォミビルセン（ＶＩＴＲＡＶＥＮＥ（登録商標））、ホスアンプレナビル（ＬＥＸＩＶＡ（登録商標）、ＴＥＬＺＩＲ（登録商標））、ホスカルネ（ＦＯＳＣＡＶＩＲ（登録商標））、ホスホネット、ガンシクロビル（ＣＹＴＯＶＥＮＥ（登録商標）、ＣＹＭＥＶＥＮＥ（登録商標）、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標））、ＧＳ  ９１３７（ＥＬＶＩＴＥＧＲＡＶＩＲ（登録商標））、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標）、ＺＹＣＬＡＲＡ（登録商標）、ＢＥＳＥＬＮＡ（登録商標））、インジナビル（ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標））、イノシン、イノシンプラノベックス（ＩＭＵＮＯＶＩＲ（登録商標））、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、クタプレッシン（ＮＥＸＡＶＩＲ（登録商標））、ラミブジン（ＺＥＦＦＩＸ（登録商標）、ＨＥＰＴＯＶＩＲ（登録商標）、ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、ラミブジン／ジドブジン（ＣＯＭＢＩＶＩＲ（登録商標））、ロピナビル、ロビリド、マラビロク（ＳＥＬＺＥＮＴＲＹ（登録商標）、ＣＥＬＳＥＮＴＲＩ（登録商標））、メチサゾン、ＭＫ−２０４８、モロキシジン、ネルフィナビル（ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標））、ネビラピン（ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標））、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ペジンテルフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））、ペンシクロビル（ＤＥＮＡＶＩＲ（登録商標））、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン（ＣＯＮＤＹＬＯＸ（登録商標））、ラルテグラビル（ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ（登録商標））、リバビリン（ＣＯＰＥＧＵｓ（登録商標）、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）、ＲＩＢＡＳＰＨＥＲＥ（登録商標）、ＶＩＬＯＮＡ（登録商標）及びＶＩＲＡＺＯＬＥ（��録商標））、リマンタジン（ＦＬＵＭＡＤＩＮＥ（登録商標））、リトナビル（ＮＯＲＶＩＲ（登録商標））、ピラミジン、サキナビル（ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）、ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標））、スタブジン、ティーツリー（ｔｅａ  ｔｒｅｅ）油（メラルーカ（ｍｅｌａｌｅｕｃａ）油）、テノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、テノフォビル／エムトリシタビン（ＴＲＵＶＡＤＡ（登録商標））、チプラナビル（ＡＰＴＩＶＵＳ（登録商標））、トリフルリジン（ＶＩＲＯＰＴＩＣ（登録商標））、トロマンタジン（ＶＩＲＵ−ＭＥＲＺ（登録商標））、バラシクロビル（ＶＡＬＴＲＥＸ（登録商標））、バルガンシクロビル（ＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標））、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））、ならびにジドブジン（アジドチミジン（ＡＺＴ）、ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）、ＲＥＴＲＯＶＩＳ（登録商標））。
【０１４２】
真菌感染症に伴う病態
本発明のＮＡＶを使用して治療できる真菌感染症に関連する疾患、障害または病態として、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、菌腫、パラコクシジオイデス症、及び足白癬が挙げられるが、これらに限定されない。更に、免疫不全を有する人は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｃｏｃｕｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）及びニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）などの真菌属による疾患に特に罹患しやすい。他の真菌は、眼、爪、毛髪、ならびに特に皮膚を攻撃し得る、いわゆる皮膚糸状真菌及び好角質性真菌であり、多様な病態を引き起こし、中でも水虫などの白癬が一般的である。また、真菌胞子は、アレルギーの主要原因であり、異なる分類学群に属する多様な真菌が、一部の人にアレルギー反応を引き起こす恐れがある。
【０１４３】
真菌病原体
真菌病原体として、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）／ポサダシ（ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、フィロバシジエラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ））、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）（例えば、エンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ  ｂｉｅｎｅｕｓｉ））及びケカビ亜門（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（例えば、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リクテイミア・コリムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
抗真菌剤
例示的な抗真菌剤として、ポリエン系抗真菌剤（例えば、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、カンジシン、ハマイシン）、イミダソール系抗真菌剤（例えば、ミコナゾール（ＭＩＣＡＴＩＮ（登録商標）、ＤＡＫＴＡＲＩＮ（登録商標））、ケトコナゾール（ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＯＲＡＬ（登録商標）、ＳＥＢＩＺＯＬＥ（登録商標））、クロトリマゾール（ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）、ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）ＡＦ、ＣＡＮＥＳＴＥＮ（登録商標））、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール（ＥＲＴＡＣＺＯ（登録商標））、スルコナゾール、チオコナゾール）、トリアゾール系抗真菌剤（例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール）、チアゾール抗真菌剤（例えば、アバファンギン）、アリルアミン（例えば、テルビナフィン（ＬＡＭＩＳＩＬ（登録商標））、ナフチフィン（ＮＡＦＴＩＮ（登録商標））、ブテナフィン（ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ））、エキノカンジン（例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、ならびにその他（例えば、ポリゴジアル、安息香酸、シクロピロックス、トルナフタート（ＴＩＮＡＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＥＳＥＮＥＸ（登録商標）、ＡＦＴＡＴＥ（登録商標））、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロギン、炭酸水素ナトリウム、アリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
原生動物感染に伴う病態
本発明のＮＡＶを使用して治療し得る原生動物感染に伴う疾患、障害または病態として、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、アフリカ睡眠病、アメリカ睡眠病、リーシュマニア症（カラアザール）、バランチジウム症、トキソプラズマ症、マラリア、アカントアメーバ角膜炎及びバベシア症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
原生動物病原体
原生動物病原体として、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉｌａ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、トキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びバベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
抗原生動物剤
例示的な抗原生動物剤として、エフロルニチン、フラソリドン（ＦＵＲＯＸＯＮＥ（登録商標）、ＤＥＰＥＮＤＡＬ−Ｍ（登録商標））、メラルソプロール、メトロニダゾール（ＦＬＡＧＹＬ（登録商標））、オルニダゾール、硫酸パロモマイシン（ＨＵＭＡＴＩＮ（登録商標））、ペンタミジン、ピリメタミン（ＤＡＲＡＰＲＩＭ（登録商標））及びチニダゾール（ＴＩＮＤＡＭＡＸ（登録商標）、ＦＡＳＩＧＹＮ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
寄生体感染に伴う病態
本発明のＮＡＶを使用して治療し得る寄生体感染に伴う疾患、障害または病態として、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエウジ病、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病及び鞭虫症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
寄生体病原体
寄生体病原体として、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、アニサキス（Ａｎｉｓａｋｉｓ）、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ウマバエ（ｂｏｔｆｌｙ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ナンキンムシ（ｂｅｄｂｕｇ）、条虫類（Ｃｅｓｔｏｄａ）、ツツガムシ（ｃｈｉｇｇｅｒｓ）、ラセンウジバエ（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、鉤虫（ｈｏｏｋｗｏｒｍ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、イヌタムシ（Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ  ｓｅｒｒａｔａ）、肝吸虫（ｌｉｖｅｒ  ｆｌｕｋｅ）、ロア糸状虫（Ｌｏａ  ｌｏａ）、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、ギョウチュウ（ｐｉｎｗｏｒｍ）、熱帯熱マラリア原生動物（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、ダニ（ｍｉｔｅ）、条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ）、トキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、鞭虫（ｗｈｉｐｗｏｒｍ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
抗寄生体剤
例示的な抗寄生体剤として、抗線虫薬（例えば、メベンダゾール、パモ酸ピランテル、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン）、抗条虫薬（例えば、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール）、抗吸虫薬（例えば、プラジカンテル）、抗アメーバ薬（例えば、リファンピン、アムホテリシンＢ）及び抗原生動物薬（例えば、メラルソプロール、エフロルニチン、メトロニダゾール、チニダゾール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
Ｂ．治療環境及び／または状況
本発明のＮＡＶは、感染症の罹患率または未達成な医学的要求の程度若しくは水準に応じて、様々な場で利用することができる。本発明のＮＡＶのいくつかの用途を表１に概説する。
【０１５２】
【表１】
0006881813.tif 000002
【０１５３】
インフルエンザ（季節性及び汎発流行性）
インフルエンザの症状は、呼吸不全へと進行する乾性咳、発熱、悪寒、筋痛及び二次性細菌感染症（例えば、ＭＲＳＡ）の危険性を含む。季節性インフルエンザは遍在性であり、３つの主要な株（Ａ［Ｈ１Ｎ１］、Ａ［Ｈ３Ｎ２］及びＢ）を含み、年次ワクチンの対象となる。汎発流行性インフルエンザは、トリとブタ間でのインフルエンザ株の抗原シフトならびに移行を可能にする、ウイルス固有の再集合能力に起因して発生する。東南アジアに生じている懸念の一つが、いくつかの新規株に関する汎発流行の可能性である。このような汎発流行性のアウトブレイクは、有効な治療がほとんどなく死亡率が高い。抗ウイルス薬は症状緩和のみを提供し、最初の４８時間以内に与えなければならない。
【０１５４】
本発明のＮＡＶは、はるかにより高い抗体力価を生成し、市販の抗ウイルス薬よりも早期に応答をもたらし、臨界期である４８時間後に投与されても有効性を持続できるという点で優れた特性を有する。
【０１５５】
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ｍＲＮＡポリヌクレオチドである本発明のＮＡＶは、ＮＡＶが自然細胞機構を取り込むときの翻訳時に適切なタンパク質のコンホメーションを生じるように適切に設計されると想定している。エクスビボで製造され、不必要な細胞応答を誘発し得る従来のワクチンとは異なり、ＮＡＶはより自然な様式で細胞系に提示される。この優れた効果に加えて、ＮＡＶの遮断または輸送に役立ち得る製剤を利用することが伴い得る。
【０１５６】
本発明によるＮＡＶは、感染予防だけではなく、インフルエンザの伝播も制限できる適合性のある活性ワクチンである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶを使用すると、ＮＡＶベースのワクチンの非常に迅速な製造プロセスによって、新規株の出現に対応することにより汎発流行性インフルエンザを予防することができる。いくつかの実施形態では、新興株（例えば、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ８）を含むインフルエンザのアウトブレイクに対処するまたはそれを予防的に回避するための新たなＮＡＶを、抗原同定時点からワクチン提供まで、６週間未満で製造することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、単一の抗原をコードするＮＡＶポリヌクレオチドの１回の注射で、インフルエンザシーズン全期にわたって防御を実現することができる。
【０１５９】
インフルエンザ：抗原記憶の維持
本発明のＮＡＶ組成物はまた、ワクチン接種計画の一部として、対象または集団の抗原記憶を維持または修復するために使用することもできる。
【０１６０】
本発明のＮＡＶ技術の迅速性及び多用性により、時間的及びウイルス性両方の株領域に及ぶワクチン接種計画を作成することが可能になる。
【０１６１】
一実施形態では、１つ以上の年別インフルエンザ抗原（flu  year  antigen）をコードするポリヌクレオチドを含むＮＡＶ組成物を作製することができる。本明細書で使用される場合、「年別インフルエンザ抗原」は、特定年からインフルエンザワクチン成分として使用されたインフルエンザ株から選択される抗原である。例えば、インフルエンザＡ型株、Ａ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３（Ｈ３Ｎ２）様ウイルスは、１９７４〜１９７５年の北半球用ワクチンの株成分の１つである。
【０１６２】
本発明によれば、当年度に進行中のワクチン接種だけではなく、集団の抗原記憶を確立及び維持するための、年、株またはそれらの群にわたる抗原記憶ブースターワクチン接種も可能であるワクチン接種方式または計画を開発する。このようにして、古い株の再発または古い株からの抗原の出現に伴う汎発流行またはアウトブレイクにも、集団が罹患しにくくなる。
【０１６３】
抗原記憶ブースターワクチンの作製または設計に利用される以前のワクチン成分株の任意の組み合わせを、本明細書で参照セットと呼ぶ。
【０１６４】
一実施形態では、抗原記憶ブースターワクチンであるＮＡＶは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０年またはそれ以上の期間にわたり抗原記憶を増強するために投与される。
【０１６５】
一実施形態では、抗原記憶ブースターワクチンであるＮＡＶは、抗原記憶を増強して、当年度に対して過去のワクチン成分株を１年おきを含む歴年で交換するために投与される。いくつかの実施形態では、ワクチン成分の選択は、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれ以上の年ごとに行うことができる。
【０１６６】
一実施形態では、抗原記憶ブースターワクチンであるＮＡＶは、１０年以上の期間にわたって抗原記憶を増強するために投与される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、抗原記憶ブースターワクチンであるＮＡＶは、抗原記憶を増強するために投与され、第１の選択としていくつかのインフルエンザＡ型株から、いくつかのインフルエンザＢ型株または本明細書で列挙する他の株からの選択と組み合わせて選択される。Ａ型またはＢ型の選択数は、独立して１、２、１、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であって良い。
【０１６８】
いずれの場合でも、ＮＡＶ中の抗原をコードするための抗原記憶ブースターワクチン株は、独立して、北半球用または南半球用いずれのワクチン成分から選択しても良い。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶブースターワクチンは集団免疫を生成するため、１回だけまたは周期的に集団に使用することができる。このような免疫は、集団の３０％超が保護されるときに存在する。
【０１７０】
抗原記憶ブースターワクチンに利用し得るインフルエンザの成分または株は、表２〜５のものを含むが、これらに限定されない。
【０１７１】
【表２−１】
0006881813.tif 000003
【表２−２】
0006881813.tif 000004
【表２−３】
0006881813.tif 000005
【０１７２】
【表３−１】
0006881813.tif 000006
【表３−２】
0006881813.tif 000007
【表３−３】
0006881813.tif 000008
【０１７３】
【表４−１】
0006881813.tif 000009
【表４−２】
0006881813.tif 000010
【表４−３】
0006881813.tif 000011
【０１７４】
【表５−１】
0006881813.tif 000012
【表５−２】
0006881813.tif 000013
【０１７５】
インフルエンザ抗原
いくつかの実施形態では、ＮＡＶポリヌクレオチドは、抗原としてインフルエンザ株の１つ以上のポリペプチドをコードしても良い。そのような抗原としては、表６〜１８に列挙されたポリヌクレオチドによってコードされる抗原が挙げられるが、これらに限定されない。表中、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、コードされた抗原の完全な、または部分的なＣＤＳを表す。ＮＡＶポリヌクレオチドは、表に列挙された配列のいずれかの領域、または列挙されたｍＲＮＡのコード領域全体を含み得る。ＮＡＶポリヌクレオチドには、ハイブリッド若しくはキメラ領域、または模倣体若しくは変異体を含み得る。
【０１７６】
表６〜１４に参照する株のいずれを、本明細書で記載する抗原記憶ブースターワクチンにしても良い。
【０１７７】
【表６−１】
0006881813.tif 000014
【表６−２】
0006881813.tif 000015
【表６−３】
0006881813.tif 000016
【表６−４】
0006881813.tif 000017
【表６−５】
0006881813.tif 000018
【表６−６】
0006881813.tif 000019
【表６−７】
0006881813.tif 000020
【表６−８】
0006881813.tif 000021
【表６−９】
0006881813.tif 000022
【表６−１０】
0006881813.tif 000023
【表６−１１】
0006881813.tif 000024
【表６−１２】
0006881813.tif 000025
【表６−１３】
0006881813.tif 000026
【表６−１４】
0006881813.tif 000027
【表６−１５】
0006881813.tif 000028
【表６−１６】
0006881813.tif 000029
【表６−１７】
0006881813.tif 000030
【表６−１８】
0006881813.tif 000031
【表６−１９】
0006881813.tif 000032
【表６−２０】
0006881813.tif 000033
【表６−２１】
0006881813.tif 000034
【表６−２２】
0006881813.tif 000035
【表６−２３】
0006881813.tif 000036
【表６−２４】
0006881813.tif 000037
【表６−２５】
0006881813.tif 000038
【表６−２６】
0006881813.tif 000039
【表６−２７】
0006881813.tif 000040
【表６−２８】
0006881813.tif 000041
【表６−２９】
0006881813.tif 000042
【表６−３０】
0006881813.tif 000043
【表６−３１】
0006881813.tif 000044
【表６−３２】
0006881813.tif 000045
【表６−３３】
0006881813.tif 000046
【表６−３４】
0006881813.tif 000047
【表６−３５】
0006881813.tif 000048
【表６−３６】
0006881813.tif 000049
【表６−３７】
0006881813.tif 000050
【表６−３８】
0006881813.tif 000051
【表６−３９】
0006881813.tif 000052
【表６−４０】
0006881813.tif 000053
【表６−４１】
0006881813.tif 000054
【０１７８】
【表７−１】
0006881813.tif 000055
【表７−２】
0006881813.tif 000056
【表７−３】
0006881813.tif 000057
【表７−４】
0006881813.tif 000058
【表７−５】
0006881813.tif 000059
【表７−６】
0006881813.tif 000060
【表７−７】
0006881813.tif 000061
【表７−８】
0006881813.tif 000062
【表７−９】
0006881813.tif 000063
【表７−１０】
0006881813.tif 000064
【表７−１１】
0006881813.tif 000065
【表７−１２】
0006881813.tif 000066
【表７−１３】
0006881813.tif 000067
【表７−１４】
0006881813.tif 000068
【表７−１５】
0006881813.tif 000069
【表７−１６】
0006881813.tif 000070
【表７−１７】
0006881813.tif 000071
【表７−１８】
0006881813.tif 000072
【表７−１９】
0006881813.tif 000073
【表７−２０】
0006881813.tif 000074
【表７−２１】
0006881813.tif 000075
【表７−２２】
0006881813.tif 000076
【表７−２３】
0006881813.tif 000077
【表７−２４】
0006881813.tif 000078
【表７−２５】
0006881813.tif 000079
【表７−２６】
0006881813.tif 000080
【表７−２７】
0006881813.tif 000081
【表７−２８】
0006881813.tif 000082
【表７−２９】
0006881813.tif 000083
【表７−３０】
0006881813.tif 000084
【表７−３１】
0006881813.tif 000085
【表７−３２】
0006881813.tif 000086
【表７−３３】
0006881813.tif 000087
【表７−３４】
0006881813.tif 000088
【表７−３５】
0006881813.tif 000089
【表７−３６】
0006881813.tif 000090
【表７−３７】
0006881813.tif 000091
【表７−３８】
0006881813.tif 000092
【表７−３９】
0006881813.tif 000093
【表７−４０】
0006881813.tif 000094
【表７−４１】
0006881813.tif 000095
【表７−４２】
0006881813.tif 000096
【表７−４３】
0006881813.tif 000097
【表７−４４】
0006881813.tif 000098
【０１７９】
【表８−１】
0006881813.tif 000099
【表８−２】
0006881813.tif 000100
【表８−３】
0006881813.tif 000101
【表８−４】
0006881813.tif 000102
【表８−５】
0006881813.tif 000103
【表８−６】
0006881813.tif 000104
【表８−７】
0006881813.tif 000105
【表８−８】
0006881813.tif 000106
【表８−９】
0006881813.tif 000107
【表８−１０】
0006881813.tif 000108
【表８−１１】
0006881813.tif 000109
【表８−１２】
0006881813.tif 000110
【表８−１３】
0006881813.tif 000111
【表８−１４】
0006881813.tif 000112
【表８−１５】
0006881813.tif 000113
【表８−１６】
0006881813.tif 000114
【表８−１７】
0006881813.tif 000115
【表８−１８】
0006881813.tif 000116
【表８−１９】
0006881813.tif 000117
【表８−２０】
0006881813.tif 000118
【表８−２１】
0006881813.tif 000119
【表８−２２】
0006881813.tif 000120
【表８−２３】
0006881813.tif 000121
【表８−２４】
0006881813.tif 000122
【表８−２５】
0006881813.tif 000123
【表８−２６】
0006881813.tif 000124
【表８−２７】
0006881813.tif 000125
【表８−２８】
0006881813.tif 000126
【表８−２９】
0006881813.tif 000127
【表８−３０】
0006881813.tif 000128
【表８−３１】
0006881813.tif 000129
【表８−３２】
0006881813.tif 000130
【表８−３３】
0006881813.tif 000131
【表８−３４】
0006881813.tif 000132
【表８−３５】
0006881813.tif 000133
【表８−３６】
0006881813.tif 000134
【表８−３７】
0006881813.tif 000135
【表８−３８】
0006881813.tif 000136
【０１８０】
【表９−１】
0006881813.tif 000137
【表９−２】
0006881813.tif 000138
【表９−３】
0006881813.tif 000139
【表９−４】
0006881813.tif 000140
【表９−５】
0006881813.tif 000141
【表９−６】
0006881813.tif 000142
【表９−７】
0006881813.tif 000143
【表９−８】
0006881813.tif 000144
【表９−９】
0006881813.tif 000145
【表９−１０】
0006881813.tif 000146
【表９−１１】
0006881813.tif 000147
【表９−１２】
0006881813.tif 000148
【表９−１３】
0006881813.tif 000149
【０１８１】
【表１０−１】
0006881813.tif 000150
【表１０−２】
0006881813.tif 000151
【表１０−３】
0006881813.tif 000152
【表１０−４】
0006881813.tif 000153
【表１０−５】
0006881813.tif 000154
【表１０−６】
0006881813.tif 000155
【表１０−７】
0006881813.tif 000156
【表１０−８】
0006881813.tif 000157
【表１０−９】
0006881813.tif 000158
【表１０−１０】
0006881813.tif 000159
【表１０−１１】
0006881813.tif 000160
【表１０−１２】
0006881813.tif 000161
【表１０−１３】
0006881813.tif 000162
【表１０−１４】
0006881813.tif 000163
【表１０−１５】
0006881813.tif 000164
【表１０−１６】
0006881813.tif 000165
【表１０−１７】
0006881813.tif 000166
【表１０−１８】
0006881813.tif 000167
【表１０−１９】
0006881813.tif 000168
【表１０−２０】
0006881813.tif 000169
【表１０−２１】
0006881813.tif 000170
【表１０−２２】
0006881813.tif 000171
【表１０−２３】
0006881813.tif 000172
【表１０−２４】
0006881813.tif 000173
【表１０−２５】
0006881813.tif 000174
【表１０−２６】
0006881813.tif 000175
【表１０−２７】
0006881813.tif 000176
【表１０−２８】
0006881813.tif 000177
【表１０−２９】
0006881813.tif 000178
【表１０−３０】
0006881813.tif 000179
【表１０−３１】
0006881813.tif 000180
【表１０−３２】
0006881813.tif 000181
【表１０−３３】
0006881813.tif 000182
【表１０−３４】
0006881813.tif 000183
【表１０−３５】
0006881813.tif 000184
【表１０−３６】
0006881813.tif 000185
【０１８２】
【表１１−１】
0006881813.tif 000186
【表１１−２】
0006881813.tif 000187
【表１１−３】
0006881813.tif 000188
【表１１−４】
0006881813.tif 000189
【表１１−５】
0006881813.tif 000190
【表１１−６】
0006881813.tif 000191
【表１１−７】
0006881813.tif 000192
【０１８３】
【表１２−１】
0006881813.tif 000193
【表１２−２】
0006881813.tif 000194
【０１８４】
【表１３−１】
0006881813.tif 000195
【表１３−２】
0006881813.tif 000196
【表１３−３】
0006881813.tif 000197
【表１３−４】
0006881813.tif 000198
【表１３−５】
0006881813.tif 000199
【表１３−６】
0006881813.tif 000200
【表１３−７】
0006881813.tif 000201
【表１３−８】
0006881813.tif 000202
【表１３−９】
0006881813.tif 000203
【表１３−１０】
0006881813.tif 000204
【表１３−１１】
0006881813.tif 000205
【表１３−１２】
0006881813.tif 000206
【表１３−１３】
0006881813.tif 000207
【表１３−１４】
0006881813.tif 000208
【表１３−１５】
0006881813.tif 000209
【表１３−１６】
0006881813.tif 000210
【表１３−１７】
0006881813.tif 000211
【表１３−１８】
0006881813.tif 000212
【表１３−１９】
0006881813.tif 000213
【表１３−２０】
0006881813.tif 000214
【表１３−２１】
0006881813.tif 000215
【表１３−２２】
0006881813.tif 000216
【表１３−２３】
0006881813.tif 000217
【表１３−２４】
0006881813.tif 000218
【表１３−２５】
0006881813.tif 000219
【表１３−２６】
0006881813.tif 000220
【表１３−２７】
0006881813.tif 000221
【表１３−２８】
0006881813.tif 000222
【表１３−２９】
0006881813.tif 000223
【表１３−３０】
0006881813.tif 000224
【表１３−３１】
0006881813.tif 000225
【表１３−３２】
0006881813.tif 000226
【表１３−３３】
0006881813.tif 000227
【表１３−３４】
0006881813.tif 000228
【表１３−３５】
0006881813.tif 000229
【表１３−３６】
0006881813.tif 000230
【表１３−３７】
0006881813.tif 000231
【表１３−３８】
0006881813.tif 000232
【表１３−３９】
0006881813.tif 000233
【表１３−４０】
0006881813.tif 000234
【表１３−４１】
0006881813.tif 000235
【表１３−４２】
0006881813.tif 000236
【表１３−４３】
0006881813.tif 000237
【表１３−４４】
0006881813.tif 000238
【表１３−４５】
0006881813.tif 000239
【表１３−４６】
0006881813.tif 000240
【表１３−４７】
0006881813.tif 000241
【表１３−４８】
0006881813.tif 000242
【表１３−４９】
0006881813.tif 000243
【表１３−５０】
0006881813.tif 000244
【表１３−５１】
0006881813.tif 000245
【表１３−５２】
0006881813.tif 000246
【表１３−５３】
0006881813.tif 000247
【表１３−５４】
0006881813.tif 000248
【表１３−５５】
0006881813.tif 000249
【表１３−５６】
0006881813.tif 000250
【表１３−５７】
0006881813.tif 000251
【表１３−５８】
0006881813.tif 000252
【表１３−５９】
0006881813.tif 000253
【表１３−６０】
0006881813.tif 000254
【表１３−６１】
0006881813.tif 000255
【表１３−６２】
0006881813.tif 000256
【表１３−６３】
0006881813.tif 000257
【表１３−６４】
0006881813.tif 000258
【０１８５】
【表１４−１】
0006881813.tif 000259
【表１４−２】
0006881813.tif 000260
【表１４−３】
0006881813.tif 000261
【表１４−４】
0006881813.tif 000262
【表１４−５】
0006881813.tif 000263
【表１４−６】
0006881813.tif 000264
【表１４−７】
0006881813.tif 000265
【表１４−８】
0006881813.tif 000266
【表１４−９】
0006881813.tif 000267
【表１４−１０】
0006881813.tif 000268
【表１４−１１】
0006881813.tif 000269
【表１４−１２】
0006881813.tif 000270
【表１４−１３】
0006881813.tif 000271
【表１４−１４】
0006881813.tif 000272
【表１４−１５】
0006881813.tif 000273
【表１４−１６】
0006881813.tif 000274
【表１４−１７】
0006881813.tif 000275
【表１４−１８】
0006881813.tif 000276
【表１４−１９】
0006881813.tif 000277
【表１４−２０】
0006881813.tif 000278
【表１４−２１】
0006881813.tif 000279
【表１４−２２】
0006881813.tif 000280
【表１４−２３】
0006881813.tif 000281
【表１４−２４】
0006881813.tif 000282
【表１４−２５】
0006881813.tif 000283
【表１４−２６】
0006881813.tif 000284
【表１４−２７】
0006881813.tif 000285
【表１４−２８】
0006881813.tif 000286
【表１４−２９】
0006881813.tif 000287
【表１４−３０】
0006881813.tif 000288
【表１４−３１】
0006881813.tif 000289
【表１４−３２】
0006881813.tif 000290
【表１４−３３】
0006881813.tif 000291
【表１４−３４】
0006881813.tif 000292
【表１４−３５】
0006881813.tif 000293
【表１４−３６】
0006881813.tif 000294
【表１４−３７】
0006881813.tif 000295
【表１４−３８】
0006881813.tif 000296
【表１４−３９】
0006881813.tif 000297
【表１４−４０】
0006881813.tif 000298
【表１４−４１】
0006881813.tif 000299
【表１４−４２】
0006881813.tif 000300
【表１４−４３】
0006881813.tif 000301
【表１４−４４】
0006881813.tif 000302
【表１４−４５】
0006881813.tif 000303
【表１４−４６】
0006881813.tif 000304
【表１４−４７】
0006881813.tif 000305
【表１４−４８】
0006881813.tif 000306
【表１４−４９】
0006881813.tif 000307
【表１４−５０】
0006881813.tif 000308
【表１４−５１】
0006881813.tif 000309
【表１４−５２】
0006881813.tif 000310
【表１４−５３】
0006881813.tif 000311
【表１４−５４】
0006881813.tif 000312
【表１４−５５】
0006881813.tif 000313
【表１４−５６】
0006881813.tif 000314
【表１４−５７】
0006881813.tif 000315
【表１４−５８】
0006881813.tif 000316
【表１４−５９】
0006881813.tif 000317
【表１４−６０】
0006881813.tif 000318
【表１４−６１】
0006881813.tif 000319
【表１４−６２】
0006881813.tif 000320
【表１４−６３】
0006881813.tif 000321
【表１４−６４】
0006881813.tif 000322
【表１４−６５】
0006881813.tif 000323
【０１８６】
【表１５−１】
0006881813.tif 000324
【表１５−２】
0006881813.tif 000325
【表１５−３】
0006881813.tif 000326
【表１５−４】
0006881813.tif 000327
【０１８７】
【表１６−１】
0006881813.tif 000328
【表１６−２】
0006881813.tif 000329
【表１６−３】
0006881813.tif 000330
【表１６−４】
0006881813.tif 000331
【表１６−５】
0006881813.tif 000332
【表１６−６】
0006881813.tif 000333
【表１６−７】
0006881813.tif 000334
【表１６−８】
0006881813.tif 000335
【表１６−９】
0006881813.tif 000336
【表１６−１０】
0006881813.tif 000337
【表１６−１１】
0006881813.tif 000338
【表１６−１２】
0006881813.tif 000339
【表１６−１３】
0006881813.tif 000340
【表１６−１４】
0006881813.tif 000341
【表１６−１５】
0006881813.tif 000342
【表１６−１６】
0006881813.tif 000343
【表１６−１７】
0006881813.tif 000344
【表１６−１８】
0006881813.tif 000345
【表１６−１９】
0006881813.tif 000346
【表１６−２０】
0006881813.tif 000347
【表１６−２１】
0006881813.tif 000348
【表１６−２２】
0006881813.tif 000349
【表１６−２３】
0006881813.tif 000350
【表１６−２４】
0006881813.tif 000351
【表１６−２５】
0006881813.tif 000352
【表１６−２６】
0006881813.tif 000353
【表１６−２７】
0006881813.tif 000354
【表１６−２８】
0006881813.tif 000355
【表１６−２９】
0006881813.tif 000356
【表１６−３０】
0006881813.tif 000357
【表１６−３１】
0006881813.tif 000358
【表１６−３２】
0006881813.tif 000359
【表１６−３３】
0006881813.tif 000360
【表１６−３４】
0006881813.tif 000361
【表１６−３５】
0006881813.tif 000362
【表１６−３６】
0006881813.tif 000363
【表１６−３７】
0006881813.tif 000364
【表１６−３８】
0006881813.tif 000365
【表１６−３９】
0006881813.tif 000366
【表１６−４０】
0006881813.tif 000367
【表１６−４１】
0006881813.tif 000368
【表１６−４２】
0006881813.tif 000369
【表１６−４３】
0006881813.tif 000370
【表１６−４４】
0006881813.tif 000371
【表１６−４５】
0006881813.tif 000372
【表１６−４６】
0006881813.tif 000373
【表１６−４７】
0006881813.tif 000374
【表１６−４８】
0006881813.tif 000375
【表１６−４９】
0006881813.tif 000376
【表１６−５０】
0006881813.tif 000377
【表１６−５１】
0006881813.tif 000378
【表１６−５２】
0006881813.tif 000379
【表１６−５３】
0006881813.tif 000380
【表１６−５４】
0006881813.tif 000381
【表１６−５５】
0006881813.tif 000382
【表１６−５６】
0006881813.tif 000383
【表１６−５７】
0006881813.tif 000384
【表１６−５８】
0006881813.tif 000385
【表１６−５９】
0006881813.tif 000386
【表１６−６０】
0006881813.tif 000387
【表１６−６１】
0006881813.tif 000388
【表１６−６２】
0006881813.tif 000389
【表１６−６３】
0006881813.tif 000390
【表１６−６４】
0006881813.tif 000391
【表１６−６５】
0006881813.tif 000392
【表１６−６６】
0006881813.tif 000393
【表１６−６７】
0006881813.tif 000394
【表１６−６８】
0006881813.tif 000395
【表１６−６９】
0006881813.tif 000396
【表１６−７０】
0006881813.tif 000397
【表１６−７１】
0006881813.tif 000398
【表１６−７２】
0006881813.tif 000399
【表１６−７３】
0006881813.tif 000400
【表１６−７４】
0006881813.tif 000401
【表１６−７５】
0006881813.tif 000402
【表１６−７６】
0006881813.tif 000403
【表１６−７７】
0006881813.tif 000404
【表１６−７８】
0006881813.tif 000405
【表１６−７９】
0006881813.tif 000406
【表１６−８０】
0006881813.tif 000407
【表１６−８１】
0006881813.tif 000408
【表１６−８２】
0006881813.tif 000409
【表１６−８３】
0006881813.tif 000410
【表１６−８４】
0006881813.tif 000411
【表１６−８５】
0006881813.tif 000412
【表１６−８６】
0006881813.tif 000413
【表１６−８７】
0006881813.tif 000414
【表１６−８８】
0006881813.tif 000415
【表１６−８９】
0006881813.tif 000416
【表１６−９０】
0006881813.tif 000417
【表１６−９１】
0006881813.tif 000418
【表１６−９２】
0006881813.tif 000419
【表１６−９３】
0006881813.tif 000420
【表１６−９４】
0006881813.tif 000421
【表１６−９５】
0006881813.tif 000422
【表１６−９６】
0006881813.tif 000423
【表１６−９７】
0006881813.tif 000424
【表１６−９８】
0006881813.tif 000425
【表１６−９９】
0006881813.tif 000426
【表１６−１００】
0006881813.tif 000427
【表１６−１０１】
0006881813.tif 000428
【０１８８】
【表１７−１】
0006881813.tif 000429
【表１７−２】
0006881813.tif 000430
【表１７−３】
0006881813.tif 000431
【表１７−４】
0006881813.tif 000432
【表１７−５】
0006881813.tif 000433
【表１７−６】
0006881813.tif 000434
【表１７−７】
0006881813.tif 000435
【表１７−８】
0006881813.tif 000436
【表１７−９】
0006881813.tif 000437
【表１７−１０】
0006881813.tif 000438
【表１７−１１】
0006881813.tif 000439
【表１７−１２】
0006881813.tif 000440
【表１７−１３】
0006881813.tif 000441
【表１７−１４】
0006881813.tif 000442
【表１７−１５】
0006881813.tif 000443
【表１７−１６】
0006881813.tif 000444
【表１７−１７】
0006881813.tif 000445
【表１７−１８】
0006881813.tif 000446
【表１７−１９】
0006881813.tif 000447
【表１７−２０】
0006881813.tif 000448
【表１７−２１】
0006881813.tif 000449
【表１７−２２】
0006881813.tif 000450
【表１７−２３】
0006881813.tif 000451
【表１７−２４】
0006881813.tif 000452
【表１７−２５】
0006881813.tif 000453
【表１７−２６】
0006881813.tif 000454
【表１７−２７】
0006881813.tif 000455
【表１７−２８】
0006881813.tif 000456
【表１７−２９】
0006881813.tif 000457
【表１７−３０】
0006881813.tif 000458
【表１７−３１】
0006881813.tif 000459
【表１７−３２】
0006881813.tif 000460
【表１７−３３】
0006881813.tif 000461
【表１７−３４】
0006881813.tif 000462
【表１７−３５】
0006881813.tif 000463
【表１７−３６】
0006881813.tif 000464
【表１７−３７】
0006881813.tif 000465
【表１７−３８】
0006881813.tif 000466
【表１７−３９】
0006881813.tif 000467
【表１７−４０】
0006881813.tif 000468
【表１７−４１】
0006881813.tif 000469
【表１７−４２】
0006881813.tif 000470
【表１７−４３】
0006881813.tif 000471
【表１７−４４】
0006881813.tif 000472
【表１７−４５】
0006881813.tif 000473
【表１７−４６】
0006881813.tif 000474
【表１７−４７】
0006881813.tif 000475
【表１７−４８】
0006881813.tif 000476
【表１７−４９】
0006881813.tif 000477
【表１７−５０】
0006881813.tif 000478
【表１７−５１】
0006881813.tif 000479
【表１７−５２】
0006881813.tif 000480
【表１７−５３】
0006881813.tif 000481
【表１７−５４】
0006881813.tif 000482
【表１７−５５】
0006881813.tif 000483
【表１７−５６】
0006881813.tif 000484
【表１７−５７】
0006881813.tif 000485
【表１７−５８】
0006881813.tif 000486
【表１７−５９】
0006881813.tif 000487
【表１７−６０】
0006881813.tif 000488
【表１７−６１】
0006881813.tif 000489
【表１７−６２】
0006881813.tif 000490
【表１７−６３】
0006881813.tif 000491
【表１７−６４】
0006881813.tif 000492
【表１７−６５】
0006881813.tif 000493
【表１７−６６】
0006881813.tif 000494
【表１７−６７】
0006881813.tif 000495
【表１７−６８】
0006881813.tif 000496
【表１７−６９】
0006881813.tif 000497
【表１７−７０】
0006881813.tif 000498
【表１７−７１】
0006881813.tif 000499
【表１７−７２】
0006881813.tif 000500
【表１７−７３】
0006881813.tif 000501
【表１７−７４】
0006881813.tif 000502
【表１７−７５】
0006881813.tif 000503
【表１７−７６】
0006881813.tif 000504
【表１７−７７】
0006881813.tif 000505
【表１７−７８】
0006881813.tif 000506
【表１７−７９】
0006881813.tif 000507
【表１７−８０】
0006881813.tif 000508
【表１７−８１】
0006881813.tif 000509
【表１７−８２】
0006881813.tif 000510
【表１７−８３】
0006881813.tif 000511
【表１７−８４】
0006881813.tif 000512
【表１７−８５】
0006881813.tif 000513
【表１７−８６】
0006881813.tif 000514
【表１７−８７】
0006881813.tif 000515
【表１７−８８】
0006881813.tif 000516
【表１７−８９】
0006881813.tif 000517
【表１７−９０】
0006881813.tif 000518
【表１７−９１】
0006881813.tif 000519
【表１７−９２】
0006881813.tif 000520
【表１７−９３】
0006881813.tif 000521
【表１７−９４】
0006881813.tif 000522
【表１７−９５】
0006881813.tif 000523
【表１７−９６】
0006881813.tif 000524
【表１７−９７】
0006881813.tif 000525
【表１７−９８】
0006881813.tif 000526
【表１７−９９】
0006881813.tif 000527
【表１７−１００】
0006881813.tif 000528
【表１７−１０１】
0006881813.tif 000529
【表１７−１０２】
0006881813.tif 000530
【表１７−１０３】
0006881813.tif 000531
【表１７−１０４】
0006881813.tif 000532
【表１７−１０５】
0006881813.tif 000533
【表１７−１０６】
0006881813.tif 000534
【表１７−１０７】
0006881813.tif 000535
【表１７−１０８】
0006881813.tif 000536
【表１７−１０９】
0006881813.tif 000537
【表１７−１１０】
0006881813.tif 000538
【表１７−１１１】
0006881813.tif 000539
【表１７−１１２】
0006881813.tif 000540
【表１７−１１３】
0006881813.tif 000541
【表１７−１１４】
0006881813.tif 000542
【表１７−１１５】
0006881813.tif 000543
【表１７−１１６】
0006881813.tif 000544
【表１７−１１７】
0006881813.tif 000545
【表１７−１１８】
0006881813.tif 000546
【表１７−１１９】
0006881813.tif 000547
【表１７−１２０】
0006881813.tif 000548
【表１７−１２１】
0006881813.tif 000549
【表１７−１２２】
0006881813.tif 000550
【表１７−１２３】
0006881813.tif 000551
【表１７−１２４】
0006881813.tif 000552
【表１７−１２５】
0006881813.tif 000553
【表１７−１２６】
0006881813.tif 000554
【表１７−１２７】
0006881813.tif 000555
【表１７−１２８】
0006881813.tif 000556
【表１７−１２９】
0006881813.tif 000557
【表１７−１３０】
0006881813.tif 000558
【表１７−１３１】
0006881813.tif 000559
【表１７−１３２】
0006881813.tif 000560
【表１７−１３３】
0006881813.tif 000561
【表１７−１３４】
0006881813.tif 000562
【表１７−１３５】
0006881813.tif 000563
【表１７−１３６】
0006881813.tif 000564
【表１７−１３７】
0006881813.tif 000565
【表１７−１３８】
0006881813.tif 000566
【表１７−１３９】
0006881813.tif 000567
【表１７−１４０】
0006881813.tif 000568
【表１７−１４１】
0006881813.tif 000569
【表１７−１４２】
0006881813.tif 000570
【表１７−１４３】
0006881813.tif 000571
【表１７−１４４】
0006881813.tif 000572
【表１７−１４５】
0006881813.tif 000573
【表１７−１４６】
0006881813.tif 000574
【表１７−１４７】
0006881813.tif 000575
【表１７−１４８】
0006881813.tif 000576
【表１７−１４９】
0006881813.tif 000577
【表１７−１５０】
0006881813.tif 000578
【表１７−１５１】
0006881813.tif 000579
【表１７−１５２】
0006881813.tif 000580
【表１７−１５３】
0006881813.tif 000581
【表１７−１５４】
0006881813.tif 000582
【表１７−１５５】
0006881813.tif 000583
【表１７−１５６】
0006881813.tif 000584
【表１７−１５７】
0006881813.tif 000585
【表１７−１５８】
0006881813.tif 000586
【表１７−１５９】
0006881813.tif 000587
【表１７−１６０】
0006881813.tif 000588
【表１７−１６１】
0006881813.tif 000589
【表１７−１６２】
0006881813.tif 000590
【表１７−１６３】
0006881813.tif 000591
【表１７−１６４】
0006881813.tif 000592
【表１７−１６５】
0006881813.tif 000593
【表１７−１６６】
0006881813.tif 000594
【表１７−１６７】
0006881813.tif 000595
【表１７−１６８】
0006881813.tif 000596
【表１７−１６９】
0006881813.tif 000597
【表１７−１７０】
0006881813.tif 000598
【表１７−１７１】
0006881813.tif 000599
【表１７−１７２】
0006881813.tif 000600
【表１７−１７３】
0006881813.tif 000601
【表１７−１７４】
0006881813.tif 000602
【表１７−１７５】
0006881813.tif 000603
【表１７−１７６】
0006881813.tif 000604
【表１７−１７７】
0006881813.tif 000605
【表１７−１７８】
0006881813.tif 000606
【表１７−１７９】
0006881813.tif 000607
【表１７−１８０】
0006881813.tif 000608
【表１７−１８１】
0006881813.tif 000609
【表１７−１８２】
0006881813.tif 000610
【表１７−１８３】
0006881813.tif 000611
【表１７−１８４】
0006881813.tif 000612
【表１７−１８５】
0006881813.tif 000613
【表１７−１８６】
0006881813.tif 000614
【表１７−１８７】
0006881813.tif 000615
【表１７−１８８】
0006881813.tif 000616
【表１７−１８９】
0006881813.tif 000617
【表１７−１９０】
0006881813.tif 000618
【表１７−１９１】
0006881813.tif 000619
【表１７−１９２】
0006881813.tif 000620
【表１７−１９３】
0006881813.tif 000621
【表１７−１９４】
0006881813.tif 000622
【表１７−１９５】
0006881813.tif 000623
【表１７−１９６】
0006881813.tif 000624
【表１７−１９７】
0006881813.tif 000625
【表１７−１９８】
0006881813.tif 000626
【表１７−１９９】
0006881813.tif 000627
【表１７−２００】
0006881813.tif 000628
【表１７−２０１】
0006881813.tif 000629
【０１８９】
【表１８−１】
0006881813.tif 000630
【表１８−２】
0006881813.tif 000631
【表１８−３】
0006881813.tif 000632
【表１８−４】
0006881813.tif 000633
【表１８−５】
0006881813.tif 000634
【表１８−６】
0006881813.tif 000635
【表１８−７】
0006881813.tif 000636
【表１８−８】
0006881813.tif 000637
【表１８−９】
0006881813.tif 000638
【表１８−１０】
0006881813.tif 000639
【表１８−１１】
0006881813.tif 000640
【表１８−１２】
0006881813.tif 000641
【表１８−１３】
0006881813.tif 000642
【表１８−１４】
0006881813.tif 000643
【表１８−１５】
0006881813.tif 000644
【表１８−１６】
0006881813.tif 000645
【表１８−１７】
0006881813.tif 000646
【表１８−１８】
0006881813.tif 000647
【表１８−１９】
0006881813.tif 000648
【表１８−２０】
0006881813.tif 000649
【表１８−２１】
0006881813.tif 000650
【表１８−２２】
0006881813.tif 000651
【表１８−２３】
0006881813.tif 000652
【表１８−２４】
0006881813.tif 000653
【表１８−２５】
0006881813.tif 000654
【表１８−２６】
0006881813.tif 000655
【表１８−２７】
0006881813.tif 000656
【表１８−２８】
0006881813.tif 000657
【表１８−２９】
0006881813.tif 000658
【表１８−３０】
0006881813.tif 000659
【表１８−３１】
0006881813.tif 000660
【表１８−３２】
0006881813.tif 000661
【表１８−３３】
0006881813.tif 000662
【表１８−３４】
0006881813.tif 000663
【表１８−３５】
0006881813.tif 000664
【表１８−３６】
0006881813.tif 000665
【表１８−３７】
0006881813.tif 000666
【表１８−３８】
0006881813.tif 000667
【表１８−３９】
0006881813.tif 000668
【表１８−４０】
0006881813.tif 000669
【表１８−４１】
0006881813.tif 000670
【表１８−４２】
0006881813.tif 000671
【表１８−４３】
0006881813.tif 000672
【表１８−４４】
0006881813.tif 000673
【表１８−４５】
0006881813.tif 000674
【表１８−４６】
0006881813.tif 000675
【表１８−４７】
0006881813.tif 000676
【表１８−４８】
0006881813.tif 000677
【表１８−４９】
0006881813.tif 000678
【表１８−５０】
0006881813.tif 000679
【表１８−５１】
0006881813.tif 000680
【表１８−５２】
0006881813.tif 000681
【表１８−５３】
0006881813.tif 000682
【表１８−５４】
0006881813.tif 000683
【表１８−５５】
0006881813.tif 000684
【表１８−５６】
0006881813.tif 000685
【表１８−５７】
0006881813.tif 000686
【表１８−５８】
0006881813.tif 000687
【表１８−５９】
0006881813.tif 000688
【表１８−６０】
0006881813.tif 000689
【表１８−６１】
0006881813.tif 000690
【表１８−６２】
0006881813.tif 000691
【表１８−６３】
0006881813.tif 000692
【表１８−６４】
0006881813.tif 000693
【表１８−６５】
0006881813.tif 000694
【表１８−６６】
0006881813.tif 000695
【表１８−６７】
0006881813.tif 000696
【表１８−６８】
0006881813.tif 000697
【表１８−６９】
0006881813.tif 000698
【表１８−７０】
0006881813.tif 000699
【表１８−７１】
0006881813.tif 000700
【表１８−７２】
0006881813.tif 000701
【表１８−７３】
0006881813.tif 000702
【表１８−７４】
0006881813.tif 000703
【表１８−７５】
0006881813.tif 000704
【表１８−７６】
0006881813.tif 000705
【表１８−７７】
0006881813.tif 000706
【表１８−７８】
0006881813.tif 000707
【表１８−７９】
0006881813.tif 000708
【表１８−８０】
0006881813.tif 000709
【表１８−８１】
0006881813.tif 000710
【表１８−８２】
0006881813.tif 000711
【表１８−８３】
0006881813.tif 000712
【表１８−８４】
0006881813.tif 000713
【表１８−８５】
0006881813.tif 000714
【表１８−８６】
0006881813.tif 000715
【表１８−８７】
0006881813.tif 000716
【表１８−８８】
0006881813.tif 000717
【表１８−８９】
0006881813.tif 000718
【表１８−９０】
0006881813.tif 000719
【表１８−９１】
0006881813.tif 000720
【表１８−９２】
0006881813.tif 000721
【表１８−９３】
0006881813.tif 000722
【表１８−９４】
0006881813.tif 000723
【表１８−９５】
0006881813.tif 000724
【表１８−９６】
0006881813.tif 000725
【表１８−９７】
0006881813.tif 000726
【表１８−９８】
0006881813.tif 000727
【表１８−９９】
0006881813.tif 000728
【表１８−１００】
0006881813.tif 000729
【表１８−１０１】
0006881813.tif 000730
【表１８−１０２】
0006881813.tif 000731
【表１８−１０３】
0006881813.tif 000732
【表１８−１０４】
0006881813.tif 000733
【表１８−１０５】
0006881813.tif 000734
【表１８−１０６】
0006881813.tif 000735
【表１８−１０７】
0006881813.tif 000736
【表１８−１０８】
0006881813.tif 000737
【表１８−１０９】
0006881813.tif 000738
【表１８−１１０】
0006881813.tif 000739
【表１８−１１１】
0006881813.tif 000740
【表１８−１１２】
0006881813.tif 000741
【表１８−１１３】
0006881813.tif 000742
【表１８−１１４】
0006881813.tif 000743
【表１８−１１５】
0006881813.tif 000744
【表１８−１１６】
0006881813.tif 000745
【表１８−１１７】
0006881813.tif 000746
【表１８−１１８】
0006881813.tif 000747
【表１８−１１９】
0006881813.tif 000748
【表１８−１２０】
0006881813.tif 000749
【表１８−１２１】
0006881813.tif 000750
【表１８−１２２】
0006881813.tif 000751
【表１８−１２３】
0006881813.tif 000752
【表１８−１２４】
0006881813.tif 000753
【表１８−１２５】
0006881813.tif 000754
【表１８−１２６】
0006881813.tif 000755
【表１８−１２７】
0006881813.tif 000756
【表１８−１２８】
0006881813.tif 000757
【表１８−１２９】
0006881813.tif 000758
【表１８−１３０】
0006881813.tif 000759
【表１８−１３１】
0006881813.tif 000760
【表１８−１３２】
0006881813.tif 000761
【表１８−１３３】
0006881813.tif 000762
【表１８−１３４】
0006881813.tif 000763
【表１８−１３５】
0006881813.tif 000764
【表１８−１３６】
0006881813.tif 000765
【表１８−１３７】
0006881813.tif 000766
【表１８−１３８】
0006881813.tif 000767
【表１８−１３９】
0006881813.tif 000768
【表１８−１４０】
0006881813.tif 000769
【表１８−１４１】
0006881813.tif 000770
【表１８−１４２】
0006881813.tif 000771
【表１８−１４３】
0006881813.tif 000772
【表１８−１４４】
0006881813.tif 000773
【表１８−１４５】
0006881813.tif 000774
【表１８−１４６】
0006881813.tif 000775
【表１８−１４７】
0006881813.tif 000776
【表１８−１４８】
0006881813.tif 000777
【表１８−１４９】
0006881813.tif 000778
【表１８−１５０】
0006881813.tif 000779
【表１８−１５１】
0006881813.tif 000780
【表１８−１５２】
0006881813.tif 000781
【表１８−１５３】
0006881813.tif 000782
【表１８−１５４】
0006881813.tif 000783
【表１８−１５５】
0006881813.tif 000784
【表１８−１５６】
0006881813.tif 000785
【表１８−１５７】
0006881813.tif 000786
【表１８−１５８】
0006881813.tif 000787
【表１８−１５９】
0006881813.tif 000788
【表１８−１６０】
0006881813.tif 000789
【表１８−１６１】
0006881813.tif 000790
【表１８−１６２】
0006881813.tif 000791
【表１８−１６３】
0006881813.tif 000792
【表１８−１６４】
0006881813.tif 000793
【表１８−１６５】
0006881813.tif 000794
【表１８−１６６】
0006881813.tif 000795
【表１８−１６７】
0006881813.tif 000796
【表１８−１６８】
0006881813.tif 000797
【表１８−１６９】
0006881813.tif 000798
【表１８−１７０】
0006881813.tif 000799
【表１８−１７１】
0006881813.tif 000800
【表１８−１７２】
0006881813.tif 000801
【表１８−１７３】
0006881813.tif 000802
【表１８−１７４】
0006881813.tif 000803
【表１８−１７５】
0006881813.tif 000804
【表１８−１７６】
0006881813.tif 000805
【表１８−１７７】
0006881813.tif 000806
【表１８−１７８】
0006881813.tif 000807
【表１８−１７９】
0006881813.tif 000808
【表１８−１８０】
0006881813.tif 000809
【表１８−１８１】
0006881813.tif 000810
【表１８−１８２】
0006881813.tif 000811
【表１８−１８３】
0006881813.tif 000812
【表１８−１８４】
0006881813.tif 000813
【表１８−１８５】
0006881813.tif 000814
【表１８−１８６】
0006881813.tif 000815
【表１８−１８７】
0006881813.tif 000816
【表１８−１８８】
0006881813.tif 000817
【表１８−１８９】
0006881813.tif 000818
【表１８−１９０】
0006881813.tif 000819
【表１８−１９１】
0006881813.tif 000820
【表１８−１９２】
0006881813.tif 000821
【表１８−１９３】
0006881813.tif 000822
【表１８−１９４】
0006881813.tif 000823
【表１８−１９５】
0006881813.tif 000824
【表１８−１９６】
0006881813.tif 000825
【表１８−１９７】
0006881813.tif 000826
【表１８−１９８】
0006881813.tif 000827
【表１８−１９９】
0006881813.tif 000828
【表１８−２００】
0006881813.tif 000829
【表１８−２０１】
0006881813.tif 000830
【表１８−２０２】
0006881813.tif 000831
【０１９０】
コンセンサス配列に対するインフルエンザＡ型Ｈ７Ｎ９株からのヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを図２２に示す。コンセンサス配列に対するインフルエンザＡ型Ｈ１０Ｎ８株からのヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを図２３に示す。
【０１９１】
本開示の態様は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。「ヘマグルチニン」、「ヘマグルチニンタンパク質」及び「ＨＡ」という用語は、本明細書全体で同じ意味で用いることができ、インフルエンザウイルスの表面に存在し得るヘマグルチニンタンパク質を指す。ウイルス表面で、ヘマグルチニンタンパク質はホモ三量体で存在し、その各モノマーはジスルフィド結合によって連結された２つのサブユニット、ＨＡ１及びＨＡ２を含む。構造的に、ヘマグルチニンタンパク質は、球状頭部ドメイン、ストークドメイン（ステムドメインとも呼ばれる）、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインという複数のドメインからなる。インフルエンザウイルスによる宿主細胞（例えば、ヒト細胞などの真核細胞）への感染時、ヘマグルチニンタンパク質は宿主細胞表面にある受容体のシアル酸を認識して結合して、宿主細胞へのウイルスの付着を促進すると一般的に考えられている（Ｇａｍｂｌｉｎら，２００４、Ｈａら，２０００）。ウイルスのエンドサイトーシス及びエンドソームの酸性化の後、ヘマグルチニンタンパク質はｐＨ依存的なコンホメーション変化を受け、これにより、ヘマグルチニンタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞のエンドソーム膜との融合を促進し、宿主細胞へのウイルス核酸の侵入を可能にする。
【０１９２】
一般に、インフルエンザウイルスは、ウイルスヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列及び／またはウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）のアミノ酸配列に基づいて分類される。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７またはＨ１８である。異なる亜型のヘマグルチニンタンパク質間のアミノ酸配列の違いは、主にタンパク質の頭部ドメインの配列内に見られる。ストークドメインのアミノ酸配列は、頭部ドメインの配列と比較してヘマグルチニン亜型間でより保存的であると考えられている。ヘマグルチニンタンパク質のドメインは、当該技術分野で既知である従来の方法を使用して予測することができる。
【０１９３】
ヘマグルチニンタンパク質と結合して中和する多くの天然に存在する抗体及び実験的に誘導される抗体は、ヘマグルチニンの頭部ドメイン内のエピトープと結合して、宿主細胞の受容体上のシアル酸とヘマグルチニンとの相互作用を防止または低減させ、それによって細胞の感染を予防または軽減すると考えられている。代わりに、または加えて、中和抗体は、エンドソーム膜とウイルス膜との融合を防止または低減させ得る。このような抗体はストークドメイン内のエピトープと結合し、それによりタンパク質のコンホメーション変化を阻害し得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＲＮＡポリヌクレオチドは、ヘマグルチニンタンパク質の断片、例えばトランケート型ヘマグルチニンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、断片はヘッドレスヘマグルチニンであり、これは断片が頭部ドメインを含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、断片は頭部ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、断片はストーク断片である（Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａら  ＰＮＡＳ（２０１４）Ｅ２５１４−Ｅ２５２３を参照）。いくつかの実施形態では、断片は、細胞質ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、断片は、膜貫通ドメインを含まない。そのような実施形態では、断片は、可溶性または分泌されたヘマグルチニンタンパク質または断片と呼ばれる場合がある。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリペプチドは、表１４〜１６のアミノ酸配列により与えられるヘマグルチニンタンパク質と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードする。２つ以上のポリペプチド配列に関連するとき、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、同じ２つ以上の配列を指す。ポリペプチド配列間のパーセント同一性は、当該技術分野で既知のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬを使用して特定することができる。
【０１９６】
ヘマグルチニンタンパク質またはその断片の配列は、いかなるソースから得ても良い。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片の配列は、トリインフルエンザ株に由来する。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片の配列は、ヒト対象へ感染可能な、または感染の危険性があるトリインフルエンザ株に由来する。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片の配列は、ブタインフルエンザ株に由来する。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片の配列は、ヒト対象へ感染可能な、または感染の危険性があるブタインフルエンザ株に由来する。
【０１９７】
本明細書に記載する実施形態のいずれかにおいて、ヘマグルチニンまたはその断片の配列は、特定の細胞または宿主生物での発現に合わせて修飾または最適化（例えばコドン最適化）されても良い。
【０１９８】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）
ＭＲＳＡは、１００，０００人当たり２０〜１００の発生率を有する最も一般的な侵襲性細菌感染症である。米国だけでも約２０，０００の死亡原因となっている。
【０１９９】
ＭＲＳＡの危険因子として、医療時曝露、抗生物質使用及びＨＩＶが挙げられる。ＭＲＳＡは関節置換手術でよくある合併症であり、発症すると関節の摘出と交換を必要とする。症状には、肺炎、皮膚及び軟組織感染症、骨髄炎（例えば、プロテーゼ）、心内膜炎、菌血症及び敗血症を含む。
【０２００】
現在の処置として、静脈内抗ブドウ球菌抗生物質（例えば、バンコマイシン、Ｚｙｖｏｘ、Ｃｕｂｉｃｉｎ）、接触感染予防措置及び敗血症の管理（目標指向型治療＋／−ＩＣＵ滞在）が挙げられる。
【０２０１】
ＭＲＳＡ  ＨＡ病原体は多重抗原を有するため、多剤耐性に対処するには複合的手法が重要原則となる。細胞培養法により、従来的な製造ワクチンの抗原数が限定される点で、本ＮＡＶの手法は優れている。
【０２０２】
ＭＲＳＡ抗原として、ＮＤＭ１、ｍｅｃＡ、全てのβ−ラクタマーゼ（抗生物質耐性）、プロテインＡの突然変異体（免疫逃避）、ＳＤＲＤ／ＳＤＲＥ（付着性）、ＩｓｄＡまたはＩｓｄＢ（ラクトフェリン逃避、Ｆｅ輸送）、ＴＳＳＴ、ａ−ＨＬ及びＰＶＬ（毒素）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２０３】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは多価ワクチンを含んで良く、例えばこれは、ＮＤＭ−１及びＳｐＡｍｕｔを含むが、それらに限定されない少なくとも２つのＭＲＳＡ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２０４】
一実施形態では、ＳｐＡ抗原、またはＭＲＳＡの機能欠損突然変異体ＳｐＡＫＫＡＡが、ＮＡＶのポリヌクレオチドによってコードされる。Ｋｉｍら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．２０７  Ｎｏ．９；１８６３−１８７０）は、５つのＩｇ結合ドメインでのブドウ球菌性プロテインＡ（ＳｐＡ）変異により、ＦｃγまたはＦａｂ  ＶＨ３と結合できず、細胞アポトーシスを亢進できない変異体ＳｐＡＫＫＡＡが生じたことを記載している。ＳｐＡＫＫＡＡ産生抗体を用いたマウスへの免疫付与は、強毒性ＭＲＳＡ株による攻撃からマウスを防御することが見出され、更にこの免疫付与によって、ＭＲＳＡの攻撃を受けたマウスの別のブドウ球菌性抗原に対する抗体反応を増大させることができた。Ｆａｌｕｇｉら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｍＢｉｏ  ４（５）：ｅ００５７５−１３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００５７５−１３）は、ＳｐＡＫＫＡＡの突然変異体が、主要な毒性抗原に対するＢ細胞応答を誘発して、致死性黄色ブドウ球菌攻撃から動物を防御すると共に、ＳｐＡＫＫＡＡの突然変異体が適応応答を誘発し、反復性感染から防御することを見出した。Ｓｃｈｉｎｅｅｗｉｎｄらは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１１１２７０３２号、同第ＷＯ２０１１００５３４１号、同第ＷＯ２０１２００３４７４号、同第ＷＯ２０１２０３４０６７号及び同第ＷＯ２０１３０２５８３４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１３６７４６号、同第ＵＳ２０１２０１１４６８６号、同第ＵＳ２０１３０１７１１８３号及び同第ＵＳ２０１３０２３０５５０号に、ＳｐＡ抗原、またはＳｐＡの機能欠損突然変異体について記載している。非限定的な例として、ＳｐＡの突然変異体は、Ｆｃ結合を攪乱する少なくとも１つのアミノ酸配列の置換と、ＶＨ３結合を攪乱する少なくとも１つのアミノ酸配列の置換とを含み得る（それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１００５３４１号及び米国特許公開第ＵＳ２０１２０１１４６８６号を参照）。別の非限定的な例として、ＳｐＡの突然変異体は、ＳｐＡ配列の９、１０、３６及び３７位のＳｐＡ配列のＤドメインに置換を含み得る（それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１１１２７０３２号、同第ＷＯ２０１２００３４７４号及び同第ＷＯ２０１２０３４０６７号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１３６７４６号、同第ＵＳ２０１３０１７１１８３号及び同第ＵＳ２０１３０２３０５５０号を参照）。９及び１０位のアミノ酸はグリシンと置換され得、３６及び３７位のアミノ酸はセリンと置換され得る（それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１１１２７０３２号及び同第ＷＯ２０１２００３４７４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１３６７４６号及び同第ＵＳ２０１３０１７１１８３号を参照）。更に別の非限定的な例として、ＳｐＡの突然変異体は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１１１２７０３２号及び同第���Ｏ２０１２００３４７４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１３６７４６号及び同第ＵＳ２０１３０１７１１８３号に記載の配列番号２の９、１０、３６及び３７位に置換を含み得る。
【０２０５】
ＳｐＡとＢ細胞表面Ｖ（Ｈ）３との結合により、Ｂ細胞受容体が架橋され、続いてＢ細胞アポトーシス、クローンＢ細胞の欠失、更に親和性成熟及びＢ細胞記憶のブロックが生じる。分泌された抗体のＦｃＲ結合部位でのＳｐＡとＦｃｇとの結合は、細菌性クリアランス及び適応免疫にとって不可欠であるエフェクター細胞の活性化を阻害する。
【０２０６】
ＳｐＡＫＫＡＡは、ＦｃｇとＶ（Ｈ）３との機能的な結合部位を欠く、ＳｐＡの機能欠損突然変異体である。
【０２０７】
ＳｐＡＫＫＡＡによるワクチン接種により、クローンＢ細胞の拡大が可能になり、抗体親和性成熟のための十分な時間が与えられることで、Ｂ細胞クローンはＳｐＡのエピトープに対して、ＳｐＡのＦｃｇまたはＶ（Ｈ）３結合よりも高い親和性を有することになる。これにより抗体は、親和性が成熟したＣＤＲを通じてＳｐＡと結合でき、Ｆｃ部分を自由に利用してエフェクター細胞の活性化及びＢ細胞の記憶形成が可能になる。
【０２０８】
このように、ＳｐＡＫＫＡＡによる免疫化により、ＭＲＳＡ攻撃を受けた対象は、様々なブドウ球菌抗原に対して抗体反応を高めることができる。
【０２０９】
一実施形態では、ＮＡＶは、ＳｐＡＫＫＡＡを主要抗原として有する多価ワクチンである。このことは、現在臨床開発中の全ての不活化ＭＲＳＡワクチンを凌ぐ重要な利点を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、ＭＲＳＡのＮＡＶは、リネゾリド耐性の関節／骨感染症、慢性疾患を有するもの、医療従事者などの危険集団を対象として、耐性株のアウトブレイクを防止するために使用される。
【０２１１】
ＰＶＬ、ａ−ＨＬ、ＴＳＳＴ−１などのＭＲＳＡ毒素を本発明のＮＡＶによってコードしても良い。あるいは、細菌の防御能を低減させ、それにより従来の抗生物質による攻撃を効きやすくする様態で、βラクタマーゼ遺伝子のいずれかを標的をすることもできる。ラクタマーゼ酵素のこのような標的化を特定の対象に合わせて個別化することができる。この場合、試料を採取して、当該技術分野で標準的な技術によって固有のラクタマーゼ配列を決定する。その後、固有のラクタマーゼ配列の阻害剤を設計し、個別化した医薬品またはワクチンを作製することができる。
【０２１２】
デング熱
デング熱は蚊が媒介するウイルスであり、流行性（東南アジア）かつ風土性（サブサハラアフリカ、インド）である。世界保健機関によると、感染者は年間１億人超、感染リスク者は世界人口の４０％にも上る。これまで約１００万〜２００万の臨床診断例がある。医療の利用しやすさに依存するが、死亡率は２０％もの高率に達し得る。
【０２１３】
症状としては、５〜７日間に及ぶ激しい関節痛及び筋肉痛を有する急激な発熱、それに続く数週間の倦怠感及び疲労感が挙げられる。脱水症及び出血が主要な死因であることから、ショック症状を回避するため静脈内輸液を利用できる必要がある。補助的治療として輸液による蘇生が可能であるが、予防がウイルスの影響を制限する主要手段である（例えば、蚊の制御、個人的防御）。
【０２１４】
デング熱の場合、疾患の特徴として、４つの最も重要なデング血清型（ＤＥＮＶ１〜４）に対し、抗体反応の中和は必要だが、抗体反応の促進は必要としない。したがって、デング熱ウイルスの４つの血清型（ＤＥＮＶ  １〜４）のキータンパク質／タンパク質ドメインを標的とする多価抗原が、ワクチンとして価値を有することになる。
【０２１５】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、Ｅタンパク質ドメインＩＩＩ（ＤＥＮＶ１〜４タンデムのｍＲＮＡ）、Ｅタンパク質ドメインＩ／ＩＩヒンジ領域（ＤＥＮＶ１〜４個々のｍＲＮＡ）、ｐｒＭタンパク質（ＤＥＮＶ１〜４タンデムまたは個々のｍＲＮＡ）及びＣタンパク質（ＤＥＮＶ１〜４タンデムまたは単一のｍＲＮＡ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２１６】
一実施形態では、Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗体力価を測定することにより最も強力なＮＡＶワクチンを選択し、続いて選択したワクチンをデング熱疾患モデルで試験する。疾患モデルの救出時、全ての血清型に対する多価ワクチンの活性を確認するために、インビトロのウイルスアッセイで交差反応性分析を実施する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、各４つのデング熱株（ＤＥＮＶ１〜４）に対する交差中和のＡｂ力価を、その内容が参照により本明細書に組み込まれる（ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４；１４：  ４４及びＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２  Ｊｕｌ；１３６（３）：３３４−４３）と同様に、ウイルス中和分析にてインビトロまたはインビボで試験する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、中和と促進のＡｂ力価の対比を評価し、別の実施形態では、デング熱疾患のヒト化マウスモデルでＲＮＡＶを試験する（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１４  Ｆｅｂ；８８（４）：２２０５−１８）。
【０２１９】
このデング熱を標的とするＮＡＶを多遺伝子型抗原ＮＡＶと呼ぶ。
【０２２０】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）
ＥＴＥＣは、年間３０万〜５０万人が死亡する、発展途上国で最も一般的な下痢症の原因である。伝播は糞便から口への伝播を介してである（水、食品）。症状としては、分泌性下痢（熱安定性及び熱不安点性２つの毒素により媒介される）、腹痛及び痙攣、悪心及び嘔吐を含む。通常、症状の持続は１週間未満であり、まれに２週間を超える。結果として生じる脱水症は、より重篤な後遺症の主因である。現在の補助的治療及び輸液による蘇生は、一般に単純性感染を自然と消散させる治療である。
【０２２１】
以前のＥＴＥＣワクチンは、単一の抗原に基づくか、または毒素中和のみを目的としており、長期持続性の免疫を付与するには有効ではなかった。
【０２２２】
本発明によれば、多価性の手法を用いて、選択された抗原ごとに次の３つの経路に対処する：（１）毒素：Ｓｔａ３及びｅｌｔＡ／ｅｌｔＢ、（２）内皮への毒素送達にとって重要な付着タンパク質：ＥａｔＡ、ｅｔｐＡ及びｅｔｐＢ、ならびに（３）コロニー化を可能にするタンパク質：ｃｓｓＡ。
【０２２３】
本発明によるＥＴＥＣのＮＡＶは、ＥＴＥＣに対して長期防御を可能にするように設計されている。更に旅行者などの予防的治療も提供する。
【０２２４】
クロストリジウム・ディフィシル
Ｃ．ディフィシルは、医療環境（例えば、入院、療養所滞在）及び抗生物質（特にアモキシシリン、クリンダマイシン）への曝露を含む主要な危険因子と関連して、次第に一般化しつつある下痢性疾患を引き起こす。
【０２２５】
症状としては、再発性下痢及び偽膜性大腸炎を含む。現在の治療には、毒素及び抗原反応による診断及び／またはメトロニダゾール及びバンコマイシンによる治療を含む。
【０２２６】
本発明は、Ｃ．ディフィシル感染症の治療に対する三価抗原手法を提供する。コードされた抗原は、毒素Ａ（腸管毒；ＣＤ毒素Ａ  １３６７５４）、毒素Ｂ（細胞毒；ＣＤ毒素Ｂ  １３６７５５）及び二成分毒素（ｃｄｔＢ；ＣＤ  ｃｄｔＢ  １３６７５７）を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、多価ＮＡＶは、生物毒の影響及び主要な毒力因子をブロックする方法で、（１）特定薬物（抗生物質、ＰＰＩ）の摂取、または（２）医療曝露（入院、療養所など）による患者間でのＣ・ディフィシル感染を予防する。
【０２２８】
結核
結核は、各種マイコバクテリア株、通常はヒト型結核菌を原因とする感染疾患である。症状には、血痰を伴う慢性咳、発熱、寝汗及び体重減少を含む。
【０２２９】
抗結核ワクチン開発にとっての現状課題は、（ｉ）感染前（予防ワクチン）、潜伏感染（治療ワクチン）及び活動性感染（治療ワクチン）という３種類の疾患状態で必要とする抗原が異なること、ならびに（ｉｉ）防御性がありながら過剰ではない免疫応答を誘発するために種々のアジュバントが不可欠であること、ならびに（ｉｉｉ）感染除去に必要な免疫応答に対する理解が不明確であることである。
【０２３０】
したがって、疾患状態に応じて、アジュバントとしての種々のサイトカインと、種々の抗原とを組み合わせることが必要となる。以下のサイトカインは、ワクチンとの潜在的なアームをアジュバントに提供する：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、ＩＦＮｇ、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、Ａｎｔｉ−ＰＤ１／２、ラクトフェリン。以下の抗原は、非網羅的リストを表す：Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４ｃ）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６ｃ）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、ＥＳＡＴ６（Ｒｖ３７８５）、Ｒｖ２６６０Ｌ、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ１８１３ｃ、Ｒｖ３６２０ｃ、Ｒｖ２６０８、Ｒｖ１１９６、Ｒｖ０１２５及びＭＴ４０１。
【０２３１】
中東呼吸症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）
新型コロナウイルスまたはＳＡＲＳ様ウイルスとして既知のＭＥＲＳ−ＣｏＶは、コロナウイルスファミリのメンバーである。症状はＳＡＲＳ感染症と類似しており、咳、粘液産生、息切れ、倦怠感（一般的な体調不良感）、胸痛、発熱、下痢（場合による）及び腎（ｒｅｎａｌ）（腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））障害を含む。
【０２３２】
ヒトエンテロウイルス７１型及びヒトエンテロウイルス６８型
エンテロウイルス７１型（ＥＶ−７１）は、手足口病（ＨＦＭＤ）の主要原因因子の１つであり、時に重度の中枢神経系疾患を伴う。エンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）感染は無症候性の場合がある。
【０２３３】
エンテロウイルス６８（ＥＶ６８、ＥＶ−Ｄ６８）は、ピコルナウイルス科ファミリーのメンバーであるエンテロウイルス（ポリオウイルス、コクスサッキーウイルス及びエコーウイルスを含むｓｓＲＮＡウイルス群）である。１９６２年に最初に単離されて以降、数年内に全世界で増加した。近年のカリフォルニアでのポリオ様疾患のアウトブレイク事例にも関与している可能性がある。
【０２３４】
抗原
本発明の抗原は、目的とするポリペプチド、ペプチド及び／またはポリペプチドを含み、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる。本発明のこのような抗原をコードするポリヌクレオチドについて、以下の「ＮＡＶポリヌクレオチドの設計、合成及び定量」で更に詳細に説明する。
【０２３５】
ＩＩＩ．ＮＡＶポリヌクレオチドの設計、合成及び定量
本発明によれば、ポリヌクレオチドは目的とする少なくとも１つのポリペプチド、例えば抗原をコードする。本発明の抗原は、野生型（すなわち、感染因子に由来する）であっても、修飾されていても良い（例えば、操作された、設計されたまたは人工的）。本発明の抗原は、本明細書に記載する特長の任意の組み合わせを有することができる。
【０２３６】
本発明は、いくつかの実施形態では、目的とする１つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードする、核酸分子、特にポリヌクレオチドを提供する。本発明によるこのようなペプチドまたはポリペプチドは、抗原または抗原分子としての役割を果たすことができる。「核酸」とう用語は、最も広義には、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと称される。
【０２３７】
本発明の例示的核酸またはポリヌクレオチドとして、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、例えばβ−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）またはそれらのハイブリッド若しくは組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
一実施形態では、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成方法のみを使用して作製された、本発明のＮＡＶの１つ以上の抗原をコードする直鎖状ポリヌクレオチドは、「ＩＶＴポリヌクレオチド」と呼ばれる。
【０２３９】
別の実施形態では、サイズ及び／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾の比率若しくは化学修飾の集合ならびに前述の組み合わせが異なる部分または領域を有する本発明のポリヌクレオチドは、「キメラポリヌクレオチド」として知られる。本発明による「キメラ」は、２つ以上の不一致なまたは異質の部分または領域を有する実体である。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長より短いポリヌクレオチドの任意の一部分として定義される。
【０２４０】
更に別の実施形態では、環状である本発明のポリヌクレオチドは、「環状ポリヌクレオチド」または「ｃｉｒｃＰ」として知られる。本明細書で使用される場合、「環状ポリヌクレオチド」または「ｃｉｒｃＰ」は、実質的にＲＮＡのように作用し、かつＲＮＡの特性を有する一本鎖環状ポリヌクレオチドを意味する。「環状」という用語はまた、ｃｉｒｃＰの二次または三次構造を包含することも意図される。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。
【０２４２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは非コードであって良い。
【０２４３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードする領域の長さは約３０ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、または最大１００，０００ヌクレオチド）。本明細書で使用される場合、このような領域は「コード領域」または「コードする領域」と称される場合がある。
【０２４４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドであって、これは翻訳されることによりインビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボで目的とするコードされたペプチドまたはポリペプチドを産生できるポリヌクレオチドを指す。
【０２４５】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、構造的に修飾されても、化学修飾されても良い。本明細書で使用される場合、「構造的」修飾は、ヌクレオチドそれ自体に対する顕著な化学修飾なしにポリヌクレオチドにおいて２つ以上の連結ヌクレオシドが挿入、欠失、重複、逆転またはランダム化しているものである。構造的修飾が生じるには、必然的に化学結合が切断され、再編成されることになるため、構造的修飾は化学的性質のものであり、ひいては化学修飾である。しかしながら、構造的修飾は異なるヌクレオチド配列をもたらすことになる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は化学的に修飾されて「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」になり得る。同じポリヌクレオチドが、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」へと構造的に修飾され得る。ここではジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドに構造的修飾がもたらされている。
【０２４６】
一実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドなどの本発明のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシドタイプの全てまたは一部の均一な化学修飾、または同じヌクレオシドタイプの全てまたは一部において、若しくは同じヌクレオシドタイプの全てまたは一部の一定比率において、ただしランダムな組み込みで、同じ出発修飾の単なる下方タイトレーションによって生じる修飾の集団、例えばシュードウリジンのような全てのウリジンがウリジンアナログで置換されたものなどを有し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたり同じヌクレオシドタイプの２つ、３つまたは４つの均一な化学修飾を有し得る（全てのウリジン及び全てのシトシンなどが同様に修飾されているなど）。
【０２４７】
本発明のポリヌクレオチドが化学的に及び／または構造的に修飾されるときに、ポリヌクレオチドを「修飾ポリヌクレオチド」と称する場合がある。
【０２４８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードする配列を含み得る。自己切断ペプチドは２Ａペプチドを含み得るが、これには限定されない。非限定的な例として、２Ａペプチドはタンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号９６３）、その断片または変異体を有し得る。一実施形態では、２Ａペプチドは最後のグリシンと最後のプロリンとの間で切断される。別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質配列ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号９６３）、その断片または変異体を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
【０２４９】
２Ａペプチドをコードする、そのようなポリヌクレオチド配列の一つは、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号９６４）である。２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される及び／または当該技術分野において既知の方法によって修飾、またはコドン最適化されても良い。
【０２５０】
一実施形態では、この配列を使用して、目的とする２つ以上のポリペプチドのコード領域を分離することができる。非限定的な例として、２Ａペプチドをコードする配列は第１のコード領域Ａと第２のコード領域Ｂとの間にあっても良い（Ａ−２Ａｐｅｐ−Ｂ）。２Ａペプチドが存在することで、１つの長いタンパク質がタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及び２Ａペプチドに切断される。タンパク質Ａとタンパク質Ｂとは、同じまたは異なる目的ペプチドまたはポリペプチドであって良い。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに２Ａペプチドを使用して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のタンパク質を産生することができる。
【０２５１】
ポリヌクレオチドの構成
従来から、ｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、少なくともコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ及びポリＡテールを含む。本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、野生型ｍＲＮＡとは機能的及び／または構造的な設計上の特徴に差異があり、それによって核酸ベースの治療法を用いた有効なポリペプチド産生に関する既存の課題を解決する役割を果たすことができる。本発明のＮＡＶの抗原は、本明細書に記載するように、ＩＶＴポリヌクレオチドによってコードされ得ると理解すべきである。
【０２５２】
図１は、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物１００を示す。そのようなポリヌクレオチドは、ＮＡＶ組成物、ＲＮＡＶ組成物またはｍＲＮＡワクチンに有用である。本明細書で使用される場合、「一次構築物」とは、目的とする１つ以上のポリペプチドをコードし、更にそのコードされた目的とするポリペプチドを十分な構造的及び／または化学的特徴を保持して翻訳可能である、本発明のポリヌクレオチドを指す。
【０２５３】
図１Ａ及び１Ｂによれば、ここでポリヌクレオチド１００は、第１のフランキング領域１０４及び第２のフランキング領域１０６と隣接する第１の連結ヌクレオチド領域１０２を含む。目的とするポリペプチドは、その５’末端に、シグナル配列領域１０３によってコードされる１つ以上のシグナル配列を含み得る。フランキング領域１０４は、完全にコドン最適化されていても、または部分的にコドン最適化されていても良い１つ以上の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオチド領域を含み得る。フランキング領域１０４は、限定されないが、ｍｉＲ配列、ＴＥＲＺＡＫ（商標）配列及び翻訳制御配列を含めた、少なくとも１つの核酸配列を含み得る。フランキング領域１０４はまた、５’末端キャップ１０８も含み得る。５’末端キャッピング領域１０８は、天然に存在するキャップ、合成キャップまたは最適化されたキャップなどのキャップを含み得る。最適化されたキャップの非限定的な例としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ７０７４５９６号及び国際特許公開第ＷＯ２００８１５７６６８号、同第ＷＯ２００９１４９２５３号及び同第ＷＯ２０１３１０３６５９号に、Ｒｈｏａｄｓによって教示されたキャップが挙げられる。第２のフランキング領域１０６は、１つ以上の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む連結ヌクレオチド領域を含み得る。第２のフランキング領域１０６は完全にコドン最適化されていても、または部分的にコドン最適化されていても良い。フランキング領域１０６は、限定されないが、ｍｉＲ配列及び翻訳制御配列を含めた少なくとも１つの核酸配列を含み得る。フランキング領域１０６はまた、３’テール配列１１０も含み得る。３’テール配列１１０は、合成テール領域１１２及び／または連鎖停止ヌクレオシド１１４を含み得る。合成テール領域の非限定的な例としては、ポリＡ配列、ポリＣ配列、及び／またはポリＡ−グアニン四重鎖が挙げられる。連鎖停止ヌクレオシドの非限定的な例としては、２’−Ｏメチル、Ｆ及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。
【０２５４】
第１の領域１０２の５’末端と第１のフランキング領域１０４とを架橋するのが、第１の操作領域１０５である。従来から、この操作領域は開始コドンを含む。あるいは操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。
【０２５５】
第１の領域１０２の３’末端と第２のフランキング領域１０６とを架橋するのが、第２の操作領域１０７である。従来から、この操作領域は停止コドンを含む。あるいは操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。ＩＶＴポリヌクレオチドには、複数の連続する終止コドンも使用することができる。一実施形態では、本発明の操作領域は２つの終止コドンを含むことができる。第１の終止コドンは「ＴＧＡ」または「ＵＧＡ」であって良く、第２の終止コドンは「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」または「ＵＡＧ」からなる群から選択されて良い。
【０２５６】
本発明のＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物の第１の領域のうち最短の長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態では、この長さは、２〜３０アミノ酸、例えば５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５または１０〜２０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分であっても良い。この長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５または３０アミノ酸のペプチド、あるいは４０アミノ酸を超えない長さ、例えば３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸を超えないペプチドをコードするのに十分であっても良い。ポリヌクレオチド配列がコードできるジペプチドの例としては、カルノシン及びアンセリンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＮＡＶ、ＲＮＡＶ、ｍＲＮＡワクチンは翻訳可能であり得、このような一次構築物の第１の領域を含み得ると理解される。
【０２５７】
本発明の目的とするポリペプチドをコードするＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物の第１の領域の長さは、約３０ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、または最大１００，０００ヌクレオチド）。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。
【０２５９】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドの第１及び第２のフランキング領域は、独立して１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、及び９００ヌクレオチド超、または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、及び１，０００ヌクレオチド）であり得る。
【０２６０】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドのテール配列は非存在から５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド）であり得る。テール領域がポリＡテールである場合、長さはポリＡ結合タンパク質の結合単位で、またはそれと相関して決まり得る。この実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個のモノマーと結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質モノマーは約３８ヌクレオチドの伸長に結合する。したがって、約８０ヌクレオチド及び１６０ヌクレオチドのポリＡテールが機能性であることが観察されている。
【０２６１】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドのキャッピング領域は、単一のキャップか、またはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態では、キャッピング領域は、１〜１０、例えば２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０または少なくとも２、または１０以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、キャップは存在しない。
【０２６２】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドの第１及び第２の操作領域は、３〜４０、例えば５〜３０、１０〜２０、１５または少なくとも４若しくは３０以下のヌクレオチド長の範囲であって良く、開始及び／または終止コドンに加えて、１つ以上のシグナル及び／または制限配列を含んでも良い。
【０２６３】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは構造的に修飾されていても、または化学的に修飾されていても良い。本発明のＩＶＴポリヌクレオチドが化学的に及び／または構造的に修飾されている場合、そのポリヌクレオチドを「修飾されたＩＶＴポリヌクレオチド」と称する場合がある。
【０２６４】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドが化学的に修飾されている場合、同じヌクレオシドタイプの全てまたは一部の均一な化学修飾、または同じヌクレオシドタイプの全てまたは一部における、同じ出発修飾の単なる下方タイトレーションによって生じる修飾の集団、または同じヌクレオシドタイプの全てまたは一部であるがランダムな組み込みを有する一定比率の化学修飾、例えばシュードウリジンのような全てのウリジンがウリジンアナログで置換されたものなどを有し得る。別の実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたり同じヌクレオシドタイプの２つ、３つまたは４つの均一な化学修飾を有し得る（全てのウリジン及び全てのシトシンなどが同様に修飾されているなど）。
【０２６５】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは、本明細書に記載する自己切断ペプチド、例えば限定されないが２Ａペプチドをコードする配列を含み得る。ＩＶＴポリヌクレオチドでの２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される及び／または当該技術分野において既知の方法によって修飾またはコドン最適化されても良い。
【０２６６】
一実施形態では、この配列を使用して、ＩＶＴポリヌクレオチドの目的とする２つ以上のポリペプチドのコード領域を分離することができる。
【０２６７】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは構造的に及び／または化学的に修飾されていても良い。化学的に及び／または構造的に修飾されている場合、ＩＶＴポリヌクレオチドを「修飾されたＩＶＴポリヌクレオチド」と称する場合がある。
【０２６８】
一実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。別の実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、目的とする２つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。目的とするペプチドまたはポリヌクレオチドの非限定的な例として、抗体の重鎖及び軽鎖、酵素及びその基質、標識及びその結合分子、二次メッセンジャー及びその酵素または多量体タンパク質若しくは複合体の成分が挙げられる。
【０２６９】
キメラポリヌクレオチドの構成
本発明のキメラポリヌクレオチドまたはＲＮＡ構築物は、ＩＶＴポリヌクレオチドと類似したモジュール構成を維持しながらも、キメラポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに有用な特性を付与する１つ以上の構造的及び／若しくは化学的修飾または改変を含む。したがって、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子であるキメラポリヌクレオチドは、「キメラ修飾ｍＲＮＡ」または「キメラｍＲＮＡ」と呼ばれる。
【０２７０】
本発明のＮＡＶの抗原は、本明細書に記載するように、キメラポリヌクレオチド、ＲＮＡ構築物、キメラ修飾ｍＲＮＡまたはキメラｍＲＮＡによってコードされ得ると理解すべきである。
【０２７１】
キメラポリヌクレオチドは、サイズ及び／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾の比率若しくは化学修飾の集合ならびに前述の組み合わせが異なる部分または領域を有する。
【０２７２】
キメラポリヌクレオチドがｍＲＮＡとして機能し、目的とするポリペプチドをコードしている部分または領域の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ、例えば５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）、コード領域、キャップ領域、ポリＡテール領域、開始領域、終結領域、シグナル配列領域、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。図２は、ｍＲＮＡとして使用できる本発明のキメラポリヌクレオチドの特定の実施形態を示す。図３は、一連のキメラポリヌクレオチドの概略図を示し、位置修飾の種々のパターンを特定し、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各領域と類似する領域を示す。他の領域間を連結するまたはその間に置かれる領域または部分は、サブ領域も有するように設計され得る。この領域を図に示す。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、式Ｉを含む構造を有する。
【化１】
0006881813.tif 000832
式中、
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、連結ヌクレオシド領域を含み；
Ｃは、任意で連結ヌクレオシド領域であり；
領域Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つは位置的に修飾されており、前記位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、またはウリジンのうち１つ以上の同じヌクレオシドタイプの少なくとも２つの化学修飾ヌクレオシドを含み、かつ同じタイプのヌクレオシドの化学修飾の少なくとも２つは異なる化学修飾であり；
ｎ、ｏ及びｐは、独立して１５〜１０００の整数であり；
ｘ及びｙは、独立して１〜２０であり；
ｚは、０〜５であり；
Ｌ１及びＬ２は独立して、任意でリンカー部分であって、前記リンカー部分は核酸ベースかまたは非核酸ベースかのいずれかであり；及び
Ｌ３は、任意でコンジュゲートまたは任意でリンカー部分であって、前記リンカー部分は核酸ベースかまたは非核酸ベースかのいずれかである。
【０２７４】
一部の実施形態では、式Ｉのキメラポリヌクレオチドは目的とする１つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードする。このようなコードされる分子は２つ以上の領域にわたってコードされ得る。
【０２７５】
別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを特徴とし、このポリヌクレオチドは式ＩＩを含む配列を有する。
【化２】
0006881813.tif 000833
式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立して任意のヌクレオシドであり；
ｎ及びｏは、独立して１５〜１０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩの構造を有し、
【化３】
0006881813.tif 000834
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、それぞれ独立して、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は、それぞれ独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニルまたはホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン（polyethylene  glycolene）若しくは任意で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、または（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃと（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆとを結びつける結合であり、ただし、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈが０である場合、Ｒ４は結合ではないく；
Ｒ８は、水素、任意で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
ここでＬ１は、ヌクレオシドのいずれかの糖で［Ａｎ］及び［Ｂｏ］と結合される（例えば［Ａｎ］のヌクレオシドの３’位の５員環糖若しくは４’位の６員環糖及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５’位の５員環糖若しくは６’位の６員環糖、または［Ａｎ］のヌクレオシドの５’位の５員環糖若しくは６’位の６員環糖及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの３’位の５員環糖若しくは４’位の６員環糖の位置）。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの［Ａｎ］及び［Ｂｏ］は式ＩＶの構造を含む。
【化４】
0006881813.tif 000835
式中、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意で置換されたアミノ、アジド、または任意で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｘ１及びＸ４は、それぞれ独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｘ２は、それぞれ独立して、ＯまたはＳであり；及び
Ｘ３は、それぞれＯＨ若しくはＳＨ、またはそれらの塩である。
【０２７７】
別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを特徴とし、このポリヌクレオチドは式ＩＩを含む配列を有する。
【化５】
0006881813.tif 000836
式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立して任意のヌクレオシドであり；
ｎ及びｏは、独立して１５〜１０００であり；ならびに
Ｌ１は結合であるか、または式ＩＩＩの構造を有する。
【化６】
0006881813.tif 000837
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、それぞれ独立して、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は、それぞれ独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニルまたはホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン若しくは任意で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、または（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃと（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆとを結びつける結合であり；
Ｒ８は、水素、任意で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
ここでＬ１は、ヌクレオシドのいずれかの糖で［Ａｎ］及び［Ｂｏ］と結合される（例えば［Ａｎ］のヌクレオシドの３’位の５員環糖若しくは４’位の６員環糖及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５’位の５員環糖若しくは６’位の６員環糖、または［Ａｎ］のヌクレオシドの５’位の５員環糖若しくは６’位の６員環糖及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの３’位の５員環糖若しくは４’位の６員環糖の位置）。
ここで、［Ａｎ］及び［Ｂｏ］のうち少なくとも１つは式ＩＶの構造を含む。
【化７】
0006881813.tif 000838
式中、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意で置換されたアミノ、アジド、または任意で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｘ１及びＸ４は、それぞれ独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｘ２は、それぞれ独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ３は、それぞれＯＨ若しくはＳＨ、またはそれらの塩であり；
ここで、少なくとも１つのＸ１、Ｘ２またはＸ４は、ＮＨまたはＳである。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＮＨである。他の実施形態では、Ｘ４はＮＨである。ある特定の実施形態では、Ｘ２はＳである。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ａ）コード領域、（ｂ）少なくとも１つのコザック配列を含む５’ＵＴＲ、（ｃ）３’ＵＴＲ、及び（ｄ）少なくとも１つの５’キャップ構造を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは（ｅ）ポリＡテールを更に含む。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、コード領域、少なくとも１つのコザック配列を含む５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、またはポリＡテールのいずれかが、［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む。
【０２８１】
他の実施形態では、コード領域、少なくとも１つのコザック配列を含む５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、またはポリＡテールのいずれかが［Ａｎ］を含み、別のコード領域、少なくとも１つのコザック配列を含む５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、またはポリＡテールが［Ｂｏ］を含む。
【０２８２】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド（例えば、表２のヌクレオシド）を含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は任意で置換されたＣ２−９ヘテロシクリレンであり、例えば、ヘテロ環は構造：
【化８】
0006881813.tif 000839
を有し得る。
【０２８４】
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ヌクレオシドのいずれかの３’位の５員環糖または４’位の６員環糖の位置で［Ａｎ］と結合し、及びヌクレオシドのいずれかの５’位の５員環糖若しくは６’位の６員環糖の位置で［Ｂｏ］と結合する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは環状である。
【０２８６】
別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物の生成方法を特長とし、このポリヌクレオチドは式Ｖ：
【化９】
0006881813.tif 000840
を含む配列を有する。
【０２８７】
この方法は、式ＶＩ：
【化１０】
0006881813.tif 000841
の構造を有する化合物を、式ＶＩＩ：
【化１１】
0006881813.tif 000842
の構造を有する化合物と反応させることを含み、
式中、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意で置換されたアミノ、アジド、または任意で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｘ１及びＸ４は、それぞれ独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｘ３は、それぞれ独立してＯＨ若しくはＳＨ、またはそれらの塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９は、それぞれ独立して、連結されたヌクレオシドの領域であり；
Ｒ１８は、ハロゲンである。
【０２８８】
別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物の生成方法を特長とし、このポリヌクレオチドは式ＶＩＩＩ：
【化１２】
0006881813.tif 000843
の構造を含む。
【０２８９】
この方法は、式ＩＸ：
【化１３】
0006881813.tif 000844
の構造を有する化合物を、式Ｘ：
【化１４】
0006881813.tif 000845
の構造を有する化合物と反応させることを含み、
式中、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意で置換されたアミノ、アジド、または任意で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｘ４は、それぞれ独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ２は、それぞれ独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ３は、それぞれ独立してＯＨ若しくはＳＨ、またはそれらの塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３は、それぞれ独立して、連結されたヌクレオシドの領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである。
【０２９０】
別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物の生成方法を特長とし、このポリヌクレオチドは式ＸＩ：
【化１５】
0006881813.tif 000846
の構造を含む。
【０２９１】
この方法は、式ＸＩＩ：
【化１６】
0006881813.tif 000847
の構造を有する化合物を、式ＸＩＩＩ：
【化１７】
0006881813.tif 000848
の構造を有する化合物と反応させることを含み、
式中、Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立して核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意で置換されたアミノ、アジド、または任意で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｘ４は、それぞれ独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｘ２は、それぞれ独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ３は、それぞれ独立してＯＨ、ＳＨまたはそれらの塩であり；
Ｒ２４及びＲ２６は、それぞれ独立して、連結されたヌクレオシドの領域であり；
Ｒ２５は、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレンまたは任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、あるいはＲ２５及びアルキニル基は共に任意で置換されたシクロアルキニルを形成する。
【０２９２】
別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物の生成方法を特長とし、このポリヌクレオチドは式ＩＩ：
【化１８】
0006881813.tif 000849
を含む配列を有する。
【０２９３】
この方法は、式ＸＩＶ：
【化１９】
0006881813.tif 000850
の構造を有する化合物を、式ＸＶ：
【化２０】
0006881813.tif 000851
の構造を有する化合物と反応させることを含み、
式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立して任意のヌクレオシドであり；
ｎ及びｏは、独立して１５〜１０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【化２１】
0006881813.tif 000852
の構造を有し、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して、０または１であり；
式中、Ａ及びＢは、それぞれ独立して任意のヌクレオシドであり；
ｎ及びｏは、独立して１５〜１０００であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、それぞれ独立して、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は、それぞれ独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニルまたはホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｒ２７は、任意で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニルまたは任意で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
ここでＬ１は、ヌクレオシドのいずれかの糖で［Ａｎ］及び［Ｂｏ］と結合される。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、任意で置換されたトリアゾレンは、構造：
【化２２】
0006881813.tif 000853
を有する。
【０２９５】
一実施形態では、Ａの連結ヌクレオシドの少なくとも１つの領域は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）として機能し得る連結ヌクレオシドの配列を含み得る。連結ヌクレオシドの配列は、天然または合成の５’ＵＴＲであり得る。非限定的な例として、キメラポリヌクレオチドは目的とするポリペプチドをコードすることができ、かつＡの連結ヌクレオシドの配列は、キメラポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの天然５’ＵＴＲをコードしても良く、連結ヌクレオシドの配列が、例えば限定されないが合成ＵＴＲなどの非相同性の５’ＵＴＲであっても良い。
【０２９６】
別の実施形態では、Ａの連結ヌクレオシドの少なくとも１つの領域は、キャップ領域であり得る。キャップ領域は、５’ＵＴＲとして機能するＡの連結ヌクレオシドの領域の５’に位置し得る。キャップ領域は、例えば限定されないが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、キャップ２及びキャップ４などのうち少なくとも１つのキャップを含み得る。
【０２９７】
一実施形態では、Ｂの連結ヌクレオシドの少なくとも１つの領域は、核酸配列の少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含み得る。核酸配列は、コドン最適化されても良く、及び／または少なくとも１つの修飾を含んでも良い。
【０２９８】
一実施形態では、Ｃの連結ヌクレオシドの少なくとも１つの領域は、３’ＵＴＲとして機能し得る連結ヌクレオシドの配列を含み得る。連結ヌクレオシドの配列は、天然または合成の３’ＵＴＲであり得る。非限定的な例として、キメラポリヌクレオチドは目的とするポリペプチドをコードすることができ、かつＣの連結ヌクレオシドの配列は、キメラポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの天然３’ＵＴＲをコードしても良く、連結ヌクレオシドの配列が、例えば限定されないが合成ＵＴＲなどの非相同性の３’ＵＴＲであっても良い。
【０２９９】
一実施形態では、Ａの連結ヌクレオシドの少なくとも１つの領域は、５’ＵＴＲとして機能し得る連結ヌクレオシドの配列を含み、Ｃの連結ヌクレオシドの少なくとも１つの領域は、３’ＵＴＲとして機能し得る連結ヌクレオシドの配列を含む。一実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは同じ種または異なる種に由来するものであって良い。別の実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、同一のまたは異なる種から得た異なるタンパク質からの天然の非翻訳領域をコードし得る。
【０３００】
図４及び図５は、式Ｉに基づく位置修飾の様々なパターンならびにブロック化または構造化された３’末端を有するものを示す一連のキメラポリヌクレオチドの概略図を示している。
【０３０１】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分または領域を含め、ヘミマー、ギャップマー、ウィングマー、またはブロックマーに分類することができる。
【０３０２】
本発明で使用される場合、「ヘミマー」は、あるパターン、パーセント、位置または集合の化学修飾の半分と、第２のパターン、パーセント、位置または集合の化学修飾の半分とを含む領域または部分を含むキメラポリヌクレオチドである。本発明のキメラポリヌクレオチドはまた、ヘミマーサブ領域も含み得る。一実施形態では、部分または領域は５０％の一方と、５０％のもう一方である。
【０３０３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチド全体が、５０％の一方と、５０％のもう一方とであり得る。本発明の任意のキメラポリヌクレオチドの任意の領域または部分がヘミマーであり得る。ヘミマーのタイプには、パターンヘミマー、集合ヘミマーまたは位置ヘミマーが含まれる。定義上、ヘミマーは５０：５０パーセントヘミマーである。
【０３０４】
本明細書で使用される場合、「ギャップマー」は、少なくとも３つの部分または領域を有し、それらの部分または領域間にギャップを持つキメラポリヌクレオチドである。「ギャップ」には、それに隣接する２つの部分または領域とキメラの性質が異なる連結ヌクレオシド領域または単一のヌクレオシドを含み得る。ギャップマーの２つの部分または領域は互いに同じであっても異なっても良い。
【０３０５】
本明細書で使用される場合、「ウィングマー」は、少なくとも３つの部分または領域を有し、それらの部分または領域間にギャップを持つキメラポリヌクレオチドである。ギャップマーと異なり、ウィングマーではギャップを取り囲む２つの隣接する部分または領域は程度または種類が同じである。このような類似性は、種々の修飾の単位数長さまたは修飾数に関してであり得る。ウィングマーのウィングはギャップより長い場合もあれば短い場合もある。ウィング部分または領域は、ギャップを含む領域と比べて長さが２０、３０、４０、５０、６０  ７０、８０、９０または９５％長い場合もあれば、短い場合もある。
【０３０６】
本明細書で使用される場合、「ブロックマー」は、部分または領域の修飾が等価のサイズまたは数及びタイプであるパターン化したポリヌクレオチドである。ブロックマーの領域またはサブ領域は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１  ６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ヌクレオシド長であり得る。
【０３０７】
化学修飾パターンを有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分または領域を含めて、「パターンキメラ」と称される。パターンキメラはまた、ブロックマーと称される場合もある。パターンキメラは、領域または部分の範囲内に、それらにわたってまたはそれらの間に修飾パターンを有するポリヌクレオチドである。
【０３０８】
部分または領域内の修飾パターンは、定義された領域内で始まり、終わるものである。部分または領域にわたる修飾パターンは、ある部分または領域で始まり、別の隣接する部分または領域で終わるパターンである。部分または領域間での修飾パターンは、ある部分または領域で始まって終わり、その第１の領域または部分に必ずしも隣接していない異なる部分または領域で繰り返されるものである。
【０３０９】
パターンキメラまたはブロックマーの領域またはサブ領域は、ＡＢＡＢ［ＡＢ］ｎなどの単純な交互のパターンを有し得る。ここでの各「Ａ」及び各「Ｂ」は、異なる化学修飾（塩基、糖または主鎖リンカーの少なくとも１つにおける）、異なるタイプの化学修飾（例えば、天然に存在する、及び天然に存在しない）、異なる比率の修飾または異なる集合の修飾を表す。パターンはｎ回（ｎ＝３〜３００）繰り返され得る。更に、ＡまたはＢは、ぞれぞれパターン中の１〜２５００単位（例えば、ヌクレオシド）を表し得る。パターンはまた、ＡＡＢＢＡＡＢＢ［ＡＡＢＢ］ｎ（２個ずつ交互の繰り返し）またはＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ［ＡＡＡＢＢＢ］ｎ（３個ずつ交互の繰り返し）パターンなどの複数個ずつの交互の繰り返しであっても良い。パターンはｎ回（ｎ＝３〜３００）繰り返され得る。
【０３１０】
また、異なるパターンが共に混合され、二次パターンを形成しても良い。例えば、単一の交互パターンが３個組の交互パターンと組み合わされ、二次交互パターンＡ’Ｂ’を形成し得る。一例として、［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］が挙げられ、このとき［ＡＢＡＢＡＢ］がＡ’であり、［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］がＢ’である。同様に、これらのパターンをｎ回（ｎ＝３〜３００）繰り返すことができる。
【０３１１】
パターンは３個またはそれ以上の異なる修飾を含み、ＡＢＣＡＢＣ［ＡＢＣ］ｎパターンを形成し得る。これらの３成分パターンも、ＡＡＢＢＣＣＡＡＢＢＣＣ［ＡＡＢＢＣＣ］ｎなどの複数個組であっても良く、ＡＢＣＡＢＣＡＡＢＢＣＣＡＢＣＡＢＣＡＡＢＢＣＣなどの他のパターンとの組み合わせとして設計されても良く、更により高次のパターンであっても良い。
【０３１２】
領域またはサブ領域の修飾される位置、パーセント及び集合は、各修飾タイプからの寄与を均等に反映する必要はない。、領域またはサブ領域は「１−２−３−４」、「１−２−４−８」などの連続を形成し得、各整数は特定の修飾タイプの単位数を表す。あるいは、領域またはサブ領域は「１−３−３−１−３−１−５」など奇数個のみであっても、偶数個のみである「２−４−２−４−６−４−８」であっても、または「１−３−４−２−５−７−３−３−４」などの奇数個の単位数と偶数個の単位数との混合であっても良い。
【０３１３】
パターンキメラは、（前述したような）程度によって、または種類によって（例えば、異なる修飾）、その化学修飾が異なり得る。
【０３１４】
同じヌクレオシドタイプ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）の２つ以上のヌクレオシドメンバーの２つ以上の異なる化学修飾を含む少なくとも１つの領域を有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分または領域を含め、「位置的に修飾された」キメラと称される。位置的に修飾されたキメラは、本明細書で「選択的配置」キメラまたは「選択的配置ポリヌクレオチド」とも称される。その名前が示すとおり、選択的配置とは、任意のＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵに対する修飾が合成方法によって同じである当該技術分野のポリヌクレオチドとは異なり、ポリヌクレオチドまたはその領域中の個々のＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵに異なる修飾を有し得るポリヌクレオチドの設計を指す。例えば、位置的に修飾されたキメラポリヌクレオチドでは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵのヌクレオシドタイプのいずれかに対して２つ以上の異なる化学修飾が存在し得る。また、同じヌクレオシドタイプの任意の２つ以上に対する２つ以上の組み合わせも存在し得る。例えば、位置的に修飾された、または選択的配置のキメラポリヌクレオチドは、分子中のアデニンの集合に対して３種類の修飾を含むことができ、また構築物中のシトシンの集合に対しても３種類の修飾を有し得る。これらは全て、固有の非ランダムな配置であり得る。
【０３１５】
化学修飾パーセントを有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分または領域を含め、「パーセントキメラ」と称される。パーセントキメラは、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の位置、パターンまたは集合の修飾を含む領域または部分を有し得る。あるいは、パーセントキメラは、修飾の位置、パターンまたは集合に関して完全に修飾されていても良い。パーセントキメラの修飾パーセントは、天然に存在する修飾と天然に存在しない修飾とに分けることができる。
【０３１６】
化学修飾集合を有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分または領域を含め、「集合キメラ」と称される。集合キメラは、ヌクレオシド（その塩基、糖若しくは主鎖連結、またはそれらの組み合わせ）が選択された修飾集合を有する領域または部分を含み得る。このような修飾は、表現型の結果を誘導、改変または調節する修飾などの機能的集合から選択され得る。例えば、機能的集合は、サイトカイン値を増加させる化学修飾の集合または選択であり得る。他の機能的集合は、個々に、または集合的に、１つ以上のサイトカイン値を低下させるように機能し得る。したがって、これと同様の機能的修飾の選択をキメラポリヌクレオチドに用いれば、「機能的集合キメラ」を構成し得る。本明細書で使用される場合、「機能的集合キメラ」は、その固有の機能的特徴が上記のような修飾の集合で定義されるものであっても良く、またはこの用語はキメラポリヌクレオチドそれ自体の全体的な機能に適用されても良い。例えば、全体としてキメラポリヌクレオチドは、非修飾または非キメラポリヌクレオチドと比較して、異なった方法で、またはそれよりも優れた方法で機能し得る。
【０３１７】
同じヌクレオシドタイプのいずれかの全ての均一な化学修飾、または同じヌクレオシドタイプのいずれかの全てにおける、同じ出発修飾の単なる下方タイトレーションによって生じる修飾の集団、または同じヌクレオシドタイプのいずれかの全てであるがランダムな組み込みを有する一定比率の化学修飾、例えばシュードウリジンのような全てのウリジンがウリジンアナログで置換されたものなどを有するポリヌクレオチドは、キメラと見なされないことに留意しなければならない。同様に、ポリヌクレオチド全体にわたって同じヌクレオシドタイプの２つ、３つまたは４つの均一な化学修飾を有する（例えば、全てのウリジン及び全てのシトシンなどが同様に修飾されている）ポリヌクレオチドは、キメラポリヌクレオチドとは見なされない。キメラでないポリヌクレオチドの一例は、先行技術の古典的シュードウリジン／５−メチルシトシン修飾ポリヌクレオチドである。これらの均一なポリヌクレオチドはインビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成のみで完全に得られ、かつ合成酵素の制約に起因して、ポリヌクレオチドに見られる同じヌクレオシドタイプ、すなわち、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）またはウリジン（ｕｒａｄｉｎｅ）（Ｕ）の存在ごとに一種類の修飾しか含まない。このようなポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドとして特徴づけられ得る。
【０３１８】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、構造的に修飾されていても、化学的に修飾されていても良い。本発明のキメラポリヌクレオチドが化学的に及び／または構造的に修飾されている場合、そのポリヌクレオチドを「修飾されたキメラポリヌクレオチド」と称する場合がある。
【０３１９】
本発明のいくつかの実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、目的とする２つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。このような目的とするペプチドまたはポリヌクレオチドとして、抗体の重鎖及び軽鎖、酵素及びその基質、標識及びその結合分子、二次メッセンジャー及びその酵素または多量体タンパク質若しくは複合体の成分が挙げられる。
【０３２０】
本発明のキメラポリヌクレオチドの領域または部分は、リンカーまたはスペーサー部分によって切り離すことができる。このようなリンカーまたはスペースは、核酸ベースでも、または非ヌクレオシドでも良い。
【０３２１】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載する自己切断ペプチド、例えば限定されないが２Ａペプチドをコードする配列を含み得る。キメラポリヌクレオチドでの２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される及び／または当該技術分野において既知の方法によって修飾またはコドン最適化されても良い。
【０３２２】
上記にかかわらず、本発明のキメラポリヌクレオチドは、位置的に修飾されていない、または本明細書で定義されるキメラではない領域または部分を含み得る。
【０３２３】
例えば、キメラポリヌクレオチドの領域または部分は１つ以上のＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵで均一に修飾され得るが、本発明によれば、ポリヌクレオチドは領域または部分全体にわたって均一に修飾されることはない。
【０３２４】
キメラポリヌクレオチドの領域または部分は１５〜１０００ヌクレオシド長であり得、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する２〜１００個の異なる領域または領域のパターンを有し得る。
【０３２５】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは目的とする１つ以上のポリペプチドをコードする。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは実質的に非コードである。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドはコード及び非コード両方の領域及び部分を有する。
【０３２６】
図２は、図１のポリヌクレオチドの足場をベースにした場合の本発明の特定のキメラポリヌクレオチドの設計を示す。この図には、キメラポリヌクレオチドの領域または部分が示されており、ここで網掛けのある領域は位置的に修飾されている領域を表し、白抜きの領域は、修飾されていることもまたは修飾されていないこともあるが、修飾されている場合には均一に修飾される領域を示す。本発明のキメラポリヌクレオチドは完全に位置的に修飾されていても、または部分的に位置的に修飾されていても良い。キメラポリヌクレオチドはまた、任意のパターンまたは設計であり得るサブ領域を有しても良い。図２には、キメラサブ領域及びヘミマーサブ領域が示されている。
【０３２７】
一実施形態では、ペプチドをコードする本発明のキメラポリヌクレオチドの領域のうち最短の長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチドまたはデカペプチドをコードするのに十分な長さであり得る。別の実施形態では、この長さは、２〜３０アミノ酸、例えば５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５または１０〜２０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分であっても良い。この長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５または３０アミノ酸のペプチド、あるいは４０アミノ酸を超えない長さ、例えば３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１若しくは１０アミノ酸を超えないペプチドをコードするのに十分であっても良い。ポリヌクレオチド配列がコードできるジペプチドの例としては、カルノシン及びアンセリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２８】
一実施形態では、目的とするペプチドまたはポリペプチドをコードする本発明のキメラポリヌクレオチド領域の長さは約３０ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、または最大１００，０００ヌクレオチド）。本明細書で使用される場合、このような領域は「コード領域」または「コードする領域」と称される場合がある。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。
【０３３０】
本発明によれば、キメラポリヌクレオチドの領域またはサブ領域はまた、独立して１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０，１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００及び９５０ヌクレオチド超、または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０及び１，０００ヌクレオチド）であり得る。
【０３３１】
本発明によれば、キメラポリヌクレオチドの領域またはサブ領域は非存在から５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ヌクレオチド）であり得る。領域がポリＡテールである場合、長さはポリＡ結合タンパク質の結合単位で、またはその関数として決まり得る。この実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個のモノマーと結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質モノマーは約３８ヌクレオチドの伸長に結合する。したがって、約８０ヌクレオチドから約１６０ヌクレオチドのポリＡテールが機能的であることが観察されている。ｍＲＮＡとして機能する本発明のキメラポリヌクレオチドはポリＡテールを含む必要はない。
【０３３２】
本発明によれば、ｍＲＮＡとして機能するキメラポリヌクレオチドはキャッピング領域を有し得る。キャッピング領域は、単一のキャップか、またはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態では、キャッピング領域は、１〜１０、例えば２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０または少なくとも２、または１０以下のヌクレオチド長であり得る。いくつか実施形態では、キャップは存在しない。
【０３３３】
本発明は、環状または環式のキメラポリヌクレオチドを企図する。その名前が示すとおり、環状ポリヌクレオチドは本質的に環状であり、これは同じタンパク質または他の分子若しくは複合体とのライゲーション、共有結合、一般的な会合によるか、あるいはハイブリダイゼーションによるかに関わらず、末端が何らかの方法で接合されていることを意味する。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／８７３，０１０号（２０１３年９月３日出願）（代理人整理番号Ｍ５１）に教示されている、いずれの環状ポリヌクレオチドをも本発明によるキメラにすることができる。
【０３３４】
キメラポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドを含む製剤及び組成物、ならびにキメラポリヌクレオチドの作製、使用及び投与方法は、それぞれその全体が参照により組み込まれる、同時係属中の表題「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の米国仮出願第６１／８７３，０３４号（２０１３年９月３日出願）及び表題「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の同第６１／８７７，５８２号（２０１３年９月１３日出願）（代理人整理番号Ｍ５７）にも記載されている。
【０３３５】
環状ポリヌクレオチドの構成
本発明は、環状または環式のポリヌクレオチドを企図する。その名前が示すとおり、環状ポリヌクレオチドは本質的に環状であり、これは同じタンパク質または他の分子若しくは複合体とのライゲーション、共有結合、一般的な会合によるか、あるいはハイブリダイゼーションによるかに関わらず、末端が何らかの方法で接合されていることを意味する。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／８７３，０１０号（２０１３年９月３日出願）（代理人整理番号Ｍ５１．６０）に教示されている、任意の環状ポリヌクレオチドである。
【０３３６】
本発明の環状ポリヌクレオチドは、図６〜図１２に示す環状ＲＮＡ構築物の足場に従って設計することができる。このようなポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドまたは環状構築物である。
【０３３７】
目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードする本発明の環状ポリヌクレオチドまたはｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡとして知られている。本発明のＮＡＶ抗原は、１つ以上の環状ＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡによってコードすることができる。
【０３３８】
本明細書で使用される場合、「環状ＲＮＡ」または「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードできる環状ポリヌクレオチドを意味する。少なくとも１つのセンサー配列を含み、かつ目的とするペプチドまたはポリペプチドをコードしない本発明のｃｉｒｃＰは、環状スポンジまたはｃｉｒｃＳＰとして知られている。本明細書で使用される場合、「環状スポンジ」、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」または「ｃｉｒｃＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列を含み、かつ目的とするポリペプチドをコードしない環状ポリヌクレオチドを意味する。非コード核酸は抗原性組成物として機能できるため、そのような非コードのポリヌクレオチドは、本発明のＮＡＶに有用であり得る。
【０３３９】
本明細書で使用される場合、「センサー配列」は、内因性核酸結合分子の受容体または擬似受容体を意味する。センサー配列の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡシード配列、シード配列のないマイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位及び擬似受容体として作用するように操作された人工結合部位ならびにこれらの一部及び断片が挙げられる。
【０３４０】
少なくとも１つのセンサー配列を含み、かつ目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードする本発明のｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡスポンジまたはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとして知られている。本明細書で使用される場合、「環状ＲＮＡスポンジ」または「ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列と、目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つの領域とを含む環状ポリヌクレオチドを意味する。
【０３４１】
図６Ａは、本発明の環状ポリヌクレオチドの代表的な環状構築物２００を示す。本明細書で使用される場合、「環状構築物」という用語は、ＲＮＡ分子と実質的に同様に作用し、かつＲＮＡ分子の特性を有し得る環状ポリヌクレオチド転写物を指す。一実施形態では、環状構築物はｍＲＮＡとして作用する。環状構築物が、目的とする１つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードする場合（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）、ポリヌクレオチド転写物は、そこでコードされる目的ポリペプチドの翻訳を可能にするのに十分な構造的及び／または化学的特徴を保持している。環状構築物は本発明のポリヌクレオチドであっても良い。構造的または化学的に修飾されているとき、構築物は修飾ｃｉｒｃＰ、修飾ｃｉｒｃＳＰ、修飾ｃｉｒｃＲＮＡまたは修飾ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと称される場合がある。
【０３４２】
再び図６Ａを参照すると、ここでの環状構築物２００は、第１のフランキング領域２０４と第２のフランキング領域２０６とが隣接する第１の連結ヌクレオチド領域２０２を含む。本明細書で使用される場合、「第１の領域」は、「コード領域」、「非コード領域」または「コードする領域」、あるいは単に「第１の領域」と称される場合がある。一実施形態では、この第１の領域は、限定されないが目的とする少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド及び／またはセンサー領域をコードするヌクレオチドなどを含み得る。目的とするペプチドまたはポリペプチドは、その５’末端に、シグナルペプチド配列領域２０３によってコードされる１つ以上のシグナルペプチド配列を含み得る。第１のフランキング領域２０４は、ｍＲＮＡ及び／またはＤＮＡ配列の非翻訳領域（ＵＴＲ）と同様に作用できる連結ヌクレオシド領域またはその一部を含み得る。第１のフランキング領域はまた、極性領域２０８も含み得る。極性領域２０８はＩＲＥＳ配列またはその一部を含み得る。非限定的な例として、直鎖状にされるとき、この領域は分離され、第１の部分が第１の領域２０２の５’末端になり、第２の部分が第１の領域２０２の３’末端になり得る。第２のフランキング領域２０６はテール配列領域２１０を含むことができ、及びｍＲＮＡ及び／またはＤＮＡのＵＴＲと同様に作用できる連結ヌクレオチド領域２１２またはその一部を含み得る。
【０３４３】
第１の領域２０２の５’末端と第１のフランキング領域１０４とを架橋するのが、第１の操作領域２０５である。一実施形態では、この操作領域は開始コドンを含み得る。あるいはこの操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。
【０３４４】
第１の領域２０２の３’末端と第２のフランキング領域１０６とを架橋するのが、第２の操作領域２０７である。従来から、この操作領域は終止コドンを含む。あるいはこの操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明によれば、複数の連続する終止コドンも使用することができる。一実施形態では、本発明の操作領域は２つの終止コドンを含み得る。第１の終止コドンは「ＴＧＡ」または「ＵＧＡ」であって良く、第２の終止コドンは、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」または「ＵＡＧ」からなる群から選択されて良い。
【０３４５】
図６Ｂを参照すると、少なくとも１つの非核酸部分２０１を環状構築物２００の調製に使用することができ、ここで非核酸部分２０１は、第１のフランキング領域２０４を第２のフランキング領域２０６に近付けるために使用される。本発明に使用できる非核酸部分の非限定的な例を、本明細書に記載する。環状構築物２００は１つより多い非核酸部分を含むことができ、このとき追加の非核酸部分は第１の非核酸部分に対して非相同性であっても、または相同性であっても良い。
【０３４６】
図７Ａを参照すると、第１の連結ヌクレオシド領域２０２はスペーサー領域２１４を含み得る。このスペーサー領域２１４を使用して、環状構築物が１つより多いオープンリーディングフレーム、非コード領域または１つのオープンリーディングフレーム及び非コード領域を含むことができるように、第１の連結ヌクレオシド領域２０２を分離することができる。
【０３４７】
図７Ｂを参照すると、第２のフランキング領域２０６は、３’ＵＴＲ２１２に１つ以上のセンサー領域２１６を含み得る。本明細書で述べるこれらのセンサー配列は、環状構築物の局所微小環境のリガンドに対する擬似受容体（または結合部位）として動作する。例えば、環状ポリヌクレオチドの環境に存在する任意のマイクロＲＮＡに対して、擬似受容体として機能するように、マイクロＲＮＡ結合部位またはｍｉＲＮＡシードをセンサーとして使用しても良い。図９に示すように、１つ以上のセンサー領域２１６がスペーサー領域２１４によって分離されていても良い。
【０３４８】
図８Ａに示すように、１つ以上のセンサー領域２１６を含む環状構築物２００は、第１の連結ヌクレオシド領域２０２にスペーサー領域２１４も含み得る。図７に関して上で述べたように、環状構築物が１つより多いオープンリーディングフレーム及び／または１つより多い非コード領域を含むことができるように、このスペーサー領域２１４を使用して、第１の連結ヌクレオシド領域２０２を分離することができる。
【０３４９】
図８Ｂを参照すると、環状構築物２００は、限定されないがセンサー領域２１６などの、少なくとも１つの非コード領域を含むｃｉｒｃＳＰとして知られる非コード構築物であり得る。センサー領域２１６それぞれには、限定されないが、ｍｉＲ配列、ｍｉＲシード、ｍｉＲ結合部位及び／またはシードのないｍｉＲ配列が含まれ得る。
【０３５０】
図９を参照すると、少なくとも１つの非核酸部分２０１を、非コード構築物である環状ポリヌクレオチド２００の調製に使用しても良い。非コード構築物である環状構築物２００は２つ以上の非核酸部分を含むことができ、このとき追加の非核酸部分は第１の非核酸部分に対して非相同性であっても、または相同性であっても良い。
【０３５１】
環状ポリヌクレオチド、環状ポリヌクレオチドを含む製剤及び組成物、ならびに環状ポリヌクレオチドの作製、使用及び投与方法は、それぞれその全体が参照により組み込まれる、同時係属中の表題「Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の米国仮出願第６１／８７３，０１０号（２０１３年９月３日出願）及び表題「Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の同第６１／８７７，５２７号（２０１３年９月１３日出願）にも記載されている。
【０３５２】
ポリヌクレオチドの多量体
本発明によれば、３’末端で修飾されているヌクレオチドを使用して、複数の異なるキメラポリヌクレオチド及び／またはＩＶＴポリヌクレオチドを３’末端を介して互いに連結することができる。化学的コンジュゲートを使用して、細胞への送達の化学量論比を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素であるイソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼが１：１比で細胞に供給され、細胞脂肪酸代謝が変化し得る。この比は、一方のポリヌクレオチド種に３’−アジド末端ヌクレオチドを、反対側のポリヌクレオチド種にＣ５−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドとを使用してキメラポリヌクレオチド及び／またはＩＶＴポリヌクレオチドを化学的に連結することにより制御することができる。修飾ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して製造者のプロトコルに従って転写後に付加される。３’−修飾ヌクレオチドの付加後、２つのポリヌクレオチド種を銅の存在下または非存在下で水溶液中にて組み合わせて、文献に記載のようにクリックケミストリー機構によって新規の共有結合性の連結を形成することができる。
【０３５３】
別の例では、官能化されたリンカー分子を使用して２つより多いキメラポリヌクレオチド及び／またはＩＶＴポリヌクレオチドを互いに連結することができる。例えば、官能化サッカリド分子を複数の化学反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３など）を含むように化学的に修飾し、３’−官能化ｍＲＮＡ分子の同族部分（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）と反応させることができる。修飾されたサッカリドの反応基の数を化学量論的な方式で制御することにより、コンジュゲートされるキメラポリヌクレオチド及び／またはＩＶＴポリヌクレオチドの化学量論比を直接制御することができる。
【０３５４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチド及び／またはＩＶＴポリヌクレオチドは、互いにパターン状に連結しても良い。パターンは単純な交互パターン、例えばＣＤ［ＣＤ］ｘであり得、ここで各「Ｃ」及び各「Ｄ」はキメラポリヌクレオチド、ＩＶＴポリヌクレオチド、異なるキメラポリヌクレオチドまたは異なるＩＶＴポリヌクレオチドを表す。パターンはｘ回（ｘ＝１〜３００）繰り返され得る。本発明のＮＡＶの抗原は、本明細書に記載するこのような連結ポリヌクレオチドによってコードし得ると理解すべきである。パターンはまた、ＣＣＤＤ［ＣＣＤＤ］ｘ（２個ずつ交互の繰り返し）またはＣＣＣＤＤＤ［ＣＣＣＤＤＤ］ｘ（３個ずつ交互の繰り返し）パターンなどの複数個ずつの交互の繰り返しであっても良い。２個ずつ交互の繰り返しまたは３個ずつ交互の繰り返しは、ｘ回（ｘ＝１〜３００）繰り返され得る。
【０３５５】
ポリヌクレオチドのコンジュゲート及び組み合わせ
タンパク質産生を更に増強するために、本発明のキメラポリヌクレオチドを、他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばプソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質類、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞または骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、ホルモン及びホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子若しくは薬物とコンジュゲートするように設計することができる。
【０３５６】
好適な実施形態では、抗原をコードする本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の樹状細胞マーカーとコンジュゲートされる。
【０３５７】
コンジュゲートの結果、増加した安定性及び／または半減期がもたらされ得、細胞、組織または生物中の特異的部位を標的とするポリヌクレオチドで特に有用であり得る。
【０３５８】
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、トリプルヘリックス形成を誘導するＲＮＡ、アプタマーまたはベクターなどの１つ以上と共投与、コンジュゲートしても、または更にそれらをコードしても良い。
【０３５９】
二官能性ポリヌクレオチド
本発明の一実施形態では、ＮＡＶは二官能性ポリヌクレオチド（例えば、二官能性ＩＶＴポリヌクレオチド、二官能性キメラポリヌクレオチドまたは二官能性環状ポリヌクレオチド）を含み得る。その名前が示すとおり、二官能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの官能性を有するかまたはその能力を有するものである。これらの分子はまた、慣例により多官能性とも称される場合がある。本発明のＮＡＶポリヌクレオチドは、上記のように、他の分子または薬剤とコンジュゲートし得ることを理解すべきである。
【０３６０】
二官能性ポリヌクレオチドの複数の官能基は、ＮＡＶによってコードされる場合もあれば（官能性は、コードされた産物が翻訳されるまで出現しないこともある）、またはポリヌクレオチドそれ自体の特性でもあり得る。官能性は構造的でも、化学的でもあり得る。二官能性修飾ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドと共有結合的にまたは静電的に会合する官能基を含み得る。更に、２つの官能基は、キメラポリヌクレオチドと別の分子との複合体の状況で与えられる場合もある。
【０３６１】
非コードポリヌクレオチド
本明細書に記載のように、部分的にまたは実質的に翻訳不可能な配列を有する、例えば非コード領域を有するポリヌクレオチドが提供される。非限定的な例の１つとして、非コード領域はＩＶＴポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドの第１の領域であり得る。あるいは、非コード領域は第１の領域以外の領域であり得る。別の非限定的な例として、非コード領域はキメラポリヌクレオチドのＡ、Ｂ及び／またはＣ領域であり得る。
【０３６２】
このような分子は一般に翻訳されないが、リボソームタンパク質またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの１つ以上の翻訳機構成分との１つ以上の結合及び１つ以上のその封鎖によって、細胞内でのタンパク質の発現が効果的に低減され、または細胞内での１つ以上の経路またはカスケードが調節され、それによってタンパク質レベルが改変されることで免疫応答またはタンパク質産生に効果を及ぼし得る。ポリヌクレオチドは、１つ以上の長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡまたはｌｉｎｃＲＮＡ）またはその一部、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含み得るか、またはそれをコードし得る。そのいずれもがポリヌクレオチドでコードされ得る、このようなｌｎｃＲＮＡ分子及びこのようなｌｎｃＲＮＡを標的化するように設計されたＲＮＡｉ構築物の例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２／０１８８８１Ａ２号に教示されている。
【０３６３】
本発明によれば、ポリヌクレオチドは目的とする１つ以上のポリペプチドまたはその断片をコードするように設計することができる。このような目的とするポリペプチドとしては、限定されないがポリペプチド全体、複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片を挙げることができ、これらは独立して、ポリヌクレオチドの１つ以上の領域若しくは部分または全体によってコードされ得る。本明細書で使用される場合、「目的とするポリペプチド」という用語は、本発明のポリヌクレオチドの範囲内でコードされるように選択されるか、またはポリヌクレオチドによってその機能が影響を受ける任意のポリペプチドを指す。本発明のペプチドまたはポリペプチドはいずれも抗原であり得る。
【０３６４】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造または機能のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを指す。一実施形態では、目的とするポリペプチドは本明細書に記載するポリヌクレオチドによってコードされる抗原である。
【０３６５】
いくつかの場合では、コードされるポリペプチドは約５０アミノ酸より小さく、このときポリペプチドはペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、それは少なくとも約２、３、４または少なくとも５アミノ酸残基長であり得る。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び前述の他の等価物、変異体及びアナログが含まれる。ポリペプチドは単一の分子であっても良く、または二量体、三量体若しくは四量体などの多分子複合体であっても良い。ポリペプチドはまた、抗体またはインスリンなどの単鎖または多鎖ポリペプチドを含んでも良く、会合または連結されていても良い。最も一般的に、多鎖ポリペプチドにはジスルフィド結合が見られる。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。
【０３６６】
「ポリペプチド変異体」という用語は、アミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失及び／または挿入を有し得る。通常、変異体は天然または参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは天然または参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同）である。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、「変異模倣体」が提供される。本明細書で使用される場合、「変異模倣体」という用語は、活性化配列を模倣し得る１つ以上のアミノ酸を含むものである。例えば、グルタメートは、リン酸化スレオニン及び／またはリン酸化セリンの模倣体として作用し得る。あるいは、変異模倣体は失活をもたらすか、または模倣体を含む不活性化産物をもたらすことができ、例えばフェニルアラニンはチロシンの不活性化置換として作用でき、またはアラニンはセリンの不活性化置換として作用することができる。
【０３６８】
「相同性」は、それがアミノ酸配列に適用されるとき、配列をアライメントし、必要であればギャップを導入して最大パーセント相同性を達成した後に、第２の配列のアミノ酸配列中の残基と同一となる候補アミノ酸配列中の残基のパーセントとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。相同性はパーセント同一性の計算に依存するが、計算に導入されるギャップ及びペナルティによって値が異なり得ると理解される。
【０３６９】
「ホモログ」とは、それがポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２の配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
【０３７０】
「アナログ」とは、１つ以上のアミノ酸改変、例えばアミノ酸残基の置換、付加または欠失の違いはあるが、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの特性の１つ以上を引き続き維持しているポリペプチド変異体を含むことを意味する。
【０３７１】
本発明は、変異体及び誘導体を含めたポリペプチドベースのいくつかのタイプの組成物を企図する。それらには、置換、挿入、欠失及び共有結合による変異体及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は「変異体」という用語と同義的に用いられるが、一般的には、参照分子または出発分子と比較して何らかの方法で修飾及び／または変更されている分子を指す。
【０３７２】
したがって、参照配列と比較して置換、挿入及び／または付加、欠失及び共有結合による修飾を含むペプチドまたはポリペプチド、特に本明細書で開示されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドが、本発明の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば１つ以上のリジンを、本発明のペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加することができる。配列タグはペプチド精製または局在化に使用することができる。リジンを、ペプチドの溶解度を増加させ、またはビオチン化を可能にするために使用するこことができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意で欠失させてトランケート配列を提供しても良い。あるいは、例えば、可溶性のまたは固体支持体に連結された、より大きい配列の一部として配列を発現させるなど、配列の用途に応じてある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）を欠失させても良い。
【０３７３】
ポリペプチドに関して、「置換変異体」は、天然または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに同じ位置に別のアミノ酸が挿入されたものである。置換は、分子中の一つのみのアミノ酸が置換された、単一の置換であっても良く、または同じ分子中の２つ以上のアミノ酸が置換された、複数の置換であっても良い。
【０３７４】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸を同様のサイズ、電荷または極性の別のアミノ酸に置き換える置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基を別の非極性残基の代わりにする置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びグリシンとセリンとの間など、ある極性（親水性）残基を別の残基の代わりにする置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基を別の塩基性残基の代わりにする置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸などのある酸性残基を別の酸性残基の代わりにする置換は、保存的置換の更に別の例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基をシステイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基の代わりにする置換、及び／または極性残基を非極性残基の代わりにする置換が挙げられる。
【０３７５】
ポリペプチドに関して、「挿入変異体」は、天然または出発配列中の特定の位置にあるアミノ酸に直に隣接して１つ以上のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸に「直に隣接」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。
【０３７６】
ポリペプチドに関して、「欠失変異体」は、天然または出発アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域で１つ以上のアミノ酸が欠失することになる。
【０３７７】
ポリペプチドに関して、「共有結合誘導体」は、有機タンパク質または非タンパク質誘導体化剤による天然または出発タンパク質の修飾、及び／または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基との反応能を有する有機誘導体化剤と反応させることによって、あるいは選択された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾機構を利用することによって導入される。得られる共有結合誘導体は、生物学的活性、イムノアッセイまたは組換え糖タンパク質のイムノアフィニティー精製のための抗タンパク質抗体の調製にとって重要な残基を特定することを目的とするプログラムに有用である。このような修飾は当該分野の当業技術の範囲内であり、過度の実験を行うことなく実施される。
【０３７８】
ある特定の翻訳後修飾は、組換え宿主細胞が発現後のポリペプチドに作用する結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は高頻度で翻訳後に脱アミド化され、対応するグルタミル及びアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明に従って産生されるポリペプチド中に存在し得る。
【０３７９】
他の翻訳後修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシ化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））。
【０３８０】
ポリペプチドに関して、「特徴」は、分子のなかで明確に異なるアミノ酸配列ベースの成分として定義される。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面発現、局所的コンホメーション形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０３８１】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「表面発現」という用語は、タンパク質の最外表面に現れるポリペプチドベースの成分を指す。
【０３８２】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「局所的コンホメーション形状」という用語は、タンパク質の限定可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチドベースの構造的な発現を意味する。
【０３８３】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化に応じて得られるアミノ酸配列のコンホメーションを指す。折り畳みは、二次または三次レベルの折り畳み過程で起こり得る。二次レベルの折り畳みの例として、βシート及びαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例として、エネルギーの力の凝集または分離によって形成されるドメイン及び領域が挙げられる。この様式でされる領域として、疎水性及び親水性ポケットなどが挙げられる。
【０３８４】
本明細書で使用される場合、「ターン」という用語は、それがタンパク質コンホメーションに関するとき、ペプチドまたはポリペプチドの主鎖の方向を変える屈曲を意味し、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸残基が関わり得る。
【０３８５】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの主鎖の方向を逆向きにするように作用し得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドに見られ、それが主鎖の方向のみを変化させている場合、４つ以上のアミノ酸残基を含み得る。Ｏｌｉｖａらは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを特定している（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２６６（４）：８１４−８３０；１９９７）。ループは開いていても、閉じていても良い。閉じたループ、すなわち「環式」ループは、架橋部分の間に２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。このような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドに典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含み得るか、あるいは架橋部分は、本明細書で使用されるジブロモジリル剤（dibromozylyl  agent）などの非タンパク質ベースであり得る。
【０３８６】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「半ループ」という用語は、その派生元となるループであるアミノ酸残基数の少なくとも半分を有する特定されたループの一部を指す。無論、ループは偶数のアミノ酸残基を含有するとは限らない。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、またはそれを含むと特定される場合、奇数のループの半ループはループの整数部分または次の整数部分（ループ／２±０．５アミノ酸のアミノ酸数）を含むことになる。例えば、７アミノ酸ループと特定されるループは、３アミノ酸または４アミノ酸の半ループを生じ得る（７／２＝３．５±０．５より、３または４となる）。
【０３８７】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、結合能、タンパク質間相互作用の部位としての役割）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０３８８】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「半ドメイン」という用語は、その派生元となるドメインであるアミノ酸残基数の少なくとも半分を有する特定されたドメインの一部を意味する。無論、ドメインは偶数のアミノ酸残基を含有するとは限らない。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、またはそれを含むと特定される場合、奇数のドメインの半ドメインはドメインの整数部分または次の整数部分（ドメイン／２±０．５アミノ酸のアミノ酸数）を含むことになる。例えば、７アミノ酸ドメインと同定されるドメインは、３アミノ酸または４アミノ酸の半ドメインを生じ得る（７／２＝３．５±０．５より、３または４となる）。また、ドメインまたは半ドメイン内にサブドメインが特定され、これらのサブドメインが、その派生元であったドメインまたは半ドメインに特定された構造的または機能的特性の一部を有し得ることも理解されよう。また、本明細書におけるドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸は、ポリペプチドの主鎖に沿って連続していなくても良い（すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれてドメイン、半ドメインまたはサブドメインが生じ得る）ことも理解されよう。
【０３８９】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「部位」という用語は、それがアミノ酸による実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義に用いられる。部位は、本発明のポリペプチドベースの分子の範囲内で修飾、操作、改変、誘導体化または変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【０３９０】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドに関して、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語はペプチドまたはポリペプチドの端部を指す。このような端部は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位のみに限定されず、末端領域に付加されたアミノ酸を含み得る。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸が終端となる）及びＣ末端（遊離カルボキシ基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸が終端となる）の両方を有するという特徴を備え得る。本発明のタンパク質は、任意で、ジスルフィド結合によって、または非共有結合性の力によって結びつく複数のポリペプチド鎖（多量体、オリゴマー）で構成される。この種のタンパク質は複数のＮ末端及びＣ末端を有することになる。あるいは、ポリペプチドの末端は、場合によって有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で開始または終結するように修飾されても良い。
【０３９１】
これらの特徴はいずれも、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの望ましい構成要素として特定または定義された後に、移動、交換、逆転、欠失、ランダム化または複製により、これらの特徴のいくつかの操作及び／または修飾のいずれかを実行しても良い。更に、特徴の操作は本発明の分子に対する修飾と同じ結果をもたらし得ることが理解されよう。例えば、ドメインの欠失と関わる操作であれば、完全長未満の分子をコードする核酸の修飾がもたらすであろうものと全く同様に分子の長さの改変が生じることになる。
【０３９２】
修飾及び操作は、限定されないが、部位特異的突然変異誘発または化学合成中の先験的組み込みなど、当該技術分野で既知の方法によって達成することができる。その後、得られる修飾分子を、本明細書に記載されるものなどのインビトロ若しくはインビボアッセイまたは当該技術分野において既知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験することができる。
【０３９３】
本発明によれば、ポリペプチドは、実験過程を通じて発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「コンセンサス」配列は、１つ以上の部位でのばらつきを許容する集合的な配列集団を表す単一の配列である。
【０３９４】
当業者が認識するように、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン及び相同タンパク質もまた、本発明の目的とするポリペプチドの範囲内にあると見なされる。例えば、本明細書では、参照タンパク質の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００超のアミノ酸長の任意のタンパク質断片（すなわち、参照ポリペプチド配列よりも少なくとも１アミノ酸残基短いが、それ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）が提供される。別の例では、本明細書に記載する配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％同一である、約２０、約３０、約４０、約５０または約１００アミノ酸の伸長を含む任意のタンパク質を本発明に従って利用することができる。特定の実施形態では、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書で提供または参照される配列のいずれかに示されるとおり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の突然変異を含む。
【０３９５】
一実施形態では、目的とする少なくとも１つのポリペプチドは、リボ核酸ワクチンの抗原若しくはその断片、または任意の成分であり得る。
【０３９６】
参照分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）は、設計される分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）とある程度の同一性を共有し得る。「同一性」という用語は、当該技術分野で既知のように、配列の比較によって決定されるような２つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関連性を指す。当該技術分野では、同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオシドのストリング間のマッチ数によって決定されるような、それらの間の配列関連度も意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されるギャップアライメント（存在する場合）を用いて、２つ以上の配列の小さいもの同士の同一マッチ率で評価する。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。このような方法として、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、及びＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９７】
一部の実施形態では、コードされたポリペプチド変異体は参照ポリペプチドと同じまたは同様の活性を有し得る。あるいは、変異体は参照ポリペプチドと比較して変化した（例えば、増加したまたは低下した）活性を有し得る。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載の及び当業者に既知の配列アライメントプログラム及びパラメータによって測定したとき、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列に対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、ただし１００％未満の配列同一性を有し得る。このようなアライメントツールとしては、ＢＬＡＳＴのスイートが挙げられる（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）。他のツールを本明細書、具体的には「同一性」の定義に記載する。
【０３９８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムの既定のパラメータには、例えば、期待閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、−２、線形ギャップコストが含まれる。任意のフィルタならびに種特異的な繰り返し、例えばホモサピエンスなどの選択を適用することができる。
【０３９９】
細胞透過性ポリペプチド
本明細書で開示するポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）はまた、１つ以上の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」またはＣＰＰは、分子の細胞取込みを促進できるポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、１つ以上の検出可能な標識を含有しても良い。ポリペプチドは部分的に標識される場合もあれば、全体にわたって完全に標識される場合もある。ポリヌクレオチドは検出可能な標識を完全にコードしても、部分的にコードしても、または全くコードしなくても良い。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列も含み得る。本明細書で使用される場合、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合するアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列を使用して、細胞透過性ポリペプチドの分泌シグナルを伝達することができる。
【０４００】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、融合タンパク質をコードし得る。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に作動可能に連結することにより作成され得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、治療用タンパク質と荷電タンパク質とが細胞への導入時にその複合体の発現を可能にする形で結合されていることを指す。本明細書で使用される場合、「荷電タンパク質」は、正電荷、負電荷または全体的に中性の電荷を持つタンパク質を指す。好ましくは、治療用タンパク質は融合タンパク質の形成過程で荷電タンパク質に共有結合的に連結され得る。表面電荷の全アミノ酸または表面アミノ酸に対する比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９であり得る。
【０４０１】
ポリヌクレオチドによってコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳後に複合体を形成し得る。この複合体は、細胞透過性ポリペプチドに連結された、例えば共有結合的に連結された荷電タンパク質を含み得る。「治療用タンパク質」は、細胞に投与されたとき、治療的、診断的及び／若しくは予防的効果を有し、ならびに／または所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を生じさせるタンパク質を指す。
【０４０２】
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは第１のドメインと第２のドメインとを含み得る。第１のドメインは過剰に荷電されたポリペプチドを含み得る。第２のドメインはタンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質結合パートナー」には、抗体及びその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーに対応する細胞内結合パートナーを更に含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチドが導入され得る細胞からの分泌能を有し得る。細胞透過性ポリペプチドはまた、第１の細胞を透過する能力も有し得る。
【０４０３】
更に別の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは第２の細胞を透過する能力を有する。第２の細胞は第１の細胞と同じ区域の細胞であっても良く、または異なる区域の細胞であっても良い。区域には、限定されないが組織及び器官を含み得る。第２の細胞はまた、第１の細胞より近位であっても、または遠位であっても良い。
【０４０４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。タンパク質結合パートナーとして、抗体、過剰に荷電された抗体または機能的断片を挙げることができるが、それらに限定されない。ポリヌクレオチドは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入される細胞に導入され得る。
【０４０５】
抗微生物及び抗ウイルス性ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、１つまたは複数の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）または抗ウイルス性ペプチド（ＡＶＰ）をコードするポリヌクレオチドをコードするように、またはそれと共投与されるように設計することができる。ＡＭＰ及びＡＶＰは、限定されないが、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類及び哺乳類などの広範な動物から単離され、記載済みである（Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９年；３７（データベース版）：Ｄ９３３−７）。例えば、抗微生物ペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ｈｔｔｐ：／／ａｐｓ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＡＰ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ）、Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９；３７（データベース版）：Ｄ９３３−７）、ＣＡＭＰ：Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｃｎｉｒｒｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ／）、Ｔｈｏｍａｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０；３８（データベース版：Ｄ７７４−８０）、ＵＳ５２２１７３２、ＵＳ５４４７９１４、ＵＳ５５１９１１５、ＵＳ５６０７９１４、ＵＳ５７１４５７７、ＵＳ５７３４０１５、ＵＳ５７９８３３６、ＵＳ５８２１２２４、ＵＳ５８４９４９０、ＵＳ５８５６１２７、ＵＳ５９０５１８７、ＵＳ５９９４３０８、ＵＳ５９９８３７４、ＵＳ６１０７４６０、ＵＳ６１９１２５４、ＵＳ６２１１１４８、ＵＳ６３００４８９、ＵＳ６３２９５０４、ＵＳ６３９９３７０、ＵＳ６４７６１８９、ＵＳ６４７８８２５、ＵＳ６４９２３２８、ＵＳ６５１４７０１、ＵＳ６５７３３６１、ＵＳ６５７３３６１、ＵＳ６５７６７５５、ＵＳ６６０５６９８、ＵＳ６６２４１４０、ＵＳ６６３８５３１、ＵＳ６６４２２０３、ＵＳ６６５３２８０、ＵＳ６６９６２３８、ＵＳ６７２７０６６、ＵＳ６７３０６５９、ＵＳ６７４３５９８、ＵＳ６７４３７６９、ＵＳ６７４７００７、ＵＳ６７９０８３３、ＵＳ６７９４４９０、ＵＳ６８１８４０７、ＵＳ６８３５５３６、ＵＳ６８３５７１３、ＵＳ６８３８４３５、ＵＳ６８７２７０５、ＵＳ６８７５９０７、ＵＳ６８８４７７６、ＵＳ６８８７８４７、ＵＳ６９０６０３５、ＵＳ６９１１５２４、ＵＳ６９３６４３２、ＵＳ７００１９２４、ＵＳ７０７１２９３、ＵＳ７０７８３８０、ＵＳ７０９１１８５、ＵＳ７０９４７５９、ＵＳ７１６６７６９、ＵＳ７２４４７１０、ＵＳ７３１４８５８及びＵＳ７５８２３０１に記載されている。
【０４０６】
本明細書に記載する抗微生物ポリペプチドは、１つ以上のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）による細胞融合及び／またはウイルス侵入をブロックすることができる。例えば、抗微生物ポリペプチドは、領域、例えば、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１などのウイルス性エンベロープタンパク質の膜貫通サブユニットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０アミノ酸の連続的な配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、Ｋｕｉｋｅｎら（２００８）．「ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ」，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、対応するウイルス性タンパク質の配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、対応するウイルス性タンパク質配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を有し得る。
【０４０８】
他の実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、領域、例えば、カプシド結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０アミノ酸の連続的な配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、カプシド結合タンパク質の対応する配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の配列相同性を有し得る。
【０４０９】
本明細書に記載する抗微生物ポリペプチドは、プロテアーゼの二量体化を妨げ、ウイルス性プロタンパク質の切断（例えば、ＨＩＶ  Ｇａｇ−ｐｏｌプロセシング）による機能性タンパク質化を阻害することにより、１つ以上のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）の放出を阻止することができる。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、対応するウイルス性タンパク質の配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。
【０４１０】
他の実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、領域、例えば、プロテアーゼ結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０アミノ酸の連続的な配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、プロテアーゼ結合タンパク質の対応する配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。
【０４１１】
本明細書に記載する抗微生物ポリペプチドには、ウイルス性病原体に向けた、インビトロ発生ポリペプチドを含み得る。
【０４１２】
抗微生物ポリペプチド
抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）は、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生体、プリオン及び腫瘍／癌細胞を含むがこれに限らず広範囲の微生物に対して広域活性を有する様々な長さ、配列及び構造の小さいペプチドである（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚａｉｏｕ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００７；８５：３１７を参照）。ＡＭＰは、潜在的に低レベルの耐性の誘発及び付随する広い抗炎症効果により、広域にわたり急速に開始される殺傷活性を有することが明らかにされた。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、１０ｋＤａ未満、例えば、８ｋＤａ、６ｋＤａ、４ｋＤａ、２ｋＤａ、または１ｋＤａ未満であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、約６〜約１００アミノ酸、例えば約６〜約７５アミノ酸、約６〜約５０アミノ酸、約６〜約２５アミノ酸、約２５〜約１００アミノ酸、約５０〜約１００アミノ酸または約７５〜約１００アミノ酸から構成される。ある特定の実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、約１５〜約４５アミノ酸から構成され得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的にカチオン性である。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的に両親媒性であり得る。ある特定の実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的にカチオン性及び両親媒性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞毒性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性及び細胞毒性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陰性細菌に対して細胞増殖抑制性でもあり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陰性細菌に対して細胞毒性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性及び細胞毒性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオンまたはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオンまたはこれらの組み合わせに対して細胞毒性であり得る。ある特定の実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオンまたはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性及び細胞毒性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト腫瘍及び／または癌細胞）に対して細胞毒性であっても良い。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト腫瘍及び／または癌細胞）に対して細胞増殖抑制性であり得る。ある特定の実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト腫瘍または癌細胞）に対して細胞毒性及び細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、分泌されたポリペプチドであり得る。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、ディフェンシンを含むかまたはそれから構成される。例示的なディフェンシンとして、α−ディフェンシン（例えば、好中球ディフェンシン１、ディフェンシンα１、好中球ディフェンシン３、好中球ディフェンシン４、ディフェンシン５、ディフェンシン６）、β−ディフェンシン（例えば、β−ディフェンシン１、β−ディフェンシン２、β−ディフェンシン１０３、β−ディフェンシン１０７、β−ディフェンシン１１０、β−ディフェンシン１３６）及びθ−ディフェンシンが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、カテリシジン（例えば、ｈＣＡＰ１８）を含むかまたはそれから構成される。
【０４１６】
抗ウイルス性ポリペプチド
抗ウイルス性ポリペプチド（ＡＶＰ）は、広範囲にわたるウイルスに対する広域活性を有する様々な長さ、配列及び構造の小さいペプチドである。例えば、Ｚａｉｏｕ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００７；  ８５：３１７を参照のこと。ＡＶＰは、潜在的に低レベルの耐性の誘発及び付随する広い抗炎症効果により、広域にわたり急速に開始される殺傷活性を有することが明らかにされた。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、１０ｋＤａ未満、例えば、８ｋＤａ、６ｋＤａ、４ｋＤａ、２ｋＤａ、または１ｋＤａ未満であり得る。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、約６〜約１００アミノ酸、例えば約６〜約７５アミノ酸、約６〜約５０アミノ酸、約６〜約２５アミノ酸、約２５〜約１００アミノ酸、約５０〜約１００アミノ酸または約７５〜約１００アミノ酸を含むかまたはそれから構成される。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、約１５〜約４５アミノ酸を含むかまたはそれから構成される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的に両親媒性である。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性及び両親媒性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞毒性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性及び細胞毒性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生体、プリオンまたはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生体、プリオンまたはこれらの組み合わせに対して細胞毒性である。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生体、プリオンまたはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性及び細胞毒性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）に対して細胞毒性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）に対して細胞増殖抑制性である。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）に対して細胞毒性及び細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドである。
【０４１７】
細胞毒性ヌクレオシド
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は１つ以上の細胞毒性ヌクレオシドを組み込むことができる。例えば、細胞毒性ヌクレオシドを二官能性修飾ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドに組み込んでも良い。細胞毒性ヌクレオシド抗癌剤としては、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ＦＴＯＲＡＦＵＲ（登録商標）（テガフールとウラシルとの組み合わせ）、テガフール（（ＲＳ）−５−フルオロ−１−（テトラヒドロフラン−２−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）及び６−メルカプトプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１８】
多くの細胞毒性ヌクレオシドアナログが抗癌剤として臨床使用中であるか、または臨床試験の対象となっている。そのようなアナログの例として、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、デシタビン、テザシタビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、クラドリビン、クロファラビン、５−アザシチジン、４’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン及び１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）−シトシンが挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物の別の例は、リン酸フルダラビンである。これらの化合物は全身投与されても良く、限定されないが、増殖性正常細胞と比べて腫瘍細胞に対して特異性がほとんどまたは全くないなど、細胞毒性剤に典型的な副作用を有し得る。
【０４１９】
当該技術分野では、細胞毒性ヌクレオシドアナログのプロドラッグも数多く報告されている。例としては、Ｎ４−ベヘノイル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−オクタデシル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−パルミトイル−１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシン及びＰ−４０５５（シタラビン５’−エライジン酸エステル）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、これらのプロドラッグは主に肝臓内及び体循環中に活性薬物へ変換され得、腫瘍組織での活性薬物の選択的な放出をほとんどまたは全く呈さない。例えば、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンの（及び最終的には５−フルオロウラシルの）プロドラッグであるカペシタビンは、肝臓及び腫瘍組織の両方で代謝される。「生理的条件下で易加水分解性のラジカル」を含有する一連のカペシタビンアナログが、Ｆｕｊｉｕら（米国特許第４，９６６，８９１号）によって特許請求されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｕｊｉｕにより記載された系列には、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンのＮ４アルキル及びアラルキルカルバメートが含まれており、このことは、これらの化合物が通常の生理的条件下で加水分解によって活性化され、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンを生じ得ることを意味する。
【０４２０】
シタラビンＮ４−カルバメートの系列が、Ｆａｄｌら（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ．１９９５，５０，３８２−７）によって報告されており、ここで化合物は肝臓及び血漿中でシタラビンに変換されるように設計された。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０４１２０３は、ゲムシタビンのプロドラッグを開示しており、ここでプロドラッグのいくつかはＮ４−カルバメートである。これらの化合物はゲムシタビンの胃腸毒性を解消するように設計され、胃腸管からのインタクトなプロドラッグの吸収後に肝臓及び血漿中での加水分解放出によってゲムシタビンを提供することが意図された。Ｎｏｍｕｒａら（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３，１１，２４５３−６１）は、１−（３−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボ−ペントファラノシル（ｐｅｎｔｏｆａｒａｎｏｓｙｌ））シトシンのアセタール誘導体について記載しており、生体内還元時に生成される中間体は、細胞毒性ヌクレオシド化合物を産生するためには、酸性条件下での更なる加水分解を必要とした。
【０４２１】
化学療法薬であり得る細胞毒性ヌクレオチドとしてはまた、ピラゾロ［３，４−Ｄ］−ピリミジン、アロプリノール、アザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、６−チオグアニン、アシクロビル、アラ−アデノシン、リバビリン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、６−アザ−ウラシル、６−アザ−シチジン、チミジンリボヌクレオチド、５−ブロモデオキシウリジン、２−クロロ−プリン及びイノシン、またはそれらの組み合わせも挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２２】
非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含むことができる。ポリヌクレオチドが目的とする少なくとも１つのポリペプチドをコードするように設計される場合、ポリヌクレオチドはこれらの非翻訳領域のうちの１つ以上を含み得る。
【０４２３】
定義によると、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが、翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは転写開始部位から始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲが核酸分子の安定性及び翻訳の点で果たす調節的役割について、一連の証拠が増えつつある。ＵＴＲの調節的特徴を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことにより、とりわけ分子の安定性を増強させることができる。また特異的特徴を組み込むことにより、不所望の器官部位への誤誘導に備え、転写物の下方調節を確実に制御することもできる。
【０４２４】
表１９及び２０は、本発明のポリヌクレオチドに利用され得る例示的なＵＴＲの一覧を示す。表１９に本発明の５’非翻訳領域の一覧を示す。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む、１つ以上のヌクレオチドが末端に付加された、または末端から除去された５’ＵＴＲの変異体を利用することができる。
【０４２５】
【表１９−１】
0006881813.tif 000854
【表１９−２】
0006881813.tif 000855
【０４２６】
表２０に本発明の３’非翻訳領域の一覧を示す。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む、１つ以上のヌクレオチドが末端に付加された、または末端から除去された３’ＵＴＲの変異体を利用することができる。
【０４２７】
【表２０−１】
0006881813.tif 000856
【表２０−２】
0006881813.tif 000857
【表２０−３】
0006881813.tif 000858
【表２０−４】
0006881813.tif 000859
【表２０−５】
0006881813.tif 000860
【表２０−６】
0006881813.tif 000861
【表２０−７】
0006881813.tif 000862
【表２０−８】
0006881813.tif 000863
【表２０−９】
0006881813.tif 000864
【０４２８】
５’ＵＴＲ及び翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において特徴的な役割を担う。天然５’ＵＴＲは、一般にリボソームによる多くの遺伝子の翻訳開始プロセスに関わることで知られる、コザック配列などのシグネチャーを有する。コザック配列はコンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号９６５）（式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、次に別の「Ｇ」が続く）を有する。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関わる二次構造を形成することも知られている。
【０４２９】
特異的標的器官の大量発現遺伝子に通常見られる特徴を操作することにより、本発明のポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を増強させることができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチンまたは第ＶＩＩＩ因子などの、肝臓に発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入を用いて、肝細胞系または肝臓におけるポリヌクレオチドなどの核酸分子の発現を増強させることができ得る。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲを使用して、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄性細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に対して、その組織における発現を向上させることが可能である。
【０４３０】
ポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）の設計及び製造に有用な非翻訳領域として、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中である共通所有の米国仮出願第６１／８２９，３７２号（代理人整理番号Ｍ４２．６０）、同第６１／８２９，３７２号（代理人整理番号Ｍ４２．６１）及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／２１５２２号（２０１４年３月７日出願）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３１】
他の非ＵＴＲ配列もまた、ポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部が本発明のポリヌクレオチドの領域に組み込まれていても良い。イントロン配列の組込みにより、タンパク質産生に加えてポリヌクレオチドレベルが増加し得る。
【０４３２】
特徴の組み合わせが、フランキング領域に含まれていても良く、他の特徴に包含されていても良い。例えば、ＯＲＦには、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールの鋳型的付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号に記載の５’ＵＴＲなどの、同一及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチド断片と第２のポリヌクレオチド断片とを含み得る。
【０４３３】
同時係属中である共通所有の米国仮出願第６１／８２９３７２号（代理人整理番号Ｍ４２．６０）及び米国仮出願第６１／８２９，３７２号（ＵＳＳＮ）（代理人整理番号Ｍ４２．６１）には、本発明のポリヌクレオチドにおいてフランキング領域として利用され得る例示的なＵＴＲの一覧が示されている。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む、１つ以上のヌクレオチドが末端に付加された、または除去された５’または３’ＵＴＲの変異体を利用することができる。
【０４３４】
ポリヌクレオチドの領域には、任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが組み込まれ得ると理解すべきである。更に、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用しても良い。また、野生型領域の変異体ではない人工的ＵＴＲを提供することも、本発明の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部は、選択元の転写物と同一方向に配置しても良く、または方向若しくは位置を改変しても良い。したがって、５’または３’ＵＴＲは反転、短縮、延長、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと共に作製されても良い。本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、それがＵＴＲ配列に関するとき、ＵＴＲが参照配列と比較して何らかの形で変更されていることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、野生型または天然ＵＴＲに対して、上記に教示したような方向または位置の変更によって改変されても良く、または追加のヌクレオチドの挿入、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換若しくは転位によって改変されても良い。これら変更のいずれかにより生じる「改変された」ＵＴＲ（３’か５’かを問わない）には、変異ＵＴＲを含む。
【０４３５】
一実施形態では、二重、三重または四重のＵＴＲ、例えば５’または３’ＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用される場合、「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが連続してまたは実質的に連続してコードされるものである。例えば、この内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１００１２９８７７号に記載のように、二重β−グロビン３’ＵＴＲを使用しても良い。
【０４３６】
また、パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用される場合、「パターン化されたＵＴＲ」は、反復または交互パターン、例えば、１回、２回または３回超、反復されるＡＢＡＢＡＢ若しくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ若しくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはこれらの変異体を示すＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字、Ａ、ＢまたはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
【０４３７】
一実施形態では、フランキング領域は、タンパク質が共通機能、構造、特性の特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的とするポリペプチドが、特定の細胞内に、組織内にまたは発生時のある時点で発現するタンパク質のファミリーに属していても良い。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲを、タンパク質が同一または異なるファミリーの任意の他のＵＴＲと交換し、新規のポリヌクレオチドを作製しても良い。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」は、最も広義には、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在性、起源または発現パターンが共通する２つ以上の目的ポリペプチドの群を指して用いられる。
【０４３８】
非翻訳領域はまた、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２００９０２２６４７０号に記載のもの及び当該技術分野において既知のものを含み得る。
【０４３９】
３’ＵＴＲ及びＡＵリッチエレメント
天然または野生型３’ＵＴＲは、そこに組み込まれたアデノシン（［Ａ］ｄｅｎｏｓｉｎｅ）及びウリジン（［Ｕ］ｒｉｄｉｎｅ）の伸長を有することが知られている。このようなＡＵリッチシグネチャーは、特に、ターンオーバー率が高い遺伝子によく見られる。ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、その配列特徴及び機能特性に基づいて、３つのクラスに分けることができる（Ｃｈｅｎら，１９９５）。クラスＩ  ＡＲＥはＵリッチ領域内にいくつかの分散したＡＵＵＵＡモチーフのコピーを含有する。Ｃ−Ｍｙｃ及びＭｙｏＤはクラスＩ  ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップするＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種のＡＲＥを含有する分子には、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−ａが含まれる。クラスＩＩＩ  ＡＲＥは、あまり明確に定義されていない。これらのＵリッチ領域はＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。このクラスのうち、研究が十分である例は、ｃ−Ｊｕｎ及びミオゲニンの２つである。ＡＲＥに結合するタンパク質のほとんどはメッセンジャーを不安定にすることが知られている一方、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むように操作すると、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化が得られることになる。
【０４４０】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を用いることにより、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）の安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチドを操作するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して本発明のポリヌクレオチドの安定性を低下させ、それにより翻訳を抑制して、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを特定して除去するか、または突然変異させることにより、細胞内の安定性を増加させ、ひいては翻訳及び得られるタンパク質の産生を増加させることができる。本発明のポリヌクレオチドを使用して、関連する細胞株でトランスフェクション実験を実施することができ、トランスフェクション後の種々の時点でタンパク質の産生を分析することができる。例えば、細胞に種々のＡＲＥ操作分子をトランスフェクトすることができ、更に関連するタンパク質にＥＬＩＳＡキットを使用することにより、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間及び７日の時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０４４１】
マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（すなわちｍｉＲＮＡ）は１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡであり、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、かつ核酸分子の安定性を低下させることによって、あるいは翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方調節する。本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列またはマイクロＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号及び同第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されたものなどの任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
【０４４２】
マイクロＲＮＡ配列は、配列がｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソンクリック相補性を有する「シード」領域、すなわち成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域にある配列を含む。マイクロＲＮＡシードは成熟マイクロＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含むことができ、ここで対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補部位にはマイクロＲＮＡ１位に対向するアデニン（Ａ）が隣接する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含むことができ、ここで対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補部位にはマイクロＲＮＡ１位に対向するアデニン（Ａ）が隣接する。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照のこと。マイクロＲＮＡシードの塩基は標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を本発明のポリヌクレオチドに（例えば、３’ＵＴＲ様領域または他の領域に）組み込むように操作することにより、当該マイクロＲＮＡが利用可能であることを条件に、分解または翻訳抑制する分子を標的化することができる。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を減少させる。マイクロＲＮＡの特定、マイクロＲＮＡ標的領域ならびにそれらの発現パターン及びバイオロジーにおける役割が報告されている（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｕｅｒら，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ及びＣｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ及びＲａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１年１２月２０日．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆら，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４；）。
【０４４３】
例えば、核酸分子がｍＲＮＡであり、肝臓への送達を意図しないが、最終的に肝臓に至る場合に、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位をポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ領域に組み込むように操作すると、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が目的とする遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位の導入を操作することにより、ポリヌクレオチドの寿命、安定性及びタンパク質翻訳を更に低下させることができる。
【０４４４】
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位またはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は従来のワトソンクリックのハイブリダイゼーション法則に従うものであっても良く、あるいはマイクロＲＮＡ部位にある、またはそれに隣接した標的配列と、マイクロＲＮＡとの何らかの安定した会合を示すものであっても良い点に留意すべきである。
【０４４５】
逆に、本発明のポリヌクレオチドの目的上、マイクロＲＮＡ結合部位は、それが存在する配列から除外するように操作する（すなわち、それから除去する）ことができ、例えばそれにより特定の組織でのタンパク質発現を増加させることができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位を除去して肝臓でのタンパク質発現を改善し得る。複数の組織での発現の調節は、１個または数個のマイクロＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成することができる。
【０４４６】
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡ及びそれによるタンパク質発現を調節することが知られる組織の例として、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄性細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。マイクロＲＮＡはまた、血管新生（ｍｉＲ−１３２）などの複合的な生物学的過程も調節し得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎａｎｄ及びＣｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。
【０４４７】
本発明に有用な発現プロファイル、マイクロＲＮＡ及び細胞株としては、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、いずれも２０１３年７月２３日出願の米国仮出願第６１／８５７，４３６号（代理人整理番号Ｍ３９）及び同第６１／８５７，３０４号（代理人整理番号Ｍ３７）に教示されたものが挙げられる。
【０４４８】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドの発現を、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的過程の状況に合わせて調整するために、このようなプロセスに関わるマイクロＲＮＡの結合部位を除去または導入しても良い。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列及びｍｉＲ結合部位の一覧は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／７５３，６６１号（２０１３年１月１７日出願）の表９、米国仮出願第６１／７５４，１５９号（２０１３年１月１８日出願）の表９、及び米国仮出願第６１／７５８，９２１号（２０１３年１月３１日出願）の表７に列挙されている。
【０４４９】
組織または疾患特異的な遺伝子発現を誘導するためにマイクロＲＮＡを使用する例が列挙されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｔｎｅｒ及びＮａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２，８０：３９３−４０３）。加えて、マイクロＲＮＡシード部位をｍＲＮＡに組み込むことにより、特定の細胞での発現を低下させて生物学的改善をもたらすことができる。この一例は、ＵＧＴ１Ａ１を発現するレンチウイルスベクターへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みである。ｍｉＲ−１４２シード部位の存在により造血細胞での発現が低下し、結果として抗原提示細胞における発現が低下して、ウイルス発現したＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答が消失した（いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｍｉｔｔら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；１３９：９９９−１００７、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａら．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０，１３９：７２６−７２９）。修飾ｍＲＮＡへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みは、造血細胞でのコードタンパク質の発現を低下でき得るのみならず、ｍＲＮＡがコードするタンパク質に対する免疫応答もまた低下または消失させることもでき得る。ｍＲＮＡへのｍｉＲ−１４２シード部位（１つまたは複数）の組み込みは、完全タンパク質欠損患者（ＵＧＴ１Ａ  Ｉ型、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性ポンペ病患者など）の治療の場合に重要となり得る。
【０４５０】
最後に、種々の細胞型でのマイクロＲＮＡの発現パターンを理解することによって、特定の細胞型において、または特定の生物学的条件下のみでより標的化された発現となるようにポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）を操作することができる。組織特異的なマイクロＲＮＡ結合部位を導入することによって、ある組織において、またはある生物学的条件の状況において、タンパク質発現に最適であり得るポリヌクレオチドを設計することができ得る。
【０４５１】
操作されたポリヌクレオチドを使用して、関連する細胞株でトランスフェクション実験を実施することができ、トランスフェクション後の種々の時点でタンパク質の産生をアッセイすることができる。例えば、種々のマイクロＲＮＡ結合部位を操作したポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトすることができ、更に関連するタンパク質にＥＬＩＳＡキットを使用することにより、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日の時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。製剤化されたポリヌクレオチドの組織特異的な発現の変化を調べるために、マイクロＲＮＡ結合部位を操作した分子を使用して、インビボ実験を実施することもできる。
【０４５２】
５’キャップを有する領域
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は核外輸送、ｍＲＮＡ安定性の増加に関与し、更に、ｍＲＮＡのキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する。ＣＢＰは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合による成熟した環状ｍＲＮＡ種の形成を通じて、細胞でのｍＲＮＡ安定性及び翻訳能力を担っている。キャップは更に、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位イントロンの除去を補助する。
【０４５３】
内因性ｍＲＮＡ分子は５’末端がキャップされており、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸連結を生じ得る。次に、この５’−グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基が生じ得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意で２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’デキャッピングによって、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子は分解の標的となり得る。
【０４５４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）を、キャップ部分を組み込むように設計しても良い。本発明のポリヌクレオチドに対する修飾により、デキャッピングを防ぐ非加水分解性のキャップ構造を生成し、それによってｍＲＮＡ半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解には５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル連結の切断が必要であるため、修飾ヌクレオチドはキャッピング反応中に用いられ得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のワクシニアキャッピング酵素をα−チオ−グアノシンヌクレオチドと共に製造者の指示に従って使用し、５’−ｐｐｐ−５’キャップにホスホロチオエート連結を作成し得る。α−メチル−ホスホネート及びセレノホスフェートヌクレオチドなどの付加修飾されたグアノシンヌクレオチドを用いても良い。
【０４５５】
付加修飾としては、糖環の２’−ヒドロキシ基上のポリヌクレオチド（前述）の５’末端及び／または５’末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化が挙げられるが、これに限定されない。ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなど、核酸分子の５’キャップの作成には、複数の異なる５’キャップ構造を使用することができる。
【０４５６】
本明細書で合成キャップアナログ、化学的キャップ、化学的キャップアナログ、または構造的若しくは機能的キャップアナログとも称されるキャップアナログは、天然（すなわち内因性、野生型または生理的）５’キャップと化学構造の点では異なる一方で、キャップ機能は維持している。キャップアナログは、本発明のポリヌクレオチドと化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成及び／または連結され得る。
【０４５７】
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、ここで一方のグアニンはＮ７メチル基ならびに３’−Ｏ−メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは同様に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも表され得る）。もう一方の非修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャップされたポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結されるようになる。このＮ７及び３’−Ｏ−メチル化グアニンが、キャップされたポリヌクレオチドの末端部分をもたらす。
【０４５８】
別の例示的キャップはｍＣＡＰであり、これはＡＲＣＡと類似しているが、グアノシンに２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０４５９】
一実施形態では、キャップはジヌクレオチドキャップアナログである。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップアナログは、別のリン酸位置でボラノリン酸基またはホスホロセレノアート基によって修飾されていて良い（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載のジヌクレオチドキャップアナログ）。
【０４６０】
別の実施形態では、キャップは、当該技術分野で既知の及び／または本明細書に記載するキャップアナログのＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態であるキャップアナログである。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップアナログの非限定的な例として、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｒｅら．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載の種々のキャップアナログ及びキャップアナログの合成方法を参照）。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４−クロロ／ブロモフェノキシエチルのアナログである。
【０４６１】
キャップアナログはポリヌクレオチドまたはその領域の同時キャッピングを可能にするが、インビトロ転写反応では、転写物の最大２０％がキャップされないまま残り得る。このことに加え、内因性の細胞性転写機構によって産生される核酸の内因性５’キャップ構造と、キャップアナログとの構造的差異が、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下をもたらし得る。
【０４６２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、真正性の高い５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、製造後に（ＩＶＴまたは化学合成を問わず）キャップされても良い。本明細書で使用される場合、「より真正性の高い」という表現は、構造的または機能的に、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正性の高い」特徴は、先行技術による合成の特徴またはアナログなどと比較して、内因性、野生型、天然または生理的細胞機能及び／または構造を適切に表しているか、または対応する内因性、野生型、天然または生理的特徴よりも１つ以上の点で優れている。本発明のより真正性の高い５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野において既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然若しくは生理的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の増強された結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低下した感受性及び／または低下した５’デキャッピングを有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間にカノニカルな５’−５’−三リン酸連結をもたらすことができ、ここでキャップグアニンはＮ７メチル化を含み、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルを含む。そのような構造はＣａｐ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば当該技術分野において既知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、より高い翻訳能力及び細胞安定性、ならびに低下した細胞炎症性サイトカイン活性をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６３】
非限定的な例として、製造後にキャップされるキメラポリヌクレオチドは、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドがキャップされ得るので、より効率的であり得る。これは、キャップアナログをインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに連結したときの約８０％とは対照的である。
【０４６４】
本発明によれば、５’末端キャップは内因性キャップまたはキャップアナログを含み得る。本発明によれば、５’末端キャップはグアニンアナログを含み得る。有用なグアニンアナログとしては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン及び２−アジド−グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６５】
ウイルス配列
本発明のポリヌクレオチドにおいて、追加のウイルス配列、限定されないが、オオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）及び／または地方病性鼻腫瘍ウイルスの翻訳エンハンサー配列（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１２９６４８号を参照）などを操作及び挿入することができ、これは構築物の翻訳をインビトロ及びインビボで刺激することができる。関連する細胞株でトランスフェクション実験を実施することができ、更にトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日目のＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をアッセイすることができる。
【０４６６】
ＩＲＥＳ配列
更に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得るポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）が提供される。ＩＲＥＳは、当初ピコルナウイルスＲＮＡの特徴を有すると同定されたものであり、５’キャップ構造が存在しないときのタンパク質合成の開始において重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位のうちの１つとしての役割を果たし得る。１つより多い機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「多シストロン性核酸分子」）。ポリヌクレオチドにＩＲＥＳが提供される場合、更に任意で第２の翻訳可能領域が提供される。本発明に従って使用できるＩＲＥＳ配列の例としては、非限定的に、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
【０４６７】
ポリＡテール
ＲＮＡプロセシングの間、安定性を増加させるために、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドにアデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）を付加しても良い。転写後直ちに転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシが遊離され得る。次にポリＡポリメラーゼがＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスによって、例えば約８０〜２５０残基長であり得る、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含む、ポリＡテールが付加される。
【０４６８】
ポリＡテールはまた、構築物が核から輸送された後にも付加され得る。
【０４６９】
本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）に、安定化のためポリＡテールの末端基を組み込んでも良い。本発明のポリヌクレオチドはデス−３’ヒドロキシテール（ｄｅｓ−３’  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｔａｉｌ）を含み得る。これはまた、Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１−１５０７，２００５年８月２３日）によって教示された構造的部分または２’−Ｏメチル修飾も含み得る。
【０４７０】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、ヒストンｍＲＮＡを含めた代替的なポリＡテール構造を含む転写物をコードするように設計されても良い。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡでは末端ウリジル化もまた見出されている。これらのｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後の潜在的な毒性のあるヒストンの蓄積防止に重要であると考えられている。これらのｍＲＮＡは、その３’ポリ（Ａ）テールの欠失によって区別され、その機能はむしろ、安定したステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって呈される。ＳＬＢＰはポリアデニル化ｍＲＮＡのＰＡＢＰと同じ機能を果たす」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）；ＡＯＰ，オンライン公開２０１３年８月２９日；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）（この内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４７１】
固有のポリＡテール長は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）にある特定の利点を与える。
【０４７２】
一般に、ポリＡテールが存在する場合、その長さは３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡテールは３５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００及び３，０００ヌクレオチド以上）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は約３０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、及び２，５００〜３，０００）を含む。
【０４７３】
一実施形態では、ポリＡテールは、ポリヌクレオチド全体の長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さと相関して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴若しくは領域の長さに基づき得るか、ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。
【０４７４】
これに関連して、ポリＡテールは、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くても良い。ポリＡテールはまた、それが属するポリヌクレオチドのごく一部として設計されても良い。これに関連して、ポリＡテールは、構築物、構築物領域の全長またはポリＡテールを減じた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％またはそれ以上であっても良い。更に、操作された結合部位及びポリＡ結合タンパク質に対するポリヌクレオチドのコンジュゲートは、発現を増強し得る。
【０４７５】
加えて、複数の別個の異なるポリヌクレオチドが、ポリＡテールの３’末端の修飾ヌクレオチドを使用して３’末端でＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）によって互いに連結され得る。関連する細胞株でトランスフェクション実験を実施することができ、更にトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日目のＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をアッセイすることができる。
【０４７６】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）はポリＡ−Ｇ四重鎖領域を含むように設計される。Ｇ四重鎖は、ＤＮＡ及びＲＮＡ両方のＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、Ｇ四重鎖はポリＡテールの末端に組み込まれる。得られるポリヌクレオチドは、種々の時点で安定性、タンパク質産生及び半減期を含めたその他のパラメータについてアッセイされる。ポリＡ−Ｇ四重鎖は、１２０ヌクレオチドのポリＡテールを単独で使用したときに見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
【０４７７】
開始コドン領域
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、開始コドン領域と類似した、またはそれと同様に機能する領域を有し得る。
【０４７８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで始まっても良い。ポリヌクレオチドの翻訳は、限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの代替開始コドンで始まり得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｏｕｒｉｏｌら．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９５（２００３）１６９−１７８、及びＭａｔｓｕｄａ及びＭａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照のこと）。非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は代替開始コドンＡＣＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は代替開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧで始まる。更に別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は代替開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧで始まる。
【０４７９】
翻訳を開始するコドン、例えば、限定されないが、開始コドンまたは代替開始コドンなどに隣接するヌクレオチドは、翻訳効率、ポリヌクレオチドの長さ及び／または構造に影響を及ぼすことが知られている（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｓｕｄａ及びＭａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照）。翻訳を開始するコドンに隣接する任意のヌクレオチドのマスキングを用いることにより、翻訳開始の位置、翻訳効率、ポリヌクレオチドの長さ及び／または構造を改変し得る。
【０４８０】
一実施形態では、、コドンをマスキングすなわち隠すことにより、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳が開始される可能性を低下させるために、開始コドンまたは代替開始コドンの近位でマスキング剤を用いることができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｓｕｄａ及びＭａｕｒｏが記載しているマスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣ（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１）を参照）。
【０４８１】
別の実施形態では、翻訳が代替開始コドンで開始される可能性を増加させるために、マスキング剤を使用してポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングしても良い。
【０４８２】
一実施形態では、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンより下流の開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳が開始される可能性を増加させるために、マスキング剤を使用して第１の開始コドンまたは代替開始コドンをマスキングしても良い。
【０４８３】
一実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンがｍｉＲ結合部位に対する完全な相補配列内に位置しても良い。ｍｉＲ結合部位の完全な相補配列は、マスキング剤と同様にポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造の制御を補助し得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替開始コドンはｍｉＲ−１２２結合部位に対する完全な相補配列の中央に位置しても良い。開始コドンまたは代替開始コドンは、１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、２０番目のヌクレオチドまたは２１番目のヌクレオチドの後に位置しても良い。
【０４８４】
別の実施形態では、開始コドンでないコドンでポリヌクレオチドの翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチド配列からポリヌクレオチドの開始コドンを除去しても良い。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの次のコドンまたは下流の開始コドン若しくは代替開始コドンで始まり得る。非限定的な例では、下流開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとしての開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧが除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、これにより翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御する、またはその制御を試みるために、下流開始コドン及び／または代替開始コドンに対する少なくとも１つのマスキング剤を更に含んでも良い。
【０４８５】
終止コドン領域
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンはＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから選択され得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは終止コドンＴＧＡと１つの追加的な終止コドンとを含む。更なる実施形態では、この追加的な終止コドンはＴＡＡであっても良い。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは３つの終止コドンを含む。
【０４８６】
シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）はまた、治療的に関連する部位へのポリペプチドの輸送を促進する追加の特徴もコードし得る。タンパク質輸送に役立つこのような特徴の１つは、シグナル配列である。本明細書で使用される場合、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は各々、それぞれのコード領域またはコードされるポリペプチドの５’（すなわちＮ末端）に組み込まれる約９〜２００ヌクレオチド長（３〜６０アミノ酸長）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つ以上の分泌経路を通じた小胞体へのコードされたポリペプチドの輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０４８７】
本発明に利用し得る追加のシグナル配列として、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／に公開されたようなデータベースで教示されるものが挙げられる。米国特許第８，１２４，３７９号、同第７，４１３，８７５号及び同第７，３８５，０３４号に記載されたものもまた本発明の範囲内であり、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４８８】
タンパク質切断シグナル及び部位
例示的実施形態では、本発明のポリペプチド（例えば、抗原ポリヌクレオチド）は、種々のタンパク質切断シグナル及び／または部位を含んでも良い。
【０４８９】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含む少なくとも１つのタンパク質切断シグナルを含んでも良い。タンパク質切断部位は、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端とＣ末端との間の任意の空間、例えば、限定されないが、Ｎ末端とＣ末端との中間、Ｎ末端と中間点との間、中間点とＣ末端との間及びこれらの組み合わせに位置し得る。
【０４９０】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリヌクレオチドが少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナルを含むように操作することができる。コードされたタンパク質切断シグナルは、限定されないが、開始コドンの前、開始コドンの後、コード領域の前、コード領域内、例えば、限定されないが、コード領域の中間、開始コドンと中間点との間、中間点と終止コドンとの間、コード領域の後、終止コドンの前、２つの終止コドンの間、終止コドンの後及びこれらの組み合わせなどを含めた任意の領域に位置し得る。
【０４９１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含む少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナルを含んでも良い。コードされたタンパク質切断シグナルは、プロタンパク質転換酵素（またはプロホルモン転換酵素）、トロンビン及び／または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。
【０４９２】
非限定的な例として、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７４，９３０号及び米国公開第２００９０２２７６６０号は、フューリン切断部位を使用して、細胞のゴルジ体からの発現産物においてＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンを切断している。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドがＧＬＰ−１でないことを条件として、少なくとも１つのタンパク質切断シグナル及び／または部位を含む。
【０４９３】
挿入及び置換
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、種々の置換及び／または挿入を含むことができる。
【０４９４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲが、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／またはストリングを挿入することによって置換され得る。ヌクレオチドの領域及び／またはストリングは、限定されないが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドを含んで良く、ヌクレオチドは天然及び／または非天然であって良い。非限定的な例として、ヌクレオチド群は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドいずれかのストリング及び／またはこれらの組み合わせを含んでも良い。
【０４９５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、限定されないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれか及び／またはこれらの組み合わせなど、２種類の塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／またはストリングを挿入することによって置換されても良い。例えば、５〜８個のアデニン塩基を挿入し、続いて５〜８個のシトシン塩基を挿入することによって５’ＵＴＲを置換しても良い。別の例では、５〜８個のシトシン塩基を挿入し、続いて５〜８個のアデニン塩基を挿入することによって５’ＵＴＲを置換しても良い。
【０４９６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼが認識し得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含んでも良い。非限定的な例として、転写開始部位のすぐ下流（限定されないが、＋１〜＋６など）の領域にある少なくとも１つの核酸を置換することにより、転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換及び／または挿入が生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域の変化は、開始速度に影響を及ぼし、見掛けのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増加させ、及び初期転写中の転写複合体からの短い転写物の解離を増加させ得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｅｂａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換及び／または挿入は配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列の変異を引き起こし得る。
【０４９７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含んでも良い。
【０４９８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは転写開始部位のすぐ下流の領域に少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含んでも良い。非限定的な例として、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のチミン及び／または本明細書に記載するヌクレオチドのいずれかによって置換され得る。
【０４９９】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは開始コドンの上流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含んでも良い。明確化しておくと、開始コドンはタンパク質コード領域の最初のコドンであり、対して転写開始部位は転写の始まる部位であることを当業者は理解されよう。ポリヌクレオチドは、限定されないが、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個または少なくとも８個のヌクレオチド塩基の置換及び／または挿入を含んでも良い。ヌクレオチド塩基は、開始コドン上流の１箇所、少なくとも１箇所、少なくとも２箇所、少なくとも３箇所、少なくとも４箇所または少なくとも５箇所で挿入または置換され得る。挿入及び／または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡまたは全てＣまたは全てＴまたは全てＧ）、２種類の塩基（例えば、ＡとＣ、ＡとＴ、またはＣとＴ）、３種類の塩基（例えば、ＡとＣとＴまたはＡとＣとＴ）または少なくとも４種類の塩基であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチドにおいて、コード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミンまたは本明細書に記載するヌクレオチドのいずれかで置換されても良い。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチドでのグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流かつ開始コドンの前の領域に１個のグアニン塩基が残るように設計されても良い（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔら．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照）。非限定的な例として、転写開始部位の下流であるが開始コドンの上流である１箇所に少なくとも５個のヌクレオチドが挿入されても良く、かつその少なくとも５個のヌクレオチドが同じ種類の塩基であっても良い。
【０５００】
転写後制御モジュレーターの組み込み
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は少なくとも１つの転写後制御モジュレーターを含んでも良い。これらの転写後制御モジュレーターは、限定されないが、小分子、化合物及び調節配列であっても良い。非限定的な例として、転写後制御は、ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によるＧＥＭＳ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｌｕｅｓ：小分子による遺伝子発現モジュレーション）スクリーニング法を用いて特定される小分子を使用して達成することができる。
【０５０１】
転写後制御モジュレーターは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００６０２２７１２号に詳述された方法によってスクリーニングされる遺伝子発現モジュレーターまたは同明細書に記載された遺伝子発現モジュレーターであり得る。翻訳制御に関わるＲＮＡ調節配列を特定する方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０６７７２８号に記載されており、この方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０６５５６１号に記載された、非翻訳領域に依存する遺伝子発現を調節する化合物を特定する。
【０５０２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書のポリヌクレオチドの５’及び／または３’非翻訳領域に位置する少なくとも１つの転写後制御モジュレーターを含んでも良い。
【０５０３】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、未熟翻訳終了を調節するための転写後制御モジュレーターを少なくとも１つ含んでも良い。転写後制御モジュレーターは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０１０１０６号、同第ＷＯ２００６０４４４５６号、同第ＷＯ２００６０４４６８２号、同第ＷＯ２００６０４４５０３号及び同第ＷＯ２００６０４４５０５号に記載された化合物、またはこれら明細書で概説された方法によって見出される化合物であり得る。非限定的な例として、化合物は、未熟翻訳終了を調節するために、２８ＳリボソームＲＮＡの領域に結合され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００４０１０１０６を参照）。
【０５０４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質発現を改変するための転写後制御モジュレーターを少なくとも１つ含んでも良い。非限定的な例として、ＶＥＧＦの発現を、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００５１１８８５７号、同第ＷＯ２００６０６５４８０号、同第ＷＯ２００６０６５４７９号及び同第ＷＯ２００６０５８０８８号に記載の化合物、またはこれら明細書に記載の方法で見出される化合物を使用して調節することができる。
【０５０５】
本発明のポリヌクレオチドは、翻訳を制御するための転写後制御モジュレーターを少なくとも１つ含んでも良い。一実施形態では、転写後制御モジュレーターはＲＮＡ調節配列であっても良い。非限定的な例として、ＲＮＡ調節配列を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００６０７１９０３号に記載の方法によって特定することができる。
【０５０６】
コドン最適化
本発明のＮＡＶに含有されるポリヌクレオチド、その領域若しくは部分またはサブ領域はコドン最適化されいても良い。コドン最適化方法は当該技術分野において既知であり、いくつかの目標のうち１つ以上を達成する取り組みに有用であり得る。このような目標として、標的及び宿主生物でのコドン頻度を一致させ、適切な折り畳みを実現すること、ＧＣ含量にバイアスを付与し、ｍＲＮＡ安定性を高めるまたは二次構造を低減すること、遺伝子構築または発現を損ない得るタンデム反復コドンまたは塩基ラン（ｂａｓｅ  ｒｕｎ）を最小化すること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされるタンパク質において翻訳後修飾部位を除去／付加すること（例えばグリコシル化部位）、タンパク質ドメインを付加、除去またはシャッフルすること、制限部位を挿入または欠失させること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能とするように翻訳速度を調整すること、またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減または消失させることが挙げられる。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは当該技術分野において既知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）のサービス及び／または独自の方法が挙げられる。一実施形態では、最適化アルゴリズムを使用してＯＲＦ配列が最適化される。アミノ酸ごとのコドンの選択肢を表２１に示す。
【０５０７】
【表２１】
0006881813.tif 000865
【０５０８】
本発明のいくつかの実施形態において有益であると考えられ得る特徴を、ポリヌクレオチドの領域によってコードすることができ、そのような領域は、ポリペプチドをコードする領域の上流（５’）でも下流（３’）でも良い。これらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン最適化の前及び／または後にポリヌクレオチドに組み込まれ得る。ポリヌクレオチドが５’及び３’フランキング領域を両方とも含有する必要はない。このような特徴の例として、限定されないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列及び検出可能タグが挙げられ、更にＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位が含まれ得る。
【０５０９】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ領域をフランキング領域としても良い。フランキング領域には、複数の５’または３’ＵＴＲが含まれても良く、それらは同じ配列であっても、異なる配列であっても良い。フランキング領域の任意の一部がコドン最適化されていても良く（どれもコドン最適化されない場合を含む）、いずれもコドン最適化の前及び／または後に、独立して１つ以上の異なる構造的または化学修飾を含んでも良い。
【０５１０】
ポリヌクレオチド成分は、（所望であれば）最適化の後に、例えば、限定されないがプラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体などのベクターに再構成され、転換される。例えば、最適化されたポリヌクレオチドが化学的形質転換能を持つ大腸菌、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに再構成及び転換されても良く、このとき本明細書に記載の方法によってプラスミド様構造または染色体構造の高コピー化が生じる。
【０５１１】
合成ポリヌクレオチド及びそれらの核酸アナログは、生化学的過程の研究及び試験において重要な役割を果たす。ポリヌクレオチド及び核酸、特に本発明のＮＡＶの特長であるポリヌクレオチド及び核酸を合成するため、以下に記載する、酵素補助的な及び化学物質を用いた様々な方法が開発されている。
【０５１２】
合成：酵素的方法
インビトロ転写−酵素合成
本明細書に記載するポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を使用して転写することができる。この系は通常、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮアーゼ阻害剤及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは自家で製造しても良く、供給業者から選択しても良く、または本明細書に記載のように合成ＮＴＰは、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含めた、本明細書に記載されるものから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ及び突然変異ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド（例えば、修飾核酸）を組み込むことが可能なポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。
【０５１３】
合成に有用なＲＮＡポリメラーゼ
本発明のポリヌクレオチドの合成には、任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたは変異体を使用して良い。
【０５１４】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または欠失させることによって修飾され得る。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の増加を示すように修飾され得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号及び米国特許第８，１０１，３８５号を参照）。
【０５１５】
変異体は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸及び／または核酸配列を最適化することにより、及び／または当該技術分野において既知の他の方法を使用することにより得ることができる。非限定的な例として、Ｅｓｖｅｌｔら（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３）によって提示された連続的な誘導発生系を使用してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体を発生させても良く、ここでのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、限定されないが、スレオニンを置換する９３位のリジン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆなどの少なくとも１つの突然変異をコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００１２００２４号及び同第２００７０１１７１１２号に記載された少なくとも１つの変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼの変異体としては、置換変異体、保存的アミノ酸置換、挿入変異体、欠失変異体及び／または共有結合誘導体も含み得るが、これらに限定されない。
【０５１６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型または変異ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計されても良い。その際にポリヌクレオチドは、野生型または親ポリヌクレオチドから配列が変化した部位または領域を含有するように修飾され得る。
【０５１７】
ポリメラーゼを利用した酵素的方法により、ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応を実施しても良い。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖中のヌクレオチド間でのホスホジエステル結合の生成を触媒する。現在既知であるＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列の比較及び結晶構造解析に基づいて種々のファミリーに分類することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のクレノウ断片、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属ＤＮＡポリメラーゼＩ、テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７  ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）またはＡポリメラーゼファミリーが、それらのファミリーの中で最も研究が進んでいるものである。もう一つの大きなファミリーは、あらゆる真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼならびにファージＴ４及びＲＢ６９由来のポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ  α）またはＢポリメラーゼファミリーである。これらは類似した触媒機構を用いるが、これらのポリメラーゼファミリーは基質特異性、基質アナログ組み込み効率、プライマー伸長の程度及び速度、ＤＮＡ合成様式、エキソヌクレアーゼ活性、及び阻害剤に対する感受性の点で異なる。
【０５１８】
ＤＮＡポリメラーゼはまた、反応温度、ｐＨ、ならびに鋳型及びプライマー濃度などの、それが必要とする最適反応条件に基づいて選択される。所望するＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するため、２つ以上のＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが用いられることもある。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、ｐＨを上げ、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減らし、伸長時間を増やし、３’から５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性の二次ＤＮＡポリメラーゼを利用して、クローニングしたインサート及びヒトゲノムＤＮＡから長い標的を有効に増幅させている（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎｇら，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９１，５６９５−５６９９（１９９４））。生化学及び生物物理学研究用のＲＮＡの調製には、バクテリオファージＴ３、Ｔ７及びＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼが広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素及びポリＡポリメラーゼは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中のＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５４６３５（Ｍ０３２）に開示されている。
【０５１９】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの合成に使用し得るＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼである（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３を参照）。Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、近年Ｚｈｕらによって海洋シアノファージＳｙｎ５から特性決定されたものであり、ここでＺｈｕらはプロモーター配列も特定している（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３を参照）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して広範な温度及び塩分濃度にわたってＲＮＡ合成を触媒したことを見出した。加えて、プロモーターでの開始ヌクレオチドの要件について、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較してＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼにおいてはストリンジェンシーが低いことが見出されており、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ合成に有望となっている。
【０５２０】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの合成にＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用しても良い。非限定的な例として、正確な３’末端を必要とするキメラポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用しても良い。
【０５２１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの合成にＳｙｎ５プロモーターを使用しても良い。非限定的な例として、Ｓｙｎ５プロモーターは、Ｚｈｕら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３）によって記載された、５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号９６６）であっても良い。
【０５２２】
一実施形態では、本明細書に記載する及び／または当該技術分野で既知の少なくとも１つの化学修飾を含むキメラポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用しても良い（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３に記載の擬似ＵＴＰ及び５Ｍｅ−ＣＴＰの組み込みを参照）。
【０５２３】
一実施形態では、本明細書に記載されるキメラポリヌクレオチドは、Ｚｈｕら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３）によって記載された、修正及び改善された精製手順を用いて精製されたＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成しても良い。
【０５２４】
遺伝子工学における種々のツールは、鋳型として機能する標的遺伝子の酵素的な増幅に基づいている。目的とする個々の遺伝子または特定の領域の配列の調査及びその他の研究ニーズでは、少量のポリヌクレオチドまたは核酸試料から複数の標的遺伝子コピーを作成することが必要とされる。そのような方法を本発明のポリヌクレオチドの製造に適用しても良い。
【０５２５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的遺伝子の高速増幅ならびにゲノムマッピング及びシーケンシングに幅広く応用されている。ＤＮＡ合成の重要な要素は、鋳型としての標的ＤＮＡ分子、標的ＤＮＡ鎖の末端に対して相補的なプライマー、構成要素としてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。変性、アニーリング及び伸長ステップを通じてＰＣＲが進行するにつれ、新規に産生されたＤＮＡ分子が次の周期の複製の鋳型として機能することができ、標的ＤＮＡの指数関数的増幅が達成される。ＰＣＲには、変性とアニーリングのために加熱と冷却のサイクルが必要である。基本的なＰＣＲの変形法として、非対称ＰＣＲ（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｎｉｓら，ＰＮＡＳ，８５号，９４３６−９４４０（１９８８））、インバースＰＣＲ（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｃｈｍａｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０巻（３），６２１−６２３，１９８８））、及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｅｍａｎら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６巻（１），１１２−２２，１２４−５（１９９９））が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＴ−ＰＣＲでは、一本鎖ＲＮＡが所望する標的であり、最初に逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。
【０５２６】
ＰＣＲを代替または補完するものとして、種々のインビトロ等温核酸増幅技術が開発されている。例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限酵素がニックを形成する能力に依拠している（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｋｅｒら，ＰＮＡＳ，８９巻，３９２−３９６（１９９２））。制限酵素の認識配列がアニールされたプライマー配列に挿入される。ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰによってプライマーが伸長され、二重鎖を形成する。二重鎖の一方の鎖のみが制限酵素によって切断される。それにより一本鎖の各鎖を、後続の合成のための鋳型として利用できるようになる。ＳＤＡは、ＰＣＲの複雑な温度制御サイクルを必要としない。
【０５２７】
転写媒介性増幅（ＴＭＡ）とも称される核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）もまた、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの組み合わせを利用する等温増幅方法である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３５０巻，９１−９２（１９９１））。標的ＲＮＡが鋳型として用いられ、逆転写酵素がその相補ＤＮＡ鎖を合成する。ＲＮアーゼＨによってＲＮＡ鋳型が加水分解されると、ＲＮＡ標的に相補的である第１のＤＮＡ鎖に対して相補的なＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼが合成するための空間が作られ、ＤＮＡ二重鎖が形成される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、このＤＮＡ二重鎖の相補ＲＮＡ鎖を連続的に生成する。これらのＲＮＡ鎖が新しいＤＮＡ合成サイクルの鋳型として機能し、その結果、標的遺伝子の増幅が生じる。
【０５２８】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は一本鎖環状ポリヌクレオチドを増幅するもので、多数の等温酵素合成過程が関わり、ここではΦ２９ＤＮＡポリメラーゼが、ポリヌクレオチド環の周りに連続して進行し、その配列を何度も繰り返し複製することによりプライマーを伸長する。したがって、環状鋳型の直鎖状コピーが実現する。次いで、この直鎖状コピーとプライマーをアニールすることができ、その相補鎖を合成できる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｚａｒｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９巻，２２５−２３２（１９９８））。一本鎖環状ＤＮＡはまた、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でのＲＮＡ合成の鋳型としての役割も果たし得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋら，ＪＡＣＳ，１１７巻，７８１８−７８１９（１９９５））。インバースｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＲＣＡは、Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４１巻，３５−４２（２００６））により記載されている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がｃＤＮＡに逆転写され、続いてＲＮアーゼＨ処理によってｃＤＮＡが分離される。次にｃＤＮＡをＣｉｒｃＬｉｇａｓｅによって環状化させると、環状ＤＮＡとなる。得られた環状ＤＮＡの増幅はＲＣＡによって行われる。
【０５２９】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）の１つ以上の領域の製造に、前述の方法のいずれを利用しても良い。
【０５３０】
ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）のリガーゼによるアセンブリも広く用いられている。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成によるポリヌクレオチド鎖の５’及び３’末端の分子間ライゲーションを促進する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つの隣接するポリヌクレオチドプローブが標的遺伝子の一方の鎖とハイブリダイズし、リガーゼによって互いにカップリングするという原理に基づいた有望な診断技術である。標的遺伝子が存在しない場合、または標的遺伝子に一塩基多型（ＳＮＰ）などのミスマッチがある場合、プローブはリガーゼ結合できない（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｅｄｍａｎｎら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，３巻（４），ｓ５１−ｓ６４（１９９４））。ＬＣＲは、検出感度を向上させるため、またはそれがポリヌクレオチド及び核酸の合成に使用される場合には産物量を増加させるために、様々な増幅技術と組み合わされる場合がある。
【０５３１】
現在、いくつかの核酸用ライブラリ調製キットが市販されている。それらのキットは、少量の核酸試料を下流適用のためインデックス付きのライブラリに変換する酵素及び緩衝液を含む。例えば、ＤＮＡ断片をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）によるＮＥＢＮＥＸＴ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（商標）ＤＮＡライブラリ調製キット内に置き、末端調製、ライゲーション、サイズ選択、クリーンアップ、ＰＣＲ増幅及び最終クリーンアップを行うことができる。
【０５３２】
増幅技術の改善のため、継続的な開発が続けられている。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓａｄａらに対する米国特許第８，３６７，３２８号は、反応エンハンサーを利用してＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の効率を増加させることを教示している。この反応エンハンサーは酸性物質または酸性物質のカチオン性錯体を含む。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉらに対する米国特許第７．３８４，７３９号は、酵素的ＤＮＡ合成を促進するカルボン酸イオン供給物質を教示し、ここでカルボン酸イオン供給物質は、シュウ酸、マロン酸、シュウ酸エステル、マロン酸エステル、マロン酸塩及びマレイン酸エステルから選択される。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｂｅｋらに対する米国特許第７，３７８，２６２号は、ＤＮＡ増幅の忠実度を増加させるための酵素組成物を開示している。この組成物は、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性は有しない１つの酵素と、ポリメラーゼであるもう１つの酵素とを含む。これらの酵素はいずれも熱安定性であり、より低温で不活性であるように可逆的に修飾される。
【０５３３】
その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｔｔｓらに対する米国特許第７，５５０，２６４号は、オリゴデオキシヌクレオチドテールをｃＤＮＡ分子の３’末端に連結し、ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写を開始することによりセンスＲＮＡ分子の複数の合成過程を実施することを教示している。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｈａｙｅｍに対する米国特許公開第２０１３／０１８３７１８号は、一本鎖ＤＮＡ鋳型に対してＲＮＡポリメラーゼ活性を呈するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によるＲＮＡ合成を教示している。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｎｅｒに対する米国特許第６，６１７，１０６号に開示されるように、非標準ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを、非標準ヌクレオチドを含む鋳型をその鋳型のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの混合物と接触させることによって酵素重合で合成することができる。
【０５３４】
合成：固相化学合成
本発明のキメラポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、全体的にまたは部分的に固相法を用いて製造して良い。
【０５３５】
ポリヌクレオチドまたは核酸の固相化学合成は自動化された方法であり、この方法では分子が固体支持体上に固定化され、反応物溶液中で段階的に合成される。不純物及び過剰な試薬は洗い流され、各ステップ後の精製は不要である。プロセスが自動化されているため、コンピュータ制御された固相合成機に適している。固相合成により、比較的大規模でのポリヌクレオチドまたは核酸の迅速な産生が可能となり、一部のポリヌクレオチドまたは核酸が商用利用されるようになっている。更に固相合成は、ポリヌクレオチドまたは核酸配列における化学修飾の部位特異的な導入に有用である。固相合成は天然核酸の修飾誘導体の設計に不可欠な手段である。
【０５３６】
自動化された固相合成では、鎖は３’から５’方向に合成される。ヌクレオシドの３’末端のヒドロキシ基は、化学的に切断可能なまたは光切断可能なリンカーによって固体支持体に係留される。活性化したヌクレオシドモノマー、例えば２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ）または化学修飾ヌクレオシドが、支持体に結合されたヌクレオシドに順次付加される。現在最も広く利用されているモノマーは、ヌクレオシド構成要素の３’−ホスホラミダイト誘導体である。活性化モノマーの３’リン原子が、支持体に結合されたヌクレオシドの５’酸素原子とカップリングし、亜リン酸トリエステルを形成する。副反応を防止するため、５’ヒドロキシ基、３’リン原子上のヒドロキシ基、リボヌクレオシドモノマーにおける２’ヒドロキシ基、及びプリンまたはピリミジン塩基上のアミノ基など、カップリング反応に関与しない全ての官能基は、保護基によって全てブロックされる。次のステップは、亜リン酸トリエステルの酸化によるリン酸トリエステルまたはホスホトリエステルの形成を伴い、ここでリン原子は五価である。次に成長鎖の末端にある５’ヒドロキシ基上の保護基が除去され、進入する活性化モノマー構成要素とのカップリング準備が整う。合成終了時、アンモニアまたは水酸化アンモニウムなどの切断剤が添加されることにより全ての保護基が除去され、固体支持体からポリヌクレオチド鎖が遊離する。光を照射してポリヌクレオチド鎖を切断しても良い。続いて、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または電気泳動により産物を更に精製することができる。
【０５３７】
固相合成では、ポリヌクレオチド鎖はその３’ヒドロキシ基を介して固体支持体に共有結合される。固体支持体は通常、直径５０〜２００μｍの、樹脂とも称される不溶性粒子である。Ｇｕｚａｅｖにより「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ポリヌクレオチド合成用の固相支持体）」（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｚａｅｖ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３．１．１−３．１．６０（２０１３））で概説されているように、現在、多種多様な樹脂が利用可能である。樹脂の最も一般的な材料としては、高度に架橋したポリスチレンビーズ及びコントロールドポアガラス（ＣＰＧ）ビーズが挙げられる。ビーズの表面は、アミノ基またはアミノメチル基などの官能基を有するように処理して良く、この官能基をリンカーがヌクレオシドを係留するアンカーポイントとして使用することができる。ビーズは、カラム、マルチウェルプレート、マイクロアレイまたはマイクロチップで実施することができる。カラムを用いた形態は、ポリヌクレオチドまたは核酸の比較的大規模な合成が可能である。樹脂は、全ての試薬及び溶媒が自由に通過できるカラム内のフィルタ間に保持される。マルチウェルプレート、マイクロアレイまたはマイクロチップは、低コストの小規模合成向けに設計されている。単一のマイクロアレイチップで最大１００万個のポリヌクレオチドを産生することができる。しかしながら、マイクロチップを用いた合成のエラー率は従来のカラムを用いた方法よりも高い（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｒｏｖｋｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８巻（１９），ｅ１８０（２０１０））。マルチウェルプレートは、異なる配列を持つポリヌクレオチドまたは核酸の同時並列合成が可能である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｎｄｅｌａｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３巻，９８２−９８７（１９９５））。固体支持体上への装填量には限界がある。加えて、伸長が進むにつれ、固体支持体上の成長鎖の形態及び嵩高さが、進入するモノマーと成長鎖の末端基との反応を妨げ得る。したがって、成長鎖に付加できるモノマー数もまた制限される。
【０５３８】
リンカーは、鎖を更に伸長させるために固体支持体に取り付けられる。リンカーは、合成の最後で鎖が固体支持体から切り出されるときを除き、合成過程で使用されるあらゆる試薬に対して安定である。特定のヌクレオシドリンカー、すなわち、Ａ、Ｃ、ｄＴ、ＧまたはＵを有する固体支持体を使用することにより、配列中の１番目のヌクレオチドとしてそれぞれＡ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵを有するポリヌクレオチドを調製することができる。非ヌクレオシドリンカーを有する汎用的な固体支持体は、あらゆるポリヌクレオチド配列に使用することができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｚａｅｖらに対する米国特許第６，６５３，４６８号）。汎用的な支持体向けに様々な非ヌクレオシドリンカーが開発されており、その多くは２つの隣接ヒドロキシ基を有する。例えば、スクシニル基が、よく使われるリンカーである。
【０５３９】
本明細書で使用される場合、リンカーは一群の原子、例えば１０〜１，０００個の原子を指し、限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル及びイミンなどの原子または基から構成され得る。リンカーは、核酸塩基または糖部分の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに取り付けることができる。リンカーは核酸ベースであっても、または非ヌクレオシドであっても良い。リンカーは、核酸配列への組込みを妨害しない程度に十分な長さであり得る。リンカーは、本明細書に記載のように、多量体（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子の連結によるもの）またはコンジュゲートの形成、ならびに治療用分子の投与または標識の組み込みなど、任意の有用な目的に使用することができる。リンカーに組み込むことのできる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリールまたはヘテロシクリル（本明細書に記載するように、それぞれ任意で置換され得る）が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール類（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールのモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコールまたはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、還元剤または光分解を用いて切断できるリンカー内の切断可能部分、例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）などが挙げられるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤、及び／または光分解を使用して切断し得るアミド結合、ならびに例えば酸性または塩基性加水分解によって切断し得るエステル結合が挙げられる。
【０５４０】
カップリング反応による鎖の伸長に必要な活性化モノマー及び成長鎖の官能基を除いて、それ以外の全ての官能基は副反応を回避するために保護されている必要がある。保護及び脱保護の条件、及び適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定することができる。保護基のケミストリーについては、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２版，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載及び／または説明されている。例えば、活性化ヌクレオシドホスホラミダイトモノマー上の５’ヒドロキシ基が４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護されても良く、リン原子上のヒドロキシ基が２−シアノエチルで保護されても良い。Ａ、Ｃ、Ｇ塩基上の環外アミノ基がアシル基で保護されても良い。
【０５４１】
固相合成系では、媒体が不均一であるため、活性化モノマーの反応性が重要である。大多数の固相合成が、上記でその機構について述べた、ホスホラミダイトヌクレオシドを使用している。別の活性化モノマーの例は、ヌクレオシドＨ−ホスホネートである（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｂｒａｍｏｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１８巻，１０６３−１０７５（２０１３））。固相合成系で高収率を確保するためには、大過剰の試薬、例えばモノマー、酸化剤及び脱保護剤が必要である。
【０５４２】
固相合成方法の更なる改善に向けた科学的調査及び研究が続けられている。例えば、十分に確立された３’から５’への合成に代えて、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらに対する米国特許第８，３０９，７０７号及び米国特許公開第２０１３／００７２６７０号は、新規ホスホラミダイト及び新規ヌクレオシド誘導体を利用して、合成ＲＮＡの３’末端での容易な修飾を可能にする５’から３’へのＲＮＡ合成を開示した。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｕｒｃｈらに対するＰＣＴ出願第ＷＯ２０１３１２３１２５号は、複数の部分配列からの標的核酸配列のアセンブリについて記載しており、ここでは部分配列を有する樹脂はエマルジョン液滴中に置かれる。部分配列は樹脂から切り出され、エマルジョン液滴内で集合する。固体支持体のコストを削減するために、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸リンカー（Ｑ−リンカー）による再利用可能なＣＰＧ固体支持体が開発されている（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７巻，１５３１−１５３８（１９９９））。
【０５４３】
固相合成用の新規保護基もまた開発されている。Ｎａｇａｔらは、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）を２’−ヒドロキシ保護基として使用することにより、候補前駆体マイクロＲＮＡの配列を有する１１０ｎｔ長ＲＮＡの合成に成功した（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｂａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５巻，３２８７−３２９６（２００７）。また、ＣＥＭを２’−Ｏ−保護基として、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の配列を含む３３アミノ酸ペプチドをコードする１３０ｎｔのｍＲＮＡが合成されている。この１３０ｎｔの人工ｍＲＮＡの生物学的活性は、無細胞タンパク質合成系及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＧＬＰ−１の産生により示されている（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｇａｔａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８巻（２１），７８４５−７８５７（２０１０）。固相合成モノマー用の新規保護基としては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらに対する米国特許８，３０９，７０６号に開示された炭酸塩保護基、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらに対する米国特許第８，２４２，２５８号に開示されたオルトエステル型２’ヒドロキシ保護基及びアシル炭酸塩型ヒドロキシ保護基、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらに対する米国特許第８，２０２，９８３号に開示された２’−ヒドロキシチオ炭素保護基、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらに対する米国特許第７，９９９，０８７号に開示された２’−シリル含有チオ炭酸塩保護基、Ａｌｖａｒａｄｏに対する米国特許第７，６６７，０３３号に開示されたアミノ保護基としての９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＳ）誘導体、Ｓｃａｒｉｎｇｅらに対する米国特許第５，８８９，１３６号に開示されたフッ化物不安定性５’シリル保護基、及びＧｒｉｆｆｅｙらに対する米国特許公開第２００８／０１１９６４５号に開示されたピキシル保護基が挙げられるが、これらに限定されない。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｂａｒｔらに対する米国特許公開第２０１１／０２７５７９３号は、塩基によって除去できる、リボースの２’位のヒドロキシ保護基を使用したＲＮＡ合成について教示している。新規固体支持体としては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｏｄｙらに対する米国特許第７．４７６，７０９号に教示された重合可能な単位に取り付けられた保護されたヒドロキシポリＣ２−４アルキレンオキシ鎖を含むモノマーで作製されたポリマーが挙げられる。
【０５４４】
合成：液相化学合成
モノマー構成要素の逐次付加による本発明のキメラポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）の合成は液相で行われても良い。モノマー間または成長鎖の末端官能基と進入するモノマーとの間に共有結合が形成される。反応に関与しない官能基は一時的に保護されている必要がある。各モノマー構成要素の付加後、次のモノマー構成要素を付加する前に反応混合物を精製しなければならない。次のモノマー構成要素との反応を可能にするためには、鎖の一方の末端にある官能基が脱保護されなければならない。液相合成は労力及び時間がかかり、自動化することができない。これらの制約にも関わらず、液相合成は短いポリヌクレオチドの大規模調製に依然として有用である。この系は均一性があるため、大過剰の試薬は不要であり、この点で費用対効果が高い。
【０５４５】
合成：合成方法の組み合わせ
上記で述べた合成方法には、それぞれそれ自体の利点及び限界がある。これらの方法を組み合わせて限界を解消する試みが行われている。このような方法の組み合わせは、本発明の範囲内である。
【０５４６】
２〜４ヌクレオチドの短いポリヌクレオチド鎖を液相で調製し、続いて固相合成により固体支持体に結合させ、伸長反応させることができる。ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＰＥＧ）ビーズをモノマー構成要素の支持体として使用する高効率液相（ＨＥＬＰ）合成が開発されている。ＭＰＥＧは塩化メチレン及びピリジン溶媒に可溶性であるが、ジエチルエーテル溶媒中では沈殿する。適切な溶媒を選択することにより、均一液相系においてモノマー間または成長鎖とＭＰＥＧに結合された進入モノマーとの間のカップリング反応を行うことができる。次にジエチルエーテル溶媒で混合物を洗浄して、生成物を容易に沈殿させ精製することができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎｏｒａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８巻，３１５５−３１５９（１９９０）。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｄａｍｏらに対する米国特許第８，３０４，５３２号は、少なくとも一部の試薬が固体支持されているオリゴヌクレオチド溶液相合成について教示している。
【０５４７】
酵素的ライゲーションと組み合わせた固相または液相化学合成の使用により、化学合成単独では得ることのできない長鎖ポリヌクレオチドの効率的な生成方法が得られる。Ｍｏｏｒｅ及びＳｈａｒｐは、化学合成によるＲＮＡ断片１０〜２０ｎｔ長の調製について記載しており、これに部位特異的な修飾を導入して、断片をｃＤＮＡ架橋とアニールし、次いでＴ４  ＤＮＡリガーゼで断片がアセンブリされ得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｏｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６巻，９９２−９９７（１９９２））。
【０５４８】
固相合成機は、ＰＣＲ及び他の増幅技術を実施するのに十分な高純度のポリヌクレオチドまたは核酸を作製することができる。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、市販のマイクロアレイを開発している。ポリヌクレオチドがマイクロアレイ基板上で合成され、強塩基または光によって切断され、続いてＰＣＲ増幅されることにより、ポリヌクレオチドのライブラリが作成され得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌｅａｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１巻（３），２４１−２４７（２００４））。
【０５４９】
合成：小領域合成
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）の領域またはサブ領域はｓｉＲＮＡなどの小さいＲＮＡ分子を含み得るため、これを同様に合成し得る。ｓｉＲＮＡの調製には、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトを使用する化学合成、インビトロ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター及びＰＣＲ発現カセットなど、いくつかの方法がある。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）はｓｉＲＮＡ供給業者の一つであり、２’位がｔ−ブチルメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトモノマーを使用してそのｓｉＲＮＡを合成している。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）のＵｌｔｒａ  Ｆａｓｔ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＵＦＰＳ）及びＵｌｔｒａ  Ｆａｓｔ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＵＦＰＤ）で固相化学合成を行うことにより、高いカップリング効率及び迅速な脱保護が実現される。最終的なｓｉＲＮＡ産物はＨＰＬＣまたはＰＡＧＥで精製され得る。このような方法を、キメラポリヌクレオチドの領域またはサブ領域の合成に使用して良い。
【０５５０】
ベクターまたはＰＣＲ生成ｓｉＲＮＡカセットからのインビトロ転写及び発現には、ｓｉＲＮＡの産生に適した鋳型が必要である。市販のＡｍｂｉｏｎ（登録商標）ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットはＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によってｓｉＲＮＡを作製するものであり、必要な酵素、緩衝液、プライマーが含まれている。このような方法を、キメラポリヌクレオチドの領域またはサブ領域の合成に使用して良い。
【０５５１】
合成：ポリヌクレオチド領域またはサブ領域のライゲーション
キメラポリヌクレオチド及び／または環状ポリヌクレオチドなどの本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特徴である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、１つ以上の領域またはサブ領域のライゲーションにより調製しても良い。
【０５５２】
ライゲーションは、ポリヌクレオチドまたは核酸断片をアセンブリしてより大きい構築物にするために不可欠な手段である。ＤＮＡ断片をリガーゼ触媒反応によって接合することにより、種々の機能の組換えＤＮＡを作製することができる。１つが５’ホスホリル基を有し、もう１つが遊離３’ヒドロキシ基を有する２つのオリゴデオキシヌクレオチドが、ＤＮＡリガーゼに対する基質として作用する。蛍光または化学発光標識を有するオリゴデオキシヌクレオチドもまた、ＤＮＡリガーゼ基質として作用し得る（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２巻，１４−１８（１９９６））。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼなどのＲＮＡリガーゼは、２つの一本鎖オリゴリボヌクレオチド間またはＲＮＡ断片間でのリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。大型ＤＮＡ構築物のコピーが、ポリヌクレオチド断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼの組み合わせで合成されている。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｇｎａｔｏｖらに対する米国特許公開第２００９／０１７００９０号は、ＤＮＡポリメラーゼに加えてＤＮＡリガーゼを使用することによる、ＰＣＴの改善、特に長距離ＰＣＲ及び／または低コピーＤＮＡ鋳型ＰＣＲ増幅の収率向上について開示している。
【０５５３】
リガーゼを他の酵素と共に使用して、所望のキメラポリヌクレオチドまたは核酸分子を調製し、及びゲノム解析を実施しても良い。例えば、ライゲーションを媒介した選択的ＰＣＲ増幅が、Ｋａｔｏに対する欧州特許公開第０７３５１４４号に開示されている。組織由来または細胞由来のＲＮＡから逆転写された相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＤＮＡが、ＩＩＳ型制限酵素によって断片に消化される（この内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。大腸菌ＤＮＡリガーゼによって、この断片にビオチン化アダプター配列が結合する。次に、このビオチン標識されたＤＮＡ断片が、下流分析のためのストレプトアビジンでコーティングされたビーズに固定化される。
【０５５４】
ライゲーションスプリントまたはライゲーションスプリントオリゴとは、リガーゼまたはリガーゼ活性を有する別の酵素を使用して１つの核酸の両端を接合（すなわち分子内接合）するか、または２つの核酸の両端を接合（すなわち分子間接合）するためのアニーリング部位またはライゲーション鋳型を提供するために用いられるオリゴヌクレオチドである。ライゲーションスプリントは互いに隣接する末端を保持し、ライゲーションされる５’−リン酸化末端と３’−ヒドロキシ化末端との間にライゲーション接合部を生成する。
【０５５５】
一実施形態では、スプリントで媒介されるライゲーション、すなわちスプリントライゲーション方法を使用して、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを合成しても良い。キメラポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１２１３８４５３号に記載されている方法のような制限エンドヌクレアーゼ切断部位の存在に依存しない方法を使用してアセンブリしても良い。スプリントで媒介されるライゲーションは、制御された連結を使用して構築物の迅速な合成が可能であり、更に接合領域での制限部位の導入を必要としないか、あるいは必要な場合でも限定的である。非限定的な例として、少なくとも１つの非翻訳領域をキメラポリヌクレオチドのコード領域に付加するためにスプリントライゲーションを使用しても良い。一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを合成する際に、スプリントライゲーションを他の合成方法と組み合わせて使用しても良い。
【０５５６】
核酸の５’−リン酸化末端と３’−ヒドロキシ末端とがライゲーションされる場合に、各末端が隣接するように末端がライゲーションスプリントにアニールされるとき、限定されないが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、Ｔｔｈ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡリガーゼまたはＴｓｃ  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｋａｒｉａ）などの酵素を使用することができる。Ｆａｒｕｇｕｉは米国特許第６，３６８，８０１号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼがＲＮＡスプリントとハイブリダイズしたとき互いに隣接するＤＮＡ分子の末端を効率的にライゲーションし得ることを開示している。このように、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡを含むライゲーションスプリントオリゴでＤＮＡ末端を接合するために好適なリガーゼである。ＲＮＡスプリントの例として、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｈｌらに対する米国特許第８，１３７，９１１号及び米国特許公開第２０１２／０１５６６７９号に開示されたＤＵＲＡＳＣＲＩＢＥ（登録商標）Ｔ７転写キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して作製される２’−フッ素−ＣＴＰ（２’−Ｆ−ｄＣＴＰ）及び２’−フッ素−ＵＴＰ（２’−Ｆ−ｄＵＴＰ）を含有する修飾ＲＮＡが挙げられる。ＤＵＲＡＳＣＲＩＢＥ（登録商標）Ｔ７転写キットから産生される修飾ＲＮＡは、ＲＮアーゼＡ消化に対して完全な耐性を有する。ＤＮＡスプリント及びＤＮＡリガーゼは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｓｔａｋらに対する米国特許第６，２５８，５５８号に開示されたＲＮＡ−タンパク質融合物の生成に使用しても良い。
【０５５７】
直鎖状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションについて、Ｋｏｏｌらに対する米国特許第７，９０６，４９０号は、ＤＮＡ合成機で直鎖状オリゴデオキシヌクレオチド断片を作製し、続いてＴ４  ＤＮＡリガーゼ及び２つの３０ヌクレオチドのスプリントオリゴヌクレオチドを用いてライゲーションすることによる８３ヌクレオチド環の構築を教示している。直鎖状センスプロモーターを含有するｃＤＮＡの環状化が、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｈｌらに対する米国特許公開第２０１２／０１５６６７９号に開示されている。ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｋａｚｙｍｅ）は、サーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）を感染させるファージＴＳ２１２６に由来するものであり、ＤＮＡ及びＲＮＡのＡＴＰ依存性分子内及び分子間ライゲーションを触媒する。
【０５５８】
ホスホラミダイトモノマーを使用する固相化学合成方法は短鎖のＤＮＡ分子の産生に限られる。長さが１５０塩基を超えると、ＤＮＡ産物の純度及び反応の収率が低下する。長いポリヌクレオチドを高収率で合成するには、化学合成と並行して酵素的ライゲーション方法を使用する方が好都合である。例えば、Ｍｏｏｒｅ及びＳｈａｒｐは、化学合成によるＲＮＡ断片１０〜２０ｎｔ長の調製について記載しており、これに部位特異的な修飾が導入されても良く、断片をｃＤＮＡスプリントにアニールした後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて断片をアセンブリしても良い（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｏｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６巻，９９２−９９７（１９９２））。大型の合成ＲＮＡを作成するためのオリゴリボヌクレオチドとＴ４  ＲＮＡリガーゼ及びＤＮＡスプリントまたはポリリボヌクレオチドとのライゲーション反応については、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０巻（１６），４３７２（１９９２）、Ｓｔａｒｋら，ＲＮＡ、１２巻，２０１４−２０１９（２００６）、及びＤｅｒａｓらに対する米国特許出願第２００５／０１３０２０１号に記載されている。固相方法で合成されたオリゴヌクレオチドには、多くの場合、酵素付加によって５’−キャップ及び３’−ポリＡテールが付加される。非限定的な例として、Ｉｗａｓｅらによる記載のように、酵素的にライゲーションされた３つの断片として合成キャップ付き４２ｍｅｒ  ｍＲＮＡが合成されている（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０巻，１６４３−１６４８（１９９２））。別の例として、６００個のオーバーラップする６０ｍｅｒポリヌクレオチドから１６．３キロベースのマウスミトコンドリアゲノムが作製されている。この方法をインビトロ組換えと増幅との間で、所望の長さに達するまで繰り返すことができる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｂｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７巻，９０１−９０３（２０１０））。１．０８メガベースのマイコプラズマ・ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）ＪＣＶＩ−ｓｙｎ１．０ゲノムのアセンブリもまた報告されている。非限定的な例として、ポリヌクレオチド合成機から化学的に生成されたポリヌクレオチド断片をアセンブリすることにより、１０８０ｂｐカセットが産生される。次に、酵母での形質転換及び相同組換えによってゲノムが３段階でアセンブリされる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｂｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２９巻，５２−５６（２０１０））。
【０５５９】
短いＤＮＡ断片を化学的リンカーで結合する研究が実施されている。アジドとアルキンとの間の環化付加反応である「クリック」ケミストリーまたは「クリック」ライゲーションは、穏やかな反応条件、高収率及び無害な副産物などのその利点から、多くの関心を集めている。「クリック」ケミストリーについては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２４巻（３），２８９−３０２（２００９）にＮｗｅらにより概説されている。クリックライゲーションによって最大３００塩基長のＤＮＡ構築物が作製されており、更に長い配列が実現可能である。ＰＣＲデータでの実証によれば、様々なＤＮＡポリメラーゼが、環化付加反応から断片間にトリアゾールリンカーが生じるにも関わらず、クリックライゲーションによって作製された合成ＤＮＡ構築物を増幅する能力を有する。合成ＤＮＡ構築物に対し、インビトロ転写及びローリングサークル増幅もまた実施することができる。最大１００ヌクレオチド長のヘアピンリボザイム及び環状ミニＤＮＡ二重鎖もまた、クリックライゲーションで調製されている（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５巻（８），１２５８−１２６７（２０１２））。
【０５６０】
固体基板上で連続ライゲーションを実施することができる。例えば、ビオチンで末端が修飾された初期リンカーＤＮＡ分子を、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに結合する。リンカーＤＮＡ分子の３’末端は、進入するＤＮＡ断片の５’末端と相補的である。各ライゲーションステップ後にビーズを洗浄及び収集し、最終的な直鎖状構築物をメガヌクレアーゼによって遊離させる。この方法は、遺伝子を最適化された順序及び向きで迅速かつ効率的にアセンブリすることを可能にする（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｋｉｔａ，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０巻（４），１−１０（２０１３））。固体支持体上で合成される標識ポリヌクレオチドについては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｌｏｖｅｉｃｈｉｋらに対する米国特許公開第２００１／００１４７５３号明細書及びＶｉｎａｙａｋらに対する米国特許公開第２００３／０１９１３０３号に開示されている。
【０５６１】
定量
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）は、エクソソーム内で、または１つ以上の体液から得られたときに定量され得る。本明細書で使用される場合、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛髪、涙、嚢胞液、胸水及び腹水、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌物、便汁、膵液、副鼻腔洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、及び臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓及び胎盤からなる群から選択される器官から抽出され得る。
【０５６２】
エクソソーム定量法では、対象から２ｍＬを超えない試料が採収され、サイズ排除クロマトグラフィ、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外ろ過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはこれらの組み合わせによってエクソソームが単離される。分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、非存在、トランケーションまたは改変であり得る。そのレベルを１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーのアッセイと相関させることが有利である。アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析またはこれらの組み合わせを使用して実施して良く、一方エクソソームは酵素結合免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法などの免疫組織化学的方法を用いて単離して良い。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィ、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外ろ過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはこれらの組み合わせによって単離されても良い。
【０５６３】
これらの方法により、残存するまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルを研究者がリアルタイムでモニターすることが可能となる。これが可能であるのは、本発明のポリヌクレオチドは構造的または化学的修飾に起因して内因性形態と異なっているためである。
【０５６４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量されても良い。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ポリヌクレオチドが適切なサイズであり得るかどうかを決定し、更にポリヌクレオチドの分解が生じていないことを確認するために、定量されたポリヌクレオチドを分析することができる。ポリヌクレオチドの分解は、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣを用いた精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認することができる。
【０５６５】
精製
本明細書に記載する本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＮＡＶの特長である、抗原をコードするポリヌクレオチド）の精製には、限定されないが、ポリヌクレオチドクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得る。クリーンアップは、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ、Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣを用いた精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などの当該技術分野において既知の方法によって実施されても良い。「精製された」という用語は、「精製ポリヌクレオチド」など、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。本明細書で使用される場合、「夾雑物」は、別の物質を不適性、不純または劣性にする何らかの物質である。したがって、精製ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見られるのとは異なった形態または状況か、あるいは治療または精製方法を施す以前に存在していたのとは異なる形態または状況で存在する。
【０５６６】
品質保証及び／または品質管理チェックが、限定されないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度または解析的ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施されて良い。
【０５６７】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によってシーケンシングされても良い。
【０５６８】
ＩＶ．修飾
例示的実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（たとえば、本発明のＮＡＶの特長である抗原をコードするポリヌクレオチド）は種々の置換及び／または挿入を含むことができる。
【０５６９】
実施例で提示されるデータは本発明の製剤を用いて有意に向上した免疫応答を明らかにしている。データは、本発明の化学的に修飾された及び未修飾のＲＮＡワクチン双方の有効性を実証した。驚くべきことに、担体で製剤化された化学的に未修飾のｍＲＮＡをワクチンの製造に使用することが好ましかった従来技術の報告とは対照的に、本明細書では、化学的に修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰは未修飾のｍＲＮＡよりもはるかに少ない、すなわち、未修飾のｍＲＮＡよりも１０倍少ない有効ｍＲＮＡの用量を必要とすることが発見された。
【０５７０】
さらに、本明細書に記載されている試験には、マウスの静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）のワクチン接種、とその後の致死量のウイルスの負荷が関与した。ワクチン接種された動物のすべての動物が致死量後生存したのに加えて、タンパク質抗原及び他の脂質系製剤（リポプレックス）に比べて、有意に強い早期の免疫応答が観察された（ウイルス中和アッセイ及びＨＡ阻害（ＨＡＩ）を介した抗ウイルス活性）。データは、化学的に修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を投与された（ＩＤまたはＩＭ）動物の双方の群がワクチン接種後１週間という早期に、それぞれ６０及び１１４で４０を超えるＨＡＩ力価を示すことを明らかにした。４０を超えるＨＡＩ力価はインフルエンザの致死性負荷から保護するのに十分であると思われる。特に、ワクチン接種後１週間目及び３週間目でさえ４０未満の不十分なＨＡＩ力価を示し続けたタンパク質抗原及び他の脂質担体（リポプレックス）で製剤化されたｍＲＮＡワクチンで見られた応答と比べると、迅速な応答は予想外だった。
【０５７１】
その後の時点（３週及び５週）のそれぞれで、本発明の製剤はタンパク質抗原よりも有意に強力な治療応答を提供し続けた。実際、ＩＶ経路で投与された化学的に未修飾のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤でさえタンパク質抗原に関して向上したＨＡＩ力価を有した。１週目及び３週目で４０未満のＨＡＩ力価を示し続けたタンパク質抗原に比べて、ＩＭまたはＩＤ投与によってｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を受け取けた動物はすべて３週までに４０を超えるＨＡＩ活性を示した。５週までに、ＩＤ経路で投与された化学的に修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、その時点でのタンパク質抗原についての４００前後のＨＡＩ力価とは対照的に、１０，０００を超える驚くべきＨＡＩ活性を有した。
【０５７２】
本発明の化学的に修飾された及び未修飾のＲＮＡワクチンは双方とも、異なる脂質担体（リポプレックス）で製剤化したｍＲＮＡワクチンよりも良好な免疫応答を生じた。５週目で、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤によって達成されたもの（６３５〜１０，１５２のＨＡＩ力価）に比べて、化学的に未修飾のｍＲＮＡ−リポプレックスワクチンは１９７のＨＡＩ力価を生じた。他のあらゆる時点で、及び化学的に修飾されたｍＲＮＡ−リポプレックスワクチンすべてについて、ＨＡＩ力価はどれも４０を超える臨界レベルに達しなかった。さらに、ｍＲＮＡ−リポプレックスワクチンはワクチン接種の５週後の遅い時期でさえ、マイクロ中和アッセイにて検出可能な中和活性を生じなかった。
【０５７３】
ポリヌクレオチド（たとえば、キメラポリヌクレオチド、ＩＶＴポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチド）において本明細書で使用されるとき、「化学修飾」または適切な場合「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、その位置、パターン、百分率または集団の１以上における修飾を指す。一般に本明細書では、これらの用語は、天然に存在する５’末端のｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチドの修飾を指すようには意図されない。
【０５７４】
ポリペプチドでは、「修飾」という用語は２０アミノ酸の標準的なセットに比べた修飾を指す。
【０５７５】
修飾は種々の異なる修飾であっても良い。いくつかの実施形態では、領域は１、２、またはそれ以上の（任意で異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチドの修飾を含有しても良い。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾されたポリヌクレオチドは未修飾のポリヌクレオチドに比べて細胞にて低下した分解を示し得る。
【０５７６】
本発明にて有用であるＮＡＶのポリヌクレオチドの修飾には表２２におけるものが挙げられるが、これらに限定されない。表にて言及されるのは、修飾の記号、核酸塩基の種類及び修飾が天然に存在するかどうかである。
【表２２−１】
0006881813.tif 000866
【表２２−２】
0006881813.tif 000867
【表２２−３】
0006881813.tif 000868
【表２２−４】
0006881813.tif 000869
【表２２−５】
0006881813.tif 000870
【表２２−６】
0006881813.tif 000871
【表２２−７】
0006881813.tif 000872
【表２２−８】
0006881813.tif 000873
【表２２−９】
0006881813.tif 000874
【表２２−１０】
0006881813.tif 000875
【表２２−１１】
0006881813.tif 000876
【表２２−１２】
0006881813.tif 000877
【表２２−１３】
0006881813.tif 000878
【表２２−１４】
0006881813.tif 000879
【表２２−１５】
0006881813.tif 000880
【表２２−１６】
0006881813.tif 000881
【表２２−１７】
0006881813.tif 000882
【表２２−１８】
0006881813.tif 000883
【表２２−１９】
0006881813.tif 000884
【表２２−２０】
0006881813.tif 000885
【０５７７】
本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドで有用であり得る他の修飾を表２３に列挙する。
【表２３−１】
0006881813.tif 000886
【表２３−２】
0006881813.tif 000887
【表２３−３】
0006881813.tif 000888
【表２３−４】
0006881813.tif 000889
【０５７８】
ＮＡＶのポリヌクレオチドはヌクレオシド間に任意の有用なリンカーを含むことができる。主鎖の修飾を含むそのようなリンカーを表２４にて提供する。
【表２４−１】
0006881813.tif 000890
【表２４−２】
0006881813.tif 000891
【０５７９】
本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドは、たとえば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合への（たとえば、連結するリン酸への／ホスホジエステル結合への／ホスホジエステル主鎖への）任意の有用な修飾を含むことができる。ピリミジン核酸塩基の１以上の原子が、任意で置換されたアミノ、任意で置換されたチオール、任意で置換されたアルキル（たとえば、メチルまたはエチル）またはハロ（たとえば、クロロまたはフルオロ）によって置き換えられてもよく、または置換されても良い。ある特定の実施形態では、修飾（たとえば、１以上の修飾）は糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本発明に係る修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドへの修飾であっても良い。追加の修飾が本明細書に記載されている。
【０５８０】
非天然の修飾されたヌクレオチドを、たとえば、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドに、または鎖の合成の間のもしくは合成後の核酸に導入して所望の機能または特性を達成しても良い。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基またはピリミジン塩基、または糖の上にあっても良い。修飾は、化学合成によってまたはポリメラーゼ酵素によって鎖の末端に、または鎖のどこか別に導入されても良い。たとえば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）はヌクレアーゼ耐性であり、ＲＮＡに対する強いハイブリッド形成を提供する。２つのコドンにてヘキシトール残基を持つ短いメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が構築されている（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＬａｖｒｉｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１１７７７−１１７８４（２００１））。５’及び３’のＨＮＡ配列が隣接するホスホロチオエート中心配列を含むキメラＨＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果も研究されている（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第３２巻（４），４４１１−４４１９（２００４）を参照のこと）。ＲＮＡ干渉、アンチセンス療法または他の応用における６員環を含む修飾されたヌクレオチドの調製及び使用は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎらへの米国特許出願番号２００８／０２６１９０５、同２０１０／０００９８６５及びＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／３００６４にて開示されており、そのそれぞれの内容は全体として参照によって本明細書に組み入れられる。修飾された核酸及びその合成は同時係属ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９（代理人明細書番号Ｍ０９）にて開示されており、その内容は全体として参照によって本明細書に組み入れられる。修飾されたポリヌクレオチドの合成及び戦略はＶｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎによってＡｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第７６巻，９９−１３４（１９９８）にて概説されており、その内容は全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
【０５８１】
酵素的なまたは化学的なライゲーション法のいずれかを用いてポリヌクレオチドまたはその領域、たとえば、蛍光標識、液体、ナノ粒子、送達剤等のような異なる機能ブロックとコンジュゲートすることができる。ポリヌクレオチドのコンジュゲート及び修飾されたポリヌクレオチドは、ＧｏｏｄｃｈｉｌｄによってＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１巻（３），１６５−１８７（１９９０）にて概説されており、
その内容は全体として参照によって本明細書に組み入れられる。Ｖｉｎａｙａｋらへの米国特許第６，８３５，８２７号及び同第６，５２５，１８３号（そのそれぞれの内容は全体として参照によって本明細書に組み入れられる）は、標識された固形支持体を用いた標識されたオリゴヌクレオチドの合成を教示している。
【０５８２】
ある特定の実施形態では、細胞に導入されたポリヌクレオチドを細胞内で分解することが望ましくあり得る。たとえば、タンパク質産生の正確なタイミングが所望であれば、ポリヌクレオチドの分解が好ましくあり得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内にて指示された方法で作動することができる分解ドメインを含有するポリヌクレオチドを提供する。
【０５８３】
ポリヌクレオチドの領域のいずれかを、本明細書で教示されるように、またはそのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年１０月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９（代理人明細書番号Ｍ９）及び２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願番号６１／８３７２９７（代理人明細書番号Ｍ３６）にて教示されたように化学的に修飾しても良い。
【０５８４】
修飾されたポリヌクレオチド分子
本発明はまた構成要素、たとえば、本発明のＮＡＶのポリヌクレオチド分子の修飾されたリボヌクレオシド及び修飾されたリボヌクレオチドも含む。たとえば、これらの構成要素は本発明のポリヌクレオチドを調製するのに有用であることができる。そのような構成要素は、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年１０月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９（代理人明細書番号Ｍ９）及び２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願番号６１／８３７２９７（代理人明細書番号Ｍ３６）にて教示されている。
【０５８５】
糖における修飾
ポリヌクレオチド（たとえば、本明細書に記載されているようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれても良い修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（たとえば、構成要素分子）は、リボ核酸の糖にて修飾することができる。たとえば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）をいくつかの異なる置換基で修飾するまたは置換することができる。２’位における例となる置換には、Ｈ、ハロ、任意で置換されたＣ１−６アルキル；任意で置換されたＣ１−６アルコキシ；任意で置換されたＣ６−１０アリールオキシ；任意で置換されたＣ３−８シクロアルキル；任意で置換されたＣ３−８シクロアルコキシ；任意で置換されたＣ６−１０アリールオキシ；任意で置換されたＣ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、任意で置換されたＣ１−１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（たとえば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されているいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（その際、ＲはＨまたは任意で置換されたアルキルであり、ｎは０〜２０（たとえば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数である）；２’−ヒドロキシルがＣ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレンの架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続される「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（その際、例となる架橋にはメチレン、プロピレン、エーテルまたはアミノの架橋を含んだ）；本明細書で定義されるようなアミノアルキル；本明細書で定義されるようなアミノアルコキシ；本明細書で定義されるようなアミノ；及び本明細書で定義されるようなアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８６】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例となる非限定の修飾されたヌクレオチドには、リボースにおける酸素の置換（たとえば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンのようなアルキレンによる）；二重結合の付加（たとえば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換するために）；リボースの環縮小（たとえば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するために）；リボースの環拡大（たとえば、ホスホルアミデート主鎖も有する無水ヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルフォリノのための追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成するために）；多環形態（たとえば、トリシクロ；及び「アンロックド」形態、たとえば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（たとえば、リボースがホスホジエステル結合に連結されたグリコール単位で置き換えられるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、トレオース核酸（リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置き換えられるＴＮＡ），並びにペプチド核酸（２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボース及びホスホジエステル主鎖を置き換えるＰＮＡ）が挙げられる。糖基は、リボースにおける対応する炭素の構造に比べて対向する立体化学構造を持つ１以上の炭素を含有することもできる。従って、ポリヌクレオチド分子は、糖として、たとえば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。そのような糖の修飾は、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年１０月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９（代理人明細書番号Ｍ９）及び２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願番号６１／８３７２９７（代理人明細書番号Ｍ３６）にて教示されている。
【０５８７】
核酸塩基における修飾
本開示は修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されているように、「ヌクレオシド」は、有機塩基（たとえば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）との組み合わせで糖分子（たとえば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されているように、「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドとして定義される。修飾されたヌクレオチドは、本明細書に記載されているような有用な方法によって（たとえば、１以上の修飾されたまたは非天然のヌクレオシドを含むように化学的に、酵素的に、または組換えで）合成されても良い。ポリヌクレオチドは連結されたヌクレオシドの領域（単数）または領域（複数）を含んでも良い。そのような領域は可変の主鎖結合を有しても良い。結合は標準のホスホジエステル結合であってもよく、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むことになる。
【０５８８】
修飾されたヌクレオチドの塩基対合は、標準のアデノシン／チミン、アデノシン／ウラシルまたはグアノシン／シトシンの塩基対だけでなく、非標準のまたは修飾された塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾されたヌクレオチドの間で形成される塩基対も包含し、その際、水素結合ドナーと水素結合アクセプターの配置は、非標準の塩基と標準の塩基との間、または２つの相補性の非標準の塩基構造の間での水素結合を可能にする。そのような非標準の塩基対合の一例は修飾されたヌクレオチドのイノシンとアデノシン、シトシンまたはウラシルとの間での塩基対合である。
【０５８９】
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含むことができる。ＲＮＡで見いだされる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡで見いだされる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンが挙げられるが、これらに限定されない。そのような修飾された核酸塩基（天然に存在することと天然に存在しないこととの区別を含む）は、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年１０月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９（代理人明細書番号Ｍ９）及び２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願番号６１／８３７２９７（代理人明細書番号Ｍ３６）にて教示されている。
【０５９０】
修飾された糖、核酸塩基及びヌクレオシド間結合の組合せ
本発明のポリヌクレオチド、たとえば、本発明のＮＡＶは糖、核酸塩基及び／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組合せを含むことができる。これらの組み合わせは本明細書に記載されている１以上の修飾を含むことができる。
【０５９１】
修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドの組み合わせの例を以下の表２５にて提供する。修飾されたヌクレオチドの組み合わせを用いて本発明のポリヌクレオチドを形成することができる。特に言及されない限り、修飾されたヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドの天然のヌクレオチドを完全に置換しても良い。非限定例として、天然のヌクレオチドのウリジンは本明細書に記載されている修飾されたヌクレオシドで置換されても良い。別の非限定例として、天然のヌクレオチドのウリジンは、本明細書で開示される修飾されたヌクレオシドの少なくとも１つで部分的に（たとえば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９．９％）置換されても良い。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せを本発明のポリヌクレオチドに組み入れてもよく、そのような修飾は、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年１０月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９（代理人明細書番号Ｍ９）及び２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願番号６１／８３７２９７（代理人明細書番号Ｍ３６）にて教示されている。
【表２５−１】
0006881813.tif 000892
【表２５−２】
0006881813.tif 000893
【表２５−３】
0006881813.tif 000894
【０５９２】
Ｖ．医薬ワクチン組成物
製剤化、投与、送達及び投薬
本発明は、任意で１以上の薬学的に許容される賦形剤との併用でＮＡＶ及びＮＡＶ組成物及び／または複合体を含む医薬組成物を提供する。
【０５９３】
本発明者らは、ＮＡＶが幾つかの点で現在のワクチンより優れていることを発見した。第１に、皮下注射及び／または皮内注射は送達の経路として筋肉内投与より良好である。第２に、液状ナノ粒子の送達は１０〜１００倍の率で文献におけるプロタミン法に含まれる他の製剤より優れ、追加のアジュバントは必要ではないことが見いだされた。第３に、修飾され、製剤化されたＮＡＶは５０倍の率で未修飾の製剤化されたＮＡＶより優れていた。
【０５９４】
本発明は、任意で１以上の薬学的に許容される賦形剤との併用でＮＡＶ及びＮＡＶの医薬組成物及び複合体を提供する。医薬組成物は任意で１以上の追加の活性物質、たとえば、治療上及び／または予防上活性のある物質を含んでも良い。本発明の医薬組成物は無菌であってもよく、及び／または発熱物質を含まなくても良い。医薬剤の製剤化及び／または製造における一般的な考察は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）にて見いだされ得る。
【０５９５】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者またはヒト対象に投与される。本開示の目的で、「有効成分」という表現は一般に、本明細書に記載されているように送達されるＮＡＶまたはその中に含有されるポリヌクレオチド、たとえば、抗原をコードするポリヌクレオチド、たとえば、ＲＮＡポリヌクレオチドを指す。
【０５９６】
本明細書で提供される医薬組成物の記載は主にヒトへの投与に好適である医薬組成物に向けられるが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物、たとえば、非ヒト動物、たとえば、非ヒト哺乳類への投与に好適であることが技量の有る熟練者によって理解されるであろう。組成物を種々の動物への投与に好適にするためのヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変はよく理解されており、普通の技量の獣医薬理学者は、あるとすれば単に普通の実験によってそのような修飾を設計し、及び／または実行することができる。医薬組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／または他の霊長類；たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／またはラットのような商業的に関連する哺乳類を含む哺乳類、及び／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ及び／またはシチメンチョウのような商業的に関連する鳥類を含む鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９７】
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の技術で既知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されても良い。一般に、そのような調製方法には、有効成分を賦形剤及び／または１以上の他の付属成分と会合させるステップと、次いで必要に応じて及び／または望ましければ、製品を所望の単回投与単位または複数回投与単位に分割すること、成形すること及び／または包装することが含まれる。
【０５９８】
本発明に係る医薬組成物における有効成分、薬学的に許容される賦形剤及び／または追加成分の相対量は、治療される対象が何であるか、対象のサイズ及び／または状態に応じて、及びさらに組成物が投与されるべきである経路に応じて変化するであろう。例として、組成物は、０．１％〜１００％の間、たとえば、０．５〜５０％の間、１〜３０％の間、５〜８０％の間、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでも良い。
【０５９９】
製剤
本発明のＮＡＶは、（１）安定性を高める；（２）細胞のトランスフェクションを高める；（３）持続したまたは遅延した放出を可能にする（たとえば、デポー製剤からの）；（４）生体分布を変える（たとえば、特定の組織または細胞型を標的とする）；（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を高める；及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）のインビボでの放出特性を変えるために１以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。たとえば、溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体溶剤、分散または懸濁の助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤のいずれか及びすべてのような従来の賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定しないで、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア／シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＮＡＶでトランスフェクトした細胞（たとえば、対象への移植のために）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体及びそれらの組み合わせを含むことができる。
【０６００】
従って、本発明の製剤は、それぞれ、ＮＡＶの安定性を高める、ＮＡＶによる細胞へのトランスフェクションを高める、ポリヌクレオチドにコードされたタンパク質の発現を高める、及び／またはポリヌクレオチドにコードされたタンパク質の放出特性を変える量で、１以上の賦形剤を含むことができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは自己集合した核酸ナノ粒子を用いて製剤化されても良い。
【０６０１】
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の技術で既知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されても良い。一般に、そのような調製方法には、有効成分を賦形剤及び／または１以上の他の付属成分と会合させるステップが含まれる。
【０６０２】
本開示に係る医薬組成物は、ばらで、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として調製され、包装され、及び／または販売されても良い。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は所定の量の有効成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。有効成分の量は一般に、対象に投与される有効成分の投与量及び／または、たとえば、そのような投与量の２分の１もしくは３分の１のような、そのような投与量の好都合な分画に等しい。
【０６０３】
本開示に係る医薬組成物における有効成分、薬学的に許容される賦形剤及び／または追加成分の相対量は、治療される対象が何であるか、対象のサイズ及び／または状態に応じて、及びさらに組成物が投与されるべきである経路に応じて変化しても良い。たとえば、組成物は０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の間の有効成分を含んでも良い。例として、組成物は、０．１％〜１００％の間、たとえば、０．５〜５０％の間、１〜３０％の間、５〜８０％の間、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでも良い。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている製剤は少なくとも１つのポリヌクレオチド、たとえば、抗原をコードするポリヌクレオチドを含有しても良い。非限定例として、製剤は１、２、３、４または５のポリヌクレオチドを含有しても良い。
【０６０５】
一実施形態では、本明細書に記載されている製剤は１種類を超えるポリヌクレオチド、たとえば、抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでも良い。一実施形態では、製剤は線状形態で及び環状形態でキメラのポリヌクレオチドを含んでも良い。別の実施形態では、製剤は環状ポリヌクレオチド及びＩＶＴポリヌクレオチドを含んでも良い。さらに別の実施形態では、製剤はＩＶＴポリヌクレオチド、キメラのポリヌクレオチド及び環状ポリヌクレオチドを含んでも良い。
【０６０６】
一実施形態では、製剤は、ヒトのタンパク質、動物のタンパク質、細菌のタンパク質、生物タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療用のペプチド及びタンパク質、分泌されたタンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質及び細胞骨格のタンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒトの疾患に関連するタンパク質及び／または非ヒトの疾患に関連するタンパク質のような、しかし、これらに限定されないカテゴリーから選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有しても良い。一実施形態では、製剤はタンパク質をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチドを含有する。一実施形態では、製剤はタンパク質をコードする少なくとも５つのポリヌクレオチドを含有する。
【０６０７】
医薬製剤はさらに、本明細書で使用されるとき、所望の特定の剤形に適するような溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体溶剤、分散または懸濁の助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤等のいずれか及びすべてを含むが、これらに限定されない薬学的に許容される賦形剤を含んでも良い。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤及び組成物を調製するための技法は当該技術で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。従来の賦形剤媒体の使用は、従来の賦形剤媒体が望ましくない生物効果を生じるまたはさもなければ有害な方法で医薬組成物の他の成分と相互作用することによって物質またはその誘導体と不適合性であり得る限りを除いて、本開示の範囲内で企図され得る。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、液状ナノ粒子のサイズは増加させても良いし、及び／または減少させても良い。粒径における変化は、炎症のような、しかし、これに限定されない生体反応を無効にするのに役立つことができて得、または哺乳類に送達される修飾されたｍＲＮＡの生物効果を高め得る。
【０６０９】
医薬組成物の製造で使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性の希釈剤、表面活性剤及び／または乳化剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤及び／または油が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は任意で本発明の医薬製剤に含まれても良い。
【０６１０】
リピドイド
リピドイドの合成は広範に記載されており、これらの化合物を含有する製剤はポリヌクレオチドの送達に特に適している（Ｍａｈｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０，２１：１４４８−１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２０１０，２６７：９−２１；Ａｋｉｎｃら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６：５６１−５６９；Ｌｏｖｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０，１０７：１８６４−１８６９；Ｓｉｅｇｗａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１１，１０８：１２９９６−３００１を参照のこと；そのすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６１１】
これらのリピドイドを用いて齧歯類及び非ヒト霊長類にて二本鎖小分子干渉ＲＮＡを効果的に送達しているが（Ａｋｉｎｃら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６：５６１−５６９；Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００８，１０５：１１９１５−１１９２０；Ａｋｉｎｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９，１７：８７２−８７９；Ｌｏｖｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０，１０７：１８６４−１８６９；Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，２９：１００５−１０１０を参照のこと；そのすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、本開示はそれらに含有されるＮＡＶまたはポリヌクレオチドを送達することにおけるそれらの製剤及び使用を記載している。
【０６１２】
これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製することができるので、局在化した及び／または全身性の投与経路を介したリピドイド製剤の注入に続く、コードされたタンパク質の産生によって判断されるように、ポリヌクレオチドの効果的な送達を生じることができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内または皮下の経路を含むが、これらに限定されない種々の手段によって投与することができる。
【０６１３】
核酸のインビボでの送達は、製剤の組成、粒子ペグ化の性質、負荷の程度、ポリヌクレオチド対脂質の比、及び粒径のような、しかし、これに限定されない生物パラメータを含むが、これらに限定されない多数のパラメータによって影響を受け得る（Ａｋｉｎｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９，１７：８７２−８７９；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長における小さな変化がインビボの有効性において著しい効果を生じ得る。ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラアミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；ａｋａ９８Ｎ１２−５，Ｍｕｒｕｇａｉａｈら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、Ｃ１２−２００（誘導体及び変異体を含む）及びＭＤ１を含むが、これらに限定されない異なるリピドイドを伴った製剤をインビボ活性で調べることができる。
【０６１４】
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と呼ばれるリピドイドは、Ａｋｉｎｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９，１７：８７２−８７９によって開示され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０６１５】
本明細書で「Ｃ１２−２００」と呼ばれるリピドイドは、Ｌｏｖｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０，１０７：１８６４−１８６９ならびにＬｉｕ及びＨｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０，６６９−６７０によって開示され、双方ともその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて３または４以上の成分を含む粒子を含むことができる。例として特定のリピドイドを伴った製剤には９８Ｎ１２−５が挙げられるが、これには限定されず、４２％のリピドイドと４８％のコレステロールと１０％のＰＥＧ（Ｃ１４アルカリ鎖長）を含有しても良い。別の例として、特定のリピドイドを伴った製剤にはＣ１２−２００が挙げられるが、これには限定されず、５０％のリピドイドと１０％のジステロイルホスファチジルコリンと３８．５％のコレステロールと１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含有しても良い。
【０６１６】
一実施形態では、全身性の静脈内投与用にリピドイドで製剤化されたポリヌクレオチドは肝臓を標的とすることができる。たとえば、ポリヌクレオチドを用い、約７．５対１の総脂質対ポリヌクレオチドの最終重量比で４２％の９８Ｎ１２−５と４８％コレステロールと１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成を含み、ＰＥＧ脂質ではＣ１４アルキルの鎖長であり、およそ５０〜６０ｎｍの平均粒度を持つ最終的な最適化された静脈内製剤は、肝臓への９０％を超える製剤の分布を生じることができる（Ａｋｉｎｃら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９，１７：８７２−８７９を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。別の例では、Ｃ１２−２００（それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国仮特許出願６１／１７５，７７０号及び公開された国際出願ＷＯ２０１０１２９７０９を参照のこと）リピドイドを用いた静脈内製剤は、７対１の総脂質対ポリヌクレオチドの重量比及び８０ｎｍの平均粒度と共に５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を有してもよく、肝細胞に対してポリヌクレオチドを送達するのに有効であっても良い（Ｌｏｖｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０，１０７：１８６４−１８６９を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイドを含有する製剤を用いてインビボでポリヌクレオチドを肝細胞に効果的に送達しても良い。
【０６１７】
筋肉内のまたは皮下の経路についての最適化されたリピドイド製剤の特徴は、標的細胞の型及び細胞外マトリクスを介して血流に拡散する製剤の能力に応じて著しく変化し得る。内皮小孔のサイズの故に効果的な肝細胞への送達には１５０ｎｍ未満の粒度が所望であり得るが（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｋｉｎｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９，１７：８７２−８７９を参照のこと）、内皮細胞、骨髄細胞及び筋肉細胞を含むが、これらに限定されない他の細胞型に製剤を送達するためのリピドイドで製剤化されたＮＡＶの使用は同様にサイズに限定されない場合がある。
【０６１８】
たとえば、骨髄細胞及び内皮のような他の非肝細胞にインビボでｓｉＲＮＡを送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（Ａｋｉｎｃら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６：５６１−５６９；Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，２９：１００５−１０１０；Ｃｈｏら．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００９，１９：３１１２−３１１８；第８回Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，８−９，２０１０を参照のこと；そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。たとえば、単球のような骨髄細胞への効果的な送達のために、リピドイド製剤は類似の成分モル比を有しても良い。リピドイドと、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＭＧを含むが、これらに限定されない他の成分との異なる比を用いて、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞等を含むが、これらに限定されない異なる細胞型への送達のためのＲＮＡＶの製剤を最適化しても良い。たとえば、成分のモル比には、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％のコレステロール及び１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧが挙げられても良いが、これらに限定されない（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，２９：１００５−１０１０を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介した核酸の細胞（脂肪細胞及び筋肉細胞のような、しかし、これらに限定されない）への限局性の送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身性送達に所望される製剤成分のすべてを必要としなくてもよく、したがってリピドイド及びＮＡＶのみを含んでも良い。
【０６１９】
リピドイドがＲＮＡＶによる細胞へのトランスフェクションを高めることができ得、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増やすことができ得るので、異なるリピドイドの組合せを用いてポリヌクレオチドが指向するタンパク質産生の有効性を改善し得る（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１９：１６８８−１６９４を参照のこと，その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６２０】
リポソーム、リポプレックス及び脂質ナノ粒子
１以上のリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を用いて本発明のＮＡＶを製剤化することができる。一実施形態では、ＮＡＶの医薬組成物はリポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層で構成され得る人工的に調製され得、栄養物及び医薬製剤の投与のための送達媒体として使用されても良い小胞である。リポソームは、直径何百ナノメートルであってもよく、且つ狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含有し得る多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍ未満であり得る小さな単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径５０〜５００ｎｍの間であり得る大きな単細胞小胞（ＬＵＶ）のような、しかし、これらに限定されない異なるサイズのものであることができる。リポソームの設計には、不健康な組織へのリポソームの接着を改善するために、またはエンドサイトーシスのような、しかし、これらに限定されない事象を活性化するためにオプソニンまたはリガンドが含まれても良いが、これらに限定されない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低いｐＨまたは高いｐＨを含有しても良い。
【０６２１】
リポソームの形成は、包含される医薬製剤及びリポソームの成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、包含される物質の実効濃度及びその潜在的な毒性、小胞の適用及び／または送達の間に関与する追加の過程、最適化サイズ、意図される用途についての小胞の多分散性及び保存可能期間、及びバッチごとの再現性及び安全で効率的なリポソーム製品の大規模製造の可能性のような、しかし、これらに限定されない物理化学的な特性に左右され得る。
【０６２２】
非限定例として、合成膜小胞のようなリポソームは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７７６３８、ＵＳ２０１３０１７７６３７、ＵＳ２０１３０１７７６３６、ＵＳ２０１３０１７７６３５、ＵＳ２０１３０１７７６３４、ＵＳ２０１３０１７７６３３、ＵＳ２０１３０１８３３７５、ＵＳ２０１３０１８３３７３及びＵＳ２０１３０１８３３７２にて記載された方法、装置及び用具によって調製されても良い。
【０６２３】
一実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物には限定しないで、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）製のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）及びＭＣ３（ＵＳ２０１００３２４１２０；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）及びＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）のＤＯＸＩＬ（登録商標）のような、しかし、これらに限定されない小分子薬剤を送達し得るリポソームから形成されるもののようなリポソームが含まれても良い。
【０６２４】
一実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物には限定しないで、インビトロ及びインビボでのオリゴヌクレオチドの送達に好適であることが以前記載され、示されている安定化されたプラスミド／脂質の粒子（ＳＰＬＰ）または安定化された核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるもののようなリポソームが含まれても良い（Ｗｈｅｅｌｅｒら．Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．１９９９，６：２７１−２８１；Ｚｈａｎｇら．Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．１９９９，６：１４３８−１４４７；Ｊｅｆｆｓら．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００５，２２：３６２−３７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２：１００２−１００７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ．２００６，４４１：１１１−１１４；Ｈｅｙｅｓら．Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７：２７６−２８７；Ｓｅｍｐｌｅら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８：１７２−１７６；Ｊｕｄｇｅら．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００９，１１９：６６１−６７３；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００８，１９：１２５−１３２；米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２２１０４を参照のこと；そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによる元々の製造法は界面活性剤透析法だったが、それは後にＪｅｆｆｓらによって改善され、自然発生的小胞形成法と呼ばれる。リポソーム製剤はポリヌクレオチドに加えて３〜４の脂質成分で構成される。例として、リポソームは、Ｊｅｆｆｓらによって記載されたように、５５％のコレステロールと２０％のジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）と１０％のＰＥＧ−ＤＭＧと１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、４８％のコレステロールと２０％のＤＳＰＣと２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡと３０％のカチオン性脂質を含有することができるが、これらに限定されず、その際、カチオン性脂質は、Ｈｅｙｓらによって記載されたように、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡまたは１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であることができる。
【０６２５】
いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約２５．０％コレステロール〜約４０．０％コレステロール、約３０．０％コレステロール〜約４５．０％コレステロール、約３５．０％コレステロール〜約５０．０％コレステロール及び／または約４８．５％コレステロール〜約６０％コレステロールを含んでも良い。好ましい実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％及び４３．５％から成る群から選択されるコレステロールの比率を含んでも良い。いくつかの実施形態では、製剤は約５．０％〜約１０．０％のＤＳＰＣ及び／または約７．０％〜約１５．０％のＤＳＰＣを含んでも良い。
【０６２６】
一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原（抗原）または対象とする任意の他のポリペプチドをコードしても良いポリヌクレオチドを送達するように形成され得るリポソームを含んでも良い。ＮＡＶは、リポソームによって被包されても良いし、及び／またはそれは、その後リポソームによって被包され得る水性コアに含有されても良い（国際公開番号ＷＯ２０１２０３１０４６、ＷＯ２０１２０３１０４３、ＷＯ２０１２０３０９０１及びＷＯ２０１２００６３７８ならびに米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１８９３５１、ＵＳ２０１３０１９５９６９及びＵＳ２０１３０２０２６８４を参照のこと；そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６２７】
別の実施形態では、リポソームは標的化された送達のために製剤化されても良い。非限定例として、リポソームは肝臓への標的化された送達のために製剤化されても良い。標的化された送達のために使用されるリポソームには、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９５９６７にて記載されたリポソーム及びそこに記載されたリポソームの作製方法が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０６２８】
別の実施形態では、免疫原（抗原）をコードし得るポリヌクレオチドは、エマルジョン粒子が油のコアと、エマルジョン粒子に分子を繋ぐポリヌクレオチドと相互作用することができるカチオン性脂質とを含むカチオン性の水中油エマルジョンで製剤化されても良い（国際公開番号ＷＯ２０１２００６３８０を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６２９】
一実施形態では、ＮＡＶは、親水性相が中で分散される連続的な疎水性相を含む油中水エマルジョンで製剤化されても良い。非限定例として、エマルジョンは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０８７７９１にて記載された方法によって作製されても良い。
【０６３０】
別の実施形態では、脂質製剤は、少なくともカチオン性脂質と、トランスフェクションを高め得る脂質と、脂質部分に連結される親水性頭基を含有する少なくとも１つの脂質とを含んでも良い（それぞれ内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０７６８０７及び米国公開番号２０１１０２００５８２）。別の実施形態では、免疫原をコードするポリヌクレオチドは、官能化された脂質二重層間で架橋を有し得る脂質小胞で製剤化されても良い（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１２１７７７２４を参照のこと）。
【０６３１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８６５２６にて記載されたようなリポソームにて製剤化されても良い。ＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８６５２６にて記載されたような逆ｐＨ勾配及び／または最適化された内部緩衝液組成物を用いてリポソームに被包されても良い。
【０６３２】
一実施形態では、ＮＡＶ医薬組成物は、たとえば、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系のリポソーム（たとえば、卵巣癌のためのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００６，５（１２）１７０８−１７１３）；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）及びヒアルロナンを被覆したリポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）のような、しかし、これらに限定されないリポソームにて製剤化されても良い。
【０６３３】
一実施形態では、カチオン性脂質は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号２０１３００９０３７２号に記載されたもののような低分子量のカチオン性脂質であっても良い。
【０６３４】
一実施形態では、ＮＡＶは官能化された脂質二重層間で架橋を有し得る脂質小胞で製剤化されても良い。
【０６３５】
一実施形態では、ＮＡＶはカチオン性脂質を含むリポソームにて製剤化されても良い。リポソームは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３００６８２５にて記載されたように、１：１〜２０：１の間のカチオン性脂質における窒素原子のＲＮＡにおけるリン酸に対するモル比（Ｎ：Ｐ比）を有しても良い。別の実施形態では、リポソームは２０：１より大きくまたは１：１より小さいＮ：Ｐ比を有しても良い。
【０６３６】
一実施形態では、ＮＡＶは脂質／ポリカチオン複合体で製剤化されても良い。脂質／ポリカチオン複合体の形成は、当該技術で既知の方法によって、及び／または全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１２１７８７０２号にて記載されたように達成されても良い。非限定例として、ポリカチオンには、たとえば、ポリリジン、ポリオルニチン及び／またはポリアルギニンのような、しかし、これらに限定されないカチオン性のペプチドまたはポリペプチド、及びそれぞれ全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０１３３２６または米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１４２８１８にて記載されたカチオン性ペプチドが挙げられ得る。別の実施形態では、ＮＡＶは、さらにコレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような、しかし、これらに限定されない非カチオン性脂質を含み得る脂質／ポリカチオン複合体にて製剤化されても良い。
【０６３７】
一実施形態では、ＮＡＶはアミノアルコールリピドイドにて製剤化されても良い。本発明で使用され得るアミノアルコールリピドイドは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４５０，２９８号に記載された方法によって調製されても良い。
【０６３８】
リポソーム製剤は、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和の程度、ペグ化の性質、成分すべての比率、及びサイズのような生物物理的パラメータによって影響を受け得るが、これらに限定されない。Ｓｅｍｐｌｅら（Ｓｅｍｐｌｅら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８：１７２−１７６；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）による一例では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質と７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリンと３４．３％のコレステロールと１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡとで構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えることは種々の抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをさらに効果的に送達し得る（Ｂａｓｈａら．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１９：２１８６−２２００；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０％〜約５０％のカチオン性脂質、約５０％〜約６０％のカチオン性脂質及び／または約５５％〜約６５％のカチオン性脂質を含んでも良い。いくつかの実施形態では、リポソームにおける脂質のｍＲＮＡに対する比は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１及び／または少なくとも３０：１であっても良い。
【０６３９】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤におけるＰＥＧの比は増えてもよくまたは減ってもよく、及び／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変してＬＮＰ製剤の薬物動態及び／または生体分布を変化させても良い。非限定例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールに比べて、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％及び／または約３．０％〜約６．０％のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）（本明細書ではＰＥＧ−ＤＯＭＧとも呼ばれる）の脂質モル比を含有しても良い。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール）のような、しかし、これらに限定されないＰＥＧ脂質によって置き換えられても良い。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００及びＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのような、しかし、これらに限定されない当該技術で既知の任意の脂質から選択されても良い。
【０６４０】
一実施形態では、ＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１７０９３０にて記載されたもののような脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０６４１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドを含むＮＡＶ製剤は、少なくとも１つの脂質を含んでも良いナノ粒子である。脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ペグ化脂質及びアミノアルコール脂質から選択されても良いが、これらに限定されない。別の態様では、脂質は、たとえば、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ及びアミノアルコール脂質のような、しかし、これらに限定されないカチオン性脂質であっても良い。アミノアルコールカチオン性脂質は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載された脂質であってもよく、及び／またはそれ記載された方法によって作製されても良い。非限定例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物３）；及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物４）；または薬学的に許容されるその塩もしくは立体異性体であっても良い。
【０６４２】
脂質ナノ粒子製剤は通常、脂質、特に、イオン化したカチオン性脂質、たとえば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに、中性脂質、ステロール及び粒子の凝集を減らすことができる分子、たとえば、ＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質を含む。
【０６４３】
一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から成る群から選択される少なくとも１つの脂質と、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭから選択される中性脂質と、（ｉｉｉ）ステロール、たとえば、コレステロールと、（ｉｖ）ＰＥＧ−脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡとから、約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ−脂質のモル比にて本質的に成る。
【０６４４】
一実施形態では、製剤は、モル基準で約２５％〜約７５％の、たとえば、モル基準で約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％または約４０％の、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を含む。
【０６４５】
一実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約１５％の、たとえば、モル基準で約３〜約１２％、約５〜約１０％または約１５％、約１０％、または約７．５％の中性脂質を含む。例となる中性脂質には、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、製剤は、モル基準で約５％〜約５０％の、たとえば、モル基準で約１５〜約４５％、約２０〜約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％または約３１％のステロールを含む。例となるステロールはコレステロールである。一実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約２０％の、たとえば、モル基準で約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％または約５％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質を含む。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質は２，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質は、２，０００Ｄａ未満、たとえば、１，５００Ｄａ前後、１，０００Ｄａ前後または５００Ｄａ前後の平均分子量のＰＥＧ分子を含む。例となるＰＥＧで修飾された脂質には、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＲｅｙｅｓら．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）にてさらに考察される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４６】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で２５〜７５％のカチオン性脂質と、０．５〜１５％の中性脂質と、５〜５０％のステロールと、０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６４７】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で３５〜６５％のカチオン性脂質と、３〜１２％の中性脂質と、１５〜４５％のステロールと、０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６４８】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で４５〜６５％のカチオン性脂質と、５〜１０％の中性脂質と、２５〜４０％のステロールと、０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６４９】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で約６０％のカチオン性脂質と、約７．５％の中性脂質と、約３１％のステロールと、約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６５０】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で約５０％のカチオン性脂質と、約１０％の中性脂質と、約３８．５％のステロールと、約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６５１】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で約５０％のカチオン性脂質と、約１０％の中性脂質と、約３５％のステロールと、約４．５％または約５％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質と、約０．５％の標的指向化脂質とを含む。
【０６５２】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で約４０％のカチオン性脂質と、約１５％の中性脂質と、約４０％のステロールと、約５％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６５３】
一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるモル基準で約５７．２％のカチオン性脂質と、約７．１％の中性脂質と、約３４．３％のステロールと、約１．４％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６５４】
一実施形態では、本発明の製剤は、ＰＥＧ脂質、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＲｅｙｅｓら．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）にてさらに考察されている）から選択されるモル基準で約５７．５％のカチオン性脂質と、約７．５％の中性脂質と、約３１．５％のステロールと、約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質とを含む。
【０６５５】
好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル比で約２０〜７０％のカチオン性脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧで修飾された脂質；さらに好ましくはモル比で約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧで修飾された脂質の脂質混合物から本質的に成る。
【０６５６】
特定の実施形態では、脂質のモル比は、およそ５０／１０／３８．５／１．５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧ）、５７．２／７．１１３４．３／１．４（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、４０／１５／４０／５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、５０／１０／３５／４．５／０．５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧＤＳＧ）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）または５２／１３／３０／５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、たとえば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで修飾された脂質、たとえば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。
【０６５７】
例となる脂質ナノ粒子組成物及びそれを作製する方法は、たとえば、Ｓｅｍｐｌｅら．（２０１０），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａら．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３；及びＭａｉｅｒら．（２０１３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２１，１５７０−１５７８（そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）にて記載されている。
【０６５８】
一実施形態では、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質と、ＰＥＧ脂質と、構造的脂質とを含んでもよく、任意で非カチオン性脂質を含んでも良い。非限定例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質と、約５〜１５％の非カチオン性脂質と、約１〜２％のＰＥＧ脂質と、約３０〜５０％の構造的脂質とを含んでも良い。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質と、約１０％の非カチオン性脂質と、約１．５％のＰＥＧ脂質と、約３８．５％の構造的脂質とを含んでも良い。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質と、約１０％の非カチオン性脂質と、約２．５％のＰＥＧ脂質と、約３２．５％の構造的脂質とを含んでも良い。一実施形態では、カチオン性脂質は、たとえば、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及びＬ３１９のような、しかし、これらに限定されない本明細書に記載されているカチオン性脂質であっても良い。
【０６５９】
一実施形態では、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子製剤は４成分の脂質ナノ粒子であっても良い。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とＰＥＧ脂質と構造的脂質とを含んでも良い。非限定例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質と、約５〜１５％の非カチオン性脂質と、約１〜２％のＰＥＧ脂質と、約３０〜５０％の構造的脂質とを含んでも良い。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質と、約１０％の非カチオン性脂質と、約１．５％のＰＥＧ脂質と、約３８．５％の構造的脂質とを含んでも良い。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質と、約１０％の非カチオン性脂質と、約２．５％のＰＥＧ脂質と、約３２．５％の構造的脂質とを含んでも良い。一実施形態では、カチオン性脂質は、たとえば、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及びＬ３１９のような、しかし、これらに限定されない本明細書に記載されているカチオン性脂質であっても良い。
【０６６０】
一実施形態では、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とＰＥＧ脂質と構造的脂質とを含んでも良い。非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡと約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧと約３８．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡと約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧと約３８．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡと約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧと約３８．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９と約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと約２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧと約３２．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。
【０６６１】
一実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０４０１８４、ＷＯ２０１１１５３１２０、ＷＯ２０１１１４９７３３、ＷＯ２０１１０９０９６５、ＷＯ２０１１０４３９１３、ＷＯ２０１１０２２４６０、ＷＯ２０１２０６１２５９、ＷＯ２０１２０５４３６５、ＷＯ２０１２０４４６３８、ＷＯ２０１００８０７２４、ＷＯ２０１０２１８６５、ＷＯ２００８１０３２７６、ＷＯ２０１３０８６３７３及びＷＯ２０１３０８６３５４、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号、同第８，２８３，３３３号、及び同第８，４６６，１２２号、ならびに米国特許公開番号ＵＳ２０１０００３６１１５、ＵＳ２０１２０２０２８７１、ＵＳ２０１３００６４８９４、ＵＳ２０１３０１２９７８５、ＵＳ２０１３０１５０６２５、ＵＳ２０１３０１７８５４１及びＵＳ２０１３０２２５８３６にて記載されたカチオン性脂質から選択されても良いが、これらに限定されない。別の実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０４０１８４、ＷＯ２０１１１５３１２０、ＷＯ２０１１１４９７３３、ＷＯ２０１１０９０９６５、ＷＯ２０１１０４３９１３、ＷＯ２０１１０２２４６０、ＷＯ２０１２０６１２５９、ＷＯ２０１２０５４３６５、ＷＯ２０１２０４４６３８及びＷＯ２０１３１１６１２６または米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７８５４１及びＵＳ２０１３０２２５８３６にて記載された式Ａから選択されても良いが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２００８１０３２７６の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩ、及び米国特許公開番号ＵＳ２０１０００３６１１５の式Ｉ−ＶＩ、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２３３３８の式Ｉから選択されても良いが、これらに限定されない。非限定例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−ｌ６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ζ，１８Ζ）−Ν，Ν−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８���，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−ｌ０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−ｌ−ノニリコサ−１１，１４−ジエン−ｌ−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−ｌ０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ−１５−エン−ｌ０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１４−エン−ｌ０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１７−エン−ｌ０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコント−２４−エン−ｌ０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−２０−エン−ｌ０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコント−２２−エン−ｌ０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコス−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−ｌ３，１６−ジエン−ｌ−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−ｌ０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（ｌＲ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ν，Ν−ジメチル−［（ｌＲ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ν，Ν−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチル��キシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクト−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン，  １−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ν，Ν−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−ｌ３，１６−ジエン−ｌ−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデク−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミンまたは薬学的に許容されるその塩もしくは立体異性体から選択されても良い。
【０６６２】
一実施形態では、脂質は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１７０８８９にて記載されたもののような切断可能な脂質であっても良い。
【０６６３】
別の実施形態では、脂質は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号ＵＳ２０１３００６４８９４の式（Ｉ）のような、しかし、これらに限定されないカチオン性脂質であっても良い。
【０６６４】
一実施形態では、カチオン性脂質は、当該技術で既知の方法によって、及び／またはそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０４０１８４、ＷＯ２０１１１５３１２０、ＷＯ２０１１１４９７３３、ＷＯ２０１１０９０９６５、ＷＯ２０１１０４３９１３、ＷＯ２０１１０２２４６０、ＷＯ２０１２０６１２５９、ＷＯ２０１２０５４３６５、ＷＯ２０１２０４４６３８、ＷＯ２０１００８０７２４、ＷＯ２０１０２１８６５、ＷＯ２０１３０８６３７３及びＷＯ２０１３０８６３５４にて記載されたように合成されても良い。
【０６６５】
別の実施形態では、カチオン性脂質はトリアルキルカチオン性脂質であっても良い。トリアルキルカチオン性脂質の非限定例及びトリアルキルカチオン性脂質の作製方法及び使用方法は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３１２６８０３にて記載されている。
【０６６６】
一実施形態では、ＮＡＶのＬＮＰ製剤は３％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有しても良い。別の実施形態では、ＲＮＡＶのＬＮＰ製剤は１．５％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有しても良い。
【０６６７】
一実施形態では、ＮＡＶの医薬組成物は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０９９７５５にて記載されたペグ化脂質の少なくとも１つを含んでも良い。
【０６６８】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤はＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有しても良い。一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００と当該技術で既知のカチオン性脂質と少なくとも１つの他の成分とを含有しても良い。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００と当該技術で既知のカチオン性脂質とＤＳＰＣとコレステロールとを含有しても良い。非限定例として、ＬＮＰ製剤はＰＥＧ−ＤＭＧ２０００とＤＬｉｎ−ＤＭＡとＤＳＰＣとコレステロールとを含有しても良い。別の非限定例として、ＬＮＰ製剤は２：４０：１０：４８のモル比でＰＥＧ−ＤＭＧ２０００とＤＬｉｎ−ＤＭＡとＤＳＰＣとコレステロールとを含有しても良い（たとえば、Ｇｅａｌｌら，Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ，２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６６９】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１２７２５５またはＷＯ２００８１０３２７６にて記載された方法によって製剤化されても良い。非限定例として、本明細書に記載されているＮＡＶは、そのそれぞれ全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１１１２７２５５またはＷＯ２００８１０３２７６にて記載されたようなＬＮＰ製剤に被包されても良い。
【０６７０】
一実施形態では、本明細書に記載されているＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２０１２０２０７８４５で記載されたような非経口経路によって送達されるナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０６７１】
一実施形態では、ＮＡＶは、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１５６８４５または国際公開番号ＷＯ２０１３０９３６４８もしくはＷＯ２０１２０２４５２６にて記載された方法によって作製される脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０６７２】
本明細書に記載されている脂質ナノ粒子は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１６４４００にて記載された系及び／または方法によって無菌環境で作製されても良い。
【０６７３】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４９２，３５９号に記載された核酸／脂質粒子のようなナノ粒子にて製剤化されても良い。非限定例として、脂質粒子は、１以上の活性剤または治療剤と；粒子に存在する総脂質の約５０モル％〜約８５モル％を構成する１以上のカチオン性脂質と；粒子に存在する総脂質の約１３モル％〜約４９．５モル％を構成する１以上の非カチオン性脂質と；粒子に存在する総脂質の約０．５モル％〜約２モル％を構成する、粒子の凝集を抑制する１以上のコンジュゲートされた脂質とを含んでも良い。ナノ粒子における核酸は本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知であるポリヌクレオチドであっても良い。
【０６７４】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１２７２５５またはＷＯ２００８１０３２７６にて記載された方法によって製剤化されても良い。非限定例として、本明細書に記載されている修飾されたＲＮＡは、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１２７２５５またはＷＯ２００８１０３２７６にて記載されたＬＮＰ製剤に被包されても良い。
【０６７５】
一実施形態では、本明細書に記載されているＬＮＰ製剤はポリカチオン性組成物を含んでも良い。非限定例として、ポリカチオン性組成物は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２００５０２２２０６４の式１〜６０から選択されても良い。別の実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、インビボ及び／またはインビトロでの本明細書に記載されている修飾されたＲＮＡの送達に使用されても良い。
【０６７６】
一実施形態では、本明細書に記載されているＬＮＰ製剤はさらに透過性エンハンサー分子を含んでも良い。非限定の透過性エンハンサー分子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２００５０２２２０６４にて記載されている。
【０６７７】
一実施形態では、ＮＡＶ医薬組成物は、たとえば、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系のリポソーム（たとえば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡの送達（Ｌａｎｄｅｎら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００６，５（１２）１７０８−１７１３）；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）及びヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｓｒａｅｌ）のような、しかし、これらに限定されないリポソームにて製剤化されても良い。
【０６７８】
一実施形態では、ＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２０１２０６０２９３にて記載されたような凍結乾燥されたゲル相リポソーム組成物にて製剤化されても良い。
【０６７９】
ナノ粒子製剤はリン酸コンジュゲートを含んでも良い。リン酸コンジュゲートはインビボでの循環時間を増やし、及び／またはナノ粒子の標的化送達を増やし得る。本発明と共に使用するためのリン酸コンジュゲートは、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０３３４３８または米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９６９４８にて記載された方法によって作製されても良い。非限定例として、リン酸コンジュゲートは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０３３４３８にて記載された式のいずれか１つの化合物を含んでも良い。
【０６８０】
ナノ粒子製剤はポリマーコンジュゲートを含んでも良い。ポリマーコンジュゲートは水溶性コンジュゲートであっても良い。ポリマーコンジュゲートは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１３００５９３６０にて記載されたような構造を有する。態様の１つでは、本発明のポリヌクレオチドを伴ったポリマーコンジュゲートは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号２０１３００７２７０９にて記載された方法及び／またはセグメント化ポリマー試薬を用いて作製されても良い。別の態様では、ポリマーコンジュゲートは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９６９４８にて記載されたポリマーコンジュゲートのような、しかし、これらに限定されない、環部分を含むペンダント側鎖基を有しても良い。
【０６８１】
ナノ粒子製剤はコンジュゲートを含んで対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させても良い。さらに、コンジュゲートは対象にてナノ粒子の食細胞によるクリアランスを抑制し得る。態様の１つでは、コンジュゲートは、ヒトの膜タンパク質ＣＤ４７から設計される「自己」ペプチド（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９，９７１−９７５）によって記載された「自己」ペプチド）であっても良い。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらが示したように、自己ペプチドは、マクロファージが媒介するナノ粒子のクリアランスを遅延させ、ナノ粒子の送達を向上させた。別の態様では、コンジュゲートは膜タンパク質ＣＤ４７であっても良い（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９，９７１−９７５を参照のこと）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらは、「自己」ペプチドと同様に、ＣＤ４７がごちゃ混ぜにしたペプチドやＰＥＧ被覆ナノ粒子に比べて対象にて循環する粒子の比率を高めることができることを示した。
【０６８２】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、対象にて本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含むナノ粒子にて製剤化される。コンジュゲートはＣＤ４７膜であってもよく、またはコンジュゲートは前に記載された「自己」ペプチドのような、ＣＤ４７膜タンパク質に由来しても良い。別の態様では、ナノ粒子はＰＥＧとＣＤ４７のコンジュゲート、またはその誘導体を含んでも良い。さらに別の態様では、ナノ粒子は上記で記載された「自己」ペプチドと膜タンパク質ＣＤ４７の双方を含んでも良い。
【０６８３】
別の態様では、本発明のＮＡＶの送達のために本明細書に記載されているように、「自己」ペプチド及び／またはＣＤ４７タンパク質をウイルス様粒子または偽ビリオンにコンジュゲートしても良い。
【０６８４】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有しても良いコンジュゲートとを含むＮＡＶ医薬組成物。コンジュゲートの非限定例には、イオン化できる水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーが挙げられる。非限定例として、分解可能な結合を伴ったコンジュゲートを含む医薬組成物及びそのような医薬組成物を送達する方法は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１８４４４３にて記載されている。
【０６８５】
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体とＮＡＶを含む炭水化物ナノ粒子であっても良い。非限定例として、炭水化物担体には、無水／修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、コハク酸フィトグリコーゲンオクテニル、フィトグリコーゲンベータデキストリン、無水／修飾フィトグリコーゲンベータデキストリンが挙げられ得るが、これらに限定されない（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１０９１２１を参照のこと）。
【０６８６】
粒子の送達を改善するために、本発明のナノ粒子製剤は、界面活性剤またはポリマーで被覆されても良い。一実施形態では、ナノ粒子は、たとえば、ＰＥＧコーティング及び／または中性の表面電荷を有するコーティングのような、しかし、これらに限定されない親水性コーティングで被覆されても良い。親水性コーティングは、中枢神経系内でのＮＡＶのような、しかし、これらに限定されない大きなペイロードでナノ粒子を送達するのに役立ち得る。非限定例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及びそのようなナノ粒子を作製する方法は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１８３２４４にて記載されている。
【０６８７】
一実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は親水性ポリマー粒子であっても良い。親水性ポリマー粒子の非限定例及び親水性ポリマー粒子を作製する方法は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２１０９９１にて記載されている。
【０６８８】
別の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は親水性ポリマー粒子をであっても良い。
【０６８９】
脂質ナノ粒子製剤は、迅速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られている生分解性カチオン性脂質でカチオン性脂質を置き換えることによって改善され得る。たとえば、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡのような、しかし、これらに限定されないイオン化できるカチオン性脂質は経時的に血漿及び組織に蓄積することが示されており、毒性の潜在的な供給源であり得る。迅速に排除される脂質の迅速な代謝は、ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量まで一桁分、脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指標を改善することができる。酵素的に分解されるエステル結合の包含は、カチオン性成分の分解と代謝のプロファイルを改善することができる一方で、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持する。エステル結合は脂質鎖の中で内部的に位置することができ、またはそれは脂質鎖の末端で末端に位置しても良い。内部エステル結合は脂質鎖における任意の炭素を置換しても良い。
【０６９０】
一実施形態では、内部エステル結合は飽和炭素のいずれかの側に位置しても良い。
【０６９１】
一実施形態では、ナノ化学種とポリマーと免疫原とを含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって免疫応答を引き出しても良い（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２０１２１８９７００及び国際公開番号ＷＯ２０１２０９９８０５）。ポリマーはナノ化学種を被包してもよく、またはナノ化学種を部分的に被包しても良い。免疫原は、組換えタンパク質、修飾されたＲＮＡ及び／または本明細書に記載されているポリヌクレオチドであっても良い。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、たとえば、病原体に対する、しかし、これらに限定されないワクチンで使用するために製剤化されても良い。
【０６９２】
脂質ナノ粒子は、粘膜バリアを浸透し得るように、粒子の表面特性を変えるように操作されても良い。粘液は、口腔（たとえば、頬膜及び食道膜及び扁桃組織）、眼、消化管（たとえば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（たとえば、鼻、咽頭、気管及び気管支の膜）、生殖器（たとえば、膣、頚部及び尿道の膜）のような、しかし、これらに限定されない粘膜組織に位置する。高い薬剤被包効率及び幅広い薬剤の持続送達を提供する能力に対して好ましい１０〜２００ｎｍより大きいナノ粒子は粘膜バリアを介して迅速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は連続的に分泌され、剥がれ、捨てられ、または消化され、及び再利用されるので、捕捉された粒子のほとんどは数秒以内または数時間以内に粘膜組織から取り除かれ得る。低分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で濃厚に被覆されている大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は水で拡散する同じ粒子よりも４〜６倍遅く粘液を介して拡散した（Ｌａｉら．ＰＮＡＳ，２００７，１０４（５）：１４８２−４８７；Ｌａｉら．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００９，６１（２）：１５８−１７１；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。ナノ粒子の輸送は、浸透の速度、及び／または、光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）及び高解像多重粒子追跡（ＭＰＴ）を含むが、これらに限定されない蛍光顕微鏡法を用いて測定されても良い。非限定例として、粘膜バリアを浸透することができる組成物は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開番号ＷＯ２０１３１１００２８にて記載されたように作製されても良い。
【０６９３】
粘液を浸透するように操作された脂質ナノ粒子はポリマー物質（すなわち、ポリマーのコア）及び／またはポリマー／ビタミンのコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含んでも良い。ポリマー物質には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリーレートが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー物質は生分解性及び／または生体適合性であっても良い。生体適合性ポリマーの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３１１６８０４にて記載されている。ポリマー物質はさらに照射されても良い。非限定例として、ポリマー物質はガンマ線照射されても良い（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際出願番号ＷＯ２０１２８２１６５を参照のこと）。具体的なポリマーの非限定例には、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ、Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ、Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、たとえば、ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のようなグリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）のようなポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（ビニルアセテート）のようなポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）のようなポリビニルハロゲン化合物、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、たとえば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースのような誘導体化セルロース、たとえば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）のようなアクリル酸のポリマー及びコポリマーｓ及びそれらの混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルソ）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ及びトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、たとえば、ブロックコポリマー（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０１２４７６にて記載された分岐鎖ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマー）、及び（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１２０１２１７１８及び米国公開番号２０１００００３３３７及び米国特許第８，２６３，６６５号を参照のこと）のような、しかし、これらに限定されないコポリマーによって被覆されてもよく、またはそれと会合しても良い。コポリマーは、一般に安全であると見なされる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新しい化学実体が作り出されないような方法であっても良い。たとえば、脂質ナノ粒子は、新しい化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に浸透することができるポロキサマーで被覆しているＰＬＧＡナノ粒子を含んでも良い（Ｙａｎｇら．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１，５０：２５９７−２６００；内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。ヒト粘液に浸透することができるナノ粒子を製造する非限定の拡張可能な方法はＸｕらによって記載されている（たとえば、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３，１７０（２）：２７９−８６を参照のこと；内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６９４】
ポリマー／ビタミンのコンジュゲートのビタミンはビタミンＥであっても良い。コンジュゲートのビタミン部分は、たとえば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性の部分または他の界面活性剤の疎水性部分（たとえば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖）のような、しかし、これらに限定されない他の好適な成分で置換されても良い。
【０６９５】
粘液に浸透するように操作された脂質ナノ粒子は、たとえば、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（たとえば、カチオン性界面活性剤、たとえば、臭化ジメチルジオクタデシル−アンモニウム）、糖または糖誘導体（たとえば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（たとえば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（たとえば、Ｎ−アセチルシステイン、ムグワート、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、アセチルシステイン、ブロモヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アムブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）及びｒｈＤＮＡ分解酵素を含む種々のＤＮＡ分解酵素のような、しかし、これらに限定されない表面変容剤を含んでも良い。表面変容剤は、粒子の表面に埋め込まれても良いし、もしくは巻き込まれてもよく、または脂質ナノ粒子の表面に配置されても良い（たとえば、コーティング、吸着、共有結合または他の方法によって）（たとえば、米国公開番号ＵＳ２０１００２１５５８０及びＵＳ２００８０１６６４１４及びＵＳ２０１３０１６４３４３を参照のこと；そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６９６】
一実施形態では、粘液に浸透する脂質ナノ粒子は少なくとも１つの本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含んでも良い。ポリヌクレオチドは脂質ナノ粒子に被包されてもよく、及び／または粒子の表面に配置されても良い。ポリヌクレオチドは脂質ナノ粒子に共有結合されても良い。粘液に浸透する脂質ナノ粒子の製剤は複数のナノ粒子を構成しても良い。さらに、製剤は、粘液と相互作用し、且つ、粘液に浸透する脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を高め得る粘膜接着を低下させる周辺粘液の構造的な及び／または接着性の特性を変える粒子を含有しても良い。
【０６９７】
別の実施形態では、粘液に浸透する脂質ナノ粒子は粘膜浸透を増強するコーティングを含む低張製剤であっても良い。製剤は、それが送達される上皮について低張であっても良い。低張製剤の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１００２８にて見いだされ得る。
【０６９８】
一実施形態では、粘膜バリアを介する送達を向上させるために、ＮＡＶ製剤は低張溶液を含んでも良いし、または低張溶液であっても良い。低張溶液は、粘液に浸透する粒子のような、しかし、これらに限定されない、粘液不活性の粒子が膣上皮表面に達することができる速度を高めることが見いだされた（たとえば、Ｅｎｓｉｇｎら．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１３，３４（２８）：６９２２−９を参照；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０６９９】
一実施形態では、ＮＡＶは、限定しないで、ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系及びＳｉｌｅｎｃｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ロンドン、英国）からの他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からのＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）のようなリポプレックスとして、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンに基づいて標的化された及び標的化されない、核酸の送達（Ａｌｅｋｕら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８，６８：９７８８−９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇら．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２，５０：７６−７８；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００６，１３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６，１３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒら、Ｐｕｌｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，２３：３３４−３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎら．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２０１０，８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎその他．２００９，３２：４９８−５０７；Ｗｅｉｄｅら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎその他．２００８，３１：１８０−１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４；Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋら、２０１１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５、２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００７，６；１０４：４０９５−４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００８，１９：１２５−１３２；すべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）として製剤化される。
【０７００】
一実施形態では、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞及び白血球を含むが、これらに限定されないインビボの様々な細胞型を受動的にまたは能動的に指向するように、そのような製剤を構築しても良いし、または組成物を変化させても良い（Ａｋｉｎｃら．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，１８：１３５７−１３６４；Ｓｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７；Ｊｕｄｇｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００９，１１９：６６１−６７３；Ｋａｕｆｍａｎｎら，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２０１０，８０：２８６−２９３；Ｓａｎｔｅｌら，Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００６，１３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６，１３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒら，Ｐｕｌｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，２３：３３４−３４４；Ｂａｓｈａら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１９：２１８６−２２００；Ｆｅｎｓｋｅ及びＣｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８，５：２５−４４；Ｐｅｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８，３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ及びＬｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１，１８：１１２７−１１３３；すべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。肝臓細胞への製剤の受動的な標的指向化の一例には、アポリポタンパク質に結合し、インビボでのこれらの製剤の肝細胞への結合と取り込みを促進することが示されているＤＬｉｎ−ＤＭＡ系、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ系及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ系の脂質ナノ粒子製剤が挙げられる（Ａｋｉｎｃら．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，１８：１３５７−１３６４；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。葉酸、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及び抗体が標的とされるアプローチ、しかし、これらに限定されないものによって例示されるように、製剤はその表面上での様々なリガンドの発現を介して選択的にも標的とされ得る（Ｋｏｌｈａｔｋａｒら，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，８：１９７−２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ及びＴｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１，１６：１３８８−１４１２；Ｙｕら，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．２０１０，２７：２８６−２９８；Ｐａｔｉｌら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２００８，２５：１−６１；Ｂｅｎｏｉｔら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１，１２：２７０８−２７１４；Ｚｈａｏら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８，５：３０９−３１９；Ａｋｉｎｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，１８：１３５７−１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１２，８２０：１０５−１１６；Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２，７５７：４９７−５０７；Ｐｅｅｒ，２０１０，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３−６８；Ｐｅｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００７，１０４：４０９５−４１００；Ｋｉｍら，Ｍ��ｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１，７２１：３３９−３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，１８：２０２８−２０３７；Ｓｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８，３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ及びＬｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２０１１，１８：１１２７−１１３３；そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７０１】
一実施形態では、ＮＡＶは固形の脂質ナノ粒子として製剤化される。固形の脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、１０〜１０００ｎｍの間の平均直径を持つ球体であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、且つ界面活性剤及び／または乳化剤で安定化されても良い固形脂質コアマトリクスを持つ。さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子は自己集合脂質／ポリマーナノ粒子であっても良い（Ｚｈａｎｇら，ＡＣＳ．Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ１６９６−１７０を参照のこと；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。非限定例として、ＳＬＮは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１０５１０１にて記載されたＳＬＮであっても良い。別の非限定例として、ＳＬＮは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１０５１０１にて記載された方法または工程によって作製されても良い。
【０７０２】
これらの製剤はＮＡＶによる細胞のトランスフェクションを増やし、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増やすことができ得るので、リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を用いてポリヌクレオチドが指向するタンパク質産生の効率を改善し得る。そのような例の１つには、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの効果的な全身性の送達を可能にする脂質被包の使用が関与する（Ｈｅｙｅｓら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００７，１５：７１３−７２０；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子も用いてポリヌクレオチドの安定性を高めても良い。
【０７０３】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは制御された放出及び／または標的化送達のために製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御された放出」は、治療成果を達成する放出の特定のパターンに従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。一実施形態では、制御された放出及び／または標的化送達のために本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知である送達剤にＲＮＡＶが被包されても良い。本明細書で使用されるとき、「被包する」という用語は内包すること、取り囲むこと、または包み込むことを意味する。それは本発明の化合物の製剤に関するので、被包は、実質的な、完全なまたは部分的なものであっても良い。「実質的に被包される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９％を超えるまたは９９．９９９％を超えるものが送達剤の中に内包される、取り囲まれるまたは包み込まれることを意味する。「部分的に被包される」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０％未満、１０、２０、３０、４０、５０％以下が送達剤の中に内包される、取り囲まれるまたは包み込まれることを意味する。有利なことに、蛍光または電子顕微鏡写真を用いて本発明の医薬組成物または化合物の漏れまたは活性を測定することによって被包が割り出され得る。たとえば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％、または９９．９９％を超えるものが送達剤に被包される。
【０７０４】
一実施形態では、制御放出製剤には、トリブロックコポリマーが挙げられても良いが、これらに限定されない。非限定例として、製剤は２つの異なる型のトリブロックコポリマーを含んでも良い（国際公開番号ＷＯ２０１２１３１１０４及びＷＯ２０１２１３１１０６；そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７０５】
別の実施形態では、ＮＡＶは脂質ナノ粒子または迅速に除かれる脂質ナノ粒子に被包されてもよく、脂質ナノ粒子または迅速に除かれる脂質ナノ粒子は次いで、本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知であるポリマー、ヒドロゲル及び／または外科封止剤に被包されても良い。非限定例として、ポリマー、ヒドロゲル及び／または外科封止剤は、ＰＬＧＡ、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍエーテルａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、たとえば、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧ系封止剤、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）のような外科封止剤であっても良い。
【０７０６】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に注射したとき、ゲルを形成し得る当該技術で既知のポリマーに被包されても良い。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリクスに被包されても良い。
【０７０７】
一実施形態では、制御された放出及び／または標的化送達のためのＮＡＶ製剤には、少なくとも１つの制御放出コーティングも含まれても良い。制御放出コーティングには、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ（登録商標）ならびにエチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））のようなセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０８】
一実施形態では、ＮＡＶの制御放出製剤及び／または標的化送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでも良い。分解性ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシル−プロリンエステル）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、分解性ポリエステルには、ペグ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションが含まれても良い。
【０７０９】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＮＡＶの制御放出製剤及び／または標的化送達製剤は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４０４，２２２号にて記載されたような少なくとも１つのＰＥＧ及び／またはＰＥＧ関連のポリマー誘導体を含んでも良い。
【０７１０】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＮＡＶの制御放出送達製剤は、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１３０１３０３４８にて記載された制御放出ポリマー系であっても良い。
【０７１１】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、本明細書で「治療用ナノ粒子ＲＮＡＶ」と呼ばれる治療用ナノ粒子に被包されても良い。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載されている、及び、たとえば、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３、ＷＯ２０１０００５７２１、ＷＯ２０１０００５７２３、ＷＯ２０１２０５４９２３、米国公開番号ＵＳ２０１１０２６２４９１、ＵＳ２０１００１０４６４５、ＵＳ２０１０００８７３３７、ＵＳ２０１０００６８２８５、ＵＳ２０１１０２７４７５９、ＵＳ２０１０００６８２８６、ＵＳ２０１２０２８８５４１、ＵＳ２０１３０１２３３５１及びＵＳ２０１３０２３０５６７ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、及び同第８，３１８，２１１号のような、しかし、これらに限定されない従来技術で既知である方法によって製剤化されても良い。別の実施形態では、治療用のポリマーナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２０１２０１４０７９０にて記載された方法によって特定されても良い。
【０７１２】
一実施形態では、治療用ナノ粒子ＮＡＶは持続放出のために製剤化されても良い。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は特定の時間にわたる放出速度に従う医薬組成物または化合物を指す。時間には、時間、日にち、週、月及び年が含まれても良いが、これらに限定されない。非限定例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー及び本発明のポリヌクレオチドのような、しかし、これらに限定されない治療剤を含んでも良い（それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号２０１００７５０７２ならびに米国公開番号ＵＳ２０１００２１６８０４、ＵＳ２０１１０２１７３７７及びＵＳ２０１２０２０１８５９を参照のこと）。別の非限定例として、持続放出製剤は、たとえば、結晶、高分子ゲル及び／または微粒子懸濁液のような、しかし、これらに限定されない、持続的な生体利用効率を可能にする作用剤を含んでも良い（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１５０２９５を参照のこと）。
【０７１３】
一実施形態では、治療用ナノ粒子ＮＡＶは標的特異的であるように製剤化されても良い。非限定例として、治療用ナノ粒子はコルチコステロイドを含んでも良い（全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０８４５１８を参照のこと）。非限定例として、治療用ナノ粒子は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２００８１２１９４９、ＷＯ２０１０００５７２６、ＷＯ２０１０００５７２５、ＷＯ２０１１０８４５２１ならびに米国公開番号ＵＳ２０１０００６９４２６、ＵＳ２０１２０００４２９３及びＵＳ２０１００１０４６５５にて記載されたナノ粒子で製剤化されても良い。
【０７１４】
一実施形態では、本発明のナノ粒子はポリマーマトリクスを含んでも良い。非限定例として、ナノ粒子は、たとえば、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン」）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシル−プロリンエステル）またはそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない２以上のポリマーを含んでも良い。
【０７１５】
一実施形態では、治療用ナノ粒子はジブロックコポリマーを含む。一実施形態では、ジブロックコポリマーには、たとえば、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン」）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシル−プロリンエステル）またはそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されないポリマーと組み合わせたＰＥＧが挙げられても良い。別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる欧州特許公開番号にて記載されたジブロックコポリマーを含んでも良い。さらに別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２００５２にて記載されたもののような高Ｘジブロックコポリマーであっても良い。
【０７１６】
非限定例として、治療用ナノ粒子はＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２０１２０００４２９３及び米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）。別の非限定例では、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２４６，９６８号及び国際公開番号ＷＯ２０１２１６６９２３を参照のこと）。さらに別の非限定例では、治療用ナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７２４０６にて記載されたようなステルスナノ粒子または標的特異的なステルスナノ粒子である。
【０７１７】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は多ブロックコポリマーを含んでも良い（たとえば、そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２６３，６６５号及び同第８，２８７，９１０号ならびに米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９５９８７を参照のこと）。
【０７１８】
さらに別の非限定例では、脂質ナノ粒子はブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む（たとえば、感熱性のヒドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、Ｌｅｅら．Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２０（１２）：１９９５−２０００にてＴＧＦベータ１遺伝子の送達手段として；Ｌｉら．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２０（６）：８８４−８８８；及びＣｈａｎｇら，  Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７，１１８：２４５−２５３にて制御された遺伝子送達系として使用された；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。本発明のＮＡＶはＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０７１９】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は多ブロックコポリマーを含んでも良い（たとえば、米国特許第８，２６３，６６５号及び同第８，２８７，９１０号並びに米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９５９８７を参照のこと；そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７２０】
一実施形態では、本明細書に記載されているブロックコポリマーは、非ポリマーミセルとブロックコポリマーとを含むポリイオン複合体に含まれても良い（たとえば、米国公開番号２０１２００７６８３６を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７２１】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は少なくとも１つのアクリル系ポリマーを含んでも良い。アクリル系ポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸エトキシエチル、メタクリル酸シアノエチル、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。。
【０７２２】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は少なくとも１つのポリ（ビニルエステル）ポリマーを含んでも良い。ポリ（ビニルエステル）ポリマーはランダムコポリマーのようなコポリマーであっても良い。非限定例として、ランダムコポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際出願番号ＷＯ２０１３０３２８２９または米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２１９５４にて記載されたもののような構造を有しても良い。態様の１つでは、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは本明細書に記載されているポリヌクレオチドにコンジュゲートされても良い。別の態様では、本発明で使用されても良いポリ（ビニルエステル）ポリマーは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるものに記載されたものであっても良い。
【０７２３】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は少なくとも１つのジブロックコポリマーを含んでも良い。ジブロックコポリマーは、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー（たとえば、国際特許公開番号ＷＯ２０１３０４４２１９を参照；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）であっても良いが、これらに限定されない。非限定例として、治療用ナノ粒子を用いて癌を治療しても良い（国際公開番号ＷＯ２０１３０４４２１９を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７２４】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知である少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含んでも良い。
【０７２５】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、たとえば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（ベータ−アミノエステル）（たとえば、米国特許第８，２８７，８４９号を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）及びそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含んでも良い。
【０７２６】
別の実施形態では、本明細書に記載されているナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許出願番号ＷＯ２０１３０５９４９６で記載されたもののようなアミンカチオン性脂質を含んでも良い。態様の１つでは、カチオン性脂質はアミノ−アミンまたはアミノ−アミドの部分を有しても良い。
【０７２７】
一実施形態では、治療用ナノ粒子はポリカチオン性側鎖を含有しても良い少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでも良い。分解性ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシル−プロリンエステル）及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、分解性ポリエステルにはペグ化ポリマーを形成するＰＥＧコンジュゲーションが含まれても良い。
【０７２８】
別の実施形態では、治療用ナノ粒子には、少なくとも１つの標的指向化リガンドのコンジュゲーションが含まれても良い。標的指向化リガンドはモノクローナル抗体のような、しかし、これらに限定されない当該技術で既知のリガンドであっても良い（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６：６７３２−６７４０；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７２９】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌を標的とするのに使用されても良い水溶液で製剤化されても良い（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０８４５１３及び米国公開番号ＵＳ２０１１０２９４７１７を参照のこと）。
【０７３０】
一実施形態では、治療用ナノ粒子ＮＡＶ、たとえば、少なくとも１つのＮＡＶを含む治療用ナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４０４，７９９号にてＰｏｄｏｂｉｎｓｋｉらによって記載された方法を用いて製剤化されても良い。
【０７３１】
一実施形態では、ＮＡＶは合成ナノ担体に被包されてもよく、連結されてもよく、及び／または会合されても良い。合成ナノ担体には、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３、ＷＯ２０１２１３５０１、ＷＯ２０１２１４９２５２、ＷＯ２０１２１４９２５５、ＷＯ２０１２１４９２５９、ＷＯ２０１２１４９２６５、ＷＯ２０１２１４９２６８、ＷＯ２０１２１４９２８２、ＷＯ２０１２１４９３０１、ＷＯ２０１２１４９３９３、ＷＯ２０１２１４９４０５、ＷＯ２０１２１４９４１１、ＷＯ２０１２１４９４５４及びＷＯ２０１３０１９６６９、ならびに米国公開番号ＵＳ２０１１０２６２４９１、ＵＳ２０１００１０４６４５、ＵＳ２０１０００８７３３７及びＵＳ２０１２０２４４２２２にて記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。合成ナノ担体は当該技術で既知である及び／または本明細書に記載されている方法を用いて製剤化されても良い。非限定例として、合成ナノ担体は、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０２６２４９１、ＵＳ２０１００１０４６４５、ＵＳ２０１０００８７３３７及びＵＳ２０１２０２４４２２にて記載された方法によって製剤化されても良い。別の実施形態では、合成ナノ担体は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０７２２１８及び米国特許第８，２１１，４７３号に記載された方法によって凍結乾燥されても良い。。さらに別の実施形態では、合成ナノ担体を含むが、これらに限定されない本発明の製剤は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２３０５６８にて記載された方法によって凍結乾燥されても良い。
【０７３２】
一実施形態では、合成ナノ担体は本明細書に記載されているポリヌクレオチドを放出するための反応基を含有しても良い（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０９５２５５２及び米国公開番号ＵＳ２０１２０１７１２２９を参照のこと）。
【０７３３】
一実施形態では、合成ナノ担体は合成ナノ担体の送達からの免疫応答を高めるための免疫刺激剤を含有しても良い。非限定例として、合成ナノ担体は免疫系のＴｈ１系の応答を高め得るＴｈ１免疫刺激剤を含んでも良い（それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０１２３５６９及び米国公開番号ＵＳ２０１１０２２３２０１を参照のこと）。
【０７３４】
一実施形態では、合成ナノ担体は標的化された放出のために製剤化されても良い。一実施形態では、合成ナノ担体は特定されたｐＨにて及び／または所望の時間間隔の後、ポリヌクレオチドを放出するように製剤化される。非限定例として、合成ナノ担体は２４時間後及び／またはｐＨ４．５にてＮＡＶを放出するように製剤化されても良い（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０１３８１９３及びＷＯ２０１０１３８１９４ならびに米国公開番号ＵＳ２０１１００２０３８８及びＵＳ２０１１００２７２１７を参照のこと）。
【０７３５】
一実施形態では、合成ナノ担体は本明細書に記載されているポリヌクレオチドの制御放出及び／または持続放出のために製剤化されても良い。非限定例として、持続放出用の合成ナノ担体は、当該技術で既知の、本明細書に記載されている、及び／またはそのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０１３８１９２及び米国公開番号２０１００３０３８５０にて記載されたような方法によって製剤化されても良い。
【０７３６】
一実施形態では、ＮＡＶは、製剤が結晶性側鎖（ＣＹＳＣ）ポリマーである少なくとも１つのポリマーを含む制御放出及び／または持続放出のために製剤化されても良い。ＣＹＳＣポリマーは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，３９９，００７号にて記載されている。
【０７３７】
一実施形態では、合成ナノ担体はワクチンとして使用するために製剤化されても良い。一実施形態では、合成ナノ担体は少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを被包しても良い。非限定例として、合成ナノ担体は少なくとも１つの抗原とワクチン剤形のための賦形剤とを含んでも良い（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１５０２６４及び米国公開番号ＵＳ２０１１０２９３７２３を参照のこと）。別の非限定例として、ワクチン剤形は、同一のまたは異なる抗原を伴った少なくとも２つの合成ナノ担体と賦形剤とを含んでも良い（それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１５０２４９及び米国公開番号ＵＳ２０１１０２９３７０１を参照のこと）。ワクチン剤形は、本明細書に記載されている、当該技術で既知である、及び／またはそのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１５０２５８及び米国公開番号ＵＳ２０１２００２７８０６にて記載された方法によって選択されても良い。
【０７３８】
一実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでも良い。非限定例として、アジュバントは、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、リン酸ジメチルジオクタデシルアンモニウムまたは酢酸ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）及びマイコバクテリウム総脂質抽出物の無極性分画もしくは前記無極性分画の一部を含んでも良い（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２４１，６１０号を参照のこと）。別の実施形態では、合成ナノ担体は少なくとも１つのポリヌクレオチドとアジュバントとを含んでも良い。非限定例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１５０２４０及び米国公開番号ＵＳ２０１１０２９３７００にて記載された方法によって製剤化されても良い。
【０７３９】
一実施形態では、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを被包しても良い。非限定例として、合成ナノ担体には、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０２４６２１、ＷＯ２０１２０２６２９、ＷＯ２０１２０２４６３２ならびに米国公開番号ＵＳ２０１２００６４１１０、ＵＳ２０１２００５８１５３及びＵＳ２０１２００５８１５４にて記載されたナノ担体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４０】
一実施形態では、合成ナノ担体は、液性応答及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を引き起こすことができても良いポリヌクレオチドに結合されても良い（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０１９６６９を参照のこと）。
【０７４１】
一実施形態では、ＮＡＶは、両性イオン脂質に被包されてもよく、連結されてもよく及び／または会合されても良い。両性イオン脂質の非限定例及び両性イオン脂質の使用方法は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２１６６０７にて記載されている。態様の１つでは、両性イオン脂質は本明細書に記載されているリポソーム及び脂質ナノ粒子にて使用されても良い。
【０７４２】
一実施形態では、ＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９７１００にて記載されたようなコロイドナノ担体にて製剤化されても良い。
【０７４３】
一実施形態では、ナノ粒子は経口投与用に最適化されても良い。ナノ粒子は、たとえば、キトサンまたはその誘導体のような、しかし、これらに限定されない少なくとも１つのカチオン性バイオポリマーを含んでも良い。非限定例として、ナノ粒子は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１２０２８２３４３にて記載された方法によって製剤化されても良い。
【０７４４】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは脂質ＫＬ５２（全体が参照によって本明細書に明白に組み入れられる米国出願公開番号２０１２／０２９５８３２にて開示されたアミノ−脂質）を含む。ＬＮＰ投与の活性及び／または安全性（ＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数及びサイトカインの産生の１以上を調べることによって測定されるような）がそのような脂質の組み込みによって改善されても良い。ＫＬ５２を含むＬＮＰは静脈内に及び／または１以上の用量で投与されても良い。いくつかの実施形態では、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与はＭＣ３を含むＬＮＰに比べて同等のまたは改善されたｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現を生じる。
【０７４５】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶは、さらに小さなＬＮＰを用いて送達されても良い。そのような粒子は、たとえば、０．１ｕｍ未満、１．０ｕｍ未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、９７５ｕｍ未満のような、しかし、これらに限定されない０．１ｕｍを下回り、１００ｎｍまでの直径を含んでも良い。
【０７４６】
別の実施形態では、ＮＡＶは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約５０ｎＭ、約２０〜約５０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ及び／または約７０〜約９０ｎｍの直径をみ得るさらに小さなＬＮＰを用いて送達されても良い。
【０７４７】
いくつかの実施形態では、そのようなＬＮＰはマイクロ流体ミキサーを備える方法を用いて合成される。例となるマイクロ流体ミキサーには、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ  ｂｅｉ  Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されたもの及び／または交互ヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ．ら）を含むが、これらに限定されないスリットインターデジタルマイクロミキサーが挙げられても良いが、これらに限定されない。ミリ秒のマイクロ流体混合を用いた水性とトリグリセリドのコアを伴った限界寸法のナノ粒子システムのボトムアップ設計及び合成が公開されている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１２．２８：３６３３−４０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ら，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２０１２．１：ｅ３７；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ら，Ｒａｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２．１３４（１６）：６９４８−５１；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰ生成の方法はさらに、微細構造が誘導するカオス的移流（ＭＩＣＡ）によって混合が生じる少なくとも２つの流入の流れの混合を含む。この方法によれば、流体の流れは、ヘリンボーンのパターンに存在する流路を介して流れ、回転流を生じ、互いの近くで流体を折り返す。この方法はまた流体の循環の間に表面が方向性を変える流体混合のための表面を含んでも良い。ＳＨＭを用いてＬＮＰを生成する方法には、それぞれが全体として参照によって本明細書に明示的に組み入れられる米国出願公開番号２００４／０２６２２２３及び２０１２／０２７６２０９にて開示されたものが挙げられる。
【０７４８】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、たとえば、スリット型インターデジタル微細構造ミキサー（ＳＩＭＭ−Ｖ２）または標準のスリット型インターデジタルマイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）またはキャタピラー（ＣＰＭＭ）またはＩｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍａｉｎｚ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、ドイツ）の衝突噴流（ＩＪＭＭ）のような、しかし、これらに限定されないマイクロミキサーを用いて作り出された脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０７４９】
一実施形態では、本発明のＮＡＶはマイクロ流体技術を用いて作り出された脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ．Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４２：３６８−３７３；及びＡｂｒａｈａｍら．Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５：６４７−６５１を参照のこと；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。非限定例として、制御されたマイクロ流体の製剤化には、低いレイノルズ数でマイクロ流路にて定常圧で動かされる流れの細流を混合する受動的な方法が含まれる（たとえば、Ａｂｒａｈａｍら．Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５：６４７−６５１を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７５０】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）のもののような、しかし、これらに限定されないマイクロミキサーチップを用いて作り出される脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。マイクロミキサーチップは、スリット及び再結合メカニズムによって２以上の流体の流れを迅速に混合するのに使用することができる。
【０７５１】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０６３４６８または米国特許第８，４４０，６１４号にて記載された薬剤を被包するマイクロスフェアを用いて送達するために製剤化されても良い。マイクロスフェアは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０６３４６８にて記載された式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物を含んでも良い。別の態様では、本発明のＮＡＶの細胞への送達には、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）が有用である（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０６３４６８を参照のこと）。
【０７５２】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍのような、しかし、これらに限定されない約１０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０７５３】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は約１０〜５００ｎｍの直径を有しても良い。
【０７５４】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍを超える、１５０ｎｍを超える、２００ｎｍを超える、２５０ｎｍを超える、３００ｎｍを超える、３５０ｎｍを超える、４００ｎｍを超える、４５０ｎｍを超える、５００ｎｍを超える、５５０ｎｍを超える、６００ｎｍを超える、６５０ｎｍを超える、７００ｎｍを超える、７５０ｎｍを超える、８００ｎｍを超える、８５０ｎｍを超える、９００ｎｍを超える、９５０ｎｍを超えるまたは１０００ｎｍを超える直径を有しても良い。
【０７５５】
態様の１つでは、脂質ナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５９９２２にて記載された限界寸法の脂質ナノ粒子であっても良い。限界寸法の脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含んでもよく、脂質二重層は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８〜Ｃ２０の脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン、及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）のような、しかし、これらに限定されないリン脂質を含んでも良い。別の態様では、限界寸法の脂質ナノ粒子は、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧのような、しかし、これらに限定されないポリエチレングリコール／脂質を含んでも良い。
【０７５６】
一実施形態では、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０６３５３０にて記載された送達法を用いてＮＡＶを特定の位置に送達してもよく、局在化させてもよく、及び／または濃縮しても良い。非限定例として、対象にＮＡＶを送達する前に、それと同時に、またはその後に対象は空のポリマー粒子を投与されても良い。空のポリマー粒子はいったん対象に接触すると体積に変化を受け、対象における特定の位置にて留まる、埋め込まれる、不動化されるまたは捕捉されるようになる。
【０７５７】
一実施形態では、ＮＡＶは、能動的な物質放出系にて製剤化されても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１０２５４５を参照のこと）。能動的な物質放出系は、（１）触媒上活性のある核酸とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド阻害剤の鎖に結合した少なくとも１つのナノ粒子と、（２）治療上活性のある物質（たとえば、本明細書に記載されているポリヌクレオチド）に結合した少なくとも１つの基質分子に結合した化合物とを含んでもよく、その際、治療上活性のある物質は触媒上活性のある核酸による基質分子の切断によって放出される。
【０７５８】
一実施形態では、ＮＡＶは、非細胞性物質を含む内側コアと細胞膜を含む外側表面とを含むナノ粒子にて製剤化されても良い。細胞膜は細胞に由来するまたはウイルスに由来する膜に由来する。非限定例として、ナノ粒子は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５２１６７に記載された方法によって作製されても良い。別の非限定例として、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５２１６７に記載されたナノ粒子は本明細書に記載されているＮＡＶを送達するのに使用されても良い。
【０７５９】
一実施形態では、ＮＡＶは多孔性ナノ粒子に支持された脂質二重層（原細胞）にて製剤化されても良い。原細胞は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５６１３２にて記載されている。
【０７６０】
一実施形態では、本明細書に記載されているＮＡＶは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４２０，１２３号及び同第８，５１８，９６３号ならびに欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号にて記載されたような、またはそこに記載された方法によって作製されるポリマーナノ粒子にて製剤化されても良い。非限定例として、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５１８，９６３号に記載されたナノ粒子またはそこで記載された方法によって作製されるナノ粒子のようなポリマーナノ粒子は高いガラス転移温度を有し得る。別の非限定例として、経口製剤及び非経口製剤のためのポリマーナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号にて記載された方法によって作製されても良い。
【０７６１】
別の実施形態では、本明細書に記載されているＮＡＶはイメージングで使用されるナノ粒子にて製剤化されても良い。ナノ粒子は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２９６３６にて記載されたもののようなリポソームナノ粒子であっても良い。非限定例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデク−１−イル｝−酢酸及び中性の完全に飽和したリン脂質成分を含んでも良い（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２９６３６を参照のこと）。
【０７６２】
一実施形態では、本発明で使用されても良いナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１３０３４８にて記載された方法によって形成される。
【０７６３】
本発明のナノ粒子はさらに、欠乏が貧血から神経管欠損までの健康被害をもたらすことができるもののような、しかし、これらに限定されない栄養物を含んでも良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０７２９２９を参照のこと）。非限定例として、栄養物は、第一鉄塩、第二鉄塩または元素鉄の形態での鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミンまたは微量栄養素であっても良い。
【０７６４】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、膨潤性ナノ粒子にて製剤化されても良い。膨潤性ナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４４０，２３１号にて記載されたものであっても良いが、これらに限定されない。非限定例として、膨潤性ナノ粒子は本発明のＮＡＶを肺系統に送達するのに使用されても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４４０，２３１号を参照のこと）。
【０７６５】
本発明のＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４４９，９１６号にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないポリ無水物ナノ粒子にて製剤化されても良い。
【０７６６】
本発明のナノ粒子及びマイクロ粒子を幾何学的に操作してマクロファージの応答及び／または免疫応答を調節しても良い。態様の１つでは、たとえば、肺への送達のような、しかし、これらに限定されない標的化された送達について本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、幾何学的に操作された粒子は種々の形状、サイズ及び／または表面の変化を有しても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８２１１１を参照のこと）。幾何学的に操作された粒子の他の物理的特徴には、開窓、角度のあるアーム、非対称の及び表面の粗さ、細胞及び組織との相互作用を変えることができる電荷が挙げられても良いが、これらに限定されない。非限定例として、本発明のナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８２１１１にて記載された方法によって作製されても良い。
【０７６７】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０９０６０１にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されない水溶性ナノ粒子であっても良い。ナノ粒子は、良好な水溶性を示すために小型で両性イオンのリガンドを有する無機ナノ粒子であっても良い。ナノ粒子は、小さな流体力学直径（ＨＤ）、時間、ｐＨ及び塩分濃度に関する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合も有しても良い。
【０７６８】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７２４０６にて記載された方法によって開発されても良い。
【０７６９】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７２４０６にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないステルスナノ粒子または標的特異的なステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７２４０６にて記載された方法によって作製されても良い。
【０７７０】
別の実施形態では、ステルスナノ粒子または標的特異的なステルスナノ粒子はポリマーマトリクスを含んでも良い。ポリマーマトリクスは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない２以上のポリマーを含んでも良い。
【０７７１】
一実施形態では、ナノ粒子は、高密度の核酸層を有するナノ粒子／核酸のハイブリッド構造であっても良い。非限定例として、ナノ粒子／核酸のハイブリッド構造は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７１６４６にて記載された方法によって作製されても良い。ナノ粒子は、本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知であるポリヌクレオチドのような、しかし、これらに限定されない核酸を含んでも良い。
【０７７２】
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、コアナノ構造に埋め込まれても良いし、またはナノ構造の中でもしくは上で少なくとも１つのペイロードを運ぶもしくは会合することが可能である低密度の多孔性３Ｄ構造もしくはコーティングで被覆されても良い。少なくとも１つのナノ粒子を含むナノ構造の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２３５２３にて記載されている。
【０７７３】
ポリマー、生分解性ナノ粒子及びコア／シェルナノ粒子
本発明のＮＡＶは、天然のポリマー及び／または合成のポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用されても良いポリマーの非限定例には、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及びＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製のＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、たとえば、限定せずに、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）製のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−ｃｏ−グリコ―ル酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）及び、たとえば、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）のような、しかし、これらに限定されないｐＨ応答性コブロックポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７４】
キトサン製剤の非限定例には、正に荷電したキトサンのコア及び負に荷電した基質の外側部分が含まれる（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１２０２５８１７６）。キトサンには、Ｎ−トリメチルキトサン、モノ−Ｎ−カルボキシメチルキトサン（ＭＣＣ）、Ｎ−パルミトイルキトサン（ＮＰＣＳ）、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７５】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、たとえば、細菌のような、しかし、これらに限定されない望ましくない物質のポリマー表面への接着を減らす及び／または抑制するように加工を受けている。ポリマーは、当該技術で既知の及び／または当該技術で記載された及び／または全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１５０４６７にて記載された方法によって加工されても良い。
【０７７６】
ＰＬＧＡ製剤の非限定例には、ＰＬＧＡ注射用デポー（たとえば、６６％のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）と水性溶媒及びリュープロリドである残りとにＰＬＧＡを溶解することによって形成されるＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）。いったん注射されると、ＰＬＧＡとリュープロリドペプチドは皮下空間に沈殿する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７７】
これらのポリマー法の多くは、インビボで細胞の細胞質にオリゴヌクレオチドを送達することにおいて有効性を明らかにしている（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００８，１９：１２５−１３２にて概説された；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。核酸のインビボでの頑強な送達が得られている２つのポリマー法は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関するこの場合、動的ポリコンジュゲート及びシクロデキストリン系のナノ粒子である（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１５６７２１を参照のこと）。これらの送達法の第１は動的ポリコンジュゲートを使用し、マウスにおいてインビボで肝細胞にてｓｉＲＮＡを効果的に送達し、内在性の標的ｍＲＮＡをサイレントにすることが示されている（Ｒｏｚｅｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００７，１０４：１２９８２−１２８８７；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。この特定の方法は、重要な特徴には、核酸、この場合ｓｉＲＮＡがジスルフィド結合を介して共有結合し、且つＰＥＧ（電荷を隠すための）基とＮ−アセチルグルコサミン（肝細胞を標的指向化するための）基の双方がｐＨ感受性の結合を介して連結される膜に活性があるポリマーが含まれる多成分ポリマー系である（Ｒｏｚｅｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００７，１０４：１２９８２−１２８８７；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。肝細胞への結合及びエンドソームへの侵入の際、ポリマー複合体は、低ｐＨ環境にて分解し、ポリマーはその正の電荷を露出して、ポリマーからのｓｉＲＮＡのエンドソーム脱出及び細胞質放出をもたらす。Ｎ−アセチルグルコサミン基のマンノース基による置換を介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現している肝細胞から類洞内皮及びクッパー細胞に標的指向化を変えることができることが示された。もう１つのポリマー法には、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリン含有のポリカチオン性ナノ粒子を使用することが関与する。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現しているユーイング肉腫の腫瘍細胞においてＥＷＳ−ＦＬＩＩ遺伝子産物の標的化されたサイレンシングを実証し（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５：８９８４−８９８２；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、これらのナノ粒子にて製剤化されたｓｉＲＮＡが非ヒト霊長類で良好に認容されることを実証している（Ｈｅｉｄｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４：５７１５−２１；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。これらの送達戦略は双方とも、標的化された送達及びエンドソーム脱出のメカニズムの双方を用いた合理的なアプローチを組み込む。
【０７７８】
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチドの持続する放出または遅延する放出（たとえば、筋肉内または皮下の注射に続く）を許容することができる。ポリヌクレオチドについて変化した放出特性は、たとえば、延長した時間にわたるコードされたタンパク質の翻訳を生じることができる。ポリマー製剤を用いてポリヌクレオチドの安定性を高めても良い。以前、生分解性ポリマーを用いてポリヌクレオチド以外の核酸を分解から保護し、インビボでペイロードの持続放出を生じることが示されている（Ｒｏｚｅｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００７，１０４：１２９８２−１２８８７；Ｓｕｌｌｉｖａｎら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０，７：１４３３−１４４６；Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１０，Ｏｃｔ．１；Ｃｈｕら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１２，Ｊａｎ．１３；Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１２，３３：２３０１−２３０９；Ｂｅｎｏｉｔら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１，１２：２７０８−２７１４；Ｓｉｎｇｈａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．２０１１，２：１３３−１４７；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００８，１９：１２５−１３２；Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ及びＷａｇｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００８，１６：１１３１−１１３８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１，８：１４５５−１４６８；Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２００９，６：６５９−６６８；Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４：１０６７−１０７０；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７７９】
一実施形態では、ＮＡＶ医薬組成物は持続放出製剤であっても良い。さらなる実施形態では、持続放出製剤は皮下送達のためのものであっても良い。持続放出製剤には、ＰＬＧＡミクロスフェア、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、たとえば、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧ系封止剤、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）のような外科封止剤が挙げられても良いが、これらに限定されない。
【０７８０】
非限定例として、ＮＡＶは、調節可能な放出速度（たとえば、日及び週）を持つＰＬＧＡミクロスフェアを調製し、被包過程の間、修飾されたｍＲＮＡの完全性を維持しながら、ＰＬＧＡミクロスフェアに修飾されたｍＲＮＡを被包することによってＰＬＧＡミクロスフェアにて製剤化されても良い。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出埋め込み応用（たとえば、緑内障用のピロカルピン眼科挿入物である徐放性製品Ｏｃｕｓｅｒｔまたは持続放出プロゲステロン子宮内用具であるプロゲスタサート；経皮送達系であるＴｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ及びＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）にて広範に使用される非生分解性で生体適合性のポリマーである。ポロキサマーＦ−４０７ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を有し、且つ１５℃を超える温度で固体ゲルを形成するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーである親水性で非イオン性界面活性剤である。ＰＥＧ系外科封止剤は、１分で調製することができ、３分で封止し、３０日以内に再吸収される送達用具で混合される２つの合成ＰＥＧ成分を含む。ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）及び天然ポリマーは投与の部位にてその場でのゲル化が可能である。それらはイオン相互作用を介してタンパク質及びペプチドの治療用候補と相互作用して安定化効果を提供することが示されている。
【０７８１】
ポリマー製剤は、葉酸塩、トランスフェリン及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）によって例示されるような、しかし、これらに限定されない様々なリガンドの発現を介しても選択的に標的化され得る（Ｂｅｎｏｉｔら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１，１２：２７０８−２７１４；Ｒｏｚｅｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００７，１０４：１２９８２−１２８８７；Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２００９，６：６５９−６６８；Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４：１０６７−１０７０；それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０７８２】
本発明のＮＡＶは、ポリマー化合物と共にまたはポリマー化合物にて製剤化されても良い。ポリマーには、ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐鎖ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾されたポロキサマー、生分解性ポリマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、多ブロックコポリマー、直鎖生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシル−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン−含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない少なくとも１つのポリマーが挙げられても良いが、これらに限定されない。
【０７８３】
非限定例として、本発明のＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１７７，２７４号にて記載されたようなＰＬＬでグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物と共に製剤化されても良い。製剤は、ポリヌクレオチドのインビトロでの細胞のトランスフェクションまたはインビボでの送達に使用されても良い。別の例では、ポリヌクレオチドはカチオン性ポリマーを伴った溶液または培地に、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２００９００４２８２９及び２００９００４２８２５にて記載されたように乾燥させることができる乾燥医薬組成物に、または溶液に懸濁されても良い。
【０７８４】
別の非限定例として、本発明のＮＡＶは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２０１２０００４２９３及び米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，００４，５７３号を参照のこと）と共に製剤化されても良い。非限定例として、本発明のＮＡＶは、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマー（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２４６，９６８号を参照のこと）と共に製剤化されても良い。
【０７８５】
ポリアミン誘導体を用いて核酸を送達しても良いし、または疾患を治療及び／または予防しても良いし、または埋め込み用具もしくは注射用具に包含されても良い（それぞれの内容が全体として参照によって本明細書組み入れられる米国公開番号２０１００２６０８１７（今や米国特許第８，４６０，６９６号））。非限定例として、医薬組成物はＮＡＶと米国公開番号２０１００２６０８１７（今や米国特許第８，４６０，６９６号；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）にて記載されたポリアミン誘導体とを含んでも良い。非限定例として、本発明のＮＡＶは、オリゴアミンを含むジルキンユナイトに炭水化物ジアジ化モノマーを組み合わせることによって調製される１，３−双極性付加ポリマーを用いて送達されても良い（全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２３６，２８０号）。
【０７８６】
本発明のＮＡＶは、少なくとも１つのアクリルポリマーと共に製剤化されても良い。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸エトキシエチル、メタクリル酸シアノエチル、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。。
【０７８７】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１１５８６２、ＷＯ２０１２０８２５７４及びＷＯ２０１２０６８１８７ならびに米国公開番号２０１２０２８３４２７にて記載された少なくとも１つのポリマー及び／またはその誘導体と共に製剤化されても良い。
【０７８８】
別の実施形態では、本発明のＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１１１１５８６２にて記載されたような式Ｚのポリマーと共に製剤化されても良い。さらに別の実施形態では、ＮＡＶは、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０８２５７４またはＷＯ２０１２０６８１８７及び米国公開番号２０１２０２８３４２にて記載された式Ｚ、Ｚ’またはＺ”のポリマーと共に製剤化されても良い。本発明の修飾されたＲＮＡと共に製剤化されるポリマーはそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０８２５７４またはＷＯ２０１２０６８１８７にて記載された方法によって合成されても良い。
【０７８９】
本発明のＮＡＶは少なくとも１つのアクリルポリマーと共に製剤化されても良い。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸エトキシエチル、メタクリル酸シアノエチル、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７９０】
本発明のＮＡＶの製剤は、たとえば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−ｃｏ−エステル）またはそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含んでも良い。非限定例として、ポリ（アミン−ｃｏ−エステル）は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８２５２９にて記載されたポリマーであってもよく、及び／または記載された方法によって作製されても良い。
【０７９１】
たとえば、本発明のＮＡＶは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、または生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、直鎖生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせを含む医薬化合物にて製剤化されても良い。生分解性のカチオン性リポポリマーは当該技術で既知の方法及び／またはそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，６９６，０３８号、米国出願番号２００３００７３６１９及び２００４０１４２４７４にて記載された方法によって作製されても良い。ポリ（アルキレンイミン）は当該技術で既知の方法及び／または全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１００００４３１５にて記載された方法を用いて作製されても良い。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当該技術で既知の方法及び／または内容がそれぞれ全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５１７，８６９号及び同第６，２６７，９８７号にて記載されたような方法を用いて作製されても良い。直鎖生分解性コポリマーは、当該技術で既知の方法及び／または米国特許第６，６５２，８８６号にて記載された方法によって作製されても良い。ＰＡＧＡポリマーは共重合されて、たとえば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド及びポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）のような、しかし、これらに限定されないポリマーと共にコポリマーまたはブロックコポリマーを形成しても良い。生分解性の架橋カチオン性多ブロックコポリマーは、当該技術で既知の方法及び／またはそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，０５７，８２１号、同第８，４４４，９９２号または米国公開番号２０１２００９１４５にて記載されたような方法によって作製されても良い。たとえば、多ブロックコポリマーは、分枝鎖ポリエチレンイミンと比べて異なるパターンを有する直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）を用いて合成されても良い。さらに、組成物または医薬組成物は、当該技術で既知の、本明細書に記載されている、またはそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１００００４３１５または米国特許第６，２６７，９８７号及び同第６，２１７，９１２号にて記載されたような方法によって作製されても良い。
【０７９２】
本発明のＮＡＶは、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルと共に製剤化されても良い。分解性ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシル−プロリンエステル）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、分解性ポリエステルはＰＥＧコンジュゲーションを含んでペグ化ポリマーを形成しても良い。
【０７９３】
本発明のＮＡＶは少なくとも１つの架橋可能なポリエステルと共に製剤化されても良い。架橋可能なポリエステルには、当該技術で既知のもの及び内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１２０２６９７６１にて記載されたものが挙げられる。
【０７９４】
本発明のＮＡＶは少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーにてまたはそれと共に製剤化されても良い。シクロデキストリンポリマー及びシクロデキストリンポリマーを作製する方法には、当該技術で既知のもの及び内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１３０１８４４５３にて記載されたものが挙げられる。
【０７９５】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、少なくとも１つの架橋されたカチオン結合ポリマーにてまたはそれと共に製剤化されても良い。架橋されたカチオン結合ポリマー及び架橋されたカチオン結合ポリマーを作製する方法には、当該技術で既知のもの及びそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１０６０７２、ＷＯ２０１３１０６０７３及びＷＯ２０１３１０６０８６にて記載されたものが挙げられる。
【０７９６】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは、少なくとも１つの分岐鎖ポリマーにてまたはそれと共に製剤化されても良い。分岐鎖ポリマー及び分岐鎖ポリマーを作製する方法には、当該技術で既知のもの及びそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１３０７１にて記載されたものが挙げられる。
【０７９７】
一実施形態では、本発明のＮＡＶは少なくとも１つのペグ化アルブミンポリマーにてまたはそれと共に製剤化されても良い。ペグ化アルブミンポリマー及びペグ化アルブミンポリマーを作製する方法には、当該技術で既知のもの及びそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２３１２８７にて記載されたものが挙げられる。
【０７９８】
一実施形態では、本明細書に記載されているポリマーは脂質終端ＰＥＧにコンジュゲートされても良い。非限定例として、ＰＬＧＡは脂質終端ＰＥＧにコンジュゲートされてＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成しても良い。別の非限定例として、本発明と共に使用するためのＰＥＧコンジュゲートは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２００８１０３２７６にて記載されている。ポリマーは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２７３，３６３号に記載されたコンジュゲートのような、しかし、これらに限定されないリガンドコンジュゲートを用いてコンジュゲートされても良い。
【０７９９】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは投与に先立ってＰＥＧまたはリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウムの溶液と混合しても良い。
【０８００】
別の実施形態では、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドはＰＥＧと混合してもよく、リン酸ナトリウム／炭酸ナトリウムの溶液とも混合しても良い。
【０８０１】
さらに別の実施形態では、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドはＰＥＧと混合してもよく、対象とする第２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドはリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウムの溶液と混合しても良い。
【０８０２】
一実施形態では、本明細書に記載されているＮＡＶは別の化合物にコンジュゲートされても良い。コンジュゲートの非限定例は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，９６４，５７８号及び同第７，８３３，９９２号にて記載されている。別の実施形態では、本発明のＮＡＶは、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，９６４，５７８号及び同第７，８３３，９９２号にて記載される式１〜１２２のコンジュゲートにコンジュゲートされても良い。本明細書に記載されているＮＡＶは、たとえば、金のような、しかし、これらに限定されない金属にコンジュゲートされても良い（たとえば、Ｇｉｌｊｏｈａｎｎら．Ｊｏｕｒｎａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１（６）：２０７２−２０７３を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。別の実施形態では、本明細書に記載されているＮＡＶは金ナノ粒子にコンジュゲートされても良いし、及び／または被包されても良い（それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１６２６９及び米国公開番号ＵＳ２０１２０３０２９４０及びＵＳ２０１３０１７７５２３）。
【０８０３】
全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１００００４３１３にて記載されたように、遺伝子送達組成物にはヌクレオチド配列及びポロキサマーが含まれても良い。たとえば、本発明のＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１００００４３１３にて記載されたポロキサマーと共に遺伝子送達組成物にて使用されても良い。
【０８０４】
一実施形態では、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロール基とポリエチレングリコール基に共有結合され得るカチオン性リポポリマーに接触させることによって安定化させても良い。ポリマー製剤は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２００９００４２８２９にて記載された方法を用いてカチオン性リポポリマーに接触させても良い。カチオン性担体には、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、塩化１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウム（ＤＯＴＩＭ）、トリフルオロ酢酸２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、臭化Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、臭化Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシフプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、塩化Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。非限定例として、ＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号２０１３００６５９４２にて記載されたもののようなカチオン性リポポリマーと共に製剤化されても良い。
【０８０５】
本発明のＮＡＶは、１以上のポリマーのポリプレックスにて製剤化されても良い（たとえば、米国特許第８，５０１，４７８号、米国公開番号２０１２０２３７５６５及び２０１２０２７０９２７及び２０１３０１４９７８３ならびに国際特許公開番号ＷＯ２０１３０９０８６１を参照のこと；そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。非限定例として、ポリプレックスは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０９０８６１にて記載された新規の（ｎоｖａｌ）アルファ―アミノアミジンポリマーを用いて形成されても良い。別の非限定例として、ポリプレックスは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５０１，４７８号にて記載されたクリックポリマーを用いて形成されても良い。
【０８０６】
一実施形態では、ポリプレックスは２以上のカチオン性ポリマーを含む。カチオン性ポリマーは直鎖ＰＥＩのようなポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含んでも良い。別の実施形態では、ポリプレックスは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、そのペグ化類似体ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ及びそれらの混合物を含む（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１４９７８３を参照のこと）。
【０８０７】
本発明のＮＡＶは、ポリマー、脂質、及び／またはリン酸カルシウムのような、しかし、これらに限定されない生分解剤の組み合わせを用いたナノ粒子として製剤化されても良い。成分をコア／シェル、ハイブリッド及び／または層ごと構造にて組み合わせて、ＮＡＶの送達が高められ得るようにナノ粒子の微細調整を可能にする（Ｗａｎｇら，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２００６，５：７９１−７９６；Ｆｕｌｌｅｒら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８，２９：１５２６−１５３２；ＤｅＫｏｋｅｒら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１１，６３：７４８−７６１；Ｅｎｄｒｅｓら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１，３２：７７２１−７７３１；Ｓｕら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０１１，Ｊｕｎ．６；８（３）：７７４−８７；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。非限定例として、ナノ粒子は、たとえば、親水性−疎水性ポリマー（たとえば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（たとえば、ＰＥＧ）及び／または親水性ポリマーのような、しかし、これらに限定されない複数のポリマーを含んでも良い（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０２２５１２９）。
【０８０８】
別の非限定例として、ＮＡＶについて親水性ポリマーを含むナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１９９３６にて記載されたものであってもよく、または記載された方法によって作製されても良い。
【０８０９】
一実施形態では、本発明で使用されても良い生分解性ポリマーはポリ（エーテル−無水物）ブロックコポリマーである。非限定例として、本明細書で使用される生分解性ポリマーは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２００６０６３２４９にて記載されたブロックコポリマーであってもよく、またはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２００６０６３２４９にて記載された方法によって作製されても良い。
【０８１０】
別の実施形態では、本発明で使用されても良い生分解性ポリマーはアルキル及びシクロアルキル終端の生分解性脂質である。非限定例として、アルキル及びシクロアルキル終端の生分解性脂質は、国際公開番号ＷＯ２０１３０８６３２２にて記載されたものであっても良く、及び／または国際公開番号ＷＯ２０１３０８６３２２にて記載された方法によって作製されても良い；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
【０８１１】
さらに別の実施形態では、本発明で使用されても良い生分解性ポリマーは脂質部分に位置する１以上の生分解性基を有するカチオン性脂質である。非限定例として、生分解性脂質は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９５９２０にて記載されたものであっても良い。
【０８１２】
脂質及び／またはポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチドを送達することが示されている。一実施形態では、アニサミドのような標的指向化リガンドも含有し得る脂質被覆のリン酸カルシウムナノ粒子を用いて本発明のＮＡＶを送達しても良い。たとえば、マウスの転移性肺モデルにてｓｉＲＮＡを効果的に送達するために、脂質被覆のリン酸カルシウムナノ粒子が使用された（Ｌｉら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２０１０，１４２：４１６−４２１；Ｌｉら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２０１２，１５８：１０８−１１４；Ｙａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２，２０：６０９−６１５；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために、標的化されたナノ粒子とエンドソーム脱出を高める成分、リン酸カルシウムとの双方を組み合わせる。
【０８１３】
一実施形態では、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーと共にリン酸カルシウムを用いてＮＡＶを送達しても良い（Ｋａｚｉｋａｗａら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００４，９７：３４５−３５６；Ｋａｚｉｋａｗａら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００６，１１１：３６８−３７０；そのそれぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８１４】
一実施形態では、ＰＥＧ−電荷転換型ポリマー（Ｐｉｔｅｌｌａら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１，３２：３１０６−３１１４；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）を用いて本発明のＮＡＶを送達するナノ粒子を形成しても良い。ＰＥＧ−電荷転換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンに切断され、それによりエンドソーム脱出を高めることによってＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改善しても良い。
【０８１５】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５５３３１にて記載されたペンタブロックポリマーのような、しかし、それらに限定されないペンタブロックポリマーであっても良い。非限定例として、ペンタブロックポリマーはＰＧＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＧＡを含み、ここでＰＥＧはポリエチレングリコールであり、ＰＣＬはポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡはポリ（グリコール酸）であり、ＰＬＡはポリ（乳酸）である。別の非限定例として、ペンタブロックポリマーはＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＬＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧを含み、そこでＰＥＧはポリエチレングリコールであり、ＰＣＬはポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡはポリ（グリコール酸）であり、ＰＬＡはポリ（乳酸）である。
【０８１６】
一実施形態では、本発明で使用されても良いポリマーは少なくとも１つのジエポキシドと少なくとも１つのアミノグリコシドとを含む（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５５９７１を参照のこと）。ジエポキシドは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４Ｂ），１，４−シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル（１，４Ｃ）、４−ビニルシクロヘキサンジエポキシド（４ＶＣＤ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）、グリセロールジグリシジルエーテル（ＧＤＥ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ＮＰＤＧＥ）、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ポリ（プロピレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＰＧＤＥ）及びレゾルシノールジグリシジルエーテル（ＲＤＥ）から選択されても良いが、これらに限定されない。アミノグリコシドは、ストレプトマイシン、ネオマイシン、フラミセチン、パロモマイシン、リボスタマイシン、カナマイシン、アミカシン、アルベカシン、ベカナマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、ネチルミシン、シソミシン、イセパミシン、ベルダミシン、アストロミシン及びアプラマイシンから選択されても良いが、これらに限定されない。非限定例として、ポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５５９７１にて記載された方法によって作製されても良い。別の非限定例として、少なくとも１つのジエポキシドと少なくとも１つのアミノグリコシドとを含むポリマーのいずれかを含む組成物は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０５５９７１にて記載された方法によって作製されても良い。
【０８１７】
一実施形態では、本発明で使用されても良いポリマーは架橋ポリマーであっても良い。非限定例として、架橋ポリマーを用いて、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４１４，９２７号にて記載されたような粒子を形成しても良い。別の非限定例として、架橋ポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７２６００にて記載された方法によって得られても良い。
【０８１８】
別の実施形態では、本発明で使用されても良いポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４６１，１３２号にて記載されたもののような架橋されたポリマーであっても良い。非限定例として、架橋されたポリマーは、生体組織の治療のための治療用組成物で使用されても良い。当該技術で既知の種々の方法及び／または注射もしくはカテーテル法のような本明細書に記載されている方法を用いて治療用組成物を損傷した組織に投与しても良い。
【０８１９】
一実施形態では、本発明で使用されても良いポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０４９３２８にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないジ−脂肪族置換されたペグ化脂質であっても良い。
【０８２０】
一実施形態では、ブロックコポリマーはＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ（たとえば、感熱性のヒドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、Ｌｅｅら．Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２０（１２）：１９９５−２０００にてＴＧＦベータ１遺伝子の送達手段として；Ｌｉら．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２０（６）：８８４−８８８；及びＣｈａｎｇら，Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７，１１８：２４５−２５３にて制御された遺伝子送達システムとして使用された；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）であり、本発明で使用されても良い。本発明は、筋肉内投与及び皮下投与のような、しかし、これらに限定されない投与のためにＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧと共に製剤化されても良い。
【０８２１】
別の実施形態では、本発明でＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを用いて生分解性の持続放出システムを開発しても良い。態様の１つでは、本発明のＮＡＶは投与に先立てブロックコポリマーと混合される。別の態様では、本発明のＮＡＶはブロックコポリマーと共投与される。
【０８２２】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４５４，９４６号にて記載されたような多官能性のＮ−マレイミジルポリマー誘導体のような、しかし、これらに限定されない多官能性ポリマー誘導体であっても良い。
【０８２３】
コア／シェルナノ粒子の使用はさらに、カチオン性架橋ナノゲルのコアと種々のシェルを合成する高処理能力法に焦点を合わせている（Ｓｉｅｇｗａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１１，１０８：１２９９６−１３００１；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達及び内部移行は、ナノ粒子のコアとシェルの成分の双方における化学組成を変えることによって正確に制御することができる。たとえば、コア／シェルナノ粒子は、それらがコレステロールをナノ粒子に共有結合した後、マウス肝細胞にｓｉＲＮＡを効果的に送達し得る。
【０８２４】
一実施形態では、中間のＰＬＧＡ層を含む中空の脂質コア及びＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を用いて本発明のＮＡＶを送達しても良い。非限定例として、ルシフェラーゼを発現する腫瘍を担っているマウスでは、脂質／ポリマー／脂質のハイブリッドナノ粒子は従来のリポプレックスに比べてルシフェラーゼの発現を有意に抑えることが見つけ出された（Ｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１，５０：７０２７−７０３１；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８２５】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は本明細書で開示されているＮＡＶのコアとポリマーのシェルとを含んでも良い。ポリマーのシェルは本明細書に記載されているポリマーのいずれかであってもよく、当該技術で既知である。追加の実施形態では、ポリマーのシェルを用いてコアにおけるポリヌクレオチドを保護しても良い。
【０８２６】
本発明のＮＡＶと共に使用するためのコア／シェルナノ粒子は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，３１３，７７７号及び国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２４８６７にて記載されており、記載された方法によって形成されても良い。
【０８２７】
一実施形態では、本明細書に記載されている製剤と共に使用されるポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１２００５３にて記載されたような修飾されたポリマー（たとえば、修飾されたポリアセタールのような、しかし、これらに限定されない）であっても良い。
【０８２８】
一実施形態では、製剤は、ポリマー担体と少なくとも１つの核酸分子を含むポリマー担体カーゴ複合体であっても良い。ポリマー担体カーゴ複合体の非限定例は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１３３２６、ＷＯ２０１３１１３５０１、ＷＯ２０１３１１３３２５、ＷＯ２０１３１１３５０２及びＷＯ２０１３１１３７３６ならびに欧州特許公開番号ＥＰ２６２３１２１にて記載されている。態様の１つでは、ポリマー担体カーゴ複合体は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１３３２５及びＷＯ２０１３１１３５０２にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されない負に荷電した核酸分子を含んでも良い。
【０８２９】
一実施形態では、医薬組成物は本発明のＮＡＶとポリマー担体カーゴ複合体とを含んでも良い。ポリヌクレオチドは、たとえば、感染性疾患に関連する病原体に由来する抗原、アレルギーまたはアレルギー性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原または癌もしくは腫瘍性疾患に関連する抗原のような、しかし、これらに限定されない対象となるタンパク質をコードしても良い（たとえば、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１３３２６、ＷＯ２０１３１１３５０１、ＷＯ２０１３１１３３２５、ＷＯ２０１３１１３５０２及びＷＯ２０１３１１３７３６ならびに欧州特許公開番号ＥＰ２６２３１２１にて記載された抗原を参照のこと）。
【０８３０】
非限定例として、コア／シェルナノ粒子を用いて眼の疾患または障害を治療しても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２０１２０３２１７１９を参照のこと）。
【０８３１】
一実施形態では、本明細書に記載されている製剤と共に使用されるポリマーは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１１２００５３にて記載されたような修飾されたポリマー（たとえば、修飾されたポリアセタールのような、しかし、これらに限定されない）であっても良い。
【０８３２】
ペプチド及びタンパク質
本発明のＮＡＶは、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを高めるためにペプチド及び／またはタンパク質と共に製剤化することができる。一実施形態では、細胞に浸透するペプチド及びタンパク質及び細胞内送達を可能にするペプチドのような、しかし、これらに限定されないペプチドを用いて医薬製剤を送達しても良い。本発明の医薬製剤と共に使用されても良い細胞に浸透するペプチドの非限定例には、細胞内空間への送達を促進するポリカチオンに連結された細胞に浸透するペプチド配列、たとえば、ＨＩＶに由来するＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴに由来する細胞に浸透するペプチドが挙げられる（たとえば、すべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＣａｒｏｎら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８（２００１）；Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃアラｔｏｎ  ＦＬ，２００２）；Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１（２００３）；及びＤｅｓｈａするら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９（２００５）を参照のこと）。組成物は、細胞内空間への組成物の送達を向上させる細胞浸透剤、たとえば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のＮＡＶは、細胞内送達を可能にするために、Ａｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＰｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製のペプチド及び／またはタンパク質のような、しかし、これらに限定されないペプチド及び／またはタンパク質に対して複合体形成させても良い（Ｃｒｏｎｉｃａｎら，ＡＣＳ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０，５：７４７−７５２；ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００９，１０６：６１１１−６１１６；Ｓａｗｙｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２００９，７３：３−６；Ｖｅｒｄｉｎｅ及びＨｉｌｉｎｓｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：３−３３；そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８３３】
一実施形態では、細胞に浸透するポリペプチドは第１のドメインと第２のドメインとを含んでも良い。第１のドメインは過荷電したポリペプチドを含んでも良い。第２のドメインはタンパク質結合パートナーを含んでも良い。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、抗体及びその機能的断片、足場のタンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。細胞に浸透するポリペプチドはさらにタンパク質結合パートナーための細胞内結合パートナーを含んでも良い。細胞に浸透するポリペプチドはポリペプチドが導入され得る細胞から分泌されるのが可能であっても良い。
【０８３４】
含んでいるペプチドまたはタンパク質の製剤を用いてＮＡＶによる細胞のトランスフェクションを向上させても良いし、ポリヌクレオチドの生体分布を変えても良いし（たとえば、特定の組織または細胞型を標的とすることによって）、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を向上させても良い（たとえば、国際公開番号ＷＯ２０１２１１０６３６及びＷＯ２０１３１２３２９８を参照のこと；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８３５】
一実施形態では、細胞に浸透するペプチドは、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２９７２６、ＵＳ２０１３０１３７６４４及びＵＳ２０１３０１６４２１９にて記載されたものであっても良いが、これらに限定されない。
【０８３６】
細胞
本発明のＮＡＶはエクスビボで細胞にトランスフェクトすることができ、その後、それは対象に移植される。
【０８３７】
非限定例の１つとして、１以上が本発明のＮＡＶによってコードされる抗原またはアジュバントまたはその双方によって患者または対象の血液試料を処理してＰＢＭＣ集団を活性化しても良い。この活性化された試料または特定の細胞のサブセットを次いでドナー患者に戻し、それによって免疫系を活性化しても良い。本発明のＮＡＶのいずれかを用いてこの活性化されたＰＢＭＣワクチンが設計されても良い。
【０８３８】
非限定例として、医薬組成物には、修飾されたＲＮＡを肝臓細胞及び骨髄細胞に送達する赤血球細胞、修飾されたＲＮＡをウイルス様粒子にて送達するビロソーム（ＶＬＰ）、ならびに、たとえば、修飾されたＲＮＡを送達するＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）製のような、しかし、これらに限定されない電気穿孔された細胞が含まれても良い。ポリヌクレオチド以外のペイロードを送達する赤血球細胞、ウイルス粒子及び電気穿孔された細胞の例は文書で記録されている（Ｇｏｄｆｒｉｎら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２，１２：１２７−１３３；Ｆａｎｇら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２，１２：３８５−３８９；Ｈｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１１，１０８：１０９８０−１０９８５；Ｌｕｎｄら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１０，２７：４００−４２０；Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅら，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００７；１７：３９−４７；Ｃｕｓｉ，Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．２００６，２：１−７；ｄｅ  Ｊｏｎｇｅら，Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００６，１３：４００−４１１；そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８３９】
それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０８５２３１及びＷＯ２０１３１１６６５６ならびに米国公開番号２０１１０１７１２４８にて記載された方法によって合成された合成ＶＬＰにてＮＡＶが送達されても良い。
【０８４０】
本発明のＮＡＶの細胞系製剤を用いて、（たとえば、細胞性担体にて）細胞のトランスフェクションを保証し、ポリヌクレオチドのインビボ分配を（たとえば、特定の組織または細胞型に対して細胞担体を標的とすることによって）改変し、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を向上させても良い。
【０８４１】
細胞への導入
ウイルス及び非ウイルスが媒介する技法を含む種々の方法が当該技術で既知であり、核酸の細胞への導入に好適であり、それらを用いて本発明のＮＡＶを導入しても良い。典型的な非ウイルス媒介の技法の例には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムが媒介する移行、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソームが媒介する移行、微量注入、微量注入が媒介する移行（ナノ粒子）、カチオン性ポリマーが媒介する移行（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８４２】
ソノポレーションまたは細胞性超音波処理の技法は、細胞の原形質膜の透過性を改変するための音波（たとえば、超音波の周波数）の使用である。ソノポレーション法は当業者に既知であり、インビボで核酸を送達するのに使用される（Ｙｏｏｎ及びＰａｒｋ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０，７：３２１−３３０；Ｐｏｓｔｅｍａ及びＧｉｌｊａ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，８：３５５−３６１；Ｎｅｗｍａｎ及びＢｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２００７，１４：４６５−４７５；そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。ソノポレーション法は当該技術で既知であり、たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１００１９６９８３にて細菌に関して、及び米国特許公開番号２０１００００９４２４にて他の細胞型に関して教示されても良い。
【０８４３】
エレクトロポレーション法も当該技術で既知であり、インビボで及び臨床的に核酸を送達するのに使用される（Ａｎｄｒｅら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２０１０，１０：２６７−２８０；Ｃｈｉａｒｅｌｌａら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２０１０，１０：２８１−２８６；Ｈｏｊｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２０１０，１０：１２８−１３８；そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。エレクトロポレーションの装置は、ＢＴＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）（たとえば、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）及びＩｎｏｖｉｏ（Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）（たとえば、Ｉｎｏｖｉｏ  ＳＰ−５Ｐ筋肉内送達装置またはＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３０００皮内送達装置）を含むが、これらに限定されない世界中の多数の会社によって販売されている。一実施形態では、ＮＡＶは実施例９にて記載されているようなエレクトロポレーションによって送達されても良い。
【０８４４】
微小器官
ＮＡＶは、長持ちする治療用製剤にて対象とするコードされたポリペプチドをその後発現することができる微小器官に含有されても良い。態様の１つでは、微小器官は、１以上の調節配列に作動可能に連結された、対象とするポリペプチドをコードする核酸配列（たとえば、本発明のポリヌクレオチド）を含むベクターを含んでも良い。非限定例として、本発明と共に使用される長持ちする治療用の微小器官は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８４５９４８号にて記載されたものであっても良い。別の非限定例として、微小器官を用いて長時間、対象とするポリペプチドの所望のレベルを維持しても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８４５９４８号にて記載されたような生理的なヘモグロビンのレベルを維持すること）。
【０８４５】
微小器官は、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも３週間、少なくとも１ヵ月間及び／または少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間または６ヵ月間を超えて対象とするポリペプチドを産生することができ得る
【０８４６】
一実施形態では、微小器官は、たとえば、少なくとも０．５ｍｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも１．５ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも２．５ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも３．５ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも４．５ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも５．５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも６．５ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも７．５ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも８．５ｍｍ、少なくとも９ｍｍ、少なくとも９．５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１０．５ｍｍ、少なくとも１１ｍｍ、少なくとも１１．５ｍｍ、少なくとも１２ｍｍ、少なくとも１２．５ｍｍ、少なくとも１３ｍｍ、少なくとも１３．５ｍｍ、少なくとも１４ｍｍ、少なくとも１４．５ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも１５．５．ｍｍ、少なくとも１６ｍｍ、少なくとも１６．５ｍｍ、少なくとも１７ｍｍ、少なくとも１７．５ｍｍ、少なくとも１８ｍｍ、少なくとも１８．５ｍｍ、少なくとも１９ｍｍ、少なくとも１９．５ｍｍまたは少なくとも２０ｍｍのような、しかし、これらに限定されない少なくとも０．５ｍｍ〜少なくとも２０ｍｍの直径を有しても良い。別の実施形態では、微小器官は、０．５〜２．５ｍｍ、１〜２．５ｍｍ、１．５〜２．５ｍｍ、０．５〜３ｍｍ、１〜３ｍｍ、１．５〜３ｍｍ、０．５〜３．５ｍｍ、１〜３．５ｍｍ、１．５〜３．５ｍｍ、０．５〜４ｍｍ、１〜４ｍｍ、１．５〜４ｍｍ、２〜４ｍｍ、０．５〜５ｍｍ、１〜５ｍｍ、１．５〜５ｍｍ、２〜５ｍｍ、２．５〜５ｍｍ、３〜５ｍｍ、０．５〜６ｍｍ、１〜６ｍｍ、１．５〜６ｍｍ、２〜６ｍｍ、２．５〜６ｍｍ、３〜６ｍｍ、３．５〜６ｍｍ、４〜６ｍｍ、０．５〜７ｍｍ、１〜７ｍｍ、１．５〜７ｍｍ、２〜７ｍｍ、２．５〜７ｍｍ、３〜７ｍｍ、３．５〜７ｍｍ、４〜７ｍｍ、４．５〜７ｍｍ、５〜７ｍｍ、０．５〜８ｍｍ、１〜８ｍｍ、１．５〜８ｍｍ、２〜８ｍｍ、２．５〜８ｍｍ、３〜８ｍｍ、３．５〜８ｍｍ、４〜８ｍｍ、４．５〜８ｍｍ、５〜８ｍｍ、５．５〜８ｍｍ、６〜８ｍｍ、０．５〜９ｍｍ、１〜９ｍｍ、１．５〜９ｍｍ、２〜９ｍｍ、２．５〜９ｍｍ、３〜９ｍｍ、３．５〜９ｍｍ、４〜９ｍｍ、４．５〜９ｍｍ、５〜９ｍｍ、５．５〜９ｍｍ、６〜９ｍｍ、６．５〜９ｍｍ、７〜９ｍｍ、０．５〜１０ｍｍ、１〜１０ｍｍ、１．５〜１０ｍｍ、２〜１０ｍｍ、２．５〜１０ｍｍ、３〜１０ｍｍ、３．５〜１０ｍｍ、４〜１０ｍｍ、４．５〜１０ｍｍ、５〜１０ｍｍ、５．５〜１０ｍｍ、６〜１０ｍｍ、６．５〜１０ｍｍ、７〜１０ｍｍ、７．５〜１０ｎｍまたは８〜１０ｎｍの直径を有しても良い。
【０８４７】
一実施形態では、微小器官は、少なくとも２ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも９ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも３５ｍｍ、少なくとも４０ｍｍ、少なくとも４５ｍｍ、少なくとも５０ｍｍ、少なくとも５５ｍｍ、少なくとも６０ｍｍ、少なくとも６５ｍｍ、少なくとも７０ｍｍ、少なくとも７５ｍｍ、少なくとも８０ｍｍ、少なくとも８５ｍｍ、少なくとも９０ｍｍ、少なくとも９５ｍｍ、少なくとも１００ｍｍ、少なくとも１０５ｍｍ、少なくとも１１０ｍｍ、少なくとも１１５ｍｍ、少なくとも１２０ｍｍ、少なくとも１２５ｍｍ、少なくとも１３０ｍｍ、少なくとも１３５ｍｍ、少なくとも１４０ｍｍ、少なくとも１４５ｍｍまたは少なくとも１５０ｍｍのような、しかし、これらに限定されない少なくとも２ｍｍ〜少なくとも１５０ｍｍの長さを有しても良い。別の実施形態では、微小器官は、５〜１００ｍｍ、１０〜１００ｍｍ、１５〜１００ｍｍ、２０〜１００ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜１００ｍｍ、３５〜１００ｍｍ、４０〜１００ｍｍ、４５〜１００ｍｍ、５０〜１００ｍｍ、５５〜１００ｍｍ、６０〜１００ｍｍ、６５〜１００ｍｍ、７０〜１００ｍｍ、７５〜１００ｍｍ、８０〜１００ｍｍ、８５〜１００ｍｍ、９０〜１００ｍｍ、５〜９０ｍｍ、１０〜９０ｍｍ、１５〜９０ｍｍ、２０〜９０ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜９０ｍｍ、３５〜９０ｍｍ、４０〜９０ｍｍ、４５〜９０ｍｍ、５０〜９０ｍｍ、５５〜９０ｍｍ、６０〜９０ｍｍ、６５〜９０ｍｍ、７０〜９０ｍｍ、７５〜９０ｍｍ、８０〜９０ｍｍ、５〜８０ｍｍ、１０〜８０ｍｍ、１５〜８０ｍｍ、２０〜８０ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜８０ｍｍ、３５〜８０ｍｍ、４０〜８０ｍｍ、４５〜８０ｍｍ、５０〜８０ｍｍ、５５〜８０ｍｍ、６０〜８０ｍｍ、６５〜８０ｍｍ、７０〜８０ｍｍ、５〜７０ｍｍ、１０〜７０ｍｍ、１５〜７０ｍｍ、２０〜７０ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜７０ｍｍ、３５〜７０ｍｍ、４０〜７０ｍｍ、４５〜７０ｍｍ、５０〜７０ｍｍ、５５〜７０ｍｍ、６０〜７０ｍｍ、５〜６０ｍｍ、１０〜６０ｍｍ、１５〜６０ｍｍ、２０〜６０ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜６０ｍｍ、３５〜６０ｍｍ、４０〜６０ｍｍ、４５〜６０ｍｍ、５０〜６０ｍｍ、５〜５０ｍｍ、１０〜５０ｍｍ、１５〜５０ｍｍ、２０〜５０ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜５０ｍｍ、３５〜５０ｍｍ、４０〜５０ｍｍ、５〜４０ｍｍ、１０〜４０ｍｍ、１５〜４０ｍｍ、２０〜４０ｍｍ、２５〜１０ｍｍ、３０〜４０ｍｍ、５〜３０ｍｍ、１０〜３０ｍｍ、１５〜３０ｍｍ、２０〜３０ｍｍ、５〜２０ｍｍ、１０〜２０ｍｍまたは５〜１０ｍｍのような、しかし、これらに限定されない少なくとも２ｍｍ〜少なくとも１５０ｍｍの長さを有しても良い。
【０８４８】
ヒアルロニダーゼ
本発明のＮＡＶの筋肉内または皮下に局在化する注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含むことができる。間質バリアの構成成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼはヒアルロナンの粘性を低下させ、それによって組織への透過性を高める（Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７−４４０；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。トランスフェクトされた細胞によって産生されるコードされたタンパク質の分散及び全身性の分布を速めることは有用である。或いは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内または皮下に投与された本発明のポリヌクレオチドに曝露される細胞の数を増やすことができる。
【０８４９】
ナノ粒子模倣体
本発明のＮＡＶはナノ粒子模倣体の中に被包されてもよく、及び／またはそれに吸収されても良い。ナノ粒子模倣体は、たとえば、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン及び細胞のような、しかし、これらに限定されない送達機能のある生物または粒子を模倣することができる。非限定例として、本発明のＮＡＶは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン粒子に被包されても良い（それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２００６３７６ならびに米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７１２４１及びＵＳ２０１３０１９５９６８を参照のこと）。
【０８５０】
ナノチューブ
本発明のＮＡＶは、ロゼットナノチューブ、リンカーと共にツイン塩基を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ及び／または単壁カーボンナノチューブのような、しかし、これらに限定されない少なくとも１つのナノチューブに連結することができ、またはさもなければ結合することができる。ＮＡＶは、たとえば、立体力、イオン力、共有結合力及び／または他の力のような、しかし、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
【０８５１】
一実施形態では、ナノチューブは１以上のＮＡＶを細胞内に放出することができる。少なくとも１つのナノチューブのサイズ及び／または表面構造は、体内でのナノチューブの相互作用を支配するように、及び／または本明細書で開示されているＮＡＶに連結するまたは結合するように変えられても良い。一実施形態では、少なくとも１つのナノチューブの構成要素及び／または構成要素に連結された官能基はナノチューブの寸法及び／または特性を調整するために変えられても良い。非限定例として、正常な血管壁の孔をナノチューブが通過するのを妨げるが、腫瘍組織の血管の大きな孔を通過するには十分依然として小さいようにナノチューブの長さを変えても良い。
【０８５２】
一実施形態では、少なくとも１つのナノチューブがポリエチレングリコールのような、しかし、これらに限定されないポリマーを含む送達を向上させる化合物で被覆されても良い。別の実施形態では、少なくとも１つのナノチューブ及び／またはＮＡＶが薬学的に許容される賦形剤及び／または送達溶剤と混合されても良い。
【０８５３】
一実施形態では、ＮＡＶは少なくとも１つのロゼットナノチューブに連結される及び／またはさもなければ結合される。ロゼットナノチューブは、当該技術で既知の方法によって及び／または全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０９４３０４にて記載された方法によって形成されても良い。少なくとも１つのＮＡＶが、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２０９４３０４にて記載された方法によって少なくとも１つのロゼットナノチューブに連結されても良いし、及び／またはさもなければ結合されてもよく、そこではロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは水性媒体にて少なくとも１つのＲＮＡＶをロゼットナノチューブ連結させ、及び／またはさもなければ結合させても良い条件下で少なくとも１つのＮＡＶと混合される。
【０８５４】
一実施形態では、ＮＡＶは少なくとも１つのカーボンナノチューブに連結されても良いし、及び／またはさもなければ結合されても良い。非限定例として、ＮＡＶは連結剤に結合されてもよく、連結剤はカーボンナノチューブに結合されても良い（たとえば、米国特許第８，２４６，９９５号を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。カーボンナノチューブは単壁ナノチューブであっても良い（たとえば、米国特許第８，２４６，９９５号を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８５５】
コンジュゲート
本発明のＮＡＶは、たとえば、キャリアまたは標的化基の共有結合されるポリヌクレオチドのような、または一緒に融合タンパク質（たとえば、標的化基と治療用のタンパク質またはペプチドを持つこと）を作出する２つのコーディング領域を含むコンジュゲートを含む。
【０８５６】
本発明のコンジュゲートは、たとえば、タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（たとえば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、インスリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質のような天然に存在する物質を含む。リガンドは、組換え分子または合成分子、たとえば、合成ポリマー、たとえば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（たとえば、アプタマー）であっても良い。ポリアミノ酸の例には、ポリアミノ酸、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファらせんペプチドが挙げられる。
【０８５７】
特にＲＮＡに対するポリヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号及び同第５，６８８，９４１号；同第６，２９４，６６４号；同第６，３２０，０１７号；同第６，５７６，７５２号；同第６，７８３，９３１号；同第６，９００，２９７号；同第７，０３７，６４６号が挙げられるが、これらに限定されず；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
【０８５８】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは本発明のＮＡＶの担体として機能しても良い。コンジュゲートは、ポリ（エチレングリコール）にグラフトされても良いポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンのような、しかし、これらに限定されないカチオン性ポリマーを含んでも良い。非限定例として、コンジュゲートはポリマーコンジュゲートに類似してもよく、ポリマーコンジュゲートを合成する方法は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５８６，５２４号に記載されている。
【０８５９】
基質にコンジュゲートする方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２１１２４９にて記載されている。その方法を用いてＮＡＶを含むコンジュゲートされたポリマー粒子を作製しても良い。
【０８６０】
コンジュゲートはまた、標的化基、たとえば、細胞または組織を標的とする作用剤、たとえば、腎臓細胞のような特定された細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、たとえば、抗体を含むこともできる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体またはアプタマーであることができる。
【０８６１】
標的化基は、タンパク質、たとえば、糖タンパク質またはペプチドであることができ、たとえば、共リガンドまたは抗体について、たとえば、癌細胞、内皮細胞または骨細胞のような特定された細胞型に結合する抗体について特定の親和性を有する分子であることができる。標的化基はホルモン及びホルモン受容体も含んでも良い。それらはまた、たとえば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコースまたはアプタマーのような非ペプチド種も含むことができる。リガンドは、たとえば、リポ多糖類またはｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子であることができる。
【０８６２】
標的化基は特定の受容体を標的とすることが可能であるリガンドであることができる。例には、限定しないで、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬのリガンドが挙げられる。特定の実施形態では、標的化基はアプタマーである。アプタマーは未修飾であることができ、または本明細書で開示されている修飾の組み合わせを有することができる。
【０８６３】
非限定例として、標的化基は、血液／中枢神経系の関門を横切る標的化した送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）を結合するコンジュゲートであっても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２１６６１０１２を参照のこと）。
【０８６４】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、相乗的な生体分子／ポリマーのコンジュゲートであっても良い。相乗的な生体分子／ポリマーのコンジュゲートは、さらに大きな治療有効性を提供する長時間作用型の連続放出システムであっても良い。相乗的な生体分子／ポリマーのコンジュゲートは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９５７９９にて記載されたものであっても良い。
【０８６５】
別の実施形態では、本発明で使用されても良いコンジュゲートはアプタマーコンジュゲートであっても良い。アプタマーコンジュゲートの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１２０４０５２４にて記載されている。アプタマーコンジュゲートを用いてＮＡＶを含む製剤の標的化された送達を提供しても良い。
【０８６６】
一実施形態では、本発明で使用されても良いコンジュゲートはアミン含有のポリマーコンジュゲートであっても良い。アミン含有のポリマーコンジュゲートの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５０７，６５３号に記載されている。第ＩＸ因子部分のポリマーコンジュゲートは、対象への送達の際、及び／または送達の後、ＮＡＶを放出する放出可能な結合を含んでも良い。
【０８６７】
一実施形態では、本発明の医薬組成物はロックド核酸に類似する修飾のような、しかし、これらに限定されない化学修飾を含んでも良い。
【０８６８】
Ｓａｎｔａｒｉｓのもののようなロックド核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる、以下米国特許６，２６８，４９０号；同第６，６７０，４６１号；同第６，７９４，４９９号；同第６，９９８，４８４号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０８４，１２５号；及び同第７，３９９，８４５号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８６９】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号及び同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、たとえば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００にて見いだすことができる。
【０８７０】
本発明の特長とするいくつかの実施形態には、ホスホロチオエート主鎖を持つポリヌクレオチド及び他の修飾された主鎖及び特に、上記の米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルアミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ネイティブのホスホジエステル主鎖が−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、ならびに上記の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を伴ったオリゴヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で特徴付けられるポリヌクレオチドは上記米国特許第５，０３４，５０６号のモルフォリノ主鎖構造を有する。
【０８７１】
２’位での修飾は送達に役立つ。好ましくは、２’位での修飾はポリペプチドをコードする配列に位置しない、すなわち、翻訳可能な領域に位置しない。２’位での修飾は５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／または尾部領域に位置しても良い。２’位での修飾には、２’位での以下：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを挙げることができ、その際、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換されたまたは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであっても良い。例となる好適な修飾にはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２’位にて以下：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善するための基、または薬力学特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基の１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエトキシ）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８：４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が挙げられる。別の例となる修飾は、本明細書の以下で実施例にて記載されるような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び本明細書の以下で実施例でも記載される２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（  ２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても当該技術で知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロピル（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。他の位置にて、特に、３’末端ヌクレオチまたは２’−５’連結ｄｓＲＮＡにおける糖の３’位及び５’末端ヌクレオシドにおける５’位にて類似の修飾も行っても良い。本発明のポリヌクレオチドはペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖部分も有しても良い。そのような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８���８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号及び同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８７２】
一実施形態では、ＮＡＶは送達を向上させる作用剤にコンジュゲートされても良い。非限定例として、作用剤は、たとえば、標的化モノマー、または全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１１０６２９６５にて記載されたような標的化モノマーまたは標的化ブロックを有するポリマーのようなモノマーまたはポリマーであっても良い。別の非限定例として、作用剤は、本発明のポリヌクレオチドに共有結合された輸送剤であっても良い（たとえば、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６．８３５，３９３号及び同第７，３７４，７７８号を参照のこと）。さらに別の非限定例として、作用剤は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，７３７，１０８号及び同第８．００３，１２９号にて記載されたような膜バリア輸送エンハンサーであっても良い。
【０８７３】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドはＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）にコンジュゲートされても良い。
【０８７４】
別の態様では、コンジュゲートは、ナノ粒子を組織または生物におけるニューロンに選択的に向けるペプチドであっても良い。非限定例として、使用されるペプチドは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２９６２７にて記載されたペプチドであっても良いが、これらに限定されない。
【０８７５】
さらに別の態様では、コンジュゲートは、脳血管関門を通過するのに役立つことができるペプチドであっても良い。
【０８７６】
自己集合型ナノ粒子
核酸自己集合型ナノ粒子
自己集合型ナノ粒子は、核酸鎖が容易に再プログラム可能であっても良いので、正確に制御され得る明確に定義されたサイズを有する。たとえば、癌を標的とするナノ送達担体についての最適な粒径は、２０ｎｍより大きい直径が腎クリアランスを回避し、向上した透過性と保持効果を介した特定の腫瘍への送達を高めるので、２０〜１００ｎｍである（Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，７：３８９−３９３；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。そのような自己集合するナノ粒子は本発明のＮＡＶを製剤化することにおいて有用であり得る。
【０８７７】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは自己集合型ナノ粒子として製剤化されても良い。非限定例として、核酸を用いて、本発明のＮＡＶのための送達系にて使用され得るナノ粒子を作製しても良い。（たとえば、国際公開番号ＷＯ２０１２１２５９８７；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８７８】
一実施形態では、核酸自己集合型ナノ粒子は本明細書で開示されているＮＡＶのコアとポリマーのシェルを含んでも良い。ポリマーのシェルは、本明細書に記載されている及び当該技術で既知であるポリマーのいずれかであっても良い。追加の実施形態では、ポリマーのシェルを用いてコアにおけるＮＡＶを保護しても良い。
【０８７９】
本発明で使用されても良い金属のナノ粒子は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１３８０３２にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないｐＨ感受性のナノ粒子であっても良い。
【０８８０】
態様の１つでは、金属の及び／または金属を認めるナノ粒子は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１３３４８３にて記載された方法によって作製されても良い。
【０８８１】
ポリマー系の自己集合型ナノ粒子
ポリマーを用いてナノ粒子に自己集合したシートを形成しても良い。これらのナノ粒子を用いて本発明のＮＡＶを送達しても良い。一実施形態では、これらの自己集合型ナノ粒子は、マイクロスポンジに自己集合する前に結晶性の「ひだが付いた」シートを形成するＲＮＡヘアピンの長いポリマーから形成されるマイクロスポンジであっても良い。これらのマイクロスポンジは、効率的な担体として機能し得、細胞にカーゴを送達することができ得るマイクロ粒子のような密に詰まったスポンジである。マイクロスポンジは直径１ｎｍ〜３００ｎｍであっても良い。マイクロスポンジは当該技術で既知の他の作用剤と複合体形成をしてさらに大きなマイクロスポンジを形成しても良い。非限定例として、マイクロスポンジは他の作用剤と複合体形成し、外層を形成してポリカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような細胞性の取り込みを促進しても良い。この複合体は高温（１５０℃）で安定なままであることができる直径２５０ｎｍの粒子を形成することができる（Ｇｒａｂｏｗ及びＪａｅｇａｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１２，１１：２６９−２６９；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。さらに、これらのマイクロスポンジはリボヌクレアーゼによる分解からの並外れた程度の保護を示すことができ得る。
【０８８２】
別の実施形態では、マイクロスポンジのような、しかし、これらに限定されないポリマー系の自己集合型ナノ粒子は完全にプログラム可能なナノ粒子であり得る。ナノ粒子の幾何構造、サイズ及び化学量論を正確に制御してＮＡＶのような、しかし、これらに限定されないカーゴの送達のための最適なナノ粒子を作り出しても良い。
【０８８３】
さらに別の実施形態では、ポリマー系ナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３００９７３６にて記載されたもののような複数の異種モノマーを含む非核酸ポリマーを含んでも良い。
【０８８４】
自己集合型高分子
ＮＡＶは、送達のための両親媒性の高分子（ＡＭ）にて製剤化されても良い。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合されたアルキル化糖主鎖を有する生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液中でＡＭは自己集合してミセルを形成する。ＡＭを形成する方法及びＡＭの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２１７７５３にて記載されている。
【０８８５】
無機ナノ粒子
本発明のＮＡＶは無機ナノ粒子（全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２５７，７４５号）にて製剤化されても良い。無機ナノ粒子には、水膨潤性である粘土物質が挙げられるが、これらに限定されない。非限定例として、無機ナノ粒子には、単純珪酸塩から作られるスメクタイト粘土が挙げられても良い（たとえば、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５８５，１０８号及び同第８，２５７，７４５号を参照のこと）。
【０８８６】
一実施形態では、無機ナノ粒子は、本明細書で開示されているＮＡＶのコアとポリマーのシェルとを含んでも良い。ポリマーのシェルは本明細書に記載されている及び当該技術で既知であるポリマーのいずれかであっても良い。追加の実施形態では、ポリマーのシェルを用いてコアにおけるＮＡＶを保護しても良い。
【０８８７】
半導体及び金属のナノ粒子
本発明のＮＡＶは、半導体物質もしくは金属物質を含む水分散性のナノ粒子にて製剤化されても良いし（米国公開番号２０１２０２２８５６５；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、または磁性ナノ粒子にて形成されても良い（米国公開番号２０１２０２６５００１及び２０１２０２８３５０３；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。水分散性のナノ粒子は、疎水性ナノ粒子であっても良いし、または親水性ナノ粒子であっても良い。
【０８８８】
一実施形態では、半導体及び／または金属のナノ粒子は、本明細書で開示されているＮＡＶのコアとポリマーのシェルとを含んでも良い。ポリマーのシェルは本明細書に記載されている及び当該技術で既知であるポリマーのいずれかであっても良い。追加の実施形態では、ポリマーのシェルを用いてコアにおけるＮＡＶを保護しても良い。
【０８８９】
外科用封止剤：ゲル及びヒドロゲル
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは、対象に注射されるとゲルを形成しても良い当該技術で既知のヒドロゲルに被包されても良い。ヒドロゲルは、親水性であり、且つ時には水が分散媒であるコロイド状ゲルとして見いだされる。ヒドロゲルは、高度に吸収性（それらは９９％を超える水を含有し得る）の天然のまたは合成のポリマーである。ヒドロゲルはまた、その有意な含水量の故に天然の組織に非常に類似する柔軟性の程度を有する。本明細書に記載されているヒドロゲルを用いて生体適合性であり、生分解性であり、及び／または多孔性である脂質ナノ粒子を被包しても良い。ヒドロゲルは溶液注射からその場で作製することができ、または移植することができる。
【０８９０】
非限定例として、ヒドロゲルは、アプタマーで官能化されたヒドロゲルであっても良い。アプタマーで官能化されたヒドロゲルは核酸のハイブリッド形成を用いて１以上のポリヌクレオチドを放出するようにプログラムされても良い（Ｂａｔｔｉｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ．２０１２，１３４：１２４１０−１２４１３；内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８９１】
別の非限定例として、ヒドロゲルは反転オパールのような形状であっても良い。オパール型ヒドロゲルは高い膨潤比を示し、膨潤反応速度はその上従来のヒドロゲルよりも一桁速い。オパール型ヒドロゲルの作製方法及びオパール型ヒドロゲルの説明は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１４８６８４に記載されている。
【０８９２】
さらに別の非限定例では、ヒドロゲルは抗菌ヒドロゲルであっても良い。抗菌ヒドロゲルは、たとえば、医薬品等級及び／または医療等級の銀塩及びアロエのゲルまたは抽出物のような、しかし、これらに限定されない薬学的に許容される塩または有機物質を含んでも良い（内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１２１５１４３８）。
【０８９３】
一実施形態では、ＮＡＶは脂質ナノ粒子に被包されてもよく、次いで脂質ナノ粒子はヒドロゲルに被包されても良い。
【０８９４】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは当該技術で既知のゲルに被包されても良い。非限定例として、ゲルはフルオロウラシルの注入用ゲルまたは当該技術で既知の化合物及び／または薬剤を含有するフルオロウラシルの注入用ゲルであっても良い。別の例として、ＮＡＶはエピネフリンを含有するフルオロウラシルのゲルに被包されても良い（たとえば、Ｓｍｉｔｈら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍоｔｈｅｒａｐｔｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９９，４４（４）：２６７−２７４；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８９５】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶはフィブリンのゲル、フィブリンのヒドロゲルまたはフィブリンの接着剤に被包されても良い。
【０８９６】
別の実施形態では、ＮＡＶは、フィブリンのゲル、フィブリンのヒドロゲルまたはフィブリンの接着剤に被包されるのに先立って、脂質ナノ粒子または迅速に除去される脂質ナノ粒子にて製剤化されても良い。さらに別の実施形態では、ＮＡＶは、フィブリンのゲル、フィブリンのヒドロゲルまたはフィブリンの接着剤に被包されるのに先立って、リポプレックスとして製剤化されても良い。フィブリンのゲル、ヒドロゲル及び接着剤は２つの成分である、フィブリノーゲン溶液とカルシウムが豊富であるトロンビン溶液を含む（それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＳｐｉｃｅｒ及びＭｉｋｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１０．１４８：４９−５５；Ｋｉｄｄら．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１２．１５７：８０−８５を参照のこと）。フィブリンのゲル、フィブリンのヒドロゲルまたはフィブリンの接着剤の成分の濃度を変化させて、フィブリンのゲル、フィブリンのヒドロゲルまたはフィブリンの接着剤の放出特性を変えることのような、しかし、これらに限定されないフィブリンのゲル、フィブリンのヒドロゲルまたはフィブリンの接着剤の特性、ネットワークメッシュのサイズ及び／または分解特性を変えることができる（たとえば、Ｓｐｉｃｅｒ及びＭｉｋｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１０．１４８：４９−５５；Ｋｉｄｄら．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１２．１５７：８０−８５；Ｃａｔｅｌａｓら．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００８．１４：１１９−１２８を参照のこと；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。この特徴は、本明細書で開示されている修飾されたＲＮＡを送達するのに使用される場合有利であっても良い（たとえば、Ｋｉｄｄら．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１２．１５７：８０−８５；Ｃａｔｅｌａｓら．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００８．１４：１１９−１２８を参照のこと；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０８９７】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号２０１３００７１４５０及び２０１３０２１１２４９にて記載されたヒドロゲルのような、しかし、これらに限定されないヒドロゲルと共に使用されても良い。
【０８９８】
非限定例として、本発明で使用されても良いヒドロゲルは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２４６２０にて記載された方法によって作製されても良い。
【０８９９】
別の実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは経皮送達用に製剤化されても良い。製剤は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号２０１３００７１４５０にて記載された少なくとも１つのヒドロゲルを含んでも良い。
【０９００】
一実施形態では、本発明で使用されても良いヒドロゲルは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４２０，６０５号、同第８，４１５，３２５号及び／または国際特許公開番号ＷＯ２０１３０９１００１及びＷＯ２０１３１２４６２０にて記載されている。
【０９０１】
一実施形態では、本発明で使用されても良いヒドロゲルは、ＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＱＬＴ  Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、キトサン、アルギン酸塩、コラーゲンまたはヒアルロン酸のヒドロゲルであっても良いが、これらに限定されない。
【０９０２】
別の実施形態では、本発明で使用されても良いヒドロゲルは、架橋されたメタクリレートである。非限定例として、本発明のヒドロゲルは創傷包帯で使用されても良い。
【０９０３】
本発明で使用されても良いヒドロゲルは、ＰＥＩ、ＰＶＡ、ポリ−リジン、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー４０７、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１及びポロキサマー３３８を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載されている作用剤及び賦形剤と共に複合体化されても良い。作用剤及び賦形剤と共にヒドロゲルを複合体化することは、細胞、組織及び／または生物にてｍＲＮＡの安定性及び取り込みを改善するのに役立ち得る。非限定例として、ヒドロゲルはポロキサマー１８８と共に複合体化されてｍＲＮＡの安定性及び取り込みを改善しても良い。
【０９０４】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは外科封止剤にて製剤化されても良い。外科封止剤は、フィブリノーゲン、ポリマー系封止剤（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、または、たとえば、ＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）及びＤＵＲＡＳＥＡＬ（商標）（トリリジンアミン／ＰＥＧ−エステル）（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のような、しかし、これらに限定されないＰＥＧ系封止剤であっても良いが、これらに限定されない。
【０９０５】
一実施形態では、ＮＡＶは、ＣＯＳＥＡＬ（登録商標）にて製剤化されてもよく、またはＣＯＳＥＡＬ（登録商標）と共投与されてもよく、細胞、組織または生物にＣＯＳＥＡＬ（登録商標）を投与した後、投与されても良い。ＣＯＳＥＡＬ（登録商標）は、２つの合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ペンタエリスリトールＰＥＧエステルテトラ−スクシンイミジル及びペンタエリスリトールＰＥＧエーテルテトラ−チオール）と、希釈塩化水素溶液と、リン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液とを含む。ＰＥＧは投与まで希釈塩化水素溶液にてリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液から分離して保持される。投与の後、ヒドロゲルが形成され、それは組織に接着してもよく、数秒で固いゲルを形成し、それは３０日以内に再吸収される。
【０９０６】
別の実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは高分子マトリクスを含むヒドロゲルにて製剤化されても良い。高分子マトリクスは、コラーゲン成分に架橋され得るヒアルロン酸成分を含んでも良い。本発明で使用されても良いヒドロゲルは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１０６７１５にて記載されたヒドロゲルであっても良いが、これらに限定されない。
【０９０７】
さらに別の実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶはキトサングリセロリン酸（ＣＧＰ）ヒドロゲルにて製剤化されても良い。製剤はさらに、ＶＧＰヒドロゲルを溶解し、ＣＧＰヒドロゲルに会合したＮＡＶを放出するのに有効な量でのキトサナーゼを含んでも良い。非限定例として、ＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１８９２４１にて記載されたＣＧＰヒドロゲルを含む制御放出送達系にて製剤化されても良い。
【０９０８】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１９６９１５にて記載された多孔性マトリクス複合材及び製剤のような、しかし、これらに限定されない制御放出のために製剤化されたヒドロゲルにて製剤化されても良い。
【０９０９】
別の実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは、分解可能な結合を有し得るヘテロ二官能性ポリ（アルキレンオキシド）を含むヒドロゲルにて製剤化されても良い。ヘテロ二官能性ポリ（アルキレンオキシド）の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４９７，３５７号にて記載されている。
【０９１０】
さらに別の実施形態では、ＮＡＶはインスリン送達系で使用され得るヒドロゲルにて製剤化されても良い。非限定例として、ヒドロゲルは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２３４９１にて記載されたようなグルコース結合両親媒性のペプチドヒドロゲルであっても良い。別の非限定例として、ヒドロゲルは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２３４９２にて記載されたグルコース応答性マイクロゲルのようなマイクロゲルであっても良い。
【０９１１】
一実施形態では、ＮＡＶは、多区画ヒドロゲルのような、しかし、これらに限定されないヒドロゲル系にて製剤化されても良い。多区画ヒドロゲル及びヒドロゲルを作製する方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２４８５５にて記載されている。多区画ヒドロゲルを用いて対象における損傷された組織を修復しても良いし、または再生しても良い。
【０９１２】
別の実施形態では、ククルビツリル系のヒドロゲルにて製剤化されても良い。ククルビツリル系のヒドロゲルの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２４６５４にて記載されている。
【０９１３】
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶはＰＥＧ系の外科封止剤またはヒドロゲルにて製剤化されても良い。
【０９１４】
一実施形態では、外科封止剤またはヒドロゲルには、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは６つを超えるＰＥＧ脂質が含まれても良い。ＰＥＧ脂質は、ペンタエリスリトールＰＥＧエステルテトラ−スクシンイミジル及びペンタエリスリトールＰＥＧエーテルテトラ−チオール、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＳＡ（１，２−ジステアリルオキシプロピル−３−アミンに結合させたＰＥＧ）、ＰＥＧ−ＤＭＡ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミンに結合させたＰＥＧ）、ＰＥＧ−ｃ−ＤＮＡ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＰＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００及び本明細書に記載されているもの及び／または当該技術で既知のものから選択されても良いが、これらに限定されない。外科封止剤またはヒドロゲルにおけるＰＥＧ脂質の濃度及び／または比率は、送達及び／または投与のための製剤を最適化するために変化させても良い。
【０９１５】
外科封止剤またはヒドロゲルのＰＥＧ脂質と組み合わせて使用される緩衝液及び／または酸の量も変化させても良い。非限定例の１つでは、緩衝液及び／または酸のＰＥＧ脂質との比は１：１である。非限定例として、ＰＥＧ脂質と共に使用される緩衝液及び／または酸の量を増やして外科封止剤またはヒドロゲルを最適化するために緩衝液／酸のＰＥＧに対する比を変えても良い。別の非限定例として、ＰＥＧ脂質と共に使用される緩衝液及び／または酸の量を減らして外科封止剤またはヒドロゲルを最適化するために緩衝液／酸のＰＥＧに対する比を変えても良い。
【０９１６】
緩衝液、酸及び／またはＰＥＧ脂質に負荷されるＮＡＶの量は変化しても良い。緩衝液、酸及び／またはＰＥＧ脂質に負荷されるＮＡＶの量は、少なくとも１ｕＬ、少なくとも２ｕＬ、少なくとも５ｕＬ、少なくとも１０ｕＬ、少なくとも１５ｕＬ、少なくとも２０ｕＬ、少なくとも２５ｕＬ、少なくとも３０ｕＬ、少なくとも３５ｕＬ、少なくとも４０ｕＬ、少なくとも４５ｕｌ、少なくとも５０ｕＬ、少なくとも５５ｕＬ、少なくとも６０ｕＬ、少なくとも６５ｕＬ、少なくとも７０ｕＬ、少なくとも７５ｕＬ、少なくとも８０ｕＬ、少なくとも８５ｕＬ、少なくとも９０ｕＬ、少なくとも１００ｕＬ、少なくとも１２５ｕＬ、少なくとも１５０ｕＬ、少なくとも２００ｕＬ、少なくとも２５０ｕＬ、少なくとも３００ｕＬ、少なくとも３５０ｕＬ、少なくとも４００ｕＬ、少なくとも４５０ｕＬ、少なくとも５００ｕＬまたは５００ｕＬを超えるものであっても良いが、これらに限定されない。
【０９１７】
一実施形態では、本発明のＮＡＶはＰＥＧに負荷されてもよく、且つ緩衝液または酸に負荷されても良い。ＰＥＧに負荷されるＮＡＶの量は、緩衝液または酸に負荷される量と同じでもよく、それより多くても、少なくても良い。別の実施形態では、ＮＡＶは、ＰＥＧ、緩衝液または酸に負荷することに先立って本明細書に記載されている方法及び／または当該技術で既知の方法によって製剤化されても良い。
【０９１８】
本発明で使用されても良いＰＥＧ系ヒドロゲルの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５２４，２１５号にて記載されている。ＰＥＧ系ヒドロゲルは、約３〜約８のアームを有する多アームのＰＥＧ−ビニルスルホンと約３〜約８のアームを有する多アームのＰＥＧ−Ｒ−スルフヒドリルとから調製される吸収性ヒドロゲルであっても良い（たとえば、米国特許第８，５２４，２１５号を参照のこと）。一実施形態では、ＰＥＧ系ヒドロゲルは吸収性ヒドロゲルであっても良い。理論によって束縛されることを望まないが、吸収性ヒドロゲルは身体によって吸収され、排出され得るので、吸収性のＰＥＧ系ヒドロゲルは永続性で慢性の外来性身体反応を減らすのに有益であり得る。
【０９１９】
一実施形態では、ヒドロゲルは感熱性ヒドロゲルであっても良い。態様の１つでは、感熱性ヒドロゲルは本明細書に記載されているもの及び当該技術で既知のもののようなトリブロックポリマーであっても良いが、これらに限定されない。非限定例として、トリブロックポリマーは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧであっても良い（たとえば、感熱性のヒドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、Ｌｅｅら．Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２０（１２）：１９９５−２０００にてＴＧＦベータ１遺伝子の送達手段として；Ｌｉら．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２０（６）：８８４−８８８；及びＣｈａｎｇら，  Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７，１１８：２４５−２５３にて制御された遺伝子送達系として使用された；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。非限定例として、感熱性ヒドロゲルを用いて、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３１２３４０７にて記載された方法によってナノ粒子及びリポソームを作製されても良い。
【０９２０】
別の実施形態では、ヒドロゲルは生分解性コポリマーのヒドロゲルであっても良い（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＮｇｕｙｅｎ及びＬｅｅ（Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０，１０：５６３−５７９）によって記載された生分解性ヒドロゲルを参照のこと）。これらのヒドロゲルは、たとえば、温度変化、ｐＨの変化またはその双方のような、しかし、これらに限定されない外部刺激に応答するゾル／ゲル相転移を示し得る。生分解性コポリマーヒドロゲルの非限定例には、トリブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＬＡ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＣｈａｎｇら、Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７，１１８：２４５−２５３を参照のこと）、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＥＧ、ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート］（ＰＨＢ）のようなポリエステル、Ｌ−イソロイシンエチルエステル（ＩｌｅＯＥｔ）、Ｄ，Ｌ−ロイシンエチルエステル（ＬｅｕＯＥｔ）、Ｌ−バリンエチルエステル（ＶａｌＯＥｔ）のようなポリホスファゼン、またはジペプチド、トリペプチド及びオリゴペプチド、ポリペプチド及びキトサンが挙げられる。生分解性コポリマーヒドロゲルを形成するのに使用されても良い温度及びｐＨに感受性のポリマーには、スルファメタジン系、ポリ（β−アミノエステル）系、ポリ（アミノウレタン）系、及びポリ（アミドアミン）系ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。放出挙動の部位特異的な制御を用いて、生分解性コポリマーヒドロゲルとＮＡＶの製剤を投与しても良い。
【０９２１】
一実施形態では、本発明で使用されるヒドロゲルは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０８２５９０にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないＰＥＧ系ヒドロゲルであっても良い。ＰＥＧ系ヒドロゲルは、硬化時に５０％以下の全体的なポリマー重量濃度を有しても良いが、これらに限定されない。非限定例として、ＰＥＧ系ヒドロゲルは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０８２５９０にて記載された方法によって作製されても良い。
【０９２２】
別の実施形態では、ＮＡＶはナノ構造化ゲル組成物にて製剤化されても良い。ナノ構造化ゲルは被包されたＮＡＶの制御放出が可能であり得る。ナノ構造化ゲルまたは自己集合型ゲルの非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１２０４０６２３にて記載されている。
【０９２３】
一実施形態では、外科封止剤、ゲル及び／またはヒドロゲルにおける本発明のＮＡＶの濃度を選択して所望の治療効果を有する範囲内での投与量を提供しても良い。
【０９２４】
一実施形態では、外科封止剤、ゲル及び／またはヒドロゲルにおける本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも０．１ｍｌ〜少なくとも３０ｍｌの外科封止剤、ゲルまたはヒドロゲルにて少なくとも０．００１ｍｇ〜少なくとも１５０ｍｇであっても良い。本発明のポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも０．１ｍｌ、少なくとも０．２ｍｌ、少なくとも０．３ｍｌ、少なくとも０．４ｍｌ、少なくとも０．５ｍｌ、少なくとも０．６ｍｌ、少なくとも０．７ｍｌ、少なくとも０．８ｍｌ、少なくとも０．９ｍｌ、少なくとも１ｍｌ、少なくとも２ｍｌ、少なくとも３ｍｌ、少なくとも４ｍｌ、少なくとも５ｍｌ、少なくとも６ｍｌ、少なくとも７ｍｌ、少なくとも８ｍｌ、少なくとも９ｍｌ、少なくとも１０ｍｌ、少なくとも１１ｍｌ、少なくとも１２ｍｌ、少なくとも１３ｍｌ、少なくとも１４ｍｌ、少なくとも１５ｍｌ、少なくとも１６ｍｌ、少なくとも１７ｍｌ、少なくとも１８ｍｌ、少なくとも１９ｍｌ、少なくとも２０ｍｌ、少なくとも２１ｍｌ、少なくとも２２ｍｌ、少なくとも２３ｍｌ、少なくとも２４ｍｌ、少なくとも２５ｍｌ、少なくとも２６ｍｌ、少なくとも２７ｍｌ、少なくとも２８ｍｌ、少なくとも２９ｍｌまたは少なくとも３０ｍｌの外科封止剤、ゲルまたはヒドロゲルにて少なくとも０．００１ｍｇ、少なくとも０．００５ｍｇ、少なくとも０．０１ｍｇ、少なくとも０．０５ｍｇ、少なくとも０．１ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも７ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１２、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも１７ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２２ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも２７ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３２ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも５５ｍｇ、少なくとも６０ｍｇ、少なくとも６５ｍｇ、少なくとも７０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、少なくとも８０ｍｇ、少なくとも８５ｍｇ、少なくとも９０ｍｇ、少なくとも９５ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも１０５ｍｇ、少なくとも１１０ｍｇ、少なくとも１１５ｍｇ、少なくとも１２０ｍｇ、少なくとも１２５ｍｇ、少なくとも１３０ｍｇ、少なくとも１３５ｍｇ、少なくとも１４０ｍｇ、少なくとも１４５ｍｇまたは少なくとも１５０ｍｇであっても良い。
【０９２５】
別の実施形態では、外科封止剤、ゲル及び／またはヒドロゲルにおける本発明のＮＡＶのポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌであっても良い。
【０９２６】
ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような、しかし、これらに限定されない、当該技術で既知である大容量の皮下注入を可能にする技術も使用されても良い。ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）は、ヒアルロン酸を一時的に破壊して皮膚の外面の真下の皮下空間に一時的な分解を起こし（約２４時間）、微視的な流路を開け、流体または薬剤が身体に分散し、吸収されるのを可能にするので、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）の使用によって本明細書に記載されている修飾されたｍＲＮＡの分散及び／または吸着を高め得る。
【０９２７】
懸濁製剤
いくつかの実施形態では、ＮＡＶ、水混和性の油デポー、界面活性剤、共界面活性剤及び／または共溶媒を含む懸濁製剤が提供される。油と界面活性剤の組み合わせによってＮＡＶの懸濁製剤が可能となり得る。水混和性のデポーにおけるＮＡＶの送達を用いて、デポーから周辺の物理環境へのＮＡＶの持続放出を介して生物利用効率を改善し、ヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの分解を防いでも良い。
【０９２８】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶの懸濁製剤は、ポリヌクレオチドと油系溶液と界面活性剤との組み合わせを用いて調製されても良い。そのような製剤は、ポリヌクレオチドを含む水性相と油及び界面活性剤を含む油系相とを含む二成分系として調製されても良い。懸濁製剤用の例となる油には、ゴマ油及びミグリオール（飽和ココナッツ油とパーム核油に由来するカプリル及びカプリン脂肪酸とグリセリンまたはプロピレングリコールのエステルを含む）、コーン油、ダイズ油、ピーナッツ油、蜜蝋及び／またはパーム実油が挙げられて得るが、これらに限定されない。例となる界面活性剤には、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、トランスクトール、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、ラブラソール、ミリスチン酸イソプロピル、及び／またはＳｐａｎ８０が挙げられて得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、懸濁液はエタノール、グリセロール及び／またはプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない共溶媒を含んでも良い。
【０９２９】
ポリヌクレオチドの水溶液と１以上の界面活性剤を含む油系相とを含むＮＡＶ製剤を先ず調製することによって懸濁液を形成しても良い。懸濁液の形成は２つの相（水性相と油系相）を混合した結果生じる。いくつかの実施形態では、そのような懸濁液は水性相に送達されて水中油エマルジョンを形成しても良い。いくつかの実施形態では、懸濁液の水性相への送達は、ポリヌクレオチドを含む油系相がナノメートルサイズの液滴からマイクロメートルサイズの液滴までのサイズに及ぶ液滴を形成する水中油エマルジョンの形成を生じる。
【０９３０】
いくつかの実施形態では、油、界面活性剤、共界面活性剤及び／または共溶媒の特定の組み合わせを利用して水性環境への投与の際に、油相にてＮＡＶを懸濁してもよく、及び／または水中油エマルジョンを形成しても良い。
【０９３１】
いくつかの実施形態では、懸濁液は周辺環境へのＮＡＶの放出の調節を提供しても良い。そのような実施形態では、ＮＡＶの放出は、水混和性デポーからの拡散、その後の周辺環境（たとえば、水性環境）での再可溶化によって調節されても良い。
【０９３２】
いくつかの実施形態では、水混和性デポー内のＮＡＶ（たとえば、油相内に懸濁された）は変化したポリヌクレオチドの安定性（たとえば、ヌクレアーゼによる変化した分解）を生じても良い。
【０９３３】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶは、注射の際、エマルジョンが自然に生じるように（たとえば、水性相に送達した際）、製剤化されても良い。そのような粒子形成は油相から水性相へのポリヌクレオチドの放出について高い表面積対容積の比を提供し得る。
【０９３４】
一実施形態では、ＮＡＶは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４９６，９４５号にて記載されたナノエマルジョンのような、しかし、これらに限定されないナノエマルジョンにて製剤化されても良い。ナノエマルジョンは本明細書に記載されているナノ粒子を含んでも良い。非限定例として、ナノ粒子は、脂質または界面活性剤の層で囲まれても良い、または被覆されても良い脂質疎水性のコアを含んでも良い。脂質または界面活性剤の層は、少なくとも１つの膜統合ペプチドを含んでもよく、且つ標的化リガンド（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４９６，９４５を参照のこと）も含んでも良い。
【０９３５】
カチオン及びアニオン
本明細書で開示されているＮＡＶの製剤はカチオンまたはアニオンを含んでも良い。一実施形態では、製剤は、たとえば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋及びそれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない金属カチオンを含む。非限定例として、製剤は金属カチオンと複合体化するポリマー及びＲＮＡＶを含んでも良い（たとえば、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号を参照のこと）。
【０９３６】
いくつかの実施形態では、二価と一価のカチオンの組み合わせを含むカチオン性ナノ粒子をＮＡＶと共に製剤化しても良い。そのようなナノ粒子は、所与の時間（たとえば、時間、日数等）をかけて自然に生じ得る。そのようなナノ粒子は、二価のカチオンのみの存在下または一価のカチオンのみの存在下では生じない。カチオン性ナノ粒子における、またはカチオン性ナノ粒子を含む１以上のデポーにおけるＮＡＶの送達は、長持ちするデポーとして作用することによって及び／またはヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることによってＮＡＶの生体利用効率を改善し得る。
【０９３７】
成形されるナノ粒子及びマイクロ粒子
本明細書に記載されているＮＡＶはナノ粒子及び／またはマイクロ粒子にて製剤化されても良い。これらのナノ粒子及び／またはマイクロ粒子はどんなサイズ形状及び化学的性質にも成形されても良い。例として、ナノ粒子及び／またはマイクロ粒子はＬＩＱＵＩＤＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を用いて作製されても良い（たとえば、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２００７０２４３２３を参照のこと）。
【０９３８】
一実施形態では、成形されたナノ粒子は本明細書で開示されているＮＡＶのコアとポリマーのシェルを含んでも良い。ポリマーのシェルは本明細書に記載されている及び当該技術で既知であるポリマーのいずれかであっても良い。追加の実施形態では、ポリマーのシェルを用いてコアにおけるＮＡＶを保護しても良い。
【０９３９】
一実施形態では、本発明のＮＡＶはマイクロ粒子にて製剤化されても良い。マイクロ粒子は、ＮＡＶのコアと生体適合性及び／または生分解性のポリマーの外皮を含有しても良い。非限定例として、本発明と共に使用されても良いマイクロ粒子は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４６０，７０９号、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２９８３０及び国際特許公開番号ＷＯ２０１３０７５０６８にて記載されたものであっても良い。別の非限定例として、マイクロ粒子は、所望の時間にわたって本発明のＮＡＶの放出を延長するように設計されても良い（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２９８３０における治療用タンパク質の持続放出を参照のこと）。
【０９４０】
本発明と共に使用するためのマイクロ粒子は、少なくとも１ミクロン〜少なくとも１００ミクロン（たとえば、少なくとも１ミクロン、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも４５ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも５５ミクロン、少なくとも６０ミクロン、少なくとも６５ミクロン、少なくとも７０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも８０ミクロン、少なくとも８５ミクロン、少なくとも９０ミクロン、少なくとも９５ミクロン、少なくとも９７ミクロン、少なくとも９９ミクロン、及び少なくとも１００ミクロン）の直径を有し得る。
【０９４１】
ナノジャケット及びナノリポソーム
本明細書で開示されているＮＡＶは、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｎａｎｏ（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）によるナノジャケット及びナノリポソームにて製剤化されても良い。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含む身体にて天然に見いだされる化合物で構成され、少量の珪酸塩も含んでも良い。ナノジャケットは５〜５０ｎｍのサイズの範囲であってもよく、たとえば、ＮＡＶのような親水性及び疎水性の化合物を送達するのに使用されても良い。
【０９４２】
ナノリポソームは、身体に天然に存在する脂質のような、しかし、これらに限定されない脂質で構成される。ナノリポソームは６０〜８０ｎｍのサイズの範囲であってもよく、たとえば、ＮＡＶのような親水性及び疎水性の化合物を送達するのに使用されても良い。態様の１つでは、本明細書で開示されているＮＡＶはセラミドナノリポソームのような、しかし、これらに限定されないナノリポソームにて製剤化されても良い。
【０９４３】
偽ビリオン
一実施形態では、本明細書で開示されているＮＡＶは偽ビリオン（たとえば、シュード−ビリオン）にて製剤化されても良い。非限定例として、偽ビリオンはＡｕｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によって開発され及び／または記載されているものであっても良い。態様の１つでは、偽ビリオンは角化細胞及び基底膜に薬剤を送達するように開発されても良い（たとえば、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３００１２４５０、ＵＳ２０１３００１２５６６、ＵＳ２１０３００１２４２６及びＵＳ２０１２０２０７８４０ならびに国際公開番号ＷＯ２０１３００９７１７を参照のこと）。
【０９４４】
一実施形態では、本発明のＮＡＶを送達するのに使用される偽ビリオンは、ヘルペス及びパピローマウイルスのような、しかし、これらに限定されないウイルスに由来しても良い（たとえば、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３００１２４５０、ＵＳ２０１３００１２５６６、ＵＳ２１０３００１２４２６及びＵＳ２０１２０２０７８４０ならびに国際公開番号ＷＯ２０１３００９７１７；ならびにＭａら．ＨＰＶ  ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｓ  ａｓ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１：２（４）：４２７−４３０；Ｋｉｎｅｓら．Ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．ＰＮＡＳ，２００９：１０６（４８），２０４５８−２０４６３；Ｒｏｂｅｒｔｓら．Ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７：１３（７）８５７−８６１；Ｇｏｒｄｏｎら，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖａｇｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ＳＩＶ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１８８（２）７１４−７２３；Ｃｕｂｕｒｕら，Ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＰＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１２：１２２（１２）４６０６−４６２０；Ｈｕｎｇら，Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＨＰＶ−１６  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＳＶ−ｔｋ  Ｇｅｎｅ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．２０１２：７（７）ｅ４０９８３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆｅｍａｌ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｔｒａｃｔ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００９：８３（５）２０６７−２０７４を参照のこと；そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０９４５】
偽ビリオンは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１２００１５８９９及びＵＳ２０１３０１７７５８７ならびに国際特許公開番号ＷＯ２０１００４７８３９、ＷＯ２０１３１１６６５６、ＷＯ２０１３１０６５２５及びＷＯ２０１３１２２２６２にて記載された方法によって調製されるウイルス様の粒子（ＶＬＰ）であっても良い。態様の１つでは、ＶＬＰは、バクテリオファージＭＳ、Ｑβ、Ｒ１７、ｆｒ、ＧＡ、Ｓｐ、ＭＩ、Ｉ、ＭＸＩ、ＮＬ９５、ＡＰ２０５、ｆ２、ＰＰ７、及び植物ウイルス、カブクリンクルウイルス（ＴＣＶ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、南豆モザイクウイルス（ＳＢＭＶ）、ならびにソラマメ斑紋ウイルス、ブロムモザイクウイルス、桂皮黄斑ウイルス、ササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）、メランドリウム（Ｍｅｌａｎｄｒｉｕｍ）黄斑ウイルス、及びクレイトニア潜伏ウイルスを含むブロモウイルス属のメンバーであっても良いが、これらに限定されない。別の態様では、ＶＬＰは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７７５８７または米国特許第８，５０６，９６７号にて記載されたインフルエンザウイルスに由来しても良い。さらに別の態様では、ＶＬＰは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１６６５６にて記載されたような脂質膜にまたは粒子の外側に繋がれたＢ７−１及び／またはＢ７−２分子を含んでも良い。態様の１つでは、ＶＬＰは、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１２０４９３６６にて記載されたＶＬＰのような、ノロウイルス、ロタウイルスの組換えＶＰ６タンパク質または二重層化したＶＰ２／ＶＰ６に由来しても良い。
【０９４６】
偽ビリオンは、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１０１２０２６６及び米国特許公開番号ＵＳ２０１２０１７１２９０及びＭａら．ＨＰＶ  ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｓ  ａｓ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１：２（４）：４２７−４３０；Ｋｉｎｅｓら．Ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．ＰＮＡＳ，２００９：１０６（４８），２０４５８−２０４６３；Ｒｏｂｅｒｔｓら．Ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７：１３（７）８５７−８６１；Ｇｏｒｄｏｎら，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖａｇｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ＳＩＶ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１８８（２）７１４−７２３；Ｃｕｂｕｒｕら，Ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＰＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１２：１２２（１２）４６０６−４６２０；Ｈｕｎｇら，Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＨＰＶ−１６  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＳＶ−ｔｋ  Ｇｅｎｅ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．２０１２：７（７）ｅ４０９８３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆｅｍａｌ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｔｒａｃｔ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００９：８３（５）２０６７−２０７４にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないヒトのパピローマウイルス様の粒子であっても良い。
【０９４７】
態様の１つでは、偽ビリオンは、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１１６４０８及びＵＳ２０１３０１１５２４７にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されないビリオンに由来するナノ粒子であっても良い。非限定例として、ビリオンに由来するナノ粒子を用いて、癌の治療に使用されても良い及び／または腫瘍の免疫系の認識を高め得るＮＡＶを送達しても良い。非限定例として、少なくとも１つの腫瘍に作用剤を選択的に送達しても良いビリオンに由来するナノ粒子は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１９８７７にて記載されたパピローマに由来する粒子であっても良い。ビリオンに由来するナノ粒子は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１１６４０８及びＵＳ２０１３０１１５２４７または国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１９８７７にて記載された方法によって作製されても良い。
【０９４８】
一実施形態では、ウイルス様の粒子（ＶＬＰ）は自己集合型の粒子であっても良い。自己集合型のＶＬＰ及び自己集合型のＶＬＰを作製する方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３１２２２６２にて記載されている。
【０９４９】
ミニ細胞
態様の１つでは、ＮＡＶは細菌のミニ細胞にて製剤化されても良い。非限定例として、細菌のミニ細胞は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８８２５０または米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７７４９９にて記載されたものであっても良い。本明細書に記載されているＮＡＶのような治療剤を含む細菌のミニ細胞を用いて脳腫瘍に治療剤を送達しても良い。
【０９５０】
半固体組成物
一実施形態では、ＮＡＶは疎水性マトリクスと共に製剤化されて半固体組成物を形成しても良い。非限定例として、半固体組成物またはペースト様組成物は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０７６０４にて記載された方法によって作製されても良い。半固体組成物は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０７６０４にて記載されたような持続放出製剤であっても良い。
【０９５１】
別の実施形態では、半固体組成物はさらに、組成物の周りに形成された微小多孔性膜または生分解性ポリマーを有しても良い（たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０７６０４を参照のこと）。
【０９５２】
本発明のＮＡＶを用いた半固体組成物は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１３０７６０４にて記載されたような半固体混合物の特徴を有し得る（たとえば、１０−４Ｎ・ｍｍ−２の弾性係数及び／または少なくとも１００ｍＰａ・Ｓの粘度）。
【０９５３】
エクソソーム
一実施形態では、ＮＡＶはエクソソームにて製剤化されても良い。エクソソームは少なくとも１つのＮＡＶが充填されて、細胞、組織及び／または生物に送達されても良い。非限定例として、ＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８４０００にて記載されたエクソソームに充填されても良い。
【０９５４】
絹を主体とした送達
一実施形態では、ＮＡＶは、持続放出の絹を主体とした送達系で製剤化されても良い。絹を主体とした送達系は、本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知であるＮＡＶのような、しかし、これらに限定されない治療剤に絹フィブロイン溶液を接触させることによって形成され得る。非限定例として、本発明で使用され得る持続放出の絹を主体とした送達系及びそのような系を作製する方法は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７７６１１にて記載されている。
【０９５５】
マイクロ粒子
一実施形態では、ＮＡＶを含む製剤はマイクロ粒子を含んでも良い。マイクロ粒子は、たとえば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルソエステル及びポリ無水物のような、しかし、これらに限定されない、本明細書に記載されている及び／または当該技術で既知であるポリマーを含んでも良い。マイクロ粒子は、吸着性表面を有して、ＮＡＶのような生物学的に活性のある分子を吸着し得る。非限定例として、本発明と共に使用するためのマイクロ粒子及びマイクロ粒子を作製する方法は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３１９５９２３及びＵＳ２０１３０１９５８９８ならびに米国特許第８，３０９，１３９号及び同第８，２０６，７４９号にて記載されている。
【０９５６】
別の実施形態では、製剤はマイクロ粒子とＮＡＶとを含むマイクロエマルジョンであっても良い。非限定例として、マイクロ粒子を含むマイクロエマルジョンは、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３１９５９２３及びＵＳ２０１３０１９５８９８ならびに米国特許第８，３０９，１３９号及び同第８，２０６，７４９号にて記載されている。
【０９５７】
アミノ酸脂質
一実施形態では、ＮＡＶはアミノ酸脂質にて製剤化されても良い。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基と１以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質を作製する方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５０１，８２４号にて記載されている。
【０９５８】
一実施形態では、アミノ酸脂質は親水性部分と親油性部分とを有する。親水性部分はアミノ酸残基であってもよく、親油性部分は少なくとも１つの親油性尾部を含み得る。
【０９５９】
一実施形態では、アミノ酸脂質製剤を用いて対象にＮＡＶを送達しても良い。
【０９６０】
別の実施形態では、アミノ酸脂質製剤は、ＮＡＶと結合し、放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でＮＡＶを送達しても良い。非限定例として、ＮＡＶの放出は、それぞれの内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、及び同第５，５０５，９３１号にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されない酸に不安定なリンカーによって提供されても良い。
【０９６１】
微小胞
一実施形態では、ＮＡＶは微小胞にて製剤化されても良い。微小胞の非限定例には、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２０９５４４にて記載されたものが挙げられる。
【０９６２】
一実施形態では、微小胞は、ＡＲＲＤＣ１が媒介する微小胞（ＡＲＭＭ）である。ＡＲＭＭ及びＡＲＭＭを作製する方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許公開番号ＷＯ２０１２１１９６０２にて記載されている。
【０９６３】
高分子電解質間錯体
一実施形態では、ＮＡＶは高分子電解質間錯体にて製剤化されても良い。高分子電解質間錯体は、電荷動的ポリマーは１以上のアニオン性分子と錯体形成する際に形成される。電荷動的ポリマー及び高分子電解質間錯体及び高分子電解質間錯体を作製する方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５２４，３６８号にて記載されている。
【０９６４】
結晶性ポリマー系
一実施形態では、ＮＡＶは結晶性ポリマー系にて製剤化されても良い。結晶性ポリマー系は結晶性部分及び／または結晶性部分を含む末端単位を伴うポリマーである。「ＣＹＣポリマー」と呼ばれる結晶性部分及び／または結晶性部分を含む末端単位を伴うポリマー、結晶性ポリマー系ならびにそのようなポリマー及び系を作製する方法の非限定例が、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５２４，２５９号にて記載されている。
【０９６５】
賦形剤
ＮＡＶ医薬組成物はさらに、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適する任意の及び全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液状媒体、分散または懸濁の助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤、風味剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤等を含むが、これらに限定されない薬学的に許容される賦形剤を含んでも良い。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤及び組成物を調製するための技法は当該技術で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で企図され得、従来の賦形剤媒体が、望ましくない生物効果を生じることによって、またはさもなければ、有害な方法で医薬組成物の他の成分と相互作用することによって物質またはその誘導体と不適合性である限りにおいてを除いて、その使用は本発明の範囲内であることが企図される。
【０９６６】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤はヒト用の使用及び獣医の使用について認可され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は合衆国食品医薬品局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は医薬品等級であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方及び／または国際薬局方の基準を満たし得る。
【０９６７】
医薬組成物の製造にて使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性の希釈剤、分散剤及び／または造粒剤、表面活性剤及び／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、及び／または油類が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意で医薬組成物に含まれても良い。組成物は、たとえば、ココアバター及び坐薬ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤及び／または芳香剤のような賦形剤も含んでも良い。
【０９６８】
例となる希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微細結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、無水デンプン、コーンスターチ、粉末化糖等、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９６９】
例となる造粒剤及び／または分散剤には、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーゴム、柑橘類果肉、寒天、ベントナイト、セルロース及び材木製品、天然のスポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、珪酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファデンプン（デンプン１５００）、微細結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、珪酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物等、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７０】
例となる表面活性剤及び／または乳化剤には、天然の乳化剤（たとえば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルクス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド状粘土（たとえば、ベントナイト［珪酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［珪酸マグネシウムアルミニウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（たとえば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコージステアレート、グリセリルモノステアレート、及びプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（たとえば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラーギーナン、セルロース性誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（たとえば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（たとえば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（たとえば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム、等及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７１】
例となる結合剤には、デンプン（たとえば、コーンスターチ及びデンプンペースト）；ゼラチン；糖類（たとえば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；アミノ酸（たとえば、グリシン）；天然の及び合成のゴム（たとえば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワーゴム、ガッチゴム、イサポール皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微細結晶性セルロース、セルロースアセテート、ポリ（ビニル−ピロリドン）、珪酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、及びカラマツ・アラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；珪酸；ポリメタクリル酸塩；ワックス；水；アルコール等；及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７２】
例となる保存剤には、抗酸化剤、キレート剤、抗菌保存剤、抗真菌保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、及び／または他の保存剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。酸化は、ｍＲＮＡ、特に液状ｍＲＮＡ製剤にとって潜在的な分解経路である。酸化を防ぐために、抗酸化剤を製剤に加えることができる。例となる抗酸化剤には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ＥＤＴＡ、ｍ−クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール及び／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。例となるキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例となる抗菌保存剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロロヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。例となる抗真菌保存剤には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。例となるアルコール保存剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール性化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、及び／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。例となる酸性保存剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸及び／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の保存剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７３】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶ溶液のｐＨは安定性を改善するためにｐＨ５〜ｐＨ８の間で維持される。ｐＨを制御する例となる緩衝液には、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（またはヒスチジン−ＨＣｌ）、炭酸ナトリウム、及び／またはリンゴ酸ナトリウムが挙げられても良いが、これらに限定されない。別の実施形態では、上記の例となる緩衝液は追加の一価の対イオン（カリウムを含むが、これらに限定されない）と共に使用されても良い。二価のカチオンも緩衝液の対イオンとして使用されても良いが、これらは、錯体形成及び／またはｍＲＮＡの分解の故に好まれない。
【０９７４】
例となる緩衝剤には、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基リン酸カルシウム、リン酸、三塩基リン酸カルシウム、水酸化燐灰石、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張の生理食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、等、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられても良いが、これらに限定されない。
【０９７５】
例となる滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、等、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７６】
例となる油には、アーモンド、アンズ核、アボカド、ババス、ベルガモット、クロフサスグリ種子、ルリジサ、ジュニパータール、カモミール、カノーラ、カラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、コーン、綿種子、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、アマニ、ゲラニオール、ウリ、ブドウ種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラベンダー、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウ種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、ピーチ核、ピーナッツ、ケシ種子、カボチャ種子、菜種、米糠、ローズマリー、ベニバナ、ビャクダン、サザンカ、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及びコムギ胚芽の油が挙げられるが、これらに限定されない。例となる油には、ステアリン酸ブチル、トリカプリル酸グリセリル、トリカプリン酸グリセリル、シクロメチオニン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱物油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７７】
ココアバター及び坐薬ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤及び／または芳香剤のような賦形剤が、考案者の判断に従って組成物に存在することができる。
【０９７８】
例となる添加剤には、生理的に生体適合性の緩衝液（たとえば、トリメチルアミン塩酸塩）、キレート剤（たとえば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（たとえば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意で、カルシウム塩もしくはナトリウム塩（たとえば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加が挙げられる。加えて、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することができる。
【０９７９】
凍結保護剤
いくつかの実施形態では、ＮＡＶ製剤は凍結保護剤を含むことができる。本明細書で使用されるとき、「凍結保護剤」という用語は、所与の物質と組み合わせると、凍結の際生じるその物質への損傷を軽減するまたは排除するのに役立つ１以上の作用剤を指す。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、凍結の間それらを安定化するためにＮＡＶと組み合わせられる。−２０℃〜−８０℃でのＮＡＶの凍結保存はポリヌクレオチドの長期（たとえば、３６カ月）の安定性にとって有利であり得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤はＮＡＶ製剤に含まれて凍結／融解のサイクルを介して及び凍結保存の条件下でポリヌクレオチドを安定化する。本発明の凍結保護剤には、スクロース、トレハロース、デキストロース、ラフィノース及び／またはマンニトールが挙げられても良いが、これらに限定されない。トレハロースは、安全と一般に見なされる（ＧＲＡＳ）として食品医薬品局によってリストアップされ、市販の医薬製剤で一般に使用されている。
【０９８０】
増量剤
いくつかの実施形態では、ＮＡＶ製剤は増量剤を含んでも良い。本明細書で使用されるとき、「増量剤」という用語は、製剤に及び／または製剤成分の安定性に所望の一貫性を付与するために製剤に含まれる１以上の作用剤を指す。いくつかの実施形態では、増量剤は凍結乾燥されたＮＡＶ製剤に含められて長期（たとえば、３６カ月）の保存の間、凍結乾燥されたＮＡＶを安定化する「薬学的に洗練された」ケーキを得る。本発明の増量剤には、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース及び／またはラフィノースが挙げられても良いが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、凍結保護剤と増量剤の組み合わせ（たとえば、スクロース／グリシンまたはトレハロース／マンニトール）を含めて、凍結の間ＮＡＶを安定化しても良いと共に凍結乾燥用の増量剤を提供しても良い。
【０９８１】
製剤及び本発明のＮＡＶを製剤化する方法の非限定例は、内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年１２月１４日に出願された国際公開番号ＷＯ２０１３０９０６４８にも提供されている。
【０９８２】
不活性成分
いくつかの実施形態では、ＮＡＶ製剤は少なくとも１つの不活性成分である賦形剤を含んでも良い。本明細書で使用されるとき、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる１以上の不活性な作用剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の製剤で使用されても良い不活性成分のすべて、または一部が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されても良いし、またはそのどれもが認可されなくても良い。不活性成分及び不活性成分の投与経路の包括的ではないリストが明確に説明されてもよく、表２６にて記載されている。表２６では、「ＡＮ」は麻酔剤を意味し、「ＣＮＢＬＫ」は頸神経ブロックを意味し、「ＮＢＬＫ」は神経ブロックを意味し、「ＩＶ」は静脈内を意味し、「ＩＭ」は筋肉内を意味し、「ＳＣ」は皮下を意味する。
【表２６−１】
0006881813.tif 000895
【表２６−２】
0006881813.tif 000896
【表２６−３】
0006881813.tif 000897
【表２６−４】
0006881813.tif 000898
【表２６−５】
0006881813.tif 000899
【表２６−６】
0006881813.tif 000900
【表２６−７】
0006881813.tif 000901
【表２６−８】
0006881813.tif 000902
【表２６−９】
0006881813.tif 000903
【表２６−１０】
0006881813.tif 000904
【表２６−１１】
0006881813.tif 000905
【表２６−１２】
0006881813.tif 000906
【表２６−１３】
0006881813.tif 000907
【表２６−１４】
0006881813.tif 000908
【表２６−１５】
0006881813.tif 000909
【表２６−１６】
0006881813.tif 000910
【表２６−１７】
0006881813.tif 000911
【表２６−１８】
0006881813.tif 000912
【表２６−１９】
0006881813.tif 000913
【表２６−２０】
0006881813.tif 000914
【表２６−２１】
0006881813.tif 000915
【表２６−２２】
0006881813.tif 000916
【表２６−２３】
0006881813.tif 000917
【表２６−２４】
0006881813.tif 000918
【表２６−２５】
0006881813.tif 000919
【表２６−２６】
0006881813.tif 000920
【表２６−２７】
0006881813.tif 000921
【表２６−２８】
0006881813.tif 000922
【表２６−２９】
0006881813.tif 000923
【表２６−３０】
0006881813.tif 000924
【表２６−３１】
0006881813.tif 000925
【０９８３】
送達
本開示は、薬剤送達の科学においてありそうな進歩を考慮に入れる適切な経路による治療、医薬、診断またはイメージングのいずれかのためのＮＡＶの送達を包含する。送達はありのままであっても良いし、または製剤化されても良い。
【０９８４】
ありのままの送達
本発明のＮＡＶは細胞にありのままで送達されても良い。本明細書で使用されるとき、「ありのまま」はトランスフェクションを促進する作用剤を含まないＮＡＶを送達することを指す。たとえば、細胞に送達されるＮＡＶは修飾を含有しなくても良い。ありのままのＮＡＶが当該技術で既知の及び本明細書に記載されている投与の経路を用いて細胞に送達されても良い。
【０９８５】
製剤化された送達
本発明のＮＡＶは本明細書に記載されている方法を用いて製剤化されても良い。製剤はさらに、修飾されても良い、または未修飾であっても良いポリヌクレオチドを含有しても良い。製剤はさらに、細胞浸透剤、薬学的に許容される担体、送達剤、インビボ分解性のまたは生体適合性のポリマー、溶媒及び持続放出の送達デポーを含んでも良いが、これらに限定されない。製剤化されたＮＡＶは当該技術で既知の及び本明細書に記載されている投与の経路を用いて細胞に送達されても良い。
【０９８６】
直接浸すことまたは浴びること、カテーテルを介した、ゲル、粉剤、軟膏、クリーム、ゲル、ローション及び／または点滴剤による、組成物等で被覆されたまたは組成物等が含浸された布または生分解性物質のような基材を使用することによることを含むが、これらに限定されない当該技術における幾つかの方法のいずれかにて臓器または組織に直接送達するために組成物が製剤化されても良い。
【０９８７】
投与
本発明のＮＡＶは治療上有効な結果を生じる経路によって投与されても良い。これらには、腸内（腸の中へ）、胃腸、硬膜外（硬膜の中へ）、経口（口によって）、経皮、硬膜外、脳内（大脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚上への塗布）、皮内（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨内点滴（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、腹腔内（腹膜への点滴または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介いて）、空洞内注射（病態空洞の中へ）腔内（陰茎の基部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身性分布のための無傷の皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、吹送（鼻吸引）、舌下、唇下、浣腸剤、点眼剤（結膜上に）、点耳剤で、耳（耳にてまたは耳経由で）、頬内（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（歯（単数）または歯（複数）に対して）、電子−浸透作用、頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨の中で）、尾内（馬尾の中で）、嚢内（大槽延髄槽の中で）、角膜内（角膜の中で）、歯科イントラコルナル、冠状内（冠状動脈内で）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張性の空間の中で）、椎間板内（椎間板の中で）、導管内（腺の管の中で）、十二指腸内（十二指腸の中で）、硬膜内（硬膜の中でまたは下で）、表皮内（表皮に対して）、食道内（食堂に対して）、胃内（胃の中で）、歯肉内（歯肉の中で）、回腸内（小腸の遠位部の中で）、病変内（限局した病変の中でまたはそれに直接導入される）、内腔内（管の内腔の中で）、リンパ管内（リンパ管の中で）、髄質内（骨の髄腔の中で）、髄膜内（髄膜の中で）、眼内（眼の中で）、卵巣内（卵巣の中で）、心膜内（心膜の中で）、胸膜内（胸膜の中で）、前立腺内（前立腺の中で）、肺内（肺またはその気管支の中で）、洞内（鼻または眼窩周囲副鼻腔の中で）、脊髄内（脊髄の中で）、滑膜内（関節の滑液腔の中で）、腱内（腱の中で）、精巣内（睾丸の中で）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルでの脳脊髄液の中で）、胸腔内（胸腔の中で）、管内（臓器の管の中で）、腫瘍内（腫瘍の中で）、鼓膜内（中耳の中で）、血管内（血管（単数）または血管（複数）の中で）、脳室内（脳室の中で）、イオン導入法（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流による）、洗浄（開放創または体腔を洗うまたは洗い流すための）、咽頭部（咽頭の直上）、経鼻胃（鼻を介して胃に）、閉塞的包帯法、眼科系（外眼部に対して）、口腔咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身性の効果のために経口でまたは経鼻で吸入することによって気道の中で）、眼球後方（橋の後または眼球の後）、心筋内（心筋に入れること）、軟組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、経胎盤（胎盤を介してまたは横切って）、経気管（気管の壁を介して）、経鼓膜（鼓室を横切ってまたは介して）、尿管（尿管に対して）、尿道（尿道に対して）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管潅流、心臓潅流、循環光療法または脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門または他の上皮関門を通過するのを可能にする方法で投与されても良い。一実施形態では、投与の経路のための製剤は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。投与の経路と投与の特定の経路のための製剤に含まれても良い不活性成分の非限定例は表２０に示されている。表２７では、「ＡＮ」は麻酔剤を意味し、「ＣＮＢＬＫ」は頸神経ブロックを意味し、「ＮＢＬＫ」は神経ブロックを意味し、「ＩＶ」は静脈内を意味し、「ＩＭ」は筋肉内を意味し、「ＳＣ」は皮下を意味する。
【表２７−１】
0006881813.tif 000926
【表２７−２】
0006881813.tif 000927
【表２７−３】
0006881813.tif 000928
【表２７−４】
0006881813.tif 000929
【表２７−５】
0006881813.tif 000930
【表２７−６】
0006881813.tif 000931
【表２７−７】
0006881813.tif 000932
【表２７−８】
0006881813.tif 000933
【表２７−９】
0006881813.tif 000934
【表２７−１０】
0006881813.tif 000935
【表２７−１１】
0006881813.tif 000936
【表２７−１２】
0006881813.tif 000937
【表２７−１３】
0006881813.tif 000938
【表２７−１４】
0006881813.tif 000939
【表２７−１５】
0006881813.tif 000940
【表２７−１６】
0006881813.tif 000941
【表２７−１７】
0006881813.tif 000942
【表２７−１８】
0006881813.tif 000943
【表２７−１９】
0006881813.tif 000944
【表２７−２０】
0006881813.tif 000945
【表２７−２１】
0006881813.tif 000946
【表２７−２２】
0006881813.tif 000947
【表２７−２３】
0006881813.tif 000948
【表２７−２４】
0006881813.tif 000949
【０９８８】
本発明のＮＡＶの投与の非限定の経路が以下で記載される。
【０９８９】
非経口及び注射の投与
非経口投与のための液状剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及び／またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。有効成分に加えて、液状剤形は、たとえば、水または、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物のような他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤のような当該技術で一般に使用される不活性希釈剤を含んでも良い。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、たとえば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、風味剤及び／または芳香剤のような補助剤を含むことができる。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、たとえば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせのような可溶化剤と混合される。
【０９９０】
非経口投与の医薬組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。非経口投与のための医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムが挙げられる。
【０９９１】
注射用製剤、たとえば、無菌の水性または油性の懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤及び／または懸濁剤を用いた既知の技術に従って製剤化されても良い。無菌の注射用製剤は、たとえば、１，３−ブタンジオールにおける溶液のような、非毒性で非経口で許容される希釈剤及び／または溶媒における無菌の注射用の溶液、懸濁液及び／またはエマルジョンであっても良い。採用されても良い溶剤及び溶媒は、水、リンガー溶液、ＵＳＰ及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。無菌の不揮発性油は溶媒または懸濁媒として従来採用されている。この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発油も採用することができる。オレイン酸のような脂肪酸を注射物質の調製に使用することができる。無菌の製剤は、たとえば、局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤のような補助剤も含んでも良い。
【０９９２】
注射用製剤は、細菌保持フィルターを介した濾過によって、及び／または使用に先立って無菌水または他の無菌注射用媒体に溶解または分散することができる無菌固形組成物の形態で無菌化剤を組み込むことによって無菌化することができる。
【０９９３】
注射用製剤は、組織、臓器及び／または対象の領域への直接注入のためのものであっても良い。非限定例として、組織、臓器及び／または対象は、虚血領域への心筋内注射によって製剤を直接注入されても良い（たとえば、Ｚａｎｇｉら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３を参照のこと；その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０９９４】
有効成分の効果を長引かせるために、皮下注射または筋肉内注射からの有効成分の吸収を遅くすることが望ましいことが多い。このことは、水難溶性を伴った結晶性または非晶質の物質の液状懸濁液の使用によって達成され得る。そのとき、薬剤の吸収の速度は溶解の速度に依存し、溶解の速度に次に結晶のサイズ及び結晶形態に依存し得る。或いは、非経口で投与された薬剤形態の遅延した吸収は油溶剤に薬剤を溶解するまたは懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマーにて薬剤のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作製される。薬剤のポリマーに対する比及び採用される特定のポリマーの性質に応じて、薬剤放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤を包含することによって調製される。
【０９９５】
直腸内及び膣内の投与
直腸または膣（たとえば、経膣）への投与用の組成物は通常、常温では固形であるが、体温では液体であるので、直腸または膣腔では溶解し、有効成分を放出するココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスのような好適な非刺激性の賦形剤と組成物を混合することによって調製することができる坐薬である。
【０９９６】
非限定例として、直腸及び／または膣への投与用の製剤は常温では固形であるが、直腸温では液体であるので、直腸及び／または膣では溶解し、薬剤を放出する好適な非刺激性の賦形剤と薬剤を混合することによって調製されても良い。そのような物質にはココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０９９７】
直腸投与用の医薬組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。直腸投与のための医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、アルコール、脱水アルコール、塩基性酢酸アルミニウム、無水クエン酸、アニス油、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ペルーバルサム、安息香酸、ベンジルアルコール、塩基性没食子酸ビスマス、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、カラメル、カルボマー９３４、カルボマー９３４ｐ、カルボキシポリメチレン、セラシント−ＳＥ、セチルアルコール、ココアバター、ココナッツ油、水素添加ココナッツ油／パーム核油グリセリド、水素添加、コラノキ種子抽出物、Ｄ＆Ｃ黄色Ｎｏ．１０、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸、エピラクトース、エチレンジアミン、食用脂肪、硬質脂肪、ＦＤ＆Ｃ青色Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ緑色Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ黄色Ｎｏ．６、風味ＦＩＧ８２７１１８、ラズベリー風味ｐｆｃ−８４０７、フルクトース、ガラクトース、グリセリン、パルミチン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧステアレート、ステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−４０ステアレート、グリシン、炭化水素、塩酸、水素添加パーム油、ヒプロメロース、ラクトース、ラノリン、レシチン、軽油、珪酸マグネシウムアルミニウム、珪酸マグネシウムアルミニウム水和物、メチルパラベン、窒素、パーム核油、パラフィン、白色ワセリン、ポリエチレングリコール１０００、ポリエチレングリコール１５４０、ポリエチレングリコール３３５０、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール８０００、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、酢酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、プロピレングリコール、プロピルパラベン、サッカリンナトリウム、無水サッカリンナトリウム、二酸化珪素、コロイド状シメチコン、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビトール、ソルビトール溶液、デンプン、ステアレス−１０、ステアレス−４０、スクロース、タガロース、ｄ−、二酒石酸、ｄｌ−、トロラミン、トロメタミン、植物油グリセリド、水素添加植物油、水素添加ワックス、乳化白色ワックス、キサンタンゴム及び酸化亜鉛が挙げられる。
【０９９８】
膣内投与用の医薬組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。膣内投与のための医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、アジピン酸、脱水アルコール、アラントイン、無水ラクトース、アンズ核油ＰＥＧ−６エステル、硫酸バリウム、蜜蝋、ベントナイト、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、乳酸カルシウム、カルボマー９３４、カルボマー９３４ｐ、微細結晶性セルロース、セテス−２０、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、パルミチン酸セチル、コレステロール、コレス、クエン酸、クエン酸一水和物、水素添加ココナッツ油／パーム核グリセリド、クロスポビドン、エデト酸二ナトリウム、エチルセルロース、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（２８％酢酸ビニル）、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（９％酢酸ビニル）、脂肪アルコール、ＦＤ＆Ｃ黄色Ｎｏ．５、ゼラチン、ｄｌ−グルタミン酸、グリセリン、イソステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、グアーゴム、高密度ポリエチレン、ヒドロゲルポリマー、水素添加パーム油、ヒプロメロース２２０８（１５０００ｍｐａ．ｓ）、ヒプロメロース、ミリスチン酸イソプロピル、乳酸、ｄｌ−乳酸、ラクトース、ラクトース一水和物、水和ラクトース、ラノリン、無水ラノリン、レシチン、ダイズレシチン、軽油、珪酸マグネシウムアルミニウム、珪酸マグネシウムアルミニウム水和物、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸メチル、メチルパラベン、微細結晶性ワックス、鉱物油、硝酸、オクチルドデカノール、ピーナッツ油、ＰＥＧ６−３２ステアリン酸／ステアリン酸グリコール、ＰＥＧ−１００ステアリン酸、ＰＥＧ−１２０グリセリルステアリン酸、ＰＥＧ−２ステアリン酸、ＰＥＧ−５オレイン酸塩、ペゴキソール７ステアリン酸、白色ワセリン、酢酸フェニル水銀、ホスホリポン９０ｇ、リン酸、ピペラジン６水和物、ポリ（ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン／メチル水素シロキサン）ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチル末端ブロックした、ポリカルボフィル、ポリエステル、ポリエチレングリコール１０００、ポリエチレングリコール３３５０、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール８０００、ポリグリセリル３オレイン酸塩、ポリグリセリル４オレイン酸塩、パルミチン酸ポリオキシル、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポリウレタン、ナトリウムミョウバン、水酸化カリウム、ポビドンｋ２９／３２、ポビドン、プロムルゲンｄ、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノパルミトステアリン酸、プロピルパラベン、クアテルニウム−１５シス形態、二酸化珪素、コロイド状二酸化珪素、シリコーン、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、二塩基性無水リン酸ナトリウム、一塩基性無水リン酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンモノステアリン酸、ソルビトール、ソルビトール溶液、スペルマセチ、２−エチルヘキサン酸第一スズ、デンプン、アルファ化デンプン１５００、コーンスターチ、ステアルアミドエチルジエチルアミン、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ｄｌ−酒石酸、ｔｅｒｔ−ブチル化ヒドロキノン、オルソ珪酸テトラプロピル、トロラミン、尿素、水素添加植物油、ウエスコビー（ｗｅｃｏｂｅｅ）ｆｓ、白色セレシンワックス及び白色ワックスが挙げられる。
【０９９９】
経口投与
経口投与用の液状剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及び／またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。有効成分に加えて、液状剤形は、たとえば、水または、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物のような他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤のような当該技術で一般に使用される不活性の希釈剤及び／または賦形剤を含んでも良い。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、たとえば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、風味剤及び／または芳香剤のような補助剤を含むことができる。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、たとえば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせのような可溶化剤と混合される。
【１０００】
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと共に製剤化することができる。そのような製剤は粘滑剤、保存剤及び風味剤及び着色剤も含有することができる。医薬組成物は無菌の注射用の水性または油性の懸濁液の形態であることができる。この懸濁液は、上記で言及されている好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いた既知の技術に従って製剤化することができる。無菌の注射用製剤は、たとえば、１，３−ブタンジオールにおける溶液のような、非毒性で非経口で許容される希釈剤または溶媒における無菌の注射用の溶液または懸濁液であることもできる。採用することができる許容される溶剤及び溶媒は、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、無菌の不揮発性油は溶媒または懸濁媒として従来採用されている。この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含むどんな銘柄の不揮発性油も採用することができる。加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注射物質の調製に使用することができる。
【１００１】
経口投薬用の懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物にて活性物質を含有しても良い。そのような賦形剤は懸濁剤であってもよく、非限定例として、懸濁剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムであってもよく；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、たとえば、レシチン、または酸化アルキレンの脂肪酸との縮合生成物、たとえば、ステアリン酸ポリオキシエチレン；または酸化エチレンの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、たとえば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、または酸化エチレンの脂肪酸とヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、たとえば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または酸化エチレンの脂肪酸と無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、たとえば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであることができる。水性懸濁液は、１以上の保存剤、たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル、１以上の着色剤、１以上の風味剤、及び１以上の、たとえば、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤も含有しても良い。
【１００２】
経口投薬用の油性懸濁液は、植物油、たとえば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油、または流動パラフィンのような鉱物油にて有効成分を懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁液は増粘剤、たとえば、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。甘味剤及び風味剤を加えて口当たりの良い経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存することができる。
【１００３】
経口投薬は水中油エマルジョンの形態であっても良い。油相は植物油または鉱物油またはそれらの混合物であることができる。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム、たとえば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、たとえば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸に由来するエステルまたは部分エステル及び無水ヘキシトール、たとえば、ソルビタンモノオレエート、及び酸化エチレンとの前記部分エステルの縮合生成物、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであることができる。エマルジョンは甘味剤及び風味剤も含有しても良い。
【１００４】
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸薬、粉剤及び顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、有効成分は、たとえば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム及び／または充填剤または増量剤（たとえば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び珪酸）、結合剤（たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、及びアラビアゴム）、保湿剤（たとえば、グリセロール）、崩壊剤（たとえば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、特定の珪酸塩、及び炭酸ナトリウム）、溶液減速剤（たとえば、パラフィン）、吸収加速剤（たとえば、四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（たとえば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアリン酸）、吸収剤（たとえば、カオリン及びベントナイト粘土）、及び滑沢剤（たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、及びそれらの混合物のような少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸薬の場合、剤形は緩衝剤を含んでも良い。固体剤形は、たとえば、唾液及び胆汁のような、しかし、これらに限定されない液体にいったん接触すると溶解しても良い。
【１００５】
経口使用を意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術で既知の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練され、口当たりの良い製剤を提供するために１以上のそのような甘味剤、風味剤、着色剤または保存剤を含有することができる。
【１００６】
固体剤形はコーティングされなくても良いし、または既知の技法によってコーティングすることができる。場合によっては、そのようなコーティングは既知の技法によって調製されて消化管における崩壊及び吸収を遅らせ、それによって長期にわたって持続する作用を提供することができる。たとえば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延物質を採用することができる。
【１００７】
経口使用のための製剤は、有効成分が不活性の固体希釈剤、たとえば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセル剤として、または有効成分が水または油の媒体、たとえば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油と混合される軟質ゼラチンカプセル剤としても提示され得る。
【１００８】
経口送達用の剤形は噛むことができても良いし、または舐めることができても良い（たとえば、トローチ剤形態）。噛むことができる剤形は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８２４７０及び米国公開番号ＵＳ２０１３０１４２８７６にて記載された持続放出組成物のような、しかし、これらに限定されない持続放出製剤であっても良い。噛むことができる剤形は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２０１３０８２４７０及び米国公開番号ＵＳ２０１３０１４２８７６にて記載されたもののような、しかし、これらに限定されない両親媒性の脂質を含んでも良い。
【１００９】
局所または経皮の投与
本明細書に記載されているように、本発明のＮＡＶを含有する組成物は経皮投与のために製剤化されても良い。皮膚は容易にアクセスできるので送達についての理想的な標的部位であり得る。遺伝子発現は皮膚に限定されて非特異的な毒性を潜在的に回避するだけでなく、皮膚の中の特定の層及び細胞型に限定され得る。
【１０１０】
送達された組成物の皮膚発現の部位は核酸送達の経路に左右されるであろう。ＮＡＶを皮膚に送達するのに２つの経路、すなわち（ｉｉ）経皮注入及び（ｉｉｉ）全身性送達（たとえば、皮膚領域及び皮膚外の領域の双方を冒す皮膚疾患の治療にため）が一般に考慮される。当該技術で既知の幾つかの異なるアプローチによってＮＡＶを皮膚に送達することができる。核酸の送達の後、基底角化細胞、皮脂腺細胞、皮膚線維芽細胞及び皮膚マクロファージを含むが、これらに限定されない多数の異なる皮膚細胞型にて遺伝子産物が検出されている。
【１０１１】
一実施形態では、本発明は１を超える注入にて送達されるＮＡＶ組成物を提供する。
【１０１２】
一実施形態では、経皮投与の前に、皮膚のような組織の少なくとも１つの領域が透過性を高め得る装置及び／または溶液に供されても良い。一実施形態では、組織は皮膚の透過性を高める摩擦装置（全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２００８０２７５４６８を参照のこと）に供されても良い。別の実施形態では、組織は超音波増強装置に供されても良い。超音波増強装置には、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２００４０２３６２６８及び米国特許第６，４９１，６５７号及び同第６，２３４，９９０号にて記載された装置が挙げられても良いが、これらに限定されない。組織の透過性を高める方法は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２００４０１７１９８０及び２００４０２３６２６８ならびに米国特許第６，１９０，３１５号にて記載されている。
【１０１３】
一実施形態では、装置を用いて、本明細書に記載されている修飾されたｍＲＮＡの製剤を送達する前に組織の透過性を高めても良い。皮膚の透過性は、当該技術で既知である及び／または全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９０，３１５号にて記載された方法によって測定されても良い。非限定例として、修飾されたｍＲＮＡ製剤は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９０，３１５号にて記載された薬剤送達法によって送達されても良い。
【１０１４】
別の非限定例では、透過性を高め得る装置に組織が供され得る前に、その間に及び／またはその後に組織を局所麻酔の共融混合物（ＥＭＬＡ）クリームで処置しても良い。Ｋａｔｚら（Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．（２００４）；９８：３７１−７６；その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）は、低エネルギー超音波との併用でＥＭＬＡクリームを用いて、表面皮膚の鎮痛の開始が低エネルギー超音波による予備処理の５分後という速さで見られることを示した。
【１０１５】
一実施形態では、透過性を高めるように組織が処理される前に、その間に及び／またはその後にエンハンサーを皮膚に塗布しても良い。エンハンサーには、輸送エンハンサー、物理的エンハンサー及びキャビテーションエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。エンハンサーの非限定例は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９０，３１５号にて記載されている。
【１０１６】
一実施形態では、本明細書に記載されている、免疫応答を引き起こす物質をさらに含有しても良いＮＡＶの製剤を送達する前に、装置を用いて組織の透過性を高めても良い。別の非限定例では、免疫応答を引き起こす物質を含有する製剤は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号２００４０１７１９８０及び２００４０２３６２６８にて記載された方法によって送達されても良い。
【１０１７】
組成物の経皮投与用の剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶液、スプレー、吸入剤及び／または貼付剤が挙げられ得る。一般に、有効成分は無菌条件下で薬学的に許容される賦形剤及び／または必要とされる保存剤及び／または必要とされ得る緩衝液と混合される。
【１０１８】
さらに、本発明は経皮貼付剤の使用を企図し、それは化合物の身体への制御された送達を提供する追加の利点を有することが多い。そのような剤形は、たとえば、適切な媒体に化合物を溶解する及び／または分散することによって調製され得る。代わりにまたはさらに、速度制御膜を提供すること及び／またはポリマーのマトリクス及び／またはゲルにて化合物を分散することによって速度を制御しても良い。
【１０１９】
経皮投与用の医薬ＮＡＶ組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。経皮投与用の医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、アクリレートコポリマー、アクリル酸−アクリル酸イソオクチルコポリマー、アクリル接着剤７８８、アドコート７２ａ１０３、アエロテックス樹脂３７３０、アルコール、脱水アルコール、アルミニウムポリエステル、ベントナイト、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチレングリコール、酪酸、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、カルボマー１３４２、カルボマー９４０、カルボマー９８０、カラーギーナン、塩化セチルピリジニウム、クエン酸、クロスポビドン、ダウバート１−５ｐｅｓｔｒ（艶消し（ｍａｔｔｅ））１６４ｚ、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、フタル酸ジエチルヘキシル、ジメチコンコポリオール、ジメチコンｍｄｘ４−４２１０、ジメチコン医療用流体３６０、メタクリル酸ジメチルアミノエチル−メタクリル酸ブチル−メタクリル酸メチルコポリマー、ジプロピレングリコール、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ２８０−２５１６、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ３８７−２５１６、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８０−１１９６、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８７−２０７０、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８７−２１９４、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８７−２２８７、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８７−２２９６、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８７−２８８８、ＤＵＲＯ−ＴＡＫ８７−２９７９、エデト酸二ナトリウム、酢酸エチル、オレイン酸エチル、エチルセルロース、エチレン酢酸ビニルコポリマー、エチレン−プロピレンコポリマー、脂肪酸エステル、ゲルバ７３７、グリセリン、ラウリン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、ヘプタン、高密度ポリエチレン、塩酸、水素添加ポリブテン６３５−６９０、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ラクトース、無水ラノリン、乳酸ラウリル、レシチン、レブリン酸、軽油、医療用接着剤改変ｓ−１５、メチルアルコール、ラウリン酸メチル、鉱物油、窒素、オクチサレート、オクチルドデカノール、オレイン酸、オレイルアルコール、オレイン酸オレイル、ペンタデカラクトン、白色ワセリン、ポラクリリン、ポリアクリル酸（２５００００分子量）、ポリブテン（１４００分子量）、ポリエステル、ポリエステルポリアミンコポリマー、ポリエステルレーヨン、ポリエチレンテレフタレート、ポリイソブチレン、ポリイソブチレン（１１０００００分子量）、ポリイソブチレン（３５０００分子量）、ポリイソブチレン１７８−２３６、ポリイソブチレン２４１−２９４、ポリイソブチレン３５−３９、ポリイソブチレン低分子量、ポリイソブチレン中分子量、ポリイソブチレン／ポリブテン接着剤、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル−ポリ酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピリジン、ポビドンｋ２９／３２、ポビドン、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノラウレート、ｒａ−２３９７、ｒａ−３０１１、珪素、コロイド状二酸化珪素、シリコーン、シリコーン接着剤４１０２、シリコーン接着剤４５０２、シリコーン接着剤ｂｉｏ−ｐｓａｑ７−４２０１、シリコーン接着剤ｂｉｏ−ｐｓａｑ７−４３０１、シリコーン／ポリエステル膜片、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ソルビタンモノオレエート、ステアラルコニウムヘクトライト／炭酸プロピレン、二酸化チタン、トリアセチン、トロラミン、トロメタミン、ユニオン７６ａｍｓｃｏ−ｒｅｓ６０３８及びビスコース／綿が挙げられる。
【１０２０】
皮内投与用の医薬ＮＡＶ組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。皮内投与用の医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クレアチニン、エデト酸二ナトリウム、グリセリン、塩酸、メタクレゾール、メチルパラベン、フェノール、ポリソルベート８０、硫酸プロタミン、酢酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、無水一塩基性リン酸ナトリウム、及び塩化亜鉛が挙げられる。
【１０２１】
デポー投与
本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態では、組成物は持続放出のためのデポーにて製剤化されても良い。一般に、特定の臓器または組織（「標的組織」）が投与について標的とされる。
【１０２２】
本発明の一部の態様では、ＮＡＶは標的組織の中でまたはその近傍で空間的に保持される。提供されるのは、組成物、特に組成物の核酸成分が標的組織で実質的に保持されるような、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％を超える組成物が標的組織で保持されることを意味するような条件下で標的組織（１以上の標的細胞を含有する）を組成物に接触させることによって哺乳類対象に組成物を提供することである。有利なことに、保持は、１以上の標的細胞に入る組成物に存在する核酸の量を測定することによって割り出される。たとえば、対象に投与された核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％または９９．９９％を超える核酸が投与の後ある期間細胞内に存在する。たとえば、リボ核酸とトランスフェクション試薬を含有する水性組成物用いて哺乳類対象への筋肉内注射を行い、筋肉細胞に存在するリボ核酸の量を測定することによって組成物の保持を判定する。
【１０２３】
本発明の態様は、組成物が標的組織で実質的に保持されるような条件下で標的組織（１以上の標的細胞を含有する）を組成物に接触させることによって哺乳類対象の標的組織に組成物を提供する方法に向けられる。組成物は、対象とするポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞で産生されるように有効量のポリヌクレオチドを含有する。「ありのまま」のＮＡＶ（たとえば、細胞浸透剤または他の作用剤を含まない核酸のような）も企図されるが、組成物は一般に、細胞浸透剤及び薬学的に許容される担体を含有する。
【１０２４】
いくつかの状況では、組織における細胞によって産生されるタンパク質の量は望ましく高められる。好ましくは、タンパク質産生におけるこの上昇は標的組織内の細胞に空間的に限定される。従って、提供されるのは哺乳類対象の組織における対象とするタンパク質の産生を増やす方法である。組成物の単位量が標的組織の所定の容積内に含有される実質的な比率の細胞で対象とするポリペプチドを産生するように決定されていることを特徴とするポリヌクレオチドを含有する組成物が提供される。
【１０２５】
いくつかの実施形態では、ＮＡＶ組成物は複数の異なるポリヌクレオチドを含み、そこでは、１以上のポリヌクレオチドが対象とするポリペプチドをコードする。任意で、組成物は細胞浸透剤も含有して組成物の細胞内送達に役立つ。判定は、標的組織の所定の容積内に含有される実質的な比率の細胞で対象とするポリペプチドを産生するのに必要とされる組成物の用量で構成される（一般に所定の容量に隣接するまたは標的組織に対して遠位にある組織では対象とするポリペプチドの有意な産生を誘導することはなく）。この判定に続いて、判定された用量を哺乳類対象の組織に直接導入する。
【１０２６】
一実施形態では、本発明は１を超える注射にてまたは分割用量注射によって送達されるＮＡＶを提供する。
【１０２７】
一実施形態では、小型で使い捨ての薬剤リザーバ、パッチポンプまたは浸透圧ポンプを用いて本発明が標的組織の近傍で保持されても良い。パッチポンプの非限定例には、ＢＤ（登録商標）（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）（たとえば、ＭｉｎｉＭｅｄ）、ＵｎｉＬｉｆｅ（Ｙｏｒｋ、ＰＡ）、Ｖａｌｅｒｉｔａｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）、及びＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）によって製造されている及び／または販売されているものが挙げられる。浸透圧ポンプの非限定例には、ＤＵＲＥＣＴ（登録商標）（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）によって製造されているもの（たとえば、ＤＵＲＯＳ（登録商標）及びＡＬＺＥＴ（登録商標））が挙げられる。
【１０２８】
肺投与
医薬組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤にて調製されてもよく、包装されてもよく、及び／または販売されても良い。そのような製剤は、約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲での直径を有する有効成分を含む乾燥粒子を含んでも良い。そのような組成物は、噴射剤の流れが粉末を分散するように向けられても良い乾燥粉末リザーバを含む装置を用いた、及び／または密封容器内で低沸点の噴射剤に溶解された及び／または懸濁された有効成分を含む装置のような自己推進する溶媒／粉末分配容器を用いた投与に好適に乾燥粉末の形態である。そのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍより大きな直径を有し、且つ粒子の少なくとも９５重量％が７ｎｍより小さい直径を有する粒子を含む。或いは、粒子の少なくとも９５重量％が１ｎｍより大きな直径を有し、且つ粒子の数での少なくとも９０％が６ｎｍより小さい直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖のような固形の微粉末希釈剤を含んでもよく、単位用量形態にて好都合に提供される。
【１０２９】
低沸点噴射剤は一般に常圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は組成物の５０％〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し得、有効成分は組成物の０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）を構成し得る。噴射剤はさらに、たとえば、液状の非イオン性界面活性剤及び／または固形のアニオン性界面活性剤及び／または固形の希釈剤（有効成分を含む粒子と同じ桁の粒度を有しても良い）のような追加の成分を含んでも良い。
【１０３０】
非限定例として、本明細書に記載されているＮＡＶは、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２５７，６８５号にて記載された方法によって肺送達のために製剤化されても良い。
【１０３１】
肺投与用に製剤化された医薬ＮＡＶ組成物は溶液及び／または懸濁液の液滴での形態で有効成分を提供し得る。そのような製剤は、任意で無菌の、有効成分を含む水溶液及び／または希釈アルコール性の溶液及び／または懸濁液として調製されてもよく、包装されてもよく及び／または販売されてもよく、噴霧化装置及び／または微粒子化装置を用いて好都合に投与されても良い。そのような製剤はさらに、サッカリンナトリウムのような風味剤、揮発油、緩衝剤、表面活性剤及び／またはメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含むが、これらに限定されない１以上の追加の成分を含んでも良い。投与のこの経路によって提供される液滴は約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲での平均直径を有しても良い。
【１０３２】
肺送達に使用されても良い本明細書で提供される組成物及び製剤はさらに１以上の界面活性剤を含んでも良い。本発明の組成物の摂取を高めるのに好適な界面活性剤または界面活性剤成分には、界面活性剤プロテインＡ、界面活性剤プロテインＢ、界面活性剤プロテインＣ、界面活性剤プロテインＤ及び界面活性剤プロテインＥの完全な形態及び切り詰め形態と同様に合成及び天然の形態、飽和ジホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピ及びロステロン、ジリコール、スルファチジン酸、グリセロール−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、グリセロール、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミチン酸、シチジンジホスフェート（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンホスフェート；と同様に界面活性剤の成分のための天然の担体手段である天然の及び人工的な層状体、オメガ−３脂肪酸、ポリエン酸、ポリエノ酸、レシチン、パルミチン酸、酸化エチレンまたは酸化プロピレンの非イオン性ブロックコポリマー、ポリオキシプロピレン、モノマー及びポリマー、ポリオキシエチレン、モノマー及びポリマー、デキストラン及び／またはアルカノイルの側鎖を伴ったポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ３５、トリトンＸ−１００及びとりわけ、合成界面活性剤ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、Ｓｕｒｖａｎ及びＡｔｏｖａｑｕｏｎｅが挙げられる。これらの界面活性剤は製剤における単一の界面活性剤としてもしくは複数の成分界面活性剤の一部として、または本明細書の医薬組成物の核酸成分の５’及び／または３’末端への共有結合付加として使用することができる。
【１０３３】
鼻内、鼻及び口腔への投与
肺送達に有用であると本明細書に記載されている製剤はＮＡＶ医薬組成物の鼻内送達に有用である。鼻内投与に好適な別の製剤は、有効成分を含み、且つ約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、嗅ぎ薬を嗅ぐ方法で、すなわち、鼻の近傍に保持された粉末の容器からの鼻孔を介した迅速な吸入によって投与される。
【１０３４】
鼻投与に好適な製剤は、たとえば、０．１％（ｗ／ｗ）という少量及び１００％（ｗ／ｗ）という多くの有効成分を含んでもよく、１以上の本明細書に記載されている追加の成分を含んでも良い。医薬組成物は口腔投与に好適な製剤にて調製されてもよく、包装されてもよく、及び／または販売されても良い。そのような製剤は、たとえば、従来の方法を用いて作製される錠剤及び／またはトローチ剤の形態であってもよく、たとえば、０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の有効成分、経口で溶解可能な及び／または分解可能な組成物を含む残り、及び任意で本明細書に記載されている追加の成分の１以上を含んでも良い。或いは、口腔投与に好適な製剤は、有効成分を含む粉末及び／またはエアロゾル化した及び／または噴霧化した溶液及び／または懸濁液を含んでも良い。そのような粉末化した及び／またはエアロゾル化した及び／またはエアロゾル化した製剤は、分散すると、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲での粒子及び／または液滴の平均サイズを有してもよく、さらに、本明細書に記載されている追加の成分の１以上を含んでも良い。
【１０３５】
吸入（呼吸器）投与のための医薬ＮＡＶ組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。吸入（呼吸器）投与用の医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、アセトン重亜硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、アルコール、脱水アルコール、アンモニア、アパフルラン、アスコルビン酸、塩化ベンザルコニウム、炭酸カルシウム、二酸化炭素、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クエン酸、Ｄ＆Ｃ黄色Ｎｏ．１０、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ＦＤ＆Ｃ黄色Ｎｏ．６、フルオロクロロ炭化水素、ゼラチン、グリセリン、グリシン、塩酸、希塩酸、ラクトース、ラクトース一水和物、レシチン、水素添加ダイズレシチン、ダイズレシチン、リジン一水和物、マンニトール、メントール、メチルパラベン、硝酸、窒素、ノルフルラン、オレイン酸、ポリエチレングリコール１０００、ポビドンｋ２５、プロピレングリコール、プロピルパラベン、サッカリン、サッカリンナトリウム、コロイド状二酸化珪素、重硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、無水硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビタントリオレエート、硫酸、チモール、二酸化チタン、トリクロロモノフルオロメタン、トロメタミン及び酸化亜鉛が挙げられる。
【１０３６】
経鼻投与用の医薬ＮＡＶ組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。経鼻投与用の医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、酢酸、脱水アルコール、アリルα−イオノン、無水デキストロース、無水クエン酸三ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、カフェイン、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微細結晶性セルロース、クロロブタノール、クエン酸、クエン酸一水和物、デキストロース、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、エデト酸二ナトリウム、グリセリン、水素添加ロジンのグリセロールエステル、塩酸、ヒプロメロース２９１０（１５０００ｍｐａ．ｓ）、メチルセルロース、メチルパラベン、窒素、ノルフルラン、オレイン酸、白色ワセリン、フェニルエチルアルコール、ポリエチレングリコール３３５０、ポリエチレングリコール４００、ポリオキシル４００ステアリン酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、一塩基性リン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピレングリコール、プロピルパラベン、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性無水リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、二塩基性リン酸ナトリウム１２水和物、二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、一塩基性無水リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、ソルビタントリオレエート、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクラロース、硫酸、トリクロロモノフルオロメタン及びクエン酸三ナトリウム二水和物が挙げられる。
【１０３７】
眼科投与及び耳投与
医薬ＮＡＶ組成物は、眼への及び／または眼の周りへの送達及び／または耳への送達（たとえば、耳（耳）投与）に好適な製剤にて調製されてもよく、包装されてもよく及び／または販売されても良い。眼への及び／または眼の周りへの送達のための投与の経路の非限定例には、眼球後方、結膜、角膜内、眼内、硝子体内、眼科及び結膜下が挙げられる。そのような製剤は、たとえば、水性または油液性の賦形剤にて有効成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液及び／または懸濁液を含む点眼剤または点耳剤の形態であり得る。そのような点滴剤はさらに緩衝剤、塩、及び／または本明細書に記載されている追加の成分の１以上のその他を含んでも良い。有用である他の眼科的に投与できる製剤には、微細結晶性形態にて及び／またはリポソーム製剤にて有効成分を含むものが挙げられる。点耳剤及び／または点眼剤は本発明の範囲内であると企図される。眼及び／または周辺組織への送達用の医薬組成物を含有するように多層薄膜装置が調製されても良い。
【１０３８】
眼科投与用の医薬ＮＡＶ組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。眼科投与用の医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、酢酸、アルコール、脱水アルコール、アルギン酸、アメルコール−ｃａｂ、水酸化アンモニウム、無水クエン酸三ナトリウム、アンチピリン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化ベンゾドデシニウム、ホウ酸、カフェイン、塩化カルシウム、カルボマー１３４２、カルボマー９３４ｐ、カルボマー９４０、カルボマーホモポリマーｂ型（アリルペンタエリスリトール架橋した）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒマシ油、セチルアルコール、クロロブタノール、無水クロロブタノール、コレステロール、クエン酸、クエン酸一水和物、クレアチニン、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチルヘキシル、ジビニルベンゼンスチレンコポリマー、エデト酸二ナトリウム、無水エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ゲランゴム（低アシル）、グリセリン、ステアリン酸グリセリル、高密度ポリエチレン、可塑化炭化水素ゲル、塩酸、希塩酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６、ヒプロメロース２９１０（１５０００ｍｐａ．ｓ）、ヒプロメロース、ジョリーン、ラノリン、ラノリンアルコール、無水ラノリン、ラノリン非イオン性誘導体、塩化ラウラルコニウム、ラウロイルサルコシン、軽油、塩化マグネシウム、マンニトール、メチルセルロース（４０００ｍｐａ．ｓ）、メチルセルロース、メチルパラベン、鉱物油、硝酸、窒素、ノノキシノール−９、オクタキシノール−４０、オクチルフェノールポリメチレン、ワセリン、白色ワセリン、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、リン酸、塩化ポリドロニウム、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリカルボフィル、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール８０００、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０水素添加ヒマシ油、ポリオキシル４０ステアリン酸、ポリプロピレングリコール、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポリビニルアルコール、酢酸カリウム、塩化カリウム、一塩基性リン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドンｋ２９／３２、ポビドンｋ３０、ポビドンｋ９０、ポビドン、プロピレングリコール、プロピルパラベン、ソーダ灰、酢酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム１０水和物、炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム一水和物、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム二水和物、二塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性無水リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、一塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性無水リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、硫酸ナトリウム、無水硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム１０水和物、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンモノラウレート、ソルビトール、ソルビトール溶液、安定化させたオキシクロロ錯体、硫酸、チメロサール、二酸化チタン、トコフェルソラン、クエン酸三ナトリウム二水和物、トリトン７２０、トロメタミン、チロキサポール及び塩化亜鉛が挙げられる。
【１０３９】
眼球後方投与用の医薬ＮＡＶ組成物は少なくとも１つの不活性成分を含んでも良い。使用される不活性成分のいずれかが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていても良いし、またはそのどれもが認可されていなくても良い。眼球後方投与用の医薬組成物で使用する不活性成分の包括的ではないリストには、塩酸及び水酸化ナトリウムが挙臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鳧薆諦躸铧꺁賥겖볯ꆼ볯蒵裦ꦉ臣醰臣辁臣节볯ꒁ臣趸듦Ꞁ裦蚈苣ꮐ苣ꞁ苣꾉臣芀뷤ꢔ臣貂苣趸듦Ꞁ裦蚈臣蒁臣貂臣貁뇧붛ꏩ膓賥겖鏥肱볯ꚼ볯ꆼ볯ꮁ苣ꎁ臣趪迥閁苣ꚁ臣ꚁ苣꾉臣鞁胣뺁臣꾁臣꺁臣貂苣貁ꫨ꾏臣貂臣蒁臣辁臣节觨蒁胣벜蛥閊룤ꢔ臣뮌雨蒵裦ꦉ臣뾽铧馁苣趸듦Ꞁ裦蚈臣薌详蒚臣꾁臣蒁菣릂菣ꮁ臣膀ꇥ隌菣뎃苣ꮃ苣讃苣ꂃ胣ꦡ賥ꮂ菣랂苣ꂃ胣꾂苣뎃藩肸냦貒觧膀ꇥ뢅胣ꦡ賥麃苣趃苣Ꚃ菣膀菣ꪃ菣讃菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣ꦡ賥ꮂ菣Ꚃ菣膀藩뢅菣袃菣Ꚃ菣膀ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣膀苣ꢂ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣誏臣뒰藩隌菣袃菣Ꚃ菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 鶡귥鎽蛥閊룤ꢔ臣뮌雨꺼볯뚼뗧邈觧꾁냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁룤뮴胦邈裥銂郥鎂臣节觨蒁胣뾽铧閁苣讂룤뮴胦邈裥꺁臣骁苣讁臣뎱鯥龣鏥뮌雨膓뇥袼볯꒼볯覼臣袂臣ꚁꫨ꾏臣貂臣蒁臣节觨蒁臣膀臣龁臣鶁臣ꦁ苣节臣趪迥閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꚁ苣꾉臣芀ꇧ邭뷤薆諦躸铧꺁賥겖뗧邈觧ꞁ뷤ꢔ臣讂룤뮴胦邈裥꺁賥겋髧ꞁ臣ꪁ臣ꪃ苣袃臣꾁胣ꦡ賥ꮂ菣랂苣ꂃ胣ꮂ菣鲃苣랂菣膃菣뮂菣궃菣릂菣袃菣Ꚃ菣膀苣ꮃ菣벃苣膀뻥내뗧뚙胦膀菣ꊂ菣궃菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀ꇥ뢅胣ꦡ賥麃苣趃苣Ꚃ菣膀苣蚃苣ꪃ菣뢅菣낂菣랂苣ꂃ胣鶃菣붂菣馃菣袃볯邼胣鶃菣鎃菣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀ꇥ隌苣ꪃ苣ꂃ胣ꊅ藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣趇苧뢅菣袃菣Ꚃ菣膀苧뢅菣袃菣Ꚃ菣膀ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣膀냦뢅賥誃菣ꪃ苣ꂃ胣貺ꇥ몟胦ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣鞼냦貒觧膀룤ꦡ鿥Ꞁ菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ룤뒰鋥ꦉ迥뎁蓨뒰苣ꢂ菣뢅룤誃菣ꪃ苣ꂃ臣馌臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뗧鲆룤閊룤ꢔ臣뮌雨꺼볯뚼뗧邈觧꾁냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁룤뮴胦邈裥銂郥鎂臣节觨蒁胣뾽铧閁苣讂룤뮴胦邈裥꺁臣骁苣讁臣뎱鯥龣鏥뮌雨膓뇥袼볯꒼볯覼臣袂臣ꚁꫨ꾏臣貂臣蒁臣节觨蒁臣膀臣龁臣鶁臣ꦁ苣节臣趪迥閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꚁ苣꾉臣芀뗧鲆룤閊룤ꢔ臣뮌雨蒵裦ꦉ臣뾽铧馁苣趸듦Ꞁ裦蚈臣薌详蒚臣꾁臣蒁菣릂菣ꮁ臣膀菣뎃苣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀ꇥ뢅迥뎁냦뢅賥誃菣ꪃ苣ꂃ臣馌臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†胨閊룤ꢔ臣뮌雨꺼볯뚼뗧邈觧꾁냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁룤뮴胦邈裥銂郥鎂臣节觨蒁胣뾽铧閁苣讂룤뮴胦邈裥꺁臣骁苣讁臣뎱鯥龣鏥뮌雨膓뇥袼볯꒼볯覼臣袂臣ꚁꫨ꾏臣貂臣蒁臣节觨蒁臣膀臣龁臣鶁臣ꦁ苣节臣趪迥閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꚁ苣꾉臣芀胨閊룤ꢔ臣뮌雨蒵裦ꦉ臣뾽铧馁苣趸듦Ꞁ裦蚈臣薌详蒚臣꾁臣蒁菣릂菣ꮁ臣膀藩뢅胣ꊅ藩ꊂ菣龃菣Ꚃ菣膀蓧뒰ꇧ뢅苣ꮃ菣讃苣ꂃ胣ꦡ賥馃菣뚂菣뎂菣Ꚃ菣膀ꇥ隌菣뎃苣袃菣Ꚃ菣膀菣뎃苣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀菣Ꚃ藩膀苧뢅苣ꮃ苣Ꚃ菣膀苣膃菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣꾂菣궃菣뾂菣벃菣膀苣궃菣궂苣것菣벃菣膀苣ꢂ菣뢅胣꾂菣ꊂ菣讃菣膀ꇧ뢅諩膀蓧뒰ꇧ뢅諩膀苣螃菣뢅뫤誃菣ꪃ苣ꂃ胣ꢂ菣袃藩膀苣ꪃ苣ꪃ菣膀苣蚃苣ꪃ菣뢅苣ꪃ苣ꪃ菣膀ꇥ뢅胣较苣覃菣뎂菣膃苣뎃胣銃菣궃苣랂苣膃菣뮂菣궃菣릂胣龃菣릂菣뎃藩ꒂ苣鞃菣钃菣膀매뢅胣것苣膃菣膀냦ꂴ럦ꂊ胣ꆃ菣ꮃ菣ꦃ菣뎃胣놉觧릲胣꾃苣ꪃ菣膀駧늉菣뮂菣뎃胣閃苣讃菣ꢂ菣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀菣ꪃ苣궂苣ꮃ볯邼苣蚃苣ꪃ菣뢅胣鶃菣ꪂ苣랂菣릂菣ꊂ菣뎃藩膀菣ꪃ苣ꮃ菣벃菣銼볯膀菣ꪃ苣ꮃ菣벃菣颼볯膀菣ꪃ菣讃菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣ꆃ苣趇뫤ꮡ藩ꮂ菣Ꚃ菣膀룤ꦡ鿥Ꞁ菣뎃藩ꮂ菣Ꚃ菣膀菣鎃菣뎃뷯馼볯蚽胣鶃菣覃菣膀菣궃菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣鞃菣钃菣뎃苣ꪃ苣벃菣뢂苣뮂菣벃菣膀菣궃菣ꮃ菣ꦃ菣뎃胣ꊅ藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣趇뫤ꮡ藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣鮃苣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣膀苣ꢂ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀냦뢅賥誃菣ꪃ苣ꂃ胣貺ꇥ몟胦ꆄ냦ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀뫤ꦡ鿥Ꞁ菣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯뒰鋥ꦉ胣肸ꇥ몟胦ꆄ냦ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀뫤ꮡ藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣ꮡ藩誏臣膃菣궃苣벃菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖骃苣궃菣覃諦躸볯鲤蟥ꒉ迥뎁닦芙觥㲤牢ਾ†铧ꦉ귥蒚꣦蒚臣꺁觧ꪳ볯貀菣ꒂ菣벃菣趀볯꺁胩钁胣龁臣袁臣膀꣦蒚臣鲤蟥꺁臣膂臣鲤蟥꾏菨ꪁ觧ꪳ臣膀臩膀臣龁臣뮲駧ꒉ臣膀臩貁触鮜臣貂苣骤闦꺁闧ꪁ苣랂菣ꪃ苣ꮁ臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣꺼볯뚼苣뾽铧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꓦ몇雦閳臣꾁胣ꒂ菣鎃菣궃臣꺁苣ꆃ菣뢂菣낂迥뎁苣뎃菣鲃臣꺁苣ꆃ菣뢂菣낂迥릖臣릖돦膀臣ꢁ臣낁胣超雧蒵맧隌귥膀铧ꦉ駧覅苣ꆃ菣뢂菣낂볯ꊼ볯ꦼ볯膀ꏧ鞰藥뒳苣ꆃ菣뢂菣낂볯궼볯ꦼ볯膀菣뢂菣궃菣뺔蟥궖뇥꺒뷥袼볯ꖼ볯覼胣뮛귥閡뻥ꆏ胣뢼럧뎂菣钃菣벃苣궖뇥꺒뷥膀菣麃菣ꒂ菣벃苣뎃苣膀藥늹룦궖뇥꺒뷥膀郥躏苣ꆃ菣뢂菣낂胣놆苣ꆃ菣뢂菣낂胣趛藥趏냥ꒂ菣벃苣뎃苣膀鯨覅ꇩ꺾迩膀鯨覅裥邭雦꒱鋦놽苣ꆃ菣뢂菣낂胣뢠ꏧ鞰藥뒳苣ꆃ菣뢂菣낂胣뢼럧ꒂ菣벃苣뎃苣膀뛨뎟돦ꒂ菣벃苣뎃苣膀藥뎟鿩ꒂ菣벃苣뎃苣膀ꃧ뚩껥ꊂ菣뮂苣膀臣龁臣뾂苣颻臣込鿦늉볯ꒂ菣벃苣뎃苣貁뇦膂苣貂苣뮻蓦꺁諧膳苣馌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†觧骮臣辰駥颮苣馨髧ꢁ臣ꚁ菣ꒂ菣벃菣膀臣ꢁ臣낁胣鲤蟥ꒉ臣龁臣뮲駧ꒉ苣내菨薆臣螌臣醐臣讂臣ꢁ臣誁臣ꚁ鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂볯ꆼ볯銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣设臣ꪁ苣내菨薆꣦蒚臣꾁胣늀苣ꂁ뷯늼볯ꆼ菣궃苣莃苣뎃苣ꮁ臣蒁臣꺁ꃦ肱鳥隌胣뺁臣꾁飩뎮觥銂郥覜臣讂뷯늼볯ꆼ臣ꎀ뗧閁苣龁ꃦ肱鳥超裥袼볯겼볯覼苣馌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†諥袁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂볯ꆼ볯銂铧蒁臣膀臣ꢁ臣낁胣龔臣ꚁ臣讂该ꦉ臣誁臣讂듧麃臣龁臣蒵맧ꮁ닦芙觥銂胩钁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣龁臣袁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂볯ꆼ볯銂铧蒁臣颫뫥ꮁꗦꞀ臣隌귥芙돦ꒉ苣膀臩鞁臣貙듧麃苣몮若馁苣鎁臣貁臣趁苣芀菣뎃苣벃苣讻臣ꚁ닦芙觥ꮁ胩邵臣貂臣꺼볯뚼臣膀닦芙觥貁듧麃臣ꖅ苣膀듧麃蛥馨髧ꮁ裥钁臣讂臣銂迥붃臣馁苣ꆃ菣邃菣꺁胩躁苣莿臣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣骃苣궃菣覃臣膀臣ꢁ臣낁胣내菨銯듧膀铦蒰胦ꒂ苣뎃胣隌귥芙돦ꒉ臣龁臣隻臣뮲駧ꒉ臣袂臣ꪁ닦芙觥ꞁ臣ꎁ臣节觨蒁胣내菨銯듧뺁臣꾁듧麃꿦Ꞁ雨ꮁ臣내菨ꮁ臣ꎁ臣覜껥ꞁ臣誂뻥讂뷤ꢔ觥貁賦銁苣貂苣芀뻤ꮁ臣膀苣궂苣벃菣膀苣ꒂ菣ꮂ菣랂菣ꊼ胣낂菣龃苣뢂菣꒼胣궇賥ꢂ菣뢂苣ꂃ胣ꢂ菣膃菣膀菣ꒂ菣麃苣랂菣膀苣袃菣랂菣膀菣讃菣랂菣膀菣뎃苣ꪃ苣膃菣膀菣뎃菣ꦃ苣膃菣膀苣ꮃ菣膃菣膀菣궂苣ꮃ菣랂菣膀菣Ꚃ菣ꮃ菣랂菣膀苣銃菣궃苣랂苣뎃菣ꦃ苣趃苣ꪂ菣膀菣袃苣떂菣袃菣뎃胣龃菣ꦃ菣ꒂ苣뎃胣ꊂ苣膃菣麃苣랂菣꒼胣醼裢螃菣覃菣蚃苣袃苣蚃菣뎃胣낂菣뎂苣ꮃ菣뎂苣覃胣鞃菣ꮂ苣뎃胣蚃菣ꦃ苣ꒂ菣膀菣覃苣ꒂ菣膀菣궃菣ꦃ菣궃菣ꮃ胣鞃菣麃苣랂菣膀菣ꒂ苣뎃苣躃苣覃胣龁臣袁臣膀菣ꒂ苣뎃苣躃菣ꮃ볯ꢅ뷤貁迥ꞅ臣袂臣ꚁ鳦躘듧뢛臣蒵臣ꖅ苣覂苣讂뇧붛觧놨곧閼볯銼볯颼볯邼볯邼迥銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣ꦃ苣Ꞃ菣麃苣랂菣袼볯ꎼ裢醼볯隼볯膀臣릁臣貁迥ꞅ臣袂臣ꚁ鳦躘듧뢛臣蒵臣ꖅ苣覂苣讂뇧붛觧놨곧閼볯钼볯閼볯邼볯銼迥膀郥견볯貼볯颼볯貼볯馼볯랏胣誏臣貐곧閼볯颼볯隼볯閼볯閼迥銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣誏臣鎁苣覂臣ꊂ菣궃苣뺁臣꾁菣ꊃ菣낂臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣뺔냥Ꞁ苣ꪂ菣ꮁ臣膀菣Ꚃ듧袼臣ꢁ臣낁胣ꢃ苣ꂴ볯銼볯뺁臣꾁菣Ꚃ듧醼볯醼볯膀苣袃菣뎃菣Ꚃ菣颼볯膀菣뎃胣醃菣뢂苣ꂃ胣뮂苣Ꚃ菣膀苣ꪃ苣Ꚃ菣膀菣릂菣Ꞃ菣袃胣뎂菣ꮃ菣膀苣莃菣ꪃ苣ꂃ볯邼胣떂菣ꪃ苣ꂃ볯閼볯膀迥뎁菣ꦃ苣ꪂ苣ꂃ臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣隻臣뮲駧ꒉ臣꾁胣ꎻ골꺋諦ꒉ볯龁臣袁臣膀菣붂菣것苣뮂菣袃胣隼裢ꆃ菣ꮂ菣袃菣ꪃ菣膀볯銈菣ꪂ苣ꊂ菣뎃胣랂苣ꦃ菣뎃胣閼裢閃菣ꪂ菣Ꚃ菣랂菣膀菣ꮂ菣邃苣뎃볯膀苣ꮃ苣ꮃ賥ꒉ볯龁臣袁臣膀菣꾂菣것苣龃菣膀菣ꪂ菣醃胣꾂菣ꦃ菣隃苣ꮃ胣ꦃ苣Ꞃ菣麃苣랂菣袼볯ꎼ裢醼볯隼볯覼胣ꆃ菣閃苣ꦃ菣膀苣ꮃ菣릂菣뎃볯ꊼ볯꺼볯覼胣궃菣릂菣뎃볯ꎼ볯꺼볯覼胣떂苣꾂菣鮃苣閃苣龃菣膀菣릂菣閃苣뎃胣뢂菣궃菣麃菣讃菣벃菣膀苣袃菣鞃菣뺂菣랂菣膀菣ꒂ菣麃苣랂菣ꎼ胣誏臣랂苣銈苣꾂菣궃苣ꊂ菣뎃駧醇볯ꦼ볯覼볯꒼볯낼볯랂苣鞃菣膃菣覼胣ꊂ菣袃菣떂苣꾂菣뎃볯龁臣袁臣膀菣Ꚃ菣ꮃ菣랂菣袼믤趉臣肃苣躃菣ꒂ苣뎃볯誏臣覃苣붂菣鎃苣뎃볯膀諦龔觥袼臣ꢁ臣낁胣肃苣膃菣麃苣랂菣袼믤趉臣ꊂ苣膃菣麃苣랂菣覼胣隃菣ꪂ菣ꒂ苣뎃胣龃苣ꦃ菣ꒂ苣뎃胣誏臣ꊂ菣袃菣麃苣랂菣袼볯궼볯覼볯膀迥뎁鳦뢳裥芣飩뎮觥袼臣ꢁ臣낁胣鎃菣꾂菣릂菣뎃胣鎃菣隃菣릂菣뎃胣뾂苣붂菣ꮃ迥뎁菣ꒂ苣뎃苣躃苣覃볯貁賦銁苣貂苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣骃苣궃菣覃臣膀臣ꢁ臣낁胣꺨胣꺁鳦龩냥蚈귥膀蓧龩賥袐觧膀菣躃닧邭胣떅듧뺁臣꾁藩ꂴ鿥ꪳ胣趛藥ꦉ돨膀駧覅觧ꪳ볯龁臣袁臣膀菣龃菣벃菣覼胣龔觧몙藥ꦉ돨袼臣ꢁ臣낁胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂胣ꮃ苣閃苣ꪃ菣膀迥뎁苣꾂苣ꪃ菣覼胣隌귥몙藥ꦉ돨膀铦蒰胦ꦉ돨袼臣ꢁ臣낁胣醼볯ꚼ胣隼볯Ꞽ뷯膀볯醼뷯ꮼ뷯膀볯銼볯芽胣醼볯醼볯躽胣醼볯鎼볯膀볯鎼볯뢼뷯膀볯邼볯뒼뷯膀볯銼볯ꦼ胣鎼볯뎼胣醼볯ꎼ胣鎼볯膀臣龁臣馼볯趽볯莽볯龁臣袁臣膀臩蚃苣趃菣Ꚃ菣뢅ꇥ袼菣꾂菣膃苣ꂃ藩ꦡ볯뚼볯ꦼ볯膀볯莽볯钼裢覼臣鞁臣覼胣誏臣ꂀ뷥ꒉ볯龁臣袁臣膀蟩袼臣ꢁ臣낁胣醇菣躃닧邭볯膀苣覃菣讃苣ꂃ볯龁臣袁臣膀苣것菣袃臣龁볯蒽볯膀藩隌觩袼臣ꢁ臣낁胣薶룥膣胦뢅賥蒉볯뎼볯ꦼ볯覼胣颍뗧뚙藩隌觩誃菣銲귥袼볯ꦼ볯꺼뷯覼胣誏臣薶냥讞뛨뢸ꏧꞀ藩隌觩袼볯뎼볯ꦼ볯覼볯膀菣뎃苣뎃苣것菣袃觥袼臣ꢁ臣낁胣궼뷯銈볯낼볯낼볯膀ꇧ뢅菣ꪃ苣ꂃ胣ꢃ菣覃賥ꂀ뷥ꒉ볯ꒂ苣颃苣떂菣벃菣覼胣꺾냥鞰돦膀臣龁臣骃菣閃菣ꪂ菣궂듧覼臣袂臣ꪁꓦ몇觥ꞁ臣ꎁ臣节觨蒁胣鶁臣袂臣ꪁ藥ꚭ髧ꮁꓦ몇迥붃臣馨귨ꮁ臣膀臣ꢁ臣낁胣邙껥鞁臣蒁臣钼裢ꊂ苣袃苣龃菣銈볯馀裢ꒂ苣膃苣랂苣誃菣릂菣ꮃ菣뎃裢銼볯銼胢뢂苣ꮃ菣뎃藩鮼苣꾂菣뢂菣誏臣颪냥鎽볯龁臣袁臣膀苣꾂菣뢂菣誏臣ꊂ苣ꪃ苣뎃苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣벃菣覼볯閼裢袼볯馀裢ꊂ菣躃苣膃菣覼苣龃菣誃菣뾂菣뎃裢醼裢릂菣鮃菣뢅볯ꖼ볯ꆼ볯뎼볯鮼볯銈苣龃菣銈볯銈볯鎼裢鎃菣ꮃ苣ꮃ菣讃菣覼菣Ꞃ菣ꮃ볯誃菣뾂菣ꒂ菣覃裢鎼볯閼苣릂菣鮃菣벃菣鮼볯銈볯钼裢ꊂ菣ꪃ菣銈볯銈菣閃菣ꮃ볯麃菣ꒂ菣覃볯ꊂ菣袃菣讃菣ꊂ菣覃볯ꊼ볯꒼볯낼볯鮼菣ꪃ菣ꊂ菣袃苣ꢂ菣벃볯꾂菣ꪃ菣誏臣颪냥鎽볯龁臣袁臣膀苣麃菣뎃胣鞼裢ꊂ菣躃裢钼裢ꆃ菣ꮃ苣麃菣뎃볯ꆼ볯ꎼ胣꾂菣ꪃ菣醼볯邼볯膀迥뎁볯銈苣龃菣銈볯銈菣ꪃ菣ꮃ苣궃菣膃菣꾂菣ꪃ菣袼苣麃菣뎃볯閼볯覼볯鮼苣ꊂ菣뎃鿦首볯랂苣躃苣뎃볯钼胢貼볯銈苣ꊂ菣讃苣躃裢銼裢閃苣讃菣ꒂ菣覃菣ꮃ볯꒼볯낼볯覼볯閼胢閼胢銈苣隃菣ꊃ菣궃苣궃菣ꮃ裢릂菣鮃菣閃苣것苣뎃볯隃菣ꊃ菣궃苣궃菣ꮃ菣莃菣覼볯鞼裢뢂苣膃菣ꊂ菣躃裢鎼裢袼볯馀裢ꒂ苣膃苣랂苣誃菣閃苣讃菣覼裢钼裢ꆃ菣ꮃ苣麃菣뎃볯뢂苣膃菣뎃菣ꪃ苣龃菣骃菣뾂苣뮂菣벃菣鮼볯貼볯馀裢뢂苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣袃苣銃菣궃裢릂菣ꮃ菣뎃裢銼볯銼胢銈苣릂菣鮃菣뢅볯钼볯钼胢銈뷯覽苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣袃苣膃菣馃菣銈볯貼볯馀裢뢂苣ꮃ菣뎃藩鮼ꇥ隌볯銈볯뢂菣膃菣ꊂ菣躃볯銈菣閃苣것菣銈볯銈苣ꮃ菣讃菣袼볯꺼볯貼ꇥ隌菣뎃苣ꮃ볯鮼볯銈苣ꆃ菣ꮃ苣龃菣閃苣讃菣ꊂ苣閃苣讃菣銈볯馀裢ꒂ苣膃苣랂苣趃菣袃볯꒼볯ꊼ볯뒼볯覼볯ꢂ苣랂菣誏臣颪냥鎽볯龁臣袁臣膀苣ꪂ苣뎃迥뎁苣ꪂ苣뎃苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣벃菣覼볯ꢂ菣릂菣랂菣誏臣颪냥鎽볯龁臣袁臣膀苣ꪃ苣궃苣뎃볯誏臣ꢂ菣릂菣랂菣ꒂ苣膃苣랂苣趃菣袃볯鮼苣膃苣Ꚃ菣鮼菣ꮃ苣것苣ꒂ菣誏臣颪냥鎽볯龁臣袁臣膀볯銈苣ꮃ菣궂苣閃菣ꪂ菣뮂苣뎃볯ꚼ볯궼볯膀볯銈볯钼볯隼裢뢂苣궃菣袃菣ꊂ苣뎃裢銼裢馽뷯覼苣龃菣閃菣ꪂ菣뮂苣뎃볯꒼볯ꆼ볯覼胣銼胢貼볯馀裢뢂菣袃苣랂裢钼胢閼胢銈苣꾂菣궃裢隼裢ꮂ菣鲃苣랂菣ꮃ苣것苣ꒂ菣膀菣ꮃ苣것苣ꒂ菣膀菣ꮃ苣것苣ꒂ菣ꒂ苣膃苣랂苣趃菣袃胣뢼裢궃菣肃菣뎃볯銈볯誏臣銈볯覼裢ꒂ苣膃苣랂苣趃菣袃볯놼볯ꦼ볯ꎼ臣龁臣뢼볯ꦼ볯ꎼ볯膀迥뎁菣ꮃ苣것苣ꮂ菣뎃볯鮼볯銈볯銼裢뮼볯銈볯뮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢醼볯醼裢뢂菣膃菣鎼裢袼볯銈苣ꮃ菣鞃菣钃菣覼裢銼볯銈菣뎃苣뮼뷯붼苣뎃菣벃菣銈볯銈苣ꪃ菣뎃볯ꢂ菣ꪃ菣뎃볯銈볯銈볯钼裢袼苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣覼裢醼裢钃菣ꦃ苣讃菣붼裢醼裢랂苣궃菣뎃菣뎃裢醼裢ꒂ菣붼苣蚃菣ꮃ볯銈볯貼볯銈苣ꆃ菣ꮃ볯銈볯鎼裢릂菣鮃菣鞃菣钃菣覼裢醼볯銈菣뎃苣뮼뷯붼苣뎃菣ꪃ苣ꂃ냦뢅賥ꦉ胣薆ꇥ膀뷯貼뷯銈苣ꢂ菣ꮃ苣뾂菣ꊂ菣뎃볯醼볯醼볯袼볯늼볯钼볯覼苣뒼臣龁賥袐觧鮼볯銈苣궃菣銈볯銈볯銼裢뮼볯銈볯袼볯銈苣궃菣銈볯銈苣膃菣銈볯袼볯ꢼ볯銈菣뎃苣膃苣뺂菣ꮃ裢ꒂ菣螃菣覼苣膃菣螃菣붼裢銼裢袼苣閃苣讃菣ꊂ菣躃볯銈볯銈苣꾂菣骃菣蚃菣銈볯銈苣ꮃ볯ꢂ菣讃菣붼裢鎼裢ꢂ菣ꮃ臩ꦡ듧뢅菣뎃苣膃苣뺂菣Ꚃ菣袼볯늼볯钼볯覼볯麃菣ꮂ苣袃苣ꪃ菣뎃苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣벃菣鮼볯銈菣膃菣Ꚃ菣馃菣閃苣궃菣ꪂ菣붂苣것苣벃菣閃苣것苣뎃볯讃菣궃菣궃苣뎃볯醃菣궃苣讃菣뎃볯閃苣躃菣ꮃ菣莃菣鮼볯銈菣ꎂ苣ꢂ菣릂菣뎃볯辽裢閃苣ꮃ苣ꊂ菣螃菣覃볯钃菣뎃迥뎁ꫨ躰뷤袼臣ꢁ臣낁胣钃菣뎃胣ꪅ藩钃菣뎃胣誏臣릂苣랂菣ꒂ菣뢂菣醼裢钃菣뎃볯鮼藩뢅蟩邭菣莃菣鮼迥鲿胦것菣覃볯袼볯ꦼ볯ꆼ볯늼볯꺼볯蚕꣦覼菣ꪃ菣ꊂ菣袃菣莃菣鎼볯銈볯覼볯궃菣肃菣뎃迥뎁ꫨ躰뷤袼臣ꢁ臣낁胣隼裢ꮂ菣鲃苣랂裢뢼裢궃菣肃菣뎃볯늼볯뢼볯膀볯銈苣ꮃ菣궂苣궃菣肃菣뎃볯늼볯Ꞽ볯膀菣떂菣뎃菣벃菣龃菣ꊼꇥ隌苣ꮃ菣讃菣궃菣讃菣袼볯袽뷯蒽볯膀菣벃菣龃菣ꊼ胣궃菣肃菣뎃볯銼볯膀菣벃菣龃菣뢼苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣벃菣膀苣ꮃ菣궃菣肃菣뎃볯膀苣ꮃ菣궃菣肃菣뎃볯邼볯膀苣ꮃ菣궃菣肃菣뎃볯邼볯꺁ꇥ隌苣ꮃ菣讃菣颪냥鎽볯蚃苣떂苣것菣覃볯膀볯貼볯貼볯馀볯꺼胢蚃菣ꦃ菣膃菣銈볯銈苣ꮃ菣궂苣궃菣肃菣뎃볯뒼볯궼볯ꆼ볯蚃菣ꦃ菣膃菣궃菣肃菣뎃胣誏臣蚃菣ꦃ菣膃菣궃菣肃菣뎃苣붂菣ꪂ苣ꊂ菣벃菣袼볯늼볯뒼볯覼볯鮼菣鲃菣ꦃ菣뎃볯궃苣벃菣뢅볯蚃菣鎃苣ꂃ苣것菣袃ꫨ躰뷤鮼苣ꊂ菣뎃裢鎼볯ꎼ뷯鎼볯鮼苣ꊂ菣뎃裢閼볯ꎼ뷯閼볯鮼苣ꊂ菣뎃裢閼볯閼볯ꎼ뷯閼볯閼볯膀苣ꊂ菣뎃裢鞼볯ꎼ뷯鞼볯鮼볯늼볯鞼볯邼볯ꦼ볯꒼볯邼볯鮼苣것苣떂볯钼볯鮼菣鮃菣隃菣벃볯閃苣궃苣ꊂ菣뎃볯誏臣誃菣뾂菣랂苣讃菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣鲤蟥ꒉ臣膀듦Ꞁ賥꺁髩ꮁꓦ몇迥붃臣ꪁ苣鲤蟥꾏菨ꞁ臣ꪁ臣趉꟩鎽臣芁臣ꚁ苣꾉臣袼臣ꢁ臣낁胣趛藥몙铧Ꞁ菣袃菣뢂菣趛藥늉듧蚈귥讧꿧ꦉ볯龁臣袁臣膀菣袃菣뢂菣銈볯꾼볯ꦼ볯림†볯겼菣袃菣뢂菣銈苣것苣뎃苣ꪃ菣뎃볯颼볯膀臣龁臣蚃菣ꦃ苣뎃裢ꊼ볯꒼볯낼볯₹뒼볯늼裢뢼볯뺁臣꾁藩ꂴ臣뮴胦隌迥붃臣趛藥Ꞁ뷤ꢔ觥袼臣ꢁ臣낁胣낼볯꾼볯ꖼ볯뎼볯袼駧늌闥馨볯袼볯覽뷯ꖼ뷯₎궼뷯蒽뷯莽뷯貽볯覼볯芀藩ꂴ꣦颭臣龁뗧邈觧銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂苣뎃菣袃菣꺁苣莃苣ꒂ臣꾁胣떅듧邵郥超雧뢐鷧ꊂ菣뮂苣袼볯겼볯뎼볯覼胣超雧袲駩ꊂ菣뮂苣膀藥ꮖ鯨覅藩ꂴ藥ꮖ苣莃苣ꒂ볯ꖼ볯ꆼ볯膀铦蒰胦超雧ꊂ菣뮂苣袼볯ꦼ볯覼胣誏臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃꟨邞臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ뷤ꢔ戼㹲 꺼볯뚼臣醼믤誸臣隻臣뮲駧ꒉ胣袺飩ꒉ胣모雦ꒉ臣龁臣ꒂ菣벃苣뎃苣ꒉ臣떽铧鞁臣뾽铧閁苣ꚁ苣꾉臣芀胣ꢁ臣떽铧趀臣袂臣ꚁ胣鎁苣覂臣膀臩릖돦꾁鳦讖ꓧ꺁꿧늛蛥ꮁ臣讂臣貂臣节胣鲽铧ꒉ臣貐駦ꮁ諦躸臣貂臣醁苣낁臣覂臣蒁迥뎁볯뺁臣꾁룤銷臣膀臩馁苣龁苣ꮁꏨꒉ賥閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ馁苣蚁臣꾁蓦뎛臣貂臣蒁胣蒵裦ꦉ臣膀볯ꖻ룤꺁믤꺁触鮜臣뮲駧ꒉ臣龁臣뮌駧ꚇ뷧ꢁ郥芙臣膀臣貂臣袅ꯧꎁ臣膀臣龁臣鶁苣ꮁ뛧蒁臣閊룤馁苣鎁臣貁臣趁苣芀룤겈臣膀郥鲽铧ꒉ臣膀臣꺁뷤ꢔ觥ꮁ臣蒁臣몱껥閁苣龁铧辇臣誏臣込臣龁臣芙雩릂苣뢂菣벃菣ꞁ諦躸臣貂苣ꞁ臣趂臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀鳦讖ꓧ꾁胣龔뷤ꦈ铧릊軧銂铦蒖臣鞾苣膀臣꺁믤鶬苣躽臣鞁뻥讂迥뎁볯뺁臣꾁뿤ꎭ臣鞾苣膀軦蒳苣醊裥鞁뻥讂胣誏臣込臣龁臣鎽蛥ꞁ臣蚈룥銂뿤ꎭ臣鞾苣鲽铧ꒉ臣꺁뷤ꢔ臣꺁賥겖뗧邈觧膀뫤늘뗧邈觧膀꣨궖뗧邈觧뺁臣꾁苣ꆃ菣뢂菣낂뗧邈觧꺁胩钁苣薌郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 떽铧꾁賥겖ꏨꒉ臣ꊽ藦ꞁ臣뾽铧ꮁ臣蒁臣붥菩袐臣邏ꓧ閁苣鞾胣鞁臣貁臣ꚁ雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣貸蟩ꒉ臣龁臣薋뷤ꢁ룤銷臣꺁룤風臣骮뻧閁苣龁苣蚁臣떽铧銂郥肂賥겖뗧邈觧꾁鳦몙飦꺁臣覂臣讂藦颧苣ꢡ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣袂臣ꪁ뷤ꢔ臣讀胣꺁賥袐觧꾁胣ꖈ胣꺁賥겖ꏨꒉ臣龁臣蒵臣袐苣鮁臣뮌雨붣觥ꮁ臣蚠곦뺁臣꾁郥芙臣閊룤馁苣鎁臣貁臣趁苣芀룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀胥薀臣隌郥ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣뮌雨붣觥ꮁ臣貐駦ꮁ諦躸臣貂苣ꞁ臣趂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 떽铧ꞁ裥ꢔ臣貂苣뮲駧誸胣袺飩誸胣모雦誸臣龁臣ꒂ菣벃苣뎃苣誸듦Ꞁ臣芁苣鲽铧ꒉ臣颍룤꺁뗧邈觧ꞁ룤銷臣閊룤閁苣ꚁ苣꾉臣鞁胣뺁臣꾁闧ꪁ苣蒵裦ꦉ臣ꖈ胣ꮁ諦躸臣貂臣节觨蒁臣ꢁ臣閁苣ꮁ跥蚈臣蚐꟨閁苣讂臣芁苣蚁胣肸裨ꮁ胣떽铧ꞁ裥ꢔ臣貂苣鲽铧ꒉ臣鶁苣覂臣讀胣ꮁ裥ꢔ臣貂苣것菣ꮃ苣薶臣ꪁ臣것菣ꮃ臣ꦈ铧閁苣讂臣ꢁ臣袺菦閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣떽铧ꞁ裥ꢔ臣貂苣것菣ꮃ臣讀胣ꮁ裥ꢔ臣貂苣节臣袂苣节뷤蒁臣芁苣蚁胣肸껥붖뷥讅臣꾁胣떽铧꾁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣蚈觥閊雨袨铧ꮁ뻥ꎁ臣膀臣貂臣貂臣龁臣肸럧ꮁ諦躸臣貂臣节觨蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ諦겖戼㹲 겜駧躘臣膀鳦몙飦ꮁ뻥ꎁ臣꺼볯뚼苣鶁苣銂뿥膦臣馁苣뺯뇨ꮁ諦躸臣讂臣ꢁ苣ꮐ苣릖돦銂迦鮾臣讂胣薿ꛨꢁ臣貂苣ꎭꋧꪁ蟩꾁胣뺯뇨꺁꣧膀맥ꊽ迥뎁藥ꮺ諧讅胣뺖苦꺁蟩螗뫥膀觧骮臣蒵裦ꦉ胣鶁臣閊룤貵럨膀듦Ꞁ臣颧볥覭臣鲿臣ꚁ꿥ꆱ臣ꢁ臣覤賥馁苣ꞁ臣趂臣芀鳦몙飦ꮁ뿤讂뗧邈觧꾁胩뢸胣閊룤꺁껥鎘臣誏臣閊룤辇臣螝룤Ꞁ臣龁苣ꮁ跥趽觥ꊽ臣붣觥隌臣貂苣芀臣讁臣ꪁ臣覂胣겜駧躘臣蒵裦ꦉ臣肸韦鎽臣誂臣뾽铧꾁臥ꢅ臣뮌駧ꒈ雦꺁꿧늛蛥ꞁ룤뮲賥ꮁ苣ꎁ臣몱껥閁苣鞾苣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣ꞁ臣趂臣芀觧骮臣ꎂ胨ꮁ臣蒁臣꺁觧骮臣뮲駧誸臣릊黦膀뫤늘룤꺁諥鲞臣龁臣ꦁ뷥ꪁ苣ꆃ菣뢂菣낂铧辇菣馃菣꾁胣뮲駧閁苣讂雧薗迥뎁雧薗臣趇韧ꚺ볯ꆎ铧閁苣讂觧骮臣隌郥ꦉ臣뮴胦鮼苦薀臣뒹뷩膀뷤趇胣ꢅ뫨뚊藦膀胦ꖈ迥뎁ꏩ论볯ꆎ铧閁苣讂觧骮臣隌郥ꦉ臣閊룤꺁駦鎖胣閊룤꺁뗧꾷迥뎁軦蒳臣龀뫥鮼軦ꢔ臣貂苣릉껥꺁賥袐觧ꢁ뷤ꢔ臣ꚁ臣龁臣貐駦ꮁ뷤ꢔ臣貂苣겖觥骼臣覂臣ꮁ賥芙諦鎡臣ꢑ鿧꺁ꇩ벼臣ꂛ귥銂郥肂꣧薀臣ꂛ귥ꮁ럥뎏臣貂苣ꞁ臣趂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣겜駧躘臣芿苣蒵裦ꦉ臣膀볯ꖗ뷥龁苣뺯뇨꺁뷤趇뷥龁苣蒴볯躼볯邼볯醼뷯螽볯讽뷯鲀듧醼볯邼뷯螽볯讽뷯膀듧邼볯邼볯醼뷯螽볯讽뷯鲀듧邼볯邼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯邼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯閼뷯螽볯讽뷯膀듧邼볯邼볯醼뷯螽볯讽뷯鲀듧邼볯邼볯閼뷯螽볯讽뷯膀듧邼볯邼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯醼뷯螽볯讽뷯鲀듧閼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯邼뷯螽볯讽뷯膀듧邼볯閼뷯螽볯讽뷯鲀듧鎼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯醼뷯螽볯讽뷯鲀듧醼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯躼볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯邼뷯螽볯讽뷯膀臣龁臣蒴볯趽뷯込뷯螽胣蒴볯閼뷯螽볯讽뷯銂胩钁臣讂臣ꮁ跥蚈臣閊룤辇菣馃菣ꞁ룤ꖗ臣醼鯥ꖻ룤閊룤閁苣ꚁ胣肉鳦꺁닦芙諥鲞胣모雦릊黦膀뫤늘諥鲞臣龁臣ꒂ菣벃苣뎃苣릊黦銂뻥ꚁ苣꾉臣袼臣ꢁ臣낁胣ꢅ뷤貁迥ꞅ臣袂臣ꚁ鳦躘듧뢛臣蒵臣ꖅ苣覂苣讂鯥鮚藥讖闧랏볯꾼볯邼볯鎼볯鞼볯醼볯馼臣ꚁ꣨覼臣貂臣颍뷤ꢔ蟩꺁꿧늛苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀触鮜臣閊룤辇臣膀볯ꖗ볯麛胣醼韦銼鯥膀볯ꖗ볯麛胣銼韦ꮁ볯麛胣鎼韦ꮁ볯麛胣躯胩膀볯놀臣ꢁ臣膀볯놀臣ꢁ臣膀臣龁臣钼胩钁臣ꮁ胩钁臣貂臣节觨蒁胣芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣肉鳦꺁諦躸蟩꾁胣螤闦麛諦躸볯龁臣袁臣膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯邼胣醼볯膀볯銼胣醼볯뺁臣꾁볯钼鯥膀臣龁臣鶁苣ꖻ룤꺁諦躸볯銂铧蒁臣膀臩閁苣ꚁ苣꾉臣芀ꓨ낕鯥閊룤貁軦ꢔ臣貂苣뒠郥膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣꺁臣袂臣ꪁ裥늉諦겖꣨뮔臣뾽铧閁苣ꚁ苣꾉臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣袂苣낁胣꺼볯뚼臣蚈觥ꢔ蟩袨铧ꞁ諦躸臣貂臣节觨蒁胣겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣ꢁ臣膀胣蚈觥ꢔ蟩趀臣膀跥肸跥趽铧辇臣龁臣醼韦ꢅ뷤ꢔ蟩꺁볯麛믤誸臣ꢔ蟩뢁臣蚈觥膀臣ꢁ臣낁胣颍룤ꢔ蟩꺁볯麛믤誸臣閊룤뢁臣蚈觥ꞁ臣讂胣겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣ꢁ臣膀胣颍룤颍뷤ꢔ蟩趀臣醼鯥꺁铧辇볯醼鯥込跥肸뗧꾷볯ꖎ꟨꺁跥肸苧膀臣ꪁ苣ꆁ胣颍룤꺁諦躸뫤ꆱ臣ꚁꫨ膂苣貂臣뮲駧ꒉ臣ꢔ蟩ꞁ臣讂胣겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣ꢁ臣膀胣醼韦ꢅ뷤ꢔ蟩趀臣銼볯芙雩꺁鳦鎖臣誁臣ꚁ룤袁苣貂苣뺁臣꾁蟥릖臣貂苣辇臣芁苣芀臣貂臣颍룤颍뷤ꢔ蟩ꢁ臣ꚁ諦躸臣貂臣节觨蒁胣肸껥붖뷥讅臣꾁胣겜駧躘臣꺼볯뚼臣蚈觥ꢔ蟩ꞁ꿥ꆱ臣閊룤閁苣讂胣꺼볯뚼臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣ꦷꇨ늶臣뾁臣ꚁ臣龁臣붣觥ꮁ臣붣觥隌臣貂臣节觨蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†觥ꊽ戼㹲 겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂볯ꆼ볯뮌雨蒵裦ꦉ臣膀볩钅蛥붣觥膀냦ꆮ蛥붣觥膀臣龁臣ꢳ냥ꒉ볯设臣낁鷩袄蛥膀鳧薆胣鶡귥鎽蛥膀귧覂蛥膀뿥鎇蛥膀藨钅蛥膀髧许ꏨꒉ볯ꪁ臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣ꒉ뷥ꮁꏨꒉ賥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 늶뷤ꒉ뷥㲢牢ਾ†鷩貵迥閊룤ꢔ臣늶뷤ꒉ뷥ꮁ臣膀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣膀菣ꒂ苣궃苣麃菣뢂菣뎃胣뚺뛦膀蟦膿뛦膀苣궃菣鞃胣誏臣込臣龁臣ꢂ菣궂苣ꮃ臣ꦁ臣芁苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀뛦鎽觥ꊽ臣膀듦Ꞁ裦蚈臣뮁臣ꮁ胣鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ룤겈臣뾽铧閁苣讂룤뮴胦貸蟩ꒉ胣设臣낁駩骮臣ꪁ臣ꞁ胣뒰臣龁臣隻臣뚺ꫥ膀迥뚺賥ꒉ迥뎁매隌觥膀뻤袁臣ꢂ菣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀苣붂菣궃菣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀苣膃菣ꮂ菣鲃菣벃菣膀藩뢅苣膃菣膀菣뎃苣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀껥꾁ꛩ뢅菣뎃苣ꮃ胣鞃菣钃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볯貼볯銈菣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀苣ꆃ菣ꮃ菣ꮃ菣ꊂ菣覃胣릲볯릉臣뾶껥릲胣ꦃ菣ꮂ苣ꒂ닦膀菣Ꚃ菣궃苣랂닦膀菨붊닦膀苣ꪃ菣隃닦膀菣麃苣릲胣誏臣뒂菣릲볯膀苣ꪃ苣궃菣ꮃ胣蚃菣ꦃ菣覃菣閃菣閃菣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣誏臣붂菣鎃苣뎃臣芄苨뢅苣릂菣ꮃ胣ꪁ苣뎁臣鶁苣覂臣랷郥ꦉ苣ꮐ臣鞾苣芀鷩貵迥閊룤꺁臣讂觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀뗧邈觧銂胣ꎼ볯ꖼ볯꾼볯ꢼ볯늼볯뮙賩蚕꣦覼胣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣릲胣覤胦릲胣낂菣뎂菣ꮃ胣鶃菣붂菣馃菣袃胣랂苣궃菣궂苣袃菣뎃胣鶃菣麃菣膀迥뎁볯뺁臣꾁臣貂苣꺁뗧뾁郥辂臣ꪁ臣꺁迥뚺賥ꒉ臣랷郥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†돦蒰觥㲤牢ਾ†돦蒰迥붃ꫨ붣觧膀뻤袁臣薻迨ꢳ냥꾏菨뒰胦뢇뿦늶臣龁臣薻迨ꢳ냥꾏菨릲胦뢇뿦늶臣膀韦ꖟ臣肊ꇨꮁ뻥ꎁ臣붣觥隌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臩螈臣蚈闦ꒉ胣뾹뷦ꒉ胣誏臣込臣龁臣뢇뿦隌觥銂郥뾁뻥讂胣薻迨ꢳ냥꾏菨뾪ꏨꦉ臣膀鷩銯胦꺁鷩貵迥蒚臣놨껥閁苣讂룥袇觥誏臣込臣龁臣뚺ꫥ궸臣薻迨閁苣龁돦蒰迥붃臣뚺뛦膀蟦膿뛦膀迥뎁볯뺁臣꾁苣麃菣뢂菣뎃胣设臣낁볯貼볯銈菣뾂菣뢂苣벃菣궸臣뚺뛦ꞁ臣誂뻥讂胣뾽铧鞁뻥讂꣨릮臣貂苣銪뷤誏臣뚺ꫥꮁ臣膀냦膀菣뎃苣ꮃ뛦膀볯躼볯躼볯躼胣誏臣覭볥Ꞁꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣뚺뛦ꪁ臣貁臣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣薻迨몛껥릲臣뚺ꫥ뺁臣꾁蟦膿ꫥꢁ臣ꚁ뻤ꦈ臣뾽铧閁苣讂胣鎁臣꺛髧ꮁ臣膀郥邈菣躃苣ꪃ苣ꪃ菣뺁臣꾁郥邈苣낂菣뮂菣覃苣ꮐ苣뮻蓦꺁蓧몈뿦Ꞁ鯥骮닦銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ꪂ菣ꒂ菣뢅臣ꦁ臣芄苨뢅臣ꢳ냥ꒉ臣뾪ꏨꮁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†돦蒰迥붃ꏨꒉ臣膀뻤袁臣내迨鶿賦閃苣ꮃ苣ꞁ臣뺿臩ꮁ苣ꎁ臣膀迥뎁볯뺁臣꾁뷤ꢔ觥ꮁ믦貏냦뺁臣꾁믤꺁믦貏돦蒰迥붃ꫥ鎽臣뚺꟨馁苣讁裥ꎕ臣鮁苣鎁臣貁臣趁苣薻迨몛뷥蒵裦ꦉ臣ꊽ藦ꞁ믦貏觥銂뗧뾁뻨肂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣薻迨馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 뮴胦邈裥꺁諥鲞苣閼臣뚻臣馁臣膂臣膀髧许돦蒰臣龁臣训苨薆돦蒰臣覂臣뮴胦邈裥꺁郥躏苣鮸胩馁苣鎁臣貁鳦뺁臣蒁ꃥ袐臣芁苣芀臣貂臣膀냦뚺胦ꮁ매鞁臣邵駦Ꞁ鷦首臣龁臣ꆄ껥ꊽ鷦首臣늶뷤뢇뿦늶苣ꢔ臣ꚁ臩邈臣鞾苣芀臣꺁ꃥ袐胣꺼볯뚼臣뢐迥龀뫥꾁臣꺁뫦ꎧ胩ꚺ臣鶾귥鞁胣뚺꟨龀뫥꾁뗧뚙苣ꒂ苣誏臣邵駦ꊽ臣鶾귥鞁뻥讂胣芁苣蒁臣膀볯ꆼ볯銂닦Ꞁꫥ鎽臣뚺꟨뺁臣꾁蟦膿臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ苣膀鷩貵迥閊룤閁苣龁볯ꆼ볯꺁郥躏臩뚻苣钁裦鞁뻥讂胣ꢳ냥꾏菨螃菣벃觥ꊽ臣膀菣ꪃ菣꾂菣覃裢鶃菣낂菣뎂菣覃臣ꦁ臣龔裥ꎧ胦鶃菣麃菣궸臣꺼볯뚼臣麃苣꾂菣ꮂ菣뮂菣隌菣袃菣莃苣릂苣ꊽ裦閁臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뷤붣臣貂苣芀菣ꪃ菣벃臣뺯臣讂볯ꆼ볯꺁꿦螎迥뎁뷤ꢔ臣讂臣꺁觧骮菣ꪃ菣벃臣릉胦ꮁ뿥颁臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뺔蟥龀뫥銂裥ꆾ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣隻臣龔裥ꎧ胦鶃菣麃菣꺁뻤ꮁ臣膀菣ꪃ볯ꪂ菣袃苣릂菣ꮃ볯誏臣鶃菣袼蓧뒰觧覼臣ꦁ臣芁苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀菣鶃菣ꢳ냥꾏菨붣觥꾁胣鎽뗧钹臣ꦁ郥馁苣ꪃ菣붂菣ꂃ臣龁臣麃苣꾂菣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣궸臣꺼볯뚼苣膰藥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苨㲺牢ਾ†苨膀臩ꮁ鳦ꢔ臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂ꏨꒉ臣뮌雨蒵裦ꦉ臣뮼藨薆胩钁臣节뷤ꢔ臣鞾苣芀볩钅蛥閊룤ꮁ臩鞁臣节臣肸臣꺁ꏨꒉ臣膀듦Ꞁ裦蚈苣ꮐ臣膀듧邼볯銼볎뷯讁苣閼볯邼볎뷯뺁臣꺁맥螝닧邭苣覜臣讂닧ꮜ臣芁苣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣붣觥꾁胣薗雨銂郥閼臣讂雦閳臣膀臣ꪁ苣ꆁ볩꺁뿨辁臣鶿賦鞁臣覲鳦꺁껥ꢙ臣覂볩鎁苣骀臣ꚁ胦龀臣뢐볥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣閊룤閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 貵볩閊룤ꮁ臩鞁臣붣觥꾁胣设臣낁룤꾁볯躼볯薼볯鞽볯鞽볯讁苣誸臣醼볯邼볯袼뷯込뷯覼臣ꞁ臣뮴胦邈裥銂郥뾁뻥讂胣뺁臣膀뗧뮼諦躸臣ꦁ臣龁ꏨꒉ臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣붿諥邈裥꺁볯ꒁ臣龁臣螤闦銂郥뾁뻥讂胣뮌雨蒵裦ꦉ臣膀迥钅닧鲆諦躸臣ꦁ臣龁ꏨꒉ臣鞁臣뾪ꏨ鞁胣薌ꏨ鞁胣讁臣込臣龁臣ꦲꏥ鞁臣节苣蒁胣鶁臣袂臣ꪁꏨꒉ臣膀뻤袁臣鎾鷦꺁雦閳苣ꢔ臣ꚁ뷤붣臣貂臣ꂌ觥誏臣込臣龁臣ꎏ룤ꂌ臣ꊽ藦ꮁ臣ꎁ臣袂臣膀뻤袁臣蒴볯躼볯薼胣銼볯薼볯鞽볯鞽볯꺁듦Ꞁ裦蚈苣ꮐ鳦鞁뻥讂胣鎁臣뒠郥膀껦誂臣膀迥钅臣뚺꟨꾏菨ꪁ迥뎁볯뺁臣꾁裥ꎧ迥붃臣蒵裦ꦉ胣ꪁ苣뎁臣뮻蓦ꞁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뿨ꂊ裦蚈臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕苣ꮐ臣鞾苣芀臣讂臣꾁胣ꎏ藨颲蛨閊룤ꮁ臩鞁臣붣觥꾁胣뮴胦邈裥銂郥肂닧ꮜ臣覂臣ꮁ볯뺁臣꾁苣ꊂ菣뺂菣隌迥뎁볯节臣辁臣Ꞝ賥뚺뛦誏臣込臣龁臣뢇뿦늶苣ꮐ臣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣覲鳦隌胣ꢂ苣궃苣ꮃ賥膀迥뎁볯뺁臣꾁苣ꊂ菣뺂菣隌ꏨꒉ臣膀裥ꎕ臣鮁苣ꢁ胣蒴볯躼볯躽뷯讁苣蒴볯邼볯躽뷯뺁臣꺁꿧늛臣뎹鷥銲뻥誏臣込臣龁臣늶믦蒾苣覜臣鞾苣芀臣龁胣鶁臣袂臣ꪁꏨꒉ臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣뮻蓦꺁뿨ꂊ裦蚈臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕苣閁苣ꮁ郥뾁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†賥겖鏥꺁ꏨꒉ迥뎁볯뺁臣꾁ꏨꂀ臣ꊖ臣讂룤겈ꯨ꾁胣设臣낁볯薽뷯覽뷯螽뷯辽뷯骼볯袽뷯₅뎼뷯覽뷯躽뷯薽†뷯躽뷯₄낼뷯膽뷯钽뷯莽뷯₅辽뷯₆낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯ₙ銼볯鎽뷯ₔ薽뷯躼볯겼뷯邽뷯覽뷯莽뷯钽뷯ₔ랼뷯貽뷯覽뷯趽뷯ₓ蚼†볯覽뷯讽뷯躽뷯貼볯邼볯閼볯芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂볯ꮁꛨ蒁臣鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†苣벃菣ꎂ菣낂臣龁臣랂苣ꮃ戼㹲 뎂菣蚃苣뎃苣誏臣랂苣ꮃ胣设臣낁藨뚺苣벃菣ꎂ菣낂迥뎁賥겖ꏨꒉ裥躇臣誁臣ꚁ釥ꖟ臣隻臣뎂菣蚃苣뎃苣銂賦ꒁ賩ꒉ胣隳ꇨꂌ胣ꮂ菣뮂菣ꒉ胣뢸觥膀迥뎁ꇩ銲觥꺁鯥鎽觥ꊽ苣뾪ꏨ馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣貂苣꾁믤辄臣뎹駧ꒉ苣ꮐ苣ꞁ苣袂臣膀藨ꆮ臣芁苣릉껥꺁菩蚈臣꺁臣膀臣龁臣뢅껧꺁룤骮菩蚈臣ꪄ藥蒚臣膀믤辄臣薁믥鞁臣膀듦Ꞁ裦蚈苣뺔蟥馁苣蒵裦銂賦ꒁ臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뾽铧馁苣鎁臣貁臣趁苣薌鿥蒵裦ꦉ臣设臣꾁胣鶃菣麃菣ꦉ돨誏臣궃苣貁郥뺁苣讂胣麡볤馁苣뾂苣鞃臣몛뷥蒵裦ꦉ臣膀菣꾂菣벃苣뺁臣꾁매隳迥뎁ꯩ蚈귥辇菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣ꪁ臣꺁돨ꊽ觥銂뷤ꎁ臣龻迥뎁ꇧ薅ꇥ벂菣膃菣ꮂ菣뮂菣ꒉ臣誁臣ꚁ胣薅ꇥ邝臣鞁臣节뷤ꢔ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 螤闦麛諦躸迥뎁迥ꦾ諦躸戼㹲 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣겜駧躘臣꺼볯뚼賥袐觧誏臣込臣龁臣蒵裦ꦉ臣膀볯麛믤誸諦躸臣貂뻥讂볯겜飦내鯦ꞁ臣貀ꓨ낕鯥閊룤趀臣蒁臣覼胣鶁臣袂臣ꪁ諦躸臣貐臣讧裦膦듧銂郥鎂臣节苣蒁臣膀믤趉臣閊룤ꮁ臣ꮐ臣貂臣蒁臣讁臣龁꟦邈ꛨꂴ苣ꮐ苣ꞁ苣袂臣芀臣꺁苣蚁臣閊룤꾁胣ꖻ觥꺁諦躸臣钯볨鞁臣膀郥뺁苣讂꟦邈ꛨꂴ臣ꪳ蟩誏臣込臣龁臣鎽ꧧ貁郥颁臣芁臣ꚁ苣袂臣鞁胣ꮐ臣貂苣讧裦膦듧꺁돨辇迥뎁볯뺁臣꾁뷤趩臣낕臣ꎁ臣节苣蒁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣螤闦麛諦躸臣趏뻥閊룤銂郥뾁뻥讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀迥ꦾ諦躸胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀껥ꪳ髧ꮁ郥颁돨辇迥뎁볯뺁臣꾁뷤趩臣躸臣覂苣讂껥ꪳ髧ꮁ郥颁꟦邈ꛨꂴ苣ꮐ苣膀胩骶臣ꚁ諦躸臣貂苣膀臣龁臣芁苣趏뻥閊룤것苣ꆃ菣薆臣閊룤閁苣讂胣銼鯥ꖻ룤꺁諦躸苣螌臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣뺯뇨꾁迥ꦾ諦躸뿥钭苣袑臣鞾苣芀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣趏뻥閊룤鲿귧趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣芁苣趏뻥閊룤것苣ꆃ菣薆臣閊룤閁苣讂믤꺁룤閊룤ꢁ臣낕臣讂胣肸迥ꦾ諦躸臣뺯臣讂꿥ꆱ臣誁臣讂뿥钭苣螌臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀臣꺁苣蚁臣鲿귧꾁胣꺼볯뚼苣ꮐ苣趏뻥閊룤ꮁ뿥钭臣ꚁ뗨鎁苣뾂菣醃苣ꪳ臣몙迧ꞁ臣誂뻥讂胣鶁臣袂臣ꪁ껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣膀臣讂迥ꦾ諦躸菣뢂菣뎃蛥ꞁ諦躸臣貂苣ꖈ臣肸諦躸臣钯볨鞁臣誸飦鞁臣蒁苣뒠郥节臣讂臣膀臣讂迥ꦾ諦躸菣뢂菣뎃蛥ꞁ諦躸臣貂苣ꖈ臣肸諦躸臣钯볨鞁臣躽룦鞁臣蒁苣뒠郥节臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣覤賥꾁胣蒴볯薼臣覂듧銼볯薼臣ꞁ胣蒴볯薼臣覂듧閼볯薼臣ꞁ胣蒴볯邼볯讁苣蒴볯邼볯뺁臣膀듧銼볯薼臣覂듧鞼볯薼臣ꞁ胣蒴볯邼볯讁苣蒴볯邼볯薼臣ꞁ胣誏臣込臣龁臣醰臣辁臣节볯邼볯薼臣芁苣鞾苣芀諦躸臣貂臣늼볯ꆼ臣覂뿧뎨臣貂苣뾂菣醃苣ꪳ臣것菣ꮃ臣鶁臣趏뻥閊룤것苣ꆃ菣薆臣ꖈ臣肸諦躸臣钯볨鞁臣钼볯薼苣薶臣ꚁ뷤鮸臣讂ꃥ袐臣膀迥ꦾ諦躸菣뢂菣뎃臣肸菩ꢁ臣ꚁ諦躸臣貂臣趽볯꺼볯꺁駧뺏臣躽룦銂胣겜飦내鯦ꞁ臣貀迥ꦾ諦躸胨Ꞁ胣ꢁ臣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†賥겖뗧邈觧꺁觧Ꞁ戼㹲 겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂볯ꆼ볯뮌雨蒵裦ꦉ臣膀믤许臣릉胦꺁볯ꒁ臣龁臣鶁苣ꖻ룤ꮁ苣ꎁ臣릉뻥ꖁ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣㲣牢ਾ†鳦꺼볯뚼臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣膀臩ꒉ臣놅臣蒵裦ꦉ臣붣觥隌臣貂臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣膀臩ꒉ苣ꂬ臣蒵裦ꦉ臣钯볨鞁臣膀菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣꺁ꋥꂊ苣袑臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣몓매開觧ꮁ諦躸臣貂臣肉룤꺁볯ꆼ볯辇臣ꢅ뫨ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣銂賦馁胣邃苣ꪂ苣馃苣ꦃ菣ꪃ菣ꎂ臣膀鏥뎹该ꦉ臣隌郥ꦉ苣閊룤鞁臣貾臣膀臣꺁賥袐觧꺁鳦覤賥讞臣늛럧许鷩趩볯ꆼ볯ꎼ볯뺁臣꾁鳦Ꞥꇨ薸룤莿뫥节臣辁臣肜ꓥ股볦궸뿦ꚺ볯ꎼ뷯膽뷯覼苣겸껥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣閩뻤馁苣鎁臣貁臣趁苣芀볯떼볯꾁胣ꪨ뫥馨볯뢼믨覼雦醐臣芙雩ꮁ꿥鞁臣ꚸ뫥馨볯림믨覼雦醐臣隌郥ꦉ臣股룦궸뿦ꚺ臣龁臣股볦궸뿦ꚺ苣鞃菣莃菣鞁臣늛럧许臣ꊝꧧ꺁뇦骮臣芁苣芀룤겈臣膀觧骮賥袐觧ꮁ雩馁苣ꆼ볯ꎼ臣膀뷥궥胨ꮁ鿧覂苣ꚁ臣讂雦閳苣ꢔ臣ꚁ胣芏藧ꮁ苣誂藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂볯躼볯躼볯膽뷯讽뷯銽볯궼뷯蒽뷯銽뷯₎낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯閽뷯覽뷯鎽볯꒼뷯閽뷯鎽†뷯躽뷯₄钽뷯薽†볯袽뷯銽뷯膽뷯薽뷯钽뷯莽뷯貽†볯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯隽볯鞼볯貼볯膽뷯莽뷯貽†볯薽뷯讽뷯銽볯꺼뷯鞽†볯辽뷯讽볯ꦼ뷯莽볯貼볯馼볯隼臣낿臣覂苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀껧몇臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯趽뷯颽胥꾁胣몓매開觧뢁臣隌郥ꦉ臣閊룤貾臣膀觥風鏥뎹该ꦉ臣股룦궸臣龁臣股볦궸臣钁裦閁苣讂觥風賥袐觧꺁鳦Ꞥ뿦ꚺ臣芁苣芀觧骮賥袐觧꺁볯趽뷯颽胥꾁胣鎽ꗦ薀臣ꖟ苣貂臣蒁苣릖돦銂铧蒁臣겸껥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣邃苣ꪂ苣馃苣ꦃ菣ꪃ菣ꎂ苣鞢諥閁臣讂胣뺁臣꾁胣겖觧開藦銂铦꾉臣讂胣ꢁ臣蚁ꇨ뺏臣膀臣讂鏥뎹该ꦉ臣誁臣ꚁ볯떼볯膀볯趽뷯颽胣뺁臣꾁볯趽뷯躽臣鞁臣겸껥閁苣讂곧醼볯ꆼ볯꺁藥ꮺ苣馃苣ꦃ菣ꪃ菣ꎂ臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣膀臩ꒉ臣놅諦躸臣貂臣뒠郥ꮁ胣鶁臣袂臣ꪁ藥閊룤銂ꇨ辂臣蒁ꃥ袐苣誂苣Ꞥ臣蒁臣ꢁ苣辄釥馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀볯ꆼ볯꺁菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣꾁胣醰臣辁臣节듧銼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯薼胣醰臣辁臣节듧醼볯薼胣醰臣辁臣节듧醼볯薼胣醰臣辁臣节듧銼볯薼胣醰臣辁臣节듧銼볯薼胣醰臣辁臣节듧鎼볯薼胣醰臣辁臣节듧鎼볯薼胣醰臣辁臣节듧钼볯薼胣醰臣辁臣节듧钼볯薼胣醰臣辁臣节듧閼볯薼胣醰臣辁臣节듧閼볯薼胣醰臣辁臣节듧隼볯薼胣醰臣辁臣节듧隼볯薼胣醰臣辁臣节듧鞼볯薼胣醰臣辁臣节듧鞼볯薼胣醰臣辁臣节듧颼볯薼胣醰臣辁臣节듧颼볯薼胣醰臣辁臣节듧馼볯薼胣醰臣辁臣节듧馼볯薼胣뺁臣꾁듧醼볯邼볯鞢諥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀볯ꆼ볯꺁뛦鎽ꏨꒉ臣閁臣隁臣ꪁ苣뎃菣鲃跥鮸鳦銂鳦鞁뻥膀닦芙諥鲞苣龔苣ꮁ臣ꢔ蟩꺁ꫨ뒕臣薿ꛨꮁ臣讂胣鎁苣ꮁ꿥ꚇ臣讂臣膂臣膀鳦몙飦꺁臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀迥ꦾ諦躸룤꺁菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣誏臣込臣龁臣뮲駧릊黦貁铦꾉臣貂苣袂臣ꮁ胣꺼볯뚼ꏨꒉ苣궨꣨鞁뻥讂胣鶁臣袂臣ꪁꏨꒉ臣膀볯ꆼ볯꺁뻥뺔苣꾏菨ꮁ臣膀臣ꒁ볯뺁臣꾁菣꾂菣ꊂ菣벂臣袂苣꺼볯뚼裥ꎧ胩ꚺ苣躽룦鞁뻥讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣꺼볯뚼胣뒰럦貒胦릲胦螃菣벃胣貕鷩뮴胦ꒉ迥뎁볯뺁臣꾁藥뚺ꫥ銂郥肂蟦膿ꏨꒉ臣邏뻤閁苣讂胣릲臣貕鷩뮴胦ꒉ臣銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣膀볯ꆼ볯銂郥肂蟦膿ꏨꒉ臣꾏菨ꮁ臣誂뻥讂胣뒰룤랷鋥Ꞁ菣鶃菣ꮁ藥貂臣꺼볯뚼臣膀臩꾁胣鶁臣螃菣벃臣覂釥늛臣龔郧ꚭ髧낒ꋥ뢁臣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁뻥뺔臣袂臣ꚁ菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣銂铦꾉臣讂臣膂臣膀臣ꒁ볯뺁臣꾁菣꾂菣ꊂ菣벂臣袂苣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈꟨銂飩ꊭ臣讂臣膂臣膀뷤ꢔ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣貺뻤ꮂ菣ꪂ菣ꢁ룤ꆾ苣膃苣뎃臣蒵臣袐苣鮁苣ꮐ苣ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ菣躃닧邭苣꺼볯뚼臣놅臣붣觥隌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ菣躃닧邭臣肉룤꺁鳦鎖볯设臣낁闦芙雩膀闦ꖗ臣ꦁ볯ꮁ苣龁臣ꚁ蟨몙髧ꮁ뫦늶苣ꊽ裦鞁뻥讂胣鶁臣袂臣ꪁ菣躃닧邭臣膀뫤ꆾ苣膃苣뎃臣醁臣颭鳥许臣龁臣肸뻤ꮂ菣ꪂ菣ꂁ臣꺁귥ꢜ룤ꞁ臣ꊽ裦閁苣ꪁ臣芀苣膃苣뎃胦誃菣銲귥ꮁ藥貂臣膀臣龁臣ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ菣躃닧邭苣ꮐ苣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣螃菣벃臣ꖅ苣ꚁ胣꺼볯뚼苣膀臩馁苣ꢁ胣膌諥Ꞁ菣鶃菣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀迥뎁볯뺁臣꾁菣꾂菣ꊂ菣벂臣袂苣蚈꟨꺁胩ꚺ苣躽룦馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣꺼볯뚼菣ꒂ苣ꊂ菣ꒂ菣鎃菣蚃苣貁铦꾉臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†닦芙苣ꒂ菣覃苣㲦牢ਾ†볯ꆼ볯꾁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂胩钁觥ꢁ藥ꮁ뗧邈觧ꮁꏨꒉ賥馁苣ꢁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂胩钁觥銂곦辁諦躸臣貂臣꺼볯뚼뗧邈觧꺁닦芙苣ꒂ菣覃苣ꢁ꿦莼臣ꚁ胣閊룤閁苣龁볯ꆼ볯蒵裦ꦉ臣뮲駧Ꚃ苣뎃菣Ꚃ臣鞢諥銂釥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀鳦躘듧뢛臣蒁臣貀닦芙苣ꒂ菣覃苣趀臣꾁胣뮲駧릊黦銂볥趁蟥馁迥붃胦貁ꯩ蒁胣股볦궸뿦ꚺ臣蒯鯥뺁臣꾁뷤ꢔ菩趽臣誁臣讂닦芙듦Ꞁ觧ꪳ臣것菣ꮃ臣蒯鯥銂賦馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣꺼볯뚼臣뮲駧Ꚃ苣뎃菣Ꚃ臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁胩钁觥ꢁ藥閊룤馁苣낁胣醰臣辁臣节듧銼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯薼胣醰臣辁臣节듧醼볯薼胣醰臣辁臣节듧醼볯薼胣醰臣辁臣节듧銼볯薼胣醰臣辁臣节듧銼볯薼胣醰臣辁臣节듧鎼볯薼胣醰臣辁臣节듧鎼볯薼胣醰臣辁臣节듧钼볯薼胣醰臣辁臣节듧钼볯薼胣醰臣辁臣节듧閼볯薼胣醰臣辁臣节듧閼볯薼胣醰臣辁臣节듧隼볯薼胣醰臣辁臣节듧隼볯薼胣醰臣辁臣节듧鞼볯薼胣醰臣辁臣节듧鞼볯薼胣醰臣辁臣节듧颼볯薼胣醰臣辁臣节듧颼볯薼胣醰臣辁臣节듧馼볯薼胣醰臣辁臣节듧馼볯薼胣뺁臣꾁듧醼볯邼볯鞢諥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†裥莸껥趩戼㹲 꺼볯뚼臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁胩钁觥ꢁ藥ꮁ뗧邈觧ꮁꏨꒉ賥馁苣ꢁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣膀臩ꒉ苣ꂬ臣蒵裦ꦉ臣꺁꿥钯臣膀铦꾉臣貂臣蚈룥릮ꧧ袼볯蒽뷯鎽뷯覼胣设臣낁뷤鮸臣龁裥莸껥趩臣龁臣꺛꣦꺁裥莸껥趩苣袑臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣蚈룥릮ꧧ袼볯蒽뷯鎽뷯覼臣膀뷤薆臣겖觧꺁蟩銂ꇨ궸臣龁臣股볦궸臣겖觧꺁뿦ꚺ臣ꊖ胩ꖁ臣讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀裥莸껥趩胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀뷤薆臣겖觧꺁럧辇苣股뛦궸臣龁臣股볦궸臣貐臣莿뫥ꞁ郥覜臣讂臣ꮁ뿥膦臣ꪁ苣늶蟩銂賦馁胣馁臣辂臣뚼뷯覽뷯钽臣袼뷤薆臣겖觧꺁蟩覼볯袼ꇨ궸臣龁臣股볦궸臣겖觧꺁뿦ꚺ볯ꮁ귧鞁臣芀뻤袁臣膀铧辇臣醼볯趽뷯讁臣股볦궸뿦ꚺ臣醼볯趽뷯込볯ꞁ臣讂ꃥ袐胣蚈룥릮ꧧ꾁볯ꪃ菣袃菣ꢁ臣蚁臣ꢁ臣ꪁ苣芀裥莸껥趩臣겖觧貁ꇨꆮꓥ蒵맧궸臣颭鳥馁苣讨뫥銂迥ꂘ臣ꚁ臣讂胣Ꞥ臣ꪁ裥莸껥趩臣膀臣讂賥袐觧貁ꇨ뾼苣뎃菣꾂돨邵郥袂苣节뗧钹꟦邈ꛨꂴ臣邵郥鞁臣ꆁ臣芁苣鎁臣銂迥ꂘ臣ꚁ臣讂胣ꢇ뫥꺁迧뒠臣꾁胣芁苣骮룥뚊藦莿뫥銂臩邈臣讂臣膂臣鶈鯥ꂲ跨辇苣몱껥馁苣龁苣ꮁ볯蒽뷯鎽뷯銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣꺼볯뚼臣蚈룥릮ꧧ꾁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣膀臩ꒉ臣놅諦躸臣讂臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯薼胣醰臣辁臣节듧閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯鮸냥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†铧ꦉ귥蒚諥鲞戼㹲 肸껥붖뷥讅臣꾁胣開觧ꮁ臣醁苣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏苣蚈黦馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀臣꺁该ꦉ臣膀臩閁苣龁볯ꆼ볯꺁铧ꦉ귥蒚諥鲞苣ꮂ菣뒂菣벃賥鞁뻥讂胣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣膀鳦몙飦꺁볯ꆼ볯銂諦躸臣龁鏥뎹该ꦉ臣覂迥蚛臣龁铧ꦉꧨ首臣蚈黦讁苣몱껥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†돨辇裥邞臣袂苣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁ꓦ몇戼㹲 ꪳ蟩蚈黦袼볯뎼볯꾁胣蚈귥銂苣ꪂ菣ꮁ믨隌臣龁뻥ꮁ臣꺁裥邭臣ꊖ臣讂꟦ꂀ菦놠迥뎁裥邭蟩込뿦ꚺ菦놠苣躸臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂裥邞諦閳臣芁苣芀裥邭臣뺁臣膀苣ꪂ菣隌臣貂苣鎁臣ꞁ胣ꎭ鯩랍臣龁臣ꂲ鯩랍苣늍뻥鞁胣ꆬ臣ꪳ蟩蚈黦薣뷧銂胩ꎁ臣趉胩鞁胣鶁臣ꪳ蟩込鯩랍볯趽볯骽볯钯臣鎾臣ꚁꓦ몇駥꺁闧ꪁ苣颠鿥ꮁ裥钁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†돨辇裥邞臣膀裥뮔臣貂臣ꚩ雦銂苣ꪂ菣隌臣ꚁ臣覂臣讂裥邞铧ꮁ跨뮛裥邭苣鲽苣몇臣龁苣꺁苣ꪂ菣邺苣ꮐ苣ꪳ蟩蚈黦袨苣ꢔ臣ꚁꇨ辂苣讂胣设臣낁ꧨ首臣ꒂ苣뎃賥꾁胣ꢂ菣꾂菣궃苣鞃菣벃苣ꪂ菣隌돦袼볯뎼볯覼胣Ꞥ냦Ꞝ賥ꚭ苣ꪂ菣隌돦袼볯낼볯ꦼ볯膀藥ꒂ苣뎃賥閳胣뮛귥ꒂ苣뎃賥閳胣颫胩龎귥鶡鋦袼볯ꆼ볯覼볯늶뷤貺곦ꒂ苣뎃賥閳볯겼볯ꦼ볯뎼볯膀菣袃菣莃苣릂铦뒏菣벃苣벃蓨ꊛ苣ꪂ菣隌돦袼볯ꆼ볯꒼볯覼胣뮛꟨ꒂ苣뎃賥閳胣뮛꟨놄鯩閳胣떂菣ꊃ苣鞃菣벃볯鞃菣몂菣릂菣것菣ꒂ苣뎃賥閳胣誏臣銲귥鎃菣ꂃ苣ꪂ菣隌돦ꮁ苣ꎁ臣財臣鞾苣芀룦骮臣袂臣ꢁ臣讂裥邞觧膀ꧨ首臣뾂苣鞃胣鲤蟥ꢙ臣뾂苣鞃胣鶃苣蚃苣隃菣벃菣讁菣겂菣ꎂ菣ꊃ菣覃臣꺁臩麊臣몟臣蒁臣ꒂ苣뎃賥릖돦꺁臩麊苨銂뇦骮臣趁苣鎁臣꾁胣鎽ꗦ薀臣꾁郧ꎧ臣貂苣ꞁ臣趂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦貁苣ꪂ菣隌臣貂臣覂胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣龔裦鞁臣ꎭ跨뮛苣ꪂ菣뺁臣꾁단랍鯩ꒂ苣뎃苣蚈黦馁苣鎁臣ꞁ胣ꪳ蟩뺯鯩랍꿦袼臣ꪁ苣ꆁ뷯込뷯覼苣몱껥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀돨辇꿥뮛跨钯苣몱껥馁苣꺁臣ꦁ臣龁돨辇裥邞ꏨ꺽臣꾁胣鮛蟩떥裥邞ꏨ꺽胣ꒂ苣뎃菣ꦃ菣鞃裥邞ꏨ꺽胣誏臣鮣ꇨ芙雩讞裥邞ꏨ꺽臣芁苣芀苣ꪂ菣꾁闦꺨ꇩ꺁ꓦ몇菣벃菣銂铧蒁臣鲤蟥鞁뻥讂胣设臣낁胣뢁諦鞁臣ꒂ苣뎃苣鲤蟥馁苣讁볯馁臣辂臣뢁諦ꒂ苣뎃菣讃苣ꪃ菣낂菣벃菣袼볯ꦼ볯覼볯膀臣讂臣꾁胣릂苣ꎃ菣ꊃ菣覃胣设臣낁ꓥ趇迥鲿菣讃苣ꪃ菣낂볯궼볯궼볯뺁臣꾁臩麊迥鲿菣讃苣ꪃ菣낂볯뎼볯궼볯銂铧蒁臣膀苣ꪂ菣銂ꓦ몇臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 骃菣膃菣馨鏥꺁껥骮郥趽뷤馨귨貸蟩閳臣ꎀ该閁臣龁뛦鎽苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ裢骤蟩趏뿥ꊃ菣뾂菣뎃苣袼볯ꎼ裢궼볯込볯늼볯覼臣膀諥鲞髧ꪁ苣뎃菣꾂돨鲤꣨릖돦ꞁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣蒁苣袼뻤袁臣ꮼ뷯鎽뷯覽뷯袽뷯膽뷯₎薽뷯ₔ膽뷯躼볯궼뷯貽†볯薽뷯貽†볯銽뷯钽뷯辽뷯覽뷯鎽†볯邼볯馼†볯骼볯鎼볯馼裢銼볯钼볯鮼볯閽뷯躽†뷯钽†뷯貽볯貼볯貽뷯躽†볯袽뷯趽†볯邼볯馼†볯閼볯醼볯邼볯銈볯醼볯鞼볯겼뷯邽뷯骽†뷯钽†뷯貽볯貼볯貽뷯躽†볯袽뷯趽†볯邼볯邼†볯隼볯銼볯醼裢銼볯邼볯鎁苣覂臣螖賧꾁臣貂臣貂迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣覼胣邃苣ꪂ菣벃苣벃駧讦ꃧ뚩臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣鎁臣꺁ꓥ蒁鷩馨髧讞돨辇裥邞臣꾁闧ꪁ苣膀꣦蒚黥궼볯閳臣膀꣨ꢙ臣ꢅ裥邞菨鮊苣螤鯩ꪁ럦袐觧궸臣낕跥鲀闦뺙臣뢁臣貂臣骃菣膃菣ꮁ鯩궸臣鮁苣骃菣膃菣超裥ꮁ鿥ꖁ臣궼볯ꊃ菣覃臣芁苣芀ꓦ몇迥뎁雦螉賥銂鯧蒚臣뾂菣醃苣ꪳ臣놔鷦馁苣骃菣膃菣ꂁ臣ꮁ裥邙臣讂臣ꢁ臣袂苣膀駧讦菣벃菣꺁볯뎼돦ꢁ꿦莼臣ꚁ蓦ꚺ迥뎁蛥뺏胦貁諥蒚臣릔觨閁苣讂胣ꪳ蟩蚈黦ꮁ鿥ꖁ臣骤蟩趏뿥ꊃ菣뾂菣뎃苣袼볯늼볯覼臣袂苣鎁臣뾂菣醃苣ꪳ껥辇돦꾁胣ꢇ뫥ꚩ雦꺁뿨龀臣馨髧讞菣ꮃ菣鞃菣莃苣릂苣뎃菣꾂돨몙迧鞃菣閃苣ꒂ菣뎃苣ꮁ苣誂胣邃苣ꪂ菣벃苣벃臣몙ꛨ誏臣骮蟩ꮁ諥蒚臣놽鿩銂迥벁臣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 肸껥붖뷥讅臣꾁胣醰臣辁臣节볯ꒁ臣겜駧躘臣꺿ꏩ趽볯꺼볯貁苣벃菣馁苣醰臣辁臣节볯ꒁ臣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ鳦鞁뻥讂铧ꦉꧨ首苣膀볯늼볯銈볯뎼臣릖돦ꮁ苣ꎁ臣蚈黦鞁뻥讂胣龔觧ꚩ雦꺁껥辇臣膀駩骮臣ꪁ臣ꞁ胣薆菩馨뫦ꢁ臣ꚁ郥趽뷤馨귨骃菣膃菣뺁臣꾁郥趽뷤馨귨뾂菣醃苣ꪳ苣閁苣ꮁ郥뾁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦ꮁ苣貂臣膀铧ꦉꧨ首臣膀꿥ꆱ臣覂藥讉臣龁뻥ꮁ胣떅듧袶賥ꮁ믤馁臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀뛦隌胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鿧蒁菣鞃菣覃臣蚈雦馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀苣뎃菣꾂돨銂뛦隌臣讂臣膂臣ꚩ雦銂蟥蚐臣讂胣ꢁ臣蚁ꇨ뺏臣膀ꧨ首룤꺁苣뎃菣꾂돨貁裥ꎧ臣貂苣袂臣ꮁꧨ首苣趓뷤馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣鎁苣覂臣떅듧ꮁ臣膀菣ꪃ菣랂菣膀苣뎃菣鞃菣蚃苣誃菣벂볯貽뷯銈볯誏臣궂菣袃菣鞃苣뎃臣ꦁ臣芁苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁鳦몙飦꺁뿤뺣뷯늼볯ꆼ臣뎂菣覃臣讂냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁苣뎃菣꾂돨銂郥覜臣鞾苣龔觧ꚩ雦銂胣떅듧銂铧蒁臣袶賥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀鳦몙飦꺁뿤뺣뷯늼볯ꆼ臣뎂菣覃臣讂苣뎃菣꾂돨銂郥覜臣鞾苣龔觧ꚩ雦銂胣ꢂ菣꾂菣궃苣鞃菣벃苣ꪂ菣隌돦銂铧蒁臣膀苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣蚈黦鞁뻥讂胣ꢂ菣꾂菣궃苣鞃菣벃苣ꪂ菣隌볯ꖼ볯ꦼ볯ꪳ蟩蚈黦袼볯뎼볯궼볯覼臣꾁胣ꪳ蟩蚈黦ꮁ苣ꎁ臣ꒂ苣뎃苣蚈黦馁苣趉臣膀鯩鞰苣趃菣꺂菣銂铧蒁臣膀뫦늶臣覂냦뢛臣꺁苣ꪂ菣꺁꟧開苣ꦊ臣讂胣ꚩ雦꾁뷥肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣ꊗ鿧꺁雦閳苣ꢔ臣ꚁ裥邞臣鞾苣袼뻤袁臣ꢼ뷯₏薽뷯ₔ膽뷯躼볯ꎼ뷯覽뷯₎ꊼ뷯辽뷯袽뷯趽†볯薽뷯躼볯邼볯鎼†볯钼볯醼볯骼볯銈볯銼볯鎁臣螖賧꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣覼胣뚺뛦궸臣ꮐ臣貂苣ꒂ苣뎃꣧꾁胣꾸鯩늶믦꺁듧讁臣鮣닦銂裥ꎕ臣鮁胣뚺ꫥ銂鋨몙臣鮁胣ꒂ苣뎃苣邀鯩늶믦讁苣붿臣몇臣ꚁ胣颫뫥ꮁ룥뮛臣龁뛦뒻臣Ꞝ苣龔裦閁臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣鞰鯧ꮁ꟧開臣鮁뻥讂胣鎁臣颫뫥ꮁ룥뮛臣龁뛦뒻臣Ꞝ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣銼臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣鎼臣膀臣龁臣醰臣辁臣节볯ꒁ臣ꪳ蟩蚈黦薣뷧膀뻤袁臣邙껥鞁臣蒁臣膀鯥趇ꗦꪳ蟩蚈黦薣뷧銂铧蒁臣蚈黦鞁뻥讂胣閁苣ꮁ胣ꪳ蟩蚈黦閳臣뺲ꏨ릂菣莃菣銂郥뾁뻥讂胣麝駩骮髧ꪁ룤设臣鞁臣膀跥肸臣趽볯骽꿦銂臩麊臣讂苣蚁臣견볯鮛蟩떥苣궨껥鞁뻥讂胣鶁臣馁苣鎁臣ꞁ胣낕臣讂뷯込뷯钯苣覜臣讂믤꺁裥邭苣ꪂ菣銂臣讂臣誁臣馁臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂臣袂苣膀볯뎼裥邞觥꺁ꓨ醛臣芙雩꺁臣讁苣ꚩ雦뺲ꏨ讉ꃩ銂軦꒙臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 肸껥붖뷥讅臣꾁胣겜駧躘臣꺿ꏩ趽볯꺼볯貁苣벃菣馁苣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ鳦鞁뻥讂铧ꦉꧨ首苣膀苣뎃菣ꂃ볯뎼볯궼볯랂苣蚃菣袼뻤袁臣궼볯込볯뎼볯ꮁ臣蒁臣膀苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣蚈黦鞁뻥讂胣麝駩骮髧ꪁ뻤ꢁ臣ꚁ胣鞃菣肃苣袃苣궂菣뎃볯馁臣辂臣風苣ꪂ菣릂苣ꎃ菣覼胣鞃菣ꮂ菣떂菣릂苣ꎃ菣袼ꛨꒂ苣뎃苣궂菣뎃볯膀菣ꖃ菣袃菣ꮃ菣릂臣龁臣骤蟩趏뿥ꊃ菣뾂菣뎃苣銂铧蒁臣膀뛦뒻苣蚈黦鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀菣袃菣莃苣릂铦뒏菣벃苣벃蓨ꊛ苣ꪂ菣隌볯궼볯겼볯ꦼ볯ꪳ蟩蚈黦袼볯ꆼ볯꒼볯궼볯覼苣ꢔ臣ꚁ胣겜駧躘臣꺿ꏩ趽볯꺼볯貁苣벃菣馁苣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ鳦鞁뻥讂铧ꦉꧨ首苣蚈黦鞁뻥讂胣궼볯겼볯ꦼ臣꾁胣뾂菣醃苣ꪳ臣ꦁ臣Ꞥ裥邭臣辰裥邭臣ꆸ雦꺁鷩뒠ꏥ蒚臣鞰賥誏臣ꒂ苣뎃賥貁迥붃臣芁苣芀볯ꆼ볯꒼볯蚈黦ꞁ臣膀裥邞觧銂臣骁胣Ꞥ菣ꮃ臩낉臣麃菣ꪃ菣꾂苣隌郥ꦉ볯鎁苣꾁胣邙껥鞁臣蒁臣膀듧隤럧뢐迥Ꞁ볥覜ꧦ뢅苣ꮐ臣鞾苣覼臣놅뗧뚙賥馁苣芀볯ꆼ볯꒼볯ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂菣袃菣莃苣릂臣麝駩骮髧ꪁ뻤꾁胣캁銈苣ꊂ菣銈볯銈菣覃菣궂苣놂苣꺚藩膀볯貼볯銈苣ꆃ菣궂苣銈볯銈菣覃菣궂苣놂苣꺚藩誏臣銼볯閼裢뢂菣覃菣궂苣覮臦馦藩ꞁ臣讂胣蚈黦ꦉ裢麃菣ꪃ菣꾂苣랷郥ꦉ臣것菣뚂菣ꞅ냥꾁胣麃菣ꪃ菣꾂苣誏臣蚈黦ꦉ臣鞰賥銂苣龁苣鞁뻥讂胣것菣뚂菣颪뗨놄鯩꾁苣뎃苣꾂菣ꪁ裥邞觧꺁ꯩ蒁苣ꪂ菣躏軧銂룤袁胣颫臣뺲뫥ꞁ臣隌郥ꦉ臣겸껥銂迥붃臣馁苣芀ꧨ首臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣ꊗ鿧꺁雦閳苣ꢔ臣ꚁ裥邞臣鞾苣袼뻤袁臣겼뷯鞽뷯鎽볯랼뷯覽†뷯躽뷯₄뎼뷯閽뷯蒽뷯讽볯ꖼ뷯莽뷯莽뷯辽뷯薽뷯覽뷯₁辽뷯₆ꆼ뷯膽뷯馽뷯覽뷯膽뷯₌ꎼ뷯薽뷯覽뷯钽뷯馽†볯邼볯邼볯閼볯颼볯銈볯颼볯钼볯鎁臣螖賧꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣覼胣麝駩骮髧ꪁ뻤ꢁ臣ꚁ胣궼볯겼볯ꦼ裥邞臣뾽铧閁苣讂돨辇裥邞ꏨ꺽臣꾁胣骷뷥鮣ꇨ芙雩讞볯뒼볯ꚼ볯ꪳ蟩蚈黦薣뷧膀볯꾼볯ꪃ菣것苣袃菣뎃黥ꪳ蟩蚈黦薣뷧뺁臣꾁菣벃菣ꢂꓥ鮏돨辇裥邞ꏨ꺽臣ꮐ臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀매ꖇ뛦뒻돦銂铧蒁臣蚈黦ꦉ裢麃菣ꪃ菣꾂苣랷郥ꦉ苣ꊽ裦閁臣鞾苣芀铧ꦉꧨ首苣麃菣ꪃ菣꾂苣ꢁ럦袐臣ꚁ胣麃菣ꪃ菣꾂苣뺯ꧨ首꿦貁臣袂臣閼볯邼볯骼볯ꞁ臣讂ꏩ貒菣袃菣莃苣릂뫦늶苣龔裦閁臣讂胣ꆬ臣膀臣꺁ꏩ貒菣袃菣莃苣릂뫦늶臣ꊂ菣뎂菣袃볯誁苣鶁볯躼볯鲀볯躼볯閽볯覼苣뺹蟧閁臣ꚁ胣蚈黦ꦉ裢麃菣ꪃ菣꾂苣랷郥ꦉ苣ꊽ裦閁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀雨꒱돦銂铧蒁臣蚈黦ꦉ裢麃菣ꪃ菣꾂苣랷郥ꦉ苣ꊽ裦閁臣鞾苣芀鷥肸臣麃菣ꪃ菣꾂苣蒖蛨銂臣骁뷥邈臣鮁胣ꆬ臣ꚩ雦銂臩ꢔ臣膀菣袃菣莃苣릂臣뢐迥閁臣讂臣ꢁ臣膀裥邞觧銈菣袃菣莃苣릂럦袐觧銂뷥邈臣鮁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀軥꒱돦銂铧蒁臣蚈黦ꦉ裢麃菣ꪃ菣꾂苣랷郥ꦉ苣ꊽ裦閁臣鞾苣芀菣袃菣뮂菣궃菣릂菣袃菣莃苣릂럦ꂊ觧銂铧蒁臣螝룤ꪁ菣袃菣莃苣릂雨鲆苣ꊽ裦閁臣讂胣肸꟦ꪁ菣袃菣銈苣ꮃ菣벃苣麃菣ꪃ菣꾂苣꒱臣鞾苣貂臣覂胣ꚩ雦銂臩ꢔ臣膀臣꺁菣袃菣莃苣릂룤ꮁ郥躏臣鮁苣鎁臣ꞁ胣蚈黦ꦉ裢麃菣ꪃ菣꾂苣랷郥ꦉ苣ꊽ裦閁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苣뎃菣Ꚃ苣莃菣閳苣ꢔ臣ꚁ裥邞觧銈菣袃菣莃苣릂럦袐觧銂뷥邈臣鮁뻥讂胣蒖뇥閳臣뒠郥ꢁ郥颁苣蚁臣麃菣ꪃ菣꾂苣邵駦꺁雨꒱苣뾪ꏨ鞁臣貾胣袃菣閃菣ꪂ菣ꊅ藩뒰뫦늶胣ꚩ雦誏臣麃菣ꪃ菣꾂苣꺁뛦뒻苣ꂊ臣讂胣ꆬ臣膀ꧨ首苣麃菣ꪃ菣꾂苣궸臣뢐迥閁臣讂臣ꢁ臣膀裥邞觧銈菣袃菣莃苣릂럦袐觧貁뷥邈臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 뚼볯躼苣莃菣誏臣螃菣ꒂ苣㲹牢ਾ†苣莃菣㲈牢ਾ†鳦몙飦꾁胣겜駧躘臣릖돦銂뻤ꦈ臣讁臣込臣龁臣릊黦蒚臣龮ꇨ馁苣龁苣꺁臣뺁臣뺁臣궂菣袃苣邏뻤馁苣芀藥讞髧ꮁ臣膀苣莃菣꾁胣ꚃ菣뚂菣貁꿥ꆱ臣뮲駧銂ꓨ낕鯥財臣讁臣込臣龁臣螤闦꺁껥鎨苣財臣鎁臣銂迥붃臣馁苣꺁臣膍裥ꪁ蟩誏臣込臣龁臣낕臣讧裦膦듧銂郥肂臣芁苣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†룤讅꟦ꮁ臣蒁臣겜駧躘臣膀鳦몙飦꺁볯ꆼ볯蚈귥袼믤辄臣뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣鶃菣貃苣것苣膃菣銂郥肂볯銂郥肂苣莃菣銂迦鮾臣讂胣肸껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣궂菣袃臣膀볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁ꧦ붃髧鞊軥뺁臣꾁臣꺁ꧦ붃髧궖觧銂郥肂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣莃菣꾁胣鞊軥꺁뿧뎨迥붃ꃩ龟苣ꮐ苣견볯鶃菣貃苣것苣膃菣銂郥肂胣뾂菣醃苣ꪳ铧ꎔ铧ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣궂菣袃臣閁苣ꮁ胣붣觥蒵裦ꦉ苣ꊽ裦閁臣讂臣膂臣薌ꏨ邝雦誏臣겪飦뢛臣覂臣ꮁ볯뺁臣꾁胩钁觥銂郥뾁뻥讂胣膀臩ꒉ臣膀ꏩꦡ냦膀菣莃菣ꆂ菣뚺뛦膀菣钃菣ꒂ菣뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣讖ꓧ馁苣뮻蓦꺁胩钁觥銂郥뾁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣莃菣ꆂ菣뚺뛦꾁胣ꦡ賥誃菣ꪃ苣ꂃ胣ꦡ賥ꮂ菣랂苣ꂃ胣ꪃ菣뢅ꇥ誏臣込臣龁臣ꖼ볯뒼볯銂郥뾁뻥讂胣节臣肸臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣邃菣閃苣벃뫦늶臣膀ꏩꦡ냦膀볯趽볯ꮂ菣랂苣ꂃ苣ꮐ苣龣ꇥ뒰胣閼볯릂苣궃菣릂胣銼뷯궼苣ꮃ苣Ꚃ菣銂郥肂볯薼苣꾂菣벃苣膀볯薼菣뎃菣袃菣ꮃ胣銼뷯궼苣ꮃ苣Ꚃ菣銂郥肂볯薼菣뎃菣袃菣ꮃ胣뎹藩ꂊ菣뎃苣ꮃ뛦膀ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣膀볯趽볯ꮂ菣랂苣ꂃ迥뎁菣뎃菣벃苣銂郥肂ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣銂郥뾁뻥讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁볯设臣낁뇧붛蟥颡藥讖곧銼볯醼볯邼볯閼볯邼볯隼迥芏藧鮼臣꺁雦꺌臣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂볯芀臣覂臣节臣肸臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣邃菣閃苣벃뫦늶苣袲껦閁臣讂臣膀蟥邵매ꖇ臣ꚁ苣袂臣芀郥讧裦膦듧꺁蟩꾁胣肸단鞁臣膀蛥뺏胦꺁臣讂胣袂苣颫뿦ꚺ臣龣ꇥ뒰臣龁臣颍듧ꪁ菣莃菣ꆂ菣붣觥貁迥붃臣ꪁ苣袂臣ꮁ胣覤鯦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 芁苣龜雩ꮁ苣龁臣ꚁ臣ꒁ볯뺁臣꾁臣뺁臣뺁臣ꆝ믤许臣꺁菣莃菣ꆂ菣뚺뛦ꮁ臣醁苣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁껥骮胦銂ꋥꂊ臣鮁苣龁苣ꮁ苣膀꟦邈ꛨꂴ苣覤鯦鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†룤讅꟦ꮁ臣蒁臣겜駧躘臣膀꣦蒚듧麃룤ꮁ냥ꖅ臣龁ꃥ袐臣뮿꣨꾏菨颠鿥貁苣벃菣馁苣肉鳦꺁蟩꺁苣뎃菣꾂돨銂铧ꎔ臣讂臣ꮁ鳦릊臣辇臣邏뻤閁苣讂胣趉꣨뮿꣨꾏菨颠鿥銂郥肂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃볯趉꣨내菨꺁藥ꦤ胦超雧鲿귧銂껥ꪳ髧ꮁ飩뎮臣讂臣ꮁ鳦릊臣辇臣邏뻤閁苣讂胣뮘껥뢠藩銂郥肂곧銼菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃볯ꪁ苣뎁臣薌ꏨ邝雦誏臣겪飦뢛苣ꮐ苣膀苣뎃菣꾂돨龔铧ꢔ臣궂菣袃苣邏뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 肸藦颧臣誁臣ꚁ鳦몙飦꾁胣내菨貃苣것苣벃苣ꮁ苣讂裥ꎧ臣躽룦銂釥馁苣膀뿧뎨迥붃ꃩ龟苣ꮐ苣鶃菣貃苣것苣膃菣膀臣覂臣ꮁ賥薣鷦首迥뎁ꫨ躘鯦銂郥肂胣뾂菣醃苣ꪳ铧ꎔ铧꺁苣莃菣銂迦鮾臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†룤讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꾁胣내菨貃苣것苣벃苣ꮁ苣讂裥ꎧ臣躽룦銂釥馁苣膀뿧뎨迥붃ꃩ龟苣ꮐ苣鶃菣貃苣것苣膃菣膀迥뎁곧醼ꃦ뢅룤꺁觥風뿧뎨迥붃ꃩ龟臣뮿꣨ꮁ臩鞁臣몓매開觧내菨銂郥肂胣뾂菣醃苣ꪳ铧ꎔ铧꺁苣莃菣銂迦鮾臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†菣邃苣릂戼㹲 겜駧躘臣膀鯧蒚臣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣膀뻤袁臣鞊軥Ꞁ菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂胣鶃菣貃苣것苣膃菣銂郥肂볯꺼볯뚼苣蒵臣벾臣鞾苣螃菣ꒂ苣銂迦鮾臣讂胣鎁苣覂臣螃菣ꒂ苣꾁胣鶁苣銂뿥膦臣馁苣뺯뇨膀뻤袁臣銃菣ꎂ胨ꮁ胣뒛臣ꮁ胩钁臣讂臣膂臣ꦈ铧馁苣鎁臣貁臣趁苣붣觥궸臣鶃菣貃苣것苣膃菣銂郥邈臣讂臣膂臣ꚩ雨麡苣膀껥骮臣붣觥궸臣ꮐ鳦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 閊룤꺁臣膂臣螃菣ꒂ苣꾁胣겜飦내鯦ꮁ闦몤臣讂跥麛諦躸菣뢂菣뎃胣螤闦麛諦躸菣뢂菣뎃臣龁臣蚈觥閊룤것苣ꆃ菣ꮁ뻥ꎁ臣겜駧躘臣꺼볯뚼苣膀臩馁苣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣螃菣ꒂ苣꾁胣设臣낁볯邼볯鎼맥鎼鳦馼韦ꮁ蟥颡臣貂臣붛髩몇ꇩ낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯邼볯隼볯袼믤蚐뫤뒕郧ꪕ迥궼볯邼볯覼臣馕ꓧ閁苣ꚁ臣誂胣鶁臣薆껥꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 내菨膀駥颮迥뎁뗧钹臣꺁ꓨ낕鯥閊룤꺁臣膂臣鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ韦ꖟ臣릖돦誏臣螃菣ꒂ苣貁胣겜駧躘臣龮雦ꊽ藦ꢁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣讖ꓧ馁苣릖돦誏臣蒵裦ꦉ臣肸럧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣膼鯥閁苣讂胣鶁苣覂臣꾁胣设臣낁ꓨ낕臣鶇苣뾽铧馁苣릖돦誏臣螤闦꺁蟩銂鳦馁苣螃菣ꒂ苣膀뻤袁臣ꆮ藨뺁臣꾁苣蚃菣蚃菣銂뷤ꢔ臣讂菣ꒂ菣ꪃ菣覃菣邃苣릂胣ꪁ苣뎁臣놆胣뮛뗦뺁臣꾁铦蒰럧貁꟩開臣讂ꧦ讧苣ꦈ铧馁苣螃菣ꒂ苣貁郥뺁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦ꮁ苣貂臣膀臣鎁臣膼鯥閁苣讂跥麛铧辇胣螤闦麛铧辇臣龁臣蚈觥ꢔ蟩꺁胩钁臣膀臣貂苣꺁ꓨ낕鯥閊룤螃菣ꒂ苣銂裥ꢔ臣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣螃菣ꒂ苣꾁胣设臣낁볯邼볯鎼맥鎼鳦馼韦ꮁ蟥颡臣貂臣붛髩몇ꇩ낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯邼볯隼볯袼믤蚐뫤뒕郧ꪕ迥궼볯邼볯覼臣馕ꓧ閁苣ꚁ臣誂胣鶁臣薆껥꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 肸껥붖뷥讅臣꾁胣꺼볯뚼臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣鎼鳦꺁蟩ꞁ볯螮触꺁闧ꪁ苣袼믤辄臣ꎚ軦馁苣覼菩趽臣膀郥芙臣뺁臣꾁볯邼裥ꖻ蛥ꮁ胣꺚룤閊룤뺁臣꾁귧覂蛥閊룤閁苣讂볯设臣낁볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀臣龁臣醼볯螮触꺁菩趽臣꺁郥芙諦躸臣龁臣隼볯蚈믤薆臣閊룤覼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣蚃菣蚃菣誏臣込臣龁臣ꆮ藨銂裥ꢔ臣讂雦閳迥뎁菣邃苣릂戼㹲 颍鯥閊룤膀ꓨ낕鯥閊룤뺁臣꾁裥늉諦躸苣놂苣ꖃ菣ꮃ臣겜駧躘臣꺼볯뚼苣閊룤馁苣龁苣ꮁ胣ꮂ菣벃菣ꮃ迥뎁껧钅苣ꦈ铧馁苣릖돦誏臣螃菣ꒂ苣銂뷤ꢔ臣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣릖돦誏臣螃菣ꒂ苣꾁胣銼볯醼볯뒹볯袜볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁鯥鮚蟥颡볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯鎼볯邼볯銼볯ꎻ郧몺闦蚐闧랏볯鎼볯邼볯ꮁ闦몤臣貂臣誁苣膀臣꺁蛥릮臣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鯩膵苣ꦈ铧馁苣릖돦誏臣螃菣ꒂ苣㲹牢ਾ†鳦躘듧뢛臣馕ꓧ馁苣颍鯥閊룤膀ꓨ낕鯥閊룤뺁臣꾁裥늉諦躸菣뢂菣뎃臣鎾臣ꚁ鳦몙飦꺁볯ꆼ볯銂諦躸臣讂臣膂臣膀鯩膵苣ꦈ铧馁苣릖돦誏臣螃菣ꒂ苣銂뷤ꢔ臣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣릖돦誏臣螃菣ꒂ苣꾁胣銼볯醼볯뒹볯袜볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁鯥鮚蟥颡볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯鎼볯邼볯銼볯ꎻ郧몺闦蚐闧랏볯鎼볯邼볯ꮁ꣨覼臣貂臣誁苣膀臣꺁蛥릮臣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꦼ볯躼껥ꦾ戼㹲 겜飦내鯦꺁臣뺁臣뺁臣螮触ꮁ臣蒁臣膀鳦讖ꓧ꺁賥袐觧꺁뷧鮏鿥銂胣꒾臣뺁臣꾁꿧늛臣讖ꓧ馁苣芀鳦讖ꓧ꾁胣鶁臣袂臣ꪁ뻧誏臣蒯鯥꺁菣뎃菣벃臣芁苣ꢁ臣覂苣讂胥ꖈ臣ꢃ裥蒚뗧뾁郥辂臣銂賥ꮐ臣讂臣ꢁ苣膀藥鎽髧ꮁ蓦뎛臣ꚁ臣讂胣设臣낁铧麪胣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣趀臣膀菣膃菣膀苣膃菣膀볯鎼苣ꮃ苣ꮃ胣ꎼ볯ꊂ菣궂菣膀볯閼苣ꮃ苣ꮃ胣誏臣ꎼ볯ꊂ菣궂菣銂胥ꖈ臣讖ꓧ馁苣鎁臣銂胣랅뷤蒚臣辄鯥鞁臣蒁苣芀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ胣貀믤辄臣꺽迦閁苣龁볯趀볯设臣낁믤辄臣꺽迦閁苣龁苣ꮃ苣ꮃ볯ꢁ臣蚁뷥込臣ꢡ迧꾁胣貀볯ꞁ臣ꎁ臣膀볯꾁믤辄臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣袼뻤袁臣貀苣ꮃ苣ꮃ臣芁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣꾁믤辄臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣覼臣覭뻤ꞁ臣讂苣꺁臣馁苣芀臣貂臣膀觧뒾胣뢼胣袼뻤袁臣ꊂ菣궂菣覼臣貂蟨鎽臣辚蓦ꞁ臣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蒴볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀듧趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣躘ꓧ鞁臣ꒀ臣슮醼볯薼苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蒵臣袐苣鮁臣閊룤骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣蒵臣袐苣鮁臣閊룤趀臣龁臣貀뷤ꢔ諦躸胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀꿥ꆱ臣銼臣ꖻ룤꺁뷤ꢔ鯥邭苣貐駦ꮁ諦躸臣讂臣膀苦薀臣뺯臣讂郥鲽铧ꂛ귥꺁諥鲞臣肸菩趇ꓨ鞁뻥讂苣蚁臣龜雩薆臣閊룤馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣鶁苣覂臣鲽铧ꂛ귥貁뫤蒁臣蒴볯邼胣鎼볯膀볯閼胣醼볯膀볯膀臣龁臣醼裥ꖻ蛥ꮁ諦躸臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀뷤ꢔ鯥邭臣閊룤貁胣蒵臣袐苣鮁臣릊黦袼뻤袁臣뢛매릊黦覼臣钁裦閁苣讂苣蚁臣膀뫤蒁臣膍裥ꮁ뿨蒁雩钚臣財苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꊂ苣ꖃ菣뎃菣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣鞊軥ꮁ꿥馁苣뺯뇨꺁藥ꮖ뿥钭苣랼賥馁苣ꦉ돨銂蓦뎑臣讂胣겜駧躘臣꺼볯뚼臣膀믤辄臣膀볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁苣뢂菣邃菣袃苣ꮐ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 開觧骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣開觧趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣開觧貕臣뮻蓦꺁菣뎃菣벃苣螌臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀胣開觧趀臣뮻蓦꺁駧龔껦躚臣芁苣銃菣銂賦馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣貀该ꦉ胣꾁믤辄臣몙铧떮髩ꮁ臣讂鷩銃菣開觧銂賦馁胣芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨麝菣袃该ꦉ臣몓매開觧袼뻤袁臣ꞽ귦麡胣麃苣릂胣ꦃ菣袃胣Ꚃ苣꺂胣떂菣膀苣貃胣趃苣膀菣蒃苣膀苣랂胣誜闩麡胣뺁臣꾁菣뾂볯ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣開觧ꮁ臣膀鏥뎹该ꦉ胣ꖳꇩ膀裧ꮙꇩ膀룤龔ꇩ膀귩麡胣誏臣閠駨麡臣ꦁ臣ꮐ臣貂苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀该ꦉ臣袃菣뎃苣뢂苣讃菣꾂该ꦉ胣몁볤邭铦覤该ꦉ胣뺁臣꾁苣궃菣뎃臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鞊軥骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ껥ꦾ臣讂铧麪胣鞊軥趀臣龁臣貀諦鎽铧龔觧ꪳ볯뮼뷯붼뷯钽뷯芽뷯蒽뷯ₙ뮼뷯붼뷯躽뷯銽뷯钽뷯銽볯趀볯貀볯螽胣覼臣膀铧ꦉ臣誁臣ꚁ藥ꮖ뿥钭苣閼臣략臣馁胣设臣낁铧ꦉ臣超雧鲿귧銂볥趁뗨鎁臣ꚁ觧ꪳ臣龁臣鲽铧ꂛ귥ꮁ꿥馁苣鞊뷤銂铧龔臣鮁苣膀觧ꮁ铧ꦉ臣誁臣讂臩鲿藥ꮖ뿥钭苣릃뗨馁苣膀뗧邈觧膀뻤袁臣ꦉ돨뺁臣꾁뷤ꢔ鯥邭苣螌臣芀諦龎臣膀觧ꮁ苣뎃菣꾂돨膀菣ꪃ菣鞃菣覃胣骤돧膀ꃦ뢅胣芄돨ꪁ臣銂郥肂胣뮻蓦꺁藥ꮖ軥Ꞁ觧ꪳ臣芁苣鎁臣貁臣趁苣芀뻤ꢁ臣讂諦龎臣龄鿦ꂛ귥ꮁ铧ꖝ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ뷤ꢔ鯥邭臣鞁臣꾁胣龄鿦ꂛ귥꺁룤ꢃ臣龁臣떂菣ꚃ菣莃菣膀뻤袁臣膀듧貏胣Ꚃ苣ꮃ苣膀迥뎁믤꺁뻥龔觧ꪁ臣꺁蓦鎟鯥邭臣뎂菣袃胣뎂菣袃꟦邈ꛨꂴ胣设臣낁苣벃菣뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣뎂菣袃菣ꪃ菣鞃菣覃胣ꢡ鷩讧裦膦듧膀뻤袁臣ꢡ鷩뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣ꢡ鷩鶃菣骃菣膃菣膀軨鲆꟦邈ꛨꂴ胣내菨膣꟦邈ꛨꂴ胣궞꿦膀럧鮯胣誏臣込臣龁臣銯듧节臣辁臣袃苣붂苣覃볯銂賦銁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣讂觧骮臣鞊軥膀뻤袁臣芄돨誏臣込臣龁臣뢠藩꾁胣붥臣鞁臣꾁苣뎃菣꾂돨誏臣込臣龁臣骤돧ꢁ뗧뾁郥辂臣龁ꃥ袐臣膀諦龎胦ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†鯧蒚臣鞊軥뺁臣꾁触鮜臣鞊軥骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣꺛髧꺁諦龎胣뺁臣꾁胣肉鳦꺁諦龎胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁볯ꆼ볯꺁꟦邈ꛨꂴ臣芁苣讁胣뺁臣꾁볯ꒁ苣鞁臣꾁ꓨ낕臣꺼볯뚼臣讧裦膦듧ꞁ臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣ꚁ臣讂胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣뾂菣醃苣ꪳ迥뎁믤꺁铧鎽裥邭苣薌郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 誁苣鶁볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣ꢔꫨ貀臣袂臣趀臣龁臣貀듧趀臣膀볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁鯧蒚臣ꒀ臣ꦁ铧閁苣ꚁ胣肨飦鞁臣芏藧ꒀ臣麡볤馁苣ꒀ苣螌臣芀臣讂觧骮臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀胣誁苣鶁胣뺁臣꾁胣蒴胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀裥떮臣肨飦貁臣讂ꃥ袐臣龁臣螖蓨誸臣蚁臣ꪁ臣鎁臣貁飦覂臣ꪁꃥ袐苣꒙臣膀꣨躘臣龁迥ꞅ胥꺁룤릖郥ꮁ볯誸룤覼볯閼볯膀볯邼볯膀볯馼볯膀볯颼볯膀볯鞼볯膀볯隼볯膀볯閼볯膀볯钼볯膀볯鎼볯膀볯銼볯膀볯醼볯膀볯邼볯膀볯薼胣颼볯膀볯薼胣隼볯膀볯薼胣钼볯膀볯薼胣銼볯膀볯薼胣뺁臣꾁臣貂鳦肺믤薆臣ꪁ苣ꒀ臣蒯鯥袼臣꺁苣蚁臣낕귥貁迥붃臣ꒀ臣醼볯邼볯銂뛨袁苣뒠郥銂駩辁볯銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣骼郥鞁臣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꢁ볤袐臣龁胣膀胣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣趀胣貀胩邵臣貂臣趀胣貀迥誂믤醁苣貂臣趀迥뎁胣芿闧閁苣龁胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀볯ꒁ믤誸臣ꢃ裥ꮁ雩ꎀ臣ꚁ뷤ꢔ臣貂臣뒠郥膀臣貂苣꺁菩蚈臣膀鯧ꖎ髧ꮁ胣뺁臣꾁胩邵觥ꢁ臣ꚁꧦ붃臣讂볯ꒁ苣鞁臣꾁ꓨ낕臣붿諥ꢃ裥銂믤鞁臣膀뫤蒁臣ꦉ郧蒚臣骼郥閁苣뺁臣꾁臣ꪁ臣貂臣膀跥蚈臣覮껥ꪁ꟦ꂀ觧銂뷥邈臣ꚁ臣誂胣鶁苣蚂臣ꮁ胣鶁臣讧胩ꦉ臣뾽铧閁苣讂鷦뚻룤ꞁ胣设臣낁铧蚐髧ꆝ믤许臣膀臣貂苣꺁菩蚈臣ꦉ郧蒚臣骼郥鞁臣뺁臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣芀胣骼郥趀臣膀뿥骁臣节胣뒛軦蒚臣놅鳦隌귥邵郥ꮁ苣讂苣꺁臣ꪁ臣ꚁ苣袂臣膀胣骼郥鞁臣趀껥鎽臣ꦉ郧蒚臣骼郥鞁臣뚊藦銂뿤ꒁ苣蚁臣膍裥ꮁ껥骮臣ꒂ苣뎃뗧袐臣龁臣뒰듧邵郥뺁臣꾁菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣ꮁ鿥ꖁ臣邵郥Ꞁ苣몤铥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뫤颮菨Ꞁ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀뫤颮菨Ꞁ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣銼臣꺁ꧦ붃苣궶賦馁苣鎁臣貁臣趁苣뮻蓦꺁觧ꪳ胣蚈귥뺁臣꾁菩蚈苣螌臣芀뷥늩껥붃臣膀郥颁뗧鲞苣钁裦馁苣节臣ꞁ臣ꎁ臣节胣낕臣讂뗧鲞苣钁裦馁苣节臣ꞁ臣ꎁ臣节苣蒁胣趉꣨颮菨銂苣龁苣馁꟦ꂀ臣貐臣ꞁ臣ꎁ臣节闧ꪁ臣ꚁ苣袂臣芀뻤袁臣膀鳦몙飦꺁뫤颮菨Ꞁ뿤뺣볯꺼볯꾁胣내菨銯胦骃菣膃菣袼곧醼ꧦ붃볯銂苣벃菣鞁뻥讂臣膀臣꺁룤릖臣膀觥風苣벃菣늼볯ꆼ苣讧裦馁苣貃苣것苣랂菣꾁臣貂苣ꪇ뷤貁듧麃꿦Ꞁ볯견볯龩菨覼臣芁苣芀臣꺁뻤ꞁ臣膀臣鎂듧麃臣꺁뫤颮菨Ꞁ뿤뺣볯꺼볯꺁胩钁臣膀臣鎂苣릔雥鞁臣龁臣뮲駧鞁뻥讂菣鞃菣覃臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ裥邭苣龔铧馁苣ꂁ臣ꞁ臣辁胣꺿ꏩ늼볯ꆼ臣뮿꣨ꞁ臣ꪁ臣蚈꟨貁뗨鎁苣꺁臣芁苣낁듧麃臣貃苣것苣랂菣꺁듧麃꿦Ꞁ菣ꒂ菣벃菣銂胩钁臣讂臣ꢁ臣节臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†铧鎽臩袐胦骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣龔뷤ꦁ郥Ꞁ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀铧趁臣蒁苣내菨膀뗧钹胣ꢙ껥뺁臣꾁돧ꢁ臩袐臣ꚁ臣ꚁ胣랂껥膀꿦Ꞁ胣뺁臣꾁藥ꮖ돧ꮁ苣讂详뚵臣ꪃ苣꾂苣뮁臣鎂臣膀臣蒁臣ꢅ臣龔臣ꪁ臣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†铧蚈꟨Ꞁ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀铧蚈꟨Ꞁ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀铧ꦉ臣鲽铧ꮁ苣ꎁ臣ꆄ껥ꪁ铧邈觧뢁臣蚈꟨閁苣鞾苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†铧ꦉ귥蒚臣뮴胦骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣龔觧ꚭ髧ꮁ듦Ꞁ胣ꢁ臣蚁ꇨ뺏臣膀铧ꦉ돧誏臣込臣龁臣龔觧ꮁ臣蒁臣뮴胦銂鳦馁苣뮻蓦꺁觧ꪳ臣릉돨銂賦馁胣设臣낁胣龔觧ꮁ諦躸臣龁ꃥ袐臣膀臣꺁铧ꦉ臣뺯臣ꚁ铧ꦉ귥蒚諥鲞苣覜臣讂觧ꪳ臣膀铧ꦉ귥蒚臣뮴胦ꞁ臣讂臣뾁臣閁苣讂胣릉껥꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣겜駧躘臣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣龁臣袁臣꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣肸菩蚈臣节胣龔觧ꚭ髧ꮁ듦Ꞁ臣芁苣讁胣龔觧ꚭ髧ꮁ蟩膦臣뾁臣閁苣讂듦Ꞁ苣ꆨ胥馁苣꺁臣芁苣낁胣龔觧ꚭ髧ꮁ듦Ꞁ臣芁苣ꢁ臣ꪁ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 貁苣릹듧麃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣貁苣릹듧麃胣꾁胣ꪇ럥螤ꏨ蒚臣誏臣込臣龁臣낕룥ꪁꋥ隮迥뎁裥隌苣략臣鞁臣ꮅ飧銂뷥邈臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂듧麃臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 隌귥ꢔꫨ骼믤许臣膀胣ꊂ苣ꮃ胣讁苣貀菣ꪂ菣ꮃ胣뺁臣膀臣뺁臣뺁臣隌귥ꢔꫨ꺁껥ꦾ苣낿臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†铧麪胣ꊂ苣ꮃ胣꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ菣讃菣몟苣讻臣ꚁꛨ蚈귥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣蒁苣뒰듧뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣ꮃ鿥袼뻤袁臣较菣ꊂ菣궂菣몟볯銂ꇨ鞁胣鮃菣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣螃菣覃鿥覼胣ꊂ苣膃菣膀菣ꪃ菣ꮃ苣궃苣뮂菣ꮃ胣鞃菣钃苣讃菣膀菣뾂菣ꒂ菣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣랂菣몟臣醼胣鞼胥膀볯鲀볯醼胥膀臣龁臣醼胣銼볯讀臣궂듧銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ苣ꮃ鿥꺁鷩邙껥蒚臣设臣鞁臣꾁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣랂菣膀苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣ꊂ菣벃菣ꒂ菣膀苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ胣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ菣銃菣膀볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꒂ菣躃胣誏臣袼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣ꒂ菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣趀鿥꾁胣ꮂ菣鲃菣ꮃ軥邭苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁裢ꎼ볯꾼볯銈볯늼胣込룤膀볯꾁胣ꢼ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯膀볯醼裢醼볯节臣辁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ鿥ꞁ臣讂볯銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ臣膀볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯醼胥뺁臣꾁볯鲀볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苣ꮃ苣궂苣몟臣閁苣ꮁ胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ苣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ苣ꮃ鿥袼뻤袁臣銈볯袼볯覼裢ꊂ菣궂菣銈볯袼볯覼裢꾼볯膀볥궸胣늼臣膀믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼胣ꎼ볯銈볯邼胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣몟臣芁苣覼苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ苣ꮃ臣鎼胣钼볯讀臣궂듧袼뻤袁臣鎼胣醼볯讀胣鎼胣醼볯讀胣鎼胣醼볯讀胣鎼胣銼볯讀胣뺁臣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯ꊂ苣ꮃ胣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣랂菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣랂菣覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣蒐苣ꮃ苣궂苣몟迥뎁苣ꮃ苣ꮃ鿥貁臣覂臣膀郥몟臣ꒁ臣ꚁ볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟볯设臣낁菣覃菣궂苣몟볯ꞁ胣겋ꯧ鞁臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣몟臣膀苣ꮃ菣讃菣銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣몟볯设臣낁裢ꎼ볯꾼볯銈볯銈苣ꮃ苣ꮃ裢ꊂ菣벃菣覼苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂鿥꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯鞼胥뺁臣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂볯设臣낁볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣銈苣ꮃ菣讃菣膀볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣銈볯醼裢醼볯ꊂ菣뎂苣랂裢ꮂ菣鲃菣ꮃ胣뺁臣꾁볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂裢ꮂ菣鲃菣ꮃ볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ鿥貁胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꪃ菣궃苣ꮃ胣몟臣膀苣ꮃ菣讃菣몟苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣벃菣몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣벃菣ꒂ菣몟臣鞼胣醼볯궂듧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣ꊂ菣벃菣몟臣膀볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꮂ菣邃菣ꒂ菣趀鿥꾁胣銈볯袼볯覼裢꺼볯늼볯醼볯銼苣ꢡ臣膀볥궸胣蒐볯꺼볯꺁蓦뎑臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂胣ꊂ菣躃胣꺁껥ꦾ臣讦臣ꂁ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ菣銃菣趀鿥꾁胣讧胩銈볯ꢼ볯銂鳦馁苣ꊂ苣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꒂ菣躃胣몟臣膀苣龃菣몟苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣颃菣궃苣꾂菣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ鿥꾁볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣袼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣ꒂ菣趀鿥꾁胣ꮂ菣鲃菣ꮃ鿥銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟苣ꢡ臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟臣膀볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 貀苣ꮃ苣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀裥떮臣躘ꓧ貁臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀볯鲀볯邼苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯邼苧ꂴ臣龁臣醼胣隼苧ꂴ볯꺁鯧階迥뎁裥邲軩붣鋥몟苣ꦁ臣覂苣薌郥馁苣芀苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁菣膃菣膀苣膃菣膀뷯銈迥뎁뷯鎽뷯銈菣궃菣ꮃ胣躽裢膀뷯薽뷯銈胣覽뷯辽裢誏臣钽뷯銽뷯銈菣膃菣膀菣ꪂ菣뎃菣ꮃ臣ꦁ臣袂臣ꚁ뻤몤臣貂胣뮻蓦ꞁ胣ꆬ臣馌臣讂鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣醼胥膀볯讀胣鎼胥膀臣龁臣袼볯궂듧ꖻ룤꺁苣ꮃ苣ꮃ臣뒠郥ꮁ臣覼볯讀臣꺽迦몟臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂볯袼볯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣鮼볯鎼볯겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣龃菣袼뻤袁臣ꆄ뷧鮏苣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯銼볯뺁臣꾁뷧鮏苣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯늼볯醼볯銼胣込룤膀볯꺼볯꾁苣龃菣ꮁ雩鞁臣骮뻧馁苣ꢁ臣誂臣芁苣覼볯袼볯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣鮼볯閼볯ꊂ苣覃볯袼볯覼菣궃볯袼볯覼볯ꎼ볯銈볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꪂ苣랂볯袼볯覼볯鶿귨몟臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣銃菣궃苣랂볯袼볯覼菣袃菣鮼볯醼볯覼苣궂苣袼뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ菣銃菣뺁臣꾁苣랂菣覼볯袼볯醼볯ꎼ볯銈볯릂菣궃苣꾂菣ꮃ볯袼볯銼볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂볯袼볯鎼볯膃苣벃菣鮼볯醼볯覼볯鶿귨몟臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣銈볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀볯ꆼ胢꾁胣ꆬ臣馌臣讂鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣骼볯膽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣겋ꯧ鞁臣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯銈볯늼볯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯覼뷯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯꺼볯꺼볯꺁苣龃菣銈菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀郥늼볯醼臣겋ꯧ鞁臣뒰듧뺁臣꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣鮼볯醼볯覼裢ꎼ볯꾼볯꺼볯ꊼ胢늼볯馀胣込룤膀볯ꊼ胢誏臣늼볯馀臣鶁苣麁苣꾁볯膽볯뒰듧膀볯芽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢뎼볯銼볯꒼胢込룤膀볯꒼胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯莽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣誏臣袼뷯覼菣覃菣궂苣讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢뎼볯銼볯늼볯馀볯ꚼ胢膀볥궸胣늼볯馀迥뎁볯ꚼ胢꺁臣貂臣貂臣膀곦ꮁ賦銁苣몟臣覂臣讂뻧袂苣겋ꯧ鞁臣뢁諦閁苣讂볯袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣鮼볯醼볯覼裢ꎼ볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀볯Ꞽ胢꾁胣ꆬ臣馌臣讂鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣骼볯膽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯銈볯늼볯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯覼뷯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯꺼볯꺼볯꺁苣龃菣銈菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀郥늼볯醼臣겋ꯧ鞁臣뒰듧뺁臣꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣鮼볯醼볯覼裢꺼볯ꢼ胢ꎼ볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀볯ꢼ胢꾁볯膽볯覼냦ꂴ迥뎁볯芽볯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣膀볯ꦼ胢꾁곦ꮁ賦銁苣몟臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯设臣낁볯銼裢隼苣ꮃ苣讃菣覼胣袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯銼볯뒰듧膀볯薽볯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯覼苣龃菣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣膀볯螽볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯覼裢꺼볯꺼볯袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯ꎼ볯銼볯ꢼ볯꾼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼볯醼臣ꊂ菣躃裢鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣込룤膀뷯醼臣醼胣醼볯袼뻤袁臣醼胣隼臣龁臣醼胣钼볯꺁闦낕臣芁苣膀뷯銼迥뎁뷯鎼臣鶁苣麁苣꾁胣겋ꯧ鞁臣膀볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀臣龁臣醼胣醼볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣蒐볯꺼볯꾁诧讫臣ꚁ냦ꂴ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣ꞁ臣讂볯袼볯邼볯銈볯늼볯馀볯袼볯覼볯늼볯馀胣込룤膀볯ꪼ胢꾁볯膽볯覼냦ꂴ迥뎁볯芽볯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣膀볯ꮼ胢꾁믤许臣몟臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯设臣낁볯銼裢隼苣ꮃ苣讃菣覼胣袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯銼볯뒰듧膀볯薽볯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯覼苣龃菣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣膀볯螽볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯覼裢꺼볯꺼볯袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯ꎼ볯銼볯ꢼ볯꾼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼볯醼臣ꊂ菣躃裢鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣込룤膀뷯醼臣醼胣醼볯袼뻤袁臣醼胣隼臣龁臣醼胣钼볯꺁闦낕臣芁苣膀뷯銼迥뎁뷯鎼臣鶁苣麁苣꾁胣겋ꯧ鞁臣膀볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀臣龁臣醼胣醼볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣蒐볯꺼볯꾁诧讫臣ꚁ냦ꂴ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣ꞁ臣讂볯誏臣袼볯醼볯ꊂ菣뢂菣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀臣貂苣꺁鿥꺁臣貂臣貂臣閁苣ꮁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂苣蚁臣꺽迦閁苣鞾苣芀뻤袁臣膀볯醼裢ꊂ菣ꮂ菣벃菣꺁苣ꮃ苣것菣몟臣閁苣ꮁ苣궂苣몟臣꺽迦閁苣ꚁ胣鶁苣麁苣꺁苣ꪃ菣궃苣ꮃ뷧鮏鿥銂룤袁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꢔꫨ貀苣ꮃ苣것菣趀臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀鯧階臣龁臣蚈닥階ꏩ貒苧隌냦ꂴ臣覂볯ꒁ臣뒰듧龎귥銂駩뮎臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁꫨ躰臣貂苣붣鋥貺뻤궂賥뒰듧ꦃ苣ꮂ菣銂ꇨ鞁胣ꆃ菣것菣膀苣膃菣뎃胣ꒂ苣鞃菣钃菣뎃臣ꦁ臣袂臣ꚁ뻤몤臣貂苣芀胣ꎼ뷯銈뷯ꊂ菣궂菣뎃胣ꢁ臣蚁铧麪迥뎁胣ꎼ뷯銈뷯膽뷯讽裢趀臣蒁臣ꖎꃩ麾臣膀뷯讀臣馽胥꺁雩꺁苧ꂴ苣覜臣讂苣ꮃ苣것菣몟苣ꢡ臣芀뷯꺁뻤ꢁ臣讂胥꾁胣醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣誏臣隼臣芁苣膀뷯꺁뻤ꢁ臣讂胥꾁볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯邼胣醼볯膀볯钼胣醼볯膀볯颼胣뺁臣꾁볯邼臣芁苣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯膀볯醼裢醼볯膀볯銼裢銼볯膀볯銼裢隼胣ꎼ볯銈볯邼胣뺁臣꾁볯銼裢銼볯ꊂ菣궂菣뎃볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣ꮃ苣것菣꾁胣ꊂ菣궂菣몟臣ꊖ臣ꚁ볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟臣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂뻥讂胣貐꟦ꮁ胣뮻蓦꺁鿥ꮁ믤醁諥袁苣貂臣ꖎ냥麾胣銈苣뎃胣꾁胣鶁臣몟臣貺뻤몟臣芁苣鎁臣銂ꓧ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†믤辄臣꺽迦閁苣龁苣ꮃ苣ꮃ迥뎁苣ꮃ苣것菣몟臣麝駩骮髧ꪁ뻤ꢁ臣ꚁ胣ꊂ苣ꮃ苣龃菣ꊂ菣궂菣膀苣랂菣ꪂ苣랂苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣궂菣膀苣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ菣ꎂ菣ꮃ胣ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣ꊂ菣궂菣膀苣龃菣ꊂ菣궂菣膀苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ胣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ苣ꮃ胣ꮂ菣鲃苣랂苣龃菣ꊂ菣궂菣膀菣궃苣ꮃ苣ꮃ胣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣ꮃ胣醃菣閃菣ꪂ菣ꊂ菣궂菣膀迥뎁苣ꮃ菣ꊂ菣궂菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ苣ꮃ苣龃菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣ꊂ菣躃鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣랂菣몟臣芁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣躃鿥貁臣覂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣것菣몟苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣ꚁ臣讂苣꺁볯馁臣辂臣膀裢ꊂ菣궂菣銈볯袼볯꺼볯覼裢ꎼ볯꾼볯銈볯膀볥궸胣늼臣ꢼ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯膀볯醼裢醼볯节臣辁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ鿥袼뻤袁臣较菣ꊂ菣궂菣覼臣芁苣膀볯꺼볯꾁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꢁ臣誂臣芁苣覼苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ苣ꮃ苣龃菣ꊂ菣궂菣몟臣膀볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯鎼胣醼胣銼볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯鎼胣銼胣銼볯膀臣龁臣銼胣钼볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀뷥늩苣ꮃ苣것菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣誁苣膀臣ꒁ볯뺁臣꾁觥風苣龃菣몟臣銈볯ꢼ볯뺁臣꾁裢꺼볯늼볯醼臣芁苣膀볥궸胣늼볯醼臣겋ꯧ鞁臣꾼볯膀볯꾼볯膀볯ꢼ볯膀볯늼볯銼볯膀볯꾼볯꾼볯꺼볯膀볯꾼볯늼볯銼胣뎼볯늼볯銼胣ꊂ菣궂菣膀苣ꪃ菣ꮃ胣ꊂ苣ꮃ볯设臣낁苣뮂菣ꮃ胣袃菣閃菣ꪂ菣ꊂ苣膃菣膀臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣隻臣ꊂ苣ꮃ볯膀臣龁臣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣궂菣ꞁ臣誂胣蒐볯꺼볯꾁볯膀苣ꮃ苣ꮃ胣뺁臣꾁苣ꪃ菣ꮃ臣芁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ苣ꮃ苣궂苣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣뢅듧龎귥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣랂菣몟臣芁臣ꚁ胣鶁臣뢅듧龎귥貁臣覂臣ꊂ菣궂菣뎃鿥銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣蒁苣节臣袼臣ꪁ苣ꆁ胣銈苣ꮃ苣ꮃ裢꾼裢ꎼ볯꾼볯銈볯膀볥궸胣늼臣ꢼ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯膀볯醼裢醼볯节臣辁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ鿥ꞁ臣讂볯銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣랂菣ꪂ苣랂苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣뎃鿥꾁胣겋ꯧ鞁臣膀볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣膀臣覂臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ苣궂苣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣ꊂ菣뎂苣랂鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁볯讀臣钼볯讀臣鎖臣궂듧袼뻤袁臣銼胣醼볯뺁臣꾁볯鲀볯邼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢醼볯ꊂ菣궂菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣誏臣趉꣨ꊂ菣뎂苣랂臣鶁苣麁苣膀볯讀胣銼胥膀볯讀臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣ꮃ鿥袼뻤袁臣銈苣ꮃ苣ꮃ裢ꎼ볯꾼볯銈볯늼胣込룤膀볯꾁胣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯邼胣ꎼ볯銈볯邼胣뺁臣꾁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ鿥ꞁ臣讂볯銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ臣鎼胣钼볯讀臣궂듧袼뻤袁臣鎼胣醼볯膀볯鲀볯鎼胣鎼胣醼볯膀볯鲀볯醼胣뺁臣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯醼裢醼볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯醼裢醼볯ꊂ菣궂菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀郥ꊂ菣궂菣몟迥뎁苣ꮃ苣궂苣몟臣閁苣ꮁ胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣銃菣궃苣랂鿥覼臣膀诧讫臣ꚁ뷧鮏臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣ꊂ菣궂菣몟臣膀볯鲀볯銼胣銼胣銼볯膀臣龁臣銼胣钼볯讀臣궂듧銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣蒐苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣龃菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣龃菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀뷥늩苣ꮃ苣ꮃ迥뎁苣龃菣꾁臣貂臣貂胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣ꎼ볯銼볯ꆼ胢뮼볥궸胣늼볯馀臣膀볯膽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣붼胣设臣낁苣ꮃ菣궂苣膀迥뎁볯뺁臣꾁볯鶿귨몟볯ꞁ胣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꮂ菣邃菣ꒂ菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀觥風苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ菣궂苣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀觥風苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁臣节苣辁胣趉꣨ꮂ菣鲃苣랂鿥꾁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁볯鶿귨몟臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣躃苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꮂ菣鲃苣랂臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣躃苣ꮃ苣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣趉꣨ꮂ菣鲃苣랂胣ꊂ菣궂菣膀迥뎁苣龃菣꾁臣貂臣貂胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣ꎼ볯銼볯ꆼ볯込룤膀볯ꆼ胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯莽볯뒰듧膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯膀뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂胣誏臣込臣龁臣꺼뿤랭鿥膀迥뎁볯뺁臣꾁볯鶿귨몟볯ꞁ胣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀菣궃苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀菣궃苣뎃鿥袼臣ꪁ苣ꆁ볯膀볯貽胣ꊼ뷯膀臣龁臣ꦼ볯ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣较菣ꊂ菣궂菣꾁볯膀볯膀볯膀臣龁臣袼볯궂듧ꖻ룤꺁苣ꮃ苣ꮃ鿥꺁ꃥ袐臣覼볯讀臣较菣늂菣ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣较菣ꊂ菣궂菣몟臣꾁胣醃菣閃菣ꪂ菣ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣銈볯ꚼ볯覼胣銈볯ꢼ볯銼胣銈볯ꢼ볯ꚼ胣銈볯ꎼ뷯鎼胣銈볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯銽胣銈볯ꢼ볯ꎼ볯袼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯銽볯ꎼ볯鎼胣誏臣銈볯ꢼ볯ꎼ볯鎼臣薌郥閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣较菣ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣ꊂ菣궂菣몟臣ꊖ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀볯鲀볯讀臣銃菣궃苣랂鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣龁臣鞁胣ꊂ菣궂菣몟臣颍룤꺁苧ꂴ臣邵郥鞁臣蒁苣銃菣궃苣랂鿥꾁볯ꒁ苣誸鯥覂臣蒁苣꺁臣馁苣芀菣覃菣궂苣ꊂ菣궂菣몟臣膀菣覃菣궂苣ꆃ菣ꮃ胣뢂菣覃菣궂苣鞃菣钃菣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣ꊂ菣궂菣몟臣ꊖ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟볯设臣낁볯鶿귨몟볯ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀苣ꮃ苣ꮃ鿥ꮁ뗧袐臣ꚁ臣讂郥뒰듧ꦃ苣ꮂ菣貁菣莃듧ꦃ苣ꮂ菣ꞁ뷧趁迦袁苣貂臣蒁苣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣醃菣閃菣ꪂ菣ꊂ菣궂菣몟臣膀菣ꪃ菣ꮃ苣궃菣膃菣膀菣뎃苣閃菣ꪂ菣ꢂ菣ꮃ臣ꦁ臣袂臣ꚁ뻤몤臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣릂菣鮃苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀裢뎼볯鎼볯꺁苣ꮃ菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁臣节苣辁胣趉꣨릂菣鮃鿥꾁臣覂臣膀볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁볯鶿귨몟볯设臣낁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣节臣覼臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 貀苣ꮃ苣讃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣ꖈ껦꺁賦骮臣芁苣뒠郥銂駩趁胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣궂듧銈苧ꂴ뫤趇뗧銂郥覜臣讂볯鲀볯邼苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯邼苧ꂴ볯꺁룤ꆾ臣뒛軩뺁臣꾁裥邲軩몟苣ꢡ臣膀苣蚃菣ꮃ胣醼裢鞃菣骃菣ꮃ胣銼裢鞃菣骃菣ꮃ胣銼裢ꆃ菣ꮃ裢醼裢鞃菣骃菣ꮃ胣醼裢隃菣讃菣膀볯銈菣蚃菣ꮃ臣ꦁ臣袂臣ꚁ뻤몤臣貂苣芀苣ꮃ苣讃菣꾁苣릂闧Ꞁ뷤ꢁ菣ꦃ菣릂闧Ꞁ뷤꺁룤릖苣薌郥馁苣芀苣ꮃ苣讃菣몟臣膀苣龃菣膀苣ꪃ菣ꮃ胣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ胣뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼胣뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣设臣ꪁ苣ꊂ菣궂菣꺽迦몟臣蒁臣貂臣讁苣겋ꯧ鞁臣뢁諦閁苣讂볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣꺽迦몟臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†믤辄臣꺽迦閁苣龁苣ꮃ苣讃菣몟臣麝駩骮髧ꪁ뻤ꢁ臣ꚁ胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣놂菣ꮃ胣ꊂ菣躃苣ꮃ苣讃菣膀迥뎁菣覃菣궂苣ꊂ菣놂菣ꮃ臣馌臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣讃菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣讃菣몟볯设臣낁裢ꊂ菣놂菣ꮃ裢ꎼ볯꾼볯銈볯늼胣込룤膀볯꾁胣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯邼胣ꎼ볯銈볯邼胣뺁臣꾁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ鿥ꞁ臣讂볯銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣讃菣꾁胣钼胣钼볯讀臣궂듧袼뻤袁臣钼胣醼볯膀볯鲀볯鎼胣钼胣醼볯膀볯鲀볯醼胣뺁臣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣놂菣ꮃ胣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣蒐苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣놂菣ꮃ胣誏臣ꊂ菣뎂苣랂鿥貁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣銃菣궃苣랂鿥覼臣膀诧讫臣ꚁ뷧鮏臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣躃苣ꮃ苣讃菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣龃菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣놂菣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣趉꣨ꊂ菣놂菣ꮃ迥뎁苣龃菣꾁臣貂臣貂胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣ꎼ볯銼볯ꆼ볯込룤膀볯ꆼ胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯莽볯뒰듧膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯膀뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂胣誏臣込臣龁臣꺼뿤랭鿥覼臣膀臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣讃菣趀鿥꾁胣醼胣鎼胥꺁菣覃菣궂苣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣놂菣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣龁臣鞁胣ꊂ菣궂菣몟臣颍룤꺁苧ꂴ臣邵郥鞁臣蒁苣銃菣궃苣랂鿥꾁볯ꒁ苣誸鯥覂臣蒁苣꺁臣馁苣芀菣覃菣궂苣ꊂ菣놂菣ꮃ鿥꾁胣뢂菣覃菣궂苣鞃菣骃菣ꮃ胣銃菣궃苣랂苣붂菣뎃菣讃菣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣讃菣몟臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀苣ꮃ苣ꮃ臣ꊖ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟볯设臣낁볯鶿귨몟볯ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†胣ꊂ菣궂菣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀苧ꂴ裢궂듧覸蟩邵郥銂郥覜臣讂볯鲀볯邼苧ꂴ軥邭볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯膀臣龁臣銼胣醼볯궂듧覼臣肸뻤꺁鯧階臣龁臣蚈닥階鿥銂ꇨ鞁胣ꢂ菣讃菣膀볯銈菣궃菣讃菣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥꾁胣ꊂ菣벃菣膀苣꾂菣ꊂ菣궂菣膀臣龁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂菣蚃菣랂苣ꪃ菣袼뻤袁臣颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯膀臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뻤ꢁ臣讂苣ꮃ苣ꮃ뷧鮏鿥꺁臣骁苣讁臣覂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁뷧鮏鿥ꞁ믤辄臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥꺁鷩邙껥蒚臣设臣鞁臣膀苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣讃菣膀苣龃菣ꊂ菣궂菣ꮃ胣誏臣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣讃菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣궂菣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥銂ꇨ馁볯设臣낁裢ꊂ菣궂菣ꮃ裢ꎼ볯꾼볯銈볯늼胣込룤膀볯꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢銼볯膀볯醼裢醼볯膀臣龁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣몟臣芁苣覼胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣讃菣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯邼胣钼胣醼볯膀볯鲀볯鞼胣钼胣銼볯膀臣龁臣钼胣鎼볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯銼裢隼苣ꮃ苣讃菣膀볯醼裢醼볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯銼裢醼볯ꊂ菣궂菣ꮃ胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯銼裢銼볯ꊂ菣궂菣ꮃ볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀郥ꊂ菣궂菣膀苣ꮃ苣讃菣膀迥뎁苣ꮃ苣궂苣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟볯设臣낁菣覃菣궂苣몟볯ꞁ胣겋ꯧ鞁臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣龃菣ꊂ菣궂菣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣躃鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣讃菣몟苣ꢡ臣芀觥風苣ꮃ苣讃菣誏臣ꊂ菣躃臣鶁苣麁苣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀臣貂臣貂臣몟臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟볯设臣낁볯꾼볯늼볯馀볯込룤膀볯ꆼ胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯莽볯뒰듧膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯膀뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂胣誏臣込臣龁臣꺼뿤랭鿥覼臣膀臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣銃菣궃苣랂苣ꮃ苣讃菣趀鿥꾁胣醼胣鎼胥꺁菣覃菣궂苣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣龁臣鞁胣ꊂ菣궂菣몟臣颍룤꺁苧ꂴ臣邵郥鞁臣蒁苣銃菣궃苣랂鿥꾁볯ꒁ苣誸鯥覂臣蒁苣꺁臣馁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣覃菣궂苣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥꾁胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣ꊂ菣궂菣ꮁ雩鞁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣꾼뿤랭鿥覼臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꢔꫨ貀苣龃菣趀臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀裢꺼볯늼볯醼볯銼苣ꢡ臣膀볥궸胣蒐볯꺼볯꾁诧讫臣ꚁ胣ꢼ胣꾼볯膀볯꾼볯膀볯袼볯꺼볯覼볯膀볯꾼볯꾼볯꺼볯膀볯꾼볯늼볯銼胣뎼볯늼볯銼胣꺼뿤랭鿥膀苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣놂菣ꮃ胣ꊂ菣궂菣ꮃ胣ꊂ菣뎂苣랂胣ꊂ菣벃菣膀苣ꮃ苣ꪃ菣ꮃ胣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ胣膽뷯讽苣꾂菣ꊂ菣궂菣膀苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣膀믤辄臣꾼뿤랭鿥膀뻤袁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣몟臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣蒁臣貂臣ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁苣节臣覼胣릂菣鮃苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ苣ꮃ볯设臣낁苣뮂菣ꮃ胣袃菣閃菣ꪂ菣ꊂ苣膃菣膀臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂믤꺁苣랂菣覼胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣膀믤辄臣꾼뿤랭鿥膀뻤袁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣몟臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣蒁臣貂臣ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁苣节臣覼胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼胣뺁臣꾁뷯貽뷯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁뷯貽뷯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯ꞁ臣讂臣袼裥馌臣龁臣貂苣꺁볯꺼볯몟臣鶁苣麁苣꾁胣뮻蓦ꞁ胣蒐鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣蚁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣覼胣뺁臣꾁볯ꒁ臣늼볯醼臣ꢅ뷤ꢁ臣ꚁ菣蚃菣랂苣ꪃ菣뺁臣꾁볯鶿귨몟苣ꊽ裦鞁胣蒐볯꺼볯꾁诧讫臣ꚁ胣ꢼ胣ꊂ菣궂菣膀臣龁臣ꊂ菣벃菣ꞁ臣讂胣겜駧躘臣ꊂ菣躃鿥꾁胣ꆄ뷧鮏苣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯銼볯ꞁ臣讂臣膀뷧鮏苣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯늼볯醼볯銼볯ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣붥臣鞁臣肸껥붖뷥讅臣꾁胣ꊂ菣躃臣銈볯ꢼ볯뺁臣꾁裢꺼볯늼볯醼臣芁苣膀臣꺁ꃥ袐胣늼볯醼臣겋ꯧ鞁臣膀볯ꢼ胣꺼볯銼胣꺼볯銼胣꺼볯꺼볯銼胣뎼볯銼볯늼볯銼胣뎼볯銼볯꺼볯膀볯꾼볯꺼볯膀苣ꮃ苣ꮃ胣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ苣ꮃ胣릂菣鮃苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ苣ꮃ볯设臣낁苣뮂菣ꮃ胣袃菣閃菣ꪂ菣ꊂ苣膃菣膀臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂믤꺁苣랂菣覼胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣钽裢隃菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ볯뺁臣꾁苣ꪃ菣ꮃ臣芁臣ꚁ胣蒐볯꺼볯꾁胣ꢼ胣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣芁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣躃鿥꺁鷩邙껥蒚臣设臣鞁臣膀苣랂菣ꊂ菣躃迥뎁苣ꮃ菣龃菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ苣ꮃ苣龃菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣龃菣몟苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ苣ꮃ鿥袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯늼볯醼볯銈볯袼볯覼裢늼胣込룤膀볯꾁볯뺁臣꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼胣ꎼ볯銈볯邼胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣몟볯设臣낁菣궃苣ꮃ苣ꮃ볯ꞁ臣誂胣늼볯醼臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂臣誁苣ꞁ臣讂볯銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣랂菣ꊂ菣躃鿥꾁胣醼胣钼볯讀臣궂듧袼뻤袁臣醼胣鞼胣醼胣醼볯膀볯鲀볯醼胣銼胣鞼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯醼胣뺁臣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣趉꣨ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣ꚁ臣誂胣讁臣込臣龁臣趉꣨ꊂ菣躃鿥꾁裢꺼볯銼臣龁臣銈볯ꢼ볯꺼볯ꞁ臣誂胣鎁臣뒠郥膀볯꺼볯꾁诧讫臣ꚁ胣꾼볯膀볯꾼볯膀볯ꢼ볯膀볯늼볯銼볯膀볯꾼볯꾼볯꺼볯膀볯꾼볯늼볯銼胣뎼볯늼볯銼胣ꊂ菣궂菣膀苣ꪃ菣ꮃ胣ꊂ苣ꮃ볯设臣낁苣뮂菣ꮃ胣袃菣閃菣ꪂ菣ꊂ苣膃菣膀臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂믤꺁苣랂菣覼胣뺁臣꾁苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ臣芁臣ꚁ胣蒐볯꺼볯꾁볯膀苣ꮃ苣ꮃ胣뺁臣꾁苣ꪃ菣ꮃ臣芁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꮂ菣邃菣ꮃ胣몟臣膀꟦ꂀ裢꺼볯꺼볯ꎼ볯鶼볯覼볯늼臣龁臣銈볯ꎼ볯鶼볯覼볯袼볯꺼볯覼볯銂鳦馁苣ꮂ菣邃菣벃菣몟苣螌臣膀볥궸胣蒐볯꺼볯꺁蓦뎑臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣貀苣龃菣趀臣骮뻧ꮁꛨ蒁臣閁苣膀볯꾁胣ꊂ菣궂菣膀苣꾂菣ꊂ菣궂菣膀뷯貽뷯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣벃菣膀苣ꮃ苣ꪃ菣ꮃ胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼胣뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣膽뷯讽菣蚃菣랂苣ꪃ菣袼뻤袁臣膽뷯讽菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂胣ꊂ菣躃藩趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣뒁軩膀苣龃菣몟胣誏臣뢅鿥袼뻤袁臣銈볯꾼볯ꢼ臣ꮂ菣鲃苣랂鿥뺁臣꾁裢뎼볯鎼볯꺁苣ꮃ菣몟볯銂鳦馁苣蚈귥銂賦鞁胣鎁臣ꞁ苣龃菣뢅臣膀臥階胣ꊂ菣躃鿥膀臣龁臣뢅鿥袼뻤袁臣뒁軩覼臣袂臣ꚁꛨ蚈귥ꮁ迥誂믤醁苣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苣龃菣뢅臣ꮂ菣鲃菣ꮃ鿥ꮁ苣ꎁ臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂胣鎁臣ꞁ臥階臣龁臣ꊂ菣躃鿥꾁觥風苣ꮃ菣讃菣몟臣随苣颻臣覂苣讂胣设臣ꪁ苣뒁軩ꢁ臣ꚁ胣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣궂菣膀苣ꪃ菣ꮃ胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ胣ꊂ菣ꮂ菣벃菣膀뷯貽뷯颃菣궃苣꾂菣ꮃ胣ꊂ菣躃苣ꮃ苣ꮃ胣ꮂ菣邃菣ꒂ菣ꊂ菣궂菣膀迥뎁苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣궂菣貁賦銁苣貂苣芀뻤ꢁ臣讂苣龃菣뢅臣鞁臣膀苣ꦃ菣뎃胣ꊂ菣꺂菣뎃胣ꊂ苣醃菣꺂菣膀苣릂菣ꦃ苣뎃藩膀苣릂菣ꒂ菣膀苣ꮃ苣龃菣뢅胣낂菣뾂菣뎃胣낂菣랂菣膀菣릂菣뢂菣膀菣覃菣궂苣躃菣邃菣뎃胣ꒂ苣궃苣랂菣膀菣ꒂ苣뎃胣ꪃ苣뎃胣ꆃ菣ꪂ菣뎃胣躃菣邃菣뎃胣ꪂ菣讃菣뎃胣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣膀菣궃菣뎃胣钃菣벃菣ꪃ苣뎃胣뮂菣躃苣릂菣ꒂ菣膀苣ꪃ菣膀苣Ꚃ菣뎃胣릂菣ꪂ菣뎃胣袃菣鞃菣閃苣뎃胣膃菣랂菣膀迥뎁菣ꪃ菣貁賦銁苣貂苣芀苣龃菣뢅鿥꾁胣뮻蓦ꞁ胣ꆬ臣馌臣讂鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣醼胣銼胣鎼胣뺁臣꾁볯銼苧ꂴ믤誸臣ꊂ菣躃藩몟臣뒠郥꾁볯钼胥꺁뷧鮏鿥ꞁ믤辄臣꺽迦閁苣龁볯袼볯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣鮼볯鎼볯겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣龃菣袼뻤袁臣ꆄ뷧鮏苣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯銼볯뺁臣꾁뷧鮏苣龃菣袼臣ꪁ苣ꆁ裢꺼볯늼볯醼볯銼胣込룤膀볯꺼볯꾁苣龃菣ꮁ雩鞁臣骮뻧鞁臣ꢁ臣誂臣芁苣覼볯袼볯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣鮼볯閼볯ꊂ苣覃볯袼볯覼菣궃볯袼볯覼볯ꎼ볯銈볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꪂ苣랂볯袼볯覼菣覃菣궂苣鮼볯馼볯讃菣궃볯袼볯邼볯ꪂ苣붂볯设臣낁苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣螃菣覃臣龁臣ꊂ苣ꮃ볯鮼볯醼볯覼볯醼裢鞼苣钃菣랂苣ꪃ菣鮼볯醼볯覼菣ꪂ苣ꮃ苣궂苣鮼볯醼볯覼菣ꪂ菣ꮃ볯袼볯钼볯銈볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀볯ꆼ胢꾁胣ꖻ룤꺁鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣骼볯膽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯銈볯늼볯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯覼뷯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯꺼볯꺼볯꺁苣龃菣銈菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀郥늼볯醼臣膀诧讫臣ꚁ냦ꂴ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣ꞁ臣讂볯袼볯閼볯銈볯袼볯覼볯늼볯馀볯ꎼ胢膀볥궸胣늼볯馀迥뎁볯ꎼ胢꺁臣貂臣貂臣膀볯膽볯뒰듧膀볯芽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢뎼볯銼볯꒼胢膀볥궸胣늼볯馀臣膀볯膽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯蒽볯銃菣궃苣랂臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼볯鞼볯銈볯꾼볯꺼볯ꖼ胢늼볯馀胣込룤膀볯ꖼ胢誏臣늼볯馀臣鶁苣麁苣꾁胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢ꎼ볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀볯Ꞽ胢꾁胣ꆬ臣馌臣讂鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣骼볯膽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯銈볯늼볯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯覼뷯醼볯ꎼ볯銼볯鎽볯꺼볯꺼볯꺁苣龃菣銈菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀郥늼볯醼臣膀诧讫臣ꚁ냦ꂴ臣龁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣ꞁ臣讂볯袼볯馼볯銈볯늼볯馀볯袼볯覼볯ꦼ胢膀볥궸胣늼볯馀臣袼뷯醼볯뒰듧誏臣袼뷯醼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂胣늼볯馀臣膀곦ꮁ賦銁苣몟臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯设臣낁볯銼裢隼苣ꮃ苣讃菣覼胣袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯銼볯뒰듧膀볯薽볯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯覼苣龃菣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣膀볯螽볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯覼裢꺼볯꺼볯袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯ꎼ볯銼볯ꢼ볯꾼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼볯醼臣ꊂ菣躃裢鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣込룤膀뷯醼臣醼胣醼볯袼뻤袁臣醼胣隼臣龁臣醼胣钼볯꺁闦낕臣芁苣膀뷯銼迥뎁뷯鎼臣鶁苣麁苣꾁胣겋ꯧ鞁臣膀볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀臣龁臣醼胣醼볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣蒐볯꺼볯꾁胣겋ꯧ鞁臣뒰듧뺁臣꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣鮼볯銼볯覼裢꺼볯ꪼ胢ꎼ볯꾼볯꾼볯ꮼ胢膀볥궸胣늼볯馀臣袼뷯醼볯뒰듧誏臣袼뷯醼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂胣늼볯馀臣膀곦ꮁ賦銁苣몟臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯膀볯芽볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯设臣낁볯銼裢隼苣ꮃ苣讃菣覼胣袼뷯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯銼볯뒰듧膀볯薽볯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯蚽볯覼苣龃菣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣膀볯螽볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯꾼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼胢꺁菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀볥궸胣鎽볯꾁볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯뺁臣꾁볯鲀볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣鎽볯誏臣鎽볯꺁臣貂臣貂臣膀诧讫臣ꚁ胣邼胣醼볯袼뻤袁臣邼胣钼胣邼胣隼胣醼胣钼胣醼胣隼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼볯꺁闦낕臣芁苣膀볯馀臣ꢼ臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣膀迥뎁볯袽볯覼裢꺼볯꺼볯袼볯ꢼ볯覼뷯銼볯ꎼ볯銼볯ꢼ볯꾼볯鎽볯袼볯ꢼ볯覼뷯鎼볯늼볯醼臣ꊂ菣躃裢鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣込룤膀뷯醼臣醼胣醼볯袼뻤袁臣醼胣隼臣龁臣醼胣钼볯꺁闦낕臣芁苣膀뷯銼迥뎁뷯鎼臣鶁苣麁苣꾁胣겋ꯧ鞁臣膀볯鲀볯邼볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯膀臣龁臣醼胣醼볯覼臣뒕闦ꞁ臣誂胣蒐볯꺼볯꾁胣겋ꯧ鞁臣뒰듧뺁臣꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ臣芁苣鮼迥뎁볯銼볯覼苣龃苣뎃胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣鎁苣覂臣몟臣鶁苣麁苣꾁臣覂臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣袂臣ꮁ믤辄臣꺽迦閁苣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†胣ꊂ菣벃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣醼臣뺁臣꾁볯ꒁ臣뎊ꛩ낒苣覜臣讂跥낒볥膀뫤낒볥膀臣龁臣骤鋧込苣ꮃ菣랂苣ꪃ菣낒돧銂ꇨ馁胣ꊂ菣벃菣꾁胣閃苣讃菣膀菣閃菣ꮃ胣醼볯銼裢뢂菣覃菣誃菣膃菣膀볯貼볯貼볯貼볯銈菣袃菣銃菣궃菣閃菣ꮃ胣ꊂ菣袃菣뮂菣ꮃ胣閃苣誃菣袃菣讃菣膀菣ꮃ苣것菣ꮃ胣ꒂ菣肃菣ꮃ胣ꒂ菣螃菣ꮃ臣ꦁ臣袂臣ꚁ뻤몤臣貂胣뮻蓦ꞁ胣袼볯覼볯醼裢鞼苣랂菣袼뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ菣銃菣覼볯袼볯覼볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀苣뢂菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣螃菣覃볯銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣较菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯膀菣覃菣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣讃菣궃裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣覼볯袼볯覼볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣膀뻤袁臣醃菣閃菣ꪂ菣ꊂ菣뎂苣랂볯鮼볯钼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣鮼볯閼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯袼볯覼苣龃菣鮼볯鞼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯袼볯覼苣뢂菣鮼볯馼볯ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯袼볯邼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯袼볯醼볯较菣鮼볯醼볯覼볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁볯醼裢醼볯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯鮼볯醼볯覼볯ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣궂苣鮼볯醼볯覼菣覃菣궂苣鮼볯醼볯覼菣袃菣鮼볯醼볯覼볯醼裢銼볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁볯醼裢隼菣ꪂ苣ꮃ苣궂苣覼볯袼볯鞼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꆼ胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯莽볯뒰듧膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼볯颼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯늼볯馀볯ꎼ胢膀볥궸胣醽臣邼胣钼臣뒕闦ꞁ臣誂胣늼볯馀迥뎁볯ꎼ胢꾁胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣겋ꯧ鞁臣뢁諦閁苣讂볯袼볯馼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯꒼胢꾁胣袼뷯覼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯莽볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼볯邼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯꺼볯ꖼ胢늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꖼ胢誏臣늼볯馀臣鶁苣麁苣꾁胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣겋ꯧ鞁臣뢁諦閁苣讂볯袼볯醼볯膃苣벃菣鮼볯銼볯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣ꪂ苣랂볯袼볯鎼볯ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯鮼볯銼볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯誏臣袼볯鞼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣膀볯膀볯膀볯膀볯膀臣龁臣閼胥꺁뷧鮏鿥ꞁ믤辄臣꺽迦閁苣鞾苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀臣貂苣꺁鿥꺁臣貂臣貂臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣袂臣ꮁ臣覂臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣芀뻤袁臣膀볯醼裢ꊂ菣ꮂ菣벃菣뺁臣꾁볯醼裢膽뷯讽菣蚃菣랂苣ꪃ菣꺁苣ꮃ苣것菣몟臣ꪂ苣붂鿥ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣ꚁ胣鶁苣麁苣꺁苣ꪃ菣궃苣ꮃ迥뎁볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꪂ苣ꮃ뷧鮏鿥銂룤袁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣뎃鿥銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꪃ菣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁胣鞼胣鎼볯궂듧袼뻤袁臣鞼胣醼볯뺁臣꾁볯鲀볯邼苧ꂴ胣设臣낁볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯醼裢醼볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣뎃迥뎁苣ꪃ菣ꮃ臣鶁苣麁苣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀臣貂臣貂臣몟臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟臣膀臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀胣膽뷯讽裢趀臣蒁臣ꖎꃩ麾臣趉臣颻臣ꚁ臣讂믤꺁鿥节郥颁苣蚁臣骮뻧閁苣膀臣鎁臣貀뷯貽뷯趀臣膀裥떮臣ꢳ꣨貁臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀볯醼裢隼苣ꮃ苣것菣銂賦鞁胣随苣颻臣覂苣讂賥ꚭ꟦ꂀ臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂臣誁苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†铧麪胣ꊂ苣覃胣꾁裢꺼볯몟苣ꢡ臣膀臣貂臣銈볯鶼볯鶼볯ꢁꇨ馁臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†胣貺鋧込胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀諨馦韦ꞁ臣ꎁ臣节鷩뎊ꛩ辗臣芁臣ꚁ苣袂臣銼臣꺁鋧銂鳦馁苣讧胩銂賦馁胣貺鋧込꟦ꂀ臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣릂菣궃苣꾂菣ꮃ鿥膀迥뎁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁黦让苣놅鳦馁苣銼臣꺁鋧銂賥ꮐ臣膀臣꺁苣蚁臣뚞ꧦ꾁胣醼軥邭苣ꮐ苣讁胣뺁臣꾁볯讀胣鎼胥节臣辁臣鶁苣ꖻ룤꺁軥邭苣ꮐ苣階苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀뻤ꢁ臣讂뫤낒볥몟臣鞁臣膀곧醼鋧ꢁ곧銼鋧貁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꮂ菣鲃苣꾂菣ꮃ鿥ꞁ臣讂뫤낒볥ꮂ菣鲃苣꾂菣ꮃ鿥鮼곧醼鋧ꢁ곧銼鋧貁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣벃菣몟臣芁苣貺鋧込苣ꪃ菣ꮃ鿥鮼곧醼鋧貁菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟臣芁苣膀곧銼鋧貁苣ꮃ菣랂苣ꪃ菣袼뻤袁臣ꊂ菣벃菣覼臣龁臣颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼鿥ꞁ臣讂뫤낒볥颃菣궃苣꾂菣ꮃ鿥鮼迥뎁곧醼鋧貁菣蚃菣ꊂ菣벃菣몟臣芁苣膀곧銼鋧貁苣ꮃ菣랂苣ꪃ菣袼뻤袁臣ꊂ菣벃菣覼臣龁臣颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼鿥ꞁ臣讂뫤낒볥颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ鿥貁賦銁苣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀뫤낒볥몟臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀苣꾂菣ꊂ菣궂菣膀菣蚃菣랂苣ꪃ菣膀迥뎁苣ꪃ菣ꮃ鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†胣鲃菣讃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣銈볯袼볯ꊼ볯覼볯銂ꇨ鞁胣込룤膀郥늼볯醼臣膀볯誏臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣궂菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣ꦃ菣ꮃ鿥꾁胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣ꊂ菣궂菣ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†胣궂듧낒볥趀迥뎁胣ꮂ菣鲃苣꾂菣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀믤辄臣꺽迦閁苣龁볯鎼裢醼볯颍鋧込胣貺鋧込胣뺁臣꾁룤낒볥讧胩ꞁ臣ꎁ臣膀鋧꾁諨馦韦ꞁ臣ꎁ臣节鷩뎊ꛩ辗臣芁臣ꚁ苣袂臣膀臣貂苣꺁鋧貁苧ꂴ軥邭臣ꊽ裦閁苣ꚁ臣讂苣꺁苣螌臣芀苣ꮃ菣랂苣ꪃ菣讧胩ꮁ臣膀苣꾂菣ꊂ菣궂菣膀苣꾂菣ꊂ菣놂菣ꮃ胣랂苣궃苣ꮃ苣讃菣膀迥뎁苣ꪃ菣ꮃ鿥貁郥뺁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†胣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀볯袼볯覼鿥銂ꇨ鞁胣鎁苣꾁볯鶼볯ꢁꇨ馁臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†胣ꮂ菣鲃苣랂胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀裢ꎼ볯銼볯銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†胣랂苣躃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀裢ꎼ볯몟苣ꢡ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 貀苣꾂菣ꊂ菣궂菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣ꖈ껦꺁賦骮臣芁苣뒠郥銂駩趁볯鲀볯궂듧꺁룤ꆾ臣붣鋥뺁臣꾁룤붣鋥麝諨馦韦낒볥궂賥뒰듧ꦃ苣ꮂ菣銂ꇨ鞁胣랂苣궃菣궃菣ꮃ胣랂苣궃菣膃菣膀苣꾂菣骃菣膃菣膀苣꾂菣颃苣랂菣膀苣꾂菣颃菣膃菣膀뫤낒볥颃菣膃菣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣궂듧銈苧ꂴ뫤趇뗧袐苣ꮐ苣릂臣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥ꢁ臣꾔룤꺁鯧閁臣芁苣뒠郥꾁胣鶁臣몟苣貀苣꾂菣ꊂ菣놂菣ꮃ胣몟臣蒁臣芀鳦몙飦ꮁ臣蒁臣ꊂ菣벃菣몟臣랂苣궃苣ꮃ苣讃菣讁苣꒙ꓥ閁苣讂胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣궂듧銈苧ꂴ룤趇뗧袐苣ꮐ苣릂臣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥ꢁ臣꾔룤꺁鯧閁臣芁苣뒠郥꾁胣鶁臣몟苣貀苣꾂菣ꊂ菣궂菣ꮃ胣몟臣蒁臣芀뻤ꢁ臣讂苣꾂菣ꊂ菣놂菣ꮃ鿥ꢁ臣ꚁ胣랂苣궃菣뎃菣讃菣膀苣꾂菣颃苣뮂菣ꮃ臣ꦁ臣馌臣覂苣讂胣겜駧躘臣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁胣뮻蓦ꞁ胣袼볯覼볯醼裢鞼苣랂菣袼뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ菣銃菣覼볯袼볯覼볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀苣뢂菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣螃菣覃볯銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣较菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯膀菣覃菣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣讃菣궃裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣覼볯袼볯覼볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣膀뻤袁臣醃菣閃菣ꪂ菣ꊂ菣뎂苣랂볯鮼볯钼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣鮼볯閼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯袼볯覼苣龃菣鮼볯鞼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯袼볯覼苣뢂菣鮼볯馼볯ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯袼볯邼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯袼볯醼볯较菣鮼볯醼볯覼볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁볯醼裢醼볯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯鮼볯醼볯覼볯ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣궂苣鮼볯醼볯覼菣覃菣궂苣鮼볯醼볯覼菣袃菣鮼볯醼볯覼볯醼裢銼볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁볯醼裢隼菣ꪂ苣ꮃ苣궂苣覼볯袼볯鞼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꆼ胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀볯莽볯뒰듧膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼볯颼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯늼볯馀볯ꎼ胢膀볥궸胣醽臣邼胣钼臣뒕闦ꞁ臣誂胣늼볯馀迥뎁볯ꎼ胢꾁胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣궂菣膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯뎼볯銼볯꒼胢膀볥궸胣醽臣邼胣钼臣뒕闦ꞁ臣誂胣늼볯馀臣膀볯膽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯莽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼볯邼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯꺼볯ꖼ胢늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꖼ胢誏臣늼볯馀臣鶁苣麁苣꾁胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣궂菣膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣鮼볯銼볯覼菣ꪂ菣ꮃ볯袼볯銼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯覼볯鎼裢颼苣꾂菣ꊂ菣뎂苣랂볯袼볯钼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣뎂苣랂볯袼볯閼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣랂苣ꪃ菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣ꊂ菣벃菣覼볯袼볯隼볯ꪂ苣붂볯袼볯鞼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣鮼迥뎁볯銼볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣궂菣ꮃ臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣鎁苣覂臣몟臣鶁苣麁苣꾁臣覂臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣袂臣ꮁ뷧鮏臣貂뻥讂胣设臣낁胣ꎼ볯銈苣ꮃ苣ꪃ菣ꮃ臣龁臣ꎼ볯銈뷯貽뷯颃菣궃苣꾂菣ꮃ臣ꊂ菣궂菣뎃鿥꾁胣ꪂ苣붂鿥ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣ꚁ胣鶁苣麁苣꺁苣ꪃ菣궃苣ꮃ뷧鮏鿥誏臣袼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣ꒂ菣꺽迦몟苣躸臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣꾂菣ꊂ菣궂菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣것菣몟볯设臣낁볯鲀볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯邼胣뺁臣꾁볯鲀볯邼苧ꂴ臣ꊂ菣궂菣뎃鿥覼苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣뎃迥뎁觥風苣꾂菣ꊂ菣궂菣꾁臣貂臣貂胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ臣覂臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 貀菣궃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀蟨ꂴ胣ꦡ듧膀菣Ꚃ듧膀臣龁臣閃菣ꂴ臣覂臩麊臣貂苣较菣늂菣銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†胣颃菣궃苣ꮃ苣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀꟦邈苧ꂴ軥邭臣醼臣뺁臣꾁볯ꒁ臣銪듧膀藩ꂴ胣뺁臣꾁ꇧ蒻臣꺽臣鮏臣覂苣ꚁ臣讂鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟苣螌臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣蚃菣ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣ꊂ菣궂菣몟臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀胣颃菣궃苣ꮃ苣讃菣趀迥뎁胣颃菣궃苣ꮃ苣讃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣鶁苣麁苣膀꟦邈苧ꂴ軥邭臣醼臣뺁臣꾁볯ꒁ臣銪듧膀藩ꂴ胣뺁臣꾁ꇧ蒻臣꺽臣鮏臣覂苣ꚁ臣讂鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣놂菣ꮃ鿥誏臣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥銂賦馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣颃菣궃苣ꮃ苣讃菣몟迥뎁菣蚃菣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀苣ꮃ苣ꮃ鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂戼㹲芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣颃菣궃苣ꮃ苣ꮃ胣颃菣궃苣ꮃ苣讃菣膀迥뎁菣蚃菣ꊂ菣궂菣ꮃ鿥꺁鷩邙껥蒚臣设臣鞁臣膀苣랂菣ꪂ苣랂胣ꊂ菣놂菣ꮃ苣궂苣膀苣ꮃ苣궂苣膀苣ꮃ苣궂苣ꊂ菣뎂苣랂胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣뎂苣랂胣ꊂ菣궂菣ꮃ苣궂苣膀苣龃菣ꊂ菣뎂苣랂胣ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂胣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ苣궂苣膀苣꾂菣ꊂ菣뎂苣랂胣较菣ꊂ菣뎂苣랂胣袼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣궂苣膀菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣궂苣膀菣ꪂ苣ꮃ苣궂苣膀迥뎁菣ꪂ菣蚃菣랂苣ꪃ菣ꊂ菣궂菣貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ苣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣뢅듧龎귥銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣랂菣몟볯馁臣辂臣銈볯銈볯袼볯覼裢늼胣込룤膀볯꾁볯뺁臣꾁믤辄臣꺽迦閁苣龁볯醼裢隼胣ꎼ볯銈볯邼胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣몟臣芁苣覼苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ苣ꮃ苣궂苣몟臣醼胣銼볯讀臣궂듧袼뻤袁臣醼胣鞼臣龁臣醼胣醼볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀觥風苣ꮃ苣ꮃ鿥貁胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣놂菣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣ꖈ껦꺁賦骮臣芁苣뒠郥銂駩趁胣늼臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣몟볯设臣낁볯銼裢隼臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣覼臣芁苣膀볥銈볯늼臣隌귥꺽迦몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂苣ꮃ苣讃菣ꪂ苣랂鿥ꢁ臣ꚁ胣ꢂ菣讃菣ꪂ苣랂胣鞃菣骃菣ꮃ苣궂苣ꪁ臣貁賦銁苣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣ꮃ苣讃菣몟臣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟볯设臣낁菣覃菣궂苣몟볯ꞁ臣覂臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂胣몟臣膀裥떮臣螌껥貁臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀볯貁볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣몟볯设臣낁볯醼裢隼臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ볯ꞁ臣讂胣込裢꾼볯꺁賥ꚭ뷧鮏鿥銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꊂ菣뎂苣랂鿥ꢁ臣ꚁ胣ꆃ菣궂苣膀苣袃苣랂胣鞃菣鶃苣랂볯设臣낁뷯銈菣궃菣궂苣誏臣ꒂ苣鞃菣鶃苣랂볯膀뷯銈菣袃苣랂臣ꦁ臣馌臣覂苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣몟臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣銃菣궃苣랂臣龁臣ꊂ菣뎂苣랂볯ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣ꊂ菣뎂苣랂鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣뎂苣랂鿥銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꮃ苣궂苣ꊂ菣뎂苣랂鿥꾁볯鲀볯邼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯銼臣龁臣銼胣銼볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣뎂苣랂裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣뎂苣랂胣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢醼볯ꊂ菣뎂苣랂胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨蒐苣ꮃ苣궂苣몟臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣ꊂ菣뎂苣랂胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣몟臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣뎂苣랂鿥袼뻤袁臣銈볯銈苣ꮃ苣ꮃ裢ꎼ볯꾼볯銈볯늼胣込룤膀볯꾁胣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꎼ볯銈볯膀볯醼裢醼볯膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣ꮃ鿥ꞁ臣讂볯銂ꇨ馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣꾁볯鲀볯醼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯邼胣鎼胣醼볯膀볯鲀볯鞼胣鎼胣銼볯膀臣龁臣鎼胣鎼볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣膀볯醼裢醼볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯醼裢醼볯ꊂ菣뎂苣랂胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣銈볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂볯芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀郥ꊂ菣뎂苣랂鿥貁臣覂臣讀裥ꮁ볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣銃菣궃苣랂鿥覼臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ苣讃菣ꪂ苣랂胣몟臣膀裥떮臣螌껥貁臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀볯貁볯銼裢銼볯ꊂ菣궂菣ꮃ鿥袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯뺁臣꾁볯銼裢醼볯ꊂ菣궂菣ꮃ볯ꞁ臣讂볥銈볯늼臣隌귥꺽迦몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂苣ꮃ苣讃菣ꪂ苣랂鿥ꢁ臣ꚁ胣ꢂ菣讃菣ꪂ苣랂胣鞃菣钃菣ꮃ苣궂苣ꪁ臣貁賦銁苣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣ꮃ苣讃菣몟臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣銃菣궃苣랂鿥覼臣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣龃菣ꊂ菣뎂苣랂胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣躃鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣궂苣몟苣ꢡ臣芀觥風苣ꮃ苣ꮃ迥뎁觥風苣龃菣꾁臣貂臣貂胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥袼뻤袁臣ꎼ볯銼볯ꆼ胢뮼볥궸胣늼볯馀臣膀볯膽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣붼胣设臣낁苣ꮃ菣궂苣覼臣膀臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂胣몟臣膀藩ꂴ軥邭苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣ꮂ菣벃菣몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂鿥꾁볯鲀볯邼胥꺁苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯隼臣龁臣鞼胣銼볯讀臣궂듧覼苣ꮐ苣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣뎂苣랂胣ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ裢ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣궂苣覼胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣벃菣ꊂ菣뎂苣랂鿥꾁胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꪃ菣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣ꖈ껦꺁賦骮臣芁苣뒠郥銂駩趁胣늼胢貁볯鲀볯颼苧ꂴ臣ꊂ菣벃菣몟臣芁苣込裢꾼볯馀臣隌귥꺽迦몟苣ꢡ臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣ꪃ菣ꮃ鿥꾁胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣뎂苣랂胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꮂ菣鲃苣랂鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣궂苣몟苣ꢡ臣芀觥風苣ꮃ苣궂苣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣ꊂ菣궂菣몟臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣ꚁ臣ꚁ苣袂臣膀觥風苣ꮃ菣궂苣몟臣뮻蓦ꞁ볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁볯鶿귨몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣랂苣궃苣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣ꖈ껦꺁賦骮臣芁苣뒠郥銂駩趁胣늼臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂볯鎼裢颼苣꾂菣ꊂ菣궂菣몟臣芁苣込裢꾼볯꺁賥ꚭ뷧鮏鿥銂ꇨ馁胣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏苣꾂菣ꊂ菣뎂苣랂鿥꾁볯鲀볯궂듧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀菣궃苣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣较菣늂菣몟볯馁臣辂臣ꚼ胣ꎼ뷯膀볯銽胣뺁臣꾁볯覼臣꺽迦閁苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣뎂苣랂鿥銂ꇨ馁胣较菣ꊂ菣뎂苣랂臣膀볯膀볯膀볯膀臣龁臣袼볯궂듧ꖻ룤꺁苣ꮃ苣ꮃ鿥꺁ꃥ袐臣覼볯讀臣较菣늂菣ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣较菣ꊂ菣뎂苣랂鿥ꮁ臣膀菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣궂苣袼뻤袁臣銈볯ꎼ볯鎼볯膀裢꾼볯ꢼ볯銼胣銈볯ꎼ볯銼볯膀裢꾼볯ꎼ뷯鎼胣銈볯ꎼ볯銼볯ꢼ볯ꊼ뷯膀裢꾼볯ꢼ볯ꎼ볯袼볯ꢼ볯ꎼ볯銼볯銽볯ꎼ볯鎼胣誏臣銈볯ꎼ볯ꦼ볯ꢼ볯貁郥뺁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣较菣ꊂ菣뎂苣랂鿥꾁臣覂臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀苣ꮃ苣ꮃ鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꪂ苣랂胣몟臣膀藩ꂴ軥邭苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣颃菣궃苣꾂菣ꮃ鿥銂ꇨ馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ鿥꾁胣醼胥膀볯讀胣鎼胥뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣궂苣趀鿥꾁胣ꊂ菣뎂苣랂鿥ꮁ뗧袐臣ꚁ臣讂郥뒰듧ꦃ苣ꮂ菣貁菣莃듧ꦃ苣ꮂ菣ꞁ뷧趁迦袁苣貂臣蒁苣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣궂苣몟苣ꢡ臣芀菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣궂苣몟臣袃菣閃菣ꪂ菣ꆃ菣궂苣膀菣뎃苣閃菣ꪂ菣ꢂ菣궂苣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ菣ꎂ菣ꮃ胣몟臣膀裢뎼볯꾼볯銈鿥銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣ꊂ菣궂菣몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣몟臣醼胣隼胣醼胣醼볯膀臣龁臣醼胣銼볯궂듧ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꊂ菣궂菣몟臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣膃苣ꊂ菣벃菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣늼臣ꊂ菣벃菣ꊂ菣궂菣몟臣芁苣込裢뎼볯꺁賥ꚭ뷧鮏鿥銂ꇨ馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꊂ菣벃菣ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣膃苣ꊂ菣뎂苣랂胣몟臣膀볯貁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣몟臣芁苣込裢뎼볯꺁賥ꚭ뷧鮏鿥銂ꇨ馁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 貀菣ꪂ菣蚃菣랂苣ꪃ菣ꊂ菣궂菣趀鿥꾁胣늼臣颃菣궃苣꾂菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ鿥ꞁ臣讂볥銈볯늼臣隌귥꺽迦몟苣ꢡ臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風菣蚃菣랂苣ꪃ菣ꊂ菣궂菣몟臣閁苣ꮁ胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁鳦躘듧뢛臣風볨馁苣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꢔꫨ貀菣蚃菣ꊂ菣벃菣趀臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀諨馦韦ꞁ臣讂鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣颃菣궃苣꾂菣ꮃ臣ꢃ裥蚛郥銂ꇨ馁胣馁臣辂臣膀菣蚃菣ꊂ菣벃菣꾁胣颍鋧込臣龁臣骤鋧込鋧뮳蛥ꮁ볯躽볯銼胥꺁胏鯩邭苣ꮐ鳦馁苣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ鿥꾁볯鲀볯銼볯设臣낁볯鲀볯醼胣醼胣醼볯膀볯鲀볯膀볯鲀볯銼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯邼胣뺁臣꾁볯鲀볯覼胥꺁苧ꂴ苣覜臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟臣ꒁ臣ꚁ껥ꦾ臣龁뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 貀菣蚃菣ꊂ菣벃菣ꊂ菣궂菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂苣ꮃ苣것菣몟苣讻臣ꚁꛨ蚈귥몟臣随苣颻臣覂苣龁鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ鿥銂賦馁胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏菣蚃菣ꊂ菣벃菣ꊂ菣궂菣몟臣銼胣鎼볯궂듧袼뻤袁臣銼胣銼볯膀볯鲀볯颼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯隼胣鎼胣醼볯膀볯鲀볯钼胣銼胣醼볯膀臣龁臣銼胣醼볯궂듧膀뻤袁臣ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣ꊂ菣벃菣膀볯醼裢醼볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣ꊂ菣벃菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯邼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣뎃迥뎁觥風菣蚃菣ꊂ菣벃菣꾁臣貂臣貂胣醼胣銼胣鎼臣龁臣钼胥꺁胣鶁苣麁苣꺁鿥ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂뷧鮏鿥ꞁ臣覂臣꺽迦閁苣鞾苣芀菣蚃菣ꊂ菣벃菣ꊂ菣궂菣몟臣颃菣궃苣꾂菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ鿥꺁菩蚈鯩袐臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 貀菣蚃菣랂苣ꪃ菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣銪듧膀藩ꂴ胣誏臣ꮡ믩讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣醼胣銼胣鎼胣뺁臣꾁볯讀臣颃菣궃軥邭苣ꮐ鳦馁苣膀裥떮臣螌껥貁臣讂ꃥ袐苣꒙臣閼鏥膀볯낒臣龁臣鞼鏥꺁鋧銂ꇨ馁胣閼鏥낒臣邼胣銼胥꺁뫤趇뗧袐苣覜臣膀볯ꆓ鋧誏臣鞼鏥낒臣邼胣鎼胥꺁뫤趇뗧袐苣覜臣讂胣设臣ꪁ苣ꆄ뷧鮏菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟臣醼胣醼볯袼뻤袁臣醼胣醼볯膀볯鲀볯邼胣醼胣馼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯醼胣銼胣醼볯膀臣龁臣銼胣馼볯讀臣궂듧銂鳦馁苣芀胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁苧ꂴ迥뎁볯뺁臣꾁菣蚃菣龎귥貁跥낒볥낒臣銼臣꺁鷩ꎚ軦ꆃ菣邃菣銂黦让臣ꚁ臣讂黦让ꓥ낒볥讧胩銂鳦馁苣螤듧낒볥隌郥ꦉ胣设臣낁苣貃苣ꪃ苣讃菣몟苣ꢡ臣芀胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ胣ꢁ臣蚁铧麪臣꾁胣誸꣨螤듧낒볥낒臣蒁臣貂臣貁볯ꒁ胣銼臣뺁臣꾁볯ꒁ臣궂듧낒볥낒胣设臣낁苣ꪃ菣ꮃ鋧膀苣꾂菣颃苣떂菣낒胣랂苣궃菣궂苣뎃鋧膀苣꾂菣骃菣뾂菣낒胣랂苣궃菣뎃菣뎃鋧膀臣龁臣节臣肸臣꺁跥낒볥螤듧낒볥낒胣设臣낁苣뎃菣ꪃ菣膀苣躃菣ꮃ胣ꒂ苣궂菣ꪃ菣膀菣袃菣銃菣궃苣躃菣ꮃ胣馃菣뺂菣ꪃ菣膀菣뎃苣膃苣讃菣ꪁ臣ꮁ黨袐臣ꚁ臣讂胣貺鋧込胣覸鋧込胣誏臣鮛鋧込鿥貁賥ꮐ臣貂苣芀黨袐菣蚃菣랂苣ꪃ菣꺁뻤ꢁ臣ꚁ胣袃菣醃菣麡迥뎁볯貼볯貼볯貼볯貼볯貼볯膽裢颃苣떂菣覃菣ꒂ菣覃菣뢂菣貁賦銁苣貂苣芀ꓨꂴ鋧込鿥ꢁ臣ꚁ臣膀菣궃菣ꮃ胣钃菣ꪃ菣ꮃ胣钃菣ꪃ苣讃菣膀菣ꦃ苣ꪃ菣膀菣ꦃ苣ꪃ菣ꮃ胣钃菣뺂菣뢂菣ꮃ胣ꒂ菣肃苣ꪃ菣膀苣龃菣뺂菣讃菣膀苣龃菣뺂菣뢂菣ꮃ胣钃菣뢂菣膀菣骃菣뢂菣ꮃ胣鮃菣钃菣ꪃ苣讃菣膀菣ꦃ苣讃菣膀菣骃菣뢂菣ꮃ胣钃菣龃苣讃菣膀菣ꪃ菣뢂菣ꮃ胣ꪂ苣떂苣ꪃ菣膀苣궂苣뺂菣뢂菣ꮃ胣ꒂ苣ꪂ苣떂苣ꪃ菣膀苣붂苣궂苣뺂菣뢂菣ꮃ胣ꊃ菣鮃菣讃菣膀菣ꪂ菣ꮃ菣ꪃ菣ꮃ胣膃苣뺂菣ꮃ胣膃苣뺂菣뢂菣ꮃ胣ꒂ苣膃苣뺂菣ꮃ胣ꒂ苣膃苣뺂菣뢂菣ꮃ胣ꒂ菣覃菣ꮃ胣ꒂ菣肃苣ꪃ菣膀苣躃菣ꮃ胣ꒂ苣궂菣ꪃ菣膀苣躃苣떂菣讃菣膀苣銃菣궃苣躃苣떂菣讃菣膀苣誃苣ꪃ菣ꮃ胣랂菣躃菣讃菣膀菣뾂菣뢂菣ꮃ胣馃菣뺂苣龃菣뺂菣ꮃ胣馃菣뺂菣ꊂ苣ꪃ菣膀菣뎃苣ꪂ苣떂苣ꪃ菣膀菣뎃苣膃苣뢂苣뺂菣ꮃ胣閃菣ꮃ胣膃苣讃菣膀菣ꊂ苣ꪃ苣讃菣膀苣붂菣ꊂ苣ꪃ菣膀菣ꪃ苣뺂菣ꮃ胣蚃菣ꦃ苣ꪃ菣膀苣궂苣뢂苣뺂菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯貼볯銈苣궂苣뢂苣뺂菣ꮃ볯膀菣ꪃ菣ꮃ胣膃苣뢂苣뺂菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯貼볯銈菣ꊂ苣ꊂ苣ꪃ菣覼胣蚃菣ꦃ菣覃菣閃菣讃菣膀苣銃菣궃菣ꦃ菣ꮃ胣蚃菣ꦃ菣覃菣膃苣讃菣膀苣銃菣궃菣ꢂ菣ꮃ胣뢂菣覃菣ꒂ菣覃菣ꮃ胣뢂菣覃菣궂菣ꪃ菣膀菣袃菣銃菣궃苣躃菣ꮃ胣蚃菣ꦃ菣覃菣ꒂ苣궂菣ꪃ菣膀苣銃菣궃苣붂苣躃菣ꮃ胣钃菣讃菣膀苣銃菣궃菣ꦃ菣ꮃ胣뢂菣ꊂ苣ꪃ菣膀菣뎃苣閃菣讃菣膀苣붂菣뎃苣閃菣讃菣膀菣뎃苣膃苣讃菣ꪁ臣貁賦銁苣貂胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣貺蟩邵郥貁苩莅臣貂胣뒰듧ꞁ뷧趁迦袁苣貂臣蒁苣膀臣貂苣꺁苣銃菣궃黥誏臣蚃菣ꦃ菣覃菣讞苣ꮐ臣貂苣芀臣覂臣隻臣设臣ꪁ苣颃菣궃苣꾂菣ꮃ臣鞁臣膀믤许臣몟臣馌臣覂苣讂볯銼볯鎼볯钼볯閼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈苣궂苣뺂菣ꮃ볯銼볯鎼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢ꒂ菣肃苣ꪃ菣鮼볯貼볯貼볯貼볯銈菣袃菣銃菣궃裢閼裢ꪂ苣붂裢醼볯銈菣ꦃ苣ꪃ菣袼뻤袁臣銼볯鎼볯钼볯閼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯銈菣Ꞃ菣ꮃ裢閼裢ꪂ苣붂裢醼볯銈菣ꦃ苣ꪃ菣覼볯銼볯鎼볯钼볯閼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢醼볯銈苣龃菣뺂菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯貼볯貼볯銈菣袃菣銃菣궃裢銼볯钼裢뢂苣궂苣銈볯銈菣膃菣銈볯銈菣Ꞃ菣ꮃ裢醼볯銈苣龃菣뺂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢膃苣궂苣銈볯貼볯貼볯銈苣궂苣뢂苣뺂菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢膃苣궂苣銈볯銈菣Ꞃ菣ꮃ裢醼볯鎼볯钼裢ꪂ苣떂苣ꊂ苣ꪃ菣覼볯钼볯閼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢袃菣ꊂ苣ꪃ菣袼뻤袁臣钼볯閼裢뢂菣覃菣銈볯銈菣膃菣銈볯銈苣龃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢袃菣ꊂ苣ꪃ菣覼볯醼볯銼볯鎼볯钼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂菣ꪃ苣讃菣袼뻤袁臣醼볯銼볯鎼볯钼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢鎼볯鎼裢뢂苣膃菣钃菣뢂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢钃菣ꪃ苣讃菣袼뻤袁臣銼볯隼裢뢂苣궂苣銈볯銈苣膃菣銈볯銈菣Ꞃ菣ꮃ菣骃菣뢂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢隼裢ꪂ苣붂菣ꪃ菣뢂菣ꮃ볯醼볯隼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣钃菣龃苣讃菣袼뻤袁臣銼裢袼菣膃菣膃苣覼裢醼볯隼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯銈菣膃菣钃菣龃苣뎃裢醼裢ꒂ菣覼볯醼볯銼볯鎼볯钼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂菣ꪃ菣뢂菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯貼볯貼볯銈菣袃菣銃菣궃裢銼볯钼裢뢂苣궂苣銈볯銈苣膃菣钃菣龃苣讃菣覼볯醼볯隼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈菣ꪃ菣뢂菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯銈苣銃菣궃裢隼裢ꪂ苣붂裢鎼裢ꢂ菣ꮃ菣ꪃ菣뢂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢隼裢ꪂ苣붂裢醼볯銼볯钼裢袃菣ꊂ苣讃菣袼뻤袁臣醼볯隼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣붂菣궃菣ꮃ裢隼裢ꪂ苣붂裢醼볯銼볯钼裢袃菣ꊂ苣讃菣覼볯銼볯鎼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢ꒂ菣覃菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯銈苣ꆃ菣ꮃ裢銼볯鎼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢ꒂ菣覃菣ꮃ迥뎁볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢ꪂ苣붂裢鎼볯鎼胢銈苣钃菣鞃菣醃菣銈볯ꢼ裢ꒂ菣覃菣ꮃ裢醼裢ꒂ菣覼볯醼볯鎼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢ꒂ苣ꒂ菣覃菣ꮃ볯醼볯鎼裢뢂菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢銼볯銈苣붂苣뎃菣ꪃ菣鮼볯ꢼ裢馃菣뺂菣ꦃ苣ꪃ菣袼뻤袁臣醼裢袼苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣覼裢醼볯銈菣뎃苣钃菣뺂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢ꪂ苣붂裢醼볯銈菣뎃苣ꒂ菣肃苣ꪃ菣袼뻤袁臣鎼裢ꢂ菣ꮃ裢銼볯鎼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢馃菣뺂苣龃菣뺂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢ꪂ苣붂裢馃菣뺂苣궂苣뺂菣ꮃ볯设臣낁볯銈苣궃菣銈볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢ꪂ苣붂裢馃菣뺂苣궂苣뺂菣ꮃ볯鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢銼裢ꪂ苣붂裢馃菣뺂苣궂苣뺂菣ꮃ볯銼裢ꪂ苣붂裢銼볯銈菣뎃苣钃菣讃菣鮼볯貼볯銈菣뎃苣뢂苣궂苣讃菣鮼볯貼볯銈菣뎃苣뢂苣궂苣讃菣鮼볯貼볯銈苣銃菣궃裢鎼裢ꪂ苣붂볯钼볯銈볯貼볯銈菣뎃苣膃苣뢂菣ꮃ볯鎼볯钼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢궂菣뺂菣讃菣袼뻤袁臣銼裢ꆃ菣ꮃ裢鎼볯钼裢뢂菣覃菣銈볯銈苣궂苣銈볯ꢼ裢궂菣뺂菣讃菣覼볯醼볯銼볯鎼볯钼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢鎼볯銈苣誃苣ꪃ菣袼뻤袁臣醼裢ꢂ菣ꮃ裢醼볯銼볯鎼볯钼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢鎼볯銈苣誃苣ꪃ菣覼볯醼볯銼볯鎼볯隼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢鞼볯銈菣ꪃ菣ꮃ볯设臣낁볯貼볯貼볯貼볯銈菣袃菣銃菣궃裢醼볯鎼裢뢂菣膃菣銈볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢鞼볯銈菣ꪃ菣ꮃ볯鮼볯貼볯貼볯貼볯銈菣袃菣銃菣궃裢銼볯隼裢뢂苣궂苣銈볯ꢼ裢鞃菣讃菣袼뻤袁臣醼볯銼볯鎼볯隼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯貼볯銈苣ꆃ菣ꮃ裢銼볯隼裢뢂苣궂苣銈볯ꢼ裢鞃菣讃菣覼볯銼裢ꪂ苣붂菣뎃苣뮼뷯貼뷯붼苣뎃菣ꪃ菣鮼볯貼볯銈苣ꪂ苣붂裢銼볯銈菣閃菣뮼볯貼볯銈뷯貼뷯붼苣붂菣ꊂ苣ꪃ菣鮼迥뎁볯貼볯銈菣閃菣것菣뢂苣ꮃ菣궂苣龃菣芀臣覂臣讂ꓨꂴ鋧込鿥ꮁ臣膀볯貼볯膽볯钼볯閼볯隼볯隼뷯銈菣궂苣銃菣궃裢钃菣궃볯鎼볯钼裢芽볯钃菣벃菣銈볯銼볯覼裢ꒂ菣膀迥뎁볯貼볯銈苣ꊂ苣鎃苣꾂菣뮼볯躼볯躼볯붼菣鞃苣뎃裢銼裢ꒂ菣膀菣ꊃ菣骃菣뢂菣ꮃ볯뺁臣꾁苣ꊂ苣醃菣ꮃ볯膀菣袃菣銃菣궃菣ꦃ菣ꮃ胣뢂菣ꊂ苣ꪃ菣膀菣뎃苣閃菣讃菣膀菣뎃苣膃苣讃菣膀苣궂苣醃菣ꮃ胣膃苣醃菣ꮃ胣ꊂ苣ꮂ菣ꮃ胣ꪂ苣뮂苣讃菣膀迥뎁菣ꪂ苣讃菣貁臣讂胣螤듧낒볥몟臣込볯㲚牢ਾ䐼噉邀賥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㔹㰰愯㰾䐯噉ਾ꺁鿥节賥ꮐ臣膀볥궸胣㲁牢ਾ†볯馀臣銈볯銈迥뎁裢ꎼ볯銈臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣鮼볯馀臣銈볯鶼볯ꢼ裢膀裢꺼볯銈볯ꢼ볯銈胣銈볯ꢼ裢ꎼ볯꾼볯銈胣銈볯ꢼ裢膀裢ꎼ볯鶼볯銈胣銈볯ꢼ볯銈볯ꢼ裢膀裢ꎼ볯꾼볯銈볯ꢼ裢膀裢ꎼ볯鶼볯ꢼ裢膀裢ꎼ볯銼裢膀裢ꎼ볯銼볯ꢼ볯銈胣銈볯ꢼ볯꾼裢膀裢꾼볯ꢼ볯銈胣銈볯銈胣誏臣銈볯銈臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣鮼볯馀臣銈볯ꢼ裢誏臣銈볯銈臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣肨迥馁苣颃菣궃苣꾂菣ꮃ鿥꾁臣骁苣节胣뮻蓦ꞁ胣ꆬ臣馌臣讂鿥讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣膀볯膀볯膀볯膀볯貼臣龁臣閼胥꺁뷧鮏鿥ꞁ뷧鮏臣貂뻥讂볯袼볯覼볯醼裢鞼苣랂菣袼뻤袁臣ꮂ菣鲃苣랂苣ꮃ菣銃菣覼볯袼볯覼볯醼裢銼볯ꊂ菣궂菣袼뻤袁臣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣躃裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀苣뢂菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼苣ꮃ菣궂苣ꊂ菣螃菣覃볯銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣较菣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ볯设臣낁菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯膀菣覃菣궂苣銈볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣讃菣궃裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀臣龁臣ꎼ볯銈볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂裢ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣覼볯袼볯覼볯醼裢銼볯ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁볯醼裢隼苣ꮃ苣궂苣膀뻤袁臣醃菣閃菣ꪂ菣ꊂ菣뎂苣랂볯鮼볯钼볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣릂菣閃苣讃菣鮼볯閼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯袼볯覼苣龃菣鮼볯鞼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ볯袼볯覼苣뢂菣鮼볯馼볯ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯袼볯邼볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣ꮃ볯袼볯醼볯较菣鮼볯醼볯覼볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁볯銼裢醼볯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯鮼볯醼볯覼볯ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣궂苣鮼볯醼볯覼菣覃菣궂苣鮼볯醼볯覼菣袃菣鮼볯醼볯覼볯醼裢銼볯膃苣ꊂ菣뎂苣랂볯设臣낁볯醼裢隼菣ꪂ苣ꮃ苣궂苣覼볯袼볯鞼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꆼ胢꾁볯膽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯芽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣袼뷯覼냦ꂴ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯ꎼ볯꺼볯ꊼ胢늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꊼ胢誏臣늼볯馀臣膀볯膽볯뒰듧膀볯芽볯ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣膀볯莽볯ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ胣誏臣袼뷯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣讁苣ꪁ苣꒾苣誂诧讫臣ꚁ臩麊臣貂苣鮼볯醼볯覼裢袼볯ꢼ볯覼뷯뎼볯銼볯꒼胢膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯꒼胢꾁胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯莽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂볯袼볯邼볯銈볯ꎼ볯銼볯醽볯꾼볯꺼볯ꖼ胢늼볯馀胣込룤膀뷯꾁볯鲀볯꺁闦낕臣芁苣膀볯ꖼ胢誏臣늼볯馀臣鶁苣麁苣꾁胣袼뷯覼냦ꂴ胣袼뷯覼볯醼裢隼苣ꮃ苣ꮃ胣袼뷯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣膀迥뎁볯蒽볯ꎼ볯銈볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯邼苣ꪃ菣ꮃ臣覂臣讂뻧袂苣겋ꯧ鞁臣뢁諦閁苣讂볯袼볯醼볯膃苣벃菣鮼볯銼볯覼볯隼裢醼볯ꊂ菣벃菣ꪂ苣랂볯袼볯鎼볯ꎼ볯銈볯랂苣궃苣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯覼苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣鮼볯銼볯覼볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯设臣낁볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣ꪃ菣ꮃ볯鮼볯銼볯覼苣궂苣鮼볯銼볯覼볯ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼苣龃菣鮼볯銼볯覼볯銼裢銼볯ꊂ菣놂菣ꮃ볯誏臣袼볯馼볯ꎼ볯銈볯邼苣ꮃ苣讃菣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀臣貂苣꺁鿥꺁臣貂臣貂臣閁苣ꮁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂苣蚁臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣芀뻤袁臣膀볯醼裢ꊂ菣ꮂ菣벃菣뺁臣꾁볯醼裢膽뷯讽菣蚃菣랂苣ꪃ菣꺁苣ꮃ苣것菣몟臣膀苣궂苣몟臣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂臣膀臣貂臣貂臣ꊂ菣벃菣ꒂ菣꺽迦몟迥뎁볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ볯ꪂ苣ꮃ뷧鮏鿥銂룤袁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣颃菣궃苣꾂菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ胣몟臣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣궂菣뎃鿥銂믤鞁臣ꪦ裥邭鿥ꮁ迥誂믤醁苣貂臣겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟苣ꢡ臣芀뻤ꢁ臣讂蓧꺽迦颃菣궃苣꾂菣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁볯鲀볯銼苧ꂴ볯设臣낁볯鲀볯銼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯鞼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯閼胣銼胣醼볯膀볯鲀볯鎼胣뺁臣꾁볯鲀볯銼苧ꂴ胣设臣낁볯醼裢隼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ胣ꎼ볯銈볯邼뷯貽뷯銈볯醼裢醼볯颃菣궃苣꾂菣ꮃ胣뺁臣꾁볯醼裢銼볯膽뷯讽裢ꎼ볯銈볯銼菣蚃菣랂苣ꪃ菣覼臣芁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀觥風苣ꮃ苣것菣誏臣趉꣨颃菣궃苣꾂菣ꮃ臣鶁苣麁苣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣膀臣貂臣貂臣몟臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺽迦몟臣閁苣ꮁ뷧鮏臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†胣궂賥뒰듧趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣궂듧龎귥ꢁ냦ꂴ軥邭臣醁臣覂臣讂鿥銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†胣銃菣궃苣랂胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀裢꾼볯몟苣ꢡ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 貀볯鶿귨ꊂ菣躃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣꺼뿤랭鿥貁볯ꒁ臣龁臣銼臣随苣颻臣覂苣ꚁ臣讂鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣ꊂ菣躃鿥銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†胣꺼뿤랭鿥趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣袐裦讉ꃩ궸臣鮜臣鞁臣ꪁ臣趏뿥讁苣ꊂ菣躃鿥銂뿤랭臣讂苣蚁臣辄鯥閁苣讂鿥銂ꇨ馁胣袂臣뾽铧閁苣讂볯鶿귨몟臣膀迥ꞅ臣袂苣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂볯銽뷯薽뷯薽胣낼뷯辽뷯薽뷯钽뷯隽뷯₅Ꞽ뷯辽뷯邽뷯ₓ覽뷯₎꾼뷯螽뷯躽뷯莽†볯馽뷯钽뷯薽뷯覽뷯趀볯銽뷯₄ꖼ뷯覽뷯覽뷯躽볯ꪼ뷯袽뷯₎랼뷯貽뷯馽†볯₆뎼뷯躽뷯貼볯薽뷯ₗ림뷯銽뷯貼볯馼볯馼볯ꮁ雩몤臣貂臣蒁苣芀볯鶿귨몟臣鞁臣膀苣랂菣膀苣ꪃ菣궃苣ꮃ胣뺁臣꾁苣ꮃ菣龃菣몟胣设臣낁菣ꮃ菣ꮃ胣ꊂ苣膃菣膀菣궃菣ꪂ菣ꮃ胣钃菣궃苣ꮃ胣钽裢隃菣ꮃ苣뮂菣ꮃ胣銼裢꾂菣궃苣뮂菣ꮃ胣銼裢隃菣ꊃ苣뮂菣ꮃ胣袃菣閃菣ꪂ菣ꊂ苣膃菣膀菣ꪃ苣궃菣ꊂ苣膃菣膀菣뾂菣ꮃ胣辽裢讃菣궃菣Ꞃ菣궂苣ꊂ苣膃菣膀뇎裢꾂菣궃菣膃菣ꮃ胣馃菣뺂苣ꮃ胣钼裢꾂菣궃菣뎃苣ꒂ菣膀볯銈菣궃菣馃菣뺂苣ꮃ胣钼裢讃菣궃菣뎃苣ꒂ菣膀迥뎁苣ꦃ菣鲣諥몟胣鶿귨뺁臣꾁蓧鶿귨꒼胣겼臣龁臣꒼볯겼裢ꊂ菣躃藩膀뻤袁臣ꊂ菣讃菣膀菣ꒂ苣뎃胣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣ꪁ臣鮼苣ꮃ菣讃菣ꮐ鳦몟胣设臣낁菣뎃苣뎃苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣ꮃ苣뎃苣ꮃ菣讃菣ꪁ臣鮼苣ꮃ菣ꆃ菣袃뷥邈鿥膀뻤袁臣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈苣궃菣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣邽裢讃菣궃菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣銼裢讃菣궃菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣邽裢隃菣ꊃ菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣鎼볯钼裢뢂菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣鎼볯閼裢뢂菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣銼볯钼裢뢂菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣钼裢ꆃ菣궂苣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈菣袃菣銈볯貼볯銈苣ꆃ菣궂苣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯貼볯貼볯銈菣ꪃ菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣醼裢袼뷯銈菣閃苣讃菣ꮃ볯銈볯銈菣膃菣ꢂ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣캁貼뇎裢뢂菣膃菣銈볯貼볯銈苣ꆃ菣궂苣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀菣뎃苣銃菣ꪃ菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣ꒂ苣鞃菣钃菣ꆃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣ꒂ苣鞃菣钃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀菣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣ꪃ菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯貼볯貼볯銈菣ꪃ苣궃菣ꢂ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣閃苣躃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈菣袃菣閃苣躃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀菣ꮃ苣것菣ꮃ裢馼裢ꆃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣랂苣궃菣뎃菣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣ꊂ菣麃菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣꾂菣颃苣랂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀菣Ꞃ菣ꮃ菣ꪂ苣ꮃ菣讃菣ꪁ臣膀苣ꮃ苣ꪃ菣ꮃ鿥膀뻤袁臣馃菣뢂菣膀菣ꪃ菣Ꞃ菣ꮃ菣膃菣膀菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꆃ菣ꮃ臣ꦁ胣誏臣랂菣ꮃ鿥膀뻤袁臣袃菣ꆃ菣ꮃ苣ꪃ菣ꪁ臣貁賦銁苣貂苣芀ꗥ뺁臣蒁볯鶿귨몟臣鮃菣龃菣膀苣뮂菣ꮃ胣馃菣뺂苣ꮃ胣钃菣궃苣ꮃ胣钽裢隃菣ꮃ苣뮂菣ꮃ胣ꊂ菣讃菣膀菣Ꞃ菣ꮃ苣ꮃ菣讃菣膀菣뎃苣ꮃ胣钽裢隃菣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ볯ꊼ뷯莽볯膀迥뎁菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ볯ꎼ뷯骽볯ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†胣讃菣궃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀裢꺼볯銼鿥銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†胣꾼뿤랭鿥趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣袐裦讉ꃩ궸臣뢅듧ꮐ鳦袼뻤袁臣閃苣躃菣ꮃ胣銃菣궃苣랂菣膀臣龁臣ꮂ菣鲃菣ꮃ볯몟苣鮜臣鞁臣ꪁ臣趏뿥讁苣鶿귨馁苣袂臣ꮁ蓦뎛臣貂苣몟苣ꢡ臣芀苣辁뷤ꢔ臣貂苣꾼뿤랭鿥꾁胣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣Ꞽ뷯薽뷯躽뷯貀볯銽뷯钽뷯莽뷯覽뷯薽†볯銽뷯閽뷯鎽†뷯躽†볯銽뷯膽뷯覽뷯₃뎼뷯躽뷯袽뷯鎽뷯鎽胣鎼뷯蒽†볯蒽뷯钽뷯辽뷯袼볯辽뷯躽†볯覽뷯薽뷯ₙ蚼†볯辽뷯鎽볯꺼뷯鞽†볯辽뷯讽볯醼볯馼볯覼臣讖ꓧ閁苣ꚁ臣讂胣设臣ꪁ苣꾼뿤랭鿥ꢁ臣ꚁ胣ꊂ苣ꮃ胣ꊂ菣벃菣ꒂ菣膀臣龁臣ꮂ菣邃菣ꮃ鿥膀뻤袁臣鮃菣龃菣膀苣뮂菣ꮃ胣鞃菣钃苣讃菣膀菣邃菣ꒂ菣膀뷯銈菣膃菣ꊂ苣膃菣膀볯銈苣궃菣ꊂ苣膃菣膀볯銈菣궃菣ꊂ苣膃菣膀菣ꪃ菣ꮃ苣궃苣뮂菣ꮃ胣袃菣꾂菣궃苣뮂菣ꮃ胣閃苣ꪃ菣膀뷯銈菣袃菣閃苣躃苣랂苣뮂菣ꮃ胣캁銈苣궃菣隃菣ꪃ菣膀菣뎃苣ꒂ菣膀볯銈苣궃菣馃菣뺂苣ꮃ胣钼裢隃菣ꊃ菣뎃苣ꒂ菣膀뷯銈菣膃菣뢂菣膃菣랂菣ꮃ胣袃菣ꒂ苣鞃菣钃菣랂菣ꮃ苣궂苣ꆃ菣ꮃ胣钼볯钼胢銈苣ꆃ菣궂苣袃菣膃菣膀苣붂菣膃菣ꮃ胣閃苣躃苣랂苣뮂菣ꮃ胣钼裢ꒂ苣鞃菣钃菣閃苣躃苣랂苣뮂菣ꮃ胣뢂菣膃菣鮃菣ꂃ苣龃苣躃胣誏臣钼裢讃菣궃菣뎃苣ꒂ菣鮼苣ꮃ苣ꮃ苣ꮃ菣讃菣몟胣设臣낁苣랂菣膀苣뮂菣ꮃ胣鞃菣钃苣讃菣膀菣邃菣ꒂ菣ꪁ臣鮼믤辄臣꺽迦閁苣龁苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ菣讃菣몟胣设臣낁菣뎃苣ꒂ菣鮼苣ꪃ菣몟胣设臣낁菣ꪃ菣膃菣랂菣ꮃ볯뒼볯뎼볯膀뷯薽뷯钽裢隃菣ꮃ苣ꆃ菣ꮃ苣ꪃ菣袼볯ꊼ볯궼볯覼胣袃菣ꒂ苣鞃菣钃菣랂菣ꮃ苣궂苣ꆃ菣ꮃ볯뒼볯궼볯膀菣ꪃ苣붂菣궃菣ꮃ苣ꪃ菣袼볯ꦼ볯뎼볯ꪁ臣鮼뷥늩菣覃菣궂苣ꮃ臣꺁苣벃菣ꮃ뷥邈鿥膀菣膃菣膀菣袃苣랂菣膃菣膀菣袃菣銃菣궃菣ꦃ菣ꮃ胣馃菣뢂菣膀뷯銈菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ胣袃菣膃菣ꪁ臣鮼苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣设臣낁菣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣붂菣궃菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣躽裢ꒂ苣鞃菣鶃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣붂菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯薽뷯銈菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈苣膃菣颃苣랂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣꾂菣颃苣랂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀菣膃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣ꪁ臣鮼苣ꮃ苣궂苣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣몟胣设臣낁菣袃苣랂菣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣袃苣랂菣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈菣袃苣랂苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈苣袃苣랂苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈菣袃苣랂苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈菣袃苣랂苣袃苣랂菣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀苣ꪃ菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀菣궃菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣銼裢隃菣뎃苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣鎼裢ꆃ菣ꮃ裢銼裢隃菣뎃苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ臣ꦁ볯较菣ꊂ菣뎂苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뻤袁臣銼裢꾂菣궃苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈苣궃菣ꢂ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣銼볯銼볯銼裢袃菣꾂菣궃苣袃苣랂苣ꮃ菣讃菣ꪁ臣鮼믤辄臣꺽迦閁苣龁苣ꪃ菣ꮃ苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ鿥膀뻤袁臣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣膃菣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣邽裢讃菣궃菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣銼볯钼裢뢂菣袃菣馃菣뢂菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯貼볯銈苣ꆃ菣ꮃ菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣邽裢꾂菣궃菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣邽裢隃菣ꊃ菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣閃菣ꪂ菣讃菣ꆃ菣ꮃ苣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ臣ꦁ볯誏臣뮻蓦ꞁ뷧鮏臣貂臣ꊂ菣벃菣ꪂ苣랂苣ꮃ菣讃菣몟胣设臣낁菣Ꞃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣邽裢讃菣궃菣Ꞃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣辽裢讃菣궃菣Ꞃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣銼볯钼裢뢂菣袃菣閃苣躃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈菣膃菣銈菣Ꞃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣趽裢ꆃ菣ꮃ菣Ꞃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣辽裢隃菣ꊃ菣Ꞃ菣궂苣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣鎼볯閼裢뢂菣膃菣閃苣躃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀뷯銈苣궃菣閃苣躃苣랂苣ꮃ菣讃菣膀볯銈苣궃菣銈볯銈菣袃菣閃苣躃苣랂苣ꮃ菣讃菣ꪁ臣鮼뷧鮏苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣벃菣膀迥뎁뷯貽뷯ꪃ菣ꮃ苣벃菣ꮃ볯设臣낁菣ꪃ菣ꮃ볯ꆃ菣ꮃ菣ꪂ菣膃菣鮼菣袃苣랂菣膃菣鮼菣뎃苣ꮃ苣궂苣ꆃ菣ꮃ볯랂菣궂苣ꆃ菣ꮃ볯銼볯銼볯銼볯銈菣ꪃ苣궃菣ꢂ菣궂苣ꆃ菣ꮃ볯蚃菣ꦃ菣覃菣钃菣讃菣鮼菣袃菣銃菣궃菣ꦃ菣ꮃ볯ꢂ菣궂苣ꢂ菣ꮃ볯醼裢뮼볯銈볯袃菣ꆃ菣ꮃ苣ꪃ菣覼苣袃苣랂볯ꢂ菣ꮃ볯銼裢袃菣ꆃ菣ꮃ苣ꪃ菣ꢂ菣ꮃ볯钽裢隃菣ꮃ苣벃菣ꮃ볯邽裢꾂菣궃菣Ꞃ菣ꮃ胣邽裢ꆃ菣궂苣閃苣讃菣膀뷯銈菣袃菣閃苣讃菣膀菣뎃苣ꮃ胣邽裢ꆃ菣궂苣馃菣뢂菣膀迥뎁菣袃菣馃菣뢂菣覼볯랂菣ꮃ苣벃菣ꮃ볯设臣낁菣ꪃ菣膃菣랂菣ꮃ볯袃菣ꢂ菣ꮃ苣ꪃ菣鮼菣ꪃ苣붂菣궃菣ꮃ苣ꪃ菣鮼苣ꆃ菣ꮃ苣붂菣궃菣ꮃ苣ꪃ菣鮼뷯銈菣膃菣뢂菣膃菣랂菣ꮃ볯钽裢隃菣ꮃ苣閃苣讃菣랂菣ꮃ볯袃菣馃菣뢂菣랂菣ꮃ볯袃菣閃苣讃菣랂菣ꮃ볯誏臣뢂菣Ꞃ菣ꮃ菣膃菣랂菣ꮃ볯鮼苣벃菣趃菣袃볯设臣낁菣膃菣膀菣袃苣랂菣膃菣膀볯銈菣ꮃ苣것菣ꮃ菣膃菣鮼苣膃菣鮼볯貼볯貼볯銈菣ꪃ苣궃菣ꢂ菣ꮃ볯銼裢袼菣ꪃ菣膃菣랂菣ꮃ볯ꢂ菣ꮃ볯鎃菣ꮃ胣ꊂ菣ꮃ胣讃菣궃菣Ꞃ菣ꮃ볯馃菣뢂菣鮼菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ볯鎼볯钼裢뢂菣袃苣랂菣뎃苣ꮃ볯誏臣讃菣궃菣뎃苣ꮃ볯鮼苣ꮃ菣讃菣鶿귨몟볯设臣낁苣뮂苣벃菣誏臣놂苣벃菣몟胣设臣낁苣ꆃ菣ꮃ苣뮂苣벃菣膀볯貼볯銈苣ꪂ苣붂菣뎃臣ꦁ볯ꊂ苣ꦃ菣ꮃ鿥鮼迥뎁苣膃苣뎃鿥膀뻤袁臣醼볯鎼裢뢂菣ꊂ菣膀볯貼볯銈苣膃苣ꊂ菣뎃臣ꦁ볯鮼苣ꮃ菣뎃藩鶿귨몟볯设臣낁苣릂菣ꮃ鿥膀뻤袁臣ꆃ菣ꮃ苣릂菣ꮃ胣馃菣뢂菣ꢂ苣蚃菣膀뷯銈菣膃菣ꢂ苣蚃菣膀苣ꮃ菣ꢂ苣蚃菣ꪁ臣鮼迥뎁苣궂苣뺂菣뎃鿥貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꢔꫨ貀苣궂苣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣鶼볯銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†胣醃菣閃菣ꪂ菣趀臣蒁臣ꖎꃩ麾臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀苣ꮃ苣ꮃ鿥ꮁ뗧袐臣ꚁ臣讂郥뒰듧ꦃ苣ꮂ菣貁菣莃듧ꦃ苣ꮂ菣ꞁ뷧趁迦袁苣貂臣蒁苣膀鳦躘듧뢛臣骮뻧馁苣뮻蓦꺁鿥銂ꇨ馁胣设臣낁菣벃菣ꮃ苣궃苣ꮃ苣ꮃ鿥꾁胣袃菣閃菣ꪂ菣ꆃ菣ꮃ胣骃菣뾂菣ꮃ苣궃苣膃菣ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣设ꓧ閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†胣鶿귨銃菣궃苣랂菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣꾼뿤랭鿥ꮁ뗧袐臣ꚁ臣讂藩ꂴ軥邭苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 貀苣钃菣랂苣ꪃ菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣ꆸꯧ貁ꛨ몟臣貐臣궂듧龎귥ꮁ뗧袐臣ꚁ苣钃菣낒볥몟苣ꊽ裦鞁臣蒁苣ꎼ볯銈볯ꊂ菣궂菣뎃苣ꦃ苣ꮂ菣銂ꇨ鞁胣ꆸꯧ貁郥颁軥邭臣邵郥鞁臣蒁苣ꎼ볯銈볯颃菣궃苣ꮃ苣것菣뢂菣뢂苣ꮃ鿥节ꇨ馁胣릂菣궃苣꾂菣ꮃ鿥銂뷥邈臣讂菣蚃菣ꊂ菣궂菣뎃菣뢂苣ꮃ臣膀ꫧꂴ胣뢅듧膀迥뎁ꇧ蒻臣覂臣讂뻧袂苣겋ꯧ鞁臣뢁諦閁苣讂볯ꒁ胣銼臣膀볯ꒁ胣뺁臣꾁볯ꒁ臣颃菣궃軥邭苣ꮐ鳦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣钃菣랂苣ꪃ菣몟臣膀觥風苣ꦃ苣ꮂ菣貁迥誂믤醁苣貂臣蒁苣궂듧龎귥銂駩蒁臣醼胣鞼胥꺁苧ꂴ軥邭苣ꮐ苣芀鳦몙飦꺁苣钃菣랂苣ꪃ菣몟臣膀믤辄臣膀苣꾂菣ꊂ菣궂菣몟迥뎁볯뺁臣꾁菣蚃菣랂苣ꪃ菣몟臣ꒁ臣ꚁ髩辄臣꺽迦몟臣鞁臣겜飦내鯦ꮁ賦銁臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣꺽迦몟臣꺽迦閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 貀苣ꮃ菣讃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣銈볯袼볯覼볯銈鿥銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†胣膃苣벃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣銈볯ꢼ鿥銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꆃ菣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꆃ菣趀臣膀볯ꒁ믤誸臣肸蟨鞁臣蒁臣龁臣낕돨ꪁ菩蚈臣龁臣颠鿥銂鳦馁苣龮뷤ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣趀臣膀苣ꒂ苣誏臣込臣龁臣隌귥꺿ꏩ醃苣벃菣膀賥ꚭ뿤뺣뷤꺽胣隌귥꺿ꏩ醃菣뮂菣袃臣龁臣隌귥꺿ꏩ낕胣誏臣趉꣨꺁뗧뾁郥辂臣貁闧ꪁ臣ꚁ臣讂菩蚈臣龁臣颠鿥銂鳦馁苣뢠藩鶃菣麃菣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣隌郥ꦉ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀ꓧ鞁臣讧胩꺁臣릁臣꺁ꯧ鎽闧Ꞁ뷤膀맥閽闧Ꞁ뷤膀뫤覤闧Ꞁ뷤膀迥뎁郥趽뷤銂賥ꮐ臣讂苣꺁臣馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂賥袐觧꾁胣趸雦ꞁ臣讂볯设臣낁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁ꯧ鎽룤莿苣覜臣讂볯鎁臣貁臣趁苣芀裥떮臣ꢡꓧ貁臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀臣릁臣꺁ꯧ鎽闧Ꞁ뷤膀뻤袁臣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃迥뎁苣ꊂ苣蚃菣ꪂ菣벃臣辄鯥閁苣ꚁ臣讂胣趸雦蒚臣꺽迦閁苣龁苧ꂴ軥邭苣ꮐ鳦馁苣겜雩몤臣隌郥ꦉ臣膀藥ꚭ듦Ꞁ黥뺁臣꾁菣뮂菣讞臣颍鯩馁苣鎁臣貁臣趁苣芀藥ꚭ듦Ꞁ臣몇駧邝雦讁苣覅귥뮴胦讞苣뾪ꏨ馁苣릖돦꾁胣设臣낁菣뮂菣랷郥ꦉ臣蚈觥ꮁ苣讂雦閳胣뺁臣꾁ꯧ鎽臩麊髧袐裦ꮁ苣讂雦閳臣ꦁ胣鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ鿧覂苣ꚁ臣讂胣ꪂ菣閃苣뎃胣ꎼ볯꺼뫤趇뗧袐臣ꦁ臣낕ꓥ辁臣뺹뷤낕胦鎽苣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣隌郥ꦉ臣꾁귥ꢜ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀鳦讖ꓧꞁ臣膀臣꺁苣蚁臣覮껥ꪁ闧Ꞁ뷤꺁臣릁臣貁볤뎛臣貂苣芀鳦讖ꓧ꺁賥袐觧꺁苣릂迥뎁菣ꦃ菣릂맥閽闧Ꞁ뷤꾁胣낕胦鎽臣랷郥ꦉ臣鞁臣膀臣龁臣蚈鯩閁苣龁闧Ꞁ뷤讞臣鞁臣膀꣨낿臣貂胣颍鯩閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜雩몤臣隌郥ꦉ臣銺ꓥ낕胦鎽黥节賥ꮐ臣讂胣銺ꓥ낕胦鎽黥꾁胣颍뗧袐臣ꎚ軦馁苣貺蟩邵郥ꢁ臣꒺迦誏臣鶁苣ꮁ믤辚臣讂菣궃菣뎃臣뮧该ꮁ苣ꎁ臣节臣覂臣貂苣芀뫤覤闧Ꞁ뷤讞臣꾁胣貐臣龮꣩込迥뎁郥颁럧뮛跨銂鳦馁苣낕胦鞃菣袃菣隌諧讅臣芁苣鞃菣袃菣뮧该讞뫤覤闧Ꞁ뷤貁郥뺁苣讂胣鞃菣袃菣뮧该讞뫤覤闧Ꞁ뷤꺁뻤ꮁ臣膀苣袃菣銈苣躃菣ꮃ菣ꊂ胣ꊂ菣覃裢ꒂ菣覃藩骃苣膀菣꾂苣ꂃ裢ꦃ苣膃菣骃苣膀苣龃菣銈苣龃菣뢅菣ꊂ胣ꢂ菣龃菣銈苣龃菣骃苣膀迥뎁볯ꒁ臣鞃菣袃菣貁ꓨꂴ鋧込돧꺁볯ꒁ믤誸臣趽뷧銂跥膂뻥讂鋧뚊黥膀뻤袁臣醼볯銈迥뎁볯ꢼ裢ꒂ菣肃苣벃菣膀볯ꢼ裢膀볯ꢼ裢誏臣钼볯銈볯貼볯貼볯銈菣ꪃ苣뺂菣ꮃ胣醼볯銈迥뎁볯ꢼ裢ꒂ苣ꒂ菣覃菣ꮃ胣ꪁ苣뎁臣醼볯銈迥뎁볯ꢼ裢钃菣뺂菣ꮃ臣ꮐ臣貂苣芀뫤覤闧Ꞁ뷤讞臣膀맥ꆡ諧讅臣芁苣讁胣ꦁ뷥ꪁ뷧鮏臣袂臣ꚁ룤릖臣ꊽ藦ꮁꯧ鎽髧ꮁ鯥骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦讖ꓧ꺁賥袐觧꾁胣궸雩鎽臣龁臣肜뗧隌郥ꦉ臣讦臣ꂁ臣貂苣龎귥꺁郥趽뷤节臣릁臣薌郥馁苣芀胣貐뷤鎽胣ꢁ臣膀軥邭闧랏臣貐臣ꞁ臣讂臣膀ꃦ薆臣궸胦邭闦貁闧ꪁ苣龁苣ꮁ돨辇闦貁闧ꪁ苣龎귥銂賦馁胣设臣낁냦ꂴ臣貐뷤鎽臣꾁룤趇냦ꂴ迥뎁뫤趇냦ꂴ臣ꮐ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜雩몤臣隌郥ꦉ迥뎁ꇥ꾁胣뢸돦ꮁ苣誂胣뚺ꫥ貒觧誏臣뒰鋥ꦉ苣ꊽ裦馁苣袂臣ꮁ뫦銪裥邭臣龁臣뒰裥邭臣蒵臣袐苣鮁臣膀ꫨ붣臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†뿤颭臣貂臣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣鶿귥閁苣ꚁ臣讂胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣龁臣鶃菣骃菣膃菣超裥꺁臣貂臣貂菣꾂菣ꪂ菣覃껦몟臣龁臣ꊂ菣躃藩议鿥ꞁ臣ꎁ臣膀꿦莼臣貂苣銼臣ꖻ룤꺁藩鞈臣貐臣趽뷧ꮁꓥ隌臣讂臣ꢁ臣辁ꛨ蒁臣閁苣讂苣꺁苣螌臣芀꿦莼髧鶿귥閁苣龁菣꾂菣ꪂ菣覃臣龁臣ꊂ菣躃藩ꢁ臣膀藩鞈룤꺁믤꺁ꃥ肉臣뺏苣讂菣꾂菣ꪂ菣覃臣龁臣ꊂ菣躃藩袂苣节雩ꎀ臣놷臣超裥鎖臣鶿귥閁苣ꚁ臣讂苣꺁苣蒁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣銼臣ꖻ룤꺁藩鞈臣銺臣ꮁ볯邼볯薼郥肸臣芁苣ꪁ苣膀臣貂苣銂胣貮藥ꮁ뿤颭臣貂臣蒁苣趀臣蒁臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯ꒁ믤誸臣超裥貁뫤蒁臣醰臣辁臣节볯邼볯貐룤膀냥ꪁ臣ꢁ苣颼볯薼郥肸胣醰臣辁臣节볯邼볯貐룤膀臣龁臣醰臣辁臣节볯閼볯貐룤ꞁ臣讂臣覂胣鶁苣覂苣貀ꯩꚺ臣鶿귥閁苣ꚁ臣讂胣ꢁ臣蚁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣銼臣ꖻ룤꺁藩鞈臣銺臣ꮁ듧鞼볯薼郥肸胣蒴볯邼볯貐룤膀듧馼볯薼郥肸胣蒴볯閼볯膀듧馼볯薼胣뺁臣꾁듧馼볯薼郥肸臣芁苣ꪁ苣膀臣貂苣銂胣颫뫥ꮁ뿤颭臣貂臣蒁苣趀臣蒁臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯ꒁ믤誸臣超裥貁뫤蒁臣醰臣辁臣节볯邼볯貐룤膀냥ꪁ臣ꢁ苣钼볯薼郥肸胣醰臣辁臣节볯邼볯貐룤膀냥ꪁ臣ꢁ苣隼볯薼郥肸胣醰臣辁臣节볯邼볯貐룤膀냥ꪁ臣ꢁ苣颼볯薼郥肸胣醰臣辁臣节볯邼볯貐룤膀臣龁臣醰臣辁臣节볯閼볯貐룤ꞁ臣讂臣覂胣鶁苣覂苣貀뿤颭臣貂臣蒁苣趀臣蒁臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯ꒁ믤誸臣超裥貁뫤蒁臣蒴볯邼볯貐룤膀듧钼볯薼郥肸胣蒴볯邼볯貐룤膀듧隼볯薼郥肸胣蒴볯邼볯貐룤膀듧颼볯薼郥肸胣蒴볯邼볯貐룤膀듧馼볯薼郥肸胣蒴볯颼볯貐룤膀臣龁臣蒴볯馼볯貐룤ꞁ臣讂臣覂胣鶁苣覂苣貀뿤颭臣貂臣蒁苣趀臣蒁臣芀藩鞈臣鶿귥꾁胣鶃菣貃苣것苣膃菣뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꢅ闩ꮁ苣龁臣ꚁ臩ꢔ臣ꚁ苣袂臣鞁胣鶁臣肸菩蚈胣肸ꃩ龟臣龁臣肸觧뒾臣ꦁ铧鞁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†铦몇裥ꆾ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀铦몇裥ꆾ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀닦芙裦鲞苣钁裦馁苣龁苣ꮁ觧骮臣뺔蟥醃苣벃菣ꮁ뻥蚁胣뮌雨蒵裦ꦉ臣龁臣隌郥ꦉ臣뺔蟥鞃菣閃苣ꒂ菣銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鋧뚊臣龁臣낒賥骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣낒諧趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣ꎀ뛧鞁臣ꪼ臣颭鳥銂賦馁胣낒諧蚈귥꾁蛥ꊽ臣芁苣薿ꛨ꾁臣辁胣ꒁ臣貁苣ꚁ胩螈苣꺁臣蒁苣隃菣讃菣袃臣階苣ꊽ裦鞁臣蒁苣낁苣蒁胣낒諧蚈귥膀뻤袁臣겜駧躘臣릔ꓥ늼볯ꆼ臣龁臣趽볯꺼볯꾁胣颍룤꺁菣讃菣袃臣龁臣麃菣膃菣벃臣芁臣ꚁ苣袂臣鞁胣螤郥鎽臣龁臣颫곦讧胩꺁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁꟦邈ꛨꂴ苣讧裦鞁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†듧麃裥芣諦뚈볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣내菨蚈ꏨ醊裥趀臣膀듧麃볯设臣낁鏥뎹该ꦉ듧麃볯设臣낁菣袃듧麃볯覼胣내迨膀苣ꒂ菣릂胣龜迨膀軥龔该ꦉ胣蒯铧ꮙ胣鞃菣ꪂ菣膀臣龁臣鶁苣覂臣蒵臣袐苣鮁臣邈闩膀裥芣胣뺁臣꾁ꋥ隮苣뮘껥鞁胣躽룦鞁胣醊裥馁苣鎁臣銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†듧麃꿦Ꞁ볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣내菨銯胦趀臣膀듧麃볯设臣낁鏥뎹该ꦉ듧麃볯设臣낁菣袃듧麃볯覼胣내迨膀苣ꒂ菣릂胣龜迨膀軥龔该ꦉ胣蒯铧ꮙ胣鞃菣ꪂ菣膀臣龁臣鶁苣覂臣蒵臣袐苣鮁苣몮臣讁胣鶁苣覂臣覜껥ꪁ諥鲞胣銯胦릊黦膀臣龁臣뒇釥蒚諥鲞苣閼臣략臣馁臣ꢁ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 膀臩骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀胩钁胣꾁胣隌郥ꦉ胣ꦉ돨膀껥鎽胣ꢃ裥膀苣벃苣뺁臣꾁菣ꒂ菣벃菣銂胩钁臣讂该鲽臣龁臣颧볥銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†胩钁觥骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀胩钁觥趀臣膀꣦蒚臣馁苣내菨뢁臣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁苣뎃菣鲃胩钁苣醰臣辁臣节菩蚈髧ꮁ껥鎘臣馁苣뮻蓦꺁觧ꪳ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 趸껥骮賥閁苣龁볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀룤覮껥ꪁ胣貀룤覮껥隌臣讂胣貀룤覮껥隌ꃩ龟胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀郥颁ꃩ龟臣龁臣蚈귥꺁鳦鶈臣躇铧讞臣龁臣趃苣蚃苣隃黥袂苣节껥骮胦貁뷤蒁ꃩ龟臣龁臣蚈귥銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†ꓦ몇迥붃臣馨귨骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀ꓦ몇迥붃臣馨귨趀臣膀菣뢂苣낂菣閃苣膀鯨覅胣隌귥몙藥膀藩ꂴ듦Ꞁ胣뢐藥ꚺ臣ꦁ苣ꮐ苣鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ韦ꖟ臣릖돦ꮁ苣ꎁ臣릮飦ꮁꓦ몇臣貂苣节臣肸臣꺁껥鎽臣随苣颻臣覂苣膀뗧뾁뻨뺁苣膀臣龁臣骼郥鞁臣蒁苣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣麃菣ꮂ菣膀苣낂菣ꮃ胣뺁臣꾁菩蚈苣螌臣芀ꓦ몇迥붃臣馨귨ꮁ臣膀铦蒰胦貐뷤鎽胣몙鯨覅鯥膀駧늉鯥膀藩ꂴ胣늉듧膀蟩麱苣ꪂ菣膀菣겂菣覃胣设臣낁菣ꪂ菣뎃胣ꊂ菣뢂菣膀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣誏臣较菣蚃菣膀蟩邭菣莃菣ꪁ臣貁臣讂胣鲤蟥꾏菨ꪁ꣦颭臣膀鳦躘듧뢛臣讖ꓧ馁苣骃菣膃菣뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨궸臣ꦁ臣趽뷧ꮁ臣ꎁ臣节苣蒁胣鲤蟥꾏菨ꪁ꣦颭臣膀苣龃菣뢅胣骃菣膃菣膀臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ臣薆菩ꮁ臣ꎁ臣节苣蒁臣膀볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧꮁ臣ꎁ臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꊂ苣蚃菣ꪂ菣벃볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀苣ꊂ苣蚃菣ꪂ菣벃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀뫤蒁臣ꆏ菥ꞁ臣ꪁ臣膀뫤蒁臣趇臣袐苣鮁苣鎁臣节臣趁臣蒁ꯧ鎽闧Ꞁ뷤銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†뛦隌볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀뛦隌胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀苣誂냥閁臣肸觧뺁臣꾁꟦邈ꛨꂴ臣ꢁ裥ꎧ臣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣芀菣ꪃ菣鞃菣覃臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ臣뒠郥ꞁ臣貂臣膀뛦隌臣骃菣膃菣꺁铧邈苣节臣覂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蚈賥내菨骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣蚈賥내菨趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣鶁臣趃苣蚃苣隃黥ꞁ臣骤菨Ꞁ臣ꪁ臣뮻蓦꺁뷤내菨銂賦馁胣蚈賥내菨꾁菩蚈髧ꮁ裥隌臣龁듧麃苣薌郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蚈賥骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣蚈賥ꂛ귥趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣肉鳦꺁듧麃苣ꒂ菣뢁臣내菨꺁裥隌苣颪駧馁苣鎁臣貁臣趁苣뾂菣醃苣ꪳ胣늼볯ꆼ臣龁臣躽裥邭臣ꦁ臣몙铧붃铦覤鯥邭苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蚈賥馁苣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀裥隌臣讂胣ꢁ臣膀鷩뎂菣莃菣내菨뺁臣꾁볥辁苣龃菣袃臣龁듧麃臣뎂菣莃菣내菨꺁觧뒾苣늍뻥馁苣躁꣧銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臩趽볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀臩趽胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀룤莿臣覂鯩貂臣趽뷧馁苣鎁臣膀臣龁臣꺛髧꺁껧肉苣鞁臣꾁ꃩ龟臣覂鯩貂臣趽뷧馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†諦躸菣뢂菣뎃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣閊룤것苣ꆃ菣趀臣膀諦躸臣릂苣뢂菣벃菣膀臣龁臣뮌룥貁뇦骮臣龁닦芙胣袺飩膀苣鞁臣꾁럧貒苣ꊂ臣것苣ꆃ菣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†铧辇裥늉뿤낕볯꒼볯ꚼ볯銈럧醼韦辇臣龁臣颍룤閊雨颍뷤꺁볯떼볯ꞁ觥ꎁ臣ꢔ蟩蚈觥뮲駧꺁볯떼볯꺁꿦芀臣꺁胥꾁諦躸菣뢂菣뎃뻧꺁꿦莼臣覂냥趁蟥閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣誃菣膃苣麃菣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣颼볯薼臣覅귥钴뫥뺁臣꾁苣誃菣膃苣麃菣躁觥螎볯馁臣辂臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣馼볯薼臣肸雦꺁苣誃菣膃苣麃菣ꞁ臣誂胣肜ꓥꞁ苣醼볯薼臣隻雦꺁苣誃菣膃苣麃菣ꞁ臣讂볯膀ꗥ뺁臣辁臣醰臣辁臣节볯邼볯膀臣覂臣붥臣鞁臣꾁냥ꪁ臣ꢁ苣馼볯薼臣覅귥钴뫥뺁臣꾁苣誃菣膃苣麃菣躁觥螎볯鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ꣦隺髧ꪁ雦閳臣몱껥閁苣讂苣꺁볯銂鳦馁苣膀鳦몙飦꺁賥袐觧꺁胥薀臣覅귥뮴胦讞苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꮂ菣뮂菣隌臣讂볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀苣鞃苣ꮃ賥馁苣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣膰藥馁苣鎁臣膀賥늛臣讂臣ꢁ胣뺁臣꾁賥肂臣ꢁ苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뎂菣覃賥뾂菣醃苣ꪳ裥궖苣낂菣ꮃ볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣뎂菣覃賥뾂菣醃苣ꪳ裥궖苣낂菣ꮃ胣ꢁ臣膀苣뎃菣꾂돨螈雦랂苣誃菣銂苣벃菣馁苣貃苣것苣膃菣超裥銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鏦鲽臣貂臣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ胣겜駧躘臣龮雦ꊽ藦貁胣讧胩ꞁ臣貂賥ꚭ髧Ꞁ돨ꞁ臣貂胣몇駧릂胣躇铧讞裥邭臣龁臣趃苣蚃苣隃裥邭臣꾁闧ꪁ苣릉뻥뺁臣꾁觧Ꞁ苣覜臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂ꃥ袐胣鶁臣龮雦ꊽ藦꾁胣趓뷤趀臣貂臣蒁苣ꢁ臣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦릊蟩骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ胣芁苣鲽铧ꂛ귥꺁胣覜諥辇胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦誛臣邵黦뺁臣꾁触鮜臣邵黦膀뻤袁臣ꢇ뫥邵黦銂臩邈臣讂臣ꮁ跥蚈臣辇臣芁苣膀臣龁臣ꎁ臣貀鳦릊蟩趀臣膀臣貂苣ꦁ铧鞁苣蚁臣鞁臣蒁苣뚊돦ꮁ뻤颭臣讂胣设臣낁胣貁苣銂닦芙臣讂뷤ꢔ鯥邭苣閊룤馁苣뒠郥ꞁ臣貂臣膀뷤ꢔ鯥邭臣覜諥辇臣膀뻤袁臣膀臣꺁뷤ꢔ鯥邭苣閊룤鞁臣讁臣龁ꃥ袐臣鞾苣貂苣鲿귧ꢁ臣钯볨ꞁ胣貁苣꺁볯겜飦내鯦ꮁ껥ꦾ臣讂볯뮲駧銂臩邈臣讂臣ꮁ跥蚈臣辇臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꢂ苣붂苣벃菣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣꾂苣붂菣ꂃ胣꾁胣몓매開觧내菨ꮁ苣ꎁ臣蚈돦閁苣讂냥麃臣龁臣늼볯ꆼ裥ꎧ臣ꊖ룤馁苣螤郥鎽臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 몙迧骼鳦躘듧뢛臣蒁臣뢠藩超裥꺁胣몙迧趀臣꾁胣ꆬ臣馌臣讂뫤ꆱ臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕苣螌臣骼볯醼볯袼뻤袁臣ꊻ蛥ꮁ苣讂볯꒼볯ꆼ藩鞈臣覂臣늼볯ꆼ菣뎃菣것菣袃臣龔铧鮼볯銼볯늼볯ꆼ믨馆觧꺁볯设臣낁苣鞃菣ꒂ苣뎃苣膀럧蚛胣閼胢궂菣莃菣ꊽ裦膀迥뎁볯뺁臣꾁볯馀ꯧ鞃菣뮂苣뎃苣ꮁ苣讂볯鞃菣뮂苣뎃苣鮼볯鎼볯鶃菣骃菣膃菣뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨뢁臣늼볯ꆼ臣뮿꣨鮼迥뎁볯钼볯鶃菣骃菣膃菣뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨꺁뿧뎨뻥꺿ꏩ芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 릉뻥骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀觧뒾胣ꢁ臣膀觧ꪳ胣릉胦膀臣龁臣膼裥蒚ꛨꂴ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 붣觥骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀ꏨꒉ胣꾁胣醰臣辁臣节볯ꆼ볯꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀臩ꒉ臣銂郥肂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†雦螉볯貀雦螉胣ꢁ臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀룤ꢃ裥銂賦馁胣设臣낁苣뎃菣꾂돨꺁雦螉臣膀鿥誤듧麃臣覂跥ꊛ臣貂臣貮藥랕苣뎃菣꾂돨銂뛦隌臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뻥覂苣讂菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꮐ臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龩菨蒚볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣龩菨蒚胣ꪁ铧ꦉ귥蒚裥邭臣꾁胣鶁臣蚈귥꺁觧뒾臣ꪁ苣릉胦誏臣込臣龁臣뮴胦銂釥馁苣ꊽ藦ꮁ臣讂铧ꦉ귥蒚裥邭臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 뢛郥Ꞁ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀鯧貐胦趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣鶃菣麃菣蚈귥鎖胣设臣낁ꃦ뢅裥邭볯设臣낁볯꺼볯蚈귥誏臣込臣龁臣늼볯ꆼ裥邭볯鎖迥뎁볯뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃裥邭雩꺁럧袐髧麡룧Ꞁ苣螌臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣ꪃ菣벃裥邭臣膀臣貂苣꺁藩鞈臣醰臣辁臣节볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀臣龁臣馼볯薼郥肸臣芁苣讁ꇩ벼臣ꚁ臣讂臣ꞁ臣貂臣膀뫤蒁臣貀鯧貐臣芁苣趀臣뾁臣閁苣讂胣貀鯧貐臣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣薿蓧蒚臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣銼臣꺁藩鞈볯鶃菣貃苣것苣膃菣超裥뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃藩鞈볯鎖臣钯볨銂賦馁胣겜駧躘臣袂苣낁胣銼臣꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀臣貂苣貁苣벃菣馁苣鶃菣骃菣膃菣貁胣醰臣辁臣节듧銼볯ꊂ菣躃藩꺁냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁苣袃菣莃菣ꮁ臣蒁臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀볯邼볯膀볯邼볯膀볯邼볯膀볯邼볯膀볯閼볯膀臣龁臣閁苣ꮁ臣馼볯薼臣芁苣ꪁ苣膀鯧貐臣芁苣ꢁ臣ꪁ臣貂苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鯧貐臣鶃菣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣醰臣辁臣节볯鲀볯讀臣ꚃ菣벃苣ꮁ賦骮臣貂臣ꊂ菣躃藩꺁苣袃菣莃菣銂苣벃菣馁苣붃諥ꮁ苣ꎁ臣릉뻥ꖁ臣覂苣讂胣隼볯貃苣것苣膃菣랕鳦肺臣鶃菣貃苣것苣膃菣超裥꺁ꃥ袐胣뢛郥Ꞁ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣钼胣閼胥꺁菣讃菣꾂臣螌껥閁苣龁苣龃菣뢅臣릂菣것菣膃苣뎂菣覃臣讂菨鮊臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂苣芀鳦몙飦ꮁ苣貂臣膀볯ꒁ臣뾂菣醃苣ꪳ藩鞈臣膀臣貂苣꺁苣뎃菣꾂돨貁胣醰臣辁臣节듧銼볯ꊂ菣躃藩꺁냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁苣袃菣莃菣ꮁ臣蒁臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀볯邼볯膀볯邼볯膀볯邼볯膀臣龁臣馼볯薼郥肸臣芁苣낁胣뢛郥ꞁ臣讂臣뾁臣閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†郥肸胦骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣貐룤Ꞁ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀菣ꪃ菣벃裥邭雩膀뻤袁臣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈귥袼뻤袁臣꒼볯ꆼ裥邭迥뎁볯뺁臣꾁볯꺼볯蚈귥覼雩誏臣込臣龁臣鶃菣骃菣膃菣蚈귥鎖臣辷郥蒚ꇩ膸胦銂賦馁胣銼臣꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣貐룤Ꞁ菣벃苣뎃菣꺁꣨鞮臣膀뻤袁臣膀臣貂苣銼臣꺁藩鞈苣肜臩ꪁ꿦莼臣龁苣ꮁ闦鞈臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁꇨ蚁臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯设臣낁胣肜臩ꪁ苣ꦃ苣뎃菣뎃菣貁뻥覂苣讂苣蚁臣견볯뢠藩超裥ꢁ곧銼ꃦ뢅藩鞈臣肸雦뺁臣꾁룤릖臣꺂菣莃菣銂냥ꖅ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀꿦莼臣龁苣ꮁ胣貐룤ꞁ臣蒁藩鞈苣ꆄꛨ馁苣鎁臣貁臣趁苣覼胣芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣钯볨꺁臣膂臣뒕裥閁苣讂藩鞈臣랕臣꾁胣몟뫦超裥꺁闩閁臣醰臣辁臣节볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣钼볯薼胣醰臣辁臣节볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣隼볯薼胣醰臣辁臣节볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣颼볯薼胣醰臣辁臣节볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣馼볯薼胣뺁臣꾁볯邼볯薼臣芁苣芀곦ꮁ胣뺯뿥馁苣貃苣것苣膃菣趽뷧ꮁ臣讂菣꾂菣ꪂ菣覃苣钯볨馁苣芀곧醼藩鞈룤꺁臣讂뷤꺽臣견볯超裥궸臣뺯뿥馁苣趽뷧ꢁ郥颁菣꾂菣ꪂ菣覃臣ꂍ苣覂苣ꚁ臣讂ꃥ袐胣鶁苣覂臣蚈귥꾁臣꺁뷤꺽臣誁臣ꚁ郥肸臣芁苣芀볯ꒁ臣超裥꺁雩꺁郥肸胦醃菣뮂菣袃臣膀臣貂苣銼臣꺁藩鞈臣肜臩ꪁ闦鞈臣龁苣ꮁ냥ꖅ臣讂뿥膦臣芁苣꺂菣莃菣꺁闦誏臣蒐苣ꎃ菣鞃臣랕臣銂胨꺅臣龁胣鶁苣覂臣超裥貁藥覜臣ꚁ臣讂郥肸뷤꺽臣낕臣ꊖ闦ꞁ臣讂胣銼臣꺁藩鞈雩꺁藩鞈臣钯볨誏臣貐룤Ꞁ菣벃苣뎃菣꺁뇦骮臣膀闦ꚭ髧ꊂ菣뒂菣몂菣銂铧蒁臣钁裦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀뻤袁臣膀볯ꒁ臣貃苣것苣膃菣超裥鎖臣貐룤Ꞁ菣벃苣뎃菣꾁胣ꎼ뷯趽뷯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯貽†볯辽뷯薽뷯閽뷯膽뷯ₒꊼ뷯辽뷯辽뷯馽볯겼뷯鎽뷯貼볯躼볯躼볯薽뷯躼볯꾼뷯蚽뷯銽뷯₄떼뷯覽뷯薽뷯鎽뷯钽뷯ₙ낼뷯薽뷯鎽볯꺼뷯鞽†볯辽뷯讽볯醼볯颼볯鮼볯覽뷯莽뷯趽뷯閽뷯覽뷯螽볯ꦼ뷯蚽뷯銽뷯膽뷯覽뷯鎽†뷯躽뷯₄Ꞽ뷯躽뷯趽뷯₅낼뷯辽뷯薽뷯钽뷯貼볯趽뷯钽뷯貼볯躼볯躼볯薽뷯躼볯ꆼ뷯膽뷯薽뷯覽뷯₃낼뷯薽뷯鎽볯꺼뷯鞽†볯辽뷯讽볯醼볯馼볯鮼볯薽뷯閽뷯躽뷯薽†볯躽뷯貽뷯鎽뷯鎽†뷯躽†볯辽뷯薽뷯閽뷯膽뷯ₒꊼ뷯辽뷯辽뷯馽볯隽뷯躽†볯薽뷯躽뷯薽볯Ꞽ볯貼볯莽뷯蒽뷯趽뷯莽†볯銽뷯鎽뷯貼볯馼볯鞼볯ꎼ뷯趽뷯閽뷯薽뷯ₒꆼ뷯膽뷯馽뷯覽뷯ₓ辽뷯₆뎼뷯醽뷯薽뷯莽뷯₅꒼뷯钽뷯貼볯膽뷯钽†볯貼볯銽뷯蚽뷯覽뷯貼볯躼볯躼볯膽뷯蒽†볯銽뷯蚽뷯覽뷯貼볯躼볯躼볯薽뷯鎽볯貼볯閽뷯膽뷯膽†볯銽뷯鎽뷯貼볯薽뷯ₗꪼ뷯銽뷯薽뷯貼볯馼볯钼볯誏臣뎼뷯醽뷯薽뷯莽뷯₅ꆼ뷯膽뷯馽뷯覽뷯ₓ낼뷯覽뷯薽뷯貼볯銽뷯芽뷯讽뷯隽볯궼볯₎膽뷯蒽†볯薽뷯薽뷯薽뷯颽볯ꪼ볯貼뷯蒽뷯躼볯궼†볯钽뷯莽뷯钽뷯躽†볯銽뷯鎽뷯貼볯薽뷯ₗ림뷯銽뷯貼볯馼볯醼臣風볨閁苣ꚁ臣讂雦閳臣ꦁ臣릖돦銂铧蒁臣몱껥馁苣鎁臣貁臣趁胣鎁苣覂臣螖賧꺁臣貂臣貂臣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀뻤袁臣膀볯ꒁ臣貃苣것苣膃菣超裥鎖臣貐룤Ꞁ菣벃苣뎃菣꾁胣ꆼ볯ꦼ볯꺼菣궃苣ꦃ菣袼菣벃苣ꞃ菣銼볯邼볯ꮁ뗧뾁뻨뺁苣ꚁ臣讂볯薽뷯薽뷯鎽迥뎁볯覽뷯貽뷯銽臣ꊂ菣뒂菣몂菣袼볯ꆼ볯ꦼ볯뎼볯醼볯颼볯貼볯骼볯醼裢醼볯覼苣뾽铧鞁胣낼볯궼볯銼볯趇臣议鿥ꢡ볯鞽뷯覽뷯袽뷯ₔ銽뷯鎽뷯蒽뷯薽†뷯膽뷯貽뷯覼胣꺂菣莃菣것菣낂苣骃菣ꮃ菣ꎂ볯銼迥뎁苣ꎃ菣鞃菣誃菣蚃苣钼苣ꢔ臣ꚁ뇦骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣芁苣蒁臣膀볯ꎼ볯붂菣袃苣Ꞃ苣醃菣놂菣뢂룤꺁볯ꆼ볯鞃菣낂菣ꂃ苣뾽铧鞁胣꺼볯뎼뷯膽뷯蒽뷯膽볯ꎼ볯낼ꇨ鞈苣ꢔ臣ꚁ볯ꒁ臣貃苣것苣膃菣超裥鎖臣貐룤Ꞁ菣벃苣뎃菣銂뇦骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣超裥鎖臣貐룤Ꞁ菣벃苣뎃菣銂뇦骮臣讂臣膂臣袂臣뾽铧閁苣讂雦閳臣꾁胣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣ꎼ뷯銽뷯貽뷯辽볯ꢼ볯貼뷯躽뷯₄겼뷯邽뷯膽뷯貼볯躼볯뎼볯ꆼ볯₭ꪼ†볯邽뷯貽뷯薽뷯₄궼뷯钽뷯躼볯钼볯骼볯邼볯鎼볯醼볯颼볯覼臣讖ꓧ閁苣ꚁ臣讂苣꺁臣芁苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀郥肸胦銂뇦骮臣讂臣膂臣肊돦꾁胣겅臣ꦈ铧ꞁ臣讂苣뎃菣ꖃ菣뾂菣궃苣ꦃ菣ꮁ뷤뮳賥閁苣ꚁ臣讂胣銼臣꺁藩鞈雩꺁鯧貐胦銂뇦骮臣讂臣膂臣设臣ꪁ苣뎂菣钃菣벃苣붂菣袃苣Ꞃ苣ꮁ臣膀볯ꎼ볯鞃菣낂菣ꂃ菣莃苣벃苣膀볯薽뷯薽뷯薽뷯颽볯ꪼ볯貼뷯钽†뷯貽볯貼볯閽뷯貽뷯覽뷯₃ꆼ뷯覽뷯鎽†볯薽뷯薽뷯銽뷯袽볯醼볯袼볯覼볯鎼볯鞼볯醼볯颼볯覼볯膀볯겼볯뎼볯낼胣ꊼ볯ꆼ볯뒼볯膀迥뎁볯ꆼ볯뒼볯₡ꆼ뷯钽뷯莽뷯閽뷯貼볯躼볯躼뷯钽†뷯貽볯貼볯躼볯辽뷯薽뷯躼볯覽뷯貽볯貼볯醼볯貼볯邼볯袼볯馼볯邼볯覼臣ꦁ臣芁苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龄鿦ꂛ귥骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣龄鿦ꂛ귥趀臣蒁臣ꢡ迧꾁胣龔觧ꮁ臣蒁臣膀뻤袁臣開觧ꮁ臣蒁臣膀蓦鎟苣节臣覂臣鎁臣貁臣趁苣鲽铧ꂛ귥銂蓦뎑臣讂胣龄鿦ꂛ귥꾁胣銃菣膀该ꦉ胣趤觧膀臣龁臣隻臣龔뷤ꮁ臣蒁臣낖裨鶼鿦Ꞁ雧ꎂ胣뮭臣龁臣隻臣龔觧ꚭ髧龩菨趸藥銂볥趁뗨鎁臣鞾苣膀믤辄臣꺾铧ꦉ胣Ꚃ苣ꮃ苣膀蓦鎟胦ꦉ돨膀臣龁臣邃苣ꪂ菣꾂菣궃苣벃臣邵黦ꢁ臣ꚁ鏦鲽臣貂뻥讂铧ꦉ귥蒚ꏨꒉ胣芁苣蒁臣鶁臣袂臣ꪁ믤辄臣꺾铧ꦉ胣Ꚃ苣ꮃ苣膀蓦鎟胦ꦉ돨膀臣龁臣龔觧ꚭ髧붣觥꺁胣뮻蓦꺁ꓥ뚄꟦邈ꛨꂴ臣龁臣龔觧ꖷ귥ꮁ苣ꎁ臣릔ꓥ閁苣龁꟦邈ꛨꂴ苣螌臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 몁볤邭臣몙迧銂飩뎮臣讂볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀臩鶼귥꺁駧뺏苣뮘껥馁苣趀臣蒁臣ꢡ迧꾁胣몁볤邭臣몙迧ꎔ觧꺁蟩꺁뷤鮸苣閼臣략臣馁臣ꢁ苣辄釥馁苣芀駧뺏铧ꦉ臣膀臩鶼귥讁苣ꊻ蛥閁苣龁볯꺼볯袼뻤袁臣趽볯꺼볯覼胣뺁臣꾁臩鶼귥讁苣ꊻ蛥閁苣龁뷯늼볯ꆼ臣覂뿧뎨臣貂臣鶃菣骃菣膃菣ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뢅黥蒚臣꾁胣趽볯꺼볯꺁菣馃菣꺁뷤鮸臣膀臣鎁臣覂뿧뎨臣貂苣鶃菣骃菣膃菣꺁菣馃菣꺁뷤鮸苣节臣覂臣芀駧뺏臣것菣ꮃ臣膀뷯늼볯ꆼ臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ苣겸껥馁苣龁苣꺁꣦隺髧肊돦銂铧蒁臣몱껥鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣ꮃ苣뎃苣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣趀臣龁臣貀菣ꮃ菣趀臣膀苣ꮃ菣龃苣붂苣ꒂ菣릂꟧袼볯銽뷯袽뷯趽뷯颽뷯隽뷯銽뷯蒽뷯薽볯꺁볯꺼볯Ꚃ苣ꮃ苣ꞁ臣讂苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣貁볥趁뗨鎁臣ꖳꇩ誏臣몓매麡臣龄鿦Ꞁ雧ꎂ臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 낕胦鎽볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀闧Ꞁ뷤趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜駧躘臣뮻蓦꺁賥袐觧꺁믤辄臣銺ꓥ낕胦鎽胣讫뷤낕胦鎽胣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃胣뺁臣꾁苣ꊂ苣蚃菣ꪂ菣벃苣辄釥馁苣芀鳦몙飦꺁賥袐觧꾁胣醼臣뺁臣꾁臣貂믤誸臣궂菣ꮃ룤莿迥뎁볯뺁臣꾁뫤趇뗧袐苣覜臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂苣袁臣讫뷤낕胦鎽胣设臣낁뫤趇뗧袐闧Ꞁ뷤袼臣ꪁ苣ꆁ맥閽볯込볯낕胦鎽볯뺁臣꾁苣ꊂ苣蚃菣ꪂ菣벃볯设臣낁苣誃菣膃苣麃菣袼臣ꪁ苣ꆁ볯讼볯뺁臣꾁볯銈볯覼臣龁臣랂苣込菣ꦃ菣릂闧Ꞁ뷤覼臣鞁臣颭鳥鞁뻥讂臣蚐꟨閁苣讂胣겜駧躘臣袂苣낁胣겜飦내鯦ꮁꓧ馁賥ꚭ꟦ꂀ臣膀臣鞁臣鶁苣蚂臣ꮁ鳦몙飦꺁賥袐觧꾁胣뺯뿥馁苣讫뷤낕胦鎽臣馁臣ꚁ胣馁臣辂臣ꆸ雦꺁ꯧ鎽闧Ꞁ뷤蒚臣钴닧ꪁ뷥讅볯设臣낁맥閽闧Ꞁ뷤蒚臣钴닧ꪁ胣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃髧ꮁ듧讲臣膀臣龁臣뢂苣릂菣것苣麃菣蒚臣钴닧ꪁ뷥讅볯誏臣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃럦袐觧誏臣讫뷤낕胦鎽럦袐觧膀뻤袁臣ꦃ苣龃뷤銂賥ꮐ臣讂胣겜駧躘臣隌郥ꦉ臣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃럦袐觧誏臣讫뷤낕胦鎽럦袐觧꾁胣뢅黥蒚臣꾁胣ꢑ鿧꺁雦閳胣设臣낁苣ꦃ菣뢛苣릂苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ胣궂菣ꮃ鯧颫胩늶뷤꾂菣麃菣낂菣閃苣膀苣ꦃ菣ꦡꓨ袐뷤ꢁ臣ꚁ臣隌郥ꦉ臣邵駦隌胣뺁臣꾁苣ꦃ菣뚺ꫥꮁ臣醁苣隌郥ꦉ臣邵駦隌臣ꦁ臣袂臣ꚁ胣鶁苣覂臣讧裦膦듧ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃臣龁臣讫뷤낕胦鎽臣蚈觥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꯧ鎽闧Ꞁ뷤蒚臣뺁臣꾁苣誃菣膃苣麃菣蒚臣钴닧ꪁ룤鎖뷤膀ꧨ겖胣誏臣ꚧꫥ讁苣膀釥ꖟ臣趸闦袐裦閳臣袂臣ꚁ胣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃迥뎁ꯧ鎽闧Ꞁ뷤銂뻥讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣袃菣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꒂ菣鎃菣궃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀铧ꦉ볯设臣낁该ꦉ胣趤觧膀臣龁臣꺾铧ꦉ볯薆臣꾁臣辁胣몺럥蒚鋧莢臣誁臣ꚁ胣设臣낁ꧨ鎨껧뺁臣꾁迥鲿껥ꢙ胣내菨릟ꓩ膀菣袃菣뾚臣ꦁ臣誁臣ꚁ뗨鎁苣论뇨銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣鲃볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀苣뎃菣鲃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀铧ꦉ볯设臣낁该ꦉ胣趤觧膀苣鞁臣꾁뻥龔觧膀臣龁臣鶁苣覂臣내菨节臣辁臣蒵맧覼蛥ꞁ뗨鎁苣论뇨銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†跥ꊛ臣貂臣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣颍鯩閁苣龁胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀볯ꪇ蓧ꮁ臣蒁臣膀臣龁臣龮꣩蒚諧膳臣誁臣ꚁ볯鶁苣ꮁ믤辚臣ꚁ臣讂꟦邈ꛨꂴ臣醰臣辁臣节룤ꢃ臣覂裥ꊛ臣貂臣ꦉ돨뺁臣꾁껥鎽苣螌臣芀跥ꊛ臣貂臣ꦉ돨꾁胣鶁苣ꮁ믤辚臣ꚁ臣龁觧ꪳ臣ꊖ臣ꚁ胣閁臣隁臣ꪁ菣馃菣꺁듧ꚺ苣覜臣鞾苣芀跥ꊛ臣貂臣ꦉ돨誏臣込臣龁臣龮뷤꾁胣鶁苣覂臣肜裥ꮁ믤辚臣ꚁ臣龁믤꺁꟦邈ꛨꂴ臣蚁臣꺁냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀듧銼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧钼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧隼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧颼볯薼胣蒴볯邼볯膀臣龁臣鶁苣ꖻ룤讁苣蚈鯩閁苣鞾苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀跥ꊛ臣貂臣鲽铧ꂛ귥꾁胣蒴볯邼볯膀듧颼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯銼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯钼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯隼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯颼볯膀듧馼볯薼胣뺁臣꾁듧馼볯薼뛨钴닧ꞁ臣讂胣겜飦내鯦ꞁ臣膀臣讂觧ꪳ臣隻臣讧裦膦듧銂껥ꪳ髧ꮁ郥뺁臣醁苣낁胣鶁臣ꦉ돨꾁胣钴닧趀臣芁苣芀껥ꪳ髧ꮁ跥ꊛ臣貂臣骼胣龮돨蒚臣颍鯩閁苣龁胣ꢁ臣膀臣貂臣ꊽ裦뺁臣꾁ꓦ몇臣貂臣낒ꋥ讁苣龮돨蒚臣蚈鯩閁苣ꚁ臣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣芀菩蚈裥ꊛ臣鞁臣꾁胣设臣낁胣겜雩몤臣隌郥ꦉ臣莿룧閁苣ꚁ臣讂뗧邈觧銂賦銁苣鎁臣貁臣趁苣芀껥ꪳ髧蚈鯩ꢁ臣ꚁ臣膀뻤袁臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯邼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯閼볯膀냥ꪁ臣ꢁ苣蒴볯鞼볯膀臣龁臣醰臣辁臣节듧馼볯趇蟩薼臣겜雩몤臣隌郥ꦉ臣龁臣鶁臣ꦡ苣ꮐ鳦馁苣蒵裦ꦉ苣馌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣隌郥ꦉ迥뎁臣貂苣꺁ꇥ銂跥ꊛ臣讂臣膂臣릖돦꾁뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ臣ꮃ菣膃菣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯뚼볯鶃菣貃苣것苣膃菣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀볯뚼볯鶃菣貃苣것苣膃菣趀臣膀苣뎃菣袃菣ꊻ蛥袼볯뚼볯覼藩ꂴ郥邈돦銂铧蒁臣鲽ꏨ鞁뻥讂럧뚊菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꪃ菣ꮂ菣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀菣뎃苣벃胣꾁胣肸뻧꺁軥邭胣设臣낁볯邼胣醼볯邼볯邼軥邭苣螌臣膀駩骮臣ꪁ臣ꞁ胣궂듧膀苣龃菣膀苣ꮃ苣ꮃ苣龃菣膀藩ꂴ胣ꮡ믩膀苣ꮃ菣궂苣覃胣릂菣鮃菣ꮃ胣ꮂ菣鲃菣ꮃ胣誏臣ꒂ菣뎃臣ꦁ臣龎귥뺁臣꾁鿥讁苣讧裦閁苣鞾苣芀菣뎃苣벃臣膀룤꾫苣꺿ꏩ貃苣것苣랂菣뺁臣꾁뿤뺣菣꾂菣ꪂ菣覃臣뢠藩ꦡ鿥뺁臣꾁돧ꢃ裥ꮁ迥誂믤醁胣节臣肸臣꺁ꯧ銂菣ꒂ菣벃菣膀뻤袁臣鲤蟥꾏菨ꪁ뷤ꢔ鯥邭臣龁臣뮲駧ꒉ臣随苣颻臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ꪃ菣ꮂ菣꾁胣뢠藩超裥뢁臣蒵臣벾臣銂ꛥ뎮臣ꪁ臣袂臣ꮁ胣膍裥ꪁ闩閁苣覜臣鞾苣芀菣뎃苣벃臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣袂臣ꮁ胣袼뻤袁臣銼臣ꖻ룤꺁苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈귥뺁臣꾁볯뚼볯鶃菣貃苣것苣膃菣銂胩邵臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ볯鶃菣貃苣것苣膃菣麃菣膃菣벃苣ꊽ裦閁臣讂臣膂胣뺁臣꾁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂뷥邈臣鮁苣龁苣膀迥뎁菣ꒂ菣벃菣銂諦躸臣讂臣膂臣ꦁ胣뮻蓦꺁鳦ꢔ臣꺛髧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ꪃ菣ꮂ菣ꮁ뗧뾁뻨肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂賥ꚭ鿥꺁뻤ꮁ臣膀苣ꮃ苣ꮃ胣ꊂ菣놂菣ꮃ胣ꊂ菣궂菣ꮃ胣ꊂ菣覃胣ꊂ菣躃胣ꢂ菣蚃菣膀菣ꪂ苣벃菣ꮃ胣ꢂ苣蚃菣膀苣ꮃ苣것菣膀菣蚃菣ꊂ菣궂菣뎃胣ꊂ菣벃菣膀臣龁臣颃菣궃苣꾂菣ꮃ臣ꦁ臣芁苣貁胣鶁苣覂臣邙껥閁苣骁胣鶁苣覂臣鶁苣麁苣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂苣蚁臣뮻蓦ꞁ믤辄臣꺽迦閁苣鞾苣芀菣뎃苣벃臣设臣鞁臣膀룤붣鋥ꊂ菣ꮂ菣膀菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣袼뻤袁臣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ臣龁臣鞃菣钃菣뎃苣ꪃ苣벃菣ꊃ菣麃菣颍뷤膀뻤袁臣뢂苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀苣鞃菣钃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀菣ꪃ菣궃菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣蚃菣ꦃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀臣龁臣蚃菣ꦃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣覼胣誏臣螃苣릂菣ꦃ菣鶃菣麃菣膀臣覂臣ꮁ臣貂苣꺁ꫨ躰뷤貁賦銁苣貂苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀믤꺁뻤ꢁ臣ꚁ胣ꪃ菣ꮂ菣薆臣螈雦꾏菨ꢃ裥膀뻤袁臣蒂藥ꒉ臣龁臣覅裥ꎧ苣ꢔ臣ꚁ裥궖臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂苣릂菣閃苣覃뗧袐볯銈볯銈볯銈볯뺁臣꾁苣뺂뗧袐볯銈볯鶼볯銈볯ꪁ臣貁賦銁苣貂苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣芀臩麊髧ꮁ裥궖迥붃臣邵郥꺁鷩邙껥蒚臣设臣鞁臣膀뻤袁臣袃菣릂볯銼裢ꮂ菣鲃苣랂苣膃菣覼菣릂菣ꎂ菣袼볯ꎼ볯낼볯膀臣龁臣隻臣蒂藥ꒉ胣誏臣込臣龁臣覅裥ꎧ臣ꦁ苣ꦈ铧鞁臣螈雦馁苣鎁臣貁臣趁苣ꊂ菣覃뗧袐胣誏臣设臣낁藩ꂊ냦蚈꟨뺁臣꾁ꇥ몟諥뒰裥ꎧ臣ꦁ臣袂臣ꚁ裥궖臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂苣릂菣ꮃ뗧袐臣馌臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꒂ苣궃볯꺼볯袼뷯覽볯꺼볯覼뗧袐菩趽볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁菣ꒂ苣궃볯꺼볯袼뷯覽볯꺼볯覼뗧袐菩趽臣膀뷯覽볯꺼볯꺁냥ꪁ臣ꢁ苣貀苣벃菣袼뷯薽뷯蒽볯趀ꃩ龟臣邵郥馁苣膀ꃦ뢅믨馆觧꺁菣꾂菣ꪂ菣覃뷤꺽臣龁臣貃苣것苣膃菣颠鿥銂ꇨ馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†뿤뺣볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣꺿ꏩ趀臣膀鳦몙飦꺁裥邭臣覤賥鞁臣뚊藦뺁臣꾁ꓥ隌臣龁꟦ꂀ苣螌臣芀裥邭臣膀賥ꚭ髧꺿ꏩ膀꟦ꂀ髧꺿ꏩ膀迥뎁ꧦ붃髧꺿ꏩ銂郥肂ꓥ辁臣릖돦ꞁ뿤뺣臣貂뻥讂胣肸껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣设臣낁鳦몙飦꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃裥邭臣ꦤ蓧ꪃ菣貃苣것苣膃菣ꆼ胣떼胣Ꞽ胣誏臣ꎼ臣ꊖ뿤馁苣뒠郥ꮁ臣膀鷩ꦤ蓧貃苣것苣랂菣誏臣込臣龁臣麝ꓥ뚄菣꾂菣ꪂ菣覃臣躰藥ꮁ苣ꎁ臣겜駧躘臣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈귥貁뿤뺣臣貂苣芀苣ꎃ菣鞃꟦ꂀ臣ꦁ臣麝꣦隺菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀볯貼볯膀볯膀볯ꪃ菣貃苣것苣膃菣꺁賥ꚭ꟦ꂀ臣꾁闧ꪁ苣节臣꺁胣貀뿤뺣胣ꢁ臣뾁臣閁苣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 颲뛦骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀닧늶胣꾁胣颲胦貁ꯩ辁菣膃菣隳苣뎃菣꾂돨銂郥肂ꓥ뚄觧ꪳ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꦤ蓧꺁볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꦤ蓧꺁胣꾁胣몺럥蒚臣鲣諥貁臣鞁臣ꪇ蓧ꮁ귥ꢜ臣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 궸鋥鞊뷤骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀룤貒諦鎽胣꾁胣鶁臣鞊軥ꮁ뗧袐臣膀諦龎臣覜臣讂臣覂苣讂铧ꦉ귥蒚듦Ꞁ苣궸鋥鞁臣龁臣袶믦閁臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ諦龎臣龁臣龄鿦ꂛ귥讁苣내菨銂飩ꆾ臣讂諦鎽苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 麝菣袃蓨躤该ꦉ볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣麝菣袃蓨躤该ꦉ胣ꮁ臣膀蟩龔꣧誏臣벣苨꺨苣ꮐ苣膀菣袃볯ꢼ뷯趽뷯₏鎽뷯邽뷯薽뷯鎽볯ꖻꓥ꺁臣릁臣꺁蓨躤该ꦉ臣ꮐ臣貂苣芀鷩銃菣誄ꓦ開觧꺁뻤ꢁ臣ꚁ胣ꊂ菣醃苣膀菣뎃菣뎃胣邃苣붂菣膀菣꾂菣膀菣뎂胣Ꚃ苣膀苣ꮂ胣ꒂ菣膀菣邃胣겂菣ꮃ胣ꒃ苣膀菣ꮃ菣莃菣膀苣麃胣ꦃ菣膀菣邃胣隃苣膀苣떂苣膀菣誃苣ꒂ胣銃菣뢂胣릂苣꺂菣Ꚃ胣誏臣ꒃ苣ꪁ臣꺁鏥뎹该ꦉ臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꃦ뢅菣꾂菣뎃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣뢠藩꾃苣膃菣趀臣龁臣貀볯ꆼ볯趀臣龁臣貀볯ꆼ볯蒵裦ꦉ胣꾁胣鞊軥袼뻤袁臣鞊軥Ꞁ苣뎃菣꾂돨뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃볯銂苣벃菣馁苣뢠藩뺁臣꾁ꃦ뢅裥邭볯设臣낁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃볯銂郥肂菣꾂菣뎃臣龁臣꾃苣膃菣蒵裦ꦉ苣螌臣芀뻤ꢁ臣讂껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣뢠藩꾃苣膃菣膀臣ꪁ苣ꆁ볯ꆼ볯꾁胣ꪃ菣뢠藩袼胣늼볯ꆼ胣覼菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃胣ꪃ菣뢠藩袼胣늼볯ꆼ胣覼臣龁臣ꪃ菣뢠藩袼胣늼볯ꆼ胣覼裥邭臣芁苣芀臣꺁苣蚁臣龮雦ꊽ藦꾁胣ꪃ菣뢠藩袼胣늼볯ꆼ胣覼菣꾂菣뎃볯늼볯ꆼ볯覼臣蒁臣鎁臣貁臣趁苣芀ꗥ뺁臣蒁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣뢠藩꾃苣膃菣膀臣ꪁ苣ꆁ볯ꆼ볯꾁胣겜飦내鯦ꮁꧨ낿臣讂苣蚁臣膀菣莃苣뎃苣ꎃ菣늼볯ꆼ볯貀뷯늼볯ꆼ胣覼菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃胣ꆃ菣뮂菣뢂菣벃볯꺼볯袼胣趽볯꺼볯趀볯뺁臣꾁菣莃苣뎃苣ꎃ菣늼볯ꆼ볯貀뷯늼볯ꆼ胣覼裥邭苣ꮐ苣芀臣꺁苣蚁臣龮雦ꊽ藦꾁胣ꆃ菣뮂菣뢂菣벃볯꺼볯袼胣趽볯꺼볯趀볯꾃苣膃菣袼뷯늼볯ꆼ볯覼臣蒁臣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꪂ菣뾂菣늂菣袃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꪂ菣뾂菣늂菣袃胣꾁胣뮻蓦꺁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁꣦蒚胣몁볤邭胣뺁臣꾁듧麃믨馆觧ꮁ꿥馁苣뮻蓦꺁蓦뎛臣ꪁ臣릊黦銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ胣뺁臣꾁胣꾼볯ꚼ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀雩讧苣覃菣膀臣貂臣骶臣ꚁꓨ낕臣ꊂ菣躃藩뎂菣覃苣覃菣銂郥肂ꃩ龟胣誏臣ꮜꯧ꺁臥ꊭ苣覃菣銂郥뾁胣趉꣨螤闦꺁苣龃菣뢅苣벃菣뎂菣뎃苣ꮐ苣颠鿥貁臥ꊭ苣覃菣銂郥覜臣ꪁ臣膀胩骶髧鶃菣貃苣것苣膃菣超裥膀뻤袁臣꒼볯ꆼ藩鞈臣龁臣늼볯ꆼ藩鞈볯设臣낁뷯늼볯ꆼ藩鞈볯銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†뷤開迥붃臣ꎀ뗧閁苣龁볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀뷤開迥붃臣ꎀ뗧閁苣龁胣ꢁ臣蚁ꇨ뺏臣膀볯ꒁ믤誸臣蚈귥膀꟦覯觧膀믨馆觧膀껥鎽胣ꢃ裥ꪁ臣꺁雩꺁ꧦ붃髧ꖎ뛧銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†믤辄臣꺽迦閁苣龁볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣貀믤辄臣꺽迦閁苣龁볯趀볯设臣낁믤辄臣꺽迦閁苣龁苣ꮃ苣ꮃ볯ꢁ臣蚁뷥込臣ꢡ迧꾁胣貀볯ꞁ臣ꎁ臣膀볯꾁믤辄臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣袼뻤袁臣貀苣ꮃ苣ꮃ臣芁臣ꚁ胣趉꣨ꊂ菣궂菣꾁믤辄臣꺽迦閁苣ꚁ臣讂胣覼臣覭뻤ꞁ臣讂苣꺁臣馁苣芀臣貂臣膀觧뒾胣뢼胣袼뻤袁臣ꊂ菣궂菣覼臣貂蟨鎽臣辚蓦ꞁ臣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣鎁臣銂蓦뎛臣讂苣꺁臣꾁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†菩蚈볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁胣ꢃ裥趀臣龁臣貀ꃩ龟胣ꢁ臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뮻蓦꺁菩蚈臣芁臣ꚁ胣鎽ꧨ鶃菣貃苣것苣膃菣꺁藥랕苣誂鿧蒁苣꺁臣骮뻧閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†菣鞃菣覃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣骃菣膃菣趀臣膀볯邼苣龃菣뢅闩ꖻ룤膀뻤袁臣蒴볯膀볯邼胣醼볯膀볯邼胣銼볯膀볯邼胣鎼볯膀볯邼胣钼볯膀臣龁臣閼볯ꊂ菣躃藩랕臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 醃菣袃菣鞃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣醃菣袃菣鞃胣ꢁ臣膀諦鎽臣鞊軥邵郥ꢃ뷤銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苦薀볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꎂ胨趀臣꾁胣뮲駧銂뇦膂臣蒁苣讁뿥膦臣鞁臣蒁苣꾏菨Ꞁ臣芁苣뺯뇨膀닦芙苣薿ꛨꢁ臣讂꿥ꆱ胣뮲駧銂迥醁臣蒁苣뺯뇨膀닦芙苣鞏臣讂뫤骮臣芁苣뺯뇨膀臣龁臣鎨럧銂迥醁臣芰雩뚮臣袂臣ꚁ觧骮臣뺖苦뺁臣꾁諧讅臣ꊖ臣讂苣ꊂ苣鞏臣ꚁ臣讂꿥ꆱ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 겖귥蒚臣놨껥閁苣讂볯貀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣趀臣蒁臣ꢡ迧꾁胣겜飦내鯦ꞁ臣膀ꛥ鎽臣뮌귥蒚裥궖臣蒯鯥薆臣膀郥蚐髧ꪁ菣趃菣ꎂ菣袃볯ꪃ苣꾂꿦ꮁ鯧鲿臣ꚁ胣躁觥ꪁ꿦Ꞁ胣몈뿦膀苣것菣꺂菣鲿귧膀臣龁臣隻臣辕ꇩ节臣辁臣袐뷤螗苣뒼臣鎁臣ꪁ臣膀菣袃迥뎁该ꦉ臣蒵맧ꢁ軦ꚧ臣鮁臣뾽铧馁苣꺁臣ꦁ臣龁胣隌郥ꦉ胣邝雦膀뗧邈觧膀迥뎁볯뺁臣꾁觥ꊽ苣螌臣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겖귥蒚臣놨껥閁苣讂돨ꊽ觥骼胣겖귥蒚臣놨껥閁苣讂돨ꊽ觥趀臣蒁臣ꢡ迧꾁胣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂賥袐觧ꖻꓥ꺁믤辄臣邈裥袼뻤袁臣뮴胦隌郥ꦉ苣뢇뿦뺁臣꾁뫦ꎧ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂ꫥ鎽볯ꞁ臣ꎁ臣膀껥ꪳ髧ꮁ鷩銯胦ꞁ臣誂苦薀臣誁臣ꚁ鷩躂韧Ꞁ臣芁苣ꢁ臣蚁觧Ꞁ苣覜臣讂苣꺁苣螌臣芀돨ꊽ觥ꢁ臣ꚁ臣设臣낁믤许臣ꦉ돨銂賦銁苣鎁臣貁臣趁苣骼믤肝飩ꊭ觥膀藩隌飩ꊭ觥膀뗧袐觥膀苣벃菣ꎂ菣낂胣Ꞝ룧ꦊ觥膀듥誣觥膀觨ꂴ볯肝觨ꒉ볯膀髧骆믨隌雨膀매隌觥膀藥ꮡ觥袼룥袇觥覼胣蒖蛨ꊽ裦ꒉ臣龁臣뎂菣蚃苣뎃苣膀ꛩ首胣뎊ꛩꒉ胣낂菣ꒂ菣뎃菣袼뗦開뿤늀觥覼胣醻닦ꒉ胣鶿귥ꒉ胣낍裥ꒂ菣꾂胣躏鷧ꒉ胣뢇뿦ꒉ臣龁臣蚈闦ꒉ胣颔釥首胣誏臣뒰鋥뒰胣设臣ꪁ苣ꚳ뷥ꒉ臣꾁胣ꆬ臣馌臣讂苣꺁臣芁苣貁胣鶁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣骼菣膃菣隌菣覃菣궂苣袃菣ꢂ菣袼볯ꢼ볯覼胣궂藩ꮂ菣랂苣ꂃ胣ꪃ菣뢅苣ꮃ苣Ꚃ菣袼뫤ꦡ鿥Ꞁ볯膀苣蚃苣ꪃ菣뢅苣ꮃ苣Ꚃ菣膀苣궃苣ꮂ菣ꆃ菣벃苣膀黦让菣ꪃ菣讃菣钃菣ꪃ菣뎃胣꾂苣뎃藩膀苣궃苣鶃菣覃菣膀苣릂菣ꒂ菣膀苣膃菣뮂菣궃菣릂胣벂菣膃菣膀菣覃菣궂苣鞃菣钃菣뮂菣궃菣릂胣銃菣궃苣랂菣궃菣ꮃ菣膃菣뮂菣궃菣릂胣ꦃ苣袃菣릂胣릂菣ꊂ菣뎃藩麃苣趃苣Ꚃ菣膀菣ꮃ菣袃菣ꮃ胣麃菣讃菣벃菣膀菣膃苣讃菣膀菣膃菣뮂菣궃菣릂胣ꆃ菣ꮃ菣ꦃ菣뎃胣꺾뗧뚙苣ꮃ菣벃苣膀菣ꪃ苣膃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀菣ꪃ菣讃菣钃菣ꪃ菣뎃胣鶃菣覃菣膀苣ꮃ菣ꆂ賥螃菣鞃菣膀菣궃菣ꮃ菣ꦃ菣뎃胣醃菣龃菣뎃藩것菣讃菣膀苣Ꞃ菣莃苣膀뫤뢅賥놂苣ꂴ胣ꮂ菣鲃苣랂菣膃菣뮂菣궃菣릂菣袃菣Ꚃ菣膀苣ꢂ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀菣뎃菣뎃苣ꪃ苣벃菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀苣ꮃ菣袃菣ꮃ胣螃菣鞃菣袼菣Ꚃ菣궃苣랂볯膀苣蚃苣ꪃ菣뢅胣릂苣궃菣릂胣뾂菣꾂胣貺藩隌菣뾂菣膀菣뾂菣뎃볯膀菣뾂菣뎃볯膀菣뾂菣뎃볯膀迥뎁苣랂菣袃菣ꮃ胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ볯겜雩몤臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂賥袐觧꺁雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ苣薌郥馁苣芀鳦躘듧뢛臣蒁臣貀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ胣ꢁ臣膀ꛨ隌郥ꦉ臣ꊗ귥꺁藩뺁臣꾁ꇥ몟苣鶁臣ꦡ黥ꮁ믨隌臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ볯设臣낁臩ꊛꇥ몟鿥銂臩螈臣覜ꧦ뢅臣趏뿥閁臣讂臣ꢁ臣ꦁ臣袂臣ꚁ볯꺿ꏩ閁苣ꚁ臣讂胣讖ꓧ隌郥ꦉ臣颪냥鎽苣螌臣芀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ臣设臣꾁胣ꊂ菣뎃臣ꦁ臣ꦡ鿥Ꞁ껦몟臣ꆄꧦ뢅ꇥ뺁臣꾁鳦龩藩ꦡ볯ꮂ菣鲃菣뢅臣ꦁ臣뢅胦议鿥꺁苣ꮃ苣ꪃꇥ뺁臣꾁鳦龩ꇥꪁ臣貁臣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ꎻꇨ蒚臣뢅믤ꂊꇥꮁ臣膀藩뢅ꇥ膀藩뢅胣ꊂ苣钃菣뢅ꇥ膀苣ꮃ苣뎃藩ꦡ胣ꊂ苣뎂菣鎃菣뢅ꇥ膀苣릂菣ꦃ苣뎃藩ꦡ胣馃菣벂菣릂菣鮃菣뢅ꇥ膀菣뎃苣뎃苣ꮃ菣뎃藩膀껥꾁ꛩ뢅ꇥ膀ꇧ뢅냦ꂴꇥ膀菣Ꚃ藩ꦡ胣ꪅ藩ꦡ胣랂菣Ꚃ菣Ꚃ藩ꦡ胣랂菣Ꚃ菣Ꚃ苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣꾂苣뎃藩ꦡ胣랂苣궃菣뎃苣뎃菣궃菣ꪂ菣뢅ꇥ膀苣낂菣뎂菣뢅ꇥ膀菣螃苣ꮃꇧ뢅ꇥ膀苣뾂菣릂菣鮃菣뢅ꇥ膀菣麃菣뢅ꇥ膀苣ꮃ苣颃菣袃菣뢅ꇥ膀苣ꪃ苣궃菣뎃藩ꦡ胣颃菣ꮡ藩ꦡ胣뢁菣袃菣뢅ꇥ膀菣궂苣뎃藩ꦡ胣궇賥뒰듧뢅ꇥ膀ꇥ뢅ꇥ膀菣Ꚃ賥뒰듧뢅ꇥ膀볯銈菣覃菣궂苣銈苣뾂菣릂菣鮃菣뢅ꇥ膀菣꾂菣鎃苣뎃藩ꦡ胣뎹藩ꦡ胣ꦃ苣ꪃ菣뢅ꇥ膀菣Ꚃ菣ꮃꇧ뢅ꇥ膀菣뎃苣뢅ꇥ膀菣것苣뎃藩ꦡ胣麃菣뎃藩ꦡ胣ꆃ苣뎃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣銼裢誃菣뾂菣뎃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣讃苣膃菣뢅ꇥ膀ꇧ뢅ꇥ膀苣것苣뎃藩ꦡ胣랂菣Ꚃ藩ꦡ胣醃菣龃菣뎃藩ꦡ胣醃菣뢅ꇥ膀菣꾂菣뎃藩ꦡ胣躁ꇧ뢅ꇥ膀볯銈菣Ꞃ菣ꮃ菣궃菣ꪂ菣뢅ꇥ膀菣뎃藩ꦡ胣钃苣ꪃ菣뢅ꇥ膀菣邃菣뢅ꇥ膀菣궃菣ꪂ菣뢅ꇥ膀苣蚃苣ꪃ菣뢅ꇥ膀苣较苣뢅ꇥ膀ꇧ뢅ꇥ膀藩뎟藩ꦡ胣膃苣랂苣趃菣袃胣袃菣ꢂ菣릂菣鮃菣뢅ꇥ膀苣뎃菣ꮂ菣뢅ꇥ膀郥覍藩ꦡ臣ꦁ臣芁苣芀믤ꢡ髧ꪁ苣ꮃ苣ꪃ蟩麱ꇥ뺁臣꾁苣ꮃ苣ꪃ鳥麡蟩麱ꇥ꾁胣誃菣ꪃ苣ꂃ胣ꪃ菣Ꚃ菣膀苣ꪃ苣ꂃ胣ꮂ菣랂苣ꂃ胣麃苣趃苣Ꚃ菣ꪁ臣膀臣覂臣ꮁ鷩銯胦ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣膀볯骴苣뎃菣讃苣ꂃ胣誏臣ꊂ菣뎃苣膃苣뎃胣设臣낁駩骮臣ꪁ臣ꞁ胣ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣膀菣袃菣ꆃ菣ꮃ苣뎃菣讃苣ꂃ胣蚃菣ꦃ苣膃菣ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣膀菣膃菣ꊂ菣뎃胣뢂菣膃菣ꊂ菣뎃胣袃菣ꆃ菣ꮃ苣龃菣膀菣ꪃ苣膃菣ꊂ菣뎃胣ꢂ菣ꮃ苣龃菣ꪁ臣銂郥肂胣겜雩몤臣겖귥蒚臣놨껥閁苣讂ꇥꮁ臣膀뻤袁臣ꆄ꿦Ꞁ蓧龩藩뺁臣꾁蓧銯胦覜ꧦ뢅臣ꦁ臣覂뷥邈臣貂臣膀ꛨ隌郥ꦉ臣鎾鷦꺁鷩銯胦ꦡ臣ꮐ臣貂苣芀鳦讖ꓧ꺁雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ臣膀ꇥ몟胦ꢃ裥뺁臣꾁藩Ꞁ菩蚈苣ꮐ鳦馁苣ꪦ賥袐觧讁苣鎾鷦꺁賥ꚭ髧릖돦ꮁ苣ꎁ臣袐裦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀룤겈臣膀臣꺁苣蚁臣ꦡ臣膀臩ꊛ藩讞臣龁臣誁鯩ꦡ鿥讞臣鎁苣覂臣隌郥ꦉ苣隌귥辇ꯨ辇臣ꦁ뷥ꪁꇥ몟臣龁臣뢅臣膀냦궸苣鞁臣꾁鳦龩뫦銪룤膀臣龁臣鶁苣覂볯ꒁ臣랷郥ꦉ룤ꞁ迥鲿臣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ馁苣鎁臣貁臣趁胣肸裨蒚臣꾁胣ꢂ菣蚃菣膀藩뢅苣膃菣膀苣뾂菣벃菣膀苣붂菣궃菣躃菣ꮃ胣뺁臣꾁苣뮂菣讃菣ꪃ菣꺁苣蚁臣麝냦Ꞁꫥ鎽臣붥臣鞁臣芀臩螈臣ꦡ臣ꪃ苣袃臣늼뷯趽뷯躽뷯钽뷯躽胢鎽†볯袽뷯銽뷯膽뷯薽뷯钽뷯莽뷯貽†볯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯醼볯钽뷯₈薽뷯躼볯궼뷯莽뷯₋낼뷯芽뷯覽뷯袽뷯躽뷯₇ꎼ뷯趽뷯膽뷯馽볯ꖼ뷯鎽뷯辽뷯貼볯膽볯貼볯馼볯閼볯邽볯醼볯醼볯膀볯袽뷯銽뷯膽뷯薽뷯钽뷯莽뷯貽†볯膽뷯钽뷯骼볯銽뷯邽뷯銽뷯覽뷯鎽볯뎼뷯貽뷯莽뷯覽뷯躽볯膽뷯蒽†볯鎽뷯貼볯躼볯躼볯钽뷯袽뷯₌膽뷯蒽†볯躼볯躼볯薽뷯趽뷯钽뷯袼뷯蒽뷯躼볯貼볯覽뷯薽뷯銈볯ꎼ볯貼볯邼볯颼胣誏臣ꊼ뷯銽뷯薽†뷯钽†뷯貽볯貼볯辽뷯銽뷯膽뷯₌辽뷯₆낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯閽뷯覽뷯膽뷯₌뎼뷯覽뷯躽뷯薽볯隼볯貼볯銈볯馼볯醼볯鞼볯覼臣讦臣ꂁ臣貂胣鎁苣覂臣螖賧꾁臣貂臣貂胣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣뚺ꫥ貒觧骼胣겖귥蒚臣놨껥閁苣讂뫦銪鋥ꦉ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀臩螈臣뚺ꫥ꺁裥邭臣邵駦베귥ꮁ뗧뾁뻨뺁苣ꚁ臣讂鳦몙飦꺁賥袐觧銂蓦뎑臣讂胣ꦁ裥ꪁ뫦銪臣閊룤閁苣讂铧辇臣誁臣ꚁ铧蚐髧ꮁꫨ릮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣设臣낁뫦銪鋥ꦉ臣膀鳦龩뫦銪胣뒰胣뺁臣꾁臣貂苣꺁럦袐觧銂郥肂뫦늶臣覂臣邵駦隌胣趆뗧뚙胣뺁臣꾁닦뾮臣袂臣ꚁꫨ붣臣鞾苣芀臩螈臣뚺ꫥ꺁뻤꾁胣ꢂ苣躃菣ꮃ胣뒰볯设臣낁룤뒰鋥ꦉ胣貺냦貒觧誏臣覸냦貒觧覼胣꺼裢ꆃ菣ꮃ菣궃菣뢂菣뎃볯꺼볯낼볯膀苣ꆃ菣ꮃ苣ꮃ菣궂苣覃볯꒼볯뎼볯覼胣꺼볯꺼胢銈苣ꆃ菣ꮃ菣ꮃ菣ꊂ菣覃볯꒼볯ꚼ볯膀볯貼볯馀裢뢂菣膃菣ꊂ苣袃苣龃菣袼볯궼볯ꎼ볯膀볯貼볯銈苣ꆃ菣ꮃ裢銼裢ꒂ菣肃苣ꪃ苣躃菣袼볯궼볯떼볯膀볯貼볯銈苣ꆃ菣ꮃ裢鎼볯钼볯閼볯隼裢蚃菣ꦃ菣覃菣銈볯銈볯醼볯覼裢钃菣龃苣躃菣袼볯궼볯떼볯膀苣뮂菣讃菣ꪃ菣袼볯ꎼ볯覼胣鞃菣钃菣뎃苣ꪃ苣벃菣膀藩뢅苣膃菣膀菣뎃苣ꮃ苣ꮃ苣벃菣膀볯銈菣궃菣覃菣膀껥꾁ꛩ뢅菣뎃苣ꮃ臣ꦁ臣芁苣芀냦貁뫦銪臣芁苣뒠郥꾁胣鶁臣뚺ꫥ貒觧銂胣뒰鋥ꦉ胣ꢁ臣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†雨ꦉ该讅볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣겖觧開藦趀臣膀铧鎽臣閊룤閁苣龁觧ꪳ臣讁釥꺁뇦骮臣ꊖ뿤馁苣袂臣ꪁ胣蚈귥뺁臣꾁賥袐觧꺁믤辄臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣릉胦銂賦馁胣겖觧開藦꾁胣뢐迥膀裥莸胣ꎻ골誏臣銎돦꺁꣧ꚺ迥뎁胩ꚺ苣ꮐ苣蒁臣ꒁ臣꺁ꃩ龟臣蚈觥閁苣讂胣鎁苣銂룤겈臣ꆼ볯궼볯ꢁ臣蒁胣鎁臣ꞁ胣袼볯覼郥躏臣ꦉ돨貁ꇨ늶뻥낒臣ꖅ苣躁꣧ꞁ臣誂胣袼볯覼裥莸臣鎽뛦誏臣鎽뗧钹룤뢁臣ꦉ돨꺁裥ꎕ臣龁臣ꎕ鳥ꞁ臣誂胣袼볯覼믤鶬볯뺁臣꾁铧鎽蛥覤迦覼臣風믤鶬铧ꦉ臣꺁ꛨ隌郥ꦉ臣趸迥蚀髧覤迦ꞁ臣誂胣袼볯覼軦蒳볯뺁臣꾁軦꒙볯꾁뫨鎽臣覂臣ꦉ돨꺁軦꒙苣螌臣芀臣貂臣设臣貁苣膀臣辁臣讁臣겖觧꾁뷤蒵맧궸臣趸迥蚀髧ꮁ鏨趩臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†觧蚐賥ꚭ髧骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀觧蚐賥ꚭ髧趀臣꾁胣ꦉ郧蒚迥뎁볯节臣辁臣隌귥蒚觧Ꞁ臣膀臣龁臣ꦉ郧蒚迥뎁볯节臣辁臣隌귥蒚觧Ꞁ臣ꊖ臣讂胣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†跥趽雨ꦉ蟩芁臣誂臣鶃菣骃菣膃菣辇볯낼볯꒼볯邽뷯貽뷯邽뷯邽뷯覽뷯薽†뷯薽뷯ₒ閽뷯覽뷯ₔ蒽뷯閽뷯覼볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁볯떼볯뺁臣꾁跥趽雨ꦉ蟩芁臣誂臣ꎔ觧辇볯邽뷯辽뷯閽뷯钽†뷯薽뷯ₒ閽뷯覽뷯ₔ蒽뷯閽뷯覼臣膀胩뢸臣鎽뛦ꮁ臣醁苣겸껥ꒀ臣늉臣龁胣邽뷯辽뷯込뷯겼胣趽뷯辽뷯込뷯겼臣ꦁ臣莿뫥ꞁ껥ꦾ臣貂苣膀뷤늶臣龁臣鎽뗧钹臣誁臣ꚁ룦骮臣貂苣ꎔ觧袼뻤袁臣鶃菣骃菣膃菣覼臣膀럧醼韦辇볯骀룥꾁볯趽뷯膀뷯螽胣讽뷯ꪁ臣覼臣내裥閁苣龁菩蚈臣骮뻧閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†飩ꊭ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀飩ꊭ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀蓦鎟胣뺖苦膀髩뎮迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣讖꟥銂菩蚈髧뺁臣꾁껥ꢅ臣薁믥閁臣讂臣ꢁ胣릉껥꺁蓦鎟胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦꺁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁韧뚊胣릉뻥膀臣龁臣ꢇ뫥蒚蟥뺏臣讖꟥銂菩蚈髧뺁臣꾁껥ꢅ臣薁믥閁臣讂臣ꢁ胣龄鿦膀觧骮臣뺖苦膀髩뎮迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣覂臣늀ꇨ銂菩蚈髧뺁臣꾁껥ꢅ臣薁믥閁臣讂臣ꢁ胣誏臣込臣龁臣龄鿦膀雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣ꊖ胩馁苣薗ꓥ貁駧钁臣讂菣릂苣銂룦醰臣鮁苣鎁臣銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†菣궃菣ꦃ菣낂볯겜雩몤臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣隌郥ꦉ臣鞃菣覃菣莃苣节賥ꮐ臣讂胣겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣鞃菣覃菣莃苣趀臣膀뷥늩觧ꪳ胣蚈귥뺁臣꾁껥鎽臣隌귥蒚臣龁臣ꦉ郧蒚铦覤苣鞏臣龁ꃥ袐臣뮲駧겖臣鞁臣鲽铧馁苣鎁臣銂髦몤臣讂뷥讅臣芁苣膀믤辄臣ꦉ돨膀裥邭臣龁臣龮뷤銂賦馁胣鞃菣覃菣莃苣꾁胣閽苣讁臣ꊽ臣놅鳦邵郥閁苣ꚁ臣讂臣뺁臣꾁髩ꊛ臣貂臣蒁臣膀臣貂臣膀鏥뎹该ꦉ꿥ꆱ臣꺁諦躸觥膀臣龁臣閊룤芙胣뺁臣꾁諦躸뻥ꮁ듦Ꞁ雨ꦉ菩蚈苣뺔蟥馁苣讁臣龁臣뮴胦겖觧ꢃ裥뢁臣ꊻ賥閁苣鞾苣芀菣궃菣ꦃ菣낂臣膀賥袐觧궸臣颭鳥馁苣颮菨몟苣膀뿤뺣菩蚈臣뢸돦ꮁ苣讂鏦鲽臣뺁臣꾁苣뎃菣鲃臣膀ꛨ隌郥ꦉ臣ꢁ裥궖臣貂苣袂臣ꪁ뷥ꞁ뿤뺣臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣뾪ꏨ馁苣鎁臣貁臣趁苣芀菣궃菣ꦃ菣낂臣꾁胣銃菣궃苣랂菣몟胣ꊂ菣躃鿥膀苣ꮃ菣銃菣ꪃ菣몟胣뺁臣꾁苣ꮃ菣궂苣ꮃ鿥貁胣몓매開觧뺯뇨ꮁ諦躸臣貂臣뒠郥ꮁ裥궖臣貂臣誁鯩꺁菣覃菣궂苣ꮃ鿥膀苣龃菣몟胣릂菣閃菣覃菣ꮃ鿥膀臣龁臣ꮂ菣鲃苣랂菣몟苣鶁苣麁苣ꊽ裦馁苣袂臣ꪁ믤辄臣몟臣邵郥閁苣ꚁ臣讂賥袐觧貁郥뺁苣讂胣鞃菣覃菣莃苣꺁ꫨ붣迥뎁뷤ꢔ臣膀볯躼볯覽뷯閽뷯袽뷯₉膽뷯蒽†볯躼†볯钽뷯貽뷯膽볯貀볯銽뷯銈뷯銽뷯螽뷯ₓ膽뷯ₓ꺼뷯隽뷯貽†볯薽뷯覽뷯薽뷯馽†볯馽뷯钽뷯趽뷯趀볯ꆼ볯ꎼ볯뎼볯뎼뷯趽뷯辽뷯覽뷯趽†볯薽뷯覽뷯鎽臣뚼뷯貽볯醼볯覼迥뎁볯覽뷯銽뷯隽뷯銽뷯覽뷯貽뷯₅ꎼ뷯銽뷯覽뷯銽뷯ₓ覽뷯₎꒼뷯閽뷯₇꒼뷯鎽뷯螽뷯貼뷯蒽볯ꖼ뷯鞽뷯銽뷯₄ꊼ볯늼뷯莽뷯薽볯ꆼ뷯薽뷯覽뷯膽뷯₎낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯閽뷯覽뷯膽뷯₌ꆼ뷯鎽뷯莽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯躽뷯₄낼뷯銽뷯膽뷯辽뷯₎낼뷯薽뷯鎽볯醼볯颼볯ꮁ臣蒁臣隫臣覂苣ꚁ臣誂胣鎁苣覂臣螖賧꾁臣ꆁ苣节迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 鞢껦馁苣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣鞢껦馁苣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣邈闩膀详Ꞥ臣龁臣鞢諥銂蓦뎑臣讂臣膀뿨龀臣邈闩膀详Ꞥ臣龁臣鞢諥銂볥趁뗨鎁臣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣貀ꋥ隮胦趀臣꾁胣鞢껦馁苣붃諥銂鳦馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣貀諦鞢껦Ꞁ胣ꢁ臣膀ꋥ隮觧Ꞁ臣뺯諦馁苣릉胦뺁臣꾁ꋥ隮觧Ꞁ臣ꦁ臣ꪁ臣릉胦銂鳦馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†뫤늘髧骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀뫤늘髧趀臣꾁胣뺖苦꺁볤궒苣늘귦馁苣龁苣ꮁ铧蒁苣貂苣뮲駧蒚뷤ꢔ臣龁臣肸胩꺁뷤ꢔ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 袺飩骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀뫤늘胣ꢁ臣膀臥랺苣궶賦鞁胣뺖苦꺁볤궒苣늘귦馁苣龁苣ꮁ臣覂苣讂軦꺽苣螌臣芀胣超雧袺飩趀臣꾁胣뺖苦꺁볤궒苣늘귦馁苣龁苣ꮁ菨開藥ꮖ臣龁臣鞏该超雧銂铧颁臣鮁苣ꪎ뷧銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣꾂돨螈雦ꢃ뷤骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀苣뎃菣꾂돨螈雦ꢃ뷤趀臣꾁胣隌귥蒚胣떅듧蒚臣龁臣覅賥ꚭ髧讉껦ꮁ苣ꎁ臣膀苣龃菣뢅軩꺁裥ꆾ臣貂臣螈雦銂臩邈臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂菩趽苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 뾂菣醃苣ꪳ裥궖苣낂菣ꮃ볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣뾂菣醃苣ꪳ裥궖苣낂菣ꮃ胣ꢁ臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣螈雦ꢔ臣閃菣낂臣龁臣麃菣꾂苣ꒁ臣讂냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁苣龃菣뢅苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 꺛髧꺁苣뎃菣꾂돨骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣꺛髧꺁苣뎃菣꾂돨趀臣龁臣貀触鮜臣뾂菣醃苣ꪳ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鳦躘듧뢛臣邏뻤閁苣讂苣꺁胣ꪁ苣뎁臣鶁苣覂臣궖觧膀ꫧ뚄ꓥ낕뷤膀ꓥ낕뷤膀迥뎁铦覤뷤銂賥ꮐ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†뿨趽볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀뿨趽胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀룤莿臣龁臣꺛髧꺁껧肉苣鞁臣꾁ꃩ龟臣醿臣릖臣趽뷧馁苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃臣膀菣꾂菣ꪂ苣覃臣芁苣Ꚃ菣뢂菣꺁볯銈苣ꪃ苣랂菣낕胦鎽苣螌臣芀胣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣ꊂ菣궃苣趀臣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣꺁믤辄臣꺿ꏩ鎽胣覤闧鎽胣ꊂ苣붂菣ꦂ菣ꂃ胣뺁臣꾁ꫨ躰뷤ꞁ臣讂胣设臣낁苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃苣誃菣낂臣꾁胣醼裢ꮂ菣鲃苣랂菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣醼裢鞃菣钃菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣膀볯銈苣Ꚃ菣躃菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣醼裢뾂苣ꪃ菣ꆃ菣ꮃ裢钼裢膃苣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯캑覼胣醼裢ꆃ菣ꮃ裢钼裢膃苣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯鎽볯캔覼胣钼裢膃苣銈볯銈菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣鎼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯鎼꣎볯膀볯銈菣ꪂ裢醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣膀볯銈菣膃菣銈볯銈菣ꊂ苣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣銼裢膃苣銈볯銈菣膃菣銈볯銈菣ꊂ苣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣뢂菣覃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣膀볯銈菣ꪂ裢뢂菣覃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣膀볯銈菣袃苣랂苣ꪃ苣뎃胣銼裢ꆃ菣궂苣銈볯銈菣ꪂ裢Ꚃ菣뢂菣膀볯銈菣袃苣랂裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣膀볯銈菣袃苣랂裢銼裢膃苣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣꺼볯銈菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃胣醼裢ꆃ菣ꮃ裢鎼裢袼볯銈苣龃菣銈볯銈苣ꮃ菣궂苣鞃菣钃菣覼苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯膽뷯邽볯캓覼胣誏臣銼胢銈볯銈菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯캈趽볯貁臣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†닧붣臣貂臣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀닧붣臣讂胣膀胣뺲ꏨ閁苣龁胣膀胣뺲ꏨ趀臣꾁胣龮돨蒚臣钴닧ꮁ臣讂臣ꢁ胣뺁臣꾁鳦뺁臣辁臣蒁꟦邈裦蚈胣骱鿦ꦉ돨膀럦貒觧膀苣鞁臣꾁곦ꖙ苣随苣꒙臣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†迥ꦾ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀迥ꦾ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣袂苣貐臣내菨릟ꓩ꺁ꓨ낕鯥꺁菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃苣螌臣芀듧麃鿥誤臣꾁胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯麛胣醰臣辁臣节볯邼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼볯麛胣醰臣辁臣节볯銼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼볯麛胣醰臣辁臣节볯钼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼볯麛胣醰臣辁臣节볯隼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼볯麛胣醰臣辁臣节볯颼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼볯麛胣醰臣辁臣节볯邼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣銼볯麛胣醰臣辁臣节볯邼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣鎼볯麛胣醰臣辁臣节볯邼鯥膀냥ꪁ臣ꢁ苣钼볯麛胣醰臣辁臣节볯邼鯥膀臣龁臣鶁苣ꖻ룤袃菣뎃苣閃苣꾂菣馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꚩ雦骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꚩ雦趀臣龁臣貀铧ꦉꧨ首胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀臣꺁뗧钹胣내菨膀臣龁臣讧裦ꢃ裥꺁菩蚈鯩袐볯设臣낁뷤늶胣邙껥鞁臣蒁臣膀ꇨ늶胣颲뛦膀菣뎃菣늶胣醻뛦膀蓨誄ꯩ늶胣뺔뛦膀뻧뒰胣誾蛨꾸ꇨ膀냥膀藨늶胣誏臣뺲뛦ꪁ臣覼苣螌臣芀臣覂臣ꚩ雦ꢁ臣ꚁ胣龔觧ꢅ뷤膀臣龁臣鶁臣蒵맧膀듧麃苣鞁臣꾁꟦邈菩蚈臣ꢃ裥蚛郥膀臣龁臣鶁苣覂臣뮔裥节臣辁臣肸菩膀뻤袁臣邙껥鞁臣蒁臣膀ꇨ뾼胣股룦膀蓨蒫뛦膀菣뎃菣늶胣꺚蛨꺁ꓥꢃ裥螉胣벑郥ꢙ껧膀藨ꆮ胣誏臣뾰铧隮駥ꆮ胣馶뛦膀铥늶胣뎹胣股뛦내菨膀藨趘胣ꢙ껥ꪁ臣讁苣뾪ꏨ閁苣讂胣鮃菣뢂菣벃菣膀뫦ꎧ觧뺁臣꾁諦몇觧节賦銁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꧨ首臣閁苣ꮁ胣뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣뢠藩蚈귥ꪁ臣꺁듧麃꟦邈ꛨꂴ苣ꮐ鳦鞁뻥讂ꃦ誤菣궃苣뺁臣꾁苣ꮃ臣ꦁ臣릟鳥节賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†苣낂菣ꮃ藩鞈볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀苣낂菣ꮃ藩鞈胣ꢁ臣蚁ꇨ뺏臣膀苣뎃菣꾂戼㹲ꪳ臣뢼胩뺁臣꾁뇥ꢜ賥銂賦몤臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂藩鞈苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 颍룤颍뷤ꢔ蟩骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀跥肸跥趽铧辇胣ꢁ臣膀볯麛臣込룤ꚺ臣込跥肸뗧꾷臣込跥肸軦ꚧ苧ꞁ諦躸臣貂苣膀臣ꪁ苣ꆁ跥肸臣閊룤论뇨ꮁ臣蒁臣閊룤閁苣讂胣뮻蓦꺁닦芙雨꺁铧辇臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 麡볤Ꞁ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀ꇩ벼胦趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣鶃菣麃菣蚈귥鎖胣设臣낁胣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈귥袼뻤袁臣꒼볯ꆼ裥邭迥뎁볯뺁臣꾁볯꺼볯蚈귥覼雩膀迥뎁볯뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃裥邭雩꺁럧袐髧麡룧Ꞁ苣螌臣芀菣ꪃ菣벃裥邭鯧銺臣麡볤Ꞁ菣벃苣뎃菣꺁꣨鞮臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣蚐꟨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣麡볤Ꞁ菣벃苣뎃菣꺁꣨鞮臣꾁뿤颭髧꺽迦貁胨꺅臣貂苣릂믤隤臣膀郥肸胦醃菣뮂菣袃臣袨껧ꢁ郥颁苣蚁臣財臣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 蚈觥ꢔ蟩骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀裥늉铧辇胣꾁胣颍룤颍뷤ꢔ蟩뺁臣꾁럧醼韦辇臣膀볯ꒁ믤誸臣ꢔ蟩뢁臣蚈觥ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†껥骮臣骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀껥骮臣趀臣膀迥鲿럦袐觧讁苣覜铧ꪁ듧ꚺ臣ꞁ跥ꊛ臣讂臩讨苣邀臣鞾苣뮁臣膍裥ꮁ볥몛臣芁苣膀ꗥ뺁臣辁臣릊黦蒚臣뮲駧ꒉ臣ꢁꏨꒉ賥馁苣鎁臣貁臣趁苣隌郥ꦉ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 覮껥隌臣貂臣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣覮껥隌臣讂胣膀胣覮껥隌臣貂臣趀胣貀껥骮賥颠鿥趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣覮껥ꮁ臣讂臣ꢁ胣뺁臣꾁껥骮臣ꪁ苣鎁臣銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꯧ鎽闧Ꞁ뷤骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣讫뷤낕胦鎽胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀臣讂賥袐觧袼뻤袁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂믤辄臣込臣隌郥ꦉ볯貁臣誂뻥讂胣馁臣ꚁ臣꾏菨ꪁ闧ꪁ苣낕胦鎽黥誏臣뎂菣閃苣ꆃ菣랂菣뎃黥膀觧ꮁ胣몟鳦蚈귥讧胩꺁臣릁臣꺁迥붃臣讫뷤隌귥蒚迥뎁苣뎃菣ꦂ菣벃苣ꞃ菣蒚闧Ꞁ黥膀臣릁臣꺁苣ꊂ苣蚃菣ꪂ菣벃胣ꢂ菣뎃菣ꪂ菣벃迥뎁볯뺁臣꾁苣뎃菣ꦂ菣麃菣銂賦馁胣겜駧躘臣蒁臣ꒁ臣꺁賥袐觧꾁胣낕臣讂뫤覤闧Ꞁ뷤讞臣颭鳥鞁뻥讂胣鶁苣覂뫤覤闧Ꞁ뷤讞臣馁臣ꚁ鳦몙飦꺁꿧늛臣薌郥閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†꿥ꆱ볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀꿥ꆱ胣뺁臣꾁胣ꎂ胨趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣겜駧躘臣袂苣蒵裦ꦉ苣设臣낁껥鎨胣모雦膀뫤늘迥뎁볯뺁臣꾁닦芙鯧蒚臣閊룤鞁뻥讂믤辄臣龔觧銂賦馁胣뢅黥蒚臣뺯뇨ꮁ臣膀该ꦉ볯设臣낁胣麃苣릂胣ꦃ菣袃胣Ꚃ苣꺂胣麝菣袃鳩랕ꇩ膀迥뎁菣袃臣ꦁ臣몓매開觧覼迥뎁볯뺁臣꾁ꓦꦉ臣ꮐ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龮돨蒚臣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣龮돨蒚臣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣꺛髧꺁觧ꪳ臣龁臣릉胦꺁藥蒯鯥节臣辁臣讨뫥뺁臣꾁臣벁藥蒯鯥节臣辁臣讨뫥銂釥馁苣ꢁ臣蚁껥Ꞁ髧뚊藦銂賦馁胣龔觧ꚭ裥躇臣鎽ꗦ薀臣芁苣낁胣龔觧ꚭ髧뺏뇨誏臣隌귥蒚迧ꆱ臣膀껥蚺臣뎇苣鎁臣誏臣込臣龁臣貮뫤馁苣뺁臣늀ꇨ馁苣鎁臣膀臣龁臣뚵꿥蒚뗧鲞苣钁裦馁苣节臣辁臣뚵꿥蒚뗧鲞苣麛臩馁苣鎁臣꾁胣蚚蓧ꞁ臣ꪁ臣ꮁ臣ꚁ苣膀臣貂臣芁苣鎁臣銂郧ꎧ臣讂臣芁苣蚁胣鶁苣蚂臣ꮁ胣겜飦내鯦ꞁ臣膀ꓥ辁臣龔觧ꚭ髧뺏뇨誏臣隌귥蒚迧ꆱ臣몛鳦꺁껥ꢅ胦꺁뷦ꢜ髧ꂬꛥ銂ꇨ뺏臣讂臣膂臣膀胣龮돨蒚臣趀臣蒁臣ꢔꫨ銂뷤ꢔ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†껥ꪳ髧ꮁ귧鞁臣骼諦겖雩꺁駦鎖럥ꮁ雩鞁臣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣鎁臣ꢔꫨ꾁胣鞃菣릂볯麃苣誃苣銼볯銂蓦뎑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†껥ꪳ髧ꮁ郥芙臣骼ꓨ낕鯥꺁諦겖臣ꊖ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣꺁铧麪臣膀볯銧믤薆苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 銂苦ꎁ臣蒁苣骼雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅胣銂苦ꎁ臣蒁苣趀胥鎽臣膀臣讂雧ꎂ胣鲚껥誏臣込臣龁臣뚊藦ꢁ꣨궖臣貂臣讁胣뺁臣꾁臣讂雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯节臣辁臣뚊藦꺁볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁韧뚊苣袑臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣립苦鞁苣馁臣骼臣讂雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅胣ꮁ뷧ꎂ臣蒂臣蒁胣讀뷤꾁胣趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦ꢁ臣모雦閁苣ꚁ臣覂臣膀臣ꒁ볯뺁臣꾁觥風雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯节臣辁臣뚊藦꺁韧뚊苣袑臣ꪁ臣鎁臣节臣讂臣膀雧ꎂ臣龁臣鶁臣螗諧銂駧螗臣讂若醐苣薆賥鞁臣蒁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅볯设臣낁臣鎂볯ꮁ뷧ꎂ臣蒂臣蒁胥鎽臣膀곦꺁臣ꆁ臣醼臣ꖻ룤銂觧뒾臣鞁뻥讂볯袼볯覼觥風雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣몙韧ꮁ雩ꎀ臣讂臩鶼귥膪蓧覤闧膀볯銼볯趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦꺁駧螗臣ꊖ胩馁苣몁볤邭ꓥ讞胣袼볯覼觥風雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣ꊖ胩馁苣뾂菣醃苣ꪳ迥뎁볯뺁臣꾁ꃦ뢅臣鞢諥鞁臣誏臣込臣龁臣鮸냥鞁臣몙迧誏臣込臣龁臣뮴胦膀볯钼볯趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦꺁駧螗臣ꊖ胩馁苣銿藦誏臣込臣龁臣龔듦颧볥膀볯閼볯趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦꺁껥辗귦膀臣覂臣ꮁ볯隼볯趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦꺁駧螗臣ꊖ胩馁苣꺾铧ꦉ臣꺁鯦늜迥뎁볯뺁臣꾁觥風뻥龔觧뢁臣龄鿦芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀臣讂雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣립苦鞁苣馁臣讀뷤貁胣趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦銂駧螗臣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀臣讂雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣립苦鞁苣馁臣讀뷤貁胣趉꣨뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦銂駧螗臣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 邾铦骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣邾铦趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣릉껥꺁鳦鎖臣辂臣ꎁ臣芁苣뺔蟥龀뫥ꮁ뻥蚁胣뮌雨蒵裦ꦉ臣龁臣隌郥ꦉ铦몇菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 袐裦骼胣袐裦趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣몺雩꺁触ꮁ苣ꎁ臣龔铧膀ꫨ붣胣誏臣込臣龁臣붣胩閁苣讂臣ꢁ苣辄釥馁苣芀鳦몙飦꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣鞁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃臣龁臣隻臣蚈귥꺁郥邈臣膀賥ꚭ髧ꞁ臣ꎁ臣节藩ꂴ髧ꞁ臣ꎁ臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†菣꾂菣뎃볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁菣꾂菣뎃臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁諦龎苣뎂菣覃臣讂냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣ꮐ苣隌郥ꦉ臣龁臣蒵裦ꦉ臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 馨髧내菨骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀꣦蒚듧麃胣ꢁ臣膀볯ꒁ臣龁臣鶁苣ꖻ룤꺁鯧蒚臣내菨銂賦馁胣내菨꾁胣ꒂ菣鎃菣궃胣ꒂ菣鎃菣膀苣뎃苣ꒂ菣ꖃ菣膀臣龁臣芁苣龔觧꺁뗧钹룤节臣辁臣ꢙ껥궸臣讦臣ꂁ臣貂뻥讂胣趉꣨龔觧꾁该ꦉ胣붥臣鞁臣꾁鏥뎹该ꦉ胣閁苣ꮁꗥ뺁臣辁臣銃菣膀鳦节ꗥ뺁臣辁臣ꎂ胨ꞁ臣誂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†닦芙觥骼胣뮲駧ꒉ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀꿥ꆱ臣閊룤閁苣龁ꃥ袐臣膀닦芙髧膀꣨궖髧膀迥뎁볯뺁臣꾁뫤늘髧릊黦銂鳦鞁胣讁臣込臣龁臣肉鳦꺁铧ꦉ귥蒚迥뎁볯节臣辁臣겖郧ꚭ髧릊黦銂볥趁蟥馁胣뮻蓦꺁뷤ꢔ鯥邭苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 뮲駧覜諥辇볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀닦芙鳦릊蟩趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣龄鿦膀雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅苣ꎂ臣ꚁ臣讂臣膀臣貂苣ꮁ뷧ꎂ臣蒂臣蒁꿥ꆱ臣閊룤閁苣龁ꃥ袐臣膀觥風蓦鎟胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦銂닦芙臣膀臣꺁韧뚊苣릔雥鞁胣모雦鞁胣늘귦鞁胣讁臣込臣龁臣鶁臣讖꟥銂臩뚻臣鮁苣꺁臣膍裥ꪁ胣膀臩閁苣讂臣趁뷤ꢔ鯥邭볯设臣낁ꃦ뢅胣겖觧膀닦芙觥膀꣨궖觥膀뫤늘觥ꪁ臣覼臣辇苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 뮲駧誸鳦릊臣邵黦骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣뮲駧誸鳦릊臣邵黦趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣龄鿦膀雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅苣ꎂ臣ꚁ臣讂臣鶁苣覂臣립苦鞁苣馁臣뺯뇨ꮁ臣蒁臣膀觥風蓦鎟胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦銂닦芙臣膀臣꺁韧뚊苣릔雥鞁胣모雦鞁胣늘귦鞁胣讁臣込臣龁臣鶁臣讖꟥銂臩뚻臣鮁苣꺁臣膍裥ꪁ뗧鲞苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 辷볯ꖗ蟩骼鳦躘듧뢛臣蒁臣貀럧醼韦辇胣ꢁ臣膀볯钼駦鎖臣躸臣覂苣讂臣龁臣ꚇ雦閁苣讂蟩ꞁ臣讂胣鎁苣꾁跥肸臣颍뷤ꢔ蟩ꢁ臣ꚁ諦躸臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꊻ蛥ꂛ귥骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꊻ蛥ꂛ귥趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣设臣낁믨馆臣뮴胦隌臣龁臣醊裥ꪁ臣ꮁ苣ꎁ臣늼볯ꆼ臣꺁볯꺼볯꺁믨馆苣뾪꿧馁苣꒼볯ꆼ뗧袐苣뎃菣꾂돨銂賦馁胣蒁臣ꒁ臣꺁믨馆鯥邭臣颍诧ꞁ믨馆臣뾪꿧銂黦龁臣貁胣隻臣뾪꿧ꂛ귥꾁믤꺁苣뎃菣꾂돨ꢁ跥뾪臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁믨馆鯥邭臣芁苣릉껥꺁鷦뚻룤ꞁ믨馆苣뮴胦隌臣讂臣ꢁ苣醊裥馁苣鎁臣节臣趁苣芀룤겈臣ꊻ蛥ꂛ귥꾁胣馨髧몁볤邭臣뾪꿧颠鿥ꮁ臣蒁臣膀觧낕髧馨髧超裥ꮁ뗧袐臣讂臣膀觧낕髧뎂菣뮂菣떂苣超裥ꮁꯩꚺ臣麡볤馁苣超裥ꮁ뗧袐臣讂胣ꊻ蛥ꂛ귥꾁跥겋臣膀臣龁臣隻臣蚈귥ꢁ臣螤郥鎽臣鞁臣膀꣦蒚臩鶼귥꺁믨馆苣뾪꿧鞁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀ꓥꂛ胦뢠藩銂듧麃룤ꮁ냥ꖅ臣讂雦閳苣螌臣芀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣릖돦ꮁ臣膀賥ꚭ髧릖돦膀觧蚐髧ꚇ郧膀迥뎁苣膃苣뎃胦芄돨뺁臣꾁럦袐觧ꪁ臣貁臣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뿧뎨볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣뮿꣨趀臣꾁胣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈귥貁胣设臣낁듧麃臣膀臣龁臣몺럥蒚臣膀菣鲃苣벃菣뺁臣꾁菣鲃苣벃菣颧臣龩꟦ꮁ苣ꎁ臣鞃菣뮂苣뎃苣閁苣ꚁ胣骃菣膃菣뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃苣龔铧馁苣躁꣧ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†믨馆볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꊻ蛥趀臣꾁胣鶃菣貃苣것苣膃菣蚈귥貁菣ꪃ菣ꦃ菣벂臣龁臣隻臣떅듧ꮁ苣ꎁ臣鞃菣뮂苣뎃苣閁苣ꚁ胣鶃菣貃苣것苣膃菣膀뻤袁臣늼볯ꆼ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣龔铧馁苣躁꣧ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†닦芙臣讂볯겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣貀닦芙臣讂胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀觧骮臣龄鿦膀雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣螗諧뺁臣꾁觧뒾苣ꢃ裥蒚臣龁臣貮藥ꮁ믨鮸臣膀꿥ꎧ臣鮁胣릔雥鞁胣ꦷ鋥鞁胣鶁臣讖꟥銂臩뚻臣鮁胣鶁臣늀ꇨ銂飩뎮臣膀臣꺁蟩螗뫥銂뷤鮸臣膀臣ꒁ볯뺁臣꾁臣꺁駧龔軧銂뷤鮸臣讂臣ꢁ苣螌臣芀닦芙臣膀雧ꎂ胣龄鿦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣뚊藦꺁뻥馀苣袑臣ꚁ臣ꪁ臣뺯뇨誏臣込臣龁臣뺖苦膀蓦鎟胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣鶈鳦뒾胥꺁臣銂釥馁苣뺯뇨ꮁ胣趉꣨뺖苦膀蓦鎟胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁諧讅臣ꊖ胩馁苣薗ꓥ銂駧螗臣讂菣릂苣銂룦醰臣鮁苣꺛髧ꞁ雦財臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꆄ뿤뺣볯겜飦내鯦ꮁ臣蚁胣ꆄ뿤뺣胣ꢁ臣膀臣ꂁ臣讁臣讂뷥ꞁ苣릔ꓥ閁苣ꚁ臣ꪁ臣뮻蓦꺁觧ꪳ胣隌郥ꦉ臣龁臣蚈귥銂賦馁胣ꆄ뿤뺣臣膀蟩龔黥뺁臣꾁菣ꒂ菣ꎂ菣讞臣龔뷤蚈귥銂賦鞁뻥讂臣膀뿥骁臣节臣蚁臣꾁臣蒁胣蚈귥꾁룤ꎀ臣꺿ꏩ銂迥醁뻥膀臣貂臣袂臣ꚁ郥꺿ꏩ蚈귥꾁胣ꖻ뻥꺁뿤뺣臣膀胣ꆄ뿤뺣胣몇駧ꦉ돨ꢁ臣ꚁ뷥讫臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 꾃苣膃菣骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣꾃苣膃菣趀臣蒁臣ꢡ迧꾁胣릉껥꺁雧ꎂ胣鲚껥뺁臣꾁諧讅臣꺁雩ꎀ臣誁臣ꚁ藥ꮖ苣릔雥馁苣龔觧ꚭ髧뾪ꏨꦉ苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ苣ꮃ苣Ꞁ苣뎃菣꾂돨骼鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣Ꚃ苣ꮃ苣Ꞁ苣뎃菣꾂돨趀臣蒁臣ꢡ迧꾁胣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ铧ꖝ臣讂믤辄臣뾂菣醃苣ꪳ苣辄釥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 螝귧ꦉ迥뎁꿧늛戼㹲 鎽ꗦ薀臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣몙飦ꮁ苣讂藥鎽髧龮雦ꊽ藦꺁鷥覭觧銂闦骤臣趪귨鞁胣뺁臣꾁韦뢸髧鲽ꗦ銂뛨袁臣蒁껥鎨苣ꢔ臣ꚁꋧ讁苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣芁苣蚁胣겜駧躘臣蒯鯥꾁룤風臣겪飦ꮁ駩骮臣貂苣节臣ꞁ臣ꪁ臣膀럦颻臣릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣몤臣ꢁ臣誂臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣誁臣ꚁ胣貀뷯趀胣貀뷯躽胣誏臣貀뷯袽뷯趀臣ꦁ臣ꂆꧨ꾁胣趏꿥꺁ꇨ몤臣芁苣뒠郥뺁臣꾁臣蚁臣ꪁ臣鎁臣貁雦袄臣覂飦붙臣芁苣뒠郥銂駩趁胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕苣辄釥鞁뻥讂胣芁苣꒾臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣ꆃ菣邃菣꺁雩ꮁ胣뺁臣꾁胣銂郥肂ꯨ花ꃩ뺁臣꾁꣨낿臣膀迥뺯臣ꢡꓧ貁臣讂ꃥ袐臣龁臣鶁臣ꞁ臣蒁臣ꢁ臣螖蓨讁苣躘駧ꞁ臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀觥風뻧꺁菣뎃菣벃臣蚁臣꺁볯ꒁ胣螤闦膀臣龁臣馁臣ꚁ臣肉룤꺁ꏨ膓臣龁臣鞃菣뮂苣ꮁ귥ꢜ臣膀뷤ꢔ臣貂胣뺁臣꾁믤꺁뷥ꞁ雩ꎀ臣讂臣ꞁ臣貂臣膀뫦龁臣貂臣蒁苣ꢁ臣ꪁ臣貂苣芀鳦몙飦꾁胣趉꣨꒾臣뎎꿥ꮁ볯ꒁ臣ꆃ菣邃菣貁触躸臣붣鏥뺁臣꾁菣궃苣릂臣颭鳥鞁胣뾽铧閁苣膀臣龁臣隻臣ꊽ臣ꊖ胩馁苣龮雦ꊽ藦銂賥ꮐ臣讂胣겜駧躘臣膀觥風뻧꺁菣뎃菣벃臣蚁臣꺁ꓨ낕臣龁臣馁臣ꚁ臣肉룤꺁ꏨ膓臣龁臣鞃菣뮂苣ꮁ귥ꢜ臣膀뷤ꢔ臣貂胣뺁臣꾁믤꺁뷥ꞁ雩ꎀ臣讂껥붖뷥讅苣薌郥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 貀郥肂胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀軦隻髧ꞁ臣蒁臣ꢁ苣辄鯥鞁胣閁苣ꪁ苣膦듧뺁臣꾁苣蚃菣鞃臣薌郥銂꣨릮臣讂臣膀臣貂苣薿ꛨꢁ臣讂苣醁臣꾁臣蒁臣ꢁ臣ꢳ蓦閁苣龁臣芀臣龁臣ꎁ臣貀郥肂胣ꢁ臣蚁铧麪苣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣뒠郥꾁胣貀臣覂臣讂胣ꢁ臣蚁铧麪苣薌郥閁苣膀雩몤臣貂臣蒁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒯鯥貁룤袁苣貂臣뒠郥膀ꯧ릂臣ꮐ臣貂苣芀臣覂臣膀裥떮臣ꢡꓧ貁臣讂ꃥ袐臣龁臣螖蓨讁苣誏臣鎽ꗦ薀臣蚐꟨讁苣鶁臣ꞁ臣蒁臣ꢁ臣躘駧ꞁ臣讂ꃥ袐苣꒙臣膀꿧늛臣鞁臣ꢡ迧閁苣龁胥꾁胣겜駧躘臣閁臣隁臣ꪁ껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ꣨躘臣貂臣蒯鯥薆臣뮻蓦꺁觧骮胥뺁臣꾁菩蚈꿧늛苣膀뷥늩꿧늛臣许駩꺁跥趽臣醼볯蚈臣醼臣ꞁ菦骮臣鞾苣ꢁ胣蚐꟨馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꂊ臣ꚁ胣袅ꇨ肊ꇨ꺁꿧늛蛥ꮁ郥뺁苣讂鳦몙飦꺁믤辄臣릉껥龮雦ꊽ藦꾁胣讫뇦薠臣蚁臣꺁믤辄臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣覂胣躘ꓧ蒚臣꒙ꓥ閁苣鞾苣ꢁ郧ꎧ臣릁臣ꞁ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ껥붖뷥讅臣鎽ꗦ薀臣꾁韦ꖟ臣芁苣ꢁ臣ꪁ臣貂苣꺁臣膀臣ꢁ臣鶁臣꒙ꓥ貁鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ飦몤髧ꮁꓧ閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꚁ苣膀臣貂苣꾁駩隤臣貂뻥讂胣겜駧躘臣蒵裦ꦉ臣뮻蓦꺁觧骮껥붖뷥讅볯设臣낁胣뮻蓦꺁ꃦ뢅臣龁臣鶁苣貁苣벃菣馁苣뾂菣醃苣ꪳ胣뮻蓦꺁铧ꎔ雦閳胣뮻蓦꺁뷤ꢔ雦閳臣ꦁ볯꾁胣袅ꇨ肊ꇨ꺁귥ꢜ臣ꊖ뿤馁苣讁郥讁臣ꊖ苣覂臣膀臣讁臣讂郧놔臣节胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뮻蓦꺁ꯨ花ꃩ讁苣꒙ꓥ馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 閼铧閁苣讂菦놠뫦膀뻤袁臣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣閼铧馁苣芏胨螖賧膀裥財觧膀菣벃苣馃菣릂胣螃菣뾂菣벃苣ꢂ菣袃菣膀迥뎁諦鎡臣膀臣ꢁ臣鶁臣閼铧ꮁ髩鞁臣躘꣨鞁臣讁臣龁臣鞁臣节胣芏藧ꮁ苣誂鳦몇ꇩꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣肨迥馁苣薃ꃥ邺臣肨飦ꢁ鳦颡臣肨飦ꢁ臣뢛迥馁苣뒠郥꾁胣겜ꇩꮁ臣醁苣肨飦貁蓥袅臣貂苣节臣ꢁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†苣꾂苣ꞃ菣誏臣ꢡ臣讦蟥鞁臣邙껥銂蓦뎛臣ꚁ臣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣龮雦设胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯鶃菣貃苣것苣膃菣꺁ꏨꂀ戼㹲 겜駧躘臣袂苣낁胣鶃菣貃苣것苣膃菣誏臣込臣龁臣鶁苣覂臣肸菩节臣辁臣颠鿥꾁胣銼볯醼볯뒹볯袜볯閼韦ꮁ蟥颡臣貂臣貀볯膽뷯閽뷯膽뷯钽뷯銽뷯躽뷯₇궼뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯辽뷯ₒ낼뷯辽뷯閽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆늼볯ꆼ†볯銽뷯躽뷯莽뷯覽뷯钽뷯趀臣財臣讂볯뎼볯꺼볯醼볯颼볯邼볯邼볯馼볯ꎻ郧몺闦蚐闧랏볯閼볯邼볯ꮁ闦몤臣貂臣蒁苣릖돦銂裥ꢔ臣ꚁ臩邈臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣꺁蛥릮臣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†닧붣雦閳臣鞁臣꾁胣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯馼볯貼볯鞼볯랏胣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯馼볯貼볯钼볯랏胣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯邼볯貼볯銼볯랏臣馕ꓧ閁苣ꚁ臣讂雦閳苣馌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂苣뎱鯥꺻觧놨蟥颡臣鶁苣麁苣꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 鶃菣貃苣것苣膃菣꺁ꓦ몇雦閳迥뎁觧뒾臣醁臣릖돦꾁胣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯馼볯貼볯颼볯랏迥뎁뇧붛믤릉꣨몇ꇩ견볯醼볯鞼볯颼볯馼볯閼迥ꮁ闦몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ껥財臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂苣꾁臣貂臣貂迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁觧뒾臣醁臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃菣莃菣뎃苣膀胩ꊻ蛥떅듧랂菣꾂苣뎃苣뎃苣膀鯩랍裥莸꟨邞胣誏臣늼볯ꆼ룤钴觧꺁ꓦ몇臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂触閳苣ꢔ臣ꚁ臩邈臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣鎁臣膀觧뒾臣醁臣膀볯꺼볯ꊻ蛥ꦉ藩鞈苣몱껥馁苣鎁臣膀볯꺼볯ꊻ蛥ꦉ臣钴뫥銂뇦骮臣讂臣ꢁ胣늼볯ꆼ믨馆觧꺁鯩랍룤螝룤Ꞁ苣몱껥馁苣鎁臣貁郥뺁苣讂胣鶁臣袂臣ꪁ雦閳臣膀뻤袁臣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯馼볯貼볯邼볯랏迥뎁뇧붛믤릉꣨몇ꇩ견볯醼볯颼볯邼볯醼볯邼迥ꮁ闦몤臣貂臣誁苣膀臣貂苣꺁믤릉꣨몇ꇩ꺁臣貂臣貂臣薆껥꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯躼苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁郥邈戼㹲 辺ꯨ㲖牢ਾ†鳦몙飦ꮁ苣貂臣膀룤ꪃ菣뢅賥ꚭ苣ꢔ臣ꚁ胣궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣銼臣꺁ꃩ龟臣龁臣ꢃ裥銂軦袐臣뺁臣꾁菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣鞁뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁雦閳臣袂苣낁胣閼胢肸菣뎃藩ꢁ鳦꾫볯馀뷯薽뷯꾼볯뺁臣꾁菣궃菣꾂臣貂臣꾼볯ꢁ苣覜臣讂볯邼볯貃苣것苣膃菣ꖻ룤꺁곧醼ꃩ龟臣龁臣견볯ꢃ裥貁賥ꚭ髧ꮁ郥邈臣貂苣芀觥風ꃩ龟臣颼볯貃苣것苣膃菣袂苣랕臣뒠郥꾁胣鶁苣銂菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣ꢔ臣銼臣꺁軩ꢁ臣ꚁ郥邈臣ꚁ苣袂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꒂ菣鎃菣궃믨馆볯ꦼ볯뒼볯銂铧蒁臣견볯颠鿥뺁臣꾁곧醼菩蚈苣麝뷤꺽觧낕髧꺿ꏩ袼뷯辽뷯銈뷯辽뷯覽뷯覽뷯躽뷯貽뷯馽†뷯辽뷯覽뷯覽뷯蒽볯颠鿥뺁臣꾁鷩趽뷧蒚觧낕髧꺿ꏩꢃ裥ꢁ臣ꚁ郥邈臣讂ꃥ袐臣膀뛧蒁臣膀볯馀룤ꪃ菣뢅臣꺁믨隌臣膀臣貂臣骶臣鎼胢ꮜꯧ꺁苣ꎃ菣钃菣낂苣財臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 肸菣뎃藩鶿귨몟臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣ꖟ苣貂臣蒁苣节臣꺁臣骁苣讁臣覂臩麊臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣견볯颠鿥뺁臣꾁곧銼菩蚈臣膀賥ꚭ郥邈돦뺁臣꾁볯뚼볯閳臣蒁臣貂臣銂铧蒁臣袐裦鞁뻥讂胣ꦼ볯뒼돦꾁胣꺿ꏩ閁苣龁苣ꎃ菣鞃苣膌臣鞃菣ꒂ菣벃苣ꦈ铧馁苣鎁臣貁臣趁苣늼볯ꆼ菣ꪃ菣ꦃ菣벂苣ꮐ臣鞾苣芀臣讂臣꾁胣醼볯邼菣꾂菣ꪂ菣覃臣ꞁ臣궂菣莃菣銂賥ꚭ髧ꮁ郥邈臣膀볯뚼볯颠鿥뺁臣꾁볯뚼볯ꢃ裥ꮁ苣莃菣ꪃ菣낂臣ꚁ苣袂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꦃ苣늂菣랂菣뎃돦ꮁ臣蒁臣꾁胣꒼볯ꆼ†볯钼菣겂菣벂臣袂苣ꦃ苣늂菣랂菣뎃臣膀臣貂臣骶臣꒼볯ꆼ뷯薽蟥蚐臣袂臣ꚁ胣뎂菣ꮂ菣麃菣隌苣릮飦ꮁ鯥뾁臣貂苣꾁臣ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꢳ蓦閁苣龁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藥鎽苣膀菣뎃藩銈돧뮸軩ꞁꏨꂀ臣讂뿥膦臣ꪁ臣芀ꓨ낕臣颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣肸臣貁菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂ꃥ袐胣鶁臣袂臣ꪁꃩ龟臣龁臣ꢃ裥꾁菣뎃藩銈돧뮸軩銂郥肂臣ꢁ臣붥臣鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꆬ臣膀믤辄臣ꊗ鿧꾂菣莃苣놂菣릂菣ꪃ菣膀苣ꮃ菣꾂菣莃苣袼뷯銽뷯袽뷯莽뷯覽뷯讽볯놂菣릂菣ꪃ菣膀苣ꮃ菣뎃苣袼뷯辽뷯閽뷯覽뷯讽볯膀臣龁臣鎽ꗦ薀臣ꖟ苣貂臣蒁苣隻臣邃苣ꪂ苣뎃苣ꖃ苣벃菣隌귥銂铧蒁臣膀菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣銂ꇨ蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†郥邈뗧꾷戼㹲 肸胩꺁蟥몙苣낂菣뎃菣銂铧蒁臣궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣鲽ꏨ馁苣芀臣꺁苣蚁臣뮂苣ꆃ菣袃臣꾁胣㲁牢ਾ볯膽볯骀룥꺁볯馀볯ꢼ苣ꮐ苣궂菣莃菣閁苣鶿귨閁苣龁볯馀苣낂菣뎃菣袼볯ꖼ볯躼볯覼胣㲁牢ਾ볯芽볯骀룥꺁볯馀볯ꢼ苣ꮐ臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣뎂菣螃苣뎃苣颠鿥銂郥뾁뻥讂胣閼胢覸菣뎃藩뮂苣ꆃ菣袃볯뎼볯Ꞽ볯銼볯膀戼㹲袼뷯覼苣ꮃ苣뮂菣뎃苣ꮐ苣膀臣龁臣鎼胢꾼볯銂郥뺁臣蒁胣궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣鎼胢꾫볯设臣낁菣벃菣覼铧꺁볯馀룤ꪃ菣뢅苣낂菣뎃菣袼볯ꖼ볯躼볯覼戼㹲貁郥뺁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†郥邈볯隌귥蒚郥邈臣龁臣ꦼ볯뒼郥邈볯貾臣膀苣낂菣뎃菣鎼볯뎼볯Ꞽ볯鎼볯銂苣ꮃ苣뮂菣뎃臣ꚇ郧鞁胣ꆬ臣钃菣鮃苣閃苣뾂菣벂臣ꚇ郧馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣閼胢肸菣뎃藩銂铧邈臣鮁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꆬ臣膀볯꺼볯ꪃ苣벃苣銂铧蒁臣膀苣낂菣뎃菣銼볯뎼볯Ꞽ볯銼볯銂볯ꖼ볯躼볯ꮁ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣馁苣芀곦ꮁ胣ꦃ苣늂菣랂菣뎃臣貂臣鶃菣貃苣것苣膃菣銂닧붣臣膀菣궃菣릂菣ꆂ苣벃苣ꞁ蟥蚐臣讂臣ꢁ臣膀뫤ꪃ菣뢅苣螈雦馁苣芀곦ꮁ胣ꚇ郧閁苣龁볯ꖼ볯躼볯銈볯ꖼ볯躼볯讧꿧ꦉ苣뺲ꏨ鞁胣閼胢ꮜꯧꮁ볯ꖼ볯躼볯銂菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣馁苣芀苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁臣覂臣讂닧붣苣蚃菣鞃苣財臣ꚁ苣袂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣뒠郥膀菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣閁苣龁苣낂菣뎃菣뺁臣꾁軦袐臣貂臣뮂苣ꆃ菣袃臣ꆬ臣袂臣ꮁꇨ鞁뻥讂볯閼胢떼볯늼볯뎼볯Ꞽ볯醼볯膀苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ胣馁臣辂臣꾼볯ꚼ볯뎼볯Ꞽ볯銼볯誏臣鎼胢떼볯늼볯鶃菣ꆼ볯뎼볯Ꞽ볯鎼볯芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 蒐苣蚃菣鞃臣躏軧꾁볯邼胣馼볯薼臣节臣誂뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤鎼볯莽볯꺼볯龔铧꺁臣膂臣낼볯늼戼㹲 莽볯꺼볯銂ꫨ붣臣讂臣膂臣낼볯늼럥讨臣膀볯膽뷯膽†볯覽뷯鎽뷯鎽뷯薽뷯鎽볯麃苣膃菣벃苣莃菣麷苣ꦂ菣邃菣뎃볯ꮁ苣讂볯쎒ꮼ볯낼볯₡ꢼ볯ꚼ볯袼闥馨볯ꢼ뷯钽볯钽뷯銽뷯ₔ늼뷯膽뷯馽볯覽뷯銂铧蒁臣財苣貂苣芀臣꺁돧꾁胣銼韃볯ꆼ볯ꆼ†볯薽뷯蒽뷯궼뷯颽†볯銼볯閼볎뷯鮼菣ꦂ菣벃菣鞃菣ꒂ菣벃볯醼볯閽볯覼볯躼볯閼볎뷯鮼菣邃菣릂菣ꦃ苣麃菣袼볯邼뷯궼볯邼볯鞼볯캕貽볯蚃菣鞃菣벃菣莽볯꺼볯銈볯邼볯躽뷯銂郥뾁胣蒽볯銼볯ꞁ볯閼볯邼볎뷯ꮁ룥袇臣貂苣芀迥鲿鷦뚻臣膀볯閼蓢ꞁ볯蚈臣貾胣馼볯莄臣銼볯銧胣ꆬ臣閼볯莄臣醼볯銧胣ꆬ臣鞼볯莄臣钼볯銧苣銼볯떂苣꾂菣膀곦ꮁ볯銼蓢ꞁ볯蚈胣ꆬ臣芵뫤뺁臣钼蓢ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꺁菣邃菣릂菣ꦃ苣麃菣ꮁ臣膀뷯늼볯ꆼ룤꺁菣ꪃ볯醼볯㲒⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯꺁⼼㹵臣膂臣膀菣ꪃ볯醼볯㲒⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯貁⼼㹵뗧뾁뻨뺁苣ꚁ臣讂胣鶃菣貃苣것苣膃菣趽볯꺼볯궸臣鶃菣袼볯覼菣벃菣꺁闩閁苣뾪꿧馁苣龁苣ꮁ胣鶃菣袼볯覼菣ꦃ苣袃臣誸꣨袂苣랕臣뺁臣꾁鿧蒁믤꺁菣邃菣릂菣ꦃ苣麃菣銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯躽뷯覽뷯銽뷯螽뷯躽臣낼볯늼볯겼볯꺼볯袼闥馨볯낼볯늼†볯覽뷯銽뷯궂菣袃볯ꮂ菣閃苣ꮃ菣ꊂ럥ꮂ菣ꮃ苣邃菣覃볯銂뷤ꢔ臣膀ꏨꂀꗦ薀臣겪飦뢛臣鎾臣ꚁ胣趏뿥銂苣ꪃ菣뎃苣莃菣馁苣袼볯캕螽臣ꞁ볯芀迥鲿臣ꆋꓥꮁ臣놨껥辇臣Ꞥ臣蒁ꏨ膓苣뾽臣龁苣ꪃ菣뎃苣莃菣貁뿥膦臣ꪁ苣ꂁ苣蚁胣꾂菣벃菣ꊂ菣鞃臣骶臣ꚁ胣꺼볯꺼볯꒼볯꾼볯袼闥馨볯銂铧蒁臣莽볯꺼볯銂껥辇臣膀苣겂菣벃苣늂菣뮛냦뎳该ꞁ裥邞臣讂臣ꢁ臣膀뷥늩뷯꒼볯ꆼ臣袺菦閁苣讂苣ꒂ苣ꞁ臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀곦ꮁ胣莽볯꺼볯銂藩鞈뇦骮꟨邞臣颻臣ꚁ臣覂胣ꒂ菣鎃菣궃믨馆迥鲿臣늀苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯躼苣뎃菣袃菣ꊻ蛥袼볯뚼볯覼戼㹲 ꒂ菣鎃菣궃믨馆迥鲿臣袂苣膀鷥肸臣꺿ꏩ閁苣龁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣ꮐ鳦馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣貁铧邈臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ鷥肸臣꺿ꏩ閁苣龁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀鳦몙飦꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣肸ꃩ龟臣龁臣肸菩蚈苣ꮐ臣鞾苣芀諦ꖅ臣讂菣꾂菣ꪂ菣覃룤ꪃ菣뢅볯꺼볯낼볯랷郥ꦉ臣膀ꓥ뚄迥뎁鷩ꦤ蓧꺼볯낼苣ꢔ臣ꚁ胣ꪇ껥ꞁ뷤覂苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†藥讞髧ꪁ苣뎃菣袃菣ꊻ蛥趏뿥꾁胣ꆬ臣馌臣讂苣꺁苣ꮐ苣骼戼㹲醼†菣뎃菣것菣袃뷯꒼볯ꆼ†볯躼볯캐螽戼㹲銼†볯邼韃믨馆菣莃菣ꆂ菣袼볯邼볯趽볯袃菣릂裢ꢼ볯貽†뷯ꢼ볯躼볯膀볯馼볯趽볯₭궼뷯ꎼ뷯銼胣閼볯趽볯₭꒼볯뒼胣醼볯趽볯릂菣ꮃ菣뢂菣覼†볯躼볯캐貽戼㹲鎼†苣릂苣ꂃ볯뒼볯袼郥銼볯趽볯覼†볯躼볯캒貽戼㹲钼†볯꺼뷯鎽뷯뮘껥ꒉ†볯邼볯㲵牢ਾ볯ₕ뒼볯ₗ늼볯ꆼ菣ꪃ菣ꦃ菣벂†볯邼볯邼볯㲵牢ਾ볯ₖ蒽볯銼볯ₐ肜ꓥ銼볯躼볯캐貽胣誏臣㲳牢ਾ볯ₗ鎼볯莄臣鎼駦鎖胣閼駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†닧ꦼ볯뒼럦袐觧꾁胣貿韦꺁苣ꪃ菣뎃苣莃菣ꮁ若袁臣膀볯莄臣芵ꓥ鶿귥鞁뻥讂胣ꆬ臣膀볯떼臣늼볯膽뷯薽菣ꪃ菣꒼볯膽뷯薽苣ꢔ臣ꚁ胣莅臣蚃菣鞃菣벃菣銂뛦隌臣讂胣鎼볯莄臣醼볯蚈雩꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾臣膀볯趽뷯覽뷯躽臣궼볯Ꞽ볯ꎼ볯ꖼ볯늼볯蚕꣦覼苣莃菣袼菣궂苣릂럥ꪂ菣릂菣뎃볯銂뷤ꢔ臣膀ꏨꂀꗦ薀臣겪飦뢛臣鎾臣ꚁ胣趽볯꺼볯銂닧붣臣讂胣鎁臣궂菣袃臣閼볯邼볎뷯뺁臣꺁볯꺼볯銂닧붣臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁臣꾂菣벃菣ꊂ菣鞃臣骶臣ꚁ胣꺼뷯躽뷯꒼뷯辽뷯銂铧蒁臣늼볯ꆼ苣骮蟩鞁胣ꊂ苣궃菣릂苣ꮃ鯩鞰돦開臣蚈黦馁苣鎁臣ꞁ胣늼볯ꆼ臣ꦁ귦ꪁ苣ꒂ苣ꞁ臣讂臣ꢁ胣誏臣늼볯ꆼ臣蚈꟨貁뗨趁臣蒁臣蒁臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯躼藩ꂴ髧궂菣莃菣뎃苣㲰牢ਾ†菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣궂菣莃菣뎃苣꾁곦꺁苣蚁臣財臣芀臣鎁臣꾁胣랷郥ꦉ臣ꦼ볯뒼†볯꺼볯₡隼볯캐螽胣醼볯邼볎뷯誏臣肜ꓥ鞼볯캒貽臣蒽볯銼볯銂郥肂胣랷郥ꦉ苣隼볯莄臣閼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣鎁臣ꞁ볯꺼볯銂ꓥꞀ臣鮁胣鶁臣貾胣뒛臣ꮁ냦ꮁ꟧馁胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†곦ꮁ鳦鞃菣袃苣벃菣ꞁ臣膀볯邼韃苣ꎃ菣钃菣낂菣莃菣ꆂ菣袼볯躼볯궼菣ꪃ苣銈볯ꎼ뷯袼뷯ꢼ볯躼볯覼胣隼볯趽볯₭ꮼ볯貽胣醼볯躼볯趽볯₭궼뷯ꎼ뷯銼볯袼볯邼볯邼볎뷯覼볯銼볯趽볯₭Ꞽ볯낼볯閼볯邼볎뷯覼볯銼볯趽볯₭뎼裢ꊂ菣躃苣ꮃ菣膃苣讃菣袼볯躼볯캕貽볯鮼볯꺼뷯鎽뷯뮘껥ꒉ볯醼볯邼볯覼볯銼胢銈볯銈菣膃菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂볯钼볯邼볯覼볯꾃苣랂菣ꊂ苣ꎃ菣钃菣낂藩ꂴ볯낂苣讃菣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣覼볯钼볯떼볯鮼뷯ꢼ볯邼볯銼볯캘貽臣ꞁ볯꺁럦袐볯誏臣鎼볯莄臣膀볯꺼볯貁볯邼볎뷯꺁ꃥ袐臣鎼볯蚈臣覂볯꺼볯貁볯颼볯캐螽臣뒠郥꺁볯芙雩뺁臣꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣銂ꇨ蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†곦ꮁ胣ꆼ뷯芽뷯辽뷯꺁볯ꖼ볯ꆼ볯겼볯ꆼ볯袼闥馨볯궂菣袃볯蚃苣떂苣麷苣벃苣膃菣覼苣뾽铧鞁胣붣胩궥胨꺁ꫨ躘鯦ꮁ뻥ꎁ臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣뺲ꏨ馁苣芀臣꺁苣ꪃ菣뎃苣莃菣ꮁ뛧蒁臣膀볯ꆼ볯꾼볯늼볯낼볯蚕꣦覼볯뒼뷯薽뷯趽뷯ꚼ뷯鎽뷯薽뷯膀菣떂菣ꖃ菣뮂菣蒃럥Ꚃ苣ꮃ苣ꂃ볯銂铧蒁臣늼볯ꆼ苣骮蟩鞁胣ꊂ苣궃菣릂苣ꮃ鯩鞰돦開臣蚈黦馁苣鎁臣ꞁ胣늼볯ꆼ臣ꦁ귦ꪁ苣ꒂ苣ꞁ臣誂胣늼볯ꆼ臣蚈꟨貁뗨趁臣蒁臣蒁臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣芀胩ꊻ蛥銈볯ꎼ볯銂ꇨꎁ臣랂菣꾂苣뎃苣뎃苣ꢔ臣莽볯꺼볯銂铧邈臣鮁苣鎁臣ꞁ胣늼볯ꆼ铧ꦉ苣超裥몱껥鞁臣节苣蒁胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤隼볯鶃菣ꆼ菣벃菣뎃苣趏뿥㲜牢ਾ†뷯꒼볯ꆼ룤ꮁ菣ꪃ볯貁臣蒁ꃥ袐臣膀鳦芵铧ꦉ臣꾂菣벃菣뎃苣趉臣鶃菣ꆼ菣벃菣뎃苣趏뿥銂ꇨ辂臣醁苣낁臣覂臣蒁胣鎁苣꾁胣궂菣莃菣閁苣龁볯뚼볯₴늼볯ꆼ볯醼볯邼볎뷯覼볯늼볯膽뷯薽飩뎮觥袼볯邼볯覼볯醼볯쎐蚃菣ꪃ菣낂菣莃菣ꆂ菣袼볯躼볯궼菣ꪃ苣銈볯ꎼ뷯袼뷯ꢼ볯躼볯覼胣銼볯閼볯₭꺼뷯ꎼ뷯膀볯邼볯趽볯₭궼뷯ꎼ뷯銼볯袼볯銼볯邼볎뷯覼볯銼볯趽볯₭ꆼ볯낼볯隼볯邼볎뷯覼볯鶃菣ꆼ菣ꪃ菣ꦃ菣벂볯銼볯떼볯鮼뷯ꢼ볯邼†볯銼볯躼볯캕貽臣ꞁ苣랷郥鞁胣鎼볯莄臣鎼볯蚈苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣財苣貂苣芀菣ꪃ볯蚃菣ꮃ臣ꊻ蛥ꦉ룤ꮁ韦ꮁ귥ꢜ臣讂ꃥ袐臣膀菣벃菣뎃苣趏뿥銂ꏩ낁臣ꚁ胣ꆼ뷯芽뷯辽뷯꺁볯ꖼ볯ꆼ볯겼볯ꆼ볯袼闥馨볯궂菣袃볯蚃苣떂苣麷苣벃苣膃菣覼臣袂苣꾂菣벃菣ꊂ菣鞃볯閼볯邼볎뷯뺁臣覼臣뒛軦늀臣鞾苣芀菣ꪃ볯鶃菣ꆃ菣벃苣꾁ꗥ뺁臣辁臣떅꿦궸臣몙迧鞁臣蒵迦袁藩ꂴ臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 鶃菣ꆼ菣벃菣뎃苣趏뿥꺁蟥蚐菨鮊臣龁臣貮藥Ꞁ臣뢸臣ꎭꋧꪁ苣ꒂ苣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣节臣覂臣ꢁ臣邙苣ꪁ臣鎁臣銂郧ꎧ臣릁臣ꞁ臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣誁苣鶁볯邼胣銼볯邼菣꾂菣ꪂ菣㲁⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢菣膀⼼㹵뻤袁臣蒴볯邼胣閼볯膀볯邼胣鞼볯膀볯邼胣馼볯膀볯醼胣馼볯膀볯鎼胣馼볯膀볯閼胣馼볯膀볯鞼胣馼볯膀볯馼胣醼볯邼胣醼볯醼胣醼볯銼胣醼볯鎼胣醼볯钼胣醼볯閼胣醼볯隼胣醼볯鞼胣醼볯颼胣醼볯馼胣醼볯邼胣醼볯邼裢醼볯閼胣醼볯閼胣醼볯隼胣醼볯鞼胣醼볯颼胣醼볯馼胣醼볯邼胣醼볯醼胣醼볯銼胣醼볯鎼胣醼볯钼臣龁臣醼볯閼臣鶃菣ꆼ菣벃菣꾁胣겜駧躘臣蒯鯥薆臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯躼ꓥ뚄볯馀苣ꎃ菣鞃迥뎁볯馀苣ꎃ菣鞃苣誃菣낂戼㹲 鶃菣貃苣것苣膃菣꺁볯馀裢궂菣莃菣뎃苣꾁胣ꆬ臣馌臣讂賥ꚭ髧늼볯ꆼ苣ꎃ菣鞃苣誃菣낂苣뾽铧鞁胣붣胩궥胨꺁菣궃菣뎂菣ꮃ臣鎾臣ꚁ볯馀裢낂苣躃苣뎃苣ꎃ菣鞃꟦ꂀ苣龔裦閁臣讂臣ꢁ臣膀苣뎃菣袃菣ꊻ蛥趏뿥궸臣ꚸꇨ鞁臣貮뫤閁臣鞾苣骼볯馀裢꾼裢궼뷯銈뷯鞼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯뮼볯늼볯ꆼ苣ꎃ菣鞃볯鮼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯鮼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯鮼뷯鞼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯鮼뷯鞼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯袼볯薽뷯ₗꖼ뷯螽뷯膽뷯蒽†볯覽뷯겼뷯芽뷯膀菣떂菣ꖃ菣뮂菣蒃럥ꒂ菣릂苣ꎂ菣膃볯芀뿤뺣볯꺼볯꺁볯馀裢궂菣莃菣뎃苣꾁胣꾃苣랂菣ꊂ苣ꒂ菣릂苣ꎃ菣钃菣낂藩ꂴ苣ꢔ臣ꚁ胣ꎼ뷯邽볯趀꟦ꂀ苣龔裦閁臣讂臣ꢁ臣膀믨馆뻥ꮁ껥蚺臣鞾苣骼뷯鞼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯袼볯薽뷯ₗꖼ뷯螽뷯膽뷯蒽†볯覽뷯겼뷯芽뷯膀菣떂菣ꖃ菣뮂菣蒃럥ꒂ菣릂苣ꎂ菣膃볯芀볯膽뷯醼꟦ꂀ臣膀菣꾂苣讃苣Ꚃ苣ꮃ苣궂菣莃菣뎃苣떅듧ꢁ볯馀裢꾼裢ꆃ菣ꮃ裢袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂臣꺁룤릖苣ꢔ臣ꚁ뷯鞼볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯銈볯馀裢꾼裢ꆃ菣ꮃ苣龔裦閁臣讂臣ꢁ臣膀铧邈臣鮁뻥讂胣ꎼ뷯邽볯讧胩꾁胣ꎼ뷯邽볯讧胩讁苣膀뛧蒁臣膀볯馀裢꾼裢ꆃ菣ꮃ裢袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂苣ꢔ臣ꚁ볯馀裢견볯袼뷯躽뷯薽뷯薽뷯閽뷯钽뷯趽뷯钽뷯覼菣꾂菣ꪂ菣覃臣銼胢銈볯銈菣膃菣隌苣財臣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣龔裦閁臣鞾苣芀볯膽뷯鎼꟦ꂀ臣膀볯膽뷯銼꟦ꂀ臣覂胣骶臣ꚁ볯馀裢꾼裢ꆃ菣ꮃ裢袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂苣ꢔ臣ꚁ볯馀裢견볯袼뷯銽뷯膽뷯钽뷯邽뷯躽뷯貽뷯覽뷯膽뷯薽볯貃苣것苣膃菣꺁볯馀裢꾼裢ꆃ菣ꮃ賥銂ꇨ蚁臣ꢁ臣袂臣ꚁ铧邈臣鮁뻥讂胣떅듧꾁ꗥ뺁臣辁臣蒵迦袁뻤ꚵ뫦ꮁ铧ꖝ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鏥뎹该ꦉ듧麃룤ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣貂臣뒠郥膀뿤뺣뷯늼볯ꆼ臣膀볯銼胣醼볯芙雩꺁雩膀臣龁臣醼볯芙雩薶胣设臣낁볯钼駦鎖胣鎼볯芙雩膀볯颼駦鎖胣隼볯芙雩膀볯銼駦鎖臣龁臣鞼볯芙雩薶臣覮껥Ꞁ苣覜臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤颼볯궂菣莃菣뎃苣ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ†볯躼苣뎃菣꾂돨몙迧ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ†鳦躘듧뢛臣馕ꓧ馁苣궂菣莃菣꺁臣骁苣讁苣ꮐ鳦鞁胣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣銂胣覭臣蒁뿦ꚺ臣내菨궸臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣馁苣鎁臣貁臣趁苣芀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣隼駦鎖胣醼볯芙雩膀볯钼駦鎖迥뎁볯隼駦鎖뻥ꮁ胣릟ꓩ릟鳥궸臣蚈돦閁苣龁苣뎃菣꾂돨꺁蟩銂胣ꖼ볯ꦼ볯ꆼ臣袂臣ꚁ苣莃苣ꒂ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣릟鳥궸臣颫菣馃菣꺁苣뎃菣꾂돨銂裥貳臣讂郥邈菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀ꯩꚺ臣뮿꣨뎂菣钃菣뎃菣ꪁ苣ꎃ菣鞃꟦ꂀ苣膌臣袐裦鶃菣貃苣것苣膃菣ꮁ꿥鲿臣讂臣芁苣蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볯躼듧ꚺ裥邞郥邈戼㹲 겜飦내鯦ꮁ闦몤臣讂苣ꎃ菣鞃臣蒁臣貂臣銂郥覜臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣膀ꓥꞀ苣겂菣벃苣뾰듧늂菣뮛냦뎳该뺁臣꾁볯낼볯ꎼ裥邞苣ꢔ臣ꚁ胣钴뫥ꮁ雩鞁臣钯볨馁苣鎁臣貁臣趁苣芀鯩鞰돦開臣颍룤꺁뗧袐臣貂臣邃菣覃苣躸臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀ꓨ낕臣邃菣覃臣龁臣麸諧꺁菣뎃菣銂룤袁苣鶃菣貃苣것苣膃菣ꢁ꿦莼臣ꚁ胣颫듧ꚺ臣龔裦ꦉ臣뺯뿥馁苣芀跥肸臣ꢼ볯겼볯钃菣꾂苣躸臣讂郥邈菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣膀ꯩ钴뫥ꪁ铧邈觧ꮁ꿥鲿臣讂臣芁苣蚁胣颫諥螎臣궂菣莃菣뎃苣趏뿥뮁臣膀ꯩ钴뫥ꪁ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃鯩ꎛ苣躸臣讂臣芁苣蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯躼苣ꒂ菣ꮂ苣뎃裥邞戼㹲 겜飦내鯦ꮁ闦몤臣讂苣ꎃ菣鞃臣蒁臣貂臣銂郥覜臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣膀ꓨ낕臣莿뫥ꞁ듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣馁苣鎁臣貁臣趁苣芀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣隼駦鎖胣醼볯芙雩膀볯钼駦鎖迥뎁볯隼駦鎖뻥ꮁ胣릟ꓩ릟鳥궸臣蚈돦閁苣龁볯꺼볯銈苣ꮃ菣ꆂ迥뎁볯ꚼ볯銈菣벃苣ꪁ臣꺁苧螗ꫨ몙胦떂苣袃苣ꒂ菣꺁蟩銂胣ꖼ볯ꦼ볯ꆼ臣袂臣ꚁ苣莃苣ꒂ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣릟鳥뢁臣颫菣馃菣ꪁ苧螗ꫨ몙胦떂苣袃苣ꒂ菣꺁裥貳苣节臣覂臣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣超雧뮴胦隌苣ꎃ菣鞃꟦ꂀ苣ꮐ鳦馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣ꮁ꿥鲿臣讂臣芁苣蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†볯躼苣ꎃ菣钃菣낂迥鲿諥螎戼㹲 겜飦내鯦ꮁ闦몤臣讂苣ꎃ菣鞃臣蒁臣貂臣銂郥覜臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣膀菣꾂菣ꊂ菣벂蟥蚐뻥ꮁ볯ꎼ裢궼볯ꮁ苣誂胣궂菣莃菣뎃苣趏뿥릊軧ꮁ臣蒁臣蚈黦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀苣ꎃ菣鞃臣貂臣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁菣꾂菣ꊂ菣벂蟥蚐臣膀볯ꎼ裢궼볯ꮁ苣ꎁ臣鲤蟥꾏菨ꪁ胣誁鯩貃苣것苣膃菣ꢁ苣ꎃ菣鞃臣貂臣閼胢銈볯銈룤ꪃ菣뢅苣ꎃ菣鞃꟦ꂀ臣꺁럦袐觧銂룤袁苣ꞁ臣趂臣芀볯ꎼ裢궼볯릂菣꾂菣ꮃ臣誁臣讂苣ꎃ菣鞃臣貂臣龔裦ꦉ臣辇臣膀迥鲿臣覂臣辷菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣醃菣뮂菣袃臣鞁臣ꢡ臣鎁臣貁臣趁胣궂菣莃菣뎃苣趏뿥릊軧ꮁ꿥鲿臣讂臣芁苣蚁胣궂菣莃菣뎃苣趏뿥릊軧꺁ꯩ蒁苣ꎃ菣鞃꟦ꂀ臣膀볯ꎼ裢궼볯ꮁ苣貂臣膀苣ꎃ菣鞃臣貂臣龔裦ꦉ臣辇臣颫臣ꞁ臣趂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯躼뿤뺣볯꺼볯뺁臣꾁볯뒼†볯ꎼ볯ꎔ觧꺁苣겂菣벃苣늂菣뮛냦뎳该㲕牢ਾ†胥薀臣鶃菣貃苣것苣膃菣袼뛦辇볯邼볎뷯궸臣銼볯邼胣钼볯邼뷯螽볯뺁臣꾁胩ꊻ蛥閁苣龁볯ꎼ볯ꎔ觧袼볯邼볯鲀볯邼볯躽뷯覼苣膀鷩覤胦醼볯銼볯ꊂ苣궃菣릂볯銈볯薽뷯袼볯躽뷯覽뷯銽뷯螽뷯躽胣ꮂ菣閃苣ꮃ菣ꊂ럥ꮂ菣ꮃ苣邃菣覃볯誸臣Ꚃ苣ꮃ臣궃菣螃苣뎃苣鞁胣붣胩궥胨꺁菣궃菣뎂菣ꮃ臣鎾臣ꚁ볯銼胣醼볯蚈胣뎳该馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯邼볯꺼뷯躽뷯蒽뷯辽뷯꺿ꏩ늼볯ꆼ껥辇迥뎁볯뚼苣骃苣袃菣螃菣뾂戼㹲 뒼볯邃菣閃苣벃볯醼볎뷯覼룤꺁뿤뺣菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣膀볯膽뷯辽뷯銽뷯邽†볯뚼郥覅뫥겸껥ꮁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣膀賥ꚭ郥邈臣龁臣ꒂ菣鎃菣궃믨馆迥鲿臣覂臣蒐菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣躏軧銂껥辇臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯躼菣钃菣ꒂ菣銂铧蒁苣꺿ꏩ趽볯꺼볯꺁ꏨꒉ賥㲖牢ਾ†菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣궨껥鞁臣钯臣ꪃ菣覃苣覃臣랷郥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣鶃菣貃苣것苣膃菣銂苣뎃菣袃菣龮꣩ꢔ臣붣觥隌臣ꚁ臣覂胣내菨ꮁ諥袁苣芀苣뎃菣鲃ꏨꒉ臣꾁胣ꮺ뷤ꢅ뷤뢁臣ꪾ鋧銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ胣붿諥邈裥銂럦ꂊ臣讂뿥膦臣芁苣鞾苣芀苣뎃菣鲃뷤ꢔ臣ꦁ臣龁닧邭苣ꊽ裦馁苣鎁苣覂臣ꪃ菣覃苣覃臣붃諥銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣膀뷯覽볯꺼볯銈菣钃菣ꒂ菣붣觥ꮁ뷤ꢔ臣貂苣馨뫦蒚ꏨꒉ賥鞃菣뮂苣銂蟥몙苧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣鞾苣芀닧邭臣ꊽ裦貾臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣ꂊ臣膀ꓨ袐뷤ꢁ뗧袐臣鮁苣芀苣鞃苣ꮃ賥릊軧꾁꣦隺髧ꪁ觨ꂴ軦꒙苣莃苣ꒂ苣ꢔ臣ꚁ뇦骮臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯銼볯뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣ꊖ臣讂苣꾂菣벃菣뎃苣꺁雦閳戼㹲 ꆼ볯ꢂ菣꾂菣궃苣鞃菣벃苣ꪂ菣隌돦㲕牢ਾ†꿥ꆱ臣閊룤閁苣龁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뎂菣覃臣讂苣뎃菣꾂돨銂郥覜臣鞾苣龔觧ꚩ雦銂ꫨ붣臣膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯낏臣ꪳ蟩蚈黦薣뷧銂铧蒁臣膀苣것苣袃菣릂菣것菣ꒂ苣뎃賥袼볯뎼볯覼돦ꮁ雩馁苣붣胩궥胨꺁菣궃菣뎂菣ꮃ臣鎾臣ꚁ裥邞臣讂胣龔觧ꚩ雦꾁胣뾂菣螃菣ꖼ볯ꦼ돨辇裥邞苣릂菣ꂃ苣ꢔ臣ꚁ裥邞臣ꚁ苣袂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 뾂菣醃苣ꪳ雦螉臣醃苣벃菣뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨ꢅ뷤銂胣肉룤꺁苣뎃菣꾂돨ꮁ雩馁苣ꊗ鿧꺁꿥ꞅ臣钯볨鞁胣钯볨ꮁ苣ꎁ臣龮뷤銂뇦骮臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯躼菣袃菣莃苣릂铦뒏菣벃苣벃蓨ꊛ볯ꒂ苣뎃賥閳戼㹲 뺯뇨ꮁ諦躸臣貂臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣鶃菣貃苣것苣膃菣貁苣벃菣馁苣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ鳦鞁뻥讂铧ꦉꧨ首苣뾪ꏨ鞁胣麃菣ꪃ菣꾂苣꾔迦것菣뚂菣놄鯩ꒂ苣뎃賥袼볯ꆼ볯꒼볯覼돦ꮁ雩馁苣붣胩궥胨꺁菣궃菣뎂菣ꮃ臣鎾臣ꚁ裥邞臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣꾂돨궖觧꺁菣뾂菣뎃臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ藥鎽苣膀触躸臣뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ臣讂韦ꖟ臣뺯藧ꢁ꿦莼臣膀꿦莼臣袂臣ꚁ껥鎽苣몱껥馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯늶뷤꾂菣麃菣낂菣閃苣銈돨辇裥邞裢ꪳ蟩蚈黦㲐牢ਾ†볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뎂菣覃臣讂苣뎃菣꾂돨銂郥覜臣鞾苣龔觧ꚩ雦銂胣袃菣鞃苣뎃藩ꂴ臣ꚇ郧馁苣鎁臣ꞁ胣鶁臣궸臣ꮐ臣貂苣뾂菣醃苣ꪳ苣袶賥鞁뻥讂胣邵黦ꢁ臣ꚁ铧颁苣骃菣膃菣銂뛦鎽苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ裢ꪳ蟩蚈黦銈돨辇裥邞볯겼볯込볯뎼볯궼볯覼臣蚈黦馁苣芀菣鞃菣覃臣ꪳ蟩蚈黦袨蛥ꞁ雦螉賥閁苣ꚁ꣨궖菣뾂菣뎃苣躸臣膀臣꺁菣뾂菣뎃苣膀苣뎃菣ꖃ菣뾂苣ꮃ苣ꪃ苣ꂃ臣袂苣膀苣뎃菣꾂돨超裥螃菣뾂菣벃苣ꢁ菣莃菣뎃苣馁苣鎁臣貁臣趁苣芀뛦隌臣貂臣ꚩ雦銂胣肉룤꺁苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣醼뷯螽믤许臣몇駧邝雦ꮁ臣讂苣蚁臣貸蟩鞁뻥讂胣颍듧ꪁ菣莃菣ꆂ菣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣袼뻤袁臣뒰臣龁臣꺏駧Ꞁꇥ麡볯銂郥覜臣讂铧ꦉꧨ首臣膀鯧ꖎ뫦늶蛥袶賥ꮁ臩ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀苣誂ꓨ醛臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣袼뻤袁臣鞴뗦ꒉ胣麝迦몙胦ꦡ胣낂菣뮂菣벃菣覼臣膀ꧨ首裥邞苣릮飦ꮁ臣讂臣膂臣膀뿨ꂊ臣꾂菣벃菣ꊂ菣鞃苣蚃菣鞃苣薿ꛨꢁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣꾂돨궖觧꺁菣뾂菣뎃臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ藥鎽苣膀触躸臣뾂菣醃苣ꪳ臣ꊖ臣讂韦ꖟ臣뺯藧ꢁ꿦莼臣膀꿦莼臣袂臣ꚁ껥鎽苣몱껥馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯鎼볯낒賥誏臣込臣龁臣뎂菣ꮂ菣麃菣隌戼㹲 겜駧躘臣袂苣낁胣鶃菣ꆼ뗧袐苣뎃菣꾂돨ꢁ볯馀ꯧ邵郥뾂菣醃苣ꪳ臣꺁雩꺁鯧銺뷤ꢔ苣꾔迦馁苣龁苣ꮁ胣鶃菣貃苣것苣膃菣銂鋧隌臣龁臣뎂菣ꮂ菣麃菣隌臣讂臣ꢁ臣膀뿧뎨苣뎃菣蚃菣袃臣蚈귥銂铧邈臣鮁뻥讂胣낒賥뺁臣꾁苣뎃苣蚃菣벃賥꺁ꧦ讧臣醰臣辁臣节볯ꒁ臣낕臣讂뗧꾷胣馁臣辂臣膀볯覼賥ꚭ髧貵럨膀볯覼藩ꂴ髧貵럨膀迥뎁볯覼菣鲃苣ꒂ菣ꚧꫥ蒚뗧꾷臣袂臣ꚁ뗨鎁苣鞾苣芀雦龁臣ꊽ裦閁苣讂볯馀裢込볯馀裢邵郥꾁裥邭蛥뺁臣꾁裥邭雩ꞁ臣誂뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼臣貵럨ꞁ臣膀뿨辁臣蒯苣ꢁ裥邭臣閼胢꾫臣鎼胢꾫臣꺁雩ꮁ雦鞁臣놅鳦邵郥銂뷥邈臣讂賥ꚭ迥鲿胦몟苣膀ꃦ뢅臣閼胢꾫迥뎁볯馀ꯧ貁郥覜臣讂胣閼胢꾫臣꺼볯뎼裢ꢂ苣蚃菣趏뿥Ꞁ鿥銂郥覜臣膀볯馀ꯧ꾁볯馀裢ꊂ菣躃鳦꾫菣꾂菣ꪂ菣覃苣ꮐ鳦鞁臣蒁臣膀郥邈뷯늼볯ꆼ裥邭臣鎼胢꾫룤꺁볯馀裢ꊂ菣躃裢ꮜꯧ貃苣것苣膃菣貁鳦龩뫦銪룤ꞁ볯馀裢꺼볯뎼裢ꢂ苣蚃菣ꢃ裥뢁臣花ꃦ뮔鋦銂뗨鎁臣鎁臣ꞁ胣낖臣蒁볯馀裢込볯馀裢ꊂ菣覃뗧袐苣ꊽ裦馁苣袂臣ꮁ臣ꎁ臣蒁臣节苣蒁胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣貵럨ꞁ臣膀볯钼†볯꺼볯ꪃ苣벃苣銂铧蒁臣膀볯馀裢鮃苣鮃菣ꮃ賥뢠藩蚈귥銂ꃦ뢅臣鎼胢銈菣覃菣궂苣ꮃ鿥ꮁ藩ꂴ髧ꮁ胩邵臣讂臣ꢁ臣膀雦鞁臣鮃苣鮃菣뢂苣릂菣ꮃ볯邽뷯辽뷯邽뷯辽뷯辽뷯覽뷯鎽뷯薽뷯覼뗧袐苣ꊽ裦鞁뻥讂胣芁苣趏뿥设臣꾁胣醼볎뷯꺁ꃦ뢅裥邭苣膀볯鲀볯邼跥趽臣뒼볯ₔ늼볯ꆼ菣겂菣벂볯꺼뷯鞽†볯躽뷯貽뷯躽뷯₄ꊼ뷯辽뷯膽뷯鎽胣麃苣膃菣벃苣莃菣麷苣鞃苣Ꚃ苣莃菣覼臣놅臣膀ꏨꂀꗦ薀臣鞃菣袃苣벃菣ꮁ뻥ꎁ臣膀볯鞼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣鎁臣ꦃ苣늂菣랂菣뎃迥鲿臣膀룤鞈臣龁볯馀ꃩ龟迥뎁볯馀ꃩ龟臣ꆸ雦ꢁꇥ몟꿥袐臣ꚁ藩ꂴ髧ꦃ苣늂菣랂菣뎃迥鲿苣꾔迦馁苣鎁臣貁臣趁苣릂菣ꪃ菣袃菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣颭鳥许臣략臣誂뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†곧鎼臣貵럨ꞁ臣膀苣뎃菣袃菣ꊻ蛥궸臣膀뗧鲞臣鞁臣龔臣讂ꃦ뢅裥邭臣膀ꃦ뢅裥邭臣閼胢꾫苣뢠藩蚈귥꺁볯馀ꯧꮁ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣馁苣鎁臣貁臣趁苣뮴胦ꪃ菣뚂苣ꂃ藩鞈苣ꮐ鳦鞁뻥讂苣蚁臣膀뷯꒼볯ꆼ菣뎃菣것菣袃臣閼胢꾫臣龁臣鎼胢꾫臣ꪃ苣벃苣ꪃ菣뚂苣ꂃ藩鞈苣뎂菣覃臣讂胣ꪃ苣벃苣ꪃ菣뚂苣ꂃ臣膀苣ꮃ菣鞃볯ꒂ菣袃菣뎃胣낂菣벃菣ꦼ苣뎃菣궃菣膀苨躂菣ꮃ苣Ꚃ苣ꮃ苣膀菣ꊂ菣뎃菣鲃苣ꒂ菣ꮁ铧ꖝ臣ꚁ苣袂臣鞁胣뎼볯겼볯뢼볯鎽뷯鎽뷯薽뷯膽뷯覽뷯₃薽뷯辽뷯閽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯覽뷯膽뷯蒽뷯ₓ芽뷯ₙ薽뷯邽뷯躽뷯躽뷯覽뷯貽†뷯躽뷯覽뷯袽뷯薽뷯钽볯ꚩ꣩ꆮ蛥늀賥覼돦ꮁ苣ꎁ臣뢁諦鞁臣节苣蒁胣ꪃ菣뚂苣ꂃ菣겂菣벂迥鲿臣邼蓢ꢁ볯鞼蓢ꢁ臣鎖臣ꦸ뫥ꞁ볯鲀볯钼駦鎖苣膦臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯钼볯鞊軥鶃菣貃苣것苣膃菣㲉牢ਾ†룤骮臣龄鿦ꂛ귥鞊軥뺁臣꾁臣貂苣꺁ꓥ낕뷤銂苣벃菣馁苣膀臣鎁臣꺁ꃧ뚩臣뾽铧鞁臣鶃菣貃苣것苣膃菣銂胣ꢡ볯颼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㈵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼裢鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㌵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼裢钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㐵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼裢閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㔵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 躇铧讞諦龎迥뎁铦覤諦龎苣ꮐ苣隻臣鞊軥銂ꇨ銼볯誏臣ꢡ볯邼臣馕ꓧ馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 躱菣ꮃ菣꺼볯뚼戼㹲 肸껥붖뷥讅臣꾁胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂ꃦ꺁胣ꢼ볯颃菣覃胣颠鿥銂駩뮎臣ꚁ苣蚃菣颠鿥뺁臣꾁蛨ꮲ胩颠鿥ꂁ臣銂껦馁胣ꆬ臣膀臣꺁ꃩ龟胣뺁臣꾁ꓨ낕臣颠鿥銂臩麊臣龁ꃥ袐臣螤闦꺁ꃩ龟苣膀藥ꮖ軥ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣ꚁ胣Ꚃ苣ꮃ苣膃菣것菣뢂臣뺯臣讂鳦ꦁ臣鲿귧ꮁ臣蒁臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣螤闦꺁ꃦꮁ꿥馁苣薹뫥蒁룤貒臣钁裦閁苣讂臣膀볯ꒁ臣ꪠ臣뺯臣讂ꓨ낕臣鲿귧貁臩邈臣貂뻥讂胣邵黦ꢁ臣ꚁ뻥覂苣讂菣꾂菣뎃臣躱苣뎃菣ꮃ苣뎃苣꾃苣膃菣ꮁ鯧鎽臣讂臣芁苣蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀뇦ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂菣꾂菣뎃苣膀鳦躘듧뢛臣讖ꓧ馁苣뮻蓦꺁藥ꮖꋥ랼鯥邭臣蒵臣袐苣鮁苣鎁臣节臣趁苣ꂁ苣蚁胣ં䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†臣讂觧骮臣龄鿦ꂛ귥鞊軥뺁臣꾁臣貂苣꺁ꓥ낕뷤銂苣벃菣馁苣膀臣鎁臣꺁ꃧ뚩臣뾽铧鞁臣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣겼볯낼苣ꮐ苣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讂ꏨꒉ臣蒁臣貂臣ꮁꏨꒉ賥馁苣鎁臣貁臣趁胣꺚蛥袼볯꒼볯閊룤뺁臣꾁귧覂蛥袼볯궼볯閊룤馁苣讁胣뮻蓦꺁臩螈臣貵럨ꮁ苣ꎁ臣閊룤鞁뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ銼볯ꮁ胣誻뿨릁臣릂菣ꂃ菣꾂菣뎃軦꺨铧邈菣궃菣뎂菣ꮃ臣뾽铧閁苣讂臣辁臣讁臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꃦ꺁볯ꆼꃩ龟胣鲆단骀ꃩ龟迥뎁듧麃돨颠鿥銂雩몤臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㔹㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㔹㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㔹㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㔹㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ†ꇨ궸胣뒼볯꾁蛨ꮲ胩銂ꇨ鞁胣ꎼ볯꾁듧麃돨銂ꇨ馁胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†룤風臣꾃苣膃菣龔裦Ꚉ闧ꮁ뛧蒁臣膀뇦閃菣벃菣꾂菣뎃苣讖駧馁苣龁苣ꮁ胣릔ꓥ鞊軥节뷤ꢔ臣鞾苣芀臣꺁苣蚁臣讧꿧ꦉ苣ꢡ볯邼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰〶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼裢鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㈶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯閼볯ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꃧ뚩裢ꢼ볯꺼볯颃菣낂菣膃菣뎃볯ꢼ볯覼諦龎戼㹲 겜ꃧ뚩臣銼껦躚臣袨铧閁苣龁胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯込볯늼볯颼볯ꢼ볯꺼볯覼铧ꖝ臣ꢼ볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯꾃苣膃菣꺁藥ꮖ軥Ꞁ苣麃苣릂臣誁臣ꚁꧨ鎨臣讂臣膂臣견볯떮髩ꢁ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯ꦼ볯ꚼ볯覼볯込볯늼볯颼볯鎼볯袼볯醼볯醼볯ꮁ苣讂蟨뮭髧膃菣것菣뢂臣뺯臣讂胥鲣苣뎃菣ꮃ苣뎃苣꾃苣膃菣꺁鳦릊胦銂菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩馁苣龁苣꺁곧銼껦躚臣芁苣芀臣꺁ꃧ뚩꣨뮔苣ꢡ볯醼臣芦ꫨ馁苣芀臣꺁ꃧ뚩臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣龁볯ꆼ볯鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣ꢡ볯颼臣讧꿧ꦉ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰钼臣㲧甯芁臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁ꃧ뚩臣견볯떮髩ꞁ臣膀볯놀鯧ꢁ볯놀鯧ꮁ胣馝蓨薆볯ꦼ볯覼胣训苨薆볯ꦼ볯覼胣뺁臣꾁髧薆볯ꦼ볯覼뗧꾷臣袂臣ꚁ胣麃苣릂臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀룤ꒁ臣꒾臣꾁菣꾂菣뎃軦꺨苣財苣骁胣肸臣꺁뻧ꮁ臣趸듦隌볯늼볯鞊軥銂諦躸臣龁胣醼胩꺛胣鎼胩꺛볯閊룤趉볯誏臣閼胩꺛臣蒐菣Ꚃ苣讁苣股룦銂迥蚛臣龁胣鎼臣꺁駦릂臣馁臣ꚁ臣ꒁ臣ꚁ胣讀胣꺁軦股觧銂胣Ꚃ苣ꮃ苣궸鋥ꊂ菣뮂苣誏臣ꢼ볯뮘껥袼볯ꆼ볯覼臣袂苣膀諦ꢼ볯뮴胦ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁胣閼胩꺛臣鞾臣鞃菣ꮃꧨ首臣醁臣ꆼ볯낼볯込볯込볯钼볯ꢼ볯꺼볯覼苣ꢔ臣讂苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣ꞁꧨ鎨臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†곧ꦼ볯떮髩㲎牢ਾ†触鮜臣超雧鲿귧貁臩邈臣貂臣꺁臣袼볯ꆼ볯鮊뻤麼볯邼볯膀ꃧ뚩臣견볯ꦼ껦躚苣財臣龁胣견볯ꦼ껦躚臣꾁胣뒇귦辇볯醼볯쎐겼볯馼볯鮼듧醼볯邼菣ꦃ菣꾂뷥邈跥趽볯낼볯떼볯覼臣ꆼ볯낼볯込볯込볯钼볯ꢼ볯꺼볯覼苣膀볩钅蛥袼볯꺼볯뒻룤馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀菣Ꚃ苣ꮁ菣ꎃ菣뎃苣銂ꇨꎁ臣芀뷤趇胣ꖁ뫥뚊藦膀迥뎁铧颭臣ꒁ臣ꚁ胣麃苣릂苣醼볯ꖗ臣辂臣ꎁ臣ꎛꛨ鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣钠ꧧꞁ臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯袼볯醼볯醼볯놔鷦꺁볯ꆼ苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃臣超雧龎胦銂菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁臣芀臣꺁ꃧ뚩臣꾁胣醼볯꒾볯閼賥骁臣覼臣ꊼ볯겼볯込뷯貛菣Ꚃ苣銂裥ꢔ臣龁胣邼胩꺛迥뎁볯놀鯧ꮁ胣뮼藨薆볯붙胦뺯藧覼胣馝蓨薆胣训苨薆胣뺁臣꾁髧薆뗧꾷臣袂臣ꚁ胣麃苣릂臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀룤ꒁ臣꒾臣꾁菣꾂菣뎃軦꺨苣財苣骁胣肸臣꺁뻧ꮁ臣膀볩钅蛥꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ苣ꎁ臣趸듦隌볯늼볯鞊軥銂諦躸臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁ꃧ뚩臣꾁胣馀ꏨꪃ菣뢠藩꾃苣膃菣誏臣붣觥貁菣Ꚃ苣銂蟨뮭髧ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯込볯늼볯颼볯鎼볯袼볯醼볯醼볯龄鿦讁苣鶿귨ꞁ臣讂臣ꦁ臣讁苣ꚩ꣩鞁臣芀뷤ꢔ臣龁菣Ꚃ苣꾁郥醼볯릌臣꒾臣隼胣颼胩ꊽ鯩ꊼ볯겼볯込뷯麃苣릂臣芁臣龁胣麃苣릂臣꾁胣邼胩꺛迥뎁볯놀鯧ꮁ胣ꦼ볯膀볯꒼胣뺁臣꾁볯뚼뗧꾷臣袂臣ꚁ菣꾂菣뎃軦꺨臣龁胣麃苣릂ꇨ薸苣麃苣꾂菣궸鋥誏臣ꢼ볯ꦼ臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣鞼胩꺛臣膀볩钅蛥袼볯꺼볯閊룤閁苣讂듧醼볯꒼볯邼臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯込볯늼볯颼볯鎼볯袼볯醼볯醼볯ꞁ胣麃苣릂臣膃菣것菣뢂苣財臣龁胣ꢂ菣覃菣ꒂ菣袃臣龄鿦貾볯鎼韦꺛胣뮭뫤膀臣龁臣覮ꗦ뮭臣芁臣龁胣鎼볯薼뛨꺁뷤趇룦醰胣떥뫥꺁韥ꂜ臣龁臣뮺韧ꮁ苣ꎁ臣몱껥閁苣讂蟩꒯臣薗諧銂釥馁苣開觧꾁껥붥귦閁臣龁胣鎽룦誏臣鎽蟩銂꿦ꖗ꣨겸臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯꺼볯붣觥꾁꿦貁볯邼볯醼볯骼볯躼볯骼볯颼볯閼臣ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ胣麝苣膃苣뎃胦芄돨膀볯ꖼ볯芄돨誏臣讧胩芄돨讁苣ꪁ臣龁胣ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ臣꒼볯覽뷯銈볯ꎼ볯銈볯궼볯袼볯邼菣ꮃ볯覼臣芁苣膀鷩ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ臣꒼볯낼볯袼볯邼菣ꮃ볯覼臣芁苣膀볯ꖼ볯芄돨꾁볯ꖼ볯銈볯꾼볯Ꞽ볯醼볯閼菣ꮃ볯覼臣芁苣膀꟦ꂀ蓨ꪳ臣뎂菣릂菣궃菣ꮃ볯鎼볯躼볯ꊃ菣薼볯ꞁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 醼胩꺛胣鎼胩꺛볯閊룤趉볯誏臣閼胩꺛臣膀郥麃苣릂臣覂ꇨ薸苣躏鯩鞁臣芀볯ꒁ臣芙苧꺁臣릁臣袼胥薀臣開觧覼臣ꒁ臣ꚁ胣讀胣꺁軦股觧銂胣Ꚃ苣ꮃ苣궸鋥ꊂ菣뮂苣誏臣ꢼ볯뮘껥袼볯ꆼ볯覼臣袂苣膀諦ꢼ볯뮴胦ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁胣閼胩꺛臣鞾臣鞃菣ꮃꧨ首臣醁臣趸듦隌苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯袼볯醼볯醼볯銂铧蒁苣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣ꚩ꣩鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 麃苣릂臣뮼藨薆蓦鎟臣ꊖ臣讂꣦隺菣궃菣뎂菣ꮃ戼㹲 貛볯鲀볯놀뷩ꊼ볯겼볯込뷯麃苣릂苣膀菣Ꚃ苣蒐볯릌臣꒾臣鞁臣躏껥鞁臣芀ꃧ뚩臣讖꟥趉냥ꪁ臣ꢁ苣鎼韦鎖臣麃苣릂苣钠ꧧ뒠触袼볯辽뷯貽뷯₅겼뷯蚽뷯₅뎼뷯覽뷯躽뷯薽뷯膀菣ꪃ菣ꦃ菣覃럥늂苣떂菣몂菣벃苣覼臣钚鯩鞁臣芀ꏩ릁觧ꢁ냦꾁蟨놔臣芑迥閁臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯꺼볯뚼臣膃菣것菣뢂苣財臣龁菣Ꚃ苣꒾臣膀믨蒁뫩钅볯ꒂ苣閃菣ꦃ菣覼룤ꞁ胣蒴볯邼韃볯꒼볯邼苣낼볯뎼룤꺁볯꺼볯뚼†볯邼볯캐겼臣鞁臣뮼藨薆볯ꦼ볯覼軦꺨臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ蓦鎟臣鮁臣芀蓦鎟뻥꾁胣뎦꿥ꢁ臣꺁뻥꺁諦躸臣龁苣ꮁ胣麃苣릂苣鶁苣麁苣꺁苣벃苣ꮁ裦鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣궸鋥㲌牢ਾ†菣ꒂ苣궃룤貒菣궃菣뎂菣ꮃ臣膀룤貕뿤ꖁꧦꊖ臣袂臣ꚁ볯邼볯邼맥醼볯袜볯ꖗ臣겅ꇨ閁苣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣꺁苣벃菣ꒂ菣뎃苣膀雧ꚭ迥뎁껧蚐臣龁苣꺁볯ꢼ볯钍諥뮂菣뾂菣袼볯ꢼ볯₯ꎼ뷯貽뷯膽뷯辽뷯膽뷯覽뷯螽†볯薽뷯钽뷯銽†뷯辽뷯ₒ뎼뷯銽뷯薽뷯貽뷯膽뷯莽뷯貼볯邽뷯蒽뷯趽뷯辽뷯辽뷯馽†뷯躽뷯₄ꎼ뷯躽뷯銽뷯貽†뷯蚽†볯躽뷯貽뷯薽뷯骽뷯覼胣뺖韧ꆮ郧袺飩뮂菣뾂菣袼볯薽뷯钽뷯銽뷯ₓ蚽뷯銽†볯薽뷯鎽뷯鎽뷯₅ꎼ뷯躽뷯銽뷯貽†뷯躽뷯₄낼뷯薽뷯薽뷯钽뷯辽뷯覼볯뎱鯥ꊂ菣ꦃ菣뾂볯ꮁ苣ꎁ臣芦ꫨ閁苣ꚁ臣讂胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂臣麃苣꾂菣궸鋥ꮁ雩馁苣馨뫦鞃菣袃苣벃菣ꢁ臣龁胣鎁苣覂臣薆껥꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 股郧鶇鯩뮘껥ꮁ苣讂苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦꺁ꇨ薸귥蒚꣨궖戼㹲 股郧鶇鯩꺁飩뎮臣ꊖ臣讂꣦隺菣궃菣뎂菣ꮃ臣膀裥財觧躀볯ꢼ볯₯ꦼ뷯蚽뷯閽뷯躽뷯膽†볯膽뷯閽뷯貽胣랼볯꾼볯ꎼ볯뎼볯ꎼ볯늼볯꺼볯뎼볯銼볯邼볯躼볯ₕ늼뷯隽볯醼臣鎼볯膠臣讦臣ꂁ臣鎁臣貁臣趁胣鶁臣薆껥꾁迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꆰ跥ꮁ뿨릁苣ꢁ胣겜菣궃菣뎂菣ꮃ臣ꆬ臣ꢁ臣誂臣芁苣骼戼㹲讉ꃩ㲆牢ਾ볯躼ꇨ薸臣ꚇ郧㲆牢ਾ볯躼ꇨ莐蟥蚛臣袂苣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂裥ꊛꃦ꺁觧骮胣㲂牢ਾ볯躼鷩릉闧蒚蟥蚛듧銂駩뮎臣讂臣膂臣膀룤낿臣袂臣ꮁꇨ薸苣뢐鷧閁臣讂胣㲂牢ਾ볯ꦼ볯늼볯ꎼ臣馨뫦隌戼㹲 鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁꫨ颭臣貂臣蒁苣讉ꃩꮁ뻥ꎁ臣늼볯ꎼ苣馨뫦隌臣讂胣㲂牢ਾ볯ꦼ볯躼꿥ꞅ諦龎臣ꢼ볯뾂苣袃菣벃苣ꞃ菣㲳牢ਾ†꿥ꞅ諦龎臣뾂苣袃菣벃苣ꞃ菣ꮁ雩馁苣誸뿨꺁触蚠臣鎾臣芀戼㹲ꦼ볯躼볯ꆼ볯ꚩ꣩ꢔ臣馨뫦隌諦龎臣뾪ꏨ誏臣貀菣莃苣뾂苣袃菣벃苣ꞃ菣趀戼㹲 蒐꿥ꞅ諦龎臣钼볯ꆼ跥趽볯銼볯캕貽胣颼볯ꆼ跥趽볯閼볯캐貽苣ꮐ鳦馁苣袂臣ꮁ꣦隺賥閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀戼㹲 ꢳ볯ꢼ볯颍뷤꺁꣨鞮臣閼볯캐貽臣늶蟩ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ臣讂臣ꞁ胣钼볯ꆼ跥趽苣銼볯캕貽臣늶蟩ꞁꧨ鎨臣ꂊ臣讂胣㲂牢ਾ볯躼ꇨ薸귥蒚꣨궖臣龁苣꺁볯ꆼ볯ꚩ꣩㲓牢ਾ볯躼臩鎽臣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣銂꣦颭臣讂胣㲂牢ਾ볯躼郥ꪕ迥颻臣鞈臣Ꚃ苣ꮃ볯鲀볯袼볯醼胣ꢼ볯銼볯ꮁ볯閼볎뷯꺁볯ꊼ볯銂諥袁苣芀戼㹲鎼볯ꪕ迥颻臣鞈臣ꦁ뷥ꪁ곧醼苣Ꞃ菣袼볯醼胣ꆼ볯銼볯ꮁ볯邼볎뷯꺁郥ꚇ郧股룦袼볯骼볯邼볯銂諥袁苣芀戼㹲钼볯ꪕ迥颻臣鞈볯鲀볯銼臣견볯Ꚃ苣ꮃ臣覂臣銼볯캕貽苣ꎀ뛧馁苣Ꚃ苣ꮃ臣뮧臣鎁臣ꮁ苣誂胣ꚇ郧股룦꺁胩骶볯趀룥袇뛦銂ꫨ붣臣讂胣㲂牢ਾ볯財臣貾臣肜뻥꺁볯閼볎뷯銂跦ꚁ苣芀戼㹲閼볯肸뗧꺁蟥蚐ꇨ薸룤꺁臣릁臣꺁苣Ꞃ菣袼볯醼胣ꢼ볯銼볯ꮁ볯閼볎뷯꺁꣦隺賥鞊軥銂諥袁苣芀戼㹲隼볯股룦뺯藧ꢔ臣ꚇ郧股룦뮂菣袃臣꾁諦龎臣ꎻ苣誂臣銼볯캕貽臣낼볯뎼苣ꂊ臣讂볯ꆼ볯鲀볯醼볯覼胣㲂牢ਾ볯躼ꧦ낢볥꾌该ꢙ룤ꞁ볯邼꟧鎖賦ꢁ臣馁苣讁胣鞃菣벃菣銂触ꞁ鋦貋臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣鞃菣벃菣꺁蛥릮觧銂럦袐臣讂胣㲂牢ਾ볯躼菣것菣袃臣讓苣鞁胣꒮룦袼볯銼胣銼볯莄볯ꞁ볯邼胣钼볯蚈苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀戼㹲馼볯馁臣ꚁ臣Ꚃ苣ꮃ臣閼볯캐貽臣馨뫦隌볯ꊼ볯銂諥袁苣芀藥ꢁ郥颧臣랷郥馁苣芀戼㹲醼볯躼菣것菣袃臣讓苣鞁胣뾽铧鞁臣蒁苣늼볯ꎼ臣鲿臣ꚁ臩鎽臣芙雩膀껥ꦸ볯銼볯鲀볯閼볯覼臣늼볯ꎼ苣袲駩閁臣讂胣㲂牢ਾ볯醼볯ꢼ볯ꦼ諥ꆾ苣風賩馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 붙胦뺯藧鞊軥誏臣뺯뿥馁苣鞊ꇨ薸臣膀믤趉臣ꚩ꣩ꢁ꿦莼臣龁ꃥ袐臣膀룤ꮲ臣龁뗧鲞苣躸臣讂臣骁臣芁苣芀胦Ꞁ鳦股룦ꢁ鯥ꦾ鳦股룦ꢁ臣鎖臣钼胥꺁諥ꆾꋥꂊ臣膀뷥늩苣뎃菣ꮃ苣뎃苣讞볯鲺黥ꮁ꿥鞁臣모雦蒚臣붙胦ꞁ臣讂臣뾁臣閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣㲈牢ਾ†볯놀鯧ꮁ菣꾂菣뎃軦꺨菣Ꚃ苣ꞁꇨꎁ臣ꆎꇨ讁苣꺁ꇨ薸苣鞃菣ꮃ臣膀苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣ꮁ臣醁苣ꎧ黦꺁臣膂臣醼볯醼볯邼볯貸蟩鞁臣芀룤뮴賥낼볯颼諦龎苣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꮁ苣ꎁ臣蚈鯩鞁胣鞃菣ꮃꇨ薸臣鞃菣벃菣鞁臣芀駩Ꞁ苣낂菣ꮃ臣견볯꒾胣견볯꒾迥뎁곧醼볯꒾臣뎦꿥閁苣膀鳦节ꯩ蒁苣낂菣ꮃ臣견볯꒾胣견볯꒾迥뎁곧醼볯꒾臣뎦꿥閁苣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†郥것菣뎃볯邼볯躽뷯꺁룤뮴賥낼볯颼諦龎苣醼볯薼菣릂菣ꪃ苣늂菣ꞁ臣뎼볯뎼臣袂臣ꚁ裥ꊛ臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ苣鶃菣鎃菣ꪃ菣뎃苣閃菣ꪂ菣覃볯낼볯꒼볯覼菣뎃菣것菣ꮁ믨馆臣膀菣뎃菣것菣銂菣ꮃ苣ꞁ菣궃菣궂菣낂臣膀볯놀鯧꺁軦股臣蒐뻧讁苣鞾臣鞃菣ꮃꇨ薸臣醼볯醼볯邼볯貸蟩늶臣鞃菣벃菣鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꒃ苣鞊菣Ꚃ苣ꊂ菣ꮂ菣鮃苣閃苣뾂菣벂볯ꆼ볯覼臣醼볯鎼볯邼볯貸蟩늶臣鞊뷤銂ꓦ몇臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†菣Ꚃ苣꺁ꛨ龯戼㹲 麃苣릂苣龄鿦貾볯鎼韦鎖臣辂臣ꎁ臣뎦꿥鞁臣袼郥袨볯钼韦膀蓦鎟뻥邼胣醼볯ꖗ볯芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 麃苣릂苣ꪂ菣较苣릂볯꾼뷯膽뷯鎽뷯覼꣨辇駥ꞁ꿦ꖗ뷤趇룦骮臣膀臣貂苣꺁뷤趇苣風賩鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 馁臣ꚁ臣開觧ꮁ臣Ꚃ苣ꮃ苣膃菣것菣뢂臣醰臣辁臣节볯ꖗ觥ꮁ臣鎽룦銂鯧隦臣讂菣莃菣貁鿥膂뻨뺁苣ꚁ臣龁胣鎽룦꾁꿦ꖗ꣨늌臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†郥麃苣릂臣龔귥誏臣ꖁ뫥뚊藦銂胣醼韦ꮁ볯麛胣閩뻤鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㌶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨꞁ臣ꖻ룤꺁闧랏臣ꦁ铧閁苣讂볯ꦼ볯膀귧覂蛥鮼볯꒼胣꺚蛥鮼볯꺼胣뮼藨薆볯ꦼ볯膀鷩袄蛥鮼볯꺼볯膀蓨ꪳ菣躃닧邭胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㘹㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 股郧鶇鯩꺁飩뎮戼㹲꾃苣膃菣ꖎ꣧貾볯놀鯧膀볯놀鯧誏臣閼胩꺛臣膀菣Ꚃ苣股룦ꚩ雦ꮁ臣醁苣股郧鶇鯩꺁飩뎮볯ꢼ볯ꦼ볯銂룦骮臣龁胣醼胩꺛臣貾臣膀곧閼뻧誏臣견볯꒾臣ꦁ臣覂苣钼볯銂뛨袁苣ꢼ볯ꦼ諥ꆾ볯鶁苣麁苣隼볯誏臣醼볯钼볯銂釥鞁臣芀볯놀鯧ꮁ臣膀곧鎼뻧鲀곧鞼뻧貁胣钼볯銂뛨袁苣ꢼ볯ꦼ듦Ꞁ苣袑臣膀鳦节ꯩ蒁듦Ꞁ臣꒾볯꺁볯隼볯ꞁ臣ꎁ臣芀볯놀鯧ꮁ臣膀곧醼뻧袼菣ꒂ菣隃볯誏臣견볯꒾苣꒙臣馁臣ꚁ臣꒾臣钼볯銂뛨袁苣ꢼ볯ꦼ듦Ꞁ苣袑臣膀곧鞼뻧ꞁ臣醼볯貼볯邼볯薶臣芁臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯骼볯邼臣覜諥Ꞁ苣袺룦馁苣节臣ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꢳ蓦閁苣龁臣芀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣꺁蟨뮭髧膃菣것菣뢂臣覂臣늘뻥ꮁ臣钼볯薶臣ꢼ볯ꦼ諥ꆾ臣薿ꛨꞁ臣讂臣莀臣覂苣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁菣벃苣꾁胣醼胩鎖뻥꺁飩ꆾ諦鎽諥ꆾ臣薿胩ꪁ雩讧胣ꪁ苣뎁臣ꆄ뿤뺣뷯늼볯ꆼ臣閼볯趀迥뎁苣뎃菣꾂돨꾃苣膃菣꺁볯邼胥ꢁ臣蚁ꯩ蒁諦鎽諥ꆾ苣뒼臣ꚁ胣뒇귦蒚苣뎃菣ꮃ苣뎃苣膃菣것菣뢂臣覂臣醼볯邼볯꺁闦몇臣략臣讂臣ꢁ苣몤臣龁胣閁苣ꮁ臣龁胣겜駧躘臣ꪃ菣뢠藩꾃苣膃菣꺁ꃥ袐胣薿ꛨꢁ臣貂苣覜諥趽볯꺼볯릮蟩貁臣讂臣ꮁ뷤蒁胣馁臣辂臣ꆄ뿤뺣뷯늼볯ꆼ臣醼볯蚈臣醼臣芁苣鎁臣节ꓧ閁苣龁볯뎛볯邼볯芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣궸鋥㲌牢ਾ†菣Ꚃ苣股룦꺁볯趀룥袇뛦銂胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤꺁볯邼볯뒼볯ꦼ볯閼볯込뷯貽臣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ諥袁臣芀볯钼駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃뻥ꮁ胣醼볯閼韃볯邼볯讀臣ꆃ苣螃苣뎃菣肃菣鎃菣ꒂ菣躅蟨내菨銂郥Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣龁胣鎼볯莄臣蒴볯邼駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃뻥ꮁ胣Ꚃ苣ꮃ苣銂ꓦ몇臣膀諦꺼볯鞊뷤ꞁ苣뎂苣隌臣膀볯馼볯躽뷯ꞁꫨ뾁迥ꎁ臣芀볯놀鯧꺁ꧨ首臣꾁룤貒듦Ꞁ臣鲤蟥閁苣ꪁ臣ꎁ臣袼苣낂菣ꮃ볯閼볯鮼ꓦ몇룤邙볯芀볯놀雩꺛臣ꞁ臣膀곧閼뻧誏臣견볯꒾臣麃苣릂臣膀볯馼臣銼볯邼볯견볯꒾볯誏臣銼볯邼볯견볯꒾볯ꢁ臣鎖臣궸鋥뮴胦銂釥鞁臣芀믤꺁뻧꾁臣骁苣节룤貒듦Ꞁ苣肸裥袑臣ꪁ臣ꎁ臣芀볯놀鯧ꮁ胣견볯꒾胣견볯꒾臣鞼볯馼臣銼볯馼볯ꢁ臣鎖臣颫臣궸鋥뮴胦銂ꓧ鞁胣견볯꒾臣銼볯馼볯ꢁ듧銼볯貼볯邼볯ꢁ臣鎖臣궸鋥뮴胦銂釥鞁臣芀룤뮴賥낼볯颼臣袂苣꾃苣膃菣ꖎ꣧銂迥醁臣뺯藧麃苣릂뻧꾁胣閼賥궸볯릌臣麃苣릂臣膀볯馼臣銼볯邼臣꺁雩ꮁ苣龁苣궸鋥뮴胦銂釥鞁臣芀臣꺁菣벃苣銂ꇨ鎼볯鲀볯閼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㘹㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㜶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㘹㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㤶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†铧颭戼㹲꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣鞼胩꺛臣膀臣릁臣꺁菣Ꚃ苣ꮁ胣뒇귦辇볯醼볯쎐겼볯馼볯覼臣ꦼ볯ꚼ볯₶ꆼ볯낼볯込볯込볯钼臣꺁菣ꎃ菣뎃苣銂ꇨꎁ臣芀鳦랕볯钼韦ꮁ苣龁臣ꚁ菣Ꚃ苣銂뷧薗諧讅迥뎁귦ꆺ軧ꮁ臣蒁臣뎦꿥鞁臣芀菣꾂菣뎃軦꺨苣鞏臣龁菣Ꚃ苣꾁臣릁臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣ꪁ臣ꎁ臣誃苣벃菣꒾볯견볯꒾볯ꢁ꿦莼臣ꚁ볯邼볯薼臣龔귥螎苣袑臣龁胣醼볯꒾볯閼賥骁臣覼臣麃苣릂臣膀볯꺼믦许臣膀듧醼볯邼볯ꚼ볯꺁볯꺼볯뚼†볯込볯늼볯颼볯鎼볯袼볯醼볯醼볯ꮁ苣讂菣ꎃ菣뎃苣銂ꇨꎁ臣芀菣Ꚃ苣銂胣ꖁ뫥뚊藦膀뷧薗諧讅胣誏臣뮭뫤螎臣ꒁ臣ꚁ胣醼볯ꖗ雩躯韦膀ꛨ龯臣龁胣誁苣鶁볯ꖗ鯧ꮁ귦ꆺ臣龁菣꾂菣뎃軦꺨臣鞁苣꒙臣馁臣ꚁ臣開觧貁臣꺁볯钼韦鎖臣钠ꧧꮁ胨袁臣龔臣议臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†뷤趇룦醰菣벃苣㲿牢ਾ†볯込볯늼볯颼볯鎼볯ꮁ苣讂菣ꎃ菣뎃苣銂迥醁臣麃苣릂臣鎽蟩鮸냥誏臣ꖁ뫥뚊藦芀볯銼뻧袼볯릌臣ꒁ볯꺁菣Ꚃ苣ꮁ胣ꦼ볯뒻룤ꮁ苣誂胣蒴볯邼볯낼볯떼臣ꦼ볯ꚼ볯₶ꆼ볯낼볯込볯込볯钼볯ꢼ볯꺼볯覼臣袂苣膃菣것菣뢂苣財臣龁胣麃苣릂苣醼볯ꖗ臣辂臣ꎁ臣膀臥랺諧讅胣립韧뚊藦膀迥뎁귦ꆺ軧ꮁ臣蒁臣뎦꿥鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁뻧꾁뷤趇룦醰苣袑臣龁苣꺁臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣꾁臣릁臣醼볯邼볯꺁铧颭軧銂釥鞁臣芀鳦꾃苣膃菣ꖎ꣧꒾臣邼볯꺁铧颭軧銂釥鞁胣龄鿦貾볯ꖗ鯧誏臣鞼韦꺛臣뮭뫤鞁臣芀菣ꎃ菣뎃苣銂迥醁臣꾃苣膃菣ꖎ꣧麃苣릂臣꾁뷤趇룦醰臣뢛臩貁ꛨ龯臣貂臣貁胣鶁臣覜蓦Ꞁ臣ꊖ臣ꚁ뗧隫苣閼臣몇臣鎁臣꾁臣趁臣蒁胣뢣臣趽볯꺼볯ꢁ藥ꮁ볯醼菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣込볯銈菣膃菣랂菣랂菣銂鳦馁苣꺼볯뚼臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣꒾臣膀蓦鎟뻥꺁볯ꖗ鯧誏臣鎼韦꺛臣貀볯趀臣ꖁ뫥뚊藦릂苣ꊂ苣袑臣龁臣膀ꃧ뚩臣议苣꺁雩ꮁ胣ꖁ뫥趀臣꺁鯥ꦾ苣鲞臣鞁臣芀볯醼菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣込볯銈菣膃菣랂菣랂菣ꦼ볯₤颼볯閽뷯誏臣ꪃ菣閃苣꾂菣ꊂ菣뎃볯邼볯邼볯겼볯銼볯邼볯覼臣覂臣ꮁ볯醼菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣誏臣閼裢ꆃ菣ꮃ苣袃苣뎃볯꺼볯₰ꦼ볯꺁볯ꆼ볯銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁뻧꾁臣ꆁ苣节胣龄鿦貾臣閼韦꺛迥뎁볯ꖗ鯧ꮁ胣銼胣꺁臥랺諧讅苣뎂苣銂釥鞁胣鶁苣꾁ꃧ뚩臣馶뛧龜雩ꢅ뷤銂胩鞁臣膌뛧鞁臣芀볯꺼볯붣觥꾁胣钯臣閼볯骼볯邼볯醼볯閼볯鎼볯躼볯꺁苣膃苣뎃胦芄돨膀鷩ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ胣낼볯Ꞽ蓨ꪳ迥뎁꟦ꂀ蓨ꪳ臣覂臣ꎁ臣芀苣膃苣뎃胦芄돨꾁볯겼뷯躽裢ꮼ볯銼裢꒼볯ꆼ볯閼볯ꊃ菣薼볯ꞁ臣誂胣麝苣膃苣뎃胦芄돨꾁볯뎼볯ꎼ볯醼볯ꊃ菣薼볯ꞁ臣誂胣낼볯Ꞽ蓨ꪳ臣낼볯Ꞽ裢꒼볯궼볯袼볯躼볯ꊃ菣薼볯ꞁ臣誂胣讧胩芄돨꾁苣것苣蚃菣벃菣袼볯颼볯閼菣ꮃ볯覼臣芁臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†臣릁臣꺁뻧貁胣芦臣ꚁ胣莅臣鎽蟩꺁볯邼胣醼볯邼볯꺁뷤趇苣궶賦鞁臣芀臣ꂁ臣膀鳦꾃苣膃菣ꖎ꣧꒾臣设ꓥꞁ胣鎁苣覂臣開觧꾁볯ꖗ鯧뺁臣ꮁ臣貂臣貂臣莅臣鎽蟩꺁臣袂臣鞼볯薼臣芁臣龁胣ꖁ뫥뚊藦꺁苣뎂苣隌臣ꢡ볯隼臣鎾臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㜹㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯隼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯躼볯늼볯ꆼꃧ뚩戼㹲 ꪃ菣뢠藩꾃苣膃菣ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂뻥讂볯늼볯ꆼ臣鞊軥ꮁ臣膀볯邽볯膀볯邽볯ꮼ볯ꆼ볯膀볯鎽뷯ꆼ胣ꦼ뷯蒽볯膀볯꒼볯꒼胣뎼볯늼볯膀볯뎼볯뒼裢醼胣낼볯겼胣膽裢ꢼ볯膀볯궼볯銈볯誏臣뎼볯ꎼ뷯薽뷯貁臣讂胣钠ꧧ袨铧銂ꇨ鎼볯ꮁꓧ馁胣鎁苣覂臣钠ꧧꞁ臣膀ꇨ銼볯꺁꟦覯觧ꪕ迥銼볯銂뷤ꢔ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯躼菣Ꚃ苣꺁믩늉菣覃苣莐迨袼볯钽뷯邽뷯躼뷯閽뷯薽뷯鎽볯몂苧膃菣것菣뢂菣螃菣ꮁ臣醁苣꺿ꏩꪃ菣뢠藩꾃苣膃菣꺁鳦릊胦꺁ꧨ鎨戼㹲 鎁臣钠ꧧꞁ臣膀볯늼볯ꆼ†볯螽볯邼볯銂苣벃菣馁苣ꪃ菣뢠藩꾃苣膃菣꺁鳦릊胦銂볯ꆼ볯ꊼ볯莽菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩馁苣芀臣꺁ꃧ뚩臣꾁볯閼뻧袼볯閼賥骁臣覼臣ꊼ볯겼볯込뷯貛菣Ꚃ苣銂裥ꢔ臣讂볯袐꣨銼볯閼賥覼胣麃苣릂臣꾁胣邼胩꺛迥뎁볯놀鯧ꮁ胣꺚蛥袼볯꒼볯貵럨뺁臣꾁귧覂蛥袼볯궼볯貵럨ꮁ苣ꎁ臣膀볯겼뷯躽裢ꮼ볯銼裢꒼볯ꆼ볯貀볯ꎼ볯趀볯뺁臣꾁볯겼뷯躽裢궼볯鎼裢꒼볯ꆼ볯貀볯ꎼ볯趀볯銂郥肂볯꺼볯붣觥꺁臣骁苣讁苣꾃苣膃菣ꖎ꣧馁苣芀볯ꎼ볯ₒ겼볯낼ꏨꒉ臣膀苣膃苣뎃胦芄돨袼볯겼뷯躽裢ꮼ볯銼裢꒼볯ꆼ胣閼볯ꊃ菣薼볯膀鷩ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ볯꒼볯낼볯膀볯邼菣ꮃ볯覼胣낼볯Ꞽ蓨ꪳ볯낼볯Ꞽ裢꒼볯궼볯膀볯躼볯ꊃ菣薼볯誏臣讧胩芄돨袼苣것苣蚃菣벃菣膀볯颼볯閼菣ꮃ볯覼臣覂臣ꎁ臣芀볯ꎼ볯ₓ겼볯낼ꏨꒉ臣膀苣膃苣뎃胦芄돨袼볯겼뷯躽裢궼볯鎼裢꒼볯ꆼ胣閼볯ꊃ菣薼볯膀鷩ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ볯꒼볯낼볯膀볯邼菣ꮃ볯覼胣낼볯Ꞽ蓨ꪳ볯낼볯Ꞽ裢꒼볯궼볯膀볯躼볯ꊃ菣薼볯誏臣讧胩芄돨袼苣것苣蚃菣벃菣膀볯颼볯閼菣ꮃ볯覼臣覂臣ꎁ臣芀볯ꒁ臣꒾臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鮁臣膀볯ꒁ臣꒾臣꾁駩Ꞁ꿥ꞅ諦龎苣閊룤鞁臣芀菣ꎃ菣뎃苣ꮁ藥ꂁ臣ꚁ胣醼胩꺛胣鎼胩꺛迥뎁볯놀鯧ꮁ菣Ꚃ苣꺁냥馝蓨讁苣ꆎꇨ鞁胣股룦ꚩ雦銂뻥꺁裥邞臣龁苣ꮁ뿤ꎁ臣誁臣芀볯놀鯧ꮁ胣뮼藨薆볯ꦼ볯覼軦꺨臣膀듧醼韃볯꒼볯邼臣궼볯뎼볯袼菣ꖃ菣麃菣ꪠ볯ꮁ苣讂菣ꎃ菣뎃苣銂胣麃苣릂臣財臣芀菣Ꚃ苣銂胣馨뫦릂苣ꊂ賥랂苣蚃菣ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ觥誂뷥ꚁ苣貂苣ꖁ뫥뚊藦릂苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ뷧薗諧讅胣鎽蟩鮸냥膀迥뎁귦ꆺ軧ꮁ臣蒁臣ꎛꛨ鞁臣芀苣뎃菣鶃苣뎃菣꾁蓦鎟뻥醼볯ꖗ鯧膀귦ꆺ胣뺁臣꾁껥붥귦ꢁ臣讂胣鎼볯薼뛨꺁뷤趇룦醰胣떥뫥꺁韥ꂜ胣뺁臣꾁뫩몗臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂苣趇꿧ꪁ韧뚊苣袑臣讂该ꦉ苣覮ꗦ뮭臣鮁苣芀菣Ꚃ苣꾁胣鶁苣覂臣開觧ꞁ臣붿諥鲽ꗦ袼뻤袁臣閁苣ꪁ苣꾃苣膃菣ꖎ꣧膀軦股臣龁臣龄鿦膃菣것菣뢂볯銂ꇨ蚁臣膂臣膀볯놀鯧뺁臣躏껥鞁臣誁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꊼ볯蒻觨隃菣Ꚃ郧貏藨鲆苧膃菣것菣뢂臣誁臣讂볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃뿤뺣菣鲃ꃦ뢅菣꾂菣뎃臣覜諥Ꞁ臣ꊖ臣讂ꧨ鎨戼㹲 鎁臣钠ꧧꞁ臣膀볯늼볯ꆼ†볯螽볯邼볯銂苣벃菣馁苣ꪃ菣뢠藩꾃苣膃菣꺁鳦릊胦銂胣ꊼ볯겼볯込뷯麃苣릂臣誁臣ꚁꧨ鎨臣龁胣鎁臣钠ꧧꞁ臣醼볯꒾볯醼볯릌臣ꒁ볯꺁볯ꆼ볯ꊼ볯莽鯩麃苣릂苣ꦈ铧鞁臣袼郥袨볯鞼볯릌볯芀菣Ꚃ苣ꮁ臣膀볯놀鯧誏臣鎼胩꺛臣膀髧薆볯ꦼ볯覼臣龁臣训苨薆볯ꦼ볯覼뗧꾷臣袂苣膀볯겼뷯躽裢ꮼ볯銼裢꒼볯ꆼ볯貀볯ꎼ볯趀볯뺁臣꾁볯겼뷯躽裢궼볯鎼裢꒼볯ꆼ볯貀볯ꎼ볯趀볯銂郥肂볯꺼볯붣觥꺁臣骁苣讁苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀볯ꎼ볯ₒ겼볯낼ꏨꒉ臣膀苣膃苣뎃胦芄돨袼볯겼뷯躽裢ꮼ볯銼裢꒼볯ꆼ胣閼볯ꊃ菣薼볯膀鷩ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ볯꒼볯낼볯膀볯邼菣ꮃ볯覼胣낼볯Ꞽ蓨ꪳ볯낼볯Ꞽ裢꒼볯궼볯膀볯躼볯ꊃ菣薼볯誏臣讧胩芄돨袼苣것苣蚃菣벃菣膀볯颼볯閼菣ꮃ볯覼臣覂臣ꎁ臣芀볯ꎼ볯ₓ겼볯낼ꏨꒉ臣ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ볯꒼볯覽뷯銈볯ꎼ볯銈볯궼볯膀볯邼菣ꮃ볯覼胣麝苣膃苣뎃胦芄돨袼볯뎼볯ꎼ胣醼볯ꊃ菣薼볯膀볯ꖼ볯芄돨袼볯ꖼ볯銈볯꾼볯Ꞽ胣醼볯閼菣ꮃ볯覼迥뎁꟦ꂀ蓨ꪳ볯뎂菣릂菣궃菣ꮃ胣鎼볯躼볯ꊃ菣薼볯讁苣ꪁ臣龁胣醼臣꺁뻧ꮁ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鮁臣膀볯ꒁ臣꒾臣꾁駩Ꞁ꿥ꞅ諦龎苣閊룤鞁臣芀菣ꎃ菣뎃苣ꮁ藥ꂁ臣ꚁ胣醼胩꺛胣鎼胩꺛迥뎁볯놀鯧ꮁ菣Ꚃ苣꺁냥馝蓨讁苣ꆎꇨ鞁胣股룦ꚩ雦銂뻥꺁裥邞臣龁苣ꮁ뿤ꎁ臣誁臣龁胣뮼藨薆믦许臣袂苣膃菣것菣뢂苣鞏臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣膀볯薽볯ꎼ볯떼볯麃苣릂臣袺菦膃菣것菣뢂铧辇苣躸臣袼菣莃苣뾂苣袃菣벃苣ꞃ菣芙臣龮髩꾁볯躼볯薽볯込菣Ꚃ苣ꞁ臣ꎁ臣覼胣ꦼ볯龄鿦ꮁ苣讂菣ꎃ菣뎃苣銂迥醁臣麃苣릂臣꾁뫤뎃胥ꞁ볯薽볯ꎼ볯떼볯麃苣릂苣躸臣龁볯邃菣꾂苣ꒂ菣것菣랂菣뎃駦꺁껥鮚臣隼볯鞼뷯隼볯ꚼ볯込菣Ꚃ苣覼胣麃苣릂苣膀꣦隺苣뎂苣隌苣릂菣ꂃ臣몟臣蒁臣늉苣鎽臣龁臥랺諧讅苣뎂苣銂铧蒁臣립韧뚊藦膀뷤趇룦醰胣誏臣뮭뫤螎臣ꒁ臣ꚁ鯧隦臣膀苣뎃菣鶃苣뎃菣꾁蓦鎟뻥醼볯ꖗ鯧膀귦ꆺ胣뺁臣꾁껥붥귦ꢁ臣讂胣鎼볯薼뛨꺁뷤趇룦醰胣떥뫥꺁韥ꂜ胣뺁臣꾁뫩몗臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂苣趇꿧ꪁ韧뚊苣袑臣讂该ꦉ臣覮ꗦ뮭臣鮁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㈷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†菣꾂菣뎃軦꺨苣鞏臣膀볯낼뗧꾷臣鎼볯隃苣ꂃ菣뎃臣袂苣膃菣것菣뢂苣鞏臣龁菣Ꚃ苣꾁臣릁臣膀菣ꎃ菣뎃苣讁苣銼볯芙雩ꖻ蛥ꮁ볯薼臣龔귥螎苣袑臣龁胣꾃苣膃菣ꖎ꣧銂迥醁胣ꦼ볯뒻룤ꮁ苣讂菣ꎃ菣뎃苣銂迥醁臣麃苣릂臣膀볯薼胣鎼볯薼臣龔귥螎臣膀볯鲀볯ꖗ臣龔귥芙雩궸ꓥꒀ苣袑臣龁胣ꚩ꣩鞁臣늼볯ꆼ菣꾂菣뎃꟦覯觧蒂胣뺯藧袼룤뮴賥내迨뺯藧誏臣뾂菣醃苣ꪳ꿥ꞅ볯ꞁ臣膀臣ꆁ苣꺁菣ꎃ菣뎃苣ꊃ菣ꮃ臣誁臣ꚁ苣膀鳦릊胦貁ꓧ閁苣ꪁ臣ꎁ臣鎁臣讁苣膀臣꺁菣螃菣꾁臣貂苣꺁꟦覯觧銂ꧨ鎨臣讂臣꾁ꛥ鎽臣꾁臣蒁臣ꢁ臣몤铥閁苣龁胣銪뷤꾃苣膃菣ꖎ꣧꒾臣銼볯薼臣龔귥螎迥뎁볯ꖗ臣龔귥芙雩궸ꓥꒀ苣袑臣龁胣蚐ꯨꮁ鷦鮸臣貂苣鎁臣꾁鳦뺁臣蒁臣膀볯늼볯ꆼ蓦鎟菣螃菣꺁蟩螗뫥貁菣꾂菣뎃鳦릊胦꺁ꓦ몇苣趸迥붃臣鞁臣ꢁ胨袁苣貂苣芀鳦릊胦銂뇦骮臣讂臣膂臣隻臣ꊃ菣ꮃ苣ꚩ꣩馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯鞼볯螃菣낂ꃧ뚩볯麃苣릂臣誁臣讂菣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣늼볯ꆼ菣꾂菣뎃臣超雧龎胦㲧牢ਾ†臣꺁ꃧ뚩臣膀볯ꆼ볯ꊼ볯莽菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣膀菣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣袼볯ꖼ볯뚼볯股룦讞볯鞊軥銂뷤ꎁ臣뢠藩趽볯꺼볯꾃苣膃菣꺁藥ꮖ軥Ꞁ臣袺若蚈黦銂迦鮾臣讂胣鎁臣钠ꧧꞁ臣膀볯钼뻧꺁볯ꆼ볯ꊼ볯莽鯩麃苣릂볯閼賥覼迥뎁鯩麃苣릂볯閼賥覼꣨醼볯릌苣ꦈ铧馁苣袼郥袨볯钼볯릌胣钠ꧧ꺁雩讧駦ꮁ볯鲀볯놀뷩芀꣨뮔臣芦ꛨꮁ臣蒁臣꾁ꇨ鎼볯銂迥ꞅ臣貂臣蒁볯芀臣꺁ꃧ뚩臣誁臣ꚁ胣뾽铧鞁臣讧꿧ꦉ闧랏臣ꢡ볯颼苣芏藧鞁臣誁苣膀ꇨ銼볯ꮁꛨ蒁臣閁苣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯놀鯧誏臣鎼胩꺛臣膀귧覂蛥袼볯궼볯뺁臣꾁髧薆볯ꦼ볯覼뗧꾷臣袂苣膀菣Ꚃ苣ꮁ菣꾂菣뎃軦꺨臣龁胣醼臣꺁뻧ꮁ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧銂臣骁胣醼臣꺁뻧ꮁ臣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ볯邼볯鞃菣벃苣ꊽ裦颍뷤袼볯ꚼ볯覼臣龔볯ꖼ볯뚼볯貼볯銼볯馼볯낼裥ꊛꃦ銂鷩袄蛥袼볯뚼볯ꢳ냥ꮁ苣ꎁ臣閊룤鞁臣芀볯놀鯧膀볯놀鯧誏臣閼胩꺛臣蒐菣Ꚃ苣讁苣股룦銂迥蚛臣龁胣醼胩꺛臣鎼胩꺛臣ꆎꇨꦉ臣龔귥궸臣ꚩ雦袼냥馝蓨ꆎꇨꦉ臣龁臣许ꇩ许軦股觧覼臣芁苣膀볯놀鯧꾁뗧ꮜ駦袼뿥鎇蛥覼軦股臣ꪁ苣芀胥薀臣股룦ꚩ雦꾁룤貒苣莃苣ꒂ臣龁臣麃苣꾂菣궸鋥ꊂ菣뮂苣ꮁ苣讂裥邞臣ꞁ裢颼볯莄臣鶿귥鞁臣芀볯놀鯧芙苧ꞁ臣蒐뻧讁苣꺁菣벃菣ꚩ雦꾁胣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣袂臣ꚁ胣Ꚃ苣ꮃ苣뚺꟨ꦉ臣꺁迥鲿胦ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㌷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㜹㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃菣벃苣ꞁ볯邼뷯꒼뷯ꢁ볯邼뷯꒼뷯ꢁ臣鎖臣뺏苣讂菣뎃菣ꮁ苣誂胣견볯꒾胣견볯閼뻧膀곧鎼볯꒾迥뎁곧钼볯꒾볯龔苣ꒂ菣릂꿥ꞅ볯ꮁ胣랂苣誃菣貁ꓦ몇臣貂臣芀臣꺁菣벃苣꾁胣颍룤꺁菣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣鞊軥ꮁ꿥馁苣趽볯꺼볯꾃苣膃菣貁胣袺若钠ꧧꮁ臣蒁臣鞊뷤銂铧龔臣趁苣鎁臣銂ꓧ蚔臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯躼뗧뢠菣鲃ꃦ뢅菣꾂菣뎃볯ꊂ苣ꖃ菣뎃菣誏臣鞊軥꺁苣뎃菣誃菣ꪃ苣ꮃ苣鞃菣벃菣㲁牢ਾ†臣꺁ꃧ뚩臣꺛髧꾁胣邵ꃦ꺁臣뺁臣뺁臣薗鳦ꮁ臣蒁臣覜諥ꪁꓥꆾꓥꊂ苣ꖃ菣뎃菣꾃苣膃菣銂觧骮臣讂臣ꢁ臣芁苣芀鳦鶈臣龮꣩ꞁ臣醼볯꺨ꇩ꺁諦龎苣颼꣧麡臣떂苣袃苣ꒂ菣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣ꢁ藥ꮁ볯꺨ꇩ꺁韧龜菣螃菣ꮁ臣蒁臣閩뻤馁苣芀鳦몙飦꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뎂菣覃臣讂諦龎臣꾁胣ꆼ뷯颼볯ꆼ볯늼뷯鎼볯邼볯莽볯膀볯螽볯閼볯袼볯隽볯颼볯隼뷯覼胣뒼볯醼볯躼볯袼볯隽볯銼볯颼볯膀볯뎼볯뒼볯袼볯隽볯鞼볯閼볯膀볯隽볯隼볯邼볯膀볯隽볯隼볯馼胣늼뷯醼볯醼볯莽胣늼뷯鎼볯銼볯莽胣늼뷯銼볯邼볯膀볯隽볯醼볯隼胣늼뷯邼볯銼볯誏臣込臣龁臣궼볯钼볯醼臣ꮐ臣貂苣芀꣦蒚苣ꒂ菣ꮂ苣뎃苣뢂菣邃菣袃臣꾁胣Ꞽ볯銈볯뎼볯膀볯겼裢醼볯貼볯ꚼ볯螽胣ꦼ볯銈볯閼胣ꦼ볯銈볯膀볯겼裢銼볯膀諦낼볯醼볯銼迥뎁볯뺁臣꾁菣꾂菣閃苣ꪃ菣貁郥뺁苣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯躼菣袃苣뎃菣궃苣ꒂ菣릂볯ꢼ볯뚼볯颼迥뎁볯ꖼ볯鞼볯覼ꃧ뚩戼㹲꾃苣膃菣꺁铧邈臣뾽铧馁苣龁苣꺁苣벃諦龎苣蒁臣ꒁ臣릉껥鞁臣芀臣貂苣ꮁ臣膀볯覽볯鎼臣꺁볯ꖼ볯隼볯뮳귨馁臣ꚁ臣뚼볯醼†볯ꎼ볯꒼볯ꮃ菣鞃胣誏臣袼뷯覽볯ꢼ볯뚼볯醼臣뚼볯醼볯뚼볯銼臣ꮐ臣貂苣芀볯ꖼ볯鞼볯鞊軥讁苣꺁菣꾂菣뎃臣龔裦ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣늼볯ꆼ볯鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣ꢡ볯颼臣讧꿧ꦉ볯㲗⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯ꞁ⼼㹵臣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯躼볯ꖼ볯뎼裢ꎼ뷯뚼ꃧ뚩戼㹲 궼볯늼볯銈볯辽볯꾁볯낼볯钼볯莽苣讻臣ꚁ듧麃臣邵郥馁苣꺁臣膀볯ꖼ볯뎼裢ꎼ뷯뚼臣뮲駧꾁胣궼볯늼볯銈볯辽볯邵郥ꢃ뷤誏臣膪蓧覤闧讞돧뾰韧랂苣誃菣뎃苣ꢔ뗧袐菩趽苣膌臣뺁臣꾁賦龁臣蒁볯낼볯钼裢ꚼ뷯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯膀迥뎁볯ꖼ볯뎼裢ꎼ뷯뚼苣醃苣꾂苣뎃菣꾂돨꺁裥궖黥鞏껥鎽뗧袐菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀볯겼뷯뎼†볯躽뷯躼볯邼볯鎼볯颼볯醼볯覼볯薽볯醼볯颼볯芏藧覼胣鎁臣꾃苣膃菣꾁胣Ꚃ苣ꮃ苣궼볯늼볯銈볯辽볯銂볥趁臣醁苣鎁臣ꮁ臣讂臣ꞁ胣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣ꎁ臣螃苣ꒂ臣鞁臣鲽铧馁苣ꞁ臣趂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 궼볯늼볯銈볯辽볯ꢔ臣节臣肸臣꺁苣벃菣꾂菣뎃臣膀諦龎臣鞁臣꺁볯ꖼ볯뎼裢ꎼ뷯뚼苣醃戼㹲ꒂ苣隳苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꢁ臣ꚁ觧骮臣貂臣蒁苣芀臣꺁苣뎃菣꾂돨超裥銂臣㲓牢ਾ臣ꮁ꣨覼臣讂볯超裥ꪕ迥㲷⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯隼볯㲒甯覼胣㲂牢ਾ†藩鞈闧랏甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰馼볯銼⼼㹵볯㲚牢ਾ뷯覽뷯鎽뷯蚽뷯貽뷯蚽뷯貽뷯邽뷯薽뷯馽뷯蒽뷯螽뷯蒽뷯覽뷯鎽뷯莽뷯薽뷯蒽뷯醽뷯钽뷯蚽戼㹲蒽뷯钽뷯邽뷯邽뷯蒽뷯鎽뷯膽뷯螽뷯覽뷯邽뷯螽뷯钽뷯鎽뷯覽뷯覽뷯馽뷯螽뷯蚽뷯馽뷯螽뷯㲄牢ਾ뷯螽뷯趽뷯隽뷯鎽뷯螽뷯膽뷯螽뷯钽뷯醽뷯貽뷯隽뷯躽뷯鎽뷯蒽뷯讽뷯蚽뷯躽뷯蚽뷯隽뷯覽戼㹲螽뷯膽뷯躽뷯钽뷯钽뷯覽뷯鎽뷯鎽뷯鎽뷯钽뷯銽뷯覽뷯邽뷯蚽뷯貽뷯鎽뷯隽뷯躽뷯鎽뷯螽뷯㲋牢ਾ뷯螽뷯蚽뷯躽뷯钽뷯隽뷯貽뷯蒽뷯莽뷯钽뷯貽뷯膽뷯馽뷯覽뷯薽뷯銽뷯螽뷯袽뷯邽뷯螽뷯鎽戼㹲馽뷯鎽뷯膽뷯馽뷯钽뷯膽뷯蒽뷯鎽뷯螽뷯馽뷯銽뷯膽뷯貽뷯鎽뷯讽뷯馽뷯躽뷯銽뷯莽뷯蚽뷯㲍牢ਾ뷯钽뷯躽뷯钽뷯蒽뷯覽뷯薽뷯蚽뷯覽뷯醽뷯膽뷯螽뷯袽뷯蚽뷯鎽뷯馽뷯蒽뷯馽뷯螽뷯趽뷯醽戼㹲蚽뷯钽뷯邽뷯馽뷯钽뷯讽뷯馽뷯覽뷯邽뷯鎽뷯銽뷯覽뷯鎽뷯銽뷯膽뷯膽뷯蚽뷯隽뷯讽뷯醽뷯㲐牢ਾ뷯钽뷯貽뷯蒽뷯鎽뷯蒽뷯馽뷯銽뷯膽뷯蒽뷯螽뷯躽뷯貽뷯醽뷯袽뷯鎽뷯薽뷯蚽뷯隽뷯鎽뷯隽戼㹲馽뷯隽뷯鎽뷯薽뷯讽뷯鎽뷯鎽뷯隽뷯醽뷯薽뷯隽뷯莽뷯蚽뷯邽뷯貽뷯螽뷯邽뷯醽뷯馽뷯蚽뷯㲋牢ਾ뷯貽뷯蚽뷯躽뷯躽뷯躽뷯钽뷯貽뷯鎽뷯蚽뷯隽뷯蒽뷯钽뷯鎽뷯覽뷯邽뷯膽뷯膽뷯躽뷯馽뷯鎽戼㹲貽뷯貽뷯馽뷯鎽뷯邽뷯鎽뷯讽뷯蒽뷯鎽뷯鎽뷯膽뷯邽뷯鎽뷯蚽뷯馽뷯醽뷯蚽뷯躽뷯钽뷯貽뷯㲉牢ਾ뷯膽뷯隽뷯袽뷯貽뷯钽뷯钽뷯邽뷯讽뷯鎽뷯覽뷯讽뷯鎽뷯貽뷯鎽뷯蒽뷯钽뷯隽뷯醽뷯隽뷯膽戼㹲躽뷯馽뷯邽뷯隽뷯覽뷯邽뷯钽뷯鞽뷯蒽뷯蒽뷯馽뷯讽뷯貽뷯邽뷯薽뷯螽뷯鞽뷯隽뷯鎽뷯鎽뷯㲔牢ਾ뷯膽뷯钽뷯醽뷯醽뷯螽뷯螽뷯钽뷯醽뷯螽뷯蒽뷯躽뷯隽뷯邽뷯貽뷯蚽뷯躽뷯钽뷯覽뷯鎽뷯貽戼㹲螽뷯莽뷯薽뷯鎽뷯馽뷯隽뷯螽뷯螽뷯蚽뷯躽뷯钽뷯隽뷯隽뷯醽뷯銽뷯隽뷯蒽뷯馽뷯躽뷯隽뷯㲇牢ਾ뷯馽뷯蒽뷯螽뷯馽뷯莽뷯銽뷯莽뷯鎽뷯邽뷯鎽뷯覽뷯蒽뷯薽뷯讽뷯袽뷯钽뷯蚽뷯鎽뷯膽뷯薽戼㹲袽뷯鎽뷯钽뷯鎽뷯馽뷯銽뷯钽뷯鎽뷯貽뷯銽뷯蒽뷯钽뷯螽뷯貽뷯钽뷯隽뷯莽뷯貽뷯貽뷯躽뷯㲓牢ਾ뷯貽뷯隽뷯蒽뷯讽뷯邽뷯螽뷯鎽뷯莽뷯貽뷯蒽뷯邽뷯钽뷯钽뷯銽뷯隽뷯鎽뷯邽뷯薽뷯銽뷯膽戼㹲鎽뷯膽뷯躽뷯邽뷯醽뷯蒽뷯貽뷯鎽뷯馽뷯讽뷯鎽뷯邽뷯躽뷯鎽뷯螽뷯钽뷯薽뷯覽뷯钽뷯覽뷯㲑牢ਾ뷯隽뷯隽뷯莽뷯醽뷯隽뷯躽뷯蚽뷯讽뷯薽뷯貽뷯銽뷯馽뷯醽뷯莽뷯讽뷯躽뷯膽뷯袽뷯膽뷯貽戼㹲銽뷯蒽뷯鎽뷯銽뷯貽뷯膽뷯隽뷯鎽뷯醽뷯鎽뷯覽뷯邽뷯蚽뷯螽뷯蚽뷯貽뷯貽뷯薽뷯隽뷯覽뷯㲓牢ਾ뷯螽뷯銽뷯膽뷯鎽뷯覽뷯蒽뷯貽뷯蒽뷯隽뷯覽뷯蒽뷯螽뷯趽뷯螽뷯蒽뷯莽뷯醽뷯螽뷯膽뷯膽戼㹲銽뷯貽뷯莽뷯醽뷯隽뷯螽뷯讽뷯貽뷯邽뷯趽뷯隽뷯趽뷯膽뷯馽뷯鎽뷯貽뷯螽뷯覽뷯螽뷯螽뷯㲗牢ਾ뷯膽뷯貽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯蚽뷯醽뷯覽뷯馽뷯貽뷯螽뷯螽뷯钽뷯醽뷯貽뷯薽뷯醽뷯貽뷯膽뷯讽戼㹲蚽뷯醽뷯貽뷯膽뷯醽뷯螽뷯钽뷯钽뷯薽뷯蚽뷯讽뷯醽뷯膽뷯躽뷯躽뷯醽뷯貽뷯讽뷯膽뷯薽뷯㲌牢ਾ뷯躽뷯蚽뷯膽뷯鎽뷯鎽뷯螽뷯覽뷯醽뷯貽뷯隽뷯薽뷯蒽뷯醽뷯蒽뷯貽뷯躽뷯銽뷯钽뷯貽뷯膽戼㹲蚽뷯膽뷯醽뷯隽뷯鎽뷯鎽뷯膽뷯鎽뷯醽뷯膽뷯蒽뷯隽뷯薽뷯隽뷯膽뷯鎽뷯銽뷯螽뷯莽뷯醽뷯㲇牢ਾ뷯袽뷯隽뷯蚽뷯隽뷯膽뷯躽뷯貽뷯蚽뷯袽뷯螽뷯馽뷯鎽뷯袽뷯薽뷯隽뷯膽뷯螽뷯莽뷯膽뷯躽戼㹲邽뷯躽뷯覽뷯邽뷯躽뷯馽뷯覽뷯钽뷯躽뷯銽뷯隽뷯薽뷯鎽뷯钽뷯鎽뷯蚽뷯膽뷯薽뷯覽뷯鎽뷯㲌牢ਾ뷯钽뷯馽뷯膽뷯醽뷯钽뷯醽뷯覽뷯钽뷯貽뷯邽뷯貽뷯螽뷯鎽뷯螽뷯蒽뷯醽뷯薽뷯蒽뷯蚽뷯讽戼㹲躽뷯鎽뷯鎽뷯邽뷯蚽뷯鎽뷯钽뷯覽뷯钽뷯貽뷯蒽뷯钽뷯薽뷯貽뷯貽뷯醽뷯隽뷯膽뷯躽뷯鎽뷯㲙牢ਾ뷯蒽뷯讽뷯貽뷯躽뷯钽뷯馽뷯讽뷯邽뷯馽뷯鞽뷯螽뷯覽뷯螽뷯隽뷯貽뷯貽뷯隽뷯蚽뷯貽뷯莽戼㹲钽뷯莽뷯钽뷯莽뷯螽뷯貽뷯莽뷯銽뷯莽뷯銽뷯薽뷯馽뷯貽뷯邽뷯讽뷯袽뷯袽㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯醼볯ꢼ볯邼볯颼苣뎃菣袃菣钠ꧧ㲶牢ਾ†볯醼볯颃菣낂菣膃菣뎃뷯늼볯ꆼ臣뮿꣨꾏菨Ꞁ臣ꊖ臣讂苣뎃菣袃菣钠ꧧ銂볯薽볯膽듧麃臣財臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣蚈黦ꮁ苣誂胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂臣ꢼ볯邼볯颼ꃦ꺁볯ꆼ苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯₡꺼볯뚼臣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣貾臣膀볯薽볯膽듧麃룤ꞁ볯ꆼ臣몙迧馁苣鎁臣貁飦覂臣ꮁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯銼볯ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꃧ뚩裢閊룤誏臣붣觥㲤牢ਾ†苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣꺁볯醼볯醼ꃦ꺁볯ꆼ苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯꾃苣膃菣銂胣閁臣隁臣ꪁ铧辇迥뎁臣뺁臣뺁臣붣觥ꞁ胣超雧鲿귧銂볥趁蟥馁菨鮊臣ꒁ臣ꚁ胣麃苣릂臣誁臣ꚁꧨ鎨臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†闧ꪁ苣ꢔ蟩誏臣붣觥꺁鳦릊胦銂菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣閩뻤鞁臣芀볯醼볯醼苣ꒂ菣릂臣ꢼ볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꮁ苣讂볯ꖗ鯧誏臣銼볯ꖗ鯧꺁菣꾂菣뎃軦꺨뻥膀볯閼韦꺛臣몱껥鞁臣麃苣릂臣ꢼ볯ꦼ諥ꆾ苣膀鯥醼볯ꮁꓧ馁胣ꦼ볯閊룤뺁臣꾁볯궼諦躸臣貂臣ꮼ볯銼ꏨꒉ臣궼볯鎼ꏨꒉ臣ꦁ臣覂臣节胣鮊뻤꾁胣醼볯캐螽†뷯늼볯ꆼ볯麃苣릂볯钼볯邼볎뷯₇趽볯꺼볯込뷯螽볯꺁铧辇臣誁臣ꚁ胣肜苣颫臣ꎁ臣袼ꇨ鎼볯覼胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㜹㰵愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯鎼볯ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꃧ뚩裢超雧꺁雩讧裢龔귥螎迥뎁볯ꆼ볯㲩牢ਾ†臣꺁ꃧ뚩臣꾁胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯込볯늼볯颼苣ꒂ菣릂臣袂苣뒇귦蒚菣ꎃ菣뎃苣貾臣貛볯ꆼ볯ꊼ볯莽菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯袼볯醼볯醼볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯꾃苣膃菣꺁鳦릊胦銂ꧨꆾ臣龁胣開觧꒾臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁胣醼胩鎖뻥膀볯놀雩貾胣鎼胩鎖뻥뺁臣꾁볯놀雩貾臣膃菣것菣뢂苣財臣龁胣膃菣것菣뢂臣趉韦ꮁ郥麃苣릂臣覂ꇨ薸苣躏鯩鞁臣芀胥薀臣ꆎꇨꦉ苣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯袼볯醼볯醼볯銂铧蒁臣股郧鶇鯩뮘껥ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁臣芀꿥ꞅ뻧ꮁ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣蒁臣蒁菣Ꚃ苣誏臣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ룤뮴賥낼볯颼苣ꒂ菣릂苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣麃苣릂苣ꮐ苣龁胣鎁苣覂臣開觧ꮁ苣膀뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣꒾臣ꚸꇨ鞁臣膀菣ꎃ菣뎃苣銂ꇨꎁ臣芀菣ꎃ菣뎃苣꾁蟨뮭蟩袼볯邼볯낼볯떼볯꺁볯込볯늼볯颼볯鎼볯袼볯醼볯醼볯銂铧蒁臣뮼藨薆믦许臣袂臣ꚁꇨꎁ臣芀꣦隺苣뎂苣隌苣릂菣ꂃ臣몟臣蒁臣늉苣鎽臣覂苣龁臥랺諧讅苣뎂苣銂铧蒁臣립韧뚊藦膀뷤趇룦醰迥뎁귦ꆺ軧ꮁ臣蒁臣膀该ꦉ苣ꎛꛨ鞁臣芀뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃苣躸臣龁菣Ꚃ苣꾁臣릁臣膀볯邼볯薼臣龔귥螎迥뎁鳦躽駩꺁뷤趇룦醰苣몤臣龁볯뎛볯銼볯鲀볯銼볯覼胣꾃苣膃菣ꖎ꣧貾胣醼胩꺛臣꾁胣趽볯꺼볯꾃苣膃菣銂룤袁臣麃苣릂迥뎁駩Ꞁ꿥ꞅ菣꾂菣뎃苣躸臣龁菣Ꚃ苣꺁ꇨ莐蟥蚛飩뎮諥ꆾ臣麡볤鞁臣蒁臣芀臣讁臣꾃苣膃菣ꖎ꣧貾胣銼胩鎖鯧膀볯놀雩꺛迥뎁볯놀雩꺛臣꾁胣趽볯꺼볯꾃苣膃菣銂룤袁臣麃苣릂臣膀駩Ꞁ꿥ꞅ菣꾂菣뎃苣躸臣龁菣Ꚃ苣ꢁ꿦莼臣ꚁꯩ蒁맥螝諥ꆾ苣몤臣龁볯뎛볯鎼볯芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 邼胩꺛臣膀鯩ꊼ볯겼볯込뷯麃苣릂볯隼胣颼胩ꊽ볯醼볯릌臣꒾臣膀곦꺁菣꾂菣뎃軦꺨苣財臣龁볯ꦼ볯ꢳ냥ꮁ苣讂铧辇볯躼볯趽뷯込뷯螽臣膀볯꺼볯ꮁ냥ꖅ臣龁뷯늼볯ꆼ볯ꦼ볯閊룤閁苣讂룤뮴賥낼볯颼苣ꒂ菣릂볯뺁臣꾁ꫥ鎽胣ં䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†菣꾂菣뎃軦꺨뻥꺁볯놀鯧膀볯놀鯧膀볯놀鯧誏臣钼胩꺛臣膀该ꦉ臣붻뫩钅룤ꞁ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯込볯钼苣ꒂ菣릂苣ꖎ꣧鞁臣芀该ꦉ臣꾁胣肜뗧莿뫥貁볯쎑醼볯鎼볯ꚼ볯込뷯겼臣ꪁ苣袂臣ꮁ볯ꊼ볯ꮁ룥袇臣龁苣ꒂ菣릂볯邼볯캐겼苣ꦼ볯뒻룤ꮁ苣ꎁ臣躸臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볯钼韦鎖볯龄鿦貾볯ꖗ鯧鲀볯鎼韦꺛볯ꮁ苣龁臣ꚁ꿦ꖗ胣ꖁ뫥뚊藦꺁ꧨꆾ苣財臣膀뷤趇苣風賩鞁臣芀铧颭迥뎁臥랺諧讅臣膀ꇨ鎼볯ꮁꓧ馁苣뎂苣隌苣릂菣ꂃ苣ꢔ臣ꚁꧨꆾ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꒂ菣릂菣ꎃ菣뎃苣꺁냥ꪁ臣ꢁ苣鎼韦趉臣꾁胣馁臣ꚁ臣開觧ꮁ胣鎽룦銂鯧隦臣讂菣莃菣銂鿥膂뻨鎂臣誁臣龁胣鎽룦꾁꿦ꖗ꣨늌臣龁胣蒐菣ꎃ菣뎃苣꺁觥ꖗ臣股룦ꚩ雦銂迥蚛臣鶁臣股룦銂볯ꆼ볯ꊂ菣뮂苣ꞁ裥邞臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†铧颭鯦骷苣뎛볯閼臣몤臣芀该ꦉ苣醼볯ꖗ雩ꮁ苣龁臣ꚁ铧颭臣ꒁ臣ꚁ鯧隦臣龁胣Ꞽ뷯膽뷯袽볯膽뷯₄낼뷯覽뷯趽†뷯隼臣궃苣銈菣뎃苣蚈黦銂ꇨꎁ臣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 趽볯꺼볯꾃苣膃菣뺁臣꾁룤뮴賥낼볯颼苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣麃苣릂臣馁臣ꚁ볯邼볯薼臣龔귥螎苣袑臣龁臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣ꪁ臣ꎁ臣麃苣릂臣邼볯ꢁ볯邼볯ꢁ臣鎖臣龔귥螎苣袑臣龁볯ꢡ볯邼볯芀蟥꺽菣Ꚃ苣꺁뷤趇臣覜蓦ꪁ룦醰臣鲤蟥閁苣ꆄ臣ꎁ臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㘷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ钼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㜹㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뎹鷥ꢼ볯鮊뻤銂鯥醼볯誏臣ꢡ볯醼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㠷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ胥꾁맥螝뇂볯꒼볯馨뫦辁럥覼臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣螃菣뾂臣膀铧辇볯躼볯趽뷯込뷯螽†볯꒼臣趽볯꺼볯꾃苣膃菣뺁臣꾁룤뮴賥낼볯颼苣ꒂ菣릂苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣麃苣릂臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯込볯钼苣ꒂ菣릂臣袂苣膃菣것菣뢂뻥膀볯놀鯧膀볯놀鯧膀볯놀鯧뺁臣꾁볯놀鯧ꮁ볯邼볯薼臣龔귥螎苣몤臣龁臣ꢁ苣龮꣨鞁臣蒁苣芀臣貂臣膀臣꺁菣꾂菣뎃臣膀臣꺁ꃧ뚩臣ꆝ믤许臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꆼ볯낼볯込볯込볯钼苣ꒂ菣릂臣袂苣龄鿦讁苣꺁飩ꆾ苣节臣覂臣龁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ꢼ볯ꦼ듦Ꞁ臣膀룤뮴賥낼볯颼苣ꒂ菣릂苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣開觧ꞁ臣膀볯놀鯧讁苣钼胩꺛臣ꞁ뷤蒁臣뺁臣芁臣龁胣趽볯꺼볯銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣꾁胣膃菣것菣뢂뻥꺁볯놀鯧꾁뷤蒁맥螝볯ꆼ볯鮊뻤銂ꓧ鞁臣貁胣銼胩꺛胣鎼胩꺛迥뎁볯놀鯧꾁臣貂臣貂ꋥꂊ臣龁諥ꆾ苣몤臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼苣뎃菣ꮃ苣뎃苣꾃苣膃菣ꮁ臣醁苣ꢼ볯릉闧蒚迥뎁볯鞼觧낕髧뒼듧麃뿥钭臣閩뻤㲡牢ਾ†볯놀鯧誏臣鎼胩꺛臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣ꢼ볯꺼볯뺁臣꾁볯鞼볯馼苣ꒂ菣릂臣ꢼ볯뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃臣膀菣Ꚃ苣銂볯꒼臣袂臣ꚁ藥ꮖ蟥꺽臣膀볯놀鯧ꮁ蓨내菨銂迥蚛臣龁胣뒼듧麃苣膀볯醼藩鞈臣龁臣ꢼ볯超裥銂蛥뺏臣讂볯ꆼ菣鞃菣覃菣ꒂ菣ꦃ菣벃볯貮藥랕苣뎃菣꾂돨꺁볯閼菣벃볯ꞁ볯隼胣醼볯芙雩몈뿦鞁臣芀볯내菨꺁鷩릉闧蒚裥肿臣낼볯ꆼ볯ꒂ苣躃菣ꒂ苣뎃苣ꢔ臣ꚁꇨꎁ臣芀볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽苣ꢔ臣ꚁ볯ꚼ볯캮ꮁ雩馁苣鎟觨銂觧骮臣龁胣ꊼ듧麃臣膀볯醼藩鞈臣龁臣ꢼ볯超裥銂蛥뺏臣讂菣鞃菣覃菣ꒂ菣ꦃ菣벃볯貮藥랕苣뎃菣꾂돨꺁볯閼菣벃볯꺁臣骁苣讁苣ꢔ臣ꚁ裥肿臣龁胣鶃菣꾂菣벃菣ꮃ볯내菨몈뿦꾁胣늼볯钼볯讼뷯ꦼ볯銈볯銂铧蒁臣財臣龁胣ꊼ듧麃볯겼볯뎼뷯辽뷯銂铧蒁臣鞊軥릉闧蒚볯螽볯ꮁ雩馁苣鎟觨銂觧骮臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽臣邵黦꾁胣ꢼ볯骃菣膃菣뺁臣꾁볯鞼菣鞃菣覃臣袂苣몈뿦貾臣뒼듧麃臣袂苣ꦼ볯ꚼ돎裥貳臣鞢諥銂껥벨臣龁볯뎛볯钼볯誏臣뎛볯钼볯覼胣낼볯ꆼ볯ꒂ苣躃菣ꒂ苣뎃臣몈뿦鞁臣뒼듧麃臣꾁胣ꦼ볯꺼돎裥貳臣鞢諥貁ꛨ龯臣貂臣讁臣龁볯뎛볯钼볯覼胣鎁苣覂臣邵黦讁苣膀볯내菨鲿귧꾁諦龎觧낕髧ꞁ臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯내菨ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽臣邵黦꾁胣貮藥랕諦龎臣ꊼ듧麃苣몈뿦鞁臣뒠郥ꮁ臣ꦼ뷯Ꞽ裥貳臣략臣讂臣膀볯醼볯ꢼ볯骃菣膃菣ꞁ볯내菨銂裥肿臣龁ꃥ袐臣꾁볯螽볯蚈돦貁뗨鎁苣ꪁ臣鎁臣銂껥벨臣龁볯뎛볯閼볯鲀볯閼볯覼胣骃菣膃菣ꦃ苣隃菣ꪃ菣ꮁ苣讂裥肿臣ꂬꛥ꾁뫤뎃臣貂苣鎁臣ꞁ臣ꎁ臣芀臣鲁臣覂胣ꦼ뷯Ꞽ뿥钭臣膀볯내菨鲿귧꺁裥肿臣薿ꛨꢁ臣貂苣궼볯ꎼ볯鞊軥袂苣랕臣뺂郥貁臣讂볯ꢼ볯ꦼ볯鞊軥ꮁ苣ꎁ臣몈뿦閁苣讂臣覂臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯閼볯麃苣릂蓨내菨ꮁ臣醁苣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂菣꾂菣뎃臣뺯臣讂볯醼胣ꢼ볯膀迥뎁볯醼볯릉闧蒚볯誏臣ꊼ듧麃뿥钭臣閩뻤㲡牢ਾ†苣뎃菣ꮃ苣뎃苣릉闧蒚臣뒼듧麃迥뎁볯내菨鲿귧銂胣ꢼ볯膀볯醼볯膀迥뎁볯鞼菣麃苣ꮃ菣讃菣뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃볯꺼볯뚼볯꺁諦躸뻥ꮁꧨꆾ臣龁胣ꆰ跥ꮁ뿨릁苣ꢁ胣邼韦꺛臣膀볯隼뻧袼볯릌臣ꒁ볯꺁鯩隼胣颼胩ꊽ볯ꆼ볯ꊼ볯莽菣Ꚃ苣ꮁ胣꺚蛥貵럨袼볯꒼볯ꮁ苣誂胣閁臣隁臣ꪁ铧辇臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀菣꾂菣뎃軦꺨臣鞼胩鎖뻥ꮁ胣開觧銂뇥몮臣膀蓨鎇苣ꆎ迥鞁臣芀蓨내菨銂볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽胣ꎼ볯鎼胣ꎼ볯钼胣ꎼ볯颼胣ꎼ볯钼볯膀볯ꎼ볯鞼胣ꎼ볯钼볯膀볯꒼볯閼胣ꦼ볯銈볯ₒꦼ볯꺼돎胣誏臣뒼볯ꚼ뇎菣벃苣벃臣내菨薆苣ꒂ菣ꮂ苣뎃鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꪁ苣뎁臣ꊼ듧麃볯겼볯뎼뷯辽뷯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꦼ볯꺼돎볯겼볯뎼뷯辽뷯蚈黦㲐牢ਾ†볯醼볯꺼볯込볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯ꎼ볯銂諦躸臣龁菣Ꚃ苣꒾臣覂臣뺄듧麃苣膀볯醼胣ꢼ볯誏臣ꢼ볯邼觧낕髧ꦼ볯꺼돎铧ꎔ臣ꒁ臣ꚁ볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽臣袂臣ꚁꧨꆾ臣龁胣誃苣벃菣麃苣릂臣겸껥꾏菨ꪁ볯ꚼ볯캮떂苣袃苣ꒂ菣鲿귧銂룤袁臣讁臣龁臣ꮁ꿥鞁胣ꢼ볯邼볯颼볯꺼볯銈菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣込볯邼苣꺚蛥ꮁ菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣膀볯醼볯骃菣膃菣릉闧蒚볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽뿥钭臣鲤蟥閁苣龁胣鎁苣覂臣鲿귧꺁볥閁臣膀諦躸臣龁菣꾂菣뎃臣ꢔ蟩ꮁ뻤颭臣讂臣ꢁ臣辂臣ꎁ臣芀菣鞃菣覃裥肿蓨내菨꾁ꓦ몇迥붃臣ꢼ볯릉闧蒚臣龁臣ꢼ볯릉闧蒚볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽뿥钭苣躸臣ꪁ臣ꎁ臣芀臣릁臣꺁뻧貁볯궼볯讼苣ꪂ菣麃苣랂菣袼駩Ꞁ꿥ꞅ볯ꮁ苣讂裥肿뻥ꮁ볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽뿥钭苣龔臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼볯醼볯Ꞽ볯込볯醼胣ꢼ볯꺼볯込볯銼볯ꎼ볯袼볯ꎼ볯붣觥覼臣龁臣ꢼ볯꺼볯込볯銼볯ꎼ볯袼볯ꎼ볯붣觥覼苣꺚蛥閊룤鞁臣麃苣릂臣覂跥ꊛ臣貂臣뺄듧麃臣覂臣ꮁ볯醼볯醼볯Ꞽ볯込볯邼볯궼볯鎼ꏨꒉ볯銂귧覂蛥閊룤鞁臣麃苣릂臣覂臣뺄듧麃臣覂臣膀볯醼菣鞃菣覃觧낕髧ꦼ볯꺼돎볯겼볯뎼뷯辽뷯鲿귧貁ꓦ몇臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꢼ볯꺼볯込볯銼볯ꎼ볯銂髧薆諦躸臣龁臣训苨薆諦躸臣龁菣Ꚃ苣讁苣颍鯩閁苣龁蓨내菨讁苣꾁胣ꢼ볯骃菣膃菣릉闧蒚볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽뿥钭臣鲤蟥閁苣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼볯醼볯Ꞽ볯込볯醼볯낼볯뎼苣躸臣龁꿥ꞅ菣Ꚃ苣讁苣꺁蓨내菨꾁胣骃菣膃菣몈뿦ꮁ꿥馁苣鲿귧銂ꓧ閁臣讁臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†볯내菨ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽裥邞戼㹲 ꆰ跥ꮁ뿨릁苣ꢁ胣ꢼ볯릉闧蒚볯螽볯誏臣ꦼ뷯궼뿥钭臣膀闧ꪁ苣ꢼ볯꾃苣膃菣붣觥銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁臣辁臣讁臣麃苣릂뻧讁苣鲤蟥閁苣龁胣ꢼ볯꺼볯込볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯ꎼ볯誏臣ꢼ볯邼볯颼볯꺼볯銈菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣込볯邼苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣麃苣릂臣꾁胣鶁苣麁苣ꢼ볯릉闧蒚迥뎁볯醼볯릉闧蒚볯螽볯誏臣ꦼ뷯궼뿥钭苣閼臣몇臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 내菨薆苣ꒂ菣ꮂ苣뎃鿦늉臣邵黦㲜牢ਾ†볯醼苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣麃苣릂臣覂臣뺄듧麃苣뺯뿥馁苣骃菣膃菣뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨ꞁ裥肿臣讂臣膀볯꒼볯讼†볯내菨誏臣ꎼ볯颼볯₋뒼듧麃臣誁臣ꚁ胣醼볯鲀볯颼駦鎖뻥誏臣钼볯芙雩貾臣膀藥ꮁ胣ꢼ볯릉闧蒚볯袽볯袼볯ꚼ볯캮膀볯꺼볯캦膀볯겼裢銼볯떂苣袃苣ꒂ菣鲿귧貁ꫨ몙臣貂苣鎁臣貁胣내菨薆苣ꒂ菣ꮂ苣뎃鿦늉迥뎁菣궃菣떂苣袃菣袃菣벃裥邞臣袂臣ꚁꓧ閁苣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†諥袁臣膀볯鞼迥뎁볯銈볯邼菣鞃菣覃迥뎁苣뎃菣꾂돨릉闧蒚볯袽볯袼볯ꚼ볯캮膀볯꺼볯캦膀볯겼裢銼볯鲿귧节胣ꎼ볯钼볯誏臣ꎼ볯颼볯₋뒼듧麃臣誁臣ꚁꓦ몇臣貂臣芀볯鞼菣꾂菣뎃ꏨꒉ苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣꒾臣꾁볯鞼觧낕髧鲿귧貁ꫨ膂苣貂胣ꢼ볯邼菣꾂菣뎃ꏨꒉ苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣꒾臣꾁볯醼볯릉闧蒚뿥钭臣뾁苣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯隼볯麃苣릂蓨내菨ꮁ臣醁苣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂菣꾂菣뎃臣뺯臣讂볯鞼迥뎁볯醼볯릉闧蒚볯내菨誏臣ꊼ듧麃뿥钭臣閩뻤銈駦鎖뗧躁戼㹲 ꢼ볯邼迥뎁볯鞼菣麃苣ꮃ菣讃菣뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃볯꺼볯뚼볯꺁諦躸뻥ꮁ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂觧낕髧뒼듧麃迥뎁볯내菨鲿귧銂ꧨꆾ臣龁胣ꆰ跥ꮁ뿨릁苣ꢁ胣邼韦꺛臣膀볯鞼뻧袼볯릌臣ꒁ볯꺁鯩隼胣颼胩ꊽ볯ꆼ볯ꊼ볯莽菣Ꚃ苣袼郥袨볯鎼볯麃苣릂볯ꮁ胣ꢡ볯銼臣몤臣閁臣隁臣ꪁ铧辇臣膀髧薆뗧꾷볯ꦼ볯覼臣袂臣ꚁ菣꾂菣뎃軦꺨臣龁胣鞼韦꺛胣銼볯ꖗ鯧誏臣颼볯ꖗ鯧ꮁ胣蒐볯릌臣꒾苣ꂱ껦鞁胣股뛦ꚩ雦誏臣뺄蟨銂迥ꮩ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꚼ볯캮ꖼ볯ꦼ볯낼볯뒼胣ꦼ뷯Ꞽ†볯겼볯뎼볯꾼볯袼볯내菨鲿귧ꢔ볯膀迥뎁듧麃蛥떂苣袃苣ꒂ菣鎟觨袼볯ꎼ볯覼苣ꢔ臣ꚁ菣Ꚃ苣뺄蟨銂裥邞臣龁胣股룦ꚩ雦銂胣뺁臣鞏껥鎽ꃧ誣藩ꂴ볯늼볯ꖼ볯ꮁ苣讂蟥蚐臣膀ꇨ薸룤ꮁ귥ꢜ臣讂ꇨ莐蟥蚛臣麝觧낕髧뮘껥ꂛ귥袼臥붙胦覼苣ꚇ郧馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣颃菣낂菣膃菣뎃臣뮘껥袼볯ꆼ볯覼臣ꒁ臣ꚁ裥邞臣龁胣ꆬ臣膀뗨股郧袼볯ꊼ볯覼苣ꢔ臣ꚁ볯꒼볯ꚇ郧股룦銂郥肝臣鮁苣鎁臣ꞁ胣麝觧낕髧ꊂ苣ꮃ菣讃菣袼臥낙胦覼苣꒙軥鞁臣芀胩骶룥袇臣龁蟥蚐ꇨ薸볯銼胥貸蟩늶볯銂胣馨뫦隌臣貂臣辇臣蒵迦袁苣뎃菣ꮃ苣뎃苣鞊軥ꢁ藥ꮁ菣것苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣讁苣膀臣꺁럦袐觧ꮁ볯ꊼ볯銂諥袁臣芀ꇨ莐蟥蚛臣뮘껥꾁볯ꆼ觧낕髧鞊뷤꺁귥ꢜ苣몤臣芀菣벃菣鞊볯醼볯麃苣릂ꇨ薸苣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣鞃菣ꮃ諦ꢼ볯邼菣Ꚃ苣股룦꾁믤趉臣뎦꿥閁苣龁菣벃苣꺁꿧늛蛥ꮁ臣讂볯ꆼ볯鮊뻤銂ꓧ鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 邼韦꺛臣趽볯꺼볯₡꺼볯뚼臣颍鯥閊룤銂迥醁臣貾胣ꢼ볯ꦼ諥ꆾ臣鞼韦꺛臣꾁ꓦ몇臣貂臣讁臣龁臣袼ꇨ钼볯覼胣銼볯ꖗ鯧ꮁ臣鲤蟥閁苣袼ꇨ钼볯覼胣颼볯ꖗ鯧뺁臣鞢諥鞁뛧醁臣袼ꇨ钼볯覼胣颼볯ꖗ鯧꺁諥ꆾ臣銼볯ꖗ鯧꺁諥ꆾ苣誂볯趀胣醼볯趀ꯩ讁臣龁볯뎛볯閼迥뎁鯥醼볯覼胣ં䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼볯꺼볯込볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯ꎼ볯붣觥궼볯鎼臣閊룤꾁胣ꢼ볯邼볯颼볯꺼볯銈菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣込볯邼ꏨꒉ볯ꎼ볯ꮁ苣ꎁ臣颪냥閁苣讂볯ꆼ볯鮊뻤ꢁ꿦莼臣ꚁꯩ蒁볯ꆼ볯鮊뻤銂苣龁苣鞁臣袼鯥醼볯覼胣궼볯鎼†볯꺼볯붣觥꾁胣ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ볯꒼볯覽뷯銈볯ꎼ볯銈볯궼볯膀볯邼菣ꮃ볯覼胣麝苣膃苣뎃胦芄돨袼볯뎼볯ꎼ胣醼볯ꊃ菣薼볯膀볯ꖼ볯芄돨袼볯ꖼ볯銈볯꾼볯Ꞽ胣醼볯閼菣ꮃ볯覼迥뎁꟦ꂀ蓨ꪳ볯뎂菣릂菣궃菣ꮃ胣鎼볯躼볯ꊃ菣薼볯讁苣ꪁ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯邼볎뷯込鯥꺁볯醼볯꺼볯込볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯ꎼ볯붣觥궼볯鎼臣閊룤꾁鳦节ꯩ蒁볯ꆼ볯鮊뻤銂苣龁苣鞁胣肸雦膀볯躼볯캐螽볯麛迥뎁볯躼볯캔螽볯麛臣閊룤貾臣ꢼ볯ꦼ諥ꆾ臣銺臣ꮁꇩ벼臣ꚁ臣讂볯뎛볯隼볯芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯銼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㤷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ钼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㠹㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ钼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㠹㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㌸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼鷩銃菣誜闩麡臣誁臣讂諦ꢼ볯邼菣麃苣ꮃ菣讃菣蚈黦銈铧辇꿧늛ꃧ뚩戼㹲 ꮂ菣꾂苣뚂菣꺁뻧ꮁ胣ꢼ볯邼볯ꆼ苣벃菣꺼볯뚼볯겼볯낼ꏨꒉ苣膀臣뺁臣뺁臣ꢔ蟩袼볯邼볎뷯込鯥膀볯邼볯캐螽볯麛胣钼볯邼볎뷯込鯥覼臣꾃苣膃菣ꖎ꣧馁苣讁胣鎼볯螃菣ꒂ苣ꞁ胩钁臣貂苣ꢼ볯邼볯ꆼ苣벃菣꺼볯뚼볯겼볯낼苣꾃苣膃菣ꖎ꣧馁苣讁胣뺁臣꾁꿥ꞅ볯醼볯ꢼ볯뎂菣覃볯ꆼ볯込볯ꊼ볯銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁胣股룦ꚩ雦銂苣ꮃ臣覂꿦놀軦随臣膀菣麃苣ꮃ菣讃菣꺁飩뎮臣ꒁ臣ꚁꧨꆾ臣龁볯ꢡ볯閼胣뎛볯馼볯芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㐸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼菣Ꞃ菣莃菣ꊃ菣ꮃ臣誁臣讂胣ꢼ볯꺼볯꾃苣膃菣銂뷤ꎁ臣超雧꺁雩讧臣ꞁ臣芙雩꺁뇦骮戼㹲 ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯込껥붾볯醼볯銼볯醼볯袼볯鞼볯馼볯꾃苣膃菣꺁藥ꮖ臣讖꟥뺁臣꺁駦鎖볯膃菣것菣뢂뻥꺁諦鎽諥ꆾ臣Ꚃ苣ꮃ苣鮊뻤꺁뷤鮸臣ꮁ苣ꎁ臣겸껥閁苣讂苣꺁볯銂苣뎃菣ꮃ苣뎃苣龄鿦꺁菣Ꞃ菣莃菣ꊃ菣ꮃ臣閩뻤鞁臣芀냧颍臣낿臣讂臣膀볯邼뻧袼볯릌臣ꒁ볯꺁菣Ꞃ菣莃菣꺁臣貂臣貂臣膀铧辇볯邼볎뷯膀볯邼볎뷯膀臣龁臣銼볯邼볎뷯꺁볯鞼볯馼†뷯늼볯ꆼ†볯ꆼ볯꾃苣膃菣膀铧辇볯邼볯캐螽臣醼볯讽볯膽苣ꎃ菣鞃苣ꂬ臣ꢼ볯꺼볯꾃苣膃菣膀臣龁臣낼볯뎼꿥ꞅ苣膀볯ꖗ鯧ꮁ胣꺚蛥貵럨ꮁ苣ꎁ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀볯邼뻧꺁臣ꆁ臣閼뻧ꮁ臣膀볯麛鯧꺁諦躸臣늘뻥銂ꋥꂊ臣鮁苣讁臣蚁臣銂뇦骮臣讂臣膂臣膀볯麛鯧꺁菣꾂菣뎃軦꺨볯隃菣릂苣벃볯銂룤袁臣芀곦ꮁ该ꦉ苣뮼藨薆뗧꾷臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂볯込껥붾볯醼볯銼볯醼볯袼볯鞼볯馼볯Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣辁鳩鞁臣芀ꃧ뚩꣨뮔苣ꢡ볯閼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㔸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†볯鞼볯馼臣閃苣것菣袃臣誁臣ꚁ蟨뮭髧뺖苦銂ꫨ몙臣ꪁ臣꺁臣膀룤膦ꧨꆾꃩ꺛臣膀볯ꎼ볯꒼볯邼볯閼볯薼뗧钹鿥誤蓦鎟蟩覼臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂苣膃菣것菣뢂볯ꖗ뻥꺁뗧钹볯뮸臣鞁臣몂볯ꮁ臣醁苣Ꚃ苣ꮃ苣ꂲ跨辇臣鞁臣芀苣ꒂ菣릂諥ꆾ臣ꂊ臣ꚁ胣꾃苣膃菣ꖎ꣧趉迥뎁菣ꎃ菣뎃苣뒛觥ꮁꇨ늶苣躏鯩鞁臣膀ꇨ莐蟥蚛飩뎮볯ꢼ볯ꦼ볯誏臣麃苣꾂菣궸鋥袼볯꺼볯ꊂ菣뮂苣ꮁ苣ꎁ臣몱껥閁苣讂苣뎃菣ꮃ苣뎃苣릉闧蒚諦鎽諥ꆾ苣몱껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 몂菣ꊃ苣趃菣袃菣벃苣讁苣膀跥麛菣꾂菣뎃軦꺨臣ꦁ臣莿뫥ꞁ苣Ꚃ苣ꮃ苣鮊뻤꺁뷤鮸苣节臣覂臣膀藥ꮖ臣讖꟥뺁臣꺁駦鎖臣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁볯ꖗ뻥袂苣趉臣芁臣龁臣ꢁ臣辂臣讂볯ꢡ볯隼볯芀菣꾂菣뎃軦꺨臣鞼韦貾臣膃菣것菣뢂臣龁臣릁臣꺁菣꾂菣뎃뻧ꞁ胣醼뷯辽뷯꺁뷤鮸臣芁臣龁胣鎁苣貁胣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁볯醼韦貾臣膃菣것菣뢂臣龁뻧ꞁ臣膀볯邼볯캐螽뻧膀볯邼볎뷯꒾胣誏臣醼볯캐螽뻧ꮁ臣蒁臣膀臣貂臣貂볯膀볯膀迥뎁볯貽뷯螽臣躽룦뢁臣膀铧辇뻤颭髧ꮁ铦蒖臣龁볯뎛볯邼볯芀臣貂臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣钼볯ꖗ뻥ꮁ菣ꎃ菣뎃苣鞁臣꒾臣꾁胣銼볯邼볎뷯꒾胣閼볯캐螽뻧膀迥뎁볯邼볎뷯꒾臣誁臣ꚁ볯膀볯膀迥뎁볯貽뷯螽臣躽룦뢁臣膀臣覂臣릔雥閁苣龁胣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁볯ꖗ뻥ꮁ胣醼볯캐螽뻧誏臣銼볯邼볎뷯꒾臣꾁胣낼볯뎼꿥ꞅ뻧ꢁ臣뺯꿦ꞁ胣놵꣨蒚鳦辄럥貁ꛨ龯臣貂臣袼뷯鲼볯躼볯閼볯芀볯邼볎뷯ꢔ蟩꒾苣몂苣ꒂ菣릂諥ꆾ臣躽룦馁苣뺂郥銂ꓧ鞁臣貁胣낼볯뎼뻧ꢁ뗧袨髧覜蓦꺷臣芁臣龁臣꾁胣隃菣릂菣銂諦躸臣龁ꃥ袐臣醁臣ꎁ臣芀臣貂臣誁臣覂臣膀臣꺁뻧ꮁ臣醁苣낁苣ꒁ臣銂ꋥꂊ臣鮁苣颫臣뚁蓧꺁鷩겜돨蒚臣颫苣ꒂ菣릂諥ꆾꧨ首臣袂苣꺁臣芁苣蚁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㠹㰶愯㰾䐯噉ਾꂀ볯閼볯貁볩鞴뗦늶볯ꎼ볯꒼볯邼苣莃苣ꒂ臣鲤蟥许駩ꞁ臣讂胣뮼듦蒵뛦ꮁ雩馁苣뺹뷤뎹鷥ꒀ苣花苣讂臣膂臣膀볯겼볯놼胥ꪜ뫦꺁臣릁臣ꮁ볯馼臣ꒀ苣늉苣鎽臣龁胣醼볯躼볯貁苨鮃菣뢂菣벃菣뒼볯ꦼ볯閼볯ꊂ菣뮂苣꺁ꓦ몇룤邙臣芁苣芀볩鞴뗦늶臣ꊖ臣讂맥閽맥螝胥銂뇦膂苣龁苣ꮁ胣겼볯꾼볯ꒀ鳦肺臣馁臣ꚁ臣颼苣늉苣鎽臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†跥麛菣꾂菣뎃軦꺨臣钯볨鞁臣붿諥꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ뗧袨髧ꦈ鯧꾁ꛨ龯臣貂臣讁臣龁臣膀臣貂臣誁臣覂臣膀跥麛菣꾂菣뎃軦꺨뻧ꢁ볯麛볯隃菣릂菣覼菣꾂菣뎃軦꺨뻧꺁臣ꆁ苣ꮁ苣뾁苣貂臣钼볯ꖗ臣ꞁ臣Ꚃ苣ꮃ苣몂諥ꆾ臣銼胣钼뷯辽뷯꺁뷤鮸臣袂苣꺁臣芁苣蚁볯ꢡ볯鞼볯芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼裢醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㜸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ钼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㠹㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 꾃苣膃菣ꖎ꣧誏臣膃菣것菣뢂臣뒛觥ꮁ郥開觧讁苣股룦銂迥蚛臣膀볯ꆼ볯ꊂ菣뮂苣ꞁ裥邞臣龁胣ꢡ볯颼臣覂苣讁苣袂臣ꮁ胣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁볯ꖗ뻥ꮁ臣ꢔ蟩鶾귥蒚ꋥꂊ臣躘駧ꞁ臣誂胣鮊뻤꾁駦鎖臣貵臩ꢁ藥ꮁꋥꂊ臣龁胣銼볯邼볎뷯銈볯钼뷯꒼뷯궂菣莃菣袼볯邼볯銈볎뷯₇钽뷯₏醼볯銈뷯꒼뷯₁莽뷯邽볯꾃苣膃菣꾁胣醼볯캐螽菣꾂菣뎃臣낼볯뎼뿥钭臣鎖臣膀菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣誸鯥讂ꓥ醰臣鮊뻤銂룤袁臣芀볯麛鯧꺁菣꾂菣뎃軦꺨苣鞏臣龁뻧꾁胣銼鯥꺛臣꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣膀諦鎽諥ꆾ臣膀铧辇뻤颭髧ꪁ볯躼볯趀臣鞢諥銂ꓧ鞁臣芀볯邼볯캐螽裢醼볯讽볯膽苣ꎃ菣鞃菣꾂菣뎃苣膀볯麛鯧꺁菣꾂菣뎃軦꺨뻥ꮁ胣鞊뷤鮊뻤꺁臣袂臣銼胥꺁ꋥꂊ苣몤臣龁胣蒁臣貂臣뒠郥节胣꾃苣膃菣ꖎ꣧趉ꇨ늶ꧨ首臣꺁꿥钯臣놵꣨蒚臣覜蓦ꪁꋥꂊ臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣銼볯ꖗ뻥ꮁ鳦鶈臣뎦꿥閁苣龁볯邽볯邼볯邼볯覼胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㠹㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 股룦ꚩ雦銂볯꺼苣莃苣ꒂ臣节裥邞臣龁胣ꢡ볯馼臣몤臣袂臣ꮁ胣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁볯ꖗ뻥ꮁ臣ꦗ臣节볯꺼諥ꆾ臣鞢諥貁ꛨ龯臣貂胣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁볯馼韦貾臣ꞁꋥꂊ臣ꒁ臣ꖁ臣龁胣鮊뻤꾁볯邼볯캐螽菣꾂菣뎃뻧ꞁ鳦节ꯩ辁胣閼볯캐螽뻧誏臣醼볯캐螽뻧ꞁ臣麡볤鞁臣蒁臣芀볯邼볎뷯꾃苣膃菣ꢔ蟩꒾迥뎁볯邼볯캐螽菣꾂菣뎃铧辇뻧ꞁ臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣鞼韦貾臣ꞁ臣놵꣨蒚臣覜蓦ꪁꋥꂊ臣뎦꿥閁苣龁볯邽볯邼볯邼볯覼胣醼볯캐螽菣꾂菣뎃铧辇뻧ꞁ臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣銼볯ꖗ뻥뺁臣覜蓦ꪁꋥꂊ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣袼뷯鲼볯躼볯閼볯芀볯邼볯캐螽裢醼볯讽볯膽苣ꎃ菣鞃菣꾂菣뎃臣膀菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣誸鯥讂ꓥ醰臣鮊뻤銂룤袁胣鶁苣꾁菣꾂菣뎃軦꺨臣钼볯ꖗ뻥뺁臣ꮁ臣놵꣨蒚臣覜蓦ꮁ臣誂볯邽볯邼볯邼볯覼胣閼볯캐螽뻧誏臣醼볯캐螽뻧꺁諥ꆾ苣誂뷤讁臣龁胣銼鯥꺛臣꾃苣膃菣ꖎ꣧銂迥醁臣꒾臣꾁胣銼鯥꺛臣꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣膀諥ꆾ臣鎼볯邼胣钼볯閼胥鞢諥鞁臣芀볯邼볯캐螽裢醼볯讽볯膽苣ꎃ菣鞃菣꾂菣뎃苣膀볯麛鯧꺁菣꾂菣뎃軦꺨뻥ꮁ臣袂臣醼볯閼胥꺁諥ꆾ臣鞢諥銂ꓧ鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰〹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鷩뢸臣骩臣龁臣ꢁ臣膀鳦몙飦꺁菣꾂菣뎃꟦覯觧꾁胣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁苣骁臣鞼韦貾臣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣辁鳩鞁臣뒠郥ꮁ胣몂臣誁臣讂苣ꒂ菣릂諥ꆾ苣躽룦鞁臣芀볯ꆼ볯誏臣궼볯ꮁ苣ꎁ臣겸껥閁苣讂諦鎽諥ꆾ臣놵꣨蒚臣覜蓦ꪁꋥꂊ臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣鞼韦貾臣꾁韦辁苣鲤蟥閁苣龁胣銼鯥꺛臣꾃苣膃菣ꖎ꣧袼臣ꪁ苣ꆁ菣벃苣뾂菣覼臣鞊뷤鮊뻤銂ꋥꂊ臣鮁臣貁胣Ꞥ跥꺁该ꦉ臣꾁跥麛臣꾃苣膃菣ꖎ꣧ꞁ臣릁臣꺁苣ꒂ菣릂臣銎駩閁苣龁臣ꞁ胣Ꚃ苣ꮃ苣鮊뻤銂뗧袨髧ꮁ뷤鮸臣讂臣ꢁ臣ꪁ臣ꎁ臣芀볯邼볯캐螽볯開觧꺁裢醼볯讽볯膽苣ꎃ菣鞃菣꾂菣뎃臣节臣覂臣늘뻥꾁볯邼볎뷯꺁껥ꢅ菣꾂菣뎃苣誂볥讁臣龁臣膀볯ꊼ볯뺯藧ꢁ臣钯볨ꞁ胣몂臣誁臣讂苣ꒂ菣릂단랍蟩銂뷤鮸臣膀諦鎽諥ꆾ苣鞢諥閁臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†꣨覼臣龁臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꮁ雩鞁臣겜駧躘苣讁臣誂ꧨ鞁臣랅뷤蒚臣겪飦鞁臣貁胣鶁臣袂臣ꪁꧨ내苣鞁臣꾁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣节胣뺁臣꾁臣꺁觧骮껥붖뷥讅臣节胣겜駧躘苣邙껥鞁苣蚁臣蒁臣辄鯥꾁臣辁胣겜駧躘臣膀鳦颡ꯨ花ꃩ銂迥ꞅ臣ꚁ胣袅ꇨ肊ꇨꮁ藧覂臣ꚁ臣貂苣꺁ꯨ花ꃩ꺁鳦Ꞥ駩꾏菨ꪁ뫥蒁꟨袇臣鞾苣貂苣袂臣ꮁ胣鶁苣蚂臣ꮁ胣겜駧躘臣辄鯥馁苣蒯鯥銂鳦릊臣薌郥馁苣袂臣ꮁ꟨袇臣貂苣릁臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ꣨誏臣龁裥財觧膀觧놨蟥颡胣릉꣨膀迥뎁믤꺁迥莀雦꺌臣蒁臣貂苣膀迥ꞅ臣袂苣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀鿧뺛臣龔臣龁ꃥ袐臣膀껥ꦾ苣ꮐ苣ꚁ鳦躘듧뢛臣ꪄ藥閁苣讂臣ꢁ臣ꪁ苣芀諥袁臣膀苣꾂苣ꞃ菣꺁ꛨ몇臣膀鷦首胣릖돦誏臣龮雦设臣颍臣讂뻤몤ꫨ躘臣芁苣膀駩骮苣辄鯥鞁臣蒁臣蒁胣ં䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†뷤ꢔ臣龁ꫨ꾁駩骮臣꾁臣辁ꫨ躘臣龁苣꺁ꫨꞁ臣誂胣겜ꇩ讫뇦薠臣蒯鯥薆臣膀鳦몙飦꺁鳧꺁꿧늛迥뎁ꛨꢗ臣覂胩놄臣讂臣ꢁ臣辁胣鶁臣閁苣ꮁ뫥蒁藦颧臣誁臣ꚁ胣覤鯦銂諥袁뻥讂臣蚐꟨馁臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㌹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰㤰㔹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠〰㤹㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰〰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰〰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰〰㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㌰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㐰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㔰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰〰㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㜰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰〰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㤰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱〱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㄰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㄰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㐱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㄰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㘱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㄰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㄰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㄰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㌲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㔲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㈰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㘳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㠳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㌰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱〴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㐰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㈴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㐰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㐴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㐰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㘴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㐰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㠴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㐰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱〵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㔰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㔰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㔰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㘵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㔰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㔰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱〶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㘰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㈶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㘰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㐶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㘰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㘶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㘰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㠶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㘰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱〷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㜰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㈷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㜰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㐷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㜰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㘷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼裢閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㜰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㜰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㜰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㜸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㠰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱㤸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼裢醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㠶ㄸㄸ⸳楴≦〾〰㠶ㄸㄸ⸳楴쉦゠㄰㤰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯銈볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㠸㠱㌱琮晩㸢〰㘰㠸㠱㌱琮晩ꃂ〰〱ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣超裥ꢡ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽⼮〰㘰㠸㠱㌱〯〰㠶ㄸㄸ〳〰〰⼱〰㘰㠸㠱㌱〰〰㄰愮灰㸢〰㘰㠸㠱㌱〰〰㄰愮灰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ⼼潢祤ਾ⼼瑨汭ਾ