(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−（３−（（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル）オキシ）フェニル）−３−（５−（１，１，１−トリフルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）イソキサゾ−ル−３−イル） 尿素，又はＣＥＰ−３２４９６を有効成分として含む，イヌのがん細胞に対する増植抑制剤。
【請求項２】
請求項１に記載の剤であって，前記イヌのがん細胞がＢＲＡＦ遺伝子変異によるものである剤。
【請求項３】
請求項１に記載の剤であって，イヌのがんの治療剤である剤。
【請求項４】
請求項３に記載の剤であって，前記イヌのがんが，イヌの移行上皮がん，イヌの前立腺がん，イヌの悪性黒色腫，又はイヌの末梢神経鞘腫である剤。
【請求項５】
請求項１に記載の剤であって，イヌのＢＲＡＦ阻害剤耐性がん細胞に対する併用薬である剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，イヌのがん細胞に対する増植抑制剤などに関する。特にこの発明は，イヌのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ：ヒトのＶ６００Ｅに相当）によるイヌのがん細胞に対する増植抑制剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌの悪性腫瘍の一つでＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）を有する移行上皮がんは局所浸潤性，遠隔転移性が高く，早期診断ならびに早期治療が望まれる腫瘍である。これまでの研究成果からＶ５９５Ｅは移行上皮がんに高率（６０−７０％）に発現しており，ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙを活性化し，移行上皮細胞をがん化するｄｒｉｖｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ であることが知られている。
【０００３】
野生型ＢＲＡＦによるＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ の活性化には，まず上流のＲｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＲＫＴｓ）の活性化，ついでＲＡＳ−ＧＴＰ活性化によるＢＲＡＦ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎのリン酸化（Ｔｈｒ５９８／Ｓｅｒ６０１）が必要である。この活性化ＢＲＡＦはＡＲＡＦ，ＢＲＡＦ，ＣＲＡＦのホモダイマーあるいはヘテロダイマー（Ｂ/ＣＲＡＦ−ＭＥＫ ｃｏｍｐｌｅｘ を含む）を形成してＭＥＫをリン酸化し活性化する。一方，ＢＲＡＦ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ には３０個所以上にがん原性遺伝子変異が認められており，それらの変異のうちＶ６００の発現（Ｖ６００Ｅなど）では，ＲＡＳに依存しないモノマー を形成する変異，あるいはダイマーを形成する変異と，Ｖ６００以外に発現しＣＲＡＦを活性化する変異に分類される。  
【０００４】
ヒトのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ６００Ｅ）を有するがん細胞（悪性黒色腫，結腸がん，甲状腺がんなど）に対しては細胞増殖抑制剤あるいは抗腫瘍薬として各種のＢＲＡＦ阻害剤が開発され，治療に用いられている。しかしながら，ＲＡＦの二量化などのがん化機構，ＢＲＡＦ阻害剤の作用機序（立体構造など），あるいはＢＲＡＦ阻害剤投与時に発現する薬剤耐性などの詳細が明らかにされるとともに更なる阻害剤の開発が望まれ，進められている。
【０００５】
すなわち，第一世代のＢＲＡＦ阻害剤であるＧＤＣ０８７９，ＡＺ６２８は遺伝子変異で活性化したＢＲＡＦの Ｌ−ｌｏｏｐ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）部位で，ＡＴＰ結合に競合（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＡＴＰ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＢＲＡＦ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）する低分子物質としてＢＲＡＦのリン酸化活性（ＭＥＫならびにＥＲＫの活性化（リン酸化））を阻害して，細胞増殖，がん化を抑制する。
【０００６】
しかしながら，ＢＲＡＦ遺伝子変異の多様性が明らかになるとともに，第一世代阻害剤ではＢＲＡＦ変異に対する抗腫瘍効果が限局されており，またＢＲＡＦＶ６００Ｅの活性阻害を標的とした第二世代の阻害剤であるＬＰＸ４７２０，Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ，Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂなどでは投与後比較的早期に薬剤耐性が引き起こされる。 
【０００７】
一方， イヌの移行上皮がんに対する治療薬（化学療法藥）に著効を示すものはなく，オキシカム系非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の抗腫瘍効果に期待するのみである。イヌのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）により引き起されるイヌの腫瘍が移行上皮がん，前立腺がん，悪性黒色腫，末梢神経鞘腫などで明らかにされてきている。しかしながら，それらがん細胞に対する増殖抑制剤や治療薬としてのＢＲＡＦ阻害剤は見出されていない。またＶ５９５Ｅがｄｒｉｖｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ であることから，代表的な第二世代ＢＲＡＦ阻害剤であるＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂが移行上皮がんの治療薬として検討された。しかしながら，Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂでは，細胞増殖抑制活性（ＩＣ５０）は８マイクロＭと十分な活性は得られていない（Ｄｅｃｋｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ. ２０１６）。イヌのＢＲＡＦＶ５９５Ｅによるがん細胞はＶ５９５Ｅが責任遺伝子変異であるので，有用なＢＲＡＦ阻害剤を開発することが強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Decker B, Parker HG, Dhawan D et al. Mol. Cancer Res 2015; 13(6); 993−1002.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この発明は，イヌのがん細胞に対する増植抑制剤，特に，イヌのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）によるイヌのがん細胞に対する増植抑制剤などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この明細書に記載される発明は，基本的には，ＣＥＰ−３２４９６を用いることでＢＲＡＦ遺伝子変異によるイヌのガン細胞の増植を抑制できるという実施例による知見に基づく。
【００１１】
この明細書に記載される発明は，イヌのがん細胞に対する増植抑制剤（本発明の剤）に関する。イヌのがん細胞に対する増植抑制剤は，対象となるイヌに投与され，イヌのガン細胞が増植することを抑制する剤である。
この剤は，１−（３−（（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル）オキシ）フェニル）−３−（５−（１，１，１−トリフルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）イソキサゾ−ル−３−イル） 尿素（本発明の化合物），又はＣＥＰ−３２４９６を有効成分として含む。
ＣＥＰ−３２４９６は，アゲラフェニブ（Ａｇｅｒａｆｅｎｉｂ：ＩＮＮ）やＲＸＤＸ−１０５，ＡＢ−０２４，及びＡＣ−０１３７７３と同義であり，ヒトのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ６００Ｅ）に対する阻害剤に関する研究用試薬として市販されている。ＣＥＰ−３２４９６の有効成分は，上記した本発明の化合物である。
【００１２】
イヌのがん細胞の例は，イヌのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）によりもたらされるがん細胞である。つまり，上記の剤の例は，イヌのがんの治療剤である。そして，イヌのがんの例は，イヌの移行上皮がん，イヌの前立腺がん，イヌの悪性黒色腫，及びイヌの末梢神経鞘腫である。
【００１３】
この明細書は，他のがんの治療薬とともにイヌに対して投与される併用薬（イヌのＢＲＡＦ阻害剤耐性がん細胞に対する併用薬：本発明の併用薬）をも提供する。
【００１４】
本発明の剤及び本発明の併用薬は，本発明の化合物又はＣＥＰ−３２４９６を有効成分として有効量含む。本発明の剤及び本発明の併用薬は，投与対象となるイヌの体重，年齢，性別，投与方法，及び剤型に応じ適切な量を，適切な頻度で投与すればよい。実施例により示された通り，上記の有効成分は極めて微量であっても有効である。そのため１回あたりの投与量の例体重１ｋｇ当たり，１ｎｇ以上１ｇ以下であり，１０ｎｇ以上５００ｍｇ以下でもよいし，１００ｎｇ以上１００ｍｇ以下でもよいし，１ｍｇ以上１００ｍｇ以下でもよいし，１ｍｇ以上２０ｍｇ以下でもよい。投与回数は，例えば１週間に１回でもよいし，１日１回でもよいし，１日２回又は３回でもよい。
本発明の剤及び本発明の併用薬は，経口投与剤，ドリンク剤，錠剤，又は注射剤として投与できる。注射剤は，静脈内，筋肉内または皮下等に有効成分を投与することができ，これらのうち静脈内投与がより好ましい。静脈内投与を行う場合，注射剤は，注射器から直接対象に投与してもよく，また点滴バッグ中で点滴液に先ず添加して対象に点滴静注を行ってもよい。
本発明の剤及び本発明の併用薬が注射剤又はドリンク剤の場合，有効成分の他に，水，生理食塩水，溶媒，培養上清，ｐＨ調整剤，酸化防止剤（ビタミンＣ），及びトレハロースといった各種素材を含んでもよい。本発明の剤及び本発明の併用薬が錠剤の場合は，賦形剤，担体といった各種素材を含んでもよい。
【００１５】
この明細書は，対象となるイヌに本発明の剤及び本発明の併用薬を投与する工程を含む，イヌのがん細胞に対する増植抑制方法，イヌのがんの治療方法をも開示する。イヌのがん細胞の例は，イヌのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）によりもたらされるがん細胞である。そして，イヌのがんの例は，イヌの移行上皮がん，イヌの前立腺がん，イヌの悪性黒色腫，及びイヌの末梢神経鞘腫である。
【発明の効果】
【００１６】
この発明は，イヌのがん細胞に対する増植抑制剤，特に，イヌのＢＲＡＦ遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）によるイヌのがん細胞に対する増植抑制剤などを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は，Ｖ５９５Ｅ移行上皮がん細胞に対するＢＲＡＦ阻害剤の反応曲線の一例（ＴＣＣＶ−Ｓｏ株）を示す図面に代わるグラフである。ＣＥＰ３２４９６のみが増殖抑制活性を示していた（ＩＣ５０： １５ ｎＭ）。
【図２】図２は，臨床例から採取し，約８０代継代クローン化したＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞（５株）に対するＢＲＡＦ阻害剤8種の増殖抑制活性のまとめである。他の7種のＢＲＡＦ阻害剤に比較してＣＥＰ３２４９６は著しく高い活性を示した。
【図３】図３は，Ｖ５９５Ｅ移行上皮がん細胞におけるＣＥＰ３２４９６とＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ同時投与時の増殖抑制反応曲線の一例（ＴＣＣＶ−Ｋａ株）を示す図面に代わるグラフである。単剤投与時に比較して同時投与時の細胞生存率は明らかな低値を示し，相乗効果あるいは相加効果を示している。
【図４】図４は，図３に示した一例（ＴＣＣＶ−Ｋａ）を含めたＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞（5株）のＩＣ５０値のまとめである。いずれの株化細胞においてもＣＥＰ３２４９６にＶｅｍｒａｆｅｎｉｂを同時投与すると細胞増殖抑制活性は増強された。ＣＥＰ３２４９６はＢＲＡＦ阻害剤の基本であるＢＲＡＦのＡＴＰ結合部位における競合拮抗作用に加えて，競合拮抗以外の機序でＢＲＡＦ阻害作用を示すと考えられた。
【図５】図５は，Ｖ５９５Ｅ移行上皮がん株化細胞のＳＣＩＤマウス異種移植時の腫瘤形成の一例（ＴＣＣＶ−Ｋａ株）を示す。図５は，株化細胞１×１０７個／３００ μlをＳＣＩＤマウス（３匹）の腹側部皮下に接種して腫瘤の形成を観察したものである。抗腫瘍活性の対象として腫瘍原性，個体内でのバラツキ，増大傾向などの点からＴＣＣＶ−Ｋａ株化細胞が適していた。グラフ中の3種の異なる記号は，３匹のマウスの各個体を示す。
【図６】図６に異種移植試験系によるＣＥＰ３２４９６の抗腫瘍活性を示した。ＣＥＰ３２４９６投与５日目より有意な腫瘤形成抑制が認められ，ＣＥＰ３２４９６はＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞に対して抗腫瘍活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【実施例】
【００１９】
これまでに発明者らが臨床例から採取し，約８０代継代クローン化したイヌのＶ５９５Ｅ移行上皮がん株化細胞5株を用いて，入手可能で細胞増殖抑制活性の高いヒトＢＲＡＦ阻害剤８種（ＧＤＣ０８７９，ＡＺ６２８，ＰＬＸ４７２０，Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ（エンコラフェニブ），Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ（ベムラフェニブ），Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ（ダブラフェニブ），ＲＡＦ２６５，ＣＥＰ３２４９６）の細胞増殖抑制活性を検討した。また，異種移植の試験系で腫瘍の増大抑制（抗腫瘍活性）を測定し，抗腫瘍活性を検討した。
【００２０】
細胞増殖抑制試験
ウェルあたり１０００から３０００個の株化細胞（ＴＣＣＶ−Ｋａ，ＴＣＣＶ−Ｓｏ，ＴＣＣＶ−Ｅｃ，ＴＣＣＶ−Ｎｉ，ＴＣＣＶ−Ｉｃ）を９６ ｗｅｌｌ のカルチャープレートに撒き２４時間培養後，０．１％ＤＭＳＯに溶解した８種のＢＲＡＦ阻害剤（ＧＤＣ０８７９，ＡＺ６２８，ＰＬＸ４７２０，Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ（エンコラフェニブ），Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ（ベムラフェニブ），Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ（ダブラフェニブ），ＲＡＦ２６５，ＣＥＰ３２４９６）を０, ５０, １００, ５００, １０００, ５０００, １００００ ｎＭで ＧＤＣ０８７９，ＡＺ６２８，Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ，Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ，ＲＡＦ２６５を，０, １, １０, １００, １０００, ５０００，１００００ｎＭで ＰＬＸ４７２０を，０, ３２, ６３, １２５, ２５０, ５００, １０００ｎＭで Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂを，0, ３, １０, ３０, １００, ３００, １０００ｎＭでＣＥＰ３２４９６を添加して，２４，４８，７２時間後の生存細胞数を，ＷＳＴ１を用いて測定し，細胞増殖抑制活性を算出した。
【００２１】
図１にイヌのＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞に対するＢＲＡＦ阻害剤の反応曲線の一例（ＴＣＣ Ｖ−Ｓｏ株）を示した。またこの反応曲線から算出した細胞増植抑制活性（ＩＣ５０: ｎＭ）を図２に示した。
【００２２】
ＧＤＣ０８７９，ＡＺ６２８，Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ，Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂの４種のＢＲＡＦ阻害剤は，用いた全ての細胞に対して十分な増殖抑制活性（ＩＣ５０: ２００ｎＭ以下)を示さなかった。ＰＬＸ４７２０，Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ，ＲＡＦ２６５ではＴＣＣＶ−Ｅｃ株のみで２００ｎＭ，１８０ｎＭ，１５０ｎＭのＩＣ５０が算出可能であった。一方，ＣＥＰ３２４９６は用いた全細胞株に対してＩＣ５０が算出でき，９−２００ｎＭの値を示した。したがって，８種のＢＲＡＦ阻害剤のうちＣＥＰ３２４９６のみがイヌのＶ５９５Ｅ移行上皮がんに対して細胞増植抑制剤または治療薬として有用と考えられた。
【００２３】
ＢＲＡＦ阻害剤はＶ５９５Ｅ変異で活性化し，ＢＲＡＦ Ｌ−ｌｏｏｐ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）の部位で，低分子でＡＴＰ結合に競合（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＡＴＰ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＢＲＡＦ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）する物質としてＢＲＡＦ活性を阻害し，ＭＥＫならびにＥＲＫの活性化（リン酸化）を阻害して細胞増殖，がん化を抑制する（Ｈｏｌｄｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ，  Ｎａｇｅｌ  ＴＥ，  Ｓｔｕａｒｔ  ＤＤ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４: １１１（４）: ６４０−６４５．）。そこで，ＣＥＰ３２４９６の細胞増殖抑制機序について代表的なＢＲＡＦ阻害剤（第二世代）であるＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂを併用投与することで検討した。
【００２４】
ＴＣＣＶ−Ｎｉ株で得られたＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂのＩＣ５０（１．５μＭ）の１/２量とＣＥＰ３２４９６を，それとは反対にＴＣＣＶ−Ｓｏ株で得られたＣＥＰ３２４９６のＩＣ５０（１５ｎＭ）の１/２量とＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂを同時投与して，Ｖ５９５Ｅ移行上皮がん細胞（５株）に対する細胞増殖抑制活性を測定した。図３に反応曲線の一例（ＴＣＣＶ−Ｋａ株）を示した。また算出したＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞（５株）のＩＣ５０を図４に示した。
【００２５】
ＢＲＡＦ祖害剤で，ＡＴＰとの結合を競合阻害するＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂをＣＥＰ３２４９６と同時に投与すると，その細胞生存率はＣＥＰ３２４９６単剤投与時に比較して明らかな低値を示した（図３，図４）。また，反対にＣＥＰ３２４９６をＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂと同時に投与するとＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ単剤投与に比較して同時投与時の細胞生存率は明らかな低値を示した。したがって，ＣＥＰ３２４９６はＢＲＡＦ阻害剤の基本であるＢＲＡＦのＡＴＰ結合部位における競合拮抗作用に加えて，競合拮抗以外の機序でＢＲＡＦ阻害作用を示すことが明らかになった。実際，ＣＥＰ３２４９６はＢＲＡＦ阻害剤であるとともに，ＭＥＫやＥＲＫ活性を阻害し，マルチキナーゼの性質を示すとも報告されている（Ｊａｍｅｓ  Ｊ，  Ｒｕｇｇｅｎ  Ｂ，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２０１２；  １１（４）：  ９３０−９４１）。
【００２６】
異種移植試験系によるＣＥＰ３２４９６の抗腫瘍活性
移植に用いるＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞
異種移植試験系における抗腫瘍活性を観察するには接種する細胞数，細胞株，動物種により腫瘤の増大の異なることが報告されている。そこで，5株のＶ５９５Ｅ移行上皮がん株化細胞を１×１０６個，１×１０７個／２００ μlをＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ．Ｊｃｌ，  ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ）の腹側部皮下に接種して腫瘤の形成を観察した。  
【００２７】
約1カ月間観察したが，３００ μlのＰＢSに１×１０７個の細胞を浮遊させた溶液を接種すれば全株化細胞で腫瘤の形成（４ ｘ ４ ｍｍ 以上：腫瘍原性）が認められた。しかしながら，その後増大しないもの（ＴＣＣＶ−Ｎｉ株），消失してしまうもの（ＴＣＣＶ−Ｉｃ株），増大はするものの抗腫瘍活性を観察する対照としては変動幅が大きく適していないものが多かった。図５にはＣＥＰ３２４９６の抗腫瘍活性判定の対照に適したＴＣＣＶ−Ｋａ株の腫瘍形成曲線を示した。
【００２８】
ＣＥＰ３２４９６の抗腫瘍活性
移植細胞をＴＣＣＶ−Ｋａ株とし，投与群，対照群各５匹のＳＣＩＤマウス右腹側に１×１０７個の細胞を接種した。２週後に約５×５ｍｍの腫瘤が形成された。投与は対照群では１０％ＤＭＳＯを，投与群には１０％ ＤＭＳＯのＣＥＰ３２４９６懸濁溶液（１０ ｍｇ／ｋｇ）２００μｌを腹腔内投与した。投与は5回/週とした。
【００２９】
ＣＥＰ３２４９６（１０ ｍｇ／ｋｇ）投与群は投与５日目以降，対照群に比較して，有意な腫瘤形成抑制を示し，ＢＲＡＦＶ５９５Ｅ移行上皮がん細胞に対する抗腫瘍活性を示した（図６）。
【００３０】
考察
これまで的確な治療法が認められないイヌのＢＲＡF遺伝子変異（Ｖ５９５Ｅ）によるがん細胞に対して細胞増殖抑制剤としての，また抗腫瘍薬としてのＣＥＰ３２４９６の有用性を明らかにした。遺伝子診断等により早期診断をはかり，ＣＥＰ３２４９６を投与することでこれら腫瘍の新しい治療法が展開できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
この発明は，動物用の薬剤の分野で利用されうる。
【要約】      （修正有）【課題】イヌのがん細胞に対する増植抑制剤の提供。【解決手段】１−（３−（（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル）オキシ）フェニル）−３−（５−（１，１，１−トリフルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）イソキサゾ−ル−３−イル）尿素，又はＣＥＰ−３２４９６を有効成分として含む，イヌのがん細胞に対する増植抑制剤であって，イヌのがん細胞の例は，ＢＲＡＦ遺伝子変異によるがん細胞である。【選択図】図２【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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