(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５５８番目のアルギニン（arginine）アミノ酸残基がヒスチジン（histidine）、アラニン（alanine）、もしくはグルタミン（glutamine）に、又は５６１番目のグリシン（glycine）アミノ酸残基がアルギニン（arginine）もしくはチロシン（tyrosine）に置換された、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する変異型ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５５８番目のアルギニンがヒスチジン、アラニン、又はグルタミンに置換され、５６１番目のグリシンがアスパラギン酸（aspartic acid）、アルギニン又はチロシンに置換された、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチド。
【請求項３】
前記変異型ポリペプチドは、配列番号２１〜２３、及び２５〜３５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の変異型ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号３６〜３８、及び４０〜５０からなる群から選択される塩基配列からなる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドを含む、Ｌ−ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された、Ｌ−ロイシンを生産するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項６に記載の微生物。
【請求項９】
（ａ）請求項６に記載のＬ−ロイシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養してＬ−ロイシンを生産するステップと、
（ｂ）前記微生物又は培養培地からＬ−ロイシンを回収するステップとを含む、
Ｌ−ロイシンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する新規変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドを含む微生物、及び前記微生物を培養してＬ−ロイシンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−ロイシンは、必須アミノ酸の一種であって、医薬、食品、飼料添加物、工業薬品などに広範囲に用いられる高価なアミノ酸であり、主に微生物を用いて生産される。Ｌ−ロイシンが含まれる分枝鎖アミノ酸の発酵生産は、主にエシェリキア属微生物又はコリネバクテリウム属微生物により行われ、ピルビン酸から様々な段階を経て２−ケトイソカプロン酸（2-ketoisocaproate）を前駆体として生合成されることが知られている（特許文献１，２）。
【０００３】
前記ロイシン生合成に関与する酵素であるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase, 以下、「ＩＰＭＳ」という）は、バリン生合成経路で生成される２−ケトイソ吉草酸（2-ketoisovalerate）をバリンに変換するのではなく、ロイシン生合成に必要なイソプロピルリンゴ酸（isopropylmalate）に変換するロイシン生合成の第１段階酵素であり、ロイシン生合成過程において重要な酵素である。しかし、前記ＩＰＭＳは、最終産物であるＬ−ロイシン又はその誘導体によるフィードバック阻害を受ける。よって、高濃度のロイシン生産を目的としてフィードバック阻害を解除したＩＭＰＳ変異体に関する様々な先行技術が存在するが（特許文献３，４）、依然としてよりよい変異体を見出すための研究は続けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０２２００１８号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０４３８１４６号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１５／００７９６４１号明細書
【特許文献４】米国特許第６４０３３４２号明細書
【特許文献５】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報
【特許文献６】国際公開第２００８／０３３００１号
【特許文献７】韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報
【特許文献８】国際公開第２００６／０６５０９５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)
【非特許文献２】Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25
【非特許文献３】Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38
【非特許文献４】Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11: 856-64
【非特許文献５】Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302: 93-102 (2000)
【非特許文献６】Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726 (1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、高濃度のＬ−ロイシン生産に用いることができるＩＭＰＳ変異体を開発すべく鋭意努力した結果、新規なＩＭＰＳ変異体を開発した。前記変異体は、最終産物であるＬ−ロイシンに対するフィードバック阻害が解除され、活性も強化され、それを含む微生物から高収率でＬ−ロイシンを生産できることを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する新規変異型ポリペプチドを提供することを目的とする。
【０００８】
また、本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本出願は、前記ポリペプチドを含む、Ｌ−ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養してＬ−ロイシンを生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１１】
本出願の新規なイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、野生型イソプロピルリンゴ酸シンターゼに比べて活性が増加し、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたものであり、それを用いてＬ−ロイシンを高収率で大量生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）活性を有する新規変異型ポリペプチドである。前記新規変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがアルギニン以外の他のアミノ酸残基に、又は５６１番目のグリシンアミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドであってもよい。本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）の活性を有するポリペプチドに比べて活性が高いだけでなく、Ｌ−ロイシンに対するフィードバック阻害が解除されていることを特徴とする。
【００１３】
本出願における「イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）」とは、２−ケトイソ吉草酸（2-ketoisovalerate）をアセチルＣｏＡと反応させてＬ−ロイシンの前駆体の１つであるイソプロピルリンゴ酸（isopropylmalate）に変換する酵素である。本出願におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼは、前記変換活性を有する酵素であればいかなる微生物由来であってもよく、具体的にはコリネバクテリウム属微生物由来の酵素であってもよい。また、イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のイソプロピルリンゴ酸シンターゼであってもよく、具体的には配列番号１のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、前記イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。例えば、このような相同性を有し、イソプロピルリンゴ酸シンターゼに相応する効果を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
【００１４】
本出願における「イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性増加」とは、イソプロピルリンゴ酸への変換活性の増加を意味するので、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号１のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を有するポリペプチドに比べて、より高いレベルのイソプロピルリンゴ酸変換活性を有する。前記イソプロピルリンゴ酸変換活性は、生成されるイソプロピルリンゴ酸のレベルを測定して直接確認してもよく、生成されるＣｏＡのレベルを測定して間接的に確認してもよい。本出願における「活性増加」は「活性強化」と混用される。さらに、イソプロピルリンゴ酸はＬ−ロイシンの前駆体の１つであるので、本出願の変異型ポリペプチドを用いると、配列番号１のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を有するポリペプチドに比べて、結果としてより高いレベルでＬ−ロイシンを生産することができる。
【００１５】
また、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号１のイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を有するポリペプチドとは異なり、最終産物であるＬ−ロイシン又はその誘導体によるフィードバック阻害が解除されていることを特徴とするものであってもよい。本出願における「フィードバック阻害（feedback inhibition）」とは、酵素系の最終産物がその酵素系の初期段階での反応を阻害することを意味する。これらに限定されるものではないが、本出願の目的上、前記フィードバック阻害は、Ｌ−ロイシン又はその誘導体がその生合成経路の第１段階を媒介するイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を阻害することであってもよい。よって、イソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害を解除すると、そうでないものに比べてＬ−ロイシンの生産性を向上させることができる。
【００１６】
本出願における「変異」、「変異型」又は「変異体」とは、遺伝的又は非遺伝的に１つの安定した表現型の変化を示す培養物や個体を意味する。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）に対応するアミノ酸配列が変異し、その活性が野生型と比較して効率的に増加した変異体や、Ｌ−ロイシン及びその誘導体に対するフィードバック阻害が解除された変異体や、活性増加とフィードバック阻害の解除の両方がもたらされた変異体を意味する。
【００１７】
具体的には、本出願のイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがアルギニン以外の他のアミノ酸残基に、又は５６１番目のグリシンアミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドであってもよい。前記アルギニン以外の他のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれてもよく、グリシン以外の他のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５５８番目のアルギニンアミノ酸残基がヒスチジン、アラニンもしくはグルタミンに、又は５６１番目のグリシンアミノ酸残基がアスパラギン酸、アルギニンもしくはチロシンに置換された変異型ポリペプチドであってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記変異型ポリペプチドは、前記５５８番目のアルギニンがヒスチジン、アラニン又はグルタミンに置換され、前記５６１番目のグリシンがアスパラギン酸、アルギニン又はチロシンに置換されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに具体的には、前記変異型ポリペプチドは、配列番号２１〜配列番号３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００１８】
また、前記変異型ポリペプチドには、配列番号２１〜配列番号３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドが含まれてもよい。例えば、このような相同性を有し、イソプロピルリンゴ酸シンターゼに相応する効果を示すアミノ酸配列であれば、特定変異位置である５５８番目及び／又は５６１番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列が変異したものは固定され、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する酵素変異体も本出願に含まれることは言うまでもない。一方、特定変異位置である５５８番目及び５６１番目は配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端を基準に把握される位置を意味するので、配列番号１のＮ末端に一部のアミノ酸が付加又は欠損した場合に当該アミノ酸の数を考慮して算定されるものも本出願に含まれることは当業者にとって明らかである。例えば、イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子であるｌｅｕＡは、配列番号１においては６１６個のアミノ酸を表記しているが、文献によっては翻訳開始コドンを３５個後方に表記して５８１個のアミノ酸で開示している場合もあるので、その場合は前記５５８番目の位置は５２３番目の位置、５６１番目の位置は５２６番目の位置と解釈され、それらも本出願に含まれる。
【００１９】
本出願における「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分間の同一性の割合を意味する。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定される。例えば、相同性は、配列情報を整列させることのできる、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド分子又は２つのポリペプチド分子間の配列情報、例えばスコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を直接整列させることにより決定される（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．０）。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間に安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズし、その後単鎖特異的なヌクレアーゼで分解し、分解した断片のサイズを確認することにより決定することができる。
【００２０】
本出願の他の態様は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２１】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがアルギニン以外の他のアミノ酸残基に、又は５６１番目のグリシンアミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有し、配列番号２１〜３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有するポリペプチド、又はイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有し、前記ポリペプチドにおいて特定変異位置である５５８番目及び／もしくは５６１番目のアミノ酸配列が変異したものは固定され、一部の配列が欠失、改変、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが全て含まれる。あるいは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによりイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。本出願における「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。例えば、相同性の高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件が挙げられる（非特許文献１）。
【００２２】
前記ハイブリダイズに用いるプローブは、塩基配列の相補配列の一部であってもよい。このようなプローブは、公知配列に基づいて作成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、このような塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲにより作製することができる。例えば、プローブとしては、３００ｂｐ程度の長さの遺伝子断片を用いることができる。より具体的には、３００ｂｐ程度の長さのプローブを用いる場合、ハイブリダイゼーションの洗浄条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００２３】
一方、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３６〜配列番号５０のいずれか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、コドンの縮退（codon degeneracy）により前記変異型ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドであってもよいことは言うまでもない。
【００２４】
本出願のさらに他の態様は、前記変異型ポリペプチドを含む、Ｌ−ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物である。
【００２５】
本出願における前記微生物には、形質転換により人工的に製造されたものや、自然に発生したものが全て含まれる。
【００２６】
例えば、前記微生物は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物であってもよい。
【００２７】
本出願における「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞内に導入して発現させることを意味する。本出願における形質転換方法は、遺伝子を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、好適な標準技術を選択して行うことができる。エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム共沈殿（calcium phosphate co-precipitation）、レトロウイルス感染（retroviral infection）、微量注入法（microinjection）、ＤＥＡＥ−デキストラン（DEAE-dextran）、カチオン性リポソーム（cationic liposome）法、ヒートショック法などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
形質転換される遺伝子は、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入された形態や、染色体外に位置する形態のいかなるものであってもよい。また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ＤＮＡやＲＮＡが含まれ、宿主細胞内に導入されて発現するものであればいかなるものであってもよい。例えば、前記遺伝子は、自ら発現する上で必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体又はポリヌクレオチド構造体、例えばベクターの形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００２９】
本出願における「ベクター」とは、宿主細胞へのポリヌクレオチドのクローニング及び／又は転移のための任意の媒体を意味する。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合することにより、結合した断片の複製を作製するレプリコン（replicon）であってもよい。「レプリコン」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち自己調節により複製可能な任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を意味する。「ベクター」には、試験管内、生体外又は生体内で宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するためのウイルス及び非ウイルス媒体が含まれてもよい。また、「ベクター」には、ミニサークルＤＮＡが含まれてもよい。例えば、前記ベクターは、バクテリアＤＮＡ配列を有さないプラスミドであってもよい。ＣｐＧ領域における豊富なバクテリアＤＮＡ配列の除去は、転移遺伝子の発現サイレンシングを減少させてプラスミドＤＮＡベクターからさらに持続的な発現をもたらすために行われている（例えば、非特許文献２、３、４）。さらに、「ベクター」には、スリーピングビューティ（Sleeping Beauty）などのトランスポゾン（非特許文献５）、又は人工染色体が含まれてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができ、具体的にはｐＥＣＣＧ１１７ベクターを用いることができる。本出願に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現／置換ベクターを用いることができる。
【００３０】
また、前記ベクターは、様々な抗生物質耐性遺伝子をさらに含む組換えベクターであってもよい。
【００３１】
本出願における「抗生物質耐性遺伝子」とは、抗生物質に対して耐性を有する遺伝子であり、それを有する細胞は当該抗生物質で処理した環境でも生存するので、大腸菌などの微生物から大量にプラスミドを得る過程において選択マーカーとして有用である。本出願における抗生物質耐性遺伝子は、本出願の中核的技術であるベクターの最適な組み合わせによる発現効率に大きく影響を及ぼす要素ではないので、選択マーカーとして一般に用いられる抗生物質耐性遺伝子を制限なく用いることができる。具体的な例としては、アンピシリン（ampicilin）、テトラサイクリン（tetracyclin）、カナマイシン（kanamycin）、クロラムフェニコール（chloroamphenicol）、ストレプトマイシン（streptomycin）又はネオマイシン（neomycin）に対する耐性遺伝子などを用いることができる。
【００３２】
本出願における「作動可能に連結された」とは、一般機能が行えるように、塩基発現調節配列と目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が連結され、コードする塩基配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。ベクターとの作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野における切断及び連結酵素などを用いて作製することができる。
【００３３】
本出願における「ベクターが導入された（形質転換された）宿主細胞」とは、少なくとも１つの標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するベクターで形質転換された細胞を意味する。前記宿主細胞は、前記ベクターを導入してイソプロピルリンゴ酸シンターゼを生産する変異型ポリペプチドを含む微生物であれば、原核微生物や真核微生物のいかなるものであってもよい。例えば、エシェリキア属（Escherichia sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、セラチア属（Serratia sp.）、プロビデンシア属（Providencia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）及びブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）に属する微生物菌株が挙げられる。前記コリネバクテリウム属の微生物の例としてはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本出願の前記イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する、Ｌ−ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物には、前記ベクター導入以外にも、様々な公知の方法により前記変異型ポリペプチドを発現する微生物が全て含まれる。
【００３５】
本出願のさらに他の態様は、（ａ）前記Ｌ−ロイシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養してＬ−ロイシンを生産するステップと、（ｂ）前記微生物又は培養培地からＬ−ロイシンを回収するステップとを含む、Ｌ−ロイシンを生産する方法である。
【００３６】
本出願における「培養」とは、前記微生物を好適に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
前記培地に含まれる炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。前記培地に含まれる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕などの有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が挙げられる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。前記培地に含まれるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及びそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩が含まれてもよい。さらに、アミノ酸、ビタミン、好適な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に好適な方法で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養物の温度は、通常は２７℃〜３７℃、具体的には３０℃〜３５℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生産量が得られるまで続けてもよく、具体的には１０〜１００時間であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本出願の前記培養ステップで生成されたＬ−ロイシンを回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて微生物又は培地から目的とするＬ−ロイシンを収集することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ−ロイシンを回収することができる。また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
ロイシン生産能を有する微生物ＫＣＣＭ１１６６１ＰのｌｅｕＡ塩基配列の確認
１２１℃で１５分間滅菌した下記成分の種培地にコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７を接種し、１３時間培養し、その後培養液２５ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍＭのクエン酸緩衝液（citrate buffer）で洗浄し、その後ＮＴＧ（N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine）を最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように添加して３０分間処理し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（phosphate buffer）で洗浄した。ＮＴＧで処理した菌株を下記成分の最小培地に塗抹して死滅率を求めたところ、死滅率は９９．６％であった。ノルロイシン（Norleucine, NL）に対する耐性変異株を得るために、ＮＬの最終濃度がそれぞれ２０ｍＭ、４０ｍＭ及び５０ｍＭになるように添加した最小培地にＮＴＧで処理した菌株を塗抹し、３０℃で５日間培養してＮＬ耐性変異株を得た。
＜種培地＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中），ｐＨ７．０
＜生産培地＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質（Soy Protein）２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中），ｐＨ７．０
【００４２】
前記方法で得られた変異株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−２４（Corynebacterium glutamicum KCJ-24）及びコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−２８（Corynebacterium glutamicum KCJ-28）と命名し、２０１５年１月２２日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターにそれぞれ受託番号ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐとして寄託した。変異株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−２４及びコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−２８は、それぞれ２．７ｇ／Ｌ、３．１ｇ／Ｌの濃度でＬ−ロイシンを生産し、母菌株に比べてＬ−ロイシン生産性が約１０倍以上向上することが確認された。
【００４３】
次に、前記変異株ＫＣＣＭ１１６６１Ｐにおいて、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase, IPMS）をコードする遺伝子（ｌｅｕＡ）が変異するか否かを確認することにした。野生型ｌｅｕＡのアミノ酸配列（配列番号１）はＧｅｎｅｂａｎｋのＷＰ＿００３８６３３５８．１を参照して確認した。変異株の染色体ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法（以下「ＰＣＲ法」という）により増幅した。前記ｌｅｕＡは、６１６個のアミノ酸として公知であるが、文献によっては翻訳開始コドンを３５個後方に表記して５８１個のアミノ酸で開示している場合もある。その場合は後述する変異したアミノ酸の番号が変わることがあるので、５８１個のアミノ酸であることを前提とする場合は括弧内に変異位置を追加した。
【００４４】
具体的には、まず前記変異株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２８回繰り返すＰＣＲ法により、約２７００個の塩基対の断片を増幅した。同じプライマーでその塩基配列を分析した結果、ＫＣＣＭ１１６６１ＰにおいてｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換されていることが確認された。これは、ＩＰＭＳタンパク質の５５８番目（又は５２３番目，以下５５８番目とのみ表記）のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異であることを意味する。また、１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換されていることが確認された。これは、５６１番目（又は５２６番目，以下５６１番目とのみ表記）のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異であることを意味する。
【実施例２】
【００４５】
ＩＰＭＳ変異体置換ベクターの作製
実施例１で確認した変異塩基配列を含むベクターを作製するために、前記変異株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２５回繰り返すＰＣＲ法により、ＳａｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を有する約１４６０個の塩基対の断片を増幅した。増幅した断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理し、その後同じ酵素で処理したｐＤＺベクター（特許文献５及び６）にライゲーション（ligation）することによりｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を作製した。また、それぞれの変異が導入されたベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１４０６７を鋳型とし、プライマー５、７及びプライマー８、６を用いて、それぞれ２個の断片を増幅した。作製した２つの断片を鋳型とし、プライマー５、６を用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２５回繰り返すＰＣＲ法により、ＳａｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を有する約１４６０個の塩基対の断片を増幅した。増幅した断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理し、その後同じ酵素で処理したｐＤＺにライゲーションすることによりｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）を作製した。同様に、プライマー５、９及びプライマー１０、６を用いてｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）を作製した。
【実施例３】
【００４６】
ＩＰＭＳ変異体置換菌株の作製
前記変異株において見出されたｌｅｕＡ変異塩基配列を含む菌株を作製するために、母菌株として野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７を用いた。
【００４７】
エレクトロポレーションにより、実施例２で作製したｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）、ｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターでコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７を形質転換した。２次交差過程を経て作製した各菌株を１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及び１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）と命名した。ｌｅｕＡの塩基置換の有無は、配列番号３及び４のプライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２８回繰り返すＰＣＲ法により、約２７００個の塩基対の断片を増幅し、その後同じプライマーで塩基配列を分析して確認した。
【００４８】
前記ｐＤＺ−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換した１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株をＫＣＪ−０１４８と命名し、韓国微生物保存センターに２０１６年１月２５日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１８１１Ｐとして寄託した。
【実施例４】
【００４９】
ＩＰＭＳ変異体置換菌株におけるＬ−ロイシン生産
実施例３で作製したコリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及び１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）からＬ−ロイシンを生産するために、次の方法で培養を行った。
【００５０】
それぞれ生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、並びに前述したように作製したコリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及び１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ−ロイシンを生産した。
【００５１】
培養終了後に、高速液体クロマトグラフィーでＬ−ロイシンの生産量を測定した。実験を行った各菌株の培養液中のＬ−ロイシン濃度を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0006848067.tif 000002
【００５３】
表１に示すように、ｌｅｕＡ遺伝子にＲ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ又はＲ５５８Ｈ／Ｇ５６１Ｄ変異のあるＬ−ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及び１４０６７：：ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）は、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に比べて、Ｌ−ロイシン生産能が約１２〜２５倍に向上することが確認された。
【実施例５】
【００５４】
ＩＰＭＳ変異体過剰発現ベクターの作製
実施例１で確認した変異塩基配列を含む発現ベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１４０６７及び実施例３で作製した変異株３種の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２５回繰り返すＰＣＲ法により、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を有する約２０５０個の塩基対の断片を増幅した。増幅した断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで処理し、その後同じ酵素で処理したｐＥＣＣＧ１１７（非特許文献６）ベクターにＰＣＪ７プロモーターが挿入されたｐ１１７＿ＰＣＪ７を用いて、ライゲーションによりｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及びｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）発現ベクターを作製した。ＰＣＪ７プロモーターは、遺伝子の発現を強化するプロモーターであり、特許文献７及び８に開示されている。
【実施例６】
【００５５】
ＩＰＭＳ変異体過剰発現ベクターが形質転換された菌株の作製
実施例５で作製したｌｅｕＡ変異塩基配列を含む過剰発現ベクターが形質転換された菌株を作製するために、母菌株である野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７及びロイシン生産菌株ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐを用いた。
【００５６】
実施例５で作製したｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及びｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐにエレクトロポレーションで形質転換することにより、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を作製した。
【実施例７】
【００５７】
ＩＰＭＳ変異体過剰発現ベクターが形質転換された菌株におけるＬ−ロイシン生産
実施例６で作製したＬ−ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）からＬ−ロイシンを生産するために、次の方法で培養を行った。
【００５８】
それぞれ生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ及び実施例６で作製した菌株をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ−ロイシンを生産した。
【００５９】
培養終了後に、高速液体クロマトグラフィーでＬ−ロイシンの生産量を測定した。実験を行った各菌株の培養液中のＬ−ロイシン濃度を表２に示す。
【００６０】
【表２】
0006848067.tif 000003
【００６１】
表２に示すように、ＡＴＣＣ１４０６７菌株においてｌｅｕＡ遺伝子に変異を含む過剰発現ベクターが形質転換されたＬ−ロイシン生産菌株１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及び１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）は、その母菌株であるＡＴＣＣ１４０６７に比べて、Ｌ−ロイシン生産が４５〜９８倍に向上し、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ菌株においてｌｅｕＡ遺伝子に変異を含む過剰発現ベクターが形質転換されたＬ−ロイシン生産菌株ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及びＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）は、その母菌株であるＫＣＣＭ１１６６１Ｐに比べて、Ｌ−ロイシン生産が２．３倍〜４．５倍に向上し、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ菌株においてｌｅｕＡ遺伝子に変異を含む過剰発現ベクターが形質転換されたＬ−ロイシン生産菌株ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）は、その母菌株であるＫＣＣＭ１１６６２Ｐに比べて、Ｌ−ロイシン生産が２〜４．２倍に向上することが確認された。
【実施例８】
【００６２】
ｌｅｕＡの過剰発現ベクターが形質転換された菌株におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性の測定
実施例６で作製したＬ−ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を測定するために、次の方法で実験を行った。
【００６３】
それぞれ種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前記菌株４種をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで１６時間振盪培養した。培養終了後に、培養液を遠心分離して上清を捨て、ペレットを溶菌緩衝液で洗浄して混濁させ、ビードビーターで細胞を破砕した。ブラッドフォード法に従って溶菌液のタンパク質定量を行い、１００μｇ／ｍｌのタンパク質を含む溶菌液を用いた場合に生成されるＣｏＡを測定することにより、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を測定した。各菌株におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性の測定結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
0006848067.tif 000004
【００６５】
次に、前記酵素のロイシンに対するフィードバック阻害の解除の程度を確認するために、ロイシンを３ｇ／ｌ添加した条件で、１００μｇ／ｍｌのタンパク質を含む溶菌液を用いた場合に生成されるＣｏＡを測定することにより、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性を測定した。各菌株におけるイソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性の測定結果を表４に示す。
【００６６】
【表４】
0006848067.tif 000005
【００６７】
表３及び４に示すように、ＩＰＭＳ変異体発現ベクターが形質転換されたＬ−ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）及び１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）は、対照群であるコリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（ＷＴ）に比べて、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの活性がそれぞれ１．０５倍、１．３倍、３．２倍に向上することが確認された。また、前記Ｌ−ロイシン生産菌株は、ロイシンを２ｇ／ｌ添加した条件でも、ＩＰＭＳ活性をそれぞれ６１％、７０％、８９％維持することが確認されたので、ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたことが確認された。
【実施例９】
【００６８】
イソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体の改良のためのベクターの作製
実施例４、７及び８においてイソプロピルリンゴ酸シンターゼのアミノ酸配列（配列番号１）のうち前記５５８番目及び５６１番目のアミノ酸がＩＰＭＳ変異体酵素活性に重要な位置であることが確認されたので、前記変異体以外の他のアミノ酸に置換した場合も酵素活性が強化されるか、又はフィードバック阻害をさらに解除できるかを確認することにした。そのために、構造的変異を引き起こす他のアミノ酸グループのアミノ酸に置換した変異体を作製した。
【００６９】
５５８番目のアルギニンをアラニン（Ａｌａ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）に置換した変異体を作製した。部位特異的突然変異誘発（Site directed mutagenesis）法により、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ）ベクターを鋳型とし、配列番号１３及び１４のプライマー並びに配列番号１５及び１６のプライマー対を用いて、５５８番目のアミノ酸をアラニン（Ａｌａ）に置換したｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ａ）、５５８番目のアミノ酸をグルタミン（Ｇｌｎ）に置換したｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｑ）ベクターを作製した。
【００７０】
５６１番目のグリシンをアルギニン（Ａｒｇ）又はチロシン（Ｔｙｒ）に置換した変異体を作製した。部位特異的突然変異誘発法により、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｄ）を鋳型とし、配列番号１７及び１８のプライマー並びに配列番号１９及び２０のプライマー対を用いて、５６１番目のアミノ酸をアルギニン（Ａｒｇ）に置換したｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｒ）、５６１番目のアミノ酸をチロシン（Ｔｙｒ）に置換したｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｙ）ベクターを得た。
【実施例１０】
【００７１】
イソプロピルリンゴ酸改良変異体を導入した菌株の作製
実施例９で作製したｌｅｕＡ変異塩基配列を含む発現ベクターが形質転換された菌株を作製するために、母菌株として野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７を用いた。
【００７２】
実施例９で作製したｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ａ）、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｑ）、ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｒ）及びｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｙ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７にエレクトロポレーションで形質転換することにより、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ａ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｑ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｒ）及び１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｙ）を作製した。
【実施例１１】
【００７３】
イソプロピルリンゴ酸シンターゼ改良変異体を導入した菌株におけるＬ−ロイシン生産
実施例１０で作製したＬ−ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ａ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｑ）、１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｒ）及び１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｙ）からＬ−ロイシンを生産するために、次の方法で培養を行った。
【００７４】
それぞれ生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７及び前記菌株４種をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ−ロイシンを生産した。
【００７５】
培養終了後に、高速液体クロマトグラフィーでＬ−ロイシンの生産量を測定した。実験を行った各菌株の培養液中のＬ−ロイシン濃度を表５に示す。
【００７６】
【表５】
0006848067.tif 000006
【００７７】
表５に示すように、Ｌ−ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ａ）及び１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｑ）は、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に比べて、Ｌ−ロイシン生産能が３２〜３８倍に向上することが確認された。
【００７８】
また、Ｌ−ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカム１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｒ）及び１４０６７：：ｐ１１７＿ＰＣＪ７−ｌｅｕＡ（Ｇ５６１Ｙ）は、母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に比べて、Ｌ−ロイシン生産能が約３６倍〜４０倍に向上することが確認された。
【００７９】
前記結果から、イソプロピルリンゴ酸シンターゼのアミノ酸配列（配列番号１）のうち前記５５８番目及び５６１番目のアミノ酸がＩＰＭＳ変異体酵素活性に重要な位置であり、また野生型ＩＰＭＳタンパク質の５５８及び５６１番目のアミノ酸がそれぞれヒスチジン及びアスパラギン酸に置換される場合だけでなく、他のアミノ酸に置換される場合も、このような変異を含む菌株においてＬ−ロイシンの生産能が大幅に増加することが確認された。
【００８０】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、前記詳細な説明ではなく後述する特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【００８１】
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【００８２】
0006848067.tif 000008
【００８３】
0006848067.tif 000009
【配列表】
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