(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの、リシン発酵生産における使用であって、
前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲが不活性化されると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅの発現が増加されることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記発酵は固定化発酵であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
固形担体を含む培地において前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを発酵させ、リシン発酵液を得ることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記固形担体は綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ゼオライト、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス、トウモロコシの茎、活性炭、プラスチック、及びガラスの中の１つ又は複数の組み合わせであることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
発酵培地における固形担体の使用量は１〜１００ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項８】
培地における各成分の濃度は、グルコース８０〜３００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３０〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５〜１．５ｇ／Ｌ、糖蜜１０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１００〜３００ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４０〜８０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５〜１５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１５〜１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．５〜２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．５〜２ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５〜２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０〜５０ｇ／Ｌであり、溶媒は水であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項９】
バッチの発酵が終了した毎に、得られた発酵液を新しい発酵培地に交換し、糖が全て消耗するまでに培養してリシン発酵液を得ることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
前記発酵は、温度２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの条件で２０〜９０ｈ発酵することであることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物及び発酵プロセス技術分野に属し、具体的には、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの吸着固定化発酵によってリシンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リシンは、アスパラギン酸ファミリーに属するアミノ酸であって、人と動物に必要である自身合成できないアミノ酸の１つであり、飼料添加剤、食品強化剤、医薬品などの面に広く適用され、その中、リシン製品の９０％以上は飼料添加剤として用いられている。
【０００３】
バイオフィルムは自然界に広く存在し、バイオフィルムの形成過程において、細菌の自身分泌による細胞外ポリマー（ＥＰＳ）はバイオフィルム形成の基質であり、層別散布という特徴を有し、細菌の粘着と会合の面で重要な役割を果たす。
【０００４】
今、固定化連続発酵という技術は既に生産に実用化され、その中、バイオフィルムによる固定化連続発酵は有効になった。しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、バイオフィルムによる固定化連続発酵はあまり開示されない。
【０００５】
コリネバクテリウム・グルタミカムは産業において重要な菌株であるが、その成膜力は極めて弱くて連続的発酵が困難であるため、当該菌株の分子修飾を行なってその成膜効果を強化させ、後期の固定化連続発酵を実現しなければならない。
【０００６】
ｅＤＮＡによって担体への菌体の最初粘着及び菌体同士の粘着を強化させ、バイオフィルムの後期形成を促進すると共に、バイオフィルムの構造を安定化させることができるという検討があった。最初のバッチの細胞が担体に到達した直後、バイオフィルムの形成は開始し、細胞は初めて分泌してＤＮＡを生成し、ＤＮＡは担体と細胞との間のバインダーとして機能するため、細胞と担体は別れないようになり、そして同じように引き寄せられる。そして、細胞は多糖とタンパクを分泌してＤＮＡによるネット構造を強固させ、バイオフィルムは崩れにくくなる。
【０００７】
従来、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを発現したコリネバクテリウム・グルタミカムと、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトしたコリネバクテリウム・グルタミカムを報告する特許があった。この２つの特許に採用された菌株は、いずれもプロリン生産に用いられたものである。プロリンはリシンに比べると、その代謝経路、生産菌株及び発酵条件は大きな差がある。本検討において、リシン生産の菌株発酵過程を検討して大量に試験したところ、１つの遺伝子を取り扱うではリシン産量の向上に限界があるが、２つの遺伝子を同時に取り扱うと、リシン産量が明らかに向上したということを発見した。そのため、リシンの産量を更に向上するために、リシン生産菌株の細胞外ヌクレアーゼ遺伝子ＥｘｅＲをノックアウトすると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅの発現を増加させた。また、このような組換え菌株に好適である固定化バッチ式発酵方法も検討したが、組換え菌の固定化発酵はオリジナル菌のフリー発酵よりも、そのリシン産量が４９．６７％向上し、発酵性能は、単に細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトしたコリネバクテリウム・グルタミカムと、単にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカムよりも遥かに優れるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来技術の不足に対して、従来技術においてリシン生産菌株の成膜力が弱くて固定化連続発酵に使用できない問題を解決し、リシンを生産する組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを提供し、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化成膜力を向上させた。
【０００９】
本発明は更に、コリネバクテリウム・グルタミカムのバッチ毎の発酵周期が長すぎるという問題を解決し、上記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの固定化連続発酵によってリシンを生産する方法を提供し、コリネバクテリウム・グルタミカムのバッチ毎の発酵周期を短縮し、その固定化連続発酵における優位性を更に明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ｅＤＮＡの量を増加し、更に菌株の固定化成膜力を強化させるために、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞外ヌクレアーゼ遺伝子ＥｘｅＲをノックアウトし、また、ＥｘｅＲをノックアウトした上に、ＩＶ型分泌システムであるタンパクアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現し、ＤＮＡの分泌を促進して成膜効果を向上した。
【００１１】
本発明は、上記した技術問題を解決するために、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲが不活性化されると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅの発現が増加される組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを開示し、当該組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトすると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現することにより構築される。
【００１２】
その中、上記した細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトすると共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現するとは、遺伝子ノックアウト又は遺伝子不活性化の技術によってコリネバクテリウム・グルタミカムゲノムにおけるＥｘｅＲ遺伝子を不活性化させ、そして、ＥｘｅＲ遺伝子不活性化コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、遺伝子強化発現の技術によってＡＴＰａｓｅ酵素発現遺伝子を強化させることである。
【００１３】
その中、上記のコリネバクテリウム・グルタミカムはＡＴＣＣ３１２６９である。
【００１４】
その中、上記の細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるものである。
【００１５】
その中、上記のアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるものである。
【００１６】
上記の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに対してＰＣＲを実行して増幅し、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示すヌクレオチド配列のＥｘｅＲ遺伝子ノックアウトサイドの上流遺伝子断片ＥｘｅＲ−Ｒと下流遺伝子断片ＥｘｅＲ−Ｌを得る工程と、
（２）ノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆに対してＰＣＲを実行し、ｃｒＲＮＡ配列を増幅し、具体的には、Primer５とPrimer６を使用して、ＥｘｅＲゲノムノックアウトサイドで選別された２０ｂｐ  ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列によってプラスミドでの元の認識配列を置換し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示すヌクレオチド配列のＥｘｅＲ−１を得る工程と、
（３）工程（１）で得られたＥｘｅＲ−Ｒ、ＥｘｅＲ−Ｌと工程（２）で得られたＥｘｅＲ−１ンを、ＡｐａＩ／ＳｗａＩ酵素切断されたｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドにクローし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示すヌクレオチド配列のノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲを得る工程、
（４）工程（３）で得られたノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入し、スクリーニングしてＥｘｅＲ遺伝子がノックアウトされたコリネバクテリウム・グルタミカムを得、配列測定によって所望のように遺伝子をノックアウトしたかを検証する工程であって、配列測定サービスは蘇州ＪｉｎＷｅｉＺｈｉ生物科技有限会社により提供され、配列測定によって正しいと検証されたノックアウト菌株を△ＥｘｅＲ菌株と名付け、ＥｘｅＲ遺伝子を成功にノックアウトした後、配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示されるものである工程と、
（５）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに対してＰＣＲを実行し、ＡＴＰａｓｅ遺伝子を増幅し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示すヌクレオチド配列の、増幅されたＡＴＰａｓｅ遺伝子断片を得る工程と、
（６）工程（５）で得られたＡＴＰａｓｅ遺伝子断片を過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９にクローンし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示すヌクレオチド配列の組換えプラスミドｐＸＭＪ１９＊ＡＴＰを得る工程と、
（７）工程（６）で得られた組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム△ＥｘｅＲに導入し、スクリーニングし、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した組換えコリネバクテリウム・グルタミカム△ＥｘｅＲ＋ＡＴＰを得る工程と、
を含む方法によって構築される。
【００１７】
工程（１）において、ＥｘｅＲ−Ｒ遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer１のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるものであり、Primer２のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されるものである。ＥｘｅＲ−Ｌ遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer３のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示されるものであり、Primer４のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０に示されるものである。
【００１８】
工程（１）において、上記したＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。
【００１９】
工程（２）において、ＥｘｅＲ−１遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer５のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるものであり、Primer６のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２に示されるものである。
【００２０】
工程（２）において、上記したＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１０秒間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。
【００２１】
工程（５）において、ＡＴＰａｓｅ遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer７のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示されるものであり、Primer８のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示されるものである。
【００２２】
工程（５）において、上記したＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。
【００２３】
工程（６）において、上記の過剰発現プラスミドはｐＸＭＪ１９である。
【００２４】
上記の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムによって発酵してリシンを生産する方法も、本発明の保護範囲内にある。
【００２５】
好ましくは、上記発酵は固定化発酵であり、固形担体を含む培地において上記の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを発酵させ、リシン発酵液を得る工程を含む。
【００２６】
具体的には、
（ｉ）組換えコリネバクテリウム・グルタミカムをシード培地に接種し、培養してシード液を得る工程と、
（ｉｉ）固定化担体を発酵培地にセットし、発酵培地にシード液を仕込み、バッチで発酵して発酵液を得る工程と、
を含む。
【００２７】
その中、バッチの発酵が終了した毎に、得られた発酵液を新しい発酵培地に交換し、糖が全て消耗するまでに培養し、約７０ｈ発酵して終了させ、リシンを得た。その中、上記の糖はグルコース、糖蜜、ショ糖の３種の組み合わせである。
【００２８】
工程（ｉ）において、シード培地における各成分の濃度は、ショ糖１５〜３５ｇ／Ｌ、ペプトン５〜１５ｇ／Ｌ、酵母パウダー１〜１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ／Ｌ、七水硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５〜１５ｇ／Ｌ、尿素１〜５ｇ／Ｌであり、溶媒は水である。上記した培養は、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍの条件で１０〜１４ｈ培養することである。
【００２９】
工程（ｉｉ）において、上記の固定化担体は綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ゼオライト、細菌セルロースフィルム、ゼオライト、シルク、サトウキビバガス、トウモロコシの茎、活性炭、プラスチック、及びガラスの中のいずれか１つ又は複数の組み合わせである。固定化担体をシート状、繊維状、マッシュ又はマイクロバルーンの形として作製してもよい。
【００３０】
好ましくは、シード状の固定化担体を予備処理した。上記の予備処理は、固定化担体を２〜８ｃｍ×２〜８ｃｍの正方形（好ましく５ｃｍ×５ ｃｍ）にカットし、純水で洗浄してオーブンで乾燥した後、エチルアルコールに１ｈ浸漬し、純水で洗浄した後、沸騰水浴で１０〜４０ｍｉｎ（好ましくは２０ｍｉｎ）処理して乾燥することである。固定化担体の使用量は１〜１００ｇ／Ｌ発酵培地である。上記の滅菌は、１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌することである。
【００３１】
工程（ｉｉ）において、発酵培地における各成分の濃度は、グルコース８０〜３００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３０〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５〜１．５ｇ／Ｌ、糖蜜１０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１００〜３００ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４０〜８０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５〜１５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ５〜１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．５〜２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．５〜２ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５〜２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０〜５０ｇ／Ｌであり、溶媒は水である。
【００３２】
工程（ｉｉ）において、５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを加え、１０％〜３０％（ｖ／ｖ）のシード液を播種し、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの条件で６０〜９０ｈ（好ましくは７２ｈ）発酵した。
【００３３】
その中、本願に係るリシンの代謝経路、生産菌株及び発酵条件は、プロリンと大きな差がある。本願における生産菌株はＡＴＣＣ３１２６９であるが、従来技術におけるリシン生産菌株はＡＴＣＣ１３０３２である。また、本願における発酵培地も、従来技術におけるリシンの発酵培地と異なる。なお、グルタミン酸発酵によるプロリン生産は、グルタミン酸を前駆体物質として変換することによって成されるが、発酵によるリシン生産の経路はもっと煩雑であり、また、その前駆体物質はα−ケトグルタル酸とアセチルコエンザイムエーＡである。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は従来技術に比べると、以下のメリットがある。
１）本発明は、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化発酵によってリシンを生産する方法を開示し、固定化材として繊維（綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス、及びトウモロコシの茎）を使用し、固定された菌体は繰り返して使用できる。
【００３５】
２）本発明によると、大規模生産にもまだ実現されない、リシンの連続化（又は反復バッチ発酵による）生産が実現された。
【００３６】
３）本発明によると、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカムを構築し、コリネバクテリウム・グルタミカムのｅＤＮＡ分泌が促進され、コリネバクテリウム・グルタミカムｅＤＮＡの分解が低減されるため、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化連続発酵はフリー発酵のオリジナル菌よりも、その産量が４９．６７％向上し、また、発酵周期が２９．１７％短縮された。小試験規模の産量は３０ｇ／Ｌ程度に達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲとｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰプラスミドのアガロースゲル電気泳動図である。その中、レーン１はオリジナルプラスミドｐＸＭＪ１９であり、レーン２は組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰであり、レーン３はｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆであり、レーン４はｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲであり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。オリジナルＭＪ１９プラスミドの大きさは６６０１ｂｐであるが、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰの大きさは７７４１ｂｐである。図から分かるように、ＡＴＰａｓｅ遺伝子断片は、既に発現プラスミドｐＸＭＪ１９に挿入された。Ｍａｒｋｅｒの大きさは１２０００ｂｐである。
【図２】△ＥｘｅＲ菌株とオリジナル菌のゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲアガロースゲル電気泳動図である。その中、レーン１、２は△ＥｘｅＲ菌株ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン３、４はオリジナル菌株ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。プライマー９とプライマー１０を使用してノックアウト菌株のゲノムに対してＰＣＲを実行し、成功にノックアウトされた後の突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物は１４９４ｂｐであるが、コントロールの野生型菌は２６１９ｂｐである。Ｍａｒｋｅｒの大きさは５０００ｂｐである。
【図３】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌と組換え菌の電子顕微鏡図である。
【図４】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌、組換え菌、ＡＴＰ菌株、△ＥｘｅＲ菌株の固定発酵とフリー発酵の周期図である。
【図５】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌と組換え菌の、クリスタルバイオレット染色法によってバイオフィルム量を半定量的に計測する試験データである。
【図６】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌、組換え菌、ＡＴＰ菌株、△ＥｘｅＲ菌株の固定発酵とフリー発酵によるリシン産量の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下の実施例によれば、本発明を更に明らかに理解できる。しかしながら、当業者にとって理解しやすいように、実施例に記載された内容はただ本発明を説明するためのものであり、請求の範囲に詳細に記述される本発明はこれに制限されるべきではない。
以下の実施例に用いられるプラスミドｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆとｐＸＭＪ１９は、武漢ＭｉａｏＬｉｎｇ生物科技有限会社から購入された。特に説明しない限り、全ての酵素はＴＡＫＡＲＡから購入され、プラスミド抽出・ゲル回収キットはＴＡＫＡＲＡから購入され、一段階クローニングキットは南京ＮｕｏＷｅｉＺａｎ生物科技有限会社から購入された。Ｌ−リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌株（以下、オリジナル菌と略する）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１２６９であり、アメリカ微生物株保存機関（ＡＴＣＣ）から購入され、寄託番号はＡＴＣＣ３１２６９である。
【００３９】
実施例１：細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲノックアウトプラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌の染色体を使用してＰＣＲを実行し、ＥｘｅＲ遺伝子ノックアウトサイドの上下流の２つの遺伝子断片を増幅し、ＥｘｅＲ−Ｒ、ＥｘｅＲ−Ｌと名付けた。具体的には、配列ＥｘｅＲ−Ｒは、以下のプライマー１とプライマー２を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸という反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１０４８ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）を増幅した。配列ＥｘｅＲ−Ｌは、以下のプライマー３とプライマー４を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するという反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１０３５ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）を増幅した。
【００４０】
ＰＣＲ増幅の反応系は以下の通りであり、全系１００μＬである（特に説明しない限り、全てのＰＣＲ反応は当該系に準ずる。）。
Ｂｕｆｆｅｒ                    ２０μＬ
ｄＮＴＰ                  １０μＬ
テンプレート                  ２μＬ
プライマー１                  ２μＬ
プライマー２                  ２μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ          ２μＬ
ＤｄＨ２Ｏ                        ６２μＬ
【００４１】
プラスミドｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆに対してＰＣＲを実行し、ｃｒＲＮＡ配列を増幅した。プライマー５とプライマー６を使用し、ＥｘｅＲゲノムノックアウトサイドで選別された２１ｂｐ  ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２）、即ち、ＥｘｅＲ遺伝子での２１ｂｐ  ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列によって、交換プラスミドでの元の認識配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３）、即ち、ｃｒｔＹｆ遺伝子での２１ｂｐ  ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列を置換した。置換された配列をＥｘｅＲ−１と名付けた。具体的には、配列ＥｘｅＲ−１は、以下のプライマー５とプライマー６を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１０秒間延伸するという反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１１０ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）を増幅した。
【００４２】
配列ＥｘｅＲ−Ｒ、ＥｘｅＲ−ＬとＥｘｅＲ−１を、ＡｐａＩ／ＳｗａＩ酵素切断されたｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドにクローンし、ノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲを得た。アガロースゲル電気泳動を図１に示す。レーン３はオリジナルｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドであり、レーン４は構築されたプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲであり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。その中、オリジナルｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドの大きさは１１９８２ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７）であるが、組換えプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲの大きさは１１８９５ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０）である。
【００４３】
増幅されたＥｘｅＲ−Ｒ配列は、２０ｂｐの担体相同の配列及び３０ｂｐのＥｘｅＲ−Ｌ相同の配列を含む。なお、プライマー１はＡｐａＩの制限酵素認識サイドを有する。増幅されたＥｘｅＲ−Ｌ配列は、３０ｂｐのＥｘｅＲ−Ｒ相同の配列及び２５ｂｐのＥｘｅＲ−１相同の配列を含む。増幅されたＥｘｅＲ−１配列は、２５ｂｐのＥｘｅＲ−Ｌ相同の配列及び１６ｂｐの担体相同の配列を含む。なお、プライマー６はＳｗａＩの制限酵素認識サイドを有する。制限酵素認識サイドをボールド体で示した。
【００４４】
【表１】
0006873306.tif 000002
【００４５】
実施例２：アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅ過剰発現プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌の染色体を使用してＰＣＲを実行し、ＡＴＰａｓｅ遺伝子を増幅した。
【００４６】
具体的には、以下のプライマー７とプライマー８を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するという反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１１８６ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）を増幅した。
【００４７】
増幅された配列はＡＴＰａｓｅコード配列及び２０ｂｐの担体相同の配列を含む。なお、プライマー７はＢａｍＨＩの制限酵素認識サイドを有し、プライマー８はＢａｍＨＩの制限酵素認識サイドを有する。ＢａｍＨＩ制限酵素認識サイドをボールド体で示した。
【００４８】
【表２】
0006873306.tif 000003
【００４９】
得られたポリヌクレオチドと制限酵素ＢａｍＨＩで処理されたｐＸＭＪ１９プラスミドを一段階クローンし、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現するための組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰを得た。そのアガロースゲル電気泳動を図１に示す。レーン１はオリジナルｐＸＭＪ１９プラスミドであり、レーン２は構築されたプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰであり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。その中、オリジナルｐＸＭＪ１９プラスミドの大きさは６６０１ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４）であるが、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰの大きさは７７４１ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１）である。図から分かるように、ＡＴＰａｓｅ遺伝子断片は既に発現プラスミドｐＸＭＪ１９に挿入された。
【００５０】
実施例３：細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子が不活性化されたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した菌株の構築
得られたｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌コンピテントセルに導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによってゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が欠失したかを検証した。プライマー９とプライマー１０を使用してノックアウト菌株のゲノムに対してＰＣＲを実行し、成功にノックアウトされた後の突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物は１４９４ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５）であるが、コントロールの野生型菌では２６１９ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６）である。アガロースゲル電気泳動を図２に示す。レーン１、２は突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン３、４はコントロールの野生型菌のＰＣＲ生成物であり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。最終に、配列測定によってコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が成功にノックアウトされたかを検証し、配列測定サービスは蘇州ＪｉｎＷｅｉＺｈｉ生物科技有限会社により提供された。得られた細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子不活性化菌株を△ＥｘｅＲ菌株と名付け、ＥｘｅＲ遺伝子が成功にノックアウトされた後の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示されるものである。
【００５１】
更に、得られたｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰ組換えプラスミドを△ＥｘｅＲ菌株のコンピテントセルに導入し、６．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによって検証し、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子がノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した組換え菌株、即ち、本願に係る組換え菌を得、△ＥｘｅＲ＋ＡＴＰ菌株と名付けた。プライマー１１とプライマー１２を使用してＰＣＲを実行し、遺伝子が組換えプラスミドに挿入されたかを検証した。
【００５２】
【表３】
0006873306.tif 000004
【００５３】
修飾菌株が成功に構築された後、９６ウェルプレート及びＳＥＭ電子顕微鏡試験を行った。９６ウェルプレートによる試験データを図５に示す。修飾された組換え菌は１２ｈで、そのバイオマスがオリジナル菌よりも５９％向上したが、菌株の持続的成長に伴って、バイオマスの差分はしだいに低減していたと認められた。電子顕微鏡写真を図３に示す。これを一見して分るように、組換え菌のバイオフィルムはオリジナル菌よりも厚く、ブロックとして形成したが、オリジナル菌のバイオフィルムは比較的薄い。成膜効果が向上された後、固定化連続発酵を行った。
【００５４】
実施例４：異なる担体での、組換え菌の固定化発酵によるリシン生産
活性化培地成分は、グルコース１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌである。
【００５５】
シード培地としては、ショ糖２５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１２ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌである。
【００５６】
発酵培地の配合としては、グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム４０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド５０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／Ｌ、ビオチン２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌである。
【００５７】
５０ｍＬ遠心管毎に活性化培地５ｍＬを加え、実施例３で調製された組換え菌を仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で２０ｈ活性化した。
【００５８】
活性化終了後、それぞれシード培地５０ｍＬ入り５００ｍＬ振盪フラスコに注ぎ、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１２ｈ培養した。
【００５９】
５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを注ぎ、表４に示す担体も発酵培地に加えて、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌した。担体使用量は、３０ｇ／Ｌが好ましい。 
【００６０】
発酵培地にシード液５ｍＬを仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で７２ｈ発酵した。
【００６１】
固定化連続発酵：発酵過程において、１バッチ目では菌体が既に固定化担体に吸着され、この際に、既に振盪フラスコにより約７２ｈ培養した。２バッチ目では発酵液を除去し、菌体が吸着された固定化担体を残し、新しい発酵培地５０ｍＬを注ぎ、グルコース、糖蜜及びショ糖の３つの組み合わせである糖が全て消耗するまでに約６０ｈ培養し、発酵周期のデータとリシン産量のデータを測定した。後のバッチの固定化連続発酵にはいずれも当該方法を採用し、最後の１０バッチの連続発酵データを表４に示す。
【００６２】
【表４】
0006873306.tif 000005
【００６３】
表４から分かるように、固定化連続発酵のため最も好ましくは綿繊維であるため、後の固定化連続発酵全体には綿繊維を固定化担体とした。
【００６４】
実施例５：組換え菌リシン発酵試験（綿繊維担体での組換え菌固定） 
活性化培地成分は、グルコース１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌである。
【００６５】
シード培地としては、ショ糖２５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１２ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌである。
【００６６】
発酵培地の配合としては、グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム４０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド５０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／Ｌ、ビオチン２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌである。
【００６７】
５０ｍＬ遠心管毎に活性化培地５ｍＬを加え、実施例３で調製された組換え菌を仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で２０ｈ活性化した。
【００６８】
活性化終了後、それぞれシード培地５０ｍＬ入り５００ｍＬ振盪フラスコに注ぎ、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１２ｈ培養した。
【００６９】
５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを注ぎ、予備処理された綿繊維担体も発酵培地に加え、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌した。
【００７０】
発酵培地にシード液５ｍＬを仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で７２ｈ発酵した。
【００７１】
固定化連続発酵：発酵過程において、１バッチ目では菌体が既に固定化担体に吸着され、この際に、既に振盪フラスコによって約７２ｈ培養した。２バッチ目では、発酵液を除去し、菌体が吸着された固定化担体を残し、新しい発酵培地５０ｍＬを注ぎ、グルコース、糖蜜とショ糖の３つの組み合わせである糖が全て消耗するまでに約６０ｈ培養し、発酵周期データを測定し、図４に示す。リシン産量を図６に示す。後の固定化連続発酵にはいずれも当該方法を採用した。
【００７２】
綿繊維担体材の予備処理：綿繊維担体を５ｃｍ×５ｃｍの正方形にカットし、純水で洗浄してオーブンで乾燥した後、エチルアルコールで１ｈ浸漬し、純水で２回洗浄した後、沸騰水浴で２０ｍｉｎ処理してオーブンで乾燥し、１．５ｇ秤量し、発酵液入り振盪フラスコに加え、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌した。
【００７３】
比較例１：オリジナル菌の固定化発酵（オリジナル菌）
実施例５に仕込まれた組換え菌をオリジナル菌に変更した以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。
【００７４】
比較例２：組換え菌のフリー発酵（組換え菌）
発酵培地に担体を加えない以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。 
【００７５】
比較例３：オリジナル菌のフリー発酵（オリジナル菌）
実施例５に仕込まれた組換え菌をオリジナル菌に変更し、発酵培地に担体を加えない以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。 
【００７６】
図４から分かるように、固定化発酵はフリー発酵に比べると、その周期が短縮され、その中、組換え菌の固定化発酵周期はオリジナル菌のフリー発酵周期よりも２９．１７％短縮された。図６から分かるように、固定化発酵はフリー発酵よりも、得られたリシンの産量が向上し、また、組換え菌の固定化産量はオリジナル菌の固定化産量よりも４９．６７％向上した。上記の発酵周期の短縮及びリシン産量の向上は、いずれも固定化発酵と組換え菌を使用してコリネバクテリウム・グルタミカムの成膜力を強化させたからである。
【００７７】
比較例４：コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＥｘｅＲ遺伝子不活性化菌株の構築
得られたｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌コンピテントセルに導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによってゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が欠失したかを検証した。プライマー９とプライマー１０を使用してノックアウト菌株のゲノムに対してＰＣＲを実行し、成功にノックアウトされた後の突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物は１４９４ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５）であるが、コントロールの野生型菌では２６１９ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６）である。アガロースゲル電気泳動を図２に示す。レーン１、２は突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン３、４はコントロールの野生型菌のＰＣＲ生成物であり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。最終に、配列測定によってコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が成功にノックアウトされたかを検証し、配列測定サービスは蘇州ＪｉｎＷｅｉＺｈｉ生物科技有限会社により提供された。細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子不活性化菌株を得、△ＥｘｅＲ菌株と名付けた。
【００７８】
比較例５：コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した菌株の構築
得られたｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌コンピテントセルに導入し、６．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含みＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによって検証し、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅ過剰発現組換え菌株を得、ＡＴＰ菌株と名付けた。
【００７９】
比較例６：△ＥｘｅＲ菌株固定化発酵
実施例５に仕込まれた組換え菌を△ＥｘｅＲ菌株（コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌からＥｘｅＲ遺伝子をノックアウトしたもの）に変更した以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。
【００８０】
比較例７：ＡＴＰ菌株固定化発酵 
実施例５に仕込まれた組換え菌をＡＴＰ菌株（コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌にＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現したもの）に変更した以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。
【００８１】
オリジナル菌、組換え菌、△ＥｘｅＲ菌株とＡＴＰ菌株の発酵データの比較から分かるように、単にＥｘｅＲ遺伝子をノックアウトした場合、単にＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現した場合は、いずれも発酵産量の向上と発酵周期の短縮が図れ、リシン産量から見れば、単にＥｘｅＲ遺伝子をノックアウトした方は、その効果が単にＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現した方よりも良好である。図６から分るように、ＡＴＰ菌株の固定化発酵によるリシン産量は、オリジナル菌の固定化発酵によるリシン産量よりも２．５６％向上し、△ＥｘｅＲ菌株の固定化発酵によるリシン産量は、オリジナル菌の固定化発酵によるリシン産量よりも９．００％向上し、組換え菌の固定化発酵によるリシン産量は、オリジナル菌の固定化発酵によるリシン産量よりも２８．５４％向上した。要するに、リシン産量から見れば、組換え菌の発酵性能は最も好ましい。
【００８２】
実施例６：還元糖の測定方法
ＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）を使用し、アルカリ条件で還元糖と酸化還元反応し、３−アミノ−５−ニトロサリチル酸を生成した。当該生成物は沸騰条件で赤茶の色を呈し、一定の濃度範囲内には、色の濃淡は還元糖の含有量に比例し、紫外分光光度計（ＯＤ５４０）で還元糖含有量を測定した。
【００８３】
見込み糖含有量を０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの間にするようにサンプルを適切に希釈した後、希釈後のサンプル０．５ｍＬを１０ｍＬ目盛りチューブに取り、ＤＮＳ  ０．５ｍＬを加え、沸騰水で５ｍｉｎ沸騰した直後、５ｍｉｎ冷却し、純水８ｍＬを加えて均一に混合し、また、純水０．５ｍＬとＤＮＳサンプル０．５ｍＬをブランクサンプルとする。予め本試験に用いられるＤＮＳ還元糖含有量の標準曲線を作製しておき、紫外分光光度計によって５４０ｎｍ波長で吸光度を計測し、還元糖含有量の計量とする。
【００８４】
実施例７：リシン含有量の測定
発酵液毎に１００μＬサンプリングし、０．１Ｍ塩酸溶液で５０倍希釈し、サンプル毎に希釈液４００μＬを取り、ＰＩＴＣプレカラム誘導体化を実行し、ＲＰ−ＨＰＬＣ法でリシン含有量を計測し、サンプル毎のリシン濃度を算出した。
【００８５】
オリジナル菌と本発明に係る構築の組換え菌で固定化連続発酵試験を行い、１０バッチの発酵試験による発酵結果を表５に示す。図６から分かるように、修飾後の菌株の固定化連続発酵によるリシン産量は、フリー発酵のオリジナル菌よりも４９．６７％向上した。図４から分かるように、修飾後の菌株の固定化発酵周期はオリジナル菌よりも２９．１７％短縮された。
【００８６】
【表５】
0006873306.tif 000006
【００８７】
実施例８：クリスタルバイオレット染色法によるバイオフィルム量の半定量的な計測
無色９６ウェルプレートに発酵培地２００μＬを加え（固定化担体と炭酸カルシウムを加えない）、そしてオリジナル菌と組換え菌２０μＬをそれぞれ加えて培養し、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ経過した時点に、クリスタルバイオレット染色法とＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ５７０ｎｍを計測した。図５から分かるように、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した組換え菌は、その成膜力が明らかに向上した。
【００８８】
本発明によると、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカム、その構築方法、及びそのリシン生産における使用の構想及び方法を提供し、具体的には、当該技術手段を実現するための方法とルートは多いが、以上に記載されたのはただ本発明の好ましい実施形態であり、当業者にとって明らかであるように、本発明の原理から離脱しない限り、若干の改良と修飾を加えることができ、これらの改良と修飾も本発明の保護範囲にある。本実施例に明確的でない各組成部分は、いずれも従来技術によって実現できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
SEQUENCE LISTING
<110>  NANJING TECH UNIVERSITY
<120>  METHOD FOR PRODUCING LYSINE BY UTILIZINGADSORPTION AND IMMOBILIZED FERMENTATION OF RECOMBINANT CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
<160>  27
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  2751
<212>  DNA
<213>  Extracellular nuclease (ExeR)
<400>  1
atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc        60
ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgctcctgt catcaacgaa       120
atctacggag gcggtggaaa cagcggatcg ttgttctcca acgacttcat tgagctctac       180
aacccaacct caggggacat ttccctcgac ggttggagcg ttacctacta cgcagccaac       240
ggtaactccg gcggaaccac aaacctgacc ggaaacatcc ctgccaacgg ttactacctc       300
atccagcaac gcgcaggcag caacaacacc ggcgctctgc ctaccccaga cgccaccggt       360
aacttggcaa tgggtgcctc ccaaggatca gttgcactga ccgacaactc tggcctaacc       420
gctgaccttg tcggattcgg tggcacgtcc atgtttgaag gaacagctgc tgcacctgag       480
accagcaaca aattgtctgt tcaacgcaaa gaagttggcg ctgactctga taacaactcc       540
gtagacttcg agactggagc tccaactcca acgtcctcgg gaggatccgc tcctgttgac       600
ccaggcgagc cagaaactcc agtaaaccct ggggaaacag tctccatcgc acaaatccaa       660
ggaaccggtc tcgctacccc actcgagggt cagaccgtca ccaccgaagg tattgtcact       720
gccgtttacg cagaaggtgg cttcaacggt tactacatcc agacacctgg atctggtact       780
gcaccaaagg ttgctggcga cgcatccgac ggcatcttcg tctacgtggg aagcaatggt       840
tcctacccag agctcggcgc atctgtcacc gtcactggca aggccaccga acactacgag       900
atgactcagc taggcaactc ctccttcacc gtttcggaca ccgcattcga gccagtaacc       960
ccactcgaac tggacaccgt tcctactggc gatgacattc gcgaagcata cgaaggcatg      1020
ctgctgaagc caaccggcgc tcacaccgtg accaacaact acgcaaccaa caccttcggt      1080
gaaattgccc tcgccccagg taacgagcct ttgtaccagg ccactcaaat ggtggcaccg      1140
ggagccgaag cgattgcgta cgaggcggaa aacgtcgcaa agcaaattac gctggatgac      1200
ggacgctccg gcaactacac tcgcggcgac tccagcacgc ctatggcatg gcttgtgcag      1260
gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt ccaggcacca      1320
gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc tgtcaccggc      1380
aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc tgagctagct      1440
tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct caactacttc      1500
acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa caacacccca      1560
gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact cgaagatcag      1620
cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg acttgaagaa      1680
atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc actcaatacc      1740
ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt cgaatctcca      1800
gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga ccaaaccacc      1860
gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg caccgcacgc      1920
cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt cgtcggcgta      1980
gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac cggcgacggc      2040
caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga ccacctggaa      2100
aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa ctcctacgcc      2160
aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc caccgaattc      2220
gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca cgcactcggc      2280
aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa cgctgacgaa      2340
gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt cgagaacaac      2400
gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag cgagaccact      2460
gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctaccgatcc aactacccca      2520
gttaagccaa ctgatccggt agagaccacg gatccatctg agccaaccga ccctgcagaa      2580
cctactgatc cagctgaacc aactgaccct gaggaaacga agaagccaga ggagccgaag      2640
aaccctggtt cctccaacgg aagctcccaa tacgccacca ttgcagcaat catcgcagca      2700
atcctaggtg ccattgcttt ggccttccag ttcttcccat tcaagttcta a               2751
<210>  2
<211>  1134
<212>  DNA
<213>  Adenosine triphosphatase (ATPase)
<400>  2
atgactgaca ttgatctggt ggtggaaaac gtccaaagga ttatcgccac caaagagaca        60
ccgccgacct ctgcggaaat agcgagcctg attcgggaac aagcaggcgt gatcagtaac       120
gaggacatcg tgatggtgtt gcgtcgactg cgcagtgatt ctgtgggcgt gggaccgttg       180
gaatctctgc ttgcgcttcc tggcgtgacg gatgtgttgg ttaatgccca tgacagcgtg       240
tggattgatc gcggtcaggg cgtggagaaa gtcgacatgg atctgggctc agaggaggcg       300
gtgcgtcgcc ttgccacccg gttggcgttg acctgtggca gacgcttaga tgatgcgcag       360
cctttcgctg atggccgaat caccagggac gacggcagcg tgttgcgcat tcacgcggtg       420
ttggcaccct tggcggaatc cggcacgtgc atcagtgtgc gagtactgcg tcaagcacgg       480
ctgagccttg atgatcttat ccaaagcggc acggtgcctg aggacatcgc gcctgcgctc       540
cggaacatca tcaatcaacg gcgctcgttc cttgttgtcg gtggcaccgg cacagggaaa       600
accacattgc tgtccgcgat gctcaccgaa gttcccgctg atcaacgaat catctgcatc       660
gaggacaccg cagagcttca tcccggccat ccaagcacca tcaacttggt gtctcgccaa       720
gcaaacgtcg agggcgccgg cgccgtgagc atggcggatt tgttgaaaca atcgctgcgc       780
atgaggcctg accggattgt cgtcggagag attcgcggtg cggaagtcgt ggatcttttg       840
gctgcgatga ataccggaca cgacggcggt gctggcacca ttcacgcgaa ctccatctct       900
gaagttcccg cgcgcatgga agctcttgcg gcgaccggcg gattggaccg catggcattg       960
cattctcaac tcgcggccgc agtggacatt gtgctggtca tgaaacacac cccttttggc      1020
cgcaggctag ctcaactcgg ggtgctccgc ggaaatcctg tgaccacgca ggtggtgtgg      1080
gatttggacc acggcatgca cgaagggagc gaagaggcat ggtttatgcc ctag            1134
<210>  3
<211>  1048
<212>  DNA
<213>  ExeR-R
<400>  3
aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac ctcaagctcg aagcgctttc        60
cctgacggac atcggaaacg ccagaaactc cgatacgtcc gagggcgcgg tgtaccgcct       120
gcccctgggg atccagaatc tcagccttag gcatgacatt gacaactaca cgggccacgg       180
tattttccct tactcaagaa atggggagga caatgtttta cgagcacaag tgtaactgtt       240
gccactggtc aaacctagcc agcccttaga tagggagatt ctcctcgatt gcttccacta       300
cctcagctgc agatggttcc gtccgaggag caaagcgctt aatcgtatta ccttctgcat       360
ctaccaggaa tttctcaaaa ttccactcga tttcgctacc atcagttgcc tctttgagca       420
ccttgtacag ggggtgggca ccctccccat tcacctcggt tttgctcaag agcgggaagg       480
tgacgtcgta ctgattttgc gcgaaagcac acacctcagc gtcggttcca ggttcctggc       540
cgttgaattg attgcagggc acgccaatga caaagaagcc tcgatcttgg tattcctcat       600
acagtttttg aagcccttca tactgtggcg tgagtccgca cttggatgcc acgttcacga       660
tgagcaaaag gtggcccgcc caatccgcca tggtggtttc tgtgccgtcg ttgagagtta       720
cgctgatgtc atgaatagaa gtcataatcg caaccctagt tgagggggag gatttagtgc       780
atcatctaaa taaaggtcag ctaataggtg aactttggtg agaccaaagg tgaactgcca       840
ggtcgaccaa attgctcgcc aagcagactc cgaaaaacac gggtaattca tatggcttgt       900
atctaatcca tactgaacag aggacctctc ctatgtctcg catttctgcg cgcactctgg       960
caatcgcact tgccggtgca accgcggcca gcctggcagt tgttccagca gcaacagcta      1020
atcctgccgg aaccgactcc agcacgcc                                         1048
<210>  4
<211>  1035
<212>  DNA
<213>  ExeR-L
<400>  4
taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc tatggcatgg cttgtgcagg acggtggcga        60
gaccatcaag tccatccgca ccggcgacca ggtggaattc caggcaccag taatcttcga       120
ttaccgctac gacctgtgga aattccagcc aaccacccct gtcaccggca acaccgcaag       180
ctccgacctt cctatcacct gggatgacac ccgcgcggct gagctagctt caatcaatga       240
cgttgctggc gaattccaca tcgcaagctt caacgtgctc aactacttca cctctctcgg       300
cgaagatgaa ccaggctgca gcgcatacag ggatatcaac aacaccccag tcaccgccaa       360
caactgtaac gtccgtggcg cttacaccga agaagcactc gaagatcagc agagcaagat       420
cgtcgaagca atcaaccgcc ttgacgtcga tgttcttgga cttgaagaaa tcgaaaacac       480
cgcgaccgtc accggcgacg tctcccgtcg cgatgacgca ctcaataccc tcgtcgcagc       540
actcaacgaa gcagttggat ccgatcgctg ggcggccgtc gaatctccag aacaattggg       600
caccgatgaa gactacatcc gcgtcgcctt catctacgac caaaccaccg tcaagcccgt       660
cggcgaatcc cgaatcttcg acgacgcagc cttcaccggc accgcacgcc agccactcgc       720
acaggaattc cagccactca acgacagcga gaaatccttc gtcggcgtag tcaaccactt       780
caagtccaag ggctctgtca ctcgtggaga cgccgacacc ggcgacggcc aaggcaacaa       840
cgccaacgtt cgcgtcgcac aggcacaggc actcatcgac cacctggaaa accaggacga       900
ctgggcatcc aagccaatct tcatcctcgg cgacaccaac tcctacgcca aggaaaccgc       960
gatgaccacc ctttacggcg ctggctacac caacatcgcc accgaattcg acgctctaga      1020
ttgacagcta gctca                                                       1035
<210>  5
<211>  110
<212>  DNA
<213>  ExeR-1
<400>  5
acgctctaga ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg gatccgaatt tctactgttg        60
tagatcctcg acggttggag cgttacattt aaataaaacg aaaggctcag                  110
<210>  6
<211>  1186
<212>  DNA
<213>  ATPase
<400>  6
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga ctgacattga tctggtggtg gaaaacgtcc        60
aaaggattat cgccaccaaa gagacaccgc cgacctctgc ggaaatagcg agcctgattc       120
gggaacaagc aggcgtgatc agtaacgagg acatcgtgat ggtgttgcgt cgactgcgca       180
gtgattctgt gggcgtggga ccgttggaat ctctgcttgc gcttcctggc gtgacggatg       240
tgttggttaa tgcccatgac agcgtgtgga ttgatcgcgg tcagggcgtg gagaaagtcg       300
acatggatct gggctcagag gaggcggtgc gtcgccttgc cacccggttg gcgttgacct       360
gtggcagacg cttagatgat gcgcagcctt tcgctgatgg ccgaatcacc agggacgacg       420
gcagcgtgtt gcgcattcac gcggtgttgg cacccttggc ggaatccggc acgtgcatca       480
gtgtgcgagt actgcgtcaa gcacggctga gccttgatga tcttatccaa agcggcacgg       540
tgcctgagga catcgcgcct gcgctccgga acatcatcaa tcaacggcgc tcgttccttg       600
ttgtcggtgg caccggcaca gggaaaacca cattgctgtc cgcgatgctc accgaagttc       660
ccgctgatca acgaatcatc tgcatcgagg acaccgcaga gcttcatccc ggccatccaa       720
gcaccatcaa cttggtgtct cgccaagcaa acgtcgaggg cgccggcgcc gtgagcatgg       780
cggatttgtt gaaacaatcg ctgcgcatga ggcctgaccg gattgtcgtc ggagagattc       840
gcggtgcgga agtcgtggat cttttggctg cgatgaatac cggacacgac ggcggtgctg       900
gcaccattca cgcgaactcc atctctgaag ttcccgcgcg catggaagct cttgcggcga       960
ccggcggatt ggaccgcatg gcattgcatt ctcaactcgc ggccgcagtg gacattgtgc      1020
tggtcatgaa acacacccct tttggccgca ggctagctca actcggggtg ctccgcggaa      1080
atcctgtgac cacgcaggtg gtgtgggatt tggaccacgg catgcacgaa gggagcgaag      1140
aggcatggtt tatgccctag ggatccccgg gtaccgagct cgaatt                     1186
<210>  7
<211>  41
<212>  DNA
<213>  Primer 1
<400>  7
aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac c                            41
<210>  8
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Primer 2
<400>  8
ggcgtgctgg agtcggttcc ggcaggatta                                         30
<210>  9
<211>  30
<212>  DNA
<213> Primer 3
<400>  9
taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc                                         30
<210>  10
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Primer 4
<400>  10
tgagctagct gtcaatctag agcgtcgaat tcggt                                   35
<210>  11
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Primer 5
<400>  11
acgctctaga ttgacagcta gctca                                              25
<210>  12
<211>  60
<212>  DNA
<213>  Primer 6
<400>  12
ctgagccttt cgttttattt aaatgtaacg ctccaaccgt cgaggatcta caacagtaga        60
<210>  13
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Primer 7
<400>  13
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga ctgacattga tctggt                       46
<210>  14
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Primer 8
<400>  14
aattcgagct cggtacccgg ggatccctag ggcataaacc atgcct                       46
<210>  15
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Primer 9
<400>  15
gtgagaccaa aggtgaactg                                                    20
<210>  16
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Primer 10
<400>  16
gtaggttctg caggatcagt                                                    20
<210>  17
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Primer 11
<400>  17
ggaattgtga gcggataaca                                                    20
<210>  18
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Primer 12
<400>  18
gtatcaggct gaaaatcttc                                                    20
<210>  19
<211>  1626
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence (Artificial)
<400>  19
atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc        60
ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgactccag cacgcctatg       120
gcatggcttg tgcaggacgg tggcgagacc atcaagtcca tccgcaccgg cgaccaggtg       180
gaattccagg caccagtaat cttcgattac cgctacgacc tgtggaaatt ccagccaacc       240
acccctgtca ccggcaacac cgcaagctcc gaccttccta tcacctggga tgacacccgc       300
gcggctgagc tagcttcaat caatgacgtt gctggcgaat tccacatcgc aagcttcaac       360
gtgctcaact acttcacctc tctcggcgaa gatgaaccag gctgcagcgc atacagggat       420
atcaacaaca ccccagtcac cgccaacaac tgtaacgtcc gtggcgctta caccgaagaa       480
gcactcgaag atcagcagag caagatcgtc gaagcaatca accgccttga cgtcgatgtt       540
cttggacttg aagaaatcga aaacaccgcg accgtcaccg gcgacgtctc ccgtcgcgat       600
gacgcactca ataccctcgt cgcagcactc aacgaagcag ttggatccga tcgctgggcg       660
gccgtcgaat ctccagaaca attgggcacc gatgaagact acatccgcgt cgccttcatc       720
tacgaccaaa ccaccgtcaa gcccgtcggc gaatcccgaa tcttcgacga cgcagccttc       780
accggcaccg cacgccagcc actcgcacag gaattccagc cactcaacga cagcgagaaa       840
tccttcgtcg gcgtagtcaa ccacttcaag tccaagggct ctgtcactcg tggagacgcc       900
gacaccggcg acggccaagg caacaacgcc aacgttcgcg tcgcacaggc acaggcactc       960
atcgaccacc tggaaaacca ggacgactgg gcatccaagc caatcttcat cctcggcgac      1020
accaactcct acgccaagga aaccgcgatg accacccttt acggcgctgg ctacaccaac      1080
atcgccaccg aattcgacgc tggctacagc taccagttct ccggccgcat tggcagcctc      1140
gaccacgcac tcggcaacga agcagccatg aagcacgtca tcgacgccga ggtctgggac      1200
atcaacgctg acgaagcaat cgcattcgaa tactcccgtc gactcaacaa cacctccgac      1260
gtattcgaga acaacgtctt ccgctcctcc gaccacgacc cgatcaaggt cggattcaac      1320
ctcagcgaga ccactgagcc caccattccg gtagagccca ctgatcctgc agaacctacc      1380
gatccaacta ccccagttaa gccaactgat ccggtagaga ccacggatcc atctgagcca      1440
accgaccctg cagaacctac tgatccagct gaaccaactg accctgagga aacgaagaag      1500
ccagaggagc cgaagaaccc tggttcctcc aacggaagct cccaatacgc caccattgca      1560
gcaatcatcg cagcaatcct aggtgccatt gctttggcct tccagttctt cccattcaag      1620
ttctaa                                                                 1626
<210>  20
<211>  11895
<212>  DNA
<213>  Knockout plasmid (pJYS3_ExeR)
<400>  20
taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt        60
gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga       120
cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat       180
tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat       240
gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat       300
gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac       360
aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc       420
ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga       480
aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac       540
tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa       600
taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt       660
aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt       720
gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca       780
gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa       840
cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga       900
ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc aatggttcgt tctcatggct       960
cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg      1020
ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa      1080
ctgttcaccg ggcccacgga atcatctacc tcaagctcga agcgctttcc ctgacggaca      1140
tcggaaacgc cagaaactcc gatacgtccg agggcgcggt gtaccgcctg cccctgggga      1200
tccagaatct cagccttagg catgacattg acaactacac gggccacggt attttccctt      1260
actcaagaaa tggggaggac aatgttttac gagcacaagt gtaactgttg ccactggtca      1320
aacctagcca gcccttagat agggagattc tcctcgattg cttccactac ctcagctgca      1380
gatggttccg tccgaggagc aaagcgctta atcgtattac cttctgcatc taccaggaat      1440
ttctcaaaat tccactcgat ttcgctacca tcagttgcct ctttgagcac cttgtacagg      1500
gggtgggcac cctccccatt cacctcggtt ttgctcaaga gcgggaaggt gacgtcgtac      1560
tgattttgcg cgaaagcaca cacctcagcg tcggttccag gttcctggcc gttgaattga      1620
ttgcagggca cgccaatgac aaagaagcct cgatcttggt attcctcata cagtttttga      1680
agcccttcat actgtggcgt gagtccgcac ttggatgcca cgttcacgat gagcaaaagg      1740
tggcccgccc aatccgccat ggtggtttct gtgccgtcgt tgagagttac gctgatgtca      1800
tgaatagaag tcataatcgc aaccctagtt gagggggagg atttagtgca tcatctaaat      1860
aaaggtcagc taataggtga actttggtga gaccaaaggt gaactgccag gtcgaccaaa      1920
ttgctcgcca agcagactcc gaaaaacacg ggtaattcat atggcttgta tctaatccat      1980
actgaacaga ggacctctcc tatgtctcgc atttctgcgc gcactctggc aatcgcactt      2040
gccggtgcaa ccgcggccag cctggcagtt gttccagcag caacagctaa tcctgccgga      2100
accgactcca gcacgcctat ggcatggctt gtgcaggacg gtggcgagac catcaagtcc      2160
atccgcaccg gcgaccaggt ggaattccag gcaccagtaa tcttcgatta ccgctacgac      2220
ctgtggaaat tccagccaac cacccctgtc accggcaaca ccgcaagctc cgaccttcct      2280
atcacctggg atgacacccg cgcggctgag ctagcttcaa tcaatgacgt tgctggcgaa      2340
ttccacatcg caagcttcaa cgtgctcaac tacttcacct ctctcggcga agatgaacca      2400
ggctgcagcg catacaggga tatcaacaac accccagtca ccgccaacaa ctgtaacgtc      2460
cgtggcgctt acaccgaaga agcactcgaa gatcagcaga gcaagatcgt cgaagcaatc      2520
aaccgccttg acgtcgatgt tcttggactt gaagaaatcg aaaacaccgc gaccgtcacc      2580
ggcgacgtct cccgtcgcga tgacgcactc aataccctcg tcgcagcact caacgaagca      2640
gttggatccg atcgctgggc ggccgtcgaa tctccagaac aattgggcac cgatgaagac      2700
tacatccgcg tcgccttcat ctacgaccaa accaccgtca agcccgtcgg cgaatcccga      2760
atcttcgacg acgcagcctt caccggcacc gcacgccagc cactcgcaca ggaattccag      2820
ccactcaacg acagcgagaa atccttcgtc ggcgtagtca accacttcaa gtccaagggc      2880
tctgtcactc gtggagacgc cgacaccggc gacggccaag gcaacaacgc caacgttcgc      2940
gtcgcacagg cacaggcact catcgaccac ctggaaaacc aggacgactg ggcatccaag      3000
ccaatcttca tcctcggcga caccaactcc tacgccaagg aaaccgcgat gaccaccctt      3060
tacggcgctg gctacaccaa catcgccacc gaattcgacg ctctagattg acagctagct      3120
cagtcctagg tataatggat ccgaatttct actgttgtag atcctcgacg gttggagcgt      3180
tacatttaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt      3240
ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg      3300
aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt      3360
aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct taagcttgca      3420
tgcctgcagg tcgacttagt tattgcggtt ctggacaaat tcaaagtatt cttcgttctt      3480
aatgacgaga ttcagcttct tgccttcctg gttgttcttg atgcgaccca ggagcatgag      3540
acccttcaga ccgatgtggt aggcgccgtt tgcatcagcg tcctgtggca tgttctttgg      3600
agcctggcgg gaatcgaaga agttgccgtt gacgtcggcc actggggaga tgaggtaatc      3660
cagctcggtg ccggtcttgg agttgcgcat ctgcaggatg gtgttgagca cagaggtcag      3720
ctttgcgaag aacttcttgt cggattcgcc gcagattgca gccttgatgc actcgccgtg      3780
gccgtattcg atggagtaat ccttcaggag cttctccagt tccttggttg ggtacacttc      3840
gcgggtatcc cagttgtggt tcttgtcgga gttgcggaag ttgatgaggc gggagccgaa      3900
ggatgcgatg gtccacttgc ccttggctgc cttatcgccg aagttcttgt agtcgaagga      3960
gaattcgaag tagcccttat ccaggttgta gcagatcttg tcgaacttgg agaagaactc      4020
ctgggacttg gagacggatt cgtactttgg gtagagctgg ttgacgaagc cggtcactgg      4080
gcagatctta gaggtgaagc cagctggcac gtagtagatg atgccggtct gcttgcccat      4140
cttcttgaag gtctcgaatg gggcggtcag ctggtatgca cggaggacgc cgccggtctt      4200
atcgaattcg ttgtccttga acacgaggta gttcagcttc tcgatgagca tcttttccag      4260
cttctggtag acctgcttct ccaccttgaa gcggccgcgc ttgaagccga agttcaggtc      4320
ttcgaagacc acgattgcgt tgtactcgat caccagctta gcgatttcgt ggaccacctg      4380
ggagaggtag ccttccttca tttccttgat gttgttgatc ttcttccaat ccttgcgagc      4440
ggaatcgcgg tccttctcga tagcggccag cttgtcgtgg tagttggtct tcatgcgatc      4500
gttgccgatg atgttgaagg tgtcctgctt gatgatgttg cccttgccgt cgaccagggt      4560
gtagtaggcg aggtggcgtt cgccgcgatc gatggacagg atgtgcacgt cgttagcctt      4620
ctccttcagg agcaggttga tttcatcgtt gaacttgttg gcgccggagg acttgaagtt      4680
gatggtgatt gggcagtgga agaagaactt gtcctcggtg aagcgcttat ccttgatcag      4740
gtcgtactcg aacacggatt ccttctttgg gttatccttg ttcttgttgg cgattgcttc      4800
cttggctggg tgggtgatct tctttgggat ggactgcttg cggtagaaca gctctgcttc      4860
gccgttgagc ttgtagacca catcctgcag gttgcgttcg tcgaagagtg ccttccagta      4920
gagggtgtgc aggtttgggc ggcccttgga gtaagcggag aagtccttgt tgtagatctg      4980
gaagaggtac agcttgccct ggttgaccac ggaatcgatg taggactcgg agatgttttc      5040
gaaggtcagc ttgtagccct ggttctccac ttcgcggtag aattcatcga tggagttgta      5100
gcgctgggta tcggagaagc ggaagccgaa gtccttccac tctgggtgct tggagatgga      5160
ctgcttgtag aaatcgatga acttgcggca gtcttcgatg ttgaactcga acttttcgta      5220
gcccttctgt ggggagccgt tcttggtgtg ggtggagtgg ttgcggatgc gcaggatatc      5280
ttcggatggg ttgtagaact tgatggactt tgcggagaag aagacctttg ggagcatctt      5340
gttagcgcct gggagcagct tgtacacgat cttcttgtag ccctcgccct tgttttcctt      5400
gatggcctta tcgtcgaaga tcttgttgtt cttcttgttc atcacgccca ggtagtactt      5460
atcgtccttg atgaagagga tggcggtgtt atctggttcc ttgttcttgt cccagccgtt      5520
tgccagggtg gagttctcga agttgagctt gaacttttca tcggagtatg gcttctgggt      5580
gatgtagttg cggatcttgt tgtacagtgg gacgatgtta gcgagttcga agtagcactc      5640
ttcgaacacc aggtagaagt gctcatcctt gtcgaggatg ttggccttgt cttcggactg      5700
ggagatgtgg aagatcttca gcttgtggag caggttgttg gtctgatcga gcaggtcctt      5760
gattgccttc acatcgtcct cagcggaggc ctggagcaga tccttcttgc cctggttctg      5820
gtacttgatg gagatctggg ccaggttatc cttgttctgt gcgatttcgt cgaagatcat      5880
tgggattgca gcgaagtttg cgaggatctc ttcgaagcgg cactgcttat cgatgtcgcg      5940
gtgcttgttg aactcttcga gagccagctt gatggtctcg agggacaggt acttagcctt      6000
ttcggtcttc ttggcgatca gctcctgttc cttcttggat gggttatcga ggttctttgg      6060
ggcgatctgc tgggtgatgt attccaggac tgcggtgccg atcacggagt aatcgtcgaa      6120
gacctgctgg gagagatcgg tcagggactt gtcgttcttg aagtagatct tggagagatc      6180
cagcttctga gccttcagat cgtcgaagag cagggagagg gtctccttga tggacttctc      6240
ttccacggtc ttgaaggctg cgatctgttc gtagaaggac tgcatggtgg tgaccacatc      6300
ggaatcgtcc tccagcttgt cgatgacgaa ggacttggat tcggtgtcgg acaggatctg      6360
cttgaagagc acggacatct tgtacttctt cagggtctta tcgttgatct gctgggagta      6420
gaggttgatg tactcgttga tgcccttgcg cttggtgttt tcgccgttga cgaacttgcc      6480
gccgatgatg gtgttgaact tggtgatgcc ggactggttc aggtagttgt tgaagttggc      6540
gatctcgaac acttcatcga gggagaagac gcgctggttc acttcagagg tcttgtaatc      6600
gatgtcgaag gtgagctctt cggccaggtc cttcttgatc tgctcgtagt tgatagcttc      6660
tggggcctta tccttcaggg actcgtactt tgccttgttt tcgaggaact ttggcaggtt      6720
atcgtcgacg atgcggtaga tgatagaggt tgggatatcg ttggaggagt acacgttctt      6780
gcggttttcg tggaagccct tgaagtaggt ggtccagccc ttgaaggact tgatgatctc      6840
cagagcttca tcgatgtcgg tgatgtcgga gttggccttg aagagctcga tgccgttatc      6900
cttggactgc ttgagccaca ggatgagatc ggattcctgg cccttctttg cgtcgatcag      6960
gttctggttg aagaggttct tgaacttctc ggaatccttg atgtattcgg agatctgctt      7020
cttgatggta tccttagcgg acttgaagtc cttctgcagg ttatcgtcat cggacttctt      7080
gagcttgaag tagacatcgg agtagttctg gagcaggtcc tcggagatgc acacggagga      7140
caggatctct tcgatgaaga actggtggta cttgtcgatg atctgctttg ccttcttgta      7200
atccttagcg cgcttttcgt catccaggat gaggccgcgt gccttgatgt tttcgagggt      7260
cttgccttgg gggatcagct caaaacggag ggtcttggac agggagtatt tattcacaaa      7320
ctcttggtag atggacatcg ttcaagtcct ttccaattcc acacatggta ccacacgatg      7380
attaattgta aacagctcag gtcatgattc cgcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac      7440
tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc      7500
acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac      7560
gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag      7620
cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc      7680
tcgccgtcgg gcatccgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga      7740
tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc      7800
tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc      7860
cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg      7920
agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg      7980
tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg      8040
tcttggagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc      8100
tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca      8160
tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca      8220
atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag      8280
atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag      8340
ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat      8400
cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc      8460
cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc      8520
tacgtgttcc gcttccggtg accgcctcga tgatcgccgg gtgggcgtgg cccaaggagg      8580
atcatccagc cattcggggt cgttcactgg ttcccctttc tgatttctgg catagaagaa      8640
cccccgtgaa ctgtgtggtt ccgggggttg ctgatttttg cgagacttct cgcgcaattc      8700
cctagcttag gtgaaaacac catgaaacac tagggaaaca cccatgaaac acccattagg      8760
gcagtagggc ggcttcttcg tctagggctt gcatttgggc ggtgatctgg tctttagcgt      8820
gtgaaagtgt gtcgtaggtg gcgtgctcaa tgcactcgaa cgtcacgtca tttaccgggt      8880
cacggtgggc aaagagaact agtgggttag acattgtttt cctcgttgtc ggtggtggtg      8940
agcttttcta gccgctcggt aaacgcggcg atcatgaact cttggaggtt ttcaccgttc      9000
tgcatgcctg cgcgcttcat gtcctcacgt agtgccaaag gaacgcgtgc ggtgaccacg      9060
acgggcttag cctttgcctg cgcttctagt gcttcgatgg tggcttgtgc ctgcgcttgc      9120
tgcgcctgta gtgcctgttg agcttcttgt agttgctgtt ctagctgtgc cttggttgcc      9180
atgctttaag actctagtag ctttcctgcg atatgtcatg cgcatgcgta gcaaacattg      9240
tcctgcaact cattcattat gtgcagtgct cctgttacta gtcgtacata ctcatattta      9300
cctagtctgc atgcagtgca tgcacatgca gtcatgtcgt gctaatgtgt aaaacatgta      9360
catgcagatt gctgggggtg cagggggcgg agccaccctg tccatgcggg gtgtggggct      9420
tgccccgccg gtacagacag tgagcaccgg ggcacctagt cgcggatacc ccccctaggt      9480
atcggacacg taaccctccc atgtcgatgc aaatctttaa cattgagtac gggtaagctg      9540
gcacgcatag ccaagctagg cggccaccaa acaccactaa aaattaatag tccctagaca      9600
agacaaaccc ccgtgcgagc taccaactca tatgcacggg ggccacataa cccgaagggg      9660
tttcaattga caaccatagc actagctaag acaacgggca caacacccgc acaaactcgc      9720
actgcgcaac cccgcacaac atcgggtcta ggtaacactg aaatagaagt gaacacctct      9780
aaggaaccgc aggtcaatga gggttctaag gtcactcgcg ctagggcgtg gcgtaggcaa      9840
aacgtcatgt acaagatcac caatagtaag gctctggcgg ggtgccatag gtggcgcagg      9900
gacgaagctg ttgcggtgtc ctggtcgtct aacggtgctt cgcagtttga gggtctgcaa      9960
aactctcact ctcgctgggg gtcatctctg gctgaattgg aagtcatggg cgaacgccgc     10020
attgagctgg ctattgctac taagaatcac ttggcggcgg gtggcgcgct catgatgttt     10080
gtgggcactg ttcgacacaa ccgctcacag tcatttgcgc aggttgaagc gggtattaag     10140
actgcgtact cttcgatggt gaaaacatct cagtggaaga aagaacgtgc acggtacggg     10200
gtggagcaca cctatagtga ctatgaggtc acagactctt gggcgaacgg ttggcacttg     10260
caccgcaaca tgctgttgtt cttggatcgt ccactgtctg acgatgaact caaggcgttt     10320
gaggattcca tgttttcccg ctggtctgct ggtgtggtta aggccggtat ggacgcgcca     10380
ctgcgtgagc acggggtcaa acttgatcag gtgtctacct ggggtggaga cgctgcgaaa     10440
atggcaacct acctcgctaa gggcatgtct caggaactga ctggctccgc tactaaaacc     10500
gcgtctaagg ggtcgtacac gccgtttcag atgttggata tgttggccga tcaaagcgac     10560
gccggcgagg atatggacgc tgttttggtg gctcggtggc gtgagtatga ggttggttct     10620
aaaaacctgc gttcgtcctg gtcacgtggg gctaagcgtg ctttgggcat tgattacata     10680
gacgctgatg tacgtcgtga aatggaagaa gaactgtaca agctcgccgg tctggaagca     10740
ccggaacggg tcgaatcaac ccgcgttgct gttgctttgg tgaagcccga tgattggaaa     10800
ctgattcagt ctgatttcgc ggttaggcag tacgttctcg attgcgtgga taaggctaag     10860
gacgtggccg ctgcgcaacg tgtcgctaat gaggtgctgg caagtctggg tgtggattcc     10920
accccgtgca tgatcgttat ggatgatgtg gacttggacg cggttctgcc tactcatggg     10980
gacgctacta agcgtgatct gaatgcggcg gtgttcgcgg gtaatgagca gactattctt     11040
cgcacccact aaaagcggca taaaccccgt tcgatatttt gtgcgatgaa tttatggtca     11100
atgtcgcggg ggcaaactat gatgggtctt gttgttggcg tcccggagcg taaaggatct     11160
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc     11220
actgagcgtc agaccttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc agtctgaatg     11280
acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag gaactgctga     11340
acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc tgagaagccc     11400
gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa aaggcgcctg     11460
tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg aatgtcacga     11520
aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca gcgatttgcc     11580
cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt gtagaggagc     11640
aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta gtgagttata     11700
cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc tataaattat     11760
aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta cagagggtct     11820
agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac ccacaactca     11880
aaggaaaagg actag                                                      11895
<210>  21
<211>  7741
<212>  DNA
<213>  Recombinant plasmid (pXMJ19*ATP)
<400>  21
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc atgactgaca ttgatctggt        60
ggtggaaaac gtccaaagga ttatcgccac caaagagaca ccgccgacct ctgcggaaat       120
agcgagcctg attcgggaac aagcaggcgt gatcagtaac gaggacatcg tgatggtgtt       180
gcgtcgactg cgcagtgatt ctgtgggcgt gggaccgttg gaatctctgc ttgcgcttcc       240
tggcgtgacg gatgtgttgg ttaatgccca tgacagcgtg tggattgatc gcggtcaggg       300
cgtggagaaa gtcgacatgg atctgggctc agaggaggcg gtgcgtcgcc ttgccacccg       360
gttggcgttg acctgtggca gacgcttaga tgatgcgcag cctttcgctg atggccgaat       420
caccagggac gacggcagcg tgttgcgcat tcacgcggtg ttggcaccct tggcggaatc       480
cggcacgtgc atcagtgtgc gagtactgcg tcaagcacgg ctgagccttg atgatcttat       540
ccaaagcggc acggtgcctg aggacatcgc gcctgcgctc cggaacatca tcaatcaacg       600
gcgctcgttc cttgttgtcg gtggcaccgg cacagggaaa accacattgc tgtccgcgat       660
gctcaccgaa gttcccgctg atcaacgaat catctgcatc gaggacaccg cagagcttca       720
tcccggccat ccaagcacca tcaacttggt gtctcgccaa gcaaacgtcg agggcgccgg       780
cgccgtgagc atggcggatt tgttgaaaca atcgctgcgc atgaggcctg accggattgt       840
cgtcggagag attcgcggtg cggaagtcgt ggatcttttg gctgcgatga ataccggaca       900
cgacggcggt gctggcacca ttcacgcgaa ctccatctct gaagttcccg cgcgcatgga       960
agctcttgcg gcgaccggcg gattggaccg catggcattg cattctcaac tcgcggccgc      1020
agtggacatt gtgctggtca tgaaacacac cccttttggc cgcaggctag ctcaactcgg      1080
ggtgctccgc ggaaatcctg tgaccacgca ggtggtgtgg gatttggacc acggcatgca      1140
cgaagggagc gaagaggcat ggtttatgcc ctagggatcc ccgggtaccg agctcgaatt      1200
cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa      1260
cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct      1320
gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc      1380
catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg      1440
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc      1500
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc      1560
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt      1620
tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac      1680
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt      1740
tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag      1800
aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg      1860
aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa      1920
tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc      1980
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg      2040
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt      2100
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa      2160
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct      2220
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc      2280
cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg      2340
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct      2400
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag      2460
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga      2520
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga      2580
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg      2640
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag      2700
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag      2760
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga      2820
agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact      2880
ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt      2940
tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac      3000
actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc      3060
ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc      3120
aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt      3180
agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg      3240
cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac      3300
gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta      3360
gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt      3420
gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg      3480
cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg      3540
ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg      3600
cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc      3660
ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc      3720
ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat      3780
gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc      3840
aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact      3900
catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta      3960
agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc      4020
taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat      4080
gagggttcta aggtcactcg cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc      4140
accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg      4200
tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg      4260
gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct      4320
actaagaatc acttggcggc gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac      4380
aaccgctcac agtcatttgc gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg      4440
gtgaaaacat ctcagtggaa gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt      4500
gactatgagg tcacagactc ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg      4560
ttcttggatc gtccactgtc tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc      4620
cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc      4680
aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct      4740
aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac      4800
acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac      4860
gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc      4920
tggtcacgtg gggctaagcg tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt      4980
gaaatggaag aagaactgta caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca      5040
acccgcgttg ctgttgcttt ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc      5100
gcggttaggc agtacgttct cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa      5160
cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt      5220
atggatgatg tggacttgga cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat      5280
ctgaatgcgg cggtgttcgc gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg      5340
cataaacccc gttcgatatt ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact      5400
atgatgggtc ttgttgttgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa      5460
ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc      5520
gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac      5580
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc      5640
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa      5700
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc      5760
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg      5820
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg      5880
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa      5940
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga      6000
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt      6060
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat      6120
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg      6180
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc      6240
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg      6300
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg      6360
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc      6420
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc      6480
gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt      6540
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca      6600
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat      6660
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg      6720
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg      6780
ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca      6840
gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg      6900
tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa      6960
tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa      7020
gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca      7080
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt      7140
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt      7200
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg      7260
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac      7320
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac      7380
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa      7440
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca      7500
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg      7560
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt      7620
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc      7680
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat      7740
t                                                                      7741
<210>  22
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Recognition sequence on ExeR gene
<400>  22
cctcgacggt tggagcgtta c                                                  21
<210>  23
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Recognition sequence on crtYf gene
<400>  23
caggcaacca tagggcagga a                                                  21
<210>  24
<211>  6601
<212>  DNA
<213>  Plasmid (pXMJ19)
<400>  24
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt        60
cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa       120
cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct       180
gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc       240
catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg       300
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc       360
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc       420
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt       480
tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac       540
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt       600
tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag       660
aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg       720
aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa       780
tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc       840
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg       900
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt       960
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa      1020
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct      1080
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc      1140
cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg      1200
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct      1260
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag      1320
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga      1380
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga      1440
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg      1500
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag      1560
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag      1620
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga      1680
agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact      1740
ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt      1800
tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac      1860
actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc      1920
ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc      1980
aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt      2040
agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg      2100
cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac      2160
gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta      2220
gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt      2280
gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg      2340
cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg      2400
ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg      2460
cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc      2520
ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc      2580
ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat      2640
gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc      2700
aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact      2760
catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta      2820
agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc      2880
taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat      2940
gagggttcta aggtcactcg cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc      3000
accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg      3060
tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg      3120
gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct      3180
actaagaatc acttggcggc gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac      3240
aaccgctcac agtcatttgc gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg      3300
gtgaaaacat ctcagtggaa gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt      3360
gactatgagg tcacagactc ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg      3420
ttcttggatc gtccactgtc tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc      3480
cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc      3540
aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct      3600
aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac      3660
acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac      3720
gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc      3780
tggtcacgtg gggctaagcg tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt      3840
gaaatggaag aagaactgta caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca      3900
acccgcgttg ctgttgcttt ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc      3960
gcggttaggc agtacgttct cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa      4020
cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt      4080
atggatgatg tggacttgga cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat      4140
ctgaatgcgg cggtgttcgc gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg      4200
cataaacccc gttcgatatt ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact      4260
atgatgggtc ttgttgttgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa      4320
ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc      4380
gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac      4440
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc      4500
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa      4560
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc      4620
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg      4680
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg      4740
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa      4800
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga      4860
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt      4920
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat      4980
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg      5040
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc      5100
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg      5160
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg      5220
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc      5280
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc      5340
gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt      5400
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca      5460
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat      5520
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg      5580
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg      5640
ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca      5700
gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg      5760
tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa      5820
tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa      5880
gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca      5940
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt      6000
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt      6060
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg      6120
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac      6180
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac      6240
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa      6300
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca      6360
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg      6420
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt      6480
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc      6540
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat      6600
t                                                                      6601
<210>  25
<211>  1494
<212>  DNA
<213>  ExeR gene PCR after being knocked out (DNA)
<400>  25
gtgagaccaa aggtgaactg ccaggtcgac caaattgctc gccaagcaga ctccgaaaaa        60
cacgggtaat tcatatggct tgtatctaat ccatactgaa cagaggacct ctcctatgtc       120
tcgcatttct gcgcgcactc tggcaatcgc acttgccggt gcaaccgcgg ccagcctggc       180
agttgttcca gcagcaacag ctaatcctgc cggaaccgac tccagcacgc ctatggcatg       240
gcttgtgcag gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt       300
ccaggcacca gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc       360
tgtcaccggc aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc       420
tgagctagct tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct       480
caactacttc acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa       540
caacacccca gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact       600
cgaagatcag cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg       660
acttgaagaa atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc       720
actcaatacc ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt       780
cgaatctcca gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga       840
ccaaaccacc gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg       900
caccgcacgc cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt       960
cgtcggcgta gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac      1020
cggcgacggc caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga      1080
ccacctggaa aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa      1140
ctcctacgcc aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc      1200
caccgaattc gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca      1260
cgcactcggc aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa      1320
cgctgacgaa gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt      1380
cgagaacaac gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag      1440
cgagaccact gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctac            1494
<210>  26
<211>  2619
<212>  DNA
<213>  ExeR gene PCR not knocked out (DNA)
<400>  26
gtgagaccaa aggtgaactg ccaggtcgac caaattgctc gccaagcaga ctccgaaaaa        60
cacgggtaat tcatatggct tgtatctaat ccatactgaa cagaggacct ctcctatgtc       120
tcgcatttct gcgcgcactc tggcaatcgc acttgccggt gcaaccgcgg ccagcctggc       180
agttgttcca gcagcaacag ctaatcctgc cggaaccgct cctgtcatca acgaaatcta       240
cggaggcggt ggaaacagcg gatcgttgtt ctccaacgac ttcattgagc tctacaaccc       300
aacctcaggg gacatttccc tcgacggttg gagcgttacc tactacgcag ccaacggtaa       360
ctccggcgga accacaaacc tgaccggaaa catccctgcc aacggttact acctcatcca       420
gcaacgcgca ggcagcaaca acaccggcgc tctgcctacc ccagacgcca ccggtaactt       480
ggcaatgggt gcctcccaag gatcagttgc actgaccgac aactctggcc taaccgctga       540
ccttgtcgga ttcggtggca cgtccatgtt tgaaggaaca gctgctgcac ctgagaccag       600
caacaaattg tctgttcaac gcaaagaagt tggcgctgac tctgataaca actccgtaga       660
cttcgagact ggagctccaa ctccaacgtc ctcgggagga tccgctcctg ttgacccagg       720
cgagccagaa actccagtaa accctgggga aacagtctcc atcgcacaaa tccaaggaac       780
cggtctcgct accccactcg agggtcagac cgtcaccacc gaaggtattg tcactgccgt       840
ttacgcagaa ggtggcttca acggttacta catccagaca cctggatctg gtactgcacc       900
aaaggttgct ggcgacgcat ccgacggcat cttcgtctac gtgggaagca atggttccta       960
cccagagctc ggcgcatctg tcaccgtcac tggcaaggcc accgaacact acgagatgac      1020
tcagctaggc aactcctcct tcaccgtttc ggacaccgca ttcgagccag taaccccact      1080
cgaactggac accgttccta ctggcgatga cattcgcgaa gcatacgaag gcatgctgct      1140
gaagccaacc ggcgctcaca ccgtgaccaa caactacgca accaacacct tcggtgaaat      1200
tgccctcgcc ccaggtaacg agcctttgta ccaggccact caaatggtgg caccgggagc      1260
cgaagcgatt gcgtacgagg cggaaaacgt cgcaaagcaa attacgctgg atgacggacg      1320
ctccggcaac tacactcgcg gcgactccag cacgcctatg gcatggcttg tgcaggacgg      1380
tggcgagacc atcaagtcca tccgcaccgg cgaccaggtg gaattccagg caccagtaat      1440
cttcgattac cgctacgacc tgtggaaatt ccagccaacc acccctgtca ccggcaacac      1500
cgcaagctcc gaccttccta tcacctggga tgacacccgc gcggctgagc tagcttcaat      1560
caatgacgtt gctggcgaat tccacatcgc aagcttcaac gtgctcaact acttcacctc      1620
tctcggcgaa gatgaaccag gctgcagcgc atacagggat atcaacaaca ccccagtcac      1680
cgccaacaac tgtaacgtcc gtggcgctta caccgaagaa gcactcgaag atcagcagag      1740
caagatcgtc gaagcaatca accgccttga cgtcgatgtt cttggacttg aagaaatcga      1800
aaacaccgcg accgtcaccg gcgacgtctc ccgtcgcgat gacgcactca ataccctcgt      1860
cgcagcactc aacgaagcag ttggatccga tcgctgggcg gccgtcgaat ctccagaaca      1920
attgggcacc gatgaagact acatccgcgt cgccttcatc tacgaccaaa ccaccgtcaa      1980
gcccgtcggc gaatcccgaa tcttcgacga cgcagccttc accggcaccg cacgccagcc      2040
actcgcacag gaattccagc cactcaacga cagcgagaaa tccttcgtcg gcgtagtcaa      2100
ccacttcaag tccaagggct ctgtcactcg tggagacgcc gacaccggcg acggccaagg      2160
caacaacgcc aacgttcgcg tcgcacaggc acaggcactc atcgaccacc tggaaaacca      2220
ggacgactgg gcatccaagc caatcttcat cctcggcgac accaactcct acgccaagga      2280
aaccgcgatg accacccttt acggcgctgg ctacaccaac atcgccaccg aattcgacgc      2340
tggctacagc taccagttct ccggccgcat tggcagcctc gaccacgcac tcggcaacga      2400
agcagccatg aagcacgtca tcgacgccga ggtctgggac atcaacgctg acgaagcaat      2460
cgcattcgaa tactcccgtc gactcaacaa cacctccgac gtattcgaga acaacgtctt      2520
ccgctcctcc gaccacgacc cgatcaaggt cggattcaac ctcagcgaga ccactgagcc      2580
caccattccg gtagagccca ctgatcctgc agaacctac                             2619
<210>  27
<211>  11982
<212>  DNA
<213>  Plasmid (pJYS3_crtYf)
<400>  27
taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt        60
gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga       120
cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat       180
tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat       240
gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat       300
gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac       360
aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc       420
ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga       480
aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac       540
tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa       600
taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt       660
aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt       720
gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca       780
gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa       840
cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga       900
ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc aatggttcgt tctcatggct       960
cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg      1020
ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa      1080
ctgttcaccg ggcccgtggg tggctaggca agttacagaa ctgatcggat aaaagcagag      1140
ttatatctga tgaattgcta ttagcagtat cgttatcaca gcaccaacaa agtagttcag      1200
ccacaggaaa actttccaac tgcgattagc ctgttcacaa ctggcatctg taatgttcca      1260
aaatcgtgcg gcattaaata cgtaagttag aatcgcaatc ccgatgatcc acgccggatt      1320
aggcaaagta gtgactaaca cagcagctag taaataaagt actactgaaa gccgaatggc      1380
tccacgcgcc ccaattacag tggcaattga gctcagatta gcttcccggt ctgcattaac      1440
atcctgtact gctccaagga tctgactggc catgccccac aagaaaaagg atcccagtgc      1500
tatccacatc gctgctgaag gagatgttcc agtgatcgtt gcaccgatta atgcaggtga      1560
agtgaagtga gtagaagatg ttagagcatc gataaagggg cgttctttaa aacgcaattt      1620
cggtgctgaa taagcaatca ctgctagcac tgagagtgtc agccataaag acgacatcca      1680
ggtgccaaat atgaaaagaa taactaggaa aggaattgtt gagatagccg aggcccataa      1740
cagtgtgctg tgggaacttt tcggtagcac ggccccctcg acgccgcctt tgcggggatt      1800
acgcatatca gattcgtaat caaaaacatc gttgatacca tacatggcga tgttatacgg      1860
gataagaaaa aatacgatgc ctagccaaaa cagccagtca atctctcctg catttaatag      1920
gtaggccaga ccaaaggggt aggcggtatt gatccagcta atggggcgag atgacaatag      1980
aattagtctt attttttcca tcatgactac ggcttttctg gctcagattg cgtggtggtg      2040
gatcgcaccc aatgagaact aggagagtac ctagataaat aaaggccata aaaatatcgc      2100
tatcttgctc attttgtgaa atatcgatga tagggatcaa aatttaatga tcgtatgagg      2160
tcttttgaga tggtgtcgtt ttaggcggca atggttcggg cagtggtcct gcactggtat      2220
cggcatgtaa acgcttaata atattctcgg cagaaattaa acacatgggt attcctacac      2280
ccgggacggt ggtggcaccg gaatagaaga ggttattgac cttgcgggag ctattgcgcc      2340
ctcttaagaa agcggactgt ctgagggtat gtgctggacc cagcgcactg cctacccatg      2400
aatggtagcg gtgctcaaaa tccgcagggc caatggtgcg tttgaccaca attcggtcag      2460
tgaggtcagg gatgccggct tgcgtagcaa tttgattgat tgcatgtgac gcgattgttt      2520
ccacggatgc tgaagccgac tgcatatacg catcaccgtg gccgatgctg ctagaggcct      2580
tggtcggaat taaaacaaaa aggttttcgt atccagcagg tgcaacgccg tcttcggacg      2640
ttgaaggctt ggagacataa atggaatttg atgcattgtg ggggcgggta agttgaggcc      2700
cgtcgaaaac tacagcaaaa tcatctgtcc aatcttcact gaagaaaagg ttgtgatggt      2760
cgagctgggg taactctcct tttacgccca ggaggattaa taccgctcca attccaggat      2820
tgcgattgga ccaatatcgt tcgggatagg ttcgaagttc ccggggaagc agattatttt      2880
ctgtatggtg taggtcgcct gctgaaacca caagatccgc atctagattt tgcacttttc      2940
tgttgtgaag caagctcaca cctgtggcgc ttgtgttgcc cctcgatgaa gcagtgttga      3000
tggaaatgac ctcagaatcg agttgaaact caaccccgtt ttccagcgct aactgatgca      3060
gagcgttaac cactgcagta aaaccaccta tagggtattt cactccctgc accaaatcgg      3120
tatgactcat caagtggtac atcgatgggg tagtagtggg tcgggaagac aggaagactg      3180
ctggataggc tagattgaca gctagctcag tcctaggtat aatggatccg aatttctact      3240
gttgtagatc aggcaaccat agggcaggaa atttaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa      3300
gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat      3360
ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc      3420
ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt      3480
gcgtttctac aaactcttaa gcttgcatgc ctgcaggtcg acttagttat tgcggttctg      3540
gacaaattca aagtattctt cgttcttaat gacgagattc agcttcttgc cttcctggtt      3600
gttcttgatg cgacccagga gcatgagacc cttcagaccg atgtggtagg cgccgtttgc      3660
atcagcgtcc tgtggcatgt tctttggagc ctggcgggaa tcgaagaagt tgccgttgac      3720
gtcggccact ggggagatga ggtaatccag ctcggtgccg gtcttggagt tgcgcatctg      3780
caggatggtg ttgagcacag aggtcagctt tgcgaagaac ttcttgtcgg attcgccgca      3840
gattgcagcc ttgatgcact cgccgtggcc gtattcgatg gagtaatcct tcaggagctt      3900
ctccagttcc ttggttgggt acacttcgcg ggtatcccag ttgtggttct tgtcggagtt      3960
gcggaagttg atgaggcggg agccgaagga tgcgatggtc cacttgccct tggctgcctt      4020
atcgccgaag ttcttgtagt cgaaggagaa ttcgaagtag cccttatcca ggttgtagca      4080
gatcttgtcg aacttggaga agaactcctg ggacttggag acggattcgt actttgggta      4140
gagctggttg acgaagccgg tcactgggca gatcttagag gtgaagccag ctggcacgta      4200
gtagatgatg ccggtctgct tgcccatctt cttgaaggtc tcgaatgggg cggtcagctg      4260
gtatgcacgg aggacgccgc cggtcttatc gaattcgttg tccttgaaca cgaggtagtt      4320
cagcttctcg atgagcatct tttccagctt ctggtagacc tgcttctcca ccttgaagcg      4380
gccgcgcttg aagccgaagt tcaggtcttc gaagaccacg attgcgttgt actcgatcac      4440
cagcttagcg atttcgtgga ccacctggga gaggtagcct tccttcattt ccttgatgtt      4500
gttgatcttc ttccaatcct tgcgagcgga atcgcggtcc ttctcgatag cggccagctt      4560
gtcgtggtag ttggtcttca tgcgatcgtt gccgatgatg ttgaaggtgt cctgcttgat      4620
gatgttgccc ttgccgtcga ccagggtgta gtaggcgagg tggcgttcgc cgcgatcgat      4680
ggacaggatg tgcacgtcgt tagccttctc cttcaggagc aggttgattt catcgttgaa      4740
cttgttggcg ccggaggact tgaagttgat ggtgattggg cagtggaaga agaacttgtc      4800
ctcggtgaag cgcttatcct tgatcaggtc gtactcgaac acggattcct tctttgggtt      4860
atccttgttc ttgttggcga ttgcttcctt ggctgggtgg gtgatcttct ttgggatgga      4920
ctgcttgcgg tagaacagct ctgcttcgcc gttgagcttg tagaccacat cctgcaggtt      4980
gcgttcgtcg aagagtgcct tccagtagag ggtgtgcagg tttgggcggc ccttggagta      5040
agcggagaag tccttgttgt agatctggaa gaggtacagc ttgccctggt tgaccacgga      5100
atcgatgtag gactcggaga tgttttcgaa ggtcagcttg tagccctggt tctccacttc      5160
gcggtagaat tcatcgatgg agttgtagcg ctgggtatcg gagaagcgga agccgaagtc      5220
cttccactct gggtgcttgg agatggactg cttgtagaaa tcgatgaact tgcggcagtc      5280
ttcgatgttg aactcgaact tttcgtagcc cttctgtggg gagccgttct tggtgtgggt      5340
ggagtggttg cggatgcgca ggatatcttc ggatgggttg tagaacttga tggactttgc      5400
ggagaagaag acctttggga gcatcttgtt agcgcctggg agcagcttgt acacgatctt      5460
cttgtagccc tcgcccttgt tttccttgat ggccttatcg tcgaagatct tgttgttctt      5520
cttgttcatc acgcccaggt agtacttatc gtccttgatg aagaggatgg cggtgttatc      5580
tggttccttg ttcttgtccc agccgtttgc cagggtggag ttctcgaagt tgagcttgaa      5640
cttttcatcg gagtatggct tctgggtgat gtagttgcgg atcttgttgt acagtgggac      5700
gatgttagcg agttcgaagt agcactcttc gaacaccagg tagaagtgct catccttgtc      5760
gaggatgttg gccttgtctt cggactggga gatgtggaag atcttcagct tgtggagcag      5820
gttgttggtc tgatcgagca ggtccttgat tgccttcaca tcgtcctcag cggaggcctg      5880
gagcagatcc ttcttgccct ggttctggta cttgatggag atctgggcca ggttatcctt      5940
gttctgtgcg atttcgtcga agatcattgg gattgcagcg aagtttgcga ggatctcttc      6000
gaagcggcac tgcttatcga tgtcgcggtg cttgttgaac tcttcgagag ccagcttgat      6060
ggtctcgagg gacaggtact tagccttttc ggtcttcttg gcgatcagct cctgttcctt      6120
cttggatggg ttatcgaggt tctttggggc gatctgctgg gtgatgtatt ccaggactgc      6180
ggtgccgatc acggagtaat cgtcgaagac ctgctgggag agatcggtca gggacttgtc      6240
gttcttgaag tagatcttgg agagatccag cttctgagcc ttcagatcgt cgaagagcag      6300
ggagagggtc tccttgatgg acttctcttc cacggtcttg aaggctgcga tctgttcgta      6360
gaaggactgc atggtggtga ccacatcgga atcgtcctcc agcttgtcga tgacgaagga      6420
cttggattcg gtgtcggaca ggatctgctt gaagagcacg gacatcttgt acttcttcag      6480
ggtcttatcg ttgatctgct gggagtagag gttgatgtac tcgttgatgc ccttgcgctt      6540
ggtgttttcg ccgttgacga acttgccgcc gatgatggtg ttgaacttgg tgatgccgga      6600
ctggttcagg tagttgttga agttggcgat ctcgaacact tcatcgaggg agaagacgcg      6660
ctggttcact tcagaggtct tgtaatcgat gtcgaaggtg agctcttcgg ccaggtcctt      6720
cttgatctgc tcgtagttga tagcttctgg ggccttatcc ttcagggact cgtactttgc      6780
cttgttttcg aggaactttg gcaggttatc gtcgacgatg cggtagatga tagaggttgg      6840
gatatcgttg gaggagtaca cgttcttgcg gttttcgtgg aagcccttga agtaggtggt      6900
ccagcccttg aaggacttga tgatctccag agcttcatcg atgtcggtga tgtcggagtt      6960
ggccttgaag agctcgatgc cgttatcctt ggactgcttg agccacagga tgagatcgga      7020
ttcctggccc ttctttgcgt cgatcaggtt ctggttgaag aggttcttga acttctcgga      7080
atccttgatg tattcggaga tctgcttctt gatggtatcc ttagcggact tgaagtcctt      7140
ctgcaggtta tcgtcatcgg acttcttgag cttgaagtag acatcggagt agttctggag      7200
caggtcctcg gagatgcaca cggaggacag gatctcttcg atgaagaact ggtggtactt      7260
gtcgatgatc tgctttgcct tcttgtaatc cttagcgcgc ttttcgtcat ccaggatgag      7320
gccgcgtgcc ttgatgtttt cgagggtctt gccttggggg atcagctcaa aacggagggt      7380
cttggacagg gagtatttat tcacaaactc ttggtagatg gacatcgttc aagtcctttc      7440
caattccaca catggtacca cacgatgatt aattgtaaac agctcaggtc atgattccgc      7500
gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc      7560
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc      7620
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc      7680
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag      7740
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tccgcgcctt gagcctggcg      7800
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga      7860
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg      7920
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc      7980
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc      8040
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg      8100
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tggagttcat tcagggcacc ggacaggtcg      8160
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag      8220
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga      8280
gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga      8340
tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact      8400
ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct      8460
gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt      8520
ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt      8580
cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgttccgct tccggtgacc gcctcgatga      8640
tcgccgggtg ggcgtggccc aaggaggatc atccagccat tcggggtcgt tcactggttc      8700
ccctttctga tttctggcat agaagaaccc ccgtgaactg tgtggttccg ggggttgctg      8760
atttttgcga gacttctcgc gcaattccct agcttaggtg aaaacaccat gaaacactag      8820
ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct agggcttgca      8880
tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg tgctcaatgc      8940
actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt gggttagaca      9000
ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa cgcggcgatc      9060
atgaactctt ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc ctcacgtagt      9120
gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc ttctagtgct      9180
tcgatggtgg cttgtgcctg cgcttgctgc gcctgtagtg cctgttgagc ttcttgtagt      9240
tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt tcctgcgata      9300
tgtcatgcgc atgcgtagca aacattgtcc tgcaactcat tcattatgtg cagtgctcct      9360
gttactagtc gtacatactc atatttacct agtctgcatg cagtgcatgc acatgcagtc      9420
atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag ggggcggagc      9480
caccctgtcc atgcggggtg tggggcttgc cccgccggta cagacagtga gcaccggggc      9540
acctagtcgc ggataccccc cctaggtatc ggacacgtaa ccctcccatg tcgatgcaaa      9600
tctttaacat tgagtacggg taagctggca cgcatagcca agctaggcgg ccaccaaaca      9660
ccactaaaaa ttaatagtcc ctagacaaga caaacccccg tgcgagctac caactcatat      9720
gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt caattgacaa ccatagcact agctaagaca      9780
acgggcacaa cacccgcaca aactcgcact gcgcaacccc gcacaacatc gggtctaggt      9840
aacactgaaa tagaagtgaa cacctctaag gaaccgcagg tcaatgaggg ttctaaggtc      9900
actcgcgcta gggcgtggcg taggcaaaac gtcatgtaca agatcaccaa tagtaaggct      9960
ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg cggtgtcctg gtcgtctaac     10020
ggtgcttcgc agtttgaggg tctgcaaaac tctcactctc gctgggggtc atctctggct     10080
gaattggaag tcatgggcga acgccgcatt gagctggcta ttgctactaa gaatcacttg     10140
gcggcgggtg gcgcgctcat gatgtttgtg ggcactgttc gacacaaccg ctcacagtca     10200
tttgcgcagg ttgaagcggg tattaagact gcgtactctt cgatggtgaa aacatctcag     10260
tggaagaaag aacgtgcacg gtacggggtg gagcacacct atagtgacta tgaggtcaca     10320
gactcttggg cgaacggttg gcacttgcac cgcaacatgc tgttgttctt ggatcgtcca     10380
ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt tttcccgctg gtctgctggt     10440
gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg gggtcaaact tgatcaggtg     10500
tctacctggg gtggagacgc tgcgaaaatg gcaacctacc tcgctaaggg catgtctcag     10560
gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt cgtacacgcc gtttcagatg     10620
ttggatatgt tggccgatca aagcgacgcc ggcgaggata tggacgctgt tttggtggct     10680
cggtggcgtg agtatgaggt tggttctaaa aacctgcgtt cgtcctggtc acgtggggct     10740
aagcgtgctt tgggcattga ttacatagac gctgatgtac gtcgtgaaat ggaagaagaa     10800
ctgtacaagc tcgccggtct ggaagcaccg gaacgggtcg aatcaacccg cgttgctgtt     10860
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gtgctggcaa gtctgggtgt ggattccacc ccgtgcatga tcgttatgga tgatgtggac     11040
ttggacgcgg ttctgcctac tcatggggac gctactaagc gtgatctgaa tgcggcggtg     11100
ttcgcgggta atgagcagac tattcttcgc acccactaaa agcggcataa accccgttcg     11160
atattttgtg cgatgaattt atggtcaatg tcgcgggggc aaactatgat gggtcttgtt     11220
gttggcgtcc cggagcgtaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca     11280
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccttgatgat accgctgcct     11340
tactgggtgc attagccagt ctgaatgacc tgtcacggga taatccgaag tggtcagact     11400
ggaaaatcag agggcaggaa ctgctgaaca gcaaaaagtc agatagcacc acatagcaga     11460
cccgccataa aacgccctga gaagcccgtg acgggctttt cttgtattat gggtagtttc     11520
cttgcatgaa tccataaaag gcgcctgtag tgccatttac ccccattcac tgccagagcc     11580
gtgagcgcag cgaactgaat gtcacgaaaa agacagcgac tcaggtgcct gatggtcgga     11640
gacaaaagga atattcagcg atttgcccga gcttgcgagg gtgctactta agcctttagg     11700
gttttaaggt ctgttttgta gaggagcaaa cagcgtttgc gacatccttt tgtaatactg     11760
cggaactgac taaagtagtg agttatacac agggctggga tctattcttt ttatcttttt     11820
ttattctttc tttattctat aaattataac cacttgaata taaacaaaaa aaacacacaa     11880
aggtctagcg gaatttacag agggtctagc agaatttaca agttttccag caaaggtcta     11940
gcagaattta cagataccca caactcaaag gaaaaggact ag                        11982
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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