(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウム属菌株、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を用いて果糖含有基質からプシコースを生産する方法であって、
前記マイクロバクテリウム属菌株は、寄託番号ＫＣＣＭ１２０３３Ｐを有するマイクロバクテリウムオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ）および寄託番号ＫＣＣＭ１２０３４Ｐを有するマイクロバクテリウムフィロスファエラエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）からなる群より選択された１種以上である、プシコースを生産する方法。
【請求項２】
前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖含有基質と反応させる工程を含む、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項３】
前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖含有基質と反応させる工程は、前記マイクロバクテリウム属菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を果糖含有基質と混合して行われる、請求項２に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項４】
前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖含有基質と反応させる工程は、前記マイクロバクテリウム属菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上が固定化された担体に果糖含有基質を接触させる工程である、請求項２に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項５】
前記果糖含有基質は、４０〜７５％（ｗ／ｗ）の濃度の果糖を含有する、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項６】
前記方法は、緩衝溶液を使用しないことを特徴とする、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項７】
前記方法は、４０〜８０℃の温度条件下で行われる、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項８】
前記方法は、１〜４８時間行われる、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項９】
果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウム属菌株、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含む、果糖からプシコースを生産するプシコース生産用組成物であって、
前記マイクロバクテリウム属菌株は、寄託番号ＫＣＣＭ１２０３３Ｐを有するマイクロバクテリウムオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ）および寄託番号ＫＣＣＭ１２０３４Ｐを有するマイクロバクテリウムフィロスファエラエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）からなる群より選択された１種以上である、組成物。
【請求項１０】
前記マイクロバクテリウム属菌株は、果糖と７０℃の温度で１８時間反応時、９〜３０％の相対転換活性を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
果糖をプシコースに転換する活性を有するマイクロバクテリウム属菌株であって、前記菌株は寄託番号ＫＣＣＭ１２０３３Ｐを有するマイクロバクテリウムオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ）または寄託番号ＫＣＣＭ１２０３４Ｐを有するマイクロバクテリウムフィロスファエラエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）である、菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロバクテリウム属菌株、前記菌株を含むプシコース生産用組成物、およびこれを用いたプシコース生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）は、果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番炭素のエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）である。果糖と比較すると、果糖の７０％に相当する甘味度を有しているが、果糖と異なり体内吸収時に殆ど代謝されず、ブドウ糖の吸収を抑制して血糖抑制作用を行う機能がある。したがって、プシコースは、糖尿病患者用食品または飲料、健康用食品または飲料などに用いることができる。更にプシコースは、肝臓での脂質合成に関与する酵素活性を抑制する機能があって腹部脂肪蓄積を抑制できるなど血糖調節、虫歯予防および肝臓での脂肪合成を阻害する機能も有しているので、健康食品など様々な機能性食品などに使用することができる。
【０００３】
砂糖代替甘味料として多く使用されている糖アルコール類は、一定量以上摂取すると、下痢を誘発するなどの副作用があるが、プシコースは、このような既知の副作用がない。よって、プシコースはダイエット甘味料として関心が高まっているが、自然界に極めて珍しく存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためには、プシコースを効率的に製造する技術の開発が必要である。
【０００４】
従来のプシコース製造方法は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いて果糖からプシコースを生産する化学的方法のような主に化学的合成過程を経て製造することである。しかし、化学的合成による場合、糖蜜処理過程またはブドウ糖異性化反応過程中にプシコースが非常に少量存在するため、そのための費用が多くかかり、副産物が発生するという短所がある。
【０００５】
このような問題点を解決するために、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプシコースエピマー化酵素によって果糖からプシコースを生産するといった、果糖を基質にして酵素反応によってプシコースを製造する生物学的方法が研究されている。
【０００６】
しかし、従来の機能が明らかになった酵素的方法によれば、プシコースを生産する酵素がアルカリ条件のｐＨ下で最適を示す場合が多く、アルカリ条件下での反応は非特異的反応と糖の褐変化を誘導するため産業化に適切でない。また、従来の酵素は高温度での安定性に劣るか、遅い反応速度によって産業化に適用されるプシコース生産の収率が低く、製造原価が上昇するという問題があった。したがって、副産物を生成せず、産業化に適した温度条件下で高い収率でプシコースを生産することができる方法が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一例は、果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を提供する。
【０００８】
本発明のまた他の例は、前記マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株、前記菌株の培養物、および／または前記菌株の破砕物を含むプシコース生産用組成物を提供する。
【０００９】
本発明のまた他の例は、前記マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を用いて果糖からプシコースを生産する方法を提供する。
【００１０】
本発明のまた他の例は、果糖をプシコースに転換する酵素を生産するマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を分離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、果糖をプシコースに転換する活性に優れた新規マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓまたはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）を分離および同定し、前記菌株の菌体を使用して果糖からプシコースへの転換能を確認し、高いプシコース転換能を得るための菌体反応の最適温度、最適反応時間を確認してプシコースを効率的に大量生産するための条件を確立して本発明を完成した。
【００１２】
本発明の一例では、果糖をプシコースに転換する活性を有するマイクロバクテリウム属菌株を提供する。
【００１３】
前記マイクロバクテリウム属菌株は、マイクロバクテリウムオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ）またはマイクロバクテリウムフィロスファエラエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）菌株であってもよく、例えば、前記マイクロバクテリウム属菌株は寄託番号ＫＣＣＭ１２０３３ＰのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＳＹＧ−Ａ１または寄託番号ＫＣＣＭ１２０３４ＰのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  ＳＹＧ−Ａ２菌株であってもよい。
【００１４】
前記マイクロバクテリウム属菌株は、果糖をプシコースに転換させるプシコース転換能に優れることを特徴とする。前記プシコース転換能は前記マイクロバクテリウム属菌株が果糖をプシコースに転換させる酵素を生産することによって得られるものであって、前記マイクロバクテリウム属菌株はプシコース転換能の高い酵素を生産するか、プシコース転換酵素を大量に生産して優れたプシコース転換能を発揮することができる。したがって、前記マイクロバクテリウム属菌株はプシコースの製造に有効に適用でき、プシコースの生産収率をより向上させることができる。
【００１５】
前記プシコース転換能は３０℃以上の温度、または４０℃以上の温度条件下で活性を有するものであってもよく、４０〜８０℃、例えば、５０〜８０℃、６０〜８０℃、または６５〜７５℃、例えば、７０℃の温度条件で最大活性を示すものであってもよい。
【００１６】
また、前記菌株が反応基質である果糖と反応する場合、反応時間は長いほどプシコース転換率が向上する。例えば、前記反応時間は１時間以上、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上とすることがよい。また、反応時間が４８時間を超えるとプシコース転換率の増加率が極く僅かになるか、むしろ減少するので、反応時間は４８時間を超えないのがよい。したがって、前記反応時間は１〜４８時間、２〜４８時間、３〜４８時間、４〜４８時間、５〜４８時間、または６〜４８時間とすることができ、産業的および経済的側面を考慮して、１〜４８時間、２〜３６時間、３〜２４時間、３〜１２時間、または３〜６時間とすることができるが、これに制限されない。
【００１７】
前記マイクロバクテリウム属菌株は果糖と７０℃の温度で１８時間反応するとき、相対転換活性（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が９〜３０％、好ましくは９〜２５％、さらに好ましくは９〜２０％であってもよい。例えば、前記マイクロバクテリウムオキシダンス菌株を７０℃の温度で１８時間反応するとき、相対転換活性が９〜１５％、好ましくは９〜１２％であってもよく、前記マイクロバクテリウムフィロスファエラエ菌株を７０℃の温度で１８時間反応するとき、相対転換活性が１５〜３０％、好ましくは１５〜２５％、さらに好ましくは１５〜２０％であってもよい。
【００１８】
本発明で提供されるプシコースを生産する方法は、緩衝溶液を使用せず菌体を用いて果糖をプシコースに転換することが可能であるので、より簡便な方法でプシコースを高い収率で生産することができるという長所がある。
【００１９】
前記プシコース転換能を有するマイクロバクテリウム属菌株およびこれを含むプシコース生産用組成物に関する事項は、前記プシコース生産方法に同様に適用できる。
【００２０】
前記マイクロバクテリウム属菌株は前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上であってもよく、前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖と反応させる工程は前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖含有基質と反応させる工程によって行うことができる。
【００２１】
他の具体例で、前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖含有基質と反応させる工程は、前記菌株（菌体、菌株の培養物、および／または菌株の破砕物）を果糖含有基質と接触させる工程、例えば、前記菌株を果糖含有基質と混合する工程または前記菌株が固定化された担体に果糖含有基質を接触させる工程によって行われてもよい。このようにマイクロバクテリウム属菌株を果糖と反応させることによって果糖をプシコースに転換して果糖からプシコースを生産することができる。
【００２２】
前記プシコース生産方法において、プシコースの効率的な生産のために、基質として使用される果糖の濃度は全反応物基準に対して４０〜７５％（ｗ／ｖ）、４５〜７５％（ｗ／ｖ）、例えば、５０〜７５％（ｗ／ｖ）であってもよい。果糖の濃度が前記範囲より低いと経済性が低下し、一方、前記範囲より高いと果糖が十分溶解されないので、果糖の濃度は前記範囲にすることがよい。前記果糖は、緩衝溶液または水（例えば、蒸留水）に溶解された溶液状態で使用できる。
【００２３】
前記プシコースの生産方法において、前記反応は、３０℃以上、例えば４０℃以上の温度条件下で行うことができる。温度が８０℃以上になれば基質である果糖の褐変現象が起こることがあるので、前記反応は４０〜８０℃、例えば、５０〜８０℃、６０〜８０℃、または６５〜７５℃、例えば、７０℃の条件下で行うことができる。
【００２４】
また、前記反応は、ｐＨ６．５〜９．０、例えば、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．５〜９．０、ｐＨ８．０〜９．０または８．５〜９．０の条件下で行うことができる。特に、ｐＨ７．０〜８．０の中性ｐＨ範囲でもプシコースの効率的な生産が可能である。
【００２５】
本発明で提供されるプシコースを生産する方法は、緩衝溶液を使用せず菌体を用いて果糖をプシコースに転換することが可能であるので、より簡便な方法でプシコースを高い収率で生産することができるという長所がある。
【００２６】
本発明のまた他の一例として、果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウム属菌株を含む、果糖からプシコースを生産するプシコース生産用組成物を提供する。
【００２７】
前記プシコース転換能を有するマイクロバクテリウム属菌株に関する事項は、前記プシコース生産用組成物に同様に適用できる。
【００２８】
例えば、前記マイクロバクテリウム属菌株はマイクロバクテリウムオキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ）またはマイクロバクテリウムフィロスファエラエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）菌株であってもよく、例えば、前記マイクロバクテリウム属菌株は寄託番号ＫＣＣＭ１２０３３ＰのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＳＹＧ−Ａ１または寄託番号ＫＣＣＭ２０３４ＰのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  ＳＹＧ−Ａ２菌株であってもよい。
【００２９】
前記マイクロバクテリウム属菌株は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含むことができる。
【００３０】
前記培養物は、前記マイクロバクテリウム属菌株から生産された酵素を含むものであって、前記菌株の前記菌株を含むか、菌株を含まないｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ形態であってもよい。また、前記破砕物は、前記マイクロバクテリウム属菌株を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液を意味するものであって、前記マイクロバクテリウム属菌株から生産された酵素を含むものである。
【００３１】
本明細書において、特に言及されない限り、プシコースの製造に使用されるマイクロバクテリウム属菌株は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。
【００３２】
前記組成物で、マイクロバクテリウム属菌株の菌体濃度は、全反応物基準に対して１ｍｇ（ｄｃｗ：乾燥細胞重量）／ｍｌ以上、例えば、１〜５０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであってもよい。菌体濃度が前記範囲未満である場合にはプシコース転換活性が低いか殆どなく、一方、前記範囲を超えると菌体が過剰に多くなってプシコース転換反応の全体的な効率が低くなるので、菌体濃度は前記範囲にすることがよい。
【００３３】
前記マイクロバクテリウム属菌株が生産する果糖をプシコースに転換させる酵素（例えば、エピメラーゼ）は金属イオンによって活性化を調節できるので、前記マイクロバクテリウム属菌株を用いたプシコース生産において、金属イオンを添加すれば果糖からプシコースへの転換効率、即ち、プシコース生産率を増加できる。
【００３４】
したがって、前記マイクロバクテリウム属菌株を含むプシコース生産用組成物は、金属イオンを更に含むものであってもよい。また、前記マイクロバクテリウム属菌株を用いたプシコース生産方法は、金属イオンを添加する工程を更に含むことができる。
【００３５】
一実施形態で、前記金属イオンは前記培養工程の培養培地に添加してもよいし、前記培養工程を前記金属イオンが添加された培養培地で行ってもよい。他の実施形態で、前記金属イオンは果糖に添加してもよいし、前記マイクロバクテリウム属菌株と果糖との混合物に添加してもよい。また他の実施形態で、前記マイクロバクテリウム属菌株が固定化された担体に添加するか（果糖添加前）、前記マイクロバクテリウム属菌株が固定化された担体と果糖との混合物に添加するか（果糖添加後）、または果糖添加時に果糖と混合物の形態でまたはそれぞれ添加してもよい。
【００３６】
前記金属イオンは、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオンなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記金属イオンはマンガンイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオンなどからなる群より選択された１種以上であってもよく、一例で、前記金属イオンはマンガンイオン、コバルトイオン、またはこれらの混合物であってもよい。
【００３７】
前記担体は、固定された菌株、または前記菌株から生産される酵素の活性が長期間維持できる環境を形成することができるものであって、酵素固定化用途に使用できる公知の全ての担体であってもよい。
【００３８】
例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）を使用することができる。アルギン酸ナトリウムは、海藻類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であって、マンヌロン酸（β−Ｄ−ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とグルロン酸（α−Ｌ−ｇｕｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）で構成されており、含量面では無作為にβ−１，４結合により形成され、菌株または酵素が安定的に固定されて優れたプシコース収率を発揮するに有利であり得る。
【００３９】
一具体例で、プシコースの収率をより向上させるために１．５〜４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、例えば、約２．５％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を菌株の固定化に使用することができる。例えば、菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養液、または前記菌株の破砕物の１〜２体積倍のアルギン酸ナトリウム水溶液に前記菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を添加して混合した後、前記得られた混合液を注射器ポンプと真空ポンプを使用して約０．２Ｍカルシウムイオン溶液に滴下してビーズが生成されるようにすることによって、アルギン酸ナトリウム担体に菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を固定化させることができる。前記酵素は、前記菌株、菌株培養物、または前記菌株の破砕物から通常の方法、例えば透析、沈殿、吸着、電気泳動、親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法によって精製されたものであってもよい。
【００４０】
本発明のまた他の一例として、果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウム属菌株を用いて果糖含有基質からプシコースを生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明は、新規に分離されたマイクロバクテリウム属菌株、前記菌株を含むプシコース生産用組成物およびこれを用いたプシコース生産方法に関するものであって、本発明のマイクロバクテリウム属菌株は産業的に有用な範囲の温度で安定性を有し、果糖から高い収率でプシコースを生産する活性を有するので、機能性糖関連健康食品および医薬産業で幅広く使用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の一実施形態で高濃度果糖からプシコースが生産されたことを高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）で確認したクロマトグラムを示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ菌株の温度によるプシコース生産相対活性を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ菌株の温度によるプシコース生産相対活性を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ菌株の反応時間によるプシコース生産相対活性を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ菌株の反応時間によるプシコース生産相対活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の保護範囲が下記実施例によって限定される意図ではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１．果糖をプシコースに転換する微生物の分離
果糖をプシコースに転換する菌株を分離するために１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加されたＭｉｎｅｒａｌ  ｓａｌｔ  ｂｒｏｔｈ（ＫＨ2ＰＯ4  ２．４ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ／Ｌ）を使用した。
【００４５】
果樹園または肥沃の土壌やチーズ、牛乳、食用花、高麗人参、ブロッコリーを１ｇ採取してＭＳＰ  ｂｒｏｔｈに添加した後、３０℃で２４時間培養して菌を増殖させた。その後、培養液１００μＬ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）を採取して寒天培地に塗抹した後、３０℃でコロニーが確認されるまで培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形状と大きさが異なるコロニーを選別してＭＳＰ  ｂｒｏｔｈに接種した後、３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体は５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝溶液（ｐＨ７．０）１００μＬに入れて浮遊させ、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を使用して破砕し、破砕液を収得した。前記破砕液を１２，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離した後、上澄み液を回収して酵素液（ｃｒｕｄｅ  ｅｎｚｙｍｅ）として使用し、前記酵素液を、１０ｍＭ果糖およびプシコースを基質にして３０℃で１２時間反応させた。
【００４６】
薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）分析により、前記反応液でプシコースが果糖に転換されたかどうかを確認した。前記薄層クロマトグラフィー分析は、横２０ｃｍ、縦１０ｃｍのシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ））固定相とアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水を８５：１５の体積比で混合した移動相展開溶媒を使用して１０分間３回ずつ展開して行った。
【００４７】
前記ＴＬＣ分析によりプシコースから果糖への転換が確認された菌株を選別して、０．１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加されたＭＳ  ｂｒｏｔｈに接種して３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離後に菌体のみ回収した。回収した菌体は０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、４００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガンイオンを添加した５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加えて浮遊させ、７０℃で１時間反応させた。
【００４８】
その後、前記反応結果物を遠心分離して上澄み液を回収した後、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）分析を実施した。前記液体クロマトグラフィー分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＲＩＤ）を用いて行った。移動相展開溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎにした。このようにして得られた結果を図１に示し、数千種の菌株のうちからプシコースを最も多く生産した菌株２種を最終選定した。
【００４９】
実施例２．プシコース転換活性を有する菌株の同定
実施例１で分離された菌株を同定するために１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列を確認した。分離菌株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列（５’→３’）はそれぞれ配列番号１および２の塩基配列を有することを確認した。
【００５０】
前記配列番号１の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列を有する菌株はＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＤＳＭ２０５７８と７８．７６％同一であることを確認し、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＳＹＧ−Ａ１と命名し、２０１７年５月２６日付で韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２０３３Ｐが付与された。
【００５１】
また、前記配列番号２の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列を有する菌株はＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  Ｐ３６９／０１６（ＮＰ＿０２５４０５．１）と１００％同一であることを確認し、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  ＳＹＧ−Ａ２と命名し、２０１７年５月２６日付で韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２０３４Ｐが付与された。
【００５２】
実施例３．前記菌株の菌体反応を用いた最適温度条件確立
前記で分離された菌株を、多様な温度条件下で菌体と基質を反応させてそれによるプシコース転換活性を比較した。
【００５３】
４００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガン金属イオンを添加した５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に前記実施例１で分離された２つ菌株の菌体濃度を５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍＬに調製して、５５〜８０℃の範囲で温度を変化させながら１時間反応させ、反応終了後、前記実施例１と同様の方法でＨＰＬＣ分析によりプシコース生産量を測定した。得られた結果を下記表、図２（Ｍ．ｏｘｙｄａｎｓ  ＳＹＧＡ１）および図３（Ｍ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  ＳＹＧＡ２）に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
上記表１、図１および図２に示すように、Ｍ．ｏｘｙｄａｎｓ  ＳＹＧ−Ａ１およびＭ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  ＳＹＧＡ２の両方とも７０℃の温度までは反応温度の増加に伴って相対活性が増加し、８０℃の温度で相対活性が減少することを確認した。また、前記菌株は７０℃の温度で最大活性を示すことを確認した。
【００５６】
実施例４．プシコース生産性の検討
反応時間による最大生産性を確認した。前記実施例１で分離された２つの菌株の菌体濃度２０ｍｇ／ｍＬ、果糖濃度４００ｇ／Ｌ、温度７０℃およびｐＨ７．０条件下で反応時間ごとに活性を確認した。前記反応は１２時間行い、２時間間隔でプシコース生産性を、ＨＰＬＣ分析により確認した。その結果を下記表と図４および図５に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
上記表２および図４から確認できるように、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＳＹＧ−Ａ１は反応時間が経過する程、プシコース転換率が益々増加することを確認した。特に、７０℃の温度で１８時間反応後におけるプシコース転換率は約１０．３％であり、このとき生産されたプシコースは約２８ｇ／Ｌであることが確認された。また、前記表２および図５から確認できるように、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ  ＳＹＧＡ２は反応時間が経過する程、プシコース転換率が益々増加することを確認した。特に、７０℃の温度で１８時間反応後におけるプシコース転換率は約１８．８％であり、このとき生産されたプシコースは約５２ｇ／Ｌであることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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