(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患；プリオン病；脊髄小脳変性症；脊髄性筋萎縮症；認知症、例えば、レビー小体、脳血管性及び前頭側頭型認知症；原発性進行性失語；軽度認知障害；ＨＩＶ関連認知障害；及び大脳皮質基底核変性症；からなる群から選択される神経変性障害の治療または予防方法に使用するための、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物。
【請求項２】
組成物が、パーキンソン病の治療または予防方法に使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、早期発症型の神経変性疾患の治療または予防方法に使用するためのものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、神経変性障害の発症または進行の予防または遅延方法に使用するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
脳損傷の治療方法に使用するための、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物。
【請求項６】
脳損傷が、脳卒中、例えば、脳虚血、限局性脳虚血、虚血性脳卒中または出血性脳卒中である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
細菌株が、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
細菌株が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
細菌株が、配列番号９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有するか、または配列番号９によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が、パーキンソン病の治療または予防方法に使用するための、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の細菌株を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、経口投与用である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
細菌株が、凍結乾燥されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
食品である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患；プリオン病；脊髄小脳変性症；脊髄性筋萎縮症；認知症、例えば、レビー小体、脳血管性及び前頭側頭型認知症；原発性進行性失語；軽度認知障害；ＨＩＶ関連認知障害；及び大脳皮質基底核変性症；からなる群から選択される神経変性障害の治療剤または予防剤。
【請求項１６】
細菌株が、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物
【請求項１７】
細菌株が、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株である、請求項１５記載の治療剤または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の消化管から単離された細菌株を含む組成物、及び疾患の治療におけるそのような組成物の使用の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管は、子宮内で無菌と考えられているが、出生後直ぐに非常に多様な母体及び環境微生物に曝される。その後、微生物の定着及び連鎖の動的期間があるが、この定着及び連鎖は、分娩様式、環境、食事、及び宿主の遺伝子型などの因子により影響を受け、それらの因子は全て、特に幼少期において、腸内微生物叢の組成に影響を与える。その後、微生物叢は安定し、成体様になる［１］。ヒト腸内微生物叢は、５００〜１０００を超える様々な系統型を含んでおり、この系統型は本質的に２つの主要な細菌分類、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する［２］。細菌のヒト腸への定着から生じる共生関係が成功することにより、多種多様な代謝的、構造的、保護的、及び他の有益な機能がもたらされる。定着された腸の増強された代謝活性により、本来なら難消化性の食事成分が、副産物の放出と共に確実に分解され、重要な栄養源が宿主に与えられる。同様に、腸内微生物叢が免疫学的に重要であることも十分に認識されており、例えば、共生細菌株の導入後に機能的に再構成される免疫系に障害がある無菌動物において示されている［３〜５］。
【０００３】
微生物叢組成物の劇的な変化が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸障害において記録されてきた。例えば、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａ細菌のレベルは、ＩＢＤ患者において低減しているが、Ｅ．ｃｏｌｉの数は増加しており、腸内の共生生物と病原性共生生物とのバランスがシフトしていることが示唆される［６〜９］。
【０００４】
ある特定の細菌株が動物の腸に与え得る潜在的な肯定的効果の認識において、様々な株が、様々な疾患の治療での使用のために提案されている（例えば、［１０〜１３］を参照されたい）。さらに、ある特定の株、例えば、ほとんどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、腸管と直接関連しない様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療に使用することが提案されている（［１４］及び［１５］の総説を参照されたい）。しかしながら、異なる疾患と異なる細菌株との間の関係、特定の細菌株が腸及び全身レベル並びに何らかの特定の種類の疾患へ与える正確な効果は、特に、神経変性障害において、十分に特徴付けられていない。
【０００５】
近年、ヒト脳の疾患において病態生理学的な役割を果たし得る腸内微生物叢の変更に関する関心が、当該技術分野において増加している［１６］。前臨床及び臨床エビデンスは、脳の発達と微生物叢との間の関連を強く示唆している［１７］。複数の神経分泌及び内分泌シグナル伝達系を伴う、脳と腸内微生物叢との間の双方向通信を実証する前臨床文献が相次いでいる。実際、微生物叢におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種のレベルの増加は、脳障害に関連しており［１８］、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門とＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門の不均衡は、脳の発達障害にも関与していた［１９］。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属のもの、及びＡｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅファミリーのものを含む、腸内共生生物のレベルの変化が、免疫介在性中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関与するという提案は、患者と健康な対象との間の微生物の変更の欠如を示唆する研究によって疑問視されている［１０］。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓは、喘息、関節リウマチ及び多発性硬化症を含む、様々な障害の治療に提案されている［２０］。
【０００６】
喘息及び関節リウマチのように、多発性硬化症は、免疫系によって主に媒介される。免疫系は、中枢神経系における有髄軸索を攻撃し、プラークまたは病変と呼ばれる、ミエリンを破壊する。脱髄は、特に、視神経、脊髄下脊髄、脳幹、小脳、及び傍皮質及び脳室周囲白質領域で発生する。
【０００７】
したがって、多発性硬化症は、他の神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病または認知症とは異なる病理学を有する。例えば、多発性硬化症は、２０代または３０代の患者で一般的に診断される一方、多くの他の神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病及び認知症は、６５歳以上の患者で主に診断される。
【０００８】
パーキンソン病は、多くの神経変性疾患のように、誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積によって主に媒介される。パーキンソン病は、ニューロン体の細胞質内のレビー小体中に不溶性繊維として凝集する、ａ−シヌクレインの蓄積を伴うシヌクレイノ病理学である。ａ−シヌクレインの蓄積は、毒性であり、ミトコンドリア、リソソーム、及び小胞体の機能を損傷し、微小管輸送を干渉する。
【０００９】
イブプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、様々な神経学的疾患の治療におけるそれらの有効性について試験されているが、パーキンソン病のような神経変性疾患に対するＮＳＡＩＤの臨床的影響は、不明なままである。いくつかの研究は、慢性的なＮＳＡＩＤ使用が、パーキンソン病に対して保護的であることを示した一方、他の研究は、有意な関係の存在を確認できなかった。最近のメタ分析は、非アスピリンＮＳＡＩＤ、特に、イブプロフェンの使用が、ＰＤのリスクを１５％まで低下させた一方、アスピリンの使用が、いずれの効果を示さなかったことを示唆した［２１］。
【００１０】
現在のところ、微生物叢とヒト脳疾患との関連の実用的な効果は、十分に特徴付けられていない。したがって、神経変性障害に対する微生物叢の変更の治療的効果を同定するためのより直接的な分析的研究が必要とされている。
【００１１】
神経変性障害を治療する新しい方法が、当該技術分野において必要とされている。さらに、腸内細菌を使用した新しい治療を開発できるような腸内細菌の潜在的効果を特徴付けることが必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、神経変性障害を治療して予防する新しい治療法を開発した。本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属由来の細菌株が、神経変性疾患の治療に有効であり得ることを確認した。実施例に記載されるように、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む組成物の投与は、活性酸素種に対して防御し、炎症を予防することで、神経保護物質として作用することができる。また、本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓによる治療が、ＬＰＳ及び変異体α−シヌクレインＡ５３Ｔによる、炎症性分子、例えば、ＮＦκＢ及びＩＬ−６の活性化を低下させることができることを確認した。本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓによる治療が、ヒストン脱アセチル化活性及び脂質過酸化をインビトロで減少することができ、細胞死及びアポトーシスの減少に役立つことができることを確認した。また、本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓが、インドールを産生することができ、炎症及び酸化ストレスを軽減することができることを確認した。また、本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓによる治療が、キヌレニンレベルを増加させることができることを実証した。
【００１３】
また、本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓによる治療が、ＢＤＮＦの活性化を増加させることを見出した。ＢＤＮＦは、ニューロン分化及び生存を増強することを示している神経栄養成長因子である。従って、本発明の組成物は、神経変性疾患の治療または防止において、ニューロン生存を増強する方法において使用することができる。
【００１４】
第１の実施形態では、本発明は、神経変性障害の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む、組成物を提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明は、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；多発性硬化症；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患；プリオン病；脊髄小脳変性症；脊髄性筋萎縮症；認知症、例えば、レビー小体、脳血管性及び前頭側頭型認知症；原発性進行性失語；軽度認知障害；ＨＩＶ関連認知障害、及び大脳皮質基底核変性症からなる群から選択される疾患または状態の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む、組成物を提供する。
【００１６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病、例えば、環境性、家族性または全身の炎症状態に関連するパーキンソン病の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む、組成物を提供する。本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ株による治療が、環境性及び家族性パーキンソンのインビトロモデルにおいて、ＬＰＳ及び変異体α−シヌクレインＡ５３Ｔによる炎症性分子、例えば、ＮＦκＢ及びＩＬ−６の活性化を低下させることができることを確認した。好ましい実施形態では、本発明は、パーキンソン病の治療に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の細菌株を含む、組成物を提供する。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを用いる組成物は、パーキンソン病の治療に特に有効であり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、早期発症型の神経変性疾患の治療または予防方法に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害の発症または進行の予防または遅延方法に使用される。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、組成物中の細菌株は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓである。近縁株、例えば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓの細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を使用してもよい。細菌株は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有するのが好ましい。配列同一性は、配列番号９に対してであるのが好ましい。本発明において使用される細菌株は、配列番号９によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有するのが好ましい。
【００１９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与用である。本発明の株の経口投与は、神経変性障害に有効であり得る。また、経口投与は、患者及び医療専門家に対して便利であり、腸管に送達及び／または部分または全体的に定着することができる。
【００２０】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、凍結乾燥されている細菌株を含む。凍結乾燥は、細菌を送達することができる安定した組成物を調製するために有効かつ便利な技術である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、本発明は、上述のような組成物を含む食品を提供する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、本発明は、上述のような組成物を含むワクチン組成物を提供する。
【００２４】
加えて、本発明は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物を投与することを含む、神経変性障害の治療または予防方法を提供する。
【００２５】
本発明のある特定の実施形態では、組成物は、脳損傷の治療に使用される。本発明の組成物の神経保護活性、及びヒストン脱アセチル化酵素活性（ＨＤＡＣ）のレベルを低下させる能力により、脳損傷の治療に有用にさせ得る。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、脳卒中の治療、例えば、脳卒中がもたらす脳損傷の治療に使用される。
すなわち本発明は以下に関する。
〔１〕神経変性障害の治療または予防方法に使用するための、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物。
〔２〕組成物が、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；多発性硬化症；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患；プリオン病；脊髄小脳変性症；脊髄性筋萎縮症；認知症、例えば、レビー小体、脳血管性及び前頭側頭型認知症；原発性進行性失語；軽度認知障害；ＨＩＶ関連認知障害；及び大脳皮質基底核変性症；からなる群から選択される疾患または状態の治療もしくは予防方法に使用するためのものである、上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕組成物が、パーキンソン病の治療または予防方法に使用するためのものである、上記〔２〕に記載の組成物。
〔４〕組成物が、早期発症型の神経変性疾患の治療または予防方法に使用するためのものである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔５〕組成物が、ニューロン死の低減またはニューロンの保護に使用するためのものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔６〕組成物が、神経変性障害の発症または進行の予防または遅延方法に使用するためのものである、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔７〕組成物が、神経変性障害の治療または予防において、ＩＬ−６レベル及び／またはＮＦκＢレベルの低減方法に使用するためのものである、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔８〕脳損傷の治療方法に使用するための、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物。
〔９〕脳損傷が、脳卒中、例えば、脳虚血、限局性脳虚血、虚血性脳卒中または出血性脳卒中である、上記〔８〕に記載の組成物。
〔１０〕細菌株が、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓである、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１１〕細菌株が、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓの細菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である前記１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１２〕細菌株が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１３〕細菌株が、
配列番号９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有するか、または
配列番号９によって表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、
上記〔１２〕に記載の組成物。
〔１４〕組成物が、パーキンソン病の治療または予防方法に使用するための、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の細菌株を含む、上記〔１〕に記載の組成物。
〔１５〕組成物が、経口投与用である、上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１６〕組成物が、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体を含む、上記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１７〕細菌株が、凍結乾燥されている、上記〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔１８〕上記〔１〕〜〔９〕及び〔１４〕のいずれか１項の使用のための、上記〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の組成物を含む食品。
〔１９〕上記〔１〕〜〔９〕及び〔１４〕のいずれか１項の使用のための、上記〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の組成物を含むワクチン。
〔２０〕Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、神経変性障害の治療または予防方法。
〔２１〕神経変性障害の治療または予防に使用するための、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株またはその派生物の細胞。
〔２２〕細胞が、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項で定義される方法に使用するためのものである、上記〔２１〕に記載の細胞。
〔２３〕神経変性障害が、パーキンソン病である、上記〔２１〕に記載の細胞。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】神経芽腫細胞の細胞生存率
【図２】Ａ：ＩＬ−６分泌の下方制御；Ｂ：ＩＬ−８分泌の下方制御
【図３Ａ】α−シヌクレイン誘発ＩＬ−６
【図３Ｂ】ＩＬ−８分泌の阻害
【図４】α−シヌクレイン誘発ＮＦκＢプロモーター活性化の阻害
【図５】ＬＰＳ誘発ＮＦκＢプロモーター活性化の阻害
【図６】抗酸化能力の変化
【図７】総抗酸化能力（脂質酸化）の変化
【図８】ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性の変化
【図９】インドール産生レベル
【図１０】キヌレニン産生レベル
【図１１】神経保護−細胞生存率。図１１と同じデータを示す。
【図１２】代謝産物の産生レベル−脳における神経伝達物質
【図１３】代謝産物の産生レベル−上清における有機酸
【図１４Ａ】腸管バリア機能に対する効果
【図１４Ｂ】腸管バリア機能に対する効果
【図１４Ｃ】腸管バリア機能に対する効果
【図１４Ｄ】腸管バリア機能に対する効果
【図１４Ｅ】腸管バリア機能に対する効果
【図１４Ｆ】腸管バリア機能に対する効果
【図１５】ＢＤＮＦ産生レベル
【図１６】（Ａ）Ｕ３７３細胞におけるＲＯＳレベルの変化、（Ｂ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＲＯＳレベルの変化
【図１７】脳における神経伝達物質の産生
【図１８】海馬受容体発現の変化−Ａ）オキシトシン受容体、Ｂ）バソプレシン受容体、Ｃ）グルココルチコイド受容体、及びＤ）ミネラルコルチコイド受容体
【図１９】Ａ）副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、Ｂ）ＢＤＮＦ発現及びＣ）ＴＬＲ４の海馬発現の変化
【図２０】Ａ）海馬副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体１（ＣＲＦＲ１）発現及びＢ）副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２（ＣＲＦＲ２）発現の変化
【図２１】Ａ）腫瘍壊死因子、Ｂ）インターロイキン１ｂ、及びＣ）ＩＬ−６の海馬発現の変化
【図２２】Ａ）海馬インテグリンアルファＭ（ＣＤ１１ｂ）発現の変化、及びＢ）海馬セロトニン１Ａ受容体（５−ＨＴ１Ａ受容体）発現の変化
【図２３】Ａ）海馬イオンチャネル型グルタミン酸受容体ＮＭＤＡ型サブユニット２Ａ（Ｇｒｉｎ２Ａ）及びＢ）イオンチャネル型グルタミン酸受容体ＮＭＤＡ型サブユニット２Ｂ（Ｇｒｉｎ２Ｂ）発現の変化
【図２４】Ａ）ガンマアミノ酪酸Ａ受容体２（ＧＡＢＡ  Ａ２）、Ｂ）ガンマアミノ酪酸Ｂ受容体１（ＧＡＢＡ  ＢＲ１）及びＣ）ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）の海馬発現の変化
【図２５】扁桃体受容体発現の変化−Ａ）オキシトシン受容体、Ｂ）バソプレシン受容体、Ｃ）グルココルチコイド受容体及びＤ）ミネラルコルチコイド受容体
【図２６】Ａ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、Ｂ）Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）、Ｃ）副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体１（ＣＲＦＲ１）、及びＤ）副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２（ＣＲＦＲ２）の扁桃体発現の変化
【図２７】Ａ）インテグリンアルファＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｂ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）、Ｃ）イオンチャネル型グルタミン酸受容体ＮＭＤＡ型サブユニット２Ａ（Ｇｒｉｎ２Ａ）、及びＤ）イオンチャネル型グルタミン酸受容体ＮＭＤＡ型サブユニット２Ｂ（Ｇｒｉｎ２Ｂ）の扁桃体発現の変化
【図２８】Ａ）ＧＡＢＡ−Ａ受容体アルファ２サブユニット（ＧＡＢＲＡ２）、Ｂ）ＧＡＢＡ−Ａ型Ｂ受容体１サブユニット（ＧＡＢＢＲ１）及びＣ）ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）の扁桃体発現の変化
【図２９】Ａ）オキシトシン受容体、Ｂ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、Ｃ）ミネラルコルチコイド受容体、及びＤ）グルココルチコイド受容体の前頭前皮質発現の変化
【図３０】Ａ）Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）、Ｂ）副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体１（ＣＲＦＲ１）、Ｃ）副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２（ＣＲＦＲ２）及びＤ）インテグリンアルファＭ（ＣＤ１１ｂ）の前頭前皮質発現の変化
【図３１】Ａ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）、Ｂ）イオンチャネル型グルタミン酸受容体ＮＭＤＡ型サブユニット２Ａ（Ｇｒｉｎ２Ａ）、Ｃ）イオンチャネル型グルタミン酸受容体ＮＭＤＡ型サブユニット２Ｂ（Ｇｒｉｎ２Ｂ）及びＤ）ＧＡＢＡ−Ａ受容体アルファ２サブユニット（ＧＡＢＲＡ２）の前頭前皮質発現の変化
【図３２】Ａ）ＧＡＢＡ−Ａ受容体Ｂ型受容体サブユニット１（ＧＡＢＢＲ１）及びＢ）ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）の前頭前皮質発現の変化
【図３３】Ａ）トリプトファンヒドロキシラーゼ−１（Ｔｐｈ１）及びＢ）インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ１）の結腸発現の変化
【図３４】Ａ）トリプトファンヒドロキシラーゼ−１（Ｔｐｈ１）及びＢ）インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ１）の回腸発現の変化
【図３５】循環トリプトファン代謝産物レベルの変化−Ａ）キヌレニン、Ｂ）トリプトファン及びＣ）代謝のキヌレニン／トリプトファン指数
【図３６】ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９を給餌したマウス由来のマウス脾細胞からのインターフェロン−γ産生に対する効果
【図３７】脾細胞からのインターロイキン−１β産生に対する効果
【図３８】脾細胞からのインターロイキン−６産生に対する効果
【図３９】脾細胞からの腫瘍壊死因子産生に対する効果
【図４０】脾細胞からのインターロイキン−１０産生に対する効果
【図４１】脾細胞からの化学誘引物質ＣＸＣＬ１産生に対する効果
【図４２】盲腸の短鎖脂肪酸レベルの変化
【図４３】ＭＲｘ００２９及びＭＲＸ００５が誘発する、アクチン、バリン、オクルディンＴＪＰ１、ＴＪＰ２、ＭＡＰ２、ＤＲＤ２、ＧＡＢＲＢ３、ＳＹＰ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７及びＮＳＥの遺伝子発現レベルの変化。
【図４４】ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９によって誘発されたＳＨＳＹ５Ｙ細胞分化。（Ａ〜Ｃ）ファロイジン及びＭＡＰ２による免疫標識細胞の代表的な画像。（Ｄ〜Ｆ）ＤＡＰＩ画像と合体したＡ〜Ｃの画像。（Ｇ〜Ｉ）β３チューブリン免疫標識細胞。（Ｊ〜Ｌ）ＤＡＰＩ画像と合体。倍率×６３０（Ｊ〜Ｋ）。ＳＨＳＹ５Ｙ細胞に対するＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９治療の効果のウェスタンブロット分析。ウェスタンブロット膜は、ＭＡＰ２（Ｍ）及びｂ３チューブリン（Ｎ）に対する抗体でプローブした。アクチンは、ローディング・コントロールとして使用した。下パネル：６つの別個の実験のうちの１つからの代表的なブロット；上パネル：相対デンシトメトリー強度。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
細菌株
本発明の組成物は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む。実施例は、この属の細菌が、神経変性障害の治療または予防に有用であることを示している。好ましい細菌株は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種のものである。
【００２８】
本発明において使用されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種の例としては、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉが挙げられる。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓと似ており、グラム陰性、偏性嫌気性、非胞子形成、非運動性及び棒状で、０．８〜１．６×１．２〜１２μｍの大きさである。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓは、ヒト糞便中で最も一般的な種の１つである。Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓの基準株は、ＪＣＭ  ５８２５Ｔ（＝ＣＣＵＧ  ４９４１Ｔ＝ＤＳＭ  ２０７０１Ｔ＝ＡＴＣＣ  ８５０３Ｔ）である。Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株ＪＣＭ  ５８２５Ｔ、ＪＣＭ  １３４００、ＪＣＭ  １３４０１、ＪＣＭ  １３４０２、ＪＣＭ  １３４０３及びＪＣＭ  １３４０４、及びＰ．ｍｅｒｄａｅ株ＪＣＭ  ９４９７Ｔ及びＪＣＭ  １３４０５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対するＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ受託番号は、それぞれ、ＡＢ２３８９２２〜ＡＢ２３８９２９、（配列番号１〜８と本明細書で開示される）である。例示の株は、［２２］にも記載されている。
【００２９】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ細菌は、実施例で試験し、株７５５またはＭＲｘ０００５とも本明細書で呼ばれる。試験した７５５株に対する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、配列番号９で提供される。株７５５は、「Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ  ７５５」として、２０１５年３月１２日にＧＴ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｏｒｎｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）によって、国際寄託当局ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２が割り当てられた。ＧＴ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄ．は、その後、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄへとその名称を変えた。
【００３０】
ＷＯ２０１６／２０３２２０は、マウスへの株７５５の投与を記載し、腸の外側の疾患プロセス（例えば、喘息及び関節炎）に影響を及ぼし得ることを示す。株７５５は、本明細書に記載されている神経変性障害の治療において、腸の外側の疾患プロセスにも影響を及ぼす。
【００３１】
株７５５のゲノム配列は、配列番号１０で提供される。この配列は、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩプラットフォームを用いて生成した。
【００３２】
実施例で試験した株に近縁する細菌株はまた、神経変性疾患及び状態の治療または予防に有効であると期待される。ある特定の実施形態では、本発明において使用される細菌株は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓの細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。本発明において使用される細菌株は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有するのが好ましい。配列同一性は、配列番号９に対してであるのが好ましい。本発明において使用される細菌株は、配列番号９によって表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有するのが好ましい。
【００３３】
受託番号４２３８２として寄託された細菌のバイオタイプである細菌株はまた、神経変性障害の治療または予防に有効であると期待される。バイオタイプは、同じかまたは非常に類似の生理学的及び生化学的特性を有する近縁株である。
【００３４】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌のバイオタイプであり、かつ、本発明での使用に適している株は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌に対する他のヌクレオチド配列をシーケンシングすることで同定され得る。例えば、実質的に全ゲノムは、配列決定され得、及び本発明において使用されるバイオタイプ株は、その全ゲノムの少なくとも８０％にわたって（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％にわたって、またはその全ゲノムにわたって）少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有し得る。バイオタイプ株の同定に使用される他の適切な配列は、ｈｓｐ６０または反復配列、例えば、ＢＯＸ、ＥＲＩＣ、（ＧＴＧ）５、またはＲＥＰを含んでいてよい［２３］。バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌の対応する配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し得る。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本発明において使用される細菌株は、配列番号１０に対する配列同一性を持つゲノムを有する。好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌株は、配列番号１０の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）にわたって、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性）を持つゲノムを有する。例えば、本発明において使用される細菌株は、配列番号１０の７０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号１０の８０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号１０の９０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号１０の１００％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号１０の７０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号１０の８０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号１０の９０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号１０の１００％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号１０の７０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０の８０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０の９０％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０の１００％にわたって、配列番号１０に対して少なくとも９８％の配列同一性を持つゲノムを有し得る。
【００３６】
あるいは、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌のバイオタイプであり、本発明での使用に適している株は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２の寄託及び制限断片分析及び／またはＰＣＲ分析を用いて、例えば、蛍光増幅断片長多型（ＦＡＦＬＰ）及び反復ＤＮＡエレメント（ｒｅｐ）−ＰＣＲフィンガープリンティング、またはタンパク質プロファイリング、または部分的１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングを用いて同定され得る。好ましい実施形態では、かかる技術を使用して、他のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株を同定してもよい。
【００３７】
ある特定の実施形態では、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌のバイオタイプであり、本発明での使用に適している株は、増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）によって分析した場合、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ制限酵素を使用した場合、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌と同じパターンを提供する株である（例示の方法及びガイダンスについて、例えば、［２４］を参照されたい）。あるいは、バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌と同じ炭水化物発酵パターンを有する株として同定される。
【００３８】
本発明の組成物及び方法に有用である他のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ株、例えば、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌のバイオタイプは、任意の適切な方法または戦略、例えば、実施例に記載のアッセイを用いて同定され得る。例えば、本発明において使用される株は、神経芽腫細胞で培養した後、サイトカインレベル、及び神経保護または神経増殖レベルを評価することで同定され得る。特に、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された細菌に対して同様の増殖パターン、代謝型及び／または表面抗原を有する細菌株は、本発明で有用であり得る。有用な株は、ＮＣＩＭＢ  ４２３８２株と同等の免疫調節活性を有する。特に、バイオタイプ株は、実施例に示す効果に対して、神経変性疾患モデルに対する同等の効果、サイトカインレベルに対する同等の効果を引き出し、実施例に記載される培養及び投与プロトコルを用いて同定され得る。
【００３９】
特に好ましい本発明の株は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株である。これは、実施例で試験した例示の７５５株であり、疾患の治療に有効であることを示す。従って、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株またはその派生物（derivative）の細胞、例えば、単離細胞、を提供する。また、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株またはその派生物の細胞を含む組成物を提供する。また、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株の生物学的に純粋な培養物を提供する。また、本発明は、特に、本明細書に記載されている疾患の治療に使用される、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株またはその派生物の細胞を提供する。
【００４０】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された株の派生物は、娘株（後代）、またはオリジナル株から培養（サブクローン）された株であり得る。本発明の株の派生物は、生物活性を除去することなく、例えば、遺伝子レベルで修飾してもよい。特に、本発明の株の派生物は、治療的に活性である。派生株は、元のＮＣＩＭＢ  ４２３８２株と同等の免疫調節活性を有する。特に、派生株は、実施例に示す効果に対して、神経変性疾患モデルに対する同等の効果、サイトカインレベルに対する同等の効果を引き出し、実施例に記載される培養及び投与プロトコルを用いて同定され得る。ＮＣＩＭＢ  ４２３８２株の派生物は、概して、ＮＣＩＭＢ  ４２３８２株のバイオタイプである。
【００４１】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株の細胞への言及は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託された株と同じ安全性及び治療効果特性を有する任意の細胞を包含し、かかる細胞は、本発明に包含される。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、生きており、腸に部分的または全体的に定着することができる。
【００４３】
本発明者らは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株が、ＩＬ−６及びＩＬ−８などの炎症性サイトカインの分泌を減少させることを見出した。ＩＬ−８は、髄鞘形成に関与していた。ＩＬ−６によって誘発された慢性炎症は、細胞死を最終的にもたらし得る。従って、本発明の細菌株は、神経変性障害の治療または予防において特に有用である。いくつかの実施形態では、細菌種は、ＩＬ−６の活性化の増強によって特徴付けられた状態の治療において有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脱髄によって特徴付けられた神経変性疾患の治療または予防に使用される。多くの神経変性疾患は、脱髄によって特徴付けられる。脱髄は、ニューロン内の活動電位の伝播を妨げ、神経系内の有効な伝達を損なう。ＩＬ−８は、髄鞘形成及び修復に積極的に寄与することが示されている。ＭＲｘ００２９は、ＩＬ−８の分泌自体を増加させる。従って、本発明の組成物は、脱髄によって特徴付けられた神経変性障害の治療または予防において特に有益である。
【００４４】
また、本発明者らは、本発明の細菌株が、ＢＤＮＦの活性化を増加させることを見出した。ＢＤＮＦは、ニューロン分化及び生存を増強することを示している神経栄養成長因子である。従って、本発明の組成物は、神経変性疾患の治療または防止において、ニューロン生存を増強する方法において使用することができる。
【００４５】
本発明の組成物で使用されてよいさらなる細菌は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ種である。実施例は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ及びＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓの両方が、神経保護活動を有するが、異なる代謝産物を産生し、異なる作用機序及び特定の神経保護活動を有し得ることを示している。従って、これらの種は、併用する場合に、特に有効であり得る。好ましい実施形態では、組成物は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の株及びＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ種の株を含む。
【００４６】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２として寄託されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ細菌は、実施例で試験し、株ＭＲｘ０００５とも本明細書で呼ばれる。ＭＲＸ０００５、ＭＲＸ００５、ＭＲｘ００５及びＭＲｘ０００５は、本明細書で交換可能に使用される。試験したＭＲｘ０００５株に対する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、配列番号９で提供される。株ＭＲｘ０００５は、「Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ  ７５５」として、２０１５年３月１２日にＧＴ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｏｒｎｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）によって、国際寄託当局ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２が割り当てられた。ＧＴ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄ．は、その後、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄへとその名称を変えた。
【００４７】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７として寄託されたＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株は、実施例で試験し、疾患の治療に有効であることを示した例示のＭＲｘ００２９株である。株ＮＣＩＭＢ  ４２７８７は、「Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＭＲｘ００２９」として、２０１７年７月１３日に４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｏｒｎｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）によって、国際寄託当局ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７が割り当てられた。従って、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７として寄託されたＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株またはその派生物の細胞、例えば、単離細胞を提供する。また、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７として寄託されたＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株の細胞またはその派生物を含む組成物を提供する。また、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７として寄託されたＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株の生物学的に純粋な培養物を提供する。また、本発明は、特に、本明細書に記載されている疾患の治療に使用される、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７として寄託されたＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株またはその派生物の細胞を提供する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、好ましくは、治療に使用される、好ましくは、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病の治療に使用される、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２７８７としてＮＣＩＭＢに寄託された株またはその派生物もしくはバイオタイプ、及び受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２３８２としてＮＣＩＭＢに寄託された株またはその派生物もしくはバイオタイプを含む組成物を提供する。
【００４９】
治療用途
実施例に示すように、本発明の細菌組成物は、神経変性障害の治療に有効である。特に、本発明の組成物による治療は、神経増殖を増加させて、ドーパミン作動性ニューロンを破壊する作用物質に対する神経保護物質として作用する。従って、本発明の組成物は、ニューロン死の結果である神経変性障害の治療または予防に有用であり得る。
【００５０】
本発明の組成物は、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−１８、ＴＮＦα及びＩＬ−６を活性化させる、ＮＦκＢプロモーターの活性化を減少させることができる。細胞を変異体α−シヌクレインで治療することは、家族性パーキンソンに対するモデルである。アデニンからトレオニンへの５３位での点突然変異は、α−シヌクレインミスフォールディングをもたらす。その後、誤って折り畳まれたα−シヌクレインは、不溶性繊維に凝集して、レビー小体を形成する。従って、本発明の組成物は、神経炎症、タンパク質ミスフォールディング及び／または環境暴露の結果である神経変性障害の治療または予防に有用であり得る。本発明の組成物は、家族性パーキンソンの治療に使用することができる。ＮＦκＢプロモーターの活性化は、ＴＬＲ４リガンドを介して媒介される。ＴＬ４は、マウスモデルＭＰＴＰにおいて細胞死を媒介することが知られ、パーキンソン病を模擬する。本発明の組成物を使用して、ＴＬＲ４シグナル伝達がＮＦκＢプロモーターを活性化する能力を阻害することができる。ＰＤに対して特に関連のあるもので、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４の両方は、ＰＤ患者の脳で上方制御されることが分かった［２５］。さらに、α−ｓｙｎは、ＴＬＲ２のリガンドとして記載されており［２６］、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞を用いて、α−ｓｙｎがＴＬＲ４のリガンドでもあることを実証した。
【００５１】
本発明の組成物は、リポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発することができる、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−６の分泌を減少させる。ＬＰＳによる細胞の処理は、環境因子に起因するパーキンソン病を模擬する。本発明の組成物を使用して、ＩＬ−６分泌を減少させることができる。本発明の組成物は、環境性パーキンソン病の治療に使用することができる。
【００５２】
ケモカインは、白血球の方向性移動というそれらの主な役割に加えて、中枢神経系（ＣＮＳ）において重要な機能を有すると想定されている。ネズミ希突起膠細胞前駆体様細胞株において、ケモカインＭＣＰ−１は、希突起膠細胞前駆体増殖を増加させなかった。一次有髄培養では、ＭＣＰ−１は、この系において、ミエリンセグメント形成を増強しなかった。本発明者らは、ＭＲｘ０００５が、ＭＣＰ−１レベルを促進することを見出した。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、疾患の治療において、ＭＣＰ−１レベルの増加に使用される。
【００５３】
本発明の組成物によって治療される神経変性疾患の例としては、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；多発性硬化症；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患；プリオン病；脊髄小脳変性症；脊髄性筋萎縮症；認知症、例えば、レビー小体、脳血管性及び前頭側頭型認知症；原発性進行性失語；軽度認知障害；ＨＩＶ関連認知障害、、及び大脳皮質基底核変性症が挙げられる。本発明の組成物によって治療されるさらなる神経変性疾患は、進行性炎症性ニューロパチーである。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、高齢患者で発症する神経変性障害の治療に有効であり得る。実施例は、本発明の組成物が、６５歳以上の患者で圧倒的に診断されるパーキンソン病を治療することができることを示す。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、６５歳以上の患者を治療するものである。他のある特定の実施形態では、患者は、４０〜６５歳である。他の実施形態では、患者は、４０歳を超える。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、老齢に関連する疾患、例えば、５０歳後に診断された疾患の治療に使用される。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、タンパク質、特に、誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積によって媒介または特徴付けられる神経変性障害の治療に使用される。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、灰白質のニューロン損失に関連する神経変性障害の治療に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、白質病変に関連しない神経変性障害を治療するものである。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、永続的症状に関連する神経変性障害の治療に使用される。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、自己免疫障害でない神経変性障害の治療に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、多発性硬化症でない神経変性障害の治療に使用される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、特に、神経変性障害の治療において、ニューロン死の低減に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、特に、神経変性障害の治療において、ニューロンの保護に使用される。
【００６０】
本発明の組成物の神経保護特性は、実施例に示すように、組成物が、神経変性障害の発症または進行の予防または遅延に特に有効であり得ることを意味する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害の発症または進行の遅延に使用される。
【００６１】
本発明の組成物は、ＩＬ−８の分泌を増加させることができる。ＩＬ−８は、ニューロンの髄鞘化に役割を果たすことが示されている。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を使用して、ＩＬ−８分泌を増加させることができる。
【００６２】
本発明の治療用組成物は、ＢＤＮＦの活性化を増加させることができる。ＢＤＮＦは、中枢神経系のある特定のニューロン上で作用して、既存のニューロンの生存を支え、新しいニューロン及びシナプスの増殖及び発達に役立つ。ＢＤＮＦは、海馬、皮質及び前脳基底核で活性であり、長期記憶において重要である。従って、本発明の組成物を使用して、ＢＤＮＦの分泌を増加させることができる。従って、組成物は、長期記憶の障害に関連する神経変性疾患の治療に使用されてよい。本発明の組成物は、長期記憶の改善、特に、神経変性疾患によって損傷している長期記憶の改善のために使用されてよい。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経細胞中のミトコンドリア代謝活性を増加させる。
【００６４】
微生物叢−腸−脳軸の調節
腸と脳の間の通信（微生物叢−腸−脳軸）は、双方向神経液性通信システムを介して生じる。腸に住む微生物叢が、脳の発達を調節し、微生物叢−腸−脳軸を介して行動表現型を産生できることが最近のエビデンスにより示されている。実際、多くの論評が、中枢神経系機能性の維持における微生物叢−腸−脳軸の役割を示唆し、中枢神経系障害及び状態の発症における微生物叢−腸−脳軸の機能不全を含意する［１６〜２７］。
【００６５】
脳と腸の間の双方向通信（すなわち、腸−脳軸）は、中枢神経系、神経内分泌及び神経免疫系、例えば、視床下部−下垂体−副腎皮質（ＨＰＡ）軸、自律神経系（ＡＮＳ）の交感神経及び副交感神経アーム、例えば、腸管神経系（ＥＮＳ）及び迷走神経、及び腸内微生物叢を含む。
【００６６】
実施例に示すように、本発明の組成物は、微生物叢−腸−脳軸を調節し、神経変性障害に関連する細胞死を減少させることができる。したがって、本発明の組成物は、神経変性障害、特に、微生物叢−腸−脳軸の機能不全に関連するこれらの障害及び状態の治療または予防に有用であり得る。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；多発性硬化症；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患；プリオン病；脊髄小脳変性症；脊髄性筋萎縮症；認知症；例えば、レビー小体；脳血管性及び前頭側頭型認知症；原発性進行性失語；軽度認知障害；ＨＩＶ関連認知障害、及び大脳皮質基底核変性症からなる群から選択される疾患または状態の治療または予防に有用であり得る。
【００６８】
本発明の組成物は、慢性疾患の治療または予防、他の治療法（例えば、レボドパ、ドーパミン作動薬、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、ＣＯＭＴ阻害剤、グルタミン酸拮抗薬、及び／または抗コリン薬による治療）に反応しなかった患者における疾患の治療または予防、及び／または微生物叢−腸−脳軸の機能不全に関連する組織の損傷及び症状の治療または予防に特に有用であり得る。
【００６９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＮＳを調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、自律神経系（ＡＮＳ）を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、腸管神経系（ＥＮＳ）を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、視床下部、下垂体、副腎皮質（ＨＰＡ）軸を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経内分泌経路を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経免疫経路を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＣＮＳ、ＡＮＳ、ＥＮＳ、ＨＰＡ軸及び／または神経内分泌及び神経免疫経路を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、対象の共生代謝産物及び／または腸透過性のレベルを調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ドーパミン作動性システムを調節するために使用されてよい。
【００７０】
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、神経系によって調節される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経系におけるシグナル伝達を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、中枢神経系のシグナル伝達を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、感覚ニューロンにおけるシグナル伝達を調節する。他の実施形態では、本発明の組成物は、運動ニューロンにおけるシグナル伝達を調節する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＡＮＳにおけるシグナル伝達を調節する。いくつかの実施形態では、ＡＮＳは、副交感神経系である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、迷走神経のシグナル伝達を調節する。他の実施形態では、ＡＮＳは、交感神経系である。他の実施形態では、本発明の組成物は、腸管神経系におけるシグナル伝達を調節する。ある特定の実施形態では、ＡＮＳ及びＥＮＳニューロンのシグナル伝達は、胃腸管の管腔内容物に直接反応する。他の実施形態では、ＡＮＳ及びＥＮＳニューロンのシグナル伝達は、管腔内細菌によって産生された神経化学物質に間接的に反応する。他の実施形態では、ＡＮＳ及びＥＮＳニューロンのシグナル伝達は、管腔内細菌または腸内分泌細胞によって産生された神経化学物質に反応する。ある特定の好ましい実施形態では、ＥＮＳのニューロンは、ＣＮＳの機能に影響を及ぼす迷走神経求心性を活性化する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、腸クロム親和性細胞の活性を調節する。
【００７１】
神経変性疾患
タウオパチーは、ヒト脳内の神経原線維またはグリア原線維のもつれにおけるタウタンパク質の病理学的凝集に関連する神経変性疾患である。アルツハイマー病は、タウ病理学の一例である。シヌクレイノパチー（α−シヌクレイノパチーとも呼ばれる）は、ニューロン、神経線維またはグリア細胞におけるα−シヌクレインの凝集の異常蓄積によって特徴付けられた神経変性疾患である。パーキンソン病は、シヌクレイノ病理学の一例である。
【００７２】
これらの２つの病理学の間には、臨床的及び病理学的な重複が存在する。パーキンソン病患者は、認知症を頻繁に有し、アルツハイマー病患者は、パーキンソニズムが現れることが多い［２８］。例えば、進行性核上性麻痺（スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群としても知られる）は、タウ病理学を有するが、際立ったパーキンソニズムももたらす［２９］。パーキンソニズムを引き起こすことで知られるＬＲＲＫ２の突然変異は、シヌクレイン、タウのどちらもないか、または両方タンパク質の蓄積に関連する［３０］。
【００７３】
レビー小体病（ＬＢＤ）は、高齢者における認知症の最も一般的な原因のうちの１つである神経変性疾患である。ＬＢＤは、タウ病理学とシヌクレイン病理学の間の連続体の存在を例示する。ＬＢＤは、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、及びアルツハイマー病と臨床的及び病理学的な特徴を共有する［２８］。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、タウオパチー及び／またはシヌクレイノパチーの治療または予防に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、タウオパチーの治療または予防に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、シヌクレイノパチーの治療または予防に有用であり得る。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズム；アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群；及び認知症；例えば、レビー小体；脳血管性及び前頭側頭型認知症からなる群から選択される疾患または状態の治療または予防に有用であり得る。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病、例えば、進行性核上性麻痺、進行性核上性麻痺、スティール・リチャードソン・オルシェフスキー症候群、正常圧水頭症、脳血管性または動脈硬化性パーキンソニズム及び薬物誘発性パーキンソニズムの治療または予防に有用であり得る。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、アルツハイマー病、例えば、ベンソン症候群。さらに好ましい実施形態では、本発明の組成物は、認知症；例えば、レビー小体；脳血管性及び前頭側頭型認知症の治療または予防に有用であり得る。
【００７６】
パーキンソン病
パーキンソン病は、神経細胞の異種集団（ドーパミン産生細胞）の変性によって神経病理学的に特徴付けられた一般的な神経変性疾患である。パーキンソン病の臨床診断には、運動緩慢、及び以下の中核症状：安静時振戦；筋硬直及び姿勢反射障害のうちの少なくとも１つを必要とする。疾患の進行中に提示または発症し得る他の兆候及び症状は、自律神経障害（唾液漏、脂漏、便秘、排尿障害、性機能、起立性低血圧、多汗症）、睡眠障害及び嗅覚または温度覚の乱れである。パーキンソン病は、微生物叢−腸−脳軸の機能不全により発症または持続し得る神経変性疾患である。従って、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、対象におけるパーキンソン病の治療または予防に使用される。
【００７７】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、パーキンソン病の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む、組成物を提供する。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物は、パーキンソン病のモデルにおける運動及び認知機能を改善し得る。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ株による治療は、中枢、自律、及び腸管神経系におけるシグナル伝達を調節し得る；ＨＰＡ軸経路の活性を調節し得る；神経内分泌及び／または神経免疫経路を調節し得る；対象の代謝産物、炎症マーカー、及び／または腸透過性のレベルを調節し得る、これらは全て、パーキンソン病の神経病理学に関与している。好ましい実施形態では、本発明は、パーキンソン病の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の細菌株を含む組成物を提供する。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを用いる組成物は、パーキンソン病の治療に特に有効であり得る。
【００７８】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、パーキンソン病の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む、組成物を提供する。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌株を含む組成物は、パーキンソン病のモデルにおける運動及び認知機能を改善し得る。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ株による治療は、中枢、自律、及び腸管神経系におけるシグナル伝達を調節し得る；ＨＰＡ軸経路の活性を調節し得る；神経内分泌及び／または神経免疫経路を調節し得る；対象の代謝産物、炎症マーカー、及び／または腸透過性透過性のレベルを調節し得るが、これらは全て、パーキンソン病の神経病理学に関与している。好ましい実施形態では、本発明は、パーキンソン病の治療または予防方法に使用される、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の細菌株を含む組成物を提供する。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを用いる組成物は、パーキンソン病の治療に特に有効であり得る。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、対象におけるパーキンソン病の症状のうちの１または２以上を予防、減少、または軽減する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、対象におけるパーキンソン病の１または２以上の中核症状を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、対象における運動緩慢を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、対象における安静時振戦；筋硬直及び／または姿勢反射障害を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、自律神経障害（唾液漏、脂漏、便秘、排尿障害、性機能、起立性低血圧、多汗症）、睡眠障害及び嗅覚または温度覚の乱れから選択される、パーキンソン病の進行に関連する１または２以上の症状を予防、減少、または軽減する。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病と共存するうつ症状を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、言語記憶及び／または遂行機能を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、注意、作動記憶、言語流暢性及び／または不安を改善する。
【００８１】
他の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病と共存する認知機能不全を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病の進行を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、後の運動合併症を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、後の運動症状の変動を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ニューロン損失を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン型認知症（ＰＤＤ）の症状を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、遂行機能、注意及び／または作動記憶の障害を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ドーパミン作動性神経伝達を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ドーパミン作動性神経伝達障害を予防、減少、または軽減する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、症状または診断尺度に従って、パーキンソン病の症状を改善する。ある特定の実施形態では、パーキンソン病における運動機能の症状の改善を評価する検査は、統一パーキンソン病評価尺度である。特に、ＵＰＤＲＳ  ＩＩは、日常生活の活動を考慮し、ＵＰＤＲＳ  ＩＩＩは、運動検査を考慮する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、症候性または診断検査及び／または尺度に従って、ＰＤＤに関連する症状を改善する。ある特定の実施形態では、検査または尺度は、ホプキンズ言語学習検査−改訂版（ＨＶＬＴ−Ｒ）；デリスカプラン実行機能システム（Ｄ−ＫＥＦＳ）色単語緩衝試験；ハミルトンうつ病評価尺度（ＨＡＭ−Ｄ  １７；うつ病）；ハミルトン不安評価尺度（ＨＡＭ−Ａ；不安）及び統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ；ＰＤ症状の重篤度）から選択される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、精神及び神経障害を評価するための臨床包括的印象−包括的改善（ＣＧＩ−Ｉ）尺度を改善する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病を有する対象の包括的、社会的、及び職業的障害に対して肯定的効果を示す。
【００８５】
アルツハイマー病及び認知症
ＤＳＭ−５では、用語「認知症」は、用語「重度神経認知障害」及び「軽度神経認知障害」と置き換えられた。神経認知障害は、異種クラスの精神疾患である。最も一般的な神経認知障害は、アルツハイマー病、続いて、脳血管性認知症、またはその２つの混合形態である。他の形態の神経変性障害（例えば、レビー小体病、前頭側頭型認知症、パーキンソン型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、及びウェルニッケ・コルサコフ症候群）は、認知症に伴う。
【００８６】
また、アルツハイマー病及び認知症は、ニューロン損失によって特徴付けられるため、本発明の組成物の実施例に示す神経保護及び神経増殖効果は、それらが、これらの状態の治療または予防に有用であり得ることを示す。
【００８７】
ＤＳＭ−５下の認知症に対する症状の基準は、学習及び記憶；言語；遂行機能；複雑性注意；知覚運動及び社会的認知から選択される１または２以上の認知領域におけるパフォーマンスの前のレベルからの著しい認知機能低下のエビデンスである。認知欠損は、日常活動の独立性に干渉しなければならない。加えて、認知欠損は、譫妄の状況の中で排他的には生じず、かつ、別の精神障害（例えば、ＭＤＤまたは統合失調症）によって良く説明されない。
【００８８】
一次症状に加えて、神経変性障害を有する対象は、動揺、攻撃性、うつ病、不安、無気力、精神病及び睡眠覚醒サイクルの乱れを含む行動及び精神症状を示す。
【００８９】
神経変性障害は、微生物叢−腸−脳軸の機能不全により発症または持続し得る。従って、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、対象における神経変性障害の治療または予防に使用される。好ましい実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病である。他の実施形態では、神経変性障害は、脳血管性認知症；混合型アルツハイマー病及び脳血管性認知症；レビー小体病；前頭側頭型認知症；パーキンソン型認知症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病；及びウェルニッケ・コルサコフ症候群から選択される。
【００９０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、対象における神経変性障害の症状のうちの１または２以上を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、対象における認知機能低下の発生を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、学習及び記憶；言語；遂行機能；複雑性注意；知覚運動及び社会的認知から選択される１または２以上の認知領域における神経変性障害を有する対象のパフォーマンスのレベルを改善する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、動揺、攻撃性、うつ病、不安、無気力、精神病及び睡眠覚醒サイクルの乱れから選択される神経変性障害に関連する１または２以上の行動及び精神症状の発生を予防、減少、または軽減する。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、前臨床段階において疑われる病原性メカニズムに介入することで、症候性疾患を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、症状進行の減速または停止による疾患緩和を改善する。いくつかの実施形態では、症状進行の減速または停止は、基になる神経病理学的プロセスを遅延するエビデンスと相関する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、強化認知及び機能改善を含む、神経変性障害の症状を改善する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、認知症（ＢＰＳＤ）の行動及び精神症状を改善する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害を有する対象が日常活動に着手する能力を改善する。
【００９２】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、アルツハイマー病を有する対象における認知及び機能の両方を改善する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、アルツハイマー病を有する対象における認知エンドポイントを改善する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、アルツハイマー病を有する対象における機能的エンドポイントを改善する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、アルツハイマー病を有する対象における認知及び機能的エンドポイントを改善する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、アルツハイマー病を有する対象における全体臨床反応（グローバルエンドポイント）を改善する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、症候性または診断検査に従って、神経変性障害の症状を改善する。ある特定の実施形態では、アルツハイマー病（及び他の神経変性障害）の症状の改善を評価する検査は、客観的認知、日常生活動作、変化の総合評価、健康に関連した生活の質の検査、及び神経変性障害の行動及び精神症状を評価する検査から選択される。
【００９４】
ある特定の実施形態では、症状の改善の評価のための客観的認知検査は、アルツハイマー病評価尺度−認知副尺度（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）、及び古典的なＡＤＡＳ尺度を使用する。ある特定の実施形態では、認知の症状の改善は、アルツハイマー病で使用される神経生理学的試験用バッテリー（ＮＴＢ）を用いて評価される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、変化の総合評価検査は、精神及び神経障害を評価するための臨床包括的印象−包括的改善（ＣＧＩ−Ｉ）尺度を使用する。いくつかの実施形態では、包括的尺度は、臨床面接による認知症変化印象尺度（ＣＩＢＩＣ  ｐｌｕｓ）である。いくつかの実施形態では、包括的尺度は、アルツハイマー病共同研究ユニットによる変化に対する臨床医の包括的印象（ＡＤＣＳ−ＣＧＩＣ）である。
【００９６】
ある特定の実施形態では、健康に関連した生活の質の尺度は、アルツハイマー病関連ＱＯＬ（ＡＤＲＱＬ）及びＱＯＬ−アルツハイマー病（ＱＯＬ−ＡＤ）である。
【００９７】
ある特定の実施形態では、神経変性障害の行動及び精神症状を評価する検査は、アルツハイマー病評価尺度（ＢＥＨＡＶＥ−ＡＤ）；認知症の行動評価尺度（ＢＲＳＤ）；神経精神症状評価表（ＮＰＩ）；及びコーエン・マンスフィールド激越評価表（ＣＭＡＩ）における行動病理学から選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害を治療する別の治療法と併用する場合に、神経変性障害の予防、減少、または軽減に特に有効である。ある特定の実施形態では、かかる治療法には、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えば、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、ガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標））及びリバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標））、及びメマンチンが含まれる。
【００９９】
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳内のニューロンを囲む髄鞘、及び脊髄が損傷している脱髄疾患である。ＭＳの正確な根本原因は未知であるが、個体間で変化すると考えられる。ある特定の形態のＭＳは、遺伝性である。環境因子もＭＳに寄与すると考えられる。いくつかの個体では、遺伝及び環境因子の両方の組み合わせが、ＭＳの発症を引き起こし得る。
【０１００】
ＭＳに関連する多種多様の症状が存在する。対象は、自律、視覚、運動または感覚制御の障害に関連するほとんど全ての神経学的症状を示し得る。正確な症状は、ニューロン損傷／脱髄の部位に応じて変化することになる。
【０１０１】
ＩＬ−８は、髄鞘の形成に関与していた。従って、本発明の組成物は、ＭＳを有する対象におけるニューロンの髄鞘再生に使用されてよい。また、本発明の組成物を使用して、ニューロンを脱髄から保護し得る。言い換えれば、本発明の組成物は、ニューロン髄鞘の喪失の回復または予防による多発性硬化症の治療または予防方法に使用されてよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、対象におけるＭＳの１または２以上の症状を予防、減少、または軽減する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、対象における倦怠感を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、対象における安静時振戦、筋力低下、筋痙攣、筋肉強直、知覚異常及び／または運動失調を予防、減少、または軽減する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、自律神経障害：便秘、排尿障害、性機能、嚥下障害、構音障害、失神、めまい及び／または眩暈；睡眠障害；及び嗅覚または温度覚の乱れからなる群から選択される、ＭＳ進行に関連する１または２以上の症状を予防、減少、または軽減する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＭＳに関連する１または２以上の眼症状を予防、減少、または軽減する。いくつかの実施形態では、眼症状は、対象における失明、眼痛、色盲、複視及び／または眼球の固視微動からなる群から選択される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、眩暈、めまい、神経因性疼痛、筋骨格痛、認知機能不全、腸失禁、嚥下障害、構音障害、またはそれらの任意の組み合わせを予防、減少、または軽減する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＭＳと共存するうつ症状または不安を予防、減少、または軽減する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物による症状の改善は、ＭＳを診断する２０１７年マクドナルド基準を用いて決定される。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物による治療は、ＭＳ発生またはＭＳ重篤度の減少をもたらす。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、再発発生または再発重篤度の低減に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物による治療は、運動機能の低減を予防し、またはＭＳに関連する運動機能の改善をもたらす。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、運動機能の低減の予防に使用され、またはＭＳの治療における運動機能の改善に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物による治療は、ＭＳにおける麻痺の発症を予防する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＭＳの治療における麻痺の予防に使用される。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、多発性硬化症のリスクがあると同定された、または早期の多発性硬化症または「再発寛解型」多発性硬化症と診断された患者における多発性硬化症の予防に使用される。本発明の組成物は、ＭＳの発症の予防に有用であり得る。本発明の組成物は、ＭＳの進行の予防に有用であり得る。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＭＳに対する遺伝的素因、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ表現型、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ２またはＨＬＡ−ＤＲ４を有すると同定された患者に使用される。
【０１０８】
本発明の組成物は、多発性硬化症の維持または軽減に有用であり得る。本発明の組成物は、多発性硬化症に関連する症状の低減に特に有用であり得る。多発性硬化症の治療または予防は、例えば、症状の重篤度の軽減、または患者に対する問題である悪化頻度またはトリガーの範囲の減少を指し得る。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、疾患の進行を減速または停止する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、再発寛解型ＭＳの治療に使用される。別の実施形態では、本発明の組成物は、進行型ＭＳ、例えば、ＲＲＭＳの診断後に徐々に発症する二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、徐々に継続する神経学的悪化を示す一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、及び、ＰＰＭＳと同様であるが、重複再発する進行性再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）の治療に使用される。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、倦怠感、視覚障害、痺れ、刺痛感、筋痙攣、筋肉強直、筋力低下、運動障害、疼痛、思考、学習及び計画の障害、うつ病及び不安、性的障害、膀胱障害、腸障害、発語障害、及び嚥下困難からなる群から選択される、ＭＳの症状のうちの１または２以上の治療に使用される。
【０１１１】
神経化学的因子、神経ペプチド及び神経伝達物質及び微生物叢−腸−脳軸
上に概説されたように、微生物叢−腸−脳軸は、多くの異なる生理系によって調節される。微生物叢−腸−脳軸は、多くのシグナル伝達分子によって調節される。これらのシグナル伝達分子レベルの変化は、神経変性疾患をもたらす。本発明者らによって行われた実験は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、特に、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓの投与が、インドール及びキヌレニンのレベルを調節することができることを示唆する。これらの代謝産物の調節異常は、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病をもたらし得る。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、脳内モノアミン及びそれらの代謝産物のレベルを調節する。好ましい実施形態では、代謝産物は、キヌレニンである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、キヌレニンを調節する。これは、トリプトファン代謝の主要経路であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）産生への経路として機能する。キヌレニンは代謝されて、神経活性化合物、例えば、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）及び３−ヒドロキシ−１−キヌレニン（３−ＯＨ−１−ＫＹＮ）になり、さらなるステップで、キノリン酸（ＱＵＩＮ）になることができる。キヌレニン経路の調節異常は、免疫系の活性化、及び潜在的に神経毒性な化合物の蓄積をもたらし得る。キヌレニン代謝の変化は、パーキンソン病の発症に関与し得る。キヌレニンレベルは、ＰＤを有する患者の前頭皮質、被殻、及び黒質緻密部において減少することが示されている［３１］。従って、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、パーキンソン病の治療におけるキヌレニンレベルの増加に使用される。
【０１１３】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の組成物は、キヌレニンレベルを増加させることができる。キヌレニンレベルの増加は、ヒトドーパミン作動性神経芽腫細胞株におけるＭＰＰ＋誘発ニューロン細胞死をインビトロで減衰することが示されている［３２］。ある特定の実施形態では、キヌレニン及びキヌレン酸は、ＧＩアリール炭化水素受容体（Ａｈｒ）及びＧＰＲ３５受容体を活性化することができる。Ａｈｒ受容体の活性化は、ＩＬ−２２産生を誘発し、局所炎症を阻害することができる。ＧＰＲ３５の活性化は、イノシトール三リン酸の産生、及びＣａ２＋動員を誘発する。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、インドールのレベルを調節する。好ましい実施形態では、代謝産物は、キヌレニンである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、トリプトファン代謝の主要経路であるキヌレニン経路を調節する。
【０１１５】
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、神経化学的因子、神経ペプチド、及び神経伝達物質のレベルによって調節される。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経化学的因子、神経ペプチド、及び神経伝達物質のレベルを調節する。したがって、ある特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＣＮＳ生化学を直接変える。
【０１１６】
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のレベルによって調節される。したがって、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＧＡＢＡレベルを調節する。ＧＡＢＡは、ニューロン興奮性を減少させる抑制性神経伝達物質である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＡＢＡレベルを増加させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＡＢＡレベルを減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＡＢＡ作動性神経伝達を変更する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、中枢神経系の異なる領域におけるＧＡＢＡ転写レベルを調節する。ある特定の実施形態では、共生由来ＧＡＢＡは、血液脳関門を交差し、神経伝達に直接影響を与える。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、海馬、扁桃体及び／または青斑核におけるＧＡＢＡの減少をもたらす。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、皮質領域におけるＧＡＢＡの増加をもたらす。
【０１１７】
免疫応答
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、免疫応答及び炎症性因子及びマーカーの変更によって調節される。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、免疫応答を調節し得る。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、循環神経免疫シグナル伝達分子の全身レベルを調節する。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、炎症性サイトカイン産生及び炎症を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、炎症状態を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−６産生及び分泌を減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＮＦκＢプロモーターの活性化を減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、強力な炎症誘発性エンドトキシンリポ多糖（ＬＰＳ）によるＩＬ−６産生の活性化を調節することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＬＰＳ及びα−シヌクレイン変異タンパク質、例えば、Ａ５３ＴによるＮＦκＢプロモーターの活性化を調節することができる。サイトカインの循環レベルの増加は、様々な神経変性障害、例えば、パーキンソン病、認知症及びアルツハイマー病に密接に関連する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害の治療において、ＩＬ−６レベル及び／またはＮＦκＢレベルの低減に使用される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−８の分泌を増加させる。ＩＬ−８は、髄鞘形成を誘発し、有効なニューロン通信を回復または保存することが示されている。従って、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経変性疾患の治療において、髄鞘形成の誘発に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ニューロン通信の回復に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ニューロン通信の保存に使用される。
【０１１９】
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、共生代謝産物のレベルによって調節される。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、微生物叢代謝産物の全身レベルを調節する。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）のレベルを調節する。ある特定の実施形態では、ＳＣＦＡのレベルは、増加または減少する。いくつかの実施形態では、ＳＣＦＡは、酪酸（ＢＡ）（または酪酸）である。いくつかの実施形態では、ＳＣＦＡは、プロピオン酸（ＰＰＡ）である。いくつかの実施形態では、ＳＣＦＡは、酢酸である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＳＣＦＡが血液脳関門を交差する能力を調節する。
【０１２０】
ヒストンアセチル化及び脱アセチル化は、遺伝子発現の重要なエピジェネティック調節因子である。ヒストンアセチル化及び脱アセチル化の不均衡は、アポトーシスをもたらし得る。かかるヒストン脱アセチル化酵素の調節異常は、加齢による神経変性疾患に関連する病因、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症及び認知機能低下に関与していた［３３］。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を調節することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を減少することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヒストンアセチラーゼ活性を減少することができる。
【０１２１】
神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症を有する患者は、高レベルの脂質過酸化を示す。脂質は、活性酸素種による酸化に対して脆弱であり、脳は、多価不飽和脂肪酸が豊富である。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、脂質過酸化を調節することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、脂質過酸化を減少することができる。活性酸素種に起因する酸化的損傷の減少を使用して、早期の神経変性疾患を標的にすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、早期の神経変性の治療に使用される。また、したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害の発症の予防に使用される。かかる実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害を発症するリスクがあると同定された患者に使用されてよい。
【０１２２】
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、腸透過性のレベルによって調節される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管上皮の完全性を変更する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管の透過性を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管の防御機能及び完全性を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管運動性を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管内腔から血流への共生代謝産物及び炎症性シグナル伝達分子の転座を調節する。
【０１２３】
微生物叢−腸−脳軸のシグナル伝達は、胃腸管中の微生物叢組成物によって調節される。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管の微生物叢組成物を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、毒性代謝産物（例えば、ＬＰＳ）の微生物叢共生及び関連の増加を予防する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのレベルを調節する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、胃腸管中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのレベルを減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉのレベルを減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、有害な嫌気性細菌の増殖、及びこれらの細菌によって産生された神経毒の産生を調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの微生物叢レベルを調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属及び／またはＡｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅファミリーの微生物叢レベルを調節する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ及び／またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉのレベルを増加させる。
【０１２４】
脳損傷
実施例は、本発明の組成物が、神経保護であり、ＨＤＡＣ阻害活性を有することを示している。ＨＤＡＣ２は、脳卒中からの機能回復の重要な標的であり［３４］、ＨＤＡＣ阻害は、白質傷害を予防することができるため［３５］、本発明の組成物は、脳損傷の治療に有用であり得る。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、脳損傷は、外傷性脳損傷である。いくつかの実施形態では、脳損傷は、後天性脳損傷である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、外傷がもたらす脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、腫瘍がもたらす脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳卒中がもたらす脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳出血がもたらす脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳炎がもたらす脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳低酸素症がもたらす脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳無酸素症がもたらす脳損傷の治療に使用される。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、脳卒中の治療に使用される。実施例に示す効果は、脳卒中の治療に特に関連する。脳卒中は、脳の少なくとも一部への血流が遮断されると発生する。脳組織に酸素及び栄養素を提供し、脳組織から老廃物を除去するための血液の十分な供給がなくなると、脳細胞は、急速に死に始める。脳卒中の症状は、不十分な血流の影響を受ける脳の領域に依存する。症状には、麻痺、痺れまたは筋肉の衰弱、平衡感覚障害、眩暈、突然の激しい頭痛、発語障害、記憶喪、推論能力の喪失、突然の意識混濁、視力障害、昏睡または死さえが含まれる。脳卒中は、脳発作または脳血管障害（ＣＶＡ）とも呼ばれる。十分な血流が短時間で回復すれば、脳卒中の症状は短い。しかしながら、不十分な血流がかなりの期間続くと、症状は永続的になり得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、脳卒中は、脳虚血である。脳虚血は、代謝要求を満たすための脳の組織への血流が不十分な場合に生じる。いくつかの実施形態では、脳虚血は、限局性脳虚血、すなわち、脳の特定領域に限局している。いくつかの実施形態では、脳虚血は、広範囲の脳虚血、すなわち、脳組織の広域を包含している。局所脳虚血は、脳血管が部分的または完全に閉塞され、脳の特定領域への血流が低下している場合に概して生じる。いくつかの実施形態では、限局性脳虚血は、虚血性脳卒中である。いくつかの実施形態では、虚血性脳卒中は、血栓性、すなわち、脳血管で発症し、血流を制限または遮断する血栓または血餅に起因する。いくつかの実施形態では、虚血性脳卒中は、血栓性脳卒中である。いくつかの実施形態では、虚血性脳卒中は、塞栓性、すなわち、血流を介して移動し、その起点から離れた部位で血流を制限または遮断する塞栓または付着していない塊に起因する。いくつかの実施形態では、虚血性脳卒中は、塞栓性脳卒中である。広範囲の脳虚血は、脳全体への血流が遮断または減少している場合に概して生じる。いくつかの実施形態では、広範囲の脳虚血は、低灌流に起因する、すなわち、発作による。いくつかの実施形態では、広範囲の脳虚血は、心停止の結果である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳虚血を罹患しているを罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、限局性脳虚血を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、虚血性脳卒中を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、血栓性脳卒中を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、塞栓性脳卒中を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、広範囲の脳虚血を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、低灌流を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、心停止を罹患している。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳虚血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、限局性脳虚血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、虚血性脳卒中の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、血栓性脳卒中の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、塞栓性脳卒中の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、広範囲の脳虚血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、低灌流の治療に使用される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、脳卒中は、出血性脳卒中である。出血性脳卒中は、脳内または脳周囲の出血に起因し、脳の細胞及び組織への腫れ、圧力及び損傷をもたらす。出血性脳卒中は、概して、弱くなった血管が破裂し、脳周囲に出血した結果である。いくつかの実施形態では、出血性脳卒中は、脳内出血、すなわち、脳組織自体内の出血に起因する。いくつかの実施形態では、脳内出血は、実質内出血に起因する。いくつかの実施形態では、脳内出血は、脳室内出血に起因する。いくつかの実施形態では、出血性脳卒中は、くも膜下出血、すなわち、脳組織の外で発生するが、まだ頭蓋内の出血である。いくつかの実施形態では、出血性脳卒中は、脳アミロイド血管症の結果である。いくつかの実施形態では、出血性脳卒中は、脳動脈瘤の結果である。いくつかの実施形態では、出血性脳卒中は、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）の結果である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、出血性脳卒中を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳内出血を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、実質内出血を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳室内出血を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、くも膜下出血を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳アミロイド血管症を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳動脈瘤を罹患している。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳ＡＶＭを罹患している。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、出血性脳卒中の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳内出血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、実質内出血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳室内出血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、くも膜下出血の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳アミロイド血管症の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳動脈瘤の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳ＡＶＭの治療に使用される。
【０１３３】
中断期間後の脳への十分な血流の回復は、脳卒中に関連する症状の軽減に有効であるが、逆説的に、脳組織へのさらなる損傷をもたらし得る。中断期間中、患部組織は、酸素及び栄養素の欠如に苦しみ、血流の突然の回復は、酸化ストレスの誘発を通じて、炎症及び酸化的損傷をもたらし得る。これは、再灌流障害として知られ、脳卒中の後だけでなく、心臓発作の後でも十分に立証されており、すなわち、虚血もしくは酸欠の期間後に血液供給が組織に戻る場合の他の組織損傷である。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、脳卒中がもたらす再灌流障害を罹患している。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳卒中がもたらす再灌流障害の治療に使用される。
【０１３４】
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、軽度の脳卒中としばしば呼ばれ、より重篤な脳卒中に対する認識された警告サインである。従って、１または２以上のＴＩＡを罹患している対象は、脳卒中のリスクがより高い。いくつかの実施形態では、脳損傷と診断された対象は、ＴＩＡを罹患している。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＴＩＡの治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＴＩＡを罹患している対象における脳損傷の治療に使用される。
【０１３５】
高血圧、高血中コレステロール、脳卒中の家族歴、心臓病、糖尿病、脳動脈瘤、動静脈奇形、鎌状赤血球症、血管炎、出血障害、非ステロイド性抗炎症薬の使用（ＮＳＡＩＤ）、たばこの喫煙、大量のアルコール飲酒、違法薬物使用、肥満、身体活動不足、及び不健康な食事は全て、脳卒中のリスク因子であると考えられる。特に、血圧の低減が、虚血性及び出血性脳卒中の両方を予防することが決定的に示されている［３６、３７］。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、脳卒中の少なくとも１つのリスク因子を有する対象における脳損傷の治療に使用される。いくつかの実施形態では、対象は、脳卒中の２つのリスク因子を有する。いくつかの実施形態では、対象は、脳卒中の３つのリスク因子を有する。いくつかの実施形態では、対象は、脳卒中の４つのリスク因子を有する。いくつかの実施形態では、対象は、脳卒中の５つ以上のリスク因子を有する。いくつかの実施形態では、対象は、高血圧を有する。いくつかの実施形態では、対象は、高血中コレステロールを有する。いくつかの実施形態では、対象は、脳卒中の家族歴を有する。いくつかの実施形態では、対象は、心臓病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、脳動脈瘤を有する。いくつかの実施形態では、対象は、動静脈奇形を有する。いくつかの実施形態では、対象は、血管炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、鎌状赤血球症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、出血障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、非ステロイド性抗炎症薬の使用歴（ＮＳＡＩＤ）を有する。いくつかの実施形態では、対象は、たばこを喫煙する。いくつかの実施形態では、対象は、大量のアルコールを飲酒する。いくつかの実施形態では、対象は、違法薬物を使用する。いくつかの実施形態では、対象は、肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、体重過剰である。いくつかの実施形態では、対象は、身体活動不足を有する。いくつかの実施形態では、対象は、不健康な食事を有する。
【０１３６】
実施例は、本発明の組成物が、脳損傷の治療、及び障害事象が発生する前に投与した場合に回復を助けるのに有用であり得ることを示す。従って、本発明の組成物は、脳損傷、例えば、脳卒中のリスクがある対象に投与した場合、脳損傷の治療に特に有用であり得る。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、潜在的な脳損傷、好ましくは、脳卒中に起因する損傷の低減に使用される。組成物は、潜在的な脳損傷が発生する前に投与した場合、特に、脳損傷のリスクがあると同定された患者に投与した場合に起因した損傷を低下させ得る。
【０１３８】
実施例は、本発明の組成物が、脳損傷の治療、及び障害事象が発生する前に投与した場合に回復を助けるのに有用であり得ることを示す。従って、本発明の組成物は、脳損傷、例えば、脳卒中の後に対象に投与した場合の脳損傷の治療に特に有用であり得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、運動障害の低減によって脳損傷を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、運動機能の改善によって脳損傷を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、筋力の改善によって脳損傷を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、記憶の改善によって脳損傷を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、社会的認識の改善によって脳損傷を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経学的機能の改善によって脳損傷を治療する。
【０１４０】
脳損傷の治療は、例えば、症状の重篤度の軽減を指し得る。また、脳損傷の治療は、脳卒中の後の神経学的障害の低減を指し得る。脳卒中の治療に使用される本発明の組成物は、例えば、脳卒中のリスクがあると同定された患者において、脳卒中の発症に先立って対象に提供され得る。脳卒中の治療に使用される本発明の組成物は、脳卒中が発生した後、例えば、回復中に提供され得る。脳卒中の治療に使用される本発明の組成物は、回復の急性期（すなわち、脳卒中後の１週間まで）中に提供され得る。脳卒中の治療に使用される本発明の組成物は、回復の亜急性期（すなわち、脳卒中後の１週間から３ヵ月まで）中に提供され得る。脳卒中の治療に使用される本発明の組成物は、回復の慢性期（脳卒中後の３ヵ月から）中に提供され得る。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、二次的作用物質と併用される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、アスピリンまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）と併用される。他の二次的作用物質には、他の抗血小板物質（例えば、クロピドグレル）、抗凝固薬（例えば、ヘパリン、ワルファリン、アピキサバン、ダビガトラン、エドキサバンまたはリバロキサバン）、抗高血圧薬（例えば、利尿薬、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬またはアルファ遮断薬）またはスタチンが含まれる。本発明の組成物は、二次的作用物質に対する患者の反応を改善し得る。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、組織に対する虚血の影響を減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、虚血に起因する組織に対する損傷の量を減少させる。ある特定の実施形態では、虚血によって損傷した組織は、脳組織である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、壊死または壊死細胞数を減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、アポトーシスまたはアポトーシス細胞数を減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、壊死及びアポトーシス細胞の数を減少させる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、壊死及び／またはアポトーシスによる細胞死を予防する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、虚血に起因する壊死及び／またはアポトーシスによる細胞死を予防する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、虚血によって損傷した組織の回復を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、壊死細胞及び／またはアポトーシス細胞のクリアランスの速度を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、壊死細胞及び／またはアポトーシス細胞のクリアランスの有効性を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、組織内の細胞の置換及び／または再生を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、虚血によって損傷した組織内の細胞の置換及び／または再生を改善する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、（例えば、生検時に）組織の全体組織構造を改善する。
【０１４３】
投与の形態
好ましくは、本発明の組成物は、本発明の細菌株による腸への送達及び／または腸への部分もしくは全体定着を可能にするために胃腸管に投与されるべきである。概して、本発明の組成物は、経口で投与されるが、これらは、経直腸的に、鼻腔内に、または頬側もしくは舌下経路を介して投与されてよい。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、泡として、スプレーまたはゲルとして投与されてよい。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、坐薬、例えば、肛門坐薬として、例えば、カカオ脂（ココアバター）、合成硬質脂肪（例えば、坐剤用基材、ウィテップゾール）、グリセロ−ゼラチン、ポリエチレングリコール、または石鹸グリセリン組成物の形態で投与されてよい。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、チューブ、例えば、鼻腔栄養チューブ、経口胃チューブ、胃チューブ、経空腸チューブ（Ｊチューブ）、経皮的内視鏡下胃瘻造設術（ＰＥＧ）、またはポート、例えば、胃、空腸及び他の好適なアクセスポートへのアクセスを付与する胸壁ポートを介して胃腸管に投与される。
【０１４７】
本発明の組成物は、一度で投与されてよく、または治療レジメンの部分として逐次的に投与されてよい。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、連日投与されるべきである。
【０１４８】
本発明のある特定の実施形態では、本発明による治療は、患者の腸内微生物叢のアセスメントを伴う。治療は、本発明の株の送達及び／またはそれによる部分的もしくは全体的定着が達成されず、その結果、効能が観察されないことになるとき、繰り返されてよく、あるいは、治療は、送達及び／または部分的もしくは全体的定着が成功裏でありかつ効能が観察されるときに中止されてよい。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、妊娠した動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに、その子宮内の胎児及び／または生まれた後の小児において発症する炎症性または自己免疫疾患を予防するために投与されてよい。
【０１５０】
本発明の組成物は、神経変性疾患と診断された、あるいは神経変性疾患のリスクがあると同定された患者に投与されてよい。組成物は、健常な患者における神経変性疾患の発症を予防するための予防対策として投与されてもよい。
【０１５１】
本発明の組成物は、異常な腸内微生物叢を有すると同定されている患者に投与されてよい。例えば、患者は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、特に、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓによる定着が縮小しているか、または定着がないかであり得る。
【０１５２】
本発明の細菌を含む組成物は、食品、例えば、栄養補助食品として投与されてよい。
【０１５３】
概して、本発明の組成物は、ヒトの治療のためのものであるが、単胃哺乳動物、例えば、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマまたはウサギを含めた動物を治療するのに使用されてよい。本発明の組成物は、動物の成長及びパフォーマンスを向上させるのに有用であり得る。動物に投与されるとき、経口胃管栄養法が使用されてよい。
【０１５４】
組成物
概して、本発明の組成物は、細菌を含む。本発明の好ましい実施形態では、組成物は、凍結乾燥形態で調合される。例えば、本発明の組成物は、本発明の細菌株を含む顆粒またはゼラチンカプセル、例えば、硬質ゼラチンカプセルを含んでいてよい。
【０１５５】
好ましくは、本発明の組成物は、凍結乾燥されている細菌を含む。細菌の凍結乾燥は、確立された手順であり、関連のガイダンスは、例えば、参照文献［３８〜４０］において入手可能である。
【０１５６】
あるいは、本発明の組成物は、生きている、活性な細菌培養物を含んでいてよい。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、不活性化されていない、例えば、熱不活性化されていない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、殺傷されていない、例えば、熱殺傷されていない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、弱毒化されていない、例えば、熱弱毒化されていない。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、殺傷されていない、不活性化されていない及び／または弱毒化されていない。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、生きている。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、生存している。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は、腸に部分的または全体的に定着することが可能である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における細菌株は生存しており、腸に部分的または全体的に定着することが可能である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、組成物は、生きている細菌株と殺傷されている細菌株との混合物を含む。
【０１５９】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腸への細菌株の送達を可能にするようにカプセル化されている。カプセル化は、目標箇所に送達するまで、例えば、ｐＨの変化によって引き起こされる場合がある化学的または物理的刺激、例えば、圧力、酵素活性または物理的崩壊による破断を通しての劣化から組成物を保護する。いずれの適切なカプセル化方法が使用されてもよい。例示的なカプセル化技術として、多孔質マトリクス内への取り込み、固体担体表面への付着または吸着、凝集によるまたは架橋剤を用いた自己会合、及び微多孔膜またはマイクロカプセルの後の機械的拘束が挙げられる。本発明の組成物を調製するのに有用であり得るカプセル化についてのガイダンスは、例えば、参照文献［４１］及び［４２］において入手可能である。
【０１６０】
組成物は、経口で投与されてよく、錠剤、カプセルまたは粉末の形態であってよい。カプセル化された製品が好ましい、なぜなら、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓが嫌気性生物であるからである。他の成分（例えば、ビタミンＣなど）が、インビボでの送達及び／または部分的もしくは全体的定着並びに生存を改善するように脱酸素剤及びプレバイオティック基質として含まれていてよい。あるいは、本発明のプロバイオティック組成物は、食品もしくは栄養製品、例えば、ミルクもしくはホエイベースの発酵乳製品として、または医薬製品として経口で投与されてよい。
【０１６１】
組成物は、プロバイオティックとして調合されてよい。
【０１６２】
本発明の組成物は、治療有効量の本発明の細菌株を含む。治療有効量の細菌株は、患者への有益な効果を発揮するのに十分である。治療有効量の細菌株は、患者の腸への送達及び／または部分的もしくは全体的定着を結果として生じさせるのに十分であり得る。
【０１６３】
例えば、ヒト成人への細菌の好適な１日量は、約１×１０３〜約１×１０１１個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）；例えば、約１×１０７〜約１×１０１０ＣＦＵ；別の例において、約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵであってよい。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、組成物は、組成物の重量に対して約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ；例えば約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量で細菌株を含有する。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ及び１０ｇであってよい。
【０１６５】
典型的には、プロバイオティック、例えば本発明の組成物は、少なくとも１つの好適なプレバイオティック化合物と任意選択的に組み合わされる。プレバイオティック化合物は、通常、上部消化管において分解または吸収されない、非消化性炭水化物、例えば、オリゴ−もしくは多糖、または糖アルコールである。公知のプレバイオティクスとして、市販品、例えば、イヌリン及びトランスガラクト−オリゴ糖が挙げられる。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本発明のプロバイオティック組成物は、組成物の合計重量に対して約１〜約３０重量％（例えば、５〜２０重量％）の量でプレバイオティック化合物を含む。炭水化物は、フラクト−オリゴ糖（またはＦＯＳ）、短鎖フラクト−オリゴ糖、インスリン、イソマルト−オリゴ糖、ペクチン、キシロ−オリゴ糖（またはＸＯＳ）、キトサン−オリゴ糖（またはＣＯＳ）、β−グルカン、アラビアガム変性及び耐性デンプン、ポリデキストロース、Ｄ−タガトース、アカシアファイバ、イナゴマメ、オート麦、並びにシトラスファイバからなる群から選択されてよい。一態様では、プレバイオティクスは、短鎖フラクト−オリゴ糖（簡潔のために、以下本明細書においてＦＯＳｓ−ｃ．ｃと示す）であり；前記ＦＯＳｓ−ｃ．ｃ．は消化性炭水化物ではなく、テンサイ糖の転換によって一般に得られ、３つのグルコース分子が結合しているサッカロース分子を含んでいる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性障害の治療または予防のための別の治療用化合物と併用される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経保護または神経増殖を調節する栄養補助食品と共に投与される。好ましい実施形態では、栄養補助食品は、栄養ビタミン類を含むかまたはそれらからなる。ある特定の実施形態では、ビタミン類は、ビタミンＢ６、マグネシウム、ジメチルグリシン（ビタミンＢ１６）、及びビタミンＣである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、別のプロバイオティックと組み合わせて投与される。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性疾患に対する第２剤の効果の増強に使用される。本発明の組成物の免疫調節効果は、従来の治療、例えば、レボドパ、ドーパミン作動薬、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、ＣＯＭＴ阻害剤、グルタミン酸拮抗薬、または抗コリン薬（これらは、本発明の組成物と組み合わせて（逐次または同時に）投与される例示の二次的作用物質である）の影響を脳により受けやすくさせ得る。
【０１６９】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を含んでいてよい。かかる好適な賦形剤の例は、参照文献［４３］において見出され得る。治療的使用のための、許容される担体または希釈剤は、薬剤分野において周知されており、例えば、参照文献［４４］において記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール及び水が挙げられる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準の薬務に関して選択され得る。医薬組成物は、上記担体、賦形剤または希釈剤として、またはこれに加えて、いずれの好適な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含んでいてもよい。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えば、グルコース、無水ラクトース、自由流動ラクトース、β−ラクトース、コーンシロップ、天然及び合成ガム、例えば、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールが挙げられる。好適な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤、安定剤、染料、及びさらなる香味剤が、医薬組成物において付与されていてよい。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、システイン、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤が使用されてもよい。
【０１７０】
本発明の組成物は、食品として調合されてよい。例えば、食品は、例えば、栄養補助食品において、本発明の治療効果に加えて、栄養的利益を付与してよい。同様に、食品は、本発明の組成物の風味を向上するように、または組成物を、医薬組成物よりもむしろ、一般食料とより類似することによって、消費するのにより魅力的であるようにするように調合されてよい。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ミルクベースの製品として調合される。用語「ミルクベースの製品」は、変動する脂肪分を有する、いずれの液体または半固体のミルク−またはホエイベースの製品も意味する。ミルクベースの製品は、例えば、ウシのミルク、ヤギのミルク、ヒツジのミルク、スキムミルク、ホールミルク、いずれの処理もしていない粉ミルク及びホエイからの還元ミルク、または加工品、例えば、ヨーグルト、凝固したミルク、カード、酸乳、酸全乳、バターミルク及び他の酸乳製品であり得る。別の重要な群としては、ミルク飲料、例えば、ホエイ飲料、発酵乳、コンデンスミルク、乳幼児ミルク；フレーバーミルク、アイスクリーム；ミルク含有食品、例えば、スイーツが挙げられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の１または２以上の細菌株を含み、いずれの他の属からの細菌も含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別の属からの細菌を含む。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの１または２以上の細菌株を含み、いずれの他の属からの細菌も含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別の属からの細菌を含む、治療に使用される組成物を提供する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の１または２以上の細菌株を含み、いずれの他の種からの細菌も含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別の種からの細菌を含む。従って、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の１または２以上の細菌株を含み、いずれの他の種からの細菌も含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別の種からの細菌を含む、治療に使用される組成物を提供する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の１または２以上の細菌株を含み、いずれの他のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種からの細菌も含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種からの細菌を含む。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の１または２以上の細菌株を含み、いずれの他のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種からの細菌も含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種からの細菌を含む、治療に使用される組成物を提供する。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、単一細菌株または種を含有し、いずれの他の細菌株または種を含有しない。かかる組成物は、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の他の細菌株または種を含んでいてよい。かかる組成物は、他の生物種を実質的に含まない培養であってもよい。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の単一細菌株を含み、いずれの他の株からの細菌を含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別の株からの細菌を含む、治療に使用される組成物を提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ種の単一細菌株を含み、いずれの他の株からの細菌を含有せず、または、ほんの僅少なもしくは生物学的に関連のない量の別の株からの細菌を含む、治療に使用される組成物を提供する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１を超える細菌株を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同種内からの１を超える株（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５を超える株）を含み、任意選択的に、いずれの他の種からの細菌も含有しない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同種内からの５０未満の株（例えば、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４または３未満の株）を含み、任意選択的に、いずれの他の種からの細菌も含有しない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同種内からの１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０株を含み、任意選択的に、いずれの他の種からの細菌も含有しない。本発明は、上記のいずれの組み合わせも含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、組成物は、微生物コンソーシアム（consortium）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、微生物コンソーシアムの一部としてＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ細菌株を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ細菌株は、腸においてインビボで共生的に生きることができる、他の属からの１または２以上の（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０の）他の細菌株と組み合わせて存在する。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、異なる属からの細菌株と組み合わせたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの細菌株を含む。いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、単一の生物、例えば、ヒトの糞便試料から得られた２以上の細菌株を含む。いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、本来は一緒には見られない。例えば、いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、少なくとも２の異なる生物の糞便試料から得られた細菌株を含む。いくつかの実施形態では、２の異なる生物は、同種、例えば、２の異なるヒトからのものである。いくつかの実施形態では、２の異なる生物は、ヒト乳児及びヒト成人である。いくつかの実施形態では、２の異なる生物は、ヒト及び非ヒト哺乳動物である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＭＲｘ０００５と同じ安全性及び治療効果特性を有するが、ＭＲｘ０００５ではない、またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓでもない細菌株をさらに含む。
【０１８０】
本発明の組成物が１を超える細菌株、種または属を含むいくつかの実施形態では、個々の細菌株、種または属は、別々、同時または逐次投与用であってよい。例えば、組成物は、１を超える細菌株、種もしくは属の全てを含んでいてよく、または細菌株、種もしくは属は、別々に貯蔵されてよく、また、別々に、同時にもしくは逐次的に投与されてよい。いくつかの実施形態では、１を超える細菌株、種または属は、別々に貯蔵されているが、使用前に一緒に混合される。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本発明において使用される細菌株は、ヒト成人の糞便から得られる。本発明の組成物が１を超える細菌株を含むいくつかの実施形態では、細菌株の全てがヒト成人の糞便から得られ、または、他の細菌株が存在するとき、ほんの僅少な量でのみ存在する。細菌は、ヒト成人の糞便から得られ、本発明の組成物において使用された後に培養されてよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本発明において使用される細菌株は、ヒト幼児の糞便から得られる。本発明の組成物が１を超える細菌株を含むいくつかの実施形態では、細菌株の全てがヒト幼児の糞便から得られ、または、他の細菌株が存在するとき、ほんの僅少な量でのみ存在する。細菌は、ヒト幼児の糞便から得られ、本発明の組成物において使用される前に培養されてよい。
【０１８３】
上述のように、いくつかの実施形態では、１または２以上のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ細菌株は、本発明の組成物において唯一の治療的活性剤（複数可）である。いくつかの実施形態では、組成物における細菌株（複数可）は、本発明の組成物において唯一の治療的活性剤（複数可）である。
【０１８４】
本発明による使用のための組成物は、販売承認を必要としてもしなくてもよい。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、本発明は、前記細菌株が凍結乾燥されている、上記医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、前記細菌株が噴霧乾燥されている、上記医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、細菌株が、凍結乾燥または噴霧乾燥されており、また、生きている、上記医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、細菌株が、凍結乾燥または噴霧乾燥されており、また、生存している、上記医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、細菌株が、凍結乾燥または噴霧乾燥されており、また、腸に部分的または全体的に定着することが可能である、上記医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、細菌株が、凍結乾燥または噴霧乾燥されており、また、生存しており、かつ腸に部分的または全体的に定着することが可能である、上記医薬組成物を提供する。
【０１８６】
いくつかの場合では、凍結乾燥されている細菌株は、投与前に再構成される。いくつかの場合では、再構成は、本明細書に記載されている希釈剤の使用による。
【０１８７】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含んでいてよい。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物であって、細菌株が、それを必要とする対象に投与した場合、神経変性障害の治療に十分な量である、医薬組成物を提供する。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物であって、細菌株が、神経変性障害の治療または予防に十分な量である、医薬組成物を提供する。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本発明は、上記医薬組成物であって、細菌株の量が、組成物の重量に対してグラム当たり約１×１０３〜約１×１０１１個のコロニー形成単位である、上記医薬組成物を提供する。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、本発明は、１ｇ、３ｇ、５ｇまたは１０ｇの用量で投与される、上記医薬組成物を提供する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本発明は、経口、直腸、皮下、鼻、頬側、及び舌下からなる群から選択される方法によって投与される、上記医薬組成物を提供する。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本発明は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される担体を含む、上記医薬組成物を提供する。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本発明は、エタノール、グリセロール及び水からなる群から選択される希釈剤を含む、上記医薬組成物を提供する。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本発明は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、自由流動ラクトース、β−ラクトース、コーンシロップ、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムからなる群から選択される賦形剤を含む、上記医薬組成物を提供する。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本発明は、防腐剤、酸化防止剤及び安定剤の少なくとも１つをさらに含む、上記医薬組成物を提供する。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、本発明は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群から選択される防腐剤を含む、上記医薬組成物を提供する。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本発明は、上記細菌株が凍結乾燥されている、上記医薬組成物を提供する。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、本発明は、組成物が約４℃または約２５℃で密閉容器に貯蔵されて容器が５０％の相対湿度を有する雰囲気に置かれているとき、コロニー形成単位で測定される細菌株の少なくとも８０％が、少なくとも約１ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、１年、１．５年、２年、２．５年または３年の期間の後に残存している、上記医薬組成物を提供する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載されている組成物を含む密閉容器において提供される。いくつかの実施形態では、密閉容器は、サチェまたはボトルである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載されている組成物を含むシリンジにおいて提供される。
【０２０１】
本発明の組成物は、いくつかの実施形態では、医薬製剤として提供されてよい。例えば、組成物は、錠剤またはカプセルとして提供されてよい。いくつかの実施形態では、カプセルは、ゼラチンカプセル（「ｇｅｌ−ｃａｐ」）である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、経口投与される。経口投与は、嚥下を含んでいてよく、その結果、化合物が、胃腸管に入ることになり、及び／または頬側、舌側、もしくは舌下投与によって化合物が口から直接血流に入ることになる。
【０２０３】
経口投与に好適な医薬製剤としては、固体プラグ、固体微粒子状物、半固体及び液体（多相及び分散系を含む）、例えば、錠剤；多−またはナノ−粒子状物を含有する軟質または硬質カプセル、液体（例えば、水溶液）、エマルジョンまたは粉末；ロゼンジ（液体が充填されたものを含む）；咀嚼剤；ゲル；急速分散剤形；フィルム；膣坐剤；スプレー；並びに頬側／粘膜接着パッチが挙げられる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、腸溶性製剤、すなわち、経口投与による腸への本発明の組成物の送達に好適である胃耐性製剤（例えば、胃のｐＨに耐性）である。腸溶性製剤は、組成物の細菌または別の成分が酸感受性である、例えば、胃条件下で分解しやすいとき、特に有用であり得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は、腸溶性コーティングを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、腸溶性コーティングされた剤形である。例えば、製剤は、腸溶性コーティングされた錠剤または腸溶性コーティングされたカプセルなどであってよい。腸溶性コーティングは、経口送達のための従来の腸溶性コーティング、例えば、錠剤、カプセルなどのための従来のコーティングであってよい。製剤は、フィルムコーティング、例えば、腸溶性ポリマー、例えば、酸不溶性ポリマーの薄膜層を含んでいてよい。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は、本質的に腸溶性であり、例えば、腸溶性コーティングを必要としない胃耐性である。そのため、いくつかの実施形態では、製剤は、腸溶性コーティングを含まない腸溶性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、熱ゲル化材料から作製されたカプセルである。いくつかの実施形態では、熱ゲル化材料は、セルロース系材料、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。いくつかの実施形態では、カプセルは、いずれのフィルム形成ポリマーも含有しないシェルを含む。いくつかの実施形態では、カプセルは、シェルを含み、シェルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含み、いずれのフィルム形成ポリマーも含まない（例えば、［４５］を参照されたい）。いくつかの実施形態では、製剤は、本質的に腸溶性のカプセル（例えば、Ｃａｐｓｕｇｅｌ製Ｖｃａｐｓ（登録商標））である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、製剤は、軟質カプセルである。軟質カプセルは、カプセルシェルに存在する軟化剤、例えば、グリセロール、ソルビトール、マルチトール及びポリエチレングリコールなどの添加のおかげで、ある特定の弾性及び柔軟性を有し得るカプセルである。軟質カプセルは、例えば、ゼラチンまたはデンプンベースで製造され得る。ゼラチンベースの軟質カプセルは、様々な供給者から市販されている。例えば、経口または経直腸などの投与方法に応じて、軟質カプセルは、様々な形状を有することができ、例えば、円形、楕円形、長方形または魚雷型であり得る。軟質カプセルは、従来のプロセス、例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒプロセス、Ａｃｃｏｇｅｌプロセスまたは液滴もしくは発泡プロセスなどによって製造され得る。
【０２０８】
培養方法
本発明において使用される細菌株は、例えば、参照文献［４６〜４８］に詳述されている標準の微生物学的技術を使用して培養され得る。
【０２０９】
培養に使用される固体または液体培地は、ＹＣＦＡ寒天またはＹＣＦＡ培地であってよい。ＹＣＦＡ培地として（１００ｍｌ当たりの近似値）：Ｃａｓｉｔｏｎｅ（１．０ｇ）、酵母エキス（０．２５ｇ）、ＮａＨＣＯ３（０．４ｇ）、システイン（０．１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＮａＣｌ（０．０９ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．０９ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００９ｇ）、ＣａＣｌ２（０．００９ｇ）、レザズリン（０．１ｍｇ）、ヘミン（１ｍｇ）、ビオチン（１μｇ）、コバラミン（１μｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（３μｇ）、葉酸（５μｇ）、及びピリドキサミン（１５μｇ）を挙げることができる。
【０２１０】
ワクチン組成物に使用される細菌株
本発明者らは、本発明の細菌株が、神経変性障害の治療または予防に有用であることを確認した。これは、本発明の細菌株が宿主免疫系に対して有する効果の結果である可能性が高い。従って、本発明の組成物は、ワクチン組成物として投与した場合、神経変性障害の予防にも有用であり得る。ある特定のかかる実施形態では、本発明の細菌株は、殺傷、不活性化、または弱毒化されてよい。ある特定のかかる実施形態では、組成物は、ワクチンアジュバントを含んでよい。ある特定の実施形態では、組成物は、注射を介して、例えば、皮下注射を介して投与される。
【０２１１】
総則
本発明の実施は、別途示さない限り、当業者の範囲内の、化学、生化学、分子生物、免疫学及び薬理学の従来の方法を用いる。かかる技術は、文献において完全に説明されている。例えば、参照文献［４９］及び［５０〜５６］などを参照されたい。
【０２１２】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなる）」を包含し、例えば、組成物がＸを「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、Ｘから排他的になってもよく、またはさらなる何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでいてもよい。
【０２１３】
数値ｘに関係する用語「約」は、任意選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２１４】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要に応じて、語「実質的に」は、本発明の定義から省略されてよい。
【０２１５】
２つのヌクレオチド配列間の百分率の配列同一性への言及は、整列している場合、ヌクレオチドの百分率が、２つの配列を比較したときに同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウエアプログラム、例えば、参照文献［５７］のセクション７．７．１８に記載されているものを使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、１２のギャップオープンペナルティ及び２のギャップエクステンションペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスによるアフィンギャップ検索を使用してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参照文献［５８］に開示されている。
【０２１６】
特に記述されていない限り、多数のステップを含むプロセスまたは方法は、方法の開始及び終了時にさらなるステップを含んでいてよく、またはさらなる介在するステップを含んでいてよい。また、ステップは、適切な場合、組み合わされ、省略され、または代替の順序で実施されてよい。
【０２１７】
本発明の様々な実施形態は本明細書に記載されている。各実施形態では特定されている特徴は、他の特定されている特徴と組み合わされて、さらなる実施形態を付与してよいことが理解されよう。特に、好適な、典型的なまたは好ましいとして本明細書において強調されている実施形態は、互いに組み合わされてよい（これらが互いに排他的であるときを除く）。
【実施例】
【０２１８】
本発明を実施するための形態
実施例１−細菌接種原が神経保護物質として作用する効能
概要
神経芽腫細胞を、本発明による細菌株を含む組成物で処置した。使用したＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞は、ドーパミン産生であり、神経変性疾患を研究するためのインビトロモデルとして確立されている。細菌株が神経増殖を増加させる能力が観察された。神経芽腫細胞を処理し、かつ、神経芽腫細胞におけるパーキンソン病の永続的症状を誘発するドーパミン作動性神経毒１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をも処理した。細菌株がＭＰＰに対する神経保護物質として作用する能力を調査した。
【０２１９】
材料及び方法
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＭＲｘ００２９
【０２２０】
細胞株
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞は、ＥＣＣＡＣＣ（カタログ番号９４０３０３０４）から購入し、栄養混合物Ｆ−１２ハム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｎ４８８８）を補充したＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ２２７９）中で増殖させた。
【０２２１】
方法
増殖させた後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を、１１，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２日間インキュベートした。その後、細胞を分化培地（ＦＢＳを１％で含有）及び１０ｕＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ２６２５−１００ＭＧ）に移した。分化培地を一日おきに交換し、細胞を分化７日目に収穫した。細胞を、ＭＰＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ０４８−１Ｇ）有りと無しで、８時間前処理した。その後、細胞を１０％の細菌上清と共に処理し、一晩インキュベートした。細胞生存率は、ＣＣＫ−８試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、細胞計数キット−８、カタログ番号９６９９２−３０００ＴＥＳＴＳ−Ｆ）を用いて測定し、４５０ｎｍ波長で読み取った。
【０２２２】
結果
これらの実験の結果を図１に示す。ＭＲｘ０００５またはＭＲｘ００２９による神経芽腫細胞の処置は、ニューロン増殖の増加をもたらした。細菌株と一緒にＭＰＰで処置した神経芽腫細胞は、ＭＰＰのみで処置した細胞（生存率を減少させた）と比較して、細胞生存率を増加させた。これらのデータは、細菌株が神経保護物質として作用し得ることを示す。
【０２２３】
実施例２Ａ−細菌接種原がＩＬ−６分泌を減少させる効能。
概要
炎症性サイトカインの活性化は、神経変性疾患におけるニューロン損傷に関連していた。リポ多糖（ＬＰＳ）は、炎症性サイトカインＩＬ−６の公知の刺激因子である。ヒト膠芽腫星状細胞腫細胞を、ＬＰＳと組み合わせて、本発明による細菌株を含む組成物で処理し、ＩＬ−６のレベルを調節するそれらの能力を観察した。
【０２２４】
材料及び方法
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
【０２２５】
細胞株
ＭＧ  Ｕ３７３は、悪性腫瘍由来のヒト膠芽腫星状細胞腫であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号０８０６１９０１−１ＶＬ）から購入した。ＭＧ  Ｕ３７３ヒト膠芽腫星状細胞腫細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、４ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、及び１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ−２２７９）中で増殖させた。
【０２２６】
方法
増殖させた後、ＭＧ  Ｕ３７３細胞を、１００，０００個の細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。細胞を、ＬＰＳ（１ｕｇ／ｍＬ）のみまたはＭＲｘ０００５からの１０％の細菌上清と共に、２４時間処理した。細胞を未処置培地でインキュベートした対照でも行った。その後、無細胞上清を回収し、４℃にて３分間、１０，０００ｇで遠心分離した。ＩＬ−６は、製造者の指示に従って、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製のヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号９００−Ｋ１６）を用いて測定した。
【０２２７】
結果
これらの実験の結果を図２Ａに示す。ＬＰＳ及び細菌株による神経芽腫細胞の処置は、ＩＬ−６の分泌レベルの減少をもたらした。
【０２２８】
実施例２Ｂ−細菌接種原がＩＬ−８分泌を調節する効能。
概要
神経炎症は、神経変性疾患に極めて重要な役割を果たし、かつ、ＩＬ−８は、神経肯定的効果を有することが示されているため、本発明の細菌株及びＬＰＳを含む組成物の、ＩＬ−８の活性化に対する効果を評価した。ヒト膠芽腫星状細胞腫細胞を、ＬＰＳと組み合わせて、本発明による細菌株を含む組成物で処理し、ＩＬ−８のレベルを調節するそれらの能力を観察した。
【０２２９】
材料及び方法
細菌株
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＭＲＸ００２９；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＭＲＸ０００５
【０２３０】
細胞株
ＭＧ  Ｕ３７３は、悪性腫瘍由来のヒト膠芽腫星状細胞腫であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号０８０６１９０１−１ＶＬ）から購入した。ＭＧ  Ｕ３７３ヒト膠芽腫星状細胞腫細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、４ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、及び１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ−２２７９）中で増殖させた。
【０２３１】
方法
増殖させた後、ＭＧ  Ｕ３７３細胞を、１００，０００個の細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。細胞を、ＬＰＳ（１ｕｇ／ｍＬ）のみ、またはＭＲＸ００２９由来の１０％の細菌上清と共に２４時間処理した。その後、無細胞上清を回収し、４℃にて３分間、１０，０００ｇで遠心分離した。ＩＬ−８は、製造者の指示に従って、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製のヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号９００−Ｋ１８）を用いて測定した。
【０２３２】
結果
これらの実験の結果を図２Ｂに示す。
【０２３３】
実施例２Ｃ−細菌接種原がα−シヌクレイン誘発炎症を減少させる効能。
概要
神経炎症は、パーキンソン病に極めて重要な役割を果たし、及びα−シヌクレインは、神経炎症をインビボで誘発することが示されている。従って、本発明の細菌株がα−シヌクレイン誘発神経炎症を阻害する能力を評価した。ヒト膠芽腫星状細胞腫細胞及び神経芽腫細胞の共培養を、野生型α−シヌクレイン、並びに変異体アイソフォームＥ４６Ｋ及びＡ５３Ｔに暴露し、本発明による細菌株を含む組成物で処置した。その後、細菌株がＩＬ−６のα−シヌクレイン誘発分泌を阻害する能力を試験した。
【０２３４】
材料及び方法
細菌株
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＭＲＸ００２９；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＭＲＸ０００５
【０２３５】
細胞株
ＭＧ  Ｕ３７３は、悪性腫瘍由来のヒト膠芽腫星状細胞腫であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号０８０６１９０１−１ＶＬ）から購入した。ＭＧ  Ｕ３７３ヒト膠芽腫星状細胞腫細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、４ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、及び１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ−２２７９）中で増殖させた。
【０２３６】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、悪性神経芽細胞腫由来のヒト神経芽腫細胞株であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号９４０３０３０４−１ＶＬ）から購入することができる。細胞を、２ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔアミン、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した５０％のＭＥＭ及び５０％の栄養混合物Ｆ−１２ハム培地中で増殖させた。増殖培地の細胞を、１１，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、インキュベーターに置いた。２日後、培地を分化培地（１％のＦＢＳを含有する増殖培地）及び１０μＭのレチノイン酸に交換した。分化培地を一日おきに交換し、細胞を、分化７日後に使用した。
【０２３７】
方法
ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を、５０，０００個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。細胞を、２ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔアミン、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した５０％のＭＥＭ及び５０％の栄養混合物Ｆ−１２ハム培地中で増殖させた。増殖培地の細胞を、１１，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、インキュベーターに置いた。２日後、培地を分化培地（１％のＦＢＳを含有する増殖培地）及び１０μＭのレチノイン酸に交換した。分化培地を一日おきに交換し、細胞を、分化７日後に使用した。Ｕ３７３を、５０，０００個の細胞／ウェルの密度で１２トランスウェルプレート（０．４μｍのポリエステル膜、Ｃｏｓｔａｒ）に７２時間播種した。細胞を２４時間一緒に共培養した後、分化培地（レチノイン酸無しの１％のＦＢＳを含有する増殖培地）で処理した。
【０２３８】
その後、細胞を、１０％の細菌上清の存在下または不在下で、２５μｇ／ｍｌのα−シヌクレイン（Ｗｔ、Ａ５３Ｔ、Ｅ４６Ｋ）で４８時間処理した。無細胞上清を回収し、４℃にて３分間、１０，０００ｇでスピンダウンし、アリコート化し、−８０℃で保存した。ヒトＩＬ−６及びＩＬ−８は、上述のように測定した。
【０２３９】
結果
これらの実験の結果を図３に示す。野生型α−シヌクレイン並びに変異体アイソフォームＥ４６Ｋ及びＡ５３Ｔによる細胞の処置は、ＩＬ−６の適度な分泌を誘発した。ＩＬ−６のα−ｓｙｎ誘発分泌は、細菌株で処置した細胞で阻害された。
【０２４０】
実施例３−細菌接種原がＮＦκＢ活性化を減少させる効能
概要
ＮＦκＢプロモーターの活性化は、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−１８、ＴＮＦα及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインの産生をもたらす。ＮＦκＢプロモーターは、ＴＬＲ４リガンドを刺激することで、α−シヌクレイン及びＬＰＳによって活性化することができる。α−シヌクレインの突然変異、例えば、α−シヌクレインＡ５３Ｔは、家族性パーキンソンに関与している。ＬＰＳによる神経細胞の処置は、環境因子に起因するパーキンソン病を模擬する。本発明による細菌株を含む組成物がＮＦκＢプロモーターの活性化を阻害する能力を調査した。
【０２４１】
材料及び方法
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
【０２４２】
細胞株
ヒトＨｅｋブルーＴＬＲ４は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号ｈｋｂ−ｈｔｌｒ４）から購入した。ヒトＨｅｋブルーＴＬＲ４を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、４ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔ、ノルモシン及び１×ＨＥＫブルー選択溶液を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ−６１７１）中で増殖させた。
【０２４３】
方法
増殖させた後、ヒトＨｅｋブルー細胞を、２５，０００個の細胞／ウェルで４連で９６ウェルプレートに播種した。一組の細胞を、α−シヌクレインＡ５３Ｔ（１ｕｇ／ｍＬ）のみ、またはＭＲｘ０００５由来の１０％の細菌上清と共に２２時間処理した。第２組の細胞を、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ６１４３）のみ、またはＭＲｘ０００５由来の１０％の細菌上清と共に２２時間処理した。その後、細胞をスピンダウンし、２０ｕｌの上清を２００ｕｌのＱｕａｎｔｉ  Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ−ｑｂ２）と混合し、２時間インキュベートし、吸光度を６５５ｎｍで読み取った。
【０２４４】
結果
これらの実験の結果を図４及び５に示す。図４は、α−シヌクレインによるＮＦκＢプロモーターの活性化が、ＭＲｘ０００５によって阻害されないことを示す。図５は、ＬＰＳによるＮＦκＢプロモーターの活性化が、ＭＲｘ０００５によって阻害されることを示す。
【０２４５】
実施例４−細菌接種原が抗酸化能力を変更する効能
概要
本発明による細菌株を含む組成物が抗酸化能力を変更する能力を調査した。細菌株の抗酸化能力は、周知のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））アッセイを用いて確立した。
【０２４６】
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
【０２４７】
方法
細菌細胞（１０６個またはそれ以上）を回収し、遠心分離した。それらを、アッセイ緩衝液（ペレット体積の３倍を用いて）中で再懸濁した。懸濁液を氷上で５分間超音波処理した後、１２，０００×ｇで１０分間スピンダウンした。上清を除去し、製造者の指示に従って、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈが製造したＡＢＴＳアッセイキット（コードＣＳ０７９０）を用いて測定した。
【０２４８】
結果
これらの実験の結果を図６に示す。図６は、ＭＲｘ０００５が、Ｔｒｏｌｏｘと比較して、おおよそ０．５ｍＭの抗酸化能力を有することを示す。
【０２４９】
実施例５−細菌接種原が脂質過酸化レベルを変更する効能
概要
本発明による細菌株を含む組成物が脂質過酸化レベルを変更する能力を調査した。チオバルビツール酸反応物質アッセイ（ＴＢＡＲ）を使用して、脂質過酸化の副生成物を測定した。
【０２５０】
材料及び方法
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
【０２５１】
方法
細菌細胞（１０６個またはそれ以上）を回収し、遠心分離し、洗浄工程を等張食塩水で行った後、ペレットを塩化カリウムアッセイ緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を氷上で１０分間超音波処理した後、１０，０００×ｇで１０分間スピンダウンした。上清を除去し、脂質過酸化レベルを、チオバルビツール酸反応物質アッセイを用いて評価した。
【０２５２】
結果
実験の結果を図７に示す。図７は、ＭＲｘ０００５が、おおよそ２０％まで脂質過酸化を阻害することができることを示し、これは、陽性対照であるブチル化ヒドロキシトルエン（１％のｗ／ｖ）の抗酸化能力よりも高い。
【０２５３】
実施例６−ヒストン脱アセチル化酵素活性に対する細菌接種原の効能
概要
本発明による細菌株を含む組成物がヒストン脱アセチル化酵素活性を変更する能力を調査した。ヒストン脱アセチル化酵素の調節異常は、加齢による神経変性疾患に関連する病因に関与していた。
【０２５４】
材料及び方法
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
【０２５５】
細胞株
細胞株ＨＴ−２９を使用したのは、ヒストン脱アセチル化酵素が存在するからである。
【０２５６】
方法
定常期細菌培養の無細胞上清は、遠心分離、及び０．２２ｕＭのフィルターの濾過によって単離した。ＨＴ−２９細胞をコンフルエンスの３日後に使用し、実験を開始する２４時間前に１ｍＬのＤＴＳにステップダウンした。ＨＴ−２９細胞を、ＤＴＳで希釈した１０％の無細胞上清でチャレンジし、これを放置して、４８時間インキュベートした。その後、ヌクレアーゼタンパク質を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈヌクレアーゼ抽出キットを用いて抽出し、ＨＤＡＣ活性測定前に試料を急速凍結した。ＨＤＡＣ活性キットは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＫ）キットを用いて蛍光分析的に評価した。
【０２５７】
結果
実験の結果を図８に示す。図８は、ＭＲｘ０００５が、ヒストン脱アセチル化酵素活性のレベルを減少させることができることを示す。
【０２５８】
実施例７−細菌中のインドール産生レベル
概要
本発明の細菌がインドールを産生する能力を調査した。インドールは、炎症及び酸化ストレスの弱毒化に関与していた。
【０２５９】
材料及び方法
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
ＡＴＣＣ  １１７７５は、インドールを産生することが知られる細菌基準株である。
【０２６０】
方法
定常期の無傷細菌細胞を、６ｍＭのトリプトファンで４８時間インキュベートした。酵素トリプトファナーゼを有する細菌種は、インドールを産生する基質として、トリプトファンを利用する。４８時間のインキュベーション期間の後、上清を除去し、コバックの試薬に添加し、インドールを定量化した。標準、原液及び試薬は、社内で検証された標準化法を用いて調製した。
【０２６１】
結果
実験の結果を図９に示す。図９は、ＭＲｘ０００５が、おおよそ０．２ｍＭの濃度で、トリプトファンからインドールを産生する能力を有することを示す。
【０２６２】
実施例８−細菌中のキヌレニン産生レベル
概要
本発明の細菌がキヌレニンを産生する能力を調査した。キヌレニン経路の調節異常は、免疫系の活性化及び潜在的に神経毒性な化合物の蓄積をもたらすことがある。キヌレニン代謝の変化は、パーキンソン病の発症に関与し得る。
【０２６３】
細菌株
７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
ＤＳＭ  １７１３６は、キヌレニンを産生することが知られるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｉｃｏｌａの株である。
【０２６４】
方法
定常期細菌培養の無細胞上清は、遠心分離、及び０．２２ｕＭのフィルターの濾過によって単離し、使用するまで凍結した。キヌレニン標準、原液及び試薬は、社内で検証された標準化法を用いて調製した。試料をトリクロロ酢酸で処理し、１０，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し、９６ウェルプレートに分配した。エールリッヒ試薬をキヌレニン検出に使用し、１：１の比で添加した。
【０２６５】
結果
実験の結果を図１０に示す。図１０は、ＭＲｘ０００５が、おおよそ７０μＭの濃度で、キヌレニンを産生する能力を有することを示す。
【０２６６】
実施例９−神経保護
ＲＡ−分化ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ＭＰＰ＋、ＭＰＴＰの活性代謝物（ＰＤ病理学の特徴のいくつかをインビトロ及びインビボで模倣するために広く使用される化学物質）で処理した。細胞生存率は、ミトコンドリア呼吸の速度で測定した（図１１）。ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９の両方は、著しい効果を示し、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞中のミトコンドリア代謝活性の増加自体を促進する。ＭＲｘ０００５保護は、ＹＣＦＡ−ＭＰＰ＋処理試料と比較して約２０％であり、ケルセチン陽性対照について観察されたものとほぼ同じであった（図１１）。
【０２６７】
実施例１０−代謝産物産生−脳の代謝産物
背景
細菌上清に存在する代謝産物は、酸化ストレス、細胞間通信、及び神経保護に対する宿主反応に直接影響を与え得る。神経学的プロセスで重要な役割を果たす代謝産物は、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９を給餌したマウスの脳組織におけるエクスビボスクリーニング中に測定した。
【０２６８】
方法
動物
ＢＡＬＢｃ（Ｅｎｖｉｇｏ，ＵＫ）成体の雄のマウスを、１２時間の明暗サイクルの下でグループ収容し；標準的なげっ歯類の餌及び水は、自由に取れるようにした。全ての実験は、ユニバーシティカレッジコーク動物倫理実験委員会による承認後の欧州ガイドラインに従って行った。動物は、実験の開始時に８週齢であった。
【０２６９】
研究デザイン
動物は、動物ユニットに到着した後、それらの保持室に１週間慣れさせた。動物は、１５：００〜１７：００に６日間連続で、１×１０９個のＣＦＵの用量で生きた生物学的治療薬の経口強制飼養（２００μＬ用量）を受ける。７日目に、動物を殺し、組織を実験用に収穫した。
【０２７０】
組織回収
動物は、治療及び試験条件に関してランダムに犠牲にした；試料採取は、午前９．００から午後１：００の間に行った。体幹の血液をカリウムＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）チューブに回収し、４０００ｇで１５分間スピンした。血漿を単離し、−８０℃で保存し、さらなる分析を行った。脳を迅速に摘出し、解剖し、各脳領域をドライアイスで急速冷凍し、−８０℃で保存し、さらなる分析を行った。脾臓を切除し、選別直後に処理し、エクスビボ免疫刺激を行った。腸組織（盲腸に最も近い回腸と結腸の２ｃｍ切片を摘出し、盲腸から最も遠い１ｃｍ組織を使用した）を、ウッシングチャンバーに載置し、腸透過性アッセイを行った。盲腸を切除し、秤量し、−８０℃で保存し、ＳＣＦＡ分析を行った。
【０２７１】
モノアミン分析
神経伝達物質濃度は、脳幹からの試料でＨＰＬＣによって分析した。簡単に言うと、内部標準として４ｎｇ／４０μｌのＮ−メチル５−ＨＴ（Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＵＫ）でスパイクした５００μｌの冷却移動相で、脳幹組織を超音波処理した。移動相は、０．１Ｍのクエン酸、５．６ｍＭのオクタン−１−スルホン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．１Ｍのリン酸二水素ナトリウム、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ（Ａｌｋｅｍ／Ｒｅａｇｅｃｏｎ、Ｃｏｒｋ）及び９％（ｖ／ｖ）メタノール（Ａｌｋｅｍ／Ｒｅａｇｅｃｏｎ）を含有し、４Ｎの水酸化ナトリウム（Ａｌｋｅｍ／Ｒｅａｇｅｃｏｎ）を用いてｐＨ２．８に調整した。その後、ホモジネートを、２２，０００×ｇで４℃にて１５分間遠心分離し、４０μｌの上清を、ＳＣＬ  １０−Ａｖｐシステムコントローラー、ＬＥＣＤ  ６Ａ電気化学検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）、ＬＣ−１０ＡＳポンプ、ＣＴＯ−１０Ａオーブン、ＳＩＬ−１０Ａオートインジェクター（４０℃に維持した試料冷却器付き）、及びオンラインＧａｓｔｏｒｒ脱気装置（ＩＳＳ、ＵＫ）からなったＨＰＬＣシステム上に注入した。３０℃で維持した逆相カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ  ２．６ｕ  Ｃ１８  １００×４．６ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を分離（流量０．９ｍｌ／分）に採用した。ガラス状炭素作用電極を、＋０．８Ｖで動作するＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）と組み合わせ、生成したクロマトグラムは、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ  ５ソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析した。神経伝達物質は、試料分析中に一定間隔で実行する標準注入によって決定されるように、それらの特性保持時間によって同定した。分析物対内部標準のピーク高さの比を測定し、標準注入と比較した。結果は、組織の生重量１ｇ当たりのｎｇの神経伝達物質として表した。
【０２７２】
代謝産物分析
ＧＣ代謝物分析の場合、細菌上清の試料を、Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ（ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１０．１０８）に記載されるプロトコルの若干修正したバージョンを用いて、クロロギ酸メチルで誘導体化した。全ての試料は、無作為順序で分析した。四重極検出器（５９９７７Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ）に連結したＧＣ（７８９０Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析を行った。システムは、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって制御した。生データを、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ｎｅｔＣＤＦフォーマットに変換した後、データをインポートし、Ｊｏｈｎｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ（ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｒｏｍａ．２０１７．０４．０５２）に記載されるＰＡＲＡＤＩＳｅソフトウェアを用いて、Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２０１４ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）で処理した。
【０２７３】
脂肪酸分析の場合、試料を、塩酸を用いて酸性化し、重水素標識内部標準を添加した。全ての試料は、無作為順序で分析した。四重極検出器（５９９７７Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ）に連結したＧＣ（７８９０Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ）に設置した高極性カラム（Ｚｅｂｒｏｎ（商標）ＺＢ−ＦＦＡＰ，ＧＣ  Ｃａｐ．Ｃｏｌｕｍｎ  ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を用いて分析を行った。システムは、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって制御した。生データを、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ｎｅｔＣＤＦフォーマットに変換した後、データをインポートし、Ｊｏｈｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｒｏｍａ．２０１７．０４．０５２）に記載されるＰＡＲＡＤＩＳｅソフトウェアを用いて、Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２０１４ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）で処理した。
【０２７４】
結果−神経伝達物質産生
結果を図１２に示す。これは、ＭＲｘ００２９を給餌したマウスの脳において、ノルアドレナリンレベルが、セロトニン及び５−ＨＩＡＡの僅かな増加を伴って増加する（ｐ＝０．０５０７）ことを示す。これらのデータは、以下に記載の代謝産物分析を支持し、ＭＲｘ０００２９が、公知の酸化防止剤（Ｗｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）である４−ヒドロキシフェニル酢酸の主要な産生物質であることを示唆する。より重要なことは、４−ヒドロキシフェニル酢酸は、ドーパミン及びノルエピネフリンの合成中間体であり、重要な生物活性分子である（Ｈｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅｓｅ  ２０１５）。実際に、ＰＤでは、退行性変化は、ドーパミン作動性システムを超えて広がり、セロトニン作動性及びノルアドレナリン作動性システムに等しく影響し、線条体及び線条体外構造の両方において、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）及びノルアドレナリン（ノルエピネフリン）のレベルの低減をさらにもたらす（Ｓｃａｔｔｏｎ  Ｂ，Ｊａｖｏｙ−Ａｇｉｄ  Ｆ，Ｒｏｕｑｕｉｅｒ  Ｌ，Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ，Ａｇｉｄ  Ｙ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９８３  Ｓｅｐ  ２６；２７５（２）：３２１−８．）。Ｌ−ＤＯＰＡは、ＰＤのドーパミン関連特徴を主に標的にするが、５−ＨＴ及びノルアドレナリンの両方における低下に対処しない。これを添加することは、Ｌ−ＤＯＰＡ治療の継続期間が長いほど、運動及び非運動合併症（例えば、ジスキネジア、精神症状）の範囲がより明確になるということである（Ｈｅｌｙ  ＭＡ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＧ，Ｒｅｉｄ  ＷＧ，Ｔｒａｆｆｉｃａｎｔｅ  Ｒ，Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００５  Ｆｅｂ；２０（２）：１９０−９．）。従って、これらのデータは、有機酸、例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸またはコハク酸を産生する細菌が、治療、特に、神経変性疾患の治療において有用であり得ることを示す。
【０２７５】
細菌上清に存在する代謝産物は、酸化ストレス、細胞間通信、及び特定の神経保護に対する宿主反応に直接影響を与えることができる。ＭＲＸ００２９及びＭＲＸ０００５の培養の上清中の代謝産物を分析し、結果を図１３に示す。
【０２７６】
いくつかの代謝産物は、分析した２つの株の間で顕著な違いを示した。コハク酸の濃度は、ＭＲｘ０００５で特に上昇した。興味深いことに、４−ヒドロキシフェニル酢酸の試料／培地の比は、ＭＲｘ００２９で有意に高かった（図１３）。
【０２７７】
上清中の脂肪酸分析により、２つの株において興味深い両断論理を明らかにした：直鎖及び分枝鎖形態の両方において、ＭＲｘ０００５は、酢酸及びプロパン酸を主に産生した一方、ＭＲｘ００２９は、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸を産生した（図１４Ｂ）。２つの株は、非常に異なって見え、特に、それぞれ、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９によるコハク酸及び４−ヒドロキシフェニル酢酸の産生が顕著であった（図１４Ａ）。さらに、ＭＲｘ０００５は、Ｃ２及びＣ３短鎖脂肪酸をより多く産生するようである一方、ＭＲｘ０００２９は、Ｃ４（酪酸）及び直鎖及び分枝鎖の両方の中鎖脂肪酸、例えば、ヘキサン酸をより多く産生した。
【０２７８】
コハク酸は、酸化的リン酸化に関与するクレブスサイクル代謝産物である。酸化的リン酸化複合体は、タンパク質及び小胞を近位及び遠位領域にシナプス輸送する重要なステップである（Ｂｕｄｄ  ＳＬ  ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，１９９８）。その機能不全は、アルツハイマー病、パーキンソン病及び脊髄小脳変性症１型を含む神経変性障害において報告されている（Ｍａｎｃｚａｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｅｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。これらの知見は、コハク酸が、ミトコンドリア活性を増加し、誤って折り畳まれたタンパク質に関係する神経変性疾患、例えば、ＰＤにおいて脆弱なニューロンを支持するために特に興味深い（Ｆｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ，２０１７）。ＢＤＮＦ及びコハク酸は両方とも、神経変性だけでなく、ＰＤまたはＡＤと診断された患者で非常に一般的なうつ病及び不安などの精神障害において同様の保護活性を有する。
【０２７９】
図１４Ｂは、ＭＲＸ００２９が、酪酸（ブタン酸）産生物質であることも示す。これは、酪酸が、血液脳関門の不透過性の減少（これは、神経保護効果を有する）において公知の役割を有するため、重要であり得る［５９］。ＭＲｘ００２９（及び他の神経保護細菌）のこの性質は、その効能に寄与し得る。
【０２８０】
実施例１１−タイトジャンクションタンパク質のｍＲＮＡ発現の調節
腸の機能不全及び炎症が、ＰＤに関連する非運動症状であることを近年のエビデンスが示唆しているため、本発明の細菌株がいずれかの腸バリア機能不全を引き起こす能力を調査した。ＨＴ２９−ｍｔｘ上皮、ムチン産生細胞単層（Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３）をインビトロモデルとして使用し、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９による処理を行った後に、腸バリア機能障害及び免疫刺激を評価した。ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）に暴露した分化ＨＴ２９−ｍｔｘ細胞は、著しい量のＩＬ−８を分泌した；これに対して、ＭＲｘ００５及びＭＲｘ００２９細菌上清による２４時間治療は、未処置及びＹＣＦＡ処置細胞の両方と比較して、ＩＬ−８のさらに低い分泌を誘発した（図１４Ａ）。
【０２８１】
その後、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９が、腸バリア形成に関与するタンパク質の発現及び局在化に関与する細胞内シグナル伝達を調節することによって上皮透過性を調節する能力を調査した。
【０２８２】
ＲＮＡを単離し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を行って、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９でインキュベーション中にタイトジャンクションタンパク質の遺伝子発現の変化を特徴付けた。ＭＲｘ００２９の投与は、インキュベーションの２時間後に、オクルディン、ビリン、タイトジャンクションタンパク質１及び２（それぞれ、ＴＪＰ１及びＴＪＰ２）のｍＲＮＡ発現を増強した（図１４Ｂ）。これに対して、ＭＲｘ０００５への暴露は、タイトジャンクションタンパク質の遺伝子発現を変更せず、２つの株が腸バリアで差別的に作用することを示唆している。
【０２８３】
インビトロ結果を、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９を給餌したマウスの腸におけるエクスビボ並行分析からのデータと比較した。ＴＪＰ２及びオクルディンの遺伝子発現を結腸及び回腸で定量化した。ＭＲｘ００２９は、ネズミ腸の結腸領域においてＴＪＰ１及びオクルディンを有意（ｐ＝０．０７３）に上方制御することができたため、エクスビボデータは、インビトロデータを完全に反映する（図１４Ｃ＋１４Ｄ）。また、ＭＲｘ００２９は、同じマウスの結腸における透過性機能を低下させることができた（図１４Ｅ＋１４Ｆ）。
【０２８４】
材料及び方法−ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析
総ＲＮＡは、製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＪＵＫ）を用いて抽出し、ＲＮＡ濃度は、分光光度計（ナノドロップＮＤ−１０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて、２６０／２８０ｎｍの吸光度で決定した。ｍＲＮＡ発現分析の場合、ｃＤＮＡは、製造者の指示に従って、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ）を用いて、２０００ｎｇの総ＲＮＡから調製した。逆転写反応は、２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、及び８５℃で５分間、Ｔｈｅｒｍｏ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲアッセイによって複製して増幅し、標準化プロファイル（サイクル前の熱変性：９５℃で１０分間、４０サイクル熱変性：９５℃で１０秒、及びアニーリング／伸長：６０で３０秒）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）で産生物を検出した。４０サイクル後に解離段階を加え、融解曲線を生成した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．２を用いて分析を行った。アクチン、バリン、オクルディンＴＪＰ１及びＴＪＰ２のプライマー配列を、配列表に提供する。
【０２８５】
実施例１２−ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞中のＢＤＮＦ分泌のレベル
背景
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、神経発達、神経保護及び神経再生に関連する、脳の遍在分子である。ＢＤＮＦは、神経変性に対して保護するだけでなく、ＰＤまたはＡＤと診断された患者の中で非常に一般的なうつ病及び不安のような精神障害に対しても保護する。
【０２８６】
方法
ＳＨ−ＳＹ５−ＳＹを、６０，０００個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、インキュベーターに置いた。２４時間後、培地を分化培地（１％のＦＢＳを含有する増殖培地）及び１０μＭのレチノイン酸に交換した。分化培地を一日おきに交換し、分化の１０日目に細胞を使用した。治療のために、分化培地を除去し、４５０ｕｌの完全増殖培地と交換し、５０μｌの細菌ＳＮを処置ウェルに添加し、またはＹＣＦＡ＋を陰性対照として添加した。
【０２８７】
結果
結果を図１５に示し、レチノイン酸と組み合わせたＭＲＸ０００５の投与が、分化神経芽腫細胞由来のＢＤＮＦの分泌を増加させることを示す。
【０２８８】
実施例１３−細菌接種原が細胞中の酸化レベルを減少させる効能
背景
活性酸素種の生成は、神経変性疾患の病態に寄与する。細菌株が、ｔ−ブチル過酸化水素（ＴＢＨＰ）による治療によって生成された活性酸素種（ＲＯＳ）から、分化ＳＨＳＹ−５Ｙ及びＵ３７３細胞を保護する能力を調査した。
【０２８９】
材料及び方法
細菌株
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＭＲＸ００２９
【０２９０】
方法
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、５０００個の細胞／ウェルの密度で黒色丸底９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターに置いた。２４時間後、培地を、分化培地（１％のＦＢＳを含有する増殖培地）及び１０μＭのレチノイン酸に交換した。分化培地を一日おきに交換した。１０日目に、分化培地を除去し、細胞を予熱ＰＢＳで洗浄し、１％のＦＢＳを含有する増殖培地中で２０分間、１０ｕＭのＤＣＦＤＡ分子プローブで染色した。その後、細胞を予熱ＰＢＳで再び洗浄し、１０％の細菌上清の存在下または不在下で、１００ｕＭのＴＢＨＰで２時間処理した。蛍光強度は、Ｅｘ／Ｅｍ４８５／５３０ｎｍで、ＴＥＣＡＮプレートリーダーを用いて測定した。
【０２９１】
結果
実験の結果を図１６に示す。図１６ｂは、ＭＲＸ０００５が、分化ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽腫細胞中のＲＯＳ産生を阻害することができることを示す。ＭＲＸ０００５は、星状膠芽腫細胞中のＲＯＳの生成を低下させる（図１６ａ）。これは、ＭＲＸ０００５が、一般的な抗酸化活性を有することを示す。
【０２９２】
実施例１４−安定性試験
本明細書に記載されている少なくとも１つの細菌株を含有する本明細書に記載されている組成物を、２５℃または４℃の密閉容器に貯蔵し、容器を３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％の相対湿度を有する雰囲気に置く。１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、１年、１．５年、２年、２．５年または３年後、標準のプロトコルによって決定されるコロニー形成単位で測定したとき、細菌株の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が残存する。
【０２９３】
実施例１５
方法
動物
使用した動物及び研究デザインは、実施例１０と同じであった。
【０２９４】
細菌株
・７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＭＲＸ００５）
・Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＭＲＸ００２９）
【０２９５】
組織回収
動物は、治療及び試験条件に関してランダムに犠牲にした；試料採取は、午前９．００から午後２：３０の間に行った。体幹の血液をカリウムＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）チューブに回収し、４０００ｇで１５分間スピンした。血漿を単離し、−８０℃で保存し、さらなる分析を行った。脳を迅速に摘出し、解剖し、各脳領域をドライアイスで急速冷凍し、−８０℃で保存し、さらなる分析を行った。脾臓を切除し、５ｍＬのＲＰＭＩ培地（Ｌ−グルタミン及び重炭酸ナトリウム、Ｒ８７５８  Ｓｉｇｍａ＋１０％のＦＢＳ（Ｆ７５２４，Ｓｉｇｍａ）＋１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｐ４３３３，Ｓｉｇｍａ）を有する）中で回収し、選別直後に処理し、エクスビボ免疫刺激を行った。腸組織（盲腸に最も近い回腸と結腸の２ｃｍ切片を摘出し、盲腸から最も遠い１ｃｍ組織を使用した）を、ウッシングチャンバーに載置し、腸透過性アッセイを行った。盲腸を切除し、秤量し、−８０℃で保存し、ＳＣＦＡ分析を行った。
【０２９６】
モノアミン分析
神経伝達物質濃度は、実施例１０に記載されるように分析した。
【０２９７】
脾臓サイトカインアッセイ
犠牲にした後、脾臓を５ｍＬのＲＰＭＩ培地中で直ちに回収し、直ちに培養した。脾臓細胞をこのＲＰＭＩ培地でまず均質化した後、１ｍＬのＲＢＣ溶解培養液（１１８１４３８９００１  ＲＯＣＨＥ，Ｓｉｇｍａ）で５分間インキュベートした。１０ｍＬのＲＰＭＩ培地をさらに添加した後、２００Ｇで５分間遠心分離した。その後、上清を、４０ｕｍ濾過器を通じて濾過した。細胞を計数し、（４，０００，０００／ｍＬ培地）播種した。適応の２．５時間後、細胞をリポ多糖（ＬＰＳ−２μｇ／ｍｌ）またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ−２．５μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。刺激後、上清を収穫し、炎症性パネル１（マウス）Ｖ−ＰＬＥＸキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、ＣＸＣＬ２、及びＩＬ６のサイトカイン放出を評価した。ＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ  １２０、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００、ＳＥＣＴＯＲ  Ｓ  ６００を用いて、分析を行った。
【０２９８】
遺伝子発現分析
総ＲＮＡを、製造者の推奨に従って、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ／Ｌｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅ処理した（Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ，Ａｍｂｉｏｎ／ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて定量化した。ＲＮＡ品質を、製造者の手順に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ，ＵＫ）を用いて評価し、ＲＮＡ品質数値（ＲＩＮ）を算出した。ＲＩＮ値＞７を有するＲＮＡを、その後の実験に使用した。ＲＮＡを、製造者の指示に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ高容量ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。簡単に言うと、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素（５０Ｕ／μＬ）（１）（２）（１）（１０）を、ＲＴマスターミックスの一部として添加し、２５℃で１０分間、３７℃で２時間、８５℃で５分間インキュベートし、４℃で保存した。定量的ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによってマウス特異的標的遺伝子に対して設計されたプローブ（６カルボキシフルオレセイン−ＦＡＭ）を用いた一方、内在性対照としてβ−アクチンを用いて実行した。増幅反応は、１μｌのｃＤＮＡ、５μｌの２×ＰＣＲマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）、９００ｎＭの各プライマーを含有し、無ＲＮａｓｅ水を添加することで、合計で１０μｌにした。全ての反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム上で、９６ウェルプレートを用いて三連で行った。熱サイクル条件は、製造者（Ｒｏｃｈｅ）の推奨通りに、５５サイクルであった。アンプリコン汚染を確認するため、各ランは、使用したプローブごとに、テンプレート対照を三連で含まなかった。サイクル閾（Ｃｔ）値を記録した。β−アクチンを用いてデータを正規化し、２−ΔΔＣＴ法を用いて変換し、対照群に対する倍数変化として提示した。
【０２９９】
盲腸内容における短鎖脂肪酸分析
盲腸内容を混合し、ＭｉｌｌｉＱ水でボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。遠心分離（１００００ｇ、５分、４℃）によって上清を得、細菌及び他の固体をペレットにし、０．２μｍで濾過した。それを透明なＧＣバイアルに移し、２−エチル酪酸（Ｓｉｇｍａ）を内部標準として使用した。ＳＣＦＡの濃度は、Ｖａｒｉａｎ  ３５００  ＧＣ炎イオン化システムを用いて分析し、ＺＢ−ＦＦＡＰカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に適合させた。標準曲線は、酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、ｎ−酪酸塩、イソ吉草酸塩及び吉草酸塩を含有する、異なる濃度の標準ミックスで構築した（Ｓｉｇｍａ）。ピークは、Ｖａｒｉａｎ  Ｓｔａｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎバージョン６．０ソフトウェアを用いて統合した。全てのＳＣＦＡデータは、μｍｏｌ／ｇとして表す。
【０３００】
統計分析
正規分布データは、平均±ＳＥＭとして提示し；ノンパラメトリックデータセットは、四分位範囲を有する中央値として提示する。独立両側ｔ検定を適用し、パラメトリックデータを分析し、マン・ホイットニー検定をノンパラメトリックに使用した。スピアマンの順位相関係数を、プールデータセットにおける相関分析に採用した。ｐ値＜０．０５は、全ての場合において有意と見なされた。
【０３０１】
結果−神経伝達物質産生
図１７の結果は、マウス脳における神経伝達物質の濃度に対するＭＲｘ００５治療の効果を示す。最も注目すべきは、ＭＲｘ００５による治療は、ドーパミンの減少をもたらす。
【０３０２】
結果−遺伝子発現
神経伝達物質受容体［セロトニン受容体１ａ（５−ＨＴＲ１ａ）、ドーパミンＤ１受容体、ＧＡＢＡ受容体サブユニットＢ１、ＧＡＢＡＡ受容体、ＮＭＤＡ２Ａ（Ｇｒｉｎ２Ａ）及びＮＭＤＡ２Ｂ（Ｇｒｉｎ２ｂ）受容体］、炎症マーカー［ＩＬ−１β、ＩＬ６、ＣＤ１１ｂ、ＴＮＦα及びＴＬＲ４］、及び内分泌マーカー［コルチコステロン放出因子（ＣＲＦ）、コルチコステロン放出因子受容体１及び２（ＣＲＦＲ１、ＣＲＦＲ２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、バソプレシン受容体、オキシトシン受容体、糖質コルチコイド受容体、及び鉱質コルチコイド受容体］の遺伝子の発現を、海馬、扁桃体、及び前頭前皮質由来の脳組織で分析した。
【０３０３】
図１８〜３２は、海馬、扁桃体、及び前頭前皮質におけるＭＲＸ００５またはＭＲＸ００２９治療後の遺伝子発現の変化を示す。ＭＲｘ００２９による治療は、扁桃体における糖質コルチコイド受容体発現の増加をもたらした（図２５Ｃ）。図２６Ａは、ＭＲｘ００５による治療が、扁桃体におけるＢＤＮＦの発現を有意に増加させた一方、ＭＲｘ００２９による治療が、扁桃体におけるＴＬＲ４の発現を有意に増加させたことを示す（図２６Ｂ）。
【０３０４】
ＭＲｘ００５及びＭＲｘ００２９の両方が、扁桃体におけるＣＤ１１ｂの発現を増加させることができる（図２７Ａ）一方、ＩＬ−６、Ｇｒｉｎ２ａ及びＧｒｉｎ２ｂの発現は、ＭＲｘ００５治療後に減少する（図２７Ｂ〜２７Ｄ）。加えて、ＭＲｘ００５及びＭＲｘ００２９は、扁桃体におけるＧＡＢＲＡ２の発現及びＧＡＢＢＲ１の発現を有意に増加させた。
【０３０５】
ＭＲｘ００５による治療は、前頭前皮質におけるＢＤＮＦの発現の有意な増加をもたらした（図２９Ｂ）。
【０３０６】
議論
ＭＲｘ００５及びＭＲｘ００２９の投与は、特に、扁桃体における遺伝子発現の変化を引き起こした。
【０３０７】
結果−Ｔｐｈ１及びＩＤＯ−１発現に対する効果
図３３は、ＭＲｘ００２９が、結腸においてトリプトファンヒドロキシラーゼ−１（Ｔｐｈ１）の発現を有意に増加させることができ、ＭＲＸ００５治療が、結腸においてＩＤＯ−１の発現を増加させることができることを示す。ＭＲＸ００５による治療は、回腸においてＴｐｈ１及びＩＤＯ１の発現を増加させた一方、ＭＲＸ０２９は、回腸においてこれらの遺伝子の発現に対する効果を有さなかった（図３４）。
【０３０８】
インドールアミン−ピロール２，３−ジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ−１）は、トリプトファン／キヌレニン経路における第１及び律速酵素である一方、トリプトファンヒドロキシラーゼ１（Ｔｐｈ１）（酵素トリプトファンヒドロキシラーゼのアイソフォーム）は、セロトニンの合成を担う。これらのデータは、ＭＲｘ００２９及びＭＲｘ００５が、セロトニンレベル及びトリプトファン／キヌレニン経路に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０３０９】
結果−トリプトファン代謝産物レベルに対する効果
図３５は、循環キヌレニン及びトリプトファンのレベルに対するＭＲｘ００５による治療の効果を示す。
【０３１０】
結果−脾細胞由来のサイトカイン発現に対する効果
エクスビボ脾細胞アッセイは、脾細胞（脾臓−免疫防御に関与する主臓器から単離した細胞）を、細菌またはウイルス模倣体チャレンジでチャレンジすることを伴う。
【０３１１】
ＭＲＸ００５は、ＬＰＳによるチャレンジ後に、脾細胞におけるインターフェロン−γのレベルを有意に減少させた（図３６）。加えて、ＭＲＸ００５は、ＬＰＳによるチャレンジ後に、インターロイキン−６及び腫瘍壊死因子のレベルを減少させた（それぞれ、図３８及び３９）。ＭＲｘ００２９による治療は、ＬＰＳによるチャレンジ後に、インターフェロン−γ、インターロイキン−１β、及びインターロイキン−６の減少をもたらした（それぞれ、図３６、３７、及び３８）。
【０３１２】
ＭＲｘ００５及びＭＲｘ００２９による治療は、化学誘引物質ＣＸＣＬ１のレベルの増加をもたらした（図４１）。
【０３１３】
結果−盲腸の短鎖脂肪酸レベルに対する効果
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、食事由来の非消化性繊維が消化管内の細菌によって発酵すると産生される。ＭＲＸ００５投与の効果を図４２に示す。
【０３１４】
実施例１６−遺伝子発現レベルにおけるＭＲＸ０２９及びＭＲＸ００５変化のさらなる分析
方法
細胞株
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞
【０３１５】
細菌株
・７５５：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＭＲＸ００５）
・Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＭＲＸ００２９）
【０３１６】
ｑＰＣＲ
ＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０ｃｍのペトリ皿に、２×１０６個の細胞の密度で播種した。２４時間後、細胞を、１０％の細菌上清またはＹＣＦＡ＋、１０ｕＭのＲＡ、２００ｕＭのヘキサン酸または２００ｕＭのバルプロ酸を有する分化培地（ＲＡ無しで１％のＦＢＳを含有する増殖培地）で１７時間処理した。その後、代表的な画像を、位相差ＥＶＯＳ  ＸＬコア顕微鏡を用いて、４０×／０．６５の倍率で撮影した。細胞を回収し、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキットプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って単離した。ｃＤＮＡは、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作製した。遺伝子発現は、ｑＰＣＲを用いて測定した。ＧＡＰＤＨは、内部対照として使用した。倍数変化は、２（−ΔΔｃｔ）法に従って算出した。ＭＡＰ２、ＤＲＤ２、ＧＡＢＲＢ３、ＳＹＰ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、及びＮＳＥのプライマー配列を配列表に提供する。
【０３１７】
免疫標識及び細胞イメージング
細胞を、５×１０４個の細胞／ウェルで８ウェルチャンバースライド（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｌａｓｓｗａｒｅ）上に一晩播種し、１０％の細菌上清と共に２４時間処理した。分化の場合、細胞を１０ｎＭのＲＡで５日間処理した後、無細胞細菌上清で２４時間処理した。その後、細胞を、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで、室温（ＲＴ）にて２０分間固定した。固定細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過性にした。ＰＢＳで洗浄後、スライドを、遮断緩衝液（４％のＢＳＡ／ＰＢＳ）で室温にて１時間インキュベートした後、１％のＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した抗ＭＡＰ２抗体またはβ３−チューブリン（それぞれ、ｓｃ−７４４２１及びｓｃ−８０００５，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）を４℃で１２時間添加した。次いで、それらをＰＢＳで２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８結合抗マウス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５９４結合ファロイジン（ａｂ１７６７５７、Ａｂｃａｍ）で室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、スライドを、ＤＡＰＩで染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を載せた。使用した蛍光色素の検出に好適な６３×／１．２のＷ  Ｋｏｒｒ対物レンズ及びフィルターセットを備えたＡｘｉｏｓｋｏｐ  ５０顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、スライドを観た。ＭＡＰ−２で免疫標識した画像のデジタル取得のためのマニュアル露出時間を一定に保つことで、異なるウェル及び治療間の比較をすることができた。ファロイジン（Ｆ−アクチン）及びＤＡＰＩ露出時間は、視野に適するように変更した。無作為視野は、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアによって制御されたＱＩｍａｇｉｎｇカメラを用いて取得した。画像は、ＴＩＦファイルとして保存し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＣ  ２０１５．１．２で開いた。その後、ＭＡＰ−２、ＤＡＰＩの画像、及びファロイジン画像のオーバーレイを重ねて、合成した。代表的な画像を選択し、調べたタンパク質の存在度及び位置の差を示した。
【０３１８】
イムノブロット法
上述の示された条件下で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＭＲｘ０００５及びＭＲｘ００２９で２４時間処理した後、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＵＫ）のカクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて推定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。その後、膜を、５％の脱脂粉乳または５％のＢＳＡで遮断し、一次抗体（それぞれ、ＭＡＰ２及びβ３−チューブリン）で４℃にて一晩インキュベートした。次いで、ブロットを適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体でインキュベートし、タンパク質を化学発光検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で検出した。ＭＡＰ２及びβ３−チューブリンの両方とも、β−アクチンは、試料中のタンパク質ローディング変動性を監視するための対照として機能した。
【０３１９】
結果及び議論
遺伝子発現
図４３は、アクチン、バリン、オクルディンＴＪＰ１、ＴＪＰ２、ＭＡＰ２、ＤＲＤ２、ＧＡＢＲＢ３、ＳＹＰ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、及びＮＳＥの発現レベルのＭＲｘ００２９及びＭＲＸ００５誘発変化を示す。
【０３２０】
結果−顕微鏡検査及びイムノブロット法
図４４は、共焦点顕微鏡によって決定されるように、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞中のＭＡＰ２の発現レベルの変化を示す。ＭＡＰ２及びＢ３−チューブリンの発現レベルは、イムノブロット分析によっても定量化した。図４４Ｍ及び４４Ｎに示す結果は、ＭＲＸ０２９が、ＭＡＰ２の発現レベルの増加を誘発することを示す。
【０３２１】
配列
ｑＰＣＲに使用したさらなるプライマー（括弧内は、配列番号）
0006840272.tif 000002
【０３２２】
配列
配列番号１（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  ５８２５−ＡＢ２３８９２２のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ遺伝子）
0006840272.tif 000003
0006840272.tif 000004
配列番号２（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  １３４００−ＡＢ２３８９２３のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ遺伝子）
0006840272.tif 000005
配列番号３（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  １３４０１−ＡＢ２３８９２４のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ遺伝子）
0006840272.tif 000006
配列番号４（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  １３４０２−ＡＢ２３８９２５のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ遺伝子）
0006840272.tif 000007
配列番号５（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  １３４０３−ＡＢ２３８９２６のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ遺伝子）
0006840272.tif 000008
配列番号６（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  １３４０４−
0006840272.tif 000009
配列番号７（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  ９４９７−ＡＢ２３８９２８のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ遺伝子）
0006840272.tif 000010
配列番号８（１６Ｓ  リボソームＲＮＡ、部分配列、株：ＪＣＭ  １３４０５−ＡＢ２３８９２９のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ遺伝子）
0006840272.tif 000011
配列番号９（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ株７５５のコンセンサス１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列）
0006840272.tif 000012
配列番号１０（株７５５ゲノム配列）−電子配列表を参照されたい。
配列番号１１（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株ＭＲＸ００２９のコンセンサス１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列）
0006840272.tif 000013
ｑＰＣＲに使用したプライマー（括弧内は、配列番号）
0006840272.tif 000014
【０３２３】
参照文献
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［３］Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．３（１２）：１０２１−３５
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［２０］  ＷＯ２０１６／２０３２２０
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［２２］Ｓａｋａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｏ（２００６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（Ｐｔ  ７）：１５９９−６０５．
［２３］Ｍａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６：５５７−５６３．
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［２６］Ｄａｎｉｅｌｅ  ＳＧ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２０１５，８（３７６）：ｒａ４５
［２７］Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ  ２２：５８９−６０５．
［２８］Ｆｏｇｕｅｍ  ＆  Ｍａｎｃｋｏｕｎｄｉａ（２０１８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１８：２４
［２９］Ｌｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．１６（３）：２９７−３０９．
［３０］Ｇａｌｐｅｒｎ  ＆  Ｌａｎｇ（２００６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ５９（３）４４９−４５８
［３１］Ｚａｄｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，１１９，２，２７５−２８３
［３２］Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８７：３８９−３９７
［３３］Ｐｉｒｏｏｚｎｉａ  ａｎｄ  Ｅｌｅｆａｎｔ（２０１３）Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：３０．
［３４］Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ，６（１０）．
［３５］Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＰＮＡＳ  １１２（９）：２５８３−２８５８
［３６］Ｐｓａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＪＡＭＡ，２８９（１９）：２５３４−４４
［３７］Ｌａｎｃｅｔ．（１９９５）３４６（８９９１−８９９２）：１６４７−５３
［３８］Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，９−２４．
［３９］Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｄａｙ  ａｎｄ  ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．
［４０］Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，３５９２−３５９７．
［４１］Ｍｉｔｒｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ．（２０１３）７１６８６１．
［４２］Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（２）：３９−４８．
［４３］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ  Ｗａｄｅ  ａｎｄ  ＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒ
［４４］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）
［４５］ＵＳ  ２０１６／００６７１８８
［４６］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）Ｒｏｎａｌｄ  Ａｔｌａｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．
［４７］Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（１９９６）Ｊｅｎｎｉｅ  Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ−Ｃｅｖｅｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
［４８］Ｓｔｒｏｂｅｌ（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５８１：２４７−６１．
［４９］Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２．
［５０］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）．
［５１］Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
［５２］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
［５３］Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）．
［５４］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）
［５５］Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）（２００２）Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）．
［５６］ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ  ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）
［５７］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０
［５８］Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９．
［５９］Ｍｉｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ（２０１６）Ａｎｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．４（１）：１５．
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【配列表】
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