(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：5’-G(L)G(L)c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^G(L)A(L)-3’として表されるｐ５３−ＡＳＯ−１５，
式：5’-G(L)G(L)c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^g^a^a^g^G(L)C(L)-3’として表されるｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１，
式：5’-G(L)G(L)c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^g^a^a^g^g^c^A(L)G(L)-3’として表されるｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２，および
式：5’-G(L)^G(L)^c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^G(L)^A(L)-3’として表されるｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６
から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド（ここで、小文字はＤＮＡを表し、「G(L)」はLNA型のグアノシンを表し、「A(L)」はLNA型のアデノシンを表し、「C(L)」はLNA型の５−メチルシチジンを表し、塩基間の「＾」はヌクレオシド間結合がチオリン酸結合であることを表す。），またはその塩。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、式：5’-G(L)^G(L)^c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^G(L)^A(L)-3’として表されるｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６オリゴヌクレオチド（ここで、小文字はＤＮＡを表し、「G(L)」はLNA型のグアノシンを表し、「A(L)」はLNA型のアデノシンを表し、塩基間の「＾」はヌクレオシド間結合がチオリン酸結合であることを表す。）である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド，またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、特願2019-124901号（出願日：2019年7月4日）の優先権の利益を享受する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は，オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現の調節に関する。より詳細には，遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の処置に関する。さらに詳細には，ｐ５３遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来的な医薬品開発における創薬技術では，タンパク質を創薬標的とする取組みが多く推進され，低分子医薬や抗体とはじめとするタンパク質やペプチドと作用する医薬による創薬が中心であった。近年，ゲノム科学や個別化医療など疾患の原因が遺伝子レベルで解明されてきたため，創薬標的を核酸とする取組みが進められており，低分子医薬品や抗体医薬品では狙いにくい治療標的にも対応できると考えられるため，核酸医薬が新しいモダリティ（創薬手法）として期待されつつある。【０００４】
基礎研究としては，アンチセンス核酸やＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）などの研究が行われ（非特許文献１），その技術に基づく医薬品開発が行われ，上市される製品も出始めている。さらに，タンパク質をコードしない核酸の機能も明らかとされつつあり，ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として遺伝子発現調節技術として創薬への応用が進められている（非特許文献２）。【０００５】
急性腎不全（ＡＲＦ）（急性腎障害（ＡＫＩ）とも呼ばれる）は，急激な腎機能の低下に伴い，体液の恒常性が維持できなくなった状態をいう。ＡＲＦは，腎機能の急速な悪化が数日以内に起こることを特徴とする臨床症候群であり，一般的には，血清クレアチニン値の急速な上昇，または血清クレアチニン値とＢＵＮの急速な上昇に基づき，急性腎不全（急性腎障害）の診断が行われる。一般に，人口１００万人あたり１７０〜２００の重度ＡＲＦ症例が毎年発生している。手術，造影検査，抗癌剤投与など医療行為に関連して，ショックなどによる虚血，シスプラチン，アミノグリコシド，造影剤などの腎毒性物質に起因する尿細管壊死による急性腎不全が発症する場合があり，例えば，急性腎障害は心臓手術などの大手術を受けた患者に起こる腎虚血再灌流障害（ＩＲＥ）の結果として発症する例も多い。手術，造影検査，抗悪性腫瘍薬や抗生物質の投与などによる急性腎不全は，細胞外液量が減少している状態において発症しやすく，前もって十分な補液を行っておくことにより，その発症の頻度が減少し，腎不全の程度を軽減し得ることが知られている。しかしながら現状，ＡＲＦに対する特異的な治療法は存在しておらず，急性腎不全の予防，治療方法には，さらなる改善が求められている。【０００６】
米国特許第９，３３４，４９９号には，急性腎不全を発症する危険性のある患者，または急性腎不全を発症した患者を治療するための方法であって，ｐ５３遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに有効な量のｐ５３遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を患者に投与することを含む方法が開示されている。また，同文献には，ｐ５３遺伝子発現のダウンレギュレーションが，癌の化学療法や放射線療法に起因する脱毛症に対しても有効となり得ることも開示されている。【０００７】
米国特許第７，９１０，５６６号には，ｐ５３遺伝子を標的とした特定の塩基配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を特定の時期に用いることを特徴とする，腎虚血再灌流後における急性腎不全の危険のある患者の処置方法が開示されている。この文献は，ラットの虚血再灌流誘導性ＡＲＦモデルにおいて，ｐ５３を標的としたｓｉＲＮＡが虚血再灌流障害の影響から腎組織を保護し，ＡＲＦの重症度を抑え得ることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第９，３３４，４９９号
【特許文献２】米国特許第７，９１０，５６６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Chery,J. (2016) RNA therapeutics: RNAi and antisense mechanisms and clinical applications. Postdoc J. 4(7): 35-50
【非特許文献２】Rupaimoole,R. & Slack,F.J. (2017) MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Review Drug Discovery, 16, 203-221
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は，ｐ５３遺伝子の発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド；以下，ＡＳＯとも言う）を含有する医薬組成物と，それを用いた疾患または状態の予防または治療方法を提供することを目的の一つとする。また本発明は，ｐ５３遺伝子の発現に対するノックダウン効率が高く，かつ細胞内への取り込み効率の高いＡＳＯを提供することも目的の一つとしている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは，ｐ５３遺伝子の発現を調節することを目的として，ｐ５３遺伝子の転写産物に対して作用するＡＳＯを同定した。これらのＡＳＯを用いて，ｐ５３遺伝子の転写産物からの翻訳を抑制することにより，急性腎不全等のｐ５３関連疾病を治療，予防し得ると考えられる。本発明は，本発明者らが開発したこれら核酸医薬に基づくものであり，以下の態様を包含する：【００１２】
［態様１］細胞においてｐ５３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する，医薬組成物。
［態様２］前記ｐ５３遺伝子がヒトｐ５３遺伝子である，態様１記載の医薬組成物。
［態様３］前記ｐ５３遺伝子が配列番号１３２の配列を有する，態様１または２記載の医薬組成物。
［態様４］前記オリゴヌクレオチドが本質的に一本鎖の分子である，態様１〜３のいずれか記載の医薬組成物。
［態様５］前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である，態様１〜４のいずれか記載の医薬組成物。
［態様６］前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）がギャップマーである，態様５記載の医薬組成物。
［態様７］前記オリゴヌクレオチドが１２〜１８塩基長である，態様１〜６のいずれか記載の医薬組成物。
［態様８］前記オリゴヌクレオチドが１４塩基長である，態様７記載の医薬組成物。
［態様９］前記オリゴヌクレオチドが２−１０−２ギャップマーである，態様８記載の医薬組成物。
［態様１０］前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記ｐ５３遺伝子に対して８０％以上相補的である，態様１〜９のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１１］前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記ｐ５３遺伝子に対して１００％相補的である，態様１〜１０のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１２］前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含む，態様１〜１１のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１３］修飾ヌクレオシドが架橋型核酸である，態様１２記載の医薬組成物。
［態様１４］架橋型核酸がＬＮＡである，態様１３記載の医薬組成物。
［態様１５］修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，態様１２〜１４のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１６］すべての修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，態様１２〜１５のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１７］すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，態様１〜１６のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１８］修飾ヌクレオシド間結合がキラル制御されている，態様１２〜１７のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１９］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されている，態様１〜１８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２０］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている，態様１〜１９のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２１］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていない，態様１〜１８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２２］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていない，態様１〜１８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２３］前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチドである，態様１〜２２のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２４］前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列からなるオリゴヌクレオチドである，態様１〜２２のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２５］前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドである，態様１〜２２のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２６］対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物である，態様１〜２５のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２７］前記疾患または症状が，ｐ５３遺伝子の発現に関連するものである，態様２６記載の医薬組成物。
［態様２８］前記疾患または症状が，虚血-再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，および急性肝不全から成る群より選択される，態様２６または２７記載の医薬組成物。
［態様２９］薬学的に許容される賦形剤，緩衝剤，および／または添加物を含有する，態様１〜２８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様３０］対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含む，本質的に一本鎖のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し，該オリゴヌクレオチドが１４塩基長のギャップマーであり，該ギャップマーの５’側および３’側のウイング領域がそれぞれ２塩基のＬＮＡからなり，該ギャップマーの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，医薬組成物。
［態様３１］対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって，ｐ５３−ＡＳＯ−１５，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２，およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６から成る群より選択されるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する，医薬組成物。
［態様３２］ｐ５３−ＡＳＯ−１５，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２，およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド，またはその塩。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は，ヒトｐ５３遺伝子の塩基配列（NM_000546.5）を示している（配列番号１３２）。
【図２】図２は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでのｐ５３−ＡＳＯ−０１〜２３の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。
【図３】図３は，標的部位を前後にずらしたＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図４】図４は，１３塩基長に短鎖化したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図５】図５は，１５塩基長に長鎖化したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図６】図６は，１６塩基長にさらに長鎖化したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図７】図７は，１７塩基長にさらに長鎖化したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図８】図８は，１８塩基長にさらに長鎖化したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図９】図９は，ウイング領域を改変したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側はトランスフェクションから１日後の結果，右側は２日後の結果を示している。
【図１０】図１０は，種々の改変を加えたＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側にトランスフェクションから１日後の結果，右側に２日後の結果が隣り合って示されている。
【図１１】図１１は，コレステロールを付加したＡＳＯの評価結果を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。左側にトランスフェクションから１日後の結果，右側に２日後の結果が隣り合って示されている。
【図１２】図１２は，ｐ５３応答エレメントをもつ，レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイにより，トランスフェクションの１日後にｐ５３タンパク質量を測定した結果を示すグラフである。左側にｐ５３−ＡＳＯ−１５を用いた結果が,右側にＱＰＩ１００２を用いた結果が示されている。
【図１３】図１３は，ｐ５３応答エレメントをもつ，レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイにより，トランスフェクションの２日後にｐ５３タンパク質量を測定した結果を示すグラフである。左側にｐ５３−ＡＳＯ−１５を用いた結果が，右側にＱＰＩ１００２を用いた結果が示されている。
【図１４】図１４は，ｐ５３−ＡＳＯ−１５およびＱｕａｒｋ社のｓｉＲＮＡであるＱＰ１００２の発現抑制効果をｑＰＣＲによって評価した結果を示すグラフである。上段は１日後の結果，下段は２日後の結果を示している。
【図１５】図１５は，ウエスタンブロッティングによる評価の実験プロトコールを示している。
【図１６】図１６は，ＡＳＯ−１５，１５−１６，およびＱＰＩ−１００２の効果をウエスタンブロッティングにより評価した結果を示している。
【００１４】
本発明者らは，比較的短いオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて，効率よく細胞内におけるｐ５３遺伝子の発現を調節する手法を開発した。以下に，本発明を詳細に説明する。【００１５】
ｐ５３遺伝子
ｐ５３遺伝子は，細胞内でのDNA修復や細胞増殖の停止，細胞増殖サイクルの抑制などに関与しており，細胞が癌化したときにはアポトーシスを起こすとされる遺伝子である。ｐ５３はいわゆる癌抑制遺伝子の一つとされ，この遺伝子の機能が障害すると癌が起こると考えられている。細胞が癌化するためには複数の癌遺伝子と癌抑制遺伝子の変化が必要と考えられているが，ｐ５３は悪性腫瘍において最も高頻度に異常が認められている遺伝子である。ｐ５３ポリペプチドは，例えば，ガンマ線照射などのＤＮＡ損傷条件，転写または複製の調節異常，および癌遺伝子による形質転換といった，種々の異なる刺激を細胞増殖の停止やアポトーシスに変換することにより，細胞ストレス応答メカニズムにおいて重要な役割を果たしている。ｐ５３ポリペプチドは，そのような刺激に対する応答としてアポトーシス，つまり，プログラムされた細胞死を誘導する。このように，ｐ５３は細胞の恒常性の維持やアポトーシス誘導といった重要な役割を有している。ほとんどの抗癌療法は，ｐ５３を有する正常な細胞にも傷害を与え，健康な細胞の損傷または死に関連する重篤な副作用を引き起こす。そのような副作用は，ｐ５３が誘導する正常細胞の細胞死に多く起因しており，抗癌療法の急性期における一時的なｐ５３の抑制が，こういった重篤な毒性を回避するための治療戦略として提案されている。つまり，当業者には，ｐ５３遺伝子の転写産物にＡＳＯなどの薬剤を作用させて，ｐ５３タンパク質の発現を制御することにより，アポトーシス誘導に関係する疾患または症状を治療または予防できることが理解される。ｐ５３遺伝子の発現抑制は，ｐ５３遺伝子から転写，翻訳を経て合成されるタンパク質量を，薬剤を作用させていない場合に比べて，７５％以下，５０％以下，４０％以下，３０％以下，２５％以下，２０％以下，１５％以下，１０％以下，５％以下，または３％以下に低減させることにより行われ得る。本発明の態様の一つは，対象におけるｐ５３遺伝子の発現に関連する疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物に関する。特定の実施態様においては，標的となる疾患または症状は，虚血−再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，または急性肝不全であるが，標的はこれらに限定はされない。【００１６】
ｐ５３遺伝子およびそのｍＲＮＡの塩基配列は公知であり，ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから容易に入手することができる。例えば，ヒトｐ５３遺伝子のｍＲＮＡ配列としては，ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００５４６．５の配列（図１；配列番号１３２）を利用することができる。【００１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯとも呼ばれる）は，標的核酸の少なくとも一部に対して実質的に相補的な配列を有し，対応する核酸塩基間のワトソン−クリック型，フーグスティーン型，または逆フーグスティーン型の水素結合によりハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，その標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する検出可能または測定可能なアンチセンス活性を示すことができる。アンチセンス効果が奏されるメカニズムは，アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションに起因する任意のメカニズムを含み，例えば，そのハイブリダイゼーションの結果または効果は，標的の分解または標的の占拠のいずれかであり得る。特定の実施形態において，アンチセンス活性は，標的核酸の量または発現の減少，またはそのような標的核酸によってコードされるタンパク質の量または発現の減少である。例えば，アンチセンス活性は，特定の実施形態においては，標的の分解（切断）によるアンチセンス阻害であり，これは，標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下における標的核酸レベルの低下を意味する。特に，４塩基以上の連続したＤＮＡを少なくとも一部に含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡとハイブリダイズして細胞内のRNase Hの基質となり，標的ＲＮＡの特異的な分解（切断）を誘導することができる。また，特定の実施形態において，アンチセンス活性は，標的の占拠による立体障害に起因するタンパク質結合阻害であり，その結果，翻訳の抑制やスプライシングの調節（例えば，エキソンスキッピング）が生じる。【００１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは，主にデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ），リボヌクレオシド（ＲＮＡ），修飾ヌクレオシド，ヌクレオシド模倣物（モルホリノ核酸，ペプチド核酸など）から構成される一本鎖オリゴマーである。RNase H切断を誘導する複数のヌクレオシド（例えば，連続４塩基以上のデオキシリボヌクレオシド）を有する内部領域の両側，または片側に１以上のヌクレオシド（例えば，ＬＮＡなどの糖修飾ヌクレオシド）を有する外部領域を有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは，ギャップマーと呼ばれる。特に，外部領域がすべてＬＮＡから成るものはＬＮＡギャップマーと呼ばれる。外部領域を片側のみに有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは，特にヘミギャップマーとも呼ばれる。内部領域に含まれるヌクレオシドは，外部領域に含まれるヌクレオシドとは化学的に性質が異なる。内部領域は「ギャップ」と呼ばれ，外部領域は「ウイング」と呼ばれることがある。例えば，５’側と３’側にそれぞれ３塩基のウイング領域を有し，８塩基のギャップ領域を有する１４塩基長のギャップマーは，３−８−３ギャップマーと呼ばれることがある。特定の実施形態においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドは２−１０−２ギャップマー，２−９−３ギャップマー，３−９−２ギャップマー，３−８−３ギャップマー，３−７−４ギャップマー，４−７−３ギャップマー，４−６−４ギャップマーのいずれかであり得る。特定の実施形態においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドは２−１０−２ＬＮＡギャップマー，２−９−３ＬＮＡギャップマー，３−９−２ＬＮＡギャップマー，３−８−３ＬＮＡギャップマー，３−７−４ＬＮＡギャップマー，４−７−３ＬＮＡギャップマー，４−６−４ＬＮＡギャップマーのいずれかであり得る。内部領域（ギャップ領域）の塩基数は，１塩基以上，例えば，２，３，４，５，６，７，８，９，または１０塩基であり得るが，これらに限定はされない。外部領域（ウイング領域）の塩基数は，５’側，３’側それぞれ独立に，０塩基以上，例えば，１，２，３，４，５，または６塩基であり得るが，これらに限定はされない。５’側および３’側のウイング領域は，それぞれ異なる塩基数を有していてもよい。特定の実施形態においては，ウイング領域は同一または異なる糖修飾ヌクレオシドにより構成されていてもよく，ウイング領域の糖修飾ヌクレオシドは例えばＬＮＡであり得るが，これに限定はされない。【００１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは，特定の実施形態においては，修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。また，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，特定の実施形態においては，オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていてもよく，例えば，オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていてもよい。特定の実施形態において，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，例えば，少なくとも８塩基長以上，例えば，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，または２１塩基長であり得るが，これらに限定はされない。一部の実施態様では，約１４塩基のＡＳＯが好適に使用される。【００２０】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは，特定の実施形態においては，実施例に開示されるｐ５３−ＡＳＯ−１５，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２，およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６のいずれかであり得る。ｐ５３−ＡＳＯ−１５およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６は配列番号１３２の１８９番目の塩基から２０２番目の塩基に相補的な配列を有している。ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２はそれぞれ，配列番号１３２の１８５番目の塩基から２０２番目の塩基および１８３番目の塩基から２０２番目の塩基に相補的な配列を有している。本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは，配列番号１３２の１８９番目の塩基から２０２番目の塩基，１８５番目の塩基から２０２番目の塩基および１８３番目の塩基から２０２番目の塩基に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。そのような相補的オリゴヌクレオチドは，本明細書中に述べる修飾を含むことができる。また，本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは，薬学的に許容される塩，プロドラッグ，そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩，および他の生物学的同等物の形態であってもよい。適切な薬学的に許容される塩は，ナトリウム塩およびカリウム塩を含むが，これらに限定はされない。【００２１】
本発明に係るＡＳＯは，公知の化学合成を用いる方法，あるいは酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として，ホスホロアミダイト法，ホスホロチオエート法，ホスホトリエステル法等を挙げることができ，例えば，ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）やＮＴＳ  Ｈ−６核酸合成機（日本テクノサービス社製），Ｏｌｉｇｏｉｌｏｔ１０核酸合成機（ＧＥヘルスケア社製）により合成することができる。酵素的転写法としては，目的の塩基配列を有するプラスミドまたはＤＮＡを鋳型として，Ｔ７，Ｔ３，ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを用いた転写を挙げることができる。合成法または転写法により製造したＡＳＯは，次いでＨＰＬＣ等にて精製する。例えばＨＰＬＣ精製時には，triethylammonium acetate（ＴＥＡＡ）またはhexylammonium acetate（ＨＡＡ）とアセトニトリルの混合溶液を用いて，ＡＳＯをカラムから溶出する。その後，溶出体積の１０００倍量の蒸留水で溶出溶液を１０時間透析し，透析溶液を凍結乾燥した後，使用時まで冷凍保存する。使用時には，例えば，蒸留水で最終濃度が１００μＭ程度になるように溶解する。【００２２】
本発明に係るＡＳＯに用いられる核酸としては，ヌクレオシドまたはそのヌクレオシドと同等の機能を有する分子がヌクレオシド間結合を介して重合した分子であればいかなるものでもよい。ヌクレオシドは，塩基（核酸塩基）と糖が結合した化合物の一種である。塩基としては，アデニン，グアニンなどのプリン塩基，チミン，シトシン，ウラシルなどのピリミジン塩基，ニコチンアミド，ジメチルイソアロキサジンなどを含む。アデノシン，チミジン，グアノシン，シチジン，ウリジンなどが代表的なヌクレオシドである。ヌクレオチドとは，ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質である。オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチドとも言う）としては，例えばリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ，デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ，ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体，修飾ヌクレオシドを含むヌクレオチド重合体が，それぞれ挙げられる。天然のＤＮＡ，ＲＮＡはヌクレオシド間結合として，ホスホジエステル結合を有している。本発明に係るＡＳＯに用いられる核酸は，修飾を含むものであってもよい。核酸修飾の位置には，糖部分，骨格（連結）部分，核酸塩基（塩基）部分，３’または５’末端部分が含まれる。また，本発明において用いられるＡＳＯには，モルホリノ核酸，ペプチド核酸が含まれていてもよい。【００２３】
修飾ヌクレオシド
修飾ヌクレオシドとしては，例えばＲＮＡまたはＤＮＡと比較して，ヌクレアーゼ耐性の向上または安定化させるため，相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため，細胞透過性をあげるため，あるいは可視化させるために，リボヌクレオシド，デオキシリボヌクレオシド，ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子を挙げることができ，例えば，２’−ＭＯＥ、ＬＮＡ、ＥＮＡなどの糖部修飾ヌクレオシドが例示される。本発明のＡＳＯは，例えば，Khvorova & Watts（Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi:10.1038/nbt.3765）に開示の修飾核酸分子を含んでいてもよい。【００２４】
修飾糖とは，天然糖部分（すなわち，ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に認められる糖部分）からの置換および／または任意の変化を有する糖を指し，糖部修飾ヌクレオシドとは，修飾糖を含む修飾ヌクレオシドを指す。糖部修飾ヌクレオシドは，ヌクレオシドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し，任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく，例えば，２’−Ｏ−メチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’−メトキシエトキシリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’−Ｏ−メトキシエチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’−Ｏ−［２−（グアニジウム）エチル］リボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’−Ｏ−フルオロリボースで置換された修飾ヌクレオシド，糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ），より具体的には，２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid：ＬＮＡ），エチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid：ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)］等があげられ，さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)］，オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)］，およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等を挙げることができる。【００２５】
ＲＮＡの２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾（２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ）は，天然にも存在する修飾であり，修飾オリゴヌクレオチドの結合親和性とヌクレアーゼ耐性を向上させると共に，免疫刺激性を低下させる。２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）は，ヌクレアーゼ耐性が２’−ＯＭｅ修飾よりもさらに増加しており，修飾ヌクレオチドの結合親和性（ΔＴｍ）も大幅に上昇している。ＲＮＡの２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾（２’−Ｆ−ＲＮＡ）を用いてオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることもできる。他の２’修飾核酸としては，２’−Ｆ−ＡＮＡや，関根らの２’ −修飾誘導体（特許第５１９４２５６号，特開２０１５−０２０９９４）を挙げることができる。【００２６】
リボースの２’酸素と４’炭素を連結したＬＮＡ（Locked nucleic acid）は，結合親和性に大幅な増加をもたらす。ＬＮＡでは，ＲＮＡのリボース糖の２’酸素と４’炭素が環構造において固定されている。この修飾は，特異性，親和性，および半減期を増加させ，目的の組織への効果的な送達を，より低い毒性で可能とする。しかし，ＬＮＡで完全に修飾された約８ヌクレオチドよりも長いオリゴマーは凝集する傾向があることが知られており，一般的には，ＤＮＡや他の糖部修飾核酸との混合で用いられる。【００２７】
ＬＮＡのメチル化類似体であるｃＥｔもＬＮＡと同様に有用である。トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）は，３環骨格に基づく拘束型ヌクレオチドである。【００２８】
修飾ヌクレオシドとしては，その他に，核酸の塩基部分の原子（例えば，水素原子，酸素原子）もしくは官能基（例えば，水酸基，アミノ基）が他の原子（例えば，水素原子，硫黄原子），官能基（例えば，アミノ基），もしくは炭素数１〜６のアルキル基で置換されたものまたは保護基（例えばメチル基またはアシル基）で保護されたもの，ヌクレオシドに，例えば脂質，リン脂質，フェナジン，フォレート，フェナントリジン，アントラキノン，アクリジン，フルオレセイン，ローダミン，クマリン，色素など，別の化学物質を付加した分子等を用いてもよい。【００２９】
修飾核酸塩基（または修飾塩基）には，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，またはウラシル以外のあらゆる核酸塩基が含まれるが，例えば，５−メチルシトシン，５−フルオロシトシン，５−ブロモシトシン，５−ヨードシトシン，Ｎ４−メチルシトシン，５−フルオロウラシル，５−ブロモウラシル，５−ヨードウラシル，２−チオチミン，Ｎ６−メチルアデニン，８−ブロモアデニン，Ｎ２−メチルグアニン，８−ブロモグアニン，およびイノシンなどが挙げられる。例えば，配列番号１〜１２５の配列を有するオリゴヌクレオチドは，少なくとも１つのシトシンが５−メチルシトシンにより置換されていてもよく，一部の実施形態においては，全てのシトシンが５−メチルシトシンにより置換されていてもよい。【００３０】
ヌクレオシド間結合
天然のＤＮＡ，ＲＮＡはヌクレオシド間結合として，ホスホジエステル結合を有している。本発明の一つの態様においては，ヌクレオシド間結合は，修飾を含んでいてもよい。修飾ヌクレオシド間結合とは，天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち，ホスホジエステル結合）からの置換または任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指し，修飾ヌクレオシド間結合には，リン原子を含むヌクレオシド間結合，およびリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合としては，ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し，任意の化学物質を付加あるいは置換したものでもよく，例えば，ホスホロチオエート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合，Ｎ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合等を挙げることができる。他の修飾ヌクレオシド間結合としては（ＳＣ５’Ｒｐ）−α，β−ＣＮＡ，ＰＭＯなどが挙げられる。【００３１】
代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては，例えば，ホスホジエステル結合，ホスホロチオエート結合（チオリン酸結合ともいう），ホスホロジチオエート結合，ホスホトリエステル結合，およびメチルホスホネート結合，メチルチオホスホネート結合，ボラノホスフェート結合，ホスホロアミデート結合を挙げることができる。【００３２】
主要な修飾ヌクレオシド間結合の一つであるホスホロチオエート（ＰＳ）結合は，ヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護するのに役立つ。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は，もともとはヌクレアーゼ耐性を付与するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれたものであるが，この修飾は，オリゴヌクレオチドの輸送と取り込みにも大きな影響を与える。ＰＳは，ＡＳＯの電荷を変えることによって，受容体部位および血漿タンパク質への結合を増加させ，標的組織に到達するＡＳＯの量を増加させる。ヘパリン結合タンパク質は，ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの最も親和性の高い標的の一つである。血漿タンパク質による適切な結合は，腎臓系による血液からの迅速な排除を抑制し，最適な送達を促進する。【００３３】
一部の実施態様において，本発明のＡＳＯは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含み，例えば，ヌクレオチド間結合の総数のうちの２０％以上，３０％以上，４０％以上，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，または９５％以上が修飾ヌクレオチド間結合であってもよい。本発明の一実施態様においては，全てのヌクレオチド間結合が修飾ヌクレオチド間結合（例えばホスホロチオエート結合）であるＡＳＯが用いられる。【００３４】
ホスホロチオエート結合は，リン原子部分に立体中心を有しており，完全修飾オリゴヌクレオチドは通常，２ｎ−１種のジアステレオマーの混合物となる（例えば，１４ｍｅｒのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは，２１３種のジアステレオマーの混合物となる）。ＳｐおよびＲｐジアステレオマー結合は，異なる特性を示すことが知られている。Ｒｐジアステレオマーは，Ｓｐジアステレオマーよりもヌクレアーゼ耐性が低いが，より高い親和性で相補鎖と結合する。本発明のＡＳＯにおいては，修飾ヌクレオシド間結合の合成時にキラル制御を行い，特定のホスホロチオエート結合が特定のジアステレオマーとなるように合成を制御してもよい。【００３５】
リガンド等を連結したオリゴヌクレオチド／末端修飾オリゴヌクレオチド
核酸に別の化学物質を付加した分子としては，例えば，５’−ポリアミン付加誘導体，コレステロール付加誘導体，ステロイド付加誘導体，胆汁酸付加誘導体，ビタミン付加誘導体，Ｃｙ５付加誘導体，Ｃｙ３付加誘導体，６−ＦＡＭ付加誘導体，ビオチン付加誘導体等および北出らの誘導体（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００００８７，ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／５９３９８）を挙げることができる。リガンド等を付加する部位は，オリゴヌクレオチドの末端（５’末端または３’末端）および／またはオリゴヌクレオチドの内部であり得る。リガンド等は，リガンド等を付加したＡＳＯに相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して間接的に結合していてもよい（ＷＯ２０１３／０８９２８３Ａ１）。【００３６】
ＡＳＯとコレステロールとは，例えば以下に示すように，トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を介して連結されることができる。【００３７】
【化１】
0006934695.tif 000002
【００３８】
末端修飾の例として，ＧａｌＮＡｃ連結オリゴヌクレオチドやＰＵＦＡ連結オリゴヌクレオチドが知られている。ＧａｌＮＡｃを末端に連結することにより，オリゴヌクレオチドの肝臓への送達効率を高めることができる。本発明において用いられるＡＳＯには，ＧａｌＮＡｃなどのリガンドが直接または間接的に連結されていてもよい。【００３９】
短いオリゴヌクレオチドは，腎臓に多く送達され，長いオリゴマーは肝臓に多く送達される傾向がある。短いオリゴヌクレオチドは，血漿タンパク質に結合しにくく，結果として血漿中の半減期が短くなる傾向があるが，切断可能なリンカーなどを用いて多量体を構築することが可能である。本発明において用いられるＡＳＯは，切断可能なリンカーなどを用いて，他のＡＳＯに連結されていてもよい。【００４０】
本発明に係るＡＳＯは，５’末端および／または３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。他の末端修飾としては，Ｅ−ＶＰ，メチルホスホネート，ホスホロチオエート，Ｃ−メチルアナログなどがあり，オリゴヌクレオチドの安定性を高めることが知られている。本発明において用いられるＡＳＯは，これらの末端修飾を含んでいてもよい。【００４１】
ＡＳＯの配列設計
ＡＳＯの配列は，標的とする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができる。ＡＳＯ配列の設計方法は，当業者には公知であり，これまでに多数のＡＳＯが設計され，その活性が評価されている。例えば，ｐ５３遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は，ＥＰ１０１２２６７Ｂ１，ＥＰ１８８９９１１Ａ２，ＷＯ９８／３３９０４，ＥＰ１５９８４２０Ａ２，ＷＯ９５／０９９１６，ＷＯ２０／２４８８５，ＷＯ９８／２２１４２，ＷＯ１９９３／００３７７０，米国特許第５６５４４１５号，米国特許第５６４１７５４号，米国特許第５０８７６１７号，日本国特許第５６７１７９１号，Hata et al.Biochemical and Biophysical Research Communivcations 1991, 179, 528-534, Bayever et al. Leukemia & Lymphoma 1994, 12, 223-231, Mahdi et al. Journal of Cell Science 1995, 108, 1287-1293， Hirota et al. Jpn. J. Cancer Res. 1996, 87, 735-742, Dai et al. Acta Pharmacologica Sinica 2006, 27, 1453-1458，Robu et al. Pros Genetics 2007, 3, e78, alachkar et al.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2012,71, 228-232, Gorska et al. 2013, PLoS ONE 8(11): e78863, Swiatkowska et al. PLOS ONE, 2015, 10, e0141676, Swaitkowska et al. Acta Biochimica Polonica, 2016, 63, 645-651.に開示されている。ＡＳＯの配列は，標的とするＲＮＡの二次構造あるいは三次構造を考慮して決定してもよい。本発明者らは，ＭｏｂｙＤｉｃｋ（商標）と名付けた独自のアルゴリズムを配列決定の際に利用している。【００４２】
なお，核酸の構造予測に関しては，以下の参考文献を参照してもよい：
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; 
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.）。【００４３】
また，配列決定の際には，標的遺伝子のノックダウン効率だけでなく，毒性，オフターゲット効果，生物種間での共通性，安定性，細胞内への取り込み効率や，その他の因子も考慮に含めることができる。【００４４】
標的配列との相補性
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は，配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列に対して実質的に同一であり得る。ここで，実質的に同一とは，オリゴヌクレオチドが標的配列に対して完全（１００％）に同一である必要はなく，８０％以上の同一性を有することを意味する。特定の実施形態においては，オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。同一性の値は，ＷＯ２０１６／０２７７４７の記載に従って算出することができる（その内容は参照により本明細書に取り込まれる）。ＡＳＯによる発現または活性の阻害は，発現または活性の減少または阻止を指し，必ずしも発現または活性が完全に排除される必要はない。【００４５】
本発明の一つの態様は，細胞においてｐ５３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し，該オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列に対して実質的に同一な配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする，医薬組成物に関する。ここで，実質的に相補的とは，オリゴヌクレオチドが標的配列に対して完全（１００％）に相補的である必要はなく，８０％以上，例えば８５％，９０％，９５％，９８％または９９％の相補的を有することを意味する。このオリゴヌクレオチドは，配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。特定の実施形態において，オリゴヌクレオチドは，配列番号１から配列番号１２５のいずれか１つの配列に対して１００％同一な配列からなる。特定の実施態様では，オリゴヌクレオチドは，相補性領域の５’側および／または３’側に付加的な配列を有していてもよい。【００４６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計，調製および使用のための手法は，当業者にとり周知であるが，例えば，ＷＯ２０１６／０２７７４７を参照することができる（その内容は参照により本明細書に取り込まれる）。【００４７】
オリゴヌクレオチドの送達
オリゴヌクレオチドの細胞への送達には，トランスフェクション試薬，リポソーム，ベクター，ナノミセル，相補的核酸などのＤＤＳツールが利用されうる。なお，本発明の一部の態様において，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，本質的に一本鎖の分子である。ここで，本質的に一本鎖であるとは，オリゴヌクレオチドの送達や製剤化の過程において，一時的に相補的な別個の核酸と二本鎖を形成しても良いことを意味する。オリゴヌクレオチドが，標的ＲＮＡにハイブリダイズしてアンチセンス効果を発揮する際には，一本鎖のオリゴヌクレオチドの形で作用し，最終的には標的ＲＮＡとＡＳＯとにより二本鎖が形成される。なお，本発明の一部の態様において，配列番号１から１２５の配列を有するオリゴヌクレオチドは，ｓｉＲＮＡの一部としても用いられうる。【００４８】
ハイブリッド型ＡＳＯ
国際公開第２０１３／０８９２８３号およびNishina et al., Nature Communications volume 6, Article number: 7969 (2015)には，ＡＳＯと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド（ＨＤＯとも呼ばれる）がＡＳＯと比較して、効率よく肝臓に送達，集積され，肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されることが記載されている。国際公開第２０１５／１０５０８３号には，ＨＤＯにＧａｌＮＡｃ誘導体がリンカーを介して結合しているＡＳＯが記載されており，そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると，トコフェロール（Ｔｏｃ）修飾体より効率的に標的遺伝子の発現が抑制されることが記載されている。さらに，国際公開第２０１７／１３１１２号には，ＡＳＯに相補的なオリゴヌクレオチドを連結させて，分子内で二本鎖を形成するようにした一本鎖オリゴヌクレオチドが，二本鎖オリゴヌクレオチドと同等以上のアンチセンス効果を示すことが記載されている。よって，本発明の一部の態様では，ＡＳＯは，それに相補的な核酸鎖と二本鎖を形成していてもよい。また，本発明の一部の態様では，ＡＳＯは，それに相補的な核酸鎖と連結されており，分子内のセルフアニーリングにより，二本鎖部分を形成していてもよい。さらに，本発明の一部の態様では，ＡＳＯに相補的な核酸領域にトコフェロール（Ｔｏｃ）やＧａｌＮＡｃなどのリガンドが連結されていてもよい。さらに，一部の態様では，本開示のオリゴヌクレオチドは，ｓｉＲＮＡ二重鎖の一部として用いられてもよい。【００４９】
医薬組成物
アンチセンス核酸はそれ単独で製剤化することもできるが，通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し，製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。医薬組成物には，異なる配列を有する複数のＡＳＯの混合物が含まれていてもよい。【００５０】
投与対象には，ヒトまたは非ヒト動物，例えば，非ヒト哺乳動物が含まれる。投与経路は，治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく，経口投与，または口腔内，気道内，直腸内，皮下，筋肉内，静脈内および経皮などの非経口投与を挙げることができ，望ましくは静脈内投与を挙げることができる。【００５１】
経口投与に適当な製剤としては，乳剤，シロップ剤，カプセル剤，錠剤，散剤，顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は，水，ショ糖，ソルビトール，果糖などの糖類，ポリエチレングリコール，プロピレングリコールなどのグリコール類，ゴマ油，オリーブ油，大豆油などの油類，ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤，ストロベリーフレーバー，ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤，錠剤，散剤，顆粒剤などは，乳糖，ブドウ糖，ショ糖，マンニトールなどの賦形剤，デンプン，アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤，ステアリン酸マグネシウム，タルクなどの滑沢剤，ポリビニルアルコール，ヒドロキシプロピルセルロース，ゼラチンなどの結合剤，脂肪酸エステルなどの界面活性剤，グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。【００５２】
非経口投与に適当な製剤としては，注射剤，座剤，噴霧剤などがあげられる。注射剤は，塩溶液，ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂，水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また，噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず，かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。【００５３】
担体として具体的には乳糖，グリセリン，リポソーム，ナノミセルなどが例示される。本発明で用いる核酸，さらには用いる担体の性質により，エアロゾル，ドライパウダーなどの製剤が可能である。また，これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【００５４】
投与量または投与回数は，目的とする治療効果，投与方法，治療期間，年齢，体重などにより異なるが，例えば，成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。【００５５】
本発明の一つの態様は，約１４〜２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む，患者における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物に関する。患者は，ヒトもしくは非ヒト動物であり得る。なお，本明細書において，約１４ｍｅｒと言った場合は，少なくともその前後１塩基の範囲，すなわち１３ｍｅｒ，１４ｍｅｒ，および１５ｍｅｒを含むものと解され，約２０ｍｅｒと言った場合は，１９ｍｅｒ，２０ｍｅｒ，および２１ｍｅｒを含むものと解される。一部の態様においては，１４ｍｅｒのＡＳＯが好適に用いられる。【００５６】
特定の実施態様において，疾患または症状は，虚血−再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，および急性肝不全のうちのいずれかであり得る。【００５７】
本発明の一つの態様は，疾患または症状の治療もしくは予防のための医薬組成物，または疾患または症状の治療もしくは予防に用いるための医薬組成物であって，以下から選択されるいずれかの配列を含むか，いずれかの配列から成るＡＳＯを含む，医薬組成物に関する：ｐ５３−ＡＳＯ−１５，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２，およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６。【００５８】
医薬の製造における使用および治療方法
本発明の一つの態様は，患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬の製造における，約1４〜２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用に関する。一部の態様においては，１４ｍｅｒのＡＳＯが好適に用いられる。【００５９】
また，本発明の一つの態様は，患者における疾患または障害の治療または予防のための方法であって，該患者に約1４〜２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を投与する工程を含むことを特徴とする，方法に関する。一部の態様においては，１４ｍｅｒのＡＳＯが好適に用いられる。【００６０】
また，本発明の一つの態様は，患者における急性腎不全（急性腎障害）の治療もしくは予防のための方法であって，以下から選択されるいずれかの配列を含むか，いずれかの配列から成るオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む方法に関する：ｐ５３−ＡＳＯ−１５，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１１，ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１２，およびｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６。【００６１】
手術に関連する急性腎不全の予防および治療
急性腎不全（ＡＲＦ）は，例えば，心血管系の大手術を受けた患者においては，手術中の腎臓への局所血流の減少および血流回復後の再灌流障害に起因して，術後数時間から数日以内に発症するおそれがあり，発症後３０日の死亡率は５０％を超える。急性腎不全の予防，重症度の軽減，または治療を行うために，本発明に係るＡＳＯを患者に投与することができる。ＡＳＯの投与は，例えば，手術の開始前（例えば，２時間前，４時間前，または６時間前）から手術後８時間以内（例えば術後３時間後，４時間後，または５時間後）のいずれかの時点で行うことができる。投与は，単回または複数回のいずれでも行われ得る。投与は，例えば静脈注射により行われ得る。【００６２】
以下に，実施例を示して本発明を具体的に説明するが，これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００６３】
例１：ｐ５３に対するアンチセンス（ＡＳＯ）の設計，合成
ｐ５３を標的とした配列をＡＳＯについて設計し，合成した。設計にはNCBI Refseqコレクションに登録されているヒト転写物NM_000546.5（配列番号１３２，図１）を利用した。合成は株式会社ジーンデザイン（GeneDesign）に委託した。【００６４】
以下に合成した各ヌクレオチド配列を示す。大文字はＲＮＡまたは糖修飾核酸，小文字はＤＮＡを示す。「５」は５−メチルシチジンを表す。なお，各ヌクレオチドにおける括弧は，リボースの２’位の修飾を示し，ＬはＬＮＡを示す。例えば，Ｇ（Ｌ）はＬＮＡ型のグアノシンを表す。また，塩基間のアクサンシルコンフレックス「＾」（この記号はキャレット，ハットとも呼ばれる）はヌクレオシド間結合がチオリン酸結合（ホスホロチオエート結合）であることを示す。以下に示されるｐ５３−ＡＳＯ−０１〜２３は，それぞれ２塩基の５’ウイング領域と３’ウイング領域を有する１４塩基長の２−１０−２ギャップマーである。なお、これらのＡＳＯの５’末端および３’末端にはリン酸基は付加されていない。【００６５】
ｐ５３−ＡＳＯ−０１（配列番号１）
5’-5(L)G(L)t^t^g^t^t^t^t^c^a^g^G(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０２（配列番号２）
5’-T(L)G(L)a^a^c^c^a^t^t^g^t^t^5(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０３（配列番号３）
5’-G(L)T(L)g^a^a^c^c^a^t^t^g^t^T(L)5(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０４（配列番号４）
5’-5(L)A(L)c^g^c^c^c^a^c^g^g^a^T(L)5(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０５（配列番号５）
5’-5(L)T(L)c^a^c^g^c^c^c^a^c^g^G(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０６（配列番号６）
5’-5(L)A(L)t^c^t^c^g^a^a^g^c^g^5(L)T(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０７（配列番号７）
5’-T(L)G(L)a^g^t^t^c^c^a^a^g^g^5(L)5(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０８（配列番号８）
5’-5(L)5(L)t^t^g^a^g^t^t^c^c^a^A(L)Ｇ(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−０９（配列番号９）
5’-G(L)G(L)a^g^c^c^c^a^g^c^a^g^5(L)T(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１０（配列番号１０）
5’-5(L)G(L)g^a^g^c^c^c^a^g^c^a^G(L)5(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１１（配列番号１１）
5’-5(L)T(L)c^c^c^a^g^c^c^c^g^a^A(L)5(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１２（配列番号１２）
5’-5(L)5(L)c^a^g^c^c^c^g^a^a^c^G(L)5(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１３（配列番号１３）
5’-G(L)T(L)c^a^c^c^g^t^c^g^t^g^G(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１４（配列番号１４）
5’-T(L)5(L)c^a^g^g^g^a^a^g^c^g^T(L)G(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１５（配列番号１５）
5’-G(L)G(L)c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^G(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１６（配列番号１６）
5’-5(L)5(L)c^a^c^a^g^c^t^g^c^a^5(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１７（配列番号１７）
5’-G(L)T(L)c^a^t^g^t^g^c^t^g^t^G(L)A(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１８（配列番号１８）
5’-A(L)G(L)t^g^t^t^t^c^t^g^t^c^A(L)T(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−１９（配列番号１９）
5’-G(L)G(L)c^a^c^c^a^c^c^a^c^a^5(L)T(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−２０（配列番号２０）
5’-5(L)T(L)c^c^a^t^c^c^a^g^t^g^G(L)T(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−２１（配列番号２１）
5’-5(L)T(L)t^c^a^g^g^t^g^g^c^t^G(L)G(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−２２（配列番号２２）
5’-T(L)T(L)t^a^t^g^g^c^g^g^g^a^G(L)G(L)-3’
ｐ５３−ＡＳＯ−２３（配列番号２３）
5’-G(L)A(L)g^t^t^t^t^t^t^a^t^g^G(L)5(L)-3’【００６６】
例２：ｐ５３に対するアンチセンスの評価
５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において，１０％ＦＢＳ（Cat no.F7524，ＳＩＧＭＡ，非働化済），１％抗体含有Ｄ−ＭＥＭ（和光純薬工業株式会社Cat no.041-29775）培地でＨｅＬａ細胞を直径１０ｃｍのシャーレに播種して，コンフルエンス近くに培養してから，トリプシン処理によってプレートから遊離させた。２４ウェルプレート内で，２×１０４細胞数／５００μＬ／１ウェル，計２ウェルとして（Ｎ＝２），一晩培養した。次の日には，予めｒｅｆｏｌｄｉｎｇ（８５℃，５ｍｉｎ後、氷上で急冷）を実施したｐ５３−ＡＳＯ−０１〜２３をそれぞれ最終濃度１２５ｎＭになるように，また，非カチオン性脂質担体TransIT-TKO（Ｍｉｒｕｓ社製Cat no.MIR2150）１ウェルあたり２．５μＬを上述の無血清培地にそれぞれ添加して，最終的に５０μＬなるようにピペッティングで良く混ぜたあと，室温で１５分間インキュベートし，こちらの混合液を各ウェルにゆっくり添加して，形質移入を実施した。細胞を２４または４８時間のいずれかにわたり培養した。【００６７】
トータルＲＮＡはＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（トータルＲＮＡ抽出試薬）（ＴａＫａＲａ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．９１０９）あるいはＲＮＡ抽出精製キットZymo-Spin IC Columns（ZYMO Research R2062）を用いて調製した。ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて，ｐ５３  ｍＲＮＡの発現変化を調べた。まずはＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴキット（Code No.FSQ-101）を用いた。１５０〜３００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として，キットの推奨条件に従って使用し，逆転写反応を行った。具体的には，１５０〜３００ｎｇ／８μＬのトータルＲＮＡを調製して，６５℃，５分間加熱した後，キット内に含まれる5xRT Master Mixを各サンプルに２μＬ添加して，３７℃，１５分，５０℃，５分，９８℃，５分，以降４℃の４ステップで反応を行った。次にTB Green Premix ExTaq II（TaKaRa Code:RR820）を用いてＰＣＲ用反応液を以下のようにして調製した。各ウェルに４００ｎＭの順方向および逆方向プライマー並びに１２．５μＬのＴＢ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｇ  ＩＩ，さらに２μＬの逆転写反応液を含む最終量２５μＬに設定した。ＰＣＲ反応を９６穴プレートで，Thermal Cycler Dice Real Time Sysytem（ＴａＫａＲａ社製）を用いて実施した。ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨを内因性対照として用いた。また，もう１つ，ハウスキーピング遺伝子のＵＢＣも対照として使用した。３つの遺伝子について，それぞれ以下のプライマー配列を用いた。【００６８】
配列番号１２６
ｐ５３  ５’プライマー：  5’-CCTCTCCCCAGCCAAAGAAG-3’
配列番号１２７
ｐ５３  ３’プライマー：  5’-GCCTCATTCAGCTCTCGGAA-3’
配列番号１２８
ＧＡＰＤＨ  ５’プライマー：  5’-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’
配列番号１２９
ＧＡＰＤＨ  ３’プライマー：  5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’
配列番号１３０
ＵＢＣ  ５’プライマー：  5’-ATTTGGGTCGCGGTTCTTG-3’
配列番号１３１
ＵＢＣ  ３’プライマー：  5’-TGCCTTGACATTCTCGATGGT-3’【００６９】
Thermal Cycler Dice Real Time Sysytem（ＴａＫａＲａ）でのＰＣＲ分析結果をもとに，”Ｒｅｌ．Ｑｔｙ”値（相対量）を算出した。”Ｒｅｌ．Ｑｔｙ”値は，ｐ５３遺伝子およびＵＢＣ遺伝子のＰＣＲ分析結果を，コントロールとして設定したハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨの分析結果で補正した値である（”／ＧＡＰＤＨ”）。各サンプルのｐ５３の”／ＧＡＰＤＨ”値をｍｏｃｋの”／ＧＡＰＤＨ”値で除算し，”／ＧＡＰＤＨ（ｍｏｃｋ＝１）”の値を求めた。また各サンプルとｍｏｃｋのｐ５３の”Ｒｅｌ．Ｑｔｙ”値を対応するＵＢＣの”Ｒｅｌ．Ｑｔｙ”値で除算した値”／ＵＢＣ”を求めた。算出された各サンプルの”／ＵＢＣ”の値をｍｏｃｋの”／ＵＢＣ”の値で除算することで”／ＵＢＣ（ｍｏｃｋ＝１）”の値を求めた。算出された”／ＧＡＰＤＨ（ｍｏｃｋ＝１）”の値と，”／ＵＢＣ（ｍｏｃｋ＝１）”の値の平均値を求め，棒グラフを作成した（図２）。【００７０】
その結果，ＨｅＬａ細胞においてトランスフェクション試薬を使用した場合，ＡＳＯ−０１〜２３の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡの発現量を低下させ得ることが約半数のサンプルで確認された（図２）。ＡＳＯ−０３〜０５，０９，１０，１２，１５，１７，１８，２１，２３の各ＡＳＯにつき，５０％以下の阻害活性が培養１日後に認められた。【００７１】
なお，ＡＳＯ−１５，２３については，ホモロジー検索の結果，標的であるｐ５３  ｍＲＮＡ以外に１００％ハイブリダイズするヒト遺伝子配列が存在しないことが判明しており，これらのＡＳＯではオフターゲット効果が生じる可能性が低い。【００７２】
例３：標的部位を前後にずらしたＡＳＯの評価（トランスフェクション試薬あり）
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするＡＳＯの位置を５’側あるいは３’側にずらしたアンチセンス配列（ＡＳＯ−２４，ＡＳＯ−１５−１８〜ＡＳＯ−１５−２８；配列番号２４〜３５）を設計した。鎖長はｐ５３−ＡＳＯ−１５と同じ１４ｍｅｒである。なお，以下に示す配列は，左側が３’末端，右側が５’末端となっており，小文字はＤＮＡ，大文字はＬＮＡ，大文字のＣは特にＬＮＡ型の５−メチルシチジンを表している（以下同様）。【００７３】
【表１】
0006934695.tif 000003
【００７４】
アッセイは実施例２と同様にして行い，終濃度２０ｎＭでＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図３に示す。中心から５’側，あるいは３’側に設計位置をずらしたもの（１５−１８〜１５−２８）は，ＡＳＯ−１５に比べると抑制効果が弱くなっていた。【００７５】
例４：ｐ５３に対する阻害活性が認められたアンチセンスの短鎖化
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするＡＳＯの位置を５’側あるいは３’側にずらして設計した（ＡＳＯ−２５〜ＡＳＯ−３６；配列番号３６〜４７）。鎖長はｐ５３−ＡＳＯ−１５よりも１ｎｔ短い１３ｍｅｒとした。【００７６】
【表２】
0006934695.tif 000004
【００７７】
アッセイは実施例２と同様にして行い，終濃度２０ｎＭでＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図４に示す。Ｄａｙ１では１４ｍｅｒであるＡＳＯ−１５よりも強い抑制効果を示すものはなかった。２５，２６が約４０％程度の抑制効果を示し，１３ｍｅｒシリーズでは最も強い。これら二つのＡＳＯはｇｒｏｉｎ部分が中心にあるＡＳＯでＡＳＯ−１５に近い配列のため，ある程度効果を示すのかもしれない。Ｄａｙ２では２５，３３がＡＳＯ−１５より若干弱い程度の効果を示した。【００７８】
例５：ｐ５３に対する阻害活性が認められたアンチセンスの長鎖化
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，ＡＳＯの位置を５’側あるいは３’側にずらして設計した（ＡＳＯ−３７〜ＡＳＯ−４９，ＡＳＯ−１５−４０；配列番号４８〜６１）。鎖長はｐ５３−ＡＳＯ−１５よりも１ｎｔ長い１５ｍｅｒとした。【００７９】
【表３】
0006934695.tif 000005
【００８０】
アッセイは実施例２と同様にして行い，終濃度２０ｎＭでＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図５に示す。鎖長を１５ｍｅｒに伸長した１５ｍｅｒシリーズを２０ｎＭでトランスフェクトした結果，１４ｍｅｒであるＡＳＯ−１５よりも明確に強い抑制効果を示すものはなかった。３８，３７，１５−４０，４３はやはりＡＳＯ−１５に近い配列である。そのため，抑制効果が強いのかもしれない。今回，ＱＰＩ１００２も２０ｎＭでトランスフェクトしたが，ＡＳＯ−１５と同程度，あるいは若干弱い抑制効果を示した。【００８１】
例６：ｐ５３に対する阻害活性が認められたアンチセンスのさらなる長鎖化
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，ＡＳＯの位置を５’側あるいは３’側にずらして設計した（ＡＳＯ−５０〜ＡＳＯ−６３，ＡＳＯ−１５−１０；配列番号６２〜７６）。鎖長はｐ５３−ＡＳＯ−１５よりも２ｎｔ長い１６ｍｅｒである。【００８２】
【表４】
0006934695.tif 000006
【００８３】
アッセイは実施例２と同様にして行い，終濃度２０ｎＭでＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図６に示す。鎖長を１６ｍｅｒに伸長した１６ｍｅｒシリーズを２０ｎＭでトランスフェクトした結果，１４ｍｅｒであるＡＳＯ−１５よりも明確に強い抑制効果を示すものはなかった。【００８４】
例７：ｐ５３に対する阻害活性が認められたアンチセンスのさらなる長鎖化
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，ＡＳＯの位置を５’側あるいは３’側にずらして設計した（ＡＳＯ−６４〜ＡＳＯ−７８，ＡＳＯ−１５−４１；配列番号７７〜９２）。鎖長はｐ５３−ＡＳＯ−１５よりも３ｎｔ長い１７ｍｅｒである（以後１７ｍｅｒシリーズと呼ぶ）。【００８５】
【表５】
0006934695.tif 000007
【００８６】
アッセイは実施例２と同様にして行い，１７ｍｅｒシリーズを終濃度２０ｎＭでＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図７に示す。鎖長を１７ｍｅｒに伸長した１７ｍｅｒシリーズを２０ｎＭでトランスフェクトした結果，１４ｍｅｒであるＡＳＯ−１５よりも明確に強い抑制効果を示すものはなかった。１５−４１がＤａｙ１，２共にＡＳＯ−１５と同程度であった。また，ＡＳＯ−７０はＤａｙ１でのみＡＳＯ−１５より若干弱い程度の効果を示した。やはりｇｒｏｉｎ部分を中心としたＡＳＯの効果が高い。【００８７】
例８：ｐ５３に対する阻害活性が認められたアンチセンスのさらなる長鎖化
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，ＡＳＯの位置を５’側あるいは３’側にずらして設計した（ＡＳＯ−７９〜ＡＳＯ−９４，ＡＳＯ−（９５），ＡＳＯ−１５−１１；配列番号９３〜１０９）。鎖長はｐ５３−ＡＳＯ−１５よりも４ｎｔ長い１８ｍｅｒである（以後１８ｍｅｒシリーズ）。【００８８】
【表６】
0006934695.tif 000008
（配列番号９５〜１１１）【００８９】
アッセイは実施例２と同様にして行い，１８ｍｅｒシリーズを終濃度２０ｎＭでＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図８に示す。鎖長を１８ｍｅｒに伸長した１８ｍｅｒシリーズを２０ｎＭでトランスフェクトした結果，１４ｍｅｒであるＡＳＯ−１５よりも明確に強い抑制効果を示すものはなかった。【００９０】
例９：ウイング領域の改変の影響
ｐ５３−ＡＳＯ−１５の設計を基に，両端に位置するＬＮＡの数を変更し，発現抑制効果に与える影響を調べた（ＡＳＯ−１５−２９〜ＡＳＯ−１５−３３；配列番号１１０〜１１４）。また，両末端のＬＮＡを２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）に変更したＡＳＯも同時に抑制効果を評価した。【００９１】
【表７】
0006934695.tif 000009
【００９２】
アッセイは実施例２と同様にして行った。結果を図９に示す。ＬＮＡ（大文字）の位置をずらした，あるいは増やした１５−２９〜１５−３２はＡＳＯ−１５と同程度か，若干弱い。２’−ＭＯＥ修飾（大文字斜体）を施した１５−３３は抑制効果をほとんど示さなかった。【００９３】
例１０：他の改変の影響
ｐ５３−ＡＳＯ−１５を中心に鎖長を５’側，３’側あるいは両端に２ｎｔずつ延長した。また，塩基間をすべてＰＳ結合化した１５−１６，ギャップ領域を狭めた１５−１７も同時に評価した（ＡＳＯ−１５−０７〜ＡＳＯ−１５−１７；配列番号１１５〜１２５）。【００９４】
【表８】
0006934695.tif 000010
【００９５】
アッセイは実施例２と同様にして行い，終濃度１００ｎＭでＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，発現抑制効果を評価した。結果を図１０に示す。上段のバーの黒色方向に塩基を伸ばしている。ＡＳＯ−１５と同程度の効果を示すのは３’側に伸ばしたときのみ（ＡＳＯ−１５のコア配列が５’末端に存在しているもの）であった。ＬＮＡ間も含めすべての塩基間をＰＳ結合にした１５−１６はオリジナルよりも強い抑制効果を示した。ＬＮＡ数を増やした１５−１７はＡＳＯ−１５よりも抑制効果が若干弱かった。ｐ５３−ＡＳＯ−１５よりも明確に強い抑制効果を示すのは塩基間をすべてＰＳ結合にしたｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６であった。ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６（配列番号１２４）の構造は，5’-G(L)^G(L)^c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^G(L)^A(L)-3’と表記されうる。【００９６】
例１１：コレステロール付加
ｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６の３’末端にコレステロールを付加したｐ５３−ＡＳＯ−１５−１６−３２を終濃度２０ｎＭでＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし，実施例２と同様なアッセイを行った。結果を図１１に示す。３’末端にコレステロールを付加したｐ５３ＡＳＯ−１５−１６−３２はＭｏｃｋ，あるいはネガティブコントロールであるＮＴＳ１と比べて，顕著にｐ５３ｍＲＮＡレベルを減少させていた。１５−１６と比較すると，トランスフェクション後１日目では若干抑制効果が弱まったが，２日目では同等の効果を有していた。この結果からリガンドとしてコレステロールを付加しても抑制効果が維持されることが示された。【００９７】
例１２：ｐ５３誘導性レポーター遺伝子アッセイ
ｐ５３応答エレメントをもつ，レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイにより，ｐ５３タンパク質量を測定した。ｐ５３−ＡＳＯ−１５，およびＱｕａｒｋ社のｓｉＲＮＡであるＱＰ１００２の発現抑制効果をルシフェラーゼアッセイによって評価した。１日後の結果を図１２に示す。ＡＳＯは１．２ｎＭから効果を示し，１００ｎＭまで濃度依存的に発現を抑制した。ＱＰＩ１００２（ｓｉＲＮＡ）は濃度依存的に発現を抑制し，３．７ｎＭから上の濃度では約８０％の効果で頭打ちになっていた。【００９８】
２日後の結果を図１３に示す。Ｄａｙ２ではＡＳＯ−１５は３．７ｎＭで約５０％の抑制効果を示した。ＱＰＩ１００２は３．７ｎＭで約７０％の抑制効果を示し，抑制効果はほぼ頭打ちの状態であった。１．２ｎＭより低濃度では両者に差はほとんどなかった。ＩＣ５０はＡＳＯでは４．０ｎＭ、ＱＰＩ１００２では２．６ｎＭであった。【００９９】
例１３：ｑＰＣＲによる濃度依存性の評価
ｐ５３ＡＳＯ−１５あるいはＱＰＩ−１００２を０．０４６〜１００ｎＭの濃度でＨＣＴ１１６細胞にＴＦし，実施例２と同様のアッセイを行うことで発現抑制効果を測定した。結果を図１４に示す。ＴＦ後２４ｈｒではｐ５３−ＡＳＯ−１５は０．０４６〜１１ｎＭでは抑制効果をほとんど示さず，３３ｎＭで２４％，１００ｎＭで４９％の抑制効果を示した。同条件下でのＱＰＩ−１００２の抑制効果は０．０４６〜１１ｎＭでは抑制効果をほとんど示さず，３３ｎＭで２３％，１００ｎＭで５９％の抑制効果を示した。ＴＦ後４８ｈｒではｐ５３−ＡＳＯ−１５は０．０４６〜３．７ｎＭでは抑制効果をほとんど示さず，１１ｎＭで１０％，３３ｎＭで２２％，１００ｎＭで５２％の抑制効果を示した。同条件下でのＱＰＩ−１００２の抑制効果は０．０４６〜３．７ｎＭでは抑制効果をほとんど示さず，１０ｎＭでは１５％，３３ｎＭで３１％，１００ｎＭで７９％の抑制効果を示した。なお、Δｐ５３と表記したサンプルはｐ５３遺伝子をノックアウトしたＨＣＴ１１６細胞から抽出したＲＮＡを用いている。【０１００】
例１４：ウエスタンブロッティングによる評価
ＨＣＴ１１６細胞にＡＳＯあるいはＱＰＩ−１００２を１〜１００ｎＭの濃度でトランスフェクト（ＴＦ）し，その後４８時間で細胞を回収した。回収した細胞は二群に分け，一方からは全細胞ライゼートを調製し，もう一方からはトータルＲＮＡを調製した（図１５）。調製した全細胞ライゼートを用いてウエスタンブロッティングを行いｐ５３タンパク質レベルを測定した。また、調製したトータルＲＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行いｐ５３ｍＲＮＡレベルを測定した。結果を図１６に示す。ｐ５３タンパク質レベルはｍＲＮＡレベルと相関しており，ＡＳＯ−１５，１５−１６を用いた場合１００ｎＭではｐ５３のバンドが検出されないほどに減弱していた。対して，ＱＰＩ−１００２は１００ｎＭの濃度でもバンド強度は弱くなるものの検出は可能なレベルであった。【０１０１】
本明細書には，本発明の好ましい実施態様を示してあるが，そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは，当業者には明らかであり，当業者であれば，本発明から逸脱することなく，様々な変形，変更，置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が，本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また，本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む，全ての刊行物に記載の内容は，その引用によって，本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明者らは，ｐ５３遺伝子の転写産物に対して作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定した。これらの比較的短いオリゴヌクレオチドを用いることで，ｐ５３  ｍＲＮＡの量を低下させ，タンパク質の発現を抑制することができる。これらのＡＳＯは急性腎不全や脱毛症などの治療または予防に有用となりうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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